(57)【要約】【課題】酵母内で、染色体を分断・脱落させるために簡易な方法を提供すること。【解決手段】標的配列（ａ）、マーカー遺伝子配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列をこの順で有する線状化染色体分断ベクター（１）を作成する工程；標的配列（ｂ）、酵母染色体のセントロメア配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列をこの順で有する線状化染色体分断ベクター（２）を作成する工程；および該染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する工程を含む、酵母中の染色体の改変方法を提供する。ここで、ｎはそれぞれ独立して、６〜１０の整数である。この染色体分断ベクターは、ＣＣＣＣＡＡの繰り返し配列を有しているにもかかわらず、ＰＣＲで特異的に増幅できるため、従来のＤＮＡ分断方法に比べて、極めて簡単にかつ容易に、染色体分断ベクターを調製することができる。そして、この染色体分断ベクターで分断されて生じる分断染色体の（Ｃ４Ａ２）ｎ配列には酵母テロメア配列が結合されていると考えられるので、分断染色体として機能できる。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列（ａ）、マーカー遺伝子配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ａ）をこの順で有する線状化染色体分断ベクター（１）を作成する工程；
標的配列（ｂ）、酵母染色体のセントロメア配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ｂ）をこの順で有する線状化染色体分断ベクター（２）を作成する工程；
および該染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する工程；  を含み、ここで、ｎはそれぞれ独立して、６〜１０の整数である；、
酵母中の染色体の改変方法。
【請求項２】
前記染色体分断ベクター（１）および染色体分断ベクター（２）が、ＰＣＲで得られたベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ａ）および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ｂ）のｎが両方とも６である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記染色体の改変が、酵母染色体の分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）および／または脱落（ｌｏｓｓ）により引き起こされる、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母の染色体分断ベクターを用いる、酵母中に存在する染色体の改変方法に関する。さらに、詳しくは、本発明は、２つの線状化染色体分断ベクターを用いて、染色体を改変する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組換えＤＮＡ技術の発展によって、遺伝子を自在に改変あるいは加工する技術が発展し、種々の生物において改変遺伝子を導入することが可能となっている。
【０００３】
ＤＮＡの改変技術には、部位特異的変異誘発、制限酵素による処理、あるいはＰＣＲを用いる方法なども含まれるが、対象となる遺伝子は、１０ｋｂ程度、大きくても４０ｋｂ程度の、ごく限られた大きさの遺伝子であり、染色体のような、巨大ＤＮＡを自在に改変する技術は、まだ、検討が始まったばかりである。
【０００４】
ところで、酵母は、古くから発酵工業に用いられている有用な微生物である。この酵母の染色体を、染色体の分断、脱落などの染色体改変技術により改変することにより、例えば、必要な染色体の数、長さ、量などに関する知見が得られ、ゲノムの構築原理の解明が期待される。この原理が構築されれば、これを利用して、例えば、エネルギーを消費する不要な遺伝子を削除した酵母を宿主として、効率的に物質生産を行うことなどが可能になると期待される。さらに、所望の染色体領域を他の酵母に移植できれば、酵母染色体機能の解析や有用酵母の育種が可能となる。
【０００５】
さらに、例えば、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣべクター）を用いて構築された、植物染色体の巨大ＤＮＡ（例えば、２００ｋｂ以上）を含むＤＮＡライブラリーが作成されている。この巨大ＤＮＡを、多様な目的に応じて自在に分離、加工することができれば、今までにない有用形質転換植物の創成をはじめとする植物バイオテクノロジーだけでなく、動植物染色体構造の解明、ポジショナルクローニングの迅速化、動植物遺伝子機能検定の簡便化、動植物人工染色体の構築など、動植物基礎生物学をも飛躍的に進展させることが期待される。
【０００６】
そこで、酵母の染色体あるいは動植物染色体を対象にして、染色体を改変する試み、例えば、染色体分断の試みがなされている。染色体の安定化の為には末端にテロメア配列が必要であり、従来の染色体分断技術では分断染色体を安定化させる為に、テトラヒメナｒＤＮＡ由来のテロメア配列（以下、Ｔｒ配列ということがある）に酵母のテロメア配列が高頻度に付加される現象を利用している（非特許文献１参照）。この染色体分断技術の概略を図１１で示す。この技術は、セントロメア（Ｃ）、逆向きに配位されたテトラヒメナｒＤＮＡ由来のテロメア繰り返し配列（Ｔｒ−Ｔｒ）、酵母形質転換体の選択符号（Ｍ）、任意の標的配列を含むベクターを酵母染色体に形質転換で導入する（図１１（ａ））と、標的配列で組換えを起こし（図１１（ｂ））、染色体に導入されたＴｒ−Ｔｒで解離が起こり（図１１（ｃ））、その後、解離末端に酵母のテロメア配列が付加される（図１１（ｄ））現象を基礎としている。
【０００７】
この染色体分断ベクターに用いられるテトラヒメナｒＤＮＡ由来のＴｒ配列を図１２に示す。Ｔｒ配列は、約７００ｂｐからなり、ＡＴリッチな約４００ｂｐに続いて、約３００ｂｐのＣＣＣＣＡＡ（Ｃ４Ａ２）繰り返し配列が続き、この繰り返し配列がシグナルとなり、酵母のテロメア配列が高頻度に付加されると考えられている（図１２（ａ））。なお、６回のＣ４Ａ２繰り返し配列（Ｃ４Ａ２）６でも、そのＤＮＡ末端に酵母のテロメア配列が付加されることが報告されている（図１２（ｂ））（非特許文献２参照）。
【０００８】
この図１２（ａ）で示される事象を利用して、例えば、酵母のセントロメア遺伝子（ＣＥＮ４）、マーカー遺伝子（ＵＲＡ３）、および２つの逆向きに配置されたテロメア配列と、そのテロメア配列の間にｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡとしてＨＩＳ３遺伝子とを有する酵母染色体分断ベクターｐＣＳＶ１を用いて、酵母染色体を分断する試みが報告されている（特許文献１参照）。
【０００９】
この分断ベクターｐＣＳＶ１を用いる酵母染色体の分断を図１３に示す。図１３において、ｐＣＳＶ１はＣＥＮ４と、ＵＲＡ３（図示せず）と、逆向きに配置されたＴｒと、２つのＴｒ配列の間にｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ（Ｘ）とを有している。分断は、まず、分断部位に対応する標的配列（Ｙ）を分断ベクターｐＣＳＶ１に導入する工程（Ｓｔｅｐ１）；ｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ（Ｘ）を除去する工程（Ｓｔｅｐ２）；ｓｔｕｆｆｅｒ  ＤＮＡ（Ｘ）を除去したプラスミドを再環状化する工程（Ｓｔｅｐ３）；および再環状化されたプラスミドを標的配列（Ｙ）中で切断して線状化し、酵母に導入する工程（Ｓｔｅｐ４）；からなっている。線状化され、酵母細胞内に導入された分断ベクターは、標的配列付近で相同組換えを起こし、ついで、対向するテロメア配列が解離され、分断されると考えられる。
【００１０】
しかし、上記方法は、複雑な４工程の手順を踏む必要があり、しかも、この方法では、（１）分断のたびに標的配列を分断ベクターに逐一クローン化する必要があり、（２）Ｓｔｅｐ１の標的配列Ｙが導入されたベクター、およびＳｔｅｐ３の再環状化したベクターは、それぞれ、一旦細胞に導入して、増幅しなければならず、そして、（３）さらに染色体への導入効率を上げるために、形質転換のたびに、制限酵素で標的配列内に一箇所切断を入れるという非常に時間のかかる作業を必要とする。このように、上記方法は、煩雑な複数の工程を必要とし、時間がかかるという問題がある。
【００１１】
そこで、テロメア配列（ｉ）−酵母染色体のセントロメア配列−標的配列（ｉ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（Ａ）と、標的配列（ｂ）−マーカー遺伝子配列−テロメア配列（ｉｉ）をこの順で有する線状化された染色体分断ベクター（Ｂ）とを調製して、酵母に導入し、染色体の分断を試みた。その結果、染色体の分断が可能なことを見出した。この２断片型分断ベクターは、図１４（ａ）に示すように、標的配列（δ）−ＣＥＮ−Ｔｒ配列を有するベクターと、標的配列（δ）−マーカー遺伝子−Ｔｒ配列を有するベクターから、それぞれの遺伝子を切り出して得られる。従って、例えば、図１３に示すような、染色体分断ベクターを用いる従来の方法に必要とされる複雑な工程は不要となる。
【００１２】
しかし、この２断片型分断ベクターは、ＰＣＲを用いても、増幅することができなかった（図１４（ｂ）参照）。上記の通り、Ｔｒ配列には約３００ｂｐの繰り返し配列が存在するため、ＰＣＲを用いても、特異的に２断片型分断ベクターを増幅できなかった。そのため、図１３に示される方法よりは、はるかに簡便な２断片型分断ベクターを用いる方法でも、未だ、環状ベクターを増幅させ、切断し、ＤＮＡ断片を回収しなければならないという操作が残る。
【００１３】
そこで、酵母を宿主として、特に染色体などの、巨大ＤＮＡを簡単に分離し、加工し、脱落させ、あるいは単離する、より簡単な技術の開発が望まれている。
【００１４】
【特許文献１】
特開平１０−８４９４５号公報
【非特許文献１】
Ｓｈａｍｐａｙら  （１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ）  ３１０，  １５４−１５７
【非特許文献２】
Ｍｕｒｒａｙら  （１９８８）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８（１１），  ４６４２−４６５０
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、染色体分断ベクターを容易に調製でき、しかも、染色体改変、特に分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）と脱落（ｌｏｓｓ）、並びに染色体の単離を容易に行うことが可能な方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、染色体分断方法、特に、使用する染色体分断ベクターについて鋭意検討したところ、従来用いられていたＴｒ配列の１／５〜１／６程度のＣＣＣＣＡＡの繰り返し単位であれば、ＰＣＲで増幅可能であること、そして、この短い繰り返ししか有していない染色体分断ベクターであっても、Ｔｒ配列として機能し、酵母染色体を分断できることを見出して本発明を完成させた。
【００１７】
本発明は、標的配列（ａ）、マーカー遺伝子配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ａ）をこの順で有する線状化染色体分断ベクター（１）を作成する工程；標的配列（ｂ）、酵母染色体のセントロメア配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ｂ）をこの順で有する線状化染色体分断ベクター（２）を作成する工程；、および該染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する工程；を含み、ここで、ｎはそれぞれ独立して、６〜１０の整数である；酵母中の染色体の改変方法を提供する。
【００１８】
好ましい実施態様においては、前記染色体分断ベクター（１）および染色体分断ベクター（２）が、ＰＣＲで得られたベクターである。
【００１９】
さらに好ましい実施態様においては、前記（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ａ）および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ｂ）のｎが両方とも６である。
【００２０】
好ましい実施態様においては、前記染色体の改変が、酵母染色体の分断（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）および／または脱落（ｌｏｓｓ）により引き起こされる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の染色体改変方法は、染色体分断ベクター（１）および染色体分断ベクター（２）の２断片型染色体分断ベクターを用いる方法である。染色体分断ベクター（１）は、標的配列（ａ）、マーカー遺伝子配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ａ）をこの順で有し、線状化されている。染色体分断ベクター（２）は、標的配列（ｂ）、酵母染色体のセントロメア配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ｂ）をこの順で有し、線状化されている。ここで、染色体分断ベクター（１）および（２）における（Ｃ４Ａ２）ｎは、Ｔｒ配列の繰り返し配列を構成する一単位であるＣＣＣＣＡＡの塩基配列がｎ回繰り返された配列を意味し、ｎはそれぞれ独立して、６〜１０の整数である。ｎが６であることが最も好ましい。
【００２２】
図１に、本発明に用いられる染色体分断べクター（１）および染色体分断ベクター（２）を示す。この２つの染色体分断ベクター（１）および（２）は、従来用いられていたＴｒ配列よりもはるかに小さいＣＣＣＣＡＡの６〜１０の繰り返し単位しか有していないにも拘わらず、酵母に同時に導入することにより、テロメア配列として機能し、酵母染色体を分断できる。また、ＰＣＲで増幅可能であるため、調製が極めて容易である。
【００２３】
（酵母染色体のセントロメア配列）
酵母染色体のセントロメア配列は、酵母染色体の有糸分裂に必要な配列をいい、どの染色体のセントロメアであっても、特に制限なく用いられる。特に、ＣＥＮ４、ＣＥＮ６などが好ましく使用される。酵母染色体のセントロメア配列は、所望のセントロメア配列を有するプラスミド（例えば、ｐＤＷ２６（Ｗｉｎｄｉａｎｔ，Ｄ．ら、Ｊ  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８２，  １９９−２０４  （１９９６））を鋳型とする、ＰＣＲで調製される。調製に際し、適切な制限酵素切断部位を含むプライマーを用いれば、所望のセントロメア配列を含む染色体断片が、容易に調製される。
【００２４】
（マーカー遺伝子）
マーカー遺伝子としては、酵母に染色体分断ベクターが導入されたことが確認できるマーカーであれば、特に制限はない。一般的には、例えば、ＨＩＳ３、ＨＩＳ５、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＬＹＳ２などの栄養要求性マーカー遺伝子などが用いられる。また、真核細胞で発現する薬剤耐性マーカー遺伝子、例えばカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｍ）を用いることもできる。マーカー遺伝子配列は、そのマーカー遺伝子を有するプラスミドを鋳型とする、ＰＣＲで調製される。調製に際し、適切な制限酵素切断部位を含むプライマーを用いれば、所望のマーカー遺伝子配列を含むＤＮＡ断片が、容易に調製される。
【００２５】
（標的配列）
標的配列は、酵母中に存在する、分断あるいは脱落の対象となる染色体（例えば、酵母染色体、植物染色体、動物染色体など）の分断位置を含む配列に対応する配列をいう。標的配列は、染色体の分断位置に相当する配列を、例えば、適切な制限酵素部位を含むように合成することにより得られる。例えば、適切な制限酵素切断部位を含むように設計されたプライマーを用い、酵母全ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、所望の標的配列を含むＤＮＡ断片が容易に調製される。
【００２６】
（染色体分断ベクター（１）の調製）
染色体分断ベクター（１）は、標的配列（ａ）、マーカー遺伝子配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ａ）をこの順で有する、線状化ベクターである。この染色体分断ベクター（１）は、例えば、適切なマーカー遺伝子を有するベクターを鋳型として、（Ｃ４Ａ２）ｎ配列と標的配列（ａ）とをプローブとして、マーカー遺伝子を含むように、ＰＣＲを行うことによって、調製される。
【００２７】
染色体分断ベクター（１）の鋳型となるプラスミドは、例えば、最も簡単には、以下のように作成され得る：Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ由来のＨＩＳ３遺伝子（ＣｇＨＩＳ３遺伝子）をｐＵＣ１８に導入したプラスミド（Ｋｉｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １６５，  ２０３−２０６）（以下、このプラスミドを、本明細書ではｐ１４１７という）を鋳型として、適切なプライマーを用いて、ＰＣＲを行う；次いで、得られたＣｇＨＩＳ３遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に挿入する。
【００２８】
得られたマーカー遺伝子を有する染色体分断ベクター（１）を使用した場合、分断された染色体を有する形質転換株は、再度、形質転換の宿主として使用できない。そのため、複数回、形質転換（染色体の分断）を行うことができない。そこで、形質転換後に、染色体が分断された形質転換株に含まれるマーカー遺伝子を除去することができれば、複数回の形質転換（染色体の分断）が可能となる。このことにより、例えば、酵母の生育に必要な染色体の数、長さ、量などに関する知見が得られ、酵母染色体機能の解析が期待される。そして、効率的に物質生産などに適した、分断ミニ染色体を有する酵母などの有用酵母の育種が可能となる。
【００２９】
そこで、染色体分断ベクター（１）の鋳型となるプラスミドに、例えば、部位特異的組換え系（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム）を用いた選択符号再利用系遺伝子を組み込み、形質転換終了後に、マーカー遺伝子を除去できるようにすることが、好ましい。このＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムは、プラスミドｐＵＧ６（Ｇｕｌｄｅｎｅｒら、（１９９６）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４（１３），  ２５１９−２５２４）に組込まれていることが知られている。図２は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを示す。図２（ａ）に示すように、マーカー遺伝子をｌｏｘＰ遺伝子で挟まれるように挿入し、Ｃｒｅ組換え酵素を発現させると、図２（ｂ）に示すような部位特異的組換えが起こり、図２（ｃ）に示すように、マーカー遺伝子が除去される。なお、Ｃｒｅ組換え酵素の発現は、ガラクトース代謝酵素をコードするＧＡＬ１遺伝子のプロモータによって調節される。
【００３０】
プラスミドｐＵＧ６を用いて、染色体分断ベクター（１）の鋳型となるプラスミドは、例えば、以下のように作成される：（ｉ）ＣｇＨＩＳ３遺伝子を保持するプラスミドｐ１４１７を鋳型として、ＰＣＲを行う；（ｉｉ）得られたＣｇＨＩＳ３遺伝子を含有するＤＮＡ断片を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする；（ｉｉｉ）再度、ＣｇＨＩＳ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を切りだし、カナマイシン耐性遺伝子を除去したプラスミドｐＵＧ６の断片に挿入する；（ｉｖ）得られたプラスミドから、ＣｇＨＩＳ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に挿入する。これによって、染色体分断ベクター（１）の鋳型となるプラスミドが得られる。
【００３１】
この（ｉ）から（ｉｖ）の工程を経て得られるＣｇＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドには、プラスミドｐＵＧ６に由来する、図２に示すような部位特異的組換え系（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム）を用いた選択符号再利用系遺伝子が含まれている。従って、このプラスミドを鋳型として、ｌｏｘＰ遺伝子に挟まれたマーカー遺伝子を含むようにＰＣＲを行う。このようにして得られた染色体分断ベクター（１）は、繰り返し形質転換が可能となる。
【００３２】
染色体分断ベクター（１）は、マーカー遺伝子を有するプラスミドを鋳型として、分断する酵母染色体の領域と相同性を有する標的配列（ａ１）および鋳型プラスミドの相同配列（ａ２）を有するプライマー、並びに（Ｃ４Ａ２）ｎ配列および鋳型プラスミドの相同配列（ａ３）を有するプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、得られる。鋳型プラスミドと相同配列を有する配列（ａ２）および（ａ３）は、マーカー遺伝子配列を挟むように選択される。ＰＣＲの条件には特に制限はなく、当業者が通常用いる条件が使用される。
【００３３】
（染色体分断ベクター（２）の調製）
染色体分断ベクター（２）は標的配列（ｂ）、酵母染色体のセントロメア配列、および（Ｃ４Ａ２）ｎ配列（ｂ）をこの順で有する線状化ベクターである。この染色体分断ベクター（２）は、例えば、酵母のセントロメア配列を有するベクターを鋳型とし、（Ｃ４Ａ２）ｎ配列と標的配列（ｂ）とをプライマーとして、ＰＣＲを行うことによって、調製される。
【００３４】
染色体分断ベクター（２）の鋳型となるプラスミドは、例えば、以下のように作成され得る：適切なプライマーを用いて、酵母の染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲを行う；次いで、得られたＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングする；さらに、適切な制限酵素により、ＣＥＮ４を含むＤＮＡ断片を回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に挿入する。これによって、染色体分断ベクター（２）の鋳型となるプラスミドが得られる。
【００３５】
染色体分断ベクター（２）は、酵母セントロメアを有するプラスミドを鋳型として、分断する酵母染色体の領域と相同性を有する標的配列（ｂ１）および鋳型プラスミドの相同配列（ｂ２）を有するプライマー、および（Ｃ４Ａ２）ｎと鋳型プラスミドの相同配列（ｂ３）を有するプライマーを用いて、ＰＣＲを行うことにより、得られる。鋳型プラスミドと相同性を有する配列（ｂ２）および（ｂ３）は、酵母セントロメア配列を挟むように選択される。
【００３６】
（酵母染色体の分断方法）
本発明の方法を、図３に基づいて、（Ｃ４Ａ２）６配列をプライマーとして用いる場合について、模式的に説明する。まず、図３（ａ）に示すように、標的配列（ａ）、標的配列（ｂ）、および（Ｃ４Ａ２）６配列を有する配列をプライマーとして、マーカー遺伝子（Ｍ）、あるいはセントロメア配列（ＣＥＮ４）を有するプラスミドを鋳型として、染色体分断ベクター（１）および染色体分断ベクター（２）を調製する。次に、図３（ｂ）に示すように、この染色体分断ベクター（１）および（２）を酵母に導入する。導入された染色体分断ベクターは、酵母染色体中の相同性のある部位で相同組換えを起こし、染色体に導入され、図３（ｃ）に示すように、組換え前に、あるいは組換え後に、（Ｃ４Ａ２）６配列に酵母のテロメア配列が付加されて、染色体として機能し得るようになると考えられる。なお、プライマー中の標的配列（ａ）または（ｂ）は、染色体の組換えが生じたときに、分断ベクターの（Ｃ４Ａ２）６配列が２つに分断されたそれぞれの染色体の末端に配置されるように、その向きが決定される。
【００３７】
（酵母染色体の分断・脱落）
本発明の染色体分断ベクターを用いる、酵母染色体の分断・脱落について説明する。染色体を分断する場合、染色体の脱落を伴わない場合と、染色体の脱落を伴う場合とがある。染色体の分断・脱落の様式を、図４に例示する。例えば、図４（Ａ）において、標的配列（ｂ）が分断位置を挟んで分断位置の左側の染色体配列を有し、標的配列（ａ）が分断位置の右側の染色体配列を有するように、標的配列（ａ）および（ｂ）を構成する。このような標的配列（ａ）および（ｂ）をそれぞれ有する線状化された染色体分断ベクター（１）および（２）を同時に酵母に導入することにより、図４（Ａ）の下段に示されるような染色体の分断が生じると考えられる。
【００３８】
また、染色体分断ベクター（１）あるいは（２）が、例えば、図４の（Ｂ）および（Ｃ）に示されるように、単独で、分断・脱落に関与することも考えられる。これらの図４に示す様式（Ａ）〜（Ｃ）が、単独で、あるいは複合して、さらには、その他の様式で、染色体の分断・脱落が起こると考えられる。
【００３９】
さらに、得られた分断染色体を有する形質転換体が部位特異的組換え系（Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム）を含む場合、Ｃｒｅ酵素を発現させてマーカー遺伝子を除去し、次の染色体分断ベクターを導入してもよい。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明がこの実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００４１】
（ＰＣＲの条件）
以下の参考例および実施例において、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅および染色体分断ベクター（１）および（２）の調製は、以下の条件で行った。
Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌ、１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液（Ｔａｋａｒａ  ＥＸ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ付属緩衝液）４μｌ、ｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ  各２．５ｍＭ）４μｌ、鋳型ＤＮＡ０．２μｌ、２種類のプライマーＤＮＡ（各２０ｐｍｏｌ／μｌ）各２μｌを０．２ｍｌの専用チューブに入れ、無菌水で４０μｌに調製した。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ）にセットし、１）９４℃、３分；２）９４℃、１分（２本鎖ＤＮＡの変性）；３）５０〜６０℃、２分（プライマーのアニーリング）；４）７２℃、１〜３分（ポリメラーゼによるＤＮＡの伸張）および５）４℃、１０分；の反応を２５回繰り返して行った。
【００４２】
（使用酵母および分断する染色体）
分断する染色体を、一倍体出芽酵母の染色体１６本のうち一番小さい第一番染色体（２３０１９５  ｂｐ）に定め、使用する選択符号はＣｇＨＩＳ３遺伝子に、分断点はそのほぼ中央部（第一番染色体１１９８７４  ｂｐと１１９８７５  ｂｐの間）に設定した。期待通りに分断されると、第一番染色体は、約１２０ｋｂｐと約１１０ｋｂｐとに分断される。なお、一倍体出芽酵母は、ＳＨ５２０９（ａ）株（旧ＦＹ８３３株：ＭＡＴａ  ｈｉｓ３Δ２００  ｕｒａ３−５２  ｌｅｕ２Δ１  ｌｙｓ２Δ２０２  ｔｒｐ１Δ６３  （Ｗｉｎｓｔｏｎら，  （１９９５）  Ｙｅａｓｔ  １１，５３−５５）である。
【００４３】
参考例１：染色体分断ベクター（１）を調製するための鋳型となるプラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３の構築
プラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３は、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムのｌｏｘＰ部位に組込まれたＣｇＨＩＳ３遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）に組込むことによって得られるプラスミドである。
【００４４】
まず、以下の配列を有するＣｇＨＩＳ３−１およびＣｇＨＩＳ３−２：
ＣｇＨＩＳ３−１：  ５’−ＣＴＣＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＡＣＣＧＡＴＣＡＧＡＴＧＣＡＣＡ−３’（配列番号１）
ＣｇＨＩＳ３−２：  ５’−ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡ−３’（配列番号２）
をプライマーとして用いて、ＣｇＨＩＳ３遺伝子を保持するプラスミドｐ１４１７を鋳型として、ＰＣＲを行った。得られた約１．６２ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングすることによって、ｐＴ７−ＣｇＨＩＳ３を構築した。なお、プライマーとして用いたＣｇＨＩＳ３−１には、ＸｂａＩ切断部位を生じる配列が組み込まれている。同様に、プライマーとして用いたＣｇＨＩＳ３−２には、ＸｈｏＩ切断部位を生じる配列が組み込まれている。
【００４５】
つぎに、得られたｐＴ７−ＣｇＨＩＳ３を制限酵素ＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化した。アガロースゲルを用いるＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ＫＩＴ（フナコシ株式会社製）により、ＣｇＨＩＳ３遺伝子を含む約１．６２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、ｐＵＧ６をＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩおよびＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化して、カナマイシン耐性遺伝子を含む約１．５４ｋｂｐが除去された断片を、アガロースゲルからＧＥＮＥ  ＣＬＥＡＮ  ＩＩ  ＫＩＴ  （フナコシ株式会社）を用いて回収した。そして、回収したｐＵＧ６のＸｂａＩ／ＸｈｏＩ切断部位に、ＣｇＨＩＳ３遺伝子を含む約１．６２ｋｂｐのＤＮＡ断片を挿入して、ｐＵＧ６−ＣｇＨＩＳ３を構築した。
【００４６】
得られたｐＵＧ６−ＣｇＨＩＳ３をＮｏｔＩで消化することによって得られるＣｇＨＩＳ３遺伝子を含んだ約１．７９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）のＮｏｔＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３構築した。
【００４７】
参考例２：染色体分断ベクター（２）を調製するための鋳型となるプラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４の構築
プラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４は、酵母のセントロメア配列を有するプラスミドであり、染色体分断ベクター（２）を調製する際の鋳型となるプラスミドである。このプラスミドは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）にセントロメアとしてのＣＥＮ４遺伝子が組み込まれているプラスミドである。
【００４８】
まず、以下の配列を有するＣＥＮ４−１およびＣＥＮ４−２：
ＣＥＮ４−１：  ５’−  ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＴＡ−３’  （配列番号３）
ＣＥＮ４−２：  ５’−  ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＧＡＧＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＴＴ−３’（配列番号４）
をプライマーとして用いて、出芽酵母野生型株Ｓ２８８Ｃの染色体ＤＮＡを鋳型にして、ＰＣＲを行った。得られた約０．８５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングすることによって、ｐＴ７−ＣＥＮ４を構築した。なお、ＣＥＮ４−１およびＣＥＮ４−２には、ＥｃｏＲＩ切断部位が組み込まれている。
【００４９】
つぎに、得られたｐＴ７−ＣＥＮ４をＥｃｏＲＩで消化して、ＣＥＮ４を含む約０．８５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４を構築した。
【００５０】
（実施例１：染色体分断ベクターの作成）
図５に、染色体分断ベクター（１Ａ）、（２Ａ）、（１Ｂ）および（２Ｂ）の作成の模式図を示す。
【００５１】
（染色体分断ベクター（１Ａ）の作成）
以下のプライマー：
ｃｈＩＹ−１１：５’−ＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＡＧＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＴＴＡＧＣＡＴＧＴＡＡＴＣＡＴＴＴＡＣＴＴＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号５）、および
Ｔｒ６−１：５’−ＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＡＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴ−３’（配列番号６）を用いた。プライマーｃｈＩＹ−１１の５’側の８０塩基は、標的配列である第一番染色体の１１９７９５ｂｐ−１１９８７４ｂｐの塩基配列とのホモロジー領域を示し、残りの１９塩基はプラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３とのホモロジー領域である。プライマーＴｒ６−１は、（Ｃ４Ａ２）６配列と２０塩基のプラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３とのホモロジー領域を有している。この２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物１を得た。
【００５２】
（染色体分断ベクター（２Ａ）の作成）
以下のプライマー：ｃｈＩｙ−１２  ：  ５’−ＧＴＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＣＧＴＴＡＣＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号７）、およびプライマーＴｒ６−１（配列番号６）を用いた。プライマーｃｈＩＹ−１２の５’側の８０塩基は、標的配列である第一番染色体の１１９８７５ｂｐ−１１９７５４ｂｐの塩基配列とのホモロジー領域を示し、残りの１９塩基はプラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４とのホモロジー領域である。この２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物２を得た。
【００５３】
（染色体分断ベクター（２Ｂ）の作成）
以下のプライマー：
ｃｈＩＹ−１３：５’−ＴＴＴＡＡＧＴＡＡＡＴＧＡＴＴＡＣＡＴＧＣＴＡＡＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＴＣＧＣＴＡＡＣＣＡＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＴＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号８）、およびプライマーＴｒ６−１（配列番号６）を用いた。プライマーｃｈＩＹ−１３の５’側の８０塩基は、標的配列である第一番染色体の１１９７９５ｂｐ−１１９８７４ｂｐの塩基配列とのホモロジー領域を示し、残りの１９塩基はプラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４とのホモロジー領域である。この２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物３を得た。
【００５４】
（染色体分断ベクター（１Ｂ）の作成）
以下のプライマー：
ｃｈＩＹ−１４：ＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＧＴＡＡＣＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号９）、およびプライマーＴｒ６−１（配列番号６）を用いた。プライマーｃｈＩＹ−１４の５’側の８０塩基は、標的配列である第一番染色体の１１１９８７５ｂｐ−１１９７５４ｂｐの塩基配列とのホモロジー領域を示し、残りの１９塩基はプラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３とのホモロジー領域である。この２つのプライマーを用いて、プラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物４を得た。
【００５５】
図５に、ＰＣＲ産物１〜４の電気泳動写真を示す。それぞれ、約２．１ｋｂｐの大きさの断片（ＰＣＲ産物１および４）、および１．２ｋｂｐの大きさの断片（ＰＣＲ産物２および３）が特異的に増幅しており、（Ｃ４Ａ２）６の繰り返し配列をプライマーとして用いたＰＣＲによって、特異的に増幅されることが明らかとなった。これによって、染色体分断ベクター（１）および（２）が、ＰＣＲによって調製できることが、明らかとなった。
【００５６】
得られた染色体分断ベクター（１Ａ）および（２Ａ）は、図６（ａ）に示されるように、分断によって生じたそれぞれの染色体に、標的配列が生成されるタイプの分断（以下、（Ａ）タイプの分断という）を行うベクターである。染色体分断ベクター（１Ｂ）および（２Ｂ）は、図６（ｂ）に示すように、分断によって生じたそれぞれの染色体に、標的配列が生成されないタイプの分断（以下、（Ｂ）タイプの分断という）を行うベクターである。
【００５７】
（実施例２：酵母染色体の分断−１）
上記ＰＣＲで得られた染色体分断ベクター（１Ａ）および（２Ａ）、または染色体分断ベクター（１Ｂ）および（２Ｂ）をそれぞれセットにして、酵母株ＳＨ５２０９に酢酸リチウム法を用いて形質転換し、Ｈｉｓ欠損培地で生育する株（期待通り第一番染色体が分断されたと思われる株）を探索した。染色体分断ベクター（１Ａ）および（２Ａ）を用いてＡタイプの分断を行った場合、６株の形質転換体が得られた。他方、染色体分断ベクター（２Ｂ）および（１Ｂ）を用いるＢタイプの分断では、４株の形質転換体が得られた。
【００５８】
次にこれらの形質転換体において第一番染色体が期待通りに分断されているかを調べる為に、パルスフィールドゲル電気泳動解析（ＰＦＧＥ）およびサザーン解析を行った（図７）。期待通りに分断されると、第一番染色体が約１２０ｋｂｐと約１１０ｋｂｐに分断される。ＰＦＧＥ解析の結果、（Ａ）タイプの分断では２株（図７：レーン２および４）において、（Ｂ）タイプの分断でも２株（図７：レーン１０および１１）において、第一番染色体のバンドが消失しており、代わりに約１２０ｋｂｐ付近に新しいバンドが生成していた。第一番染色体が期待通り分断されると、約１２０ｋｂｐと約１１０ｋｂｐの二つに分断されるはずであるが、おそらくこの二つのバンドは約１２０ｋｂｐ付近で重なっているものと考えられる。そこで、サザーン解析を行った。その結果、約１１０ｋｂｐの分断染色体に含まれると思われるＣｇＨＩＳ３をプローブとした解析でも、約１２０ｋｂｐの分断染色体に含まれると思われるＣＥＮ４をプローブとした解析でも、レーン２、４、１０および１１において、約１２０ｋｂｐ付近にシグナルが得られた。よって、ＣｇＨＩＳ３を含む分断染色体（約１１０ｋｂｐ）とＣＥＮ４を含む分断染色体（約１２０ｋｂｐ）とは重なっており、レーン２、４、１０および１１の形質転換株においては、期待通り第一番染色体が分断されていることが分かった。
【００５９】
なお、ＣＥＮ４をプローブとした解析において、第四番染色体がすべてのレーンにおいて検出されなかった。これは第四番染色体が非常に大きく（約１．５  Ｍｂｐ）、サザーン解析用メンブレンに転写されにくかった為と考えられる。また、レーン５、６、８、および９の形質転換株では第一番染色体が分断されていなかったが、これはＣｇＨＩＳ３をプローブとしたサザーン解析から、第一番染色体とは異なる染色体にＣｇＨＩＳ３遺伝子が導入された為、これらの株がＨｉｓ欠損培地で生育できたと考えられる。さらに、レーン７の形質転換株では、第一番染色体は分断されていないが、ＣｇＨＩＳ３を含む分断染色体（約１１０ｋｂｐ）を余分に保持している為、Ｈｉｓ欠損培地で生育できたと考えられる。これらの結果をまとめると、（Ａ）タイプの分断ベクターでは１／３の確率で、（Ｂ）タイプの分断ベクターでは１／２の確率で酵母第一染色体が分断されており、（Ａ）および（Ｂ）の両タイプにおける分断効率の差はほとんど見られなかった。このように、ＰＣＲを用いて簡便に調製した分断用断片を用いて、高頻度で染色体を分断できることが明らかとなった。
【００６０】
（実施例３：染色体分断ベクター（１Ｃ）および（２Ｃ）の作成）
（染色体分断ベクター（１Ｃ）の作成）
図８に染色体分断ベクター（１Ｃ）の作成の模式図を示す。以下のプライマー：ｃｈＩＹ−１５：５’−ＣＡＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＧＣＡＧＴＧＡＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＴＡＣＴＣＡＧＧＴＡＴＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）、およびＴｒ６−１（配列番号６）を用いた。プライマーｃｈＩＹ−１５の５’側の４５塩基は、標的配列である第一番染色体の１８１１６５ｂｐ−１８１２０９ｂｐの塩基配列とのホモロジー領域を示し、残りの１５ｂｐはプラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３とのホモロジー領域である。このプライマーを用いて、プラスミドｐＳＫ＋ＣｇＨＩＳ３を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物５を得た。
【００６１】
（染色体分断ベクター（２Ｃ）の作成）
図８に染色体分断ベクター（２Ｃ）の作成の模式図を示す。以下のプライマー：ｃｈＩＹ−１６：５’−ＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＡＴＴＣＧＡＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１１）、およびＴｒ６−１（配列番号６）を用いた。ｐＳＫ＋ＣＥＮ４を鋳型として、ＰＣＲを行った。プライマーｃｈＩＹ−１６の５’側の４５塩基は、標的配列である第一番染色体の１８１２１０ｂｐ−１８１２５４ｂｐの塩基配列との相同配列を示し、残りの１５塩基はプラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４との相同配列を示す。このプライマーを用いて、プラスミドｐＳＫ＋ＣＥＮ４を鋳型として、ＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物６を得た。
【００６２】
図８に、ＰＣＲ産物５およびＰＣＲ産物６の電気泳動写真を示す。それぞれ、約２．０ｋｂｐおよび約１．２ｋｂｐの大きさの断片が特異的に増幅しており、染色体分断ベクター（１Ｃ）および（２Ｃ）が得られたことを確認した。
【００６３】
得られた染色体分断ベクター（１Ｃ）および（２Ｃ）は、図６（ｂ）に示される（Ｂ）タイプの分断を行うベクターである。期待通りに分断されると、図８に示すように、第一番染色体が１８１２０９  ｂｐと１８１２１０  ｂｐとの間で分断され、約１８０ｋｂｐと約５０ｋｂｐとに分断される。
【００６４】
（実施例４：酵母染色体の分断−２）
染色体分断ベクター（１Ｃ）および（２Ｃ）を酵母株ＳＨ５２０９に酢酸リチウム法を用いて形質転換し、Ｈｉｓ欠損培地で生育する株を探索した。多数の形質転換体が得られたので、任意に２４株選び、ＰＦＧＥを行った。結果を図９に示す。レーン８の形質転換株において第一番染色体のバンドが消失しており、代わりに約１８０ｋｂｐ付近と約５０ｋｂｐ付近に新しいバンドが生成していた。そこで、詳細に調べる為に、サザーン解析を行った（図１０）。その結果、レーン８の形質転換株において、ＣｇＨＩＳ３をプローブとした解析では約１８０ｋｂｐ付近で、ＣＥＮ４をプローブとした解析では約５０ｋｂｐ付近で、それぞれシグナルが得られた。これらの結果より、レーン８の形質転換株は、期待通りに、第一番染色体が約１８０ｋｂｐと約５０ｋｂｐとに分断されていることが分かった。よって、４５ｍｅｒのホモロジー領域を持つ分断法でも、１／２４の割合で期待通り分断できるということが分かった。
【００６５】
なお、第一番染色体中央部での分断（実施例２）と比べて、実施例４では分断株の出現率が低かったが、これには以下の３つの原因：１）分断部位の構造が異なるなどの要因で、分断効率が大きく左右されること；２）染色体とのホモロジー領域の長さが８０塩基から４５塩基と半分程度に減少したこと；３）今回の分断では生育のために必要な遺伝子（以下、必須遺伝子という）が分断染色体に分配されなかったこと；が考えられる。
【００６６】
得られた約５０ｋｂｐの分断された染色体には、必須遺伝子は存在しない。従って、たとえ、ＣｇＨＩＳ３を有する染色体分断ベクター（１Ｃ）と組換えを起こしても、ＣＥＮ４を有する染色体分断ベクター（２Ｃ）とは組換えを起こす必要がなくなる。ところが、第一番染色体中央部での分断では、必須遺伝子が分断染色体に分配されることから、ＣｇＨＩＳ３を有する分断用断片とのみ組換えを起こすと、この必須遺伝子を消失してしまうことから生存できない。よって、必須遺伝子の分配を伴わない第一番染色体右腕約５０ｋｂｐでの分断（実施例４の分断）のほうが、必須遺伝子の分配を伴う第一番染色体中央部での分断よりも、Ｈｉｓ欠損培地で生育する擬陽性（レーン２、３、２１、２２、２３、２４など）の形質転換株が増加し、結果として分断株の収率が低下したと考えられる。あるいは、これらの擬陽性形質転換体は、期待通りに約１８０ｋｂｐと約５０ｋｂｐとに分断されたが、この約５０ｋｂｐの断片には必須遺伝子が存在しない為、その後培養中に約５０ｋｂｐの断片が消失したということも考えられる。しかし、いずれにしても、４５塩基のホモロジー領域をもつ断片を用いても、期待通り染色体が分断された形質転換株が得られた。
【００６７】
【発明の効果】
従来、ＰＣＲで特異的に増幅することができなかった繰り返し配列（Ｃ４Ａ２）（Ｔｒ配列）を有するＤＮＡ断片が、（Ｃ４Ａ２）ｎのｎを６〜１０とすることにより、ＰＣＲで特異的に増幅できることを見出した。そして、この（Ｃ４Ａ２）ｎ配列をプライマーとして用いると、ＰＣＲで簡単に染色体分断ベクターが増幅できることを見出した。従って、本発明は、図１３に示すような、染色体分断ベクターの調製に複雑な多段階の工程が必要とされる従来の方法、あるいはＴｒ配列を有する２断片型染色体分断ベクターを、ＰＣＲを用いることなく調製する方法と比べると、染色体分断ベクターの調製を飛躍的に簡素化し得る。しかも、このＰＣＲで増幅された（Ｃ４Ａ２）ｎ（ｎ＝６〜１０）配列を染色体分断ベクターとして酵母に導入することによって染色体が分断され、分断染色体に取りこまれた（Ｃ４Ａ２）ｎ配列には、酵母のテロメア配列が結合されていると考えられるので、分断染色体として機能できる。本発明の方法は、例えば、酵母内にクローニングされた植物遺伝子、動物遺伝子の分断、分離に利用できる。有用形質転換微生物あるいは動植物の創生、染色体の構造解析の加速、植物人工染色体の構築の加速、ポジショナルクローニングの迅速化、微生物、動植物遺伝子の機能試験の精密化あるいは簡便化などの、酵母あるいは動植物に関する研究のみならず、さらに、ヒトの染色体の研究および医療への応用などにも有用である。
【００６８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いられる染色体分断べクターの模式図である。
【図２】Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムによるマーカー遺伝子の削除様式を示す図である。
【図３】本発明の方法を用いる染色体の分断を示す模式図である。
【図４】酵母染色体の分断・脱落の様式を示す模式図である。
【図５】染色体分断ベクターのＰＣＲによる作成の模式図、およびＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図６】染色体分断ベクターの分断様式を示す模式図である。
【図７】形質転換体の染色体のパルスフィールドゲル電気泳動写真（ＰＦＧＥ）およびサザーン解析の写真である。
【図８】別の染色体分断ベクターのＰＣＲによる作成の模式図およびＰＣＲ産物の電気泳動写真である。
【図９】形質転換体の染色体のパルスフィールドゲル電気泳動写真（ＰＦＧＥ）である。
【図１０】図９のＰＦＧＥのサザーン解析を示す写真である。
【図１１】染色体分断の基本原理を示す模式図である。
【図１２】テトラヒメナのテロメア配列およびその配列への酵母テロメア配列の付加を示す模式図である。
【図１３】ｐＣＳＶ１を用いる、従来の染色体分断方法を示す模式図である。
【図１４】Ｔｒ配列を有する２断片型分断ベクターを用いる従来の染色体分断方法およびこの２断片型分断ベクターについてＰＣＲを行ったときの電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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