(57)【要約】【目的】本発明は、癌細胞に特異的に発現し、肝臓にも特異的に少量発現している肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−２）を利用して、癌細胞に選択的に薬物を輸送するための医薬組成物を提供する。【構成】本発明は、アデノウイルスなどのキャリヤーを用いてＬＳＴ−２遺伝子を腫瘍部に注入して癌細胞にＬＳＴ−２を特異的に発現させたのち、メトトレキセート（ＭＸＴ）などのＬＳＴ−２に特異的に輸送される抗癌剤を投与し、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させて癌細胞を選択的に死滅させるものである。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを含有してなる医薬組成物。
【請求項２】
キャリアーが、アデノウイルスである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬組成物が、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）に特異的に輸送される抗癌剤を投与して、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させるためのものである請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗癌剤が、メトトレキセートである請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを含有してなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌化学療法では抗癌剤を投与し、癌細胞の抑制・殺傷を図り病巣を消滅させるものである。抗癌剤は、一度に全部の癌細胞をすべて殺傷するものではなく、ある一定割合の癌細胞を死滅させてゆくものである。そのために、長期間に亘って頻繁に投与しなければならないし、完全に癌細胞を消滅させることは困難な場合が多い。また、多くの抗癌剤は、細胞周期に特異的であり、特定の細胞周期においてのみ細胞に感受性があり、このことが短期間にすべての癌細胞を死滅させることをよけいに困難にしている。さらに、長期間の投与により、抗癌剤に感受性を示さなくなる癌細胞が出現することもある。
しかしながら、ある種のリンパ腫や絨毛上皮腫や睾丸腫瘍など抗癌剤が極めて有効な治療法になっている癌もある。
【０００３】
抗癌剤としては、シクロフォスファミドやトリエチレンメラミンなどのアルキル化剤、メルカプトプリンや５−フルオロウラシルやメトトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシンやアドリアマイシンなどの抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド類、ホルモン類などがある。
これらの抗癌剤は、投与量を増やすと副作用が現れ十分な腫瘍消滅効果を出すことが難しい場合が多い。これは抗癌剤が癌細胞だけでなく正常細胞にもはたらくためである。これらの抗癌剤を癌細胞に選択的に導入することができれば、このような副作用が現れることなく、より短期間で、少ない投与量で癌を治療することができる。
このために、癌細胞に特異的な抗体を用いる方法や、レーザーで誘導する方法などが開発されてきているが、十分な効果が得られていない。
【０００４】
本発明者らは、先に肝臓に少量発現している肝臓特異的有機アニオントランスポーター（Ｌｉｖｅｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ａｎｉｏｎ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　−　２（ＬＳＴ−２））をクローニングしてきた（Ｔａｋａａｋｉ，　Ａｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，　（２００１），　１２０，　１６８９−１６９９）。ＬＳＴ−２は肝臓特異的なトランスポーターであるが、癌細胞に特異的に発現し、メトトレキセート（ＭＴＸ）のような有機アニオンの取り込みを行うトランスポーターであることを報告してきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、癌細胞に特異的に発現し、肝臓にも特異的に少量発現している肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−２）を利用して、癌細胞に選択的に薬物を輸送するための医薬組成物、及びそのための方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、肝臓特異的有機アニオントランスポーター（ＬＳＴ−２）が胃癌、大腸癌、膵臓癌、胆のう癌の癌細胞で発現し、肺癌においても少し発現していることを報告し、そして、ＬＳＴ−２がメトトレキセート（ＭＴＸ）のような有機アニオンの取り込みを行うトランスポーターの１種であることを報告してきた（Ｔａｋａａｋｉ，　Ａｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，　（２００１），　１２０，　１６８９−１６９９）。しかし、メトトレキセート（ＭＴＸ）のような有機アニオンの取り込みを行うトランスポーターはＬＳＴ−２だけでなく、ＬＳＴ−１などの他の有機アニオントランスポーターも同様にメトトレキセート（ＭＴＸ）のような有機アニオンの取り込みを行い、生体内において選択的にメトトレキセート（ＭＴＸ）のような有機アニオンの取り込みを行うことは困難であった。本発明者らは、この点について検討してきた結果、ＬＳＴ−２をコードする遺伝子を生体に導入し、ＬＳＴ−２を強制発現させることにより、ほぼ選択的にメトトレキセート（ＭＴＸ）のような有機アニオンの取り込みを癌細胞に特異的に行うことができることを見出した。
【０００７】
即ち、本発明は、アデノウイルスなどのキャリヤーを用いてＬＳＴ−２遺伝子を腫瘍部に注入して癌細胞にＬＳＴ−２を特異的に発現させたのち、メトトレキセート（ＭＸＴ）などのＬＳＴ−２に特異的に輸送される抗癌剤を投与し、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させて癌細胞を選択的に死滅させることからなる、癌の治療、抑制方法、及びその処置、治療用の医薬組成物を提供するものである。
本発明は、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを含有してなる医薬組成物、より詳細には、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）に特異的に輸送される抗癌剤を投与して、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させるための、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを含有してなる医薬組成物に関する。
【０００８】
本発明者らは、すでに、正常では肝臓のみに少量発現しているトランスポーターＬＳＴ−２の配列を確認し、ＬＳＴ−２が消化器固形癌に多量に発現し、抗癌剤メトトレキセート（ＭＴＸ）の細胞内輸送を促進することをインビトロの試験により報告してきた。生体内において、癌細胞に抗癌剤を選択的に高濃度に輸送し、正常細胞には少ししか輸送しないことができれば抗癌剤の治験を高めうるはずである。このために、ＬＳＴ−２をコードする遺伝子（ＬＳＴ−２遺伝子）の導入を試験した。
本発明者らは、生体内におけるＬＳＴ−２のＭＴＸ輸送促進機能や、その結果として癌細胞の抑圧効果を確認する目的で、ＬＳＴ−２遺伝子を生体内に導入して癌細胞におけるＬＳＴ−２の選択的な発現を強化することができるか否かを確認し、その後、ＭＸＴなどの抗癌剤を投与したときの癌細胞及び性状細胞の挙動を検討した。
【０００９】
即ち、ＬＳＴ−２遺伝子をアデノウイルスに組入れ、ＬＳＴ−２遺伝子が組み入れられたアデノウイルスを、ＭＢ２３１乳癌細胞又はＺＲ７５−１乳癌細胞の癌細胞を移植して発症させたスキッド（ＳＣＩＤ）マウスの腫瘍部分に注入した後、ＭＴＸを注入した。この結果、図１に示すように、無処置群では、腫瘍が成長しており、ＬＳＴ−２遺伝子が導入されていない対象群では、無処置群よりは効果がみられたものの、腫瘍は消滅することなく成長していたが、本発明の方法によるＬＳＴ−２遺伝子が導入された群では癌細胞が４週間でほぼ消滅するという結果を得た。
【００１０】
この結果、ＬＳＴ−２のアデノウイルスを「抗癌剤の運び屋」とする方法により癌細胞内でのＬＳＴ−２発現量を高め、そのトランスポーター機能を用いることでＭＴＸを選択的に癌細胞に取りこませ得ることがわかった。
したがって、この手法を用いれば、ＬＳＴ−２の発現レベルの高い消化器固形癌などに対しては、低投与量でも抗癌剤が選択的に癌細胞に輸送されるあるいはＬＳＴ−２が発現していなくてもアデノウイルスを用いてその増強を図るため、副作用を低く抑えながら癌病巣部の縮減効果を高めることができる。
【００１１】
以上のように、本発明は、アデノウイルスなどのキャリヤーを用いてＬＳＴ−２遺伝子を腫瘍部に注入して癌細胞にＬＳＴ−２を特異的に発現させたのち、メトトレキセート（ＭＸＴ）などのＬＳＴ−２に特異的に輸送される抗癌剤を投与し、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させて癌細胞を選択的に死滅させることからなる、癌の治療、抑制方法、及びその処置、治療用の医薬組成物を提供するものである。即ち、本発明は、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを含有してなる医薬組成物、より詳細には、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）に特異的に輸送される抗癌剤を投与して、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させるための、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを含有してなる医薬組成物を提供するものである。
【００１２】
本発明のＬＳＴ−２遺伝子は、７０２個のアミノ酸からなり、１２個の膜貫通ドメインを有する膜蛋白質をコードする遺伝子であり、ＬＳＴ−２の詳細は前記した本発明者らの文献（Ｔａｋａａｋｉ，　Ａｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，　（２００１），　１２０，　１６８９−１６９９）に記載されており、当該文献の記載を引用する。また、そのヒトゲノムＤＮＡは、図２に示されるように約１１ｋｂｐからなるものであり、２個のエキソン領域を有している。
本発明のＬＳＴ−２遺伝子としては、ＬＳＴ−２の全長をコードするものであってもよいし、部分長でよく、有機アニオンとなって抗癌剤を癌細胞に取り込める蛋白質を発現できる長さであればよい。蛋白質をコードする翻訳領域の上流側にプロモーター領域などを必要に応じて付加することが望ましい。目的の蛋白質を発現させることができるものであれば、プロモーターの種類に特に制限はないが、ＬＳＴ−２のｃＤＮＡ又はゲノムからのものが好ましい。また、下流側にも必要に応じて適当な長さの非翻訳領域を有するものが好ましい。本発明のＬＳＴ−２遺伝子としては、ｃＤＮＡから誘導される全長の翻訳領域及びその前後の非翻訳領域を含む遺伝子、ゲノム遺伝子などが挙げられる。
【００１３】
本発明のＬＳＴ−２遺伝子のキャリアーは、生体内に安全にＬＳＴ−２遺伝子を導入することができるものであれば、特に制限はないが、例えば、アデニウイルなどのウイルスや、プラスミドベクターなどのベクターが好ましい。本発明のＬＳＴ−２遺伝子をキャリアーに含有させる方法としては、キャリアーに応じた通常の方法で行うことができる。例えば、キャリアーとしてウイルスを使用する場合には、リン酸カルシウム法にてトランスフェクションし、目的の遺伝子を発現する株を同定することにより行うことができる。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、ＬＳＴ−２をコードする遺伝子、より具体的には当該遺伝子を生体内に導入するためにキャリアーに組み込まれた遺伝子、即ち、ＬＳＴ−２をコードする遺伝子を含有してなるキャリアーを有効成分とするものである。本発明の医薬組成物は、癌細胞に選択的にＬＳＴ−２を発現させ、ＬＳＴ−２のトランスポーター機能を媒介して癌細胞に選択的に抗癌剤を送達させるためのものである。本発明の医薬組成物は、
より詳細には、本発明の医薬組成物は、ヒト肝臓特異的有機アニオントランスポーター−２（ＬＳＴ−２）に特異的に輸送される抗癌剤と組み合わされて使用されるものであり、当該抗癌剤を選択的に癌細胞に取り込ませるためのものである。したがって、本発明は、前記した本発明の医薬組成物及びＬＳＴ−２により特異的に輸送される抗癌剤からなる癌の処置、治療用のキットを包含するものでもある。
本発明の医薬組成物は、前記した有効成分のほかに、必要に応じて製薬上許容される担体を含有することができる。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、癌組織に直接注入して投与するのが好ましいが、これに限定されるものではなく、通常の遺伝子治療と同様な投与方法とすることもできる。ＬＳＴ−２は癌組織、特に膵臓癌、消化器系固形癌に選択的に発現するものであるが、正常肝細胞にも少量発現し、肝臓への影響が少なくなるように配慮する投与方法が好ましい。
本発明の医薬組成物の投与量としては、癌組織の状態や大きさにもよるが、通常はＬＳＴ−２遺伝子の数として１０万〜１００億個、１００万〜１０億個、１００万〜１億個、５００万〜５０００万個程度を断続的に投与するのが好ましい。好ましい投与方法としては、抗癌剤の投与を開始する１〜３０日前、１〜２０日前、１〜１０日前、好ましくは３〜７日前に本発明の医薬組成物の投与を開始するのが好ましい。癌組織におけるＬＳＴ−２の発現に応じて、さらに投与を断続的に継続することもできる。
【００１６】
本発明の癌の処置、治療において使用される抗癌剤としては、ＬＳＴ−２により細胞内に取り込まれるものであれば、特に制限はない。抗癌剤がＬＳＴ−２により細胞内に取り込まれるか否かは、本発明者らの前記した文献（Ｔａｋａａｋｉ，　Ａｂｅ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，　（２００１），　１２０，　１６８９−１６９９）に記載された方法により確認することができる。好ましい抗癌剤の例としては、メトトレキセート（ＭＸＴ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１７】
本発明は、癌細胞に選択的に発現する有機アニオントランスポーターに着目して、癌組織に選択的な新規な薬物送達システムを提供するものであり、癌組織の殺傷効果を増強し、抗癌剤の投与期間の短縮、さらに正常細胞への抗癌剤の作用を無くし副作用を解消するなどの極めて優れた薬物送達システムを提供するものである。さらに、本発明の薬物送達システムは、使用される抗癌剤とは独立して構築することができ、現在使用されている抗癌剤をそのまま使用することができるものである。
【００１８】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
実施例１　（アデノウイルスへのＬＳＴ−２遺伝子の組み込み）
ＣＡＧプロモーターを含むコスミドベクター（ｃｏｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ）に、配列表の配列番号１に示されるＬＳＴ−２の蛋白翻訳領域及びその前後の非翻訳領域を含む断片を、リン酸カルシウム法でＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、ＬＳＴ−２遺伝子組み換えアデノウイルスを発現する株を同定した。シグナルが確認できたサンプルから１５ｃｍディッシュ３０枚を用意し、超遠心及び透析によりウイルスを精製した。さらに培養した２９３細胞に感染させて、ＩＣ５０を与えるウイルス濃度を求めた。
【００２０】
実施例２　（スキッド（ＳＣＩＤ）マウスによるＭＢ２３１乳癌細胞における試
験）
６週齢のスキッドマウスにＭＢ２３１乳癌細胞５００万個を注入した。このマウスを１群８匹づつに分け、３群用意した。第１群は無処置の群とし、第２群はＬＳＴ−２遺伝子を導入しない群とし、第３群はＬＳＴ−２遺伝子を導入した群とした。
癌細胞を注入して１週間後に、第３群には２５００万個の実施例１で製造したウイルスを２日連続で腫瘍部に注入した。第１群及び第２群にはウイルスの注入を行わなかった。
遺伝子の注入した３日目から、第２群及び第３群には、メトトレキセートを連続５日間腹腔内に注入した（２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）。
各群の結果を図１に示す。図１の横軸は癌細胞を注入してからの時間（週）を示し、縦軸は癌細胞の大きさ（ｍｍ３）を示す。黒四角印はＬＳＴ−２を投与した場合を示し、灰色三角印はＬＳＴ−２を投与しない場合を示し、バツ印は無処理の場合を示す。
ＬＳＴ−２遺伝子を導入した第３群は、癌細胞が４週間でほぼ消滅するという結果を示した。これは図３でＬＳＴ−２が癌細胞での蛋白発現が抗体で確認されたことからわかるように、ＬＳＴ−２の媒介によりＭＴＸが選択的に癌細胞に輸送され、結果として、図４に示すように癌細胞にＭＴＸが集積し、高い殺細胞効果を示して経時的に癌細胞が縮小し最終的には消滅させたものである。
【００２１】
実施例３　（スキッドマウスによるＭＢ２３１乳癌細胞における試験）
１群の数を１５匹として、実施例２と同様に試験した。
【００２２】
実施例４　（スキッドマウスによるＺＲ７５−１乳癌細胞ＭＢ２３１乳癌細胞における試験）
乳癌細胞を実施例２に記載のＭＢ２３１乳癌細胞に代えて、ＺＲ７５−１乳癌細胞を用いた他は実施例２及び実施例３と同様にして試験した。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、ＬＳＴ−２の発現レベルの高い消化器固形癌、膵臓癌などに対して、低投与量でも抗癌剤が選択的に癌細胞に輸送される、あるいはＬＳＴ−２が発現していなくてもアデノウイルスを用いてその増強を図るため、副作用を低く抑えながら癌病巣部の縮減効果を高めることができる。
また、本発明は、癌組織に選択的な新規な薬物送達システムを提供するものであり、癌組織の殺傷効果を増強し、抗癌剤の投与期間の短縮し、さらに正常細胞への抗癌剤の作用を無くし副作用を解消するなどの極めて優れた効果を奏するだけでなく、本発明の薬物送達システムは、使用される抗癌剤とは独立して構築することができ、現在使用されている抗癌剤をそのまま使用することができるものである。
【００２４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の医薬組成物を用いた場合の試験結果を示すものである。
【図２】図２は、ＬＳＴ−２遺伝子のヒトゲノムの構造を模式的に示したものである。エキソンを四角枠で示している。図中のＨＲＥは、ハイポキア応答性エレメント（ｈｙｐｏｘｉａ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）であることを示す。
【図３】図３は、ＬＳＴ−２遺伝子のＭＢ２３１乳癌細胞における発現を抗体で確認するために行った結果を示す図面に代わる染色写真である。図中の「ａ」、「ｃ」、「ｅ」はＬＳＴ−２遺伝子が正常細胞と癌細胞を同組織内で選択する過程を経時的に観察した写真である。また、図中の「ｂ」は図中の「ａ」の拡大写真であり、図中の「ｄ」は図中の「ｃ」拡大写真であり、図中の「ｆ」は図中の「ｅ」の拡大写真であることを示す。
【図４】図４は、ＬＳＴ−２の媒介により放射線標識されたＭＴＸが選択的に癌細胞に集積し、癌細胞が縮小しする結果を示す図面に代わる写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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