(57)【要約】【課題】  人体に対して安全性が高い抗インフルエンザウイルス剤の提供を目的とする。【解決手段】  本発明によれば、クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの予防または治療剤、ならびに、これらをヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの予防または治療方法が提供される。本発明における対象となるインフルエンザの臨床症状としては、呼吸器症状以外にも、発熱、倦怠感、頭痛、腰痛、筋肉痛、関節痛などの全身症状、および消化器症状も含まれる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項２】
クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの予防または治療剤。
【請求項３】
クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの臨床症状の発症予防または症状緩和剤。
【請求項４】
クロモグリク酸またはその塩の有効量をヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの予防または治療方法。
【請求項５】
クロモグリク酸またはその塩の有効量をヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの臨床症状の発症予防または症状緩和方法。
【請求項６】
インフルエンザの臨床症状が、発熱、倦怠感、頭痛、腰痛、筋肉痛、関節痛、腹痛、嘔吐、下痢および／または食欲不振である請求項３または５に記載の剤または方法。
【請求項７】
クロモグリク酸またはその塩がクロモグリク酸ナトリウム塩である請求項１〜６に記載の剤または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗インフルエンザウイルス剤に関する。さらに詳しくは、本発明は、クロモグリク酸またはその非毒性塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの予防または治療剤、ならびに、これらをヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの予防または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスを病原体とするインフルエンザは、現代においてもその強烈な伝播力によって大きな流行を繰り返す伝染病であり、社会に莫大な被害を及ぼしている。様々な伝染病が克服される中、インフルエンザウイルスに有効で安全性の高い薬剤は少ないうえに、それらに対する耐性ウイルスの出現なども問題視され始め、新しい抗インフルエンザ薬の開発が期待されている。
【０００３】
インフルエンザウイルスは急性の呼吸器感染症を引き起こし、その臨床症状は、急激な発熱、頭痛、関節痛、全身倦怠などの全身症状とともに、鼻汁、咳などの風邪にみられる種々の呼吸器症状および３８℃以上の高熱を伴うのが特徴である。健常人では通常１〜２週間程度で治癒するが、乳幼児、高齢者や呼吸器・循環器・腎臓に慢性疾患を持つ患者、糖尿病などの代謝疾患や免疫機能が低下している患者などでは、細菌などによる二次感染や肺炎を併発して死に至る場合も少なくない。また、呼吸器の局所感染にとどまらず、インフルエンザ脳炎・脳症などに代表される重症神経系合併症といった極めて重篤な症例も報告されている。このほか、腹痛、悪心・嘔吐、下痢などの消化器症状がみられることもあり、特に小児では注意を要する。診断する上で注意すべき大きな特徴は、呼吸器症状に比べて、熱その他の全身症状が顕著である点である。
【０００４】
現在、インフルエンザの治療に臨床的に用いられている抗インフルエンザ薬として、アマンタジン、ザナミビル、オセルタミビルなどが挙げられる。アマンタジンは、Ａ型インフルエンザウイルスには効果を示すが、Ｂ型インフルエンザウイルスには無効であることや、神経系の副作用を生じやすいこと、また比較的早期に薬剤耐性ウイルスが出現することなどが問題視されている。そこで新規に開発されたのがシアリダーゼ阻害薬のザナミビルやオセルタミビルである。Ａ型、Ｂ型ウイルスともに有効で、耐性化の頻度も低く、その有効性は近年の治験結果で明らかにされている。しかしながら、これらの薬剤はまだ臨床現場での実績が少ないこと、小児や高齢者に対する安全性が確立していないことなどの問題点もある。また、現行のインフルエンザワクチンは、重症化や合併症の予防には効果が認められているが、ウイルスの感染やインフルエンザの発症そのものを完全には防御できていない。このように、現在、インフルエンザに対する治療方法はまだ十分確立されておらず、未だ人類に残されている最大級の疫病であることから、より有効で安全性の高いインフルエンザ治療薬が臨床現場において強く要望されている。
【０００５】
一方、クロモグリク酸ナトリウムは、臨床では気管支喘息やアレルギー性鼻炎に抗アレルギー薬として用いられており、副作用は粉末製剤を吸入するときに時々みられる咳など、ごくわずかに認められる程度であり、臨床的に非常に安全性の高い薬剤であると認められている。クロモグリク酸ナトリウムは、臨床での投与が長年続けられているにもかかわらず、重篤な副作用の報告はなく、特筆すべきは小児に対する作用および安全性が確立している点である。
【０００６】
これまで、クロモグリク酸ナトリウムがインフルエンザに有効であるという知見はなく、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス作用については、Lovedayらがin vitroおよびマウスでの感染実験においていずれも、クロモグリク酸ナトリウムの効果は見られなかったと報告している。この文献では、インフルエンザウイルス（Influenza A/PR/8及びInfluenza A/Hongkong）以外にも５タイプのウイルス（Vaccinia、Herpes simplex、Poliovirus 2、Parainfluenza 1、Respiratory syncytial）で試験をしているが、いずれのウイルスに対してもクロモグリク酸ナトリウムの影響は見られなかったと記載されている（非特許文献１参照）。
上記報告の引例として先に発表された文献が、Penttinenらのクロモグリク酸ナトリウムの抗ウイルス活性についての報告であるが、この報告は、インフルエンザウイルスとは異なるウイルス（Adenovirus 5、Echovirus 7、Herpes simplexおよびSemliki Forest virus）を使用した実験であり、クロモグリク酸ナトリウムはウイルスの増殖には影響しないがウイルスによる細胞障害を阻害するという内容である（非特許文献２参照)。
【０００７】
また、クロモグリク酸およびサルブタモールを含む溶液が、喘息の他にも気管支炎、通常の風邪に伴う鼻腔および気管支障害等の気道の疾患にも有効であると記載してある特許文献もある（特許文献１参照）。
【０００８】
更に、クロモグリク酸ナトリウムによる治療が上気道感染症の症状の緩和に有効であったと記載されている先行技術文献もある。しかし、これらの文献に示された実験内容を詳細にみると、上気道感染症の症状を示す被験者１３５人のうち、インフルエンザの臨床像が見られたのは僅か１０人程度であり、ほとんどが通常の風邪の症状であり、特に、臨床症状ごとに分けた結果を見ると、インフルエンザの特徴である発熱による症状（寒気および痛み）に対してはクロモグリク酸ナトリウムによる効果は見られていない。これらの文献には、クロモグリク酸ナトリウムが上気道感染症における上気道局所の臨床症状に限った対症療法としては有効であることが記載されているのみであり、その作用機序として感染ウイルスに直接作用するからであるかどうか何も記載されていない（特許文献２および非特許文献３参照）。
【０００９】
【非特許文献１】D. Loveday他、Brit. Med. J., II, 6086, p557-558 (1977).
【非特許文献２】K. Penttinen他、Brit. Med. J., I, 6053, p82 (1977).
【非特許文献３】N. Aberg他、Clin. Exp. Allergy, 26, p1045-1050 (1996).
【特許文献１】ＥＰ０３７０６３２
【特許文献２】ＷＯ９５／０５８１６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はこのような従来技術における現状に鑑みてなされたものであり、その目的は人体に対して安全性が高い抗インフルエンザウイルス剤を提供することにあり、特に小児に対する安全性が確立している既存の薬剤をインフルエンザの予防または治療剤として提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上述したように、クロモグリク酸ナトリウムが抗インフルエンザウイルス作用を持たないという結果が記載された前記非特許文献１、及びクロモグリク酸ナトリウムを被験者に投与してもインフルエンザの特徴的症状である発熱症状には効果が見られなかった結果が記載された前記特許文献２の公知事情から判断すると、クロモグリク酸ナトリウムを抗インフルエンザウイルス剤としてインフルエンザの予防または治療に使用するという発想は、この分野における当業者としては思いつかないことであった。しかしながら、発明者らは、臨床現場においてクロモグリク酸ナトリウムを服用していたアレルギー患者が服用していなかった人に比べてインフルエンザにかかりにくい傾向があることを発見し、その効果をin vitroおよびマウスでの感染実験において検証することによって本発明を完成した。
【００１２】
したがって本発明によれば、以下の［１］〜［６］に示す、クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの予防または治療剤、ならびに、これらをヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの予防または治療方法が提供される。
［１］  クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
［２］  クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの予防または治療剤。
［３］  ［２］に記載の予防または治療剤をヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの予防または治療方法。
［４］  ［２］に記載の予防または治療剤をヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの臨床症状の発症予防または症状緩和方法。
［５］  インフルエンザの臨床症状が、発熱、倦怠感、頭痛、腰痛、筋肉痛、関節痛、腹痛、嘔吐、下痢および／または食欲不振である［４］に記載の方法。
［６］  クロモグリク酸またはその塩がクロモグリク酸ナトリウム塩である［１］〜［５］に記載の剤または方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、人体に対して安全性が高い抗インフルエンザウイルス剤、さらに詳しくは、クロモグリク酸またはその塩を有効成分として含有することを特徴とするインフルエンザの予防または治療剤、ならびに、これらをヒトまたは動物に投与することからなるインフルエンザの予防または治療方法が提供される。
本発明における対象となるインフルエンザの臨床症状としては、呼吸器症状以外にも、発熱、倦怠感、頭痛、腰痛、筋肉痛、関節痛などの全身症状、および消化器症状も含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明におけるインフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルスであり、ウイルス内部に存在する核タンパク質（ＮＰ）とマトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）の抗原性の違いによりＡ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。更に、インフルエンザウイルスは宿主細胞由来の脂質二重膜からなるエンベロープを持ち、その表面にはヘマグルチニン（ＨＡ、赤血球凝集素）とノイラミニダーゼ（ＮＡ、シアリダーゼ）がスパイク状の糖蛋白質として突き出しており、それら２種類のスパイク糖タンパク質の抗原性の違いにより多くの亜型に分類される。Ａ型インフルエンザウイルスにおいて、ヘマグルチニンは１５種類（Ｈ1〜Ｈ15）、ノイラミニダーゼは９種類（Ｎ1〜Ｎ9）の抗原性の異なる亜型が知られている。
【００１５】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスの感染による流行性の急性呼吸器感染症である。インフルエンザは毎年冬季に流行を繰り返し、短期間に集中して数百万人規模で多数の患者が発生する。
その臨床像としては、１〜３日の潜伏期の後に多くは突然に発熱して、高熱と全身倦怠感、頭痛、腰痛、筋肉痛、関節痛などの全身症状を特徴とし、これらの全身症状とほとんど同時に、あるいはやや遅れて、鼻汁、鼻閉塞、咽頭痛、嗄声、咳、くしゃみ、痰などの呼吸器症状（上気道炎症状）が現れ、数日の臥床を強いられるような重症感を伴う。熱は発病時から急速に上昇し、第１〜第３病日には最高体温を示し、３８〜３９℃を示すことが多い。このほか、腹痛、嘔吐、下痢、食欲不振などの消化器症状がみられることもある。健常人では通常１〜２週間程度で治癒する。
【００１６】
本発明における対象となるインフルエンザの臨床症状としては、鼻汁、鼻閉塞、咽頭痛、嗄声、咳、くしゃみ、痰などの呼吸器症状（上気道炎症状）が含まれ、それ以外にも、発熱、倦怠感、頭痛、腰痛、筋肉痛、関節痛などの全身症状、および腹痛、嘔吐、下痢、食欲不振などの消化器症状も含まれる。
【００１７】
本発明で使用するクロモグリク酸は、公知化合物５,５’−[（２−ヒドロキシトリメチレン）ジオキシ］ビス（４−オキソ−４H−１−ベンゾピラン−２−カルボン酸）のことである。
クロモグリク酸の塩としては、例えばナトリウムまたはカリウムのようなアルカリ金属との塩、カルシウムまたはマグネシウムのようなアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、第４級アンモニウム塩などの非毒性塩が挙げられるが、これらのうちでもクロモグリク酸ナトリウムが特に好ましい。
【００１８】
本発明のインフルエンザの予防または治療剤は、有効成分であるクロモグリク酸またはその非毒性塩それ自体あるいは薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を配合して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、軟膏剤、液剤、懸濁剤、エアゾール剤、トローチ剤等の剤形として提供することができる。
【００１９】
賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、デキストリン、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、珪酸アルミニウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等が挙げられる。
本発明のインフルエンザの予防または治療剤は、所望により、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤（甘味料、酸味料、香料等）、抗酸化剤、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム）、色素、懸濁化剤、希釈剤、製剤用溶剤（例えば、水、エタノール、グリセリン、脂肪油等）等の通常の添加剤を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明のインフルエンザの予防または治療剤は、経口的または非経口的に投与することができるが、クロモグリク酸またはその塩がインフルエンザウイルスの主たる感染経路である受容者の呼吸器組織（口腔、鼻腔、気道、肺の組織）へ送達され得る投与方法、例えば点鼻、経鼻、経肺、口腔内投与等によって投与することが好ましい。また、鼻腔内投与と口からの吸入による投与を組み合わせることもできる。
【００２１】
クロモグリク酸またはその塩は溶液または懸濁液の形あるいは乾燥粉末として投与しうる。溶液および懸濁液は水性であり、例えば、水のみ（例えば、無菌または発熱物質非含有水）、あるいは水および生理学的に許容される補助溶媒（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ＰＥＧ ４００のようなポリエチレングリコール）から一般に製造される。そのような溶液または懸濁液は他の賦形剤、例えば防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノールなど）、ポリソルベートのような可溶化剤／表面活性剤（例えば、トゥイーン８０、スパン８０、レシチンなど）、緩衝剤（例えば、ホウ酸、ホウ砂、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張性調節剤（例えば、塩化ナトリウムなど）、安定化剤（例えば、エデト酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴール600、マクロゴール4000など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄｌ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ウイキョウ油、ハッカ油、ハッカ水など）吸収促進剤および増粘剤等をさらに含有していてもよい。懸濁液は懸濁化剤（例えば、微結晶質セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）をさらに含有していてもよい。
【００２２】
クロモグリク酸またはその塩の液剤または懸濁剤は一般的な手段、例えばスポイト、ピペットまたは噴霧器で鼻腔または口腔に直接施す。配合物は一回のみの投与量または多数回投与量の形で提供しうる。噴霧器の場合、例えば計量噴霧スプレーポンプの手段によってなしうる。
気道または肺への投与は、液剤または懸濁剤をクロロフルオロカーボン類（ＣＦＣ、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヘプタフルオロプロパン）、二酸化炭素または他の適当なガスのような適当な噴射剤と共に加圧パックの形にされたエアゾール配合物によってなしうる。薬剤の投与量は、計量バルブを備えることによって制御しうる。
【００２３】
クロモグリク酸またはその塩を乾燥粉末の形態とする場合には、単独で、もしくは例えば、乳糖、マンニトール、澱粉、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやポリビニルピロリドンのような適当な粉末基剤と混合した粉末混合物の形で提供してもよい。
この粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセルやカートリッジ、または吸入器に用いて粉末を投与することのできるプラスチックやブリスターの容器に入れたものとする単位投与量の形態で、または例えば粉末用の容器に入れたものとする多回投与量の形態で提供しうる。投与方法としては、乾燥粉末吸入器により、口から吸入することも鼻腔内に投与することもできる。吸入器は、単回投与量用であっても、多回投与量用であってもよい。
【００２４】
クロモグリク酸またはその塩は超微粉砕してもよいし、しなくてもよい。鼻内配合物を含めた気道または肺へ投与するための配合物では、化合物の粒子サイズは一般に小さく、例えば５ミクロン以下である。そのような粒子サイズは、超微粉化によるような当業界で公知の方法によって得られる。望ましいときには、有効成分を持続放出するようにしてある配合物を用いてもよい。
【００２５】
クロモグリク酸またはその塩は、他の治療薬、例えばアマンタジン、リマンタジン、リバビリン、ザナミビル、オセルタミビルのような抗インフルエンザ薬と組み合わせて使用することもできる。そのような組み合わせの個々の成分は、別々のまたは一緒にした医薬配合物の形で、順次または同時に投与しうる。
【００２６】
本発明の方法が適用される動物は通常の家畜や愛玩動物であり、牛、豚、馬、羊、山羊、犬、猫のような哺乳動物および家禽のような鳥類、などが挙げられる。
【００２７】
インフルエンザの予防または治療のために有効なクロモグリク酸またはその塩の使用量は、対象とするヒトまたは動物の種類、投与される者の体重・年齢等の状態、投与方法により異なるが、一般に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の割合で用いることができ、例えば、鼻腔または口腔に直接施す場合、１回当たり０．１〜１００ｍｇ、好ましくは１〜２０ｍｇを、１日当たり１〜１０回、好ましくは２〜５回投与することが望ましい。
【００２８】
本発明をインフルエンザ予防剤として投与する場合は、インフルエンザ流行シーズンに開始し、必要に応じて増減しながら行うことができる。即ち、インフルエンザ流行が身近に迫った場合や、感染の可能性のある行動の前あるいは行動の後、インフルエンザ発症の前に投与する。
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
吸入カプセルの製造
クロモグリク酸ナトリウムの超微粉２０ｍｇを入れた硬カプセル剤を製造する。これはインタール（Ｒ）（藤沢薬品工業株式会社製）の商品名で市販されている。
【実施例２】
【００３１】
吸入液の調製
クロモグリク酸ナトリウム        ２０ｍｇ
精製水                          ２ｍｌ
上記の成分を混合し、プラスチックアンプルに注入して製剤化する。これはインタール（Ｒ）吸入液（藤沢薬品工業株式会社製）の商品名で市販されている。
【実施例３】
【００３２】
エアゾールの調製
クロモグリク酸ナトリウム        ２００ｍｇ
精製水                          １０ｍｌ
上記の成分を混合し、アルミニウム製の容器に充填してエアゾール剤とする（添加物として、ヘプタフルオロプロパン(HFA-227)、ポリビニルピロリドンＫ３０、マクロゴール６００を含む）。これはインタール（Ｒ）エアロゾルＡ（藤沢薬品工業株式会社製）の商品名で市販されている。
【実施例４】
【００３３】
点鼻液の調製
クロモグリク酸ナトリウム        １９０ｍｇ
精製水                          ９．５ｍｌ
上記の成分を混合し、常法によりプラスチック容器に入った点鼻液（鼻用定量噴霧式吸入剤）とする（添加物として、エデト酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウムを含む）。これはインタール（Ｒ）点鼻液（藤沢薬品工業株式会社製）の商品名で市販されている。
【実施例５】
【００３４】
クロモグリク酸ナトリウムによるインフルエンザウイルス感染への影響（in vitro試験）
In vitroでの細胞へのウイルス感染の定量的評価は、細胞内酵素である乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の培養上清中の活性を測定することで、細胞膜に障害を受けた細胞数を定量的に測定する方法である中和活性法によって行った。
【００３５】
Ｉ．試験材料
インフルエンザウイルスは、表１に示した５株を、それぞれ表１に示したウイルス濃度（ＨＡＵ）となるよう希釈して使用した。
【００３６】
【表１】
2004352712.tif 000002
【００３７】
ＨＡＵはモルモット赤血球が凝集するために必要なウイルスの最高希釈倍率で、以下のように測定した(J. Biol. Chem. 260, 1362-1365 (1985))。
精製インフルエンザウイルス液を、0.01％ゼラチン含有ＰＢＳで２１０倍まで希釈後、更にマイクロプレート(96 U-Bottom, Falcon)上にて倍々希釈（50μl＋50μl）を繰り返した。0.5％(V/V)モルモット赤血球を含むＰＢＳ溶液50μlを加え、４℃で２時間放置した後、赤血球の凝集を観察した。なお、ウイルスを含まない0.01％ゼラチン含有ＰＢＳも対照として同様に実験を行った。
【００３８】
クロモグリク酸ナトリウム溶液は、最終濃度10、３および１ｍＭ用には、クロモグリク酸ナトリウムを100ｍＭとなるよう精製水で溶解し、0.2μｍフィルターで濾過滅菌した。最終濃度0.3および0.1ｍＭ用には、100ｍＭ溶液を希釈してそれぞれ30ｍＭおよび10ｍＭ溶液とした。
【００３９】
ＩＩ．試験方法
９６ウェル培養マイクロプレート（Nunc社製）を使用し、１ウェル当たりに10％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地100μl中にＭＤＣＫ細胞を２×104個となるように入れ、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１６〜２４時間培養した後、顕微鏡下でウエル一面に単層になっているのを確認した。
次に、表１のウイルス濃度になるように各ウイルスを無血清培地で希釈し、これらのウイルスを含む培地およびウイルスを含まない培地それぞれ100μl中に、クロモグリク酸ナトリウムの最終濃度が10、３、１、0.3、および0.1ｍＭとなるように、クロモグリク酸ナトリウム溶液（10μl、３μlまたは１μl）を加えた。尚、薬剤を入れない対照には精製水10μlを加えた。
これらを室温で３０分間放置した後、無血清培地100μlで３回洗浄した細胞に100μl加え、34.5℃、５％ＣＯ２存在下で５時間静置することで、クロモグリク酸ナトリウム処理ウイルスを細胞に感染させた。感染終了後、細胞を無血清培地100μlで２回洗浄後、５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地100μlを加え、34.5℃、５％ＣＯ２存在下で２０時間培養した。
培養終了後、新しい別のマイクロプレート（96 Flat-Bottom Maxisorp、Nunc）に５×ＰＢＳ10μlを入れ、培養後の上清40μlを加えて混和し、全量50μlとした。このプレートを３７℃５分間静置後、ＬＤＨ測定試薬（ＬＤＨリニア−ネオ、シノテスト社製、呈色試薬１瓶を基質液3.0ｍｌで溶解した）50μlを加え混和し、３７℃で１０分間静置した。0.5Ｎ塩酸100μlを加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダー（MTP-32、Corona）により測定波長550nm、対照波長630nmにて各ウェルの吸光度を測定することにより、ＬＤＨ活性の測定を行った。
【００４０】
ＩＩＩ．試験結果
０ｍＭクロモグリク酸ナトリウムで処理した時のＬＤＨ活性を100％として、各濃度のクロモグリク酸ナトリウム処理によるＬＤＨ活性を相対的に表して比較した結果を図１に示した。10ｍＭクロモグリク酸ナトリウムでウイルスを直接処理した場合、すべてのウイルス株に対してＭＤＣＫ細胞へのウイルス感染を抑制する効果が認められた。特にH3N2型のA/Memphis/1/71やA/Aichi/2/68では、非処理に対して55〜65％の抑制効果が示された。
【実施例６】
【００４１】
マウスでのクロモグリク酸ナトリウムによるインフルエンザ感染防御試験（in vivo薬効評価試験）
Ｉ．試験方法
インフルエンザウイルスA/PR/8株を発育鶏卵に接種し、３７℃で培養後、回収した漿尿液をストック液として以下の実験に使用した。ウイルスタイターの測定はプラークアッセイ法で定法（ウイルス実験プロトコール、メジカルビュー社p157, 1995）に従って行った。４週齢、雌のBALB/cマウス（１群８匹）を麻酔した後、２０μlのウイルス懸濁液（５×１０２PFU/mouse）を経鼻で接種した。クロモグリク酸ナトリウムの投与（３２mg/kg）は経鼻で行い、投薬スケジュールは、感染４時間後に１回、感染１日目および２日目には１日２回ずつ、感染３日目に１回の計６回とした。感染後１４日目まで体重変化と生死の経過を観察し、その延命効果で薬効を評価した。
【００４２】
ＩＩ．試験結果
生存率の結果を図２に示した。感染１４日目の生存率でみると、無投薬対照群の２５％に対して、クロモグリク酸ナトリウム（３２mg/kg）投与群は６２．５％の生存率を示し、インフルエンザウイルスに対する感染防御効果が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＬＤＨ活性の相対値によってインフルエンザウイルスの細胞への感染抑制効果を示す。
【図２】インフルエンザウイルス感染マウスの生存率によって感染防御効果を示す。
【図１】
2004352712.tif 000003
【図２】
2004352712.tif 000004