(57)【要約】【課題】ＥＳ細胞から樹状細胞を安定的に産生方法を提供すること、および、Ｔ細胞刺激活性の優れた樹状細胞を製造する方法を提供すること。【解決手段】哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を、マクロファージを分化させる能力のあるサイトカインを産生しないストローマ細胞と共培養する第一工程、次いで上記共培養した細胞を上記ストローマ細胞とコロニー刺激因子の存在下で培養する第二工程、および更に第二工程を経た培養細胞をストローマ細胞が存在せず、コロニー刺激因子が存在する培養液で培養する第三工程からなる方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を、マクロファージを分化させる能力のあるサイトカインを産生しないストローマ細胞と共培養する第一工程、次いで上記共培養した細胞を上記ストローマ細胞とコロニー刺激因子の存在下で培養する第二工程、および更に第二工程を経た培養細胞をストローマ細胞が存在せず、コロニー刺激因子が存在する培養液で培養する第三工程とを含むことを特徴とする樹状細胞の産生方法。
【請求項２】
マクロファージを分化させる能力のあるサイトカイン類が、Ｍ−ＣＳＦであることを特徴とする請求項１記載の樹状細胞の産生方法。
【請求項３】
コロニー刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦであることを特徴とする請求項１〜２記載の樹状細胞の産生方法。
【請求項４】
第三工程で産生した樹状細胞を、更にＴＮＦあるいはインターロイキン類の存在下に培養する第四工程を含むことを特徴とする請求項１〜３記載の樹状細胞の産生方法。
【請求項５】
インターロイキン類が、インターロイキン４であることを特徴とする請求項４記載の樹状細胞の産生方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞が、樹状細胞において人為的に発現させようとするタンパク質をコードする遺伝子を導入したＥＳ細胞であることを特徴とする請求項１〜５記載の樹状細胞の産生方法。
【請求項７】
遺伝子の導入が、プラスミドで行われることを特徴とする請求項６記載の樹状細胞の産生方法。
【請求項８】
遺伝子の導入が、電気穿孔法により行われることを特徴とする請求項６〜７記載の樹状細胞の産生方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の技術分野】
本発明は、樹状細胞の産生方法に関するものである。更に詳しくは、本発明は、哺乳動物、特にマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に対して、これを人工的に樹状細胞に分化させることにより、樹状細胞を産生する方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
種々の難治性疾患を含む自己免疫疾患、および社会的にも大きな問題となっているアレルギー疾患の根本的な治療のためには、個体の免疫反応を抗原特異的に制御する手法の開発が望まれる。また、悪性腫瘍に対する免疫療法を有効性の高いものとするためには、特定の抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の反応を強力に賦活する方法の開発が不可欠である。このために、生体内で免疫応答の制御に中心的な役割を果たしている樹状細胞の機能を研究し、その機能強化をはかることが必要である。
【０００３】
樹状細胞は、抗原タンパク質を貪食し、ペプチドに分解した後、そのペプチドをＭＨＣ（主要組織適合抗原）との複合体としてＴ細胞に提示してＴ細胞を刺激する（抗原提示）。樹状細胞は、生体内において抗原提示能力が最も高い細胞である。樹状細胞は、抗原提示によりＴ細胞を抗原特異的に活性化する一方で、自己抗原に反応性を有するＴ細胞の機能を抑制し、免疫学的な自己寛容の維持にも関与している。このように、樹状細胞は、生体内において免疫応答を制御する中心的な役割を果たしている。
【０００４】
樹状細胞は、生理的には骨髄中で血液幹細胞から分化、産生される。骨髄中の血液幹細胞は、増殖因子の存在により樹状細胞以外に、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ等に分化する。
【０００５】
ＥＳ細胞から、血液細胞を得る技術は公知である。例えば、ストローマ細胞を用いて、ＥＳ細胞から樹状細胞、顆粒球、赤血球、Ｂリンパ球、血小板等を含む各種血液細胞を発生させる方法が知られている。この方法は、これまでに造血機構の基礎的研究において、種々の分子や細胞の機能解析に応用されている。
【０００６】
樹状細胞の遺伝子を改変することにより、その機能を人工的に修飾した樹状細胞を生体に投与し、免疫応答を抗原特異的に制御できる可能性がある。樹状細胞あるいは骨髄中の血液幹細胞の遺伝子改変を行なう方法として、ウイルスベクターなどを用いる方法が考えられるが、遺伝子導入効率、発現の安定性、ベクターシステムの安全性などの問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ＥＳ細胞から効率的に樹状細胞を産生する方法について検討した結果、本発明に到達した。本発明の目的は、第一に、ＥＳ細胞から樹状細胞を安定的に産生する方法を提供することを目的とする。本発明の他の目的は、Ｔ細胞刺激活性の優れた樹状細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、哺乳動物のＥＳ細胞を、マクロファージを分化させる能力のあるサイトカインを産生しない骨髄由来ストローマ細胞と共培養する第一工程、次いで上記共培養した細胞を上記ストローマ細胞とコロニー刺激因子の存在下で培養する第二工程、および更に第二工程を経た培養細胞をストローマ細胞が存在せず、コロニー刺激因子が存在する培養液で培養する第三工程とを含むことを特徴とする樹状細胞の産生方法である。
【０００９】
マクロファージを分化させる能力のあるサイトカインとは、Ｍ−ＣＳＦである。
【００１０】
コロニー刺激因子は、ＧＭ−ＣＳＦである必要がある。
【００１１】
第三工程で産生した樹状細胞は、更にＴＮＦ，あるいはインターロイキン類の存在下に培養する第四工程を含むことが好ましい。
【００１２】
インターロイキン類は、インターロイキン４である必要がある。
【００１３】
導入する遺伝子は、プラスミドで行われることが好ましい。
【００１４】
遺伝子の導入は、電気穿孔法により行われることが好ましい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
発明の実施の形態につき説明する。
【００１６】
本発明の方法は、哺乳動物のＥＳ細胞を、骨髄ストローマ細胞と共培養し、次いで上記共培養した細胞をストローマ細胞とＧＭ−ＣＳＦの存在下で培養し、更にストローマ細胞が存在せず、ＧＭ−ＣＳＦが存在する培養液で培養するという３つの工程からなる。
【００１７】
本発明の方法における第一工程について説明する。本発明では、まず哺乳動物のＥＳ細胞を、マクロファージの分化に関与するサイトカイン（Ｍ−ＣＳＦ）を産生しないストローマ細胞と共培養する。
【００１８】
本明細書では、哺乳動物のＥＳ細胞として、マウスのＥＳ細胞を用いた例につき説明する。なお、本発明における哺乳動物は、マウスに限定されず、ヒト、さる、犬、猫、ぶた、牛、馬、羊、山羊、うさぎ、ラット等を対象としうる。
【００１９】
本発明で用いるＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）は、胚性幹細胞とも呼ばれ、公知の如く、受精卵から胚に発達する段階、具体的には胚盤胞内の内部細胞塊を取り出して培養処理をした細胞である。ＥＳ細胞はどの哺乳動物からも作成が可能と考えられている。
【００２０】
本発明で着床細胞として使用するストローマ細胞（フィーダー細胞）は、器官などで、その機能を担う細胞や組織を取り巻き支持する細胞で、機能を担う細胞の分化や機能発現を誘導・促進する細胞である。本発明では、ストローマ細胞としては、血液幹細胞からリンパ球や赤血球を分化誘導する働きをもつ骨髄から採取したストローマ細胞を用いることが好ましい。マウスのフィーダー細胞としては、ＰＡ６、ＯＰ９またはＳＴ２が知られている。ＰＡ６とＳＴ２はマクロファージの分化に関与するサイトカイン（Ｍ−ＣＳＦ）を産生する。本発明では、Ｍ−ＣＳＦを産生しないストローマ細胞、ＯＰ９を用いることが好ましい。なお、ＯＰ９は、マクロファージコロニー増殖因子（Ｍ−ＣＳＦ）欠損ｏｐ／ｏｐマウス由来の骨髄ストローマ細胞ラインである。ＴＴ２は多くの変異マウス系統の作製にもちいられている。また、遺伝子トラッププロジェクトを行なうための宿主細胞として使用されている。
【００２１】
血液細胞を分化させる能力のあるサイトカイン類とは、例えば、ＳＣＦ（幹細胞増殖因子）、ＩＬ（インターロイキン）−３、ＧＭ−ＳＣＦ（顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、エリトロポエチン等をいう。本発明の第一工程では、特にＭ−ＣＳＦを産生しないストローマ細胞を用いることが好ましい。
【００２２】
ＥＳ細胞を培養するための培養液としては、通常はＮａ、Ｍｇ、Ｃａ等の金属イオンを含んだ生理食塩水に各種アミノ酸、例えばＬ−Ａｒｇ，  Ｌ−Ｃｙｓ，  Ｌ−Ｇｌｎ，  Ｌ−Ｈｉｓ、及び各種ビタミン、例えば葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド、ピリドキサール、リボフラビン等を含んだ培養液、好ましくはイーグルのＭＥＭ培養液あるいはダルベッコ改良イーグル培養液（ＤＭＥＭ）培養液としてバイオフルイド社から入手できる培養液等を用いることができる。これらの中では、ダルベッコ改良イーグル培養液（ＤＭＥＭ）を好ましく用いることができる。本発明の第一工程と第二工程においては、α必須培養液（α−ＭＥＭ）に牛胎児血清を２０％の濃度で加えたものを用いる必要がある。
【００２３】
本発明で、上記培養液を入れて培養するための容器としては、各種の動物細胞培養のための市販の容器を用いることができる。このような容器として、本発明の第一工程と第二工程においては組織培養用コーティングがなされたプラスチック製培養容器を用いることが好ましい。市販品として入手可能なプラスチック製培養容器を使用直前にゼラチンでコーティングした後に、培養に用いることが好ましい。
【００２４】
本発明の第一工程において、培養するための温度は、３７℃である。また、培養時間は通常４〜７日、好ましくは４〜６日の範囲である。
【００２５】
上記第一工程で培養したＥＳ細胞を、次いで、第二工程に移し、ストローマ細胞とコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で培養する。この第二工程で用いるストローマ細胞は、第一工程と同じ種類（ＯＰ９）のものを使用することが必要である。
【００２６】
本発明の産生方法の第二工程で用いるコロニー刺激因子とは、上記サイトカイン類の１つで、例えば、ＳＣＦ（幹細胞増殖因子）、ＧＭ−ＳＣＦ（顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、等をいう。本発明の第二工程では、特にＧＭ−ＣＳＦを用いる。ＧＭ−ＣＳＦは２．５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌの範囲の量で配合することが好ましい。
【００２７】
ＥＳ細胞を培養するための培養液および培養容器は、前述の第一工程で説明したものを同様に使用することができる。また、培養温度としては３７℃でなければならない。また、培養時間は通常４〜７日、好ましくは４〜６日の範囲である。この第二工程により、形状が球形あるいは一部不規則な浮遊細胞が現れる。
【００２８】
第二工程を経て得られた浮遊細胞を、更に第三工程として、ストローマ細胞が存在せず、ＧＭ−ＣＳＦが存在する培養液で培養する。
【００２９】
第三工程でのＥＳ細胞を培養するための培養液は、ＲＰＭＩ−１６４０培養液に牛胎児血清を１０％の濃度で加えたものを用いる。培養容器はまた、細菌培養用プラスチック製培養皿を用いる。また、および培養温度としては第一、第二工程と同様の条件を取りうる。培養期間は、７日から１５日である。この第三工程により、形態学上は不規則かつ突起を有し、また、Ｔ細胞刺激活性を有する細胞が産生される。
【００３０】
以上の工程からなる本発明の樹状細胞の産生方法によれば、ＥＳ細胞から樹状細胞を選択的に、かつ効率よく産生することができる。ここで産生された樹状細胞は、抗原蛋白を貪食した後、分解したペプチドをＴ細胞に提示することによりＴ細胞を強く刺激する活性を有している。
【００３１】
本発明の方法では、上記第一〜第三工程を経て製造された樹状細胞を、更に樹状細胞刺激に関与するサイトカイン類の存在下に培養すること（以下「第四工程」という）により、Ｔ細胞刺激性の向上した樹状細胞（成熟樹状細胞）を産生することができる。
【００３２】
本発明で対象とするＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識するキラーＴ細胞（Ｔｃ）およびＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された抗原ペプチドを認識するＴヘルパー細胞（Ｔｈ）である。Ｔｈ細胞は、樹状細胞から抗原を提示されて活性化すると、各種のサイトカインを産生し、それによりＢ細胞やマクロファージを活性化させる。Ｔｈ細胞は更にＴｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される。
【００３３】
樹状細胞成熟刺激活性のあるサイトカイン類としては、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２，ＩＦＮ（インターフェロン）−α、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−α、ＴＮＦ−β等を挙げることができる。これらの中で、本発明による樹状細胞の成熟には、ＩＬ−４とＴＮＦ−αとが効果が優れる。サトカイン類は１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの範囲の量で配合することが好ましい。
【００３４】
本発明ではまた、樹状細胞を、更に樹状細胞の成熟刺激に関与するサイトカイン類の存在下に培養する際に、更にリポ多糖類（ＬＰＳ）、および／または抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を培養液に添加することにより、Ｔ細胞刺激活性を更に増大させることができる。ＬＰＳは０．１〜１０μｇ／ｍｌ程度配合することが好ましい。
【００３５】
このような本第四工程により、ＥＳ細胞由来樹状細胞は、形態学的にも高いＴ細胞刺激能力の点からも完全に成熟した樹状細胞の様相を示すことができる。
【００３６】
本発明の方法では、ＥＳ細胞として、抗原をコードする遺伝子を導入したＥＳ細胞を用いることができる。
【００３７】
本発明における抗原とは、治療や診断の対象となる蛋白、あるいはペプチドであり、例えば各種細菌、各種ウイルス、これらを構成するタンパク、癌細胞に特異的に発現する蛋白（腫瘍抗原タンパク）、腫瘍抗原タンパクの一部であるペプチド等を挙げることができる。
【００３８】
ＥＳ細胞へ抗原をコードする遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を採用することができる。例えば、コードする遺伝子をそのままＥＳ細胞に導入する方法、あるいは、ベクターを用いる方法を挙げることができる。これらの方法のうちではベクターを用いる方法が遺伝子が導入され発現する効率が高いため、好ましい。
【００３９】
遺伝子をＥＳ細胞内に挿入する方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いる導入法等が知られている。これらの中では、エレクトロポレーション法がＥＳ細胞の分化性能を損なわないため、好ましい。
【００４０】
ベクターとしては、ファージ、ウイルス、プラスミドを用いる方法が知られているが、本発明ではプラスミドを用いる方法が、目的とする遺伝子導入が容易であり安全性が高いため好ましい。
【００４１】
ベクターに目的とする抗原遺伝子を挿入する方法は公知であり、例えば、エンハンサー、プロモーターとスプライシングシグナルの間に目的とする抗原蛋白のｃＤＮＡを組込む方法を用いることもできる。
【００４２】
具体的な遺伝子導入・発現方法としては、βアクチンプロモータと内部リポソームエントリーサイト（ＩＲＥＳ）−ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現ベクターを用いる方法と、Ｃｒｅ−ｌｏｘ仲介標的遺伝子の蓄積を遺伝子トラップしたＥＳ細胞クローンに入れる方法の２つの方法が特に有効である。
【００４３】
抗原をコードする遺伝子が導入されたＥＳ細胞は、上記の記載の方法と同様の方法により分化が誘導されて樹状細胞となる。本発明の遺伝子改変ＥＳ細胞から分化された樹状細胞は後述の実施例で示すように、極めて高い抗原特異的Ｔ細胞刺激活性を誘導する。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の方法で産生された樹状細胞は、抗原特異的なＴ細胞反応を強力に惹起できるため、抗腫瘍免疫療法および感染症治療に応用できる可能性がある。また、Ｔ細胞の免疫反応を抑制することもできるため、哺乳動物の免疫寛容を誘導し、自己免疫疾患あるいはアレルギー疾患を治療できる可能性がある。また、抗アレルギー剤や免疫抑制剤の開発の際の指標として使用できる可能性がある。また、本発明の方法は、免疫療法、特に自己免疫疾患の治療や樹状細胞の機能研究に応用できる。
【００４５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明につき説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００４６】
【実施例１】
（第一工程）
ＥＳ細胞として、ＴＴ２ＥＳ細胞を用いた。ＥＳ細胞の樹状細胞への分化は図１のように行った。ＥＳ細胞を２０％ＦＣＳ（牛胎児血清）が補給されたαＭＥＭ（α必須培養液）に、１．５ｘ１０４個／２ｍＬ培養液／ウエルの密度で懸濁させた。そして、６穴プレート中のＯＰ９細胞層上にて培養した。３日後、培養液の半分を除去し、各ウエルに新しい培養液を加えた。
【００４７】
（第二工程）
５日目に細胞を、燐酸緩衝生理食塩液（０．２５％トリプシン／１ｍＬ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）を用いてＯＰ９細胞層から分離し回収した。そして、新しいＯＰ９細胞層上にて再度培養を行なった。そして、２０％ＦＣＳと  ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）とが補給されたαＭＥＭ中で培養した。この段階で、６ウエル培養プレート中の３ウエルから取り出された細胞を、培養プレート中の２０ｍＬ培養液に懸濁し、１５０ｍｍの培養皿に供給した。１０日後（移植後５日目）、ピペッティングすることにより多くの丸く浮遊する細胞を観察した。（図１）。平均して４〜８ｘ１０６個／１５０ｍｍ培養皿が認められた。これは、未分化のＥＳ細胞の数が１００〜２００倍増加したことを示す。これらの細胞は、ほとんどがＣＤ１１ｂを発現し、骨髄系細胞（ミエロイド）の系統に類似していた。
【００４８】
（第三工程）
この段階で、６ウエル培養プレート中の３ウエルから取り出された細胞（２．５ｘ１０５個細胞／９０ｍｍ皿）を、細菌培養用プラスチック製培養皿に移し、ストーマ細胞なしで、１０％ＦＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍＬ）と２ＭＥが補給されたＲＰＭＩ−１６４０培養液で培養した。１７〜１９日後、１．５〜２．５ｘ１０５個細胞／９０ｍｍ皿の浮遊、またはゆるく結合した細胞が現れた。この培養段階のＥＳ由来樹状細胞の細胞数は、未分化ＥＳ細胞の数の１００〜２００倍であった。
【００４９】
この工程の後、いくつかの（＜３０％）細胞はマクロファージのように培養皿の表面に付着していた。浮遊細胞は大雑把に２つのタイプに別れた。１つは丸い形で大サイズの群、もう１つは、小サイズで突出部のある不規則な形状（図２）であった。加えて、後者のタイプの浮遊細胞の塊が１７〜１９日に観察された。
【００５０】
（細胞表面分子解析）
フローサイトメータ（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン−ディキンソン社製、米国）を用いて細胞表面分子の解析を行なった。浮遊細胞はＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＥＣ２０５及びＣＤ１１ｃに陽性であった（図３）。形態学及び細胞表面分子と機能から、突起をもった細胞をＥＳ細胞由来樹状細胞とした。ＥＳ細胞由来樹状細胞はＦ４／８０とＣＤ１１ｂを発現しＣＤ８αを発現せず、骨髄細胞（ミエロイド）系統の樹状細胞であることが示唆された。
【００５１】
【比較例１】
（骨髄細胞からの樹状細胞の生成）
対照にマウス骨髄血液細胞から産生される樹状細胞を用いた。マウス骨髄細胞から産生される樹状細胞の生成は、報告されている方法を改良して行った。すなわち、マウス骨髄血液細胞を（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡ）Ｆ１マウスから分離し、細菌培養用プラスチック製培養皿で（１．５ｘ１０６個細胞／９０ｍｍ皿）、１０％ＦＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（５００Ｕ／ｍｌ）と２ＭＥ（５０μＭ）が補給されたＲＰＭＩ−１６４０培養液で培養した。培養液は５日毎に交換した。９〜１２日後培養液の浮遊細胞をピペッティングすることにより回収した樹状細胞を骨髄細胞由来樹状細胞として機能試験に用いた。抗原提示能力の解析では、骨髄細胞由来樹状細胞にペプチド、ＯＶＡやＰＣＣペプチドを加え、２回洗浄し、刺激細胞として用いた。
【００５２】
（抗原提示能力評価）
ＥＳ細胞由来樹状細胞をＰＣＣ蛋白（５０μｇ／ｍｌ、シグマ社）が添加された、あるいは添加されていない９６ウエル平底培養プレート上で培養した。６時間後、２Ｂ４ハイブリドーマ細胞を加えた（５ｘ１０４個細胞／ウエル）。さらに、２４時間後、上澄み液（５０μＬ／ウエル）を集めた。これを、別の９６ウエル平底培養プレート中で培養しているＩＬ−２依存の細胞株、ＣＴＬＬ−２０（５ｘ１０３個細胞／１００μＬ／ウエル）に加えた。１６時間後、３Ｈチミジンを加え、細胞を更に８時間培養した。ＣＴＬＬ−２０の増殖に伴う３Ｈチミジンの染色体ＤＮＡへの取り込みを、β線測定用のシンチレーションカウンターを用いて測定した。
【００５３】
（ＥＳ細胞由来樹状細胞による抗原の分解と提示）
抗原としてハトチトクロムＣ（ＰＣＣ）を用いて、ＥＳ細胞由来樹状細胞の抗原提示機能の評価を行なった。ＥＳ細胞由来樹状細胞をＰＣＣタンパク質の存在下で６時間培養し、Ｔ細胞ハイブリドーマへのＰＣＣエピトープの提示能力を調べた。Ｔ細胞ハイブリドーマとしては、ＰＣＣエピトープを特異的に認識しＩＬ−２を産生することが知られている２Ｂ４を用いた。２Ｂ４によるＩＬ−２産生量を測定することによりＰＣＣエピトープの提示能力を定量的に評価した。後述するように、ＥＳ細胞由来樹状細胞と骨髄細胞由来樹状細胞の抗原提示機能を、抗原蛋白の濃度と樹状細胞の数が異なる複数の条件のもとに比較することにより、ＥＳ細胞由来樹状細胞の抗原提示機能を評価した。図４に示したように、ＥＳ細胞由来樹状細胞の抗原提示高率は比較例である骨髄由来の樹状細胞より高いことが判明した。また、これらの結果は、ＥＳ細胞由来樹状細胞は溶解している抗原蛋白を捕らえ、分解し、ペプチドとしてＭＨＣクラスＩＩ分子拘束性に提示する能力があることを示している。
【００５４】
【実施例２】
実施例１で得られた樹状細胞を更にサイトカインで刺激した。すなわち、
実施例１の方法で１０日以上培養したＥＳ細胞由来樹状細胞を、新しい細菌培養用プラスチック製培養皿に移し、ＧＭ−ＣＳＦが添加されず、１０％ＦＣＳが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培養液で培養した。次の日、ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）とＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍＬ）と、抗ＣＤ４０抗体（１０μｇ／ｍＬ、クロ−ン３／２３）、またはＩＬ−４、ＴＮＦ−αとリポ多糖類（ＬＰＳ：１μｇ／ｍＬ）を加えた。
【００５５】
２〜３日後、細胞をピペットで採取し、機能と細胞形態学上の分析を行った（図５）。その結果、ＩＬ−４とＴＮＦ−αと抗ＣＤ４０抗体、あるいは、ＩＬ−４とＴＮＦ−αとＬＰＳの組み合わせが、ＥＳ細胞由来樹状細胞の成熟を顕著に増強させることが分かった。ＩＬ−４とＴＮＦ−αと抗ＣＤ４０抗体の組合せで成熟させたＥＳ細胞由来樹状細胞のほとんどはクラスターを形成した。一方、ＩＬ−４とＴＮＦ−αとＬＰＳの組み合わせでは、ほとんどクラスターを生成しなかった。これらの刺激により成熟したＥＳ細胞由来樹状細胞は高い水準でＭＨＣクラスＩ、クラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を発現した（図６）。また、ＩＬ−４とＴＮＦ−αとＬＰＳの組み合わせで刺激したＥＳ細胞由来樹状細胞は処理前に発現がなかったＣＤ４０を細胞表面上に発現していた。一方、ＣＤ１１ｃの発現量は変化なかった。更に処理前に発現していたＦ４／８０とＣＤ１１ｂの発現量は低下した。
【００５６】
【実施例３】
（リンパ球反応（ＭＬＲ））
反応性Ｔ細胞として、脾臓の単核細胞をＢａｌｂ／ｃマウスから準備した。Ｔ細胞をこれらの細胞から抗ＣＤ９０抗体超磁気マイクロビーズ（ミルトニ  バイオテック社、ドイツ）を用いて磁気細胞選択法で分離した。また、刺激細胞として成熟化したＥＳ細胞由来樹状細胞を用いた。このＭＬＲの結果、刺激細胞の密度に依存して、反応性Ｔ細胞の強い増殖反応が認められた（図７）。この結果、成熟したＥＳ細胞由来樹状細胞が強いＴ細胞刺激活性を有していることが示された。
【００５７】
【実施例４】
《ＩＲＥＳ−ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼカセットを含む発現ベクターを用いたＥＳ細胞由来樹状細胞の遺伝子改変》
遺伝子改質ＥＳ細胞由来樹状細胞を作成するために、ＥＳ細胞に発現ベクターを導入し、遺伝子組み替えしたＥＳ細胞から樹状細胞を作成することを試みた。すなわちマウス胚由来繊維細胞（ＰＥＦ）層上に保持されたＴＴ２ＥＳ細胞を採取し、ダルベッコ改良イーグル培養液（ＤＭＥＭ）に２．５ｘ１０７／ｍＬ懸濁した。そして、１ｘ１０７細胞を４ｍｍギャップのキュベット−２００Ｖ、９５０μＦの条件で電気穿孔法による遺伝子導入を行なった。
【００５８】
【実施例５】
上記の遺伝子導入には、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に高い効率でＰＣＣエピトープを提示する効果のあるベクター、ｐＣＩ−ＰＣＣを用いた。このベクターは、ヒトインバリアント鎖（ｌｉ）のＣＬＩＰ領域を抗原ペプチドＰＣＣをコードするＤＮＡ断片に置換したものであり、ヒトインバリアント鎖とＰＣＣエピトープの融合タンパク質をコードする。さらに、上記の融合タンパク質を効率良く発現させるために、β―アクチンプロモータとＩＲＥＳ細胞由来ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼカセット（ｐＣＡＧ−ＩＰ）とを含有する発現ベクター（ｐＣＡＧＩＰ）を用いた。ｐＣＡＧＩＰにｌｉＰＣＣ融合蛋白をコードするＤＮＡ断片を挿入したｐＣＡＧＩＰ−ＣＩ−ＰＣＣを作成し（図８）、ＥＳ細胞にこのベクターを導入した。そして、ピューロマイシン耐性ＥＳ細胞クローンを単離し、樹状細胞へ分化させた。単離したＥＳ細胞の２８クローン中２４クローンが樹状細胞へ分化した後、ヒトｌｉを発現した。図９では、そのうちの１クローンの樹状細胞へ分化した後のヒトｌｉの発現を示している。対照として、遺伝子導入を行なっていないＥＳ細胞由来樹状細胞の解析結果を示す。
【００５９】
この工程により作製したＰＣＣエピトープを提示するＥＳ細胞由来樹状細胞のＰＣＣ特異Ｔ細胞ハイブリドーマ２Ｂ４を刺激する能力を定量的に評価した。図１０に示したように、ｌｉＰＰＣ発現ベクタ−が導入されているＥＳ細胞由来樹状細胞は、ＰＣＣ（１０μＭ）ペプチドを外来性に負荷しておいた骨髄細胞由来の樹状細胞よりもより強力にＴ細胞を刺激した。
【００６０】
【実施例６】
遺伝子トラップＥＳクローンにおいては、ＥＳ細胞の染色体の様々な部位にレポーター遺伝子として、ｌｏｘ−β−ｇｅｏ−ｌｏｘカセットが導入されている。Ｃｒｅ発現ベクターを用いて、遺伝子トラップＥＳ細胞クローンのレポーター遺伝子を卵白アルブミン抗原（ＯＶＡ）の遺伝子と置換するために、２０μｇのｐ６ＡＯＶＡとｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅをトランスフェクションに用いた。この遺伝子置換により、β−ｇｅｏ配列が、ＯＶＡの遺伝子に置換される。トランスフェクションしたＥＳ細胞は、９０ｍｍ培養皿上のＰＥＦ層上で培養し、３、５、７日に２４時間毎にピュ−ロマイシン（２μｇ／ｍｌ）で選択した。薬剤耐性コロニーを９日目に２４ウエル培養プレート上へ移した。さらに、遺伝子組み換えＥＳ細胞由来樹状細胞のクローンを樹状細胞に分化させた。
【００６１】
分化の後、得られた樹状細胞によるＯＶＡを特異的に認識するＴ細胞ハイブリドーマ（ＲＦ３３．７０）に対する刺激活性を調べることにより、ＯＶＡエピトープ提示能力を定量的に評価した。その結果、１０クローンのうち９クローンが強いハイブリドーマ刺激活性を示し、ＯＶＡエピトープ提示能力を有していることが判明した。置換ベクターが導入されたＥＳクローンから分化したＥＳ細胞由来樹状細胞によるＯＶＡエピトープ提示能を解析した結果を図１１に示す。遺伝子導入によりＯＶＡを発現したＥＳ細胞由来樹状細胞は、１〜１０μＭのＯＶＡペプチドを負荷した骨髄由来樹状細胞より優れたハイブリドーマ刺激活性を示した。以上の結果より、遺伝子トラップ法は、分化させた樹状細胞が導入された抗原遺伝子を高いレベルで発現する遺伝子改変ＥＳ細胞を効率的に得る方法として有効であることが明らかとなった。
【００６２】
【実施例７】
（遺伝子改変されたＥＳ細胞由来樹状細胞のマウスへの注入による抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化）
ＯＶＡ発現ベクターが導入されたＥＳ細胞由来樹状細胞の抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の活性化能力を調べるために、ＯＶＡ発現ベクター導入ＥＳ細胞由来樹状細胞あるいは、非導入ＥＳ細胞由来樹状細胞を、Ｆ１マウスに７日間隔で腹腔内に２回注入した。実施例２の方法によりＩＬ−４、ＴＮＦ−αそして、抗ＣＤ４０ｍＡｂ抗体とで刺激したＥＳ細胞由来樹状細胞を、マウスに注入した。（５ｘ１０４個細胞／マウス）注入は２回７日間隔で行った。２回目の注入から７日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を分離した。脾臓細胞を溶血緩衝液（１４０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタンスルフォン酸］、ｐＨ７．４）で１分処理し、洗浄し、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）とＯＶＡペピチド（０．１μＭ）が補給された４５％ＲＰＭＩ／４５％ＡＩＭＶ／１０％牛血清、２４ウエル培養プレートで培養した。（２．５ｘ１０６個細胞／ウエル）
【００６３】
（ＯＶＡペプチドを負荷したＥＬ−４胸腺細胞を標的細胞とした細胞傷害活性の測定）
標的細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを起源とする胸腺腫細胞株であるＥＬ−４をナトリウム［５１Ｃｒ］−クロメート１時間、３７℃でラベルし、１０％ＦＣＳが補給されたＲＰＭＩ−１６４０培養液で２回洗浄した。次いで、標的細胞を２４ウエル培養プレートで、１ｘ１０６個細胞／ウエルの密度で１０μＭのＯＶＡペプチド添加、あるいは非添加下で３時間インキュベートした。次いで、これを回収し、１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培養液で洗浄し、９６−ウエル丸底培養プレートにて培養した。（５ｘ１０３個細胞／ウエル）脾臓細胞由来の細胞傷害性Ｔ細胞（５ｘ１０４個細胞／ウエル）を標的細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベートの終わりに、プレートを遠心分離し、上澄み液（５０μＬ／ウエル）を収穫し、γカウンターで計測した。下記の計算式により特異的細胞傷害活性を計算した。
（実験放出値―自然放出値）／（最大放出値―自然放出値）Ｘ１００
自然放出値と最大放出値とは、各々、培養液中で放置した状態で細胞内より自然に遊離される放射活性値および１％トリトンｘ−１００の存在下で標的細胞を完全に溶解させた状態で測定した値である。
【００６４】
上記方法により、ＥＳ細胞由来樹状細胞を注入したマウスより分離し、さらに５日間培養を行なった脾臓細胞による、ＯＶＡペプチドを負荷されたＥＬ−４胸腺細胞に対する細胞傷害活性を調べた。結果を図１２に示す。ＯＶＡエピトープ特異性のある細胞傷害性Ｔ細胞が、ＯＶＡ発現ＥＳ細胞由来樹状細胞により活性化され、ＯＶＡ非発現ＥＳ細胞由来樹状細胞では活性化されなかったことを示す。これらのことはＯＶＡ抗原を発現するように遺伝子が操作されたＥＳ細胞由来樹状細胞が、生体内でＯＶＡ抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する能力のあることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の実施例における第二工程の培養液中の浮遊細胞の顕微鏡写真である。
【図２】図２は、本発明の実施例における第三工程の培養液中の浮遊細胞の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の実施例における第三工程の培養液中の浮遊細胞の、細胞表面分子の発現を解析した結果を示した図である。
【図４】図４は、本発明の実施例におけるＰＣＣ蛋白質の存在下で培養したＥＳ細由来の樹状細胞の抗原提示機能の評価結果を示したグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例における第四工程で培養液中の浮遊細胞の顕微鏡写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例における第四工程の培養液中の浮遊細胞の、細胞表面分子の発現を解析した結果を示した図である。
【図７】図７は、本発明の実施例における第四工程の培養液中の浮遊細胞によるＴ細胞刺激活性をＭＬＲにより解析した結果のグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例でＥＳ細胞に導入する融合蛋白をコードするＤＮＡ断片の構造図である。
【図９】図９は、本発明の実施例における遺伝子組み換えＥＳ細胞由来の樹状細胞のヒトｌｉ分子の発現を示した図である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例における遺伝子組み換えＥＳ細胞由来の樹状細胞の、ＰＣＣ特異Ｔ細胞ハイブリドーマ刺激活性を示したグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例における遺伝子組み換えＥＳ細胞由来の樹状細胞の、ＯＶＡペプチド負荷ＥＬ−４胸腺細胞に対するＴ細胞の細胞障害性ハイブリドーマ刺激活性を示したグラフである。
【図１２】図１２は、ＥＳ細胞由来樹状細胞を注入したマウスより分離し、さらに５日間培養を行なった脾臓細胞による、ＯＶＡペプチドを負荷されたＥＬ−４胸腺細胞に対する細胞傷害活性を調べた結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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