(57)【要約】【課題】従来の回転モーター分子とは特性の異なった新しい回転モーター分子を提供する。【解決手段】ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶ１部分を構成するＡサブユニット３個、Ｂサブユニット３個、Ｄサブユニット１個を有する複合体分子であって、ＡＴＰ存在下で回転運動することを特徴とする回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。【選択図】  図１
2004166612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶ１部分を構成するＡサブユニット３個、Ｂサブユニット３個、Ｄサブユニット１個を有する複合体分子であって、ＡＴＰ存在下で回転運動することを特徴とする回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項２】
耐熱性を有する請求項１の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項３】
好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である請求項２の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項４】
Ａサブユニットに相当する配列番号３のポリペプチド３個、Ｂサブユニットに相当する配列番号４のポリペプチド３個、Ｄサブユニットに相当する配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体である請求項３の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項５】
配列番号３における第２３２番目Ｓｅｒ残基のＡｌａ残基への置換、および第２３５番目Ｔｈｒ残基のＳｅｒ残基への置換の少なくとも一方を有する請求項４の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項６】
ＡサブユニットおよびＢサブユニットの少なくとも一方が基板上に固定されている請求項１から５のいずれかの回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項７】
ＡサブユニットのＮ端に結合したＨｉｓタグを介して基板上に固定されている請求項６の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項８】
Ｄサブユニットにジョイント部材が結合している請求項１から７のいずれかの回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項９】
配列番号５における第４８番目Ｇｌｕ残基を置換したＣｙｓ残基、および第５５番目Ｇｌｎ残基を置換したＣｙｓ残基の少なくとも一方のＣｙｓ残基にジョイント部材を結合している請求項８の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項１０】
ＡサブユニットおよびＢサブユニットにおける全てのＣｙｓ残基が非Ｃｙｓ残基に置換されている請求項９の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、マイクロマシンやナノマシンの駆動部（ナノアクチュエータ）等として有用な新規回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
分子サイズの大きさで機械的な動きをするマイクロマシンやナノマシンの開発が注目されている。このようなマイクロマシンやナノマシンは、例えば、分子コンピューターの配線を加工する分子ロボットや体内で治療作業を行う医療用ロボットとして有望視されているからである。
【０００３】
マイクロマシンやナノマシンを作成するためには、個々の要素デバイス（センサ、アクチュエータ、ミニチュア機械）や、それらの組立方法（マイクロマシニングやナノマシニング）に至るまで、様々な技術開発が必要とされている。特に、マイクロマシン駆動部であるマイクロアクチュエータやナノアクチュエータ（回転モーター）の開発は、マシンの自律運動にとって不可欠であり、様々な微細加工技術を利用したモーターデバイスの開発が進められている。しかしながら微細加工技術を応用した方法で作成できるマイクロアクチュエータは、小さいものでも１００μｍ程度であり、マイクロマシンやナノマシンに装備するには、モーター装置の更なる微少化が求められている。
【０００４】
そこで、微細加工技術によってモーターを構築するのではなく、回転運動能を有する単一分子をモーターとして利用することが提案されている。
【０００５】
一般に、モーターとして利用できる分子は、外部エネルギーを回転運動に変換する動力機構があること、および１方向の回転を実現できることの２点を満たすことが求められている。そして、このような条件を満たす低分子有機化合物としては、例えば（３Ｒ，３’Ｒ）−（Ｐ，Ｐ）−ｔｒａｎｓ−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−３，３’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４，４’−ｂｉｐｈｅａｎｔｈｒｙｄｉｅｎｅ（非特許文献１）とＴｒｉｐｔｙｃｙｌ（４）ｈｅｌｉｃｅｎｅ（非特許文献２）が知られている。前者は、炭素−炭素二重結合を挟んで左右対称的な形を持っているが、立体的な込み合いのためねじれた構造となっている。これに適当な熱や光を加えると４つのプロセスを経て１方向に回転させることができる。また２回の光反応と熱異性化反応で１サイクルを完了し、１方向のみに進行する。すなわち、この有機化合物は、熱異性化反応と光反応とによって回転運動を行う。光反応による回転は非常に速い（ピコセカンドのレベル）が、熱異性化反応による回転には数分以上かかるため、実用化に適していない。また、駆動力が極めて弱いという問題点を有してもいる。一方、後者はフォスゲン付加反応とウレタン結合形成、開裂という化学反応を利用して分子の一方向の回転を示す。しかしながら、この分子は繰り返し回転ができないという、アクチュエータとしての致命的な欠陥を有している。
【０００６】
一方、マイクロマシンやナノマシン等に利用可能な単一分子モーターとしては、鞭毛モーター（非特許文献３、４）、ＡＴＰ合成酵素（非特許文献５）、ミオシンモーター（非特許文献６、７）、微少管系モーター（非特許文献８）、核酸合成酵素の運動タンパク質（非特許文献９）等の生体分子も知られている。
【０００７】
このうち、ＡＴＰ合成酵素は、真核生物のミトコンドリア内膜、葉緑体のチラコイド膜、原核細胞膜などに普遍的に存在する膜タンパク質であり、細胞の消費するＡＴＰの大部分を合成している。ＡＴＰ合成酵素（ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素）は分子量約５０万にも及ぶ巨大膜タンパク質複合体であり、膜中に存在するＦｏ部分と膜の外に存在するＦ１部分からなる。Ｆｏ部分は膜をプロトン（Ｈ＋）が通過するために通り道になっており、Ｆ１部分にはＡＴＰを合成／加水分解する触媒部位がある。Ｆ１部分の分子量は約３８万であり、例えばバクテリア由来のＡＴＰ合成酵素におけるＦ１部分のサブユニット組成はα３β３δγ１ε１である。αとβサブユニットはどちらにも似たようなＡＴＰ結合部位を有するが、触媒活性はβサブユニットにある。両者は交互に並んでリングを形成しており、このα３β３リングの中心部にγサブユニットが存在している。δサブユニットはα３β３リングの頂上に結合し、ＡＴＰ加水分解活性を制御しているεサブユニットはγサブユニットに結合している。一方、Ｆｏ部分は分子量約１０万であり、そのアミノ酸組成は、プロトンの移動に必須なグルタミン酸およびアスパラギン酸を多く含んでいる。サブユニット組成はａ１ｂ２ｃ９−１２であり、ｃサブユニットは膜の中でリング状に配列し（ｃリング）、それにａサブユニットと、膜の外に長く突き出した腕を持つｂサブユニット２個が結合している。従って、ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素は、Ｆ１部分とＦｏ部分とが、γε−ｃリング、δ−ｂ２の２箇所で結合している。さらに特筆すべきは、このＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素分子が２種類のトルク発生装置を備えている点である。一つはＦ１部分に存在するＡＴＰ駆動型装置であり、他方はＦｏ部分に存在するプロトン駆動型装置である。すなわち、Ｆｏ部分がプロトンを細胞膜内に取り込む場合にはｃリングが時計回りに回転し、プロトンを細胞膜外に排出する場合にはｃリングは反時計回りに回転する。一方、Ｆ１部分は、ＡＴＰ合成時にはそのγサブユニットがＦｏ側からみた場合に時計回りに回転し、ＡＴＰ分解時には反時計回りに回転する。そして、このような２種類のトルク発生装置を備えることによって、ＡＴＰ合成酵素が生み出すトルクは数十ピコニュウトン・ｎｍであり、分子モーターとしての十分な駆動力を有している。また水系で作動するため体内でのアクチュエータとして最適であり、アクチンを充分に動かす力があるために生体内の蛋白質、糖質、脂質、核酸を操作することも可能である。
【０００８】
そしてこの出願の発明者らは、このＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素分子を改良して、広範な回転速度の制御が可能な改変型ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素分子とその利用発明を既に発明し、特許出願している（特願２００２−１４８２３２：出願日２００２年５月２２日）。また、最近になって、Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素分子に亜鉛結合部位を導入し、亜鉛によって回転の開始・停止を制御することのできる回転モーター分子が報告されてもいる（非特許文献１０）。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１５２−１５５，  １９９９
【非特許文献２】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１５０−１５２，  １９９９
【非特許文献３】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：１−１８，  １９６７
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ  ２４５：３８０−３８２，  １９７３
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９９−３０２，  １９９７
【非特許文献６】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １９９：１０５７−１０６３，  １９９４
【非特許文献７】
Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７：  ８９−９３，  １９９５
【非特許文献８】
Ｃｅｌｌ  ４２：３９−５０，  １９８５
【非特許文献９】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  １１３−１１９，  ２００１
【非特許文献１０】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １：１７３−１７７，  ２００２
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、様々な回転モーター分子がマイクロマシンやナノマシン等の駆動部材として提案されており、回転の形態や回転数、トルク、回転の制御方法等においてそれぞれに特徴を有している。従って、実際にマイクロマシンやナノマシンを作成するためには、その用途やマシン構成に応じて多くの候補分子から適切なものを選択する必要がある。しかしながら、これまでに報告されている回転モーター分子のそれぞれは、マイクロマシンやナノマシンの他種多様な用途や構成の全てに対応可能であるとは言い難い。そのため、マイクロマシンやナノマシン等の開発に当たっては、回転モーター分子のラインナップを一つでも多く充実させることが望まれている。
【００１１】
従って、この出願は、従来の回転モーター分子とは特性の異なった新しい回転モーター分子を提供することを課題としている。
【００１２】
また出願は、その回転運動をさらに円滑なものにするために、さらには回転運動の伝達手段等を分子に付加するために改良された新規回転モーター分子を提供することを課題としてもいる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶ１部分を構成するＡサブユニット３個、Ｂサブユニット３個、Ｄサブユニット１個を有する複合体分子であって、ＡＴＰ存在下で回転運動することを特徴とする回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅを提供する。
【００１４】
この発明のＶ１−ＡＴＰａｓｅは、触媒部位のＡサブユニットを含み、ＡとＢサブユニットは交互に配列し、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅのα３β３のように六量体の円筒を形成するものであって、ＤサブユニットはＡ３Ｂ３の円筒の中央の空洞を埋めており、Ｆサブユニットは、Ｄサブユニットに結合しており、ＤサブユニットとＦサブユニットは、回転子（回転シャフト、回転軸）として働く。
【００１５】
この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、耐熱性分子であることを一つの態様としており、その場合に好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の分子であることを好ましい態様としている。
【００１６】
さらにこの好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、Ａサブユニットに相当する配列番号３のポリペプチド３個、Ｂサブユニットに相当する配列番号４のポリペプチド３個、Ｄサブユニットに相当する配列番号５のポリペプチド１個を有する複合体であることを一つの好ましい態様としている。
【００１７】
さらにこの発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、配列番号３における第２３２番目Ｓｅｒ残基のＡｌａ残基への置換、および第２３５番目Ｔｈｒ残基のＳｅｒ残基への置換の少なくとも一方を有する改変型分子であることを別の態様としている。
【００１８】
この改変されたＶ１−ＡＴＰａｓｅは、触媒部位であるＡサブユニットを改変することによりＭｇＡＤＰ阻害が解消され、ＡＴＰ加水分解活性が亢進する。すなわち野生型Ｖ１−ＡＴＰａｓｅはＭｇＡＤＰ阻害によって回転た抑制される傾向にあるが、ＭｇＡＤＰ阻害が解消された変異型Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、効率よい回転運動を示す。
【００１９】
またさらに、この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの少なくとも一方が基板上に固定されている改変型分子であることを別の態様としている。そしてこの場合には、ＡサブユニットのＮ端に結合したＨｉｓタグを介して基板上に固定されていることを好ましい態様としている。
【００２０】
この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅはまた、Ｄサブユニットにジョイント部材が結合していることを別の態様としている。そしてこの場合には、配列番号５における第４８番目Ｇｌｕ残基を置換したＣｙｓ残基、および第５５番目Ｇｌｎ残基を置換したＣｙｓ残基の少なくとも一方のＣｙｓ残基にジョイント部材を結合していること、さらにはＡサブユニットおよびＢサブユニットにおける全てのＣｙｓ残基が非Ｃｙｓ残基に置換されていることをそれぞれ好ましい態様としている。
【００２１】
すなわち、この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、細菌や真核生物のオルガネラ（液胞、リソソーム、ゴルジ体、細胞膜、被覆小胞、分泌顆粒等）に存在するＶ型（液胞膜型）ＡＴＰａｓｅ（ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ）の、Ｖ１部分（Ａサブユニット３個、Ｂサブユニット３個、Ｄサブユニット１個からなる複合体）である。従来、ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素が回転モーター分子として機能することは知られていたが、このＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶ１部分（Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ）が回転運動することは全く知られていなかった。この発明のＶ１−ＡＴＰａｓｅは、Ａサブユニット３個およびＢサブユニット３個によって構成される「筒状体」の内側に位置するＤサブユニットが回転シャフトとして機能することを初めて見出して完成されたものである。
【００２２】
なお、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶ１部分はＤサブユニットにＦサブユニット１個を結合しているが、この発明のＶ１−ＡＴＰａｓｅはこのＦサブユニットを結合した分子をも包含する。また、この発明のＶ１−ＡＴＰａｓｅは野性型だけでなく、前記のとおりの各種変異体をも包含する。さらに、前記の非特許文献１０に開示されているような亜鉛認識部位の導入変異体をも包含する。
【００２３】
以下、発明の実施形態を示し、前記各発明について詳しく説明するが、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等の記載を参考にすることができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、各種細菌や真核生物が産生するＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶ１部分（Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ）であり、このＶ１−ＡＴＰａｓｅをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片。好ましくはｃＤＮＡ断片。以下「Ｖ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチド」と記載することがある）を用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわちＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅをコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ断片）の配列は公知のデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋデータベース：ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ等）において多数公開されており、これらの配列情報を利用したプローブハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によって既存のｃＤＮＡライブラリー等から容易に取得することができる。
【００２５】
そして、このＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを公知の遺伝子工学的方法で発現させることによって、Ａサブユニット３個、Ｂサブユニット３個、Ｄサブユニット１個からなる複合体Ｖ１−ＡＴＰａｓｅを取得することができる。例えば、例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターにＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを組換え、この組換えベクターをプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、回転能を有するＶ１−ＡＴＰａｓｅをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。また、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを適当な宿主−ベクター系において発現させれば、回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などで生産することができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のＶ１−ＡＴＰａｓｅ分子を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、ポリヌクレオチドを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドをプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターをトランスフェクトした真核細胞から目的のＶ１−ＡＴＰａｓｅ分子を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたＶ１−ＡＴＰａｓｅを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げら���る。
【００２６】
またこのこの発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、工業的な利用の観点から、耐熱性分子であることが好ましい。従って、６５℃以上で生育するＴｈｅｒｍｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属やＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属等の細菌由来のＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを使用することが好ましい。さらに、７０℃以上でも生育することができる好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを使用することが特に好ましい。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドは配列番号１に示した塩基配列を有している。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｆサブユニット）、配列番号３のポリペプチド（Ａサブユニット）、配列番号４のポリペプチド（Ｂサブユニット）および配列番号５のポリペプチド（Ｄサブユニットからなる複合体）をコードしている。従って、配列番号１の３３４−４１９６  ｎｔ配列を前記の遺伝子工学的方法により発現させることにより、Ａサブユニット３個、Ｂサブユニット３個およびＤサブユニット１個からなる耐熱性Ｖ１−ＡＴＰａｓｅを得ることができる。また配列番号１の１−４１９６  ｎｔ配列を発現させることによって、ＤサブユニットにＦサブユニット１個を結合した耐熱性Ｖ１−ＡＴＰａｓｅを得ることができる。
【００２７】
この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのさらに別の好ましい態様は、配列番号３における第２３２番目Ｓｅｒ残基のＡｌａ残基への置換、および第２３５番目Ｔｈｒ残基のＳｅｒ残基への置換の少なくとも一方、さらに好ましくはこれらの置換の両方を有する改変型分子（以下、両方の置換を有する分子を「ＴＳＳＡ変異体」と記載することがある）である。すなわち、真核細胞のＶ−ＡＴＰａｓｅと異なり、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の細菌由来のＶ１−ＡＴＰａｓｅは触媒の代謝回転の間、いわゆるＭｇＡＤＰ阻害によって反応が中断するという傾向を有しており（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  ２０５０４−２０５１０，  １９９８）、通常はＡＴＰを基質として加えてから５分以内このＡＤＰ抑制を示し、約１０分間でＡＴＰ加水分解を停止する。そこでこの出願の発明者らは幾つかの変異体を作成してＡＤＰ抑制の効果を検討した結果、前記のＴＳＳＡ変異体が、ＡＴＰを基質として加えてから１時間もＡＴＰ活性を持続させることを見出した。
【００２８】
この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのさらにまた別の好ましい態様は、ＡサブユニットまたはＢサブユニットの少なくとも一方が基板上に固定されている改変型分子である。すなわち、この固定によって、Ｄサブユニットの回転を効率よく伝達することが可能となる。このようなＡおよび／またはＢサブユニットの基板への結合は、例えば共有結合を用いた各種の方法によって行うことができるが、好ましくは、ＡサブユニットのＮ端にＨｉｓタグ（ヘクタヒスチジン）を結合させ、このＨｉｓタグをＮｉ−ＮＴＡスライドに結合する方法（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９９−３０２，  １９９７；  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７０：２４４−２４８，  ２０００）を採用することができる。
【００２９】
この発明の回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅはまた、Ｄサブユニットにジョイント部材が結合していることを別の好ましい態様としている。この場合の「ジョイント部材」とは、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅにおけるＤサブユニットの回転運動を他の部材（例えば、ギアや運動機関のシャフト等）に伝達するための部材である。またこのジョイント部材は他の部材との連結用としてではなく、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅの回転を観察するための「プローブ」、あるいは「プロペラ」としても利用することができる。このようなジョイント部材としては、例えば後記実施例に例示したようなビーズを複数個連結したもの（マイクロスフェア）や、あるいはアクチンフィラメント（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９９−３０２，  １９９７）等の微細繊維を利用することができる。そして、このようなジョイント部材は、ＤサブユニットのＣｙｓ残基に、例えばマレイミド、ジスルフィド結合等によって結合することができる。ただし、配列番号５にアミノ酸配列を示したＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのＤサブユニットにはＣｙｓ残基が存在しないため、適当な非Ｃｙｓ残基をＣｙｓ残基に置換する必要がある。そこでこの発明は、配列番号５における第４８番目Ｇｌｕ残基を置換したＣｙｓ残基、および第５５番目Ｇｌｎ残基を置換したＣｙｓ残基の少なくとも一方（好ましくは両方）のＣｙｓ残基にジョイント部材を結合していることを好ましい態様とする。また、Ｄサブユニット以外のＣｙｓ残基（Ａサブユニットの合計９個、Ｂサブユニットの合計３個）にジョイント部材が結合しないように、これらのＣｙｓ残基を他の残基（例えばＳｅｒ残基）に置換することが好ましい。
【００３０】
また、ジョイント部材はＤサブユニットではなく、Ｄサブユニットに結合したＦサブユニットに結合させることもできる。その場合には、例えば配列番号２のアミノ酸における第２８番目Ｓｅｒおよび／または第３５番目Ｓｅｒ残基をＣｙｓ残基に置換し、これらのＣｙｓ残基にジョイント部材を結合させればよい。
【００３１】
なお、前記の各変異体Ｖ１−ＡＴＰａｓｅは、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸残基をコードするトリプレットを、ミューテーション・キット等を使用する方法、変異導入型のＰＣＲ法、ポリヌクレオチド合成法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０−３４４４，  １９９７等）によって置換し、この変異型ポリヌクレオチドを遺伝子工学的方法によって発現させることによって取得することができる。
【００３２】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３３】
【実施例】
１．  材料と方法
１−１．タンパク質の調製
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８由来Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆの各サブユニットをコードするＤＮＡ配列をｌａｃプロモーター支配下に保持しているプラスミッドｐＵＣＶ１によって形質転換した大腸菌株ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＰ（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）を用いてＶ１−ＡＴＰａｓｅを発現させた。なお、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｆの各サブユニットをコードするＤＮＡ配列には以下の変異体作成のための改変を加えた（アミノ酸位置は配列番号２−５に対応する）。
Ｉ：Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／ΔＣｙｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／Ｄ−Ｅ４８Ｃ／Ｄ−Ｑ５５Ｃ）
（１）  ＡサブユニットのＮ端にＨｉｓタグを結合（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ）
（２）  ＡおよびＢサブユニットの全てのＣｙｓ残基がＳｅｒ残基に置換（ΔＣｙｓ）
（３）  Ａサブユニットの第２３２番目ＳｅｒがＡｌａに置換（Ａ−Ｓ２３２Ａ）
（４）  Ａサブユニットの第２３５番目ＴｈｒがＳｅｒに置換（Ａ−Ｔ２３５Ｓ）
（５）  Ｄサブユニットの第４８番目ＧｌｕがＣｙｓに置換（Ｄ−Ｅ４８Ｃ）
（６）  Ｄサブユニットの第５５番目ＧｌｎがＣｙｓに置換（Ｄ−Ｑ５５Ｃ）
ＩＩ：Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／ΔＣｙｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／Ｆ−Ｓ２８Ｃ／Ｆ−Ｓ３５Ｃ）
（１）  ＡサブユニットのＮ端にＨｉｓタグを結合（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ）
（２）  ＡおよびＢサブユニットの全てのＣｙｓ残基がＳｅｒ残基に置換（ΔＣｙｓ）
（３）  Ａサブユニットの第２３２番目ＳｅｒがＡｌａに置換（Ａ−Ｓ２３２Ａ）
（４）  Ａサブユニットの第２３５番目ＴｈｒがＳｅｒに置換（Ａ−Ｔ２３５Ｓ）
（７）  Ｆサブユニットの第２８番目ＳｅｒがＣｙｓに置換（Ｓ２８Ｃ）
（８）  Ｆサブユニットの第３５番目ＳｅｒがＣｙｓに置換（Ｓ３５Ｃ）
形質転換細胞を、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／ＨＣＩ（ｐＨ８．０）に懸濁し、６５℃で３０分間熱処理をした後、熱に不安定なタンパク質を除き、Ｎｉ２＋−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供して０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．５Ｍ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／ＨＣＩ（ｐＨ８．０）で溶出した。緩衝液をかえ、限外濾過（ＶＩＶＡ−Ｓｐｉｎ，ＶＩＶＡ  ｓｃｉｅｎｃｅ）し、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎに供した。Ｖ１−ＡＴＰａｓｅを含む部分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｃｏｌｕｍｎ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）にかけ、コンタミネーションしているタンパク質を除去した。精製されたＶ１−ＡＴＰａｓｅを２モル過剰の６−［Ｎ’−［２−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］  −Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌａｍｉｄｏ］ｈｅｘｙｌ  Ｄ−ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅ  （ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＡＣ５−ｍａｌａｉｍｉｄｅ，  Ｄｏｊｉｎｄｏ）でビオチン化した。２５℃で１５分間インキュベーションした後、タンパク質をＰＤ−１０  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供し、未反応試薬を除いた。ＤおよびＦサブユニットのビオチン化は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ウエスタンブロッティングにより確認した（図２）。
１−２．  回転観察
５μｌのフローセルを、２枚のカバースリップ（５０ｎｍ厚のスペーサーを介在）から作成した。底のガラス表面はＮｉ２＋−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄでコートし、ビオチン化したＶ１−ＡＴＰａｓｅ（０．１−１μＭ）を緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＫＣＩ，  ５ｍＭＭｇＣｌ２，  ａｎｄ  ０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡからなるＡ溶液中でフローセルに注入し、Ｈｉｓタグをガラスに結合させてＶ１−ＡＴＰａｓｅを固定した。
【００３４】
０．１％（ｗ／ｖ）のＳｔｅｒｅｐｔａｖｉｄｉｎでコートしたビーズ（φ＝０．５６μｍ，  Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．）溶液をフローセルに満たし、未結合ビーズは洗浄除去して、ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ結合によってＤまたはＦサブユニットにビーズを結合した。
【００３５】
Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ分子の回転は、所定濃度のＡＴＰ中（０．２ｍｇ／ｍｌ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  と２．５ｍＭ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＡＴＰ再生システム中）で、ビーズの回転を明視野顕微鏡（ＩＸ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ、倍率１０００）を使用して観察した。また回転の状態はＣＣＤカメラでビデオ記録した。なお、このＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転観察システムは、Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの回転システム（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，  １３６４９−５４，  ２００１）と同様である。すなわち、回転はＤまたはＦサブユニットに結合したビーズにより、斜めに結合された形で観察された（図２）。
１−３．その他のアッセイ
タンパク質濃度はＵＶ測定によって行った。ＡＴＰ加水分解活性は、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅとｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとをカップリングさせたＮＡＤＨ酸化により測定した。２．結果
２−１．回転の観察
Ｖ１−ＡＴＰａｓｅ（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／ΔＣｙｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／  Ｄ−Ｅ４８Ｃ／Ｄ−Ｑ５５Ｃ）およびＶ１−ＡＴＰａｓｅ（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／ΔＣｙｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／Ｆ−Ｓ２８Ｃ／Ｆ−Ｓ３５Ｃ）の２つの変異体について回転を観察した。２つの変異体は、同じようなＭｉｃｈａｅｌｉｓ  ＭｅｎｔｅｎタイプのＫｉｎｅｔｉｃｓを示し、Ｋｍ＝０．３−０．５ｍＭ，Ｖｍａｘ（ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｒａｔｅ）＝〜１０ｓｅｃ−１を示した。これらの数値は、野生型のＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素と同程度であった（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  ２０５０４−１０１４，  １９９８）．
２−２．Ｄサブユニットの回転
ＡＴＰを含む緩衝液をフローセルに注入させる場合に、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのＤサブユニットに結合したビーズの回転が観察された（図３Ａ−３Ｄ）。一つのフローセルでは、５−１０個の回転ビーズが観察された。
【００３６】
回転は一方向であり、Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの回転方向と同様に、細胞膜側からみると常に反時計回りであった。ＡＴＰを含まない緩衝液中では、ブラウン運動との区別のつく一方向の回転は観察されなかった。
【００３７】
アジド（Ａｚｉｄｅ）はＦ１−ＡＴＰａｓｅのＡＴＰａｓｅ活性も回転も阻害するが（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，  ２９９−３０２，  １９９７）、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのＡＴＰａｓｅ活性は阻害していないことが知られている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５，  ２１９４６−５０，  １９９０）。変異体Ｖ１−ＡＴＰａｓｅの回転についても同様であり、アジド（Ａｚｉｄｅ）は４ｍＭ  ＡＴＰ存在下（図３Ａ、Ｂ）や０．１ｍＭ  ＡＴＰ存在下でのＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転に影響を与えなかった。
【００３８】
４ｍＭ  ＡＴＰ存在下での平均回転数は、約２．６  ｒｐｓ  （ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｓｅｃ：回転数／秒）以下であった。１  ｍＭ  ＡＴＰ存在下での平均回転数は約２．４  ｒｐｓ以下であった。１回転に３分子のＡＴＰが使用されると仮定すれば、回転速度は、バルクの酵素反応速度論（〜１０  ＡＴＰｓの加水分解／秒）から観察されるＡＴＰ加水分解速度に良く一致している。また、０．５  ｍＭ  ＡＴＰでは平均回転数は約２．２  ｒｐｓと低下している（図３Ｃ）
２−３．  Ｆサブユニットの回転
Ｆサブユニットに結合したビーズ回転も観察された。４  ｍＭ  ＡＴＰ濃度の条件では、１〜３個の回転ビーズが観察された（図４）。回転方向も常に反時計回りであった。回転速度は、約２．５  ｒｐｓであり、Ｄサブユニットの回転速度と同程度であった。
【００３９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、新規の回転モーター分子としてのＶ１−ＡＴＰａｓｅが提供される。また、この回転モーター分子Ｖ１−ＡＴＰａｓｅのさらに実用的形態としての各種変異体Ｖ１−ＡＴＰａｓｅが提供される。これらは、マイクロマシンやナノマシン等の作成に大きく寄与する。
【００４０】
【配列表】
2004166612.tif 000003
2004166612.tif 000004
2004166612.tif 000005
2004166612.tif 000006
2004166612.tif 000007
2004166612.tif 000008
2004166612.tif 000009
2004166612.tif 000010
2004166612.tif 000011
2004166612.tif 000012
2004166612.tif 000013
2004166612.tif 000014
2004166612.tif 000015
2004166612.tif 000016
2004166612.tif 000017
2004166612.tif 000018
2004166612.tif 000019
2004166612.tif 000020
2004166612.tif 000021
2004166612.tif 000022
2004166612.tif 000023
2004166612.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｖ１−ＡＴＰａｓｅの回転観察の状態を示した模式図である。矢印は回転方向を示す。
【図２】ＤまたはＦサブユニットのビオチン化を確認したウェスタンブロット分析の結果である。左側（レーン１−４）はＣＢＢ染色、右側（レーン５−８）はａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅコンジュゲート染色である。レーン１および５はＤサブユニットがビオチン化されたＶ１−ＡＴＰａｓｅ、レーン２および６はビオチン化されたＦサブユニットを持つＶ１−ＡＴＰａｓｅ、レーン３および７はビオチン化されていないＶ１−ＡＴＰａｓｅ、レーン４および８は分子量マーカーである。
【図３】Ｄサブユニットに固定したビーズ回転の経時変化を測定した結果である。Ａは４  ｍＭ  ＡＴＰ、０．５  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ存在下でのビーズの回転である。Ｂ−Ｄはｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ非存在下で、Ｂは４  ｍＭ  ＡＴＰ、Ｃは０．５  ｍＭ  ＡＴＰ、Ｄは０．２  ｍＭ  ＡＴＰ溶液中でのビーズ回転の結果である。
【図４】Ｆサブユニットに固定したビーズ回転の経時変化を、４  ｍＭ  ＡＴＰ溶液中で測定した結果である。
【図１】
2004166612.tif 000025
【図２】
2004166612.tif 000026
【図３】
2004166612.tif 000027
【図４】
2004166612.tif 000028