(57)【要約】【課題】白血病関連因子ＭＬＦ１の機能を明らかにし、この機能を利用した強力な細胞増殖抑制方法およびこの機能を欠損させることによる細胞増殖促進方法を提供する。【解決手段】細胞増殖を制御しようとする細胞中で、白血病関連因子であるＭＬＦ１タンパク質の発現量を変化させるか、または、発現しているＭＬＦ１タンパク質の機能を調節する。具体的には、細胞増殖を抑制する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させ、細胞増殖を促進する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を低下させるか、細胞中に発現している上記ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する。これにより、創薬・医療・研究といった様々な分野に応用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞増殖を制御しようとする細胞中で、白血病関連因子であるＭＬＦ１タンパク質の発現量を変化させるか、または、発現しているＭＬＦ１タンパク質の機能を調節することを特徴とする細胞増殖制御方法。
【請求項２】
上記ＭＬＦ１タンパク質が、次に示す（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の細胞増殖制御方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質。
【請求項３】
細胞増殖を抑制する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項４】
上記細胞がガン細胞であることを特徴とする請求項３に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項５】
上記ＭＬＦ１タンパク質の発現は、細胞中にＭＬＦ１タンパク質をコードするＭＬＦ１遺伝子を導入することにより実現されることを特徴とする請求項３または４に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項６】
上記ＭＬＦ１遺伝子として、配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子が用いられることを特徴とする請求項５に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項７】
少なくとも上記ＭＬＦ１遺伝子とプロモーターとを含む組換え発現ベクターを、細胞に導入することによって、ＭＬＦ１タンパク質を発現させることを特徴とする請求項５または６に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項８】
ガンの遺伝子治療に用いられることを特徴とする請求項５、６または７に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項９】
ＭＬＦ１遺伝子を導入したＭＬＦ１トランスジェニック生物の生産に用いられることを特徴とする請求項５、６または７に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項１０】
細胞増殖を促進する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を低下させるか、細胞中に発現している上記ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害することを特徴とする請求項１または２に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項１１】
上記細胞が幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項１２】
上記幹細胞として造血幹細胞が用いられるとともに、骨髄移植に用いられることを特徴とする請求項１０または１１に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項１３】
ＭＬＦ１遺伝子の機能を欠失させるＭＬＦ１ノックアウト生物の生産に用いられることを特徴とする請求項１０に記載の細胞増殖制御方法。
【請求項１４】
配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列を含み、請求項３ないし９の何れか１項に記載の細胞増殖制御方法に用いられる発現ベクター。
【請求項１５】
ウイルスベクターを用いることを特徴とする請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
さらに、組織特異的なプロモーターを有していることを特徴とする請求項１４または１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１ないし１３の何れか１項に記載の細胞増殖制御方法を実施するための細胞増殖制御キット。
【請求項１８】
配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列を有する発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１７に記載の細胞増殖制御キット。
【請求項１９】
白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質を含み、細胞周期を同調させる培養に用いられることを特徴とする細胞周期同調薬剤
【請求項２０】
上記ＭＬＦ１タンパク質として、次に示す（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質を用いることを特徴とする請求項１９に記載の細胞周期同調薬剤。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質。
【請求項２１】
白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質を含み、ガン細胞の増殖を抑制することを特徴とするガン治療薬剤。
【請求項２２】
上記ＭＬＦ１タンパク質として、次に示す（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質を用いることを特徴とする請求項２１に記載のガン治療薬剤。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質。
【請求項２３】
白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する物質をスクリーニングする方法であって、次に示す（ａ）または（ｂ）記載のタンパク質を用いることを特徴とするスクリーニング方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質。
【請求項２４】
請求項２３に記載のスクリーニング方法を用いて得られた、ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する物質を含む細胞増殖促進薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、白血病関連因子ＭＬＦ１の機能を利用した細胞増殖制御方法およびその利用に関するものであり、特に、細胞の増殖を抑制することも促進することも可能で、各種疾患の治療に応用可能な細胞増殖制御方法およびその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、ガン治療は、一般にガン細胞の完全撲滅を目指した化学療法が主体であり、分化誘導療法、補助療法等が併用される。しかしながら、これらのガン治療は患者が受ける苦痛に反して再発率が高く、根治的治療ではない。一方、白血病等では骨髄移植を行うことにより完治が可能である。しかしながら、骨髄提供者には全身麻酔等の多大な負担が強いられる。
【０００３】
そこで、幹細胞の効率的な体外増幅法やガン発症機構に基づく細胞増殖制御の研究により、治療効率の高いガン治療薬、ガン治療法の開発が期待されている。
【０００４】
白血病関連因子ＭＬＦ１（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ  １）タンパク質は、ｔ（３；５）転座型急性白血病の原因遺伝子ＮＰＭ−ＭＬＦ１により同定された分子である（非特許文献１参照）。ＭＬＦ１タンパク質は正常では造血幹細胞に発現しており、その異常が白血病の原因となることがわかっている。また、ＭＬＦ１タンパク質はｔ（３；５）転座型急性白血病のみならず、骨髄性白血病や骨髄異形成症候群全般においても、白血化の進行とともに発現の亢進を示すことが知られている（非特許文献２参照）。
【０００５】
一方、サイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ、以下ＣＤＫと略す）は細胞周期に重要な役割を果たしていることが知られている。ＣＤＫの機能抑制因子ＣＤＫインヒビターの一種であるｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質（以下ｐ２７タンパク質と称する）は細胞周期Ｇ１期進行の抑制因子であり、様々なガンにおいてその悪性度とｐ２７タンパク質量とが逆相関することが知られている。また、ｐ２７タンパク質をコードするｐ２７遺伝子のノックアウトマウスは大型化し、すべての組織の細胞数が増加していることが報告されている（非特許文献３参照）。したがって、ｐ２７タンパク質の分解を特異的に調節する因子の中にガン悪性化の遺伝的標的が存在すると考えられている。
【０００６】
さらに、ｐ２７タンパク質と特異的に結合し、ｐ２７タンパク質の分解制御に関与する因子として、Ｊａｂ１／ＣＯＰ９シグナロソーム複合体が知られている。このＪａｂ１／ＣＯＰ９シグナロソーム複合体はｐ２７タンパク質の分解を誘導し、その結果、細胞増殖を促進する。
【０００７】
なお、本発明者らは、ＭＬＦ１により細胞増殖が抑制されることから、ＭＬＦ１がｐ２７の上流において、その分解機構を抑制する細胞周期制御因子として機能するという知見を報告している（非特許文献４参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｙｏｎｅｄａ−Ｋａｔｏ  Ｎ．，  Ｌｏｏｋ  Ａ．Ｔ．，  Ｋｉｒｓｔｅｉｎ  Ｍ．Ｎ．，  Ｖａｌｅｎｉｎｅ  Ｍ．Ｂ．，  Ｒａｉｍｏｎｄｉ  Ｓ．Ｃ．，  Ｃｏｈｅｎ  Ｋ．Ｊ．，  Ｍｏｒｒｉｓ  Ｓ．Ｗ．  Ｔｈｅ  ｔ（３；５）（ｑ２５．１；ｑ３４）  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ，  ＮＰＭ−ＭＬＦ１．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １２，  ２６５−２７５，  １９９６．
【０００９】
【非特許文献２】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｎ．，  Ｙｏｎｅｄａ−Ｋａｔｏ  Ｎ．，  Ｉｇｕｃｈ  Ｔ．，  Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｙ．，  Ｋｙｏ  Ｔ．，  Ｓａｗａｄａ  Ｈ．，  Ｔａｔｓｕｍｉ  Ｅ．，  Ｆｕｋｕｈａｒａ  Ｓ．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ＭＬＦ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｙｅｌｏｉｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４，  １７５７−１７６５，  ２０００．
【００１０】
【非特許文献３】
Ｆｅｒｏ  Ｍ．Ｌ．，  Ｒｉｖｋｉｎ  Ｍ．，  Ｔａｓｃｈ  Ｍ．，  Ｐｏｒｔｅｒ  Ｐ．，  Ｃａｒｏｗ  Ｃ．Ｅ．，  Ｆｉｒｐｏ  Ｅ．，  Ｐｏｌｙａｋ  Ｋ．，  Ｔｓａｉ  Ｌ．，  Ｂｒｏｕｄｙ  Ｖ．，  Ｐｅｌｍｕｔｔｅｒ  Ｒ．ＭＡ．  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｏｒｇａｎ  Ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｗｉｔｈ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｉｇａｎｔｉｓｍ，  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐ２７ｋｉｐ１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｍｉｃｅ．  Ｃｅｌｌ  ８５，  ７３３−７４４，  １９９６．
【００１１】
【非特許文献４】
第２５回日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集、２Ｐ−０７６１（第２５回日本分子生物学会年会組織委員会、２００２年１１月２５日発行）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
幹細胞の効率的な体外増幅法開発のためには、幹細胞の増殖分化制御因子の研究が必要である。効率的な幹細胞体外増幅法が確立できれば、有効なガン治療法となるとともに、幹細胞提供者は外来での局所麻酔による骨髄液の提供が可能となる。また、ガン発症機構に基づく細胞周期制御因子の研究は、発ガン関連因子や細胞周期制御因子を標的とする特異性のある治療薬や治療方法の開発に繋がる。
【００１３】
一方、ＭＬＦ１タンパク質はその異常が白血病の原因となること、および白血病の進行とともに発現の亢進を示すことから、ガン発症に何らかの役割を果たしていることが予想される。しかしながら、ＭＬＦ１タンパク質の機能は未だ十分に解明されていなかった。
【００１４】
本発明は、上記従来の問題に鑑みなされたものであり、その目的は、ＭＬＦ１タンパク質の機能を解明することにより、創薬・医療への幅広い応用に繋がる白血病関連因子ＭＬＦ１の機能を利用した細胞増殖制御方法とその利用方法とを提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＭＬＦ１タンパク質が強力な細胞増殖抑制能を有しており、ＭＬＦ１タンパク質の異常がガンの成因に関与している可能性を初めて明らかにし、この知見に基づいて細胞増殖を制御することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１６】
すなわち、本発明にかかる細胞増殖制御方法は、上記の課題を解決するために、細胞増殖を制御しようとする細胞中で、白血病関連因子であるＭＬＦ１タンパク質の発現量を変化させるか、または、発現しているＭＬＦ１タンパク質の機能を調節することを特徴としている。
【００１７】
上記細胞増殖制御方法においては、上記ＭＬＦ１タンパク質が、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質であることが好ましい。
【００１８】
上記細胞増殖制御方法において、細胞増殖を抑制する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させる。このＭＬＦ１タンパク質の発現は、細胞中にＭＬＦ１タンパク質をコードするＭＬＦ１遺伝子を導入することにより実現することができる。このとき、上記ＭＬＦ１遺伝子として、配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子を用いればよい。また、少なくとも上記ＭＬＦ１遺伝子とプロモーターとを含む組換え発現ベクターを、細胞に導入することによって、ＭＬＦ１タンパク質を発現させればよい。この場合、上記細胞がガン細胞であれば、本発明をガンの遺伝子治療に用いることができる。
【００１９】
また、本発明の用途は、上記ガンの遺伝子治療に限定されるものではなく、例えば、ＭＬＦ１遺伝子を導入したＭＬＦ１トランスジェニック生物の生産にも用いることができる。
【００２０】
本発明にかかる細胞増殖制御方法においては、細胞増殖を促進する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を低下させるか、細胞中に発現している上記ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害すればよい。このとき、上記細胞が幹細胞、特に造血幹細胞であれば、本発明を骨髄移植に用いることができる。また、ＭＬＦ１遺伝子の機能を欠失させるＭＬＦ１ノックアウト生物の生産に用いることができる。
【００２１】
本発明にかかる細胞増殖制御方法の利用については特に限定されるものではないが、例えば、配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列を含み、上記細胞増殖制御方法に用いられる発現ベクターを挙げることができる。この発現ベクターにおいては、特に、ガンの遺伝子治療等に用いる場合には、ウイルスベクターを用いることが好ましく、さらに、組織特異的なプロモーターを有していることがより好ましい。
【００２２】
本発明にかかる細胞増殖制御方法の他の利用としては、上記細胞増殖制御方法を実施するための細胞増殖制御キットを挙げることができる。具体的には、例えば、  配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列を有する発現ベクターを含む構成を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明には、細胞周期同調薬剤が含まれる。この細胞周期同調薬剤は、白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質を含み、細胞周期をＧ１期で停止するものであればよい。この細胞周期同調薬剤では、上記ＭＬＦ１タンパク質として、前記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を用いればよい。
【００２４】
また、本発明には、ガン治療薬剤が含まれる。このガン治療薬剤は、白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質を含み、ガン細胞の増殖を抑制するものであればよい。このガン治療薬剤では、上記ＭＬＦ１タンパク質として、前記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を用いればよい。
【００２５】
さらに、本発明には、白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する物質をスクリーニングする方法が含まれる。このスクリーニング方法では、前記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を用いればよい。また、このスクリーニング方法を用いて得られた、ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する物質（ＭＬＦ１阻害剤）は、細胞増殖促進薬剤として用いることができる。すなわち、本発明には、ＭＬＦ１阻害剤を含む細胞増殖促進薬剤が含まれる。
【００２６】
上記構成によれば、ＭＬＦ１遺伝子・タンパク質を利用することで、細胞増殖を抑制したり促進したりすることができる。そのため、ガンの治療や骨髄移植等、創薬・医療・研究といった様々な分野へ応用することが可能となる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明にかかる細胞増殖制御方法は、細胞増殖を制御しようとする細胞中で、白血病関連因子であるＭＬＦ１タンパク質の発現量を変化させるか、または、発現しているＭＬＦ１タンパク質の機能を調節する方法である。これにより、細胞増殖を抑制したり促進したりすることが可能となるので、ガンの治療薬剤や治療方法等、創薬・医療への幅広い分野に利用することが可能となる。
【００２９】
以降の説明では、本発明にかかる細胞増殖制御方法の詳細とその有用性、並びにその利用についてそれぞれ説明する。
【００３０】
（Ｉ）本発明にかかる細胞増殖制御方法
本発明者らは、ＭＬＦ１タンパク質を過剰発現させた細胞では増殖の遅延がみられＧ１期で停止していること、ＥＳ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血液細胞への分化誘導系ではＭＬＦ１タンパク質により細胞増殖は明らかに抑制されコロニーが小型となること、ＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させたＭＬＦ１トランスジェニックマウスは対照のマウスと比較して小型化すること等を見出した。
【００３１】
さらに、本発明者らは、ＭＬＦ１タンパク質の解析により上記のような知見が得られる原因についてさらに検討したところ、ＭＬＦ１タンパク質は、Ｊａｂ１／ＣＯＰ９シグナロソーム複合体（ｐ２７タンパク質の分解を誘導する因子）の構成因子の１つであるＣＳＮ３タンパク質と特異的に結合し、Ｊａｂ１／ＣＯＰ９シグナロソーム複合体に対して抑制的に機能することを見出した。
【００３２】
すなわち、ＭＬＦ１がＪａｂ１／ＣＯＰ９シグナロソーム複合体の機能を抑制することによりｐ２７タンパク質は分解されず、その結果ＣＤＫを抑制するため、細胞周期の進行が抑制されることを見出した。この作用機序により、ＭＬＦ１タンパク質は強力な細胞増殖抑制能を持つことが明らかとなった。逆に、ＭＬＦ１タンパク質の異常は細胞増殖を抑制しないため、様々な癌の成因に関与している可能性が示唆された。本発明者らは、これら知見から本発明を完成させるに至った。
【００３３】
＜ＭＬＦ１タンパク質・ＭＬＦ１遺伝子＞
本発明にかかる細胞増殖制御方法で標的となる上記ＭＬＦ１タンパク質としては、例えば、ＭＬＦ１遺伝子にコードされるタンパク質を挙げることができる。このＭＬＦ１遺伝子は、ｔ（３；５）転座型急性白血病の原因遺伝子ＮＰＭ−ＭＬＦ１により見出されたものである。ｔ（３；５）転座型急性白血病は、ＭＬＦ１遺伝子に異常を示す疾患の一例である。ＭＬＦ１遺伝子の具体的な構成としては、配列番号１に示される１１１６ｂｐからなる塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として含む遺伝子を挙げることができる。
【００３４】
本発明で用いられるＭＬＦ１タンパク質は、上記ＭＬＦ１遺伝子にコードされているタンパク質を挙げることができ、より具体的には、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質か、または、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質を挙げることができる。
【００３５】
上記「１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３６】
また、上記ＭＬＦ１タンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、Ｈｉｓ  やＭｙｃ  、Ｆｌａｇ等によってＭＬＦ１タンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００３７】
また、ＭＬＦ１遺伝子としては、配列番号１に示される塩基配列の一部を改変した塩基配列であってもよい。ここでいう改変とは、配列番号１に示される塩基配列において、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするように、遺伝暗号に基づく範囲内で、塩基に置換が生じていることを意味する。
【００３８】
また、本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡであっても、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖であってもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。
【００３９】
さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００４０】
＜細胞増殖制御方法の詳細１：細胞増殖抑制方法＞
本発明にかかる細胞増殖制御方法では、細胞増殖の抑制および促進の双方を実現することが可能である。このうち、細胞増殖を抑制する場合には、細胞中の上記ＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させる手法を用いることができる。
【００４１】
細胞中でＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させる手法としては特に限定されるものではないが、代表的な例としては、細胞中にＭＬＦ１タンパク質をコードするＭＬＦ１遺伝子を導入する手法を挙げることができる。ＭＬＦ１遺伝子の導入方法としては特に限定されるものではなく、公知の形質転換方法を用いることができるが、一般的には、少なくとも上記ＭＬＦ１遺伝子とプロモーターとを含む組換え発現ベクターを構築し、これを細胞に導入する方法を挙げることができる。
【００４２】
ＭＬＦ１タンパク質は強力な細胞増殖抑制能を有するので、ＭＬＦ１遺伝子を適当な発現ベクターに搭載して目的の細胞に導入することにより、細胞内でＭＬＦ１タンパク質が発現し、細胞は増殖が抑制される。なお、発現ベクターの詳細については、後述の（ＩＩＩ）本発明にかかる細胞増殖方法の利用の項で詳述する。
【００４３】
本発明にかかる細胞増殖制御方法において、細胞中のＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させる方法は、上記ＭＬＦ１遺伝子の導入に限定されるものではなく、他の方法であってもよい。具体的には、例えば、細胞のゲノム中に存在するＭＬＦ１遺伝子の転写を促進するように制御することによって、ＭＬＦ１タンパク質の産生を増加させる方法を挙げることができる。なお、転写制御の具体的な方法については特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。
【００４４】
＜細胞増殖制御方法の詳細２：細胞増殖促進方法＞
本発明にかかる細胞増殖制御方法では、細胞増殖を促進する場合には、細胞中のＭＬＦ１タンパク質の発現量を低下させるか、細胞中に発現している上記ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する手法を用いることができる。
【００４５】
細胞中でＭＬＦ１タンパク質の発現量を低下させる手法としては特に限定されるものではないが、例えば、ＭＬＦ１遺伝子の機能を抑制する方法を挙げることができる。具体的には、例えば、アンチセンス法やＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法を用いてＭＬＦ１遺伝子の発現を抑制する手法を挙げることができる。また、細胞中に発現している上記ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する手法としては特に限定されるものではないが、例えば、阻害剤やＭＬＦ１タンパク質に特異的に結合する抗体（抗ＭＬＦ１抗体）等を用いてＭＬＦ１タンパク質の機能に関わる経路を遮断する手法を挙げることができる。
【００４６】
換言すれば、上記各手法のうち、ＭＬＦ１遺伝子の機能を抑制する方法は、ＭＬＦ１遺伝子−タンパク質の機能を遺伝子レベルで抑制する手法であるということができ、ＭＬＦ１タンパク質の機能に関わる経路を遮断する手法は、ＭＬＦ１遺伝子−タンパク質の機能をタンパク質レベルで抑制する方法であるということができる。ただし、ＭＬＦ１遺伝子−タンパク質の機能を抑制する方法は上記各手法に限定されるものではなく、ＭＬＦ１遺伝子−タンパク質の機能を抑制できる方法であればよい。
【００４７】
＜ＭＬＦ１遺伝子およびタンパク質の取得方法＞
上記ＭＬＦ１遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記配列番号１に示される塩基配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。
【００４８】
例えば、配列番号１に示される塩基配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒト等のゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、配列番号１に示される塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、どのような配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００４９】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成およびその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、ＭＬＦ１遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００５０】
上記ＭＬＦ１遺伝子を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、配列番号１に示される塩基配列のうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒトまたはマウスのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係る遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００５１】
また、上記ＭＬＦ１タンパク質の取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上記配列番号１に示される塩基配列を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物または動物細胞などに組み入れて形質転換体として、ＭＬＦ１タンパク質を発現させ精製することで、容易に取得することができる。
【００５２】
なお、このようにホスト細胞（宿主）に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
【００５３】
変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いればよい。これによって、配列番号１に示される塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  ストラタジーン社製）を利用してもよい。
【００５４】
（ＩＩ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の有用性
上記のように、本発明にかかる細胞増殖制御方法は、細胞増殖の抑制も促進も可能であることから、様々な分野に応用することができる。具体的な一例として、創薬・医療分野への応用を挙げることができる。
【００５５】
＜ガンの治療＞
上述したように、ＭＬＦ１遺伝子をガン細胞に導入する等により、ＭＬＦ１タンパク質の発現量を増加させれば、ガン細胞の増殖を抑制することができる。したがって、本発明にかかる細胞増殖制御方法では、細胞増殖を抑制する場合には、ガンの遺伝子治療に適用することができる。また、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、ＭＬＦ１タンパク質をガン細胞に投与してもよい。これによっても細胞内で正常なＭＬＦ１タンパク質を増加させることができるので、本発明はガンの投薬治療にも適用することができる。
【００５６】
ガン細胞の増殖を抑制できれば、ガン細胞を完全に消滅させてガンを完治することはできないまでも、延命効果、ＱＯＬの向上効果を得ることができる。例えば、固形ガンの場合には、本発明により細胞増殖を抑制した後に外科的切除を行うと、切除できなかったガン組織が残ったとしてもその後の増殖が抑制されるので、治癒したと同等の効果が得られる可能性がある。また、外科的切除後の化学療法等により、完治させることも可能である。白血病等の血液ガンの場合には、本発明により細胞増殖を抑制した後に化学療法等により完治させることが可能である。したがって、本発明を用いてガン細胞の増殖を抑制する遺伝子治療は、ガン治療法の１つの選択肢として非常に有用な治療法であると考えられる。
【００５７】
＜造血幹細胞の増殖＞
また、ＭＬＦ１タンパク質は造血幹細胞に特異的に発現することが知られている。そこで、ＭＬＦ１タンパク質の細胞増殖抑制機能を抑制することにより、造血幹細胞を効率的に増幅させることが可能となる。したがって、本発明にかかる細胞増殖制御方法では、細胞増殖を促進する場合には、造血幹細胞の増殖に有効である。造血幹細胞の増殖を促進することができれば、骨髄移植において提供者から少量の骨髄液を得てこれを体外で増幅した後にガン患者に移植することができる。したがって、骨髄提供者の負担を軽減することができるとともに、効率的なガン治療を行うことができる。
【００５８】
骨髄移植（造血幹細胞移植）は、現在、慢性骨髄性白血病を完全に治すことのできる唯一の方法と言われている。しかしながら、骨髄提供者から骨髄液を採取するためには全身麻酔を施す必要があり、骨髄提供者に多大な負担を強いることとなる。少量の骨髄液や血液から得られた少数の造血幹細胞を体外で増幅することができれば、提供者の負担は大幅に軽減され、骨髄移植施行機会の増加を期待することができる。また、本発明を用いて体外で必要数に増幅した造血幹細胞を、予め放射線照射等により異常な白血球を全滅させた患者に移植することにより、骨髄移植（造血幹細胞移植）を実施することができる。
【００５９】
＜本発明の適用対象＞
本発明にかかる細胞増殖制御方法が適用可能な細胞は、上記ガン細胞や造血幹細胞に限定されるものではない。例えば、細胞増殖を促進する場合には、造血幹細胞以外の幹細胞にも本発明を適用することが可能である。換言すれば、本発明を適用可能な疾患は、ガンや血液疾患（白血病等）に限定されるものではなく、細胞の増殖を抑制したり促進したりすることにより治療効果が認められるすべての疾患に適用することができる。
【００６０】
また、上述した例は、本発明を創薬・医療分野に応用する例であったが、本発明はこれに限定されるものではなく、研究用試薬や研究用素材の分野に応用することも可能である。
【００６１】
具体的には、例えば、本発明を利用した、通常よりも小型の生物や大型の生物を生産する方法、またはこの生産に用いられる試薬類、キット等を挙げることができる。
【００６２】
例えば、ある動物の受精卵を用い、ＭＬＦ１遺伝子を当該受精卵の前核中へマイクロマニピュレーターを用いて注入し、この受精卵を仮親の卵管に移植する。これにより、ＭＬＦ１トランスジェニック動物を生産することができる。ＭＬＦ１遺伝子−タンパク質は細胞増殖を抑制する機能を有するため、全ての細胞にＭＬＦ１遺伝子を持つトランスジェニック生物は、成長期の細胞増殖が抑制され、全ての組織の細胞数が減少し、動物自体が小型化する。この方法を用いることによって、家畜やペットを小型化することが可能となる。
【００６３】
なお、上記小型生物の生産方法、すなわちＭＬＦ１遺伝子を導入したＭＬＦ１トランスジェニック生物の生産方法は上記の例に限定されるものではない。例えば、上記ＭＬＦ遺伝子の導入方法はマイクロマニピュレーターを用いる方法に限定されるものではなく、ＭＬＦ１遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターを用いて、細胞にＭＬＦ１遺伝子を導入してもよい。さらに、マウスの場合は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用する方法であってもよい。
【００６４】
また、例えば、マウスＭＬＦ１遺伝子の一部を破壊した遺伝子を含むベクターを作製し、このベクターをマウスＥＳ細胞に導入して相同組換により一方のＭＬＦ１遺伝子が破壊されたＥＳ細胞を選抜する。受精卵の胚盤胞にこのＥＳ細胞を注入し、キメラマウスを得る。ＥＳ細胞由来の生殖細胞を持つキメラマウスと正常マウスを交配すると、一方のＭＬＦ１遺伝子がすべて破壊されたヘテロ接合体のマウスを生産することができる。さらに、ヘテロ接合体マウス同士を交配することにより、ホモ接合体マウス、すなわちＭＬＦ１ノックアウトマウスを得ることができる。ＭＬＦ１遺伝子−タンパク質は細胞増殖を抑制する機能を有するため、すべての細胞のＭＬＦ１遺伝子が破壊されたＭＬＦ１ノックアウト生物は正常動物と比較して大型化する。この方法を用いることによって、家畜やペットを大型化することができる。
【００６５】
なお、上記大型生物の生産方法、すなわちＭＬＦ１遺伝子の機能を欠失させたＭＬＦノックアウト生物の生産方法が適用できる生物としては、ＥＳ細胞が樹立されている動物であればよい。
【００６６】
上記小型または大型生物の生産方法が適用可能な生物の具体的な種類は特に限定されるものではない。例えば、研究・実験用としては、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル等の実験動物を挙げることができる。
【００６７】
（ＩＩＩ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の利用
本発明の具体的な利用方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＭＬＦ１遺伝子を発現させる発現ベクター、疾患治療用の薬剤や治療キット、実験・研究用の試薬やキット等を挙げることができる。
【００６８】
＜発現ベクター＞
本発明にかかる発現ベクターは、ＭＬＦ１遺伝子、すなわち配列番号１に示される塩基配列またはこの塩基配列の一部を改変した塩基配列を含み、上述した細胞増殖制御方法に用いられる発現ベクターであればよい。
【００６９】
上記発現ベクターに用いられるベクターの種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これとＭＬＦ１遺伝子とを各種ベクターに組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
【００７０】
特に、本発明は、細胞増殖を抑制する場合に、ガンの遺伝子治療に用いることが可能であるため、本発明にかかる発現ベクターは、ウイルスベクターであることが好ましい。このウイルスベクターとしては特に限定されるものではないが、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターを挙げることができる。遺伝子治療のような医療用途に用いる場合には、使用実績のあるベクターを選択することが、遺伝子治療の安全性や有効性の予測が可能であるため有利である。中でも、可能であれば、ガン細胞への遺伝子導入効率および導入後の発現効率が高く、安全なベクターを使用することが好ましい。この観点からも、遺伝子治療用の発現ベクター（ＭＬＦ１遺伝子を搭載した遺伝子治療用ベクター）としては、上記アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターを好ましく用いることができる。
【００７１】
また、ホスト細胞中でＭＬＦ１タンパク質を生産して回収（取得）する用途であれば、ホスト細胞の種類に応じて発現効率の高いベクターを選択すればよい。例えば、大腸菌や酵母中で発現させる場合には、公知のプラスミドを用いればよい。また、この用途で用いられるホスト細胞としては、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、上記大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、上記酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の真菌、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物（ラット、ウサギ、ブタ、サル等）の培養細胞、あるいは、キイロショウジョウバエ、カイコガ等の昆虫の培養細胞等を挙げることができる。
【００７２】
本発明にかかる発現ベクターにおいては、ＭＬＦ１遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーとなる遺伝子が含まれていてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明の遺伝子とを含む発現ベクターをホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現からＭＬＦ１遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、ＭＬＦ１タンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、ＭＬＦ１タンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。
【００７３】
本発明にかかる発現ベクターでは、ＭＬＦ１遺伝子を有効に発現させ、その発現効率を高めるため、人為的に強力なプロモーターを組み込んでいることが特に好ましい。中でも、本発明では、ガンの遺伝子治療に用いられる場合には、組織特異的なプロモーターを有していることが好ましい。これによって、患者に対して本発明にかかる遺伝子治療用ベクター（発現ベクター）を全身に投与することが可能となるという利点がある。
【００７４】
ガンの遺伝子治療において、組織特異的でないプロモーターを用いているベクターを投与すると、目的の細胞以外の細胞で導入した遺伝子が発現するおそれがある。この場合、導入した遺伝子の発現により治療効果以外の好ましくない効果が発生する可能性がある。それゆえ、遺伝子治療では、ガン部に直接ベクターを投与することが多い。しかしながら、例えば、ガン組織のみで特異的に作用するプロモーター（組織特異的なプロモーター）を用いたベクターであれば、ガン細胞以外の細胞に導入しても遺伝子は発現しない。それゆえ、本発明にかかる遺伝子治療用ベクター（発現ベクター）を全身に投与することにより、ガン細胞以外の細胞に遺伝子が導入されたとしても、ＭＬＦ１遺伝子をガン細胞でのみ発現させることが可能となる。
【００７５】
上記プロモーターの種類としては特に限定されるものではなく、ホスト細胞の種類や用途に応じた適切なプロモーターを選択すればよい。組織特異的なプロモーターの場合、ＭＬＦ１遺伝子を発現させたい組織、すなわちガンが生じている組織で特異的に発現するプロモーターであればよい。また、発現ベクターにおけるプロモーターの位置は、当該プロモーターの下流にＭＬＦ１遺伝子が組み込まれていればよい。ベクターの作製方法としては、公知の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００７６】
本発明にかかる発現ベクターをホスト細胞に導入する方法は特に限定されるものではなく、公知の形質転換方法を用いることができる。例えば、遺伝子治療に用いる場合、発現ベクターの投与については、用いるベクターの特徴によって様々な投与法が可能である。ガンが固形ガンである場合は、ガン病巣に直接ベクター液を投与することにより行うことが好ましい。上記組織特異的なプロモーターを持つベクターであれば、静脈内投与等の全身性の投与が可能である。なお、投与経路は、上記病巣内投与および静脈内投与に限定されるものではない。
【００７７】
本発明にかかる発現ベクターを遺伝子治療用ベクターとして用いた場合、その遺伝子治療の効果は、発ガンモデルマウスを用いた実験を行うことにより予想することができる。例えば、ヌードマウスの皮下にヒトガン細胞を移植して腫瘍を形成させる。そして、ＭＬＦ１遺伝子を搭載したアデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを直接腫瘍内に投与する。これにより、腫瘍の縮小効果の有無を観察することができる。また、上記組織特異的なプロモーターを用いたウイルスベクターの場合には、ウイルスベクターを静脈内に投与することにより、目的のガン細胞組織においてＭＬＦ１遺伝子を発現させ、腫瘍の縮小効果の有無を観察することができる。
【００７８】
＜ガン治療薬剤＞
本発明にかかる疾患治療用の薬剤の一例としては、上記遺伝子治療用ベクターと同様の用途であるガン治療の用途に用いる薬剤、すなわちガン治療薬剤を挙げることができる。
【００７９】
上記ガン治療薬剤としては、白血病関連因子ＭＬＦ１タンパク質を含み、ガン細胞の増殖を抑制することができるものであれば得に限定されるものではない。このとき用いられるＭＬＦ１タンパク質としては、前記（Ｉ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の項で説明したように、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質を挙げることができる。
【００８０】
また、上記ガン治療薬剤には、必要に応じて、ＭＬＦ１タンパク質以外の成分（たとえば、安定剤、ｐＨ調整剤等）を添加してもよい。これにより安定した製剤とすることができる。ただし、安定剤やｐＨ調整剤は一例であり、ＭＬＦ１タンパク質以外の成分については限定されるものではない。
【００８１】
上記ガン治療薬剤の生産方法も特に限定されるものではなく、前記（Ｉ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の項で説明したように、ＭＬＦ１遺伝子を発現ベクターに搭載し、大腸菌や哺乳類細胞等のホスト細胞に導入して、ＭＬＦ１タンパク質を産生させ、これを適切な方法で回収・精製し、精製ＭＬＦ１タンパク質を得ればよい。この精製ＭＬＦ１タンパク質（リコンビナントＭＬＦ１タンパク質）をガン細胞に導入すれば、細胞増殖を抑制することが可能となるため、ガン治療薬剤として用いることができる。
【００８２】
ＭＬＦ１タンパク質を含むガン治療薬剤の効果は、上記発現ベクターの項でも説明したように、発ガンモデルマウスを用いた実験を行うことにより予想することができる。例えば、ヌードマウスの皮下にヒトガン細胞を移植して腫瘍を形成させ、リコンビナントＭＬＦ１タンパク質をヌードマウス皮下腫瘍に投与することにより、腫瘍の縮小効果の有無を観察することができる。
【００８３】
＜細胞増殖促進薬剤・阻害剤＞
本発明にかかる疾患治療用の薬剤の他の例としては、細胞増殖促進薬剤を挙げることができる。この細胞増殖促進薬剤は、例えば、前記（ＩＩ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の有用性で説明したように、造血幹細胞等の幹細胞の増殖に利用することができる。
【００８４】
上記細胞増殖促進薬剤としては、ＭＬＦ１タンパク質の機能を抑制または阻害する物質、すなわちＭＬＦ１タンパク質の阻害剤（ＭＬＦ１阻害剤）を含んでいれば特に限定されるものではない。この「阻害剤」は、ＭＬＦ１タンパク質による細胞増殖の抑制機能を抑制または阻害する物質であればよく、その阻害の具体的なメカニズムは特に限定されるものではない。したがって、本発明にかかる細胞増殖促進薬剤として用いられるＭＬＦ１阻害剤は、上記ＭＬＦ１タンパク質の細胞増殖の抑制機能を可逆的に阻害するものであってもよいし、不可逆的に阻害するものであってもよい。また、可逆的に阻害する阻害剤の場合、競合型（拮抗型）の阻害剤（拮抗剤・アンタゴニスト）であってもよいし、非競合型の阻害剤であってもよい。
【００８５】
上記細胞増殖促進薬剤には、上記ガン治療薬剤と同様、必要に応じて、ＭＬＦ１阻害剤以外の成分を添加してもよい。もちろんＭＬＦ１阻害剤以外の成分については限定されるものではない。
【００８６】
上記ＭＬＦ１阻害剤としては、公知の物質を用いてもよいし、新規な物質をスクリーニングにより新たに見出してもよい。すなわち、ＭＬＦ１タンパク質を用いてスクリーニングすることによりＭＬＦ１阻害剤を特定してもよい。このスクリーニング方法に用いられるＭＬＦ１タンパク質としては、前記（Ｉ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の項で説明したように、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質を挙げることができる。ＭＬＦ１阻害剤のスクリーニング方法としては、ＭＬＦ１タンパク質の細胞増殖の抑制機能を抑制または阻害する機能の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。
【００８７】
＜細胞周期同調薬剤およびキット＞
本発明には、細胞周期同調薬剤が含まれる。ＭＬＦ１タンパク質を過剰発現した培養細胞は細胞周期がＧ１期で停止する。そのため、ＭＬＦ１タンパク質は細胞周期を同調させる培養用薬剤として利用することができる。このとき用いられるＭＬＦ１タンパク質としては、前記（Ｉ）本発明にかかる細胞増殖制御方法の項で説明したように、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞周期の抑制因子群を誘導するタンパク質を挙げることができる。
【００８８】
また、ＭＬＦ１タンパク質およびその他の溶液類や細胞、培地等を含めてキット化しておけば、簡便に培養細胞を同調培養することができる。
【００８９】
＜細胞増殖制御キット＞
本発明には、これまで述べた細胞増殖制御方法を実施するための細胞増殖制御キットが含まれる。この細胞増殖制御キットの具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途に応じてさまざまな構成を挙げることができる。代表的な例としては、少なくともＭＬＦ１タンパク質および／またはＭＬＦ１遺伝子を搭載する上記発現ベクターを含む構成を挙げることができる。
【００９０】
より具体的には、本発明にかかる細胞増殖制御キットを、ガンの遺伝子治療に用いる場合には、上記発現ベクターとしてＭＬＦ１遺伝子を搭載した遺伝子治療用ベクターを含んでいればよく、さらには、遺伝子治療用ベクター以外に、希釈用緩衝液、投与用シリンジ等も含めることができる。これにより、投与用のベクター液の調製時間を短縮できるので、ベクター液の調製開始から投与までの時間経過による感染力の低下等の弊害を防止することができる。その結果、使用者は簡便に遺伝子治療を実施することが可能となる。
【００９１】
また、本発明にかかる細胞増殖制御キットを、研究用キットとして用いる場合には、発現ベクターを導入するために必要な溶液類、発現ベクターを導入するホスト細胞（宿主）や培地等を含ませることができる。これにより、本発明にかかる細胞増殖制御方法を研究・実験用に簡便に利用することができる。
【００９２】
もちろん、本発明にかかる細胞増殖制御キットは、細胞増殖の制御そのものを研究するために用いることもできる。この場合、ＭＬＦ１遺伝子を搭載した発現ベクター、遺伝子導入に必要な溶液類、遺伝子を導入するための細胞、細胞培養用の培地等を含ませればよい。これにより、ＭＬＦ１遺伝子を導入した細胞を容易に作製することができ、ＭＬＦ１遺伝子が発現する細胞において、細胞増殖制御の研究を簡便に行うことができる。
【００９３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９４】
【実施例】
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、各実施例において用いた細胞株および具体的な実験方法について先に説明する。
【００９５】
〔使用した細胞株〕
Ｋ５６２：ＣＭＬ由来細胞で、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤感受性株である。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞：マウス線維芽細胞で、細胞周期Ｇ１制御機構の解析およびガン関連因子の解析に頻用されている細胞株である。
【００９６】
〔実施例１：Ｋ５６２細胞を用いた実験〕
エレクトロポレーション法によりヒト血球系細胞Ｋ５６２にＭＬＦ１遺伝子を導入し、ＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させる細胞を作製した。さらに、正常なＭＬＦ１遺伝子の機能を欠損しているＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子をＫ５６２細胞に導入し、ＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子を過剰発現している細胞を作製した。両細胞のＣＤＫインヒビターｐ２７タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により対照（ベクターのみを導入したＫ５６２細胞）と比較した。その結果を図１に示す。ＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させると、ｐ２７タンパク質の増加がみられた。一方、ＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させるとｐ２７タンパク質の減少がみられた。
【００９７】
〔実施例２：ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた実験〕
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にレトロウイルスを用いてＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させ、同一面積あたりの細胞数、ＭＬＦ１遺伝子の発現および細胞の形態について観察した。その結果を図２（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図中のｖｅｃはベクターのみを導入した細胞、Ｎ／ＭはＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子を導入した細胞、Ｐ−５およびＰ−７は２２６番目のアミノ酸がプロリンである塩基配列を持つＭＬＦ１遺伝子を導入した細胞、Ｔ−１０は２２６番目のアミノ酸がスレオニンである塩基配列を持つＭＬＦ１遺伝子を導入した細胞を表す（図２（Ａ）および（Ｂ））。
【００９８】
図２（Ａ）は同一面積あたりの細胞数を示したグラフである。ＭＬＦ１発現細胞は同一面積あたりの細胞数が少ないことが示された。図２（Ｂ）は抗ＭＬＦ１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示している。ＭＬＦ１遺伝子導入細胞にはＭＬＦ１タンパク質の発現が認められた。同一面積あたりの細胞数が最も少なかったＴ−１０は、ＭＬＦ１タンパク質の発現量が最も多いことがわかった。図２（Ｃ）は細胞の形態を示す写真である。上段の正常細胞（図中Ｎｏｒｍａｌ  ｃｅｌｌ）と比較して、下段のＭＬＦ１発現細胞（図中Ｆｌａｔ  ｃｅｌｌ）は平たく大きく広がる傾向が観察された。
【００９９】
次に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＭＬＦ１遺伝子と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合遺伝子をリン酸カルシウム法により導入し、ＭＬＦ１とＧＦＰの融合タンパク質発現させた。すなわち、Ｐ−ＭＬＦ１（２２６番目のアミノ酸がプロリンであるＭＬＦ１）遺伝子およびＴ−ＭＬＦ１（２２６番目のアミノ酸がスレオニンであるＭＬＦ１）遺伝子をｐＭＳＣＶｐｕｒｏＧＦＰベクターにＧＦＰ遺伝子とフレームが同じになるようにサブクローニングした。この発現ベクターを改変したリン酸カルシウム法によりＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、５ｎｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で４日間培養して、細胞を選択した。さらに１０日間培養し、ＧＦＰ融合タンパク質を発現しているコロニーを選択し、その形態、単一細胞クローンの増殖曲線およびＭＬＦ１タンパク質の発現を観察した。その結果を図３（Ａ）〜（Ｃ）に示す。
【０１００】
図３のｖｅｃはＧＦＰ遺伝子のみを導入した細胞、Ｎ／ＭはＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子を導入した細胞、Ｐ−ＭＬＦ１は２２６番目のアミノ酸がプロリンである塩基配列を持つＭＬＦ１遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子を導入した細胞、Ｔ−ＭＬＦ１は２２６番目のアミノ酸がスレオニンである塩基配列を持つＭＬＦ１遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子を導入した細胞を表す。図３（Ａ）はコロニーの形態を示す写真である。図中のＰＣは明視野で観察した写真、ＧＦＰは同一視野の蛍光を観察した写真である。ＭＬＦ１発現細胞ではコロニーが小さく、細胞密度が低くなる傾向が観察された。図３（Ｂ）は単一細胞クローンの増殖曲線を示したグラフである。ＭＬＦ１発現細胞は明らかに増殖速度が遅いことが観察された。図３（Ｃ）は抗ＭＬＦ１抗体（ＭＬＦ１タンパク質のＣ末端側を認識するモノクローナル抗体）を用いたウエスタンブロットの結果を示している。ＭＬＦ１遺伝子導入細胞にはＭＬＦ１タンパク質の発現が認められた。
【０１０１】
さらに、ＧＦＰ融合タンパク質発現細胞を用いたフローサイトメーターによる解析結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図４（Ａ）のＧＦＰ−ｖｅｃｔｏｒはＧＦＰ遺伝子のみを導入した細胞、図４（Ｂ）のＧＦＰ−Ｐ−ＭＬＦ１  ｈｉｇｈは２２６番目のアミノ酸がプロリンである塩基配列を持つＭＬＦ１遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子を導入した細胞のうち、ＭＬＦ１タンパク質の発現量が高い細胞、図４（Ｃ）のＧＦＰ−Ｐ−ＭＬＦ１  ｌｏｗは２２６番目のアミノ酸がプロリンである塩基配列を持つＭＬＦ１遺伝子とＧＦＰ遺伝子の融合遺伝子を導入した細胞のうち、ＭＬＦ１タンパク質の発現量が低い細胞を表す。ＭＬＦ１発現量の高い細胞ではＧ０／Ｇ１期に存在する細胞が多いことが示された。
【０１０２】
〔実施例３：ＭＬＦ１トランスジェニックマウス〕
２２６番目のアミノ酸がプロリンであるＭＬＦ１（Ｐ−ＭＬＦ１）遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（図中Ｐ−ＭＬＦ１  Ｔｇ）を作製し、ベクターのみを導入したトランスジェニックマウス（図中Ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｇ）と成長を比較した。トランスジェニックマウスはＰ−ＭＬＦ１を発現しているＥＳ細胞を用いて作製した。このＥＳ細胞は、ｐＩＲＥＳｎｅｏＣＡＧベクターにＰ−ＭＬＦ１のｃＤＮＡを挿入し、この発現ベクターをエレクトロポレーション法によりＥ１４  ＥＳ細胞に導入して、Ｇ４１８を含む培地で２週間選抜することにより得た。ベクターのみを導入したＥＳ細胞も同様の方法で得た。このＥＳ細胞をＣ５７／Ｂ６Ｊマウスの胚盤胞にマイクロインジェクションし、キメラマウスを得た。このキメラマウスとＣ５７／Ｂ６Ｊ雌マウスを交配し、Ｆ１マウスを得、Ｆ１マウス同士を交配することによりＦ２（トランスジェニック）マウスを得た。図５に体重の変化を表したグラフを示す。ＭＬＦ１トランスジェニックマウスは対照マウスと比較して体重が軽いことが示された。また、体長も小さかった（図なし）。すなわち、ＭＬＦ１トランスジェニックマウスは痩せ型マウスではなく、小型マウスであった。
【０１０３】
次に、ＭＬＦ１トランスジェニックマウス胎児からＭＥＦ細胞（Ｍｕｒｉｎｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、胎児由来線維芽細胞）を作成し、その解析を行った。この細胞は、Ｆ２世代の１３．５日目の胚を取り出し、頭部および臓器を除いて細切し、トリプシン−ＥＤＴＡで消化した後、培養することにより得た。結果を図６に示す。
【０１０４】
図６（Ａ）はウエスタンブロットによるヒトＭＬＦ１（ｈＭＬＦ１）タンパク質の発現を示している。レーン１はｈＭＬＦ１発現陽性ＭＥＦ細胞、レーン２はｈＭＬＦ１発現陰性ＭＥＦ細胞、レーン３は陽性コントロール細胞（ｈＭＬＦ１を強制発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞）である。図６（Ｂ）はｈＭＬＦ１発現陽性ＭＥＦ細胞（ｈＭＬＦ１＋）およびｈＭＬＦ１発現陰性ＭＥＦ細胞（ｈＭＬＦ１−）の増殖曲線を示したグラフである。ｈＭＬＦ１発現陽性ＭＥＦ細胞は、明らかに増殖が抑制された。
【０１０５】
〔実施例４：ＥＳ細胞の血液細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化誘導系を用いた解析〕
２２６番目のアミノ酸がプロリンであるＭＬＦ１（Ｐ−ＭＬＦ１）およびＮＰＭ−ＭＬＦ１を発現するＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液細胞へ分化誘導した（参考文献１：Ｗｉｌｅｓ  ＭＶ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２２５，  ９００−９１８，  １９９３．）。これらのＥＳ細胞の作製法は、実施例３と同じである。図７に分化誘導後形成した血液細胞コロニーを示す。図中のＶｅｃｔｏｒはベクターのみを導入した細胞、ＮＰＭ−ＭＬＦ１はＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子を発現している細胞、ＭＬＦ１はＭＬＦ１遺伝子を発現している細胞を示す。また、図中のＰＣは明視野、Ｗ−Ｇはライト・ギムザ染色を表す。ＭＬＦ１発現細胞は、１コロニーあたりの構成細胞数が著明に少なく、造血幹細胞の増殖抑制が認められた。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明は、白血病関連因子ＭＬＦ１が強力な細胞増殖抑制機能を持つという新たな知見に基づいて完成されたものである。そのため、ＭＬＦ１遺伝子・タンパク質を利用することで、細胞増殖を抑制したり促進したりすることができる。そのため、ガンの治療や骨髄移植等、創薬・医療・研究といった様々な分野へ応用することが可能となるという効果を奏する。
【０１０７】
したがって、本発明は医薬品産業、研究用試薬産業への応用が期待できる。特に、強力な細胞増殖抑制機能を利用した癌治療薬、遺伝子治療法への応用、および細胞増殖抑制機能を欠損させることによる幹細胞の体外増幅法への応用に最適であることから、創薬・医療の分野での応用が大いに期待できる。
【０１０８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ５６２細胞でＭＬＦ１遺伝子およびＮＰＭ−ＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させたときのｐ２７タンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＭＬＦ１遺伝子を過剰発現させた実験結果を示した図であって、（Ａ）は、同一面積あたりの細胞数を示したグラフを示し、（Ｂ）は、ＭＬＦ１遺伝子の発現量をウエスタンブロッティングにより検出した図であり、（Ｃ）は正常細胞とＭＬＦ１過剰発現細胞の形態を比較した図である。
【図３】ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＭＬＦ１−ＧＦＰ融合タンパク質発現させた実験結果を示した図であって、（Ａ）は、コロニーの形態を示す図であり、（Ｂ）は、単一細胞クローンの増殖曲線を示したグラフであり、（Ｃ）は、抗ＭＬＦ１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果を示した図である。
【図４】（Ａ）〜（Ｃ）は、ＭＬＦ１−ＧＦＰ融合タンパク質を発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞をフローサイトメーターにより解析した結果を示した図である。
【図５】ＭＬＦ１トランスジェニックマウスの体重の変化を対照マウスと比較したグラフである。
【図６】ＭＬＦ１トランスジェニックマウス胎児由来線維芽細胞の解析結果を示した図であって、（Ａ）は、ヒトＭＬＦ１の発現量をウエスタンブロット法により検出した図であり、（Ｂ）は、ヒトＭＬＦ１発現陽性細胞およびヒトＭＬＦ１発現陰性細胞の増殖曲線を示したグラフである。
【図７】ＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで血液細胞へ分化誘導したときの、血液細胞コロニーを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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