(57)【要約】【課題】マラリア原虫が肝臓に感染する機構を標的として、マラリアの治療と予防のために資する新たな技術を提供することが、本発明の課題である。【解決手段】本発明により、ネズミマラリア原虫由来のＰｂｓｐ１蛋白質、および当該蛋白質をコードする遺伝子が与えられた。本発明のＰｂｓｐ１蛋白質は、マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有するという特徴を有するために、スポロゾイトを標的としたマラリアのワクチンの作製や医薬の開発のためのツールとして有用であると考えられる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネズミマラリア原虫由来の蛋白質であり、以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする蛋白質。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−２４１で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするアミノ酸配列。
（ｂ）マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有する、（ａ）の一部が欠損、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
ネズミマラリア原虫由来の蛋白質をコードし、以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１５９２  で示される塩基配列からなることを特徴とする塩基配列。
（ｄ）マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有する蛋白質をコードし、（ｃ）の一部が欠損、置換若しくは付加された塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ネズミマラリア原虫由来のＰｂｓｐ１蛋白質、および当該蛋白質をコードする遺伝子に関する。Ｐｂｓｐ１蛋白質は、マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有するという特徴を有する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアは、マラリア原虫が赤血球に感染することによって起こる、原虫性の熱性疾患である。毎年２億から３億人もの人々がマラリアに羅患しているといわれ、海外のマラリア流行地を旅行中に感染したケースを中心にして、日本国内でも年間数百人程の発症者が認められる。原虫の種類によってマラリアは、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、卵型マラリア、四日熱マラリアに分類される。マラリアの症状としては、２〜３日ごとの高熱発作、進行性の貧血、脾腫が挙げられ、予後は良好である。しかし、熱帯熱マラリアの場合には脳症、腎不全、広汎性血管内凝固などを起こして悪性となる場合もある。
【０００３】
マラリアの感染は蚊を媒介としており、スポロゾイトと言われるステージにあるマラリア原虫が蚊を介してヒトに感染した後、この原虫はヒトの肝臓に侵入して肝臓性原虫となる。肝細胞内でマラリア原虫は数千の赤血球感染型原虫（メトロゾイト）に発育し、血中に放出される。肝細胞にスポロゾイトが感染し、その中で増殖してメトロゾイトとなるというステップは、マラリア伝播の成立おいて非常に重要である。
【０００４】
マラリアの治療薬としては現在クロロキン、キニーネ、ピリメサミン、メバクリン、プリマキンなどの抗マラリア薬が使用されている。この中では、副作用が少ないためにクロロキンが第一選択薬である。マラリアのワクチンに関しては、原虫の抗原が変化することなどもあって、その開発は困難であるといわれている。近年、原虫の抗原を遺伝子工学的に生産することにより、マラリアに対するワクチンを開発することも試みなども行われているが、実用化されたものはまだない。そこでマラリアの治療と予防のために、有効かつ安全な新たなワクチンの提供が待望されている。
【０００５】
ところで、従来開発されてきたマラリアのワクチンや治療薬は、主に赤血球侵入のステージであるメトロゾイトを標的にするものであった。しかし、［０００３］において述べたステップから判るように、メトロゾイトを標的とした手段はマラリアの症状を緩和することはできるが、マラリアの感染自体を阻止することはできない。また、大量に増殖するステージを標的としているため、耐性を持った原虫が出現する可能性が高い。それを考えると、スポロゾイトを標的としたワクチンや薬剤を開発することができれば、感染サイクルそのものを遮断することができるため、劇的な効果をあげる可能性がある。しかしスポロゾイトの感染に関する分子生物学的な知見はまだ不足しているのが実情であり、スポロゾイトを標的としたマラリア治療のアプローチは未だ進展していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
よって本発明の課題は、スポロゾイトが肝臓に感染する機構を標的としたアプローチにより、マラリアの治療と予防の目的に有用な新たな技術を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明者らは、スポロゾイト段階のネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）が肝臓へ感染する機構について検討を行った。その結果、本発明において、ネズミマラリア原虫由来のＰｂｓｐ１蛋白質、および当該蛋白質をコードする遺伝子が与えられた。Ｐｂｓｐ１蛋白質は、スポロゾイトの肝臓への感染を介助する蛋白質であるために、スポロゾイトを標的としたマラリアのワクチンや抗マラリア薬を開発するためのツールなどに有用である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、下記の実施例で示すように、ネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）を感染蚊の唾液腺より回収し、スポロゾイトのｃＤＮＡライブラリーを作製し、ランダムに塩基配列を決定した。そのようにして得られたのが本発明のＰｂｓｐ１遺伝子である。得られたＰｂｓｐ１遺伝子の塩基配列およびその遺伝子がコードするＰｂｓｐ１蛋白質の推定アミノ酸配列を図１に示す。図１において、下線部は分泌ペプチドを、＊のマークは終止コドンを示す。得られたｃＤＮＡの全長は１５９２塩基であり、推定アミノ酸配列は２４１アミノ酸残基により構成されていた。コンピューターによる相同性検索を行ったところ、Ｐｂｓｐ１蛋白質の相同体がヒトマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）において見出された。ヒトマラリア原虫由来の相同体は、Ｐｂｓｐ１蛋白質とアミノ酸レベルで４６％一致していた。
【０００９】
そして蛍光抗体法による発現時期の解析を行ったところ、本発明のＰｂｓｐ１蛋白質は肝臓感染性を持つ原虫（スポロゾイト）に特異的に発現していることを見出した。さらに免疫電顕法を用いて、その遺伝子がマイクロネームと呼ばれる分泌器官に局在していることを見出した。更に、この遺伝子を欠損した原虫を、相同組み換えにより作出した。そのように作製されたスポロゾイトのネズミ肝臓への感染性を解析したところ、野生型の約１０分の１に減少していた。その知見より、Ｐｂｓｐ１蛋白質はスポロゾイトの肝臓への感染性に関与していることが明らかとなった。他にもマラリア原虫の肝臓感染に関与する因子が存在するかもしれないが、Ｐｂｓｐ１蛋白質は、スポロゾイトが肝臓に感染する機構の少なくとも一部分を担っていると考えられる。そのためにＰｂｓｐ１蛋白質は、マラリアに対するワクチンや治療薬を開発するための良いツールとなる可能性がある。
【００１０】
Ｐｂｓｐ１蛋白質は、配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−２４１で示されるアミノ酸配列により特定される。本願明細書において、配列番号１に示す蛋白質の一部が欠失、置換若しくは付加された蛋白質とは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換された蛋白質であり、アミノ酸が過度に置換されたものを意味するものではない。その程度の欠失、置換若しくは付加ならば、本技術分野の当業者は、Ｐｂｓｐ１蛋白質の活性を失うことがなく、そのアミノ酸配列を改変することが可能である。また、その様な蛋白質と配列番号１に示すアミノ酸配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な蛋白質も、マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有するＰｂｓｐ１蛋白質としての機能を有する限り、本発明の範囲内である。
【００１１】
また、Ｐｂｓｐ１遺伝子は上記のＰｂｓｐ１蛋白質をコードしており、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１５９２  で示される塩基配列からなることを特徴とする。なお、塩基配列中の塩基番号５９０−１３１２に相当する部分が読み枠であり、上記の蛋白質をコードしている。遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡ  の特定の部位に、当該ＤＮＡ  の基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むものである。
【００１２】
即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換された遺伝子である。その程度の欠失、置換若しくは付加ならば、本技術分野の当業者は、Ｐｂｓｐ１遺伝子がコードする蛋白質の活性を失うことがなく、その塩基配列を改変することが可能である。また、その様な遺伝子と配列番号２に示す塩基配列とは、９５％以上、好ましくは９７％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その様な遺伝子も、マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有するＰｂｓｐ１蛋白質としての機能を有する蛋白質をコードする限り、本発明の範囲内である。また、その様な遺伝子はストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号２に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。なお図１に、Ｐｂｓｐ１遺伝子の塩基配列と、それから予想されるアミノ酸配列を示す。
【００１３】
本発明のＰｂｓｐ１遺伝子配列の知見を基にして、スポロゾイトを標的としたマラリアワクチンを製造することができる。具体的には、本技術分野で汎用しているアデノウイルスベクターにＰｂｓｐ１遺伝子を組み込み、組み換えアデノウイルスを作製する。Ｐｂｓｐ１遺伝子を組み込むベクターとして、アデノウイルスベクター以外の他の適切なベクターを使用することも、当然に可能である。この組み換えウイルスをマウス又はラットに投与することにより、当該動物が免疫され、スポロゾイトを標的とした細胞性免疫を誘導する可能性がある。即ち本発明のＰｂｓｐ１遺伝子またはＰｂｓｐ１蛋白質により、スポロゾイトを標的とした新たなマラリアワクチンを提供することができる。また、ワクチンで免疫された動物と免疫されていないコントロール動物にスポロゾイトを再び投与し、両者におけるマラリア感染を比較することにより、得られたマラリアワクチンの有効性を評価することができる。
【００１４】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
マラリア感染血を注入することにより、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ株をメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（６−１０週齢）に感染させた。スポロゾイトを精製するために、感染血を与えた２４−２８日後に感染した蚊を解剖した。唾液腺と中腸を１９９培地中に収集し、細かく砕いてスポロゾイトを放出させた。そしてオーキネートと赤血球段階の原虫を調製した。
【００１５】
スポロゾイトの肝臓への感染に関与している分子を探索するために、ネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）の唾液腺のＥＳＴライブラリーのスクリーニングを行った。宿主と原虫の相互作用を考えて、分泌蛋白質と膜結合蛋白質に絞ってスクリーニングを行った。ネズミマラリア原虫のゲノムＤＮＡ（２μｇ）をＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ又はＸｂａＩで消化し、１．２％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜上に転写した。ゲノムＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲにおいて以下のプライマーを、３２Ｐでラベルしてプローブとして使用した。
５’−ＴＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧ−３’  （配列番号３）
５’−ＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧ−３’  （配列番号４）
【００１６】
ここで同定されたｃＤＮＡ  （配列番号２）は２４１個のアミノ酸（配列番号１）からなる分泌蛋白質をコードしていると推定された。この蛋白質をＰｂｓｐ１蛋白質と命名したが、後に詳細に述べるように、Ｐｂｓｐ１蛋白質は寄生虫の肝臓細胞への侵入に必須の蛋白質であった。なお、Ｐｂｓｐ１蛋白質をコードする遺伝子は、４つのイントロンを含んでいる単一コピー遺伝子である。
【００１７】
マラリア原虫のゲノムデータベースについて、コンピューター検索を行ったところ、この遺伝子はいくつかのマラリア原虫の間で保存されていることが明らかとなった。ヒトマラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は臨床上最も重要なヒトのマラリア寄生虫であるが、この蛋白質はヒトマラリア原虫の相同体と４５．６％の相同性を有していた。図２に、ネズミマラリア原虫由来のＰｂｓｐ１蛋白質と、ヒトマラリア原虫由来の相同体におけるアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【００１８】
次に、マラリアの生活サイクルにおけるこの遺伝子発現のプロフィルを検討した。そしてそのためのツールとして、Ｐｂｓｐ１蛋白質に対する抗体を作製した。シグナル解析を行っていない組み換えＰｂｓｐ１蛋白質を、ｐＧＥＸ  ６ｐ−１システム（アマシャムバイオサイエンス）を用いて、ＧＳＴ組み換え蛋白質として発現させた。組み換え蛋白質をＧＳＴカラムで精製し、ウサギの免疫に使用した。特異的な抗体をＮＨＳ活性化カラムを用いて精製し（アマシャムバイオサイエンス）、ＳＰＥＣＴ蛋白質と結合させた。ＣＳ抗血清を産生させるために、繰り返し領域に相当するペプチドであるＤＰＰＰＰＮＡＮＤＰＡＰＰＮＡＮを、担体であるキーホールリンペットヘモシニアンと結合させ、ウサギの免疫化に使用した。
【００１９】
免疫蛍光解析を用いてＰｂｓｐ１蛋白質の発現の時期を解析した。その結果Ｐｂｓｐ１蛋白質の発現は、肝臓感染能を有する段階の原虫であるスポロゾイトにおいて認められた。作製した抗体を用いてウエスタンブロット解析を行ったところ、Ｐｂｓｐ１蛋白質は、唾液腺由来のスポロゾイトに存在する２２ｋＤａ蛋白質として検出された。一方、中腸のスポロゾイトにおいてはＰｂｓｐ１蛋白質は検出されず、その産生は唾液腺に侵襲した後に起こることが確認された。
【００２０】
更に免疫電子顕微鏡による検討を行ったところ、Ｐｂｓｐ１蛋白質は分泌器官であるマイクロネームに局在することが示された。マイクロネームは、マラリア原虫において運動を行う段階において共通して存在する器官であり、寄生虫が移動する間に先端孔から分泌され、宿主に感染する際の移動において中心的な役割を果たしている。これらの結果は、スポロゾイトが唾液腺にいる間にＰｂｓｐ１蛋白質はマイクロネームに貯蔵され、スポロゾイトが肝臓に感染するにあたって中心的な役割を果たしていることを示唆している。
【００２１】
Ｐｂｓｐ１蛋白質の機能を解明するために、本発明者らは、相同性組み換えによってＰｂｓｐ１遺伝子の発現を破壊し、Ｐｂｓｐ１蛋白質の機能が失われた寄生虫を作製した。標的ベクターを構築するために、Ｐｂｓｐ１遺伝子の２つの断片をＰＣＲにより増幅した。ゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを使用した。これらの断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中の選択可能なマーカー遺伝子にクローンニングした。
５’−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＡＧＣＣＡ−３’（配列番号５）
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＣＧＡＴＡＴＧＴＧＡ−３’  （配列番号６）
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣ−３’  （配列番号７）
５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＴＣＧＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＧＡＧＴＴＡＴＧＡＡＧＴ−３’  （配列番号８）
【００２２】
図３に、相同性組み換えによる遺伝子破壊の手法の模式図を示す。図３において、選抜可能なマーカー遺伝子を含んでいるターゲッティングベクターの構造を上段に、Ｐｂｓｐ１遺伝子座（斜線）付近の構造を中段に示す。Ｐｂｓｐ１遺伝子座にターゲッティングベクターが挿入された結果、図３の下段に示すように、Ｐｂｓｐ１遺伝子が破壊されることになる。
【００２３】
ここで行った遺伝子破壊により、マラリア原虫のＰｂｓｐ１遺伝子が破壊されると共に、抗マラリア薬であるピリメサミンに耐性となる。そこでＰｂｓｐ１が破壊された原虫をピリメサミンにより選択し、限界希釈によって野生型の原虫から分離した。またサザンブロット解析により、Ｐｂｓｐ１遺伝子座が破壊されていることを確認した。Ｐｂｓｐ１が破壊された原虫の集団が、単一クローンのみから得られたという可能性を排除するために、Ｐｂｓｐ１が破壊された原虫集団を２種類検討した。即ち、２つの独立したクローン由来の原虫集団である、Ｐｂｓｐ１（−）１とＰｂｓｐ１蛋白質（−）２とを下記の実験に使用した。
【００２４】
ラット血液中における赤血球型原虫の成長率は、Ｐｂｓｐ１が破壊された集団と野生型集団の間で、ほとんど差がなかった。よって、遺伝子の破壊は原虫の成長には影響しないと考えられる。次に、感染した蚊を調製して、中腸と唾液腺に存在しているスポロゾイトを計測した。各器官におけるスポロゾイト数は、Ｐｂｓｐ１が破壊された集団と野生型集団において本質的に差はなかった。それは、Ｐｂｓｐ１蛋白質遺伝子を破壊しても、原虫の成長に影響しないことを示唆している。よってＰｂｓｐ１破壊体も正常な感染能を有しており、蚊に感染する段階と赤血球に感染する段階の間を通じて、正常に感染及び増殖することが可能である。
【００２５】
本発明者は、Ｐｂｓｐ１を破壊したスポロゾイトの肝臓への感染性を検討した。蚊の唾液腺から収集したスポロゾイトを培地１９９に懸濁し、３週齢のメスのウィスターラットに注射した。接種を行う前にスポロゾイトの移動能をインビトロで検討し、６０％以上の運動性のスポロゾイトが含まれていることを確認した。ギムザ染色により１２時間毎に感染血液のチェックを行った。
【００２６】
図４に、Ｐｂｓｐ１遺伝子の発現を破壊した原虫の肝臓感染性を示す。各ラットの寄生虫血をギムザ染色によって評価した。図４において、接種した原虫の数はそれぞれ、Ｐｂｓｐ１  （−）１が３０，０００個（白丸）、Ｐｂｓｐ１  （−）２が３０，０００個（白三角）、野生型が３０，０００個（黒丸）および野生型が３，０００個（黒四角）である。
【００２７】
図４において、３０，０００個を接種して３．５日後の平均値の結果から、２クローンのＰｂｓｐ１破壊体の肝臓感染性は、野生型と比較して１５倍（Ｐｂｓｐ１（−）１）と２８倍（Ｐｂｓｐ１（−）２）低いと推定された。この結果は、Ｐｂｓｐ１蛋白質は肝臓感染において重要な役割をはたし、ミクロゾームにおける局在を併せて考慮すると、Ｐｂｓｐ１蛋白質はスポロゾイトの肝臓侵入に寄与していることを強く示唆している。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、ネズミマラリア原虫由来のＰｂｓｐ１蛋白質、および当該蛋白質をコードする遺伝子が与えられた。本発明のＰｂｓｐ１蛋白質は、マラリア原虫スポロゾイトの肝臓への感染を介助する活性を有するという特徴を有するために、スポロゾイトを標的としたマラリアのワクチンの作製や医薬の開発のためのツールとして有用であると考えられる。
【００２９】
【配列表】
2004344105.tif 000002
2004344105.tif 000003
2004344105.tif 000004
2004344105.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｐｂｓｐ１遺伝子の塩基配列と、予想されるアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２は、ネズミマラリア原虫由来のＰｂｓｐ１蛋白質と、ヒトマラリア原虫由来の相同体におけるアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図３】図３は、相同性組み換えによる遺伝子破壊の手法を示す模式図である。
【図４】図４は、Ｐｂｓｐ１遺伝子の発現を破壊した原虫の肝臓感染性を示すグラフである。
【図１】
2004344105.tif 000006
【図２】
2004344105.tif 000007
【図３】
2004344105.tif 000008
【図４】
2004344105.tif 000009