(57)【要約】【課題】アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害し、従来のＡＣＥ阻害ペプチドに比べて血圧上昇抑制効果を高める。【解決手段】ペプチド中のプロリンをハイドロキシプロリンへの変換することより、上記ペプチドの持つアンジオテンシン変換酵素への阻害活性を２倍から１００倍強くすることを特徴とするペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性を強める方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドであって、次の（１）、（２）、（３）又は（４）で表されるアミノ酸配列の全部又は一部を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチド。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（３）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（４）Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
【請求項２】
アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドであって、次の（１）、（２）又は（３）で表されるアミノ酸配列の１以上のＰｒｏ（プロリン）をＨｙｐ（ハイドロキシプロリン）で置換えたアミノ酸配列の全部又は一部を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチド。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（３）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
【請求項３】
複数のプロリンを有するアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチド中の上記複数のプロリンの中の１以上のプロリンをハイドロキシプロリンへ置換することより、上記ペプチドの持つアンジオテンシン変換酵素への阻害活性を２倍から１００倍強くすることを特徴とするペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性を強める方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害する活性を有するペプチドに関し、特に食肉分解物から得られ、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害することで血圧上昇を抑制する効果を有するアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、成人病のひとつである高血圧症が増加の一途を辿っており、高齢化が進むに伴い大きな社会問題となっている。以前から、高血圧症などの循環器系病態の原因解明や対策が研究されている。
【０００３】
高血圧発症のメカニズムは種々存在するが、レニン・アンジオテンシン系とカリクレイン・キニン系が大きく関係するといわれている。アンジオテンシン変換酵素（本明細書では、「ＡＣＥ」とも言う。）は、アンジオテンシンＩ（ｉｎａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ）を強い血管収縮作用をもつアンジオテンシンＩＩ（ａｃｔｉｖｅ　ｆｏｒｍ）に変換すると共に、血管拡張作用のあるブラジキニンを不活性な３種のペプチドに分解する。
【０００４】
そこで、ＡＣＥ活性（アンジオテンシン変換酵素の酵素活性）を阻害するカプトプリルやエナラプリルなどのＡＣＥ阻害物質（アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害する物質）が高血圧治療薬として、従来から利用されている。
【０００５】
食品あるいは食品原料から得られるＡＣＥ阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤、健康志向食品として期待でき、日常の食生活において摂取可能となる。しかしながら、食品由来のＡＣＥ阻害物質の中には、消化器官で分解等され活性が低下するものもあり、その有効性が疑問視されるものもある。
【０００６】
これまで多くの天然物や食品等の酵素分解物の中からＡＣＥ阻害物質が報告されている。
【０００７】
例えば、ゼラチン分解物（特開昭５２−１４８６３１号）、カゼイン分解物（特開昭６０−２３０８６号、特開平３−１６７１９８、特開平６−２７７０９１号、特開平６−２７９４９１号）、ゼイン（特開平０２−３６１２７号）、鰯筋肉分解物（特開平３−１１０９７号、特開平６−３４０６９２号）、鰹節分解物（特開平４−１４４６９６号、特開平５−３３１１９１号）、肉類分解物（特開平５−２４４９７９号）などが知られている。
【０００８】
多くの場合、これらのＡＣＥ阻害ペプチドは酵素処理によって小片化（アミノ酸として３〜１０残基）されており、構造中にＰｒｏ（あるいは疎水的構造）をもっている。例えば、松藤らは魚たんぱく質のアルカリプロテアーゼ分解物中のＡＣＥ阻害ペプチドとして、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ，　Ａｒｇ−Ｔｙｒ，　Ｌｅｕ−Ｔｙｒ，　Ｔｙｒ−Ｌｅｕ，　Ｌｙｓ−Ｔｒｐ，　Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ，　Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ，　Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，　Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ，　Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ等を報告している。
【０００９】
また、これまでに多くのＡＣＥ阻害ペプチドが報告されており、その多くがＰｒｏを配列の中に持っている。Ｃｈｅｕｎｇらは、Ｎ末あるいはＣ末がグリシル化したモデルペプチドを用いてＡＣＥ酵素の基質特異性を調べている。Ｃ末におけるＧｌｙに続くアミノ酸の比較（Ｘ−Ｇｌｙ）では、もっとも好ましいアミノ酸はＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅであった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
以上のようなＡＣＥ阻害ペプチドが従来から知られていたが、食肉分解物由来のＡＣＥ阻害ペプチドの血圧上昇抑制効果は不十分であり、ＡＣＥ阻害活性のより高いペプチドやＡＣＥ阻害活性を高める方法が望まれていた。
【００１１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性とアミノ酸配列との関わりについて検討することにより、ＡＣＥ阻害活性を従来のＡＣＥ阻害ペプチドに比べてより高める（１０倍近く高める）ことの可能なＡＣＥ阻害ペプチドを得ることを課題とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するために、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドであって、次の（１）、（２）、（３）又は（４）で表されるアミノ酸配列の全部又は一部を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドを提供する。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（３）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（４）Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するために、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドであって、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列の１以上のＰｒｏをＨｙｐ（ハイドロキシプロリン）で置換え、次の（１）〜（７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列の全部又は一部を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチド。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（３）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（４）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（５）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（６）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
（７）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ
【００１４】
本発明は上記課題を解決するために、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドであって、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列の１以上のＰｒｏをＨｙｐ（ハイドロキシプロリン）で置換え、次の（１）〜（７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列の全部又は一部を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチド。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ
（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ
（３）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ
（４）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（５）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（６）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
（７）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ
【００１５】
本発明は上記課題を解決するために、アンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドであって、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列のＰｒｏ（プロリン）をＨｙｐ（ハイドロキシプロリン）で置換え、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙで表されるアミノ酸配列の全部又は一部を有することを特徴とするアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチドを提供する。
【００１６】
本発明は上記課題を解決するために、複数のプロリンを有するアンジオテンシン変換酵素に対する阻害活性を持つペプチド中の上記複数のプロリンの中の１以上のプロリンをハイドロキシプロリンへ置換することより、上記ペプチドの持つアンジオテンシン変換酵素への阻害活性を２倍から１００倍強くすることを特徴とするペプチドのアンジオテンシン変換酵素阻害活性を強める方法を提供する。
【００１７】
本発明は上記課題を解決するために、ヒトの消化酵素群の代替として家畜や実験動物の胃又は腸の粘膜酵素と反応させることを特徴とするペプチドの選択方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明に係るアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド（アンジオテンシン変換酵素への阻害活性を持つペプチド）の実施の形態を実施例、試験例を参照して、以下説明する。
【００１９】
まず本発明を想到するに至った経緯とともに説明する。本発明者らは、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性とアミノ酸配列の関わりについて、鋭意研究した結果、人のＡＣＥの活性中心の１０８９番目にはＨｉｓが存在しており、これによって酵素活性が、中性よりアルカリ性側で高くなると考えられた。そこで、活性部位の環境をアルカリ性と逆の酸性にすれば、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害出来るのではないかと考えられた。
【００２０】
その手段の一つとして、切断部位近傍のアミノ酸をＰｒｏ（プロリン）よりＨｙｐ（ハイドロキシプロリン）に置き換えれば、ｐＨが酸性側に傾き、ＡＣＥの活性を低下させるのではないかと考えられた。
【００２１】
また、ＰｒｏをＨｙｐに置換するとペプチドの分子構造が変化すると共に、ＡＣＥの活性部位のヒドロキシル基切断に関与する電子の授受にも影響するので、ＡＣＥ阻害活性を増加させることが出来るのではないかと考えられた。
【００２２】
このような発想に基づく本発明を具体的に、食肉タンパク質の酵素分解物中のペプチドで説明する。本発明者らは、本発明のアンジオテンシン変換酵素に対して阻害活性を有するペプチドとしては、配列表の配列番号１、２又は３に示すもの又はＬｅｕ−Ｐｈｅ、即ち次の（１）、（２）、（３）又は（４）のアミノ酸配列のものを見出した。
（１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　（配列番号１参照）
（２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号２参照）
（３）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号３参照）
（４）Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
【００２３】
ところで、本発明者らは、上述のように、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を阻害するためには、活性部位の環境をアルカリ性と逆の酸性とするという発想に基づいて、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のペプチドについて、夫々含まれるプロリン（Ｐｒｏ）の１以上をハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に置換えると、アンジオテンシン変換酵素に対してより強い阻害活性を持つペプチドが得られることを見出した。このペプチドの配列は配列番号４〜１８に示すもの、即ち次の（５）〜（１９）に示すものである。
【００２４】
（５）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号４参照）
（６）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号５参照）
（７）Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号６参照）
（８）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号７参照）
（９）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号８参照）
（１０）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号９参照）
（１１）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１０参照）（１２）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１１参照）（１３）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１２参照）（１４）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号１３参照）
（１５）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号１４参照）
（１６）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１５参照）
（１７）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１６参照）
（１８）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１７参照）
（１９）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（配列番号１８参照）
【００２５】
ここで、ペプチド中のプロリンをハイドロキシプロリンへの変換することよりなるアンジオテンシン変換酵素への阻害活性は、変換する前のものに比較して、２倍から１００倍、通常約１０倍強くすることができる。
【００２６】
上記配列表の（１）、（２）、（３）又は、（４）に示す本発明のペプチドは、例えば、鶏胸肉を豚小腸等から得られるタンパク質分解酵素で処理されたものの中に含まれているものであり、以下、実施例でこの本発明のペプチドの具体的な製法及び血圧抑制効果を説明する。
【００２７】
（実施例１）
材料：
鶏胸肉と新鮮な豚小腸は屠殺場から調達した。小腸粗酵素は小腸粘膜上皮からリン酸緩衝液（ｐＨ　７．２）で抽出した液を用いた。ウサギ肺ＡＣＥ、Ｈｉｐ−ＨＬ、トリプシン、キモトリプシンは、シグマ社製（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）を購入した。ペプチド合成試薬は島津（京都、日本）より購入した。その他の試薬は和光純薬（大阪、日本）より購入した。
【００２８】
鶏胸肉エキスの調製：
鶏胸肉エキスは工業的手法によって調製した。すなわち鶏胸肉１　ｋｇを３．５時間加熱抽出し、濾過し、さらに遠心分離によって残渣を除去した。この抽出液をＢｒｉｘ　２５になるまで濃縮した。
【００２９】
鶏胸肉エキスの分解：
上記のエキスを種々の酵素（プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、トリプシン、キモトリプシン、及び小腸粗酵素：以下、消化酵素群）で加水分解した。まず、エキスをプロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ及びプロテアーゼＣでｐＨ７、５０℃で、４０分間消化し、遠心分離し、その上清を次の酵素処理に供した。トリプシンとキモトリプシンによる消化はｐＨ６．０、３７℃で、１時間行った。そして、その後に小腸粘膜より調製した小腸粗酵素による消化を、ｐＨ７．２、３７℃３０分間行なった。ここで、上記のごとく鶏胸肉エキスを酵素処理したものを以下鶏胸肉エキス酵素処理物と呼ぶ。尚、小腸粗酵素を用いたのは、経口摂取で機能するペプチドを得るために、小腸で消化されるペプチドを前もって取り除いておくためである。
【００３０】
鶏胸肉エキス酵素処理物由来血圧上昇抑制ペプチドの単離と精製：
鶏胸肉エキス酵素処理物を限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ　ＭＷ＝１０００）を用いて分画した。また、逆相ＨＰＬＣ（溶出条件：ＣＨ３ＣＮ；８−４０％　ｉｎ　０．１％　ＣＦ３ＣＯＯＨ）によってＡＣＥ阻害ペプチドを精製した。溶出ピークは２２０ｎｍで検出した。
【００３１】
ＡＣＥ阻害ペプチドの精製：
鶏胸肉エキス酵素処理物を逆相ＨＰＬＣによって分画した。図１に示す溶出パターンに従い７つに分画（Ｆ０￣Ｆ６）し、それぞれのＡＣＥ阻害活性を比較した。高阻害活性画分（Ｆ６）を同じ方法で再分画したところ、図２に示すように６つのピークが得られた。これらすべてのピークのアミノ酸配列をヒューレット・パッカード社製プロテインシークエンサー（Ｇ１００５Ａ）で決定した。
【００３２】
ＡＣＥ阻害ペプチドの構造解析：
上記の鶏の胸肉エキス酵素処理物より得られたＡＣＥの阻害ペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号１、２、３又はＬｅｕ−Ｐｈｅであった。これらの内、配列番号１、２、３は、いずれもコラーゲンタンパク質由来と思われる特徴的な配列、（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎをとっていた。尚、ここで明らかとなった配列表の配列番号１、２、３は、鶏胸肉エキス酵素処理物より得たものであるが、同様に、牛、豚、馬、羊、山羊等の家畜を含むヒト以外の多くの哺乳類の外、カエル等の両生類、サケ等の魚類など、より多くの動物からも得ることが出来る
【００３３】
ペプチド合成：
ペプチドはＦｍｏｃ固相法により自動ペプチド合成機（ＰＳＳＭ８　島津）を用いて作成した。脱保護の後、逆相ＨＰＬＣ（ＰＥＧＡＳＩＬ３００ＯＤＳ）ならびに質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ　ＭＡＴ）で確認した。なお、ヒドロキシプロリンを含むペプチドは、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を用いたペプチド合成、プロリン（Ｐｒｏ）で合成した後にプロリンヒドロキシラーゼを作用させること、又は食肉等の酵素分解物にプロリンヒドロキシラーゼを作用させることによっても調製できる。
【００３４】
合成ペプチドのＡＣＥ阻害活性：
鶏胸肉エキス酵素処理物から得られたペプチドを基に１９種類の合成ペプチドを作成した。即ち、配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示すペプチド及び配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示すペプチドに含まれるプロリン（Ｐｒｏ）の１以上をハイドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に置換えた配列表の配列番号４〜１８に夫々示すペプチド及びＬｅｕ−Ｐｈｅの全１９種類の合成ペプチドを作成した。
【００３５】
ＡＣＥ阻害活性の測定：
ＡＣＥ阻害活性の測定は、Ｃｈｅｎｇらの方法に従って行った。最終容量が０．２５ｍｌとなるよう１００ｍＭ　ホウ酸溶液（ｐＨ８．３）、５ｍＭ　Ｈｉｐ−ＨＬ、５００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｍＵ　ウサギＡＣＥ、タンパク質加水分解物を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。酵素反応は１Ｎ　ＨＣｌの添加で停止させた。Ｈｉｐ−ＨＬの加水分解により放出される馬尿酸量を吸光値２２８ｎｍで測定した。ＡＣＥを５０％阻害するときの阻害剤濃度をＩＣ５０と定義する。
【００３６】
（試験例１）
鶏胸肉エキス酵素処理物および同限外ろ過膜処理物のＡＣＥ阻害活性：
鶏胸肉エキス酵素処理物は、ＡＣＥ阻害活性を示した。表１に示すように、限外濾過によって分画された分子量１０００以下の画分に強い阻害活性が認められた。
【００３７】
【表１】
2004067519.tif 000002
【００３８】
（試験例２）
この配列番号１〜１８及びＬｅｕ−Ｐｈｅの合成ペプチドのＡＣＥ阻害活性を比較した。その結果を次の表２に示す。ＰｒｏをＨｙｐに置換するとＡＣＥ阻害活性は１０倍上昇した。
【００３９】
例えば、表１の上から８番目のペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）は、ＩＣ５０が８０７となっており、一方、この配列上の３つのＰｒｏの全てをＨｙｐに変えたものは、表１の１番上にあるペプチド（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）で、ＩＣ５０値は８５となっている。この値は、アンジオテンシン変換酵素に対して５０％の阻害を与えるために必要なペプチドの量を示しており、８５は８０７のおよそ１／１０であることから、１番目のペプチド（ＩＣ５０＝８５）は８番目のペプチド（ＩＣ５０＝８０７）のおよそ１／１０の量で５０％阻害を与えることを意味している。これより、阻害活性がおよそ１０倍高いと言える。
【００４０】
【表２】
2004067519.tif 000003
【００４１】
（試験例３）
ペプチド投与ＳＨＲの血圧測定：
高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）を用いて次の（１）、（２）の２種類の試験を行った。
【００４２】
（１）単回投与試験
雄ＳＨＲ（１１週齢；チャールズリバー）は市販の非精製餌（標準食、ＡＩＮ−７６；オリエンタル酵母）と水で２３℃、湿度５５％に調整された部屋で飼育し、試験時には生理的食塩水あるいは血圧降下作用を持つペプチドＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号４）を（１ｍｇ／ｋｇ　体重）を経口的に投与した。ラット尾動脈圧および心拍数を非観血式血圧測定器（Ｓｏｆｔｒｏｎ９８Ａ、Ｓｏｆｔｒｏｎ、東京、日本）で経時的に測定した。データの解析はＤｕｎｎｅｔ’ｓ−ｔｅｓｔにより行った。
【００４３】
ペプチドのＳＨＲにおける血圧上昇抑制作用：
ＳＨＲの血圧を経口投与前後で経時的に測定した。投与後、ペプチド投与ＳＨＲの血圧は、生理食塩水投与ＳＨＲ（コントロール−ＳＨＲ）の血圧に比べ低い値を示し、降圧効果は投与後１時間後から検出され測定時間（４時間）を通して継続した。
【００４４】
（２）長期投与試験
単回投与試験と同様の８週齢の雄ＳＨＲを用いた。標準食とたんぱく質量とミネラル量を同等に調製した、添加するペプチドとして、ペプチドＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号４）を使用し、ペプチド高用量（６ｍｇ／ｋｇ飼料）、低用量（３ｍｇ／ｋｇ飼料）を４週間自由摂取させた。測定項目は単回投与試験と同じとした。投与２週目から、高、低用量投与ＳＨＲのいずれも、標準食投与（コントロール）ＳＨＲの血圧に比べ有意に低い値を示し、降圧効果は測定期間（４週間）を通して継続した。
【００４５】
以上本発明に係るアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドの形態を実施例、試験例に基づいて説明したが、本発明は特にこのような実施例に限定されることなく、特許請求の範囲記載の技術的事項の範囲内でいろいろな実施例があることはいうまでもない。
【００４６】
【発明の効果】
本発明に係るアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドは、以上のような構成であるから、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を十分阻害し、従来のＡＣＥ阻害ペプチドに比べて血圧上昇抑制効果は十分奏する。
【００４７】
【配列表】
2004067519.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＰＬＣにより鶏胸肉エキス（抽出物）の酵素処理物を粗分画した場合の溶出パターンを示す図である。
【図２】図１の溶出パターンに示される高阻害活性画分（Ｆ６）を再分画した場合の溶出パターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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