(57)【要約】【課題】経時の異なる検体について、異なる経時の影響を抑えてペプシノーゲン濃度を測定することが可能なペプシノーゲン測定法および測定用キットを提供すること。【解決手段】ヒト由来の検体中のペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩを、抗ペプシノーゲンＩ抗体または抗ペプシノーゲンＩＩ抗体と抗原抗体反応により凝集反応せしめてペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する方法。その際、上記凝集反応を行う前にヒト由来の検体を予め第４級アンモニウム塩と混合し次いで前記凝集反応を弱酸性ないし中性の条件下で実施するとともに同条件下でペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の検体中のペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩを、抗ペプシノーゲンＩ抗体または抗ペプシノーゲンＩＩ抗体と抗原抗体反応により凝集反応せしめてペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する方法であって、上記凝集反応を行う前にヒト由来の検体を予め第４級アンモニウム塩と混合し次いで前記凝集反応を弱酸性ないし中性の条件下で実施するとともに同条件下でペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する、ことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
第４級アンモニウム塩が塩化コリン、臭化コリンまたは塩化アセチルコリンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第４級アンモニウム塩がｐＨ６〜８．６の２〜１０重量％の塩化コリン水溶液として用いられ、抗ペプシノーゲンＩ抗体が不溶性担体に担持されそしてｐＨ６〜７．５のラテックスとして用いられそしてペプシノーゲンＩの濃度を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第４級アンモニウム塩がｐＨ６〜７の１〜５重量％の塩化コリン水溶液として用いられ、抗ペプシノーゲンＩＩ抗体が不溶性担体に担持されそしてｐＨ６〜７．５のラテックスとして用いられそしてペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第４級アンモニウム塩の水溶液並びに不溶性担体に担持した抗ペプシノーゲンＩ抗体のラテックスおよび／または不溶性担体に担持した抗ペプシノーゲンＩＩ抗体のラテックスの組合せからなる、ペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩ測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプシノーゲンＩまたはＩＩの濃度を測定するためのペプシノーゲンＩまたはＩＩ測定方法およびペプシノーゲンＩまたはＩＩ測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペプシノーゲンは、胃粘膜から分泌される蛋白分解酵素ペプシンの前駆体で、ペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩに分けられる。慢性萎縮性胃炎が進行すると血液中のペプシノーゲンＩの濃度は低下するが、ペプシノーゲンＩＩの濃度は低下しないといわれている。ペプシノーゲン法は、血液中のペプシノーゲンＩの低下およびＩとＩＩの比を調べることにより、慢性萎縮性胃炎の進行度を調べ、胃がんになりやすい状態か否かのふるいわけを行う方法であり、胃がん高危険群のスクリーニング法として有用性が高く評価されている（厚生省がん研究助成金による血清ペプシノーゲンによる胃がんスクリーニングに関する研究９−８、平成１２年度研究報告　参照）。
【０００３】
ペプシノーゲンＩまたはＩＩの測定には、放射線免疫測定法、酵素免疫測定法、化学発光免疫法、ラテックス凝集免疫比濁法が用いられている。
【０００４】
特に、ラテックス凝集免疫比濁法は、他法に比べて簡便かつ迅速な測定方法である。なお、ラテックス比濁法の詳細については、例えば、臨床検査機器・試薬，２１（６），６０７−６１２，１９９８を参照されたい。このように、ラテックス凝集免疫比濁法は、簡便かつ迅速にペプシノーゲンＩまたはＩＩの測定が行える方法となっているものの、他方、検体鮮度の影響により正しい値が測定できない問題があった。すなわち、採血直後における測定値と、検体を冷蔵保存した後における測定値が変動したり、あるいは検体を冷蔵保存した日数によっても測定値が相違したりする方法となっていた。従って、従来のラテックス凝集免疫比濁法を用いて、正確なペプシノーゲン濃度を得るためには、採血後、一定期間内に測定を行うといった管理が必要になっていたが、このような管理を行うことは極めて困難であった。そのような理由から、正確に測定するためには検体を凍結保存して測定するなどの管理が必要であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、経時の異なる検体について、異なる経時の影響を抑えてペプシノーゲン濃度を測定することが可能なペプシノーゲン測定法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的は、本発明のペプシノーゲン測定法に好適に使用されるペプシノーゲン測定用キットを提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、ヒト由来の検体中のペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩを、抗ペプシノーゲンＩ抗体または抗ペプシノーゲンＩＩ抗体と抗原抗体反応により凝集反応せしめてペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する方法であって、上記凝集反応を行う前にヒト由来の検体を予め第４級アンモニウム塩と混合し次いで前記凝集反応を弱酸性ないし中性の条件下で実施するとともに同条件下でペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩの濃度を測定する、ことを特徴とする前記方法によって達成される。
【０００９】
また、本発明の上記目的および利点は、本発明によれば、第２に、第４級アンモニウム塩の水溶液並びに不溶性担体に担持した抗ペプシノーゲンＩ抗体のラテックスおよび／または不溶性担体に担持した抗ペプシノーゲンＩＩ抗体のラテックスの組合せからなる、ペプシノーゲンＩまたはペプシノーゲンＩＩ測定用キットによって達成される。
【００１０】
【発明の好ましい実施形態】
本発明のペプシノーゲン測定方法の具体的な実現方法は、特に限定されない。いわゆる、一液型の試薬の使用により実現してもよく、二液型の試薬の使用により実現してもよい。好ましくは二液型の試薬での実現である。
【００１１】
例えば、検体を希釈するための第一試薬であって、第４級アンモニウム塩を含む第一試薬と、前記第一試薬によって希釈された前記検体と混和される第二試薬であって、抗ペプシノーゲンＩまたはＩＩ抗体が感作された不溶性担体を含む第二試薬とを用意しておき（例えばペプシノーゲンＩまたはＩＩ測定用キットとして）、まず、検体と第一試薬とを混和し、つぎに得られた混和物と第二試薬とを混和することによって反応系を調整し、その反応系内で生ずる前記不溶性担体の凝集反応に基づき前記ペプシノーゲンＩまたはＩＩの濃度を測定するといった手順で、本発明にかかるペプシノーゲンＩまたはＩＩの測定方法を実現することができる。
【００１２】
本発明によるペプシノーゲンＩまたはＩＩの測定方法を使用する場合、反応系における第４級アンモニウム塩の含有率（濃度）を高くしておいた方が、検体経時の影響がより少ない状態での測定が可能となる。しかしながら、第４級アンモニウム塩の濃度が高くなるほど測定感度が低下するようになるため、反応系内の第４級アンモニウム塩の含有率（重量基準）は、０．５〜１０％程度であることが好ましく１〜５％、特に２〜３％としておくことがさらに好ましい。このとき、反応系のｐＨを弱酸性〜弱塩基性、好ましくは弱酸性にすると塩基性に比べて測定感度を高くすることができる。つまり、反応系を弱酸性から中性にすることで第４級アンモニウム塩を多く含ませることができる。
【００１３】
また、上記の如く第一試薬と第二試薬とを用いる態様で本発明を実施する場合には、その混合の結合物の第４級アンモニウム塩含有率が上記範囲となるようにしておけばよい。すなわち、第一試薬と第二試薬の双方に第４級アンモニウム塩を含ませておいてもよく、一方のみに第４級アンモニウム塩を含ませておいてもよい。後者の場合は、第一試薬に第４級アンモニウム塩を含ませておいた方が好ましい。
【００１４】
第４級アンモニウム塩としては、例えば塩化コリン、臭化コリンまたは塩化アセチルコリンが好ましく用いられる。
【００１５】
また、第一試薬のｐＨが、弱酸性〜弱塩基性において、検体を希釈することによって、測定における検体鮮度の影響性を軽減できる。具体的には、第一試薬のｐＨが６〜８．２が好ましい。特にペプシノーゲンＩＩの測定では、第一試薬のｐＨが６〜７が好ましい。
【００１６】
さらに好ましくは、ペプシノーゲンＩの濃度の測定では、第４級アンモニウム塩がｐＨ６〜８．６の２〜１０重量％の塩化コリン水溶液として用いられそして抗ペプシノーゲンＩ抗体が不溶性担体に担持されそしてｐＨ６〜７．５のラテックスとして用いられる。
【００１７】
また、ペプシノーゲンＩＩの濃度の測定では、第４級アンモニウム塩がｐＨ６〜７の１〜５重量％の塩化コリン水溶液として用いられそして抗ペプシノーゲンＩＩ抗体が不溶性担体に担持されそしてｐＨ６〜７．５のラテックスとして用いられる。
【００１８】
不溶性担体としては、一般に免疫学的凝集法に用いられているラテックス粒子を用いることができることは当然として、その他リポゾーム、金コロイド等を用いることができる。好ましくはその粒子径は０．０５〜０．５μｍであり、より好ましくは０．２〜０．５μｍである。また、何種類かの不溶性担体を組合せて用いてもよい。抗ペプシノーゲンＩまたはＩＩ抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体のいずれであってもよい。また、抗体由来の動物種は特に限定されない。不溶性担体への抗ペプシノーゲンＩまたはＩＩ抗体の感作は、周知の方法を用いて抗ペプシノーゲンＩまたはＩＩ抗体を不溶性担体へ吸着または結合させることにより実現できる。
【００１９】
また、第一試薬は、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液などを元として調製することができる。その際、アルブミン等のタンパク、ポリエチレングリコール等の高分子、ツイーン、トライトン等の界面活性剤、塩化ナトリウム等の塩化物、アジ化ナトリウム等の防腐剤等を含めることもできる。
【００２０】
本発明によれば、本発明の上記測定法に好適に使用される免疫学的測定用キットが同様に提供される。このキットは、第４級アンモニウム塩の水溶液例えば上記の如きｐＨや濃度を持つ第４級アンモニウム塩の水溶液と、不溶性担体に担持された抗ペプシノーゲンＩ抗体のラテックスおよび／または不溶性担体に担持された抗ペプシノーゲンＩＩ抗体のラテックスの組合せからなる。上記水溶液とラテックスとは、それぞれ別個の容器に収容されそして測定時に例えば前記第一試薬および第二試薬として用いられる。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例によって、さらに詳しく本発明の説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２２】
実施例１
（１）ペプシノーゲンＩ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
抗ペプシノーゲンＩモノクロナール抗体（Ａ）３ｍｇをリン酸ナトリウム緩衝液９．５ｍＬに溶解し、０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％緩衝液）０．５ｍＬを加え、３７℃で２時間インキュベーションした。次いで、これに２％ＢＳＡ−リン酸緩衝液２ｍＬを加え、３７℃で９０分間インキュベーションすることによりポストコーティングを行った。次に遠心分離（１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心）を行い、上清を捨て、沈殿を牛血清アルブミン溶液（０．１Ｍグリシン、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、０．２％ＢＳＡ、５％コリン）に懸濁させ、ペプシノーゲンＩ抗体感作ラテックス（Ａ）を調製した。同様に、抗ペプシノーゲンＩ抗体（Ｂ）を用いて、ペプシノーゲンＩ抗体感作ラテックス（Ｂ）を調製した。（Ａ）および（Ｂ）を混合して、ペプシノーゲンＩ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
【００２３】
（２）ペプシノーゲンＩ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％ＢＳＡ−５０ｍＭグリシン緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）に塩化コリン５％を加えて調製した。
【００２４】
（３）ペプシノーゲンＩの測定
自動分析装置７１７０（日立社製）を用いて行った。前記調製法によって得られたペプシノーゲンＩの各々の第一試薬、第二試薬を用いて以下の条件で測定した。
検体量：１０μＬ、第一試薬：２７０μＬ、第二試薬：５０μＬ
測定波長：７００ｎｍ、測定温度：３７℃、測定ポイント２０−３４ｐ
【００２５】
検体に第一試薬を添加して約４．５分間インキュベーションを行った後、第二試薬を添加して約１分後から５分後の吸光度の差を測定し、濁度変化量（ΔＯＤ）とした。検体の代わりにペプシノーゲンＩの標準品を用いて前記の通りに測定して検量線を作成しておき、この検量線から検体のペプシノーゲンＩの濃度を測定した。ヒト血清１５例を検体として測定に用いた。検体は採血後０、４、１５日間冷蔵保存（５℃）されたものを測定して、その経時変化を比較した。その結果を図１に示す。ここで、変化率とは、保存期間が０日である検体のペプシノーゲンＩの測定結果Ｃ０と、保存期間がｎ日である検体のペプシノーゲンＩの測定結果Ｃｎとから、１００×（Ｃｎ−Ｃ０）／Ｃ０で算出した値のことである。
【００２６】
比較例１
対照第一試薬の調製
１％ＢＳＡ−５０ｍＭグリシン緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）を調製した。実施例１において、塩化コリンを加えない他は最終的に実施例１の（２）と同じ組成になるように調製した。
上記コリンを含まない第一試薬を用いる他は実施例１と同様に行った。結果を図２に示した。
図１および図２に示した結果の対比から、実施例１の方法（塩化コリン存在下）では比較例１の方法（従来の方法）に比べて検体の経時変化の影響を受けずに測定できたことが分かる。
【００２７】
実施例２
（１）ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
抗ペプシノーゲンＩＩモノクロナール抗体（Ａ）および（Ｂ）を用いて、実施例１と同様に操作して、ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
（２）ペプシノーゲンＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
実施例１と同様に操作して、塩化コリン２．０％を含むペプシノーゲンＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）を調製した。
（３）ペプシノーゲンＩＩの測定
実施例１と同様に操作して、ペプシノーゲンＩＩを測定した。その結果を図３に示す。
【００２８】
比較例２
対照第一試薬の調製
１％ＢＳＡ−５０ｍＭグリシン緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）を調製した。実施例２において、塩化コリンを加えない他は最終的に実施例２の（２）と同じ組成になるように調製した。結果を第４図に示す。
図３および図４に示した結果の対比から、実施例２の方法（塩化コリン存在下）は比較例２の方法（従来の方法）に比べ検体の経時変化を受けずに測定できたことが分かる。
【００２９】
実施例３
（１）ペプシノーゲンＩおよびＩＩ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
実施例１および２で調製したペプシノーゲンＩおよびＩＩ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
（２）ペプシノーゲンＩおよびＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％ＢＳＡ−グリシン緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）ｐＨ９．５およびｐＨ８．２を調製した。また、同様に１％ＢＳＡ−リン酸緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）ｐＨ６．０およびｐＨ７．０を調製した。
（３）ペプシノーゲンＩおよびＩＩの測定
実施例１または２と同様に操作して、ペプシノーゲンＩおよびＩＩを測定した。第一試薬は、ｐＨの異なる４種類について比較した。第一試薬のｐＨが６．０、８．２、９．５のとき、反応液中のｐＨは７．１７、７．５６、９．４４となった。図５はペプシノーゲンＩについての、また図６はペプシノーゲンＩＩについての、反応液中のｐＨと検体鮮度の影響性の関係を表す（ヒト血清１５例を検体として測定に用いた。検体は採血後０日と７日間冷蔵保存（５℃）されたものを測定して、その経時変化を比較した。）ここで、変化率とは、保存期間が０日である検体のペプシノーゲンＩまたはＩＩの測定結果Ｃ０と、保存期間がｎ日である検体のペプシノーゲンＩまたはＩＩの測定結果Ｃｎとから、１００×（Ｃｎ−Ｃ０）／Ｃ０で算出した値のことである。図７はペプシノーゲンＩについての、図８はペプシノーゲンＩＩについての、反応液中のｐＨと吸光度変化量（ΔＯＤ）との関係を表す。
【００３０】
図５に示したように、ペプシノーゲンＩの測定においては、反応液中のｐＨが中性から弱アルカリ性（第一試薬のｐＨが６〜８．２）で検体鮮度の影響が受けにくいことがわかる。ｐＨが９．４４（第一試薬のｐＨが９．５）では変動率が１０％を超える。また、ペプシノーゲンＩＩでは、中性付近（第一試薬のｐＨが６〜７）、もしくはｐＨが９．４４（第一試薬のｐＨが９．５）で検体鮮度の影響を受けにくいが、塩基性が強くなると吸光度変化量（ΔＯＤ）が小さくなるため（図６）、相関係数が低下する。
【００３１】
実施例４
（１）ペプシノーゲンＩおよびＩＩ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
実施例１および２で調製したペプシノーゲンＩおよびＩＩ抗体感作ラテックス試薬を使用した。
（２）ペプシノーゲンＩおよびＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％ＢＳＡ−グリシン緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）ｐＨ８．２を調製した。これに塩化コリンを０％、５％および１０％を加えて３種類の第一試薬を調製した。
（３）ペプシノーゲンＩおよびＩＩの測定
実施例１または２と同様に操作して、ペプシノーゲンＩおよびＩＩを測定した。塩化コリンの含有量と吸光度変化量（ΔＯＤ）の関係を図９（ペプシノーゲンＩについて）および図１０（ペプシノーゲンＩＩについて）に示す。
ペプシノーゲンＩおよびＩＩは、より多くの塩化コリンを含む第一試薬を用いた方が、検体鮮度の影響を受けたいためには有効であるが、図９および図１０に示すように、第一試薬中の塩化コリン濃度を増やすと、吸光度変化量（ΔＯＤ）が低下してしまう。
【００３２】
実施例５
（１）ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
実施例２と同様に操作して、ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
（２）ペプシノーゲンＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
実施例２、３と同様に操作して、塩化コリンは２．５％を含む１％ＢＳＡ−リン酸緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％アジ化ナトリウムを含む）ｐＨ６．０であるペプシノーゲンＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）を調製した。
（３）ペプシノーゲンＩＩの測定
実施例１の手順と同様に操作して、ペプシノーゲンＩＩを測定した。その結果を図１１に示す。
図１１に示した結果から、実施例５の方法（２．５％の塩化コリン存在下、第一試薬ｐＨ６．０）は検体鮮度の影響を受けにくい測定であることがわかる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によれば、径時の異なる検体について、異なる径時の影響を抑えてペプシノーゲン濃度を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】保存日数が０日である検体と保存日数が４日または１５日である検体についてのペプシノーゲンＩの測定結果の関係（実施例１）。
【図２】保存日数が０日である検体と保存日数が４日または１５日である検体についてのペプシノーゲンＩの測定結果の関係（比較例１）。
【図３】保存日数が０日である検体と保存日数が４日または１５日である検体についてのペプシノーゲンＩＩの測定結果の関係（実施例２）。
【図４】保存日数が０日である検体と保存日数が４日または１５日である検体についてのペプシノーゲンＩＩの測定結果の関係（比較例２）。
【図５】ペプシノーゲンＩについての変動率と相関係数のｐＨ依存性（実施例３）。
【図６】ペプシノーゲンＩＩについての変動率と相関係数のｐＨ依存性（実施例３）。
【図７】ペプシノーゲンＩについてのΔＯＤのｐＨ依存性（実施例３）。
【図８】ペプシノーゲンＩＩについてのΔＯＤのｐＨ依存性（実施例３）。
【図９】ペプシノーゲンＩについてのΔＯＤに対する塩化コリン濃度の影響（実施例４）。
【図１０】ペプシノーゲンＩＩについてのΔＯＤに対する塩化コリン濃度の影響（実施例４）。
【図１１】保存日数が０日である検体と保存日数が２１日である検体についてのペプシノーゲンＩＩの測定結果の関係（実施例５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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