(57)【要約】      （修正有）【課題】ＰＨＧＰｘのヒトゲノム遺伝子変異と特発性男性不妊症（特に無精子症や高度乏精子症患者）との関連・遺伝子変異による蛋白の発現への影響について明らかにすること。【解決手段】男性不妊症患者ＰＨＧＰｘゲノム遺伝子異常のＰＣＲ＿ＴＴＧＥ法による遺伝子変異の検出、男性不妊症患者ＰＨＧＰｘゲノム遺伝子異常のシークエンス法による検討、男性不妊患者ＰＨＧＰｘの特定変異ゲノム遺伝子の病態との相関の解析、及び得られた変異におけるＰＨＧＰｘの発現・機能に及ぼす影響についての検討等を行った結果、特定部位（プロモーター領域に存在する塩基）の変異と男性不妊症との相関から遺伝子診断、治療、新薬の研究に新規展開可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むリン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（以下ＰＨＧＰｘ）遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の変異の有無を指標にすることを特徴とする男性不妊症の診断のための検査方法。
【請求項２】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むＰＨＧＰｘ遺伝子の発現の減少を生じさせる変異の有無を指標とすることを特徴とする男性不妊症の診断のための検査方法。
【請求項３】
ＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の変異が、以下の変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの変異である請求項１又は２に記載の検査方法。
（１）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基の変異
（２）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基の変異
（３）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基のアデニンが対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換している変異
（４）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基のシトシンが対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換している変異
（５）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基のアデニンが対立遺伝子の双方においてチミンに置換している変異
（６）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基のシトシンが対立遺伝子の双方においてチミンに置換している変異
【請求項４】
請求項３に記載の方法に用いられる検査用ＤＮＡ断片。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるプライマーである請求項４のＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの塩基番号７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅できることを特徴とする請求項４または請求項５のＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの塩基番号７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基の変異を検出できることを特徴とする請求項４または５のＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号２〜９の少なくとも１に表された塩基配列を含む請求項６のＤＮＡ断片。
【請求項９】
以下のＤＮＡ断片からなる群；
１）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基及び７７９番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片、
２）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基及び７７９番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片の相補配列からなるＤＮＡ断片、
３）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基及び７７９番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるＤＮＡ断片、および
４）上記１）〜３）の配列のうち１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡ断片；
から選ばれるＤＮＡ断片の少なくとも５つの連続した塩基配列からなるヌクレオチドを含むＤＮＡ断片。
【請求項１０】
請求項４から９の何れか１項に記載のＤＮＡ断片の何れか１つを含む男性不妊症を診断するためのＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検査用試薬キット。
【請求項１１】
請求項９に記載のＤＮＡ断片が有する塩基配列の何れか一つを含む組換え用ＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＤＮＡを含む形質転換体。
【請求項１３】
男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列を解析し、健常者の塩基配列と異なる部分を同定することを特徴とするＰＨＧＰｘ遺伝子の変異箇所の同定方法。
【請求項１４】
男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列を解析し、健常者の塩基配列と異なる部分を同定し、該変異部分による遺伝子発現への影響を測定することを含むＰＨＧＰｘ遺伝子の変異箇所の同定方法。
【請求項１５】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析することを特徴とする、以下の用途からなる群から選ばれる少なくとも１つの用途のための検査方法。
１）不妊症患者の不妊原因の特定、
２）不妊症患者の不妊原因が、ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現量の低下であると特定、
３）不妊症発症リスクの特定、
４）ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現能の特定、および
５）上記１）〜４）の特定に基づく男性不妊症の診断。
【請求項１６】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、請求項１５に記載の検査方法。
【請求項１７】
配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１６に記載の検査方法。
【請求項１８】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
【請求項１９】
配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１８に記載の診断方法。
【請求項２０】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、請求項１５に記載の検査方法。
【請求項２１】
増幅した断片を制限酵素ＢｇｌＩで切断することを特徴とする、請求項２０に記載の検査方法。
【請求項２２】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を増幅することを特徴とする、請求項２０又は２１に記載の検査方法。
【請求項２３】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
【請求項２４】
増幅した断片を制限酵素ＢｇｌＩで切断することを特徴とする、請求項２３に記載の診断方法。
【請求項２５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を増幅することを特徴とする、請求項２３又は２４に記載の診断方法。
【請求項２６】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、請求項１５に記載の検査方法。
【請求項２７】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
【請求項２８】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、請求項１５に記載の検査方法。
【請求項２９】
被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
【請求項３０】
被験者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、該増幅されたＤＮＡ部分配列と配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いて該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定し、他方、該増幅されたＤＮＡ部分配列を制限酵素ＢｇｌＩで切断することにより該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする請求項１５に記載の検査方法。
【請求項３１】
被験者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、該増幅された部分配列と配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いて該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定し、他方、該増幅されたＤＮＡ部分配列を制限酵素ＢｇｌＩで切断することにより該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする診断方法。
【請求項３２】
請求項３０に記載の検査方法で用いられる検査用キット。
【請求項３３】
請求項３１に記載の診断方法で用いられる診断用キット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＨＧＰｘ遺伝子の変異に関係する疾患の検査方法、特に男性不妊症に関連する変異を有するＰＨＧＰｘ遺伝子を利用した男性不妊症に関連する遺伝子変異の検査法に関する。具体的には、ＰＨＧＰｘ遺伝子（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモーター領域の塩基配列中の変異、この変異の有無を指標とする男性不妊症に関連するＰＨＧＰｘ遺伝子変異を検査する方法、該検査方法に利用されるＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を含む試薬キット、さらには男性不妊症特異的な変異を有するＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域を含む組換えＤＮＡ分子、これを含む形質転換体、さらには、ＰＨＧＰｘ遺伝子変異を検査することによる以下のような用途（不妊症患者の不妊原因の判定。不妊症患者の不妊原因が、ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現能の低下と判定。不妊症発症リスクの判定。ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現能の判定）等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、結婚したカップルの約１割が不妊であり、さらに近年のストレス社会や、環境ホルモン等の問題により、不妊症例の割合は増加の傾向にある。不妊の原因の約半数は男性側にあると考えられている。
我が国における出生率は明らかに減少傾向にあり、不妊症の原因の約半数を占める男性不妊症の治療の進歩が期待されている。しかし、その治療成績はあまり良好とはいえない。この理由は、男性不妊症の原因の半数以上を占める特発性精子形成傷害の病因、病態がほとんど不明であり、理論的な治療がおこなわれていないからである。このため、精子形成機構の解明及び精子形成にかかわる遺伝子の同定が男性不妊症の診断や治療の進歩にも重要である。
近年のノックアウトマウスや発現遺伝子の解析から、精子形成に関わる遺伝子ａｚｏｏｓｐｅｒｍｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ（ＡＺＦ）は、Ｙ染色体・常染色体に広く存在していると考えられるようになっている。本発明の対象であるリン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ＰＨＧＰｘ）（ＥＣ１．１１．１．１２）は、酸化ストレスなどで生じた膜過酸化脂質を消去する酵素として見出された。本酵素には、ミトコンドリア型、非ミトコンドリア型、核型の３つのタイプが存在し、ひとつのゲノム遺伝子から３つのタイプが転写される。ＰＨＧＰｘは様々な臓器に広く存在するが、特に精巣に強い発現をしている（非特許文献１）。また精巣内では、特に後期精母細胞以降、精子形成細胞、精子に強い発現をしており（非特許文献２）、マウスやラットにおいては性成熟にしたがって、著しい発現上昇がみられ、精子形成に重要な役割を担っていることが推測されていた。本発明者等はこれまでにＰＨＧＰｘのｃＤＮＡやゲノムのクローニングをおこない、さらにミトコンドリア型、非ミトコンドリア型のＰＨＧＰｘの高発現細胞株を作製し、ＰＨＧＰｘの細胞内機能の解析を行っている（非特許文献１−１５）。その結果、非ミトコンドリア型ＰＨＧＰｘは核において、リポキシゲナーゼ（非特許文献５）やシクロオキシゲナーゼ（非特許文献１１）の活性化を抑制し、ロイコトリエン、プロスタグランジンの産生を抑制すること、ミトコンドリア型ＰＨＧＰｘはミトコンドリア電子伝達系から産生する活性酸素の消去を行い、ミトコンドリア機能の維持を行うこと（非特許文献６）、さらにミトコンドリア型ＰＨＧＰｘはミトコンドリアを経由するアポトーシスを抑制する抗アポトーシス因子であることを見出している（非特許文献９）。
精子のミトコンドリアはエネルギーの産生部位であり、精子の運動能に重要な役割を果たしていると考えられる。本発明者等は、ヒト精子のミトコンドリアにＰＨＧＰｘが多量に存在すること、精子のＰＨＧＰｘは過酸化水素や脂質ヒドロペルオキシドの消去に重要な役割を担っていることを明らかにした（非特許文献１５）。このことから精子の運動能の低い男性不妊症患者精子のＰＨＧＰｘの発現を抗ＰＨＧＰｘ抗体により検討したところ、男性不妊症患者の約１割に著しいミトコンドリア型ＰＨＧＰｘの発現低下症をはじめて見出し、２００１年に報告した（非特許文献１５）。これらの患者はＷＨＯの基準による分類から、いずれも重度な男性不妊症患者であるａｚｏｚｏｏｓｐｅｒｉｍａに属し、このカテゴリー内では約３割を占めることが明らかとなった。このＰＨＧＰｘの著しい発現低下症の精子の特徴は、ミトコンドリアの障害による運動能の低下と総精子数の著しい減少である。２００２年には、イタリアのグループも同様に蛋白質化学的解析から、ＰＨＧＰｘの発現量の低下と男性不妊症の相関性を報告した（非特許文献１７）。このようにミトコンドリア型ＰＨＧＰｘは精巣分化における抗アポトーシス因子であるとともに、精子ミトコンドリアの構造蛋白質（非特許文献１６）・ミトコンドリア防御酵素として機能しており、精子形成に重要な役割を担っている。すなわち、ＰＨＧＰｘは新たに見出された精子形成に関わる遺伝子ＡＺＦのひとつである。
【０００３】
不妊症の患者はその原因が多種多様であることから、通常様々な検査を重ねることによりその原因を特定し、原因に適した治療方法を受けることになる。上記のように、ＰＨＧＰｘの発現低下は男性不妊の一因であることが知られている。しかしながら、ＰＨＧＰｘの発現は後期精母細胞以降の生殖細胞で特異的に認められること、また、その発現量は多いものではないことから、ＰＨＧＰｘの発現量を解析することは、患者に過度の負担を強いることになる上、技術的にも難しい。したがって、不妊症の原因がＰＨＧＰｘの発現低下であることを簡単な検査で特定できる方法は現在までのところ知られていなかった。
【０００４】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】Imai H., Sumi D., Hanamoto A., Arai M., Sugiyama K., Chiba N., Kuchino Y. and Nakagawa Y. Molecular cloning and functional expression of cDNA for rat phospholipid Hydroperoxide glutathione peroxidase:3'-untranslated region of the gene is necessary for functional expression. J. Biochem. 118 1061-1067 (1995)
【非特許文献２】Imai H., Sumi D., Sakamoto H., Hamamoto A., Arai M., Chiba N. and Nakagawa Y. Overexpression of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase suppressed cell death due to oxidative damage in rat basophile leukemia cells(RBL-2H3). Biochem. Biophys. Res. Commun. 222 432-438 (1996)
【非特許文献３】Arai M., Imai H., Sumi D., Imanaka T., Takano T., Chiba N. and Nakagawa Y. Import into Mitochondria of Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase Requires a Leader Seaquence Biochem. Biophys. Res. Commun. 227 433-439 (1996)
【非特許文献４】Arai M., Imai H., Metori A. and Nakagawa Y. Preferential esterification of endogenously formed 5-hydroxyeicosatetraenoic acid to phospholipids in activated polymorphonuclear leukocyte. Eur. J. Biochem. 244 513-519 (1997)
【非特許文献５】Imai H., Narashima K., Sakamoto H., Chiba N. and Nakagawa Y. Suppression of leukotoriene formation in RBL2H3 cells that overexpressed phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase. J. Biol. Chem. 273 1990-1997 (1998)
【非特許文献６】Arai M., Imai H., Koumura T., Madoka Y., Emoto K., Umeda M., Chiba N. and Nakagawa Y. Mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx) play a major role in preventing oxidative injury to cells. J. Biol. Chem. 274 4924-4933 (1999)
【非特許文献７】Chiba N., Imai H. and Nakagawa Y. Determination of 5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid produced in rat basophilic leukemia cell line RBL2H3 by high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection. J. Chromatography B.728(1) 35-40 (1999)
【非特許文献８】Chiba N., Imai H., Narashima K., Arai M., Oshima G., Kunimoto M. and Nakagawa Y. Cellular Glutathione Peroxidase as a Predominant Scavenger of Hydroperoxyeicosatetraenoic Acids in Rabbit Alveolar Marcrophages. Biochem Pharm. Bull 22(10) 1047-1051(1999)
【非特許文献９】Nomura K., Imai H., Koumura T., Arai M., and Nakagawa Y. Mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase suppresses apoptosis mediated by a mitochondrial-death pathway. J. Biol. Chem. 274 28284 - 29302 (1999)
【非特許文献１０】Nomura K., Imai H., Koumura T., Kobayashi T. and Nakagawa Y. Mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase inhibits the release of cytochrome c from mitochondria by suppressing the peroxidation of cardiolipin in hypoglycemia-induced apoptosis. Biochem. J. 351 183-193 (2000)
【非特許文献１１】Sakamoto H., Imai H. and Nakagawa Y. Involvement of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in the modulation of prostaglandin D2 synthesis. J. Biol. Chem. 275 40028-40035(2000)
【非特許文献１２】Nakagawa Y. and Imai H. Novel functions of mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) as anti-apoptotic factor -Mini review-. J. Health Science 46 869 11-14 (2000)
【非特許文献１３】Nomura K., Imai H., Koumura T. and Nakagawa Y. Involvement of mitochondrial phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidaseas an antiapoptotic factor. Biol. Signals Recept. Vol.10 81-92 (2001)
【非特許文献１４】Obata F., Ichikawa T., Imai H., Nakagawa Y., Komatsu H. and Ishihara K., Okayasu I. and Kusakabe T. Selenium-dependent glutathione peroxidase-GI is localized in basal granulated cells of rat stomach. Biomed Res. 22(1) 7-14 (2001)
【非特許文献１５】Imai H., Suzuki K., Ishizaka K., Ichinose S., Oshima H., Okayasu I., Emoto K., Umeda M. and Nakagawa Y. Failure of the expression of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx) in the spermatozoa of human infertile males. Biology of Reproduction 64 674-683 (2001)
【非特許文献１６】Ursini F., Heim S., Kiess M., Maiorino M., Roveri A., Wissing J. and Flohe L. Dual function of the selenoprotein PHGPx during sperm maturation. Science 285(5432):1393-1396 (1999)
【非特許文献１７】Foresta C., Flohe L., Garolla A., Roveri A., Ursini F. and Maiorino M. Male Fertility Is Linked to the Selenoprotein Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase. Biol Reprod. 67(3):967-971 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記に述べたように男性不妊症患者のうち、乏精子症患者には、精子でのＰＨＧＰｘの蛋白質の発現量が著しく低下している患者が認められることが明らかとなったが、その発現低下の原因は全く明らかになっていない。また、精子の全くない無精子症やあるいは高度乏精子症で蛋白化学的に解析が不可能な患者においてはＰＨＧＰｘの関与を解析することが不可能である。本発明の課題は、新たに見出されたＡＺＦ遺伝子のひとつであるＰＨＧＰｘのヒトゲノム遺伝子変異と特発性男性不妊症（特に無精子症や高度乏精子症患者）との関連・遺伝子変異による蛋白の発現への影響について明らかにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、男性不妊症患者ＰＨＧＰｘゲノム遺伝子異常のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による遺伝子変異の検出、男性不妊症患者ＰＨＧＰｘゲノム遺伝子異常の直接シークエンス法による検討、男性不妊症患者ＰＨＧＰｘの特定変異ゲノム遺伝子の病態との相関の解析、及び得られた変異におけるＰＨＧＰｘの発現・機能に及ぼす影響についての検討等をおこない、その結果、特定部位の変異と男性不妊症との相関を見出し本発明を完成した。
つまり、本発明は、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡサンプルの塩基配列を解析することにより、不妊症の原因がＰＨＧＰｘの発現低下であることを特定できることを明らかにしたものである。ＰＨＧＰｘの発現低下が不妊の原因であるということを特定できれば、不必要な検査を受ける必要がなくなり患者の負担を軽減できる上、例えばＰＨＧＰｘを生理的な濃度で供与する手段（例えば、遺伝子治療等）を講じる等、不妊症の原因にあった適切な治療を患者に施すことが可能になる。本発明は、患者の負担が少ない簡便な方法であるので、不妊症の原因を診断する上で、第一選択肢となりうる。
【０００７】
本発明は、以下からなる発明を提供する。
１．配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むリン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（以下ＰＨＧＰｘ）遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の変異の有無を指標にすることを特徴とする男性不妊症の診断のための検査方法。
２．配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むＰＨＧＰｘ遺伝子の発現の減少を生じさせる変異の有無を指標とすることを特徴とする男性不妊症の診断のための検査方法。
３．ＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の変異が、以下の変異からなる群から選ばれる少なくとも１つの変異である前項１又は２に記載の検査方法。
（１）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基の変異
（２）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基の変異
（３）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基のアデニンが対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換している変異
（４）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基のシトシンが対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換している変異
（５）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基のアデニンが対立遺伝子の双方においてチミンに置換している変異
（６）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基のシトシンが対立遺伝子の双方においてチミンに置換している変異
４．前項３に記載の方法に用いられる検査用ＤＮＡ断片。
５．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるプライマーである前項４のＤＮＡ断片。
６．配列番号１に記載のポリヌクレオチドの塩基番号７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を含むＤＮＡ断片を増幅できることを特徴とする前項４または前項５のＤＮＡ断片。
７．配列番号１に記載のポリヌクレオチドの塩基番号７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基の変異を検出できることを特徴とする前項４または５のＤＮＡ断片。
８．配列番号２〜９の少なくとも１に表された塩基配列を含む前項６のＤＮＡ断片。
９．以下のＤＮＡ断片からなる群；
１）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基及び７７９番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片、
２）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基及び７７９番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片の相補配列からなるＤＮＡ断片、
３）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基及び７７９番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるＤＮＡ断片、および
４）上記１）〜３）の配列のうち１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡ断片；
から選ばれるＤＮＡ断片の少なくとも５つの連続した塩基配列からなるヌクレオチドを含むＤＮＡ断片。
１０．前項４から９の何れか１項に記載のＤＮＡ断片の何れか１つを含む男性不妊症を診断するためのＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検査用試薬キット。
１１．前項９に記載のＤＮＡ断片が有する塩基配列の何れか一つを含む組換え用ＤＮＡ。
１２．前項１１に記載のＤＮＡを含む形質転換体。
１３．男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列を解析し、健常者の塩基配列と異なる部分を同定することを特徴とするＰＨＧＰｘ遺伝子の変異箇所の同定方法。
１４．男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列を解析し、健常者の塩基配列と異なる部分を同定し、該変異部分による遺伝子発現への影響を測定することを含むＰＨＧＰｘ遺伝子の変異箇所の同定方法。
１５．配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析することを特徴とする、以下の用途からなる群から選ばれる少なくとも１つの用途のための検査方法。
１）不妊症患者の不妊原因の特定、
２）不妊症患者の不妊原因が、ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現量の低下であると特定、
３）不妊症発症リスクの特定、
４）ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現能の特定、および
５）上記１）〜４）の特定に基づく男性不妊症の診断。
１６．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、前項１５に記載の検査方法。
１７．配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、前項１６に記載の検査方法。
１８．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
１９．配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、前項１８に記載の診断方法。
２０．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、前項１５に記載の検査方法。
２１．増幅した断片を制限酵素ＢｇｌＩで切断することを特徴とする、前項２０に記載の検査方法。
２２．配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を増幅することを特徴とする、前項２０又は２１に記載の検査方法。
２３．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基がチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
２４．増幅した断片を制限酵素ＢｇｌＩで切断することを特徴とする、前項２３に記載の診断方法。
２５．配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を増幅することを特徴とする、前項２３又は２４に記載の診断方法。
２６．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、前項１５に記載の検査方法。
２７．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
２８．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、前項１５に記載の検査方法。
２９．被検者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、被検者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかおよび／または該ポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする、男性不妊症の診断方法。
３０．被験者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、該増幅されたＤＮＡ部分配列と配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いて該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定し、他方、該増幅されたＤＮＡ部分配列を制限酵素ＢｇｌＩで切断することにより該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする前項１５に記載の検査方法。
３１．被験者からＤＮＡを得て、該ＤＮＡから配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に記載のポリヌクレオチドを用いて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目の塩基および／または７７９番目の塩基を少なくとも含む部分配列を増幅し、該増幅された部分配列と配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に記載のポリヌクレオチドを用いて該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２番目のアデニンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定し、他方、該増幅されたＤＮＡ部分配列を制限酵素ＢｇｌＩで切断することにより該被験者のＤＮＡにおいて配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目のシトシンに相当する塩基が対立遺伝子のいずれにおいてもチミンに置換しているかどうかを同定することを特徴とする診断方法。
３２．前項３０に記載の検査方法で用いられる検査用キット。
３３．前項３１に記載の診断方法で用いられる診断用キット
【発明の効果】
【０００８】
本発明は、男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域に特有の変異が存在することを見出した。そして、ＰＨＧＰｘ遺伝子上の男性不妊症に特有の変異が男性不妊症におけるＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検査に有用であることを明らかにした。このことは、男性不妊症の遺伝子診断、また、その治療、新薬の研究において新規な展開を達成するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（１）ＰＨＧＰｘ遺伝子解析
本発明の１は、男性不妊症の可能性のある個体から、ＰＨＧＰｘ遺伝子特にプロモーター領域を少なくとも含むＤＮＡを抽出し、該ＰＨＧＰｘ遺伝子、特にプロモーター領域の塩基配列中の男性不妊症に特有の変異を検出することを特徴とする男性不妊症に関連するＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検出方法である。該検出方法を用いた男性不妊症の遺伝子診断方法も本発明の範囲に含まれる。
プロモーター領域を含むヒトのＰＨＧＰｘ遺伝子の部分塩基配列は、配列表の配列番号１に示した。以下、ＰＨＧＰｘ遺伝子における塩基の位置を表わすとき、該遺伝子の転写開始点の塩基を＋１として慣用の表示方法に従って表示する。配列番号１に記載の塩基配列において、ＰＨＧＰｘ遺伝子の転写開始点に相当する塩基は、配列表の配列番号１の第１０２７番目のアデニン（以下、Ａ又はａと表示する）である。したがって、例えばＰＨＧＰｘ遺伝子の−２７５番目及び−２５８番目の塩基は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列においてそれぞれ第７５２番目及び第７７９番目の塩基に相当する。
【００１０】
男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列中における変異を指標にし、特に該遺伝子における配列番号１に記載の塩基配列において７５２（−２７５）番目のアデニンおよび／または７７９（−２５８）番目のシトシン（以下Ｃ又はｃと表示する）における変異は、男性不妊症に関連するＰＨＧＰｘ遺伝子上の変異の検査を可能とする。この変異の同定は、ダイレクトシークエンス法等で変異を直接測定することで検査可能である。
あるいは、当該変異はＰＨＧＰｘ遺伝子の発現に変異を生じるものであることから、制御下蛋白質のｍＲＮＡレベルでの転写量測定、又は制御下蛋白質の発現量をマーカー蛋白質の発現量を確認することで検査可能である。
【００１１】
検査における指標としては、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列、例えば以下における変異等が挙げられる
（１）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基の変異
（２）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９（−２５８）番目の塩基の変異
（３）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基のアデニンが対立遺伝子のいずれかにおいてチミン（以下、Ｔ又はｔと表示する）に置換している変異
（４）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９（−２５８）番目の塩基のシトシンが対立遺伝子のいずれかにおいてチミンに置換している変異
（５）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基のアデニンが対立遺伝子の双方においてチミンに置換している変異
（６）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９（−２５８）番目の塩基のシトシンが対立遺伝子の双方においてチミンに置換している変異
【００１２】
さらに、ＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列の具体的な変異のうち特に好適な指標となる変異は、以下があげられる。
（７）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの塩基番号７５２（−２７５）番目の塩基の置換がチミンにホモに置換しているもの、
（８）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９（−２５８）番目の塩基の置換がチミンにホモに置換しているもの、
（９）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基の置換がチミンにホモに置換し、同時にＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列の塩基番号７７９（−２５８）番目の塩基の置換がチミンにホモに置換しているもの。
【００１３】
上記したＰＨＧＰｘ遺伝子の男性不妊症特有の変異の検査方法としては、（１）男性不妊症の可能性のある個体からＤＮＡを精製し、（２）該ＤＮＡのＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域をそれ自体既知の通常用いられる方法によって解析することによって行うことができる。
男性不妊症の可能性のある個体から精製するＤＮＡは、すくなくともＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域を含むものであれば如何なるものであってもよく、ゲノムＤＮＡが好ましく用いられる。ＤＮＡを精製するために上記個体から取得される生体試料としては、生体から取得することが容易であり、ＰＨＧＰｘ遺伝子を含むＤＮＡを含有するものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、体液、精液、血液に含まれる白血球細胞、毛髪、生体材料組織、手術切除組織等が用いられる。これらの生体試料からのＤＮＡの取得は、それ自体既知の通常用いられる方法を用いて行うことができる。
【００１４】
かくして得られたＤＮＡについて、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の上記した変異を解析する方法としては、例えばＡ）ＰＣＲ断片シークエンシング法、Ｂ）一本鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ法：Orita M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,86(8), 2766-2770(1989)）、Ｃ）ヘテロ二本鎖変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ法：Sheffield V. C., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86(1),232-236(1989)）、Ｄ）インベーダー法（Griffin, T. J., et al., Trend Biotech, 18,77(2000)）、Ｅ）ＳｎｉＰｅｒＴＭ法（Amersham pharmacia biotech）、Ｆ）タックマンＰＣＲ法（Livak K. J., Genel. Anal., 14,143(1999); Morris T., etal., J. Clin. Microbiol.,34, 2933(1996)）、Ｇ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Griffin T. J.,etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96(11),6301-6(1999)）、Ｈ）制限酵素長多型解析法（RFLP：Murray J. C., et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80(19),5951-5955(1983)）、Ｉ）ＤＮＡチップハイブリダイゼーション法（Kokoris K.,et al., J. Med. Genet., 36, 730(1999)）、Ｊ）ＭａｓｓｃｏｄｅＴＭ法（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等に例示される公知の方法から選択され得るが、これらに限定されるものではなく、遺伝子変異を検出する方法であれば、あらゆる手段を適用することができる。
【００１５】
解析法としては、取得したＤＮＡを鋳型として、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域における上記の変異を含む断片をＰＣＲにより増幅した後に、これを適当な方法によりシークエンシングして変異の有無を分析する。具体的には、例えばＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目と７７９（−２５８）番目の塩基の変異については、実施例に示すとおり、配列番号２のプライマーａと配列番号３のプライマーｈを用いたＬＡ−ＰＣＲにより増幅したａｈ断片をシークエンスして変異の有無を解析する。ここで、用いられるプライマーとしては、ＰＨＧＰｘ遺伝子の上記の変異部分を含むＤＮＡ断片を増幅し得るものが用いられ、プライマーａとプライマーｈには限定されない。変異の検出には、上記の変異を含む部位に相補的な合成オリゴヌクレオチドを設定し、ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせ点変異を検出するのである。この場合のオリゴヌクレオチドは、長さ５〜５０個で変異のターゲット部位を中心部に設計すればよい。
【００１６】
解析のためには、定量化分析のためのリアルタイムＰＣＲ法（Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ法、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー法、ａｄｊａｃｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ法、及びインターカレーション法）、ｍｕｔａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＭＡＳＡ）法、又は／及び、ＰＣＲ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法等を利用して検出してもよい。
具体的には、例えばＴａｑ−Ｍａｎプローブ法では、ＰＣＲをＴａｑ−Ｍａｎプローブと組合せて用いる。Ｔａｑ−Ｍａｎプローブは、２０−３０塩基のオリゴヌクレオチドで、その５’末端をフルオレセイン系蛍光色素（レポーター色素）、３’末端をローダミン系蛍光色素（クエンチャー色素）により標識されている。反応はＰＣＲの反応過程でＰＣＲプライマー〔実施例ではＦｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして１４０Ａ／Ｔ−２８Ｆ（配列番号６）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして１４０Ａ／Ｔ−１７８Ｒ（配列番号７）を用いた〕とともに、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ〔実施例では１４０Ａ（配列番号８）、１４０Ｔ（配列番号９）を用いた〕が、標的ＤＮＡにアニールする。ＰＣＲの伸長反応とともに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブの５’末端から加水分解がおこる。その結果、レポータ色素の遊離がおこりシグナルを発して、標的ＤＮＡの量を測定できるのである。
ＰＣＲ−ＲＦＬＰでは、遺伝子の変異が予測される標的領域をＰＣＲで増幅し、正常配列の当該変異が起こり得る部位を認識する制限酵素（例えばＢｇｌＩ）で増幅産物を処理する。点突然変異の生じているＤＮＡは切断されないので正常配列との差異をサイズの大きさとして電気泳動等で分析する。
【００１７】
本発明には、ＰＨＧＰｘ遺伝子の上記変異を検出するために、変異を基礎にして設計された上記方法で用いられる全てのポリヌクレオチド、プライマー、あるいはプローブなどが含まれる（本明細書中では、これらを「検査用ＤＮＡ断片」と称することがある）。また、これらの検査用ＤＮＡ断片には、必要であれば適当な蛍光物質などにより修飾したものも含まれる。
【００１８】
本発明においては、上記変異に関する情報をもとに、既知遺伝子変異検出手段と組み合わせ、さらに各検出手段所望の検出試薬と前記選択される検査用ＤＮＡ断片等を組合わせれば、好適な男性不妊症に関連するＰＨＧＰｘ遺伝子上の変異の検査用試薬キットが提供される。
【００１９】
（２）ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域において男性不妊症特有の変異を有するポリヌクレオチド
上記（１）の検査法により指標とされる変異を有するＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域のポリヌクレオチド（以下、これを単に「変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチド」と称することがある）は男性不妊症の患者が生体内に有しているＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域と同様のものである可能性が極めて高いため、男性不妊症の研究に非常に有用である。
変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチドとしては、ヒトの配列として、ＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域の塩基配列において、上記（１）の検査法により指標とされる変異を有するものが挙げられる。具体的な変異としては、例えば、以下の少なくとも５つのヌクレオチドからなる塩基配列を含むＤＮＡ断片が挙げられる。
【００２０】
１）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片、
２）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片と相補配列からなるＤＮＡ断片、
３）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の少なくとも１がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるＤＮＡ断片、
４）上記１）〜３）の配列のうち１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡ断片。
【００２１】
さらに、好適な指標となるものは、以下のものがあげられる。
５）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基がチミンに置換された配列、
６）配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基がチミンに置換された配列を含むＤＮＡ断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる配列からなるＤＮＡ断片、
７）上記５）又は６）の配列のうち１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡ断片。
【００２２】
このようなポリヌクレオチドとしては、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の全長を含むものに限らず、少なくとも１つの上記変異を有するものであれば塩基数５〜１００、５〜５０、及び５〜３０個等如何なるものでもよい。また、これらのポリヌクレオチドは、男性不妊症の個体から上記（１）に記載した方法により取得したＤＮＡからＰＣＲなどの方法により調製したものでもよいし、野生型のＰＨＧＰｘ遺伝子を有する個体から取得したＤＮＡにそれ自体既知の通常用いられる方法により変異を導入して作製することもできる。さらには、化学合成により取得することもできる。
上記変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチドは、これを含む組換えベクターを作製し、遺伝子発現検査用などに用いられる。ベクターとしてはこれを導入する宿主内でＰＨＧＰｘポリヌクレオチドが機能する（ＰＨＧＰｘ遺伝子あるいはマーカー遺伝子が発現する）かどうかが判定されうるものであれば特に制限はない。また、プラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。
【００２３】
具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）等が挙げられる。また、ｐＭＫＩＴＮｅｏ（丸山和夫、細胞工学別冊８、新細胞工学実験プロトコール、２５９頁、秀潤社、１９９３年）等も好ましく用いられる。
【００２４】
ベクターへの変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチド又はこれを含むＤＮＡ断片がプロモーター機能を発揮しうるかどうかを判定することを目的とするから、ベクター中のレポーター遺伝子（例えば実施例ではルシフェラーゼ系を用いた）の上流に、該レポーター遺伝子の発現を制御下におくように連結して行う。また、変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチドとレポーター遺伝子の間にコザック配列（Kozak M., Gene, 234, 187, (1999)）を挿入したり、レポーター遺伝子の下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、ＦＬＡＧタグ（BioTechniques, 7, 580, (1989)）等が挙げられる。
【００２５】
このようにして得られた本発明の組換えベクターは、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551(1983)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Science,215,166(1982)）、電気パルス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81,7161(1984)）、インビトロパッケージング法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA,72, 581(1975)）、ウィルスベクター法（Cell, 37, 1053(1984)）、あるいはリポフェクション法（Lipofection Reagent(GibcoBRL社製））等によって適当な宿主に導入される。
【００２６】
このとき、該組み換えベクターを導入する宿主としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつマーカー蛋白質等が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばＡｃＮＰＶ（J. Biol. Chem., 263, 7406(1988)）とその宿主であるＳｆ−９（J. Biol. Chem.,263, 7406(1988)）等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞C127（J. Viol., 26, 291(1978)）やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 77, 4216(1980)）やアフリカミドリザル腎臓由来細胞ＣＯＳ−７（ATCC CRL1651：アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション）等が挙げられる。
【００２７】
上記したような組み換えベクターを用いる発現方法の他に、変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチドを宿主の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（A. A. Vertes et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,57,2036(1993)）、あるいはトランスポゾンや挿入配列（A. A. Vertes et al.,Molecular Microbiol., 11,739(1994)）等を用いて発現させることができる。
【００２８】
組み換えベクターを導入した導入体は、それぞれに適した培地により培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清及び耐性スクリーニングに用いられる薬剤などが含有される。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合には、例えばＬＢ培地（ナカライテスク社製）等、酵母の場合には、ＹＰＤ培地（Genetic Engineering, 1, 117, Plenum Press(1979)）等、宿主が昆虫細胞及び動物細胞の場合は、２０％以下のウシ胎仔血清を含有するＨａｍ−１２培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社製）等を挙げることができる。また、培養は通常温度２０℃〜４５℃、ＣＯ２濃度２〜１０％の範囲で行うことが好ましい。培養時間は、宿主及び組み換えベクター等によって適宜選択することができるが、好ましくは１２〜８０時間である。さらに、必要に応じて通気、攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも導入宿主が生育し、挿入されたマーカー蛋白質等が生成されれば如何なるものであってもよい。
【００２９】
また、上記変異ＰＨＧＰｘポリヌクレオチドは、公知の無細胞蛋白質合成系等によってもマーカー蛋白質の発現を指標にその機能の判定をすることができる。無細胞蛋白質合成系に用いられる細胞抽出液として具体的には、大腸菌等の微生物、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等、既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Pratt J. M. et al., Transcription and Tranlation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins S. J., eds, IRL Press, Oxford(1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。
【００３０】
市販の細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＲＴＳ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製、インビトロテック社）等が挙げられる。
【００３１】
抽出されたマーカー蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等により分離し、適当な染色試薬、例えば、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）等によりゲルを染色することにより確認することができる。
【００３２】
あるいは、ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子変異を有するプロモーター領域と該プロモーター領域の作用により発現するレポーター遺伝子との融合体を用い、マウス精巣にインビボで遺伝子導入して、該レポーター遺伝子の発現を確認することにより、ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子変異を有するプロモーター領域のインビボでの機能を試験することも可能である。かかる方法は、既に開示されているＨｕａｎｇらの方法に従って実施可能である（Huang Z. et al., FEBS Letters, 487, 248-251 (2000)）。
【００３３】
以上説明したように、本発明は男性不妊症と遺伝子変異の関係を明らかにしたことから、この知識を利用すれば、（１）男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域に相当する配列を解析し、健常者の配列と異なる部分を同定することを特徴とする男性不妊症に関連するＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検査方法に用いられる変異箇所の同定方法や、（２）男性不妊症患者のＰＨＧＰｘ遺伝子中のプロモーター領域に相当する配列を解析し、健常者の配列と異なる部分を同定し、該変異部分による遺伝子発現への影響を測定することを含む男性不妊症に関連するＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検査方法に用いられる変異箇所の同定方法、さらに（３）上記記載の検査法による男性不妊症の診断方法に応用可能である。加えて、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの一部を少なくとも含むＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を解析することによって、該検査方法は以下の用途から選択される判定に有用である。１）不妊症患者の不妊原因の特定、２）不妊症患者の不妊原因が、ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現量の低下である特定、３）不妊症発症リスクの特定、４）ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現能の特定、５）上記１）〜４）の特定に基づく男性不妊症の診断。また、本発明による男性不妊症と特定遺伝子変異の関係の知見をもとにして、該変異が診断された患者に対して、当該変異部位を遺伝子治療的に修復する又は補完する手段を導入することは男性不妊症の治療法として有用である。特に、上記組換えベクターを利用した手段により、正常なＰＨＧＰｘ遺伝子の発現系を導入することは有用である。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
また、以下の実施例において行なった全ての実験は北里大学倫理審査委員会の承認を受けて行なったものである。
【００３５】
実施例１
ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検出
男性不妊症患者由来のゲノム試料について、第１９番染色体上腕に存在する４型グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ４）であるＰＨＧＰｘ遺伝子異常の検出を、該遺伝子のプロモーター領域約１０００ｂｐ、７つのエキソン及びイントロンを検討対照として、ＰＣＲ＿ＴＴＧＥ（ＰＣＲ＿Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法により行った。すなわち、検査対象範囲のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＴＴＧＥ法にて遺伝子変異・欠失の有無について検出を行った。
【００３６】
ゲノム試料は、患者又は健常者の血液３ｍｌから、ＧＦＸ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、使用説明書に基づき取得した。ＰＣＲに用いたプライマーは、図１のＰＨＧＰｘ遺伝子の構造を説明する模式図中に矢印で示した部分の塩基配列に基づいて設計し作成したものを用いた。その結果、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域に変異があると考えられた。
【００３７】
ＰＣＲ−ＴＴＧＥ法により変異の可能性があると考えられたプロモーター領域について、不妊症患者５３名及び健常者１０名のゲノム試料から、その領域をＰＣＲにより増幅し、ダイレクトシークエンス法を用いて配列の分析を行い、さらに詳細に遺伝子変異・欠失の同定を行った。まず、ゲノム試料を鋳型として、プロモーター領域の塩基配列に基づいて設計し作成したプライマーａ及びｈを用いてＬＡ−ＰＣＲ法により該ゲノムの部分配列を増幅した。得られた増幅産物から電気泳動法により目的とするＤＮＡ断片を分離し、さらにジーンエリュートアガローススピンカラム（ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ａｇａｒｏｓｅ  ＳＰＩＮ  ＣＯＬＵＭＮ、ＳＩＧＭＡ）を用いて常法に従って抽出処理を行い、該ＤＮＡ断片（以下、ａｈフラグメントという）を精製した。ａｈフラグメントを鋳型にして、さらに、プライマーｃ及びｊ、あるいはプライマーｐ及びｅを用いてＬＡ−ＰＣＲ法を行い、ｃｊフラグメント及びｐｅフラグメントを得た。
これらＤＮＡ断片の配列をダイレクトシークエンス法により分析した結果、不妊症患者のｃｊフラグメントにおいて、−６２９番、−５７８番又は−５２１番の塩基の少なくとも１つの塩基に一塩基遺伝子多型（Singlenucleotide polymorphism、SNP)が存在することが明らかになった。また、ｐｅフラグメントにおいて、−２７５（７５２）番目の塩基がＡからＴに、および／または−２５８（７７９）番目の塩基がＣからＴに置換しているものがあることを見出した。
さらに、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基および／または７７９（−２５８）番目の塩基のＳＮＰについては、患者特異的に変異がみられた。このことから、ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基および／または７７９（−２５８）番目の塩基のＳＮＰが、男性不妊症と関連すると考えた。
【００３８】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基を含むｐｅフラグメントを増幅するために用いたプライマーを以下に示す（図１参照）。
プライマーａ：cgctcgtgta atcccagct            配列番号２
プライマーｈ：accaaggtca ctggagcct            配列番号３
プライマーｐ：aggtaaataa gagttgggg            配列番号４
プライマーｅ：acagaattcc ggacttgtt gttggcgac  配列番号５
【００３９】
ＬＡ−ＰＣＲに用いた試薬を以下に示す。１０×ＬＡ−ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋無添加）、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ及びＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＴａｑはＴＡＫＡＲＡ社より入手した。
ゲノム  ＤＮＡ                    １００ｎｇ
１０×ＬＡ−ＰＣＲ  バッファーＩＩ（Ｍｇ２＋無添加）
５μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２              ５μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ          ８μｌ
２５μＭ  ５’プライマー          ０．４μｌ
２５μＭ  ３’プライマー          ０．４μｌ
ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ        ０．５μｌ
ＰＣＲ用滅菌水                    適当量
全量５０μｌ
【００４０】
ＰＣＲの運転条件を以下に示す。
９４℃に１分間
９８℃で２０秒間、６８℃で１５分間のサイクルを１４回
９８℃で２０秒間、６８℃で１５分＋１５秒間のサイクルを１６回
最後に、７２℃で１０分間
【００４１】
実施例２
ＰＨＧＰｘ遺伝子変異と男性不妊症との相関の解析
実施例１で増幅して得たｐｅフラグメントを用い、遺伝子変異の簡易検出法として、制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ法）及びリアルタイム−ＰＣＲ法を用いて、不妊症患者由来及び健常人由来のＰＨＧＰｘ遺伝子変異の検出を行い、該変異と男性不妊症との関連について解析を行った。
【００４２】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９（−２５８）番目の塩基の解析は、制限酵素ＢｇｌＩを用いてＲＦＬＰ法により行った。７７９Ｃ（野生型）の場合は、ＢｇｌＩが７７９（−２５８）番目の塩基の手前でｐｅフラグメントを切断するので、１５３ｂｐと５５ｂｐの２つのＤＮＡ断片が生じる。しかし、７７９（−２５８）番目の塩基がＴに変異している場合は、ＢｇｌＩによる切断がおこらないため、２０８ｂｐのままである。したがって、電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し染色してＲＦＬＰパターンを得ることにより、点変異の有無が検出できる。図２に示したように、ＲＦＬＰパターンにおいて１５３ｂｐと５５ｂｐの各ＤＮＡ断片を示す２つのバンドが得られた場合は、該変異がＰＨＧＰｘ対立遺伝子の双方に存在すると判定できる。一方、２０８ｂｐ、１５３ｂｐ及び５５ｂｐのＤＮＡ断片を示す３つのバンドが得られた場合は、該変異がＰＨＧＰｘ対立遺伝子の一方にのみ存在すると判定できる。
以下、ＰＨＧＰｘ遺伝子のある位置の塩基が対立遺伝子の双方で同一であることを「ホモ」と称し、対立遺伝子で異なることを「ヘテロ」と称することがある。また、「ホモ」又は「ヘテロ」の塩基を、塩基を意味する記号Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧと、記号／を用いて表わすことがある。例えばＣ／ＣとはＰＨＧＰｘ対立遺伝子の双方である位置の塩基がＣであることを意味し、Ｃ／ＴとはＰＨＧＰｘ対立遺伝子においてある位置の塩基が一方の遺伝子ではＣであり他方ではＴであることを意味する。
上記方法により、健常者５０名及び不妊症患者３１６名について７７９（−２５８）番目の塩基の解析を行った。その結果、７７９（−２５８）番目の塩基が対立遺伝子の双方でＴに変異している（Ｔ／Ｔ）割合が、健常人と比較して不妊症患者で高いことが明らかになった（表１）。このことから、７７９（−２５８）番目の塩基におけるＣからＴへの変異がホモであることが、男性不妊症に関連すると考えられる。
【００４３】
【表１】
2004344164.tif 000002
【００４４】
配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基の解析は、健常者５０名及び不妊症患者３１３名について、Ｔａｑ−ｍａｎＰＣＲ法により常法に従って行った（Livak K. J., Genel. Anal.,14,143(1999); Morris T., et al., J. Clin. Microbiol., 34, 2933(1996)）。用いたプライマー及びプローブを以下に示す。
フォワードプライマー  １４０Ａ／Ｔ−２８Ｆ：
tctgcgagtt ggagaaacca  配列番号６
リバースプライマー  １４０Ａ／Ｔ−１７８Ｒ：
gcttgtgtct aggaggccgt  配列番号７
Ｔａｑｍａｎ  ＭＧＢプローブ  １４０Ａ：
ctgcctcccg acgc        配列番号８
Ｔａｑｍａｎ  ＭＧＢプローブ  １４０Ｔ：
tgcctcccgt cgc         配列番号９
【００４５】
用いた試薬及び方法を以下に示す。１０×ＰＣＲ反応バッファー（Ｍｇ２＋添加）、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｕｔｒｅ及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ社より入手した。
抽出したＰＣＲ産物（１００ｎｇ相当）
１０×ＰＣＲ反応バッファー（Ｍｇ２＋添加）  １０μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｕｔｒｅ                      ２μｌ
２５μＭ  ５’プライマー                      ２μｌ
２５μＭ  ３’プライマー                      ２μｌ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ                    ０．５μｌ
ＰＣＲ用滅菌水                                適当量
全量  １００μｌ
【００４６】
ＰＣＲの運転条件を以下に示す。
９４℃に４分間
９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で４５秒間のサイクルを３５回
７２℃に１０分間
【００４７】
結果を図３及び図４に示した。
図３上段は、ＰＣＲ回数に応じた、７５２（−２７５）番目の塩基Ａに対応する蛍光量を示したもので、正常の場合、対立遺伝子もＡでＡ／Ａであると、蛍光量が高く、ヘテロＡ／Ｔの場合、約半量の蛍光量となり、ホモ変異Ｔ／Ｔでは蛍光量は低い。  一方、同様に図３下段は、同じサンプルをＰＣＲ回数に応じた、７５２（−２７５）番目の塩基Ｔに対応する蛍光量を示したもので、Ｔ／Ｔ変異の場合、最も高い蛍光量を示し、ヘテロＡ／Ｔの場合、約半量の蛍光量となり、正常Ａ／Ａでは蛍光量が低く、この条件で、７５２（−２７５）番目の塩基のＡ及びＴのホモ、ヘテロが同定できる。これを組み合わせたのが図４である。
【００４８】
図４は、各試料についての蛍光強度を示したもので、横軸に変異プローブ（ｍｕｔａｎｔプローブ）の蛍光強度の強さ、縦軸に正常プローブ（ｎｏｒｍａｌプローブ）の蛍光強度の強さを示す。７５２（−２７５）番目の塩基がＡからＴへ変異している場合、ｍｕｔａｎｔプローブに連結した蛍光物質の蛍光強度が強く観察されるがｎｏｒｍａｌプローブに連結した蛍光物質の蛍光強度は弱く観察される。図４に示したように、これら２種の各プローブに連結した蛍光物質の蛍光強度により、７５２（−２７５）番目の塩基が対立遺伝子の双方で正常である群（Ａ／Ａ）、双方で変異している群（Ｔ／Ｔ）、及び一方のみで変異している群（Ａ／Ｔ）に、各試料を分類した。各群に分類された試料数の全試料数に対する割合を算出したところ、７５２（−２７５）番目の塩基がＴ／Ｔである割合が、健常人と比較して不妊症患者において高いことが明らかになった（表２）。このことから、７５２（−２７５）番目の塩基におけるＡからＴへの変異がホモであることが、男性不妊症に関連すると考えられる。
【００４９】
【表２】
2004344164.tif 000003
【００５０】
さらに、７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基の変異と疾患との関係を分析した結果を表３に示す。表中、ａａ／ｃｃとは、対立遺伝子の双方において、７５２（−２７５）番目の塩基がＡであり（ホモ）、７７９（−２５８）番目の塩基がＣである（ホモ）ことを意味する。ａａ／ｃｃが野生型である。ａｔ／ｃｔとは、７５２（−２７５）番目の塩基が対立遺伝子の一方においてＡであり、他方においてはＴに変異しており（ヘテロ）、７７９（−２５８）番目の塩基が一方においてＣであり、他方においてはＴに変異していることを。ｔｔ／ｔｔとは、対立遺伝子の双方において、７５２（−２７５）番目の塩基と７７９（−２５８）番目の塩基が全てＴに変異していることを意味する。ａａ／ｃｔとは、７５２（−２７５）番目の塩基がＡのホモであり、７７９（−２５８）番目の塩基がＣとＴのヘテロであることを意味する。ａｔ／ｃｃとは、７５２（−２７５）番目の塩基がＡとＴのヘテロで、７７９（−２５８）番目の塩基がＣのホモであることを意味する。ｔｔ／ｃｔとは、７５２（−２７５）番目の塩基がＴのホモで７７９（−２５８）番目の塩基がＣとＴのヘテロであることを意味する。ａｔ／ｔｔとは、７５２（−２７５）番目の塩基がＡとＴのヘテロで７７９（−２５８）番目の塩基がＴのホモであることを意味する。
【００５１】
表３に示したように、この２箇所がｔｔ／ｔｔである割合が、健常人では２％であるのに対して、男性不妊症患者では５．４３％と高いことが明らかになった。このことから、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基が対立遺伝子の双方において全てＴに変異していることは、男性不妊症と密接な関係があると考えられる。
【００５２】
【表３】
2004344164.tif 000004
【００５３】
実施例３
ｔｔ／ｔｔ変異と精子数及び精巣のＰＨＧＰｘ遺伝子発現の解析
実施例２において、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基が対立遺伝子の双方において全てＴに変異していることが、男性不妊症と密接に関連することが示唆されたことから、該変異と精子数との関係を分析した。
ゲノムタイプがｔｔ／ｔｔである男性不妊症患者は３１３人中、かつ精子中の精子のみられた男性不妊症患者では、１９人中、９人が精液中に精子数、運動能の低い患者であった。残りの８名のうち４人が精液中の精子のいない患者でこのうち生検の検査を受けているのは４人であった。ｔｔ／ｔｔである男性不妊症患者は、健常人に比べすべて運動能が低く、また精子数も低く、７５２（−２７５）番目の塩基と７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基が対立遺伝子の双方において全てＴに変異していることが、精子数の減少に関連すると考えられた。
【００５４】
次に、精子の正常発生が認められている男性不妊症患者の精巣生検について、７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基の変異によるＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡ発現への影響を検討した。検討はリアルタイムＰＣＲ分析により常法に従って行い、結果を図５に示した。ＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡの発現は、ハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現に対する割合で示した。７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基のゲノムタイプがＴＴ／ＴＴである患者由来の試料（例数ｎ＝３）では、ゲノムタイプがＡＡ／ＣＣ（例数ｎ＝６）の患者又はＡＴ／ＣＴ（例数ｎ＝６）の患者由来の試料と比較して、有意にＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡの発現が低下していることが明らかになった。また、ＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡ低発現のコントロールとして用いたセルトリ細胞だけの不妊症患者（例数ｎ＝６）では、ＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡの発現はほとんど認められなかった。これらから、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基の対立遺伝子双方におけるＴへの変異が、ＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡの発現の著しい低下に関連していると考えられる。
【００５５】
実施例４
ＰＨＧＰｘ遺伝子の発現・機能への変異の影響についての検討
ＰＨＧＰｘ遺伝子のプロモーター領域の変異と男性不妊症との関係が示唆されたことから、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基がそれぞれＴに変異している変異体（Ｔ／Ｔ）のプロモーター活性の変動をルシフェラーゼアッセイ及びゲルシフトアッセイにより検討した。
【００５６】
（Ａ）ルシフェラーゼアッセイによる細胞内でのプロモーター活性の解析
まずヒトＰＨＧＰｘ遺伝子の５’フランキング領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を得るために、配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２Ａと７７９Ｃを含む領域に基づいてプライマーを設計して作成した。
フォワードプライマー  ：tatgg taccg tccaa tcacg gtgaa ctca  配列番号１０
リバースプライマー    ：atagg tacca gatct gtcgg ctttc cgcg  配列番号１１
鋳型ＤＮＡとしては、男性不妊症患者又は健常人のゲノム試料（実施例１で取得したもの）１００ｎｇを用いた。ＰＣＲにより該領域の増幅を行った後、電気泳動を行い、ジーンエリュートアガローススピンカラムを用いてＤＮＡ断片を抽出した。ＤＮＡ断片をＫｐｎＩ、又はＫｐｎＩとＸｈｏＩで制限酵素処理し、さらに同様に抽出処理を行った。ホタルルシフェラーゼレポータベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＰＲＯＭＥＧＡ  Ｅ１７５１）を用い、これにＤＮＡ断片を常法により挿入してベクターを構築し、該ベクターで大腸菌を形質転換した。形質転換された大腸菌の５ｍｌをＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ培地で８時間前培養し、培養液の１ｍｌを１００ｍｌのＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ培地に加え、１２〜１６時間培養した後、ＱＬＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＬＡＧＥＮ  １２１４５）を用いてＤＮＡを回収し、適当量の滅菌水に溶かしてＯＤ２６０を測定し濃度を決定した。細胞数６×１０４のヒト血管内皮細胞由来細胞ＥＣＶ３０４を用い、ＬＩＰＯＦＥＣＴ  ＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ１０９６４−０２１）を用いてホタルルシフェラーゼレポーターベクター（３６０ｎｇ）及びｐＲＬ−ＳＶ４０（４０ｎｇ）を細胞内に遺伝子導入した。遺伝子導入の２４時間後に、細胞溶解剤１００μｌを加え、１５分室温放置後に細胞を回収した。凍結融解処理を２回行った後に遠心処理し（１２０００ｒｐｍで２分間）、上清を分取した。上清１０μｌを９６穴プレートに分注し、５０μｌのピッカジーンデュアル発光基質を加えて直ちにトップカウンターによりホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
結果は図６に示した。図６の横軸は、酵素活性（ＩＵ）を示し、縦軸は各試料を表わす。図中、ｃｏｎｔ．はｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒを導入した試料、ｈＪは７５２（−２７５）番目の塩基と７７９（−２５８）番目の塩基がそれぞれＡ及びＣである野生型のプロモーター領域を導入した試料、ｈｊｍは７５２（−２７５）番目の塩基と７７９（−２５８）番目の塩基をともにＴに変異させたプロモーター領域を導入した試料を意味する。プロモーター領域に変異が導入された場合、レポーター遺伝子の発現が有意に低下した。このことから、７５２（−２７５）番目の塩基と７７９（−２５８）番目の塩基の変異はＰＨＧＰｘ遺伝子の発現を低下させると考えられる。
【００５７】
（Ｂ）ゲルシフトアッセイによるインビトロでのプロモーター活性の解析
ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子プロモーター領域の配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基を含む領域からセンスプライマーとアンチセンスプライマーとを設計して作成した。作成したセンスプライマーは配列番号１に記載の塩基配列の第７４０番目から第７７４番目までの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、アンチセンスプライマーは該オリゴヌクレオチドの逆向き相補鎖である。これら２つのプライマーをアニーリングバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて常法によりアニーリングさせ、２本鎖ＤＮＡプローブを調製した（以下、野生型ＤＮＡプローブという。）。得られた２本鎖ＤＮＡプローブの１０ｐｍｏｌを〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ  ＤＮＡ  ５’−Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて５’末端標識した後、Ｇ−２５カラムを用いて遠心処理により精製し、標識２本鎖ＤＮＡプローブを得た（以下、標識野生型ＤＮＡプローブという。）。
また、ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子プロモーター領域の７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基がＴに変異したプロモーター領域から上記同様にＤＮＡプローブを作製した（以下、変異型プローブという。）。変異型プローブは標識せずに使用した。
一方、ＰＨＧＰｘ遺伝子プロモーター領域に結合する転写因子等の蛋白質として、マウスの精巣から核蛋白質を常法により調製して用いた。
標識野生型ＤＮＡプローブの１×１０４ｃｐｍ、１ｍｇ／ｍＬ  Ｐｏｌｙ〔ｄＩ−ｄＣ〕（ＳＩＧＭＡ）１μＬ、５×ＨＤＫＥバッファー〔１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．９、２５０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン（ＢＳＡ）４μＬ〕及び核蛋白質５μｇに滅菌水を加えて全量２０μＬの反応液を作製し、３０分間氷中放置して反応させた。反応終了後、反応液に６×色素液を４μＬ加え、そのうち１０μＬを６％ポリアクリルアミドゲルにアプライして２０ｍＡで１．５時間電気泳動した。泳動後、ＢＡＳ２０００を用いて標識野生型ＤＮＡプローブと核蛋白質との結合を解析した。
この反応液に非標識野生型プローブ又は変異型プローブを、標準野生型プローブに対して２５、５０、１００又は２００倍量加えて同様に反応を行った。図７に示したように、非標識野生型プローブは、標識野生型ＤＮＡプローブと核蛋白質との結合を阻害したが、変異型プローブは該結合を阻害しなかった。すなわち、野生型ＤＮＡプローブは核蛋白質と結合するが、変異型プローブは結合しないことが明らかになった。このことから、プロモーター領域の配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基及び７７９（−２５８）番目の塩基のＴへの変異が、転写因子等の遺伝子発現調節蛋白質のプロモーター領域への結合を減弱させ、ひいてはヒトＰＨＧＰｘ遺伝子の発現に影響するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ヒトＰＨＧＰｘゲノム配列におけるＳＮＰの存在位置を示す模式図である。図中、＊及び＃はＳＮＰの位置〔左から順に−６２９、−５７８、−５２１、−２７５（配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２）及び−２５８（配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９番目）〕を示す。矢頭はＳＮＰ解析のためのＰＣＲ用プライマーの設計に使用した塩基配列の位置を示し、矢頭の下に記載した数字及びアルファベットは各プライマーの名称である。図中、Ｅとはエキソンを意味する。
【図２】ヒトＰＨＧＰｘゲノム配列における配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７７９（−２５８）番目の塩基の変異の検出をＲＦＬＰ法で行った結果を示す電気泳動図である。各レーンは異なった試料を示す。
【図３】ヒトＰＨＧＰｘゲノム配列における配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基の変異の検出をＴａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲ法で行った結果を示す図である。上図及び下図はそれぞれ、７５２（−２７５）番目の塩基のＡの塩基の量及び７５２（−２７５）番目の塩基のＴの塩基の量を示している。
【図４】ヒトＰＨＧＰｘゲノム配列における配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基の変異の検出をＴａｑ−Ｍａｎ  ＰＣＲ法で行った結果を示す図である。各試料についての蛍光強度を示したもので、横軸に変異型プローブ（ｍｕｔａｎｔプローブ）の蛍光強度の強さ、縦軸に野生型プローブの蛍光強度の強さを示す。
【図５】ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子における配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）番目の塩基と７７９（−２５８）番目の塩基の２箇所の塩基が対立遺伝子の双方において全てＴに変異している（ＴＴ／ＴＴ）ことが認められた男性不妊症患者の精巣生検において、ＰＨＧＰｘ  ｍＲＮＡの発現が低下していたことを示す図である。
【図６】ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子における配列番号１に記載のポリヌクレオチドの７５２（−２７５）Ａと７７９（−２５８）Ｃの２箇所の塩基を両方ともＴに変異している（Ｔ／Ｔ）変異体プロモーター領域（ｈＪｍ）を導入したレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）の発現が、野生型プロモーター領域を導入したもの（ｈＪ）と比較して有意に低下したことを示す図である。横軸は、酵素活性（ＩＵ）を示し、縦軸は各試料を表わす。図中、ｃｏｎｔ．はルシフェラーゼ遺伝子を導入しなかった陰性対照である。
【図７】ヒトＰＨＧＰｘ遺伝子プロモーター領域の非標識野生型プローブ（図中、ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌと表示）は、標識野生型ＤＮＡプローブ（図中、ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｂｅと表示）とマウス核蛋白質（図中、ｍｏｕｓｅ  ｔｅｓｔｉｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｔｒａｃｔと表示）との結合を阻害したが、変異型プローブ（図中、ｈｕｍａｎ  ｍｕｔａｎｔと表示）は該結合を阻害しなかったことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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