(57)【要約】【目的】簡便な方法により、個人の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能を測定する方法を提供する。【構成】唾液及びふっ素イオンの存在下で、カルシウム塩とりん酸塩を反応させて、りん酸カルシウムを生成させ、その際の溶液のｐＨ変化をｐＨ指示薬又はｐＨ試験紙により検知して、唾液によるりん酸カルシウム沈澱物形成の抑制力を求める、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。【選択図】        図１
2004245813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液及びふっ素イオンの存在下で、カルシウム塩とりん酸塩を反応させて、りん酸カルシウムを生成させ、その際の溶液のｐＨ変化をｐＨ指示薬又はｐＨ試験紙により検知して、唾液によるりん酸カルシウム沈澱物形成の抑制力を求める、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。
【請求項２】
反応液中の該ふっ素イオンの濃度が５０−１０００μＭである請求項１記載の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。
【請求項３】
該カルシウム塩が硝酸カルシウム等の水溶性カルシウム塩である請求項１又は２記載の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。
【請求項４】
該りん酸塩がりん酸水素２ナトリウム等の水溶性第１りん酸塩である請求項１、２又は３記載の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。
【請求項５】
該ｐＨ指示薬がブロムチモルブルーである請求項１、２、３又は４記載の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。
【請求項６】
該ｐＨ指示薬をｐＨ指示薬溶液又はｐＨ試験紙として用いる請求項１、２、３、４、又は５記載の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯科医療において、う蝕と歯周病の予防に関係して、唾液中のカルシウム分による歯の再石灰化と歯石形成に影響する、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
唾液は１日に１０００〜１５００ｍｌが分泌するが、その成分は年齢、採取時期、採取方法等により変化しやすい。唾液中に含有するカルシウム成分がハイドロキシアパタイト（以下ＨＡＰという。）として沈着して、歯のエナメル質の再石灰化及び歯石形成等の口腔内石灰化を行う。唾液中にはプロリンリッチ、チロシンリッチのカルシウム結合性の糖蛋白質が含まれており、これらの蛋白質は口腔内石灰化の調節に関与しているが、その個人差が大きい。
【０００３】
唾液の性質が歯の再石灰化を起こしやすい場合は、う蝕の発生が少ないが、歯石が生じやすくなり、逆に歯の再石灰化が起こり難い場合は、う蝕が生じ易いが、歯石が生じ難いと言う二律背反の関係にある。このため歯科医が患者個人の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能を測定することができれば、その個人のう蝕と歯石の発生のし易さを予測することができ、う蝕と歯周病予防に対する適切な指導、助言が可能となるため、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の簡便な測定法が求められている。
【０００４】
口腔内石灰化に際し、ＨＡＰ形成に先行して、無定形りん酸カルシウム（以下ＡＣＰという。）の形成が起こるが、このＡＣＰからＨＡＰへの転換反応は自動触媒的であり、ピロりん酸、ふっ素、蛋白質等の溶液環境の無機イオンや有機物質の影響を受ける。このＡＣＰ形成とＨＡＰへの転換反応の結果、水素イオンが副生し、液のｐＨが低下する。
【０００５】
本願発明者らはＡｒｃｈｓ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．３６：４９−５４，１９９１及び歯基雑誌３４：２２６−２７３，１９９２  において、ｐＨメーターを用いて、ｐＨの低落を測定することにより、▲１▼ＡＣＰ形成速度、▲２▼ＡＣＰからＨＡＰへの転換反応を誘導するに要する時間、▲３▼ＨＡＰへの転換反応速度の３点の増減を測定することができ、口腔の重要な環境因子である唾液の石灰化に対する影響を調べることができることを明らかにした。
【０００６】
唾液に硝酸カルシウム等のカルシウム塩溶液及びりん酸２水素カリウム等のりん酸塩溶液を添加してＡＣＰおよびＨＡＰの生成速度をｐＨメーターを用いて測定する、上記従来のｐＨ低落法は、ｐＨメーターを用いる必要があり、ｐＨメーター、記録計等の機器を必要とするので、更に簡便な方法が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は簡便な方法により、個人の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能を測定する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成すべく、本発明らが鋭意研究を重ねた結果、唾液に硝酸カルシウム等のカルシウム塩溶液及びりん酸２水素カリウム等のりん酸塩溶液を添加してふっ素イオン存在下で反応させ、その反応液のｐＨ変化をブロムチモルブルー（以下ＢＴＢという。）等のｐＨ指示薬又はｐＨ試験紙の色調変化により測定し、標準色調基準と比較することにより、唾液のＡＣＰ及びＨＡＰ生成速度に及ぼす影響を測定することができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】
すなわち本発明は、唾液及びふっ素イオンの存在下で、カルシウム塩とりん酸塩を反応させて、りん酸カルシウムを生成させ、その際の溶液のｐＨ変化をｐＨ指示薬又はｐＨ試験紙により検知して、唾液によるりん酸カルシウム沈澱物形成の抑制力を求める、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法を要旨とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるふっ素イオンは、好ましくはふっ化ナトリウム、ふっ化カリウム等の水溶性無機ふっ化物塩を添加して得られる。反応液中のふっ素イオン濃度の下限は５０μＭが好ましく、１００μＭが更に好ましく、２００μＭが最も好ましく用いられ、ふっ素イオン濃度の上限は１０００μＭが好ましく、５００μＭが更に好ましく、３００μＭが最も好ましく用いられる。ふっ素イオン濃度が２００μＭから少なくなると反応の促進効果は少しずつ低下し、５０μＭ以下では反応の促進効果が少なく、１０００μＭ以上添加しても反応の促進効果は増大しない。
【００１１】
本発明で用いられるカルシウム塩としては硝酸カルシウム、塩化カルシウム等の水溶性カルシウム塩が好ましく用いられる。更に本発明で用いられるりん酸塩は、りん酸２水素カリウム、りん酸２水素ナトリウム、りん酸１水素カリウム、りん酸１水素ナトリウム等の水溶性りん酸塩が好ましく用いられる。
【００１２】
本発明で用いられるｐＨ指示薬としては、ｐＨ６．０−ｐＨ７．５の範囲で変色する指示薬が用いられ、例えばＢＴＢ指示薬が好ましく用いられる。本発明で用いられるｐＨ試験紙も同様にｐＨ６．０−ｐＨ７．５の範囲で変色する試験紙が用いられ、例えばＢＴＢ試験紙が好ましく用いられる。
【００１３】
次に本発明の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法について、実験データに基づいて詳細に説明する。
〔実験方法〕
〔唾液の採取法〕
５名の成人男性（平均年齢４５．５歳）の全唾液は無刺激下で遠心分離管に採取し、混合、均一化した後、遠心分離して、食物残渣等を除いた上澄液を実験に用いた。１０名の女性（平均年齢２０．５歳）の全唾液は混合することなく、個々に遠心分離して、その上澄液を個人唾液として用いた。
【００１４】
〔ｐＨの測定法〕
記録計を接続したｐＨメーターとｐＨ電極を用いた。反応液の容量は２ｍｌ、温度は口腔内の体温に略等しい３７±０．１℃に保ち、反応液を攪拌しつつｐＨの変化を記録した。
【００１５】
〔ｐＨ変化によるＡＣＰ形成とＨＡＰへの転換反応の測定〕
Ｎ−２ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２エタンスルホン酸ナトリウム塩（以下Ｈｅｐｅｓという。）の濃度２ｍＭの水溶液よりなる弱い緩衝作用を有する緩衝溶液（ｐＨ７．４）に硝酸カルシウムを溶解して１００ｍＭの硝酸カルシウム溶液とし、また同じＨｅｐｅｓ緩衝溶液にりん酸２水素カリウムを溶解して１００ｍＭのりん酸２水素カリウム溶液を調製した。次に２ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝溶液１．８８ｍｌに１００ｍＭ硝酸カルシウム溶液６０μｌを加え、これに唾液１０〜２００μｌを加え、同時にＮａＦを反応液中の濃度が５０〜１０００μＭとなるように添加した。更に５分後に１００ｍＭりん酸２水素カリウム溶液６０μｌを加え反応を開始した。カルシウム、りん酸とも反応液中の最終濃度は３ｍＭであった。（但し１０％（ｖ／ｖ）の全唾液濃度中に含まれる遊離カルシウムイオンとりん酸イオンはそれぞれ、０．１２ｍＭ及び０．５３ｍＭであるので、唾液を加える時はそれぞれの唾液量に含有されるカルシウム及びりん酸量を差し引いて、硝酸カルシウム溶液及びりん酸２水素カリウム溶液を加え、カルシウム及びりん酸の最終濃度がそれぞれ３ｍＭとなるように調節した。
【００１６】
ＡＣＰ形成とそのＨＡＰへの転換反応速度をカルシウム−りん酸混合物のｐＨ変化を追跡することにより測定した。その結果を図１に示す。図１に示すように反応は明瞭な２つのステップで進行する。第１のステップはＡＣＰの形成段階であり、急激なｐＨ低落が２分間以内に生ずる。その後７−８分のＡＣＰ安定期間を経て、ＨＡＰへの転換反応による第２の急激なｐＨ低落が生ずる。
【００１７】
これらのｐＨ低落カーブに対して接線を引いてそれぞれの初速度（１分間当たりのｐＨ変化量）を求めた。この１分間当たりのｐＨ変化量を１分間あたりのカルシウム消費量に換算した。また第２のｐＨ低落スロープに対する接線とベースラインとの交点ａより誘導時間を求めた。
【００１８】
〔ＢＴＢの変色によるりん酸カルシウム沈澱物形成反応の測定〕
上記のｐＨ変化によるＡＣＰ形成とＨＡＰへの転換反応の測定の場合と同様に溶液を混合して、カルシウム−りん酸混合物を作成した。但し吸光度測定に必要なため、混合する各溶液量をそれぞれ２倍とし、溶液総量が４ｍｌとなるようにした。唾液添加量は２０−４００μｌである。
【００１９】
ＢＴＢは最終濃度が１０％となるように唾液と共に添加して、その５分後に前記と同様にりん酸２水素カリウム溶液を加えた。混合溶液を３７℃に保ち、４０分間反応させ、遠心分離（８７００ｇ、４分間）して、上澄液を分光光度計を用いて５６０ｎｍの波長で吸光度を測定した。又ＢＴＢ溶液の代わりにＢＴＢ試験紙（ｐＨ６．２−７．８）を用いて同様に色調を比較した。
【００２０】
〔個人唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成抑制能の評価〕
２ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝溶液（ｐＨ７．４）１６４ｍｌ、１００ｍＭ硝酸カルシウム溶液５．７６ｍｌ、１００ｍＭＮａＦ溶液０．５ｍｌ、ＢＴＢ溶液２０ｍｌを混合して混合溶液Ａを調製した。３本の試験管にそれぞれ唾液２５、５０、７５ｍｌをとり、これに混合溶液Ａを加えて全液量がそれぞれ１．９５ｍｌとなるようにした。これに１００ｍＭりん酸２水素カリウム溶液５０μｌを加えて反応を開始した。３７℃に３０分間保った後、冷却して反応を止めて色調スコアの色見本を用いて半定量的にｐＨを測定した。
【００２１】
表１に示すようにｐＨ７．４−ｐＨ５．８まで９種類の色見本を作成し、それらの色調を４．５−０．５の数値で評価した。３本の試験管のスコア数値の合計を算出し、３回の測定の平均値を求めた。同時にｐＨメーターを用いてｐＨを測定し、同様にスコア数値を得た。上記実験データは３−５回の実験から得られたものであり、平均値±標準偏差で表した。有意差検定を行いＰ＜０．５の時、有意差ありとした。
【表１】
2004245813.tif 000003
【００２２】
〔実験結果〕
〔ｐＨ低落法によるりん酸カルシウム沈澱物形成の測定結果〕
表２に示すように、ＮａＦは５０−１０００μＭの濃度範囲で、ＡＣＰ形成に対しては影響がなかった。しかし、ＨＡＰへの転換反応を濃度に比例して促進させた。又１０００μＭの濃度範囲では誘導時間に対する遅延効果は有意でなかった。ＮａＦ添加は第２番目のｐＨ減少スロープ中に第３番目のスロープ（図１に破線矢印で示す肩部）を出現させる効果があった。
【００２３】
表３に示すように、ＮａＦ無添加の対照で、この反応の最終ｐＨは６．８±０．０２であったが、ＮａＦ添加ではＮａＦ濃度に比例して最終ｐＨが低下して、１０００μＭではｐＨ６．１±０．０２となった。
【表２】
2004245813.tif 000004
【表３】
2004245813.tif 000005
【００２４】
〔ＢＴＢ発色法によるりん酸カルシウム沈澱物形成の測定結果〕
表３に示すように、吸光度の差（ΔＯ．Ｄ．）はＮａＦ無添加で対照例（反応開始時）が０．１８の時、０．０８１±０．００５となり、ＮａＦ濃度の増加に比例して増加した。ＮａＦ濃度が２５０μＭ以上で、ΔＯ．Ｄ．が対照例の吸光度の８０％以上となった。肉眼で見た対照例の青色は、ＮａＦ濃度が０−５０μＭでは黄緑色に変化し、２５０μＭ以上の濃度では黄色の色調に変化した。そこで唾液の効果を調べる実験では２５０μＭのＮａＦ濃度を用いた。
【００２５】
〔ｐＨ低落法による唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成に対する抑制の検査結果〕
表４に示すように、唾液は２５０μＭのＮａＦ添加・無添加に拘わりなく、ＡＣＰ形成には全く影響を与えなかった。更にＮａＦ無添加では、ＨＡＰへの転換反応にも影響を全く与えなかったが（図２）、延長時間のみを濃度に比例して増加させた（図３）。一方、ＮａＦ２５０μＭ存在下では、ＨＡＰへの転換反応に対しては唾液濃度が２．５％（ｖ／ｖ）以上で８０％まで抑制した（図２）。誘導時間に関しては、唾液濃度が５％（ｖ／ｖ）以上で抑制効果が一定（約４０分）に達した（図３）。
【表４】
2004245813.tif 000006
【００２６】
〔ＢＴＢ発色法による唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成に対する抑制結果〕
図４に示すように、ＮａＦ無添加では、唾液濃度が２．５％（ｖ／ｖ）の時、３７℃で４０分後の吸光度は開始時の６１％、色調は黄緑色、唾液濃度５−１０％（ｖ／ｖ）では変化なく青色であった。一方ＮａＦ２５０μＭ添加では、唾液濃度２．５％（ｖ／ｖ）の時、吸光度が開始時の１８％となり、唾液０％（ｖ／ｖ）と同様に黄色になったが、唾液濃度が５−１０％（ｖ／ｖ）では反応が抑制されて、青色のままであった。ＢＴＢ指示薬溶液に較べてＢＴＢ試験紙による変色反応は感度が劣り、ＮａＦ無添加では４０分後も同様に黄緑色調であって、色調差の判定が困難であった。しかし、ＮａＦ２５０μＭ添加では、黄色色調に変化したので、黄緑色との色調差が観察された。このためＢＴＢ試験紙を用いた唾液濃度５−１０％（ｖ／ｖ）による抑制反応はＮａＦ添加条件下でのみ観察された。
【００２７】
〔個人唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成抑制能の検査結果〕
表５に示すように、１０名の個人唾液（１０％（ｖ／ｖ））はＡＣＰ形成には影響を与えなかったが、ＨＡＰへの転換反応に対しては７名で有意の抑制効果を示した。誘導時間に関しては、対照の１．９２−１３倍の範囲で有意に誘導時間を延長させた。
【表５】
2004245813.tif 000007
【００２８】
表６に示すように、色見本で半定量的に測定を行ったところ、色調スコアはほぼ同様に６．５−１２．０の範囲であった。ｐＨメーターを用いると略同様に６．５−１２．８の範囲であり、よく一致した。従って色見本使用による色調スコア（表６）と誘導時間延長能（表５）との間に高い相関関係が見られた（ｒ＝０．８８）。誘導時間をｘ軸、色調スコアをｙ軸にとると、ｙ＝０．０３ｘ＋６．８で表される。又、半定量的な色見本使用の場合とｐＨメーター使用の場合のスコア数値間にも高い相関が認められた（ｒ＝０．９０）。
【表６】
2004245813.tif 000008
【００２９】
以上詳述したように、硝酸カルシウムとりん酸２水素カリウム溶液との反応では、第１りん酸イオンから水素イオンが生ずるので、ＨＡＰ形成反応をｐＨの変化で追跡することができる。カルシウム、りん酸とも３ｍＭ、３７℃の条件では、反応開始時のｐＨ７．４から２０分後には低下して、ｐＨ６．８となる（ｐＨ変化（ΔｐＨ）は０．６）（図１及び表３）。この時２５０−１０００μＭのＮａＦが存在すると、最終ｐＨは更に低下して６．５−６．１となる。このようにふっ素イオンはＡＣＰからＨＡＰへの転換反応を促進すると共に（表２）、ｐＨの低下の幅を約２倍に増大する効果がある。
【００３０】
ふっ化物はアパタイトの結晶成長と再石灰化に影響を与えることが知られている。その作用は複雑であり、ＡＣＰからＨＡＰへの転換反応を促進するが、５０−７５０μＭの濃度範囲では誘導時間に影響せず（表２）、図１の第２のｐＨ低下スロープ中に第３のスロープ（顕著な肩部）を出現させ、反応終了時間の遅延効果を伴う。この第３のｐＨ低下スロープはＨＡＰ結晶成長中の出来事であり、ふっ素イオンは結晶成長の活性部位に吸着することにより、反応を促進させていると考えられる。
【００３１】
唾液はＡＣＰ形成とＨＡＰへの転換反応には影響を与えないで、誘導時間のみを濃度２．５−１０％部に比例して延長させる（図２、図３）。分画分子量３０００のメンブレンフィルターで濾過して蛋白質を除去した唾液は誘導時間を延長させる能力を失うので、抑制の原因は高分子物質であると考えられる。
【００３２】
りん酸カルシウム沈澱物形成反応は反応開始時のｐＨ７．４から２０分後にはＮａＦ無添加でｐＨ６．８となり、ＮａＦ２５０−１０００μＭ添加では、ｐＨが６．３−６．１となる。そして黄色の色調はＮａＦが２５０μＭの濃度で充分である（表３）。このりん酸カルシウム沈澱物形成反応をｐＨ指示薬のＢＴＢの変色特性（変色域はｐＨ６．０（黄色）−７．６（青色））で追跡すると、ＮａＦ無添加で５６０ｎｍの青色光の吸光度が反応開始時の５５％となり、色調は黄緑色となった。
【００３３】
ＮａＦ２５０μＭ添加では同じ光の吸光度が反応開始時の２２％となり、黄色の色調となった。唾液濃度２．５−１０％（ｖ／ｖ）で抑制効果がＢＴＢの色調変化により観察できる（図４）ことは、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成に対する効果をＢＴＢ指示薬を用いて簡便迅速に測定できることを示す。又、ＢＴＢ試験紙はＢＴＢ液に比較して感度が劣るので、ＮａＦの添加が不可欠である。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能の検査法によれば、唾液にふっ化物、カルシウム塩、りん酸塩の溶液を添加してｐＨの変化をｐＨ指示薬又はｐＨ試験紙で観察し、その色調を色見本と比較するという極めて簡便な方法により、唾液のりん酸カルシウム沈澱物形成能を検査することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＨ低落法によるりん酸カルシウム沈澱物形成の際のｐＨの時間的変化の測定結果を示すグラフである。
【図２】ヒト全唾液がＡＣＰからＨＡＰへの転換反応に与える影響を示すグラフである。
【図３】ヒト全唾液濃度がりん酸カルシウム生成反応の誘導時間に与える影響を示すグラフである。
【図４】ヒト全唾液がりん酸カルシウム沈澱物形成反応中のｐＨ低下に与える影響を、唾液濃度とＢＴＢｐＨ指示薬の色調変化を吸光度により測定した値の関係で示すグラフである。
【図１】
2004245813.tif 000009
【図２】
2004245813.tif 000010
【図３】
2004245813.tif 000011
【図４】
2004245813.tif 000012