(57)【要約】      （修正有）【課題】産業廃棄物系のデンプン、セルロース系物質の加水分解物を発酵できる耐酸性、耐塩性の高い酵母を見いだす。【解決手段】酸や塩等に高い耐性を示すIssatchenkia属orientalis種のアルコール発酵性酵母MF-121株(受託番号FERM P-19368)を提供する。この酵母は、耐酸性・耐塩性・耐糖性・耐アルコール性を複合的に有する。この酵母を用いると、バイオマス資源を硫酸等の酸で加水分解した糖液に、ｐＨが３以下で、若干の栄養源を添加するだけでアルコール醗酵ができ、高いアルコール生産が可能となる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ種のアルコール発酵性酵母ＭＦ−１２１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３６８）。
【請求項２】
請求項１に記載の酵母を含むその培養液。
【請求項３】
請求項２に記載の培養液に単糖を含む有機基質を加えることから成るエタノールを製造する方法。
【請求項４】
前記培養液のｐＨが３以下である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記有機基質が、糖質資源を加水分解することにより得られたものである請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖質資源が澱粉又はセルロースを含む請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、アルコール発酵性酵母に関し、より詳細には、酸や塩に高い耐性を示すアルコール発酵性酵母に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エネルギー生産を目的としてバイオマス資源から微生物を用いてアルコールを生産する方法に関して多くの文献が知られている。この原料のバイオマスは大きく澱粉系とセルロース系に分類される。澱粉系のバイオマスをグルコースに分解する方法として、糖化とアルコール発酵を別の工程で行う方法（非特許文献１）や糖化とアルコール発酵を同時に行う方法（非特許文献２）等が知られているが、そのｐＨはほぼ５〜６で行われている。
一方、セルロース系のバイオマスについては、濃硫酸でセルロースの結晶構造を壊してから、薄めて希硫酸にした後、加熱して完全加水分解する方法が最も一般である。このような方法として、現在米国を中心にセルロース系バイオマス資源を高濃度硫酸で加水分解し、石灰等で中和処理後、沈殿性の硫酸カルシウムを遠心等で除去後、アルコール発酵するシステムの開発が進んでいる（非特許文献３）。しかし、硫酸カルシウムを連続遠心機で除く工程は運転コスト、大量生産、連続遠心機の維持等を考えると、経済的な面で問題がある。また、硫酸カルシウムの沈殿には無視できない糖（グルコース）の吸着があり、アルコールの生産効率改善のためには吸着された糖を回収するための改善策が求められる。
一方、醸造食品関連分野ではアルコール醗酵は古くから行われており、醸造用の酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が最も一般に用いられている。しかし、これらの酵母は耐塩性の能力が低く、一般にｐＨ５付近でアルコール生産されている。このため、培養液や醗酵装置の殺菌や温度制御は不可避であり、低コストが要求されるエネルギー生産分野には適していない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｔｅｃ．  ＆  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ２７，  ３１６−３２０  （１９８５）
【非特許文献２】
Ｂｉｏｔｅｃ．  ＆  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ６５，  ６７３−６７６  （１９９９）
【非特許文献３】
日経バイオビジネス２００２．０９  ｐ５２−６１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酸や塩等に高い耐性を示すアルコール醗酵酵母を提供することを目的とする。このような酵母を用いると、バイオマス資源を硫酸等の酸で加水分解した糖液に、ｐＨが３以下で、若干の栄養源を添加するだけでアルコール醗酵ができ、高いアルコール生産が可能となる。また、この酵母は、耐酸性・耐塩性・耐糖性・耐アルコール性を複合的に有するため、培地や醗酵装置の殺菌が不要となる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
酸性河川（万座温泉街を流れる万座川の支流）から取得した河川水から、アルコール発酵性酵母ＭＦ１２１株を分離した。幾多の試験の結果、この酵母は耐酸性・耐塩性・耐糖性・耐アルコール性を複合的に有し、低ｐＨ条件でアルコール発酵が可能であることが分かった。
即ち、本発明は、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ種のアルコール発酵性酵母ＭＦ−１２１株である。
また、本発明は、請求項１に記載の酵母を含むその培養液である。
また、本発明は、この培養液に単糖を含む有機基質を加えることから成るエタノールを製造する方法である。この培養液のｐＨは３以下であってもよい。この有機基質は、糖質資源を加水分解することにより得られてもよい。この場合、酸等により加水分解したものには菌の生育阻害物質が含まれていることがあるので（非特許文献１）、活性炭等で濾過しておくことが好ましい。
【０００６】
本発明の酵母は単糖をアルコール発酵するものであるため、有機基質としては、単糖を含む必要がある。単糖としては、グルコース、キシロース等を、特に制限なく用いることができる。糖質資源を基質とする場合には、糖質にはオリゴ糖や多糖が含まれるため、これらを加水分解して単糖にしておくことが好ましい。この糖質資源として、澱粉又はセルロースを含むものであってもよい。糖質としてはグルコースを構成単位とする糖質が最も好ましい。
本発明において有機基質として、例えば、澱粉又はセルロース類を多く含む残飯、非商品デンプン系菓子類、生分解性プラスチック、バイオマスなどが挙げられる。セルロース類の場合には、これに予め加水分解等の処理を行っておくことは特に有効である。
なお、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ種のアルコール発酵性酵母ＭＦ−１２１は、平成１５年５月２２日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３６８が付与された。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ属ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ種のアルコール発酵性酵母ＭＦ−１２１の分類学的性質を示す。
１．形態特性
（ａ）ＧＰＹ培地（ｐＨ６．０）で培養したものの顕微鏡写真を図１に示す。これは栄養状態の良いときの菌体を示している。
（ｂ）スライド培養したものの顕微鏡写真を図２に示す。これはポテトグルコース寒天培地をスライドグラスに薄く引き、白金耳で菌体を薄く移植したあと十分に培養したあとの菌体、即ち、栄養状態が悪くなったときの菌体を示している。
【０００８】
２．生態的分類法による性質
この分類法はＴｈｅ  ｙｅａｓｔｓ  ａ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｉｒｄ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｌａｒｇｅｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｎ．Ｊ．Ｗ．  Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ  Ｒｉｊ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．  （１９８４）．及び  Ｙｅａｓｔｓ：  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｉｔｃｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ａ．  Ｂａｒｎｅｔｔ，  Ｒ．Ｗ．  Ｐａｙｎｅ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｙａｒｒｏｗ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２０００）．に従って行った。
（１）諸性質
【表１】
2004344084.tif 000002
【０００９】
（２）その他の性質
【表２】
2004344084.tif 000003
（３）胞子の形成
有性胞子：  子嚢胞子・・・有り      球形胞子
（４）資化性と発酵性
【表３】
2004344084.tif 000004
【００１０】
３．遺伝子配列による同定
以上の結果、アルコール発酵性酵母ＭＦ−１２１は、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）に最も近いと考えられたが、完全に一致しているとは判断できなかった。  そのため、更にＤＮＡの塩基配列で菌株の同定を行った。
この菌株ＭＦ−１２１から常法によりＤＮＡを抽出し、ユニバーサルプライマー（Ｅ２１Ｆ（配列番号１）及びＥ１７７８ｒ（配列番号２））を用いてＰＣＲ反応を行い、電気泳動を行い、精製したものを、シクエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＺＭ３１０，  ＤＹＥｎａｍｉｃ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅａｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ，  プライマー：Ｅ２１Ｆ、Ｅ１７７８ｒ、ＮＳ２（配列番号３）及びＮＳ３（配列番号４）ＮＳ４（配列番号５）及びＮＳ５（配列番号６））によりその配列（配列番号７）を決定した。
【００１１】
この配列（配列番号７）をデータベース（ＮＣＢＩ）上で検索したところ、Ｃａｎｄｉｄａ  Ｋｒｕｓｅｉ  （Ｍ５５５２８）、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  （ＡＢ０５３２３９）及びＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  （ＡＹ２１８８９４）と相同性がそれぞれ９９％、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ  （ＡＹ２５１６３５）と相同性が９７％、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｌａｍｂｉｃａ  （ＡＢ０５３２３８）と相同性が９８％、Ｐｉｃｈｉａ  ｍａｎｓｈｕｒｉｃａ  （ＡＹ２５１６３７）と相同性が９７％、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ  （Ｘ５８０５５）と相同性が９７％であった。この結果、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ，  Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，  Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．が上位に上げられ、本菌はＣａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ  又は  Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ  と考えられる。
しかし、これらはｐＨ２．５程度の低ｐＨでアルコール発酵するという特性は知られておらず、本発明のアルコール発酵性酵母ＭＦ−１２１株は新種の酵母と考えられる。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
万座温泉街を流れる万座川の支流から採取した河川水（ｐＨ約２−３）２５ｍｌとスクリーニング培地２５ｍｌ（ｐＨ２．５）を混ぜ、１００ｍｌ程度のマイヤーを使用して培養液が白濁するまで３０℃で振とう培養した。このスクリーニング培地組成（改変ＧＰＹ培地）は、グルコース１０％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、硫酸ナトリウム５％、水道水から作製し、５規定（Ｎ）硫酸でｐＨ２．５に調整し、培養液の殺菌はしなかった。
ＧＰＹ培地を、グルコース１０％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％から作製した。
培養液２５ｍｌと、同じスクリーニング培地２５ｍｌを混合し再度培養し目的酵母の濃縮を計った。有用菌株の濃縮の段階では、スクリーニング培地は低温加熱殺菌（６５℃、３０分程度の条件）をした培地を使用した。
上記スクリーニング培地に２％寒天を加え固体培地を作成し、培養液の一部を固体培地上に広げコロニーを出させた。
コロニーを２０種類ほど釣り上げ、スクリーニング培地（１０ｍｌ）で培養した。培養液がエタノール臭を示す株を第一段階目のアルコール発酵性菌株として選択した。
この選択株を再度培養し、培養液中のエタノール濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。培養液の一部を遠心後、フィルター濾過しＨＰＬＣでアルコール濃度を正確に測定した。
アルコール濃度が高かった株について、再度コロニーを出させ純化した。
酸性培地での生育性とアルコール醗酵能を総合評価し、最終的にＭＦ１２１株を分離した。
【００１３】
実施例２
本実施例では、ＭＦ１２１株の特殊培養条件におけるアルコール生産条件を検討した。試験条件設定等は以下の考え方で行った。
Ａ：硫酸塩濃度を５％まで試験した。高濃度澱粉（４０−５０％澱粉溶液）を０．８−２．０規定濃度の硫酸中で１００−１２０℃、約１時間加熱処理すると、ほとんどの澱粉はグルコースに加水分解される。これを苛性ソーダでｐＨ２．５まで中和すると硫酸ソーダ塩濃度は約５％弱となる。
Ｂ：培養液のグルコース濃度を２０％と２５％濃度で試験した。耐糖性のある酵母でも一般的に２５％グルコース濃度以上となると生育は容易でない。塩を含むとさらに条件は悪くなる。たとえ生育できてもアルコール発酵は期待できない。
Ｃ：アルコール発酵能の上限を設定した。一般に、培地の糖濃度の約５０％変換率がほぼアルコール発酵の上限と考えられる。残り５０％の糖は生育やアルコール生合成系に利用される。そのような理由から、２０％から２５％濃度グルコースから発酵で期待できるアルコール濃度の最高値としては約１０−１２．５％を目標とすることが一般的である。
Ｄ：最終的にバイオリアクターでアルコール発酵を行った。１回ごとにアルコール発酵を行うと（回分式発酵）、グルコースが細胞の生育に使用されグルコースのアルコール変換率が悪い。バイオリアクター内に酵母を生育させた後に、連続してグルコースをアルコールに変換すると２回目以降のグルコースは主にアルコール発酵に回り、理論上アルコール変換効率は上がる。また、連続的にアルコールの製造が可能となるため、スケールアップするのに都合が良い。
【００１４】
生育条件は以下のとうりである。
グルコース２０％と２５％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％のＧＰＹ培地をベースにｐＨ３．０、  ｐＨ２．５、  ｐＨ２．０と硫酸ナトリウム濃度を０％から５％に変化させ生育特性調べた。比較菌株として、実際の醸造に使用されている酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）４種類を使用した。Ｓ：焼酎酵母、ｎｏ．３：ワイン酵母、ｎｏ．７とｎｏ．９は清酒酵母。
生育特性の評価は以下の方法で行った。培養液を１０倍水で希釈後、吸光度（６６０ｎｍ）で測定し、菌体の濁度を指標に菌の生育程度を比較した。
【００１５】
生育結果を下記の表４及び表５にまとめた。
【表４】
2004344084.tif 000005
【表５】
2004344084.tif 000006
この結果、ＭＦ１２１株は２５％グルコース、ｐＨ２．０、５％硫酸ナトリウムのＧＰＹ培地でも生育は十分できることが明らかとなり、複合耐性酵母であることが証明された。一方、醸造に利用されている一般の酒酵母では、同じ培養条件では全く生育できなかった。
【００１６】
実施例３
本実施例では、ＭＦ１２１株のアルコール醗酵能を試験した。比較のため実施例２で用いた４種類の酒酵母についても同様に試験した。
５００ｍｌ容三角フラスコに酸性ＧＰＹＳ培地１００ｍｌを作り、前培養液（５ｍｌ）を加え、３０℃で緩やかに振とう培養を５日間行い、アルコール濃度を測定した。
この酸性ＧＰＹＳ培地は、グルコース２０％と２５％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％をベースに培養液とし、ｐＨと硫酸ソーダ塩濃度を変えた。
アルコール濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＡｐａｋ−Ａで測定した。
【００１７】
結果を表６及び表７にまとめる。
【表６】
2004344084.tif 000007
【表７】
2004344084.tif 000008
【００１８】
ＭＦ−１２１株は（１）２０％グルコース、５％硫酸ソーダ、ｐＨ２．５の培地条件、及び（２）２５％グルコース、５％硫酸ソーダ、ｐＨ３．０の培地条件まで生育及び高いアルコール発酵能を示したのに対し、醸造用の酵母では、十分な生育ができず、アルコール生産もほとんどなかった。
グルコース濃度が２０％と２５％でアルコール生産性に有意な差が認められなかったことから、効率的には浸透圧の低い２０％グルコースの方が適している。同様の考えで、硫酸ソーダ塩の濃度も２．５％濃度の方が菌株の生育上には良いと考えられる。
以上のことから、ＭＦ−１２１株の酸性培地中でのアルコール発酵は、グルコース２０％、硫酸ソーダ２．５％、ｐＨ２．５が適当と判断した。またこの条件でも、醸造用酵母のアルコール発酵能はかなり低い。
培養条件が厳しくなるとアルコール発酵能は低下するが、下記のデータでは上昇している箇所がある。この理由として、本菌は発泡性の性質があり、菌体が泡の中に包まれると培養液の上層に浮きアルコール発酵がしにくくなると考えられる。一方、ｐＨが下がると泡の生成が少なくなり、多くの酵母菌体がアルコール発酵する機会が与えられ生産量が上昇したと考えられる。
【００１９】
実施例４
本実施例では、図３に示すバイオリアクターを用いてアルコール生産実験を行った。酸性ＧＰＹＳ培地として、グルコース２０％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、硫酸ナトリウム２．５％から成り、ｐＨ２．５に調整したものを用いた。培地は第１回目だけ低温加熱殺菌（６５℃、３０分程度）するが、菌体が増えアルコールが生産されてくるとアルコール殺菌の効果も現れてくるので、培地交換をするときには培地の殺菌は不要となる。
装置の仕様は以下のとうりである
（ｉ）リアクターのカラム：内径３ｃｍ  長さ４０ｃｍ
（ｉｉ）担体：ヘチマ繊維
（ｉｉｉ）酸性ＧＰＹＳ培地：５００  ｍｌ
（ｉｖ）培地の流速：０．５  ｍｌ／ｍｉｎ  （３０  ｍｌ／ｈ）
実験は、一定時間ごとに培地中のグルコースとエタノール濃度を測定した。酸性ＧＰＹＳ培地を付け替えるごとに内容液を抜き取り、新たに循環させた。その結果を図４に示す。
【００２０】
本実験の結果以下のことがわかった。
（１）約９％アルコール生産まで到達する。
（２）バイオリアクター内の固定化酵母菌体量を増やせばアルコール生産速度は向上すると考えられる。
（３）約４ヶ月、１０回以上ＧＰＹＳ培地を付け替えて運転したが、状態が悪くなるようなことはなかった。酸性ＧＰＹＳ培地にアルコールが約９％程度含まれるため、最初の培養時だけ簡単な殺菌操作をすれば、その後の培地の殺菌はする必要性がないと考えられる。
【００２１】
実施例５
本実施例では、澱粉の加水分解物からアルコール発酵させた。
馬鈴薯澱粉（ポテト澱粉）１０ｇを１．０規定（Ｎ）硫酸３０ｍｌを加え、１１０℃で２時間加水分解した。加水分解後、遠心した上澄液を苛性ソーダでｐＨ２．５に調整し、ポリペプトン４％と酵母エキス２％を溶解した栄養培地（ｐＨ２．５）１０ｍｌ加えた。これに、ＭＦ１２１株の培養液５ｍｌを加え、３０℃で３日間振とう培養後、さらに３日間静置培養を行った。培養液を遠心した上澄み液をフィルター濾過後ＨＰＬＣでアルコール濃度を分析した結果、培養液中のアルコール濃度は５．８％であった。
【００２２】
実施例６
本実施例では、セルロースの加水分解からアルコール発酵させた。
市販セルロースを５４％硫酸溶液に２０℃で１時間浸し膨潤させた後、大量の蒸留水で希釈、沈澱したセルロースを自然沈降法と遠心法で集め、よく洗浄した。このセルロースの結晶構造は相当弱くなっているため、完全加水分解が天然のものと比べると容易であると考えられる。
この前処理を施したセルロース１０ｇを１％市販セルラーゼを含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５０ｍｌに懸濁し、４５℃で４日間反応させた後、１０規定（Ｎ）硫酸１０ｍｌを加え、１１０℃で４時間加水分解した。加水分解後遠心した上澄み液を、苛性ソーダでｐＨ２．５に調整し、ポリペプトン１５％と酵母エキス７．５％を溶解した栄養培地（ｐＨ２．５）５ｍｌ加えた。これに、ＭＦ１２１株の培養液５ｍｌを加え、３０℃で３日間振とう培養後、さらに３日間静置培養を行った。培養液を遠心した上澄み液をフィルター濾過後ＨＰＬＣでアルコール濃度を分析した結果、培養液中のアルコール濃度は２．０％であった。
以上から、本発明の酵母により、セルロース等を酸で加水分解した生成物を用いてｐＨが２．５の条件でアルコール発酵することができることがわかる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の複合耐性酵母は、澱粉資源の硫酸加水分解溶液を苛性ソーダでｐＨ２．５程度に調整後、活性炭等で脱色処理と、多少の栄養源を添加するだけで、アルコール（エタノール）の工業生産が可能である。
図３に示すバイオリアクター装置（アルコール発酵工程）に、有機基質を加水分解する工程を付加して、その加水分解物を基質（図３の１）として使用することにより、このバイオリアクター装置でより広いバイオマス資源をエタノールに経済的に変換することが可能となる。特に、セルロース系バイオマス資源を物理的・生化学的に前処理をしてセルロース構造を柔らかくし、硫酸で加水分解すれば、このような酵母の発酵工程だけでは処理が困難なセルロース系バイオマス資源からアルコール生産ができる。
【００２４】
【配列表】
2004344084.tif 000009
2004344084.tif 000010
2004344084.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＦ−１２１株をＧＰＹ培地（ｐＨ６．０）で培養したものの顕微鏡写真を示す図である。
【図２】ＭＦ−１２１株をスライド培養したものの顕微鏡写真を示す図である。
【図３】バイオリアクター装置（アルコール発酵工程）を示す図である。
【図４】本発明の酵母を用いたアルコール生産実験を示す図である。
【符号の説明】
１  基質（グルコース）
２  ＧＰＹＳ培地
３  温水装置（３０℃）
４  固定化した酵母
５  ポンプ
６  炭酸ガス抜き
【図１】
2004344084.tif 000012
【図２】
2004344084.tif 000013
【図３】
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【図４】
2004344084.tif 000015