(57)【要約】【課題】副作用が極めて少なく、患者に負担を与えることなく、安全に投与でき、しかも癌細胞に対する抑制作用に優れた抗癌剤及びそれを含有する飲食品を提供する。【解決手段】２〜６糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含む、下記式（１）で示されるオリゴ糖を抗癌剤の有効成分とする。この抗癌剤を飲食品に添加して利用することもできる。Ｒ１−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２−Ｒ２…（１）（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は糖を表すが、Ｒ１、Ｒ２はなくてもよい。Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＨ２はグルコサミン又はその塩を表す。）【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜６糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含む、下記式（１）で示されるオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤。
Ｒ１−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２−Ｒ２…（１）
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は糖を表すが、Ｒ１、Ｒ２はなくてもよい。Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＨ２はグルコサミン又はその塩を表す。）
【請求項２】
前記式（１）において、Ｒ１が１〜５糖のガラクトース又ガラクトオリゴ糖である請求項１記載の抗癌剤。
【請求項３】
下記式（２）又は（３）で示されるオリゴ糖を有効成分とする請求項１記載の抗癌剤。
Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２…（２）
Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２…（３）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＨ２はグルコサミン又はその塩を表す。）
【請求項４】
ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がα１−６結合である請求項１〜３のいずれか１つに記載の抗癌剤。
【請求項５】
ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ１−４結合である請求項１〜３のいずれか１つに記載の抗癌剤。
【請求項６】
ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ１−６結合である請求項１〜３のいずれか１つに記載の抗癌剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗癌剤を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２〜６糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤及びそれを含有する飲食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
厚生労働省の人口動態統計によれば、２０００年度の全死亡数９６万１６５３人のうち、２９万５４８４人が、癌が原因で死亡しており、死亡原因の第一位にあがっている。癌の死亡率はここ数年上昇傾向にあるが、医療技術、治療薬の進歩により５年生存率は上昇しており、新しい技術や効果的な治療薬の開発が盛んに望まれている分野である。
【０００３】
癌の治療法は、外科的療法、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、生物反応修飾物質によるＢＲＭ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）療法に分類され、これらの作用機序はすべて異なり、これらを併用して治療効果をあげることが有効とされている。化学療法は、術後の補助療法として転移巣の増殖を抑えるのが目的で、標的が定まらないまま薬剤を投与することもあるため、副作用をきたすことが多く、腫瘍細胞と正常細胞の違いにより腫瘍細胞のみを破壊、死滅させる全身療法が期待されている。抗腫瘍薬としては、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗生物質、植物アルカロイド、白金化合物、ホルモンやインターフェロンなどがあり、副作用として急性の自覚的副作用である吐き気、嘔吐、食欲不振などがあり、慢性の多角的副作用として骨髄障害、肺や皮膚の変化、脱毛、臓器障害などがある。特に化学療法では、治療量と中毒量の幅が狭く投与量をコントロールするのが難しいため、副作用の問題が度々生じる。
【０００４】
また、血液の癌である白血病の治療法としては、骨髄移植か、白血病細胞増殖抑制作用又は細胞分化誘導作用を持つ薬剤による治療が行われている。例えば、アルキル化薬として、シクロホスファミドやブスルファンがあるが、副作用として出血性膀胱炎や痙攣発作などが起こる。また、代謝拮抗薬としては、シタラビンやメトトレキサートなどがあり、併用により効果増強や腎毒性の作用がある。白血病の治療には、通常、作用機序の異なる薬剤を併用し、症状により適宜薬剤を換えながら治療を行うため、薬剤間による相互作用にとくに注意を払う必要がある。
【０００５】
一方、各種のオリゴ糖が抗癌作用を示すことも知られている。例えば下記特許文献１には、β１−６グルコサミンジサッカライドを含む抗癌剤が開示されている。また、下記特許文献２には、マンノース及びガラクトース含有オリゴサッカライドを有効成分とする結腸における発癌の予防剤が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】
特表平９−５０５０７１号公報
【特許文献２】
特表２００３−５１６７５７号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、従来の抗癌剤は、各種の副作用を伴うので、患者に対する負担や危険性が大きく、投与量をコントロールするのが難しいなどの問題があった。
【０００８】
一方、前記のように、各種のオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤も提案されているが、癌細胞に対する十分な抑制作用を示す、より有効な抗癌剤の開発が望まれている。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、副作用が極めて少なく、患者に負担を与えることなく、安全に投与でき、しかも癌細胞に対する抑制作用に優れた抗癌剤及びそれを含有する飲食品を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、アミン物質が体の機能に深く関わりがあるという事実、生体内糖鎖の末端のガラクトースが細胞間相互作用に深く関わっているとされる事実に着眼し、アミノ基とガラクトースを有する各種オリゴ糖について試験を行った結果、それらが癌細胞に対して顕著な抑制効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、２〜６糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含む、下記式（１）で示されるオリゴ糖を有効成分とする抗癌剤を提供するものである。
【００１２】
Ｒ１−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２−Ｒ２…（１）
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２は糖を表すが、Ｒ１、Ｒ２はなくてもよい。Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＨ２はグルコサミン又はその塩を表す。）
本発明において、前記オリゴ糖としては、前記式（１）において、Ｒ１が１〜５糖のガラクトース又ガラクトオリゴ糖であるものが好ましい。
【００１３】
本発明において、前記オリゴ糖としては、下記式（２）又は（３）で示されるオリゴ糖がより好ましい。
【００１４】
Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２…（２）
Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＨ２…（３）
（上記式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＨ２はグルコサミン又はその塩を表す。）
【００１５】
また、前記オリゴ糖としては、ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がα１−６結合であるものが好ましい。
【００１６】
更に、前記オリゴ糖は、ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ１−４結合であるものであってもよい。
【００１７】
更にまた、前記オリゴ糖は、ガラクトースとグルコサミン又はその塩との結合がβ１−６結合であるものであってもよい。
【００１８】
なお、前記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２の糖としては、１〜４糖の糖又はオリゴ糖であればいずれでもよく、好ましくはガラクトース又はグルコサミンであるが、その他に、シアル酸、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸などが挙げられ、またそれらの水酸基やアミノ基部分に硫酸基やリン酸基などが結合した糖でもよい。また、本発明のオリゴ糖を脂質やタンパク、人工ポリマーなどに結合させたものを抗癌剤として利用することもできる。
【００１９】
本発明の抗癌剤は、後述する試験例において示されるように、癌化した細胞株に対し、他の中性糖には見られない効果的な増殖抑制効果を示したことから、種々の癌、とくに白血病に対する投与により特異的に作用し、抗癌、抗白血病、抗腫瘍としての薬理効果が期待できる。
【００２０】
また、本発明のオリゴ糖は、天然由来のラクトース、ラフィノース、グルコサミン塩酸塩などのような、食品として経口可能な素材を用い、糖加水分解酵素による転移反応から得ているため、得られたオリゴ糖は食品としても経口可能なオリゴ糖であり、人体にも影響が少なく安全性が高い。このため、機能性食品としての利用の可能性が多いにあり、また、医薬品としても患者に負担が少なく、経口投与がしやすいという利点がある。更に、原料が安価であり、一段階のステップで合成でき、精製もイオン交換カラムを用いることにより純品を得ることができるため、製造のコスト面で安価にできるという大きなメリットがある。
【００２１】
また、オリゴ糖の結合位置、配向や糖の数、種類のような構造の違いによって、癌細胞の感受性が異なるという結果が得られたことから作用機序を推測すると、オリゴ糖が、癌細胞が有すると予測される受容体に働きかけ、選択的に細胞に取り込まれていると考えることができる。つまり、求める標的細胞や薬効の強さによって、オリゴ糖の構造を変えることで、様々な疾患、とくに癌を抑制する薬剤が創出できるのものと推測される。
【００２２】
また、本発明の抗癌剤を各種飲食品に添加することにより、機能性食品、健康食品として利用することもできる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下に本発明について説明する。
【００２４】
本発明の抗癌剤の有効成分であるオリゴ糖は、２〜６糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含む、前記式（１）で示されるオリゴ糖である。
【００２５】
すなわち、ガラクトースと、一級アミンを有するグルコサミンとが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含むことが条件であり、このガラクトシルグルコサミン構造は、ガラクトースの１位炭素とグルコサミンの３、４、６位のいずれかの炭素が酸素原子を介して結合している。アミンは塩であってもよく、たとえば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩などであってもよい。
【００２６】
前記式（１）におけるＲ１、Ｒ２の糖としては、１〜４糖の糖又はオリゴ糖であればいずれでもよく、好ましくはガラクトース又はグルコサミンであるが、その他に、シアル酸、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸などが挙げられる。これらの糖の結合位置としては、ガラクトシルグルコサミンの非還元末端側でも還元末端側でも、両側に伸びていてもよく、直鎖、分岐いずれもとることができる。また、それら糖の水酸基やアミノ基が硫酸化、リン酸化、アセチル化された糖でもよい。更に、本発明の抗癌剤は、上記オリゴ糖を脂質やタンパク、人工ポリマーなどに結合させたものであってもよい。
【００２７】
本発明において、前記オリゴ糖としては、前記式（１）において、Ｒ１が１〜５糖のガラクトース又ガラクトオリゴ糖であるもの、すなわち下記式（４）で示されるものが好ましい。
【００２８】
（Ｇａｌ）ｎ−ＧｌｃＮＨＣｌ−Ｒ２…（４）
（式中、Ｒ２はその他の糖、ｎは１〜５）
また、上記式中ｎが１〜２であって、前記オリゴ糖が二〜三糖であるのがより好ましい。更には、前記式（２）又は（３）で示されるオリゴ糖がより好ましい。
【００２９】
ガラクトースとグルコサミンの間の結合は、特に限定されないが、好ましくはα型＞β型で、より好ましくはα１−６＞β１−４＞β１−６の順であり、本発明の抗癌剤におけるもっとも好ましいオリゴ糖は、Ｇａｌα１−６ＧｌｃＮＨＣｌであるメリビオサミン塩酸塩である。
【００３０】
ここで、α１−６結合のガラクトシルグルコサミン構造は、下記式（５）であらわされる。
【００３１】
【化１】
2004352673.tif 000003
【００３２】
また、β１−４結合のガラクトシルグルコサミン構造は、下記式（６）であらわされる。
【００３３】
【化２】
2004352673.tif 000004
【００３４】
更に、β１−６結合のガラクトシルグルコサミン構造は、下記式（７）であらわされる。
【００３５】
【化３】
2004352673.tif 000005
【００３６】
本発明で用いるオリゴ糖は、糖加水分解酵素（ガラクトシダーゼ）による転移反応により合成することができる。例えば下記反応式（８）に示すように、対応するグリコシド結合をもつガラクトオリゴ糖とグルコサミン塩酸塩（Ｎ−アセチルグルコサミン）の共存下、酵素添加により、対応するオリゴ糖のガラクトースの部分が分解を受けると同時にグルコサミン塩酸塩が転移することにより、ガラクトースにグルコサミン塩酸塩が付与したオリゴ糖が得られる。
【００３７】
【化４】
2004352673.tif 000006
【００３８】
本発明で用いるオリゴ糖のうち、α１−６結合のガラクトシルグルコサミン構造を有するオリゴ糖として、例えばＧａｌα１−６ＧｌｃＮＨＣｌ（メリビオサミン塩酸塩）は、下記反応式（９）によって合成することができる。
【００３９】
【化５】
2004352673.tif 000007
【００４０】
また、本発明で用いるオリゴ糖のうち、β１−４結合のガラクトシルグルコサミン構造を有するオリゴ糖として、例えばＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＨＣｌ（ラクトサミン塩酸塩）及びＧａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＨＣｌ（ガラクトシルラクトサミン塩酸塩）は、下記反応式（１０）によって合成することができる。
【００４１】
【化６】
2004352673.tif 000008
【００４２】
更に、本発明で用いるオリゴ糖のうち、β１−６結合のガラクトシルグルコサミン構造を有するオリゴ糖として、例えばＧａｌβ１−６ＧｌｃＮＨＣｌ（アロラクトサミン塩酸塩）は、下記反応式（１１）によって合成することができる。
【００４３】
【化７】
2004352673.tif 000009
【００４４】
上記反応式（８）〜（１１）において、原料として用いられるオリゴ糖は、末端にガラクトース残基を有していればよく、酵素は、転移能のあるガラクトシダーゼならば種や属によらず何を用いてもよい。
【００４５】
また、別の製法として、ＵＤＰ−ガラクトースとガラクトシルトランスフェラーゼを用いる方法によって合成されたものでもよい。
【００４６】
グルコサミン塩酸塩は、キチンの分解により得られ、例えば食品素材として市販されているナチュラルグルコサミン（焼津水産化学工業株式会社製）などを用いることができる。これらオリゴ糖は、アミノ基を有していることから、陽イオン交換カラムなどにより、反応液中から容易に精製することができる。以下に示す細胞試験は、各オリゴ糖の酵素反応液から精製操作を経て高純度品としたオリゴ糖の乾燥粉末を得ることができる。
【００４７】
本発明におけるオリゴ糖の癌細胞に対する作用機序はまだよくわからないが、ひとつには、Ｋ５６２細胞の細胞膜上には、メリビオースやメリビオサミン塩酸塩のようなＧａｌα１−６構造を認識する受容体があり、オリゴ糖を細胞内に能動的に
取り込む機構の存在が考えられる。オリゴ糖が細胞内部に取り込まれることで、細胞の代謝過程を阻害し、増殖を抑えると考えることができる。あるいは、細胞間の相互作用がオリゴ糖と細胞表面糖鎖との競合によって妨げられることにより増殖できないのか、またアポトーシスが誘導されることも考えられる。
【００４８】
本発明に用いるガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖が、白血病細胞の増殖に決定的な損傷を与え、抑制効果を示すことはこれまで知られておらず、生体親和性の高いオリゴ糖を用いた安全かつ選択的で効果的な抗癌剤、特には抗白血病剤、抗腫瘍剤として利用が大いに期待できる。
【００４９】
本発明で用いるガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖は、水溶性であり、ｐＨ３〜１１にて１００℃、１時間の煮沸により分解されないことがわかっているため、幅広い範囲のｐＨで扱うことができ、体内でのｐＨ変化に対して分解を受けないと考えられる。更にαアミラーゼやペプシンにより分解されないことから、継続して経口摂取することにより胃や腸などの消化器系疾患（癌）、血中の白血病などに対し抗癌効果が期待され、癌の治療、補助療法剤、予防薬、あるいは機能性食品として使用できる。経口の場合には、既知の方法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの形態とすることができ、それらの組成物中に一般に使用される結合剤、滑沢剤、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を混合することもできる。また、シロップ剤などの液剤として使用することもでき、液剤には通常用いられる添加剤、保存剤のいずれかを混合することもできる。非経口薬の場合、注射用としては、既知の方法により調整され、安定剤、保存剤などの添加剤を混合することができ、水溶液、懸濁液、溶液のような形態で用いられる。
【００５０】
本発明の抗癌剤は、癌や腫瘍を抱えた重度から軽度の患者に投与されるが、健常者でも摂取されることができ、癌の予防に対してもきわめて有効である。すなわち、本発明で用いる上記オリゴ糖は、マクロファージを活性化する可能性が期待でき、特に免疫力が低下している高齢者や患者に対して、免疫賦活による相乗効果が期待できる。また、他の抗癌剤と併用して用いられるとより効果がある。本発明で用いる上記オリゴ糖は経口投与の場合、胃や腸などの消化器系で分解されず、かつ水溶性を示すことから、そのままの形で効率的に吸収されて、血液や各器官に運ばれると考えられる。注射の場合は、例えば皮下、筋肉、体内に静脈注射、点滴などが可能である。
【００５１】
本発明の抗癌剤の有効投与量は、年齢、個人差、病状などにより影響されるので範囲外の量を投与する場合もあるが、ヒトの場合の経口投与量は、大人１日体重１ｋｇ当たり０．５  〜１，０００ｍｇ  、好ましくは１〜３００ｍｇであり、何回かに分けて摂取するとよい。
【００５２】
本発明の抗癌剤に関するオリゴ糖の急性毒性試験は行われていないが、素材が生体の構成成分であるオリゴ糖であるため安全性は高いといえる。例えば、構成糖のグルコサミン塩酸塩は、ラットを用いた急性毒性試験の結果５ｇ／ｋｇ体重の単回投与で異常は認められず、変異原生も認められていない。また、本オリゴ糖のメリビオサミン塩酸塩と同じＧａｌα１−６構造であるラフィノースでは、急性毒性試験や変異原生試験においていずれも異常は確認されていない。ラフィノースの最大無作用量は１０ｇ／日である。また、マンノースやＮ−アセチルガラクトサミン、フコースという単糖においてもヒトに対し毒性は見受けられず、異常な量を投与しない限り副作用も見出されていない。これらのことを総合的に考えると、本オリゴ糖のヒトへの毒性は極めて低いものと判断される。
【００５３】
本発明の抗癌剤を、機能性食品、健康食品として利用する場合、例えば各種ビタミン類、ミネラル類、甘味料、糖質、酸味料、香料、保存料、果汁、着色料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、調味料、その他添加物一般、他の機能性素材などとともに配合することもできる。また、栄養ドリンク、スープ等の液状の食品への添加および固形食品、粉末食品などの各種食品への添加によって用いることができ、含有量、摂取量は、上記抗癌剤としての医薬品の摂取量に従うことが好ましい。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明について、更に具体的に説明する。
（１）オリゴ糖の調整
試験を行ったオリゴ糖は、全１１種類であり、そのうち、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ラクトース（Ｌａｃ：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、メリビオース（Ｍｅｌ：Ｇａｌα１−６Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルアロラクトサミン（ＡｌｌｏＬａｃＮＡｃ：Ｇａｌβ１−６ＧｌｃＮＡｃ）、グルコサミン塩酸塩（ＧｌｃＮＨＣｌ）については市販のものを用いた。
【００５５】
ラクトサミン塩酸塩（ＬａｃＮＨＣｌ：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＨＣｌ）、アロラクトサミン塩酸塩（ＡｌｌｏＬａｃＮＨＣｌ：Ｇａｌβ１−６ＧｌｃＮＨＣｌ））、メリビオサミン塩酸塩（ＭｅｌＮＨＣｌ：Ｇａｌα１−６ＧｌｃＮＨＣｌ）、ガラクトシルラクトサミン塩酸塩（ＧａｌＬａｃＮＨＣｌ：Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＨＣｌ）、Ｎ−アセチルメリビオサミン（ＭｅｌＮＡｃ：Ｇａｌα１−６ＧｌｃＮＡｃ）は、糖加水分解酵素（ガラクトシダーゼ）による転移反応により合成した。その詳細は以下の通りである。
【００５６】
▲１▼ラクトサミン塩酸塩、ガラクトシルラクトサミン塩酸塩の合成
ラクトース６８４ｇとグルコサミン塩酸塩（商品名：ナチュラルグルコサミン、焼津水産化学工業株式会社製）８６２ｇを、４Ｌの脱塩水に溶解し、ｐＨを６．０に調整後、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）起源のβガラクトシダーゼ（商品名「Ｂｉｏｌａｃｔａ」、大和化成株式会社製）１６００Ｕを添加し、３０℃にて、撹拌しながら２４時間反応を行った。
【００５７】
反応液を１５分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、半量を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（２５Ｌ）（樹脂：商品名：Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ×４）に供し、０．５Ｎ  ＨＣｌにて溶出し、ラクトサミン塩酸塩及びガラクトシルラクトサミン塩酸塩の高純度のフラクションを集め、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ  ５．４に中和、脱塩濃縮後、凍結乾燥により、ラクトサミン塩酸塩の乾燥粉末７．５ｇ及びガラクトシルラクトサミン６．０ｇを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【００５８】
ラクトサミン塩酸塩（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＨＣｌ）；
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），δ５．３６（０．５５Ｈ，Ｈ−１α），４．８８（０．４５Ｈ，Ｈ−１β），  ４．３８（１Ｈ，Ｈ−１’），３．４４−３．９６（１１Ｈ），３．２５，２．９６（１Ｈ，Ｈ−２α，Ｈ−２β），１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），δ１０３．１（Ｃ−１’），９２．６（Ｃ−１β），８９．０（Ｃ−１α），７８．３，  ７８．２，７５．５，７５．１，７２．５，７１．０，７０．８，７０．４，６８．６，６８．４，６１．２（Ｃ−６’），５９．９（Ｃ−６β），５９．８（Ｃ−６α），５６．６（Ｃ−２β），５４．１（Ｃ−２α）
ガラクトシルラクトサミン塩酸塩（Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＨＣｌ）；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），δ５．４３（０．６５Ｈ，  Ｈ−１α），４．９５（０．３５Ｈ，Ｈ−１β），４．５９，４．４９（２Ｈ，Ｈ−１’，１’’），３．５４−４．１９（１７Ｈ），３．３２，３．０３（１Ｈ，Ｈ−２），  １３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），δ１０５．１（Ｃ−１’’），１０３．９（Ｃ−１’）  ，９３．５（Ｃ−１β），  ８９．８（Ｃ−１α），７９．３，７９．２，７８．２，７６．１，７６．０，７５．５  ７３．９，７３．８，７２．４，７１．８，７１．３，６９．６，６９．３，６１．９，６１．８（Ｃ−６’，６’’），６０．８（Ｃ−６β），６０．７（Ｃ−６α），５７．５（Ｃ−２β），５５．０（Ｃ−２α）
【００５９】
▲２▼アロラクトサミン塩酸塩の製造
ラクトース１８０ｇとグルコサミン塩酸塩（商品名：ナチュラルグルコサミン、焼津水産化学工業株式会社製）２１５ｇを、１Ｌの脱塩水に溶解し、ｐＨを４．５に調整後、アスペルギルス・オリゼイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）起源のβガラクトシダーゼ（商品名「ラクターゼＹ−ＡＯ」、カルピス工業薬品株式会社製）１６００Ｕを添加し、５０℃、撹拌しながら２１時間反応を行った。
【００６０】
反応液を１５分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、反応液の１／１０量を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（４．４ｃｍ×９０ｃｍ  ）（樹脂：商品名：Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ×４）に供し、０．５Ｎ  ＨＣｌにて溶出した。この操作を繰り返した後、アロラクトサミン塩酸塩の高純度のフラクションを全量集め、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ  ５．４に中和、脱塩濃縮後、凍結乾燥により、アロラクトサミン塩酸塩の乾燥粉末２００ｍｇを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【００６１】
アロラクトサミン塩酸塩（Ｇａｌβ１−６ＧｌｃＮＨＣｌ）；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），  δ５．３５（０．５５Ｈ，  Ｈ−１α），  ４．８７（０．４５Ｈ，Ｈ−１β），  ４．３５（１Ｈ，Ｈ−１’），  ３．４５−４．１４（１１Ｈ），  ３．２２，２．９３（１Ｈ，Ｈ−２α，Ｈ−２β），１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），δ１０３．３（Ｃ−１’），  ９２．８（Ｃ−１β），  ８９．２（Ｃ−１α），  ７５．２，  ７２．６，  ７１．９，  ７０．７，  ７０．６，  ６９．５，  ６９．４，  ６８．６．  ６８．４（Ｃ−６β），  ６８．３（Ｃ−６α），  ６１．０（Ｃ−６’），  ５６．６（Ｃ−２β），  ５４．２（Ｃ−２α）
【００６２】
▲３▼メリビオサミン塩酸塩の製造
メリビオース（和光純薬工業株式会社製）１７．１ｇとグルコサミン塩酸塩（商品名：ナチュラルグルコサミン、焼津水産化学工業株式会社製）２１．６ｇを、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍＬに溶解し、１ｍＬの純水に溶解したアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ）由来のα−ガラクトシダーゼ（商品名「スミチームＡＧＳ」、新日本化学工業株式会社製、３００００Ｕ／ｇ）４０ｍｇを添加し、５０℃、撹拌しながら２３時間反応を行った。
【００６３】
反応液を１５分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、全液を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（４．４ｃｍ×９０ｃｍ）（樹脂：商品名：Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ×４）に供し、０．５Ｎ  ＨＣｌにて溶出した。高純度画分を集めて、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ  ５．２に中和し、脱塩濃縮後、凍結乾燥によりメリビオサミン塩酸塩の乾燥粉末０．９３ｇを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【００６４】
メリビオサミン塩酸塩（Ｇａｌα１−６ＧｌｃＮＨＣｌ）；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），δ５．３５（０．６Ｈ，Ｈ−１α），４．８６−４．８９（１．４Ｈ，Ｈ−１’，  Ｈ−１β），３．４７−３．９８（１１Ｈ），３．２１（０．６Ｈ，Ｈ−２α），２．９２（０．４Ｈ，  Ｈ−２β），  １３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），δ９８．２（Ｃ−１’），  ９２．８（Ｃ−１β），  ８９．２（Ｃ−１α），  ７４．６，  ７２．１，  ７１．０，７０．３，６９．８，６９．５，６９．４，  ６９．２，６８．４，６５．６（Ｃ−６α），６５．５（Ｃ−６β），６１．１（Ｃ−６’），５６．６（Ｃ−２β），５４．２（Ｃ−２α）
【００６５】
▲４▼Ｎ−アセチルメリビオサミンの製造
メリビオース（和光純薬工業株式会社製）１４．１ｇとＮ−アセチルグルコサミン（商品名：マリンスウィート、焼津水産化学工業株式会社製）１８．１ｇを、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）８２ｍＬに溶解し、２ｍＬの純水に溶解したアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ）由来のα−ガラクトシダーゼ（商品名：スミチームＡＧＳ、新日本化学工業株式会社製、３００００Ｕ／ｇ）３３．０ｍｇを添加し、５０℃、撹拌しながら２４時間反応を行った。
【００６６】
反応液を１５分間沸騰水中で加熱することで酵素を失活後、室温まで冷却し、全液を活性炭カラムクロマトグラフィー（４．４ｃｍ×９０ｃｍ）に供した。水から２０％のイソプロピルアルコール溶液によるグラジエント法にて溶出し試験管に採取した。Ｎ−アセチルメリビオサミンの高純度画分を全量集めてエバポレーターにて濃縮し、凍結乾燥によって乾燥粉末１．７６ｇを得た。得られた粉末は核磁気共鳴装置により構造が確認された。化学シフト値は以下の通りである。
【００６７】
Ｎ−アセチルメリビオサミン（Ｇａｌα１−６ＧｌｃＮＡｃ）；
１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ），δ５．１１（０．５５Ｈ，Ｈ−１α），４．８８（１Ｈ，Ｈ−１’），  ４．６２（０．４５Ｈ，Ｈ−１β），３．４２−３．９２（１２Ｈ），１．９４（３Ｈ，ＣＨ３），１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），δ１７４．７（Ｃ＝Ｏ−β），１７４．５（Ｃ＝Ｏ−α），９８．２（Ｃ−１’），９５．０（Ｃ−１β），９０．９（Ｃ−１α），７４．４，７４．０，７０．９，７０．２，７０．０，６９．７，６９．４，６９．２，６８．５，６８．４，６５．９（Ｃ−６α），６５．８（Ｃ−６β），６１．１（Ｃ−６’），５６．６（Ｃ−２β），５４．０（Ｃ−２α），２２．２（ＣＨ３−β），２１．９（ＣＨ３−α）
【００６８】
（２）癌細胞に及ぼす影響
ヒトの骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）株及びマウス白血病（Ｆｒｉｅｎｄ）細胞を用い、以下に示す方法で、各オリゴ糖添加による細胞の増殖抑制効果を調べた。
【００６９】
▲１▼ヒト赤芽球様白血病（Ｋ５６２）細胞
以下の実験において、細胞培養液は、ＲＰＭＩ−１６４０（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  １０％ＦＣＳ，２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，５０Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ）を用い、被験物質は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解して用いた。
【００７０】
２４ウエルディッシュに、Ｋ５６２  ｃｅｌｌｓを２．７〜４．４×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ含む懸濁液７２０μｌを分注し、次いで、被験物質を加え、培養液の最終量が８００μｌになるように培養液又は緩衝液を加えた。なお、糖非添加の系をコントロールとした。
【００７１】
３７℃、５．０％  ＣＯ２の条件下で７２時間培養した後、各被験物質を添加したウエルの単位当たりの細胞数をトーマの血球計算板でカウントし、対象を１００％として増殖率（％）を下記式によって求めた。すべての試料はトリプレットで行った。
【００７２】
増殖率（％）  ＝  ［試料中の細胞数（／ｍｌ）／対象の細胞数（／ｍｌ）］×１００
ヒトの骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２）株を用い、各オリゴ糖添加による細胞の増殖抑制効果を調べた。培養条件は、３７℃、５．０％ＣＯ２で３日間培養した。オリゴ糖を添加しない系をコントロールとした。また、各オリゴ糖に対してトリプレットで実験を行った。
【００７３】
図１は、コントロールと、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコサミン塩酸塩（ＧｌｃＮＨＣｌ）、ラクトース（Ｌａｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、ラクトサミン塩酸塩（ＬａｃＮＨＣｌ）、メリビオサミン塩酸塩（ＭｅｌＮＨＣｌ）、ガラクトシルラクトサミン塩酸塩（ＧａｌＬａｃＮＨＣｌ）の７種のオリゴ糖を各５ｍＭ濃度で添加した系で培養した細胞の細胞数をグラフに表したものである。
【００７４】
図１に示されるように、ＧｌｃＮＡｃ、Ｌａｃ、ＬａｃＮＡｃのようなフリーのアミノ基のない中性糖添加系では、コントロールと比較し増殖にあまり影響しないのに対し、ＧｌｃＮＨＣｌ、ＬａｃＮＨＣｌ、ＭｅｌＮＨＣｌ、ＧａｌＬａｃＮＨＣｌのようなフリーのアミノ基（グルコサミン残基）を有するオリゴ糖は致命的に細胞増殖を抑制した。その中でもＭｅｌＮＨＣｌは効果的に増殖を抑制した。
【００７５】
そこで、次に、これらオリゴ糖の添加濃度を１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭと変えて、細胞の増殖を見たところ、図２に示すように、濃度依存的に細胞増殖を抑制しているのが確認された。
【００７６】
また、ＭｅｌＮＨＣｌは、ＧｌｃＮＨＣｌよりも強力な抑制を示した。このように、これら４種のオリゴ糖においても抑制効果に差が見られ、結合位置や配向、結合している糖の違いにより抑制効果に差があることが示された。このことから、Ｋ５６２細胞の増殖抑制が、構造依存的、すなわちアミノ基をもつオリゴ糖が受容体などを介して特異的に作用することで、細胞の生育機構を阻害しているということが示唆された。
【００７７】
更に、ガラクトシルグルコサミンのα結合体とβ結合体で比較を行った結果を図３に示す。その結果、α１−６結合のＭｅｌＮＨＣｌが、コントロールの９．７％と効果的に抑制したのに対し、β１−６結合のＡｌｌｏＬａｃＮＨＣｌは９４％とあまり影響を及ぼさず、
α１−６体が明らかな増殖抑制効果を示した。これによりグリコシド結合の配向により抑制効果が異なることが示された。
【００７８】
更に、アミノ基の影響を調べるため、アミノ基をアセチル基に変換したＭｅｌＮＡｃを合成し、同様な実験を行った結果を図４に示す。その結果、ＭｅｌＮＡｃは抑制効果を示さず、メリビオースも抑制しなかったことから、アミノ基の関与性が示された。
【００７９】
そこで、次に、最も活性の強かったＭｅｌＮＨＣｌと同じＧａｌα１−６骨格を有するメリビオースを予め培養系に添加し、後からＭｅｌＮＨＣｌを添加する実験を行ったところ、予めメリビオースを添加した系と添加しなかった系では、増殖抑制に差があらわれた。すなわち、コントロール（オリゴ糖非添加）及びＭｅｌ単独の場合は、初期細胞数に比べ４７０％の増殖を示し、ＭｅｌＮＨＣｌ単独の場合は初期細胞数の８０％の抑制を示したのに対し、予めＭｅｌを加えて一時間後にＭｅｌＮＨＣｌを添加して培養した系では、１０％の抑制という結果となり、抑制効果が大幅に弱まった。このことから、Ｋ５６２細胞には、メリビオースやメリビオサミン塩酸塩に共通して見られるＧａｌα１−６の構造を認識する受容体が存在し、細胞の代謝過程に関与している
ことが示唆された。
【００８０】
▲２▼マウス白血病（Ｆｒｉｅｎｄ）細胞
次に、マウスの白血病（フレンド）細胞を用い、各種のオリゴ糖について、同様の増殖実験を行った。
【００８１】
培地（粉末）としては、ＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製薬株式会社製、商品名「ニッスイ」▲１▼粉末、Ｃｏｄｅ  ０５９１１）を用いた。
【００８２】
血清は、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（以下、ＦＢＳ）（Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２６１４０−０８７）を用いた。
【００８３】
培養は全て小シャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ社：３５ｍｍ×１０ｍｍ）を用いて行った。
また、使用する試薬のモル濃度に応じて、以下のように添加量を変えた。
【００８４】
１）原液が１００ｍＭの時：
最終濃度を５ｍＭとした場合は、１０６μｌ添加。
最終濃度を１０ｍＭとした場合は、２２３μｌ添加。
【００８５】
２）原液が５０ｍＭの時：
最終濃度を５ｍＭとした場合は、２２２μｌ添加。
最終濃度を５ｍＭとした場合は、５００μｌ添加。
【００８６】
使用培地：５％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地
細胞を１．０×１０５個／ｍｌ  ×  ２．０ｍｌでシャーレにまき、直後に所定量の各オリゴ糖を添加した。３日間培養後、ピペッティングで細胞を撹拌し、エッペンドルフチューブに０．１ｍｌとり、等量（０．１ｍｌ）のトリパンブルー試薬を加え染色し、血球計算盤で細胞数及び生存率を下記式に基づいて算出した。
【００８７】
（細胞数の算出）
・１ｍｌ中の生細胞数＝血球計算盤上の４区画の合計生細胞数／４×２×１０４＝（１区画の平均生細胞数）×（トリパンブルーによる希釈換算）×（１ｍｌ中への体積換算）
【００８８】
（生存率の算出方法）
・生存率（％＝生細胞数／全細胞数  ×  １００
この結果を図５に示す。図５に示されるように、やはりアミノ基を持つオリゴ糖が効果的に増殖を抑制することがわかった。特に、ＭｅｌＮＨＣｌは極めて強力であり、ＧｌｃＮＨＣｌに比べ８０倍も抑制効果を示した。
【００８９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、２〜６糖のオリゴ糖であって、該オリゴ糖鎖の内部又は末端に、ガラクトースとグルコサミン又はその塩とが結合したガラクトシルグルコサミン構造を含むオリゴ糖を有効成分とすることにより、既知の中性糖に比べて飛躍的に白血病細胞の増殖を抑制する効果が得られ、これにより生体との親和性が高く安全性の高いオリゴ糖を用いた抗癌剤、特には抗白血病剤、抗腫瘍剤を提供することができ、死亡率の高い癌の抑制に大きく寄与することができる。また、本発明の抗癌剤を各種飲食品に添加することにより、機能性食品、健康食品として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｋ５６２細胞に及ぼす各オリゴ糖の影響を調べた結果を示す図表である。
【図２】Ｋ５６２細胞に及ぼす各オリゴ糖の濃度の影響を調べた結果を示す図表である。
【図３】Ｋ５６２細胞に及ぼす各オリゴ糖の影響を調べた結果を示す図表である。
【図４】Ｋ５６２細胞に及ぼすオリゴ糖のアミノ基による影響を調べた結果を示す図表である。
【図５】フレンド細胞に及ぼすオリゴ糖の影響を調べた結果を示す図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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