(57)【要約】【課題】標本に対する複数の照明光の光量を広い範囲で連続的に調整することができると共に安価に構成できる蛍光観察用の落射照明装置、およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供する。【解決手段】複数の蛍光物質で標識された標本２０を対物レンズ２１を介して照明する蛍光観察用の落射照明装置（１１〜１９）において、照明光を射出する光源手段（１１〜１４）と、照明光の波長域のうち、複数の蛍光物質の各々を励起可能な複数の波長域を同時に抽出する抽出手段１８と、複数の波長域の照明光が対物レンズの瞳面２１ａを通過するときの断面の面積と前記断面における強度分布との少なくとも一方を各々の波長域ごとに個別に調整する調整手段１５，１５ａとを備える。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の蛍光物質で標識された標本を対物レンズを介して照明する蛍光観察用の落射照明装置において、
照明光を射出する光源手段と、
前記照明光の波長域のうち、前記複数の蛍光物質の各々を励起可能な複数の波長域を同時に抽出する抽出手段と、
前記複数の波長域の照明光が前記対物レンズの瞳面を通過するときの断面の面積と前記断面における強度分布との少なくとも一方を各々の波長域ごとに個別に調整する調整手段とを備えた
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。
【請求項２】
請求項１に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、
前記対物レンズの瞳面に共役な基準面を前記光源手段と前記抽出手段との間に規定する光学系を備え、
前記調整手段は、前記照明光の光路中でかつ前記基準面の近傍に配置され、前記光路に交差する方向に沿って移動可能なフィルタ部材を有し、
前記フィルタ部材は、当該フィルタ部材の移動方向に交差する１以上の境界を挟んで隣り合う複数の領域を含み、
前記複数の領域のうち、隣り合う領域どうしは、分光特性が互いに異なる
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。
【請求項３】
請求項２に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、
前記複数の領域の境界は、前記フィルタ部材の移動方向に対して斜め方向に形成されている
ことを特徴とする蛍光観察用の落射照明装置。
【請求項４】
複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、
請求項１から請求項３の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置と、対物レンズを含み、前記標本からの蛍光を集光して前記標本の蛍光像を形成する結像光学系とを備えた
ことを特徴とする蛍光顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の蛍光物質で標識された標本を照明する蛍光観察用の落射照明装置およびそれを備えた蛍光顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察が蛍光顕微鏡などを用いて行われている。複数の蛍光物質の各々は、標本の中の異なる部位に付着している。このため、各々の蛍光物質から発生する蛍光に基づいて、標本の蛍光像を取り込むことにより、複数の蛍光物質で標識された標本の複数の異なる部位を同時に観察することができる。
【０００３】
ところで、標本の中の各々の蛍光物質から蛍光を発生させるためには、各々の蛍光物質を適切な波長域の照明光で励起しなければならず、各々の蛍光物質に対する照明光の適切な波長域は一般に異なる。このため、標本の蛍光観察時、複数の蛍光物質で標識された標本には、波長域の異なる複数の照明光が照射されることになる。このような複数の照明光は、通常、予め定められた複数の異なる波長域で光を透過する励起フィルタにより生成される。
【０００４】
また、各々の蛍光物質は一般に蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）が異なるため、標本に照射される複数の照明光（波長域が異なる）の光量が互いに等しい場合には、各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量が異なってしまう。
そして、この状況で取り込んだ標本の蛍光像には、蛍光発生効率の高い蛍光物質の付着部位が明るい像として、蛍光発生効率の低い蛍光物質の付着部位が暗い像として現れることになる。このように、標本の蛍光像に明るい像と暗い像が混在してしまうと、適切な像の取得が難しい。
【０００５】
そこで、標本の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくするために、標本に照射される複数の照明光の光量を調整する方法が提案された。例えば特許第３０９３００９号には、照明光の光路中の光源と励起フィルタとの間に干渉フィルタを配置し、この干渉フィルタへの入射光束の入射角を調整するための回転機構を設けている。
【０００６】
したがって、干渉フィルタの回転角度を変化させることによって、干渉フィルタを透過する照明光のスペクトルがシフトし、励起フィルタに入射する照明光のスペクトルもシフトするため、励起フィルタで生成される複数の照明光の光量を調整することができる。
また、透過波長域の異なる複数の干渉フィルタを予め用意しておき、励起フィルタの波長域に応じて、何れか１つの干渉フィルタを選択的に照明光の光路中（光源と励起フィルタとの間）に配置させることで、照明光のスペクトルを変更し、標本に対する複数の照明光の光量を調整する方法も提案されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記の干渉フィルタを回転させる方法では、干渉フィルタを透過する照明光のスペクトルのシフト方向が短波長側に限定されてしまう問題があった。また、干渉フィルタの回転機構を小スペース内に納めるために、複雑化する問題がある。
【０００８】
本発明の目的は、標本に対する複数の照明光の光量を広い範囲で連続的に調整することができると共に安価に構成できる蛍光観察用の落射照明装置、およびそれを備えた蛍光顕微鏡を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の発明は、複数の蛍光物質で標識された標本を対物レンズを介して照明する蛍光観察用の落射照明装置において、照明光を射出する光源手段と、前記照明光の波長域のうち、前記複数の蛍光物質の各々を励起可能な複数の波長域を同時に抽出する抽出手段と、前記複数の波長域の照明光が前記対物レンズの瞳面を通過するときの断面の面積と前記断面における強度分布との少なくとも一方を各々の波長域ごとに個別に調整する調整手段とを備えたものである。
【００１０】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、前記対物レンズの瞳面に共役な基準面を前記光源手段と前記抽出手段との間に規定する光学系を備え、前記調整手段は、前記照明光の光路中でかつ前記基準面の近傍に配置され、前記光路に交差する方向に沿って移動可能なフィルタ部材を有し、前記フィルタ部材は、当該フィルタ部材の移動方向に交差する１以上の境界を挟んで隣り合う複数の領域を含み、前記複数の領域のうち、隣り合う領域どうしは、分光特性が互いに異なるものである。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載した蛍光観察用の落射照明装置において、前記複数の領域の境界が、前記フィルタ部材の移動方向に対して斜め方向に形成されたものである。
請求項４に記載の発明は、複数の蛍光物質で標識された標本の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡において、請求項１から請求項３の何れか１項に記載した蛍光観察用の落射照明装置と、対物レンズを含み、前記標本からの蛍光を集光して前記標本の蛍光像を形成する結像光学系とを備えたものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態は、請求項１，請求項２，請求項４に対応する。ここでは、図１に示すように、標本２０の蛍光観察に用いられる蛍光顕微鏡１０に組み込まれ、標本２０を照明する落射照明装置（１１〜１９）の例を説明する。
【００１３】
蛍光顕微鏡１０には、蛍光観察用の落射照明装置（１１〜１９）の他に、観察系（２１〜２４）が設けられている。まず初めに、観察対象の標本２０について説明し、次いで、蛍光顕微鏡１０の観察系（２１〜２４）について簡単に説明し、その後で、落射照明装置（１１〜１９）について詳しく説明する。
【００１４】
標本２０は、例えば２種類の蛍光物質で標識された生物標本（ＤＮＡや蛋白質など）である。そして、落射照明装置（１１〜１９）によって照明されると、２種類の蛍光物質の各々が励起され、２種類の蛍光を発生する。以下の説明では、標本２０の中の一方の蛍光物質を励起するために適切な波長域を“λＳ”、他方の蛍光物質を励起するために適切な波長域を“λＬ”とする（λＳ＜λＬ）。ちなみに、蛍光の発生方向は、照明方向に拘わらず四方八方となる。
【００１５】
観察系（２１〜２４）は、光軸２０ａに沿って標本２０側から順に、無限遠系の対物レンズ２１と、バリアフィルタ２２と、第２対物レンズとして機能する結像レンズ２３と、カメラ２４とが配置された構成となっている。バリアフィルタ２２は、標本２０から発生する２種類の蛍光の波長域を選択的に透過する特性の波長選択フィルタである。
【００１６】
標本２０の蛍光観察時、標本２０から発生した２種類の蛍光は、対物レンズ２１と後述のダイクロイックミラー１９とバリアフィルタ２２と結像レンズ２３を介してカメラ２４に入射し、対物レンズ２１と結像レンズ２３の作用によってカメラ２４の撮影面に集光される。
このとき、カメラ２４の撮影面には、２種類の蛍光に基づく標本２０の蛍光像が形成される。撮影面の蛍光像は、カメラ２４によって撮影され、標本２０の蛍光画像として取り込まれる。上記の対物レンズ２１および結像レンズ２３は、請求項の「結像光学系」に対応する。
【００１７】
次に、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）について説明する。
落射照明装置（１１〜１９）は、光軸１０ａに沿って順に、光源１１と、コレクタレンズ１２と、光源結像レンズ１３と、開口絞り１４と、光量バランスフィルタ１５と、視野絞り１６と、視野レンズ１７と、励起フィルタ１８と、ダイクロイックミラー１９とが配置され、かつ、光量バランスフィルタ１５に駆動部１５ａが接続された構成となっている。
【００１８】
また、落射照明装置（１１〜１９）は、光軸１０ａが上記の観察系（２１〜２４）の光軸２０ａに対して略直交する向きで、観察系（２１〜２４）の対物レンズ２１とバリアフィルタ２２との間に組み込まれる。このとき、光軸２０ａ上には、落射照明装置（１１〜１９）のダイクロイックミラー１９が配置される。
標本２０の蛍光観察時、光源１１からの照明光は、概略、コレクタレンズ１２と光源結像レンズ１３と開口絞り１４と光量バランスフィルタ１５と視野絞り１６と視野レンズ１７と励起フィルタ１８を透過し、ダイクロイックミラー１９で反射して、観察系（２１〜２４）の光軸２０ａ上に導かれる。そして、対物レンズ２１を通過した後、標本２０に照射される。このように、落射照明装置（１１〜１９）は、対物レンズ２１を利用して標本２０を照明するように構成されている。
【００１９】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）では、対物レンズ２１の瞳面２１ａに共役な基準面が視野レンズ１７によって光源１１と励起フィルタ１８との間に規定され、この基準面の近傍に、開口絞り１４と光量バランスフィルタ１５とが近接して配置されている。なお、対物レンズ２１の瞳面２１ａは、入射瞳面または後側焦点面とも言う。視野レンズ１７は、請求項の「光学系」に対応する。
【００２０】
光源１１は、例えば水銀ランプなどの高輝度光源であり、紫外線や可視光線などの照明光（標本２０の２種類の蛍光物質を励起するために適切な２つの波長域λＳ，λＬを含む波長域の照明光）を対物レンズ２１側のコレクタレンズ１２に向けて射出する。コレクタレンズ１２および光源結像レンズ１３は、光源１１からの照明光を集光して、開口絞り１４と光量バランスフィルタ１５の近傍（対物レンズ２１の瞳面２１ａに共役な基準面の近傍）に光源像を形成する。
【００２１】
開口絞り１４には、円形状の開口１４ａが落射照明装置（１１〜１９）の光軸１０ａに中心を揃えて設けられている。本実施形態では、上記した光源像の大きさおよび形状が、開口絞り１４の開口１４ａと同じであるとして説明を行う。開口１４ａの大きさは例えば３ｍｍ〜５ｍｍ程度である。
また、開口絞り１４と光量バランスフィルタ１５は互いに十分近接しているため、光量バランスフィルタ１５の開口絞り１４側の面に入射する照明光の大きさおよび形状も、開口絞り１４の開口１４ａと同じ（つまり光源像と同じ）であると考えることができる。
【００２２】
このため、以下の説明では、光量バランスフィルタ１５の開口絞り１４側の面に入射するときの照明光の断面を「光源像」という。なお、上記の光源１１，コレクタレンズ１２，光源結像レンズ１３，開口絞り１４は、請求項の「光源手段」に対応する。
さて、光量バランスフィルタ１５について説明する。光量バランスフィルタ１５は、１枚のガラス基板の一方の面（開口絞り１４側の面）にコーティングを付けることにより作製された干渉フィルタである。この光量バランスフィルタ１５は、照明光の光路中に配置されている。
【００２３】
また、光量バランスフィルタ１５には、図２（ａ）に示すように、３つの領域３１，３２，３３が一方向（Ａ）に沿って設けられている。図２（ａ）は光量バランスフィルタ１５を光軸１０ａの方向から見た図である。一方向（Ａ）は、光軸１０ａの方向に垂直な方向であり、照明光の光路に交差している。
これら３つの領域３１〜３３のうち、両側の領域３１，３３は、上記のコーティングが付けられた領域であり、中央の領域３２は、コーティングのないガラス基板のままの領域である。このため、３つの領域３１〜３３のうち、隣り合う領域どうし（領域３１，３２どうし）（領域３２，３３どうし）は、分光特性が互いに異なることになる。
【００２４】
さらに、本実施形態では、両側の領域３１，３３のコーティング状態（例えば、材料や膜厚など）が、互いに異なる。このため、両側の領域３１，３３の分光特性も互いに異なることになる。すなわち、光量バランスフィルタ１５には、分光特性の異なる３つの領域３１〜３３が確保されている。また、各々の領域３１〜３３の分光特性は、各々の領域３１〜３３内で均一とする。
【００２５】
光量バランスフィルタ１５の領域３１，３２，３３の分光特性について具体例を説明すると、領域３１の分光特性は、図２（ｂ）に示すように、上記した標本２０の２種類の蛍光物質を励起するために適切な波長域λＳ，λＬの間に臨界波長が設定され、この臨界波長から短波側（波長域λＳを含む側）の波長域を透過し、長波側（波長域λＬを含む側）の波長域を遮断するような分光特性である。
【００２６】
領域３２の分光特性は、図２（ｃ）に示すように、２つの波長域λＳ，λＬを含む全ての波長域を透過するような分光特性である。さらに、領域３３の分光特性は、図２（ｄ）に示すように、２つの波長域λＳ，λＬの間に臨界波長が設定され、この臨界波長から長波側（波長域λＬを含む側）の波長域を透過し、短波側（波長域λＳを含む側）の波長域を遮断するような分光特性である。
【００２７】
また、光量バランスフィルタ１５において、領域３１，３２の境界３４、および、領域３２，３３の境界３５は、共に、領域３１〜３３の配列方向（つまり一方向（Ａ））に対して垂直方向に形成されている。光量バランスフィルタ１５は、請求項の「フィルタ部材」に対応する。
さらに、本実施形態では、上記した光量バランスフィルタ１５に駆動部１５ａ（図１）が接続され、この駆動部１５ａを手動操作することにより、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）に沿ってスライドさせることができるようになっている。この駆動部１５ａと光量バランスフィルタ１５とを含めて、請求項の「調整手段」に対応する。
【００２８】
駆動部１５ａを操作して光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせると、開口絞り１４からの照明光が光量バランスフィルタ１５に入射する位置は一方向（Ａ）に沿って相対的に変化する。そして、図３（ａ）〜（ｇ）に示すように、光量バランスフィルタ１５上の光源像１１ａの位置も一方向（Ａ）に沿って相対的に変化することになる。図３（ａ）〜（ｇ）は、光源像１１ａと光量バランスフィルタ１５を光軸１０ａの方向から見た図である。
【００２９】
光量バランスフィルタ１５に入射した照明光は、例えば図３（ａ）に示す光源像１１ａの位置に応じて領域３１のみを透過し（図１の照明光Ｌ１）、後段の視野絞り１６に向かう。光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせて、光源像１１ａの位置を図３（ｂ）〜（ｇ）の何れかに変化させることにより、領域３１，領域３２の双方や、領域３２のみ、または、領域３２，領域３３の双方、領域３３のみを透過させることも可能である（後述する）。
【００３０】
なお、光量バランスフィルタ１５の領域３１〜３３の少なくとも１つを透過した後の照明光Ｌ１は、その波長域が、光量バランスフィルタ１５に入射する前の照明光と同じである。つまり、光量バランスフィルタ１５により照明光Ｌ１の波長域が変化することはない。詳細は後述するが、光量バランスフィルタ１５は、照明光の波長域を調整するためのフィルタではなく、照明光の光量バランスを調整するためのフィルタである。
【００３１】
光量バランスフィルタ１５を透過した後の照明光Ｌ１は、視野絞り１６（図１）を介して視野レンズ１７に入射する。視野絞り１６は、標本２０とカメラ２４の撮影面との双方に共役な面に配置され、標本２０の観察視野（照明範囲）を規定する。
視野レンズ１７は、既に説明したように、対物レンズ２１の瞳面２１ａに共役な基準面を規定する光学系である。このため、その基準面の近傍に配置された光量バランスフィルタ１５からの照明光Ｌ１は、視野レンズ１７の作用によって対物レンズ２１の瞳面２１ａに集光される。
【００３２】
ただし、視野レンズ１７を透過した照明光は、観察系（２１〜２４）の光軸２０ａ上に導かれる前に、つまり、落射照明装置（１１〜１９）の光軸１０ａ上を進行している間に、励起フィルタ１８を透過する。この励起フィルタ１８は、図４に示すように、予め定められた２つの異なる波長域λＳ，λＬで照明光を透過するフィルタである。
【００３３】
励起フィルタ１８の２つの波長域λＳ，λＬのうち一方は、前述のように、標本２０の中の一方の蛍光物質を励起するために適切な波長域であり、２つの波長域λＳ，λＬのうち他方は、標本２０の中の他方の蛍光物質を励起するために適切な波長域である。
励起フィルタ１８に入射する照明光の波長域は、上記の光量バランスフィルタ１５を透過した照明光Ｌ１の波長域と同じである。つまり、視野レンズ１７によって照明光の波長域が変化することはない。このため、励起フィルタ１８は、照明光Ｌ１の波長域のうち、２つの波長域λＳ，λＬ（図４）のみを同時に抽出する。励起フィルタ１８は、請求項の「抽出手段」に対応する。
【００３４】
したがって、励起フィルタ１８を透過した照明光は、異なる波長域λＳ，λＬの２つの照明光ＬＳ，ＬＬを含むものとなる。この２つの照明光ＬＳ，ＬＬは、励起フィルタ１８に入射する照明光Ｌ１の一部である。そして、２つの照明光ＬＳ，ＬＬが対物レンズ２１の瞳面に集光され、対物レンズ２１を通過した後、標本２０の観察視野に照射される。
【００３５】
なお、励起フィルタ１８の後段に配置されたダイクロイックミラー１９は、励起フィルタ１８を透過した２つの波長域λＳ，λＬの照明光ＬＳ，ＬＬを反射可能で、標本２０から発生する２種類の蛍光を透過可能な分光特性を有する。
標本２０の観察視野内では、一方の蛍光物質が例えば波長域λＳの照明光ＬＳによって励起され、自身の蛍光発生効率（照明光の光量に対する蛍光の光量の比率）に応じた光量の蛍光を発生する。同様に、他方の蛍光物質は例えば波長域λＬの照明光ＬＬによって励起され、自身の蛍光発生効率に応じた光量の蛍光を発生する。
【００３６】
これら２種類の蛍光は、上記した観察系（２１〜２４）のカメラ２４に導かれ、カメラ２４によって２種類の蛍光に基づく標本２０の蛍光像が撮影され、標本２０の蛍光画像として取り込まれる。このとき、２種類の蛍光の光量が異なってしまうと、標本２０の蛍光画像には明るい像と暗い像が混在することになり、非常に観察し辛い。
【００３７】
次に、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくするために、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）を用い、標本２０に照射される２つの照明光ＬＳ，ＬＬの光量を調整する方法について説明する。照明光ＬＳ，ＬＬの光量の調整は、駆動部１５ａを操作して光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせることにより行われる。
【００３８】
ここでは、説明を簡単にするため、光量バランスフィルタ１５に入射する照明光のうち、波長域λＳの成分（以下「照明光Ｌ０Ｓ」という）、および、波長域λＬの成分（以下「照明光Ｌ０Ｌ」という）のみに着目する。同様に、光量バランスフィルタ１５を透過した照明光Ｌ１のうち、波長域λＳの成分（以下「照明光Ｌ１Ｓ」という）、および、波長域λＬの成分（以下「照明光Ｌ１Ｌ」という）のみに着目する。波長域λＳ，λＬ以外の波長域の成分は、励起フィルタ１５（図４）を透過するときに遮断され、標本２０には到達しないからである。
【００３９】
ちなみに、波長域λＳの照明光Ｌ０Ｓは、光量バランスフィルタ１５を介して照明光Ｌ１Ｓとなり、励起フィルタ１８を介して照明光ＬＳとなり、標本２０に入射する。また同様に、波長域λＬの照明光Ｌ０Ｌは、光量バランスフィルタ１５を介して照明光Ｌ１Ｌとなり、励起フィルタ１８を介して照明光ＬＬとなり、標本２０に入射する。
さらに、説明を簡単にするため、光量バランスフィルタ１５に入射するときの照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面が、図５（ａ）に示すように何れも円形であり、図３に示す光源像１１ａと同じ大きさであるとする。
【００４０】
さらに、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面における強度分布は、図５（ｂ）に示すように、均一であるとする。この場合、光量バランスフィルタ１５を透過したときの照明光Ｌ１Ｓ，Ｌ１Ｌの断面や、励起フィルタ１８からの照明光ＬＳ，ＬＬが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面でも、強度分布が均一になる。
上述したように（図３（ａ）〜（ｇ）参照）、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせると、光量バランスフィルタ１５上の光源像１１ａの位置は、一方向（Ａ）に沿って相対的に変化する。そして、光源像１１ａの一部分を構成している照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面（図５（ａ）参照）の位置も、一方向（Ａ）に沿って相対的に変化する。
【００４１】
また、上述したように（図２（ｂ）〜（ｄ）参照）、光量バランスフィルタ１５の領域３１〜３３の分光特性は互いに異なる。ここで、領域３１〜３３の分光特性に関して、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌ（波長域λＳ，λＬ）のみに着目して説明する。
領域３１（図２（ｂ））は、短波側の波長域λＳの照明光Ｌ０Ｓを透過して、長波側の波長域λＬの照明光Ｌ０Ｌを遮断する。領域３２（図２（ｃ））は、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌを共に透過する。領域３３（図２（ｄ））は、照明光Ｌ０Ｓを遮断して、照明光Ｌ０Ｌを透過する。以下、適宜、領域３１を「短波透過領域３１」、領域３２を「全透過領域３２」、領域３３を「長波透過領域３３」と呼ぶことにする。
【００４２】
ここで、光量バランスフィルタ１５のスライドにより、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面の位置が一方向（Ａ）に沿って相対的に変化し（図３（ａ）〜（ｇ）参照）、例えば図３（ｄ）のように、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面の全体が全透過領域３２内に形成されるとき、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌは、共に、そのまま光量バランスフィルタ１５から透過することになる。
【００４３】
この場合、光量バランスフィルタ１５を透過したときの照明光Ｌ１Ｓ，Ｌ１Ｌの断面は、図６（ｄ）に示すように、何れも円形なまま保たれる。したがって、励起フィルタ１８からの照明光ＬＳ，ＬＬが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面も、円形なまま保たれる。そして、標本２０に照射される照明光ＬＳ，ＬＬの光量は、共に最大光量となる。
【００４４】
照明光ＬＳ，ＬＬの最大光量は、概略、光量バランスフィルタ１５に入射する照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの光量（Ｉ０Ｓ，Ｉ０Ｌ）と、励起フィルタ１８の波長域λＳ，λＬでの透過率（Ｔ０Ｓ，Ｔ０Ｌ）との積に応じて決まる一定光量である。そして、標本２０に照射される照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスは、概略、（Ｉ０Ｓ×Ｔ０Ｓ）：（Ｉ０Ｌ×Ｔ０Ｌ）となる。
【００４５】
これに対し、長波側の波長域λＬの照明光ＬＬを減光したい場合には、図３に示すように、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）に沿って「短波透過領域３１が光軸１０ａに近づく側（図中プラス側と記載）」へスライドさせ、短波透過領域３１と全透過領域３２との境界３４が照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面を横切るような状態（例えば図３（ｂ），（ｃ））に設定すればよい。
【００４６】
図３（ｂ），（ｃ）の状態では、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面の一部（図中左側部分）が短波透過領域３１内に位置し、他の一部（図中右側部分）が全透過領域３２内に位置している。
このとき、短波側の照明光Ｌ０Ｓは、そのまま光量バランスフィルタ１５から透過する。したがって、光量バランスフィルタ１５を透過したときの照明光Ｌ１Ｓの断面（図６（ｂ），（ｃ））も、励起フィルタ１８からの照明光ＬＳが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面も、円形なまま保たれる。そして、標本２０に照射される照明光ＬＳは最大光量のままである。
【００４７】
一方、長波側の照明光Ｌ０Ｌ（図３（ｂ），（ｃ））は、断面のうち全透過領域３２内の部分で光量バランスフィルタ１５を素通りするが、短波透過領域３１内の部分で遮断されることになる。したがって、光量バランスフィルタ１５を透過したときの照明光Ｌ１Ｌの断面（図６（ｂ），（ｃ））は、円形ではなく、短波透過領域３１との重なり部分３１ａ（ハッチング部）が欠けた形状となる。
【００４８】
したがって、励起フィルタ１８からの照明光ＬＬが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面も、図６（ｂ），（ｃ）と同様の形状となる。そして、標本２０に照射される照明光ＬＬの光量は、最大光量より弱くなる。
この場合の減光率は、図６（ｄ）のように照明光Ｌ１Ｌの断面が円形であるときの面積をＳｍａｘ、短波透過領域３１との重なり部分３１ａ（図６（ｂ），（ｃ））の面積をＳＬとすると、ＳＬ／Ｓｍａｘで表すことができる。これは、上述のように、各々の断面における強度分布が均一であるとしたからである。
【００４９】
このように、光量バランスフィルタ１５の短波透過領域３１と全透過領域３２との境界３４が照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面を横切るような状態（図３（ｂ），（ｃ））に設定すると、短波側の照明光ＬＳは最大光量のままで、長波側の照明光ＬＬのみを減光することができる。標本２０に照射される照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスは、概略、（Ｉ０Ｓ×Ｔ０Ｓ）：（Ｉ０Ｌ×Ｔ０Ｌ×（１−ＳＬ／Ｓｍａｘ））となる。
【００５０】
なお、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面の全体が短波透過領域３１内に位置する状態（図３（ａ））では、短波側の照明光ＬＳを最大光量のままで、長波側の照明光ＬＬのみを完全に遮断することができる。
また逆に、短波側の波長域λＳの照明光ＬＳを減光したい場合には、図３に示すように、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）に沿って「長波透過領域３３が光軸１０ａに近づく側（図中マイナス側と記載）」へスライドさせ、全透過領域３２と長波透過領域３３との境界３５が照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面を横切るような状態（例えば図３（ｅ），（ｆ））に設定すればよい。
【００５１】
図３（ｅ），（ｆ）の状態では、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面の一部（図中左側部分）が全透過領域３２内に位置し、他の一部（図中右側部分）が長波透過領域３３内に位置している。
このとき、長波側の照明光Ｌ０Ｌは、そのまま光量バランスフィルタ１５から透過する。したがって、光量バランスフィルタ１５を透過したときの照明光Ｌ１Ｌの断面（図６（ｅ），（ｆ））も、励起フィルタ１８からの照明光ＬＬが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面も、円形なまま保たれる。そして、標本２０に照射される照明光ＬＬは最大光量のままである。
【００５２】
一方、短波側の照明光Ｌ０Ｓ（図３（ｅ），（ｆ））は、断面のうち全透過領域３２内の部分で光量バランスフィルタ１５を素通りするが、長波透過領域３３内の部分で遮断されることになる。したがって、光量バランスフィルタ１５を透過したときの照明光Ｌ１Ｓの断面（図６（ｅ），（ｆ））は、円形ではなく、長波透過領域３３との重なり部分３３ａ（ハッチング部）が欠けた形状となる。
【００５３】
したがって、励起フィルタ１８からの照明光ＬＳが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面も、図６（ｅ），（ｆ）と同様の形状となる。そして、標本２０に照射される照明光ＬＳの光量は、最大光量より弱くなる。
この場合の減光率は、図６（ｄ）のように照明光Ｌ１Ｓの断面が円形であるときの面積をＳｍａｘ、長波透過領域３３との重なり部分３３ａ（図６（ｅ），（ｆ））の面積をＳＳとすると、ＳＳ／Ｓｍａｘで表すことができる。これも、上述のように、各々の断面における強度分布が均一であるとしたからである。
【００５４】
このように、光量バランスフィルタ１５の長波透過領域３３と全透過領域３２との境界３５が照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面を横切るような状態（図３（ｅ），（ｆ））に設定すると、長波側の照明光ＬＬは最大光量のままで、短波側の照明光ＬＳのみを減光することができる。標本２０に照射される照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスは、概略、（Ｉ０Ｓ×Ｔ０Ｓ×（１−ＳＳ／Ｓｍａｘ））：（Ｉ０Ｌ×Ｔ０Ｌ）となる。
【００５５】
なお、照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面の全体が長波透過領域３３内に位置する状態（図３（ｇ））では、長波側の照明光ＬＬを最大光量のままで、短波側の照明光ＬＳのみを完全に遮断することができる。
上述したように、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）では、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、２つの照明光ＬＳ，ＬＬが対物レンズ２１の瞳面２１ａを通過するときの断面の面積（（Ｓｍａｘ−ＳＬ）または（Ｓｍａｘ−ＳＳ））を、各々の波長域λＳ，λＬごとに個別に調整することができる。そして、断面の面積を小さく調整した分だけ、照明光ＬＳ，ＬＬの光量を弱くすることができる。照明光ＬＳ，ＬＬの光量は、瞳面２１ａでの面積（（Ｓｍａｘ−ＳＬ）または（Ｓｍａｘ−ＳＳ））に比例する。
【００５６】
すなわち、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）では、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、標本２０に照射される照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを広い範囲で簡単に調整することができる。
また、本実施形態では、照明光ＬＳ，ＬＬのうち一方を最大光量のまま保ちながら、他方のみを減光することができる。長波側の照明光ＬＬと短波側の照明光ＬＳとの何れを減光するかは、光量バランスフィルタ１５をスライドさせる側（プラス側またはマイナス側）によって決めることができる。また、減光量は、光量バランスフィルタ１５の位置に応じて連続的に調整することができる。
【００５７】
さらに、本実施形態では、光量バランスフィルタ１５の短波透過領域３１（図２（ｂ））で、長波側の波長域λＬの照明光Ｌ０Ｌが遮断され、長波透過領域３３（図２（ｄ））で、短波側の波長域λＳの照明光Ｌ０Ｓが遮断されるため、標本２０に照射される照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを特に広い範囲で調整できる。
実際の使用方法としては、例えばカメラ２４により取り込まれた蛍光画像をモニタまたは接眼レンズ（不図示）で観察しながら、光量バランスフィルタ２５をスライドさせ、標本２０の蛍光画像の明るさバランスが最善となった位置で光量バランス２５の操作を終了することになる。
【００５８】
したがって、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）によれば、光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせるだけで、標本２０に照射される２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを容易に調整することができ、標本２０の各々の蛍光物質から発生する蛍光の光量を等しくできる。
その結果、カメラ２４で取り込まれる標本２０の蛍光画像には、標本２０の異なる部位に関する２種類の蛍光像が共に適切な明るさで混在することになり、良好な蛍光観察が可能となる。
【００５９】
また、励起フィルタ１８を異なる２つの波長域のものに交換したときでも、その２つの波長域のうち、短波長側が上記した波長域λＳの近傍またはそれ以下で、長波長側が上記した波長域λＬの近傍またはそれ以上であれば、光量バランスフィルタ１５を交換する必要がない。
つまり、光量バランスフィルタ１５を交換しなくても、任意の蛍光物質の組み合わせにも柔軟に対応することができ（波長対応性の向上）、照明光Ｌ１，Ｌ２の光量バランスを連続的に調整できる。その結果、作業が簡単化すると共に安価に構成でき、汎用性が向上する。
【００６０】
さらに、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）では、光量バランスフィルタ１５を対物レンズ２１の瞳面２１ａに共役な基準面の近傍に配置するため、標本２０の観察視野における光学特性の劣化（照明ムラなど）が生じることはない。つまり、標本２０の観察視野を波長域λＳ，λＬの照明光ＬＳ，ＬＬの各々により均一に照明できる。したがって、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを連続的に調整した場合でも、高精度な蛍光観察が可能となる。
【００６１】
また、本実施形態の落射照明装置（１１〜１９）では、光量バランスの調整機構が、１枚の光量バランスフィルタ１５を一方向（Ａ）にスライドさせるだけの構成であるため、省スペース化も実現する。
（変形例）
なお、上記した実施形態では、図２（ａ）に示すように、３つの領域３１，３２，３３が一方向（Ａ）に沿って設けられた光量バランスフィルタ１５の例を説明したが、本発明はこれに限定されない。光量バランスフィルタの領域の数は２つでも４つ以上でも構わない。
【００６２】
例えば２つの領域により光量バランスフィルタを構成する場合には、▲１▼短波透過領域と全透過領域との組み合わせや、▲２▼長波透過領域と全透過領域との組み合わせ、▲３▼短波透過領域と長波透過領域との組み合わせなどが考えられる。
【００６３】
上記▲１▼の場合は、短波側の照明光ＬＳを最大光量のまま保ち、長波側の照明光ＬＬを減光することで、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを調整できる。上記▲２▼の場合は、長波側の照明光ＬＬを最大光量のまま保ち、短波側の照明光ＬＳを減光することで、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを調整できる。標本２０から発生する蛍光は微弱なため、２つの領域のうち一方を全透過領域にすることが好ましい。
【００６４】
また、上記した実施形態では、対物レンズ２１の瞳面２１ａに共役な基準面の近傍に１枚の光量バランスフィルタ１５を設けたが、図７（ａ）に示すように、２枚の光量バランスフィルタ１５（１），１３（２）を近接させて配置することもできる。この構成は、励起フィルタが３つの異なる波長域λＳ，λＣ，λＬで照明光を透過するように構成されている場合に有効である。光量バランスフィルタ１５（１），１３（２）は、駆動部１５ａによって独立にスライド可能である。
【００６５】
一方の光量バランスフィルタ１５（１）には、図７（ｂ）に示すように、２つの領域４１，４２が一方向（Ａ）に沿って設けられている。領域４１の分光特性は、上記した長波透過領域３３と同様であり、図７（ｃ）に示すように、波長域λＳ，λＣの間に臨界波長が設定され、この臨界波長から長波側（波長域λＣ，λＬを含む側）の波長域を透過し、短波側（波長域λＳを含む側）の波長域を遮断するようになっている。領域４２の分光特性は、上記した全透過領域３２と同様である。
【００６６】
他方の光量バランスフィルタ１３（２）には、図７（ｂ）に示すように、２つの領域４３，４４が一方向（Ａ）に沿って設けられている。領域４３の分光特性は、上記した全透過領域３２と同様である。領域４４の分光特性は、上記した短波透過領域３１と同様であり、図７（ｄ）に示すように、波長域λＣ，λＬの間に臨界波長が設定され、この臨界波長から短波側（波長域λＳ，λＣを含む側）の波長域を透過し、長波側（波長域λＬを含む側）の波長域を遮断するようになっている。
【００６７】
この場合、一方の光量バランスフィルタ１５（１）では、上記▲２▼と同様に、波長域λＣ，λＬの照明光を最大光量のまま保ち、短波側の波長域λＳの照明光を減光することができ、他方の光量バランスフィルタ１３（２）では、上記▲１▼と同様に、波長域λＳ，λＣの照明光を最大光量のまま保ち、長波側の波長域λＬの照明光を減光することができる。
【００６８】
したがって、光量バランスフィルタ１５（１），１３（２）を一方向（Ａ）に独立にスライドさせることにより、真ん中の波長域λＣの照明光を最大光量のまま保ちながら、短波側の波長域λＳの照明光と長波側の波長域λＬの照明光とを独立に減光させることができ、結果として、３つの異なる波長域λＳ，λＣ，λＬの照明光の光量バランスを連続的に調整することができる。
【００６９】
また、４つ以上の蛍光物質で標識された標本２０の蛍光観察を行う場合にも、本発明は適用できる。この場合には上記と同様に、光量バランスフィルタの数を増やせばよい。
また、光量バランスフィルタに設けられた複数の領域の配列方向は、上記のような一方向（Ａ）だけに限らない。つまり、光軸１０ａに垂直な方向に限らず、光軸１０ａに交差していれば、どのような方向に沿って複数の領域を配列してもよい。さらに、１つの方向に限らず、光軸１０ａに交差する２つの方向に沿って複数の領域を配列してもよい。この場合、光量バランスフィルタも２つの方向に移動可能とすることが好ましい。
【００７０】
さらに、上記した実施形態では、光量バランスフィルタの全透過領域がコーティングのないガラス基板のままの領域である例を説明したが、この全透過領域は中空にすることもできる。この場合、それ以外の領域を構成するガラス基板の厚さを薄くすることが好ましい。中空部分とガラス基板との光路差を小さくするためである。
【００７１】
また、上記した実施形態では、光量バランスフィルタを干渉フィルタにより構成したが、各々の領域に必要な透過率特性を有する色ガラスフィルタに置き換えることもできる。２枚の色ガラスフィルタを隣接させる場合は、端面どうしを接合すればよい。
【００７２】
さらに、上記した実施形態では、図５（ｂ）に示すように、光量バランスフィルタに入射するときの照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面における強度分布が均一である例を説明したが、その強度分布が不均一な場合にも、本発明は適用できる。この場合には、図６に示す重なり部分３１ａ，３３ａの面積（ＳＬ，ＳＳ）だけでなく、その重なり部分３１ａ，３３ａにおける照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの強度分布も加味されて、２つの照明光ＬＳ，ＬＬのうち一方の減光率が決まることになる。
【００７３】
また、上記した実施形態では、光量バランスフィルタにおける領域の境界３４，３５（図２（ａ））が、光量バランスフィルタの移動方向（例えば一方向（Ａ））に対して直交する例を説明したが、本発明はこれに限定されない。例えば、図８に示す光量バランスフィルタ５５のように、その移動方向（一方向（Ａ））に対して斜め方向に、領域５１，５２の境界５３を形成することもできる（請求項３）。
【００７４】
一方向（Ａ）に対する境界５３の方向が角度θをなす場合、この角度θが小さいほど、光量バランスフィルタ５５の一方向（Ａ）への移動量δ１に対する境界５３の実際の移動量δ２の比（＝δ２／δ１）を小さくすることができる。このため、光量バランスフィルタ５５の移動量δ１を厳密に調整しなくても、境界５３の微妙な移動量δ２の調整が簡単に行える。つまり、簡単な手動操作により、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスの微調整を行うことが可能となる。
【００７５】
このような構成は、光量バランスフィルタ５５上での光源像が、図３の光源像１１ａのような円形ではなく、光量バランスフィルタ５５の移動方向（一方向（Ａ））に対して垂直な方向に縦長の場合（例えばピーナツ状）、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスをさらに微調整しやすくなるため、特に有効である。
さらに、上記した実施形態では、短波透過領域３１，４４の分光特性として、長波側を完全に遮断するような特性（透過率≒０％）の例を説明したが、図９に示すように、短波側から長波側にかけて徐々に透過率が低下するような分光特性でも、短波側と長波側とで段階的に透過率が変化するような分光特性でも、本発明を適用できる。長波透過領域３３，４１についても同様である。
【００７６】
上記構成の短波透過領域（または長波透過領域）と全透過領域（または中空）とを組み合わせた光量バランスフィルタの場合は、そのスライドにより、対物レンズ２１の瞳面２１ａにおける照明光の断面の面積（（Ｓｍａｘ−ＳＬ）または（Ｓｍａｘ−ＳＳ））は変化しない。
しかし、その代わりに、瞳面２１ａでの照明光の断面における長波透過領域（または短波透過領域）の強度分布が変化することになる。この場合には、瞳面２１ａでの強度分布の変化に応じて、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを調整することができる。また、瞳面２１ａでの断面の面積と、断面における強度分布との双方を変化させることにより、照明光ＬＳ，ＬＬの光量バランスを調整してもよい。
【００７７】
さらに、上記した実施形態では、光源１１，コレクタレンズ１２，光源結像レンズ１３，開口絞り１４からなる光源手段の例を説明したが、開口絞り１４を省略することもできる。また、このような光源手段（１１〜１４）に代えて、光ガイドを用いることもできる。光ガイドを用いる場合、その出射端面を光量バランスフィルタの近傍に配置することが好ましい。また、光源手段（１１〜１４）に代えて、小型の半導体レーザーや発光ダイオードなどを用いてもよい。この場合は、開口絞りとの組み合わせ構成も考えられる。
【００７８】
また、上記した実施形態では、開口絞り１４，光量バランスフィルタ１５の順に配置する例を説明したが、開口絞り１４と光量バランスフィルタ１５の位置関係は逆でもよい。
さらに、上記した実施形態では、落射照明装置（１１〜１９）と観察系（２１〜２４）とが交差する箇所にダイクロイックミラー１９を配置したが、これに代えてビームスプリッタを配置しても良い。
【００７９】
また、励起波長域λＳ，λＬの種類ごとに光量バランスフィルタ１５を多数用意しておけば、蛍光観察（励起波長の種類）に応じて取り替えるだけで、使い勝手の良いものとなる。
さらに、上記した実施形態では、蛍光顕微鏡１０に落射照明装置（１１〜１９）を組み込む例で説明したが、落射照明装置（１１〜１９）は、蛍光顕微鏡だけでなく、他の蛍光測定装置に組み込むこともできる。
【００８０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、標本に対する複数の照明光の光量を広い範囲で連続的に調整することができると共に安価に構成することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛍光顕微鏡１０および落射照明装置（１１〜１９）の全体構成図である。
【図２】光量バランスフィルタ１５の構成を説明する図である。
【図３】光量バランスフィルタ１５と光源像１１ａとの位置関係を説明する図である。
【図４】励起フィルタ１８の分光特性を説明する図である。
【図５】光量バランスフィルタ１５に入射する照明光Ｌ０Ｓ，Ｌ０Ｌの断面状態を説明する図である。
【図６】落射照明装置（１１〜１９）による光量バランスの調整方法を説明する図である。
【図７】２枚の光量バランスフィルタを設けた落射照明装置を説明する図である。
【図８】他の光量バランスフィルタの構成を説明する図である。
【図９】他の短波透過領域の分光特性を説明する図である。
【符号の説明】
１０　蛍光顕微鏡
１１　光源
１２　コレクタレンズ
１３　光源結像レンズ
１４　開口絞り
１５，５５　光量バランスフィルタ
１５ａ　駆動部
１６　視野絞り
１７　視野レンズ
１８　励起フィルタ
１９　ダイクロイックミラー
２０　標本
２１　対物レンズ
２２　バリアフィルタ
２３　結像レンズ
２４　カメラ
【図１】
2004012961.tif 000003
【図２】
2004012961.tif 000004
【図３】
2004012961.tif 000005
【図４】
2004012961.tif 000006
【図５】
2004012961.tif 000007
【図６】
2004012961.tif 000008
【図７】
2004012961.tif 000009
【図８】
2004012961.tif 000010
【図９】
2004012961.tif 000011