(57)【要約】【課題】抗酸菌中の遺伝子を溶菌・抽出するための前処理方法において、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の抗酸菌の沈殿物を再分散した後の遠心分離装置や特殊な試薬を用いることなく、簡単かつ短時間に、前処理・溶菌・増幅といった一連の流れを実現できるようにする。【解決手段】抗酸菌の含有が疑われる検体をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理した後、遠心分離処理を介することなく、その検体処理物を直接に溶菌手段に供する。当該検体処理物を滅菌蒸留水のみで分散してから溶菌手段に供してもよい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸菌中の遺伝子を溶菌・抽出するための前処理方法であって、抗酸菌の含有が疑われる検体をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理した後、得られた沈澱物を直接に溶菌手段に供することを特徴とする、抗酸菌の前処理方法。
【請求項２】
該沈澱物を滅菌蒸留水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ：Ｄ．Ｗ）のみで分散し、その分散液を溶菌手段に供することを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記載の前処理方法。
【請求項３】
前記溶菌手段が、有機溶媒と混合するものである、特許請求の範囲第１項に記載の前処理方法。
【請求項４】
前記溶菌手段が、超音波を物理的に当てる方法である、特許請求の範囲第１項に記載の前処理方法。
【請求項５】
前記溶菌手段が、凍結・融解を繰り返す方法である、特許請求の範囲第１項に記載の前処理方法。
【請求項６】
前記溶菌手段が、非イオン界面活性剤を含む試薬と混合することである、特許請求の範囲第１項に記載の前処理方法。
【請求項７】
非イオン界面活性剤が、ｄ−ソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステルおよびポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである特許請求の範囲第６項に記載の前処理方法。
【請求項８】
さらに金属キレート剤を含む、特許請求の範囲第６項に記載の前処理方法。
【請求項９】
前記金属キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ｏ−フェナンスロリンおよびサリチル酸からなる群から選択された少なくとも一つである特許請求の範囲第８項に記載の前処理方法。
【請求項１０】
溶菌対象となる抗酸菌が、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１から９のいずれかに記載の前処理方法。
【請求項１１】
抗酸菌の遺伝子を特異的に増幅若しくは検出する方法であって、請求項１から１０のいずれかの方法により抗酸菌を処理して遺伝子を抽出し、これを試料として遺伝子を特異的に増幅若しくは検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗酸菌中の遺伝子を抽出するための前処理方法およびそれを用いた遺伝子増幅若しくは検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗酸菌の中でも、特に結核菌が引き起こす結核は、今なお、世界的に重要な細菌性疾患であり、その治療方法のみならず診断方法は極めて重要である。結核の最終的確認は、培養法により行われるが、結核菌の増殖速度は極めて遅いため、培養法の前段階で実施される予備的診断方法の確立が望まれている。このような予備的診断方法として、注目されているのは、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ法）を適用した方法である。この方法は、結核菌の遺伝子に特異的なプライマーを用い、結核菌の遺伝子を増幅して検出することにより、結核菌の有無を判定する方法である。
【０００３】
前記ＰＣＲ法を適用した予備的診断方法では、その前段階として結核菌といった抗酸菌を溶菌して、核内から遺伝子を抽出する必要がある。さらにその前段階として、生体試料から抗酸菌のみを集菌する必要がある。
【０００４】
例えば結核菌のみを収集するための処理方法として、Ｎ―アセチル―Ｌ―システイン・水酸化ナトリウム（ＮＡＬＣ―ＮａＯＨ）法が用いられる。もともと、ＮＡＬＣ―ＮａＯＨ法の目的は、検査材料（喀痰など）を消化・均等化し、含まれる雑菌を殺して汚染除去し、遠心（３０００Ｇ、２０分間）し、得られる沈澱を浮遊させて培地へ摂取し、抗酸菌のみを選択的に培養することにある。
【０００５】
非結核性抗酸菌、特にエム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）やエム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）などの迅速発育菌は結核菌よりもアルカリに対する抵抗性が弱いため、抗酸菌の分離に当たっては、粘液溶解剤で喀痰を溶解しつつ、水酸化ナトリウムの濃度をできるだけ低く抑えることが重要である。そこで、最近では、前処理剤として粘液溶解剤である上記ＮＡＬＣ―ＮａＯＨ法の使用が推奨されている（Ｋｕｂｉｃａ  ＧＰ，  Ｄｙｅ  Ｅ，Ｃｏｈｎ  ＭＬ  ｅｔ  ａｌ．：Ｓｐｕｔｕｍｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｆｏｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ．  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．  １９６３；８７：７７５−７７９．）。このようにＮＡＬＣ―ＮａＯＨ法は、前処理剤による消化均等化と遠心による集菌を組み合わせ、アルカリの影響を極端に少なくした方法であり、多用されている（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  （ＡＳＭ）：Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３．  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＭｉｃｏｒｏｂｉｏｌｏｇｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．  ＡＳＭ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，１９９４．）。
【０００６】
さて、多くの細菌検査室では、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の沈殿をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再分散させている。これは、前工程で使用したＮａＯＨの中和を完全に行い、ｐＨの影響を受けやすい培養検査への影響を軽減するためである。実際、新結核菌検査指針２０００（日本結核病学会  抗酸菌検査法検討委員会編）には、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の沈殿は滅菌ＰＢＳに浮遊させるよう規定されている。
【０００７】
ところが、これまでの発明者らの実験結果から、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後のサンプルをそのまま溶菌してＰＣＲ法にかけて核酸増幅を行うと、ＰＣＲ法を阻害する率が極めて高いことが判明している。
【０００８】
そのＰＣＲ法を阻害する原因として、喀痰中の蛋白質、ｐＨ、検体由来の阻害物質などが考えられるが、実はＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の抗酸菌の沈殿物（ペレット）を再分散させる際に用いるＰＢＳが、ＰＣＲを阻害する主原因である。
【０００９】
これらの核酸増幅反応を阻害する要因を回避する最も確実な方法としては、再分散後に遠心分離して得た沈澱物のみを回収し、上清である溶媒をＰＢＳから他のものに取りかえるか、除去することが考えられる。実際、遺伝子増幅キットであるアンプリコア検体前処理キット（ロシュ社製）は、遠心分離操作によりＰＢＳ除去を行っている。
【００１０】
【非特許文献１】
新結核菌検査指針  ２０００，ｐ．２８−２９、財団法人結核予防会  発行
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の抗酸菌の沈殿物を再分散した後に、上記のように溶媒を取りかえるためには、もう一度ペレットを得るために、１３０００Ｇ，１０分間の高速遠心分離を必要とする。高速遠心分離は操作が煩雑であり、より大型の装置も必要である。遠心分離の手間を介在させるため、使用者の接触感染の危険性も高まる。また、通常試料を移し替えるので、試料が汚染される機会が増える。遠心分離機にかける必要があるため、精製操作を連続的な工程に組み込むことができない。
【００１２】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、特殊な装置や試薬を用いることなく、簡単かつ短時間に抗酸菌を前処理から溶菌，増幅するといった一連の流れを実現できる方法の提供を、その目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明は、抗酸菌中の遺伝子を溶菌・抽出するための前処理方法であって、抗酸菌の含有が疑われる検体をＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理した後、得られた沈澱物を直接に溶菌手段に供することを特徴とする、抗酸菌の前処理方法である。
【００１４】
この方法によれば、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理して得られたペレットを、高速遠心分離を伴う煩雑な再集菌作業を行うことなしに、直接に溶菌作業へ供することができる。更に、溶菌後の検体試料は、直接に核酸増幅反応の鋳型として用いることができる。阻害物質となるＰＢＳを一切使わないために、ＰＢＳを除去するための遠心分離が不要になり、増幅前の前処理にかかる時間が大幅に短縮され、操作も簡略化される。ＰＢＳを使用しなくとも前処理操作が可能になるとは意外な発見であり、盲点であった。
【００１５】
さらに加えて、本発明の前処理方法は、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理した後の沈澱物を滅菌蒸留水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ：Ｄ．Ｗ）のみで分散し、その分散液を溶菌手段に供することもできる。
【００１６】
そのように滅菌蒸留水で分散することにより、検体試料の全体量が増加し、一部の検体試料は培養方法へ、また一部の検体試料はＰＣＲ法へ用いることができるという効果が得られる。そのため、複数種類の診断方法を併用することができるという利点も得られ、現在の保健制度における結核の必須最終的確認である培養法と、予備的診断方法であるＰＣＲ法とを、一度に利用することができる。
【００１７】
ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の滅菌蒸留水分散に続く溶菌手段は、有機溶媒や界面活性剤等を用いた化学的方法、超音波や凍結・融解を繰り返す物理的方法等を用いることが出来る。その中でも特に、非イオン界面活性剤を含む溶菌試薬と混合する方法が、安全面の高さ，核酸損傷度の低さなどから、好ましく用いることが出来る。
【００１８】
その際の非イオン界面活性剤としては、ｄ−ソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステルおよびポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つが好ましく使用できる。もちろん、複数種を混合して使用してもよい。
【００１９】
また更に、該溶菌試薬が金属キレート剤を含むことが好ましい。前記金属キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ｏ−フェナンスロリンおよびサリチル酸からなる群から選択された少なくとも一つが好ましく使用できる。もちろん、複数種を混合して使用してもよい。
【００２０】
溶菌対象となる抗酸菌は、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からなる群から選択される少なくとも一つである。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。
喀痰に結核菌を添加した擬似陽性サンプルを用いて、本願発明の方法と従来の前処理法の性能を比較した。
【００２２】
擬似陽性ＮＡＬＣ処理済み検体の調整について
１．培養結核菌の用意
結核菌をマイコブロス（極東製薬工業製培養液）で３５℃、一週間培養し、滅菌蒸留水にてＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度に調整し、１０倍希釈系列を作製した。
２．喀痰液（１５検体）の用意
結核菌陰性の健常者由来喀痰を２分割してＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理した後、一方をＰＢＳ（リン酸緩衝液ｐＨ６．８）に分散させ、他方を滅菌蒸留水に分散させた。
３．サンプルの調整
２の喀痰溶液（ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の沈殿を、ＰＢＳおよび滅菌蒸留水に分散させたもの）それぞれに、１の上記培養結核菌を添加し、擬似陽性ＮＡＬＣ処理済み検体を調整した。
【００２３】
各方法のプロトコルについて
（従来法）
アンプリコアキットの添付文書通りに行った。すなわち、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の沈殿をＰＢＳに分散させたサンプル１００μＬへ、検体洗浄液５００μＬを加え、遠心分離（１３，０００ｇ，１０分間）後、上清を除去し、溶菌試薬１００μＬを添加し、６０℃，４５分間加熱した。その後、中和試薬１００μＬを添加し、溶菌液２５μＬをＰＣＲ増幅へかけた。
（本願発明法（滅菌蒸留水法））
ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理後の沈殿を滅菌蒸留水に分散させたサンプル１００μＬへ、ＴＥ−Ｔｒｉｔｏｎ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ，１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、３％Ｔｒｉｔｏｎ）５０μＬを添加し、９６℃，１０分間加熱した。その後、得られた溶菌液１８．７５μＬをＰＣＲ増幅へかけた。
【００２４】
増幅・検出について
アンプリコアマイコバクテリウムツベルクローシス増幅試薬セット（日本ロシュ）およびアンプリコアマイコバクテリウムツベルクローシス検出試薬セット（日本ロシュ）を使用し、操作はキットの添付文書通りに行った。検出結果の判定は、ウェルの吸光度が０．３５以上のものを結核菌陽性「＋」、ウェルの吸光度が０．３５未満のものを結核菌陰性「−」とした。また、１回目の測定でウェルの吸光度が０．１以上１．０未満だったものについては、Ｎ＝２で再検を行い、計３測定の結果の多数決で「＋」か「−」かを判定した。
【００２５】
結果
結果を図１に示す。
図中の「＋」は、１回目の測定で結果が陽性であるか、または再検後に陽性になったもの、あるいはＰＣＲへ持ち込む検体量を１８．７５μＬから２４μＬに増加させた場合に結果が陽性となったことを示す。図中の「−」は陰性を示す。希釈倍率における「１０＾３」は、「１０のマイナス３乗」を示す。
【００２６】
【図１】
【００２７】
図に示すように、従来法と本願発明法とを比較すると、同等の感度が得られていることが判る。
【００２８】
以上の結果から、滅菌水直接前処理法はアンプリコア前処理法に比べて操作が大幅に簡略化されるだけでなく、検出感度も従来の感度（アンプリコア法の感度）をほぼ維持出来ることが判った。
【００２９】
本方法ではリン酸緩衝液置換を行わない原理であるため、遠心法に比べると検体中に含まれる夾雑物の影響を受けやすいことが懸念される。しかし意外なことに、これも大きな影響は受けなかった。
【００３０】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明の構成により、特殊な装置や試薬を用いることなく、簡単かつ短時間に抗酸菌を前処理から溶菌，増幅するといった一連の流れを実現できた。
【図面の簡単な説明】
図１は、喀痰に結核菌を添加した擬似陽性サンプルを用いて、本願発明の方法と従来の前処理法の性能を比較した結果を示す表である。
【図１】
2004344108.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月10日(2003.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（図１）に示す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】喀痰に結核菌を添加した擬似陽性サンプルを用いて、本願発明の方法と従来の前処理法の性能を比較した結果を示す。


【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2004344108.tif 000004