(57)【要約】【課題】化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法等を提供すること。【解決手段】脊椎動物における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法であって、（１）検体における、下記の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無又はその発生程度を評価する第二工程を有することを特徴とする方法＜登録番号群１＞ＡＦ０２３０８７，  ＡＦ０３６３３５，  ＡＦ０６２３８９，  Ｄ００３６２，  Ｄ１２７７０，  Ｄ１７４４５等等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無又はその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
ＡＦ０２３０８７，  ＡＦ０３６３３５，  ＡＦ０６２３８９，  Ｄ００３６２，  Ｄ１２７７０，  Ｄ１７４４５，  Ｄ３７９２０，  Ｄ７８５９１，  Ｄ８４４１８，  Ｈ３２１８９，  Ｊ０３６２７，  Ｌ１９６９９，  Ｍ１８４１６，  Ｍ２７２０７，  Ｍ３７５８４，  Ｍ５５５３４，  ＡＡ８００６７８，  ＡＡ８００７３５，  ＡＡ８００７５３，  ＡＡ８００８０３，  ＡＡ８５８６３６，  ＡＡ８５９５３６，  ＡＡ８６００３０，  ＡＡ８６００３９，  ＡＡ８６００５５，  ＡＡ８７４７９４，  ＡＡ８７４８７３，  ＡＡ８７４８８７，  ＡＡ８７５０３３，  ＡＡ８７５０９８，  ＡＡ８７５６３０，  ＡＡ８９１８４２，  ＡＡ８９２２７３，  ＡＡ８９２４９８，  ＡＡ８９２９９９，  ＡＡ８９３１９１，  ＡＡ８９３２６０，  ＡＡ８９３７１７，  ＡＡ８９９８５４，  ＡＡ９４５０５４，  ＡＡ９４５０８２，  ＡＡ９４５８６７，  ＡＡ９９６４０１，ＡＩ００８８３６，  ＡＩ００９６８２，  ＡＩ１７１９６２，  ＡＩ１７５９５９，  ＡＩ１７６４５６，  ＡＩ２３０２５６，  ＡＩ２３１８２１，ＡＩ２３３２６１，  ＡＩ６３９０８２，  Ｈ３１６９５，  Ｓ６３５２１，  Ｓ６６１８４，  Ｓ８２８２０，  Ｕ１７５６５，  Ｕ６０５７８，  Ｕ７５３９７，  Ｕ７５４０５，  Ｘ０５５６６，  Ｘ５４６５６，  Ｘ５８２９４，  Ｘ６０７６７，  Ｘ６７７８８，  Ｘ９７４４３
【請求項２】
検体が、肝臓腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
第二工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高いことを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無又はその発生程度を評価する工程であることを特徴とする請求項１，２、３又は４記載の方法。
【請求項６】
物質の肝発癌活性の検定方法であって、
（１）肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法。
＜登録番号群１＞
ＡＦ０２３０８７，  ＡＦ０３６３３５，  ＡＦ０６２３８９，  Ｄ００３６２，  Ｄ１２７７０，  Ｄ１７４４５，  Ｄ３７９２０，  Ｄ７８５９１，  Ｄ８４４１８，  Ｈ３２１８９，  Ｊ０３６２７，  Ｌ１９６９９，  Ｍ１８４１６，  Ｍ２７２０７，  Ｍ３７５８４，  Ｍ５５５３４，  ＡＡ８００６７８，  ＡＡ８００７３５，  ＡＡ８００７５３，  ＡＡ８００８０３，  ＡＡ８５８６３６，  ＡＡ８５９５３６，  ＡＡ８６００３０，  ＡＡ８６００３９，  ＡＡ８６００５５，  ＡＡ８７４７９４，  ＡＡ８７４８７３，  ＡＡ８７４８８７，  ＡＡ８７５０３３，  ＡＡ８７５０９８，  ＡＡ８７５６３０，  ＡＡ８９１８４２，  ＡＡ８９２２７３，  ＡＡ８９２４９８，  ＡＡ８９２９９９，  ＡＡ８９３１９１，  ＡＡ８９３２６０，  ＡＡ８９３７１７，  ＡＡ８９９８５４，  ＡＡ９４５０５４，  ＡＡ９４５０８２，  ＡＡ９４５８６７，  ＡＡ９９６４０１，  ＡＩ００８８３６，  ＡＩ００９６８２，  ＡＩ１７１９６２，  ＡＩ１７５９５９，  ＡＩ１７６４５６，  ＡＩ２３０２５６，  ＡＩ２３１８２１，  ＡＩ２３３２６１，  ＡＩ６３９０８２，  Ｈ３１６９５，  Ｓ６３５２１，  Ｓ６６１８４，  Ｓ８２８２０，  Ｕ１７５６５，  Ｕ６０５７８，  Ｕ７５３９７，  Ｕ７５４０５，  Ｘ０５５６６，  Ｘ５４６５６，  Ｘ５８２９４，  Ｘ６０７６７，  Ｘ６７７８８，  Ｘ９７４４３
【請求項７】
遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする請求項６又は７記載の方法。
【請求項９】
第三工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高いことを指標とし、前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脊椎動物における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌が遺伝子の関わる異常を原因とする疾病であることが次第に明らかになりつつあるが、癌に対する羅漢率、死亡率は未だ高い。このような状況において、様々な化学物質の発癌性の有無を事前に確認しておくための安全性試験は極めて重要である。従来、化学物質の発癌性を検定する代表的な方法としては、種々の脊椎動物（例えばラット）を用いた安全性試験において腫瘍マーカーを指標として用いることにより、発癌性の有無を評価する方法が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、脊椎動物を用いた安全性試験において、例えば、最も頻繁に用いられる肝臓腫瘍マーカーの一つであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（胎盤型）の場合には、肝細胞中のペルオキシソーム数を増大させるペルオキシソーム誘導剤により誘発される肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変を検出することはできない等の欠点があり、場合によっては必ずしも十分に満足のゆくものではなかった。
そこで、化学物質の発癌性をできるだけ正確かつ簡便に評価するための癌検定方法の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
かかる状況の下、本発明者らは鋭意検討した結果、脊椎動物における肝臓腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞において、特定の遺伝子の発現レベルが隣接する正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルに比べ増大していることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．脊椎動物における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法であって、
（１）検体における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第一工程、及び
（２）第一工程で得られた前記検体における遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無又はその発生程度を評価する第二工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
ＡＦ０２３０８７，  ＡＦ０３６３３５，  ＡＦ０６２３８９，  Ｄ００３６２，  Ｄ１２７７０，  Ｄ１７４４５，  Ｄ３７９２０，  Ｄ７８５９１，  Ｄ８４４１８，  Ｈ３２１８９，  Ｊ０３６２７，  Ｌ１９６９９，  Ｍ１８４１６，  Ｍ２７２０７，  Ｍ３７５８４，  Ｍ５５５３４，  ＡＡ８００６７８，  ＡＡ８００７３５，  ＡＡ８００７５３，  ＡＡ８００８０３，  ＡＡ８５８６３６，  ＡＡ８５９５３６，  ＡＡ８６００３０，  ＡＡ８６００３９，  ＡＡ８６００５５，  ＡＡ８７４７９４，  ＡＡ８７４８７３，  ＡＡ８７４８８７，  ＡＡ８７５０３３，  ＡＡ８７５０９８，  ＡＡ８７５６３０，  ＡＡ８９１８４２，  ＡＡ８９２２７３，  ＡＡ８９２４９８，  ＡＡ８９２９９９，  ＡＡ８９３１９１，  ＡＡ８９３２６０，  ＡＡ８９３７１７，  ＡＡ８９９８５４，  ＡＡ９４５０５４，  ＡＡ９４５０８２，  ＡＡ９４５８６７，  ＡＡ９９６４０１，  ＡＩ００８８３６，  ＡＩ００９６８２，  ＡＩ１７１９６２，  ＡＩ１７５９５９，  ＡＩ１７６４５６，  ＡＩ２３０２５６，  ＡＩ２３１８２１，  ＡＩ２３３２６１，  ＡＩ６３９０８２，  Ｈ３１６９５，  Ｓ６３５２１，  Ｓ６６１８４，  Ｓ８２８２０，  Ｕ１７５６５，  Ｕ６０５７８，  Ｕ７５３９７，  Ｕ７５４０５，  Ｘ０５５６６，  Ｘ５４６５６，  Ｘ５８２９４，  Ｘ６０７６７，  Ｘ６７７８８，  Ｘ９７４４３
２．検体が、肝臓腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量又は翻訳産物量の測定によりなされることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする前項１、２又は３記載の方法；
５．第二工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高いことを指標とし、当該指標に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無又はその発生程度を評価する工程であることを特徴とする前項１，２、３又は４記載の方法；
６．物質の肝発癌活性の検定方法であって、
（１）肝細胞と被験物質とを接触させる第一工程、
（２）第一工程で前記被験物質と接触させた前記肝細胞における、以下の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログから選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを測定する第二工程、及び
（３）第二工程で得られた遺伝子の発現レベルの測定値を当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する第三工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明肝発癌活性検定方法と記すこともある。）
＜登録番号群１＞
ＡＦ０２３０８７，  ＡＦ０３６３３５，  ＡＦ０６２３８９，  Ｄ００３６２，  Ｄ１２７７０，  Ｄ１７４４５，  Ｄ３７９２０，  Ｄ７８５９１，  Ｄ８４４１８，  Ｈ３２１８９，  Ｊ０３６２７，  Ｌ１９６９９，  Ｍ１８４１６，  Ｍ２７２０７，  Ｍ３７５８４，  Ｍ５５５３４，  ＡＡ８００６７８，  ＡＡ８００７３５，  ＡＡ８００７５３，  ＡＡ８００８０３，  ＡＡ８５８６３６，  ＡＡ８５９５３６，  ＡＡ８６００３０，  ＡＡ８６００３９，  ＡＡ８６００５５，  ＡＡ８７４７９４，  ＡＡ８７４８７３，  ＡＡ８７４８８７，  ＡＡ８７５０３３，  ＡＡ８７５０９８，  ＡＡ８７５６３０，  ＡＡ８９１８４２，  ＡＡ８９２２７３，  ＡＡ８９２４９８，  ＡＡ８９２９９９，  ＡＡ８９３１９１，  ＡＡ８９３２６０，  ＡＡ８９３７１７，  ＡＡ８９９８５４，  ＡＡ９４５０５４，  ＡＡ９４５０８２，  ＡＡ９４５８６７，  ＡＡ９９６４０１，  ＡＩ００８８３６，  ＡＩ００９６８２，  ＡＩ１７１９６２，  ＡＩ１７５９５９，  ＡＩ１７６４５６，  ＡＩ２３０２５６，  ＡＩ２３１８２１，  ＡＩ２３３２６１，  ＡＩ６３９０８２，  Ｈ３１６９５，  Ｓ６３５２１，  Ｓ６６１８４，  Ｓ８２８２０，  Ｕ１７５６５，  Ｕ６０５７８，  Ｕ７５３９７，  Ｕ７５４０５，  Ｘ０５５６６，  Ｘ５４６５６，  Ｘ５８２９４，  Ｘ６０７６７，  Ｘ６７７８８，  Ｘ９７４４３
７．遺伝子の発現レベルの測定が、当該遺伝子の転写物量の測定によりなされることを特徴とする前項６記載の方法；
８．遺伝子の発現レベルの対照値が、当該遺伝子の正常組織又は正常細胞における発現レベルの値であることを特徴とする前項６又は７記載の方法；
９．第三工程において、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高いことを指標とし、前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価することを特徴とする前項８記載の方法；
１０．前項６〜９のいずれかに記載される方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜する工程を有することを特徴とする肝発癌物質の探索方法；
等を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明において検体とは、例えば、肝臓腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞或いはその内容物が含まれる可能性のある生体試料をあげることができ、具体的には、例えば、被験動物から採取された肝臓組織等の組織或いはこれら組織から分離された細胞又はその培養細胞等をあげることができる。これらの試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された試料を検体として用いてもよい。
本発明において発現レベルが測定される遺伝子は、上記の登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログ（以下、一括して本遺伝子と記すこともある。）から選ばれる１以上の遺伝子である。Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列に関する情報は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  のＷＥＢページ（ＵＲＬ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から、Ｇｅｎｂａｎｋによって各遺伝子に付与されている上記の登録番号  （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）をもとに検索を行うことによって入手することができる。因みに、ＧｅｎＢｎａｋ、ＤＤＢＬ及びＥＭＢＬの各データバンクが公開しているデータ全てを誰でも制限なしで利用でき、ＩＮＳＤに登録されたデータは科学資料として永久に保存され公開されることは、上記３データバンクで構成される国際塩基配列データベース（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ，  ＩＮＳＤ）の諮問機関である国際諮問委員会により作成された「ＤＤＢＬ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢｎａｋの登録データの取り扱い」（２００２年５月２３−２４日）で明文化されており、如何なる当業者であっても登録番号  （Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）に基づきデータの照合、検索、入手等は可能である。
本発明において利用される本遺伝子には、上記の公知の塩基配列と全く同一の塩基配列を有する遺伝子のほか、前記の遺伝子の塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【０００６】
本遺伝子の発現レベルの測定は、例えば、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができる。
本遺伝子の転写物量を測定するには、例えば、当該遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ量を測定する。特定の遺伝子のｍＲＮＡ量の測定は、具体的には、例えば、定量的リアルタイム−ポリメラーゼチェイン反応（以下、定量的ＲＴ−ＰＣＲと記す。）、ノーザンハイブリダイゼーション法［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年］、ＤＮＡアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等により実施することができる。
また、本遺伝子の翻訳産物量を測定するには、例えば、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質の量を測定する。特定の蛋白質の量の測定は、具体的には、例えば、当該蛋白質に対する特異抗体を用いた免疫学的測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、免疫組織化学的検査等）、二次元電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー等により実施することができる。本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質に対する特異抗体は、常法に準じて、本遺伝子の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を免疫抗原として調製することができる。
【０００７】
本遺伝子の転写物量の測定方法についてさらに説明する。
本遺伝子の転写物であるｍＲＮＡ量は、例えば、本遺伝子の塩基配列に基づいて設計、調製されたプローブ又はプライマーを使用して、通常の遺伝子工学的方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等を用いることによって測定することができる。具体的には、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著；モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）発行、１９８９年等に記載された方法に準じて行うことができる。この際、組織における発現レベルが恒常的に一定であることが知られている遺伝子（以下、対照遺伝子と記す。）、例えば、β−ａｃｔｉｎ遺伝子（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．３，  ｐ．１６８７，１９８４）や３６Ｂ４（Ａｃｉｄｉｃ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，  ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１４，  ｐ．３９９８，１９９１）遺伝子等のｍＲＮＡ量を同時に測定しても良い。そして、対照遺伝子のｍＲＮＡ量若しくはその指標値あたりの本遺伝子のｍＲＮＡ量又はその指標値を算出することにより、本遺伝子の発現レベルを求めてもよい。
【０００８】
（１．ノザンハイブリダイゼーション法）
まず、ｍＲＮＡ量を測定しようとする遺伝子のＤＮＡを調製し、次いで、その全部又は一部からなるＤＮＡを標識してプローブを調製する。
上記遺伝子は、市販のｃＤＮＡ（例えば宝酒造から入手）又は以下に示した方法により調製したｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ等によって調製することができる。例えば、まず当該遺伝子を発現する組織から、塩酸グアニジン／フェノール法、ＳＤＳ−フェノール法、グアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法等の通常の方法によって全ＲＮＡを抽出する。例えばＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）等の市販のキットを利用して全ＲＮＡを抽出してもよい。
抽出された全ＲＮＡから、例えば、以下のようにしてｍＲＮＡを調製する。まず、オリゴｄＴをリ癌ドとして有するポリＡカラムを５倍カラム容量以上のＬｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製された全ＲＮＡをカラムにかけ、１０倍カラム容量のｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄する。さらに５倍カラム容量のＷａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ［２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］で洗浄する。続いて、３倍カラム容量のｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）でｍＲＮＡを溶出させることによってｍＲＮＡを得る。
次いで、オリゴｄＴプライマーを前記全ＲＮＡ或いはｍＲＮＡのポリＡ鎖にアニールさせ、例えばｃＤＮＡ合成キット（宝酒造）のプロトコールに従って、一本鎖ｃＤＮＡを合成する。この時、鋳型とするＲＮＡは、全ＲＮＡ或いはｍＲＮＡのどちらでも良いが、ｍＲＮＡを用いる方がより好ましい。
前記一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、ＴａＫａＲａ  ｔａｑ（宝酒造）等のＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲすることにより、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲの条件は、測定対象とする動物の種類、使用するプライマーの配列等により異なるが、例えば、反応緩衝液［１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］中、２．５ｍＭ  ＮＴＰ存在下で、９４℃，３０秒間次いで４０℃〜６０℃，２分間さらに７２℃，２分間の保温を１サイクルとしてこれを３０〜５５サイクル行う条件等を挙げることができる。
【０００９】
このようにして増幅された本遺伝子のＤＮＡはｐＵＣ１１８等のベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。当該ＤＮＡの塩基配列は、Ｍａｘａｍ  Ｇｉｌｂｅｒｔ法  （例えば、Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ＆Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５６０，１９７７  等に記載される）やＳａｎｇｅｒ法（例えばＳａｎｇｅｒ，Ｆ．＆Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４，４４１，１９７５  、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ，＆  Ｎｉｃｋｌｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３，１９７７等に記載される）等により確認することができる。
【００１０】
このようにして調製された本遺伝子のＤＮＡの全部又はその一部を、次のようにして放射性同位元素や蛍光色素等で標識することによりプローブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたＤＮＡを鋳型とし、当該ＤＮＡの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ或いは［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰを含むｄＮＴＰを反応液に添加してＰＣＲを行うことにより３２Ｐで標識されたプローブが得られる。また、上記のようにして調製されたＤＮＡを、例えば、Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム社）、ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ（宝酒造）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００１１】
次に、上記プローブを使用して、ノザンハイブリダイゼーション分析を行う。具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。調製された全ＲＮＡ  ２０μｇ或いはｍＲＮＡ  ２μｇをアガロースゲルで分離し、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．３５Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブラン［例えば、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャム製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブランを入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．２１Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液［０．１％（ｗ／ｖ）フィコール４００、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ］、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド〕２５ｍｌを加えて、５０℃、２時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たに２ｍｌ〜６ｍｌのハイブリダイゼーションバッファーを加える。更に上記方法で得られたプローブを加え、５０℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のＤＩＧ  ＥＡＳＹ  Ｈｙｂ（ベーリンガーマンハイム社）等を用いることができる。メンブランを取り出して、５０〜１００ｍｌの２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で室温、１５分間インキュベートし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に５０〜１００ｍｌの０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で６８℃、３０分間インキュベートする。メンブラン上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの量を測定することができる。
【００１２】
（２．定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに例えばＭＭＬＶ（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ］中、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ及び２５μｇ／ｍｌオリゴｄＴ存在下で４２℃、１５分間〜１時間反応させ、対応するｃＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造）を用いて対応するｃＤＮＡを調製しても良い。調製されたｃＤＮＡを鋳型にして、本遺伝子の塩基配列の一部分を有するＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行う。プライマーとしては、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに登録番号Ｘ５８２９４で登録されている塩基配列を有する本遺伝子の部分塩基配列を有するプライマーとして、配列番号１又は２で示される塩基配列からなるプライマーをあげることができる。ＰＣＲの条件としては、例えば、例えば、ＴＡＫＡＲＡ  ｔａｑ（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］中、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ及び［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰ存在下で、例えば、９４℃，３０秒間次いで４０℃〜６０℃，２分間さらに７２℃，２分間の保温を１サイクルとしてこれを３０〜５５サイクル行う条件をあげることができる。増幅されたＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたＤＮＡの放射活性量を測定することにより、本遺伝子のｍＲＮＡの量を測定することができる。或いはまた、例えば、ＴＡＫＡＲＡ  ｔａｑ（宝酒造）を使用し、反応緩衝液［１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ，１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２］中、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ＲｅａｇｅｎｔｓＰＣＲ（ＡＢＩ社）  ２５μｌを含む５０μｌの反応液を調製し、ＡＢＩ７７００（ＡＢＩ社）を用いて、５０℃，２分間次いで９５℃，１０分間の保温の後、９５℃，１５秒間次いで６０℃，１分間の保温を１サイクルとしてこれを４０サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの蛍光を測定することにより、本遺伝子のｍＲＮＡの量を測定することができる。
【００１３】
（３．ＤＮＡアレイ解析）
本発明の転写物量の測定には、ナイロンメンブラン等のメンブランフィルター等に本遺伝子のｃＤＮＡをスポットして作製されるマクロアレイ、スライドガラス等に本遺伝子のｃＤＮＡをスポットして作製されるマイクロアレイ、スライドガラス上に本遺伝子の塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド（通常１８〜２５ｍｅｒの鎖長）を光化学反応を利用して固定して作製されるプローブアレイ等、公知の技術に基づいたＤＮＡアレイを利用することができる。これらのアレイの作製は、例えばゲノム機能研究プロトコール  実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて行うことができる。またＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社等から市販されているＧｅｎｅｃｈｉｐ等を利用することもできる。
【００１４】
以下、ＤＮＡアレイを用いて本遺伝子の転写物量を測定する方法の一例を示す。（３−１．マクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えばＭＭＬＶ（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＫＣｌ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴを含む液］中、０．５ｍＭｄＮＴＰ、［α３２Ｐ］−ｄＣＴＰ、及び２５μｇ／ｍｌオリゴｄＴ存在下で４２℃、１５分間〜１時間反応させて、標識ＤＮＡを調製し、これをプローブとする。このとき、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造）等を用いても良い。メンブランフィルターに本遺伝子のｃＤＮＡをスポットして作製されたマクロアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．２１Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液［０．１％（ｗ／ｖ）フィコール４００、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．１％  ＢＳＡ］、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド〕２５ｍｌを加えて、５０℃、２時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新たに２ｍｌ〜６ｍｌのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。更に上記プローブを加え、５０℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のＤＩＧ  ＥＡＳＹ  Ｈｙｂ（ベーリンガーマンハイム社）等を用いることもできる。マクロアレイを取り出して、５０ｍｌ〜１００ｍｌの２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに浸し室温にて１５分間程度インキュベートした後、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に５０ｍｌ〜１００ｍｌの０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で６８℃、３０分間インキュベートする。マクロアレイ上の標識量を測定することにより、本遺伝子の転写物であるｍＲＮＡの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１５】
（３−２．マイクロアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えばＭＭＬＶ（東洋紡社）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＫＣｌ、及び１０ｍＭ  ＤＴＴを含む液］中、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、（又はＣｙ５−ｄＵＴＰ）及び２５μｇ／ｍｌオリゴｄＴ存在下で４２℃、１５分間〜１時間反応させる。アルカリバッファー（例えば、１Ｎ  ＮａＯＨ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む液）を加え、６５℃１０分間保温した後、ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３０等を用いて遊離のＣｙ３又はＣｙ５を除くことにより蛍光標識ＤＮＡを調製し、これをプローブとする。得られたプローブを用いてマイクロアレイに対して（３−１  ＤＮＡマクロアレイによる定量）に記載された方法と同様にしてハイブリダイゼーションを行う。アレイ上のシグナル量をスキャナーにより測定することによって、本遺伝子の転写物であるｍＲＮＡの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１６】
（３−３．プローブアレイによる定量）
本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞から上記（１  ノザンハイブリダイゼーション法）に記載された方法と同様の方法でｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、ｃＤＮＡ合成キット（ＧＥＮＳＥＴ社）等を用いてｃＤＮＡを調製する。調製されたｃＤＮＡを、例えば、ビオチンラベル化ｃＲＮＡ合成キット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ社）（Ｅｎｚｏ社）等によりビオチン標識し、ｃＲＮＡ  ｃｌｅａｎｕｐ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  キット（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ社）により精製する。生成されたビオチン標識ＤＮＡをＦｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  バッファー（２００ｍＭトリス酢酸（ｐＨ８．１）、５００ｍＭ  ＫＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ）により断片化する。これに内部標準物質Ｃｏｎｔｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）、２×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ〔２００ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ  ［Ｎａ＋］，  ４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０  （Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７〕及びＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水を加え、ハイブリカクテルを作製する。
１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたプローブアレイ［例えば、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）等］を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍ、１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去する。その後、該プローブアレイに上記のハイブリカクテル２００μｌを添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍ、１６時間回転させる（ハイブリダイゼーション）。続いてハイブリカクテルを除去し、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ〔６×ＳＳＰＥ［２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈］、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．００５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社）を含む〕で満たした後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置に上記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って洗浄する。次いで、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）の染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って該プローブアレイを染色する。ＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）により５７０ｎｍの蛍光輝度を測定することにより、本遺伝子の転写物であるｍＲＮＡの量、即ち、本遺伝子の発現量を測定することができる。
【００１７】
（４．インサイチューハイブリダイゼーション法）
基本的には１）組織の固定、包埋、及び切片の作製、２）プローブの調製、３）ハイブリダイゼーションによる検出からなり、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをプローブとすること以外は、例えば、Ｈｅｉｌｅｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６，９７８，１９８８、遺伝子工学ハンドブック  羊土社  ２７８  １９９１、細胞工学ハンドブック，羊土社，２１４，１９９２、細胞工学ハンドブック，羊土社，２２２，１９９２等に記載される方法に準じて行うことができる。
ＲＮＡプローブを調製する場合には、まず、例えば前記（１  ノザンハイブリダイゼーション法）に記載した方法と同様にして本遺伝子のＤＮＡを取得し、当該ＤＮＡをＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをもったベクター（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｐＧＥＭ等）に組み込んで大腸菌に導入し、プラスミドＤＮＡを調製する。次いで、センス（ネガティブコントロール用）、アンチセンス（ハイブリダイゼーション用）ＲＮＡができるようにプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断する。これらＤＮＡを鋳型とし、放射性標識の場合はα−３５Ｓ−ＵＴＰ等、非放射性標識の場合はディゴキシゲニンＵＴＰ或いはフルオレセイン修飾ＵＴＰ等を基質として、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成しながら標識し、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼーションに適したサイズに切断することによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡを調製する。なお、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはＲＮＡラベリングキット（アマシャム社）が、非放射性標識用にはＤＩＧ  ＲＮＡラベリングキット（ベーリンガー・マンハイム社）やＲＮＡカラーキット（アマシャム社）が市販されている。
また、ＤＮＡプローブを調製する場合には、例えば、３２Ｐ等で標識した放射性ヌクレオチド又はビオチン、ディゴキシゲニン若しくはフルオレセインで標識したヌクレオチドを、ニックトランスレーション法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１３，２３７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，１０，６−１０，１２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．）又はランダムプライム法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３２，６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３７，２６６）によって取り込ませることによって、あらかじめ放射性若しくは非放射性物質で標識されたＤＮＡを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレーションキット（アマシャム社）やＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム社）が、非放射性標識用にはＤＩＧ  ＤＮＡ標識キット（ベーリンガーマンハイム社）、ＤＮＡカラーキット（アマシャム社）等が市販されている。
具体的には、本遺伝子の発現レベルを測定しようとする組織又は細胞をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製しスライドグラスに張り付ける。又は、上記の組織又は細胞をＯＣＴコンパウンドに包埋後、液体窒素又は液体窒素で冷却したイソペンタン中にて凍結させ、その薄切切片を作製し、スライドグラスに張り付ける。このようにしてスライド標本を得る。
次に、上記の組織又は細胞中にあって使用されるプローブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナーゼＫ処理し、アセチル化する。次いで、該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプローブとのハイブリダイゼーションを行う。例えば、上記のプローブを９０℃で３分間加熱した後ハイブリダイゼーション溶液で希釈し、該溶液を前処理の終了したスライドグラス切片上に滴下してフィルムでおおい、モイスチャーチャンバー中で４５℃、１６時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーションの後、非特異的吸着或いは未反応プローブを洗浄等（ＲＮＡプローブを用いた場合はＲＮａｓｅ処理も加える）により除去する。転写物量は、例えば、スライドグラス切片上の標識量を測定すること、或いは薄切切片中のラジオアイソトープ若しくは蛍光活性を示す部分の面積若しくは細胞数をカウントすることにより、本遺伝子の転写物であるｍＲＮＡの量又はそれに相当する値を測定することができる。
【００１８】
本発明検出方法においては、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の検体における発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、登録番号群１に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログを複数選んでもよい。登録番号群１に示される登録番号のうち以下の登録番号群１’に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログは、肝臓腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞における発現レベルと正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルとの差がより大きい遺伝子として好ましくあげることができる。
＜登録番号群１’＞
ＡＡ９４５０５４，  Ｍ５５５３４，  Ｕ７５４０５，  Ｍ２７２０７，  Ｕ６０５７８，  Ｄ８４４１８，  Ｓ６６１８４，  ＡＩ１７１９６２，  Ｘ６０７６７，  Ｄ８４４１８，  ＡＡ８５９５３６，  ＡＡ８６００３９，  ＡＩ００９６８２，  ＡＩ２３１８２１
【００１９】
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量又は翻訳産物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００２０】
上記のようにして得られた前記検体における本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記検体における肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の有無又はその発生程度を評価する。
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、正常組織での細胞における当該遺伝子の発現レベルの値をあげることができる。ここで、正常組織とは、例えば、病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、発現レベルについて転写物量の測定をする方法としてインサイチューハイブリダイゼーション法や、翻訳産物量の測定をする方法として免疫組織化学的検査方法等を用いる場合には、転写物量又は翻訳産物量のシグナルが腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織より明らかに弱い組織を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを、検体における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。また、複数の正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを測定してその平均値を対照値としてもよい。
例えば、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルの値を対照値として、検体における、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルの測定値が対照値よりも高ければ、検体中に肝臓腫瘍性病変又は前腫瘍性病変を有すると評価することができる。
【００２１】
本発明肝発癌活性検定方法癌においては、まず、肝細胞癌と被験物質とを接触させる。用いられる肝細胞としては、哺乳動物から採取された肝臓組織内に存在している状態にある肝細胞、或いは、当該組織から分離された細胞又はその培養細胞等があげられる。
【００２２】
本発明肝発癌活性検定方法癌において、肝細胞と被験物質との接触は、例えば、哺乳動物に被験物質を投与することにより行なってもよい。哺乳動物は、天然の動物のほか、トランスジェニック動物、遺伝子ノックアウト動物等であってもよい。哺乳動物への被験物質の投与方法としては、例えば、経口（強制又は飲料水や餌に混じ）、筋肉内、静脈内、皮下、腹腔内、経気道等により行うことができる。投与量、投与回数及び投与期間は、例えば、全身状態、全身諸器官組織等に重篤な影響を及ぼさない範囲内（例えば投与量は、最大耐量）とすればよい。
【００２３】
次に、上記のようにして被験物質と接触させた肝細胞における、本遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の発現レベルを、上述のようにして測定する。発現レベルを測定する遺伝子を複数選ぶ場合には、同一の登録番号群に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログを複数選んでもよい。上記の登録番号群１’に示される登録番号で登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログは、肝腫瘍性病変組織を構成する肝細胞における当該遺伝子の発現レベルと正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルとの差異がより大きい遺伝子として好ましくあげることができる。
本遺伝子の発現レベルの測定は、上述のようにして、単位量の検体あたりの本遺伝子の転写物量を測定する方法、単位量の検体あたりの本遺伝子の翻訳産物量を測定する方法等により行うことができ、本遺伝子の転写物量を測定する方法を好ましくあげることができる。
【００２４】
上記のようにして被験物質と接触させた又は肝細胞から得られた本遺伝子の発現レベルの測定値を、当該遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づいて前記被験物質の肝発癌活性の有無又はその量を評価する。
本遺伝子の発現レベルの対照値としては、例えば、前記被験物質と接触させていない肝細胞における発現レベルの値をあげることができる。肝細胞は、正常組織での肝細胞における当該遺伝子の発現レベルの値を好ましくあげることができる。ここで正常組織とは、例えば、被験物質と接触していない肝臓組織で病理組織学的検査において異常の認められない組織を意味し、特に、発現レベルを転写物量で測定する方法としてインサイチューハイブリダイゼーション法、又は翻訳産物量で測定する方法として免疫組織化学的検査方法を用いる場合には、被験物質と接触した肝臓組織であっても転写物量又は翻訳産物量のシグナルが肝臓腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織よりも明らかに弱い組織を示す。
かかる対照値は、正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを、被験物質と接触させた肝臓組織での細胞における当該遺伝子の発現レベルと併行して測定して求めてもよいし、別途測定して求めてもよい。例えば、被験物質と接触させる前の肝臓組織の一部を採取して本遺伝子の発現レベルを測定し、得られた値を対照値とすることもできる。また、複数の正常組織での細胞における本遺伝子の発現レベルを測定してその平均値を対照値としてもよい。
例えば、被験物質と接触させた肝細胞における本遺伝子の発現レベルの測定値が、正常組織又はでの細胞における本遺伝子の発現レベルの値よりも高ければ、前記被験物質との接触による肝腫瘍性病変組織又は前腫瘍性病変組織を構成する肝細胞の発生を意味し、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価することができる。
【００２５】
さらに、上記のような本発明肝発癌活性検定方法は、肝発癌活性を有する物質の探索等に利用することができる。具体的には、本発明肝発癌活性検定方法により評価された肝発癌活性の有無又はその量に基づき肝発癌活性を有する物質を選抜することによって、肝発癌活性物質を探索することができる。選抜された肝発癌活性物質は、例えば、肝癌モデル哺乳動物の作製等に利用することもできる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１  （本遺伝子の発現レベルの測定）
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
ラット肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）及び正常組織それぞれ湿重１ｇに対して１０ｍｌのＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、５分間室温で放置する。次いで、４℃、９，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、水層を５０ｍｌ遠心チューブ（ＩＷＡＫＩ社製）に回収する。ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔの１／５容量のクロロホルム（関東化学社製）を添加し、１５秒間上下に激しく撹拌した後、５分間室温で放置する。次いで、４℃、９，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、水層を新しい５０ｍｌ遠心チューブに回収する。更に、ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔの１／２容量の２−プロパノール（関東化学社製）を添加して、転倒混和した後、室温で１０分間静置する。４℃、９，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、上清を除去しペレットを得る。得られたペレットを、ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔの１／１０容量のＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水（和光純薬工業社製）で溶解する。得られるＲＮＡ溶液０．１ｍｌにＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）添付のＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒ  （１０μＬ  β−メルカプトエタノール／ｍＬ  ＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒ）３５０μｌを添加し、混和する。更に、２５０μｌ  エタノール（関東化学社製）を添加し、混和する。当該混和液をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ添付のＲＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにアプライし、室温、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を再度同じＲＮｅａｓｙ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにアプライし、室温、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで４倍希釈したＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ添付のＲＰＥ  ｂｕｆｆｅｒを５００μｌプライし、室温、１０，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心分離する。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで希釈したＲＰＥ  ｂｕｆｆｅｒを５００μｌアプライし、室温、１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離する。その後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ添付の蒸留水を５０μｌ添加し、１分間室温で静置する。静置後、室温、１０，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって溶出し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得る。正常組織についても、上記と同様の操作を行い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製する。
【００２８】
（２）ｃＤＮＡの調製
上記（１）で肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ及び正常組織から調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  それぞれ１０μｇ、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）  １００ｐｍｏｌを含む１１μｌの混合液を、７０℃、１０分間加熱した後、氷上で冷却する。冷却後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）に含まれる５×Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、当該キットに含まれる０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、及び当該キットに含まれる１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １μｌを添加し、４２℃、２分間加熱する。更に、当該キットに含まれるＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ  ２μｌ（４００Ｕ）を添加し、４２℃、１時間加熱した後、氷上で冷却する。冷却後、ＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水９１μｌ、当該キットに含まれる５×Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３μｌ、当該キットに含まれるＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μｌ（１０Ｕ）、当該キットに含まれるＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ４μｌ（４０Ｕ）、及び当該キットに含まれるＥ．  ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  １μｌ（２Ｕ）を添加し、１６℃、２時間反応させる。次いで、当該キットに含まれるＴ４  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μｌ（１０Ｕ）を加え、１６℃、５分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μｌを添加する。次いで、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液（ニッポンジーン社製）１６２μｌを添加し、混合する。当該混合液を、予め室温、１４，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心分離しておいたＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ  Ｌｉｇｈｔ（エッペンドルフ社製）に移し、室温、１４，０００ｒｐｍ、２分間遠心分離した後、１４５μｌの水層をエッペンドルフチューブに移す。これに、７．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液７２．５μｌ、エタノール３６２．５μｌを加え混合した後、４℃、１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨て、ＤＮＡペレットを得る。その後、ＤＮＡペレットに８０％エタノール０．５ｍｌを添加し、４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨てる。ＤＮＡペレットに再度８０％エタノール０．５ｍｌを添加し、４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を捨て、次いで当該ペレットを乾燥させ、これをＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水１２μｌに溶解することにより、ｃＤＮＡ溶液を得る。一方、正常組織から調製した  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡについても、上記と同様の操作を行うことによりｃＤＮＡ溶液を調製する。
【００２９】
（３）ラベル化ｃＲＮＡの調製
肝臓腫瘍性性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）由来のｃＤＮＡ及び正常組織由来のｃＤＮＡそれぞれを用いて、それぞれラベル化ｃＲＮＡを調製する。即ち、上記（２）で得られたｃＤＮＡ溶液５μｌ、ＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水１７μｌ、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、当該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ４μｌ、当該キットに含まれる１０×ＤＴＴ  ４μｌ、当該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ  ４μｌ及び当該キットに含まれる２０×Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μｌを混合し、３７℃、５時間反応させる。当該反応液にＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水６０μｌを加えたのち、上記（１）に記載された  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いてラベル化ｃＲＮＡの精製を行う。
【００３０】
（４）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
精製されたラベル化ｃＲＮＡ  ２０μｇ、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸  ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、  ５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）及び１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μｌを含む反応液４０μｌを、９４℃、３５分間加熱した後、氷冷し、フラグメント化ｃＲＮＡ溶液を得る。
【００３１】
（５）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）由来のフラグメント化ｃＲＮＡ及び正常組織由来のフラグメント化ｃＲＮＡそれぞれを、以下のようにしてそれぞれプローブアレイとハイブリダイズさせる。即ち、上記（４）で得られたフラグメント化ｃＲＮＡ溶液  ４０μｌ、５ｎＭ  Ｃｏｎｔｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２  （Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μｌ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ４μｌ、Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ  ［Ｎａ＋］，  ４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０  （Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７）  ２００μｌ及びＤＥＰＣ処理滅菌蒸留水１４４μｌを混合し、４００μｌのハイブリカクテルを得る。得られたハイブリカクテルを９９℃、５分間加熱し、更に４５℃、５分間加熱する。加熱後、室温、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得る。
１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたラットゲノムＵ３４プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍ、１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去する。その後、当該プローブアレイに該ハイブリカクテル上清２００μｌを添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍ、１６時間回転させ、ハイブリダイズ済みプローブアレイを得る。
【００３２】
（６）プローブアレイの染色
上記（５）で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイからハイブリカクテルを除去し、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ［６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む］で満たす。ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置に前記プローブアレイを装着し、プロトコールに従って前記プローブアレイを洗浄した後、ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）の染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って以下の方法により前記プローブアレイを染色する。まず１次染色液［１０μｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  （ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍｌ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む］に４５分間浸漬する。次いで、２次染色液［１００μｇ／ｍｌ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  （Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍｌ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍｌ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．００５％  Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０を含む］に１０分間浸漬し、最後に１次染色液に４５分間浸漬する。
【００３３】
（７）プローブアレイのスキャン、解析
上記（６）で染色した肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）由来のプローブアレイ及び正常組織由来のプローブアレイそれぞれを、ＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、シグナルを５７０ｎｍの蛍光輝度を測定することによって読み取る。得られた結果をＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によって比較解析し、正常組織と肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）間で発現レベルが異なる遺伝子を抽出した。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子は、上記の肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルが、正常組織由来のプローブアレイにおいて検出されたシグナルを上回った。
＜登録番号群１＞
ＡＦ０２３０８７，  ＡＦ０３６３３５，  ＡＦ０６２３８９，  Ｄ００３６２，  Ｄ１２７７０，  Ｄ１７４４５，  Ｄ３７９２０，  Ｄ７８５９１，  Ｄ８４４１８，  Ｈ３２１８９，  Ｊ０３６２７，  Ｌ１９６９９，  Ｍ１８４１６，  Ｍ２７２０７，  Ｍ３７５８４，  Ｍ５５５３４，  ＡＡ８００６７８，  ＡＡ８００７３５，  ＡＡ８００７５３，  ＡＡ８００８０３，  ＡＡ８５８６３６，  ＡＡ８５９５３６，  ＡＡ８６００３０，  ＡＡ８６００３９，  ＡＡ８６００５５，  ＡＡ８７４７９４，  ＡＡ８７４８７３，  ＡＡ８７４８８７，  ＡＡ８７５０３３，  ＡＡ８７５０９８，  ＡＡ８７５６３０，  ＡＡ８９１８４２，  ＡＡ８９２２７３，  ＡＡ８９２４９８，  ＡＡ８９２９９９，  ＡＡ８９３１９１，  ＡＡ８９３２６０，  ＡＡ８９３７１７，  ＡＡ８９９８５４，  ＡＡ９４５０５４，  ＡＡ９４５０８２，  ＡＡ９４５８６７，  ＡＡ９９６４０１，  ＡＩ００８８３６，  ＡＩ００９６８２，  ＡＩ１７１９６２，  ＡＩ１７５９５９，  ＡＩ１７６４５６，  ＡＩ２３０２５６，  ＡＩ２３１８２１，  ＡＩ２３３２６１，  ＡＩ６３９０８２，  Ｈ３１６９５，  Ｓ６３５２１，  Ｓ６６１８４，  Ｓ８２８２０，  Ｕ１７５６５，  Ｕ６０５７８，  Ｕ７５３９７，  Ｕ７５４０５，  Ｘ０５５６６，  Ｘ５４６５６，  Ｘ５８２９４，  Ｘ６０７６７，  Ｘ６７７８８，  Ｘ９７４４３
【００３４】
実施例２  （プローブアレイを用いた肝臓腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）の検定）
無処置ラットの病理組織学的に正常な肝臓試料を含む、異なる２つ以上の肝臓試料から実施例１（１）と同様の操作によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作によって無処置ラットの正常肝臓試料由来のフラグメント化ｃＲＮＡ及び被験肝臓試料由来のフラグメント化ｃＲＮＡを調製する。次に、実施例１（５）と同様の操作によって無処置ラットの正常肝臓試料由来のフラグメント化ｃＲＮＡ及び被験肝臓試料由来のフラグメント化ｃＲＮＡを、本遺伝子の塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが固定されたプローブアレイにハイブリダイズした後、染色する。得られた染色済みのプローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、シグナルを５７０ｎｍの蛍光輝度を測定することによって読み取り、得られた結果をＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によって比較解析する。登録番号群１に示された登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの発現レベルを無処置ラットの正常肝臓試料及び被験肝臓試料間で比較し、その差異に基づいて被験肝臓試料における肝腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）を構成する肝細胞を検出する。即ち、登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの被験肝臓試料における発現レベルの測定値が、無処置ラット正常肝臓試料における当該遺伝子の発現レベルよりも高ければ、前記被験生検試料中に肝腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）を構成する肝細胞が存在すると評価する。
【００３５】
実施例３  （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた肝臓腫瘍性病変（前腫瘍性病変を一部に含む）の検定）
無処置ラットの病理組織学的に正常な肝臓試料を含む、異なる２つ以上の肝臓試料から実施例１（１）と同様の操作によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した後、実施例１（２）と同様の操作によって無処置ラット正常肝臓試料由来のｃＤＮＡ及び被験肝臓試料由来のｃＤＮＡを調製する。次に、調製されたｃＤＮＡを鋳型として、以下のようにしてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡを定量する。即ち、当該ｃＤＮＡ  １μｌ、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー１  ２０ｐｍｏｌ、配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー２  ２０ｐｍｏｌ、及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ＲｅａｇｅｎｔｓＰＣＲ（ＡＢＩ社）  ２５μｌを含む５０μｌの反応液を調製し、ＡＢＩ７７００（ＡＢＩ社）を用いて、５０℃  ２分間次いで９５℃  １０分間保温した後、９５℃  １５秒次いで６０℃  １分間の保温を１サイクルとしてこれを４０サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの量から、被験肝臓試料での本遺伝子の発現量レベルと無処置ラット正常肝臓試料での本遺伝子の発現レベルを求める。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの被験肝臓試料における発現レベルの測定値が、無処置ラット正常肝臓試料における当該遺伝子の発現レベルよりも高ければ、前記被験肝臓試料中に肝腫瘍性病変組織（前腫瘍性病変組織を一部に含む）を構成する肝細胞が存在すると評価する。
【００３６】
実施例４  （プローブアレイを用いた肝発癌活性検定方法）
▲１▼  （１）脊椎動物への被験物質の投与
例えば、肝中期発癌性試験モデル（Ｉｔｏ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，  １９：  ３８５−４１５，  １９８９．）を用いることができる。
具体的には、被験物質が変異原性物質の場合には、雄Ｆ３４４系ラット（投与開始時６週齢）に、例えば、Ｎ−ジエチルニトロサミン（以下、ＤＥＮと記す。）２００ｍｇ／ｋｇ・体重を腹腔内に単回投与し、対照として被験物質の溶媒を単回投与した群をさらに設けた。被験物質が非変異原性の場合には、同じ雄Ｆ３４４系ラットに上記と同用量のＤＥＮを単回投与後２週目から被験物質として、例えば、クロフィブレート３０００ｐｐｍやＷＹ−１４，６４３  １０００ｐｐｍを混餌投与した群をそれぞれ設け、対照として基礎飼料のみを混餌投与した群をさらに設けた。被験物質の変異原性に関わらず、試験開始から３週目に２／３部分肝切除術を全例に施し、８週目に各群動物の肝臓を採取した。
【００３７】
（２）遺伝子の発現解析
被験物質投与群由来の肝臓組織及び基礎飼料のみ投与群由来の肝臓組織それぞれから、実施例１（１）と同様の操作によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作によって被験物質投与群及び基礎飼料投与群それぞれの肝臓組織由来のフラグメント化ｃＲＮＡを調製する。次に、実施例１（５）と同様の操作によって被験物質投与群及び基礎飼料投与群それぞれの肝臓組織由来のフラグメント化ｃＲＮＡを、本遺伝子の塩基配列の部分塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが固定されたプローブアレイにハイブリダイズした後、染色する。得られた被験物質投与群及び基礎飼料投与群それぞれのプローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、シグナルを５７０ｎｍの蛍光輝度を測定することによって読み取り、得られた結果をＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によって比較解析する。登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子又はそのオーソログの、被験物質投与群における発現レベルが、基礎飼料投与群の発現レベルの２倍以上であれば、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００３８】
実施例５  （定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）脊椎動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。
【００３９】
（２）遺伝子の発現解析
被験物質投与群の肝臓組織及び基礎飼料のみ投与群由来の肝臓組織それぞれから、実施例１（１）と同様の操作によってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した後、実施例１（２）と同様の操作によって被験物質投与群及び基礎飼料投与群それぞれの肝臓組織由来のｃＤＮＡを調製する。次に、調製されたｃＤＮＡを鋳型として、以下のようにしてＰＣＲを行って増幅されたＤＮＡを定量する。即ち、当該ｃＤＮＡ  １μｌ、配列番号１で示される塩基配列からなるプライマー１  ２０ｐｍｏｌ、配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー２  ２０ｐｍｏｌ及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ＲｅａｇｅｎｔｓＰＣＲ（ＡＢＩ社）  ２５μｌを含む５０μｌの反応液を調製し、ＡＢＩ７７００（ＡＢＩ社）を用いて、５０℃  ２分間次いで９５℃  １０分間保温した後、９５℃  １５秒次いで６０℃  １分間の保温を１サイクルとしてこれを４０サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの量から、被験物質投与群の肝臓組織における本遺伝子の発現レベル及び基礎飼料投与群の肝臓組織における本遺伝子の発現レベルそれぞれを求める。被験物質投与群の肝臓組織における発現レベルが、基礎飼料投与群の肝臓の発現レベルの２倍以上であれば、当該被験物質は肝発癌活性を有すると評価する。
【００４０】
実施例６  （インサイチューハイブリダイゼーションを用いた肝発癌活性検定方法）
（１）脊椎動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。但し、肝臓はそのまま、又は、固定液（４％パラホルムアルデヒド＋０．５％グルタールアルデヒド／０．０７５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２〜７．４）で灌流した後に採取する。
【００４１】
（２）肝臓組織の固定、包埋及び薄切切片の作製
採取した肝臓は固定液（４％パラホルムアルデヒド＋０．５％グルタールアルデヒド／０．０７５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２〜７．４）で４℃、一晩固定する。固定後、被験物質投与群の肝臓組織及び基礎飼料のみ投与群由来の肝臓組織それぞれをアルコール脱水し、パラフィンに包埋した後、ミクロスライサーを用いて２〜１０μｍの厚さで薄切し、これをスライドグラスに載せる。
【００４２】
（３）ｃＤＮＡの調製
登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子を発現している組織（例えば、Ｘ５８２９４では大脳組織）から実施例１（１）と同様の操作にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１μｇ／μｌになるように調製する。次に目的遺伝子（例えば、Ｘ５８２９４）の約１ｋｂｐを選定し、当該塩基配列を有するＤＮＡをＰＣＲで増やすためのプライマーの合成を行う。プライマーは、そのｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒの５’末端にＴ３プロモーター配列（ａａｔ  ｔａａ  ｃｃｃ  ｔｃａ  ｃｔａ  ａａｇ  ｇｇａ  ａｃ）を、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒの５’末端にＴ７プロモーター配列（ｇｔａ  ａｔａ  ｃｇａ  ｃｔｃ  ａｃｔ  ａｔａ  ｇｇｇ  ａｇ）を付加したものとし、合成は遺伝子工学的手法にて用いられる通常の方法により合成する。ＲＴ−ＰＣＲには、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｇｉｂｃｏ社）及びＰＬＡＴＩＵＭ  ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  （Ｇｉｂｃｏ社）の各キットを用いる。まず、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅのプライマー２０ｐｍｏｌ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  １μｌ、当該キット内のＨ２０を混じ、６５℃、５分間保温し、その後、氷上で冷却する。次いで、５×ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、０．１Ｍ  ＤＤＴ  １μｌ、ＲＮａｓｅ  ＯＵＴ  １μｌ、滅菌水１μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ２μｌ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  １μｌを加え、６５℃で１時間保温した後、８５℃で５分間加温し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴを失活させる。これを氷上で冷却した後、１μｌのＲＮａｓｅ  Ｈ  （Ｇｉｂｃｏ社）を加え、３７℃で２０分間反応させることでｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡ  ５μｌに、ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ２０ｐｍｏｌ、×１０  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ  ２μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰｍｉｘ  １μｌ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈｔ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ０．２μｌ、滅菌水３４．８μｌを加え、９４℃で２分間加温した後、９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  １分間を１サイクルとして４０サイクル実施し、最後に６８℃で５分間反応を行う。このＰＣＲ反応液を１％アガロースゲル電気泳動に供し、目的ＰＣＲ産物をゲルから切り出した後、等量のイソプロパノールと混じ、当該キット内のカラムに供して、２分間遠心分離する。遠心後、カラムに新しいチューブを繋ぎ、当該キット内のＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μｌをカラムに供して遠心分離し、目的ＤＮＡ産物を得る。
【００４３】
（４）ラベル化ｃＲＮＡの調製
実施例６（３）で合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、Ｔ３  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ又はＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてｃＲＮＡプローブ（ＦＩＴＣ標識）を合成する。具体的には、ｃＤＮＡ  ０．２〜１μｌに×１０  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＤＴＴ＋）（宝酒造）２μｌ、×１０  ＦＩＴＣ−ｌａｖｅｌｉｎｇ  ｍｉｘ  （ベーリンガマンハイム）  ２μｌ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ニッポンジーン）１μｌを加え、さらにＨ２Ｏを加えて総量を１８μｌにする。そこにｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅを合成する場合には２μｌのＴ３  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）  、ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅを合成する場合には２μｌのＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）をそれぞれ加え、３７℃で３〜５時間保温する。次いで、１μｌのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅのＤＮａｓｅ  Ｉ（ベーリンガマンハイム社）を加え、さらに２０分間保温する。合成されたｃＲＮＡはエタノール沈澱させ、得られたペレットを６０℃に加温した１００μＬの  ４０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，  ６０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３  （ｐＨ１０．２）に溶解する。その後、アルカリ分解により約１５０ｂの断片になるように、次の計算式から得られた時間、６０℃で保温する。加温時間（分）  ＝  （ｃＤＮＡ長（ｋｂ）−加水分解後の平均断片長（ｋｂ））／（０．１１×ｃＤＮＡ長（ｋｂ）×加水分解後の平均断片長（ｋｂ））。反応後、氷上で冷却し、１μｌの酢酸を加える。更に、１０分の１量の４Ｍ  ＬｉＣｌを添加し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を棄てる。５００μｌのエタノールを加えてペレットを洗浄した後、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ  ２μｌ、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １μｌを加え溶解する。
【００４４】
（５）ハイブリダイゼーション
実施例６（２）で作製したスライド標本を室温で脱パラフィンし、再水和する。次に、前処理として１×Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＤＡＫＯ）を加え、オートクレーブにより１２１℃で２０分間加温する。６０℃まで温度が下がった後にこれを取り出し、室温に２０分間放置することで更に冷却する。冷却後、室温でＤＥＰＣ処理滅菌水に２分×２回、３％過酸化水素水／ＤＥＰＣ処理滅菌水に３０分間、ＤＥＰＣ処理滅菌水に２分×３回、９０％エタノール／ＤＥＰＣ処理滅菌水に３分間、１００％エタノールに３分間浸漬した後、風乾する。実施例６（４）で調製したｃＲＮＡプローブをｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：４０％ホルムアミド（ニッポンジーン），  ４×ＳＣＣ  （ｐＨ５．０）（Ｇｉｂｃｏ），  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  １×Ｄｅｎｈａｒｄｅｔ’ｓ（Ｎｉｐｐｏｎ  ｇｅｎｅ），２５０μｇ／ｍｌ  ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ  （Ｇｉｂｃｏ），１２５μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ  （Ｇｉｂｃｏ），  １０％ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅで０．１〜０．３μｇ／ｍｌ／ｋｂとなるように希釈し、切片上で滴下し、ＥａｓｉＳｅａｌ（ＨＹＢＡＩＤ社）を用いて封入する。封入したスライドグラスを湿潤箱に並べ、６０℃で５時間以上保温する。その後、スライドグラスを６５℃に保温した５×ＳＣＣ  （ｐＨ５．０）中に浸し、６５℃に加温した洗浄液Ａ（組成：２×ＳＣＣ［ｐＨ５．０］，  １％ＳＤＳ）に３０分間×２回浸漬し、室温の洗浄液Ｂ（組成：１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５），  ０．５Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）に５分間×３回浸漬した後、３７℃に加温した洗浄液Ｂに２０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ  （ＳＩＧＭＡ）を加えたものに２０分間浸漬する。その後、６５℃に加温した洗浄液Ｃ（組成：２×ＳＣＣ［ｐＨ５．０］，  ５０％  ホルムアミド［和光］）で３０分間×２回、室温のＴＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ［ｐＨ７．５］，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で３分間×３回洗浄を行う。洗浄後、切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、組織周囲をＰＡＰ  ＰＥＮ（大道産業株式会社）で囲んだ後、ＦＩＴＣ標識プローブ検出キット（ＤＡＫＯ）に含まれるアルカリフォスファターゼ標識抗ＦＩＴＣ抗体を１％Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ／ＴＢＳで希釈したものを、切片上に滴下し、湿潤箱中に３７℃で６０分間放置する。反応後、室温のＴＢＳＴ（組成：ＴＢＳ  ＋  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）に５分間×３回、室温のＴＢＳに２〜３分浸漬する。切片周囲の過剰な溶液を拭き取り、ＡＰ基質溶液（ＤＡＫＯ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質溶液）を滴下し、湿潤箱中に３７℃で６０分〜２日間放置する。その後、流水中で発色液を洗い流し、透徹、封入する。
【００４５】
（６）遺伝子の発現解析
本遺伝子の転写物量は、被験物質投与群の肝臓薄切切片及び基礎飼料投与群の肝臓薄切切片それぞれの各蛍光活性を示す部分の面積又は細胞数をカウントすることにより、本遺伝子の転写物であるｍＲＮＡの量又はそれに相当する値を測定することができる。その後、適当な統計学的解析を実施することで肝発癌活性の有無を評価することができる。
【００４６】
実施例７  （免疫組織化学的検査を用いた肝発癌活性検定方法）
（１）脊椎動物への被験物質の投与
実施例４（１）と同様の操作にて肝臓組織を採取する。
【００４７】
（２）組織の固定、包埋、及び切片の作製
採取した肝臓から組織を適度な大きさに切り出した後、ＯＣＴコンパウンドにこれを包埋し、液体窒素にて冷却したイソペンタン中で凍結させる。これを−２０℃に冷却したクリオスタット中で約５μｍの厚さに薄切し、スライドグラスに載せ、乾燥させる。
【００４８】
（３）薄切切片の免疫組織化学的染色
上記（２）で作製した薄切切片を７０％エタノールで１分間固定した後、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（組成：１０  ｍＭ  リン酸ナトリウム  ［ｐＨ７．４］，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）で洗浄してＯＣＴコンパウンドを落とし、０．３％過酸化水素水で５分間処理する。ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５分間×３回洗浄し、正常血清で室温２０分間処理する。次いで、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで適度に希釈した登録番号群１に示される登録番号のいずれかでＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列を有する遺伝子の翻訳産物に対する抗体（以下、一次抗体）で室温６０分間処理する。反応後、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５分間×３回洗浄し、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで適度に希釈した一次抗体と同じ免疫動物のＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ／ＡＢＣ試薬（フナコシ）で室温３０分間処理する。更に、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで５分間×３回洗浄した後、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ナカライ）を用いて発色させる。その後、蒸留水で洗浄し、脱水、透徹、封入を行う。
【００４９】
（４）遺伝子翻訳産物の発現解析
画像解析装置ＩＰＡＰ（住化テクノサービス（株））を用いて染色性の確認された肝細胞巣の面積及び肝臓薄切切片全体の面積それぞれを測定し、（染色性を認めた肝細胞巣の面積）／（肝臓薄切切片全体面積）を算出する。また他の方法として、染色性の確認された肝細胞巣の個数をカウントし、（染色性を認めた肝細胞巣の個数）／（肝臓薄切切片全体面積）を算出する。
次に適当な検定手法を用いて統計学的解析を行い、被験物質投与群における値が基礎飼料投与群の当該値より有意な増加を示した場合には、被験物質は肝発癌性を有すると評価する。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によって、遺伝子の発現レベルの異常を指標とした脊椎動物の肝腫瘍性病変又は前腫瘍性病変の検定方法等が提供可能となる。
【００５１】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００５２】
【配列表】
2004344068.tif 000002
2004344068.tif 000003