(57)【要約】【課題】制限酵素やＰＣＲ法を利用しなくとも簡便に、順序性および選択性を保持して、ヘアピン構造を開裂させ、信号の伝達や出力等を可能とすることのできる新しい多状態分子機械を提供する。【解決手段】ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が逐次的な状態遷移を行う分子機械であって、１個以上のヘアピン構造を有する一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子の１種類以上で構成され、このヘアピン構造中の二本鎖部分の塩基配列およびそれに隣接する一本鎖部分の塩基配列に対して相補的な一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子をインプットオリゴマーとし、１個以上、かつ、１種類以上のこのインプットオリゴマーをヘアピン構造に与えることによって、ヘアピン構造の一端から他端へ順次ハイブリダイゼーション反応が生じ、逐次的にヘアピン構造を崩して、そのヘアピン構造の分子状態を把握することを特徴とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が逐次的な状態遷移を行う分子機械であって、１個以上のヘアピン構造を有する一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子の１種類以上で構成され、このヘアピン構造中の二本鎖部分の塩基配列およびそれに隣接する一本鎖部分の塩基配列に対して相補的な一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子をインプットオリゴマーとし、１個以上、かつ、１種類以上のこのインプットオリゴマーをヘアピン構造に与えることによって、ヘアピン構造の一端から他端へ順次ハイブリダイゼーション反応が生じ、逐次的にヘアピン構造を崩して、そのヘアピン構造の分子状態を遷移させることを特徴とする多状態分子機械。
【請求項２】
ヘアピン構造を、連続的に有している請求項１の多状態分子機械。
【請求項３】
インプットオリゴマーが、１０から５０塩基の範囲である請求項１または２の多状態分子機械。
【請求項４】
配列番号１または２の塩基配列からなるヘアピン構造を有する請求項１または２の多状態分子機械。
【請求項５】
配列番号３から８のいずれかの塩基配列からなるインプットオリゴマーが、少なくとも１種類以上が与えられる請求項３の多状態分子機械。
【請求項６】
分子状態の遷移により信号の伝達、もしくは信号の出力を行う請求項１から５のいずれかの多状態分子機械。
【請求項７】
配列番号１から８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、多状態分子機械に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を利用した順序性および選択性を備えた、多状態分子機械に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来のＤＮＡ分子を利用した分子機械としては、たとえば、ＤＮＡ分子を用いて組み合わせ問題を解く、分子的計算機（特許文献１）が知られている。この分子的計算機は、エネルギー効率がよく、かつ、迅速な計算速度で、組み合わせ問題（ＮＰ完全問題）（たとえば、ハミルトン経路問題）の解を得ることができるとしている。だが、この分子的計算機では、たとえば、ハミルトン経路問題において、この問題の構成する条件の一部のみが、ＤＮＡ分子としてコード化されている。このため、コード化されていない問題については、この問題の各条件に適合するものを選択するために、条件ごとに種々の操作を行う必要性がある等といった問題があった。
【０００３】
そこで、前記の問題を解消するため、ＮＰ完全問題の解を得る方法（特許文献２）が提案されている。この方法では、ＤＮＡ分子が、２次構造を形成することを利用して、より少ない操作工程でＮＰ完全問題（充足可能性問題）の解を得る方法としている。この方法は、ＮＰ完全問題の条件が、ＤＮＡ分子の２次構造にコード化されているため、これらＤＮＡ分子を混合するだけで、自律的に演算を行うことができ、ＮＰ完全問題の解を得ることができる。すなわち、充足解に相当しないＤＮＡ分子は、ヘアピン構造を形成するため、制限酵素やＰＣＲ法を利用して、このヘアピン構造を形成するＤＮＡ分子を除去して、充足解を表すＤＮＡ分子のみを得ることができる、この塩基配列を解析することによって充足解が得られるとしている。
【０００４】
しかしながら、この方法では、ヘアピン構造を除去するために、前記のとおり以下の操作を必要とし、それぞれに問題があった。すなわち：
（１）制限酵素による、ヘアピン構造の除去について
特定の箇所に制限酵素認識部位を別途デザインしなければならず、ヘアピン構造の除去機構も順序性を有していない。また、ＮＰ完全問題をコードするＤＮＡ分子の塩基配列が、制限酵素認識部位と同一、もしくは類似している場合、ヘアピン構造以外のＤＮＡ分子を切断する可能性も生じる。
（２）ＰＣＲ法の利用による、ヘアピン構造の除去について
バッファー濃度や補酵素の種類の選択等の反応系の条件検討が必要となり、またＮＰ完全問題をコードするＤＮＡ分子の塩基配列が、ＡＴ結合より結合力が強いＧＣ結合が豊富に存在する場合、ＰＣＲ反応条件（特にアニーリング温度）の検討の必要性が生じる。
等といった煩雑な操作を要する問題があった。
【０００５】
【特許文献１】
特表２００１−５１５６１４号公報
【特許文献２】
特開２０００−３５３１５６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
そこでこの出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の問題点を解消し、制限酵素やＰＣＲ法を利用しなくとも簡便に、順序性および選択性を保持して、ヘアピン構造を開裂させ、信号の伝達や出力等を可能とすることのできる新しい多状態分子機械を提供することを課題としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、第１には、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が逐次的な状態遷移を行う分子機械であって、１個以上のヘアピン構造を有する一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子の１種類以上で構成され、このヘアピン構造中の二本鎖部分の塩基配列およびそれに隣接する一本鎖部分の塩基配列に対して相補的な一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子をインプットオリゴマーとし、１個以上、かつ、１種類以上のこのインプットオリゴマーをヘアピン構造に与えることによって、ヘアピン構造の一端から他端へ順次ハイブリダイゼーション反応が生じ、逐次的にヘアピン構造を崩して、そのヘアピン構造の分子状態を把握することを特徴とする多状態分子機械を提供する。第２には、ヘアピン構造を、連続的に複数有している多状態分子機械を、第３には、インプットオリゴマーが、１０から５０塩基の範囲である多状態分子機械を提供する。
【０００８】
またこの出願の発明は、第４には、配列番号１または２の塩基配列からなるヘアピン構造を有する多状態分子機械を、第５には、配列番号３から８のいずれかの塩基配列からなるインプットオリゴマーが、少なくとも１種類以上与えられる多状態分子機械を、第６には、分子状態の遷移により信号の伝達、もしくは信号の出力を行う多状態分子機械を、そして、第７には、配列番号１から８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が逐次的な状態遷移を行う分子機械であって、１個以上のヘアピン構造を有する一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子の１種類以上で構成され、このヘアピン構造中の二本鎖部分の塩基配列およびそれに隣接する一本鎖部分の塩基配列に対して相補的な一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子をインプットオリゴマーとし、１個以上、かつ、１種類以上のこのインプットオリゴマーをヘアピン構造に与えることによって、ヘアピン構造の一端から他端へ順次ハイブリダイゼーション反応が生じ、逐次的にヘアピン構造を崩して、そのヘアピン構造の分子状態を把握することを特徴とする多状態分子機械である。
【００１０】
この出願の発明における「ヘアピン構造」とは、一本鎖ＤＮＡ分子または、一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中に、相補的な部分配列が存在すると形成される２次構造のことであり、ヘアピン構造の中で二本鎖を形成している部分（“ｓｔｅｍ”）とヘアピン構造の末端に塩基対を形成していない部分（“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”）とからなる、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子である。また、逐次的にＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の状態遷移を得るためには、このヘアピン構造が複数個備えられ、連続的に配置されていることが好ましい。なお、ヘアピン構造を構成する一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列は、ヘアピン構造を形成するのであれば、限定されるものではない。また、複数のヘアピン構造が備えられている場合、ヘアピン構造それぞれが、異なる塩基配列による一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子で構成されていてももちろんよい。この出願の発明において、ＲＮＡ分子よりＤＮＡ分子のほうが、安定であるため、ＤＮＡ分子を利用することが好ましい。
【００１１】
「インプットオリゴマー」とは、“ｓｔｅｍ”および“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子であり、このインプットオリゴマーをヘアピン構造に作用させると、２次構造変化（“ｂｒａｎｃｈ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ”）が起こり、その結果ヘアピン構造の開裂が生じる。インプットオリゴマーは、１０から５０塩基の範囲で、形成されることが好ましい。インプットオリゴマーにおいても、前記のとおり、複数種のヘアピン構造の場合、それぞれのヘアピン構造に対応して、複数種のインプットオリゴマーが使用される。
【００１２】
「逐次的」とは、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子が連続して２個以上のヘアピン構造が形成される場合、連続したヘアピン構造のうち、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”を有している末端のヘアピン構造のみが、このヘアピン構造に対応するインプットオリゴマーによって開裂が生じることである。詳しくは、他のヘアピン構造は、“ｓｔｅｍ”の配列に相補的な配列を有するインプットオリゴマーが存在していても、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”を有していないため、インプットオリゴマーが結合できず開裂は生じない。しかし、末端のヘアピン構造が開裂すると、その開裂したヘアピン構造の“ｓｔｅｍ”であった部分が一本鎖となり（すなわち、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”に相当する）、そこにインプットオリゴマーが結合し、隣接するヘアピン構造も開裂する。つまり、連続するヘアピン構造においては、一端から順序性を保って他端へ次々と開裂し、しかもヘアピン構造とインプットオリゴマーの塩基配列が、相互に対応している必要があるため、ヘアピン構造の塩基配列とインプットオリゴマーの塩基配列とが対応（相補的）していなければ、開裂が生じない。すなわち、選択性をも備えている。「分子状態」とは、物理的、もしくは化学的に分子の性質が一定時間以上持続することであり、特にこの出願の発明においては、一本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子で構成されている前記のヘアピン構造が開裂状態であるか、または未開裂状態であるかを意味し、前記のヘアピン構造が、順次に開裂していく状態のことである。また、この出願の発明の「多状態分子機械」は、分子状態の遷移により信号の伝達、もしくは信号の出力を行うことも特徴としており、ヘアピン構造のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（外部からの入力に応じて、その状態を遷移可能な分子）を機械、すなわち分子機械とみなし、インプットオリゴマーのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をその機械の入力操作としてみなし、ヘアピン構造の開裂状態および未開裂状態の状態遷移を備え、これを利用したプログラムの演算等をおこなうことのできるものである。たとえば、分子メモリのアドレッシング等があり、この出願の発明を適用することができる。分子メモリアドレッシングは、ヘアピン構造の塩基配列が種々の順序で連結された分子の集合を用意し、インプットオリゴマーの入力列をアドレスとしてみなすと、それによって特定の分子のみが、ヘアピン構造をすべて開裂することにより、そのアドレスに対応する分子を特定でき、アドレッシングが行われることとなることを特徴としている。
【００１３】
この多状態分子機械は、たとえば、インプットオリゴマーを添加しヘアピン構造を開裂させることによって、その際の一本鎖ＤＮＡ分子と二本鎖ＤＮＡ分子との導電性の差異に基づいた電気信号の伝達によって、入力された情報を伝達することも考えられる。また、ヘアピン構造の大きく開裂する側の一端に蛍光物質等を付加させ、この蛍光物質の波長の変化をもって、状態を検出すること等も期待できる。
【００１４】
さらに、この出願の発明を実施するのにあたり、配列番号１の塩基配列からなるヘアピン構造を有し、このヘアピン構造に対応（相補的）した配列番号３のインプットオリゴマーであることが好ましく、また、配列番号２のヘアピン構造は、連続的なヘアピン構造であり、それぞれに対応する配列番号４から８の塩基配列からなるインプットオリゴマーを用いるのが好ましい。そして、上記のヘアピン構造を次々と連結させ、多状態分子機械とすることもできる。
【００１５】
以下、添付した図面とともに実施例を示して、この出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明する。もちろん、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００１６】
【実施例】
（実施例１）ヘアピン構造の開裂
図１は、ヘアピン構造の開裂する様子を例示した模式図である。
【００１７】
この図１に例示したように、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”を付加させたヘアピン構造を用意した。このヘアピン構造は、６７ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ分子であり、ヘアピンテンプレートとした。また、このヘアピン構造を開裂させるために、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”部分とそれに続く“ｓｔｅｍ”部分とに結合する配列（相補鎖）を有する４０ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡ分子をインプットオリゴマーとした。それぞれの配列は、表１に例示した。そして、ヘアピンテンプレートとインプットオリゴマーとを溶液中で混合すると、開裂が生じる。
【００１８】
その確認実験として、ヘアピンテンプレートとインプットオリゴマーをそれぞれ終濃度５  ｐｍｏｌ／μｌになるよう調整した。次に１０μｌの反応系で、ＰＣＲを行った。なお、バッファー成分は、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）付属の１０×バッファーを終濃度１×になるように使用した。用意したサンプルは、コントロールとして、ヘアピンテンプレート１μｌをＰＣＲ反応させたもの、レーン２にはヘアピンテンプレート１μｌ＋インプットオリゴマー２μｌの混合液をＰＣＲ反応させたものである。そして、ＰＣＲ反応後の各サンプル１０％  ポリアクリルアミド電気泳動で解析した。なお、レーンＭは、分子量マーカーであり、レーン１は、ヘアピンテンプレート１μｌをＰＣＲ反応させたものであり、レーン２は、ヘアピンテンプレート１μｌ＋インプットオリゴマー２μｌの混合液をＰＣＲ反応させたものである。泳動条件は、ＴＡＥバッファーを用いて、定常電圧２００Ｖ、３５分間で行った。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
結果は、図２に示したとおりである。レーン１においては、ヘアピンテンプレートのみのバンドが確認されたが、レーン２では、ヘアピンテンプレートとインプットオリゴマーとが結合しているため、開裂していないヘアピンテンプレートより分子量が大きくなり、レーン１のバンドよりも上方にバンドが確認された。（実施例２）連続したヘアピン構造の開裂
図３は、４つの連続したヘアピン構造の開裂の様子を例示した模式図である。
【００２１】
まず、４つの連続したヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ分子を作成し、ヘアピンテンプレート２とした。このヘアピン構造の大きさは、“ｓｔｅｍ”部分が２０ｍｅｒ、“ヘアピン”部分が７ｍｅｒとした。そして、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”部分を２０ｍｅｒとして、５’末端側と３’末端側との両末端に付加させている。そのため、この実施例２におけるヘアピン構造の全長は、（２０＋７＋２０）×４＋（２０×２）＝２２８ｍｅｒである。なお、この４つのヘアピン構造は、それぞれ異なる配列を有している。この４種類のヘアピン構造を開裂させるため、これらヘアピン構造にそれぞれ相補的な配列を有した、インプットオリゴマーＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの５種類を用意し、混合させることによって、図３に例示したように、“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”部分を有した末端側から順次に、しかも相互に対応した箇所とのみ結合して、開裂させる。なお、ヘアピン構造および各インプットオリゴマーの配列を表２に例示した。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
確認実験として、１０％ポリアクリルアミド電気泳動を行い、解析を行った。電気泳動の条件としては、ＴＡＥバッファー、定常電圧２００Ｖ、３５分間であり、泳動終了後のゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色し、各サンプルのバンドを確認した。
【００２４】
各インプットオリゴマーを終濃度５  ｐｍｏｌ／μｌに調整した。ヘアピンテンプレート２を１μｌ、各インプットオリゴマーを順に、少なくとも１分以上の時間間隔を設けて加えて、２０μｌの反応系として反応を行った。なお、１回目に添加されるインプットオリゴマーは１μｌ、２回目に添加されるインプットオリゴマーは２μｌ、３回目に添加されるインプットオリゴマーは３μｌ、４回目に添加されるインプットオリゴマーは４μｌとし、順を追うごとに添加量を増やした。この混合サンプル液の半分を混合のみにし、残り半分を９４℃を１分間行い、２０℃に冷却（冷却速度は０．４℃／ｓｅｃ）し、変性およびハイブリダイゼーション反応を行った。なお、バッファー成分は、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）付属の１０×バッファーを終濃度１×になるように使用した。
【００２５】
結果は、図４および図５に示したとおりである。図４は、連続したヘアピン構造の開裂の様子を電気泳動で確認した図である。なお、この実施例２において、インプットオリゴマーＥ側の末端（３’末端側）から順次開裂をさせているため、他端側（５’末端側）の“ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ”と結合するインプットオリゴマーＡは使用していないため、結果は示していないが、インプットオリゴマーＡ側の末端から順次開裂をさせることができることも確認されている。
【００２６】
図４中の囲み枠の下に見られるバンドは、インプットオリゴマー同士が結合したものである。隣接し合うヘアピン構造を開くためのインプットオリゴマー同士は構造上相補的な塩基配列を有すため、結合する可能性がある。そのため、前記のとおり、インプットオリゴマーの添加量を段階的に増やすことで、インプットオリゴマー同士の結合を回避することができる。これによって、ヘアピン構造を開裂させるためのインプットオリゴマーの量が確保でき、より効率的にヘアピン構造を開裂させことができる。
【００２７】
図５は、図４の囲み枠の部分を拡大した図であるが、１種類のインプットオリゴマーを加えた場合、インプットオリゴマーＥを加えた場合のみ、ヘアピンテンプレート２よりも上方にバンドが確認された。このことは、インプットオリゴマーＥのみが、ヘアピン構造の開裂の開始を担うことができることを示している。インプットオリゴマーＥの次に、別の各インプットオリゴマーを加えた場合では、インプットオリゴマーＤのみのバンドが、そして、さらに次に別の各インプットオリゴマーを加えた場合、インプットオリゴマーＣを加えた場合のみ、バンドの位置がずれている（すなわち、開裂している）ことが確認された。このことから、複数種のインプットオリゴマーを用いる際、正しい順番でインプットオリゴマーを加えれば、ヘアピン構造は開裂されることが確認された。この実施例２においての、正しい順番はインプットオリゴマーＥ、Ｄ、Ｃ、Ｂであった。
【００２８】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、制限酵素やＰＣＲ法を利用しなくとも簡便に、順序性および選択性を保持して、ヘアピン構造を開裂させ、信号の伝達や出力等を可能とすることができ、たとえば、アゾベンゼンのシス・トランス異性化を利用した光制御やヘアピン構造の“ｓｔｅｍ”の分岐による状態の分岐可能な機械等にも応用可能な新しい多状態分子機械が提供される。
【００２９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヘアピン構造の開裂する様子を例示した模式図である。
【図２】図１に例示した開裂の様子を電気泳動で確認した図である。
【図３】連続したヘアピン構造の開裂する様子を例示した模式図である。
【図４】図３に例示した開裂の様子を電気泳動で確認した図である。
【図５】図４の部分拡大図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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