(57)【要約】【課題】ヒト血管内皮増殖因子の発現を強く抑制する。【解決手段】ヒト血管内皮増殖因子のメッセンジャーＲＮＡの特定の塩基配列に対応するｓｉＲＮＡ配列を用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管内皮増殖因子の発現を抑えるｓｉＲＮＡ配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト血管内皮増殖因子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）は、血管内皮細胞に強い特異性を有し、強力な血管新生を促すヘパリン結合性増殖因子として、１９８９年に、Ｆｅｒｒａｒａらによって下垂体濾胞星状細胞の培養上清から見出された（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１３，１８−３２，１９９２；Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６−１３０９，１９８９）。その後、ＶＥＧＦのｃＤＮＡクローニングが行われると、ＶＥＧＦは、１９８３年にすでに、Ｓｅｎｇｅｒらによって見出されていた血管透過性因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＰＦ）と同一物質であることが明らかとなった（Ｐａｍｅｒａ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０９−１３１２，１９８９）。Ｓｅｎｇｅｒらは、腫瘍に関連した血管における蛋白質の透過性を亢進する活性を指標にＶＰＦを単離した（Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９，９８３−９８５，１９８３）。これらの研究背景から、血管内皮増殖因子はＶＥＧＦ／ＶＰＦまたは単にＶＥＧＦと表記するのが通例となった。ＶＥＧＦは分子量約２２，０００のサブユニットが二量体を形成する構造を持ち、血管内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成を促進し、個体レベルでの血管新生・血管透過性の亢進を起こす。また、組織因子やプラスミノーゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ＰＡ）などの凝固系・線溶系因子の産生亢進、マトリックス・メタロプロテイナーゼやＰＡ受容体の発現などの亢進を誘導し、血管基底膜を分解する（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７７，５２７−５４３，１９９９）。また、ＶＥＧＦはＶＰＦという別名が示す如く、血管透過性を亢進する。
ＶＥＧＦはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇにより、５個のサイズの異なるアイソフォーム（すなわちＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８９，ＶＥＧＦ２０６：下付の数字は構成アミノ酸数を示す）として存在することが知られている（Ｔｉｓｃｈｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１１９４７−１１９５４，１９９１）。これら５種のＶＥＧＦサブタイプの性質上の相違点はヘパリンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合能の有無や結合力の違いにある。ヘパリン結合ドメインを包含するエクソン６およびエクソン７を有しないＶＥＧＦ１２１のみヘパリン結合能がなく、また、ＶＥＧＦ１８９とＶＥＧＦ２０６はより強いヘパリン結合能を持つ。ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１６５は強力な血管内皮細胞増殖能を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける血管新生を誘導する。いずれのサブタイプもシグナルペプチドを持ち、糖鎖修飾を受けて分泌される。ＶＥＧＦを産生している細胞は、何種類かのサブタイプを同時に産生している。通常、ＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５が優位であるが、ＶＥＧＦ１８９も多くの細胞で発現が観察されている。ＶＥＧＦ１４５の発現は組織限定的で、これまで女性生殖器官に由来する細胞でのみの発現とされてきたが、最近口腔悪性腫瘍からＶＥＧＦ１４５が同定された（Ｍｉｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．，３６：８１−８８，２０００）。このようなａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇによって生合成される５種のＶＥＧＦサブタイプの遺伝子構造を詳細に把握することは、本発明のヒト血管内皮増殖因子の発現を抑えるｓｉＲＮＡ配列を設計するために、非常に重要であると考えられる。
ＶＥＧＦは強力な血管新生作用を持つことから、癌治療の分子標的として非常に有用であると推測される。従って、ＶＥＧＦの生産を抑えるか作用を阻害することによって、癌の治療に寄与することが可能と考えられる。また、癌以外のＶＥＧＦ過剰発現をその主病因とする疾患、例えば眼内血管新生病（糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症など）、動脈硬化症などの治療にも寄与することが可能と考えられる。
【０００３】
ＶＥＧＦの活性を抑えるためには抗ＶＥＧＦ抗体が考えられ、実際、ヒト型ＶＥＧＦ中和抗体の投与によりヒト胃癌細胞株や大腸癌株の腫瘍成育抑制効果を認めている。（Ｋａｎａｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７：９３３−９３６，１９９８）。しかし、抗体が、すべてのＶＥＧＦ分子に接触し得るわけではないので、効率的なＶＥＧＦ抑制にはＶＥＧＦの生合成そのものをおさえる必要がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトＶＥＧＦタンパク質の生合成を特異的に強く抑制する物質を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
特定のタンパク質の生合成を阻害するためには、そのタンパク質の合成を指令するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とすることが考えられる。すなわち、標的遺伝子のｍＲＮＡの働きを抑制し、かつそのｍＲＮＡ自体を分解に導く戦略、つまりＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅを基本原理とする遺伝子発現制御システムを選択した。ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの現象は、１９９８年、Ｆｉｒｅらによって報告された、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに２本鎖ＲＮＡを導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで特定遺伝子のノックダウンに成功したという発表（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ：３９１，８０６−８１１，１９９８）により広く知られるようになった。使用された２本鎖ＲＮＡのターゲット遺伝子に対する特異性は、非常に高くターゲット配列に相補しない２本鎖ＲＮＡでは一切の発現制御効果を示さなかった。次いで、この実験系を哺乳動物に応用する試みがなされたが、２本鎖ＲＮＡの導入に伴う、インターフェロン作用が働くため、哺乳動物細胞の遺伝子をターゲットとした２本鎖ＲＮＡは使用できない事が大きな問題となった。その後、Ｔｕｓｃｈｌの研究グループがもっとも効率よく遺伝子をノックダウンする２本鎖ＲＮＡの研究をすすめ、３’末端に２塩基のオーバーハングを持った２１−ｍｅｒという短い２本鎖を用いると、哺乳類細胞で問題となっていたインターフェロン作用を引き起こさずにＲＮＡｉを機能させることができると報告した。このような短い２本鎖ＲＮＡをｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ぶ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４−４９８，２００１，Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９，２００１）。申請者らは、ヒトＶＥＧＦ  ｍＲＮＡに作用し、ＶＥＧＦタンパク質の発現を阻害可能なｓｉＲＮＡの塩基配列を見出した。
【０００６】
すなわち、本発明は、（１）ヒトＶＥＧＦの生合成を強く抑制するｓｉＲＮＡ配列の決定からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１は検討した４種のＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡと陰性コントロールとして使用した１種のｓｉＲＮＡの構造を示す。図２Ａは４種のＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡをヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）に投与し、回収した上清中のＶＥＧＦ発現の抑制を調べるための酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）の測定結果である。図２Ｂは、ＶＥＧＦ合成阻害に最も有効であることが判明したＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２とそのスクランブル配列ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２−ＳＣＲをＰＣ−３に投与し、回収した上清中のＶＥＧＦ発現の抑制を図２Ａと同様に検討した結果を示す。
【０００８】
１．ｓｉＲＮＡの分子設計について説明する。ヒトＶＥＧＦのｍＲＮＡ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０６−１３０９，１９８９；Ｋｅｃｋ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１３０９−１３１２）は既に報告されている。その翻訳領域の中で工夫をこらして選択を行った。まず、ＡＡおよびＣＡから始まるターゲット配列よりＧＣ含有量が４５〜５５％の２１塩基の候補配列１４種を選択し、「ＧＣの偏り」が比較的少ない配列７種に候補を絞った。続いて、この７種について、ＢＬＡＳＴサーチによる類似配列の検索を行い、類似配列の少ないターゲットを選択し、かつその近傍二次構造解析結果を参考に、比較的立体障害の影響の少ないと想定できる４種を最終的に選択した。なお、この配列から出発して、ターゲット配列との相補性に影響の少ない置換、付加を行った配列は請求に含まれる。また、ｓｉＲＮＡの３’末端に付加するオーバーハングの選択において、ｄＴｄＴ以外の２塩基についても請求に含まれる。
【０００９】
２．ｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦの合成抑制の効果判定について説明する。ｓｉＲＮＡをＶＥＧＦを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるＶＥＧＦ量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定した。
【００１０】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１１】
（実施例１）ｓｉＲＮＡの作成を行った。ヒトＶＥＧＦのｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００３３７６）において、ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇにより生合成される５種のＶＥＧＦサブタイプ（ＶＥＧＦ１２１，ＶＥＧＦ１４５，ＶＥＧＦ１６５，ＶＥＧＦ１８９，ＶＥＧＦ２０６）がすべて共有する第１エクソンから第５エクソンまでの翻訳領域内から前述の配列選定法に基づいて設計したｓｉＲＮＡ４種をＤｈａｒｍａｃｏｎ社に依託し合成した。合成したｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘは図１に示す如くであり、各ｓｉＲＮＡのｍＲＮＡの標的部位は下記の如くである。
ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃１（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列１４９番目から１６７番目；ＧＣＵＡＣＵＧＣＣＡＵＣＣＡＡＵＣＧＡ；ＧＣ含有量４７％）、
ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列１８９番目から２０７番目；ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣ；ＧＣ含有量４７％）、
ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃３（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列２９０番目から３０８番目；ＣＵＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＣ；ＧＣ含有量４７％）、
ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃４（ｍＲＮＡ標的部位：塩基配列３３６番目から３５４番目；ＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡ；ＧＣ含有量５２％）
【００１２】
配列番号１  ５’−（ＣＡ）ＧＣＵＡＣＵＧＣＣＡＵＣＣＡＡＵＣＧＡ−３’
配列番号２  ５’−（ＣＡ）ＧＧＡＧＵＡＣＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣ−３’
配列番号３  ５’−（ＣＡ）ＣＵＧＡＧＧＡＧＵＣＣＡＡＣＡＵＣＡＣ−３’
配列番号４  ５’−（ＣＡ）ＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡ−３’
【００１３】
（実施例２）ｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦ産生の抑制を行った。ＶＥＧＦを分泌しているヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣＮｕｍｂｅｒ  ＣＲＬ−１４３５）を３５ｍｍディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ，３００１）に２×１０５個／ディッシュ［ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％／Ｆ１２Ｋ培地（Ｆ１２Ｋ）］の細胞密度で正確にまき、３７℃、５％ＣＯ２存在下で１晩前培養した。あらかじめ、２０μＭに濃度調整したＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃１，＃２，＃３，＃４の各々をそれぞれ５μｌとり、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１０５μｌと混合し、プラス試薬（インビトロジェン社）１０μｌを加え、よく混合し、室温で１５分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬（インビトロジェン社）４μｌを加え、室温で１５分反応させ、ｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は３５ｍｍディッシュで１枚に投与可能な量である。続いてＰＣ−３細胞に新鮮なＦ１２Ｋ０．８ｍｌを満たし、前述のｓｉＲＮＡ・リポソーム処理液を０．２ｍｌを加えた後、３７℃、４時間トランスフェクションを行った。このとき、ｓｉＲＮＡの投与濃度は１００ｎＭとなる。１０％ＦＢＳ／Ｆ１２Ｋ  １ｍｌを加え、６時間培養した。細胞をＦ１２Ｋで洗浄し、２０μｇ／ｍｌのヘパリンを含むＦ１２Ｋ  １ｍｌを加え、さらに１６時間培養を続け、上清を回収した。回収した培養上清についてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から販売されているＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いてＶＥＧＦ濃度を測定した。その結果を図２Ａに示す。図２Ａに示す如く、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを投与することにより、培養上清中に分泌されるＶＥＧＦ濃度の低下を認めた。各培養上清中のＶＥＧＦ濃度を比較するため、無処理細胞の濃度を１００％と定義すると、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃１では３．６％、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２では１．６％、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃３では２２．３％、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃４では５３．５％の濃度であることが明らかとなった（図２Ａ）。
【００１４】
（実施例３）ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡによるＶＥＧＦ産生の抑制の特異性を検討した。すなわち、実施例２において、ＶＥＧＦ産生抑制が最も強かったＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２のアンチセンス鎖をスクランブルにし、それに相補的な２本鎖ＲＮＡ（ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２−ＳＣＲ）を新たに合成し、陰性コントロールとして用いた。
実施例２で示した方法と全く同様の方法を用いて、上記のＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２とＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２−ＳＣＲをヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）にトランスフェクションした。回収した培養上清について実施例２で示した如く、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡキットを用いてＶＥＧＦ濃度を測定した。その結果を図２Ｂに示す。各培養上清中のＶＥＧＦ濃度を比較するため、無処理細胞の濃度を１００％と定義すると、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２では１．３％、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２−ＳＣＲでは９４．９％の濃度であることが明らかとなった（図２Ｂ）。以上のように、ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ＃２の配列特異的に、ＰＣ−３細胞の分泌するＶＥＧＦが減少していることが明らかとなった。
【００１５】
【発明の効果】
以上図示し説明したように本発明のｓｉＲＮＡによってヒトＶＥＧＦの発現を強く抑制することが出来る。
【００１６】
【配列表】
2004313141.tif 000002
【００１７】
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【００１８】
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【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明における、４種のＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘと１種のコントロールｓｉＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘの構造である。
【図２】この発明の一実施例に関わる、ｓｉＲＮＡなどを投与したＰＣ−３細胞の培養上清中のヒトＶＥＧＦ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定し、各測定値をグラフ化したものである。各投与群について、平均値±標準偏差（ｎ＝４）をグラフに示した。図２Ａおよび図２Ｂにおいて、各ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを投与したときのＶＥＧＦ産生低下量を無投与時のＶＥＧＦ濃度を１００％と定義したときの濃度比として、グラフ内に示した。
【図１】
2004313141.tif 000007
【図２】
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