(57)【要約】【課題】薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分析試料から脂質を分離抽出する必要をなくするとともに、ラベル化反応が容易でラベル化された脂肪酸の安定性も高い脂肪酸の分析方法を提供する。【解決手段】脂質を脂肪酸に分解する脂質分解工程と、脂肪酸をハロゲン化シンナモイル又はその誘導体と反応させてシンナモイル化するラベル化工程と、シンナモイル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度を高速液体クロマトグラフィーにより分析するＨＰＬＣ工程とを、この順序で含むことを特徴とする脂肪酸の分析方法。【選択図】  図８
2004245628.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼ又はホスホリパーゼを用いて脂質を脂肪酸に分解する脂質分解工程と、脂肪酸をラベル化剤と反応させるラベル化工程と、ラベル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度を高速液体クロマトグラフィーにより分析するＨＰＬＣ工程とを、この順序で含むことを特徴とする脂肪酸の分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の脂肪酸の分析方法において、以下の一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイル又はその誘導体をラベル化剤として用いて前記ラベル化工程を行うことを特徴とする脂肪酸の分析方法。
【化１】
2004245628.tif 000009
（但し、ＸはＣｌ又はＢｒを示す。）
【請求項３】
脂質を脂肪酸に分解する脂質分解工程と、脂肪酸を以下の一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイル又はその誘導体と反応させてシンナモイル化するラベル化工程と、シンナモイル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度を高速液体クロマトグラフィーにより分析するＨＰＬＣ工程とを、この順序で含むことを特徴とする脂肪酸の分析方法。
【化２】
2004245628.tif 000010
（但し、ＸはＣｌ又はＢｒを示す。）
【請求項４】
請求項２又は３に記載の脂肪酸の分析方法において、前記ハロゲン化シンナモイルが以下の化学式（２）で示されるシンナモイルクロライドであることを特徴とする脂肪酸の分析方法。
【化３】
2004245628.tif 000011
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の脂肪酸の分析方法において、トリエチルアミンを反応促進剤として用いて前記ラベル化工程を行うことを特徴とする脂肪酸の分析方法。
【請求項６】
以下の一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイル又はその誘導体からなることを特徴とする脂肪酸のラベル化剤。
【化４】
2004245628.tif 000012
（但し、ＸはＣｌ又はＢｒを示す。）
【請求項７】
請求項６に記載の脂肪酸のラベル化剤において、前記ハロゲン化シンナモイルが以下の化学式（２）で示されるシンナモイルクロライドであることを特徴とする脂肪酸のラベル化剤。
【化５】
2004245628.tif 000013
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、脂肪酸の分析方法及び脂肪酸のラベル化剤に関する。特に、生体中における脂肪酸の成分及び／又はその濃度を分析するのに好適な脂肪酸の分析方法及びそのような脂肪酸の分析方法に好適に用いることができる脂肪酸のラベル化剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
図１１は、脂質に含まれる脂肪酸の成分及び／又はその濃度を分析する従来の方法を説明する図である。図１１に示すように、従来の脂肪酸の分析方法は以下のような２つの方法（図１１（ａ）及び図１１（ｂ））により行われていた。
【０００３】
まず、一の方法は、図１１（ａ）に示すように、以下の工程（ａ１）〜（ａ４）により行われていた。
（ａ１）試料準備工程
分析しようとする脂質を準備して分析試料とする。
（ａ２）加水分解工程
分析試料を塩酸等により加水分解して、脂質を各脂肪酸成分に変換する。
（ａ３）エステル化工程
変換された各脂肪酸成分をエステル化する。
（ａ４）ＧＣ分析工程
エステル化された各脂肪酸成分及びその濃度をガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＣ」ということもある。）により分析する（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
上記した一の方法においては、各脂肪酸の成分及び濃度をＧＣで分析する際に、フリーの脂肪酸をそのまま分析するのではなくて、脂肪酸をエステル化して分析するようにしているので、エステル化された脂肪酸が揮発性を有するようになるため、ＧＣで分析しやすくなるという特徴がある。
なお、上記した一の方法においては、（ａ２）の加水分解工程と（ａ３）のエステル化工程とを一工程の反応で一挙に行うこともできる。
【０００５】
また、他の方法は、図１１（ｂ）に示すように、以下の工程（ｂ１）〜（ｂ４）により行われていた。
（ｂ１）試料準備工程
分析しようとする脂質を準備して分析試料とする。
（ｂ２）加水分解工程
分析試料を塩酸等により加水分解して、脂質を各脂肪酸成分に変換する。
（ｂ３）ラベル化工程
ラベル化剤を用いて、変換された各脂肪酸成分をラベル化する。
（ｂ４）ＨＰＬＣ分析工程
ラベル化された各脂肪酸成分及びその濃度を高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」ということもある。）により分析する。
【０００６】
上記した他の方法においては、各脂肪酸の成分及び濃度をＨＰＬＣで分析する際に、フリーの脂肪酸をそのまま分析するのではなくて、脂肪酸をラベル化して分析するようにしているので、ＨＰＬＣの分離精度及び検出感度が向上するため、脂肪酸の分析精度が向上するという特徴がある。
【０００７】
脂肪酸のラベル化剤としては、２−ニトロフェニルヒドラジド（２−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（２−ＮＰＨ））、臭化ｐ−ブロモフェナシル（ｐ−Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎａｃｙｌ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＰＢＰＢ））、Ｎ−クロロメチル−４−ニトロフタルイミド（Ｎ−Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）、３，５−ジニトロ塩化ベンゾイル（３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＮＢＣ））などが知られれている（例えば、非特許文献２〜非特許文献４参照。）
【０００８】
【非特許文献１】
Ｔ．  Ｒａｃｌｏｔ，  Ｃ．  Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｌａｎｇｉｎ，  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ４２，  ２０４９−２０５７（２００１）
【非特許文献２】
株式会社ワイエムシイ  ２００１／２００２  ＹＭＣ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＣＡＴＡＬＯＧ  ＨＰＬＣ  ＣＯＬＵＭＮ  ＆  ＧＥＬ（８０〜８１頁）
【非特許文献３】
ナカライテスク株式会社  高速液体クロマトグラフカタログ２００１（９０−９１頁）
【非特許文献４】
日本ウォーターズ株式会社  高速液体クロマトグラフィー用カラム・消耗品総合カタログ  ２０００−２００１（１２５頁）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前者の方法を用いて生体中における脂肪酸の成分及び／又はその濃度を分析しようとすると、上記した加水分解工程で脂質以外の成分をも加水分解してしまい分析精度を低下してしまう。このため、加水分解工程の前に、薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」ということもある。）により脂質成分のみを分離しておく必要があった。このＴＬＣによる分離作業は、分析試料を溶媒に溶かした後、時間をかけてＴＬＣにより分離展開し、その後分離された脂質をかきとって脂質のみを抽出することにより行われる。このため、このＴＬＣによる分離作業が煩雑であるという問題点があった。また、脂肪酸がＴＬＣのシリカゲルに付着するため分離後の抽出効率が低いという問題点があった。
また、前者の方法においては、各脂肪酸成分及びその濃度をＧＣにより分析しているため、ＧＣの温度安定化のための時間がかかるうえ分析を比較的高温で行うため分析対象物である脂肪酸が変質し易くなるという問題点があった。
【００１０】
また、後者の方法においても、分析試料をＴＬＣにより分離する必要があるため、前者の方法と同様に、ＴＬＣにおける分離作業が煩雑であり分離後の抽出効率も低いという問題点があった。
また、後者の方法においては、各脂肪酸をラベル化することによってＨＰＬＣの分離精度及び検出感度を向上させているが、ラベル剤を用いて各脂肪酸をラベル化するには、比較的高温（６０〜８０℃）で比較的長い時間（数十分）の反応が必要であり煩雑であるとともに分析試料が変質し易いという問題点があった。また、ラベル化された脂肪酸の安定性が比較的低いため、ラベル化した翌日にＨＰＬＣによる分析を行うことは容易ではない場合があるという問題点があった。
【００１１】
そこで、本発明は、上記の問題を解決し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて分析試料から脂質を分離抽出する必要をなくするとともに、ラベル化反応が容易でラベル化された脂肪酸の安定性も高い脂肪酸の分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ラベル化反応が容易でラベル化された脂肪酸の安定性も高い脂肪酸のラベル化剤を提供することを目的とする
【００１２】
【課題を解決するための手段】
（１）本発明の脂肪酸の分析方法は、リパーゼ又はホスホリパーゼを用いて脂質を脂肪酸に分解する脂質分解工程と、脂肪酸をラベル化剤と反応させるラベル化工程と、ラベル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析するＨＰＬＣ工程とを、この順序で含むことを特徴とする。
【００１３】
このため、本発明の脂肪酸の分析方法によれば、リパーゼ又はホスホリパーゼを用いて脂質のみを脂肪酸に分解することができる。このため、ＴＬＣを用いて分析試料から脂質をあらかじめ分離する必要がなくなる。また、ラベル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度をＨＰＬＣにより分析するため、ＧＣを用いることによる温度安定化のための時間がかかったり脂肪酸が変質し易くなるという問題点もなくなる。
【００１４】
（２）上記（１）に記載の脂肪酸の分析方法においては、以下の一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイル又はその誘導体をラベル化剤として用いて前記ラベル化工程を行うことが好ましい。
【化６】
2004245628.tif 000003
（但し、ＸはＣｌ又はＢｒを示す。）
【００１５】
このような方法とすることにより、比較的低温（室温）かつ比較的短い時間（１分以内）での反応でラベル化を行うことが可能になる。このため、ラベル化反応が簡便になるとともに分析試料が変質し易いという問題点もなくなる。
【００１６】
また、ラベル化された脂肪酸（シンナモイル脂肪酸無水物）は共役エステル構造を有するため、極めて化学的安定性が高く、ラベル化した翌日にＨＰＬＣによる分析を行うことが可能になるなど、脂肪酸の分析をより簡便にすることができる。
【００１７】
また、このシンナモイル脂肪酸無水物は、紫外域において安定して大きな吸収帯を有する（エタノール中２８４ｎｍにおけるモル吸光係数は２４０００）。このため、脂肪酸の検出感度を高くすることができる。また、吸収ピークは２８４ｎｍであり、従来のラベル化剤を用いてラベル化した場合（吸収ピークは２３０〜２５４ｎｍ）と比較して長波長である。このため、他の成分や溶媒による吸収の影響を受けにくく、従来より精度の高い定量分析を行うことが可能になるとともに溶媒選択の自由度が高まる。
【００１８】
なお、本発明において、ハロゲン化シンナモイルの誘導体とは、上記した一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイルにおけるベンゼン環に直接結合した「Ｈ」及び／又はベンゼン環に結合された−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＸ基の「Ｈ」が他の置換基（例えば、アルキル基、アルコキシル基、アシル基、ハロゲン、ニトロ基、他の芳香環など）に置換されている化合物をいう。これらの誘導体であっても、上記したハロゲン化シンナモイルと同様の効果を有する。
【００１９】
（３）本発明の脂肪酸の分析方法は、脂質を脂肪酸に分解する脂質分解工程と、脂肪酸を以下の一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイル又はその誘導体と反応させてシンナモイル化するラベル化工程と、シンナモイル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度を高速液体クロマトグラフィーにより分析するＨＰＬＣ工程とを、この順序で含むことを特徴とする。
【化７】
2004245628.tif 000004
（但し、ＸはＣｌ又はＢｒを示す。）
【００２０】
このため、本発明の脂肪酸の分析方法によれば、従来のように塩酸等を用いて脂質を脂肪酸に分解することとした場合にも、上記（２）に記載した効果が得られる。
【００２１】
（４）上記（２）又は（３）に記載の脂肪酸の分析方法においては、前記ハロゲン化シンナモイルが以下の化学式（２）で示されるシンナモイルクロライドであることが好ましい。
【化８】
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【００２２】
このような方法とすることにより、脂肪酸との反応を非常に速くすることができるため、ラベル化反応をさらに穏和な条件（例えば、低濃度、低温）で行うことが可能になる。また、シンナモイルブロマイドの場合と比較すれば、毒性・刺激性が低く、取り扱いが容易になる。
【００２３】
（５）上記（２）〜（４）のいずれかに記載の脂肪酸の分析方法においては、トリエチルアミンを反応促進剤として用いて前記ラベル化工程を行うことが好ましい。
【００２４】
このような方法とすることにより、脂肪酸とハロゲン化シンナモイルとの反応をさらに速くすることができるため、ラベル化反応をさらに穏和な条件（例えば、低濃度、低温）で行うことが可能になる。また、反応時間が短いため、分析試料の劣化や副産物の産生を抑制できるという効果もある。
【００２５】
（６）本発明の脂肪酸のラベル化剤は、以下の一般式（１）で示されるハロゲン化シンナモイルからなることを特徴とする。
【化９】
2004245628.tif 000006
（但し、ＸはＣｌ又はＢｒを示す。）
【００２６】
このため、本発明の脂肪酸のラベル化剤によれば、比較的低温（室温）かつ比較的短い時間（１分以内）での反応でラベル化を行うことが可能になる。このため、ラベル化反応が簡便になるとともに分析試料が変質し易いという問題点もなくなる。
【００２７】
また、ラベル化された脂肪酸（シンナモイル脂肪酸無水物）は共役エステル構造を有するため、極めて化学的安定性が高く、ラベル化した翌日にＨＰＬＣによる分析を行うことが可能になるなど、脂肪酸の分析をより簡便にすることができる。
【００２８】
また、生成するシンナモイル脂肪酸無水物は、紫外域において安定して大きな吸収帯を有する（エタノール中２８４ｎｍにおけるモル吸光係数は２４０００）ため、脂肪酸の検出感度を高くすることができる。また、吸収ピークは２８４ｎｍであり、従来のラベル化剤を用いた場合（吸収ピークは２３０〜２５４ｎｍ）と比較して長波長である。このため、他の成分や溶媒による吸収の影響を受けにくく、従来より精度の高い定量分析を行うことが可能になるとともに溶媒選択の自由度が高まる。
その結果、本発明に係る脂肪酸のラベル化剤は、特に生体中における脂肪酸の分析に好適なラベル化剤となる。
【００２９】
（７）上記（６）に記載の脂肪酸のラベル化剤においては、前記ハロゲン化シンナモイルが以下の化学式（２）で示されるシンナモイルクロライドであることが好ましい。
【化１０】
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【００３０】
このように構成することにより、脂肪酸との反応を非常に速くすることができるため、ラベル化反応をさらに穏和な条件（例えば、低濃度、低温）で行うことが可能になる。また、シンナモイルブロマイドの場合と比較すれば、毒性・刺激性が低く、取り扱いが容易になる。その結果、脂肪酸分析精度がさらに向上し、特に生体中における脂肪酸の分析にさらに好適なラベル化剤となる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を用いて、本発明の実施の形態を詳しく説明する。
【００３２】
図１は、本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法を説明するための図である。本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法は、図１に示されるように、以下の工程を、この順序で含んでいる。
【００３３】
（Ｅ１）試料準備工程
生体組織（例えば臓器）をホモジナイザーにより微細化して、脂質を含む分析試料とする。
（Ｅ２）脂質分解工程
その後、リパーゼ又はホスホリパーゼを用いて分析試料に含まれる脂質を脂肪酸に分解する。
（Ｅ３）ラベル化工程
その後、脂肪酸を以下の化学式（２）で示されるシンナモイルクロライドと反応させてシンナモイル化することにより、各脂肪酸の成分をそれぞれラベル化する。
【化１１】
2004245628.tif 000008
（Ｅ４）ＨＰＬＣ分析工程
その後、シンナモイル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＤＬ）により分析する。
【００３４】
このため、本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法によれば、リパーゼ又はホスホリパーゼを用いて脂質のみを脂肪酸に分解することができる。このため、ＴＬＣを用いて分析試料から脂質をあらかじめ分離する必要がなくなる。また、ラベル化された脂肪酸の成分及び／又はその濃度をＨＰＬＣにより分析するため、ＧＣを用いることによる温度安定化のための時間がかかったり脂肪酸が変質し易くなるという問題点もない。
【００３５】
また、本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法によれば、比較的低温（室温）かつ比較的短い時間（１分以内）での反応でラベル化を行うことが可能になる。このため、ラベル化反応が簡便になるとともに分析試料が変質し易いという問題点もなくなる。
【００３６】
また、本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法によれば、ラベル化された脂肪酸（シンナモイル脂肪酸無水物）は共役エステル構造を有するため、極めて化学的安定性が高く、ラベル化した翌日にＨＰＬＣによる分析を行うことが可能になるなど、脂肪酸の分析をより簡便にすることができる。
【００３７】
また、本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法によれば、生成されるシンナモイル脂肪酸無水物は紫外域において安定して大きな吸収帯を有する（エタノール中２８４ｎｍにおけるモル吸光係数は２４０００）ため、脂肪酸の検出感度を高くすることができる。また、吸収ピークは２８４ｎｍであり、従来のラベル化剤を用いた場合（吸収ピークは２４０〜２５０ｎｍ）と比較して長波長である。このため、他の成分や溶媒による吸収の影響を受けにくく、従来より精度の高い定量分析を行うことが可能になるとともに溶媒選択の自由度が高まる。
【００３８】
なお、実施の形態における分析方法を創作するにあたっては、以下の実験例１〜実験例３の結果を参考にした。
【００３９】
（実験例１）
実験例１は、シンナモイルクロライドを脂肪酸のラベル化剤として好適に用いることができるかどうかに関する実験例である。
まず、脂肪酸として、リノール酸を１ｍｍｏｌ準備する。このリノール酸にラベル化剤としてのシンナモイルクロライド３ｍｍｏｌ及び反応促進剤としてのトリエチルアミン２ｍｍｏｌを加え、ジクロロメタン１ｍｌ中で反応させる。
【００４０】
その後、反応生成物をＴＬＣにより分離・展開する。ＴＬＣプレートとしては和光純薬株式会社製のシリカゲル７０Ｆ２５４を用い、展開溶媒としては、ヘキサンとジクロロメタンの混合溶媒（容積比で３：７のもの）を用いた。
【００４１】
図２は、展開された後のＴＬＣプレ−トの様子を示す図である。図２に示されるように、脂肪酸としてのリノール酸とシンナモイルクロライドとの反応生成物のスポットが、リノール酸ともシンナモイルクロライドとも異なる位置に分離展開されることが、紫外線照射やよう素蒸気環境下に置くこと等の方法により確認された。
【００４２】
その後、反応生成物のスポットをかきとり、ジクロロメタンで抽出する。その後、シリカゲルをろ過により取り除き、シクロロメタンを蒸発により除去する。以上により、シンナモイル脂肪酸無水物が得られた。
【００４３】
図３は、得られた反応生成物（リノール酸シンナモイルエステル）のエタノール中における紫外吸収スペクトルを示す図である。図３に示すように、この反応生成物（リノール酸シンナモイルエステル）は、紫外域に大きな吸収帯（エタノール中２８４ｎｍにおけるモル吸光係数は２４０００）を有することが確認された。また、吸収ピークも２８４ｎｍであり、従来のラベル化剤を用いてラベル化した場合（吸収ピークは２３０〜２５４ｎｍ）と比較して長波長である。このため、他の成分や溶媒による吸収の影響を受けにくく、従来より精度の高い定量分析を行うことを可能にするとともに溶媒選択の自由度を高くすることができ、シンナモイルクロライドが脂肪酸のラベル化剤として好適に使用できることが確認できた。
【００４４】
（実験例２）
実験例２は、シンナモイルクロライドによりラベル化された脂肪酸がＨＰＬＣで分離精度よく分離されるかどうかに関する実験例である。
まず、脂肪酸として、リノレン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸を含有する脂肪酸を１００μｍｏｌ準備する。この脂肪酸にラベル化剤としてのシンナモイルクロライド２ｍｍｏｌ及び反応促進剤としてのトリエチルアミンン１．４ｍｍｏｌを加えて反応させる。
【００４５】
その後、得られた反応生成物の成分及び濃度をＨＰＬＣにより分析する。ＨＰＬＣカラムとしてはナカライテスク株式会社製のＣ１８−ＯＤＳ（４．６×１５０ｍｍ）を用い、移動相としてはメタノール及び酢酸の混合溶媒（容量比で９３：７のもの）を用いた。カラム温度は４０℃、流量は１ｍｌ／分である。検出波長は２８４ｎｍとした。
【００４６】
図４は、実験例２の検出結果を示す図である。横軸は時間、縦軸は吸光度である。図４に示されるように、実験例２においては、脂肪酸としてのリノレン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸を十分に分離された形で検出することができることが確認された。また、従来の脂肪酸の分析方法の場合と比較して、より低温（４０℃）、より低流量（１ｍｌ／分）、しかも１５０ｍｍのカラム長を有する一般のカラム（ナカライテスク株式会社製のＣ１８−ＯＤＳ）を用いて上記結果を得ることができ、高い分離精度を有することが確認できた。
【００４７】
図５は、実験例２における各脂肪酸成分の濃度と吸光度の検量線を示す図である。横軸は各成分の濃度、縦軸はピーク面積である。また、図５に示されるように、実験例２においては、脂肪酸の各成分とも、その濃度とピーク面積との間に良好な比例関係があることが確認され、精度のよい定量分析が可能であることが確認された。
【００４８】
（実験例３）
実験例３は、脂質を分解するのにリパーゼがどのくらい必要か、反応時間はどのくらい必要かに関する実験例である。
まず、１５％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩液（ＢＳＡ／ＰＢＳ（−）溶液）をＰＨ７．４、７０℃で２時間加温する。その後、上記１５％のＢＳＡ／ＰＢＳ（−）溶液及び種々の濃度のリパーゼ溶液をそれぞれ３７℃に加温する。その後、脂質としてトリアシルグリセロール（トリオレイン）が２ｍｇ入った試験管に上記した１５％のＢＳＡ／ＰＢＳ（−）溶液０．３ｍｌ及びリパーゼ溶液０．２ｍｌを加え、３７℃に加温する。
【００４９】
図６は、そのときの反応を説明するための図である。図６に示されるように、脂質としてのトリアシルグリセロール（トリオレイン）は、リパーゼによりエステル結合が開裂して脂肪酸（オレイン酸）に分解される。脂質がリン脂質である場合には、図７に示されるように、脂質は、ホスホリパーゼ（例えば、ホスホリパーゼＢ）によりエステル結合が開裂して、対応する各脂肪酸に分解されることになる。
【００５０】
上記反応終了後、クロロホルム及びメタノールの混合溶媒（容量比で２：１のもの）１．５ｍｌを加え、ボルテックス振盪器で１分間振盪させる。その後、３５００ｒｐｍ、１０℃の条件で、５分間遠心分離を行う。その後、クロロホルム層を目盛り付き試験管に分取する。その後、真空乾燥機でクロロホルムを留去する。これにより、脂質としてのトリアシルグリセロール（トレオレイン）の構成成分である脂肪酸（オレイン酸）が得られる。
【００５１】
その後、得られた試料をジクロロメタンで５ｍｌに定容する。その後、この試料をシンナモイルクロライドと反応させる。これにより、シンナモイル脂肪酸無水物（シンナモイルオレイン酸無水物）が得られる。図８は、脂肪酸（オレイン酸）とシンナモイルクロライドとの反応式を示す図である。図８に示されるように、脂肪酸（オレイン酸）は、シンナモイルクロライドと反応してシンナモイル脂肪酸無水物（シンナモイルオレイン酸無水物）となる。その後、このシンナモイル脂肪酸無水物（シンナモイルオレイン酸無水物）の濃度をＨＰＬＣにより分析する。
【００５２】
図９は、反応時間とオレイン酸の生成量との関係を示す図である。図９に示されるように、トリアシルグリセロール９．５ｍｇに対してリパーゼを５３ｕｎｉｔ以上添加した場合（Ｃ，Ｄ）には、２０分程度で十分な量のオレイン酸が生成することが確認された。
【００５３】
図１０は、反応時間とオレイン酸の回収率との関係を示す図である。図１０に示されるように、トリアシルグリセロール９．５ｍｇに対してリパーゼを５３ｕｎｉｔ以上添加した場合（Ｃ，Ｄ）及びトリアシルグリセロール１．９ｍｇに対してリパーゼを５３ｕｎｉｔ添加した場合（Ｂ）には、２０分程度で十分な回収率（１０％以上）が得られることが確認された。
【００５４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の脂肪酸の分析方法によれば、リパーゼ又はホスホリパーゼを用いて脂質のみを脂肪酸に分解することができるため、ＴＬＣを用いて分析試料から脂質をあらかじめ分離する必要がなくなる。
また、本発明の脂肪酸の分析方法によれば、比較的低温（室温）かつ比較的短い時間（１分以内）での反応でラベル化を行うことが可能になる。このため、ラベル化反応が簡便になるとともに分析試料が変質し易いという問題点もなくなる。
また、本発明の脂肪酸の分析方法によれば、ラベル化された脂肪酸（シンナモイル脂肪酸無水物）は共役エステル構造を有するため、極めて化学的安定性が高く、ラベル化した翌日にＨＰＬＣによる分析を行うことが可能になるなど、脂肪酸の分析をより簡便にすることができる。
また、本発明の脂肪酸の分析方法によれば、生成するシンナモイル脂肪酸無水物は紫外域において安定して大きな吸収帯を有する（エタノール中２８４ｎｍにおけるモル吸光係数は２４０００）ため、脂肪酸の検出感度を高くすることができる。また、吸収ピークは２８４ｎｍであり、従来のラベル化剤を用いてラベル化した場合（吸収ピークは２４０〜２５０ｎｍ）と比較して長波長である。このため、他の成分や溶媒による吸収の影響を受けにくく、従来より精度の高い定量分析を行うことが可能になるとともに溶媒選択の自由度が高まる。
その結果、本発明の脂肪酸の分析方法は、特に生体中における脂肪酸の分析に好適な脂肪酸の分析方法となる。
【００５５】
本発明の脂肪酸のラベル化剤によれば、比較的低温（室温）かつ比較的短い時間（１分以内）での反応でラベル化を行うことが可能になる。このため、ラベル化反応が簡便になるとともに分析試料が変質し易いという問題点もなくなる。
また、本発明の脂肪酸のラベル化剤によれば、ラベル化された脂肪酸（シンナモイル脂肪酸無水物）は共役エステル構造を有するため、極めて化学的安定性が高く、ラベル化した翌日にＨＰＬＣによる分析を行うことが可能になるなど、脂肪酸の分析をより簡便にすることができる。
また、本発明の脂肪酸のラベル化剤によれば、生成するシンナモイル脂肪酸無水物は紫外域において安定して大きな吸収帯を有する（エタノール中２８４ｎｍにおけるモル吸光係数は２４０００）ため、脂肪酸の検出感度を高くすることができる。また、吸収ピークは２８４ｎｍであり、従来のラベル化剤（吸収ピークは２４０〜２５０ｎｍ）と比較して長波長である。このため、いわゆる他の成分や溶媒による吸収の影響を受けにくく、従来より精度の高い定量分析を行うことが可能になるとともに溶媒選択の自由度が高まる。
その結果、本発明の脂肪酸のラベル化剤は、特に生体中における脂肪酸の分析に好適なラベル化剤となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る脂肪酸の分析方法を説明するための図である。
【図２】展開された後のＴＬＣプレ−トの様子を示す図である。
【図３】得られた反応生成物の紫外吸収スペクトルを示す図である。
【図４】実験例２の検出結果を示す図である。
【図５】実験例２で得られた各脂肪酸成分における検量線を示す図である。
【図６】脂質がリパーゼにより分解される反応を説明するための図である。
【図７】リン脂質がホスホリパーゼＢにより分解される反応を説明するための図である。
【図８】脂肪酸がシンナモイルクロライドと反応してシンナモイル脂肪酸無水物が生成する反応式を示す図である。
【図９】反応時間とオレイン酸の生成量との関係を示す図である。
【図１０】反応時間とオレイン酸の回収率との関係を示す図である。
【図１１】従来の脂肪酸の分析方法を説明するための図である。
【符号の説明】
Ａ  トリアシルグリセロール９．５ｍｇにリパーゼを加えなかった場合
Ｂ  トリアシルグリセロール１．９ｍｇにリパーゼ５３ｕｎｉｔを加えた場合
Ｃ  トリアシルグリセロール９．５ｍｇにリパーゼ５３ｕｎｉｔを加えた場合
Ｄ  トリアシルグリセロール９．５ｍｇにリパーゼ５３０ｕｎｉｔを加えた場合
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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