(57)【要約】【課題】簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物等を提供する。【解決手段】以下の一般式（１）で表される化合物等。【化１】2004166522.tif 000028（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）【選択図】  図７
2004166522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（１）で表される化合物。
【化１】
2004166522.tif 000022
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）
【請求項２】
以下の一般式（２）で表される化合物。
【化２】
2004166522.tif 000023
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）
【請求項３】
以下の一般式（３）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【化３】
2004166522.tif 000024
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。ｎは０、１、２又は３を示す。）
【請求項４】
以下の一般式（４）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【化４】
2004166522.tif 000025
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。ｎは０、１、２又は３を示す。）
【請求項５】
ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
【化５】
2004166522.tif 000026
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
【請求項６】
ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（６）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
【化６】
2004166522.tif 000027
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
【請求項７】
プローブとして用いるための請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体。
【請求項８】
基体上に１又は複数の請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたＤＮＡチップ。
【請求項９】
請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程と
を含む標的核酸中のヌクレオチドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基配列中の特定部位の塩基の種類の決定に用いられるポリヌクレオチド誘導体、その中間体であるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物、並びに、その利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ハイブリダイゼーションを利用した核酸塩基決定は、プローブとしてのポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを、蛍光ラベルされた標的核酸とハイブリダイズさせ、その融解温度を測定することにより行っている。詳述すれば、プローブの所定位置の塩基が標的核酸の対応塩基と塩基対を形成する場合としない場合とで、２本鎖の融解温度が若干異なることを利用して、塩基の同定を行っている。
【０００３】
しかし、この場合は、対合する塩基が塩基対を形成する場合としない場合との融解温度の差ができるだけ大きくなるような条件設定を、個々の標的核酸ごとに行う必要がある。また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ易い。さらに、標的核酸のラベル量を少なくせざるを得ない場合や、長時間の操作により蛍光が退色する場合には、検出誤差が大きくなる。
【０００４】
なお、標的核酸配列を検出するために蛍光ラベルしたプローブを用いることも提案されている（例えば特許文献１、２、３及び４）。しかし、これらの蛍光プローブは、標的核酸と塩基対を形成することにより標的核酸を標識するものにすぎず、標的核酸中の特定塩基を同定することはできない。
【０００５】
【特許文献１】
特公平３−７１４３７号公報（第４欄一般式（Ｉ）、第５欄第５−９行）
【０００６】
【特許文献２】
特表平９−５０５５５６号公報（請求項１、第１５頁第１１−１９行）
【０００７】
【特許文献３】
特開平６−１３５９９１号公報（請求項１、段落０００４、段落０００５）
【０００８】
【特許文献４】
特開昭６２−０５９２９３号公報（請求項１、第２頁右下欄第５−８行）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物、ＤＮＡチップ、並びに、標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供することを主目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、以下の知見を見出した。
▲１▼  １又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）又は一般式（６）で表されるヌヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体は蛍光を発する。このポリヌクレオチド誘導体をプローブとして用いて標的核酸とのハイブリダイゼーションを行うと、相補鎖中の当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドの種類によって蛍光が増大したり、消光したり、蛍光
発光波長がシフトしたりする。
【００１１】
【化７】
2004166522.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
【００１３】
【化８】
2004166522.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
▲２▼  例えば、上記一般式（５）において、Ｒ１がアミノ基であり、Ｒ２〜Ｒ８が水素原子であるポリヌクレオチド誘導体（ナフトデアザアデニン（ＮＤＡ）含有ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体）の場合には、  （ＮＤＡ）含有ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体と対合する相補鎖中のヌクレオチドがアデニル酸である場合には、２本鎖形成前の蛍光を維持するが、その他のチミジル酸、グアニル酸又はシチジル酸の場合には、蛍光が消光する。
▲３▼  また例えば、一般式（６）において、Ｒ１１がメトキシ基であり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２及びＲ１３が水素原子であるポリヌクレオチド誘導体（メトキシベンゾデアザイノシン（ＭＤＩ）含有ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体）の場合には、  （ＭＤＩ）含有ポリデオキシリボヌクレオチド誘導体と対合する相補鎖中のヌクレオチドがチミジル酸である場合には、蛍光極大波長が短波長側にシフトするとともに蛍光強度が大幅に増大する。一方、対合するヌクレオチドがアデニル酸又はグアニル酸である場合には、蛍光極大波長が短波長側にシフトするとともに蛍光強度が若干増大する。さらに、対合するヌクレオチドがチミジル酸である場合には、蛍光極大波長が短波長側にシフトするとともに、一本鎖の場合の蛍光強度が維持される。
▲４▼  従って、標的核酸に相補的なポリヌクレオチドの所定位置のヌクレオチドに代えてこれらのヌクレオチド誘導体を導入したものをプローブとして用いることにより、標的核酸の所定位置の塩基を簡単かつ正確に同定できる。
【００１５】
本発明は、前記知見に基づき完成されたものであり、以下の化合物、ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体、ポリヌクレオチド誘導体、ＤＮＡチップ及び標的核酸中のヌクレオチドの同定方法を提供する。
【００１６】
項１．  以下の一般式（１）で表される化合物。
【００１７】
【化９】
2004166522.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）
項２．  以下の一般式（２）で表される化合物。
【００１９】
【化１０】
2004166522.tif 000006
【００２０】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）
項３．  以下の一般式（３）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【００２１】
【化１１】
2004166522.tif 000007
【００２２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。ｎは０、１、２又は３を示す。）
項４．  以下の一般式（４）で表されるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体。
【００２３】
【化１２】
2004166522.tif 000008
【００２４】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。ｎは０、１、２又は３を示す。）
項５．  ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
【００２５】
【化１３】
2004166522.tif 000009
【００２６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
項６．  ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（６）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体。
【００２７】
【化１４】
2004166522.tif 000010
【００２８】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
項７．  プローブとして用いるための項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体。
【００２９】
項８．  基体上に１又は複数の項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたＤＮＡチップ。
【００３０】
項９．  項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程と
を含む標的核酸中のヌクレオチドの同定方法。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の化合物
＜塩基化合物＞
本発明の第１の化合物は、文献未記載の新規化合物であり、以下の一般式（１）で表される。
【００３２】
【化１５】
2004166522.tif 000011
【００３３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）
また本発明の第２の化合物は、文献未記載の新規化合物であり、以下の一般式（２）で表される。
【００３４】
【化１６】
2004166522.tif 000012
【００３５】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。）本明細書において、低級アルキル基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基及び低級アルキルチオ基の低級アルキルとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等の炭素数１〜４個程度の直鎖又は分岐状のアルキルが挙げられる。
【００３６】
また、低級アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基等の炭素数１〜４個程度の直鎖又は分岐状のアルコキシ基が挙げられる。
【００３７】
アシルオキシ基としては、以下の一般式（７）において、Ｒが例えば上記低級アルキル基、置換基を有していてよいフェニル基、ハロゲン原子等である置換基が挙げられる。
【００３８】
【化１７】
2004166522.tif 000013
【００３９】
また、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４０】
また、フェニル基は、例えばアミノ基、モノ−（低級アルキル）アミノ基、ジ−（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基等の置換基を有していてもよい。
【００４１】
本明細書において、Ｒ１〜Ｒ１３が水酸基である場合には、互変異性によりオキソ基になる場合もある。
【００４２】
一般式（１）の化合物において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８の好適な組み合わせとしては、例えばＲ１がアミノ基であり、Ｒ２〜Ｒ８が水素原子である組み合わせ（ナフトデアザアデニン（ＮＤＡ））が挙げられる。
【００４３】
また、一般式（２）の化合物において、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３の好適な組み合わせとしては、Ｒ１１がメトキシ基であり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２及びＲ１３が水素原子である組み合わせ（メトキシベンゾデアザイノシン（ＭＤＩ））；  Ｒ１０及びＲ１１が結合してベンゾ環を形成し、Ｒ９、Ｒ１２及びＲ１３が水素原子である組み合わせ（ナフトデアザイノシン（ＮＤＩ））；  Ｒ９〜Ｒ１３が水素原子である組み合わせ（ベンゾデアザイノシン（ＢＤＩ））等が挙げられる。特にＭＤＩが好ましい。
＜ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体＞
本発明の第１のヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、文献未記載の新規化合物であって、以下の一般式（３）で表される化合物である。
【００４４】
【化１８】
2004166522.tif 000014
【００４５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。ｎは０、１、２又は３を示す。）
本発明の第２のヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、文献未記載の新規化合物であって、以下の一般式（４）で表される化合物である。
【００４６】
【化１９】
2004166522.tif 000015
【００４７】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。ｎは０、１、２又は３を示す。）
Ｒ１〜Ｒ１３については前述した通りである。
【００４８】
Ｒ１４が水素原子である場合には、上記化合物はデオキシリボヌクレオシド又はデオキシリボヌクレオチド誘導体であり、Ｒ１４が水酸基である場合には、上記化合物はリボヌクレオシド又はリボヌクレオチド誘導体である。
【００４９】
また、ｎが０である場合すなわちリン酸基が存在しない場合には、上記化合物はヌクレオシド誘導体であり、ｎが１、２又は３である場合には、上記化合物はヌクレオチド誘導体である。
＜ポリヌクレオチド誘導体＞
本発明の第１のポリヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（５）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体である。
【００５０】
【化２０】
2004166522.tif 000016
【００５１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８が同時に水素原子であることはない。Ｒ３とＲ４、Ｒ５とＲ６、Ｒ７とＲ８とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
本発明の第２のポリヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチドにおいて、１又は２以上のヌクレオチドが以下の一般式（６）で表されるヌクレオチド誘導体で置換されているポリヌクレオチド誘導体である。
【００５２】
【化２１】
2004166522.tif 000017
【００５３】
（式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は同一又は互いに異なって、水素原子、アミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を表し、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３が同時に水素原子であることはない。Ｒ１０とＲ１１、Ｒ１２とＲ１３とが結合して置換基を有していてよいフェニル基を形成していてもよい。Ｒ１４は水素原子又は水酸基を表す。）
Ｒ１〜Ｒ１４については前述した通りである。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ＤＮＡであってもよくＲＮＡであってもよい。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド誘導体のヌクレオチド数は特に限定されないが、例えば、最大１００個程度、好ましくは最大５０個程度、より好ましくは最大３０個程度、さらにより好ましくは最大２０個程度のヌクレオチドからなるものが挙げられる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドにはオリゴヌクレオチドも含まれる。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、全体のヌクレオチド数により異なるが、上記本発明のヌクレオチド誘導体を２０個程度まで有していてよい。より好ましくは５個程度までである。上記本発明のヌクレオチド誘導体が余りに多いと、塩基間相互作用により蛍光波長が移動してしまう可能性がある。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。
化合物の製造方法
＜塩基化合物＞
本発明の上記一般式（１）で表される化合物は、例えば以下の方法で合成できる。先ず、炭素原子１位から、水酸基、ニトロ基、Ｒ８、Ｒ７、Ｒ６、Ｒ５、Ｒ４、Ｒ３を置換基としてこの順に有するナフタレンを適当な溶媒に溶解させた溶液にｐ−トルエンスルフォニルクロリドを添加する。炭素原子１位に、置換基として、水酸基に代えてハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）を有している場合は、ｐ−トルエンスルフォニルクロリドによる処理を必要とせず、次のエチルシアノアセテート及びｔｅｒｔ−カリウムブトキシド添加のステップに直接進むことができる。
【００５７】
次いで、適当な溶媒中にエチルシアノアセテート及びｔｅｒｔ−カリウムブトキシドを添加する。次いで、酸性条件下で亜鉛粉末を添加する。次いで、ナトリウムメトキシド及びフォルムアミドを添加、加熱する。さらに、ＰＯＣｌ３及びｐ−ジオキサンを添加する。これにより、一般式（１）において、Ｒ１がハロゲン原子であり、Ｒ２が水素原子であり、任意のＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８を有する化合物が得られる。
【００５８】
上記操作において、フォルムアミドに代えて、低級カルボン酸アミド、尿素または低級アルキル尿素を用いることにより、Ｒ２として低級アルキル基、アミノ基、低級アルキル置換アミノ基を導入できる。また、Ｒ２がアミノ基である化合物に亜硝酸塩添加後、低級アルキルアミンやハロゲン化剤などの求核性試薬を添加することにより、アルキルアミノ基やハロゲン原子などを導入できる。
【００５９】
次いで、ＲＯ−、ＲＳ−、ＲＨＮ−、（Ｒ）２Ｎ−、Ｈ２Ｎ−（いずれもＲは低級アルキル基）等の求核性試薬を添加することにより、Ｒ１としてアミノ基、モノ（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、水酸基、アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、アシルオキシ基、ハロゲン原子、シアノ基、チオール基又は置換基を有していてよいフェニル基を導入することができる。
＜ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体＞
本発明のヌクレオシド誘導体は、例えば以下の方法で合成できる。先ず、２−デオキシ−Ｄ−リボースの１位水酸基をＯ−メチル化して１−メチルグリコシドを得る。次いで、適当な溶媒中でｐ−トルオイルクロリドを添加することにより３位炭素及び５位炭素の水酸基をトルオイル基等で置換する。次いで、塩酸を添加することにより、１位炭素に脱離基としての塩素原子を導入する。
【００６０】
得られた化合物と、別途合成した塩基化合物とを常法により反応させることにより本発明のヌクレオシド誘導体が得られる。
【００６１】
ヌクレオチド誘導体は当該ヌクレオシド誘導体から常法により得ることができる。すなわち、ＰＯＣｌ３及びリン酸トリメチルを添加することにより、ヌクレオチド（ｎ＝１）が得られる。さらに、ピロリン酸トリブチルアンモニウム塩を添加することにより、三リン酸体が得られる。
＜ポリヌクレオチド誘導体＞
本発明のポリヌクレオチド誘導体は、例えば核酸自動合成機を用いたフォスフォロアミダイト法による化学合成方法において、特定ヌクレオシドに代えて本発明のヌクレオシド誘導体を用いることにより合成できる。
用途
本発明の（塩基）化合物、及び、ヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は、ポリヌクレオチド誘導体の合成に供することができる。
【００６２】
本発明の化合物及びヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体は蛍光を発するところ、これを含む本発明のポリヌクレオチド誘導体は、標的核酸とハイブリダイズさせると、１本鎖の場合に比べて、対合するヌクレオチドの種類によって蛍光の発光強度が増大したり、低減したり、発光波長がシフトしたりする。
【００６３】
例えば、一般式（５）において、Ｒ１がアミノ基であり、Ｒ２〜Ｒ８が水素原子であり、Ｒ１４が水素原子である場合（ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体）には、ＮＤＡ含有ヌクレオチド誘導体に対合するヌクレオチドがシチジル酸である場合には１本鎖の場合と同様の蛍光強度を示すが、アデニル酸、チミジル酸又はグアニル酸である場合には蛍光が消光する。本発明のポリヌクレオチド誘導体は、この現象を利用して以下の用途に使用できる。
ｉ）  標的核酸と相補的なポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして用いることにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。同様の方法で１塩基多型の検出に利用できる。
ｉｉ）    ＤＮＡチップにおいて、ポリヌクレオチドに代えて基板上に固定ないしは吸着させることにより、特定核酸配列を有するか否かを確認できる。特に、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を決定できる。
ｉｉｉ）  アンチセンスポリヌクレオチドに代えて使用する場合には、通常のポリヌクレオチドとは異なるために、核酸分解酵素（例えば制限酵素）や核酸結合タンパク質（例えば転写因子）等の標的核酸への結合を阻害できる。このことから、これらの作用を利用した実験用試薬として利用できる。
ｉｖ）    それ自体蛍光を発するため、核酸の蛍光ラベルに使用できる。
ｖ）  ＤＮＡ複製において、複製されるＤＮＡと相補的なプローブとして使用すること  によりＤＮＡ複製のリアルタイム検出ができる。同様に、ＲＮＡへの転写において  、転写されるＲＮＡと相補的なプローブとして使用することによりＲＮＡ転写のリ  アルタイム検出ができる。
ｖｉ）    相補的配列とハイブリダイズすることにより蛍光波長のシフトが起こるようなポリヌクレオチド誘導体である場合は、蛍光波長のシフトにより当該ポリヌクレオチド誘導体の酸化還元電位が変化する。このため、電極上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を固定しておき、被験ポリヌクレオチドをこの電極に作用させて酸化還元電位を測定する方法で、核酸配列応答性のバイオセンサーとして利用できる。
ｖｉｉ）  本発明のポリヌクレオチドは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に供される蛍光性プローブとして利用できる。
プローブ
前述したように、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、プローブとして使用して試料中に含まれる標的核酸の特定位置の塩基の種類を決定できる。
【００６４】
プローブとして使用する場合は、試料の種類によって異なるが、ヌクレオチド数は例えば４〜１００個程度、好ましくは１０〜３０個程度とすることができる。
【００６５】
試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートＤＮＡ又はＲＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡ又はＲＮＡ等の修飾核酸であってもよい。
【００６６】
ハイブリダイズに際しては、標的核酸を含む試料に対して本発明のポリヌクレオチド誘導体を１ｎＭ〜１ｍＭ程度、特に１μＭ〜５０μＭ程度添加することが好ましい。また、ハイブリダイズ条件はポリヌクレオチドの長さによっても異なるが、例えば０〜６０℃程度、特に１５〜４０℃程度の温度で、例えば５〜６０分間程度、特に５〜１０分間程度行うことができる。また、ハイブリダイズさせる試料は、例えばｐＨ５．５〜８．０程度、特にｐＨ  ６．５〜８．０程度に調整すればよい。
【００６７】
また、試料から抽出及び精製された標的核酸と本発明のポリヌクレオチド誘導体とをハイブリダイズさせる場合には、ポリヌクレオチドの長さによって異なるが、例えば室温（２５℃程度）〜５０℃程度、１０〜４８時間程度、２〜６×ＳＳＣ程度の条件とすることができる。さらに、同程度の濃度のＳＳＣ溶液で３〜５回程度洗浄すればよい。
ＤＮＡチップ
本発明のＤＮＡチップ（又はＤＮＡアレイ）は、基体上に本発明のポリヌクレオチド誘導体が固定又は吸着されたものである。固定には共有結合などによる結合も含まれる。
【００６８】
基体上へのＤＮＡのスポット径は特に限定されないが、例えば５０〜２００μｍ程度とすることができる。またスポットピッチは特に限定されないが、例えば１００〜５００μｍ程度とすることができる。
【００６９】
基体の材料は特に限定されず、例えばガラス、シリカ、金等を用いることができる。また、基体の形状は、板状（基板状）、ビーズ状等のどのような形状のものであってもよい。
【００７０】
基体上に本発明のポリヌクレオチド誘導体を結合する場合には、本発明のポリヌクレオチド誘導体の一端を、例えば金属−硫黄結合などの方法を使用して、基体に結合させることができる。
【００７１】
ＤＮＡチップに固定等される本発明のポリヌクレオチド誘導体のヌクレオチド数は、試料の種類によって異なるが、例えば１０〜２００個程度、好ましくは５０〜１００個程度とすることができる。
【００７２】
試料が細胞抽出液等のヌクレアーゼを含むものである場合には、本発明のポリヌクレオチド誘導体は、ヌクレアーゼにより切断され難いように、ホスホロチオエートＤＮＡ又はＲＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡ又はＲＮＡ等の修飾核酸であってもよい。
【００７３】
ハイブリダイズに際しては、基体に固定された本発明のポリヌクレオチド誘導体に対して、試料を例えば０．１μＭ〜１００μＭ程度、特に１μＭ〜１０μＭ程度添加することができる。また、ハイブリダイズ条件はポリヌクレオチド誘導体の種類によって異なるが、例えば０〜６０℃程度、特に２０〜４０℃程度の温度で、例えば１〜３０分間程度、特に１〜５分間程度とすることができる。また、ハイブリダイズさせる試料は例えばｐＨ５．５〜８．０程度、特にｐＨ  ６．５〜８．０程度に調整しておくことが好ましい。
【００７４】
ハイブリダイズ後は、チップの種類に適した洗浄液で２〜５回程度洗浄すればよい。
【００７５】
また、試料から抽出及び精製された標的核酸を用いる場合には、標的核酸を例えば２〜６×ＳＳＣ程度のハイブリダイズ溶液に溶解させたものを本発明のＤＮＡチップに作用させるのが好ましい。温度、時間、洗浄条件については、未精製の標的核酸を用いる場合と同様である。
本発明のヌクレオチドの同定方法
本発明のヌクレオチドの同定方法は、上記説明した本発明のポリヌクレオチド誘導体を試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる工程と；
ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトルを測定する工程と；
この蛍光スペクトルをハイブリダイズ前の本発明のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトルと比較することにより、標的核酸の特定位置のヌクレオチドの種類を同定する工程とを含む方法である。
【００７６】
試料は、核酸を含むものであればよく、細胞抽出液、血液のような体液、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【００７７】
ハイブリダイズ条件は、プローブ又はＤＮＡチップについて説明した通りである。
【００７８】
蛍光スペクトルは、常法に従い、照射波長２５０〜６００ｎｍ程度で測定すればよい。ハイブリダイズ前のポリヌクレオチド誘導体の蛍光スペクトル測定と、ハイブリダイズ産物の蛍光スペクトル測定とは、同じ媒体に溶解又は懸濁させた状態で行うことが好ましい。通常はハイブリダイゼーション溶液に溶解又は懸濁させた状態で測定すればよい。
【００７９】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるポリヌクレオチド誘導体、その中間体として使用できるヌクレオシド又はヌクレオチド誘導体及び塩基化合物が提供される。
【００８０】
また、本発明によれば、簡便かつ正確に核酸塩基の同定を行えるＤＮＡチップ及び簡便かつ正確に標的核酸中の特定塩基の同定を行える方法が提供される。
【００８１】
さらにいえば、本発明のヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチド誘導体は、標的核酸とハイブリダイズさせると、標的核酸における当該ヌクレオチド誘導体と対合するヌクレオチドの種類によって、蛍光強度が増大したり、消光したり、発光波長特に極大波長がシフトしたりする。
【００８２】
従来は、プローブと標的核酸との特定位置における塩基対形成の有無により、プローブと標的核酸とにより形成される２本鎖の融解温度が若干異なることに基づいて塩基の同定を行っていたため、検出可能な程度に融解温度差を大きくするために、個々の標的核酸ごとにハイブリダイズ条件設定を行う必要があった。これに対して本発明では、蛍光の増大、低減、波長のシフト等により塩基の同定を行うため、このような手間のかかるハイブリダイズ条件設定が不要である。
【００８３】
また、２本鎖の融解によらないため、融解が生じ難いような長いポリヌクレオチド誘導体とすることもできる。
【００８４】
また、塩基間の非特異的な吸着や塩基対形成の不安定性などによる検出エラーが生じ難い。
【００８５】
また、対合するヌクレオチドにより蛍光発光の波長がシフトする場合には、特定ヌクレオチドと対合した場合の蛍光波長に合わせたフィルター（特定の数十ｎｍの波長の光だけを透過するフィルターであり、市販されている）を使用してこのフィルターに蛍光を通すことにより、特定波長の蛍光だけを検出することができ、対合ヌクレオチドの検出感度が増大する。
【００８６】
また、他の長波長蛍光色素を反応系中に添加することにより、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）を利用して検出感度を向上させたり、目で見える色の蛍光に変化させることができる。
【００８７】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１（ＮＤＡ含有ヌクレオシド誘導体の合成）
図１を参照して本発明の１実施態様であるデオキシリボヌクレオシド誘導体の合成方法を説明する。
＜糖部分の調製＞
２−デオキシ−Ｄ−リボース（３．０ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）を０．１％メタノール／ＨＣｌ（６０ｍｌ）中に溶解させ、２０分間撹拌することによりメチルグリコシドを得た。炭酸銀（０．８８ｇ、３．１９ｍｌ）を添加して溶液を中性に調整し、濾過し濃縮して、シロップを得た。残存するメタノールをピリジンとともに２回留去させることにより除去した。残存物を無水ピリジン中に溶解し、０℃で冷却し、ｐ−トルオイルクロリド（７．５０ｇ、４８．５ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下完了後、混合物を５０℃で２時間加熱し、室温で終夜撹拌した。水（１００ｍｌ）を添加し、混合物をエーテル（２００ｍｌ）を用いて抽出した。エーテル相を水、希塩酸（５％）及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、留去により粘稠なシロップを得た。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１０）により白色粉末として純粋な１α／β−Ｏ−メチル−２−デオキシ−Ｄ−リボフラノシルビス（ｐ−トルエート）を得た（図１化合物（ａ））。
【００８８】
化合物（ａ）（１１．８ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）の溶液に酢酸中の１Ｍ塩酸溶液（１１０ｍｌ）を添加した。室温下で、この溶液にガス状ＨＣｌを通し、約１０分後に溶液中に塩化物が結晶化した。白色結晶を濾過により集め、ヘキサンで洗浄し、真空デシケーター中で水酸化カリウム上で乾燥させ、９．０ｇの純粋な１α−クロロ−２−デオキシ−Ｄ−リボフラノシルビス（ｐ−トルエート）を得た（図１化合物（ｂ））。
＜核酸塩基誘導体部分の導入＞
次に、図２を参照して、糖への核酸塩基誘導体の導入を説明する。２−ニトロ−１−ナフトール（９５％、１０．０ｇ、５０．１ｍｍｏｌ）をピリジン（１５０ｍｌ）に溶解させ、ｐ−トルエンスルフォニルクロリド（１２．０ｇ、６２．９ｍｍｏｌ）を０℃において加えた。混合物を室温下６時間撹拌した。得られた混合物を減圧により濃縮した。粗生成物をクロロフォルムを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、橙色の固形物として、２−ニトロナフチルｐ−トルエンスルフォネート（図２化合物（ｃ））を得た。
【００８９】
次いで、無水ＴＨＦ（１７０ｍｌ）中にエチルシアノアセテート（４．６２ｍｌ、４２．６ｍｍｏｌ）を溶解させ氷冷した溶液に、ｔｅｒｔ−カリウムブトキシド（４．７８ｇ、４２．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた白色の懸濁液を１５分間撹拌し、化合物（ｃ）（７．３ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を加えた。懸濁液を７時間還流しつつ加熱した。溶液を水に注入し、水性混合物を濃塩酸を用いてｐＨ２に調整した。混合物をエーテルを用いて３回抽出し、次いで、有機化合物相を乾燥させ、減圧下に濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝１０：１）にかけ、シアノ（２−ニトロ−ナフタレン−１−イル）酢酸エチルエーテル（図２化合物（ｄ））（３．７ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、収率６５％）を黄色固体として得た。
【００９０】
化合物（ｄ）の酢酸（１５０ｍｌ）溶液にＺｎ粉末（３．９ｇ、６０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４４℃に加熱し、３．３時間超音波処理しさらにＺｎ粉末を追加した（２．４ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）。さらに加熱及び３．３時間超音波処理した後、混合物を濾過した。濾液を減圧により濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝２０：１）により精製し、２−アミノ−３Ｈ−ベンゾ［ｅ］インドール−１−カルボキシリックアシッドエチルエステル（図２化合物（ｅ））（２．３４ｇ、９．２ｍｍｏｌ、６７％）を黒色固体として得た。
【００９１】
化合物（ｅ）（１．１ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）の溶液、ナトリウムメトキシド（１．０ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）及びフォルムアミド（４０ｍｌ）を２２０℃で６時間加熱し、２２０℃で濃縮して固体を得た。その固体をメタノール中で粉末にし、濾過した。濾液を濃縮して固体を得た。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝１０：１）により精製し、３，１１−ジヒドロ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−オン（図２化合物（ｆ））（３７９ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ、３７％）を黄色固体として得た。
【００９２】
化合物（ｆ）（２００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）、ＰＯＣｌ３（２０ｍｌ）及びｐ−ジオキサン（２０ｍｌ）を３時間還流しつつ加熱した。混合物を濃縮して固体とし、次いで、水で洗浄した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝４０：１）により精製し、４−クロロ−１１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図２化合物（ｇ））（１４５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ、６７％）を黄色固体として得た。
【００９３】
次いで、化合物（ｇ）（１１２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１０ｍｌ）中に室温で懸濁した。この懸濁液に水素化ナトリウム（油中６０％、６０ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加し、混合物を５５℃で２時間撹拌した。これに、図１の化合物（ｂ）（１８４ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１５分間撹拌し、乾燥するまで蒸発させ、残存物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝１０：１）で精製し、黄色固体として４−クロロ−１１−（２’デオキシ−３’，５’−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−１１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図２化合物（ｈ））（２３４ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
【００９４】
４０ｍｌのメタノール／アンモニア溶液（−７６℃で飽和）中の化合物（ｈ）の懸濁液（１０１ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を密閉容器中で１５０℃で７時間撹拌した。混合物を蒸発により乾燥させ、残さをシリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）により精製し、白色固体として４−アミノ−１１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−１１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール（５５．６ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ、９５％）（図２化合物（ｉ））を得た。
【００９５】
この化合物（ｉ）は、塩基としてアデニン誘導体であるナフトデアザアデニン（ＮＤＡ）を有するデオキシリボヌクレオシド誘導体である。
【００９６】
実施例２（ＮＤＩ含有ヌクレオシド誘導体の合成）
図１を参照して説明する。実施例１において合成した化合物（ｈ）（９０ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）、エタノール（５ｍｌ）、クロロフォルム（１．５ｍｌ）及び６Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）の混合物を還流しつつ４時間加熱した。次いで、飽和ＮＨ４Ｃｌを添加し、溶媒を蒸発させて固体を得た。次いでＤＭＦを添加して濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝１０：１）で精製し、黄色固体として２’−デオキシ−β−エリスロ−ペントフラノシル−３，１１−ジヒドロ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール（３３ｍｇ、０．９４０ｍｍｏｌ、収率６６％）（図２化合物（ｊ））。
【００９７】
この化合物は、塩基としてイノシン誘導体であるナフトデアザイノシン（ＮＤＩ）を有するデオキシリボヌクレオシド誘導体である。
【００９８】
実施例３（ＭＤＩ含有ヌクレオシド誘導体の合成）
図３を参照して説明する。２−ブタノン（５０ｍｌ）中に３−フルオロ−４−ニトロフェノール（６．０ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）、インドメタン（２５ｍｌ）及び炭酸カリウム（１０．０ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）を含む混合物を４０℃で４時間加熱した。反応混合物を蒸発し、クロロホルム（５０ｍｌ）中に注入した。これにより白色固体として６．８１ｇの３−フルオロ−４−ニトロアニソール（図３化合物（ｋ））が得られた。
【００９９】
無水ＴＨＦ（１５３ｍｌ）中のエチルシアノアセテート（９．８ｍｌ、９３．４ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、窒素ガス下で、ｔｅｒｔ−カリウムブトキシド（１０．９ｇ、１０１．９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた白色懸濁液を１５分間撹拌し、化合物（ｋ）（８．０ｇ、４６．７ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を還流しつつ１．５時間加熱した。溶液を水中に注入し、水性混合物をエーテルで３回抽出し、有機化合物相を乾燥し、濃縮して油にした。次いで、この油をクロロフォルムに溶解し、カラムクロマトグラフィーでクロロフォルムを用いて溶出させることにより精製した。精製物画分を合わせて、濃縮することにより、淡黄色油としてシアノ（２−ニトロフェニル）酢酸エチルエステル（図３化合物（ｌ））１４．５ｇを得た。
【０１００】
化合物（ｌ）（１３．２ｇ、４６．３ｍｍｏｌ）の氷酢酸（１８５ｍｌ）溶液にＺｎ粉末（１２．１ｍｇ、１８５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を超音波処理し、５５℃で４５分間加熱し、さらに４ｇのＺｎ粉末を添加した。超音波処理後、さらに１０５分間加熱し、茶色混合物を濾過した。濾液を濃縮し、残さを得た。残さをカラムクロマトグラフィーにより精製し、連続的に０％、５％、１０％の酢酸エチルのヘキサン溶液で溶出した。これにより、２−アミノ−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−カルボキシリックアシッドエチルエステル（図３化合物（ｍ））２．０７ｇ（収率５２％）を得た。
【０１０１】
化合物（ｍ）（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）、ナトリウムメトキシド（５０ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）及びフォルムアミド（２０ｍｌ）の懸濁液を２２０℃で１．５時間加熱した。溶液を２５℃に冷却し、水中に注入した。茶色固体を集め、乾燥することにより１，９−ジヒドロ−６−メトキシ−４Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−オン（図３化合物（ｎ））（４７ｍｇ、収率５２％）を得た。
【０１０２】
化合物（ｎ）（５００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、フォスフォリルクロリド（２５ｍｌ）及び１，４−ジオキサン（２５ｍｌ）の混合物を６時間還流した。混合物を減圧下に濃縮し、残さをエタノール中に注入した。５分間撹拌後、茶色の懸濁液を濾過し濾液を水中に注入した。白色固体として４−クロロ−６−メトキシ−１Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図３化合物（ｏ））を回収した（６２０ｍｇ、収率９６％）。
【０１０３】
化合物（ｏ）（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１０ｍｌ）に室温で懸濁した。この懸濁液に水素化ナトリウム（油中６０％、１９ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１０分間還流しつつ撹拌した。リボース（１８４ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン中の２０％酢酸エチルで溶出させることより精製した。これにより、４−クロロ−６−メトキシ−７−（２−デオキシ−３，５−ジ−Ｏ−ｐ−トルオイル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図３化合物（ｐ））２１０ｍｇ（収率８２％）を得た。
【０１０４】
１０％エタノール及び１％クロロホルムを含む化合物（ｐ）（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を６時間還流した。冷却後、混合物を減圧下に濃縮し、残さをＤＭＦ（１００ｍｌ）中に注入した。懸濁液を濾過し、濾液を減圧下に濃縮して乾燥し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝１０：１）により精製し、１−ヒドロ−６−メトキシ−９−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−オン（図３化合物（ｑ））５３ｍｇ（収率９４％）を得た。
【０１０５】
この化合物は、塩基としてイノシン誘導体であるメトキシベンゾデアザイノシン（ＭＤＩ）を有するデオキシリボヌクレオシド誘導体である。
【０１０６】
実施例４（ＭＤＡ含有ヌクレオシド誘導体の合成）
図３を参照して説明する。２０ｍｌメタノール／アンモニア（−７６℃で飽和）中の化合物（ｐ）（５００ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を密閉容器内で１５０℃で１０時間撹拌した。濁った溶液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィによりクロロフォルム中の１０％メタノールを用いて溶出し、４−アミノ−６−メトキシ−９−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図３化合物（ｒ））（４２０ｍｇ、７５％）を得た。
【０１０７】
この化合物は、塩基としてメトキシベンゾデアザアデニン（ＭＤＡ）を有するデオキシリボヌクレオシド誘導体である。
【０１０８】
実施例５（ＮＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体の合成）
図４を参照して、実施例１により得られたＮＤＡ含有ヌクレオシド誘導体からＮＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体を合成した例を説明する。
【０１０９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミドジメチルアセタール（５ｍｌ、２８ｍｍｏｌ）を含む、図２の化合物（ｉ）（５５．６ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）のジメチルフォルムアミド（５ｍｌ）溶液を室温下で３時間撹拌した。この溶液を減圧下で濃縮した。残さをシリカゲルクロマトグラフィー（クロロフォルム：メタノール＝１０：１）により精製し、黄色固体として４−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチリデン）アミノ−１１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−１１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図４化合物（ｓ））（４２．５ｍｇ、０．１０５ｍｍｏｌ、６６％）を得た。
【０１１０】
化合物（ｔ）（２２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピル−２−シアノエチルフォスフォロアミダイト（１０．７５ｍｌ、０．０３４ｍｍｏｌ）及びテトラゾール（２．３８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）の０．４０ｍｌアセトニトリル溶液を室温下で１．５時間撹拌した。混合物を濾過した。これにより、４−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノメチリデン）アミノ−１１−（２’−デオキシ−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−３’−Ｏ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）−１１Ｈ−ベンゾ［ｅ］ピリミド［４，５−ｂ］インドール（図４化合物（ｕ））を得た。この化合物（ｕ）を精製せずにＤＮＡ合成に供した。
【０１１１】
化合物（ｕ）を用いてアプライドバイオシステム３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いてフォスフォロアミダイト法によりオリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体５’−ＣＧＣＡＡＴＸＴＡＡＣＧＣ−３’（配列番号１）である（Ｘは、ＮＤＡ含有デオキシリボヌクレオチド；化合物（ｕ）相当）。得られたＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を５−ＯＤＳ−Ｈカラム（１０×１５０ｍｍ）を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製した。溶出は、０．１Ｍトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ），ｐＨ７．０においてアセトニトリルを２０分間で５％から２５％の勾配をつけて、流速３．０ｍｌ／分間で行った。
【０１１２】
実施例６（ＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体の合成）
実施例５において、ＮＤＡ含有ヌクレオシド誘導体に代えて、実施例３により得られたＭＤＩ含有ヌクレオシド誘導体（図３化合物（ｑ））を用い、その他は実施例５と同様にしてＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体を合成した。
【０１１３】
実施例７（ＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体の合成）
実施例５において、ＮＤＡ含有ヌクレオシド誘導体に代えて、実施例４により得られたＭＤＡ含有ヌクレオシド誘導体（図３化合物（ｒ））を用い、その他は実施例５と同様にしてＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体を合成した。
＜オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体の同定＞
ＨＰＬＣ
実施例５により得られたＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを仔ウシ腸アルカリフォスファターゼ（５０Ｕ／ｍｌ）、蛇毒フォスフォジエステラーゼ（０．１５Ｕ／ｍｌ）及びＰ１ヌクレアーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）により３７℃で３時間完全に分解した。分解産物をＣＨＥＭＣＯＢＯＮＤ  ５−ＯＤＳ−Ｈカラム（４．６×１５０ｍｍ）（０．１Ｍトリメチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７．０、４０分間かけて０％から４０％のアセトニトリルの勾配、流速１．０ｍｌ／分）を用いたＨＰＬＣにより分析した。０．１ｍＭのデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）及びデオキシチミジル酸（ｄＴ）を標準溶液として用いて、ピーク位置及び面積を比較することによりＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドに含まれるヌクレオチドを確認した。
【０１１４】
ＨＰＬＣの溶出パターンを図５に示す。図５の（ａ）がＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドを酵素分解したサンプルの溶出パターンであり、図５の（ｂ）はデオキシアデニル酸（ｄＡ）、デオキシシチジル酸（ｄＣ）、デオキシグアニル酸（ｄＧ）及びデオキシチミジル酸（ｄＴ）の混合物の溶出パターンである。図５から、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴのいずれにも該当しないＮＤＡ含有デオキシリボヌクレオチドによると考えられるピークが観察された。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
実施例５により得られたＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドについて、２’，３’，４’−トリヒドロキシアセトフェノンをマトリクスとして用い、内部標準としてＴ８ｍｅｒ（［Ｍ−Ｈ］−２３７０．６０）及びＴ１７ｍｅｒ（［Ｍ−Ｈ］−５１０８．３７）を用い、蛍光分光光度計（島津製作所製ＲＦ５３００ＰＣ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。マススペクトルを図６に示す。計算上の［Ｍ−Ｈ］−４０２５．７２が４０２５．８６の位置に検出された。
【０１１５】
このことから、実施例５のオリゴヌクレオチドは、合成過程で分解反応のような副反応や反応停止等を起こさずに所望の組成で得られたものであることが分かる。
＜蛍光分析＞
ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体
実施例５により得られたＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３５０ｎｍ、発光波長３８３ｎｍであり、４２０ｎｍにおける蛍光強度は、２．０であった。
【０１１６】
上記溶液に、ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体とＮＤＡ含有ヌクレオチド以外の部分が相補的な、別途合成したオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）；５’−ＧＣＧＴＴＡＡＡＴＴＧＣＧ−３’（配列番号２）、（Ｔ’）；５’−  ＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＧＣＧ  −３’（配列番号３）、（Ｇ’）；５’−ＧＣＧＴＴＡＧＡＴＴＧＣＧ−３’（配列番号４）、（Ｃ’）；５’−ＧＣＧＴＴＡＣＡＴＴＧＣＧ  −３’（配列番号５）をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【０１１７】
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４２０ｎｍにおける蛍光強度は０．３であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４２０ｎｍにおける蛍光強度は０．３であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）を加えた場合には、４２０ｎｍにおける蛍光強度は０．５であり、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）を加えた場合には、４２０ｎｍにおける蛍光強度は４．６であった。
【０１１８】
このように、ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体は、相補鎖上のＮＤＡ含有ヌクレオチドと対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸である場合には、ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体単独の場合の蛍光強度が維持されるが、デオキシアデニル酸である場合には蛍光が８５％消光し、デオキシチミジル酸である場合には蛍光が８５％消光し、デオキシグアニル酸である場合には蛍光が７５％消光した。蛍光スペクトルを図７に示す。
ＭＤＩ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体
実施例６により得られたＭＤＩ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、２５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて約２５℃で測定したところ、励起波長３２０ｎｍ、発光波長４１１ｎｍであり、４１１ｎｍにおける蛍光強度は２．３であった。
【０１１９】
上記溶液に、上記オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）、（Ｔ’）、（Ｇ’）及び（Ｃ’）をそれぞれ２５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【０１２０】
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、発光極大波長が短波長側にシフトするとともに３９７ｎｍにおける蛍光強度は４．６であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、発光極大波長が短波長側にシフトするとともに３９６ｎｍにおける蛍光強度は８．２であった。（Ｇ’）を加えた場合には、発光極大波長が短波長側にシフトするとともに３９９ｎｍにおける蛍光強度は５．１であった。（Ｃ’）を加えた場合には、発光極大波長が短波長側にシフトするとともに３９８ｎｍにおける蛍光強度は２．１であった。
【０１２１】
このように、ＭＤＩ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体は、それ単独の場合に比べて、相補鎖上のＭＤＩ含有ヌクレオチドと対合するヌクレオチドがデオキシチミジル酸である場合には蛍光極大波長が短波長側にシフトするとともに蛍光強度が大幅に増大した。これに対して、デオキシシチジル酸である場合には蛍光極大波長が短波長側にシフトするとともに蛍光強度が維持された、また、デオキシアデニル酸である場合及びデオキシグアニル酸である場合には蛍光極大波長が短波長側にシフトするとともに蛍光強度が若干増大した。
【０１２２】
蛍光スペクトルを図８に示す。
ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体
ＭＤＡオリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、２５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液に、ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体とＭＤＡ含有ヌクレオチド以外の部分が相補的な、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）、（Ｔ’）、（Ｇ’）及び（Ｃ’）をそれぞれ２５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【０１２３】
これらの溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定したところ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）を加えた場合には、４２３ｎｍにおける蛍光強度は０．３であった。オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）を加えた場合には、４２３ｎｍにおける蛍光強度は０．４であった。（Ｇ’）を加えた場合には、４２１ｎｍにおける蛍光強度は２．８であった。（Ｃ’）を加えた場合には、４２３ｎｍにおける蛍光強度は１０．８であった。
【０１２４】
このように、ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体は、それ単独の場合に比べて、相補鎖上のＭＤＡ含有ヌクレオチドと対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸である場合に蛍光強度が大幅に増大した。また、対合するヌクレオチドがデオキシグアニル酸である場合には蛍光強度が若干増大した。これに対して、デオキシチミジル酸又はデオキシアデニル酸である場合には蛍光強度の変化は観察されなかった。
【０１２５】
蛍光スペクトルを図９に示す。
ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体
ＭＤＡオリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、２５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。この溶液に、ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体とＭＤＡ含有ヌクレオチド以外の部分が相補的な、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）、（Ｔ’）、（Ｇ’）及び（Ｃ’）をそれぞれ２５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【０１２６】
各混合物に波長３１２ｎｍの光を照射し、各混合物の色を観察した。各混合物をデジタルカメラで撮影した写真を図１０に示す。図１０に示されるように、相補鎖上のＭＤＡ含有ヌクレオチドと対合するヌクレオチドがデオキシシチジル酸である場合にのみ、１本鎖の場合には見られない強い蛍光が観察された。
【０１２７】
なお、各混合物の融解温度（Ｔｍ）を波長２６０ｎｍにおける吸収スペクトルの変化を測定することにより決定したところ、（Ａ’）の場合４２．１℃、（Ｔ’）の場合５４．６℃、（Ｇ’）の場合４８．０℃、（Ｃ’）の場合５２．０℃であり、ハイブリダイズを行った温度である２５℃はいずれの組み合わせにおいても２本鎖を形成できる温度である。
＜１塩基多型の検出＞
家族性乳ガン及び卵巣癌で突然変異を引き起こす腫瘍抑制因子をコードする遺伝子であるＢＲＣＡ−１の１塩基多型部位を含むポリヌクレオチドに対して、プローブとしてＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体及びＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体をそれぞれ用いてハイブリダイゼーションを行い、蛍光を観察した。
【０１２８】
詳述すれば、ＢＲＣＡ−１のＴアレルを含むポリヌクレオチドとして、５’−ＴＡＴＴＴＣＡＴＴＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号６）を合成し、Ｃアレルを含む配列として５’−ＴＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣ−３’（配列番号７）を合成した。
【０１２９】
プローブとして、上記ＢＲＣＡ−１の部分配列に相補的であって、多型部位に対応する位置にＭＤＡ含有ヌクレオシド誘導体を有するオリゴヌクレオチド誘導体５’−ＧＧＴＡＣＣＡＸＴＧＡＡＡＴＡ−３’（配列番号８）（Ｘは  ＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体）を得た。合成方法は、実施例５において、ＮＤＡ含有ヌクレオシド誘導体に代えて実施例４により得られたＭＤＡ含有ヌクレオシド誘導体を用い、その他は実施例５と同様とした。
【０１３０】
また同様にして、実施例３により得られたＭＤＩ含有ヌクレオシド誘導体を用いて配列番号８においてＸがＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体であるＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体を得た。
【０１３１】
上記のＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体及び上記のＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液を調製した。これらの溶液に、ＢＲＣＡ−１のＴアレルを含むオリゴヌクレオチド及びＢＲＣＡ−１のＣアレルを含むオリゴヌクレオチドのそれぞれを、２５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【０１３２】
各混合物に３１２ｎｍの光を照射し、各混合物の色を観察した。各混合物をデジタルカメラで撮影した写真を図１１に示す。図１１から明らかなように、プローブとしてＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体を用いた場合には、ＢＲＣＡ−１の多型部位がＣアレルである場合に強い蛍光が観察された。また、プローブとしてＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体を用いた場合には、ＢＲＣＡ−１の多型部位がＴアレルである場合にやや強い蛍光が観察された。
＜熱力学パラメーター＞
ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を、２．５μＭとなるように、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた溶液に、上記オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）、（Ｔ’）、（Ｇ’）及び（Ｃ’）をそれぞれ２．５μＭとなるように添加し、ボルテックスミキサーにて混合した。
【０１３３】
各混合物について、形成された２本鎖の融解温度Ｔｍを波長２６０ｎｍにおける吸収スペクトルの変化を測定することにより決定した。
【０１３４】
対照として、上記ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体において、ＮＤＡ含有デオキシリボヌクオチド誘導体に代えて、上記一般式（１）で表される化合物において、Ｒ１がアミノ基でありＲ２〜Ｒ６が水素原子であるベンゾデアザアデニン（ＢＤＡ）を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体を用いて、同様にしてオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ａ’）、（Ｇ’）、（Ｃ’）及び（Ｔ’）とそれぞれ２本鎖を形成させ、それぞれＴｍを測定した。
【０１３５】
結果を以下の表１に示す。
【０１３６】
【表１】
2004166522.tif 000018
【０１３７】
表１に示すように、ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体ではオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）又は（Ｔ’）と対合させた場合には、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｇ’）又は（Ａ’）と対合させた場合に比べてＴｍが高かった。一方、ＢＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体では、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｔ’）と対合させた場合にのみ比較的高いＴｍを示した。
【０１３８】
このことから、ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体は、オリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）又は（Ｔ’）安定な２本鎖を形成できることが分かる。塩基部分において縮合しているベンゾ環が一つ増えることによりオリゴデオキシリボヌクレオチド（Ｃ’）とも安定な２本鎖を形成できるようになることが分かる。
【０１３９】
【配列表】
2004166522.tif 000019
2004166522.tif 000020
2004166522.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヌクレオチド又はヌクレオシド誘導体の合成に供される糖誘導体の合成手順を示す図である。
【図２】本発明のヌクレオシド誘導体の実施態様であるＮＤＡ含有デオキシリボヌクレオシド及びＮＤＩ含有デオキシリボヌクレオシドの合成手順を示す図である。
【図３】本発明のヌクレオシド誘導体の実施態様であるＭＤＩ含有デオキシリボヌクレオシド及びＭＤＡ含有デオキシリボヌクレオシドの合成手順を示す図である。
【図４】本発明のポリヌクレオチド誘導体の実施態様であるＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成手順を示す図である。
【図５】ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体の酵素分解物のＨＰＬＣパターンを示す図である。
【図６】ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体のマススペクトルを示す図である。
【図７】ＮＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体に各種オリゴマーをハイブリダイズさせた場合の蛍光スペクトルの変化を示す図である。
【図８】ＭＤＩ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体に各種オリゴマーをハイブリダイズさせた場合の蛍光スペクトルの変化を示す図である。
【図９】ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体に各種オリゴマーをハイブリダイズさせた場合の蛍光スペクトルの変化を示す図である。
【図１０】ＭＤＡ含有オリゴデオキシリボヌクレオチド誘導体に各種オリゴマーをハイブリダイズさせた場合の蛍光を観察した図面代用写真である。
【図１１】乳ガン遺伝子であるＢＲＣＡ−１の１塩基多型部位を含む部分配列に対して、プローブとしてＭＤＡ含有オリゴヌクレオチド誘導体及びＭＤＩ含有オリゴヌクレオチド誘導体を用いてハイブリダイゼーションを行い、蛍光を観察した図面代用写真である。
【図１】
2004166522.tif 000029
【図２】
2004166522.tif 000030
【図３】
2004166522.tif 000031
【図４】
2004166522.tif 000032
【図５】
2004166522.tif 000033
【図６】
2004166522.tif 000034
【図７】
2004166522.tif 000035
【図８】
2004166522.tif 000036
【図９】
2004166522.tif 000037
【図１０】
2004166522.tif 000038
【図１１】
2004166522.tif 000039