(57)【要約】【課題】深海生物組織の培養細胞及び培養方法を提供すること【解決手段】この培養細胞は、深海生物であるコンゴウアナゴのヒレ由来の繊維芽細胞様細胞である。深海生物組織の培養方法は、捕獲した深海生物を深海環境圧力の海水中に保持し、この保持海水の水圧を、深海生物にストレスを生じさせないように、深海環境圧力から常圧に徐々に減圧し、深海生物から組織細胞を採取し、その後、組織細胞を培地中、常圧〜深海環境圧力の圧力下で培養する。深海生物はネクトン、脊椎動物又はこれに近似する動物、コンゴウアナゴなどである。培養温度は０〜２０℃、培養圧力は常圧〜２０ＭＰａである。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
深海生物であるコンゴウアナゴのヒレ由来の繊維芽細胞様細胞であることを特徴とする深海生物組織の培養細胞。
【請求項２】
捕獲した深海生物を深海環境圧力の海水中に保持し、
この保持海水の水圧を、上記深海生物にストレスを生じさせないように、深海環境圧力から常圧に徐々に減圧し、
次いで、上記深海生物から組織細胞を採取し、
しかる後、上記組織細胞を培地中、常圧〜深海環境圧力の圧力下で培養することを特徴とする深海生物組織の培養方法。
【請求項３】
上記深海生物がネクトンであることを特徴とする請求項１に記載の深海生物組織の培養方法。
【請求項４】
上記深海生物が、脊椎動物又はこれに近似する動物であることを特徴とする請求項２又は３に記載の深海生物組織の培養方法。
【請求項５】
上記深海生物がコンゴウアナゴであり、上記組織細胞はそのヒレ細胞から採取された繊維芽細胞様細胞であることを特徴とする請求項２に記載の深海生物組織の培養方法。
【請求項６】
上記培地が、塩化ナトリウムと牛又は馬の胎児血清を含む液体培地であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１つの項に記載の深海生物組織の培養方法。
【請求項７】
培養温度が０〜２０℃であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１つの項に記載の深海生物組織の培養方法。
【請求項８】
培養圧力が常圧〜２０ＭＰａであることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１つの項に記載の深海生物組織の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、深海生物の組織細胞由来の培養細胞、及び深海生物の組織細胞を培養する方法に係り、更に詳細には、深海領域で捕獲した深海生物から組織を採取し、この組織を常圧〜加圧下で培養して得られる細胞、及び培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、深海環境に関する研究が種々行われており、深海生物の生態を解明するためにも、深海魚などの深海生物を深海で捕獲して地上に持ち帰り、水槽中で飼育することが試みられている。
ところが、かかる深海生物は大きな水圧に抗して生息している関係上、そのまま地上付近に水揚げして常圧下に曝した場合は勿論のこと、深海での捕獲とその後の飼育とを両立させるべく作製された特殊な加圧容器中で飼育しようとしても、短命で終わってしまうことを回避できず、深海生物の生態解明に足りるような深海生物の個体飼育は現状では不可能である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、深海生物の個体飼育は試みられているものの、深海生物由来の組織を培養することは試みられておらず、且つそのような組織培養に関する成功例も報告されていない。
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、深海生物組織の培養細胞及び培養方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、深海生物の捕獲から組織採取及びその後の培養を所定条件下で行うことにより、上記目的が達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明の深海生物組織の培養細胞は、深海生物であるコンゴウアナゴのヒレ由来の繊維芽細胞様細胞であることを特徴とする。
一方、本発明の深海生物組織の培養方法は、捕獲した深海生物を深海環境圧力の海水中に保持し、
この保持海水の水圧を、上記深海生物にストレスを生じさせないように、深海環境圧力から常圧に徐々に減圧し、
次いで、上記深海生物から組織細胞を採取し、
しかる後、上記組織細胞を培地中、常圧〜深海環境圧力の圧力下で培養することを特徴とする。
【０００６】
また、本発明の深海生物組織の培養方法の好適形態は、上記深海生物がネクトンであることを特徴とし、更には、脊椎動物又はこれに近似する動物であることを特徴とする。
更に、本発明の深海生物組織の培養方法の他の好適形態は、上記深海生物がコンゴウアナゴであり、上記組織細胞はそのヒレ細胞から採取された繊維芽細胞様細胞であることを特徴とする。
また、本発明の深海生物組織の培養方法の更に他の好適形態は、上記培地が、塩化ナトリウムと牛又は馬の胎児血清を含む液体培地であり、培養温度が０〜２０℃であり、培養圧力が常圧〜２０ＭＰａであることを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の深海生物組織の培養細胞について説明する。なお、本明細書において、「％」は特記しない限り質量百分率を表すものとする。また、「深海環境圧力」とは、水深２００ｍ以深における水圧を意味しており、約２ＭＰａ以上の圧力がこれに相当する。
【０００８】
本発明の深海生物組織の培養細胞は、コンゴウアナゴのヒレ細胞由来の繊維芽細胞様細胞である。コンゴウアナゴは、水深約１０００〜４０００ｍに生息していると考えられており、その生態の詳細は不明である。
なお、この培養細胞は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８４として平成１４年１０月２２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託してある。
【０００９】
本発明の培養細胞は、地上に比し極めて不純物が少ない環境に生息しているコンゴウアナゴ由来の培養細胞であるため、不純物が極めて少ない環境下でなければ生育しない。よって、この培養細胞に種々の遺伝子組み換え技術を適用すれば、高純度の組み換えタンパクや形質転換体を得ることができ、このような高純度なタンパクなどは医療業のみならず各種バイオ産業や、他の産業にも多大な利益をもたらすものと思われる。
【００１０】
また、本発明の培養細胞は、後述するように、従来の微生物や細胞と異なり加圧下、特に２０ＭＰａ程度の高圧下でも生育可能であるため、このような圧力下で本発明の培養細胞と他の細胞等とを共培養しても、本発明の培養細胞のみが生存・増殖する。従って、本発明の培養細胞では、圧力を他の不純物（細胞や微生物）との選別手段として用いることができる。
この点、従来の細胞や微生物では、温度調整やｐＨ調整によって不純物との選別を行っていたが、特に熱処理による温度調整では培養系内の均熱性を担保することが困難であり、熱分布是正のために培養液や細胞等を攪拌すると細胞等が損傷を受け又は死滅し、また、大がかりで精密な装置を用いなければならずコスト高となったりしていた。
これに対し、培養系内を均圧に保持することは容易であるため、本発明の培養細胞は、その培養や遺伝子操作に関し、他種からの選別や不純物の除去が容易で取扱性に優れ、所定圧力さえ確保できれば必ずしも無菌環境下での処理を必要としないという利点がある。よって、本発明の培養細胞は、種々の遺伝子組み換え技術その他の生物化学的処理を適用する際に使い勝手が良く、しかも低コスト化を実現できる。
【００１１】
更に、本発明の培養細胞は、いわゆる高等動物の細胞に属し、バクテリアなどの単細胞と異なり細胞の分化・形態変化を伴うため、より高度な細胞由来の生産物質、例えば各種抗体、インターロイキンやインターフェロンなどの産生に用いることもできる。
【００１２】
次に、本発明の深海生物組織の培養方法について説明する。
まず、本発明の前提となる深海生物の捕獲法につき説明する。
深海生物は、通常の漁法で捕獲することはできず、また捕獲し得たとしても、大きな水圧に抗して生息している関係上、そのまま地上付近に引き上げる途中で死亡したり、水揚げして常圧下に曝すと即座に死亡してしまうことが殆どである。
本発明者らは、このような問題を解消すべく深海生物の捕獲装置を提案しており（平成１３年８月２２日付けの特願２００１−２５１４７５号）、かかる装置よれば、本発明の対象となる深海生物を生存状態で、又は大きな損傷を与えることなく捕獲し、地上付近に引き上げることが可能である。
【００１３】
以下、上述した深海生物の捕獲装置について説明する。
図１は、かかる捕獲装置の一例を示す断面図である。
図示の捕獲装置は、例えば水深２００ｍを超える深水域での捕獲に好適なものであって、金属製の上部容器３２と下部容器３３で形成した捕獲容器３１を備えている。上部容器３２と下部容器３３は、互いに当接するフランジ３２Ａ，３３Ａにおいて、図示しないパッキングを介してボルト・ナットにより水密的に結合され、結合する際に網３４の外周部を挟み込んで、上側の捕獲空間３５Ａと後記する体積可変体３６の収容空間３５Ｂを形成している。
【００１４】
また、上部容器３２の上部中央には、上側に向けて開口面積が減少するテーパ状の生物入口用開口部３７が設けてあり、下部容器３３の下部中央には、下側に向けて開口面積が減少する接続口３９が設けてある。これら開口部３７及び接続口３９は、外周にめねじ部３８Ａ，３８Ｂが形成してあり、当該捕獲容器３１を回収後に飼育容器に接続したり、捕獲容器３１内の圧力を保ったままで水循環装置や給餌装置等の他の装置を接続したりするのに用いられる。
【００１５】
捕獲容器３１には、開口部３７を容器内側から閉塞する閉塞体４０が収容してある。この閉塞体４０は、上側に、上側ワイヤ４１を介して、容器外部に設けた浮き４２が連結してあり、下側に、下側ワイヤ４３を介して、接続口３９を容器内側から閉塞する栓４４が連結してある。また、下側ワイヤ４３の途中は、水生生物の餌を適宜の手段により固化成形した解除部４５により形成してある。
【００１６】
栓４４は、水よりも比重の大きい材料で形成してあると共に、収容空間３５Ｂに収容してあり、網３４に通した下側ワイヤ４３に連結してある。そして、水中においては、浮き４２の浮力により、上下のワイヤ４１，４３を介して閉塞体４０及び栓４４が引き上げられ、且つ栓４４が網３４で浮上規制されて、開口部３７よりも下位側に閉塞体４０を保持する。
【００１７】
即ち、この実施例では、主に下側ワイヤ４３及び栓４４により、水中で閉塞体４０を開口部開放位置に規制する規制手段を構成しており、また、解除部４５により、捕獲した水生生物の捕食行為を利用して規制手段による閉塞体４０の位置規制を解除する解除手段を構成している。
【００１８】
なお、閉塞体４０及び栓４４は、開口部３７及び接続口３９のテーパ形状に対応した外周面を有しており、この外周面あるいは開口部３７及び接続口３９の内周には、水密的閉塞を行うために図示しないオーリング等のシール材が設けてある。
【００１９】
また、開口部３７の上部には、梁４６が掛け渡した状態で設けてあり、この梁４６には、上側ワイヤ４１を開口部中心に保持するためのガイド４６が設けてある。上側ワイヤ４１の容器外部には、コ形の二股ピン４８が下向きに設けてある。これに対して、錘４９には、捕獲容器３１の外側に添う連結用ワイヤ５０が連結してあると共に、連結用ワイヤ５０の両端には、二股ピン４８に係止されるリング５１，５１が設けてある。即ち、この実施例では、二股ピン４８とリング５１によって錘離脱手段を構成している。なお、連結用ワイヤ５０を捕獲容器３１の下側から上側に向けて添わせるため、捕獲容器３１には、連結用ワイヤ５０の横ずれを防止する溝等のガイド部（図示略）が設けてある。
【００２０】
体積可変体３６は、空気、窒素、炭酸ガス及びヘリウム等のガスやシリコンオイル等の圧縮率の高い液体、あるいはガスと液体の混合物といった流体を封入した可撓性の袋であり、その内外の圧力差によって形状が変化して体積が変動する。この体積可変体３６は、封入ガスを透過させない各種プラスチックやゴムで形成してあり、収容空間３５Ｂに適数個が収容してある。
【００２１】
更に、上部容器３２には、捕獲容器３１の内圧を解放する調整弁５２が設けてある。この調整弁５２は、拡大図にも示すように、上側容器３２に一体成形したノズル５３、弁体５４、スプリング５５及び調整ねじ５６を備えている。この調整弁５２は、スプリング５５でノズル５３を閉塞する状態に押圧付勢されており、スプリング５５の押圧付勢は調整ねじ５６の挿入長で調整される。
【００２２】
上記構成を備えた捕獲装置は、水中に投入した後、錘４９により沈下する過程において、水圧に対して反比例的に体積が変化する体積可変体３６が次第に収縮する。そして、着底時には、捕獲容器３１と錘４９が連結用ワイヤ４８により離間した状態で連結してあるので、第１実施例と同様に、水底の地形にあまり左右されることなく、捕獲容器３１が図１に示す如く開口部３７を上向きにして水中に浮いた状態で保持される。
【００２３】
こののち、水生生物が開口部３７から入り、餌で形成した解除部４５を食べると、下側ワイヤ４３が分断され、浮き４２の浮力で浮上する閉塞体４０が開口部３７を閉塞すると共に、水よりも比重が大きい栓４４が沈下して接続口３９を閉塞する。これにより、水生生物は捕獲容器３１に完全に閉じ込められる。
【００２４】
このとき、浮き４２により上側ワイヤ４１及び閉塞体４０が浮上すると、これとともに二股ピン４８も移動してリング５１との係止が解除され、捕獲容器３１から錘４９が離脱する。そして、浮き４２の浮力により捕獲容器３１が浮上する。即ち、この実施例では、規制手段による閉塞体４０の位置規制を解除する解除手段（解除部４５）と、錘離脱手段（二股ピン４８及びリング５１）とが連動するものとなっており、水生生物の捕食行為を引きがねとして、捕獲容器３１の閉塞及び自己浮上が行われる。
【００２５】
また、当該捕獲装置は、閉塞体４０及び栓４４が開口部３７及び接続口３９を水密的に閉塞し、捕獲容器３１を密閉容器とする。このとき、当該捕獲装置は、開口部３７及び接続口３９がテーパ状を成しているので、浮上に伴って次第に容器外側の圧力が低下すると、内外の圧力差によって閉塞体４０及び栓４４が更に密着する。
【００２６】
更に、浮上過程で捕獲容器３１にかかる外圧が低下して内外圧の差が増大すると、容器自体が体積膨張して容積が増加する。このとき、圧力に対する液体の体膨張率は小さく、容器内容積の僅かな変化によっても内圧が減少する。このような状況に対して、当該捕獲装置では、捕獲容器３１に内外の圧力差により体積変化が生じる体積可変体３６が収容してあるので、浮上過程に伴って体積可変体３６が膨張し、容器内の圧力低下を緩和する。
【００２７】
したがって、当該捕獲装置は、深水域で捕獲した水生生物に圧力変化による損傷を与えることがなく、しかも、捕獲空間３５Ａと収容空間３５Ｂを網３４により仕切ってあるので、膨張する体積可変体３６が水生生物に直接的な影響やストレスを与えることもない。
【００２８】
更にまた、当該捕獲装置は、調整弁５２を備えているため、密閉状態での捕獲容器３１の設定内圧（耐圧強度）を超えた条件下でも使用することができる。即ち、設定内圧を超えた場合には、上記調整弁５２が作動して内圧を解放するため、設定内圧を超える深度の領域に移動させることが可能になる。
【００２９】
以上に説明した捕獲装置によれば、各種深海生物を捕獲可能であるが、本発明の培養方法は、ネクトンの組織細胞を対象とし、更には、脊椎動物又はこれに近似する動物の組織細胞をも対象にすることができ、典型的には、コンゴウアナゴのヒレ組織細胞を対象とする。
【００３０】
次に、組織細胞の採取や培養条件等について説明する。
まず、組織細胞の採取法については、対象とする深海生物の種類によっても適宜変更可能であるが、コンゴウアナゴのような深海魚類にあっては、捕獲した深海生物を深海環境と同等な環境で馴養しながら、深海魚類にストレスを与えないように観察を続行しつつ圧力を深海環境圧力から常圧に減圧する。なお、深海魚類等にストレスがかかったか否かはいわゆるストレスタンパクが細胞内に発現するか否かで判定することができるが、これ以外にもいわゆる回避行動を採るか否かでも概略的に判断できる。
上述のように常圧にした後、好ましくはいわゆる無菌環境下でメスやハサミなどを用いてヒレ等のの組織細胞を採取する。
なお、上記の減圧操作によって対象深海生物が死亡することがあるが、ストレスタンパクが多量に発現していなければ、本発明の培養方法に供することができる。
【００３１】
採取した組織細胞は、塩化ナトリウムと牛又は馬の胎児血清を含む液体培地を用い、培養温度０〜２０℃、好ましくは１０〜１５℃の条件下で培養する。
この際、塩化ナトリウムの濃度には、生理食塩水における塩化ナトリウム濃度よりも高い濃度を適用することが好ましい。なお、ミネラルやアミノ酸組成としては、いわゆるＬ１５培地と同様でよい。
また、驚くべきことには、コンゴウアナゴのような深海魚類の組織細胞の培養であっても、牛又は馬の胎児血清を使用可能であり、深海魚類の成長因子（ＧＦ）の代わりに陸上脊椎動物の成長因子が使用可能であることが分かった。この現象の詳細は、現時点では必ずしも明確ではないが、組織細胞は分化終了期に当たるため、ＥＳ細胞のような活発な分裂を行わず、従って、牛胎児血清中などに存在する成長因子を加えることによって、分化を促進できるものと推察される。この点において、微生物の場合と最も異なると思われる。
なお、上述のように牛胎児血清を使用可能であることは、生物進化の系統図を考慮すると興味深い現象であると言える。
【００３２】
また、培養温度は、上述のように比較的低温であるが、通常の深海水温が２〜４℃であることを考慮すると適切な温度範囲である。
培養温度が０℃未満では、深海のような加圧下を除き水が氷点に達してしまい培養に不都合であり、２０℃を超えると、増殖率が低下することがある。
なお、培養圧力は、上述のように常圧〜深海環境圧力（２ＭＰａ以上）とするが、常圧〜２０ＭＰａ程度が適切であり、この範囲内で高圧を採用する程、上述した不純物除去などをいっそう容易に行うことが可能になる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３４】
（実施例１）
コンゴウアナゴ（Ｓｉｍｅｎｃｈｅｌｙｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）は、高深度潜水調査船「しんかい２０００」に搭載した保圧捕獲容器（図１参照）により、相模湾初島南東沖の水深１，１６２ｍの地点で採取した。保圧捕獲容器内に採取したコンゴウアナゴ（体長１５ｃｍ程度）は、この容器内を１０ＭＰａの圧力に保持したまま常圧環境（大気圧・海表面）まで４５分間で持ち上げた。そして、１０ＭＰａの圧力に保った保圧捕獲容器を４℃に冷却し、運搬した。保圧捕獲容器内のコンゴウアナゴを図２に示す。
【００３５】
次いで、４℃の環境下０．２５ＭＰａ／ｍｉｎ．以下の速度で保圧捕獲容器内の減圧を行ったが、この減圧はコンゴウアナゴの様子を観察しながら回避行動を採らせないように段階的に行った。２５時間かけて段階的に減圧した後、保圧捕獲容器水圧を大気圧と均一にした。
このようにして４℃の常圧下においたコンゴウアナゴを、２０ｍｇ／Ｌのエルバージュ（魚病薬）を含む人工海水（１Ｌ中に３０ｇのＮａＣｌ，０．７ｇのＫＣｌ，５．３ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ，１０．８ｇのＭｇＣｌ−６Ｈ２Ｏ，１ｇのＣａＳＯ４−２Ｈ２Ｏを含む）で２４時間薬浴させた。薬浴後、コンゴウアナゴの胸びれ部分をメスとハサミで切り取り、得られた組織切片を５０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、５０００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍＬファンギゾンを含む４℃人工海水に浸し、１５分間組織表面を滅菌した。
【００３６】
滅菌後、コンゴウアナゴ胸びれ組織をクリーンベンチ内で１ｍｍ３の大きさまで切断し、コラーゲンコートした培養フラスコに乗せ、組織培養を試みた。
４ｇ／ＬのＮａＣｌを添加した２０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５（ｐＨ７．３）培地中にて１０〜１５℃の温度条件下エクスプラント法で培養することによって、組織切片から遊走細胞を誘発させた。この遊走細胞は７〜１１日間の培養の後に観測されなくなる。
残った組織切片をさらに４℃でコラゲナーゼ−ディスパーゼを含むＤａｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ培地で１２時間酵素処理した後、再び４ｇ／ＬのＮａＣｌを添加した２０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５（ｐＨ７．３）培地中に戻し、同培地で培養を試み、コンゴウアナゴの胸びれ組織切片から分離してきた繊維芽様胸びれ細胞を得た。得られた培養細胞の光学顕微鏡写真を図３に示す。
得られた培養細胞は、加圧環境下で培養した結果、２０ＭＰａの静水圧環境下にあっても増殖することが確認された（図４参照）。
【００３７】
【発明の効果】
以上説明してきたように、本発明によれば、深海生物の捕獲から組織採取及びその後の培養を所定条件下で行うこととしたため、深海生物組織の培養細胞及び培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】深海生物捕獲装置の一例を示す断面図である。
【図２】捕獲容器内に採取したコンゴウアナゴを示す写真である。
【図３】コンゴウアナゴ組織の培養細胞を示す光学顕微鏡写真である。
【図４】コンゴウアナゴ組織の培養細胞の増殖状態を示すグラフである。
【符号の説明】
３１    捕獲容器
３７    開口部
３６    体積可変体
４０    閉塞体
４３    下側ワイヤ（規制手段）
４４    栓（規制手段）
４８    二股ピン（錘離脱手段）
４９    錘
５１    リング（錘離脱手段）
５２    調整弁
【図１】
2004166575.tif 000002
【図２】
2004166575.tif 000003
【図３】
2004166575.tif 000004
【図４】
2004166575.tif 000005