(57)【要約】【課題】広い範囲の観察を可能とした顕微鏡の観察方法及びそれを用いるための顕微鏡を提供する。【解決手段】コンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に、輪帯状の開口４１を有する開口ユニット４０が配置されている。開口４１は、対物レンズ１５の瞳の外周に略内接するように投影され、対物レンズ１５の位置を通常の合焦位置から観察物体４に対し前後何れかに微小量だけ移動させて観察する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の照明光学系の瞳位置に開口を配置し、該開口を通過した光により照明された観察物体を、観察光学系の合焦位置からずれた位置で観察することを特徴とする顕微鏡観察方法。
【請求項２】
前記開口を、前記対物レンズの瞳の外周部分に略内接するように投影するように調整して観察することを特徴とする請求項１記載の顕微鏡観察方法。
【請求項３】
光源と、この光源からの光を観察物体に導く照明光学系と、この照明光学系の略瞳位置に配置される開口と、この開口を通過した光により照明された前記観察物体の像を合焦位置からずれた位置で観察するための観察光学系とを備えることを特徴とする顕微鏡。
【請求項４】
前記開口は、前記対物レンズの瞳の外周部分に略内接するように投影されることを特徴とする請求項３記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡の観察方法及びそれを用いるための顕微鏡に関するものであり、特に、生体細胞等の位相物体を広範囲で観察可能する場合や、半導体やガラス基板上に形成された微細な凹凸を観察するための観察方法及びそれに用いる顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体細胞等は無色透明な物体であり、このような無色透明な物体は位相物体と呼ばれる。この位相物体を顕微鏡で観察する場合、位相差観察や微分干渉観察の特殊な観察法が用いられている。
【０００３】
位相差観察法は、例えば、特開平７−２２５３４１号に示されているように顕微鏡のコンデンサーレンズの瞳位置に輪帯状の開口を配置し、この輪帯開口と観察物体を介して共役な対物レンズの瞳位置に輪帯開口と相似な位相膜を配置して、位相物体の位相分布に比例した像コントラストが得られる観察法である。
【０００４】
また、微分干渉観察は、例えば、特開平８−１２２６４８号に示されているように顕微鏡のコンデンサーレンズと対物レンズの瞳位置に夫々複屈折プリズムを配置し、直行する２つの偏光成分が横ずらしされて干渉し、位相物体の位相分布の微分値に比例した像コントラストが得られる観察法である。
【０００５】
一方、生体から細胞を採取し、培養して増殖した生体細胞を採取した生体に戻し、生体の疾病を治療する再生医療に関する研究が進められている。
このような再生医療で細胞を培養する場合、細胞の培養状態を速やかに観察する必要がある。生体細胞の培養には通常φ９０ｍｍ程度のシャーレ等が用いられ、シャーレ全面を早く観察するために、出来るだけ広い範囲を一度に観察することが望まれている。よって、再生医療に関する研究の場合では、培養状態の確認をより低倍の観察で行うのが望まれており、実際には、顕微鏡観察において、１倍、１．２５倍、２倍、２．５倍、４倍等の低倍の対物レンズが利用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、生体細胞は位相物体であるために、位相差観察法や微分干渉観察法を用いないと生体細胞を見ることは出来ない。
【０００７】
位相差観察法及び微分干渉観察法は、コンデンサーレンズの瞳と対物レンズの瞳の共役関係が重要になっており、低倍の対物レンズを用いた場合は、コンデンサーレンズから対物レンズに瞳がリレーされる際に瞳収差が発生する。このために、コンデンサーレンズと対物レンズの瞳の共役関係を保つのが難しくなる。
【０００８】
このような理由により、現状では、４倍の対物レンズを用いた観察より低い倍率の対物レンズを用いた観察を良好に行うことが難しい。つまり、培養細胞の状態を観察する場合、４倍の対物レンズの視野より広い範囲を観察することが難しい。
【０００９】
本発明は、上記の状況を鑑みてなされたもので、広い範囲の観察を可能とした顕微鏡の観察方法及びそれを用いるための顕微鏡を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１に係る顕微鏡観察方法は、顕微鏡の照明光学系の瞳位置に開口を配置し、該開口を通過した光により照明された観察物体を、観察光学系の合焦位置からずれた位置で観察することを特徴とする。
【００１１】
請求項２に係る顕微鏡観察方法は、前記開口を、前記対物レンズの瞳の外周部分に略内接するように投影するように調整して観察することを特徴とする。
請求項３に係る顕微鏡は、光源と、この光源からの光を観察物体に導く照明光学系と、この照明光学系の略瞳位置に配置される開口と、この開口を通過した光により照明された前記観察物体の像を合焦位置からずれた位置で観察するための観察光学系とを備えることを特徴とする。
【００１２】
請求項４に係る顕微鏡は、前記開口は、前記対物レンズの瞳の外周部分に略内接するように投影されることを特徴とする。
ここで、本発明を用いて、生体細胞の位相分布に比例した像コントラストを発生させる原理について説明する。
【００１３】
図１は原理説明図であり、物点、光学系入射瞳、射出瞳、結像面を模式的に示したものである。これに示すように、合焦位置に観察物体を配置すると、観察物点から出た光は実線で示すように球面状に広がり入射瞳に入る。入射瞳に入った光は、射出瞳から球面状の収束光になり結像面に集光して像を形成する。この時、光学系を透過する各光線の間に光路（位相）差は生じないので、像にボケは生じない。
【００１４】
しかし、物点を点線に示す位置に移動させると、物点からの光は入射瞳に球面状に入射する。入射瞳に入射した光は、射出瞳から移動後の像面に向かった球面状の光に変わる。移動後の像面で観察すれば、光に光路（位相）差は発生しないが、観察点を移動させずに当初の結像面で観察すると各光線に光路（位相）差が発生する。
【００１５】
本発明では、これを利用して、観察物体を光学系の合焦位置からずらした位置に配置することにより、光学系を透過する夫々の光線に位相差を発生さている。また、図１においては、光学系の光軸と、最大ＮＡ光線との位相の差が最も大きくなる。
【００１６】
一方、培養観察に用いられる生体細胞は、略同じ形状であり、この為、シャーレ内に分布している培養細胞に光を入射させると、細胞の形状に依存して特有の方向に回折光が発生する。シャーレ内の細胞に特定の方向から照明光を入射させると、入射光の方向に透過光が発生し、更に透過光に対し特定の角度で回折光が発生する。
【００１７】
本発明では、顕微鏡の照明光学系の瞳位置に開口を照明光学系の光軸に対して偏心させて配置することにより、観察物体に対し特定の角度を持った照明光を照射させている。開口を偏心させている分、観察物体への入射光の方向に透過する透過光に対して角度を持たせた回折光を光学系の入射瞳に入射させることができ、透過光と回折光との位相差を大きくすることができる。
【００１８】
すなわち、本発明においては、観察物体を観察光学系の合焦位置から外れた位置で観察することにより、観察物体を透過した光と回折した光の間に合焦位置からのずれ量（デフォーカス量）に対応した位相差量を発生させることができる。また、開口を照明光学系の光軸から偏心させて配置することにより、回折光を透過光に対してより角度を持たせたものとすることができる。つまり、透過光と回折光との位相差をより大きくすることができる。
【００１９】
よって、この位相差量が位相差観察法で用いている位相膜と等価な機能をして、培養細胞の位相分布に比例した像コントラストを与えることが出来、無色透明な培養細胞を観察することが出来る。
【００２０】
この時、観察光学系の倍率が低い場合の方が、観察光学系を通過する回折光の角度が限定させ易くなり、像のコントラストも良くなる。
位相物体を観察する場合、位相物体の位相分布に比例した像コントラストは、観察物体の位相量と透過光と回折光の間に与える位相差量とに比例する。観察物体で回折される光と透過光の間の角度は、観察物体の形状に依存して変わる。回折光と透過光の間の角度が変わると同じデフォーカス量でも２つの光束の間に発生する位相差量が異なってくる。
【００２１】
観察する細胞ごとにデフォーカス量を変える事により、より良い像コントラストを得ることが出来る。
デフォーカスによって生じる各光線の位相差は、観察物体が観察光学系の合焦位置から近点側にずれた場合と遠点側にずれた場合で符号が変わる。
【００２２】
培養細胞等の観察物体を観察光学系の合焦位置から近点側にずらして観察した画像と遠点側にずらして観察した画像は、観察物体の位相分布に相当して夫々得られる画像の像コントラストが反転している。
【００２３】
また、シャーレ付着したゴミ等の光を吸収する物体は、位相物体ではなくなり、デフォーカスによって位相差が与えられても像コントラストに変化は生じない。
【００２４】
よって、近点側にずらして撮像した画像と遠点側にずらして撮像した画像を画像間演算することにより、デフォーカスによって与えられる位相差に影響されない画像成分を分離することが出来る。特に、２つの画像の各画素ごとに差演算を行なうことにより、観察物体の位相分布に相当する画像成分の像コントラストは２倍にすることが出来、ゴミや異物、照明ムラなどの位相情報をもたない画像成分を無くすことが出来る。
【００２５】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
図２から図４を用いて、本発明の第１の実施の形態の構成について説明する。
【００２６】
図２は倒立型顕微鏡の概略図、図３は開口の形状を示す図、図４は開口の投影図である。
図２に示すように、倒立顕微鏡１は、光源２と、光源２から発せられた光を導くための照明光学系３と、観察物体４の像を形成するための観察光学系５と、観察物体４の像を拡大して目視観察するための接眼レンズ６と、観察物体４の像を撮像するための撮像素子７を有するＣＣＤカメラ８とにより構成されている。また、ＣＣＤカメラ８には、図示しないテレビモニターが接続されている。
【００２７】
照明光学系３は、光源２側から順に、コレクターレンズ１０、照明光の光軸１１を偏向させるための偏向ミラー１２、光源２を準単色とするための干渉フィルタ１３、及びコンデンサレンズ１４により構成されている。
【００２８】
観察光学系５は、観察物体４側から順に、観察物体４の像を形成するための対物レンズ１５、第１のリレーレンズ１６、対物レンズ１５からの光を偏向するための偏向ミラー１７、第１のリレーレンズ１６と共に対物レンズ１５の像（観察物体４の像）を結像面に結像させるための第２のリレーレンズ１８により構成されている。
【００２９】
また、第２のリレーレンズ１８と結像面１９との間には、観察物体４の像を接眼レンズ６による目視観察とＣＣＤカメラによる観察が同じまたは任意に切り替えることができるように、ハーフミラーである切替ミラー２０が配置されている。
【００３０】
また、光源２の像が投影されるコンデンサーレンズ１４の瞳位置２５には図４に示す部分輪帯の開口２６を有する開口ユニット２７が、着脱自在に配置されている。開口２６自体は、瞳の中心に対して偏心した状態になるように配置されている。また、開口ユニット２７の開口２６以外は、遮光性の遮光板から形成されている。開口２６は、図５に示すように、対物レンズ１５の瞳の外周部分に略内接するように投影される寸法に形成されている。また、開口２６の幅（Ｒｏ−Ｒｉ）は、共役関係にある対物レンズ１５の瞳半径の３分の１以下であることが望ましい。観察する生体細胞の種類によって適宜移動量を設定することで、最良の像コントラスト得ることが可能になる。
【００３１】
次に、第１の実施の形態の作用について説明する。
光源２は、コンデンサーレンズ１４の瞳位置に投影される。そして、この光源２像は、コンデンサーレンズ１４によってケーラー照明として観察物体４を照明する。観察物体４を照明した光は、観察物体４を透過して対物レンズ１５に入射する。対物レンズ１５に入射した光は、対物レンズ１５と第１のリレーレンズ１６及び第２のリレーレンズ１８により結像面１９に観察物体４の像を形成する。
【００３２】
結像面１９に形成された観察物体４の像は、接眼レンズ６に入射すると共に、切替ミラー２０により、ＣＣＤカメラ８の撮像素子７の撮像面上に結像する。
一方、開口ユニット２７をコンデンサーレンズ１４の瞳位置に配置した場合、開口２６の位置を調整することで、開口２６の像は、図５に示すように対物レンズ１５の瞳の外周部分に略内接するように投影され、観察物体４は対物レンズ１５の最大ＮＡと同じ角度で特定の方向から偏斜照明される。
【００３３】
偏射照明光は、観察物体４である培養される立体的な大きさを持った生体細胞細胞に入射され、透過光、屈折光、及び回折光に分解されて細胞から射出する。細胞の輪郭が球や楕円体に近い形状をしている部分の場合は、屈折する光が多くなり、扁平な部分の場合は透過光と回折光が多くなる。細胞の球や楕円体に近い部分で屈折した光は、一部の光が対物レンズ１５のＮＡより大きくなり対物レンズ１５には取込まれない。
【００３４】
本発明では、対物レンズ１５の位置を通常の観察の合焦位置とされている位置から観察物体４に対し前後何れかに微小量だけ移動させる。これにより、観察光学系５を透過する各光線に移動量に比例した位相差が発生し、この位相差は、対物レンズ１５の最大ＮＡを通過する光線が最大になる。この時、偏射照明により、回折光の一部は対物レンズ１５のＮＡ外に回折され、観察光学系５を透過しなくなり、屈折光の場合と同様にレリーフ感のある像コントラストが形成される。
【００３５】
また、対物レンズ１５を前後に移動させる移動量は、形成される像にボケが生じない範囲であることが必要であり、観察に使用する光源２の波長を使用する対物レンズ１５のＮＡの２乗で割った値以下であることが望ましい。
【００３６】
第１の実施の形態の効果について説明する。
本発明では、対物レンズの位置を通常の観察の合焦位置から観察物体４に対し微小量だけ移動させることにより、位相差用の対物レンズを使用しなくても、位相差観察法と同様な像コントラストを得ることができる。
【００３７】
対物レンズとコンデンサーレンズとの瞳収差を考慮する必要がないので、より低倍の対物レンズを使用できる。つまり、位相差観察法が行なえない１倍や２倍の対物レンズを使用しても培養細胞のような位相物体の観察が可能になり、従来の観察法では、実現できなかったより広い範囲の観察が可能になる。
【００３８】
さらに、偏射照明により、位相分布に陰影を付けたレリーフ感のある像コントラストを得ることができる。
また、切替ミラーにより、目視観察とテレビモニターによる観察とをすることができる。
【００３９】
開口を取り外せば、通常の顕微鏡観察ができる。
（第２の実施の形態）
図５、及び図６を用いて第２の実施の形態を説明する。
【００４０】
図５は開口の形状を示す図、図６は開口の投影図である。
この実施の形態は、第１の実施の形態のコンデンサーレンズの瞳位置に、図５に示す開口ユニット３０を配置するものであり、その他は第１の実施の形態と同じである。
【００４１】
図５に示すように、開口ユニット３０は、中心から離れた位置に矩形の開口３１を備え、その他の部分は遮光性の遮光板から形成されており、開口３１自体は、瞳の中心に対して偏心した状態になるように配置されている。
【００４２】
この第２の実施の形態では、開口ユニット３０の矩形の開口３１により、観察物体４を偏射照明し、図６のように開口３１を投影させる。
第２の実施の形態では、矩形の開口が瞳の中心に対して同心円状に配置されていないので、細長い細胞を観察する場合など、コントラストのつき方を良好にすることができる。
（第３の実施の形態）
図２、図７、及び図８を用いて第３の実施の形態の構成について説明する。
【００４３】
図７は開口の形状を示す図、図８は開口の投影図である。
第３の実施の形態では、図２のＣＣＤカメラ８に、ＣＣＤカメラ８からの画像を格納及び演算するための図示しないパーソナルコンピュータが接続されている。さらに、このパーソナルコンピュータには図示しないテレビモニターが接続されている。
【００４４】
図２の照明光学系３のコンデンサーレンズ１４の瞳位置２５には、図７の示す開口ユニット４０が配置されている。この開口ユニット４０は、第１の実施の形態の開口２６と異なり、略全周に亘って存在する輪帯状の開口４１を有し、その他は遮光性の遮光板で形成されている。開口４１自体は、瞳の中心に対して偏心した状態になるように配置されている。また、この開口４１は、図７に示すように、対物レンズ１５の最大ＮＡに近い角度で観察物体４を照明する輪帯照明が行えるように、対物レンズ１５の瞳の外周に略内接するような寸法に形成されている。
【００４５】
第３の実施の形態の作用について説明する。
図７に示す状態になるように、開口４１の位置を調整し、この開口４１を通過した光源２からの光は、第１の実施の形態とは異なり、観察物体４に対して光軸に対して対称に照明される。
【００４６】
切替ミラー２０をＣＣＤカメラ８に切り替えることにより、観察物体４の像はＣＣＤカメラ８を介してテレビモニターに表示される。
対物レンズ１５の位置を観察物体４側（近点側）に微少量移動させて画像を撮像してパーソナルコンピュータに近点画像として格納する。次に、合焦点を挟んで反対側（遠点側）に対物レンズを近点側の移動量と略同程度移動させて画像を撮像してパーソナルコンピュータに遠点画像として格納する。
【００４７】
パーソナルコンピュータにより、格納された２つの画像の夫々に対応する画素毎に、（近点画像）−（遠点画像）又は（遠点画像）−（近点画像）の演算を行なう。
【００４８】
第３の実施の形態の効果について説明する。
この第３の実施の形態の場合、第１の実施の形態と異なり光軸に対して対称に照明されるために、レリーフ感のある像コントラストではなく位相差観察法と同じ方向性の無い画像を得ることができる。
【００４９】
パーソナルコンピュータに格納された近点及び遠点の画像の夫々対応する画素毎の（近点画像）−（遠点画像）又は（遠点画像）−（近点画像）の演算を行なうことで、観察物体４の位相分布に比例する像コントラストが２倍に画像強調される。また、観察物体４の位相分布以外の成分は像コントラストが略０になり、本来観察したい位相分布に比例する画像成分を強調することが可能になる。
（第４の実施の形態）
図９を用いて第４の実施の形態の構成を説明する。
【００５０】
図９はターレット５０を示す図である。
この実施の形態は、図９に示すようなターレット５０がコンデンサーレンズ１４の瞳位置２５に配置されている。ターレット５０には、回転軸５１に対して同心円状に複数の開口装着孔５２を有し、種種の形状の開口を装着することが可能である。ターレット５０は、複数の開口装着孔の夫々の中心点が、照明光学系３の光軸と略一致するように回転軸に対して回転自在な構成になっており、使用する対物レンズと観察方法によってターレット５０を回転させることで、適宜開口装着孔を選択できるようになっている。
【００５１】
複数の開口装着孔に、例えば図３，５，６に示す形状であって、対物レンズの倍率に合った大きさの開口を装着する。
この第４の実施の形態では、ターレットの回転により、簡単に対物レンズの倍率変換に合わせて、開口の形状、大きさを変えることができるので、良好な観察を行うことができる。
（第５の実施の形態）
第１から第４の実施の形態では、生体細胞の観察に応用した例を示した。本第５の実施の形態では、位相物体とみなせる物体の観察、つまり、半導体やガラス基板上に形成された微細な凹凸を観察する場合に応用したものである。これは、表面の微小な凹凸はその微小な段差が作り出す位相成分と考えることが出来、本発明を使用することが有効である。
【００５２】
半導体表面やガラス基板に形成された微細な凹凸の観察は、図１０に示す落射顕微鏡を用いるので、落射顕微鏡を用いて説明する。
落射顕微鏡６０は、光源６１と、光源６１から発せられた光を観察物体６２に導くための照明光学系６３と、観察物体６２の像を形成するための観察光学系６４と、観察物体６２の像を撮像するための撮像素子６５を有するＣＣＤカメラ６６とにより構成されている。また、ＣＣＤカメラ６６には、図示しないテレビモニターが接続されている。
【００５３】
照明光学系６３は、光源６１側から順に、コレクターレンズ６７、照明リレーレンズ６８、照明光の光軸６９を偏向させるためのハーフミラー７０、観察光学系６４も構成する対物レンズ７１により構成されている。
【００５４】
また、光源６１の像が投影される位置には開口ユニット７２が、着脱自在に配置されている。この開口ユニット７２に装着する開口の形状は、図３，５，６に示すような形状であり、対物レンズの瞳の大きさに応じて、開口の大きさが決定されるものである。
【００５５】
観察光学系６４は、観察物体６２側から順に、観察物体６２の像を形成するための対物レンズ７１と、この対物レンズ７１の像を結像するための結像レンズ７２により構成されている。
【００５６】
第５の実施の形態の作用について説明する。
光源６１から発せられた光はコレクターレンズ６７により、照明光学系６３内に光源６１像を結像する。この光源６１像は、照明リレーレンズ６８により、ハーフミラー７０で偏向された後に対物レンズ７１の瞳位置にリレーされ再び光源６１像を形成する。そして、リレーされた光源６１像は対物レンズ７１により観察物体６２をケーラー照明する。このとき、対物レンズ７１はコンデンサーレンズとしての機能も果たす。
【００５７】
観察物体６２を照明した光は、観察物体６２で反射され対物レンズ７１に入射する。対物レンズ７１に入射した光は、ハーフミラー７０を透過して結像レンズ７２により結像面に観察物体６２像を形成する。結像面上にＣＣＤカメラ６６のを配置して、ＣＣＤカメラ６６を介してテレビモニター上に観察物体６２の像を映し出して観察を行なう。
【００５８】
本実施の形態では、コレクターレンズ６７によって光源６１の像画形成される位置に開口ユニット７２を配置する。更に、観察物体６２を通常の合焦位置から微少量前後に移動させ、観察物体４の像コントラストを調節する。
【００５９】
第５の実施の形態の効果について説明する。
本第５の実施の形態では、観察物体として半導体やガラス基板を観察することができる。つまり、半導体やガラス基板の表面の微小な凹凸を、微小な段差が作り出す位相成分として観察することができる。
【００６０】
また、図３または図５に示す形状の開口を用いれば、レリーフ感のある像コントラストを得ることができる。
また、図６に示す形状の開口を用いれば、方向性の無い像コントラストを得ることができる。
【００６１】
更に、コントラスト強調するために、合焦位置から前後２ヶ所ずらした位置で画像を撮像し、その差演算を行うことが有効である。
尚、これまでの実施の形態では、輪帯開口を対物レンズの瞳の外周部に内接するように配置したが、円形のピンホール状の開口を瞳の中心部に配置する事でも同様に位相差観察法と同じ像コントラストを得ることが出来る。この場合、ピンホールは共役関係にある対物レンズの瞳の略中心近傍になるように位置調整することが望ましく、方向性の無い像コントラストを得ることができる。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、低倍率による広い範囲の観察を良好に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】原理説明図
【図２】倒立型顕微鏡の概略図
【図３】第１の実施の形態の開口の形状を示す図
【図４】開口の投影図
【図５】第２の実施の形態の開口の形状を示す図
【図６】開口の投影図
【図７】第３の実施の形態の開口の形状を示す図
【図８】開口の投影図
【図９】ターレットを示す図
【図１０】落射顕微鏡の概略図
【符号の説明】
１４…コンデンサーレンズ
２６…開口
２７…開口ユニット
３０…開口ユニット
３１…開口
４０…開口ユニット
４１…開口
５０…ターレット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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