(57)【要約】【課題】単離細胞及び／又は培養細胞をその細胞膜に損傷を与えることなく電極上に固定することができ、固定された細胞の電気生理的活動を、十分な感度で検出可能な一体型電極を提供する。【解決手段】少なくとも一つの導電体を備えた基板、及び前記導電体からの電気信号を導出する配線部を有し、前記導電体の表面に固定された細胞の電気生理的変化に起因する電気信号を検出し得る一体型電極であって、前記導電体は、その表面の少なくとも一部が誘電体材料で被覆され、前記誘電体材料は、正荷電性の高分子材料であり、前記細胞は、単離細胞及び／又は培養細胞である。【選択図】図１
2004166692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの導電体を備えた基板、及び前記導電体からの電気信号を導出する配線部を有し、前記導電体の表面に固定された細胞の電気生理的変化に起因する電気信号を検出し得る一体型電極であって、
前記導電体は、その表面の少なくとも一部が誘電体材料で被覆され、
前記誘電体材料は、正荷電性の高分子材料であり、
前記細胞は、単離細胞及び／又は培養細胞である、一体型電極。
【請求項２】
前記一体型電極は、前記細胞を変性させることなく前記導電体の表面に固定され得るように構成されている、請求項１に記載の一体型電極。
【請求項３】
前記誘電体材料は、ポリエチレンイミン、ポリオルニチン、及びポリリジンからなる群から選択される高分子材料を含む、請求項１に記載の一体型電極。
【請求項４】
前記誘電体材料は、ビグアニド基、もしくはカルバモイルグア二ド基を持つ高分子材料を含む、請求項１に記載の一体型電極。
【請求項５】
前記導電体が、白金、金、パラジウム、ロジウム、銀、タングステン、ＩＴＯ、及びこれらの組合せからなる群から選択される材料を含む材料からなる請求項１に記載の一体型電極。
【請求項６】
前記誘電体材料で被覆された前記導電体の表面の少なくとも一部が、さらに、固定化材料で被覆され、
前記固定化材料は、前記細胞との間に静電相互作用及び／又は分子間力が働く材料であり、前記誘電体材料とは異なる材料である、請求項１に記載の一体型電極。
【請求項７】
前記固定化材料が、細胞接着性のタンパク質である請求項６に記載の一体型電極。
【請求項８】
前記導電体は、０．１Ｍ電解質溶液との界面の電気二重層容量が、印加電圧０Ｖにおいて、２７μＦ／ｃｍ2以上である請求項１に記載の一体型電極。
【請求項９】
前記導電体が、基板に形成された少なくとも一つの貫通孔の孔内及び／又は前記基板上面における前記貫通孔の孔周囲に形成されている請求項１に記載の一体型電極。
【請求項１０】
一つの前記貫通孔に対し、一つの前記導電体が形成されている、請求項９に記載の一体型電極。
【請求項１１】
複数の前記貫通孔に対し、一つの前記導電体が形成されている、請求項９に記載の一体型電極。
【請求項１２】
請求項１に記載の一体型電極と、前記一体型電極の前記導電体の表面を含む領域で、前記細胞を培養するための溶液保持部とを備える、細胞固定化器。
【請求項１３】
前記一体型電極は前記導電体を複数備え、前記溶液保持部が、一つの導電体毎に分離されている、請求項１２に記載の細胞固定化器。
【請求項１４】
前記一体型電極は前記導電体を複数備え、前記溶液保持部が、複数の導電体毎に分離されている、請求項１２に記載の細胞固定化器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離細胞及び／又は培養細胞の電気生理的活動に起因する電気信号を検出するための一体型電極及び当該一体型電極を備える細胞固定化器に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細胞の電気生理的活動を検出するための技術が知られている。このような技術は、例えば細胞の電気生理的活動を指標にして薬品をスクリーニングするために用いられる。細胞の電気生理的活動とは、主として細胞のイオンチャンネルの活性度をいう。細胞においては、イオンチャンネルの活性度に対応するイオン透過性の変化に伴って細胞膜内外のイオン濃度が変化する。したがって、細胞内の電位変化を検出することにより、イオンチャンネルの開閉時間、開閉タイミング、開閉回数等、イオンチャンネルの活性度（細胞の電気生理的活動）の検出が可能となる。
【０００３】
細胞内の電位変化を検出する方法として、パッチクランプ法が知られている。図１７は、パッチクランプ法の原理を模式的に示す断面図である。パッチクランプ法は、まず、図１７（ａ）に示すように、例えばガラスピペット１０１で細胞１０２を吸引することによりガラスピペット１０１の先端に細胞１０２を密着させ、さらなる吸引圧によってガラスピペット１０１に密着している範囲内の細胞１０２の細胞膜を破り、ピペット１０１内と細胞１０２内を同電位とする。したがって、検出手段１０４を用いて、ピペット内の電極１０３の電位を参照電極１０４の電位との差として検出することにより、細胞１０２内の電位変化を検出することができる。
【０００４】
しかしながら、パッチクランプ法においては、細胞の細胞膜が破壊されてしまうので、１時間程度で細胞が死んでしまう。また、細胞膜が破壊されている細胞の状態は、生体内での状態とは大きく相違する。したがって、生体内の細胞の電気生理的活動を予測するために有用なデータを得難い。さらに、ガラスピペットを細胞に密着させる操作などに熟練した技術を要し、一つの試料の測定に多くの時間を要するので大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングするためには適していない。
【０００５】
高速の薬品スクリーニングの用途、特にファーストスクリーニング（第一候補の絞り込み）の用途には、測定の迅速性、簡便性がより重視されるため、このような用途には、平板電極を使った細胞外電位記録法が適している（例えば、特許文献１、２、３、４、５参照）。
【０００６】
平板電極を使った細胞外電位記録法は、生体内塩濃度組成に近い溶液中で細胞、組織片等の生体試料を平板電極上に配置し、その電極の電位変化を測定することによりイオンチャンネルを通過するイオン流を検出する。すなわち、細胞外電位記録法は、細胞の電気生理的活動が、細胞の近傍に配置された電極の電位に変化をもたらすことを利用する。
【０００７】
上記細胞外電位記録法は、細胞を平板電極上に配置しただけで測定することができ、細胞をガラスピペットに密着させる操作等を必要とせず、また細胞の細胞膜を破壊させることもないので、簡便かつ迅速に生体内での状態に近い細胞の電気生理的活動を測定することができる。したがって、薬品の高速スクリーニング等に適している。
【０００８】
しかしながら、細胞の電気生理的活動に起因する電気信号の変化は非常に微弱であり、平板電極を用いた細胞外電位記録法においては、かかる信号の変化を溶液を介して検出することになるためさらに微弱化する。したがって、精度の高い測定を行うためには、細胞の電気生理的活動に起因する電気信号の変化を感度良く検出する必要がある。
【０００９】
感度良い検出を達成する方法として、平板電極のインピーダンスを低減させる方法が挙げられる。平板電極のインピーダンスを低減させる方法として、白金黒で被覆された電極が好適に用いられている（例えば、特許文献６参照）。
【００１０】
白金黒による電極の被覆は、白金塩や白金錯体を電気分解し、白金原子が多数集合したナノ粒子群が電極表面に立体的かつ複雑に堆積されることによる。故に、白金黒は、多孔性構造を有し、電極表面は、極めて大きな表面積を有する粗面となる。したがって、電極インピーダンスが低減する。電解メッキする際に印加する電圧によって、前記ナノ粒子の粒径は異なるが、その直径は、略１０ｎｍ〜１μｍの範囲内にある。
【００１１】
図１８は、回路抵抗が３００ｋΩ、印加電圧が７Ｖの条件下で堆積された白金黒の表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。図１８において、前記ナノ粒子の直径は、略６０ｎｍ〜１６０ｎｍの範囲内であることがわかる。また、図１８において、明暗から判断すると、少なくともナノ粒子が高さ方向に１５層以上形成されていることがわかる。よって、堆積された白金黒の厚みは、ＳＥＭ写真が捉える範囲だけでも、略０．９μｍ（６０ｎｍ×１５層）〜２．４μｍ（１６０ｎｍ×１５層）であると推測される。また、１μｍ2の範囲内について見ると、最凸部と最凹部との高さの差が少なくともナノ粒子５層分はあるので、略０．３μｍ（６０ｎｍ×５層）〜０．８μｍ（１６０ｎｍ×５層）程度の表面粗さ（以下、本明細書においては、１μｍ2内の最凸部と最凹部との高さの差で表面粗さを規定する）を有する。
【００１２】
一方、電極に固定する細胞の大きさは、細胞種により異なるが、ＨＥＫ２９３（Human Embryo Kidney）細胞は、単離時で直径略１０〜１５μｍの球形を有し、基板に定着し張り付き、伸張すると厚みは略１μｍとなる。したがって、図１８に示した白金黒で被覆された電極の表面粗さは、細胞の厚みに対して無視できない粗さであり、電極の表面と細胞との接触面積を十分に確保できず、細胞等の微小生体試料を固定することは困難である。尚、白金黒で被覆された電極であっても、電極の表面粗さが生体試料の厚みに対して無視できるような、ある程度の厚みを有する組織片等の生体試料であれば、固定することができる。
【００１３】
単離細胞を電極上に固定するためには、電極の表面が、細胞の厚みに対して無視できる程度の粗さしか有さず、ほぼ平坦である必要がある。具体的には、電極の表面粗さが、単離細胞の厚みの略１０％以下、一例を挙げるのであれば、０．１μｍ以下であることが好ましい。電気分解の条件等を調整することにより、白金黒で被覆された電極であっても、白金分子の集合体であるナノ粒子の粒径程度の表面粗さとすることができる可能性が理論上はあり得るが、この場合、電極のインピーダンスの低減効果をほとんど得ることができず、単離細胞に由来する微弱な電気信号を感度良く検出するという課題を達成することはできない。
【００１４】
細胞膜を破壊することなく、その表面に単離細胞を容易に固定できる電極を備えた細胞外電位測装置も開示されているが（例えば、特許文献７参照）、より感度良く細胞外の電位測定が可能な電極の開発が望まれていた。
【特許文献１】特許第２９４９８４５号公報
【特許文献２】米国特許第５８１０７２５号公報
【特許文献３】米国特許第５５６３０６７号公報
【特許文献４】特開平９−８２７３１８号公報
【特許文献５】米国特許第５１８７０６９号公報
【特許文献６】特開平６−７８８８９号公報
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０２／０５５６５３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、単離細胞及び／又は培養細胞を変性させることなく電極上に固定することができ、固定された細胞の電気生理的活動を、十分な感度で検出可能な一体型電極を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明の一体型電極は、少なくとも一つの導電体を備えた基板、及び前記導電体からの電気信号を導出する配線部を有し、前記導電体の表面に固定された細胞の電気生理的変化に起因する電気信号を検出し得る一体型電極であって、前記導電体は、その表面の少なくとも一部が誘電体材料で被覆され、前記誘電体材料は、正荷電性の高分子材料であり、前記細胞は、単離細胞及び／又は培養細胞である。
【００１７】
細胞は、通常その細胞膜が、負に帯電しているので、正荷電性の高分子材料との間に静電相互作用が働く。したがって、導電体の表面が正荷電性の高分子材料で被覆されていることにより、導電体表面に細胞を固定しやすく、またより強固に固定することができる。本明細書でいう「正荷電性の高分子」とは、その高分子のｐＫａ以下のｐＨで正に帯電する高分子のことである。なお、前記誘電体材料は、細胞との間に働く静電相互作用により細胞の固定化に寄与するので、細胞を変性させることがない。もちろん、細胞を殺すこともない。本明細書でいう「細胞の変性」とは、細胞膜の破壊、細胞膜および、細胞膜中または細胞膜上に存在する機能物質の化学的変性を含む。
【００１８】
前記誘電体材料として、例えば、ポリエチレンイミン、ポリオルニチン、及びポリリジンからなる群から選択される高分子材料を含む材料を使用し得る。または、ビグアニド基、もしくはカルバモイルグア二ド基を持つ高分子材料を含む材料を使用し得る。
【００１９】
前記導電体は、好ましくは、白金、金、パラジウム、ロジウム、銀、タングステン、ＩＴＯ、及びこれらの組合せからなる群から選択される材料で作製される。
【００２０】
また、前記一体型電極において、前記誘電体材料で被覆された前記導電体の表面の少なくとも一部が、さらに、固定化材料で被覆された構成とし得る。この場合、前記固定化材料は、前記細胞との間に静電相互作用及び／又は分子間力が働く材料であり、前記誘電体材料とは異なる材料とする。前記誘電体材料での被覆と、さらに前記固定化材料での被覆により、細胞の導電体への固定化をより容易及び／又はより強固にし得る。また、前記固定化材料は、前記細胞との間に働く静電相互作用及び／又は分子間力により細胞の固定化に寄与するので、細胞を殺すことがなく、さらに細胞を変性させることがないことは、前記誘電体材料と同様である。前記固定化材料としては、例えば細胞接着性のタンパク質を使用することができる。
【００２１】
前記導電体と溶液との界面の電気二重層容量は、大きいほど導電体のインピーダンスを低減させる効果が大きく好ましい。具体的には、前記導電体は、０．１Ｍ電解質溶液との界面の電気二重層容量が、印加電圧０Ｖにおいて、２７μＦ／ｃｍ2以上となるようにすることが、前記細胞の電気生理的活動に起因する電気信号の検出感度の点から好ましい。
【００２２】
また、前記一体型電極は、前記導電体が、基板に形成された少なくとも一つの貫通孔の孔内及び／又は前記基板上面における前記貫通孔の孔周囲に形成されている構成とすることができる。この場合、前記貫通孔に細胞を捕捉することができ、または前記貫通孔の下方から細胞を吸引することができるので、細胞の固定化をより容易にすることができる。一つの前記貫通孔に対し、一つの前記導電体が形成されているように構成してもよいし、複数の前記貫通孔に対し、一つの前記導電体が形成されているように構成してもよい。
【００２３】
本発明の細胞固定化器は、前記一体型電極と、前記導電体の表面を含む領域で、前記細胞を培養するための溶液保持部とを備える。前記一体型電極の前記基板上に導電体が複数形成されている場合、前記溶液保持部は、一つの導電体毎に分離されてもよいし、複数の導電体毎に分離されている構成であってもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の一体型電極においては、単離細胞及び／又は培養細胞を電極上に固定することができ、また、これらの細胞の電気生理的変化に起因する電気信号を感度よく検出することができる。さらに、生きたまま、かつ変性されることなく固定された細胞の電気生理的変化に起因する電気信号を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、図面を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００２６】
（第１の実施形態）
［細胞固定化器の構成］
本実施形態は、細胞の電気生理的変化に起因する電気信号検出用の細胞固定化器を備えた細胞外電位測定装置に係るものである。図１は、本実施形態の細胞外電位測定装置の一部分を構成する細胞固定化器１９の構成を模式的に示す断面図である。図２は図１のＡ−Ａ矢視断面図である。ただし、図１は細胞固定化器１９に細胞６が固着されている状態を示すが、図２は細胞６を省略して示す。また、図２においては、センサ部１６の裏面に形成されているリード線９を点線で示す。
【００２７】
細胞固定化器１９は、電極（本明細書でいう「導電体」に該当する）１１を備えたセンサ部１６（本明細書でいう「一体型電極」に該当する）及び溶液保持部１７とからなる。センサ部１６は、電極１１及びこれに接続するリード線９を備えた基板１からなる。電極１１の上面は、誘電体層１２で被覆されており、リード線９は外部接続部１０を除いてその上面が絶縁層３で被覆されている。リード線９の外部接続部１０の上面は、被覆層２１で被覆されている。被覆層２１は、外部接続部１０が曝される周囲の雰囲気に応じて、かかる雰囲気に対して耐性の強い導電性材料を選択するようにする。外部接続部１０は、被覆層２１で被覆されていることより、その耐久性が向上するが、必ずしも被覆層２１により被覆されていなくてもよい。
【００２８】
電極１１の上面形状は、好ましくは、円形もしくは正方形であって、例えば、直径もしくは一辺の長さが略１μｍ〜２０００μｍの範囲であり得る。電極の大きさが測定対象の細胞より大きい場合、一つの電極で複数の細胞の電気生理的活動に由来する電気信号を検出することができる。
【００２９】
一つの単離細胞の電気生理的活動を測定するためのセンサ部１６においては、測定対象の細胞の大きさによるが、例えば測定対象の細胞が長径略１５μｍの細胞である場合には、直径略５μｍの円形の電極１１とし得る。この場合、一つの単離細胞を電極１１上に容易に固定化することができ、一つの単離細胞の電気生理的変化に起因する電気信号を容易に検出することができるからである。
【００３０】
細胞固定化器１９は、センサ部１６上に細胞培養のための溶液保持部１７を備える。溶液保持部１７は、センサ部１６上に設置された円筒状の隔壁部材４、隔壁部材４の内部領域、及び当該内部領域に設置された参照電極１３からなる。
【００３１】
参照電極１３は、測定時に、細胞培養液５に浸漬されていればよく、予め溶液保持部１７内に固定されている構成であってもよいし、測定時に培養液５内に投入され固定される構成であってもよい。例えば、図示しないが、参照電極１３は、隔壁部材４の内壁に取り付けられている構成であってもよい。
【００３２】
基板１としては、好ましくは、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、シリコン・オン・インシュレータ（ＳＯＩ）などに代表されるこれら半導体材料の複合材料、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、および窒化ケイ素からなる群から選択される無機絶縁材料、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンからなる群から選択される有機材料により形成された基板を使用する。さらに好ましくは、単結晶シリコン、ＳＯＩ、ＰＥＴ、またはＰＣにより形成された基板を使用する。
【００３３】
電極１１を形成する電極材料としては、好ましくは、白金、金、パラジウム、ロジウム、銀、およびタングステンからなる群から選択される金属材料、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛、およびインジウム錫酸化物（ＩＴＯ）からなる群から選択される金属酸化物材料が使用される。これらの材料から選択された１種類の材料を使用して電極１１を形成してもよいし、複数種類の材料を、例えば層状に堆積させて電極１１を形成してもよい。電極１１上面は、表面粗さが０．１μｍ以下となる平坦性が確保されていることが好ましく、さらに導電性高分子、または単分子膜によって被覆することにより、上記平坦性を確保するようにしてもよい。電極１１に接続するリード線９を形成するリード線材料にも、上記電極材料と同様の材料を好適に使用することができる。
【００３４】
誘電体層１２を形成する誘電体材料としては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリオルニチン（ＰＯ）、ポリリジン（ＰＬ）等、正荷電性である高分子材料が好適に用いられる。誘電体層１２は、電極１１のインピーダンスを低下させるとともに、後述する実施例３に示すように、正荷電性高分子で形成されることにより、表面が負に帯電した細胞を、静電相互作用により引き付ける作用も併せ持つ。細胞膜表面には、シアル酸が存在するので、かかるシアル酸が細胞表面の負荷電に寄与する。本実施形態の細胞固定化器では、上記静電相互作用を利用して細胞を電極上面に固定化するので、細胞膜の破壊、細胞膜及び細胞膜中または細胞膜上の機能物質の化学的変性等を招くことがない。従って、生きた状態であって、かつ生体内での状態に近い状態の細胞の電気生理的変化を検出することができる。尚、単離細胞であっても、培養細胞であってもいずれも測定対象の細胞として使用し得る。
【００３５】
また、その他の強塩基性官能基を持つ高分子材料が誘電体材料として好適に用いられる。高分子中の強塩基性官能基は、細胞培養液に晒された状態で、正に帯電するので、表面が負に帯電した細胞との間に静電相互作用が働く。例えば、ビグアニド基、もしくはカルバモイルグアニジド基等の強塩基性官能基を持つ高分子材料が好適に用いられる。このようなポリマーとして、具体的にはアリルビグアニド−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＢ）、アリル−Ｎ−カルバモイルグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＣ）が挙げられる。
【００３６】
誘電体層１２は、誘電体材料が所定の濃度で溶解された誘電体溶液を、電極１１上に曝し、所定時間経過後、電極１１の上面から誘電体溶液を取り除き、上面を洗浄液で少なくとも１回以上洗浄し、乾燥することにより形成することができる。または、上記誘電体溶液を、電極１１の上面だけにスポットし、被覆する方法であってもよい。
【００３７】
誘電体層１２による電極の被覆は、細胞の大きさに対する電極１１表面の平坦性に影響を与えることはない。ＰＥＩは分子量が６００〜７５００００で、下記に示す構造式（Ｉ）を有する。
【００３８】
【化１】
2004166692.tif 000003
上記構造式（Ｉ）において、５≦ｘ≦９０００、５≦ｙ≦９０００である。
【００３９】
例えば、誘電体材料１２としてＰＥＩを用いた場合、各官能基の原子間距離から予想される分子の厚みは５ｎｍ程度である。ＰＥＩは分子構造から導かれるオーダー程度の厚みと粗さを有するのみであると推測される。尚、データは示さないが、ＰＥＩにより被覆がされていない基体表面と、ＰＥＩにより被覆がされた基体表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を観察しても、両者においてほとんど差異は確認できない。かかる事実からも、ＰＥＩを被覆した電極１１の表面粗さは、被覆されていな状態の電極１１表面の粗さと同程度であることがわかる。すなわち、電極１１の表面粗さが０．１μｍ以下である場合、ＰＥＩにより被覆された電極１１の表面粗さも略０．１μｍ以下となる。したがって、ＰＥＩによって被覆された電極１１表面は、図１８に示した白金黒と比較にならない程平坦であり、その表面粗さは細胞の厚みに対して無視できる程度であり、細胞の電極上面への固定には障害とならない。ＰＥＩの被覆が、細胞の固定の障害とならないことは、後述の実施例３によっても確認される。
【００４０】
尚、ＰＥＩは、上記構造式に示すように、細胞培養液中で正に帯電する強塩基性官能基であるＮＨ2基を持つため、負に帯電した細胞との間に静電相互作用が働く。
【００４１】
誘電体材料の被覆条件等により、電極のインピーダンスは異なるが、誘電体材料で電極を被覆することにより、電極のインピーダンスは低減する。電極のインピーダンスに寄与するインピーダンスの一つとして、電極の溶液との界面の電気二重層容量によるインピーダンスがあるが、かかる電気二重層容量が、印加電圧０Ｖ、電解質濃度が０．１Ｍにおいて、好ましくは２５μＦ／ｃｍ2以上、より好ましくは２７μＦ／ｃｍ2以上となるように電極の被覆を行う。
【００４２】
リード線９を被覆し絶縁するための絶縁層３の材料としては、ポリイミド（ＰＩ）樹脂、エポキシ樹脂などの樹脂が挙げられる。好ましくは、ネガティブフォトセンシティブポリイミド（ＮＰＩ）などの感光性樹脂が用いられる。感光性樹脂を用いる場合、まずセンサ部１６上面全体に感光性樹脂を塗布し、その後フォトエッチングによるパターン形成を利用して、電極１１上及びリード線９の外部接続部１０の上に形成された絶縁層３を取り除くことにより、該電極１１及び外部接続部１０を露出させ、任意の領域に絶縁層３を形成することが可能となる。生産効率の点から、上述の方法により、絶縁層３を形成することが好ましい。
【００４３】
電極１１からの電気信号は、参照電極１３の電位を基準として測定される。通常、参照電極１３は、好ましくは、その表面積が電極１１の表面積以上であり、金、白金、銀−塩化銀などの材料からなるものとするが、任意の大きさ及び形状であり得る。
【００４４】
隔壁部材４は、例えばアクリルにより作製し得る。隔壁部材４は、電極１１上面を含むセンサ部１６の上面を底面とする内部領域に細胞培養液５を保持できる構成であれば良く、その形状は円筒状に限定されることはない。
【００４５】
［細胞固定化器の作製方法］
細胞固定化器１９の作製方法の一例を示す。まず、電極材料を基板１上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、電極１１、および対応するリード線９を１セットとしてかかるセットを複数セット有する所望のパターンを形成する。その後、外部接続部１０を除くリード線９の上面を絶縁層３で被覆する。そして、電極１１上面を誘電体材料で被覆し、誘電体層１２を形成する。さらに、リード線９の外部接続部１０の上面を被覆層２１で被覆する。その後、基板１を所定角の小片に切り出し、一つの小片をセンサ部１６とする。一つの小片には、電極１１及びリード線９が１セット形成されているようにする。電極１１のパターンは、予め前記パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法によって形成してもよい。このように形成されたセンサ部１６の上面に隔壁部材４を接着し、溶液保持部１７を形成する。
【００４６】
［細胞固定化器の使用方法］
まず、測定対象である細胞６を電極１１の上面に固定化する。センサ部１６の最上面のうち隔壁部材４内の領域、少なくとも電極１１の上面に誘電体層１２を形成する誘電体材料とは異なる固定化材料を塗布する。固定化材料として、細胞６との間に静電相互作用及び／又は分子間力が働く材料を使用する。かかる材料で電極１１の上面を被覆することにより、細胞６の電極１１への固定化を容易及び／又は強固にすることができる。
【００４７】
電極１１上面に被覆された誘電体層１２は、細胞を静電相互作用により引きつける作用を有するので、かかる作用により固定化材料を塗布しなくても、電極１１の上面に細胞６を固定化できるように構成することができるが、電極１１の上面を、さらに固定化材料で被覆することにより、細胞６の固定化をより容易及び／又は強固にすることが可能となる。固定化材料による電極１１の上面の被覆は、隔壁部材４を設置する前に行ってもよい。
【００４８】
固定化材料は、細胞の細胞を変性させることがない材料を用いる。したがって、固定化材料と細胞膜との間で、架橋反応が生じることにより、細胞を固定化するような材料は使用しない。生体内での状態に近い状態の細胞の電気生理的変化に由来する電気信号を検出するためである。固定化材料として、例えば、マトリクス材料を用いることができる。マトリクス材料として、細胞接着性のタンパク質が好適に用いられ、かかるタンパク質としてコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等が挙げられる。なお、固定化材料による電極１１上面の被覆は、必ずしも行わなくもよい。
【００４９】
次に、溶液保持部１７内に細胞培養液５を満たす。細胞培養液５としては、２０ｍＭ以上４００ｍＭ以下の塩化ナトリウムを主成分とする生理食塩水溶液、および種々の栄養素、成長因子、抗生物質などを含有する培地、所定の化学物質、化合物、薬剤を溶解させた緩衝溶液などが好適に用いられる。
【００５０】
その後、細胞培養液５内に、所望の細胞６を播種する。細胞６の培養が進行すると同時に、付着性細胞が、センサ部１６の最上面に固定化される。
【００５１】
細胞６が、センサ部１６の最上面に固定化された状態で細胞の電気生理的変化に起因する電気信号の測定を開始する。電気信号の測定は、一対の電極１１、１３から検出される電気信号に基づいて、電極１１と参照電極１３との間の電位差を測定する。細胞は、上述のように、そのイオンチャンネルの活性に対応して、細胞膜のイオン透過性が変化し、かかる変化に伴って細胞膜内外のイオン濃度が変化する。すなわち、細胞膜内外のイオン濃度勾配が変化する。かかるイオン濃度勾配の変化に伴って、電極１１と参照電極１３との間の電位差が変化する。したがって、前記電位差を測定することにより、細胞の電気生理的変化を間接的に検出することができる。前記電位差は、例えば、後述する細胞外電位測定装置により測定することができる。
【００５２】
［細胞外電位測定装置の構成］
図３は、本実施形態の細胞外電位測定装置の概略図である。細胞外電位測定装置４０は、制御部３９、これに接続された信号増幅部３３、刺激信号付与部３４及び溶液駆動部３８、撮像部３５、並びに載置部３６からなる。
【００５３】
載置部３６には、細胞固定化器１９が載置される。載置部３６は、載置された細胞固定化器１９を所定の温度、ガス濃度、湿度に保つ機能を備える。制御部３９は、信号増幅部３３から入力される信号に基づいて、細胞固定化器１９の電極１１，１３間の電位差を検出、記録する。また、制御部３９は、設定された刺激条件に基づいて刺激信号付与部３４を制御する。刺激信号付与部３４は、Ｄ／Ａ変換器を備え、当該変換器、及び回線３７を介して、細胞固定化器１９上の細胞に電気的刺激を印加する。細胞固定化器１９からの電気信号は回線３２を介して信号増幅装置３３に導出され、ここで増幅され、周波数帯域を制限され、Ａ／Ｄ変換器を介して制御部３９に入力される。
【００５４】
溶液駆動部３８は、細胞固定化器１９の溶液保持部１７内に保持された培養溶５を排出し、あるいは溶液保持部１７内に培養液５を注入する機能を有する。必要に応じて制御部３９により駆動される。撮像部３５を用いて、細胞固定化器１９上の電極１１を撮像もしくは観察することが可能である。また、刺激信号付与部３４は、撮像部３５による撮像データに基づいて、出力する刺激信号を選択する構成であってもよい。
【００５５】
細胞外電位測定装置４０は、刺激信号付与部３４から細胞６に刺激信号付与し、その応答に対応した細胞６の電気生理的変化を検出することもできるし、刺激信号を与えることなく、細胞において自発的に生じる電気生理的変化を検出することもできる。
【００５６】
（第２の実施形態）
図４は、第２の実施形態の細胞固定化器１９ａのセンサ部１６ａの上面を示す図である。細胞固定化器１９ａは、６行６列の格子状の各交点に電極１１ａが配置されている構成である。第１の実施形態の細胞固定化器１９は、センサ部１６上に一つの電極１１のみが形成されている構成であるが、本実施形態の細胞固定化器１９ａは、センサ部１６ａ上に複数の電極１１ａとこれに対応するリード線９ａが形成されている構成である。
【００５７】
図４は、溶液保持部を省略して示すが、溶液保持部を構成する隔壁部材（第１の実施形態の隔壁部材４と同様の構成）は、一つの電極１１ａ毎に設置する構成、複数の電極１１ａ毎に設置する構成いずれであってもよい。一つの電極１１ａ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ａ上に固定された細胞の薬品応答性を測定する際に有用であり、複数の電極１１ａ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ａ上に固定化した神経細胞間でネットワークを形成させることができ、ネットワークに関する解析を行う際に有用である。
【００５８】
細胞固定化器１９ａの他の構成及び使用方法等は、第１の実施形態の細胞固定化器１９と同様であるので、説明を省略する。
【００５９】
（第３の実施形態）
図５は、本実施形態の細胞固定化器１９ｂの構成を模式的に示す断面図である。図６は図５のＢ−Ｂ矢視図である。ただし、図５は細胞固定化器１９に細胞６が固定化されている状態を示すが、図６は細胞６を省略して示す。また、図６においては、センサ部１６の下面に形成されているリード線９を点線で示す。
【００６０】
本実施形態の細胞固定化器１９ｂは、第１の実施形態の細胞固定化器１９とは、センサ部の構成が異なるのみなので、センサ部以外の構成は同一の符号を付して説明を省略する。
【００６１】
基板１ｂは貫通孔１４ｂを有する。貫通孔１４ｂの孔壁面１４１ｂ、および孔開口部周縁１４２ｂには、電極１１ｂが形成されている。電極１１ｂは、真空蒸着法あるいはスパッタ法を用いて電極材料を貫通孔１４の孔壁面１４１ｂおよび開口部周縁１４２ｂに付着させることにより形成する。電極１１ｂの表面は誘電体層１２ｂで被覆されている。誘電体層１２による電極１１ｂの被覆は、第１の実施形態と同様の方法を採用し得る。誘電体層１２ｂによる電極１１ｂの被覆は、電極１１ｂの０．１Ｍ電解質溶液との界面の電気二重層容量が、印加電圧０Ｖにおいて、好ましくは２５μＦ／ｃｍ2以上、より好ましくは２７μＦ／ｃｍ2以上となるように行うことは、第１の実施形態と同様である。
【００６２】
センサ部１６ｂの下面には、電極１１ｂに接続するようにリード線９ｂが形成されている。尚、リード線９ｂは、センサ部１６ｂの上面に形成されている構成であっても良い。
【００６３】
貫通孔１４ｂは、上面開口部が下面開口部より大きい円錐台形状を有する。貫通孔１４ｂに細胞６の一部が捕捉され、細胞６がセンサ部１６ｂ上に密着して保持される。貫通孔１４ｂは、円錐台形状を有することにより、細胞６との広い密着面積を確保することができるが、貫通孔１４ｂの形状は、円錐台形状に限定されることはなく（例えば、第５の実施形態参照）、細胞６の一部を捕捉可能な形状であればよい。貫通孔１４ｂの大きさは、捕捉対象となる細胞６に依存した任意の大きさを採用し得る。例えば、センサ部１６ｂ上面での開口部の直径が１０μｍ以上５００μｍ以下の範囲にあり、通常は直径が１０μｍ以上１００μｍ以下の範囲にあり、好適な例示としては生体試料として用いる細胞の長径が略３０μｍの場合、直径が略２０μｍである。
【００６４】
貫通孔１４ｂの形成方法は、基板１ｂの材料によって異なるが、例えば基板１ｂがＰＥＴからなる場合には、エキシマレーザを用いて形成することができる。また、例えば基板１ｂがＳｉウェハーである場合には、エッチングにより形成することができる。
【００６５】
さらに、貫通孔１４ｂの下方から細胞６を吸引可能な吸引手段を備える構成とすることができる。このように構成することにより、貫通孔１４ｂにおける細胞６の捕捉をより強固なものとすることができ、浮遊性の細胞であっても貫通孔１４ｂに捕捉することができる。
【００６６】
基板１ｂを形成する基板材料、電極１１ｂを形成する電極材料、誘電体層１２ｂを形成する誘電体材料、いずれも第１の実施形態に示した材料を使用することができる。細胞固定化器１９ｂの使用方法は、第１の実施形態の細胞固定化器１９の使用方法と同じである。
【００６７】
（第４の実施形態）
図７は、第４の実施形態の細胞固定化器１９ｃのセンサ部１６ｃの上面を示す図である。尚、リード線９ｃは、センサ部１６ｃの下面に形成されているため、上面には現れないが、図７においては、便宜上、リード線９ｃを上面に示す。細胞固定化器１９ｃは、６行６列の格子状の各交点に電極１１ｃが配置されている構成である。第３の実施形態の細胞固定化器１９ｂは、センサ部１６ｂ上に一つの電極１１ｂのみが形成されている構成であるが、本実施形態の細胞固定化器１９ｃは、センサ部１６ｃ上に複数の電極１１ｃとこれに対応するリード線９ｃが形成されている構成である。
【００６８】
図７は、溶液保持部を省略して示すが、溶液保持部を構成する隔壁部材（第３の実施形態の隔壁部材４と同様の構成）は、一つの電極１１ｃ毎に設置する構成、複数の電極１１ｃ毎に設置する構成いずれであってもよい。一つの電極１１ｃ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｃ上に固定された細胞の薬品応答性を測定する際に有用であり、複数電極１１ｃ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｃ上に固定化した神経細胞間でネットワークを形成させることができ、ネットワークに関する解析を行う際に有用である。尚、センサ部１６ｃは、その上面にリード線９ｃが形成されていないので、センサ部１６と隔壁部材とは必ずしも別構成である必要はなく、一体で形成することも可能である
細胞固定化器１９ｃの他の構成及び使用方法等は、第３の実施形態の細胞固定化器１９ｂと同様であるので、説明を省略する。
【００６９】
（第５の実施形態）
図８は、本実施形態の細胞固定化器１９ｄの構成を模式的に示す断面図である。細胞固定化器１９ｄは、第１の実施形態の細胞固定化器１９とは、センサ部の構成が異なるのみなので、センサ部以外の構成は同一の符号を付して説明を省略する。
【００７０】
基板１ｄは貫通孔１４ｄを有する。貫通孔１４ｄの孔壁面１４１ｄ、および孔開口部周縁１４２ｄには、電極１１ｄが形成されている。電極１１ｄは、真空蒸着法あるいはスパッタ法を用いて電極材料を貫通孔１４ｄの孔壁面１４１ｄおよび開口部周縁１４２ｄに付着させることにより形成する。電極１１ｄの表面は誘電体層１２ｄで被覆されている。誘電体層１２ｄによる電極１１ｄの被覆は、第１の実施形態と同様の方法を採用し得る。誘電体層１２ｄによる電極１１ｄの被覆は、電極１１ｄの０．１Ｍ電解質溶液との界面の電気二重層容量が、印加電圧０Ｖで、好ましくは２５μＦ／ｃｍ2以上、より好ましくは２７μＦ／ｃｍ2以上となるように行うことは、第１の実施形態と同様である。
【００７１】
センサ部１６ｄの下面には、電極１１ｄに接続するようにリード線９ｄが形成されている。尚、リード線９ｄは、センサ部１６ｄの上面に形成されている構成であってもよい。
【００７２】
本実施形態の細胞固定化器１９ｄは、第３の実施形態の細胞固定化器１９ｂとはセンサ部に形成された貫通孔の形状が異なるのみである。貫通孔１４ｄは、基板１ｄの上面より形成された円錐台状の窪み１５１と、基板１ｄの下面より形成された円錐台状の窪み１５２とが一体となって形成されている。貫通孔１４ｄは、このような形成方法により、基板１ｄの厚みの都合上、連続的な円錐台状の貫通孔の作製が困難であっても容易に形成することができる。
【００７３】
（第６の実施形態）
図９は、本実施形態の細胞固定化器１９ｅの構成を模式的に示す断面図である。図１０は、図９のＣ−Ｃ矢視断面図である。ただし、図９は細胞固定化器１９ｅに細胞６が固定化されている状態を示すが、図１０は細胞６を省略して示す。また、図１０はセンサ部１６の下面に形成されているリード線９ｅを点線で示す。細胞固定化器１９ｅは、第１の実施形態の細胞固定化器１９とは、センサ部の構成が異なるのみなので、センサ部以外の構成は同一の符号を付して説明を省略する。
【００７４】
センサ部１６ｅは、図５に示す貫通孔１４ｂと同様の形状の貫通孔１４ｅが一つの電極１１ｅに対して複数形成されている構成を有する。図１０に示すように（図９では省略する）、電極１１ｅは誘電体層１２ｅで被覆されている。貫通孔１４ｅは、基板１ｅにおいて、放射状に２５個形成されている。ただし、貫通孔１４ｅの数及び位置関係はこれに限定されない。本実施形態においては、複数の貫通孔１４ｅに保持された細胞６に起因する電気信号が一つの電気信号として一つの電極１１ｅから検出されることになる。本実施形態の細胞固定化器１９ｅは、複数の細胞の応答を同時に検出する薬品スクリーニング等において有用である。
【００７５】
（第７の実施形態）
図１１は、第７の実施形態の細胞固定化器１９ｆのセンサ部１６ｆの上面を示す図である。尚、リード線９ｆは、センサ部１６ｆの下面に形成されているため、上面には現れないが、図１１においては、リード線９ｆを模式的に示す。細胞固定化器１９ｆは、６行６列の格子状の各交点に電極１１ｆが配置されている構成である。第６の実施形態の細胞固定化器１９ｅは、センサ部１６ｅ上に一つの電極１１ｅのみが形成されている構成であるが、本実施形態の細胞固定化器１９ｆは、センサ部１６ｆ上に複数の電極１１ｆとこれに対応するリード線９ｆが形成されている構成である。
【００７６】
図１１では、溶液保持部を省略して示すが、溶液保持部を構成する隔壁部材は、一つの電極１１ｆ毎に設置する構成、複数の電極１１ｆ毎に設置する構成いずれであってもよい。一つの電極１１ｆ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｆ上に固定された細胞の薬品応答性を測定する際に有用であり、複数電極１１ｆ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｆ上に固定化した神経細胞間でネットワークを形成させることができ、ネットワークに関する解析を行う際に有用である。尚、センサ部１６ｆは、その上面にリード線９ｆが形成されていないので、センサ部１６ｆと隔壁部材とは必ずしも別構成である必要はなく、一体で形成することも可能である
細胞固定化器１９ｆの他の構成及び使用方法等は、第６の実施形態の細胞固定化器１９ｅと同様であるので、説明を省略する。
【００７７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７８】
第６の実施形態（貫通孔１４ｅの個数は、図１０に示すものとは異なる）の細胞固定化器１９ｅ（実施例１）と、実施例１の細胞固定化器１９ｅとは電極１１ｅを誘電体層１２ｅで被覆していない点のみ異なる細胞固定化器（比較例１）とを作製し、電極の特性を調べる実験を行った。
【００７９】
基板１として１００ｍｍ角、厚さ２５μｍのＰＥＴフィルムを、電極１１ｅ及びリード線９ｅの材料として金を用いた。ＰＥＴフィルム上に、パルス発振させたエキシマレーザを用いて、貫通孔１４ｅを形成した。貫通孔１４ｅは、各領域に１００個ずつ、複数領域に形成した。各領域において、１００個の貫通孔１４ｅは放射状となるように形成した。各貫通孔１４ｅは、上面開口部の直径が２０μｍ、下面開口部の直径が５μｍの円錐台形状とした。一つの領域は、直径１ｍｍの範囲内に含まれる大きさとした。尚、各領域間は、後の工程における小片の切り出しを容易とするために、隣接する領域間は左右間隔が３ｍｍ、上下間隔が１０ｍｍとなるようにした。
【００８０】
そして、基板１ｅの上面の貫通孔１４ｅの開口部より一回り大きい孔が各貫通孔１４ｅに対応するように形成されているステンシルマスクを通じて、電極材料である金を厚さ２０ｎｍとなるようにスパッタした。その後、基板１ｅの下面に、上記と同様の方法で、リード線９ｅの形状をスパッタした。これにより、基板１ｅ上面の直径１ｍｍの範囲及び貫通孔１４ｅ内壁に形成された電極１１ｅは、裏面に形成されたリード線９ｅに接続された。その後、一つの小片が一つの領域を含むように１００ｍｍ角のＰＥＴフィルムを複数の小片に切り出した。切り出した小片についてフィルム上面に形成された電極１１ｅ上面からリード線９ｅへの導通を確認した。一つの小片を比較例１のセンサ部とした。
【００８１】
実施例１については、さらに以下の処理を施した。ｐＨ８．４のホウ酸緩衝液に終濃度０．１重量％となるようにＰＥＩを希釈した誘電体溶液を、センサ部上に１６時間曝し、その後誘電体溶液を取り除いた。そして、センサ部表面を滅菌水で十分にリンスした。このようにして、電極１１ｅ上面に誘電体層１２ｅを形成したセンサ部を、実施例１のセンサ部とした。
【００８２】
実施例１、比較例１のセンサ部を用いてそれぞれ細胞固定化器を作製し、細胞固定化器を含む回路のインピーダンスを測定した。インピーダンスの測定は、基準電極として白金電極を用い、溶液保持部には０．１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を満たし、実施例１および比較例１のセンサ部上の電極を測定電極として、電気化学測定システムＨＣ３０００（北斗電工社製）を用いて、周波数を１Ｈｚから２０ｋＨｚまで連続的に変化させて正弦波電圧を電極間に印加し、回路のインピーダンスを測定した。バイアス電圧は０Ｖとし、印加電圧の振幅は５０ｍＶとした。図１２に測定結果を示す。図１２に示されるように、実施例１と比較例１では、インピーダンスに顕著な違いが見られる。周波数が３ｋＨｚ以下では、実施例１のインピーダンスは、比較例１のインピーダンスより小さく、かかる傾向は印加周波数が低い程顕著であり、周波数が２０Ｈｚ以下の低周波印加領域では、１０分の１以下であった。
【００８３】
本測定におけるインピーダンスは、測定電極と溶液との界面及び基準電極と溶液との界面に形成される容量、溶液抵抗、電極表面抵抗、回路抵抗等さまざまなものの合成インピーダンスである。しかしながら、図１２の測定結果からは、実施例１と比較例１とのインピーダンスの違いには、周波数依存性があることがわかる。したがって、両者のインピーダンスの違いは、周波数依存性がある測定電極と溶液との界面に形成される容量によるものであることがわかる。尚、基準電極と溶液との界面に形成される容量によるインピーダンスにも周波数依存性があるが、基準電極の構成に関し、両者に差異はないため、かかるインピーダンスは、図１２の測定結果におけるインピーダンスの差異には寄与していないと考えることができる。
【００８４】
したがって、低周波領域における実施例１のインピーダンスと比較例１のインピーダンスとの比較は、測定電極界面での容量のインピーダンスの比較であるといえ、低周波領域において実施例１における測定電極界面での容量のインピーダンスは、比較例１のものと比較して１０分の１以下であるといえる。
【００８５】
上記インピーダンスの測定結果から、実施例１及び比較例１の測定電極界面の電気二重層容量を計算したところ、実施例１では１６５μＦ／ｃｍ2、比較例１では１０μＦ／ｃｍ2となった。電気二重層容量は印加電圧や電解質の濃度によって異なるが、上記計算値は印加電圧が０Ｖであり、電解質濃度が０．１Ｍにおける値である。
【実施例２】
【００８６】
実施例１、比較例１と同様のセンサ部を作製し、それぞれのセンサ部に細胞接着性たん白質であるコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４５１１）を固定化材料として電極表面を含むセンサ部上に所定の方法で１時間被覆した（３７℃雰囲気下）。このように作製したセンサ部を実施例２（ＰＥＩ被覆有り）、比較例２（ＰＥＩ被覆無し）のセンサ部とした。
【００８７】
それぞれのセンサ部にアクリル製の隔壁部材を接着し、溶液保持領域を形成した後、溶液保持領域内を培養液で満たし、ラット大動脈由来平滑筋細胞ＶＳＭＣｓ Ａ−１０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４７６）を２×１０4細胞／ｍｌの濃度となるように播種し、ＣＯ2インキュベータ中で５日間培養した（３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下）。培養液はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いた。実施例２、比較例２のセンサ部を用いて測定される電圧（基準電極及び測定電極間の電圧）をそれぞれ図１３、図１４に示す。横軸は時間、縦軸は電圧（すなわち細胞の活動を表す電位の強さ）を示す。図１３で検出される細胞の周期的活動が、図１４ではほとんど検出されない。尚、図１４においても円で囲んだ箇所で周期的変化が検出されているが、図１３と比較した場合、電気信号の変化は小さいものである。
【実施例３】
【００８８】
実施例１、比較例１と同様のセンサ部を作製し、実施例３（ＰＥＩ被覆有り）、比較例３（ＰＥＩ被覆無し）のセンサ部とした。
【００８９】
それぞれのセンサ部にアクリル製の隔壁部材を接着し、溶液保持領域を形成した後、溶液保持領域内を培養液で満たし、ラット大動脈由来平滑筋細胞Ａ７ｒ５を１×１０6細胞／ｍｌの濃度となるように播種し、ＣＯ2インキュベータ中で培養した（３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下）。培養液はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを用いた。実施例３、比較例３の２日間培養後のセンサ部上面の実体顕微鏡写真をそれぞれ、図１５、図１６に示す。ラット大動脈由来平滑筋細胞Ａ７ｒ５は、単離時には、溶液の圧力を等方的に受け、球形となる。そして、基板に定着後、前記細胞は、細胞内部の細胞骨格を伸張させ、紡錘形状へと変化する。図１５と図１６に示す実体顕微鏡写真の比較からわかるように、実施例３では、細胞の定着が進行しているが、比較例３では細胞がほとんど定着していない。すなわち、センサ基板上の電極上面をＰＥＩで被覆するか否かによって、電極上面での細胞の定着性に差が生じることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の一体型電極および細胞固定化器は、細胞の電気生理的変化に関する評価を簡便かつ高速に行う装置を構成するために有用である。このような装置は、例えば、薬品スクリーニング、神経細胞間で形成されるネットワークに関する解析を行う際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、第１の実施形態の細胞外電位測定装置の構成を模式的に示す断面図である。
【図２】図２は、第１の実施形態の細胞外電位測定装置の構成を模式的に示す、図１のＡ−Ａ矢視断面図である。
【図３】図３は、第１の実施形態の細胞外電位測定装置の概略図である。
【図４】図４は、第２の実施形態の細胞固定化器のセンサ部の上面図である。
【図５】図５は、第３の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す断面図である。
【図６】図６は、第３の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す、図５のＢ−Ｂ矢視断面図である。
【図７】図７は、第４の実施形態の細胞固定化器のセンサ部の上面図である。
【図８】図８は、第５の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す断面図である。
【図９】図９は、第６の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す断面図である。
【図１０】図１０は、第６の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す、図９のＣ−Ｃ矢視断面図である。
【図１１】図１１は、第７の実施形態の細胞固定化器のセンサ部の上面図である。
【図１２】図１２は、印加周波数に対する実施例１、比較例１のインピーダンスの測定結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例２の測定結果（経過時間に対する電圧）を示す図である。
【図１４】図１４は、比較例２の測定結果（経過時間に対する電圧）を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例３の実体顕微鏡写真を示す図である。
【図１６】図１６は、比較例３の実体顕微鏡写真を示す図である。
【図１７】図１７は、パッチクランプ法の原理を模式的に示す断面図である。
【図１８】図１８は、電気分解により堆積された白金黒の表面のＳＥＭ写真である。
【符号の説明】
【００９２】
１，１ｂ，１ｄ    基板
４    隔壁部材
５    培養液
６    細胞
９，９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ，９ｅ，９ｆ    リード線
１１，１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄ，１１ｅ，１１ｆ  電極
１２，１２ｂ，１２ｄ，１２ｅ  誘電体層
１３  参照電極
１４ｂ，１４ｃ，１４ｄ，１４ｅ，  貫通孔
１６，１６ａ，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄ，１６ｅ，１６ｆ  センサ部
１７  溶液保持部
１９，１９ａ，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄ，１９ｅ，１９ｆ  細胞固定化器
３３  信号増幅部
３４  刺激信号付与部
３５  撮像部
３６  載置部
３８  溶液駆動部
３９  制御部
４０  細胞外電位測定装置
【図１】
2004166692.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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