(57)【要約】【課題】大量の昆虫の組換えウイルスによる感染率を高める飼料の製造方法及び大量の昆虫に同時に経口的に組換えウイルスを接種させる方法を提供する。【解決手段】昆虫用粉体人工飼料およびキチン合成阻害剤を含む、昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫用粉体人工飼料およびキチン合成阻害剤を含む、昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【請求項２】
キチン合成阻害剤が、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジンからなる群から選択される、請求項１記載の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【請求項３】
昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、請求項１または２記載の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【請求項４】
昆虫が、カイコである請求項３記載の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【請求項５】
組換えウイルスが組換えバキュロウイルスである、請求項１から４のいずれか１項に記載の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【請求項６】
昆虫用粉体人工飼料５００ｇ当たり、チキン合成阻害剤を０．０００５〜５ｇ含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料。
【請求項７】
粉体人工飼料１０〜１０００００ｇ、キチン合成阻害剤０．００００１〜１０００ｇ、水２５〜２５００００ｍＬを混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れて、オートクレーブで加熱することからなる組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法。
【請求項８】
昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、請求項７記載の昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法。
【請求項９】
昆虫が、カイコである請求項８記載の昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法。
【請求項１０】
キチン合成阻害剤が、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジンからなる群から選択される、請求項７から９のいずれか１項に記載の組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法。
【請求項１１】
オートクレーブによる加熱が、１００〜１２１℃、１０〜３０分である請求項７から１０のいずれか１項に記載の組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法。
【請求項１２】
飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法であって、飼育している大量の昆虫に請求項１記載の方法により製造した飼料を与え、２〜２４時間後に、組換えウイルス液を塗布した飼料を与えることにより組換えウイルス液塗布飼料を給餌することを含む、方法。
【請求項１３】
昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、請求項１２記載の飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法。
【請求項１４】
昆虫が、４齢または５齢のカイコである請求項１２または１３記載の飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫のウイルスに対する感染率を高める飼料の製造方法および該飼料を用いた効率的なウイルス接種方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子組換え技術を利用して、カイコで有用タンパク質を生産する技術が実用化されている。例えば、カイコ核多角体病ウイルスをベクターとして利用する方法がある（例えば、特許文献１および特許文献２を参照）。これらの方法は、カイコ核多角体病ウイルスの有する多角体遺伝子をインターフェロン等の他の有用物質をコードする遺伝子に置き換えて組換えウイルスを調製し、これを５齢カイコに接種して感染させ、４〜８日後に組換え体ウイルスが増殖の過程でカイコ細胞中で産生し、体液中に分泌した有用物質を採取、分離、精製するというものである。
【０００３】
このようなカイコを利用した遺伝子組換えの技術は、宿主となるカイコが、従来用いられている大腸菌や酵母と比べて遺伝的に人間に近いものであるため、産生有用物質の活性や抗原性の点等から好ましい。
【０００４】
この際、カイコへのウイルス接種法として（１）カイコに一頭ずつウイルスを注射する、（２）５齢カイコを低温処理してウイルスを経口接種する、および（３）カイコに蛍光増白剤を加えた飼料を食下させてウイルス感受性を高めた後にウイルスを経口接種する方法が知られている（特願２００１−３０８６０３号、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ０２／０９８５４）。しかし、（１）の方法は作業効率が悪く大量のカイコを処理するには適さない。また、（２）の方法は低温処理設備を必要とし、大量のカイコを処理するのに適さない。さらに、（３）の方法は、カイコの発育が遅れる傾向が認められ、適用できるカイコの品種も限定される。また、蛍光増白剤の効果が長期間持続するために夾雑する病原体がカイコに感染する機会も増すので、清浄な環境を維持する手段が必要とされる。
【０００５】
また、野生型の非組換え核多角体病ウイルスのカイコに対する感染が、キチン合成阻害剤であるフルフェノクスロンおよびニッコーマイシンにより促進されるという報告はあったが（例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照）、野生型ウイルスと組換えウイルスの感染機構は異なると考えられており、野生型ウイルスで得られた結果は組換えウイルスには適用できなかった。すなわち、核多角体病ウイルスは、感染機構の異なる２種類のウイルス粒子を作ることが知られている。一つは「経口感染型ウイルス」であり、もう一つは「組織間感染型ウイルス」である。これらは感染性が異なり、経口感染型ウイルスは経口接種した場合にはよく感染するが昆虫に注射により接種した場合は感染せず、また組織間感染型ウイルスは注射により接種した場合にはよく感染するが経口接種しても感染しないというのが、当業界での通説であった。「遺伝子組換え核多角体病ウイルス」または「バキュロウイルスベクター」という場合、「組織間感染型ウイルス」を意味する。上記報告においては、カイコ核多角体病ウイルスの「経口感染型ウイルス」を用いており、経口感染して当然であり、経口感染型ウイルスの経口感染を促進する物質が、組織間感染型ウイルスの感染を促進するとは予測できなかった。
【０００６】
さらに、カイコだけではなくクスサン、サクサン等の昆虫を用いた有用物質の産生も可能であり、これらの昆虫全般へ効率的に組換えウイルスを感染させる方法の確立が望まれている。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭６１−９２８８号公報
【特許文献２】
特開昭６２−２０８２７６号公報
【非特許文献１】
Ｔ．ＡＲＡＫＡＷＡ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．３７（１）、２００２、ｐ．７−１１
【非特許文献２】
Ｔ．ＡＲＡＫＡＷＡ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｚｏｏｌ．３７（３）、２００２、ｐ．３９３−３９７
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大量の昆虫へ労力を要しないで効率よく接種することができ、しかも作業者の人数を大幅に減少することができ、しかも昆虫の種類および品種を問わずウイルスを経口感染させることが可能でかつ外来病原体の夾雑を防止する手間を軽減し得る、昆虫へのウイルスの感染を促進し得る飼料、該飼料の製造方法および該飼料を用いた昆虫に組換えウイルスを感染させる方法を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討の結果、昆虫の人工飼料をキチン合成阻害剤を含んだ水と混合して攪拌磨砕し、オートクレーブで加熱した飼料を昆虫に摂食させ、次いでウイルスを混ぜた飼料を摂食させることにより、ウイルスの種類に拘わらず、手間をかけずに一度に大量の昆虫に組織間感染型ウイルスである組換えウイルスを感染させることができ、しかも外来病原体の夾雑の問題も解決し得ることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  昆虫用粉体人工飼料およびキチン合成阻害剤を含む、昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
（２）  キチン合成阻害剤が、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジンからなる群から選択される、（１）の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
【００１１】
（３）  昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、（１）または（２）の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
（４）  昆虫が、カイコである（３）の昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
【００１２】
（５）  組換えウイルスが組換えバキュロウイルスである、（１）から（４）のいずれかの昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
（６）  昆虫用粉体人工飼料５００ｇ当たり、チキン合成阻害剤を０．０００５〜５ｇ含む、（１）から（５）のいずれかの昆虫への組換えウイルスの感染率を高める飼料、
【００１３】
（７）  粉体人工飼料１０〜１０００００ｇ、キチン合成阻害剤０．００００１〜１０００ｇ、水２５〜２５００００ｍＬを混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れて、オートクレーブで加熱することからなる組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
（８）  昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、（７）の昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
【００１４】
（９）  昆虫が、カイコである（８）の昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
（１０）  キチン合成阻害剤が、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジンからなる群から選択される、（７）から（９）のいずれかの組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
【００１５】
（１１）  オートクレーブによる加熱が、１００〜１２１℃、１０〜３０分である（７）から（１０）のいずれかの組換えウイルスによる昆虫の感染率を増加させる飼料の製造方法、
（１２）  飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法であって、飼育している大量の昆虫に（１）の方法により製造した飼料を与え、２〜２４時間後に、組換えウイルス液を塗布した飼料を与えることにより組換えウイルス液塗布飼料を給餌することを含む、方法、
【００１６】
（１３）  昆虫が、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からなる群から選択される、（１２）の飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法、および
【００１７】
（１４）  昆虫が、４齢または５齢のカイコである（１２）または（１３）の飼育している大量の昆虫に組換えウイルスを同時に経口的に接種する方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
１．本発明に用いる昆虫、ウイルスおよび昆虫用人工飼料
本発明において用いられる昆虫については特に制限はなく、いずれの昆虫も用いることができが、好ましくは、遺伝子工学の技法により有用物質の産生技術が確立している昆虫である。例えば、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クスサン（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）、エリサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、タサールサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、アメリカシロヒトリ（Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ）、エビガラスズメ（Ａｇｒｉｕｓ  ｃｏｎｖｏｌｖｕｌｉ）、タバコスズメガ（Ｍａｎｄｕｃａ  Ｓｅｘｔａ）、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）、ヘリコベルパ・アサルト（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、アワヨトウ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、セクロピアサン（Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ  ｃｅｃｒｏｐｉａ）、ヤママユガ（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）が好ましい昆虫として挙げられる。ここで、ヘリオシス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ヘリコベルパ・ジー（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）およびヘリコベルパ・アサルタ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｓｓｕｌｔａ）は一般名タバコガに含まれる種類である。特に好ましい昆虫はカイコである。カイコは、一般に普及している品種を用いることができ、例えばＢＮＳＬ１×ＢＣＳＬ１、日１３７号×支１４６号、秋光×竜白、錦秋×鐘和、芙蓉×東海などの交雑品種が好適に用いられる。また、カイコは４齢または５齢のものが好ましい。
【００１９】
本発明のウイルスの昆虫への感染率を高める飼料のベースとなる飼料としては、市販の人工飼料を用いることができ、例えばシルクメート（登録商標、日本農産工業社製）を用いることができる。人工飼料は、粉末のものが望ましいが、ペレット状の飼料を粉砕して用いてもよい。粉末状の人工飼料を、キチン合成阻害剤と混合し、加熱殺菌することにより本発明の飼料を得ることができる。キチン合成阻害剤は、限定されないが、ポリオキシン、ニッコーマイシン、ウリジン２リン酸、ウリジン３リン酸、シトシン２リン酸、シトシン３リン酸、キャプタン、キャプタホール、ダイホルタン、ジクロフルアニド、１シトロネリル２メチルベンズイミダゾール、１ゲラニル２メチルベンズイミダゾール、バーバン、Ｈ−２４１０８、プラムバジン、ブプロフェジン、ジフルベンズロン、クロルフルアズロン、フルフェノクスロン、ルフェヌロン、テフルベンズロン、アロサミジン等が挙げられ、この中でもポリオキシン、ニッコーマイシン、キャプタン、フルフェノクスロンが好ましい。ポリオキシンとしては例えば、科研製薬株式会社製のポリオキシンＡＬ水和剤を用いることができる。
【００２０】
粉末状の人工飼料にキチン合成阻害剤を最終濃度（Ｗ／Ｗ）が０．０２５〜２．５％となるように混合し、さらに水を人工飼料５００ｇに対して１０００〜２０００ｍＬ添加し、十分に攪拌磨砕する。その後耐熱性ポリ袋に入れ、オートクレーブ等により加熱処理することにより本発明のキチン合成阻害剤を含有し、昆虫へのウイルス感染率を高める人工飼料を得ることができる。ここで用いる耐熱性ポリ袋の素材は限定されないが、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ、ＭＤＰＥ）、無延伸ポリプロピレン（ＣＰＰ）等が用いられる。加熱処理は、７０℃〜１２１℃、好ましくは１００℃〜１０５℃で１０〜３０分間行えばよい。
【００２１】
昆虫に投与するウイルス量は、使用する組換えウイルスの種類、産生させるべき有用タンパク質の種類により変わるが、組換えウイルスに感染させた昆虫の体液の遠心上清、または組換えウイルスに感染させた培養細胞の培養上清を、希釈しないでそのまま用いてもよいし、または１０万倍までのいずれかの倍率で希釈したものを用いてもよい。好ましくは、前記上清を１００倍から１０００倍に希釈したものを用いる。例えばカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）を用いる場合は、核多角体病蚕体液の遠心上清の０．１％液を飼料に塗布して、数時間食下させればよい。
【００２２】
本発明において、用いられる組換えウイルスは限定されず、外来の有用タンパク質をコードする遺伝子を有する組換えウイルスを用いることができる。組換えウイルスの例としては、カイコ核多角体病ウイルス等のバキュロウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス等が挙げられる。上述の昆虫種ごとに適したウイルスがあり、例えばオートグラファ・カリフォルニカ、イラクサギンウワバ、スポドプテラ・フルギペルダ、ヘリオシス・ビレセンス、ヘリコベルパ・ジーおよびタバコスズメガには遺伝子組換えＡｃＮＰＶが、カイコには遺伝子組換えＢｍＮＰＶが、アメリカシロヒトリには遺伝子組換えＨｙｃｕＮＰＶが、シンジュサンには遺伝子組換えＡｎｐｅＮＰＶが、サクサンにはＨｙｃｕＮＰＶおよびＡｎｐｅＮＰＶが好適に用いられる。ここに挙げたウイルスは、すべて核多角体病ウイルスの一種である。ここで、外来の遺伝子とは、組換えられるウイルスが元々有する遺伝子以外の遺伝子をいう。例えば、カイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（ＢｍＮＰＶ  ＤＮＡ）の多角体蛋白構造遺伝子部分に、目的とする有用タンパク質の遺伝子を組み込んだものが挙げられる。組換えウイルスの調製は常法にしたがって行なうことができる。例えば、カイコ核多角体病ウイルスの多角体タンパク質発現プロモーターを含むプラスミドを調製し、このプロモーターの下流に目的とする有用タンパク質をコードする遺伝子を組み込み、トランスファーベクターを調製する。次いで、このトランスファーベクターと予めクローン化してあるカイコ核多角体病ウイルスとでカイコ樹立細胞をコ・トランスフェクトさせ、形質転換された組換えウイルスを同じくカイコ樹立細胞中で培養増殖し、その細胞を破壊するかまたは培養上清を採取して組換えウイルスを取得すれば良い。
【００２３】
なお、本発明で用いる組換えウイルスは、組織間感染型ウイルスであり、従来経口接種しても昆虫に感染しないと考えられており、本発明の方法によれば、組織間感染型ウイルスであっても、経口的に効率よく感染させることができる。
【００２４】
２．昆虫へのウイルス接種および飼育方法
本発明の昆虫へのウイルス接種および飼育方法によれば、効率的に一度に大量の昆虫を飼育し、ウイルス接種を行うことができる。昆虫の数は、必要に応じて増減することができるが、一度に数百頭から数百万頭程度飼育することができる。
例えば、昆虫がカイコである場合、以下の方法によりウイルス接種を行うことができ、カイコ以外の他の昆虫も同様の方法によりウイルス接種を行うことができる。
【００２５】
大量のカイコを、蚕箔（蚕座）等に載せて温度および湿度を適度に調節して飼育し、蚕箔上のカイコに上述のキチン合成阻害剤含有人工飼料を給餌する。この際、人工飼料の量は蚕が２０〜２４時間で完全に食下できる量、例えば５齢カイコ１，０００頭当たり１，４００ｇが望ましい。次いで、ウイルスを塗布した飼料をキチン合成阻害剤含有人工飼料を食下したカイコに給餌する。この際の飼料の量は、カイコが数時間、例えば６時間で食下できる量が望ましく、その量は例えば、５齢カイコ１，０００頭当たり約６００ｇである。給餌はカイコが通過可能な網の上に載せてカイコを飼育している蚕箔に網ごと載せるのが好ましい。このようにすることにより、カイコを移す手間が省け、またウイルス塗布飼料を食下したカイコが網の上に載っているので、大量のカイコを一度に網ごと移動させることができる。その後、ウイルス塗布飼料を食下したカイコを網ごと、数日分の飼料を載せた蚕箔上に載せて、飼育する。一定の飼育日数で安定した目的のタンパク質を得ることができる。例えば、組換えウイルスとしてカイコ核多角体病ウイルスを使用し、約２５℃の一定の温度で飼育した場合、感染したカイコ幼虫は投与後５日目には核多角体病（膿病）特有の病徴を呈し、有用物質の産生が進行する。
なお、上記のキチン合成阻害剤含有飼料のカイコへの投与量、食下に要する時間は一例であり、本発明はこれらの記載によっては限定されない。
【００２６】
昆虫体内で産生された目的タンパク質を回収することにより目的タンパク質を得ることができる。例えば、昆虫がカイコの場合、以下の方法により目的タンパク質の回収・分離を行うことができる。カイコ以外の昆虫も同様の方法で目的タンパク質の回収・分離を行うことができる。
【００２７】
カイコ体中で産生された目的タンパク質の回収・分離は、カイコ体中に目的タンパクが最も多く蓄積される感染後４〜６日目にカイコ体液を採取し、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の各種分離手段により有用タンパク質を取得、精製することによりできる。また、別の手段としては、カイコを摺りつぶし、ＳＤＳ水溶液、尿素水溶液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液等で抽出した後、あるいは加熱処理により夾雑タンパク質を変性除去した後に、常法処理によって有用タンパク質を分離、採取する方法が挙げられる。更に別の手段としては、摺りつぶしたカイコをリン酸バッファー等に懸濁させ、超音波処理したのち血球等の、そのタンパク質と特異的に結合する物質を加えて有用タンパク質を取得する方法を挙げることができる。
【００２８】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕  カイコへのウイルスの感染率を高める飼料の製造
粉体の人工飼料（市販のシルクメート（登録商標）、日本農産工業社製）５００ｇとキチン合成阻害剤であるポリオキシンＡＬ水和剤（科研製薬株式会社製）９．４ｇ、および水１３５０ｍｌを混合し、攪拌磨砕し、耐熱性ポリ袋に入れ、さらにオートクレーブで１０５℃で１５分間加熱滅菌した。加熱滅菌後成形し、使用時まで４℃で保存した。本飼料をポリオキシン飼料と称する。
【００２９】
〔実施例２〕  カイコへのウイルス接種
（１）５齢起蚕（５齢１日目カイコ）へのウイルス接種
実施例１のポリオキシン飼料１４００ｇを５齢起蚕（品種は表１に示す）１０００頭に与えて２４時間食下させた。次いで薄切した普通飼料６００ｇにＢｍＮＰＶ液（核多角体病蚕体液の遠心上清の１０００倍希釈液）５０ｍＬを洗浄瓶を用いて全面に塗布したものを与えて、飼育を継続し、ウイルス感染率を測定した。ウイルス感染率は、それぞれのカイコから体液を採取し、ＢｍＮＰＶの感染の有無を調べ、感染率を算出した。なお、ポリオキシン飼料の代わりに普通飼料を与えたものを対照とした。
（２）４齢起蚕へのウイルス接種
実施例１のポリオキシン飼料３０ｇを４齢起蚕（品種は表１に示す）１００頭に与えて２４時間食下させた。次いで薄切した普通飼料６０ｇにＢｍＮＰＶ液（核多角体病蚕体液の遠心上清の１０００倍希釈液）を５ｍＬを洗浄瓶を用いて全面に塗布したものを与えて、飼育を継続し、ウイルス感染率を測定した。ウイルス感染率は、それぞれのカイコから体液を採取し、ＢｍＮＰＶの感染の有無を調べ、感染率を算出した。なお、ポリオキシン飼料の代わりに普通飼料を与えたものを対照とした。
結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
表に示すように、ポリオキシン投与区のカイコでは全数がＢｍＮＰＶに感染していた。
なお、図１には、本発明のカイコへのウイルス接種の具体的な一例を示す。図１に示す方法は以下の通りである。１０００頭の５齢起蚕のカイコを蚕箔に載せ、実施例１のポリオキシン飼料一日分を蚕箔上に置きカイコに食下させた（図１ａ）。２０〜２４時間後カイコが食下した後に、ＢｍＮＰＶ液（核多角体病蚕体液を０．１％となるように蒸留水で希釈したもの）を洗浄瓶を用いて全面に塗布した普通飼料をカイコが通過可能な大きさの網目を有する網の上に置き、網ごと蚕箔上のカイコの上に載せた（図１ｂ）。カイコがＢｍＮＰＶ塗布飼料を完全に食下した６時間後、カイコは蚕箔から網の上に移っており（図１ｃ）、網ごと別の蚕箔上に置いた４日分の普通飼料の上に載せた（図１ｄ）。飼料の乾燥とカイコの這い出しを防ぐために蓋をし、４日間放置した。
【００３２】
【発明の効果】
実施例に示すように、本発明のキチン合成阻害剤を含む人工飼料を、ウイルス感染前に給餌した昆虫はウイルスに感染しやすくなっており、本発明の方法により、一度に大量の昆虫に効率的にウイルスを感染させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ｂ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ｃ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ｄ】キチン合成阻害剤含有飼料を用いて大量のカイコにウイルスを経口的に接種する方法を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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