(57)【要約】【課題】容易かつ低コストで合成可能なアノマー混合物である１−リン酸化糖を反応基質とする汎用性の高いヌクレオシドの製法を提供する。【解決手段】非天然型の１−リン酸化糖のアノマー混合物と塩基との反応をホスホリラーゼ活性の作用により行う際に、１−リン酸化糖のリン酸基と塩基との交換反応をアノマー選択的に行う。また、反応液にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを存在させることにより、反応の副生成物であるリン酸イオンを難水溶性の塩として沈殿させ、反応の平衡をヌクレオシド合成方向へ移動させることにより反応収率が向上させる。また、交換反応速度の差を利用してヌクレオシドの光学異性体の一方が多く含まれる混合物を得ることができる。【効果】アノマー混合物である１−リン酸化糖を反応基質とする汎用性の高いヌクレオシドの製法が容易かつ低コストで提供できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不斉炭素に起因する異性体以外の構造的特徴ゆえに非天然である１−リン酸化糖のアノマー混合物にヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりリン酸残基と塩基との交換反応を行い、アノマー選択的にヌクレオシドを製造する方法であって、
前記アノマー混合物がＤ体のアノマーを含み、該Ｄ体アノマーのα−Ｄ−体のリン酸基を選択的に塩基と交換し、β−Ｄ−ヌクレオシドを得る工程と、
前記アノマー混合物がＬ体のアノマーを含み、該Ｌ体アノマーのβ−Ｌ−体のリン酸基を選択的に塩基と交換し、α−Ｌ−ヌクレオシドを得る工程と、
の少なくとも一方の工程を有することを特徴とするヌクレオシドを製造する方法。
【請求項２】
前記アノマー混合物がＤ／Ｌラセミ体のアノマー混合物である請求項１記載のヌクレオシド製造法。
【請求項３】
前記Ｄ／Ｌラセミ体のアノマー混合物に含まれるα−Ｄ−体における前記交換反応の反応速度がβ−Ｌ−体の前記交換反応における反応速度よりも大きいことを利用して、β−Ｄ−ヌクレオシドがα−Ｌ−ヌクレオシドよりも多い反応混合物を得る請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アノマー混合物がＤ体のアノマー混合物である請求項１記載のヌクレオシド製造法。
【請求項５】
前記アノマー混合物がＬ体のアノマー混合物である請求項１記載のヌクレオシド製造法。
【請求項６】
前記１−リン酸化糖が式（１）：
【化１】
2004313002.tif 000017
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、保護されたヒドロキシメチル基、カルボキシル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、−（ＮＨＲ４）を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、Ｒ４はアシル基を表わし、ｎは０または１を表し、ｍ及びｑは、それぞれ独立してＺが酸素原子またはイオウ原子の場合は０から３の整数を表し、Ｚが炭素原子の場合は０から４の整数のいずれかを表わし、ｑが２以上の場合における複数のＸはそれぞれ独立に上記の基のいずれかを表わす。）
で示される請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
【請求項７】
前記１−リン酸化糖が式（２）：
【化２】
2004313002.tif 000018
（式中、Ｗ、Ｚは、前記と同義。Ｒ３は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアルコキシ基または置換されていてもよいアルキルチオ基を表す。）で示される請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
【請求項８】
前記１−リン酸化糖が式（３）：
【化３】
2004313002.tif 000019
で示される請求項１〜５のいずれかに記載の製造法。
【請求項９】
前記塩基がピリミジン、プリン、アザプリンまたはデアザプリンである請求項１〜８のいずれかに記載の製造法。
【請求項１０】
前記塩基が、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）または６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）である請求項１〜８のいずれかに記載の製造法。
【請求項１１】
前記塩基が式（４）：
【化４】
2004313002.tif 000020
で示される請求項１から８のいずれかに記載のヌクレオシド製造法。
【請求項１２】
前記交換反応を水性媒体中で行い、該水性媒体中にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンを存在させる請求項１から１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
前記金属カチオンが、カルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンから選ばれる１種類以上の金属カチオンである請求項１２記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ウイルス医薬品、抗ガン医薬品やアンチセンス医薬品などの原料または原体として使用されるヌクレオシド化合物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヌクレオシドは、抗ウイルス医薬品、抗ガン医薬品やアンチセンス医薬品などの原料または原体として重要な化合物であり、数々の合成法が知られている。
【０００３】
ヌクレオシドの合成法としては、例えばＯｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ＶＯＬＵＭＥ５５（２０００，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）が総説としてあげられる。また、近年、抗ウイルス薬として非天然型ヌクレオシドが注目されており、例えばチオキソラン構造を有する化合物が、ＥＰ３８２５２６、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ２０００，２５（８），８５５−８５７、ＷＯ  ０００９４９４、ジオキソラン構造を有する化合物が、特表平８−５０１０８６号公報、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ  ２０００，２５（５），４５４−４６１、ＷＯ  ００３９１４３等で知られている。
【０００４】
一方、ヌクレオシドホスホリラーゼはリン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を加リン酸分解できる酵素の総称であり、次式で示される反応を触媒する。
【０００５】
ヌクレオシド  ＋  リン酸（塩）  →  塩基  ＋１−リン酸化糖
この酵素反応は可逆的であり、逆反応を利用した各種ヌクレオシドの合成が以前より知られている。例えば、２’−デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基（チミン、アデニンまたはグアニン）からチミジン（特開平０１−１０４１９０号公報）、２’−デオキシアデノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）または２’−デオキシグアノシン（特開平１１−１３７２９０号公報）を製造する方法が開示されている。
【０００６】
更に、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５０（１），ＰＰ．１２１〜１２６，（１９８６）では、イノシンをリン酸存在下で、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼを用いた反応により、リボース１−リン酸とヒポキサンチンに分解した後、イオン交換樹脂で単離したリボース１−リン酸と１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドより、同じくＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来のプリンヌクレオシドホスホリラーゼにより、抗ウイルス剤であるリバビリンを製造する技術が報告されている。
【０００７】
さらに、Ｌ体のヌクレオシドの合成に関しては、ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＳ  ＆  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ，１３（８），１６７９〜１６９３（１９９４）において化学合成により合成したα−Ｌ−ピリミジンヌクレオシドから、酵素によるα−Ｌ−プリンヌクレオシドの合成が報告されているが、Ｄ／Ｌラセミ体からの光学活性なヌクレオシドの合成例は未だ報告されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、１−リン酸化糖の工業的な製造方法が未確立であるため、ヌクレオシドホスホリラーゼの逆反応を利用した汎用性の高いヌクレオシドの工業的な製造方法についても未確立であった。さらに、原料となる糖の光学活性体が天然から容易に得られる場合を除き、非天然糖の多くが、１）多工程の不斉合成、２）高価な光学活性体の原料より合成、３）光学活性体の混合物の煩雑な分離精製などの方法により製造されている。従って、容易かつ低コストで得られるアノマー混合物からなる非天然糖からの簡便な光学活性ヌクレオシドの製造法が望まれていた。また、該酵素の逆反応を利用して、１−リン酸化糖誘導体と塩基よりヌクレオシドを生成させる反応は平衡反応であるため、転化率が向上しないという技術的欠点も存在していた。
【０００９】
本発明の課題は、容易かつ低コストで合成可能なアノマー混合物である１−リン酸化糖を反応基質とする汎用性の高いヌクレオシドの製法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行い、非天然型の１−リン酸化糖のアノマー混合物（Ｄ／Ｌラセミ体もしくはＤ体もしくはＬ体）と塩基をホスホリラーゼ活性の作用により反応させて１−リン酸化糖のリン酸基と塩基との交換反応を行うことにより、アノマー選択的に該交換反応が進行し、効率的にヌクレオシドを製造し得ることを見出した。また、反応液にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンを存在させることにより、反応の副生成物であるリン酸イオンが難水溶性の塩として沈殿し、反応の平衡がヌクレオシド合成方向へ移動するために反応収率が向上することも見出した。更に、Ｄ／Ｌラセミ体のアノマー混合物が、α−Ｄ−体とβ−Ｌ−体とを含む場合に、α−Ｄ−体における交換反応速度がβ−Ｌ−体における交換反応速度よりも大きいこと、更には、この反応速度差を利用してβ−Ｄ−ヌクレオシドがα−Ｌ−ヌクレオシドよりも多量に含まれる混合物が得られる点を見出した。
【００１１】
これらの知見により、本発明を完成するに至ったものである。
【００１２】
本発明には、以下の各態様が含まれる。
（１）  不斉炭素に起因する異性体以外の構造的特徴ゆえに非天然である１−リン酸化糖のアノマー混合物にヌクレオシドホスホリラーゼの作用によりリン酸残基と塩基との交換反応を行い、アノマー選択的にヌクレオシドを製造する方法であって、
前記アノマー混合物がＤ体のアノマーを含み、該Ｄ体アノマーのα−Ｄ−体のリン酸基を選択的に塩基と交換し、β−Ｄ−ヌクレオシドを得る工程と、
前記アノマー混合物がＬ体のアノマーを含み、該Ｌ体アノマーのβ−Ｌ−体のリン酸基を選択的に塩基と交換し、α−Ｌ−ヌクレオシドを得る工程と、
の少なくとも一方の工程を有することを特徴とするヌクレオシドを製造する方法。
【００１３】
（２）  前記アノマー混合物がＤ／Ｌラセミ体のアノマー混合物である上記（１）項に記載のヌクレオシド製造法。
【００１４】
（３）  前記Ｄ／Ｌラセミ体のアノマー混合物に含まれるα−Ｄ−体における前記交換反応の反応速度がβ−Ｌ−体の前記交換反応における反応速度よりも大きいことを利用して、β−Ｄ−ヌクレオシドがα−Ｌ−ヌクレオシドよりも多い反応混合物を得る上記（２）項に記載の製造方法。
【００１５】
（４）  前記アノマー混合物がＤ体のアノマー混合物である上記（１）項に記載のヌクレオシド製造法。
【００１６】
（５）  前記アノマー混合物がＬ体のアノマー混合物である上記（１）項に記載のヌクレオシド製造法。
【００１７】
（６）  前記１−リン酸化糖が式（１）：
【００１８】
【化５】
2004313002.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、保護されたヒドロキシメチル基、カルボキシル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、−（ＮＨＲ４）を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、Ｒ４はアシル基を表わし、ｎは０または１を表し、ｍ及びｑは、それぞれ独立してＺが酸素原子またはイオウ原子の場合は０から３の整数を表し、Ｚが炭素原子の場合は０から４の整数のいずれかを表わし、ｑが２以上の場合における複数のＸはそれぞれ独立に上記の基のいずれかを表わす。）
で示される上記（１）〜（５）項のいずれかに記載の製造法。
【００２０】
（７）  前記１−リン酸化糖が式（２）：
【００２１】
【化６】
2004313002.tif 000003
【００２２】
（式中、Ｗ、Ｚは、前記と同義。Ｒ３は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、置換されていてもよいアルコキシ基または置換されていてもよいアルキルチオ基を表す。）で示される上記（１）〜（５）項のいずれかに記載の製造法。
【００２３】
（８）  前記１−リン酸化糖が式（３）：
【００２４】
【化７】
2004313002.tif 000004
【００２５】
で示される上記（１）〜（５）項のいずれかに記載の製造法。
【００２６】
（９）  前記塩基がピリミジン、プリン、アザプリンまたはデアザプリンである上記（１）〜（８）項のいずれかに記載の製造法。
【００２７】
（１０）  前記塩基が、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）または６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）である上記（１）〜（８）項のいずれかに記載の製造法。
【００２８】
（１１）  前記塩基が式（４）：
【００２９】
【化８】
2004313002.tif 000005
【００３０】
で示される上記（１）〜（８）項のいずれかに記載のヌクレオシド製造法。
【００３１】
（１２）  前記記交換反応を水性媒体中で行い、該水性媒体中にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンを存在させる上記（１）〜（１１）項のいずれかに記載の製造方法。
【００３２】
（１３）  前記金属カチオンが、カルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンから選ばれる１種類以上の金属カチオンである上記（１２）項に記載の製造方法。
【００３３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３４】
本発明で用いられる１−リン酸化糖を得るための糖類は、天然型に対して不斉炭素に起因する異性体としての非天然型以外の構造的特徴において非天然型のもの、すなわち、人工的な構造変更、例えば人工的な置換基の導入などによる修飾に起因する非天然型のものである。従って、この構造変更による非天然型には、天然型に対する不斉炭素に起因する異性体としての非天然型そのものは含まれない。
【００３５】
このような非天然型の糖類としては、例えば、ピラノース型あるいはフラノース型の糖類に対して人工的な修飾加えたもの、例えば、これらにカルボキシル基などを導入した糖誘導体、これらの有するアミノ基や水酸基などを保護基で保護した糖誘導体、これらが有する水酸基がハロゲン原子で置換されたハロゲン化糖誘導体、２，３−ジデオキシリボースやジオキソラン糖、チオキソラン糖などの非天然型糖類を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明において規定される非天然型の糖類を得る場合に用いることのできる天然型の糖類としては、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−リキソース、Ｄ−リボースのようなアルドペントース；Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｄ−リブロースのようなケトペントース；Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノースのようなアルドヘキソース；Ｄ−タガトース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−プシコース、Ｄ−フルクトースのようなケトヘキソース；Ｄ−２−デオキシリボース、Ｄ−２，３−ジデオキシリボース；Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−ラムノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フコピラノース、Ｌ−フコピラノース、Ｄ−ラムノフラノース、Ｌ−ラムノフラノース、Ｄ−アロメチロース、Ｄ−キノボース、Ｄ−アンチアロース、Ｄ−タロメチロース、Ｌ−タロメチロース、Ｄ−ジキタロース、Ｄ−ジギトキソース、Ｄ−シマロース、チベロース、アベコース、パラトース、コリトース、アスカリロースのようなデオキシ糖類；グルコサミン、ダウノサミンのようなアミノ糖類；及びグルクロン酸、ガラクツロン酸のようなウロン酸類などを挙げることができる。
【００３７】
これらの天然の糖類に対して、上述したような人工的な修飾を施して得られる本発明で定義する非天然型の糖類を１−リン酸化糖の製造に用いることができる。また、これらの天然型の糖類に対する不斉炭素に基づく非天然型の異性体についても、上記したような人工的な修飾を加えることで本発明に規定する非天然型の糖類を得ることができる。
【００３８】
上記のハロゲン化糖誘導体を得るためのハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を挙げることができ、必要に応じてこれらの２種以上を糖に置換することができる。
【００３９】
上記の保護基とは、加水素分解、加水分解、光分解のような化学的方法によって除去される保護基を指し、アミノ酸、ペプチド、核酸などの合成において利用されているものを用いることができる。そのような基としては、ホルミル基、アシル基、シリル基、アルキル基、アラルキル基、カルボニル基があり、中でも好ましくは、ホルミル基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基、アルコキシアルキル基、ハロゲン化アルキル基、アラルキル基、アルコキシカルボニル基及びアラルキルオキシカルボニル基が挙げられ、必要に応じてこれらの２種以上を糖の修飾に用いることができる。
【００４０】
芳香族アシル基としては置換ベンゾイル基を挙げることができ、その具体例としては、２−フルオロベンゾイル基、３−フルオロベンゾイル基、４−フルオロベンゾイル基、２−クロロベンゾイル基、３−クロロベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基、２−ブロモベンゾイル基、３−ブロモベンゾイル基、４−ブロモベンゾイル基、２，４−ジクロロベンゾイル基、２，６−ジクロロベンゾイル基、３，４−ジクロロベンゾイル基、３，５−ジクロロベンゾイル基、４−フェニルベンゾイル基などを例示することができる。
【００４１】
このような非天然型の糖を用いて得られる１−リン酸化糖としては、先に示した式（１）で表わされる化合物を好適なものとして挙げることができる。
【００４２】
更に好適に用い得る１−リン酸化糖としては、下記の化合物を挙げることができる。
（１）Ｘが、ハロゲン原子、アルコキシ基またはアルキルチオ基であり、ｍは０から３の整数を表わし、ｎは０または１を表わし、ｑは０から４の整数を表す式（１）の化合物（Ｒ１、Ｒ２、Ｗ及びＺは式（１）と同義である。）
（２）下記式（ａ）：
【００４３】
【化９】
2004313002.tif 000006
【００４４】
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、保護されたヒドロキシメチル基または保護されたカルボキシル基を表し、Ｒ４はアシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、置換されていてもよいアルコキシ基または置換されていてもよいアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｎは０または１を表し、ｍおよびｑは０から４の整数を表し、ｒは０または１を表す。（ただし、ｍ、ｑ、ｒ、ｎは、Ｚが酸素原子、イオウ原子の場合には、ｍ＋ｒ≦ｎ＋１、ｑ≦２×（ｎ＋１）−２×（ｍ＋ｒ）を、Ｚが炭素原子の場合はｍ＋ｒ≦ｎ＋２、ｑ≦２×（ｎ＋２）−２×（ｍ＋ｒ）を満たす。）〕で示される化合物。
（３）下記式（ｂ）
【００４５】
【化１０】
2004313002.tif 000007
【００４６】
（式中、Ｒ２は、独立してそれぞれ水素原子、メチル基、ヒドロキシメチル基、保護されたヒドロキシメチル基、保護されたカルボキシル基またはカルボキシル基を表し、Ｘはハロゲン原子、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を表し、Ｗは酸素原子またはイオウ原子を表し、Ｚは酸素原子、イオウ原子または置換されてもよい炭素原子を表し、ｍは０から３の整数を表し、ｎは０または１を表し、ｑは０から４の整数を表す。）で示される化合物。
（４）上記式（２）で表わされる化合物。
（５）上記式（３）で表わされる化合物。
【００４７】
上記各式における保護基としては、先に挙げた保護基を用いることができる。
【００４８】
上記各式中におけるアルコキシ基としては、炭素数１〜７の低級アルキル基が酸素原子と結合したアルコキシ基を挙げることができる。このアルコキシ基の有するアルキル基は、更に、アルキル基、アラルキル基及びアルコキシ基からなる群から選択された基の１以上で更に置換されていてもよい。これらの置換基の有するアルキル基としても炭素数１〜７の低級アルキル基を挙げることができる。
【００４９】
この置換されていてもよいアルコキシ基の好ましい具体例としては、メトキシ基及びメトキシエトキシ基などを挙げることができる。
【００５０】
上記各式におけるアルキルチオ基としては、炭素数１〜７の低級アルキル基がイオウ原子と結合したアルキルチオ基を挙げることができる。このアルキルチオ基の有するアルキル基は、上記のアルコキシ基の場合と同様に、更に、アルキル基、アラルキル基及びアルコキシ基からなる群から選択された基の１以上で更に置換されていてもよい。これらの置換基の有するアルキル基としても炭素数１〜７の低級アルキル基を挙げることができる。
【００５１】
この置換されていてもよいアルキルチオ基の好ましい具体例としては、メチルチオ基を挙げることができる。
【００５２】
上記のアルコシキ基及びアルキルチオ基に置換してもよいアラルキル基としては、ベンジル基などの無置換のアラルキル基；２−メチルベンジル基、３−メチルベンジル基、４−メチルベンジル基などの低級アルキル基で置換されたアラルキル基；２−メトキシベンジル基、３−メトキシベンジル基、４−メトキシベンジル基などの低級アルコキシ基で置換されたアラルキル基；２−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基などのニトロ基で置換されたアラルキル基；２−クロロベンジル基、３−ブロモベンジル基、４−フルオロベンジル基などのハロゲン置換されたアラルキル基；２−シアノベンジル基、３−シアノベンジル基、４−シアノベンジル基などのシアノ基で置換されたアラルキル基；などを挙げることができる。
【００５３】
上記各式中におけるＺとしての置換されてよい炭素原子とは、置換基が１つないし２つ置換した炭素原子を表し、置換していない場合には、水素原子で置換されている炭素原子を指す。
【００５４】
この炭素原子を置換し得る置換基としては、アルキル基、ハロゲン原子、アルコキシ基及びアルキルチオ基を挙げることができ、アルキル基、アルコキシ基及びアルキルチオ基としては、例えば炭素数が１〜７の低級アルキル基、低級アルコキシ基及び低級アルキルチオ基を挙げることができる。
【００５５】
上記式におけるＲ４であるアシル基としては、例えば、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、さらに、メタンスルホニル基、トリフルオロメタンスルホニル基のような低級アルカンスルホニル基、ベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基のようなアリールスルホニル基を挙げることができる。
【００５６】
脂肪族アシル基としては、アルキルカルボニル基またはハロゲン置換された低級アルキルカルボニル基が挙げられる。芳香族アシル基としては、アリールカルボニル基、ハロゲン置換されたアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシアリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基、アリール化アリールカルボニル基を挙げることができる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルカンスルホニル基であり、好ましい具体例としては、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンゾイル基、メタンスルホニル基を挙げることができる。
【００５７】
本発明における１−リン酸化糖は塩の形で供給することができ、この塩とは、化合物が分子内に有するリン酸基が形成する塩を示す。塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムのようなアルカリ金属の塩、マグネシウム、カルシウム、バリウムのようなアルカリ土類金属の塩、アルミニウム、鉄のような金属の塩、アンモニウム塩、１級、２級、３級のアルキルアミンの塩が挙げられる。
【００５８】
上記の１級アルキルアミンとしては、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミンのようなアルキルアミン類、シクロヘキシルアミンのようなシクロアルキルアミン類、ベンジルアミンなどを挙げることができる。
【００５９】
また、２級アルキルアミンとしては、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、ジヘキシルアミン、ジオクチルアミンのようなジアルキルアミン類、ジシクロヘキシルアミンのようなジシクロアルキルアミン類、ピペリジン、モルフォリン、Ｎ−メチルピペラジンのような環状アミンを例示できる。
【００６０】
３級アルキルアミンとしては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、トリブチルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、Ｎ−エチルジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルフォリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンのような３級のアルキルアミン、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジオクチルアニリンのようなアニリン類、ピリジン、２，６−ジメチルピリジン、２，４，６−ルチジン、ニコチンアミドのようなピリジン類の塩、グリシン、アラニン、プロリン、リジン、アルギニン、グルタミンのようなアミノ酸類、シンコニジン、１−（１−ナフチル）エチルアミン、１−フェニルエチルアミンのような光学活性アミンを挙げることができ、何れも１価あるいは２価の塩を包含する。
【００６１】
なお、本発明で用いる１−リン酸化糖の塩は、大気中に放置することにより水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となる場合があるが、そのような塩も本発明において用いることができる。
【００６２】
本発明に用いられる塩基は、ピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された天然または非天然型の塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。
【００６３】
置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。
【００６４】
アルキル基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１〜７の低級アルキル基が例示される。
【００６５】
ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数１〜７のアルキル基を有するハロアルキル基が例示される。
【００６６】
アルケニル基としては、ビニル、アリルなどの炭素数２〜７のアルケニル基が例示される。
【００６７】
ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数２〜７のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。
【００６８】
アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数２〜７のアルキニル基が例示される。
【００６９】
アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数１〜７のアルコキシ基が例示される。
【００７０】
アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、エチルメルカプトなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。
【００７１】
アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル、エチルフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルを有するアルキルフェニル基；メトキシフェニル、エトキシフェニルなどの炭素数１〜５のアルコキシを有するアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル、ブロモフェニルなどのハロゲノフェニル基などが例示される。
【００７２】
ピリミジン塩基を具体的に例示すれば、シトシン、ウラシル、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨ−ドシトシン、５−ヨ−ドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルシトシン、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２−オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。
【００７３】
プリン塩基を具体的に例示すれば、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−シクロプロピルアミノプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）などが挙げられる。
【００７４】
アザプリン塩基およびデアザプリン塩基を具体的に例示すれば、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。
【００７５】
更に、好ましい塩基としては先に式（４）で示した塩基を挙げることができる。
【００７６】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を分解する酵素の総称であり、本発明においては逆反応を利用することができる。反応に使用する酵素は、相当する１−リン酸化糖誘導体と塩基から目的とするヌクレオシドを生成し得る活性を有していればいかなる種類及び起源のものでもかまわない。該酵素はプリン型とピリミジン型に大別され、例えば、プリン型としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジン型としてピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）などが挙げられる。
【００７７】
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物とは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物であれば特に限定はされない。
【００７８】
このような微生物の具体例としては、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイヘラ（Ｋｌｕｙｖｅｒｅ）属、ミコバクテリウム（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ミコプラナ（Ｍｉｃｏｐｌａｎａ）属、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、好熱性のバチルス属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ザルチナ（Ｓａｒｔｉｎａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属、ロドコッッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属またはシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に含まれる微生物株を好適な例として挙げることができる。
【００７９】
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
【００８０】
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【００８１】
ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
【００８２】
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
【００８３】
また、本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼ活性とは、上述の該酵素活性を有する微生物菌体のみならず、該酵素活性を有する微生物菌体の菌体処理物またはそれらの固定化物なども使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。
【００８４】
本発明における１−リン酸化糖のアノマー混合物に対するリン酸残基と塩基との交換反応においては、先に記載したとおり、アノマー混合物にＤ体のアノマーが含まれる場合には、Ｄ体アノマーのα−Ｄ−体のリン酸基が選択的に塩基と交換され、β−Ｄ−ヌクレオシドが得られる。また、アノマー混合物にＬ体のアノマーが含まれる場合には、Ｌ体アノマーのβ−Ｌ−体のリン酸基が選択的に塩基と交換され、α−Ｌ−ヌクレオシドが得られる。これらの混合物がＤ体とＬ体の両方を含む場合はこれらの両方の交換反応が選択的に行われる。
【００８５】
アノマー混合物の態様としては、以下のものを挙げることができる。
（１）Ｄ体のアノマー混合物
（２）Ｌ体のアノマー混合物
（３）Ｄ体のアノマーとＬ体のアノマーの両方の混合物
（４）Ｄ／Ｌラセミ体のアノマー混合物
本発明の方法におけるリン酸基と塩基との交換反応において、α−Ｄ−体における交換反応の反応速度はβ−Ｌ−体の交換反応における反応速度よりも大きい。そこで、Ｄ／Ｌラセミ体のアノマー混合物に対して本発明の方法を適用することで、β−Ｄ−ヌクレオシドがα−Ｌ−ヌクレオシドよりも多い反応混合物を得ることができ、これらの混合比を変化させて、その後の分離精製操作を容易とするという効果を得ることができる。
【００８６】
本発明の方法においては、反応媒体中にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンを存在させることで、反応媒体中に副生したリン酸イオンを塩として沈殿させることで、ヌクレオシドの製造効率を向上させることができる。
【００８７】
本発明において、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンとは、反応において副生したリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し、反応液中に沈殿し得るものであれば限定されない。そのようなものとして、カルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、モリブデン、鉛、亜鉛、リチウムなどの金属カチオンが挙げられる。それらのうち工業的に汎用性や安全性が高く、反応に影響を与えない金属塩が特に好ましく、そのようなものの例としてカルシウムイオン、バリウムイオン、または、アルミニウムイオンが挙げられる。
【００８８】
本発明におけるリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンとは、リン酸と難水溶性の塩を形成し得る金属カチオンを、塩素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、酢酸イオン及び水酸イオンの中から選ばれる１種類以上のアニオンとの金属塩として反応液中に添加すればよい。具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化マグネシウム、塩化バリウム、硝酸バリウム、炭酸バリウム、硫酸バリウム、酢酸バリウム、塩化アルミニウム、硝酸アルミニウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸アルミニウムなどが例示される。
【００８９】
また、該金属カチオンは、ペントース−１−リン酸の塩として反応液中に存在させてもよい。一例を挙げると、リボース−１−リン酸・カルシウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・カルシウム塩、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸・カルシウム塩、アラビノース−１−リン酸・カルシム塩、リボース−１−リン酸・バリウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・バリウム塩、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸・バリウム塩、アラビノース−１−リン酸・バリウム塩、リボース−１−リン酸・アルミニウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・アルミニウム塩、２，３−ジデオキシリボース−１−リン酸・アルミニウム塩、アラビノース−１−リン酸・アルミニウム塩、などが挙げられる。
【００９０】
本発明におけるヌクレオシド化合物の合成反応は、目的とするヌクレオシド、基質である１−リン酸化糖誘導体と塩基、反応触媒であるヌクレオシドホスホリラーゼ又は該酵素活性を有する微生物、そしてリン酸を反応系より除外させるために添加する金属塩の種類とその特性により、適切なｐＨや温度などの反応条件ならびに管理幅を選べばよいが、通常はｐＨ５〜１０、温度１０〜６０℃の範囲で行うことができる。ｐＨに関して、その管理幅を外れた場合、目的物や基質の安定性、酵素活性の低下、リン酸との難水溶性塩の未形成などが原因で反応転化率の低下を招く可能性がある。反応途中、ｐＨの変化が生じるようであれば必要に応じて塩酸、硫酸などの酸や水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリを適時添加すればよい。反応に使用する１−リン酸化糖誘導体と塩基の濃度は０．１〜１０００ｍＭ程度が適当であり、両者のモル比は添加する塩基の比率を１−リン酸化糖誘導体又はその塩に対して０．１〜１０倍モル量で行える。反応転化率を考えれば０．９５倍モル量以下が好ましい。
【００９１】
また、添加するリン酸と難水溶性の塩を形成し得る金属塩は、反応に使用する１−リン酸化糖誘導体に対して０．１〜１０倍モル量、より好ましくは０．５〜５倍モル量添加するのが良い。その添加方法について制限は無く、一括添加や反応中に逐次添加しても良い。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。なお、高濃度の反応においては、基質の塩基や生成物のヌクレオシド化合物が溶解しきれずに反応液中に存在する場合もあるが、このような場合にも本発明を適用することができる。
【００９２】
また、添加するリン酸と難水溶性の塩を形成し得る金属塩は、反応に使用する１−リン酸化糖誘導体に対して０．１〜１０倍モル量、より好ましくは０．５〜５倍モル量添加するのが良い。その添加方法について制限は無く、一括添加や反応中に逐次添加しても良い。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。なお、高濃度の反応においては、基質の塩基や生成物のヌクレオシド化合物が溶解しきれずに反応液中に存在する場合もあるが、このような場合にも本発明を適用することができる。
【００９３】
このようにして製造したヌクレオシド化合物は、濃縮、晶析、溶解、電気透析処理、イオン交換樹脂や活性炭による吸脱着処理どの常法を適用することにより単離することができる。
【００９４】
【実施例】
以下に実施例により、本発明を更に詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９５】
実施例１  ２−（Ｒ）−ベンジルオキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−（Ｒ，Ｓ）−リン酸  シクロヘキシルアミン塩の合成
反応式（１）
【００９６】
【化１１】
2004313002.tif 000008
【００９７】
２−（Ｒ）−ベンジルオキシメチル−４−（Ｒ，Ｓ）−アセトキシ−１，３−ジオキソラン［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３，６９４９−６９５２（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，６２７−６３６（１９９５）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３，６２６３−６２６６（１９９２）、ＷＯ９２１８５１７（Ｃｈｅｎｇ．Ｙｕｎｇ．Ｃｈｉら）などで公知。］化合物１（１．０６ｇ，  ４．２ｍｍｏｌｅ）のエーテル（１２ｍｌ）溶液に、氷冷下４Ｎ塩酸−ジオキサン（４ｍｌ）を加え、３．５時間攪拌後、室温まで昇温した。溶媒を濃縮後、さらにトルエンにて共沸し、無色透明の油状物（５００ｍｇ）を得た。
【００９８】
アセトニトリル１．１ｍｌに、オルトリン酸０．２７ｇ、トリ−ｎ−ブチルアミン０．６６ｍｌ、モレキュラーシーブ４Ａ（０．２３ｇ）を順次加え１．５時間攪拌した。このけんだく液中に、氷冷下先に得た油状物（０．２７ｇ）を加え、氷冷下５．５時間攪拌した。トリ−ｎ−ブチルアミン０．６ｍｌを加え３０分攪拌後、トルエンで希釈して水抽出を行った。水層をｎ−ブタノールで抽出し、濃縮した。濃縮物をトルエンに溶解後、シクロヘキシルアミンを加え濃縮して、化合物２を白色固体として得た。
【００９９】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δｐｐｍ：  ０．９８−１．１０（２Ｈ，  ｍ），  １．１４−１．２３（６Ｈ，ｍ），  １．４７−１．５１（２Ｈ，ｍ），  １．６１−１．６４（４Ｈ，ｍ），  １．７８−１．８３（４Ｈ，ｍ），  ２．９４−３．００（２Ｈ，ｍ），  ３．４６−３．６０（２Ｈ，ｍ），  ３．７２−３．７９（１Ｈ，ｍ），  ３．９２−４．００（１Ｈ，ｍ），  ４．４１−４．５１（２Ｈ，ｍ），  ５．０１−５．０３  ａｎｄ  ５．２２−５．２４（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，  ｍ），  ５．６４−５．７２（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，ｍ），  ７．２４−７．３０（５Ｈ，ｍ）。
【０１００】
実施例２  ２−（Ｒ）−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−（Ｒ，Ｓ）−リン酸  シクロヘキシルアミン塩の合成
反応式（２）
【０１０１】
【化１２】
2004313002.tif 000009
【０１０２】
反応式（２）
実施例１で得た化合物２（０．２ｇ）をメタノール１０ｍｌに溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ０．１１ｇを触媒として常圧水素添加を行った。触媒をろ過後、ろ液を濃縮し化合物３のシクロヘキシルアミン塩を得た。
【０１０３】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δｐｐｍ：  ０．９９−１．０６（２Ｈ，ｍ），  １．１０−１．２４（６Ｈ，ｍ），  １．４７−１．５０（２Ｈ，ｍ），  １．６２−１．６６（４Ｈ，ｍ），  １．８０−１．８５（４Ｈ，ｍ），  １．９６−３．０２（２Ｈ，ｍ），  ３．５１−３．５７（２Ｈ，ｍ），  ３．７２−３．７９（１Ｈ，ｍ），  ３．９３−４．００（１Ｈ，ｍ），  ４．９９−５．０１  ａｎｄ  ５．１３−５．１５（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，  ｍ），  ５．６４−５．６７  ａｎｄ  ５．７０−５．７３（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，ｍ）．
ＡＰＣＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）：  ｍ／ｚ１９９（ＭＨ−）。
【０１０４】
実施例３  （２Ｒ，４Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−４−（２’−アミノ−６’−シクロプロピルアミノ−プリン−９’−イル）−１，３−ジオキソランの合成
反応式（３）
【０１０５】
【化１３】
2004313002.tif 000010
【０１０６】
エシェリヒア・コリＫ−１２／ＸＬ−１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で一夜培養した後集菌し、リゾチーム１ｍｇ／ｍｌを含む溶菌液で溶菌した。溶菌液をフェノール処理した後、通常の方法によりエタノール沈殿によりＤＮＡを沈殿させた。生じたＤＮＡの沈殿は、ガラス棒に巻き付けて回収した後、洗浄し、大腸菌染色体ＤＮＡを調製した。
【０１０７】
ＰＣＲ用のプライマーには、エシェリヒア・コリの既知のｄｅｏＤ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＥ０００５０８（コード領域は塩基番号１１５３１−１２２５０）に基づいて設計した配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。これらのプライマーの５’末端付近及び３’末端付近には、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素認識配列を有する。
配列番号１：
ｇｔｇａａｔｔｃａｃ  ａａａａａｇｇａｔａ  ａａａｃａａｔｇｇｃ  ３０
配列番号：２
ｔｃｇａａｇｃｔｔｇ  ｃｇａａａｃａｃａａ  ｔｔａｃｔｃｔｔｔ  ２９
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全に消化した前記大腸菌染色体ＤＮＡ６ｎｇ／μｌ及びプライマー各３μＭを含む０．１ｍｌのＰＣＲ反応液を用いて、変性：９６℃、１分、アニーリング：５５℃、１分、伸長反応：７４℃、１分からなる反応サイクルを、３０サイクルの条件でＰＣＲを行なった。
【０１０８】
上記反応産物及びプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造（株））を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ライゲーション・ハイ（東洋紡（株））を用いて連結した後、得られた組換えプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αを形質転換した。形質転換株を、アンピシリン（Ａｍ）５０μｇ／ｍｌ及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含むＬＢ寒天培地で培養し、Ａｍ耐性で且つ白色コロニーとなった形質転換株を得た。このようにして得られた形質転換株よりプラスミドを抽出し、目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを、ｐＵＣ−ＰＮＰ７３と命名した。こうして得られた形質転換体を、エシェリヒア・コリ  ＭＴ−１０９０５と名づけた。
【０１０９】
エシェリヒア・コリ  ＭＴ−１０９０５株をＡｍ５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍＬで３７℃・１晩振とう培養した。得られた培養液を１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、菌体を集めた。菌体を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、超音波により破砕したものを酵素源として用いた。
【０１１０】
１０ｍＭの化合物３、１０ｍＭの２−アミノ−６−シクロプロピルアミノ−プリン、上記のように調整した０．１ｍｌのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ生産菌の超音波破砕酵素液、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に２０ｍＭ塩化カルシウムを添加した反応液１ｍｌを５０℃、９２時間反応させた。
【０１１１】
反応終了後、遠心分離（１８００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）で菌体を除去後、濃縮乾固した。メタノールに溶解して、不溶物をろ過後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（溶媒ＭｅＯＨ）、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：アンモニア水＝１００：１０：１）により順次精製を行い反応生成物を単離した。生成物の分析値は、文献（ＷＯ００３９１４３）記載の分析値と一致した。
実施例４  （２Ｒ，４Ｒ）−２−ヒドロキシメチル−４−（２’−アミノ−６’−アミノ−プリン−９’−イル）−１，３−ジオキソランの合成
反応式（４）
【０１１２】
【化１４】
2004313002.tif 000011
【０１１３】
実施例３と同様に反応を行い、化合物５を得た。
生成物の分析値は、文献（特表平８−５０１０８６、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅＦｕｔｕｒｅ２０００，２５（５）４５４−４６１）記載の分析値と一致した。
【０１１４】
実施例５  ２−（Ｒ，Ｓ）−ベンジルオキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−（Ｒ，Ｓ）−リン酸  シクロヘキシルアミン塩の合成
反応式（５）
【０１１５】
【化１５】
2004313002.tif 000012
【０１１６】
２−（Ｒ，Ｓ）−ベンジルオキシメチル−４−（Ｒ，Ｓ）−アセトキシ−１，３−ジオキソラン［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３，６９４９−６９５２（１９９２）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，６２７−６３６（１９９５）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３３，６２６３−６２６６（１９９２）、ＷＯ９２１８５１７（Ｃｈｅｎｇ．Ｙｕｎｇ．Ｃｈｉら）などで公知。］化合物６（２．５５ｇ，１０ｍｍｏｌ，Ｄ−トランス、Ｄ−シス、Ｌ−シス、Ｌ−トランスの４種の光学異性体混合物）のジエチルエーテル（５０ｍｌ）溶液に氷冷下４Ｎ塩酸−ジオキサン（２０ｍｌ）を加え、氷冷で１時間攪拌後、室温で４．５時間攪拌した。溶媒を濃縮後、さらにトルエンにて共沸し、無色透明の油状物を得た。
【０１１７】
アセトニトリル１０ｍｌにオルトリン酸２．９４ｇ（３０ｍｍｏｌ）、トリ−ｎ−ブチルアミン２．５ｍｌ、モレキュラーシーブ４Ａ（３．２ｇ）を加え４．５時間室温で攪拌した。氷冷下先に得た油状物のアセトニトリル（２ｍｌ）溶液を加え、一晩攪拌した。トリ−ｎ−ブチルアミン７．５ｍｌを加えた後１時間氷冷下攪拌した。混合物に水を加え、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して、得られた油状物をトルエンに溶解した後、シクロヘキシルアミン（３．５ｍｌ）を加えた。水で抽出を行い、水層を濃縮乾固することにより化合物７のジシクロヘキシルアミン塩３．４３ｇ（７０％収率）を白色固体として得た。
【０１１８】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δｐｐｍ：  ０．９８−１．１０（２Ｈ，  ｍ），  １．１４−１．２３（６Ｈ，ｍ），  １．４７−１．５１（２Ｈ，ｍ），  １．６１−１．６４（４Ｈ，ｍ），  １．７８−１．８３（４Ｈ，ｍ），  ２．９４−３．００（２Ｈ，ｍ），  ３．４６−３．６０（２Ｈ，ｍ），  ３．７２−３．７９（１Ｈ，ｍ），  ３．９２−４．００（１Ｈ，ｍ），  ４．４１−４．５１（２Ｈ，ｍ），  ５．０１−５．０３  ａｎｄ  ５．２２−５．２４（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，  ｍ），  ５．６４−５．７２（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，ｍ），  ７．２４−７．３０（５Ｈ，ｍ）。
【０１１９】
実施例６  ２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−（Ｒ，Ｓ）−リン酸  シクロヘキシルアミン塩の合成
反応式（６）
【０１２０】
【化１６】
2004313002.tif 000013
【０１２１】
化合物７（３．２ｇ，Ｄ−トランス、Ｄ−シス、Ｌ−シス、Ｌ−トランスの４種の光学異性体混合物）のメタノール（１５０ｍｌ）溶液に、窒素気流下１０％Ｐｄ／Ｃ（５０％ｗｅｔ．  １．０８ｇ）を加え、水素気流下室温で２４時間攪拌した。Ｐｄ／Ｃを濾別後、溶媒を留去しえられた残渣にメタノールとジイソプロピルエーテルを加え、析出した固体を濾取、乾燥することにより化合物８のシクロヘキシルアミン塩２．４７ｇを得た。以下に生成物中の４種の異性体比率を示す。
【０１２２】
【化１７】
2004313002.tif 000014
【０１２３】
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δｐｐｍ：  ０．９９−１．０６（２Ｈ，ｍ），  １．１０−１．２４（６Ｈ，ｍ），  １．４７−１．５０（２Ｈ，ｍ），  １．６２−１．６６（４Ｈ，ｍ），  １．８０−１．８５（４Ｈ，ｍ），  １．９６−３．０２（２Ｈ，ｍ），  ３．５１−３．５７（２Ｈ，ｍ），  ３．７２−３．７９（１Ｈ，ｍ），  ３．９３−４．００（１Ｈ，ｍ），  ４．９９−５．０１  ａｎｄ  ５．１３−５．１５（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，  ｍ），  ５．６４−５．６７  ａｎｄ  ５．７０−５．７３（ｔｏｔａｌ  １Ｈ，ｍ）。
【０１２４】
実施例７
実施例６で得た２−（Ｒ，Ｓ）−ヒドロキシメチル−１，３−ジオキソラン−４−（Ｒ，Ｓ）−リン酸  ジシクロヘキシルアミン塩５００ｍｇ（ＤＬ−ラセミ体。４種の異性体比は実施例６記載の通り）、２−アミノ−６−Ｎ−シクロプロピルアミノプリン８５．９ｍｇを、１ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）４．５２ｍｌと水で溶解し、全量を４５．２ｍｌとした。実施例３で得た集菌体４５２ｍｇを加え、撹拌しながら５０℃で１００時間反応を行った。
【０１２５】
反応終了液を下記のＨＰＬＣ条件で分析した結果、原料の４種の異性体（Ｄ−トランス、Ｄ−シス、Ｌ−シス、Ｌ−トランス）のうち２種の異性体（Ｄ−トランスおよびＬ−シス）が反応し、２種の異性体（Ｄ−シス体およびＬ−トランス体）の２−ヒドロキシメチル−４−（２’−アミノ−６’−シクロプロピルアミノプリン−９’−イル）−１，３−ジオキソランが生成していることが判明した。生成物のＤ−シス体：Ｌ−トランス体の比率は６４：１であり、Ｄ−トランスおよびＬ−シス体の反応速度に１４倍の差があることが明らかとなった。
ＨＰＬＣ分析条件
2004313002.tif 000015
ＨＰＬＣ分析結果
２−アミノ−６−Ｎ−シクロプロピルアミノプリン
保持時間：７．３分  面積相対値：２０．１
２−ヒドロキシメチル−４−（２’−アミノ−６’−シクロプロピルアミノプリン−９’−イル）−１，３−ジオキソラン
Ｄ−シス体      保持時間：１３．７分  面積相対値：７８．７
Ｌ−トランス体    保持時間：１６．１分  面積相対値：  １．２
【０１２６】
【発明の効果】
本願発明により、容易かつ低コストで合成可能なアノマー混合物である１−リン酸化糖を反応基質とする汎用性の高いヌクレオシドの製法を提供することができる。また、リン酸基と塩基との交換反応の差を利用して、ヌクレオシドの光学異性体の一方が多く合成されるヌクレオシドの合成方法を提供することができる。
【０１２７】
【配列表】
2004313002.tif 000016