(57)【要約】【課題】高温において安定な酵素活性を有する耐熱性キチナーゼ、更には、該酵素ををコードする遺伝子を提供すること。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる、至適温度が８０〜１００℃であるパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来の耐熱性キチナーゼ：（ａ）配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ酵素活性を有するアミノ酸配列。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる耐熱性キチナーゼ；
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列からなる耐熱性キチナーゼ；
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
以下の（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列からなる耐熱性キチナーゼ；
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、
（ｆ）アミノ酸配列（ｅ）において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項４】
以下の（イ）、（ロ）、（ハ）又は（ニ）からなるＤＮＡ；
（イ）配列番号５で表される遺伝子配列、
（ロ）上記（ｂ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ハ）（イ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ニ）（ロ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の（ホ）、（ヘ）、（ト）又は（チ）からなるＤＮＡ；
（ホ）配列番号６で表される遺伝子配列、
（ヘ）上記（ｄ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ト）（ホ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（チ）（ヘ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
以下の（リ）、（ヌ）、（ル）又は（ヲ）からなるＤＮＡ；
（リ）配列番号７で表される遺伝子配列、
（ヌ）上記（ｆ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ル）（ホ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ヲ）（ヘ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の耐熱性キチナーゼを有効成分とする防カビ剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高温において安定なキチナーゼ活性を有する耐熱性キチナーゼに関する。本発明はまた、上記耐熱性キチナーゼをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キチンはカニ、エビなどの甲殻類等に含まれる主成分で、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ−１，４結合した多糖類である。近年、その脱アセチル化体であるキトサンとともに多様な分野で用途開発が進展している（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
キチンを部分加水分解することにより得られるキチンオリゴ糖は、さわやかな甘味を有し、乳酸菌増殖効果、ビフィズス菌増殖効果、免疫賦活効果などの新しい機能を持った食品新素材として、食品、医薬業界で大きな関心を集めている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、現在、キチンの処理は耐熱性の低いバクテリア由来の酵素を使用して行われており（例えば、非特許文献２参照）、高温下で処理できないために、キチンの処理効率は非常に低い（例えば、非特許文献２及び３参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
ロバータス・ジェイエヌ（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ  ＪＮ）及びハート・ジェイ（Ｈａｒｔ  Ｊ．）著，サドラー・ジェイエヌ（Ｓａｄｄｌｅｒ  ＪＮ）及びペナー・エムエイチ（Ｐｅｎｎｅｒ  ＭＨ）編集，スリー・ディメンショナル・ストラクチャー・オブ・アン・エンドキチナーゼ・フロム・バーレイ（Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｒｌｅｙ．），「エンザイマティック・ディグラデーション・オブ・インソルブル・カルボハイドレーツ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．），アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），ワシントン・ディー・シー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ），１９９５年，  第５章（Ｃｈａｐ．５）
【０００６】
【非特許文献２】
ヤブキ・エム（Ｙａｂｕｋｉ  Ｍ），ヤブキ・ワイ（Ｙａｂｕｋｉ  Ｙ），ヤナイ。イー（Ｙａｎａｉ  Ｅ），アンドウ・エー（Ａｎｄｏ  Ａ），フジイ・ティー（Ｆｕｊｉｉ  Ｔ）著，アイソレーション・アンド・キャラクタライゼーション・オブ・キチノリティック・バクテリウム：アエロモナス・ハイドロフィラ（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ：  Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ），日本，「テクニカル・ブレチン・オブ・ファカルティ・オブ・ホーティカルチャー，千葉大学（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｃｈｉｂａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）」，１９８３年，  ３２巻，ｐ．５１
【０００７】
【非特許文献３】
フランコフスキー・ジェイ（Ｆｒａｎｋｏｗｓｋｉ  Ｊ），ロリト・エム（Ｌｏｒｉｔｏ  Ｍ），スカラ・エフ（Ｓｃａｌａ  Ｆ），シュミット・アール（Ｓｃｈｍｉｄ  Ｒ），バーグ・ジー（Ｂｅｒｇ  Ｇ），バール・エイチ（Ｂａｈｌ  Ｈ）著，ピューリファイケーション・アンド・プロパティーズ・オブ・トゥー・キチノリティック・エンザイムズ・オブ・セラティア・プリムチカ・ＨＲＯ−Ｃ４８（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｈｉｔｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ  ＨＲＯ−Ｃ４８），「アーカイブス・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，２００１年，１７６巻，ｐ．４２１−４２６
【０００８】
【特許文献１】
特開平９−３２４３６８号公報
【０００９】
【特許文献２】
特開２００１−５４３８１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、高温において安定なキチナーゼ活性を有する耐熱性キチナーゼ、更には、上記耐熱性キチナーゼをコードする遺伝子を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、好熱性微生物の遺伝子配列の中にキチナーゼ活性を示すと思われる遺伝子を見出し、その知見に基いて本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の耐熱性キチナーゼ及び該酵素をコードする遺伝子に関する。
【００１３】
１．以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる耐熱性キチナーゼ；
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００１４】
２．以下の（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列からなる耐熱性キチナーゼ；
（ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００１５】
３．以下の（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列からなる耐熱性キチナーゼ；
（ｅ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、
（ｆ）アミノ酸配列（ｅ）において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、耐熱性キチナーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００１６】
４．以下の（イ）、（ロ）、（ハ）又は（ニ）からなるＤＮＡ；
（イ）配列番号５で表される遺伝子配列、
（ロ）上記（ｂ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ハ）（イ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ニ）（ロ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
５．以下の（ホ）、（ヘ）、（ト）又は（チ）からなるＤＮＡ；
（ホ）配列番号６で表される遺伝子配列、
（ヘ）上記（ｄ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ト）（ホ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（チ）（ヘ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
６．以下の（リ）、（ヌ）、（ル）又は（ヲ）からなるＤＮＡ；
（リ）配列番号７で表される遺伝子配列、
（ヌ）上記（ｆ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ル）（ホ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ヲ）（ヘ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
７．上記項１〜３のいずれかに記載の耐熱性キチナーゼを有効成分とする防カビ剤。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明において得られる耐熱性キチナーゼは、９０〜１００℃程度の高温で生育する超好熱性細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）の遺伝子配列の中から、キチナーゼ活性を有する酵素をコードすると推測される配列を見出し、その配列をもとに完成したものである。
【００２１】
本発明で使用される細菌としては、硫黄代謝好熱性古細菌であるパイロコッカス属に属する細菌が使用でき、好ましくはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）である。本細菌は、理化学研究所の微生物系統保存施設に寄託されており、登録番号はＪＣＭ８４２２である。本細菌の培養方法も公知の方法を用いることができる。
【００２２】
公知のキチナーゼ（ＫＯＤ−１株由来のキチナーゼ：特開２００１−５４３８１参照）をコードする配列に基いて、パイロコッカス・フリオサスの遺伝子配列（配列番号１に示す。）の中から、キチナーゼ活性を有する酵素をコードすると推測されるＤＮＡ配列を見出し、その配列に基いて、生物工学的手法により本発明の耐熱性キチナーゼを完成させた。
【００２３】
本発明のキチナーゼをコードする遺伝子配列としては、好ましくは、配列番号５〜７で表される配列が例示できる。配列番号５で表される遺伝子配列は、配列番号１で表されるパイロコッカス・フリオサスの遺伝子配列中の、９４〜３２２９位の配列の５’末端に「ＡＴＧ」を付加したものである（従って、「Ａ」が５’末端となる。）。ここで、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｇ」及び「Ｃ」は、それぞれＤＮＡを構成する４種類の塩基を示し、「Ａ」はアデニン、「Ｔ」はチミン、「Ｇ」はグアニン、そして「Ｃ」はシトシンを示す。
【００２４】
また、配列番号６で表される遺伝子配列は、配列番号１で表されるパイロコッカス・フリオサスの遺伝子配列の１５７４〜３２２９位で表される配列である。
【００２５】
更に、配列番号７で表される遺伝子配列は、配列番号１中の第１００６位に該当する「Ａ」を削除したものである（この配列は配列番号５及び６の配列を配列番号５が５’末端になるようにつなぎ合わせたものに概ね相当する）。また、配列番号１中の第１００６位に該当する「Ａ」を削除している限り、配列番号５及び６を逆に、即ち、配列番号６を５’につないでも（この配列は配列番号５及び６の配列を、配列番号５が５’末端になるようにつなぎ合わせたものに、概ね相当する）耐熱性キチナーゼ活性を得ることはできる。
【００２６】
ここで、本発明においてキチナーゼをコードする３種の配列を例示したが、８０〜１００℃程度の高温においてキチナーゼ活性を有する酵素をコードする限り、上記３種のＤＮＡに限定されるものではない。例えば、上記の配列番号５〜７のＤＮＡ配列において、１又は複数個、好ましくは１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入又は付加されたポリヌクレオチド配列であっても良い。
【００２７】
更に、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。
【００２８】
ここで、上記のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、以下のものが例示できる；
（Ｉ）０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件下で、配列番号５で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ分子
（ＩＩ）０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件下で、配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ分子
（ＩＩＩ）０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件下で、配列番号７で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ分子。
【００２９】
本発明の耐熱性キチナーゼは、上記の遺伝子配列を用いて公知の生物工学的手法により得ることができる。例えば、上記３種類のＤＮＡ、又は、それらの遺伝子配列においてヌクレオチドを欠失、置換、挿入又は付加させたＤＮＡ、更には、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ耐熱性キチナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ法等の公知の方法により増幅させ、当該遺伝子配列の多数のコピー（ＰＣＲ産物）を得る。
【００３０】
このＰＣＲ法において使用されるプライマーは、上記の遺伝子配列に基いて適宜設定することができ、公知の方法によって合成することができる。また、増幅させたＰＣＲ産物は、公知の方法により単離、精製、確認することができる。
【００３１】
本発明の酵素は、公知の遺伝子組換え技術（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４，  １４３１，  （１９８４）；  Ｂｉｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  １３０，  ６９２  （１９８５）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８０，  ５９９０  （１９８３）等参照）によって得ることができる。
【００３２】
例えば、本発明のキチナーゼは、これをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで、得られる培養物から回収することができる。
【００３３】
上記の宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができる。原核生物の宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるものが広く挙げられる。好ましくは大腸菌、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  （ＤＥ３）  等が挙げられる。
【００３４】
真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。脊椎動物の細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，  ２３：  １７５  （１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７７：  ４２１６  （１９８０）〕などを好適に使用できる。酵母の細胞としては、サッカロミセス属酵母細胞などを好適に利用できる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００３５】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）核酸配列、更にタンパク合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。
【００３６】
上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＥＴ−２１ｄ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを例示できる。これらの中でも、特にｐＥＴ−２１ｄが好ましい。
【００３７】
プロモーターとしても特に限定なく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌を宿主とする場合は、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００３８】
本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合タンパク発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを例示できる。
【００３９】
成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助ける核酸配列としては、分泌配列及びリーダ配列が例示できる。本発明タンパク質（キチナーゼ）の製造には、これらの配列を利用することもできる。また、本発明タンパク質の製造に当たっては、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列（ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ）、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン（ＨＡ）・タグなどを利用することもできる。
【００４０】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００４１】
形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的タンパク質（酵素）が、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００４２】
培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択利用できる。培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００４３】
上記のようにして得られる本発明の組換え蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９  頁、第１版第１刷、１９８０年  ６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２５（２５），  ８２７４  （１９８６）；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６３，  ３１３  （１９８７）など参照〕により分離、精製できる。
【００４４】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、タンパク沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示できる。本発明で得られる酵素（タンパク質）が、耐熱性であることから、例えば、約７０〜１００℃、好ましくは約８０〜９０℃で１０〜６０分程度、好ましくは２０〜４０分程度加熱して、熱変性するタンパク質を遠心分離して沈澱させて除去して得られる上澄液を、各種のクロマトグラフィーに供することにより、精製することもできる。
【００４５】
また、本発明の酵素は、化学的な合成によっても得ることができる。化学的な合成法としては、公知のポリペプチド合成法、例えば、液相合成法あるいは固相合成法によって製造することができる。
【００４６】
このようにして、得られた配列番号２〜４で表される本願発明の３種類の耐熱性キチナーゼを得ることができる。
【００４７】
本願発明の耐熱性キチナーゼは、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるものが好ましいが、８０〜１００℃程度の高温でキチナーゼ活性を有する限り、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列の１又は複数、好ましくは１又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は付加されたものであってもよい。
【００４８】
本発明で得られた酵素は、例えば、コロイダルキチンを基質として、Ｍｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｅｌｓｏｎ法のような公知の方法で加水分解後に生じる還元性末端を定量することにより、キチナーゼ活性を確認することができる。
【００４９】
また、例えば、本発明の酵素を含む酢酸緩衝液中で６０〜１００℃程度、好ましくは８０〜９０℃程度で０．１〜４８時間程度、好ましくは０．５〜２４時間程度加熱した後に、上記のような公知の方法で酵素活性を測定することにより、本発明の酵素の耐熱性を確認するこができる。
【００５０】
防カビ剤
さらに、本発明の耐熱性キチナーゼは防カビ効果を有するので、防カビ剤としても使用することができる。使用態様、使用方法等は特に限定されず、例えば、水や溶液に混合して滴下、噴霧等行うのが簡便で好ましい。
【００５１】
本発明の防カビ剤を適用する場所は限定されず、例えば、壁紙に使用する糊などの建築資材、風呂場、新築マンションの青畳のカビ、湿った畳、エアコンの吹き出し口、冷蔵庫、布、木綿、アルミ・ジュラルミンを腐食させるカビ、ＧＬボンド＋クロス貼り、コンタクトレンズ、古文書、カメラ、顕微鏡等のレンズ、プリント（基盤）配線板等が例示できる。
【００５２】
また、本発明のキチナーゼが耐熱性であることから、高温下においても使用することができる。例えば、高温下で食器を洗浄する食器洗浄機に使用することもでき、成型前のプラスチックや樹脂等に予め混合しておくことも可能である。
【００５３】
本発明の防カビ剤を使用する濃度としても限定されず、カビの生育が抑制されればよい。例えば、本発明耐熱性キチナーゼの濃度として０．０００００１〜０．１ｍｇ／ｍｌ程度が例示できる。
【００５４】
本発明の耐熱性キチナーゼを有効成分とする防カビ剤を適用するカビの種類も特に限定されず、あらゆる種類のカビに対して使用することができるが、例えば、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ユーロチウム（カワキコウジカビ）、アスペルギルス（コウジカビ）、ペニシリウム（アオカビ）、クラドスポリウム（クロカビ）、アルテルナリヤ（ススカビ）  、リゾプス（クモノスカビ）、ムコール（ケカビ）、トリコルデルマ（ツチアオカビ）、ケトミウム（ケタマカビ）、フザリウム（アカカビ）、オーレオバシデウム（黒色酵母様菌）等が例示できる。
【００５５】
本発明の防カビ剤は、他の防カビ剤や抗菌剤等と併用することも可能である。また、本発明の防カビ剤はタンパク質なので、体内に蓄積するなどして副作用を起こす可能性も非常に小さく、安全である。
【００５６】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。
【００５７】
実施例１：菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ：ＪＣＭ８４２２）の培養
１３．５ｇの食塩、４ｇのＮａ２ＳＯ４、０．７ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＮａＨＣＯ３、０．１ｇのＫＢｒ、３０ｍｇのＨ３ＢＯ３、１０ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．５ｇのＣａＣｌ２、２５ｍｇのＳｒＣｌ２、１．０ｍｌのレザスリン溶液（０．２ｇ／Ｌ）、１．０ｇの酵母エキス、５ｇのバクトペプトンを１Ｌの超純水に溶かし、この溶液のｐＨを６．８に調整し、加圧殺菌した。
【００５８】
ついで、乾熱滅菌した元素硫黄を０．２％となるように加え、この培地をアルゴンで飽和して嫌気性とした後、パイロコッカス・フリオサス（ＪＣＭ８４２２）を植菌した。培地が嫌気性となったか否かはＮａ２Ｓ溶液を加えて、培養液中でＮａ２Ｓによるレザスリン溶液のピンク色が着色しないことにより確認した。この培養液を９５℃で２〜４日培養し、その後、遠心分離により集菌した。
【００５９】
実施例２：染色体ＤＮＡの調整
培養終了後、５０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を集菌し、菌体を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄した後ＩｎＣｅｒｔ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ−１ｍｇ／ｍｌ  プロテアーゼＫ溶液中で処理することにより、染色体ＤＮＡがＡｇａｒｏｓｅブロック中に分離調製された。
【００６０】
実施例３：発現プラスミドの構築１（配列番号５）
配列番号５の前に平滑末端、後に制限酵素（ＸｈｏＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマー（それぞれ、配列番号８で示されるフォワードプライマー１及び配列番号９で示されるリバースプライマー１）を合成し、ＰＣＲ（９８℃で１分、６５℃で２分、７４℃で４分、３５サイクル）で配列番号５で表される遺伝子の前に平滑末端、後に制限酵素サイトを導入した。
【００６１】
ＰＣＲ反応後、制限酵素（Ｂｓｐ  ＨＩ及びＸｈｏＩ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、アガロースゲル電気泳動に供し、目的の遺伝子の分子量に対応するバンドを紫外線で検出し、ゲルから切り取り、これからＤＮＡを抽出することにより、その構造遺伝子を精製した。
【００６２】
ｐＥＴ−  ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素Ｎｃｏ  Ｉで切断した後  Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化し、更にＸｈｏＩで切断、精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１６℃で２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部をＥ．ｃｏｌｉ−ＸＬ２−ＢｌｕｅＭＲＦ’のコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に導入した。方法は同社のマニュアルに従った。詳細は実施例６に示した。形質転換体のコロニーを得た。
【００６３】
得られたコロニーから発現プラスミドをアルカリ法（”Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ”，  Ｂｉｒｍｂｏｉｍ  ＨＣ，  Ｄｏｌｙ  Ｊ  （１９７９）    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ７：１５１３−１５２３  ）で精製した。
【００６４】
精製した発現プラズミドについてＤＮＡ塩基配列を決定し、本発明の遺伝子配列が挿入されていることを確認した。
【００６５】
実施例４：発現プラスミドの構築２（配列番号６）
構造遺伝子領域の前に平滑末端、後に制限酵素（ＸｈｏＩ）サイトを構築する目的でＤＮＡプライマーを合成し（それぞれ、配列番号１０で示されるフォワードプライマー２及び配列番号９で示されるリバースプライマー１）、ＰＣＲでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
【００６６】
ＰＣＲ反応後、制限酵素（Ｂｓｐ  ＨＩ及びＸｈｏＩ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、アガロースゲル電気泳動に供し、目的の遺伝子の分子量に対応するバンドを紫外線で検出し、ゲルから切り取り、これからＤＮＡを抽出することにより、その構造遺伝子を精製した。
【００６７】
ｐＥＴ−  ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素Ｎｃｏ  Ｉで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化し、更にＸｈｏで切断・精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１６℃で２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部をＥ．ｃｏｌｉ−ＸＬ−２  ＢｌｕｅＭＲＦ’のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドを、実施例３と同様のアルカリ法で精製した。
【００６８】
精製した発現プラズミドについてＤＮＡ塩基配列決定を行ない、本発明の遺伝子配列が挿入されていることを確認した。
【００６９】
実施例５：発現プラスミドの構築３（配列番号７）
構造遺伝子領域の前に平滑末端、後に制限酵素（ＸｈｏＩ）サイトを構築し、かつ、遺伝子中の１塩基（配列番号１中で「Ａ」で示した第１００６塩基座位「Ａ」）を削除する目的で、２対のＤＮＡプライマーを合成した（それぞれ、配列番号８で表されるフォワードプライマー１及び配列番号１１で表されるリバースプライマー２、配列番号１２で表されるフォワードプライマー３及び配列番号９で表されるリバースプライマー１を用いた。）。
【００７０】
塩基削除を行う部位の前後に分けて２つのＰＣＲ反応を行い、その産物をオーバーラップエクステンションＰＣＲ法により連結させた。これにより、その遺伝子（本来の構造遺伝子）の前後に制限酵素サイトを導入するとともに、第１００６位の「Ａ」を削除した遺伝子を調製した。連結反応後、制限酵素（ＸｈｏＩ）で完全分解（３７℃で２時間）した後、アガロースゲル電気泳動に供し、目的の遺伝子の分子量に対応するバンドを紫外線で検出し、ゲルから切り取り、これからＤＮＡを抽出することにより、その構造遺伝子を精製した。
【００７１】
ｐＥＴ−２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素Ｎｃｏ  Ｉで切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで切断末端を平滑化し、更にＸｈｏＩで切断、精製した後、上記の構造遺伝子とＴ４リガーゼで１６℃で２時間反応させ連結した。連結したＤＮＡの一部をＥ．ｃｏｌｉ−ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーから発現プラスミドを、実施例３と同様のアルカリ法で精製した。
【００７２】
精製した発現プラズミドについてＤＮＡ塩基配列決定を行ない、本発明の遺伝子配列が挿入されていることを確認した。
【００７３】
実施例６：配列番号５〜７の組換え遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３），  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセル０．１ｍＬをファルコンチューブに移した。その中に配列番号５で表されるＤＮＡを含む発現プラスミド溶液０．００５ｍＬを加え、氷中に３０分間放置した後、４２℃でヒートショックを３０秒間行い、０．９ｍＬのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養した。その後、アンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレートに適量播き、３７℃で一晩培養し、形質転換体を得た。
【００７４】
当形質転換体を、アンピシリンを含む２ＹＴ培地で６００ｎｍの吸光度が１に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加え、更に６時間培養した。その後、培養後遠心分離（６，０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）により集菌した。
【００７５】
実施例７に示す方法で形質転換体から得られた粗酵素液（８５℃で３０分間加熱後、遠心分離して得た上澄液）に対し、実施例８に示した方法でコロイド状キチンを８５℃で分解する活性が存在することを確認することにより、目的の酵素が発現していると判断した。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、アミノ酸配列から計算された分子量に対応するバンドの存在を確認した。
【００７６】
配列番号６で表されるＤＮＡを含む発現プラスミド及び配列番号７で表されるＤＮＡを含む発現プラスミドについてもこれと同様にした。
【００７７】
実施例７：本発明の耐熱性酵素の精製
実施例６で得られた配列番号６で表されるＤＮＡを含む形質転換体を集菌し、集菌した菌体の２倍量のアルミナを加え、菌体を超音波によって粉砕した後、５倍量の１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて懸濁液を得た。得られた懸濁液を８５℃で３０分間加熱した後遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）し、上澄をＨｉＴｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムに吸着させ、活性画分を得た。
【００７８】
配列番号６で表されるＤＮＡを含む形質転換体及び配列番号７で表されるＤＮＡを含む形質転換体についても同様にして得た。
【００７９】
実施例７に示す方法で形質転換体から得られた粗酵素液（８５℃で３０分間加熱後、遠心分離して得た上澄液）に対し、実施例８に示した方法でコロイド状キチンを８５℃で分解する活性が存在することを確認することにより、目的の酵素が発現していると判断した。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、アミノ酸配列から計算された分子量に対応するバンドを確認した。
【００８０】
実施例８：キチン分解活性
基質として１％コロイド状キチンを使用し、２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）中に、４９０μｌの基質溶液に対し１０μｌの酵素を加えて８５℃で１時間反応させた後、Ｍｏｒｇｅｎ  ａｎｄ  Ｅｌｍｅｒ法（水酸化カリウムでｐＨ９．１に調整した１．６Ｍホウ酸緩衝液３０μｌを酵素反応液１５０μｌに加えて混合し、正確に３分間煮沸した。
【００８１】
これを氷冷した後、９００μｌのＤＭＡＢ（パラ−ジメチルアミノベンザルデヒド）試薬を加え、３７℃で２０分間加熱した後、５８５ｎｍでの吸光度を測定することにより、還元末端の増加を測定した。標準物質としてはアセチルグルコサミンを用いた。ＤＭＡＢ試薬は１０Ｎ塩酸を１２．５％含む酢酸１００ｍｌにＤＭＡＢを１０ｇ加えたものであり、使用直前に酢酸で１０倍に希釈して用いた。）により活性を調べた。
【００８２】
配列番号２、３及び４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、全て５８５ｎｍでの発色が見られた。この結果により、本発明で得られた３種の酵素が、高温においてキチン分解活性を有することが明らかになった。
【００８３】
実施例９：耐熱性
本発明で得られた酵素（配列番号２、３、４）を含むそれぞれの酵素溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を２００ｍＭ酢酸酸緩衝液（ｐＨ５．６）中で加熱することによって耐熱性を調べた。
【００８４】
その結果、１００℃で３分間加熱後に実施例８と同様に酵素活性を測定した場合、３種のどの酵素においても酵素活性の低下はみられなかった。また、８５℃で３時間加熱後、同様にして酵素活性を測定した結果、約６４％の活性が保存されていた。これらの結果より、本発明で得られた酵素が耐熱性を有することが分かった。
【００８５】
実施例１０：防カビ剤
本発明の防カビ剤の、種々のカビ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．，  Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．，  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）に対する効果を３７℃において調べた。
【００８６】
培地として、サブローデキストロースＣＧ寒天培地（カゼイン−スイ消化ペプトン５．０ｇ、動物組−ペプシン消化ペプトン５．０ｇ、ブドウ糖４０．０ｇ、寒天１５．０ｇを水１Ｌに溶解したもの）を用いた。
【００８７】
本発明の耐熱性キチナーゼをそれぞれ０．０１ｍｇ／ｍｌになるように加えた培地では、加えなかった培地に比べて上記３種類のカビの生育が大きく阻害された。なお、本発明の耐熱性キチナーゼは３種類とも同様に強い防カビ効果を発揮した。
【００８８】
【発明の効果】
本発明によれば、８０℃以上の高温で活性を有する、耐熱性キチナーゼが提供できる。本発明の酵素分子が高温で安定であることから、キチン、キトサン等の分解を高温で行うことができ、反応効率の上昇、混入微生物の除去（死滅）等、多くの利点が得られる。
【００８９】
また、本発明の酵素は耐熱性であるので、何度も加熱（キチン等の処理）に使用できできるので非常に便利である。更に、分子量が小さいことからも非常に扱い易い。
【００９０】
また、耐熱性を有することから耐有機溶媒性も考えることができ、キチナーゼに防カビ効果があることから、耐熱性の防カビ剤としても使用できる。
【００９１】
【配列表】
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