(57)【要約】【課題】システイン残基のシスチンへの穏やかな酸化処理方法を提供する。【解決手段】本発明は、スルフヒドリル基を有する物質を、ＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインの少なくとも２つを含むポリペプチド及びｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い電子受容体の存在下で酸化して、ジスルフィド結合を形成せしめることを特徴とする、スルフヒドリル基の酸化方法に関する。電子受容体としては、レザズリン等の酸化体と還元体とで色の異なるものが好ましい。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルフヒドリル基を有する物質を、ＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインの少なくとも２つを含むポリペプチド及びｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い電子受容体を含有する溶液とともにインキュベートし、それによりスルフヒドリル基を酸化してジスルフィド結合を形成せしめることを特徴とする、スルフヒドリル基の酸化方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、インビボで調製されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号１、２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記電子受容体がレザズリンである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記スルフヒドリル基を有する物質がケラチン物質である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインの少なくとも２つを含むポリペプチド及びｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い電子受容体を含んでなる、スルフヒドリル残基のための酸化剤組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、インビボで調製されたものである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドの濃度が少なくとも５００ｐｍｏｌである、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、スルフヒドリル基の新規な酸化方法に関する。特に、Ｐ型ＡＴＰａｓｅであるＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインにより触媒されるスルフヒドリル基の銅イオンを介したジスルフィドへの新たな酸化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ヒトの毛髪等におけるケラチンタンパク質の分子間シスチン結合（Ｓ−Ｓ結合）は、ケラチン繊維の正常な形状及び強度を維持するのに極めて重要である。例えば、シスチン結合の減少は、毛髪の損傷、例えば毛髪表面の滑らかさの喪失を招き、毛髪繊維の強度を低下させる（例えば、非特許文献１参照）。特に、毛髪タンパク質はシスチン結合で高度に架橋され、脱水状態にあるため、既に自己増殖できない状態となっている。よって、一旦損傷を受けると自ら修復することはできない（非特許文献２参照）。
ところが、ヒト毛髪にパーマネントウェーブ処理を施した後にケラチンタンパク質の分子間Ｓ−Ｓ結合は減少する。これは、還元過程で生成された全てのＳＨ基が酸化過程で完全に再結合されず、毛髪中にＳＨ基が酸化されずに残るからである。また、紫外線及び空気中に存在する還元剤もケラチンタンパク質中のＳ−Ｓ結合を還元してＳＨ基を生成させ得る。
【０００３】
スルフヒドリル基（−ＳＨ基）からジスルフィド結合を形成させる従来の酸化方法としては、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）又はホウ酸ナトリウム（ＮａＢｒＯ３）等の酸化剤を使用する方法が一般的であった。これらの従来の酸化剤は非常に強い酸化力を有するため身体に刺激性であることが多く、動物繊維に損傷を与える場合があった。例えば、これらの酸化剤により、メラニン粒子の破壊によって生じるヒト毛髪色の変化及びシステイン（ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨ）のシステイン酸（ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＯ３Ｈ）への酸化による毛髪繊維の変性等が生じていた。従って、これら従来の酸化剤の身体への使用、特に毛髪用化粧品での使用は、パーマネントウェーブ剤及び染毛剤に限られていた。
【０００４】
我々は、ヒトの毛髪等の動物繊維の角化領域に存在するケラチンタンパク質におけるＲ−ＳＨからＳ−Ｓへの酸化システムに着目して鋭意研究を進めてきた。
銅は、様々な物質の酸化における良好な触媒として広く知られた金属イオンであり、種々の酵素の重要な補因子、例えば、メラノサイトにおけるチロシナーゼの補因子としても作用する。銅の異常はメラニン生合成を阻害して白髪の発生させ、チロシナーゼを不活性化させる。
一方、ＡＴＰ７Ａタンパク質はＰ型の銅輸送性ＡＴＰアーゼとして知られている。このＡＴＰ７Ａは、膜を８回貫通するタンパク質であり、幾つかの機能的ドメイン、例えば、Ｎ−末端の６つの銅結合ドメイン、ホスファターゼドメイン、リン酸化ドメイン等を有している。胃腸管におけるＡＴＰ７Ａの機能不全は、メンケス病と呼ばれる全身性の銅欠乏症として顕現し胎児初期での死亡をもたらす。この疾患の特徴の一つは異常な縮れ毛であり、ケラチン中間繊維におけるＳ−Ｓ架橋の著しい減少をともなっている。この事実は、銅が毛髪発生における角質化に関与することを示唆している。しかし、生理学的環境では、遊離した銅イオンの酸化還元能力が無作為に作用することを避けるために銅は厳しく捕捉されるべきであることも知られている。従って、毛包で発現される特定の銅結合性タンパク質は発育に関与している可能性がある。
【０００５】
【非特許文献１】内藤幸雄，  繊維学会誌，  第５３巻，  １２−１９頁  （１９９２年）
【非特許文献２】内藤幸雄、「機能性化粧品の開発」、高橋雅夫監修、シーエムシー、第１６１頁（２０００年）
【０００６】
我々は、全長ＡＴＰ７Ａタンパク質自体が内毛根鞘（ＩＲＳ）では発現されるが毛細管の存在する毛乳頭細胞では発現されないことを初めて見出した（図１）。この発見は、ＡＴＰ７Ａが、細胞の毛細管からケラチノサイトへの銅イオン輸送ではなくケラチンタンパク質の角化に関与する機能を有することを示唆している。ＩＲＳ組織は毛幹を真直ぐな形状に保つ鞘状構造体として機能し、毛幹より早期に角化されることが知られている。従って、メンケス病患者のＩＲＳにおけるＡＴＰ７Ａ発現の低下は患者のＩＲＳの不完全な角化を招き、その結果として縮れ毛が生ずるという仮説を立てることが出来る。よって、膜から幾分自由な状態にあるＮ−末端近傍に存在する銅結合ドメインは、毛髪生長において鍵となる分子であると思われる。これらの発見が本発明の基礎をなしている。
【０００７】
即ち、本発明は、上記の知見に基づき、ケラチンタンパク質の角化、即ち−ＳＨ基からＳ−Ｓ結合の形成に関与すると考えられるＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインを利用し、それにより、日常生活において健康な毛髪を維持するために求められていたシステイン残基のシスチンへの穏やかな酸化処理方法を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
よって本発明は、スルフヒドリル基を有する物質を、ＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインの少なくとも２つを含む触媒及びｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い電子受容体の存在下で銅イオンを介して酸化し、ジスルフィド結合を形成せしめることを特徴とする新規なスルフヒドリル基の酸化方法を提供する。
【０００９】
本発明の酸化方法によれば、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）又はホウ酸ナトリウム（ＮａＢｒＯ３）等の身体に刺激性を示しうる従来の酸化剤を一切使用する必要がない。さらに、酸化反応が生理的環境に近い中性ｐＨで進行するので、例えばパーマネントウェーブ剤等の身体に適用する化粧品に配合することにより極めて穏やかな条件でＳ−Ｓ結合を形成することができ、使用者の身体にとって安全かつ快適である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
「−ＳＨ」で表される構造を有する官能基には、「スルフヒドリル基」、「チオール基」、「システイン残基」等の幾つかの呼称があるが、本明細書においては、これらの用語は互換可能に使用されるものとする。同様に、「ジスルフィド結合」あるいは「シスチン結合」なる語は、ともに「Ｓ−Ｓ」結合を意味するものとする。
【００１１】
本発明の酸化方法は、スルフヒドリル基を有する物質を、ＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインの少なくとも２つを含むポリペプチド及びｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い電子受容体の存在下で酸化して、スルフヒドリル基間にジスルフィド結合を形成させるものである。
本発明の方法により酸化されるスルフヒドリル基を有する物質は、少なくとも１つのスルフヒドリル基を有する物質であれば特に限定されないが、ケラチン物質、特にヒトの毛髪等が好ましい。
【００１２】
ヒト由来のＡＴＰ７Ａタンパク質は１５００アミノ酸からなる。その全長アミノ酸配列は既に知られており、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースにＱ０４６５６の番号で登録されている。ＡＴＰ７Ａは６つの銅結合ドメインを有していることも知られており、それらは、ＡＴＰ７Ａの全長アミノ酸配列のアミノ酸残基１６〜２２、１７９〜１８５、２８５〜２９１、３８５〜３９１、４９６〜５０２、及び５７２〜５７８に存在する。本発明で使用するポリペプチドは、これらのＡＴＰ７Ａタンパク質の銅結合ドメイン（以下、「ＣｕＢＤ」と略記する）の少なくとも２つを含んでいる。
【００１３】
上記のＣｕＢＤを、Ｎ−末端に近いものから順に１番目、２番目、・・・、５番目及び６番目と番号を付すると、本発明のポリペプチドは、好ましくは１番目及び２番目、１番目から４番目、５番目及び６番目といったように少なくとも２つの連続するＣｕＢＤを含んでいる。しかしながら、例えば、１番目と３番目、１番目と４番目というように元のＡＴＰ７Ａタンパク質において不連続に存在するＣｕＢＤを２つ以上含んでいてもよい。
【００１４】
これらのポリペプチドは、例えば、ＡＴＰ７Ａの少なくとも２つのＣｕＢＤを含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を適当なベクターに組み込み、適切な宿主細胞に導入して発現させ、適宜に生成されたタンパク質を分離精製することにより、インビボで調製することができる。例えば、ヒト２９３細胞などのＡＴＰ７Ａを発現する事が知られた細胞から、適当なプローブを用いてＡＴＰ７ＡのｍＲＮＡをつり上げ、当該ｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを取得することができる。また、ＡＴＰ７ＡのｍＲＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースにＬ０６１３３の番号で登録されている。
【００１５】
本発明で使用するＡＴＰ７Ａは、ヒト由来のものが好ましいが、本発明で意図する特性を有している限り非ヒト動物に由来するものでもよい。また、使用するＡＴＰ７Ａのアミノ酸配列はゲノム配列と同一でもよいが、本発明で意図する特性を失わない限り、１又はそれ以上の置換、欠失、挿入等の変異を有していてもよい。
所望のポリペプチドの発現に使用する宿主は、大腸菌等の原核生物細胞、あるいは酵母菌や哺乳動物等の真核生物細胞であってよい。使用する宿主細胞に適したベクターは、当業者により容易に選択される。当該ベクターは、ポリペプチドの発現に適するプロモーター配列やシグナル配列等を含んでいてもよく、それらは当業者により過度の実験をすることなく決定され得る。
【００１６】
上記のようにして発現されるポリペプチドは、例えば、大腸菌等の原核細胞内に不溶性粒子の形態で生成された場合は、尿素などの細胞溶解剤で処理し、次いでカラム分離及び透析を経て精製される。一方、真核細胞において細胞外に分泌させた場合には、細胞溶解工程を省略することができる。
【００１７】
このようにして精製されたポリペプチドは、上述したように、少なくとも２つのＣｕＢＤを含んでいる。ＡＴＰ７Ａタンパク質の全長アミノ酸配列（１５００アミノ酸長）を有するポリペプチドは水には不溶であることが一般に知られているが、本発明で使用するポリペプチドは水溶性である。例えば、インビボで生成されたポリペプチドが水に難溶であった場合、当該ポリペプチドの一部、好ましくはＣｕＢＤ以外の部分を親水性基で修飾することによりポリペプチドを水溶性とすることもできる。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、互いにペプチド結合したアミノ酸のみからなる分子であるのが好ましいが、アルキレン鎖、エステル、エーテル等の他の構造を有していてもよい。例えば、１番目と３番目又は２番目と４番目等の不連続なＣｕＢＤを含む分子の場合、各ＣｕＢＤに相当するアミノ酸配列を有する複数の短鎖ポリペプチドを別々に調製し、それらの短鎖ポリペプチドをペプチド結合以外の化学結合によって結合させて１つの分子としてもよい。そのような分子も本発明におけるポリペプチドに包含されるものとする。
【００１９】
例えば、本明細書に記載する配列番号１、２、３又は４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、本発明において好ましく使用されるポリペプチドの例である。配列番号：１は１番目〜４番目のＣｕＢＤを含み、配列番号：２は１番目及び２番目のＣｕＢＤを含み、配列番号：３は５番目及び６番目のＣｕＢＤを含み、そして配列番号：４は１番目〜６番目のＣｕＢＤを含んでいる。これらのポリペプチドに関しては、後の実施例において詳述する。
【００２０】
上述したようにインビボで調製したポリペプチドは、そのＣｕＢＤに、宿主細胞中に微量に存在する銅イオンが結合した状態で得ることができる。即ち、インビボで調製した場合には、精製したポリペプチドに銅イオンを添加することなく、銅イオンを包含した形態のポリペプチドを得ることができる。よって、本発明における「ポリペプチド」は、（インビボで調製された）銅イオンを包含した形態のポリペプチドを意味するものとする。
【００２１】
一方、本発明で使用する「ポリペプチド」と同一のアミノ酸配列を有し、銅イオンを包含しない分子は、例えば固相合成を含む化学合成手法を用いてインビトロで合成することも可能である。そのような合成ポリペプチドも、後に銅イオンを添加して銅イオンを包含したものとすることにより、本発明における「ポリペプチド」として使用できる。添加する銅イオンの量は特に限られず、ポリペプチドに含まれるＣｕＢＤの数に応じて適宜調節される。
【００２２】
次に、本発明で使用されうる電子受容体は、スルフヒドリル基をジスルフィドに酸化することにより自身は還元されたＣｕ（Ｉ）イオンから電子を受け取り、Ｃｕ（Ｉ）イオンをＣｕ（ＩＩ）イオンに酸化することのできる物質であればよい。
例えば、Ｃｕ（Ｉ）イオンとＣｕ（ＩＩ）イオンとの間の可逆的酸化還元反応における平衡電極電位は、ｐＨ７．０において０．１５Ｖであることが知られている（「ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（生化学計算法）」，  ＩＲＷＩＮ  Ｈ．  ＳＥＧＥＬ著、廣川書店、ｐ４６３参照）。従って、Ｃｕ（Ｉ）から電子を受容してＣｕ（ＩＩ）とすることのできる物質としては、ｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い物質であればよい。
【００２３】
上記の条件に合致する物質の例としては、レザズリン（酸化還元電位０．３５Ｖ）、メチレンブルー（０．５３Ｖ）、バリアミンブルーＢ（０．６８Ｖ）、ジフェニルアミン（０．７６Ｖ）及びフェロイン（１．０６Ｖ）等の酸化体と還元体とで色調が著しく変化する物質が挙げられる。その他に、ＡｇＣｌ（０．２２Ｖ）、Ｈｇ２Ｃｌ２（０．２７Ｖ）、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ） ６（０．３６Ｖ）、Ｉ２（０．５４Ｖ）及びＫＭｎＯ４（０．３６Ｖ）等の金属化合物、チトクロムａ（０．２９Ｖ）、チトクロムｃ（０．２２Ｖ）及びチトクロムｆ（０．３７Ｖ）等の生体関連化合物を挙げることができる。
【００２４】
本発明においては、特に、電子受容体としてレザズリンが好ましく使用される。レザズリンは酸化還元指示薬として知られ、酸化体（レザズリン）は青色を呈し還元体（レゾルフィン）は赤色を呈する。レザズリンを含む指示薬は、例えばアラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）という商品名でＴｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から市販されており、特に細胞増殖／細胞毒性の測定等に使用されている。アラマーブルーは、レザズリンの自然還元を防止する添加剤を含有しており、還元反応により青色からピンク色に変化する。このような酸化体と還元体とで異なる色を呈する化合物（例えば酸化還元指示薬）を電子受容体として使用すると、スルフヒドリル基からジスルフィドへの酸化反応の進行が、反応系の色の変化により直接確認できるという付加的な利点がある。
【００２５】
本発明の酸化方法にあっては、酸化されるべきスルフヒドリル基を有する物質を、上記ポリペプチド（銅イオンを包含する）及び電子受容体と接触させることにより、スルフヒドリル基からポリペプチドに包含されるＣｕ（ＩＩ）イオンへの電子移動が起こり、スルフヒドリル基が酸化されてジスルフィド結合が形成され、それと同時にＣｕ（ＩＩ）イオンはＣｕ（Ｉ）イオンに還元される（図２、左側）。次いで、生成されたＣｕ（Ｉ）イオンから、共存する電子受容体（酸化型）への電子移動が起こり、Ｃｕ（Ｉ）がＣｕ（ＩＩ）に再酸化されると同時に電子受容体が還元型に変換される（図２、右側）。この反応系における電子移動の方向は、図２における左側から右側に向かっている。電子受容体としてアラマーブルーを使用した場合には、この反応が進行することにより溶液全体が青色からピンク色に変化する。
【００２６】
本発明の方法においては、スルフヒドリル基からジスルフィドへの酸化によって消費されたＣｕ（ＩＩ）イオンが、電子受容体への電子移動によって再酸化される。従って、反応が進行してもＣｕ（ＩＩ）イオンを補充する必要がなく、酸化反応は、酸化されるべき物質あるいは酸化体の電子受容体が枯渇するまで続くことになる（図２参照）。よって、使用するポリペプチド（銅イオンを包含する）の量は少量でも良いが、酸化されるべきスルフヒドリル基に対して少なくとも約１／１０００、好ましくは少なくとも約１／５００、より好ましくは少なくとも約１／３００のモル比とすることができる。また、電子受容体の濃度は、電子受容体の酸化型から還元型への反応に関与する電子数にもよるが、タンパク質中に含まれるスルフヒドリル基の完全な酸化を意図する場合、酸化されるべきスルフヒドリル基に対して少なくとも約１／１（等モル倍）、好ましくは約１０／１（１０モル倍）、より好ましくは約５０／１（５０モル倍）比とすることができる。
【００２７】
別の態様においては、本発明は、ＡＴＰ７Ａの銅結合ドメインの少なくとも２つを含むポリペプチド及びｐＨ７．０における酸化還元電位が０．１５Ｖより高い電子受容体を含んでなる、スルフヒドリル残基のための酸化剤組成物を提供する。
この酸化剤組成物で使用されうるポリペプチド及び電子受容体は、既に詳細に説明した通りである。
本発明の酸化剤組成物に含まれるポリペプチド量は特に限定されないが、一般的にはＣｕＢＤのモル数で、少なくとも約１ｎｍｏｌ、好ましくは少なくとも約７００ｐｍｏｌ、より好ましくは少なくとも約５００ｐｍｏｌとする。電子受容体量は特に限定されず、例えば前記の好ましいモル比等を参考にして適宜選択できるが、一般的には少なくとも約２０ｎｍｏｌ、好ましくは約２００ｎｍｏｌ、より好ましくは約１０００ｎｍｏｌとする。
なお、ポリペプチドを多量に用いる場合には、触媒能を損なわない範囲で、温和な非イオン性界面活性剤を使用してポリペプチドの溶解を促進してもよい。
【００２８】
本発明の酸化剤組成物は、中性付近のｐＨにおいてスルフヒドリル基をジスルフィドに酸化することができる。よって、本発明の酸化剤組成物は、ヒトに適用される毛髪化粧料、特にパーマネントウェーブ剤や毛髪用ケア製品として好ましく使用される。毛髪化粧料として使用する場合には、化粧品で通常使用されている各種の活性成分を更に添加することができる。
【００２９】
【実施例】
以下に具体例を示し、本発明を更に詳細に説明する。
（実施例１）
ヒト腎臓２９３細胞から単離したｍＲＮＡを用いた逆転写（ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によってＡＴＰ７ＡｃＤＮＡを得た。ＡＴＰ７Ａタンパク質の８−４８７アミノ酸（配列番号：１）で表される配列を有するポリペプチド（ＣｕＢＤ（１−４）と命名）に対応するヌクレオチド断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理して切り出し、ｐＰＲＯ−ＥＸ−ＨＴＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にインフレームで結合した。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１株に導入した。１．５時間の培養の後、大腸菌形質転換体を１ｍＭのイソプロピル−＿−Ｄ−チオガラクトシドで処理し、さらに５時間培養した。細胞を回収し、バッファーＡ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８Ｍの尿素）中で超音波処理した。得られた粗細胞抽出物をキレートセファロースＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に通した。カラムをバッファーＢ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．３）、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８Ｍの尿素）で洗浄した後、ヘキサ−ヒスチジン−タグＣｕＢＤ（１−４）をバッファーＣ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、８Ｍの尿素）で溶離した。次いでＣｕＢＤ（１−４）を、４、２、１及び０．５Ｍの尿素含有及び尿素を含まないトリスバッファー塩水（ＴＢＳ）（Ｔａｋａｒａ社）で各３時間ずつ透析することにより再構成した。精製したＣｕ（１−４）の濃度を、ＢＳＡを標準として用いるＲＣ  ＤＣプロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）により見積もった。
【００３０】
次いで、２４μｇ（４２５ｐｍｏｌ）のＣｕＢＤ（１−４）を、２０ｎｍｏｌのシステイン残基を含有する１０％（ｖ／ｖ）のアラマーブルー溶液（Ｔａｋａｒａ社）に添加し（この溶液を溶液（１）とする）、当該溶液（１）を３７℃でインキュベートした。以下の全ての実験と同様にＴＢＳ濃度は０．６倍希釈した。その結果、アラマーブルーを含む溶液（１）は、日数が経過するとともに青色からピンク色に変化し、図２に示す酸化反応が進行したことが確認された（図３）。
この溶液（１）の吸収スペクトル（波長４００〜７００ｎｍ）を、インキュベーション開始時、開始から７２時間、１４４時間、２４０時間及び３１２時間後に測定し、その結果を図４（Ａ）に示した。このグラフにより、アラマーブルーの酸化体（ピンク色）に相当する５７３ｎｍにおける吸光度の増加、及び還元体（青色）に相当する６０３ｎｍにおける吸光度の減少が見られた。
【００３１】
（実施例２）
溶液（１）に換えて以下の溶液（２）〜（５）を用いて実施例１と同様の実験を実施した。
溶液（２）：溶液（１）からＣｕＢＤ（１−４）を除いたもの；
溶液（３）：溶液（２）に１．７ｍｍｏｌのＣｕＣｌ２を加えたもの；
溶液（４）：溶液（１）に銅イオンのキレート剤であるバソキュプロインジスルホン酸（ＢＣＳ）１０ｎｍｏｌを加えたもの；及び
溶液（５）：溶液（３）に１０ｎｍｏｌのＢＣＳを加えたもの。
【００３２】
上記の溶液（２）〜（５）を、実施例１と同様に３７℃でインキュベートし、その吸収スペクトルの変化を測定した。それらの結果を図４の（Ｂ）〜（Ｅ）（各々、溶液（２）〜（５）に対応）に示す。溶液（２）の結果（図４（Ｂ））から、溶液（１）で観察された酸化還元反応が進行するにはＣｕＢＤ（１−４）が必要であることがわかり、溶液（４）の結果（図４（Ｄ））から、その反応が、銅イオンのキレート剤（ＢＣＳ）の添加により阻害されたことがわかる。また、溶液（３）及び（５）の結果（図４（Ｃ）及び（Ｅ））から、銅イオンのみでは上記の酸化還元反応は進行せず、それはキレート剤（ＢＣＳ）の有無に関係ないことがわかる。
【００３３】
図４に各溶液毎に示した結果を、各測定時間毎のグラフにまとめたのが図５である。波長６０３ｎｍにおける吸光度の減少は、ＣｕＢＤ（１−４）を含む溶液（１）及び（４）のみで見られ、波長５７３ｎｍにおける吸光度の増加はＢＣＳを含まない溶液（１）のみで観察された。
さらに、波長５７３ｎｍ及び波長６０３ｎｍにおける吸光度の変化のみを図６に示した（各々、図６（Ａ）及び（Ｂ））。本発明の酸化剤組成物においてのみ良好に酸化還元反応サイクルが進行していることがわかる。
以上の結果より、図２に示した酸化還元反応サイクルには、ＣｕＢＤ（１−４）に結合した銅イオンの存在が必須であることが明らかにされた。
【００３４】
（実施例３）
ＡＴＰ７Ａタンパク質のアミノ酸８−２０７（配列番号：２）、４８６−６４７（配列番号：３）、及び１０−６４７（配列番号：４）に示す配列を有するポリペプチド（各々、ＣｕＢＤ（１−２）  、ＣｕＢＤ（５−６）、及びＣｕＢＤ（１−６）と命名する）に対応するＡＴＰ７ＡｃＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。以下の説明では、ＣｕＢＤ（ｎ−ｎ’）に相当するｃＤＮＡ断片をＣｕＢＤ（ｎ−ｎ’）断片と呼ぶ。
【００３５】
ＰＣＲ実験で使用したプライマーＤＮＡのヌクレオチド配列を以下に示す；
１）ＣｕＢＤ（１−２）断片について：
５’−ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＣＣＡ−３’（配列番号：５）及び
５’−ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＴＴＡ  Ａ−３’（配列番号：６）
２）ＣｕＢＤ（１−６）断片について：
５’−ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＴＴＧ  Ａ−３’（配列番号：７）及び
５’−ＧＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＴ  ＡＴＴ  ＴＣＴ  ＣＧＴ  ＴＴＡ  ＴＧＡ  Ｔ−３’（配列番号：８）
【００３６】
ＣｕＢＤ（１−２）断片は、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化され、ＣｕＢＤ（１−６）断片はＳａｌＩで消化された。ＣｕＢＤ（５−６）断片は、ＣｕＢＤ（１−６）断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで消化して切り出した。次いで、それらをｐＰＲＯ−ＥＸ−ＨＴＣベクターにインフレームで結合した。タンパク質発現及び精製を含む以下の操作は、実施例１におけるＣｕＢＤ（１−４）についての操作と同じである。
【００３７】
酸化還元反応の実施においては、９００ｐｍｏｌのＣｕＢＤ（１−２）及びＣｕＢＤ（５−６）の濃度を９００ｐｍｏｌとし、ＣｕＢＤ（１−４）の濃度を４５０ｐｍｏｌとし、そしてＣｕＢＤ（１−６）の濃度を３００ｐｍｏｌとして、各溶液に含まれるＣｕＢＤのモル数を一定にした。即ち、いずれのＣｕＢＤを用いた場合にも、系に存在する銅イオン量は１．８ｎｍｏｌとなる。１０％（ｖ／ｖ）のアラマーブルー溶液及び２５ｎｍｏｌのシステイン残基を含有するタンパク質溶液に各ポリペプチドを添加し、ＢＳＣ有又は無で、３７℃において３日間インキュベートした。３日後の各溶液の吸収スペクトルを図７に示す。４つのペプチドは、いずれも同程度の酸化還元反応が進行し、それはＢＣＳの存在によって阻害された。
【００３８】
（実施例３）
ケラチン混合物を次のようにして調製した。４０ｇの精製したウールを、０．４Ｍのチオグリコール酸溶液（ｐＨ１１．０、ＫＯＨで調節）に、５０℃で２０分間攪拌しながら溶解させた。尿素を８Ｍとなるまで添加した後、溶液を３０℃で２４時間、１ｍＭのＥＤＴＡとともにアルゴンガス下で攪拌した。沈殿物を遠心分離で除去した後、上清を１０ｍＭのトリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）に対して、アルゴンガス下で１週間透析した。溶液を再度遠心分離し、得られた上清をケラチン混合物として使用した。
【００３９】
ウールケラチンは、約４０のシステイン残基を含むことが知られている。実験では、０．５又は１ｎｍｏｌのケラチン混合物（約２０又は４０ｎｍｏｌのシステイン残基を含む）に１０％（ｖ／ｖ）にアラマーブルー溶液を含有せしめて放置するか、５００ｐｍｏｌのＣｕＢＤ（１−４）とともに３７℃で２週間インキュベートした。同様に、１ｎｍｏｌのケラチン混合物を５００ｐｍｏｌのＣｕＢＤ（１−４）とともにアラマーブルーの不存在下でインキュベートした。
【００４０】
反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１０％のポリアクリルアミドゲルを用いて実施した。１／２０の濃度に希釈した生成物についても分析した。分離したタンパク質は銀染色ＩＩキットＷａｋｏ（Ｗａｋｏ社）で染色した。ケラチンのみ、及びアラマーブルー無しの反応を分析した際、ケラチンは非常に不安定で、その殆どが分解してゲルの底部に移動した（図８（Ａ）、レーン３、４、７、８、１１及び１２）。しかしながら、ＣｕＢＤ（１−４）の存在下では、ケラチンモノマーより高分子量の位置に尾を引く染色が観察された（図８（Ａ）、レーン５及び９）。
これらの結果は、ケラチンタンパク質が本発明の酸化方法に従って酸化重合され、高分子量の物質が生成されるとともにケラチンタンパク質の分解が回避されたことを示唆している。
【００４１】
次に、各溶液を還元剤である２−メルカプトエタノールの存在下で煮沸した。その結果、酸化重合に基づく高分子量の物質が還元され、尾を引く染色が減少した（図８（Ａ）のレーン６を５と、レーン１０を９と比較されたい）。即ち、上記の高分子量化が酸化反応によるものであることが確認された。
【００４２】
次に、ウェスタンブロット分析を実施した。詳細には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、ＰＶＤＦメンブレンに分離タンパク質をブロットした。これを、５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ／ＴＢＳＴ（０．１％−Ｔｗｅｅｎ−２０）で一晩ブロッキングした。次に、マウス毛のケラチンタイプＩタンパク質のＮ−末端部分に対して生じた抗−ケラチン抗血清（１μｇ／ｍｌ）／ＴＢＳＴ（０．１％−Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸し室温下で３時間放置した。Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（４０ｎｇ／ｍｌ）に浸し室温下で２時間処理した後、ＥＣＬ−ｐｌｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で化学発光を検出した。図８（Ｂ）に示すように、得られた結果はケラチン分子の酸化的重合を明らかに示している。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】毛髪におけるＡＴＰ７Ａの発現を示す図である。
【図２】本発明の酸化方法における酸化還元反応の機構を示す模式図である。
【図３】実施例１における溶液（１）の色の変化を示す図である。
【図４】実施例１及び２における各溶液の吸収スペクトルの時間変化を示すグラフである。グラフ（Ａ）は溶液（１）；（Ｂ）は溶液（２）；（Ｃ）は溶液（３）；（Ｄ）は溶液（４）；そして（Ｅ）は溶液（５）を示す。各グラフにおける印は、（○）がインキュベーション開始時、（□）が開始から７２時間後、（△）が１４４時間後、（◇）が２４０時間後、そして（×）が３１２時間後のデータを示す。
【図５】実施例１及び２における各測定時の吸収スペクトルを示すグラフである。グラフ（Ａ）はインキュベーション開始時；（Ｂ）は７２時間後；（Ｃ）は１４４時間後；（Ｄ）は２４０時間後；そして（Ｅ）は３１２時間後のデータを示す。各グラフにおける印は、（○）が溶液（１）、（□）が溶液（２）、（△）が溶液（３）、（◇）が溶液（４）、そして（×）が溶液（５）のデータを示す。
【図６】実施例１及び２における各溶液の（Ａ）波長５７３ｎｍ及び（Ｂ）波長６０３ｎｍにおける吸光度の時間変化を示すグラフである。各グラフにおける印は、（○）が溶液（１）、（□）が溶液（２）、（△）が溶液（３）、（◇）が溶液（４）、そして（×）が溶液（５）のデータを示す。
【図７】実施例３における、各溶液の７２時間のインキュベーション後の吸収スペクトルを示す図である。グラフ（Ａ）はＣｕＢＤ（１−２）；（Ｂ）はＣｕＢＤ（５−６）；（Ｃ）はＣｕＢＤ（１−６）；そして（Ｄ）はＣｕＢＤ（１−４）のデータを示す。各グラフにおける印は、（○）が各溶液、（×）が各溶液にＢＣＳを添加した場合のデータを示す。
【図８】実施例４における（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び（Ｂ）ウェスタンブロット分析の結果を示す図である。レーン１及び２はインキュベーション前のケラチンタンパク質；レーン３及び４は０．５ｎｍｏｌケラチンタンパク質のみのインキュベーション後；レーン５及び６は０．５ｎｍｏｌケラチンタンパク質とＣｕＢＤ（１−４）との混合溶液のインキュベーション後；レーン７及び８は１ｎｍｏｌケラチンタンパク質のみのインキュベーション後；レーン９及び１０は１ｎｍｏｌケラチンタンパク質とＣｕＢＤ（１−４）とアラマーブルーとを含む溶液のインキュベーション後；レーン１１及び１２は１ｎｍｏｌケラチンタンパク質とＣｕＢＤ（１−４）とを含みアラマーブルー（電子受容体）を含まない試料のインキュベーション後のデータを示す。偶数レーンは分析時に２−メルカプトエタノールによる還元処理有り、奇数レーンは還元処理無しの結果を示す。図中の矢印は、各々タイプＩケラチン及びタイプＩＩケラチンを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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