(57)【要約】【課題】  マイクロ流路内で液体中の微粒子の流れを操作する微粒子操作ユニット、それを搭載したチップと検出装置、およびタンパク質の分離、捕獲、検出方法を提供する。【解決手段】  基板４１上に形成された流路１が分岐点４３において流路２と流路３とに分岐する構成とする。そして、流路１と流路２、及び流路３の分岐点に、柱状構造の妨害体８を一定の間隙を設けて配列する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板上に形成された、第一の流路および該第一の流路から分岐する第二の流路を含む流路と、を備え、前記流路内の液体中を流動する微粒子の流動方向を操作する微粒子操作ユニットであって、
前記第一の流路から一以上の前記第二の流路が分岐する分岐点の近傍の前記第一の流路中に、前記微粒子の少なくとも一部に対し透過を制限する透過制限領域を備えることを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項２】
請求項１に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記透過制限領域は、離間して配置された複数の妨害体を有することを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項３】
請求項２に記載の微粒子操作ユニットにおいて、隣接する前記妨害体間の間隙が、前記微粒子の一部を透過する大きさに設定されたことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項４】
請求項２または３に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記微粒子の流動を形成する力の方向と、前記透過制限領域の前記分岐点側最前面における前記妨害体の配列方向とが、非直角または非平行となるように前記妨害体が配置されていることを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項５】
請求項２乃至４いずれかに記載の微粒子操作ユニットにおいて、複数の前記妨害体の配列により前記微粒子の流動方向を制御し前記微粒子の少なくとも一部を前記第一の流路または前記第二の流路のいずれかに導くことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項６】
請求項２乃至５いずれかに記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記妨害体が、平面的に周期的に配置されていることを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項７】
基板と、該基板上に形成された、主流路および該主流路から前記主流路の下流側に向かって分岐する一以上の副流路を含む流路と、を備え、前記流路内を流動する微粒子の流動方向を操作する微粒子操作ユニットであって、
前記主流路から一以上の前記副流路が分岐する分岐点の上流側に流動制御部を備え、
前記流動制御部は、前記微粒子の流動方向を制御し、前記微粒子の少なくとも一部を前記主流路または前記副流路のいずれかに導くことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項８】
請求項７に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部は複数の妨害体を有し、該複数の妨害体の配列により前記微粒子の流動方向を制御し前記微粒子の少なくとも一部を前記主流路または前記副流路のいずれかに導くことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項９】
請求項７または８に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部は、周期的に配置された複数の前記妨害体を有することを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１０】
請求項９に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部における隣接する前記妨害体間の間隙が、前記主流路の形成方向と、前記副流路の形成方向とで異なることを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１１】
基板と、該基板上に形成された流路と、を備え、前記流路内を流動する微粒子の流動状態を操作する微粒子操作ユニットであって、前記流路中に、トレンチが流路壁面に形成された流動制御部を有し、前記微粒子の少なくとも一部を所定の方向に導くことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記トレンチが前記流路壁面に周期的に形成された流動制御部を有することを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１３】
請求項１２に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部は、前記トレンチの開口形状または前記トレンチの間隔の異なる複数の周期パターンを含むことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１４】
請求項１３に記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記複数の周期パターンは、前記流動制御部において鏡映対称に形成されていることを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１５】
基板と、該基板上に形成された流路と、を有し、前記流路内を流動する微粒子の流動方向を操作する微粒子操作ユニットであって、
前記流路中に、前記微粒子の少なくとも一部に対し透過を制限する透過制限領域が設けられ、
前記透過制限領域の入口幅が前記透過制限領域の幅よりも狭く、
前記透過制限領域内を流動する前記微粒子に、一の方向への移動速度を付与する第一の駆動手段および前記一の方向と異なる他の方向への移動速度を付与する第二の駆動手段を有し、
前記透過制限領域に、離間して配置された複数の妨害体が設けられたことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１６】
請求項１乃至１５いずれかに記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記微粒子が、高分子樹脂、金属、半導体、または生体分子のいずれかを含むことを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１７】
請求項１乃至１６いずれかに記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記微粒子をその大きさに依存して分離する機能を有することを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１８】
請求項１乃至１７いずれかに記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記流路に微粒子を懸濁した懸濁液が導入され、前記懸濁液を希釈する機能を有することを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項１９】
請求項１乃至１７いずれかに記載の微粒子操作ユニットにおいて、前記流路に微粒子を懸濁した懸濁液が導入され、前記懸濁液を脱塩する機能を有することを特徴とする微粒子操作ユニット。
【請求項２０】
請求項１乃至１９いずれかに記載の微粒子操作ユニットを有することを特徴とするチップ。
【請求項２１】
請求項２０に記載のチップと、前記微粒子の検出手段とを備えることを特徴とする検出装置。
【請求項２２】
請求項２１に記載の検出装置において、前記微粒子の検出手段が質量分析装置により構成されていることを特徴とする検出装置。
【請求項２３】
それぞれ異なる分離手段を用いる二つ以上の工程を含むタンパク質の分離方法であって、
タンパク質を分離する前記工程の一つに、少なくともタンパク質を連続的に分離する機能を有するチップを用いてタンパク質を分離する工程を含むことを特徴とするタンパク質の分離方法。
【請求項２４】
それぞれ異なる分離手段を用いる二つ以上の工程を含むタンパク質の分離方法であって、
タンパク質を分離する前記工程の一つに、請求項２０に記載のチップを用いてタンパク質を粗分離する工程を含むことを特徴とするタンパク質の分離方法。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載のタンパク質の分離方法によりタンパク質を分離した後、分離されたタンパク質をプロテアーゼ処理により分解し、さらにその分解生成物を質量分析装置により同定する工程を含むことを特徴とするタンパク質の検出方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載のチップを用いてタンパク質を分離した後、複数のタンパク質を含む懸濁液から、親和性を利用して目的とするタンパク質を捕獲することを特徴とするタンパク質の捕獲方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載のタンパク質の捕獲方法によりタンパク質を捕獲した後、前記チップの表面を洗浄し、さらに前記捕獲したタンパク質を質量分析装置により同定する工程を含むことを特徴とするタンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子操作ユニット、それを搭載したチップと検出装置、ならびにタンパク質の分離、捕獲、および検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロ・エレクトロ−メカニカル・システム（ＭＥＭＳ）技術の発展により、特にバイオＭＥＭＳ分野でマイクロ流路を利用した微粒子の処理への応用が試みられている。たとえば、従来高分子ゲルを使用していた電気泳動用の妨害体を微細加工技術で作製した分画装置が提案されている（特許文献１）。これにより、従来の高分子ゲルの調製の手間が無くなる、再現性が向上する等の産業利用上の利点が見出されていた。しかしながら、マイクロ流路を利用した微粒子の処理装置はその処理量が極めて少ないという課題があった。
【０００３】
これを解決するために、連続的に微粒子の処理を行う方法が提案されている（特許文献２）。特許文献２記載の技術においては、電気泳動を行うための緩衝液を連続的に流しながら、その流れに対して直角に電界を印加し、緩衝液中の生体分子の泳動を行うことにより、微粒子の一種である生体分子の連続的な分離を実現している。この連続的な処理により、処理時間を長く取る事によって処理量が極めて少ないという制約を排除することができる。
【０００４】
一方、妨害体の作製に微細加工技術を利用する試みもなされている（非特許文献１）。非特許文献１に記載の方法では、流れに対して非対称の形状を有する妨害体の規則格子を用いて、連続的に微粒子の分離を行っている。
【０００５】
ところが、これらの従来の技術には以下のような課題があった。特許文献２記載の技術においては、ポンプにより緩衝液を流しながら電気泳動を行い、その速度により分離角度が決定されるため、脈動するポンプにより緩衝液の流速が変動し、この流速の変動に分離能が著しく左右されていた。
【０００６】
また、非特許文献１に記載のデバイスでは妨害体が固定されているため、特許文献２記載の方法と比較すると、より安定に分離が行える。しかし、妨害体の形状に分離性能が依存しているため、生体分子のように、分子レベルの大きさを有する微細な粒子に対応することが困難であった。たとえばタンパク質のように粒径が５０ｎｍ以下の微粒子を分離する場合、妨害体の形状にはより高い精度が求められるが、このような微細な形状を精度良く作製することは、現状の微細加工技術では困難であった。また、細胞などのミリメートルオーダーの微粒子を分離する場合においても、分離する微粒子のサイズに対して妨害体の形状に求められる加工精度が高いため、その加工精度を実現可能な高価な加工技術を必要としていた。
【特許文献１】特表平９−５０４３６２号公報
【特許文献２】特開２００２−１９５９８２号公報
【非特許文献１】Ｃｈｉａ−Ｆｕ  Ｃｈｏｕら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（ＵＮＩＴＥＤ  ＳＴＡＴＥＳ）、１９９９年、９６巻、２４号、ｐ．１３７６２−１３７６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、マイクロ流路内で液体中の微粒子の流れを操作する微粒子操作ユニット、チップ、およびタンパク質の処理方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によれば、基板と、該基板上に形成された、第一の流路および該第一の流路から分岐する第二の流路を含む流路と、を備え、前記流路内の液体中を流動する微粒子の流動方向を操作する微粒子操作ユニットであって、前記第一の流路から一以上の前記第二の流路が分岐する分岐点近傍の前記第一の流路中に、前記微粒子の少なくとも一部に対し透過を制限する透過制限領域を備えることを特徴とする微粒子操作ユニットが提供される。
【０００９】
本発明において、「微粒子」とは、ミリメートルオーダー以下の大きさを有する分子または原子、あるいは集合体であって、たとえば金属微粒子、半導体微粒子、高分子樹脂、細胞、生体高分子等を含む。このうち生体高分子には、タンパク質、核酸、多糖、脂質およびこれらの複合体を含む。また、「微粒子の操作」とは、主として流路内における微粒子の流れの方向や経路を調節する操作をいう。微粒子の流れを制御することにより、分離、濃縮、希釈、脱塩、溶媒置換等様々な処理が可能となる。
【００１０】
本発明に係る微粒子操作ユニットは、流路中に制限透過領域を備える。このため、第一の流路と第二の流路とが分岐する分岐点よりも下流側への微粒子の移動を制限することができる。第一の流路から透過制限領域に至った液体中の微粒子のうち、所定の形状、大きさの微粒子のみが透過制限領域を透過し、第一の流路の下流側へと導かれる。また、液体中に含まれる微粒子のうち、特定の微粒子、すなわち透過制限領域を透過することができない微粒子の流動方向を操作し、このような粒子のみを第二の流路へと導くことが可能となる。このように、本発明に係る微粒子操作ユニットによれば、液体中の微粒子の流れる方向を簡便に効率よく制御することが可能となる。
【００１１】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記透過制限領域は、離間して配置された複数の妨害体を有する構成とすることができる。この構成により、妨害体の間隙を透過することが可能な微粒子と不可能な微粒子とを、微粒子の表面の性質や形状、大きさ、変形のしやすさ等に基づいて分離することができる。
【００１２】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、隣接妨害体間の間隙が、前記微粒子の一部を透過する大きさに設定された構成とすることができる。この構成により、第一の流路中の液体に含まれる微粒子を、その形状、大きさに基づき確実に分離することが可能となる。
【００１３】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記微粒子の流動を形成する力の方向と、前記透過制限領域の前記分岐点側の最前面における前記妨害体の配列方向とが、非直角または非平行となるように前記妨害体が配置された構成とすることができる。
【００１４】
ここで、「透過制限領域の分岐点側の最前面における妨害体の配列方向」とは、第一の流路の下流側から妨害体の配列を見た際に、最前面に位置する妨害体を結ぶ方向を指す。この配列方向と、微粒子の流動を形成する力の方向を非直角とすることにより、透過制限領域を透過することができない微粒子が、透過制限領域近傍に堆積することを抑制し、効率よく第二の流路中へと導くことができる。また、非平行とすることにより、液体中の微粒子のうち、透過制限領域を通過できる形状、大きさ等を有する微粒子について、確実に透過制限領域を通過させることができる。
【００１５】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記複数の妨害体の配列により前記微粒子の流動方向を制御し前記微粒子の少なくとも一部を前記第一の流路または前記第二の流路のいずれかに導く構成とすることができる。この構成により、複数の妨害体の配列を利用して微粒子を所定の流路に導くことができる。従って、第一の流路に導かれる微粒子と第二の流路に導かれる微粒子とを確実に分離することができる。
【００１６】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記妨害体が、平面的に周期的に配置されている構成とすることができる。この構成により、より一層精度の高い処理が可能となる。
【００１７】
本発明によれば、基板と、該基板上に形成された、主流路および該主流路から前記主流路の下流側に向かって分岐する一以上の副流路を含む流路と、を備え、前記流路内を流動する微粒子の流動方向を操作する微粒子操作ユニットであって、前記主流路から一以上の前記副流路が分岐する分岐点の上流側に流動制御部を備え、前記流動制御部は、前記微粒子の流動方向を制御し前記微粒子の少なくとも一部を前記主流路または前記副流路のいずれかに導くことを特徴とする微粒子操作ユニットが提供される。
【００１８】
本発明に係る微粒子操作ユニットによれば、主流路から副流路が分岐する分岐点の上流側に流動制御部が形成されているため、分岐点に導入された微粒子をその表面の性質、形状、大きさ、変形のしやすさ、等に基づいていずれかの副流路に誘導することができる。したがって、複数の微粒子を含む液体中の各成分を所望の副流路に分配することが可能となる。
【００１９】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部は複数の妨害体を有し、該複数の妨害体の配列により前記微粒子の流動方向を制御し、前記微粒子の少なくとも一部を前記主流路または前記副流路のいずれかに導く構成とすることができる。この構成により、複数の妨害体の配列を利用して微粒子を所定の流路に導くことができる。従って、主流路に導かれる微粒子と副流路に導かれる微粒子とを確実に分離することができる。
【００２０】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部は、周期的に配置された複数の妨害体を有する構成とすることができる。この構成により、妨害体の間隙を透過することが可能な微粒子と不可能な微粒子とを、微粒子の表面の性質や形状、大きさ、変形のしやすさ等に基づいて分離することができる。
【００２１】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部における隣接妨害体間の間隙が、前記主流路の形成方向と、前記副流路の形成方向とで異なる構成とすることができる。ここで、主流路または副流路の形成方向についての「隣接妨害体間の間隙」とは、流路の形成方向に対して垂直な断面における妨害体間の間隙のことを指す。主流路と副流路とでこの間隙が異なる構成とすることにより、流動制御部中の微粒子の形状、大きさ等に基づき確実に各副流路または主流路へと分配させることができる。
【００２２】
本発明によれば、基板と、該基板上に形成された流路と、を備え、前記流路内を流動する微粒子の流動状態を操作する微粒子操作ユニットであって、前記流路中に、トレンチが流路壁面に形成された流動制御部を有し、前記微粒子の少なくとも一部を所定の方向に導くことを特徴とする微粒子操作ユニットが提供される。
【００２３】
本発明に係る微粒子操作ユニットによれば、流動制御部にトレンチが形成されているため、トレンチの形状や形成方向に基づき、流路中の液体に含まれる微粒子のうち、トレンチと相互作用することができる微粒子をトレンチとの相互作用の大小に従って選択的に所望の方向に誘導することが可能となる。したがって、複数の微粒子を含む液体中の特定の成分について、分離、濃縮等の所定の処理を行うことができる。
【００２４】
なお、本発明において、微粒子の流動状態として、たとえば流動方向または流動速度が挙げられる。
【００２５】
本発明に係る微粒子操作ユニットにおいて、前記トレンチが流路壁面に周期的に形成された流動制御部を有する構成とすることができる。この構成により、流路の壁面に形成されたトレンチの配列を利用してより一層確実に微粒子の流動を制御することができる。
【００２６】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記流動制御部は、前記トレンチの開口形状または前記トレンチの間隔の異なる複数の周期パターンを含む構成とすることができる。この構成により、微粒子の流動をより一層精密に制御することができる。
【００２７】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記複数の周期パターンは、前記流動制御部において鏡映対称に形成された構成とすることができる。この構成により、液体中の所定の微粒子を、流路中の特定領域に濃縮することが可能となる。
【００２８】
本発明によれば、基板と、該基板上に形成された流路と、を有し、前記流路内を流動する微粒子の流動方向を操作する微粒子操作ユニットであって、前記流路中に、前記微粒子の少なくとも一部に対し透過を制限する透過制限領域が設けられ、前記透過制限領域の入口幅が前記透過制限領域の幅よりも狭く、前記透過制限領域内を流動する前記微粒子に、一の方向への移動速度を付与する第一の駆動手段および前記一の方向と異なる他の方向への移動速度を付与する第二の駆動手段を有し、前記透過制限領域に、離間して配置された複数の妨害体が設けられたことを特徴とする微粒子操作ユニットが提供される。
【００２９】
本発明に係る微粒子操作ユニットにおいては、透過制限領域に、微粒子を互いに異なる複数の方向に移動させる第一の駆動手段および第二の駆動手段を有する。そして、流路に複数の妨害体が設けられている。このため、微粒子の表面の性質や形状、大きさ、変形のしやすさ等に基づいて安定的に分離することができる。また、透過制限領域の入口幅が透過制限領域の幅よりも狭く構成されているため、微粒子を確実に分離することができる。
【００３０】
本発明において、前記微粒子は、高分子樹脂、金属、半導体、または生体分子のいずれかを含むものとすることができる。
【００３１】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記微粒子をその大きさに依存して分離する機能を有する構成とすることができる。
【００３２】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記流路に微粒子を懸濁した懸濁液が導入され、前記懸濁液を希釈する機能を有する構成とすることができる。
【００３３】
本発明の微粒子操作ユニットにおいて、前記流路に微粒子を懸濁した懸濁液が導入され、前記懸濁液を脱塩する機能を有する構成とすることができる。
【００３４】
本発明によれば、前記微粒子操作ユニットを有することを特徴とするチップが提供される。本発明に係るチップは、微粒子の流れを操作し、分離、濃縮、希釈、脱塩、溶媒置換等の機能を有する。たとえば、本発明に係るチップにおいて、微粒子操作ユニットが第一の流路および第一の流路から分岐する第二の流路を含む流路を有し、第一の流路から一以上の前記第二の流路が分岐する分岐点の近傍の第一の流路中に、微粒子の少なくとも一部に対し透過を制限する透過制限領域を備えた構成とすることができる。
【００３５】
このような構成である場合、第一の流路中の微粒子は、透過制限領域を経由して、第一の流路および第二の流路に分離され、これをもって微粒子の流動方向が操作されている。このような構成の微粒子操作ユニットを有するチップにおいて、透過制限領域よりも上流側に、第一の流路と連通する試料導入部を有してもよい。また、他の流路から微粒子を含む試料を導入することも可能である。一方、透過制限領域よりも上流側には、第一の流路または第二の流路と連通する試料排出部を有していてもよいし、試料回収部を有していてもよい。
【００３６】
また本発明によれば、このチップと、前記微粒子の検出手段とを備える検出装置が提供される。
【００３７】
この検出装置において、前記微粒子の検出手段が質量分析装置により構成されている構成とすることができる。
【００３８】
本発明によれば、それぞれ異なる分離手段を用いる二つ以上の工程を含むタンパク質の分離方法であって、タンパク質を分離する前記工程の一つに、少なくともタンパク質を連続的に分離する機能を有するチップを用いてタンパク質を分離する工程を含むことを特徴とするタンパク質の分離方法が提供される。
【００３９】
また、本発明によれば、タンパク質を粗分離する工程と、該工程の後、粗分離されたタンパク質を電気泳動により分離する工程と、を含み、タンパク質を粗分離する前記工程は、少なくともタンパク質を連続的に分離する機能を有するチップを用いてタンパク質を粗分離する工程を含むことを特徴とするタンパク質の分離方法が提供される。
【００４０】
本発明によれば、それぞれ異なる分離手段を用いる二つ以上の工程を含むタンパク質の分離方法であって、タンパク質を分離する前記工程の一つに、前記チップを用いてタンパク質を粗分離する工程を含むことを特徴とするタンパク質の分離方法が提供される。
【００４１】
また、本発明によれば、タンパク質を粗分離する工程と、該工程の後、粗分離されたタンパク質を電気泳動により分離する工程と、を含み、タンパク質を粗分離する前記工程は、前記チップを用いてタンパク質を粗分離する工程を含むことを特徴とするタンパク質の分離方法が提供される。
【００４２】
さらに、本発明によれば、前記タンパク質の分離方法によりタンパク質を分離した後、分離されたタンパク質をプロテアーゼ処理により分解し、さらにその分解生成物を質量分析装置により同定する工程を含むタンパク質の検出方法が提供される。
【００４３】
また本発明によれば、本発明のチップを用いてタンパク質を分離した後、複数のタンパク質を含む懸濁液から、親和性を利用して目的とするタンパク質を捕獲するタンパク質の捕獲方法が提供される。
【００４４】
さらに、このタンパク質の捕獲方法によりタンパク質を捕獲した後、前記チップの表面を洗浄する工程を有し、さらに前記捕獲したタンパク質を質量分析装置により同定する工程を含むタンパク質の検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００４５】
以上説明したように、本発明によれば、マイクロ流路内で液体中の微粒子の流れを操作する微粒子操作ユニット、それを搭載したチップと検出装置、およびタンパク質の分離、捕獲、検出方法が実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下、本発明の実施形態の例について図面を参照しながら説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００４７】
（第一の実施形態）
本実施形態は、流路に形成された妨害体によって試料液体中に含まれる微粒子の流れを操作し、所定の方向に導く微粒子操作ユニットに関する。図１は本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す斜視図である。図１に示されるように、基板４１上に形成された流路１が分岐点４３において流路２と流路３とに分岐する構成であり、流路１と流路２、および流路３の分岐点には一定の間隙を設けて配列された複数の柱状構造の妨害体８からなる妨害部が設けられている。
【００４８】
まず、流路１の上流に微粒子４を含む懸濁液を充填する。微粒子４の大きさは、たとえばミリメートルオーダー以下とすることができる。また、たとえば、ミクロンオーダー以下とすることができる。この懸濁液は、流路１では矢印５の、流路２では矢印６の、流路３では矢印７の方向にそれぞれ流れる。この際、懸濁液を流すための外力の付与方法として、たとえば流路１の上流あるいは流路２と流路３の下流にポンプを設置することができる。また、毛細管現象を利用してもよい。毛細管現象を利用すれば、ポンプ等の外力付与装置が不要となり、装置全体を小型、簡略化することができる。
【００４９】
またその他、懸濁液の流れを生じせしめる機構であればその種類に制限はない。この懸濁液の流れは微粒子４に作用し、微粒子４を流す力ともなる。また、液体を流すことなく、電気泳動や誘電泳動により微粒子４のみを泳動させてもよい。たとえば流路１、流路２および流路３にそれぞれ電極（不図示）を形成しておき、各電極間に電圧を印加すれば、微粒子４が電荷を有する場合、電極に向かって効率よく誘導される。
【００５０】
図１の微粒子操作ユニットにおいて、分岐点４３では、懸濁液中の成分のうち妨害体８の間隙を通過できる成分のみが流路２へと流れ、通過できない成分は流路３に流れる。図２は、分岐点に設けられた妨害体８と、分岐点４３の上流に存在する微粒子４を示す上面図である。以下、微粒子４の流れる方向が妨害体によって操作される機構を、図２を用いて説明する。なお、本明細書において、粒子の変形のしやすさを考慮した粒径を、「実効的な粒径」と呼ぶ。
【００５１】
図２に示すように、複数の妨害体８間の間隙の幅ａが、溶媒中での変形のしやすさを考慮した微粒子４の実効的な粒径ｂよりも狭い場合、微粒子４が間隙を通過しようとする際に受ける抵抗により、流路３の方向に微粒子４が通過する確率と比較して流路２の方向に通過する確率は小さくなる。また、この構造のうち隣接する妨害体８を結ぶ線分、たとえば線分９は微粒子４に作用する力の方向１０に対してある傾きを持って配置されている。すなわち角度１１について、０°＜角度１１＜９０°が成り立つ。角度１１が０°の場合には、懸濁液全体が流路３のみに流れ、流路２に流れる成分がなくなってしまうからである。また、角度１１が９０°の場合には、微粒子４が流路３に流れずに妨害体８の間隙に挟まって留まってしまい、妨害体８付近に堆積してしまうからである。
【００５２】
なお、力の方向１０は矢印５、６、および７で表される力の合力の方向を表している。微粒子４は液体中でブラウン運動しているため、０°＜角度１１＜９０°であれば妨害体８間の間隙に挟まって留まるのではなく、平均的には徐々に流路３の方向に流れていく。
【００５３】
たとえば、懸濁液として血液を考え、微粒子４として赤血球を考えた場合、複数の妨害体８間の間隙の幅ａを３μｍ程度とすることができる。こうすれば、懸濁液としての血液を、流路１の上流より毛細管現象を利用して流した場合に、分岐点４３にて赤血球は血漿とともに流路３の方向に流れ、流路２には血漿のみ流れる。したがって、遠心分離装置を用いることなく血液から血漿を分離できる。
【００５４】
この際、抽出用のバッファ等を用いないため、血漿の濃度が変化することはない。また、この場合、赤血球の破壊を防ぐためには、妨害体８から受ける抵抗をなるべく小さくすることが望ましいため、角度１１をなるべく小さくすることが望ましい。また、赤血球にかかる力は毛細管現象による血液の流れる力にも関わるため、流路２と流路３の断面積の比を考慮することが望ましく、赤血球の破壊を防ぐためには流路３の断面積を相対的に大きくすることが望ましい。
【００５５】
このように、本実施形態では、液体で満たされた流路１において微粒子４を流しながらその流れを操作するユニットが構成される。また、この流れの操作においては、微粒子４を連続的に流すことが可能である。このため、比較的大量の試料を連続的に処理することが可能となる。
【００５６】
また、従来、たとえば前述の非特許文献1に記載の方法に従ってタンパク質のように５０ｎｍ以下の粒径を有する微粒子の流れを操作するためには、妨害体８の形状に求められる精度は高く、複雑な形状の妨害体を微細加工技術で作製するのは困難であった。これに対し、本実施形態によると、微粒子４の流れは複数の妨害体８の間の間隙によって制御され、妨害体８の形状にほとんど影響されない。このため、妨害体８の形状に求められる精度が微粒子の粒径と比較してさらに小さなオーダーとなることはない。即ち、通常行われる微細加工で容易に作製可能な断面が円形の柱状構造を採用しても、微粒子４の流れを高い精度で制御することが可能となる。従って、本実施形態の微粒子操作ユニットは、微細な粒子に対応して容易に作製可能であり、連続的に微粒子４の流れの操作を行うことができる。
【００５７】
基板４１の材料としては、シリコンを用いる。シリコン表面にはシリコン酸化膜を形成することが好ましい。このシリコン酸化膜により、基板４１の表面が親水性を有することとなり、試料流路を好適に形成することが可能となる。なお、基板４１の材料として石英等のガラスや、プラスチック材料等を用いてもよい。プラスチック材料として、たとえばシリコン樹脂、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＣ（ポリカーボネート）等の熱可塑性樹脂や、エポキシ樹脂などの熱硬化性樹脂等が挙げられる。このような材料は成形加工が容易なため、製造コストを抑えることができる。さらに、基板４１に金属を用いてもよい。
【００５８】
妨害体８は、たとえば、基板４１を所定のパターン形状にエッチングすることにより形成することができるが、その作製方法には特に制限はない。
【００５９】
また、図１の妨害体８は円柱であるが、円柱、楕円柱等の擬円柱に限らず、円錐、楕円錘等の錐体；
三角柱、四角柱等の多角柱；
その他の断面形状を有する柱体；
等としてもよい。但し、微粒子の流れを高精度に制御するためには、錐体より柱体が好ましい。
【００６０】
さらに、妨害体８にかわり、複数の開口部を有する板状の隔壁を形成してもよい。このとき、隔壁に形成する開口部の形状は、円形、楕円形、多角形、の孔やスリット等、微粒子４の形状、大きさに応じて適宜選択される。
【００６１】
妨害体８のサイズは、たとえば、幅は１０ｎｍ〜１０μｍ程度とする。また、隣接する妨害体８の間隔は、微粒子４の形状、大きさに応じて適宜選択されるが、たとえば、５ｎｍ〜１０μｍとする。また、高さは図１では流路１の深さと同程度となっている。
【００６２】
また、基板４１の表面に被覆を形成してもよい。被覆を設けることにより、流路１、流路２、および流路３中の試料液体の乾燥等が抑制される。被覆の材料としては、たとえば基板４１と同様の材料の中から選択することができる。基板４１と同種の材料を用いてもよいし、異なる材料としてもよい。
【００６３】
次に、図１の微粒子操作ユニットの製造方法について説明する。基板４１上への流路１、流路２、および流路３、および妨害体８の形成は、基板４１を所定のパターン形状にエッチング等を行うことによってできるが、その作製方法には特に制限はない。
【００６４】
たとえば、微細加工用レジストのカリックスアレーンを用いた電子線露光技術を利用して作製することが可能である。カリックスアレーンの分子構造の一例を以下に示す。カリックスアレーンは電子線露光用のネガレジストとして用いられ、ナノメートルスケールの微細加工用のレジストとして好適に利用することができる。
【００６５】
【化１】
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【００６６】
ここでは、基板４１として面方位が（１００）のシリコン基板を用いる。まず、基板４１上にシリコン酸化膜、カリックスアレーン電子ビームネガレジスト膜をこの順で形成する。シリコン酸化膜、カリックスアレーン電子線露光用ネガレジスト膜の膜厚は、それぞれ４０ｎｍ、５５ｎｍとする。次に、電子線露光装置を用い、妨害体８となる領域を電子線露光する。現像はキシレンを用いて行い、イソプロピルアルコールによりリンスする。この工程により、カリックスアレーン電子線露光用ネガレジストがパターニングされる。
【００６７】
つづいて全面にポジフォトレジストを塗布する。膜厚は１．８μｍとする。この際、電子線露光され、現像工程を経て残ったカリックスアレーンレジストはポジフォトレジストの溶媒に溶解しない。その後、流路１、流路２、および流路３となる領域が露光するようにマスク露光をし、現像を行う。この工程により、カリックスアレーンとポジフォトレジストによるレジストマスクが形成される。
【００６８】
次に、レジストマスクを用いてシリコン酸化膜をＣＦ4、ＣＨＦ3の混合ガスを用いてドライエッチング除去する。残ったポジフォトレジストをアセトン、アルコール、水の混合液を用いた有機洗浄により除去した後、更に残ったポジフォトレジストとカリックスアレーンレジストを酸化プラズマ処理により除去する。つづいて、レジストパターンを転写したシリコン酸化膜をマスクとして、シリコン基板をＨＢｒガスにより２μｍドライエッチングする。つづいてバッファードフッ酸水溶液でウェットエッチングを行い、シリコン酸化膜を除去する。以上により、基板４１上に流路１、流路２、および流路３、および妨害体８が形成される。
【００６９】
ここで、以上の工程に次いで、基板４１表面の親水化を行うことが好ましい。基板４１表面を親水化することにより、流路１、流路２、および流路３や妨害体８に試料液体が円滑に導入される。特に、妨害体８により流路が微細化した分岐点４３においては各流路の表面を親水化することにより、試料液体の毛細管現象による導入が促進され、流れの操作精度が向上する。
【００７０】
そこで、たとえばエッチング工程の後、基板４１を酸化炉に入れてシリコン熱酸化膜を形成する。このとき、たとえばシリコン熱酸化膜の膜厚が３０ｎｍとなるように熱処理条件を選択する。またこの場合には、予めこの酸化膜厚を考慮して妨害体８の配列を設計する。シリコン熱酸化膜を形成することにより、分離装置内に液体を導入する際の困難を解消することができる。その後、被覆を設ける場合は静電接合を行い、シーリングして微粒子操作ユニットを完成する。
【００７１】
また、基板４１にプラスチック材料を用いる場合、エッチングやエンボス成形等の金型を用いたプレス成形、射出成形、光硬化による形成等、基板４１の材料の種類に適した公知の方法で行うことができる。
【００７２】
基板４１にプラスチック材料を用いる場合にも、基板４１表面の親水化を行うことが好ましい。基板４１の表面を親水化することにより、流路や妨害体８の形成された領域に試料液体が円滑に導入される。特に、妨害体８により流路が微細化した分岐点４３においては、基板４１の表面を親水化することにより、試料液体の毛細管現象による液体の導入が促進されるため好ましい。
【００７３】
親水性を付与するための表面処理としては、たとえば、親水基をもつカップリング剤を流路の側壁に塗布することができる。親水基をもつカップリング剤としては、たとえばアミノ基を有するシランカップリング剤が挙げられ、具体的にはＮ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−β（アミノエチル）γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、γ−アミノプロピルトリメトキシシラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−フェニル−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン等が例示される。これらのカップリング剤は、スピンコート法、スプレー法、ディップ法、気相法等により塗布することができる。
【００７４】
なお、図１の微粒子操作ユニットでは、流路１と流路２とを含む第一の流路と、分岐点４３において第一の流路から分離する流路３、すなわち第二の流路とを有する構成とした。図１では、流路１と流路２との形成方向は一致しており、流路１および流路２に対し、流路３は所定の角度をもっているが、流路１と流路２とが所定の角度をなしていてもよい。
【００７５】
（第二の実施形態）
本実施形態は、流路に形成された妨害体によって試料液体中に含まれる微粒子の流れを操作し、所定の方向に導く微粒子操作ユニットに関する。第一の実施形態と異なる点は、複数段の妨害部が形成された領域を有する点である。図３は本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す斜視図である。
【００７６】
図４は、分岐点４３に設けられた妨害体８と、分岐点４３の上流に存在する微粒子４を示す上面図である。以下図４を用いて、微粒子４の流れる方向が妨害体によって操作される機構を説明する。図４に示されるように、複数段になった妨害体８の配列構造は、一点鎖線で示した単位胞１２を形成している。この単位胞１２中の間隙の幅においては、図４に示したとおり、試料液体中での変形のしやすさを考慮した微粒子４の実効的な粒径ｂと比較して間隙の幅ａは小さく、幅ｃは大きく設定されている。すなわちａ＜ｂ＜ｃである。従って、粒子４は方向１０の方向に合力を受けて流れていこうとするが、間隙の幅ａが小さいため、幅ａを横切る方向に妨害体８の配列を移動できる確率は低く、ブラウン運動により妨害体８と衝突を繰り返しながら、その多くは流路３の方向に流れていくことになる。
【００７７】
本実施形態の場合、妨害体８の配列構造が合力の方向１０に対して複数段設けられている部分がある。微粒子４がＤＮＡやタンパク質のような生体高分子等、ある程度変形する粒子の場合には、このように複数段の配列構造を設けることにより、幅ａを横切る方向に妨害体８の配列中を移動する確率を更に低くすることができる。但し、本実施形態の微粒子操作ユニットによって流れを操作される微粒子は、生体分子に限られるわけではなく、たとえば抗体を付着させたポリスチレンビーズや金微粒子、あるいは半導体量子ドットのように高分子樹脂、金属、または半導体であっても適用でき、連続的に微粒子の流れの操作を行うことができる。
【００７８】
また、本実施形態で操作する試料液体には、図に示されるように、試料が微粒子４の他に更に小さい微粒子１３を含んでいてもよい。試料液体中での微粒子１３の実効的な粒径ｄは妨害体８間の間隙の幅ａより小さい。すなわち、ｄ＜ａ＜ｂ＜ｃである。従って、微粒子１３については、幅ａを横切る方向に妨害体８の配列中を移動できる確率は十分大きい。即ち、微粒子４と微粒子１３を含む懸濁液を試料液体として流路１の上流から流すことにより、流路２では微粒子４を含まない液体を取り出すことができる。
【００７９】
このため、本実施形態に係る微粒子操作ユニットは、微粒子４および１３をその大きさに依存して平面的に分離する機能を有している。なお、本実施形態では流路３にも微粒子１３が流れ込むが、微粒子を流す力を加減すると共に流路の分岐点の構造を工夫することにより、流路３に流れ込む微粒子１３の量を十分少なく抑えることも可能である。
【００８０】
図１１は、本実施形態に係る微粒子操作ユニットの分岐点に設けられた妨害体の構成を示す斜視図である。図１１の微粒子操作ユニットについては後述するが、この構成では流路２および流路３の交差部の流路壁の角部を除去し、流路拡張部４５を形成している。そして、流路拡張部４５にも妨害体８を形成することにより、妨害体８の配列の長さを増すことが可能となるため、より一層精度、効率よく微粒子の流れを操作することができる。
【００８１】
なお、本実施形態に係る微粒子操作ユニットに用いる材料および製造方法は、たとえば第一の実施形態に記載の材料、方法を用いることができる。本実施形態の微粒子操作ユニットは、妨害体８が複数段形成されているが、妨害体の形状自体は微細加工技術を用いて容易に作製することが可能であり、微粒子の流れをさらに精度良く制御することが可能な構成である。
【００８２】
（第三の実施形態）
本実施形態は、流路内の壁面に所定の大きさの微粒子と相互作用可能なトレンチ構造を単位胞とする妨害体の配列構造の形成された、微粒子の流れを操作するユニットに関する。図５は本実施形態に係る微粒子操作ユニットの一例を示す斜視図である。図５に示す通り、基板４７上に流路１４が形成されている。流路１４の上流には微粒子１５を懸濁させた試料液体が充填される。この微粒子１５は図５中に示した矢印１６の方向に流れる。第一の実施形態と同様に微粒子１５を矢印１６の方向に流す力は電気泳動や誘電泳動等の方法で生じさせても良いし、微粒子１５に作用する力であればこれらに限らない。
【００８３】
図５に示した通り、流路１４内には、トレンチ構造１７を単位胞とする配列構造が流路底面に形成されている。なお本実施形態では流路１４の底面にトレンチ構造１７が形成されているが、流路１４における他の壁面でもかまわない。トレンチ構造１７からなる配列構造の一部分を上面図で示したのが図６である。図６に示されるように、一点鎖線１８で囲まれたトレンチ構造１７からなる単位胞により配列構造が形成されている。この配列構造中にはトレンチ構造１７ａとその鏡映対称になるトレンチ構造１７ｂの２種類の配列構造を、一点鎖線１９を境界にして含んでいる。
【００８４】
このようなトレンチ構造は半導体微細加工技術やＭＥＭＳ技術で作製できる。また、たとえばタンパク質のように５０ｎｍ以下の粒径の微粒子の流れを操作する場合には、自己組織的に形成できる多孔性材料を用いて形成することもできる。多孔性材料としてはシリカやジルコニア等のメソポーラス構造が良く知られており、有機高分子膜をテンプレートにすることにより、配列構造を形成できる。また、陽極酸化アルミナは自己組織的にトレンチ構造の配列構造をアルミ膜の陽極酸化により形成するが、さらに、ナノインプリント法等を用いて陽極酸化前にアルミ膜に核形成点となる傷を予め作製し、その後陽極酸化することにより、図６に示したような規則構造を作製することが可能である。
【００８５】
なお、図５の微粒子操作ユニットでは、流路１４の底面に設けられたトレンチ構造１７の径と単位胞の周期が共に二次元平面的に方向により異なるが、どちらか一方のみでも良い。また、図５においてはトレンチ構造１７が楕円形の場合を例示しているが、楕円形に限定されるものではない。流路１４底面に設けられた楕円形をした孔の長径ｅと短径ｆは微粒子１５と十分相互作用するために微粒子１５の粒径ｇに近いことが望ましい。楕円形のようにトレンチ構造１７の径が二次元平面上で異なる場合にはその差異により微粒子１５との相互作用に対しても二次元平面的な差異が生じる。またトレンチ構造１７の周期が二次元平面上で異なる場合には微粒子１５が流れる間にトレンチ構造１７から相互作用を受ける頻度が二次元的に方向によって異なってくる。
【００８６】
以上のように、妨害体をトレンチ構造１７とした場合にも、微粒子１５の流れを操作する微粒子操作ユニットを実現できる。このとき、トレンチ構造１７が微粒子１５の流れに対する抵抗となり、抵抗の大きさは微粒子１５の大きさに依存する。このため、トレンチ構造１７と微粒子１５との相互作用の程度は微粒子１５の形状、大きさによって異なることを利用して、試料中の特定の微粒子について分離、濃縮等の処理を施すことが可能となる。
【００８７】
なお、この微粒子１５の操作の原因となる相互作用は第一または第二の実施形態のように柱状の妨害体の配列による相互作用より一般的に弱いため、微粒子１５の流れる方向に沿って複数段設けることが望ましい。また、図５においては、微粒子１５の流れを形成する力の矢印１６に対してトレンチ構造１７の長軸方向と短軸方向が平行でも垂直でも無い配列構造を取っている。これにより、効果的に流路１４内において微粒子１５の流れを図中の左右方向に操作することができる。
【００８８】
本実施形態の場合には、さらに配列構造に鏡映対称性を持たせていることにより、微粒子１５が流れるうちにその境界を示している一点鎖線１９近傍に集まってくる。このため、微粒子１５の濃縮効果を有する。なお、本実施形態においては、一点鎖線１９と矢印１６が平行になっているが、平行でないトレンチ構造を形成することもできる。またトレンチ構造１７の配列は鏡映対称な配列には限定されず、流路１４の分岐の有無等の構成に対応して所望の配列を選択することが可能である。
【００８９】
また、本実施形態に係る微粒子操作ユニットの下流側に、直進する流路と、当該流路に分岐する流路とを設けておけば、たとえば一種の微粒子が分散する分散液を流した際に、直進する流路には分離、濃縮された微粒子が流出し、分岐する流路には分散溶媒のみを回収することができる。
【００９０】
（第四の実施形態）
本実施形態に係る微粒子操作ユニットは、平面的に配列された妨害体を有し、試料液体の希釈、脱塩、溶媒置換等を行うものである。図７は、本実施形態に係る微粒子の流れを操作する微粒子操作ユニットの構成を示す上面図である。図７の微粒子操作ユニットにおいては、基板（不図示）上に形成された流路２０に流路２１および流路２３が接続しており、その接続点よりも下流側に、流路２２、流路２４、および流路２５の３本の流路が分岐する分岐点が形成されている。そしてこの分岐点および分岐点の上流側に妨害体が形成されている。すなわち、図７では、流路の接続点近傍から分岐点近傍に至る領域に、妨害体が形成されている。
【００９１】
今、流路２０を、微粒子２６を含む試料懸濁液または緩衝液を分岐点に向かって流すための流路とする。また、流路２１および流路２３を、希釈用の緩衝液または脱塩用の洗浄液、あるいは置換用の溶媒を分岐点に向かって注入するための流路とする。流路２２と２４は廃液を分岐点から抽出する流路である。流路２５は微粒子２６を含む希釈、脱塩、または置換された液体を抽出する流路である。分岐点への各流路の接続領域に示した矢印２７〜３２は各流路の接続領域における液体の流れる方向を示している。分岐点となる領域には間隙を挟んだ複数の柱状構造の妨害体３３が鏡映対称性を持って図７に示した通り配置されている。
【００９２】
ここで、複数の妨害体３３の間の間隙の幅ｈ、ｉおよびｊは微粒子の粒径ｋと比較してｊ＞ｈ＞ｋ＞ｉとなっている。従って、微粒子２６は幅ｉを横切る方向には妨害体３３の配列を通過しにくく、幅ｈとｊを横切る方向には通過しやすい。その結果、微粒子２６は流路２０から流路２５に選択的に導かれ通過し易く、流路２２と流路２４に流出しにくいため、流路２５に選択的に排出されることになる。
【００９３】
一方、希釈用の緩衝液または脱塩用の洗浄液、あるいは置換用の溶媒は充分分子サイズが小さいため妨害体３３の間の間隙の幅に依存せずに分岐点にて混合し、流路２２、流路２４、および流路２５から排出される。従って図７の微粒子操作ユニットを用いることにより、液体を希釈する機能や、緩衝液を脱塩する機能、あるいは溶媒を置換する機能を実現できる。
【００９４】
本実施形態に係る微粒子操作ユニットに用いる材料および製造方法には、たとえば第一の実施形態に記載の材料、方法を用いることができる。
【００９５】
なお、以上の各実施形態に示した各々分離、濃縮、希釈、脱塩、溶媒置換等の機能を実現する微粒子操作ユニットは各々単独で使用することもできるし、組み合わせて使用することもできる。組み合わせて使用する場合には同一基板上に集積化することにより、安価に製造できる。また、同一基板上に集積化したチップ上で所望とする処理を連続的に行えば、各ユニットを単独で使用する場合と比較してユニット間での試料の損失を抑制できる。
【００９６】
さらに、このようなチップを試料成分の分析装置、検出装置等に搭載し、微粒子処理システムを構成した場合にも、微粒子操作ユニットにおける上述の利点は有用である。このような微粒子処理システムとしては、たとえば微粒子がタンパク質である場合に、質量分析装置に連携させたタンパク質分析システム等の分析装置が一例として挙げられるが、この例に限定されることなく、種々の構成を採用することができる。
【００９７】
（第五の実施形態）
本実施形態は、試料中に含まれる特定のタンパク質を分離し、その同定を行うための微粒子処理システムに関する。図８は本実施形態に係るタンパク質の分析手順を示す図である。
【００９８】
ステップ１０１は、細胞や組織、あるいは生体標本等から分析するタンパク質を抽出し、その抽出液を電気泳動に供するのに適した状態の試料に調製する試料調製工程を示している。
【００９９】
ステップ１０２は、第二の実施形態に記載の微粒子操作ユニットを有するチップを使用して、分析するタンパク質をその大きさに応じて分離するステップである。このようなチップとして、たとえば図１０に示されるチップを用いることができる。図１０に示されるチップについては、後に詳細に説明する。
【０１００】
ステップ１０３は、電気泳動によりタンパク質を分離するステップを示しており、たとえば等電点と分子量の違いによりタンパク質を分離する二次元電気泳動やその前処理としてのクロマトグラフィーによる分離もこのステップに含まれる。
【０１０１】
ステップ１０４は、プロテアーゼ処理のステップを示しており、プロテアーゼによってタンパク質を加水分解することによりペプチドを含む分解生成物を得る。
【０１０２】
ステップ１０５は、ステップ１０４で得た分解生成物を質量分析に供してペプチドの分子量を決定し、タンパク質の種類を同定するステップを示している。ステップ１０５には、質量分析に先立ち必要な脱塩等の前処理や、アミノ酸配列やアミノ酸組成等を決定する等の後処理のステップなども含まれる。
【０１０３】
ここで、微粒子操作ユニットを用いた分離のステップ１０２を設けていない従来の方法の場合、以下のような課題を有していた。二次元電気泳動は極めて分離能が高いが、二次元電気泳動を行う際にゲルに投入できるタンパク質の総量には限界があった。しかし、タンパク質の発現量は種類によって一定ではないため、発現量の多いタンパク質があると、発現量の少ない微量タンパク質は二次元電気泳動後のスポットには極微量にしか含まれないことになる。この結果、タンパク質が微量であるためにスポットが判別できず、回収が困難であった。また、たとえスポットが判別できたとしても、タンパク質が微量であるため、質量分析の検出限界を下回り、検出不能になってしまっていた。
【０１０４】
これに対し、本実施形態ではステップ１０２において、電気泳動に先立ち分離を行う。このとき、第二の実施形態に記載の分離機能を有する図３の微粒子操作ユニットを使用して、発現量の多いタンパク質をその大きさに応じて分離除外する。このため、従来の方法についての上述の課題が解決され、発現量の少ないタンパク質の解析が可能となる。また、発現量の多いタンパク質に特に焦点を合わせて分離除外しなくても、タンパク質の大きさにより事前に粗く分離することにより、ゲルへの微量タンパク質の投入量を増加させることができるため、試料不足の問題を緩和することができる。このとき、図３の微粒子操作ユニットを用いれば連続的に分離を行うことができるため、二次元電気泳動の際にゲルに投入するタンパク質の量も容易に確保されるという利点がある。さらに微粒子操作ユニットはゲルを用いずに微細加工技術によって作製されているため、経時的な劣化が少なく、分離の再現性に優れているという利点も有する。
【０１０５】
また、以上のように図１０に示すチップによって分離した試料を二次元電気泳動により分離した後、さらにタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置）用試料調製および測定を行うこともできる。
【０１０６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ測定を行うためには、測定対象のタンパク質を、１０００Ｄａ程度まで低分子化する必要があるため、ステップ１０４において低分子化を行った後、マトリックス溶液と混合し、乾燥試料とする。
【０１０７】
まず、測定対象のタンパク質が分子内ジスルフィド結合を有する場合、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）等の還元試薬を含むアセトニトリル等の溶媒中で還元反応を行う。この還元反応により、次の分解反応が効率よく進行する。なお、還元後、チオール基をアルキル化等により保護し、再び酸化するのを抑制することが好ましい。
【０１０８】
次に、トリプシン等のプロテアーゼを用いて還元処理されたタンパク質分子の低分子化処理を行う。低分子化は燐酸バッファ等の緩衝液中で行われるため、反応後、脱塩および高分子画分すなわちトリプシンの除去を行う。そして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳのマトリックスと混合する。
【０１０９】
その後、濃縮、乾燥を行って、マトリックスと分解されたタンパク質の混合物を析出させる。乾燥後の試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置にセットして電圧を印加し、たとえば３３７ｎｍの窒素レーザー光を照射し、ステップ１０５の質量分析を行う。
【０１１０】
ここで、本実施形態で用いる質量分析装置について簡単に説明する。図１４は、質量分析装置の構成を示す概略図である。図１４において、試料台上に、以上の手順により得られた乾燥試料（不図示）が設置される。そして、真空下で乾燥試料に波長３３７ｎｍの窒素レーザーが照射される。すると、乾燥試料はマトリックスとともに蒸発する。試料台は電極となっており、電圧を印加することにより、気化した試料は真空中を飛行し、リフレクター検知器、リフレクター、およびリニアー検知器を含む検出部において検出される。
【０１１１】
したがって、乾燥試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置の真空槽に設置しＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳを行うことが可能である。
【０１１２】
なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ用のマトリックスは、測定対象物質に応じて適宜選択されるが、たとえば、シナピン酸、α−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）、２，５−ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）、２，５−ＤＨＢおよびＤＨＢｓ（５−メトキシサリチル酸）の混合物、ＨＡＢＡ（２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸）、３−ＨＰＡ（３−ヒドロキシピコリン酸）、ジスラノール、ＴＨＡＰ（２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン）、ＩＡＡ（トランス−３−インドールアクリル酸）、ピコリン酸、ニコチン酸等を用いることができる。
【０１１３】
図１０は本実施形態に用いるチップの構成を示す図である。図１０のチップは、本実施形態においてタンパク質の検出に使用される５個の微粒子操作ユニットを１枚の基板上に集積化したタンパク質の分離機能を有する。シリコン基板２０１上に流路２０２が形成され、その上に蓋２０３が接着されている。シリコン基板２０１への流路２０２および妨害体の形成においては、狭い間隙をシリコン基板２０１上に作製する必要があるため、電子線露光装置を使用してリソグラフィーを行う。そして、シリコン基板２０１をドライエッチングした後、熱酸化して円柱状の妨害体の径を増すことにより、間隙を狭めるという加工プロセスを採用することにより作製できる。但し、このような狭いギャップを作製する方法は上記の方法に限らず、たとえばガラス基板を加工した後にアルミ薄膜を成膜、酸化するといったような他の加工プロセスも採用できる。
【０１１４】
また、本実施形態では微細加工の適用性に優れるシリコン基板２０１を用いたが、シリコンに限らず、高分子樹脂や金属、絶縁体の基板を用いてもよい。また、シリコン基板２０１と静電接合するため、本実施形態では蓋２０３の材料にガラスを使用したが、接着方法は静電接合には限らず、蓋２０３の材料、ガラスだけでなく高分子樹脂や金属、絶縁体等が利用可能である。
【０１１５】
蓋２０３上には７個の送液用パイプ口２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、および２１０が設置されており、各々蓋２０３を貫通して流路２０２に連通している。流路２０２には一点鎖線で囲まれた５個の分岐点２１１、２１２、２１３、２１４、および２１５が設けられている。
【０１１６】
各々の分岐点は、図１１に模式的に示す構造を取っている。即ち、流路内に複数段からなる円柱状の妨害体の配列が構成されており、タンパク質をその大きさに依存して平面的に分離する機能を有した微粒子操作ユニットとなっている。各種の大きさのタンパク質を含んだ懸濁液は送液用パイプ口２０４から流路２０２に流し込まれ、分岐点２１１から分岐点２１５を通って、送液用パイプ口２０５から２１０に排出される。各分岐点の妨害体の配列は図１１に示したように流路２０２の上流側では間隙の幅ｎは広く、下流に行くに従って間隙の幅はｍ、ｌと狭くなっていく。但し、間隙の幅ｏは一定で十分広く取ってある。
【０１１７】
このような設計により、流路２０２の上流より流れてくるタンパク質は分岐点に容易に侵入し、幅ｌよりサイズの大きいタンパク質は分岐点を幅ｌの間隙を抜けて通過できないため、ブラウン運動と妨害体との衝突等を繰り返しながら、平均的に斜め方向に伸びた流路に流れていく。一方、幅ｌよりサイズの小さいタンパク質は分岐点を幅ｌの間隙を抜けて通過できるため、直線状に流れてゆきやすい。さらに、斜めに延びた流路側に切れ込んで妨害体の配列が並んでおり、サイズの小さいタンパク質が妨害体の間隙を抜ける確率が高くなる様に流路構造が工夫されている。このような流路の構造で、さらに各パイプ口の送液量を調整する事により十分な分離能でタンパク質をその大きさに従って分離できる。
【０１１８】
なお、図１１は模式図であるため３段の配列を描いているが、実際は１０００段程度の配列とすることが望ましい。また、間隙の幅もｌ、ｍ、ｎの三種類より細かく分けて作製されていることが望ましい。間隙の幅のうち、ｎ、ｍ、ｌは各分岐点２１１から２１５で各々異なり、２１１から２１５になるにつれて広くなっていくようにする。ただし、ｎ、ｍ、ｌの大小関係は各分岐点で変わらない。本実施形態では、たとえば分岐点２１１の間隙の幅ｌとして１０．０ｎｍ、分岐点２１２の間隙の幅ｌとして１２．５ｎｍ、分岐点２１３の間隙の幅ｌとして１５．０ｎｍ、分岐点２１４の間隙の幅ｌとして１７．５ｎｍ、分岐点２１５の間隙の幅ｌとして２０．０ｎｍと設計することができる。
【０１１９】
微粒子操作ユニットをこのような構成とすることにより、ほぼ１０ｋＤａから１００ｋＤａのタンパク質をその大きさに従って分離することができる。最も小さなタンパク質は分岐点２１１にて分離されパイプ口２０６から排出される。さらにパイプ口２０７、２０８、２０９、２１０と順々により大きなタンパク質が排出される。図１２はこの様子を描いた模式図である。図１２において、分岐点２１１で分離され、パイプ口２０６にて排出されるタンパク質は、たとえばタンパク質の大きさと通過確率で囲まれる領域２１６で示される。さらにパイプ口２０７、２０８、２０９、２１０から排出されるタンパク質は、各々領域２１７、２１８、２１９、２２０で示される。
【０１２０】
以上のチップによる粗精製ステップをゲルによる二次元電気泳動の前処理として挿入すると、ゲル上の分離したタンパク質のスポットにおいて、その中のタンパク質の濃度を増加させることができる。図１３は二次元電気泳動により分離したタンパク質のスポットの様子を示す模式図である。図１３（ａ）は従来の前処理として粗精製ステップを行わない場合を示しており、図１３（ｂ）は前処理として粗精製ステップを行った場合を示している。図１３（ａ）に示されるように、横軸は等電点による分離を示しており、縦軸は分子量による分離を示している。分離されたタンパク質のスポットは、たとえば図１３（ａ）中のスポット２２１ａの様に二次元マップ上に現れる。
【０１２１】
二次元電気泳動においては、一回の分離においてゲルに投入できるタンパク質の総量は１００μｇ程度に限られているため、通常スポットに含まれるタンパク質の濃度には限界がある。しかしながら、二次元電気泳動の前処理として図１０のチップを使用して粗精製を行うと、図１２のように分子量と相関のあるタンパク質の大きさに従って、タンパク質試料を５分割できる。従って、分割したタンパク質試料を各々１００μｇずつ５枚のゲルに投入することにより、図１３（ｂ）の様にタンパク質のスポットを有する５枚のゲルが得られる。これらのスポットは一点鎖線で示した領域２２２から２２６に各々集中して現れる。
【０１２２】
図１３（ａ）の従来の場合と比較して、これらのスポットは各々ほぼ５倍の量のタンパク質を含む。従って、たとえばスポット２２１ａから収集できるタンパク質の量があまりに微量であるために、質量分析装置の検出感度を下回っていた場合においても、スポット２２１ｂの場合には質量分析装置で検出することが可能となる場合がある。
【０１２３】
以上、図１０のチップを用いて分離した試料を用いた場合を例に説明をしたが、その他の実施形態に記載の微粒子操作ユニットを含むチップを用いることももちろん可能である。
【０１２４】
また、以上においてはステップ１０５においてタンパク質の質量分析を行う場合を例に説明したが、シークエンサーなどを用いた分析等を行う場合にも、本実施形態に係る微粒子操作ユニットによる前処理が適用可能である。また、本実施形態において使用する微粒子操作ユニットは、第二の実施形態に記載の構成に限定されるものではなく、その他の態様とすることも可能である。
【０１２５】
（第六の実施形態）
本実施形態は、試料中に含まれる特定のタンパク質を分離し、その同定を行うための微粒子処理システムの別の一例に関する。図９は本実施形態に係るタンパク質の分析手順を示す図である。
【０１２６】
図９において、ステップ１０６は細胞や組織、あるいは生体標本等から分析対象となるタンパク質を抽出し、その抽出液をプロテインチップにより精製するのに適した状態の試料に調製する試料調製ステップを示している。
【０１２７】
ステップ１０７は、第二の実施形態に記載の図３の微粒子操作ユニットを使用して、分析するタンパク質をその大きさに応じて分離するステップである。
【０１２８】
ステップ１０８は、ステップ１０７で粗精製され、分離されたタンパク質をプロテインチップ上に添加し、チップ上に固定化された被吸着物質に親和性のあるタンパク質のみを分離するステップを示している。
【０１２９】
ステップ１０９は、洗浄ステップを示しており、プロテインチップ上に残留している塩等の不純物や親和性を有しない物質を水や緩衝液により洗い流して除去するステップである。
【０１３０】
ステップ１１０は、ステップ１０９を経てプロテインチップ上に残留した親和性のあるタンパク質を質量分析に供して分子量を決定し、タンパク質の種類を同定するステップを示している。
【０１３１】
ここで、粗精製のステップ１０７でスピンカラムを使用していた従来の方法の場合、以下のような問題点を有していた。プロテインチップは比較的分子量の小さい２５ＫＤａ以下のタンパク質の感度が高い。このため、前処理としてスピンカラムによる粗精製が行われていた。ところが、粗精製にスピンカラムを使用した場合、精製後のタンパク質の量がプロテインチップに投入するのに不足していた場合には、再度スピンカラムによる粗精製を行わなければならなかった。従って、処理操作が煩雑であり、自動化等にも支障をきたしていた。
【０１３２】
これに対し、本実施形態では、粗精製のステップ１０７において図３の微粒子操作ユニットを使用することにより、スピンカラムで間欠的にしか行うことができなかった粗精製ステップを連続的に行っている。従って、プロテインチップに必要とするタンパク質の量に達するまで目的のタンパク質を連続的に収集できる。このため、ステップの自動化にも好適である。
【０１３３】
また、この微粒子操作ユニットはチップ上に搭載できるため、プロテインチップと同一のチップ上に集積化することもできる。この場合には、操作する人間の手間が省けるだけでなく、ステップ１０７からステップ１０８の間の試料の損失を最小限に抑えることができる。従って、タンパク質の検出方法全体としても、高感度化を実現できるという産業上の利点を有する。
【０１３４】
（第七の実施形態）
本実施形態は、電界と流路に形成された妨害体により試料液体中に含まれる荷電微粒子の流れを操作し、荷電微粒子の大きさに従って所定の方向に導く微粒子操作ユニットに関する。図２１は本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す上面図である。図２１において、妨害体１０１を含む流路構造が基板１０３上に作製されている。ｘ軸は流路１０２の延在方向に平行であり、ｙ軸はｘ軸に垂直な方向である。
【０１３５】
図２１において、図中ｘ軸方向に平行な妨害体１０１の列が設けられており、その列をｙ軸方向に一定の間隔で複数段設けた構成となっている。また、妨害体１０１は、断面が円形の柱状構造をしている。また、妨害体１０１は、流路１０２内で図に示すとおりに横（図中ｘ軸）方向と縦（図中ｙ軸）方向とで間隙の幅が異なるように配置されている。
【０１３６】
なお、本実施形態では、妨害体１０１の断面形状として円形を選択しているが、これはリソグラフィーの容易さを考慮したものであり、四角形等の他の断面形状であってもよい。また、妨害体は、所定の間隔の列等のマトリックス状に配置されていることが好ましい。こうすれば、微粒子をさらに安定的に分離することができる。
【０１３７】
また、本実施形態の微粒子操作ユニットは、挿入口１０４の上流側に設けられた電極１１０と、挿入口１０４の下流側に、流路１０２の延在方向に沿って設けられた電極１０６および流路１０２を横切るように設けられた電極１０５とを有する。図２１では、電極１０５と電極１０６とが直交する向きに設けられている。電極１０５は、流路１０２の下流側の端部の流路壁に沿って、図中のｘ軸方向に設けられ、電極１０６は、流路１０２の側壁に沿って、図中のｙ軸方向に設けられている。また、電極１０６に対向する側の流路壁近傍に、試料を導入する挿入口１０４が設けられている。流路１０２において、挿入口１０４の幅は、その下流に設けられた微粒子の流動を操作する領域よりも狭い構成となっている。
【０１３８】
この流路に挿入口１０４からＤＮＡやＳＤＳ処理したタンパク質のような荷電微粒子を導入し、電気泳動させる。その際、挿入口１０４のさらに上流にある電極１１０と電極１０５と電極１０６に電圧を印加する。電圧条件としては、たとえば微粒子がＤＮＡなどのように負に帯電している場合、図２２に示したように、上流の電極１１０を負極として、電極１０５および電極１０６に正の電圧を印加する。さらに、電極１０５に印加する電圧は電極１０６に印加する電圧より大きくすることができる。こうすれば、微粒子の移動方向を大きさによって異ならせつつ、図中のｙ軸方向に優先的に移動させることができる。
【０１３９】
また、図２３および図２４に示したように、パルス状の電圧を与え、さらに電極１０５にはパルスの印加時間や印加回数を電極１０６より長くしたり多くしたりすることもできる。図２３では、電極１０５と電極１０６のパルスの周期を等しくし、パルス電圧の印加時間を電極１０５の方が大きくなるように設定した例である。また、図２４は、電極１０５と電極１０６において、一度の印加のパルス幅を等しくし、印加回数を電極１０５の方が大きくなるように設定した例である。この場合にも、微粒子の移動方向を大きさによって異ならせつつ、図中のｙ軸方向に優先的に移動させることができる。
【０１４０】
図２１にもどり、特に、電極１０５および電極１０６に直流電圧を印加する場合には、泳動した微粒子を誘導し、回収する隔壁１０７を設けることが望ましい。隔壁１０７は、一方向に沿って形成され、微粒子の回収部とすることができる。図２１では、挿入口１０４から遠い側の流路１０２の側壁に、複数の隔壁１０７が設けられている。隔壁１０７は、流路１０２の側壁から挿入口１０４の方向に向かう方向に設けられている。また、隔壁１０７は、流路１０２を区画して微粒子を分画できるように配置されていればよく、たとえば、ｘ軸方向に水平であってもよい。図２１のように、上流側に角度を有する隔壁１０７を流路１０２の延在方向に沿って複数配置することにより、異なる速度で移動した微粒子を、その大きさに応じて簡便に分取することができる。
【０１４１】
このような条件で、小さい微粒子１０８と大きい微粒子１０９を含む試料を挿入口１０４から導入して電気泳動した場合、大きな微粒子や、硬い粒子ほど妨害体１０１による抵抗を受ける。このため、ｙ軸方向の移動速度は、たとえば微粒子の粒径が小さいほど泳動速度が速く、粒径が大きいほど遅くなる。一方、妨害体１０１の間隙がｘ軸方向には広いため、微粒子の粒径によりｙ軸方向のような速度差はつかないか、またはついても小さい。ただし、妨害体１０１を配置する際に、ｙ軸方向の間隙の幅は微粒子の粒径と同程度にし、ｘ方向の間隙の幅は微粒子の粒径より大きくすることが望ましい。従って、小さい微粒子１０８と大きい微粒子１０９は電界と妨害体１０１の間隙を通過する際の抵抗により、図２１に示したように、図中左上から右下に向かって斜めに泳動する。さらに、小さい微粒子１０８と大きい微粒子１０９の泳動方向は微粒子の大きさに従って異なり、大きい微粒子ほど、図中のｘ軸方向に近い方向に泳動する。
【０１４２】
このように、図２１の微粒子操作ユニットでは、流路１０２の一方の側壁近傍に設けられた挿入口１０４に導入された試料を、下流側に移動させつつ、他方の側壁側に移動させる。そして、流路１０２に多段に形成された柱状の妨害体１０１により、微粒子の移動速度を微粒子の表面の性質や形状、大きさ、変形のしやすさ等によって異ならせる。このため、微粒子の大きさなどに応じて試料中の微粒子を分離し、流路１０２の延在方向に沿って当該他方の側壁に複数並んで配置された隔壁の間に回収することができる。
【０１４３】
なお、本実施形態の微粒子操作ユニットは、試料中の微粒子に、異なる２方向に移動させる駆動力を付与する。このため、微粒子の移動は、妨害体１０１が設けられていない場合、これらの合力方向となる。そして、妨害体１０１の間隔、妨害体１０１の直径、微粒子の半径等によって微粒子の受ける抵抗が異なるため、この抵抗の違いによって、微粒子が受ける合力の方向が異なることとなる。このため、表面の性質や形状、大きさ、変形のしやすさ等によって安定的に分離することができる。そして、微粒子を流路１０２の所定の位置に一定方向に並んで設けられた隔壁１０７に微粒子を分離し、回収することができる。
【０１４４】
実施形態に係る微粒子操作ユニットに用いる材料および製造方法は、たとえば第一の実施形態に記載の材料および方法を用いることができる。本実施形態の微粒子操作ユニットは、妨害体１０１がｙ軸方向に複数段形成されているが、妨害体の形状自体は微細加工技術を用いて容易に作製することが可能であり、微粒子の流れをさらに精度良く制御することが可能な構成である。
【０１４５】
なお、本実施形態では、ＤＮＡを例にとって説明したが、たとえばタンパク質を泳動した場合には、各々サイズの異なるタンパク質を電極１０６の各部に集め、その後電極１０６にレーザーをスキャンしながら照射することにより質量分析を行うこともできる。
【０１４６】
また、図２１の微粒子操作ユニットでは、一列をなす妨害体１０１がｘ軸に平行な方向に配置されたが、妨害体１０１の列が、ｘ軸に対して所定の角度を有して配置されてもよい。また、妨害体の配置は、図２１に示した列状の配置には限定されず、後述する微粒子の移動速度や、挿入口１０４や隔壁１０７を設ける位置に応じて適宜選択することができる。たとえば、図２１においては、妨害体１０１のｘ軸方向の間隔が、どの列についても一定である構成としたが、妨害体１０１のｘ軸方向の間隔が、ｙ軸方向に上流から下流へ狭くなるよう構成してもよい。こうすることにより、分離する微粒子の大きさの範囲をさらに拡張することができる。
【０１４７】
また、図２１では、電極１０４、電極１０５、および電極１１０を用い、異なる方向に電圧を印加することにより微粒子を移動させているが、ポンプ等を用いて、微粒子を圧送することにより移動させてもよい。また、図２１では、２方向に電位を生じさせる構成としているが、微粒子を移動させる駆動力を付与する方向は２方向に限らず、３方向以上とすることもできる。
【０１４８】
以上、本発明を実施形態に基づき説明した。本発明は上記の実施形態に限定されず、本発明の技術思想の範囲内において、適宜変更され得ることは明らかである。すなわち、これらの実施形態は例示であり、各構成要素や各製造工程の組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１４９】
たとえば、以上の実施形態において、微粒子の移動を妨害する妨害部として、柱状体にかえて、流路の表面に疎水性領域を形成し、疎水性領域を除く表面を親水性領域としてもよい。こうすれば、分子サイズが大きい程、疎水性領域が障害となり、移動に要する時間が長くなる。疎水性領域は、疎水基を有するカップリング剤を基板の表面に付着ないし結合することにより形成することができる。
【０１５０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１５１】
（実施例）
本実施例では、図１１を用いて前述した微粒子操作ユニットの分岐流路の方向が左右逆転した構成の微粒子操作ユニットをチップ上に作製し、評価した。図１５は、本実施例に係るチップの概略構成を示す上面図である。チップ２４５では、基板２３１上に、流路２３３および流路２３５からなる主流路と、流路２３７が形成されている。流路２３３、流路２３５、および流路２３７のそれぞれに、液溜め２３９、液溜め２４１、および液溜め２４３が連通している。また、流路２３３、流路２３５、および流路２３７は図中に点線で示される分岐点２４７にて連通している。また、液溜め２３９、液溜め２４１、および液溜め２４３は、それぞれ白金線（不図示）の挿入により形成された電極（不図示）を有する。
【０１５２】
本実施例において、微粒子操作ユニットの作製には、第五の実施形態に記述した加工方法を用いた。図１６は、作製した微粒子操作ユニットの分岐点２４７を示す顕微鏡像を示す図である。分岐流路の方向が左右逆転しているが、図１１に模式的に示した微粒子操作ユニットに対応する構成となっていることがわかる。なお、図１６において、流路２３３および流路２３５の流路幅は４０μｍとした。また、図中の妨害体領域に、妨害体の配列を１０００段程度形成した。
【０１５３】
図１７は、妨害体領域の走査電子顕微鏡像を示す図である。図中の白い点の一つ一つが妨害体８である。妨害体８の間隙は分岐点下流側に向かって徐々に狭くなっている。ここで、図１７は分岐点の下流側であって、流路２３７に面した部分の走査電子顕微鏡像である。図１１のｌに当たる妨害体８の間の間隙は約３２ｎｍであり、ｎに相当する間隔は１５０ｎｍである。一方、図１１のｏに相当する間隔は約１５０ｎｍである。図１８は、妨害体領域に形成された妨害体８の配列構造を拡大した電子顕微鏡像を示す図である。
【０１５４】
本実施例では、微粒子操作ユニットを用いることにより、以下に記載するＤＮＡの操作を行った。
【０１５５】
バッファ液を満たした流路中で、蛍光染色したＤＮＡを電気泳動し、観察した。電気泳動の際には、流路２３３に−５Ｖ、流路２３５に１８Ｖ、流路２３７に１．５Ｖの電圧をそれぞれ印加した。
【０１５６】
図１９は、図１６と同一位置で観察した、１００ｂｐのＤＮＡを電気泳動した場合の蛍光顕微鏡像を示す図である。図１９において、白い一点一点が各々蛍光染色されたＤＮＡに相当する。ほとんどのＤＮＡは流路２３７には泳動せず、多くは約３２ｎｍの間隙を通って流路２３５に流れている。なお、Ｐ．  Ｇ．  Ｒｉｇｈｅｔｔｉ著，「Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，  １９９６  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐ．４８０によると、ＤＮＡの慣性半径は、下記式（１）によって算出される。
【０１５７】
【数１】
2004354364.tif 000004
【０１５８】
（ただし、上記式（１）において、ｒは慣性半径であり、ｂはＫｕｈｎ長であり、１００ｎｍである。また、ＮはＤＮＡの塩基対の数である。）
上記式（１）を用いて算出した慣性半径を用いると、１００ｂｐのＤＮＡの慣性半径から算出した粒径は約２２ｎｍであり、本実施例の印加電圧条件下におけるバッファ液中での変形のしやすさを考慮したＤＮＡの粒径はさらに小さくなるため、約３２ｎｍの間隙を通過している。
【０１５９】
また、図２０は、３００ｂｐのＤＮＡを同じ印加電圧の条件で電気泳動した場合の蛍光顕微鏡像を示す図である。ＤＮＡは約３２ｎｍの間隙を通ることなく流路２３７に流れている。なお、３００ｂｐのＤＮＡの慣性半径から算出した粒径は、上記式（１）より約５７ｎｍであり、本実施例の印加電圧条件下におけるＤＮＡの変形のしやすさを考慮した粒径よりも十分大きく、約３２ｎｍの間隙を通過することはできない。
【０１６０】
以上示した通り、本実施例においては、ＤＮＡの大きさに従って流動方向を操作可能な微粒子操作ユニットが実現されている。なお、本実施例の微粒子操作ユニットを用いて、これらのＤＮＡの分離を行うこともできた。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す斜視図である。
【図２】図１の微粒子操作ユニットの分岐点に設けられた妨害体と、分岐点の上流に存在する微粒子を示す上面図である。
【図３】本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す斜視図である。
【図４】図３の微粒子操作ユニットの分岐点に設けられた妨害体と、分岐点の上流に存在する微粒子を示す上面図である。
【図５】本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す斜視図である。
【図６】図５の微粒子操作ユニットに設けられた妨害体および微粒子を示す上面図である。
【図７】本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す上面図である。
【図８】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を示す図である。
【図９】本実施形態に係るタンパク質の分析手順を示す図である。
【図１０】本実施形態に係るチップの構成の一例を示す図である。
【図１１】本実施形態に係る微粒子操作ユニットの分岐点に設けられた妨害体の構成を示す斜視図である。
【図１２】本発明の実施例を説明する、タンパク質の分離状況の一例を示す模式図である。
【図１３】実施例において二次元電気泳動により分離したタンパク質のスポットの様子を示す模式図である。
【図１４】質量分析装置の構成を模式的に示す図である。
【図１５】実施例のチップの概略構成を示す上面図である。
【図１６】実施例のチップの分岐点の構成を示す図である。
【図１７】実施例のチップの妨害体領域の構成を示す図である。
【図１８】実施例のチップの妨害体領域の構成を示す図である。
【図１９】実施例の微粒子操作ユニットに１００ｂｐのＤＮＡを電気泳動した様子を示す図である。
【図２０】実施例の微粒子操作ユニットに３００ｂｐのＤＮＡを電気泳動した様子を示す図である。
【図２１】本実施形態に係る微粒子操作ユニットの構成の一例を示す上面図である。
【図２２】図２１の微粒子操作ユニットの電極に印加する電圧を示す図である。
【図２３】図２１の微粒子操作ユニットの電極に印加する電圧を示す図である。
【図２４】図２１の微粒子操作ユニットの電極に印加する電圧を示す図である。
【符号の説明】
【０１６２】
１〜３、１４、２０〜２５  流路
４、１３、１５、２６  微粒子
５〜７、１６、２７〜３２  矢印
８、３３  妨害体
９  線分
１０  力の方向
１１  角度
１２  単位胞
１７、１７ａ、１７ｂ  トレンチ構造
１８、１９  一点鎖線
４１、４７  基板
４３  分岐点
４５  流路拡張部
１０１  妨害体
１０２  流路
１０３  基板
１０４  挿入口
１０５  電極
１０６  後電極
１０６  電極
１０７  隔壁
１０８  小さい微粒子
１０９  大きい微粒子
１１０  電極
２０１  シリコン基板
２０２  流路
２０３  蓋
２０４〜２１０  送液用パイプ口
２１１〜２１５  分岐点
２１６〜２２０  領域
２２１ａ、２２１ｂ  タンパク質のスポット
２２２〜２２６  領域
２３１  基板
２３３  流路
２３５  流路
２３７  流路
２３９  液溜め
２４１  液溜め
２４３  液溜め
２４５  チップ
２４７  分岐点
【図１】
2004354364.tif 000005
【図２】
2004354364.tif 000006
【図３】
2004354364.tif 000007
【図４】
2004354364.tif 000008
【図５】
2004354364.tif 000009
【図６】
2004354364.tif 000010
【図７】
2004354364.tif 000011
【図８】
2004354364.tif 000012
【図９】
2004354364.tif 000013
【図１０】
2004354364.tif 000014
【図１１】
2004354364.tif 000015
【図１２】
2004354364.tif 000016
【図１３】
2004354364.tif 000017
【図１４】
2004354364.tif 000018
【図１５】
2004354364.tif 000019
【図１６】
2004354364.tif 000020
【図１７】
2004354364.tif 000021
【図１８】
2004354364.tif 000022
【図１９】
2004354364.tif 000023
【図２０】
2004354364.tif 000024
【図２１】
2004354364.tif 000025
【図２２】
2004354364.tif 000026
【図２３】
2004354364.tif 000027
【図２４】
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