(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子導入非ヒト哺乳動物および新規なＨＩ７Ｔ２１３タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ並びにそれらの用途を提供する。【解決手段】白内障などの疾患の病態モデル動物として利用することができ、これらの病態機序の解明および疾患の治療方法の検討、ならびに予防および／または治療薬のスクリーニングを行うことが可能な遺伝子導入非ヒト哺乳動物、また該遺伝子導入非ヒト哺乳動物を用いたスクリーニング法ならびにＨＩ７Ｔ２１３タンパク質、形質転換体によるＨＩ７Ｔ２１３タンパク質の製造方法、その抗体、該タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその一部。
【請求項２】
非ヒト哺乳動物がラットである請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項３】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子である請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項４】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子である請求項１記載の動物またはその一部。
【請求項５】
（１）白内障を発症している、
（２）粗毛を発症している、
（３）一過性の皮膚発疹または落屑が認められる、
（４）眼球において、水晶体線維の融解/変性が認められる、
（５）眼球において水晶体線維の異常が認められる、
（６）水晶体前極での水晶体上皮の重層化がみられる、
（７）腎臓で好塩基性尿細管が増加している、
（８）腎臓で細胞障害が起きている、
（９）尿細管細胞の増殖促進活性が高い、
（１０）若齢期の皮膚において、表皮肥厚と錯角化が認められる、
（１１）増殖関連抗原であるＰＣＮＡ陽性細胞が表皮基底層および毛穴付近に認められる、
（１２）ケラチン６遺伝子発現細胞の増加またはＰＣＮＡ陽性細胞の増加が認められる、
（１３）細胞増殖促進活性が亢進している、
（１４）ケラチン１４、ケラチン１０またはロリクリンの発現亢進を伴う表皮分化異常が認められる、
（１５）ケラチン６陽性部位において表皮自由神経終末が豊富である、
（１６）表皮異常部位での神経栄養因子群の発現が増強している、および
（１７）増殖促進活性に伴う分化異常、
から選ばれる少なくとも一つの表現型を示す請求項１から４記載の動物またはその一部。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載の動物またはその一部に被験物質を適用し、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト活性またはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト活性を検定することを特徴とするＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の動物またはその一部に被験物質を適用し、請求項５記載の表現型またはがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛もしくは痛覚過敏の改善効果を検定することを特徴とする、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療のために用いられる物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
創傷または脊髄損傷の予防および／または治療、あるいは腎再生のために用いられる物質をスクリーニングするための請求項１から４のいずれかに記載の動物またはその一部の使用。
【請求項９】
がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療のために用いられる物質をスクリーニングするための請求項１から５のいずれかに記載の動物またはその一部の使用。
【請求項１０】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を導入した受精卵。
【請求項１１】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、非ヒト哺乳動物において該遺伝子を発現し得るベクター。
【請求項１２】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子である請求項１１記載のベクター。
【請求項１３】
ｐＣＡＧ２１３−１で表示される請求項１１記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１１記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１５】
形質転換体が大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＡＧ２１３−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０７）である請求項１４記載の形質転換体。
【請求項１６】
配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩。
【請求項１７】
配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなる請求項１６記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩。
【請求項１８】
請求項１６記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１９】
ＤＮＡである請求項１８記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号：６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１８記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２１記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項２３】
請求項２２記載の形質転換体を培養し、請求項１６記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする請求項１６記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法。
【請求項２４】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩を含有してなる創傷または脊髄損傷の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤。
【請求項２５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる創傷または脊髄損傷の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤。
【請求項２６】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる創傷、脊髄損傷、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の診断剤。
【請求項２７】
請求項１６記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項２８】
請求項１６記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である請求項２７記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤。
【請求項３０】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる創傷、脊髄損傷、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の診断剤。
【請求項３１】
請求項１８記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤。
【請求項３３】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するリガンドまたはアゴニストを含有してなる創傷または脊髄損傷の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤。
【請求項３４】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤。
【請求項３５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる物質を含有してなる創傷または脊髄損傷の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤。
【請求項３６】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる物質を含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤。
【請求項３７】
哺乳動物に対して、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するリガンドまたはアゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を増加させる物質の有効量を投与することを特徴とする創傷または脊髄損傷の予防および／または治療法、あるいは腎再生方法。
【請求項３８】
哺乳動物に対して、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を減少させる物質の有効量を投与することを特徴とするがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療法。
【請求項３９】
創傷または脊髄損傷の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤を製造するための、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するリガンドまたはアゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を増加させる物質の使用。
【請求項４０】
がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤を製造するための、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を減少させる物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子導入非ヒト哺乳動物、および新規なＨＩ７Ｔ２１３タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ並びにそれらの用途等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体のホメオスタシスの維持、生殖、個体の発達、代謝、成長、神経系、循環器系、免疫系、消化器系、代謝系の調節、感覚受容などの重要な機能調節は、様々なホルモンや神経伝達物質のような内在性因子あるいは光や匂いなどの感覚刺激をこれらに対して生体が備えている細胞膜に存在する特異的なレセプターを介して細胞が受容し、それに応じた反応をすることによって行われている。このような機能調節に与るホルモンや神経伝達物質のレセプターの多くはguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇタンパク質と略称する場合がある）と共役しており、このＧタンパク質の活性化によって細胞内にシグナルを伝達して様々な機能を発現させることを特徴とする。また、これらのレセプタータンパク質は共通して７個の膜貫通領域を有する。これらのことからこうしたレセプターはＧタンパク質共役型レセプターあるいは７回膜貫通型レセプターと総称される。このように生体機能の調節には様々なホルモンや神経伝達物質およびそれに対するレセプタータンパク質が存在して相互作用し、重要な役割を果たしていることがわかっているが、未知の作用物質（ホルモンや神経伝達物質など）およびそれに対するレセプターが存在するかどうかについてはいまだ不明なことが多い。
近年、ヒトゲノムＤＮＡあるいは各種ヒト組織由来のｃＤＮＡのランダムな配列決定による配列情報の蓄積および遺伝子解析技術の急速な進歩によってヒトの遺伝子が加速度的に解明されてきている。それにともない、機能未知のタンパク質をコードすると予想される多くの遺伝子の存在が明らかになっている。Ｇタンパク質共役型レセプターは、７個の膜貫通領域を有するのみでなく、その核酸あるいはアミノ酸に多くの共通配列が存在するためそのようなタンパク質の中から明確にＧタンパク質共役型レセプターとして区分することができる。一方でこうした構造の類似性を利用したポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Polymerase Chain Reaction：以下、ＰＣＲと略称する）法によってもこうしたＧタンパク質共役型レセプター遺伝子が得られている。このようにしてこれまでに得られたＧタンパク質共役型レセプターのうちには既知のレセプターとの構造の相同性が高いサブタイプであって容易にそのリガンドを予測することが可能な場合もあるが、ほとんどの場合その内在性リガンドは予測不能であり、これらのレセプターは対応するリガンドが見いだされていない。このことからこれらのレセプターはオーファンレセプターと呼ばれている。このようなオーファンレセプターの未同定の内因性リガンドは、リガンドが知られていなかったために十分な解析がなされていなかった生物現象に関与している可能性がある。そして、このようなリガンドが重要な生理作用や病態と関連している場合には、そのレセプターアゴニストあるいはアンタゴニストの開発が革新的な医薬品の創製に結びつくことが期待される（Stadel, J. et al.、TiPS、18巻、430-437頁、1997年、Marchese, A.
et al.、TiPS、20巻、370-375頁、1999年、Civelli, O. et al.、Brain Res.、848巻、63-65頁、1999年）。しかし、これまで実際にオーファンＧタンパク質共役型レセプターのリガンドを同定した例はそれほど多くない。
最近、幾つかのグループによってこうしたオーファンレセプターのリガンド探索の試みがなされ、新たな生理活性ペプチドであるリガンドの単離・構造決定が報告されている。ReinsheidらおよびMeunierらは独立に、動物細胞にオーファンＧタンパク質共役型レセプターＬＣ１３２あるいはＯＲＬ１をコードするｃＤＮＡを導入してレセプターを発現させ、その応答を指標としてorphanin FQあるいはnociceptinと名付けられた新規ペプチドをブタ脳あるいはラット脳の抽出物より単離し、配列を決定した（Reinsheid, R. K. et al.、Science、270巻、792-794頁、1995年、Meunier, J.-C. et al.、Nature、377巻、532-535頁、1995年）。このペプチドは痛覚に関与していることが報告されたが、さらに、レセプターのノックアウトマウスの研究により記憶に関与していることが明らかにされた（Manabe, T. et al.、Nature、394巻、577-581頁、1998年）。
その後これまでに上記と同様な方法によりＰｒＲＰ（prolactin releasing peptide）、orexin、apelin、ghrelinおよびＧＡＬＰ（galanin-like peptide）などの新規ペプチドがオーファンＧタンパク質共役型レセプターのリガンドとして単離された（Hinuma, S. et al.、Nature、393巻、272-276頁、1998年、Sakurai, T. et al.、Cell、92巻、573-585頁、1998年、Tatemoto, K. et al.、Bichem. Biophys. Res. Commun.、251巻、471-476頁、1998年、Kojima, M. et al.、Nature、402巻、656-660頁、1999年、Ohtaki, T. et al.、J. Biol. Chem.、274巻、37041-37045頁、1999年）。
一方、これまで明らかでなかった生理活性ペプチドのレセプターが同様な方法によって解明される場合もある。腸管収縮に関与するmotilinのレセプターがＧＰＲ３８であることが明らかにされた（Feighner, S. D. et al.、Science、284巻、2184-2188頁、1999年）ほか、ＳＬＣ−１がメラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）のレセプターとして同定され（Chambers, J. et al.、Nature、400巻、261-265頁、1999年、Saito, Y. et al.、Nature、400巻、265-269頁、1999年、Shimomura, Y. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、261巻、622-626頁、1999年、Lembo, P. M. C. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、267-271頁、1999年、Bachner, D. et al.、FEBS Lett.、457巻、522-524頁、1999年）、またＧＰＲ１４（ＳＥＮＲ）がurotensin IIのレセプターであることが報告された（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年、Mori, M. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、265巻、123-129頁、1999年、Nothacker, H.-P. et al.、Nature Cell Biol.、1巻、383-385頁、1999年、Liu, Q. et al.、Biochem. Biophys. Res. Commun.、266巻、174-178頁、1999年）。ＭＣＨはそのノックアウトマウスが羸痩の表現型を示すことから肥満に関与することが示されていたが（Shimada, M. et al.、Nature、396巻、670-674頁、1998年）、そのレセプターが明らかにされたことにより抗肥満薬としての可能性を有するレセプターアンタゴニストの探索が可能となった。また、urotensin IIはサルに静脈内投与することによって心虚血を惹起することから心循環系に強力な作用を示すことも報告されている（Ames, R. S. et al.、Nature、401巻、282-286頁、1999年）。
このように、オーファンレセプターおよびそのリガンドは新たな生理作用に関与する場合が多く、その解明は新たな医薬品開発に結びつくことが期待される。しかし、オーファンレセプターのリガンド探索においては多くの困難さが伴い、これまでに数多くのオーファンレセプターの存在が明らかにされながらそのリガンドが明らかにされたレセプターはごく一部に過ぎない。
オーファンレセプターの１つとして、ｈＨＩ７Ｔ２１３が知られている（配列番号：１および配列番号：３；特開２０００−１６６５７６号公報（特許文献１））。また、オーファンレセプターとしてＭｒｇＸ３（ヒト型）、ＭｒｇＡ４（マウス型）、ＭｒｇＡ６（マウス型）が知られており（Nature Neuroscience, 5, 201-209 (2002)（非特許文献１）、Cell、106、619―632(2001)（非特許文献２））、このＭｒｇＸ３はｈＨＩ７Ｔ２１３（配列番号：１）と同一のアミノ酸配列を有している。さらに、ｈＨＩ７Ｔ２１３はガン遺伝子ｍａｓともアミノ酸レベルで約３０％の相同性を有している。
【特許文献１】特開２０００−１６６５７６号
【非特許文献１】Nature Neuroscience, 5, 201-209 (2002)
【非特許文献２】Cell、106、619−632(2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
新たな遺伝子導入（トランスジェニック）動物は、いろいろな疾患の予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発を可能にする。
したがって、本発明の分野では、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子導入非ヒト動物（以下、トランスジェニック動物と称することもある）を見出し、がん、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏などの疾患モデル動物を大量に生産する方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、外来性のＨＩ７Ｔ２１３を発現させた新規なトランスジェニックマウスを作製したところ、白内障、粗毛、皮膚発疹、落屑などの表現型を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、公知のＭｒｇＡ４と一部のアミノ酸が異なる新規なマウス由来ＨＩ７Ｔ２１３（配列番号：５）をそれぞれコードする新規なｃＤＡＮをクローニングすることに成功した。本発明者は、これらの知見を基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は
［１］外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物またはその（生体の）一部、
［２］非ヒト哺乳動物がラットである上記［１］記載の動物またはその一部、
［３］外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有するＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子である上記［１］記載の動物またはその一部、
［４］外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子である上記［１］記載の動物またはその一部、
［５］（１）白内障を発症している、
（２）粗毛を発症している、
（３）一過性の皮膚発疹または落屑が認められる、
（４）眼球において、水晶体線維の融解/変性が認められる、
（５）眼球において水晶体線維の異常が認められる、
（６）水晶体前極での水晶体上皮の重層化がみられる、
（７）腎臓で好塩基性尿細管が増加している、
（８）腎臓で細胞障害が起きている、
（９）尿細管細胞の増殖促進活性が高い、
（１０）若齢期の皮膚において、表皮肥厚と錯角化が認められる、
（１１）増殖関連抗原であるＰＣＮＡ陽性細胞が表皮基底層および毛穴付近に認められる、
（１２）ケラチン６遺伝子発現細胞の増加またはＰＣＮＡ陽性細胞の増加が認められる、
（１３）細胞増殖促進活性が亢進している、
（１４）ケラチン１４、ケラチン１０またはロリクリンの発現亢進を伴う表皮分化異常が認められる、
（１５）ケラチン６陽性部位において表皮自由神経終末が豊富である、
（１６）表皮異常部位での神経栄養因子群の発現が増強している、および
（１７）増殖促進活性に伴う分化異常、
から選ばれる少なくとも一つの表現型を示す上記［１］から［４］記載の動物またはその一部、
［６］上記［１］から［４］のいずれかに記載の動物またはその一部に被験物質を適用し、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト活性またはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト活性を検定することを特徴とするＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストのスクリーニング方法、
［７］上記［６］記載のスクリーニング方法により得られうるＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト、
［８］上記［６］記載のスクリーニング方法により得られうるＨＩ７Ｔ２１３アゴニストを含有してなる創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤、
［９］上記[１]から［５］のいずれかに記載の動物またはその一部に被験物質を適用し、上記［５］記載の表現型またはがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛もしくは痛覚過敏の改善効果を検定することを特徴とする、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療のために用いられる物質のスクリーニング方法、
［１０］上記［９］記載のスクリーニング方法を用いて得られる、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療のために用いられる物質、
［１１］上記［９］記載のスクリーニング方法を用いて得られる物質を含有してなる、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療用医薬、
［１２］哺乳動物に対して、上記［６］記載のスクリーニング方法を用いて得られるＨＩ７Ｔ２１３アゴニストの有効量を投与することを特徴とする創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療法、あるいは腎再生方法、
［１３］創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤を製造するための、上記［６］記載のスクリーニング方法を用いて得られるＨＩ７Ｔ２１３アゴニストの使用、
［１４］創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療、あるいは腎再生のために用いられる物質をスクリーニングするための上記［１］から［４］のいずれかに記載の動物またはその一部の使用、
［１５］哺乳動物に対して、上記［９］記載のスクリーニング方法を用いて得られる物質の有効量を投与することを特徴とするがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療法、
［１６］がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤を製造するための、上記［９］記載のスクリーニング方法を用いて得られる物質の使用、
［１７］がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療のために用いられる物質をスクリーニングするための上記[１]から［５］のいずれかに記載の動物またはその一部の使用、
［１８］外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を導入した受精卵、
［１９］外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、非ヒト哺乳動物において該遺伝子を発現し得るベクター、
［２０］外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子である上記［１９］記載のベクター、
［２１］さらにニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーター、ウサギグロビンポリＡ付加シグナルを含む領域、ＳＶ４０複製開始領域、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を含有する上記［１９］記載のベクター、
［２２］ｐＣＡＧ２１３−１で表示される上記［１９］記載のベクター、
［２３］上記［１９］記載のベクターで形質転換された形質転換体、
［２４］形質転換体が大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＡＧ２１３−１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０７）である上記［２３］記載の形質転換体、
［２５］配列番号：５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、
［２６］配列番号：５で表されるアミノ酸配列からなる上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩、
［２７］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
［２８］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
［２９］ＤＮＡである上記［２８］記載のポリヌクレオチド、
［３０］配列番号：６で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
［３１］上記［２８］記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
［３２］上記［３１］記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
［３３］上記［３２］記載の形質転換体を培養し、上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドを生成せしめることを特徴とする上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の製造法、
［３４］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
［３５］上記［２８］記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［３６］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその塩を含有してなる創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤、
［３７］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤、
［３８］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる創傷、脊髄損傷、無痛覚症、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の診断剤、
［３９］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
［４０］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質のシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記［３９］記載の抗体、
［４１］上記［３９］記載の抗体を含有してなる医薬、
［４２］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤、
［４３］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる創傷、脊髄損傷、無痛覚症、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の診断剤、
［４４］上記［２８］記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、
［４５］上記［４４］記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
［４６］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチドを含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤、
［４７］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
［４８］上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
［４９］上記［４７］記載のスクリーニング方法または上記［４８］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、リガンドと該Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
［５０］上記［４９］記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
［５１］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するリガンドまたはアゴニストを含有してなる創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤、
［５２］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニストを含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤、
［５３］上記［２９］記載のＤＮＡを用いることを特徴とする上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる物質のスクリーニング方法、
［５４］上記［２９］記載のＤＮＡを含有することを特徴とする上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる物質のスクリーニング用キット、
［５５］上記［５３］記載のスクリーニング方法または上記［５４］記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる、上記［２５］記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を変化させる物質、
［５６］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を増加させる物質を含有してなる創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤、
［５７］配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドの発現量を減少させる物質を含有してなるがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤、
［５８］  哺乳動物に対して、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するリガンドまたはアゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を増加させる物質の有効量を投与することを特徴とする創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療法、あるいは腎再生方法、
［５９］  哺乳動物に対して、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を減少させる物質の有効量を投与することを特徴とするがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療法、
［６０］  創傷、脊髄損傷または無痛覚症の予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤を製造するための、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するリガンドまたはアゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を増加させる物質の使用、
［６１］  がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏の予防および／または治療剤を製造するための、(i)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、(ii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列またはその一部を含有してなるポリヌクレオチド、(iii)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩に対するアンタゴニスト、または(iv)配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の発現量を減少させる物質の使用、
などを提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、白内障などの疾患の予防薬あるいは治療薬の評価、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子異常患者の遺伝子治療用実験などに用いることができ、本発明の遺伝子導入非ヒト哺乳動物から採取した細胞などを培養し、ＨＩ７Ｔ２１３阻害薬の評価に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の遺伝子導入動物は、例えば、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子およびその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは８細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とする外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を目的とする細胞などに導入することにより作出される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とするＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることにより遺伝子導入動物を作出することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とするＤＮＡを導入し、予め該ＤＮＡが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ＥＳ細胞を胚盤胞に注入するかあるいはＥＳ細胞塊と８細胞期胚とを凝集させてキメラマウスを作製し、生殖系列に導入遺伝子が伝達されたものを選択することによっても遺伝子導入動物を得ることが可能である。
また、このようにして作製された遺伝子導入動物の（生体の）一部（例えば、（ｉ）外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する細胞、組織、臓器など、（ｉｉ）これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じ、継代したものなど、（ｉｉｉ）該遺伝子導入動物から単離し得る各種タンパク質またはＤＮＡなど）も、本発明の「外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物の一部」として、本発明の「外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることが出来る。
遺伝子導入動物の一部である組織としては、特に限定されないが、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、肺、副腎、精巣、卵巣、眼球などが好ましい。
遺伝子導入動物の一部である細胞としては、特に限定されないが、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、肺、副腎、精巣、卵巣、眼球などの細胞が好ましい。
【０００７】
本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどが挙げられる。好ましくは、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウスまたはラットであり、なかでも齧歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）が好ましく、とりわけラット（Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）、特にＷｉｓｔａｒ系統のラットが疾患モデル動物として最も好ましい対象動物である。他に鳥類動物として、ニワトリなども本発明で対象する「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることが出来る。
対象となる非ヒト哺乳動物に導入する外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子としては、例えば、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなどの哺乳動物由来のＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を用いることができる。
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子とは、遺伝子導入対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子であり、具体的には前記の哺乳動物から単離・精製したＨＩ７Ｔ２１３遺伝子または合成したＨＩ７Ｔ２１３遺伝子などが用いられる。
本発明の外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の変異遺伝子としては、本発明のＤＮＡに変異（例えば、突然変異、部位特異的突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じた遺伝子が挙げられる。より具体的には、該塩基の付加、欠損、他の塩基への置換の結果、ＨＩ７Ｔ２１３を構成するアミノ酸配列において、１ないし３０個、好ましくは１ないし１０個、さらに好ましくは１ないし５個、より好ましくは１または２個のアミノ酸に置換、付加または欠損が生じるように変異させることが好ましく、ＨＩ７Ｔ２１３の機能を失わない変異であれば何れの変異であってもよい。
具体的には、外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子としては、例えば、後述するＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が用いられるが、より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡ（配列番号：２）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡ（配列番号：４）、配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含有するマウスＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡ（配列番号：６）、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するマウスＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡ（配列番号：８）などが用いられる。
【０００８】
本発明における外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子またはその変異遺伝子（以下、単にＨＩ７Ｔ２１３遺伝子と称することもある）は、導入または発現の対象とする非ヒト哺乳動物と同種あるいは異種、どちらの哺乳動物由来のものであってもよいが、異種の哺乳動物由来のものであることが好ましい。該遺伝子を対象動物に導入するにあたっては、当該遺伝子を対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として用いるのが一般に有利である。具体的には、ヒトのＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を導入させる場合、ヒトＨＩ７Ｔ２１３遺伝子と相同性が高いＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を有する各種哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど（好ましくはラットなど））に由来し、ヒトのＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、該遺伝子を連結したベクターを、対象となる非ヒト哺乳動物の受精卵（例えばラット受精卵）へマイクロインジェクションすることによって、目的とするヒトＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を高発現する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出できる。
ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられ、特に大腸菌由来のプラスミドが好ましい。
【０００９】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の遺伝子発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、ウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）に由来する遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する遺伝子（例えば、アルブミン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲン、サイクリックＡＭＰ依存タンパクキナーゼβＩサブユニット、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロテイナーゼ１組織インヒビター、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖伸長因子１α（ＥＦ１−α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン塩基性タンパク質、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなど）のプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーターなどを用いることができる。
さらに好ましくは、目的とする疾患モデルに応じて、標的組織で外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を特異的もしくは高発現させ得るプロモーター（例：肝臓で高発現可能な血清アミロイドＰコンポーネント（ＳＡＰ）、アルブミン、トランスフェリン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシンなどの遺伝子プロモーター；心臓で高発現可能なαおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２などの遺伝子プロモーター；腎臓で高発現可能なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターなどの遺伝子プロモーター；副腎で高発現可能なＡＣＴＨレセプターなどの遺伝子プロモーター；消化管で高発現可能な脂肪酸結合タンパク質などの遺伝子プロモーター；脳で高発現可能なミエリン塩基性タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質などの遺伝子プロモーター等）を適宜選択することができる。例えば、本発明の遺伝子導入動物が腎疾患モデルである場合、腎臓で高発現可能なプロモーターを用いることが好ましい。
【００１０】
上記ベクターは、遺伝子導入哺乳動物において、目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（ポリＡ、一般にターミネーターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の配列を用いて遺伝子発現を操作することが出来る。好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。その他、目的の遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。
また、上記のベクターは、導入遺伝子が安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。さらに、相同組換えにより宿主染色体の特定の部位に導入遺伝子を組み込むこと（即ち、ノックイン動物の作製）を意図する場合には、上記のベクターは、ランダムな挿入を排除するために、標的部位と相同なＤＮＡ配列の外側に単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子をネガティブ選択マーカー遺伝子としてさらに含むことが好ましい。これらの実施態様については後で詳述する。
【００１１】
ＨＩ７Ｔ２１３の翻訳領域は、ヒトや各種非ヒト哺乳動物（ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の肝臓、腎臓、繊維芽細胞などに由来するＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーに由来するゲノムＤＮＡの全てあるいは一部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動物の肝臓、腎臓、繊維芽細胞に由来するＲＮＡから公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として用いて、取得することが出来る。また、上記の細胞あるいは組織などから得られたＨＩ７Ｔ２１３の翻訳領域を用いて、点突然変異誘発法などにより変異した翻訳領域を作製することもできる。これらは何れも遺伝子導入動物に利用可能な材料である。
以上の翻訳領域は、導入動物において発現しうる遺伝子コンストラクト（例、ベクターなど）として前記のプロモーターの下流（好ましくは、転写終結部位の上流）に連結させる通常の遺伝子工学的手法により、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を組み込んだＤＮＡを作製することができる。
具体的には、ニワトリアクチンプロモーターを含むＣＡＧプロモーター、ウサギグロビンポリＡ付加シグナルを含む領域、ＳＶ４０複製開始領域、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＣＸＮ２に、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を挿入したｐＣＡＧ２１３−１（後述する実施例１）などが用いられる。
【００１２】
好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られる外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）を用いる場合は、雌が約４〜約６週齢、雄が約２〜約８月齢程度のものが好ましく、また、約１２時間明期条件（例えば７：００−１９：００）で約１週間飼育したものが好ましい。
体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と１個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にＰＭＳＧと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にｈＣＧと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約４８時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約２０〜約５０ＩＵ／個体、好ましくは約３０ＩＵ／個体、黄体形成ホルモンの投与量は約０〜約１０ＩＵ／個体、好ましくは約５ＩＵ／個体である。
一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：Ｍ１６培地、修正Whitten培地、ＢＷＷ培地、Ｍ２培地、ＷＭ−ＨＥＰＥＳ培地、ＢＷＷ−ＨＥＰＥＳ培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下でＤＮＡ顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００１３】
一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：ＴＹＨ培地中で体外受精時まで微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で培養した後、２個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにＤＮＡの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
【００１４】
受精卵へのＤＮＡの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてＤＮＡ溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入遺伝子はＣｓＣｌ密度勾配超遠心等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入遺伝子は制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
【００１５】
ＤＮＡ導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により５％炭酸ガス／９５％大気下で１細胞期から胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ＩＣＲ系の雌マウス（好ましくは約８〜約１０週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ＩＣＲ系の雄マウス（好ましくは約２月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にＬＨＲＨと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。ＬＨＲＨ類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。ＬＨＲＨもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはＩＣＲ系のマウスなど）の場合には、通常、ＬＨＲＨもしくはその類縁体を投与した後、約４日目に雄マウスと交配させることが好ましく、ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量は、通常、約１０〜６０μｇ／個体、好ましくは約４０μｇ／個体である。
【００１６】
通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、１細胞期から８細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、２細胞期胚を移植するには偽妊娠後約０．５日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約２．５日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約５〜約１０個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはＩＣＲ系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
【００１７】
受精卵細胞段階における外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子の導入は、導入遺伝子が対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（Ｆ0）の生殖系列細胞において外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が存在することは、その後代（Ｆ1）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてに外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が存在することを意味する。
通常、Ｆ0動物は相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のＦ0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を有するホモ接合体を得るためには、Ｆ0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してＦ1動物を作出し、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。１遺伝子座にのみ導入遺伝子が組み込まれていれば、得られるＦ2動物の１／４がホモ接合体となる。
【００１８】
別の好ましい一実施態様においては、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入される。
ＥＳ細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ＩＣＭの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ＥＳ細胞としては、既に樹立された細胞株ものを用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（Nature、第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系マウス由来のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で、例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）から樹立されるＥＳ細胞なども良好に用いることができる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これ由来のＥＳ細胞は疾患モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
【００１９】
ＥＳ細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）などの近交系マウス、Ｂ６と他の近交系とのＦ1など）を用いる場合は、約２月齢以上の雄マウスと交配させた約８〜約１０週齢程度の雌マウス（妊娠約３．５日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代繊維芽細胞や公知のＳＴＯ繊維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するＩＣＭを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりＥＳ細胞が得られる。
【００２０】
ＥＳ細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとして、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
【００２１】
このようにして得られるＥＳ細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるＬＩＦ（１〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス／９５％空気または５％酸素／５％炭酸ガス／９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, Nature、第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、Journal of embryology and experimental morphology、第87巻、27頁、1985年〕、本発明の外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入されたＥＳ細胞を分化させて得られる外来性ＨＩ７Ｔ２１３発現非ヒト哺乳動物細胞は、インビトロにおける外来性ＨＩ７Ｔ２１３の細胞生物学的検討において有用である。
【００２２】
ＥＳ細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるＥＳ細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、１０6〜１０8細胞／ｍｌとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含むベクターを１０〜１００μｇ添加し、２００〜６００Ｖ／ｃｍの電気パルスを印加することにより行うことができる。
【００２３】
導入遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、ＥＳ細胞を用いるトランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入ベクターは、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）遺伝子など）やレポーター遺伝子（例：β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子としてｎｐｔＩＩ遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のＥＳ細胞をＧ４１８などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをＰＣＲもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入遺伝子の存在を確認する。
【００２４】
導入遺伝子の組込みが確認されたＥＳ細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のＩＣＭに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。キメラ動物の中でＥＳ細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入遺伝子が遺伝的に固定された遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作出することができる。
【００２５】
キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがあるが、ＥＳ細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、８細胞期胚の透明帯内へのＥＳ細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ＥＳ細胞塊と透明帯を除去した８細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。
いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのＥＳ細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ＥＳ細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ＥＳ細胞が１２９系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてＣ５７ＢＬ／６マウス（毛色：ブラック）やＩＣＲマウス（毛色：アルビノ）を用い、ＥＳ細胞がＣ５７Ｂ／６もしくはＤＢＦ1マウス（毛色：ブラック）由来やＴＴ２細胞（Ｃ５７Ｂ／６とＣＢＡとのＦ1（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてＩＣＲマウスやＢＡＬＢ／ｃマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
また、生殖系列キメラ形成能はＥＳ細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、１２９系統由来のＥＳ細胞に対してはＣ５７Ｂ／６系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、Ｃ５７Ｂ／６系統由来のＥＳ細胞に対してはＢＡＬＢ／ｃ系統由来の宿主胚等が好ましい。
採卵用雌マウスは約４〜６週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約２〜約８月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
【００２６】
胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約３．５日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内に外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞（約１０〜約１５個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
共培養法による場合は、８細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約２．５日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは８細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で８細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中に外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡが導入されたＥＳ細胞塊（細胞数約１０〜約１５個）を入れ、さらに上記８細胞期胚または桑実胚（好ましくは２個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
【００２７】
移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
生殖系列キメラの選択は、まずＥＳ細胞の雌雄が予め判別されている場合はＥＳ細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ＥＳ細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からＥＳ細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、５０％以上）を選択する。例えば、１２９系マウス由来の雄性ＥＳ細胞であるＤ３細胞とＣ５７Ｂ／６マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるＦ1動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌Ｃ５７Ｂ／６マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるＦ1の毛色はアグーチとなる。
【００２８】
上記のようにして得られる外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のファウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方に外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるＦ1動物のうち相同染色体の一方にのみ導入遺伝子を有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばＦ1動物の尾部より分離抽出した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより検定することができる。１遺伝子座にのみ導入遺伝子が組み込まれていれば、得られるＦ2動物の１／４がホモ接合体となる。
【００２９】
本発明の遺伝子導入動物は、外来性ＨＩ７Ｔ２１３に対する被験物質の作用を定量的に測定可能な程度に外来性ＨＩ７Ｔ２１３の発現量が確保される限り、内因性ＨＩ７Ｔ２１３の発現については特に制限はない。しかしながら、本発明の遺伝子導入動物を外来性ＨＩ７Ｔ２１３だけでなく内因性ＨＩ７Ｔ２１３にも作用し得る薬剤の評価にも使用する場合は、内因性ＨＩ７Ｔ２１３の発現を不活性化することが望ましい。内因性ＨＩ７Ｔ２１３の発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、公知の方法（例えば、Lee S.S.ら、Mol. Cell. Biol.、第15巻、第3012頁、1995年を参照）により選択されるＨＩ７Ｔ２１３遺伝子がノックアウトされたＥＳ細胞、あるいは該ＥＳ細胞から上記の方法に従って作出されるＨＩ７Ｔ２１３ノックアウト動物由来の初期胚もしくはＥＳ細胞に、上記の方法に従って外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入することによって得ることができる。ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子をノックアウトする具体的な手段としては、対象非ヒト哺乳動物由来のＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を常法に従って単離し、例えば、そのエクソン部分に他のＤＮＡ断片（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ｃａｔ遺伝子等のレポーター遺伝子等）を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか（この場合、前述のように導入遺伝子の組込みは薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を指標として選択され得る）、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いてＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させるか、タンパク質コード領域内へ終止コドンを挿入して完全なタンパク質の翻訳を不能にするか、あるいは転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入して、完全なｍＲＮＡの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、相同組換えにより対象非ヒト哺乳動物のＨＩ７Ｔ２１３遺伝子座に組み込ませる方法が好ましく挙げられる。
【００３０】
通常、哺乳動物における遺伝子組換えは大部分が非相同的であり、導入されたＤＮＡは染色体の任意の位置にランダムに挿入される。したがって、薬剤耐性やレポーター遺伝子の発現を検出するなどの選択によっては相同組換えにより標的となる内因性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子にターゲッティングされたクローンのみを効率よく選択することができず、選択されたすべてのクローンについてサザン法もしくはＰＣＲ法による組み込み部位の確認が必要となる。そこで、ターゲッティングベクターの標的配列に相同な領域の外側に、例えば、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を連結しておけば、該ベクターがランダムに挿入された細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有するため、ガンシクロビル含有培地では生育できないが、相同組換えにより内因性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子座にターゲッティングされた細胞はＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を有しないので、ガンシクロビル耐性となり選択される。あるいは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の代わりに、例えばジフテリア毒素遺伝子を連結すれば、該ベクターがランダムに挿入された細胞は自身の産生する該毒素によって死滅するので、薬剤非存在下で相同組換え体を選択することもできる。
【００３１】
あるいは、内因性ＨＩ７Ｔ２１３の発現が不活性化された本発明の遺伝子導入動物は、相同組換えを用いた遺伝子ターゲッティングにより外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子をコードするＤＮＡで内因性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を置換したノックイン動物であってもよい。
ノックイン動物はノックアウト動物と基本的に同様の手法に従って作製することができる。例えば、対象非ヒト哺乳動物由来のＨＩ７Ｔ２１３遺伝子のエクソンを適当な制限酵素を用いて切除し、代わりに外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の対応する領域を挿入することにより得られるＤＮＡを含むターゲティングベクターを、上記の方法に従って対象非ヒト哺乳動物由来のＥＳ細胞に導入し、相同組換えにより該動物の内因性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子座に外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が組み込まれたＥＳ細胞クローンを選択すればよい。クローン選択はＰＣＲ法やサザン法を用いて行うこともできるが、例えば、ターゲッティングベクターのＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の３'非翻訳領域などにネオマイシン耐性遺伝子等のポジティブ選択用マーカー遺伝子を挿入し、さらに標的配列と相同な領域の外側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子やジフテリア毒素遺伝子等のネガティブ選択用マーカー遺伝子を挿入すれば、薬剤耐性を指標にして相同組換え体を選択することができる。
また、ポジティブ選択用マーカー遺伝子が導入された外来性ＨＩ７Ｔ２１３の発現を妨げる場合があるので、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端にｌｏｘＰ配列もしくはｆｒｔ配列を配したターゲッティングベクターを用い、相同組換え体選択後の適当な時期にＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼまたは該リコンビナーゼ発現ベクター（例：アデノウイルスベクターなど）を作用させることにより、ポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出すことが好ましい。あるいは、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系やＦｌｐ−ｆｒｔ系を用いる代わりに、ポジティブ選択用マーカー遺伝子の両端に標的配列と相同な配列を同方向に繰り返して配置し、該配列間での遺伝子内組換えを利用してポジティブ選択用マーカー遺伝子を切り出してもよい。
【００３２】
また、本発明の遺伝子導入動物は、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデルであってもよい。
「ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患」とは、ＨＩ７Ｔ２１３活性の異常に起因するかもしくは結果的にＨＩ７Ｔ２１３活性の異常を生じる疾患だけでなく、ＨＩ７Ｔ２１３活性を調節することにより予防および／または治療効果が得られ得る疾患をも含めた概念として把握されるべきである。例えば、ＨＩ７Ｔ２１３を活性化することにより予防および／または治療可能な疾患として創傷、脊髄損傷または無痛覚症などが、ＨＩ７Ｔ２１３を阻害することにより予防および／または治療可能な疾患として、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛または痛覚過敏などがそれぞれ挙げられる。
「他の遺伝子改変」とは、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が導入される以外の遺伝子改変を意味し、自然突然変異により内因性遺伝子が改変された自然発症疾患モデル動物、他の遺伝子をさらに導入されたトランスジェニック動物、内因性遺伝子を不活化されたノックアウト動物（挿入突然変異等による遺伝子破壊のほか、アンチセンスＤＮＡや中和抗体をコードするＤＮＡの導入により遺伝子発現が検出不可能もしくは無視し得る程度にまで低下したトランスジェニック動物を含む）、変異内因性遺伝子が導入されたドミナントネガティブ変異体などが含まれる。したがって、内因性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の改変もまた、本発明における「他の遺伝子改変」に該当する。
【００３３】
「ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル」としては、例えば、高脂血症もしくは動脈硬化症モデルとしてＷＨＨＬウサギ（低比重リポタンパクレセプター（ＬＤＬＲ）に変異を有する；Watanabe Y.、Atherosclerosis、第36巻、第261頁、1980年）、ＳＨＬＭ（ａｐｏＥ欠損変異を有する自然発症マウス；Matsushima Y.ら、Mamm. Genome、第10巻、第352頁、1999年）、ＬＤＬＲノックアウトマウス（Ishibashi S.ら、J. Clin. Invest.、第92巻、第883頁、1993年）、ａｐｏＥノックアウトマウス（Piedrahita J.A.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、第4471頁、1992年）、ヒトａｐｏＢ導入マウス（Callow M.J.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、第2130頁、1994年）等が、虚血性心疾患モデルとしてＣＤ５５／ＣＤ５９ダブルトランスジェニックマウス（Cowan P.J.ら、 Xenotransplantation、第5巻、第184-90頁、1998年）等が、脳出血もしくは脳梗塞モデルとしてCuZn-スーパーオキシドディスムターゼ トランスジェニックマウス（Saito A.ら、Stroke、第2巻、1652頁、2001年）等が、皮膚炎モデルとしてinterleukin 1トランスジェニックマウス（Groves R.W. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA第９２巻、11874頁、1995年）等が、免疫不全モデルとしてＣＤ１９ノックアウトマウス（Spielman J.ら、Immunity、第3巻、39頁、1995年）等が、低血糖モデルとしてＳＰＣ２ノックアウトマウス（Furuta M. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第９４巻、６６４６頁、1997年）等が、脂肪肝モデルとしてｏｂ／ｏｂマウス（Herberg L.及びColeman D.L.、Metabolism、第26巻、第59頁、1977年）、ＫＫマウス（Nakamura M.及びYamada K.、Diabetologia、第3巻、第212頁、1967頁）、ＦＬＳマウス（Soga M.ら、Lab. Anim. Sci.、第49巻、第269頁、1999年）、糖尿病モデルとしてＮＯＤマウス（Makino S.ら、Exp. Anim.、第29巻、第1頁、1980年）、ＢＢラット（Crisa L.ら、Diabetes Metab. Rev.、第8巻、第4頁、1992年）、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス（Hummel L.ら、Science、第153巻、第1127頁、1966年）、ＫＫマウス、ＧＫラット（Goto Y.ら、Tohoku J. Exp. Med.、第119巻、第85頁、1976年）、Zucker fattyラット（Zucker L.M.ら、Ann. NY Acad. Sci.、第131巻、第447頁、1965年）、ＯＬＥＴＦラット（Kawano K.ら、Diabetes、第41巻、第1422頁、1992年）等が、肥満モデルとしてｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、ＫＫマウス、Zucker fattyラット、ＯＬＥＴＦラット等が、アルツハイマー病モデルとして変異アミロイド前駆体タンパク質遺伝子導入マウス等が、貧血性低酸素症モデルとしてbeta SAD (beta S-Antilles-D Punjab)トランスジェニックマウス（Trudel M.ら、 EMBO J、第10巻、3157頁、1991年）等が、性腺障害モデルとしてSteroidogenic factor 1ノックアウトマウス（Zhao L.ら、Development、第128巻、147頁、2001年）等が、肝臓癌モデルとしてｐ５３ノックアウトマウス（Kemp C.J. Molecular Carcinogenesis, 第12巻、132頁、1995年）等が、乳癌モデルとしてｃ−ｎｅｕトランスジェニックマウス（Rao G.N.ら、Breast Cancer Res Treat, 第48巻、265頁、1998年）等が、子宮内膜炎モデルとしてperforin/Fas-ligandダブルノックアウトマウス（Spielman J.ら、J Immunol. , 第161巻、7063頁、1998年）等が挙げられる。
これらの「他の遺伝子改変を有する」疾患モデル非ヒト哺乳動物は、例えば、米国のJackson研究所などから購入可能であるか、あるいは周知の遺伝子改変技術を用いて容易に作出することができる。
本発明の非ヒト哺乳動物は、「ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変」に加えて、同一もしくは他の疾患モデルを作製し得る非遺伝的処理を施されていてもよい。「非遺伝的処理」とは対象非ヒト哺乳動物における遺伝子改変を生じさせない処理を意味する。このような処理としては、例えば、高脂肪食負荷処理、糖負荷処理、飢餓処理、血管結紮／再灌流等が挙げられる。
【００３４】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物に、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を導入する方法は特に制限はなく、例えば、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物と、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する方法；ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する疾患モデル非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入してトランスジェニック動物を得る方法；外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、上述の方法により、あるいはノックアウト技術により、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を導入する方法等が挙げられる。また、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が外来遺伝子やドミナント変異遺伝子の導入による場合、野生型非ヒト哺乳動物の初期胚やＥＳ細胞に、該外来遺伝子等と外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子とを同時にもしくは順次導入してトランスジェニック動物を得てもよい。さらに、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変が内因性遺伝子の破壊による場合は、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を破壊すべき内因性遺伝子にターゲッティングされ得るようにデザインして野生型非ヒト哺乳動物のＥＳ細胞に導入してもよい。この場合、ターゲッティングベクターは、内因性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を破壊されるべき内因性遺伝子に置き換える以外は、上記のノックイン動物の作製に関して例示したものが好ましく使用され得る。
【００３５】
外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子を導入された非ヒト哺乳動物と、ＨＩ７Ｔ２１３の活性調節が関与する疾患と同一もしくは類似の病態を生じさせる１以上の他の遺伝子改変を有する同種の疾患モデル非ヒト哺乳動物とを交雑する場合、ホモ接合体同士を交雑することが望ましい。例えば、外来性ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子が１遺伝子座に組み込まれたホモ接合体と、ａｐｏＥホモ欠損高脂血症（動脈硬化）モデルとを交雑して得られるＦ1は両遺伝子についてヘテロである。このＦ1同士を兄妹交配して得られるＦ2個体の１／１６は外来性ＨＩ７Ｔ２１３ホモ導入・ａｐｏＥホモ欠損となる。
【００３６】
上記のようにして得られる本発明の非ヒト哺乳動物は、内因性ＨＩ７Ｔ２１３に加えて（あるいはそれに代えて）外来性ＨＩ７Ｔ２１３を発現するので、外来性ＨＩ７Ｔ２１３に対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するが、内因性ＨＩ７Ｔ２１３に対しては活性を有しない外来性ＨＩ７Ｔ２１３特異的アゴニストまたはアンタゴニストについて、その薬効をインビボで評価することを可能にする。
また、本発明の非ヒト哺乳動物が外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を過剰発現している場合、以下の少なくとも１つの表現型を有している。
（１）白内障、粗毛を発症している。
（２）一過性の皮膚発疹、落屑が認められる。
（３）眼球においては、水晶体線維の融解/変性が認められる。眼球において水晶体線維の異常が認められ、中には水晶体前極での水晶体上皮の重層化がみられる。すなわち、白内障を発症している。
（４）腎臓で好塩基性尿細管増加の所見が認められる。腎臓で細胞障害が起きている。尿細管細胞の増殖促進活性が高い。
（５）若齢期の皮膚において、表皮肥厚と錯角化が認められる。
（６）増殖関連抗原であるPCNA陽性細胞が表皮基底層および毛穴付近に認められる。
（７）keratin 6遺伝子発現細胞の増加、PCNA陽性細胞の増加が認められる。
細胞増殖促進活性が亢進している。
（８）keratin 14、keratin 10、ロリクリンの発現亢進を伴う表皮分化異常が認められる。
（９）Keratin６陽性部位において表皮自由神経終末が豊富である。
（１０）表皮異常部位での神経栄養因子群の発現が増強している。
（１１）増殖促進活性に伴う分化異常。
本発明の非ヒト哺乳動物は、上記のような極めてユニークな特徴を有しているので、以下に示す有用な用途を有している。
【００３７】
（１）本発明の非ヒト哺乳動物は、外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が高発現させられているので、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストの評価のために用いることができる。
すなわち、本発明は、
(i)本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に被験物質を適用し、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト活性またはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト活性を検定することを特徴とするＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストのスクリーニング方法、
(ii)本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に被験物質を適用し、創傷、脊髄損傷または無痛覚症などの疾患の改善効果または腎再生効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防および／または治療のために用いられるＨＩ７Ｔ２１３アゴニストのスクリーニング方法を提供する。
ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストの候補化合物は、例えば、ＨＩ７Ｔ２１３との結合実験により選定することができる。
具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
ＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト活性としては、創傷、脊髄損傷または無痛覚症などの疾患の改善作用、あるいは腎再生作用が挙げられる。
本発明の非ヒト哺乳動物が本来的に有するＨＩ７Ｔ２１３による上記作用の変動は無視してよい。
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、本発明の非ヒト哺乳動物に傷をつけたり、脊髄を損傷させた後、被検物質を投与する。そして、被検物質を投与しない場合に比べて、被検物質を投与した場合の創傷や脊髄損傷などの症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善された場合、該被検物質を上記の疾患に対して予防および／または治療効果を有する物質として選択することができる。
一方、ＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト活性としては、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの疾患の改善作用が挙げられる。
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、本発明の非ヒト哺乳動物に上記疾患を発症させた後、被検物質を投与する。そして、被検物質を投与しない場合に比べて、被検物質を投与した場合のがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏など症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善された場合、該被検物質を上記の疾患に対して予防および／または治療効果を有する物質として選択することができる。
【００３８】
このようにして選択されたＨＩ７Ｔ２１３アゴニストは、安全で低毒性な創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの疾患の予防および／または治療薬、あるいは腎再生薬として使用することができる。
一方、選択されたＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストは、安全で低毒性な、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療薬として使用することができる。
ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストは塩を形成していてもよく、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
選択されたＨＩ７Ｔ２１３アゴニストまたはＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、予防および／または治療用医薬として選択された物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００３９】
また、選択された物質がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。当該ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、創傷の治療目的でＨＩ７Ｔ２１３アゴニストを経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき当該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、創傷の治療目的で注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４０】
（２）また、本発明の非ヒト哺乳動物は、外来性ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が高発現させられており、上記した表現型またはがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの疾患を発症している場合がある。
したがって、本発明の非ヒト哺乳動物は、上記表現型の改善薬、上記疾患の予防薬あるいは治療薬の評価のために用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に被験物質を適用し、上記表現型または疾患の改善効果を検定することを特徴とする、上記疾患の予防および／または治療のために用いられる物質のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、本発明のスクリーニング方法では、本発明の非ヒト哺乳動物に被検物質を投与する。被験物質としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、被検物質の投与により、上記表現型またはがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの疾患の改善効果があると判定された場合（例えば、上記表現型または疾患が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善された場合）、その被検物質はこれらの疾患の予防および／または治療用医薬として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法において選択される物質は、例えば、ＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト、ＨＩ７Ｔ２１３の発現を阻害（抑制）する物質、ＨＩ７Ｔ２１３プロモーターのプロモーター活性を阻害（抑制）する物質などである。
【００４１】
選択された物質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、予防および／または治療用医薬として選択された物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
【００４２】
また、選択された物質がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。当該ＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
選択された物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、白内障の治療目的で経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき当該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、白内障の治療目的で注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
さらに、本発明の非ヒト哺乳動物は、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子異常患者の遺伝子治療用実験に用いることができる。
【００４３】
以上の本発明の遺伝子導入哺乳動物を、組織培養のための細胞源として使用することも可能である。また例えば、本発明の遺伝子導入マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現されたタンパク組織を分析することにより、核内レセプターの複雑な作用の転写因子との関連性について解析することもできる。あるいは、遺伝子を有する組織の細胞を、標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば脂肪組織を形成する細胞などの一般に培養が困難な組織に由来する細胞の機能を研究することもできる。さらに、その細胞を用いることにより、例えば細胞の機能を高めるような薬剤の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、ＨＩ７Ｔ２１３を大量に単離精製すること、ならびにその抗体を作製することも可能である。
【００４４】
本発明で用いられるＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（以下、ＨＩ７Ｔ２１３と略記する場合がある）は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプタータンパク質である。
ＨＩ７Ｔ２１３は、例えば、ヒトや非ヒト哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
【００４５】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と約７６％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、ぞれぞれ配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００４６】
また、ＨＩ７Ｔ２１３としては、ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、ｂ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、またはｄ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
【００４７】
本明細書におけるＨＩ７Ｔ２１３は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するＨＩ７Ｔ２１３をはじめとするＨＩ７Ｔ２１３は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＨＩ７Ｔ２１３がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＨＩ７Ｔ２１３に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＨＩ７Ｔ２１３には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３の具体例としては、例えば、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＨＩ７Ｔ２１３、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＨＩ７Ｔ２１３などが用いられる。このうち、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＨＩ７Ｔ２１３は新規なレセプタータンパク質である。
【００４８】
ＨＩ７Ｔ２１３の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、上記したＨＩ７Ｔ２１３の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、例えば、ＨＩ７Ｔ２１３のタンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のレセプター結合活性を有するものなどが用いられる。
具体的には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を有するＨＩ７Ｔ２１３の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記した本発明のレセプタータンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約７６％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列の相同性は、前記と同様の相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用い、同様の条件にて計算することができる。
ここで、「実質的に同質のレセプター活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質のレセプター活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
【００４９】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ-）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＨＩ７Ｔ２１３と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００５０】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３またはその塩は、上記したヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知のレセプタータンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後に記載する本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後に記載するタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００５１】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２'，４'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ'−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢt、ＨＯＯＢt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢtエステルあるいはＨＯＯＢtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００５２】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００５３】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００５４】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００５５】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００５６】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のＨＩ７Ｔ２１３を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のＨＩ７Ｔ２１３を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下のａ）〜ｅ）に記載された方法が挙げられる。
ａ）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
ｂ）SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年) 
ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
ｄ）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００５７】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするポリヌクレオチドとしては、上記した本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のＨＩ７Ｔ２１３のｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるＨＩ７Ｔ２１３と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００５８】
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning ２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３（ｈＨＩ７Ｔ２１３）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるヒト由来ＨＩ７Ｔ２１３（ｈＨＩ７Ｔ２１３）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＨＩ７Ｔ２１３（＃１１）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるマウス由来ＨＩ７Ｔ２１３（＃８）をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、ＧＰＲ遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいはＨＩ７Ｔ２１３関連ＲＮＡとの相互作用を介してＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現を調節・制御することができる。ＧＰＲ関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、およびＧＰＲ関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外でＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の５'端ヘアピンループ、５'端６−ベースペア・リピート、５'端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３'端非翻訳領域、３'端パリンドローム領域、および３'端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ＨＩ７Ｔ２１３遺伝子内の如何なる領域もアンチセンス・ポリヌクレオチドの対象として選択しうる。
【００５９】
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、対象物と「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００６０】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,
Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３'端あるいは５'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３'端あるいは５'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００６１】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞または組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞または組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列を含有するＨＩ７Ｔ２１３と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するレセプタータンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、前記した相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴを用い、同様の条件にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションの方法および条件は前記と同様である。
【００６２】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３またはその部分ペプチド（以下、本発明のＨＩ７Ｔ２１３と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のＨＩ７Ｔ２１３の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のＨＩ７Ｔ２１３の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning ２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎTM−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎTM−Ｋ（宝酒造（株））などを用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５'末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３'末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００６３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００６４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００６５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research，９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔Genetics，３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔Journal of
Biochemistry，９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
【００６６】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Nature，３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００６７】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，６９巻，２１１０（１９７２）やGene，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular ＆ General Genetics，１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Virology，５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００６８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller）， Journal of Experiments in Molecular Genetics，４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００６９】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., Nature, 195, 788(1962)）に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology，８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association, １９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のＨＩ７Ｔ２１３を生成せしめることができる。
【００７０】
上記培養物から本発明のＨＩ７Ｔ２１３を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりＨＩ７Ｔ２１３の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＨＩ７Ｔ２１３が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるＨＩ７Ｔ２１３の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００７１】
かくして得られるＨＩ７Ｔ２１３が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するＨＩ７Ｔ２１３を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のＨＩ７Ｔ２１３の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００７２】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体は、本発明のＨＩ７Ｔ２１３を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体は、本発明のＨＩ７Ｔ２１３を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００７３】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のＨＩ７Ｔ２１３は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化レセプタータンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００７４】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、レセプタータンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００７５】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００７６】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（ＨＩ７Ｔ２１３抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００７７】
本発明のＨＩ７Ｔ２１３、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、ＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、本発明のＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ（以下、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）は、以下の用途を有している。
【００７８】
（１）ＨＩ７Ｔ２１３またはＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する医薬
ＨＩ７Ｔ２１３またはＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡは、例えば、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤などの医薬として使用することができる。
ＨＩ７Ｔ２１３またはＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを上述の医薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡは、（イ）ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）細胞などにＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、該患者の細胞におけるＨＩ７Ｔ２１３の量を増加させ、リガンドの作用を充分に発揮させることができる。ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを用いる場合は、該ＤＮＡを単独またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。
【００７９】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えばヒトや非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、マントヒヒ、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
例えば、ＨＩ７Ｔ２１３またはＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の創傷患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の創傷患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８０】
（２）ＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体を含有する医薬
上述したように、ＨＩ７Ｔ２１３を高発現している動物では、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などを発症している場合があるので、ＨＩ７Ｔ２１３の活性を中和する作用を有する抗体は、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療剤として使用することができる。
本発明の抗体（例、中和抗体）を含有する上記疾患の予防および／または治療剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、白内障の治療目的で成人に使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００８１】
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００８２】
（３）ＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体を含有する診断剤
ＨＩ７Ｔ２１３に対する抗体は、ＨＩ７Ｔ２１３を特異的に認識することができるので、被検液中のＨＩ７Ｔ２１３の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化されたＨＩ７Ｔ２１３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＨＩ７Ｔ２１３の割合を測定することを特徴とする被検液中のＨＩ７Ｔ２１３の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のＨＩ７Ｔ２１３の定量法を提供する。
【００８３】
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体がＨＩ７Ｔ２１３のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がＨＩ７Ｔ２１３のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、ＨＩ７Ｔ２１３に対するモノクローナル抗体を用いてＨＩ７Ｔ２１３の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＨＩ７Ｔ２１３の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ＨＩ７Ｔ２１３量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００８４】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ＨＩ７Ｔ２１３あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のＨＩ７Ｔ２１３量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００８５】
本発明のサンドイッチ法によるＨＩ７Ｔ２１３の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、ＨＩ７Ｔ２１３の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ＨＩ７Ｔ２１３のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のＨＩ７Ｔ２１３の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」」)))
Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のＨＩ７Ｔ２１３を感度良く定量することができる。
【００８６】
さらには、本発明の抗体を用いてＨＩ７Ｔ２１３の濃度を定量することによって、ＨＩ７Ｔ２１３の濃度の減少が検出された場合、例えば、ＨＩ７Ｔ２１３の機能不全に関連する疾患、例えば創傷、脊髄損傷、無痛覚症である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ＨＩ７Ｔ２１３の濃度の増加が検出された場合には、例えば、ＨＩ７Ｔ２１３の過剰発現に起因する疾患、例えば、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００８７】
（４）遺伝子診断剤
ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）におけるＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡまたはそれに対するアンチセンス・ポリヌクレオチドを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Genomics，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＨＩ７Ｔ２１３の発現減少が検出された場合は、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの疾患である可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションによりＨＩ７Ｔ２１３の発現過多が検出された場合は、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの疾患である可能性が高い、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００８８】
（５）アンチセンスＤＮＡを含有するＤＮＡ
ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡに対するアンチセンスＤＮＡは、ＨＩ７Ｔ２１３の発現を抑制することができるので、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療剤として使用することができる。
上記アンチセンスＤＮＡを上記の予防および／または治療剤として使用する場合は、該アンチセンスＤＮＡを、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡと同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は低毒性であり、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
なお、該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進用の補助剤などの生理学的に認められる担体とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することもできる。
該アンチセンスＤＮＡの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより異なるが、例えば、白内障の治療の目的でアンチセンスＤＮＡを臓器（例、肝臓、肺、心臓、腎臓など）に局所投与する場合、成人（体重６０ｋｇ）に対して、一日あたり約０．１〜１００ ｍｇである。
【００８９】
さらに、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡとを含有する二重鎖ＲＮＡ（RNAi；RNA interference法）、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなどは、上記アンチセンスＤＮＡと同様に、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡの発現を抑制することができ、生体内におけるリガンドまたはＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡの機能を抑制することができる。
したがって、該二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムは、ＨＩ７Ｔ２１３の発現を抑制することができるので、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療剤として使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のＤＮＡの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、ＨＩ７Ｔ２１３のＤＮＡの配列を基に設計して製造することができる。例えば、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るＨＩ７Ｔ２１３のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防および／または治療剤として使用する場合、アンチセンスＤＮＡと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００９０】
（６）スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、
（６Ａ−１）(i)リガンドおよび(ii)ＨＩ７Ｔ２１３（以下、部分ペプチドも含む）を用いることを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、
（６Ａ−２）ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを用いることを特徴とするＨＩ７Ｔ２１３の発現量を調節する物質のスクリーニング方法である。
【００９１】
まず、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法について説明する。
ＨＩ７Ｔ２１３を用いるか、または組換え型ＨＩ７Ｔ２１３の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質をスクリーニングすることができる。
このような物質には、ＨＩ７Ｔ２１３を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する物質（すなわち、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない物質（すなわち、ＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト）などが含まれる。「リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる」とは、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合を阻害する場合と、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００９２】
すなわち、本発明は、（ｉ）ＨＩ７Ｔ２１３にリガンドを接触させた場合と（ii）ＨＩ７Ｔ２１３にリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）ＨＩ７Ｔ２１３にリガンドを接触させた場合と（ｉｉ）ＨＩ７Ｔ２１３にリガンドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えばＨＩ７Ｔ２１３に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００９３】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、
（ｉ）標識したリガンドをＨＩ７Ｔ２１３に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３に接触させた場合における、標識したリガンドのＨＩ７Ｔ２１３に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、
（ｉｉ）標識したリガンドをＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、（ｉｉｉ）標識したリガンドを、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨＩ７Ｔ２１３に接触させた場合と、標識したリガンドおよび試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨＩ７Ｔ２１３に接触させた場合における、標識したリガンドの該ＨＩ７Ｔ２１３に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、
【００９４】
（ｉｖ）ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物（例えば、リガンド、アゴニスト）をＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞に接触させた場合と、ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物および試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞に接触させた場合における、ＨＩ７Ｔ２１３を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法、および
（ｖ）ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物（例えば、リガンド、アゴニスト）をＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨＩ７Ｔ２１３に接触させた場合と、ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物および試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＨＩ７Ｔ２１３に接触させた場合における、ＨＩ７Ｔ２１３を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とするリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法などである。
【００９５】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるＨＩ７Ｔ２１３としては、前記したＨＩ７Ｔ２１３を含有するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや非ヒト温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたＨＩ７Ｔ２１３などが適している。
本発明のスクリーニング方法において、ＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞または該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
ＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
ＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞としては、ＨＩ７Ｔ２１３を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＨＩ７Ｔ２１３と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該ＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞や膜画分中のＨＩ７Ｔ２１３の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００９６】
リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質をスクリーニングする前記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）を実施するためには、適当なＨＩ７Ｔ２１３画分と、標識したリガンドが用いられる。ＨＩ７Ｔ２１３画分としては、天然型のＨＩ７Ｔ２１３画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型ＨＩ７Ｔ２１３画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。
標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識されたリガンドなどを利用することができる。
具体的には、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニングを行うには、まずＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるＨＩ７Ｔ２１３やリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ml〜１０ｍｌの該ＨＩ７Ｔ２１３溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識したリガンドを添加し、同時に１０-4〜１０-1μＭの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から約５０℃、望ましくは約４℃から約３７℃で約２０分から約２４時間、望ましくは約３０分から約３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ０)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００９７】
リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質をスクリーニングする前記の（ｉｖ）〜（ｖ）の方法を実施するためには、ＨＩ７Ｔ２１３を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なＨＩ７Ｔ２１３を発現した細胞が必要である。本発明のＨＩ７Ｔ２１３を発現した細胞としては、前述の組換え型ＨＩ７Ｔ２１３発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００９８】
リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる物質のスクリーニング用キットは、ＨＩ７Ｔ２１３、ＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞または該細胞の膜画分、および（または）リガンドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（ｉ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｉｉ）ＨＩ７Ｔ２１３標品
ＨＩ７Ｔ２１３を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０5個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ2、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｉｉｉ）標識リガンド
〔3Ｈ〕、〔125Ｉ〕、〔14Ｃ〕、〔35Ｓ〕などで標識したリガンド
適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｉｖ）リガンド標準液
リガンドを０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００９９】
２．測定法
（ｉ）１２穴組織培養用プレートにて培養したＨＩ７Ｔ２１３を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｉｉ）１０-3〜１０-10Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識したリガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物のかわりに１０-3Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
（ｉｉｉ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ  ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｉｖ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
［数１］
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ０   ：最大結合量
【０１００】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質は、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合を変化させる（結合を阻害または促進する）物質であり、具体的にはＨＩ７Ｔ２１３を介して細胞刺激活性を有する物質（いわゆるＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト）または該刺激活性を有しない物質（いわゆるＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニスト）である。
該物質は、前記した試験化合物から選ばれるペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。  ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストであるか、アンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）〜（iv）に従えばよい。
（ｉ）例えば、前記（i）〜（iii）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、リガンドとＨＩ７Ｔ２１３との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）物質を得た後、該物質が上記したＨＩ７Ｔ２１３を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する物質はＨＩ７Ｔ２１３アゴニストであり、該活性を有しない物質はＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストである。
（ii）（ａ）試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞に接触させ、上記ＨＩ７Ｔ２１３を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する物質はＨＩ７Ｔ２１３アゴニストである。
（ｂ）ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物（例えば、リガンドなど）をＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞に接触させた場合と、ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物および試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３を含有する細胞に接触させた場合における、ＨＩ７Ｔ２１３を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。ＨＩ７Ｔ２１３を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る物質はＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストである。
（iii）（ａ）本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に試験化合物を適用し、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニスト活性を検定する。アゴニスト活性を有する物質はＨＩ７Ｔ２１３アゴニストである。
（ｂ）本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に試験化合物を適用し、創傷、脊髄損傷または無痛覚症などの疾患の改善効果または腎再生効果を検定する。該疾患の改善効果または腎再生効果が認められた物質はＨＩ７Ｔ２１３アゴニストである。
（iv）上記した表現型またはがん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの疾患を発症している本発明の非ヒト哺乳動物またはその一部に試験化合物を適用し、上記表現型または疾患の改善効果を検定する。上記表現型または疾患の改善効果が認められた物質はＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストである。
【０１０１】
該ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストは、ＨＩ７Ｔ２１３に対するリガンドと同様に、ＨＩ７Ｔ２１３を活性化することができるので、安全で低毒性な、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤などの医薬として有用である。
逆に、ＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストは、リガンドによるＨＩ７Ｔ２１３の活性化を抑制することができるので、安全で低毒性な、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療剤などの医薬として有用である。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質（例、アゴニスト、アンタゴニスト）は塩を形成していてもよく、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。具体的には、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【０１０２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質を上述の医薬として使用する場合、上記のＨＩ７Ｔ２１３を含有する医薬組成物と同様に製剤化することができる。
例えば、ＨＩ７Ｔ２１３アゴニストの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の創傷患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の創傷患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、ＨＩ７Ｔ２１３アンタゴニストの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人の白内障患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では成人の白内障患者（体重６０ｋｇとして）への投与においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１０３】
次に、ＨＩ７Ｔ２１３の発現量を調節する物質のスクリーニング方法について説明する。
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、（ｉ）ＨＩ７Ｔ２１３を発現し得る細胞または組織を、試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのＨＩ７Ｔ２１３の発現量またはリガンドをコードするｍＲＮＡ量を測定し、比較することを特徴とするＨＩ７Ｔ２１３の発現を促進または阻害する物質のスクリーニング方法である。
ＨＩ７Ｔ２１３を発現し得る細胞または組織としては、ヒトや非ヒト温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等）、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。その際、株化細胞、初代培養系を用いてもよい。また、前記したＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体を使用してもよい。
ＨＩ７Ｔ２１３を発現し得る細胞の培養方法は、前記した形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、前記の試験化合物の他、ＤＮＡライブラリーなどを用いることができる。
【０１０４】
ＨＩ７Ｔ２１３の発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、リガンドをコードするｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
ｍＲＮＡの発現量の比較をハイブリダイゼーション法によって行うには、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。
具体的には、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするｍＲＮＡの量の測定は、公知の方法に従って細胞から抽出したＲＮＡと、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドとを接触させ、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドと結合したｍＲＮＡの量を測定することによって行われる。ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドを、例えば放射性同位元素、色素などで標識することによって、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドに結合したｍＲＮＡの量が容易に測定できる。放射性同位元素としては、例えば32Ｐ、3Ｈなどが用いられ、色素としては、例えばfluorescein、ＦＡＭ（PE Biosystems社製）、ＪＯＥ（PE Biosystems社製）、ＴＡＭＲＡ（PE Biosystems社製）、ＲＯＸ（PE Biosystems社製）、Ｃｙ５（Amersham社製）、Ｃｙ３（Amersham社製）などの蛍光色素が用いられる。
また、ｍＲＮＡの量は、細胞から抽出したＲＮＡを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするＤＮＡもしくはその一部または本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲによって、増幅されるｃＤＮＡの量を測定することによって行うことができる。
このように、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするｍＲＮＡの量を増加させる試験化合物を、ＨＩ７Ｔ２１３の発現を促進する活性を有する物質として選択することができ、また、ＨＩ７Ｔ２１３をコードするｍＲＮＡの量を減少させる試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３の発現を阻害する活性を有する物質として選択することができる。
【０１０５】
さらに、本発明は、
（ii）ＨＩ７Ｔ２１３をコードする遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域の下流にレポーター遺伝子を連結した組換えＤＮＡで形質転換した形質転換体を試験化合物の存在下および非存在下で培養した場合における、それぞれのレポーター活性を測定し、比較することを特徴とする当該プロモーター活性を促進または阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Green fluorescent protein（ＧＦＰ）、β−ラクタマーゼなどが用いられる。
レポーター遺伝子産物（例、ｍＲＮＡ、タンパク質）の量を公知の方法を用いて測定することによって、レポーター遺伝子産物の量を増加させる試験化合物を本発明のＨＩ７Ｔ２１３のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に促進）する作用を有する物質、すなわちＨＩ７Ｔ２１３の発現を促進する活性を有する物質として選択できる。逆に、レポーター遺伝子産物の量を減少させる試験化合物をＨＩ７Ｔ２１３のプロモーターもしくはエンハンサーの活性を制御（特に阻害）する作用を有する物質、すなわちＨＩ７Ｔ２１３の発現を阻害する活性を有する物質として選択することができる。
試験化合物としては、前記と同様のものが使用される。
形質転換体の培養は、前記の形質転換体と同様にして行うことができる。
レポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えば、Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999）。
【０１０６】
ＨＩ７Ｔ２１３の発現を促進する活性（発現量を増加させる活性）を有する物質は、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤などの医薬として使用することができる。
ＨＩ７Ｔ２１３の発現を阻害する活性（発現量を減少させる活性）を有する物質は、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質は、前記した試験化合物から選ばれた物質である。  本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質の塩としては、前記したアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を用いて得られる物質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる物質を上述の予防および／または治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記したリガンドを含有する医薬組成物と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該物質の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、創傷の治療目的でＨＩ７Ｔ２１３の発現量を促進する物質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、創傷の治療目的でＨＩ７Ｔ２１３の発現量を促進する物質を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、白内障の治療目的でＨＩ７Ｔ２１３の発現量を阻害する物質を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、白内障の治療目的でＨＩ７Ｔ２１３の発現量を阻害する物質を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
これらの医薬は前記したＨＩ７Ｔ２１３を含有する医薬と同様に製剤化して、使用することができる。
【０１０７】
（７）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（ii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iii）ネオマイシン耐性である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（iv）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（ｉ）項記載の胚幹細胞、
（ｖ）ゲッ歯動物がマウスである第（iv）項記載の胚幹細胞、
（vi）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（vii）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、
（viii）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（vi）項記載の非ヒト哺乳動物、（ix）ゲッ歯動物がマウスである第（viii）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（ｘ）第（vii）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
【０１０８】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のＨＩ７Ｔ２１３の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のＨＩ７Ｔ２１３の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【０１０９】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【０１１０】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、Journal of embryology and experimental morphology、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のＨＩ７Ｔ２１３の細胞生物学的検討において有用である。
【０１１１】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
【０１１２】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１１３】
（７ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防および／または治療効果を有する物質のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して予防および／または治療効果を有する物質のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などに対して予防および／または治療効果、あるいは腎再生効果を有する物質のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、前記と同様のものが用いられる。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の予防および／または治療効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【０１１４】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善された場合、該試験化合物を上記の疾患に対して予防および／または治療効果を有する物質として選択することができる。
具体的には、該試験化合物を例えば、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの予防および／または治療剤、あるいは腎再生剤などの医薬として使用することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる物質は、上記した試験化合物から選ばれた物質であり、ＨＩ７Ｔ２１３の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防および／または治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた物質から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１１５】
該スクリーニング方法で得られた物質は塩を形成していてもよく、該物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた物質を含有する医薬は、前記したＨＩ７Ｔ２１３を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、創傷の治療目的で該物質を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、創傷の治療目的で該物質を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１１６】
（７ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する物質をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、ｌａｃＺ遺伝子、可溶性アルカリホスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子で置換している場合、本来、本発明のペプチドの発現する組織で、本発明のペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のＨＩ７Ｔ２１３の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のＨＩ７Ｔ２１３欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる物質は、上記した試験化合物から選ばれた物質であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する物質である。
該スクリーニング方法で得られた物質は塩を形成していてもよく、該物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１１７】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する物質は、ＨＩ７Ｔ２１３の発現を促進し、ＨＩ７Ｔ２１３の機能を促進することができるので、例えば、創傷、脊髄損傷、無痛覚症などの予防および／または治療剤あるいは腎再生剤などの医薬として使用することができる。
一方、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する物質は、ＨＩ７Ｔ２１３の発現を阻害し、ＨＩ７Ｔ２１３の機能を阻害することができるので、例えば、がん、腎障害、白内障、皮膚炎、慢性疼痛、痛覚過敏などの予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。
さらに、上記スクリーニングで得られた物質から誘導される物質も同様に用いることができる。
【０１１８】
該スクリーニング方法で得られた物質を含有する医薬は、前記したリガンドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、創傷の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する物質を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、創傷の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する物質を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、白内障の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する物質を経口投与する場合、一般的に成人患者（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、白内障の治療目的で本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する物質を注射剤の形で通常成人患者（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１１９】
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する物質をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防および／または治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のＨＩ７Ｔ２１３のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１２０】
本発明の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕ヒトＨＩ７Ｔ２１３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕ヒトＨＩ７Ｔ２１３（ｈＨＩ７Ｔ２１３）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕ヒトＨＩ７Ｔ２１３のアミノ酸配列を示し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の第１６９番目のＡｓｐがＡｓｎに変わったアミノ酸配列である。
〔配列番号：４〕ヒトＨＩ７Ｔ２１３（ｈＨＩ７Ｔ２１３）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕マウスＨＩ７Ｔ２１３（＃１１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６〕マウスＨＩ７Ｔ２１３（＃１１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕マウスＨＩ７Ｔ２１３（＃８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕マウスＨＩ７Ｔ２１３（＃８）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕後述の実施例１で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕後述の実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕後述の実施例２で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕後述の実施例４で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕後述の実施例４で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕後述の実施例６で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕後述の実施例６で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕後述の実施例６で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕後述の実施例８で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕後述の実施例８で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕後述の実施例８で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕後述の実施例１５で行われたＰＣＲ法に用いられたプライマーの塩基配列を示す。
【０１２１】
本願明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次に挙げる。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ   ：アラニン
Ｖａｌ    ：バリン
Ｌｅｕ   ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ   ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
【０１２２】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Cl2Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキ
シイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ、Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【０１２３】
後述の実施例２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＡＧ２１３−１は２００２年１０月１５日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０７として寄託されている。
【０１２４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例１】
【０１２５】
マウス型ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の組織における発現
マウス型ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を取得するため、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子をプローブとして、マウスゲノムライブラリー（129/SvJ、東洋紡）に対して、プラークハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、最終0.5ｘSSCの塩濃度で65℃にて洗浄し、単一プラーク（#8  配列番号：８、#11 配列番号：６）を得た。得られた遺伝子のうち、#8遺伝子（mMrgA6に相当）と#11遺伝子(mMrgA4に類似)について、各組織における内在の遺伝子発現を調べた（図１）。
C57BL/6マウス（日本チャールズリバー）各組織について、ＲＴ−ＰＣＲサザンハイブリダイゼーションを行った。即ち、脊髄後根神経節、脳、小腸、筋肉、心臓、皮質、腎臓、肝臓、脾臓、精巣の各組織より全ＲＮＡを調製し、逆転写酵素処理を行った。次に、#8と#11に共通のアミノ酸配列（CLSV(M/L)CPIWYおよびLVF(L/F)LCGLP）をもとにしたプライマーセット（PIWY primer: TGCCTGTCTGT(C/A)CT(G/A)TGCCC(C/T)ATCTGGTAT（配列番号：９）およびCGLP primer: GGGCAA(C/T)CC(G/A)CAGAGGA(G/A)AAAAACCAAAA（配列番号：１０））によりＰＣＲを行った反応物を電気泳動後、メンブレンフィルターに移した。トランスファーしたフィルターに対して、両因子にそれぞれ特有のアミノ酸配列（#8: TKYEDDYG、#11: GPKYVIDS）に相当するオリゴＤＮＡ（#8 probe: TACCAAATATGAAGATGACTATGG（配列番号：１１）、#11 probe: GGTCCCAAATATGTAATTGACTCT（配列番号：１２））をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、両因子が発現している組織を調べた。このとき、プローブの標識にはOligo dT tailing kit（ロッシュ）を用い、ハイブリダイゼーション後の洗浄は2xSSC溶液にて42℃で行った。#8遺伝子は若齢期より脳で発現が認められ、成熟期脳および精巣で明瞭に発現していた。それに対し、#11遺伝子も若齢期より脊髄後根神経節で明瞭な発現が認められ、他にも成熟期脳、筋肉、心臓、および精巣で発現していた。
以上の成績から、マウスにおけるMrg遺伝子群の中には、脊髄後根神経節以外にも発現している事実が判明した。
【実施例２】
【０１２６】
トランスジェニックラット作出用発現ベクターの構築
トランスジェニックラット作出用発現ベクター、ｐCAG213-1を常法に基づいて構築した（図２）。
本プラスミドはｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子をコードするＤＮＡ断片（配列番号：４）がｐCXN2のEcoRIサイトに挿入されたものである。ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の作製、および、プラスミドｐCXN2の内容は下記の（１）、（２）に示した。
（１）ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子：ヒト由来ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子（配列番号：４、特開平２０００−１６６５７６号公報）をコードするＤＮＡに対して、TTGAATTCGCCACCATGGATTCAACCATCCCAGTCT（配列番号：１３）および、TTGAATTCTTATCACTGCTCCAATCTGCTTCCCGACAGCT（配列番号：１４）のプライマーを用いて、ＰＣＲ法を行い、得られた断片をEcoRIで切断した９７０ｂｐ断片。
（２）pCXN2：ニワトリアクチンプロモーターを含むCAGプロモーター（１７００ｂｐ）、ウサギグロビンポリＡ付加シグナルを含む領域（７００ｂｐ）、ＳＶ４０複製開始領域、アンピシリン耐性遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子を有する全長５９００ｂｐのプラスミド。
ｐCAG213-1を大腸菌ＪＭ１０９に形質転換して大腸菌ＪＭ１０９／ｐＣＡＧ２１３−１を得た。トランスジェニックラット作出の際には、ｐＣＡＧ２１３−１をSalIおよびPvuIで切断した後、BamHIの部分消化により目的とする３３７０ｂｐの断片を得た。
【実施例３】
【０１２７】
ｈＨＩ７Ｔ２１３を導入したトランスジェニックラットの作製
採卵用雌ラット（Wistar系統、9週齢）に30IUのPMSGを腹腔内投与  し、12時間明期／12時間暗期の飼育室で2日間飼育後、5IUのhCG  を腹腔内投与して雄ラット（Wistar系統、12週齢）と交配させた。別途、自  然発情している受胚用雌ラット（Wistar系統、９から１３週齢）を精管結紮雄ラッ  ト（Wistar系統、１０週齢以上）と交配させた。翌日、膣栓形成により交尾を確認  した採卵用雌ラットの腹腔を開いて卵管を取り出し、20%FCSを含むHER培地（  ＨＡＭ−Ｆ１２粉末培地（大日本製薬）３．１８０ｇ、ＲＰＭＩ−１６４０粉末培地（  大日本製薬）１．０４０ｇ、ＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ粉末培地（大日本製薬）０．９５０ｇ  、ＮａＨＣＯ3（和光純薬）０．７８０ｇ、Penicillin-G（GIBCO BRL）  ５００００ＵおよびStreptomycin（GIBCO BRL）５００００Ｕを５００ｍｌの  蒸留水に溶解）中、実体顕微鏡下にピンセットで受精卵を取り出した。卵丘細胞がとれ  た受精卵をピペットで吸い上げ、ミネラルオイルで覆われた20%FCSを含むHER  培地のドロップ中に入れて、インジェクションするまでの間37℃、5% CO2下  で培養した。
受精卵をミネラルオイルで覆われた20%FCSを含むPBSのドロップ中に入れて  ホールディングピペットで吸引固定した。実施例２で調製したインジェクション断片溶  液（１０μｇ／ｍｌ）をインジェクションピペットに吸引し、実体顕微鏡下にインジェ  クションピペットを受精卵の雄性前核に突き刺し、インジェクション断片を注入した。  インジェクション終了後、受精卵をミネラルオイルで覆われた２0%FCSを含むHE  R培地のドロップ中に入れて、受胚用雌への移植までの間37℃、5% CO2下  で培養した。
膣栓形成により偽妊娠状態を確認した受胚用雌ラットをネンブタールで麻酔後、後背  部を切開して脂肪塊をピンセットで摘まんで引き出し、クレンメで固定した。実体顕微  鏡下に卵巣嚢をピンセットで引き裂き、８〜１３個の受精卵をトランスファーピペット  を用いて卵管開口部に注入した。卵巣と卵管を体内に戻して切り口を縫合した後、12  時間明期／12時間暗期の飼育室で飼育を続けた。胚移植を０日として２２日後に  仔ラット（F０）が産まれた。仔ラットへの導入遺伝子の伝達は、尾部を1cm  程度ハサミで切り取り、該組織抽出液から常法によりＤＮＡを単離してＰＣＲ法により  確認した。
導入遺伝子の伝達が確認されたF０個体は、生殖可能になった段階でWistar  ラットと交配させて産仔（F１）を得た。上記と同様に導入遺伝子の伝達を確認し  、導入遺伝子を有するF１個体同士を兄妹交配させ、導入遺伝子に関してホモ接合  体を得た。
【実施例４】
【０１２８】
トランスジェニックラットの遺伝子解析
４週齢に達した出産仔の尾からB.Hoganら（Manupulating The Mouse Embryo  、1986、Cold Spring Harvor Laboratories）の方法で採取したＤＮＡを用  いて、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子（実施例２）の塩基配列を基に設計したプライマー（  5'-TGAGCTTCACGGGGCTGACGTGCATCGTTT-3'（配列番号：１５））、および5'-TTGGCAC  TGCTGTTAAGAGCGGACAGGAAA-3'（配列番号：１６））を用いてＰＣＲを行った。合計  168個体の産仔ラットを解析した結果、720ｂｐのＰＣＲ断片の検出できたＰＣ  Ｒ陽性個体は６個体であった。
これら６個体のＰＣＲ陽性個体のゲノムＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション法に  より解析した。すなわち、５μｇのＤＮＡをEcoRＩで完全に切断し、1．０％  アガロースゲル電気泳動後、ナイロンフィルターへ移した。このフィルターを、実施例  ２で得られたｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子を含むＤＮＡ断片をＤＩＧ  ＲＮＡラベリングキ  ット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）で標識したプローブと一晩ハイブリダ  イズし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて室温で2回洗浄し、次に０．１ｘＳＳＣ  、０．１％ＳＤＳにて６８℃で２回洗浄した。検出にはＤＩＧ蛍光検出キット（ロッシ  ュ・ダイアグノスティックス社製）を用いた。その結果、これら６個体は、全てｈＨＩ  ７Ｔ２１３由来の970ｂｐの断片が確認され、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の導入が確  認された。また、導入された遺伝子のコピー数は１３M系統が３０コピー、82F  系統が1コピー以下、90F系統が１コピー以下、92M系統が１コピー以  下、９６M系統が5コピー、148M系統が1コピーであることが確認さ  れた。
【実施例５】
【０１２９】
ヘテロザイゴートのトランスジェニックラット取得
実施例４で得られた系統（第１世代（Ｆ0））が１２週齢に達した時、Wistar  （日本クレア）系統ラットと交配し、第２世代（Ｆ1）の取得を試みた。４週齢  に達した時、実施例４に記載の方法でＰＣＲを行い、ヘテロザイゴートを選抜し、実施  例５に用いたが、第２世代が取得されたのは、１３M、９６M、１４８M  の3系統のみであった。
【実施例６】
【０１３０】
トランスジェニックラット各系統のｈＨＩ７Ｔ２１３ｍＲＮＡのTaqMan解析
実施例５で得た8週齢のトランスジェニックラット（Ｆ1）から摘出した脳  、心臓、腎臓、約５００ｍｇをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）中でホモジナイズ  し、常法によりtotal ＲＮＡを抽出した。total ＲＮＡ ５μｇを使用し  、First strand cDNA synthesis kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）  を用いてプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成を行い、テンプレートとした。TaqMan  解析のプライマーとして、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の検出には、Forward primer（  5'-TCCTGTCCGCTCTTAACAGCA-3'（配列番号：１７））、Reverse primer（5'  -TTTTGACGCTGCCTAAAGGAG-3'（配列番号：１８））、およびFAM標識TaqMan p  rimer（5'-TGCCAACCCCATCATTTACTTCTTCGTG-3'（配列番号：１９））のプライマ  ーセットを用いてTaqMan解析（TaqMan7700、Applied Biochemicals）を行  った。内部標準であるG3PDHの検出には、rodent G3PDH セット(Applied B  iochemicals)を用いた。また、陰性コントロールとして、実施例５で行われたＰＣＲ  により野生型と判断された個体を用いた。ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現は１３M、  ９６M、１４８M系のすべての臓器で認められた（図３）。９６Mと１３  Mとは発現様式は同じであるが、発現量は９６Mの方が多いと考えられた。そ  れに対し、１４８Mの発現量は、１３Mおよび９６Mに比べて少なく、発  現様式も異なっていたことから、挿入場所による影響が示唆された。
【実施例７】
【０１３１】
トランスジェニックラットの特徴観察
実施例５で取得された13Mおよび96MのF1個体では白内障、粗毛を発症  する個体がみられたが、その頻度と程度は96Mにおいて高かった。それに対して、  遺伝子発現量が低い148Mでは異常は認められなかった。また、96Mでは生後  7日齢付近をピークとして一過性の皮膚発疹、および落屑が認められた（図４）。落  屑を生じる個体は産仔の50％以上であったが、各個体における落屑の程度にはばら  つきがあった（図４a-b）。以上の成績より、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子過剰発現ラ  ットの表現型の典型例は13Mと96Mであると考えられ、症状が明確であること  から、以後の解析には主に96Mを用いた。
【実施例８】
【０１３２】
トランスジェニックラットにおけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の組織分布
各組織におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現量の測定を実施例６と同様にして行った  。即ち、９６Mの11週齢のトランスジェニックラット（Ｆ1）について、  脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、網膜、水晶体、皮膚、小腸、胃、筋肉、肺から実施例  6で示したようにtotal RNAを調製し、TaqMan解析を行った。このとき、  G3PDHまたはアクチン遺伝子を内部標準に用いた。G3PDHの検出には、rodent   G3PDH セット(Applied Biochemicals)を用い、アクチン遺伝子の検出にはFo  rward primer
（5'-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3'（配列番号：１８））、 Reverse primer   （5’-ACACAGCCTGGATGGCTACGTA-3’（配列番号：１９））、VIC標識  TaqMan primer （5'-TTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCA-3’（配列番号：２０））を用  いた。いずれの臓器からもｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現が認められたが、発現量は心臓  、腎臓、水晶体、皮膚、および、筋肉で多い傾向にあった（図５）。
【実施例９】
【０１３３】
トランスジェニックラットの病理解析とｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現
5週齢ラットの主要臓器において、病理検索とｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現につ  いて調べた。病理解析は以下のように行った。ラットの肝臓、腎臓、心臓、脾臓、肺、  副腎、精巣、卵巣、および、眼球を摘出し、10％中性緩衝ホルマリン液にて固定し  た後、常法に従い、パラフィン包埋を行い、4 μmの厚さで薄切した。次に、  ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本を作製後、鏡検した。眼球の固定には  Davidson固定液中30分の処理を、10％中性緩衝ホルマリン液処理の前に加え  た。ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現はIn situ hybridization法により調べた。この  とき、DIGで標識したリボプローブの作製は以下のように行った。ｈＨＩ７Ｔ２１  ３遺伝子を含む1.0 kbpの断片を挿入したプラスミドpCRScript 213-2を作製  し、５'突出の制限酵素で切断後、T3ポリメラーゼ（アンチセンスプローブと  しては、XhoI切断を行った）またはT7ポリメラーゼ（センスプローブとしては  、NotI切断を行った）で転写した。ハイブリダイゼーションには、厚さ25μ  mの凍結切片、または厚さ４μmのパラフィン切片を用いた。切片を4％パ  ラホルマリン-0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.4）にて固定した後、Proteinase   K（1μg/ml、ロッシュ、37℃10分）処理、0.2 M HCl処理  10分、アセチル化処理10分の工程を行った。プローブを添加して、55℃にて  一晩ハイブリダイゼーション後、2xSSCを含む50％ホルムアミド液にて55  ℃で洗浄後、5μg/mlのRNaseA（ニッポンジーン）処理を行い、最終濃度  0.4xSSCにて55℃で洗浄した。シグナルの検出には、抗DIG-AP抗体（ロッ  シュ）処理後、BCIPおよびNBA（Promega）にて一晩暗箱中で発色させた  。必要に応じ、エオジン(和光)またはNuclear fast red（フナコシ）を  用いて対比染色を行った。
病理検査の結果、肝臓、心臓、脾臓、肺、副腎、精巣、卵巣では異常は認められなか  った（表１）。
【表１】
2004166691.tif 000002
眼球においては、水晶体線維の融解/変性が認められ、典型的な白内障と診断さ  れた（図６a-d）。また、腎臓では好塩基性尿細管増加の所見が得られ、腎臓で細  胞障害が起きたこと、または、尿細管細胞の増殖促進活性が高いことが示唆された（図  ７a-b）。さらに、若齢個体の眼球および皮膚について上記と同様に病理検索を行  ったところ、生後3日齢から7日齢では、眼球においても5週齢時と同様  な水晶体線維の異常が認められ（図６e-j）、中には水晶体前極での水晶体上皮の  重層化がみられる個体もあり（図６g,h）、白内障は若齢から発症していることが  わかった。また、若齢期の皮膚においては、表皮肥厚と錯角化の所見が得られた（図８  a,c,e,g）。これら異常のみられた臓器におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現を  in situ hybridizationにより調べたところ、眼球においては、胎生12日齢にお  いて、将来水晶体線維となる部位での発現がみられた（図６k,l）。腎臓において  は糸球体よりはむしろ尿細管または髄質に発現がみられ（図７c-e）、皮膚におい  ては表皮および毛穴付近に発現がみられた（図８b,d,f,h）。これらの発現部位は  いずれも組織学的異常部位とおおむね一致していた。
【実施例１０】
【０１３４】
トランスジェニックラットにおける白内障とｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現量
ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現と表現型異常との関連を明確にするため、ｈＨＩ７Ｔ    ２１３遺伝子発現量と表現型異常の相関について調べた。即ち、96Mおよび13    Mについて、実施例８と同様にしてTawMan解析により、実施例９に用いた個体    におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現を調べ、白内障の程度と比較した。その結果を    図９に示す。
13Mに比べ、水晶体線維の融解/変性の程度の高い96Mの方が、筋肉    および皮膚におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現量が多かった。また、同一系統内で    は、白内障の程度の高い個体の方が、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現が相対的に高い傾    向にあった。以上の成績から、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子高発現とトランスジェニック    ラットにみられる表現型異常とは相関している可能性が考えられた。
【実施例１１】
【０１３５】
トランスジェニックラットにみられる表皮分化異常
抗keratin6抗体（フナコシ）、抗keratin14抗体（コスモバイオ）、抗    keratin10抗体（DAKO）、抗loricrin抗体（フナコシ）、抗PCNA抗体    を用いた免疫組織染色は下記の様に行った。即ち、パラフィン切片に対してキシレン    系列、アルコール系列により脱パラフィン化を行った後、antigen unmasking solu    tion（フナコシ）750 ml中にて電子レンジで沸騰後、さらに7分間沸騰を    続けた。1時間以上かけて室温に戻した後、100％アセトン処理5分に    よる処理を行った。ベクタステインキット（フナコシ）の定法により、ブロッキング    、各種一次抗体、二次抗体、3% H2O2-PBS（5分）、ABC試薬処理後    、DAB染色液により発色反応（10分以内、フナコシ）を行った。必要に応じ    、Nuclear fast red（フナコシ）またはヘマトキシリンで対比染色した。抗ke    ratin14抗体、抗keratin10抗体、抗loricrin抗体染色には、連続切片を    用いた。その結果を図１０に示す。
7日齢の対照ラットでは創傷、増殖時関連の表皮タンパク質であるkeratin     6遺伝子発現細胞はほとんどみられず、増殖関連抗原であるPCNA陽性細胞は表    皮基底層および毛穴付近にのみ認められた（図１０d-f）。それに対して、7    日齢トランスジェニックラットのｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現が多い表皮部位では    、keratin 6遺伝子発現細胞の増加、および、PCNA陽性細胞の増加がみられ    た（図１０j-l）。従って、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が高発現した表皮では、細    胞増殖促進活性が亢進していることが示唆された。
次に、表皮の分化状態を調べるため、基底細胞層で発現するkeratin 14 、有    棘細胞層で発現するkeratin 10、および、顆粒細胞層で発現するloricrin遺    伝子の発現を調べた。NonTgではkeratin 14、keratin 10、および、    loricrin陽性細胞には異常がみられなかったのに対し（図１０a-c）、ｈＨＩ    ７Ｔ２１３遺伝子発現が多い表皮部位では、keratin14、keratin10、およ    び、loricrin陽性細胞が増加していた（図１０g-i）。
以上の成績より、表皮肥厚はkeratin14、 keratin10、 および、    loricrin陽性細胞の増加と関連していることが示唆された。keratin6および     keratin14陽性の増殖性細胞の増加に伴い、表皮基底層細胞のターンオーバー時間    が短縮し、その結果、脱核化に要する時間が不十分となり、核が残存した状態である    錯角化がみられ、落屑として観察されたと考えられる。
【実施例１２】
【０１３６】
トランスジェニックラットにみられる表皮自由神経終末
ウサギ抗PGP9.5抗体、およびマウス抗keratin6抗体を用いた二重免疫組織    化学により表皮自由神経終末を調べた。二次抗体には、Alexa488標識抗ウサギ二    次抗体、およびCy３標識抗マウス二次抗体を用いた。即ち、厚さ２５μｍの新鮮    凍結切片に対して、antigen unmasking solution（フナコシ）750ｍｌ中に    て電子レンジで沸騰後、さらに1分間沸騰を続けた。1時間以上かけて室温    に戻した後、１００％アセトン5分による処理を行った。切片に対して、ブロッ    キング、一次抗体、二次抗体処理を行った後、レーザー顕微鏡（LSM510、Zeis    s）にて観察した。その結果を図１１に示す。
7日齢の対照ラット（図１１a-c）では、keratin 6陽性はほとんど    観察されず、自由神経終末も表皮に多く認められた。それに対して、keratin 6    陽性の多い7日齢トランスジェニックラット（図１１d-ｆ）では、表皮自由    神経終末が、対照ラットに比してかなり豊富であった。また、表皮のみならず、表皮    下でも自由神経終末が対照ラットに比して豊富であった（図１１g-i）。
【実施例１３】
【０１３７】
脊髄神経節でのｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現解析
ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子は脊髄神経節の自由神経終末を有する神経細胞の一部に発現していることが報告されており、実施例１２でみられた豊富な自由神経終末は本来ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が発現している脊髄神経細胞での外来遺伝子過剰発現に基づく作用増強の結果であることも考えられる。この点を明らかにするため、始めにトランスジェニックラットの脊髄神経節での導入遺伝子の発現を調べた。耐性18日齢のNonTgとトランスジェニックラットから脊髄神経節、皮膚、眼球、および腎臓を摘出し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）中でホモジナイズし、常法によりtotal ＲＮＡを抽出した。脊髄神経節の場合にはtotal ＲＮＡ 0.1 μｇを使用し、皮膚、眼球、および腎臓の場合には、total ＲＮＡ 1 μｇを使用して、First strand cDNA synthesis kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成を行い、テンプレートとした。TaqMan解析（TaqMan7700、Applied Biochemicals）のプライマーは実施例６に示した。即ち、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の検出には、Forward primer（5’-TCCTGTCCGCTCTTAACAGCA-3’（配列番号：１７））、Reverse primer（5’-TTTTGACGCTGCCTAAAGGAG-3'（配列番号：１８））、およびFAM標識TaqMan primer（5'-TGCCAACCCCATCATTTACTTCTTCGTG-3'（配列番号：１９））のプライマーセットを用い、内部標準のG3PDHの検出には、rodent G3PDH セット(Applied Biochemicals)を用いた。図１２に示すように脊髄神経節、皮膚、眼球、および腎臓いずれもｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が発現していた。
【実施例１４】
【０１３８】
トランスジェニックラットのCGRP陽性神経終末
実施例１３より、ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子がトランスジェニックラットの脊髄神経節でも発現していたことから、自由神経終末が豊富であるのは導入遺伝子高発現による作用増強の可能性が考えられる。脊髄神経節での高発現に基づく作用増強に起因するなら、表皮いずれにおいても自由神経終末のみが特異的に豊富になり、かつ、CGRP陽性神経線維のような他種類の神経線維には変化がないことが予想される。この点を明らかにするため、自由神経終末以外の神経線維分布を調べるため、CGRP染色を合わせて行った。このとき、トランスジェニックラット皮膚は、外見上正常な検体、および異常を示す検体の両方で比較を行い、変化が脊髄神経節に起因するのか、異常のある表皮に限定されるのかを明らかにすることも合わせて行った。
一次抗体は、ウサギ抗CGRP抗体、ウサギ抗PGP9.5抗体、およびマウス抗keratin6抗体を用い、二次抗体には、Alexa488標識抗ウサギ二次抗体、およびCy３標識抗マウス二次抗体を用いた。厚さ２５μｍの新鮮凍結切片に対して、antigen unmasking solution（フナコシ）750ｍｌ中にて電子レンジで沸騰後、さらに1分間沸騰を続けた。1時間以上かけて室温に戻した後、１００％アセトン5分による処理を行った。切片に対して、ブロッキング、一次抗体、二次抗体処理を行った後、レーザー顕微鏡（LSM510、Zeiss）にて観察した。
7日齢の外見上正常なトランスジェニックラット皮膚では、keratin 6陽性像はいずれもNonTgと同様であり、異常は認められなかった。（図１２a-f）。それに対して、異常なトランスジェニックラット皮膚では、keratin 6陽性像、PGP9.5陽性線維共に、NonTgに比してかなり豊富であり、同時にCGRP陽性線維も豊富であった（図１２g-i）。上記の成績から、トランスジェニックラットで神経終末が豊富になる現象は表皮異常部位に限局しており、かつ、PGP9.5陽性線維を含む自由神経終末に特異的なことではないことも判明した。従って、トランスジェニックラットにおける皮膚異常はｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子が脊髄神経節で過剰発現していることに起因するのではなく、異常のある表皮側から何らかの誘導因子である神経栄養因子が出ていることに起因する可能性が示唆された。
【実施例１５】
【０１３９】
表皮異常部位での神経栄養因子群の発現増強
実施例１４で異常のあるトランスジェニックラット皮膚では、神経栄養因子が産生されている可能性が示唆されたため、表皮におけるNGF、BDNF遺伝子の発現量を調べた。NonTg、外見上正常なトランスジェニックラット、及び異常のあるトランスジェニックラットの皮膚を摘出し、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）中でホモジナイズし、常法によりtotal ＲＮＡを抽出した。total ＲＮＡ ５ μｇを使用して、First strand cDNA synthesis kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いてプロトコールに従ってｃＤＮＡ合成を行い、テンプレートとした。TaqMan解析（TaqMan7700、Applied Biochemicals）のプライマーには以下を用いた。ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の検出には、Forward primer（5'-TCCTGTCCGCTCTTAACAGCA-3'（配列番号：１７））、Reverse primer（5'-TTTTGACGCTGCCTAAAGGAG-3'（配列番号：１８））、およびFAM標識TaqMan primer（5'-TGCCAACCCCATCATTTACTTCTTCGTG-3'（配列番号：１９））を、NGF遺伝子の検出には、Forward primer（5'-AGCCCACTGGACTAAACTTCAGC-3' （配列番号：２３））、Reverse primer（5'- GGGCACTGCGGGCTC -3' （配列番号：２4））、およびFAM標識TaqMan primer（5'-TTCCCTTGACACAGCCCTCCGC-3' （配列番号：２５））を、BDNF遺伝子の検出には、Forward primer（5'-GGTGATGCTCAGCAGTCAAGT-3' （配列番号：２６））、Reverse primer（5'-CGAACCCTCATAGACATGTTTG-3' （配列番号：２７））、およびFAM標識TaqMan primer（5'-TTTGGAGCCTCCTCTGCTCTTTCTGC-3' （配列番号：２８））プライマーセットを用い、内部標準のアクチン遺伝子の検出には、Forward primer（5'-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA -3' （配列番号：２９））、Reverse primer（5'- GCACAGCCTGGATGGCTA -3' （配列番号：３０））、およびVIC標識TaqMan primer（5'-TTTGAGACCTTCAACACCCCAGCCA-3' （配列番号：３１））を用いた。図１４aに示されるように、トランスジェニックラットにおいては、異常のある皮膚でのｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現量は正常な皮膚での発現量よりも有意に高かった。また、NGFおよびBDNF遺伝子発現量はNonTgと正常なトランスジェニックラットの皮膚での発現量の間には差がなかったのに対し、異常なトランスジェニックラットの皮膚では、有意に発現量が多かった（図１４b,c）。以上の成績から、表皮分化異常を伴うトランスジェニックラット皮膚ではNGFおよびBDNFといった神経栄養因子群の発現量が増加したため、PGP9.5陽性神経線維が豊富になったと考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】マウスの各組織における内在性ｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現を示す。上部パネルは＃８遺伝子の発現を、下部パネルは＃１１遺伝子の発現をそれぞれ表す。Ｐ０、Ｅ１８、Ａｄ、Ｄ、Ｂ、Ｉ、Ｍ、Ｈ、Ｃ、Ｋ、Ｌ、ＳおよびＴはそれぞれ、新生仔マウス、１８日齢胎児マウス、成体マウス、脊髄後根神経節、脳、小腸、筋肉、心臓、皮質、腎臓、肝臓、脾臓および精巣を表す。
【図２】トランスジェニックラット作出用発現ベクターｐＣＡＧ２１３−１の構築図である。
【図３】トランスジェニックラット各系統におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現を示す。Ｎｏｎ  Ｔｇは非トランスジェニックラットを用いた実験であり、Ｂｒ、Ｈｅ、Ｋｉはそれぞれ、脳、心臓、腎臓を表す。グラフのエラーバーは標準誤差を表す。
【図４】トランスジェニックラット９６Ｍの特徴を示す。（ａ）左側がトランスジェニックラット、右側が非トランスジェニックラットである。矢印は落屑を示す。（ｂ）５日齢のトランスジェニックラットの結果を示す。（ｃ）９日齢の非トランスジェニックラットの結果を示す。（ｄ）９日齢のトランスジェニックラットの結果を示す。
【図５】トランスジェニックラット９６ＭにおけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の組織分布を示す。Ｂｒ、Ｈｅ、Ｋｉ、Ｓｐ、Ｌｉ、Ｒｅ、Ｌｅ、Ｓｋ、Ｉｎ、ＭｕおよびＬｕはそれぞれ、脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓、網膜、水晶体、小腸、筋肉および肺を表す。
【図６】トランスジェニックラット９６Ｍの水晶体の病理解析の結果を示す。対照としての非トランスジェニックラットの結果を左側パネル（ａ、ｃ、ｅ、ｆ、ｉ、ｋ）に、９６Ｍの結果を右側パネル（ｂ、ｄ、ｇ、ｈ、ｊ、ｌ）に表す。５Ｗ（ａ−ｄ）は５週齢、Ｐ３（ｅ−ｊ）は３日齢、Ｅ１２（ｋ、ｌ）は胎生１２日齢を示す。
【図７】腎臓における病理解析とｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子発現の結果を示す。ａおよびｂはそれぞれ、５週齡の非トランスジェニックラットおよびトランスジェニックラットのヘマトキシリン／エオシン染色（H & E staining）の結果を、ｃからｅは３日齡の非トランスジェニックラット（ｃ）およびトランスジェニックラット（ｄおよびｅ）の腎臓におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子のin situ ハイブリダイゼーションの結果を表す。
【図８】トランスジェニックラットにおける表皮肥厚および錯角化の観察結果を示す。（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）および（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ）はそれぞれ、非トランスジェニックラットおよびトランスジェニックラットを用いた結果を表す。（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）はヘマトキシリン／エオシン染色の結果を、また、（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）はｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子のin situ ハイブリダイゼーションの結果を表す。（ａ−ｄ）は３日齢、（ｅ−ｈ）は７日齢を示す。
【図９】トランスジェニックラット９６Ｍおよび１３Ｍの筋肉および皮膚におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現量を示す。個体番号は表１に対応する。
【図１０】トランスジェニックラット９６Ｍの７日齢における表皮分化異常の観察結果を示す。（ａからｆ）および（ｇからｌ）はそれぞれ、非トランスジェニックラットおよびトランスジェニックラットを用いた結果を表す。各種抗体染色およびｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子のin situハイブリダオゼーション（ｆ、ｌ）は上に表記した。
【図１１】トランスジェニックラット９６Ｍの７日齢における表皮自由神経終末の観察結果を示す。Keratin6およびPGP9.5はそれぞれ、マウス抗ケラチン６抗体およびウサギ抗ＰＧＰ９．５抗体を用いていることを示す。また、Ｎｏｎ（ａ−ｃ）は対照ラット（非トランスジェニックラット）、Ｔｇ（ｄ−ｉ）はトランスジェニックラットを表し、表皮の境界を点線で示した。
【図１２】トランスジェニックラット96Mの胎生18日齢におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子の発現を示す。Ｎｏｎ  Ｔｇは非トランスジェニックラットを用いた実験であり、D、S、E、Kはそれぞれ、脊髄神経節、皮膚、眼球、腎臓を表す。
【図１３】トランスジェニックラット96Mの生後7日齢における神経終末の観察結果を示す。Keratin6、PGP9.5、CGRPはそれぞれ、マウス抗ケラチン６抗体、ウサギ抗ＰＧＰ９．５抗体、およびウサギ抗CGRP抗体を用いていることを示す。また、ＮｏｎTg（a-c）は対照ラット（非トランスジェニックラット）、Tg-Norは外見上正常なトランスジェニックラットの皮膚を、Tg-Abは異常な皮膚を示す。
【図１４】トランスジェニックラット96Mの生後7日齢におけるｈＨＩ７Ｔ２１３遺伝子、NGF遺伝子、およびBDNF遺伝子の発現を示す。ＮｏｎTg（a-c）は対照ラット（非トランスジェニックラット）、Tg-Norは外見上正常なトランスジェニックラットの皮膚を、Tg-Abは異常な皮膚を示す。値はn=4の平均値であり、SEはエラーバーを示す（t-TEST：＊＊はｐ＜0.01、＊＊＊はｐ＜0.001）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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