(57)【要約】【課題】簡便なアルミニウム耐性植物の判別方法を提供する。【解決手段】アルミニウム処理直後から、根からクエン酸を分泌し、温度の低下とともにクエン酸分泌量が減少するというオオムギの新規アルミニウム耐性メカニズムに基づいて、アルミニウム耐性オオムギを判別する。このようにして判別したオオムギの中から選抜した特にアルミニウム耐性の優れたオオムギ品種は、酸性土壌でも効率的に育成可能である。それゆえ、オオムギの栽培地域の拡大が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルミニウム存在下における植物の有機酸分泌の速度と温度依存性とによって、アルミニウム耐性の有無を判別することを特徴とするアルミニウム耐性植物の判別方法。
【請求項２】
アルミニウム暴露直後から有機酸を分泌し、かつ、温度の低下とともに有機酸分泌量が減少する植物を、アルミニウム耐性植物と判定することを特徴とする請求項１に記載のアルミニウム耐性植物の判別方法。
【請求項３】
さらに、アルミニウム濃度に非依存的に有機酸を分泌する植物を、アルミニウム耐性植物と判定することを特徴とする請求項２に記載のアルミニウム耐性植物の判別方法。
【請求項４】
さらに、アルミニウム暴露によって内部有機酸含有量が増加する植物を、アルミニウム耐性植物と判定することを特徴とする請求項２または３に記載のアルミニウム耐性植物の判別方法。
【請求項５】
上記植物が、イネ科植物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルミニウム耐性植物の判別方法。
【請求項６】
上記植物が、オオムギであることを特徴とする請求項５に記載のアルミニウム耐性植物の判別方法。
【請求項７】
上記有機酸が、クエン酸であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のアルミニウム耐性植物の判別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルミニウム耐性植物の判別方法に関し、より詳細には、特に、オオムギのアルミニウム耐性の判別に好適に利用できるアルミニウム耐性植物の判別方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
世界の耕作地の約３割を占めているとされている酸性土壌においては、しばしば植物の生育阻害が見られ、作物生産に重大な影響を及ぼしていることが知られている。酸性土壌における作物の生育阻害の主な要因は、アルミニウムイオンによる根の伸長阻害である。アルミニウムイオンが、細胞壁、細胞膜、および生体物質と結合することによって、根の伸長が阻害される。
【０００３】
このような酸性土壌で作物を栽培するには、石灰等による酸性土壌の矯正が必要となる。土壌への石灰散布は、アルミニウムによる植物の生育阻害の改善に効果的であるものの、コスト上の問題や、下層土では効果がないこと、多量の石灰散布が土壌構造に有害な影響をもたらすなど、新たな問題が生じてしまう（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
ところで、植物には酸性土壌に高い耐性を示す品種が存在する。このような高い耐性を示す品種では、クエン酸やリンゴ酸などの有機酸の分泌が観察される（例えば非特許文献２，３又は４参照）。また、実際にリンゴ酸の分泌量が高い品種では、アルミニウム耐性が強くなっている（例えば非特許文献５）。
【０００５】
このような現象から、植物の有機酸分泌と、酸性土壌耐性（アルミニウム耐性）との間には何らかの関係があると考えられている。例えば、植物から分泌された有機酸が土壌中のアルミニウムと結合して、無毒な形態に変化させた結果、アルミニウム耐性を示すと考えられている。
【０００６】
また、有機酸とアルミニウムとがキレートを形成することによって、アルミニウムイオンが植物体内に吸収されることを防止する結果、アルミニウム耐性を示すとも考えられている。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ  ．Ｂｉｏｓｃｉ  （１９９３）  ４３，４５４−４６４．
【０００８】
【非特許文献２】
Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｃ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９１）  ９６，７３７−７４３．
【０００９】
【非特許文献３】
Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９３）  １０３，６９５−７０２
【００１０】
【非特許文献４】
Ｋｏｃｈｉａｎ  Ｌ．Ｖ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  （１９９５）  ４６，２３７−２６０．
【００１１】
【非特許文献５】
Ｒｙａｎ  Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （１９９５）  ２２，５３１−５３６．
【００１２】
【非特許文献６】
Ｍｉｎｅｌｌａ  Ｅ，  Ｓｏｒｒｅｌｌｓ  ＭＥ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ  （１９９２）  ３２：５９３−５９８．
【００１３】
【非特許文献７】
Ｒｅｉｄ  ＤＡ，  Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＡＬ，  Ｆｏｙ  ＡＤ  Ａｇｒｏｎ  Ｊ  （１９７１）  ６３：  ６００−６０３．
【００１４】
【非特許文献８】
Ｒａｍａｎ  Ｈ，  Ｍｏｒｏｎｉ  ＪＳ，  Ｓａｔｏ  Ｋ，  Ｒｅａｄ  ＢＪ，  Ｓｃｏｔｔ  ＢＪ  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  （２００２）  １０５：  ４５８−４６４．
【００１５】
【非特許文献９】
Ｍｉｎｅｌｌａ  Ｅ，  Ｓｏｒｒｅｌｌｓ  ＭＥ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄ  （１９９７）  １１６：  ４６５−４６９．
【００１６】
【非特許文献１０】
Ｔａｎｇ  Ｙ，  Ｓｏｒｒｅｌｌｓ  ＭＥ，  Ｋｏｃｈｉａｎ  ＬＶ，  Ｇａｒｖｉｎ，  ＤＦ  Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ  （２０００）  ４０：  ７７８−７８２．
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
アルミニウム耐性は、種差や、同一種の品種間での差も幅広く、多種多様に存在する。例えば、イネ科植物（禾穀類）のアルミニウム耐性は、通常、イネとライムギが強く、これに続いて、コムギ、オオムギの順に低くなり、イネ科植物（禾穀類）の中でも、オオムギのアルミニウムに対する感受性が最も高い。そして、この高いアルミニウム感受性が原因となり、世界各地の農業地帯へのオオムギ栽培の拡大が制限されている。
【００１８】
このため、オオムギのアルミニウム耐性に関する研究が精力的に行われている。例えば、オオムギのアルミニウム耐性にかかわる種々の遺伝的変異や、アルミニウム耐性を制御する優性遺伝子（Ａｌｐ）に関する報告がなされている（非特許文献６〜１０）。
【００１９】
しかし、オオムギ品種間でのアルミニウム耐性の相違、すなわち、オオムギのアルミニウム耐性メカニズムの詳細については、未だ解明されていないのが現状である。
【００２０】
酸性土壌でのオオムギの生産性を改善するための方法として、アルミニウム耐性が優れた品種を選抜する方法と、アルミニウム耐性遺伝子を導入したアルミニウム耐性品種を育種する方法とが用いられる。
【００２１】
しかし、前述のように、オオムギのアルミニウム耐性のメカニズムは、不明であるため、アルミニウム耐性が優れた品種を、効率よく選抜することは困難である。また、オオムギのアルミニウム耐性遺伝子は単離されていないため、その遺伝子を導入することができない。このため、異なる種のアルミニウム耐性遺伝子を導入した形質転換オオムギの作製が検討されているが、実用化には至っていない。
【００２２】
したがって、もしオオムギのアルミニウム耐性メカニズムを解明することができれば、アルミニウム耐性の優れたオオムギを判別できる。さらに、そのアルミニウム耐性遺伝子を単離することができれば、アルミニウム耐性が増強された形質転換植物を作製することも可能となる。
【００２３】
本発明は、上記従来の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、オオムギのアルミニウム耐性メカニズムを解明し、それに基づいた新規アルミニウム耐性植物の判別方法を提供することにある。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ａｌ存在下での根からの有機酸分泌に着目し、オオムギのアルミニウム耐性メカニズムについて鋭意に検討した。その結果、アルミニウム耐性オオムギが、▲１▼Ａｌ暴露直後に、▲２▼温度依存的に、クエン酸を分泌するという、他の植物種とは異なる有機酸分泌経路を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２５】
すなわち、本発明のアルミニウム耐性植物の判別方法は、上記の課題を解決するために、アルミニウム存在下における植物の有機酸分泌速度と温度依存性とによって、アルミニウム耐性の有無を判別することを特徴としている。
【００２６】
また、本発明のアルミニウム耐性植物の判別方法では、アルミニウム暴露直後から有機酸を分泌し、かつ、温度の低下とともに有機酸分泌量が減少する植物を、アルミニウム耐性植物と判定することが好ましく、さらに、アルミニウム濃度に非依存的に有機酸を分泌する植物、および／または、アルミニウム暴露によって内部有機酸含有量が増加する植物を、アルミニウム耐性植物と判定することがより好ましい。
【００２７】
また、本発明のアルミニウム耐性植物の判別方法では、上記植物が、イネ科植物であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。
【００２８】
また、本発明のアルミニウム耐性植物の判別方法では、上記有機酸が、クエン酸であることが好ましい。
【００２９】
本発明によれば、これまでに解明されていなかったオオムギのアルミニウム耐性メカニズムに基づいて、アルミニウム耐性植物を判別することができる。これにより、特に、アルミニウム耐性オオムギの簡便な判別が可能となる。それゆえ、アルミニウム耐性の優れたオオムギを選抜すれば、アルミニウム毒性のある酸性土壌地帯にもオオムギの栽培を拡大できる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、言うまでもないが、本発明は、特に本実施の形態の記載のみに限定されるものではない。
【００３１】
本発明のアルミニウム耐性植物の判別方法（以下「本判別方法」と称する）は、アルミニウム存在下において、植物の根から分泌される有機酸の分泌速度と、有機酸分泌量の温度依存性とに基づいて、植物のアルミニウム耐性を判別するものである。
【００３２】
上記「アルミニウム耐性」とは、アルミニウム存在下においても正常に成長できる植物の能力のことを言う。また、上記「アルミニウム」は、イオン化されているものでも、塩を形成しているものであってもよい。
【００３３】
また、上記「有機酸」は、特に限定されるものではなく、植物で生合成される有機酸であればよい。例えば、ＴＣＡサイクルにより生合成されるクエン酸、リンゴ酸、コハク酸、オキサロ酢酸などのカルボン酸が挙げられる。これらの有機酸のうち、クエン酸が特に好ましい。後述する実施例のように、クエン酸は、アルミニウムとのキレート形成能力が強いため、リンゴ酸よりも効率的にアルミニウムイオンを外部で排除することが可能である。
【００３４】
したがって、アルミニウムに暴露された直後から、根からクエン酸を分泌する植物は、優れたアルミニウム耐性を有すると判定できる。後述のように、アルミニウム耐性オオムギは、アルミニウム存在下、クエン酸を分泌することにより、優れたアルミニウム耐性を示す。
【００３５】
なお、有機酸の他にも、アルミニウムと結合し得る化合物であれば、アルミニウム耐性植物の判別の指標となりうる。また、アルミニウムとの結合性が強いほど、アルミニウム耐性も優れていると判定できる。
【００３６】
次に、本判別方法の詳細について、アルミニウム耐性オオムギの判別方法を例に挙げて説明する。
【００３７】
アルミニウム耐性オオムギの判別方法は、後述する実施例に示すように、オオムギの新規アルミニウム耐性メカニズムに基づいて、アルミニウム耐性オオムギを判別するものである。より具体的には、オオムギのアルミニウム耐性メカニズムは、以下の▲１▼〜▲４▼の特徴を有している。
▲１▼アルミニウム暴露直後から、アニオンチャネルを介して有機酸（特にクエン酸）が分泌される。
▲２▼アルミニウム暴露による有機酸（特にクエン酸）分泌は、温度依存的である。
▲３▼アルミニウム暴露による有機酸（特にクエン酸）分泌は、アルミニウム濃度に非依存的である。
▲４▼アルミニウム暴露によって、オオムギの内部有機酸（特にクエン酸）含有量が増加する。
【００３８】
このようなオオムギの有機酸分泌パターンは、コムギやライムギ・ライコムギの有機酸分泌パターンとは異なる。
【００３９】
コムギなどの有機酸分泌パターン（パターンＩ）の特徴は、（イ）アルミニウムがアニオンチャネルを活性化して有機酸分泌を促進すること；（ロ）有機酸分泌が温度の影響を受けないことである。このため、パターンＩでは、オオムギと同様、アルミニウム暴露直後から有機酸（有機酸アニオン）が分泌される。しかし、オオムギとは異なり、有機酸の分泌は、温度依存性を示さず、一定である。
【００４０】
一方、ライムギ・ライコムギなどの有機酸分泌パターン（パターンＩＩ）の特徴は、（ハ）有機酸の分泌が低温で減少すること；（ニ）有機酸代謝を司る遺伝子、または有機酸（有機酸アニオン）を輸送する遺伝子によって、有機酸分泌を促進することである。このため、パターンＩＩでは、オオムギと同様、アルミニウム暴露によって温度依存的に有機酸が分泌される。しかし、オオムギとは異なり、アルミニウム暴露直後からは有機酸が分泌されず、有機酸分泌に遅延がみられる。
【００４１】
このように、オオムギの有機酸分泌パターンは、アルミニウム暴露直後、速やかに有機酸が分泌される点ではパターンＩに類似しており、有機酸の分泌が温度依存的である点ではパターンＩＩに類似しているものの、いずれのパターンにも属さない新規な有機酸分泌パターンである。
【００４２】
さらに、上記▲３▼に示したような、有機酸の分泌量がアルミニウム濃度に依存しない点も、パターンＩにもＩＩにも属さない新規な有機酸分泌パターンである。すなわち、オオムギのアルミニウム耐性メカニズムは、コムギ、ライムギ、ライコムギなどとは大きく異なっている。
【００４３】
また、上記▲４▼に示したような、アルミニウム暴露を引き金とする、オオムギの内部有機酸（特にクエン酸）含有量の増加は、有機酸合成酵素（特にクエン酸合成酵素）の活性化によるものではなく、アルミニウム耐性オオムギに特有の現象である。
【００４４】
したがって、アルミニウム耐性オオムギの判別は、少なくとも上記▲１▼および▲２▼の特徴に基づいて行えばよく、さらに加えて、上記▲３▼および／または▲４▼の特徴に基づいて行うことが好ましい。
【００４５】
すなわち、（ａ）アルミニウム暴露直後から有機酸を分泌し、かつ、温度の低下とともに有機酸分泌量が減少するオオムギをアルミニウム耐性オオムギと判定することができる。後述する実施例に示すように、アルミニウム耐性オオムギは、室温と比べて、低温で有機酸分泌量が著しく減少する。このため、本判別方法は、室温と低温（例えば、６℃）とにおける有機酸分泌量を比較することにより、アルミニウム耐性の判別が可能である。また、室温では多量の有機酸が分泌されるので、例えば、５０ｐｍｏｌ  ｒｏｏｔ  −１  ｈ−１以上の有機酸を分泌するものをアルミニウム耐性オオムギと判定することも可能である。
【００４６】
上記（ａ）に加えて、（ｂ）アルミニウム濃度に非依存的に有機酸を分泌するオオムギ、および／または、（ｃ）アルミニウム暴露によって有機酸含有量が増加するオオムギは、より優れたアルミニウム耐性を示すオオムギである。
【００４７】
このように、上記（ａ）の判定によって簡便にアルミニウム耐性オオムギを判別することができ、さらに上記（ｂ）および／または（ｃ）の判定を加えることによって、高精度かつアルミニウム耐性に優れたオオムギの判別が可能となる。
【００４８】
上記（ｂ）の判定を加えれば、アルミニウム濃度に関係なくアルミニウム耐性の判別を行うことができる。それゆえ、厳密なアルミニウム濃度は不要であるので、アルミニウム耐性の判別ミスを少なくできる。
【００４９】
本判別方法は、このような新規有機酸分泌パターンに基づいているので、イネ科植物の中でも、特にオオムギのアルミニウム耐性の判別に好適である。
【００５０】
本判別方法は、アルミニウム存在下で分泌される、有機酸（特にクエン酸）分泌様式をアルミニウム耐性の指標として利用している。イネ科植物などの禾穀類では、クエン酸のみならずリンゴ酸等の有機酸も分泌するため、アルミニウム耐性の指標とする有機酸の種類を多くすれば、アルミニウム耐性植物の判別精度も向上し、よりアルミニウム耐性に優れた植物の判別が可能である。
【００５１】
本判別方法によれば、アルミニウム耐性が不明な既存する植物の品種から、アルミニウム耐性品種を選抜することができる。また、例えば、品種改良の際に、アルミニウム処理によって、温度依存的に根からクエン酸を分泌する品種を選抜して、アルミニウム耐性品種を選抜することもできる。
【００５２】
言い換えると、本判別方法は、クエン酸をはじめとする有機酸の分泌量が多いほど、アルミニウム耐性が高いと判定するものである。このため、例えば、品種改良等の際に、アルミニウムに応答して分泌される有機酸量が多いということを基準に選抜すれば、アルミニウム耐性品種を簡便かつ効果的に選抜することが可能となる。
【００５３】
なお、上記の説明では、アルミニウム耐性オオムギの判別を例に挙げて説明したが、本判別方法を適用できる「植物」は、オオムギと同様のアルミニウム耐性メカニズムを有する植物であれば、特に限定されるものではない。例えば、食用作物、果実や野菜、花・木その他の有効樹木を含む園芸作物、工芸作物、さらには飼肥料作物等が挙げられる。なお、上述した食用作物園芸作物、工芸作物、飼肥料作物にそれぞれ含まれる具体的な作物については、例えば、農学大辞典改訂第４版（養賢堂・１９９７年４月３０日発行）の目次８〜１６頁にも詳細に記載されている。また、酸性土壌耐性は、ホウレンソウや甜菜等のアカザ科の作物、オオムギをはじめとする禾穀類の作物など広範囲の植物で問題となっており、このような植物のうち、オオムギと同様のアルミニウム耐性メカニズムを有する植物について、本発明を適用することは好ましい。
【００５４】
すなわち、アルミニウム暴露直後から有機酸を分泌し、その有機酸分泌が温度依存的な植物のアルミニウム耐性の判別も行うことができる。例えば、コムギ、ライムギ、ライコムギ、イネ、アワ、ヒエ、キビ、トウモロコシ等、穀物の収穫を主要な目的として栽培されるイネ科植物（禾穀類）において、オオムギと同様のアルミニウム耐性メカニズムを有する植物のアルミニウム耐性の判別も行うことが可能である。
【００５５】
また、クエン酸、リンゴ酸等の有機酸の測定は、特に限定されるものでなく、例えば、自体公知のＨＰＬＣを用いた測定、又は自体公知の酵素法（Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９３）  １０３，６９５−７０２）を用いた測定などが適用可能である。さらに、有機酸の測定を行うタイミングは、アルミニウム直後から、約１０時間まで、任意に設定することができる。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５７】
〔実施例１〕
実施例１では、アルミニウムに対する感受性の異なる２１種類のオオムギを用いて、オオムギのアルミニウム耐性メカニズムの解明を検討した。なお、データは示さないが、ｐＨ４．５では、アルミニウム耐性および感受性オオムギともに、根の伸長が著しく阻害されたため、ｐＨ５．０で実験を行った。
【００５８】
（ａ）使用植物
岡山大学資源生物科学研究所オオムギ野生植物資源研究センターから提供された２１品種のオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）の種子を使用した。これらの２１品種は、Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ，  Ｍｕｒａｓａｋｉ  Ｍｏｃｈｉ，  Ｓｃｏｔｓ  Ｂｅｒｅ，  Ｋｅａｒｎｅｙ，  Ｍｏｒｅｘ，  Ｓｋｉｆｆ  ，  Ａｋａｓｈｉｎｒｉｋｉ，  Ｂｏｓｅｏｎｇ  Ｃｏｖｅｒｅｄ  ８  ，  Ｈａｒｕｎａ  Ｎｉｊｏ，  Ｊｉｎｇ  Ｐｉ  １９８，  Ｌａｏ  ｗｕ  ｈｕ  ｘｕ  ｍａｉ，  Ｈｉｎｏｄｅ  Ｈａｄａｋａ，  Ｔａｐｇｏｌｂｏｒｉ，  Ｊａｎｇｈｅｕｎｇ  Ｎａｋｅｄ  ２，  Ｕｌｌｅｒｉ  １０，  ＴＫＮ１４アルミニウムｉｕｓｓｕｃｈｉａｏ  ２  ，  Ｈａｍａｎ  Ｗａｅｄｏｎｇ  ２  ，  Ｓａｚａｎｓｈｕ  ，  Ｒｏｋｋａｋｕｍｕｇｉ  、および  ４８８７−３である。これらの品種は、予備的なアルミニウム耐性のスクリーニングに基づいて選択し、アルミニウム耐性が異なるものである。
【００５９】
（ｂ）根の伸長測定
種子を脱イオン水に２時間浸した後、湿ったろ紙を用いてシャーレに移動し、２２〜２４℃で２４時間暗所に保存した。発芽した種子をネットに載せ、１．５Ｌのプラスチック製容器中で、継続的にエアレーションを行っている１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液上に浮かばせた。この苗は、１日間２２〜２４℃で暗所に保存し、その後自然光下、２５℃に移動した。溶液は、毎日交換した。４日目に、苗を、１０μＭ  ＡｌＣｌ３を含有する１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液、または含有しない１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液に浸した。根の伸長は、定規を用いて、処理前後（２４時間）の最長の根の長さ測定を１０回繰り返して評価した。アルミニウム耐性は、相対的な根の伸長として表した（（アルミニウム存在下での根の伸長）／（アルミニウム非存在下での伸長）×１００）。試験後、根を、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液を用いて、３回簡単に洗浄し、根の頂端（０〜１ｃｍ）を切り取った後、後述するアルミニウム測定用サンプルとした。
【００６０】
（ｃ）根の分泌物の収集
１２個の種子（４日齢）を、エアレーションをした１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）入り１．２Ｌプラスチック容器に移植し、一昼夜経過後、１０μＭ  ＡｌＣｌ３を含む１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液中に６時間暴露した。用量−作用実験のために、同様の種子を６時間、０、５、１０、２０μＭ  ＡｌＣｌ３を含む１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶中に浸した。タイムコース試験は、１０μＭ  ＡｌＣｌ３を含む１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液中に、種子を、２０、４０、６０、あるいは１２０分、または、２、４、６、８、あるいは１０時間浸すことによって実施した。
【００６１】
根の分泌液を収集した後、５ｇのアンバーライトＩＲ−１２０樹脂（Ｈ＋型）（オルガノ社製）を充填した陽イオン交換樹脂カラム（１６×１４ｍｍ）に通し、続いて、ＡＧ  １×  ８  樹脂  （１００−２００  ｍｅｓｈ；  ギ酸塩型）  （バイオラット社製）を充填した陰イオン交換樹脂カラム（１６×１４ｍｍ）に供した。続いて、陰イオン交換樹脂上に保持された有機酸を、２Ｎ塩酸を用いて溶出し、その溶出液をロータリーエバポレーター（４０℃）を用いて蒸発乾固した。残渣を１ｍＬ  超純水に溶かし、有機酸分析を行った。すべての実験は、３回繰り返して実施した。
【００６２】
各実験の終わりに、各容器の根の頂端数を数え、根の頂端あたりのクエン酸分泌を表した。
【００６３】
（ｄ）アニオンチャネル阻害剤によるクエン酸分泌の影響
Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）の種子（４日齢）を、５μＭニフルム酸（ＮＩＦ）、４，４’−ジイソチオシアネート−スチルベン−２，２−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、または９−アントラセンカルボン酸（Ａ９Ｃ）存在下、または非存在下の０または１０μＭ  ＡｌＣｌ３を含有する１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）溶液にさらした。これらのアニオンチャネル阻害剤をエタノールに溶解し、処理溶液中のエタノールの最終濃度を０．０１％未満とした。コントロール溶液には、さらに、エタノール０．０１％を加えた。
【００６４】
別の実験では、５μＭニフルム酸を含有する１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液（ｐＨ  ５．０）中、または含有しない１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液（ｐＨ  ５．０）中の０または１０μＭ  Ａｌに、苗をさらした。６時間後、クエン酸測定のために根の分泌液を収集し、内部クエン酸含有量の決定のために根の頂端（０〜１ｃｍ）を切り取った。
【００６５】
（ｅ）温度によるクエン酸分泌の影響
１２個の苗（４−ｄ−ｏｌｄ）を、１．２Ｌプラスチック製容器内の１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２  （ｐＨ  ５．０）中の０または１０μＭ  ＡｌＣｌ３に、２５℃または６℃でさらした。低温処理に用いる溶液は、予め６℃に冷却しておいた。６時間後、クエン酸の測定のために根の分泌液を収集し、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）および内部クエン酸含有量を決定するために根の頂端（０〜１ｃｍ）を切り取った。
【００６６】
（ｆ）アルミニウム含有量の決定
切り取った根の頂端（１サンプル当たり１０個）を、２Ｎ塩酸１ｍＬを含有する１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに浸した。そのチューブを時々振動させて、少なくとも２４時間立てかけた。溶液中のアルミニウムの濃度は、希釈後、フレームレス原子吸光分析（ｍｏｄｅｌ  Ｚ−５０００，  日立製）によって決定した。
【００６７】
（ｇ）クエン酸の測定
切り取った根の頂端（１サンプル当たり４０個）を、氷冷した０．６Ｎ過塩素酸１ｍＬに砂を混ぜて、乳鉢と乳棒を用いて氷上でホモジナイズした。懸濁液を遠心チューブに移し、５分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離した。続いて、遠心上清液（約０．９ｍＬ）を新しいチューブに移し、５Ｍ  Ｋ２ＣＯ３８０μＬを加えた。遠心分離（５分間、１３０００ｒｐｍ）後、クエン酸の測定のために遠心上清液を新たなチューブに移した。
【００６８】
根分泌液および根サンプル中のクエン酸は、Ｄｅｌｈａｉｚｅ等の方法にしたがって測定した（Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｏｌ（１９９３），１０３，６９５−７０２）。簡単に説明すると、希釈サンプル（＜５０ｎｍоｌ）１ｍＬに、１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１２０μＬおよび１０ｍＭ  ＮＡＤＨ１５μＬを添加した。２５℃、４０分、インキュベート後、酵素混合物（１．２５Ｕの乳酸デヒドロゲナーゼおよび０．５Ｕのリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含有）２μＬを加え、反応混合物をさらに４０分、インキュベートした。この時点で、３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、続いて、シトレートリアーゼ（０．５Ｕ）１０μＬを加えて、１０分後に２回目の吸光度を測定した。標準物質の測定も同様にした。
【００６９】
（ｈ）クエン酸分泌と根の伸長及び根の頂端におけるアルミニウム含有量との関係（（ａ）〜（ｇ）の実験結果）
オオムギの根がアルミニウムに暴露されると、他の有機酸が検出されないにもかかわらず、クエン酸が分泌される。しかしながら、クエン酸の分泌量は、品種によって異なり、２．９〜１２６ｐｍｏｌ  ｒｏｏｔ  ａｐｅｘ−１ｈ−１である（図１参照）。２１品種でのクエン酸分泌量と、相対的な根の伸長との間に、正の相関（ｒ＝０．８７３）が有った（図１参照）。一方、根の頂端のアルミニウム含有量は、アルミニウム感受性品種よりもアルミニウム耐性品種の方が多く、根の頂端でのクエン酸の分泌量とアルミニウム含有量の間に負の相関（ｒ＝０．８５４）が得られた（図２参照）。
【００７０】
図２により、アルミニウム感受性オオムギに比べて、アルミニウム耐性オオムギの根の頂端に、アルミニウムがより少ないことがわかる。これは、アルミニウム耐性オオムギのアルミニウム耐性メカニズムが、根の頂端からアルミニウムを排除することを示している。また、この検討では、オオムギが、アルミニウムストレスに応じて根からクエン酸を分泌することも明らかとなった。さらに、２１種のオオムギ品種において、クエン酸分泌が、アルミニウム耐性にプラスに関与し、根の先端におけるアルミニウムの蓄積にマイナスに関与する。
【００７１】
これらの結果は、根からのクエン酸の分泌が、オオムギにおけるアルミニウム耐性のメカニズムであることを示している。よって品種改良の際に、根からのクエン酸の分泌量が多い系統を選抜すれば、アルミニウム耐性品種を選抜することができる。
【００７２】
オオムギでのＡｌ誘導されたクエン酸分泌の特徴を示すために、１つのＡｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）と１つのＡｌ感受性品種（Ｋｅａｒｎｅｙ）を選択して、さらに検討した。Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）のクエン酸分泌は、すぐに誘発され、Ａｌにさらされた直後の２時間以内に起こった（図３（ａ）参照）。続く実験では、Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）の根からのクエン酸分泌は、Ａｌ溶液にさらされた２０分以内に起こった。クエン酸の分泌速度は、分泌液を収集する間、一定のレベル（およそ１３０ｐｍｏｌ  ｒｏｏｔ  ａｐｅｘ−１ｈ−１）に維持された。Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）は、Ａｌに応じて、Ａｌ感受性品種（Ｋｅａｒｎｅｙ）よりも、より多くのクエン酸を分泌した（図３（ａ）（ｂ））。
【００７３】
また、アルミニウム耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）とアルミニウム感受性品種（Ｋｅａｒｎｅｙ）についてクエン酸分泌のタイムコースを検討した。その結果、Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎのクエン酸分泌は、アルミニウムに暴露された直後の２０分以内に開始し、クエン酸の分泌速度は、２０分後からから１０時間の間は、ほぼ一定のレベル（およそ１３０ｐｍｏｌ  ｒｏｏｔ  ａｐｅｘ−１ｈ−１）に維持されていた（図３参照）。一方、Ｋｅａｒｎｅｙのクエン酸分泌量は、Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎに比べて明らかに低いレベルを保っていた。
【００７４】
よって、アルミニウム耐性オオムギの判別を行う場合、クエン酸の測定は、少なくともアルミニウムに暴露した直後２０分から１０時間であればいずれの時間で測定してもよい。たとえば、２０分後、４０分後、６０分後、１２０分後、４時間後、６時間後、８時間後または１０時間後でもよい。したがって、本判別方法では、クエン酸の測定を行うタイミングを任意に設定できる。それゆえ、アルミニウム耐性を判別しようとするサンプル数の多少によらず、柔軟に判別できる。
【００７５】
さらに、暴露するアルミニウム濃度を増減させた場合のクエン酸分泌速度については、Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎでアルミニウム濃度が５、１０、２０μＭのときで大差はなかった（図４参照）。よって、本判別方法は、暴露されるアルミニウム濃度条件についても寛容であるため、厳密なアルミニウム濃度条件が要求されず、アルミニウム耐性の判別のミスが少ないというメリットがある。
【００７６】
Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）でのＡｌ誘導されたクエン酸分泌は、ニフルム酸およびＡ９Ｃによるアニオンチャネル阻害剤によって、を著しく阻害されたが、ＤＩＤＳによる阻害はなかった。Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）の根が低温（６℃）でＡｌ溶液にさらされると、クエン酸の分泌が停止した（表１参照）。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
クエン酸の内部濃度へのＡｌの影響は、別の条件下で調査した。根の頂端の内部クエン酸含有量は、２５℃で、Ａｌ耐性品種（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）ではＡｌにさらされるのと共に増加したが、Ａｌ感受性品種（Ｋｅａｒｎｅｙ）では増加しなかった（表１参照）。低温（６℃）では、内部クエン酸含有量は、どの品種でもＡｌによる影響を受けなかった。さらに、クエン酸分泌がニフルム酸存在下で阻害されると、内部クエン酸レベルの増加は、観測されなかった（表２参照）。
【００７９】
【表２】
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【００８０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの根の頂端におけるクエン酸シンターゼ活性は、Ａｌ耐性およびＡｌ感受性オオムギ品種のいずれの場合も、Ａｌにさらされるのと共に変化しなかった（図６参照）。
【００８１】
以上のように、本発明では、Ａｌ感受性オオムギ品種に比べて、Ａｌ耐性オオムギ品種の頂端にＡｌがより少ないことが明らかとなった（図２参照）。これは、Ａｌ耐性オオムギ品種にはＡｌ耐性に作用するメカニズムが根の頂端からＡｌを排除することを示している。また、本実施例では、オオムギが、Ａｌストレスに応じて根からクエン酸を分泌することを明らかにした。さらに、２１種のオオムギ品種において、クエン酸分泌が、Ａｌ耐性にプラスに関連し、根の伸長においてはＡｌの蓄積がマイナスに関連する。これらの結果は、根からのクエン酸の分泌が、オオムギにおいて、Ａｌ耐性を引き起こすメカニズムであることを示している。
【００８２】
クエン酸分泌は、低温の影響を著しく受ける（表１）。通常、パターンＩ型の有機酸アニオン分泌は温度の影響を受けない。一方、パターンＩＩ型の分泌は、低温で減少する。例えば、コムギ（パターンＩ）では、Ａｌに誘導されたリンゴ酸の分泌は、低温でも通常の温度でも違いはない。一方、ライムギ（パターンＩＩ型）では、クエン酸の分泌が、低温で減少する。オオムギの根からのクエン酸の分泌は、Ａｌによってすぐに誘発されるけれども、低温で分泌が停止する（表２）。これらの結果は、オオムギと他の植物種とでは、有機酸アニオンの分泌をもたらす経路が異なっていることを意味している。オオムギでは、エネルギー依存型プロセスが、Ａｌ誘導されたクエン酸の分泌に関与している。
【００８３】
内部クエン酸含有量は、Ａｌ耐性品種では、Ａｌにさらされるのに伴い増加している（表１）。しかしながら、Ａｌ存在下低温ではクエン酸分泌がない場合、内部クエン酸含有量の増加は、観測されなかった（表１）。アニオンチャネル阻害剤やニフルム酸によってクエン酸分泌が阻害されると、内部クエン酸含有量も増加しない（表２）。しかしながら、Ａｌ感受性品種のオオムギでは、Ａｌ処理や温度にかかわらず、内部クエン酸含有量が変化しないままである。この発見は、内部クエン酸含有量の増加が、Ａｌに誘導されたクエン酸の分泌によってもたらされることを意味している。しかしながら、クエン酸シンターゼ活性は、Ａｌによる影響を受けない（図６）。内部クエン酸濃度が増加する原因は、不明である。
【００８４】
〔実施例２〕
（ａ）オオムギと他のイネ科植物（禾穀類）との有機酸分泌の比較
同一実験条件下でのオオムギとその他のイネ科植物（禾穀類）の有機酸分泌量を比較するために、アルミニウム耐性の異なる４種類９品種について、有機酸分泌および根の伸長を検討した。
【００８５】
オオムギ（ｃｖｓ．  ＫｅｒｎｅｒｙおよびＳｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．  ｃｖｓ．  Ａｔｌａｓ  ６６、ＥＴ８、Ｓｃｏｕｔ  ６６、およびＥＳ８）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅｅ  ｃｅｒｅａｌｅ  Ｌ．  ｃｖ．  Ｋｉｎｇｓ）、およびライコムギ（ｘＴｒｉｔｉｃｏｓｅｃアルミニウムｅ  Ｗｉｔｔｍａｒｋ．  ｃｖｓ．  ＳＴ２  ａｎｄ  ＳＴ２２）の種子（４日齢）を、０．５  ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ  ４．５）中の３０μＭ  アルミニウムに暴露した。２４時間後、根の分泌液を実施例１と同様にして収集し、各容器の根の頂端数を数えた。根の分泌液中のクエン酸およびリンゴ酸は、酵素法を用いて測定した（Ｄｅｌｈａｉｚｅ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｏｌ（１９９３），１０３，６９５−７０２参照）。この実験をそれぞれ独立して５回繰り返し、全ての実験の平均を算出した。別の容器で、アルミニウム含有（３０μＭ）または非含有溶液における根の伸長を、１０回繰り返して測定した。
【００８６】
リンゴ酸は、クエン酸に比べると、アルミニウムに対するキレート能力が弱い。アルミニウムを完全に無毒化するのに必要なクエン酸は、等モル量であるのに対して、リンゴ酸は、アルミニウムの８倍以上必要であるという報告がいくつかある（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔ  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９５）２２，５３１−５３６、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．ｐｌａｎｔ  Ｓｏｉｌ（２００２）２４２，２３５−２４３参照）。品種および種間における有機酸の分泌量の比較を可能とするために、有機酸の含有量を、異なるキレート能力を考慮して、（クエン酸＋リンゴ酸／８）として示した。
【００８７】
有機酸の分泌量は、ライムギ（Ｋｉｎｇｓ）、ライコムギ（ＳＴ２）、コムギ（Ａｔｌａｓ６６）＞コムギ（ＥＴ８）＞＞コムギ（Ｓｃｏｕｔ６６、ＥＳ８）、オオムギ（Ｓｉｇｕｒｄｋｏｒｎ）、ライコムギ（ＳＴ２２）＞オオムギ（Ｋｅａｒｎｅｙ）であった。
【００８８】
相対的な根の伸長は、ライムギ（Ｋｉｎｇｓ）、コムギ（ＥＴ８およびＡｔｌａｓ６６）＞ライコムギ（ＳＴ２）＞＞オオムギ（Ｓｉｇｒｄｋｏｒｎ）、ライコムギ（ＳＴ２２）、コムギ（Ｓｃｏｕｔ６６およびＥＳ８）＞オオムギ（Ｋｅａｒｎｅｙ）である。アルミニウム耐性と有機酸の分泌量との間には、良好な相関（ｒ＝０．８９８）が得られた（図７参照）。
【００８９】
以上の結果から、有機酸の分泌が、イネ科植物（禾穀類）共通するアルミニウム耐性のメカニズムであるといえる。
【００９０】
【発明の効果】
以上のように、本発明のアルミニウム耐性植物の判別方法は、アルミニウム処理によって植物から分泌される有機酸の分泌様式に基づいて、アルミニウム耐性の有無を判別するものである。
【００９１】
したがって、特に、これまでアルミニウム耐性メカニズムが不明であったオオムギから、アルミニウム耐性品種を判別することができる。このようにして選抜したアルミニウム耐性に優れたオオムギは、酸性土壌地帯でも効率よく栽培することが可能となる。それゆえ、これまで栽培が制限されていた、オオムギの栽培地域を拡大することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１における２１品種のオオムギの相対的な根の伸長とアルミニウム誘導されたクエン酸分泌との相関を示すグラフである。
【図２】実施例１における２１品種のオオムギのクエン酸分泌と根内部のアルミニウム含有量との相関を示すグラフである。
【図３】実施例１におけるオオムギのアルミニウム耐性品種（Ｓｉｇｒｄｋｏｒｎ）とアルミニウム感受性品種（Ｋｅａｒｎｅｙ）とにおける、アルミニウム誘導されたクエン酸分泌の時間経過を示すグラフである。図３（ａ）は２時間から１０時間、図３（ｂ）は２０分から１２０分の時間経過を示すグラフである。
【図４】実施例１におけるオオムギのアルミニウム耐性品種（Ｓｉｇｒｄｋｏｒｎ）とアルミニウム感受性品種（Ｋｅａｒｎｅｙ）とにおける、アルミニウムの濃度とアルミニウム誘導されたクエン酸分泌量の関係を示すグラフである。
【図５】実施例１におけるアルミニウム誘導されたクエン酸分泌のアニオンチャネル阻害剤による影響を示すグラフである。
【図６】実施例１における根の頂端のクエン酸シンセターゼ活性のアルミニウムによる影響を示すグラフである。
【図７】実施例２における４種類９品種の相対的な根の伸長と、アルミニウム誘導された有機酸分泌との相関関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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