(57)【要約】【課題】従来知られている技術と異なる観点から、メタノール資化性細菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させる技術を提供する。【解決手段】Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、前記微生物として、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたメタノール資化性細菌を用いる。【選択図】  図１
2004166595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、
前記微生物は、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されるように改変されたメタノール資化性細菌であり、前記Ｌ−アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸の製造法。
【請求項２】
前記メタノール資化性細菌はメチロフィラス属細菌である請求項１記載の方法。
【請求項３】
６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強されるようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンから選ばれる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されるように改変されたメタノール資化性細菌であって、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸を生産する能力を有する細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の製造法及びそれに用いる細菌に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸生産能が向上したメタン資化性細菌及びそれを用いたＬ−アミノ酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イロソイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸は、従来、主としてブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属に属するいわゆるコリネ型細菌を用いた発酵法により製造されている（非特許文献１）。また、バチルス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属（特許文献１）、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、アエロバクター属、キャンディダ属（特許文献２）、エシェリヒア属（特許文献３）等の微生物も、Ｌ−アミノ酸の製造に用いられている。
【０００３】
また、これらの微生物は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
【０００４】
ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりＬ−アミノ酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属（特許文献４）、プロタミノバクター属（特許文献５）、プロタミノバクター属及びメタノモナス属（特許文献６）、ミクロサイクラス属（特許文献７）、メチロバチルス属（特許文献８）、バチルス属（特許文献９）などに属する微生物を用いる方法が知られている。また本発明者らはこれまで、人工変異による育種および組換えＤＮＡ技術を使って、メチロフィラス属細菌を用いたＬ−アミノ酸製造法の開発を行ってきた（特許文献１０）。
【０００５】
一方、グルコース  ６−リン酸イソメラーゼ（特許文献１１）、フルクトースホスホトランスフェラーゼ（特許文献１２）、エノラーゼ（特許文献１３）等の解糖系酵素遺伝子を導入することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる技術も知られている。
【０００６】
ところで、多くのメタノール資化性細菌は、メタノール発酵経路の一つとして、エントナー・ドゥドロフ経路を有している。同経路は６−ホスホグルコン酸から２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸の反応を触媒する６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（以下、「ＥＤＤ」と略す）と２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を開裂してグリセルアルデヒド−３−リン酸とピルビン酸を生成する酵素２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（以下、「ＥＤＡ」と略す）から成る。ＥＤＤ及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ及びザイモモナス・モビリス等でクローニングされ、塩基配列が報告されている。エシェリヒア・コリのＥＤＤをコードする遺伝子（ｅｄｄ）及びＥＤＡをコードする遺伝子（ｅｄａ）の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｌ２０８９７として登録されている。また、ザイモモナス・モビリスのｅｄａの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｘ５８３６４として、ｅｄｄの塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ６０６１５  Ｍ３７９８２として、データベースに登録されている。
しかし、エントナー・ドゥドロフ経路とＬ−アミノ酸生産性との関係は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第３，２２０，９２９号
【特許文献２】
米国特許第３，５６３，８５７号
【特許文献３】
特開平５−２４４９７０号
【特許文献４】
特開昭４５−２５２７３号公報
【特許文献５】
特公昭４９−１２５５９０号公報
【特許文献６】
特開昭５０−２５７９０号公報
【特許文献７】
特開昭５２−１８８８６号公報
【特許文献８】
特開平４−９１７９３号公報
【特許文献９】
特開平３−５０５２８４号公報
【特許文献１０】
特願平１１−３６８０９７号
【特許文献１１】
国際公開パンフレット第０１／０２５４２号（ＷＯ  ０１／０２５４２  Ａ１）
【特許文献１２】
国際公開パンフレット第０１／４８１４６号（ＷＯ  ０１／４８１４６  Ａ１）
【特許文献１３】
国際公開パンフレット第０１／０２５４３号（ＷＯ  ０１／０２５４３  Ａ１）
【非特許文献１】
アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来知られている技術と異なる観点から、細菌のＬ−アミノ酸生産性を向上させる技術を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、糖リン酸化合物からピルビン酸合成に至る代謝経路のうち、エントナー・ドゥドロフ経路（以後、「ＥＤ経路」ともいう。）に着目した。グラム陰性の偏性メタノール資化性菌においてメタノールからＬ−リジン等のＬ−アミノ酸の合成原料となるピルビン酸に至る代謝経路の主なものは、エムデン・マイヤーホフ・パルナス経路（以後、「ＥＭＰ経路」と略する場合がある）やエントナー・ドゥドロフ経路であると考えられる。
まず、ＥＭＰ経路を利用して、ピルビン酸の供給を増やすために、本発明者らは、ホスホフルクトキナーゼやホスホグリセレートキナーゼの酵素活性を増強することを当初実施したが、これらの酵素活性の増強に当たっては、該当する酵素の遺伝子が、目的とするメタノール資化性細菌の細胞へ導入できなかったり、あるいは、導入しても最終生産物であるＬ−リジンの生産量に影響が無かった。
そのため、ＥＤ経路上の代謝産物の流れを強化すべく検討した。
【００１０】
ＥＤ経路を通して、ピルビン酸の供給を増やすためには、▲１▼６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ等の遺伝子を欠損又は弱化させる、あるいは▲２▼エントナー・ドゥドロフ経路を強化する、という２つの方法が考えられる。両者ともに、同じくピルビン酸供給量の向上を期待できるが、▲２▼の場合、活性の強弱を調節することで、ピルビン酸供給経路とリブロースモノリン酸経路の代謝のバランスをとることができ、リブロースモノリン酸経路の中間物質であるリブロース５リン酸や中間体の誘導体である核酸等の供給も可能であると考えられた。そして、種々検討を行った結果、エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、メタノール資化性菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
（１）Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、Ｌ−アミノ酸を培地中に生成蓄積させ、該培地よりＬ−アミノ酸を採取する、Ｌ−アミノ酸の製造法において、
前記微生物は、エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたメタノール資化性細菌であり、前記Ｌ−アミノ酸は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸から選ばれる、Ｌ−アミノ酸の製造法。
（２）前記細菌はメチロフィラス属細菌である（１）の方法。
（３）６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性が、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又は２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のこれらの遺伝子の発現が増強されるようにこれらの遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、（１）又は（２）の方法。
（４）Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンから選ばれる（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）エントナー・ドゥドロフ経路を有し、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増強されるように改変されたメタノール資化性細菌であって、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸を生産する能力を有する細菌。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
＜１＞本発明の細菌
本発明において用いられるメタノール資化性細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつ、エントナー・ドゥドロフ経路を有するメタノール資化性細菌である。
【００１４】
本発明において、「Ｌ−アミノ酸を生産する能力」とは、本発明の細菌を培養したときに、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積する能力をいう。このＬ−アミノ酸生産能は、メタノール資化性細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。本発明を適用することのできるＬ−アミノ酸としては、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸であり、具体的には、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−フェニルアラニン等が挙げられる。
【００１５】
後述の実施例に示すように、ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性を増強することによりエントナー・ドゥドロフ経路を強化された細菌は、Ｌ−バリン生成が増大した。Ｌ−バリンはピルビン酸から生成するので、Ｌ−バリンの生成が増大したことは、ピルビン酸の供給量が増大したことを示している。したがって、エントナー・ドゥドロフ経路を強化された細菌は、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸の生産能が上昇すると予想される。
【００１６】
エントナー・ドゥドロフ経路を有するメタノール資化性細菌として具体的には、メチロフィラス属、メチロバチラス属に属する細菌等が挙げられる。細菌がエントナー・ドゥドロフ経路を有するか否かは、例えば、菌体破砕液をグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を検出することによって決定することができる。グリセルアルデヒド−３−リン酸の生成が確認された細菌は、エントナー・ドゥドロフ経路を有する。
【００１７】
本発明においてメタノール資化性菌、即ち、メチロトローフとは、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強するように改変されることによって、Ｌ−アミノ酸生産能が増強又は付与され得る細菌である。具体的には、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）等のメチロフィラス属細菌、及び、メチロバチラス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）、メチロバチラス・フラゲラタム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｍ）等のメチロバチラス属細菌が挙げられる。
【００１８】
メチロフィラス属細菌としては具体的にはメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）があげられる。メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株はナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所  ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，  Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。
【００１９】
また、メチロバチラス・グリコゲネスとしては、Ｔ−１１株（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）、ＡＴＣＣ  ２１２７６株、  ＡＴＣＣ  ２１３７１株、ＡＴＲ８０株（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  （１９９４）、４２巻，  ｐ６７−７２に記載）、Ａ５１３株（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  （１９９４）、４２巻，  ｐ６７−７２に記載）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ  １１３７５株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所  ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，  Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。また、メチロバチラス・フラゲラタムとしては、ＫＴ株（Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  （１９８８），  １４９巻、ｐ４４１−４４６に記載）等が挙げられる。
【００２０】
本発明のメタノール資化性細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつ、上記のようなエントナー・ドゥドロフ経路を有する細菌であって、ＥＤＤ活性もしくはＥＤＡ活性、又はこれらの両方の活性が増強されたメタノール資化性細菌である。本発明の細菌は、好ましくはＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方が増強されたメタノール資化性細菌である。
【００２１】
「ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が増強された」とは、細胞当たりのＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性が、野生型のメタノール資化性細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりのＥＤＤ又はＥＤＡ分子の数が増加した場合や、ＥＤＤ又はＥＤＡ分子当たりのＥＤＤ又はＥＤＡの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型のメタノール資化性細菌とは、ＥＤＤ活性又はＥＤＡ活性増強する操作が行われていないメタノール資化性細菌である。
【００２２】
細菌のＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強は、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＥＤＤ及び／又はＥＤＡをコードする遺伝子断片を、目的とする細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを同細菌に導入して形質転換すればよい。ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性の両方を増強する場合は、ＥＤＤをコードする遺伝子断片及びＥＤＡをコードする遺伝子断片は、それぞれ別個に異なるベクターに搭載してもよいが、同じベクターに搭載することが好ましい。尚、Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌に上記組換えＤＮＡを導入してもよいが、野生型の細菌に上記組換えＤＮＡを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株にＬ−アミノ酸生産能を付与してもよい。
【００２３】
ＥＤＤをコードする遺伝子及びＥＤＡをコードする遺伝子は、エントナー・ドゥドロフ経路を有する細菌由来の遺伝子のいずれも使用することができる。具体的には、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ由来のＥＤＤをコードする遺伝子（ｅｄｄ）及びＥＤＡをコードする遺伝子（ｅｄａ）は、オペロンを形成していることが報告されている（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９２，  Ｊｕｌ；  １７４（１４）：  ４６３８−４６）。以下、ＥＤＤをコードする遺伝子をｅｄｄ、ＥＤＡをコードする遺伝子をｅｄａと記す。また、ザイモモナス属細菌の遺伝子も報告されており、これらの遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲ（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；  Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ５，  １８５  （１９８９）参照）、又は上記遺伝子の配列に基づいて作製したプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子を取得することができる。例えば、エシェリヒア・コリのｅｄｄ及びｅｄａを含むオペロン断片は、後述のプライマーｅｄｄ−Ｆ（配列番号１１）及びｅｄａ−Ｒ（配列番号１２）を用いたＰＣＲ法によって取得することができる。他の微生物のｅｄｄ及びｅｄａも、同様にして取得され得る。前記ハイブリダイゼーションの条件としては、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件が挙げられる。
【００２４】
染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｈ．  Ｓａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｉｕｒａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ  ｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２，  ６１９  （１９６３）、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
【００２５】
ＰＣＲ法により増幅されたｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子は、エシェリヒア・コリ等の細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＭＷ２１９，  ｐＳＴＶ２８，  ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９，  ｐＨＳＧ３９９，  ｐＨＳＧ３９８，  ＲＳＦ１０１０，  ｐＢＲ３２２，  ｐＡＣＹＣ１８４等が挙げられる。
【００２６】
上記のように調製した組換えＤＮＡをメチロフィラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７（１９９７））が挙げられる。
【００２７】
ｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。細菌の染色体ＤＮＡ上にｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
【００２８】
ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上のｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、ｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子の発現が強化され、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強される。これら発現調節配列の改変は、ｅｄｄ及び／又はｅｄａ遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００２９】
ＥＤＤ活性及びＥＤＡ活性が増強されたことは、菌体破砕液を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及び６−ホスホグルコン酸と混合し、６−ホスホグルコン酸を基質として生成するグリセルアルデヒド−３−リン酸を測定することによって、確認することができる。この反応において、反応後に残存した６−ホスホグルコン酸を、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼを用いて定量するか、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ過剰存在化で生成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて定量することによって、ＥＤＡ活性を測定することができる。尚、６−ホスホグルコン酸又はピルビン酸は、デヒドロゲナーゼ反応におけるＮＡＤＨの増加により定量することができる。また、ＥＤＤ活性は、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を基質として生成するピルビン酸を乳酸デヒドロゲナーゼを用いて検出することによって、測定することができる。
【００３０】
＜２＞本発明のメタノール資化性細菌
本発明の細菌は、上記のようにしてＥＤＤ活性もしくはＥＤＡ活性又はこれらの両方の活性が増強されるように改変され、かつ、ピルビン酸を中間体とする生合成経路によって生成するＬ−アミノ酸の生産能を有するメタノール資化性細菌である。前記Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、及びＬ−フェニルアラニン等が挙げられる。
【００３１】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するメタノール資化性細菌のＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強するように改変することによって得られる。また、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強するように改変されたメチロフィラス属細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することによっても、本発明のメタノール資化性細菌を得ることができる。また、本発明のメタノール資化性細菌は、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強するように改変されたことによってＬ−アミノ酸生産能が付与されたものであってもよい。
【００３２】
Ｌ−アミノ酸生産能を有するメタノール資化性細菌は、メタノール資化性細菌の野生株にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７〜１００頁参照）。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３３】
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。
【００３４】
次に、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素遺伝子の増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００３５】
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
メタノール資化性細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、メタノール資化性属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをメタノール資化性細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をＤＤＰＳ、アスパルトキナーゼをＡＫ、アスパルトキナーゼＩＩＩをＡＫＩＩＩと略すことがある。
【００３６】
ＤＤＰＳをコードする遺伝子及びＡＫをコードする遺伝子の供与微生物としては、メタノール資化性細菌中でＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはＥ．  ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））Ｋ−１２株及びメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードする遺伝子（ｄａｐＡ、Ｒｉｃｈａｕｄ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ２９７（１９８６））及びＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（ｌｙｓＣ、Ｃａｓｓａｎ，  Ｍ．，  Ｐａｒｓｏｔ，  Ｃ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｇ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２６１，  １０５２（１９８６））は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のｄａｐＡ及びｌｙｓＣを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。
【００３７】
本発明に用いるＤＤＰＳ及びＡＫは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の野生型ＤＤＰＳはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の野生型ＡＫＩＩＩはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、メタノール資化性細菌に導入するｄａｐＡ及びｌｙｓＣは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＤＤＰＳ及びＡＫＩＩＩをコードするものであることが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＤＤＰＳを「変異型ＤＤＰＳ」、変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡを「変異型ｄａｐＡ」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＥ．  ｃｏｌｉ由来のＡＫＩＩＩを「変異型ＡＫＩＩＩ」、変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡを「変異型ｌｙｓＣ」と呼ぶことがある。
【００３８】
尚、本発明においては、ＤＤＰＳ及びＡＫは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のＤＤＰＳはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００３９】
Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の野生型ｄａｐＡの塩基配列を配列番号１３に、同塩基配列によってコードされる野生型ＤＤＰＳのアミノ酸配列を配列番号１４に例示する。
【００４０】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとしては、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するＤＤＰＳをコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡとしては、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有するＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４１】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００４２】
また、メタノール資化性細菌で機能するベクターとしては、例えばメタノール資化性細菌で自律複製出来るプラスミドが挙げられる。具体的には、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えばｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ，  Ａ．Ｙ．，  Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，  Ｙ．Ｄ．  Ｐｌａｓｍｉｄ，  １９８６，  １６，  １６１−１６７）、あるいはｐＭＦＹ４２（ｇｅｎｅ，  ４４，  ５３（１９９０））、ｐＲＰ３０１、ｐＴＢ７０（Ｎａｔｕｒｅ，  ２８７，  ３９６，  （１９８０））等が挙げられる。
【００４３】
ｄａｐＡ及びｌｙｓＣとメチロフィラス属メタノール資化性細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ｄａｐＡ及びｌｙｓＣを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ｄａｐＡ及びｌｙｓＣは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００４４】
変異型ＤＤＰＳをコードする変異型ｄａｐＡ及び変異型ＡＫＩＩＩをコードする変異型ｌｙｓＣを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドＲＳＦＤ８０が知られている（ＷＯ９５／１６０４２号）。同プラスミドで形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株は、ＡＪ１２３９６と命名され、同株は１９９３年１０月２８日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３９３６として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８５９の受託番号のもとで寄託されている。ＲＳＦＤ８０は、ＡＪ１２３９６株から、公知の方法によって取得することができる。
【００４５】
ＲＳＦＤ８０に含まれている変異型ｄａｐＡは、配列番号１３に示す野生型ｄａｐＡの塩基配列において塩基番号５９７のＣがＴに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型ＤＤＰＳは、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する。また、ＲＳＦＤ８０に含まれている変異型ｌｙｓＣは、野生型ｌｙｓＣの塩基配列において塩基番号１６３８のＣがＴに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型ＡＫＩＩＩは、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する。
【００４６】
上記のように調製した組換えＤＮＡをメタノール資化性細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７（１９９７））が挙げられる。
【００４７】
ＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性の増強は、ｄａｐＡ及びｌｙｓＣをメタノール資化性細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。メタノール資化性細菌の染色体ＤＮＡ上にｄａｐＡ及びｌｙｓＣを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ｄａｐＡ及び／又はｌｙｓＣをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のｄａｐＡ及ｌｙｓＣのコピー数が上昇する結果、ＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性が増幅される。
【００４８】
目的遺伝子の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、目的遺伝子の発現が強化されることによって目的遺伝子がこードする酵素活性が増幅される。発現調節配列の増強は、目的遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００４９】
遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，    （１９８９）等に記載されている。
【００５０】
ＤＤＰＳ及びＡＫの増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以上、ＷＯ９６／４０９３４号参照）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平６−１０２０２８号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。
【００５１】
また、メタノール資化性菌としてメチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素は、ＷＯ  ００／６１７２３に開示されている。
【００５２】
さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（ＷＯ  ９５／２３８６４参照）。
【００５３】
上記のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強する手法は、他のＬ−アミノ酸ンについても同様に適用することができる。尚、本発明のメタノール資化性細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、ＥＤＤ活性及び／又はＥＤＡ活性が増強するように改変されたこと以外は、野生型の形質であってもよい。
【００５４】
また、Ｌ−アミノ酸の菌体外への排出に関与するタンパク質の活性を強化することによっても、Ｌ−アミノ酸生産能を向上させることができる。例えば、Ｌ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質としては、ｌｙｓＥ遺伝子によってコードされるＬｙｓＥタンパク質が知られている。尚、本発明者らは、ブレビバクテリウム属細菌に由来する野生型ｌｙｓＥ遺伝子は、メチロフィラス属細菌やメチロバチラス属細菌中では全く機能しないが、メチロトローフで機能するような改変が可能であることを確認している。このようなｌｙｓＥタンパク質の改変体としては、後記実施例に示すｌｙｓＥ２４が挙げられる。
【００５５】
ｌｙｓＥ遺伝子がコードするＬｙｓＥタンパク質は、６個の疎水性へリックス領域を有している。それらの疎水性へリックス領域のいくつかは膜貫通領域であると推定される。また、Ｎ末端から３番目と４番目の疎水性へリックス領域の間の領域は親水性であり、ループ構造をとると推定される。この親水性領域を本願発明においてはループ領域と呼ぶ。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型ｌｙｓＥの塩基配列及びＬｙｓＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。同アミノ酸配列において、疎水性へリックス領域は、５〜２０、３７〜５８、６７〜９３、１４６〜１６８、１８１〜２０３、２１１〜２３２に相当する。また、ループ領域は９４〜１４５に相当する。
【００５６】
本発明者らは、ｌｙｓＥ遺伝子はメタノール資化性菌においては致死的に働くが、ループ領域を持たない、あるいは実質的に疎水性ヘリックスのみからなるＬｙｓＥタンパク質の改変体をコードするＤＮＡは、メタノール資化性菌のＬ−リジン及び／又はＬ−アルギニンの細胞外への排出を促進することを見い出した。ｌｙｓＥ２４は、このような野生型ＬｙｓＥタンパク質が持つループ領域を持たない変異型ＬｙｓＥタンパク質、又は実質的に疎水性ヘリックスのみからなる変異型ＬｙｓＥタンパク質をコードする。
【００５７】
上記のような変異型ｌｙｓＥとしては、少なくとも一つ又は二つ以上の疎水性ヘリックスを有し、メタノール資化性菌に導入したときにＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進するものであれば特に制限されないが、具体的にはＮ末端から１番目〜６番目の疎水性ヘリックスのすべてを有する変異型ＬｙｓＥをコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、Ｎ末端から１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードするＤＮＡが挙げられる。前記ｌｙｓＥ２４は、このような１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドとをコードする変異型ｌｙｓＥの一例である。ｌｙｓＥ２４遺伝子には、３番目の疎水性ヘリックスをコードする領域の下流に終止コドンが変異により導入されているが、この終止コドンよりも下流の領域を欠失させると、ｌｙｓＥ２４遺伝子を導入したメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株はＬ−リジンを培地中に蓄積しないことを、発明者らは確認している。このことから、１番目〜３番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドと、４番目〜６番目の疎水性ヘリックスを含むペプチドがそれぞれ別個に翻訳され、メタノール資化性細菌中で機能しているものと推定される。いずれにしても、ｌｙｓＥ２４遺伝子をメタノール資化性細菌に導入すれば、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンの生産量が向上する。
【００５８】
前記のようなＬ−リジンの細胞外への排出に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわちｌｙｓＥ遺伝子またはその相同遺伝子の供与微生物としては、それらの遺伝子の改変体がメタノール資化性菌中でＬ−リジン排出活性を発現することができるものを保持する微生物であれば、いかなる微生物でも利用できる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。
【００５９】
メタノール資化性細菌においてアミノ酸の排出遺伝子を増強する場合は、その遺伝子断片を、メタノール資化性細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して、組換えＤＮＡを作製し、これをメタノール資化性細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。あるいは、トランスポゾンに搭載し、染色体への組み込みにより、また、メタノール資化性細菌内で強力転写を誘導するようなプロモーターを、その遺伝子の上流に連結させることも可能である。
【００６０】
＜３＞Ｌ−アミノ酸の製造
上記にようにして得られるＬ−アミノ酸生産能を有するメタノール資化性細菌を培地に培養し、該培養物中に同Ｌ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物から同Ｌ−アミノ酸を採取することにより、同Ｌ−アミノ酸を製造することができる。
【００６１】
本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養することができる。本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。
【００６２】
メタノールを主たる炭素源として用いると、Ｌ−リジン又はＬ−バリンを安価に製造することができる。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に０．００１〜３０％添加する。窒素源としては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。
【００６３】
培養は、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、ｐＨ５〜９、温度２０〜４５℃に保持して行われ、通常２４〜１２０時間で終了する。
培養物からのＬ−リジン又はＬ−バリンの採取は、通常イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もｐＨはＮａＯＨまたはＨＣｌで調整した。
【００６５】
（ＬＢ培地）
トリプトン・ペプトン（ディフコ社製）  １０ｇ／Ｌ
酵母エキス（ディフコ社製）                ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                                                                    １０ｇ／ＬｐＨ７．０
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。］
【００６６】
（ＬＢ寒天培地）
ＬＢ培地
バクトアガー                        １５ｇ／Ｌ
［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。］
【００６７】
（ＳＥＩＩ培地）
Ｋ２ＨＰＯ４                        １．９ｇ／Ｌ
ＮａＨ２ＰＯ４                      １．５６ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ０．２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                  ５ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ５μｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                    ２５μｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ２３μｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                    ７２ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                      ９．７ｍｇ／Ｌ
ＣａＣＯ３（関東化学製）  ３０ｇ／Ｌ
メタノール      ２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
ｐＨ７．０
［メタノール以外は１２１℃、１５分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。］
【００６８】
（ＳＥＩＩ寒天培地）
Ｋ２ＨＰＯ４                        １．９ｇ／Ｌ
ＮａＨ２ＰＯ４                        １．５６ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                  ５ｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ５μｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                    ２５μｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ２３μｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                    ７２ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                      ９．７ｍｇ／Ｌ
メタノール                    ０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
ｐＨ７．０
バクトアガー（ディフコ社製）    １５ｇ／Ｌ
［メタノール以外は１２１℃、１５分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。］
【実施例１】
【００６９】
＜１＞エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素遺伝子のクローン化
エントナー・ドゥドロフ経路を構成する酵素ＥＤＤ及びＥＤＡをそれぞれコードする遺伝子ｅｄｄ及びｅｄａは、エシェリヒア・コリ、ザイモモナス・モビリス等よりクローン化されている。メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株中でエシェリヒア・コリの遺伝子は発現可能であることが知られているので、エシェリヒア・コリのｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子をクローン化し、メチロフィラス属細菌中で発現させることとした。
（１）ｅｄｄ及びｅｄａを保持するプラスミドｐＭＷ−ＥＤＤＡの構築
【００７０】
エシェリヒア・コリにおいては両遺伝子はオぺロンを形成しており（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １９９２，  Ｊｕｌ；１７４（１４）：４６３８−４６）、すでに、公知の技術にて、それらを取得することが可能である。  そこで、両遺伝子を同時に増幅できるプライマー、ｅｄｄ−Ｆ（配列番号１１）及びｅｄａ−Ｒ（配列番号１２）を設計し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としＰＣＲにより両遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲは、宝酒造（株）製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、９４℃  １分の反応の後、９４℃  ３Ｏ秒、６０℃  ３Ｏ秒、７２℃  ３分からなる反応を３０サイクル行った。
【００７１】
次に、得られた増幅断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで完全分解し、プラスミドｐＭＷ２１９をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで完全分解したものと連結し、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造（株）から購入）を形質転換した。得られた形質転換体コロニーを２０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、目的とするプラスミドを得た。このプラスミドをｐＭＷ−ＥＤＤＡと命名した。
【００７２】
（２）ｅｄｄ及びｅｄａのメチロフィラス属細菌への導入用プラスミドｐＲＳｅｄｄａの構築
メチロフィラス属細菌にｅｄｄ及びｅｄａを導入するために、公知のプラスミドｐＲＳを用いて、ｅｄｄ及びｅｄａ導入用プラスミドｐＲＳｅｄｄａを構築した。ｐＲＳはＲＳＦ１０１０の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ，  Ａ．Ｙ．，  Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，  Ｙ．Ｄ．  Ｐｌａｓｍｉｄ，  １９８６，  １６，  １６１−１６７）に由来するｐＶＩＣ４０プラスミド（ＷＯ９０／０４６３６国際公開パンフレット、特表平３−５０１６８２号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００７３】
具体的には、ｐＲＳは以下のようにして構築した。ｐＶＩＣ４０プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、ベクター側を含む約８キロベースペア（以下、「ｋｂｐ」と記載）のＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。このように調製したｐＶＩＣ４０プラスミドのベクター領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて自己連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳを得た。
【００７４】
次に、このｐＲＳより、ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃを図１に示す方法で構築した。ｐＲＳベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約８キロベースペアのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、ｔａｃプロモーター領域を、ｐＲＫ２２３−３プラスミド（発現用ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を鋳型とし、配列番号１および２に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒のサイクルを３０サイクル行った）。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２を用いて回収した。
【００７５】
上記のように調製したｐＲＳベクター消化物と、ｔａｃプロモーター領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳｔａｃを得た。ｐＲＳベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とｔａｃプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、ｐＲＳｔａｃとして選択した。ｐＲＳｔａｃプラスミドはｐＲＳ上に遺伝子を発現させる装置としてｔａｃプロモーター領域を挿入したプラスミドである。
【００７６】
続いて、上記のｐＲＳｔａｃを、Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造製）およびＳａｐＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約８．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、（１）で構築したｐＭＷ−ＥＤＤＡを制限酵素ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００７７】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、目的とするプラスミドを得た。このプラスミドをｐＲＳｅｄｄａと命名した。ｐＲＳｅｄｄａは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００７８】
＜２＞メチロフィラス属細菌からのＬ−リジン生産菌構築
ｐＲＳｅｄｄａプラスミドのＬ−リジン生産に及ぼす影響を調べるために、メチロフィラス属細菌中で、ｐＲＳ由来のベクターと共存可能で、Ｌ−リジン排出活性タンパク質およびＤＤＰＳ酵素をコードする各遺伝子を増幅することが可能であるｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドを構築した。
【００７９】
（１）ｐＲＳｌｙｓＥの構築
コリネバクテリウム属細菌で知られているＬ−リジンの排出を促進する遺伝子の相同遺伝子であるｌｙｓＥ遺伝子をブレビバクテリウム属細菌よりクローニングし、メチロフィラス属細菌での発現を試みた。
【００８０】
上記のようにして得たｐＲＳｔａｃを、Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造製）およびＳａｐＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９．０ｋｂｐのＤＡＮ断片を回収した。
【００８１】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号５および６に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒）によりｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。このとき、ｌｙｓＥ遺伝子がメチロフィラス属細菌中で発現可能となるように、ｌｙｓＥ遺伝子の翻訳開始コドンより９〜１５ｂｐ塩基を、メチロフィラス属細菌で機能することがわかっている配列（Ｗｙｂｏｒｎ，  Ｎ．  Ｒ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｊ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｉｓ，  Ｓ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．Ｗ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２４０，  ３１４−３２２（１９９６））に変更するようにプライマーをデザインした。得られた断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳａｐＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで回収した。
【００８２】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｌｙｓＥ遺伝子領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥを得た（図１）。ｐＲＳｌｙｓＥは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｌｙｓＥ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００８３】
（２）メチロフィラス属細菌へのｐＲＳｌｙｓＥの導入
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入した。なお、対照として、ｐＲＳをｐＲＳｌｙｓＥと同様にしてＡＳ１株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＳでは１μｇのＤＮＡあたり数千個のコロニーを得たが、それに対してｐＲＳｌｙｓＥでは数個のコロニーしか得られなかった。
（２）メチロフィラス属細菌へのｐＲＳｌｙｓＥの導入
【００８４】
ｐＲＳｌｙｓＥが導入されたと思われる形質転換株よりプラスミドを抽出して塩基配列を調べたところ、調べたすべてのプラスミドにおいて、ｌｙｓＥをコードする領域内に自然変異が導入され、それらの変異のうちいくつかは、アミノ酸をコードするコドンが翻訳を停止させる停止コドンに置き換わるナンセンス変異が導入されていた。また、別のプラスミドではｌｙｓＥ遺伝子に欠失がみられた。これらのプラスミドに搭載されているｌｙｓＥは、いずれも、機能が失われていることが考えられた。
【００８５】
以上のように、全長のｌｙｓＥ遺伝子を搭載するｐＲＳｌｙｓＥのメチロフィラス・メチロトロファスへの導入頻度は極めて低く、また機能を失わせるような変異が導入されたｌｙｓＥ変異遺伝子を持つプラスミドのみが導入できたことと併せて考えると、メチロフィラス・メチロトロファスにｌｙｓＥ遺伝子を導入することは致死的であると考えられた。このことは、ｌｙｓＥ遺伝子が異種の細菌においてＬ−リジンの排出に関して万能に機能するものではないことを示している。
【００８６】
変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥを持つメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株を、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートに塗り広げ、３７℃にて１晩培養したのち、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて３４時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。その結果、変異型ｌｙｓＥ遺伝子が導入されてもＬ−リジンの排出が促進されたと思われる株はほとんど得られなかった。
【００８７】
（３）メチロフィラス属細菌でＬ−リジン排出活性を示す遺伝子の取得
前項で述べたように、既知のｌｙｓＥ遺伝子はメチロフィラス属細菌中では致死的であることが示唆され、機能が失われたような変異型遺伝子が多く得られた。
【００８８】
しかしながら、大多数の変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥの解析を行ううちに、メチロフィラス属細菌中で機能する変異型ｌｙｓＥ遺伝子を取得することができた。
【００８９】
この変異型ｌｙｓＥ遺伝子をｌｙｓＥ２４遺伝子と命名した。ｌｙｓＥ２４遺伝子の塩基配列を解析したところ、この変異は、アミノ酸置換が起こる変異ではなく、ｌｙｓＥの翻訳領域内のほぼ中央に終止コドンが導入されるナンセンス変異であることがわかった。
この変異型ｌｙｓＥ遺伝子をｌｙｓＥ２４遺伝子と命名した。ｌｙｓＥ２４遺伝子の塩基配列を解析したところ、この変異は、アミノ酸置換が起こる変異ではなく、ｌｙｓＥの翻訳領域内のほぼ中央に終止コドンが導入されるナンセンス変異であることがわかった。
【００９０】
ｌｙｓＥ２４の塩基配列を決定した結果を配列番号９に示す。対照としてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型ｌｙｓＥの塩基配列及びＬｙｓＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号７及び８に示す。ｌｙｓＥ２４では、配列番号７の３５５位のＧ（グアニン）のあとにＴ（チミン）が挿入されていた。このｌｙｓＥ２４を持つプラスミドをｐＲＳｌｙｓＥ２４と命名した。
【００９１】
ｌｙｓＥ２４の塩基配列を決定した結果を配列番号９に示す。対照として野生型のｌｙｓＥの塩基配列を配列番号７に示した。ｌｙｓＥ２４では、配列番号７の３５５位のＧ（グアニン）のあとにＴ（チミン）が挿入されていた。このｌｙｓＥ２４を持つプラスミドをｐＲＳｌｙｓＥ２４と命名した（図１）。
【００９２】
ｐＲＳｌｙｓＥ２４で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３０と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３６９として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４０の受託番号のもとで寄託されている。
ｌｙｓＥ２４遺伝子をメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株に導入することによって、培地中にＬ−リジンが蓄積することがわかった。これは、Ｌ−リジンの排出が促進されたことによると考えられた。
【００９３】
（４）ｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｄａｐＡの構築
Ｌ−リジン生合成系酵素遺伝子として、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ＊）を持つプラスミドを作製した。
【００９４】
ｐＲＳｔａｃをＳｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９５】
ｄａｐＡ＊遺伝子断片は、同遺伝子を含む公知のプラスミドＲＳＦＤ８０（ＷＯ９０／１６０４２号参照）を鋳型として、配列番号３および４に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒）により増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られたｄａｐＡ＊断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで分離後、約０．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９６】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｄａｐＡ＊遺伝子領域断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造社）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｄａｐＡプラスミドを得た。ｐＲＳｄａｐＡプラスミドは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｄａｐＡ＊遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
（５）ｌｙｓＥ２４及びｄａｐＡ＊を持つプラスミドの構築
ｌｙｓＥ２４とｄａｐＡ＊の組み合わせ効果を評価するために、ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドにｄａｐＡ＊遺伝子を挿入したプラスミドを、図２に示した方法で構築した。（３）項で作製したｐＲＳｌｙｓＥ２４を制限酵素ＳａｐＩで消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）にて末端を平滑化した。また、前項で構築したｐＲＳｄａｐＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｐＩで消化し、０．８％アガロースゲルにより約１ｋｂｐのｔａｃプロモーターおよびｄａｐＡ＊領域を含む断片を分離し、同断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて回収した。この断片を前記と同様に平滑化し、前記のｐＲＳｌｙｓＥ２４の消化物とＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて連結した。
【００９７】
上記の連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドを得た。このプラスミドは、ｌｙｓＥ２４とｄａｐＡ＊の各遺伝子の転写の向きが同一になるように配置されている。
【００９８】
ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株はＡＪ１３８３２と命名され、同株は２００１年６月４日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８３７１として寄託され、平成１４年５月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０４２の受託番号のもとで寄託されている。
【００９９】
（６）ｐＲＳベクターと共存可能なプラスミドｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡの構築
次に、ｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡからｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡを作成した。
ｐＢＢＲ１プラスミドはメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株中で複製可能であり、ｐＲＳベクターと共存することが可能であることが知られている（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７）；ＭｏＢｉＴｅｃ  ＧｍｂＨ社  Ｌｏｔｚｅｓｔｒａｓｓｅ  ２２ａ３７０８３  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ    Ｇｅｒｍａｎｙ、フナコシ株式会社から購入可能）。まず、ｐＢＢＲ１をＤｒａＩにて消化後、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約５．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１００】
次に、（５）項で構築したｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩにて消化後、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、ｌｙｓＥ２４及びｄａｐＡ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１０１】
このようにして得られたｐＢＢＲ１ベクター消化物と、ｌｙｓＥ２４及びｄａｐＡ遺伝子領域からなるＤＮＡ断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡを得た。
【０１０２】
上記のようにして得られたｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドをエレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株に導入した。なお、対照として、ｐＢＢＲ１をｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡと同様にしてＡＳ１株に導入した。
＜３＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるＬ−リジン生産
【０１０３】
上記のようにして得られたｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡプラスミドを保持するメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＡＳ１／ｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡと略すことがある）に、ｐＲＳｅｄｄａプラスミドをエレクトロポレーション法により導入して、Ｌ−リジン生産能を評価することにした。
【０１０４】
得られた形質転換株（以下、「ＡＳ１／ＰＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡ／ｐＲＳｅｄｄａ」ともいう）、および対象としてｐＲＳプラスミドを導入したメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１／ｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡ株（以下、「ＡＳ１／ｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡ／ｐＲＳ」ともいう）について、菌体内Ｌ−アミノ酸濃度および培養上清中のＬ−アミノ酸濃度を調べた。
【０１０５】
各形質転換株を５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＳＥＩＩプレートで３７℃にて１晩培養した後、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて４８時間振とう培養した。培養終了後、培養液の一部を用いて菌体を遠心分離によって除去し、培養上清に含まれるＬ−アミノ酸濃度をアミノ酸分析計（日立分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。
【０１０６】
結果を表１に示した。ＡＳ１／ｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡ／ｐＲＳｅｄｄａでは、培地中においてＡＳ１／ｐＢＢＲ−ｌｙｓＥｄａｐＡ／ｐＲＳと比較して、より高濃度のＬ−リジンを培地中に蓄積し、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子の強化によってＬ−リジンの生産性が向上していることがわかる。
【０１０７】
【表１】
2004166595.tif 000003
【０１０８】
以上のように、エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、Ｌ−リジン生産能を向上させ得ることが示された。
＜４＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株によるＬ−バリン生産
【０１０９】
次に、野生株であるメチロイフィラス・メチロトロファスＡＳ１株に、上記のようにして得られたｐＲＳｅｄｄａを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７））により導入した。なお、対照として、ｐＲＳを同様にしてＡＳ１株に導入した。
【０１１０】
得られた形質転換株（以下、「ＡＳ１／ｐＲＳｅｄｄａ」ともいう）、および対象としてｐＲＳプラスミドを導入したメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（以下、「ＡＳ１／ｐＲＳ」ともいう）について、菌体内Ｌ−アミノ酸濃度および培養上清中のＬ−アミノ酸濃度を調べた。
【０１１１】
各形質転換株を５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートで３７℃にて１晩培養した後、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて４８時間振とう培養した。培養終了後、培養液の一部を用いて菌体を遠心分離によって除去し、培養上清に含まれるＬ−アミノ酸濃度をアミノ酸分析計で定量した。
【０１１２】
結果を表２に示した。ＡＳ１／ｐＲＳｅｄｄａでは、培地中においてＡＳ１／ｐＲＳと比較して、より高濃度のＬ−バリンを培地中に蓄積し、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子の強化によってＬ−バリンの生産性が向上していることがわかる。
【０１１３】
【表２】
2004166595.tif 000004
【０１１４】
以上のように、エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、Ｌ−バリン生産能を向上させ得ることが示された。
【０１１５】
＜５＞エントナー・ドゥドロフ経路強化株による他のＬ−アミノ酸の生産能の検討
ＡＳ１／ｐＲＳｅｄｄａ及びＡＳ１／ｐＲＳを、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートで３７℃にて１晩培養した後、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて４８時間振とう培養した。培養終了後、培養液の一部を用いて菌体を遠心分離によって除去し、培養上清に含まれるＬ−アミノ酸濃度をアミノ酸分析計で定量した。
【０１１６】
結果を表３に示した。いずれのＬ−アミノ酸についても、ＡＳ１／ｐＲＳｅｄｄａはＡＳ１／ｐＲＳと比較してより高濃度のＬ−アミノ酸を培地中に蓄積し、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子の強化によって各種Ｌ−アミノ酸の生産性が向上していることがわかる。＜４＞項で示したＬ−バリン以外には、特にＬ−ロイシン、Ｌ−イロソイシンに関して大幅に生産性が向上している。
【０１１７】
【表３】
2004166595.tif 000005
【０１１８】
以上のように、エントナー・ドゥドロフ経路を強化することによって、各種Ｌ−アミノ酸生産能を向上させ得ることが示された。
【発明の効果】
本発明により、エントナー・ドゥドロフ経路を有するメタノール資化性細菌のＬ−アミノ酸生産能を向上させることができる。
【０１１９】
【配列表】
2004166595.tif 000006
2004166595.tif 000007
2004166595.tif 000008
2004166595.tif 000009
2004166595.tif 000010
2004166595.tif 000011
2004166595.tif 000012
2004166595.tif 000013
2004166595.tif 000014
2004166595.tif 000015
2004166595.tif 000016
2004166595.tif 000017
2004166595.tif 000018
2004166595.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【図１】ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃ、及びｐＲＳｔａｃにｌｙｓＥ遺伝子又はｌｙｓＥ２４遺伝子が挿入されたプラスミドｐＲＳｌｙｓＥ及びｐＲＳｌｙｓＥ２４の構築を示す図。
【図２】ｌｙｓＥ２４遺伝子とｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡの構築を示す図。
【図１】
2004166595.tif 000020
【図２】
2004166595.tif 000021