(57)【要約】【課題】改善された補酵素Ｑ１０−生産を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の提供。【解決手段】この課題は、ａ）スポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を突然変異誘発により遺伝子変化させ、かつｂ）突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を選択し、その際突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を、ａ）で使用したスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の増殖を阻害する条件下で培養し、その際その条件を突然変異誘発された菌株がａ）で使用したスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株に比較して上昇したＱ１０−生産により増殖阻害を克服し、発酵培地中で増殖するように選択し、かつｃ）発酵培地から単離する、ことを特徴とする、乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有する、突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を製造する方法により解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有する、突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を製造する方法において、
ａ）スポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を突然変異誘発により遺伝子変化させ、かつ
ｂ）突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を選択し、その際突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を、ａ）で使用したスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の増殖を阻害する条件下で培養し、その際その条件を突然変異誘発された菌株がａ）で使用したスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株に比較して上昇したＱ１０−生産により増殖阻害を克服し、発酵培地中で増殖するように選択し、かつ
ｃ）発酵培地から単離する、
ことを特徴とする、突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の製法。
【請求項２】
突然変異誘発が突然変異誘発物質または高エネルギーの照射をスポリジオボラス・ルイネニアエゲノムに作用させることにより生じ、突然変異誘発の際に３０〜９９％の致死率が生じる、請求項１記載の製法。
【請求項３】
乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の選択を酸化ストレスが生じる条件により行う、請求項１または２記載の製法。
【請求項４】
酸化ストレスをパラコート、過酸化水素または不飽和脂肪酸、例えばリノレン酸により生じさせる、請求項３記載の製法。
【請求項５】
乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の選択を呼吸鎖のインヒビターにより実施する、請求項１または２記載の製法。
【請求項６】
呼吸鎖のインヒビターがアンチマイシンＡ、ピエリシジン、ムシジン、ロテノンまたはメナジオンである、請求項５記載の製法。
【請求項７】
乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の選択をスポリジオボラス・ルイネニアエのＱ１０−生合成経路の１工程の阻害により実施する、請求項１または２記載の製法。
【請求項８】
スポリジオボラス・ルイネニアエのＱ１０−生合成経路の１工程の阻害を、グリホサート、ロバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、コンパクチンまたはエチオニンにより実施する、請求項７項記載の製法。
【請求項９】
乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載の製法により得られた突然変異スポリジオボラス・ルイネニアエ菌株。
【請求項１０】
請求項９記載の菌株の細胞を培養培地中で培養し、この細胞を増殖期の後に単離し、これからＱ１０を単離することを特徴とする、Ｑ１０の製法。
【請求項１１】
細胞の培養を流加培養法で実施し、その際バッチ法における最初の増殖期の後に、供給物の形で付加的に栄養源を添加供給して、その消費を補う、請求項１０記載の製法。
【請求項１２】
供給物中の栄養源がＣ−源、Ｎ−源またはこれらの混合物を包含する、請求項１１記載の製法。
【請求項１３】
供給物中のＣ−源がグリセリン、グルコース、ショ糖、糖蜜、マルトースまたはアセテートの群から選択され、Ｎ−源がアンモニアもしくはアンモニウム塩、酵母エキス、大豆サポニン、麦芽エキスまたはコーンスチープリカーの群から選択される、請求項１２記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された補酵素Ｑ１０−生産を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ（Sporidiobolus ruineniae）菌株の製法に関し、このように得られたスポリジオボラス・ルイネニアエ（S. ruineniae）種の菌株並びにユビキノン−１０（補酵素Ｑ１０、以下にＱ１０と呼称する）を生産するためのこの菌株の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
補酵素Ｑ１０は一般式：
【０００３】
【化１】
2004313187.tif 000002
を有するユビキノンの群からの化合物である。
【０００４】
Ｑ１０の化学的構造は、環置換キノン誘導体および一般式−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）−ＣＨ２−のイソプレン単位ｎ個の疎水性鎖からなり、前記式により記載される。イソプレン単位の数値ｎは前記有機体のユビキノンに関して特異的である。
【０００５】
Ｑ１０は前記一般式のユビキノンであり、この際Ｑ１０中のイソプレン単位の数値ｎはｎ＝１０である（Ｃ−原子５０のイソプレン鎖に相当する）。Ｑ１０は天然の有機体中に広く分布しており、とりわけヒト、その他の動物および植物界からの高度な有機体中に、または種々の種類のバクテリア、真菌または酵母中にも分布している。他の公知のユビキノンはＱ６（イースト）、Ｑ８（Ｅ.コリ）、Ｑ９（ロドバクター・カプスラツス(Rhodobacter capsulatus)）である。
【０００６】
Ｑ１０の化学構造はその生理学化学的機能、並びに細胞の中での局在化を引き起こす。キノイド構造は生化学的エフェクター機能を有し、可逆的な電子受容（２つの電子による還元、ヒドロキノン型）および電子放出（酸化、キノン型）を可能とする。中間工程としてセミキノン型（電子１個のみの受容もしくは放出）も公知である。疎水性イソプレン鎖は細胞膜中へのＱ１０の局在化に作用する。
【０００７】
Ｑ１０の公知の生化学的および生理学的機能に属するのは（総括的な文献“Biochemical Functions of Coenzyme Q10”. F.L. Crane, J. of the Am. College of Nutrition (2001) 20: 591-598中に総括されている）：
−  呼吸鎖における電子キャリヤー（エネルギー移動）、
−  細胞膜中の酸化的損傷に対する保護（酸化防止機能および他の酸化防止剤の再生）、
−  細胞増殖の刺激および細胞死の阻害
である。
【０００８】
この生化学的および生理学的機能のために、Ｑ１０は多くの分野、例えば医薬品、食料品および化粧品において使用される。
【０００９】
医薬品の分野におけるＱ１０に関する公知使用分野は、心不全およびその他の心臓血管系疾患である。食料品の分野においてはＱ１０はビタミン製剤中の栄養補助剤として使用される。化粧品の分野においてはＱ１０は最近、肌用クリーム中の添加剤としておよび歯の衛生用剤中への使用がテストされている。
【００１０】
Ｑ１０に関する安価な化学的合成法は知られていない。Ｑ１０の製造は天然に存在する供給源からの抽出により行われる。天然に存在する供給源中のＱ１０含有量は一般に僅かであり、抽出によるＱ１０の獲得は不経済である。Ｑ１０含量が十分に高い天然の供給源は僅かである（例えば、幾つかの僅かな微生物または植物油である）。従って、上昇する需要にもかかわらずＱ１０に関する値段は今なお非常に高値である。
【００１１】
比較的高いＱ１０−生産を有する種々の微生物が記載されている。細菌性の生産体は特に、アグロバクテリウム、ロドバクターまたはヒフォモナス属からの菌株に属する。一部高いＱ１０−生産性が記載されているが、商業的な利用は未知である。
【００１２】
Ｑ１０−生産を有する公知酵母菌株は代表的なものとして、例えばスポロボロマイセス、ロードトルラ、オオスポリジウムおよびスポリジオボラスの属からのものである。すでに１９７８年に、スポリジオボラス・ルイネニアエ種の特別な菌株が、バイオマスｇ当たり０.９２ｍｇのＱ１０生産性を有する良好なＱ１０の生産菌であることは公知であった（ＵＳ４０７０２４４）。これは公知のＱ１０−生産酵母菌の中でも最も高い生産性に属する。
【特許文献１】ＵＳ４０７０２４４
【非特許文献１】“Biochemical Functions of Coenzyme Q10”. F.L. Crane, J. of the Am. College of Nutrition (2001) 20: 591-598
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
早期に発見された、スポリジオボラス・ルイネニアエの良好なＱ１０−生産体としての特性にもかかわらず、それ以来、Ｑ１０−製造のためにスポリジオボラス・ルイネニアエを商業的な使用に導く改善に関する記載は全くない。改善されたＱ１０生産を有するＳ.ルイネニアエの単離のための方法並びにＱ１０製造のための発酵法の開発は全く公知でないということは特別なことであり、このことはスポリジオボラス・ルイネニアエの開発の際に困難があることを推測させる。この困難は本願により克服された。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、乾燥バイオマスｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより大きなＱ１０−生産性を有する、突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を製造する方法に関し、
ａ）スポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を突然変異誘発により遺伝子変化させ、かつ
ｂ）突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を選択し、その際突然変異誘発されたスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株を、ａ）で使用したスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株の増殖を阻害する条件下で培養し、その際その条件を突然変異誘発された菌株がａ）で使用したスポリジオボラス・ルイネニアエ菌株に比較して上昇したＱ１０−生産により増殖阻害を克服し、発酵培地中で増殖するように選択し、かつ
ｃ）発酵培地から単離する、
ことを特徴とする。
【００１５】
微生物中のＱ１０の生合成には２つの物質代謝工程が関与しており、すなわち芳香族アミノ酸への合成工程およびイソプレノイド物質代謝が関与している。ユビキノンの生合成に関する詳細な記載は“Ubiquinone Biosynthesis in Microorganisms”, R. Meganathan, FEMS Microbiology Letters (2001) 203:131-139中に開示されている。
【００１６】
生化学的機能および生合成工程の認識により本発明の方法においては改善されたＱ１０−生産を有する菌株を単離することができる。本発明による方法の原理（スクリーニング）は選択的な細胞増殖に起因する：Ｓ．ルイネニアエ細胞を通常細胞増殖が押さえられる条件下に培養する。この増殖阻害条件は、細胞を上昇したＱ１０生産により増殖阻害を克服し、再び増殖することができるように選択する。改良された菌株の上昇したＱ１０生産はスクリーニングの後に、増殖阻害物質の不存在でも観察されるべきである。
【００１７】
その際、上昇したＱ１０−生産は種々の方法で遂行することができるが、常にＳ．ルイネニアエ菌株の遺伝的変化に起因する。Ｓ．ルイネニアエ中での上昇したＱ１０−生産に導く遺伝学的変化は、有利に突然変異誘発物質または高エネルギー線をＳ．ルイネニアエゲノムに作用させることにより（突然変誘発）、種々のＳ．ルイネニアエ細胞の融合およびこれにより惹起した遺伝的組換え（いわゆる“ゲノムのかき混ぜ”）により、または遺伝子工学的方法でＱ１０生合成工程における所定の介入により実施する。変化した特性、例えば上昇したＱ１０−生産を有する突然変異体は好適な選択条件により同定することができる。
【００１８】
突然変異誘発のために好適な物質はＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、ジメチルスルフェート（ＤＭＳ）およびその他の比較可能な全ての突然変異誘発物質である。遺伝的損傷を引き起こす照射線はエネルギーの高い、短波長のＵＶ光、Ｘ−線または放射線である。
【００１９】
方向性のない遺伝的素質の変化が、Ｓ．ルイネニアエの突然変異体中のＱ１０生産を上昇する効果をもたらす、その他の種類の遺伝的損傷を引き起こす物質または放射線も好適である。
【００２０】
突然変異誘発のために有利に使用するのは、ＮＧ、ＥＭＳおよびＵＶ−放射線である。ＮＧ−放射線およびＵＶ−放射線は特に突然変異誘発に有利に使用される。
【００２１】
突然変異誘発の際には、突然変異原を、突然変異誘発されたＳ．ルイネニアエ細胞の致死率が引き続く選択の前に、３０〜９９％に達する量で使用する。この突然変異誘発における有利な致死率はＳ．ルイネニアエ細胞の４０〜９０％である。特に有利な致死率はＳ．ルイネニアエ細胞の５０〜９０％である。このことは、例えばＮＧ−濃度０.０１〜０.０６ｍｇ／ｍｌにより達せられる。
【００２２】
選択的細胞増殖により改善されたＱ１０−生産を有する突然変異体を本発明により単離するために、種々の方法を使用することができる。
【００２３】
選択的細胞増殖の条件は、Ｑ１０−生合成経路のレベルで生じさせることができる。選択条件によりＱ１０−生合成の個々の生合成工程を阻害することができる。これに属するのは芳香族アミノ酸の４−ヒドロキシ安息香酸、および引き続くチロシンへの生合成経路の全ての工程、およびイソプレン側鎖のための生合成経路の全ての工程が属する。
【００２４】
この生化学的合成経路の競合インヒビター、例えばＮ−ホスホノメチルグリシン（名称グリホサート下にも、もしくは概要からも公知）によるシキメートからコリスメートの工程への芳香族アミノ酸の生合成の阻害が有利である。
【００２５】
芳香族アミノ酸の生合成経路をシキメートからコリスメートへの工程で、この生化学的合成工程の競合的インヒビター、例えばＮ−ホスホノメチルグリシン（グリホサートもしくはラウンドアップ（Round Up）としても公知である）により阻害することは有利である。
【００２６】
メバロン酸の合成のレベルでのイソプレン側鎖の合成の競合的阻害も有利である。特に好適であるのは酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの競合的阻害物質（いわゆる、スタチン（Statine）もしくはコレステリン降下剤）である。好適な選択的阻害物質はスタチン、例えばロバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチンおよびコンパクチン（メバスタチン）、それぞれその遊離形またはそのラクトン型、もしくはＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼの阻害により作用する任意の種類の阻害物質、例えばメバロネート（これはＨＭＧ−ＣｏＡ−レダクターゼの合成に影響を与える（Dimster-Denk, 1994））である。特に有利であるのはロバスタチンおよびセリバスタチンである。
【００２７】
改善されたＱ１０−生産を有するＳ．ルイネニアエ菌株の選択のために好適であるが、これに制限されない、イソプレノイドに導く生合成経路からの更なる反応工程はゲラニルピロホスフェートに、ファルネシルピロホスフェートに、スクワレンにまたは例えばフィトエンに導く反応工程である。
【００２８】
Ｑ１０−キノン骨格の生合成は３つのメチル化工程を包含し、この際Ｓ−アデノシルメチオニンはメチル基のドナーとして働く。Ｑ１０−生産を上昇させることの可能な、Ｓ−アデノシルメチオニンの上昇したレベルを有する菌株は、例えば選択的な試薬、エチオニン、メチオニン類似体を用いて単離することができる。
【００２９】
改善されたＱ１０−生産を有するＳ．ルイネニアエ菌株のその他の有利な本発明方法は、Ｑ１０の生化学的機能を介して行われる。Ｑ１０の抗酸化作用のために、酸化ストレスが生じる全ての条件が本発明による選択法に好適である。酸化ストレスを生じさせる試薬は、例えば活性化酸素種である。これには過酸化水素および過酸化水素から誘導される全ての可能なペルオキシド、並びにその場で過酸化水素と他の物質とから生じる全ての反応性の酸化性種を挙げることができる。このための例は、過酸化水素およびリノレン酸もしくは一般的に不飽和脂肪酸からなる組合せである。１つまたは複数の不飽和基を有する脂肪酸からの反応性リピドペルオキシドの形成はDo等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 7534-7539に記載されている。反応性酸素種に挙げることのできるのは更にスーパーオキシドラジカルもしくはスーパーオキシドラジカルを生じるために好適である化合物、例えばパラコート（１,１′−ジメチル−４,４′−ビピリジニウムジクロリド、並びにメチルビオロゲンまたはグラモキソンとも呼ばれる）を挙げることができる。更にヒドロキシルラジカルおよびヒドロキシルラジカルを形成するために好適な化合物がこの群に属する。更に、細胞に熱ショックを与えることにより、細胞への酸化ストレスを生じさせることができる。
【００３０】
酸化ストレスによる選択法のための有利な試薬は、過酸化水素、これから誘導されるペルオキシド、並びに過酸化水素と他の物質の組合せから生じる反応性の酸化性種、およびスーパーオキシドラジカルを形成することのできる化合物、例えばパラコート、その他に不飽和脂肪酸、例えばリノレン酸である。酸化ストレスによる選択法のための、特に有利な試薬は過酸化水素、パラコートおよびリノレン酸もしくはその他の１つまたは複数の不飽和基を有する脂肪酸またはこれらの試薬の組合せである。
【００３１】
有利な本発明の更なる方法として、改善されたＱ１０−生産を有するＳ．ルイネニアエの選択のために好適であるＱ１０の第２の生化学的機能は、呼吸鎖における電子キャリヤーとしてのＱ１０の機能である。この機能により、呼吸鎖の機能を阻害することのできるインヒビターが改善されたＱ１０生産を有する細胞の選択のために好適である。Ｑ１０は呼吸鎖において、一方では錯体ＩおよびＩＩの間の（電子受容）および他方では錯体ＩＩＩへの（電子放出）電子キャリヤーとして働く。呼吸鎖におけるＱ１０の機能は総括的な文献“Biochemical Functions of Coenzyme Q10”. F. L. Crane, J. of the Am. College of Nutrition (2001) 20: 591-598に記載されている。
【００３２】
インヒビターとして呼吸鎖の機能を阻害することのできる種々の化合物は公知である（A. Tzagoloffによる“Mitochondria”, p 92-95, 1982 Plenum Press New York, ISBN 0-306-40778-7参照）。一般的なインヒビター、例えばシアニドまたは一酸化炭素の他に、特にＱ１０の構造類似体が本発明による改善されたＱ１０生産を有するＳ．ルイネニアエ菌株の単離のために好適である。呼吸鎖の好適なインヒビターの例は、アンチマイシン、特にアンチマイシンＡ、ロテノン、アモバルビタール、カプサイシン、ＭＰＰ＋、ミクソチアゾール、ムシジン、メナジオンまたはピエリシジンのような化合物である。有利なインヒビターは、メナジオン、ロテノン、アンチマイシンＡおよびピエリシジンである。特に有利なインヒビターはメナジオン、アンチマイシンＡおよびピエリシジンである。
【００３３】
改善されたＱ１０−生産を有するＳ．ルイネニアエ菌株の単離のための前記選択試薬は、一般的に考慮可能な濃度で並びに任意の可能な相互の組合せを使用することができる。  選択的な試薬は有利に、０.００５％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）（パラコート、過酸化水素）、５ｍＭ〜５００ｍＭ（リノレン酸）、０.００１ｍＭ〜１ｍＭ（アンチマイシンＡ、ピエリシジンＡ、メナジオン）の濃度で使用する。
【００３４】
選択的な試薬は有利に、０.０１％（ｗ／ｖ）〜０.３％（ｗ／ｖ）（パラコート）、２０ｍＭ〜３００ｍＭ（リノレン酸）、０.０１ｍＭ〜０.５ｍＭ（アンチマイシンＡ、ピエリシジンＡ、メナジオン）の濃度で使用する。
【００３５】
前記の有利な濃度範囲において、選択試薬の有利な組合せは、過酸化水素＋パラコート、過酸化水素＋リノレン酸、パラコート＋リノレン酸、パラコート＋リノレン酸＋ピエリシジンＡ、パラコート＋アンチマイシンＡ並びにパラコート＋ピエリシジンである。
【００３６】
前記の特に有利な濃度範囲において特に有利であるのは、過酸化水素およびパラコートの組合せ、過酸化水素およびリノレン酸の組合せ、パラコートおよびリノレン酸の組合せ、並びにパラコートおよびリノレン酸およびピエリシジンＡの組合せである。
【００３７】
改善されたＱ１０−生産を有するＳ．ルイネニアエの突然変異体は以下の本発明方法により単離される。Ｓ．ルイネニアエをすでに記載した方法で出突然変異誘発する。本発明による選択条件下に増殖する突然変異体をつまみとり、更に培養する。改善されたＱ１０−生産を有する突然変異体の選択のための比較試験は振盪フラスコ中での培養により実施する。
【００３８】
単離した突然変異体を培養培地中で液体培養し、バイオマスを製造する。このバイオマスを単離し、これから公知法でＱ１０を抽出する。Ｑ１０の量を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で定量的に測定し、その際Ｑ１０−測定のための任意の定量法が好適である。
【００３９】
種々の突然変異体のＱ１０−生産を出発菌株と比較して、最も高いＱ１０−生産の突然変異体を選択し、前記の突然変異誘発および選択の新たなラウンドを行う。この際、新たな突然変異誘発および選択の条件は前に定義した有利な条件により選択する。この方法を用いてＱ１０のバイオ工学的生産のために好適であり、従来技術に対して明らかに改善されている、Ｓ．ルイネニアエの本発明による菌株を単離することが達成される。そのような菌株は有利には１〜１０ラウンドの突然変異誘および選択、特に有利には２〜６ラウンドの突然変異誘および選択により得られる。
【００４０】
こうして、本発明による方法はＳ．ルイネニアエの明らかに改善されたＱ１０−生産菌株を獲得することを可能にする。Ｓ．ルイネニアエの明らかに改善されたＱ１０−生産菌株とは、そのＱ１０−生産性がＵＳ４０７０２４４に開示されたバイオマスｇ当たりＱ１０ ０.９２ｍｇという技術水準に対して、少なくとも５０％だけ上昇している菌株として定義される。こうしてこの菌株はバイオマス１ｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより多いＱ１０生産性を有する。こうして、本発明の突然変異誘発および選択の方法により得られる、バイオマス１ｇ当たりＱ１０ １.３８ｍｇより多いＱ１０生産性を有するＳ．ルイネニアエ菌株は同様に本発明の対象である。
【００４１】
スポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ−１菌株（Deutsch Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweigに寄託番号ＤＳＭ１５５５３でブタペスト条約により寄託）が、記載した方法において菌株を改善するために使用される。
【００４２】
本発明の更なる課題は、Ｑ１０−生産のための改善された方法を提供することである。この課題は、Ｓ．ルイネニアエの本発明により改善されたＱ１０−生産性菌株の細胞を培養培地中で培養し、この細胞を増殖時間７０〜１５０時間の後に単離することを特徴とする方法により解決する。Ｑ１０の生産のためには選択した菌株を培養培地中で培養し、バイオマスを製造する。この培養は当業者が通常行う方法で実施する。このためには、振盪フラスコ（実験室規模）中で培養するか、または発酵によっても実施することができる。
【００４３】
当業者に十分に公知の培養培地は文献に記載されており（ＵＳ４０７０２４４）、典型的には炭素源（Ｃ−源）、窒素源（Ｎ−源）並びにビタミン、塩および微量元素のような細胞増殖を最適化する添加物からなる。Ｃ−源はＳ．ルイネニアエによりバイオマス形成に利用することのできるものである。これには、グルコース、デキストロース、マルトース、アセテート（酢酸）、グリセリンおよびエタノールが属する。スポリジオボラス属の菌株の培養において利用可能なＣ−源は技術水準から公知である。この概要は、例えばオランダの微生物寄託機関“Centraalbureau voor Schimmelcultures”, CBSのインターネットのアドレス（www.cbs.knaw.nl/cbshome. html）から得られる。
【００４４】
スポリジオボラス属の菌株を培養するための有利なＣ−源は、グルコース、デンプン、マルトデキストリン、グリセリン、マルトース、酢酸およびその塩、サッカロース、糖蜜、クエン酸およびその塩である。
【００４５】
Ｎ−源はＳ．ルイネニアエによりバイオマス形成に利用することのできるものである。これには、アンモニア、ガス状またはＮＨ４ＯＨとして水溶液の形で、またはその塩として、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは硝酸アンモニウムが属する。その他にＮ−源として好適であるのは公知の硝酸塩、例えばＫＮＯ３、ＮａＮＯ３、硝酸アンモニウム、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＮＯ３）２並びにその他のＮ−源、例えば尿素が属する。Ｎ−源には複合アミノ酸混合物、例えば酵母エキス（この中には工業的な酵母エキス、例えばQuest社のＨＹイースト４４４が含まれる）、プロテオーゼペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、トウモロコシ膨潤水（コーンスチープリカー）並びにＮＺ−アミンおよび酵母窒素原基礎培地も属する。
【００４６】
培養はいわゆるバッチ法で行うことができ、その際スポリジオボラス・ルイネニアエの開始培地で培養培地を接種し、次いで細胞の増殖をその他の栄養源の添加なしに行う。
【００４７】
培養は、いわゆる流加培養法で実施することもでき、その際バッチ法での最初の増殖期の後に、付加的に栄養源を添加し（供給）、その消費を補う。この供給物はＣ−源、Ｎ−源またはこれら両者の混合物からなる。付加的に、他の培地成分並びに特異的にＱ１０−生産を上昇させる添加物をこの供給物に添加することもできる。
【００４８】
流加培養法による培養が有利である。
【００４９】
供給物中の有利なＣ−源はグリセリン、グルコース、サッカロース、糖蜜、マルトースまたはアセテートである。
【００５０】
供給物中の有利なＮ−源はアンモニア、ガス状またはＮＨ４ＯＨとして水溶液の形で、およびその塩である硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウム、更にＫＮＯ３、ＮａＮＯ３および硝酸アンモニウム、酵母エキス、ＨＹイースト４４４、プロテオーゼペプトン、麦芽エキス、大豆ペプトン、カザミノ酸、トウモロコシ膨潤水（コーンスチープリカー）並びにＮＺ−アミンおよび酵母窒素原基礎培地である。
【００５１】
供給物中への特に有利なＮ−源はアンモニアもしくはアンモニウム塩、酵母エキス、大豆ペプトン、麦芽エキスまたはコーンスチープリカーである。
【００５２】
培養培地はＱ１０−生産の上昇のために特異的に好適である成分（いわゆる誘導原）を添加することができる。これには例えばＰ−ヒドロキシ安息香酸並びにその塩およびエステル（ＵＳ４０７０２４４）、イソペンテノール（ＵＳ４２２０７１９）、チロシンおよびその生化学的前駆物質、例えばシキミ酸またはコリスミン酸および不飽和脂肪酸、例えば油酸（R. A. Hagerman等、Free Radical Research (2002) 36: 485-490）のような化合物を挙げることができる。
【００５３】
培養はスポリジオボラス・ルイネニアエの増殖およびＱ１０−生産に有利なｐＨ−および温度条件で行う。有用なｐＨ−範囲はｐＨ４〜ｐＨ１０である。有利なｐＨ−範囲はｐＨ４〜ｐＨ９である。特に有利であるのはｐＨ５.０〜ｐＨ８.５のｐＨ−範囲である。
【００５４】
Ｓ．ルイネニアエの増殖に有利な温度は２０℃〜４０℃である。特に有利な温度範囲は２５℃〜３５℃である。
【００５５】
Ｓ．ルイネニアエの増殖のためには酸素の十分な供給が必要である。酸素供給は有利に圧縮空気または純粋な酸素で行うことができる。
【００５６】
Ｑ１０−生産のために、Ｓ．ルイネニアエの増殖時間は１０〜２００時間である。有利な増殖時間は３０〜１２０時間である。特に有利な増殖時間は４０〜１００時間である。
【００５７】
前記の培養方法で得られたＳ．ルイネニアエ細胞はＱ１０−生成物を含有する。Ｑ１０をこの細胞から抽出し、単離することができる。しかしながら、この細胞からＱ１０を単離することなく、この細胞を直接更なる使用のために調製することもできる。
【００５８】
Ｑ１０の単離の方法は公知であり（ＵＳ４０７０２４４）、Ｑ１０を細胞膜から遊離させなければならない抽出工程を含む。この工程は、機械的に（破砕により）または溶剤により化学的に行うことのできる細胞構造の破壊を包含する。次いで、Ｑ１０を有機溶剤中に抽出し、不純成分を除去しなければならない。このことは沈殿法、クロマトグラフィー法または特異的な複合体形成（例えば、シクロデキストリン）により行うことができる。単離したＱ１０の同定のための種々の分析法は提供可能であるが、特に質量分析法、ＮＭＲ、ＵＶ／Ｖｉｓ−吸収スペクトル法、ＨＰＬＣまたはこれらの組合せがこれに属する。
【００５９】
Ｑ１０の有利な分析方法はＨＰＬＣである。
【００６０】
培養からのスポリジオボラス・ルイネニアエ細胞の、その中に含有されるＱ１０を予め精製することなく直接その後に使用するための調製法は、凍結乾燥、噴霧乾燥、熱乾燥並びに得られた乾燥バイオマスの破砕および過篩である。そのように調製されたＱ１０は、好適な条件下に更なる適用のために直接使用することができる。
【実施例】
【００６１】
次に実施例につき、本発明をより詳細に説明する。
【００６２】
例１：Ｑ１０の単離
Ｓ．ルイネニアエの機械的細胞砕解を行わないＱ１０−単離
この方法を改善されたＱ１０−生産を有する突然変異体のスクリーニングの際に使用した。ＹＰＧＣ−培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、５％グリセリン、２％トウモロコシ膨潤水（コーンスチープリカー））５０ｍｌをスポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ−１（ＤＳＭ１５５５３）で接種し、オルビタール振盪器（Orbitalschuettler：Infors、１４０ｒｐｍ）上で２８℃で１２０時間培養した。この配合物を遠心管（Falconroerchen）５０ｍｌ中に入れ、Ｓ．ルイネニアエ細胞を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、１０分間、Heraeus Megafuge 1.0R）、完全脱塩水３０ｍｌ中で洗浄し、完全脱塩水５ｍｌ中に再懸濁し、５０ｍｌ丸底フラスコ中に導入する。引き続き、この細胞懸濁液をエタノール／ドライアイス混合物中で、できるだけ均質に凍結し、かつ凍結乾燥した（Christ Gefriertrockner "alpha 2-4"）。乾燥バイオマス２００ｍｇを１２ｍｌガラス管中に秤量し、エタノール１０ｍｌを添加し、ガス状窒素で覆った。抽出のためには１夜４０℃で水平に振盪した。その後、懸濁液を遠心分離し、上澄みを集め、窒素で覆った。第２の抽出においては、沈殿物をエタノール８〜１０ｍｌ中に取り込み、窒素で覆い、十分に混合し、４０℃で２時間水平に振盪した。第３の抽出においては、経過を繰り返し、懸濁液を４０℃で１時間水平に振盪した。第１回目から３回目の抽出の上澄みを合して、完全脱塩水５ｍｌおよびｎ−ヘプタン１０ｍｌと混合し、相分離のために遠心分離した。有色の上方のｎ−ヘプタン相を５０ｍｌ丸底フラスコ中にピペットで移し、下相をもう１回ｎ−ヘプタン１０ｍｌで振出し、かつ相分離のために遠心分離した。ｎ−ヘプタン相を合して、溶剤を回転蒸発器を用いて除去した。帯赤色の残分が残り、これをＴＨＦ１ｍｌ中に取り込み、較正したＨＰＬＣによる定量測定のために使用した。
【００６３】
Ｓ．ルイネニアエの機械的細胞砕解を用いるＱ１０−単離：
この方法は発酵試料のＱ１０−測定のために使用した。発酵から採取した細胞懸濁液（例６および７参照）２５ｍｌを５０ｍｌの遠心分離管（Falconroerchen）中に供給し、Ｓ．ルイネニアエ細胞を遠心分離し（３０００ｒｐｍ１０分間、Heraeus Megafuge 1.0R）かつ細胞ペレットを一回水で洗浄した。この細胞ペレットを水１０ｍｌ中に懸濁させ、風袋の質量を測定した５０ｍｌ丸底フラスコ中に導入する。この細胞懸濁液を凍結し、かつ一夜凍結乾燥し（Christ Gefriertrockner "alpha 2-4"）、引き続き秤量により乾燥バイオマスを測定した。次いで、いわゆるジスメンブレーター（Dismembrator; Braun, Melsungen）で機械的に細胞砕解した。このためには、乾燥バイオマス３００ｍｇをこのジスメンブレーターに適合する３ｍｌテフロン室に秤量し、鋼製の球（直径５ｍｍ）をこれに添加し、テフロン室を密閉し、液体窒素中で凍結した。引き続き、低温凍結したテフロン室をジスメンブレーター中に装着し、２分間振動数２０００／分で振盪した。このように機械的に砕解した乾燥バイオマス２００ｍｇを１２ｍｌガラス管中に秤量し、ｎ−ヘプタン８ｍｌを添加して、１夜４０℃で振盪した。次いで、この配合物を遠心分離し（３０００ｒｐｍ、１０分間、Heraeus Zentrifuge）、有機相を１００ｍｌガラスフラスコ中に移した。ｎ−ヘプタンでの抽出を更に２回繰り返した（４０℃でそれぞれ２時間振盪）。ｎ−ヘプタン相を合して溶剤を回転蒸発器を用いて除去した。帯赤色の残分が残り、これをＴＨＦ１ｍｌ中に取り込み、較正したＨＰＬＣによる定量測定のために使用した。
【００６４】
較正したＨＰＬＣによるＱ１０−生産の定量：
Ｑ１０含有試料の定量を較正したＨＰＬＣにより行った。Elite Hy-Purity C18カラムを備えるAgilent 1100 HPLC（製造者、Phenomenex）を使用した。溶離剤（定組成）はアセトニトリル７１％（ｖ／ｖ）、ジクロロメタン２２％（ｖ／ｖ）、メタノール４％（ｖ／ｖ）、Ｈ２Ｏ２％およびプロピオン酸１％（ｖ／ｖ）からなる組成であった。液体速度は２ｍｌ／分であった。カラム温度は室温であった。担持体積は５μｌであった。検出器は、ピーク面積を定量測定するためのインテグレータと組み合わせたＨＰダイオードアレー検出器（Hewlett Packard）であった。波長２８０ｎｍで測定した。較正のためには、ＴＨＦ中のＱ１０のスタンダード溶液（Sigma）０.２ｍｇ／ｍｌを使用した。記載した条件下でのＱ１０の保持時間は１０.３分間であった。ピークのＵＶ−スペクトルを定量すべき試料中の生成物ピークの同定および純度測定のために使用した。未知の試料のＱ１０ピーク面積に対するＱ１０スタンダード溶液のピーク面積の比較から、Ｑ１０量は定量的に測定された。定量的なＨＰＬＣ測定から、Ｑ１０−体積生産（Ｑ１０  ｍｇ／ｌ培養培地）およびＱ１０−生産性（Ｑ１０  ｍｇ／ｇ乾燥バイオマス）を測定した。
【００６５】
例２：
ＵＶ−照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＧ）を用いるスポリジオボラス・ルイネニアエの突然変異誘発
ＹＰＤ−プレート上でのＵＶ−突然変異誘発：
スポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ−１を振盪フラスコ培養でＹＰＤ−培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）中で２８℃で４８時間培養した。その後、培地を光学密度ＯＤ６００ ０.１に希釈し、その０.１ｍｌをＹＰＤ−寒天培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース、１.５％寒天）上に塗布した。その後、このプレートをＵＶ−光に露光した（ＵＶ光源：ＵＶシェード  ＴＦＰ  ２０Ｍ、６×１５Ｗ、２１３ｎｍ、 Firma Vilbert Lourmat, フランス製）。予備実験において、スポリジオボラス・ルイネニアエ細胞の所望の致死率に導く照射量（照射時間および照射強度）を測定した。致死率は５０〜９９％の間であるべきである。この方法でＵＶ−突然変異誘発された細胞を２８℃で２〜５日間、コロニーが可視になるまでインキュベートした。並行する配合物においてはスポリジオボラス・ルイネニアエに選択圧をかけ、Ｑ１０−過剰生産を行う突然変異体が有利な増殖を達成する添加物を有するＹＰＤ−プレートを使用した（例３および４を参照）。
【００６６】
細胞懸濁液中のＵＶ−突然変異誘発
スポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ−１を振盪フラスコ培養でＹＰＤ−培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）中で２８℃で４８時間培養した。この前培養物で、新鮮なＹＰＤ−培地を接種し、同じ条件下で培地をＳ．ルイネニアエ細胞がＯＤ６００ ０.４を達成するまで培養した。この細胞懸濁液の０.５ｍｌを遠心分離し、０.９％ＮａＣｌ−溶液２ｍｌ中に再懸濁し、滅菌ペトリシャーレ中でＵＶ処理に２０、３０および４０秒間露出した（ＵＶ光源：ＵＶシェード  ＴＦＰ  ２０Ｍ、６×１５Ｗ、２１３ｎｍ、 Firma Vilbert Lourmat, フランス製）。引き続き、突然変異誘発された細胞をＹＰＤ−プレート上に塗布し、２８℃で２〜５日間、コロニーが可視になるまでインキュベートした。並行する配合物においてはスポリジオボラス・ルイネニアエに選択圧をかけ、Ｑ１０−過剰生産を行う突然変異体が有利な増殖を達成する添加物を有するＹＰＤ−プレートを使用した（例３および４参照）。
【００６７】
ＮＧ−突然変異誘発
スポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ−１を振盪フラスコ培養でＹＰＤ−培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％グルコース）中で２８℃で４８時間培養した。この前培養物で、新鮮なＹＰＤ−培地を接種し、同じ条件下で培地をＳ．ルイネニアエ細胞がＯＤ６００ １.０を達成するまで培養した。この細胞懸濁液の１０ｍｌを遠心分離し、クエン酸緩衝液（０.１ＭＮａ−シトレート、ｐＨ５.５）１０ｍｌ中で洗浄し、１ｍｌの部分量でクエン酸緩衝液中で種々の量のＮＧ（０.０１〜０.０６ｍｇ／ｍｌ）と共に、２８℃で１時間、試験管中でインキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、リン酸緩衝液（０.１ＭＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨでｐＨ７.０に調節）１ｍｌ中で洗浄し、種々の希釈でＹＰＤ−プレート上に担持した。このプレートを２８℃で２〜５日間、コロニーが可視になるまでインキュベートした。並行する配合物においてはスポリジオボラス・ルイネニアエに選択圧をかけ、Ｑ１０−過剰生産を行う突然変異体が有利な増殖を達成する添加物を有するＹＰＤ−プレートを使用した（例３および４参照）。
【００６８】
ここに記載した方法は、改善されたＱ１０−生産を有するスポリジオボラス・ルイネニアエの突然変異体を単離するために好適である。この方法は、特に改善されたＱ１０−生産を有する突然変異体を選択し、次のラウンドの突然変異誘発および選択のための出発菌株として使用するという、繰り返しの突然変異誘発および選択のラウンドにより、Ｓ．ルイネニアエのＱ１０−生産を著しい程度で改善するために、特に好適である（以下の例を参照）。
【００６９】
例３：
改善されたＱ１０−生産を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ突然変異体の選択
Ｓ．ルイネニアエの突然変異体を例２に記載されているように製造し、かつ選択条件下に培養した。この選択増殖条件を、突然変異によりＱ１０−物質代謝において上昇したＱ１０生産することが可能であるような突然変異体を単離することができるように選択した。
【００７０】
選択試薬を、突然変異誘発のために使用した出発菌株の増殖が５０％〜９０％だけ低下する濃度で使用した。他に記載のない限り、選択試薬をＹＰＤ−プレートに添加混合し、例２で製造した突然変異誘発した細胞をプレートに塗布した。
【００７１】
個別に次の選択条件を選択した：
パラコートを０.１〜０.５％（ｗ／ｖ）の濃度でＹＰＤ−プレートに添加した。メナジオン（２−メチル−１,４−ナフトキノン）を３μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌの濃度でＹＰＤ−プレートに添加した。アンチマイシンをＹＰＤ−プレートに５〜１００μＭの濃度で、ピエリシジンＡを２０、５０または１００μＭの濃度で添加混合した。
【００７２】
例４：
種々の添加物の組合せによるスポリジオボラス・ルイネニアエ突然変異体の選択
突然変異誘発された改善されたＱ１０−生産を有するスポリジオボラス・ルイネニアエ細胞を種々の選択試薬の組合せにより単離した。
【００７３】
パラコートとリノレン酸の組合せでの選択：
Ｓ．ルイネニアエＳｒ−１細胞を例２に記載されているようにＮＧ−処理により突然変異誘発し、次いで更に振盪培地中で選択的な条件下に２８℃で４時間インキュベートした。振盪培養のためにＹＰＤ−培地を選択試薬パラコート、濃度０.０１％およびリノレン酸、濃度５０ｍＭまたは１００ｍＭの組合せの添加下に使用した。２８℃で４時間インキュベートした後、細胞をＹＰＤ−プレート上に塗布した。
【００７４】
パラコート、リノレン酸およびピエリシジンＡの組合せでの選択：
Ｓ．ルイネニアエＳｒ−１細胞を例２に記載されているようにＮＧ−処理により突然変異誘発し、次いで更に振盪培地中で選択的な条件下に２８℃で４時間インキュベートした。振盪培養のためにＹＰＤ−培地を選択試薬パラコート、濃度０.０１％およびリノレン酸、濃度５０ｍＭまたは１００ｍＭの組合せの添加下に使用した。２８℃で４時間インキュベートした後、細胞を付加的にピエリシジンＡを５０μＭの濃度で含有するＹＰＤ−プレート上に塗布した。
【００７５】
前記の方法で前処理したＳ．ルイネニアエ細胞を接種したＹＰＤ−プレートを２８℃で２〜５日間培養した。このようにして製造されたＳ．ルイネニアエの突然変異体の個々のコロニーをつまみ取り新鮮なＹＰＤ−プレート上に個別にし、新たに培養した。それぞれの突然変異誘発ラウンドで突然変異体４００種を単離し、引き続きこれを上昇したＱ１０−生産に関して実験した（例５参照）。
【００７６】
例５：
スポリジオボラス・ルイネニアエ突然変異体のＱ１０−生産の分析
例２に記載された突然変異誘発法および例３および４に記載された選択法によりスポリジオボラス・ルイネニアエの突然変異体を単離した。スクリーニングのラウンドを２回実施した。それぞれのスクリーニングラウンドにおいて突然変異体４００種をつまみ取り、引き続くＱ１０−分析のためにＹＰＤ−プレート上で培養した。Ｑ１０−分析は突然変異体を振盪フラスコ中で培養し、引き続きＱ１０−生産の定量的測定により実施された。
【００７７】
ＹＰＧＣ−培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、５％グリセリン、２％コーンスチープリカー）５０ｍｌを突然変異体で接種し、２８℃および振盪速度１４０ｒｐｍで１２０時間インキュベートした。その後、この細胞を遠心分離し、完全脱塩水３０ｍｌ中で洗浄し、完全脱塩水５ｍｌ中に再懸濁し、風袋を量った５０ｍｌ丸底フラスコ中に導入する。引き続き、この細胞懸濁液をエタノール／ドライアイス混合物中で、できるだけ均質に凍結し、かつ凍結乾燥した。凍結乾燥したバイオマスの質量を乾燥バイオマスとして測定した。乾燥バイオマス２００ｍｇを秤量し、エタノール１０ｍｌを添加し、ガス状窒素で覆う。Ｑ１０−抽出を例１に記載されているように実施した（Ｑ１０−単離は機械的な砕解なしに実施した）。Ｑ１０−体積生産（Ｑ１０  ｍｇ／ｌ）および比Ｑ１０−生産（Ｑ１０  ｍｇ／ｇバイオマス）を測定した。それぞれのスクリーニング列において突然変異誘発のために使用した出発菌株を参照として使用した。それぞれ突然変異体４００種から、繰り返しの実験により、最も強く改善されたＱ１０−体積生産を有する菌株を選択し、次のスクリーニングラウンドに出発菌株として使用した。
【００７８】
第１表は、例１、２および３に記載されたように製造され、出発菌株に比べて明らかに改善されたＱ１０−生産により優れた、第１のスクリーニングラウンドから選択された突然変異体のＱ１０−生産を示す。第１のスクリーニングラウンドにおいて、Ｓ．ルイネニアエの突然変異誘発はＵＶ−突然変異誘発により行われた。
【００７９】
【表１】
2004313187.tif 000003
【００８０】
第１のスクリーニングラウンドから菌株Ｓｒ−２２０を第２のスクリーニングラウンドに選択した。第２のスクリーニングラウンドにおいては菌株Ｓｒ−２２０の突然変異体をＮＧ−突然変異誘発により実施した。突然変異体の選択は、パラコートおよびリノレン酸の組合せにより行った。Ｑ１０−生産において改善された突然変異体の選択は第２表中に記載した。
【００８１】
【表２】
2004313187.tif 000004
【００８２】
第２のスクリーニングラウンドから菌株Ｓｒ２２０−１５９を選択し、Ｓ．ルイネニアエの発酵のための方法を実施した（例６および７を参照）。Ｓ．ルイネニアエの野生型Ｓｒ−１および突然変異体Ｓｒ２２０−１５９の比較は、新規な菌株改善法によりＳ．ルイネニアエのＱ１０−生産を著しく改善することができることを示す。突然変異誘発および選択の２回のラウンドによりＱ１０−生産性（Ｑ１０  ｍｇ／ｇバイオマス）およびＱ１０−体積生産（Ｑ１０  ｍｇ／ｌ培養培地）は、それぞれ約３００％上昇した。
【００８３】
例６：
Ｓ．ルイネニアエのバッチ式発酵法
バッチ式発酵のために発酵器（Fermenter Biostat M; Braun, Melsungen）を使用した。培養容器は全体積２ ｌを有した。この作業域体積は１ ｌであった。更に、この発酵器にｐＯ２およびｐＨを測定するための電極を設置した。発酵のｐＨは６.０であり、水酸化アンモニウムおよびリン酸で調節した。圧縮空気を発酵容器中に１.６ ｌ／分で導入した。発酵温度は２８℃、攪拌速度は９００ｒｐｍであった。更に、この発酵器は、消泡剤Structol J 647（Schill und Seilacher）、Ｈ２Ｏで１：５に希釈、の供給を制御する泡ゾンデを備えている。この発酵器に１ ｌ滅菌ＹＰＧＣ−培地（例１参照）を装入した。接種材料を製造するために菌株スポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ２２０−１５９の第１の前培養体を同じ培地中で２８℃および１４０ｒｐｍ（振盪装置、Infors）で４日間製造した。第１の前培養体５ｍｌを第２の前培養体の接種のためにＹＰＧＣ−培地５０ｍｌに使用した。第２の前培養体を２８℃および１４０ｒｐｍで一夜振盪した。第２の前培養体を用いて発酵器を無菌状態で接種し、発酵を開始した。発酵期間は９６時間であった。発酵の終了後、乾燥バイオマスおよびＱ１０を例１に記載されているように測定した。乾燥バイオマスは２５ｇ／ｌを有し、比Ｑ１０−収量はＱ１０ ０.８９ｍｇ／ｇ乾燥バイオマスであった。
【００８４】
例７：
Ｓ．ルイネニアエの流加式発酵法
流加式発酵のために発酵器（Fermenter Biostat M; Braun, Melsungen）を使用した。培養容器は全体積２ ｌを有した。この作業域体積は１ ｌであった。更に、この発酵器にｐＯ２およびｐＨを測定するための電極を設置した。発酵のｐＨは６.０であり、水酸化アンモニウムおよびリン酸で調節した。圧縮空気を発酵容器中に１.６ ｌ／分で導入した。発酵温度は２８℃、攪拌速度は９００ｒｐｍであった。更に、この発酵器は、消泡剤Structol J 647（Schill und Seilacher）、Ｈ２Ｏで１：５に希釈、の供給を制御する泡ゾンデを備えている。この発酵器に１ ｌ滅菌ＹＰＧＣ−培地（例１参照）を装入した。接種材料を製造するために菌株スポリジオボラス・ルイネニアエＳｒ２２０−１５９の第１の前培養体を同じ培地中で２８℃および１４０ｒｐｍ（振盪装置、Infors）で４日間製造した。第１の前培養体５ｍｌを第２の前培養体の接種のためにＹＰＧＣ−培地５０ｍｌに使用した。第２の前培養体を２８℃および１４０ｒｐｍで一夜振盪した。第２の前培養体を用いて発酵器を無菌状態で接種し、発酵を開始した。発酵期間は９６時間であった。発酵開始２４時間後に飼料供給を開始した。飼料溶液はグリセリン７５％（ｖ／ｖ）、酵母エキス２％ｗ／ｖ）からなった。飼料供給速度は発酵の２４時間〜４８時間の間、１２ｍｌ／ｈ、４８時間〜発酵の最後まで（９６時間）、６ｍｌ／ｈであった。種々な時間に、Ｑ１０−収率を定量的に測定するために発酵培地を採取した。Ｑ１０−測定をジスメンブレーター法（例１参照）により実施した。発酵の最後にはバイオマスは７３.６ｇ／ｌおよびＱ１０収率は３.１２ｍｇ／ｇ乾燥バイオマスであった。このことはバッチ式発酵法およびスポリジオボラス・ルイネニアエに関する公知技術（ＵＳ４０７０２４４、Ｑ１０−生産０.９２ｍｇ／ｇ、バイオマス１８ｇ／ｌ）に対して明らかな上昇を示している。