(57)【要約】【課題】高密度培養等が可能な細胞培養方法を提供すること。【解決手段】培地に浸漬されたメンブランフィルター等の多孔膜１を細胞２が増殖する際の足場として用いる細胞培養方法を提供し、該方法によって、立体的に細胞が増殖できる生体内と近似した環境を形成し、更には、多孔膜１の細胞増殖面１０１から反対面１０２へ負圧吸引又は細胞増殖面１０１側から加圧することによって老廃物３を除去することにより、高密度な細胞２（２１）を連続的に培養できるようにする。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地に浸漬された多孔膜で細胞培養を行うことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記多孔膜が多層化されたことを特徴とする請求項１記載の細胞培養方法。
【請求項３】
前記多孔膜の一方の面に細胞を付着し、その反対面から負圧吸引又は細胞増殖面側から加圧することによって培地流を形成し、前記細胞から産生された老廃物を前記多孔膜の細胞増殖面から除去しながら細胞培養を行うことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養技術に関する。詳しくは、特に再生医療等の分野で有用な、多孔膜を細胞増殖の足場等に用いる細胞培養技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞培養技術は、培養器具の所定の培養箇所に移入された細胞が、該細胞の走化性（化学走性）に基づいて、その周辺領域に細胞を徐々に移住させて増殖させていく性質を利用する技術である。
【０００３】
細胞の増殖は、細胞の遊走（運動性）に大きく依存しているので、移入された最初の細胞が、培養箇所に確実に密着し、固定されないと、細胞の遊走（運動性）がうまく引き出されず、活発な細胞増殖が行われない。従って、細胞の足場（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）を確保することは、細胞培養技術の重要な課題の１つとされている。
【０００４】
当初、細胞培養は、ガラス製のシャーレ、ディッシュ、フラスコ等の器具を用いて行われるのが一般的であったが、その後プラスチック製の培養器具が開発され、更には、細胞がより付着し易くするために、器具表面に対して、親水処理が施されたり、細胞外マトリクスのコラーゲンやフィブロネクチンまたポリリジン等によって被覆処理されたりしたことによって、細胞培養効率が向上し、培養できる細胞の種類も増加させることができた。
【０００５】
このように、従来の細胞培養技術では、培養箇所表面に対する移入細胞の接着性を高めて足場を確保するという点に専ら改良のポイントが置かれ、この着想に基づいて、種々の培養専用器具が開発されてきた。
【０００６】
ここで、特許文献１には、酸素供給の装置などを必要とせずに、細胞の代謝に必要な酸素などの気体を定常的かつ充分に供給することができ、細胞汚染がなく、輸送も簡便である、容器の少なくとも一部が気体透過性プラスチック材料によって形成された細胞培養用容器が開示されている。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１１−０２８０８３号報。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、生体内において細胞は、その周囲を細胞と細胞外マトリクスによって取り囲まれており、通常は、細胞の表面全体で栄養補給、老廃物の放出、シグナル伝達等を行っている。
【０００９】
つまり、生体内環境では、細胞の増殖の方向性には物理的な障壁がほとんどないが、生体外で行われる従来の細胞培養では、物質の移動が全くできないガラス製やプラスチック製培養器具の硬質の表面上において、細胞培養が行われていたため、細胞の増殖の方向性や細胞の増殖形態に必然的に制限が加わってしまうという技術的課題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、細胞増殖の際の足場として機能するとともに、物質の移動が可能な「多孔膜」を用いて、簡単に高密度細胞培養を実現できる細胞培養方法を提供することを主な目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記技術的課題を解決するために、まず、本発明では、培地に浸漬された多孔膜で細胞培養を行うように工夫した細胞培養方法を提供する。
【００１２】
本発明において採用可能な多孔膜は、均一な細孔を備え、気体透過性並びに物質透過機能（ろ過機能）を備える膜体を広く包含し、狭く解釈されない。「多孔膜」の代表例としては、一般に、メンブランフィルター（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ）と称される合成高分子膜を挙げることができる。
【００１３】
多孔膜を用いる上記細胞培養方法によれば、多孔膜に強固な足場を形成できるので、細胞の遊走る性が促進されて増殖が活発に行われるようになる。また、ガラス製又はプラスチック製器具の表面における細胞培養と比較して、細胞増殖の方向性の制限が緩和され、細胞が重層化し易くなる。即ち、細胞が、生体内環境と同様に、立体的に増殖できるようになる結果、単位面積当たりの細胞密度が増大し、細胞によるコラーゲン等のタンパク質生産量を増加させることができる。そして、多孔膜は気体透過性に加えて物質透過性を備えるので、細胞の高密度培養に適している。
【００１４】
次に、本発明では、前記多孔膜を多層化して用いるように工夫した。即ち、多孔膜単体を複数に重ね合わせて用いるように工夫した。特に、適宜の手段を用いて多孔膜間に隙間を形成させた状態で、該多孔膜を積層（多層化）するように更に工夫を加えることによって、多層化された各多孔膜上において培養される細胞の周囲での自由な物質（栄養、老廃物）移動やガスの供給又は交換が行われ易くなるという細胞培養条件を確保できるので、細胞の高密度培養に適する手段となる。
【００１５】
この多孔膜を多層化手段によれば、細胞の高密度培養が可能となる。即ち、細胞培養用バイオリアクターを提供できる。また、単位となる多孔膜の使用枚数によって、細胞密度のコントロールが可能となり、タンパク質の産生量も予測計算できるという利点がある。また、多孔膜上の細胞の観察や培地のサンプリングが可能な培養器具の設計も可能となるので、現在主流のホローファイバー式培養法にはない利点も得られる。なお、ホローファイバー式培養法とは、ホローファイバーを束ねたカラムを作製し、その中で細胞を培養する方法であり、細胞はファイバーの表面あるいはひだの間に入り込んで増殖し、培養液は連続的に環流するのが特徴である。
【００１６】
続いて、本発明では、前記多孔膜の一方の面に細胞を付着し、その反対面から負圧吸引又は細胞増殖面側から加圧することによって培地流を形成し、前記細胞から産生された老廃物を前記多孔膜の細胞増殖面から除去しながら細胞培養を行うように工夫した細胞培養方法を提供する。
【００１７】
なお、この構成の細胞培養方法においては、多孔膜の細孔の直径は、０．１μｍ〜１．０μｍの範囲が特に好ましい。その理由は、０．１μｍ未満の場合では、負圧吸引又は加圧の際の圧力を高めないと、多孔膜を通過する好適な培地流が形成され難いことから、所定の高圧条件が必要になるところ、この高圧の負荷によって培養細胞に損傷が加わってしまうので適当でないからであり、一方、１．０μｍよりも大きいと、産生されたタンパク質が老廃物とともに除去されてしまうからである。細胞から産生されたタンパク質は、同様に産生されるペプチドやプロテオグリカン等と結合して見かけの分子量が大きくなっているので、１．０μｍ以内の孔径であれば、目詰まりを起こして通過しにくくなる。
【００１８】
この細胞培養方法では、多孔膜の上下面に培地を導入して、該多孔膜が有するろ過機能を活用し、細胞から産生される低分子の尿素、尿酸、過酸化脂質等の老廃物を、多孔膜の細胞増殖面から反対面へ、細孔を介して通過させて、細胞増殖面から前記老廃物を除去することが可能となる。この結果、細胞の寿命が延びるので、連続培養が容易になる。なお、多孔膜の孔径等を選択することによって、除去物質をコントロールすることができるという利点がある。
【００１９】
本発明に係る細胞培養方法は、細胞増殖を高密度で、かつ連続的に行うことができるので、広範な生化学分野、特に、再生医療技術、即ち細胞、細胞の足場、細胞増殖因子の組み合わせで、生体の内外で組織や臓器を再生（再構築）する技術において有用であるという技術的意義を有する。
【００２０】
【実施例】
本発明に係る細胞培養方法の効果を検証するため、以下の実験１〜５を行った。
【００２１】＜実験１＞
細胞の足場の違い（培養用プラスチック製ディッシュメンブランフィルターの比較）によるタンパク質産生量の差を検証するための「実験１」を行った。
【００２２】
なお、「実験１」におけるタンパク質定量は、回収した培養上清を９６穴マイクロプレートのウエルに入れ、それと等量のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ）を添加し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で行った。スタンダードにはＢＳＡを使用する。得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗コラーゲン抗体を用いたイムノブロッティング解析により、タンパク質の大部分がコラーゲンであることを確認した。
【００２３】
（比較例１）
ヒト初代線維芽細胞をφ６０ｍｍのプラスチック製培養シャーレに播種し（１０％牛胎児血清（以下、「ＦＢＳ」）含有ＤＭＥＭ：日水製薬株式会社）、３７℃のインキュベーター内で培養する。即ち、多孔膜を用いないで細胞培養を行った。コンフルエントに達した時点で、培養上清をアスピレーターにより吸引除去し、細胞培養培地を無血清培地（ｎｏｎＦＢＳ−ＤＭＥＭ）に交換した。一週間ごとに前記培養上清を回収し、タンパク質定量を行った。培地はその都度無血清培地に交換し、何れの場合も抗生物質を添加した。なお、「ＤＭＥＭ」とは、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍの略称として一般的である。
【００２４】
（実施例１〜４）
メンブランフィルター（以下、「ＭＦ」と略称。）を用いた培養は、予めφ１０ｃｍディッシュの底面に、ＭＦ（直径１３ｍｍまたは４７ｍｍ）を固定し、上記比較例１と同様に、ＭＦ上にヒト初代線維芽細胞を播種し（１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ：日水製薬株式会社）、３７℃のインキュベーター内で培養した。播種した前記細胞が、均一にφ１０ｃｍディッシュ底面に付着・増殖すれば、ＭＦ外のディッシュ底面の細胞がコンフルエント状態であることから、ＭＦ上も細胞がコンフルエントと想定することができる。培養後のＭＦを新しいφ１０ｃｍディッシュに移した後、無血清培地に交換した。無血清培地の培地交換は、５日間毎に行った。
【００２５】
細胞培養用ディッシュ（培養面積：２０．０ｃｍ２）上で、ヒト初代繊維芽細胞をコンフルエントにまで培養した後、無血清培地に交換し、該無血清培地中のタンパク質量と細胞の付着した直径４７ｍｍのＭＦ（培養面積：１７．３ｃｍ２）を入れた無血清培地中のタンパク質量とをそれぞれ測定して比較した。
【００２６】
この際のＭＦの材質は、Ａ〜Ｄの４種類を用いた。ＭＦの種類をＭＦ−Ａ、ＭＦ−Ｂ、ＭＦ−Ｃ、ＭＦ−Ｄと略記する。なお、ＭＦ−Ａ（実施例１）は、親水性ポリテトラフルオロエチレン（孔径：０．５μｍ）、ＭＦ−Ｂ（実施例２）は、親水性ポリビニリデンジフロライド（孔径：０．４５μｍ）、ＭＦ−Ｃ（実施例３）は、未親水処理ポリテトラフルオロエチレン（孔径：０μｍ）、ＭＦ−Ｄ（実施例４）は、ポリカーボネート（孔径：０．４μｍ）である。その結果を以下の表１に表す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
前掲した「表１」からもわかるように、ＭＦ上で細胞培養を行うと、産生されるタンパク質（コラーゲン）量が増加し、単位面積当りのタンパク質産生量も増加することから単位面積当りの細胞密度が大きくなる。とくに、多孔膜としてＭＦ−Ａ、ＭＦ−Ｂを使用した場合は、ディッシュ使用の場合と比較して、産生タンパク質量が歴然に増大し、より高密度で細胞が培養できることがわかった。即ち、親水性の多孔膜である親水性ポリテトラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンジフロライドは、多孔膜の材料として、特に好適である。
【００２９】＜実験２＞
細胞の足場（培養用プラスチックとメンブレンフィルター）による細胞寿命の差（培養可能期間の増加）を検証する「実験２」を行った。
【００３０】
ヒト初代線維芽細胞を培養用プラスチック器具（ファルコン製ディッシュ）で培養した場合を「比較例２」とし、メンブランフィルター上で培養した場合を「実施例５」とした。それぞれの場合で、細胞が底面から剥がれて浮遊するまでの時間を比較した。この際、細胞はコンフルエント後に無血清培養し、培養上清の３０％を残して１週間毎に培地を交換した。実験２の結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
前掲する表２に示されているように、ＭＦを用いて細胞培養を行うことで、細胞は、ＭＦを足場として活発に増殖し、ディッシュを用いた細胞培養（比較例２）よりも細胞寿命が長くなることがわかった。即ち、ＭＦを用いた細胞培養は、細胞の連続培養に適していることがわかった。
【００３３】
ここで、実験２の結果を一般的な初代培養細胞の寿命から考えた場合、４ヶ月を超えることは異常とも考えられる。しかし、生体内の皮膚繊維芽細胞は、５〜６年の周期で新陳代謝を行っていることを考えると、本実施例５における培養条件は、生体内環境に近似したものであると考えることができる。
【００３４】
また、この結果は、細胞がコンフルエント状態で細胞増殖を停止したのではなく、重層化で細胞増殖が継続しているからであると考えた方が、矛盾が無い。そして、シート状に繋がった細胞が、ＭＦから剥がれることがないため、個々の細胞死が起っているが、生体内と同じように細胞死が起きた空間を埋めるように、新しい細胞が次々に増殖していると考えられる。
【００３５】
このＭＦを多層化して配置することで、細胞の高密度培養が可能となると考えられる。高密度培養を行うためのシステムは、動物細胞培養用バイオリアクター（リアクター）と称されており、動物細胞はその増殖形態から２つに分類されることから、一般に前記リアクターも大きく２つに分けられる。
【００３６】
まず、細胞は、培地中で浮遊して増殖できる浮遊細胞と足場に付着しないと増殖できない付着細胞がある。リアクターに工夫が必要であったのは、前記付着細胞を扱う場合であり、付着面積を増やした水平円筒回転式（ローラーボトル）や微小球形粒子（マイクロキャリアー）表面に細胞を付着させ、その粒子をリアクター内に懸濁させる方法（攪拌懸濁法、エアリフト式、セルリフト式等）が開発された。更に、高密度化でホローファイバー式とセラミックマトリックス式が考案された。
【００３７】
しかしながら、細胞密度は飛躍的に伸びたが、細胞培養のスケールアップ、細胞環境のモニタリングのためのサンプリングができないなどの問題も生じていた。このモニタリングは、細胞の生産物の品質を管理する上で、細胞環境を均一にする際に必須の方法である。
【００３８】＜実験３＞
ＭＦ上で培養された細胞の形態を検証する「実験３」を行った。
【００３９】
ヒト初代線維芽細胞を、ＭＦ上で１〜２ヶ月培養した後、細胞を染色して実体顕微鏡で観察した。その結果、細胞が重層化し部分的に立体構造を取ることが観察された。前記顕微鏡による写真を添付した図１に示す。なお、図１に示す写真で、トリパンブルー染色の濃い部分は、細胞密度が高い部分を示している。
【００４０】
通常のプラスチック培養器具を用いた細胞培養方法では、器具表面が多孔質ではなく硬質であるので、このような立体構造を有する細胞は形成され得ないので、このような立体的な細胞の増殖は、ＭＦを足場とした場合の一つの大きな特徴と考えられる。なお、ＭＦを多層化することで、単位面積当たりの細胞数も増加し、タンパク質の高生産量が維持される（後述の実験４で検証）。写真で色の濃い部分は、細胞密度が高いことを示している。
【００４１】
なお、上記実施例は、多孔膜としてメンブランフィルター（ＭＦ）を採用したが、これに限定するものではなく、本発明に係る細胞培養方法では、少なくとも、均一な細孔を有する膜体であって、細胞培養に適している多孔膜であれば採用でき、更に多層化が可能なものが好適に採用できる。
【００４２】
ここで、図２に基づいて、本発明に係る細胞培養方法の好適な発展形態について説明する。図２は、前記発展形態の概念を簡易に表す図である。
【００４３】
図２中、符号１で示された多孔膜の一方の面１０１に細胞２を付着させ、その反対面１０２から負圧吸引することによって、多孔膜１を通過する培地流Ｆを形成し、前記細胞２から産生された老廃物３を、多孔膜１の細胞増殖面１０１から除去しながら細胞培養を行うように工夫することができる。
【００４４】
また、多孔膜１の細胞増殖面１０１側から加圧することによって、細胞２から産生された老廃物３を、細胞増殖面１０１から反対面１０２へ培地流Ｆにのせて流出させ、除去する方法も採用することができる。
【００４５】
負圧吸引又は加圧の方法は、培地４に流れ（培地流Ｆ）を、本発明の目的に添う程度に形成できる方法、即ち、細胞２に損傷を与えることなく、老廃物３のみを反対面１０２側に除去できる方法であれば採用でき、また、これらの方法は、ＭＦを多層化した場合においても適用でき、多層化されたＭＦに培地流Ｆを形成することができる。
【００４６】
なお、図２において符号２１は、移入された細胞２が、多孔膜１上で、立体的に増殖していくことを模式的に表している。
【００４７】＜実験４＞
多孔膜を多層化した場合の細胞培養の効果を検証する「実験４」を行った。
【００４８】
まず、ＭＦを多層化し易くするため、直径４７ｍｍの円形薄膜状のＭＦを挟持して固定するためのボス部位を複数箇所備えるフレームを作製した。この実験４で使用したフレームは、該フレーム自体を重ねたときに、フレーム同士が互いに固定されるように工夫した。フレームを積み重ねることによって、各フレームに挟持されて固定されているＭＦを、各ＭＦ間に隙間（空間）を確保した状態で積層（多層化）することができた。
【００４９】
更に、重ねたＭＦと該ＭＦを固定する前記フレームを収容する円筒形容器を準備し、この円筒形容器はガス透過性の高い材質（ポリメチルペンテンやポリカーボネート）のものを選んだ。さらに、この円筒形容器の蓋についても、ガス透過性の前記材質を選定した。
【００５０】
（実験４に関連する比較例３及び実施例６〜９）
まず、ＭＦ上に細胞を接着させるために、直径６０ｍｍのディッシュに直径４７ｍｍのＭＦ（ＭＦ−Ａ又はＭＦ−Ｂ）を白色ワセリンで固定し、ヒト初代線維芽細胞を播種し（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）、３７℃のインキュベーターで培養した。ＭＦには予め直径１ｍｍの穴を十字に１ｃｍ間隔で９個作っておき、この穴にまで細胞が増殖したら、ＭＦ上の細胞はコンフルエントとした。この細胞が接着したＭＦを新しい直径６０ｍｍのディッシュにワセリンで直接固定したものを「比較例３」とした。
【００５１】
また、上記したフレームにＭＦを１枚ずつ固定して、上記の円筒形容器に入れた。ＭＦ１枚のものを「実施例６」とし、ＭＦ２枚のものを「実施例７」、ＭＦ５枚のものを「実施例８」、ＭＦ６枚のものを「実施例９」とした。比較例３並びに実施例６〜９を各々１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養し、１週間後に洗浄して無血清培地に交換した。その後１０日目に培養上清中の蛋白質量を測定した。測定結果を以下の「表３」に示す。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
まず、前掲した「表３」の比較例３と実施例６の結果の比較から、フレームを使用したことによってＭＦと容器底面間に隙間（空間）が生まれ、タンパク質の生産性が上がることが明らかになった。この理由は、前記隙間が形成されたことによって、細胞の周囲での自由な物質（栄養、老廃物）移動やガスの供給又は交換が行われ易くなったためと考えられる。
【００５４】
次に、実施例６〜９に示したように、ＭＦを固定したフレームを重ね、ＭＦを多層化した場合でも、比較例３に比べてタンパク質の高い生産性が維持されていることがわかる。即ち、ＭＦを多層化した構成も有効であることが明らかである。
【００５５】
なお、ＭＦが１枚の場合（実施例６）とＭＦが２枚の場合（実施例７）に比べて、ＭＦが５枚の場合（実施例８）やＭＦが６枚の場合（実施例９）では、約３５％程度のタンパク質生産量の差が見られる。これは、ＭＦ１枚の生産量からＭＦ６枚の生産量を３５％程度の誤差で推定できる。これは、スケールアップやタンパク質総生産量の予測計算が可能であることを示している。
【００５６】
以上のように、本発明では、ＭＦを細胞の足場とすることによって細胞培養を高密度で効率よく行うことが可能となる。さらに、ＭＦとＭＦを密着させて多層化するのではなく、ＭＦとＭＦの間に隙間を形成して多層化することによって、従来最も効率的と考えられていたホローファイバー式培養法の欠点を改善できる。即ち、細胞が付着したＭＦの枚数に基づいてタンパク質産生量を容易に予測計算でき、スケールアップが簡単となる。ＭＦ上の細胞を観察することや培地をサンプリングできるような培養器具も容易に設計できる。
【００５７】＜実験５＞
ＭＦを収容するための容器（円筒形容器）の好適な材質を検討することを目的として、以下の「実験５」を実施した。
【００５８】
多層化したＭＦを収容する円筒形容器として３種類の材質のものを準備した。それぞれの容器の中で細胞を培養し、培養上清中のタンパク質量を測定し、細胞によるタンパク質生産におけるガス交換性（気体透過性）の有効性を検討した。容器の材質は、ポリプロピレン（実施例１０）、ポリカーボネート（実施例１１）、ポリメチルペンテン（実施例１２）を用いた。更に、培養上清中のタンパク質量が最大であった材質の円筒形容器の上部にガス交換性（気体透過性）のあるフィルターを取り付け、更にガス交換性を高めた実施例も準備した（実施例１３）。なお、この円筒形容器は、蓋を回して閉める形状の機密性の高いもので、水を入れて逆さにしても水漏れはないものである。
【００５９】
実験５の方法を具体的に説明すると、ＭＦ上に細胞を接着させるために、直径６０ｍｍのディッシュに直径４７ｍｍのＭＦ（既述したＭＦ−Ａ又はＭＦ−Ｂ）を白色ワセリンで固定して、ヒト初代線維芽細胞を播種し（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）、３７℃のインキュベーターで培養した。ＭＦには予め直径１ｍｍの穴を十字に１ｃｍ間隔で９個作っておき、この穴にまで細胞が増殖したら、ＭＦ上の細胞はコンフルエントとした。この細胞が付着し増殖したＭＦをフレームにセットして、実施例１０〜１２の円筒形容器に収容し、更に１．５ｇのマイクロキャリアーに細胞を付着させたものも入れた。１週間培養後、十分に血清培地を除去、洗浄して無血清培地に交換した。それから１４日間培養後、培養上清中の蛋白質量を測定した。測定結果を次の「表４」に示す。
【００６０】
【表４】
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【００６１】
前掲した「表４」の実施例１０〜１２では、いずれも培養上清中のタンパク質濃度は高かったが、特に実施例１１のポリメチルペンテン製の円筒形容器で最大であった（３９．２μｇ／ｍｌ）。なお、別途行った材質試験の結果においてもポリメチルペンテンのガス透過性が最大であった。即ち、細胞によるタンパク質生産性は、容器のガス透過性に密接に関連している。
【００６２】
また、実施例１２と実施例１３を比較すると、ポリメチルペンテン製の容器であれば、更にガス透過性のフィルターを付けても、タンパク質濃度にあまり変化はなかった。この結果からポリメチルペンテンのようにガス透過性の高い材質で円筒形容器を形成すれば、ガス透過性のフィルターを用いる等してガス透過性を高める必要はないことがわかった。
【００６３】
以上の実験５から、多層化したＭＦをガス透過性の高いポリメチルペンテン製の容器に収容して細胞培養を行うことによって、高密度の細胞培養を実施でき、高いタンパク質生産性を確保できる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明に係る細胞培養方法によれば、細胞は、多孔膜に強固な足場を形成できるので、細胞の遊性が促進されて増殖が活発に行われ、細胞増殖の方向性の制限も緩和され、細胞の重層化できるので、細胞の高密度培養が可能となる。
【００６５】
また、細胞の高密度培養が可能となる結果、細胞によるコラーゲン等のタンパク質生産量を増加させることができるので、再生医療技術、特に、採取された自己細胞を増殖させることによって得られる自己組織を用いた再生医療の基本技術なり得る細胞培養方法である。
【００６６】
記多孔膜を多層化して用いるように工夫することによって、更に高密度の細胞培養が可能となり、単位となる多孔膜の使用枚数によって、細胞密度のコントロールやタンパク質産生量の計算が可能となるので、非常に便利である。また、多孔膜上の細胞の観察や培地のサンプリングが可能な培養器具の設計も可能となるという利点もある。
【００６７】
多孔膜の一方の面に細胞を付着し、その反対面から負圧吸引又は細胞増殖面側から加圧することによって、多孔膜を通過する培地流を形成し、前記細胞から産生された老廃物を除去するように工夫すれば、細胞から産生される低分子の尿素、尿酸、過酸化脂質等の老廃物を、多孔膜の細胞増殖面から効率よく、かつ確実に除去することが可能となる。この結果、細胞の寿命が延び、連続培養を確実行うことができるようになる。更には、多孔膜の孔径等を選択することによって、除去物質をコントロールすることができる。
【００６８】
細胞の自己分泌物、オートクラインによって産生した生理活性物質を、多孔膜によって濃縮し、低分子の老廃物を、多孔膜を通して除去できるようにすれば、生理活性物質の供給をウシ胎児血清（ＦＢＳ）に依存せずに、自己分泌物で代替でき、無タンパク質の培養液を添加することで、細胞の増殖、維持を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験３における培養細胞の実体顕微鏡の拡大写真
【図２】本発明に係る細胞培養方法の好適な発展形態の概念を簡易に表す図
【符号の説明】
１  多孔膜
２  細胞
３  老廃物
Ｆ  培地流
【図１】
2004344002.tif 000007
【図２】
2004344002.tif 000008