(57)【要約】【課題】新しい生理活性や機能が期待できる非還元末端にガラクトースを有する非天然型の新規な二糖類、それを含有する組成物及びその製造方法を提供する。【解決手段】非還元末端に一又は複数個のガラクトースがα型で結合しているα結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体と、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンとを、緩衝液又は水に溶解し、α−ガラクトシダーゼを作用させることにより、下記式（１）で示される二糖類を得る。前記α結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体として、メリビオース、又はラフィノースあるいはその水和物を用いることが好ましい。また、前記グルコサミン塩として、グルコサミン塩酸塩を用いることが好ましい。この二糖類は、食品、医薬品、化粧品等の原料として利用できる。【化１】2004352672.tif 000011【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で示される化合物又はその塩からなる新規な二糖類。
【化１】
2004352672.tif 000009
【請求項２】
前記化合物の塩は、塩酸塩である請求項１記載の新規な二糖類。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の二糖類と、食品、医薬品、化粧品から選ばれた他の原料とを含有する組成物。
【請求項４】
非還元末端に一又は複数個のガラクトースがα型で結合しているα結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体と、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンとを、緩衝液又は水に溶解し、α−ガラクトシダーゼを作用させることにより、下記式（１）で示される化合物又はその塩を生成することを特徴とする新規な二糖類の製造方法。
【化２】
2004352672.tif 000010
【請求項５】
前記α結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体として、メリビオース、又はラフィノースあるいはその水和物を用いる請求項４記載の新規な二糖類の製造方法。
【請求項６】
前記グルコサミン塩として、グルコサミン塩酸塩を用いる請求項４又は５記載の新規な二糖類の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞増殖抑制活性等の生理活性を有し、食品、医薬品、化粧品、機能性素材として幅広く利用することが可能な二糖類に関し、詳しくは、ガラクトースと、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンとがα結合した非天然型の二糖類、それを含有する組成物及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖と糖の結合は、その結合の配向によりα結合とβ結合に分けられるが、食品として一般に利用されているガラクトオリゴ糖は、乳糖の非還元末端に１〜４個のガラクトースがβ結合でつながっているオリゴ糖のことを言い、口、胃、小腸で分解されず、またビフィズス菌に選択的に利用されることから、難う蝕性、腸内フローラ改善等の生理作用を有する食品素材として、各食品に広く利用されている。
【０００３】
例えば、下記特許文献１には、ガラクトース又はガラクトースを含む物質を原料としてα−ガラクトシダーゼの脱水縮合反応によって合成されるα−ガラクトオリゴ糖組成物が開示されており、該α−ガラクトオリゴ糖組成物がビフィズス菌増殖促進活性を有することが記載されている。
【０００４】
また、生体中には、ポリラクトサミン等の糖タンパク、糖脂質の複合糖鎖、あるいはケラタン硫酸等のプロテオグリカンとして、非還元末端にガラクトースが結合したオリゴ糖鎖が多種存在し、生体の維持に関わっていることが知られている。更に、ガラクトースが２個α型で結合したガラクトビオース、又はそれらを含む糖鎖について様々な報告がなされており、例えば、α１−４ガラクトビオースが病原性大腸菌Ｏ−１５７のベロ毒素の阻害剤となること、α１−３ガラクトビオースの構造が臓器移植の際の超急性拒絶反応を引き起こすこと、α１−２やα１−６ガラクトビオースは、細胞表面にタンパクをつなぎとめるＧＰＩ（グリコシルフォスファチジルイノシトール）アンカーの重要な糖鎖配列として存在していること等が知られている。
【０００５】
例えば、下記特許文献２には、２〜６糖のオリゴ糖であって、非還元末端にガラクトースを有し、ガラクトースと他の１〜５糖との結合がα１−６結合であるオリゴ糖又はその誘導体を含む体液性免疫調節剤が開示されている。
【０００６】
一方、植物界においても、メリビオース（ガラクトースとグルコースがα１−６結合した２糖）、ラフィノース（スクロースにガラクトースがα１−６結合した３糖）、スタキオース（スクロースにガラクトース二分子がα１−６結合した４糖）等のα結合ガラクトースを持つオリゴ糖が、遊離の状態で広く存在していることが知られている。ラフィノース、メリビオースには、強いビフィズス菌選択増殖活性、経口投与による制がん効果、メリビオースにはＮＫ細胞活性化効果が報告されている。
【０００７】
例えば、下記特許文献３には、「ラフィノースを有効成分とするアトピー性皮膚炎の予防又は治療用の組成物」が開示されており、最近ではメリビオースにも抗アトピー効果が報告されている。
【０００８】
更に、ウシやトリにおいて、メリビオースに対する抗体が見出されており、下記非特許文献１、２には、これら糖鎖を抗原とした防御機構の存在が示唆されている。
【０００９】
また、グルコサミンは、グルコースの２位水酸基がアミノ基（ＮＨ２）である化合物で、キチンの酸分解により多量に得られる単糖であり、生体内において、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等の軟骨グリコサミノグリカンの前駆物質であることが知られている。
【００１０】
例えば、下記非特許文献３、４には、グルコサミンによる関節軟骨のグリコサミノグリカンの合成促進効果や、ＩＬ−１β等のサイトカインで刺激した軟骨細胞による一酸化窒素やプロスタグランジンＥ２合成抑制効果、また好中球機能抑制による抗炎症剤としての利用可能性が示唆されている。
【００１１】
また、グルコサミンのアミノ基部分がアセトアミド基であるＮ−アセチルグルコサミンも同様、ヒアルロン酸等のプロテオグリカンの生合成を促進することが知られている。
【００１２】
【特許文献１】
特許第３０２８２５８号公報
【特許文献２】
特開２００３−４０７７９号公報
【特許文献３】
米国特許第５９９４３２６号公報
【非特許文献１】
Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．５２：９３９−９４５（１９９０）
【非特許文献２】
Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．５５：１２５−１２８  （１９９３）
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７９：２３４−２３９  （２０００）
【非特許文献４】
Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４４：３５１−３６０  （２００１）
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、近年、オリゴ糖の分野においては、非還元末端にガラクトースを有するオリゴ糖の機能性や有用性が注目されており、食品分野、医薬品分野、化粧品分野等において、このようなオリゴ糖を機能性素材として利用する試みが積極的になされていることから、非還元末端にガラクトースを有する新しいオリゴ糖の開発は非常に有意義であると考えられる。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、新しい生理活性や機能が期待できる非還元末端にガラクトースを有する非天然型の新規な二糖類、それを含有する組成物及びその製造方法を提供することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、ガラクトースが、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合した非天然型の新規な二糖類を酵素合成することに成功すると共に、該二糖類が細胞増殖抑制作用を有すること見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明の一つは、下記一般式（１）で示される化合物又はその塩からなる新規な二糖類を提供するものである。
【００１７】
【化３】
2004352672.tif 000002
【００１８】
上記発明によれば、ガラクトースが、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合した非天然型の新規な二糖類、あるいは該二糖類を含有する糖組成物を提供することができる。本発明の二糖類は、▲１▼分子量が小さく、水溶性を示す、▲２▼３７℃、ｐＨ１．１で少なくとも４時間安定である、▲３▼アミラーゼ、ペプシン等の消化酵素により分解を受けない、等から、経口摂取した場合、胃酸や消化酵素による分解を受けず、そのままの構造を維持したまま、胃や小腸から、血液、各器官への移行、吸収がスムーズに起こることが予測され、様々な生理活性効果が期待できる。
【００１９】
上記発明においては、前記化合物の塩は、塩酸塩であることが好ましい。これによれば、ガン細胞に対して増殖抑制作用を有する二糖類を提供することができる。
【００２０】
また、本発明のもう１つは、上記二糖類と、食品、医薬品、化粧品から選ばれた他の原料とを含有する組成物を提供するものである。これによれば、上記様々な生理活性効果が期待できる食品、医薬品、又は化粧品を提供できる。
【００２１】
更に、本発明のもう一つは、非還元末端に一又は複数個のガラクトースがα型で結合しているα結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体と、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンとを、緩衝液又は水に溶解し、α−ガラクトシダーゼを作用させることにより、下記式（１）で示される化合物又はその塩を生成することを特徴とする新規な二糖類の製造方法を提供するものである。
【００２２】
【化４】
2004352672.tif 000003
【００２３】
本発明の製造方法においては、前記α結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体として、メリビオース、又はラフィノースあるいはその水和物を用いることが好ましい。
【００２４】
また、前記グルコサミン塩として、グルコサミン塩酸塩を用いることが好ましい。
【００２５】
本発明の製造方法によれば、α結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体を原料とし、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの存在下、α−ガラクトシダーゼによる転移反応を行うことにより、ガラクトースが、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合した非天然型の新規な二糖類を一段階の反応で効率よく得ることができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の二糖類は、ガラクトースが、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合した非天然型の二糖類であり、下記一般式（１）で示される化合物又はその塩からなるものである。
【００２７】
【化５】
2004352672.tif 000004
【００２８】
なお、以下の説明において、上記一般式（１）で示される化合物又はその塩からなる二糖類を総称して「αガラクトシルグルコサミン」という。また、前記αガラクトシルグルコサミンのうち、ガラクトースにグルコサミン又はその塩が結合したものを「メリビオサミン」又は「メリビオサミン塩」といい、ガラクトースにＮ−アセチルグルコサミンが結合したものを「Ｎ−アセチルメリビオサミン」という。
【００２９】
本発明のαガラクトシルグルコサミンの原料として用いられるα結合ガラクトオリゴ糖（好ましくは２〜７糖）は、非還元末端に一又は複数個（好ましくは２〜６個）のガラクトースがα結合しているものであれば特に制限なく用いることができ、化学合成等によって得られたαガラクトシル基を非還元末端にもつオリゴ糖を用いることもできるが、食品等への利用の点からは天然物から抽出精製したものが好ましく用いられる。具体的には、植物等から抽出したメリビオース、ラフィノース、スタキオース等が例示でき、好ましくは、メリビオース、又はラフィノースあるいはその水和物が例示できる。例えば、メリビオースは、ハチミツ、ビート（甜菜糖大根）、大豆等に含まれており、ラフィノースは植物界に広く分布するショ糖に次ぐオリゴ糖で、ビート、ユーカリ樹液、大豆等に比較的多く含まれており、スタキオースも大豆に含まれている。これらのα結合ガラクトオリゴ糖は精製品（純品）を用いてもよく、それらを含有する組成物を用いてもよい。なお、組成物として用いる場合は、α結合ガラクトオリゴ糖を３０〜９９％含有するものを用いることが好ましく、例えば、工業的に生産されかつ食品への利用が可能なラフィノース（商品名「ニッテンラフィノース」、日本甜菜精糖株式会社製）、大豆オリゴ糖（カルピス株式会社）等が好ましく用いられる。
【００３０】
また、α結合ガラクトオリゴ糖の誘導体としては、具体的には、ニトロフェニル−α−ガラクトピラノシド、フェニル−α−ガラクトピラノシド、メチルウンベリフェリル−α−ガラクトピラノシド、フッ化−α−ガラクトピラノシル等が例示できる。
【００３１】
本発明のαガラクトシルグルコサミンの原料として用いられるグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンは、合成品や天然物由来のものを用いることができるが、好ましくは食品に利用可能な天然物由来のものが用いられる。なお、本発明でいうグルコサミン塩とは、グルコサミン、グルコサミン塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩等を意味し、好ましくはグルコサミン塩酸塩が用いられる。また、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの純度は８０％以上、好ましくは９０〜１００％のものが用いられる。天然物由来のグルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンは、市販されており、例えば、商品名「ナチュラルグルコサミン」（焼津水産化学工業株式会社製）や、商品名「マリンスウィート」（焼津水産化学工業株式会社）等を用いることができる。
【００３２】
本発明で用いられるα−ガラクトシダーゼは、αガラクトオリゴ糖からガラクトースを他の糖に選択的に転移させること、すなわち転移能を有するα−ガラクトシダーゼであれば特に制限なく用いることができ、起源・種類に限定されない。具体的には、ピクノポラス・シナバリヌス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、キャンディダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルジルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、等の微生物由来のα−ガラクトシダーゼや、緑色コーヒー豆であるコフィ・アラビカ（ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）等の植物が発現するα−ガラクトシダーゼ等が例示できる。これらの酵素は、市販品のほか、上記微生物の培養による菌体、菌体破砕物、菌体培養液や粗精製液等の混合物をそのまま用いてもよく、クロマトグラフィー等の手法を用いて精製したものを用いてもよい。本発明においては、α１−６結合に対する転移能が高いことから、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）やキャンディダ・ギリエルモンディー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）由来のα−ガラクトシダーゼが好ましく用いられる。また、食品用酵素としても工業生産されている、商品名「スミチームＡＧＳ」（新日本化学工業社製）や、商品名「アルファーガル」（ノボザイム社製）等も利用することができる。
【００３３】
以下、本発明のαガラクトシルグルコサミンの製造方法について説明する。  まず、α結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体と、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンをモル比で１：０．１〜１：１０、好ましくは１：１〜１：３の比で各０．２〜１．５Ｍ濃度となるように緩衝液又は水（脱塩水）に溶解する。なお、グルコサミン塩を用いることにより、メリビオサミン又はメリビオサミン塩を得ることができ、メリビオサミン塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩等が例示できる。また、Ｎ−アセチルグルコサミンを用いることにより、Ｎ−アセチルメリビオサミンを得ることができる。
【００３４】
そして、ｐＨを酵素活性の高い３．０〜７．０、好ましくは４．０〜６．０に希酸、希アルカリ等を用いて調整し、少量の水に溶解したα−ガラクトシダーゼを１〜２００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌになるように添加して、３０〜６５℃、好ましくは４０〜６０℃、より好ましくは４５〜５５℃で、１〜１００時間、好ましくは１０〜３０時間程度反応を行う。反応中は、必要に応じて適宜ｐＨ調整を行ってもよい。また、反応中に、反応液をサンプリングしてＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のＲＩ検出法により溶液中のαガラクトシルグルコサミンの含量を求め、含量が１〜２０質量％、好ましくは１０〜２０質量％となるまで反応を行うのが好ましい。そして、反応終了後、反応溶液を１０〜３０分間煮沸して酵素を失活させるとよい。
【００３５】
なお、本発明において、α−ガラクトシダーゼ１Ｕとは、１分間にｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシドから１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量を意味する。
【００３６】
得られた反応液は、そのまま、あるいは凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥等により粉末化して本発明の糖組成物として利用することが可能であるが、逆浸透（ＲＯ）膜やナノ濾過（ＮＦ）膜による膜分離法、各種有機溶媒による溶剤沈殿法、硫安等による塩析法、活性炭、樹脂等による吸着法、イオン交換、ゲル濾過、逆相（ＯＤＳ）、アミノカラム、活性炭カラム等の各種クロマトグラフィー法等の精製操作を適宜組み合わせることにより純度を高めることもできる。
【００３７】
例えば、Ｎ−アセチルメリビオサミンは、反応液を逆浸透膜、ナノ濾過膜等を用いて粗精製を行った後、活性炭カラムクロマトグラフィーに供し、０−２０％の水−イソプロパノールによるグラジエント溶出により、精製することができる。また、０−５０％の水−メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ブタノールやアセトン、アセトニトリル溶液等のグラジエント溶出を行うこともできる。なお、純度の低い画分は再度活性炭カラムに供して精製すればよい。
【００３８】
一方、メリビオサミン塩（塩酸塩）は、反応溶液を逆浸透膜、ナノ濾過膜等を用いて粗精製を行った後、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに供し、０．０１〜２．０Ｎ好ましくは０．０５〜１．０Ｎ塩酸で溶出することにより、精製することができる。なお、純度の低い画分は再度イオン交換カラムに供して精製すればよい。
【００３９】
上記のようにして得られるαガラクトシルグルコサミン（メリビオサミン塩酸塩、Ｎ−アセチルメリビオサミン）の理化学的性質について表１に示す。なお、各種溶媒に対する溶解性は、メリビオサミン塩酸塩又はＮ−アセチルメリビオサミンの乾燥粉末に対して、１質量％溶液になるように水又は有機溶媒９種をそれぞれ添加した。
【００４０】
【表１】
2004352672.tif 000005
【００４１】
本発明のαガラクトシルグルコサミンのうち、メリビオサミン塩（塩酸塩）は、例えば、実施例に示されるように、ガン細胞に対する細胞増殖抑制作用を有していることから、抗白血病から抗ガンに至る薬理の可能性が期待できる。
【００４２】
また、メリビオースやガラクトビオースの作用からも示唆されるように、オリゴ糖末端のα結合ガラクトースが生体の様々な生理作用に深く関与していること、及びグルコサミンやＮ−アセチルグルコサミンが生体内外で極めて重要な糖であることなどから、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンにαガラクトースという目印を付与した本発明のαガラクトシルグルコサミンは、αガラクトースと相互作用を引き起こす微生物、ウイルス、細胞、タンパク、脂質、糖質、抗体、ホルモン等を標的としてグルコサミン（アミノ基）を特異的に取り込ませたり、作用させることもできると考えられる。
【００４３】
更に、本発明のαガラクトシルグルコサミンは、メリビオースのグルコース骨格の２位炭素にアミノ基を導入した化合物とも考えられ、ウシやトリで知られる抗メリビオース抗体等との相互作用という見方から、何らかの活性の変化、あるいは新しい活性を有することも予測される。
【００４４】
したがって、本発明のαガラクトシルグルコサミンは、食品、医薬品、診断薬、研究試薬、化粧品、農薬等の幅広い分野において機能性素材としての利用が期待でき、今後の我々の医療、健康に大変利用価値の高いオリゴ糖であると考えられる。なお、本発明のαガラクトシルグルコサミンを食品、医薬品、化粧品等の原料として用いる場合、上記αガラクトシルグルコサミンに組み合わされる他の原料としては、例えばビタミン、ミネラル、甘味料、糖質、酸味料、香料、保存料、果汁、着色料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、調味料、その他添加物一般、他の機能性素材などが挙げられる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００４６】
実施例１（Ｎ−アセチルメリビオサミンの製造）
メリビオース（和光純薬工業株式会社製）１４．１ｇとＮ−アセチルグルコサミン（商品名「マリンスウィート」、焼津水産化学工業株式会社製）１８．１ｇを、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）８２ｍｌに溶解し、２ｍｌの純水に溶解したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ由来のα−ガラクトシダーゼ（商品名「スミチームＡＧＳ」、新日本化学工業株式会社製、３００００Ｕ／ｇ）３３．０ｍｇを添加し、５０℃で撹拌しながら２４時間反応を行った。反応中、反応液をサンプリングし、下記表２に示す条件でＨＰＬＣによる分析を行った。その結果を図１に示す。
【００４７】
【表２】
2004352672.tif 000006
【００４８】
反応終了後、反応液を沸騰水中で１５分間加熱して酵素を失活させ、室温まで冷却し、全液を活性炭カラムクロマトグラフィー（４．４ｃｍ×９０ｃｍ）に供し、水から２０％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコール溶液によるグラジエント法にて溶出し、２８ｍｌ×１００本試験管に採取した。検出は、波長２１０ｎｍの紫外吸収によるアセチル基のカルボニルの吸収、及びフェノール硫酸法による還元糖にて行った。その結果を図２に示す。
【００４９】
そして、紫外吸収かつ還元性のあるピーク画分について、表２に示す条件でＨＰＬＣによる分析を行い、純度１００％のＮ−アセチルメリビオサミン画分を回収してエバポレーターにて濃縮し、０．４５μｍのメンブランフィルターにより清澄濾過後、凍結乾燥して白色の粉末１．７６ｇを得た。ＨＰＬＣの結果を図３に示す。
【００５０】
得られた粉末の構造確認のため、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲ，ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣスペクトルを測定した結果を図４に示す。図中に示されていないが、アセチル基に由来するカルボニル（１７４．６ｐｐｍ）とメチル（２２．１）炭素ピークが見られた。また、図に示すように結合に関与している６位炭素が、メリビオースの６位炭素ピークとほぼ同じシフト値（６５．９）にあり、通常のフリーの６位炭素に比べ６ｐｐｍほど低磁場にシフトしているのが観察されたことから、６位で結合していることが確認された。炭素数及び各ピークから、Ｎ−アセチルメリビオサミンであると同定された。
【００５１】
なお、化学シフト値は以下の通りである。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），δ５．１１（０．５５Ｈ，  Ｈ−１α），  ４．８８（１Ｈ，  Ｈ−１’），  ４．６２（０．４５Ｈ，  Ｈ−１β），  ３．４２−３．９２（１２Ｈ），  １．９４（３Ｈ，  ＣＨ３），  １３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），δ１７４．７（Ｃ＝Ｏ−β），  １７４．５（Ｃ＝Ｏ−α），  ９８．２（Ｃ−１’），  ９５．０（Ｃ−１β），  ９０．９（Ｃ−１α），  ７４．４，  ７４．０，  ７０．９，  ７０．２，  ７０．０，  ６９．７，  ６９．４，  ６９．２，  ６８．５，  ６８．４，  ６５．９（Ｃ−６α），  ６５．８（Ｃ−６β），  ６１．１（Ｃ−６’），  ５６．６（Ｃ−２β），  ５４．０（Ｃ−２α），  ２２．２（ＣＨ３−β），  ２１．９（ＣＨ３−α）
【００５２】
実施例２（メリビオサミン塩酸塩の製造）
メリビオース（和光純薬工業株式会社製）１７．１ｇとグルコサミン塩酸塩（商品名「ナチュラルグルコサミン」、焼津水産化学工業株式会社製）２１．６ｇを、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに溶解し、１ｍｌの純水に溶解したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ由来のα−ガラクトシダーゼ（商品名「スミチームＡＧＳ」、新日本化学工業株式会社製、３００００Ｕ／ｇ）４０ｍｇを添加し、５０℃で撹拌しながら２３時間反応を行った。反応終了後、反応液を沸騰水中で１５分間加熱して酵素を失活させ、室温まで冷却した。反応前、及び酵素失活後の反応液をサンプリングし、下記表３に示す条件でＨＰＬＣによる分析を行った。その結果を図５に示す。
【００５３】
【表３】
2004352672.tif 000007
【００５４】
酵素失活させた反応液を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（４．４ｃｍ×９０ｃｍ）（樹脂：商品名「Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ×４」）に供し、０．５Ｎ  ＨＣｌにて溶出し、２５ｍｌ×１００本試験管に採取した。検出はニンヒドリン試薬を用いて行った。その結果を図６に示す。
【００５５】
図６に示す二番目に大きなピークをメリビオサミン塩酸塩のピークとして全量を回収し、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ５．２に中和し、濃縮後、マイクロアシライザー（旭化成製）による脱塩を行った。更に、脱塩液を、活性炭カラムクロマトグラフィー（４．４ｃｍ×９０ｃｍ）に供し、水から１０％（ｖ／ｖ）のイソプロピルアルコール溶液によるグラジエント法にて溶出し、２８ｍｌ×１３０本試験管に採取した。検出は、ニンヒドリン試薬を用いて行った。
【００５６】
メインのピークの各画分について、表３に示す条件でＨＰＬＣによる分析を行い、純度１００％のメリビオサミン塩酸塩画分を回収し、ｐＨを４．０に調整後、エバポレーターにより濃縮、０．４５μｍのメンブランフィルターにより清澄濾過後、凍結乾燥して白色粉末０．９３ｇを得た。ＨＰＬＣの結果を図７に示す。
【００５７】
得られた粉末の構造確認のため、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲ，ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣスペクトルを測定した。その結果を図８に示す。図８に示すように、６位炭素のピークがメリビオースの６位炭素とほぼ同じシフト値（６５．６）にあり、通常のフリーの６位炭素に比べ６ｐｐｍほど低磁場にシフトしているのが観察されたことから、６位で結合していることが確認された。また、２位のプロトン、カーボンピークがフリーのアミノ基と結合していることを示しており、炭素数及び各ピークから、メリビオサミン塩酸塩であると同定された。
【００５８】
なお、化学シフト値は以下の通りである。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），  δ５．３５（０．６Ｈ，  Ｈ−１α），  ４．８６−４．８９（１．４Ｈ，  Ｈ−１’，  Ｈ−１β），  ３．４７−３．９８（１１Ｈ），  ３．２１（０．６Ｈ，  Ｈ−２α），  ２．９２（０．４Ｈ，  Ｈ−２β），  １３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ），δ９８．２（Ｃ−１’），  ９２．８（Ｃ−１β），  ８９．２（Ｃ−１α），  ７４．６，  ７２．１，  ７１．０，  ７０．３，  ６９．８，  ６９．５，  ６９．４，  ６９．２，  ６８．４，  ６５．６（Ｃ−６α），  ６５．５（Ｃ−６β），  ６１．１（Ｃ−６’），  ５６．６（Ｃ−２β），  ５４．２（Ｃ−２α）
【００５９】
実施例３（食品素材向けメリビオサミン塩酸塩の製造）
ラフィノース（商品名「ニッテンラフィノース」、日本甜菜精糖株式会社製）５９４．５ｇとグルコサミン塩酸塩（商品名「ナチュラルグルコサミン」、焼津水産化学工業社製）８６２．５ｇを、純水に溶解して４Ｌ溶液とし、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ５．５に調整後、３０ｍｌの純水に溶解したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ由来のα−ガラクトシダーゼ（商品名「スミチームＡＧＳ」、新日本化学工業株式会社製、３００００Ｕ／ｇ）１．６ｇ（＝４８０００Ｕ）を添加し、５０℃で撹拌しながら２４時間反応を行った。
【００６０】
反応液を沸騰水中で１５分間加熱して酵素を失活させた後、室温まで冷却し、固形分の１／５量の活性炭を添加し、１時間撹拌した後、濾過して濾液を回収した。
【００６１】
次に、回収した濾液を、逆浸透膜装置（商品名「ＮＴＲ−７４５０ＨＧ」、日東電工社製）により加水濃縮することでメリビオサミン含量を高めた。
【００６２】
得られた濃縮液の半量を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（２５Ｌ）（樹脂：商品名「Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗ×４」）に供し、０．１Ｎ  ＨＣｌにより溶出を行い、カラム体積の７〜９倍量付近に溶出したメリビオサミン塩酸塩画分を回収した。回収した画分を実施例２と同条件にてＨＰＬＣによる分析を行い、純度１００％画分のみ集めて、４８質量％  ＮａＯＨ水溶液によりｐＨ５．５とし、ＲＯ膜装置（商品名「ｎａｎｏｍａｘ−５０」、日本ミリポア株式会社社製）により、脱塩、濃縮を行った。
【００６３】
得られた濃縮液に、活性炭を固形分の半量投入し、１時間撹拌した後、濾過して濾液を回収し、ｐＨを４．９に調整後、０．４５μｍのフィルターパス、凍結乾燥により、メリビオサミン塩酸塩の乾燥粉末１５．６ｇを得た。
【００６４】
試験例１（ヒト赤芽球様白血病細胞（Ｋ５６２  ｃｅｌｌｓ）の増殖に及ぼすメリビオサミン塩酸塩及びＮ−アセチルメリビオサミンの影響）
以下の実験において、細胞培養液は、ＲＰＭＩ−１６４０（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｗｉｔｈ  １０％ＦＣＳ，２ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，５０Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，５０μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ）を用い、被験物質は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ  ＮａＣｌに溶解して用いた。
【００６５】
２４ウエルディッシュに、Ｋ５６２  ｃｅｌｌｓを９．４×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ含む懸濁液７２０μｌを分注し、次いで、被験物質として、メリビオース、Ｎ−アセチルメリビオサミン、メリビオサミン塩酸塩を終濃度５ｍＭになるように加え、培養液の最終量が８００μｌになるように培養液又は緩衝液を加えた。なお、糖非添加の系をコントロールとした。
【００６６】
３７℃、５．０％  ＣＯ２の条件件下で７２時間培養した後、各被験物質を添加したウエル（ｎ＝３）の単位当たりの細胞数をトーマの血球計算板でカウントした。その結果を図９に示す。
【００６７】
図９から、コントロール（６．５±０．３１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に対し、メリビオース添加系では７．０±０．９９×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、Ｎ−アセチルメリビオサミン添加系では６．５±０．８３×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌであり、メリビオース及びＮ−アセチルメリビオサミンは細胞増殖にほとんど影響を及ぼさないことが分かった。一方、メリビオサミン塩酸塩添加系では０．７１±０．１４×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（コントロールに対する増殖率が約１１％）と低く、細胞の増殖が抑制されていることが分かる。なお、増殖率は下記式により求めた。
【００６８】
【数１】
2004352672.tif 000008
【００６９】
以上の結果から、メリビオサミン塩酸塩が、ガン細胞に対する増殖抑制効果を有していることが分かった。
【００７０】
試験例２
実施例１、２で得られたＮ−アセチルメリビオサミン及びメリビオサミン塩酸塩を用いてｐＨによる加熱安定性を調べた。具体的には、メリビオサミン塩酸塩、又はＮ−アセチルメリビオサミンを１質量％含む、各ｐＨに調整した溶液を調製し、１００℃で１時間加熱後、メリビオサミン塩酸塩又はＮ−アセチルメリビオサミンの残存率（％）をＨＰＬＣによって測定した。その結果を図１０に示す。
【００７１】
図１０から、メリビオサミン塩酸塩は、ｐＨ３〜１１の広範囲で安定であることが分かる。なお、強酸側ではグリコシド結合の分解、強アルカリ側では糖骨格の分解が見られた。一方、Ｎ−アセチルメリビオサミンは、ｐＨ３〜５の条件で極めて安定であることが分かる。なお、強酸側、中性から弱アルカリ領域にかけてグリコシド結合の分解が見られ、強アルカリでは糖骨格の分解が見られた。
【００７２】
この結果から、１００℃、１時間の加熱条件下においては、メリビオサミン塩酸塩は、弱酸〜アルカリ（ｐＨ３〜１１）の広い範囲、Ｎ−アセチルメリビオサミンは弱酸〜中性（ｐＨ３〜５）で安定であることが分かり、食品や医薬品等における機能性素材として十分に利用できることが示唆された。また、ｐＨ１．１、３７℃で４時間放置の条件では、メリビオサミン塩酸塩及びＮ−アセチルメリビオサミンのいずれも全く分解は起こらなかったことから、通常の条件では、極めて広いｐＨ範囲での取り扱いも可能であることが示された。
【００７３】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、α結合ガラクトオリゴ糖又はその誘導体を原料とし、グルコサミン塩又はＮ−アセチルグルコサミンの存在下、α−ガラクトシダーゼによる転移反応を行うことにより、ガラクトースが、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンにα１−６結合した非天然型の新規な二糖類（αガラクトシルグルコサミン）を一段階の反応で効率よく得ることができる。
【００７４】
このαガラクトシルグルコサミンは、ガン細胞に対する細胞増殖抑制作用を有しているほか、様々な生理効果が期待でき、食品、医薬品、診断薬、研究試薬、化粧品、農薬等の幅広い分野において機能性素材としての利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応液中のＮ−アセチルメリビオサミンの生成量の経時変化をＨＰＬＣで調べた結果を示す図である。
【図２】前記反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーによって分画した結果を示す図である。
【図３】前記活性炭カラムクロマトグラフィーにより分画されたＮ−アセチルメリビオサミン画分をＨＰＬＣにより分析した結果を示す図である。
【図４】得られたＮ−アセチルメリビオサミンのＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
【図５】反応液中のメリビオサミン塩酸塩の生成量の経時変化をＨＰＬＣで調べた結果を示す図である。
【図６】前記反応液を陽イオン交換カラムクロマトグラフィーによって分画した結果を示す図である。
【図７】前記陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分画されたメリビオサミン塩酸塩画分をＨＰＬＣにより分析した結果を示す図である。
【図８】得られたメリビオサミン塩酸塩のＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
【図９】メリビオース、Ｎ−アセチルメリビオサミン、メリビオサミン塩酸塩のＫ５６２細胞に対する増殖抑制作用を調べた結果を示す図である。
【図１０】Ｎ−アセチルメリビオサミン及びメリビオサミン塩酸塩のｐＨによる加熱安定性を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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