(57)【要約】【課題】本発明は、化学除草剤のように環境問題を起こす虞がなく、容易に且つ安価に、各種有害藻類や雑草類の駆除が出来、水田除草（藻）剤、浄水槽浄化剤、水源地浄化剤、湖沼・河川浄化剤等として有効に使用し得る新規な生物農薬を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を含んでなる農薬に関する。また、本発明は、ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を用いることを特徴とする、雑草又は／及び藻類の駆除方法に関する。更に、本発明は、ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を含んでなる雑草又は／及び藻類の駆除剤に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を含んでなる農薬。
【請求項２】
ウィルスが単細胞緑藻クロレラに特異的に感染するクロロウィルス（クロレラウィルス）である請求項１に記載の農薬。
【請求項３】
クロロウィルス（クロレラウィルス）がＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科  Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属するウィルスである請求項２に記載の農薬。
【請求項４】
溶菌液がクロロウィルスを単細胞緑藻クロレラにｍｏｉ１〜１０で接種して得られた溶菌液である請求項１〜３の何れかに記載の農薬。
【請求項５】
ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を用いることを特徴とする、雑草又は／及び藻類の駆除方法。
【請求項６】
ウィルスが単細胞緑藻クロレラに特異的に感染するクロロウィルス（クロレラウィルス）である請求項５に記載の駆除方法。
【請求項７】
溶菌液がクロロウィルスを単細胞緑藻クロレラにｍｏｉ１〜１０で接種して得られた溶菌液である請求項５又は６に記載の駆除方法。
【請求項８】
雑草又は／及び藻類が水田、浄水槽、水源地又は湖沼・河川に繁茂する雑草又は／及び藻類である請求項５〜７の何れかに記載の駆除方法。
【請求項９】
ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を含んでなる雑草又は／及び藻類の駆除剤。
【請求項１０】
ウィルスが単細胞緑藻クロレラに特異的に感染するクロロウィルス（クロレラウィルス）である請求項９に記載の駆除剤。
【請求項１１】
溶菌液がクロロウィルスを単細胞緑藻クロレラにｍｏｉ１〜１０で接種して得られた溶菌液である請求項９又は１０に記載の駆除剤。
【請求項１２】
雑草又は／及び藻類が水田、浄水槽、水源地又は湖沼・河川に繁茂する雑草又は／及び藻類である請求項９〜１１の何れかに記載の駆除剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水田除草（藻）剤、浄水槽浄化剤、水源地浄化剤、湖沼・河川浄化剤等として使用し得る新規な生物農薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
水田における雑草や藻類を駆除する目的で多種の化学除草剤（オキサジクロメホン系、ザ・ワン、スパークスター、クラッシュ、ウルフエース、ザーク、プロスパー、等々）が大量に使用されているが、化学除草剤は環境複合汚染の原因物質として大きな問題を抱えている。
一方、生物農薬としてウイルスを使用した例はこれまでに未だ見られない。
雑草の繁茂は、更にいもち病発生の原因ともなり、また、ウンカ駆除剤の効力をも半減させている。
水源地、浄水槽に自然繁茂する藻類は規制により薬剤駆除が出来ないので、関係者はその対応に苦慮している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き現状に鑑みなされたもので、化学除草剤のように環境問題を起こす虞がなく、容易に且つ安価に、各種有害藻類や雑草類の駆除が出来、水田除草（藻）剤、浄水槽浄化剤、水源地浄化剤、湖沼・河川浄化剤等として有効に使用し得る新規な生物農薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を含んでなる農薬に関する。
【０００５】
また、本発明は、ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を用いることを特徴とする、雑草又は／及び藻類の駆除方法に関する。
【０００６】
更に、本発明は、ウィルスに感染して溶解した単細胞緑藻クロレラの溶菌液を含んでなる雑草又は／及び藻類の駆除剤に関する。
【０００７】
本発明者はこれまで単細胞緑藻クロレラに感染するウイルス（クロロウイルス）を自然界より多数分離取得しその性質を調べてきた。このウイルスはＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科  Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属し、ある種のクロレラ株に特異的に感染する。感染プロセスの中でウイルスは固有の多糖質分解酵素群を発現して、単細胞緑藻クロレラの固く堅牢な細胞壁を容易に溶解する。これらウイルス酵素を以下の表１に示す。
【０００８】
【表１】
2004277373.tif 000002
【０００９】
ここで、ｖＡＬ−１，ｖＡＬ−２はウロン酸を含む糖鎖を分解する新規酵素であり、キチナーゼ、キトサナーゼはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ）から成るキチン質、キトサン質をそれぞれ分解する。β−１，３−グルカナーゼは一般的なβ−１，３−グルカン成分を分解する。これら酵素活性以外にも、ウイルスがコードする遺伝子が多々あり、溶菌液中には未同定の酵素活性複数種が存在する可能性が高い。
即ち、本発明者は、これら複数種の酵素の相互作用によって単細胞緑藻クロレラの複雑・不均一な細胞壁構造が分解されるのではないかと考え、更には、この強力な酵素活性を水田等の雑草や藻類の溶解に利用出来るのではないかと考え、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに到った。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、単細胞緑藻クロレラに感染させるウイルスとしては、単細胞緑藻クロレラに特異的に感染するクロロウィルス（クロレラウィルス）が挙げられる。
クロロウィルス（クロレラウィルス）は、分類学上はＰｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科  Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ属に属するウィルスである。
クロロウィルスは自然界に広く分布し、日本においても各地の自然淡水中から検出されている（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９１，５７，３４３３−３４３７；Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９３，５７，７３３−７３９等）。
これまでに明らかにされたクロロウィルスの特徴は、以下のように要約される。
（１）藻類クロレラを宿主とする。
（２）直径１４０〜１９０の巨大な正二十面体粒子であり（ショ糖密度勾配沈降係数２３００ｓ）、主としてタンパク質（６４％）、ＤＮＡ（２５％）、及び脂質（１０％）から成る。
（３）ウィルス粒子は５０種以上の構成タンパク質から成り、その内主要タンパク質Ｖｐ５４（Ｖｐ５２）が約４０％を占める。
（４）ウィルスゲノムは巨大な（３００〜３８０ｋｂｐ）線状ｄｓＤＮＡであり、特殊なヘアピン末端構造を有する。
（５）ウィルスゲノムには７００個以上の遺伝子読み取り枠（ＯＲＦ）があり、その多くが感染サイクル中に発現している。
（６）感染様式はバクテリオファージと類似し、プラークを形成する。
（７）ウイルス粒子は宿主細胞質で増殖する。
【００１１】
本発明に係る単細胞緑藻クロレラの溶菌液としては、例えば、クロロウィルスを単細胞緑藻クロレラにｍｏｉ１〜１０で接種して得られた溶菌液が挙げられる。
本発明においては、ウイルスが感染して完全に溶解したクロレラの溶菌液（多数の細胞壁溶解酵素活性を含む）を生物農薬として、また、雑草や藻類の駆除剤として、各種有害藻類や雑草類の駆除に用いる。
本発明はクロロウイルスがクロレラ（非常に固い殻を持っている）に感染する際特殊な酵素を発現して、固い細胞壁を分解する特性を利用して、この強力な酵素活性を水田等の雑草や藻類の溶解に利用しようと言うものである。
酵素は一種類ではなく数種類の混合物であり、ウイルスが感染してクロレラ細胞が溶解した溶菌液をそのまま酵素製剤として利用するのである。
【００１２】
本発明に係るクロレラ溶菌液は、単細胞緑藻クロレラ細胞にクロロウィルスを接種し、感染させて、これを溶解させることにより達成されるが、クロレラウィルスの使用量としては、通常、１Ｌのクロレラ培養液（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）にクロロウィルスをｍｏｉ１〜１０程度（細胞あたりのウイルス数）接種すればよい。
【００１３】
本発明に係るクロレラ溶菌液を得るために、クロレラ細胞に接種、感染させるクロロウィルスとしては、例えば、ＣＶＨＩ１、ＣＶＫＡ１、ＣＶＢＲ４、ＣＶＡ１、ＣＶＮＩ１、ＣＶＮＡ１、ＣＶＴＳ１、ＣＶＳＥ１、ＣＶＯ１、ＣＶＫ２、ＣＶＮＡ２、ＣＶＫＵ２、ＣＶＩＫ１、ＣＶＨＡ１等が挙げられるが、中でも宿主クロレラ細胞に感染させることによりキチンを生産するクロロウィルスであるＣＶＫ２，ＣＶＮＡ２，ＣＶＫＵ２等がより好ましく、ＣＶＫ２が特に好ましい。
【００１４】
クロロウィルスを感染させるクロレラ細胞としては、例えば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４ＡやＣ．ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ  ２１１−６等のクロレラ株が用いられる。
クロレラの培養に用いられる培地としては、例えば、ＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ｐＨ６．５）やＭＡＭ培地（硝酸アンモニウム０．０２５％、硝酸カリウム０．０１％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、塩化ナトリウム０．００２５％、β−グリセロリン酸ナトリウム０．１％、バクトペプトン０．１％、酵母エキス０．０５％、カザミノ酸０．１％、マルトエキス０．０５％）等が用いられる。
クロレラの培養は、通常、光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養する。増殖速度（倍加時間）は約６時間程度である。
【００１５】
斯くして得られたクロレラ培養液にクロロウイルスをｍｏｉ１〜１０で接種する。ウィルス接種後、２５℃でそのまま静置し、６〜８時間後にウイルス溶菌液を得る。次いで、遠心分離（１０，０００Ｇ）等により細胞残滓を除けば、目的の溶菌液となる。一般的には除草試験にこの溶菌液をそのまま用いる。濃縮する場合は、ウイルス感染前のクロレラ細胞濃度を適当に調整する。溶菌液は冷凍保存可（活性低下は一ヶ月保存後も１０％以内）である。
【００１６】
ウイルスの調製法は、例えば下記のようにして行えばよい。
即ち、クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４ＡやＣ．ｐｒｏｔｏｔｅｃｈｏｉｄｅｓ  ２１１−６等）を宿主とした寒天平板培地プラークアッセイ法により単離したウイルス各種をクロレラ培養細胞（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に接種する。数時間後の溶菌液を遠心分離（１５，０００Ｇ）し、沈殿したウイルス粒子を適当量のＭＢＢＭ培地に懸濁し、０．４５μｍ孔径のメンブランフィルターで濾過する。ウイルス粒子はクロレラ培養液１Ｌ（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）当り２×１０１３ＰＦＵ程度得られる。
【００１７】
クロレラ溶菌液を用いた本発明の雑草又は／及び藻類の駆除方法は、例えば、以下のようにして実施される。
即ち、例えば、５００ｍｌの植物組織培養ガラスビンに２００ｍｌの水田土壌、と２００ｍｌの水田水を加え水田自生のアオミドロ（例えば３ｇ湿重量）、ヒビミドロ（例えば３ｇ湿重量）、単細胞藻類（水田自生クロレラ様、例えば１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を植菌し室温（２５℃）で、（明）１６ｈ、（暗）８ｈの条件で一週間静置培養する。安定生育条件下で本発明に係るクロレラ溶菌液を１ｍｌ（１ｍｌ／２００ｍｌ）添加する。ウイルス液は、例えばＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ株等を宿主として（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）、ウイルス株、例えばＣＶＫ２を感染させて約６時間後の溶菌液を用いる。ウイルス液添加後随時対象藻類の性状を観察する。
【００１８】
本発明に係るクロレラ溶菌液を用いることにより、化学除草剤のように環境問題を起こすこともなく、容易に、安価に、且つ極めて効率的に水田、浄水槽、水源地又は湖沼・河川等に繁茂する雑草や藻類を駆除することが出来る。
【実施例】
以下、参考例及び実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら参考例、実施例により何ら限定されるものではない。
【００１９】
参考例１  クロロウイルスの調製
クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ）を宿主とした寒天平板培地プラークアッセイ法により単離したウイルス各種をクロレラ培養細胞（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に接種した。数時間後の溶菌液を遠心分離（１５，０００Ｇ）し、沈殿したウイルス粒子を適当量のＭＢＢＭ培地に懸濁し、０．４５μｍ孔径のメンブランフィルターで濾過した。ウイルス粒子はクロレラ培養液１Ｌ（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）当り２×１０１３ＰＦＵが得られた。
【００２０】
実施例１  クロレラ溶菌液の調製
クロレラ株（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．ＮＣ６４Ａ）をＭＢＢＭ培地（硝酸ナトリウム０．０２５％、塩化カルシウム０．００２５％、硫酸マグネシウム０．００７５％、リン酸１カリウム０．０１７５％、リン酸２カリウム０．００７５％、食塩０．００２５％、ペプトン０．１％、ｐＨ６．５）で光照射下（白色光３０００〜５０００ルックス）、２５℃で対数増殖期後期（１０７〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）まで培養した後、クロロウイルス（ＣＶＫ２）をｍｏｉ１〜１０で接種した。２５℃でそのまま静置し、８時間後にウイルス溶菌液を得た。遠心分離（１０，０００Ｇ）により細胞残滓を除き、雑草及び藻類駆除用の溶菌液とした。
【００２１】
実施例２  有害藻類の殺滅処理
５００ｍｌ容器（植物組織培養ガラスビン）に２００ｍｌ水田土壌及び２００ｍｌ水田水を加え水田自生のアオミドロ（３ｇ湿重量）、ヒビミドロ（３ｇ湿重量）及び単細胞藻類（水田自生クロレラ様、１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を植菌し室温（２５℃）で、（明）１６ｈ、（暗）８ｈの条件で一週間静置培養した。ここに安定生育条件下でクロレラ溶菌液を１ｍｌ添加（１ｍｌ／２００ｍｌ）した。  ウイルス液はＣｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．  ＮＣ６４Ａ株を宿主として（１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）ウイルス株ＣＶＫ２を感染させて６時間後の溶菌液を用いた。ウイルス液添加後随時対象藻類の性状を観察した。
結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
2004277373.tif 000003
【００２３】
表２からも明らかなように、自然水田環境に設定した条件下で、被検体アオミドロ、ヒビミドロに対して本発明に係る溶菌液は顕著な殺藻効果を示した（褐変、細胞萎縮、凝縮、一週間で藻体容積１／５に減少その後死滅）。また、クロレラ様単細胞藻類（多くの浄水緑化減少の原因生物となる）もほぼ完全に溶菌消滅する（４日後に１／１００に、１週間後に１／１００００に細胞数減少）。
【００２４】
【発明の効果】
本発明に係る農薬、雑草又は／及び藻類の駆除剤は、従来の化学合成除草剤と異なり自然生物に由来する除草剤であり環境問題を起こす虞がない。また、その作用効果も絶大である。一方、その製造に当たっては、極めて容易に、且つ安価に高生産できる。
クロレラの培養は、大気温暖化ガス二酸化炭素を産業生産の場で吸収するプロセスとして従来研究されてきている。それらプロセスによる生産細胞を本発明とカップリングさせれば一石二鳥の効果がある。