(57)【要約】【課題】少なくとも最外相が油性成分の化粧品等において、確度の高いチャレンジテスト法により、最適な防腐防黴剤の配合量を決定する手段を提供すること。【解決手段】少なくとも最外相が油性成分である試料の防腐防黴力を判定するにあたって、油性成分中に分散させた汚染微生物を前記試料に接種し、この汚染微生物の生育の度合いにより試料の防腐防黴力を判定する、防腐防黴力の判定方法と、当該方法において検出される汚染微生物の生育の度合いと試料における防腐防黴剤の添加量を関連付けて、試料における防腐防黴剤の最適な添加量を決定する、防腐防黴剤の添加量の決定方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも最外相が油性成分である試料の防腐防黴力を判定するにあたって、油性成分中に分散させた汚染微生物を前記試料に接種し、この汚染微生物の生育の度合いにより試料の防腐防黴力を判定する、防腐防黴力の判定方法。
【請求項２】
汚染微生物の生育の度合いが、汚染微生物数の経時的な変動である、請求項１記載の防腐防黴力の判定方法。
【請求項３】
少なくとも最外相が油性成分である試料が、油中水型乳化組成物である、請求項１又は２記載の防腐防黴力の判定方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかの請求項記載の防腐防黴力の判定方法において検出される汚染微生物の生育の度合いと試料における防腐防黴剤の添加量を関連付けて、試料における防腐防黴剤の添加量を決定する、防腐防黴剤の添加量の決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、防腐防黴力の判定方法に関する発明である。より具体的には、本発明は、油中水型組成物等の、少なくとも最外相が油性成分である試料における防腐防黴力の判定方法に関する発明である。
【０００２】
【従来の技術】
薬事法第５６条に、医薬品について規定されているのと同じく、微生物により汚染されている化粧品が製造されたり販売されたりするのは好ましくない。工場等での製造工程における微生物汚染など、消費者による使用以前に起こり得る「一次汚染」は、メーカー側の品質管理上の努力により、克服することが可能である。
【０００３】
しかしながら、消費者による使用に際して起こり得る「二次汚染」に対しては、例えば、パラベン類などの防腐防黴剤を製品中に配合させたこと等による、製品それ自体の防腐防黴力に依存するところが大きい。
【０００４】
特に、化粧品は、種々の成分の混合物であることが多いので、配合されている防腐防黴剤の作用が、配合されている油、界面活性剤、増粘剤、皮膜剤、保湿剤等の性質や分量によって大きく影響を受けることが一般的に知られている。近年では、化粧品の処方構成から配合した防腐防黴剤の効果を理論的に予測したり、処方成分から必要な防腐防黴剤の量を決定することが可能になってきている。しかしながら、多様な剤型に適用可能であり、かつ、精度が高い防腐防黴剤の量の決定方法はなく、結局のところ、一品一品の製品に汚染微生物を接種して、その汚染微生物が死滅するか否かを確認する必要がある。
【０００５】
また他方では、安全性を特に考慮すると、製品に配合する防腐防黴剤の量は、極力少量であることが望まれる。このことからも、より精度の高い防腐力の判定方法が求められている。
【０００６】
典型的な防腐防黴力の判定方法として、汚染微生物を製品に接種して、その汚染微生物が死滅するか否かを確認する方法（チャレンジテスト）、すなわち、特定の汚染微生物を、水や緩衝液に分散させて、この汚染微生物分散液を製品に接種後、経日での汚染微生物数の変化を観察する方法が採られていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このようなチャレンジテストは、その最外相が水性成分の製品については好適であるが、最外相が油性成分の製品においては、汚染微生物分散水が均一に混ざりにくく、その結果の判定にばらつきを生じる原因の一つとなっていた。加えて、カビの胞子のように、水や緩衝液を用いることでは、分散性が十分でない菌種も存在する。日本薬局方１３改正では、カビの胞子液調製方法として、界面活性剤を含有する水溶液を用いて分散させる方法が記されているが、この方法では、胞子自体の分散や、製剤への菌液の均一混合が難しく、その結果として、過剰量の防腐防黴剤を配合することとなり、これが皮膚刺激の原因の１つとなっていた。
【０００８】
本発明において解決すべき主要な課題は、少なくとも最外相が油性成分の化粧品等において、確度の高いチャレンジテスト法により、最適な防腐防黴剤の配合量を決定する手段を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題の解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、カビ胞子等の汚染微生物を分散させる分散液として、油性成分を用いることにより、少なくとも最外相が油性成分の化粧品等において、確度の高い結果を得ることが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、少なくとも最外相が油性成分である試料の防腐防黴力を判定するにあたって、油性成分中に分散させた汚染微生物を前記試料に接種し、この汚染微生物の生育の度合いにより試料の防腐防黴力を判定する、防腐防黴力の判定方法（以下、本発明判定方法ともいう）を提供する。
【００１１】
また、本発明は、本発明判定方法において検出される汚染微生物の生育の度合いと試料における防腐防黴剤の添加量を関連付けて、試料における防腐防黴剤の最適な添加量を決定する、防腐防黴剤の添加量の決定方法（以下、本発明決定方法ともいう）を提供する。
【００１２】
本発明において、「少なくとも最外相が油性成分である試料（以下、試料ともいう）」とは、製品の使用中に直接外気に触れる最外相が油性成分である試料のことを意味し、例えば、油中水型乳化組成物、オイル組成物、油性原料等のことを意味する。よって、最外相が水性成分である水中油型乳化組成物は、試料の定義から除外される。
【００１３】
また、本発明において、「汚染微生物」とは、凡そ化粧品等の汚染の原因になる微生物の中で、特に胞子を形成する微生物、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  属、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｆｕｓａｌｉｕｍ属等のカビ類、さらには真菌類を例示することができる。
【００１４】
これらの汚染微生物は、各々の性質に応じた通常公知の方法で、個別的に培養等して得たものを、本発明判定方法において用いることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明判定方法は、上述のように、試料中に、油性成分中に分散させた汚染微生物を接種し、この汚染微生物の生育の度合い、特に、汚染微生物数の経時的な変動の度合いにより、試料の汚染微生物に対する防腐防黴力を判定する、防腐防黴力の判定方法である。
【００１６】
汚染微生物を分散させる油性成分は、試料中の少なくとも最外相を構成する油性成分との相溶性が良好である油性成分を選択することが好ましい。また、一般的には、油性成分中に微生物を可能な限り容易に分散させることが可能であることが好ましいことを考慮すると、比較的低粘度の油性成分を、汚染微生物を分散させる対象として選択することが好ましい。
【００１７】
具体的には、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、シクロメチコーン４量体、５量体、６量体（製品名称エキセコールＤ−４，５，６）、ヒマシ油、エステル油などに代表される化粧品汎用油分等を上記油性成分として選択することが好適である。この汚染微生物の油性成分中における分散手段は、汚染微生物の生育に直接的に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されるものではなく、例えば、人力の他、ミキサーや超音波等を用いることも可能である。
【００１８】
また、油性成分中に分散させる、単位当りの汚染微生物数は、目標とする防腐防黴力に応じて適宜選択されるべきであるが、概ね１０３  ｃｆｕ／ｍＬ〜１０６  ｃｆｕ／ｍＬ程度である。
【００１９】
このようにして調製した、油性成分中に分散させた汚染微生物（分散汚染微生物ともいう）を、検査対象となる試料に接種する。
試料は、通常、乳液、クリーム、乳化ファンデーション、口紅、アイライナー、マスカラ、ヘアクリーム、ヘアワックス等の化粧品や、シリコーンエマルジョンなどの最外相が油性である製品であるが、「少なくとも最外相が油性成分である試料」である限り、例えば食品・工業用原料などの他の種類の製品についても本発明判定方法を適用することが可能である。
【００２０】
本発明判定方法においては、このようにして調製した試料に、上記分散汚染微生物を接種して、この汚染微生物接種済みの試料における、この汚染微生物の生育の度合いを把握することにより、この試料の汚染微生物に対する防腐防黴力を判定することができる。例えば、上記の試料における、汚染微生物数の経時的な変動を指標として、この試料における防腐防黴力を判定することができる（汚染微生物数の経時的な減少の度合いが大きいほど、試料の防腐防黴力が優れていると、判定される）。
【００２１】
試料における、汚染微生物の生育の度合いは、防腐力の判定対象である汚染微生物の性質に応じた条件（通常は、室温付近で、かつ好気的条件）で、試料をインキュベートして、例えば、試料中における接種当日の汚染微生物数と、インキュベート後の汚染微生物とを、通常公知の手段、例えば試料を寒天培地へ塗布し、出現したコロニー数を目視により計測することによる生菌数の確認、蛍光基質もしくは発色基質含有培地における特定の蛍光もしくは発色の程度の確認、電気伝導度・電気抵抗・静電容量測定による菌数測定等を検討することにより特定することができる。
【００２２】
この汚染微生物数が横這いもしくは減少する場合には、その製品においては、少なくとも、その汚染微生物に対する防腐防黴性が認められると判定され、増加する場合には、防腐防黴性は認められないと判定される。
【００２３】
上述したように、本発明判定方法においては、水ではなく、油性成分中に分散させた汚染微生物を、試料中に接種することによって、例えば、油中水型乳化組成物における最外相を構成する油相のように、外気に直接接触するにもかかわらず、その中において均等に汚染微生物を分散させることが困難であった油相部分においても、所望する汚染微生物を均等に分散させることが可能になる。すなわち、本発明判定方法によって、従来は確度の高いチャレンジテストが困難であった「少なくとも最外相が油性成分である試料」においても、水性試料と同様に、確度の高いチャレンジテストを行うことが可能になった。
【００２４】
また、本発明決定方法は、上述した本発明判定方法おいて検出される汚染微生物の生育の度合いと、試料における防腐防黴剤の添加量を関連付けて、試料における防腐防黴剤の適切な添加量を決定する、防腐防黴剤の添加量の決定方法である。
【００２５】
本発明決定方法では、本発明判定方法において想定される妥当な防腐防黴力の基準を、例えば、単位時間当りの汚染微生物数の変動（典型的には、横這いないし減少）の度合いを指標とし、あらかじめ基準を設定して、その基準に合致する防腐防黴剤の添加量を、用いた試料における防腐防黴剤の適切な添加量として関連付けて、所望する防腐防黴剤の添加量を決定することができる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例を用いて説明するが、これにより、本発明の技術的範囲は限定されない。
【００２７】
汚染微生物の培養
汚染微生物として、しばしば化粧品類が汚染される原因となり得るカビであるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ    ｓｐ．及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ   ｎｉｇｅｒ  を用いた。これらのカビは、ポテトデキストロース寒天培地を用いて、２５℃で１４日間前培養を行って調製した胞子を、本実施例における汚染微生物として用いた。
【００２８】
胞子懸濁液の調製
キャップ付き試験管に、下記に記載の試料１〜３（常法により調製した油中水型乳化組成物）の最外相と同一又は類似の油分、具体的には、試料１、２はスクワラン、試料３はデカメチルシクロペンタシロキサンを５ｍＬずつ分注した。次に、個別に前培養した前記の２種類のカビの胞子を、上記油分と同一の油分を浸した綿棒で掻きとって、試験管中の５ｍＬの油分の中に懸濁させ、最終的に胞子数が３×１０６  ｃｆｕ／ｍＬ程度となるように、試験管ミキサーでこの試験管を十分に攪拌して分散させて、所望する胞子分散液を得た。比較例として、従来のイオン交換水もしくは界面活性剤溶液を用いた方法も実施した。
【００２９】
2004313044.tif 000002
【００３０】
2004313044.tif 000003
【００３１】
2004313044.tif 000004
【００３２】
胞子懸濁液の接種
予め、ガラス瓶に３０ｇずつ分注した試料（試料１〜３）に、調製した胞子分散液を１株毎別々にメスピペットで０．１ｍＬずつ接種し、最終的にカビの胞子数が試料当り１×１０４  ｃｆｕ／ｇとなるようにした。
【００３３】
次に、試料をよく攪拌混合し、接種当日のおよその菌数を測定するために、綿棒による塗抹法により、この試料を培地（ポテトデキストロース寒天培地）に塗布し、これを２５℃で培養を行って、経時での生育菌数を測定した（なお、接種済み試料は、試験開始から２１日後まで２５℃で保存した）。
【００３４】
結果
得られた結果を第１表〜第３表（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ    ｓｐ．）  及び第４表〜第６表（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ   ｎｉｇｅｒ  ）  において示す。
【００３５】
試料１へＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ    ｓｐ．を接種
【表１】
2004313044.tif 000005
【００３６】
試料２へＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ    ｓｐ．を接種
【表２】
2004313044.tif 000006
【００３７】
試料３へＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ    ｓｐ．を接種
【表３】
2004313044.tif 000007
【００３８】
試料１へＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ      ｎｉｇｅｒ  を接種
【表４】
2004313044.tif 000008
【００３９】
試料２へＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ      ｎｉｇｅｒ  を接種
【表５】
2004313044.tif 000009
【００４０】
試料３へＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ      ｎｉｇｅｒ  を接種
【表６】
2004313044.tif 000010
これらの表において、各記号は以下の意味で表示されている。
【００４１】
＋        ：培地上にコロニーが１００個以上認められた。
１〜９９：培地上にコロニーが１〜９９個認められた。
−        ：培地上にコロニーが認められない。
【００４２】
以上の結果から、比較例においては、カビのコロニーの出現の仕方、及び減少傾向にバラツキが認められたが、本発明判定方法においては、このようなバラツキは認められず、カビの試料における減少傾向を精度よく判定することが可能であり、本発明判定方法が、既存の判定方法よりも、さらに精度が高い防腐防黴力の判定手段であることが判明した。
【００４３】
本発明判定方法では、試料中の汚染微生物数が横這いもしくは減少する場合には、その試料においては、少なくとも、その汚染微生物に対する防腐防黴性が認められると判定され、増加する場合には、防腐防黴性は認められないと判定される。
【００４４】
また、本発明決定方法として、本発明判定方法において想定される妥当な防腐防黴力の基準を、例えば、単位時間当りの汚染微生物数の減少の程度を指標とし、あらかじめ基準を設定して、その基準に合致する防腐防黴剤の添加量を、用いた試料における防腐防黴剤の適切な添加量として関連付けて、防腐防黴剤の好適な添加量（典型的には、十分な防腐防黴効果を有する最低量）を決定することができる。本発明決定方法では、上述したように、本発明判定方法が、非常に確度の高い防腐防黴力の判定方法であるので、防腐防黴剤の好適な添加量を正確に決定することが可能である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明により、少なくとも最外相が油性成分である試料における、確度の高いチャレンジテスト法が提供される。