(57)【要約】【課題】ＰＴＧＳサプレッサーとして機能する植物ウイルスの複製タンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子の利用法を提供する。【解決手段】トバモウイルス属等の植物ウイルスが有する１３０Ｋ複製タンパク質は、植物におけるＰＴＧＳを抑制する活性を有している。このため、上記複製タンパク質は、転写後遺伝子発現抑制を抑制する薬剤等として利用することができる。これらの薬剤等は、例えば、形質転換植物における導入遺伝子の発現効率を高めて有用物質を効率的に生産させることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物ウイルスの複製タンパク質を含むことを特徴とする転写後遺伝子発現抑制を抑制する薬剤。
【請求項２】
上記植物ウイルスが、トバモウイルス属に属するウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
上記植物ウイルスが、タバコモザイクウイルスまたはトマトモザイクウイルスであることを特徴とする請求項１または２に記載の薬剤。
【請求項４】
上記植物ウイルスの複製タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
（ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性を有するタンパク質。
【請求項５】
植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え発現ベクターを含むことを特徴とする転写後遺伝子発現抑制を抑制するための試薬キット。
【請求項６】
上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項５に記載の試薬キット。
（ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性を有するタンパク質。
【請求項７】
上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列のうち、７２〜３４２２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子、または配列番号３に示される塩基配列のうち、６９〜３４１９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子であることを特徴とする請求項５または６に記載の試薬キット。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤または試薬キットを用いて、転写後遺伝子発現抑制を抑制する方法。
【請求項９】
植物ウイルスの複製タンパク質を含むことを特徴とする形質転換植物における導入遺伝子発現効率を高める薬剤。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤または試薬キットを用いて、形質転換植物において導入遺伝子の発現効率を高める方法。
【請求項１１】
外来遺伝子が導入されている形質転換植物において植物ウイルスの複製タンパク質を共発現させることにより、上記形質転換植物における導入遺伝子の発現効率を高める方法。
【請求項１２】
転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有することを特徴とする弱毒ウイルス。
【請求項１３】
上記転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質が、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質であることを特徴とする請求項１２に記載の弱毒ウイルス。
【請求項１４】
転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有することを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１５】
上記転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質が、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の弱毒ウイルスまたは組換え発現ベクターを含むことを特徴とする植物におけるウイルス性疾患を防除するための薬剤。
【請求項１７】
請求項１２または１３に記載の弱毒ウイルスを植物に感染させることにより、または請求項１４または１５に記載の組換え発現ベクターを植物に導入することにより、植物におけるウイルス性疾患を防除するための方法。
【請求項１８】
転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列を有することを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換え発現ベクターを含む、転写後遺伝子発現抑制により植物の内在性遺伝子の発現を抑制するための薬剤。
【請求項２０】
請求項１８に記載の組換え発現ベクターを植物に導入し、転写後遺伝子発現抑制を引き起こし、植物の内在性遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項２１】
転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列を当該植物内にて共発現させることによって、当該植物における内在性遺伝子の発現を転写後遺伝子発現抑制により抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物ウイルス、例えば、トバモウイルス属のウイルスが有する複製タンパク質および当該複製タンパク質をコードする遺伝子の利用法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
線虫、ショウジョウバエをはじめとして、マウスやヒト、そして植物等の種々の生物において、細胞は、その活動に不適切なＲＮＡを効率よく排除する機能を有する。なかでも、特定の配列を有するＲＮＡを選択的に分解する転写後遺伝子発現抑制（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ、以下ＰＴＧＳと略す）が比較的よく知られている。例えば、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）等もこのＰＴＧＳのうちの一つで、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）がその制御に関わっているといわれている。
【０００３】
このうち、植物におけるＰＴＧＳの役割は、ウイルス感染に対する防御機構の一つであると考えられている。すなわち、植物にウイルスが感染すると、植物細胞にとって好ましくないウイルス由来のＲＮＡ（ｍＲＮＡやＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ）が多量に生産される。このため、ウイルスに感染した植物細胞では、ＰＴＧＳを機能させ、かかるウイルス由来のＲＮＡを駆逐し、ウイルス感染の拡大を防いでいる。
【０００４】
これに対して、多くの植物ウイルスは、植物細胞におけるＰＴＧＳを抑制する能力を有する。すなわち、ウイルスはＰＴＧＳによる増殖抑制に対抗すべく、それを抑えるサプレッサー（抑制因子）を発現させる。
【０００５】
植物ウイルスが発現するＰＴＧＳサプレッサーとしては、例えば、ポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）属のＨＣ−Ｐｒｏ（非特許文献１参照）、ククモウイルス（Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ）属の２ｂ（非特許文献２参照）、ポテックス（Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ）属のｐ２５（非特許文献３参照）、トムブスウイルス（Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ）属のｐ１９（非特許文献４参照）、カルモウイルス（Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ）属のコートタンパク質（非特許文献５参照）等が報告されている。
【０００６】
また、トバモウイルス（Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）属に属するタバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、以下、ＴＭＶと称する）を感染させた植物では、ＰＴＧＳが抑制されることが報告されている（非特許文献６参照）。さらに、トマトモザイクウイルス（Ｔｏｍａｔｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ、以下ＴｏＭＶと略す）の複製酵素がＰＴＧＳ抑制に関与していることが示唆されていた（例えば、非特許文献７参照）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ａｎａｎｄａｌａｋｓｈｍｉ  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９８，  ９５，  １３０７９−１３０８４．
【０００８】
【非特許文献２】
Ｂｒｉｇｎｅｔｉ  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９９８，  １７，  ６７３９−６７４６．
【０００９】
【非特許文献３】
Ｖｏｉｎｎｅｔ  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ２０００，  １０３，  １５７−１６７．
【００１０】
【非特許文献４】
Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２００２，  ２１，  ３０７０−３０８０．
【００１１】
【非特許文献５】
Ｑｕ  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００３，  ７７，  ５１１−５２２．
【００１２】
【非特許文献６】
Ｖｏｉｎｎｅｔ  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９９，  ９６，  １４１４７−１４１５２．
【００１３】
【非特許文献７】
久保田  健嗣  他３名共著、「トバモウイルスのＰＴＧＳ抑制能」平成１４年度  日本植物病理学会大会プログラム・講演要旨集、題目４１４
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のトバモウイルス属のウイルスについては、ウイルスがコードするタンパク質のうち、どのタンパク質がＰＴＧＳサプレッサーとして機能しているかがはっきりと特定されていなかった。また、ウイルスが有するＰＴＧＳサプレッサーの利用法は未だ十分に開発されておらず、その利用法を開発することが強く求められていた。
【００１５】
本発明は、上記従来の問題に鑑みなされたものであり、その目的は、植物ウイルス（例えば、トバモウイルス属のウイルス）の未知のＰＴＧＳサプレッサーとして機能するタンパク質を同定し、当該タンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子の利用法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ＰＴＧＳによって、外来緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＧＦＰと略す。）の発現が抑制されているＧＦＰ組換タバコに対して、ＴＭＶやＴｏＭＶ等のトバモウイルスを感染させた場合はＧＦＰ蛍光が復活するが、複製酵素（１３０Ｋ複製タンパク質）に変異を有する弱毒株ＴｏＭＶを感染させた場合は、ＧＦＰ蛍光の復活が認められないという現象等から、ＴｏＭＶの複製酵素（１３０Ｋ複製タンパク質）がサプレッサー因子であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかる転写後遺伝子発現抑制を抑制する薬剤は、上記の課題を解決するために、植物ウイルスの複製タンパク質を含むことを特徴としている。また、上記植物ウイルスが、トバモウイルス属に属するウイルスであることが好ましい。さらには、上記植物ウイルスが、タバコモザイクウイルスまたはトマトモザイクウイルスであることがより好ましい。また、上記植物ウイルスの複製タンパク質が、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であることが好ましい。（ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性を有するタンパク質。さらに、ここでいう複製タンパク質とは１３０Ｋ複製タンパク質であることが好ましい。
【００１８】
上記の構成によれば、上記薬剤は、例えば、ＴｏＭＶにおける１３０Ｋ複製タンパク質等のＰＴＧＳ抑制活性を有するタンパク質を有するため、植物のＰＴＧＳを効率的に抑制することができる。なお、本発明でいうＰＴＧＳは、植物細胞に外部から導入された外来遺伝子に対するＰＴＧＳ、および／または植物の内在性遺伝子に対するＰＴＧＳをいう。
【００１９】
また、本発明にかかる転写後遺伝子発現抑制を抑制するための試薬キットは、植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え発現ベクターを含むことを特徴としている。また、上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子が、上述の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。また、上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列のうち、７２〜３４２２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子、または配列番号３に示される塩基配列のうち、６９〜３４１９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子であることが好ましい。
【００２０】
上記の試薬キットを用いることにより、簡便かつ効率的にＰＴＧＳを抑制させることができる。
【００２１】
また、上記薬剤または試薬キットを用いて、転写後遺伝子発現抑制（ＰＴＧＳ）を抑制する方法が本発明には含まれる。
【００２２】
また、上記ＰＴＧＳ抑制薬剤または試薬キットは、例えば、有用物質を生産する目的で作製された形質転換植物に用いられることで、導入遺伝子の発現効率を高めるために利用することができる。
【００２３】
すなわち、本発明にかかる形質転換植物における導入遺伝子発現効率を高める薬剤は、植物ウイルスの複製タンパク質を含むことを特徴としている。また、上記薬剤または試薬キットを用いて、形質転換植物において導入遺伝子の発現効率を高める方法も本発明に含まれる。また、外来遺伝子が導入されている形質転換植物において植物ウイルスの複製タンパク質を共発現させることにより、上記形質転換植物における導入遺伝子の発現効率を高める方法も本発明に含まれる。
【００２４】
上記の薬剤や方法を用いることにより、例えば、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質を共発現させることにより、形質転換植物に導入された導入遺伝子に対するＰＴＧＳを効率的に抑制することができる。このため、形質転換植物の導入遺伝子発現効率を高めることができ、結果として有用物質を効率的に生産させることができる。
【００２５】
また、本発明にかかる弱毒ウイルスは、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有することを特徴としている。また、上記弱毒ウイルスは、上記転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質が、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質であることが好ましい。
【００２６】
また、本発明にかかる組換えベクターは、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有することを特徴としている。また、上記組換えベクターは、上記転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質が、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質であることが好ましい。
【００２７】
上記の弱毒ウイルスまたは組換えベクターを用いて、ＰＴＧＳサプレッサー活性が適当に弱められた複製タンパク質を植物細胞内で発現させることによって、ＲＮＡを介した干渉効果を引き起こすことができる。このため、上記の弱毒ウイルスまたは組換えベクターは、植物がウイルス感染の効率的な予防、または治療に利用することができる。
【００２８】
すなわち、本発明には、上記いずれかの弱毒ウイルスまたは組換え発現ベクターを含む植物におけるウイルス性疾患を防除するための薬剤、および上記いずれかの弱毒ウイルスを植物に感染させることにより、または上記いずれかの組換え発現ベクターを植物に導入することにより、植物におけるウイルス性疾患を防除するための方法が含まれる。
【００２９】
上記の薬剤または方法を用いることにより、効率的にＲＮＡを介した干渉効果を発生させることができ、植物のウイルス感染防除に利用することができる。このため、植物がウイルスに感染して引き起こされる植物病の発症を簡便かつ効率的に予防または治療することができる。
【００３０】
また、本発明にかかる組換え発現ベクターとしては、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列を有するものが挙げられる。
【００３１】
上記の組換え発現ベクターが植物に導入された場合、植物ウイルス由来の外来ｍＲＮＡ、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列に相当するｍＲＮＡが植物細胞内で多量に発現する。これに対して、植物細胞では、上記ｍＲＮＡを排除すべく、ＰＴＧＳが活性化する。しかし、上記組換え発現ベクターによって発現する複製タンパク質は、ＰＴＧＳ抑制活性が低下しているため、上記植物細胞内のＰＴＧＳは抑制されない。このため、活性化されたＰＴＧＳによって、上記一部の塩基配列を有する、植物の内在性遺伝子由来のｍＲＮＡも分解されてしまう。したがって、上記組換え発現ベクターは、転写後遺伝子発現抑制により植物の内在性遺伝子の発現を簡便かつ効率的に抑制するために利用することができる。
【００３２】
すなわち、本発明には、上記組換え発現ベクターを含む、転写後遺伝子発現抑制により植物の内在性遺伝子の発現を抑制するための薬剤が含まれる。また、上記組換え発現ベクターを植物に導入し、転写後遺伝子発現抑制を引き起こし、植物の内在性遺伝子の発現を抑制する方法も本発明に含まれる。
【００３３】
また、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列を当該植物内にて共発現させることによって、当該植物における内在性遺伝子の発現をＰＴＧＳにより抑制する方法でも、上記方法等と同様に転写後遺伝子発現抑制によって植物の内在性遺伝子の発現を簡便かつ効率的に抑制することができる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明は、植物におけるＰＴＧＳを抑制する活性を有する、植物ウイルス由来の複製タンパク質またはその遺伝子を利用する薬剤等の利用法を提供するものである。そこで以下では、まず、上記ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質について説明し、次いで、この複製タンパク質の利用法について説明することとする。なお、本発明はこれに限定されるものではないことはいうまでもない。
【００３５】
（１）複製タンパク質およびその遺伝子
（１−１）ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質およびその遺伝子
本発明に用いられる複製タンパク質としては、植物ウイルス由来の複製タンパク質であって、ＰＴＧＳ抑制活性を有するものであればよく、特に限定されるものではない。上記複製タンパク質としては、例えば、トバモウイルス属の植物ウイルスが有する１３０Ｋ複製タンパク質が挙げられる。ここで、トバモウイルス属とは、アルファ様ウイルススーパーグループに分類される、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスグループである。トバモウイルス属に属するウイルスとしては、例えば、Ｃｕｃｕｍｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｔｔｌｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＣＧＭＭＶ、ゲノムシークエンスアクセッションナンバー（以下、単にＡＣＣ  ｎｏ．）：Ｄ１２５０５、Ｄ０１１８８）、Ｆｒａｎｇｉｐａｎｉ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＦｒＭＶ）、Ｋｙｕｒｉ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｔｔｌｅ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＫＧＭＭＶ）、Ｏｂｕｄａ  ｐｅｐｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ（ＯｂＰＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｌ１１６６５、Ｄ１３４３８）、Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ  ｖｉｒｕｓ（ＯＲＳＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｓ８３２５７、Ｅ０４３０５、Ｕ３４５８６、Ｘ８２１３０）、Ｐａｐｒｉｋａ  ｍｉｌｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＰａＭＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｘ７２５８６）、Ｐｅｐｐｅｒ  ｍｉｌｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＰＭＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｍ８１４１３）、Ｒｉｂｇｒａｓｓ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＲＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｕ６９２７）、Ｓａｍｍｏｎｓ’ｓ  Ｏｐｕｎｔｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＳＯＶ）、Ｓｕｎｎ−ｈｅｍｐ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＳＨＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｕ４７０３４、Ｊ０２４１３）、Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｉｌｄ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＴＭＧＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｍ３４０７７、Ｍ２２４８３）、Ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＴＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｊ０２４１５、Ｘ６８１１０、Ｄ６３８０９）、Ｔｏｍａｔｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＴｏＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｘ０２１４４）、Ｔｕｒｎｉｐ  ｖｅｉｎ−ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ（ＴＶＣＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｕ０３３８７、Ｚ２９３７０）、Ｕｌｌｕｃｕｓ  ｍｉｌｄ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓ（ＵＭＭＶ）、Ｙｕｃａｒｉ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ（ＹｏＭＶ、ＡＣＣ  ｎｏ．：Ｕ３０９４４、Ｄ３８４４４）などが挙げられる。
【００３６】
また、上記トバモウイルス属に属するウイルスのなかでも、特に、ＴＭＶが有する１３０Ｋ複製タンパク質（ｐ１２６または１２６Ｋ複製タンパク質と称されることもあるタンパク質）や、ＴｏＭＶが有する１３０Ｋ複製タンパク質が好ましい。
【００３７】
また、上記複製タンパク質としては、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が挙げられる。（ａ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性を有するタンパク質。これらの複製タンパク質としては、例えば、ＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質や、ＴＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質が挙げられる。
【００３８】
なお、本発明でいう「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３９】
以下では、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質を例に挙げて、本発明に用いられる複製タンパク質が有する機能について具体的に説明する。
【００４０】
ＴｏＭＶは、トバモウイルス属に属するＲＮＡウイルスであり、配列番号１に示す塩基配列に相当するＲＮＡをゲノムとして有する。このＴｏＭＶゲノムには少なくとも４個のタンパク質、すなわち、１３０Ｋ複製タンパク質、１８０Ｋ複製タンパク質、移行タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＰ）、外被タンパク質（ｃｏａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＰ）がコードされている。（図３（ａ）参照）。
【００４１】
このうち、ＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質は、配列番号２に示される１１１６残基のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、配列番号１に示される塩基配列のうち、７２〜３４２２番目の塩基配列をＯＲＦとして有する３３５１塩基対からなるｃＤＮＡによってコードされている。
【００４２】
本発明者らは、後述する実施例に示すように、ＧＦＰを発現する形質転換タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ）に対して、野生型ＴｏＭＶを感染させると、ＰＴＧＳが抑制され、モザイク病徴に一致してＧＦＰ蛍光が復活する一方、ＴｏＭＶの弱毒変異株のＬ１１Ａ株を感染させるとＧＦＰ蛍光の復活が認められず、Ｌ１１Ａ株がＰＴＧＳ抑制能に欠損を持つことを見出した。そして、野生型の強毒ＴｏＭＶと、ＴｏＭＶの弱毒変異株Ｌ１１Ａ株との組換ウイルスを用いた解析から、ＴｏＭＶの弱毒変異株Ｌ１１Ａの１３０Ｋ複製タンパク質をコードする遺伝子には変異が存在し、かかる変異がＰＴＧＳ抑制活性の欠損の原因であることが判明した。さらに、後述する実施例に示すように、アグロフィルトレーション実験により、ＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質自身にＰＴＧＳ抑制活性があることを明らかにした。
【００４３】
さらに、ＴＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質も、かかるＰＴＧＳ抑制活性を有することが、本発明者らによって実験的に確かめられている。ここで、ＴＭＶは、トバモウイルス属に属するＲＮＡウイルスであり、配列番号３で示される塩基配列に相当するＲＮＡをゲノムとして有するものである。このうち、ＴＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質は、配列番号４に示される１１１６残基のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、配列番号３に示される塩基配列のうち、６９〜３４１９番目の塩基配列をＯＲＦとして有する３３５１塩基対からなるｃＤＮＡによってコードされている。
【００４４】
以上のことから、ここで説明したＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質、ＴＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質のみならず、かかる複製タンパク質と相同性が高い植物ウイルスの複製タンパク質、例えば、上述したトバモウイルス属のウイルスが有する１３０Ｋ複製タンパク質もＰＴＧＳ抑制活性を有すると考えられる。
【００４５】
ここで、ＰＴＧＳの機構について簡単に説明する。ＰＴＧＳは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成によって開始する。ｄｓＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖との両者が同時に発現したり、長い逆位配列を持つＲＮＡが転写されたりすると生じる。また、１本鎖ＲＮＡが過剰に発現した場合にも、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の働きによって合成されると考えられている。
【００４６】
そして、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ（あるいはＤｉｃｅｒ−ｌｉｋｅ，ＤＣＬ）と呼ばれる酵素によって約２１〜２３塩基の短い断片（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に分断される。そのため、このｓｉＲＮＡの存在は、ＰＴＧＳ発生の指標となる。ｓｉＲＮＡのうちの片側の鎖は、ＲＮａｓｅ活性を持つ複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）に取り込まれる。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡを見出し、それを切断する。ｄｓＲＮＡからＲＩＳＣに至る経路はＲＮＡサイレンシングに共通している。この経路に加え、植物や線虫では、ＲｄＲｐが（おそらくｓｉＲＮＡをプライマーとして利用し）標的ＲＮＡをｄｓＲＮＡにする反応がおこる。ＲｄＲｐの関与により閉じた経路が形成され、その結果、標的ＲＮＡの合成量が多いほど、ＲＩＳＣによる分解活性も上昇することになる。そして、細胞質内の標的ＲＮＡのレベルは極めて低く抑えられ、ＰＴＧＳの表現型は強く現れる。
【００４７】
上記の複製タンパク質が、上記ＰＴＧＳ経路のどの段階で抑制効果を発揮するのかについての詳細は現在鋭意検討中であるが、ＴＭＶやＴｏＭＶの強毒株感染葉においてもウイルス由来のｓｉＲＮＡが蓄積することや、一旦成立したＰＴＧＳはウイルス感染によって阻害されないことから、トバモウイルス属のウイルスが感染した細胞では、新規のＲＩＳＣ形成が抑制されるものと考えられる。
【００４８】
これら植物ウイルスにおける複製タンパク質は、当該ウイルスが植物に感染したときにＰＴＧＳ抑制因子として機能するのは当然であるが、当該複製タンパク質単独でもＰＴＧＳ抑制因子として機能することが実験的に確認されている（後述の実施例参照）。したがって、これらのＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質および上記複製タンパク質をコードする遺伝子は、後述の（２−１）の欄に記載する種々の利用法への応用が可能である。
【００４９】
なお、本発明でいう「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。
【００５０】
（１−２）ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質およびその遺伝子
また、ここまでは、ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質について説明してきたが、例えば、アミノ酸変異が導入されてＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質についても種々の利用法が考えられる。そこで、ここでは、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質について説明する。
【００５１】
上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質としては、例えば、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質が挙げられる。このような複製タンパク質としては、例えば、配列番号２に示されるＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質の変異タンパク質であって、ＰＴＧＳ抑制活性が低下したタンパク質が挙げられる。また、配列番号４に示されるＴＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質の変異タンパク質であって、ＰＴＧＳ抑制活性が低下したタンパク質が挙げられる。
【００５２】
上記変異複製タンパク質のより具体的な例を挙げると、例えば、後述する実施例に示すように、３４９番目のシステイン残基がチロシン残基に変異しているＴｏＭＶ１３０Ｋ複製タンパク質が挙げられる。上記３４９番目のシステイン残基がチロシン残基に変異しているＴｏＭＶ１３０Ｋ複製タンパク質では、１アミノ酸置換が大きな機能変化を引き起こしていることから、おそらく３４９番目のシステイン残基近傍の領域がＴｏＭＶ１３０Ｋ複製タンパク質のＰＴＧＳ抑制能にとって重要な領域であると思われる。このため、３４９番目のシステイン残基近傍のアミノ酸残基に変異を有する複製タンパク質は、ＰＴＧＳ抑制活性が低下したタンパク質として利用することができると考えられる。しかし、かかる領域は、タンパク質の温度感受性（温度安定性）に関与する領域である可能性もあり、この変異により温度が少し上がっただけでタンパク質の構造が崩れ、そのためＰＴＧＳ抑制活性が落ちているとも考えられる。この点についての詳細は現在鋭意検討中である。
【００５３】
すなわち、上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質とは、例えば、ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質に変異が導入された変異タンパク質であるともいえる。
【００５４】
なお、本発明でいう「ＰＴＧＳを抑制する活性が低下した複製タンパク質」とは、ウイルスは感染できるが、ウイルス増殖量が低く抑えられる程度にＰＴＧＳ抑制活性が低下している複製タンパク質をいうが、この他にも、ＰＴＧＳ抑制活性が完全に欠損しているタンパク質も含まれる。
【００５５】
また、このような変異タンパク質およびその遺伝子は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、（２−２）欄において後述するように、ＲＮＡを介した干渉効果によるウイルス感染防除にも利用することができる点で有用である。
【００５６】
また、本発明において、上記複製タンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００５７】
また、上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質をコードする遺伝子は、弱毒ウイルスを作製したり、組換えベクター等を作製するのみ利用することができる点で、非常に有用である。
【００５８】
（２）複製タンパク質およびその遺伝子の利用法
上述のように、植物ウイルス、例えば、トバモウイルス属のウイルスが有する複製タンパク質は、植物におけるＰＴＧＳを抑制する活性を有する。このため、上記植物ウイルスにおける複製タンパク質およびその遺伝子の利用法として、まず、ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質等を利用するものが挙げられる。さらに、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質等も利用可能である。そこで、以下に、まず、ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質等の利用法について説明し、次いで上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質等の利用法について説明する。
【００５９】
（２−１）ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質等を利用した薬剤、試薬キット、ＰＴＧＳ抑制方法等
本発明にかかるＰＴＧＳを抑制する薬剤は、植物ウイルスの複製タンパク質を含んでいればよく、その他の薬剤の具体的な組成は、特に限定されるものではない。具体的には、植物細胞内のＰＴＧＳが抑制され、ＰＴＧＳによる標的ＲＮＡの分解が抑制されるように、本発明にかかる複製タンパク質の機能が発揮できるための緩衝液等が含まれていればよい。なお、上記緩衝液の具体的な組成は、使用対象の植物の種類に応じて変化させることができることはいうまでもない。また、本発明の薬剤を用いる際の反応条件、例えば、対象植物、タンパク質の濃度、反応温度や反応時間、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については特に限定されるものではない。
【００６０】
また、本発明の薬剤の使用方法も、特に限定されるものではない。例えば、植物細胞内に当該複製タンパク質を導入することが好ましい。最も簡便な方法としては。例えば、ＴｏＭＶやＴＭＶ等の植物ウイルス（例えば、トバモウイルス属のウイルス）を感染させることである。これらのウイルスが植物に感染すると、ウイルス自身の増殖のために、上記複製タンパク質が発現されるため、ウイルス感染とともにＰＴＧＳ抑制効果が現れる。しかし、ＴｏＭＶ等のウイルスが感染した場合、植物にモザイク病が発症するため、他の方法を選択することが好ましい。
【００６１】
すなわち、植物に上記複製タンパク質のみを導入させることが好ましい。植物に上記複製タンパク質のみを導入する方法としては、例えば、植物細胞内で挿入遺伝子を発現することができるように設計された適当な発現ベクター（例えば、プラスミド）に、植物ウイルス（例えば、トバモウイルス属のウイルス）のゲノムＲＮＡ（参考文献１：Ｍ．Ｈ．Ｖ．  ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ他共著、「ＶＩＲＵＳ  ＴＡＸＯＮＯＭＹ−Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」、ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ、ｐ８８９−８９４、２０００、参考文献２：Ｏｈｎｏ  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８４，  ９６，  １９１５−１９２３．）の複製タンパク質をコードするオープンリーディングフレームに相当するｃＤＮＡを挿入したものを作製して用いることができる。
【００６２】
具体的には、例えば、プラスミドｐＢＩ１２１（クロンテック社製）に、ＴｏＭＶの５’非コード領域および１３０Ｋ複製タンパク質オープンリーディングフレームに相当するｃＤＮＡ（配列番号１で示される塩基配列のうち、７２〜３４２２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子）を挿入することにより作製することができる。なお、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質オープンリーディングフレームのリーキーな終止コドンの直後に終止コドンを付加することが好ましい。
【００６３】
このように作製した上記プラスミド（発現ベクター）は、従来公知の方法を用いて、植物に導入することができ、形質転換方法は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、植物細胞のプロトプラストに直接導入することができる。また、上記プラスミドをアグロバクテリウムに導入した後、このアグロバクテリウムを植物に感染させることにより、当該プラスミドを植物細胞に導入することもできる。
【００６４】
上記いずれの方法を用いても、植物細胞内部で上記複製タンパク質を発現させることができれば、ＰＴＧＳを抑制するという目的を達成することができる。また、上記複製タンパク質の遺伝子導入方法（形質転換方法）を使い分けることにより、例えば、特定の葉や茎においてのみＰＴＧＳを抑制する部分的ＰＴＧＳ抑制、または植物個体の全身のＰＴＧＳを抑制する全身性ＰＴＧＳ抑制を選択することもできる。例えば、上述のアグロバクテリウムを用いるアグロインフィルトレーション法を用いることにより、植物の部位特異的に遺伝子を導入することができる。
【００６５】
すなわち、上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え発現ベクターを含む転写後遺伝子発現抑制を抑制するための試薬キットとして利用することができる。上記試薬キットは、上記複製タンパク質を発現させることができる塩基配列を含む発現ベクターを含んでいればよく、その他の具体的な構成は、特に限定されるものではない。
【００６６】
上記発現ベクターとしては、使用対象の植物細胞内において、上記複製タンパク質をコードする遺伝子、上記複製タンパク質を発現させるためのプロモーター配列、上記複製タンパク質をコードする遺伝子を導入するための制限酵素サイト等の従来公知の発現ベクターとして利用可能な程度の構成を含んでいればよく、特に限定されるものではない。また、上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子が、上述の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。また、上記植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列のうち、７２〜３４２２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子、または配列番号３に示される塩基配列のうち、６９〜３４１９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する遺伝子であることが好ましい。
【００６７】
上記の薬剤または試薬キットを用いることにより、上記複製タンパク質を植物細胞内に、容易に導入することができ、植物のＰＴＧＳを簡便かつ効率的に抑制することができる。
【００６８】
ここで、植物におけるＰＴＧＳの役割の一つは、上述のとおり、ウイルス感染に対する防御であると考えられているが、ウイルス感染と同様に、形質転換植物において外部から導入された遺伝子の発現がＰＴＧＳにより抑制される場合がある。このため、例えば、有用物質を生産させるための外来遺伝子が導入されている形質転換植物に対して、上記薬剤または試薬キットを使用することにより、当該導入遺伝子がＰＴＧＳにより発現抑制され導入遺伝子の発現効率が低下することを抑制できる。すなわち、上記の薬剤または試薬キットを用いることにより、形質転換植物における導入遺伝子の発現効率を高めることができ、導入遺伝子の発現を安定的かつ高効率で維持できると考えられる。
【００６９】
形質転換植物の導入遺伝子発現効率を高めるための具体的な方法としては、例えば、外来遺伝子が導入されている形質転換植物において植物ウイルスの複製タンパク質を共発現させる方法が挙げられる。
【００７０】
上記「外来遺伝子」は、植物において発現させる意図をもって植物個体外から導入した遺伝子であって、植物内在性の遺伝子以外の遺伝子をいう。かかる遺伝子には、植物由来の遺伝子だけでなく、ウイルス、微生物、昆虫、および動物由来の種々の遺伝子が含まれ、特に限定されるわけではない。
【００７１】
上記複製タンパク質を共発現させるための手法としては、従来公知の遺伝子工学的手法を用いることができ、特に限定されるものではない。より具体的には、例えば、目的の導入遺伝子を挿入した発現ベクター、および上記複製タンパク質遺伝子を挿入した発現ベクターを同時に植物細胞に導入し、共発現している細胞を選抜して植物個体を得る方法が挙げられる。
【００７２】
目的の導入遺伝子のみを発現させる形質転換植物では、導入遺伝子の発現に対して植物がＰＴＧＳを起こし発現効率が低下する可能性があるが、上記複製タンパク質を共発現させることにより、複製タンパク質がＰＴＧＳ抑制剤として作用するので、導入遺伝子は安定的に高効率の発現を維持できる。かかる場合、植物に目的遺伝子を導入する際に、同時に上記複製タンパク質遺伝子を導入し、予め共発現していることを確認しておくことが好ましい。
【００７３】
なお、ここまで、植物ウイルスにおける複製タンパク質の利用法について説明してきたが、上記複製タンパク質としては、上記（１−１）の欄で記載したＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質であればよく、特に限定されるものではないことはいうまでもない。また、ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質をコードする遺伝子も適宜利用することができる。
【００７４】
また、本発明に係るタンパク質を大量に取得するには、従来公知の遺伝子工学的手法を用いることができる。例えば、同種、あるいは異種発現系で大量生産し精製すればよい。
【００７５】
また、上記本発明のいずれの利用法においても、対象植物は適宜設定可能であり、特に限定されるものではないが、より好適には、例えば、ウイルスが感染する宿主（ホスト）植物と、当該ウイルスが有する複製タンパク質とを組み合わせて使用することが好ましい。
【００７６】
さらに、本発明にかかる試薬キットを使用すれば、上記複製タンパク質遺伝子を挿入した発現用プラスミドを作製する必要がないので、時間、手間、コスト等を軽減することができ、容易に複製タンパク質遺伝子を植物に導入することができる。
【００７７】
本発明にかかる試薬キットを、上記複製タンパク質をコードする遺伝子を挿入したプラスミドに加えて必要な溶液類や培地等を含むものとすれば、一層容易に上記複製タンパク質をコードする遺伝子を植物に導入することができる。さらに、形質導入したい有用遺伝子発現用のプラスミドをこの試薬キットに含めれば、キット使用者は目的の遺伝子を準備するだけで、目的遺伝子と上記複製タンパク質をコードすると遺伝子を共発現する形質転換植物を容易に作製することが可能となる。
【００７８】
さらに、上記ＰＴＧＳ抑制活性を有する植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換植物は、植物個体自体がＰＴＧＳ抑制活性を有しており、形質転換効率を高めたり、有用物質をコードした導入遺伝子の発現効率を高めたりでき、学術的な面だけでなく、産業的な面でも非常に有用である。なお、上記遺伝子を形質転換植物に導入する方法は、従来公知の方法が利用でき特に限定されるものではない。また、上記遺伝子としては、上述の遺伝子を利用できる。
【００７９】
（２−２）ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質等を利用した弱毒ウイルス、発現ベクター、およびそれらの利用法
あるウイルスに感染した植物は同種のウイルスには感染しないことが古くから経験的に知られている（干渉効果）。この干渉効果を利用して、ＴｏＭＶの弱毒変異株であるＬ１１Ａ株は、従来から栽培トマトへの強毒ＴｏＭＶの感染を防除するために広く用いられてきた。すなわち、Ｌ１１Ａ株はモザイク病を発症しないため、予め栽培トマトにＬ１１Ａ株を感染させることにより、その後の強毒ＴｏＭＶの感染によるモザイク病の発症を防ぐことができた。しかし、かかる弱毒変異株のＬ１１Ａ株がなぜ弱毒なのかということについて、詳細な機構はわかっていなかった。このため、弱毒ウイルスを意図的に作製できず、ウイルス感染の防除のために弱毒ウイルスを利用したいという強い要請に十分に対応できていなかった。
【００８０】
本発明者らは、ＴｏＭＶのＰＴＧＳ抑制因子を特定するための検討過程で、ＴｏＭＶの弱毒変異株であるＬ１１Ａ株はＰＴＧＳ抑制能に欠損を持つことを明らかにした。このことはＬ１１Ａ株による上記干渉効果にＰＴＧＳが関与していることを示唆するものである。このことから、本発明者らは、ＴｏＭＶ以外のウイルスについてもＰＴＧＳ抑制活性を適当に弱めることにより、干渉効果による防除を目的とした弱毒ウイルスを意図的に作出できる可能性があることを見出した。
【００８１】
すなわち、本発明にかかる弱毒ウイルスは、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスであればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。なお、上記弱毒ウイルスにおいて、上記転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質が、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質であることが好ましい。
【００８２】
上記弱毒ウイルスの具体的な例としては、例えば、後述する実施例にて作製した組換えウイルスであるＴＬＪ株やＴＬＪＡ１株等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
また、干渉効果を利用したウイルス防除の手段として、上述の弱毒ウイルスを作製するほかにも、例えば、上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを作製し、これを植物に導入することにより、当該植物にウイルス防除機能を付与することができる。
【００８４】
すなわち、本発明にかかる発現ベクターは、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を有していればよい。なお、上記組換え発現ベクターにおいて、上記転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質が、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下したタンパク質であることが好ましい。
【００８５】
上記弱毒ウイルスは、例えば、従来公知の遺伝子工学的方法によって、ウイルスゲノムのうち、ＰＴＧＳ抑制活性を有する複製タンパク質をコードする遺伝子に相当する部分に変異を導入し、ＰＴＧＳ抑制活性が弱まった組換えウイルスを選択することにより得ることができる。
【００８６】
また、上記組換えベクターは、例えば、従来公知の遺伝子工学的方法により、上記複製タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入した変異遺伝子を公知の発現ベクターに挿入した後、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質を発現するものを選択することにより得ることができる。
【００８７】
遺伝子に変異を導入する具体的な方法は、従来公知のＰＣＲを利用した方法や、部位特異的変異導入法を利用することができ、特に限定されるものではない。
【００８８】
また、弱毒ウイルスやＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質をコードする遺伝子を有する組換えベクターを選択する方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、ＧＦＰ組換えタバコを利用する方法が挙げられる。すなわち、上記組換えウイルスを感染させたＧＦＰ組換えタバコ、あるいは上記変異遺伝子を有する組換えベクターを導入したＧＦＰ組換えタバコのＧＦＰ発光の強弱に基づき、変異複製タンパク質のＰＴＧＳ抑制活性の強弱を判断し、好適なＰＴＧＳ抑制活性を有する弱毒ウイルスまたは変異複製タンパク質をコードする遺伝子を有する組換えベクターを選択する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８９】
上記弱毒ウイルスは、植物に感染させて利用することができるし、上記組換えベクターは、（２−１）欄で述べたような従来公知の方法で植物に導入できる。
【００９０】
また、上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質は、上記（１−２）の欄で記載した複製タンパク質であればよく、特に限定されるものではないことはいうまでもない。また、上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質をコードする遺伝子も、適宜利用することができる。
【００９１】
さらに、上記弱毒ウイルスや発現ベクターを利用して、ウイルス感染を防除する薬剤や方法も本発明に含まれる。
【００９２】
すなわち、本発明にかかる植物におけるウイルス性疾患を防除するための薬剤は、上記弱毒ウイルスまたは組換え発現ベクターを含んでいればよい。また、本発明にかかるウイルス感染防除方法は、上記弱毒ウイルスを植物に感染させることにより、または上記組換え発現ベクターを植物に導入することにより、植物におけるウイルス性疾患を防除するための方法であればよい。
【００９３】
なお、本発明でいう「ウイルス性疾患を防除する」とは、ウイルスの感染により引き起こされる疾病の発症を予防することは、もちろん、いったん発症した疾病を治療することをも含む意である。
【００９４】
上述のような弱毒ウイルス、または発現ベクターを意図的に作出し、これを利用することは、植物のウイルス病を防除する上で非常に有用な技術であり、農学的な応用の観点から有望であると共に、食糧問題の解決に対しても画期的な技術となり得る。
【００９５】
さらに、上記ＰＴＧＳ抑制活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子を導入した形質転換植物は、植物個体自体のウイルス病に対する防除能が高められており、農業的に非常に有用である。なお、上記遺伝子を形質転換植物に形質転換する方法は、従来公知の方法が利用でき特に限定されるものではない。また、上記遺伝子としては、上述の遺伝子を利用できる。
【００９６】
また、本発明には、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列を有する組換え発現ベクターが含まれる。
【００９７】
上記組換え発現ベクターは、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した植物ウイルス（例えば、トバモウイルス属のウイルス）の変異複製タンパク質をコードする遺伝子と、植物内在性遺伝子の一部の塩基配列とを有し、上記組換え発現ベクターが宿主に導入された際に、上記遺伝子および塩基配列に相当するｍＲＮＡが宿主内にて発現（転写）されるベクターであればよく、その他の具体的な構成は、特に限定されるものではない。例えば、従来公知のサブゲノミックＲＮＡプロモーターの下流に上記遺伝子および塩基配列を挿入することにより、上記遺伝子および塩基配列に相当するｍＲＮＡが発現し、これらの遺伝子および塩基配列に対するＰＴＧＳが引き起こされる。また、例えば、従来公知のウイルス（ベクター）のゲノム中に上記遺伝子および塩基配列を挿入しておく（組み込んでおく）ことでも、植物内在性遺伝子の発現をＰＴＧＳにより抑制できる。
【００９８】
また、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質をコードする遺伝子を有する植物ウイルス（例えば、トバモウイルス属のウイルス）ゲノムの一部に、上記植物内在性遺伝子の一部の塩基配列を挿入しておくことでも、植物内在性遺伝子の発現をＰＴＧＳにより抑制することができる。
【００９９】
また、上記「植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列」とは、植物が有する遺伝子の一部分の塩基配列であって、ｍＲＮＡに転写される塩基配列の一部分の塩基配列であればよく、当該遺伝子の種類等は適宜選択可能である。また、「一部の塩基配列」の長さは、特に限定されるものではないが、２５塩基以上あることが好ましく、さらには、３０塩基以上の長さが好ましい。これにより、効率的にＰＴＧＳが引き起こされ、植物内在性遺伝子の発現が抑制されることになるためである。なお、上記「一部の塩基配列」の長さは、長ければＰＴＧＳを引き起こす効率が高まるが、その一方でウイルス（ベクター）の増殖率が低下する。このため、上記「一部の塩基配列」の長さの上限としては、例えば、１００塩基程度であると考えられるが、この点については現在鋭意検討中である。
【０１００】
すなわち、上記の組換え発現ベクターが植物に導入された場合、植物ウイルス由来の外来ｍＲＮＡ、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列に相当するｍＲＮＡが植物細胞内で多量に発現する。これに対して、植物細胞では、上記ｍＲＮＡを排除すべく、ＰＴＧＳが活性化する。しかし、上記組換え発現ベクターによって発現する複製タンパク質は、ＰＴＧＳ抑制活性が低下しているため、上記植物細胞内のＰＴＧＳは抑制されない。このため、活性化されたＰＴＧＳによって、上記一部の塩基配列を有する、植物の内在性遺伝子由来のｍＲＮＡも分解されてしまう。したがって、植物の内在性遺伝子の発現がＰＴＧＳにより抑制されることになる。すなわち、上記組換え発現ベクターは、転写後遺伝子発現抑制により植物の内在性遺伝子の発現を抑制するために利用することができる。さらに、上記組換え発現ベクターは、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した変異複製タンパク質を利用しているため、ＰＴＧＳ抑制活性が低下していない野生型の複製タンパク質を利用する場合よりも、植物内のＰＴＧＳが活性化されたままであり、効率的に植物内在性遺伝子の発現を抑制できる。なお、上述のような組換え発現ベクターを用いた植物内在性遺伝子のＰＴＧＳによる発現抑制は、データは示さないが実験的に確認されている。
【０１０１】
また、本発明には、上記組換え発現ベクターを含む、転写後遺伝子発現抑制により植物の内在性遺伝子の発現を抑制するための薬剤が含まれる。上記薬剤は、上述の組換え発現ベクターを含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。上記の薬剤を用いることにより、上記組換え発現ベクターが保持する一部の塩基配列を有する植物内在性遺伝子の発現をＰＴＧＳにより簡便かつ効率的に抑制することができる。
【０１０２】
また、本発明には、上記組換え発現ベクターを植物に導入し、転写後遺伝子発現抑制を引き起こし、植物の内在性遺伝子の発現を抑制する方法も含まれる。上記植物の内在性遺伝子の発現を抑制する方法は、上述の組換え発現ベクターを植物に導入し、植物細胞内においてＰＴＧＳを引き起こし、上記組換え発現ベクターがコードする一部の塩基配列に相当する塩基配列を有する植物の内在性遺伝子の発現を抑制する方法であればよく、その他の具体的な工程は、限定されるものではない。上記の方法を用いることにより、上記組換え発現ベクターが保持する一部の塩基配列を有する植物内在性遺伝子の発現をＰＴＧＳにより簡便かつ効率的に抑制することができる。
【０１０３】
また、転写後遺伝子発現抑制を抑制する活性が低下した植物ウイルスの複製タンパク質をコードする遺伝子、および植物の内在性遺伝子の一部の塩基配列を当該植物内にて共発現させることによって、当該植物における内在性遺伝子の発現をＰＴＧＳにより抑制する方法でも、上記方法等と同様に転写後遺伝子発現抑制によって植物の内在性遺伝子の発現を簡便かつ効率的に抑制することができる。
【０１０４】
「共発現」させるための方法としては、従来公知の方法が利用でき、特に限定されない。例えば、上述の発現ベクターを利用する方法等が挙げられる。
【０１０５】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１０６】
【実施例】
〔１〕ＧＦＰ発現形質転換タバコの作製と当該形質転換タバコの解析
まず、ＧＦＰをコードする遺伝子をタバコに導入し、ＧＦＰ遺伝子に対して自発的にＰＴＧＳを起こす系統の形質転換タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ）と、ＧＦＰを恒常的に発現している系統（ＰＴＧＳを起こさない系統）の形質転換タバコとを得た。具体的には、以下のように行った。
【０１０７】
まず、リーフディスク法（Ｇａｒｙｂｕｒｎ，  Ｆ．  Ｌ．，  Ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  ｐ．３６１−３７６．  Ｗ．  Ｖ．  Ｄａｓｈｅｋ  （ｅｄ．）  「Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ．）により、ＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドを持つアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて、タバコにＧＦＰ遺伝子を形質転換した。
【０１０８】
その結果、Ｇ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２の２系統の形質転換タバコを得た。Ｇ３Ｓｍ２がＧＦＰ遺伝子に対して自発的にＰＴＧＳを起こす系統であり、Ｇ３Ｓｍ１がＧＦＰを構成的に発現している系統（ＰＴＧＳを起こさない系統）である。これらＧ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰ蛍光が、生育するにつれてどのように変化するか調べた。青色光を照射して観察した結果を図１（ａ）に示す。なお、右下のバーは２ｍｍである。
【０１０９】
Ｇ３Ｓｍ１は、発芽２週間目（図１（ａ）中「Ｇ３Ｓｍ１    ２Ｗ」で示すパネル）でも、６週間目（図１（ａ）中「Ｇ３Ｓｍ１    ６Ｗ」で示すパネル）においても蛍光が観察された。一方、Ｇ３Ｓｍ２は、発芽２週間目（図１（ａ）中「Ｇ３Ｓｍ２    ２Ｗ」で示すパネル）ではＧ３Ｓｍ１と同様に蛍光を発するが、３週間目（図１（ａ）中「Ｇ３Ｓｍ２    ３Ｗ」で示すパネル）には蛍光が消失し始め、６週間後（図１（ａ）中「Ｇ３Ｓｍ２    ６Ｗ」で示すパネル）には蛍光が完全に消失した。なお、両系統タバコの生長は正常であった。
【０１１０】
次に、上記ＧＦＰ形質転換タバコＧ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰｍＲＮＡについて解析を行い、形質転換タバコにおけるＰＴＧＳについて調べた。具体的には、以下のようにして行った。
【０１１１】
まず、形質転換系統タバコＧ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２および形質転換していない系統タバコ（ＮＴ）の葉からＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット法によりＧＦＰｍＲＮＡを検出した。その結果を図１（ｂ）に示す。コントロールとして、同一サンプルをエチジウムブロマイドで染色し、下段にｒＲＮＡｓとして示す。
【０１１２】
同図に示すように、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰｍＲＮＡは、Ｇ３Ｓｍ１のＧＦＰｍＲＮＡと比較して低レベルであった。しかし、Ｇ３Ｓｍ２のＧＦＰｍＲＮＡは、ほとんど検出できないほどの低レベルではなかった。
【０１１３】
次いで、両形質転換系統タバコおよび形質転換していない系統タバコ（ＮＴ）の葉のホモジネート上清を用いて、ＧＦＰタンパク質についてのウエスタンブロット解析を行った。その結果を図１（ｃ）に示す。同図に示すように、Ｇ３Ｓｍ１では、ＧＦＰタンパク質のバンド検出されたが、Ｇ３Ｓｍ２においては検出されなかった。
【０１１４】
また、両形質転換系統タバコおよび形質転換していない系統タバコ（ＮＴ）において、ＧＦＰ遺伝子の塩基配列を持つ低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が検出されるか否かについて調べた。その結果を図１（ｄ）に示す。なお、下段はゲルの５．８Ｓおよび５Ｓ  ｒＲＮＡのエチジウムブロマイド染色像である。その結果、図１（ｄ）に示すように、Ｇ３Ｓｍ２においては、ＧＦＰ遺伝子の塩基配列を持つ低分子ＲＮＡが検出された。一方、Ｇ３Ｓｍ１およびＮＴにおいては、ＧＦＰ遺伝子の塩基配列を持つ低分子ＲＮＡが検出されなかった。これらの低分子ＲＮＡの存在は、ＰＴＧＳが機能していることの指標となるものである。
【０１１５】
以上の結果より、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰの発現は、転写後に抑制されているものと考えられた。すなわち、Ｇ３Ｓｍ２では、ＧＦＰ遺伝子に対して、ＰＴＧＳが起こっているため、ＧＦＰの発現が抑制されていると考えられた。
【０１１６】
〔２〕ＴｏＭＶが感染した形質転換タバコについての解析
続いて、上記〔１〕にて作製した、ＰＴＧＳを引き起こすＧＦＰ形質転換タバコＧ３Ｓｍ２にＴｏＭＶを感染させて、その形態変化を観察した。その結果を図２に示す。
【０１１７】
まず、Ｇ３Ｓｍ２に対して、野生型（ＴＬＷ３株）のＴｏＭＶを接種し、ＴｏＭＶ接種後１１日目におけるモザイク葉のＧＦＰ蛍光パターンを図２（ａ）に示す。左パネルは白色光、右パネルは青色光を照射して撮影した。図２（ａ）の左パネルに示すように、上位葉に緑色の濃淡（モザイク病徴）が生じた。なお、モザイク葉の淡緑部は、ＴｏＭＶが感染した部位である。そして、当該モザイク病徴が生じた葉における淡緑部では、図２（ａ）の右パネルに示すように、強い緑色蛍光が観察された（図中、白い斑点状に見える箇所が発光している箇所）。
【０１１８】
また、上記蛍光が観察された葉について、さらに詳細に解析するために拡大して観察した。図２（ｂ）に、ＴｏＭＶ接種後１２日目のモザイク葉の拡大像を示す。左パネルは白色光、右パネルは青色光を照射して撮影した。バーは２ｍｍである。図２（ｂ）に示すように、ＧＦＰの蛍光は、モザイク葉の淡緑部において観察された。
【０１１９】
また、図２（ｃ）に、接種後６日目の接種葉（Ｌ０）から上位３番目の葉（Ｌ３）におけるＧＦＰ発現の回復を示す。同図に示すように、蛍光は葉脈沿いに観察された。
【０１２０】
すなわち、ＴｏＭＶが感染した部位では、ＧＦＰが発現していることがわかった。これらの結果から、ＴｏＭＶの感染により、Ｇ３Ｓｍ２のＧＦＰ遺伝子に対するＰＴＧＳが抑制されたことがわかった。すなわち、ＴｏＭＶは、Ｇ３Ｓｍ２のＧＦＰ遺伝子に対するＰＴＧＳを抑制する能力を持つことが明らかとなった。
【０１２１】
〔３〕弱毒変異ＴｏＭＶが感染した形質転換タバコについての解析
次に、弱毒変異ＴｏＭＶを形質転換タバコに感染させて、その形態変化を解析した。具体的には、従来から知られているＴｏＭＶの弱毒変異株であるＬ１１Ａ株を用いた。このＬ１１Ａ株は、従来からタバコに感染しても葉にモザイクを生じさせないことが知られている。このＬ１１Ａ株を上記形質転換タバコＧ３Ｓｍ２に感染させたところ、ＧＦＰの蛍光が観察されなかった（不図示）。このことから、モザイクを生じさせない弱毒変異株であるＬ１１Ａ株は、タバコのＰＴＧＳを抑制する能力を欠損していると考えられた。
【０１２２】
野生型のＴｏＭＶ（図中、ＴｏＭＶ−Ｌ  ＴＬＷ３）は、図３（ａ）に示すように、そのゲノムに１３０Ｋ複製タンパク質、１８０Ｋ複製タンパク質、移行タンパク質（ＭＰ）、外被タンパク質（ＣＰ）の４つのタンパク質をコードしている。
【０１２３】
そして、Ｌ１１Ａ株は、ゲノムの１０ヶ所において野生型のＴｏＭＶ（ＴｏＭＶ−Ｌ  ＴＬＷ３）と異なる塩基を有しており（図３（ａ）中、Ｌ１１Ａにおける白黒のアローヘッドで示す位置）、このうち３ヶ所はアミノ酸変異を伴っている（図３（ａ）中、Ｌ１１Ａにおける黒のアローヘッドで示す位置）。すなわち、Ｌ１１Ａ株では、野生型のＴｏＭＶと比べて、１１１７番目のグアニン（Ｇ）がアデニン（Ａ）に変異し、それに伴い３４９番目のシステイン残基（Ｃｙｓ）がチロシン残基（Ｔｙｒ）に変異しており、２３４９番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に変異し、それに伴い７６０番目のアスパラギン残基（Ａｓｎ）がアスパラギン酸残基（Ａｓｐ）に変異しており、２７５４番目のアデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）に変異し、それに伴い８９５番目のグリシン残基（Ｇｌｙ）がアルギニン残基（Ａｒｇ）に変異している。これらの変異のうち、どの変異がＰＴＧＳ抑制能の欠損に関与しているのかを明らかにするために、組換ウイルス：ＴＬＪＡ１株を作製し検討した。
【０１２４】
まず、ＴＬＪＡ１株は、図３（ａ）に示すように、野生型ＴＬＷ３株と比較して４ヶ所の位置に異なる塩基を持ち、Ｌ１１Ａ株に存在するアミノ酸変異を伴う３ヶ所の変異をすべて有している。このＴＬＪＡ１株をＧ３Ｓｍ２に接種すると、Ｌ１１Ａ株と同様にモザイクを生じず、ＧＦＰ蛍光の復活は認められなかった（不図示）。
【０１２５】
そこで、ＴＬＪＡ１株の持つ４ヶ所のうち、ウイルスゲノムにおける１１１７番目の塩基の変異のみを有するＴＬＪ株と、他の３ヶ所の変異を有するＴＬＡ株を作製し（図３（ａ）参照）、それぞれＧ３Ｓｍ２に接種した。その結果を図３（ｂ）に示す。なお、図３（ｂ）の上段パネルは白色光、下段パネルは青色光を照射して撮影した。バーは４ｍｍである。
【０１２６】
図３（ｂ）に示すように、野生型のＴＬＷ３株を感染させた葉では、ウイルスの感染により葉にモザイク状の緑濃部（図中、白星（☆）で示す位置）と緑淡部が生じ、緑淡部位において蛍光が観察された（図３（ｂ）中、ＴＬＷ３のパネル）。また、ＴＬＡ株を感染させたタバコでも、軽度のモザイク病状による緑濃部（図中、白星（☆）で示す位置）と緑淡部とが観察され、緑淡部位において蛍光が観察された（図３（ｂ）中、ＴＬＡのパネル）。これに対して、ＴＬＪ株を感染させたタバコでは、モザイク状病徴を生じず、ＧＦＰ蛍光の復活も認められなかった（図３（ｂ）中、ＴＬＪのパネル）。
【０１２７】
以上の結果より、システイン（Ｃｙｓ）からチロシン（Ｔｙｒ）へのアミノ酸変異を伴う１１１７番目のヌクレオチドのグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への塩基置換が、ウイルスの弱毒化とともに、ＴｏＭＶのＰＴＧＳ抑制能の欠損に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【０１２８】
なお、図３（ａ）中、右端部分のプラス（＋）・マイナス（−）は、それぞれＰＴＧＳ抑制活性を有しているか否かを示している。すなわち、野生型ＴｏＭＶおよびＴＬＡ株は、ＰＴＧＳ抑制活性を有しており、一方、Ｌ１１Ａ株、ＴＬＪＡ１株、およびＴＬＪ株は、ＰＴＧＳ抑制活性を有していないことを示している。
【０１２９】
〔４〕ＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質の機能解析
ここで、上記１１１７番目の塩基置換は、１３０Ｋ複製タンパク質内部のアミノ酸変異を引き起こす。したがって、この１３０Ｋ複製タンパク質がＰＴＧＳサプレッサー因子として機能していると予測された。そこで、当該１３０Ｋ複製タンパク質自身が、ＰＴＧＳ抑制活性を有するのか否かを調べることとした。具体的には、ＧＦＰが形質転換されており、ＧＦＰを構成的に発現しているベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に対して、アグロインフィルトレーション法により１３０Ｋ複製タンパク質をコードする遺伝子、および／または外来ＧＦＰ遺伝子を導入して、当該１３０Ｋ複製タンパク質がＰＴＧＳ抑制活性を有するか否かを解析した。なお、アグロインフィルトレーション法とは、外来遺伝子を有するアグロバクテリウムを培養した組換えアグロバクテリウム培養液を、シリンジを用いて葉の細胞間隙に浸潤させることにより、植物個体に対して局所的に外来遺伝子を導入することができる手法である（Ｏ．  Ｖｏｉｎｎｅｔ  ：  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，  １７，  ４４９  （２００１）．）。
【０１３０】
実験としては、まず、３５Ｓ／ＧＦＰ遺伝子（３５Ｓプロモーターの下流にＧＦＰをコードする塩基配列を繋いだ遺伝子）を有するプラスミドを保持するアグロバクテリウム（以下、ＧＦＰアグロバクテリウムと称する）、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドを保持するアグロバクテリウム（以下、ＴｏＭＶ  １３０Ｋアグロバクテリウムと称する）、遺伝子をフレームシフトさせて機能を欠損させたＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドを保持するアグロバクテリウム（以下、ＴｏＭＶ  １３０Ｋ（ＦＳ）アグロバクテリウムと称する）、ＰＴＧＳ抑制タンパク質として周知であるジャガイモＹウイルスのＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子を有するプラスミドを保持するアグロバクテリウム（以下、ＨＣ−Ｐｒｏアグロバクテリウムと称する）、および挿入遺伝子を有しない空（から）のプラスミドを保持するアグロバクテリウム（以下、Ｅｍｐｔｙアグロバクテリウムと称する）を調製し、それぞれのアグロバクテリウム培養液を準備した。
【０１３１】
そして、ＧＦＰアグロバクテリウム培養液とＴｏＭＶ  １３０Ｋアグロバクテリウム培養液との混合物、ＧＦＰアグロバクテリウム培養液とＴｏＭＶ  １３０Ｋ（ＦＳ）アグロバクテリウム培養液との混合物、ＧＦＰアグロバクテリウム培養液とＨＣ−Ｐｒｏアグロバクテリウム培養液との混合物、およびＧＦＰアグロバクテリウム培養液とＥｍｐｔｙアグロバクテリウム培養液との混合物をそれぞれ、１枚のベンサミアナの葉における異なる部位に浸潤させた後、ＧＦＰ遺伝子の発現が亢進されるか否かを観察した。その結果を図４に示す。
【０１３２】
図４に示すように、３５Ｓ／ＧＦＰ遺伝子を有するプラスミドと挿入遺伝子を持たない空のプラスミドとをベンサミアナの葉にともに導入すると、導入後２日以内に導入部位のＧＦＰ蛍光が減少した（図中、Ｅｍｐｔｙで示す部位）。また、図中矢印はインフィルトレーション領域周囲の内因性遺伝子由来のＧＦＰ発現抑制を示している。この矢印で示すように、内因性遺伝子由来のＧＦＰ蛍光に対する同時サイレンシングは、最初に辺縁部で観察されたが、注入されていない部分より明らかにＧＦＰレベルが低かった。すなわち、遺伝子を導入した局所において、ＰＴＧＳが起こっていることがわかった。
【０１３３】
一方、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質遺伝子またはジャガイモＹウイルスのＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子を３５Ｓ／ＧＦＰ遺伝子とともに導入した部位では、ＧＦＰに対するＰＴＧＳは抑制され、その結果高レベルの蛍光が観察された（図中、ＰＹＶ  ＨＣ−ＰｒｏまたはＴｏＭＶ  １３０Ｋで示す部位）。
【０１３４】
さらに、フレームシフト変異を導入したＴｏＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質（ＦＳ）遺伝子を３５Ｓ／ＧＦＰ遺伝子とともに導入した部位は、空のプラスミドを導入した場合と同様に、遺伝子導入後２日以内に導入部位のＧＦＰ蛍光が減少した（図中、ＴｏＭＶ  １３０Ｋ（ＦＳ）で示す部位）。なお、１３０Ｋ複製タンパク質単独の発現では内因性ＧＦＰ遺伝子の発現亢進は起こらなかった（不図示）。
【０１３５】
以上の結果より、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質は、それ自身がＰＴＧＳ抑制する活性を有するタンパク質であり、ウイルスを複製することなくＰＴＧＳ抑制因子として機能することが明らかとなった。
【０１３６】
したがって、ＴｏＭＶの１３０Ｋ複製タンパク質を単独で植物に導入することにより、ＰＴＧＳを抑制することが可能となり、様々な分野に応用できる可能性が示唆された。
【０１３７】
また、ＴｏＭＶゲノム上の１塩基の置換がＴｏＭＶのＰＴＧＳ抑制能を欠損させ、ウイルス自体を弱毒化することが明らかとなり、弱毒ウイルスを意図的に作出できる可能性が示唆された。
【０１３８】
なお、本実施例には示さないが、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）の１３０Ｋ複製タンパク質についても同様の実験結果を得ており、ＴＭＶ  １３０Ｋ複製タンパク質もＰＴＧＳ抑制活性を有することが明らかとなった。
【０１３９】
【発明の効果】
以上のように、トバモウイルス属等の植物ウイルスが有する複製タンパク質（例えば、１３０Ｋ複製タンパク質）は、植物におけるＰＴＧＳを抑制する活性を有している。このため、上記複製タンパク質およびその遺伝子は、ＰＴＧＳを抑制する薬剤、ＰＴＧＳを抑制する方法、試薬キット等として利用することができ、例えば、形質転換植物における導入遺伝子の発現効率を高めて有用物質を効率的に生産させることができるという効果を奏する。
【０１４０】
また、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質およびその遺伝子を利用した弱毒ウイルスや組換えベクターは、ＲＮＡを介した干渉効果を引き起こすことができるという効果を奏する。このため、植物のウイルス防除に役立てることができ、農業的にも非常に有用性が高い。
【０１４１】
また、ＰＴＧＳ抑制活性が低下した複製タンパク質をコードする遺伝子と植物内在性の遺伝子の一部の塩基配列とを植物内で発現させることにより、植物内においてＰＴＧＳを効率的に引き起こすことができ、植物内在性遺伝子の発現を簡便なかつ効率的に抑制することができるという効果を奏する。
【０１４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はＧＦＰ形質転換タバコ：Ｇ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰ蛍光の経時的変化を示す図であり、（ｂ）は上記Ｇ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰｍＲＮＡをノーザンブロット法により解析した結果を示す図であり、（ｃ）は上記Ｇ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰタンパク質の発現をウエスタンブロット法により解析した結果を示す図であり、（ｄ）は上記Ｇ３Ｓｍ１、Ｇ３Ｓｍ２におけるＧＦＰｍＲＮＡのｓｉＲＮＡをノーザンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、ＰＴＧＳによりＧＦＰの発現を抑制する形質転換タバコ：Ｇ３Ｓｍ２に野生型ＴｏＭＶを感染させた場合の葉のＧＦＰ蛍光を観察した結果を示す図である。
【図３】（ａ）は野生型ＴｏＭＶ−Ｌ  ＴＬＷ３株のゲノムと、弱毒変異のＬ１１Ａ株、組換えウイルスＴＬＪＡ１株、ＴＬＪ株、およびＴＬＡ株のゲノムにおける変異部位とを模式的に示す図であり、（ｂ）は野生型ＴｏＭＶ−Ｌ  ＴＬＷ３株、組換えウイルスＴＬＪ株、およびＴＬＡ株を形質転換タバコ：Ｇ３Ｓｍ２にそれぞれ感染させた場合の葉の状態とＧＦＰ蛍光とを観察した結果を示す図である。
【図４】ＴｏＭＶ１３０Ｋ複製タンパク質による局所のＰＴＧＳ抑制を調べた結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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