(57)【要約】【課題】プロビデンシア属細菌を簡便な操作で短時間に検出、同定するための培地およびその検出方法を提供する。【解決手段】（ａ）プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分、（ｂ）グラム陽性菌発育抑制物質、（ｃ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類及び（ｄ）ｐＨによって変色する色素を含有することを特徴とするプロビデンシア属細菌の検出用選択培地及び該プロビデンシア属細菌の検出用選択培地に検体を塗布した後、４時間〜８０時間培養し、出現したコロニーの色によって検体中のプロビデンシア属細菌の有無を判定することを特徴とするプロビデンシア属細菌の検出方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分、（ｂ）グラム陽性菌発育抑制物質、（ｃ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類及び（ｄ）ｐＨによって変色する色素を含有することを特徴とするプロビデンシア属細菌の検出用選択培地。
【請求項２】
（ｂ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類が、マルトース及びＤ−キシロースであることを特徴とする請求項１記載のプロビデンシア属細菌の検出用選択培地。
【請求項３】
培地成分としてさらに（ｅ）プロビデンシア属細菌以外の細菌の増殖を抑制し得る抗生物質及び／又は抗菌剤を含有することを特徴とする請求項１又は２記載のプロビデンシア属細菌の検出用選択培地。
【請求項４】
請求項１乃至３記載のプロビデンシア属細菌の検出用選択培地に検体を塗布した後、４時間〜８０時間培養し、出現したコロニーの色によって検体中のプロビデンシア属細菌の有無を判定することを特徴とするプロビデンシア属細菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌の検出用培地に関し、特に糞便、尿及び血液検体中のプロビデンシア属細菌を選択的に検出する培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロビデンシア属細菌は、鶏腸管内に常在するとされており、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・スチュアーティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）がヒトに対して尿路感染や下痢症などの感染症を時々引き起こすことは知られていたが、多くの場合他の菌も混在し起炎菌との確証がとれず、臨床検査の現場では非病原菌との考えが多かった。しかし、近年プロビデンシア・アルカリファシエンスによる胃腸炎（下痢）症例が海外で数例報告され、国内でも大阪大学微生物病研究所、本田武司教授らのグループがこの細菌を１９９６年に福井県で発生した２７０人の集団食中毒の原因菌として特定した（非特許文献１及び非特許文献２参照）。その後、２００２年に東京都で発生した１２０人の集団食中毒事件では患者糞便の７９％からこの細菌が検出されており、最近になってプロビデンシア・アルカリファシエンスに病原性があることがわかってきた。
【０００３】
これまで食中毒の原因菌としてはサルモネラ、病原性大腸菌、腸炎ビブリオ、赤痢菌など多くが知られており、食中毒症状を呈する患者に対しては糞便検体をこれらの細菌を選択的に検出できる選択培地に塗布し、コロニーの色や形態よりある程度の推測をし、その後詳細な生化学的性状等を観察して原因菌を特定する作業が広く行われている。しかし、プロビデンシア属細菌には簡便な選択培地がこれまで無かった。そのため、原因菌がプロビデンシア属細菌であった場合、既知の病原菌を対象とした検査を行ってもその結果がすべて陰性になり見逃すか、数種類の生化学的性状検査や、１６ＳｒＲＮＡを用いる核酸同定法、Ａｐｉ２０Ｅ（日本ビオメリュー・バイテック社）などのキットを用いる数値同定法などを行うことによって特定していた。この操作には長時間と経費を要し、熟練された技術が必要であった。
【０００４】
【非特許文献１】
村田健ほか「Ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ」、ジャーナル・オブ・インフェクショナル・デジース（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、２００１年、第１８４巻、ｐ．１０５０−５
【非特許文献２】
本田武司、「新型プロビデンシア・アルカリファシエンス（ＰＡ）菌の病原性」、日本臨床、２００２年、第６０巻、第６号、ｐ．１２２８−３２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、プロビデンシア属細菌を簡便な操作で短時間に検出、同定するための培地およびその検出方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題に鑑み鋭意努力の結果、少なくとも、プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分、プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類、ｐＨによって変色する色素を含有する培地を用いることによって、発育した細菌コロニーの色の違いからプロビデンシア属細菌を簡便な操作で短時間に検出できる選択培地を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、（ａ）プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分、（ｂ）グラム陽性菌発育抑制物質、（ｃ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類及び（ｄ）ｐＨによって変色する色素を含有することを特徴とするプロビデンシア属細菌の検出用選択培地を要旨とするものであり、好ましくは（ｂ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類が、マルトース及びＤ−キシロースであり、さらに好ましくは、培地成分としてさらに（ｅ）プロビデンシア属細菌以外の細菌の増殖を抑制し得る抗生物質及び／又は抗菌剤を含有するものである。
本発明の別の発明は、前記のプロビデンシア属細菌の検出用選択培地に検体を塗布した後、４時間〜８０時間培養し、出現したコロニーの色によって検体中のプロビデンシア属細菌の有無を判定することを特徴とするプロビデンシア属細菌の検出方法を要旨とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明で対象とするプロビデンシア属細菌は、腸内細菌科に属するグラム陰性桿菌で、鶏腸内に常在していることが知られているほか、腐敗した動物死体などからしばしば分離される。プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）、プロビデンシア・スチュアーティ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、プロビデンシア・ルスチジアニ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ）、プロビデンシア・ハイムバケ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｈｅｉｍｂａｃｈａｅ）の５種類に分類されている。主な性状は、周毛性鞭毛を持ち、マンノース、グルコース分解性、マルトース、ラクトース、キシロース非分解性、インドール産生、硫化水素非産生、フェニルアラニン脱アミノ反応陽性、ＩＰＡ陽性、ゼラチン液化陽性である。
【０００９】
本発明で対象とするプロビデンシア属細菌は、日和見的な感染症を引き起こすことが知られていた。特にプロビデンシア・アルカリファシエンスについては、１９７０年代にはバングラディッシュ、オーストラリア、ナイジェリアなど海外で下痢を起こすことが報告されていたが、下痢症原因菌としての確証が得られていなかった。１９９６年まで我が国ではプロビデンシア属細菌が原因とされた食中毒事件はなく、臨床の現場においては非病原菌であるとされていた。
【００１０】
そのような中、１９９６年１１月２２日に福井市内の２ヶ所の幼稚園と１ヶ所の高校において生徒又は園児２６１名と教員９人が発症した大規模な食中毒が発生した。この時点の調査では、既知の食中毒原因菌約２０種は検出されず、ウイルス（ロタ、アデノ、ＳＲＳＶ、エンテロ）の抗原検出も陰性であり、原因不明とされた。この集団食中毒は発症率が４４％と非常に高かった。その後、３ヶ所の事例から無作為に選ばれた１８下痢便検体が凍結保存されていたことから、大阪大学微生物病研究所、本田武司教授らのグループが再検討を行ったところ、７検体からプロビデンシア・アルカリファシエンスが検出された。正常便検体からのプロビデンシア・アルカリファシエンスの検出例は２０００分の１以下であること、検出された７株のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）のＤＮＡパターンが一致したこと、有症者８例中７例でこの細菌に対する抗体価が有意に上昇していたこと、分離した菌株が動物を用いた腸管病原性試験で陽性であったことから考え、この集団食中毒の原因菌はプロビデンシア・アルカリファシエンスであると判断された。
【００１１】
更に、２００２年１０月２２日に東京都の中学高校の寮において、寮生１５７名中１２０人が発症する集団食中毒が発生した。この事例においても既知の食中毒原因菌、ウイルスは検出されておらず、患者糞便１０７検体中８０検体（７５％）、非発症者糞便３１検体中６検体（１９％）からプロビデンシア・アルカリファシエンスが検出され、分離された菌株のＰＦＧＥパターンに違いは認められなかったことが報告されており（感染症学雑誌、第７７巻臨時増刊号、１９９頁）、プロビデンシア・アルカリファシエンスが原因菌であることが推察された。
【００１２】
上記の２地域でのプロビデンシア・アルカリファシエンスによると考えられる食中毒の症状は以下の通りであった。福井市の事例では下痢・腹痛９６．４％、発熱３８．２％、頭痛１６．４％、悪寒１４．５％、吐気１０．９％、脱力感１．８％であった（日本臨床２００２，  ６０  （６），  １２２８−３２）。東京都の事例では下痢８４．２％、腹痛８０．０％、渋り腹５４．２％、発熱１５．８％であった。
【００１３】
本発明の培地は、プロビデンシア属細菌を選択的に検出するものである。本発明における検出原理は、プロビデンシア属細菌が特異的に分解できず、他の細菌が分解して酸を産生する物質を培地に含有させ、ｐＨによって変色する指示薬を添加しておき、変色しないコロニーをプロビデンシア属細菌とするものである。さらに、プロビデンシア属細菌以外の細菌が生育できず、集落を形成させないことによる選択も組入れるものである。
【００１４】
本発明の培地には、（ａ）プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分、（ｂ）グラム陽性菌発育抑制物質、（ｃ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類及び（ｄ）ｐＨによって変色する色素を含有することが必要である。
（ａ）プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分としては、プロビデンシア属細菌が生育できるものであれば特に限定されない。好ましい例としては、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトン、大豆ペプトン、トリプトン、カジトン、トリプトース、カザミノ酸などのペプトン類、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ジャガイモエキス、可溶性デンプン、血液成分などが挙げられ、これらは自作しても良いし、既製品が販売されているのでそれを利用しても良い。また、これらは単独で用いても良いし、２種以上を混合しても良い。これらの中で、特に肉エキスが好ましい。肉エキスの既製品としては、例えばＯｘｏｉｄ社製Ｌａｂ  Ｌｅｍｃｏ  ｐｏｗｄｅｒが挙げられる。本発明の培地中に添加する（ａ）プロビデンシア属細菌の発育に必要な栄養分の量としては、１０００ｍｌ中に１ｇ〜５０ｇ添加することが好ましく、５ｇ〜２０ｇ添加することがさらに好ましい。使用する栄養分は滅菌状態のものが好ましいが、滅菌状態に無いものは滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行っても良いし、栄養分だけを滅菌しても良い。
【００１５】
（ｂ）グラム陽性菌発育抑制物質は、特に限定されないが、例えばデオキシコール酸ナトリウム、アポコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウムなどの胆汁酸塩、Ｓｈｅｌｌ社より販売されているティーポル、ラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは単独で用いても、２種以上を混合して用いても良い。これらの中ではデオキシコール酸ナトリウムが最も好ましい。本発明の培地中に添加する（ｂ）グラム陽性菌発育抑制物質の量としては、１０００ｍｌ中に０．１ｇ〜３０ｇ添加することが好ましく、１ｇ〜１０ｇ添加することがさらに好ましい。使用するグラム陽性菌発育抑制物質は滅菌状態のものが好ましいが、滅菌状態に無いものは滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行っても良いし、グラム陽性菌発育抑制物質だけを滅菌しても良い。
【００１６】
（ｃ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類は、特に限定されないが、例えばＬ−アラビノース、セロビオース、ズルシトール、グリセロール、ラクトース、マルトース、メリビオース、ラフィノース、サリシン、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−キシロースなどが挙げられる。これらは単独で用いても、数種類を混合して用いても良いが、単独では他の細菌も分解できないために選択性が低下する可能性があるため、数種を混合して用いることが好ましい。添加する糖の種類を少なくする場合には、比較的プロビデンシア属細菌以外の細菌が分解できるものが多いものを用いるべきであり、かかる糖類及び／又はアルコール類としては、Ｌ−アラビノース、マルトース、Ｄ−キシロースが好ましく、特にマルトース及びＤ−キシロースを混合して用いることが好ましい。また、プロビデンシア属の一部が分解する能力を有する糖類及び／又はアルコール類を培地中に含有させ、プロビデンシア属の菌種を絞り込むことができる。かかる糖類及び／又はアルコール類としては、Ｄ−アドニトール、Ｄ−アラビトール、ミオイノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトール、スクロース、トレハロースなどが挙げられる。例えばＤ−アドニトールはＰ．ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐ．ｈｅｉｍｂａｃｈａｅは分解して酸を産生するが、Ｐ．ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ、Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉは分解できない、Ｄ−アラビトールはＰ．ｈｅｉｍｂａｃｈａｅ、Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉは分解して酸を産生するが、他の３種は分解できない、トレハロースはＰ．ｓｔｕａｒｔｉｉのみが分解して酸を産生し、他の４種は分解できない、などの性質を有することから、これらの糖類及び／又はアルコール類を添加することにより、プロビデンシア属細菌の中で菌種を絞ることができる。この絞込みは一度目の選択の時に行っても良いし、まずプロビデンシア属細菌を分離してから新たな培地に植菌し集落の色で菌種を特定しても良い。本発明の培地中に添加する（ｃ）プロビデンシア属細菌が分解することができない糖類及び／又はアルコール類の量は、全体として培地１０００ｍｌ中に３ｇ〜４０ｇ添加することが好ましく、１種類あたり１ｇ〜１０ｇ添加することが好ましい。使用する糖類及び／又はアルコール類は滅菌状態のものが好ましいが、滅菌状態に無いものは、滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行うこともできるが、糖類及び／又はアルコール類によっては１２１℃程度の高温や紫外線照射で分解するものがあるので、そのような場合には０．１μｍ〜０．５μｍの目開きのフィルターを用いてろ過滅菌したり、１００℃程度の温度で２０〜４０分加熱滅菌して、滅菌済みの培地に後から添加すればよい。
【００１７】
（ｄ）ｐＨによって変色する色素としては、いかなるものも用いることができるが、ｐＨ７〜９における色と、ｐＨ４〜６における色が明確に異なるものが好ましく、肉眼で判別できるものが好ましい。かかる色素としては例えば、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、ブロムクレゾールパープル、ニュートラルレッドなどが挙げられ、これらの中で、フェノールレッドが特に好ましい。（ｄ）ｐＨによって変色する色素の量は色の変化が確認できる量であれば、いかなる量でも良いが、培地１０００ｍｌ中に１ｍｇ〜１ｇ添加することが好ましく、５０ｍｇ〜１００ｍｇ添加することがさらに好ましい。使用する色素は滅菌状態のものが好ましいが、滅菌状態に無いものは滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行っても良いし、色素だけを滅菌しても良い。
【００１８】
本発明のプロビデンシア属細菌の検出用選択培地においては、さらに、（ｅ）プロビデンシア属細菌以外の細菌の増殖を抑制し得る抗生物質及び／又は抗菌剤を用いることが好ましい。（ｅ）プロビデンシア属細菌以外の細菌の増殖を抑制し得る抗生物質及び／又は抗菌剤としては、アモキシシリン、セファクロル、セファスロジン、セファゾリン、ポリミキシンＢ硫酸塩等が挙げられ、これらの中でポリミキシンＢ硫酸塩が最も好ましい。培地中の該抗生物質及び又は抗菌剤の量はプロビデンシア属細菌以外の細菌の増殖を抑制できれば限定されないが、好ましくは培地１０００ｍｌ中に１０００単位〜１０００００００単位、さらに好ましくは１００００単位〜１００００００単位である。使用する抗生物質及び又は抗菌剤は滅菌状態のものが好ましいが、滅菌状態に無いものは、滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行うこともできるが、抗生物質及び又は抗菌剤によっては１２１℃程度の高温や紫外線照射で分解するものがあるので、そのような場合には０．１μｍ〜０．５μｍの目開きのフィルターを用いてろ過滅菌して、滅菌済みの培地に後から添加すればよい
【００１９】
その他、本発明の培地には、本発明の効果を妨げない限りいかなるものを添加しても良い。例えば、プロビデンシア属細菌の発育および増殖を促進するために、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどの無機塩類、コハク酸、クエン酸などの有機塩類、各種ビタミン類、各種アミノ酸類、各種脂質類などを添加することができる。これらの成分は滅菌状態のものを使用することが好ましいが、滅菌状態に無い場合には滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行っても良いし、別に滅菌しても良い。滅菌方法は本発明の効果を損なわない限りいかなる方法も使用できる。
【００２０】
また、糖の分解性以外の生化学的性質を利用した検査手法を導入し、選択性を上げることもできる。例えばチオ硫酸ナトリウムやシステイン、メチオニンなどの含硫化合物を添加すれば、硫化水素産生菌は黒色集落を形成し、プロビデンシア属細菌などの硫化水素非産生菌は黒色集落を形成しないことから選択性、確実性をあげることができる。
【００２１】
本発明の培地における形態は、細菌集落（コロニー）を形成できるものであればいかなるものでもよく、例えばシャーレ状、ポット状、フィルム状、シート状、線状などが好ましく、これらの中でシャーレ状のものが最も好ましい。培地は細菌集落を形成させるために固形のものが好ましく、例え内部が液状であっても試料を植菌し、判定する表層部分は固形化していることが好ましい。
固形化せしめるために各種の固形化剤を添加することができる。固形化剤としては本発明の効果を妨げるものでなければ特に限定されないが、例えば寒天、ゼラチン、マンナン、アルギン酸ナトリウム、グアーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ゲランガム、デンプンなどの天然由来の組成物及び又はアクリル酸系樹脂、架橋アクリル酸系樹脂、ポリビニルアルコール、架橋ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、架橋ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸、架橋ポリアスパラギン酸、ポリエチレングリコール系樹脂などの吸水性高分子又はヒドロゲル形成能を有する化学製品を添加することができる。これらの中で、寒天、ゲランガム、架橋ポリビニルアルコールが好ましく、寒天が最も好ましい。培地中に添加する固形化剤の量は特に限定されず、また用いる固形化剤によっても異なるが、例えば寒天においてはシャーレにする場合、培地１０００ｍｌ中に５ｇ〜５０ｇが好ましく、１０ｇ〜２０ｇが特に好ましい。フィルム状、シート状の培地とする場合にはこの限りではなく、さらに添加量を増加させることが好ましい。使用する固形化剤は滅菌状態のものが好ましいが、滅菌状態に無いものは、滅菌して使用することが好ましい。滅菌操作は他の培地成分と混合した後に一度に行うこともできるし別に行うこともできるが、高圧蒸気滅菌の場合、滅菌と同時に固形化剤を溶解させることができるので、他の培地成分と混合した後に一度に行うことが好ましい。
【００２２】
本発明の培地に使用する水は、本発明の効果を損なわない限りいかなるものでも使用することができるが、蒸留水、脱イオン水、０．５μｍ以下の目開きのフィルターによって処理された水などを用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の培地の製造方法は特に限定されず、従来公知の方法で製造することができる。培地上で検体以外に由来する細菌の増殖を防ぐため、滅菌されていない成分を添加する場合は滅菌操作を行うことが好ましい。滅菌操作は本発明の効果を損なわない限りいかなる方法も用いることができるが、１〜６０分紫外線照射を行う方法や１１０〜１３０℃で１０〜６０分高圧蒸気滅菌を行うことが好ましく、固形化剤を同時に溶解することができるために高圧蒸気滅菌を行うことが特に好ましい。ここで、糖類、抗生物質など高温や紫外線照射で活性の低下が認められる成分においては、別にろ過滅菌や１００℃程度の低温での蒸気滅菌を行っても良い。
【００２４】
本発明の培地は、個々の成分を順次添加、溶解して作製することもできるが、あらかじめ各成分を所定の比率で混合したものを所定量水に溶解させて作製することもできる。あらかじめ各成分を所定の比率で混合したものは例えば、各成分を粉末にして所定比率混合しても良いし、この混合物を打錠、プレス加工などによって成型しても良い。また、この混合物を一度水に溶解させて均一な培地組成を作製し、減圧乾燥法、真空凍結乾燥法、流延乾燥法、自然乾燥法、加熱乾燥法などにより水分を除去することによって作製してもよい。該乾燥品は粉砕した状態で保存してもよいし、シャーレやフィルム上で乾燥させ、そのまま保存してもよい。この場合は使用する時に所定量の水を添加するだけで使用に供することができる。また、水分を除去する前に、高圧蒸気滅菌などの滅菌操作を加え、その後無菌的に作業を行い保存すれば、培地混合物を使用する際に更なる滅菌を行なわずに使用に供することができ便利である。
【００２５】
本発明の培地でプロビデンシア属細菌を検出する対象となる試料は特に限定されない。臨床分野での検体としては、例えば糞便、血液、嘔吐物、喀痰、唾液、鼻汁、精液、尿、皮膚組織、鼻腔組織、気道組織、肝臓、肺などが挙げられる。食品検査においては、鶏肉をはじめ種々の検体を対象とでき、それらの検体はそのまま用いても良いし、水や培地での洗浄によって表面に付着した細菌を採取することもできるし、ストマッカーやミキサーで破砕して用いても良い。環境検査においては従来公知の方法で採取した検体を対象とできる。例えば綿棒や布で拭き取った試料などである。また、研究用途として、プロビデンシア属細菌の確認や、プロビデンシア属細菌の採取、混合試料からの分離にも使用できる。各検体はそのまま用いることもできるし、希釈、濃縮して用いることもできる。確実性を高めるために、数種類の希釈および濃縮系列を作製して試験するのが好ましい。希釈には滅菌された水や液体培地、リン酸緩衝液などを用いることができる。濃縮は細菌が通過しない大きさの目開きのフィルターでろ過する方法などを用いることができる。
【００２６】
本発明のポロビデンシア属細菌の検出方法は、上記したプロビデンシア属細菌の検出用選択培地に検体を塗布し、培養して集落を形成る。検体の塗布方法は特に限定されず、白金耳、綿棒、楊枝、スプレッダーなど公知の器具を用いることができる。培養温度はプロビデンシア属細菌が発育すれば特に限定されないが、１０℃〜４２℃が好ましく、３５℃〜３８℃が特に好ましい。培養時間は細菌が集落を形成する様子が確認できれば特に限定されないが、４〜８０時間が好ましく、６〜４８時間がさらに好ましい。この時間より短ければ集落が肉眼で確認できにくく、この時間より長ければ、迅速な検査とはならず、また細菌集落が大きくなり隣のものと結合して判定が困難になる可能性がある。
【００２７】
本発明において検体中のプロビデンシア属細菌の有無の判定は、細菌集落の色によって行う。集落の色はその培地に含有される酸性度によって変色する色素によって異なるが、含有する色素が酸性を示す色の集落はプロビデンシア属細菌以外の細菌であり、細菌塗布前の培地の色を示す集落がプロビデンシア属細菌である。例えばフェノールレッドを添加した培地では、プロビデンシア属細菌の集落は桃色を示し、その他の細菌の集落は黄色を示す。ブロモチモールブルーを添加した培地では、プロビデンシア属細菌の集落は青色を示し、その他の細菌の集落は黄色を示す。ブロムクレゾールパープルを添加した培地では、プロビデンシア属細菌の集落は紫色を示し、その他の細菌の集落は黄色を示す。ニュートラルレッドを添加した培地では、プロビデンシア属細菌の集落は黄色を示し、その他の細菌の集落は赤色を示す。
【００２８】
さらに、プロビデンシア属細菌を検出した後、菌種を同定するには分解性に特異性のある糖類及び／又はアルコール類を用いた生化学的性状試験、１６ＳｒＲＮＡの配列解析による核酸同定法、Ａｐｉ２０Ｅ（日本ビオメリュー・バイテック社）を用いた数値同定法などを行うことができる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１
肉エキス（ベクトン・ディッキンソン社製）１０ｇ、デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）２ｇ、リン酸水素二ナトリウム（シグマ社製）１ｇ、フェノールレッド（和光純薬工業株式会社製）１００ｍｇ、寒天末（ベクトン・ディッキンソン社製）１５ｇを９５０ｍｌの蒸留水中に導入し、１２１℃、３０分オートクレーブにて高圧蒸気滅菌し、培地組成▲１▼とした。一方で、キシロース（シグマ社製）３ｇ、マルトース（和光純薬工業株式会社製）３ｇを５０ｍｌの蒸留水に溶解し、１００℃の沸騰水中で３０分煮沸滅菌して培地組成▲２▼とした。高圧蒸気滅菌した培地組成▲１▼は攪拌しながら冷却し、５０℃まで冷却したところで無菌的に培地組成▲２▼を添加した。これを直径９０ｍｍ、深さ１５ｍｍのプラスチック製滅菌シャーレに２０ｍｌずつ流延し、クリーンベンチ内で蓋を開けた状態で１５分間静置して固形化および表面の乾燥を行った。本操作によって、５０枚のプロビデンシア属細菌検出用選択培地が作製できた。表１に示すように本培地にプロビデンシア属細菌４種の集落をそれぞれ塗布し３７℃１８時間培養したところ、いずれもピンク色の集落が出現した。一方、プロビデンシア属細菌以外の８種の集落を塗布して培養したところ、グラム陰性菌はいずれも黄色の集落を形成し、プロビデンシア属細菌の集落と容易に識別できた。グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は集落が出現しなかった。
【００３０】
実施例２
実施例１の培地組成▲２▼に抗生物質ポリミキシンＢ硫酸塩（ファイザー製薬株式会社製）１８０ｍｇを添加した以外は実施例１と同様にして、５０枚のプロビデンシア属細菌検出用選択培地を作製した。表１に示すように本培地にプロビデンシア属細菌４種の集落をそれぞれ塗布し３７℃１８時間培養したところ、いずれもピンク色の集落が出現した。一方、プロビデンシア属細菌以外の８種の集落を塗布して培養したところ、グラム陰性菌は大腸菌、サルモネラのみが黄色の集落を形成し、プロビデンシア属細菌の集落と容易に識別できた。その他の細菌は集落が出現しなかった。
【００３１】
実施例３
フェノールレッドの代わりにブロモチモールブルー（和光純薬工業株式会社製）を添加した以外は実施例１と同様にして、５０枚のプロビデンシア属細菌検出用選択培地を作製した。表１に示すように本培地にプロビデンシア属細菌４種の集落をそれぞれ塗布し３７℃１８時間培養したところ、いずれも青色の集落が出現した。一方、プロビデンシア属細菌以外の８種の集落を塗布して培養したところ、グラム陰性菌はいずれも黄色の集落を形成し、プロビデンシア属細菌の集落と容易に識別できた。グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌は集落が出現しなかった。
【００３２】
実施例４
実施例１の培地組成▲１▼をトリプトン（ベクトン・ディッキンソン社製）１０ｇ、酵母抽出物（ベクトン・ディッキンソン社製）５ｇ、デオキシコール酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）２ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）５ｇ、フェノールレッド（和光純薬工業株式会社製）１００ｍｇ、寒天末（ベクトン・ディッキンソン社製）１５ｇとした以外は実施例１と同様にして５０枚のプロビデンシア属細菌検出用選択培地を作製した。表１に示すように本培地にプロビデンシア属細菌４種の集落をそれぞれ塗布し３７℃１８時間培養したところ、いずれもピンク色の集落が出現した。一方、プロビデンシア属細菌以外の８種の集落を塗布して培養したところ、グラム陰性菌はいずれも黄色の集落を形成し、プロビデンシア属細菌の集落と容易に識別できた。グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌は集落が出現しなかった。
【００３３】
実施例５
実施例１の培地組成▲２▼にＤ−アラビトール（和光純薬工業株式会社製）３ｇを添加した以外は実施例１と同様にしてプロビデンシア属細菌検出用選択培地を作製した。表１に示すように、プロビデンシア属細菌４種の集落をそれぞれ塗布し３７℃１８時間培養したところ、Ｐ．ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｒｕｓｔｉｇｉａｎｉｉ、Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉの３種はピンク色の集落が出現し、Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉは黄色の集落が出現した。一方、プロビデンシア属細菌以外の８種の集落を塗布して培養したところ、グラム陰性菌はいずれも黄色の集落を形成し、Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ以外のプロビデンシア属細菌の集落と容易に識別できた。グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌は集落が出現しなかった。
【００３４】
比較例１
デオキシコール酸ナトリウムを添加しなかった以外は実施例１と同様にして、プロビデンシア属細菌検出用選択培地を作製した。表１のように、グラム陽性菌の黄色ブドウ球菌の発育が抑制されず、桃色集落として検出され、プロビデンシア属細菌が選択的に検出できなかった。
【００３５】
比較例２
培地組成▲１▼にＤ−マンノース（和光純薬工業株式会社製）３ｇを添加した以外は実施例１と同様にしてプロビデンシア属細菌検出用選択培地を作製した。表１のようにプロビデンシア属細菌がすべてＤ−マンノースを分解して酸を産生して集落が黄色となり他の細菌と判別できなかった。
【００３６】
実施例６
実施例１においてシャーレに流延する前の培地組成物を４００ｍｍ×３００ｍｍの角型バットに流延し、無菌的に−４５℃、１０Ｐａにて１８時間真空凍結乾燥を行った。得られた乾燥品はクリーンルームにおいてフレーク状に破砕し、プロビデンシア属細菌検出用選択培地作製用組成物１とした。該組成物１の３．４ｇを１００ｍｌの蒸留水に導入し、攪拌懸濁したものを電子レンジにおいて組成物１が溶解し、透明になるまで加熱した。これを緩やかに攪拌しながら放冷し、約５０℃になったところで直径９０ｍｍ、深さ１５ｍｍのプラスチック製滅菌シャーレに２０ｍｌずつ流延し、クリーンベンチ内で蓋を開けた状態で１５分間静置して固形化および表面の乾燥を行った。本操作によって、５枚のプロビデンシア属細菌検出用選択培地が作製できた。本培地において、細菌の種類に対して得られる集落の状態は実施例１と同様になった。
【００３７】
実施例７
実施例１において、培地組成▲１▼の蒸留水の量を１５０ｍｌとした。培地組成▲１▼、培地組成▲２▼を混合した後、厚み５０μｍの滅菌ポリエステル製フィルム（ユニチカ株式会社製）にバーコーターを用いて４００μｍの厚みに塗工した。培地を塗工したフィルムは、室温下で１０分静置して表面を乾燥し１００ｍｍ×１００ｍｍに切断して５０枚のプロビデンシア属細菌検出用フィルム状培地を得た。また、培地を塗工したフィルムを減圧乾燥機に導入し減圧下２５℃１８時間乾燥し、１００ｍｍ×１００ｍｍに切断すると、長期保存にも耐え、薄くなったフィルム状培地乾燥品が作製できた。該フィルム状培地乾燥品は使用前に蒸留水中に１時間浸漬させると膨潤して厚みが約４００μｍとなり、プロビデンシア属細菌検出用フィルム状培地として使用できた。本培地において、細菌の種類に対して得られる集落の状態は実施例１と同様になった。
【００３８】
【表１】
2004344098.tif 000002
【００３９】
実施例８〔限度試験〕
プロビデンシア・アルカリファシエンス培養菌液をリン酸緩衝液で種々の菌量に希釈し、本発明の選択培地にて集落が形成される最少菌量を調べた。なお、対象としてサルモネラ・エンテリティディスを用いた。その結果、表２に示すようにプロビデンシア・アルカリファシエンスは実施例１、３、４、５において１０ｃｅｌｌｓ／ｍｌの低菌量においても検出でき、実施例２の抗生物質を含有させた培地においては１００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの菌量で検出できた。さらに実施例２の培地ではサルモネラ菌の発育阻害が確認され、サルモネラ菌の黄色集落は菌量が１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるまで認められなかった。
【００４０】
【表２】
2004344098.tif 000003
【００４１】
応用例１
関西国際空港にて帰国後下痢症状を訴えた海外旅行者７７人に対して採取した下痢便検体を、本発明の実施例２の培地に１白金耳塗抹した。培地を３７℃で静置し、１８時間後に評価したところ、２４検体において桃色集落が認められた。出現した桃色集落を日本ビオメリュー・バイテック社製ＡＰＩ２０Ｅで菌種同定したところ、すべてプロビデンシア属細菌であった。
【００４２】
応用例２
プロビデンシア・アルカリファシエンス１００個を含む水１Ｌに鶏肉１００ｇを１時間浸漬した。この鶏肉をストマッカーで処理し、検体１００ｍｇを実施例１の培地に塗布した。培地を３７℃で静置し、１８時間後に評価したところ、桃色集落が認められた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、これまで長時間と高度な技術を要していたプロビデンシア属細菌の検出を簡便、迅速に行うことができるようになった。このことにより、臨床分野でのプロビデンシア属細菌による感染症の診断の簡便、迅速化、食品分野での衛生管理の簡便、迅速、確実化、研究におけるプロビデンシア属細菌の同定、分離の簡便、迅速化が期待できる。