(57)【要約】【課題】メタノール資化性菌のＬ−リジン及びＬ−アルギニンの生産性を向上させる。【解決手段】コリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質又はその相同タンパク質の変異体をコードするＤＮＡであって、同変異体は、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有するＤＮＡを、メタノール資化性菌に導入する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質又はその相同タンパク質の変異体をコードするＤＮＡであって、同変異体は、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２】
前記変異体が、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である請求項１に記載のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、少なくとも５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、少なくとも５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換され、かつ、５６位以外の位置において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつ、コードされるタンパク質の５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有するＤＮＡ。
【請求項４】
前記他のアミノ酸残基がセリン残基である請求項２又は３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
前記Ｌ−リジンアナログがＳ−（２−アミノエチル）−システインである請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
前記メタノール資化性菌がメチロフィラス属細菌又はメチロバチラス属細菌である請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
メチロフィラス属又はメチロバチルス属に属し、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡが、発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有する細菌。
【請求項８】
請求項７に記載の細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。
【請求項９】
前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする請求項８に記載のＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物工業に関連したものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法、および同製造法に用いる微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イロソイシン、Ｌ−バリン及びＬ−フェニルアラニン等のＬ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、シュードモナス属、アースロバクター属、セラチア属、ペニシリウム属、キャンディダ属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。これらの微生物は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。
【０００３】
上記のような微生物育種や製造法の改良により、Ｌ−アミノ酸の生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要のいっそうの拡大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ−アミノ酸の製造法の開発が求められている。
【０００４】
ところで、従来、安価に大量に入手可能な発酵原料であるメタノールから発酵法によりＬ−アミノ酸を製造する方法としては、アクロモバクター属およびシュードモナス属（特許文献１）、プロタミノバクター属（特許文献２）、プロタミノバクター属及びメタノモナス属（特許文献３）、ミクロサイクラス属（特許文献４）、メチロバチルス属（特許文献５）、バチルス属（特許文献６）などに属する微生物を用いる方法が知られている。本発明者らはこれまで、人工変異による育種および組換えＤＮＡ技術を使って、メチロフィラス属およびメチロバチラス属細菌を用いたＬ−アミノ酸製造法の開発を行ってきた（特許文献７、８）。
【０００５】
近年、Ｌ−アミノ酸を特異的に微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパク質および遺伝子が同定され、特にＶｒｌｊｉｃらは、コリネバクテリウム属細菌からＬ−リジンの菌体外への排出に関与する遺伝子を同定した（非特許文献１）。この遺伝子はｌｙｓＥと名付けられ、同遺伝子をコリネバクテリウム属細菌において増強させることによって、コリネバクテリウム属細菌のＬ−リジン生産能が向上することが報告されている（特許文献９）。また、エシェリヒア・コリにおいてアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇させることにより、いくつかのＬ−アミノ酸の生産性を向上させることができることが知られている（特許文献１０）。例えば、エシェリヒア・コリにおいては、ＯＲＦ３０６遺伝子の発現を増強することによって、シスチン、システイン等の生産性が向上することが報告されている（特許文献１１）。
【０００６】
しかし、これまでメタノール資化性菌を用いたメタノールからの発酵法によるアミノ酸製造において、アミノ酸の排出強化による生産性向上を示した例はない。また、メタノール資化細菌で、排出活性を発揮できる、アミノ酸排出遺伝子についての報告はない。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭４５−２５２７３号公報
【特許文献２】
特公昭４９−１２５５９０号公報
【特許文献３】
特開昭５０−２５７９０号公報
【特許文献４】
特開昭５２−１８８８６号公報
【特許文献５】
特開平４−９１７９３号公報
【特許文献６】
特開平３−５０５２８４号公報
【特許文献７】
国際公開第００／６１７２３号パンフレット（ＷＯ  ００／６１７２３）
【特許文献８】
特開２００１−１２０２６９号
【特許文献９】
国際公開第９７／２３５９７号パンフレット（ＷＯ  ９７／２３５９７）
【特許文献１０】
特開平２０００−１８９１８０号
【特許文献１１】
欧州特許出願公開第８８５９６２号
【非特許文献１】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２：８１５−８２６（１９９６）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安価に大量に入手可能なメタノールを用いて、効率良く、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンを製造する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、メタノール資化性菌、とりわけメチロフィラス属細菌とメチロバチラス属細菌を利用してＬ−アミノ酸、とりわけＬ−リジンあるいはＬ−アルギニンを製造する場合、それらのＬ−アミノ酸の菌体外への排出過程が一つの障壁であること、そして、この障壁を打破する因子として、特にこれら微生物にてアミノ酸の排出活性を発揮する遺伝子を取得することに成功し、これを利用することで効率の良いアミノ酸生産ができることを見いだした。
【００１０】
本発明者らは、既に知られているコリネバクテリウム属細菌由来のｌｙｓＥ遺伝子を、メタノール資化性菌に導入し、そのアミノ酸生産に及ぼす効果を調べたが、導入したｌｙｓＥ遺伝子には変異や欠損が生じ、ｌｙｓＥを機能させることはできなかった。排出を司るようなタンパク質は、細胞膜に組み込まれてその機能を発揮するため、タンパク質と膜の脂質組成などの状態とが両者で適切なものである必要がある。したがって、異種の生物に由来する膜タンパク質を、その機能を発揮する形で発現させることは困難であると考えられ、上述した結果は、それを裏付けるものであった。
【００１１】
本発明者らは、上記のＬ−アミノ酸の排出遺伝子に関する研究の過程において、偶然にもメタノール資化性菌において機能し得る変異遺伝子を取得した。また、同変異遺伝子を利用することで、メタノール資化性菌を用いたアミノ酸製造において、顕著な効果を見出している。そして、同研究をさらに進め、メタノール資化性菌において機能し得る複数の変異遺伝子を取得することに成功した。
【００１２】
本発明は、上記のようにして完成するに至ったものであり、その要旨は以下のとおりである。
（１）コリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質又はその相同タンパク質の変異体をコードするＤＮＡであって、同変異体は、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有することを特徴とするＤＮＡ。
（２）前記変異体が、下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である（１）のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、少なくとも５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、少なくとも５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換され、かつ、５６位以外の位置において１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつ、コードされるタンパク質の５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換される変異を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、メタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する活性を有するＤＮＡ。
（４）前記他のアミノ酸残基がセリン残基である（２）又は（３）のＤＮＡ。
（５）前記Ｌ−リジンアナログがＳ−（２−アミノエチル）−システインである（１）〜（４）のいずれかのＤＮＡ。
（６）前記メタノール資化性菌がメチロフィラス属細菌又はメチロバチラス属細菌である（１）〜（５）のいずれかのＤＮＡ。
（７）メチロフィラス属又はメチロバチルス属に属し、（１）〜（６）のいずれかのＤＮＡが、発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有する細菌。
（８）（７）の細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン又はＬ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。
（９）前記培地がメタノールを主たる炭素源とすることを特徴とする（８）のＬ−リジン又はＬ−アルギニンの製造法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、コリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質又はその相同タンパク質の変異体をコードするＤＮＡであって、メタノール資化性菌に導入したときに、ＬｙｓＥタンパク質の機能を発現し得るＤＮＡである。
ここで、「ＬｙｓＥタンパク質の機能」とは、少なくとも以下の（１）又は（２）に示すいずれかの機能をいう。
【００１４】
（１）前記変異体をコードするＤＮＡをメタノール資化性菌に導入したときに、同細菌にＬ−リジンアナログに対する耐性を付与する機能。
前記細菌に「Ｌ−リジンアナログに対する耐性を付与する」とは、前記変異体をコードするＤＮＡが導入されたメタノール資化性菌が、同ＤＮＡを保持しない細菌、例えばメタノール資化性菌の野生株よりも高濃度のＬ−リジンアナログ存在下で生育できるようになることをいう。例えば、一定濃度のＬ−リジンアナログを含有する寒天培地で一定時間培養し、前記ＤＮＡが導入されたメタノール資化性菌の形質転換株がコロニーを形成し、非形質転換株がコロニーを形成しないときは、前記形質転換株はＬ−リジンアナログに対する耐性が付与されている。Ｌ−リジンアナログとしては、Ｓ−（２−アミノエチル）−システインである請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
【００１５】
（２）前記変異体をメタノール資化性菌に導入したときに、Ｌ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進する機能。
「Ｌ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の細胞外への排出を促進する」とは、本発明のＤＮＡを保持しないメタノール資化性菌に比べて、本発明のＤＮＡを保持するメタノール資化生菌を培養したときに、培地中に排出されるＬ−リジンもしくはＬ−アルギニン又はこれらの両方のＬ−アミノ酸の量を増大させることをいう。Ｌ−アミノ酸の細胞外への排出の促進は、その結果として、本発明のＤＮＡを保持しないメタノール資化性菌に比べて、本発明のＤＮＡを保持するメタノール資化生菌を培養したときに培地中に蓄積するＬ−アミノ酸濃度が高くなることによって観察される。また、Ｌ−アミノ酸の細胞外への排出の促進は、本発明のＤＮＡをメタノール資化性菌に導入したときに、細胞内のＬ−アミノ酸濃度が低下することによっても観察され得る。
【００１６】
本発明においてメタノール資化性菌、即ち、メチロトローフとは、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、本発明のＤＮＡを導入することによって、ＬｙｓＥタンパク質の機能が発現され得る細菌である。具体的には、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）等のメチロフィラス属細菌、及び、メチロバチラス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）、メチロバチラス・フラゲラタム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｍ）等のメチロバチラス属細菌が挙げられる。
【００１７】
メチロフィラス・メチロトロファスとしては、ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）等が挙げられる。メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所  ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。
【００１８】
また、メチロバチラス・グリコゲネスとしては、Ｔ−１１株（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）、ＡＴＣＣ  ２１２７６株、  ＡＴＣＣ  ２１３７１株、ＡＴＲ８０株（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  （１９９４）、４２巻，  ｐ６７−７２に記載）、Ａ５１３株（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  （１９９４）、４２巻，  ｐ６７−７２に記載）等が挙げられる。メチロバチラス・グリコゲネスＮＣＩＭＢ  １１３７５株は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストゥリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所  ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，  Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。また、メチロバチラス・フラゲラタムとしては、ＫＴ株（Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  （１９８８），  １４９巻、ｐ４４１−４４６に記載）等が挙げられる。
【００１９】
本発明のＤＮＡの一形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、少なくとも５６位のグリシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたタンパク質をコードするＤＮＡである。
【００２０】
また、本発明のＤＮＡのより具体的な形態は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、以下の変異を有するＤＮＡである。
（ｉ）５６位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｉｉ）５６位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換、及び５５位のアラニン残基の他のアミノ酸残基への置換
（ｉｉｉ）５６位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への置換、及び１３７位のアスパラギン酸の他のアミノ酸残基への置換
５６位における置換として具体的には、グリシン残基からセリン残基への置換が挙げられる。５５位における置換としては、アラニン残基からスレオニン残基への置換が挙げられる。１３７位における置換としては、アスパラギン酸残基からグリシン残基への置換が挙げられる。
【００２１】
上記置換を有する本発明のＤＮＡのさらに具体的な形態は、後記実施例に示すｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５と名付けられたＤＮＡである。これらは、コリネバクテリウム属細菌で報告されているｌｙｓＥ遺伝子のホモログとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムから単離された遺伝子の変異体である。したがって、本発明のＤＮＡを、便宜的に「変異型ｌｙｓＥ」、本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質を「変異型ＬｙｓＥ」と称することがある。
【００２２】
コリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質をコードするＤＮＡとして、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型のｌｙｓＥの塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２３】
ｌｙｓＥ５６４がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示す野生型ＬｙｓＥのものと比較すると、アミノ末端から５６番目のセリンがグリシンへ変化しており、ｌｙｓＥ５６２がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示す野生型ＬｙｓＥと比較して、アミノ末端から５６番目のセリンがグリシンへ、１３７番目のアスパラギン酸がグリシンへ、そして、ｌｙｓＥ５６５がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、野生型ＬｙｓＥのものと比較すると、アミノ末端から５６番目のセリンがグリシンへ、５５番目のアラニンがスレオニンへ置換したアミノ酸配列を持っていることがわかった。そして、それらに共通する変異点は、５６番目のセリンからグリシンへの変化であることが発見された。この位置における変化が、特にメチロトローフでのＬ−リジン排出に活性のある排出担体を作製する上で、重要なものと推察された。
【００２４】
本発明のＤＮＡは、コードされる変異型ＬｙｓＥが、上記変異を有し、かつ、メタノール資化性菌中でＬｙｓＥタンパク質の機能を示す限り、５６位、又は５５位及び５６位、又は５６位及び１３７位以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列を有していてもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から１０個、好ましくは、２から５個、より好ましくは２から３個である。
【００２５】
上記のような変異型ＬｙｓＥと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加を含むように、変異型ｌｙｓＥの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，    （１９８９）等に記載されている。
【００２６】
上記のような変異を有するＤＮＡを、メタノール資化性菌で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、変異型ＬｙｓＥと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００２７】
尚、本発明において、アミノ酸残基の位置は、必ずしも個々のＬｙｓＥタンパク質における絶対的な位置ではなく、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相対的な位置を示す。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列において、５６位よりもＮ末端側で１アミノ酸残基の欠失があると、前記５６位のアミノ酸残基はＮ末端から５５番目のアミノ酸残基となる。そのような場合、Ｎ末端から５５番目のアミノ酸残基は、配列番号２における５６位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基であるから、「５６位」のアミノ酸残基である。
【００２８】
コリネ型細菌のＬｙｓＥタンパク質又はその相同タンパク質をコードするＤＮＡ、すなわちｌｙｓＥ遺伝子またはその相同遺伝子の供与微生物としては、それらの遺伝子の改変体がメタノール資化性菌中でＬ−リジン排出活性を発現することができるものを保持する微生物であれば、いかなる微生物でも利用できる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等が挙げられる。
【００２９】
ＬｙｓＥの相同遺伝子としては、配列番号１に示す塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記のアミノ酸置換により、メタノール資化性菌中でＬｙｓＥタンパク質の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。前記「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３０】
プローブとして、配列番号１の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、配列番号１の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００３１】
メチロフィラス属細菌又はメチロバチラス属細菌等のメタノール資化性菌において変異型ｌｙｓＥ遺伝子を増強する場合は、その遺伝子断片を、メタノール資化性菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して、組換えＤＮＡを作製し、これをメタノール資化性菌の宿主に導入して形質転換すればよい。あるいは、同遺伝子をトランスポゾンに搭載し、染色体へ組み込んでもよい。また、メタノール資化性菌内で強力転写を誘導するようなプロモーターを、その遺伝子の上流に連結させることも可能である。
【００３２】
ｌｙｓＥを開示している文献（ＷＯ  ９７／２３５９７）には、コリネ型細菌のｌｙｓＥ遺伝子をコリネ型細菌に導入した場合のみを提示している。そして、排出されたアミノ酸としてＬ−リジンのみが示され、更に、ＬｙｓＥを含む新しい排出系のタンパク質の構造体として、膜横断へリックスが６個のものを開示している。しかし、本発明者らは、メタノール資化性細菌においては、コリネ型細菌に由来するようなＬｙｓＥは全く機能しないことを確認した。更に、取得できた因子は、特異的な箇所にアミノ酸置換の変異をもつ、新しいＬ−リジンの排出担体であり、このような因子は、先のｌｙｓＥ特許明細書からは全く類推できるものではない。
【００３３】
＜２＞本発明のメタノール資化性菌
本発明のメタノール資化性菌は、前記本発明のＤＮＡが発現可能な形態で導入され、かつ、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメタノール資化性菌である。本発明のメタノール資化性菌は、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメタノール資化性菌に本発明のＤＮＡを導入することによって得られる。また、本発明のＤＮＡが導入されたメタノール資化性菌に、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を付与することによっても、本発明のメタノール資化性菌を得ることができる。また、本発明のメタノール資化性菌は、本発明のＤＮＡが発現可能な形態で導入されたことによってＬ−リジン又はＬ−アルギニン生産能が付与されたものであってもよい。
メタノール資化性菌としては、前記したようなメチロフィラス属細菌又はメチロバチラス属細菌が挙げられる。
【００３４】
Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメタノール資化性菌は、メタノール資化性菌の野生株にＬ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株の取得、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンの生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、１９８６年５月３０日初版発行、第７７〜１００頁参照）。Ｌ−リジン又はＬ−アルギニン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００３５】
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭４８−２８０７８号、特公昭５６−６４９９号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭５５−９７８４号、特開昭５６−８６９２号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。
【００３６】
また、Ｌ−アルギニン生産菌は、サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有する変異株；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有する変異株（特開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有する変異株（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐性を有する変異株（特開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有する変異株（特開平２−１８６９９５号）、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭５７−１５０３８１号参照）、ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭５２−１１４０９２号参照）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭５２−９９２８９号参照）、アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭５１−６７５４号参照）、コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭５８−９６９２号）、アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭５２−８７２９号参照）、アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭５３−１４３２８８号参照）、及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭５３−３５８６号参照）として育種することができる。
【００３７】
次に、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素遺伝子の増強によってＬ−アミノ酸生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００３８】
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
メタノール資化性菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、メタノール資化性菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをメタノール資化性菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をＤＤＰＳ、アスパルトキナーゼをＡＫ、アスパルトキナーゼＩＩＩをＡＫＩＩＩと略すことがある。
【００３９】
ＤＤＰＳをコードする遺伝子及びＡＫをコードする遺伝子の供与微生物としては、メタノール資化性菌中でＤＤＰＳ活性及びＡＫ活性を発現することができる遺伝子を保持する微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはＥ．  ｃｏｌｉ（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））Ｋ−１２株、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）、及びメチロバチラス・グリコゲネスとしては、Ｔ−１１株（ＮＣＩＭＢ  １１３７５）等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードする遺伝子（ｄａｐＡ、Ｒｉｃｈａｕｄ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ２９７（１９８６））及びＡＫＩＩＩをコードする遺伝子（ｌｙｓＣ、Ｃａｓｓａｎ，  Ｍ．，  Ｐａｒｓｏｔ，  Ｃ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｇ．Ｎ．  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６１，  １０５２（１９８６））は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のｄａｐＡ及びｌｙｓＣを例として説明するが、本発明に用いる遺伝子は、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明に用いるＤＤＰＳ及びＡＫは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の野生型ＤＤＰＳはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の野生型ＡＫＩＩＩはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、メタノール資化性菌に導入するｄａｐＡ及びｌｙｓＣは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＤＤＰＳ及びＡＫＩＩＩをコードするものであることが好ましい。以下、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＤＤＰＳを「変異型ＤＤＰＳ」、変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡを「変異型ｄａｐＡ、又はｄａｐＡ＊」と呼ぶことがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するＥ．  ｃｏｌｉ由来のＡＫＩＩＩを「変異型ＡＫＩＩＩ」、変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡを「変異型ｌｙｓＣ」と呼ぶことがある。
【００４１】
尚、本発明においては、ＤＤＰＳ及びＡＫは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のＤＤＰＳはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００４２】
Ｅ．  ｃｏｌｉ由来の野生型ｄａｐＡの塩基配列を配列番号３に、同塩基配列によってコードされる野生型ＤＤＰＳのアミノ酸配列を配列番号４に例示する。
【００４３】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとしては、配列番号４に示すアミノ酸配列において１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するＤＤＰＳをコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡとしては、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有するＡＫＩＩＩをコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４４】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、ｐＢＲ３２２、ｐＴＷＶ２２８、ｐＭＷ１１９、ｐＵＣ１９等が挙げられる。
【００４５】
また、メチロフィラス属細菌で機能するベクターとしては、例えばメチロフィラス属細菌で自律複製出来るプラスミドが挙げられる。具体的には、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えばｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ，  Ａ．Ｙ．，  Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，  Ｙ．Ｄ．  Ｐｌａｓｍｉｄ，  １９８６，  １６，  １６１−１６７）、あるいはｐＭＦＹ４２（ｇｅｎｅ，  ４４，  ５３（１９９０））、ｐＲＰ３０１、ｐＴＢ７０（Ｎａｔｕｒｅ，  ２８７，  ３９６，  （１９８０））等が挙げられる。
【００４６】
一方、メチロバチラス属細菌で機能するベクターとしては、例えばメチロバチラス属細菌で自律複製出来るプラスミドが挙げられる。具体的には、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えばｐＭＦＹ４２（ｇｅｎｅ，  ４４，  ５３（１９９０））等が挙げられる。
【００４７】
ｄａｐＡ及びｌｙｓＣとメチロフィラス属メタノール資化性細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ｄａｐＡ及びｌｙｓＣを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ｄａｐＡ及びｌｙｓＣは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００４８】
変異型ＤＤＰＳをコードする変異型ｄａｐＡ及び変異型ＡＫＩＩＩをコードする変異型ｌｙｓＣを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドＲＳＦＤ８０が知られている（ＷＯ９５／１６０４２号）。同プラスミドで形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株は、ＡＪ１２３９６と命名され、同株は１９９３年１０月２８日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１３９３６として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４８５９の受託番号のもとで寄託されている。ＲＳＦＤ８０は、ＡＪ１２３９６株から、公知の方法によって取得することができる。
【００４９】
ＲＳＦＤ８０に含まれている変異型ｄａｐＡは、配列番号１３に示す野生型ｄａｐＡの塩基配列において塩基番号５９７のＣがＴに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型ＤＤＰＳは、配列番号１４に示すアミノ酸配列において１１８位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有する。また、ＲＳＦＤ８０に含まれている変異型ｌｙｓＣは、野生型ｌｙｓＣの塩基配列において塩基番号１６３８のＣがＴに変化した配列を有し、それによって、コードされる変異型ＡＫＩＩＩは、３５２位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された配列を有する。
【００５０】
上記のように調製した組換えＤＮＡをメチロフィラス属細菌またはメチロバチラス属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７（１９９７））が挙げられる。
【００５１】
目的遺伝子の増強は、それをコードする遺伝子をメチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。メチロフィラス属細菌の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内の目的遺伝子のコピー数が上昇する結果、目的遺伝子活性が増幅される。
【００５２】
目的遺伝子の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、目的遺伝子の発現が強化されることによって目的遺伝子活性が増幅される。発現調節配列の増強は、目的遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５３】
遺伝子断片とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  Ｅ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，    （１９８９）等に記載されている。
【００５４】
ＤＤＰＳ及びＡＫの増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（以上、ＷＯ９６／４０９３４号参照）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７８８号）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（特公平６−１０２０２８号）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。
【００５５】
また、メチロフィラス・メチロトロファス由来のアスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及び、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素は、ＷＯ  ００／６１７２３に開示されている。
【００５６】
さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（ＷＯ  ９５／２３８６４参照）。
【００５７】
上記のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強する手法は、Ｌ−アルギニンについても同様に適用することができる。
Ｌ−アルギニンは、例えば、アセチルオルニチンデアセチラーゼ活性、Ｎ−アセチルグルタミン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性、Ｎ−アセチルグルタモキナーゼ活性、及びアルギニノサクシナーゼ活性を増強することによって付与することができる（特公平５−２３７５０号）。
【００５８】
また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＰ  １  ０５７  ８９３  Ａ１）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ＥＰ  ０  ９９９  ２６７  Ａ１）、カルバモイルリン酸シンセターゼ（ＥＰ  １  ０２６  ２４７  Ａ１）、もしくはＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（特開昭５７−５６９３号参照）の活性を増強すること、又は、アルギニンリプレッサーをコードする遺伝子（ａｒｇＲ）を破壊することによって、Ｌ−アルギニン生産能を向上させることができる。
＜３＞Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンの製造
上記にようにして得られるＬ−リジン又はＬ−アルギニン生産能を有するメチロフィラス属細菌あるいはメチロバチラス属細菌等のメタノール資化性菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−リジン又はＬ−アルギニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジン又はＬ−アルギニンを採取することにより、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンを製造することができる。
【００５９】
本発明で用いられる微生物は、通常メタノール資化性微生物の培養に用いられる方法で培養することができる。本発明で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。
【００６０】
メタノールを主たる炭素源として用いると、Ｌ−リジン又はＬ−アルギニンを安価に製造することができる。メタノールは、主たる炭素源として用いる場合は、培地中に０．００１〜３０％添加する。窒素源としては硫酸アンモニウムなどを培地に添加して用いる。これらの他に、通常、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどの微量成分が少量添加される。
【００６１】
培養は、振とう培養又は通気撹拌培養などの好気条件下、ｐＨ５〜９、温度２０〜４５℃に保持して行われ、通常２４〜１２０時間で終了する。
培養物からのＬ−リジン又はＬ−アルギニンの採取は、通常イオン交換樹脂法、沈殿法、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００６２】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もｐＨはＮａＯＨ、ＫＯＨまたはＨＣｌで調整した。
【００６３】
2004166592.tif 000003
【００６４】
2004166592.tif 000004
【００６５】
2004166592.tif 000005
【００６６】
2004166592.tif 000006
【００６７】
【実施例１】
＜１＞変異型ｌｙｓＥ遺伝子ライブラリーの作製
【００６８】
まずは、コリネバクテリウム属細菌で知られているＬ−リジンの排出を促進する遺伝子の相同遺伝子であるｌｙｓＥ遺伝子をブレビバクテリウム属細菌よりクローニングし、メチロフィラス属細菌での発現を試みた。
（１）ｐＲＳｌｙｓＥの構築
メチロフィラス属細菌にｌｙｓＥを導入するために、公知のプラスミドｐＲＳ（特表平３−５０１６８２号公報参照）を用いて、ｌｙｓＥ発現用プラスミドｐＲＳｌｙｓＥを構築した。ｐＲＳは、ＲＳＦ１０１０の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｒｅｒｄｏｖ，  Ａ．Ｙ．，  Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，  Ｙ．Ｄ．  Ｐｌａｓｍｉｄ，  １９８６，  １６，  １６１−１６７）に由来するｐＶＩＣ４０プラスミド（ＷＯ９０／０４６３６国際公開パンフレット、特表平３−５０１６８２号公報）より、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするＤＮＡ領域を削除してベクター部分のみを持つプラスミドである。
【００６９】
具体的には、ｐＲＳは以下のようにして構築した。ｐＶＩＣ４０プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、ベクター側を含む約８キロベースペア（以下、「ｋｂｐ」と記載）のＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。このように調製したｐＶＩＣ４０プラスミドのベクター領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて自己連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳを得た。
【００７０】
次に、ｐＲＳより、ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃを図１に示す方法で構築した。ｐＲＳベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約８ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。一方、ｔａｃプロモーター領域を、ｐＲＫ２２３−３プラスミド（発現用ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を鋳型とし、配列番号７および８に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒のサイクルを３０サイクル行った）。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限酵素サイト、すなわちＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＴ２２Ｉで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約０．１５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２を用いて回収した。
【００７１】
上記のように調製したｐＲＳベクター消化物と、ｔａｃプロモーター領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、ｐＲＳｔａｃを得た。ｐＲＳベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝子の転写方向とｔａｃプロモーターの転写方向が同じ向きになっているものを、ｐＲＳｔａｃとして選択した。
【００７２】
上記のようにして得たｐＲＳｔａｃを、Ｓｓｅ８３８７Ｉ（宝酒造製）およびＳａｐＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９．０ｋｂｐのＤＡＮ断片を回収した。
【００７３】
また、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム２２５６株（ＡＴＣＣ１３８６９）より抽出した染色体を鋳型として、配列番号９および１０に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−９０秒）によりｌｙｓＥ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。このとき、ｌｙｓＥ遺伝子がメチロフィラス属細菌中で発現可能となるように、ｌｙｓＥ遺伝子の翻訳開始コドンより９〜１５ｂｐ塩基を、メチロフィラス属細菌で機能することがわかっている配列（  Ｗｙｂｏｒｎ，  Ｎ．  Ｒ．，  Ｍｉｌｌｓ，  Ｊ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｉｓ，  Ｓ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．Ｗ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２４０，  ３１４−３２２（１９９６））に変更するようにプライマーをデザインした。得られた断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳａｐＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで回収した。
【００７４】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｌｙｓＥ遺伝子領域断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥを得た（図１）。ｐＲＳｌｙｓＥは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｌｙｓＥ遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００７５】
（２）メチロフィラス属細菌へのｐＲＳｌｙｓＥの導入
上記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入した。なお、対照として、ｐＲＳをｐＲＳｌｙｓＥと同様にしてＡＳ１株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＳでは１μｇのＤＮＡあたり数千個のコロニーを得たが、それに対してｐＲＳｌｙｓＥでは数個のコロニーしか得られなかった。
【００７６】
ｐＲＳｌｙｓＥが導入されたと思われる形質転換株よりプラスミドを抽出して塩基配列を調べたところ、調べたすべてのプラスミドにおいて、ｌｙｓＥをコードする領域内に自然変異が導入され、それらの変異のうちいくつかは、アミノ酸をコードするコドンが翻訳を停止させる停止コドンに置き換わるナンセンス変異が導入されていた。また、別のプラスミドではｌｙｓＥ遺伝子に欠失がみられた。これらのプラスミドに搭載されているｌｙｓＥは、いずれも、機能が失われていることが考えられた。
【００７７】
以上のように、全長のｌｙｓＥ遺伝子を搭載するｐＲＳｌｙｓＥのメチロフィラス・メチロトロファスへの導入頻度は極めて低く、また機能を失わせるような変異が導入されたｌｙｓＥ変異遺伝子を持つプラスミドのみが導入できたことと併せて考えると、メチロフィラス・メチロトロファスにｌｙｓＥ遺伝子を導入することは致死的であると考えられた。このことは、ｌｙｓＥ遺伝子が異種の細菌においてＬ−リジンの排出に関して万能に機能するものではないことを示している。
【００７８】
変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥを持つメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株を、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートに塗り広げ、３７℃にて１晩培養したのち、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて３４時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。その結果、変異型ｌｙｓＥ遺伝子が導入されてもＬ−リジンの排出が促進されたと思われる株はほとんど得られなかった。
【００７９】
上記のように、既に知られているコリネバクテリウム属細菌由来のｌｙｓＥ遺伝子は、メタノール資化性菌に導入すると致死的であり、わずかに得られる導入株は、導入したｌｙｓＥ遺伝子には変異や欠損が生じ、ｌｙｓＥを機能させることはできなかった。アミノ酸の排出を司るようなタンパク質は、細胞膜に組み込まれてその機能を発揮するため、タンパク質と膜の脂質組成などの状態の両者が適切なものである必要がある。したがって、異種の生物に由来する膜タンパク質を、その機能を発揮する形で発現させることは困難であると考えられた。そこで、自然変異よりもより多くの変異を積極的に導入できる人工変異導入法を用いれば、その中からうまくＬ−リジン排出能を持った変異型ｌｙｓＥを取得できるのではないかと考えた。この考えに基づき、後述するようにヒドロキシルアミンを用いた変異導入法を用いて変異型ｌｙｓＥライブラリーを作製した。
さらに本発明者らは、メタノール資化性菌においてＬ−リジンを排出する活性のあるｌｙｓＥ変異型遺伝子が、メタノール資化性菌に導入された場合、Ｌ−リジンのアナログ化合物であるＡＥＣ（Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン）に対しての耐性度が上昇するのではないかと考えた。この考えに基づき後述するスクリーニング系を開発した。まず、変異ｌｙｓＥライブラリーの作製について詳細に述べる。
【００８０】
（２）ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドの変異処理
野生型のｌｙｓＥを搭載するｐＲＳｌｙｓＥプラスミドを保持するＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（宝酒造から入手可能）を２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出した。
そして、調製したｐＲＳｌｙｓＥに、ヒドロキシルアミンを用いた試験管内の変異導入方法にて変異を導入した。すなわち、最終濃度でｐＨ６．０に調製したリン酸カリウムバッファーを２５０ｍＭ、ｐＨ６．０に調整したヒドロキシルアミン溶液を４００ｍＭおよび２μｇのｐＲＳｌｙｓＥプラスミドを含み、水で全量を２００マイクロリットルに調製した溶液を準備し、これを７５℃に２時間または３時間保温した。この後、この溶液から、ＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いてｐＲＳｌｙｓＥプラスミドを回収した。ヒドロキシルアミンと２時間反応させたプラスミドと、３時間反応させたプラスミドを混ぜ合わせることによって、様々な確率で変異が導入されたｐＲＳｌｙｓＥ集合体を取得した。
【００８１】
上記のようにして得た、様々な位置に変異が導入されたと思われる変異ｐＲＳｌｙｓＥ集合体を増幅し、大腸菌でライブラリーを作るために、このプラスミド集合体でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーをすべてかきとり、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドライブラリーとした。
【００８２】
＜２＞メチロフィラス属細菌への変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドの導入とＬ−アミノ酸生産
（１）人工変異が導入されたｌｙｓＥライブラリーからの機能型ｌｙｓＥのスクリーニング
上記のようにして得られた変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドライブラリーを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７））によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入した。なお、対照として、野生型ｐＲＳｌｙｓＥをＡＳ１株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＳｌｙｓＥでは、以前の検討の結果が再現され、１μｇのＤＮＡあたり数個のコロニーしか得られなかった。それに対して変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドライブラリーでは数百から数千のコロニーが得られた。これまでの検討から、野生型のｐＲＳｌｙｓＥを導入した場合の出現する数個のコロニーはそのほとんどすべてが、自然変異導入によりｌｙｓＥが機能を失ったものであることがわかっている。すなわち全長のｌｙｓＥ遺伝子を搭載するｐＲＳｌｙｓＥのメチロフィラス・メチロトロファスへの導入頻度は極めて低く、また機能を失わせるような変異が導入されたｌｙｓＥ変異遺伝子を持つプラスミドのみが導入できたことと併せて考えると、メチロフィラス・メチロトロファスにｌｙｓＥ遺伝子を導入することは致死的であると考えられた。これに対して、変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドライブラリーを導入した場合には、これよりはるかに多くのコロニーが出現することから、ヒドロキシルアミン処理による変異導入が高効率で行われたことを示している。
【００８３】
上記のようにして変異ｌｙｓＥライブラリーを、変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドライブラリーとして得ることができた。そこでＬ−リジンを菌体外へ排出する活性を発現する機能型ｌｙｓＥを得るためのスクリーニング系を開発した。
【００８４】
上記のようにして得られた変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドライブラリーを保持するメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株を、１プレートに数百個のコロニーが出現するように適当に希釈して、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび３ｇ／ＬのＬ−スレオニンを含むＳＥＩＩ寒天培地に塗布し、３７℃で４８時間保温した。出現したコロニーを、Ｌ−スレオニンを３ｇ／Ｌ、およびＡＥＣをそれぞれ０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ含むＳＥＩＩ寒天培地にレプリカした。ＡＥＣを含まないプレートにレプリカした場合では、もとのプレートにあったコロニー数とレプリカ後の複製プレートに出現するコロニーは同数であったが、ＡＥＣを含むプレートにレプリカした場合は、もとのプレートより複製プレートに出現したコロニーの数は大幅に減少した。ＡＥＣをそれぞれの濃度で含む複製プレートで形成されたコロニーは、それぞれのプレートからＡＥＣを含む新しいＳＥＩＩ寒天培地に移して培養し、同培地上でシングルコロニーを形成できることで、ＡＥＣ耐性を獲得していることを確認した。このような株の中から１００株を無作為に選び出し、更なる選別に供した。
【００８５】
（２）変異ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドを導入した株によるＬ−アミノ酸生産
変異が導入され、ＡＥＣ耐性を宿主に与えると思われた変異ｐＲＳｌｙｓＥを持つメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株のうち１００株を、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートにそれぞれ塗り広げ、３７℃にて１晩培養したのち、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて４８時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−アミノ酸を薄層クロマトグラフィーで分離し、ニンヒドリン検出をもちいた方法でおおよその定量を行った。その結果、様々な濃度のＬ−リジンおよびＬ−アルギニンを菌体外に排出していることがわかった。そのパターンから大まかにこの１００株を５つのグループに分類した。
【００８６】
これらの５つのグループの中から代表的な株をそれぞれ１株ずつ選び、それぞれの株が持つプラスミドをｐＲＳｌｙｓＥ５６１、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６３、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５と命名した。これらのプラスミドを精製し、ｌｙｓＥ領域の塩基配列を解析した結果、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２とｐＲＳｌｙｓＥ５６３、およびｐＲＳｌｙｓＥ５６１とｐＲＳｌｙｓＥ５６４は全く同一の配列であることがわかった。そこで、以降は、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５について調べた。
ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５のｌｙｓＥタンパク質をコードする領域の塩基配列を解析した結果、ｌｙｓＥ５６４では、配列番号１に示す野生型ｌｙｓＥのＤＮＡ配列における１６６位のＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に置換していた。その結果、配列番号２に示す野生型ｌｙｓＥのアミノ酸配列における５６位のＧｌｙ（グリシン）がＳｅｒ（セリン）に置換していた。ｌｙｓＥ５６２では、配列番号１に示す野生型ｌｙｓＥのＤＮＡ配列における１６６位のＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に、４１０位のＡ（アデニン）がＧ（グアニン）に置換していた。その結果、配列番号２に示す野生型ｌｙｓＥのアミノ酸配列における５６位のＧｌｙ（グリシン）がＳｅｒ（セリン）に、１３７位のＡｓｐ（アスハ゜ラキ゛ン酸）がＧｌｙ（グリシン）にそれぞれ置換していた。ｌｙｓＥ５６５では、配列番号１に示す野生型ｌｙｓＥのＤＮＡ配列における１６６位のＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に、１６３位のＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に置換していた。その結果、配列番号２に示す野生型ｌｙｓＥのアミノ酸配列における５６位のＧｌｙ（グリシン）がＳｅｒ（セリン）に、５５位のＡｌａ（アラニン）がＴｈｒ（スレオニン）にそれぞれ置換していた。ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５をあらためてＡＳ１株に導入したところ、ｐＲＳとほぼ同頻度でプラスミドが導入できた。プラスミド導入株について上記と同様の方法で培養を行い、培養上清に含まれるＬ−リジンおよびＬ−アルギニン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。測定した結果を、表１に示す。
【００８７】
【表１】
2004166592.tif 000007
【００８８】
以上のことから、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５は、Ｌ−リジンおよびＬ−アルギニンを有意に排出する活性を持つことがわかった。また、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５をＡＳ１株に再導入しても、Ｌ−リジンおよびＬ−アルギニンを排出する活性を保持していることから、ＡＥＣ耐性を獲得した株の変異は宿主側に導入されたものではなく、プラスミド上の変異であることが明らかにされた。
【００８９】
ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５で共通に導入された変異は、配列番号２に示す野生型ｌｙｓＥのアミノ酸配列における５６位のＧｌｙ（グリシン）がＳｅｒ（セリン）に置換するというものであった。この共通の変異のみを持つｐＲＳｌｙｓＥ５６４で形質転換されたＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株はＡＪ１１００８６と命名され、同株は２００２年９月２６日に、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１９６としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００９０】
ｌｙｓＥ５６２およびｌｙｓＥ５６５遺伝子は、ｌｙｓＥ５６４より当業者によく知られた方法により容易に取得することができる。具体的には、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４よりｌｙｓＥ５６４をコードする領域断片を、例えばＰｒｏｍｅｇａ社の部位特異的変異導入用ベクターｐＳＥＬＥＣＴＴＭ−１に組込み、同社の部位特異変異導入キットＡｌｔｅｒｅｄ  ＳｉｔｅｓＴＭを用いて部位特異的変異を導入し、配列番号１の４１０位のＡ（アデニン）をＧ（グアニン）に置換してｌｙｓＥ５６２遺伝子を得ることができる。このとき、例えば配列番号５に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いればよい。配列番号５の２０番目の塩基は、野生型のｌｙｓＥ遺伝子において塩基置換される塩基である。同様にして、配列番号１に示す１６６位のＧ（グアニン）をＡ（アデニン）に置換することでｌｙｓＥ５６５遺伝子を得ることができる。変異導入には、例えば配列番号６に示す合成オリゴヌクレオチドを用いればよい。配列番号６の１６番目及び１９番目の塩基は、野生型のｌｙｓＥ遺伝子において塩基置換される塩基である。
【００９１】
【実施例２】メチロフィラス・メチロトロファスへのＬ−リジン生合成系酵素遺伝子及び、ｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４またはｌｙｓＥ５６５遺伝子の導入
ｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５遺伝子の導入により菌体外へのＬ−リジンの排出が促進されることがわかったので、ｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５遺伝子を導入した株においてＬ−リジン生合成系酵素の強化を行い、生産性の更なる向上を目指した。
【００９２】
（１）ｄａｐＡ＊遺伝子を持つプラスミドプラスミドｐＲＳｄａｐＡの構築
Ｌ−リジン生合成系酵素遺伝子として、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子（ｄａｐＡ＊）を持つプラスミドを作製した。
【００９３】
実施例１で作製したｐＲＳｔａｃをＳｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、０．８％アガロースゲルで分離し、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９４】
ｄａｐＡ＊遺伝子断片は、同遺伝子を含む公知のプラスミドＲＳＦＤ８０（ＷＯ  ９５／１６０４２号参照）を鋳型として、配列番号１１および１２に示すプライマーを用いたＰＣＲ法（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒）により増幅した。ＰＣＲ反応には、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。得られたｄａｐＡ＊断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、制限酵素Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＸｂａＩで消化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収し、０．８％アガロースゲルで分離後、約０．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００９５】
上記のように調製したｐＲＳｔａｃベクター消化物と、ｄａｐＡ＊遺伝子領域断片を、ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造社）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｄａｐＡプラスミドを得た。ｐＲＳｄａｐＡプラスミドは、ｔａｃプロモーターの転写方向に対して、ｄａｐＡ＊遺伝子の転写方向が同じ向きになるように配置されている。
【００９６】
（２）ｄａｐＡ＊遺伝子と、ｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４又はｌｙｓＥ５６５遺伝子のいずれかの遺伝子を持つプラスミドの構築
ｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４又はｌｙｓＥ５６５とｄａｐＡ＊との組み合わせ効果を評価するために、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５プラスミドのそれぞれにｄａｐＡ＊遺伝子を挿入したプラスミドを構築した。実施例１で作製したｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５を制限酵素ＳａｐＩで消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）にて末端を平滑化した。また、プラスミドｐＲＳｄａｐＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｐＩで消化し、０．８％アガロースゲルにより約１ｋｂｐのｔａｃプロモーターおよびｄａｐＡ＊領域を含む断片を分離し、同断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて回収した。この断片を前記と同様に平滑末端化し、前記のｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５の消化物のそれぞれと、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ２（宝酒造製）にて連結した。
【００９７】
上記のそれぞれの連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造社製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５ｄａｐＡプラスミドを得た。このプラスミドは、ｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５の各遺伝子とｄａｐＡ＊の転写の向きが逆向きになるように配置されている。
【００９８】
上記の方法で得られたｐＲＳｌｙｓＥ５６２ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５ｄａｐＡプラスミドを、エレクトロポレーション法によりメチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ１０５１５）に導入したところ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４ｄａｐＡは形質転換株が得られたが、ｐＲＳｌｙｓＥ５６５ｄａｐＡは形質転換株が得られなかった。これは、プラスミドの安定性がＡＳ１株中で低下してしまったことによるのかもしれない。
【００９９】
（３）ｌｙｓＥ５６２又はｌｙｓＥ５６４、およびｄａｐＡ＊を保持するメチロフィラス属細菌によるＬ−リジンの製造
前記のようにして得られたｐＲＳｌｙｓＥ５６２ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４ｄａｐＡ又は対照としてｐＲＳｌｙｓＥｄａｐＡが導入されたＡＳ１株を、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩプレートに塗り広げ、３７℃にて１晩培養したのち、培地表面約０．３ｃｍ２の菌体をかきとって２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃にて３４時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。結果を表２に示す。ｐＲＳｌｙｓＥ５６２ｄａｐＡ、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４ｄａｐＡを導入した株は、培地中のＬ−リジン蓄積が向上し、ｐＲＳｌｙｓＥ５６２、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４を単独で導入した場合と比較して、培地中のＬ−リジン蓄積が大幅に向上し、排出における律速が解除され、ｄａｐＡ＊遺伝子増強効果が相乗的に表れたことがわかる。
【０１００】
【表２】
2004166592.tif 000008
【０１０１】
【実施例３】メチロバチラス・グリコゲネスへのｌｙｓＥ５６４遺伝子の導入とＬ−アミノ酸生産
（１）ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃの作製
メチロバチラス属細菌で変異型ｌｙｓＥであるｌｙｓＥ５６２、ｌｙｓＥ５６４、ｌｙｓＥ５６５が機能することを確認することにした。そのために、ｌｙｓＥ５６４を選び、ｌｙｓＥ５６４発現用プラスミドｐＲＳｌｙｓＥ５６４の改変を行った。ｐＲＳｌｙｓＥ５６４プラスミドはストレプトマイシン耐性遺伝子を搭載しているが、メチロバチラス・グリコゲネスは本来、このストレプトマイシンに耐性であるため、ｐＲＳｌｙｓＥプラスミドを選別することができない。そこで、メチロバチラス・グリコゲネスで使用可能なテトラサイクリン耐性遺伝子をｐＲＳｌｙｓＥプラスミドに挿入した改変プラスミドを構築した。
【０１０２】
まず、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４より、テトラサイクリン耐性遺伝子を搭載するｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃを構築した。ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、ＤＮＡ  ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ  （宝酒造社製）を用いて、切断末端を平滑化処理した。０．８％アガロースゲルにて分離し、約９キロベースペア（以下、「ｋｂｐ」と記載）のＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（ＤＮＡ回収キット、宝酒造社製）を用いて回収した。
【０１０３】
一方、テトラサイクリン耐性遺伝子領域を、ｐＲＫ３１０プラスミド（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（１９９４）  ２３９：６２３−６６３  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｐａｎｓｅｇｒａｕ，  Ｅｒｉｃｈ  Ｌａｎｋａ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｔ．  Ｂａｒｔｈ，  ＤａｖｉｄＨ．  Ｆｉｇｕｒｓｋｉ，  Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．  Ｇｕｉｎｅｙ，  Ｄｉｅｔｅｒ  Ｈａａｓ，  Ｄｏｎａｌｄ  Ｒ．  Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，  Ｈｅｌｍｕｔ  Ｓｃｈｗａｂ，  Ｖｉｌｍａ  Ａ．  Ｓｔａｎｉｓｉｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｍ．  Ｔｈｏｍａｓ）を鋳型とし、配列番号１３および１４に示すプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した（変性９４℃−２０秒、アニーリング５５℃−３０秒、伸長反応７２℃−６０秒のサイクルを３０サイクル行った）。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を使用した。増幅されたテトラサイクリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片をＰＣＲｐｒｅｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製した後、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収後、ＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  ｋｉｔ（  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｎａｔｉｏｎ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、宝酒造製）を用いて、末端の平滑化、およびリン酸化を行った後、フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてＤＮＡを回収した後、０．８％アガロースゲルにて分離し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をＥＡＳＹ  ＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２を用いて回収した。
尚、テトラサイクリン耐性遺伝子は、ｐＲＫ３１０に代えて他のプラスミド、例えば、ｐＲＫ２プラスミドを鋳型とし、上記と同様のＰＣＲ反応によっても、取得することができる。
【０１０４】
上記のように調製したｐＲＳｌｙｓＥ５６４ベクター断片と、テトラサイクリン耐性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液でエシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、宝酒造製）を形質転換し、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを、２０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で８時間振盪培養した。アルカリ−ＳＤＳ法にて各培養液からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、  ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃを得た。
【０１０５】
（２）メチロバチラス属細菌へのｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃの導入とＬ−アミノ酸生産
上記のようにして得られたｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃを、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３．  １９７  （１９９７））によりメチロバチラス・グリコゲネス  ＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。なお、対照として、ｐＲＫ３１０を同様にしてメチロバチラス・グリコゲネス  ＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。その結果、対照として用いたｐＲＫ３１０とほぼ同じ頻度でｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃが導入されたコロニーが得られた。
【０１０６】
ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃと同様な方法で、野生型ｌｙｓＥを搭載するｐＲＳｌｙｓＥプラスミドにテトラサイクリン耐性遺伝子領域を挿入したｐＲＳｌｙｓＥＴを構築し、同様の方法でメチロバチラス・グリコゲネス株に導入を試みたが、導入株は得られなかった。メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株で見られたのと同様の現象で、やはり、メチロバチラス属細菌においても野生型のｌｙｓＥは正常に機能しないと考えられた。
【０１０７】
ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃを持つメチロバチラス・グリコゲネス  ＮＣＩＭＢ１１３７５株を、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＳＥＩＩプレートに塗り広げ、３０℃にて１晩培養したのち、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３０℃にて６０時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるＬ−リジン濃度をアミノ酸分析計（日本分光製、高速液体クロマトグラフィー）で定量した。その結果を、表３に示す。
【０１０８】
【表３】
2004166592.tif 000009
【０１０９】
（３）ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃの作製
ｌｙｓＥ５６４遺伝子をメチロバチラス・グリコゲネス株に導入することによって、培地中にＬ−リジンが蓄積することがわかった。これは、Ｌ−リジンの排出が促進されたことによると考えられた。
そこで、実施例２と同様に、メチロバチラス・グリコゲネスにおいて、Ｌ−リジン生合成遺伝子とｌｙｓＥ５６４遺伝子を組み合わせて増強した場合の効果を調べた。
【０１１０】
実施例２の（２）項で作製したｐＲＳｌｙｓＥ５６４ｄａｐＡプラスミドに実施例３の（１）項と全く同様の方法でテトラサイクリン耐性遺伝子を搭載したプラスミドを構築した。得られたプラスミドをｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃと命名した。
（４）ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃプラスミドのメチロバチラス・グリコゲネスへの導入とＬ−アミノ酸生産
【０１１１】
上記のようにして得られたｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃを、エレクトロポレーション法によりメチロバチラス・グリコゲネス  ＮＣＩＭＢ１１３７５株に導入した。得られた形質転換株（以下、「ＮＣＩＭＢ１１３７５／ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃ」ともいう）、前記のｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃが導入されたメチロバチラス・グリコゲネス株（以下。「ＮＣＩＭＢ１１３７５／ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−Ｔｃ」ともいう）、および対象としてｐＲＫ３１０プラスミドを導入したメチロバチラス・グリコゲネス株（以下、「ＮＣＩＭＢ１１３７５／ｐＲＫ３１０」ともいう）について、培養液上清中のＬ−アミノ酸濃度を調べた。
【０１１２】
各形質転換株を１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＳＥＩＩプレートで３０℃にて２晩培養した後、培地表面約１０ｃｍ２の菌体をかきとって１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３０℃にて６０時間振とう培養した。培養終了後、培養液の一部を用いて菌体を遠心分離によって除去し、培養上清に含まれるＬ−アミノ酸濃度をアミノ酸分析計で定量した。
【０１１３】
結果を表４に示した。ＮＣＩＭＢ１１３７５／ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃでは、培地中に著量のＬ−リジンを蓄積した。ＮＣＩＭＢ１１３７５／ｐＲＳ−ｌｙｓＥ５６４−ｄａｐＡ−Ｔｃを導入した株は、ｐＲＳｌｙｓＥ５６４Ｔを単独で導入した場合と比較して、培地中のＬ−リジン蓄積が向上し、ｌｙｓＥ５６４遺伝子の導入により、排出における律速が解除され、ｄａｐＡ＊遺伝子増強効果が相乗的に表れたと考えられる。
【０１１４】
【表４】
2004166592.tif 000010
【０１１５】
〔配列表の説明〕
配列番号１        ：野生型ｌｙｓＥ塩基配列
配列番号２        ：野生型ＬｙｓＥアミノ酸配列
配列番号３        ：野生型ｄａｐＡ塩基配列
配列番号４                ：野生型ＤＤＰＳアミノ酸配列
配列番号５、６    ：ｌｙｓＥ５６２部位特異的変異導入プライマー
配列番号７、８    ：ｔａｃプロモーター増幅用プライマー
配列番号９、１０  ：ｌｙｓＥクローニング用プライマー
配列番号１１、１２：ｄａｐＡ＊クローニング用プライマー
配列番号１３、１４：テトラサイクリン耐性遺伝子領域増幅用プライマー
【０１１６】
【発明の効果】
本発明により、メタノール資化性菌のＬ−アミノ酸生産性、特にＬ−リジン及びＬ−アルギニンの生産性を向上させることができる。
【０１１７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｔａｃプロモーターを持つプラスミドｐＲＳｔａｃ、及びｐＲＳｔａｃにｌｙｓＥ遺伝子が挿入されたプラスミドｐＲＳｌｙｓＥの構築を示す図。
【図１】
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