(57)【要約】【課題】糖尿病の治療またはその研究等に利用可能なインスリン産生細胞であって、正常な肝臓組織から得られる肝臓由来細胞を材料に用いて作製し得るインスリン産生細胞、およびその作製方法を提供すること。【解決手段】本発明者は、未分化幹細胞である小型肝細胞を一定の条件で培養することにより、インスリン産生細胞へ分化誘導させ得ること、さらに、Ｐｄｘ−１遺伝子を細胞内導入することにより、細胞の刺激応答性インスリン細胞外分泌機構を向上させ得ることを明らかにした。こうして得られたインスリン産生分泌細胞は、生理的に膵島β細胞と極めて近く、糖尿病の治療またはその研究等に利用可能であり、特に糖尿病の細胞移植治療におけるドナー細胞などへの利用が期待できる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓由来細胞を培養することにより得られるインスリン産生細胞。
【請求項２】
肝臓由来細胞として小型肝細胞を培養することにより得られる請求項１記載のインスリン産生細胞。
【請求項３】
請求項１又は２記載のインスリン産生細胞であって、Ｐｄｘ−１遺伝子またはその発現を正に制御する蛋白の遺伝子を導入することにより刺激応答性インスリン細胞外分泌機能を向上させたインスリン産生細胞。
【請求項４】
請求項１又は２記載のインスリン産生細胞であって、シナプトタグミンまたは他のホルモン物質の細胞外輸送用膜蛋白を発現誘導することにより刺激応答性インスリン細胞外分泌機能を向上させたインスリン産生細胞。
【請求項５】
ラット、マウス、又はヒト由来の細胞であることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のインスリン産生細胞。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載のインスリン産生細胞から得られたインスリン。
【請求項７】
肝臓由来細胞を培養することによりインスリン産生機能を誘導することを特徴とするインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項８】
肝臓由来細胞として小型肝細胞を培養することを特徴とする請求項７記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項９】
培地中に血清を含む第１の培養条件下で細胞培養後、培地中の血清濃度を第１の培養条件より低くした第２の培養条件で更に細胞培養を行うことを特徴とする請求項７又は８記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項１０】
第２の培養条件における培地中の血清濃度を約０．１〜０．５％にすることを特徴とする請求項９記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項１１】
第２の培養条件において、ＤＭＥＭとハムＦ１２Ｋとの混合培地を使用することを特徴とする請求項９又は１０記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項１２】
第２の培養条件下での培養中またはその培養前に、Ｐｄｘ−１遺伝子を細胞内導入することを特徴とする請求項９〜１１の何れか１項に記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項１３】
Ｐｄｘ−１遺伝子の細胞内導入にアデノウイルスベクターを使用することを特徴とする請求項１２記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項１４】
ラット、マウス、又はヒトの肝臓由来細胞から作製することを特徴とする請求項７〜１３の何れか１項に記載のインスリン産生細胞の作製方法。
【請求項１５】
未分化幹細胞を培養することにより得られるインスリン産生細胞。
【請求項１６】
肝臓由来細胞、その他の未分化幹細胞を培養することによりグルカゴン及び／又はソマトスタチンの産生機能を誘導することを特徴とする内分泌ホルモン産生細胞の作製方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法により作製された細胞から得られた内分泌ホルモン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インスリン産生細胞とその作製方法に関する。本発明は、特に糖尿病の治療に有用であり、細胞移植による糖尿病の根本的治療、さらにそのための細胞生産分野へ利用し得るものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、根治的糖尿病治療として、インスリン産生細胞やそれらを組み込んだ人工膵の移植治療が有望視されており、受精卵由来のＥＳ細胞（胚性幹細胞）からインスリン産生細胞への分化誘導の成功例も報告されている。しかし、ＥＳ細胞の医療への応用は倫理的問題など解決すべき多くの難問があり、その臨床応用は現時点においてあまり現実的ではない。
【０００３】
一方、ＥＳ細胞ではなく成体幹細胞などを使用して人為的にインスリン産生機能を誘導する方法についても既にいくつか提案されている。例えば、下記の特許文献１には、培養膵細胞にＰＤＸ−１（Ｐｄｘ−１）遺伝子を発現させ、さらにＧＬＰ−１受容体アゴニストで刺激することによってインスリン遺伝子の発現を誘導する方法が開示されている。しかし、糖尿病患者への細胞移植治療を考慮した場合、このように膵細胞を使用する方法よりも患者などからの入手が容易な肝臓由来細胞からインスリン産生を誘導する方法が望ましい。
【０００４】
下記の非特許文献１には、マウス個体に対しウイルスベクターによりＰＤＸ−１遺伝子を導入したところ、肝臓にインスリン遺伝子の発現を誘導できたことが報告されている。しかし、このように肝臓の細胞を単離せずウイルスベクターによって個体に直接遺伝子を導入し、異所的にインスリンを発現誘導させる方法では、糖尿病治療の臨床応用は困難である。また、下記の非特許文献２には、肝円形細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ）を培養することでインスリン産生機能を付与する方法が開示されている。しかし、肝円形細胞は、通常の肝臓には存在せず、薬物などでダメージを受けた場合のみに出現するので、移植医療などには利用困難である。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第６４４８０４５号明細書
【非特許文献１】
Ｆｅｒｄｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  第６巻第５号  ５６８−５７２頁
【非特許文献２】
Ｙａｎｇ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  ＰＮＡＳ  第９９巻第１２号  ８０７８−８０８３頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、肝臓由来細胞、特に健常肝臓組織から得られる肝臓由来の未分化幹細胞を用いて、これを体外において分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）させインスリン産生を誘導する方法は未だ成功例が報告されていない。
【０００７】
肝臓は発生学的に膵臓と同じ前腸から分化し形成される器官であり、これまでの成体幹細胞を用いた分化誘導の研究報告も、成体の健常肝臓組織由来の未分化幹細胞からインスリン産生細胞へ分化誘導し得る可能性、即ち、肝臓由来細胞からインスリン産生細胞を作製し得る可能性を示唆するものといえる。もしこのようなインスリン産生細胞の作製方法が確立されれば、移植による糖尿病治療に大変有用な材料を提供できることになる。また、臨床応用のためには、移植用細胞のインスリン分泌に関わる生理機能が、できるだけ正常な膵島β細胞に近いことが望ましいものになる。
【０００８】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、糖尿病の治療またはその研究等に利用可能なインスリン産生細胞であって、正常な肝臓組織から得られる肝臓由来細胞を材料に用いて作製し得るインスリン産生細胞、およびその作製方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、成体の健常肝臓組織からの分離が可能であり、肝前駆細胞としての性質を持つ小型肝細胞（ｓｍａｌｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：以下、略して「ＳＨＣ」ということがある。）に着目し、鋭意研究を進めた。その結果、（１）この小型肝細胞を一定の条件で培養することにより、インスリン産生細胞へ分化転換させ得ること、（２）さらに、Ｐｄｘ−１遺伝子を細胞内導入することにより、細胞の刺激応答性インスリン細胞外分泌機構を強化させることができ、インスリン分泌の点で膵島β細胞と生理的に極めて近い細胞を作製し得ること、（３）Ｐｄｘ−１遺伝子の導入により、分泌顆粒の輸送に関与するシナプトタグミン１の発現が誘導されること、等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、医学上・産業上有用な物及び方法として、下記Ａ）〜Ｑ）の発明を含むものである。
Ａ）  肝臓由来細胞を培養することにより得られるインスリン産生細胞。尚、ここで肝臓由来細胞とは、健常肝臓組織から得られる細胞を意味する。したがって、肝円形細胞の如き薬物などでダメージを受けたときのみ出現し、移植治療に適さない細胞は、ここにいう肝臓由来細胞には含まれない。
Ｂ）  肝臓由来細胞として小型肝細胞を培養することにより得られる上記Ａ）記載のインスリン産生細胞。
Ｃ）  上記Ａ）又はＢ）記載のインスリン産生細胞であって、転写因子Ｐｄｘ−１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ−１）遺伝子またはその発現を正に制御する蛋白の遺伝子を導入することにより刺激応答性インスリン細胞外分泌機能を向上させたインスリン産生細胞。
Ｄ）  上記Ａ）又はＢ）記載のインスリン産生細胞であって、シナプトタグミン（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）または他のホルモン物質の細胞外輸送用膜蛋白を発現誘導することにより刺激応答性インスリン細胞外分泌機能を向上させたインスリン産生細胞。
Ｅ）  ラット、マウス、又はヒト由来の細胞であることを特徴とする上記Ａ）〜Ｄ）の何れかに記載のインスリン産生細胞。
Ｆ）  上記Ａ）〜Ｅ）の何れかに記載のインスリン産生細胞から得られたインスリン。
Ｇ）  肝臓由来細胞を培養することによりインスリン産生機能を誘導することを特徴とするインスリン産生細胞の作製方法。
Ｈ）  肝臓由来細胞として小型肝細胞を培養することを特徴とする上記Ｇ）記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｉ）  培地中に血清を含む第１の培養条件下で細胞培養後、培地中の血清濃度を第１の培養条件より低くした第２の培養条件で更に細胞培養を行うことを特徴とする上記Ｇ）又はＨ）記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｊ）  第２の培養条件における培地中の血清濃度を約０．１〜０．５％にすることを特徴とする上記Ｉ）記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｋ）  第２の培養条件において、ＤＭＥＭとハムＦ１２Ｋとの混合培地を使用することを特徴とする上記Ｉ）又はＪ）記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｌ）  第２の培養条件下での培養中またはその培養前に、Ｐｄｘ−１遺伝子を細胞内導入することを特徴とする上記Ｉ）〜Ｋ）の何れかに記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｍ）  Ｐｄｘ−１遺伝子の細胞内導入にアデノウイルスベクターを使用することを特徴とする上記Ｌ）記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｎ）  ラット、マウス、又はヒトの肝臓由来細胞から作製することを特徴とする上記Ｇ）〜Ｍ）の何れかに記載のインスリン産生細胞の作製方法。
Ｏ）  未分化幹細胞を培養することにより得られるインスリン産生細胞。
Ｐ）  肝臓由来細胞、その他の未分化幹細胞を培養することによりグルカゴン及び／又はソマトスタチンの産生機能を誘導することを特徴とする内分泌ホルモン産生細胞の作製方法。
Ｑ）  上記Ｐ）記載の方法により作製された細胞から得られた内分泌ホルモン。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１２】
（１）  肝臓由来細胞からのインスリン産生細胞の作製方法
本発明者は、正常な肝臓組織から分離可能な肝臓由来細胞のうち、体外で長期間増殖し、肝臓実質細胞へ分化する能力をもつ小型肝細胞（ＳＨＣ）に着目し、同細胞からインスリンを産生する機能を誘導するための種々の条件について検討した。その結果、小型肝細胞を簡便かつ生物に毒性を及ぼすような方法を用いることなく、安全な方法で培養することによりインスリン産生細胞へ分化転換させることに成功した。さらに、同細胞に転写因子Ｐｄｘ−１遺伝子をトランスフェクションして強制発現させることで、生体内における膵島β細胞の生理機能と同様に、各種刺激に応答したインスリンホルモンの分泌を可能とした。
【００１３】
本発明者が行った各実験方法および結果の詳細は後述の実施例において説明するが、以下では図１を参照しながら、実際に小型肝細胞からインスリン産生分泌細胞を誘導した方法について説明する。
【００１４】
まず手順１では、コラゲナーゼ肝灌流法を用いてラットの正常な肝臓組織から小型肝細胞（ＳＨＣ）を含む細胞を分離した。具体的には、正常で体重１００−１５０ｇのラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ種、雄）の開腹を行い、門脈下方から肝臓基部へ向けてカニュレーションを挿入し、通法にしたがってＨｅｐｅｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎにて肝灌流を行い、コラゲナーゼによる消化処理により、ＳＨＣを含む肝臓非実質細胞（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ：ＮＰＣ）を単離した。さらに遠心分離によって細胞を純化した後、細胞を３群に分けた。
【００１５】
次に手順２では、３群のＳＨＣをそれぞれＨＧＭ培地で５日間培養する。具体的には、細胞培養用ペトリ皿に２−５×１０４  ｖｉａｂｌｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の割合で播種した。このとき、培地（培養液）としては、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ダルベッコ変法イーグル培地））をベースとし、下記の成分を添加したＨＧＭ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）培地を用いた。
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抗生物質（１００  Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，  １００  μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，  ０．２５  μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）
【００１６】
細胞は  ３７℃、５％  ＣＯ２−９５％  ａｉｒ  のインキュベーター内で２日間培養した後、培地を新しいものに取り替えて更に３日間培養した。このように手順２ではＨＧＭ培地で５日間細胞培養を行ったが、期間は後述のように３〜７日程度であればよい。
【００１７】
次の手順３では、上記ＨＧＭ培地に１％  ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）を加えて同様の条件下２日間培養する。その後、３群の培養ＳＨＣ細胞のうち２群の細胞は実験群として次の手順４・５の処理を行った。一方、残り１群の細胞は対照群としてこの手順３の培養条件を１５日目まで継続した。
【００１８】
手順４では、２群のＳＨＣ細胞を手順３の培地とは異なる低血清培養条件で２日間培養した。具体的には、血清の種類は手順２・３と同様、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用し、その培地（培養液）中の濃度を０．２％と低濃度に設定した。培地には、ＤＭＥＭとハムＦ１２Ｋ（Ｋａｉｇｈ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２）とがおよそ１：１の割合で混合された培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｋ）を使用し、下記の成分を添加した
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抗生物質（手順２・３と同様の条件とする。）
【００１９】
インキュベーター内の条件は手順２・３と同様の条件に設定した。この手順４の培養後、手順５ではアデノウイルスベクターを用いて、２群のＳＨＣ細胞のうち一方の細胞へＰｄｘ−１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子を、他方の細胞へＧＦＰ遺伝子をそれぞれ導入した（以下便宜上、前者の細胞を「＋Ｐｄｘ−１」、後者の細胞を「−  Ｐｄｘ−１」ということがある）。具体的には、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターを基にし、チキン  ベータアクチン  （ＡＧ）プロモーターの３’下流にＰｄｘ−１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子またはＧＦＰ遺伝子がクローニングされた発現ベクターを準備する。Ｐｄｘ−１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ遺伝子は、マウスの転写因子Ｐｄｘ−１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ−１）をコードする遺伝子配列、ｍＲＮＡ内部のリボゾーム結合サイトであるＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）のコード配列、および、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする配列からなる。ＧＦＰは遺伝子導入の有無などを確認するためのものである。
【００２０】
上記のアデノウイルス発現ベクターを、手順４後の２群の細胞に対して重複感染率（ＭＯＩ）  ３０−５０の条件で感染（トランスフェクション）させ、一方の細胞（＋Ｐｄｘ−１）にはＰｄｘ−１およびＧＦＰを、他方の細胞（−  Ｐｄｘ−１）にはＧＦＰのみを強制発現させた。手順５では、このように細胞内に遺伝子導入後、手順４と同じ培地・培養条件で更に６日間培養を継続した。
【００２１】
このように本方法では、実験群（＋Ｐｄｘ−１）、実験群（−  Ｐｄｘ−１）、および対照群の３群の細胞を作製した。そして、９日目、１２日目、１５日目における各細胞のインスリン産生量を測定した。その結果が図５のグラフに示される。グラフ中、「Ｇｒｏｕｐ  １」は実験群を、「Ｇｒｏｕｐ  ２」は対照群をそれぞれ意味する。同グラフに示すように、１５日目では、対照群に比べて、実験群（＋Ｐｄｘ−１及び−  Ｐｄｘ−１）のインスリン産生量が顕著に増加した。この実験群（＋Ｐｄｘ−１及び−  Ｐｄｘ−１）の細胞においては、インスリンのみならず、グルカゴンおよびソマトスタチンの産生も認められた（図１３参照）。
【００２２】
また、抗インスリン抗体を用いて細胞内インスリンの検出を行ったところ、１５日目の実験群（＋Ｐｄｘ−１）の細胞では、インスリンが細胞内に産生されているのが観察された（図３（ｂ）の左側パネル参照）。これに対して、１５日目の対照群の細胞では、シグナルは殆ど検出されず、インスリンの産生は殆ど認められなかった（図３（ｃ）の左側パネル参照）。
【００２３】
さらに、各種刺激に応答して、各細胞のインスリン分泌量がどのように変化するかを調べた。その結果が図６上段の各グラフに示される。左側のグラフは、０．２％  ＦＢＳ  を含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＫＲＢＢ）  液に、高濃度グルコース（２５  ｍＭ）および１０  ｎＭ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １（ＧＬＰ−１  ［７−３７］）を添加したもので刺激した結果、中央のグラフは、低濃度グルコース（５  ｍＭ）のＫＲＢＢ液に、４５  ｍＭ  ＫＣｌ  および  ０．２  ｍＭ  ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅを添加したもので刺激した結果、右側のグラフは、対照用であり、ｂａｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒである低濃度グルコース（５  ｍＭ）のＫＲＢＢ液のみによる測定結果である。各グラフ中、「Ｇｒｏｕｐ  １」は実験群を、「Ｇｒｏｕｐ  ２」は対照群をそれぞれ意味する。この結果から、特にＰｄｘ−１を強制発現させた実験群（＋Ｐｄｘ−１）では、実験群（−  Ｐｄｘ−１）に比べて刺激応答性のインスリン細胞外分泌が促進することが示された。このことは、上記刺激試験３０分後に細胞内に残存するインスリン量を調べた結果からも確認された。即ち、実験群（−  Ｐｄｘ−１）に比べて実験群（＋Ｐｄｘ−１）の細胞における残存インスリン量は顕著に少なく、実験群（＋Ｐｄｘ−１）では刺激応答性のインスリン細胞外分泌機能が向上していることが認められた（図８参照）。
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、実験群（＋Ｐｄｘ１および−Ｐｄｘ１）では、ホルモン分泌に寄与する細胞内輸送膜蛋白群（ＳＮＡＰ２５など）の発現が認められた。特にＰｄｘ−１を強制発現させた実験群（＋Ｐｄｘ−１）では、シナプトタグミン１（ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  １：Ｓｙｔ  １）の発現誘導が観察された（図９参照）。このシナプトタグミン１は、分泌顆粒や細胞膜に結合し、細胞内から細胞外へのホルモン分泌に重要な役割を担っていると考えられる。したがって、Ｐｄｘ−１を強制発現させることでシナプトタグミン１の発現が誘導され、これにより各種刺激に応答した実験群（＋Ｐｄｘ−１）のインスリン分泌機能が向上したものと考えられる。
尚、各実験方法の詳細は後述の実施例において説明する。
【００２５】
以上のように、実験群（＋Ｐｄｘ−１及び−  Ｐｄｘ−１）の細胞では、対照群に比べてインスリン産生量が顕著に増加しており、上記の方法により、小型肝細胞からインスリン産生細胞を誘導することができた。さらに、Ｐｄｘ−１を強制発現させることで、刺激応答性のインスリン分泌機能を向上させることができた。これにより、各種刺激に応答してインスリンの分泌量を調節する生体内の膵島β細胞に近い生理機能をもったインスリン産生分泌細胞を構築することができた。さらに、この細胞を薬物誘導糖尿病ヌードマウスへ移植することで血糖値の上昇を軽減する効果が得られた。
【００２６】
（２）  本発明の変更態様について
勿論、本発明は上記の方法およびこの方法で作製されたインスリン産生細胞に限定されるものではなく、種々の変更が可能であることはいうまでもない。
【００２７】
例えば、上記の方法は小型肝細胞（ＳＨＣ）を材料に用いて、同細胞からインスリン産生機能を誘導するものであったが、他の肝臓由来細胞であっても、（１）正常な肝臓組織から分離可能であり、（２）未分化幹細胞としての性質を有するものであれば、同様の培養誘導によってインスリン産生機能を誘導できると考えられる。
【００２８】
さらに、肝臓由来細胞以外の未分化幹細胞についても、本発明の作製方法により、インスリン産生細胞へ分化誘導できると考えられる。このような未分化幹細胞としては、▲１▼成体由来未分化幹細胞、例えば、血球系幹細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）を末梢血もしくは骨髄成分中より単離して、これを肝実質細胞様細胞へと分化誘導（Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）させた細胞、▲２▼ＥＳ細胞を肝実質細胞様細胞へと分化誘導させた細胞、などが例示される。
【００２９】
インスリン産生細胞への分化誘導のためには、本来ある細胞へ分化予定の未分化幹細胞の増殖を一旦抑制することが重要と考えられる。そのため、上記の方法では、培養途中において、使用培地を高血清濃度のものから低血清濃度のものへ変更している。具体的には、手順２・３では１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）の培地を使用し、後続の手順４・５では、肝臓実質細胞へ分化予定の小型肝細胞の増殖を一旦抑制するため、０．２％と低血清濃度の培地を使用している。
【００３０】
換言すれば、培地中に血清を含む第１の培養条件下で細胞培養後、培地中の血清濃度を第１の培養条件より低くした第２の培養条件で更に細胞培養を行うことが、インスリン産生機能の誘導のために重要と考えられる。このとき、第２の培養条件における培地中の血清濃度は、使用する血清の種類などにもよるが、増殖抑制を図るため、約０．１〜０．５％にすることが好ましく、０．２〜０．３％程度にすることがより好ましい。他方、第１の培養条件における培地中の血清濃度は、５〜２０％程度とすることが好ましく、７〜１５％程度とすることがより好ましい。
【００３１】
第１及び第２の培養条件に使用する血清の種類は特に限定されるものではなく、ウシ及びウシ以外の哺乳類（ウマ・ニワトリなど）の血清が例示され、ウシ血清としては、胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ、又はＦｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、新生児血清（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ＮＢＳ）、子牛血清（Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＣＳ）、等が例示されるが、好適にはウシ胎児血清（ＦＣＳ又はＦＢＳ）を挙げることができる。また、血清の種類は第１及び第２の培養条件を通じて同じものを使用することが好ましい。
【００３２】
使用する培地（培養液）についても特に限定されるものではないが、第１の培養条件においては、ＤＭＥＭをベースとするＨＧＭ培地を使用することが肝細胞の増殖を図る点から好ましく、また第２の培養条件においては、一旦細胞の増殖を抑える観点からＨＧＭ培地以外の培地を使用することが好ましい。本発明者が行った実験では、第２の培養条件の基礎培地成分は、汎用されているＤＭＥＭとハムＦ１２（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２）との混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）よりも、ＤＭＥＭとハムＦ１２Ｋ（Ｋａｉｇｈ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２）との混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｋ）を使用するほうが良好な結果が得られた。また、ＤＭＥＭとハムＦ１２Ｋとの割合はおよそ１：１程度とし、培地中のグルコース（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）濃度は５ｍＭ前後（１〜１．３  ｇ／Ｌ）することで良好な結果が得られた。
【００３３】
尚、培地は試薬から調製してもよいが、ＤＭＥＭおよびハムＦ１２Ｋを含めて現在種々のものが市販されているので、これらの市販品を利用して調製してもよい。
【００３４】
第２の培養条件における培地添加物としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ニコチンアミド（Ｎｉｃｏｔｉａｍｉｄｅ）、肝臓増殖因子（ＨＧＦ）が好ましいものとして挙げられる。ＥＧＦおよびニコチンアミドは、インスリン産生系細胞への分化誘導を助ける上で、またＨＧＦは、低血清濃度という過酷な条件に弱い肝臓細胞の生存を助ける上で添加することが望ましい。各添加物質の濃度は特に限定されるものではないが、例えばＨＧＦの濃度は１０−２５ｎｇ／ｍＬの範囲が例示される。そのほか、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅおよび  ＩＴＳ、細胞増殖因子（線維芽細胞増殖因子など）、視床下部・脳下垂体抽出物も好ましい培地添加物として挙げられ、さらに、細胞培養に汎用される他の栄養成分、抗生物質などを培地に添加してもよい。
【００３５】
細胞培養期間についても特に限定されるものではなく、他の条件との関係で適宜設定すればよいが、例えば、手順２は３〜７日間程度、手順３は１〜４日間程度、手順４は２〜８日間程度に設定することが好ましい。Ｐｄｘ−１遺伝子を強制発現させない場合は手順５は不要であり、手順４を適当な期間、延長すればよい。
【００３６】
Ｐｄｘ−１遺伝子の細胞内導入方法についても特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウイルス法、エレクトロポレーション法、など種々の遺伝子導入方法が知られているので、公知の遺伝子導入方法の中から適切なものを選択すればよい。このうち、ウイルスベクターを用いたウイルス法は高効率で遺伝子導入可能であるため好ましく、一般的なアデノウイルスベクターのほか公知の種々のウイルスベクターを使用できる。本発明者が行った上記の方法では、目的遺伝子であるＰｄｘ−１遺伝子の下流にＩＲＥＳのコード配列をつないだものをチキン  ベータアクチン（ＡＧ）プロモーターの下流に配したアデノウイルスベクターを使用し、このベクターによるトランスフェクションによって高効率の遺伝子導入が得られた。
【００３７】
Ｐｄｘ−１遺伝子の細胞内導入は、第２の培養条件下での培養中に行うことが好ましいが、その培養前に行ってもよい。また、上記の方法では、内因性のラットＰｄｘ−１の発現と区別できるようマウスのＰｄｘ−１遺伝子を導入したが、宿主細胞と同じ生物種由来の遺伝子を導入しても勿論よい。
【００３８】
マウス、さらにヒトの肝臓由来細胞からも、同様の培養誘導によってインスリン産生細胞を作製できると考えられる。ヒトの肝臓由来細胞を使用する場合、生体肝移植手術などで行われる公知の方法により肝臓を一部切除し、その組織から肝臓由来細胞を調製すればよい。
【００３９】
また、前述したように、Ｐｄｘ−１を強制発現させることでシナプトタグミン１の発現が誘導され、これにより細胞の刺激応答性インスリン分泌機能が著明に向上したものと考えられる。したがって、Ｐｄｘ−１を強制発現させる方法以外に他の方法によって、ホルモン物質の細胞外輸送用膜蛋白、特に、シナプトタグミン１（又は他のシナプトタグミン）の発現を誘導し、これにより細胞の刺激応答性インスリン分泌機能を向上させてもよい。このようにシナプトタグミン１（または他の細胞外輸送用膜蛋白であるＳＮＡＰ２５、Ｇβγ、ＴＧａｓｅ  ２など）の発現を誘導する他の方法としては、例えば、転写因子Ｎｅｕｒｏ  Ｄなど、Ｐｄｘ１の発現を上流で促進制御する一連の転写因子群やホルモン・神経伝達物質の細胞外輸送を促進する遺伝子を強制発現させる方法が考えられる。
【００４０】
（３）  本発明の利用分野（有用性）
本発明は、糖尿病の治療またはそのための研究・実験に特に有用である。本発明の作製方法によって、肝臓由来のもともと未分化な幹細胞にインスリンを合成させることができ、さらに、転写因子Ｐｄｘ−１を強制発現させることによって、細胞は合成したインスリンを刺激に応じて効率よく分泌する能力を獲得した。正常な膵臓のβ細胞においても常にインスリンを細胞内に貯蓄し、刺激に応じて速やかに血中に放出することで、厳密な血糖コントロールを可能にしている。このことと照らし合わせても、本発明のインスリン産生細胞は生理的に膵島β細胞と近い機能を持つ細胞と考えられる。
【００４１】
さらに、本発明の作製方法による肝臓由来細胞からインスリン産生細胞への分化誘導過程においても、本来の膵島β細胞の発生分化のコントロールに重要な役割を果たす遺伝子の発現について、時間的にリンクして正常発生のパターンを模倣するような発現パターンを示した（後述の実施例参照）。
【００４２】
したがって、本発明のインスリン産生細胞およびその作製方法は、糖尿病の根本的治療として期待される細胞移植治療に使用されるドナー細胞などとして、さらにそのための細胞生産分野へ利用可能である。例えば、糖尿病患者の肝臓から未分化幹細胞を単離し、これをもとに作製したインスリン産生細胞を自家移植のドナー細胞として利用してもよいし、入手した肝臓由来細胞をもとに作製したインスリン産生細胞を他家移植のドナー細胞として利用してもよい。
【００４３】
また、本発明のインスリン産生細胞およびその作製方法は、直接糖尿病の治療に利用すること以外に、その前段階としての治療法開発のための基礎的研究、動物試験、臨床試験などにおいて利用可能である。
【００４４】
さらに、本発明のインスリン産生細胞により合成され分泌されたインスリンは医薬品（インスリン製剤）や試薬、実験材料等として利用することができ、このようにして細胞から単離・精製されたインスリンも本発明に含まれる。尚、ラットおよびマウスの細胞から単離・精製されるインスリンは、インスリン１遺伝子由来であってもインスリン２遺伝子由来であってもよい。インスリンを単離・精製する方法については、公知の方法を使用すればよい。
【００４５】
また、本発明の方法により、インスリンのみならず、グルカゴン及び／又はソマトスタチンの産生を誘導することが可能である（図１３参照）。このようにして得られた内分泌ホルモン産生細胞、および同細胞から単離・精製される内分泌ホルモンについても産業上有用であり、本発明に含まれる。
【００４６】
【実施例】
以下図面を参照して、本発明の実施例について説明する。
【００４７】
〔実施例１：小型肝細胞からのインスリン産生細胞の作製〕
図１および図２に示す方法によって、小型肝細胞からインスリン産生細胞を作製した。作製方法は前述したとおりであり、ここではその説明を省略する。なお、図２中、「Ｇｒｏｕｐ  １」は実験群を、「Ｇｒｏｕｐ  ２」は対照群をそれぞれ意味し、以降の図においても同じ意味である。
【００４８】
図３（ａ）は、培養７日目の細胞を位相差顕微鏡で観察したもの、同図（ｂ）（ｃ）は免疫蛍光染色法により抗インスリン抗体を用いてインスリンの検出を行った結果である。（ｂ）の左側パネルは、１５日目の実験群（＋Ｐｄｘ−１）の細胞においてインスリンを蛍光染色した結果、右側パネルは、その結果と同細胞における細胞核をＤＡＰＩによって蛍光染色した結果とを重ね合わせたものである。ＤＡＰＩは細胞の核染色のための色素物質である。（ｃ）の左側パネルは、１５日目の対照群の細胞においてインスリンを蛍光染色した結果、右側パネルは、その結果と同細胞におけるＤＡＰＩを蛍光染色した結果とを重ね合わせたものである。１５日目の実験群（＋Ｐｄｘ−１）の細胞では、インスリンが細胞内に産生されているのが観察された（（ｂ）の左側パネル）が、１５日目の対照群の細胞では、インスリンの産生は殆ど認められなかった（（ｃ）の左側パネル）。
【００４９】
また、培養９日目、１２日目、１５日目における各細胞のインスリン産生量を測定した。インスリンの定量化については、細胞を回収し、通法に従って、酸エタノール液ｅｔｈａｎｏｌ  （０．１Ｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  含有）にてマイナス２０℃、１２〜２４時間浸漬し、インスリン抽出を行った。この抽出液をＥＬＩＳＡ法にて測定・定量化した。同サンプルにおける総蛋白量をＢＣＡ法にて定量し、サンプル間の抽出効率の補正を行った。その結果が図５のグラフに示される。同グラフに示すように、１５日目では、対照群に比べて、実験群（＋Ｐｄｘ−１及び−  Ｐｄｘ−１）のインスリン産生量が顕著に増加した。
【００５０】
〔実施例２：培養過程における遺伝子発現の検討〕
図１に示す培養方法の各段階における、発生分化に関わる転写因子などの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。ＲＴ−ＰＣＲ法は、培養細胞から通法に従い、ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ−ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅにて逆転写反応を行い、相補鎖ＤＮＡへ変換した後、Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにてＰＣＲ反応を行った。各ＰＣＲ反応に使用したプライマーは、図１１および図１２に示すとおりであり、必要に応じてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。結果はアガロースゲル電気泳動にて確認した。その結果が図４に示される。
【００５１】
培養０日目において、ＳＨＣは、成熟肝細胞のマーカーであるアルブミン、成熟肝細胞およびβ細胞に発現するｃ−Ｍｅｔ、膵島祖先細胞のマーカーであるニューロゲニン３（ｎｇｎ３）を発現した。培養７日目では、アルブミンおよびニューロゲニン３の発現は消失し、ネスチンの発現が観察された（レーン１と２）。この結果は、上記の手順２・３の培養によりネスチン陽性のＳＨＣが増殖したことを示すものである。
【００５２】
培養１５日目において、インスリン１の発現が実験群（＋Ｐｄｘ−１及び−  Ｐｄｘ−１）の細胞のみに検出された。これらの細胞はまた、β細胞のマーカーであるＧＬＵＴ２およびＩＡＰＰを発現し、この結果はＳＨＣからβ細胞への分化がなされたことを示すものであった。
【００５３】
インスリン２の発現は、実験群（＋Ｐｄｘ−１）でのみ認められ、実験群（−  Ｐｄｘ−１）では認められなかった。マウスｍ  Ｐｄｘ−１の強制発現は、内因性のラットｒＰｄｘ−１およびＮｅｕｒｏ  Ｄの発現を誘導した。インスリン２の発現にはＰｄｘ−１及び／又はＮｅｕｒｏ  Ｄの発現が重要と考えられる。成熟β細胞のマーカーであるＩｓｌ１およびＰａｘ６は、培養９日後に検出された。対照的に外分泌細胞のマーカーであるＰＴＦ１の発現は解析したいずれの細胞にも観察されなかった。
【００５４】
ＨＮＦ−１ａ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−１ａ）、ＨＮＦ−１ｂ、ＨＮＦ−４ａの変異は糖尿病の原因となるが、今回調べた細胞の間では、これらの発現に変化が認められなかった。
【００５５】
〔実施例３：各種刺激に応答したインスリンホルモンの分泌〕
各種刺激に応答して、各細胞のインスリン分泌量がどのように変化するかを調べた。その結果が図６上段の各グラフに示される。左側のグラフは、０．２％  ＦＢＳ  を含むＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ＫＲＢＢ）  液に、高濃度グルコース（２５  ｍＭ）および１０  ｎＭ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １（ＧＬＰ−１  ［７−３７］）を添加したもので刺激した結果、中央のグラフは、低濃度グルコース（５  ｍＭ）のＫＲＢＢ液に、４５  ｍＭ  ＫＣｌ  および  ０．２  ｍＭ  ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅを添加したもので刺激した結果、右側のグラフは、対照用であり、ｂａｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒである低濃度グルコース（５  ｍＭ）のＫＲＢＢ液のみによる測定結果である。インスリン分泌量の定量化は図５の実験と同様に行った。
【００５６】
図７に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてグルコースはインスリンの分泌を促進する。グルコースが細胞内輸送されると、解糖系およびクレブス回路を介してアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が生成され、Ｃａ２＋の流入が亢進し、次いで細胞内に貯蔵されていたＣａ２＋が細胞質に放出される。この細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）やプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の関与するリン酸化反応を招来し、これらの反応がインスリンの分泌を促進する。また、ＧＬＰ−１は、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路のアクチベータであり、Ｋ＋およびｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅは、Ｃａ２＋の細胞内流入を亢進させ、いずれもインスリンの分泌を刺激する。
【００５７】
図６上段の各グラフに示すように、Ｐｄｘ−１を強制発現させた実験群（＋Ｐｄｘ−１）では、実験群（−  Ｐｄｘ−１）に比べて刺激応答性のインスリン分泌機能が向上していた。このことは、上記刺激試験３０分後に細胞内に残存するインスリン量を調べた結果からも確認された。即ち、実験群（−  Ｐｄｘ−１）に比べて実験群（＋Ｐｄｘ−１）の細胞における残存インスリン量は顕著に少なく、実験群（＋Ｐｄｘ−１）では刺激応答性のインスリン細胞外分泌機能が向上していることが認められた（図８参照）。
【００５８】
また、実験群（＋Ｐｄｘ−１）の細胞におけるインスリン分泌の時間変化を調べたところ、その時間変化はグルコース刺激による膵島β細胞からのインスリン分泌量の時間変化に類似していた（図６下段のグラフ参照）。
【００５９】
〔実施例４：Ｐｄｘ−１強制発現によるシナプトタグミン１の発現誘導〕
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、インスリンホルモンの分泌に寄与する他の蛋白ＳＮＡＰ２５、Ｇβγ、ＴＧａｓｅ  ２の発現については、培養１５日目の実験群（＋Ｐｄｘ−１）と−Ｐｄｘ−１の両方）で同様に認められた。特に、Ｐｄｘ−１を強制発現させた実験群（＋Ｐｄｘ−１）では、シナプトタグミン１（Ｓｙｔ  １）の発現誘導が観察された。（図９参照）。
【００６０】
上記の結果から、シナプトタグミン１（Ｓｙｔ  １）は、転写因子Ｐｄｘ−１の直接または間接の標的物質と考えられ、Ｐｄｘ−１はＳｙｔ  １の転写を正に制御することが示された。これまでの実験結果から、膵島β細胞におけるＰｄｘ−１、Ｓｙｔ  １、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ、Ｐａｘ６、ＨＮＦ−３βの相互関係については、図１０に示されるようなモデルが考えられ、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ等もＳｙｔ  １の転写を正に制御すると考えられる。
【００６１】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、肝臓由来細胞を培養することにより得られるインスリン産生細胞とその作製方法に関するものであり、前述したとおり、糖尿病の根本的治療におけるドナー細胞などとして、糖尿病の治療、さらにそのための細胞生産分野へ利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】小型肝細胞からのインスリン産生細胞の作製工程を概略的に示すフローチャートである。
【図２】図１の作製工程を簡略化して示す図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、上記作製工程により得られた細胞におけるインスリン産生の有無を免疫蛍光染色法により調べた結果を示す。
【図４】上記作製工程の各段階における、発生分化に関わる転写因子などの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した結果を示す図である。
【図５】上記作製工程により得られた細胞におけるインスリン産生量を調べた結果を示すグラフである。
【図６】上記作製工程により得られた細胞について、各種刺激に応答して細胞のインスリン分泌量がどのように変化するかを調べた結果を示すグラフである。
【図７】膵島β細胞における、各種刺激に応答したインスリン分泌機構を説明する図である。
【図８】刺激試験後に、細胞内の残存インスリン量を測定した結果を示すグラフである。
【図９】インスリン分泌に寄与する蛋白の遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果を示す図である。
【図１０】膵島β細胞におけるＰｄｘ−１、Ｓｙｔ  １、Ｎｅｕｒｏ  Ｄ、Ｐａｘ６、ＨＮＦ−３βの相互関係をモデルとして示す図である。
【図１１】図４のＲＴ−ＰＣＲ解析において使用した各プライマー配列を示す図である。
【図１２】図１１と同様、図４のＲＴ−ＰＣＲ解析において使用した各プライマー配列を示す図である。
【図１３】図１の方法により作製された細胞（＋Ｐｄｘ−１および−Ｐｄｘ−１）におけるグルカゴンおよびソマトスタチンの遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年5月11日(2004.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、肝臓由来細胞を培養することにより得られるインスリン産生細胞とその作製方法に関するものであり、前述したとおり、糖尿病の根本的治療におけるドナー細胞などとして、糖尿病の治療、さらにそのための細胞生産分野へ利用できるほか種々の有用性を有するものである。
【配列表】
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