(57)【要約】【課題】ケロイドと肥厚性瘢痕とを簡便かつ正確に鑑別可能な手段を提供する。【解決手段】ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、（１）被検試料を用意する工程、（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量と正常組織由来被検試料中の発現量とを比較してケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量と正常組織由来被検試料中の発現量とを比較してケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【請求項２】
ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【請求項３】
ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１およびＯ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の８倍以上である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【請求項４】
ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【請求項５】
ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、
（３）被検試料中のジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の発現量を測定する工程、および、
（４）ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上で、かつ、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【請求項６】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項４または請求項５に記載の遺伝子産物を認識する抗体を用いて、被検試料中の遺伝子産物の発現量を測定する請求項１、請求項２、請求項３、請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１、請求項２、請求項３、請求項４または請求項５に記載の遺伝子産物をコードする核酸にハイブリダイゼーションするプローブ核酸を用いて、被検試料中の遺伝子産物の発現量を測定する請求項１、請求項２、請求項３、請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
被検試料から得られたｍＲＮＡを鋳型として得られたｃＤＮＡを用いて測定する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【請求項１１】
ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ペリオスチン、ファイブロネクチン１およびＯ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の８倍以上であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【請求項１２】
ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【請求項１３】
ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であることを測定し、かつ、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下であることを測定してケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【請求項１４】
ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物を認識する抗体を用いる請求項１０、請求項１１、請求項１２または請求項１３のいずれか１項に記載の診断用キット。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１４に記載の診断用キット。
【請求項１６】
ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物をコードする核酸にハイブリダイゼーションするプローブ核酸を用いる請求項１０、請求項１１、請求項１２または請求項１３のいずれか１項に記載の診断用キット。
【請求項１７】
プローブ核酸が固相担体の表面に固定化されたプローブ核酸である請求項１６に記載の診断用キット。
【請求項１８】
ケロイドの診断、ケロイドの病変組織の拡大防止またはケロイドの治療のための物質をスクリーニングする方法であって、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物またはそれらをコードする核酸のうち、少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含むケロイドの診断、ケロイドの病変組織拡大防止またはケロイドの治療のための医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はケロイドの診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ケロイド（真性ケロイド又は突発性ケロイドと呼ばれることもある）は軽微な外傷に続いて発症し、あるいは外傷歴がなく突然発症し、紅色から紅褐色の半球状色ないし表面平滑な硬い皮膚結節を形成する疾患である。この結節は徐々に拡大して増殖する反応性の結合組織増殖であり、掻痒感があり、つまむと圧痛がある。思春期以後の前胸部とくに乳房間や肩、背部に発生することが多く、しばしば座瘡や外傷、手術、ＢＣＧ接種などに続発し、切除により通常大きさが倍加する。ケロイドは発症機序が不明であり、まだ動物モデルも存在しないことから、原因の究明や治療方法の確立が著しく遅れている。
【０００３】
一方、肥厚性瘢痕（瘢痕ケロイドと呼ばれることもある）は、外傷や熱傷などに続発するが、外傷の創面の範囲を超えた増殖がない疾患であり、数年のうちに次第に萎縮して扁平化する。肥厚性瘢痕の治療には、副腎皮質ホルモンの病巣内注入、閉鎖密封、及び持続圧迫などが行われる。
【０００４】
ケロイドと肥厚性瘢痕は組織学的及び病理学的に共通点が多い。組織学的には、線維芽細胞と血管の増殖、繊維化、硬化（硝子化）が認められ、創面が隆起する結合組織の肥大増殖、病変部の硬化と強い紅色調、強い掻痒感と圧痛、及び時に自発痛を伴う点で両者は共通している。また、病理学的には、真皮内に渦巻状ないし結節状の膠原腺維の増殖が認められる点でも共通しており、両者を鑑別することは不可能である。遺伝子発現に関する情報では、ケロイドと肥厚性瘢痕の両者で発現しているものとしてＴＧＦ−β１及びその受容体Ｉ及びＩＩ型、並びにコラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、及びコラーゲンＶＩ型が知られている。
【０００５】
このように、ケロイドと肥厚性瘢痕とは別の疾患であるものの、組織学的及び病理学的に極めて類似点が多いことから、臨床医にとってその鑑別が極めて難しく、治療法法の選択を誤ると疾患を悪化させることにもなりかねないという問題がある。ケロイドと肥厚性瘢痕の相違点については明確な報告がなく、過去には病理学的鑑別が試みられたこともあったが、統一した見解はいまだ得られていない。このため、臨床医は一般に臨床経過や各自のあいまいな基準で両者の鑑別を行っているのが現状である。
【０００６】
ケロイドと肥厚性瘢痕の鑑別関しての遺伝子発現に関する情報では、肥厚性瘢痕組織で発現しているがケロイド組織での発現が確認されていないものとしてＶｅｒｓｉｃａｎ及びｂｉｇｌｙｃａｎが報告されており、ケロイド組織で発現しているが肥厚性瘢痕組織では確認されていないものとしてコラーゲンＸ型が報告されている。しかしながら、これらの遺伝子発現に関する情報は、ケロイドと肥厚性瘢痕とを明確に鑑別するための情報としては信頼性及び再現性などの観点から到底満足すべきものとは言えない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題は、ケロイドと肥厚性瘢痕とを簡便かつ正確に鑑別可能な手段を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく、ケロイド患者の皮膚サンプルから調製したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを調製し、マイクロアレイを用いてｍＲＮＡレベルが上昇している遺伝子を解析した。その結果、正常組織よりも数倍高い発現量を伴う複数の遺伝子を特定することに成功し、これらの遺伝子がケロイド組織でも発現していることを確認した。また、これらの遺伝子のうち肥厚性瘢痕組織では有意に発現していない遺伝子を特定することに成功し、これらの遺伝子を用いた診断によりケロイドと肥厚性瘢痕とを簡便かつ正確に鑑別できる手法を確立した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明により、下記の発明が提供される。
１．ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量と正常組織由来被検試料中の発現量とを比較してケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【０００９】
２．ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【００１０】
３．ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１およびＯ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の８倍以上である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【００１１】
４．ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【００１２】
５．ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、
（３）被検試料中のジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の発現量を測定する工程、および、
（４）ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上で、かつ、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下である場合にケロイド陽性であると判定する工程、を含む方法。
【００１３】
６．上記１ないし５のいずれかに記載の遺伝子産物を認識する抗体を用いて、被検試料中の遺伝子産物の発現量を測定する上記１ないし５のいずれかの方法。
７．抗体がモノクローナル抗体である上記６に記載の方法。
８．上記１ないし５のいずれかに記載の遺伝子産物をコードする核酸にハイブリダイゼーションするプローブ核酸を用いて、被検試料中の遺伝子産物の発現量を測定する上記１ないし５のいずれかに記載の方法。
９．被検試料から得られたｍＲＮＡを鋳型として得られたｃＤＮＡを用いて測定する上記８に記載の方法。
１０．ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【００１４】
１１．ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ペリオスチン、ファイブロネクチン１およびＯ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の８倍以上であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
１２．ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【００１５】
１３．ケロイドか否かを判定するための診断用キットであって、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であることを測定し、かつ、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下であることを測定してケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット。
【００１６】
１４．ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物を認識する抗体を用いる上記１０ないし１３のいずれかに記載の診断用キット。
１５．抗体がモノクローナル抗体である上記１４に記載の診断用キット。
１６．ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物をコードする核酸にハイブリダイゼーションするプローブ核酸を用いる上記１０ないし１３のいずれかに記載の診断用キット。
【００１７】
１７．プローブ核酸が固相担体の表面に固定化されたプローブ核酸である上記１６に記載の診断用キット。
１８．ケロイドの診断、ケロイドの病変組織の拡大防止またはケロイドの治療のための物質をスクリーニングする方法であって、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物またはそれらをコードする核酸のうち、少なくとも１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
１９．上記１８に記載の方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含むケロイドの診断、ケロイドの病変組織拡大防止またはケロイドの治療のための医薬。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、ケロイドか否かを判定する方法であって、下記の工程、
（１）被検試料を用意する工程、
（２）被検試料中の（Ａ）ペリオスチン、（Ｂ）ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、（Ｃ）ミネカン、（Ｄ）ルミカン、（Ｅ）セリンプロテアーゼ１１、（Ｆ）ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および（Ｇ）１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定する工程、および、
（３）測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量と正常組織由来被検試料中の発現量とを比較してケロイド陽性であると判定する工程を含むことを特徴としている。上記の遺伝子産物（Ａ）から（Ｇ）はいずれも公知であり、それぞれのアミノ酸配列の情報も入手可能である。
【００１９】
また、本発明の方法に用いられる遺伝子産物は、上記のアミノ酸配列により特定される各遺伝子産物と実質的に同一の生物学的機能を有するものであれば、上記の公知のアミノ酸配列において、１個ないし数個のアミノ酸が置換、挿入、又は欠失した変異アミン酸配列を有する遺伝子産物であっても差し支えない。本明細書において用いられる「遺伝子産物」の用語には、上記の変異アミノ酸配列を有する遺伝子産物も包含される。
【００２０】
本発明の方法では、被験者から病変組織を採取し、一方、同一の被験者又は別の健常者から正常組織を採取して、それぞれの組織中における上記の（Ａ）ないし（Ｇ）のいずれか１つ以上の遺伝子産物の発現量の測定を行う。一人または複数の健常者の正常組織における上記遺伝子産物の発現量をあらかじめ測定しておき、正常組織での発現量として用いてもよい。複数の健常者の正常組織での発現量の平均値を用いることもできる。正常組織は、患者の病変組織の周囲の組織から採取してもよい。
【００２１】
上記の遺伝子産物の発現量を測定する方法は特に限定されず、当業者が利用可能な方法であればいかなる方法を用いてもよい。例えば、上記遺伝子産物の発現量を測定する方法として、上記の遺伝子産物を認識する抗体を用いる方法を例示することができる。上記の遺伝子産物を認識する抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、上記の遺伝子産物を特異的に認識できるモノクローナルを用いることが望ましい。あるポリペプチドについて抗原性が明らかである場合、該ポリペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体を製造する方法は当業者に周知かつ慣用である。例えば、マウスやウサギなどの動物を免疫感作することによってポリクローナル抗体を製造することができ、免疫した動物のリンパ球を用いたハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生することができる。
【００２２】
抗体としては、抗体の活性フラグメントを用いてもよい。活性フラグメントとしては、具体的にはＦ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖなどを挙げることができる。例えば、抗体をペプシンで分解するとＦ（ａｂ’）２  が得られ、パパインで分解するとＦａｂが得られる。Ｆ（ａｂ’）２  を２−メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨード酢酸でアルキル化するとＦａｂ’が得られる。Ｆｖは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた一価の抗体活性フラグメントである。さらに、これらの活性フラグメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメントに置換することでキメラ抗体が得られる。これらの活性フラグメントやキメラ抗体を上記遺伝子産物の発現量の測定に用いることができる。
【００２３】
上記の遺伝子産物を抗体を用いて定量する方法としては、例えば、標識された抗体を用いる方法、又は上記の遺伝子産物を認識する抗体に反応する標識二次抗体を用いる方法などを挙げることができる。抗体の標識手段は特に限定されないが、例えば、放射性同位元素、酵素、アビジン若しくはビオチン、又は蛍光物質などを適宜選択可能である。
【００２４】
また、上記遺伝子産物の発現量を測定する方法として、例えばマイクロアレイ法を利用することができる。この方法の原理は当業者によく知られているが、一般的には、固相担体に既知の遺伝子又はその断片を固定化してマイクロアレイを形成する工程；固相担体上の遺伝子又はその断片に試料由来の標識核酸を接触させてハイブリッドを形成させる工程；及び固相担体上の遺伝子又はその断片と試料由来の標識核酸との間でハイブリッドを形成した多重鎖核酸の有無を上記標識を利用して検出する工程を含んでいる。
【００２５】
本発明の方法では、組織における上記遺伝子産物の発現量を測定する必要があることから、一般的には、上記遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定することが望ましいが、上記遺伝子産物をコードするｍＲＮＡを鋳型として相補的配列を有するｃＤＮＡを調製し、ｃＤＮＡの量を測定してもよい。本発明の方法では、一般的には、上記ｍＲＮＡ又はそれを鋳型として調製されたｃＤＮＡ（これらの核酸を「遺伝子産物をコードする核酸」と呼ぶ場合がある。）との間でハイブリッドを形成可能な核酸を検出に用いることができる（本明細書において、この核酸を「プローブ核酸」と呼ぶ）。
【００２６】
プローブ核酸として利用可能な核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであってもよい。プローブ核酸の全長も特に限定されないが、例えば１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上であれば上記遺伝子産物をコードするｍＲＮＡとの間で特異的なハイブリッドを形成できる。上記遺伝子産物を効率的に検出するために、上記に説明した各アミノ酸配列の情報を利用することができ、当業者は適宜のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブ核酸として調製できる。
【００２７】
マイクロアレイの形成方法は特に限定されず、当業者が利用可能ないかなる方法を採用してもよい。例えば、固相担体表面で直接プローブ核酸を合成する方法、又は予め調製したプローブ核酸を固相担体表面に結合する方法のいずれを採用してもよい。固相担体表面で直接プローブ核酸を合成する場合には、光照射で選択的に除去される保護基を用い、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術を組み合わせて所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行なう方法が一般的である。予めプローブ核酸を調製して固相担体表面に結合する方法では、プローブ核酸の種類や固相担体の種類に応じて、スポッタ装置によりポリ陽イオン化合物やアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤などで表面処理した固相担体の表面に点着する方法、反応活性基を導入したプローブ核酸を合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該プローブ核酸を点着して該プローブ核酸を固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法などを利用できる。
【００２８】
組織からの核酸試料の調製方法は特に限定されず、当業者が利用可能な任意の方法を採用できる。組織から分離採取したｍＲＮＡを鋳型として、逆転写反応により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は塩基がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味する。）を取り込ませた標識ｃＤＮＡを調製することが好ましい。一回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量は通常は数μｇ以下である。標識方法としては放射性同位元素（ＲＩ）を用いた方法、又は非ＲＩ法（蛍光法、ビオチン法、化学発光法等）のいずれを用いてもよい。蛍光標識を行う場合の蛍光物質の種類は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば特に限定されず、例えば、シアニン系色素（市販のＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを適宜選択できる。
【００２９】
上記で調製した標識ｃＤＮＡとプローブ核酸とのハイブリッド形成は、例えば、標識ｃＤＮＡを含む溶液をプローブ核酸を固定した固相担体上に点着することによって行うことができる。点着の容量は特に限定されないが、通常は１〜１００ｎＬ程度であり、ハイブリッド形成は室温〜７０℃の温度範囲で１〜２０時間程度行うことができる。標識ｃＤＮＡとプローブ核酸との間でハイブリッドを形成させた後、界面活性剤及び緩衝剤を含む溶液などで洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去することが好ましい。その後、標識の種類に応じてハイブリッドを形成した標識ｃＤＡＮの量を測定することにより、被験組織に含まれていた遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの量を測定することができる。以上、本発明の方法において上記遺伝子産物の発現量を測定するための例を具体的に説明したが、本発明の方法において採用可能な測定方法は上記の特定の態様に限定されることはなく、当業者が適宜の方法を採用可能であることは言うまでもない。
【００３０】
このようにして測定された病変組織における遺伝子産物の発現量を正常組織における遺伝子産物の発現量と比較することにより、ケロイド陽性であるか否かを判定することができる。
例えば、被検試料中のファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定し、測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上である場合にケロイド陽性であると判定することができ、好ましくは被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１およびＯ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定し、測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の８倍以上である場合にケロイド陽性であると判定することができる。
【００３１】
また、被検試料中のジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の発現量を測定し、測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下である場合にケロイド陽性であると判定することができ、好ましくは被検試料中のペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の発現量を測定し、かつ被検試料中のジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の発現量を測定し、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、測定した少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であり、かつ、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下である場合にケロイド陽性であると判定することができる。
【００３２】
本発明の診断キットは上記の原理を利用してケロイドか否かを判定するための診断用キットであり、その代表例としては、例えば、
ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット；
ペリオスチン、ファイブロネクチン１およびＯ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の８倍以上であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット；
【００３３】
ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下であることを測定しケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キット；及び
ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカンおよびセリンプロテアーゼ１１からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の５倍以上であることを測定し、かつ、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および／または１５型コラーゲンアルファ１鎖の病変組織由来被検試料中の発現量が正常組織由来被検試料中の発現量の７倍以下であることを測定してケロイド陽性であると判定可能な手段を含む診断用キットを挙げることができる。
【００３４】
好ましい態様では、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物を認識する抗体を用いることができ、抗体としてはモノクローナル抗体を用いることがさらに好ましい。
【００３５】
また、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物のうち、少なくとも１つの遺伝子産物をコードする核酸にハイブリダイゼーションするプローブ核酸を用いることも好ましい。この診断キットは、マイクロアレイ法により上記のようにしてプローブ核酸を固相担体表面上に点着することにより調製することができる。
【００３６】
本発明により、ケロイドの診断、ケロイドの病変組織の拡大防止またはケロイドの治療のための物質をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、例えば、ペリオスチン、ファイブロネクチン１、Ｏ−結合型マンノースベータ１，２Ｎアセチルグリコサミニルトランスフェラーゼ、ミネカン、ルミカン、セリンプロテアーゼ１１、ジーンバンクアクセッションナンバー（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）ＢＣ０３２８３９で同定される遺伝子産物および１５型コラーゲンアルファ１鎖からなる群より選ばれる遺伝子産物またはそれらをコードする核酸のうち、少なくとも１つを用いることを特徴とする方法である。また、本発明により、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含むケロイドの診断、ケロイドの病変組織拡大防止またはケロイドの治療のための医薬が提供される。スクリーニングの結果として得られる物質には、例えば、低分子有機化合物のほか、該遺伝子産物を認識可能な中和抗体、好ましくは該遺伝子産物を特異的に認識可能な中和抗体であるモノクローナル抗体、上記の遺伝子産物をコードする遺伝子ＤＮＡ又はｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なアンチセンス核酸などが含まれる。
【００３７】
本発明により提供される医薬は、上記のスクリーニングにより得られた物質を有効成分として含み、ケロイドの診断、ケロイドの病変組織の拡大防止またはケロイドの治療のために有用である。本発明の医薬の投与経路は有効成分である物質の種類に応じて適宜選択できるが、注射による局所投与、外用剤による局所投与などを好適な投与経路として挙げることができる。有効成分の物質の種類によっては経口的又は非経口的な全身投与により有効性を達成できる場合もある。本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類により適宜選択できるが、一般的にはケロイド病変組織における有効濃度が上記遺伝子産物の発現を抑制可能な濃度を上回るように選択することができる。本発明の医薬の製造にあたっては、１又は２種以上の製剤用添加物を適宜選択して用いることができ、投与経路に応じた適宜の製剤形態を選択して医薬組成物を調製することができるが、このような選択は当業者が容易になしうることである。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例により限定されることはない。
例１
（Ａ）材料と方法
（ａ）組織試料とＲＮＡの調製
ケロイド病変組織及びその周囲の正常組織を外科的に７名のケロイド患者（１３歳〜７０才、男性４名、女性３名）から切除した。また、健常者１名から美容整形術中に皮膚試料を採取した。これらの組織試料を液体窒素中で急速凍結し、試験に供するまで−８０℃で保存した。全ＲＮＡを組織試料からシングルステップ法により分離した。マイクロアレイ法では全ＲＮＡからオリゴテックス−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ精製キット（タカラ）を用いてｍＲＮＡを精製した。
【００３９】
（ｂ）ノーザンブロッティング
全ＲＮＡを２．２Ｍホルムアルデヒド−１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロンフィルターに転写した。このフィルターをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（クロンテック）中で６５℃で１時間ハイブリダイズさせた。以下の３２Ｐ標識体を用いた。ヒトＨＳＰ４７、ｐｒｏα１（Ｉ）コラーゲン（Ｃ末端プロペプチドをコードする塩基番号３７３１〜４５３４のフラグメント）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）コラーゲン（ｐｒｏα１（Ｉ）コラーゲン及び他の型のコラーゲンと有意な塩基配列相同性を有しないＣ末端プロペプチドをコードする塩基番号３３８６〜４５６０のフラグメント）、及びβ−アクチンｃＤＮＡ（コントロール）。フィルターを０．１Å〜ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃（コラーゲンＩＩＩ型プローブ）又は６８℃（それ以外のプローブ）にて洗浄した。フィルターの放射能をＳＴＯＲＭ８２０システム（モレキュラーダイナミクス）で測定した。
【００４０】
（ｃ）ｃＤＮＡマイクロアレイ分析
ｃＤＮＡの分析にはＨＵＭＡＮ  Ｕｎｉ  ＧＥＭバージョン２．０アレイ（インサイト）を用いた。このアレイには配列既知の１９８２種のｃＤＮフラグメントが固定されている。このアレイを用いた場合の測定感度は１０万個の転写物のうちの１個を検出できるものであった。正常組織にはＣｙ３及びケロイド組織にはＣｙ５でラベルしたｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製し、これらを一緒に同一のアレイ上でハイブリダイズさせた。蛍光比は、感度、発現差、逆転写量、及びシグナル・バックグラウンド（比）の制御を含む全ての要素について計算し、これらの要素全部を考慮に入れてＣｙ５とＣｙ３の蛍光比である補正発現量を計算した。また、異なる患者から得た３個の独立のケロイド試料についてノーザンブロッティングを行った。
【００４１】
（Ｂ）結果
ｃＤＮＡマイクロアレイ分析により、発現量に差のある配列が多数見出された。その結果を下記表１に示す。表中、シグナル強度はＣｙ３：Ｃｙ５強度（正常組織に対してケロイド病変組織においてＸ倍）として示し、３．５倍以上の差が認められた場合に有意差ありと判定した。この結果から、ペリオスチン（クローンＮｏ．１）、ファイブロネクチン１（クローンＮｏ．２）などの発現が正常組織に対して著しく亢進していることが分かる。ノーザンブロッティングにより、これらの遺伝子産物がケロイド組織中に実際に発現しており、正常組織での発現に比べて高い濃度を与えていることも確認できた。同様にして肥厚性瘢痕組織から得られた結果を表１に示す（表中、ｈｙｐｅｒｔｒｏｆｉｃ  ｓｃａｒの欄）。
【００４２】
【表１】
2004313133.tif 000002
2004313133.tif 000003
2004313133.tif 000004
【００４３】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、従来診断が極めて困難であったケロイドと肥厚性瘢痕を簡便かつ正確に鑑別することができ、ケロイドに対して適切な治療を行うことができるようになる。