(57)【要約】【課題】  本発明は、制限エンドヌクレアーゼの産生に対する新しいアプローチを提供する。【解決手段】  この制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ及びこの制限エンドヌクレアーゼに対して宿主ＤＮＡを保護し得るメチラーゼの発現ベクターを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換することからなるこれらの酵素の過剰発現に関する新規方法を提供する。メチラーゼベクターは、制限エンドヌクレアーゼ発現ベクターと適合性である。好ましくは、発現ベクターは、T7発現ベクターであり、宿主細胞は発現ベクターを制御する第３の適合性ベクターで形質転換される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）目的の制限エンドヌクレアーゼに対して保護を提供し得るメチラーゼをコードするＤＮＡを含む中コピー数または高コピー数のベクターで宿主細胞を形質転換し；
（ｂ）段階（ａ）の宿主細胞を、当該制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターであって、且つメチラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターと適合性の発現ベクターで形質転換し；次いで
（ｃ）段階（ｂ）の宿主細胞を制限エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下で培養する
段階を包含する制限エンドヌクレアーゼを過剰発現させる方法。
【請求項２】
発現ベクターがＴ７発現ベクターであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、宿主細胞をＴ７発現ベクターの発現を制御する第３の適合性のベクターで形質転換することを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メチラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターは、低コピー数ベクターを突然変異することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、AatII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、組換えＤＮＡからのこれらの酵素の製造並びにエンドヌクレアーゼの過剰発現（overexpressing）に関する関連方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
II型制限エンドヌクレアーゼは、天然で微生物中に存在する酵素の一種である。これらを他の微生物が混ざった成分から精製すると、制限エンドヌクレアーゼは、研究室で、ＤＮＡ分子を分子クローニング及び遺伝子キャラクタリゼーション用に小さなフラグメントに切断するために使用し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ってヌクレオチドの特定の配列（制限配列）を識別し且つ結合することにより作用する。一旦結合すると、これらは、制限配列の内部またはこの一端で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を持つ。今日まで、実験された数百種の微生物種の中で特徴的な特異性を持つ150種類以上の制限エンドヌクレアーゼが、同定された。
【０００４】
微生物は、１種当たりせいぜい数種の制限エンドヌクレアーゼしか持っていない。通常、エンドヌクレアーゼは、それらが誘導された微生物にちなんで名付けられている。従って、例えば、Deinococcus radiophilus種は、DraI、DraII及びDraIIIと名付けられた３種類の制限エンドヌクレアーゼを合成する。これらの酵素は、各々配列TTTAAA、PuGGNCCPy及びCACNNNGTGを認識し且つ切断する。他方、Escherichia coli RY13は、配列GAATTCを認識するたった１種の酵素EcoRIを合成する。
【０００５】
理論に拘束されるつもりはないが、実際に制限エンドヌクレアーゼは微生物細胞の繁栄（welfare）に保護的な役割を示すと考えられている。これらのエンドヌクレアーゼは、微生物を破壊または寄生するウイルス及びプラスミド等の外来ＤＮＡ分子に感染しないようにする。これらは、認識配列が発生する度に侵入する外来ＤＮＡ分子を切断することにより耐性を付与する。切断が起きると、多くの感染遺伝子が無能になり、ＤＮＡを非特異的なエンドヌクレアーゼによりさらに分解し易くする。
【０００６】
微生物保護系の第２の成分は、修飾メチラーゼである。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼに対して相補的であり、これら自身のＤＮＡを保護し、外来の感染ＤＮＡを区別する手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同一ヌクレオチド認識配列を認識且つ結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、これらはメチル基を付加することにより配列内で１個以上のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化後、認識配列は制限エンドヌクレアーゼによってもはや結合も切断もしない。微生物細胞のＤＮＡは通常、その修飾メチラーゼの活性により完全に修飾されている。従って、内因性制限エンドヌクレアーゼの存在には、全く感受性がない。制限エンドヌクレアーゼの認識及び切断に感受性であるのは、未修飾で識別可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、現在では、遺伝子をクローニングし且つ慣用の精製技術で得られるよりももっと多量に該遺伝子によってコードされる蛋白質及び酵素を産生し得る。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する解決策は、該クローンが10−３〜10−４ぐらいの低い頻度で生じる際には、複雑な「ライブラリー」即ち「ショットガン」法により誘導したクローン集団内でこのようなクローンを識別する簡単且つ信頼性の高い方法を開発することである。好ましくは、本方法は、望ましくない多くのクローンを破壊し、望ましい希なクローンを生存させるように選択的でなければならない。
【０００８】
II型制限-修飾系は、高頻度でクローニングされている。第１のクローニング系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染が使用された［EcoRII：Kosykhら，Molec.gen.Genet 178：717-719,(1980)；HhaII：Mannら，Gene 3:97-112,(1978)；PstI：Walderら，Proc.Nat.Acad.Sci.78 1503-1507(1981)］。微生物中に制限-修飾系が存在するとバクテリアオファージによる感染に耐えられるので、クローニングした制限-修飾遺伝子を保持する細胞は、一般に、ファージに暴露されたライブラリーから残存物として選択的に単離し得る。しかしながら、この方法では、非常に少量しか得られない。特に、クローニングした制限-修飾遺伝子は、常に選択的に生存させるのに十分ファージ耐性であるとは限らないことが明らかになった。
【０００９】
もう一つのクローニングの試みとしては、大腸菌クローニングプラスミドへのプラスミド-ボーン（plasmid-borne）として最初に特徴付けられたトランスファー系を包含する［EcoRV：Bougueleretら，Nucl.Acid.Res.12:3659-3676,（1984）；PaeR7：Gingeras及びBrooks，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:402-406,（1983）；Theriault及びRoy，Gene 19:355-359（1982）；PvuII：Blumenthalら，J.Bacteriol.164:501-509,（1985）］。
【００１０】
第３の試みは、多くの系をクローニングするのに使用されており、この系は、現在活性メチラーゼ遺伝子に関する選択によりクローニングされている［本出願人の欧州特許出願公開第193,413号（1986年９月３日）及びBsuRI：Kissら，Nucl.Acid.Res.13：6403-6421,（1985）参照］。制限及び修飾遺伝子は近接して結合していることが多いため、両方の遺伝子は同時にクローニングされ得る。この選択は、完全な制限系を常に与えるとは限らないが、その代わりメチラーゼ遺伝子のみを与える［BspRI：Szomolanyiら,Gene 10:219-225,（1980）；Bcn I：Janulaitisら,Gene 20:197-204（1982）；Bsu RI：Kiss及びBaldauf,Gene 21:111-119,（1983）；及びMsp I：Walderら，J.Biol.Chem.258:1235-1241（1983）］。
【００１１】
ある系に於いては、修飾によっては通常保護されない宿主に、エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすると、クローニングに問題がある。メチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアーゼ遺伝子を共通のＤＮＡフラグメントに導入する場合、エンドヌクレアーゼ遺伝子が宿主ゲノムを切断する前に、メチラーゼ遺伝子は宿主を修飾または保護しなくてはならない。
【００１２】
大腸菌でこれらの系をクローニングするもう一つの障害が、種々のメチラーゼをクローニングする方法で知見された。多くの大腸菌株（クローニングで通常使用するものを含む）は、シトシンメチル化を含むＤＮＡの導入に耐える系を有する［Raleigh及びWilson，Proc.Natl.Acad.Sci,USA 83:9070-9074,（1986）］。従って、クローニングに使用するためには大腸菌株を注意深く考慮する必要がある。
【００１３】
外来の制限修飾系をクローニングし、大腸菌に導入する場合、大腸菌での遺伝子の転写または翻訳が不十分なため、エンドヌクレアーゼの収量は、天然のエンドヌクレアーゼ産生株と比較して非常に低いこともある。クローニングされた制限修飾系を保持する大腸菌細胞が、殆ど生長しない場合もある。これは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の不十分なメチル化保護及び未制御の構成発現（constitutive expression）によるものと考えられる。従って、よく制御された発現系は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子などの大腸菌毒性遺伝子中で発現させるのに望ましい。
【００１４】
非誘導条件下ではエンドヌクレアーゼを最小レベルで産生し、誘導時に所望のエンドヌクレアーゼを多量に産生する発現系が望ましい。このようにして外来制限修飾系は、大腸菌宿主に安定して保持され得る。
【００１５】
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは、研究室での遺伝子の特徴付けに有用な道具であり、多量にこれらの酵素を合成する組換えＤＮＡ技術により細菌株を得るための商業的誘因である。このような株は、精製を簡便化し、並びに商業的に有用な量を産生する手段を提供するため、有用である。
【００１６】
一態様に於いて、本発明は、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるための発現ベクターと、大腸菌で当該制限エンドヌクレアーゼに対してＤＮＡを保護し得るレベルにメチラーゼ遺伝子を発現し得るメチラーゼ遺伝子を発現させるための中（medium）または高（high）コピー数適合性ベクターとを含む制限エンドヌクレアーゼを過剰発現させる方法に関する。好ましい発現系は、発現ベクター（例えば、エンドヌクレアーゼ遺伝子を挿入するためのT7発現ベクター）、発現ベクターを制御する第２の適合性ベクター（例えば、その遺伝子産物がT7 ＲＮＡポリメラーゼを阻害し、T7 lacプロモーターからの基底レベルのターゲット遺伝子発現を減少させるT7 リゾチーム遺伝子を含むベクター）及びメチラーゼ遺伝子をクローニングするための第３の適合性プラスミドからなる。好ましい態様に於いて、メチラーゼ遺伝子をクローニングするための第３のプラスミドは、好ましくはコピー数を増やすためにＵＶ突然変異誘発により突然変異したコピー数変異株（copy-number mutant）である［Miller，J.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor,N.Y.1972 p.121-124］。本発明の発現系では、低レベルの構成発現を有する高レベルの誘導を可能にするので、大腸菌（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）での毒性蛋白質の発現には有用である。
【００１７】
もう一つの態様に於いて、本発明は、Acetobacter acetiから得られるAatII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼに関する遺伝子をコードする組換えＤＮＡ並びに、組換えＤＮＡからのAatII制限酵素の製造の関連方法に関する。本発明は、制限エンドヌクレアーゼAatIIを発現する形質転換宿主、ＤＮＡ配列5'-GACGTC-3'を認識し、両方のＤＮＡ鎖のＴとＣの間で切断して、3'から突き出る４個の塩基を放出する酵素にも関する［Sugisaki,Hら，Nucle.Acids Res.10:5747-5752］。本発明により産生したAatIIエンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、実施例１に記載の慣用方法により製造した制限エンドヌクレアーゼ製剤で通常知見された汚染源を含まない。
【００１８】
AatII制限-修飾系をクローニングするための好ましい方法の一つは、好適なベクターを選択し、Acetobacter Aceti由来のＤＮＡを含む幾つかのライブラリーを形成し、AatII修飾メチラーゼをコードするＤＮＡを含むこれらのクローンを単離し、ベクターを使用してメチラーゼ遺伝子に隣接する付加的染色体ＤＮＡをクローニングし、AatIIエンドヌクレアーゼを産生するこれらのクローンをスクリーニングし、クローンの上にaatIIR及びaatIIM遺伝子をマッピング（aatIIR及びaatIIMは、各々AatIIエンドヌクレアーゼ及びAatIIメチラーゼをコードする遺伝子である）し、aatIIR及びaatIIM遺伝子のＤＮＡ配列を決定し、次いで大腸菌でaatIIR及びaatIIM遺伝子を過剰発現させることからなる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、エンドヌクレアーゼ遺伝子が発現ベクターに含まれ、メチラーゼ遺伝子が発現ベクターと適合性である別個の中コピー数または高コピー数ベクター上に含まれている発現系を使用することからなる制限エンドヌクレアーゼの過剰発現方法に関する。
【００２０】
好ましい一態様としては、以下のものがある。
【００２１】
１）エンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするためのT7lacプロモーター及びColEI複製開始点を含むT7発現ベクター［Novagen Inc，Dubendorff,J.W及びStudier,F.W.,J.Mol.Biol.219：45-59,（1991）］並びに、p15A複製開始点及び、その遺伝子産物がT7 RNAポリメラーゼを阻害し且つT7プロモーターからの基底レベル（basal level）のターゲット遺伝子発現を減少させるT7 リゾチーム遺伝子を含む第２の適合性ベクター［Studier,F.W.，J.Mol.Biol.219：37-44,（1991）］。他の発現ベクター、例えば、Pｌａｃ、PｌａｃＵＶ５、Pｔａｃ及びλPＬなどのエンドヌクレアーゼ発現に使用し得るプロモーターを含むpUC19及びpBR322誘導体も使用し得る。
【００２２】
２）lac プロモーターから発現されるメチラーゼ遺伝子をクローニングするためのpSC101複製開始点を含む中コピー数クローニングベクター［Wang,R.F.及びKushner,S.R.，Gene 100：195-199,(1991)］。他の増加されたコピー数の適合性クローニングベクターは、例えば突然変異の誘発、好ましくはUV突然変異の誘発（Miller,J.,上掲）を用いて、例えば、RP4、RP1、R18、R68、RSF1010、R1162及びR300B［Kues.,U及びStahl,U,Microbiological Reviews 491-516 1989］のような低コピー数の適合性ベクターから製造し得た。
【００２３】
本発明は、AatII制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ並びに、このような組換えＤＮＡからAatII制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関する。
【００２４】
本明細書中に記載する方法により、AatII制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子は、図１に記載の如くクローニング及び発現されるのが好ましい。本方法は以下の段階を含む。
【００２５】
１．Acetobacter acetiのゲノムＤＮＡを精製する。
【００２６】
２．ＤＮＡを、無傷のAatIIメチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを産生する制限エンドヌクレアーゼ（例えば、HindIII）またはその任意のアイソシゾマーで一部消化する。あるいは、完全制限修飾系［例えば、NdeIゲノムライブラリー］を含むライブラリーを作成し得る（段階７にスキップする）。フラグメントは、クローン化可能なサイズ、即ち1.5〜14kbでなければならない。
【００２７】
３．HindIII-消化ゲノムＤＮＡをpUC19クローニングベクターに連結する。得られた混合物を使用して、好適な宿主、即ちhsdR−、mcrBC−、mrr−株、例えば大腸菌株RR1を形質転換する。ＤＮＡ/細胞混合物を、形質転換細胞用のアンピシリン選択培地にプレートする。インキュベーション後、形質転換細胞コロニーを一緒に収穫して、一次（primary）細胞ライブラリーを形成する。上記の如く、このような一次細胞ライブラリーを全部で10個を、個々のクローニングエンドヌクレアーゼによるAcetobacter aceti ＤＮＡの完全または部分消化物及び宿主株を使用することにより構築した。
【００２８】
４．組換えプラスミドを一次細胞ライブラリーからin totoで精製し、一次プラスミドライブラリーを作成する。精製したプラスミドライブラリーを、Acetobacter aceti細胞または任意のAatIIアイソシゾマーから調製されるAatIIエンドヌクレアーゼでin vitroで完全に消化する。AatIIエンドヌクレアーゼ消化により、未修飾の、非メチラーゼ含有クローンを選択的に破壊し、AatIIメチラーゼ-保持クローンの相対頻度を高める。
【００２９】
５．AatIIメチラーゼクローンの同定：消化したプラスミドライブラリーＤＮＡを宿主（例えば、大腸菌株RR1）に戻し形質転換し、形質転換したコロニーを再びアンピシリンプレートにプレートして得る。コロニーを拾い出し、そのＤＮＡをAatIIメチラーゼ遺伝子の存在に関して、精製したプラスミドDNAをin vitroでAatIIエンドヌクレアーゼとインキュベートし、AatII消化に対して耐性であるかどうかを決定することにより分析する。
【００３０】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングしたことが確認できたら、クローンをAatIIエンドヌクレアーゼ活性に関して分析する。活性が検出される場合、AatII制限遺伝子はメチラーゼ遺伝子に結合しており、そのクローン中に存在する。このような場合には、以下の段階にスキップする。しかしながら、本発明の方法では、全く制限活性は検出できなかった。制限活性の欠失は、制限遺伝子がメチラーゼ遺伝子に結合していないか、結合していてもメチラーゼ遺伝子と共に完全にクローニングされていないか、完全にクローニングされていても発現されていないか、若しくは完全系がクローニングされていてもメチラーゼ遺伝子の発現が制限エンドヌクレアーゼに対して十分に保護するのに不十分であるということ、即ち、選択から生存するクローンだけがエンドヌクレアーゼ遺伝子に於いて自然発生的突然変異若しくは欠失を起こしたということを示している。上記のどの可能性がこの場合であるかを検出するために、クローニングしたフラグメントを制限-マッピングし、クローニングフラグメント内でメチラーゼ遺伝子の相対位置がどこであるかを決定するために欠失を行う。次いで情報を使用して、結合している場合、メチラーゼ遺伝子のいずれかの側に制限遺伝子をコードするための十分なＤＮＡが存在するかどうかを検出する。十分な長さのＤＮＡがある場合、制限遺伝子は結合していないか、発現せずにクローン内に存在すると想定される（段階１０にスキップする）。クローニングしたＤＮＡのメチラーゼ遺伝子の両側に、結合した制限遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡが無い場合、本発明のHindIIIクローン、p（UC）AatIIM18に関して知見されるように、メチラーゼ遺伝子の一部を使用して、存在するクローン化ＤＮＡの境界を越えて伸長する領域のゲノムマップをサザンハイブリダイゼーションにより作成するためにAcetobacter aceti染色体の消化物を精査する。このデータは、ある種のエンドヌクレアーゼ、例えば、メチラーゼ遺伝子並びに多量の隣接ＤＮＡを保持する個々のフラグメントに制限-修飾領域を切断するNdeIの同定に役立つ。このようなエンドヌクレアーゼにより生成したフラグメントの正確なサイズは、同様にデータから計算される。制限及び修飾遺伝子が結合していることが知見される場合、このようなフラグメントは制限遺伝子もコードするだろう。
【００３１】
７．豊富なライブラリーを、NdeIでAcetobacter aceti ＤＮＡを消化し、次いで生成したフラグメントを例えばpUC19などの好適なベクターに連結することにより構築する。ＤＮＡ、メチラーゼ遺伝子並びに隣接領域を保持するクローンを、メチラーゼ選択により単離する［欧州特許出願公開第193,413号（1986年9月3日）及びBsuRI:Kissら,Nucl.Acid.Res.13:6403-6421,（1985）］。
【００３２】
８．制限遺伝子クローンの同定：メチラーゼ選択及び形質転換後、アンピシリン耐性形質転換細胞を、存在するメチラーゼクローンの境界を越えて伸長するＤＮＡ挿入物に関してスクリーニングする。このようなクローンを同定したら、粗な細胞抽出物をこれらのクローンから調製し、細胞抽出物を連続希釈し、次いでAatIIエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイする。aatIIM及びaatIIR遺伝子の両方を保持するクローンを、これらの細胞抽出物のAatIIエンドヌクレアーゼ活性アッセイ及びAatIIエンドヌクレアーゼ切断に対するベクターバックボーン（backbone）耐性を与える活性により同定する。
【００３３】
９．aatIIR及びaatIIM遺伝子を含む領域を、欠失マッピングによりマップ化し、サブクローンし、ジデオキシヌクレオチド終止法によりＤＮＡ配列を決定した［Sanger,F.,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.,1977,74：5463-5467］。
【００３４】
１０．過剰発現：本発明のもう一つの好ましい態様によると、AatII制限エンドヌクレアーゼ及び/または他の制限エンドヌクレアーゼに関する好ましい一つのアプローチとしては、以下のものが挙げられる。
【００３５】
１）例えば、pSC101複製開始点を含む増加コピー数の変異株を構築し、aatIIM遺伝子または他のメチラーゼ遺伝子を上記で作成した中コピー数のプラスミドにクローニングして、大腸菌宿主を予備修飾且つ保護する。aatIIM遺伝子（または他のメチラーゼ遺伝子）をlacプロモーターから発現する。
【００３６】
２）aatIIRに関しては、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現ベクター［例えば、pSYX22（pSYX22の構築に関しては実施例１に詳細を説明する）］上のT7 lacプロモーターの下流に挿入し得る。これは、ポリメラーゼ連鎖反応によりエンドヌクレアーゼ遺伝子を増幅するためのプライマー中に制限部位を組み込む（Saiki,R.K.ら。Science 230:1350-1354）か、または特定部位の突然変異誘発によりエンドヌクレアーゼ遺伝子の始めと終わりに制限部位を組み込む［Kunkel,T.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492．（1985）］ことにより実施し得る。さらに、強力なリボソーム結合部位［Shine＆Dalgarno,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71,1342-1346（1974）］を遺伝子の前に配置して、翻訳効率を高め得る。エンドヌクレアーゼ発現に使用し得る他のプロモーターとしては、pUC19及びpBR322誘導体上のPｌａｃ、PｌａｃＵＶ５、Pｔａｃ、PＲ、T3及びλPLが挙げられる。しかし、これらのプロモーターは、非誘発条件下では厳格に抑制されないので、低い誘発率を与える。
【００３７】
aatIIR及びaarIIM遺伝子のＤＮＡ配列は、大腸菌でより効率良く使用されるコドンを使用する慣用のホスホアミダイト（phosphoramidite）またはホスホトリエステル（phosphotriester）化学により合成し得る［Applied Biosystems user bulletins #13,1988；Usman,Nら,J．Am．Chem．Soc.，109:7845-7854,1987］。
【００３８】
１１．AatII産生及び精製：AatIIメチラーゼまたはエンドヌクレアーゼは、抗生物質（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール及びカナマイシン）を含む富裕培地中、発酵器で増殖することにより、AatIIメチラーゼ遺伝子（または異種メチラーゼ）及び過剰発現制限エンドヌクレアーゼを保持するクローンから産生し得る。その後、細胞を遠心分離して収穫し、超音波処理して破壊して、AatIIメチラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗な細胞抽出物を得る。AatIIメチラーゼ及びエンドヌクレアーゼを含む粗な細胞抽出物を、標準蛋白質精製技術（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィー）により精製する。
【００３９】
上記概略の段階は本発明を実施するための好ましい態様であるが、上記のアプローチは、当業界で公知の技術に従って改変し得ることは当業者には公知である。
【００４０】
以下の実施例は、実施するのに好ましい本発明の態様を説明するものである。この実施例は単なる説明であり、特許請求の範囲に示されるものを除いて、本発明は実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００４１】
１．AatII制限及び修飾系のクローニング：まずaatIIM遺伝子を、AatIIエンドヌクレアーゼでプラスミドライブラリーをチャレンジすることによるメチラーゼ選択を使用してHindIIIフラグメントにクローニングし、次いで形質転換後の生存物を探した。後に、aatIIR遺伝子のほんの一部がこのHindIII挿入物中に存在することが知見された。Acetobacter acetiゲノムＤＮＡの制限マッピングにより、NdeIフラグメントは、aatIIR遺伝子の隣のＤＮＡの一端を伸長すべきであることが示された。AatII制限-修飾系、aatIIR及びaatIIM遺伝子を、メチラーゼ選択法によりpUC19ベクター中のNdeI制限フラグメントにクローニングした。このクローンをp（UC）AatIIR＋M＋18と名付けた。これは、湿潤大腸菌細胞１グラム当たりAatIIエンドヌクレアーゼ200単位を作る。p（UC）AatIIR＋M＋21は、同一NdeI挿入物を含んでいたが、反対方向であった。
【００４２】
２．aatIIM及びaatIIR遺伝子の制限マッピング：aatIIM及びaatIIR遺伝子を以下のようにマッピングした。5500-bp NdeIフラグメント挿入物には２個のXbaI部位（約300bp離れている）があり、pUC19の多重クローニング部位には１個のXbaI部位がある。２個のXbaI制限フラグメントを欠失するXbaIフラグメント欠失サブクローン（約1000bpの欠失）を構築した。p（UC）AatIIR＋M＋18 ２μgを、１×制限緩衝液（50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl２，１mM ジチオスレイトール）50μl中、37℃で１時間、XbaI 20単位で消化した。消化したＤＮＡをフェノール-CHCl３及びCHCl３の等容量で抽出し、エタノールで沈澱させて乾燥した。得られたＤＮＡ0.2μgを、１×連結緩衝液（50mM Tris-HCl,10mM MgCl２,10mM ジチオスレイトール、ウシ血清アルブミンの1mM ATP 25μg/ml）50μl中、16℃で一晩、T4 ＤＮＡリガーゼで連結した。連結したＤＮＡに、滅菌-蒸留水を等量添加して希釈した。希釈したＤＮＡ10μlを、ER1821 △（hsd-mrr-mcrBC）コンピテント細胞0.1mlと混合し、４℃で30分間、42℃で3分間インキュベートした。LB培地0.1mlを添加して、37℃で1時間インキュベートした後、細胞/ＤＮＡ混合物をLB寒天プレート＋アンピシリン（Ap）50μg/ml上にプレートし、37℃で一晩インキュベートした。12個の個々のアンピシリン耐性（Apｒ）形質転換細胞を拾いだし、LB＋Ap ２ml中に接種し、37℃で一晩振蕩した。各細胞1.5mlを、1.5mlエッペンドルフ管中で遠心分離し、Birnboim及びDolyの方法により改造したミニプレパレーション方法によりプラスミドDNAを作成した［Nucleic Acids Res.7:1513-1523（1979）］。
【００４３】
プラスミドミニプレパレーション法：一晩培養した培地1.5mlを、6,000×ｇで３分間ペレット化した。上清を捨て、細胞ペレットを25mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM EDTA、50mM グルコース、20μg/ml RNaseAの0.2ml中に再懸濁させた。室温で５分後、0.2M NaOH、1% SDSの0.2mlを添加し、細胞を溶解させるために管を逆さにした。室温で５分後、3M 酢酸ナトリウム（pH4.8）0.15mlを添加し、逆さにして十分に混合した。形成した沈澱を12,000×g、４℃で10分間遠心分離した。上清を除去し、等容量のフェノール/クロロホルム（1:1）で抽出した。層を、12,000×gで5分間遠心分離することにより分離した。上層を新しい遠心分離管に取り出し、等容量のクロロホルムで抽出した。ＤＮＡを95% エタノール0.9mlと混合した。管を12,000×gで10分間回転させ、沈澱した核酸をペレット化した。上清を捨て、ペレットを再び70% エタノール1mlで洗浄し、再ペレット化し、15分間真空下で乾燥した。一旦乾燥させたら、ペレットはTE緩衝液（10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0）100μl中に再懸濁させた。
【００４４】
12個のプラスミドＤＮＡをXbaIエンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動により分析し、XbaI欠失を確認した。これら総ては正しいサイズの欠失を含んでいた。XbaI欠失クローン、即ちp（UC）AatIIM＋（XbaI△）は、AatIIエンドヌクレアーゼでチャレンジしてもプラスミドＤＮＡがAatII開裂に対して耐性であることから、まだ無傷のaatIIM遺伝子を含んでいた。さらにaatIIM遺伝子のサイズを小さくするために、Eco0109IフラグメントをベクターのEco0109I部位と残りの挿入物のEco0109I部位の間で欠失した。この欠失は、Eco0109I末端がまず大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて充填され、次いで自己連結された以外にはXbaI欠失と同一方法で構築した。得られたEco0109I欠失クローンは、AatIIエンドヌクレアーゼ消化に対して一部耐性であり、aatIIM遺伝子がまだクローン中に含まれていることを示している。XbaI欠失クローン及びEco0109I欠失クローンは、約1800bpのＤＮＡフラグメント内にaatIIMを規定した。XbaI欠失クローンを、これが無傷のaatIIR遺伝子を含んでいるかどうかに関してAatIIエンドヌクレアーゼ活性に関してもアッセイした。粗な細胞抽出物を以下のようにして調製した。LB＋Ap 200mlを細胞２mlと一晩接種し、37℃で一晩振蕩した。細胞を遠心分離し、細胞ペレットを超音波緩衝液（10mM Tris-HCl,10mM β-メルカプトエタノール）20ml中に再懸濁させ、30秒間10回超音波処理し、15000×gで30分間遠心分離して、細胞片を分離した。細胞抽出物1μl、２μl、４μl及び８μlを、１×AatII制限緩衝液（50mM 酢酸カリウム、20mM Tris酢酸塩、10mM 酢酸マグネシウム、1mM ジチオスレイトール）30μl中で37℃１時間、λＤＮＡ 1μgと一緒にインキュベートした。停止溶液３mlを添加し、ＤＮＡをアガロース電気泳動により分析した。XbaI欠失クローン中にはAatIIエンドヌクレアーゼ活性は検出されず、エンドヌクレアーゼ遺伝子の一部が欠失したことを示していた。
【００４５】
aatIIR遺伝子の境界をマッピングするために、aatIIM遺伝子をまずＰｔａｃ及び多重クローニング部位を含むベクターpR976、即ちpACYC184誘導体（Paul Riggs，New England Biolabs，Beverly，MAにより構築されたもの）にクローニングした。aatIIM遺伝子を含む3000bp PstIフラグメントをpR976のPstI部位に挿入した。得られたプラスミド、即ちpR976AatIIM＋を、大腸菌株ER1821△（hsd-mrr-mcrBC）に形質転換した。欠失サブクローンを予備修飾したER1821［p（R976）AatIIM＋］に形質転換し、無傷のaatIIR遺伝子を含むかどうかを見た。
【００４６】
p（UC）AatIIR＋M＋18にはHincII部位が２個、ベクターの多重クローニング部位に１個及び挿入物にもう１個ある。HincII欠失、則ち約4500bpの欠失は、XbaI欠失クローンと同一方法で構築した。このプラスミドをER1821［p（R976）AatIIM＋］細胞に形質転換し、細胞抽出物を形質転換細胞から調製したが、AatIIエンドヌクレアーゼ活性は検出されなかった。もう１つの欠失クローンは、約4200bpのＤＮＡを欠失したEcoRV/SmaIフラグメント欠失を含んでいる。この欠失クローンは、粗な細胞抽出物中にAatIIエンドヌクレアーゼ活性を示す。これらの結果から、aatIIR遺伝子は、約1300bpのＤＮＡフラグメント内にあることが解った。
【００４７】
３．aatIIM及びaatIIR遺伝子のＤＮＡ配列分析：aatIIM及びaatIIR遺伝子の両方を含むＤＮＡ領域を配列決定するために、さらに４つの欠失サブクローン（BamHIフラグメント欠失、EcoRIフラグメント欠失、HindIIIフラグメント欠失及びPstIフラグメント欠失）を個々のエンドヌクレアーゼ開裂及び自己連結によりXbaIフラグメント欠失で実施したのと同一方法で構築した。全部で3365bpのＤＮＡを、Sangerのジデオキシ-終止配列決定方法により両方の鎖上で配列決定した［Sanger,Fら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463-5467］。２個の大きな読み取り枠、則ち各々996bp及び1038bpは、aatIIM及びaatIIR遺伝子がマッピングされる領域に知見された。プラスミド中で996bp読み取り枠をサブクローニングすると、AatII部位修飾を示し、この読み取り枠をaatIIM遺伝子と帰属した（図２）。aatIIM遺伝子から予想されたアミノ酸配列から、これがN-6アデニンメチラーゼに関する保存されたモチーフ（モチーフDPPY及びDPF-GSG-T）を含むことが解った。プラスミド中で1038bp読み取り枠をサブクローニングし、AatIIメチラーゼ-修飾細胞を形質転換すると、粗な細胞抽出物中にAatIIエンドヌクレアーゼ活性が見られた。従って、この読み取り枠を、aatIIR遺伝子と帰属した（図３）。
【００４８】
４．大腸菌でのaatIIR遺伝子の過剰発現：
Ａ．λPＬプロモーター下でのaatIIM及びaatIIR遺伝子の過剰発現：aatIIM及びaatIIR遺伝子の両方を含むBspEI/NdeI ＤＮＡを、発現ベクターpDNEV5、則ちλPＬプロモーター及びλ温度-感受性リプレッサ−遺伝子cI８５７を含むpUC19誘導体（Donald Nwankwo,New England Biolabs，Beverly,MAにより構築されたpDNEV5）にクローニングした。得られたプラスミドをp（DNEV5）AatIIR＋M＋と名付けた。ER1821［p（DNEV5）AatIIR＋M＋］細胞は、43℃で一晩インキュベーション後に湿潤細胞１g当たりAatIIエンドヌクレアーゼを40,000単位製造した。収率は、天然のAcetobacter aceti株の20倍以上であった。しかしながら、この過剰産生株は不安定である。これは、100リットル発酵器中で殆ど生長せず、幾つかの細胞は培地で溶解した。従って、より安定なクローンの構築を試みた。
【００４９】
Ｂ．Pｔａｃプロモーター下でのaatIIR遺伝子の発現：AatIIエンドヌクレアーゼ産生クローンを安定化させるために、PstI/NdeIフラグメント中に含まれていたaatIIM遺伝子をpUC19にサブクローニングした。得られたプラスミド、則ちp（UC）AatIIM＋（PstI/NdeI）の４つのAatII部位を、AatIIメチラーゼにより完全に修飾した。aatIIR遺伝子を保持するEcoRI制限フラグメントを、Pｔａｃプロモーター及びLacリプレッサ制御下で、適合性発現プラスミドpR976にクローニングした。大腸菌細胞ER2267［p（UC）AatIIM＋（PstI/NdeI）、p（R976）-AatIIR＋（EcoRI/EcoRI）］を１リットル細胞培地中0.5mM IPTGを添加することにより誘発すると、AatIIエンドヌクレアーゼの収率は、湿潤細胞１g当たり10,000単位であり、天然のAcetobacter aceti株の５倍の過剰発現であった。しかしながら、培地を100リットルの発酵器にスケールアップすると、収率は湿潤細胞１g当たり2000単位に減少した。スケールアップに失敗した原因は解らない。
【００５０】
Ｃ．発現ベクターpRRS上でのPｌａｃＵＶ５プロモーター下でのaatIIR遺伝子の発現：
１）aatIIM遺伝子のpWSK129へのクローニング
プラスミドpWSK129は、pUC19及びpBR322誘導ベクター上に保持したColEIオリジンと適合性であるpSC101複製開始点並びにカナマイシン耐性（Kanｒ）遺伝子を含む低コピー数のプラスミドである［Wang R.F.及びKushner,S.R.Gene，100:195-199,1991］。プラスミドpWSK129も、T7及びT3 ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによりフランキングされた多重クローニング部位を含む。aatIIM遺伝子は、２個のプライマー（プライマー１は、5'末端付近にBamHI部位を有する：5' CGG GAT CCG GAG GAA TAA AAT GAC CGC TCG TCC 3'，SEQ ID：1，プライマー２は、5'末端付近にPstI部位を含む：5' CCT TAA CTG CAG TCA TTT GTT GAT ATC CAG AG 3'，SEQ ID：2）を使用してp（UC）AatIIR＋M＋21からPCRにより増幅した。このPCR産物を精製し、BamHI及びPstIで切断し、BamHI/PstIで消化したpWSK129に連結した。連結したＤＮＡを使用して大腸菌ER2206細胞を形質転換し、形質転換細胞をカナマイシン耐性に関して選択した。18個の個々の形質転換細胞を、ミニプレパレーションプラスミドＤＮＡ中でaatIIM挿入物に関してスクリーニングした。11個の形質転換細胞は正しいサイズの挿入物を含んでおり、得られたプラスミドをp（WSK129）AatIIM＋と名付けた。プラスミドは、AatIIの消化に対して耐性であり、AatIIメチラーゼにより十分に修飾されていることを示している。
【００５１】
２）発現ベクターpRRS2へのaatIIR遺伝子のクローニング
発現ベクターpRRSは、lacUV5プロモーター、多重クローニング配列及び多重クローニング部位の下流に正のレトロ制御（retroregulator）ステム-ループ要素を含むpUC19-誘導ベクターである［Skoglund C.M.ら，Gene，88:1-5（1990）］。pRRS誘導体、即ちpRRS2を、lacUV5プロモーターに対し遠位のEcoRI部位に充填し、次いで新しいRcoRIリンカーをプロモーター近辺のHindIII部位に挿入することにより構築した。２個のプライマーを使用してp（UC）AatIIR＋M＋21からのaatIIR遺伝子を増幅した。プライマー１は、EcoRI部位とリボソーム結合部位を含んでいた（5' CTG AAT TCG GAG GTT TAA AAT ATG AAC CCA GAC GAA GTA TTT TCA 3'，SEQ ID：3）。SalI部位をプライマー２に作成した（5' TCG AGG GTC GAC TTT AGG ATT CTG ATT GTG GGA 3'，SEQ ID：4）。aatIIR遺伝子を、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ反応により増幅した（95℃で１分間，50℃で２分間，72℃で１分間，20サイクル）。ＤＮＡ産物をフェノール-CHCl３で２回、CHCl３で２回抽出し、エタノール沈澱させた。EcoRI及びSalIで37℃で１時間制限消化後、ＤＮＡを再びフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノールで沈澱させ、乾燥させ、次いでTE緩衝液100μl中に再懸濁させた。aatIIR遺伝子をEcoRI/SalIで切断したpRRS2に連結し、ER2206［p（WSK129）AatIIM＋］/F' lacIｑ,Tn10（Tcｒ）に形質転換した。２種類のコロニーモルフォロジーが形質転換細胞中に知見され、その一方は通常のコロニーであり、他方は平坦で透明なコロニーであった。後者のコロニーは、pRRS2にaatIIR挿入物を含んでおり、10mlの小培養中にAatIIエンドヌクレアーゼを産生した。これは200mlサブカルチャー中でAatIIエンドヌクレアーゼの産生に失敗したが、これはクローンが不安定であることを示す。この不安定性は、多分、メチル化条件下では、pUC19-誘導ベクターのコピー数が細胞１個当たり400と多すぎたためと予想されたが、プラスミドを含むメチラーゼのコピー数が細胞１個当たりたったの約６〜８コピーである。他の理由としては、lacIｑ遺伝子がF'の低コピー数プラスミド上に保持されているので、非誘導条件下ではaatIIR遺伝子の発現を抑制するのに十分なLacリプレッサーが細胞中に産生しなかったことが考えられる。厳格に制御された発現系がAatII発現に必要である。
【００５２】
Ｄ．大腸菌中でaatIIM遺伝子を発現するための中コピー数のベクターの構築：安定してAatIIエンドヌクレアーゼを過剰発現させるために、増加コピー数の変異プラスミドを以下のようにpWSK129から単離した。pWSK129を保持するXL1-Blue細胞を増殖させて、LB＋カナマイシン（Kan）50μg/ml中に２×10８細胞/mlとし、細胞を回転させて10倍に濃縮し、10mM Tris-HCl、10mM MgSO４（pH7.8）の1/10倍容量に再懸濁させた。細胞を15秒間UV処理で突然変異を誘発させた（6 J/秒）。突然変異誘発した細胞を、通常のKanプレートより40倍もKanが多い２mg/mlKanプレートにプレートし、37℃で一晩インキュベートした。35個のKanｒコロニーが知見され、これを一緒にプールして、LB＋２mg/ml Kan 10mlに接種した。宿主の突然変異のため２mg/Kanで増殖し得るコロニーを除去するために、プラスミドＤＮＡを1.5mlの一晩培養物から調製し、新しい宿主ER1821に形質転換し、２mg Kan/mlプレートにプレートした。プラスミドのコピー数を評価するために、Kanｒ形質転換細胞をLB＋Kan中で生長させ、プラスミドＤＮＡを、pWSK129及びpBR322プラスミドを用いて平行的にミニプレパレーション法により等数の細胞から調製した。pWSK129 ５ml、コピー数変異体及びpBR322 ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分析した。ゲル中で臭化エチジウムで染色したＤＮＡの写真を撮った。写真のネガを、各レーンのＤＮＡの相対量を評価するためにデンシトメトリーでスキャンした。変異体１個（＃3）はプラスミドのコピー数を３倍（細胞１個当たり18〜24個）に増加させることが知見された。このプラスミドをpSYX19と名付けた。aatIIM遺伝子をpSYX19にクローニングするために、２個のプライマーを設計してaatIIM遺伝子を、第１のプライマーが上端ストランド（Watsonストランド）上のaatIIM遺伝子の開始部分にアニールし、第２のプライマーが底部ストランド（Crickストランド）上のaatIIM遺伝子の末端にアニールするようにして、aatIIM遺伝子を増幅した。プライマー１（5' CGG GAT CCG GAG GAA TAA AAT GAC CGC TCG TCC 3',SEQ ID:1）は、BamHI部位とATG開始コドンの６塩基上流の部位に結合する有効なリボソーム結合部位を含む。プライマー２（5' CCT TAA CTG CAG TCA TTT GTT GAT ATC CAG AG 3',SEQ ID:2）は、5'末端の近くにPstI部位を含む。aatIIM遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応によりVent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs,Inc.）で増幅した（95℃１分間，50℃２分間，72℃１分間，20サイクル）。ＤＮＡ産物をフェノール-CHCl３で２回、CHCl３で２回抽出し、エタノールで沈澱させた。BamHI及びPstIで、37℃で１時間制限消化した。ＤＮＡをフェノール-CHCl３及びCHCl３で再び抽出し、エタノールで沈澱させ、乾燥させ、TE緩衝液100μl中に再懸濁させた。pSYX19ベクターＤＮＡ5μgをBamHI及びPstIでも切断し、フェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液100μl中に再懸濁させた。aatIIMＤＮＡ10μl及びpSYX19ベクターＤＮＡ10μlを、全容量30μl中１×連結緩衝液中、16℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌-蒸留水70μlを添加して希釈し、ＤＮＡ10μlを使用してER1821細胞を形質転換し、Kan（50μl/ml）プレートにプレートした。18個のKanｒ形質転換細胞を1.5ml LB＋カナマイシンで一晩生長させ、プラスミドＤＮＡをこれらの一晩生長させた培養物から調製した。18個の内11個が、BamHI及びPatI制限消化による正しいサイズの挿入物を含んでいる。これ���のうち５個をAatIIエンドヌクレアーゼで消化した時、これらの５個全部のプラスミドはAatII消化に対して耐性であった。１個のプラスミドをp（SYX19）AatIIM＋と名付け、AatIIエンドヌクレアーゼの共発現（coexpression）に使用した。
【００５３】
T7lacプロモーター下での中コピー数プラスミドに於けるaatIIR遺伝子の発現：pET-llaは、T7 プロモーター（このT7プロモーター＋lacオペレーターは、T7lacプロモーターと呼ばれる）の4bp下流のlacオペレーター、lacIｑ遺伝子及びクローニングするための２個の制限部位（即ち、NdeI及びBamHI）を含むpBR322から誘導したT7発現ベクターである（Dubendorff,J.W.及びStudier,F.W.,J.Mol.Biol．219：45-59,1991）。pET-lla誘導体、即ちT7プロモーターの上流にrrnB転写ターミネーターのコピーを４個含むpAII17（William Jack at New England Biolabs,Beverly,MAにより構築されたpAII17）を構築した。T7プロモーターの上流の転写ターミネーターはさらに、ターゲット遺伝子の発現を基底レベルに減少する。BamHI部位はaatIIR遺伝子中に生じるため、ベクター上のBamHI部位を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで充填し、SalIリンカーを挿入してBamHI部位を置き換えた。このプラスミドをpSYX22と名付けた。２個のプライマーを、第１のプライマーがaatIIR遺伝子の開始部分にアニールするNdeI部位を含み、SalI部位はaatIIR遺伝子の末端に相補的である第２のプライマー中に作成されるように設計される（プライマー１：5' CAA CAT ATG AAT CCA GAC GAA GTA TTT TCA 3',SEQ ID：5；プライマー２：5' TCG AGG GTC GAC TTT AGG ATT CTG ATT GTG GGA 3',SEQ ID：6）。aatIIR遺伝子を、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼによりPCRで増幅した（95℃１分間，50℃２分間，72℃１分間，20サイクル）。PCR産物をフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、NdeI及びSalIで切断した。ＤＮＡを再びフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、次いでTE緩衝液100μl中に再懸濁させることにより精製した。aatIIR ＤＮＡ10μlをNdeI/SalIで処理したpSYX22 0.5μgに、16℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌-蒸留水70μlを添加して希釈して、このうち10μlを使用してBL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［p（SYX19）AatIIM＋,Kanｒ；pLysS,Cmｒ］を形質転換し、LB寒天＋Ap（50μg/ml）、Cm（30μg/ml）、Kan（50μg/ml）上にプレートした。プラスミドpLysSは、T7 ＲＮＡポリメラーゼを阻害してT7lacプロモーターからの基底レベルのターゲット遺伝子の発現を減少させるファージT7リゾチームをコードする（Studier,F.W.，J.Mol.Biol.219：37-44，1991）。プラスミドＤＮＡは、12個の個々の形質転換細胞の1.5ml培養物から調製し、aatIIR ＤＮＡ挿入物に関して分析した。４個のプラスミドは正しいサイズの挿入物を含んでいる。１個のクローン、即ちp（SYX22）AatIIR＋を以下の如くAatIIエンドヌクレアーゼ活性に関して試験した。200mlの富裕なブロス培地＋Ap（50μg/ml）、Cm（30μg/ml）、Kan（50μg/ml）を２ml、細胞に一晩接種し、37℃で振蕩してKlett 100の細胞密度とした（中間対数増殖期；（midlog phase））。IPTGインデューサーを培養物に添加して、終濃度0.5mMとした。細胞を２時間誘発し、Klett 175で収穫した。細胞を４℃、5000×gで15分間遠心分離してペレット化し、20ml超音波緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.8，10mM β-メルカプトエタノール）20ml中に再懸濁させ、氷上で30秒間で10回超音波処理した。細胞破砕片を４℃15000×gで30秒間遠心分離することにより除去した。上清を新しい管に移し、超音波緩衝液中10１、10２、10３及び10４倍に希釈し、希釈した抽出物２μlを使用して、全容量30μlの１×AatII制限緩衝液中HindIII-直線化pUC19 1μgを切断した。pUC19には単一AatII部位があった。HindIII-���線化pUC19をAatIIエンドヌクレアーゼで切断すると、２個のフラグメント、即ちサイズ516bp及び2170bpができた。37℃で１時間後、反応を停止溶液３μlを添加して停止し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。100倍に希釈した細胞抽出物を用いて完全な消化が達成されたことが知見された。このクローンは湿潤細胞１g当たりAatIIエンドヌクレアーゼを10６単位作成すると評価された。AatIIの１単位は、50μlの反応液中、37℃で１時間λＤＮＡ１μgを完全に消化する酵素量である。
【００５４】
５．安定性試験：BL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［p（SYX22）AatIIR＋，p（SYX19）AatIIM＋，pLysS］細胞を25%グリセロール中、−70℃で一晩凍結した。細胞を凍結ストックからLB寒天＋Ap、Cm及びKan上に画線培養し、単一コロニーを得た。500mlの富裕なブロス＋抗生物質を、単一コロニーに接種し、一晩振蕩した。コロニー形成単位を、富裕な寒天プレートまたは、Ap、Cm及びKanを補った富裕な寒天プレート上で一晩培養した培養物から決定した。過剰産生株は両方のプレート上で同一プレート率を有することが知見された（1.5×10９コロニー形成単位/ml）。一晩培養した培養物5mlを、500mlの新しい、富裕なブロス＋抗生物質に接種し、Klett単位が100になるまで生長させた。培養物にIPTGを0.5mMまで添加して誘発し、37℃でインキュベーションを継続した。細胞を遠心分離により収穫した。細胞抽出物を調製し、AatIIエンドヌクレアーゼ活性を直線化したpUC19 ＤＮＡ上で決定した。少なくとも10６単位のAatIIエンドヌクレアーゼ/湿潤細胞gが検出された。
【００５５】
６．AatII過剰産生株（NEB ＃725）由来のAatII制限エンドヌクレアーゼの精製（Americn Type Culture Collectionに1992年7月7日に寄託し、受託番号＃ を受けた）：富裕なブロス培地２リットルに50μg/ml Ap、30μg/ml Cm及び50μg/ml Kanを足したものを、AatII過剰産生プラスミドp（SYX22）AatIIR＋、p（SYX19）AatIIM＋及びpLysSを保持するBL21細胞を20mlと一晩インキュベートした。細胞をmid-log phase（Klett単位100）まで37℃で生長させた。IPTGインデューサーを培養物に添加し、終濃度0.5mMとし、２時間インキュベーションを継続した。細胞を４℃で5000×g,20分間遠心分離し、細胞ペレットを超音波緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.8，10mM β-メルカプトエタノール）80ml中に再懸濁させ、超音波処理した。以下の精製方法を４℃で実施した。抽出物を15000×gで30分間遠心分離し、上清をDEAEセファロースカラム（1.5×15cm）に載置した。塩勾配液0〜１M NaClを適用し、画分を収集し、AatIIエンドヌクレアーゼ活性に関してアッセイした。AatIIエンドヌクレアーゼを含む画分をプールし、75mM NaCl、10mM KPO４（pH7）、1mM DTT、1mM EDTAを含む緩衝液で透析した。酵素混合物をヘパリンセファロースカラム（1.5×15cm）に載置し、NaCl 0〜1Mの勾配液で蛋白質を溶離した。AatIIエンドヌクレアーゼを含む画分を同様にプールし、0.15M NaCl緩衝液に対して透析した。溶液を1.5×15cmのホスホセルロースカラムに載置し、NaClの0.15M〜1Mの勾配液を適用した。AatIIエンドヌクレアーゼを含む画分をプールし、貯蔵緩衝液（50%グリセロール，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH7.4，0.1mM EDTA，1mM DTT及び200μg/ml BSA）に対して透析した。最終収量は、細胞９gからAatIIエンドヌクレアーゼが10６単位であった（240,000単位AatII/ml）。酵素を10倍に希釈して24,000単位/mlとし、希釈した酵素２μl〜10μlをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。IPTG-誘導及び未誘導細胞抽出物も同一ゲルに載置した。図４に示された結果から、精製したAatIIエンドヌクレアーゼ蛋白質は少なくとも90%の純度であったことが解った（注：68,000ダルトンウシ血清アルブミンは汚染蛋白質ではなかった。これはAatIIエンドヌクレアーゼを安定化するためにAatII酵素製剤に添加した。）。
【００５６】
この精製法から得られたAatII制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋で非特異的エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。AatII制限エンドヌクレアーゼ製剤の純度を以下の基準に従ってチェックした。
【００５７】
１）連結：λＤＮＡの10倍過剰消化後、生成したＤＮＡフラグメントの90%以上をT4 ＤＮＡリガーゼで連結した。連結したフラグメントの95%は、AatIIで再切断可能であった。
【００５８】
２）長時間の消化：λＤＮＡ１μg及び酵素72単位を含む反応液50μlを16時間インキュベーション後、酵素１単位で１時間実施した反応と同一のＤＮＡバンドパターンが生じた。
【００５９】
３）エキソヌクレアーゼ活性：１μgの超音波処理した３Ｈ ＤＮＡ（10５cpm/μg）を含む50μl反応液中酵素72単位と37℃で４時間インキュベーション後、0.01%未満の放射能が放出された。試験は総て以下の緩衝液（50mM 酢酸カリウム，20mM Tris-酢酸塩，10mM 酢酸マグネシウム，1mM ジチオスレイトール）中で実施した。
【実施例２】
【００６０】
大腸菌に於けるNlaIIIエンドヌクレアーゼの過剰発現：NlaIIIメチラーゼ遺伝子（nlaIIIM）及びNlaIIIエンドヌクレアーゼ遺伝子（nlaIIIR）をクローニングし（欧州特許出願公開第477,532号，1992年４月１日）、次いで配列決定した。NlaIIIクローニング及びクローンからのNlaIIIエンドヌクレアーゼの産生法に関する特許出願は為されている（特許出願番号第07/575,285号）。以下に本出願人は、本発明の発現系を使用する大腸菌に於けるNlaIIIエンドヌクレアーゼの過剰発現方法について記載する。
【００６１】
構成発現ベクターを構築するために、lacZa遺伝子を含むBssHII制限フラグメントをpSYX19から欠失し、テトラサイクリン耐性（Tcｒ）遺伝子を保持するSspI/PvuII制限フラグメントを残りのＤＮＡと連結した。得られたプラスミドpSYX20は、Kanｒ遺伝子及びTcｒ遺伝子の両方を含んでいた。これをAmerican Type Culture Collectionに1992年７月７日に寄託し、受託番号＃ を受けた。ＤＮＡをTcｒ遺伝子にクローニングするとこれを不活化し、挿入物を検出するのに容易なスクリーニング方法を提供する。単一のEcoRV、BamHI、SalI及びSphI制限部位は、Tcｒ遺伝子にクローニングするのに都合の良い部位である。挿入された外来遺伝子は、Tcプロモーターから構成的に発現され得る。
【００６２】
１．nlaIIIM遺伝子のpSYX20ベクターへのクローニング：プラスミドpSYX20は、Kanｒ及びTcｒ遺伝子並びにpSC101複製開始点を保持する中コピー数プラスミドである。Tcｒ遺伝子に挿入されたnlaIIIM遺伝子は、Tcプロモーターから構成的に発現され得る。２個のプライマーを使用してp（UC）NlaIIIR＋M＋からnlaIIIM遺伝子を増幅した。プライマー１は、5'末端の近くにBamHI部位及びATG開始コドンの7bp上流に効率のよいリボソーム結合部位を含んでいる（5' CGG GAT CCG GAG GTT AAT TAA ATG AAC TAC ATC GGC TCC AAA CTA 3'，SEQ ID：7）。プライマー２は、5'末端の近くにSalI部位を有する（5' CAA GTC GAC TTA AAA GGT CTT TTC TAA AAT ATG 3'，SEQ ID：8）。nlaIIIM遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応によりVent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼで増幅した（95℃1分間、50℃2分間、72℃1分間、20サイクル）。PCR産物をフェノール-CHCl３で２回、CHCl３で２回抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液100μlで再懸濁させた。BamHI及びSalIで37℃1時間制限消化させた後、ＤＮＡを再びフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、乾燥し、TE緩衝液100μlに再懸濁させた。pSYX20ベクターＤＮＡ5μgをBamHI及びSalIで切断し、フェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液100μl中に再懸濁させた。nlaIIIMＤＮＡ10μl及びpSYX20ベクターＤＮＡ10μlを、全容量30μl中で１×連結緩衝液中16℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌-蒸留水70μlを添加して希釈し、ＤＮＡ10μlを使用してER1821細胞を形質転換し、Kan（50μg/ml）プレートにプレートした。18個のKanｒ形質転換細胞を1.5mlLB＋Kanで一晩生長させ、プラスミドＤＮＡを製造し、BamHI及びSalI制限消化により分析した。４個のクローンが正しいサイズの挿入物を含んでいた。これらをNlaIIIエンドヌクレアーゼでチャレンジすると、４個全部のプラスミドはNlaIIIの消化に対して耐性であり、NlaIIIメチラーゼによる完全な修飾を示した。１個のプラスミドをp（SYX20）NlaIIIM＋と名付け、BL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［pLysS］細胞を形質転換するのに使用し、LB寒天プレート＋30μg/ml Cm、50μg/ml Kanにプレートした。Cmｒ及びKanｒ形質転換細胞が得られ、NlaIIIエンドヌクレアーゼの発現用宿主として後で使用した。
【００６３】
２．発現ベクターpSYX22へのnlaIIIR遺伝子のクローニング：発現ベクターpSYX22は、T7lacプロモーター、lacIｑ遺伝子、翻訳融合クローニング用の２個の制限部位（NdeI及びSalI）を含んでいる。pSYX22の構築は実施例１に記載した。２個のプライマーを、第１のプライマーがnlaIIIR遺伝子の開始部分にアニールされているNdeI部位を含み、SalI部位がnlaIIIR遺伝子の末端に相補的である第２のプライマーに作成されるように設計した（プライマー１：5' TTG CAT ATG AAA ATC ACA AAA ACA GAA CTA 3'，SEQ ID：9，プライマー２：5' CGA GTC GAC TCA TCC GTT ATC TTC TTC ATA TAA 3'，SEQ ID：10）。nlaIIIR遺伝子を、Vent（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用してPCRでp（UC）NlaIIIR＋M＋から増幅した（95℃で1分、50℃で2分、72で1分、20サイクル）。PCR産物をフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、NdeI及びSalIで切断した。ＤＮＡを再びフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液100μl中に再懸濁させた。nlaIIIRＤＮＡ10μgを、NdeI/SalIで処理したpSYX22 0.5μgに16℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを滅菌-蒸留水70μlを添加して希釈し、その10μlを使用して、大腸菌株ER2267 recA1 △（hsd-mrr-mcrBC）を形質転換し、Apプレートにプレートした。48個の個々の形質転換細胞を2ml LB＋Apに接種し、37℃で一晩振蕩した。プラスミドＤＮＡを製造し、NdeI及びSalI制限消化により分析した。プラスミドは、正しいサイズの挿入物を含んでいた。１個のクローンp（SYX22）NlaIIIR＋（＃4）を使用して、BL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［p（SYX20）NlaIIIM＋,pLysS］を形質転換し、LB寒天＋Ap（50μg/ml）、Cm（30μg/ml）、Kan（50μg/ml）上で形質転換細胞を選択した。プラスミドpLysSは、T7 ＲＮＡポリメラーゼを阻害してT7lacプロモーターからの基底レベルのターゲット遺伝子の発現を減少させるファージT7リゾチームをコードする（Studier,F.W.，J.Mol.Biol.219：37-44，1991）。大腸菌株BL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［p（SYX22）NlaIIIR＋,p（SYX20）NlaIIIM＋,pLysS］を以下のようにNlaIIIエンドヌクレアーゼ産生に関して試験した。富裕なブロス培地200ml＋Ap（50μg/ml）、Cm（30μg/ml）、Kan（50μg/ml）に細胞２mlを一晩接種し、Klett 75の細胞密度に到達するまで37℃で振蕩した。IPTGインデューサーを培地に添加し、終濃度0.5mMとした。細胞を２時間誘導し、Klett 175で収穫した。細胞を、4℃、5000×gで15分間遠心分離することによりペレット化し、超音波緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.8，10mM β-メルカプトエタノール）20mlに再懸濁させ、30秒間10回氷上で超音波にかけた。細胞片を４℃15000×gで30分間遠心分離して除去した。上清を新しい管に移し、超音波緩衝液中10１、10２、10３及び10４倍に希釈し、希釈した抽出物５μlを使用して、全容量30μlの１×NlaIII制限緩衝液中λＤＮＡ 1μgを切断した。37℃で１時間消化後、停止溶液３μlを添加して反応を停止し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを分析した。細胞抽出物10３倍希釈で完全に消化できたことが知見された。このクローンは湿潤細胞１g当たりNlaIIIエンドヌクレアーゼ２×10６単位を生成した。非誘導条件下で生長時にNlaIII過剰産生株をNlaIIIエンドヌクレアーゼ産生に関して分析すると、細胞抽出物は、湿潤未誘発細胞１g当たりたったの1000単位しか含んでいなかった。従って、誘導比は2000倍である。高レベルの誘発及び低基底レベル発現を特徴とする本発明の発現系は、例えば��腸菌に於ける制限エンドヌクレアーゼ遺伝子などの毒性遺伝子の発現に対して非常に有用な発現系である。
【００６４】
３．NlaIIIエンドヌクレアーゼの精製：１リットルの培養物からの細胞約５gを超音波緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.8，10mM β-メルカプトエタノール）75mlに再懸濁させ、超音波処理した。細胞片を15000×gで30分間遠心分離して除去し、10% グリセロールを添加して、上清を−70℃で凍結した。融解時、KClを添加して終濃度0.2Mとし、細胞抽出物をホスホセルロースカラム（2.5×７cm）に載置した。次いで、塩勾配液（0.2M〜2M KCl）を適用し、画分を収集して、NlaIIIエンドヌクレアーゼ活性に関して分析した。NlaIII活性を有するこれらの画分をプールした。BSA 200μg/mlを添加後、これらを緩衝液（10mM KPO４，pH7，10mM β-メルカプトエタノール，0.1mM EDTA，0.3M NaCl，10% グリセロール）で平衡化させたヒドロキシアパタイトカラムに載置した。酵素をホスフェート勾配液10mM〜0.7 KPO４で溶離した。NlaIIIエンドヌクレアーゼを含む画分をプールし、緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.6，10mM β-メルカプトエタノール，0.1mM EDTA，50mM NaCl及び10% グリセロール）で透析した。BSA 200μg/mlをプールしておいた酵素に再び添加して、これをDEAEセファロースカラム（2.5×4.5cm）に適用した。酵素を流し、ヒドロキシアパタイトカラムにすぐに適用した。酵素をホスホネート勾配液10mM〜0.7M KPO４で溶離した。NlaIIIエンドヌクレアーゼを有する画分をプールし、貯蔵緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.5，0.1mM EDTA，1mM ジチオスレイトール，0.2M KCl，50% グリセロール）で透析し、−70℃で貯蔵した。上記精製法により、総収量400,000単位のNlaIIIが得られた。精製したNlaIIIエンドヌクレアーゼをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。明らかに分子量27000ダルトンを有するNlaIIIエンドヌクレアーゼ蛋白質は少なくとも90%の純度であった（図５．注：68000ダルトンBSA蛋白質は、汚染蛋白質ではない。これをエンドヌクレアーゼを安定化するためにNlaIII調製物に添加した。）。
【００６５】
この精製法から得られたNlaIIIエンドヌクレアーゼは実質的に純粋で、非特異的なエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含んでいなかった。NlaIII制限エンドヌクレアーゼ製剤の純度は、以下の基準に従ってチェックした。
【００６６】
１）連結：精製酵素でΦｘＤＮＡを20倍過剰消化（20-fold overdigestion）した後、産生したＤＮＡフラグメント95%以上をT4ＤＮＡリガーゼで連結した。この３個の連結したフラグメントの内、95%はNlaIIIで再切断可能であった。
【００６７】
２）長時間の消化：Φｘ174 ＤＮＡ １μg及び酵素200単位を含む50μl反応液を16時間インキュベーション後、酵素１単位で１時間実施した反応と同一のＤＮＡバンドが生じた。
【００６８】
３）エキソヌクレアーゼ活性：超音波処理した３H ＤＮＡ１μg（10５cpm/μg）を含む50μl反応液中で、酵素200単位を37℃で４時間インキュベーション後、0.21%の放射能が放出した。全試験は以下の反応緩衝液中で実施した：50mM 酢酸カリウム，20mM Tris-酢酸塩，10mM 酢酸マグネシウム，1mM ジチオスレイトール。
【実施例３】
【００６９】
１．pSYX20ベクターへのメチラーゼ遺伝子のクローニング：プラスミドpSYX20は、Kanｒ及びTcｒ遺伝子並びにpSC101複製開始点を保持する中コピー数プラスミドである。Tcｒ遺伝子に挿入されたメチラーゼ遺伝子は、Tcプロモーターから構成的に発現し得る。pSYX20の構築は、実施例２に詳しく記載済みである。あるいは、ColEI及びp15Aと適合性である任意のプラスミドベクター、好ましくは、中コピー数ベクターは、メチラーゼ遺伝子のクローニングにも使用し得る。また、バクテリオファージベクターを使用して、メチラーゼ遺伝子をクローニングし、宿主ＤＮＡ修飾のために大腸菌宿主染色体に組み込むことも可能である。所望の制限部位を備えた２個のプライマーを使用して、プラスミドからまたはゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応によりメチラーゼ遺伝子を増幅し得る。効率的なリボソーム結合部位、例えば、GGAGGTは、ATG開始コドンので７〜10bp上流のプライマー中に作成し得る。ポリメラーゼ連鎖反応条件は、通常、95℃で１分間、50℃で２分間、72℃で１〜２分間である。PCR産物をフェノール-CHCl３で２回、CHCl３で２回抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液に再懸濁させた。制限消化した後、ＤＮＡをフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液に再懸濁させた。ベクターＤＮＡpSYX20を同一制限エンドヌクレアーゼで切断し、フェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液に再懸濁させた。pSYX20ベクターＤＮＡ及びメチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡを、１×連結緩衝液中で16℃で一晩連結した。連結したＤＮＡを必要により滅菌-蒸留水を添加して希釈し得、ＤＮＡ画分を使用して大腸菌細胞（mcrA−，mcrBC−,hsd−,mrr−）を形質転換し、次いでKan（50μl/ml）プレートにプレートした。Kanｒ形質転換細胞をプラスミドＤＮＡのミニプレパレーション及び制限消化により正しいサイズの挿入物に関してスクリーニングした。正しいサイズの挿入物を有するプラスミドを、完全な修飾を確認するために同種のエンドヌクレアーゼでチャレンジした。プラスミドを含むメチラーゼ遺伝子を使用して、例えばBL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［pLysS］細胞を形質転換し、LB寒天プレート＋Cm 30μg/ml、Kan 50μg/mlにプレートした。Cmｒ及びKanｒ形質転換細胞が得られ、これを対応するエンドヌクレアーゼの発現用宿主として使用した。あるいは、無傷のメチラーゼ遺伝子を含む制限フラグメントを、制限部位（AatII，EcoRI，ClaI/BspDI，EcoRV，BamHI，SphI，SalI，PshAI，EagI，NruI，BspMI，SmaIまたはXhoI）を使用してpSYX20に直接クローニングし得る。
【００７０】
２．発現ベクターpSYX20への制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング：発現ベクターpSYX20は、T7lacプロモーター、T7lacプロモーターの上流のrrmB転写ターミネーター、lacIｑ遺伝子、翻訳融合クローニング用に２個の制限部位（NdeI及びSalI）を含む。pSYX20の構築については実施例１に記載済みである。あるいは、pSYX22の誘導体は、挿入物クローニング用にNcoI、SphI、BspHIまたはAflIII制限部位を含むように構築し得る。２個のプライマーは、第１のプライマーがエンドヌクレアーゼ遺伝子の開始部分にアニールされたNdeI部位及びエンドヌクレアーゼ遺伝子の末端に相補的である第２のプライマー中に作成されたSalI部位を含むように設計し得る。エンドヌクレアーゼ遺伝子は、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、例えばVent（登録商標）でPCRによりゲノムＤＮＡまたはプラスミドクローンから増幅し得る（95℃１分間、50℃２分間、72℃１〜２分間、20〜30サイクル）。PCR産物を、フェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、NdeI及びSalIで切断した。ＤＮＡを再びフェノール-CHCl３及びCHCl３で抽出し、エタノール沈澱させ、TE緩衝液に再懸濁させた。エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮＡをNdeI/SalIで処理したpSYX22に16℃で一晩連結し得る。連結したＤＮＡを滅菌-蒸留水を添加して希釈し、この一部を使用して大腸菌細胞を形質転換し、Apプレートにプレートした。個々の形質転換細胞をLB＋Ap２mlに接種し、37℃で一晩振蕩した。プラスミドＤＮＡを製造し、NdeI及びSalI制限消化により分析し得る。あるいは、所望のエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む制限フラグメントを、pSYX22発現ベクターのT7lacプロモーターの下流に直接クローニングし得る。正しいサイズの挿入物を含むプラスミドを使用して、例えばBL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［p（SYX20）メチラーゼ＋，pLysS］細胞を形質転換し、LB寒天プレート＋Ap（50μg/ml）、Cm（30μg/ml）、Kan（50μg/ml）にプレートした。大腸菌株BL21（λDE3）△（hsd-mrr-mcrBC）［p（SYX22）R＋，p（SYX20）M＋，pLysS］を以下の如くエンドヌクレアーゼ産生に関して試験し得る。富裕ブロス培地200〜1000ml＋Ap（50μg/ml）、Cm（30μg/ml）、Kan（50μg/ml）に一晩増殖した細胞２mlを接種し、Klett 75〜100の細胞密度になるまで37℃で振蕩し得る。IPTGインデューサー（終濃度0.5mM）を培養物に添加し得る。この細胞を２〜14時間誘導して収穫した。細胞を４℃、5000×gで15分間遠心分離してペレット化し、超音波緩衝液（10mM Tris-HCl，pH7.8，10mM β-メルカプトエタノール）に再懸濁させ、氷上で完全に細胞が溶解するまで超音波処理した。細胞片を４℃15000×gで30分間遠心分離して除去した。上清を新しい管に移し、超音波緩衝液で希釈し、希釈抽出液１〜10μlを使用して、1×制限緩衝液中でλＤＮＡまたは任意の基質ＤＮＡ１μgを切断し得る。37℃で１時間消化後、反応を停止溶液を添加して停止し、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ分析した。エンドヌクレアーゼの収量は、湿潤誘導細胞の１g当たりで評価した。所望の制限エンドヌクレアーゼをイオン交換カラム、ゲル濾過またはアフィニティーカラムで精製し得る。精製した制限エンドヌクレアーゼをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し得る。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】AatII制限エンドヌクレアーゼをクローニング及び産生するためのスキームを示す図である。
【図２Ａ】aatIIM遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図２Ｂ】aatIIM遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図３Ａ】aatIIR遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図３Ｂ】aatIIR遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされた蛋白質配列を示す図である。
【図４】IPTG-誘導及び未誘導細胞抽出物及び精製AatIIエンドヌクレアーゼ蛋白質を示す電気泳動写真である。矢印Ａ及びＢは、各々AatIIエンドヌクレアーゼ蛋白質及びウシ血清アルブミン（BSA）を示す。
【図５】IPTG-誘導及び未誘導細胞抽出物及び精製NlaIIIエンドヌクレアーゼ蛋白質を示す電気泳動写真である。矢印Ａ及びＢは、各々NlaIIIエンドヌクレアーゼ蛋白質及びウシ血清アルブミン（BSA）を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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