(57)【要約】      （修正有）【課題】各種ヒト型結核菌およびウシ型結核菌が分泌する各種の蛋白質ＭＰＴ６４および蛋白質ＭＰＢ６４に対して幅広く免疫反応するモノクローナル抗体を提供することにより、より精度の高い結核診断法を提供する。【解決手段】Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の特定のアミノ酸配列からなる２種類のペプチドに対するモノクローナル抗体、および、これら２種のモノクローナル抗体を併用するサンドイッチ式免疫測定法からなる結核症診断方法。これら２種のモノクローナル抗体の何れか一方を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、他方のモノクローナル抗体と所定量の被験試料とを適当な展開溶媒に混合するとともに、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる結核菌由来の蛋白を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３または４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体とを併用するサンドイッチ式免疫測定法からなる結核症診断方法。
【請求項３】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の何れか一方を担体に固定しておく請求項２に記載の診断方法。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の何れか一方を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、他方のモノクローナル抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる結核菌由来の蛋白と前記他方のモノクローナル抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
【請求項５】
前記他方のモノクローナル抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項４に記載の測定法。
【請求項６】
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項４に記載の測定法。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記モノクローナル抗体の何れか一方は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記モノクローナル抗体の他方は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなる結核症診断用イムノクロマト法テストストリップ。
【請求項８】
前記標識物質が金コロイドまたはラテックスである請求項７に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項９】
前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項７に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つのペプチド：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つのペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。
【請求項１２】
請求項１１の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３の形質転換体によって発現された前記組換えベクター由来の、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す組換えタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なモノクローナル抗体、その用途および製造に関し、さらに詳細には、各種ヒト型結核菌およびウシ型結核菌が分泌する多型な蛋白質ＭＰＴ６４および蛋白質ＭＰＢ６４の間で保存された領域を特異的に認識するモノクローナル抗体、その結核症診断用途および製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
結核菌群は分類学的には抗酸菌に属する菌群である。抗酸菌には、ヒト型結核菌（マイコバクテリウム  ツベルクローシス  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（マイコバクテリウム  ボビス  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ネズミ型結核菌（マイコバクテリウム  ミクロチ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリ型結核菌（マイコバクテリウム  アビウム  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）および冷血動物結核菌などが知られている。しかして、これらの中でヒトの結核症に関与するのは、ほとんど全てヒト型結核菌であるが、稀には、ウシ型結核菌による感染がある。また、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコバクテリウム  アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）およびネズミ型結核菌以外のマイコバクテリウム属に属する微生物は、非定型抗酸菌と呼ばれている。
【０００３】
ヒト型結核菌（マイコバクテリム  ツベルクローシス  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｓ）は、蛋白質ＭＰＴ６４（本明細書においては  ＭＰＴ６４蛋白  とも記す）を特異的に産生し、菌体外へ分泌する。一方、ＢＣＧ菌株のウシ型結核菌（マイコバクテリウム  ボビス  ＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）、以下、  ＢＣＧ菌  と記す）は、蛋白質ＭＰＢ６４（本明細書においては  ＭＰＢ６４蛋白  とも記す）を特異的に産生し、菌体外へ分泌する。そして、ＭＰＴ６４蛋白はＭＰＢ６４蛋白と同一の物質であることが知られている。
【０００４】
Ｍ．  Ｈａｒｂｏｅらは、このＭＰＢ６４蛋白をＢＣＧ菌から分離、精製して、その性質などについて研究して報告している（Ｍｏｒｔｅｎ  Ｈａｒｂｏｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＰＢ６４，  ＭＰＢ７０，  ａｎｄ  ＭＰＢ８０  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．，  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，  Ｖｏｌ．５２，  ２９３−３０２，  １９８６）。また、特開平１−２４７０９４号公報も、ＭＰＢ６４蛋白は、ヒトに感染して結核症と酷似した症状を呈する非定型抗酸菌によっては産生されないが、ウシ型結核菌のＢＣＧ菌によって産生され、かつＭＰＴ６４蛋白と同一物質であり、ＢＣＧ菌およびヒト型結核菌に特異な蛋白質であるとしている。
【０００５】
従って、このことは抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は抗原をＭＰＢ６４蛋白とする抗体であるが、同時にＭＰＴ６４蛋白の抗体でもあることを意味する。従って、病原性的には無害なＢＣＧ菌を培養し、その培養液からＢＣＧ菌によって産生されたＭＰＢ６４蛋白を抽出、精製し、該ＭＰＢ６４蛋白を抗原として抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を作成し、その抗体を用いた抗原抗体反応（免疫反応）によって被検体中の結核菌を検出することにより、ヒトの結核症を明確、かつ迅速に判別することができる結核症の簡便な診断法を確立することが可能となる。なお、ＭＰＢ６４蛋白をコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列はＲ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉらによって既に報告されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＰＢ６４  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｖｏｌ．  ５７，  ２８３−２８８，  １９８９）。
【０００６】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を使用した結核菌の検査薬および検出方法として、たとえば、特開平７−１１０３３２号公報記載の方法が知られている。この方法における免疫学的方法として、逆受身血球凝集反応（ＲＰＨＡ）、逆受身ラテックス凝集反応（ＲＰＬＡ）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが記載されている。前二者においては凝集時間が、たとえば、３時間程度と長く、感度が低く、かつ定量性は全くないなどの不都合な問題がある。後者においては、前二者に比較して試験操作が煩雑で、かつ通常は特殊な機械を使用する関係上、安全キャビネット中での実施が容易ではないなどの欠点がある。
【０００７】
そこで、本発明者らは、特開平１１−１０８９３１号公報において、ＭＰＴ６４蛋白が混在する被検体を呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白モノクローナル抗体と免疫反応により結合せしめ、これによって生じた抗原抗体複合体を第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体により捕捉することを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法などによる結核菌検出法を提案した。しかしながら、最近、前記の免疫反応において、ヒト型結核菌のうちで陰性を示す或る種の結核菌が見受けられることが明らかとなった。
【０００８】
【特許文献１】特開平１−２４７０９４号公報
【特許文献２】特開平７−１１０３３２号公報
【特許文献３】特開平１１−１０８９３１号公報
【非特許文献１】Ｍｏｒｔｅｎ  Ｈａｒｂｏｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＰＢ６４，  ＭＰＢ７０，  ａｎｄ  ＭＰＢ８０  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．，  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，  Ｖｏｌ．５２，  ２９３−３０２，  １９８６
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＰＢ６４  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｖｏｌ．  ５７，  ２８３−２８８，  １９８９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来の抗ＭＰＢ６４蛋白モノクローナル抗体が認識しないヒト型結核菌が存在することに鑑み、各種ヒト型結核菌およびウシ型結核菌が分泌する各種のＭＰＴ６４蛋白およびＭＰＢ６４蛋白に対して幅広く免疫反応するモノクローナル抗体を提供することにより、より精度の高い結核診断法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の目的の下に鋭意研究した結果、結核菌の中にはＭＰＴ６４蛋白をコードする遺伝子のレベルでミューテーションが起きているものがあり、遺伝子に多型が存在することを見出した一方で、そのＮ末端付近の配列は多型の中でも保存されていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、従来の抗ＭＰＢ６４蛋白モノクローナル抗体が認識しないヒト型結核菌のうち、１つは、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、６６番目のアミノ酸のロイシン（Ｌｅｕ）から８６番目のアミノ酸のプロリン（Ｐｒｏ）までの２１個のアミノ酸をコードする遺伝子が欠損していることがわかった。また、他の１つは、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、第２６６番目のシトシン（Ｃ）が欠損し、それ以降のコドンがフレームシフトを起こしていることがわかった。また、別の１つは、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、５１２番目から６８７番目までの１７６ｂｐの塩基が欠損していることがわかった。
【００１２】
その一方で、上記何れのヒト型結核菌においても、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、２４番目のアミノ酸のアラニン（Ａｌａ）から６５番目のアミノ酸のセリン（Ｓｅｒ）までの４２個のアミノ酸配列からなるペプチド（以下ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチド  と記す）をコードする遺伝子（以下  ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子  と記す）が保存されていることがわかった。
【００１３】
かくして、本発明者は、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドに対するモノクローナル抗体を取得することに鋭意研究した結果、配列表の配列番号１の２４番目のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ）から４１番目のアミノ酸であるシステイン（Ｃｙｓ）までの１８個のアミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）からなるペプチド（以下  ＭＰＢ６４ΔＡペプチド  と記すこともある）および４２番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）から６５番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）までの２４個のアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸配列）からなるペプチド（以下  ＭＰＢ６４ΔＢペプチド  と記すこともある）のいずれも抗原性が強く、抗原決定基あるいはエピトープを含む領域であるとの知見が得られた。
【００１４】
したがって、本発明の第１の局面によれば、配列番号３または４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体が提供される。かくして、ＭＰＢ６４ΔＡペプチドとＭＰＢ６４ΔＢペプチドの２種類の抗原のそれぞれに対する抗体が得られたので、変異の有無に拘わらず、これを使用して結核菌を検出することが可能となる。また、これら２種のモノクローナル抗体は、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドのそれぞれ異なる領域に位置するＭＰＢ６４ΔＡペプチドおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドを認識するので、これら２種のモノクローナル抗体を併用することで、精度の高いサンドイッチ式免疫測定法が実施できる。
【００１５】
したがって、本発明の第２の局面によれば、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体とを併用するサンドイッチ式免疫測定法からなる結核症診断方法が提供される。ここにおいて、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の何れか一方を担体に固定しておくこともでき、例えば、ＥＬＩＳＡ測定系やイムノクロマトグラフィー測定法に応用できる。
【００１６】
かくして、本発明の第３の局面によれば、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の何れか一方を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、他方のモノクローナル抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる結核菌由来の蛋白と前記他方のモノクローナル抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。ここにおいて、上記他方のモノクローナル抗体は適当な標識物質で標識しておくと好都合である。
【００１７】
また、本発明の第４の局面によれば、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記モノクローナル抗体の何れか一方は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記モノクローナル抗体の他方は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなる結核症診断用イムノクロマト法テストストリップが提供される。
また、配列番号３および４のアミノ酸配列からなるペプチドがＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すことは従来知られていなかった。したがって、本発明の第５の局面によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つのペプチドが提供される：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。
さらに、本発明の第６の局面によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つのペプチドをコードする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。
配列番号３および４には特定の遺伝子配列が記載されているが、上記アミノ酸配列をコードする限り、コドンの縮重に基づく変更が許容され、また、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す限り、１または数個のアミノ酸の欠失、置換または付加による変更が許容されることは言うまでもない。
また、この遺伝子は、常法により、各種の発現ベクターに組み込むことが可能であり、さらに、当該組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換して上記遺伝子を発現させることにより、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す組換えタンパク質を製造することができる。宿主は、遺伝子工学で通常使用されている大腸菌などの細菌や酵母などが好適であるが、これらに限定されるものではない。
したがって、本発明のさらに他の局面によれば、上記遺伝子を含有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、および、当該形質転換体によって発現された前記組換えベクター由来の、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す組換えタンパク質が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体の製造および本発明のモノクローナル抗体を使用するヒト結核症の診断法における各ステップは、それぞれ、それ自体、公知の免疫学的手法に準拠して行なわれる。
【００１９】
すなわち、ＭＰＢ６４蛋白に対する２種の特異的モノクローナル抗体は、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  東京株のようなウシ型結核菌の培養上清から抽出精製したＭＰＢ６４蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめる。
【００２０】
増殖せしめた株を前記のようにして得られたＭＰＢ６４蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより抗ＭＰＢ６４蛋白抗体産生株を選別する。さらに、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子、ＭＰＢ６４ΔＡペプチドをコードする遺伝子（以下、  ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子  と記す）またはＭＰＢ６４ΔＢペプチドをコードする遺伝子（以下、  ＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子  と記す）を組み込んだ発現プラスミドを構築し、その発現蛋白を使用して、酵素標識免疫法などにより本発明のモノクローナル抗体産生株を選別する。
【００２１】
別法として、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子またはＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子を組み込んだ発現プラスミド構築し、その発現蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、免疫されたマウスのような動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞使用して、上記と同様の選別を行ってもよい。
【００２２】
ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子またはＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子は、化学合成によって得ることができ、また、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子を鋳型として適当なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることによって得ることもできる。これらの遺伝子は、両末端に適当な制限酵素部位を付加するなど、常法により適当な発現プラスミドに組み込むことができる。
【００２３】
本発明の２種のモノクローナル抗体はそれぞれＭＰＢ６４蛋白の２種の異なる抗原決定基あるいはエピトープを認識するので、両者を従来のサンドイッチ式免疫測定法に使用することで、従来よりも精度の高い結核症診断を実施できる。上記２種のモノクローナル抗体の何れか一方を固定しておくことも可能であり、これにより、例えば、イムノクロマトグラフィー測定法を容易に実施できる。
【００２４】
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。具体的には、例えば、図３に示されるイムノクロマト法テストストリップが挙げられる。本発明においては、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体との何れか一方を第一の抗体として使用し、他方を第二の抗体として使用できる。
【００２５】
図３において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応する第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【００２６】
含浸部材２は、前記第一の抗原決定基と異なる部位に位置する第二の抗原決定基にて前記抗原と抗体抗原反応する第二の抗体を含浸せしめた部材からなる。当該第二の抗体は、適当な標識物質で予め標識される。図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
【００２７】
第二の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便にに判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
【００２８】
図３に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図３の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図３の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
【００２９】
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【００３０】
さらに、市販品の場合、図３のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。
【００３１】
かくして、適当な展開溶媒中に所定量の生体試料を混合してクロマト展開可能な混合液を被験試料として得た後、当該混合液を図３に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の抗体と混合する。その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
【００３２】
【実施例】
次の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
参考例１（ＭＰＢ６４蛋白の精製）
ＭＰＢ６４蛋白は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ＴＯＫＹＯ  １７２（ＡＴＣＣ  ３５７３７）の培養上清からＭｏｒｔｅｎ  Ｈａｒｂｏｅらの方法（Ｍｏｒｔｅｎ  Ｈａｒｂｏｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＰＢ６４，  ＭＰＢ７０，  ａｎｄ  ＭＰＢ８０  ｏｆ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ．，  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，  Ｖｏｌ．５２，  ２９３−３０２，  １９８６）に準拠して抽出精製した。すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  ＴＯＫＹＯ  １７２を培養後、その培養上清を７５％飽和硫安分画し、生じた沈殿物を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０カラムクロマト、次にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラムクロマト操作により分画した。ゲル電気泳動法により確認したＭＰＢ６４蛋白相当画分を、限外ろ過濃縮後、さらに、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂカラムクロマト、限外ろ過濃縮、さらにＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００カラムクロマトを行い、精製した。
【００３４】
参考例２（ＭＰＢ６４蛋白によるマウス免疫とハイブリドーマの作製）
参考例１で得られたＭＰＢ６４蛋白２００μｇ（５０μｌ）をフロインドの完全アジュバンド５０μｌと混合してエマルジョンを作製し、これをＢａｌｂ／ｃメスマウス皮下に注射した。この免疫操作を３週間後に再度行い、さらに３週間後にタイター価の上昇を確認した後、５０μｇ（５０μｌ）の上記ＭＰＢ６４蛋白そのものを腹腔に注射し、３日後に脾臓を摘出し、その脾臓細胞とマウス・ミエローマ細胞（ＳＰＩＩ細胞）とを５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液を用いて細胞融合した。融合細胞は、一般的方法のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）含有培養液で選別後、ＰＲＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）製、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ））含有ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地）で培養増殖させた。
【００３５】
参考例３（ＭＰＢ６４蛋白特異的抗体産生ハイブリドーマの選別）
参考例１で得られたＭＰＢ６４蛋白をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２μｇ／ｍｌに希釈し、その１００μｌを９６穴プレートの各ウェルに添加し、室温で約１６時間放置して固相化した。このＭＰＢ６４蛋白固相化プレートを０．２％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ溶液でブロッキング処理した後、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体産生株の選別に使用した。
【００３６】
すなわち、参考例２で得られた種々のハイブリドーマの培養上清をそれぞれ採取し、その１００μｌを上記プレートの各ウェルに添加した。約１時間室温でインキュベーション後、培養上清を廃棄し、プレートを洗浄した。それに、ビオチン標識抗マウス・ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μｌ添加し、約３０分間室温でインキュベーション後に反応液を廃棄し、その後、プレートを洗浄した。
【００３７】
そのプレートに、アビジンとビオチン標識ホースラディッシュ・ぺルオキシダーゼ（以下  ＨＲＰ−ビオチン  と記す）との複合体溶液を１００μｌ添加し、約３０分間室温でインキュベーション後、反応液を廃棄し、プレートを洗浄した。洗浄プレートにＨＲＰ基質、ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と過酸化水素との混合溶液を１００μｌ添加し、室温で１０分間反応後、０．２Ｎリン酸溶液５０μｌを添加し反応を停止した。各ウェルの色度をマイクロプレートリーダーで測定し、その強度を指標に抗ＭＰＢ６４蛋白抗体産生株を選別した。
【００３８】
実施例１（ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドの大腸菌における発現）
ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを認識する抗体を取得することを目的に、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子を備えた発現プラスミドを作成し，大腸菌で発現させた。
【００３９】
まず、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子を含む配列表の配列番号２に示されるＤＮＡの両ストランドを化学合成した。なお、この合成遺伝子では、ベクター挿入後に正常に融合タンパクが発現されるように、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子のＮ末端側及びＣ末端側にそれぞれ７塩基及び６塩基のＤＮＡ配列が付加されている。
【００４０】
化学合成した互いに相補的な２本のＤＮＡオリゴマー各３８ｐｍｏｌを総量３４μｌ水溶液にし、１００℃で１分間加熱した後、室温まで自然に冷やし、アニールした。このＤＮＡ溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  ＤＴＴ，Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ  ５４単位の総量５０μｌの溶液にして３７℃、１時間反応させた。反応後、フェノール抽出し、エーテルで洗浄後、２．５倍量のエタノールと１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えＤＮＡのエタノール沈澱を行った。この沈澱を減圧乾燥後、１７μｌの滅菌水を加え大腸菌発現ベクター導入用ＤＮＡ断片とした。
【００４１】
このようにして得られたＤＮＡ断片を下記に示す方法で大腸菌発現用ベクターに導入した。
大腸菌発現用ベクターｐＲＳＥＴ  Ａ  １０μｇを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、７ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ＰｖｕＩＩ  １００単位の総計５０μｌ反応溶液中で３７℃、１時間反応させた。反応後、１００℃、５分、熱処理をし、２．５倍量のエタノールと１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えＤＮＡのエタノール沈殿を行った。沈殿を減圧乾燥後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０単位  子牛胸腺アルカリフォスファターゼの総量５０μｌ反応溶液を加え５０℃で３０分間反応させた。反応後、マイクロピュア−ＥＺ遠心式酵素リムーバー（ミリポア）でろ過し、子牛胸腺アルカリフォスファターゼを除去した。ろ過液に２．５倍量のエタノールと１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えＤＮＡのエタノール沈殿を行った。この沈殿を減圧乾燥後、１０μｌの滅菌水を加えＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子ＤＮＡ断片挿入用大腸菌発現ベクター断片とした。
【００４２】
この大腸菌発現ベクター断片０．１μｇと上記で調製した発現ベクター導入用ＤＮＡ断片０．５μｇを混合し、滅菌水を加えて２μｌにした後、２μｌのライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ，  ＴＯＹＯＢＯ）溶液を加え、１６℃で３０分間反応させた。反応後、反応混合液４μｌをＥ．Ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’株コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）５０μｌに加え、０℃で３０分間静置し、４２℃で３０秒間、次いで０℃で５分間静置した。この混合液に、トリプトン２％、イーストエクストラクト０．５％、ＮａＣｌ  ０．０５％、ＫＣｌ  ０．０１８６％、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、グルコース２０ｍＭを含有するＳＯＣ培地５００μｌを加え３７℃で３０分間震盪した。
【００４３】
次に６０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を半量捨て、再懸濁し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−Ｄ−ガラクトシド  以下同様）、０．００４％Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、イーストエクストラクト０．５％、ＮａＣｌ  １％、アガー  １．５％）に塗布し、３７℃にて一晩培養してβ−ガラクトシターゼ活性非保有株の白色クローンを得た。これらのクローン約５０個のコロニーをＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）にて一晩培養し、常法にてプラスミドＤＮＡを抽出精製した後、ＰｖｕＩＩ  サイトの外側にある制限酵素サイトＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化した。この消化溶液をアガロース電気泳動に供し、９クローンに関して目的のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断断片フラグメントに相当する大きさの断片を確認した。
【００４４】
次に、これらクローンのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断断片フラグメントをダイデオキシ法による塩基配列決定法（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７４，５４６３  （１９７７））により配列を決定した。その結果、目的の方向に挿入されており、かつ、正しいアミノ酸配列を有するＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミド１クローンを得た。
【００４５】
上記で調製したＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミドを常法に従ってＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換した菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）中３７℃で一晩震盪培養した。この培養液２ｍｌを新たにＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）に加え、３７℃で約４時間震盪培養し６００ｎｍの吸光度が０．５になった時点で、０．５Ｍ  ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように加え、さらに３７℃で３時間震盪培養を行った。
【００４６】
培養後、菌体を遠心分離にて集め−８０℃にて保存した。集めた菌体の少量をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム  以下同様）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（６０ｍＭトリス、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー）２０μｌに懸濁、１００℃で２分間処理し溶解した後、ラエンムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２７７，  ６８０  （１９７０）  ）に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した。その結果、４つのクローン全てにおいてＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子がコードするＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドが発現していることを確認できた。
【００４７】
実施例２（ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマの選別）
実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを発現する大腸菌を培養し、溶菌後、その溶解液の中から、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを含有する蛋白をニッケル結合カラムを用いて分離精製した。精製した蛋白を２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解後、その１００μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、固相化した。
【００４８】
その後、参考例３に記述した操作方法により、参考例３で得られたＭＰＢ６４蛋白に特異的な抗体を産生するハイブリドーマの中から、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを特異的に認識する抗体産生株の選別を行った。参考例３で約３００株のＭＰＢ６４蛋白特異的抗体産生株が得られたが、その内、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを特異的に認識する抗体産生株はわずか６株であった。
【００４９】
実施例３（ＭＰＢ６４ΔＡペプチドまたはＭＰＢ６４ΔＢペプチドを持つ組み換え蛋白の作製）
実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミドを鋳型として、ＭＰＢ６４ΔＡペプチドまたはＭＰＢ６４ΔＢペプチドの発現プラスミドを構築し、大腸菌内で発現させた。
【００５０】
すなわち、実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミドを鋳型として、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子およびＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子の２つの遺伝子断片を増幅した。
【００５１】
増幅におけるポリメラーゼ連鎖反応は、１００  ｎｇの実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミド、およびプライマーペア（それぞれ１００  ｐｍｏｌｅ）、１２．５  ｎｍｏｌｅのｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリフォスフェート）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジントリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジントリフォスフェート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリフォスフェート）のそれぞれ、５μｍｏｌｅの塩化カリウム、５μｍｏｌｅのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１５０  ｎｍｏｌｅの塩化マグネシウム、１０  ｍｇのゼラティンを含む、１００μｌの水溶液を調製し、これに２ユニットのＴａｑポリメラーゼ２０００（フナコシ株式会社から購入）を加え、９４℃で１分、５５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を２０回繰り返して行った。
【００５２】
この反応後の１００μｌの水溶液を、０．７％のアガロース電気泳動に供した。電気泳動は、１００ボルト、約３０分で、緩衝液は１×ＴＥ（４０  ｍＭトリス酢酸、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、ｐＨ  ８．０）を使用した。
【００５３】
電気泳動後、アガロースゲルを１０μｇ／ｍｌのエチジュウムブロマイド水溶液に２時間浸したのち、アガロースゲルをＤＮＡ用紫外線照射器上に置き、紫外線を照射し、オレンジ色に光るＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、さらに細かく切り、１．５  ｍｌ  容積のチューブに入れ、これに切り出したアガロースゲルと同量（体積）のＴＥ緩衝液（１０  ｍＭトリス塩酸、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、ｐＨ  ８．０）で飽和したフェノールを加え、攪拌し、−８０℃冷凍庫で凍らせた。
【００５４】
１時間後、冷凍庫から上記チューブを出し室温に置き解かした後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この上清を１．５  ｍｌ  容積のチューブに採取した。この上清をクロロホルムで抽出を２回行ない、遠心分離した上清を取り、これに１０分の１量（体積）の３  Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）を加えた後、最終濃度７０％になるようにエチルアルコールを加え、再び、−８０℃冷凍庫で凍らせた。１時間後、冷凍庫から上記１．５  ｍｌ  容積のチューブを出し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿をロータリーエパポレターにて乾燥させた。
【００５５】
乾燥した沈殿を５μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、各２  ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを１μｌ、１００  ｍＭトリス塩酸を２μｌ、５０  ｍＭの塩化マグネシウムを２μｌ、２ユニットのＴ４ポリメラーゼを加え、最終体積を純水で２０μｌとし、１０分間、室温に放置し、その後、７５℃で１０分間処理した。この２０μｌの反応液に２３０μｌのＴＥ緩衝液を加え混ぜ、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、攪拌し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この上清を１．５  ｍｌ  容積のチューブに移し、クロロホルムによる抽出を２回おこない、遠心分離した上清を取り、前記と同じ工程でエチルアルコールにより沈殿させ、乾燥させた。
【００５６】
乾燥した沈殿を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、このうち５μｌに、１００  ｍＭトリス塩酸を２μｌ、５０  ｍＭの塩化マグネシウムを２μｌ、１μｌの１０  ｍＭ  ＡＴＰ、２ユニットのＴ４ポリメラーゼを加え、最終体積を純水で２０μｌとし、３７℃で１時間保った。この２０μｌの反応液に２３０μｌのＴＥ緩衝液を加え混ぜ、前記と同じ工程で、フェノールとクロロホルムで処理し、エチルアルコールにより沈殿させ、乾燥させた。
【００５７】
乾燥した沈殿を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、このうち２μｌを０．５  ｍｌ  容積のチューブに移し、試薬ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡績株式会社から購入）２μｌと混ぜ、１６℃で１５時間、反応させた。凍結ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（フナコシ株式会社から購入）１００μｌを１．５  ｍｌ  容積のチューブに用意し、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを加え、１０分間、氷上で時々振り、前記の１６℃で反応させたＤＮＡ溶液を２μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢ培地（１  ％  ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、  ０．５  ％  ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１  ％  塩化ナトリウム）を加え、３７℃で１時間培養し、これを５０  ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で１８時間、保温した。
【００５８】
ＬＢ寒天プレートに生じた大腸菌コロニー（それぞれ２５個）を５０  ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間、培養し、この培養液を、９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。この菌体からキアゲンプラスミドミニキット（株式会社キアゲンの商品）によりプラスミドを調製した。得られたプラスミドについて  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムジャパン株式会社）によりその塩基配列を調べた。それぞれ２５個のプラスミドのうち、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子またはＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子を含む目的の発現プラスミドが数個得られた。
【００５９】
上記操作により目的の発現プラスミドが得られたことから、これらを大腸菌に導入した。すなわち、凍結ＢＬ２１  Ｇｏｌｄ大腸菌（フナコシ株式会社から購入）１００μｌを１．５  ｍｌ  容積のチューブに入れ、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを加え、１０分間、氷上で時々振り、上記目的の発現プラスミドの１０  ｎｇ／μｌ溶液を１μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢ（１  ％  ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、  ０．５  ％  ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、  １  ％  塩化ナトリウム）を加え、３７℃で１時間培養し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で１８時間、保温した。
【００６０】
生じた大腸菌コロニー（それぞれ４個）を３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。この培養液を１００ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に入れ、３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．６になったときに、１００ｍＭ  ＩＰＴＧを１ｍｌ加え、さらに３時間培養した後、５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。１．５  ｍｌ  容積のチューブにて、１ｍｌ培地あたりの菌体を２００μｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁した後、２００μｌの２×ＳＤＳＰＡＧＥ  サンプリング液（５０  ｍＭ  トリス、１％ラウリル硫酸ナトリウム、５％２‐メルカプトエタノール）を加え、混合し、９５℃で５分間、熱処理をし、このうち１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびウェスターン・イムノブロッティングに供与したところ、図１および図２のようにそれぞれのペプチドが発現していることが示された。なお、図１は、ゲルコードブルー（（株）フナコシから購入）により蛋白質染色した結果であり、図２は、抗ヒスチジンタグ抗体（マウスＩｇＧ）にビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｋｉｔ（（株）フナコシから購入）により呈色反応させた結果である。
【００６１】
図１および図２のそれぞれにおいて、−および＋は、それぞれ、ＩＰＴＧ誘導前およびＩＰＴＧ誘導後を示す。また、Ｌａｎｅ  １はＭ  （分子量マーカー）を、Ｌａｎｅ  ２  および  ３  はＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白可溶化画分を、Ｌａｎｅ  ４  および  ５  はＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白質可溶化画分をそれぞれ示している。
【００６２】
実施例４（ＭＰＢ６４ΔＡペプチドおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマの選別）
実施例３で得られた形質転換大腸菌を培養し、ＩＰＴＧによる蛋白発現誘導を行った後、溶菌操作を行い可溶性蛋白質を回収した。その可溶化画分の中から、ＭＰＢ６４ΔＡペプチド含有発現蛋白質およびＭＰＢ６４ΔＢペプチド含有発現蛋白質をニッケル結合カラムを用いて分離精製した。それら精製蛋白質を２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解後、その１００μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、固相化した。その後、参考例３に記述した操作方法により、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを認識する抗体産生ハイブリドーマ（すなわち実施例２で得られた６種）の培養上清を用いて、その特異性について検討した。
【００６３】
その結果、６種のハイブリドーマの内、４種のハイブリドーマがＭＰＢ６４ΔＡペプチドを認識する抗体を、２種のハイブリドーマがＭＰＢ６４ΔＢペプチドを認識する抗体を産生していることが判明した。
【００６４】
実施例５（選別したハイブリドーマの特性）
実施例４で最終的に得られた６種のハイブリドーマの特性を検討するため、参考例３で記述した免疫測定方法により、３種の抗原に対する反応性を検討した。用いた抗原は、以下の３種であった。
抗原６４：ＭＰＢ６４蛋白；
抗原６４ΔＡ：ＭＰＢ６４ΔＡペプチド含有発現蛋白質；
抗原６４ΔＢ：ＭＰＢ６４ΔＢペプチド含有発現蛋白質。
【００６５】
上記の３種の蛋白質をＥＬＩＳＡプレートに固相化した後、前記６種のハイブリドーマの培養上清を添加し、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体添加、アビジン−ＨＲＰ標識ビオチン複合体添加、ＨＲＰ基質添加、発色反応、比色定量の作業を順次行い、６種のハイブリドーマ産生抗体の特性を検討した。
【００６６】
【表１】
2004166564.tif 000002
【００６７】
【表２】
2004166564.tif 000003
【００６８】
上記表１および表２のそれぞれから、ハイブリドーマ１−２Ｇ、２−６Ｄ、３−２Ｃおよび４−７Ｆは何れもＭＰＢ６４ΔＡペプチドに対する抗体産生細胞であり、ハイブリドーマ５−３Ｆおよび６−８Ｆは何れもＭＰＢ６４ΔＢペプチドに対する抗体産生細胞であることが示された。
【００６９】
実施例６（ＭＰＢ６４ΔＡペプチドおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドに対する特異抗体を用いたＭＰＢ６４抗原のＥＬＩＳＡ測定系の作製）
実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを含む発現蛋白質を抗原とし、実施例５で示したＭＰＢ６４ΔＡペプチドに対する抗体産生細胞であるハイブリドーマ１−２ＧおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドに対する抗体産生細胞であるハイブリドーマ５−３Ｆを用いてＥＬＩＳＡにより反応性を確認した。
【００７０】
ハイブリドーマ５−３Ｆが産生した抗体５−３Ｆを９６穴プレートのウェルに５０μｌ添加し、１晩冷所で固相化し、各ウェルをブロッキングし、続いて洗浄した後、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを含む発現蛋白質を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で２時間反応させた。各ウェルを洗浄し、ハイブリドーマ１−２Ｇが産生した抗体１−２ＧをＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）標識して各ウェルに１００μｌ添加した後、室温で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットＳＴの構成品である３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）液（株式会社タウンズの製品）を各ウェルに１００μｌ添加して発色させ、室温で１０分間反応させた後、２Ｎ硫酸１００μｌを添加して反応を停止させた。各ウェルの色度を、測定波長４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００７１】
対照として、参考例３で得られたが実施例２で選別されなかった２種のハイブリドーマが産生する２種のモノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂとする）を用いたＥＬＩＳＡにより、反応性を確認した。なお、このＥＬＩＳＡ測定系は、抗体Ａを固相化し、抗体ＢをＰＯＤ標識した以外は、前記と同様であった。結果を表３に示す。なお、抗体Ａ及びＢは、免疫反応において抗原であるＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白に対する結合部位が相互に異なる従来のモノクローナル抗体である。
【００７２】
【表３】
2004166564.tif 000004
【００７３】
なお、固相化抗体５−３Ｆの代わりにハイブリドーマ６−８Ｆが産生する抗体を用いても測定値は殆ど変わらなかった。また、標識化抗体１−２Ｇの代わりにハイブリドーマ２−６Ｄ、３−２Ｃおよび４−７Ｆが産生するいずれの抗体を用いても測定値は殆ど変わらなかった。
【００７４】
この結果は、従来のモノクローナル抗体がＭＰＢ６４蛋白のＮ末端付近を認識しないのに対し、本発明の新規なモノクローナル抗体はＭＰＢ６４蛋白のＮ末端付近を認識することを示している。
【００７５】
実施例７（本発明によるヒト型結核菌の変異株１のＥＬＩＳＡ）
結核病患者１からの被検体由来の結核菌を小川培地で培養し、ヒト型結核菌と認められたコロニーを１白金耳掻き取り、５００ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝液  以下同様）に懸濁させた懸濁液を抗原液１とした。なお、この結核菌抗原蛋白ＭＰＢ６４遺伝子（Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６２（５），２０５８−２０６４，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ＭＰＴ６４（１９９４））を調べた処、配列表の配列番号１のＤＮＡ配列のうち、１９６番目から２５８番目までの６３ｂｐのＤＮＡ配列の欠落が確認された。
【００７６】
上記抗体１−２Ｇおよび５−３Ｆを用いてＥＬＩＳＡにより反応性を確認した。すなわち、抗体５−３Ｆを９６穴プレートのウェルに５０μｌ添加し、１晩冷所に放置して固相化し、各ウェルをブロッキングし、続いて洗浄した後、上記で調製した結核菌変異株の抗原液１を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で２時間反応させた。
【００７７】
各ウェルを洗浄し、ＰＯＤ標識した抗体１−２Ｇを各ウェルに１００μｌ添加後、室温で１時間反応させ、続いて各ウェルを洗浄後、ＴＭＢＺ液を各ウェルに１００μｌ添加して発色させ、室温で１０分間反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを添加して反応を停止させた。各ウェルの色度を、測定波長４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーにより測定した。結果を表４に示す。
【００７８】
対照として、上記抗原液１を用いて、実施例６で使用した２種のモノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡにより、反応性を確認した。すなわち、抗体Ａを固相化し、抗体ＢをＰＯＤ標識した以外は、前記と同様な手順を行なった。結果を表４に示す。
【００７９】
【表４】
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【００８０】
なお、固相化抗体５−３Ｆの代わりにハイブリドーマ６−８Ｆが産生する抗体を用いても測定値は殆ど変わらなかった。また、標識化抗体１−２Ｇの代わりにハイブリドーマ２−６Ｄ、３−２Ｃおよび４−７Ｆが産生する抗体のいずれを用いても測定値は殆ど変わらなかった。
【００８１】
これらの結果から、結核病患者の診断において、結核菌の分泌蛋白質であるＭＰＢ６４の遺伝子の変異株に感染した場合、従来の抗体を用いたアッセイでは偽陰性になってしまうのに対し、本発明の新規モノクローナル抗体を用いた場合では陽性となり、正しい診断を行なうことが可能となったことが判る。
【００８２】
実施例８（本発明のモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト測定系によるヒト型結核菌の変異株の検出）
結核病患者２からの被検体由来の結核菌を小川培地で培養し、ヒト型結核菌と認められたコロニーを１白金耳掻き取り、５００ｍｌのＰＢＳに懸濁させた懸濁液を抗原液２とした。なお、この結核菌抗原蛋白ＭＰＢ６４遺伝子を調べた処、配列表の配列番号１のＤＮＡ配列の５１２番目から６８７番目に当たる１７６ｐｂの欠落が確認された。
【００８３】
上記抗体１−２Ｇおよび５−３Ｆを用いてイムノクロマトグラフィー法により反応性を確認した。
【００８４】
すなわち、図３に示される要領でイムノクロマト法テストストリップを作成した。抗体５−３Ｆを膜担体に固定して捕捉部位を形成する抗体として用い、抗体１−２Ｇを金コロイド標識抗体として用いた。このようにして作成したイムノクロマト法テストストリップの試料滴下部に、上記で得られた抗原液２を１００μｌ滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色を肉眼で判定した処、赤紫色の呈色が見られ、捕捉部位に上記抗原が捕捉されたことが示された。
【００８５】
対照として、上記抗原液２を用いて、実施例６で使用した２種のモノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）を用い、反応性を確認した。すなわち、抗体Ａを膜担体に固定して捕捉部位を形成する抗体として用い、抗体Ｂを金コロイド標識抗体として用いた以外、上記と同様のイムノクロマト法テストストリップを作成した。そして、その試料滴下部に、上記で得られた抗原液２を１００μｌ滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色を肉眼で判定した処、呈色は見られず、捕捉部に上記抗原が捕捉されなかったことを示した。
【００８６】
これらの結果から、イムノクロマト法テストストリップにおいても、本発明の新規モノクローナル抗体を使用することにより、結核病患者の診断において結核菌変異株による偽陰性を回避することが可能となることが判る。
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、被検体中のヒト型結核菌および／またはウシ型結核菌のそれぞれを変異株または非変異株に拘わらず免疫学的手法により検知することが可能となる。
【００８８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＢ６４ΔＡ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白可溶化画分（Ｌａｎｅ  ２及び３）およびＰＢ６４ΔＢ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白質可溶化画分（Ｌａｎｅ  ４及び５）のそれぞれのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す写真である。
【図２】ＰＢ６４ΔＡ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白可溶化画分（Ｌａｎｅ  ２及び３）およびＰＢ６４ΔＢ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白質可溶化画分（Ｌａｎｅ  ４及び５）のそれぞれのウェスターン・イミュノブロッティング転写像を示す写真である。
【図３】ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図。
【符号の説明】
１  粘着シート
２  含浸部材
３  膜担体
３１  捕捉部位
４  吸収用部材
５  試料添加用部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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