(57)【要約】【課題】遊離型薬物をタンパク結合型薬物から分離するための前処理を容易にする。【解決手段】六方バルブ４を図示の流路に設定し、ポンプ６からトラップ用移動相を供給し、オートサンプラ８から分析対象試料を注入して前処理カラム２へ送り、タンパク結合型薬物は排出し遊離型薬物のみを前処理カラム２に捕捉する。その後、六方バルブ４を切り替え、ポンプ１０，１２からの分析用移動相により前処理カラム２に捕捉されていた遊離型薬物を溶出して分析用カラム１６に導入し、分析用カラム１６から溶出した遊離型薬物をＵＶ検出器１８と質量分析計２２で定性、定量を行なう。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、孔内面に薬物を捕捉する化学修飾が施された充填材が充填された内面浸透制限型カラムを前処理カラムとして用い、タンパク質含有試料をトラップ用移動相により前記前処理カラムに通してその試料中の遊離型薬物を捕捉し、タンパク質と結合したタンパク結合型薬物をタンパク質とともに排出させる分離ステップと、
前記分離ステップで前記前処理カラムに捕捉された遊離型薬物を分析用移動相により溶出させ分析計に導いて分析するステップとを備えたことを特徴とする遊離型薬物測定方法。
【請求項２】
前記トラップ用移動相は、試料中での遊離型薬物とタンパク結合型薬物との平衡状態を維持するように調製された溶媒である請求項１に記載の遊離型薬物測定方法。
【請求項３】
外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、孔内面に薬物を捕捉する化学修飾が施された充填材が充填された内面浸透制限型カラムを備えた前処理部と、
タンパク質含有試料をトラップ用移動相により供給する試料導入部と、
前記カラムに捕捉された薬物を溶出させる分析用移動相を供給する分析用移動相供給部と、
前記カラムから分析用移動相により溶出された薬物を検出する分析計と、
前記試料導入部を前記カラムに接続する分離用流路及び前記分析用移動相供給部を前記カラムに接続しそのカラムからの溶出液を前記分析計に導く分析用流路の間で切り替える流路切替え部とを備えたことを特徴とする遊離型薬物の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は高速液体クロマトグラフィーなどを用いて血漿や血清などの生体試料中の薬物を測定する方法と装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血漿や血清中の薬物には、タンパク質と結合したタンパク結合型薬物と遊離状態で存在する遊離型薬物がある。それらの薬物を定量する方法としては、タンパク結合型薬物と遊離型薬物の総量を定量する方法もあるが、遊離型薬物のみを定量したいという要望もある。本発明は遊離型薬物のみを定量する方法とその装置に関するものである。
【０００３】
遊離型薬物のみを定量する方法としては、前処理として限外濾過によりタンパク結合型薬物と遊離型薬物とを分離した後、遊離型薬物を含んだ溶液を高速液体クロマトグラフに導入して分析することが行われている。限外濾過は試料溶液に含まれる溶質の大きさに基づいて分離を行なうものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
限外濾過によりタンパク結合型薬物と遊離型薬物とを分離する場合、１検体ずつオフラインで前処理することが必要である。
本発明は遊離型薬物をタンパク結合型薬物から分離するための前処理を容易にすることを目的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明の遊離型薬物測定方法は、内面浸透制限型カラムを前処理カラムとして用い、タンパク質含有試料をトラップ用移動相によりその前処理カラムに通してその試料中の遊離型薬物を捕捉し、タンパク質と結合したタンパク結合型薬物をタンパク質とともに排出させる分離ステップと、分離ステップでその前処理カラムに捕捉された遊離型薬物を分析用移動相により溶出させて分析計に導いて分析するステップとを備えたことを特徴としている。
【０００６】
内面浸透制限型カラムとは、外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、孔内面に薬物を捕捉する化学修飾が施された充填材が充填されたカラムである。内面浸透制限型カラムに血清や血漿などの生体試料を導入すると、タンパク結合型薬物はタンパク質のサイズが大きいためにタンパク質とともに排出され、遊離型薬物はサイズが小さいために充填材の孔内に入り化学修飾された孔内面に捕捉される。その後、流路を切替えて分析用移動相をそのカラムに流し、溶出液を分析計に導入することにより、容易に遊離型薬物のみを分析することができる。
【０００７】
トラップ用移動相として、試料中での遊離型薬物とタンパク結合型薬物との平衡状態を維持するように調製された溶媒を使用すると、試料中での平衡が保たれた状態で遊離型薬物濃度のみが内面浸透制限型カラムに捕捉されるので、遊離型薬物濃度の定量精度が向上する。
【０００８】
本発明の遊離型薬物測定方法を実施するための測定装置は、上記の内面浸透制限型カラムを備えた前処理部と、タンパク質含有試料をトラップ用移動相により供給する試料導入部と、前記カラムに捕捉された薬物を溶出させる分析用移動相を供給する分析用移動相供給部と、前記カラムから分析用移動相により溶出された薬物を検出する分析計と、前記試料導入部を前記カラムに接続する分離用流路及び前記分析用移動相供給部を前記カラムに接続しそのカラムからの溶出液を前記分析計に導く分析用流路の間で切り替える流路切替え部とを備えている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
内面浸透制限型カラムに充填する充填剤は、外表面がタンパク質に対して不活性になる処理が施され、孔内面に薬物を捕捉する化学修飾が施されたものである。
充填材の外表面をタンパク質に対して不活性になるように処理する方法としては、シリカゲルの外表面をタンパク質に対して不活性なポリマーでコーティングしたり、シリカゲルの外表面をアルブミンなどのタンパク質で予めコーティングして新たなタンパク質が吸着しないようにすることなどが挙げられる。
【００１０】
充填材の穴内面を化学修飾する方法としては、オクタデシル基やイオン交換基で化学修飾することなどを挙げることができる。
そのような充填材を充填したカラムの具体的なものとしては、シリカゲルの外表面をタンパク質に対して不活性なポリマーでコーティングし穴内面のみをオクタデシル基で化学修飾した充填材を充填したもの（製品として、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＭＡＹＩ−ＯＤＳ：株式会社島津製作所の製品）がある。
【００１１】
これらの充填剤を充填した内面浸透制限型カラムに血清や血漿などの生体試料を導入すると、タンパク質結合型薬物は、たんぱく質のサイズの大きさによってこの充填剤に捕捉されずに排出され、遊離型薬物は充填材の穴に入り化学修飾されている内面に捕捉される。
【００１２】
次に、図１を参照して一実施例を具体的に説明する。
２は前処理カラムとしての内面浸透制限型カラムであり、一例としてシリカゲルの外表面をタンパク質に対して不活性なポリマーでコーティングし穴内面のみをオクタデシル基で化学修飾した充填材を充填したもの（Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＭＡＹＩ−ＯＤＳ：株式会社島津製作所の製品）を使用する。カラム２は流路切替え部を構成する六方バルブ４の２つのポート間に接続されている。
【００１３】
六方バルブ４の他の１つのポートにはカラム２に試料をトラップ用移動相により導入するための試料導入部が接続され、その試料導入部はトラップ用移動相を供給する送液ポンプ６と、その移動相流路に配置された試料注入用オートサンプラ８を備えている。トラップ用移動相としては、試料中のタンパク結合型薬物と遊離型薬物の平衡が保たれるように、分析対象の生体液に近い組成、例えば塩濃度とｐＨが分析対象の生体液と同じになるように調整された溶液が好ましい。
【００１４】
六方バルブ４のさらに他の１つのポートには、分析用移動相を供給するための分析用移動相供給部が接続されており、その分析用移動相供給部は２台の移動相用送液ポンプ１０，１２と、それらの送液ポンプ１０，１２から供給される移動相を混合するミキサー１４を備えている。分析用移動相は目的対象物に応じて種々の溶媒を使用することができ、この実施例では２種類の溶媒を混合してグラジエント分析を行なえるようにしている。分析用移動相の一例として、ポンプ１０から酢酸アンモニウム溶液を供給し、ポンプ１２からアセトニトリル又はメタノールを供給する。しかし分析用移動相はこれに限られるものではない。
【００１５】
六方バルブ４のさらに他のポートには分析計として高速液体クロマトグラフの分析用カラム１６が接続されている。分析用カラム１６の下流には分析用カラム１６からの溶出液から薬物を検出するために、ＵＶ（紫外線）検出器１８が設けられ、更にその下流にはスプリッタ２０を介して質量分析計２２が接続されている。分析用カラム１６からの溶出液の量によってはスプリッタを備えないで質量分析計２２に直接供給するものであってもよい。
六方バルブ４のさらに他の１つのポートは前処理カラム２から流出する液をドレインに排出する排出用ポートである。
【００１６】
図１の実施例において、まず六方バルブ４を図示の流路に設定し、ポンプ６からトラップ用移動相を供給し、オートサンプラ８から分析対象試料、例えば血漿を注入する。注入された試料は前処理カラム２を通り、試料中のタンパク結合型薬物は排出用ポートからドレインへ排出され、遊離型薬物が前処理カラム２に捕捉される。
【００１７】
その後、六方バルブ４を切り替える。ポンプ１０，１２を作動させ、ミキサー４で混合した分析用移動相を六方バルブ４から前処理カラム２に供給し、前処理カラム２に捕捉されていた遊離型薬物を溶出して六方バルブ４から分析用カラム１６に導入する。分析用カラム１６では供給された溶液中の遊離型薬物を夾雑物から分離し、溶出してＵＶ検出器１８と質量分析計２２に導き、定性と定量を行なう。
【００１８】
検出計としては、実施例としてはＵＶ検出器１８と質量分析計２２を備えているが、ＵＶ検出器１８だけでもよく、あるいは質量分析計２２だけでもよい。
また、実施例では分析用カラム１６を備えているが、分析用カラム１６を省略し、前処理カラム２で捕捉された遊離型薬物を質量分析計２２に直接導入するようにしてもよい。
さらに、質量分析計２２としてはＭＳ／ＭＳ（タンデム質量分析法）を用いてもよい。
【００１９】
【発明の効果】
本発明では、内面浸透制限型カラムを前処理カラムとして用い、タンパク質含有試料をトラップ用移動相により前処理カラムに通してその試料中の遊離型薬物を捕捉し、タンパク結合型薬物を排出させ、前処理カラムに捕捉された遊離型薬物を分析用移動相により溶出させて分析計に導いて分析するようにしたので、遊離型薬物のみを迅速に、かつ容易に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一実施例を示す概略構成図である。
【符号の説明】
２      前処理カラムである内面浸透制限型カラム
４      流路切替え部である六方バルブ
６      トラップ用移動相用の送液ポンプ
８      オートサンプラ
１０，１２      分析用移動相用の送液ポンプ
１４      ミキサー
１６      分析用カラム
１８      ＵＶ検出器
２０      スプリッタ
２２      質量分析計
【図１】
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