(57)【要約】【課題】優れた抗ＨＩＶ活性を有する新規化合物を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）：【化１】2004067605.tif 000007（式中、Ｘは−ＳＣＨ３又は−Ｓ＋ＣＨ３Ｒ１を示し；Ｒ１、Ｒ４はそれぞれ水素原子又は炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基を示し；Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素原子、炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基、又は炭素数２から１５のアシル基を示す。）で表される化合物、および該化合物を有効成分として含有する医薬。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2004067605.tif 000005
（式中、Ｘは−ＳＣＨ３又は−Ｓ＋ＣＨ３Ｒ１を示し；Ｒ１、Ｒ４はそれぞれ水素原子又は炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基を示し；Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素原子、炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基、又は炭素数２から１５のアシル基を示す。）
で表される化合物。
【請求項２】
下記式（ＩＩ）：
【化２】
2004067605.tif 000006
で表される化合物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を有効成分として含有する医薬。
【請求項４】
抗ＨＩＶ薬である請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
エイズ（ＡＩＤＳ）を予防及び／又は治療するための請求項３に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗ＨＩＶ薬等の医薬の有効成分として有用な新規化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＩＤＳ））はヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１：　ＨＩＶ−１）がヒトのＴ細胞に感染して破壊し、免疫機能を低下させる疾患である。ＵＮＡＩＤＳの報告によると、現在世界中には約４０００万人のＨＩＶ−１感染者およびエイズ（以下、ＡＩＤＳという）患者がいると報告され、そのうち９０％近くは発展途上国に集中している。
【０００３】
ＡＩＤＳの原因ウイルスとして１９８３年にＨＩＶ−１が発見・同定されて以来、これまで多くの抗ＨＩＶ薬に関する研究や開発が行われてきた。現在臨床で使用されている抗ＨＩＶ薬は、大きく分けて逆転写酵素阻害剤（ＡＺＴ，ｄｄＩ，ｄｄＣ，ｄ４Ｔ，３ＴＣ等）とプロテアーゼ阻害剤（リトナビル、インディナビル、サキナビル、ネルフィナビル等）の２種類があり、ＨＡＡＲＴ　（ｈｉｇｈｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ　ｔｈｅｒａｐｙ）　と呼ばれるそれらの併用療法が有効であるとされている。しかしながら、上記のプロテアーゼ阻害剤はいずれも高価であること、しばしば腎結石等の副作用をもたらすこと、ＨＩＶ−１のもつ易変異性による薬剤耐性ウイルスが出現すること等の種々の問題がある。また、ワクチンはＨＩＶ−１が外被糖蛋白質の遺伝子を変異させるためすぐに効力を失ってしまう。従って、優れた抗ＨＩＶ活性を有するとともに、安全性が高くしかも低コストのＡＩＤＳ治療薬の開発が望まれている。
【０００４】
レトロウイルス複製の一般的な特徴は、ウイルスの産生するプロテアーゼがウイルスの前駆体タンパクをプロセシングすることによって、ウイルスの構成及び機能に必要な成熟タンパク質を生成することにある。ＨＩＶ−１の場合も、ＨＩＶ−１が粒子を組み立てている間、ＨＩＶ−１　プロテアーゼはＧａｇ前躯体とＧａｇ−Ｐｏｌ前躯体を切断して、ウイルスの複製に必要な構造タンパク質（ｐ１７ｇａｇ、ｐ２４ｇａｇ、ｐ２ｇａｇ、ｐ７ｇａｇ、ｐ１ｇａｇ、ｐ６ｇａｇ）とウイルスの酵素（プロテアーゼ、逆転写酵素／ＲＮアーゼＨ、インテグラーゼ）にする（Ｋｏｈｌ，Ｎ．Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５，　４６８６−４６９０，　１９８８；Ｖａｉｓｈｎａｖ，Ｙ．Ｎ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６０，　５７７−６３０，　１９９１）。つまり、ＨＩＶ−１　プロテアーゼはウイルス自身の感染性獲得に必須である。従って、上記プロセシングを阻害すれば、感染性のウイルスを防止することができると考えられる。例えば、Ｋｏｈｌ，　Ｎ．　Ｅ．らは上記文献において、ＨＩＶ−１がコードするプロテアーゼが遺伝的に不活性になると成熟した感染性ウイルス粒子が産生されないことを明らかにしている。すなわち、ＨＩＶ−１プロテアーゼ活性の阻害物質は、ＨＩＶ感染やＡＩＤＳ発症の予防若しくは治療のための医薬として有用であると考えられる。このような考えに基づき、ＨＩＶ−１プロテアーゼ活性の阻害物質が探索され、既に多くの阻害物質が合成され、また、自然界から見出されており、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで抗ＨＩＶ活性を示すものが報告されている（Ｓ．　Ｔｈａｉｓｒｉｖｏｎｇｓ，Ａｎｎ．　Ｒｅｐｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　１３３−１３４，　１９９４；Ａ．　Ｗｌｏｄａｗｅｒ，　Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，１４（６　Ｐｔ２），　９Ｓ−２０Ｓ，　１９９４；Ｇ．　Ｍｏｙｌｅ　ａｎｄ　Ｂ．　Ｇａｚｚａｒｄ，　Ｄｒｕｇｓ，　５１，　７０１−７１２，　１９９６）。本発明者らは、前駆体タンパク質Ｐｒ５５ｇａｇの最終プロセング産物であるｐ２　ペプチド　（ＡＥＡＭＳＱＶＴＮＴＡＴＩＭ）　がｉｎ　　ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１　プロテアーゼ活性を自殺的に阻害する　（Ｋｉ　＝　３０．２μＭ，　ＩＣ５０　＝　１０μＭ）　ことを発見した。さらに、その阻害様式はプロテアーゼの活性二量体形成の阻害によることが明らかにされている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は優れた抗ＨＩＶ活性を有する新規化合物を提供することにある。
本発明の別の課題は、上記化合物を有効成分として含有する、副作用がなく低コストの抗ＨＩＶ薬等の医薬を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、内因性のＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害物質であるｐ２　ペプチド　（ＡＥＡＭＳＱＶＴＮＴＡＴＩＭ）に着目し、この物質の構造活性相関の解析を進めた結果、メチオニンとグルタミン酸とが結合した化合物が優れた抗ＨＩＶ活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、下記式（Ｉ）：
【化３】
2004067605.tif 000002
（式中、Ｘは−ＳＣＨ３又は−Ｓ＋ＣＨ３Ｒ１を示し；Ｒ１、Ｒ４はそれぞれ水素原子又は炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基を示し；Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素原子、炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基、又は炭素数２から１５のアシル基を示す。）
で表される化合物を提供するものである。
【０００８】
本発明の好ましい態様によれば、下記式（ＩＩ）：
【化４】
2004067605.tif 000003
で表される化合物が提供される。
【０００９】
本発明の別の観点からは、本発明により、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を有効成分として含有する医薬が提供される。
この医薬は、抗ＨＩＶ薬、ＡＩＤＳを予防及び／又は治療するための医薬として用いることができる。
【００１０】
さらに別の観点からは、上記の医薬の製造ための上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の使用；ＡＩＤＳの予防及び／又は治療方法であって、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上記式（Ｉ）において置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の「炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基」としては、飽和又は不飽和の炭素数１から２０の脂肪族炭化水素基、例えば炭素数１から２０のアルキル基又は炭素数１から２０のアルケニル基が挙げられる。アルキル基又はアルケニル基は、直鎖状、分枝鎖状のいずれでもよく、アルケニル基中の不飽和結合の個数は特に限定されないが、例えば１個ないし３個、好ましくは１個である。具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デジル、ウンデチル、ドデシル、テトラデシル、エイコシル等のアルキル基；エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−エチル−２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、１−メチル−２−ブテニル、１−メチル−１−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、２−メチル−４−ペンテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル等のアルケニル基が挙げられる。これらのうち、炭素数１から４のアルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
【００１２】
上記式（Ｉ）において置換基Ｒ２、Ｒ３の「炭素数２から１５のアシル基」としては、直鎖状若しくは分枝鎖状のいずれもでもよく、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ヘキサノイル、ピバロイル、オクタノイル、ノニルカルボニル、デシルカルボニル、３−メチルノニルカルボニル、８−メチルノニルカルボニル、３−エチルオクチルカルボニル、３，７−ジメチルオクチルカルボニル、ウンデシルカルボニル、ドデシルカルボニル、トリデシルカルボニル、テトラデシルカルボニルのような脂肪族アシル基；ベンゾイル、α−ナフトイル、β−ナフトイルのような芳香族アシル基等が挙げられる。なかでも、炭素数２から６のアシル基が好ましく、アセチル基又はプロピオニル基がより好ましい。
また、式（Ｉ）において、上記に定義される置換基Ｒ２、Ｒ３は同一であることが好ましい。
【００１３】
上記式（Ｉ）の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の種類により不斉炭素等に基づく光学異性体又はジアステレオマー等の立体異性体が存在するが、本発明の範囲には純粋な立体異性体のほか、任意の立体異性体の混合物又はラセミ体等が包含される。さらにオレフィン性二重結合の幾何異性に基づく幾何異性体が存在するが、純粋な形態の幾何異性体のほか、任意の幾何異性体の混合物も本発明の範囲に包含される。
【００１４】
本発明の範囲には、遊離形態の上記化合物のほか、上記化合物の塩、好ましくは生理学的に許容される塩が包含される。生理学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、臭化水素塩、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、酢酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、アスコルビン酸、クエン酸、サリチル酸、ニコチン酸、酒石酸等の有機酸との塩；ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩；マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩等が挙げられる。さらに本発明の範囲には、上記化合物又はその塩の水和物又は溶媒和物が包含される。溶媒和物を形成する有機溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、エーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を例示することができる。
【００１５】
上記式（Ｉ）で表される化合物のうち、好ましい化合物は上記式（ＩＩ）で表される化合物である。本明細書において、上記式（ＩＩ）で表される化合物を「シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）」と呼ぶ場合がある。
【００１６】
シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）の調製は、メチオニンとグルタミン酸とを等モル量酸性の水媒体に供給し、水媒体中で触媒の存在下、非存在下で反応させて調製することができる。
【００１７】
また、シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）は公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えばＳｃｈｒｅｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋｅ，　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，　ｖｏｌ．１，　１９９６，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮｅｗＹｏｒｋ，　Ｕ．Ｓ．Ａ等の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法等）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法等、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。本発明においては、上記のような一般的なポリペプチドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワイズ法による方法を用いることができる。
【００１８】
ステップワイズ法による固相合成は、例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ．Ｒ．Ｂ．，　Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，　８５，　２１４９−２１５９，　１９６３に従い、以下のようにして行うことができる。まず、アミノ基を保護した第１のアミノ酸（本発明ではグルタミン酸）をそのカルボキシル基（グルタミン酸ではγ−カルボキシル基）によって不溶性樹脂に結合させ、その後、上記第１のアミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性アミノ基に、アミノ基を保護した第２のアミノ酸（本発明ではメチオニン）の反応性カルボキシル基を縮合反応により結合させる。その後、第２のアミノ酸のアミノ基の保護基及び第１のアミノ酸のα−カルボニル基の保護基を除去した後、環状化させ、合成された環状ジペプチドを不溶性樹脂からはずす。
【００１９】
上記の固相合成において用いられる不溶性樹脂は、第１のアミノ酸の反応性カルボキシル基（グルタミン酸ではγ−カルボキシル基）との結合性を有するものであればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂等が挙げられる。
【００２０】
また、第１のアミノ酸のアミノ基の保護基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフイノチオイル等の基が挙げられる。
【００２１】
一方、第２のアミノ酸のカルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬等も公知のものから適宜選択すればよい。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等とのエステル）等を形成させることにより行う。
ここで、本発明においては第１のアミノ酸であるグルタミン酸のα−カルボキシル基が上記の活性化を受けないように保護しておく必要がある。かかる手段としては、例えばアリル基やＤｍａｂエステル（４−｛Ｎ−［１−（４，４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２，６−ｄｉｏｘｏ−ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｉｄｅｎｅ）−３−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｈｙｌ］−ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｙｌｏｘｙによる保護が挙げられる。
【００２２】
上記の固相における反応性アミノ基と反応性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用できるものであればいずれでもよい。例えば無水又は含水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）等を単独で、あるいは２種以上の混合溶媒として使用することができる。
【００２３】
また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（ＤＣＣ）、カルボジイミダゾール等のカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Ｂｏｐ試薬）等の存在下に行うこともできる。
【００２４】
得られたペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。精製のための手段としては、例えばＤＥＡＥ−セルロース等のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０　、セファデックスＧ−２５　等の分配クロマトグラフィー、シリカゲル等の順相クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲル等の逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００２５】
また上記式（Ｉ）で表される化合物は、上記のようにして合成したシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）中の水素原子を通常のアルキル化、アシル化手法によりそれぞれ上記に定義されたＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の置換基にすることにより合成することができる。
【００２６】
本発明の化合物は、後述する実験例の記載の通り、ＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を示す。従って、本発明の化合物は抗ＨＩＶ薬のほか、ＡＩＤＳの予防及び／又は治療のため医薬として有用である。
【００２７】
本発明の医薬は他の抗ＨＩＶ薬やＡＩＤＳ予防治療薬、特に逆転写酵素阻害薬、例えばジドブシン、ジダノシン、ザルシタビン、ラミプジン、スタブジン等と併用してもよい。
【００２８】
本発明の医薬は、使用目的に応じて投与方法、剤型、又は投与量を適宜決定することが可能である。本発明の医薬の投与形態は、経口投与でも非経口投与でもよい。本発明の医薬の形態は特に限定されないが、例えば、粉剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、溶剤等の経口投与剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等の非経口投与剤等を挙げることができる。これらの製剤は、その剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、滑沢剤、コーティング剤、基材等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、既知の方法で医薬組成物として調製することができる。注射剤の場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とする。
【００２９】
経口投与に適する医薬組成物には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
【００３０】
注射あるいは点滴用に適する医薬組成物には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の添加物を用いることができる。
【００３１】
本発明の医薬の投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、又は体重によっても異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、成人に経口で投与する場合、通常、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、非経口で投与する場合、通常、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは、０．０１〜２ｍｇ／ｋｇ／日を投与する。これを１回あるいは数回に分割して投与すればよい。
【００３２】
【実施例】
以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明の各実施例において用いる試薬の入手先はそれぞれ以下の通りである。ドデシル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ＰＭＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、平均分子量８０００）は、シグマアルドリッチジャパン株式会社（東京、日本）；ワコシル−ＰＴＣ（登録商標）ＨＰＬＣカラム（４．０×１５０ｍｍ）、ＢＳ３、トリトンＸ−１００は、和光純薬工業株式会社（大阪、日本）；化学蛍光剤は、パーキン−エルマー・ライフ・サイエンシーズ社（ボストン、マサチューセッツ州）；ＲＰＭＩ−１６４０培地は日水製薬株式会社；ＨＩＶ−１陽性の血漿はスクリップス・ラボラトリーズ（サン・ディエゴ、カリフォルニア州）；ポリビニリデン・ジフルオリドは日本ミリポア株式会社（東京、日本）。合成オリゴペプチドの純度は、基質を用いたＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ−ＭＳ分析装置で確認した。
【００３３】
（実施例１）　シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）の合成
Ｌ−グルタミン酸　γ−ｔ−ブチルエステル−２−クロロトリチル−レジン（２．１３　ｍｍｏｌ，　レジン　２．５ｇ　に相当）　をジメチルホルムアミド　（ＤＭＦ，　１５ｍｌ）に加え、十分に膨潤させ、ＤＭＦを除いた。このレジンにフルオロメトキシカルボニル　（Ｆｍｏｃ）−Ｍｅｔ（４．２５　ｍｍｏｌ，　１．５８　ｇ）を含むＤＭＦ溶液１５ｍｌ、Ｎ−メチルモルホリン０．７　ｍｌ、　Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール　（ＨＯＢｔ，　４．２５　ｍｍｏｌ，　０．６５ｇ）　及びベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ，　４．２５　ｍｍｏｌ，　１．８８ｇ）を含むＤＭＦ　溶液５　ｍｌを加え、室温で２時間撹拌した。
反応により生じたジペプチド−レジンをＤＭＦ及びジクロロメタン（ＤＣＭ）で十分に洗浄し、２０％ピペリジンを含むＤＭＦ１５　ｍｌ中で３０分間撹拌した。この操作によって、Ｆｍｏｃ基を除去したジペプチド−レジンをＤＭＦで洗浄し、弱酸（氷酢酸：ＴＦＥ　（トリフルオロエタノール）：ＤＣＭ＝１：１：８）１５ｍｌにて３０分間処理してレジンを除き、凍結乾燥した。得られたＭｅｔ−Ｇｌｕ（ｏｔＢｕ）ジペプチドをＤＭＦ　（３０　ｍｌ）に溶解し、Ｎ−メチルモルホリン　（０．７　ｍｌ）、ＨＯＢｔ（４．２５　ｍｍｏｌ，　０．６５ｇ）　及びＢＯＰ（４．２５　ｍｍｏｌ，　１．８８ｇ）を含むＤＭＦ　溶液（５　ｍｌ）を加え、室温で一夜撹拌し、環状化した。この反応溶液を１０　ｍｌに濃縮して、冷水４０　ｍｌを加えて、生じる沈殿を集め、少量のＣＨ３ＣＮに溶かし、凍結乾燥した。
得られたシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ））をＴＦＡ（１００％，　３　ｍｌ）に溶かし、０℃、２時間、脱保護を行い、凍結乾燥し、ＨＰＬＣで精製して用いた。得られたシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）の質量分析の結果、シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）の質量数（図１）をＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ−ＭＳ分析装置によって確認した。なお、収率は　１０％であった。
【００３４】
（参考例）　プロテアーゼ阻害アッセイ
プロテアーゼ阻害アッセイは文献（Ｍｉｓｕｍｉ，Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４１，２７５−２８０，　１９９７）に従って実施した。ＨＩＶ−１プロテアーゼ（以下、ＨＩＶ−１　ＰＲ）の活性は、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ　５．５）中で１ｍＭのスクシニル（Ｓｕｃ）−ＳＱＮＹＰＩＶＱを基質として用い、ペプチド性阻害物質が存在する場合と存在しない場合について常法に従って測定した。ペプチド性阻害物質は別途５０ｍＭのＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ　５．５）に溶解させ、いろいろな濃度のものを別々に作った。阻害物質溶液３０μｌと酵素溶液５０μｌ（２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡを含む同じ緩衝溶液中に０．１３４μｇ／μｌ）の混合物を３７℃にて３０分間にわたってプレインキュベーションし、基質溶液（２０μｌ）を添加した。ペプチド性阻害物質を種々の濃度（０〜２５０μＭ）にしたこの混合物を、１２０分間にわたって３７℃に維持した。酵素反応は、１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むアセトニトリル（１００％、１１．１μｌ）を添加することにより停止させた。遊離されたＳｕｃ−ＳＱＮＹの量は、ワコシル−ＰＴＣ（４．０×１５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣによって推定し、酸加水分解物（１３１℃、２時間）のアミノ酸分析によって決定した。活性を５０％低下させるのに必要な阻害物質の濃度（ＩＣ５０）は、グラフを用い阻害率と阻害物質の濃度の関係を示す曲線から決定した。
【００３５】
（実施例２）　改変ｐ２ペプチドとシクロオリゴペプチドのＨＩＶ−１　プロテアーゼ活性阻害
（１）実験方法
合成ｐ２ペプチド（ＡＥＡＭＳＱＶＴＮＴＡＴＩＭ）はインビトロでＨＩＶ−１　ＰＲ活性を阻害し、１０μＭ　でＩＣ５０となり、２５０μＭでＨＩＶ−１　ＰＲの活性を完全に阻害する。また、阻害定数Ｋｉは３０μＭである（Ｍｉｓｕｍｉ，Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　２４１，２７５−２８０，　１９８７）。コンセンサス配列ＡＥＡＭＳＱのＣ末端から延びるさまざまな長さの改変ｐ２ペプチドを調製して分析したところ、ＡＥＡＭＳＱのＣ末端にＶＴＮを付加したノナｐ２ペプチドＡＥＡＭＳＱＶＴＮが強い阻害活性（ＩＣ５０＝５μＭ）を有し、阻害活性を示すｐ２ペプチドの最小長であることわかっている（Ｍｉｓｕｍｉ，Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　同上）。本実験では、アラニンで置換した種々の改変ｐ２ペプチドを合成し、ｐ２ペプチド配列の構造活性相関を明らかにする。
【００３６】
（２）実験結果
完全長ノナｐ２ペプチド（ＡＥＡＭＳＱＶＴＮ）のいずれかのアミノ酸をアラニンで置換することにより得られたペプチドについて上記参考例に記載の方法にて測定したＨＩＶ−１　ＰＲ活性のデータを表１に示す。
【００３７】
【表１】
2004067605.tif 000004
【００３８】
Ｅ２とＳ５がアラニンで置換されることにより、活性がそれぞれ２０分の１、２４．８分の１に減少した。Ｍ４とＴ８における置換は、それぞれ阻害活性にとって極めて重要だった（表１）。完全長ｐ２ペプチド（ＡＥＡＭＳＱＶＴＮＴＡＴＩＭ）においてＭ４又はＴ８がアラニンで置換されていたり、Ｍ４が欠失していたりすると、やはり阻害活性が低くなる（それぞれＩＣ５０＝１４２、１１０、１２６μＭ）（表１）。これらの結果より、ｐ２ペプチドがＨＩＶ−１　ＰＲに対して強い阻害活性を示すためにはＭ４やＴ８の側鎖が必要であることがわかった。
【００３９】
また、ノナｐ２ペプチドＡＥＡＭＳＱＶＴＮが強い阻害活性を有する一方で、ヘキサｐ２ペプチドＡＥＡＭＳＱ、及びそれに１個又は２個のアミノ酸を付加したペプチド（ＡＥＡＭＳＱＶとＡＥＡＭＳＱＶＴ）は阻害活性を示さないため、ノナｐ２ペプチドの阻害効果が、二次構造を取る能力に依存している可能性があると考えられた。そこで、ノナｐ２ペプチドの構造の半経験的なＭＯ計算（ＭＮＤＯ−ＰＭ３）（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｊ．Ｐ．，　Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，　１０，　２０９−２２０，　１９８９；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｊ．Ｐ．，　Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，　１０，　２２１−２６４，　１９８９）を一部を変更したＭＯＰＡＣ６．０（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｊ．Ｐ．（１９８９）ＱＣＰＥ　Ｂｕｌｌ．９，１０）を用い、ＳＰＡＲＴＡＮインターフェイスを通じてＳｃｉｅｎｔｉｓｔｓ’　Ｐａｒａｄｉｓｅ　Ｄｒａｇｏｎ　ＡＸＰ５Ａ／４３３コンピュータで実行した。ノナｐ２ペプチドのＰＭ３構造を最適化した結果から、ｐ２ペプチドのＮ末端領域（１−９）がαヘリックスを形成することが予測された。このデータは、ｐ２ペプチドの高度に保存されているＮ末端が、ｐ２４タンパク質において始まるαヘリックスの一部を形成することがＰＨＤプログラムによって予測されるというモデルのデータと矛盾しない（Ａｃｃｏｌａ，Ｍ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，　７２，　２０７２−２０７８，１９９８）。
【００４０】
これらの結果に基づき、２つの新たな阻害候補物質、すなわちシクロ（メチオニン−トレオニン）（シクロ（Ｍｅｔ−Ｔｈｒ））とシクロ（メチオニン−グルタミン酸）（シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ））を合成し、ＨＩＶ−１　ＰＲに対するこれら物質の阻害効果を評価した。表１に示したように、シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）は組み換えＨＩＶ−１　ＰＲの活性を強く阻害した（ＩＣ５０＝２４μＭ）のに対し、シクロ（Ｍｅｔ−Ｔｈｒ）は阻害活性がなかった。
【００４１】
（実施例２）ＨＩＶ−１　ＰＲの架橋
（１）実験方法
先の研究において、ｐ２ペプチドで処理したＨＩＶ−１　ＰＲの排除ゲルろ過により、ｐ２ペプチドがＨＩＶ−１　ＰＲの活性に及ぼす阻害効果はＨＩＶ−１　ＰＲの二量体が単量体に解離するため生じることが示された（（Ｍｉｓｕｍｉ，Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．，　同上）。この結論をさらに裏付けるために、ｐ２ペプチドとシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）が存在している場合と存在していない場合のＨＩＶ−１　ＰＲの二量体の安定性を架橋反応で試験した。
【００４２】
Ｐａｕｌｕｓらのプロトコルに変更を施したプロトコルに従って架橋反応を起こさせた（Ｐａｕｌｕｓ，Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２７４，２１５３９−２１５４３，　１９９９）。組み換えＨＩＶ−１　ＰＲ（１６．２ピコモル／μｌ、１００μｌ）を、ｐＨ　７．２のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−））からなる１００μｌの緩衝溶液中にｐ２ペプチド又はシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）（１００μＭ）が存在している状態、又は存在していない状態で、２５℃にて４０分間にわたってプレインキュベーションした。ホモ二価性架橋剤ＢＳ３をＰＢＳ（−）に溶解し、それを反応容積の１％の割合で添加して、ＢＳ３の最終濃度を０．２４ｍＭにした。対照サンプルには溶媒だけを入れた。サンプルを５分間反応させ、４０ｍＭのトリス（２μｌ）で反応を停止させ、４０．４％のトリクロロ酢酸（１００μｌ）と２．０２ｍｇ／ｍｌのデオキシコール酸ナトリウム（１００μｌ）を添加してタンパク質を沈殿させた。得られたペレットを氷冷アセトンで洗浄し、空気中で乾燥させた。タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル上で溶解させ、電気泳動により分離したタンパク質をＰＶＧＦ膜の上にブロットし、マウスの抗ＨＩＶ−１　ＰＲ抗体（イムノディアグノスティックス社、ウーバン、マサチューセッツ州）で検出した。ケミルネッセンス法によりバンドを可視化した。
【００４３】
（２）実験結果
図２はｐ２ペプチド、及びシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）がＨＩＶ−１　ＰＲのサブユニットの架橋に及ぼす効果を示す。図２上は２２−ｋＤａのＨＩＶ−１　ＰＲ二量体を表わすバンド、図２下は１１−ｋＤａのＨＩＶ−１　ＰＲ単量体を表わすバンドを示す。
以前の研究から予想されるように、架橋反応の際にｐ２ペプチドが存在しているとＨＩＶ−１　ＰＲの二量体が解離した（図２、レーン３）のに対し、存在していないと二量体が形成された（図２、レーン２）。シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）もｐ２ペプチドと同様、ＨＩＶ−１　ＰＲの二量体の形成を阻害した（図２、レーン４）。
【００４４】
【発明の効果】
本発明の化合物は優れたＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害活性を有している。従って、本発明の化合物は、抗ＨＩＶ薬、ＡＩＤＳの予防及び／治療のための医薬の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】シクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）のＭＡＬＤＩ　ＴＯＦ−ＭＳ分析結果を示す。
【図２】ｐ２ペプチド、及びシクロ（Ｍｅｔ−Ｇｌｕ）がＨＩＶ−１　ＰＲのサブユニットの架橋に及ぼす効果を示す。
【図１】
2004067605.tif 000008
【図２】
2004067605.tif 000009