(57)【要約】【課題】微生物を含む液状検体から微生物の計数を迅速に行うことができる方法および当該方法を実施するために用いる微生物捕捉部材を提供すること。【解決手段】本発明の微生物計数方法は、微生物を濾過して捕捉することができる所定の微細な大きさを有する濾過領域を平面上に離間させて多数設けたことによって濾過領域が特定された微生物捕捉部材の上方から、微生物を含む液状検体を滴下して濾過することで濾過領域の表面に微生物を捕捉した後、個々の濾過領域を順次光学的に検査して、検体中の微生物を計数することを特徴とする。また、本発明の微生物捕捉部材は、所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた２枚の平板で濾過膜を挟持し、一方の平板の細孔から濾過膜を介して他方の平板の細孔へ液状検体が濾過されるように構成したことで濾過領域が特定されていることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を濾過して捕捉することができる所定の微細な大きさを有する濾過領域を平面上に離間させて多数設けたことによって濾過領域が特定された微生物捕捉部材の上方から、微生物を含む液状検体を滴下して濾過することで濾過領域の表面に微生物を捕捉した後、個々の濾過領域を順次光学的に検査して、検体中の微生物を計数することを特徴とする微生物計数方法。
【請求項２】
個々の濾過領域の大きさを直径１〜１０００μｍの円形とすることを特徴とする請求項１記載の微生物計数方法。
【請求項３】
微生物を含む液状検体を滴下する微生物捕捉部材の面積に対する濾過領域全体の面積の比率が１０〜７５％であることを特徴とする請求項１または２記載の微生物計数方法。
【請求項４】
濾過膜の表面に所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた平板を密着させることで微生物捕捉部材とし、当該平板の上方から微生物を含む液状検体を滴下して濾過することで平板に設けた細孔部分に相当する濾過膜部分を濾過領域としてその表面に微生物を捕捉することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物計数方法。
【請求項５】
微生物を含む液状検体および／または濾過領域の表面に捕捉された微生物に蛍光発色試薬を添加することで微生物を蛍光発色させて計数することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物計数方法。
【請求項６】
コンピュータの移動プログラムによってステージ駆動が可能なオートステージに微生物捕捉部材を載置し、個々の濾過領域をオートスキャニングして計数することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物計数方法。
【請求項７】
所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた２枚の平板で濾過膜を挟持し、一方の平板の細孔から濾過膜を介して他方の平板の細孔へ液状検体が濾過されるように構成したことで濾過領域が特定されていることを特徴とする微生物捕捉部材。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物（その意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念である）を含む液状検体から微生物の計数を迅速に行うことができる方法と当該方法を実施するために用いる微生物捕捉部材に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
この種の微生物計数方法に関する発明としては、例えば、下記の特許文献１に記載されている、親水性の濾過膜で検体液を濾過し、その検体液中に含まれている生菌を該濾過膜上に捕捉し、次いでその上から生菌中のアデノシン−３−燐酸を抽出するための沸点が１２０℃以下の揮発性抽出剤を噴霧しつつ、又はした後、室温もしくは加温して液体を揮散せしめてから、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬液を噴霧して発光せしめ、その発光量を発光量測定装置を用いて測定することを特徴とする検体中の生菌数の測定方法などが知られている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平５−３２８９９５号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の方法においては、微生物の捕捉を濾過膜の表面全体において行うので、発光量を測定するためには濾過膜の表面全体をくまなく検査する必要があり、例えば、有効面積が直径２０ｍｍの濾過膜を用いた場合、測定に数時間を費やさなければならないという問題がある。
そこで本発明は、微生物を含む液状検体から微生物の計数を迅速に行うことができる方法および当該方法を実施するために用いる微生物捕捉部材を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の点に鑑みてなされた本発明の微生物計数方法は、請求項１記載の通り、微生物を濾過して捕捉することができる所定の微細な大きさを有する濾過領域を平面上に離間させて多数設けたことによって濾過領域が特定された微生物捕捉部材の上方から、微生物を含む液状検体を滴下して濾過することで濾過領域の表面に微生物を捕捉した後、個々の濾過領域を順次光学的に検査して、検体中の微生物を計数することを特徴とする。
また、請求項２記載の微生物計数方法は、請求項１記載の微生物計数方法において、個々の濾過領域の大きさを直径１〜１０００μｍの円形とすることを特徴とする。
また、請求項３記載の微生物計数方法は、請求項１または２記載の微生物計数方法において、微生物を含む液状検体を滴下する微生物捕捉部材の面積に対する濾過領域全体の面積の比率が１０〜７５％であることを特徴とする。
また、請求項４記載の微生物計数方法は、請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物計数方法において、濾過膜の表面に所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた平板を密着させることで微生物捕捉部材とし、当該平板の上方から微生物を含む液状検体を滴下して濾過することで平板に設けた細孔部分に相当する濾過膜部分を濾過領域としてその表面に微生物を捕捉することを特徴とする。
また、請求項５記載の微生物計数方法は、請求項１乃至４のいずれかに記載の微生物計数方法において、微生物を含む液状検体および／または濾過領域の表面に捕捉された微生物に蛍光発色試薬を添加することで微生物を蛍光発色させて計数することを特徴とする。
また、請求項６記載の微生物計数方法は、請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物計数方法において、コンピュータの移動プログラムによってステージ駆動が可能なオートステージに微生物捕捉部材を載置し、個々の濾過領域をオートスキャニングして計数することを特徴とする。
また、本発明の微生物捕捉部材は、請求項７記載の通り、所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた２枚の平板で濾過膜を挟持し、一方の平板の細孔から濾過膜を介して他方の平板の細孔へ液状検体が濾過されるように構成したことで濾過領域が特定されていることを特徴とする。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物計数方法は、微生物を濾過して捕捉することができる所定の微細な大きさを有する濾過領域を平面上に離間させて多数設けたことによって濾過領域が特定された微生物捕捉部材の上方から、微生物を含む液状検体を滴下して濾過することで濾過領域の表面に微生物を捕捉した後、個々の濾過領域を順次光学的に検査して、検体中の微生物を計数することを特徴とするものである。
本発明の微生物計数方法によれば、微生物の捕捉は所定の微細な大きさを有する濾過領域において行われるので、微生物は言わば特定位置に集菌された状態にある。従って、微生物の計数は個々の濾過領域を順次検査して行えばよいだけであるので、測定時間の短縮を図ることができる。
【０００７】
微生物捕捉部材における個々の濾過領域の大きさは、例えば、直径１〜１０００μｍの円形とすることが好ましい。この際、光学的検査手段における測定視野領域内に１つの濾過領域が存在するように、測定視野領域の大きさを考慮して濾過領域の大きさを選択すれば、より測定時間の短縮を図ることができる。即ち、例えば、光学的検査手段として４０倍対物レンズを装着した蛍光顕微鏡を用いる場合、その測定視野領域の大きさは直径約３００μｍであるので、濾過領域の大きさを直径３００μｍとすれば、１つの濾過領域の検査を１回の測定で済ませることができる。濾過領域の大きさが測定視野領域の大きさよりも大きい場合、１つの濾過領域の測定にスキャニングを必要とする一方、測定視野領域内に複数の濾過領域が存在する場合、微生物の計数過程において、１つの濾過領域の重複測定を回避するために測定済みの濾過領域と未測定の濾過領域を峻別する必要があり、いずれにしても測定時間の短縮を阻害する要因になる恐れがある。
【０００８】
微生物を含む液状検体を滴下する微生物捕捉部材の面積に対する濾過領域全体の面積の比率は、１０〜７５％であることが好ましい。面積比率が１０％を下回ると濾過が円滑に行われなくなる恐れがある一方、面積比率が７５％を上回ると微生物捕捉部材の強度に悪影響を及ぼす恐れがあるからである。なお、所定の面積比率を確保した上で、個々の濾過領域の測定を行うためのスキャニングの回数を減らすためには、微生物捕捉部材における個々の濾過領域の大きさは、直径１００μｍ以上の円形とすることが好ましい。
【０００９】
濾過領域が特定された微生物捕捉部材の具体例としては、濾過膜の表面に所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた平板を密着させたものが挙げられる。このような微生物捕捉部材においては、平板に設けた細孔部分に相当する濾過膜部分が濾過領域となる。微生物を捕捉するための濾過膜（メンブレンフィルター）は、例えば、ポリカーボネート樹脂などのような濾過膜として通常用いられる材質からなるものであればよい。所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた平板は、例えば、メタクリル樹脂などのような合成樹脂からなるものであればよい。濾過膜と平板は、予めまたは用時に接着剤やグリースなどで密着されたものであることが好ましい。また、濾過膜と平板の表面を黒色とすることで紫外線領域の励起光の反射を防止することができる。なお、所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた平板を用いる代わりに、印刷技術により濾過膜の表面を所定のパターンに被覆することで濾過領域を設けてもよい。
【００１０】
濾過膜の表面に所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた平板を密着させた微生物捕捉部材は、例えば、所定の大きさを有する細孔を離間させて多数設けた２枚の平板で濾過膜を挟持し、一方の平板の細孔から濾過膜を介して他方の平板の細孔へ液状検体が濾過されるように構成することが好ましい。図１はこのような微生物捕捉部材の平面図（ａ）と断面図（ｂ）である。図１において、符号１は微生物捕捉部材、符号２は濾過膜、符号３は平板、符号４は細孔である。
【００１１】
微生物捕捉部材における個々の濾過領域の光学的検査による微生物の計数は、例えば、微生物を含む液状検体および／または濾過領域の表面に捕捉された微生物に蛍光発色試薬を添加することで微生物を蛍光発色させて行う。
蛍光発色試薬としては、微生物を蛍光発色させることができるものとして知られている各種の試薬を用いることができる。例えば、蛍光グルコース（２−ＮＢＤＧ：２−［Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ−４ｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）は、生体内へ取り込ませることで微生物を１細胞単位で検出することができ、かつ、生きた微生物を生きたままの状態で検出することができる。また、その反応時間は数分程度と短い。従って、２−ＮＢＤＧを用いた方法は、簡便・迅速かつ高感度な方法であるといえ、生きている微生物のリアルタイム検出ができるといった利点を有する。その他、生きている微生物も死んでいる微生物もいずれも蛍光発色させることができる試薬（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩など）、死んでいる微生物だけを前記発色と異なる波長で蛍光発色させることができる試薬（プロピデュームイオダイドなど）、生きている微生物だけを前記発色と異なる波長で蛍光発色させることができる試薬（６−カルボキシフルオレセインジアセテートなど）、特定微生物由来物質と反応することで前記発色と異なる波長で特定微生物だけを蛍光発色させることができる試薬（大腸菌や大腸菌群が生産する酵素タンパク質であるβ−グルクロニダーゼやβ−ガラクトシダーゼと特異的に反応することによって分解されて４−メチルウンベリフェロンを生成する４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドなど）などを、単独でまたは複数種類を混合して用い、生きている微生物と死んでいる微生物の計数、生きている微生物のみの計数、死んでいる微生物のみの計数、特定微生物のみの計数などを行ってもよい。
【００１２】
図２は微生物捕捉部材に捕捉された微生物の計数を行うための微生物計数装置の一態様を示す概念図である。この微生物計数装置は、光源１０４、光源集光手段としてのレンズ１１０、受光部１１１を含む。光源１０４から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ１１２で分光する。分光された励起光はダイクロイックミラー１１３を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１１０を経て検査台１１６に載置された微生物捕捉部材１の表面に集光される。検査台１１６は微生物捕捉部材１を嵌合させるための陥没部分（装置溝）を有し、ここに微生物捕捉部材１をそのまま組み込むことができる形状としてある。微生物捕捉部材１の表面で励起光によって励起された蛍光は、再びダイクロイックミラー１１３を透過する。その際、蛍光はダイクロイックミラー１１３をそのまま透過し、受光部１１１に到達する。受光部１１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ１１４を経て、受光部１１１に内蔵された光電変換素子１１５に到達し、信号化され、認識される。光電変換素子１１５に到達した蛍光は、微生物判断手段１０５において微生物由来の蛍光または異物由来の蛍光と判断され、微生物由来と判断された蛍光は積算されて、微生物が計数される。微生物捕捉部材を載置する検査台１１６をコンピュータの移動プログラムによってステージ駆動が可能なオートステージとし、個々の濾過領域をオートスキャニングして計数するようにすれば、測定時間のより一層の短縮を図ることができる。この際、測定視野領域内に１つの濾過領域が存在するように、測定視野領域の大きさを考慮して濾過領域の大きさを選択すれば、個々の濾過領域の測定を行う際にオートステージを移動制御する必要がなく、全濾過領域の全微生物の計数に際してのオートステージ移動は、単に個々の濾過領域の間において行えばよいだけであるから、オートステージ移動についての高い位置精度を必要としないという利点がある。
【００１３】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定して解釈されるものではない。
【００１４】
（濾過領域が特定された微生物捕捉部材の作製）
図３と図４にそれぞれ概略的な平面図と断面図を示したプレート本体とホルダ部を厚さ１ｍｍのメタクリル樹脂押出板（デラグラスＡ：旭化成社）を用いて作製した。プレート本体とホルダ部には、濾過領域に相当する５５個の直径３００μｍの細孔（面積約０．０７ｍｍ２）を切削により離間して設けた。なお、個々の濾過領域のスキャニングを容易ならしめるために細孔の位置を特定すべく、各細孔の中心を特定座標に設定してその中心から半径１５０μｍの範囲を切削して細孔とした。
メンブレンフィルターは直径２５ｍｍでポアサイズ０．２２μｍの黒色のもの（ミリポア社）を直径８ｍｍの円形に切断して用いた。
ホルダ部の上面から天然ラテックスを用いて細孔を塞いだ後、下面に高真空グリースを塗抹した。その後、硬化した天然ラテックスを除去して細孔を確保した状態でホルダ部の下面にメンブレンフィルターを圧着してホルダ部とメンブレンフィルターを密着させた。そして、このメンブレンフィルターを密着させたホルダ部をプレート本体にセットすることで微生物捕捉部材とした（図５参照：有効面積に対する濾過領域全体の面積の比率は１３．８％）。
【００１５】
（２−ＮＢＤＧの合成）
１０ｍＬの０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解したＤ−グルコサミン（シグマ社）０．５ｇと、２０ｍＬのメタノールに溶解した７−クロロ−４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ−Ｃｌ）０．５ｇを１００ｍＬ三角フラスコ中で混合し、すぐに窒素ガスをフラスコ内に充填して適当に口を閉じた。このフラスコ全体をアルミホイルで覆い、暗下、３７℃で１８時間以上震盪反応を行った。その後、エバポレーター（３７℃）を用いて反応生成物からメタノールを除去した後、蒸留水にて全量を１０ｍＬとした。この反応性生物の溶液を、予め蒸留水で一晩以上膨潤させておいたアニオン性ゲルであるＤＥＡＥセファデックスＡ−５０｛ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−５０：２．０ｇ／Ｄ．Ｗ．：３００ｍＬ（アマシャムファルマシア社）｝を充填した内径３０ｍｍ×高さ２００ｍｍのオープンカラムにローディングし、溶離液に蒸留水を用いて溶出した。これにより溶出してくるオレンジ色の反応生成物を回収し、再びエバポレーター（３７℃）を用いて濃縮した。これを予め蒸留水で膨潤させておいたセファデックスＬＨ−２０｛Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０：２０ｇ／Ｄ．Ｗ．：２００ｍＬ（アマシャムファルマシア社）｝を充填した内径２０ｍｍ×高さ２５０ｍｍのオープンカラムにローディングした。このゲル濾過により未反応のＤ−グルコサミンを除去し、回収した溶出液を凍結乾燥機を用いて乾燥粉末状の２−ＮＢＤＧを得た。
【００１６】
（液状検体の調製）
試験菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）を血球計算盤にて１００ｃｅｌｌｓ／１００μＬに調整し、更に各段階で２倍希釈を行い、１００ｃｅｌｌｓ、５０ｃｅｌｌｓ、２５ｃｅｌｌｓ、１２ｃｅｌｌｓ、６ｃｅｌｌｓ（各１００μＬ中）の菌液を液状検体とした。なお、希釈液には５０ｍＭリン酸緩衝液を用いた。
【００１７】
（菌体の捕捉）
１００μＬの液状検体に１００μＭの２−ＮＢＤＧを１１μＬ添加し（終濃度を約１０μＭとする）、水浴にて５分間３７℃下におき、菌体の２−ＮＢＤＧ取り込み反応を行った。その後、図６のようにして、吸引ビンに接続した減圧濾過用フィルターホルダ上に微生物捕捉部材を載置し、その上方から液状検体を滴下し、アスピレーターで吸引しながら液状検体を濾過して微生物捕捉部材における５５箇所の濾過領域に菌体を捕捉した。更に未反応の２−ＮＢＤＧを濾過領域の表面から除去するために５００μＬのリン酸緩衝液を上方から滴下して洗浄処理を行った。
【００１８】
（蛍光顕微鏡による菌体の計数）
５５箇所の濾過領域に菌体を捕捉した微生物捕捉部材を、その下方から寒天により水分補給を行うことで保湿状態を維持することができるように設計されたプレートケースに嵌合し、コンピュータの移動プログラムによってステージ駆動が可能なオートステージに載置した。そして４０倍長焦点対物レンズを装着した落射型蛍光顕微鏡（ＢＨ−２：オリンパス社）にて個々の濾過領域を順次目視で検査して菌体の計数を行った。なお、移動プラグラムにおける移動座標は、５５個の細孔の中心に存在するものを（０，０）とし、Ｙ座標上にある最上部の細孔（０，２１００）と最下部の細孔（０，−２１００）の合計３個の細孔（単位はμｍ）を基準にして決定した。蛍光顕微鏡の励起光はＩＢ励起を用いた。以上のようにして菌体の計数を行った後（菌体の捕捉から蛍光顕微鏡による計数に費やした時間は約６０分）、微生物捕捉部材からメンブレンフィルターを取り外し、これをＬＢ培地｛Ｔｒｙｐｔｏｎ  Ｐｅｐｔｏｎ（和光純薬社）２ｇとＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ（ディフコ社）１ｇと塩化ナトリウム１ｇを純水２００ｍＬに溶解してからｐＨ７．０に調整して高圧蒸気滅菌処理したもの｝に１．５％バクトアガー（ディフコ社）を添加して作製した寒天培地上で培養し、コロニーを形成させて生菌の確認を行った。寒天法と蛍光顕微鏡を用いた計数方法の相関性を調べるために、寒天培地に各希釈段階における液状検体を１００μＬ塗抹して１８時間３７℃にて培養し、形成されたコロニー数と蛍光顕微鏡を用いた計数方法による結果を比較した。
各希釈段階の液状検体における寒天法と蛍光顕微鏡を用いた計数方法の相関性に関するグラフを図７に示す。両者は、ｙ＝０．９５０ｘ−０．３３７、Ｒ２＝０．９４６という高い相関性を有していた（ｎ＝２３）。
【００１９】
（スパイク試験）
菌数を１００ｃｅｌｌｓ／１００μＬに調整した液状検体１０μＬをリン酸緩衝液９０μＬに添加したものをサンプルとした（添加菌数１０ｃｅｌｌｓ）。このサンプルに１００μＭの２−ＮＢＤＧを１１μＬ添加し（終濃度を約１０μＭとする）、水浴にて５分間３７℃下におき、菌体の２−ＮＢＤＧ取り込み反応を行った。その後、上記と同様にして微生物捕捉部材における５５箇所の濾過領域に菌体を捕捉し、蛍光顕微鏡を用いて菌体の計数を行った。以上のようにして菌体の計数を行った後、上記と同様にして微生物捕捉部材からメンブレンフィルターを取り外し、これを寒天培地上で培養し、コロニーを形成させて生菌の確認を行った。寒天法と蛍光顕微鏡を用いた計数方法の相関性を調べるために、寒天培地にサンプルを１００μＬ塗抹して１８時間３７℃にて培養し、形成されたコロニー数と蛍光顕微鏡を用いた計数方法による結果を比較した。結果は寒天法においては１０．３±３．７（ｎ＝３）であり、蛍光顕微鏡を用いた計数では１０．０±３．５（ｎ＝３）であった。
【００２０】
（考察）
以上の結果から、蛍光顕微鏡を用いた計数方法は、液状検体に含まれる全菌体の計数を迅速かつ高精度に行うことができるものであることがわかった。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、微生物を含む液状検体から微生物の計数を迅速に行うことができる方法および当該方法を実施するために用いる微生物捕捉部材が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微生物捕捉部材の一態様の平面図（ａ）と断面図（ｂ）である。
【図２】微生物捕捉部材に捕捉された微生物の計数を行うための微生物計数装置の一態様を示す概念図である。
【図３】実施例で用いた微生物捕捉部材を構成するプレート本体の概略的な平面図と断面図である。
【図４】同、ホルダ部の概略的な平面図と断面図である。
【図５】実施例で用いた微生物捕捉部材の概略的な分解図である。
【図６】実施例における菌体の捕捉方法の説明図である。
【図７】実施例における寒天法と蛍光顕微鏡を用いた計数方法の相関性を示すグラフである。
【符号の説明】
１  微生物捕捉部材
２  濾過膜
３  平板
４  細孔
１０４  光源
１０５  微生物判断手段
１１０  レンズ
１１１  受光部
１１２  励起光分光フィルタ
１１３  ダイクロイックミラー
１１４  蛍光分光フィルタ
１１５  光電変換素子
１１６  検査台
【図１】
2004344095.tif 000003
【図２】
2004344095.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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