(57)【要約】【課題】  グラム陽性染色性を示す細菌、特に産業上および医学上重要な乳酸菌、の遺伝子修飾に使用できるプラスミドの提供。【解決手段】  本発明によれば、グラム陽性菌で効率的な複製起点を有した細菌ベクタープラスミドが提供される。このプラスミドは、細菌宿主株で自己を発現する少くとも１つのマーカー遺伝子、宿主株の生存と適合しうる温度で熱感受性である効率的複製系を有し、更に複製阻害の温度が約３７℃以下であることで特徴付けられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌で有効である複製起点を含んだ細菌ベクタープラスミドであって、該プラスミドが少なくとも：
−  細菌宿主株で発現されるマーカー遺伝子と、
−  宿主株の生存と適合しうる温度で温度感受性である有効な複製系と
を含み、かつ複製系が、ＴｈａＩ−ＲｓａＩ領域に少なくとも一つの変異を有する、プラスミドｐＷＶ０１の大きなＣｌａ１断片（但し、ＴｈａＩ−ＲｓａＩ領域に９７２、９７７、９８０、および９８７位の４つの変異を有する場合を除く）により保有されている系であることを特徴とする、細菌ベクタープラスミド。
【請求項２】
プラスミドｐＷＶ０１のＲｅｐＡに相当する領域で少なくとも一つの変異を有する、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
ｐＷＶ０１の配列に関して、下記位置：９７２、９７７、９８０、９８７位で少なくとも１つの変異を有する、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項４】
Bacillus、Enterococcus、Lactobacillus 、Lactococcus 、Streptococcus 、Listeria、Pediococcus 、Staphylococcus、Clostridia、Leuconostoc 、および大腸菌を含んでなる群から選択される細菌で有効である複製系を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項５】
組換えを行えるように、染色体ＤＮＡ配列と相同的な少くとも１つのＤＮＡ配列を更に含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【請求項６】
マーカー遺伝子が組換えの場合に染色体に組込まれるように置かれている、請求項５に記載のベクタープラスミド。
【請求項７】
マーカー遺伝子が化合物耐性を付与するか、または栄養要求性の相補性を許容する遺伝子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【請求項８】
温度感受性複製系が約３５℃以上で阻害される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【請求項９】
プラスミドが接合を行える移動可能な遺伝子座を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【請求項１０】
プラスミドの配列に隣接した２つの同一反復配列を含んでいる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【請求項１１】
２８℃で複製性であって、約３５℃以上の温度で非複製性である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１２】
移動可能な遺伝子座がグラム陽性菌のプラスミドから抽出されたori Ｔ遺伝子座である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１３】
大腸菌で活性であるレプリコンを更に含み、グラム陰性、グラム陽性シャトルプラスミドを形成している、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１４】
トランスポゾンを保有している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１５】
目的タンパク質をコードする遺伝子を、その発現に必要な要素の制御下で更に含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１６】
遊離形で、または染色体に組込まれた形で、請求項１〜１５のいずれか一項に記載されたプラスミドを含むことを特徴とする細菌。
【請求項１７】
ａ）請求項１５に記載されたプラスミドが形質転換または接合により細菌中に導入され、
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度にて選択培地上で培養され、
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられ、そして
ｄ）生存細菌が何回かの増殖サイクル後に回収されることを特徴とする、細菌中への異種遺伝子の導入方法。
【請求項１８】
工程ｄ）の最後に得られた生存細菌が、複製起点の阻害温度以下の温度で、非選択培地上において再び培養される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｂ）が約２８℃の温度で行われる、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明はグラム陽性染色性を示す細菌、特に産業上および医学上重要な乳酸菌、の遺伝子修飾に使用できるプラスミドに関する。
【０００２】
本発明はまたこのようなプラスミドを含有した細菌にも関する。最終的に、本発明は細菌染色体中に通常存在する遺伝子を不活化するか、または関心ある遺伝子を導入および発現させるためにこのようなプラスミドを用いる遺伝子修飾方法に関する。
【０００３】
グラム陽性染色性を示す多くのグラム細菌は生物学的モデル（例えば、Bacillus属の細菌）、産業上重要な発酵株（乳酸菌）または病原体（例えば、Clostridia、Listeria、Staphylococcus、Streptococcus)として研究の対象とされている。これらの株の多くは生理学的観点から特徴付けられているが、遺伝学的にはほとんど研究または改変されていない。株の研究または改変は、細菌染色体中に直接的または非特異的な挿入を行えるベクターの使用により促進される。非複製ベクターに基づくデリバリー系は高頻度で形質転換しうる細菌に限定され、ある条件下だけで活性なレプリコンを利用するものはそれらの宿主範囲に通常は制限される。このため、組換え株の作成には多大な努力を要し、効率上はある特定の微生物に適用できるだけである。
【０００４】
遺伝子の付加、削除または修飾は、発酵のような工業プロセスにおいて生物の役割を変化させることができる。  バイオテクノロジーによって微生物の産業使用を促進しようとされている。例えば、乳酸菌は農業食品において、主に発酵酪農製品の製造で、但し乳工業以外にもワイン、サイダー、調理肉およびサイレージの製造で、用いられる。
【０００５】
このため、これらの生物において遺伝子を特異的および永続的に導入または修飾するために役立つ有効な手段を有することが特に望まれる。
【０００６】
現在、乳酸菌における染色体の修飾は非複製プラスミドの形質転換により系を介して行われている。単一の工程において、２つの頻度の低い現象、即ちプラスミドによる形質転換と染色体の組換えとが必要となる。単一の工程でこれら２つの現象を得る確率は、各々の確率の積である；このため修飾を得る見込みは非常に小さい。
【０００７】
プラスミドｐＷＶ０１はLactococcus lactis亜種cremorisで最初に単離された潜在プラスミドである；それはグラム陽性およびグラム陰性菌の双方、特に大腸菌、Bacillus subtilis 、Lactococcus lactis、Streptococcus およびLactobacillus 、で複製しうる広宿主範囲プラスミドである。それは特徴付けられて、そのヌクレオチド配列はLeenhouts et al.(1991)により公表された。
【０００８】
出願ＷＯ８５／０３４９５では、このプラスミドの大きな断片がエリスロマイシン耐性の遺伝子および／またはクロラムフェニコール（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））耐性の遺伝子で標識された組換えプラスミドｐＧＫ１２を構築するために用いられている。このプラスミドｐＧＫ１２は細菌染色体の組込みに用いることはできない。
【０００９】
従来用いられてきた非複製プラスミドでこの問題を解決できるが、但しこの系には、染色体での転移または組換えのような低頻度現象を検出しうるほど高度の形質転換が必要となる；現在、ほとんどの乳酸菌は弱い形質転換性である。
【００１０】
乳酸菌または他の細菌でデリバリーベクターとして使用されうる温度感受性レプリコンを得ることによりすべてのこれら困難を克服することは可能であろう。
【００１１】
プラスミドｐＥ１９４およびｐＳＨ７１は５１℃の温度以上で自然温度感受性として記載されている(J.Bacteriol.,1990,172,4543-4548) 。
【発明の概要】
【００１２】
このため、本発明の目的は、少くとも：
‐細菌宿主株で発現されるマーカー遺伝子
‐宿主株の生存と適合しうる温度以上で温度感受性
（Ｔｓ）である有効な複製系
を含み、かつ、複製の阻害温度が約３７℃以下であることを特徴とする、グラム陽性菌で有効である複製起点を含んだ種類の細菌ベクタープラスミドである。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明によるプラスミドが３７℃で非複製性であるという事実は、細菌が比較的低い増殖温度を有する場合、または実質的な熱ショックが望まれない場合に特に適する。本発明によるプラスミドは単独で使用でき、他のプラスミドと組合せる必要はない。約３７℃以上の温度による複製の阻害は株依存性でない。それは広宿主範囲を有し、特にBacillus、Enterococcus、Lactobacillus 、Lactococcus 、Streptococcus 、Listeria、Pediococcus 、Staphylococcus、Clostridia、Leuconostoc 、大腸菌を含めた群に属する伝統的な株で自己定着することができる。これらの中では、下記種、例えばB.subtilis、E.faecalis、L.fermentum 、L.helveticus、L.bulgaricus、L.lactis、S.pyogenes、S.thermophilus、S.sanguis 、L.monocytogenes が挙げられる。
【００１４】
本発明によるプラスミドは選択マーカーについてコードする少くとも１つの遺伝子と、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター等のようなその発現に必要な要素を有している。選択しうる遺伝子は、例えば抗生物質（エリスロマイシン、クロラムフェニコール）耐性の遺伝子、またはある成分を欠いた培地上で増殖を行える遺伝子等である。
【００１５】
マーカー遺伝子は組換えの場合に染色体に組込まれる。
【００１６】
「複製系」は複製起点とその機能化を誘導するタンパク質を含んだ系を意味するとして理解される；上記タンパク質は複製系を阻害する温度以上で不活化される。
【００１７】
このようなプラスミドは、多数の細菌において通常２８℃で複製する。約３５℃以上の温度で、このプラスミドの複製は阻害される；プラスミドの複製を阻害するこの温度は比較的低く、ほとんどの細菌、特に乳酸菌の増産および正常増殖を可能にする。このプラスミドの有効な不活化に勧められる温度は３７℃である。
【００１８】
その態様の１つによれば、本発明の主題は、プラスミドｐＷＶ０１の大きなＣｌａＩ断片を含み、ＴｈａＩ‐ＲｓａＩ領域に少くとも１つの変異を有することを特徴とするベクタープラスミドである。
【００１９】
更に詳しくは、本発明による温度感受性複製を示すベクタープラスミドは、プラスミドｐＷＶ０１のＲｅｐＡに相当する領域で少くとも１つの変異を有する。ＲｅｐＡタンパク質はｐＷＶ０１上で確認される４つの読取り枠（ＯＲＦ）のうち１つ、すなわちＯＲＦ  Ａによりコードされ、複製に必要である。
【００２０】
このプラスミドの好ましい変異は、ｐＷＶ０１のヌクレオチド配列の９７２、９７７、９８０および９８７位に位置している。
【００２１】
本発明によるプラスミドでコードされるＲｅｐＡタンパク質は、野生型と比較して、図３に示された修飾、即ち下記の置換を有する：
‐Ser の代わりにAsn 
‐Asp の代わりにAsn 
‐Val の代わりにIle 
‐Arg の代わりにGln 。
【００２２】
このようなプラスミドは、乳酸菌の分野においてユニークなタイプの広宿主範囲自殺ベクターを構成する。
【００２３】
その結果、染色体への組込みを２工程に分割することが可能となる。第一の形質転換工程で、プラスミドが細胞に定着される。第二工程において、染色体での組換え現象が温度を上昇させることにより選択される。こうして、形質転換が難しいと思われる細菌は遺伝的に改変される。
【００２４】
更に詳しくは、本発明によるプラスミドは図９、１０および１１のうち１つで示された配列、またはこれらの配列と少くとも８０％相同性である配列のうち１つを含んでいる。
【００２５】
こうして開発された遺伝手段により、遺伝子を細菌染色体中に導入して、そこで安定させることができる。
【００２６】
例えば、相同的組換えを用いる方法の適用が選択される。
【００２７】
この目的のため、改変が望まれる細菌の染色体ＤＮＡと相同的な少くとも１つのＤＮＡ断片を更に含んだ本発明による温度感受性レプリコンが用いられる。
【００２８】
その態様の１つによれば、本発明の主題は：
ａ）本発明によるプラスミドが形質転換により細菌中に導入される；
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度にて選択培地上で培養される；
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられる；
ｄ）生存細菌がプラスミド複製の阻害温度で何回かの増殖サイクル後に回収される；
ことを特徴とする、細菌の染色体に存在する遺伝子の不活化方法である。
【００２９】
工程ｄ）によれば、プラスミドマーカーを有した細菌を選択することができる。
【００３０】
プラスミドに組込んでクローニングされた染色体断片は正確な遺伝子に相当しうるが、これは遺伝子の染色体コピーにおけるプラスミドの組込みで特異的に不活化される。細菌群では、この組込み部位だけが見い出される。
【００３１】
もう１つの態様において、プラスミドに存在する細菌ＤＮＡはクローニング用に染色体断片のライブラリーから選択され、ランダムな組込みが起きる；プラスミドの組込み部位は細菌毎に異なり、こうして変異誘発が生じる。
【００３２】
その方法はトランスポゾンを有する温度感受性レプリコンに適用してもよい。異なるトランスポゾンが染色体を変異誘発させる上で利用しうる。
【００３３】
Ｔｓプラスミドはこれらトランスポゾンの１つのキャリアとして用いられ、適宜にL.lactisで活性であるように修飾される。各トランスポゾンはマーカー遺伝子（例えば、耐性遺伝子）を有する。前記プロトコール（ａ〜ｃ）を適用することにより、染色体にトランスポゾンを組込んだ細胞が得られる。これらの細胞はトランスポゾンマーカーにより選択される。転移の場合には、プラスミドは染色体に組込まれない。
【００３４】
変形として、本発明によるベクタープラスミドは接合を行える移動可能な遺伝子座も含んでいる。好ましくは、この移動可能な遺伝子座はグラム陽性菌のプラスミドから抽出されるori Ｔ遺伝子座であり、これは好ましくはStreptococcus プラスミドから抽出できる。この遺伝子座を有するベクタープラスミドは移動可能とされて、接合により非形質転換性細菌種中に移すことができる。
【００３５】
細菌中における遺伝子の不活化方法は下記工程を含んでなる：
ａ）移動可能な遺伝子座と、染色体に相同的な断片および／またはトランスポゾンとを有する本発明のプラスミドが接合により細菌中に導入される；
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度にて選択培地上で培養される；
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられる；
ｄ）生存細菌がプラスミド複製の阻害温度で何回かの増殖サイクル後に回収される。
【００３６】
工程ｄ）の最後に得られた細菌は組換えまたは転移現象をうけ、トランスポゾンまたはプラスミドのマーカーを有している。
【００３７】
変形として、本発明によるベクタープラスミドは大腸菌で活性なレプリコンも含んでいる。この遺伝子座を有するベクタープラスミドとこれらの誘導体は、大腸菌で増殖させてよい。次いで、（第二レプリコンにより）３７℃において大腸菌で調製および増殖された構築物は、Ｔｓレプリコンのみが活性である乳酸菌に移してもよい。
【００３８】
上記方法において、工程ａ）の形質転換または接合による細菌中へのベクタープラスミドの導入後に、プラスミドは２８〜３０℃で複製により細菌群で自己定着させることができる。
【００３９】
選択しうる特徴はすべての細菌で発現される。温度が３５℃以上に上がると、遊離形のプラスミドは複製できなくなり、こうして細胞分裂中に失われる。このプラスミドが染色体中に組換えで組込まれるようになったか、またはトランスポゾンが染色体に組込まれるようになった細菌のみが、プラスミドまたはトランスポゾンにより保有される遺伝情報を維持および伝達して、選択培地でそれらを増殖させることができる。このため、低頻度組込み現象は、選択培地上３５〜３７℃で増殖する細菌を回収することにより選択される。
【００４０】
プラスミドが染色体に組込まれると、それは優れた安定性を有しており、３７．５℃で７５世代後に９９％程度である。
【００４１】
相同的組換えによるプラスミドの組込みで行われる実施法は図６で示されている。
【００４２】
本発明によるプラスミドｐＶＥ６００２を含んだL.lactis株ＶＥ６００２は、受託番号Ｉ‐１１７９のもと、25-28 rue du Docteur Roux,Paris,Pasteur Institute の国立機関に寄託された。
【００４３】
その態様のもう１つによれば、本発明の主題は異種遺伝子を細菌中に導入させることができる方法である。その実施は、前記のように定義することができて、更に関心あるタンパク質についてコードする遺伝子を含んだ温度感受性ベクタープラスミドは、その発現に必要で当業者に公知な要素の制御下で用いられる。適宜に、この遺伝子はトランスポゾンに保有させてもよい。この工程は下記の通りである。
【００４４】
ａ）本発明によるプラスミドが形質転換または接合により細菌中に導入される；
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度にて選択培地上で培養される；
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられる；
ｄ）生存細菌がプラスミド複製の阻害温度で何回かの増殖サイクル後に回収される。
【００４５】
工程ｄ）によれば、プラスミドまたはトランスポゾンのマーカーを有した細菌を選択することができる。
【００４６】
本発明の主題は、更に、本発明によるプラスミドを遊離形でまたは染色体に組込んで含んだ細菌である。
【００４７】
このような細菌は農業食品、特に酪農またはチーズ製造産業の分野でも用途を有する。
【００４８】
前記ケースの一部においては、本発明による方法で細菌染色体中に導入された遺伝物質の全部または一部を除去しうることが望ましい。
【００４９】
相同的組換え法によれば２工程にできる：第一はプラスミドの組込み現象を選択することからなり、任意である第二工程はレプリコンと食品標準に相当しないマーカーを染色体から切出すことからなる。
【００５０】
レプリコンの切出し：相同的組換えによる組込みはＴｓプラスミドの両端で重複を生じる（図７ａ）。染色体に組込まれた複製ローリングサークル（rolling-circle）プラスミドは隣接配列間で相同的組換えを強く促進することが示された。Ｔｓプラスミドにより保有される染色体断片がマーカーを含む場合には、組込みにより生じる重複でレプリコンを切出すことができ、不活性染色体遺伝子を残す（図７ａ）。実験上、操作では（３７℃で既に選択された）組込みプラスミドを含んだ株を２８℃で培養する。許容温度で、複製は反復配列間で組換えを再開および促進し、レプリコンを欠失させる（図７ａ）。
【００５１】
本発明の主題は、更に、温度感受性複製性を示し、既に記載された特色のうち１以上を有し、しかも内部領域が重複しているベクタープラスミドである。２つの同一配列は、除去することが望まれる領域と隣接するようにおかれる。このようなプラスミドは、前記のように、細菌染色体で遺伝子の不活化のための、または組換えによる異種遺伝子の導入のための方法に用いられる。
【００５２】
工程ｄ）の最後に、生存細菌は阻害温度以下の温度、例えば２８〜３０℃で、非選択培地上において再び培養される。実際に、複製プラスミドは隣接配列間の相同的組換えを強く促進する。組込みプラスミドを含んで、３５〜３７℃で既に選択された株は許容温度で培養される：プラスミド複製が再開し、反復配列間の組換えを促進する。例えば農業食品でこの系の使用と適合しないマーカーとレプリコンは切出されるが、修飾遺伝子の保持は可能である。望ましくないマーカーを切出した細菌の選択は、非許容温度でプレート培養後に行われる。このメカニズムは図７ｂに示されている。
【実施例】
【００５３】
下記例は、本発明の範囲を何ら制限せず、本発明を説明するために記載されている。
【００５４】
例１：温度感受性ベクタープラスミドの製造および特徴
物質および方法
研究はLaboratoire de Genetique Microbienne,Institut de Biotechnologie [Microbial Genetics Laboratory,Biotechnology Institute],INRA,78352 Jouy-en-Josas cedex France で実施した。
【００５５】
細菌株、プラスミドおよび培養条件
用いられたプラスミドおよび細菌株は表１に示されている。ｐＶＥ６０４３およびｐＶＥ６０４４の構築は図２に記載され、プラスミドｐＶＥ６００４、ｐＶＥ６００６およびｐＶＥ６００７は図４に示されている。ｐＶＥ６００４（またはｐＧ+ ｈｏｓｔ４）は、Ｃｍ耐性遺伝子を欠いた、原Ｔｓ単離物の平滑末端化３３４０bpＣｌａＩ‐ＨｐａII断片中への４４５bpＰｖｕIIＤＮＡ断片の挿入により構築する。４４５bpＰｖｕII断片はマルチクローニング部位、すなわちＴ７およびＴ３プロモーター並びにベクターから直接配列決定できるＭ１３〜２０、Ｔ７、Ｔ３および逆プライマー用の部位、を含んでいる。このプラスミドは大腸菌を含めて試験されたすべての宿主において温度感受性であり、２８℃で維持されねばならない。
【００５６】
大腸菌およびBacillus subtilis をＬＢ培地で培養した。L.lactis亜種lactis（L.lactis）は、ラクトースがグルコースに代えられたＭ１７培地で培養する。クロラムフェニコール（Ｃｍ）をL.lactisおよびB.subtilisで各々５μg/mlの濃度、エリスロマイシン（Ｅｍ）を各々５μg/mlおよび０．５μg/mlの濃度で用いた。Ｃｍ、アザエリスロマイシンおよびエリスロマイシンを大腸菌の場合に１５μg/ml、１００μg/mlおよび１５０μg/mlの各最終濃度で用いた。
【００５７】
分子クローニング、受容能および形質転換操作
市販酵素を供給業者による指示通りに用いた。全細胞およびプラスミドＤＮＡのミニ溶解物を文献で記載されたように調製した。大腸菌およびB.subtilisの受容能誘導と形質転換を標準操作（Hanahan,1985またはNiaudet et al.,1979)により行った。L.lactis株をLangellaおよびChopin,1989aで記載されたように電気的に形質転換させたが、その操作はHoloおよびNes,1989により変更されている。
【００５８】
表１：株およびプラスミドのリスト
株または          遺伝マーカー                  出所または
プラスミド        または記載                    参考文献  
L.lactis：        細菌株
IL1403        プラスミド欠失,R−  M-            Chopinら,
２プロファージb1285 とb1286      1984
MG1363        プラスミド欠失
B.subtilis：                                     Gasson,M.J.1983
SB202         trpC2,tyrA1,aroB2,hisH2,           INRAラボラトリー
thyA                           
大腸菌：
DH5           F-  endA1 recA1 hsdR17           Hanahan,D.  1985
（rk-mk+ ）supE44 thi1 gyrA96 relA1                
プラスミド
pBluescript   Apｒ    M13-ori pBR322-ori      Strategene 
pGK12         Emr  Cmr                        Kokら,1984
pVE6004       pBluescriptの445-bp断片と
pVE6002の3340-bp               本発明
ClaI-HpaII 断片      Emr
pVE6006       pVE6002のClaI部位に挿入された
pBluescript の445-bp断片       図４
Emr Cmr
pVE6007       pVE6006から1175-bp の         本発明
ScaI欠失              Cmr
pVE6043       pGK12のSstI-ThaI 断片(ori+)
pVE6002のThaI-SstI 断片(ORF A) 本発明
Emr Cmr
pVE6044       pVE6002のSstI-ThaI 断片(ori+)
pGK12のThaI-SstI 断片(ORF A)     図２
Emr  Cmr 
プラスミドの変異誘発
ヒドロキシルアミン変異誘発をThomas,1987 に記載された条件下においてプラスミドｐＧＫ１２ＤＮＡで行った。７０℃で１１０および１２０分間の処理後、ヒドロキシルアミンをＤＮＡのイソプロパノール沈降により除去する。
【００５９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡの配列決定のため、ｐＶＥ６００２のＴｈａＩ（７５６bp）‐ＲｓａＩ（１６２０bp）をプラスミドｐブルースクリプトに組み込んでクローニングした。一連の重複クローンをエキソヌクレアーゼIII およびヤエナリヌクレアーゼ(Strategene)の使用により作成する。変異誘発に用いられるプラスミドｐＧＫ１２の調製のＴｈａＩ（７５６bp）‐ＮｄｅＩ（１１４０bp）断片も同操作により配列決定する。
【００６０】
ＤＮＡ配列決定は、Perkin ElmerＰＣＲ装置を用いて、Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem)で二本鎖ＤＮＡにおいてジデオキシチェインターミネート法により行う。配列決定反応をケイ光オリゴヌクレオチド(Applied Biosystem) で開始し、自動シーケンサー（３７０Ａ  ＤＮＡシーケンサー、Applied Biosystem)で分析する。得られた配列を両鎖で調べた。
【００６１】
結  果
変異体の単離
これらの実験で用いられるプラスミドｐＧＫ１２は、抗生物質耐性の２つのマーカーを含んだｐＷＶ０１の誘導体である（Kok et al.,1984)。プラスミドＤＮＡ１０μｇをインビトロにおいてヒドロキシルアミンで変異誘発させ、変異誘発剤の除去後にlactococcus 株ＩＬ１４０３中にエレクトロポレーションで導入する。変異誘発の効率はプラスミドの生存率の減少と、エリスロマイシンまたはクロラムフェニコールに感受的な変異体の出現により評価する。１１０〜１２０分間の処理後、プラスミドの生存率は０．１％以下に下がり、形質転換株の約１０％は抗生物質の１つに感受性のプラスミドを含んでいる。これらの変異誘発条件は温度感受性プラスミドを捜すために選択されるが、これはエリスロマイシン含有培地上２８℃で得られる形質転換株の複製により確認し、形質転換株を３７．５℃でインキュベートする。ｐＶＥ６００１およびｐＶＥ６００２と表示される２つの温度感受性候補は約５０００クローンをスクリーニングして得ている。それらのプラスミドコピー数を比較し、３７．５℃で消失数を調べる。
【００６２】
変異体の特徴：ｐＶＥ６００１は非Ｔｓ変異体である
プラスミドｐＶＥ６００１は２８℃でｐＧＫ１２よりも不安定であり、この欠陥は３７．５℃でより顕著になる。しかしながら、細菌株の７％は３７．５℃で８時間の非選択的増殖後にもなおプラスミドを含んでおり、このことは複製が制限条件下で起きることを示唆している（図１Ａ、左）。
【００６３】
ｐＧＫ１２と比較して、ｐＶＥ６００１のコピー数は、選択してもまたはしなくても、２８℃および３７．５℃で減少していることがわかり（図１Ａ）、これがその低い安定性についての説明になるであろう。高温でのプラスミドの消失は高温における宿主の生理学的変化のためであり、プラスミドの温度感受性のためではないであろう。
【００６４】
変異体の特徴：ｐＶＥ６００２は３５℃以上で温度感受性変異体である。
【００６５】
抗生物質なしでの増殖中におけるプラスミドの安定性の測定では、ｐＶＥ６００２が２８℃でｐＧＫ１２と同じくらい安定であるが、３７．５℃で劇的に消失することを示している（図１Ｂ）。３７．５℃におけるｐＶＥ６００２の急速な消失は、複製が温度変化後直ちに遮断されることを示唆している。８時間の増殖後、エリスロマイシン耐性細胞の約０．１％が残っているだけである。ｐＧＫ１２およびｐＶＥ６００２のコピー数は選択および非選択下２８℃で同様であるが、しかしながら３７．５℃で５時間後にｐＶＥ６００２は検出不能であり、一方ｐＧＫ１２のコピー数も大体同様である（図１Ｂ）。ｐＶＥ６００２における変異が複製の温度感受性欠陥をまさに構成していることが、これらの実験から結論付けられる。
【００６６】
ｐＶＥ６００２を消失させる最小温度を調べた。ｐＶＥ６００２を含んだ株ＩＬ１４０３を、２８、３０、３３、３５および３７．５℃で８時間の非選択的増殖後に、プラスミド消失について試験した（表２）。
【００６７】
表２：群中のＥｍｒ細胞率
時間(hr)                増殖温度
28℃    30℃    33℃    35℃    37.5℃
0      100     100     100     100     100 
2      100     100      99      97      98 
4      100     100      48      47      38 
6      100     100       9       3       4 
8      100      99       5       1       1 
Ｅｍ含有Ｍ１７でｐＶＥ６００２保有ＩＬ１４０３を一晩培養した物を新鮮な選択培地で希釈し、２８℃で３時間増殖させる。次いで培養物を非選択培地で１０，０００倍希釈し、異なる温度でインキュベートする。様々な時間間隔でサンプルを採取し、２８℃でＭ１７上におく。各温度および時点において、プラスミドの消失は２８℃にて選択培地（Ｅｍ）のデッシュ上で約１００のコロニーを継代培養することにより評価する。
【００６８】
プラスミド消失は３７．５℃および３５℃で同等であることが分かった。プラスミドの一部消失は３３℃で既に観察されており、一方プラスミドは２８℃および３０℃で安定であった。このため、ｐＶＥ６００２を有する細胞は、温度を３５℃以上に上げることでこのプラスミドを消失させることができる。
【００６９】
ｐＶＥ６００２は、パルスフィールド電気泳動プロフィールの比較によればＩＬ１４０３と異なるLactococcus のもう１つの株、ＭＧ１３６３(Gasson,1983) 中にも導入した。配列分析では、ＭＧ１３６３がおそらくL.lactis亜種cremoris株(Godon et al.,1992) であることを示している。ｐＶＥ６００２はこの環境で同様の温度感受性を示し、このことはプラスミド変異体の表現型が株と関連していないことを実証している。
【００７０】
ｐＶＥ６００２の広宿主範囲およびＴｓ表現型
Ｔｓプラスミドは他の生物で有用なクローニング手段にもなる。そこで、ｐＶＥ６００２の温度感受性挙動をB.subtilisおよび大腸菌で試験した。これらの株は原レプリコンｐＷＶ０１の広宿主範囲の代表例として選択した。プラスミドＤＮＡを２８℃で形質転換および選択により双方の種に導入した。B.subtilisおよび大腸菌がL.lactis亜種の場合より高い最大増殖温度を有するという事実から、ｐＶＥ６００２の複製を２８℃、３７℃および４２℃で試験した。結果は、ｐＶＥ６００２が双方の宿主で温度感受性であることを示している。ｐＶＥ６００２はそれが定着しうる広範囲の宿主でその温度感受的性質を保持しているらしい。
【００７１】
Ｔｓ変異のマッピング
ｐＷＶ０１のＤＮＡ配列はオリジン‐プラス(origin-plus) と４つのＯＲＦの存在を示す。Leenhouts は、よりよく特徴付けられたプラスミドＤＮＡとそれとの類似性から、ＯＲＦ  Ａがオリジン‐プラスでＤＮＡ鎖の開裂に関与する複製タンパク質（ＲｅｐＡ）についてコードしていることを導き出している。更に、相同性は、ＯＲＦ  ＣがＲｅｐＡの発現を調節しうることを示唆している。機能はＯＲＦ  ＢおよびＯＲＦ  Ｄについてまだ明らかには判明していないが、後者は複製に不要であることが知られている。
【００７２】
ｐＶＥ６００２に温度感受性を付与する変異を位置決めするために、温度感受性レプリコンの部分と未変異部分を組み合わせたハイブリッドプラスミドを構築した。ｐＶＥ６０４３はオリジン‐プラス、ＯＲＦ  ＢおよびＯＲＦ  Ｃを含んだｐＧＫ１２の断片と、そのプロモーターを欠いたＯＲＦ  Ａ（ＲｅｐＡ）、ＯＲＦ  Ｄ並びにＥｍおよびＣｍ耐性のマーカーを含んだｐＶＥ６００２断片（Ｔｓ）とからなる（ＳａｃＩおよびＴｈａＩ制限部位が用いられる、図２）。このハイブリッドはｐＶＥ６００２と同じ速度で３７．５℃にて消失し、一方逆ハイブリッド（ｐＶＥ６０４４）はｐＧＫ１２と同じ安定性で維持される（図２）。このため、ｐＶＥ６００２に温度感受性を付与する変異はＲｅｐＡ、ＯＲＦ  Ｄおよび抗生物質のマーカーについてコードするＤＮＡ断片の中に位置している。ＯＲＦ  Ｄは必須でなく、抗生物質のマーカーは候補でないという事実から、温度感受機能はＲｅｐＡタンパク質であると結論付けられるであろう。
【００７３】
配列決定データ
Ｔｓ変異を位置決めするために、ｐＶＥ６００２のＲｅｐＡタンパク質についてコードする８６４bp断片を配列決定した。４つの変異を９７２、９７７、９８０および９８７位で確認した（図３）。変異誘発に用いられた親プラスミドｐＧＫ１２の対応領域はｐＷＶ０１に関して公表された配列と一致することが確認された(Leenhouts et al.,1991) 。４つの変異は、ヒドロキシルアミンの既知変異誘発効果と一致する、ＧからＡへのトランジションである。塩基の各変化はアミノ酸を変え（図３）、そのうちの１つ、Val からIle へは保存的である。これら変化の１以上の関与がＴｓ表現型に係わっているのであろう。
【００７４】
Ｔｓプラスミドの誘導体
クローニングの目的で、最初のＴｓプラスミドｐＶＥ６００２の誘導体を開発した（図４）。これらの誘導体は双方の抗生物質耐性（ＥｍおよびＣｍ）または一方だけ（ＥｍまたはＣｍ）を含むように修飾され、それらはすべてプラスミドｐブルースクリプトＳＫ+ に由来する多部位配列を有している。
【００７５】
レプリコンの切出し
図７ａに示されるように、抗生物質耐性の遺伝子（Ａｂｒ）で遮断された細菌染色体と相同的な領域を保有するｐＶＥ６００２に由来したプラスミドから二重逆交換現象を得ることが可能であった。２８℃で細菌中へのプラスミドの導入後、第一工程は抗生物質含有培地上３７℃で培養により染色体で組込体を選択することからなる。相同性の領域は組込み後に重複化される（図７ａ）。第二工程において、レプリコンの切出しは、２８℃のインキュベートにより得られ、プラスミド複製を再開させて、第二組換え現象を促進する。切出し現象を３７℃培養により選択し、染色体遺伝子をＡｂｒ遺伝子により不活化させる。
【００７６】
例２：L.lactisの染色体における温度感受性プラスミドの組込み
この研究で用いられた細菌株とプラスミドは表３で示されている。大腸菌株はＬＢブロスで培養する。L.lactisは、Ｍ１７- グルコースブロス、またはそれがｉｌｖ表現型について試験される場合には最少培地、で培養およびプレート培養する。エリスロマイシン（Ｅｍ）は、L.lactis亜種lactisの場合５μg/mlおよび大腸菌の場合１５０μg/mlの濃度で加え、テトラサイクリンはL.lactisの場合１２．５μg/mlの濃度で用いる。L.lactis亜種lactisのエレクトロポレーション(Appl.Env.Microbiol.55,3119-3123,1989)では、ＩＬ１４０３の場合でプラスミドＤＮＡμｇ当たり形質転換株１０５〜１０６および遺伝子置換実験に用いられたｉｌｖ+ 株ＮＣＤＯ２１１８の場合でプラスミドＤＮＡμｇ当たり形質転換株約１０２を生じる。大腸菌はHanahan(1985,DNA cloning: A practical approach,Vol 1: 109-135,IRL Press Ed Glover)で記載された方法により形質転換させる。
【００７７】
表３
株        遺伝マーカーまたは記載        出所
L.lactis：自然単離物                        * 
NCD02118
大腸菌：  supE hsdΔ5  thiΔ(lac-proAB)F  Sambrook
TG1      [traD36proAB+lacIq lacZΔM15]    ら
プラスミド
pG+host4   pGK12の温度感受性誘導体, Emr     **
またはpV6004
pG+host5  pBR322の1.46-Kb AvaI-AlwNI断片    **
に結合されたpG+host4のNsiI断片, Emr 
pVE7021   IL1403染色体のランダムEcoRV-      **
〜pVE7034 HindIII 断片に結合されたpG+host5
のSmaI-HindIII制限産物
pIL515    ｐブルースクリプト中IL1403の      **
3.9-Kb ilv EcoRI断片,Ampr 
pVE7009    EcoRIで切断されたpG+host5に      **
結合されたpIL515の3.9-Kb EcoRI断片
pVE7009R  反対方向に挿入された pVE7009と    **
同じ構築物
pVE7015    3362-bp ilv断片を残した          **
pVE7009RからのSphI-EcoRV欠失
pVE7014    2904-bp ilv断片を残した          **
pVE7009RからのStyI-EcoRV欠失
pVE7010    2552-bp ilv断片を残した          **
pVE7009RからのClaI欠失
pVE7016    1912-bp ilv断片を残した          **
pVE7009RからのXcmI-EcoRV欠失
pVE7013    1206-bp ilv断片を残した          **
pVE7009RからのAatII-EcoRV 欠失
pVE7011   497-bp ilv断片を残した            **
pVE7009RからのHindIII 欠失
pVE7012   356-bp ilv断片を残した            **
pVE7009RからのPstI欠失
pVE7017   330-bp ilv断片を残した            **
pVE7009RからのPflMI-EcoRV 欠失
pIL500    pIL253中NDC02118染色体の        Godon ら
18.5-Kp ilv XbaI断片
pIL1202    Tet M遺伝子の4-Kb BamHI断片に
結合されたpIL500の18.5-Kp 断片
の1.1-Kp XbaI-BglII と2.5-Kp
EcoRI-XbaI末端を含むpG+host4の
XbaI断片
pIL1261   BglII 部位に挿入されｐブルー
スクリプトXbaI-EcoRIに結合された
Tet M 遺伝子、4-Kb BamHIで遮断され
たpIL500の2.3-Kb XbaI-EcoRI 断片
pIL1263    pIL1261の6.3-Kb XbaI-EcoRI 断片
に結合されたpG+host4 XbaI-EcoRI 
* ：National Collection of Dairy Organisms
**：本発明
組込み用プラスミドの構築
ａ）ベクターの構築
プラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ４（またはｐＶＥ６００４）は例１に従い調製されたｐＷＶ０１のＴｓ誘導体である。大腸菌でクローニングを促進するために、ｐＢＲ３２２の起点を含む１．４Kb断片をｐＧ+ ｈｏｓｔ４に挿入する。プラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ５はＮｓｉＩで切断された直鎖化ｐＧ+ ｈｏｓｔ４中へのｐＢＲ３２２のＡｖａＩ‐ＡｌｗＮＩ断片（ｐＢＲ３２２の複製起点を含む）の挿入により構築される。その構造は図８で示されている。ｐＧ+ ｈｏｓｔ５(Appligene,Illkirch,France) と称される得られたプラスミドを、すべてのクローニングに用いる。ｐＢＲ３２２の起点の活性は大腸菌中３７℃でそれを維持でき、Ｔｓ起点はグラム陽性菌中２８℃でｐＧ+ ｈｏｓｔ５を維持する。
【００７８】
ｂ）ｐＧ+ ｈｏｓｔ５中に組込まれたランダム染色体
断片のクローニング
株ＩＬ１４０３の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄIII で切断する。サイズが０．９〜１．４Kbの染色体断片をアガロースゲルから精製し、ＳｍａＩ‐ＨｉｎｄIII で処理されたｐＧ+ ｈｏｓｔ５と結合させる。組換えプラスミドを大腸菌で定着させ、その後エレクトロポレーションでL.lactisに導入する。後者の生物はプラスミドの構築とインサートのサイズを確認するために用いる。結果は下記表４で示されている。制限酵素ＨｐａＩ（ベクター部分で単一の部位）とＨｉｎｄIII （インサートとベクターとの間で単一の部位）を用いて、構築物を分析する。
【００７９】
表４：L.lactis染色体上の異なる位置におけるＩｐｃ
プラスミドインサートのサイズ          ＩＰＣ
(Kb)            平均±SD
グループＩ：
pVE7025           1.29         3.0±0.3 ×10-2
pVE7034           1.05         3.8±0.5 ×10-3
pVE7021           1.29         3.4±2.6 ×10-3
pVE7024           0.96         2.5±1.3 ×10-3
pVE7030           1.42         2.3±0.8 ×10-3
pVE7028           1.46         7.2±0.7 ×10-4
pVE7023           1.29         6.6±3.9 ×10-4
pVE7022           1.08         5.7±0.3 ×10-4
pVE7027           1.05         5.2±1.3 ×10-4
pVE7026           0.96         4.0±0.5 ×10-4
グループII：
pVE7029           1.02         1.1±0.4 ×10-5
pVE7031           0.96         9.9±3.9 ×10-6
pVE7032           1.37         8.6±5.0 ×10-7
pVE7033           1.25         3.9±0.9 ×10-7
ｉｐｃ：組込み頻度／細胞
ｃ）ｉｌｖオペロン断片のクローニングおよび欠失
ＩＬ１４０３のｉｌｖオペロンの３９４９bpＥｃｏＲＩ断片(J.Bacteriol.,174,6580-6589(1992))を（ｐＶＥ７００９およびｐＶＥ７００９Ｒを得るために）ｐＧ+ ｈｏｓｔ５のＥｃｏＲＩ部位でいずれかの向きでクローニングする。
【００８０】
L.lactis染色体での単一交差(sco) による組込み
試験プラスミドを含むLactococcus 株をエリスロマイシンの存在下２８℃で一晩培養し、その後同培地で１００倍希釈し、２８℃で２〜２1/2 時間培養する（指数的増殖相）。培養物は、プラスミドのコピー数／細胞を減少させるために、３７．５℃で３時間おく。次いでサンプルを希釈し、組込み現象を検出するためにＭ１７  Ｅｍ培地上３７℃で、更に生存細胞の数を調べるために非選択培地上２８℃でプレート培養する。組込み頻度／細胞(ipc) は、３７℃のＥｍｒ細胞数対２８℃の生存細胞数の比率としてみる。３７℃で単離された組込体は、後の使用のために、３７．５℃でＥｍを含むＭ１７培地で維持する。
【００８１】
L.lactis染色体で二重交差(dco) による組込み
プラスミドｐＩＬ１２６３およびｐＩＬ１２０２は、Ｔｓベクター（ｐＧ+ ｈｏｓｔ４、Ｅｍｒ）と、Ｔｎ１５４５のＴｅｔ遺伝子により遮断された各々２．３Kbまたは３．６Kb染色体領域から構成される(Nucl.Acids Res.,14,7047-7058,1986) 。ｐＩＬ１２０２またはｐＩＬ１２６３を保有する株をＴｅｔまたはＥｍ含有Ｍ１７中３７．５℃で一晩培養して、組込体の群を得る。次いで培養物を無抗生物質Ｍ１７培地で１／１０５まで希釈し、プラスミド複製で組換えを促進するため２８℃にする。２８℃で１２時間以上の培養により、最大遺伝子置換頻度を得る。２８℃の一晩培養した物は、Ｔｅｔによる選択下または非選択下、３７℃にて異なる細胞濃度でプレート培養する。遺伝子置換が起きたコロニーはＴｅｔｒおよびＥｍ感受性（Ｅｍｓ）表現型を有する。染色体ＤＮＡは既知方法に従い調製する(Gruss et al.,1988) 。
【００８２】
精製ＤＮＡを制限酵素で処理し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＤＮＡプローブとのサザンハイブリッド形成により分析して、相同的組換えを検出する(Sambrook et al.,1989)。
【００８３】
結  果
１）単一交差による組込み
大腸菌でｐＧ+ ｈｏｓｔ５に組込まれたL.lactisの染色体断片のクローニングにより、０．９〜１．４Kbの異なる染色体インサートを各々含んだ１４の異なるプラスミドを単離することができる。ＩＬ１４０３中２８℃で定着されたこれらのプラスミドを用いて、L.lactis染色体での組込み頻度を測定する。組込み頻度／細胞は１０-2〜１０-7である。染色体インサートのないｐＧ+ ｈｏｓｔ５ベクターのｉｐｃは１０-6〜１０-7である。染色体インサートを保有するプラスミドは、それらの組込み頻度に従い２群に分類してもよい。グループＩにおいて、ｉｐｃは３×１０-2〜４×１０-4である。これらの変動は、そのサイズよりもむしろ、インサートの位置または性質に基づいているにちがいない。グループIIにおいて、プラスミドのｉｐｃは１０-5〜３×１０-7である。これは、非相同的組込みのみを観察できる必須染色体遺伝子の遮断におそらく基づいている。これらプラスミドのうち２つ（ｐＶＥ７０２８およびｐＶＥ７０３４）だけが高分子量（ＨＭＷ）分子を生じる。酵素制限と、プローブとしてプラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ５を用いるサザンハイブリッド形成により、３７℃で維持された組込み株から得られた染色体ＤＮＡの分析では、８プラスミドの場合で単および多タンデム組込み、２プラスミドの場合で多数コピーによる組込みを示す。ＨｉｎｄIII による組込体のＤＮＡの切断から、組込みが単一交差により起きることを確認した。各プラスミドはベクターインサート結合箇所で１つのみのＨｉｎｄIII 部位を含んでおり、切断でプラスミドサイズ化ＤＮＡの単一バンドを遊離するはずである。
【００８４】
非切断全ＤＮＡのサザンハイブリッド形成ではいずれのグループＩプラスミドでも遊離プラスミドを出現せず、このことはプラスミドのコピーが組込まれたことを示している。プラスミドｐＶＥ７０２８およびｐＶＥ７０３４の類似分析から、これらのプラスミドも単一交差で組込まれていることを確認した。ベクター内の単一部位を認識するＨｐａＩの使用により、各プラスミドが異なる位置で組込まれたことを調べることができる。
【００８５】
４つのグループIIプラスミド（低い組込み頻度）はランダムに組込まれたようであり、その理由はＨｉｎｄIII 切断がプラスミドのモノマーバンドを遊離せず、同プラスミドの３組込体のＨｐａＩ切断がゲルで同様のプロフィールを与えないからである。ＳｍａＩおよびＡｐａＩに関して作成されたL.lactis染色体の制限地図から、単一交差によるプラスミドの組込み部位を染色体地図で位置決めすることができる。各組込体は異なるセグメント上に存在する。これらの結果はまとめてみると染色体挿入が染色体上でランダムに位置していることを示し、こうして操作上いかなる偏りも排除している。
【００８６】
組込み頻度は相同部分の鎖長に依存している。
【００８７】
配列決定されたＩＬ１４９３のｉｌｖオペロンの３．９KbセグメントをｐＧ+ ｈｏｓｔ５に組込んでクローニングし、その断片からの一組の欠失を同ベクターで生じさせる。２方向のうち一方で３．９Kbの全インサートを保有するプラスミド（ｐＶＥ７００９およびｐＶＥ７００９Ｒ）はL.lactisである程度の構造不安定性を有するが、ｐＶＥ７００９Ｒの８つの欠失誘導体は安定である。これらのクローンを用いて、相同部分の鎖長と組込みの頻度との関係を研究する。対数関係が組込みの頻度と長さ０．３５〜２．５Kbの相同鎖長との間に存在する。２．５Kb超の断片では、組換えの頻度が一定水準に達するらしく、その理由は２．５、３．３および３．９Kbの相同的セグメントのｉｐｃ値が有意には異ならないからである。鎖長以外のファクターも重要であるらしい。ベクター、インサートまたはベクター‐インサート結合箇所で単一部位を認識する制限酵素による分析から、組込みが単一交差による相同的組換えで起きることを確認した。用いられた各プラスミドで、プラスミドの多コピー組込みが起きる。これらの結果は、ｐＧ+ ｈｏｓｔが３３０塩基対と小さな相同的セグメントを保有するならば、それが単一交差による組込みの有効手段を提供しうることを示している。
【００８８】
２）二重交差による組込み
上記単一交差(sco) 系において、組込みプラスミドを反復配列で隣接させる。このため、３７℃で生じた組込み株を２８℃でおくときには、プラスミドの複製は第二組換え現象を強く促進する。この現象の帰結はレプリコンの高頻度の切出しであり、親構造またはｄｃｏ（二重交差）染色体構造に至る。
【００８９】
分岐アミノ酸(Ilv、Leu 、Val)に関して原栄養性であり、しかも遺伝子修飾が今まで行えなかったL.lactisの弱形質転換性株、ＮＣＤＯ２１１８を用いる。隣接または非隣接染色体セグメントを保有するｐＧ+ ｈｏｓｔ４の２誘導体を用いる。ｐＩＬ１２６３は、テトラサイクリン耐性のマーカー（Ｔｅｔｒ）を含む４KbＤＮＡセグメントで遮断された２．３Kb染色体断片をｉｌｖオペロンの上流に含んでいる。遺伝子の置換で染色体中にＴｅｔｒマーカーを挿入させ、ｉｌｖ+ オペロンをそのまま残すはずである。プラスミドｐＩＬ１２０２は、４KbＴｅｔｒマーカーを介して結合された、ｉｌｖオペロンを含む１８．５Kb領域の末端に相当する非隣接１．１Kbおよび２．５Kbセグメントを含んでいる。遺伝子の置換でｉｌｖオペロンを含む１４．９Kbの染色体から欠失を起こし、ｉｌｖ- 表現型を生じるはずである。
【００９０】
置換遺伝子の選択：ｐＩＬ１２０２またはｐＩＬ１２６３を含む株を、選択マーカーとしてＴｅｔを用いて、前記条件下で培養する。ｐＩＬ１２６３との独立実験では、Ｔｅｔｒコロニーの６９〜９８％がＥｍｓであった；ｐＩＬ１２０２では、Ｔｅｔｒコロニーの５０〜９１％がＥｍｓである。同期間にわたり３７℃で維持されたコントロール培養では、すべてのＴｅｔｒコロニーがＥｍｒである。この結果は、（環状複製を示す）ｒｃプラスミドの複製が染色体からの切出しを促進することを示している。ｐＩＬ１２０２の組込みにより得られた５つのＥｍｓコロニーは、分岐アミノ酸を欠く最少培地で培養したところ、ｉｌｖ- であり、それにより組換えが起きたことを確認した。５つのＴｅｔｒＥｍｓ単離物の対応染色体領域の構造をサザンハイブリッド形成により研究し、すべての場合で遺伝子の置換を確認した。
【００９１】
非選択：プラスミドに保有される染色体断片が選択マーカーを有しないケースを扱えるように、同一プロトコールをＴｅｔによる選択なしに用いた。ｐＩＬ１２６３を用いた３回の実験（遺伝子挿入）では、選択せずに３７℃で得られたコロニーの１０〜４０％がＴｅｔｒＥｍｓであり、遺伝子置換現象が起きたことを示している。ｐＩＬ１２０２（染色体欠失）では、コロニーの１〜７％がＴｅｔｒＥｍｓであって、遺伝子置換を示している；試験された４つのＴｅｔｒＥｍｓコロニーのうち、すべてがｉｌｖ- である。各タイプの４つのｄｃｏ組込体の染色体構造の分析から、置換が新たな挿入断片の選択なしに起こることを確認した。これらの結果は、染色体に抗生物質マーカーを残すことのない遺伝子置換の実行可能性を実証している。そのため、このプロトコールは選択マーカーを使用しない染色体修飾に合っている。
【００９２】
他のグラム陽性菌におけるｐＧ+ ｈｏｓｔの使用
B.subtilis染色体の１２の異なる位置における分子間組換えの効率を、コンピテント細胞を非複製プラスミドで形質転換することにより調べた(J.Bacteriol.,174,5593-5587,1992) 。これらの実験において、相同的セグメントは不変である（ｐＢＲ３２２の断片の挿入）。効率は組込みの位置に応じて約３倍違う。非複製ベクターの代わりにｓｃｏ  ｐＧ+ ｈｏｓｔ系を用いて、同一組換えの実験を、組込み頻度について３倍程度の差異で、２種のB.subtilis株で行ってもよい。ｐＢＲ３２２の１．４Kb断片を保有するｐＧ+ ｈｏｓｔ５を関心あるB.subtilis株に導入する。前記ｓｃｏ操作を用いたところ、組込みの頻度は１．８±０．６×１０-3〜６．１±０．９×１０-4である。同じ３倍のバリエーションが非複製系で得られた場合のように２つの異なる位置の間で観察される。この結果は系の有効性を実証している。
【００９３】
例３：非形質転換性生物の遺伝子修飾
一部のlactobacilliのような産業上重要な生物は現在形質転換しえない；しかしながら、接合でそれらの中にプラスミドを導入することは可能である。プラスミドｐＩＰ５０１の移動可能な遺伝子座ｏｒｉＴを特徴付けた。ｐＩＰ５０１はこれらlactobacilliの一部の中に自己移動しうる。
【００９４】
このｏｒｉＴ断片をＴｓプラスミド（プラスミドＴｓ：ｏｒｉＴ）に組込んでクローニングした；トランス移動のためのタンパク質を与えるヘルパープラスミド（ｐＩＰ５０１に由来する）の存在下で移動されるその能力について試験した。何回かの種内または間交配をうまく実施した（表５）；プラスミドＴｓ：ｏｒｉＴのみを含む接合完了体で、組換えによる組込みの将来の方法が適用できる。このため、酪農産業でますます用いられてきている非形質転換性種、Lactobacillus bulgaricusの染色体に遺伝情報を導入することが可能である。
【００９５】
組換えによる組込み方法の目的は、細菌株の遺伝特徴の変更である；これは変更される性質が分子レベルで特徴付けられることを想定している。機能的転移系（トランスポゾンのＴｓプラスミドの組合せ）の開発は、L.lactisの分析用の遺伝手段として相当な貢献を果たすようになる。
【００９６】
表５：プラスミドＴｓ：ｏｒｉＴとの接合頻度
ドナー
受容体         L.lactis IL1403/pヘルパー/pTs:oriT
L.lactis
IL1403 strr    5×10-3exc/don * 
E.faecalis
IL1885 strr     10-5exc/don 
L.bulgaricus
IL1687 strr    3×10-5exc/don 
S.sanguis 
IL1474 strr    3×10-7exc/don 
*exc/don:Ｔｓ：ｏｒｉＴを含む接合完了体の数／ドナー細胞
例４：トランスポゾン用のベクターとして温度感受性プラスミドの使用
ｐＶＥ６００４の誘導体に組込んでクローニングされた転移カセットＴｎ１０を転移試験に用いる。細胞の約１％は３７℃でＥｍｒであり、これはトランスポゾンまたはプラスミドが染色体に組込まれていることを示している。転移カセットがないプラスミドの非特異的組込みは、１０-7以下の頻度で起きる。転移は８コロニーからのＨｉｎｄIII で切断されたＤＡＮの分析により判断する。ＨｉｎｄIII はプラスミドに２つの制限部位を有するが、転移性単位にはない。染色体ＤＮＡを８つのＥｍｒ耐熱性クローンから抽出し、ＨｉｎｄIII で切断する；次いで処理されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、プローブとしてＥｍｒトランスポゾンを含むＤＮＡ断片とハイブリッド形成させる。これらの条件下、全ベクターの組込み（即ち、転移なし）で１．３Kbハイブリッド形成バンドを作るようになるが、それはここでは観察されない。各染色体サンプルは、トランスポゾンを含むＤＮＡ断片がプローブとして用いられる場合に、単一のプロフィールを示す。ハイブリッド形成バンドはいずれも１．３Kbのサイズを有さず、これは全プラスミドがベクターの一部位に組込まれたときに考えられる。加えて、ハイブリッド形成は、Ｔｓベクタープラスミドがプローブとして用いられたときに観察されない。これらの結果は、転移が異なる部位で起き、しかもプラスミドＤＮＡがトランスポゾンと共に染色体に組込まれていないことを示している。このため、温度感受性プラスミドはデリバリーベクターとして用いられる。
【００９７】
本発明は下記の通りである。
【００９８】
１．  グラム陽性菌で有効である複製起点を含んだ細菌ベクタープラスミドであって、少くとも：
‐細菌宿主株で発現されるマーカー遺伝子と、
‐宿主株の生存と適合しうる温度以上で温度感受性
である有効な複製系と
を含み、かつ、複製の阻害温度が約３７℃以下であることを特徴とする、細菌ベクタープラスミド。
【００９９】
２．  Bacillus、Enterococcus、Lactobacillus 、Lactococcus 、Streptococcus 、Listeria、Pediococcus 、Staphylococcus、Clostridia、Leuconostoc 、大腸菌を含んでなる群から選択される細菌で有効である複製系を有する、（１）に記載のプラスミド。
【０１００】
３．  組換えを行えるように、染色体ＤＮＡ配列と相同的な少くとも１つのＤＮＡ配列を更に含んでなる、（１）または（２）に記載のベクタープラスミド。
【０１０１】
４．  マーカー遺伝子が組換えの場合に染色体に組込まれるように置かれている、（３）に記載のベクタープラスミド。
【０１０２】
５．  マーカー遺伝子が化合物耐性を付与するか、または栄養要求性の相補性を許容する遺伝子である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【０１０３】
６．  温度感受性複製系が約３５℃以上で阻害される、（１）〜（５）のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【０１０４】
７．  プラスミドが接合を行える移動可能な遺伝子座を含んでなる、（１）〜（６）のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【０１０５】
８．  プラスミドの配列に隣接した２つの同一反復配列を含んでいる、（１）〜（７）のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【０１０６】
９．  複製系が、ＴｈａＩ‐ＲｓａＩ領域に少くとも１つの変異を有した、プラスミドｐＷＶ０１の大きなＣｌａ１断片により保有されている系である、（１）〜（８）のいずれか一項に記載のベクタープラスミド。
【０１０７】
１０．  プラスミドｐＷＶ０１のＲｅｐＡに相当する領域で少くとも１つの変異を有している、（９）に記載のプラスミド。
【０１０８】
１１．  ｐＷＶ０１の配列に関して、それが下記位置：９７２、９７７、９８０、９８７位のうち１つで少くとも１つの変異を有している、（９）または（１０）に記載のプラスミド。
【０１０９】
１２．  複製系に相当する断片が図３で示された変異を有するタンパク質をコードしている、（９）〜（１１）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１０】
１３．  図９、１０または１１で示された配列のうち１つ、またはこれらの配列と少くとも８０％相同性を有した配列を含んでなる、（１）〜（１２）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１１】
１４．  ２８℃で複製性であって、約３５℃以上の温度で非複製性である、（９）〜（１３）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１２】
１５．  移動可能な遺伝子座がグラム陽性菌のプラスミドから抽出されたori Ｔ遺伝子座である、（７）〜（１４）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１３】
１６．  大腸菌で活性であるレプリコンを更に含み、グラム陰性、グラム陽性シャトルプラスミドを形成している、（７）〜（１７）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１４】
１７．  トランスポゾンを保有している、（１）〜（１６）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１５】
１８．  目的タンパク質をコードする遺伝子を、その発現に必要な要素の制御下で更に含んでなる、（１）〜（１７）のいずれか一項に記載のプラスミド。
【０１１６】
１９．  遊離形で、または染色体に組込まれた形で、（１）〜（１８）のいずれか一項に記載されたプラスミドを含むことを特徴とする細菌。
【０１１７】
２０．  ａ）（１）〜（６）、（８）〜（１４）、（１６）、（１７）または（１８）のいずれか一項で記載されたプラスミドが形質転換により細菌中に導入され、
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度で選択培地上で培養され、
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられ、そして
ｄ）生存細菌が何回かの増殖サイクル後に回収されることを特徴とする、細菌の染色体に存在する遺伝子の不活化方法。
【０１１８】
２１．  ａ）（７）〜（１８）のいずれか一項に記載されたプラスミドが接合により細菌中に導入され、
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度にて選択培地上で培養され、
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられ、そして
ｄ）生存細菌が何回かの増殖サイクル後に回収される；ことを特徴とする、細菌中における遺伝子の不活化方法。
【０１１９】
２２．  ａ）（１８）に記載されたプラスミドが形質転換または接合により細菌中に導入され、
ｂ）細菌が複製起点の阻害温度以下の温度にて選択培地上で培養され、
ｃ）培養温度が上記阻害温度以上の温度に上げられ、そして
ｄ）生存細菌が何回かの増殖サイクル後に回収されることを特徴とする、細菌中への異種遺伝子の導入方法。
【０１２０】
２３．  工程ｄ）の最後に得られた生存細菌が、複製起点の阻害温度以下の温度で、非選択培地上において再び培養される、（２０）〜（２２）のいずれか一項に記載の方法。
【０１２１】
２４．  工程ｂ）が約２８℃の温度で行われる、（２０）〜（２３）のいずれか一項に記載の方法。
【０１２２】
参考文献
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2004166712.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】本発明によるｐＶＥ６００２および非Ｔｓ  ｐＶＥ６００１の消失の動態とコピー数の分析を示した図である。プラスミドｐＧＫ１２、ｐＶＥ６００１またはｐＶＥ６００２を保有したL.lactis亜種lactisＩＬ１４０３が２８℃または３７．５℃で培養される。異なる培養時間後にサンプルが取り出され、選択および非選択培地上２８℃で培養される。１００のコロニーが、群においてプラスミドを含む細胞の割合を評価するために、選択培地（Ｅｍ５μg/ml）上で非選択培地から継代培養される。全ＤＮＡの抽出は２８℃または３７．５℃で５時間３０分にわたり選択せずに培養物で行われる。
【図２】ｐＧＫ１２およびｐＶＥ６００２のハイブリッドプラスミドを示した図である。ｐＶＥ６０４３はｐＶＥ６００２の３３８４bpＴｈａＩ‐ＳａｃＩ断片に結合されたｐＧＫ１２の９９４bpＳａｃＩ‐ＴｈａＩ断片からなる。ｐＶＥ６０４４はｐＧＫ１２の３３８４bpＴｈａＩ‐ＳａｃＩ断片に結合されたｐＶＥ６００２の９９４bpＳａｃＩ‐ＴｈａＩ断片、逆対を含んでいる。細い線はｐＧＫ１２ＤＮＡに相当し、太い点線はｐＶＥ６００２ＤＮＡに相当する。
【図３】ｐＶＥ６００２のＲｅｐＡ遺伝子におけるＴｓ変異の位置決定を示した図である。ＲｅｐＡ遺伝子を含んだｐＶＥ６００２のＴｈａＩ‐ＲｓａＩ断片を双方の鎖で配列決定した。配列は９７２、９７７、９８０および９８７位で４つの変異を示し、残りの配列は親レプリコンｐＷＶ０１に関して公表された配列と異ならない。
【図４】温度感受性誘導体を示した図である。ｐＶＥ６００６はｐＶＥ６００２のＣｌａＩ部位中へのｐブルースクリプトＳＫ+ の４４５bpＰｖｕII断片の挿入により構築される。ｐＶＥ６００７はｐＶＥ６００６からＳａｃＩ欠失により得られ、エリスロマイシン耐性の遺伝子を失う。ｐＶＥ６００４は、クロラムフェニコール耐性の遺伝子を欠いたｐＶＥ６００２のＣｌａＩ‐ＨｐａII断片中へのｐブルースクリプトＳＫ+ の４４５bpＰｖｕII断片の挿入により構築される。
【図５】ＰＥ．１９４のＲｅｐと類似したタンパク質の比較を示した図である。
【図６】遺伝子の不活化方法を示した図である。
【図７ａ】２つの工程におけるＴｓレプリコンの切出し例を示した図である。
【図７ｂ】プラスミド重複によるレプリコンの切出し図を示した図である。
【図８】プラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ４（またはｐＶＥ６００４）からのプラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ５およびプラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ６の構築：プラスミドｐＧ+ ｈｏｓｔ５は、ＮｓｉＩで直鎖化されたｐＧ+ ｈｏｓｔ４中へのｐＢＲ３２２のＡｖａＩ‐ＡｌｗＮＩ断片（ｐＢＲ３２２の複製起点を含む）の挿入により構築される。ｐＧ+ ｈｏｓｔ６は、ＮｓｉＩで直鎖化されたｐＧ+ ｈｏｓｔ４中へのｐＢＲ３２２のＡｖａＩ‐ＥｃｏＲＩ断片（ｐＢＲ３２２の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を含む）の挿入により構築される。
【図９ａ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ４のヌクレオチド配列を示した図である。
【図９ｂ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ４のヌクレオチド配列を示した図である。
【図９ｃ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ４のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１０ａ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ５のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１０ｂ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ５のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１０ｃ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ５のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１０ｄ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ５のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１０ｅ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ５のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１１ａ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ６のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１１ｂ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ６のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１１ｃ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ６のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１１ｄ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ６のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１１ｅ】ｐＧ+ ｈｏｓｔ６のヌクレオチド配列を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
2004166712.tif 000016
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
2004166712.tif 000018
【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１１ａ】
2004166712.tif 000021
【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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