(57)【要約】【課題】昆虫細胞の培養のための、新規な低血清培地及び無血清培地の提供。【解決手段】鳥類肉の蛋白質分解酵素加水分解物を含んでなる昆虫細胞培養用培地。【選択図】      図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類肉の蛋白質分解酵素加水分解物を含んでいる昆虫細胞培養用培地。
【請求項２】
前記鳥類肉が、鶏肉、ウズラ肉、アヒル肉、カモ肉、ハト肉又はスズメ肉である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記鳥類肉の蛋白質分解酵素分解物が、鳥類肉を破砕し、プロテイナーゼで処理し、ペプチダーゼで処理し、酵素を不活性化した後、不要物を除去したものである、請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
前記プロテイナーゼがパパインである、請求項３に記載の培地。
【請求項５】
昆虫細胞培養用培地の製造方法において、鳥類肉を破砕してペーストを得、このペーストをプロテイナーゼにより酵素処理を行ない、次にペプチダーゼで酵素処理後、前記のプロテイナーゼ及びペプチダーゼを熱変性不活性化せしめ、そして不要物を除去する、ことを特徴とする方法。
【請求項６】
前記プロテイナーゼがパパインである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鳥類肉が、鶏肉、ウズラ肉、アヒル肉、カモ肉、ハト肉又はスズメ肉である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地を使用することを特徴とする昆虫細胞の培養方法。
【請求項９】
前記昆虫細胞が有用物質生産能を有するものであり、培養が当該有用物質の製造のためである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記有用物質が、生物学的に活性蛋白質又はペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記昆虫細胞が、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）の培養細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の培養細胞、センチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）の培養細胞、ナミアゲハ（Ｐａｐｉｌｉｏ  ｘｕｔｈｕｓ）の培養細胞、アワヨトウ（Ｌｅｕｃａｎｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）の培養細胞、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｏｃｔｕｓ）の培養細胞、スジモンヒトリ（Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｓｅｒｉａｔｏｐｕｎｃｔａｔａ）の培養細胞、クワゴマダラヒトリ（Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｉｍｐａｒｉｌｉｓ）の培養細胞、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）の培養細胞、オビカレハ（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ  ｔｅｓｔａｃｅａ）の培養細胞、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ  ｃｕｐｒｅａ）の培養細胞、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）の培養細胞、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）の培養細胞、又はテンサン（Ｓａｍｉａ  ｓｙｎｔｈｉａ）の培養細胞である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、昆虫細胞培養用培地、その製造方法、及びその培地を使用する昆虫細胞の培養方法に関する。本発明は特に、昆虫培養用低血清培地及び無血清培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え技術などを用いて宿主細胞を培養して、有用物質、例えば生物学的に活性な蛋白質やペプチドを製造するに際して、哺乳動物からの培養細胞が広く用いられている。しかしながら、哺乳類の培養細胞の培養においては培養により達成される細胞濃度を十分に高くすることが困難である、培養管理が複雑であるなどの難点が存在する。
【０００３】
この問題の解決手段の一つとして、昆虫細胞の使用が提案されている。しかしながら、昆虫細胞の栄養要求性については十分に解明されておらず、牛胎児血清又は昆虫血液を添加した培地が用いられている。しかしながら、これらの添加物は高価であり、また牛胎児血清にはウイルスによる汚染の危険性が否定できず、また昆虫血液は十分な量を安定に入手することが困難である、などのため、工業的の大規模な昆虫細胞の培養には適さない、などの問題点が存在する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、牛胎児血清や昆虫血液などを使用しない、昆虫培養用の無血清培地を提供しようとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題を解決すべく種々検討を行った結果、蛋白質分解酵素により鳥類肉を分解して得られる分解物を、任意の昆虫細胞培養用培地に添加することにより、牛胎児血清や昆虫血液を添加することなく、昆虫細胞を高濃度にまで容易に培養することができるという、全く新しい知見を得、本発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明は、鳥類肉の蛋白質分解酵素加水分解物を含んでなる昆虫細胞培養用培地を提供する。前記鳥類肉は、例えば、鶏肉、ウズラ肉、アヒル肉、カモ肉、ハト肉又はスズメ肉などである。前記鳥類肉の蛋白質分解酵素分解物は、例えば、鳥類肉を破砕し、プロテイナーゼで処理し、ペプチダーゼで処理し、酵素を不活性化した後、不要物を除去したものであり、前記プロテイナーゼとしては、例えばパパインが使用される。
【０００７】
本発明は更に、昆虫細胞培養用培地の製造方法において、鳥類肉を破砕してペーストを得、このペーストをプロテイナーゼにより酵素処理を行ない、次にペプチダーゼで酵素処理後、前記のプロテイナーゼ及びペプチダーゼを熱変性不活性化せしめ、そして不要物を除去する、ことを特徴とする方法を提供する。前記プロテイナーゼは、例えばパパインである。前記鳥類肉としては、例えば、鶏肉、ウズラ肉、アヒル肉、カモ肉、ハト肉、スズメ肉などが使用される。
【０００８】
本発明は更に、本発明の前記の昆虫細胞培養用培地を用いることを特徴とする、昆虫細胞の培養方法を提供する。典型的には、前記昆虫細胞は用物質生産能を有するものであり、培養は当該有用物質、例えば生物学的に活性な蛋白質又はペプチドの製造のためのものである。培養される昆虫細胞としては、例えば、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）の培養細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の培養細胞、センチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）の培養細胞、ナミアゲハ（Ｐａｐｉｌｉｏ  ｘｕｔｈｕｓ）の培養細胞、アワヨトウ（Ｌｅｕｃａｎｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）の培養細胞、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｏｃｔｕｓ）の培養細胞、スジモンヒトリ（Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｓｅｒｉａｔｏｐｕｎｃｔａｔａ）の培養細胞、クワゴマダラヒトリ（Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｉｍｐａｒｉｌｉｓ）の培養細胞、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）の培養細胞、オビカレハ（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ  ｔｅｓｔａｃｅａ）の培養細胞、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ  ｃｕｐｒｅａ）の培養細胞、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）の培養細胞、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）の培養細胞、テンサン（Ｓａｍｉａ  ｓｙｎｔｈｉａ）の培養細胞などが挙げられる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する鳥類肉としては、特に限定されないが、十分な量を安定して入手出来るとうい実用的見地から、鶏肉、ウズラ肉、アヒル肉、カモ肉、ハト肉など、食肉用又は採卵用等として飼育される鳥類の肉が好ましい。更に、スズメ肉など、野生の鳥類の肉を使用することも出来る。
【００１０】
鳥類肉は、蛋白質分解酵素による処理に先立って破砕される。これは、鳥類肉中の蛋白質と蛋白質分解酵素との接触を促進するためであり、畜肉の加工や、魚肉の加工に際して常用されている肉破砕手段、例えばミキサーなどを用いて行う事ができる。鳥類肉の破砕に際しては、粘度調節等のために水を添加してもよい。この破砕により、鳥類肉のペーストが得られる。
【００１１】
次に、こうして得られた鳥類肉のペーストを蛋白質分解酵素により処理する。好ましくは、蛋白質分解酵素による処理は、プロテイナーゼによる処理と、それに続くペプチダーゼによる処理とにより行う。
プロテイナーゼによる処理は、鳥類肉中の蛋白質をある程度分解して鳥類肉破砕物の粘度を低下せしめ、又は可溶化して、それに続く工程でのペプチダーゼによる分解を促進するためのものである。プロテイナーゼとしては特に限定されず、パパイン、キモパパイン、プロメライン、フィシンなど、植物起源の蛋白質分解酵素およびカビ、細菌、酵母などの微生物起源の蛋白質分解酵素が使用される。
【００１２】
基質（蛋白質）濃度の調整、粘度の調整などのために、プロテイナーゼ処理の前に、鳥類肉に水を加えてもよい。プロテイナーゼによる処理の条件は、プロテイナーゼの種類、鳥類肉の種類などにより異なるが、ｐＨとしては、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、そして典型的には中性付近である。温度は３０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃であり、通常はおよそ５０℃である。処理時間は、プロテイナーゼの種類及び量、鳥類肉の種類などにより異なり、鳥類肉ペーストの可溶化の程度を観察しながら選定される。０．５〜８時間、好ましくは１〜４時間であり、例えばおよそ２時間である。
【００１３】
具体例として、例えば、パパインを使用する場合、ｐＨ７及び４０℃の温度において、２時間処理される。プロテイナーゼの添加は、鳥類肉の破砕前又は破砕中に行う事もできるが、破砕処理が終了した後に添加するのが好ましい。
【００１４】
プロテイナーゼ処理に続き、ペプチダーゼによる処理を行う。これは、プロテイナーゼ処理により生成したポリペプチド又はオリゴペプチドを更に分解するための工程であり、ペプチダーゼとしては、例えばカビ、細菌、酵母等の微生物に由来するエキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ジペプチダーゼなどが使用される。ペプチダーゼによる処理の条件はペプチダーゼの種類などにより異なるが、ｐＨとしては、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、そして典型的には中性付近である。温度は３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃であり、通常はおよそ４０℃である。処理時間は、ペプチダーゼの種類及び量などにより異なり、１〜７２時間、好ましくは１２〜６０時間、更に典型的には２４〜４８時間である。
【００１５】
次に、前記のように添加した蛋白質分解酵素、即ちプロテイナーゼ及びペプチダーゼを不活性化する事により酵素処理を終了する。蛋白質分解酵素の不活性化は常法により行えばよく、例えば９５℃以上の温度において１０〜３０分間加熱することにより行われる。
次に、酵素処理物中の不溶物の除去を行う。不溶物の除去は常法により行えばよく、例えば遠心分離又は濾過により行う事ができる。
不純物が除去された酵素処理生成物は、昆虫細胞培養用培地にそのまま加えることも出来るが、凍結乾燥により貯蔵可能な形態にするのが好ましい。
【００１６】
本発明の昆虫細胞培養用培地は、好ましくは牛胎児血清などを添加してない常用の昆虫細胞培養用培地（基礎培地）に、鳥類肉の蛋白質分解酵素を添加したものである。任意の昆虫細胞培養用培地としては、例えば、Ｇｒａｃｅの培地、ＭＭ−ＳＦ培地、Ｌａｎｄｕｒｅａｕの培地（Ｓ−１９培地、Ｓ−１９Ｂ培地、Ｓ−２０培地、Ｌ−２１培地）、ＷｉｌｋｉｅらのＣＤＭ培地、ＭＭ培地、ＭＴＣＭ−１１０３培地、ＩＰＬ混合培地、ＲＩＬ培地、Ｋｉｔａｍｕｒａらの培地、Ｅｃｈａｌｉｅｒの培地（これらの培地の組成は、細胞工学  Ｖｏｌ．７，  Ｎｏ．２，（１９８８）ｐ．１４５−１５５に記載されている）などが挙げられる。
【００１７】
更に、好ましい昆虫細胞培養用基礎培地の１例として、三橋らにより開発されたＭＭ−ＳＦ培地（Ｎａｇａｓａｗａ，  Ｎ．，Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｊ．  ＆  Ｓａｚａｋｉ，Ａ．：ＶＩＩ  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｃｏｎｆ．  Ｉｎｖｅｒｔ．  Ｆｉｓｈ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｏｈｉｔｏ，  Ｊａｐａｎ（１９８７）；培地組成：Ｇｌｕｃｏｓｅ  ０．４％、Ｌａｃｔｏ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（「Ｌｈ」と略す場合がある）０．６％、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．７％、ＫＣｌ  ０．０２％、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ  ０，０１％、ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ＮａＨＣＯ３  ０．０１２％：ｐＨ６．３〜６．５）が挙げられる。
【００１８】
本発明の昆虫細胞培養用培地は、上記の如き基礎培地又は改変した基礎培地に、本発明の鳥類肉の酵素分解物を添加したものであり、この場合の鳥類肉酵素分解物の添加量は、鳥類肉酵素分解物の凍結乾燥物の量として、培地１Ｌ当り、０．５ｇ〜３ｇ、好ましくは１．０ｇ〜１．５ｇである。
また、本発明の昆虫細胞培養用培地のｐＨは、６．０〜７．０、好ましくは６．３〜６．５、例えば約ｐＨ６．４である。
本発明の昆虫細胞培養用培地による昆虫細胞の培養における培養温度は、２０℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３０℃であり、典型的にはおよそ２６℃である。
【００１９】
本発明はまた、昆虫細胞の培養による有用物質、典型的には生物学的活性を有する蛋白質又はペプチドの製造方法に関する。この場合、目的とする生物学的に活性な蛋白質をコードする核酸を含んで成る発現ベクターにより、定法に従って昆虫細胞を形質転換し、形質転換された昆虫細胞を本発明の方法に従って培養し、培養物から目的とする蛋白質を回収する。生物学的に活性な蛋白質としては、例えば、各種の酵素類、各種の抗体類、例えばキメラ抗体、ヒト型化抗体など、各種のサイトカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類、各種血液凝固関連因子などが挙げられる。
【００２０】
本発明の昆虫細胞培養用培地で培養することができる昆虫細胞としては、特に限定されず、基礎培地を適切に選択することにより、広範囲の昆虫細胞を培養することができる。例えば、上に記載した、ヨトウガ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）の培養細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の培養細胞、センチニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）の培養細胞、ナミアゲハ（Ｐａｐｉｌｉｏ  ｘｕｔｈｕｓ）の培養細胞、アワヨトウ（Ｌｅｕｃａｎｉａ  ｓｅｐａｒａｔａ）の培養細胞、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｏｃｔｕｓ）の培養細胞、スジモンヒトリ（Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｓｅｒｉａｔｏｐｕｎｃｔａｔａ）の培養細胞、クワゴマダラヒトリ（Ｓｐｉｌｏｓｏｍａ  ｉｍｐａｒｉｌｉｓ）の培養細胞、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）の培養細胞、オビカレハ（Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ  ｎｅｕｓｔｒｉａ  ｔｅｓｔａｃｅａ）の培養細胞、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ  ｃｕｐｒｅａ）の培養細胞、サクサン（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）の培養細胞、シンジュサン（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ  ｐｒｙｅｒｉ）の培養細胞、テンサン（Ｓａｍｉａ  ｓｙｎｔｈｉａ）の培養細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
そして、上記の昆虫細胞には、目的とする蛋白質をコードする核酸を含んで成る発現ベクターにより形質転換されたものも含まれる。
【００２２】
【実施例】
次に、実施例により本願発明を更に具体的に説明する。
実施例１． 蛋白質分解酵素による鳥類肉の加水分解
鶏肉をミキサーにより破砕し、鶏肉ぺーストを得た。このペースト１００ｇに水１５０ｍｌを加えて混合し、それに植物由来パパイン０．４ｇを添加し、そしてｐＨ７及び５０℃の条件下で２時間インキュベートし酵素分解を行った後、可溶化した鶏肉破砕物を得た。次に、これにペプチダーゼ（製品名などペプチダーゼＲ（天野エンザイムＫＫ）又はタシナーゼＫＥ１０（協和エンザイムＫＫ））０．４ｇを添加し、４０℃にて２４〜４８時間酵素分解を行った後、９５℃にて１５分間加熱することで酵素を失活させた。次に、酵素加水分解物を遠心分離、及び濾過操作により不溶物を除去し、これを凍結乾燥することにより、酵素加水分解物３５ｇを得た。
【００２３】
実施例２． 各種の由来の肉の蛋白質分解酵素加水分解物の比較
鶏肉の酵素加水分解物（実施例１）のほかに、ラクトアルブミン酵素加水分解物（Ｌｈ）、豚肉酵素加水分解物、大豆蛋白質酵素加水分解物、ホタテ酵素加水分解物、及びカツオ魚肉酵素加水分解物を用いて昆虫細胞（ヨトウガの培養細胞Ｓｆ−９）を培養し、各種添加物の昆虫細胞増殖促進効果を比較した。
【００２４】
（１）Ｓｅｅｄ培養
市販培地ＥＸ−ＣＥＬＬ培地を１００ｍｌプラスチック製三角コルベンに２５ｍｌ分注した。このＳｅｅｄ培地に、継代培養液から細胞数５×１０５  細胞／ｍｌになるように細胞を移植した。  培養温度２６℃にて、ロータリーシェーカー上で回転数８０ｒ．ｐ．ｍ  で、約９６〜１２０時間振とう培養を行い、細胞濃度約７×１０６細胞／ｍｌまで培養した。
【００２５】
（２）Ｍａｉｎ培養
培地
ＭＭ−ＳＦ培地（Ｎａｇａｓａｗａ，  Ｎ．，Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｊ．  ＆  Ｓａｚａｋｉ，Ａ．：ＶＩＩ  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｃｏｎｆ．  Ｉｎｖｅｒｔ．  Ｆｉｓｈ．  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｏｈｉｔｏ，  Ｊａｐａｎ（１９８７）；培地組成：Ｇｌｕｃｏｓｅ  ０．４％、Ｌａｃｔｏ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（「Ｌｈ」と略す場合がある）０．６％、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．７％、ＫＣｌ  ０．０２％、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ  ０，０１％、ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ  ０．０２％、ＮａＨＣＯ３  ０，０１２％：ｐＨ６．３〜６．５）を改変して基礎培地として使用し、これに上記の各種の添加物を加えた。この実験においては、Ｇｌｕｃｏｓｅ濃度を１％にする改変を行なった。
【００２６】
こうして調製した培地２５ｍｌを０．２２ｍフィルターを用いて除菌した後、１００ｍｌプラスチック製三角コルベンに分注した。抗生物質混液０．５ｍｌ、及びＦＣＳ  ０．７８ｍｌを添加した後、上記Ｓｅｅｄ培養液を１．８ｍｌを移植した。（なお、Ｍａｉｎ培養に移植するＳｅｅｄ培養液量はＥＸ−ＣＥＬＬ培地の影響を考慮して１．８ｍｌに統一した。また、移植細胞数がＭａｉｎ培養液に対して５×１０５  細胞／ｍｌになるように、Ｓｅｅｄ培養の培養時間を調整した。）
【００２７】
培養条件
Ｓｅｅｄ培養の場合と同様、培養温度は２６℃とし、ロータリーシェーカー上で回転数８０ｒ．ｐ．ｍ  で振とう培養を行った。培養は、８日間行なった。
細胞数の測定
経時的に血球測定板を用いて測定した。
【００２８】
（３）結果
図１に示すように、鶏肉酵素加水分解物を用いた場合が最高で、次いで乳蛋白質加水分解物（Ｌｈ）、魚肉（カツオ）の順であった。ホタテ肉酵素加水分解物は殆ど増殖が認められなかった。
【００２９】
実施例３． グルコース濃度および鶏肉酵素加水分解物濃度の影響
Ｓｅｅｄ培養は実施例２と同様にし、Ｍａｉｎ培養においては、基本培地のグルコース濃度を０．５％及び１％に変更し、Ｌｈの代わりに鶏肉酵素加水分解物を、濃度０．５％、１．０％及び１．５％を添加した培地を調製した。実施例２に記載したのと同様にしてＳｆ−９株を培養し、培養６日目及び８日目に細胞数を測定した。図２に示すように、グルコース濃度１％および鶏肉酵素加水分解物濃度１．５％の組み合わせにおいて最高の細胞増殖が認められた。
【００３０】
実施例４． 各無機塩類および濃度の影響
グルコース１％、鶏肉酵素加水分解物  １．５％、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ０．５％とし、各種無機塩類（ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ、ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、ＮａＨ２ＰＯ  ２Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３）の種類と濃度の組み合わせにより種々の培地を調製した。それらの培地で、実施例２に記載した様にしてＳｆ−９株を培養し、培養６日目および８日目の細胞数を測定した。その結果、代表的な組み合わせおよび濃度を図３に示す。
【００３１】
図中、培地ＡはＮａＣｌ，７００；ＫＣｌ，２０；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，２０；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，１０；ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，２０；ＮａＨＣＯ３，１２、培地ＢはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，１１４；ＮａＨＣＯ３，３５；ＫＣｌ，２２４；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，１３２；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，２２８；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２７８、培地ＣはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，５６．５；ＫＣｌ，１２０；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，４０；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，１２０；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，１６０、培地ＤはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，１１４；ＫＣｌ，２８７；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，１３２；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２８７；ＮａＣｌ，５０、そして培地ＥはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，２２．６；ＫＣｌ，２０；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，２０；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，２０；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，１０；ＮａＣｌ，７００、（無機塩類濃度ｍｇ／１００ｍｌ）の結果を示す。
図３に示すように、哺乳類細胞と異なり、ＮａＣｌよりＫＣｌが良く、ＭｇＣｌ２  およびＭｇＳＯ４  濃度が低いと細胞の増殖が悪いことが判明した。またＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏは１００ｍｇ／１００ｍｌ以上の濃度は必要と思われる。哺乳類細胞の培養に必須のＮａＨＣＯ３  は効果が認められなかった。
【００３２】
実施例５． ｙｅａｓｔｏｌａｔｅの至適濃度の検討
ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ至適濃度の検討を行った。基本培地としてグルコース１％、鶏肉酵素加水分解物  １．５％（ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ  １１４ｍｇ、ＫＣｌ  ２８７ｍｇ、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  １３２ｍｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ２８７ｍｇ、ＮａＣｌ  ５０ｍｇ／１００ｍｌ）の組成を有する培地にｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  を０．５〜０．８％の濃度範囲にわたって添加し、実施例２に記載したのと同様にしてＳｆ−９細胞を培養し、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅが増殖に及ぼす影響を調べた。
結果は図４に示すように、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ濃度０．８％が最高の増殖を示した。
【００３３】
実施例６． 各種鳥類種による細胞増殖促進作用
鶏肉酵素加水分解物を用いて、細胞増殖培地の検討を行ってきたが、これに加えてウズラ、カモ及びハトの肉酵素加水分解物を、実施例１に記載したようにして調製した。基本培地として、グルコース１％、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ０．８％（ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ  １１４ｍｇ、ＫＣｌ  ２８７ｍｇ、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  １３２ｍｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ２８７ｍｇ、ＮａＣｌ  ５０ｍｇ／１００ｍｌ）に鳥類肉酵素加水分解物１．５％を添加し、細胞増殖に及ぼす影響を調べた。結果は図５に示すように鳥類種による相違は見られなかった。
【００３４】
以上、Ｓｆ−９株を用いて低血清培地組成の検討をした結果、細胞増殖の良好な培地の例として次の培地組成を示す。
グルコース１％、鶏肉酵素加水分解物  １．５％、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ０．８％（ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ  １１４ｍｇ、ＫＣｌ  ２８７ｍｇ、ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ  １３２ｍｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ２８７ｍｇ、ＮａＣｌ  ５０ｍｇ／１００ｍｌ）培地  ｐＨ６．４
【００３５】
実施例７． 既存培地との比較
現在、昆虫細胞培養用培地として培地組成の公開されているＭＭ−ＳＦ培地（Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，  Ｊ．  ＆  Ｍａｒａｍｏｒｏｓｃｈ，  Ｋ．  （１９６４）  Ｃｏｎｔｒｉｂ．  Ｂｏｙｃｅ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｉｎｓｔ．  ２２；４３５）及びＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｄ．Ｃ．  （１９６２）  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｓｅｃｔ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９５：７８８−７８９；）と、本発明の最適培地の比較検討を行った。その結果を図６に示す。図が示すように、既存培地と比較して今回開発した培地は昆虫細胞の増殖促進が優れていることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、昆虫細胞（Ｓｆ−９株）の増殖に及ぼす、各種蛋白質の加水分解物の効果を示すグラフであり、鳥類肉の蛋白質分解酵素による分解物が最適であることを示している。
【図２】図２は、昆虫細胞（Ｓｆ−９株）の増殖に及ぼす、グルコース濃度及び鶏肉酵素加水分解物濃度の影響を示すグラフである。
【図３】図３は、昆虫細胞（Ｓｆ−９株）の増殖に及ぼす、無機塩類の種類と濃度の影響を示すグラフである。図中、培地ＡはＮａＣｌ，７００；ＫＣｌ，２０；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，２０；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，１０；ＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，２０；ＮａＨＣＯ３，１２、培地ＢはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，１１４；ＮａＨＣＯ３，３５；ＫＣｌ，２２４；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，１３２；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，２２８；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２７８、培地ＣはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，５６．５；ＫＣｌ，１２０；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，４０；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，１２０；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，１６０、培地ＤはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，１１４；ＫＣｌ，２８７；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，１３２；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，２８７；ＮａＣｌ，５０、そして培地ＥはＮａＨ２ＰＯ４２Ｈ２Ｏ，２２．６；ＫＣｌ，２０；ＣａＣｌ２２Ｈ２Ｏ，２０；ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ，２０；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，１０；ＮａＣｌ，７００（無機塩類濃度単位ｍｇ／１００ｍｌ）の結果を示す。
【図４】図４は、昆虫細胞（Ｓｆ−９株）の増殖に及ぼす、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅの濃度の効果を示すグラフである。
【図５】図５は、昆虫細胞（Ｓｆ−９株）の増殖に及ぼす、各種の鳥類肉の酵素加水分解物の効果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の昆虫細胞培養用培地と既知の昆虫細胞培養用培地を、昆虫細胞（Ｓｆ−９株）の増殖について比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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