(57)【要約】【課題】本発明は、封入体経路を介して抗融合性ペプチドを高収率で組換え産生することを可能にする方法であって、このようなペプチドを工業的に大量生産するのに適した方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、微生物宿主細胞において繰り返しペプチドとして抗融合性ペプチドをコードする核酸の発現、該繰り返しペプチドを含む封入体の単離、該封入体の可溶化、および切断後の抗融合性ペプチドの単離により、抗融合性ペプチドを組換え産生する方法であって、pH 6.5またはそれ以下で変性剤を用いて該封入体を洗浄する段階、少なくともpH 9で該繰り返しペプチドを含む該封入体を可溶化する段階、および該繰り返しペプチドを切断して該抗融合性ペプチドを得る段階を特徴とする方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物宿主細胞において繰り返しペプチドとして抗融合性ペプチドをコードする核酸の発現、該繰り返しペプチドを含む封入体の単離、該封入体の可溶化、および切断後の抗融合性ペプチドの単離により、抗融合性ペプチドを組換え産生する方法であって、pH 6.5またはそれ以下で変性剤を用いて該封入体を洗浄する段階、少なくともpH 9で該繰り返しペプチドを含む該封入体を可溶化する段階、および該繰り返しペプチドを切断して該抗融合性ペプチドを得る段階を特徴とする方法。
【請求項２】
洗浄段階がpH 3〜5で行われることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
繰り返しペプチドが封入体の可溶化の間または後に切断されることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
N末端からC末端方向において、
(a)少なくとも2個の同一の抗融合性ペプチド配列の繰り返しペプチドとしての、抗融合性ペプチド；
(b)該抗融合性ペプチドの間に位置する切断部位
からなる融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５】
抗融合性ペプチドが10個から100個のアミノ酸からなることを特徴とする、請求項4記載の核酸。
【請求項６】
繰り返しが2個から20個の同一の抗融合性ペプチド配列からなることを特徴とする、請求項4または5記載の核酸。
【請求項７】
N末端からC末端方向において、
(a)約10個から約100個の長さのアミノ酸の繰り返しペプチドとしての、抗融合性ペプチド；
(b)該抗融合性ペプチドの間に位置する切断部位
からなる融合ポリペプチドを含む封入体の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスと標的細胞の膜との融合を阻害するペプチドの組換え生産方法に関する。特に、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）などのレンチウイルス、麻疹ウイルス（MEV）、呼吸系発疹ウイルス（RSV）などのインフルエンザウイルス、またはヒトパラインフルエンザウイルス（HPV）のペプチド阻害剤の組換え生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスと細胞膜との融合は、HIV-I、HIV-II、RSV、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、エプスタイン-バーウイルス、および肝炎ウイルスなどの膜に包まれた（エンベローブ）ウイルスが、細胞に侵入するために不可欠な段階である。細胞への侵入後、ウイルス感染の結果としてウイルス複製のカスケードが開始される。
【０００３】
HIVは、複合体ゲノムを有し円錐形キャプシドコア粒子を示すレトロウイルスを含む、レンチウイルス属のメンバーである。レンチウイルスの他の例としては、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ビスナウイルス、およびウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）が含まれる。全てのレトロウイルスのように、HIVのゲノムは、RNAによってコードされ、新たな宿主細胞に侵入する際、ウイルス逆転写酵素（RT）によってウイルスDNAに逆転写される。インフルエンザウイルスおよびこれらの細胞侵入の機序は、非特許文献１、２および３に記載されている。
【０００４】
全てのレンチウイルスは、宿主細胞の膜由来の脂質二重層によって包まれている。露出表面の糖タンパク質（SU、gp120）は、膜貫通タンパク質（TM、gp41）との相互作用を介して、ウイルスに固定される。脂質二重層はまた、主要組織適合抗原、アクチン、およびユビキチンを含む、宿主細胞に由来するいくつかの細胞膜タンパク質を含む（非特許文献４）。約2000コピーの基質タンパク質（MA、p17）を含む基質の殻はウイルス膜の内部表面に並び、約2000コピーのキャプシドタンパク質（CA、p24）を含む円錐形キャプシドコア粒子はウイルスの中心に局在する。キャプシド粒子は、2コピーのスプライシングされていないウイルスゲノムを包み、これは、約2000コピーの核キャプシドタンパク質（NC、p7）とのリボ核タンパク質複合体として安定化されており、また、3つの必須のウイルス性コード酵素であるプロテアーゼ（PR）、逆転写酵素（RT）、およびインテグラーゼ（IN）を含む。ウイルス粒子はまた、アクセサリータンパク質であるNef、Vif、およびVprをパッケージングしている。宿主細胞内で機能する3つの付加的なアクセサリータンパク質、Rev、Tat、およびVpuは、パッケージングされていないと考えられる。
【０００５】
HIVの場合には、ウイルスの侵入はHIVエンベローブ表面糖タンパク質に関連する（非特許文献５および６）。HIV-1の場合には、この表面タンパク質は単一の160 kDの前駆タンパク質として合成され、細胞プロテアーゼにより分解されて、2つの糖タンパク質gp-41およびgp-120となる。gp-41は膜貫通タンパク質であり、gp-120は、三量体または多量体の形態でgp-41と非共有結合する細胞外タンパク質である（非特許文献７）。HIVは、CD4表面タンパク質がHIV-1ウイルスの細胞受容体として作用するため、CD4+リンパ球に対して標的化される。細胞内へのウイルスの侵入は、gp-120が細胞CD4+受容体分子に結合することに依存しており、一方、gp-41はウイルス膜におけるエンベローブ糖タンパク質複合体を固定して、膜融合を媒介している（非特許文献８および９）。
【０００６】
gp41はウイルスおよび細胞の膜の融合を介する膜貫通サブユニットである。gp41外部ドメインコアは、3個のヘリックスヘアピンから構成される6個のヘリックス束であり、それぞれ逆平行Cヘリックスと対を形成するNヘリックスからなる（非特許文献１０、１１、および１２）。Nヘリックスは、3個の保存された疎水性の溝を有する、内部の三量体コイルド-コイルを形成し、Cヘリックスは、これらの溝の各々をパッケージングする。この構造は、gp41の融合活性状態のコアと対応する可能性が高い。Chan, D. C.ら（非特許文献１３）により、HIV1型のgp-41におけるコイルド-コイル中の突出した腔が魅力的な薬物標的である証拠が示されている。
【０００７】
膜融合を媒介するgp-41の機序にコイルド-コイル三量体の形成が含まれる可能性があり、例えば、非特許文献１、２および３に記載のように、インフルエンザ赤血球凝集について、休止期から融合性状態への移行を誘導すると考えられる。
【０００８】
エンベローブウイルスのCペプチド（Cヘリックスに対応するペプチド）、例えばDP178およびC34は共に、実験用に適応された株であり且つ最初の単離物であるHIV-1によって膜融合が阻害される可能性がある（非特許文献１４および１５）。CペプチドDP178による第一相臨床試験では、DP178が、インビボにおいて抗ウイルス活性を有し、その結果、ウイルス量が減少することが示唆されている（非特許文献１６）。gp41コアの構造的特徴により、これらのペプチドは、ドミナント-ネガティブな機序で作用しており、Cペプチドがgp41の中心コイルド-コイルに結合して、不活性化が引き起こされることが示唆される（非特許文献１７）。
【０００９】
各コイルド-コイル境界面の内部に深い腔があり、これはNヘリックスコイルド-コイルにおける残基のクラスターによって形成され、これは抗ウイルス化合物の開発のための魅力的な標的であると提唱されている。Cヘリックス由来の3つの残基（Trp-628、Trp-631、およびIle-635）はこの腔に挿入され、高度の疎水性の接触を引き起こす。変異解析において、この腔を含む2つのNヘリックス残基（Leu-568およびTrp-571）が膜融合活性において重要であることが示されている（非特許文献１８）。従って、この腔に高親和性で結合し、且つ通常のNヘリックスとCヘリックスの対形成を防止する化合物は効果的なHIV-1阻害剤である可能性を有する。腔における残基は、様々なHIV-1単離物の間で高度に保存されている。さらに、腔結合領域を含むCペプチドは、この領域を欠失しているDP178よりも耐性ウイルスの進化を受けにくい（非特許文献１９）。これらの観察により、保存されたコイルド-コイル表面（特に、その溝）を標的化する高親和性リガンドは、様々なHIV単離物に対して広範囲の活性を有すると考えられ、薬物エスケープ変異体によって回避される可能性が低い。
【００１０】
エンベローブ融合タンパク質の融合性構造は、インフルエンザウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびサル免疫不全ウイルス（非特許文献１３）、ヒト呼吸系発疹ウイルス、エボラウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、およびサルパラインフルエンザウイルスにより示されている。オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、レトロウイルス科、およびフィロウイルス科などの他の科の間には密接な関係が示されており、標的細胞へのウイルスの侵入は、HIV-1のgp41などの膜貫通糖タンパク質、インフルエンザの血液凝集、エボラのGP2などによって可能となる（非特許文献２０）。
【００１１】
当技術分野において、ペプチド阻害剤（Cペプチド）の調製についての方法が記載されている（非特許文献２１参照）。RootらはHIV-1に由来するペプチドC37-H6を記載している。HXB2は625位〜661位の残基を含む。GGR-リンカーおよびヒスチジンタグを有するN40セグメントとして組換え的に発現され、大腸菌（E. coli）で発現され、細菌溶解物の可溶性画分から精製された。Zhao, Xらは、非特許文献２０において、recRSV-1（ヒト呼吸系発疹ウイルス）（153位〜209位）、Gリッチリンカー（476位〜524位）、ファクターXa切断部位、およびhis-タグの合成遺伝子を記載している。Chen, C. H.らは、非特許文献２２において、MBPとの融合タンパク質（540位〜686位）として合成されるgp41の細胞外ドメインの組換え発現を記載している。
【００１２】
例えば、非感染細胞へのレトロウイルス転移を阻害することを含む、そのような膜融合に関連する事象の多くのペプチド阻害剤（抗融合性ペプチドとも称される）が知られている。そのようなペプチドは、例えば、非特許文献２３および特許文献１〜６に記載されている。さらに、融合に関連する事象を阻害するペプチドは、例えば特許文献１〜３および７〜１１に記載されている。
【００１３】
ウイルス性融合を阻害するHIV-1 gp-41外部ドメイン由来の直鎖状ペプチドの例として、DP-107およびDP-178がある。DP-107は、N末端融合ペプチド近傍のgp-41の一部分であり、ヘリックスであることが示されており、コイルド-コイル形成に適応した様式で、強くオリゴマー化する（非特許文献１１および２４）。DP-178は、gp-41外部ドメインのC末端領域に由来する（非特許文献１１）。溶液中に認識可能な構造がないにもかかわらず、このペプチドおよびこれに由来する制限された類似体は、ヘリックス構造をとり、gp41のN末端コイルド-コイル三量体の溝に結合し、従って、gp41が融合性状態に移行するのを妨げる（非特許文献２５）。
【００１４】
そのような短鎖は通常、化学合成によって調製される。化学合成は、例えば、非特許文献２６、２７、および２８に記載されている。さらなる方法は特許文献１２に記載されている。
【００１５】
しかし、化学的なペプチド合成はいくつかの欠点を有している。ラセミ化が最も重要であり、これにより、光学純度が不十分となる。また、ペプチド化学において、ラセミ化は、いくつかのキラル中心のうち1つで異性化されることを意味する。わずか1％のラセミ化が1回のカップリング工程で生じるとすると、100回のカップリング工程では、わずか61％の標的ペプチドのみがラセミ化を受けると考えられる（非特許文献２９）。鎖の長さの増加に従って、夾雑物の数が増加し、分別がより困難で費用のかかるものとなることは明らかである。
【００１６】
大規模な化学合成は、非常に費用がかかり、且つ出発材料である保護されたアミノ酸誘導体の入手可能性が乏しいために、制限される。一方では、これらの出発材料は完全な反応を行うために過剰に使用されるが、他方では、これらの使用を、費用的理由、安全性、および環境的な局面から秤にかけなければならない（非特許文献２７）。
【００１７】
HIV-1 Revペプチドの組換え産生方法が、非特許文献３０に記載されている。ペプチドは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）タンパク質Aの合成G型免疫グロブリン（IgG）結合ドメインとの融合タンパク質として発現される。このペプチドは、約20個の長さのアミノ酸を有し、IgG結合部分は、約170個の長さのアミノ酸を有し、従って、発現された融合タンパク質は、全長約190個のアミノ酸を有する。この融合タンパク質は、発現され、培地中に可溶性の形態で分泌され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。著者は、この方法を用いて、1リットルの培養物に対して数百ミリグラム量の組換えタンパク質が産生可能と思われると報告した。しかし、この方法論は、融合タンパク質および切断されたペプチドのシグナルペプチド配列内でのオルタナティブ・スプライシングならびにいくつかの翻訳後修飾のために、制限される。アミノ酸の平均分子量が110ダルトンであるすると、望ましいペプチドは、約2,000ダルトン〜約5,000ダルトンの分子量を有するのに対して、ブドウ球菌タンパク質AのIgG結合ドメインが融合尾部として使用される場合、融合尾部は少なくとも170個の長さのアミノ酸（約19,000ダルトン）を有する。従って、10％から25％のみの組換え産生タンパク質が望ましいペプチドである。
【００１８】
大腸菌における融合タンパク質による小型ペプチドの組換え産生のさらなる例および方法は、非特許文献３１、３２、および３３に記載されている。非特許文献３４は、大腸菌のp24 gag遺伝子の組換え発現を記載している。
【００１９】
特許文献１３は原核宿主細胞内の約14個〜約70個の長さのアミノ酸の融合ペプチドとして、抗融合性ペプチドの産生方法を記載しており、この方法は、融合ペプチドの封入体が形成されるような条件下で、該宿主細胞内で、約4アミノ酸から約30アミノ酸長のペプチドをN末端にさらに結合する約10アミノ酸から約50アミノ酸長の抗融合性ペプチドからなる融合ペプチドをコードする核酸を発現させる段階；この宿主細胞を培養する段階；封入体を形成し、回収し、可溶化する段階；および融合ペプチドを単離する段階を特徴とする。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第6,013,263号明細書
【特許文献２】米国特許第6,017,536号明細書
【特許文献３】米国特許第6,020,459号明細書
【特許文献４】国際公開第00/69902号パンフレット
【特許文献５】国際公開第99/59615号パンフレット
【特許文献６】国際公開第96/40191号パンフレット
【特許文献７】米国特許第6,093,794号明細書
【特許文献８】米国特許第6,060,065号明細書
【特許文献９】米国特許第5,464,933号明細書
【特許文献１０】米国特許第5,656,480号明細書
【特許文献１１】国際公開第96/19495号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第99/48513号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第02/103026号パンフレット
【非特許文献１】Bullough, P. A.ら、Nature、1994年、第371巻、p.37-43
【非特許文献２】Carr, C. MおよびKim, P. S.、Cell、1993年、第73巻、p.823-832
【非特許文献３】Wilson, I. A.ら、Nature、1981年、第289巻、p.366-373
【非特許文献４】Arthur, L. O.ら、Science、1992年、第258巻、p.1935-1938
【非特許文献５】Lawless, M. K.ら、Biochemistry、1996年、第35巻、p.13697-13708
【非特許文献６】Turner, B. G.およびSummers, M. F.、J. Mol. Biol.、1999年、第285巻、p.1-32
【非特許文献７】Hammarskjold, M. L.ら、Biochem. Biophys. Acta.、1989年、第989巻、p.269-280
【非特許文献８】McDougal, J. S.ら、Science、1986年、第231巻、p.382-385
【非特許文献９】Maddon, P. J.ら、Cell、1986年、第47巻、p.333-348
【非特許文献１０】Chan, D. C.ら、Cell、1997年、第89巻、p.263-273
【非特許文献１１】Weissenhorn, W.ら、Nature、1997年、第387巻、p.426-430
【非特許文献１２】Tan, K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、第94巻、p.12303-12308
【非特許文献１３】Chan, D. C.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1998年、第95巻、p.15613-15617
【非特許文献１４】Malashkevich, V. N.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、1998年、第95巻、p.9134-9139
【非特許文献１５】Wild, C. T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1994年、第91巻、p.9770-9774
【非特許文献１６】Kilby, J. M.ら、Nature Medicine、1998年、第4巻、p.1302-1307
【非特許文献１７】Chan, D. C.ら、Cell、1998年、第93巻、p.681-684
【非特許文献１８】Cao, J.ら、J. Virol.、1993年、第67巻、p.2747-2755
【非特許文献１９】Rimsky, L. T.ら、J. Virol.、1998年、第72巻、p.986-993
【非特許文献２０】Zhao, X.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、2000年、第97巻、p.14172-14177
【非特許文献２１】Root, M. J.ら、Science、2001年、第291巻、p.884-888
【非特許文献２２】Chen, C. H.ら、J. Virol.、1995年、第69巻、p.3771-3777
【非特許文献２３】Lambert, D. M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1996年、第93巻、p.2186-2191
【非特許文献２４】Gallaher, W. R.ら、Aids Res. Hum. Retrovirus 、1989年、第5巻、p.431-440
【非特許文献２５】Judice, J. K.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、第94巻、p.13426-13430
【非特許文献２６】Merger, M.ら、Tetrahedron Letters、1988年、第29巻、p.4005-4008, p.4009-4012
【非特許文献２７】Andersson, L.ら、Biopolymers、2000年、第55巻、p.227-250
【非特許文献２８】Jones, J. H.ら、J. Pept. Sci.、2000年、第6巻、p.201-207
【非特許文献２９】Jakubke, H. D.ら、Peptide, Spektrum Akad. Verlag., Heidelberg、1996年、p.198
【非特許文献３０】Lepage, P.ら、Analytical Biochemistry、1993年、第213巻、p.40-48
【非特許文献３１】Uhlen, M.およびMoks, T.、Methods Enzymol.、1990年、第185巻、p.129-143
【非特許文献３２】Williamson, R.編、Genetic Engineering、Expression of eukaryotic genes in E. coli. (London)、Academic Press、1983年、第4巻、p.127-185
【非特許文献３３】Kopetzki, E.ら、Clin. Chem.、1994年、第40巻、p.688-704
【非特許文献３４】Ningyi, L.ら、Gaojishu Tongxun、2000年、第10巻、p.28-31
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、封入体経路を介して抗融合性ペプチドを高収率で組換え産生することを可能にする方法であって、このようなペプチドを工業的に大量生産するのに適した方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
従って、本発明は、微生物宿主細胞、好ましくは原核宿主細胞において繰り返しペプチドとして抗融合性ペプチドをコードする核酸の発現、該繰り返しペプチドを含む封入体の単離、該封入体の可溶化、および切断後の抗融合性ペプチドの単離により、抗融合性ペプチドを組換え産生する方法であって、pH 6.5またはそれ以下で変性剤を用いて該封入体を洗浄する段階、少なくともpH 9で該繰り返しペプチドを含む該封入体を可溶化する段階、および該繰り返しペプチドを切断して該抗融合性ペプチドを得る段階を特徴とする方法を提供する。
【００２３】
驚くべきことに、抗融合性活性を有するポリペプチドの繰り返しの封入体（以降、融合ポリペプチドとも称する）は、pH 6.5およびそれ以下の変性条件で耐性であることが見出された。これを基に、本発明の条件により、高効率な方法で、宿主細胞ポリペプチドおよび他の宿主細胞由来不純物からそのような繰り返しペプチドを含む封入体を精製することが可能であり、封入体に含まれる全ての物質の多くはこのような変性条件で容易に可溶化するため、このような変性条件下で封入体を単に洗浄することにより除去することができる。
【００２４】
その後の段階において、封入体は可溶性繰り返しペプチドの回収の為にpH 9およびそれ以上で可溶化されるため、洗浄剤または変性剤を加える必要はない。可溶化の後、繰り返しペプチドは、化学的または酵素的に切断され、所望の抗融合性ペプチドを得ることができる。
【００２５】
本発明の好ましい態様において、切断配列は繰り返しの抗融合性ペプチドの間に局在し、繰り返しペプチドは、好ましくは約1アミノ酸から約10アミノ酸長である切断配列と共に結合されることを特徴とする、融合ポリペプチドに含まれる。抗融合性ペプチド自体は、10個から100個の長さのアミノ酸を有し、それにより（封入体の安定な発現および形成に関して）、融合ポリペプチドの長さは、少なくとも約50アミノ酸であることが好ましい。
【００２６】
従って本発明は、封入体を単に洗浄して、その後これらを異なるpH値で可溶化することにより、封入体経路を介して抗融合性ペプチドを極めて簡単に組換え産生する方法を提供する。
【００２７】
本発明に係る方法においては、（１）微生物宿主細胞において繰り返しペプチドとして抗融合性ペプチドをコードする核酸の発現、該繰り返しペプチドを含む封入体の単離、該封入体の可溶化、および切断後の抗融合性ペプチドの単離により、抗融合性ペプチドを組換え産生する方法であって、pH 6.5またはそれ以下で変性剤を用いて該封入体を洗浄する段階、少なくともpH 9で該繰り返しペプチドを含む該封入体を可溶化する段階、および該繰り返しペプチドを切断して該抗融合性ペプチドを得る段階を特徴とする方法であることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る方法においては、（２）洗浄段階がpH 3〜5で行われることを特徴とする、(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る方法においては、（３）繰り返しペプチドが封入体の可溶化の間または後に切断されることを特徴とする、(1)または(2)記載の方法であることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係る核酸においては、（４）N末端からC末端方向において、
(a)少なくとも2個の同一の抗融合性ペプチド配列の繰り返しペプチドとしての、抗融合性ペプチド；
(b)該抗融合性ペプチドの間に位置する切断部位
からなる融合ポリペプチドをコードする核酸であることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る核酸においては、（５）抗融合性ペプチドが10個から100個のアミノ酸からなることを特徴とする、(4)記載の核酸であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係る核酸においては、（６）繰り返しが2個から20個の同一の抗融合性ペプチド配列からなることを特徴とする、(4)または(5)記載の核酸であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る方法においては、（７）N末端からC末端方向において、
(a)約10個から約100個の長さのアミノ酸の繰り返しペプチドとしての、抗融合性ペプチド；
(b)該抗融合性ペプチドの間に位置する切断部位
からなる融合ポリペプチドを含む封入体の調製方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、微生物宿主細胞において繰り返しペプチドとして抗融合性ペプチドをコードする核酸の発現、該繰り返しペプチドを含む封入体の単離、該封入体の可溶化、および切断後の抗融合性ペプチドの単離により、抗融合性ペプチドを組換え産生する方法であって、pH 6.5またはそれ以下で変性剤を用いて該封入体を洗浄する段階、少なくともpH 9で該繰り返しペプチドを含む該封入体を可溶化する段階、および該繰り返しペプチドを切断して該抗融合性ペプチドを得る段階を特徴とする方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本明細書において、「抗融合性」および「抗膜融合」とは、2個またはそれ以上の構造（例えば、細胞膜、ウイルスエンベロープ、または線毛）間の融合事象のレベルが、ペプチドが存在しない構造間で生じる膜融合のレベルに対して、阻害されるまたは減少するペプチドの能力を指す。本明細書の例としては、レンチウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、呼吸系発疹ウイルス（RSV）、ヒトパラインフルエンザウイルス（HPV）、麻疹ウイルス（MEV）、およびサル免疫不全ウイルス（SIV）のペプチド阻害剤がある。このような抗融合性ペプチドは、レンチウイルス属のウイルス由来のエンベローブ融合タンパク質の膜貫通サブユニットのCヘリックスに由来し、それぞれのウイルスの膜貫通サブユニットの中心コイルド-コイルに結合する。
【００３６】
HIV-1抗融合性ペプチドが特に好ましく、好ましくはgp-41のCペプチド断片である。表1に、gp41のCペプチドに由来するHIV-1抗融合性ペプチドの例を示す。これらの抗融合性ペプチドおよびその断片は、本発明において特に有用である。
【００３７】
（表１）
2004166703.tif 000002
＊N末端アセチル化および/またはC末端アミド化ペプチドについて；T-20（DP178と同義）およびT-1249は、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）に由来し、T-118は、呼吸器発疹ウイルス（RSV）に由来し、およびT-257は、麻疹ウイルス（MEV）に由来する。
1) 国際公開第99/59615号パンフレット
2) Rimsky, L. T.ら、J. Virol.、1998年、第72巻、p.986-993 
3) Lembert, D. M.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1996年、第93巻、p.2186-2191
【００３８】
抗融合性ペプチドの長さは重要ではない。しかし、約10個から約100個の長さのアミノ酸を使用することが好ましい。酸性pH値で変性剤に対して安定性を提供するのに十分な長さでなければならない。最大の長さは、主として、可溶化、切断、および精製の間の融合ポリペプチドの適切な取り扱いに依存する。
【００３９】
本発明の好ましい態様において、本発明に係る繰り返しペプチドは、そのN末端で、約4個から約30個のアミノ酸の第2のペプチドと結合される。第2のペプチドは、例えば、発現（例えば、インターフェロンα-2aなどの高い発現率を有するポリペプチドのN末端断片）、精製（例えば、His-タグ；Zhang, J. H.ら、Nanjing Daxue Xuebao, Ziran Kexue、2000年、第36巻4号、p.515-517）を増加させる、またはその後のアセチル化もしくはPEG化のようなN末端修飾を引き起こすために、付加的な特性を抗融合性ペプチドに与えることを目的とする。
【００４０】
第2のペプチドは少なくとも4個のアミノ酸（切断および/または発現のための、メチオニンおよび3個のさらなるアミノ酸）から約30個のアミノ酸、好ましくは10個から約20個のアミノ酸（核酸コドンレベルに関して）からなる短いペプチド鎖である。第2のペプチドの長さは、本発明で重要ではない。しかし、抗融合性ペプチドの収率を向上させるため、第2のペプチドは極めて短いことが好ましい。第2のペプチドが、切断プロテアーゼの高レベルの発現に適合する、もしくは切断プロテアーゼの接近を向上させる（立体障害の回避）いくつかのアミノ酸、および/またはHis-タグのような精製もしくは固定化タグ（精製方法についてはHengen, P.、Trends Biochem. Sci.、1995年、第20巻、p.285-286）のようないくつかのアミノ酸の適当な切断部位、ならびに開始コドンによってコードされることが必要なメチオニンからなることが特に好ましい。
【００４１】
本発明に係る第2のペプチドは、好ましくは、発現、可溶化、精製、およびペプチド修飾の間に抗融合性ペプチドのN末端を保護するために、融合ペプチドにおいて使用される。そのような融合ペプチドは特に、N末端に修飾を受けた抗融合性ペプチドの産生方法に価値がある。そのような方法は、融合部分がN末端を保護する融合ペプチドとして、組換えポリペプチドを形成する段階を含む。その後、組換え融合ペプチドは側鎖反応基を選択的に保護するための化学保護剤と反応されうる。その後、融合ペプチドは、少なくとも1種の切断試薬を用いて、ペプチドと融合部分との間で切断され、保護されていない末端アミノ酸反応基を形成する。その後、保護されていない末端アミノ酸反応基は、N末端アセチル化のために、無水酢酸もしくは酸性N-ヒドロキシスクシンイミド-エステルなどの化学修飾剤を用いて修飾されうる。従って、側鎖は選択的に脱保護され、N末端修飾ペプチドが形成される。そのような方法は、例えば、国際公開第94/01451号パンフレット；米国特許第5,635,371号；および米国特許第5,656,456号に記載されている。
【００４２】
第2のペプチド部分は好ましくは、融合ペプチドの精製および/または固定化を促進するような構造を有する。この目的のため好ましくは、第2のペプチドは「親和性タグ」（Pandjaitan, B.ら、Gene、1999年、第237号、p.333-342参照）、例えばポリヒスチジン（約6個のヒスチジン残基）などを含むことが好ましい。加えて、第2のペプチドは好ましくは、N末端メチオニン（ATGによりコードされる）および切断部位をコードするC末端の1つもしくは複数のアミノ酸を含む。
【００４３】
本発明に係る特に好ましい第2のペプチドは、ヒトインターフェロンα-2aのN末端断片であり、好ましくはHis-タグを含む断片である（標準一文字表記によるアミノ酸）
2004166703.tif 000003
【００４４】
本発明に従い、融合性ポリペプチドは、特異的な切断を行うプロテイナーゼ（制限プロテイナーゼ）を用いて、または化学的方法により、封入体の可溶化後に酵素的に切断されうる。プロテイナーゼは、産生すべき抗融合性ペプチドのアミノ酸配列を考慮して選択される。可能であれば、制限プロテイナーゼの認識/切断配列が抗融合性ペプチドには存在せず、好ましくは第2のペプチドにも存在せず、即ち、切断領域（リンカー領域）にのみ存在すべきであることに注意されたい。適当な特異的切断を行うエンドプロテイナーゼは、例えば、ファクターXa、トロンビン、サブチリシン、サブチリシンのBTN変種、ユビキチンプロテアーゼ、レンニン、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、プレシジョン（precision）・プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼLys-C、カリクレイン（Ladisch, M. R、Willson, R.C.、Painton, C. C.、Builder, S. E.編、Caeter, P.、「Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes」、ACS Symposium Series No. 427、American Chemical Society、1990年、p.181-193）、TEVプロテイナーゼ（Parks, T. D.ら、Anal. Biochem.、1994年、第216巻、p.413-417）、IgAプロテアーゼ（Pohlner, J.ら、Nature、1987年、第325巻、p.458-462）、Kex2pプロテイナーゼ（EP-A 0 467 839）、または黄色ブドウ球菌V8プロテイナーゼである。
【００４５】
第2のペプチドの配列は、好ましくは、予め選択された切断環境における効果的な切断を促進する、他の設計方法を利用することができる。特に、予め選択された切断剤がエンドペプチダーゼである場合には、第2のペプチドは水性環境に可溶性であることが好ましい。従って、荷電した側鎖基および親水性特性を有するアミノ酸が、可溶化を促進するように、好ましくは第2のペプチドに含まれるか、または切断プロテイナーゼの接触を促進する他のアミノ酸に含まれる。そのようなアミノ酸は、例えば、GluおよびAsp（陰イオン性）、ArgおよびLys（陽イオン性）、ならびにSerおよびThr（中性、親水性）である。アルギニンおよび/またはリシンを使用する場合には、アルギニンおよびリシンがトリプシン切断部位を構成することを考慮しなければならない。
【００４６】
切断部位は典型的には、切断が自由に起こり、付加的な配列を有さない所望の抗融合性ペプチドが得られるように選択される（例えばトリプシンはArgの後ろで切断し、その後、ArgはカルボキシペプチダーゼBにより除去される）。従って、切断部位は、各繰り返しの一端に位置し、好ましくはペプチド繰り返しのN末端に位置する。そのような切断部位はペプチドの化学修飾の間にN末端の中間保護に使用されうるため、このことは、融合ポリペプチドが上記に定義したような第2のペプチドを含まない場合にも好ましい。化学的および酵素的切断部位ならびにペプチドの切断に作用するように使用される対応物質は、例えば、国際公開第92/01707号パンフレットおよび国際公開第95/03405号パンフレットに記載の部位の一つと密接に結合する。
【００４７】
切断酵素および切断配列の例を、以下の表2に記載する。
【００４８】
（表２）
2004166703.tif 000004
1) 一文字表記のアミノ酸
【００４９】
好ましくはトリプシンが使用され、これは、アルギニンおよびリシンのC末端で、タンパク質およびペプチドを特異的に切断する。このような酵素は、例えば、ブタ、ウシ、もしくはヒトの膵臓、または組換え酵母もしくは大腸菌（国際公開第99/10503号パンフレット）に由来することが知られている。トリプシンは、特に、リシン残基が保護される場合には、所望のポリペプチドを産生するのに適している。
【００５０】
エンドプロテイナーゼにより切断されうるペプチド配列は、好ましくは1個から20個のアミノ酸、より好ましくは1個から3個のアミノ酸で構成され、且つ所望のエンドプロテイナーゼに対するC末端切断部位を含む短鎖ペプチド配列として、本発明の意味において理解される。この第2のペプチドは好ましくは、N末端と所望のエンドプロテイナーゼ認識配列との間で、いくつかのアミノ酸（第1の部分）、好ましくはGly、Thr、Ser、Ala、Pro、Asp、Glu、Arg、およびLysなどの親水性アミノ酸から選択されるアミノ酸の組み合わせを付加的に含む。2個から8個のこれらの付加的なアミノ酸が負に荷電したアミノ酸Aspおよび/またはGluであるアミノ酸鎖は、好ましくは第1の部分として使用される。
【００５１】
抗融合性ペプチドがメチオニンを含まない限り、切断は、BrCN（化学的切断）を用いても可能となる。
【００５２】
本発明のさらに好ましい態様において、抗融合性ペプチドは、C末端にグリシンを含む。このグリシンはその後の酵素的なC末端アミド化のために有用である（Bradbury, A. F.およびSmyth, D, G.、Trends Biochem. Sci.、1991年、第16巻、p.112-115）。
【００５３】
従って、融合ポリペプチドの要素として、好ましくは
-  抗融合性ペプチド、
-  切断部位、
-  発現および/または精製を促進するための第2のペプチド、
-  C末端のグリシン
である。
【００５４】
切断部位は、抗融合性ペプチドを融合ポリペプチドの他の要素から放出させるために必要である。従って、切断部位は、融合ポリペプチドの抗融合性ペプチド間に、好ましくはN末端保護基として位置する。
【００５５】
本発明に従い、抗融合性ペプチド繰り返しは、原核生物のような微生物において、このペプチドおよび他のポリペプチドを含む不溶性タンパク質封入体が形成される条件下で過剰発現される。本発明の特性は、抗融合性ペプチドの単一の繰り返し（2個の同一の抗融合性ペプチド配列）に既に見出されている。しかし、複数個の繰り返し、即ち5個、10個、または20個までの同一な抗融合性ペプチド配列を有する融合ポリペプチドを使用することもできる。産生すべき融合ペプチドは、安定に発現し、且つ宿主細胞内で封入体を形成するために、十分な長さを有さなければならない。通常、少なくとも約80個のアミノ酸、好ましくは約100個を超えるアミノ酸をコードする遺伝子は、安定な様式で発現され、分解されず、封入体として沈殿する。繰り返しに実際の上限は存在しない。しかし、3,000個を超えるアミノ酸をコードする遺伝子を発現させることは困難であり、事実上稀である。
【００５６】
例えば、エシェリキア属（Escherichia）、サルモネラ属（Salmonella）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、またはバチルス属（Bacillus）は、原核宿主生物として適している。酵母（例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces））は真核宿主生物として好ましい。本発明に係る融合ペプチドを産生するために、微生物を通常の方法でペプチドをコードするDNAを含むベクターにより形質転換し、その後、通常の方法で発酵させる。
【００５７】
封入体は、細胞質に認められ、水に不溶性の凝集形態で繰り返しペプチドを含む。通常、封入体のそのようなタンパク質は変性された形態（例えばランダムに結合されたジスルフィド架橋）にある。これらの封入体は、例えば、細胞を溶解した後、遠心によって他の細胞構成成分から分離される。
【００５８】
本発明により、封入体はpH 6.5より低い値、好ましくは約pH 3から約pH 5での変性条件下で洗浄される。驚くべきことに、そのような変性条件は融合ポリペプチドの溶解性を多量に高めることはないが、ポリペプチドを含む多くの他の宿主細胞由来の不純物の溶解性を高めることができる。そのような変性剤は当技術分野で周知であり、例えば高濃度の塩酸グアニジン溶液（例えば約6 mol/l）または尿素溶液（例えば約8 mol/l）がある。変性剤は好ましくは緩衝溶液として使用される。
【００５９】
洗浄の後、約pH 9またはそれ以上のアルカリ性pH値で、好ましくは洗浄剤または変性剤を添加することなく、封入体を可溶化させる。さらに驚くべきことに、このようなアルカリ性条件は十分に融合ポリペプチドを可溶化させることができる。可溶化の後、融合ポリペプチドは抗融合性ペプチドを回収するために切断されうる。
【００６０】
可溶化の後、融合ペプチドまたは抗融合性ペプチドを、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または逆相クロマトグラフィーなどの単純な方法で精製することができる。
【００６１】
適した発現ベクターの構築のため、および遺伝子発現のためのプロセスのさらなる全ての工程は当技術分野の先端技術であり、当業者に知られている。そのような方法は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、USA、1989年に記載されている。
【００６２】
封入体経路を介した微生物/原核生物でのタンパク質の組換え産生を記載している多くの刊行物が存在する。そのような総説の例として、Misawa, S.ら、Biopolymers、1999年、第51巻、p.297-307；Lilie, H.、Curr. Opin. Biotechnol.、1998年、第9巻、p.497-501；およびHockney, R. C.、Trends Biotechnol.、1994年、第12巻、p.456-463がある。
【００６３】
本発明に係るペプチドを微生物/原核生物で過剰発現する。過剰発現により、封入体が形成される。開始コドンによってコードされ上記の例に記載されたメチオニンは、宿主細胞内の発現/翻訳の間に主に除去される。微生物/原核生物におけるタンパク質の過剰発現のための一般的な方法は、当技術分野において以前から周知である。当技術分野の刊行物の例として、Skelly, J. V.ら、Methods Mol. Biol.、1996年、第56巻、p.23-53；Das, A.、Methods Enzymol.、1990年、第182巻、p.93-112；およびKopetzki, E.ら、Clin. Chem.、1994年、第40巻、p.688-704がある。
【００６４】
原核生物における過剰発現は、tacプロモーターまたはlacプロモーター（EP-B 0 067 540）などのプロモーターと共に、最適化された発現カセット（米国特許第6,291,245号）を使用することによる発現を意味する。通常、これは、化学誘導プロモーターまたは温度変化により誘導されるプロモーターを含むベクターを使用することにより行われる。大腸菌に対する有用なプロモーターの1つは、温度感受性λPLプロモーター（EP-B 0 041 767参照）である。効果的なさらなるプロモーターは、tacプロモーター（米国特許第4,551,433号参照）である。大腸菌などの原核生物に対するこのような強力な調節シグナルは通常、細菌に曝露したバクテリオファージから生じる（Lanzer, M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、第85巻、p.8973-8977；Knaus, R.およびBujard, H.、EMBO Journal、1988年、第7巻、p.2919-2923を参照のこと。λT7プロモーターについては、Studier, F. W.ら、Methods Enzymol.、1990年、第185巻、p.60-89；T5プロモーターについては、EP-A 0 186 069；Stuber, Dら、Immunological Methods IV、System for high-level production in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function anlysis、1990年、p.121-152）
【００６５】
このような過剰産生性の原核細胞発現系を使用することにより、本発明に係るペプチドは、細胞の全発現タンパク質の少なくとも10％、典型的には30％〜40％、まれには50％までを含むようなレベルで産生される。
【００６６】
本明細書において用いられる「封入体（inclusion body：IB）」とは、微生物/原核生物におけるコード核酸を過剰発現させて、組換え産生されるポリペプチドの不溶性形態を意味する。この現象は当技術分野において公知であり、例えば、Misawa, S.およびKumagai, I、Biopolymers、1999年、第51巻、p.297-307；Guise, A. D.ら、Mol. Biotechnol.、1996年、第6巻、p.53-64；およびHockneyら、Trends Biotechnol.、1994年、第12巻、p.456-463に総説されている。
【００６７】
封入体の可溶化は、好ましくは約pH 9またはそれ以上の値で水性溶液の使用により行われる。最も好ましくは、pH 10.0またはそれ以上の値である。可溶化のために洗浄剤または変性剤を添加することは必ずしも必要ではない。最適pH値は、実施例7に従って容易に決定することができる。ポリペプチドを変性しうる強力なアルカリ性条件として最適pH値が存在していることが明らかである。この最適な範囲は、pH 9〜pH 12の間で見出される。
【００６８】
融合ペプチドをコードする核酸（DNA）は、当技術分野において公知の方法に従って産生される。宿主細胞内の発現を最適化するために、付加的な調節および転写要素と共に、核酸配列を伸ばすことがさらに好ましい。発現に適した核酸（DNA）は、好ましくは、化学合成によって産生される。このような方法は、当業者には公知であり、例えば、Beattie, K. L.およびFowler, R. F.、Nature、1991年、第352巻、p.548-549；EP-B 0 424 990；Itakura, K.ら、Science、1977年、第198巻、p.1056-1063に記載されている。本発明に係るペプチドの核酸配列を修飾することも、都合にかなったものであると思われる。
【００６９】
このような修飾は、例えば
-  ライゲーション段階、クローニング段階、および変異誘発段階を促進するような制限酵素の様々な認識配列を誘導するための、核酸配列の修飾；
-  宿主細胞に対して好ましいコドンを導入するための核酸配列の修飾；
-  宿主細胞内の遺伝子発現を最適化するための、付加的な調節および転写要素を有する核酸配列の伸長
である。
【００７０】
以下の実施例、参考文献、図1、および配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱しない限り、記載された方法において改変がなされることが理解される。
【００７１】
出発材料
本発明の多量体ペプチド前駆タンパク質の発現のために用いた大腸菌宿主/ベクター系（大腸菌株および基本ベクター）は、米国特許第6,291,245号に記載されている。
【００７２】
一般的方法
組換えDNA技術
Sambrook, J.ら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989年に記載のような標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の指示に従って使用した。
【００７３】
タンパク質の定量
多量体T繰り返し融合タンパク質の濃度は、280 nmの吸光度（OD）を測定し、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用することにより決定した［T-繰り返し：ε＝148680 cm2/mol；IFN-α-2a：ε＝18020 cm2/mol；F9a＝44650 cm2/mol］。
【実施例１】
【００７４】
T-繰り返し融合遺伝子の合成
1.1  T-繰り返し融合遺伝子の遺伝子設計
人工T-繰り返し融合遺伝子は、分子量27,242 Daを有する217個のアミノ酸の融合タンパク質をコードする。融合タンパク質は、ヒトインターフェロン-α-2aのN末端の13個のアミノ酸
（MCDLPQTHSLGSR（配列番号：5）；担体タンパク質）
および5コピーの抑制性HIVペプチドT-1357
2004166703.tif 000005
；標的ペプチド）
から構成され、これらはトリプシンにより切断可能なペプチドリンカー（GR）を介して結合されている。
【００７５】
大腸菌発現プラスミドpBRori-URA3-LacI-RFN-Edel（産生方法および説明：実施例2を参照のこと）に、T-繰り返し構造遺伝子を挿入するために、合成リボソーマルRBSII結合部位、および単一のEcoRI切断部位を、5'末端の上流、および3'末端の上流のCelII制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挿入した。
【００７６】
1.2  T-繰り返し融合遺伝子の遺伝子合成
化学合成により、単一のEcoRIおよびCelII制限エンドヌクレアーゼ切断部位と隣接する長さ約690 bpのRBSII T-繰り返し遺伝子をオリゴヌクレオチドから調製した。二本鎖RBSII T-繰り返し遺伝子は、オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、その後のクローニングにより、大腸菌プラスミドにおける長さ691 bpのEcoRI/CelII断片として構築された。所望のプラスミドはpT-繰り返しと命名された。クローニングされたRBSII T-繰り返し遺伝子の予め決定されたDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。
【実施例２】
【００７７】
大腸菌発現プラスミドの構築
2.1  開始プラスミドpBRori-URA3-LacI-RFN-Edelの構築
プラスミドpBRori-URA3-LacI-RFN-Edelは、大腸菌におけるインターフェロン-α-2a（IFN-α-2a）の発現のためのベクターである。これは、INF-α-2b発現プラスミドOripBR-URA3-EK-IFN（米国特許第6,291,245号）に基づいている。pBRori-URA3-LacI-RFN-Edelは、lacIリプレッサー遺伝子が付加的に存在し、且つIFN-α-2b遺伝子の代わりにIFN-α-2a遺伝子が存在することから、OripBR-URA3-EK-IFNとは異なる。IFN-α-2aおよびIFN-α-2bは、21位の1アミノ酸でのみ異なる（Lys21Arg置換）。lacIリプレッサー遺伝子はプラスミドpUHA1に由来する（Stuber, D.ら、Immunological Methods IV、System for high-level production in Escherichia coli and rapid application to epitope mapping, preparation of antibodies, and structure-function analysis、1990年、p.121-152）。これは、プライマーN1（配列番号：12）およびプライマーN2（配列番号：13）を用いて、Mullis, K. B.およびFaloona, F. A.（Methods Enzymol.、1987年、第155巻、p335-350）に記載の方法に従って、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。
2004166703.tif 000006
その後、OripBR-URA3-EK-IFNの単一のNotI切断部位に長さ約1210 bpのNotI断片として、ライゲーションを行った。
【００７８】
2.2  発現ベクターpBRori-URA3-LacI-T-繰り返しの構築
T-繰り返し遺伝子を、プラスミドpT-繰り返しから、長さ約690 bpのEcoRI/CelII断片として単離し（実施例1.2参照）、その後、EcoRIおよびCelIIにより切断した長さ約3.1 kbpのpBRori-URA3-LacI-RFNベクター断片にライゲーションした。所望のプラスミドpBRori-URA3-LacI-T-繰り返しを制限マッピングによって同定し、サブクローニングされたT-繰り返し遺伝子をDNA配列決定によって再確認した。
【実施例３】
【００７９】
大腸菌におけるT-繰り返し遺伝子の発現
本発明に係る融合遺伝子を発現させるため、大腸菌栄養要求性（PyrF）の比較により、抗生物質を含まないプラスミド選別が可能な大腸菌宿主/ベクター系を使用した（米国特許第6,291,245号）。
【００８０】
3.1  選択培地におけるpyrF栄養要求性の比較による形質転換および細胞の培養
T-繰り返し遺伝子を発現させるために、大腸菌K12株［UT5600（ΔpyrF）と称する］を、実施例2.2に記載の発現プラスミドpBRori-URA3-LacI-T-繰り返しにより形質転換した。形質転換されたUT5600（ΔpyrF）/pBRori-URA3-LacI-T-繰り返し細胞を、はじめに寒天プレート上で37℃にて増殖させ、その後、0.5％のカサミノ酸（Difco）を含むM9最小培地中で、550 nmの吸光度（OD550）が0.6〜0.9になるまで、振盪培養を行い、さらにIPTGで誘導した（最終濃度1 mmol/l〜5 mmol/l）。37℃で4時間から16時間の誘導期間の後、遠心分離により細胞を回収し、50 mmol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）で洗浄し、次の使用まで-20℃で保存した。
【００８１】
3.2  発現解析
発現解析のために、3 OD550nm単位（1 OD550nm＝550 nmの吸光度が1である1 mlの細胞懸濁液）の培養培地を遠心して得た細胞ペレットを、0.25 mlの10 mmol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）に再懸濁し、細胞を超音波処理（50％の強度で30秒に2回のパルス）により溶解した。不溶性細胞構成成分を沈殿させて（14,000 rpm、5分）、上清を1/5容積（vol）の5×SDS試料緩衝液（1×SDS試料緩衝液：50 mmol/l Tris-HCl（pH 6.8）、1％SDS、50 mmol/l DTT、10％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブルー）と混合した。不溶性細胞片画分（ペレット）を0.3 mlの1×SDS試料緩衝液に再懸濁し、試料を95℃にて5分間インキュベートし、再び遠心した。その後、タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により分離し（Laemmli, U. K.、Nature、1970年、第227巻、p.680-685）、クーマシーブリリアントブルーR色素で染色した。
【００８２】
合成したT-繰り返し融合タンパク質をホモジナイズしたところ、不溶性タンパク質凝集物（いわゆる封入体（IB））の形状で、不溶性細胞片画分でのみ見出された。発現収率は全てのクローンにおいて測定精度の範囲内で比較可能であり、全大腸菌タンパク質に対して30％〜60％の間であった。
【実施例４】
【００８３】
T-繰り返しを組換え産生するための大腸菌の10 L高細胞密度発酵
前培養
前培養物を調製するために、1000 mlのエルレンマイヤーフラスコに入れた300 mlのM9プラス培地（0.5％カサミノ酸および各々0.9 g/lのTrp、Pro、およびLeuを添加したM9培地）に大腸菌UT5600ΔpyrF pBRori-URA3-LacI-T-繰り返しの1 mlグリセロールストックを接種した。OD578nmが3.0に達するまで培養物を150rpmのエクセンター（excenter）シェーカー上で、37℃にて約6時間インキュベートした。
【００８４】
10 Lの流加培養本発酵
発酵の開始時に、前培養物を10リットルの発酵槽に移した。本培養はグルコースの代わりに1.4％グリセロールを含み、且つ2％カサミノ酸、ならびに各々0.1％のアミノ酸Trp、Leu、およびProを含む規定M9塩培地で、OD578nmが20に達するまで増殖させた。続いて、グリセロール酵母投与（ストック溶液：30％酵母抽出物および33％グリセロール）により培養物に栄養補給を開始した。流速は、培養物のpH値の動向により0.8 ml/分から3.5 ml/分の間で変動し、それによって、さらなるいかなる補正の補助剤（H3PO4、KOH）の添加も必要としなかった。pHは7.0で維持され、PO2値はrpm制御により50％で維持された。
【００８５】
OD578nmが70で1.5 mmol/lのIPTGを添加し、遺伝子/タンパク質発現を誘導した。全発酵には約36時間を要し、OD578nmが160〜180で終了した。
【００８６】
バイオマスの回収
発酵槽の内容物をフロースルー遠心（13,000 rpm、13 L/時間）により遠心し、回収したバイオマスを使用まで-20℃で保存した。
【実施例５】
【００８７】
5.1  標準方法：細胞の溶解およびIBの調製
200 gの大腸菌（湿重量）を1 Lの0.1 mol/l Tris-HCl（pH 7.0）に0℃で懸濁し、300 mgのリゾチームを加え、0℃で20分間インキュベートした。続いて、高圧分散法により、細胞を機械的に完全に溶解し、2 mlの1 mol/ml MgCl2および10 mg DNAseを加えて、DNAを25℃で30分間切断した。その後、溶解溶液に、500 mlの60 mmol/l EDTA、6％トライトンX-100、および1.5 mol/l NaCl（pH 7.0）を混合し、0℃でさらに30分間インキュベートした。続いて、不溶性構成成分（細胞片およびIB）を遠心によって沈殿させた。
【００８８】
ペレットを1 Lの0.1 mol/l Tris-HCl、20 mmol/l EDTA（pH 6.5）に懸濁し、25℃で30分間インキュベートし、IB調製物を遠心により単離した。
【００８９】
5.2  本発明の方法：IBの細胞溶解および調製
200 gの大腸菌（湿重量）を1 Lの0.1 mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 5.0）に懸濁し、300 mgのリゾチームを加え、0℃で20分間インキュベートした。続いて、高圧分散法により、細胞を機械的に完全に溶解し、2 mlの1 mol/ml MgCl2および10 mg DNAseを加えて、DNAを25℃で30分間切断し、続いて、不溶性構成成分（細胞片およびIB）を遠心によって沈殿させた。
【００９０】
その後、ペレットを0.1 mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 5.0）で2回洗浄した。この目的のため、ペレットを1 Lの0.1 mol/lカリウム緩衝液（pH 5.5）に2回懸濁し、攪拌しながら25℃で30分間インキュベートし、遠心により単離した。
【００９１】
5.3  本発明の方法：高純度のIBの細胞溶解および調製
200 gの大腸菌（湿重量）を1 Lの0.1 mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 5.0）に0℃で懸濁し、300 mgのリゾチームを加え、0℃で20分間インキュベートした。続いて、高圧分散法により、細胞を機械的に完全に溶解し、2 mlの1 mol/ml MgCl2および10 mg DNAseを加えて、DNAを25℃で30分間切断し、続いて、不溶性構成成分（細胞片およびIB）を遠心によって沈殿させた。
【００９２】
その後、ペレットを5.5 mol/lグアニジン塩酸塩（および各々8.0 mol/l尿素）および10 mmol/l EDTA（pH 3.0）で2回洗浄した。この目的のため、ペレットを5.5 mol/lグアニジン塩酸塩（および各々8.0 mol/l尿素）および10 mmol/l EDTA（pH 3.0）に2回懸濁し、攪拌しながら25℃で10分から30分間インキュベートし、遠心により単離した。
【００９３】
その後、ペレットを0.1 mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 5.0）で2回から3回洗浄した。この目的のため、ペレットを1 Lの0.1 mol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 5.5）に2回から3回懸濁し、攪拌しながら25℃で30分間インキュベートし、遠心により単離した。
【実施例６】
【００９４】
酸性範囲の変性剤存在下における、「標準」IB（IFN-α-2aおよびF9a）に対するT-繰り返しIBの溶解性
試験すべきIB［IFN-α-2a：実施例2.1、3.1、4および5.1に記載のように調製された。しかし、UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-T-繰り返し細胞ではなく、UT5600(ΔpyrF)/pBRori-URA3-LacI-RFN-Edel細胞が使用された；F9a：国際公開第97/47737号パンフレットに記載のように調製された；T-繰り返し：実施例2.2、3.1、4および5.2に記載のように調製された］を、以下の(a)および(b)中にそれぞれ1 g/20 mlの濃度で、室温にて攪拌しながら再懸濁した：
(a) 5.5 mol/lグアニジン塩酸塩および10 mmol/l EDTA（pH 3.0）；および
(b) 8 mol/l尿素および10 mmol/l EDTA（pH 3.0）。
【００９５】
12時間から24時間後、200μlの試料を各容器から回収し、不溶性構成成分を遠心により沈殿し（Eppendorf 5415遠心機、14,000 rpm、10分間）、80μlの上清を20μlの5×SDS試料緩衝液（1×SDS試料緩衝液：50 mmol/l Tris-HCl（pH 6.8）、1％SDS、50 mmol/l DTT、10％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブルー）と混合した。SDS-PAGEの前に、5.5 mol/lグアニジン塩酸塩を含む上清を8 mol/l尿素で透析した。不溶性ペレットを200μlのリン酸カリウム緩衝液（pH 5.0）で一回洗浄し、その後、250μlの1×SDS試料緩衝液に再懸濁した。タンパク質を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の方法で分離する前に、全ての試料を95℃で5分間インキュベートし、クーマシーブリリアントブルーR色素で染色した。その後、該当するゲルバンドをポリペプチド含量の測定のために、デンシトメトリー的に解析した（表3）。
【００９６】
（表３ａ）5.5 mol/lグアニジン塩酸塩、10 mmol/l EDTA（pH 3）
2004166703.tif 000007
【００９７】
（表３ｂ）8 mol/l尿素、10 mmol/l EDTA（pH 3）
2004166703.tif 000008
【実施例７】
【００９８】
アルカリ性範囲の水性緩衝液における、「標準」IB（IFN-α-2aおよびF9a）に対するT-繰り返しIBの溶解性
溶解すべきIFN-α-2a、F9aおよびT-繰り返しIB（実施例6の記載に従って調製した）を以下の(a)および(b)のそれぞれにおいて、試験すべきpH値（8.0、9.0、10.0、11.0および12.0）にて室温で攪拌しながらインキュベートした：
(a) 50 mmol/l Tris-HCl；および
(b) 50 mmol/l NaHCO3。
4時間後、200μlの試料を各容器から回収し、不溶性構成成分を遠心により沈殿し（14,000 rpm、15分間）、80μlの上清を20μlの5×SDS試料緩衝液（1×SDS試料緩衝液：50 mmol/l Tris-HCl（pH 6.8）、1％SDS、50 mmol/l DTT、10％グリセロール、0.001％ブロモフェノールブルー）と混合した。不溶性ペレットを200μlの50 mmol/lリン酸カリウム緩衝液（pH 6.5）で一回洗浄し、250μlの1×SDS試料緩衝液に再懸濁した。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の方法で分離する前に、試料を95℃で5分間インキュベートし、クーマシーブリリアントブルーR色素で染色した。その後、該当するゲルバンドをポリペプチド含量の測定のために、デンシトメトリー的に解析した（表4）。
【００９９】
（表４ａ）IFN-α-2a
2004166703.tif 000009
【０１００】
（表４ｂ）F9a
2004166703.tif 000010
【０１０１】
（表４ｃ）T-繰り返し
2004166703.tif 000011
【実施例８】
【０１０２】
8.1  標準方法：変性条件下におけるIBの可溶化
20 g IBペレット（湿重量）を200 mlの50 mmol/l Tris-HCl緩衝液、6 mol/lグアニジン塩酸塩（および各々8 mol/l尿素）および10 mmol/l EDTA（pH 7.0）中に、25℃で2時間攪拌することによって懸濁した。不溶性構成成分を遠心により分離し、透明な上清を次の処理に用いた。
【０１０３】
8.2  本発明の方法：水性弱アルカリ性緩衝液でのIBの可溶化
10 g IBペレット（湿重量）を200 mlの50 mmol/l Tris-HCl緩衝液（pH 9）（および各々50 mmol/NaHCO3緩衝液（pH 9〜pH 10））中に、25℃で4時間から16時間攪拌することによって懸濁した。不溶性構成成分を遠心により分離し、透明な上清を［任意で、無水シトラコン酸を用いたT-繰り返し融合タンパク質の主要アミノ基（リシンのεアミノ基）の誘導の後に］、トリプシンを用いた酵素切断によりさらに処理した。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】発現ベクターpBRori-URA3-LACI-RFN-Edelを示す図である。
【図１】
2004166703.tif 000012
【配列表】
2004166703000001.app