(57)【要約】    【課題】  形質転換された表現型の悪性哺乳動物細胞を形質転換されていない細胞に付与する遺伝学的サプレッサー因子（ＧＳＥ）、かかる因子の同定および取得方法、かかる因子に対応する遺伝子の単離および同定方法、およびかかる因子の使用方法を提供する。また、本発明のＧＳＥに対応する遺伝子を提供する。    【解決手段】  哺乳動物における新生物形質転換された表現型の確立または維持に関連するＧＳＥを単離する方法および材料の使用。【選択図】図１４
2004344163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞における形質転換された表現型の確立または維持に関連する遺伝学的サプレッサー因子を単離する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞の全ｍＲＮＡから調製したランダムに断片化されたｃＤＮＡを合成してＤＮＡフラグメントを生成し；
（ｂ）該ＤＮＡフラグメントを発現ベクターに転移して遺伝学的サプレッサー因子ライブラリーを生成し、ここに該発現ベクターは、形質転換された表現型の発現能を有する生細胞にてＤＮＡフラグメントの発現能を有する；
（ｃ）遺伝学的サプレッサー因子ライブラリーを細胞に導入することにより、該生細胞を遺伝学的に修飾し；
（ｄ）形質転換された細胞を同定することが可能な条件下で細胞を選択することにより、形質転換された表現型を細胞に付与する遺伝学的サプレッサー因子を含有する遺伝学的に修飾された生細胞を単離するかまたは強化し；
（ｅ）形質転換された表現型を遺伝学的に修飾された生細胞に付与する遺伝学的サプレッサー因子を得る
ことからなることを特徴とする方法に従って産生され、ここに、該遺伝学的サプレッサー因子がペプチドをコードするセンス定方向性遺伝学的サプレッサー因子である遺伝学的サプレッサー因子（ＧＳＥ）によりコードされるアミノ酸配列の６からすべてのアミノ酸までの対応するアミノ酸配列を有する合成ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により産生され、ここに、該遺伝学的サプレッサー因子がアンチセンスＲＮＡをコードするアンチセンス定方向性遺伝学的サプレッサー因子である遺伝学的サプレッサー因子（ＧＳＥ）によりコードされるアンチセンスＲＮＡのヌクレオチド配列の１２からすべてのヌクレオチドまでのヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物細胞の新生物形質転換の制御に関連する遺伝子および遺伝因子に関する。さらに詳しくは、本発明はそのような遺伝子および遺伝学的サプレッサー因子の同定方法、ならびにそのような遺伝子および遺伝学的サプレッサー因子についての使用に関する。本発明は特に哺乳動物細胞の形質転換された表現型に関連する遺伝子に由来する遺伝学的サプレッサー因子、およびそれに関連する治療的および診断的使用を提供する。本発明はまた哺乳動物細胞の新生物形質転換の制御に関連する遺伝子を提供する。
【背景技術】
【０００２】
合衆国において、癌は、依然として主たる死亡原因の１つである。臨床的には、ヒトの癌の治療にて、一般に、手術、放射線照射治療および化学療法薬治療を含む、種々の医学的方法が用いられている（テキストブック：CANCER Principle＆Practice of Oncology、第２版、De Vitaら編、J.B.Lippincott Company、フィラデルフィア、ペンシルベニア州、１９８５参照のこと）。しかし、そのような方法は、悪性形質転換および新生物増殖の正確な細胞原理の明確な理解を基本的に欠くことにより制限されたままである。
【０００３】
そのような悪性形質転換および新生物増殖の細胞原理の理解の基礎が、過去１０年にわたって明らかにされてきた。正常細胞の増殖は、今日、各々、プロトオンコ遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子として知られている、増殖促進遺伝子と増殖阻害遺伝子のバランスにより制御されると考えられている。プロトオンコ遺伝子は非制御細胞増殖を刺激するその能力を亢進する調節または構造変異によってオンコ遺伝子に変わる。したがって、これらの変異は明らかに優性（例、変異体ＲＡＳ遺伝子）または補優性（co-dominant）（ＮＭＹＣまたはＨＥＲ２／ＮＥＵのようなオンコ遺伝子の増幅の場合のように）とされる（Varmus，１９８９，“A historical overview of oncogenes” in Oncogenes and the Molecular Origin of Cancer，Weinberg編，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，pp.３−４４参照）。
【０００４】
優性および補優性遺伝子は、遺伝子転移に基づくまたは増幅もしくは過剰発現ＤＮＡ配列を選択的に単離することに基づく種々の技法を用いて効果的に同定し、研究することができる（Kinzlerら、１９８７、Science２３６：７０−７３；Schwabら、１９８９、Oncogene４：１３９−１４４；Nakataniら、Jpn.J.Cancer Res.８１：７０７−７１０）。発現選択法を用い、多くの細胞性オンコ遺伝子をクローンするのに成功している。オンコ遺伝子の優性特性は、in vitroにおける細胞培養およびin vivoにおける形質転換した動物における両方でのその機能の分析を容易にした。これまで、５０個近くの細胞性オンコ遺伝子が同定されている（Hunter、１９９１、Cell６４：２４９−２７０）。
【０００５】
しかし、異常な細胞増殖よりもむしろ抑制に関連する癌細胞関連遺伝子が少なくとも多数あるようである。アンチ−オンコ遺伝子または腫瘍サプレッサーとして知られているこの種の遺伝子は、Weinberg（１９９１、Science２５４：１１３８−１１４６）により「その喪失または不活化が細胞に新生物増殖の脱調節の一または別の表現型を表示させる遺伝学的因子」として定義された。その機能または発現の喪失をもたらす腫瘍サプレッサー遺伝子の変化は劣性である、というのは、同じ遺伝子の正常な対立遺伝子の存在下にて表現型の結果が全くないからである。腫瘍サプレッサーに関連する変異の劣性特性は、そのような遺伝子を遺伝子転移技法により分析または同定することを非常に困難なものとし、オンコ遺伝子の研究が腫瘍サプレッサーの研究よりもずっと有利であるという理由を説明する。
【０００６】
正常な細胞にて、腫瘍サプレッサー遺伝子は、増殖阻害シグナルおよびその核への伝達の認識から、最終的に該シグナルへの細胞応答を決定するセカンダリー応答遺伝子の誘起（または阻害）までの種々のレベルで増殖阻害に関係しているかもしれない。公知の腫瘍サプレッサー遺伝子は、実際に、調節経路の種々の工程に関連している。かくして、ＤＣＣおよびＥｒｂＡは２つの異なる種類のレセプターをコードする（Fearonら、１９９０、Science２４７：４９−５６；Sapら、１９８６、Nature３２４：６３５−６４０；Weinbergerら、１９８６、Nature３２４：６４１−６４６）。遺伝子ＮＦ−１は、ｒａｓ−相互作用蛋白質に類似し、シグナル経路のメンバーであるポリペプチドをコードする（Xuら、１９９０、Cell６２：５９９−６０８；Ballesterら、１９９０、Cell６２：８５１−８５９；Buchbergら、１９９０、Nature３４７：２９１−２９４；Barbacid、１９８７、Ann.Rev.Biochem.５６：７７９−８２７）。ｐ５３、ＲＢおよびＷＴ遺伝子は核調節蛋白質をコードする（Fieldsら、１９９０、Science２４９：１０４６−１０４９；Raycroftら、１９９０、Science２４９；１０４６−１０４９；Raycroftら、１９９０、Science２４９：１０４９−１０５１；Kernら、１９９１、Oncogene６：１３１−１３６；O'Rourkeら、１９９０、Oncogene５：１８２９−１８３２；Kernら、１９９１、Science２５２：１７０８−１７１１；Leeら、１９８７、Nature３２９：６４２−６４５；Friendら、１９８７、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８４：９０５９−９０６３；Callら、１９９０、Cell６０：５０９−５２０；Gesslerら、１９９０、Nature３４３：７７４−７７８）。
【０００７】
以前、腫瘍サプレッサー遺伝子をクローンするのに２つの方法が用いられていた。最初の方法は、ある種の型の腫瘍にて観察された非作為的な遺伝的欠失または再配列に関連する領域を単離することに基づいている。この方法は極端に骨の折れる結合分析の使用を要し、推定サプレッサー遺伝子の機能に関する直接的情報を何ら提供するこのではない（Friendら、１９９１、Science２５１：１３６６−１３７０；Viskochilら、１９９０、Cell６２：１８７−１９２；Vogelsteinら、１９８８、N.Engl.J.Med．３１９：５２５−５３２）。事実、ある種の腫瘍におけるヘテロ接合性の喪失についての多くの観察のうち（Solomonら、１９９１、Science２５４：１１５３−１１６０；LaForgiaら、１９９１、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８：５０５6−５０４０；Trentら、１９８９、Cancer Res．４９：４２０−４２３）、変質した遺伝子の機能が理解されているのはほんの２ないし３の例があるにすぎない。これらの稀なケースのうち２つにおいて、その遺伝子機能は別の方法を用い、優性な負の変異体蛋白質を分析することで同定された。
【０００８】
詳細には、腫瘍サプレッサー遺伝子、ｅｒｂＡおよびｐ５３が、最初に、変異体蛋白質をコードする変形した形態にて見いだされた（Sapら、１９８６、前掲；Weinbergerら、１９８６、前掲；Raycroftら、１９９０、前掲；Milnerら、１９９１、Molec.Cell.Biol．１１：１２−１９）。これらの変形遺伝子を単独でまたは他のオンコ遺伝子と組み合わせて（ｐ５３の場合はｒａｓおよびｅｒｂＡの場合はｅｒｂＢ；Eliyahuら、１９８４、Nature３１２：６４６−６４９；Paradaら、１９８４、Nature３１２：６４９−６５１；Graf＆Beug、１９８３、Cell３４：７−９；Dammら、１９８９、Nature３３９：５９３−５９７）トランスフェクションした場合、細胞の形質転換を誘起したため、該遺伝子は、最初、オンコ遺伝子として分類された。しかし、後になって、これらの「オンコ遺伝子」は共に対応する野生型遺伝子の機能を干渉することにより作用することがわかった。かくして、オンコ遺伝子の変異体ｐ５３蛋白質は、野生型蛋白質と機能的に不活性な複合体を形成し；そのような複合体はｐ５３蛋白質の正常な負の調節機能を提供しない（Herskowitz、１９８６、前掲；MIlnerら、１９９１、前掲；Montenarh＆Quaiser、１９８９、Oncogene４：３７９−３８２；Finlayら、１９８８、Molec.Cell.Biol．８：５３１−５３９）。ニワトリ赤芽細胞ウイルスに見られるオンコ遺伝子ｅｒｂＡは、エリスロイド分化の誘起に関連する転写調節蛋白質、甲状腺ホルモンレセプターについてのニワトリ遺伝子の変異体である（Dammら、１９８９、前掲；Dammら、１９８７、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３７５−３８２）。変異体のｅｒｂＡ蛋白質は、ＤＮＡにおけるその特異的結合部位を占めることにより野生型レセプターの機能を遮断する（Sapら、１９８９、Nature３４０：２４２−２４４）。
【０００９】
かくして、自然に得られる優性の負の変異体は対応する腫瘍サプレッサー遺伝子の同定を可能とするだけでなく、その機能分析に関する手段に供される。しかし、劣性遺伝子の同定についてのそのような自然の手段が、新規な腫瘍サプレッサー遺伝子を見いだすこの方法の有用性を制限することは稀である。
【００１０】
新生物形質転換に関与する新規な劣性遺伝子の発見および分析は、そのような遺伝子に由来し、その機能を選択的に抑制する能力を有する遺伝学的サプレッサー因子（ＧＳＥ）の使用により大いに促進されるかもしれない。ＧＳＥは、特定のＧＳＥが対応する遺伝子に関する劣性型の表現型を付与する優性の負の因子である。最近、ＧＳＥ技法を用いて劣性遺伝子を単離することの困難な分野にてある開発がなされた。Roninsonらの米国特許第５,２１７,８８９号（１９９３年６月８日）は、ＧＳＥを得るための一般化された方法を教示する（さらに、Holzmayerら、１９９２、Nucleic Acids Res.２０：７１１−７１７参照）。Gudkovらは、１９９３、Proc.Natl.Acad.Sci.USA９０：３２３１−３２３５において、トポイソメラーゼＩＩ相互作用薬に対する耐性を誘発するトポイソメラーゼＩＩｃＤＮＡからのＧＳＥの単離を教示する。継続中の米国特許出願番号０８／０３３,９８６（１９９３年３月３日出願）および出願番号０８／１７７,５７１（１９９４年１月５日出願）は、抗癌ＤＮＡ損傷剤、エトポシドに対して耐性的な細胞のＲＮＡより単離したＧＳＥが、カイネシン重鎖遺伝子の一部と相同的なアンチセンスＲＮＡをコードするＧＳＥを包含するという新規かつ意外な結果である本願発明者による発見を開示した。加えて、継続中の米国特許出願番号０８／０３３,９８６は、今まで知られていない遺伝子に由来の２つの他のＧＳＥ、エトポシド耐性を哺乳動物細胞に付与する該ＧＳＥの発現を開示した。継続中の米国特許出願番号０８／１９９,９００（１９９４年２月２２日出願）は、今まで知られていない遺伝子に由来のＧＳＥ、シスプラチン耐性を哺乳動物細胞に付与する該ＧＳＥの発現を開示した。
【００１１】
発明者らによって開発されたＧＳＥの技術力はこれらの結果によりさらに強調され、癌細胞における薬耐性を包含する、予期せぬ機構に関与する劣性遺伝子介在の生物学的現象を解明し、それにより癌患者に薬耐性を克服する機会および手段を提供する。この技法は、今日、ＧＳＥを発現する今まで形質転換されていない細胞にて悪性の哺乳動物細胞の形質転換表現型を付与するＧＳＥを単離し、同定し、かつ形質転換された表現型に関連する遺伝子を単離し、同定するのに用いられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は悪性哺乳動物細胞の形質転換された表現型に関連する遺伝子に由来のランダムフラグメントである遺伝学的サプレッサー因子（ＧＳＥ）であって、そのようなＧＳＥを発現する細胞に形質転換された表現型を付与するＧＳＥを提供する。本発明は、出典明示により本明細書の一部とし、ＧＳＥを発現する細胞に化学療法剤に対する耐性を付与するＧＳＥを同定し、単離する方法を提供する、継続中の米国特許出願番号０８／０３３,０８６（１９９３年３月３日出願）、出願番号０８／１７７,１５７（１９９４年１月５日出願）および出願番号０８／１９９,９００（１９９４年２月２２日出願）に開示されている知見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第一の態様にて、本発明はＧＳＥを発現する細胞に形質転換された表現型を付与するＧＳＥの同定方法を提供する。この方法は、正常な細胞、好ましくは正常なマウスまたはヒト線維芽細胞に由来の全ｃＤＮＡから誘導されたランダムフラグメント発現ライブラリーから得たクローンを収容し、その後、不死化された、形態学的に形質転換されているかまたは明らかに腫瘍原性細胞からのライブラリーインサートを取得する細胞を選択することを利用する。第二の態様において、本発明は悪性哺乳動物細胞の形質転換された表現型に関連する遺伝子を同定し、クローンする方法を提供し、さらに遺伝子その物を提供する。この方法は、細胞に形質転換された表現型を付与するＧＳＥで（または、別法としてそのようなＧＳＥの一部を構成するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドで）完全長のｃＤＮＡライブラリーをスクリーンし、得られた正のクローンのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を決定する工程からなる。また、「アンカードＰＣＲ」法（後記の実施例３参照のこと）を用い、形質転換された表現型を付与するＧＳＥに対応するｃＤＮＡを単離することができる。また、本発明のこの態様にて、例えば、ゲノムＤＮＡライブラリーからの、形質転換された表現型に関連する遺伝子をコードするゲノムＤＮＡの単離が挙げられる。第三の態様にて、本発明は、特定の遺伝子の発現がないこと、または発現不足により、形質転換された表現型を発現する、形質転換された細胞、特にヒト腫瘍細胞を特徴付けるための診断アッセイを提供する。この診断アッセイは、好ましくは、試験すべき特定の腫瘍細胞サンプルによって特定の遺伝子産物の発現のレベルを定量的に測定し、正常な形質転換されていない細胞における発現のレベルと比較することからなる。本発明のこの態様の一の特徴は、蛋白質の発現不足または発現のないことが悪性の哺乳動物細胞、最も好ましくは悪性のヒト細胞における形質転換された表現型に関連する蛋白質に特異的な抗体を発生させることにある。かかる抗体はバイオプシーまたは他の組織サンプルにて腫瘍細胞を検出するための、およびそのような細胞における形質転換された表現型の発現の特性および程度を特徴付けるための診断剤としての有用性を有する。第四の態様において、本発明はin vitroにおける薬剤スクリーニングの開始点および腫瘍細胞に対して有用な、すなわち、抗癌剤である医薬品の合理的なデザインを提供する。形質転換された表現型に関連する遺伝子の発現の構造、機能、位置およびパターンを試験することにより、そのような細胞（かかる遺伝子は発現されていないか、または発現が不足している）を選択的に殺すか、またはその増殖を阻害するであろう医薬品を形成する戦略を発展させることができる。また、本発明は、形質転換された表現型を付与する本発明のＧＳＥを発現し、それにより形質転換される哺乳動物細胞の培養物を提供する。かかる細胞は悪性哺乳動物細胞の形質転換についての生理学的および生化学的基礎を決定するのに有用である。そのような細胞はまたかかる細胞を選択的に殺し、その増殖を阻害する医薬および化学療法剤の開発にて有用性を有し、かくして改良された化学療法プロトコルを確立し、より効果的に新生物疾患を治���するにおいて最終的に有用である。
【００１４】
本発明の特に好ましい具体例が、次のある種の好ましい具体例および請求の範囲のより詳細な記載から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、悪性哺乳動物細胞の形質転換された表現型に関連する特定の遺伝子機能を同定するための手段に関する。本発明は、遺伝学的サプレッサー因子（ＧＳＥ）、形質転換された表現型を形質転換されていない線維芽細胞に付与するかかるＧＳＥの発現を提供する。さらに本発明は、かかるＧＳＥの同定方法、ならびにそれらの使用方法を提供する。本発明の目的からして、用語、「悪性哺乳動物細胞の形質転換された表現型」および「形質転換された表現型」は、下記の細胞性形質転換に関連した表現型の特徴を包含するが、これらに限らない：不死化、形態学的もしくは増殖の変化、および細胞培養において増殖を延長することにより検出されるような腫瘍原性、半固体培地での増殖、または免疫不適合もしくは相乗的動物における変異原性増殖。
【００１６】
第１の態様において、本発明は、形質転換された細胞に悪性哺乳動物細胞の形質転換された表現型を付与するＧＳＥを同定する方法を提供する。この方法により同定されるＧＳＥは、悪性哺乳動物細胞の形質転換された表現型に関連した均一で１つの遺伝子となっている。本発明の目的からすると、用語「均一で１つの遺伝子となっている」は、ＧＳＥがアンチセンスまたは抗原機構により作用するか、あるいは蛋白レベルにおける干渉機構により作用するかにより、２つの異なる意味を有する。前者の場合、アンチセンスまたは抗原オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであるＧＳＥは、生理学的条件下においてホーグステーン（Hoogsteen）またはワトソン−クリック（Watson-Crick）塩基対により遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列を有する場合には、均一で１つの遺伝子である。後者の場合、蛋白分子に干渉するＧＳＥは、その蛋白をコードする遺伝子の一部によりコードされているアミノ酸配列と同じであるかまたは同じであるが保存的アミノ酸の置換があるアミノ酸配列を有する場合には、均一で該蛋白分子をコードする遺伝子である。いずれの場合にも、実際問題として、ＧＳＥは均一で１つの遺伝子であるかどうかということは、ＧＳＥが当該遺伝子の機能を阻害または低下させうるかどうかを評価することにより調べられる。
【００１７】
本発明のこの態様による方法は、全ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのランダムフラグメント発現ライブラリーを表現型の上からスクリーニングして、未形質転換受容細胞に形質転換された表現型を付与するクローンを同定する工程からなる。好ましくは、全ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのランダムフラグメントからなるライブラリーをレトロウイルス発現ベクター中にクローン化する。この好ましい具体例において、ライブラリーを含有するレトロウイルス粒子を用いて細胞に感染させ、例えば、インビトロ培養における「危機」を経て増殖する能力、または形態学的に変化したと認識される様式での増殖能、または軟寒天もしくはアガロースまたはメチルセルロースのごとき半固体培地での増殖能により、あるいは動物における明らかな腫瘍原の増殖により、その形質転換された表現型を示す能力について感染細胞を試験する。好ましくはライブラリー中のインサートは約１００ｂｐないし約７００ｂｐの範囲であり、より好ましくは約２００ｂｐないし約５００ｂｐのサイズである。もっとも好ましくは、ランダムフラグメントライブラリーは、いずれの遺伝子の発現レベルにも無関係に、ライブラリーが形成される細胞タイプにおいて発現される各遺伝子に対応するほぼ同数のクローンを含む正規化されたライブラリーである。しかしながら、均一で豊富にまたは中程度に発現される遺伝子となっているＧＳＥの単離にはライブラリーの正規化は不要である。形質転換された表現型を示す細胞のクローン集団を単離したならば、ＧＳＥをコードしているライブラリーのクローンを細胞から取得する。この段階において、発現ライブラリーのインサートをそのヌクレオチド配列に関して試験してもよい。別法として、そして好ましくは、ヌクレオチド配列決定の前に、さらなるトランスフェクションまたは感染および選択アッセイにおいて形質転換された表現型を付与する能力について取り出したライブラリーのクローンをさらに試験してもよい。もちろん、ヌクレオチド配列はＧＳＥの同定となる。この方法を実施例１および２においてさらに説明する。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、哺乳動物細胞における新生物の増殖の調節に関連した遺伝子ならびにこの方法により得られる遺伝子の同定およびクローニング方法を提供する。これは、ＧＳＥまたはその一部をプローブとして用いて全長のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをースクリーニングし、それらの起源の遺伝子を同定できることによる。別法として、「アンカードＰＣＲ」の方法（下記実施例３参照）を用いて形質転換された表現型を付与するＧＳＥに対応するｃＤＮＡを単離することもできる。哺乳動物細胞において新生物増殖の調節に関連している遺伝子は十分に進化の上で保存されており、本発明により提供されるＧＳＥまたはかかるＧＳＥに対応した遺伝子をプローブとして用いてヒトを含むいずれの哺乳動物種からもかかる新生物増殖に関連したＧＳＥに対応する遺伝子を単離することができるということが認識されよう。いくつかの場合、形質転換された表現型に関連した遺伝子は全く驚くべきものであることがわかるであろう。例えば、未形質転換細胞に形質転換された表現型を付与しうることがわかったＧＳＥは、ヒト・Ｐ１２０仁抗原遺伝子およびＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼに関する遺伝子由来のマウス相同体由来のＧＳＥを包含し、さらに以前未同定であった遺伝子からの３種のＧＳＥ由来のＧＳＥを包含する。さらに、同時係属の米国特許出願番号０８／１７７,１５４（１９９４年１月５日出願）および０８／０３３,０８６（１９９３年３月３日出願）において開示されているように、マウス・キネシン遺伝子由来でエトポシド耐性に関連するＧＳＥはマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）および正常ヒト・線維芽細胞に対して細胞培養増殖の不死化を付与しうることが以前に発見されている。それゆえ、本発明のこの態様による方法も、老化に関する遺伝学的根拠についての貴重な情報を提供する。本発明のこの態様による方法およびそれにより同定された遺伝子ならびにその細胞に対する効果を研究するための該方法の利用を実施例３においてさらに説明する。
【００１９】
第３の態様において、本発明は、特定の遺伝子が発現しないことまたは発現低下により形質転換された表現型を発現する形質転換された細胞、詳細にはヒトの腫瘍細胞を特徴づけるための診断アッセイを提供する。本発明の第１および第２の態様を用いることにより、かかる遺伝子を同定し、クローン化する。かかる遺伝子が発現しないことおよび発現低下が本来的に起こるものであるかどうかを調べるために、そして新生物増殖および癌に関する医学的に重要な根拠であるかどうかを調べるために、対象とする特定の遺伝子の発現レベルについてヒトの腫瘍細胞を評価する。腫瘍を生じる正常組織における発現と比較して、発現しないことまたは有意に低下した発現を、細胞タイプならびに組織型、発生率、侵略性、転移能、および当該特定の腫瘍に関連した他の特性を包含する特定の癌の自然な履歴と関連づける。したがって、かかる低下した発現または無発現は、組織試料中の腫瘍原細胞の存在および拡張に関する診断アッセイについての根拠となりうる。遺伝子の過剰発現結果としての悪性形質転換および新生物増殖は、本発明により提供される同様の診断アッセイを用いても検出できる。本発明のこの態様による診断アッセイの第１の具体例は、発現を測定すべき遺伝子の配列に相同的なオリゴヌクレオチドを用いる。この具体例において、ＲＮＡを組織または腫瘍試料から抽出し、対象遺伝子に特異的なＲＮＡを標準的なフィルターハイブリダイゼーション法、すなわちＲＮａｓｅ保護アッセイまたは定量的ｃＤＮＡ  ＰＣＲにより定量する（ヌーマン（Nooman）ら、１９９０年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８７巻：７１６０〜７１６４頁）。本発明のこの態様の第２の具体例において、対象遺伝子によりコードされる蛋白の一部と同じアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して抗体を生成させる。次いで、これらの抗体を慣用的な定量的イムノアッセイ（例えば、ＲＩＡまたは免疫組織学的アッセイ）において使用して、試験すべき腫瘍細胞から抽出された蛋白試料中、または試験すべき腫瘍細胞の表面もしくはその中の部位に存在する対象とする遺伝子産物量を測定する。第３の具体例において、癌細胞の新生物形質転換に関連した遺伝子の特性である酵素活性を用いて、該蛋白をコードしている遺伝子が癌細胞において過剰発現または発現低下するかどうかを測定することができる。
【００２０】
第４の態様において、本発明はインビトロ薬剤スクリーニング、およびインビボにおいて腫瘍細胞による腫瘍原性ならびに新生物増殖に対抗作用しうる医薬製品の合理的な設計のための出発点を提供する。この点について、本発明は、本発明の形質転換された表現型を付与するＧＳＥを発現し、それにより不死化されそして／または形質転換されている哺乳動物細胞の培養物を提供する。ほとんどすべての組織または細胞系を表わす細胞培養物が本発明のこの態様に包含される。かかる細胞は、哺乳動物細胞の悪性形質転換についての生理学的および生化学的根拠の決定、ならびにかかる形質転換細胞の殺傷または選択的増殖抑制のための医薬および化学療法薬剤のスクリーニングに有用である。かかる薬剤の同定は、新生物疾患をより有効に治療するための改良された化学療法プロトコールの開発につながるであろう。
【００２１】
ＧＳＥが得られる遺伝子によりコードされる蛋白配列をそのｃＤＮＡ配列から推定することができ、既知遺伝子との相同性をサーチすることにより、あるいは蛋白配列中の既知機能モチーフをサーチすることにより、対応蛋白の機能を決定を決定してもよい。これらのアッセイが蛋白機能を示さない場合、遺伝子を抑制するＧＳＥの表現型の効果によりそれを推定できる。ＧＳＥ発現に関連する、種々の増殖に関係した、形態学的な、生化学的な、あるいは抗原の変化を分析することにより、かかる効果を細胞レベルで調べることができる。トランスジーンとして対応するＧＳＥをトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入し、ＧＳＥ発現に関連した発生の異常さを分析することにより、生物レベルでのＧＳＥの効果も研究することができる。細胞またはトランスジェニック動物中の強力なプロモーターから、ＧＳＥよりもむしろ対応遺伝子の全長のｃＤＮＡを発現し、当該遺伝子の過剰発現に関連した変化を研究することによっても遺伝子機能を研究することができる。
【００２２】
全長または部分ｃＤＮＡ配列を用いて慣用的な原核もしくは真核発現系における蛋白合成を指令することもでき、得られた蛋白を免疫原として用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体を得ることができる。これらの抗体を用いて蛋白の局在化を調べることができ、蛋白機能の特異的阻害剤といて用いることもでき、さらに診断目的にも用いることができる。詳細には、ＧＳＥ  Ｔｒ６、Ｔｒ１９およびＴｒ２２の配列によりコードされる合成ペプチド、またはＰ１２０仁抗原遺伝子もしくはＳＡＨＨ遺伝子の対応領域に対して生成された抗体は特に有用である（実施例２ならびに３、および図５、９〜１１、ならびに１５〜１８参照）。
【００２３】
哺乳動物細胞の悪性形質転換に関与する遺伝子の生化学的機能を理解することは、かかる遺伝子の機能を刺激もしくは模倣するための薬理学的手段を示唆し、かくして抗癌剤に対する細胞障害応答についての説明となる可能性がある。例えば、遺伝子がある化合物を生じる酵素をコードする場合、かかる化合物を化学的に合成し、細胞障害性薬剤とともに投与することができる。薬理学的アプローチが蛋白機能から明らかにならない場合、高レベルの転写における遺伝子発現の上昇的転調を行ってもよい。対応遺伝子のプロモーター領域をクローニングし、特定の生物学的刺激剤にたいする応答を与えることが知られているシスエレメントの存在についてプロモーター配列を分析することにより、これを行うことができる。かかるアプローチは、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能を置換すること、例えば、新生物疾患を生じさせる変異または他の生物学的要因によって失われたかかる遺伝子の腫瘍抑制機能を回復することにおいて有用である。
【００２４】
ＧＳＥアプローチにより同定された遺伝子の発現（その発現の損失は細胞の悪性形質転換を生じ、細胞はもはや機能的に遺伝子を発現しなくなる）を増大させる最も簡単な方法は、かかる遺伝子に関する全長の遺伝子を遺伝子療法用発現ベクター、例えばレトロウイルスベクター中に挿入することであろう。組み換えレトロウイルスの形態のかかるベクターはインビボで腫瘍細胞に送達され、組み込みが起こるとすぐに、かかる細胞の新生物増殖を抑制または除去するであろう。分裂中の細胞に対するレトロウイルスにより媒介される形質導入の選択性に基づいて、腫瘍細胞への選択的送達を行うことができる。別法として、例えば、癌胎児性抗原遺伝子のプロモーターのごとき組織もしくは腫瘍特異的プロモーターからの遺伝子発現を発動することにより、選択性を達成することができる。
【００２５】
ｃＤＮＡ配列から推定された蛋白構造をコンピューターによるドラッグデザインに用いて、既知の抗癌剤と同じ様式でこの蛋白に影響する新薬を開発することもできる。便利な発現系において生産される精製蛋白を、抗癌活性を有する新しい化合物を探すインビトロ生化学的スクリーニング系の重要成分として用いることもできる。さらに、本発明の形質転換された表現型を付与するＧＳＥを発現する哺乳動物細胞は、対応遺伝子の下方調節に関連した新生物増殖を選択的に停止または阻害する能力に関しての化合物のスクリーニングに有用である。
以下の実施例は本発明の特定の好ましい具体例をさらに説明するものであり、本質的に限定的なものではない。
【実施例１】
【００２６】
レトロウイルスベクターにおける正規化ランダムフラグメントｃＤＮＡライブラリーの生成およびウイルスパッキング細胞系への誘導
同時係属の米国特許出願第０８／０３３,０８６号（１９９３年３月３日出願）（これを参照により本明細書に記載されているものと見なす）に記載されたようにして正規化ｃＤＮＡ集団を調製した。簡単に説明すると、マウスＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（受託番号ＣＲＬ１６５８、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）（細胞の形質転換アッセイにおいて有用であることが知られている不死化マウシ細胞系（シー（Shih）ら、１９７９年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第７６巻：５７１４〜５７１８頁参照））の対数増殖期および静止期の集密単層培養物から抽出した同量の全ＲＮＡからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。ランダムにプライミングされたｃＤＮＡ集団における５'−末端の過剰再発現を回避するために、５分間煮沸することによりＲＮＡをフラグメント化して平均サイズ６００〜１０００ヌクレオチドとした。次いで、これらのＲＮＡフラグメントをランダムにプライミングされた２本鎖ｃＤＮＡを調製するために使用した。次いで、このランダムにプライミングされたｃＤＮＡを合成アダプターに連結して、３つの可能な読み枠全部にＡＴＧコドンを与え、翻訳開始のための正しい配列とした（図１参照）。アダプターの構造は、各フラグメントが独立別個に開始コドンからその方向へと始まるようにｃＤＮＡの平滑末端フラグメントへの連結を決定した。アダプターの「センス」鎖をＰＣＲプライマーとして用い、特定の配列のランダムな過剰または過小増幅を最小にして生成物の収率を増加させるために順次行われた１２の別個の反応において、連結混合物をＰＣＲにより増幅した。次いで、６％ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によりＰＣＲ増幅混合物をサイズにより分画し、約２００〜５００塩基対（ｂｐ）のサイズ範囲のフラグメントをさらなる処理のために選択した。
【００２７】
正規化のために、ｃＤＮＡ調製物を変性させ、下記再アニーリング時点を用いて再アニーリングした：０、２４、４８、７２および１２０時間。次いで、各アニーリング混合物からの１本鎖および２本鎖ＤＮＡをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより分離した。各再アニーリング時点からのこれらのＤＮＡフラクションをアダプター由来のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ヒト・細胞において異なるレベルで発現されている遺伝子に対応するプローブとのスロットブロットハイブリダイゼーションにより分析した。α−チューブリンおよびｃ−ｍｙｃプローブを用いて高発現遺伝子を得て、アデノシンデアミナーゼおよびトポイソメラーゼ−IIプローブを用いて（後者のｃＤＮＡの５'および３'末端について別々のプローブを用いる）中程度に発現される遺伝子を得て、ｃ−ｆｏｓプローブを用いて低レベルで発現される遺伝子を得た。同様の割合の高、中、および低発現遺伝子を含有するフラクションをライブラリーの調製に使用した。
【００２８】
ｎｅｏ（Ｇ４１８耐性）遺伝子を有し、レトロウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）中に含まれるプロモーターの転写調節下で発現され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター由来のｃＤＮＡインサート配列を発現する、ＭｏＭＬＶを基礎とするレトロウイルスベクターｐＬＮＣＸのＣｌａI部位中に正規化されたｃＤＮＡ調製物をクローン化した（図２およびミラー（Miller）とロスマン（Rosman）、１９８９年、バイオテクニークス（Biotechniques）第７巻：９８０〜９８６頁参照）。ｐＬＮＣＸは、３種の読み枠すべてにおいてクローニング部位の下流２０ｂｐ以内に翻訳終止コドンを有している。ＧＳＥ選択のための典型的なサイズのライブラリーを得るために、この連結混合物を５部に分け、エレクトロポーレーションのための慣用的方法および標準的条件を用いる５種の別個のエレクトロポーレーション実験においてイー・コリ（E.coli）を形質転換するのに使用した（サムブルック（Sambrook）ら、１９９２年、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor）、ＮＹ参照）。形質転換された細菌を全部で５００枚の寒天プレート（直径１５０ｍｍ）に撒き、生成したプラスミド（全部で１８ｍｇ）を寒天から洗い取ったコロニーから単離した。全部で約５ｘ１０７個のクローンが得られ、５０個のランダムにピックアップしたコロニーについてのＰＣＲ増幅により評価したところ、その６０％以上が正規化ｃＤＮＡのインサートを有していた。
【００２９】
下記実施例２において議論するような、適当な細胞の形質転換された表現型を付与しうるＧＳＥのインビボ選択にプラスミドＤＮＡを使用した。エコトロピック（ecotropic）およびアムフォトロピック（amphotropic）なパッケージング細胞（ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞由来；マルコビッツ（Markowitz）ら、１９８８年、ウイロロジー（Virology）第１６７巻：４００〜４０６頁参照、トランスフェクション前日にプレートあたり１.５ｘ１０６個の密度で接種された細胞）の１：１混合物を含有する２０枚のＰ１５０培養プレート中へのトランスフェクションにより、上記のごとく調製されたプラスミドライブラリーをレトロウイルス粒子の混合物に変換した。１５μｇのランダムフラグメントレトロウイルスライブラリー（ＲＦＲＬ）プラスミドＤＮＡをＰ１５０プレート１枚につきトランスフェクションした。トランスフェクション後３日間にわたりレトロウイルス含有細胞培養物の上清を１２時間ごとに集め、０.２２μｍの膜により濾過することにより精製した。
【実施例２】
【００３０】
マウス繊維芽細胞へのレトロウイルス・ランダム・フラグメント・ライブラリーの導入
実施例１に従い調製された精製されたレトロウイルス含有上清を、哺乳動物細胞中の該形質転換表現型の３個の別個の態様を検出するために選択されたこれらの検定のそれぞれで使用した。形質転換ＧＳＥの選択には、同定可能で選択可能な形質転換関連変化を受ける能力を有する適当な指示細胞を使用しなければならなかった。腫瘍形質転換に関連した表現型特徴を誘導するＧＳＥについての３個の異なる選択プロトコルを使用した。まず、老化細胞を不死化する能力を有するＧＳＥの選択のために、指示細胞系としてマウス胚繊維芽細胞を使用した。残りの２個の選択プロトコルでは、腫瘍形質転換の異なる段階に特異的なＧＳＥを選択するために、それぞれ形質転換関連特徴で相違する、３個の異なる型の不死化マウス繊維芽細胞を利用した。これらの細胞系の２個はＮＩＨ３Ｔ３細胞の亜変異体であり、この３個の型の細胞は、自発形質転換ＭＥＦ細胞から新しく樹立されたスイス３Ｔ３細胞のいくつかの集団よりなっている。これらの後者の細胞は、異なるＧＳＥの影響を相違して受ける複数の表現型変異体を含有し、それにより、検出され得るＧＳＥの異なる型の数を増加させると予想された。３個の型の不死化細胞のそれぞれのいくつかの特徴的な性質を表１に示す。
【００３１】
表１
細胞型      自発フォーカス  プレーティング            腫瘍化ａ
形成率          効率              ３週間    ６週間  
NIH 3T3-HF     2-5×10−６      20-30%             0/6         5/6
NIH 3T3-LF    < 1×10−７       20-30%             0/6         0/6
スイス3T3     < 1×10−７       < 0.1%             N.T.        N.T.
a  ＝  腫瘍を有するマウス数／試験されたマウス数
N.T. ＝ 試験せず
【００３２】
Ａ．マウス胚繊維芽細胞を不死化する能力を有するＧＳＥの選択
老化細胞を不死化する能力についてのＧＳＥの選択を、図３Ａおよび３Ｂに示すプロトコルを用いて、実施例１のＲＦＲＬよりなるレトロウイルス粒子で感染させたマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）の培地上で行った。通常のトリプシン化法を用いて、１１日齢のスイスウェブスターマウス胚から主ＭＥＦ培地を調製した。各継代時にＰ１５０培養プレート毎にプレーティングし１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた２.５×１０６個の細胞で３〜４日毎に細胞を分断した。さらに、それぞれの第２継代後、該培養が老化および「分利（crisis）」を受けるまで、クリオ（cryogenic）保護溶液中で−７０℃で凍結することにより約５×１０６個の細胞を保存した。レトロウイルス感染実験のために、分利前に４継代凍結した細胞を解凍し、１×１０６細胞／プレートの密度で１０個のＰ１５０プレート上の培養中で増殖させた。該解凍細胞にＲＦＲＬ由来レトロウイルスを１２時間間隔で３日にわたり感染させ、それぞれの集めた上清でＭＥＦに繰り返し感染させた。ＲＦＲＬ由来レトロウイルスの感染で開始して、各Ｐ１５０プレートを独立して加工した。Ｇ４１８の存在および不存在下で５日間、等しい数の感染細胞をプレーティングし、その時点でＭＴＴ検定により相対細胞生存率を測定することにより、感染の効率を評価した（ポーウェルズ（Pauwels）ら、1988, J. Virol. Meth. 20: 309-321）。かかる検定で得られた典型的な感染効率から、約７０％のＭＥＦがＲＦＲＬ由来レトロウイルスに感染していることが示された。
【００３３】
該細胞培養が老化および分利を克服した後、該ウイルスをレスキューするために、１９９４年２月２２日付け同時継続米国特許出願第０８／１９９,９００号に既に記載されているとおりにポリエチレングリコールを使用することにより、各プレートからの生存細胞をエコトロピックパッケージング細胞と融合した。レスキューされたウイルス集団の複雑性を、クローニングアダプターのセンス鎖に対応するオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用することにより、プロウイルス挿入物のＰＣＲ増幅により評価した（図４に示すとおり）。ＲＦＲＬ由来レトロウイルス感染ＭＥＦ細胞からのＰＣＲ生成物は、最初に長さ２００〜５００塩基対の断片の連続的なしみを形成した。該細胞が分利を受けるにつれて、該cＤＮＡ挿入物の複雑性は減少し、分離帯が可視化した（図２）。
【００３４】
比較的低い力価（〜１０４／mL）でウイルスを含有する分利後細胞からのレスキューされたウイルス調製物を使用して、分利前ＭＥＦ細胞の新鮮な集団に感染させ、ついでこれを分利させた。これらの２次感染細胞の効率は、分利前および後のＧ４１８選択により評価した。いくつかの２次選択実験では感染細胞の集団が分利後に増加したが、これはＧＳＥ担持細胞についての強化を示唆する。この第２ラウンドの選択に生き残った不死化細胞からの細胞ＤＮＡ上で行ったＰＣＲ分析は、推定不死化付与ＧＳＥを含有するいくつかのcＤＮＡ挿入物の選択を示した。
【００３５】
これらの挿入物をpＬＮＣＸレトロウイルスベクターにそれぞれ別々にサブクローニングし、ＭＥＦ細胞を不死化する能力について調べた（図３Ｂに示すとおり）。分利前に２個の継代であるＭＥＦにＧＳＥ担持ウイルスを感染させ、ついで低密度（例えば３×１０４細胞／１００ｍｍ細胞プレート）でプレーティングし、ついでプレーティングの２週間後に固定し染色した。生存コロニー数は該感染集団中の不死化細胞の割合を表す。
【００３６】
Ｂ．マウス繊維芽細胞を形態学的に形質転換しうるＧＳＥの単離
不死化ＭＥＦの形態学的形質転換誘導能を有するＧＳＥを単離するために、上記Ａ項に記載の不死化ＭＥＦ細胞を使用した。１０個のＰ１００プレートに２.５×１０６細胞／プレートで細胞をプレーティングし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中に３週間維持した。形態学的に形質転換された細胞の２〜２０個のフォーカスが各プレートに出現した。２個のフォーカスを単離し、培養中で増殖することにより拡大させた。ついで、これらの拡大フォーカスからの細胞をパッケージング細胞と融合し、該ハイブリッド細胞をＧ４１８で選択し、上記のとおりレトロウイルス集団をレスキューするために使用した。該拡大フォーカスからこのように単離されたウイルスを使用して、新鮮なスイス３Ｔ３細胞に感染させ、該感染細胞をＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中で維持した。
【００３７】
これらの２個のフォーカスのそれぞれからレスキューされ不死化ＭＥＦ細胞の元のプレートの１つから単離されたウイルスは、２個の別個の実験でスイス３Ｔ３細胞の形態学的形質転換を誘導した。形質転換されたスイス３Ｔ３細胞の４個の独立したフォーカスから単離されたゲノムＤＮＡ上で行った、該形質転換ウイルス（Ｔr６−ＧＳＥと称する）中に存在するcＤＮＡ挿入物のＰＣＲ分析は、単一の挿入帯を示した。この帯からのＤＮＡをpＬＮＣＸベクター中に再クローニングし、通常の技術（サムブルック（Sambrook）ら、前掲、を参照されたし）により該ヌクレオチド配列を決定した。このクローンは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション・データベース（National Center for Biotechnology Information database）に存在する公知の核酸またはタンパク質配列との有意な相同性を全く示さない、２８５塩基対の挿入物（図５に示す）を含有することが判明した。この再クローニングされたＴr６−ＧＳＥ担持レトロウイルスは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞および不死化ＭＥＦの形態学的形質転換を誘導するのに効率的であった（図６Ａに示す）。老化ＭＥＦ細胞のこのウイルスによる感染によっては、バックグランドに対して不死細胞数の有意な増加が全く生じなかった。
【００３８】
しかしながら、異なる検定によりＴr６がＭＥＦ不死化に影響を及ぼすことが判明した。この検定では、ＬＮＣＸ、またはＬＮＣＸ担持Ｔr６−ＧＳＥ、または細胞腫瘍抑制遺伝子ｐ５３をコードする全長cＤＮＡを担持するレトロウイルス構築物、または該ｐ５３レトロウイルスおよびＴr６−ＧＳＥ担持レトロウイルスの組み合わせを、老化から２継代のＭＥＦ細胞に感染させた。該ＬＮＣＸベクターレトロウイルスに感染したＭＥＦ細胞は、低いバックグランドの自発不死化細胞を与えた（図６Ｂ）。これに対し、すべての細胞が感染する条件下で該ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の全長cＤＮＡを担持する該組換えレトロウイルスに感染したＭＥＦ細胞は、不死化コロニーを全く生じなかった。しかしながら、同じ細胞を同じ条件下で、Ｔr６およびｐ５３を担持するレトロウイルスで感染させた場合、不死化コロニーが形成された（図６Ｂ）。
【００３９】
また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態学的形質転換を誘導する能力について、ＧＳＥを選択した（図７に示す）。これらの実験では、ＲＦＲＬプラスミドＤＮＡをエコトロピックおよび両種性ウイルスパッケージング細胞の１：１混合物にトランスフェクションした。感染の２４、４８および７２時間後にレトロウイルス粒子含有組織培養培地上清を集め、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の反復感染のために使用した。感染に使用したウイルスの全量は＞１０７感染単位と評価された。受容ＮＩＨ３３細胞を、１×１０６細胞／プレートの密度で１０個のＰ１５０プレートにプレーティングし、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でインキュベートした。ベクタープラスミドｐＬＮＣＸによるパッケージング細胞のトランジエント（transient）トランスフェクションにより生成したＧＳＥ挿入物を全く含有しない対照ウイルスを４個のプレートに感染させて、これらの細胞における自発（すなわち非ＧＳＥ仲介）形質転換を評価した。
【００４０】
最終感染の次の日に、該感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞の一部分を上記のとおりに凍結させ、他の部分を２×１０６細胞／プレートの密度で１０個のＰ１５０培養プレート中にスプリットさせ、ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ中で２週間培養した。感染の効率をＧ４１８選択により評価した。典型的には、該細胞の少なくとも５０％が感染していることが判明した。実験プレートおよび対照プレートの両方で同様の数の明らかに形質転換されている細胞が観察された（５〜１５フォーカス／プレート、２.５〜７.５×１０６フォーカス／細胞に相当）。上記と同様にして個々のフォーカスを拾い、拡大し、エコトロピックパッケージング細胞との融合により各フォーカスからウイルスをレスキューした。新鮮なＮＩＨ３Ｔ３細胞にレスキューされたレトロウイルスを感染させ、２／５０のレスキューされたウイルス集団で感染した細胞は、５％血清中でより一層高い密度に到達することを含む改変された増殖性を示す細胞集団を生じさせることが判明した（図８Ａおよび８Ｂに示す）。これらの集団からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は、かかる改変された細胞増殖性を誘導するその２個のウイルス調製物のそれぞれが単一のcＤＮＡ挿入物を担持することを示した。
【００４１】
このようにして単離された形質転換レトロウイルスにより担持されたこの２個のcＤＮＡ挿入物を配列決定し、ＮＣＢＩデータベースに存在する公知の核酸およびタンパク質配列との相同性について分析した。この分析により、該形質転換ウイルスの１つが、該センス配向でクローニングされた、酵素Ｓ−アデノシルホモシステインヒドラーゼ（ＳＡＨＨ）をコードするcＤＮＡのコーディング領域の開始点に対応する２８５塩基対の断片を担持することが示された（図９〜１１に示す）。ＳＡＨＨは、メチオニン、システインおよびＳ−アデノシルメチオニン合成（後者の化合物はメチル化反応のメチル基の主要源である）を含む多数の生化学的経路に関与していることが知られている。異常ＳＡＨＨ発現は、細胞ＤＮＡメチル化パターンにおける一般的な改変を起こし得、種々の細胞の特徴を改変することが知られている（ウォロス（Wolos）ら, 1993, J. Immunol. 150: 3264-3273; リウ(Liu)ら, 1992, Antivir. Res. 19: 247-265; ドゥエレ（Duerre）ら, 1992, Biochim, Biolog. Cellulaire 70: 703-711を参照されたし）。この実験からのＳＡＨＨ由来cＤＮＡ挿入物をpＬＮＣＸベクター中に、元のプロウイルスと同じ配向（すなわちセンス配向）で再クローニングし、以下に記載のとおりさらに試験するのに使用した。
【００４２】
第２形質転換ウイルス調整物からの挿入物は、アダプターにより互いに結合した異なる結合cＤＮＡ断片を含有することが判明した。これらの断片の１つを、構造タンパク質であるフィラミンをコードするcＤＮＡから誘導した。Ｔr１９−ＧＳＥ（図１２に示す）と称される残りの断片の配列は、ＮＣＢＩデータベース中のいずれかの公知の遺伝子との有意な相同性を全く有さなかった。さらに試験するために、これらの２個の断片を別々にｐＬＮＣＸレトロウイルスベクター中に再クローニングした。
【００４３】
エコトロピックパッケージング細胞にトランスフェクションし、得られたウイルスをＮＩＨ３Ｔ３細胞（各ｃＤＮＡ挿入物の形態学的形質転換能について試験するため）およびＭＥＦ細胞（不死化および形態学的形質転換能の両方について試験するため）に感染するのに使用することにより、該再クローニングｃＤＮＡ断片を試験した。該ＮＩＨ３Ｔ３細胞試験では、非常にばらつきの大きな結果を得た。一方、該ＭＥＦ細胞実験は、より効率的かつ再現可能であった。これらの実験の結果を、図１３Ａ〜１３Ｃに示す。ＳＡＨＨ cＤＮＡ配列を担持するウイルス（ＳＡＨＨ−ＧＳＥ）による感染の結果、ＭＥＦ細胞の不死化および形態学的形質転換の両方が生じた。フィラミンcＤＮＡ断片を担持するウイルスによる感染はＭＥＦ細胞に全く影響を与えなかったが、Ｔr１９−ＧＳＥ担持ウイルスは、ＳＡＨＨ−ＧＳＥより低効率ではあったが、ＭＥＦ細胞の不死化誘導能を有することが判明した。これらの結果により、本明細書に開示の戦略により２個の形質転換ＧＳＥ（そのうちの一方は未知（Ｔr１９）であり、他方は、公知であったが現在まで腫瘍形質転換に関与していなかった遺伝子由来であった）が単離できたことが確認された。
【００４４】
Ｃ．ヌードマウスにおける腫瘍化増殖を可能にするＧＳＥの選択
免疫不能なヌード（nulnu）マウスにおけるＮＩＨ３Ｔ３細胞の腫瘍化増殖を可能にする能力を有するＧＳＥを単離するために、以下の実験を行った。これらの実験についてのスキームを図１４に示す。この選択のために、上記のとおりに調製されたＲＦＲＬ感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞をマウス当たり５×１０５細胞でヌードマウス（Balb/c系統）の脇腹に皮下接種した。ｐＬＮＣＸベクター由来ウイルスで感染させたＮＩＨ３３細胞を対照として使用した。接種後６週間まで毎週、腫瘍形成についてマウスを調べた。これらの実験の結果を表IIに要約する。
【００４５】
表II
腫瘍担持マウスの数
細胞型        ２週      ３週      ４週      ５週      ６週
対照           0/3       0/3       0/3       1/3       1/3
RFRL           0/9       6/9       7/9       9/9       9/9
【００４６】
ＬＮＣＸ由来レトロウイルスより高い、ＲＦＲＬ由来レトロウイルスにより感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞中の腫瘍化変異体の頻度を示すこれらの結果は、ＲＦＲＬ由来レトロウイルスの集団中の腫瘍化ＧＳＥの存在を示した。腫瘍の大きさが直径５mmに達した場合、各腫瘍を外植し培養中で樹立させた。これらの腫瘍由来培養の３個からのゲノムＤＮＡを使用して行ったＰＣＲ分析は、異なるcＤＮＡ挿入物を担持するいくつかのプロウイルスの存在を示した。ついで、上記のとおり該腫瘍細胞をエコトロピックパッケージング細胞と融合させ、新鮮なＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させ、腫瘍化についてヌードマウス中で選択することにより、ウイルスをこれらの腫瘍細胞からレスキューした。各導入細胞集団当たり２匹のマウスを用い、これらのマウス内で形成した腫瘍からのプロウイルス挿入物をＰＣＲ分析により特徴づけた（図１５に示す）。試験された３個の集団のうちの２個で、共に独立に注射されたマウスの第２腫瘍において、単一挿入物が強化されていることが判明した。第３の元のＮＩＨ３Ｔ３細胞集団に由来するウイルスに感染させた細胞を注射したマウスの第２腫瘍中に異なる挿入物が検出された。
【００４７】
これらの推定腫瘍化ＧＳＥを共に、ヌクレオチド配列決定により特徴付けし、該配列をＮＣＢＩデータベースに存在する公知の核酸およびタンパク質配列と比較した。Ｔr２２−ＧＳＥと称される該cＤＮＡ挿入物の１つは、該データベース中のいずれかの配列との有意な相同性を全く共有しないことが判明し、したがって新規遺伝子の断片を示した（この配列を図１６に示す）。1bb1−ＧＳＥと称されるもう一方のcＤＮＡは、増殖性細胞のヒトＰ１２０核小体抗原のマウス相同体からの内部領域からの８７個のアミノ酸をコードするセンス配向ＧＳＥである。このＧＳＥのヌクレオチド配列を図１７に示し、Ｐ１２０配列とＧＳＥ配列との間の核酸およびアミノ酸配列比較をそれぞれ図１８および１９に示す。
【００４８】
1bb1断片をｐＬＮＣＸベクター中に再クローニングし、エコトロピックパッケーッジング細胞中にトランスフェクションし、得られたウイルスを使用してスイス３Ｔ３細胞に感染させた。該1bb1担持ウイルスによる感染により、これらの細胞中で形態学的に形質転換されたフォーカスが形成した（図２０）。これらの結果は、Ｐ１２０の全長cＤＮＡがＮＩＨ３３細胞中で優性腫瘍遺伝子として作用する能力を有するという最近の報告（パーラキー（Perlaky）ら、1992, Cancer Res. 52: 428-436）と一致する。本明細書に開示されている結果は、該1bb1ＧＳＥよりなるＰ１２０cＤＮＡの部分が、Ｐ１２０タンパク質の約１０％に相当する機能性腫瘍ドメインをコードすることを示す。この結果は、腫瘍タンパク質のかかる小さな部分が発ガン的に機能性であることの初めての証明である。
【実施例３】
【００４９】
各形質転換ＧＳＥが誘導された遺伝子のクローニングおよび分析
上記実施例２に記載の結果は、腫瘍細胞中の細胞形質転換に関与する３個の新しく同定された遺伝子の単離を開示する。これら３個のＧＳＥに対応する遺伝子のそれぞれは以下のとおり単離される。各ＧＳＥをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、正常細胞から調製されたマウスまたはヒトcＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。適当な緊縮時のインタースペシフィック（interspecific）ＤＮＡハイブリダイゼーションは、ＧＳＥまたはかかるＧＳＥに対応する遺伝子（上記実施例２に記載のとおりに単離されたもの）と相同な核酸プローブを使用することにより、いずれかの哺乳動物種からのＧＳＥに対応する遺伝子の単離を可能にすると予想される。ついで、各ＧＳＥについてこのように単離された最長cＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定し、該配列を分析して、各鎖からの推定遺伝子生成物をコードする最長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定する。ついで、最長ＯＲＦの配列上で上記のとおりの配列相同性分析を行って、関連タンパク質が既に同定されているか否かを決定する。ついで、必要に応じて、該アミノ末端からのアミノ酸をコードするいずれかの追加的ヌクレオチドを、オハラ（Ohara）ら（1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5763-5677）により記載されているとおりに「アンカード（anchored）ＰＣＲ」技術を用いて単離された５'−特異的cＤＮＡから決定する。また、この技術を用いて、追加的な欠けている３'末端配列を単離する。該「アンカードＰＣＲ」技術は、ライブラリースクリーニングなしで直接ＧＳＥ配列から開始して全長ｃＤＮＡを単離するのにも使用できる。
【００５０】
上記開示は本発明のある特定の具体例を強調しており、それと同等のあらゆる修飾または代替は添付する請求の範囲に記載の本発明の精神および範囲内であると理解されるべきである。
【００５１】
シーケンス・リスティング
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）名称  ：ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・
ユニバーシティ・オブ・イリノイ
（Ｂ）通り名：２０１ライト・ストリート、ヘンリー・
アドミニストレーション・ビルディング３５２
（Ｃ）都市名：アーバナ
（Ｄ）州名  ：イリノイ州
（Ｅ）国名  ：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：６１８０１
（Ｇ）電話番号：
（Ｈ）テレファックス番号：
（ii）発明の名称：哺乳動物細胞における新生物形質転換の制御に関連する遺伝子および遺伝学的因子
（iii）配列の数：１３
（iv）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）媒体型：フロッピーデイスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェアー：パテンチン・リリース＃１.０、
バージョン＃１.２５（ＥＰＯ）
（ｖ）最新の出願データ
出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９５／
【００５２】
（２）配列番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１：
【００５３】
【表１】
2004344163.tif 000003
【００５４】
（２）配列番号２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号２：
【００５５】
【表２】
2004344163.tif 000004
【００５６】
（２）配列番号３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２８５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号３：
【００５７】
【表３】
2004344163.tif 000005
【００５８】
（２）配列番号４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２１０塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号４：
【００５９】
【表４】
2004344163.tif 000006
【００６０】
（２）配列番号５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２７３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号５：
【００６１】
【表５】
2004344163.tif 000007
【００６２】
（２）配列番号６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２８５塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号６：
【００６３】
【表６】
2004344163.tif 000008
【００６４】
（２）配列番号７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号７：
【００６５】
【表７】
2004344163.tif 000009
【００６６】
（２）配列番号８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２８９塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号８：
【００６７】
【表８】
2004344163.tif 000010
【００６８】
（２）配列番号９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：９５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：蛋白質
（xi）配列の記載：配列番号９：
【００６９】
【表９】
2004344163.tif 000011
【００７０】
（２）配列番号１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２６３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１０：
【００７１】
【表１０】
2004344163.tif 000012
【００７２】
（２）配列番号１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：１０８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１１：
【００７３】
【表１１】
2004344163.tif 000013
【００７４】
（２）配列番号１２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：２６２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列番号１２：
【００７５】
【表１２】
2004344163.tif 000014
【００７６】
（２）配列番号１３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ：８７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子の型：ペプチド
（xi）配列の記載：配列番号１３：
【００７７】
【表１３】
2004344163.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、ｃＤＮＡクローニングに用いるアダプターの構造を示す。ヌクレオチド配列をアダプターのＡＴＧ−センス鎖（配列番号：１）およびＡＴＧ−アンチセンス鎖（配列番号：２）について示す。
【図２】図２は、ｃＤＮＡクローニングにおいて用いるｐＬＮＣＸベクターの構造を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞ｃＤＮＡ由来のランダムフラグメント発現ライブラリー（ＲＦＥＬ）から得たＭＥＦ細胞中の不死化ＧＳＥの選択のためのスキームを示す。図３Ａは、危機を生き延びた細胞の１ラウンド選択によるかかるＧＳＥの選択を示し；図３Ｂは、図３Ａに示すスキームにより得られる不死化されたＭＥＦの集団からの不死化ＧＳＥの再選択および豊富化のためのスキームを示す。
【図４】図４は、ＭＥＦを不死化するＧＳＥからなるＰＣＲフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図５】図５は、Ｔｒ６−ＧＳＥのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、Ｔｒ６−ＧＳＥ（配列番号：３）が、Ｓwiss３Ｔ３細胞およびＭＥＦ細胞の両方に形態学的に形質転換された表現型を付与する能力を有すること（図６Ａ）、およびＭＥＦ細胞を不死化させる能力も有すること（図６Ｂ）（ＭＥＦ細胞において外因性の誘導されたｐ５３遺伝子の発現により自発的不死化が抑制される）を示す実験結果を示す。
【図７】図７は、形態学的形質転換を付与するＧＳＥの選択のためのスキームを示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、取得された形質転換性ＧＳＥ保持レトロウイルスを新鮮なＮＩＨ  ３Ｔ３細胞に再感染させた実験結果を示す。図８Ａは、フォーカス２４、２５ならびに２６由来のウイルスに感染した細胞のＧ４１８耐性に関する選択（感染効率の測定として）および５％ＦＣＳを補足した培地中での形態学的形質転換の結果を示す。図８Ｂは、形態学的に形質転換されたフォーカスのゲノムＤＮＡ由来のレトロウイルスのインサートのＰＣＲ分析結果を示す。
【図９】図９は、ＳＡＨＨ−ＧＳＥのヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。
【図１０】図１０は、ＳＡＨＨ−ＧＳＥのヌクレオチド配列（配列番号：４；上の配列）とヒト・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼｍＲＮＡ配列（配列番号：５；下の配列）との間の比較を示す。
【図１１】図１１は、ＳＡＨＨ−ＧＳＥによりコードされるペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６；上の配列）とヒト・Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ蛋白のアミノ酸配列（配列番号：７；下の配列）との間の比較を示す。
【図１２】図１２は、Ｔｒ１９−ＧＳＥ（配列番号：８）のヌクレオチド配列を示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＳＡＨＨ−ＧＳＥが、ＭＥＦ細胞に対して不死化および形態学的形質転換の双方を付与する能力があること（図１３Ａ）、およびＴｒ１９−ＧＳＥがＭＥＦ細胞を不死化させ（図１３Ｂ）、さらにＳＡＨＨ−ＧＳＥおよび抗−ｋｈｃｓＧＳＥはともにＭＥＳ細胞を不死化させうるが、ＳＡＨＨ−ＧＳＥのみがＭＥＦ細胞を形態学的に形質転換することができること（図１３Ｃ）を示す実験結果を示す。
【図１４】図１４は、腫瘍原性ＧＳＥの選択スキームを示す。
【図１５】図１５は、腫瘍原性ＧＳＥからなるＰＣＲフラグメントのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図１６】図１６は、Ｔｒ２２−ＧＳＥのヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す。
【図１７】図１７は、１ｂｂ１−ＧＳＥのヌクレオチド配列（配列番号：１０）を示す。
【図１８】図１８は、１ｂｂ１−ＧＳＥのヌクレオチド配列（配列番号：１０；上の配列）とＰ１２０ヒト・仁抗原遺伝子配列（配列番号：１１；下の配列）との間の比較を示す。
【図１９】図１９は、１ｂｂ１−ＧＳＥによりコードされるペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２；上の配列）とＰ１２０ヒト・仁抗原アミノ酸配列の一部（配列番号：１３；下の配列）との間の比較を示す。
【図２０】図２０は、１ｂｂ１−ＧＳＥ（配列番号：１０）を有するレトロウイルスでのスイス（Swiss）３Ｔ３細胞の感染を用いるフォーカス形成アッセイの結果を示す。
【図１】
2004344163.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
2004344163.tif 000019
【図５】
2004344163.tif 000020
【図６】
2004344163.tif 000021
【図７】
2004344163.tif 000022
【図８】
2004344163.tif 000023
【図９】
2004344163.tif 000024
【図１０】
2004344163.tif 000025
【図１１】
2004344163.tif 000026
【図１２】
2004344163.tif 000027
【図１３】
2004344163.tif 000028
【図１４】
2004344163.tif 000029
【図１５】
2004344163.tif 000030
【図１６】
2004344163.tif 000031
【図１７】
2004344163.tif 000032
【図１８】
2004344163.tif 000033
【図１９】
2004344163.tif 000034
【図２０】
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