(57)【要約】      （修正有）【課題】α−１，２−マンノシダーゼを菌体外に生産する新規菌株、α−１，２−マンノシダーゼを発現し得る微生物の作成のためのＤＮＡ、およびこれらを用いてα−１，２−マンノシダーゼを工業的に有利に製造する方法を提供すること。また、α−１，２−マンノシダーゼを用いる、生産効率のよいα−マンノシル糖化合物の製造方法を提供すること。【解決手段】セルロシミクロビウム属由来の新規α−１，２−マンノシダーゼ。特定の配列の２位から１７５７位までのアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうち１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、α−１，２−マンノシダーゼが提供され、そして該α−１，２−マンノシダーゼをコードするＤＮＡも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（７）の特性を有する新規α−１，２−マンノシダーゼ：
（１）作用
（ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に分解する；および
（ｂ）マンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する；
（２）基質特異性
α−マンナン、α−１，２−マンノビオース、非還元末端にα−１，２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、およびｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドには作用するが、α−１，３−マンノビオースおよびα−１，６−マンノビオースには実質的に作用しない；
（３）最適温度：３５℃〜４５℃；
（４）最適ｐＨ：５〜７；
（５）安定温度：４０℃；
（６）安定ｐＨ：５〜１２；および
（７）分子量：約４００，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）。
【請求項２】
前記α−１，２−マンノシダーゼがセルロシミクロビウム属由来である、請求項１に記載のα−１，２−マンノシダーゼ。
【請求項３】
前記α−１，２−マンノシダーゼがセルロシミクロビウム・セルランス由来である、請求項１または２に記載のα−１，２−マンノシダーゼ。
【請求項４】
前記α−１，２−マンノシダーゼがセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９０）由来である、請求項１から３のいずれかの項に記載のα−１，２−マンノシダーゼ。
【請求項５】
配列表の配列番号２の２位から１７５７位までのアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうち１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、α−１，２−マンノシダーゼ。
【請求項６】
配列表の配列番号２の−４９位から１７５７位までのアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうち１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のα−１，２−マンノシダーゼ。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかの項に記載のα−１，２−マンノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、および自律複製可能なベクターを含む、複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項８】
α−マンノシル糖化合物の製造方法であって、
マンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖質に請求項１から６のいずれかの項に記載のα−１，２−マンノシダーゼを作用させる工程、および
得られたα−マンノシル糖化合物を回収する工程、
を含む、方法。
【請求項９】
前記α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ糖である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
セルロシミクロビウム属由来の細菌を培養する工程、および該培養物からα−１，２−マンノシダーゼを採取する工程を含む、α−１，２−マンノシダーゼの製造方法。
【請求項１１】
前記セルロシミクロビウム属由来の細菌がセルロシミクロビウム・セルランスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
α−１，２−マンノシダーゼ生産能を有するセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９０）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、α−１，２−マンノシダーゼ、該酵素をコードする新規なＤＮＡ、および該α−１，２−マンノシダーゼを用いるα−マンノシル糖化合物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食中毒などの感染患者数が増加し、大きな社会問題となっている。サルモネラ汚染や大腸菌Ｏ−１５７などによる食中毒は、これらの病原菌が腸管細胞へ付着することから始まる。そしてサルモネラ菌や大部分の大腸菌はマンノースを含む糖鎖を認識して付着することが知られている（非特許文献１）。ハイマンノース型糖鎖に見られるように、糖鎖構造中には、α−マンノシド結合を有するマンノオリゴ糖構造が多く存在している。この糖鎖と類似の構造を示すマンノオリゴ糖は、病原菌に付着することによって、病原菌の腸管への接着を阻害することが知られているため（非特許文献２）、α−マンノシド結合を有するα−マンノオリゴ糖には感染症を予防する効果が期待できる。そこで、α−マンノオリゴ糖を、食品や飼料として大量に生産できる技術の確立が望まれていた。
【０００３】
マンノオリゴ糖などのマンノシル糖化合物は、天然物からの抽出によって得られる。例えば、天然に存在するα−マンノシド結合からなるマンナンとして、酵母の細胞壁に存在する酵母マンナンが挙げられる。酵母マンナンを酸加水分解あるいは酵素処理することにより、α−マンノオリゴ糖を製造する方法が考えられる。しかし、この方法では均一な組成のオリゴ糖を製造することができないことから、作用のばらつきが予想され、特定の効果を安定して得ることは困難と考えられる。
【０００４】
マンノオリゴ糖の化学合成方法も知られているが、工程が複雑であり、収率が極めて低いという問題がある。
【０００５】
一方、酵素を利用する合成法によれば、マンノースを基質とした縮合反応により、比較的簡略な工程で効率的にマンノオリゴ糖を製造できると考えられる。これまでに各種起源のα−マンノシダーゼが報告されており、縮合反応によるマンノースからマンノオリゴ糖の合成が試みられている。植物由来のα−マンノシダーゼとしては、例えば、タチナタマメあるいはアーモンドなどに由来するα−マンノシダーゼが挙げられる（特許文献１）。微生物由来のものとして、アスペルギルス属に属する糸状菌由来のもの（特許文献２）、バチルス属に属する細菌由来のもの（特許文献３）、担子菌由来のもの（非特許文献３）などが挙げられる。しかし、これらのマンノシダーゼは活性が低いこと、培養および精製が煩雑であること、マンノオリゴ糖の収率が低いことなどの問題があり、実用化には至っていない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平５−４９４９２号公報
【特許文献２】
特開昭５７−５４５８８号公報
【特許文献３】
特開平５−６４５８６号公報
【非特許文献１】
Ｎ．Ｓｈａｒｏｎら、ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒ，２１７巻，１４５−１５７頁，１９８７年
【非特許文献２】
Ｓ．Ｕ．Ｓａｊｊａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，５８巻，８６０頁，１９９０年
【非特許文献３】
Ｍ．Ｍａｒａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７７巻，２５５−２６３頁，２０００年
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来のα−１，２−マンノシダーゼは、いずれもα−１，２−マンノシダーゼ活性が低く、また、培養法および精製法が煩雑なものが多く、工業的に安価に生産することは困難であるという問題がある。さらに、上記のバチルス属に属する細菌由来の酵素は、縮合によるオリゴ糖生成率が低いという問題点がある。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、α−１，２−マンノシダーゼを菌体外に生産する新規菌株、およびこの菌株を用いてα−１，２−マンノシダーゼを工業的に有利に製造する方法を提供することにある。さらに、本発明は、該α−１，２−マンノシダーゼを発現し得る微生物の作成のためのＤＮＡを提供することを目的とする。また、本発明は、該α−１，２−マンノシダーゼを用いる、生産効率のよいα−マンノシル糖化合物の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、マンノースからα−マンノオリゴ糖を生成し得るα−マンノシダーゼを探索した結果、セルロシミクロビウム・セルランス（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｂｒｏｂｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｎｓ）Ｈ−１６株がα−１，２−マンノシダーゼを効率的に生産することを発見した。本菌は産業総合研究所生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９０として寄託されている。本発明者らは、この菌株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を単離することに成功し、さらに遺伝子工学的手法により組換え微生物を作成することによってα−１，２−マンノシダーゼを効率的に製造する方法を確立して、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、以下の（１）〜（７）の特性を有する新規α−１，２−マンノシダーゼを提供する：
（１）作用
（ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に分解する；および
（ｂ）マンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する；
（２）基質特異性
α−マンナン、α−１，２−マンノビオース、非還元末端にα−１，２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、およびｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドには作用するが、α−１，３−マンノビオースおよびα−１，６−マンノビオースには実質的に作用しない；
（３）最適温度：３５℃〜４５℃；
（４）最適ｐＨ：５〜７；
（５）安定温度：４０℃；
（６）安定ｐＨ：５〜１２；および
（７）分子量：約４００，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）。
【００１１】
好適な実施態様では、上記α−１，２−マンノシダーゼはセルロシミクロビウム属由来である。
【００１２】
より好適な実施態様では、上記α−１，２−マンノシダーゼはセルロシミクロビウム・セルランス由来である。
【００１３】
さらに好適な実施態様では、上記α−１，２−マンノシダーゼはセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９０）由来である。
【００１４】
本発明はまた、配列表の配列番号２の２位から１７５７位までのアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうち１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含む、α−１，２−マンノシダーゼを提供する。
【００１５】
好適な実施態様では、上記α−１，２−マンノシダーゼは、配列表の配列番号２の−４９位から１７５７位までのアミノ酸配列、または該アミノ酸配列のうち１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明はさらに、上記のいずれかのα−１，２−マンノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、および自律複製可能なベクターを含む、複製可能な組換えＤＮＡを提供する。
【００１７】
本発明はまた、α−マンノシル糖化合物の製造方法を提供し、この方法は、
マンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖質に上記のいずれかのα−１，２−マンノシダーゼを作用させる工程、および得られたα−マンノシル糖化合物を回収する工程を含む。
【００１８】
好適な実施態様では、上記α−マンノシル糖化合物はマンノオリゴ糖である。
【００１９】
本発明はさらに、セルロシミクロビウム属由来の細菌を培養する工程、および該培養物からα−１，２−マンノシダーゼを採取する工程を含む、α−１，２−マンノシダーゼの製造方法を提供する。
【００２０】
好適な実施態様では、上記セルロシミクロビウム属由来の細菌はセルロシミクロビウム・セルランスである。
【００２１】
本発明はまた、α−１，２−マンノシダーゼ生産能を有するセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９０）を提供する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２３】
（α−１，２−マンノシダーゼを産生する菌株）
本発明のセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株は、本発明者らによって土壌中より発見された菌種であり、産業総合研究所生命工学工業技術研究所に、平成１５年４月４日にＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９０として寄託されている。
【００２４】
上記セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株は、以下の菌学的諸性質を有する：
細胞の形および大きさ：桿菌
培養２４時間：０．５〜０．６×１．５〜４．０μｍ
培養７２時間：０．７×０．７〜０．８μｍ
グラム染色性：＋
胞子形成：−
運動性：−
コロニー形態：円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、淡黄色〜黄色（培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ；２４時間培養）
培養温度：３７℃：＋、４５℃：−
酸／ガス産生：−／−
Ｏ／Ｆテスト：−／−
生化学的性質：以下の表１に示す。
【００２５】
【表１】
2004313074.tif 000002
【００２６】
（セルロシミクロビウム属由来のα−１，２−マンノシダーゼ）
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、セルロシミクロビウム属に属する微生物から生産されるものであればいずれでもよい。このような微生物としては、セルロシミクロビウム・セルランスが知られている。本発明においては、特に、上記のセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株から産生されるものが好ましい。また、後述のように、これらの組換え酵素も利用できる。産生されたα−１，２−マンノシダーゼは、菌体内に蓄積されてもよく、あるいは菌体内または菌体外に分泌されてもよい。
【００２７】
（セルロシミクロビウム属由来のα−１，２−マンノシダーゼの製造）
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、以下のような、通常用いられる培養手段により製造され得る。
【００２８】
上記のセルロシミクロビウム属に属する微生物を、適切な炭素源、微生物の増殖に必要な窒素化合物、およびミネラルを含む培地中で、２０〜３５℃、好ましくは３０℃前後で好気条件下において、１〜５日、好ましくは１〜３日培養する。主な炭素源としては、マンナンが挙げられる。微生物の増殖に必要な窒素化合物としては、酵母エキス、魚肉エキス、ペプトン、アミノ酸などの有機窒素源、ならびに硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が挙げられる。
【００２９】
産生したα−１，２−マンノシダーゼが菌体内に蓄積または分泌される場合、培養液からを回収し、超音波もしくは自己消化法などにより菌体を破砕して該酵素を抽出する。その後、再度濾過または遠心分離により菌体を除去し、濾液または上清を得る。菌体外に分泌される場合は、培養液から濾過または遠心分離により菌体を除去し、濾液または上清を得る。こうして得られた濾液または上清から、例えば、硫安による塩析、エタノール、アセトンなどによる溶媒沈澱法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂などの当業者が通常用いる酵素精製方法によってα−１，２−マンノシダーゼが精製され得る。
【００３０】
例えば、セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株を、主要な炭素源として酵母マンナンを含み、そして酵母エキスを含む培地中、好気的な条件下で培養し、得られた培養液から菌体を分離除去する。次いで、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（商品名：東ソー株式会社製））およびゲル濾過クロマトグラフィー（例えば、トヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品名：東ソー株式会社製））によって精製し、電気泳動的にほば均一な精製酵素標品を得ることができる。
【００３１】
（α−１，２−マンノシダーゼの活性測定法）
α−１，２−マンノシダーゼ活性は、以下の測定法１または測定法２に従って測定し得る。
【００３２】
［測定法１］
酵母マンナンを基質として、酵素反応により遊離するマンノースを定量することによって測定する。すなわち、２ｗ／ｖ％酵母マンナン水溶液０．１ｍｌ、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌに酵素液０．１ｍｌ加え、蒸留水で全量を１．０ｍｌとした後、４０℃にて１０分から１時間反応させた後、反応液を１００℃で１０分間加熱し、反応を停止させる。反応終了後、マンノースを標準として、還元糖をネルソン・ソモジ法によって定量する。酵素活性の単位は、上記反応において１秒間に１モルのマンノースを遊離する酵素量を１カタール（以下、ｋａｔ）とする。あるいは、上記反応において１分間に１μｍｏｌのマンノースを遊離する酵素量を１単位とする。
【００３３】
［測定法２］
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドを基質として、酵素反応により遊離するｐ−ニトロフェノールを定量することによって測定する。すなわち、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシド水溶液０．１ｍｌに酵素液０．１ｍｌ、０．２ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．１ｍｌを加え、蒸留水で全量を１．０ｍｌとした後、４０℃で１０分から１時間反応を行い、０．５Ｍの炭酸ナトリウム溶液を０．５ｍｌ加えて反応を停止させる。酵素活性単位は、上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量を１単位とする。
【００３４】
（セルロシミクロビウム属由来のα−１，２−マンノシダーゼの理化学的性質）
本発明のセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株由来のα−１，２−マンノシダーゼの理化学的性質は、以下のとおりである：
（１）作用
（ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に分解する；および
（ｂ）マンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する；
（２）基質特異性
α−マンナン、α−１，２−マンノビオース、非還元末端にα−１，２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、およびｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドには作用するが、α−１，２−マンノビオースおよびα−１，６−マンノビオースには実質的に作用しない（実施例２参照）；
（３）最適温度：３５℃〜４５℃
本酵素について、２０〜６０℃の温度で、終濃度６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０分間反応させて相対活性を調べたところ、最適温度は、図１に示すように３５℃〜４５℃であった；
（４）最適ｐＨ：５〜７
本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用いて４０℃、３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、最適ｐＨは、図２に示すように５〜７であった；
（５）安定温度：４０℃以下
本酵素について、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、０〜６０℃の範囲で１０分間処理した後、４０℃、３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、安定温度は、図１に示すように４０℃以下であった。
（６）安定ｐＨ：５〜１２
本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）の広域緩衝液を用いて、４℃、２４時間の処理を行った後、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、４０℃、３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、安定ｐＨは、図２に示すように５〜１２であった。
（７）分子量：約４００，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
【００３５】
（α−１，２−マンノシダーゼのアミノ酸配列）
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、配列表の配列番号２の２位から１７５７位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド、または該アミノ酸配列のうち１もしくは複数のアミノ酸配列が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含む。例えば、配列表の配列番号２の−４９位から１７５７位までのアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。本発明のα−１，２−マンノシダーゼには、上記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約６５％の相同性、好ましくは７０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するα−１，２−マンノシダーゼも含まれる。
【００３６】
（α−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の取得）
本発明のα−１，２−マンノシダーゼをコードする遺伝子は、例えば、セルロシミクロビウム・セルランスを遺伝子供与体として、通常行われている以下の２つの方法により得ることができる。
【００３７】
第１の方法によれば、ある生物種で既にマンノシダーゼ遺伝子がクローニングされている場合、その遺伝子配列をプローブとして利用することにより、目的の生物種から、類似の機能を有し、かつ配列的にも相同性のある遺伝子を単離することができる。
【００３８】
この方法によれば、例えば、以下のようにして遺伝子を単離し得る：まず、公知であるバチルス・エスピー由来のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子配列をジゴキシゲニンなどで標識することによりプローブを作成する。次いで、セルロシミクロビウム・セルランスの染色体ＤＮＡを調製し、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＰｓｔＩなどの制限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動に供し、ナイロンメンブレンにブロッティングする。得られたメンブレンおよび上記のプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティック社製）などを用いることにより陽性シグナルを検出する。セルロシミクロビウム・セルランスがバチルス・エスピーのα−１，２−マンノシダーゼと相同性のある配列を有する場合は、シグナルが検出される。検出された陽性シグナルから、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）などを用いることにより、目的のＤＮＡ断片を分画し、精製することができる。得られたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）などを用いることにより、適当なベクターに連結され、組換え体ＤＮＡが作成される。ベクターは、宿主中で複製可能であればいかなるものでもよく、例えば、プラスミドベクターとしては、ｐＵＣ１８（宝酒造社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＢＲ３２２（宝酒造社製）などが挙げられる。得られた組換え体ＤＮＡは、大腸菌などの宿主に導入され、形質転換体を得ることができる。大腸菌としてはＤＨ５αやＪＭ１０９などが挙げられる。このようにして、得られた形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）などを用いることにより上記のＤＮＡ断片が挿入された組換え体ＤＮＡを調製することができる。挿入されたＤＮＡ断片の配列は、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｕｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および３７１  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などを用いることにより決定できる。
【００３９】
第２の方法によれば、菌株を適切な培地で培養後、その菌株から酵素を精製し、一部のアミノ酸配列を決定し、その配列をもとに合成ＤＮＡを作成し、ＰＣＲを行うことにより、遺伝子を単離できる。
【００４０】
この方法によれば、例えば、以下のようにして遺伝子を単離し得る：まず、セルロシミクロビウム・セルランスを、酵母マンナンを主要な炭素源とし、酵母エキスを添加した培地中で好気的条件下培養する。得られた菌体、菌体処理物、濾液または上清から、例えば、硫安分画法、アセトンによる溶媒沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂などの一般的に用いられる酵素精製法を用いてα−１，２−マンノシダーゼを精製し、電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。精製した酵素は、当業者が通常用いる方法に従い一部アミノ酸配列を決定することができる。次いで、決定されたアミノ酸配列をもとに合成ＤＮＡを作成し、ＰＣＲを行って遺伝子を単離することができる。
【００４１】
（α−１，２−マンノシダーゼ発現ベクターの構築）
上記のいずれかの方法によって得られた遺伝子は、発現ベクターに導入され、α−１，２−マンノシダーゼ発現ベクターが作成される。通常、プロモーターの下流の適切な部位にクローニング部位を有するプラスミドが使用され、このプロモーターによって、本発明のα−１，２−マンノシダーゼが発現される。
【００４２】
発現ベクターの作成に用いられるベクターとしては、自律複製可能なベクターが好ましく、導入する宿主を考慮して適切な発現ベクターを選択すればよい。例えば、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、ｐＭＥＸなどが好適であり、枯草菌を宿主とする場合は、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＵＢ１１０などが好適である。その他のベクターとして、ｐＥＴ、ｐＬｅｘ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０などのプラスミドベクター、λｇｔ１１、λＺＡＰなどのファージベクターが挙げられる。
【００４３】
ベクターは、適切な制限酵素切断部位、例えば、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ切断部位などをクローニングサイトとして有していることが好ましく、マルチクローニングサイトであることがさらに好ましい。このクローニングサイトに適合する制限酵素で切断したＤＮＡ断片を導入することにより、容易に発現ベクターが構築される。
【００４４】
発現ベクターは、α−１，２−マンノシダーゼを分泌し得るように設計してもよい。本発明のα−１，２−マンノシダーゼのリーダーペプチドをコードする配列と本発明のα−１，２−マンノシダーゼをコードする配列とを結合することにより、あるいは宿主のリーダーペプチドをコードする配列と本発明のα−１，２−マンノシダーゼをコードする配列とをイン−フレームで結合させることにより、本発明のα−１，２−マンノシダーゼを分泌させることができる。リーダーペプチド配列と本発明のα−１，２−マンノシダーゼとの結合は、例えば、部位特異的突然変異などの当業者が通常用いる方法で行われ得る。
【００４５】
（組換え細胞によるα−１，２−マンノシダーゼの発現）
得られた発現ベクターは、当業者が通常用いる方法で宿主となる細胞に導入される。宿主としては、大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞、酵母、糸状菌などの真核細胞、動物細胞、植物細胞などが挙げられる。導入方法は、当業者が通常用いる方法、例えば、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、細胞融合などが用いられる。
【００４６】
得られた組換え細胞は、次いで、適切な培地中で培養され、本発明のα−１，２−マンノシダーゼを産生し、マンノシダーゼ活性を発現する。リーダーペプチド配列を用いた場合、α−１，２−マンノシダーゼは細胞外（ペリプラズムを含む）に分泌される。
【００４７】
α−１，２−マンノシダーゼは、細胞内あるいはペリプラズムに存在する場合は、細胞を細胞壁溶解酵素処理、超音波処理、加圧処理などにより溶菌して回収し、一方、細胞外に分泌される場合は、培養液より回収される。回収されたα−１，２−マンノシダーゼはそのまま、あるいは当業者が通常用いる方法により精製して、マンノオリゴ糖の製造に用いられ得る。
【００４８】
α−１，２−マンノシダーゼが細胞内あるいはペリプラズムに存在する場合は、細胞を固定化して、固定化酵素として用いてもよい。
【００４９】
（α−マンノシル糖化合物の製造）
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、（ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に分解する特性、および（ｂ）マンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する特性を有する。また、本発明の酵素は、従来のバチルス属由来のもの（特許文献３参照）とは違い、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに作用する基質特異性を有する。したがって、上記のような本発明の酵素の特性を利用すれば、マンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物を製造することができる。
【００５０】
（Ａ）α−１，２−マンノシダーゼの使用形態
α−１，２−マンノシダーゼとしては、（ｉ）細胞を通常の方法で固定化したもの、（ｉｉ）細胞を機械的、酵素的、もしくは界面活性剤や有機溶剤などで処理したもの、またはそれらを固定化したもの、（ｉｉｉ）細胞を破砕して破砕残渣を除去したもの、またはそれを固定化したもの、（ｉｖ）酵素精製物、またはそれを固定化したもの、（ｖ）培養液または細胞を除去した培養上清、またはそれを濃縮、乾燥、および／あるいは固定化したものなどが挙げられる。細胞としては、上記のα−１，２−マンノシダーゼを産生し得る細胞（組換え細胞を含む）を培養して得られた細胞が用いられる。固定化は、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、イオン交換担体、キトサンビーズなど、当業者が一般に用いる通常の固定化方法で行われる。
【００５１】
（Ｂ）縮合反応によるマンノオリゴ糖の製造
本発明のα−１，２−マンノシダーゼの縮合反応性を利用することにより、マンノースを脱水縮合させてマンノオリゴ糖を製造することができる。例えば、マンノオリゴ糖としては、Ｍａｎ１−２Ｍａｎ、Ｍａｎ１−３Ｍａｎ、Ｍａｎ１−６Ｍａｎなどを製造することができる。あるいは、フラクトースとマンノースイソメラーゼとの反応による反応生成物を本発明のα−１，２−マンノシダーゼと反応させてもよい。
【００５２】
マンノースからマンノオリゴ糖を製造する場合は、マンノースと本発明のα−１，２−マンノシダーゼとを適切なｐＨ条件および適切な温度条件下で反応させればよい。マンノースは、高濃度に水溶液または緩衝液に溶解させたものであればよい。アミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有する改変されたポリペプチドからなるα−１，２−マンノシダーゼを用いる場合は、最適温度、最適ｐＨなどが改変前のα−１，２−マンノシダーゼと異なる可能性もあるので、使用前に確認しておくことが好ましい。一般的には、ｐＨが５．５〜１０、温度が室温〜８０℃、好ましくは６５℃以下、より好ましくは４０℃で反応を行う。
【００５３】
フラクトースからマンノオリゴ糖を製造する場合、まず、フラクトースとマンノースイソメラーゼとを反応させて、反応生成物を単離し、この反応生成物とα−１，２−マンノシダーゼとを反応させてもよい。あるいは、フラクトース、マンノースイソメラーゼ、およびα−１，２−マンノシダーゼを同時に混合して反応させてもよい。この場合、マンノースイソメラーゼは、α−１，２−マンノシダーゼの最適ｐＨおよび最適温度が近いものを選択することが必要となる。これらの方法は、酵素（必要に応じて微生物自体）を固定化して連続的に行うこともできる。
【００５４】
反応終了後、例えば、酵素を除去または加熱により失活させ、濾過、遠心分離などにより不純物を取り除いた後、活性炭、イオン交換クロマトグラフィー、膜濾過、濃縮などの、分離、精製プロセスを経て、マンノオリゴ糖が精製される。
【００５５】
（Ｃ）転移反応によるα−マンノシル糖化合物の製造
本発明のα−１，２−マンノシダーゼの転移反応性を利用することにより、マンノース供与体とマンノース受容体からα−マンノシル糖化合物を製造することができる。
【００５６】
マンノース供与体としては、例えばｐ−ニトロフェニル−α−マンノシド、メチル−α−マンノシド、フェニル−α−マンノシドなどが挙げられる。マンノース受容体としては、マンノース、マンノビオース、ラミナリビオースなどが挙げられる。
【００５７】
上記の反応は、通常行われる反応条件下で、受容体と供与体とを含有する基質溶液に、本発明の酵素を作用させることにより行われ得る。基質溶液としては、受容体と供与体とを含有する水溶液またはジメチルスルホキシドなどの有機溶剤液が用いられる。その場合、受容体と供与体のモル比は１：５０〜５０：１が好ましく、基質濃度は５〜５０重量％が好ましい。反応時のｐＨおよび温度は、通常、ｐＨ４〜８、温度２０〜７０℃が適切である。
【００５８】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。特別に標記がない場合、百分率はｗ／ｖ％である。
【００５９】
（実施例１）セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株由来のα−１，２−マンノシダーゼの精製
酵母マンナン０．２％、硫酸第２鉄（７水和）０．００３％、硫酸マグネシウム（７水和）０．０４％、塩化カルシウム（２水和）０．００６％、リン酸水素２カリウム０．６９％、リン酸２水素カリウム０．２３％、硫酸アンモニウム０．０５％、および酵母エキス０．１５％を含む液体培地８００ｍｌ（ｐＨ７．０）を、３Ｌの坂口フラスコに入れ、１昼夜培養したセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株を加え、３０℃で２晩培養した。次いで、この培養液を９，０００×ｇで３０分間遠心して菌体を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析を行い、粗酵素液を得た。粗酵素液の活性測定を行ったところ、１９ｍｋａｔ／Ｌであった。
【００６０】
透析後の粗酵素液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。
【００６１】
溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析した後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させた。０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。
【００６２】
溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析した後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させた。０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１５〜０．４５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。
【００６３】
溶出させた活性画分を集めて、限外濾過（分画分子量１０，０００）で濃縮した後、１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたトヨパールＨＷ−５５Ｆカラムに供し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により酵素を溶出させて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、均一なバンドからなる精製酵素を得た。活性収率は１５％であった。
【００６４】
（実施例２）精製酵素の基質特異性
各マンノビオース（α−１，２−マンノビオース、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノビオース）０．０５％含む３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、実施例１で得たα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃にて９０分間インキュベートした後、以下の条件でマンノビオースの分解を分析した：
ＨＰＬＣ：ウォーターズ社製
検出器：示差屈折計（日立Ｄ−２５００  クロマトインテグレーター）
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ２０００ＰＷ（東ソー株式会社製）
流速：０．５ｍｌ／分
溶出：水
【００６５】
分析結果を、図３〜５に示す。図３はα−１，２−マンノビオース、図４はα−１，３−マンノビオース、および図５はα−１，６−マンノビオースの結果である。図３からわかるように、α−１，２−マンノビオースが分解され、マンノースの位置にピークがシフトしていた。これに対して、図４（α−１，３−マンノビオース）および図５（α−１，６−マンノビオース）では、ピークに変化はなかった。これらの結果から、本発明のα−１，２−マンノシダーゼにより、α−１，２−マンノビオースのみが分解されたことがわかる。
【００６６】
（実施例３）縮合反応の確認
６０％（ｗ／ｗ）のマンノース溶液に、マンノース１ｇ当たり２０ｎｋａｔとなるように実施例１で得たα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃にて７２時間反応させた。反応後の液を、実施例２と同様にＨＰＬＣで分析した。その結果、全糖中に占めるマンノオリゴ糖の割合は６．５％であった。この結果から、本発明のα−１，２−マンノシダーゼには、マンノースを脱水縮合させて、マンノオリゴ糖を生成する活性があることがわかる。
【００６７】
（比較例１）縮合反応
本発明のα−１，２−マンノシダーゼに代えて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ｍ−９０株由来のα−１．２−マンノシダーゼ（特許文献３参照）を使用したこと以外は、実施例３と同様にして、マンノースの縮合反応を行った。その結果、全糖中に占めるマンノオリゴ糖の割合は２．２％であった。上記実施例３と比較例１の分析結果の比較から、マンノースを脱水縮合する活性は、本発明の酵素の方が公知の酵素より高いことがわかる。
【００６８】
（実施例４）転移反応の確認
マンノース供与体としてｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド３０％、およびマンノース受容体としてラミナリビオース３０％を含有する基質溶液（ｐＨ６）に、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド１ｇ当たり２０ｎｋａｔとなるように実施例１で得たα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃にて７２時間反応させた。反応後の液をＨＰＬＣで分析した。その結果、全糖中に占める転移生成物の割合は０．９％であった。この結果から、本発明のα−１，２−マンノシダーゼには、非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を転移させて、α−マンノシル糖化合物を生成する活性があることがわかる。
【００６９】
（実施例５）セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の内部配列の取得
セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を取得するために、プローブとしてバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子配列を用いて、サザンハイブリダイゼーションおよびコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【００７０】
プローブの調製は以下のようにして行った。ＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）にバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）Ｍ−９０株を一白金耳植菌し、３７℃で１８時間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。得られた菌体からＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製し、それを鋳型として、配列表の配列番号３および４に記載の合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行い、バチルス・エスピーのα−１，２−マンノシダーゼの全遺伝子配列を増幅した。増幅した約６．０ｋｂからなるＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）およびＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて分画・精製し、ＤＩＧ−Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＤＩＧ標識を行うことによりプローブを調製した。
【００７１】
次いで、ＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）にセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株を一白金耳植菌し、３０℃で１８時間振とう培養した後、遠心分離により集菌した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡのうち約５μｇを制限酵素ＰｓｔＩで完全消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム社製）にブロッティングし、１２０℃にて３０分間ベークすることによりＤＮＡを固定した。ＤＮＡを固定化したメンブレン、上記で調製したプローブ、およびハイブリダイゼーション液としてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてハイブリダイゼーションを行った。ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によりシグナルの検出を行ったところ、約１．６ｋｂ付近に陽性シグナルを検出した。
【００７２】
次いで、セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡ約５μｇをＰｓｔＩで完全消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、シグナルが検出された約１．６ｋｂ付近からＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりＤＮＡ断片を分画・精製した。次いで、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、これに上記の精製したＰｓｔＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、組換えプラスミドを得た。これを、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）に導入し、氷冷下で３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣ培地（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  グルコース、ｐＨ７．５）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、組換えプラスミドを大腸菌に導入した。得られた大腸菌形質転換体をアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有するＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で１８時間培養した。生育したコロニーをナイロンメンブレン（ロシュ・ダイアグノスティック社製）にブロッティングし、８０℃にて３０分間ベーキングを行うことによりＤＮＡを固定化した。次いで、ＤＮＡを固定化したメンブレン、プローブとしてＤＩＧ標識したバチルス・エスピーのα−１，２−マンノシダーゼの全遺伝子配列を含むＤＮＡ断片、およびハイブリダイゼーション液としてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によりシグナルの検出を行った。その結果、約２００個のコロニーのうち、１つのコロニーに陽性シグナルが認められた。
【００７３】
（実施例６）セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の内部配列の決定
実施例５で得られた陽性コロニーに含まれる組換えプラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。次いで、このプラスミドの挿入断片の塩基配列を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｕｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および３７１  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。決定した塩基配列を解析したところ、挿入断片には、バチルス・エスピー由来のα−１，２−マンノシダーゼと相同性が高いアミノ酸配列が存在することがわかった（図６を参照のこと）。
【００７４】
（実施例７）セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼのＮ末端配列の決定
セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列の解析を目的とし、培養液からα−１，２−マンノシダーゼの精製を行った。酵母細胞壁由来マンナンを炭素源とした培地を用い、３０℃で２４時間通気攪拌培養により得た培養液から、遠心分離により上清を回収し、粗酵素液とした。以下の操作は全て１０℃以下の低温室にて行った。精製は、測定法２に従って測定したマンノシダーゼ活性を指標として行った。
【００７５】
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化した陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍを充填したカラムに粗酵素液を通液し、同緩衝液で洗浄した後、ＮａＣｌ濃度勾配（０〜０．５Ｍ）により溶出した。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析を行い、再度ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍカラムに通液した。０．１５ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、ＮａＣｌ濃度勾配（０．１５〜０．４５Ｍ）により溶出した。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析を行った後、０．２ＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇに供し、同緩衝液により溶出した。活性画分を集めて精製酵素とした。
【００７６】
精製酵素を、１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、クマシーブルーにより染色したところ、分子量２０万付近にバンドが検出された。これをＰＶＤＦ膜に転写し、プロテインシークエンサーを用いてＮ末端アミノ酸配列の解析を行った。その結果、配列番号１３に記載のアミノ酸配列であることがわかった。
【００７７】
（実施例８）セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の５’末端配列の取得
実施例７で得られたＮ末端アミノ酸配列をもとに設計した配列番号５に記載の合成ＤＮＡ、および実施例６で得られたバチルス・エスピー由来のα−１，２−マンノシダーゼと相同性が高い部分のアミノ酸配列から設計した配列番号６に記載の合成ＤＮＡを用いて、実施例１で調製したセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）によりプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）にクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン社製）に導入した。得られた大腸菌形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を決定した。決定した塩基配列解析したところ、挿入断片には、実施例７で決定したＮ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列がすべて含まれており、また実施例６で得られた塩基配列と同一の配列も存在することが明らかになった。
【００７８】
さらに、Ｎ末端側のアミノ酸配列をコードする塩基配列を正確に決定するために、上記で得られた挿入断片をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションおよびコロニーハイブリダイゼーションを行った。実施例５で調製したセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡをＳｍａＩで完全消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム社製）にブロッティングし、１２０℃にて３０分間ベークすることによりＤＮＡを固定した。ＤＮＡを固定化したメンブレン、上記の挿入断片をＤＩＧ標識したプローブ、およびハイブリダイゼーション液としてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いてハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によりシグナルの検出を行った。その結果、約２ｋｂ付近に陽性シグナルを検出した。
【００７９】
次いで、セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡ５μｇをＳｍａＩで完全消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。シグナルが検出された約２ｋｂ付近から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡ断片を分画・精製した。次いで、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）をＳｍａＩにより切断し、ＢＡＰ（宝酒造社製）によりアルカリホスファターゼで処理した後、上記のＳｍａＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結することにより、組換えプラスミドを得た。これを、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）に導入し、生育したコロニーをナイロンメンブレン（ロシュ・ダイアグノスティック社製）にブロッティングし、８０℃にて３０分間ベーキングを行うことによりＤＮＡを固定化した。ＤＮＡを固定化したメンブレン、サザンハイブリダイゼーションで用いたプローブ、およびハイブリダイゼーション液としてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、コロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、約２５０個のコロニーのうち、１つのコロニーに陽性シグナルが認められた。得られた陽性コロニーから、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｕｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および３７１  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。決定した塩基配列を解析したところ、開始コドン上流部には原核生物のプロモーター領域に特徴的な配列であるリボソーム結合領域、−３５領域、および−１０領域が存在することがわかった（図６を参照のこと）。
【００８０】
（実施例９）セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の３’末端配列の取得
セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子の３’末端側配列を取得するために、実施例５で得られたＰｓｔＩ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｔＩで切断し、得られた約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をプローブとして用いて、サザンハイブリダイゼーションおよびコロニーハイブリダイゼーションを行った。実施例１で調製したセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで完全消化後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン（アマシャム社製）にブロッティングし、１２０℃にて３０分間ベークすることによりＤＮＡを固定した。ＤＮＡを固定化したメンブレンと、実施例５で得られたＰｓｔＩ断片をＢｇｌＩＩ処理して得られた約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をＤＩＧ標識したプローブと、ハイブリダイゼーション液としてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）とを用いてハイブリダイゼーションを行い、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）によりシグナルの検出を行った。その結果、約５．０ｋｂ付近に陽性シグナルを検出した。
【００８１】
次いで、セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡ５μｇをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで完全消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、シグナルが検出された約５．０ｋｂ付近から、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡ断片を分画・精製した。次いで、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）をＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、ＢＡＰ（宝酒造社製）によりアルカリホスファターゼで処理した後、上記のＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結することにより組換えプラスミドを得た。これを、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）に導入し、生育したコロニーをナイロンメンブレン（ロシュ・ダイアグノスティック社製）にブロッティングし、８０℃にて３０分間ベーキングを行うことによりＤＮＡを固定化した。ＤＮＡを固定化したメンブレンと、サザンハイブリダイゼーションで用いたプローブと、ハイブリダイゼーション液としてＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）とを用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、約１５０個のコロニーのうち、１つのコロニーに陽性シグナルが認められた。得られた陽性コロニーから、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｕｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および３７１  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。決定した塩基配列を解析したところ、挿入断片にはバチルス・エスピー由来のα−１，２−マンノシダーゼと相同性が高いアミノ酸配列をコードする塩基配列が存在し、３’末端配列側には終止コドンをコードするＴＧＡ配列があることがわかった（図６を参照のこと）。
【００８２】
以上の結果から、本発明のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子は、配列表の配列番号１に記載の５４２１塩基からなるコーディング領域を有し、リーダーペプチドとして４９アミノ酸残基をコードし、１７５７残基のアミノ酸をコードしていることが明らかになった。また、公知のバチルス・エスピーのα−１，２−マンノシダーゼとは、ＤＮＡ配列では５５％、アミノ酸配列では４６％の相同性を示した。
【００８３】
（実施例１０）宿主として大腸菌を用いたα−１，２−マンノシダーゼの発現実施例５で調製したセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡを鋳型にし、ＥｃｏＲＩ配列を付加した配列番号７に記載の合成ＤＮＡと、ＨｉｎｄＩＩＩ配列を付加した配列番号８に記載の合成ＤＮＡとを用いて、ＰＣＲにより本発明のα−１，２−マンノシダーゼの全遺伝子配列を増幅した。得られた増幅断片をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した大腸菌発現ベクターｐＭＥＸ８（フナコシ社製）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結し、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）へ導入した。得られた大腸菌形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断後、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＭＥＸ８に約５．４ｋｂのα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子がクローニングされていることを確認した。
【００８４】
構築した組換えプラスミドを含む形質転換体を、ＬＢ培地に一植菌耳植菌し３７℃で一晩培養した。得られた培養液を新たなＬＢ培地に５％植菌し２５℃で２４時間振とう培養後、遠心分離により集菌し、菌体を得た。得られた菌体を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、高圧連続式ホモジナイザー（ＡＶＥＳＴＩＮ社製）により菌体破砕した後、遠心分離により上清を得た。得られた上清をウルトラフリー１５（ミリポア社製）を用いて濃縮することにより粗酵素液を得た。得られた粗酵素液のマンノシダーゼ活性を、測定法２に従って測定した。その結果、７．０６単位／Ｌ・培養液であった。
【００８５】
（比較例２）
ｐＭＥＸ８のみが導入された大腸菌形質転換体について、実施例９と同様な操作により粗酵素液を調製し活性を測定した。その結果、０．０１単位／Ｌ・培養液以下であった。
【００８６】
（比較例３）
セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株を実施例７と同様な操作により培養し、粗酵素液を調製し活性を測定した。その結果、０．９９単位／Ｌ・培養液であった。
【００８７】
実施例５、比較例２、および比較例３の結果から、本発明のα−１，２−マンノシダーゼはマンノシダーゼ活性を有し、該酵素の生産性は野生株より高いことがわかった。
【００８８】
（実施例１１）形質転換体が生産するα−１，２−マンノシダーゼを用いたマンノオリゴ糖の製造
６０％（ｗ／ｗ）のマンノース糖液に、実施例１０で調製した粗酵素液を、１ｇのマンノース当たり８．５単位（測定法１による）になるように加え、４０℃で７２時間反応させた。反応後の液をＨＰＬＣで分析したところ、全糖中に占めるマンノオリゴ糖の割合は１４．５％であった。
【００８９】
（比較例４）
実施例１０と同様な操作によりＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  Ｍ−９０株由来のα−１，２−マンノシダーゼを含む粗酵素液を調製し、実施例１０と同様にして、マンノースの縮合反応を行った。分析結果によると、全糖中に占めるマンノオリゴ糖の割合は３．４％であった。
【００９０】
実施例１１および比較例４の分析結果の比較から、マンノオリゴ糖の収率は本発明による酵素のほうが公知の酵素より高いことがわかる。
【００９１】
（実施例１２）α−１，２−マンノシダーゼのアミノ酸置換変異体の作成
アミノ酸置換は配列番号２の第１８番目のプロリンをロイシンに置換することにより行った。図７に基づき、配列番号９に記載の合成ＤＮＡと、プロリンをコードするＣＣＣをロイシンをコードするＣＴＣに置換した配列番号１０に記載の合成ＤＮＡとを用い、セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＰＣＲ産物１を得た。同様に、プロリンをコードするＣＣＣをロイシンをコードするＣＴＣに置換した配列番号１１に記載の合成ＤＮＡと配列番号１２に記載の合成ＤＮＡとを用い、ＰＣＲ産物２を得た。得られたＰＣＲ産物１および２を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、目的のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて分画、精製した。得られたＰＣＲ産物１および２を混合し、ＰＣＲ反応を行うことによりＰＣＲ産物３を取得し、次いで配列番号９および配列番号１２に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲ反応により、ＰＣＲ産物４を得た。得られたＰＣＲ産物４をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、目的のＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて分画・精製した。同様に実施例１０で構築したα−１，２−マンノシダーゼ発現プラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、大腸菌発現ベクターｐＭＥＸ８を含むＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて分画・精製した。取得したＤＮＡ断片と上記のＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ処理したＰＣＲ産物４とを、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて連結することにより、組換えプラスミドを得た。これをコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（宝酒造社製）に導入し、得られた大腸菌形質転換体から、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）および３７１  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子配列を決定した。得られた塩基配列を解析し、プロリンをコードするＣＣＣがロイシンをコードするＣＴＣに置換される部位特異的変異が導入されていることを確認した。
【００９２】
得られたアミノ酸置換変異体を含む大腸菌形質転換体から実施例１０と同様な操作により粗酵素液を調製し、活性を測定した。その結果、変異型α−１，２−マンノシダーゼは、野生型α−１，２−マンノシダーゼとほぼ同等の活性を有することがわかった。
【００９３】
【発明の効果】
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、α−１，２−マンノシド結合の分解反応性やマンノースまたは非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させて、マンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物を生成する性質を有し、従来知られているバチルス属のα−１，２−マンノシダーゼに比べて、オリゴ糖生成率が数倍高いので、マンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物の製造に非常に有用である。また、本発明のα−１，２−マンノシダーゼの作用条件とマンノースイソメラーゼの作用条件とがほぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼを併用することにより、フルクトースからα−マンノシル糖化合物を製造することもできる。さらに、本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、発色物質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対して作用するので、活性測定などが容易である。
【００９４】
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、セルロシミクロビウム・セルランスに属する細菌を液体培養することによって培地中で生産し得る。そのため、タチナタマメなどから抽出したり、アスペルギルス属の糸状菌を培養して製造される公知の酵素に比べて培養・精製が容易であり、大量生産に適している。
【００９５】
あるいは、本発明によれば、セルロシミクロビウム属細菌、特にセルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株由来のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子が提供され、この塩基配列に基づき遺伝子工学的手法により作成された組換え微生物を培養することによって、α−１，２−マンノシダーゼを容易に生産できる。すなわち、α−１，２−マンノシダーゼの生産性が飛躍的に上昇し、不純物の少ない組換えα−１，２−マンノシダーゼを、工業的規模で大量かつ効率良く製造できる。また、このような組換えα−１，２−マンノシダーゼを用いると、有用なα−マンノシド結合を有するマンノオリゴ糖を、飛躍的に効率良く製造できる点で、非常に有用である。
【００９６】
このように、本発明のα−１，２−マンノシダーゼを利用することにより、マンノース（フルクトース）またはα−１，２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノオリゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率よく製造することができるので、糖タンパクや糖脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研究やその薬理研究などに供することができる点で、非常に価値がある。
【００９７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のα−１，２−マンノシダーゼの最適温度と安定温度を示すグラフである。
【図２】本発明のα−１，２−マンノシダーゼの最適ｐＨと安定ｐＨを示すグラフである。
【図３】本発明のα−１，２−マンノシダーゼによるα−１，２−マンノビオースの経時的な分解を示す、高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。
【図４】本発明のα−１，２−マンノシダーゼによるα−１，３−マンノビオースの経時的な分解を示す、高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。
【図５】本発明のα−１，２−マンノシダーゼによるα−１，６−マンノビオースの経時的な分解を示す、高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。
【図６】セルロシミクロビウム・セルランス  Ｈ−１６株由来のα−１，２−マンノシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図である。
【図７】α−１，２−マンノシダーゼのアミノ酸置換変異体の構築方法を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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