(57)【要約】【課題】生物学的マイクロアレイの作製をより容易に、且つ、より安価にし、さらに、マイクロアレイレシーバに使用するビーズ（マイクロスフィア）をコード化するために使用する色スペクトルを同定する処理を単純化する。【解決手段】生物学的プローブによって修飾される第１のマイクロスフィアのセットと、上記マイクロスフィアに関連付けられる少なくとも１つの色素から生成される光学バーコードとを含む構成物により生物学的活性領域がコーティングされる基盤を含むマイクロアレイレシーバと、基盤に関連付けられる較正領域とを含み、較正領域は、生物学的活性領域の外側にあり、光学バーコードの色を含むエリアを有する。【選択図】　　図１
2004012460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的プローブによって修飾される第１のマイクロスフィアのセットと、上記マイクロスフィアに関連付けられる少なくとも１つの色素から生成される光学バーコードとを含む構成物により生物学的活性領域がコーティングされる基盤を含むマイクロアレイレシーバと、
上記基盤に関連付けられる較正領域とを含み、
上記較正領域は、上記生物学的活性領域の外側にあり、上記光学バーコードの色を含むエリアを有する、マイクロアレイレシーバを較正する装置。
【請求項２】
上記基盤をコーティングする上記構成物は、（ａ）夫々、一意の生物学的プローブによって修飾される、複数のマイクロスフィアのセットと、（ｂ）上記マイクロスフィアに関連付けられる少なくとも１つの色素から生成される一意の光学バーコードとを含み、
上記較正領域は、複数の別個のエリアを含み、
各エリアは、上記複数の一意の光学バーコードの色のうちの１つを含む、請求項１記載の装置。
【請求項３】
上記複数のマイクロスフィアのセットは、上記生物学的活性領域の全体にランダムに分布される、請求項２記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に、色ビーズを用いて作製される分子生物学システムに係り、より具体的には、マイクロアレイリーダが、ランダムビーズをコード化するのに使用した色を決定することができるようにする手段に係る。
【０００２】
【従来の技術】
１９９０年代初期に発明されて以来（非特許文献１）、２次元の固体支持体上における、生理活性プローブの空間的にアドレス指定可能な合成により形成される高密度アレイは、生物学研究及び開発の処理を、大きく向上し、且つ、単純化させた。現在のマイクロアレイ技術の鍵は、「空間的にアドレス指定可能な」方法で、生理活性剤を、マイクロチップ上の単一のスポットに配置することにある。
【０００３】
現行の技術は、マイクロアレイを作製するのに様々なアプローチを用いている。例えば、特許文献１（１９９５年５月２日発行、ＭｃＧａｌｌ外）、及び、特許文献２（１９９６年２月６日発行、Ｆｏｄｏｒ外）は、ペプチド及びＤＮＡマイクロアレイを形成するために、光リソグラフィー法を用いることを示す。この特許は、感光性保護基を使用して、光リソグラフィーによって１ｃｍ×１ｃｍのチップ上に画成されたスポットを脱保護し、次に、活性アミノ酸又はＤＮＡ塩基を、表面全体に流す連続サイクルを介して、ペプチド及びＤＮＡマイクロアレイを調製することを教示する。この処理を繰り返すことによって、アレイ上の異なるスポットに、何千もの任意に異なるペプチド又はオリゴヌクレオチド配列を有するペプチド又はＤＮＡマイクロアレイが作成される。しかし、この方法は高価である。例えば、特許文献３（２０００年６月２７日発行、Ｐａｐｅｎ外）、特許文献４（２０００年７月４日発行、Ｐａｐｅｎ外）、及び、特許文献５（２０００年８月１日発行、Ｐａｐｅｎ外）では、インクジェット法を用いて、空間的にアドレス指定可能なアレイを作製することが示されるが、この技法も、４０乃至１００マイクロメートル（μｍ）の比較的大きいスポットサイズに加えて、高い製造費がかかる欠点を有する。一般的に、単一のチップに置かれるべき生理活性プローブの数は、１，０００から１００，０００プローブの間であるので、空間アドレス指定法は、チップがどのように作製されるかに関係なく、本質的に高価となる。空間アドレス指定可能な方法に対する代替のアプローチは、蛍光色素が組込まれた高分子ビーズを使用して、生物学的に多重化されたアレイを形成するというコンセプトである。特許文献６（１９９９年１１月９日発行、Ｃｈａｎｄｌｅｒ外）は、フローサイトメトリと共に、色コード化されたビーズを利用して、多重化された生物学的定量法を行う方法を開示する。ＤＮＡ又は単クローン抗体プローブと、その表面において、接合されたマイクロスフィアは、２つの別個の蛍光色素の様々な比率で、内部で着色される。数百の「スペクトル的にアドレス指定された」マイクロスフィアは、生体サンプルと反応することが可能にされ、「液体アレイ」は、サンプル情報をデコード化するために、単一のマイクロスフィアをフローサイトメトリ細胞に通すことによって、解析される。特許文献７（２０００年２月８日発行、Ｗａｌｔ外）は、色素が付けられたマイクロスフィアをアセンブルするために、遠位端に予めエッチングされたマイクロウェルを有する光ファイババンドルを使用することを開示する。各スペクトル的にアドレス指定されたマイクロスフィアの表面には、一意の生理活性剤が取り付けられ、異なる生理活性剤を有する数千のマイクロスフィアは組合わされて、光ファイババンドルの予めエッチングされたマイクロウェル上に「ビーズアレイ」を形成する。より最近では、新規の光コード化されるマイクロスフィアのアプローチが実現された。このアプローチは、マイクロスフィアに組込まれる、様々な寸法を有する硫化亜鉛キャップ化されたセレン化カドミウムのナノ結晶を用いることによって実現された（非特許文献２）。ナノ結晶により示される狭い帯域幅が与��られるに、このアプローチは、マイクロスフィアにおけるスペクトル的なバーコードの容量をかなり拡張する。
【０００４】
「スペクトル的にアドレス指定されるマイクロスフィア」のアプローチは、確かに、マイクロアレイ作製における従来の「空間的にアドレス指定可能な」アプローチに対して、単純さに関して、利点を提供するが、この技術分野では依然として、生物学的マイクロアレイの作製をより容易に、且つ、より安価にし、さらに、マイクロアレイレシーバに使用するビーズ（マイクロスフィア）をコード化するために使用する色スペクトルを同定する処理を単純化する必要性がある。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許第５，４１２，０８７号
【特許文献２】
米国特許第５，４８９，６７８号
【特許文献３】
米国特許第６，０７９，２８３号
【特許文献４】
米国特許第６，０８３，７６２号
【特許文献５】
米国特許第６，０９４，９６６号
【特許文献６】
米国特許第５，９８１，１８０号
【特許文献７】
米国特許第６，０２３，５４０号
【非特許文献１】
ステファン　Ｐ．Ａ．フォードア（Ｓｔｅｐｈａｎ　Ｐ．　Ａ．　Ｆｏｒｄｏｒ）、Ｊ．レイトン・リード（Ｊ．　Ｌａｉｇｈｔｏｎ　Ｒｅａｄ）、マイケル　Ｃ．ピラング（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ．　Ｐｉｒｒｕｎｇ）、ルベルト・ストレア（Ｌｕｂｅｒｔ　Ｓｔｒｙｅｒ）、エイミー・ツサイ・ルー（ＡｍｙＴｓａｉ　Ｌｕ）、デニス・ソラス（Ｄｅｎｎｉｓ　Ｓｏｌａｓ）、「Ｌｉｇｈｔ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ，　Ｓｐａｔｉａｌｌｙ　Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ　Ｐａｒａｌｌｅｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ−ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９１年２月１５日、ｐ．７６７−７７３
【非特許文献２】
ミンヨン・ハン（Ｍｉｎｇｙｏｎｇ　Ｈａｎ）、シャオフ・ガオ（Ｘｉａｏｈｕ　Ｇａｏ）、ジャック・Ｚ・スー（Ｊａｃｋ　Ｚ．　Ｓｕ）、シュミン・ニエ（Ｓｈｕｍｉｎｇ　Ｎｉｅ）、「Ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ−ｔａｇｇｅｄ　ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｃｏｄｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、ネイチャ・バイオテクノロジ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２０００年７月、第１９巻、ｐ．６３１−６３５
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上述した問題に対する解決策を提供し、上述した必要性を満たすことを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の１つの特徴では、マイクロアレイレシーバを較正する装置を提供する。本発明の装置は、生物学的プローブによって修飾される第１のマイクロスフィアのセットと、マイクロスフィアに関連付けられる少なくとも１つの色素から生成される光学バーコードとを含む構成物により生物学的活性領域がコーティングされる基盤を含むマイクロアレイレシーバと、基盤に関連付けられる較正領域とを含み、較正領域は、生物学的活性領域の外側にあり、光学バーコードの色を含むエリアを有する。
【０００７】
本発明は、以下の利点を有する。
１．マイクロアレイリーダが、ランダムアレイ構造に使用するマイクロスフィア（ビーズ）をコード化するのに使用した色スペクトルを同定することを可能にするロバストな手段が与えられる点。
２．マイクロアレイリーダが較正領域の場所を探し出すことを容易にするよう、識別マークをその隣りに有する較正色領域が、マイクロアレイレシーバに与えられる点。
【０００８】
【発明の実施の形態】
一般的に、本発明は、生物学的に機能的な部位のランダムの、又は、所定のアレイを有するマイクロアレイレシーバを含む生物学解析システムに関する。ランダム、又は、所定のアレイは、レシーバ上に反復パターンを形成することができる。マイクロアレイレシーバの一例は、Ｃｈａｒｉ外による米国特許出願番号０９／９４２，２４１に説明される。この特許出願の内容は、本願に参考として組込む。以下にマイクロアレイレシーバの一般的な説明を記すが、より完全な説明は、上述の特許出願を参照されたい。
【０００９】
マイクロアレイレシーバは、ゲル化剤、又は、ゲル化剤の先駆物質を含む流体において分散されたマイクロスフィア（ビーズ）を含む構成物でコーティングされる基盤を含み、マイクロスフィアは、基盤上において、ランダムの又は規則正しい場所に固定される。基盤には、マイクロスフィアと物理的又は化学的に相互作用するよう設計される受容体がない。マイクロスフィアの集団の１つ以上の下位集団は、マイクロスフィアに関連付けられる少なくとも１つの色素から生成される一意の光学バーコードと、マイクロスフィアが接触する検体と反応する一意の生物学的機能性又はプローブを含む。
【００１０】
基盤上におけるマイクロスフィアの分布又はパターンは、全くランドム（基準又は偏りを示さない空間分布）であっても、マイクロスフィアが、基盤上に予めマークが付けられた、又は、予め決められた部位に引き付けられるか又は保持されてもよい。アレイにおける各マイクロスフィアは、別個の色アドレス（一意のＲＧＢ値、例えば、Ｒ＝０、Ｇ＝２０４、及び、Ｂ＝１５３）を有する数千の識別可能なマイクロスフィアを作成するために、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、及び、青（Ｂ）の三原色を表す３つの色素を混合することから得られる色に基づいた別個のサインを有する。マイクロスフィアは、その表面に活性部位が形成され、その活性部位に、特定の生理活性プローブが取り付けられる。従って、各色アドレスは、特定の生理活性プローブに対応することができる。
【００１１】
マイクロスフィアのマイクロアレイ、又は、集団は、数個の、又は、数百以上のマイクロスフィアの下位集団を含むことが可能である。各下位集団は、同一の色コードと、同一の生理活性プローブを含む。マイクロスフィアの各マイクロアレイは、基盤のサブエリアを占有し、基盤のエリア全体にパターンが繰り返される。マイクロアレイのサブエリアの寸法エリアは、１つのマイクロタイターウェルに匹敵するか、又は、多数のウェルが１つのマイクロアレイサブエリアをオーバレイし得る。
【００１２】
マイクロスフィアは、Ｃｈａｒｉ外による米国特許出願番号０９／９４２，２４１に開示されるように、基盤上にコーティングされることが好適である。
【００１３】
未知の生物学的ターゲットサンプルを解析するために、生理活性プローブを有するマイクロアレイを使用するには、解析されるサンプルは、蛍光色素、又は、化学発光法による活性分子を用いて、非選択的にラベル付けされなければならない。
【００１４】
生物学的ターゲットサンプルは、マイクロアレイ生理活性プローブと接触するようにされる。未知の生理学的ターゲットサンプルが、コーティングされたマイクロスフィアの表面上の生理活性プローブとハイブリダイズする結果得られる蛍光／化学発光信号が、電子カメラ／画像プロセッサシステムによって、検出され、且つ、解析される。
【００１５】
本発明は、ロバストな手段を提供するが、この手段は、マイクロアレイリーダが、ランダムアレイ構造に使用されるビーズ（マイクロスフィア）をコード化するのに使用した色スペクトルを同定することを可能にする。マイクロアレイリーダは、先験的に、アレイを生成するために使用したビーズの色スペクトルを知っているので、検査下のビーズの色スペクトルを、より高い精度で、識別することが可能となる。１つの実施例は、それぞれ特定のビーズの色を有する一連のエリアを有する領域を含むターゲットを含み得る。これらのエリアは、診断領域から離れて、線形アレイ状にマイクロアレイレシーバ上に印刷されることが好適である。想定されるように、マイクロアレイリーダは、ダーテム、又は、基準マークを同定することによって、較正ターゲットの位置を突き止め、そのターゲット内の各領域の色スペクトルを決定する。このコンセプトは、検査下の特定のビーズを、高い精度で、決定する手段を提供する。色付きのビーズのランダムアレイでは、２つ以上のビーズが重なり合う（塊になる）可能性は有限であることから、ロバスト性質、又は、高い精度が実現する。この場合、検出器が、全てのビーズからの信号をまとめ、独立しているビーズの色のサインとは異なる色のサインを生成する。ソフトウェアは、較正エリアを用いて、各一意の色と、各一意の色の組合せから色のサインを決定し、一意の色を逆重畳し、それにより、ビーズを同定することが可能となる。そうでない場合、この場合では、塊になったビーズは、同定されて無視されなければならない。これは、アレイの多様性を減少する。
【００１６】
較正エリアは、ビーズをコード化するのに使用した各色と、これらの一意の色の小さなエリアを含むことを理解するものとする。各較正エリアは、５００ｕｍ×５００ｕｍであることが好適であり、より詳しくは、２ｍｍ×２ｍｍであることが好適である。これらのエリアは、インクジェットデポジションを含む様々なプリント手段によって作成され得る。
【００１７】
図１を参照するに、本発明の１つの実施例を示す。図示するように、マイクロアレイレシーバ１０は、ランダムに、又は、規則正しく分布される、生物学的プローブが取り付けられた色付きビーズ１４を含む生理活性エリア１２を含む。本発明では、マイクロアレイレシーバ１０は更に、生理活性エリア１２の外側に較正領域１６を含む。較正領域１６は、複数の別個の色エリア１８を含み、各色エリア１８は、色付きビーズに使用された色に対応する１つの色を含む。従って、生理活性エリア１２は、１５の異なる生物学的プローブを表す１５の異なる色のビーズを含み、較正領域１６は、１５のビーズの色にマッチする１５の色を有する１５のエリア１８を有する。
【００１８】
図２に示すように、較正領域１６には、識別子（標識）２０が領域１６の隣りに設けられ、それにより、マイクロアレイレシーバリーダが、較正領域１６の位置を突き止めることを容易にする。
【００１９】
較正領域１６は、生理活性領域以外のレシーバ１０の前部又は背部のどこに置いてもよい。
【００２０】
図３は、本発明を使用するシステムを示すブロック図である。ブロック３０は、レシーバ上の生物学的プローブをハイブリダイズすることが可能な１つ以上の未知の生物学的ターゲットを含むサンプル検体と接触した後のマイクロアレイレシーバを表す。ハイブリダイズされたプローブは、発光又は燐光のために、リーダ３２によって処理されることが可能である。リーダ３２は更に、レシーバ１２の較正領域１６における色エリア１８も読出しする。プロセッサ３４は、較正領域１６からの既知の色を、ハイブリダイズされた色付きビーズ１４から読出しされる色とをマッチさせて、検体における未知の生物学的ターゲットを同定することができる。
【００２１】
図４は、本発明に使用することのできる、マイクロアレイレシーバを示す。図示するように、マイクロアレイレシーバ１０は、４行×６列のマトリクス状の、２４の領域６０からなるパターンを含む。各領域６０は、ランダムに分布された生物学的プローブの部位からなる同一のマイクロアレイを含む。マイクロアレイの一部を、分解図として示す。この図では、マイクロスフィアに取り付けられる１６の異なる生物学的プローブが、領域６０の部分６２全体にランダムに分布される。本発明では、各プローブは、そのプローブに一意の色のマイクロスフィアに取り付けられ、それにより、１６の異なる色が部分６２にある。例えば、１６プローブに対し１６の相補的なターゲットの夫々を含む１つの検体が、部分６２と接触すると、１６のプローブによる１６のターゲットのハイブリダイゼーションは、適切な検出システムによって検出される１６の異なる色の燐光又は蛍光を形成する。較正領域６４は、マイクロスフィアに取り付けられるプローブに一意の１６の色に対応する１つの色を夫々有する１６のエリア６６を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の１つの実施例を示す図である。
【図２】本発明のもう１つの実施例を示す図である。
【図３】本発明を使用するためのシステムを示すブロック図である。
【図４】本発明のもう１つの実施例を示す図である。
【符号の説明】
１０　マイクロアレイレシーバ
１２　生理活性エリア
１４　色付きビーズ
１６　較正領域
１８　各色のエリア
２０　識別子
３０　マイクロアレイレシーバ
３２　リーダ
３４　プロセッサ
６０　領域パターン
６２　領域パターンの一部
６４　較正領域
６６　各色のエリア
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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