(57)【要約】【課題】セルロース含有繊維の毛羽立ちの低減、肌触りおよび外観の改善、色の澄明化、色の局所的変化、ごわつきの低減や洗剤組成物に使用される他、古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善等に有用なエンドグルカナーゼを提供する。【解決手段】ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）から新規エンドグルカナーゼＭＴＥ１を単離精製する。さらには、エンドグルカナーゼＭＴＥ１をコードする遺伝子を単離し、その遺伝子をフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）などの宿主にて発現させる。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有する、タンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列である。
【請求項２】
下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
【請求項３】
ミリオコッカム属（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）に属する糸状菌由来である、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）に属する糸状菌由来である、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＤＮＡであることを特徴とする請求項５に記載の、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７（ｉｉ）が、請求項７（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項７（ｉｉ）が、請求項７（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列からなる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞が酵母または糸状菌である請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属するものである、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
糸状菌が、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものである、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主および／またはその培養物から請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質の製造法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法で生産された、タンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる、セルラーゼ調製物。
【請求項２０】
セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項２１】
セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項２２】
セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項２３】
着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２４】
着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２５】
セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項２６】
繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、またはすすぎを通じて行われる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状または安定化された液体状で含有してなる、洗剤添加物。
【請求項２８】
請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる、洗剤組成物。
【請求項２９】
古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行なう工程において、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
【請求項３０】
紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【請求項３１】
動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項１〜４および請求項１８のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１９に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドグルカナーゼＭＴＥ１およびそれを含んでなるセルラーゼ調製物、並びにそれらを利用したセルロース含有繊維の処理方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セルロース含有繊維に所望の特性を与えるために、セルロース含有繊維をセルラーゼで処理することが行われている。例えば、繊維業界においては、セルロース含有繊維の肌触りおよび外観を改善するために、あるいは着色されたセルロース含有繊維にその色の局所的な変化を提供する「ストーンウオッシュ」の外観を与えるために、セルラーゼによる処理が行われている［欧州特許第３０７，５６４号明細書（特許文献１）］。
【０００３】
現在、デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウオッシュ外観の付与、肌触りの改善用途には、木材不朽菌であるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）やフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のセルラーゼが使用されている。これらセルラーゼは複数のセルラーゼ成分の混合物である。それらの実用化は、セルロース含有繊維に対して所望の効果を奏するには多量のセルラーゼ調製物を使用する必要から生じる困難性によって妨げられてきた。上記のセルラーゼ調製物の短所は、多量のエンドグルカナーゼを含む調製物によって改善されつつある。例えば、エンドグルカナーゼ活性を増強したセルラーゼ調製物は、国際公開第８９／０９２５９号パンフレット（特許文献２）、国際公開第９１／１７２４３号パンフレット（特許文献３）、国際公開第９８／０３６４０号パンフレット（特許文献４）、および国際公開第９４／２１８０１号パンフレット（特許文献５）で公表されている。また、フミコーラ由来のエンドグルカナーゼ成分であるＮＣＥ４（以下「ＮＣＥ４」と略記することもある）［国際公開第９８／０３６４０号パンフレット（特許文献４）］が、従来公知の複数のセルラーゼ成分の混合物であるセルラーゼ調製物の２５倍のジーンズ脱色活性、１００倍ものリヨセル毛羽除去活性を有することが開示されている。
【０００４】
【特許文献１】
欧州特許第３０７，５６４号明細書
【特許文献２】
国際公開第８９／０９２５９号パンフレット
【特許文献３】
国際公開第９１／１７２４３号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第９８／０３６４０号パンフレット
【特許文献５】
国際公開第９４／２１８０１号パンフレット
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
デニム染めセルロース含有繊維へのストーンウオッシュ外観の付与、肌触りの改善のために上記セルラーゼによる処理がおこなわれていたが、その場合、処理工程中で衣料にインジゴ染料の一部が再付着または逆染色、すなわち白場汚染してしまう等の問題が発生している。また、セルラーゼを洗剤中に配合した場合、界面活性剤により安定性が損なわれ、十分な効果が生じない問題点がある。
【０００６】
汚染の度合いを低める試みには、セルラーゼ処理液中に界面活性剤等の試薬を添加し、インジゴ染料を分散させる方法がある。しかしながら、この方法は追加の化学品の経費を生じ、廃液の環境負荷を増大させるという問題がある。したがって、デニム染めセルロース含有繊維への処理において、高活性でありながら白場汚染の度合いが低いセルラーゼが所望されていた。また、洗剤用としては、界面活性剤中での安定性の高いセルラーゼが望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、今般、糸状菌であるミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）より、セルロース繊維を崩壊する高い活性を有する新規のエンドグルカナーゼＭＴＥ１およびその遺伝子を見出し、これらを提供するものである。
【０００８】
また、本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１をペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）を宿主として発現させて得た調製物を用いたデニム染めセルロース含有繊維への処理において、白場汚染の程度がＮＣＥ４と比較して著しく低いという有利な性質を有することを見出した。また、市販洗剤中での安定性が高く、洗剤用酵素としての非常に高い有用性を示した。本発明によるタンパク質によれば、デニム染めセルロース含有繊維への処理における、界面活性剤等の化学品の添加量を低減し、その結果、コストの低減化を実用化し、環境への負荷への低減を達成しうる。また、市販洗剤中での安定性が高く、綿繊維の毛羽発生抑制および毛羽除去を効率的にできることから、この点からもコストの低減化、環境への負荷低減を達成することができる。
【０００９】
したがって、本発明は、デニム染めセルロース含有繊維への処理において白場汚染の度合いが低く、市販洗剤中での安定性が高いエンドグルカナーゼ活性を有する新規なタンパク質およびその遺伝子を提供するものである。また、本発明は、その遺伝子によって形質転換された宿主細胞、および当該宿主細胞を培養して目的タンパク質を採取する方法を提供するものである。さらに、本発明のタンパク質を含有し、良好な特性を有するセルラーゼ調製物およびそれを用いたセルロース含有繊維の効率的で安価な処理法を提供するものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有する、タンパク質：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列である。
（２）下記からなる群より選択される、タンパク質：
（ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質、
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質、および
（ｃ）前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
（３）ミリオコッカム属（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）に属する糸状菌由来である、（１）または（２）に記載のタンパク質。
（４）ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）に属する糸状菌由来である、（３）に記載のタンパク質。
（５）（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（６）ＤＮＡであることを特徴とする（５）に記載の、ポリヌクレオチド。
（７）下記からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
（８）  （７）（ｉｉ）が、（７）（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％の相同性を有する塩基配列からなる、（７）に記載のポリヌクレオチド。
（９）  （７）（ｉｉ）が、（７）（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列からなる、（７）に記載のポリヌクレオチド。
（１０）  （１）〜（９）のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
（１１）  （１０）に記載の組換えベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（１２）宿主細胞が酵母または糸状菌である（１１）に記載の宿主細胞。
（１３）酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属するものである、（１２）に記載の宿主細胞。
（１４）酵母が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である（１３）に記載の宿主細胞。
（１５）糸状菌が、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものである、（１２）に記載の宿主細胞。
（１６）糸状菌が、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）である、（１５）に記載の宿主細胞。
（１７）  （１１）〜（１６）のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主および／またはその培養物から（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含んでなる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のタンパク質の製造法。
（１８）  （１７）に記載の方法で生産された、タンパク質。
（１９）  （１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質を含んでなる、セルラーゼ調製物。
（２０）セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
（２１）セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
（２２）セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物と接触させる工程を含んでなる、方法。
（２３）着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（２４）着色されたセルロース含有繊維の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（２５）セルロース含有繊維がごわ付き始める速度を低減するかまたはセルロース含有繊維のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（２６）繊維の処理がその繊維の浸漬、洗濯、またはすすぎを通じて行われる、（２０）〜（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２７）  （１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物を、飛散性のない顆粒状または安定化された液体状で含有してなる、洗剤添加物。
（２８）  （１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物を含んでなる、洗剤組成物。
（２９）古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行なう工程において、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする古紙の脱インキ方法。
（３０）紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
（３１）動物飼料の消化能を改善する方法であって、セルロース含有繊維を、（１）〜（４）および（１８）のいずれか一項に記載のタンパク質、または（１９）に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含んでなる、方法。
【発明の実施の形態】
【００１１】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質
本明細書において「エンドグルカナーゼ」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素、すなわちエンド−１，４−β−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）を意味し、当該酵素は、β−１，４−グルカンのβ−１，４−グルコピラノシル結合を加水分解する。また、本明細書の「エンドグルカナーゼ活性」とは、ＣＭＣアーゼ活性を意味する。さらに、「ＣＭＣアーゼ活性」とは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、東京化成工業株式会社製）を加水分解する活性を意味し、被験タンパク質とＣＭＣ溶液を一定時間インキュベーションした後に遊離してくる還元糖量を測定して、１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位と定義する。
【００１２】
エンドグルカナーゼ活性は、例えば、次のような手順により測定することができる。まず、被験タンパク質を含む溶液０．５ｍＬを、２％のＣＭＣを溶解させた５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．５ｍＬに添加し、５０℃で３０分間インキュベーションする。次いで、得られる反応液の生成還元糖濃度を、３，５−ジニトロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で定量する。すなわち、反応３０分後の反応液１．０ｍＬ中にＤＮＳ試薬３．０ｍＬを添加し、沸騰水浴中で５分間インキュベーションした後、蒸留水８．０ｍＬで希釈し、５４０ｎｍの吸光度を測定する。段階的に希釈したグルコース溶液を用いて検量線を作成し、酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決定する。１分間に１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量を１単位として活性を算出する。なお、ＤＮＳ試薬は文献（例えば、「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、ｐ．１９〜２０、福井作蔵著、学会出版センター）の記載に従って調製することができるが、例えば、次のような手順で調製することができる。まず、４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍＬに、１％３，５−ジニトロサリチル酸溶液８８０ｍＬ、およびロッセル塩２５５ｇを添加する（溶液Ａ）。別に、１．０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍＬに結晶フェノール１０ｇを加え、さらに水を加えて溶解して１００ｍＬとする（溶液Ｂ）。溶液Ｂ６９ｍＬに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを加えて溶解させ、溶液Ａを注いでロッセル塩が十分に溶解するまで攪拌混合し、２日間放置した後に濾過する。
【００１３】
本発明によるタンパク質は糸状菌類、具体的にはミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）属、例えばミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、より好ましくはミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳＭＢＬ２８８３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８４１）またはその変異株の微生物から得ることができる。
【００１４】
さらに、本発明によるタンパク質は、典型的には、そのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列を有する。Ｎ末端のアミノ酸配列は、例えば後述の実施例２で示した方法により決定することができる。
【００１５】
本発明によれば、ミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）属由来の、下記の特性を有するタンパク質が提供される：
（Ａ）エンドグルカナーゼ活性を有し、
（Ｂ）Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で表わされる配列である。
【００１６】
本発明の別の態様では、配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、並びにその改変タンパク質またはその相同タンパク質が提供される。
【００１７】
「配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質」には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、および、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、シグナルペプチドと考えられる１〜２０番目のアミノ酸配列が切断され、２１〜２６６番目の配列を有するタンパク質が含まれる。
【００１８】
本発明における「改変タンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで、「置換、欠失、付加もしくは挿入」などの改変に係るアミノ酸の数は、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜６個である。
【００１９】
さらに、改変タンパク質には、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質を包含する。ここで、「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように１個もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体的には、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００２０】
本発明における「相同タンパク質」とは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも８０％、より好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質である。ここで示した相同性の数値は、当業者に公知の相同性検索プログラムであるＦＡＳＴＡ３〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２７，  １４３５−１４４１  （１９８５）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ２４４４−２４４８  （１９８８）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｅ−ｍａｉｌ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｊ．ｈｔｍｌ〕においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値を示す。
【００２１】
なお、本発明のタンパク質は、例えば実施例１に記載のように微生物から単離、精製することにより得ることができる。また、後述のように遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な宿主において発現させ、生産されたタンパク質を単離、精製することによっても得ることができる。
【００２２】
エンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明によれば、配列番号２に記載されるアミノ酸配列、その改変タンパク質およびその相同タンパク質（以下、単に「本発明のタンパク質」という）をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドを選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれ、ＤＮＡが好ましい。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドの少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入された塩基配列からなり、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（ｉｖ）前記（ｉ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００２４】
前記（ｉ）の塩基配列において１個もしくは複数個の塩基が置換、欠失、付加もしくは挿入されてもよい塩基の数は、具体的には１〜６０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１８個、さらに好ましくは１〜９個、である。
【００２５】
ここで、前記（ｉｖ）における「ストリンジェントな条件下」とは、配列番号１で表わされる塩基配列を含んでなるプローブと、相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドとがハイブリダイズする一方で、このプローブが、ミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）由来の２０ｋＤａセルラーゼ（米国特許第６１８４０１９号明細書）とはハイブリダイズしない程度に制御された条件を意味する。
【００２６】
より具体的には、例えばプローブとして標識化したエンドグルカナーゼＭＴＥ１のアミノ酸配列をコードする塩基配列の全長を有するものを用い、ハイブリダイゼーションの条件は、基本的にＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ（Ａｍａｓｈａｍ社製）に添付された説明書の方法に従って行なうことが挙げられる。具体的には、まず、プレハイブリダイゼーション溶液（２０倍のＳＳＰＥ溶液６．２５ｍｌ、１００倍のデンハードＶｓ溶液１．２５ｍｌ、１０％ＳＤＳ溶液１．２５ｍｌを水で２５ｍｌにフィルアップしたもの）を調製する。超音波処理したＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを１００℃にて５分間保温する。その後、氷上で冷却し、ナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ）とプレハイブリダイゼション溶液を入れたハイブリダイゼーションバッグに添加する。続いて、６５℃で１時間処理し、ディネイチャーした（１００℃にて５分処理）ラベル（Ｐ３２）したプローブをプレハイブリダイゼーションバッグに添加する。ここでプローブの濃度は２０ｎｇ／ｍｌを超えないようにする。そして、６５℃で１２時間インキュベートした後、メンブレンを取り出し、２倍のＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳ溶液中で１０分間リンスする。この操作を２回繰り返す。溶液を１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１５分間処理する。さらに溶液を０．１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１０分間処理する。
【００２７】
本発明によるポリヌクレオチドは、天然由来のものであっても、全合成したものであってもよく、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでもよい。本発明によるポリヌクレオチドの典型的な取得方法としては、ミリオコッカム・サーモフィラムのｃＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプローブを用いて、スクリーニングを行う方法などが挙げられる。
【００２８】
本発明による、エンドグルカナーゼＭＴＥ１のアミノ酸配列をコードする典型的配列は、配列番号１に記載されるポリヌクレオチドの一部または全部を有するものである。配列番号１に記載されるポリヌクレオチドは、１〜３番目のＡＴＧで始まり、７９９〜８０１番目のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレームを有する。また、６１〜６３番目のポリヌクレオチドは２４６残基のアミノ酸配列からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
【００２９】
発現ベクターおよび形質転換された微生物
本発明においては、前記の本発明のタンパク質をコードする塩基配列（以下、単に「本発明によるポリヌクレオチド」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、そのポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３０】
本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するポリヌクレオチドや形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するポリヌクレオチドとしては、プロモーター、ターミネーターおよびシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。また、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００３１】
更に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系、およびそれらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。また、この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
【００３２】
更に、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明のタンパク質を単離して得ることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、前記の本発明のタンパク質の製造方法が提供される。形質転換体の培養およびその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
【００３３】
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明によるＤＮＡ配列によってコードされるエンドグルカナーゼを発現させ得る酵母細胞が提供される。本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【００３４】
本発明における宿主糸状菌は、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属またはアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属するものであることができる。さらにそれらの好ましい例としては、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）若しくはアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）またはアクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）が挙げられる。
【００３５】
微生物の寄託
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ  ＭＢＬ２８８３は、平成１４（２００２）年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８４１である。
エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を含むプラスミドｐＥＭＴで形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株は、平成１４（２００２）年４月２６日付で独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８４０である。
【００３６】
セルラーゼの用途／セルラーゼ調製物
本発明は、本発明のタンパク質、および本発明の宿主細胞を培養することにより得られるタンパク質（以下「本発明のタンパク質等」という）を含んでなるセルラーゼ調製物に関する。
本発明によるセルラーゼ調製物は、本発明のタンパク質等に、他のセルラーゼ、例えばセロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼおよび本発明以外のエンドグルカナーゼを含めてもよく、更にセルラーゼ調製物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等とともに混合され製造されてもよい。また、本発明におけるセルラーゼ調製物はいずれか適当な形状、例えば粉末または液体状に調製することができる。
【００３７】
更に本発明によれば、着色セルロース含有繊維の澄明化をもたらす方法であって、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物で着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる方法、並びに、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす方法、すなわち、着色セルロース含有繊維にストーンウオッシュの外観を与える方法が提供される。そして、この方法は、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物により着色セルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
【００３８】
本発明による上記方法は、洗濯中にセルロース含有繊維を処理することにより実施できる。しかしながら、繊維の処理は、場合によって、ソーキングまたはすすぎ中に、繊維が浸漬されているかまたは浸漬されうる水に、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を添加することによって実施されてもよい。
【００３９】
更に本発明によれば、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するか、毛羽立ちを低減するか、肌触りが悪くなる速度を低減するか、またはごわ付きを低減する方法が提供される。この方法は、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する工程を含んでなる。
【００４０】
接触温度、上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物の添加量などの条件は、他の種々の条件を勘案して適宜決定されてよいが、例えば、セルロース含有繊維の肌触りおよび外観の改善を目的とした減量加工の場合、５０〜６０℃程度の温度で、１〜１００ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を使用することにより処理することができる。更に、着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化をもたらす場合、５０〜６０℃程度の温度で、２〜５０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を使用することにより処理することができる。
【００４１】
また、セルロース含有繊維の毛羽立ち始める速度を低減するかまたは毛羽立ちを低減する場合、５０〜６０℃程度の温度で、０．０５〜１０ｍｇ／Ｌのタンパク濃度の上記タンパク質等または上記セルラーゼ調製物を使用することにより処理することができる。
【００４２】
また、本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物を洗剤組成物中で用いることにより、粒質土壌除去、色彩澄明化、脱毛羽立ち、脱ピリングおよび手粗さ軽減に関し、それらを改善することができる。本発明が定義する洗剤組成物は、界面活性剤（アニオン性、ノニオン性、カチオン性、両性または双性イオン性あるいはそれらの混合物であり得る）をも含有し得る。
【００４３】
更に、本発明の洗剤組成物は、当分野で既知の他の洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、腐食防止剤、金属イオン封鎖剤、汚れ解離ポリマー、香料、他の酵素（プロテアーゼ、リパーゼ、アミラ−ゼなど）、酵素安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤等をも含有し得る。代表的なアニオン性界面活性剤は直鎖状アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェート（ＡＳ）、アルファーオレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）および天然脂肪酸のアルカリ金属塩等がある。ノニオン性界面活性剤の例としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、アルキルポリエチレングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、スクロース、およびグルコースの脂肪酸エステル、並びにポリエトキシル化アルキルグルコシドのエステル等がある。
【００４４】
本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物は古紙に作用させることにより、脱インキが可能である。これにより、古紙から再生紙をつくる過程において本発明によるエンドグルカナーゼによる処理で有意に改善できる。本発明に用いられる古紙は、一般に言われる古紙は全て用いることができ、例えば機械パルプ、化学パルプを配合した新聞古紙、雑誌古紙、下級〜中級印刷古紙、化学パルプよりなる上質古紙、これらの塗工紙等の印刷古紙が含まれる。
【００４５】
また、本発明に言う脱インキ薬品は、一般に古紙の脱インキに用いられる薬品をいい、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ、硅酸ソーダ、過酸化水素、燐酸塩、それにアニオン系、ノニオン系の界面活性剤、オレイン酸等の補集材、助剤としてｐＨ安定剤、キレート剤、分散剤等が挙げられる。
【００４６】
また、本発明によれば、紙パルプのろ水性が、強度の著しい低下を伴うことなく、本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物による処理で有意に改善できるものと考えられる。したがって、本発明によれば、パルプのろ水性の改善方法であって、本発明のタンパク質等またはセルラーゼ調製物で紙パルプを処理する工程を含んでなる方法が提供される。本発明で処理できるパルプの例としては、古紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフトパルプ、亜硫酸パルプまたは加工熱処理および他の高収率パルプが挙げられる。
【００４７】
さらに、本発明は、動物飼料の消化能を改善する方法に関し、動物飼料を、本発明のタンパク質等または本発明のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む。  該方法によれば、動物飼料中のグルカンが適度に低分子化されるため、動物飼料の消化能を改善することができる。
【００４８】
さらに、本発明のタンパク質等を動物飼料中で用いることにより、飼料中のグルカンの消化能を改善することができる。したがって、本発明によれば、動物飼料の消化能を改善する方法であって、本発明のタンパク質等または本発明のセルラーゼ調製物で動物飼料を処理する工程を含んでなる方法が提供される。
【００４９】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００５０】
〔実施例１〕ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）からのエンドグルカナーゼ成分の単離精製
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ  ＭＢＬ２８８３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８４１）を、ＰＤＡ培地（２０％馬鈴薯浸出液、２．０％ブドウ糖、ｐＨ５．６）に植菌し、２５℃で振とう培養した。７日間培養の後、培養液を吸引濾過により菌体を除き、得られた培養上清液を限外濾過濃縮、凍結乾燥を経て、粗精製セルラーゼ調製物とした。
【００５１】
この粗精製セルラーゼ調製物を、常法に従い、硫安塩析し、脱塩後０．０２５ｍｏｌ／ｌのイミダゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて平衡化し、ｍｏｎｏＰカラムに供しｐＨ７．５からｐＨ４．３で溶出した。溶出されたフラクションのＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）アーゼ活性（ｐＨ５．０、５０℃）を測定したところ、フラクション６〜フラクション１０に活性が認められた。
【００５２】
全てのフラクションをデニム洗浄試験に供した。ラウンダーメーターに１０ｃｍ×１０ｃｍのデニム小片を入れ、ＣＭＣアーゼとして５Ｕ／ｍｌとなるよう分画した酵素を加え、ｐＨ５．０、５０℃にて６０分間処理をした。その結果、フラクション１０が他のフラクションに比べデニムの強い脱色を示した。
【００５３】
また、各フラクションの酵素のＣＭＣアーゼ活性を５０℃、ｐＨ５．０、ｐＨ７．０，ｐＨ９．０にて測定した。その結果、フラクション１０がｐＨ９．０で、相対的に高い活性を示した。
【００５４】
更に、フラクション１０のエンドグルカナーゼを洗剤に多く使用される代表的なアニオン界面活性剤であるＬＡＳが２．５ｇ／ｌ存在する条件で、５０℃にてｐＨ５．０およびｐＨ７．０での残存活性を調べた結果、１２０分までの処理時間において非常に高い残存活性を示した。
【００５５】
ここで、得られた活性画分のうち６ｍｌ分を５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）になるように調製した後、あらかじめ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化させた、ＭｏｎｏＳ  ５／５ＨＲカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）流速１ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。次に５０  ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）から５０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムに対して、直線勾配溶出法により流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出し、分画した。このうち、塩化ナトリウム濃度が約０．１ｍｏｌ／ｌのときに得られた画分の一部に綿毛羽除去活性が強く認められた。そこで、この画分１〜３ｍｌを分取した。この画分をエンドグルカナーゼＭＴＥ１として単離した。このエンドグルカナーゼＭＴＥ１はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一なバンドを示した。ここまでのＭＴＥ１の精製の工程を５０回繰り返し、精製サンプルを大量に得た。
【００５６】
〔実施例２〕  エンドグルカナーゼＭＴＥ１の部分アミノ酸配列
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の同定
フラクション１０をｍｏｎｏＰカラムに供し、クロマトフォーカシングを実施した。これにより単一タンパク質にまで精製された。このタンパク質のＣＭＣａｓｅ活性を測定したところ、ｐＨ５．０で２８Ｕ／ｍｇ、ｐＨ７．０で１５Ｕ／ｍｇであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量は約２８ｋＤａであった。このタンパク質をアセトン沈殿法により回収し、Ｎ末端のアミノ酸を測定したところ、次の配列が得られた。
【００５７】
エンドグルカナーゼＭＴＥ１のＮ末端アミノ酸配列
ＡＡＤＧＫＳＴＲＹＷＤＣＣＫＰＳＣＳＷ（配列番号３）
【００５８】
〔実施例３〕  エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子のクローニング
本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１の遺伝子を単離するため、ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ  ＭＢＬ２８８３から常法に従ってゲノムＤＮＡを単離・精製した。
続いて、配列番号４および配列番号５に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型として常法に従ってＰＣＲを実施した。
【００５９】
５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＹＧＣＮＴＧＧＣＣＮＡＡＲ−３（配列番号４）５’−ＡＡＲＣＴＧＡＣＣＡＡＲＧＴＹＴＴＲＣＧＣＣＴＡＧＧＡＡ−３（配列番号５）
【００６０】
増幅された生成物をアガロースゲル電気泳動的に供した結果、ほぼ単一であり、その断片をｐＵＣ１２９（Ｋｅｅｍ  Ｎ．Ｔ．，  Ｔａｍａｋｉ  Ｓ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｄ．，  Ｔｒｏｌｌｉｎｇｅｒ  Ｄ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｇｅｎｅ，  １９８８  ｖ．７０，  ｐｐ．１９１−１９７）にサブクローニングした。
【００６１】
ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ  ＭＢＬ２８８３の全ゲノムを制限酵素（ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＳａｌＧＩ、ＣｌａＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ）にてそれぞれ消化した後、上述のｐＵＣ１２９にサブクローニングしたＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条件は、基本的にＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ（Ａｍａｓｈａｍ社製）に添付された説明書の方法に従った。まず、プレハイブリダイゼーション溶液（２０倍のＳＳＰＥ溶液６．２５ｍｌ、１００倍のデンハードＶｓ溶液１．２５ｍｌ、１０％ＳＤＳ溶液１．２５ｍｌを水で２５ｍｌにフィルアップしたもの）を調製した。超音波処理したＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌを１００℃にて５分間保温した。その後、氷上で冷却し、ナイロンメンブレン（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ）とプレハイブリダイゼション溶液を入れたハイブリダイゼーションバッグに添加した。続いて、６５℃で１時間処理し、ディネイチャーした（１００℃にて５分処理）ラベル（Ｐ３２）したプローブをプレハイブリダイゼーションバッグに添加した。プローブの濃度は２０ｎｇ／ｍｌを超えないようにした。そして６５℃で１２時間インキュベートした。続いて、メンブレンを２倍のＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳ溶液中で１０分間リンスし、この操作を２回繰り返した。溶液を１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１５分間処理した。さらに溶液を０．１倍のＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳに変更し、６５℃にて１０分間処理した。
【００６２】
その結果、ＮｄｅＩ、ＣｌａＩおよびＸｂａＩ消化においては１０ｋｂよりも大きなＤＮＡ断片にハイブリダイズすることを見いだした。また、ＳｐｈＩで８ｋｂ、ＳａｃＩＩで８ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩで６ｋｂ、ＳａｌＧＩで５ｋｂ、ＥｃｏＲＩで４ｋｂ、ＸｈｏＩで３．７ｋｂ、ＳａｃＩで１ｋｂ付近の分子量の断片にハイブリダイズすることがわかった。
【００６３】
〔実施例４〕  エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子の遺伝子配列の決定
実施例３に記載したミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）ＦＥＲＧＵＳ  ＭＢＬ２８８３のゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（４ｋｂ）を環状化した後、得られた環状物の直接ＰＣＲ反応を下記のプライマーを用いて行った。
【００６４】
５’−ＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＧＡＧＣＡＣＧＡＣＧＧ−３’  （配列番号６）
５’−ＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣ−３’  （配列番号７）
【００６５】
続いて、得られたＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化したｐＵＣ１２９へ、常法に従いクローニングした。プラスミドＤＮＡの単離を行い、この挿入したＰＣＲ生成物の塩基配列を常法に従って決定した。この際、ｐＵＣベクター用の標準的なプライマーとともに以下のプライマーを使用した。
【００６６】
５’−ＴＧＣＡＧＧＣＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣ−３’  （配列番号８）
５’−ＣＧＣＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’（配列番号９）
５’−ＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＣ−３’  （配列番号１０）
５’−ＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＴＡＣＧＧＣＡ−３’  （配列番号１１）
５’−ＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＡ−３’  （配列番号１２）
５’−ＣＧＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＣＴ−３’  （配列番号１３）
【００６７】
この配列を解析したところ７９８ｂｐからなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、この配列から予測されるタンパク質は、２６６アミノ酸残基、約２８ｋＤａであり、エンドグルカナーゼと相同性を示すことが明らかとなった。また、最も高い相同性を示したタンパク質は、Ａｒｊａ  Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ−Ｏｉｎｏｎｅｎらによるミリオコッカム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ）の２０ｋＤａセルラーゼ（米国特許第６１８４０１９号明細書）であり、その相同性は７５％であった。このように単離した本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子のＯＲＦの塩基配列を配列表の配列番号１に、またそのアミノ酸配列を配列番号２に示した。Ｎ末端のアミノ酸配列は実施例２で調べた配列番号３と一致した。また、ポリヌクレオチドとエンドグルカナーゼ遺伝子のコード領域のアミノ酸配列は、長さ６７ｂｐおよび５７ｂｐの２つのイントロンで遮断されていた。
【００６８】
次に常法に従い、ミリオコッカム・サーモフィラムの遺伝子ライブラリーをＥＭＢＬ３で作成し、完全長のエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を含むファージをスクリーニングした。その後、エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（３．２ｋｂ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳベクターにクローニングし、プラスミドｐＥＭＴ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８４０）を単離した。
【００６９】
〔実施例５〕  エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子のペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）での発現
実施例４により単離したエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子を鋳型として、以下に記載するプライマーを用いてＰＣＲにて増幅させ、エンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子配列内にＡｐａＩ制限酵素部位を導入した。このことにより、ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）の発現用プラスミドに導入することを可能とした。
【００７０】
５’−ＴＣＧＣＡＴＣＣＧＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＧＴＣＴＡ−３’  （配列番号１４）
５’−ＧＡＧＣＧＣＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣ−３’  （配列番号１５）
【００７１】
ＰＣＲ断片はＡｐａＩで消化して、プラスミドｐＰｒＥＧのＡｐａＩ部位に挿入した。プラスミドｐＰｒＥＧはペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来の成熟β−ガラクトシダーゼ（ｂｇａＳ遺伝子）のプロモーター領域から同遺伝子のターミネーター領域を有するプラスミドである。ｐＰｒＥＧのＡｐａＩ部位は、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来β−ガラクトシダーゼのリーダーペプチドをコードする領域の直下流に存在しており、ＰＣＲ断片を翻訳フレームが合う様にクローニングした。
【００７２】
次に得られたプラスミドを制限酵素ＳｔｕＩとＮｏｔＩで二重消化し、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来の成熟β−ガラクトシダーゼをコードする領域を除去した。制限部位ＳｔｕＩとＮｏｔＩで境界の定まった残りのエンドグルカナーゼＭＴＥ１遺伝子をコードする領域は、このコンストラクトにフレームで融合した。
【００７３】
従って、得られたプラスミドｐＰｒＥＧ５にはペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来ｂｇａＳ遺伝子のプロモーター領域、ペニシリウム・カネスセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）由来β−ガラクトシダーゼのリーダーペプチドをコードする領域、ミリオコッカム・サーモフィラム（Ｍｙｒｉｏｃｏｃｃｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ  ）由来のエンドグルカナーゼＭＴＥ１の翻訳領域とターミネーター領域、およびペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）由来ｂｇａＳ遺伝子のターミネーター領域を含んでいた。
【００７４】
ｎｉａＤ遺伝子に突然変異のあるペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）菌株を、同時形質転換の受容菌株として用いた。約５×１０８個のプロトプラストを、プラスミドｐＳＴＡ１０（ｎｉａＤ）とｐＰｒＥＧ５の混合物で同時形質転換した。ＮｉａＤ＋表現型を示した形質転換体について、次にエンドグルカナーゼ産生性を分析した。
【００７５】
この形質転換体をＣＭＣを含む寒天培地で培養した後にコンゴレッド染色して、コロニー周囲へのハロ形成能を調べた。その結果、試験した形質転換体のうちの、エンドグルカナーゼ陽性体の割合は約２０％であった。顕著なハロを示した形質転換体を選び、液体培地中での酵素産生性を調べた。具体的には２つの独立した形質転換実験で得た２種類の陽性形質転換体を調べた。
【００７６】
これらの形質転換体はいずれも非形質転換体と比較して７〜８倍高いエンドグルカナーゼ活性を示した。一方、液体培地中でのペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）宿主に由来する酵素分泌活性には変化はなかった。液体培地のタンパク質についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、いずれの形質転換体［（１−１６）株、（２−２１）株］にも新しいバンドが認められた。
【００７７】
〔実施例６〕  ｐＭＴＥ１の形質転換体の培養および特性解析
２つの形質転換体［（１−１６）株、（２−２１）株］を１０ｌのファーメンターにて実施例１記載の培養液を用いて培養した。培養後、濾過、ＵＦ膜による濃縮を経て最終的に凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物のＣＭＣアーゼ  （セルラーゼ）、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、ポリガラクチュロナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ（以上ｐＨ５．０）、プロテアーゼ（ｐＨ５．０の基質はヘモグロビン、ｐＨ７．０およびｐＨ９．０の基質はカゼインを使用した）を測定した。その結果を以下の第１表、第２表、第３表に示す。
【００７８】
【表１】
2004313022.tif 000002
【００７９】
【表２】
2004313022.tif 000003
【００８０】
【表３】
2004313022.tif 000004
【００８１】
〔実施例７〕  ペニシリウム・シンプリシシマム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｓｓｉｍｕｍ）で発現させたＭＴＥ１によるデニム染めセルロース含有繊維の脱色活性評価
１０ｃｍ×１０ｃｍのデニムを５００ｍｌ容のステンレスシリンダーに入れ、メタルボールを添加した。１０Ｕ／ｍｌの（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ由来のＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を含む０．１ｍｏｌ／ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌを添加し、５０℃でシェーカーにて６０分間、２００ｒｐｍにて攪拌した。続いてデニムを取り出し、５分間蒸留水で水洗し、一夜乾燥させた。デニムの色の分析は、ＪＰＥＧデータとして取り込んだ後、ｌｅｖｅｌ  ３０（Ｐ３０）値を計算した。
【００８２】
また、白場汚染は  白綿布（１０ｃｍ×１０ｃｍ）を５００ｍｌ容のステンレスシリンダーに入れ、１０Ｕ／ｍｌの（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ由来のＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）を含む０．１ｍｏｌ／ｌの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）および１ｍｇ／ｍｌのインジゴを含む溶液１００ｍｌを添加し、５０℃でシェーカーにて６０分間２００ｒｐｍにて攪拌した。続いて白綿布を取り出し、５分間蒸留水で水洗し、一夜乾燥させた着色度の分析は、ＪＰＥＧデータとして取り込んだ後、ｌｅｖｅｌ  １１０（Ｐ１１０）の値を用いた。
【００８３】
その結果、デニムの脱色は（１−１６）株で３２．９、（２−２１）株で３５．１およびフミコーラ由来のＮＣＥ４で３１．４とほぼ同等であったのに対し、白場汚染は（１−１６）株で１．０、（２−２１）株で０．５およびフミコーラ由来のＮＣＥ４で３４．６となり、ＭＴＥ１はＮＣＥ４に比べ著しく白場汚染が低いことが示された。
【００８４】
〔実施例８〕ＭＴＥ１の界面活性剤中での安定性
（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のＮＣＥ４（国際公開第９８／０３６４０号パンフレット）のセルラーゼ溶液を、５ｇ／ｌのノニオン界面活性剤であるネオノール（オキシエチルノニルフェノール）中で５０℃において、ｐＨ５．０（０．１ｍｏｌ／ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液）、ｐＨ７．０（０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸−リン酸緩衝液）およびｐＨ９．０（０．１ｍｏｌ／ｌ炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液）での安定性を調べた。３時間保温した後の残存活性を界面活性剤の無添加と比べた結果、ｐＨ５．０およびｐＨ７．０では（１−１６）株、（２−２１）株およびフミコーラ由来のＮＣＥ４とも約８０％の残存活性を示した。一方ｐＨ９．０では、（１−１６）株が約８０％、（２−２１）株が約９０％およびフミコーラ由来のＮＣＥ４が約８０％の残存活性を示した。
【００８５】
同様にして、アニオン界面活性剤であるＬＡＳ（リニアーアルキルベンゼンスルフォネート）５ｇ／ｌ中での安定性を測定した。ｐＨ５．０において（１−１６）株が約６０％、（２−２１）株が約５０％の残存活性を、フミコーラ由来のＮＣＥ４は約３５〜４０％の残存活性を示した。ｐＨ７．０およびｐＨ９．０では、全てのサンプルでほぼ１００％活性がなかった。
【００８６】
さらに、市販の洗剤を用いて安定性を測定した。のＴＩＤＥ（Ｐ＆Ｇ社製）を５ｇ／ｌの濃度に調製し、同様にして安定性を測定した。（１−１６）株および（２−２１）株は約８０〜９０％の残存活性を示したのに対し、ＮＣＥ４は３０％の残存活性であった。
【００８７】
【発明の効果】
本発明のエンドグルカナーゼＭＴＥ１は、洗剤組成物に使用される他、古紙の脱インキ、紙パルプのろ水性の改善、並びにセルロース含有繊維の毛羽立ちの低減、肌触りおよび外観の改善、色の澄明化、色の局所的変化、ごわつきの低減等に有用である。
【００８８】
【配列表】
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