(57)【要約】【課題】患者の侵襲を可及的に小さくし、制癌作用を効果的に発現させることができるように、制癌剤として局所へ２価のマンガンイオンを輸送することができる新規ドラッグデリバリーシステムを提供する。【解決手段】第１の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステムは、２価の金属イオンを含有する微小粒子からなる。第２の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステムは、２価の金属イオンとこれを保持するデバイスとからなる。第１および第２の発明において、金属イオンは好ましくは２価のマンガンイオン、２価の銅イオンまたは２価の亜鉛イオンであり、特に好ましくは２価のマンガンイオンである。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２価の金属イオンを含有する微小粒子からなる細胞死誘発ドラッグデリバリーシステム。
【請求項２】
２価の金属イオンとこれを保持するデバイスとからなる細胞死誘発ドラッグデリバリーシステム。
【請求項３】
金属イオンが２価のマンガンイオン、２価の銅イオンまたは２価の亜鉛イオンである請求項１または２に記載の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステム。
【請求項４】
金属イオンが２価のマンガンイオンである請求項１または２に記載の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、肝細胞癌、胆管細胞癌、腎細胞癌等の癌細胞や、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞等を死滅させるのに有用な新規ドラッグデリバリーシステムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マンガンは細胞に必須の微量金属であり、低濃度では細胞に効果的に働くが、高濃度では細胞毒性があり、細胞を細胞死へと誘導することが知られている。近年、マンガンによる細胞死のメカニズムが明らかにされてきた。
【０００３】
報告によれば、高濃度の２価のマンガンイオン（以下、単に「マンガンイオン」という）は、小胞体ストレスシグナルに関係するカスパーゼ１２を活性化し、活性化されたカスパーゼ１２がカスパーゼ３を活性化することによって線維芽細胞のアポトーシスを誘発する。具体的には、ＮＩＨ３Ｔ３（線維芽）細胞において、マンガンイオン５００μＭにて２４時間処理すると、小胞体由来のカスパーゼ１２が活性化され、カスパーゼ３の活性が８倍に上昇した。（非特許参考文献１参照）。
【０００４】
同様のメカニズムによって引き起こされている可能性のある、マンガンイオンによる細胞死の報告が多数ある。以下、具体的な報告例を挙げる。
【０００５】
ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）細胞において、マンガンイオン１ｍＭ、２ｍＭにて２４時間処理すると、カスパーゼ３の活性が非処理群の３倍以上に増加した（非特許参考文献２参照）。
【０００６】
ＰＣ（褐色細胞腫）細胞においてマンガンイオン１００μＭにて７２時間処理すると、細胞の活性が非処理群の１／４にまで低下した。同様の実験で、マンガンイオン１ｍＭでは、２４時間で１／２まで、４８時間で１／６まで細胞活性が低下した（非特許参考文献３、４参照）。
【０００７】
ヒト乳癌細胞において、マンガンイオン５００μＭにて４８時間処理すると細胞活性が２５％以下になる。同様の実験で、マンガンイオン１００μＭ以下では細胞活性に変化がない（非特許参考文献５参照）。
【０００８】
また、マンガンイオン様作用を示す他の２価イオンとしては銅イオン、亜鉛イオンなどが報告されている。以下、具体的な報告例を挙げる。
【０００９】
ＨｅｐＧ２細胞において、銅イオン１７０μＭにて２４時間処理すると細胞活性が８０％にまで細胞活性が低下した。同様の実験で、亜鉛イオン１７０μＭでは７０％、銅イオン１７０μＭ＋亜鉛イオン１７０μＭでは１０％以下にまで細胞活性が低下した。また、銅イオン１．５ｍＭにて４８時間処理すると２５％にまで細胞活性が低下した（非特許参考文献６、７参照）。
【００１０】
ＨＬ（ヒト白血病）細胞において亜鉛イオン２５〜２００μＭにて６時間処理しても細胞活性にあまり変化はないが、亜鉛イオノポア１μＭ存在下では亜鉛５０μＭ以上において細胞活性が２０％以下まで低下した（非特許参考文献８参照）。
【００１１】
Ｃ６グリオーマ細胞において、亜鉛イオン１５０μＭ以上で４８時間処理するとＤＮＡの断片化が生じた（非特許参考文献９参照）。
【００１２】
ＨｅｐＧ２細胞において、亜鉛イオン１５０μＭで処理すると、２４時間で細胞活性が２５％まで、４８時間ではほぼ０％にまで低下した（非特許参考文献１０参照）。
【００１３】
これらの報告により、マンガン以外に、銅や亜鉛をはじめとする２価イオンも、過剰に存在することによって細胞に毒性的に働くことが示唆される。
【００１４】
また、マンガン、亜鉛、銅以外の２価イオンも、過剰に存在することによって細胞に毒性的に働くことが示唆される。
【００１５】
以上のことより、２価イオンは生体にとっては必要な微量元素であるが、過剰に存在することによって細胞に対して毒性的に働く。すなわち、２価の陽イオンは高濃度においては制癌剤様の作用を示す物質である。そこで、全体の投与量を少なくし、局所濃度を高くすることで２価の陽イオンを局所制癌剤として作用させることが期待できる。また、全身に拡散してしまった２価の陽イオンは体液で希釈され、低濃度となるため生体毒になることはない。
【００１６】
一方、一般に手術不能な悪性腫瘍や手術前の腫瘍の縮小などには動脈注入化学療法がよく用いられる。この療法にはリピオドールを用いる方法とリザーバーを用いる方法がある。前者にはリピオドールを制癌剤と混合したりこの療法を塞栓療法と併用する方法があるが、適用範囲が狭く、腫瘍多発例や門脈塞栓症例では適応がない。後者は、皮下に埋め込んだポートから目的の血管内へ制癌剤を流し込むことができるため、持続動脈注入療法として広く用いられているが、リザーバー留置の際の胃動脈群の塞栓術、カテーテルの血管内留置、ポートの皮下への埋込み、留置リザーバーの除去等、患者に及ぼす侵襲が非常に大きい。
【００１７】
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２７７  （２３），  ２０１３５−２０１３８，  ２００２
【００１８】
【非特許文献２】
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ９８（１７），  ９５０５−１０，  ２００１  Ａｕｇ  １４
【００１９】
【非特許文献３】
Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ．  ２４  （２００２）  ６３９−６５３
【００２０】
【非特許文献４】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ６１，  １６２−１７１，  ２０００
【００２１】
【非特許文献５】
Ａｒｃｈｉｅｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．  ３６５  （２），  ３１７−３２７，  １９９９
【００２２】
【非特許文献６】
Ｔｏｘｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．  １５，  ４９７−５０２，  ２００１
【００２３】
【非特許文献７】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎａｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．  ８４，  １５６２−１５６８，  １９８９
【００２４】
【非特許文献８】
Ｅｕｒ．Ｊ．ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６９，  ６２０４−６２１１，  ２００２
【００２５】
【非特許文献９】
Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ  １５，  １５−２５，  ２００２
【００２６】
【非特許文献１０】
Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ  １６，  ２９５−３０９，  ２００３。
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、上記の実情に鑑みてなされたものであって、その目的は、患者の侵襲を可及的に小さくし、制癌作用を効果的に発現させることができるように、制癌剤として局所へ２価のマンガンイオンを輸送することができる新規ドラッグデリバリーシステムを提供することである。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
この発明による第１の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステムは、２価の金属イオンを含有する微小粒子からなる。
【００２９】
この発明による第２の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステムは、２価の金属イオンとこれを保持するデバイスとからなる。
【００３０】
第１および第２の発明において、金属イオンは好ましくは２価のマンガンイオン、２価の銅イオンまたは２価の亜鉛イオンであり、特に好ましくは２価のマンガンイオンである。
【００３１】
【発明の実施の形態】
第１および第２の発明で用いる２価のマンガンイオンは、２価のマンガンの化合物、特に２価のマンガンの塩（例えば塩化物のようなハロゲン塩）を源とする。２価の銅イオンは、２価の銅の化合物、特に２価の銅の塩（例えば塩化物のようなハロゲン塩）を源とする。２価の亜鉛イオンは、２価の亜鉛の化合物、特に２価の亜鉛と強酸との塩（例えば硫酸塩）を源とする。本発明において複数の２価の金属イオンを組み合わせて使用しても良い。
【００３２】
第１の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステムにおいて、２価の金属イオンを含有する微小粒子は、例えば塩化マンガンのような２価の金属化合物を含む生分解性ポリマー（例えばポリ乳酸）の微小粒子であってよい。
【００３３】
本発明で用いる微小粒子の材料は、ケシ油、ゴマ油、コーン油などの通常注射剤に用いられる油類、鉄、フェライトなどの通常の金属、硫酸バリウムなどの金属の不溶性塩、ハイドロキシ・カルシウムアパタイト焼結体あるいは三リン酸カルシウム焼結体のようなリン酸カルシウムの焼結微小粒体などのセラミックス、コレステロール、脂肪酸のグリセロールエステル、シリコンなどのワックスおよび活性炭などである。さらには以下に例示する通常の天然および合成の高分子などを用い、そのまま固化するかあるいはホルムアルデヒドなどの架橋剤を用いて粒子を硬化するなどそれ自身公知の方法で調製したものも使用できる。
【００３４】
高分子としてはポリペプチド、多糖類、ポリ脂肪酸エステル、ポリアミノ酸、ポリアルデヒド、ポリビニル系高分子、無水マレイン酸系高分子等が挙げられる。  ポリペプチドとしては、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、アルブミン、ヘモグロビン、トランスフェリン、グロブリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ケラチン硫酸等が挙げられる。
【００３５】
多糖類としては、デキストラン、アガロース、プルラン、キトサン、マンナン、カラゲナン、アルギン酸、でんぷん、アミロース、アミロペクチン、ペクチン、レンチナン、ヒアルロン酸、ハイラン、エーテルセルロース（メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど）等が挙げられる。
【００３６】
ポリ脂肪酸エステルとしては、乳酸、グリコール酸、ヒドロキシ酪酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸などの単一重合体および共重合体等が挙げられる。
【００３７】
例えばポリ乳酸および乳酸−グリコール酸の共重合体としては乳酸／グリコール酸比率（モル比）が１００／０〜３０／７０、より好ましくは１００／０〜４０／６０で、分子量が１，０００〜４００，０００、より好ましくは２，０００〜８０，０００程度のものが挙げられる。
【００３８】
ポリアミノ酸としてはポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸等が挙げられる。
【００３９】
ポリビニル系高分子としては、エチレン、プロピレン、ブタジエン、アクリル酸、アクリル酸エステル、メタクリル酸、メタクリル酸エステル、酢酸ビニル、塩化ビニル、ビニルアルコール、ビニルピロリドン、ビニルエーテル、ビニルカルバゾール、スチレン、スチレン誘導体、α−シアノアクリル酸エステル、アクリルアミド、ジビニルベンゼンなどの単一重合体および共重合体等が挙げられる。
【００４０】
これらのうち、生体内で徐々に溶解、もしくは分解する高分子であるゼラチン、アルブミン、コラーゲン、でんぷん、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体などが好ましい。
【００４１】
本発明による微小粒子は、油溶液、エマルションあるいはサスペンションの状態で血管内に投与され得る。
【００４２】
本発明による微小粒子は、微小粒子の材料と２価の金属の化合物とを単に混合した状態のものであるか、あるいはそれ自身公知の方法で前者に後者を吸着または含有させたものであるが、後者がより好ましい。
【００４３】
本発明による微小粒子の径は好ましくは５〜５００μｍである。
【００４４】
目的の局所への微小粒子の輸送は、例えばカテーテルチューブ、医療用細管誘導針、ポリマーコートされた医療用ワイヤー、拡張バルーン、ステント、インプラント等を用いて行うことができる。微小粒子を輸送液に含ませる場合、微小粒子の輸送液中の濃度は、好ましくは３〜４０重量％である。
【００４５】
第２の細胞死誘発ドラッグデリバリーシステムにおいて、デバイスはカテーテルチューブ、医療用細管誘導針、ポリマーコートされた医療用ワイヤー、拡張バルーン、ステント、インプラント等であってよいが、ステントが好ましい。ステントは一般に円筒形で、スロット、卵形、円形又は他の形状の通路が穿孔されている。また、ステントはらせん状に巻いた又は曲がりくねったワイヤから構成されていてもよく、ワイヤ間の空間が通路を形成する。ステントは、平らで穿孔した構造体を巻いてチューブ状又は円筒状構造体を形成したものでもよく、これを織り、巻き、穴をあけ、エッチング又は切って通路を形成する。ステントは、生物学的適合性材料から製造できる。適当な生物学的適合性金属の例として、限定はしないがステンレス鋼、タンタル、チタン合金（ニチノールを含む）及びコバルト合金（コバルト−クロム−ニッケル合金を含む）が挙げられる。適当な非金属生物学的適合性物質の例として、限定はしないが、ポリアミド、ポリオレフィン（即ち、ポリプロピレン、ポリエチレンなど）、非吸収性ポリエステル（即ち、ポリエチレンテレフタレートなど）及び生物学的吸収性脂肪族ポリエステル（即ち、乳酸、グリコール酸、ラクチド、グリコリド、パラ−ジオキサノン、トリメチレンカルボネート、ε−カプロラクトンなど及びこれらの混合物のホモポリマー及びコポリマー）が挙げられる。
【００４６】
２価の金属イオンを保持する代表的なデバイスとしては、２価の金属イオンを含むコラーゲンや生分解性ポリマー（例えばポリ乳酸）でコーティングされたステントが挙げられる。ステントの材質、形状、サイズ等は公知のものであってよく、目的とする局所に適合するように選択される。目的の局所へのステントの導入は公知の方法で行うことができる。コーティング方法としては、浸漬、吹き付け、ペイント塗り、溶媒膨潤等がある。コーティングは複数の層で構成することもある。例えば、イオン性界面活性剤を含む外層と、２価の金属イオンを含む貯蔵層とからなるコーティングを形成してもよい。ステントの形状は、例えば、第１の面と第２の面とこれらの間の通路とを有するステントを通路のブロックとブリッジ以外をコーティングしたもの（特開２０００−５１３６７号公報参照）であってよい。、
本発明によるデバイスは、現在動脈注入化学療法が行われている肝癌、腎癌、腎盂癌、膵癌、膀胱癌、前立線癌、乳癌、胃癌、大腸癌、結腸癌などの腫瘍に対して有効である。
【００４７】
【実施例】
つぎに、この発明を具体的に説明する。
【００４８】
実施例１（塩化マンガンによる平滑筋細胞への影響）
ラットの大動脈を取り出し、コラゲナーゼおよび／またはエラスターゼで処理して、平滑筋細胞を採取した。
【００４９】
これを、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）を用いて、コラーゲン等の細胞外基質でコートした複数のシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製の細胞培養用ディッシュ）内で、３７℃、５％ＣＯ２に設定したＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。２４時間後に、各シャーレにＭｎＣｌ２を濃度０ｍＭ（コントロールとして）、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように添加した。その後、培養を続け、２０時間後に１μＣｉの  ［３Ｈ］チミジンを各シャーレに加え、さらに４時間培養した。その後、細胞中の［３Ｈ］チミジンの量を計測した。同様な操作をＭｎＣｌ２添加後、４４時間後にも行い、４時間培養し、細胞中の［３Ｈ］チミジンの量を計測した。この測定結果を図１のグラフに示す。
【００５０】
図１から分かるように、濃度が高くなるに従い、［３Ｈ］チミジンの取り込み量が低くなる。０．５ｍＭ以上の４８時間後の結果では、ほとんど細胞分裂していないことが分かる。取り込み量が低いことは、細胞分裂が少なく、細胞周期が停止しているか、細胞が死滅していることを示す。この値を高いことは、細胞分裂が盛んで、ＤＮＡの修復も盛んであることを示す。
【００５１】
実施例２（塩化銅による平滑筋細胞への影響）
各シャーレにＭｎＣｌ２の代わりにＣｕＣｌ２を濃度０ｍＭ（コントロールとして）、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように添加した。その他の点は、実施例１と同様の操作を行って、細胞の生存率を求めた。この結果を図２のグラフに示す。
【００５２】
図２から分かるように、０．５ｍＭ以上の添加により［３Ｈ］チミジンの取り込みが低くなる。
【００５３】
実施例３（硫酸亜鉛による平滑筋細胞への影響）
各シャーレにＭｎＣｌ２の代わりにＺｎＳＯ４を濃度０ｍＭ（コントロールとして）、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように添加した。その他の点は、実施例１と同様の操作を行って、細胞の生存率を求めた。この結果を図３のグラフに示す。
【００５４】
図３から分かるように、０．５ｍＭ以上の添加により［３Ｈ］チミジンの取り込みが低くなる。
【００５５】
実施例４（塩化マンガン含有ポリ乳酸微小粒子の作製）
ポリ乳酸１ｇを１０ｍｌの塩化エチレンに溶解し、得られた溶液にＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを５０ｍｇ添加し、全体を撹拌した。得られた混合液を、界面活性剤（スパン８０）２重量％を含む綿実油１００ｍｌに撹拌下に滴下した。この液を遠心分離機に掛け、得られた沈殿物をｎ−ヘキサンで洗浄した。こうして、塩化マンガン含有ポリ乳酸微小粒子を作製した。
【００５６】
実施例５（塩化マンガン含有ポリ乳酸コーティングステントの作製）
ポリ乳酸１ｇを１０ｍｌの塩化エチレンに溶解し、得られた溶液にＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを５０ｍｇ添加し、全体を撹拌した。得られた混合液にスパイラルＺステント（メディコスヒラタ社製、長さ３ｃｍ、直径６ｍｍ）を浸漬し、引き上げて、乾燥させた。こうして、塩化マンガン含有ポリ乳酸をコーティングしたステントを作製した。
【００５７】
【発明の効果】
この発明のドラッグデリバリーシステムによれば、患者の侵襲を可及的に小さくし、制癌剤として２価の金属イオンを局所へ輸送して制癌作用を効果的に発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭｎＣｌ２の濃度と［３Ｈ］チミジンの取り込み量の関係を示すグラフである。
【図２】ＣｕＣｌ２の濃度と［３Ｈ］チミジンの取り込み量の関係を示すグラフである。
【図３】ＺｎＳＯ４の濃度と［３Ｈ］チミジンの取り込み量の関係を示すグラフである。
【図１】
2004277379.tif 000002
【図２】
2004277379.tif 000003
【図３】
2004277379.tif 000004