(57)【要約】【課題】薬理活性および含有成分を効率的かつ安定的に有する冬虫夏草菌糸体の培養方法の提供。また、冬虫夏草菌糸体の薬理作用の増強方法の提供。【解決手段】培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射して冬虫夏草菌糸体を培養する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射することを特徴とする冬虫夏草菌糸体の培養方法。
【請求項２】
培地が、穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物を含む請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
冬虫夏草がコルジセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属に属することを特徴とする請求項１記載の培養方法。
【請求項４】
請求項１記載の培養方法により得られた冬虫夏草菌糸体。
【請求項５】
請求項４記載の冬虫夏草菌糸体より抽出されるエキス。
【請求項６】
請求項１記載の培養方法により得られた冬虫夏草菌糸体、及び／又は当該菌糸体より抽出されるエキスと、医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項１記載の培養方法により得られた冬虫夏草菌糸体、及び／又は当該菌糸体より抽出されるエキスを含有してなる食品組成物。
【請求項８】
培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射することを特徴とする、冬虫夏草菌糸体の薬理作用の増強方法。
【請求項９】
培地が、穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物を含む請求項８記載の増強方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、冬虫夏草菌糸体の培養方法、当該方法により得られた菌糸体  当該菌糸体より抽出されるエキス、及びそれらを含有する医薬組成物若しくは食品組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、不老長寿、滋養強壮の妙薬として、また、結核、黄疸等の治療薬として古来より珍重されてきた。近年においても、薬効や有効成分の研究によりその有用性が再認識され、医薬品や食品としての需要がさらに増大している。例えば、最近では、抗癌作用、国際公開第９６／００５８０号パンフレット（ＰＣＴ／ＪＰ９５／０１２９８）（特許文献１）に示されるような、強心、降圧、鎮咳、及び抗疲労作用、特開平１０−２４５３４０号公報（特許文献２）に示されるような強壮強精作用、また、特開平１０−２４５３４１号公報（特許文献３）に示されるような血糖降下作用他種々の薬効も報告されている。また、冬虫夏草の成分としては、抗菌作用を有するコルジセピン、心筋収縮抑制作用を有するＮ６−（２−ヒドロキシエチル）−アデノシン（ＨＥＡ）（フルヤ（Ｆｕｒｕｙａ  Ｔ．）外，フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２２巻，第１１号，１９８３年，ｐ．２５０９）（非特許文献１）及び免疫抑制作用を有するミリオシン等が単離同定されている。
【０００３】
しかしながら、冬虫夏草の採取物は薬理活性のばらつきが非常に大きく、安定した活性を期待することができない。また、冬虫夏草自体を天然から大量に入手することは非常に困難である。
【０００４】
また、冬虫夏草の培養方法について、種々検討が行われ、例えば、特開平９−３２７２３２号公報（特許文献４）に示すように、培地中にさなぎ粉を含有する方法、特開平１０−４２６９１号公報（特許文献５）に示すように、蚕の蛹組成成分を主成分とする培地を用いる方法、また、特開平１０−１１７７７０号公報（特許文献６）に示すように、冬虫夏草の寄生した同一種の昆虫の抽出エキスを培地に添加する方法等が報告されている。しかしながら、これらの培養方法はいずれも培地組成を天然の冬虫夏草の栄養源に類似させただけであり、菌の状態は同じ培地を用いても環境因子に大きく影響されるため、培地組成を工夫するだけでは薬理活性及び含有成分を安定に有する冬虫夏草を得ることはできない。
【０００５】
さらに、特開平９−６２号公報（特許文献７）には、おが屑、コーンコブ粉砕物等の培地基材に、米糠、豆皮等の栄養材を混合した培地を使用し、屋内での環境（温度、湿度等）制御により冬虫夏草（子実体）を栽培する方法が記載されている。さらに、特開２００１−２６９０５４号公報（特許文献８）には、菌糸培養工程においては黄色若しくは赤色の光を照射し、子実体発生工程においては青色若しくは緑色の光を照射して、子実体の収穫量を向上させる冬虫夏草の栽培方法が記載されている。
しかし、冬虫夏草菌糸体培養の際に、特定の波長域にピークを有する光が、得られる菌糸体培養物の薬理活性や含有成分に与える影響について今まで研究されたものはなかった。
【０００６】
【特許文献１】
国際公開第９６／００５８０号パンフレット
【特許文献２】
特開平１０−２４５３４０号公報
【特許文献３】
特開平１０−２４５３４１号公報
【特許文献４】
特開平９−３２７２３２号公報
【特許文献５】
特開平１０−４２６９１号公報
【特許文献６】
特開平１０−１１７７７０号公報
【特許文献７】
特開平９−６２号公報
【特許文献８】
特開２００１−２６９０５４号公報
【非特許文献１】
フルヤ（Ｆｕｒｕｙａ  Ｔ．）外，フィトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），第２２巻，第１１号，１９８３年，ｐ．２５０９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、薬理活性及び含有成分を安定に有する冬虫夏草菌糸体を効率的に得ることができる、冬虫夏草菌糸体の培養方法、当該方法により得られた菌糸体、当該菌糸体より抽出されるエキス、及びそれらを含有する医薬組成物若しくは食品組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、冬虫夏草菌糸体の薬理作用の増強方法の提供をも目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、冬虫夏草は、例えばコルジセプス属等のように子実体よりも菌糸体の方に薬理活性及び有効成分の含有量を豊富に持つ場合も多いことから、活性に遜色がなければ、子実体よりも菌糸体の方が培養日数も短く培養条件も調節しやすいことに着目した。さらに本発明者らは研究の末、接種した菌に３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射することで、薬理活性及び含有成分を安定に有する冬虫夏草菌糸体を効率よく得ることができることを見出し、なおかつこの培養方法により得られる冬虫夏草菌糸体は薬理活性及び／又は有効成分の含有量が増大していることを見出して、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射することを特徴とする冬虫夏草菌糸体の培養方法、
（２）培地が、穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物を含む上記（１）記載の培養方法、
（３）冬虫夏草がコルジセプス（ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属に属することを特徴とする上記（１）記載の培養方法、
（４）上記（１）記載の培養方法により得られた冬虫夏草菌糸体、
（５）上記（４）記載の冬虫夏草菌糸体より抽出されるエキス、
（６）上記（１）記載の培養方法により得られた冬虫夏草菌糸体、及び／又は当該菌糸体より抽出されるエキスと、医薬として許容できる担体を含む医薬組成物、
（７）上記（１）記載の培養方法により得られた冬虫夏草菌糸体、及び／又は当該菌糸体より抽出されるエキスを含有してなる食品組成物、
（８）培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射することを特徴とする、冬虫夏草菌糸体の薬理作用の増強方法、及び、
（９）培地が、穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物を含む上記（８）記載の増強方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明の対象となる冬虫夏草は、子嚢菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、核菌網（Ｐｙｒｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、麦角菌目（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｌｅｓ）、麦角菌科（Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ又はＨｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ）に属し、完全世代と不完全世代とを有する微生物である。例えば、コルジセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属（例えばサナギタケ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、ウスキサナギタケ（Ｃ．ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）等）等が挙げられる。子実体よりも菌糸体の方に薬理活性及び／又は有効成分の含有量を豊富に持つことから、コルジセプス属が好ましい。これらの菌は、日本、台湾、中国、ネパール等に分布し、発生時期は３〜１１月である。ガの蛹、幼虫等に寄生して養分を摂取して増殖し、虫の死骸より子実体を発生する。
【００１１】
本発明に係る冬虫夏草菌糸体の培養方法は、穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物を含む培地で栽培することが好ましい。穀類には、一般に人間の主食となる作物が含まれ、例えば米、米糠、粟、麦（小麦、大麦、ハト麦等）、蕎麦、ヒエ、キビ、トウモロコシ、アマランサス、豆類等が挙げられる。酵母としては、例えば乾燥ビール酵母、パン用酵母、清酒用酵母、ワイン用酵母等が挙げられる。酵母は、そのまま用いることもできるが、水、熱水、あるいは、有機溶媒等で抽出した酵母の抽出物（酵母エキス）を用いることもできる。穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物に、さらに、豆皮、おから等の豆類、サナギ粉、魚粉、煮干粉砕物等の動物紛のいずれか１つ又は複数を添加してもよい。また、おが屑、コーンコブ粉砕物等の培地基材を用いて、これに穀類、又は穀類及び酵母若しくはその抽出物を加えたものでもよく、さらに上記の豆類、動物紛等を添加してもよい。穀類を用いることで、菌糸増殖の支持体と栄養源を兼ねる。また、酵母あるいはその抽出物は、アミノ酸、ミネラルを豊富に含むので、少量で効率的な増殖が得られる。また、穀類や酵母は、入手しやすく、成分的にも比較的安定した培地組成である。
【００１２】
穀類の配合量は、培地成分（後述の水等を含まない成分）の全重量の通常５．０〜５５．０重量％、好ましくは１０．０〜３５．０重量％である。酵母を用いる場合は、その配合量は、培地成分の全重量の通常１．０〜１０．０重量％、好ましくは４．０〜７．０重量％である。酵母の抽出物を用いる場合は、その配合量は、培地成分の全重量の通常０．０１〜３．０重量％、好ましくは０．０２〜１．０重量％である。
さらに豆類、動物粉等を添加する場合は、その配合量は、培地成分の全重量の通常１．０〜１０．０重量％、好ましくは４．０〜７．０重量％である。また、おが屑、コーンコブ粉砕物等の培地基材を添加する場合は、その配合量は、培地成分の全重量の通常５．０〜５０．０重量％、好ましくは６．０〜２０．０重量％である。
上記の培地のうち、麦（割麦）と乾燥ビール酵母とからなる培地が好ましく、麦（割麦）１４０〜１６０ｇ、乾燥ビール酵母２０〜４０ｇの割合で配合した培地がさらに好ましい。具体的には、例えば、麦（割麦）１５０ｇ：乾燥ビール酵母３０ｇ：水３００ｍｌ、麦（割麦）１４０ｇ：乾燥ビール酵母４０ｇ：水３００ｍｌ、または麦（割麦）１６０ｇ：乾燥ビール酵母２０ｇ：水３００ｍｌの割合で配合した培地等が好ましい。
上記の成分を含有する培地は、従来公知の方法により作製することができ、例えば、これらの培地成分全重量に対して、水等を、通常５０．０〜８５．０重量％、好ましくは６０．０〜７５．０重量％に調製し、高圧蒸気滅菌器にて殺菌することにより作成することができる。
【００１３】
本発明では、培養条件として上記に例示されるような培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光（主に青色若しくは緑色の光）を連続又は間欠的に照射することで、薬理活性及び含有成分を効率的に安定的に有することが可能となった。
子実体発生に有効な光は青色域の光であることが知られており、前記特開２００１−２６９０５４号公報（特許文献８）に示すように、菌糸培養工程においては、黄色若しくは赤色、また、子実体発生工程においては、青色若しくは緑色を用いることで、子実体の収穫量が向上している。
しかしながら、菌糸体で薬理活性や含有成分を効率的かつ安定的に有する培養方法としては、菌糸の接種直後から、３５０〜５５０ｎｍ、好ましくは３５０〜５３０ｎｍ、さらに好ましくは４００〜５００ｎｍの波長域にピークを持つ光を連続又は間欠的に照射することが望ましいことを見出した。波長域は、３５０ｎｍ未満では、菌糸の増殖を阻害する傾向が強まり、また、５５０ｎｍを超えると、薬理活性や含有成分の低下を招く。
【００１４】
３５０〜５５０ｎｍの波長域等にピークを持つ光とは、光源から照射される光のうち、可視光域の波長における光の中で、相対発光強度が最も強い強度を示す光の波長が３５０〜５５０ｎｍの波長域にある光のことをいう。３５０〜５５０ｎｍの波長域等にピークを持つ光を照射し得る光源としては、例えば蛍光管では、カラー蛍光ランプの青色、緑色、ブラックライト等があり、また、発光ダイオードでは、青又は緑の発光ダイオードが挙げられるが、これらに限定されず、同等域にピークのある光源であれば何れも用いることができる。
照度は、通常１０ｌｕｘ以上、好ましくは１２００〜５０００ｌｕｘである。
間欠的に光を照射する場合には、照射する時間と暗所に置く時間が１：１であることが好ましい。例えば、照射時間が３０分である場合は暗所時間を３０分とし、照射時間を１２時間とした場合は暗所時間を１２時間とする。
【００１５】
菌の接種は、特に限定されず従来公知の方法で行うことができるが、例えば野生の菌から純粋分離した菌株を、寒天培地または液体培地に接種した菌株を接種することにより行うことができる。
培養温度は、通常１５〜３０℃、好ましくは１９〜２３℃、培養湿度は、通常６０〜９５％、好ましくは８５〜９５％である。培養期間は、通常１〜２ヶ月、好ましくは４〜６週間である。
【００１６】
ハナサナギタケ（Ｉ．Ｊａｐｏｎｉｃａ）等のイサリア属は、無性胞子を有する子実体を形成するが、子実体の方に薬理活性及び／又は有効成分を有する場合も多く、大島らは、ハナサナギタケ子実体に薬理活性を有するセスキテルペン系の新規成分を見出している（特願２００２−５２１４０号）。一方、サナギタケ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、ウスキサナギタケ（Ｃ．ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）等のコルジセプス属は、子嚢果に子嚢胞子を有する子実体を形成するが、子実体よりも菌糸体の方に薬理活性及び／又は有効成分の含有量を豊富に持つ場合も多い。また、活性に遜色がなければ、菌糸体の方が培養日数も短く、培養条件も調節しやすい利点をもつ。そこで、発明者らは、特にコルジセプス属等に属する冬虫夏草を、培地に菌を接種し、３５０〜５５０ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射することで、薬理活性及び／又は含有成分を効率よく安定に有する菌糸体を取得する方法を開発した。
【００１７】
このような発明の方法に従えば、１〜２ヶ月間程度の培養により、充分量の冬虫夏草の菌糸体を得ることができる。しかも得られる菌糸体は、神経細胞の分化誘導活性、及び／又は、癌細胞増殖抑制活性及び／又は抗疲労活性を有する。また、抗菌活性を有するコルジセピンの含有量が高くなるという効果を有する。
【００１８】
本発明の上記培養方法により得られる冬虫夏草菌糸体（以下本発明の冬虫夏草菌糸体ともいう。）としては、例えばコルジセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属（例えばサナギタケ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、ウスキサナギタケ（Ｃ．ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）等）等の冬虫夏草菌糸体が挙げられ、コルジセプス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）属（例えばサナギタケ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）、ウスキサナギタケ（Ｃ．ｔａｋａｏｍｏｎｔａｎａ）等）が好ましい。
本発明の冬虫夏草菌糸体より抽出されるエキスは、上記冬虫夏草菌糸体を常法により有機溶媒（例えば３０％エタノール等）や水等で抽出して得ることができる。
【００１９】
本発明の冬虫夏草菌糸体は、神経細胞の分化誘導活性、及び／又は、癌細胞増殖抑制活性及び／又は抗疲労活性を有する。また、抗菌活性を有するコルジセピンの含有量が高くなっているという特徴を有する。例えば、本発明の冬虫夏草菌糸体１ｇ中のコルジセピンの含有量は、少なくとも１ｍｇ／ｇ−Ｄ．Ｗ．（乾燥菌体）以上、好ましくは２ｍｇ／ｇ−Ｄ．Ｗ．〜２０ｍｇ／ｇ−Ｄ．Ｗ．、さらに好ましくは３ｍｇ／ｇ−Ｄ．Ｗ．〜１２ｍｇ／ｇ−Ｄ．Ｗ．である。コルジセピンの含有量があまり高いと、他の活性（例えば抗癌活性）が失われる傾向もあり、全体のバランスからは上記の範囲であるのが好ましい。
本発明の培養方法により、薬理活性が、上記３つの活性（神経細胞の分化誘導活性、癌細胞増殖抑制活性、抗疲労活性）を同時に有し、かつ、抗菌活性を有するコルジセピン含有量が上記の範囲である菌糸体を得ることが可能となる。
【００２０】
このように、本発明の培養方法によれば、得られる冬虫夏草菌糸体の薬理活性及び／又は有効成分の含有量を増大させることができ、その結果、冬虫夏草菌糸体の薬理作用、例えば神経細胞の分化誘導作用、癌細胞増殖抑制作用、抗疲労作用、抗菌作用、強心、強壮強精作用、免疫調整作用や増強作用等を増強することができる。
例えば、抗菌活性を有するコルジセピンの含有量は、同一の培地を用いて、昼色光を用いた場合に比べ、抽出エキスあたり少なくとも２０重量％以上増加する。
ここで、本明細書において昼色光とは、白色蛍光管による光をいう。
【００２１】
本明細書で使用する冬虫夏草菌糸体、及び／又は菌糸体より抽出されるエキスとは、冬虫夏草菌糸体の乾燥物をそのまま、あるいは粉末化したもの、あるいは、例えば有機溶媒や水等で抽出した抽出エキス、及び抽出エキスを特定の化合物に完全精製に至るまでの任意の純度まで精製したもの（部分精製品）をいう。形態としては、水溶性や、減圧濃縮し乾固させた固体、凍結乾燥品等の液状物や固形物を含む。本発明の方法によって得られた冬虫夏草菌糸体、当該菌糸体より抽出されるエキスは、脳神経細胞の細胞死を伴う疾患及び／又は免疫増強及び／又は心臓・呼吸器系疾患及び／又は癌の予防及び／又は治療用、免疫増強及び疲労回復に有効な医薬若しくは食品として、又は後述する適当な担体等とともに医薬組成物若しくは食品組成物として利用できる。
【００２２】
食品組成物として、本発明の冬虫夏草菌糸体、及び／又は菌糸体より抽出されるエキスを、例えば、ジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、豆腐、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキ、パン、クッキー、スナック菓子等に含有させることもできる。（これらも、本明細書では食品組成物に含める）。あるいは、菌子体粉末等又はそのエキスを、デキストリン、乳糖、デンプン、コーンスターチ等の賦形剤や香料、色素等とともに、ペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、ゼラチン等で被覆してカプセルに加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
本発明の食品組成物の「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、栄養補助食品、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品をも含むものである。
【００２３】
食品組成物における、本発明の冬虫夏草菌糸体等の配合量は、食品や組成物の種類や状態により一律に規定しがたいが、菌糸体の乾燥物あるいは粉末化したもの、あるいは抽出エキス固形物やその部分精製品として、通常約０．０１〜５０重量％、好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による効果が期待できず、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり、当該食品を調製できなくなる場合がある。
【００２４】
医薬組成物として、菌子体粉末やそのエキス、又は、エキスの部分精製品等を用いることができる。更に、食品組成物と同様に、デキストリン、乳糖、デンプン等の賦形剤や香料、色素等とともに、ペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、ゼラチン等で被覆してカプセルに加工して利用することもできる。下記の通常、医薬組成物に用いられる担体と共に用いることができ、当業者公知の方法により以下に記載の医薬製剤の形態とすることができる。
【００２５】
医薬組成物の形態としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤、トローチ剤等の経口剤、注射剤、点眼剤、エアゾール剤、経皮吸収剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。
【００２６】
本発明の医薬組成物は、本発明の培養方法で得られた冬虫夏草菌糸体、及び／又は当該菌糸体より抽出されるエキスと、医薬として許容できる担体を含む。本明細書で使用する「医薬として許容できる担体」という用語は添加剤も含む。「医薬として許容できる担体」として、当業者公知のように、例えば、賦形剤（例えば、デンプン、コーンスターチ、ブドウ糖、果糖、ソルビトール、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、乳糖、ショ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム等）、結合剤（例えば、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ゼラチン、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、デンプン、コーンスターチ、ショ糖等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等）、滑沢剤（例えば、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ケイ酸マグネシウム、タルク等）、希釈剤（例えば、水、食塩水、大豆油、ゴマ油、オリーブ油等のような植物油等）、軟膏基剤（例えば、パラフィン、ラノリン、白色ワセリン、ミツロウ等）、矯味剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等のようなパラオキシ安息香酸エステル類、安息香酸ナトリウム等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ブドウ糖、マンニトール等）、保存剤（例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル等）、増粘剤（例えば、グアガム等）、酸化防止剤（例えば、ビタミンＥ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
注射剤の場合は、安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。
【００２８】
投与量は、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、経口の場合、通常成人１日あたり前記部分精製品を、１〜１０００ｍｇを１日１回から数回に分けて服用するのが適当である。非経口の場合、通常、成人で１日あたり前記部分精製品を０．５〜５００ｍｇを１日１回から数回に分けて静脈注射、皮下注射、筋肉注射するのが好ましい。
【００２９】
本発明の培養方法によって得られた冬虫夏草菌糸体、そのエキス、あるいは、エキスの部分精製品は、従来より用いられてきた生薬材料を原料とするもので、有効投与量での毒性は極めて低く、副作用はほとんど認められない。ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ等の哺乳類に対して安全に投与することができる。家畜の飼料用途に適用する場合には、例えば冬虫夏草菌糸体、そのエキス、あるいは、エキスの部分精製品を、通常の飼料に添加して投与することができる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を詳細に説明するために実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３１】
実施例１（サナギタケ菌糸体の培養方法）
割麦１５０  ｇ、乾燥ビール酵母（キリンビール（株）製）３０  ｇと水３００  ｍｌを混合し、１２１℃で１５分間、高圧蒸気滅菌器にて殺菌してから室温になるまで放置し、その後無菌状態で、滅菌容器に培地を充填し、試験区とした。サナギタケの菌糸体の直径３  ｍｍの寒天片（寒天培地（ポテトデキストロース）で前培養したコロニーよりコルクボーラーで３  ｍｍΦの寒天片を打ち抜いたもの）を上記培地に接種し、２４℃、湿度９０％以上、２１日間培養した。その間、１日に、４００〜５００  ｎｍの波長域にピークを持つ青色光（ＮＥＣ製：カラー蛍光ランプ）を６時間照射し、６時間暗所に置くことを繰り返した。菌糸が覆った培地を割りほぐして、同様に光を間欠的に照射しながら、更に１４〜２１日培養を続け、本発明の菌糸培養物４６３  ｇを得た。対照区として、おが屑８０  ｇ、米糠６４  ｇ、サナギ粉３６  ｇと水３００  ｍｌを混合した培地で、昼色光（白色蛍光管）を間欠的にあてて、同様に試験を行い、菌糸体培養物４６０  ｇを得た。得られた菌糸体（全量）より３０％エタノールにて抽出し、エキス各々９０  ｇおよび７１  ｇを得た。得られたエキスを用いて、後述のように神経細胞の分化誘導活性、及び、骨髄性白血病細胞の増殖抑制作用を調べた。また、液体クロマトグラフィーにてコルジセピンを分析した。
【００３２】
神経細胞の分化誘導活性は、以下のように調べた。
１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞はグリア細胞の一種であるアストロサイトが癌化したものであり、アストロサイトと同様に外部からの刺激により神経栄養因子を分泌する。また、神経細胞のモデル細胞であるＰＣ１２細胞は、ラット副腎髄質由来褐色細胞腫より樹立された細胞株（親クロム細胞腫細胞）であり、神経成長因子（ＮＧＦ）に応答して神経突起を伸展し、神経細胞様に変化する。１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞に関しては５（ｖ／ｖ）％牛胎児血清を含んだダルベッコ変法イーグル培地中で、３７℃、５％二酸化炭素混有空気（水蒸気飽和）中でｐＨ  ７．２〜７．４で培養した。ＰＣ１２細胞に関しては１０（ｖ／ｖ）％牛胎児血清及び５（ｖ／ｖ）％馬血清を含んだダルベッコ変法イーグル培地中で、３７℃、５％二酸化炭素混有空気（水蒸気飽和）中でｐＨ  ７．２〜７．４で培養した。
【００３３】
３５  ｍｍシャーレに細胞を約２万個ずつ１３２１Ｎ１アストロサイトーマ細胞を分注し、翌日細胞が容器に付着したことを確認し、前記抽出エキスを添加した。抽出エキスは、ジメチルスルホキシドに溶解し、ミリポアフィルター（０．２  μｍ）にてろ過滅菌後、最終濃度１０  ｎＭになるように添加した。分化誘導の陽対照には、ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）をジメチルスルホキシドに溶解させ、最終濃度１００  ｎＭとなるように添加した。２日後その培養上清を取り、あらかじめ培養しておいたＰＣ−１２細胞の培養用培地と交換した。ＰＣ−１２細胞を培養上清で２日間培養後、位相差顕微鏡により形態観察を行い、その分化の程度を評価した。その評価方法は、個々の細胞について、全く変化していないものを０点、細胞体の直径と同程度の突起進展が見られるものを１点、細胞体の２−３倍の突起進展が見られるものを２点、非常に長い突起進展やシナプス形成が見られるものを３点とし、１００個の細胞について得られた点数の平均値を細胞分化の指標とした。この結果を表１に示す。この結果から、本発明の方法により得られた冬虫夏草菌糸体が高い神経細胞の分化誘導活性を有していることがわかる。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
骨髄性白血病細胞に対する増殖抑制活性は、以下のように調べた。
ヒト白血病細胞ＨＬ−６０は、前骨髄性白血病由来の癌細胞株（原ＡＴＣＣ株ＣＣＬ−２４０、浮遊細胞）であり、好中球、マクロファージに分化できる能力を持ち、分化及びアポトーシス研究に多様される。この細胞をシャーレの中で静置培養し、前記抽出エキスを添加して、細胞に対する増殖抑制能について検討した。培養液はＲＰＭＩ１６４０培地に１０（ｖ／ｖ）％牛胎児血清を含み、３７℃、５％二酸化炭素混有空気（水蒸気飽和）中でｐＨ７．２〜７．４に保った。
【００３６】
２４穴プレート（浮遊細胞用）を用い、８〜２０万ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように、１  ｍｌ／穴の細胞懸濁液を接種し、細胞培養２〜３日目に、希釈した試料を１０  μｌ／穴で添加した。前記抽出エキスは、ジメチルスルホキシドに溶解・希釈し、ミリポアフィルター（０．２  μｍ）にてろ過滅菌後、ＨＬ−６０細胞培養液に最終濃度が１００  μｇ／ｍｌになるように添加した。負対照には、希釈液ジメチルスルホキシド１０  μｌ／穴を添加した。
【００３７】
培養１日後、細胞懸濁液１５  μｌ／穴を取り、培地で１０倍に希釈した。この細胞希釈液のＡＴＰ活性をＡＴＰアナライザー（東亜電波工業製）で測定した。また、細胞形態を顕微鏡で観察した。細胞がつぶれて、培養液中に顆粒が散乱しているものを、細胞増殖抑制＋（有り）、細胞形態がきれいで変化しないものを、細胞増殖抑制−（無し）とした。
【００３８】
試料は、ｎ＝３穴でＡＴＰ活性を測定し、平均と標準偏差を求めた。無添加（ＤＭＳＯのみ添加）の平均値を１００として、各試料の平均値と標準偏差値を算出し、Ｔ−検定法を用いて、無添加に対する有意差を求めた。ｐ＜０．０５を有意差有りとした。結果を表２に示す。この結果から、本発明の方法により得られた冬虫夏草菌糸体が高い骨髄性白血病細胞の増殖抑制活性を有していることがわかる。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
また、抗菌活性を有するコルジセピンの含有量は、以下のように調べた。逆相系液体クロマトグラフィー（カラムＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−８０ＴＭ、東ソー社製）を用いて前記抽出エキス成分を分離し、エキス中のコルジセピン含有量を測定した。検出にはＵＶ波長２６８  ｎｍを使用し、移動相には、１０％メタノールを使用した。含有量を表３に示す。この結果から、本発明の方法により得られた冬虫夏草菌糸体はコルジセピンを高濃度に含有していることがわかる。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
実施例２（ウスキサナギタケ菌糸体の培養方法）
培地は、Ｎｏ．１（米糠９０  ｇ、コーンコブ粉砕物４５  ｇ、豆皮４５  ｇ）、Ｎｏ．２（おが屑８０  ｇ、米糠５０  ｇ、コーンコブ粉砕物２０  ｇ、サナギ粉３０  ｇ）、Ｎｏ．３（割麦７０  ｇ、おが屑８０  ｇ、サナギ粉３０  ｇ）、Ｎｏ．４（割麦１２０  ｇ、おが屑３０  ｇ、サナギ粉３０  ｇ）、Ｎｏ．５（割麦１５０  ｇ、サナギ粉３０  ｇ）、Ｎｏ．６（割麦１５０  ｇ、煮干し３０  ｇ）、Ｎｏ．７（割麦１４０  ｇ、酵母４０  ｇ）、Ｎｏ．８（割麦１６０  ｇ、酵母エキス２０  ｇ）、Ｎｏ．９（蕎麦１６０  ｇ、酵母エキス２０  ｇ）、Ｎｏ．１０（割麦５０  ｇ、サナギ粉１００  ｇ、酵母３０  ｇ）を使用し、水３００  ｍｌを加えて培地を作成した。なお、酵母は乾燥ビール酵母（キリンビール製）を使用した。酵母エキスは乾燥酵母エキス（ナカライラスク（株）製）を使用した。昼色光、又は、４００〜５００  ｎｍの波長域にピークを持つ青色光を実施例１と同様に間欠的に照射して実施例１と同様に培養を行い、菌糸体培養物を得た。得られた菌糸体（全量）より３０％エタノールにてエキスを抽出した。得られたエキスを実施例１記載の方法で、神経細胞の分化誘導活性、骨髄性白血病細胞の増殖抑制活性の有無、及びコルジセピンの含有量を測定した。結果を表４に示す。この結果から、本発明の方法（青色光照射）により得られた冬虫夏草菌糸体は、昼色光を用いた場合に比べてコルジセピンを高濃度に含有していることがわかる。
また、昼色光を用いた場合に比べ、本発明の方法を用いると、神経細胞分化誘導活性の指標値の増加がみられる。さらに、Ｎｏ．５、６、１０では、昼色光を用いた場合には骨髄性白血病細胞増殖抑制活性が認められなかったのに対し、本発明の方法では当該抑制活性が認められた。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
実施例３（冬虫夏草株の培養）
実施例１記載（試験区）の本発明の方法で、異なる冬虫夏草株の菌糸体培養を行い、菌糸体培養物を得た。得られた菌糸体（全量）より３０％エタノールにて抽出しエキスを得た。得られたエキスを実施例１記載の方法で、神経細胞の分化誘導活性、骨髄性白血病細胞の増殖抑制活性の有無、及びコルジセピンの含有量を測定した。結果を表５に示す。この結果から、本発明の方法により得られたこれらの冬虫夏草菌糸体はコルジセピンを高濃度に含有し、神経細胞の分化誘導活性及び骨髄性白血病細胞の増殖抑制活性を有していることがわかる。
【００４５】
【表５】
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【００４６】
実施例４（抽出エキスを含む固形物の製造方法）
実施例１記載（試験区）の本発明の方法により、培養・抽出したエキスに、倍量の重量のコーンスターチを加え均一になるまで混合・練合する。この練合物を乾燥機にて６０〜７０℃で２４時間乾燥する。乾燥物をミキサーにて粉砕して粉末とした。この製剤は医薬組成物又は食品組成物として利用できるものである。
【００４７】
実施例５（抽出エキスを含む固形物の製造方法）
実施例１記載（試験区）の本発明の方法により、培養・抽出したエキスを、デキストリン、グアガム等の混合物に噴霧して顆粒を形成させ、実施例４と同様に利用することができる。
【００４８】
実施例６（抽出エキスを含む液状物の製造方法）
実施例１記載（試験区）の本発明の方法により、培養・抽出したエキス１５０  ｍｇ、精製大豆油１２５  ｇ、ミツロウ１５  ｍｇ及びビタミンＥ１０  ｍｇを窒素ガス雰囲気下で約４０℃に加温し、十分に混合して均質な液状物とした。これをカプセル充填機に供給して１粒内容量３００  ｍｇのゼラチンカプセル製剤を作製した。この製剤は、実施例４と同様に利用することができる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の冬虫夏草菌糸体の培養方法は、３５０〜５５０  ｎｍの波長域にピークをもつ光を連続又は間欠的に照射しながら培養することで、薬理活性及び含有成分を有する菌糸体を効率的に、かつ、安定に生産することができる。また、これらの冬虫夏草培養品より抽出を行うことで、前記薬理活性画分及び／又は有効成分を効率よく回収することができる。前記薬理活性及び／又は有効成分を含む固形物及び液状物を調製することで、これらは、脳神経細胞の細胞死を伴う疾患、癌に対する予防及び治療、免疫増強等の医薬品用組成物及び食品用組成物を提供することができる。