(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒスタミン生産菌の検出方法、菌種同定方法及び該方法で用いるプライマーを提供する。【解決手段】ヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素コーディング配列を基に設計したプライマーを用いて、検査試料にＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を電気泳動することによりヒスタミン生産菌を検出し、かつＳＳＣＰ解析により検出したヒスタミン生産菌の菌種を同定する。【効果】本発明の方法によりヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出できるようになった。また本発明の同定方法により原因菌の特定が容易になり、汚染源を速やかに解明することが可能となった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミン生産菌の検出方法であって、
ヒスタミン生産菌検出用プライマーを検査試料に加えること；
該検査試料を用いてＰＣＲを行うこと；及び
得られたＰＣＲ産物を電気泳動することを特徴とする該検出方法。
【請求項２】
該電気泳動で、ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列を含むＰＣＲ産物のバンドを検出する、請求項１記載の該検出方法。
【請求項３】
ヒスタミン生産菌検出用プライマーが、配列番号１の塩基配列を有する複数のフォワードプライマーを含む、請求項１記載の該検出方法。
【請求項４】
該フォワードプライマーの長さが２３〜４２塩基である、請求項３記載の該検出方法。
【請求項５】
ヒスタミン生産菌検出用プライマーが、配列番号２の塩基配列を有する複数のフォワードプライマーを含む、請求項１記載の該検出方法。
【請求項６】
ヒスタミン生産菌検出用プライマーが、配列番号３の塩基配列を有する複数のリバースプライマーを含む、請求項１記載の該検出方法。
【請求項７】
該リバースプライマーの長さが１７〜４２塩基である、請求項６記載の該検出方法。
【請求項８】
ヒスタミン生産菌検出用プライマーが、配列番号４の塩基配列を有する複数のリバースプライマーを含む、請求項１記載の該検出方法。
【請求項９】
配列番号１の塩基配列を含むヒスタミン生産菌検出用プライマー。
【請求項１０】
該塩基配列の長さが２３〜４２塩基である、請求項９記載のヒスタミン生産菌検出用プライマー。
【請求項１１】
配列番号２の塩基配列を含むヒスタミン生産菌検出用プライマー。
【請求項１２】
配列番号３の塩基配列を含むヒスタミン生産菌検出用プライマー。
【請求項１３】
該塩基配列の長さが１７〜４２塩基である、請求項１２記載のヒスタミン生産菌検出用プライマー。
【請求項１４】
配列番号４の塩基配列を含むヒスタミン生産菌検出用プライマー。
【請求項１５】
ヒスタミン生産菌の菌種同定方法であって、
ヒスタミン生産菌検出用プライマーを検査試料に加えること；
該検査試料を用いてＰＣＲを行うこと；
得られたＰＣＲ産物を電気泳動すること；
電気泳動で得られたバンドから、ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列を含むＰＣＲ産物を回収すること；
該ＰＣＲ産物を変性させて一本鎖ＤＮＡフラグメントとし、非変性条件下で電気泳動してＰＣＲ産物の泳動パターンを得ること；及び
該泳動パターンを、ヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンと比較して菌種を同定することを特徴とする該菌種同定方法。
【請求項１６】
変性させて一本鎖ＤＮＡ断片を得る前に、該ＰＣＲ産物を制限酵素により切断する工程を含む、請求項１５記載の該菌種同定方法。
【請求項１７】
該制限酵素がＨｉｎｆ  Ｉである、請求項１６記載の該菌種同定方法。
【請求項１８】
ヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンを有する、ヒスタミン生産菌同定用標準データシート。
【請求項１９】
エンテロバクター  アムニゲネス、モルガネラ  モルガニイ、Ｅ．  アエロゲネス、及びホトバクテリウム  ダムセラエからなる群から選ばれた少なくとも１種のヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンを有する、請求項１８記載のヒスタミン生産菌同定用標準データシート。
【請求項２０】
配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号３の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、ヒスタミン生産菌の検出用キット。
【請求項２１】
配列番号２の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、請求項２０記載の該キット。
【請求項２２】
配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号３の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、ヒスタミン生産菌の菌種同定用キット。
【請求項２３】
配列番号２の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、請求項２２記載の該キット。
【請求項２４】
ＰＣＲ産物の切断用制限酵素を含む、請求項２２又は２３記載の該キット。
【請求項２５】
ヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンを有する、ヒスタミン生産菌同定用標準データシートを含む、請求項２２又は２３記載の該キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒスタミン生産菌の検出方法、及び該方法で用いるプライマーに関するものである。さらに詳細に述べると、本発明は、新規なヒスタミン生産菌検出用プライマーを用いるヒスタミン生産菌の検出方法、及び該プライマーを用いてヒスタミン生産菌のＰＣＲ産物を得て、ＳＣＣＰ解析によりヒスタミン生産菌の菌種を同定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９５０年代初頭、日本各地において発生した赤身魚加工品によるアレルギー様食中毒は、原因食品の分析からヒスタミンがその主因であることが判明した。該食中毒は、食後５分〜３時間、平均３０分で発症し、顔面紅潮、じん麻疹、酩酊感、頭痛、希に嘔吐、下痢などの症状を呈し、２４時間以内に回復し、抗ヒスタミン薬剤の投与が有効とされている。１９８６年〜１９９５年の本食中毒の発生状況からは、マグロ、イワシ、サンマといった赤身魚類が原因となっている。また、ヒスタミンは熱に対して安定であるため、焼き魚、フライ、缶詰などに加工された食品においても頻発しており、最近は欧米でも魚食嗜好を反映して本食中毒の発生が増加傾向にある。
【０００３】
本食中毒の原因物質であるヒスタミンは、食品中に含まれる遊離ヒスチジンが微生物由来のヒスチジン脱炭酸酵素の作用により脱炭酸化されることによって生成される。赤身魚において本食中毒が起きやすいのは、遊離ヒスチジン含量が白身魚では数ｍｇ〜数十ｍｇ／１００ｇであるのに対し、赤身魚では７００ｍｇ〜１８００ｍｇ／１００ｇと非常に高いためとされている。
【０００４】
現在までに、水産物において本食中毒の原因となるヒスチジン脱炭酸酵素を持つ細菌は、エンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ  プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、モロガネラ  モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）等の腸内細菌群で多く見出されている。これらはグラム陰性菌で、共通してピリドキサールリン酸依存型のヒスチジン脱炭酸酵素を持つことが知られている。
【０００５】
従来から、これらヒスタミン生産菌の分離や検出には生化学に基づく手法として、ニベン（Ｎｉｖｅｎ）培地が一般的に用いられてきたが、この培地は菌体の生成するアミンによる培地のｐＨ上昇を指示薬で判定するので、擬陽性や擬陰性のような不明瞭な判定となることも多く、ヒスタミン生産菌を正確に検出することは困難で、その判定にもかなりの時間と労力を要するものであった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来の生化学的方法、及び培養法によるヒスタミン生産菌判定の不明瞭さ、大きな時間的、労力的負担を解決し、ヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出する方法を提供することを目的とする。
また本発明は、ヒスタミン生産菌の正確かつ容易な検出を可能にするポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと記載する。）用プライマーを提供することを目的とする。
さらに本発明は、ＳＳＣＰ解析を利用して、検出されたヒスタミン生産菌の菌種を、正確かつ容易に同定する方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、ヒスタミン生産菌の個別菌種又は菌株のＰＣＲ産物電気泳動パターンを有する、ヒスタミン生産菌同定用標準データシートを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するため本発明者らは、公知のヒスタミン生産菌３菌種のヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子の共通配列をもとに、独自に分離したヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子増幅、及び塩基配列の決定を繰り返した。この研究の結果、本発明らは、水産生鮮魚介類から分離されるほぼすべてのヒスタミン生産菌を非常に特異的かつ高感度に検出する共通ＰＣＲプライマーを見出した。
【０００８】
これにより本発明者らは、該ＰＣＲプライマーを用いて、ヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出する方法を完成させた。すなわち、被検試料中に該共通ＰＣＲプライマーの標的配列を有するＤＮＡが含まれていない場合、ＤＮＡの増幅が起こらないので遺伝子断片は増加しないが、該ＤＮＡが含まれる場合、増幅したＤＮＡを検出することによりヒスタミン生産菌が検出できるのである。
【０００９】
また、分離した多数のグラム陰性ヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子を系統解析した結果、該遺伝子の多型性は限定されており、菌種の同定に使用可能であるという知見を得た。そこで、これまで２種以上の遺伝子における１塩基以上の差異の高感度検出に用いられていたＳＳＣＰ解析技術を、菌同定のために適用することができるのではないかと考え研究を行った。その結果、前記ヒスタミン生産菌検出用プライマーにより得たＰＣＲ産物を用いてＳＳＣＰ解析を行うヒスタミン生産菌の菌種同定を行う方法を完成させることができた。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒスタミン生産菌の検出方法であって、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを検査試料に加えること；該検査試料を用いてＰＣＲを行うこと；及び得られたＰＣＲ産物を電気泳動することを特徴とする該検出方法を提供する。また、該方法において検出するＰＣＲ産物は、ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列を含むものであってもよい。
【００１１】
また本発明は、特定の塩基配列、例えば、配列番号１の塩基配列を有する複数のフォワードプライマーを含むヒスタミン生産菌検出用プライマーを提供する。
さらに、本発明は、特定の塩基配列、例えば、配列番号３の塩基配列を有する複数のリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを提供する。
さらに本発明は、ヒスタミン生産菌の菌種同定方法であって、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを検査試料に加えること；該検査試料を用いてＰＣＲを行うこと；得られたＰＣＲ産物を電気泳動すること；電気泳動で得られたバンドから、ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列を含むＰＣＲ産物を回収すること；該ＰＣＲ産物を変性させて一本鎖ＤＮＡ断片とし、非変性条件下で電気泳動してＰＣＲ産物の泳動パターンを得ること；及び該泳動パターンをヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンと比較して菌種を同定することを特徴とする該菌種同定方法を提供する。該菌種同定方法において、変性させて一本鎖ＤＮＡ断片を得る前に、該ＰＣＲ産物を制限酵素、例えばＨｉｎｆ  Ｉにより切断してもよい。
【００１２】
さらに本発明は、ヒスタミン生産菌の菌種同定用泳動パターンを有する、ヒスタミン生産菌同定用標準データシートを提供する。
さらに本発明は、配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号３の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、ヒスタミン生産菌の検出用キットを提供する。
さらに本発明は、配列番号１の塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号３の塩基配列を含むリバースプライマーを含む、ヒスタミン生産菌検出用プライマーを含む、ヒスタミン生産菌の菌種同定用キットを提供する。
【００１３】
次に本明細書における用語と定義について説明する。
本明細書における用語「ヒスタミン生産菌検出用プライマー」とは、ヒスタミン生産菌を特異的かつ高感度に検出する共通ＰＣＲプライマーをいい、フォワードプライマー及びリバースプライマーを複数含むものを意味する。
本明細書における用語「フォワードプライマー」とは、増幅したい遺伝子領域の５’末端部分に相当する塩基配列（センス側）を有する、アンチセンス鎖の３’側プライマーをいう。
本明細書における用語「リバースプライマー」とは、増幅したい遺伝子領域の３’末端部分に相補的な塩基配列（アンチセンス側）を有する、コード鎖の３’側プライマーをいう。
【００１４】
本明細書における用語「ＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素」とは、ヒスチジンを基質としヒスタミンを合成する酵素（ヒスチジン脱炭酸酵素）のうち、補酵素としてピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を必要とするものをいう。
本明細書における用語「ｈｄｃ遺伝子」とは、ヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝情報をコードした遺伝子のことをいう。
本明細書における用語「ヒスチジン脱炭酸酵素」とは、ヒスチジンからヒスタミンを合成する酵素で、補酵素としてピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を必要とするＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素と、活性中心にピルボイル基をもつピルボイル型ヒスチジン脱炭酸酵素の２種類を含む。
【００１５】
本明細書における用語「非変性条件」とは、２本鎖ＤＮＡであるＰＣＲ産物が一本鎖に分かれた状態で維持される条件を意味する。
本発明の菌種同定方法で使用する「ＳＳＣＰ解析」（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）とは、一本鎖ＤＮＡフラグメントを非変性条件下で電気泳動すると、移動度はＤＮＡ鎖長と配列に依存して異なることを利用したＤＮＡフラグメントの変異又は多型を高感度にスクリーニングする解析方法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
アレルギー様食中毒を起こすヒスタミン生産菌の検討
本食中毒の原因となるヒスチジン脱炭酸酵素を持つ細菌としては、腸内細菌群のエンテロバクター  アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ  プランチコラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ）、モルガネラ  モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）などや、海洋性細菌の強いヒスタミン生成能をもつホトバクテリウム  ヒスタミヌム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｉｓｔａｍｉｎｕｍ  （＝Ｐ．  ｄａｍｓｅｌａｅ））が報告されている。これらはグラム陰性菌で、共通してピリドキサールリン酸依存型のヒスチジン脱炭酸酵素を持つことが知られている。
【００１７】
また、チーズやキャベツの酢漬けなどの発酵食品、及びワインやビールのような飲料においても高濃度のヒスタミンが蓄積することがあり、これらはグラム陽性菌で、ピルボイル型のヒスチジン脱炭酸酵素をもつラクトバシルス  ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、レウコノストク  オエノス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｏｅｎｏｓ）などの乳酸菌が主な生産菌であるとされている。これらヒスタミン生産菌のＰＣＲ検出は、Ｖｏｓｓｅｎらの論文（Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  ７８：３１６−３２６，  １９９５）によってワイン中のグラム陽性ヒスタミン生成乳酸菌の検出として報告されている。
【００１８】
しかし、水産物の食中毒の原因となる、グラム陰性ヒスタミン生産菌についてはまだ行われておらず、衛生学的観点にもとづくこれら菌群の挙動の把握や食中毒の原因究明を簡便、正確かつ迅速に検出する方法が必要であった。本発明者らはＰＣＲ法によるグラム陰性ヒスタミン生産菌の検出法を検討し、グラム陰性ヒスタミン生産菌のヒスチジン脱炭酸酵素の分子系統学的知見を得、これに基づく同定法の確立、及び海洋性ヒスタミン生産菌Ｐ．  ヒスタミヌムの分子系統の再度見直しを行い、ＰＣＲによる遺伝子同定の確度向上を図った。
【００１９】
ヒスタミン生産菌検出用プライマー
該検出用プライマーを作成する遺伝情報を得るため、食中毒を引き起こす可能性が指摘されているグラム陰性ヒスタミン生産菌のうち、エンテロバクター  アエロゲネス、クレブシエラ  プランチコラ、モルガネラ  モルガニイを選択した。これらの菌は、共通してピリドキサールリン酸依存型のヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）を持つことが報告されているおり、またその遺伝子についても詳細な知見が得られている。
【００２０】
グラム陰性菌においてヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝子の知見が得られているのは、上記３菌種のみであり、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）やハフニア属（Ｈａｆｎｉａ）などの中にはヒスタミン生成能を持つ菌がいることは報告されているものの、その酵素や遺伝子についての知見はない。該遺伝子についての知見が得られている３菌種の塩基配列は、互いの相同性が７０％以上と大変高く、ＰＣＲ法等の分子生物学的手法による検出が可能であると考えられた。
【００２１】
プライマーの設計は次のように行った。国立遺伝研究所のデーターベース上に登録されているモルガネラ  モルガニイ（ＡＴＣＣ３５２００）、エンテロバクター  アエロゲネス  （ＡＴＣＣ４３１７５）、クレブシエラ  プランチコラ（ＡＴＣＣ４３１７６）のｈｄｃ塩基配列について、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ  ｖｅｒ．１０（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を用いてアライメントをとり、相同性が高く、プライマーに適していると思われる領域を特定した。
【００２２】
ＰＣＲ産物として増幅する領域を、ヒスチジン脱炭酸酵素（ＨＤＣ）の活性中心であるＳ−Ｘ−Ｈ−Ｇをコードしている部位を含む７０９ｂｐの範囲としてプライマーを設計した。ここでフォワードプライマーはｈｄｃ遺伝子の１３２−１５０塩基の位置、リバースプライマーは８１７−８４１塩基の位置を基準にそれぞれ作成した。プライマー配列はＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ１．０  （Ｐｅｒｋｉｎ−  Ｅｌｍｅｒ）ソフトウェアを用いて、Ｔｍ値、プライマーダイマーの可能性等を検討して決定した。
【００２３】
（フォワードプライマー）
本発明のフォワードプライマーは次の塩基配列を含むものである。
ｈｄｃ−ｆ（１）：  ５’−Ｈ  ＡＴＹ  ＡＲＹ  ＡＡＣ  ＴＧＹ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  Ｒ−３’    （２３ｂｐ）（配列番号１）
ｈｄｃ−ｆ（２）：  ５’−ＴＣＨ  ＡＴＹ  ＡＲＹ  ＡＡＣ  ＴＧＹ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＲＧ−３’  （２６ｂｐ）  （配列番号２）
式中、Ｈはアデニン、シトシン又はチミン、Ｒはグアニン又はアデニン、かつＹはチミン又はシトシンである。
【００２４】
配列番号１の塩基配列はそれぞれ９６通りあり、したがって、フォワードプライマーはその塩基長が同じであれば９６種類存在する。本発明を実施する場合、必要に応じて各フォワードプライマーを組み合わせて、又はすべて使用することができる。
フォワードプライマーの長さは、配列番号１の塩基配列を含めば特に制限する必要はないが、通常２３〜４２塩基、好ましくは２３〜３２塩基である。また、配列番号２の塩基配列からなる２６塩基長さのフォワードプライマーを、組み合わせて又はすべて使用して、本発明の検出方法を実施することができる。
【００２５】
（リバースプライマー）
本発明のリバースプライマーは次の塩基配列を含むものである。
ｈｄｃ−ｒ（１）：  ５’−  ＫＣＡ  ＴＢＡ  ＲＷＧ  ＧＤＧ  ＴＲＴ  ＧＲ−３’    （１７ｂｐ）（配列番号３）
ｈｄｃ−ｒ（２）：  ５’−  ＣＣＣ  ＡＣＡ  ＫＣＡ  ＴＢＡ  ＲＷＧ  ＧＤＧ  ＴＲＴ  ＧＲＣ  Ｃ−３’  （２５ｂｐ）（配列番号４）
式中、Ｂ  はグアニン、シトシン又はチミンを、Ｋはグアニン又はチミン、Ｒはグアニン又はアデニン、かつＷはアデニン又はチミンである。
【００２６】
配列番号３の塩基配列はそれぞれ２８８通りあり、したがって、リバースプライマーはその塩基長が同じであれば２８８種類存在する。本発明を実施する場合、必要に応じて各フォワードプライマーを組み合わせて、又はすべて使用することができる。
リバースプライマーの長さは、配列番号３の塩基配列を含めば特に制限する必要はないが、通常１７〜４２塩基、好ましくは１７〜３２塩基である。また、配列番号４の塩基配列からなる２５塩基長さのフォワードプライマーを、組み合わせて又はすべて使用して、本発明の検出方法を実施することができる。
【００２７】
本発明のヒスタミン生産菌検出用プライマーは、複数の前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、ヒスタミン生産菌を特異的かつ高感度に検出する共通ＰＣＲプライマーである。前記フォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせは特に制限されないが、必要に応じて配列番号１の塩基配列すべてに対応するフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列すべてに対応するリバースプライマーを有する組み合わせを用いることもできる。
【００２８】
本発明のヒスタミン生産菌検出方法
本発明の被検試料には、食品衛生上、ヒスタミン生産菌検査を必要とするあらゆる食品、（例えば、魚介類、水産加工品、食肉・食肉製品、乳製品、穀類、野菜・果物、農産加工品等）、食品加工工場、又は調理施設などの廃液、廃棄物などがある。これらの被検試料からヒスタミン生産菌の核酸を含むＰＣＲ用試料を調製する。該被検試料からヒスタミン生産菌の核酸を含むＰＣＲ用試料の調製は、従来のゲノムＤＮＡの調製の場合と同様の手法により行うことができ、例えば、ＳＤＳ溶解法、フェノール／クロロホルム抽出、塩化セシウム密度勾配遠心法等を適宜組み合わせて行うことができる。
【００２９】
本発明のＰＣＲは、常法により、市販のＰＣＲ装置、例えばＡＢＩ社製２４００を用いて実施することができる。周知のようにＰＣＲ法の増幅反応は、ＤＮＡの熱変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼ伸長反応のそれぞれの温度条件で反応液をインキュベートすることによって進行し、この三つのステップからなる温度サイクルを繰り返すことで所望のＰＣＲ産物が得られる。本発明においては、使用する複数のプライマーの塩基長を均一にし至適条件を予備実験などによって確認することで高感度で目的とする増幅産物を得ることができる。
【００３０】
本発明で用いるプライマーと、ＰＣＲ産物の大きさを考慮すると、通常、ＤＮＡの熱変性は、９０〜１００℃で、５秒〜２分、特に９４〜９８℃で１５秒〜１分、アニーリングは、４５〜６５℃で、３０秒〜２分、特に５６〜６０℃で３０秒〜１分３０秒、かつポリメラーゼ伸長反応は６０〜７５℃で３０秒〜２分間、特に７０〜７２℃で３０秒〜１分とするのが好ましい。
特に、本発明では、配列番号２の塩基配列からなる均一長のフォワードプライマー、及び配列番号４の塩基配列からなる均一長のリバースプライマーを使用する場合、これらＰＣＲ反応の温度及び反応時間を予備実験により厳格に定めることにより極めて高い感度でヒスタミン生産菌の遺伝子に対応するＰＣＲ産物を得ることができる。
【００３１】
本発明で検出するヒスタミン生産菌の遺伝子は、該菌を検出できるものであれば特に制限されないが、好ましいのはＰＬＰ依存型ヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心のアミノ酸配列Ｓ−Ｇ−Ｈ−Ｋをコードする塩基配列、又は該塩基配列の相補的配列である。本発明では、ＰＣＲ法によりこれらの塩基配列に対応するＰＣＲ産物を得て、アガロースゲルによる電気泳動を行ってヒスタミン生産菌を検出する。
【００３２】
ヒスタミン生産菌の同定
本発明者らは、分離されたヒスタミン生産菌についてｈｄｃ遺伝子の塩基配列を決定し、得られた配列に関して系統解析を行い、当該配列がヒスタミン生産菌の属や種を反映し、菌種の同定や類縁関係の解析に応用が可能であるか否かを検討した。
ヒスタミン生産菌であるＭ．  モルガニイ  ４株、Ｒ．  プラチコラ  ２株、Ｐ．  ダムセラエ  ２株、プロテウス  ブルガリス，  エルウィニア  ｓｐ．，  Ｐ．  ホスホレウム各１株のｈｄｃ遺伝子の塩基配列を決定し、互いの相同性を調べたところ、ＤＮＡレベルで７３．８％〜９８．９％，  アミノ酸レベルで８２．６％〜１００％の相同性を有していた。これらの配列は全く同じ位置にＰＬＰ依存型のヒスチジン脱炭酸酵素の活性中心であるＳ−Ｇ−Ｈ−Ｋの配列を含んでいた。
【００３３】
当該遺伝子配列の進化系統を解析し、１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列に基づく系統樹と比較したところ、類似した系統関係を示した（図４）。図４においてＡは１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列に基づく系統樹であり、Ｂはｈｄｃ遺伝子配列に基づく系統樹である。
この比較から判るように１６Ｓ  ｒＤＮＡ  に基づく系統解析で近縁であるとされているＭ．  モルガニイとＰｒ．  ブルガリス  はｈｄｃ遺伝子による系統解析でも近縁であり、同様に１６Ｓ  ｒＤＮＡによる系統的に近縁である海洋性細菌ホトバクテリウムに属する株は腸内細菌科の菌群とは別のクラスターを形成した。
【００３４】
このようにｈｄｃ遺伝子の種特異性が示され、またその系統解析により種内での保存性、種間での多型が明らかとなったため、この多型を検出し、菌種判別が可能であると判断された。
本発明ではｈｄｃ遺伝子の多型解析を塩基配列の決定ではなく、ＳＳＣＰ  （Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）  解析により行う。
該ＳＳＣＰ解析は、解析する２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖に解離し、その塩基配列に依存した独自の高次構造をポリアクリルアミドゲル電気泳動することを原理としており、１塩基置換を移動度の差として検出できるので、遺伝子中の数塩基の変異を検出することが可能である。該解析において、ゲル濃度や泳動温度を一定にすることで極めて高い再現性を得ることができる。このような特質から該ＳＳＣＰ解析は遺伝子のポイント変異の解析や、環境中の微生物相の解析に利用されている。該ＳＳＣＰ解析は、多型解析法の一つであり、１９９１年、関谷らにより、ヒトがん細胞においてがん抑制遺伝子の１塩基変異を検出するために開発されたものである（Ｔ．  Ｓｅｋｉｙａらの論文，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ８６：２７６６−２７７０，  １９８９）。
【００３５】
本発明においては、該ＳＳＣＰ解析にヒスタミン生産菌の検出で得た２本鎖ＤＮＡ、つまりＰＣＲ産物を利用する。すなわち該ＳＳＣＰ解析によりヒスタミン生産菌の標準株から菌種同定用泳動パターンを作成し、該パターンと前記検出方法で得たＰＣＲ産物の１本鎖ＤＮＡ電気泳動パターンを比較することにより、検出されたヒスタミン生産菌の菌種を特定するのである。
【００３６】
本発明においては、標準株から得た菌種同定用泳動パターンを集めて同定用標準データを作成する。該標準データは紙、プラスチックフィルムなどのデータシートとするか、又はこれらをコンピュータによりデータベースとする。
本発明においてＳＳＣＰ解析を常法により行う。該ＳＳＣＰ解析において、２本鎖ＤＮＡをホルムアミド、尿素、水酸化ナトリウム、ホルムアルデヒドなどの解離剤の存在下で処理し１本鎖ＤＮＡに解離させる。
また、電気泳動にもちいるポリアクリルアミドゲルのゲル濃度及び泳動温度は、使用するＰＣＲプライマーなどにより最適な条件を決めるのが好ましいが、ゲル濃度は、通常６〜３０％、特に２０〜２５％とするの好ましく、また泳動温度は通常５〜２５℃、特に１０〜１５℃とするのが好ましい。
【００３７】
本発明のプライマーにより得られるＰＣＲ産物は７００塩基以上と長いため、ＳＳＣＰ解析の必要に応じて制限酵素処理することが好ましい。該制限酵素は得られるＰＣＲ産物をＳＳＣＰ解析に適当な長さ、例えば２００〜３００塩基長に切断できるものであれば特に制限なく使用することができる。該制限酵素の例を挙げると、Ｈｉｎｆ  Ｉ，  Ｍｓｅ  Ｉ，  Ａｌｕ  Ｉ，  Ｍｂｏ  Ｉ，  Ｈａｅ  ＩＩＩ，  Ｒｓａ  Ｉ，  ＴａｑＩ，  Ｓａｕ３Ａ  Ｉ，  Ｍａｅ  Ｉ，  Ｍｓｐ  Ｉ，  Ｍａｅ  ＩＩなどがある。
なお、本発明のＰＣＲ産物を制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉで切断した場合、ほとんどの場合３〜４断片に切断された。例えば、その断片長はＭ．  モルガニイでは２７７ｂｐ，  ２６１ｂｐ，  １７１ｂｐ、またＲ．  プラチコラでは２７７ｂｐ，  ２６１ｂｐ，  １３０ｂｐ，  ４０ｂｐであった。
実施例により本発明を更に詳細に説明する。これら実施例は本発明の説明と理解促進することを目的とし、本発明の保護範囲の限定を意図するものではない。
【００３８】
【実施例】
（実施例１）プライマー特異性試験
ＰＣＲ用試料の調製
魚肉などの被検試料から市販の核酸抽出キットＭａｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ  （東洋紡績株式会社）を用い、添付のプロトコルに従いＰＣＲ用試料を調製した。抽出したＤＮＡの濃度は、波長２６０ｎｍにおける吸光値  １  ＯＤ  をＤＮＡ５０μｇ／ｍｌとして算出した。
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
ヒスタミン生産菌の所望の遺伝子を増幅してヒスタミン生産菌を検出するため、ヒスタミン生産菌検出用プライマー存在下で、前記ＰＣＲ用試料に対しＰＣＲによる増幅反応を行った。すなわち、各菌株のＤＮＡ（５ｎｇ／ＰＣＲ）、各々５μｌについて、配列番号２の塩基配列からなるすべてのフォワードプライマー２００ｎＭと配列番号４の塩基配列からなるすべてのリバースプライマー２００ｎＭを加え、２０μＬあたり１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ４種のデオキシヌクレオシド三リン酸、０．５Ｕ  Ｔａｑ  ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）となるよう反応液を調製した。
【００３９】
次いで、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、熱変性を９４℃で、３０秒行って増幅対象ＤＮＡを１本鎖とし、アニーリングを５８℃で、１分行い、次いで伸長反応を７２℃で、１分行う３ステップ  ＰＣＲを３５サイクル実施した後、該ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（ＦＭＣ）を用い電気泳動し、エチジウムブロマイドにより染色した後、ＵＶトランスイルミネータ（２５４ｎｍ）によって検出した。
【００４０】
生成ヒスタミン量の測定
ヒスタミン生産菌のヒスタミン生成活性を、ヒスチジンブロス中で２５℃、２４時間培養し、蓄積したヒスタミン量をＨＰＬＣで測定することにより求めた。該培養液は口径０．２μｍのフィルターＤｉｓｍｉｃ−１３（アドバンテック東洋（株））を用いて濾過し、これを測定試料とした。魚肉懸濁液の試料では、５％過塩素酸で除タンパク処理を行った後、同様に濾過した。測定には蛍光検出器付きＨＰＬＣを用い、山中らの方法に従って行った（Ｙａｍａｎａｋａらの論文，  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｈｙｇ．  Ｓｏｃ．  Ｊｐｎ．  ３０：３９６−４００．  １９８９）。
【００４１】
本実施例では、配列番号２の塩基配列からなるすべてのフォワードプライマーと配列番号４の塩基配列からなるすべてのリバースプライマーで構成されるヒスタミン生産菌検出用プライマーを用いた。
プライマーを設計した際に用いた菌株：Ｅ．  アエロゲネス、Ｒ．プランチコラ及びＭ．モルガニイ、並びに菌株保存機関であるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、理化学研究所微生物系統保存施設  （ＪＣＳ：  Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）；応用微生物学研究所（ＩＡＭ：  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）から取り寄せた標準株を用い、さらに、市販鮮魚などから分離されたヒスタミン生産菌及びヒスタミン生成能を持たない一般細菌を分離した。すなわち、本発明のプライマーの特異性評価にもちいたヒスタミン生産菌は３７株、ヒスタミン生成能のない一般細菌は４７３株で合計５１０株を用いた。
【００４２】
各菌株でＰＣＲを行った結果、ヒスタミン生成能を持つグラム陰性菌３７株中、Ｐ．  ヒスタミヌムを除く３６株において目的とする７０９ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。ヒスタミン生成能を持たない４７３株にはＰＣＲ産物は見られなかった（表１〜３）。すなわち１株を除いた５０９株においては、ヒスタミン生成能の有無とＰＣＲ産物の有無が完全に一致し、したがって、本発明のプライマーはグラム陰性ヒスタミン生産菌の検出に高い特異性を有していることが明らかとなった。
【００４３】
なお、鮮魚より分離したヒスタミン生産菌は、Ｖｉｔｅｋシステム（Ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕ  Ｖｉｔｅｋ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｉｎｃ．，  Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，  Ｍｏ．）によって同定し、これで同定できない菌群ラオウルテラはＡＰＩ  ＩＤ３２Ｅ  （Ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕ  Ｖｉｔｅｋ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、ホトバクテリウム  ホスホレウムはコバヤシらの方法（Ｔ．  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  らの論文，  Ｆｉｓｈ．  Ｓｃｉ．  ６３：８０７−８１０，  １９９７）を用いて同定した。
【００４４】
図１に目的とする７０９ｂｐのＰＣＲ産物を確認した電気泳動の結果を示す。図１中、レーンｍは１００ｂｐラダーマーカ、レーン１はモルガネラ  モルガニイＡＴＣＣ３５２００、レーン２はＭ．モルガニＪＣＭ１６７２Ｔ、レーン３はＭ．モルガニ８７４１１、レーン４はＭ．モルガニＡＰ２８、レーン５はＭ．モルガニＪＵ２７、レーン６はエンテロバクター  アエロゲネスＡＴＣＣ４３１７５、レーン７はラオウルテラ  プランチコラＡＴＣＣ４３１７６、レーン８はＲ．プランチコラ８４３３、レーン９はＲ．  プランチコラ４１３１、レーン１０はプロテウス  ブルガリスＡＵ３４、レーン１１はエルウィニアｓｐ、レーン１２はホトバクテリウム  ダムセラエＡＴＣＣ３３５３９Ｔ、レーン１３はＰ．  ダムセラエＪＣＭ８９６８、レーン１４はＰ．ホスホレウムＭＢ３６及びレーン１５は陰性コントロールである。これらは下記表から明らかなようにすべてヒスタミン生産菌である。
【００４５】
また、下記表に各菌株のヒスタミン生成量、ＰＣＲの結果を示す。
2004344004.tif 000002
【００４６】
2004344004.tif 000003
【００４７】
2004344004.tif 000004
【００４８】
表１〜３の注釈
＊ａ  他に示さない限り、魚から分離された菌株はＶＩＴＥＫシステムにより同定されたものである。すべての分離菌株の同定はさらに１６Ｓｒ  ＤＮＡの部分配列により確認した。
＊ｂ  ＡＰＩ  ＩＤ３２Ｅにより同定された。
＊ｃ  フジイらの方法により同定した（Ｆｕｊｉｉらの論文１９９７，  Ｆｉｓｈ．  Ｓｃｉ．  ６３：８０７−８１０）。
＊ｄ  ＶＩＴＥＫシステム又はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｅのいずれかで同定されていない。１６Ｓｒ  ＤＮＡの部分配列によるとエルウィニアｓｐ．と９８％の同一性を示した。
【００４９】
＊ｅ  ＶＩＴＥＫシステム又はＡＰＩ  ＩＤ３２Ｅのいずれかで同定されていない。１６Ｓｒ  ＤＮＡの部分配列によるとプロテウス  ブルガリスと９８％の同一性を示した。
＊ｆ  ヒスチジン倍地中において２５℃で２４時間培養した。培養倍地のヒスタミン量をＨＰＬＣで測定した。
＊ｇ  ＮＤは未検出を意味する。
＊ｈ  細菌の提供先：ＡＴＣＣ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）；  ＪＣＭ，  理化学研究所微生物系統保存施設  （Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）  埼玉県、日本国）；ＩＡＭ，  応用微生物学研究所  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）東京、日本国；魚類から分離された細菌  該細菌は異種の魚から得られた菌株とは無関係である。
【００５０】
（実施例２）純菌系におけるヒスタミン生産菌の検出
本発明のヒスタミン生産菌検出用プライマーの検出感度と、ヒスタミン生産菌のヒスタミン生成能の関係を調べるため、強いヒスタミン生成能を持つＭ．  モルガニイを供試菌として用い、ヒスチジンブロス中におけるＭ．  モルガニイの増殖、及びヒスタミン蓄積量の経時変化とＰＣＲにより検出が可能となる時間の関係について検討を行った（図２）。
【００５１】
当初１．０×１０１ｃｆｕ／ｍｌであった菌は、培養のおよそ２時間後から対数増殖期に移行した。その後、速やかに増殖し、培養開始から１２時間後には１０９ｃｆｕ／ｍｌとなり、定常期に移行、２４時間後まで定常期とみられる状態が続いた。一方、倍地でのヒスタミン蓄積はこの定常期に達したと考えられる培養１２時間後から始まり、その後１０時間で急激に増加し、最終的に２２８ｍｇ／１００ｍｌの蓄積が見られた。Ｍ．  モルガニイのＰＣＲ検出は、培養開始から６時間後の菌数が１０４／ｍｌに増殖した時点で可能となった。この結果から明らかなように、Ｍ．モルガニイを用いた純菌系実験ではヒスタミンが蓄積するかなり前の時点でその検出が可能になった。合計３回同一の系で実験を行い、再現性を確かめたところ、ほぼ一致した結果が得られた。
【００５２】
（実施例３）魚肉を用いた試験区におけるヒスタミン生産菌の検出
魚肉を用いた試験区において、一般生菌数１０１ｃｆｕ／ｇの魚肉に同率  （１０１ｃｆｕ／ｇ）になるようにＭ．モルガニイを接種した。経時的な菌数、及びヒスタミン蓄積量を図３に示した。接種したＭ．モルガニイは魚肉中の一般生菌数と類似した挙動を示した。培養開始１６時間後にはおよそ１０７ｃｆｕ／ｇまで増殖し、ヒスタミンの蓄積が始まった。その後、魚肉中の菌数は２０時間後に１０８／ｇまで増加した後、４８時間後までほぼ水平に推移したが、魚肉中のヒスタミン量は経時的に増加し、最終計測点の４８時間後には４１．７ｍｇ／１００ｇのヒスタミンを蓄積した。
【００５３】
培養開始８時間後に１０５ｃｆｕ／ｇとなった時点でＰＣＲによる検出が可能となった。対照とした非接種区のサンプルでは、一般生菌数は接種区と変わらない増殖曲線を示したが、魚肉由来のヒスタミン生産菌は検出されず、ＰＣＲを用いた検出においても増幅産物は見られなかった。この結果から明らかなように、Ｍ．モルガニイを用いた魚肉を用いた実験ではヒスタミンが蓄積するかなり前の時点でその検出が可能になった。合計３回同一の系で実験を行い、再現性を確かめたところ、ほぼ一致した結果が得られた。
【００５４】
（実施例４）  市販鮮魚中のヒスタミン生産菌の検出
市販鮮魚１３検体から得た試料を用いてＰＣＲ検出の感度とヒスタミン蓄積量を調べた。８〜２０時間インキュベートを行った後、全１３検体のうち１０検体においてＰＣＲによるｈｄｃ遺伝子の増幅が確認された。これらの試料ではｈｄｃ遺伝子由来のＰＣＲ産物が検出された数時間後にヒスタミンの蓄積が始まり、ＰＣＲによるヒスタミン生産菌の検出は、魚肉中へのヒスタミンの蓄積に先行することが確認された。
【００５５】
（実施例５）  ヒスタミン生産菌の菌種同定用データの作成
ヒスタミン生産菌の標準菌株、及び市販鮮魚由来のｈｄｃ遺伝子を持つ菌株を用いた。これらのｈｄｃ遺伝子の７１０ｂｐ領域を、実施例１と同じＰＣＲ法により増幅し、４塩基認識制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉを用いて、該ＰＣＲ産物を切断した。該制限酵素処理は、３７℃で３〜５時間行い、終了後２％アガロースゲル（株式会社ニッポンジーン）を用いて電気泳動を行った。該泳動終了後、エチジウムブロマイドを用いてゲルの染色を行い制限酵素による切断を確認した。
【００５６】
制限酵素処理を行ったＰＣＲ産物を用い、該処理終了後全量２０μｌあたりホルムアミド溶液（ｈｏｒｍａｍｉｄｅ／０．５Ｍ    ＥＤＴＡ  ＝４９  ：  １）を１２μｌ加えた。沸騰水中で５分間処理し、ＰＣＲ産物を１本鎖ＤＮＡに変性した後、直ちに氷中で急冷した。該変性ＤＮＡに１０倍量の添加液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（株式会社タカラ））を加え、電気泳動に供した。該泳動には、１２％ポリアクリルアミドのプレキャストゲル（ＧｅｎｅＧｅｌ  Ｅｘｃｅｌ  １２．５／２４  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社））及び、Ｇｅｎｅｐｈｏｒフラグメント解析装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた。該泳動は１２℃で、２５ｍＡ（７００Ｖ）の設定で１１０分間行い、泳動終了後  Ｐｌｕｓ  Ｏｎｅ  ＤＮＡ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてゲルの銀染色を行い、泳動パターンを得た。
【００５７】
本実施例で制限酵素Ｈｉｎｆ  Ｉを使用した結果、ほとんどの菌株で、３〜４断片への切断が確認され、その切断断片長はＭ．モルガニイでは２７７ｂｐ，  ２６１ｂｐ，  １７１ｂｐ、Ｒ．  プラチコラでは２７７ｂｐ，  ２６１ｂｐ，  １３０ｂｐ，  ４０ｂｐであった。データベース作成に使用したヒスタミン生産菌は計３４菌株であり、これらのｈｄｃ増幅産物をＳＳＣＰ解析した結果、２１のＳＳＣＰタイプに分類された。Ｍ．モルガニイ  １３株は７タイプ、Ｒ．  プラチコラ  ９株は３タイプ、Ｐ．ダムセラエ  ３株は２タイプのパターンが示され、他の株はそれぞれ異なる泳動パターンを示した。
【００５８】
図５に、これら標準菌株等の泳動パターンを含むデータシートを示す。図５中、レーンｍは１００ｂｐサイズのラダーマーカ、レーンａはエンテロバクター  アムニゲネスの泳動パターン、レーンｂはモルガネラ  モルガニイの泳動パターン、レーンｃはＥ．  アエロゲネスの泳動パターン、レーンｄはホトバクテリウム  ダムセラエの泳動パターン、レーンｅはＭ．モルガニイの泳動パターン、及びレーンｆはＭ．モルガニイの泳動パターンを示す。
【００５９】
（実施例６）  ヒスタミン生産菌の菌種同定
実施例１と同じ方法で、魚肉１０検体からヒスタミン生産を検出した。該菌から得られたｈｄｃ遺伝子由来のＰＣＲ産物を実施例５と同じ方法でＳＳＣＰ解析し、泳動パターン９種を得た。図５の標準菌株等の泳動パターンと比較して菌種同定を試みた結果、Ｍ．  モルガニイ  ４菌株、エンテロバクター    アエロゲネス  ２菌株、Ｐ．  ダムセラエ  １菌株が、及びエンテロバクター  ｓｐ．  １菌株が同定できた。残りの２菌株は一致する泳動パターンがなく、同定できなかった。
【００６０】
検体のｈｄｃ遺伝子由来ＰＣＲ産物の泳動パターンは図６に示されており、レーン１はマグロ１（１６時間培養）の泳動パターン、レーン２はマグロ１（２０時間培養）の泳動パターンであり、以下同様にレーン３はマグロ３（１６時間）、レーン４はマグロ３（２０時間）、レーン５はマグロ４（１６時間）、レーン６はマグロ４（２０時間）、レーン７はマグロ５（１６時間）、レーン８はマグロ５（２０時間）、レーン９はマグロ７（２０時間）、レーン１０はマグロ７（２４時間）、レーン１１はイワシ１（１１時間）、レーン１２はイワシ１（１６時間）、レーン１３は  サバ（２０時間）、レーン１４はブリの稚魚（２４時間）、レーン１５はマアジ（１６時間）、レーン１６はマアジ（２０時間）、レーン１７はブリ（１６時間）、レーン１８はブリ（２０時間）であり、左右のレーンｍは１００ｂｐサイズのラダーマーカである。
【００６１】
図５のデータシートのレーンと比較すると、図６のレーン３及び４は図５のレーンａに対応しエンテロバクター  ａｍｎｉｇｅｎｅｓであることを示し、レーン７及び８はレーンｂのモルガネラ  モルガニイ、レーン９、１０、１７及び１８はレーンｃのＥ．  アエロゲネス、レーン１１及び１２はレーンｄのホトバクテリウム  ダムセラエ、レーン１３及び１４はレーンｅのＭ．  モルガニイ、レーン１５及び１６はレーンｆのＭ．  モルガニイに対応し、それぞれの菌種を同定している。レーン１、２，５及び６は該データシートに対応するレーンがなく菌種を同定できなかった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明のプライマー及びヒスタミン生産菌検出方法により、従来の生化学的方法、及び培養法によるヒスタミン生産菌判定の不明瞭さ、大きな時間的、労力的負担が解決され、ヒスタミン生産菌を正確かつ容易に検出できるようになった。すなわち、本発明の検出方法により、従来の方法における擬陽性や擬陰性のない正確な検出が可能となり、さらに魚肉中へのヒスタミンの蓄積（高感度液体クロマトグラフによるヒスタミン検出法）よりも先行してヒスタミン生産菌を検出できるようになった。さらに、今まで、ヒスタミン食中毒が起きた場合、原因食材からヒスタミンを検出することはできても、冷凍や加熱によってヒスタミン生産菌が死滅している場合には原因菌の特定はできなかったが、本発明の検出方法では、菌自体が死滅していてもＤＮＡさえ残っていれば食品における原因菌の検出が可能になった。
【００６３】
また本発明のヒスタミン生産菌同定用標準データシート、及びＳＳＣＰ解析を利用して、ヒスタミン生産菌の菌種を、正確かつ容易に同定できるようになった。すなわち、本発明の同定方法により原因菌の特定が可能になり、これにより、どの原料から、あるいは、工場のどのラインから汚染が生じたのかを速やかに解明することが可能となった。
【００６４】
【配列表】
2004344004.tif 000005
2004344004.tif 000006
2004344004.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、グラム陰性ヒスタミン生産菌のｈｄｃ遺伝子由来ＰＣＲ産物の電気泳動パターンを示す。
【図２】図２は、ヒスチジンブロス中におけるＭ．  モルガニイの増殖、及びヒスタミン蓄積量の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、一般生菌数１０１ｃｆｕ／ｇの魚肉に同率  （１０１ｃｆｕ／ｇ）になるようにＭ．モルガニイを接種した場合の経時的な菌数、及びヒスタミン蓄積量を示すグラフである。
【図４】図４は、ヒスタミン生産菌の系統図である。
【図５】図５は、ＳＣＣＰ解析に用いるヒスタミン生産菌標準菌株等の泳動パターンを含むデータシートを示す。
【図６】図６は、ＳＣＣＰ解析により示された複数のヒスタミン生産菌の電気泳動パターンを示す。
【図１】
2004344004.tif 000008
【図２】
2004344004.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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