(57)【要約】【課題】  臨床症状を反映し、アトピー性皮膚炎の発症や治療方法の解明に役立つモデル動物および当該動物を用いたアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法等を提供する。【解決手段】  ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を導入し、Ｔ細胞またはＢ細胞でＧＡＴＡ−３を高発現してなるアトピー性皮膚炎モデル動物、前記アトピー性皮膚炎モデル動物に薬剤を適用することを特徴とするアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法、前記アトピー性皮膚炎モデル動物から単離されてなる臓器、組織、細胞または細胞株、および前記アトピー性皮膚炎モデル動物由来のＴ細胞もしくはＢ細胞またはその細胞株を同種または同系の動物に移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎モデル動物の作出方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を導入し、Ｔ細胞またはＢ細胞でＧＡＴＡ−３を高発現してなるアトピー性皮膚炎モデル動物。
【請求項２】
抗原刺激によりＴｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインの産生率が上昇している請求項１に記載の動物。
【請求項３】
抗原刺激前後のＴｈ１型サイトカインの産生率よりＴｈ２型サイトカインの産生率が上昇している請求項１に記載の動物。
【請求項４】
前記Ｔｈ１型サイトカインがＩＦＮ−γであり、前記Ｔｈ２型サイトカインがＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＬ−１３である請求項２または３に記載の動物。
【請求項５】
前記動物がマウスである請求項１〜４いずれかに記載の動物。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル動物に薬剤を適用することを特徴とするアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜５いずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル動物から単離されてなる臓器、組織または細胞。
【請求項８】
請求項１〜５いずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル動物または請求項７に記載の臓器、組織もしくは細胞から得られる細胞株。
【請求項９】
前記細胞または細胞株がＴ細胞もしくはＢ細胞またはそれらの細胞株である請求項７または８に記載の細胞または細胞株。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞または細胞株を同種または同系の動物に移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎モデル動物の作出方法。
【請求項１１】
前記細胞または細胞株がＴ細胞またはその細胞株であり、前記動物がマウスである請求項１０に記載の作出方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の作出方法により得られたアトピー性皮膚炎モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子ＧＡＴＡ−３遺伝子導入アトピー性皮膚炎モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
接触性皮膚炎は、Ｔｈ１型サイトカインが関与する炎症であり、そのモデル動物が作製されている。一方、アトピー性皮膚炎は、臨床上Ｔｈ１型サイトカインとＴｈ２型サイトカインが混在して関与する炎症であり、そのほとんどの患者で高血清ＩｇＥ値と好酸球増多が認められる（非特許文献１および２を参照) が、現在適当なモデルがなく、接触性皮膚炎を起こす薬剤を数カ月繰り返し適用することにより急性炎症から慢性炎症へと移行させることで、Ｔｈ１型の炎症からＴｈ２型サイトカインも関与する炎症モデルができるようになった（非特許文献３および４を参照）。
【０００３】
Ｔｈ２型サイトカイン産生を全体として制御する転写因子としてＧＡＴＡ−３が報告されている（非特許文献５を参照）。ＧＡＴＡ−３は、Ｔｈ２型サイトカイン遺伝子発現に必須な正の転写因子であることが知られている（非特許文献6 を参照）。また、喘息患者の気道においてＧＡＴＡ−３の発現が亢進していることが報告されている（非特許文献７を参照）。しかし、生体においてＧＡＴＡ−３による各Ｔｈ２型サイトカイン産生がどのように制御されているかはまだ予測できない状況である。
【０００４】
現在、ＧＡＴＡ−３遺伝子を導入したトランンスジェニックマウスがいくつか知られており（非特許文献５、特許文献１および２を参照）、これらのトランスジェニックマウスを種々の免疫疾患モデル動物として利用することが期待されている。しかしながら、これらのトランスジェニックマウスでは、皮膚局所での抗原刺激に対するサイトカイン誘導能ならびにその種類、さらに炎症を惹起する浸潤細胞に関して未知であった。
【０００５】
一方、気管支喘息、アレルギー性鼻炎のようなアレルギー性疾患の病態研究が進展し、アレルギー性疾患の発症には、Ｔｈ１型サイトカイン産生とＴｈ２型サイトカイン産生のバランス変化が大きく影響すると報告されている（非特許文献８を参照）。アレルギー性疾患の中でもうひとつ問題となっているアトピー性皮膚炎は、最近難治化傾向にあり、成人のアトピー患者が増加しつつある。アトピー性皮膚炎患者ではその約８割に血清ＩｇＥ値高値例がみられ、しかもアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体保有率と力価が高い。急性病変では、真皮上層血管周囲にＣＤ４陽性Ｔ細胞、単核球（リンパ球および組織球）、好酸球の浸潤が認められる。慢性病変では、真皮にＣＤ４陽性Ｔ細胞、単核球浸潤のほか多数の肥満細胞を認める。この状態では、通常好酸球を見出すことは稀とされるが、好酸球由来化学伝達物質に対する抗体で陽性反応を得ることからその存在が確認できる。皮疹部でのサイトカイン発現パターンは、発症初期にはＴｈ２型サイトカインが主体で、皮疹が完成するとＴｈ１型サイトカインの発現が加わり、両者が複雑に関係しつつ皮膚炎を維持していることが推察されている。さらに、慢性皮疹では、ＩＬ−４発現と相関しないという報告もみられる（非特許文献９および１０を参照）。アトピー性皮膚炎の原因の解明や治療法の確立に対する要望が高まっているが、上記の臨床所見を充分満たすような有用なモデル動物は未だ報告例がなかった。
【特許文献１】特開２００２−１１２６６６号公報
【特許文献２】特開２００２−１１２７８１号公報
【非特許文献１】炎症と免疫、第7 巻  ｐ19〜26（1999）
【非特許文献２】Biotherapy  第13巻、p335-339 (1999)
【非特許文献３】Journal of Investigative Dermatology 105 p749-755 (1995)
【非特許文献４】Journal of Immunology 159 p2484-2491 (1997)
【非特許文献５】Cell, 89, p587-596 (1997)
【非特許文献６】臨床免疫、30, p839-842 (1998)
【非特許文献７】J Allergy Clin Immunol, 103, p215-222 (1999)
【非特許文献８】Science, 275, p77-79 (1997)
【非特許文献９】Medicina 34 ：220-223 (1997)
【非特許文献１０】炎症と免疫 7：237-244 (1999)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、臨床症状を反映し、アトピー性皮膚炎の発症や治療方法の解明に役立つモデル動物および当該動物を用いたアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、鋭意検討の結果、転写因子ＧＡＴＡ−３を高発現する動物が容易かつ短期間でアトピー性皮膚炎様症状を発症することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明の要旨は、
［１］  ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を導入し、Ｔ細胞またはＢ細胞でＧＡＴＡ−３を高発現してなるアトピー性皮膚炎モデル動物、
［２］  抗原刺激によりＴｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインの産生率が上昇している前記［１］に記載の動物、
［３］  抗原刺激前後のＴｈ１型サイトカインの産生率よりＴｈ２型サイトカインの産生率が上昇している前記［１］に記載の動物、
［４］  前記Ｔｈ１型サイトカインがＩＦＮ−γであり、前記Ｔｈ２型サイトカインがＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＬ−１３である前記［２］または［３］に記載の動物、
［５］  前記動物がマウスである前記［１］〜［４］いずれかに記載の動物、
［６］  前記［１］〜［５］いずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル動物に薬剤を適用することを特徴とするアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法、
［７］  前記［１］〜［５］いずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル動物から単離されてなる臓器、組織または細胞、
［８］  前記［１］〜［５］いずれかに記載のアトピー性皮膚炎モデル動物または前記［７］に記載の臓器、組織もしくは細胞から得られる細胞株、
［９］  前記細胞または細胞株がＴ細胞もしくはＢ細胞またはそれらの細胞株である前記［７］または［８］に記載の細胞または細胞株、
［１０］  前記［９］に記載の細胞または細胞株を同種または同系の動物に移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎モデル動物の作出方法、
［１１］  前記細胞または細胞株がＴ細胞またはその細胞株であり、前記動物がマウスである前記［１０］に記載の作出方法、および
［１２］  前記［１０］または［１１］に記載の作出方法により得られたアトピー性皮膚炎モデル動物
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物は、抗原刺激により容易かつ短期間でアトピー性皮膚炎様症状を発症することができる。本発明のモデル動物は、臨床症状を良好に反映し、アトピー性皮膚炎の発症や治療方法の解明に役立つものである。本発明のモデル動物を用いたアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法によれば、動物での治療効果を確認することでこれまでにない有用な治療剤を提供することができる。本発明のモデル動物由来の臓器、組織、細胞または細胞株は、アトピー性皮膚炎の発症または治療の解明をより詳細に行なうために有用である。特に、本発明のモデル動物由来の細胞または細胞株を同種（同系）の動物に移入することにより、容易にアトピー性皮膚炎モデルを作出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるＧＡＴＡ−３遺伝子とは、動物由来のＧＡＴＡ−３遺伝子であれば特に限定されるものではなく、導入する動物の種に応じて適宜選択することができる。好ましくは、ヒトまたはマウスのＧＡＴＡ−３遺伝子を挙げることができる。より好ましくは、マウスＧＡＴＡ−３のｃＤＮＡ（配列番号：１）を挙げることができる。
【００１１】
マウスのＧＡＴＡ−３遺伝子は、例えば文献 J Immunol.,136, 2348-2357 (1986) 記載の方法で取得することができる。また、ヒトのＧＡＴＡ−３遺伝子は、例えば文献 Immunol. Today, 12, 256-257 (1991) 記載の方法で取得することができる。
【００１２】
本発明におけるＧＡＴＡ−３遺伝子の変異遺伝子とは、マウスを例にとると、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１または２以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入または置換の少なくとも１つの変異を生じさせたポリペプチドをコードする遺伝子や、配列番号：１に記載の塩基配列において、１または２以上の塩基の欠失、付加、挿入または置換の少なくとも１つの変異を生じさせた遺伝子であって、転写因子ＧＡＴＡ−３と同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をいう。
【００１３】
ここで、転写因子ＧＡＴＡ−３と同等の活性とは、前記変異遺伝子をＴ細胞またはＢ細胞で発現させた場合にＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＬ−１３などのＴｈ２型サイトカインの産生を亢進させることをいう。前記サイトカインの産生は、ＥＬＩＳＡ等により確認することができる。
【００１４】
したがって、本発明において転写因子ＧＡＴＡ−３とは、ＧＡＴＡ−３変異遺伝子によりコードされるタンパク質をも含むものである。
【００１５】
前記アミノ酸配列もしくは塩基配列に変異を導入することは、例えば部位特異的突然変異誘発（Methods in Enzymology, 100, 448- (1983))やＰＣＲ法（Molecular Cloning 2nd Edt. 15 章,Cold Harbor Laboratory Press (1989)、"PCR APractical Approach" IRL Press 200-210(1991))等により、当業者ならば容易に行うことができる。
【００１６】
本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物とは、前記ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子が導入され、Ｔ細胞またはＢ細胞でＧＡＴＡ−３を高発現しているものであれば特に限定されるものではなく、ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子が導入されて得られた動物そのもの、前記動物から得られる子孫、モデル動物と同種の動物との交配により得られた動物、および後述する本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物の作出方法により得られたアトピー性皮膚炎モデル動物を含む概念である。
【００１７】
交配対象の動物としては、同種の動物であれば特に限定されるものではないが、モデル動物の作製の容易さから、アトピー性皮膚炎に罹りやすい性質を有する動物、またはアトピー性皮膚炎を誘発しやすくするようにＧＡＴＡ−３以外の遺伝子をさらに導入または欠失させた動物が好ましく、前者の例としてはＮＣ／Ｎｇａマウス（H. Matsudaら、Int. Immunol. 1997, 9: 461-466) があげられ、後者の例としては、卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的Ｔ細胞レセプター遺伝子導入マウス（T.Satoら、Eur. J. Immunol. 1994, 24: 1512-1516) やＴＮＰ特異的ＩｇＥ遺伝子導入マウス（K. Matsuoka ら、Int. Immunol. 1999, 11: 987-994)があげられる。
【００１８】
本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物は、前記ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を人為的に生殖細胞に導入させることにより作製することができる。
【００１９】
導入する動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等の実験動物およびウシ、ブタ等の家畜等が挙げられるが、遺伝子工学、細胞工学的な技術開発が目覚ましいマウスが好適に用いられる。
【００２０】
本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物は、Ｔ細胞またはＢ細胞でＧＡＴＡ−３を高発現するものであり、特にＴ細胞で高発現するものが好ましい。
【００２１】
前記特性を有するモデル動物を作出するためには、ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を所定のベクターに連結させて発現ベクターを作製し、次いで、当該ベクターを生殖細胞に導入することが好ましい。
【００２２】
したがって、Ｔ細胞またはＢ細胞での発現に適したプロモーター、エンハンサーを含むベクターを選択し、ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を作動可能に連結することが好ましい。連結方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、モレキュラークローニング（Molecular Cloning ）第２版(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))に記載されている。
【００２３】
前記プロモーターとしては、例えば、恒常型プロモーターの例として、CAG プロモーター、CMV プロモーター、EF-1αプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、RSV プロモーター、Lck キナーゼの遠位プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（MLP ）などが挙げられる。また、誘導型のプロモーターの例としては、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、マウス乳ガンウイルス（MMTV）プロモーターなどが挙げられる。以上のようなプロモーターを有する発現ベクターは、いずれも市販されているか、あるいは公的な機関から入手できる。市販されている場合は、例えば Invitrogen 社、Clontech社などから購入することができる。より好ましいものとして、SRαプロモーター、Lck キナーゼの遠位プロモーター、CAG プロモーター等を挙げることができる。
【００２４】
一方、エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、ポリオーマウイルスエンハンサー、MoMuLVエンハンサー、MoMuＳV エンハンサー、AKV エンハンサー、SL3-3 エンハンサー、ＨＰＶのＩＥ２あるいはＩＥ６エンハンサー、ＨＢＶエンハンサー、HCMVエンハンサー等のウイルスエンハンサー、例えば、ＩｇＨエンハンサー、ＩｇＬエンハンサー、Ｔ細胞レセプターα鎖エンハンサー、HLADQ αおよびβ遺伝子エンハンサー、β−ＩＦＮエンハンサー、ＩＬ−２エンハンサー、ＩＬ−２Ｒエンハンサー等の免疫系遺伝子のエンハンサー、例えば、β−アクチンエンハンサー、ＭＣＫエンハンサー、プレアルブミン遺伝子エンハンサー、エラスターゼＩ遺伝子エンハンサー、メタロチオネイン遺伝子エンハンサー等の細胞エンハンサーが挙げられる。好ましくは、ＩｇＨエンハンサー（Ｅμ）等を挙げることができる。
【００２５】
遺伝子導入マウスを例にとって、遺伝子導入動物の作製方法を簡単に述べる。第１の方法は、マウスの受精卵の前核中に前記発現ベクターをマイクロインジェクションする方法、第２の方法は、８細胞期胚に組換えレトロウイルスの形で感染させることにより、前記発現ベクターを導入する方法、第３の方法は、全能性を有する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に、エレクトロポレーション法等により前記発現ベクターを導入し、これを他の胞胚に注入して、キメラを作製する方法が知られている（ビー＝ホーガンらの編纂によるマニピュレーション  オブ  マウス  エンブリオ 1986 年  コールドスプリングハーバーラボラトリー、相澤慎一著  ジーンターゲッティング  1995年羊土社）。
【００２６】
このようにして得られた遺伝子導入モデル動物は、Ｔ細胞またはＢ細胞においてＧＡＴＡ−３が高発現している。ＧＡＴＡ−３の高発現は、ＧＡＴＡ−３遺伝子またはその変異遺伝子を導入しない同種の動物と比べてｍＲＮＡまたはタンパク質がより多く発現していることをいう。ＧＡＴＡ−３の高発現は、ＰＣＲ法、ノーザンブロッティング法またはウェスタンブロッティング法により確認することができる。
【００２７】
前記モデル動物は、抗原刺激によりＴｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインの産生率が上昇していることが好ましい。
【００２８】
前記抗原としては、例えば、卵白アルブミン（ＯＶＡ）もしくは卵白アルブミン由来のペプチド、インシュリン由来のペプチド、ミエリン由来のペプチド、チトクロームＣ由来のペプチド、リゾチーム由来のペプチド、Ｈ−Ｙ抗原等のタンパク質抗原、核酸抗原、炭水化物抗原、脂質抗原、または、２，４，６−トリニトロ−１−クロロベンゼン（ＴＮＣＢ）、４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン (ＯＸ) 、２, ４−ジニトロフルオロベンゼン (ＤＮＦＢ) 、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等のハプテンが挙げられる。
【００２９】
前記モデル動物は、抗原刺激前後のＴｈ１型サイトカインの産生率よりＴｈ２型サイトカインの産生率が上昇していることが好ましい。この特性により、Ｔｈ１型サイトカインとＴｈ２型サイトカインとのバランスが崩れ、アトピー性皮膚炎の症状をより良く反映することができる。
【００３０】
前記Ｔｈ１型サイトカインとしてはＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−βなどが挙げられるが、ＩＦＮ−γが好ましい。一方、前記Ｔｈ２型サイトカインとしてはＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０またはＩＬ−１３などが挙げられるが、ＩＬ−４、ＩＬ−５またはＩＬ−１３が好ましく、ＩＬ−５またはＩＬ−１３がより好ましい。
【００３１】
前記モデル動物を抗原刺激する方法は、特に制限がないが、例えば、前記抗原を適用な溶媒に溶解し、動物の皮膚に塗布（感作）し、一定の期間（例えば、数日間）を置いて２回目の塗布を行う（誘発、チャレンジ）方法が挙げられる。感作部位と誘発部位とは同一または異なっていてもよい。
【００３２】
誘発部位の皮膚は、アトピー性皮膚炎特有の症状（発疹、腫脹など）が短期間に現れる。また、誘発部位の皮膚細胞からは、抗原刺激しない対照動物では認められないＴｈ１型サイトカインおよびＴｈ２型サイトカインの産生が認められる。Ｔｈ２型サイトカイン、特にＩＬ−５およびＩＬ−１３については、トランスジーンを持たない対照動物と比べて抗原誘発後に産生量が増加し、一方、Ｔｈ１型サイトカイン、特にＩＦＮ−γについては、対照動物と同じく産生される。また、誘発部位には、好酸球、単核球（リンパ球および組織球）または肥満細胞の浸潤がトランスジーンを持たない対照動物より有意に多く観察される。さらに、血清中のＩｇＥ（総ＩｇＥ）量は、抗原誘発後一定期間に顕著な上昇が見出される。これらの特徴は、アトピー性皮膚炎の皮膚局所の臨床所見に極めて類似しており、本発明の実施例から初めて得られた知見で、ＧＡＴＡ−３トランスジェニックマウスというだけでは類推できなかった特徴である。これらの特徴は、以下の本発明のスクリーニング方法に有利に利用することができる。
【００３３】
本発明のアトピー性皮膚炎の治療剤のスクリーニング方法は、本発明のアトピー性皮膚炎モデル動物に薬剤を適用することを特徴とする。
【００３４】
前記モデル動物への薬剤の適用方法は、特に制限がないが、前記モデル動物を抗原刺激してアトピー性皮膚炎の症状を誘発した後、当該誘発部位に目的の薬剤を常法により適用する方法などが挙げられる。この際に、薬剤を含まない陰性対照および／または既知の薬効を有する陽性対照（抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤、ステロイド、免疫抑制剤など）も準備し、前記薬剤と同様に適用する。
【００３５】
薬剤適用後、所定の期間に誘発部位における発疹、腫脹などを観察し、対照と比較して薬剤の治療効果を評価する。あるいは、薬剤適用後の誘発部位におけるＴｈ１型およびＴｈ２型サイトカインの変動や、好酸球、肥満細胞などの浸潤の程度を調べることによっても治療効果を評価することができる。
【００３６】
薬剤の適用は、抗原刺激の後であってもよいが、抗原刺激の前であってもよい。
【００３７】
目的の薬剤の長期投与による影響を評価するためには、抗原刺激を繰り返しながらアトピー性皮膚炎を再発させ、薬剤投与を続けることもできる。
【００３８】
また、本発明は、前記アトピー性皮膚炎モデル動物から単離された臓器、組織または細胞に関する。これらの単離物は、適当な条件下で流通または保存することができ、アトピー性皮膚炎の原因の解明を分子レベルで研究するためのツールとして有用であり、治療法の確立の検証にも役立つものである。
【００３９】
前記臓器または組織としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、小腸、大腸、生殖器等の臓器、または脳組織、神経組織、皮膚、皮下組織、上皮組織、骨、筋、毛、爪、骨髄、血管、血液、リンパ組織、リンパ液等の組織が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
前記細胞としては、前記モデル動物から直接単離した細胞または前記臓器もしくは組織から得られるあらゆる細胞が含まれる。
【００４１】
また、本発明は、前記臓器、組織または細胞から得られる細胞株に関する。前記細胞株は、由来する臓器、組織または細胞に応じて不死化することにより、あるいは自然発生的に得られるものであり、継代培養することができるので、好ましい。
【００４２】
前記細胞または細胞株の中でも、下記モデル動物の作出方法に用いるためにはＧＡＴＡ−３を高発現しているＴ細胞もしくはＢ細胞またはそれらの細胞株が特に有用であり、好ましい。
【００４３】
さらに、本発明は、前記Ｔ細胞もしくはＢ細胞またはそれらの細胞株を同種または同系の動物に移入することを特徴とするアトピー性皮膚炎モデル動物の作出方法に関する。前記細胞または細胞株を同種または同系の動物に移入する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、皮内、皮下または静脈から注入する方法があげられる。
【００４４】
移入する細胞または細胞株は、ＧＡＴＡ−３が高発現しており、アトピー性皮膚炎を誘導しやすい点からＴ細胞またはその細胞株が好ましく、ＣＤ４陽性細胞またはその細胞株がより好ましい。移入対象の動物は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等の実験動物およびウシ、ブタ等の家畜等があげられるが、移入した細胞等の生着率の高い免疫不全動物が好ましく、その種類が豊富なマウスが好ましい。好ましい免疫不全マウスとしては、市販されており、容易に入手可能であるヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ２ノックアウトマウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γc nullマウス（M. Itoら、Blood 2002, 100: 3175-3182) 等があげられる。
【００４５】
移入された動物は、抗原刺激により接触性皮膚炎を惹起させる。刺激後所定の時間経過後に遅発型の炎症が確認された場合、アトピー性皮膚炎を発症したモデル動物となる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００４７】
［動物の維持、飼育］
下記実施例で作出したトランスジェニックマウスおよび週齢の一致した野生型（ＷＴ）同腹子対照マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス、日本クレア）は、特定の病原体のない条件下に収容し、市販の飼料と水を自由に与えた。前記マウスは、８〜１５週齢で用いた。各実験群は、少なくとも５匹のマウスからなるものであった。
【００４８】
［刺激用ハプテン］
２，４，６−トリニトロ−１−クロロベンゼン（ＴＮＣＢ）は、東京化成株式会社より購入し、アセトンに溶解して、感作剤および誘発剤として使用した。
【００４９】
［ハプテンによるマウスの感作手法および誘発手法］
マウスの腹部を剃毛し、その皮膚上に、１００μｌの７重量％ＴＮＣＢ溶液を１回局所塗布し、接触感作した。７日後、左耳介に裏表に１０μｌずつ（合計２０μｌ）１重量％ＴＮＣＢ溶液を塗布（チャレンジ）し、ＴＮＣＢに対する感作を誘発した。
【００５０】
［統計学的解析］
実験データは、平均±ＳＤで表した。図中では明確性のため平均＋ＳＤで示す。統計学的解析は、Student's ｔ検定を用いて行った。
【００５１】
実施例１
マウスＧＡＴＡ−３高発現トランスジェニックマウスの作製
マウスＧＡＴＡ−３ｃＤＮＡ（配列番号：１）をＬｃｋキナーゼ遠位プロモーターと連結した発現ベクターを構築し、トランスジーンを作製した。これをＣ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に注入して、遺伝子導入マウスを得た。導入遺伝子の子孫への伝播は、ＰＣＲ法に加え、ノーザンブロッティングによりｍＲＮＡの発現とウェスタンブロッティングにより蛋白質の発現を確認した。ノーザンブロッティングの結果によれば、ＧＡＴＡ−３トランスジーンを持つマウスと持たない同胞子マウスの胸腺、脾臓、腎臓におけるＧＡＴＡ−３ｍＲＮＡの発現量を比較したところ、トランスジェニックマウスの脾臓における発現量が、同腹子マウスより顕著に増大していた。ウェスタンブロッティングの結果によれば、トランスジェニックマウスと同胞子マウスの胸腺、脾臓、リンパ節におけるＧＡＴＡ−３蛋白質の発現量を比較したところ、トランスジェニックマウスの胸腺における発現量が、同腹子マウスより顕著に増大していた。
【００５２】
実施例２
実施例１において、Ｌｃｋキナーゼ遠位プロモーターの代わりにＳＲαプロモーター／Ｅμエンハンサーを含む発現ベクターにマウスＧＡＴＡ−３ｃＤＮＡに連結してトランスジーンを構築したこと以外は実施例１と同様にして、トランスジェニックマウスを作出した。
【００５３】
実施例３
皮膚組織抽出物からのＲＴ−ＰＣＲ
実施例１で作出したＧＡＴＡ−３トランスジェニックマウスおよび同腹子（ＷＴ）にハプテンを適用した後、経時的にマウスを脛骨脱臼により屠殺し、両耳介を切断した。前記耳介をＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン株式会社製）でホモジナイズし、製造業者の指示に従って全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。逆転写の条件は、１×ＲＴ緩衝液（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、０．５ｍＭのｄＮＴＰ（タカラバイオ株式会社製）、０．１５μｇのランダムプライマー、４０ＵのＲＮアーゼインヒビター（ロシュダイアグノスティックス社製）、２００ＵのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）および１０ｍＭのＤＴＴ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含む２０μｌの反応混合液中で行った。
【００５４】
得られたｃＤＮＡを４３℃で１時間次いで９５℃で３分間インキュベートした後、ＩＬ−５、ＩＦＮ−γまたはβアクチン増幅用に２μｌのｃＤＮＡ標品をそれぞれ用いてｃＤＮＡを増幅させた。増幅反応は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、各２５ｐＭの５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーならびに２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（パーキンエルマー社製）を含む２５μｌの反応混合液中で行った。ＤＮＡサーモサイクラー４８０（パーキンエルマーシータス社製）を用いて、９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、および７２℃で１分の伸長を３２サイクル（ＩＬ−５の場合）または、９４℃で４５秒の変性、６０℃で４５秒のアニーリング、および７２℃で２分の伸長を４０サイクル（ＩＦＮ−γおよびβアクチンの場合）を行った。最終のサイクル後、温度を７２℃で７分間維持した。前記ｃＤＮＡ増幅に使用したプライマーを下記に示す。
ＩＬ−５：Sense primer      5'-ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC（配列番号３）
Antisense primer  5'-CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG（配列番号４）
ＩＦＮ−γ：Sense primer    5'-TGAACGCTACACACTGCATCTTGG （配列番号５）
Antisense primer  5'-CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAG  （配列番号６）
βアクチン：Sense primer    5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC（配列番号７）
Antisense primer  5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG（配列番号８）
前記ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル電気泳動に付し、臭化エチジウムで染色して可視化した。結果を図１に示す。
【００５５】
図１より、トランスジェニックマウスは、野生型マウスに比べて、ハプテンをチャレンジ後６〜１８時間でＴｈ２型サイトカインのＩＬ−５の発現が亢進しており、特に１２〜１８時間後で顕著であった。一方、Ｔｈ１型サイトカインであるＩＦＮ−γは、トランスジェニックマウスと野生型マウスとでは同程度の発現レベルであった。
【００５６】
実施例４
皮膚組織抽出物におけるサイトカインレベルの定量
ＥＬＩＳＡ用の耳介組織抽出物の試料は、Fergusonら(J Exp Med. 179:1597-1604 (1994)) に記載の方法により調製した。要約すると、ＴＮＣＢのチャレンジ後１８時間目に、上記と同様にして耳介を切断し、直ちに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０のＰＢＳ溶液を５００μｌ加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを液体窒素−水浴（３７℃）で凍結融解し、１５秒間超音波処理を行い、１３０００ｇで５分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡに供した。上清は、使用直前まで−８０℃で保存した。ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γに関するＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡキット（Endogen 社製) を用いて製造業者の指示に従って行った。ＩＬ−１３に関するＥＬＩＳＡは、ＩＬ−１３Quantikine kit(R&D Systems製) を用いて製造業者の指示に従って行った。結果を図２に示す。
【００５７】
図２より、トランスジェニックマウスは、野生型マウスに比べて、Ｔｈ２型サイトカインのＩＬ−５およびＩＬ−１３の発現が亢進していることがわかる。しかし、ＩＬ−４とＴｈ１型サイトカインのＩＦＮ−γについては有意差はなかった。
【００５８】
実施例５
耳介の肥厚の測定
前記したように、ＴＮＣＢの適用によりトランスジェニックマウスおよび同腹子マウスを感作およびチャレンジした。耳介の肥厚は、実験期間中経時的に、軽いエーテル麻酔下でダイヤル厚さ計（尾崎製作社製）により測定した。耳介の腫脹反応の経時分析の場合、耳介の肥厚は、各誘発後６、１２、１８、２４および４８時間で測定した。結果を図３に示す。
【００５９】
図３より、トランスジェニックマウスは、ＴＮＣＢのチャレンジ後６時間目にはすでに有意な耳介の肥厚化が観察され、２４時間後まで持続した。耳介の肥厚は、野生型マウスの約２〜３倍に達した。
【００６０】
実施例６
病理組織学的実験
ＴＮＣＢのチャレンジ後１８時間目に、耳介の皮膚検体を切出し、１０％ホルマリン溶液で固定し、次いで切片を作製してヘマトキシリン−エオシン染色またはトルイジンブルー染色を行った。単核細胞ならびに皮膚に浸潤した好中球および好酸球などの顆粒球の数は、ヘマトキシリン−エオシン溶液で皮膚検体を染色することにより評価した。皮膚に浸潤した肥満細胞の数は、トルイジンブルー溶液で皮膚検体を染色することにより評価した。切片を４００倍の倍率で顕微鏡観察した。各片につき、少なくとも１０個の視野を調べた。細胞数を計数し、１ｍｍ2 当たりの細胞数で表した。結果を図４に示す。
【００６１】
図４より、トランスジェニックマウスの病理組織中の浸潤細胞は、好酸球および単核球（リンパ球および組織球）ばかりでなく、肥満細胞も有意に増加していることがわかる。このことから、本トランスジェニックマウスは、アトピーの臨床病態をよりよく反映したものであるといえる。
【００６２】
実施例７
ＩｇＥの血清濃度の測定
ＴＮＣＢのチャレンジ後２４時間目に、静脈洞から血液を採取し、１５００ｇで１０分間遠心分離することにより血清を得た。血清中の総ＩｇＥレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図５に示す。
【００６３】
図５より、トランスジェニックマウスは、野生型マウスに比べて非常に高いＩｇＥレベルを保持していることがわかる。
【００６４】
実施例８
本発明トランスジェニック・マウスを用いるアトピー性皮膚炎治療薬のスクリーニング方法
グルココルチコイド軟膏やプロトピック軟膏は免疫反応を全般的に抑制するのではなく、低濃度ではより選択的にＴｈ１リンパ球を抑制するため、ストレス下ではＴｈ２リンパ球が優位となり、アトピー性皮膚炎の病態をさらに悪化させる方向に働く可能性がある。本発明のトランスジェニック・マウスと野生型マウスを用いてハプテン塗布による接触性皮膚炎を惹起し、薬剤を事前投与することで、よりトランスジェニック・マウスにおける耳介浮腫を抑制する薬剤をスクリーニングすれば、グルココルチコイドやタクロリムスと異なる薬剤を得ることができる。また、抗ヒスタミン作用が中心の抗アレルギー薬は、即時型の浮腫にしか効果を示さないため、抗原チャレンジ１８〜２４時間後の遅発型の浮腫において効果を示す薬剤は、従来の抗アレルギー薬とも差別化できる。本スクリーニング方法において、以下の実験を行なった。
【００６５】
トランスジェニックマウスおよび同腹子（野生型）マウスの腹側部に、７％ＴＮＣＢ溶液（アセトン溶解）１００μ１を塗布し、１週間後にタクロリムス（プログラフ注射液にて調製）１ｍｇ／ｋｇを１％ＴＮＣＢ耳介チャレンジの６時間前に腹腔内投与した。１％ＴＮＣＢ耳介チャレンジの後、経時的に耳介の腫脹を測定した。遅発型の耳介腫脹のピークを示すチャレンジ１８時間後にて、腫脹を評価した。結果を図６に示す。
【００６６】
図６より、タクロリムスは、トランスジェニックマウスに比べて野生型マウスの耳介腫脹抑制効果が大きいことがわかる。したがって、本スクリーニング方法によって野生型マウスよりもトランスジェニックマウスの耳介腫脹抑制効果を示す薬剤は、従来の治療薬とは異なって、アトピー性の炎症に対してより治療効果を奏する候補薬となりうる。
【００６７】
実施例９
免疫不全マウスへの移入実験プロトコール
トランスジェニックマウスおよび同腹子（野生型）マウスの腹側部に、７％ＴＮＣＢ溶液（アセトン溶解）１００μ１を塗布し、１週間後に各々の処置マウスから脾臓を摘出して細胞浮遊液を調製した。調製された細胞にマウス抗ＣＤ４抗体結合マグネットビーズを反応させ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を回収した。免疫不全マウスとしてＲＡＧ２ノックアウトマウス（実験動物中央研究所より入手し、自家繁殖させたもの）に対して、一匹当たり２×１０6 個のＣＤ４陽性細胞を尾静脈から注入(i.v.)し、翌日、免疫不全マウスの耳介に１％ＴＮＣＢ溶液を裏表に１０μｌずつ塗布して、経時的に耳介の腫脹を測定した（図７）。ＴＮＣＢ塗布２４時間後に耳介の皮膚検体を切出し、１０％ホルマリン溶液で固定し、次いで切片を作製してヘマトキシリン−エオシン染色またはトルイジンブルー染色を行った。単核細胞ならびに皮膚に浸潤した好中球および好酸球などの顆粒球の数は、ヘマトキシリン−エオシン溶液で皮膚検体を染色することにより評価した。皮膚に浸潤した肥満細胞の数は、トルイジンブルー溶液で皮膚検体を染色することにより評価した。切片を４００倍の倍率で顕微鏡観察した。各片につき、少なくとも１０個の視野を調べた。細胞数を計数し、１ｍｍ2 当たりの細胞数で表した。結果を図８に示す。
【００６８】
図７より、本発明のＴＮＣＢ感作トランスジェニックマウスから得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞を免疫不全マウスに移入した場合、野生型マウスから得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞を用いて同様に行なった場合と比べて、耳介の腫脹応答がより強く惹起された。
【００６９】
図８より、ＧＡＴＡ−３トランスジェニックマウス由来の細胞を移入したマウスは、野生型マウス由来の細胞を移入したマウスに比べて、耳介の皮膚組織に好酸球および肥満細胞が有意に浸潤していることがわかる。
【００７０】
これらの結果から、本発明のトランスジェニックマウス由来の細胞を同種マウスに移入することにより、容易にアトピー性モデル動物を作出することができることがわかる。
【００７１】
実施例１０
抗原塗布実験プロトコール
本実施例においては、卵白アルブミン特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）遺伝子およびＧＡＴＡ−３遺伝子を導入したトランスジェニックマウスＧＡＴＡ−３／ＴＣＲと、ＴＣＲ遺伝子のみを導入したＷＴ／ＴＣＲトランスジェニックマウスを用いた。前記トランスジェニックマウスは、特開２００２−１１２６６６号公報に記載の方法により作出した。前記トランスジェニックマウスそれぞれに、１週間に１回の割合で卵白アルブミン（ＯＶＡ（５０）) とアラム（Ａｌｕｍ、１ｍｇ) を計３回腹腔に投与した。下記ＡおよびＢの実験を行なった。
【００７２】
Ａ．最終免疫より１週間後に、５０μｇ／１０μｌのＯＶＡ溶液を耳介皮内に摂取して、耳介の腫脹を経時的に測定した。対照にはＰＢＳを同量摂取した。結果を図９に示す。
【００７３】
Ｂ．最終免疫より１週間後に１０μｇ／１０μｌのＯＶＡ溶液をしみ込ませたろ紙をｆｉｎｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（大正製薬株式会社製）に入れて、剃毛腹側部にバンドに接着させ、１８時間後、その部位の組織学的検査を行った。結果を図１０に示す。
【００７４】
図９より、本発明のトランスジェニックマウスはタンパク質抗原刺激によっても、対照マウスと比べて耳介腫脹応答を強く惹起することがわかる。図１０より、皮内接種だけでなく、皮膚に接触させただけでも卵白アルブミンによって皮膚炎が惹起され、その部位には、アトピー性皮膚炎の臨床病態を反映する好酸球と肥満細胞の浸潤が観察されたことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）にハプテンを適用した後の耳組織におけるＩＬ−５およびＩＦＮ−γの発現をＰＣＲ法により調べた結果を示す電気泳動写真である。
【図２】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）にハプテンを適用した後の耳組織における種々のサイトカインの発現をＥＬＩＳＡにより調べた結果を示すグラフである。
【図３】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）にハプテンを適用した後の耳介の肥厚を調べた結果を示すグラフである。
【図４】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）にハプテンを適用した後の耳介の皮膚に浸潤した種々の細胞の数を調べた結果を示すグラフである。
【図５】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）にハプテンを適用した後の血清中の総ＩｇＥ量を示すグラフである。
【図６】実施例８のスクリーニング方法において、タクロリムスを投与した後のトランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）の耳介の肥厚の減少を調べた結果を示すグラフである。
【図７】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）または同腹子（ＷＴ）由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を移入した免疫不全マウスにおいて、ハプテンを適用した後の耳介の肥厚を調べた結果を示すグラフである。
【図８】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）または同腹子（ＷＴ）由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞を移入した免疫不全マウスにおいて、ハプテンを適用した後の耳介の皮膚に浸潤した種々の細胞の数を調べた結果を示すグラフである。
【図９】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）に抗原（卵白アルブミン）を適用した後の耳介の肥厚を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】トランスジェニックマウス（ＧＡＴＡ−３）および同腹子（ＷＴ）に抗原（卵白アルブミン）を適用した後の耳介の皮膚に浸潤した種々の細胞の数を調べた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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