(57)【要約】【課題】窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在する新規微生物、及びその亜硝酸還元酵素ＮｉＲ  Ｋ及びＮｉＲ  Ｓ遺伝子の新規塩基配列の提供。【解決手段】窒素除去に関わる微生物を、亜硝酸還元酵素ＮｉＲ  Ｋ、及びＮｉＲ  Ｓ遺伝子を検出することにより、特定し、また、本遺伝子の一部の塩基配列を明らかにすることにより、上記塩基配列に基づき窒素除去に関わる微生物を特定することができる。これらの特定された微生物を含む活性汚泥を用いて新規窒素除去方法を確立することができる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は３に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｕ１３近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号２に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ１７近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項３】
配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１４又は１６に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ４ＦＢ１１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項４】
配列番号５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＳＴＣ１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号８に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項６】
配列番号１１に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ２７近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項７】
配列番号１５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項８】
配列番号１７に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ５８近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項９】
配列番号１８、３３又は３９に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  Ｐｄ１２２２近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１０】
配列番号１９に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１１】
配列番号２０、２２又は２４に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１２】
配列番号２１に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１３】
配列番号２３に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｚｏａｒｃｕｓ  ｔｏｌｕｖｏｒａｎｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１４】
配列番号２５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ４近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１５】
配列番号２６に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ２近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１６】
配列番号２７に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＡＮＩＳ−７６近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１７】
配列番号２８、２９、３０、３６又は３８に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＨＮＩＳ−６近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ
Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１８】
配列番号３１に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項１９】
配列番号３２に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｌｉｎａｌｏｏｌｅｎｔｉｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項２０】
配列番号３４に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項２１】
配列番号３５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｔｅｒｐｅｎｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ５８Ｅｕ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項２２】
配列番号３７に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍｉ１１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【請求項２３】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片の塩基配列を含み、かつ、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物。
【請求項２４】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に請求項９〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片の塩基配列を含み、かつ、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物。
【請求項２５】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１又は３に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｕ１３近縁細菌。
【請求項２６】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ１７近縁細菌。
【請求項２７】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１４又は１６に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ４ＦＢ１１近縁細菌。
【請求項２８】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＳＴＣ１近縁細菌。
【請求項２９】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号８に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ近縁細菌。
【請求項３０】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１１に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ２７近縁細菌。
【請求項３１】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ近縁細菌。
【請求項３２】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１７に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ５８近縁細菌。
【請求項３３】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号１８、３３又は３９に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  Ｐｄ１２２２近縁細菌。
【請求項３４】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号１９に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌。
【請求項３５】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２０、２２又は２４に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ近縁細菌。
【請求項３６】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２１に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌。
【請求項３７】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２３に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｚｏａｒｃｕｓ  ｔｏｌｕｖｏｒａｎｓ近縁細菌。
【請求項３８】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ４近縁細菌。
【請求項３９】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２６に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ２近縁細菌。
【請求項４０】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２７に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＡＮＩＳ−７６近縁細菌。
【請求項４１】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２８、２９、３０、３６又は３８に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＨＮＩＳ−６近縁細菌。
【請求項４２】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３１に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌。
【請求項４３】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３２に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｌｉｎａｌｏｏｌｅｎｔｉｓ近縁細菌。
【請求項４４】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３４に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌。
【請求項４５】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｔｅｒｐｅｎｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ５８Ｅｕ近縁細菌。
【請求項４６】
その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３７に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍｉ１１近縁細菌。
【請求項４７】
請求項２３〜４６のいずれか１項に記載の微生物又は細菌を含む、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理に用いる活性汚泥。
【請求項４８】
請求項４７に記載の活性汚泥を使用する窒素削減のための水処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物、及びその亜硝酸還元酵素ＮｉＲ  Ｋ及びＮｉＲ  Ｓの遺伝子の塩基配列、並びに上記微生物を含む活性汚泥を使用する、窒素削減のための水処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
都市下水や農業、畜産排水などのように、アンモニア態窒素、硝酸態窒素、亜硝酸態窒素といった窒素を含む水の処理には、硝化脱窒法が広く用いられている。しかしながら、例えばコークス炉から発生する排水（安水という）のように、高濃度の窒素を含む水の処理には、硝化脱窒は適用されていない。最近になって、ようやく、安水のような高濃度の窒素を含む排水に対して、硝化脱窒が試みられるようになり始めたのが現状である（特許文献１：特開第２００３−５３３８３号公報参照）。
また、高濃度の窒素を含有する排水から窒素を除去する際、硝化脱窒に用いる活性汚泥中で、具体的にどのような微生物が窒素除去に関与しているのかは明らかではなく、微生物群集を解析した研究例はない。
【０００３】
微生物を利用する窒素除去では、硝化脱窒法が広く用いられる。硝化脱窒法は、微生物の作用で、排水中のアンモニア態窒素を亜硝酸態窒素を経て硝酸態窒素まで酸化した後、硝酸態窒素から亜硝酸態窒素を経て窒素分子にまで還元して、窒素ガスとして大気中に放散させる窒素除去方法である。アンモニア態窒素を硝酸態窒素まで酸化する反応を硝化と呼び、硝酸態窒素から窒素分子へ還元する反応を脱窒と呼ぶ。すなわち硝化と脱窒が組み合わさって硝化脱窒法となっている。一般に、硝化は酸素を供給する好気槽で、脱窒は、酸素を供給しない嫌気槽で進む反応である。
【０００４】
硝化脱窒を効率的に行わせるために様々な試みがなされてきた。Ｂａｒｎａｒｄ法は、前段に脱窒を行わせる嫌気槽、後段に硝化を行わせる好気槽を設置し、後段の硝化で生じた硝化液を前段の脱窒反応槽に戻すよう循環させる硝化脱窒法である。脱窒反応では、同時に基質となるＣＯＤ成分の消費が必要となる。原水由来のＣＯＤ成分を直接、脱窒反応に利用できることから、Ｂａｒｎａｒｄ法は極めて効率的な硝化脱窒法となっている。もしも硝化反応槽を前段に設置すると、原水由来のＣＯＤ成分は好気槽の酸素で容易に酸化分解されてしまう。このため、脱窒反応に必要なＣＯＤ成分が不足してしまうことになる。
【０００５】
硝化脱窒は、単一の微生物が行える反応ではなく、活性汚泥に存在する複合微生物系が担っている。まず硝化であるが、アンモニア態窒素を亜硝酸態窒素にまで酸化するアンモニア酸化細菌や、亜硝酸態窒素を硝酸態窒素にまで酸化する亜硝酸酸化細菌が存在することが知られている。アンモニア酸化細菌としては、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）などが知られている。亜硝酸酸化細菌としては、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）などが知られている。
【０００６】
脱窒反応については、硝酸態窒素、あるいは亜硝酸態窒素を窒素分子まで還元するさまざまな脱窒細菌の存在が知られている。窒素除去反応である脱窒反応では、生物が保有する様々な酵素の関与が知られている。硝酸態窒素を亜硝酸態窒素に還元する硝酸（塩）還元酵素ＮａＲ（Ｎｉｔｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、亜硝酸態窒素を一酸化窒素に還元する亜硝酸（塩）還元酸素ＮｉＲ（Ｎｉｔｒｉｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する酸素ＮＯＲ（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、亜酸化窒素を窒素分子に還元する酸素Ｎ２ＯＲ（Ｎｉｔｒｏｕｓ  Ｏｘｉｄｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）である。これらの酵素による触媒作用を受けて、排水中の硝酸態窒素あるいは亜硝酸態窒素は、最終的に無害な窒素ガスとなって、大気中に放散させることが可能である。
このうち、亜硝酸還元酵素ＮｉＲが司る反応は、脱窒反応の中で反応律速になっている可能性があり、脱窒反応上、極めて重要な反応となっている。
【０００７】
一般に、微生物群集の解析にあたって、活性汚泥中の微生物の培養可能性（ｃｕｌｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ）は低い。したがって、培養による微生物解析では窒素除去を司る活性汚泥中の微生物群集構造を把握することができない。
【０００８】
特に、窒素除去にかかわっている、亜硝酸還元酵素を有する微生物は未だ特定されていない。
【特許文献１】
特開２００３−５３３８３号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような背景から、高濃度の窒素を含有する排水から、窒素を除去する水処理に用いることができる活性汚泥の微生物群集を把握し、窒素除去に関与する有用な微生物を発見し、かかる微生物を利用して、高濃度の窒素を含有する排水から窒素を効率的に除去するための新規水処理方法を提供する必要性がある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
微生物群集の解析にあたって、一般に、活性汚泥中の微生物の培養可能性（ｃｕｌｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ）は低い。したがって、培養による微生物解析では窒素除去を司る活性汚泥中の微生物群集構造を把握することが難しい。そこで本発明者は、高濃度の窒素を含有する排水から、活性汚泥を用いる硝化脱窒による窒素除去で、汚泥中に存在し、窒素除去をおこなっている微生物を、窒素除去に関わる機能酵素の遺伝子に着目して、明らかにすることを試みた。すなわち、窒素除去反応に置いて重要な反応である、亜硝酸態窒素を一酸化窒素に変換する反応を司る、亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ）に着目した。亜硝酸還元酵素には、ＮｉＲ  Ｋ、  ＮｉＲ  Ｓと呼ばれる２種類の酵素があることが知られている。本発明者は、窒素除去に関わる微生物を、亜硝酸還元酵素ＮｉＲ  Ｋ、  ＮｉＲ  Ｓの遺伝子を検出することにより、特定した。また、本遺伝子の一部の塩基配列を明らかにすることで、塩基配列に基づいて窒素除去に関わる微生物を特定することを可能にすることに成功した。そしてこれらの微生物を含む活性汚泥を用いた窒素除去方法を確立することに成功し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、
本発明により、以下の〔１〕〜〔４８〕が提供される：
〔１〕  配列番号１又は３に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｕ１３近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔２〕配列番号２に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ１７近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔３〕配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１４、又は１６に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ４ＦＢ１１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【００１２】
〔４〕配列番号５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＳＴＣ１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔５〕配列番号８に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔６〕配列番号１１に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ２７近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔７〕配列番号１５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【００１３】
〔８〕配列番号１７に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ５８近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔９〕配列番号１８、３３又は３９に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  Ｐｄ１２２２近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１０〕配列番号１９に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１１〕配列番号２０、２２又は２４に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【００１４】
〔１２〕  配列番号２１に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１３〕配列番号２３に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｚｏａｒｃｕｓ  ｔｏｌｕｖｏｒａｎｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１４〕配列番号２５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ４近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１５〕配列番号２６に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ２近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１６〕  配列番号２７に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＡＮＩＳ−７６近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【００１５】
〔１７〕配列番号２８、２９、３０、３６又は３８に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＨＮＩＳ−６近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔１８〕配列番号３１に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【００１６】
〔１９〕配列番号３２に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｌｉｎａｌｏｏｌｅｎｔｉｓ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔２０〕配列番号３４に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔２１〕配列番号３５に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｔｅｒｐｅｎｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ５８Ｅｕ近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
〔２２〕配列番号３７に示す配列を有する、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍｉ１１近縁細菌の亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子のＤＮＡ断片。
【００１７】
〔２３〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のＤＮＡ断片の塩基配列を含み、かつ、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物。
【００１８】
〔２４〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に上記〔９〕〜〔２３〕のいずれかに記載のＤＮＡ断片の塩基配列を含み、かつ、窒素削減のために用いる活性汚泥法による水処理プラントの活性汚泥中に存在する微生物。
【００１９】
〔２５〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１又３に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｕ１３近縁細菌。
〔２６〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号２に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ１７近縁細菌。
〔２７〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号４、６、７、９、１０、１２、１３、１４又は１６に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ４ＦＢ１１近縁細菌。
【００２０】
〔２８〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．  ＳＴＣ１近縁細菌。
【００２１】
〔２９〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号８に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ近縁細菌。
〔３０〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１１に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ２７近縁細菌。
〔３１〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ近縁細菌。
〔３２〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｋ）遺伝子に配列番号１７に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  Ｍ５８近縁細菌。
【００２２】
〔３３〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号１８、３３又は３９に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
Ｐｄ１２２２近縁細菌。
〔３４〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号１９に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌。
【００２３】
〔３５〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２０、２２又は２４に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ近縁細菌。
〔３６〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２１に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌。
〔３７〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２３に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＡｚｏａｒｃｕｓ  ｔｏｌｕｖｏｒａｎｓ近縁細菌。
【００２４】
〔３８〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ４近縁細菌。
〔３９〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２６に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ｎｉｒＳＡＫ２近縁細菌。
〔４０〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２７に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＡＮＩＳ−７６近縁細菌。
〔４１〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号２８、２９、３０、３６又は３８に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＵｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｌｏｎｅ  ＨＮＩＳ−６近縁細菌。
【００２５】
〔４２〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３１に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｐａｎｔｏｔｒｏｐｈｕｓ近縁細菌。
〔４３〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３２に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｌｉｎａｌｏｏｌｅｎｔｉｓ近縁細菌。
〔４４〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３４に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＲ１近縁細菌。
〔４５〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３５に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＴｈａｕｅｒａ  ｔｅｒｐｅｎｉｃａ  ｓｔｒａｉｎ  ５８Ｅｕ近縁細菌。
〔４６〕その亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ  Ｓ）遺伝子に配列番号３７に示す塩基配列を含み、かつ、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理プラントの活性汚泥中に存在するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｓｔｒａｉｎ  Ｍｉ１１近縁細菌。
【００２６】
〔４７〕上記〔２３〕〜〔４６〕のいずれかに記載の微生物又は細菌を含む、硝化液循環型硝化脱窒活性汚泥法による窒素削減のための水処理に用いる活性汚泥。
【００２７】
〔４８〕上記〔４７〕に記載の活性汚泥を使用する窒素削減のための水処理方法。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、実施例において詳細に説明するが、高濃度のアンモニア態窒素とＣＯＤ成分をむ原水から、硝化脱窒による窒素除去をおこなうためのパイロットプラントの運転を行ない、このパイロットプラントから採取した活性汚泥に対して、微生物の解析を行った。
【００２９】
図１に硝化脱窒による窒素除去パイロットプラントの概要を示す。窒素除去を担う活性汚泥中の脱窒細菌を、亜硝酸還元酵素であるＮｉＲ  Ｋ及びＮｉＲ  Ｓの遺伝子を検出することにより、そのＤＮＡの塩基配列に基づき特定した。亜硝酸還元酵素の遺伝子ｎｉｒＫ（以下、亜硝酸還元酵素ＮｉＲ  Ｋの遺伝子についてはｎｉｒＫと表記する）の解析には、クローニングによるクローンライブラリー作成を用いて、活性汚泥に存在する窒素除去に関わる脱窒細菌が保有する、約５５０塩基にわたるｎｉｒＫ遺伝子の塩基配列を決定した。また、亜硝酸還元酵素の遺伝子ｎｉｒＳ（以下、亜硝酸還元酵素ＮｉＲ  Ｓの遺伝子についてはｎｉｒＳと表記する）の解析は、ＰＣＲ−ＤＧＧＥを用いて、活性汚泥に存在する窒素除去に関わる脱窒細菌が保有する、ｎｉｒＳ遺伝子の塩基配列の部分配列を決定した。
【００３０】
以下、実施例に用いた実験原理手順を説明する。
【００３１】
活性汚泥試料の採取と保管
プラントから採取した汚泥を、汚泥：エタノール＝９：１で混ぜてしばらく４℃で保存した。ＤＮＡ抽出用のサンプリングは以下のように行った。
１．２ｍｌチューブに汚泥を１ｍｌ取ったものを数個用意し、遠心分離にかけ上澄みを取り除く。
２．ペレットをＴＨ（ｐＨ８．０）バッファーで懸濁し、遠心分離で上澄みを取り除く。
３．−２０℃で保存する。
【００３２】
ＤＮＡ抽出
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌ（ＢＩＯ１０１）を使用した。
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌ（ＢＩＯ１０１）は、５００ｍｇまでの土壌や他の環境サンプルから３０分以内で効率的にＤＮＡを抽出できるＫｉｔである。ホモジナイズする装置が必要ではあるが、抽出作業時間が短い、フェノールやクロロホルムなどの有機溶媒が不要、また比較的抽出しにくいとされてきたグラム陽性細菌なども抽出可能、等の利点がある。
【００３３】
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  ＳＰＩＮ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｓｏｉｌの操作は大きく分けて２つのステップからなる。
１）細胞の破砕・ＤＮＡの可溶化・タンパク質の可溶化
サンプルを、ホモジナイズとタンパク質の可溶化が可能なバッファーに溶解させ、それをセラミックとシリカからなるビーズと混ぜることにより、細胞を破砕しＤＮＡを可溶化する。この段階で、ほとんどＲＮＡの混入のないＤＮＡを得ることができる。
【００３４】
２）ＤＮＡの精製と濃縮
可溶化したＤＮＡのみをシリカ製のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘに吸着させることで、混在する阻害物質を除去する。その後、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘに吸着したＤＮＡを溶出させて、精製ＤＮＡを得ることができる。
【００３５】
以下、手順を説明する。
【００３６】
１．サンプリングして保存しておいたペレットに、サンプルをホモジナイズし、タンパク質を可溶化することのできるＳｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＢｕｆｆｅｒとＭＴ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、ペレットを懸濁する。
２．ビーズの入ったＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｅ  ｔｕｂｅに１を移す。３．２をＦａｓｔ  Ｐｒｅｐに設置し、Ｓｐｅｅｄ５．０、３０ｓｅｃで２回処理を行い、細胞を破砕し溶解させる。
【００３７】
４．上澄みを新しいチューブに移し、ＰＰＳを加え、手で攪拌する。
５．遠心分離にかけタンパク質を沈殿させ、上澄みを新しいチューブに移すことでタンパク質を除去する。
６．５で移した上澄みと等量のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘを加え、手で反転浸透した後数分静置してＢｉｎｄｉｎｇ  ＭａｔｒｉｘにＤＮＡを吸着沈殿させる。
【００３８】
７．上澄みを除去した後、残った液でＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  ＤＮＡを懸濁し、それをＳｐｉｎ  Ｆｉｌｔｅｒに移す。
８．７を遠心分離にかけ、その後、ＳＥＷＳ−Ｍを加えてＦｉｌｔｅｒ上のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ−ＤＮＡを洗浄濃縮する。
９．Ｆｉｌｔｅｒ上のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  ＤＮＡにＤＥＳを加えて、遠心分離によりＤＮＡを溶出させ、ＰＣＲグレードのＤＮＡを回収する。ＤＮＡは−２０℃で保存可能である。
【００３９】
ＰＣＲ
以下の実施においては、解析対象サンプル中に存在する微生物のうち、窒素除去に関わるものを追跡するため、脱窒反応で重要な亜硝酸還元を司る亜硝酸還元酵素である、ＮｉＲ  ＫとＮｉＲ  Ｓの遺伝子をターゲットとしたＰＣＲを行った。
【００４０】
ｎｉｒＫ遺伝子とｎｉｒＳ遺伝子をターゲットとしたＰＣＲ法について、実験の流れを説明する。
【００４１】
１．ＤＮＡ抽出後、吸光光度計を用いてＤＮＡの濃度を測定する。
２．テンプレートとするＤＮＡを５０ｎｇ／μｌに調製する。
３．以下の表１に示すようにＰＣＲ  ｍｉｘｔｕｒｅを調製する。
【００４２】
【表１】
2004344138.tif 000002
【００４３】
使用するｐｒｉｍｅｒは以下の表２より選択する。
【００４４】
【表２】
2004344138.tif 000003
【００４５】
４．サーマルサイクラーＴ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）またはＧｅｎｅＡｍｐ９６００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、目的に応じたプログラム条件でＰＣＲを行う。
【００４６】
５．アガロースゲル（アガロースを１×ＴＡＥに溶かし１質量％から２質量％としたもの）を用いて１００Ｖで１５分間電気泳動を行い、その後１５分間のエチジウムブロマイド染色を行い、ＵＶトランスイルミネーター（東洋紡）でＰＣＲ産物が得られたかどうか確認をする。
【００４７】
クローニング
複合微生物系で、ある遺伝子を標的としたＰＣＲを行いそのＰＣＲ産物をテンプレートとしてクローニングを行うと、系の中に存在する様々な微生物がある確率で単離した状態で得られ、さらにクローンライブラリーを作成することで、存在微生物の全体像を知ることができる。硝化脱窒型の窒素除去を行う水処理プロセスの活性汚泥中の微生物について、ｎｉｒＫ遺伝子ののｐｒｉｍｅｒで得たＰＣＲ産物からクローンライブラリーを作成した。
【００４８】
クローニングは、大きく分けて次の２段階の反応からなる。
ライゲーション
ライゲーションとは、プラスミドベクターにインサート（特定の遺伝子産物（ＰＣＲ産物））を組み込む操作である。クローニングに用いられるプラスミドベクターは、インサートを組み込む必要があるため、制限酵素で切断されるクローニングサイトをもつ必要がある。また、最終的にプラスミドを大腸菌に感染させて、大腸菌を増やすことでプラスミドに組み込まれたＰＣＲ産物を増やすことをするので、プラスミドベクターは大腸菌に認識される複製開始点を持ち、さらにプラスミドを持つ大腸菌を選択的に増殖させるために薬剤耐性遺伝子を持つ必要がある。プラスミドベクターの調製は自分でも行うことはできるが、上記のように調製済みのベクターが市販されている。
【００４９】
ライゲーションの際には、ＰＣＲ産物の末端の修飾方法やベクター／インサート比に注意が必要である。末端の修飾方法にはいくつかあるが、比較的よく行われているのは、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用したＴＡクローニングという方法である。また、ベクター／インサート比については、効率よくライゲーションが行われるように通常は１／１から１／１０程度にする必要がある。
【００５０】
トランスフォーメーション（形質転換）
トランスフォーメーションとは、ライゲーションを行ったプラスミドを、ＤＮＡの取り込む能力のある大腸菌のコンピテント細胞に感染させる操作である。トランスフォーメーションした細胞を薬剤の含んだプレート上に播くことにより、薬剤耐性を持つ大腸菌、すなわちプラスミドを含む大腸菌が選択的に増殖してコロニーを形成する。一つのコロニーは一種類のみのインサートを含む大腸菌から成るので、複合微生物系において微生物ごとに遺伝子を分けることができる。
【００５１】
１）クローニングの方法の検討
インサートの末端修飾には幾つかの方法があり、それに伴いライゲーションの方法もいくつかあるが、本実験では、操作が比較的簡単で、形質転換体が７０％程度の確率で得られるといわれるＴＡクローニング法の変法を採用した。ＴＡクローニング法は、ＰＣＲでのＤＮＡ合成の際に付加されるデオキシアデノシン（ｄＡ）を利用した方法であり、鋳型ＤＮＡの配列によってはＰＣＲ産物にｄＡが付加しない平滑状のものが混ざった状態なので、ＰＣＲの鋳型ＤＮＡ等の条件によりクローニング効率が変わることに注意を要する。
【００５２】
ＴＡクローニング法として市販されているものの中で、具体的にはＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＡクローニング）のＫｉｔを使用した。これは、ＴＡクローニング法の変法で、Ｔの代わりにＵの付いたベクターを用いたものである。Ｔは非相補的な塩基（Ｇ，Ｃ，Ｔ）とハイブリダイズしやすく、Ｔが付加されたベクターはベクター同士のアニーリング等の結果をもたらす可能性が有るが、Ｕは非特異的なベースペアを形成しにくい為、クローニング効率が高いと言われている（ＱＩＡＧＥＮプロダクトガイド）。本実験においても、ＴＡクローニングとＵＡクローニングの比較を行った。ＴＡクローニングはインサート率（出現コロニー当たりのインサートが入ったコロニーの割合）が半分程度であったが、ＵＡクローニングはインサート率が９割程度と高く、ＵＡクローニング法の方がクローニング効率がよいことが明らかとなった。
【００５３】
２）適切なベクター／インサート比の検討
ベクター／インサート比については、通常１／１から１／１０程度にする。これは、インサートが少ないとインサート率が低くなり、逆にインサートが多すぎると複数のインサートが一つのベクターに入ってしまうという可能性も出てくるためである。本実験では、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＳｙｓｔｅｍのＫｉｔで推奨されている１／５と１／１０の両方について実験を行った。その結果、１／５と１／１０の両者で１／１０の方がコロニー数が１、２割程度多かったものの、顕著な差ではなかったため、１／５や１／１０程度の比であればどちらでもよいという結論に達した。
【００５４】
３）インサートの確認方法の検討
インサートの確認には、コロニーを液体培養で増やし、ミニプレップでプラスミドの抽出・精製を行った後にＰＣＲまたは制限酵素処理を行い、アガロースゲル電気泳動をする方法を使用した。
【００５５】
以下、手順を説明する。
【００５６】
１）ＰＣＲ産物（インサート）の精製
１．クローニングしたい目的のＰＣＲ断片を含むＰＣＲ産物を１サンプルにつき数本用意する。
２．それらを集め、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて過剰なプライマーやｄＮＴＰを除去して精製を行う。
３．精製したサンプルのＤＮＡ濃度を測定する。
【００５７】
２）クローニング操作
クローニングの基本的操作は、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍのプロトコルに準じた。
１．Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅを作成する。（ライゲーション反応液内のベクター／インサート比については、各サンプルにつき１／５と１／１０の両方を調製する。）
２．ＧｅｎｅＡｍｐ９６００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、１６℃で３０分間インキュベーションし、ライゲーション反応を行う。
３．トランスフォーメーションの操作をプロトコル通りに行う。
４．トランスフォーメーション液を寒天プレートに播く。
５．でき上がったプレートを３７℃で１７時間程度（一晩）インキュベートする。
【００５８】
３）プラスミド抽出
１．コロニーの生えたプレートを１時間程度４℃でコールドインキュベーションする。
２．プラスミドが入っているホワイトコロニーのみを楊枝でピックアップし、液体培地に入った１５ｍｌチューブに楊枝ごと入れる。
３．２を振とうしながら８〜１０時間培養する。
【００５９】
４．ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて付属のプロトコルに従いプラスミド抽出を行う。（このＫｉｔでは、大腸菌からプラスミドを溶出させ、精製、濃縮を行っていることになり、フェノール／クロロホルム抽出やエタノール沈殿等の操作を改めて行う必要はない。）
【００６０】
４）Ｍ１３  ＰＣＲ
得られたプラスミド抽出液をテンプレートとし、インサートよりも外側に位置している以下の表３に示すＭ１３プライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ条件はインサートの長さにより変える必要がある。
【００６１】
【表３】
2004344138.tif 000004
【００６２】
ＤＧＧＥ
ＤＧＧＥはｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法）の略であり、元来染色体ＤＮＡの点変異検出に用いられた技術である。ＤＧＧＥ法は、ＰＣＲと組み合わせることで、微量のサンプルから環境中に存在する微生物の遺伝子を培養過程を経ずに検出することができるということで、微生物生態分野において急速に普及した。ＤＧＧＥ法は、培養できない微生物の遺伝子でも検出できるという点ではクローニングと似ているが、バンドとして可視化出来るため、環境中にどれくらいの種類の微生物が存在するのかを容易に判断することができるという利点をもっている。
【００６３】
ＤＧＧＥは、ＤＮＡ変性剤（尿素とホルムアルデヒド）の濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲル中でＤＮＡ電気泳動を行うことにより、長さのそろった複数種の２本鎖ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ産物）を、塩基配列の違いにより分離できる方法である。
【００６４】
ＧＣクランプ（配列：ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧ）付きのプライマーセットを用いて、ＰＣＲで増幅した２本鎖ＤＮＡを変性剤の濃度勾配をつけたポリアクリルアミドゲルで電気泳動すると、ＤＮＡ変性剤の濃度上昇とともに２本鎖ＤＮＡ間の水素結合が切断され、二重らせん構造から１本鎖ＤＮＡに変性する。しかし、ＧＣクランプ部分は結合力が強いため、ＤＮＡは３方向に伸びた形になる。このように変性したＤＮＡは、ゲルを移動する速度が著しく小さくなるため、ある場所に集まり、バンドを形成する。配列の異なる複数の２本鎖（異なる微生物）のＤＮＡはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ間の水素結合の数及び配列の違いにより、異なるＤＮＡ変性剤濃度で解離するため、異なる位置にバンドが形成され、その結果、微生物を種類ごとに分離することができる。このようにして、サンプルごとにバンドプロファイルが得られ、そのパターンにより群集を評価することができるということになる。
【００６５】
以下、手順を説明する。
１）ポリアクリルアミドゲルの作成
１．変性剤について低濃度ゲル溶液、高濃度ゲル溶液、さらに０質量％のゲル溶液を調製する。ポリアクリルアミド濃度は８質量％とする。ゲルの組成を以下の表４に記す。
【００６６】
【表４】
2004344138.tif 000005
【００６７】
２．１をそれぞれ脱気したものについて、低濃度・高濃度ゲル溶液を１４ｍｌずつ用意する。
３．用意した高濃度ゲルにＤｙｅを加え、低濃度高濃度のそれぞれに架橋剤である０．５質量％ＡＰＳと０．０５質量％ＴＥＭＥＤを加える。
４．変性剤の濃度勾配をつけられる装置を用いてゲルキャスティングを行う。
５．１２時間放置することで重合を促進させる。
【００６８】
２）電気泳動
ＤＧＧＥの泳動装置には、Ｄ  ｃｏｄｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を使用した。
１．サンプルを用意する。
２．サンプル２０μｌと６×Ｄｙｅ４μｌを混ぜ、調製する。
３．１×ＴＡＥ７Ｌを６０℃まで加温したチャンバーにゲルをセットし、サンプルをアプライする。
４．１３０Ｖで５〜６時間、電気泳動を行う。
【００６９】
３）画像取得と解析
画像取得とその解析はＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ５９５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）Ｓｃａｎｎｅｒ  ＣｏｎｔｒｏｌとＩｍａｇｅ  Ｑ  ｗａｎｔ、ＦｒａｇｍｅＮＴを使用し行った。
【００７０】
１．泳動し終わったゲルを１万倍に希釈したＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎで１５分間染色する。
２．余分な染色液を取り除き、蛍光イメージアナライザーＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）のＳｃａｎｎｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌを用いて、画像解析ソフトＩｍａｇｅ  Ｑ  ｗａｎｔで画像を取り込む。
【００７１】
３．塩基配列決定の為、バンドを切り出す必要のある場合はバンドを切り出す。
４．バンド強度をもとめる等の解析をする場合は、画像解析ソフトＦｒａｇｍｅＮＴを利用して付属のマニュアルに従い解析を行う。
【００７２】
シーケンシング
シーケンシングの一例として、ＳＱ−５５００（日立製作所）を用いた場合を例に、シーケンシングの方法を説明する。
【００７３】
１）オートシーケンサーＳＱ−５５００（日立製作所）によるシーケンシング
１．プロトコルに従いポリアクリルアミドゲルを作成する。
２．Ｖｉｓｔｒａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍａｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｓｈｉａ）を用い、そのプロトコルに従ってシーケンシング反応のｍｉｘｔｕｒｅを調製する。
３．Ｔ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）またはＧｅｎｅＡｍｐ９６００（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、シーケンシング反応を行う。シーケンシング反応のプログラムは、増幅部位の長さに関わらず、＜９５℃５ｍｉｎ、〔９５℃：３０ｓｅｃ、６０℃：３０ｓｅｃ〕×２５回、４℃＞を使用する。
【００７４】
４．ＨＩＴＡＣＨＩ  ＳＱ−５５００で１時間予備泳動したゲルに、３のサンプルをアプライする。
５．適当な時間、電気泳動を行う。
６．ｆｏｒｗａｒｄ鎖とｒｅｖｅｒｓｅ鎖のａｓｓｅｍｂｌｅを行い、必要に応じて修正し塩基配列を決定する。
【００７５】
【実施例】
実施例１：パイロットプラントの運転
高濃度のアンモニア態窒素とＣＯＤ成分として、フェノールと、チオ硫酸、チオシアンといった硫黄化合物を含む原水を調製し、この原水から硝化脱窒による窒素除去を行うパイロットプラントを運転した。水質データのモニタリングを行い、また定期的に複合微生物解析のため、活性汚泥の採取を行った。図１に、パイロットプラントの概要を、そして以下の表５に運転条件を示す：
【００７６】
【表５】
2004344138.tif 000006
【００７７】
パイロットプラントは、安水のＣＯＤ削減とアンモニア除去を行うため硝化液循環型の硝化脱窒活性汚泥法を採用した。原水の構成成分を以下の表６に示す：
【００７８】
【表６】
2004344138.tif 000007
【００７９】
原水は前段で、嫌気槽である脱窒槽を、後段で、好気槽である硝化槽を通り、硝化液は脱窒槽へ戻って循環処理される。処理水は、沈殿槽を経て放流される。硝化液の循環率は２００％、汚泥返送率は１００％である。汚泥の引き抜きを行い、ＳＲＴが約３０日間となるように運転した。各水質の測定項目を以下の表７に示す：
【００８０】
【表７】
2004344138.tif 000008
【００８１】
微生物群集解析用の活性汚泥は硝化槽の２槽めから採取した。
【００８２】
以下にパイロットプラントの運転状況を示す。
まず、窒素除去性能であるが、図２に原水と処理水の全窒素濃度及び窒素除去性能の目安となる原水と処理水の全窒素濃度の差の推移を示す。
【００８３】
図２に示すように経時的に良好な窒素除去性能が得られるようになった。
また、窒素除去が少ない２００２年８月２１日の時点と、窒素除去が良好な２００２年１１月１３日の時点における、脱窒槽でのフェノール、チオ硫酸、チオシアンの消費速度を計算した結果を、以下の表８に示す：
【００８４】
【表８】
2004344138.tif 000009
【００８５】
脱窒による窒素除去の高まりと対応して、フェノール、チオ硫酸、チオシアンが多く消費されることが明らかとなった。フェノール、チオ硫酸、チオシアンをＣＯＤ成分として消費する硝酸態窒素からの脱窒反応、及び、亜硝酸態窒素からの脱窒反応は、それぞれ以下のように表すことができると考えられる。
【００８６】
まず、硝酸態窒素からの脱窒反応については、以下のように表せる。
フェノールを用いる硝酸態窒素からの脱窒反応は、  ：
５Ｃ６Ｈ５ＯＨ  ＋  ２８  ＮＯ３−  →  １４Ｎ２  ＋  ３０ＣＯ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  ２８ＯＨ−
のように表すことができ、フェノール１ｇあたり硝酸態窒素を０．８３ｇ脱窒できることが計算される。
【００８７】
チオ硫酸を用いる硝酸態窒素からの脱窒反応は、
５Ｓ２Ｏ３２−  ＋  ８ＮＯ３−  ＋  Ｈ２Ｏ  →  ４Ｎ２  ＋  １０ＳＯ４２−  ＋  ２Ｈ＋
のように表すことができ、チオ硫酸１ｇあたり硝酸態窒素を０．２ｇ脱窒できることが計算される。
【００８８】
チオシアンを用いる硝酸態窒素からの脱窒反応は、
５ＳＣＮ−  ＋  ３ＮＯ３−  ＋  Ｈ２Ｏ  →  ４Ｎ２  ＋  ５ＳＯ４２−  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  ２Ｈ＋
のように表すことができ、チオシアン１ｇあたり硝酸態窒素を０．１４ｇ脱窒できることが計算される。
【００８９】
次に、亜硝酸態窒素からの脱窒反応については、以下のように表せる。
フェノールを用いる亜硝酸態窒素からの脱窒反応は、
３  Ｃ６Ｈ５ＯＨ  ＋  ２８  ＮＯ２−  ＋  ２８  Ｈ＋  →  １４  Ｎ２  ＋  １８  ＣＯ２  ＋  ２３  Ｈ２Ｏ
のように表すことができ、フェノール１ｇあたり亜硝酸態窒素を１．４ｇ脱窒できることが計算される。
【００９０】
チオ硫酸を用いる亜硝酸態窒素からの脱窒反応は、
３  Ｓ２Ｏ３２−  ＋  ８  ＮＯ２−  ＋  ２  Ｈ＋  →  ４  Ｎ２  ＋  ６  ＳＯ４２−  ＋  Ｈ２Ｏ
のように表すことができ、チオ硫酸１ｇあたり亜硝酸態窒素を０．３３ｇ脱窒できることが計算される。
【００９１】
チオシアンを用いる亜硝酸態窒素からの脱窒反応は、
３  ＳＣＮ−  ＋  １１  ＮＯ２−  ＋  ８  Ｈ＋  →  ７  Ｎ２  ＋  ３  ＳＯ４２−  ＋  ３  ＣＯ２  ＋  ４  Ｈ２Ｏ
のように表すことができ、チオシアン１ｇあたり亜硝酸態窒素を０．８８ｇ脱窒できることが計算される。
【００９２】
したがって、本パイロットプラントの結果から、硝酸態窒素又は亜硝酸態窒素からの脱窒が、原水由来のフェノール、チオ硫酸、チオシアンを用いて可能であることが実証できた。上記の計算結果から、化学量論的に、亜硝酸態窒素とフェノール又はチオシアンを基質とする脱窒、あるいは硝酸態窒素とフェノールを基質とする脱窒反応が効率的に進んだことが考えられる。
【００９３】
実施例２：クローニングによる亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＫの塩基配列決定と、当該遺伝子を有する微生物の特定
クローニングでは、ＰＣＲで増幅することができさえすれば、サンプル中に存在する微生物全てが、ある確率でクローンとして得られることになる。そこで、窒素除去性能が良好な時点のパイロットプラントから活性汚泥を採取して、その中に存在する脱窒菌を亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＫを有することを手掛かりに、特定することを試みた。まず、活性汚泥に存在する微生物に対して、亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＫの約５１５ｂｐの領域のクローニングを行い、その塩基配列を決定した。
【００９４】
方法
クローニングの操作は、先に説明したプロトコルに従って行った。窒素除去性能が良好な時点のパイロットプラントから採取した活性汚泥について、ＤＮＡ抽出液から亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＫの約５１５ｂｐの領域をＰＣＲ増幅した（ＰＣＲ条件＜９５℃：１０ｍｉｎ、〔９４℃：３０ｓｅｃ、５０℃：３０ｓｅｃ、７２℃：２ｍｉｎ〕×２５回、７２℃：１０ｍｉｎ、４℃＞）。ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓをＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ  （ｐＴ７ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  （Ｔａｋａｒａ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ），  ＤＨ５α  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｋｉｔ  （ＴＯＹＯＢＯ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ））を使用してクローニングした。寒天プレート上に得られたコロニーのうち、白いコロニーのみ、滅菌した爪楊枝で採取し、予め用意したＰＣＲ  ｍｉｘｔｕｒｅ（１００μｌ）に懸濁した。ＰＣＲ  ｍｉｘｔｕｒｅの組成、ＰＣＲ条件は、春日らの報告（春日ほか  （２００１）水環境学会誌，  ２４，  ８５６−８６４）に従ったが、ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒにはベクターをターゲットとしたＭ１３  ｐｒｉｍｅｒを用い、同プライマーによりインサートを増幅した。なお得られたＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓに対しアガロース電気泳動を行い、増幅を確認した。ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓをＭｉｃｒｏｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）により精製し、ｐｒｉｍｅｒ  ｄＮＴＰを除去した。
【００９５】
次に精製したＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（２０ｎｇ）を表３に記載のＭ１３  ｐｒｉｍｅｒ、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使って、シーケンシング反応を行った。反応条件はＡＢＩ３１０  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のマニュアルに従った。シーケンシング反応で得られた産物中に含まれるｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを  Ｃｅｎｔｒｉ−ｓｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で除去した後、ＡＢＩ３１０ＤＮＡシーケンサーでシーケンシングを行った。
【００９６】
決定した塩基配列を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．  ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）を用いて既知種の中から相同性の高い塩基配列を検索し、相同性を調べ、微生物の特定を行った。
【００９７】
結果・考察
亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＫの塩基配列として、配列表の配列番号１〜１７に記載の塩基配列を決定した。相同性解析の結果を表９に記す。
【００９８】
【表９】
2004344138.tif 000010
【００９９】
全てデータベース上に１００％一致のものがなく、新規なｎｉｒＫ遺伝子の塩基配列を有する微生物であることを実証した。
【０１００】
実施例３：ＰＣＲ−ＤＧＧＥによる亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＳの塩基配列決定と、当該遺伝子を有する微生物の特定
ＰＣＲ−ＤＧＧＥは、環境サンプル等の培養できない微生物の遺伝子でも検出し、バンドとして可視化でき、さらにはバンドを切り出すことでそのバンドの塩基配列情報を得ることができるため、近年、複合微生物系である環境サンプルの解析などにおいて急速に普及してきた技術である。また、微生物の変化を系時的にバンドの変化として追うことができるという利点を有している。そこで、窒素除去性能が良好な時機のパイロットプラントから活性汚泥を採取して、その中に存在する脱窒菌を亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＳを有することを手掛かりに、特定することを試みた。まず、活性汚泥に存在する微生物に対して、亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＳの一部塩基配列を決定した。
【０１０１】
以下、手順を説明する。
窒素除去性能が良好な時機のパイロットプラントから採取した活性汚泥からＤＮＡを抽出し、以下の表１０に記載したＧＣクランプ付きプライマーセットを用いて亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＳの一部領域を増幅して解析対象とした。
【０１０２】
【表１０】
2004344138.tif 000011
【０１０３】
ＰＣＲ条件は、＜９５℃：１０ｍｉｎ、〔９４℃：３０ｓｅｃ、５３℃：３０ｓｅｃ、７２℃：３０ｓｅｃ〕×３５回、７２℃：１０ｍｉｎ、４℃＞であった。その後、ＤＧＧＥのプロトコルに従い４０質量％から６０質量％の変性剤濃度勾配をつけたゲルを用いて、１３０Ｖで６時間電気泳動を行った。
【０１０４】
塩基配列解読によるＤＧＧＥバンドの近縁種決定
得られたバンドについて、それぞれどのような微生物なのかを確認し、パイロットプラント内に存在する微生物の全体像を把握するため、各バンドの近縁種の決定を試みた。
【０１０５】
方法
ＤＧＧＥのゲルから主要なバンドを切り出し、滅菌ｍｉｌｌｉＱとともに凍結融解を３回繰り返すことで、ゲル片からＤＮＡを回収し、それをテンプレートとしてＰＣＲ−ＤＧＧＥを行うという精製の操作を繰り返し、ＤＧＧＥのゲル上で一本のバンドにした。最増幅のＰＣＲ条件は、＜９５℃：１０ｍｉｎ、〔９４℃：３０ｓｅｃ、５３℃：３０ｓｅｃ、７２℃：３０ｓｅｃ〕×２５回又は２０回、７２℃：１０ｍｉｎ、４℃＞である。その後、精製したＤＮＡをテンプレートとしてＧＣクランプ無しのプライマーで亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｒＳの当該領域を再増幅（ＰＣＲ条件：＜９５℃：１０ｍｉｎ、〔９４℃：３０ｓｅｃ、５３℃：３０ｓｅｃ、７２℃：３０ｓｅｃ〕×２５回、７２℃：１０ｍｉｎ、４℃＞）し、シーケンシング反応のテンプレートとした。シーケンシング反応は先に説明したプロトコルに従い、またシーケンサーはＨＩＴＡＣＨＩ（ＳＱ−５５００）を用いた。塩基配列を決定した後、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｉｒａｌ．ｇｅｎｅｓ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｂｌａｓｔ．ｓｈｔｍｌ）を用いて既知種の中から相同性の高い塩基配列を検索し、ＤＧＧＥ各バンドの近縁種を決定した。
【０１０６】
結果・考察
亜硝酸還元酵素遺伝子  ｎｉｒＳの一部塩基配列として、配列表の配列番号１８から３９に記載の塩基配列を決定した。相同性解析の結果を以下の表１１に示す：
【０１０７】
【表１１】
2004344138.tif 000012
【０１０８】
全てデータベース上に１００％一致のものがなく、新規なｎｉｒＫ遺伝子の塩基配列を有する微生物であることを実証した。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明は、窒素含有排水から窒素除去する作用を有する微生物を明らかにすると共に、ＤＮＡの塩基配列を用いて当該微生物を検出する方法を確立した。これにより、窒素除去方法及びその評価方法を提供することを可能にした。
【配列表】
2004344138.tif 000013
2004344138.tif 000014
2004344138.tif 000015
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2004344138.tif 000019
2004344138.tif 000020
2004344138.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、硝化脱窒による窒素除去パイロットプラントの概略図である。
【図２】図２に原水と処理水の全窒素濃度及び窒素除去の性能の目安となる原水と処理水の全窒素濃度の差の推移を示す。
【図１】
2004344138.tif 000022
【図２】
2004344138.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月30日(2003.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
【発明の効果】
本発明は、窒素含有排水から窒素除去する作用を有する微生物を明らかにすると共に、ＤＮＡの塩基配列を用いて当該微生物を検出する方法を確立した。これにより、窒素除去方法及びその評価方法を提供することを可能にした。
【配列表】
2004344138.tif 000024
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