(57)【要約】【課題】ダイオキシン類分解能を有する酵素の活性を長期間維持することができ、再使用可能な顆粒状のダイオキシン類分解剤を提供する。また、かくして得られたダイオキシン類分解剤を汚染土壌に施し、土壌中のダイオキシンを効果的に分解除去する土壌浄化方法を提供する。【解決手段】栄養源を加えた培養物中で白色腐朽菌を培養し、次いで、前記培養物中から粗酵素を抽出し、得られた粗酵素を包括法により固定化した顆粒状のダイオキシン類分解剤。及び、この顆粒状のダイオキシン類分解剤を、汚染土壌に鋤き込んで土壌中のダイオキシン類を分解する土壌浄化方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
白色腐朽菌を培養するための培養物基材に、白色腐朽菌と、この白色腐朽菌を繁殖させるのに必要な量の栄養源を加えて前記白色腐朽菌を培養し、次いで、前記培養物中から粗酵素を抽出し、得られた粗酵素を包括法により固定化したことを特徴とする顆粒状ダイオキシン類分解剤。
【請求項２】
前記白色腐朽菌は、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルド６５菌株、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株、カワタケ属２６７菌株、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株、コウヤクタケ科に属する微生物、カワタケ属コウヤタケ科に属する微生物、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１の内、いずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の顆粒状ダイオキシン類分解剤。
【請求項３】
前記培養物基材が、木紛、又は木紛とバーク堆肥の混合物、又はこれらに、界面活性剤、ベラトリルアルコール、又は金属イオンの内、いずれか１つを混合したものであることを特徴とする請求項１に記載の顆粒状ダイオキシン類分解剤。
【請求項４】
前記栄養源が、米糠又は及び小麦ふすまを含むことを特徴とする請求項１に記載の顆粒状ダイオキシン類分解剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の顆粒状のダイオキシン類分解剤を、ダイオキシン類で汚染された田畑を含めた土壌中に散布及び混入し、１ヶ月以上の自然放置をもって、ダイオキシン類を分解すると共に、前記土壌中に残留物を残さないことを特徴とする汚染土壌浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ダイオキシン類を効果的に分解することができる白色腐朽菌が産出する粗酵素を、包括法により固定化してなる顆粒状ダイオキシン類分解剤及びその顆粒状ダイオキシン類分解剤を汚染土壌中に散布及び混入することにより、ダイオキシン類を分解すると共に、前記土壌中に残留物を残さない汚染土壌浄化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、廃棄物焼却施設において生成されるダイオキシンが社会的問題となっている。このダイオキシンは、焼却灰や排ガス或いは飛散灰中に存在し、飛散灰は近くの地上に落下する。また排ガスは、より遠くへ気流に乗って放散され、やがて近隣の土壌へ落下する。こうして土壌中に含有されることとなったダイオキシンは、川に流れ、魚介類に蓄積され、やがて人体に蓄積されることになる。それに伴う発ガン性や偏奇形性が、大きな社会問題として懸念されるところである。
【０００３】
ダイオキシンは、有機塩素化合物の一種で、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素原子によって結び付けられた骨格構造を持つジベンゾフラン又はシベンゾ−Ｐ−ダイオキシンの総称で、塩素原子の置換のされ方によって、理論的には夫々１３５種類及び７５種類の異性体が存在するとされる。毒性は、塩素の置換位置と数により大きく変化し、中でも２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−Ｐ−ダイオキシンの毒性が最も高いとされている。
【０００４】
これらダイオキシン類を分解除去する技術として、完全燃焼法、熱分解処理法、ペレット化焼成法、光分解法、化学的分解法、超臨界水処理法等が提案され、大型焼却炉の焼却灰の処理や煙道の排ガス処理等に利用されつつある。
【０００５】
しかしながら、これら公知の技術にあっては、大型焼却炉を設置して焼却灰中のダイオキシンを処理したり、煙道中に取付けて飛散灰を少なくしたり、排ガス中のダイオキシンを少なくすることは可能とされるものの、小形焼却炉には適用できず、また既に大気中に放散され土壌中に拡散されてしまったダイオキシンに対しては、全く無力であった。
【０００６】
一方、土壌中に拡散されたダイオキシンの分解除去は、微生物の応用によってのみ解決されることが期待されるところである。そこで、愛媛大学農学部生物資源学科森林資源利用化学研究室等では、ダイオキシン分解能の有る微生物を緊急研究し、既に特開平１１−３４１９７８号公報や特開２００１−１６１３４９号公報で、ダイオキシン分解能の高い新規微生物を得て公表している。特開平１１−３４１９７８号公報では、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルド６５菌株と、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株と、カワタケ属２６７菌株と、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株と、コウヤタケ科（特にカワタケ属）に属する微生物が紹介されている。特開２００１−１６１３４９号公報では、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２と、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１が紹介されている。
【０００７】
かくして見出されたダイオキシン分解能を有する微生物は、農地等の土壌中に投与すると、その土壌中の雑菌により前記微生物の生息が阻害される場合が多いので、雑菌の多い土壌中では思うようにダイオキシンの分解が進行しない場合が多い。前記の微生物が直接ダイオキシンを分解するのではなくて、この微生物が産出する酵素がダイオキシン類を分解する。
【０００８】
前記微生物が発生する酵素は一般的に不安定であり、酸、アルカリ、有機溶媒や雑菌類よって、またその他の物理的、化学的要因によって、その活性が失われるので、酵素を直接農地等の土壌中に投与しても、ダイオキシン類分解能は短期間で失われる。
【０００９】
この対策として、特開２００１−２３２３４６号公報には、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水に、磁性体微粒子に固定化された塩素化ダイオキシン分解酵素を接触させて、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水を浄化する方法が開示されている。しかしながら、この塩素化ダイオキシン分解酵素は磁性体微粒子の表面に付着しているだけであり、酵素が汚染された土壌と直接接触し、酵素の活性を長期間持続できない。
【特許文献１】
特開平１１−３４１９７８号公報、第１頁
【特許文献２】
特開２００１−１６１３４９号公報、第１頁
【特許文献３】
特開２００１−２３２３４６号公報、第１頁
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記従来技術に鑑みて、既に研究開発されたダイオキシン分解能を有する微生物、即ち白色腐朽菌が発生する粗酵素を包括法で固定化することにより、酵素の活性を長期間維持することができ、再使用可能な顆粒状ダイオキシン類分解剤を提供することを目的とする。
【００１１】
また、かくして得られた顆粒状ダイオキシン類分解剤を汚染土壌に施し、土壌中のダイオキシンを効果的に分解除去する土壌浄化方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明は、白色腐朽菌を培養するための培養物基材に、白色腐朽菌と、この白色腐朽菌を繁殖させるに必要な量の栄養源を加えて前記白色腐朽菌を培養し、次いで、前記培養物中から粗酵素を抽出し、得られた粗酵素を包括法で固定化したことを特徴とする顆粒状ダイオキシン類分解剤である。白色腐朽菌としては、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株、カワタケ属２６７菌株、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株、コウヤクタケ科に属する微生物、カワタケ属コウヤタケ科に属する微生物、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１等ダイオキシン分解能が高いことを実証されたもの等を用いることができる。
【００１３】
本発明で用いる培養物基材は、菌床基材または液体培地である。菌床基材としては、木紛、又は木紛とバーク堆肥の混合物、又はこれらに、界面活性剤、ベラトリルアルコール、又は金属イオンの内、いずれか１つを混合したものである。木紛としては、楢又はブナ等の落葉樹の木紛が好ましく用いられる。これ等の培養物基材に加える栄養源として、鉄、マグネシウム、銅、又は亜鉛等の金属イオン等の活性化物質に米糠又は及び小麦ふすま等を含めたものを加えたものがよい。このような菌床を用いることにより、より効率的に白色腐朽菌を培養することができる。
【００１４】
本発明の土壌浄化方法は、前記粗酵素を包括法で固定化してなる顆粒状のダイオキシン類分解剤を、ダイオキシン類で汚染された田畑を含めた土壌中に散布及び混入し、１ヶ月以上の自然放置をもって、ダイオキシン類を分解することを特徴とするものである。
【００１５】
粗酵素を固定化する包括法としては、マイクロカプセル型と格子型があり、いずれも高分子等によって酵素を内部に格納しているので、酵素が直接外気と接触することがなく、長期間酵素活性を持続させることができる。高分子等としては、アルギン酸カルシウム、カラゲナシ、セルロース、ポリアミド、アクリルアミド等が好ましく用いられる。
【００１６】
本発明の包括法で固定化してなる顆粒状ダイオキシン類分解剤は、１０ｍｍ以下、好ましくは１〜６ｍｍ程度の顆粒状に形成して、ダイオキシン類分解剤とする。この顆粒状ダイオキシン類分解剤をダイオキシン類で汚染された田畑を含めた土壌中に散布及び混入するので、ダイオキシン類分解能を長期間持続することができると共に、前記土壌中に残留物を残さない特徴がある。
【００１７】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の好ましい実施の形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
まず、粗酵素をマイクロカプセル型に固定化した顆粒状のダイオキシン類分解剤の製造方法について示す。培養物基材として楢又は及びブナの木紛からなる菌床を用いる。液体培地としてはグルコース、コハク酸ナトリウム六水和物、第一リン酸カリウム等からなるＫｉｒｋの培地を用いる。
【００１９】
これらの培養物基材に白色腐朽菌と、この白色腐朽菌を繁殖させるのに必要な量の栄養源を加える。栄養源として、米糠又は及び小麦ふすまを加える。白色腐朽菌としては、例えば、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１若しくはヒラタケ２又はタコンキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１を用いる。ここでは、これをＰＬ１菌と称す。
【００２０】
以上のようにして作成した培養物中で、ＰＬ１菌を菌糸蔓延した状態まで培養した後、この菌体にリン酸緩衝液を加えて摩砕し、粗酵素を濾過抽出する。マロン酸緩衝液に溶解させた前記粗酵素液にグルコース、アルギン酸ナトリウム水溶液を加えて混合し、塩化カルシウムが溶解したマロン酸緩衝液に滴下して、粗酵素をアルギン酸カルシウムによってマイクロカプセル型に固定化した、粒径が３〜６ｍｍの顆粒状ダイオキシン類分解剤を得る。
【００２１】
かくして得られた顆粒状ダイオキシン類分解剤をダイオキシン類で汚染された田畑を含めた土壌中に散布及び混入する。土壌中への混入割合は、絶乾土壌１ｋｇに対しておよそ４００〜３０００Ｕに相当する量の酵素を含む顆粒状ダイオキシン類分解剤である。ここで、Ｕとは、酵素量を表すために規定された量で、酵素活性の強さ、すなわち一定条件において、一定時間に酵素によって触媒された反応量で表される。通常、１分間に１μ  ｍｏｌの変化をおこなう酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）とする。混合した顆粒状ダイオキシン類分解剤は、マイクロカプセル化しているので、酵素が直接外気に触れることが無く、ダイオキシン類分解能を長期間持続することができると共に、前記土壌中に残留物を残さない。
【００２２】
ダイオキシン類で汚染された水を浄化する場合は、前記顆粒状ダイオキシン類分解剤を充填したバイオリアクター内に、ダイオキシン類で汚染された水を巡回させることによって、繰り返し何回でも汚染水を浄化することができる。
【００２３】
（実施例）（１）粗酵素の固定化：マロン酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ４．５）に溶解させた酵素４２００Ｕ、グルコースオキシタ−ゼ６００Ｕ及びグルコース２．５ｇを、１．５％アルギン酸ナトリウム水溶液３５０  ｍｌに加えて撹拌しながら溶解して均一な溶液にした。この溶液をピペットに取り、スターラーで撹拌している氷冷したマロン酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ  ４．５）［０．１Ｍ塩化カルシウムを含む］にゆっくり滴下して、アルギン酸カルシウムによる顆粒状の固定化酵素ゲルを作成した。次いで、この固定化酵素をマロン酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ  ４．５）で洗浄して、３５０ｇの顆粒状の固定化酵素を得て、実験に使用した。
（２）土壌中のダイオキシンの固定化酵素による分解：ダイオキシンの１種である３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニール（以下ＴＣＢという）１．０ｍｇを適量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし、これを、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を１％含む水２００  ｍｌに溶解したものを土壌４０００ｇ（乾燥重量）に加えて、よく混合して４等分し、１ｐｐｍのＴＣＢを含む土壌を調製した。この土壌に、（１）で調製した固定化酵素を表１に示す量加えて混合した。次いで、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を１％含む５０ｍｌの水［ＨＢＴ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）５３．３ｍｇ及び０．５ｍＭのＭｎＳＯ４を含む］をそれぞれの土壌に添加して、１５及び３０日間処理した。尚３０日後に、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を１％含む５０ｍｌの水［ＨＢＴ５３．３ｍｇ及び０．５ｍＭのＭｎＳＯ４を含む］をそれぞれの土壌に再度添加して、１５及び３０日間処理した（第１回目の添加日から、４５日及び６０日間処理したことになる）。１５，３０，  ４５及び６０日間処理後のＴＣＢ分解率を表１に示す。
（比較例）土壌中のＰＣＢｓの粗酵素による分解：マロン酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ  ４．５）に溶解した酵素１２００Ｕ、グルコースオキシターゼ６００Ｕ、グルコース２．５ｇ、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を１％含む５０ｍｌの水［ＨＢＴ５３．３ｍｇ及び０．５ｍＭのＭｎＳＯ４を含む］を（２）で作成した１ｐｐｍのＴＣＢを含む土壌１０００ｇ（乾燥重量）に加えて混合して、１５及び３０日間処理した。尚３０日後に、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０を１％含む５０ｍｌの水［ＨＢＴ５３．３ｍｇ及び０．５ｍＭのＭｎＳＯ４を含む］を土壌に再度添加して、１５及び３０日間処理した（第１回目の添加日から、４５日及び６０日間処理したことになる）。１５，３０，  ４５及び６０日間処理後のＴＣＢ分解率を表１に示す。
【表１】
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【００２４】
表１に示すように、酵素量が多い程、ＴＣＢの分解率が高いことが分る。また、租酵素液は処理日数によって、分解能力が低下するが、固定化した酵素は、処理日数によって分解能力の低下が少ないことが分る。
【００２５】
次に、以上の如き粗酵素を包括法で固定化した顆粒状ダイオキシン類分解剤の土壌への適用方式について示す。基本的には、直径１〜６ｍｍの顆粒状のダイオキシン類分解剤を土壌に撒き、これをトラクターで耕運し、鋤き込むことで実施できる。散布量は、耕運する絶乾土壌１ｋｇに対し４００〜３０００Ｕに相当する量の酵素を含む顆粒状ダイオキシン類分解剤を目安とする。適用可能な土壌としては、田畑等の農地の他、工場跡地やその他の土地が挙げられる。
【００２６】
【発明の効果】
以上の通り本発明は、特許請求の範囲に記載の通りの包括法により固定化された顆粒状ダイオキシン類分解剤である。汚染土壌を浄化する場合は、これを土壌に鋤き込むことにより、土壌中に分散されたダイオキシン類を効果的に分解除去することができる。また、汚染水を浄化する場合は、これをバイオリアクターに充填し、ダイオキシン類で汚染された水を巡回させることによって、繰り返し何回でも汚染水を浄化することができる。
【００２７】
また、本発明は、上記ダイオキシン類分解剤を顆粒状物とした上で土壌中に鋤き込み、鋤き込まれた分解剤は包括法によって固定化された顆粒状のダイオキシン類分解剤なので、酵素が直接外気に触れることが無く、ダイオキシン類分解能を長期間持続することができるので、１ヶ月以上の期間をかけて土壌を浄化する。例えば農地を冬季の有休期間中に浄化することができ、農地、工場跡地、公園、ゴミ処理場週辺等の各種土壌を効果的に土壌浄化することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例に係るダイオキシン類分解剤の土壌への添加量及び効果の特性を示す特性線図である。
【図１】
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