(57)【要約】【課題】エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解して、その機能を消失させることができ、エイズウイルスの感染の予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素、およびそれを利用した抗ＨＩＶ薬剤を提供する。【解決手段】ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を作製し、そのモノクローナル抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の可変領域のアミノ酸配列、塩基配列を決定した。続いて、このアミノ酸配列について分子モデリングを行い、その３次元構造を推定し触媒三つ組残基構造を有しているか否かを確認した。そして、触媒三つ組残基構造を有するモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の可変領域を本発明の抗体酵素として取得した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ−５の抗体または抗体断片であり、かつ、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解することを特徴とする抗体酵素。
【請求項２】
上記抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５抗体の可変領域を含んでなることを特徴とする請求項１記載の抗体酵素。
【請求項３】
上記抗体酵素は、触媒三つ組残基構造を有することを特徴とする請求項１または２記載の抗体酵素。
【請求項４】
上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項５】
上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項６】
上記抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項７】
上記抗体酵素は、配列番号１１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載の抗体酵素。
【請求項８】
請求項１ないし７の何れか１項に記載の抗体酵素を含み、エイズウイルスの感染を阻害することを特徴とする抗ＨＩＶ薬剤。
【請求項９】
請求項１ないし７の何れか１項に記載の抗体酵素を含んでなるエイズウイルス感染患者に対する抗ＨＩＶ薬剤。
【請求項１０】
請求項１ないし７の何れか１項に記載の抗体酵素をコードする遺伝子。
【請求項１１】
配列番号２に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１２】
配列番号６に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１３】
配列番号１０に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１４】
配列番号１２に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項１０記載の遺伝子。
【請求項１５】
請求項１０ないし１４の何れか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５記載の形質転換体を含んでなる抗ＨＩＶ薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エイズウイルス（ＨＩＶ）のコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ−５に対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＩＤＳ（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、その原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルスＩ型（ｈｕｍａｎ    ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ    ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ−１）の感染によって免疫機能が低下し、それに伴って日和見感染症や悪性腫瘍、神経症状、痴呆などを合併した病態である。ＨＩＶ−１に感染すると、急性期、無昇症候期、エイズ関連症候群を経てエイズへと進展する。ＨＩＶ関連の研究や治療法などの進歩によって、エイズは不治の病から治療可能な病気になりつつあるが、現段階では確実な抗ＨＩＶ薬剤はなく、薬物による治療法も確立できていないのが現状である。
【０００３】
ＨＩＶの感染機構に関する研究において、１９８４年にＨＩＶ−１のレセプターとしてＣＤ４が同定された。ＣＤ４はヒトの細胞表面に存在し、ＨＩＶ−１の外皮糖タンパクであるｇｐ１２０と結合することによって、細胞に感染することが知られている。
【０００４】
しかし、ＣＤ４のみではウイルスの外皮と宿主細胞の細胞膜との融合は起こらず、ＨＩＶ−１の感染は成立しないため、コレセプター（セカンドレセプター）の存在が示唆されていた。そして、ＣＤ４の発見から１０年以上経過した後に、ＨＩＶのコレセプターであるケモカインレセプターＣＣＲ−５が発見された。さらに、ケモカインレセプターＣＣＲ−５が正常でない場合は、ＨＩＶ−１の感染・発症に抵抗を示すことも報告されたため、現在、多くの研究者や企業が、このコレセプターを標的としてＨＩＶ−１の侵入を阻害する薬剤の開発に乗り出している。
【０００５】
このようなＨＩＶコレセプターを標的とした抗ＨＩＶ薬剤の研究・開発の現状に関しては、以下に示す非特許文献１に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】
村上務、山本直樹著：タンパク質  核酸  酵素、Ｖｏｌ．４３、          ６７７−６８５頁（１９９８年）、「新しい抗ＨＩＶ薬剤の開発−ＨＩＶのコレセプター（セカンドレセプター）に作用する薬剤」
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記非特許文献１の表１に示すように、世界中の製薬企業が大学などの基礎研究機関と共同で、ＨＩＶコレセプターを標的とした抗ＨＩＶ薬剤の研究・開発に乗り出している。ケモカインレセプターＣＣＲ−５を標的としてＨＩＶ−１の感染を予防できる抗ＨＩＶ薬剤の候補としては、そのアンタゴニストとして作用する化合物が報告されている。
【０００８】
しかしながら、現在のところ、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５を直接攻撃して、その機能を消失させることのできる有効な薬剤は全く提案されていない。
【０００９】
そこで本発明では、ケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解して、その機能を消失させることができ、エイズウイルスの感染の予防やエイズの治療に利用できる抗体酵素を提供する。さらに本発明では、その抗体酵素をコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用した抗ＨＩＶ薬剤を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、上記課題を解決するために、抗体でありながら酵素作用を有し、標的としたタンパク質を完全分解することのできる抗体酵素に着目し、ケモカインレセプターＣＣＲ−５に対する抗体酵素を得るために鋭意検討した。その結果、ケモカインレセプターＣＣＲ−５に対する抗体のうち、抗体酵素としての機能を発揮するものが存在することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
即ち、本発明に係る抗体酵素は、ヒト由来ケモカインレセプターＣＣＲ−５の抗体、またはその抗体断片であり、かつ、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解することを特徴とするものである。ここで、上記「抗体断片」とは、ケモカインレセプターＣＣＲ−５を抗原とする抗体を構成する各ペプチド鎖、さらにはこの各ペプチド鎖内の一部の領域のペプチド断片を意味する。
【００１２】
また、上記「抗体酵素」とは、抗体でありながら酵素作用を有するものであり、その中でも特に、その抗原タンパク質を標的として高い分解活性を示すものは「スーパー抗体酵素」と呼ばれる。上記「スーパー抗体酵素」は、標的としたタンパク質を完全分解することができ、しかも天然型酵素に近い活性を有する（参考文献：Ｓｕｐｅｒ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ［Ｉ］  ：  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｉｔｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ．  Ｈｉｆｕｍｉ，  Ｅ．，  Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｕｄａ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ８８（３），  ３２３−３２７  （１９９９））。本発明の抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５を抗原とする抗体であり、当該ＣＣＲ−５を完全分解するため、「スーパー抗体酵素」に含まれる。
【００１３】
上記抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の抗体としての性質を色濃く残した状態で、その抗原であるケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解するという性質を持っている。そのため、上記抗体酵素は特異性が高く、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のみを狙って分解することができる。このケモカインレセプターＣＣＲ−５は、ＨＩＶの感染において重要な役割を示すコレセプターであることから、その機能を消失させることができる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染の予防や、エイズの治療に使用される抗ＨＩＶ薬剤として有効に利用することができる。
【００１４】
上記抗体酵素は、上記ケモカインレセプターＣＣＲ−５抗体の可変領域を含んでなることが好ましい。この「可変領域」とは、抗体を構成するＨ鎖及びＬ鎖のうち、Ｎ末端から約１１０残基のアミノ酸からなる部分のことである。この可変領域は、抗体の種類によって一次構造に多様性が見られ、抗体が酵素としての活性を有する場合にその活性中心が含まれている可能性が高い。それゆえ、上記抗体酵素が抗体の可変領域を含めば、酵素として高い活性を有することができる。
【００１５】
また、上記抗体酵素は触媒三つ組残基構造を有することが好ましい。なお、「触媒三つ組残基構造」とは、少なくともセリンを含む３つのアミノ酸残基が活性部位に含まれ活性中心を形成していると推定される構造のことを言う。この触媒三つ組残基構造を有するプロテアーゼは、活性部位にセリンが含まれることからセリンプロテアーゼと呼ばれる。従って、上記抗体酵素はセリンプロテアーゼの一種であると言うこともできる。この触媒三つ組残基と推定される構造を有していれば、プロテアーゼとして高い活性を有していると予測できる。
【００１６】
本発明に係る抗体酵素として、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１に示されるアミノ酸配列おいて、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１７】
この配列番号１に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−２のＬ鎖の可変領域は、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００１８】
本発明に係る抗体酵素の他の例として、配列番号５に示すアミノ酸配列、又は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００１９】
この配列番号５に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００２０】
本発明に係る抗体酵素のさらに他の例として、配列番号９に示すアミノ酸配列、又は、配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２１】
この配列番号９に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００２２】
本発明に係る抗体酵素のさらに他の例として、配列番号１１に示すアミノ酸配列、又は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含んでなるものを挙げることができる。
【００２３】
この配列番号１１に示すアミノ酸配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域である。このＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖の可変領域も、後述の実施例に示されるように、ＣＣＲ−５分解酵素としての高い活性が確認された。
【００２４】
また、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加」とは、例えば、遺伝子工学的手法を用いて部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、および／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されるものであればよい。このように、遺伝子工学的手法を用いた場合、配列番号１、５、９、１１の何れかに示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなる抗体酵素は、換言すれば、配列番号１、５、９、１１の何れかに示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体である。
【００２５】
本発明の抗体酵素は、ＨＩＶの感染において重要な役割を果たすケモカインレセプターＣＣＲ−５を分解して、その機能を消失させるため、ＨＩＶの感染を阻害する抗ＨＩＶ薬剤として使用することもできる。すなわち、本発明の抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素を含み、エイズウイルスの感染を阻害することを特徴とするものである。
【００２６】
また、本発明の抗体酵素は、ＨＩＶ感染患者に対してエイズの発症を遅らせたり、病気の進行を阻止したりすることも可能である。すなわち、本発明の抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素を含み、エイズウイルス感染患者に対する治療薬として作用するものであってもよい。
【００２７】
本発明の抗ＨＩＶ薬剤は、上記抗体酵素のみを含み、それを静脈注射などによって直接投与して使用することもできるが、上記抗体酵素に加えて、薬理学的に許容される担体がさらに含まれていてもよい。このような抗ＨＩＶ薬剤の製造は、従来公知の製造方法によって行うことができる。この抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ−５分子のみを特異的に狙って分解するため、効果が顕著であるというだけでなく、副作用が少ないということも期待できる。
【００２８】
本発明には、上記抗体酵素をコードする遺伝子も含まれる。この遺伝子を適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入すれば、本発明の抗体酵素をその宿主内で発現させることができる。
【００２９】
なお、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、本発明の抗体酵素をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００３０】
本発明の遺伝子として、具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３１】
本発明の遺伝子の他の例として、配列番号６に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号６に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３２】
本発明の遺伝子のさらに他の例として、配列番号１０に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１０に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖（Ｌ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３３】
本発明の遺伝子のさらに他の例として、配列番号１２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１２に示す塩基配列は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖（Ｈ鎖）の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００３４】
さらに本発明には、上記遺伝子が導入された形質転換体も含まれる。この形質転換体は、上記遺伝子が適当な宿主（例えば細菌、酵母）に発現可能に導入されたものであり、本発明の抗体酵素を自身の体内で発現させることができる。そのため、上記形質転換体もエイズウイルスの感染を予防する抗ＨＩＶ薬剤や、エイズ治療のための抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明についてより具体的に以下に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３６】
（１−１）本発明に係る抗体酵素、および遺伝子について
ここでは、本発明の抗体酵素の一例として、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３の抗体断片を例に挙げて説明する。上記ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３の抗体断片は、より具体的には、ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ）、および、ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ）である。
【００３７】
この２つの抗体酵素は、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチド（ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫ（配列番号１３）、あるいは、ＲＳＱＫＥＧＬＨＹＴＣＳ（配列番号１４））を免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から得られたものである。そして、上記抗体酵素は、上記モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００３８】
本発明の抗体酵素ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の分解酵素として作用する。このことは、後述の実施例にも示されるように、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−ＬがケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチド（配列番号１３または配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるペプチド）を完全に分解するという結果からも明らかである。
【００３９】
ここで、ケモカインレセプターＣＣＲ−５（以下、ＣＣＲ−５とする）について、簡単に説明する。
【００４０】
ＣＣＲ−５は、エイズウイルスＨＩＶ−１のコレセプターであり、ＨＩＶ−１エンベロープにコンフォメーション変化をもたらし、ウイルスと宿主細胞との膜融合を導くと考えられることから、ＨＩＶ−１がヒトに感染する際の重要な要素である。欠損変異型ＣＣＲ−５遺伝子を持つヒトは、ＨＩＶ−１の感染・発症に抵抗性を示す。
【００４１】
また、ＣＣＲ−５は、ヒトからヒトへの感染に関与するＨＩＶ−１のマクロファージ指向性株の感染においてコレセプターとして用いられる唯一のものである。このことから、ＣＣＲ−５の機能を抑制させることがＨＩＶ感染の予防、病気進行の阻止につながると期待されている。
【００４２】
上述の２つの抗体酵素は、このＣＣＲ−５を完全に分解し、その機能を消失させることができる。欠損変異型ＣＣＲ−５遺伝子を持つヒトには、明らかな免疫不全や組織病変はなく、健康上何ら問題は見られないことから、ＣＣＲ−５の機能を消失させる上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染を予防したり、エイズの症状の進行を抑えたりする抗ＨＩＶ薬剤として有効に活用できると考えられる。
【００４３】
続いて、上記ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖の可変領域であり、配列番号１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００４４】
図１には、軽鎖と重鎖からなるＥＣＬ２Ｂ−２の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図１においては、軽鎖をＬで示し、重鎖をＨで示している。図１に示すように、配列番号１に示すアミノ酸配列において、第１番目のアスパラギン酸（図１では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ａｓｐ１と記す）、第２８番目のセリン（図１では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ２７ａと記す）、第９８番目のヒスチジン（図１では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ９３と記す）、あるいは上記第９８番目のヒスチジンの代わりとして、第３１番目のヒスチジン（図１では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ２７ｄと記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００４５】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−２抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００４６】
なお、ＥＣＬ２Ｂ−２の重鎖の可変領域は、配列番号３に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、このＥＣＬ２Ｂ−２の重鎖には、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、このＥＣＬ２Ｂ−２の重鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号４として併せて記載する。
【００４７】
次に、上記ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の可変領域であり、配列番号５に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００４８】
図２には、軽鎖と重鎖からなるＥＣＬ２Ｂ−３の可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図２においては、軽鎖をＬで示し、重鎖をＨで示している。図２に示すように、配列番号５に示すアミノ酸配列において、第８６番目のアスパラギン酸（図２では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ａｓｐ８２と記す）、第１４番目のセリン（図２では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ１４と記す）、あるいは上記第１４番目のセリンの代わりとして、第６７番目のセリン（図２では、カバットの分類によって、Ｓｅｒ６３と記す）、第８０番目のヒスチジン（図２では、カバットの分類によって、Ｈｉｓ７６と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。
【００４９】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号５に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−３抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００５０】
なお、ＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖の可変領域は、配列番号７に示すアミノ酸配列を一次構造として有しているが、このＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖には、触媒三つ組残基と推測される構造は存在しなかった。また、このＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号８として併せて記載する。
【００５１】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号２に示す塩基配列からなるもの、あるいは、配列番号６に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−２のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号６に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つである。
（１−２）本発明の抗体酵素の他の例
続いて、本発明の抗体酵素の他の例として、ケモカインレセプターＣＣＲ−５のモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の抗体断片を例に挙げて説明する。上記ＥＣＬ２Ｂ−４の抗体断片とは、より具体的には、ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ）、および、ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖の可変領域（すなわち、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ）である。
【００５２】
この２つの抗体酵素も、上述のＥＣＬ２−３−Ｌなどと同様に、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチドを免疫原として用いて取得されるモノクローナル抗体から得られたものである。そして、上記抗体酵素は、上記モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を分子モデリングすることによってその立体構造を推定した結果、セリン、ヒスチジン（又はグルタミン酸）、アスパラギン酸からなる触媒三つ組残基を構成できるアミノ酸配列（抗体断片）として探し出されたものである。
【００５３】
抗体酵素ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈも、後述の実施例に示すように、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチド（配列番号１３示すアミノ酸配列からなるペプチド）を分解するため、ケモカインレセプターＣＣＲ−５の分解酵素として作用する。
【００５４】
つまり、上述の２つの抗体酵素も、このＣＣＲ−５を完全に分解し、その機能を消失させることができる。それゆえ、上記抗体酵素は、ＨＩＶ感染を予防したり、エイズの症状の進行を抑えたりする抗ＨＩＶ薬剤として有効に活用できると考えられる。
【００５５】
続いて、上記ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖の可変領域であり、配列番号９に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５６】
図５には、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図５に示すように、配列番号９に示すアミノ酸配列において、第１番目のアスパラギン酸（図５では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ｄ１と記す）、第２８番目のセリン（図５では、カバットの分類によって、Ｓ２６と記す）、第３１番目のヒスチジン（図５では、カバットの分類によって、Ｈ２７ｄと記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、上記第３１番目のヒスチジンの代わりとして、第９８番目のヒスチジン（図５では、カバットの分類によって、Ｈ９３と記す）でもよい。また、上記第３１番目のセリンの代わりとして、第２８番目（図５では、Ｓ２７ａと記す）、第３２番目（図５では、Ｓ２７ｅと記す）、第９７番目（図５では、Ｓ９２と記す）の何れかであってもよい。
【００５７】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＨＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１０に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−４抗体Ｌ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００５８】
次に、上記ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの構造について、以下に詳細に説明する。ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、ＣＣＲ−５の細胞外領域ペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖の可変領域であり、配列番号１１に示すアミノ酸配列を一次構造として有している。
【００５９】
図６には、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域の立体構造モデリング（分子モデリング）を行った結果、推定された立体構造を模式的に示す。図６に示すように、配列番号１１に示すアミノ酸配列において、第９２番目のアスパラギン酸（図６では、カバット（ＫＡＢＡＴ）の分類によって、Ｄ８６と記す）、第６５番目のセリン（図６では、カバットの分類によって、Ｓ６０と記す）、第４８番目のグルタミン酸（図６では、カバットの分類によって、Ｅ４６と記す）が触媒三つ組残基を構成していると推測される。なお、上記第９２番目のアスパラギン酸の代わりとして、第６４番目のアスパラギン酸（図６では、カバットの分類によって、Ｄ５９と記す）であってもよい。また、上記第６５番目のセリンの代わりとして、第９０番目のセリン（図６では、Ｓ８４と記す）であってもよい。また、上記第４８番目のグルタミン酸の代わりとして、第９１番目のグルタミン酸（図６では、Ｅ８５と記す）であってもよい。
【００６０】
また、本発明の抗体酵素は、配列番号１１に示すアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるもの、即ち、上記ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの変異体であり、ＣＣＲ−５の分解酵素として作用するものであってもよい。さらに上記抗体酵素は、配列番号１１に示すアミノ酸配列のＣ末端側にＥＣＬ２Ｂ−４抗体Ｈ鎖の残りのアミノ配列が適宜付加されたものでもよい。
【００６１】
本発明に係る遺伝子は、上記抗体酵素をコードする遺伝子であり、より具体的には、配列番号１０に示す塩基配列からなるもの、あるいは、配列番号１２に示す塩基配列からなるものを挙げることができる。配列番号１０に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つであり、配列番号１２に示す塩基配列からなる遺伝子は、ＥＣＬ２Ｂ−４のＨ鎖の可変領域をコードする遺伝子の塩基配列の一つである。
【００６２】
（２）本発明に係る抗体酵素の取得方法について
本発明に係る抗体酵素が、ＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖全長や、ＥＣＬ２Ｂ−３のＬ鎖全長、あるいは、ＥＣＬ２Ｂ−４のＬ鎖全長や、ＥＣＬ２Ｂ−４のＨ鎖全長などのように、ＣＣＲ−５の抗体のＬ鎖の全長である場合には、従来公知の抗体取得方法を利用して、該当するＣＣＲ−５のモノクローナル抗体を取得し、Ｈ鎖とＬ鎖を分離すればよい。また、本発明に係る抗体酵素が、ＣＣＲ−５の抗体断片である場合には、先ず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。
【００６３】
また、上述のＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈなどのようにそのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列が明らかとなっている抗体酵素については、従来公知の遺伝子組み換え技術などを用いて取得することができる。この場合、上記抗体酵素をコードする遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されたペプチドを精製するという方法などを採用することができる。なお、大量発現させることができる適当なプロモーターとともに上記抗体酵素をコードする遺伝子を組み込めば、目的とする抗体酵素を効率よく取得できる可能性がある。
【００６４】
上記抗体酵素のアミノ酸配列が明らかでない場合には、先ずモノクローナル抗体産生細胞やそのハイブリドーマなどからｍＲＮＡを取得し、当該ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成しその遺伝子配列を読み取る。その後、その遺伝子配列からアミノ酸配列を推定し、分子モデリングによって３次元構造を予測して触媒三つ組残基様構造が含まれているか否かを確認すればよい。そして、上記触媒三つ組残基様構造が含まれている抗体断片を抗体酵素として取得することができる。
【００６５】
また、本発明に係る抗体酵素をコードする遺伝子については、その塩基配列が明らかとなっているものの場合には、そのｃＤＮＡ（あるいはゲノムＤＮＡ）を取得した後、それを鋳型として適当なプライマーを用いてＰＣＲを行い、該当する領域を増幅させることで取得することができる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用して、配列番号２、６、１０、または１２に示す塩基配列からなる遺伝子に適当な変異を導入すれば、それを導入した形質転換体においては、配列番号１、５、９、１１に示すアミノ酸配列からなる抗体酵素の変異体が翻訳産物としてそれぞれ得られる。
【００６６】
（３）本発明の抗体酵素の利用方法について
これまでに、ＣＣＲ−５の働きを抑制する作用をもつ抗ＨＩＶ薬剤は開発されてきたが、本発明の抗体酵素は、これらの抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる手法に基づいて、ＣＣＲ−５を直接攻撃して機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。
【００６７】
当該抗体酵素を含む抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ−５を酵素的に完全に分解してその機能を消失させるという、新しい作用機構でＨＩＶの感染を阻害したり、エイズの発症を抑制したりすることができる。そして、このような抗ＨＩＶ薬剤は、ＣＣＲ−５分子だけを特異的に狙って分解するため、顕著な効果が期待できるととともに副作用も少ないと考えられる。また、当該抗体酵素の反応機構から考えると、現在使用されている他の抗ＨＩＶ薬剤と併用することによって、エイズに対する治療効果がより向上することが期待できる。
【００６８】
さらに、本発明の抗体酵素は、それをコードする遺伝子を適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することに利用できる。即ち、本発明に係る形質転換体は、上記抗体酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、遺伝子が対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。この形質転換体は、自身の体内で上記抗体酵素を発現させることができる。
【００６９】
本発明に係る形質転換体としてより具体的には、配列番号２または配列番号６（配列番号１０または配列番号１２でもよい）に示す塩基配列からなる遺伝子が宿主細胞に導入されたものを挙げることができる。上記宿主細胞としては、大腸菌、酵母、バキュロウイルスなど、通常使用しているもの適宜用いることができる。
【００７０】
上記形質転換体は、自身の体内でＣＣＲ−５を特異的に認識して完全に分解し、その機能を消失させることができるため、抗ＨＩＶ薬剤として利用することができる。また、上記抗体酵素を大量発現できるような形質転換体であれば、ＨＩＶの感染の予防や、エイズの症状の治療を効率よく行うことができると考えられ、より有効な抗ＨＩＶ薬剤を得ることができる可能性がある。
【００７１】
なお、本実施の形態において説明した図４（ａ）、図４（ｂ）、図８（ａ）、図８（ｂ）、図１３、図１５、図１７、図２３、図２４、図４１、図４２、に示す各抗体酵素のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号は、カバットの分類による番号であるため、それに該当する各配列番号に示すアミノ酸の番号とは異なっている。
【００７２】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１から実験９として以下に説明する。
【００７３】
〔実験１〕（ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体の作製）
モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３が、ＣＣＲ−５の細胞外領域を構成する２０個のアミノ酸からなる部分ペプチド（ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫ：配列番号１３）を免疫原に用いて作製された。
【００７４】
先ず、上記部分ペプチドのＣ末端にグリシンとシステイン残基が、Ｋｅｙｈｏｌｅ    Ｌｉｍｐｅｔ    Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）と共役させるために導入された。なお、実際のＣＣＲ−５ペプチドにおいては、上記部分ペプチドのＮ末端はシステイン残基であるが、本実験に使用するペプチドはアルギニン残基に置き換えられている。上記ペプチドおよびそのペプチドのＫＬＨとの結合体は、タカラ酒造製のものを使用した。
【００７５】
ＫＬＨと結合したペプチドは、Ｂａｌｂ／ｃマウスへ免疫された。第１および第２免疫は、Ｆｒｅｕｎｄの完全免疫賦活剤を使用して、２週間間隔で実施された。第３免疫は、Ｆｒｅｕｎｄの不完全免疫賦活剤を使用して第２免疫後４週間経過時に実施された。最終のブースター（追加免疫）は、第３免疫から６週間後に実施された。最終のブースターから３日後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞（ＳＰ／ＮＳＩ／ｌ−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）との細胞融合が実施され、その後ＨＡＴ選択とスクリーニングが行われた。クローニングが２度実施された後、モノクローナル抗体（ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３；ＩｇＧｌ（ｋ））を分泌する細胞系が確立された。
【００７６】
〔実験２〕（抗体サブユニットの精製と分離）
ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ    Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ    ＭＡＰＳ−ＩＩ  ｋｉｔ（日本ＢＩＯ−ＲＡＤ製）の精製マニュアルに基づいて精製された。
【００７７】
先ず、ＥＣＬ２Ｂ−３およびＥＣＬ２Ｂ−３を含む腹水が、同体積の硫酸アンモニウム飽和水溶液と混合された。その沈殿は遠心分離によって回収され、その後沈殿には５ｍｌのＰＢＳが加えられた。この工程は２回繰り返され、その後、ＰＢＳに対する透析が２度実施された。ＥＣＬ２Ｂ−２あるいはＥＣＬ２Ｂ−３を含む一定分量のＰＢＳ溶液が、同体積の結合バッファーＭＡＰＳ−ＩＩと混合された後、混合物はＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（プロテインＡ）が詰まった基盤上に置かれ、結合した抗体の溶出が行われた。溶出した抗体は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ＝８．０）緩衝液（４℃）で２回透析された。その結果得られた抗体は、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０（Ａｍｉｃｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、３回限外濾過された。５ｍｇの抗体は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓと０．１５Ｍ  ＮａＣｌとからなる緩衝液（ｐＨ８．０）２．７ｍｌに溶解され、０．３ｍｌの２Ｍ  ２−メルカプトエタノールが加えられて、１５℃で３時間還元された。
【００７８】
その溶液には３ｍｌの０．６Ｍ  ヨードアセトアミドが加えられた。その後１Ｍ  ＴｒｉｓによってｐＨ＝８に調製された。そして、その溶液は１５℃で１５分間インキュベートされた。その結果得られた溶液は、０．５ｍｌに限外濾過されたのち、サンプルの半量が、溶離液として６Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨ＝６．５）用いた流速０．２ｍｌ／ｍｉｎのＨＰＬＣ（カラム：Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ３００、７．８×３００ｍｍ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｗａｔｅｒｓ製）にかけられた。軽鎖および重鎖のフラクションがそれぞれ集められ、その後６Ｍグアニジン塩酸塩で希釈された。これらは、３〜４日間に７回バッファー交換が行われながら、４℃のＰＢＳに対して透析された。
【００７９】
上記の実験で作製された抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３は、以下の実験３、実験４によって同定・定量された。
【００８０】
〔実験３〕（ＥＬＩＳＡ法によるイムノアッセイ）
ＰＢＳ溶液（５μｇ／ｍｌ）に溶解されたＣＣＲ−５の部分ペプチド（ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＧ（配列番号１５に示す）：前述の実験１において使用したＣＣＲ−５部分ペプチドのＣ末端のシステイン残基を欠いて合成されたもの。以下、このペプチドをＥＣＬ２Ｂペプチドと呼ぶ）５０μｌは、免疫プレート（Ｎｕｎｃ製）に固定された。ブロッキングが、２％ゼラチンを使用して室温で実施された。上記プレートを洗浄した後、ＥＣＬ２Ｂ−２あるいはＥＣＬ２Ｂ−３は免疫反応され、その後アルカリフォスファターゼと結合した抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）との反応が実施された。基質反応後、免疫プレートリーダー（ＩｎｔｅｒＭｅｄ  ＮＪ−２００１製）を使用して、４０５ｎｍの吸光度が測定された。
【００８１】
本実験におけるイムノアッセイの結果、得られたモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３のクラスおよびサブクラスは、ＩｇＧ１（κ）であった。上記のモノクローナル抗体は、ＫＬＨ、ＨＡＳ、ＯＶＡ、ヒトヘモグロビンなどの他のタンパク質と交差反応をしなかった。さらに、上記のモノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０  Ｖ３環状ペプチド（ＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＧＥＩＩＧＤＩＲＱＡＨＣ：配列番号１６）、ｇｐ４１の保持領域のペプチドＴＰ４１−１（ＨＩＶ−１／ＴＰＲＧＰＤＲＰＥＧＩＥＥＥＧＧＥＲＤＲＤ：配列番号１７）、ＲＴ−２  （ＫＬＬＲＧＴＫＡＬＴＦＶＩＰＬＴＥＥＡＥ：配列番号１８）、４１Ｓ−２ｍＡｂ  ＣＤＲＬ−１  （ＲＳＳＫＳＬＬＹＳＮＧＮＴＹＬＹ：配列番号１９）、１Ｄ３  ｍＡｂ  ＣＤＲＨ−２  （ＤＫＦＮＱＮＹＳＴＡＧＮＹＰＮＩＲ：配列番号２０）、ＣＡ−２  （ＲＳＳＫＳＬＬＹＳＮＧＮＴＹＬＹＧＰＤＫＦＮＱＮＹＳＴＡＧＮＹＰＮＩＲ：配列番号２１）などのペプチドとは反応しなかった。
【００８２】
〔実験４〕（ＨＰＬＣ解析および質量分析）
触媒反応をモニターするために、実験３で得られた反応液２０μｌが、温度４０℃、１３％アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡの定組成条件下、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎの逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｕｒｅｓｉｌ    Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ：Ｗａｔｅｒｓ  ＮＹ製、ＨＰＬＣ：Ｊａｓｃｏ製）に注入された。その結果、抗体ペプチドの純度は９０％以上であった。
【００８３】
抗体ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｌｔｄ．製、ＡＵＴＯＦＬＥＸ）を使用して同定された。その結果、その質量は理論上のイオン分布と同じであった。同じ質量スペクトル条件は、ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖による触媒反応において見られる断片の同定に適用された。
【００８４】
〔実験５〕（ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体の配列決定および分子モデリング）
ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ    Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｔｄ．製）を使用して、ＥＣＬ２Ｂ−２あるいはＥＣＬ２Ｂ−３を有するハイブリドーマから単離された。その後、軽鎖および重鎖のｃＤＮＡは、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ    Ｉｎｃ．製）によって合成された。
【００８５】
配列決定は、Ａｕｔｏ  Ｒｅａｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ    Ｂｉｏｔｅｃｈ製）およびＤＮＡ自動シークエンサー（ＡＬＦ  ＩＩ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ    Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を使用して実施された。３次元分子構造の構築のためのコンピュータ解析（分子モデリング）は、ワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ    Ｇｒａｐｈｉｃｓ    Ｉｎｃ．製）およびＡｂＭのソフトウエア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｌｔｄ．製）によって実施された。
【００８６】
結果として得られたＰＤＢデータは、ソフトウエアＤｉｓｃｏｖｅｒ  ＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ    Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．製）を使用して、トータルエネルギーが最小となるようにして適用された。構造を図式化するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ    Ａｄｖｉｓｅｒ  Ｖｅｒ．  ３．５（ＦＱＳ  Ｌｔｄ．製）のソフトウエアが使用された。
【００８７】
以上のような方法で、モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ酸配列、およびそれをコードするｃＤＮＡの配列が決定された。
【００８８】
配列番号１に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−２軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号２に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号３に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−２重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号４に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号５に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−３軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号６に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号７に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−３重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号８に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。
【００８９】
ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖の配列はともに、生殖系列ｂｄ２において最高のスコアを示した。
【００９０】
次に、配列決定された各アミノ酸配列を基にして、分子モデリングが行われた。図１には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−２の可変領域の３次元構造を示す。また、図２には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−３の可変領域の３次元構造を示す。
【００９１】
ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ）において、Ａｓｐ１（あるいは、Ａｓｐ２７ｄ）、Ｓｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３という３つのアミノ酸残基は、分子構造中で触媒三つ組残基を形成することができると推定された（図１参照）。
【００９２】
トリプシン、トロンビン、プラスミンなどの多くのセリンプロテアーゼは、ペプチド結合を切り離す活性部位にＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓからなる触媒三つ組残基構造を有する。抗原性の血管作用腸ペプチド（ＶＩＰ）を分解することのできる天然の抗体酵素ＶＩＰａｓｅの軽鎖（ＶＩＰａｓｅ−Ｌ）は、その構造中に、Ａｓｐ１（ＦＲ−１内）、Ｓｅｒ２７ａ（ＣＤＲ１内）、Ｈｉｓ９３（ＣＤＲ３内）という３つのアミノ酸残基を有していると報告されている［参考文献１：Ｓ．  Ｐａｕｌ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９  （１９９４年）、３２３８９頁］。また、本願発明者らは、モノクローナル抗体ｉ４１ＳＬ１−２の軽鎖であるｉ４１ＳＬ１−２−Ｌが、同じＡｓｐ１、Ｓｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３からなる触媒三つ組残基を有し、その抗原であるＣＤＲＬ−１ペプチドを分解する酵素活性を示すということをすでに報告している［参考文献２：Ｙ．  Ｚｈｏｕ，  Ｅ．  Ｈｉｆｕｍｉ，  Ｈ．  Ｋｏｎｄｏ，  Ｔ．  Ｕｄａ，  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ＡＣＳ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ８３０，  ２００−２０８頁（２００２年）、および、参考文献３：Ｔ．  Ｕｄａ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｈｉｆｕｍｉ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｎａｎｏ−Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ／Ｓｙｓｔｅｍ，  ｐｐ４７−５２，（２００２年、Ｔｏｋｙｏ）］。
【００９３】
図３には、ｉ４１ＳＬ１−２−Ｌ（図３ではｉ４１Ｓ２−Ｌと記す）、ＶＩＰａｓｅ−Ｌ（図３ではＶＩＰと記す）、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ（図３ではＥＣＬ２Ｂ（Ｌ）と記す）におけるアミノ酸配列の比較を示す。図３では、各配列において触媒三つ組残基を構成しているアミノ酸を四角枠で囲んでいる。図３に示すように、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌは、ＶＩＰａｓｅ−Ｌ、および、ｉ４１ＳＬ１−２−Ｌと同じ位置に３つのアミノ酸残基を有していることが確認された。これらは同じ生殖系列ｂｄ２に属しているため、これらの配列の相同性はとても高い。
【００９４】
なお、ＶＩＰａｓｅ−Ｌは、部位特異的変異によって、Ａｓｐ１、Ｓｅｒ２７ａ、Ｈｉｓ９３からなる触媒三つ組残基が活性部位であることが報告されている［参考文献１］。このことからも、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌは抗原性ペプチドＣＣＲ−５を分解する触媒活性を有していることが予想される。
【００９５】
一方、ＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖（ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ）は、Ｓｅｒ１４（あるいは、Ｓｅｒ６３）、Ｈｉｓ７６、Ａｓｐ８２、というやや異なるタイプの触媒三つ組残基を有しているように推定された（図２参照）。
【００９６】
続いて、触媒三つ組残基を構成する残基間の距離が確認された。分子モデリングでは、Ｘ線構造解析とは異なり、原子間の正確な距離を決定できないので、残基内のα炭素の距離が、触媒三つ組残基を構成する残基間のおおよその距離として見積もられた。そのデータを、他の天然の抗体酵素のデータとともに表１に示す。
【００９７】
【表１】
2004313166.tif 000002
【００９８】
表１に示すように、Ｈｉｓ（Ｃα）とＳｅｒ（Ｃα）との距離は、酵素（トリプシンやトロンビン）や天然の抗体酵素（４１Ｓ−２−Ｌ、４１Ｓ−２−Ｈ、ｉ４１ＳＬ１−２−Ｌ、ｉ４１−７−Ｌ）に匹敵するものであった。一方、４１Ｓ−２−Ｈ、ｉ４１ＳＬ−２−Ｈ、ｉ４１−７−Ｈは、約４Å前後と小さかった。
【００９９】
ＨｉｓとＡｓｐとのα炭素の距離に関しては、やや異なる特徴を示した。トリプシン、トロンビン、ｉ４１ＳＬ１−２−Ｌ、ｉ４１ＳＬ１−２−Ｈは、ほとんど同じ距離であり、それ以外のものについては２〜５Åよりも長い距離であった。４１Ｓ−２−Ｌ、４１Ｓ−２−Ｈ、ｉ４１ＳＬ１−２−Ｈ、ｉ４１−７−Ｈなどの抗体サブユニットは、セリンプロテアーゼのような触媒活性を示した。この事実から、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、セリンプロテアーゼのような触媒活性を有すると予想される。
【０１００】
続いて、ＥＣＬ２Ｂ−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３の酵素活性を確認するためのペプチド分解試験が以下のようにして行われた。
【０１０１】
〔実験６〕（ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３抗体の酵素活性試験）
モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３による抗原性ペプチドＥＣＬ２Ｂの分解反応実験を実施するに先立って、ほぼ全てのガラス器具およびプラスチック器具、緩衝溶液が、加熱（１８０℃、２時間）、オートクレーブ（１２１℃、２０分間）あるいは、０．２μｍの滅菌フィルターを通すことによって殺菌された。この実験における操作は、空気中の異物のコンタミネーションを防止するために、安全キャビネット内で実施された。分解反応は２５℃の７．５ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で実施された。反応をモニタリングするために、２０μｌの反応液がカラム温度４０℃、定組成条件下のＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｊａｓｃｏ製）に注入された。
【０１０２】
先ず、モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２およびＥＣＬ２Ｂ−３の軽鎖（ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ）を用いて、抗原性ペプチド（ＥＣＬ２Ｂペプチド：ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＧ（配列番号１５））の触媒分解試験が実施された。
【０１０３】
精製されたＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ（０．８μＭ）、あるいはＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌ（０．８μＭ）を含む溶液５００μｌは、滅菌試験管内で、２５℃で、同体積の１２０μＭ  ＥＣＬ２Ｂペプチドを含む溶液と混合された。ＥＣＬ２Ｂペプチドのタイムコースは、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用してモニタリングされた。なお、比較のために、ＥＣＬ２Ｂ−ペプチドの代わりにペプチドＢを基質として用いたものについても同様に実験を行った。
【０１０４】
その結果を図４のグラフに示す。図４のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるＥＣＬ２Ｂペプチドの濃度（μＭ）を示す。
【０１０５】
ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌを用いた場合（図４において、●で示す）、ＥＣＬ２Ｂペプチドの分解は、ＥＣＬ２Ｂ−２−ＬとＥＣＬ２Ｂペプチドを混合した後、約８０時間の誘導時間を経た後に開始し、ＥＣＬ２Ｂペプチドの濃度は急激に減少した。なお、この種の誘導時間は、多くの反応においてよく見られるものである。ＥＣＬ２Ｂペプチドは、混合後約９０時間以内で完全に消失した。
【０１０６】
また、ＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌを使用し場合（図４において▲で示す）は、ＥＣＬ２Ｂペプチドの分解は、ＥＣＬ２Ｂ−３−ＬとＥＣＬ２Ｂペプチドの混合した後、約１９０時間というより長い誘導時間を経て開始した。ＥＣＬ２Ｂペプチドは、誘導時間経過後約２５０時間以内で、急激に分解された。なお、ペプチドＢについて同様の実験を行った場合（図４において■で示す）は、そのペプチドは分解されなかった。
続いて、酵素としてＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌを用いた場合の得られる分解生成物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳによって解析した。その結果、ＥＣＬ２Ｂペプチド由来の多種のペプチド断片を確認した。分解の初期段階では、ＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱやＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷのような比較的長いペプチドが観察された。分解反応の最終段階（配列番号１５に示すペプチドが、反応系から消失する段階）においては、ＲＳＳＨＦＰＹＳ、ＲＳＳＨＦＰＹ、ＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱ、ＳＳＨＦＰＹＳＱ、ＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮ、ＹＳＱＹＱＦＷＫＮ、ＹＳＱＹＱなどの多くの小さなペプチドが生成されたことが確認された。上記の多くのペプチド断片が生成されたことから、ＥＣＬ２Ｂ−２−ＬあるいはＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、抗原性ペプチドＲＳＳＨＦＰＹＳＱＹＱＦＷＫＮＦＱＴＬＫＧを連続的に分解することができたと言える。
【０１０７】
既に述べたように、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌにおいて触媒三つ組残基を形成する３つの残基は、ＶＩＰａｓｅやｉ４１ＳＬ１−２−Ｌの３つの触媒三つ組残基と同一の場所に位置する。この一貫性は、ＥＣＬ２Ｂ−２の軽鎖（ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌ）が、抗原性ペプチド（ＥＣＬ２Ｂペプチド）を触媒的に分解する能力を有していることを示唆する。
【０１０８】
以上の結果から、ＥＣＬ２Ｂ−２−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌは、ＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチドを完全に分解することのできる抗体酵素であることが確認された。
【０１０９】
なお、上述の実験と同じ条件の下で、モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２、ＥＣＬ２Ｂ−３の重鎖（ＥＣＬ２Ｂ−２−ＨおよびＥＣＬ２Ｂ−３−Ｈ）に対する実験が行われた。しかしながら、これらの重鎖はともに抗原性ペプチドＥＣＬ２Ｂを分解しなかった。すなわち、質量分析において、どのようなペプチド断片も検出されなかった。
【０１１０】
また、可変領域以外の領域も含む完全なモノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−２を用いた抗原性ペプチドの分解実験が、上述の実験と同じ条件下で実施された。しかしながら、この場合もＣＣＲ−５の部分ペプチドであるＥＣＬ２Ｂペプチドは全く分解されなかった。
【０１１１】
〔実験７〕（ＥＣＬ２Ｂ−４抗体の作製および抗体サブユニットの精製）
実験１と同様の方法で、モノクローナル抗体ＥＣＬ２Ｂ−４が、ＣＣＲ−５の細胞外領域を構成する２０個のアミノ酸からなる部分ペプチド（配列番号１３参照）を免疫原に用いて作製された。
【０１１２】
続いて、実験２と同様の方法で、ＥＣＬ２Ｂ−４が精製された。本実験で精製された抗体ＥＣＬ２Ｂ−４は、実験３と同様の方法によって同定・定量された。
【０１１３】
〔実験８〕（ＥＣＬ２Ｂ−４抗体の配列決定および分子モデリング）
実験５と同様の方法で、ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖および重鎖の可変領域のアミノ配列決定、および、それをコードするｃＤＮＡの配列決定が実施された。その後、決定されたアミノ酸配列に基づく分子モデリングが行われた。その結果を以下に示す。
【０１１４】
配列番号９に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−４軽鎖のアミノ酸配列であり、配列番号１０に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。配列番号１１に示すアミノ酸配列が、ＥＣＬ２Ｂ−４重鎖のアミノ酸配列であり、配列番号１２に示す塩基配列が、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列である。
【０１１５】
また、図７には、ＥＣＬ２Ｂ−４軽鎖のアミノ酸配列、および、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列を併記するとともに、可変領域（ＣＤＲ−１〜ＣＤＲ−３）を示す。図８には、ＥＣＬ２Ｂ−４重鎖のアミノ酸配列、および、それをコードするｃＤＮＡの塩基配列を併記するとともに、可変領域（ＣＤＲ−１〜ＣＤＲ−３）を示す。
【０１１６】
次に、配列決定された各アミノ酸配列を基にして、分子モデリングが行われた。図５には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域の３次元構造を示す。また、図６には、分子モデリングによって推定されたＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域の３次元構造を示す。
【０１１７】
ＥＣＬ２Ｂ−４の軽鎖（ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ）において、Ｓ２６（あるいは、Ｓ２７ａ、Ｓ２７ｅ、Ｓ９２の何れか）、Ｈ２７ｄ（あるいは、Ｈ９３）、Ｄ１という３つのアミノ酸残基が、分子構造中で触媒三つ組残基を形成することができると推定された（図５参照）。
【０１１８】
また、ＥＣＬ２Ｂ−４の重鎖（ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ）においては、Ｓ６０（あるいは、Ｓ８４）、Ｅ４６（あるいは、Ｅ８５）、Ｄ５９（あるいは、Ｄ８６）という３つのアミノ酸残基が、分子構造中で触媒三つ組残基を形成することができると推定された（図６参照）。
【０１１９】
続いて、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの酵素活性を確認するためのペプチド分解試験が以下のようにして行われた。
【０１２０】
〔実験９〕（ＥＣＬ２Ｂ−４抗体の酵素活性試験）
実験６と同様の方法で、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈについて酵素活性試験を実施した。
【０１２１】
先ず、ＥＣＬ２Ｂペプチド（配列番号１５）の分解反応が、２５℃の１５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で実施された。反応をモニタリングするために、２０μｌの反応液がカラム温度４０℃、定組成条件下のＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｊａｓｃｏ製）に注入された。
【０１２２】
この分解反応の反応液として、以下の▲１▼〜▲５▼が作製された。
▲１▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｌ）０．８μＭ＋ＥＣＬ２Ｂ  ペプチド：５０μＭ：８００μｌ作製
▲２▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｈ）０．４μＭ＋  ＥＣＬ２Ｂ  ペプチド：５０μＭ：８００μｌ作製
▲３▼ＥＣＬ２Ｂ  ペプチド：５０μＭ：５００μｌ作製
▲４▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｌ）：０．８μＭ：３００μｌ作製
▲５▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｈ）：０．４μＭ：３００μｌ作製
その結果を図９〜図１１に示す。図９のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるＥＣＬ２Ｂペプチドの濃度（μＭ）を示す。また、図１０（ａ）〜（ｃ）には、ＨＰＬＣを使用してモニタリングされた結果を示す。また、図１１には、この酵素分解実験における速度論的解析結果を示す。図１１（ａ）は、基質（ＥＣＬ２Ｂペプチド）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１１（ｂ）は、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットの結果を示すグラフである。
【０１２３】
そして、上記Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを用いて算出したＶｍａｘ、Ｋｍ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／Ｋｍ値（平均プロット）を以下の表２に示す。
【０１２４】
【表２】
2004313166.tif 000003
【０１２５】
これらの結果から、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、ＥＣＬ２Ｂペプチドの分解反応における酵素活性を有することが確認された。それゆえ、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、ＣＣＲ−５の細胞外領域を構成するペプチドを狙って、完全に分解することのできる抗体酵素であることが確認された。
【０１２６】
続いて、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−ＨのＴＰ４１−１ペプチド（配列番号１７）に対する酵素活性試験を実施した。この分解反応は、２５℃の１５ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６．５）中で実施された。反応をモニタリングするために、２０μｌの反応液がカラム温度４０℃、定組成条件下のＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｊａｓｃｏ製）に注入された。
【０１２７】
この分解反応の反応液として、以下の▲１▼〜▲５▼が作製された。
▲１▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｌ）０．８μＭ＋ＴＰ４１−１  ペプチド：１２０μＭ：８００μｌ作製
▲２▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｈ）０．４μＭ＋ＴＰ４１−１  ペプチド：１２０μＭ：８００μｌ作製
▲３▼ＴＰ４１−１  ペプチド：１２０μＭ：５００μｌ作製
▲４▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｌ）：０．８μＭ：３００μｌ作製
▲５▼ＥＣＬ２Ｂ−４（Ｈ）：０．４μＭ：３００μｌ作製
その結果を図１２〜図１４に示す。図１２のグラフでは、横軸に反応時間（時間）を、縦軸に基質であるＥＣＬ２Ｂペプチドの濃度（μＭ）を示す。また、図１３（ａ）〜（ｃ）には、ＨＰＬＣを使用してモニタリングされた結果を示す。また、図１４には、この酵素分解実験における速度論的解析結果を示す。図１４（ａ）は、基質（ＴＰ４１−１ペプチド）濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図１４（ｂ）は、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットの結果を示すグラフである。
【０１２８】
そして、上記Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを用いて算出したＶｍａｘ、Ｋｍ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／Ｋｍ値（平均プロット）を以下の表３に示す。
【０１２９】
【表３】
2004313166.tif 000004
【０１３０】
これらの結果から、ＥＣＬ２Ｂ−４−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈは、ＴＰ４１−１ペプチドの分解反応においても低い酵素活性を有することが確認された。また、表２と表３とを比較すれば分かるように、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌは、本来の抗原であるＥＣＬ２Ｂペプチドの方をＴＰ４１ペプチドよりも速く分解していることが実験によって示され、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌが確かにＥＣＬ２Ｂに対する抗体酵素であることが証明された。
【０１３１】
【発明の効果】
エイズウイルスがヒトに感染する場合には、ウイルス側に存在するｇｐ１２０やｇｐ４１や、ヒトの細胞側に存在するＣＤ４およびケモカインレセプターＣＣＲ−５が重要な役割を果たす。ケモカインレセプターＣＣＲ−５が正常でない場合は、エイズウイルスの感染が成立しないことが判明している
本発明の抗体酵素は、上述のようにＣＣＲ−５に対して特異的に作用し、これを分解して機能を消失させることができるため、ＨＩＶの感染の予防やエイズの治療のための抗ＨＩＶ薬剤として有用である。本発明の抗体酵素は、ＣＣＲ−５の働きを抑制するという従来の抗ＨＩＶ薬剤とは全く異なる新しい作用機構でＣＣＲ−５を破壊するものであるため、現在有効な治療法が見出されていないエイズの治療に有効利用できることが期待される。
【０１３２】
【配列表】
2004313166.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＣＬ２Ｂ−２の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図２】ＥＣＬ２Ｂ−３の可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図３】ｉ４１ＳＬ１−２−Ｌ、ＶＩＰａｓｅ−Ｌ、ＥＣＬ２Ｂ−２−Ｌのアミノ酸配列を比較して示す図である。
【図４】ＥＣＬ２Ｂ−２−ＬおよびＥＣＬ２Ｂ−３−Ｌについて酵素活性試験を行った結果を示すグラフである。
【図５】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図６】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域の立体構造を示す模式図である。
【図７】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌの可変領域のアミノ酸配列（一次構造）とそれをコードする塩基配列を示す図である。
【図８】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈの可変領域のアミノ酸配列（一次構造）とそれをコードする塩基配列を示す図である。
【図９】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ（図中では、Ｌと示す）およびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ（図中では、Ｈと示す）を用いてＥＣＬ２Ｂペプチドの分解実験を行った結果を示す図である。
【図１０】（ａ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌを用いたＥＣＬ２Ｂペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してＥＣＬ２Ｂの濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｂ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈを用いたＥＣＬ２Ｂペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してＥＣＬ２Ｂの濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｃ）は、ＥＣＬ２Ｂペプチドの分解実験のコントロールとして、ＨＰＬＣを使用してＥＣＬ２Ｂの濃度をモニタリングした結果を示す図である。
【図１１】酵素分解実験における速度論的解析結果を示す図である。（ａ）は、基質（ＥＣＬ２Ｂペプチド）濃度と分解速度との関係を示す図であり、（ｂ）は、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットの結果を示す図である。
【図１２】ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌ（図中では、Ｌと示す）およびＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈ（図中では、Ｈと示す）を用いてＴＰ４１−１（図中では、ＴＰと示す）ペプチドの分解実験を行った結果を示す図である。
【図１３】（ａ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｌを用いたＴＰ４１−１ペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してＴＰ４１−１の濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｂ）は、ＥＣＬ２Ｂ−４−Ｈを用いたＴＰ４１−１ペプチドの分解実験において、ＨＰＬＣを使用してＴＰ４１−１の濃度をモニタリングした結果を示す図である。（ｃ）は、ＴＰ４１−１ペプチドの分解実験のコントロールとして、ＨＰＬＣを使用してＴＰ４１−１の濃度をモニタリングした結果を示す図である。
【図１４】酵素分解実験における速度論的解析結果を示す図である。（ａ）は、基質（ＴＰ４１−１ペプチド）濃度と分解速度との関係を示す図であり、（ｂ）は、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットの結果を示す図である。
【図１】
2004313166.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004313166.tif 000027
【図８】
2004313166.tif 000028
【図９】
2004313166.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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