(57)【要約】【課題】酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（ＭＴＨ１）を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいアッセイ系を提供する。【解決手段】ＭＴＨ１欠損ノックアウトマウス胎仔の線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞に被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに当該被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択するスクリーニング方法。無細胞スクリーニング系におけるような細胞膜透過性を有しない薬剤を選別するという問題も回避される。【選択図】        図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（ＭＴＨ１）を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、ＭＴＨ１欠損ノックアウトマウス胎仔の線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞に被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬剤を開発するための技術分野に属し、特に、抗癌剤となり得る酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
がん治療において化学療法は重要なアプローチの一つであり、現在臨床で用いられている抗癌剤は５０種以上にものぼるが、未だ充分ではなく、新しい抗癌剤の開発が日夜続けられている。抗癌剤の効率的な開発のためには、本格的な薬理学的試験や臨床試験の前に、学術的検討から明らかにされた知見に基づき、抗癌剤の候補となり得る各種の生理活性物質を予めスクリーニングすることのできる系を確立することが必要である。
【０００３】
酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（一般に、ＭＴＨ１またはＮＵＤＴ１と略称される。本明細書においてもＭＴＨ１と略称することがある）は、酸化されたプリンヌクレオシド三リン酸（８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ，２−ＯＨ−ｄＡＴＰ，２−ＯＨ−ＡＴＰ等）を一リン酸に分解する活性を有することから、酸化核酸前駆体が複製や転写の際にゲノムＤＮＡやＲＮＡに取り込まれる結果引き起こされる突然変異や翻訳エラーを回避することにより遺伝情報の維持に重要な役割を持つと考えられている。事実、Ｍｔｈ１ノックアウトマウスでは肝細胞がんを始めとする複数の臓器の自然発癌頻度の増加が認められている（Ｔ．  Ｔｓｕｚｕｋｉ，  Ｙ．  Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８，  １１４５６−１１４６１  （２００１）（非特許文献１）。一方、ＭＴＨ１は、脳腫瘍細胞において８−オキソデオキシグアノシン（８−ｏｘｏ−ｄＧ）の細胞内蓄積の上昇とともに高発現することも認められている（Ｔ．  Ｉｉｄａ，  Ｙ．  Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ａｐｒｉｌ，  ７３−８１  （２００１））。これらの事実から、ＭＴＨ１は遺伝情報の維持から腫瘍発生を抑制するのみならず、酸化ストレスを受けた細胞の機能障害や細胞死の回避に関わる可能性が示唆される。
【０００４】
したがって、ＭＴＨ１を阻害する薬剤は癌細胞の持つ酸化ストレス抵抗性を抑制することが予想され、他の抗癌剤との併用によりその抗癌剤の用量の軽減や、放射線療法時の照射線量の軽減、さらにこれらの療法に抵抗性の癌の化学療法及び放射線療法に応用できるものと期待されるが、そのような薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができる系は未だ見出されていない。特に、ＭＴＨ１は、試験管内では酸化プリンヌクレオシド二リン酸のような物質により効率よく阻害されることは知られているが、酸化プリンヌクレオシド二リン酸は細胞膜を透過できないために薬剤としては使用できない。すなわち、ＭＴＨ１を阻害する薬剤を判別するにあたり、無細胞スクリーニング系を用いることは、細胞膜透過性を有しない薬剤が得られるという問題がある。
【非特許文献１】Ｔ．  Ｔｓｕｚｕｋｉ，  Ｙ．  Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，  １１４５６−１１４６１  （２００１）
【非特許文献２】Ｔ．  Ｉｉｄａ，  Ｙ．  Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ａｐｒｉｌ，  ７３−８１  （２００１）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（ＭＴＨ１）を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることのできる新しいアッセイ系を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、研究を重ねた結果、ＭＴＨ１が発現しないと細胞死に陥る細胞系に着目し、これを利用することにより上述の目的を達成し得る本発明を案出したものである。
かくして、本発明に従えば、酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素（ＭＴＨ１）を阻害する薬剤のスクリーニングが可能となり、Ｍｔｈ１欠損ノックアウトマウス胎仔の線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞に被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択することを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明が対象とする酸化プリンヌクレオシド三リン酸分解酵素ＭＴＨ１は、哺乳動物における核酸の酸化損傷の防御機構に関与する酵素の１種であり、そのｃＤＮＡと遺伝子は本発明者らによりクローニングされ、大腸菌のＭｕｔＴ蛋白質の配列とホモロジーを有することからＭＴＨ１（ｍｕｔＴ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）と命名された（Ｈ．  Ｏｄａ，  Ｙ．  Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２７，  ４３３５  （１９９９））。
【０００８】
本発明者らは、このＭｔｈ１遺伝子が欠損したノックアウトマウスを用いて各種臓器の自然発癌性に関する研究を行なう（前記の非特許文献１）とともに、ＭＴＨ１欠損ノックアウトマウスの胎仔の線維芽細胞にヒトＭＴＨ１（ｈＭＴＨ１）を強制発現させた細胞株を樹立し、過酸化水素負荷条件下の細胞の機能障害や細胞死に注目して解析を行なった。その結果、ｈＭＴＨ１強制発現株は非発現株と比較して有意に高い生存率を示すことを見出し、この現象がＭＴＨ１（ヒトＭＴＨ１）を阻害する薬剤の当否判別に利用できるものと考え、本発明を導き出したものである。
【０００９】
以下、本発明に従うＭＴＨ１阻害剤のスクリーニング法において用いられる細胞株の由来するＭＴＨ１欠損ノックアウトマウスの作製法、その胎児線維芽細胞株およびｈＭＴＨ１過剰発現株の樹立法、ならびに、該細胞株を用いるスクリーニング法に沿って本発明の実施の形態を説明する。但し、以下に示す具体的な実施の形態は例示のためのものであり、本発明の実施の形態はこれに限定されるものではなく、当業者であれば同等の材料と手法を用いて同等のものを作製できることは勿論である。
【００１０】
ＭＴＨ１欠損マウスの作製
ＭＴＨ１が欠損したノックアウトマウスは、ＥＳ細胞と遺伝子ターゲッティングを用いる常法に従って作製することができ、その１例は本発明者らによる上記文献（非特許文献１）にも記載されているが、以下のとおりである：
マウス１２９ＳＶ系由来の遺伝子ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社より購入、  Ｃａｔ．  Ｎｏ．９４６３１３）よりＭｔｈ１遺伝子を単離しその構造を解析した。Ｍｔｈ１遺伝子は約  ７  ｋｂｐ  の大きさで  ５  つのエクソンより成り、第１，第２の２つのエクソンは  ５’  側非翻訳領域で、開始コドンは第３エクソンに含まれていた。ヒト、マウス及び大腸菌を含む３種の細菌由来のＭｕｔＴ様蛋白質間でアミノ酸配列がよく保存されている領域が認められるが、その部分はマウスの遺伝子上でエクソン３と４に分かれてコードされていた。第３エクソンをＧ４１８耐性遺伝子カセット（Ｄｅｎｇ，  Ｃ．，  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｋ．  Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３：  ２１３４−２１４０  （１９９３）参照）と置換したターゲティングベクターを構築した。ベクターの両端には、ネガティブ選別用にＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｒａｎｃｏｕｒｔ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｔｓｕｚｕｋｉ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．  Ｒ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ９：  １０８−１２２  （１９９５））を配置した。
【００１１】
このターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によりＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８・ガンシクロビル耐性クローンの中からＭｔｈ１の対立遺伝子の片方にＧ４１８耐性遺伝子カセットが挿入されたＭｔｈ１ヘテロ欠損細胞クローン（Ｍｔｈ１＋／−）を選択した。なお、用いたＥＳ細胞は、ＣＣＥ細胞株（Ｅ．  Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ博士より分与：Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．  Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （１９８７）参照）であり、このＣＣＥ細胞は研究目的であれば無償配布されている。同等のＥＳ細胞は、例えば、ＡＴＣＣよりＣＲＬ−１１６３２としても入手することができる。
上述のＭｔｈ１＋／−  ＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に導入して得られたキメラマウスをＢＤＦ１マウス（日本クレア社より購入）と交配し、Ｍｔｈ１＋／−  マウスを樹立した。Ｍｔｈ１＋／−  マウスはＣ５７ＢＬ６マウスと１２世代戻し交配を行い、その遺伝的背景を純化した。
【００１２】
ＭＴＨ１ホモ欠損マウス胎仔線維芽細胞株（Ｍｔｈ１−／−  ＭＥＦ）の樹立
ＭＴＨ１欠損ノックアウトマウスからその胎仔線維芽細胞株の樹立化は、当該分野で既知の細胞培養の手法に従い次のように実施することができる：
１２世代戻し交配したＭｔｈ１＋／−  マウスの雄と雌を交配し、妊娠１７．５日目のマウスを開腹、無菌的に子宮から１個体づつ胎仔を摘出した。Ｍｔｈ１−／−マウス胎仔より約８ｍｍ×８ｍｍの皮膚を剥離、切除し、培養シャーレに移す。少量の培地中（ＤＭＥＭ  （低グルコース）、１０％ウシ胎仔血清）で組織片をはさみでミンチし、シャーレの培養面に広げ、ＣＯ２インキュベーター中で静置する。
１時間後、組織片が剥がれないように注意深く培地を添加し、数日間培養する。組織片より移行して増殖してきた繊維芽細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡで剥がして回収し、新しいディッシュに移して３日おきに継代培養を継続する。３０世代以上の継代の後にコロニー形成率（ｐｌａｔｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が３０％を超えた段階で株化したものとみなした。Ｔ２およびＴ５の２つの独立の株を樹立した。
【００１３】
ヒトＭＴＨ１を過剰発現するＭｔｈ１−／−ＭＥＦの樹立
以上のようにして得られるＭＴＨ１ホモ欠損マウス胎仔線維芽細胞株Ｍｔｈ１−／−ＭＥＦ（Ｔ２およびＴ５）に、ヒトＭＴＨ１  ｃＤＮＡをサブクローニングした発現ベクター（ｐｃＤＥＢΔ：ｈＭＴＨ１）をリポフェクション法により導入し、ハイグロマイシンＢ耐性細胞クローンを複数分離した。単一細胞由来のコロニー形成を２回繰り返し、純化したクローンについて抗ＭＴＨ１抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりヒトＭＴＨ１の発現を確認し、２つのクローン（Ｔ２：ｈＭＴＨ１およびＴ５：ｈＭＴＨ１）を樹立した。コントロールとしてｐｃＤＥＢΔのみを導入したＴ２：ｖｅｃｔｏｒおよびＴ５：ｖｅｃｔｏｒを樹立した。なお、上記の発現ベクター（ｐｃＤＥＢΔ：ｈＭＴＨ１）や抗ＭＴＨ１抗体については、文献（Ｋａｎｇ，  Ｄ．，およびＴａｋｅｓｈｉｇｅ，  Ｋ．他、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １４６５９−１４６６５  （１９９５））に詳述されている。また、ヒトＭＴＨ１  ｃＤＮＡはＴＨＥ  Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．  ＣＯＮＳＯＲＴＩＵＭから入手できる。
【００１４】
ＭＴＨ１阻害剤のスクリーニング法
本発明に従えば、以上のようにして樹立したＭＴＨ１欠損ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞（Ｍｔｈ１−／−ＭＥＦ）を利用して、ＭＴＨ１を阻害する薬剤をスクリーニングすることができる。すなわち、Ｍｔｈ１−／−ＭＥＦにヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞に、ＭＴＨ１阻害剤の候補となる被験物質を添加し、過酸化水素の存在下に細胞を培養して、その細胞死が認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択する。
実際の操作に当たっては、ヒトＭＴＨ１を過剰発現するＭｔｈ１−／−ＭＥＦを対数増殖期から適当な条件で培養（一般的には、３７℃、５％ＣＯ２存在下に２４時間程度）した後、被験物質を添加して適当時間（例えば１〜５時間）培養し、その後、異なる濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を添加し、さらに培養（一般的には２４時間程度）し、細胞の生存率を測定または観察し、その細胞死が有意に認められたときに被験物質をＭＴＨ１阻害剤として選択する。用いる培地は、特殊なものではなく標準的なＭＥＭ培地でよい。また、細胞毒性の効果を軽減するためにピルビン酸を加えてもよいが、本発明のアッセイ系は一般にピルビン酸を添加しなくても測定できる。
【００１５】
本発明のスクリーニング法において細胞の生存率を測定または観察する手段は、特に限定されるものではなく、細胞死を判定するための各種の手法、例えば、代謝酵素活性測定法、コロニー形成法、細胞分染法による顕微鏡観察、生合成能測定法などを用いることができる。このうち、代謝酵素活性測定法は、９６穴マイクロプレートなどを用いて多数の検体を比較的簡単に測定できることから好ましい。代謝酵素活性測定法の例としては、Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （Ｄｏｊｉｎｄｏ：株式会社同仁化学研究所製）が挙げられ、これは、テトラゾリウム塩が細胞内脱水素酵素により還元されて生じる水溶性のホルマザンの吸光度を測定することにより生細胞数を検出するタイプの測定法の１種である。
【００１６】
【実施例】
本発明の特徴を更に具体的に示すために以下に実施例を記す。実施例１は、本発明のスクリーニング法の背景となる現象を明らかにするものであり、ＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株は非発現株と比較して過酸化水素負荷後に有意に高い細胞生存率を有し、この系においてはＭＴＨ１が存在しないと細胞死が起こることを示すものである。実施例２は、ＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株は、そのＭＴＨ１活性が、特定の物質の存在により阻害され、したがって、そのような阻害物質を選別し得るのに使用できることを示すものである。
【００１７】
実施例１：過酸化水素感受性試験
対数増殖期のＴ５：ｖｅｃｔｏｒ（ヒトＭＴＨ１非発現株：既述）とＴ５：ｈＭＴＨ細胞（ヒトＭＴＨ１強制発現株）を９６穴マイクロプレートに５０％飽和になるように播種し（３ｘ１０３  ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％  ＣＯ２存在下に２４時間培養した。用いた培地はＭＥＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１０９５−０８０）である。次に、異なる濃度のＨ２Ｏ２（１０μｌ／ｗｅｌｌ）を培地に添加し、さらに２４時間培養した。Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  Ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１０  μｌ／ｗｅｌｌ添加し、９０分から１２０分後に培養液の２つの吸光度の差（Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍ）を測定した。未処理細胞の吸光度の値を１．０として相対生存率を求めた。
その結果を図１に示す。この系では、ＭＴＨ１が存在しないと細胞死が起こることが理解される。
【００１８】
実施例２：ＭＴＨ１阻害剤
ＭＴＨ１阻害剤として硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を用いた。試験管内ではＭＴＨ１の８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ分解活性は１７μＭのＣｕ２＋の存在下で５０％阻害されることが知られており（Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｎａｋａｂｅｐｐｕ他、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １８  （９），  １７８５−１７９１  （１９９７））、本発明で用いるＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞のＭＴＨ１活性が、そのような阻害物質によって阻害されるか否かを調べた。
対数増殖期のＴ５：ｈＭＴＨ細胞を９６穴マイクロプレートに５０％飽和になるように播種し（３ｘ１０３  ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ｗｅｌｌ）、３７℃、５％  ＣＯ２存在下に２４時間培養した。培地はＭＥＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １１０９５−０８０）である。次に、ＭＴＨ１阻害剤（ＣｕＳＯ４）を最終濃度５０μＭで培地に添加し２時間培養した。その後、異なる濃度のＨ２Ｏ２（１０μｌ／ｗｅｌｌ）を培地に添加し、さらに２４時間培養した。Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  Ｋｉｔ  ＷＳＴ−８  （Ｄｏｊｉｎｄｏ）を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、９０分から１２０分後に培養液の２つの吸光度の差（Ａ４５０ｎｍ−Ａ６２０ｎｍ）を測定した。Ｈ２Ｏ２未処理細胞の吸光度の値を１．０として相対生存率を求めた。測定結果を図２に示す。図２に示されるように、ＭＴＨ１阻害剤の存在により細胞死が認められる。
【００１９】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明の方法を用いれば、ＭＴＨ１を阻害する薬剤を簡便且つ確実にスクリーニングすることができ、無細胞スクリーニング系におけるような細胞膜透過性を有しない薬剤を選別するという問題も回避される。かくして、本発明は、ＭＴＨ１阻害剤の効率的なスクリーニングを通じて抗癌剤や癌治療法の開発に資するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いられるＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株が非発現株と比較して過酸化水素負荷条件下に有意に高い細胞生存率を有することを示す。
【図２】本発明で用いられるＭＴＨ１ノックアウトマウス胎仔線維芽細胞にヒトＭＴＨ１を強制発現させた細胞株がＭＴＨ１阻害剤により細胞死を起こすことを示す。
【図１】
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【図２】
2004166590.tif 000004