(57)【要約】【課題】翻訳異常により引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質を提供することを目的とする。【解決手段】ＳＥＬＥＸ法により取得されたＲＮＡであって、ｅＩＦ４Ｅに対して結合能を有するＲＮＡ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２記載の塩基配列で表されるＲＮＡ。
【請求項２】
下記の二次構造（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含み、ｅＩＦ４Ｅに対する結合活性を有するＲＮＡ。
【化１】
2004344008.tif 000018
（二次構造中Ｎ１は３個以上の核酸塩基であり、Ｎ２は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【化２】
2004344008.tif 000019
（二次構造中Ｎ３は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【化３】
2004344008.tif 000020
（二次構造中Ｎ４は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【化４】
2004344008.tif 000021
（二次構造中Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【化５】
2004344008.tif 000022
（二次構造中Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【化６】
2004344008.tif 000023
（二次構造中Ｎ５は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【請求項３】
請求項１又は２記載のＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡであって、ｅＩＦ４Ｅに対する結合活性を有するＲＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＲＮＡのヌクレオチド配列中に少なくとも１個の修飾ヌクレオチドが導入されているＲＮＡであって、ｅＩＦ４Ｅに対する結合活性を有するＲＮＡ。
【請求項５】
ＲＮＡが標識化されている請求項１〜４のいずれかに記載のＲＮＡ。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、ｅＩＦ４Ｅを検出および／または定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合するリボ核酸（ＲＮＡ）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の生合成は大多数の遺伝情報発現の最終段階であり、極めて重要な反応である。遺伝子からタンパク質への翻訳はｍＲＮＡの示す情報に従い、その翻訳開始コドンの位置でリボソーム、メチオニン−ｔＲＮＡ複合体（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ）を含む開始複合体を作ることにより開始される。この翻訳開始複合体の形成の反応は幾つかのステップにより成り立っており、数々のタンパク質因子が逐次的に関与する複雑な反応である。真核細胞翻訳開始因子（ｅＩＦ）は、それらを構成するサブユニットや関連因子を含むと３０種類以上のタンパク質が同定されている。４０ＳリボソームサブユニットはｅＩＦ３とｅＩＦ１Ａが結合した後、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡ・ｅＩＦ２・ＧＴＰ複合体が結合し４３Ｓ  複合体を形成する。一方で、ｍＲＮＡ上では幾つかのｅＩＦが翻訳開始の準備を行っている。ｅＩＦ４ＦはｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａ、ｅＩＦ４Ｇからなる複合体の総称で、ｅＩＦ４ＥはｍＲＮＡのキャップ構造に対し結合能を持ち、複合体をｍＲＮＡの５’末端に導く。ｅＩＦ４ＧはｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ａをまとめる骨格の役割を持つ。ｅＩＦ４ＡはＡＴＰａｓｅ活性を有するＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  でｍＲＮＡの５’末端非翻訳領域（５’  ＵＴＲ）に存在する２次構造をほどくことにより４３Ｓ複合体が結合する部位を提示する。４３Ｓ複合体がｍＲＮＡと結合し翻訳開始部位に到達すると、ｅＩＦ５によりｅＩＦ２のＧＴＰａｓｅ活性が促進され、これにより複合体に結合していたｅＩＦが解離し、その後６０Ｓサブユニットが結合し、ポリペプチド伸長反応が始まる。これらのｅＩＦのうち、ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２Ｂ、ｅＩＦ４Ｅ及びこれに結合してｅＩＦ４Ｅの機能を抑制するｅＩＦ４Ｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （４Ｅ−ＢＰ）は細胞外のシグナルによりリン酸化・脱リン酸化が行われ、その活性が調節されている。しかし、多くのｅＩＦを構成するサブユニットや関連因子の作用機序はよくわかっていない。
【０００３】
ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質であるｅＩＦ４Ｅは、ｍＲＮＡに最初に結合する翻訳開始因子であり、また多くの細胞内で他の翻訳開始因子と比較して最も分子数の少ない因子である。さらに、ｅＩＦ４Ｅはリン酸化酵素であるＭｎｋ１によるリン酸化や、４Ｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （４Ｅ−ＢＰｓ）  による機能制御を受けており、翻訳開始反応を調節する上で重要な役割を担っている。これらのことから、ｅＩＦ４Ｅとキャップの結合が翻訳開始反応の律速段階の一つであると考えられている。
【０００４】
近年、癌や遺伝性疾患の中には、タンパク質への翻訳異常によるものが報告されていて、とくに癌化に関する情報が蓄積しつつある。ｅＩＦ４Ｅは細胞内でその発現量は少なく、さらに細胞外シグナルによる機能発現調整が行われており、翻訳開始の律速段階といわれている。このｅＩＦ４ＥをＮＩＨ３Ｔ３やＣＨＯなどの培養細胞中に過剰発現させると細胞の癌化が引き起こされる（Ｌａｚａｒｉｓ−Ｋａｒａｔｚａｓ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｍＲＮＡ  ５’  ｃａｐ，  Ｎａｔｕｒｅ，    ３４５：５４４−５４７，  １９９０、Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ４Ｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃ−ｍｙｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｂｕｔ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｘ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆ．，  ２：３４７−３７１，  １９９４）。また実際、ｅＩＦ４Ｅはヒトの乳癌や扁平上皮癌において、その発現量が上昇していることが報告されている（Ｋｅｒｅｋａｔｔｅ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ４Ｅ：  ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  ｃａｎｃｅｒ，  ６４：２７−３１，  １９９５、Ｎａｔｈａｎ  Ｃ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｅＩＦ４Ｅ  ｉｎ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｍａｒｇｉｎｓ  ｍａｙ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １５：５７９−５８４，  １９９７）。他のｅＩＦ４グループのタンパク質のｅＩＦ４Ｇでも、ＮＩＨ３Ｔ３で過剰発現させることにより細胞の癌化が起ることが知られている（Ｓｈｉｍｏｇｏｒｉ  Ｔ．  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ４Ｇ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５７：５０４１−５０４４，  １９９７）。さらに、肺癌の細胞中でｅＩＦ４Ｇ遺伝子の増幅が見られる（Ｂｒａｓｓ  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ−４ｇａｍｍａ  ｉｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ６：３３−３９，  １９９７）。また、  ｅＩＦ４Ａ１のｍＲＮＡ量がヒト黒色腫において上昇している（Ｅｂｅｒｌｅ  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ−４Ａ１  ｍＲＮＡ  ｉｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｌｙ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅ��ｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ７１：３９６−４０１，  １９９７）。以上のようにｅＩＦ４Ｆ構成因子の過剰発現と細胞の癌化は密接に関わっていることが報告されてきている。このｅＩＦ４Ｆ複合体量の増加が癌遺伝子などの病原遺伝子の翻訳量を上昇させ、癌化につながると考えられる。
【０００５】
さらに他のｅＩＦも癌化との関係が示されており、ｅＩＦ２αのリン酸化されない変異体や、ｅＩＦ２αキナーゼの変異によって細胞が癌化する（Ｋｏｒｏｍｉｌａｓ  Ａ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＦＮ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｓＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５７：１６８５−１６８９，  １９９２、Ｄｏｎｚｅ  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ−２  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＩＨ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４：３８２８−３８３４，  １９９５）。さらにｅＩＦ３のサブユニットの１つであるｐ４８をコードする遺伝子はマウス乳腫瘍ウイルスの組込み部位で、仮想的な癌抑制遺伝子として知られていたｉｎｔ６と同一であることが報告され（Ａｓａｎｏ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ３−ｐ４８  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔ−６，  ａ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２：２３４７７−２３４８０，  １９９７）、さらに、ヒトの肺癌と乳癌でのｅＩＦ３−ｐ４８の染色体部位のヘテロ染色体欠失（ＬＯＨ）とｅＩＦ３−ｐ４８サブユニットの発現量の低下に相関関係があること  が（Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＮＴ−６／ｅＩＦ３−ｐ４８  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．，  １８：１７５−１７９，  ２００１）  、さらに、ｅＩＦ３−ｐ４８の過剰発現により細胞が癌化する事が報告されている（Ｍａｙｅｕｒ  Ｇ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ３  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｐ４８  （ｅＩＦ３ｅ），  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５１４：４９−５４，  ２００２）。このように、タンパク質の翻訳と癌化がより密接に関係していることが示されてきているが、そのメカニズムはまだよく分かっていない。現在明らかになっている遺伝子異常による癌患者は全体の数％でしかない。残り９割以上の原因を明らかにするためには、翻訳異常により引き起こされる癌化メカニズムの解明は重要な課題である。翻訳開始因子と特異的に結合する物質、生理活性を阻害する物質が得られれば、上記のような発症メカニズムの解明に役立つばかりでなく、その診断、治療薬として有望であるが、現在、この様なアプローチが行われているという報告は少ない。
【０００６】
ところで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてある標的物質と特異的に結合するＲＮＡを選択・濃縮する手法として、ＳＥＬＥＸ法と呼ばれる新たな手法が開発されている（Ｃ．  Ｔｕｅｒｋ  ＆  Ｌ．  Ｇｏｌｄ，  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５−５１０，  １９９０）。ＳＥＬＥＸ法は、ＰＣＲプライマー用の配列（一方にはＴ７ポリメラーゼの配列を含む）を両端に含む適当な長さのランダム配列を持つＲＮＡを合成し、これを標的タンパク質と会合させ固相化する。結合しなかったＲＮＡを洗浄後、結合したＲＮＡを回収し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅後、次のラウンドで用いるＲＮＡのテンプレートとする。これを１０ラウンド前後繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得する。この方法では、標的タンパク質と特異的に結合するＲＮＡ配列を明らかにできるだけでなく、標的タンパク質の機能を促進や阻害するような生理活性を持つＲＮＡを取得することが可能である。このことは病原タンパク質をターゲットにしてＳＥＬＥＸを行うことにより、得られたアプタマーを医薬品として応用できることを示唆している。従来の創薬に比べこのＳＥＬＥＸ法を用いた創薬の優れている点として（１）従来の化学物質のスクリーニングより大規模の母集団よりスクリーニングをシステマティックに行える。（２）試験管内で容易に大量合成することができる。（３）免疫排除がない。（４）容易に合目的に改良を行える。（５）保存性が高く抗体を作ることが困難なタンパク質を標的にできる。などがあげられる。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−３００８８５号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は翻訳異常により引き起こされる疾患の発症機構の解明、診断および治療に利用可能な物質を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、この様な物質の候補としてヒト翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅに対するＲＮＡアプタマーを作製した。すなわち、ｅＩＦ４Ｅを標的タンパク質としてＳＥＬＥＸを行ない、得られたアプタマーの標的タンパク質との結合活性、標的タンパク質の作用に与える影響を調べ、その有用性を示した。本発明は、これらの知見に基づいて、完成されたものである。
【００１０】
本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）配列番号１又は２記載の塩基配列で表されるＲＮＡ。
（２）下記の二次構造（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含み、ｅＩＦ４Ｅに対する結合活性を有するＲＮＡ。
【００１１】
【化７】
2004344008.tif 000002
（二次構造中Ｎ１は３個以上の核酸塩基であり、Ｎ２は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１２】
【化８】
2004344008.tif 000003
（二次構造中Ｎ３は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１３】
【化９】
2004344008.tif 000004
（二次構造中Ｎ４は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１４】
【化１０】
2004344008.tif 000005
（二次構造中Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１５】
【化１１】
2004344008.tif 000006
（二次構造中Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
【００１６】
【化１２】
2004344008.tif 000007
（二次構造中Ｎ５は１個以上の核酸塩基であり、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｕはウラシルであり、核酸塩基間をつなぐ実線は核酸塩基間の水素結合を表す。）
（３）（１）または（２）のＲＮＡの塩基配列に変異を導入したＲＮＡであって、ｅＩＦ４Ｅに対する結合活性を有するＲＮＡ。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のＲＮＡのヌクレオチド配列中に少なくとも１個の修飾ヌクレオチドが導入されているＲＮＡであって、ｅＩＦ４Ｅに対する結合活性を有するＲＮＡ。
（５）ＲＮＡが標識化されている（１）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡ。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載の少なくとも１つのＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（７）（６）記載のＤＮＡが挿入されたベクター。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、ｅＩＦ４Ｅを検出および／または定量する方法。
【００１７】
（１）のＲＮＡ（ＲＮＡアプタマー）は、ｅＩＦ４Ｅ（例えば、ヒト由来のもの、マウス由来のもの）に対して結合能を有する。本明細書において、「ｅＩＦ４Ｅに対して結合能を有する」とは、セレクションの最初に用いるランダム配列ＲＮＡと比較してｅＩＦ４Ｅとの結合活性が有意に上昇していることをいう。ＲＮＡアプタマーとｅＩＦ４Ｅとの結合活性は、以下のようにして調べることができる。１ｎＭ以下の３２Ｐ標識したＲＮＡアプタマーを様々な濃度のｅＩＦ４Ｅと、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．６），  ８０  ｍＭ  Ｋ−ａｃｅｔａｔｅ，  ２．５  ｍＭ  Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，  １  ｍＭ  ＤＴＴ，  １００  Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  １０  μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ，  ５  ％  ｇｌｙｃｅｒｏｌの条件下で２５℃で３０分間インキュベーションした後、ニトロセルロース膜にＲＮＡアプタマーと翻訳開始因子の複合体を吸着させ、非特異的に結合しているＲＮＡアプタマーを洗浄後、膜に吸着した３２Ｐのカウントを測定し、結合活性を定量する。
【００１８】
（１）のＲＮＡは、後述のＳＥＬＥＸ法により取得することができる。（１）のＲＮＡは、ｅＩＦ４Ｅに結合し、その機能を阻害する。ｅＩＦ４Ｅの過剰発現は細胞の癌化と密接に関わっていると考えられている。従って、ｅＩＦ４Ｅの機能を阻害する（１）のＲＮＡは癌に対する予防又は治療剤の有力な候補となり得る。
【００１９】
（２）のＲＮＡは、上記の二次構造（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかをとることができるヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
二次構造（Ａ）において、Ｎ１は３個以上の核酸塩基であり、好ましくは３〜７個の核酸塩基である。Ｎ１は全ての核酸塩基を取りうる。Ｎ２は１個以上の核酸塩基であり、好ましくは１〜３個の核酸塩基である。Ｎ２は全ての核酸塩基を取りうる。好ましい二次構造（Ａ）の一例としては、図１に示すＴｙｐｅＩアプタマーの５６〜７７番目の塩基配列で表される構造を挙げることができる。
【００２１】
二次構造（Ａ）の構造の特徴として２つのｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造が挙げられる。生物界においてＲＮＡがタンパク質の立体構造をまねて機能を有する「分子擬態」という概念が提出されている（Ｉｔｏ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ  ’ａｎｔｉｃｏｄｏｎ’  ｄｅｃｉｐｈｅｒｓ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０３：６８０−６８４，  ２０００、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｍｉｃｒｙ  ｇｒａｓｐｓ  ｒｅａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，  Ｃｅｌｌ，  １０１：３４９−３５２，  ２０００）。この概念は、ＲＮＡがｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造、シュードノット構造や分子内四重鎖構造（Ｇ−カルテット）などの安定な高次構造を作りタンパク質のような機能を発揮する可能性を示している。実際、このような高次構造を持つＲＮＡの中にはタンパク質の機能ドメインと結合し、生理活性を有するものがある。二次構造（Ａ）の２つのｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造もこのような安定な高次構造を作り、生理機能を与えていると考えられる。
【００２２】
二次構造（Ｂ）において、Ｎ３は１個以上の核酸塩基であり、好ましくは１０〜１４個の核酸塩基である。Ｎ３は全ての核酸塩基を取りうる。好ましい二次構造（Ｂ）の一例としては、図１に示すＴｙｐｅＩアプタマーの１７〜３８番目の塩基配列で表される構造を挙げることができる。
【００２３】
二次構造（Ｂ）の構造の特徴はｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造にある。これは二次構造（Ａ）と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２４】
二次構造（Ｃ）において、Ｎ４は１個以上の核酸塩基であり、好ましくは４〜８個の核酸塩基である。Ｎ４は全ての核酸塩基をとりうる。好ましい二次構造（Ｃ）の一例としては、図２に示すＴｙｐｅＩＩアプタマーの１８〜３１番目の塩基配列で表される構造を挙げることができる。
【００２５】
二次構造（Ｃ）の構造の特徴はやはりｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造にあり、二次構造（Ａ）と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２６】
二次構造（Ｄ）は、図２に示すＴｙｐｅＩＩアプタマーの３７〜４１番目および７１〜７５番目の塩基配列で表される構造であり、二次構造（Ｅ）は、図２に示すＴｙｐｅＩＩアプタマーの４２〜４６番目および６３〜６７番目の塩基配列で表される構造である。
【００２７】
二次構造（Ｆ）において、Ｎ５は１個以上の核酸塩基であり、好ましくは５〜９個の核酸塩基である。Ｎ５は全ての核酸塩基をとりうる。好ましい二次構造（Ｆ）の一例としては、図２に示すＴｙｐｅＩＩアプタマーの４９〜６１番目の塩基配列で表される構造を挙げることができる。
【００２８】
二次構造（Ｆ）の構造の特徴もｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造で、二次構造（Ａ）と同様に、安定な高次構造を作り生理機能を与えていると考えられる。
【００２９】
ヌクレオチド配列の二次構造は、一般の遺伝情報処理ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ：  ソフトウェア開発社製、ＤＮＡＳＩＳ：  日立ソフトウェアエンジニアリング社製など）に塩基配列を入力して予測することができ、このような方法で、あるヌクレオチド配列が二次構造（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかをとることが予測された場合に、そのヌクレオチド配列は二次構造（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかをとることができるものとする。あるいはまた、ヌクレオチド配列の二次構造は、二本鎖ＲＮＡを特異的に切断するＲＮａｓｅ  Ｖ１や、一本鎖ＲＮＡを特異的に切断するＲＮａｓｅ  Ｔ１やＲＮａｓｅ  Ａなどを用いてｍａｐするような実験的な手法で確認してもよい。
【００３０】
（２）のＲＮＡは既知の化学合成法により取得することができる。
【００３１】
（２）のＲＮＡは、９〜８６ｍｅｒの長さであるとよく、好ましくは、５８〜８０ｍｅｒの長さである。
【００３２】
（３）の変異を導入したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
（１）又は（２）に記載のＲＮＡアプタマーに対するテンプレートＤＮＡ配列に対して任意のプライマーを用いて高塩濃度やＭｎＣｌ２の存在下でｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ＰＣＲを行うか、あるいはｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法で変異の入ったテンプレートＤＮＡを作製し、これをＲＮＡポリメラーゼプロモーターの下流にクローン化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写、精製することにより得ることができる。
【００３３】
（３）の変異を導入したＲＮＡは、より結合活性が高い、および／または生理活性の阻害効果が強いという利点を有しうる。
【００３４】
（２）および（３）のＲＮＡは、（１）のＲＮＡと同様に、ｅＩＦ４Ｅに結合し、その機能を阻害することができる。従って、これらのＲＮＡは癌に対する予防又は治療剤の有力な候補となり得る。
【００３５】
（４）のＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡアプタマーをテンプレートよりＲＮＡポリメラーゼで転写する時に、ある塩基のヌクレオシド三リン酸の代わりに、修飾の入ったヌクレオシド三リン酸を用いて転写を行い、転写産物を精製する。
【００３６】
本明細書において、「修飾ヌクレオチド」とは、天然の核酸に見られる通常のヌクレオチド以外のヌクレオチド誘導体をいう。
【００３７】
修飾の入ったヌクレオシド三リン酸、例えば、２’−ｆｌｕｏｒｏ  ＵＴＰ，  ２’−ｆｌｕｏｒｏ  ＣＴＰ，  ２’−ａｍｉｎｏ  ＵＴＰ，  ２’−ａｍｉｎｏ  ＣＴＰ，  ２’−ｈｙｄｒｏｘｙ  ＵＴＰ，  ２’−ｈｙｄｒｏｘｙ  ＣＴＰを用いて合成することにより、ＲＮＡアプタマーの安定性を高くすることができる。
【００３８】
（５）の標識化したＲＮＡは、以下のようにして作製することができる。
ＲＮＡアプタマーを５’−Ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（アマシャム  バイオサイエンス社製）により蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で標識することができる。またＲＮＡアプタマーのテンプレートを用いてＲＮＡ合成時に３２Ｐラベルしたヌクレオチドを取り込ませることにより放射性同位体で標識することが、ＤＩＧ  ＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）の使用によりジゴキシゲニンで標識化することができる。
【００３９】
（５）の標識化したＲＮＡは、翻訳開始因子の検出・定量に用いることができる。例えば、蛍光物質で標識化したＲＮＡアプタマーと翻訳開始因子との結合をＭｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＡＢＩ社製）により確認することができる。修飾ヌクレオチドを導入したアプタマーを標識化することにより、さらに感度を上げることができる。
【００４０】
（６）のＤＮＡは、（１）〜（４）のいずれかに記載の一つまたは複数のＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
【００４１】
（６）のＤＮＡは、既知の化学合成法により作製することができる。
【００４２】
（７）のベクターは、以下のようにして作製することができる。
【００４３】
（１）〜（４）のいずれかに記載のＲＮＡに対して適当なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、これを後述のｐＵＣ−ｔＲＲなどのベクターにサブクローニングすることにより、作製することができる。また、化学合成により作製したＤＮＡ断片をベクターにサブクローニングすることにより作製できる。
【００４４】
（６）のＤＮＡおよび（７）のベクターは、癌などの翻訳異常による疾患の遺伝子治療に用いることができる。
【００４５】
（１）〜（５）のいずれかに記載のＲＮＡを用いて、ｅＩＦ４Ｅを検出および／または定量することができる。具体的な検出および／または定量方法の一例を以下に記載する。ｅＩＦ４Ｅを含む溶液を９６−ｗｅｌｌ  ｍｕｌｔｉ  ｐｌａｔｅ（コーニング社製）に分注、洗浄の後、蛍光物質で標識したＲＮＡアプタマーを結合させる。洗浄の後、プレートリーダー（ＡＢＩ社製など）で蛍光強度を測定することによりｅＩＦ４Ｅを定量することができる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
本発明において用いたＳＥＬＥＸ法の概略を図３に示す。
【００４７】
ｅＩＦ４Ｅに対するＲＮＡアプタマーの選択は、Ｈｉｓ−ｔａｇの付いたマウスｅＩＦ４Ｅを標的タンパク質に用いて、これをＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅに固相化し、４０  ｍｅｒのランダム配列を持つＲＮＡプールに対して行った。１４ラウンドまでｓｅｌｅｃｔｉｏｎのサイクルを回した後、濃縮されてきたＲＮＡをコードするｃＤＮＡをｐＧＥＭ  Ｔ−ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒにクローン化し、塩基配列を決定したところ８つの配列に収束していた（図４Ａ）。
【００４８】
収束したＲＮＡプールの結合活性をみるため、１４ラウンド目で収束した８つの主なＲＮＡ配列に対してニトロセルロース膜を用いたフィルタートラップによる結合活性の評価を行なったところ、二種類の配列においてマウスｅＩＦ４Ｅの濃度に依存した結合活性の上昇がみられた  （図４Ｂ）。ここで、結合性の高いものからｅＩＦ４ＥアプタマーＴｙｐｅ  Ｉ、Ｔｙｐｅ  ＩＩとした。Ｔｙｐｅ  Ｉ及びＴｙｐｅ  ＩＩのランダム配列部分に対応するｃＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
Ｔｙｐｅ  Ｉ：  ５’−ＴＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＡＡＣＧＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＣ−３’（配列番号３）
Ｔｙｐｅ  ＩＩ：  ５’−ＧＣＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＡＡＡＡＣＣＧＡＧ−３’（配列番号４）
また、この系におけるアプタマーの解離定数はＴｙｐｅ  ＩはＫｄ＝〜５μＭ、Ｔｙｐｅ  ＩＩはＫｄ＝〜７μＭであった。
【００４９】
これらのうち、アプタマーＴｙｐｅ  ＩがヒトｅＩＦ４Ｅに対して結合活性を有するかを調べた。その結果、このアプタマーはヒトｅＩＦ４Ｅにも結合し、その解離定数はＫｄ＝〜１μＭであった（図５）。また、Ｈｉｓタグを切断したマウスｅＩＦ４Ｅに対する結合活性はＨｉｓタグの付加しているマウスｅＩＦ４Ｅに対する結合活性と比べて変化がなかった。このことからレコンビナントタンパク質に付加されているＨｉｓタグは結合活性に影響を与えない事が分かった。本発明では以下ｅＩＦ４ＥはマウスｅＩＦ４Ｅを指す。
【００５０】
より詳細な結合情報を得るために表面プラズモン共鳴解析を行った。ストレプトアビジンセンサーチップ上にビオチン化したｐｏｌｙ  ｄＴを結合させ、さらに３’側をｐｏｌｙ  Ａ化したアプタマーをｐｏｌｙ  ｄＴと対合させてチップ上に固相化し、リガンドとした  （図６Ａ）。アナライトであるｅＩＦ４Ｅを流し二分子間の相互作用をみたところ、特異的な結合解離反応がみられた  （図６Ｂｂ）。ｅＩＦ４Ｅ濃度０．１〜１０μＭのときの結合速度定数はｋａｓｓ  （Ｍ−１ｓ−１）  ＝  ２．００  ±  ０．３３  ｘ  １０４、解離速度定数ｋｄｉｓｓ  （ｓ−１）  ＝  １．７８  ±  ０．１２  ｘ  １０−２、得られた結合速度定数と解離速度定数から算出した結合定数はＫｄ  （Ｍ）  ＝  １．０７  ±  ０．１５  ｘ  １０−６であった。この値はフィルタートラップでのＫｄ値の７分の１である。これはフィルタートラップの系では二分子間で安定な複合体を形成しなければ検出されないのに比べ、表面プラズモン共鳴解析では結合解離の速度がＫｄ値に反映されるためと思われる。
【００５１】
次に、得られたアプタマーがｅＩＦ４Ｅと相互作用することで、ｅＩＦ４Ｅのキャップ結合活性にどのような影響を与えるかを調べるため、アプタマー存在下でｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅによるｐｕｌｌ−ｄｏｗｎを行い、レジンを数回洗った後ｅＩＦ４Ｅをｍ７ＧＴＰで溶出し、キャップ構造に結合したｅＩＦ４ＥをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した  （図７）。アプタマーＴｙｐｅ  Ｉ、Ｔｙｐｅ  ＩＩを系に加えたものは濃度に依存してｅＩＦ４Ｅとｍ７ＧＴＰの結合を阻害した。コントロールとして４０ＮランダムＲＮＡを加えたものはｅＩＦ４Ｅとｍ７ＧＴＰの結合に影響しなかった。阻害効果はＴｙｐｅ  ＩでＫＩ  ＝  １μＭ、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＫＩ  ＝  ６μＭであった。さらにこのアプタマーが内在性のｅＩＦ４Ｅに対して働くかを調べるために、ウサギ網状赤血球ライセートを用いて同様のｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ実験を行なった（図８）。その結果、アプタマーＴｙｐｅ  Ｉはウサギ網状赤血球ライセート中のｅＩＦ４Ｅのキャップ結合を阻害した。また、アプタマーＴｙｐｅ  Ｉはウサギの内在性のｅＩＦ４Ｅに対して、リコンビナントｅＩＦ４Ｅとほぼ同程度の阻害効果を示した。
【００５２】
このＲＮＡアプタマーによるキャップ構造−ｅＩＦ４Ｅの結合阻害が翻訳反応に与える影響をみるため、ウサギ網状赤血球ライセート中におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳阻害効果を検証した  （図９）。キャッピングしたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のｍＲＮＡを基質とし、翻訳産物量の経時変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出したところ反応開始後約１５分で産物の量は一定となった。この系にアプタマーＴｙｐｅ  Ｉを加えたところ系のアプタマー濃度に比例して阻害効果は上昇し、ＲＮＡ  ０．５μＭで翻訳産物量は  ６０  ％、１．０〜２．０μＭで２０  ％以下に減少し、３μＭで産物はほとんど検出されなかった。このことからアプタマーはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を阻害することが示された。
【００５３】
アプタマーＴｙｐｅ  Ｉの結合活性に重要な部位を検索するためにアプタマーＴｙｐｅ  Ｉの５’及び３’末端の欠損変異体を作製した。アプタマーＴｙｐｅ  Ｉの配列からＭＦＯＬＤアルゴリズムにより、その二次構造性を予測した  （図１０Ａ、図１１Ａ）。Ｔｙｐｅ  Ｉ  は３つのステム領域とその先端のループからなるクローバー状の構造をしている。一方、５’側の１６ｎｔ  と３’側の  ９ｎｔ  は相補的な塩基対を形成せず二次構造性がみられない。そこで、５’側と３’側を欠失したアプタマーを作成しその結合活性を調べた。５’側は  ４ｎｔ  及び  ８ｎｔ  欠損させると活性は大きく減少し１６ｎｔ  欠損させると活性は失われた（図１０Ｂ）。３’側を６ｎｔ  欠損させると活性は減少し、９ｎｔ欠損させると活性は失われたが、４ｎｔ  の欠損は結合活性に影響はみられなかった（図１１Ｂ）。これらのことから、プライマー由来の固定化された配列であり、二次構造性をもたないと予測された５’、３’領域も、ＲＮＡの結合活性を維持する上で重要であると考えられる。
【００５４】
以上のように本発明ではｅＩＦ４Ｅに対するＲＮＡアプタマーを２種類取得した。これらのアプタマーが細胞内での翻訳阻害活性を有していれば、多くの癌遺伝子の発現抑制を行うことが可能である。また、腫瘍細胞に対して特異的に働かせる系を確立すれば、原因遺伝子に関わらず癌細胞の増殖を抑制する万能な治療薬となりうることも考えられる。
【００５５】
これら、ｅＩＦ４Ｅに対するＲＮＡアプタマーを利用して以下（１）〜（３）のことが可能となる。
【００５６】
（１）翻訳開始因子の機能解析：  あるｅＩＦを構成するタンパク質に対するアプタマーがそのタンパク質の生理機能を阻害したとき、タンパク質のどの部分がその生理機能を担っているかを明らかにすることができる。すなわち、アプタマーにＢｒ−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ社製）などの修飾ヌクレオチドを導入し、タンパク質と結合させたのちに紫外線を当ててアプタマーとタンパク質を共有結合させる。アプタマー、タンパク質を加水分解した後、高速液体クロマトグラフィーでアミノ酸分析を行うと、アプタマーとタンパク質の結合していた部分が分かる。また、個々のｅＩＦサブユニットからｅＩＦ複合体を再構成することが可能である。この系にタンパク質との結合部位が明らかとなっているＲＮＡアプタマーを加えることにより、複合体形成を形成する際の個々のタンパク質同士の結合部位を明らかにすることができる。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  だけではなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ  における機能解析も行うことができる。アプタマーを既知の遺伝子導入方法、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）を用いたリポフェクションや、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたエレクトロポーレーションにより培養細胞に導入することができる。あるいは細胞表層へ結合後細胞内へ浸潤する性質をもつ１５〜３０アミノ酸長の特異的なデリバリー用ペプチド（Ａ．  Ａｖｒａｍｅａｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉ−ＤＮＡ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：５６０１−５６０６，  １９９８）をＲＮＡに化学結合させて培養細胞又は個体の細胞内へ直接移入することができる。また、ｐＵＣ−ｔＲＲ（Ｈ．  Ｋａｗａｓａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｓｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅ１Ａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ３００  ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｐ３００）  ａｎｄ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ２４：３０１０−３０１６，  １９９６）などの発現ベクターにアプタマーを組み込み、同様に培養細胞に導入することにより、アプタマーを細胞内で発現させることができる。これにより、アプタマーに培養細胞の癌化を抑制する作用があるかどうかを確かめることができる。
【００５７】
（２）治療薬としての応用：  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  ｉｎ  ｖｉｖｏ  で作用のあったアプタマーが治療薬として有効であるかどうかを調べることができる。既知の方法で癌を発症させた実験動物に培養細胞と同様の方法でアプタマーを血中、もしくは直接患部に投与して癌組織に変化が起これば、そのアプタマーは治療薬として有望である。このとき、アプタマーをより安定化させて効果を上げるために、既知の方法で修飾ヌクレオチドを導入することができる。
【００５８】
（３）診断薬としての応用：  ＲＮＡアプタマーは抗体の特徴を有しているが、これはＲＮＡアプタマーを抗体の変わりに「ＲＮＡ抗体」として用いることができることを意味する。これまで抗体を用いて行われていた免疫染色・ＥＬＩＳＡなどでこのＲＮＡ抗体を用いた新規の検出系が構築できる。すなわち、種々のアプタマーを用いた翻訳開始因子の定量的測定が可能である。これにより発症機構の分かっていない疾患が翻訳調節異常を伴うかどうかを明らかにすることができる。また、前述のように腫瘍細胞では正常細胞に比べｅＩＦの発現量に異常が見られるという報告がある。さらに、ラットにおいて種々の癌細胞でｅＩＦ４ＥのｍＲＮＡ量が異なっていることが報告されている（Ｍｉｙａｇｉ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ−４Ｅ，  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，  ９１：２４７−２５２，  １９９５）。このように腫瘍細胞の良性・悪性、さらには転移性の強さなどでｅＩＦの発現パターンに違いがあることが予想される。アプタマーを用いてｅＩＦの発現量の差を認識できる系をＥＬＩＳＡやアプタマーのチップ化により確立することにより、安価で簡便でな癌診断が可能となる。さらに、種々のｅＩＦに対してアプタマーを取得しカタログ化し、ｅＩＦの発現パターンを調べることにより、腫瘍の種類を識別できる診断法を開発することができる。
【００５９】
【実施例】
以下、本発明の実験の手法を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
［実施例１］  精製タンパク質
本発明で用いたヒト及びマウスｅＩＦ４Ｅはヒスチジンのタグのついた融合タンパク質として大腸菌内で過剰発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて粗精製し、さらに陽イオン交換カラムＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓ（アマシャム  バイオサイエンス社製）により精製分離した。
【００６１】
［実施例２］  ＲＮＡアプタマーの取得
ＳＥＬＥＸ法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ａ．Ｄ．  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ  Ｊ．Ｗ．，  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４６：８１８−２２，  １９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｌ．，
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９：５０５−５１０，  １９９０）を改良して行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎに用いたＲＮＡ  ｐｏｏｌは化学合成した以下のプライマー及びランダム配列テンプレート（グライナー・ジャパン社に合成依頼）より作製した。ＰＣＲで増幅させたランダム配列のＤＮＡ断片を転写のテンプレートとし、プライマーＰ１に含まれるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより転写し、フェノール抽出とゲルろ過により精製した。Ｐ１：  ５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡ−３’（配列番号５）
Ｐ２：  ５’−ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ−３’（配列番号６）
ランダム配列テンプレート：
５’−ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡ  （４０Ｎ）
ＴＴＣＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＣ−３’
ＲＮＡとタンパク質との結合はｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ［２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），  ８０  ｍＭ  Ｋ−ａｃｅｔａｔｅ，  ２．５  ｍＭ  Ｍｇ−ａｃｅｔａｔｅ，  １  ｍＭ  ＤＴＴ，  ５  ％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ］中で行われた。ｅＩＦ４ＥとＲＮＡとの反応後、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅによりｅＩＦ４Ｅをｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ後、ＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅の後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写を行ない、次のラウンドのＲＮＡを得た。毎ラウンド、ＲＮＡはｅＩＦ４Ｅと反応させる前にＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅと混ぜ、これに結合するＲＮＡを取り除いた。１４ラウンドｓｅｌｅｃｔｉｏｎを行った後、ＰＣＲ産物はｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニング後、大腸菌株ＮｏｖａＢｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、単一クローンを得た。これらは、ｐｌａｓｍｉｄを抽出後ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００，  ＡＢＩ社製）で、以下のｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いて塩基配列を決定した。
ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｒ：  ５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号７）
得られた塩基配列は遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発社製）によりＲＮＡの二次構造予測を行った。
【００６２】
［実施例３］  ＲＮＡ結合活性
得られたＲＮＡアプタマーの結合活性はニトロセルロース膜を用いて測定した。ＲＮＡアプタマーは［α−３２Ｐ］ＣＴＰ存在化で転写を行いＲＩラベルした。ラベルされたＲＮＡアプタマーは種々の濃度のｅＩＦ４Ｅとｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ中で混合し、２５℃で３０分間インキュベートした後、吸引ろ過装置でｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで処理されたニトロセルロース膜を透過させ、１ｍｌのｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄、乾燥後、膜に吸着した３２Ｐのカウントをシンチレータ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）で測定した。系に加えた総ＲＮＡのラベルのカウントに対する、膜に吸着したカウントの相対量を結合効率としてグラフにプロットした。
【００６３】
［実施例４］表面プラズモン共鳴解析
表面プラズモン解析はＢＩＡｃｏｒｅ−２０００  （ＢＩＡｃｏｒｅ社）により行なった。ストレプトアビジンセンサーチップ（ＳＡ  ｃｈｉｐ，  ＢＩＡｃｏｒｅ）に５’末端をビオチン標識化したｐｏｌｙ（ｄＴ）オリゴヌクレオチド（ビオチンｄＴ１６）をよく脱気した結合バッファーで２  μｇ  ／  ｍｌの濃度に希釈し、フローセルにインジェクトして６００  ＲＵのビオチンｄＴ１６を固定化した。さらに、このチップに対して３’側にｐｏｌｙ  Ａ１６を付加したアプタマーを結合バッファーで４００  ｎＭの濃度に希釈したものを６０秒間インジェクトし、１２０秒間結合バッファーで洗った。このとき、ＳＡチップ上に４００  ＲＵのＲＮＡを結合させた。その後、０〜１．０μＭの濃度に結合バッファーで希釈したｅＩＦ４Ｅを６０秒間インジェクトし結合反応速度を測定した後、結合バッファーで洗いを行ない、解離反応速度を測定した。リファレンスとしてＲＮＡアプタマーを固定化していないＳＡチップを用い、ＲＮＡアプタマーの結合反応は全て同じフローセル内で測定した。
【００６４】
［実施例５］  ｍ７−ＧＴＰ結合阻害解析
結合バッファーに溶かしたリコンビナントｅＩＦ４Ｅ  １μＭ・２５μｌの系に対して、１μｌのｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを加えて２５℃  ３０  ｍｉｎインキュベートした。その後、レジンを２００μｌの結合バッファーで３回洗い、ｍ７ＧＴＰ溶出バッファー（１０  ｍＭ  ｍ７ＧＴＰ  ＋  結合バッファー）  を２０μｌ加え、２５℃  ６０  ｍｉｎ  でｅＩＦ４Ｅを溶出した。３  ｋｒｐｍ  ４℃  １ｍｉｎで遠心してレジンを沈降させ、上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥした。ＰＡＧＥ後にＣＢＢ染色し、バンドを定量した。
【００６５】
［実施例６］  ウサギ網状赤血球ライセート中でのｍ７−ＧＴＰ結合阻害解析
以下の系に対して、１μｌのｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅを加えて２５℃  で３０  ｍｉｎインキュベートした。
【００６６】
【表１】
2004344008.tif 000008
その後、レジンを２００μｌの結合バッファーで３回洗い、ｍ７ＧＴＰ溶出バッファー（１０  ｍＭ  ｍ７ＧＴＰ  ＋  結合バッファー）  を１５μｌ加え、２５℃  ６０  ｍｉｎ  でｅＩＦ４Ｅを溶出した。３  ｋｒｐｍ  ４℃  １ｍｉｎで遠心してレジンを沈降させ、上清５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥした。ＰＡＧＥ後にヒトｅＩＦ４Ｅ抗体でウェスタンブロットを行ない、ＬＡＳ−１０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）でバンドを測定した。
【００６７】
［実施例７］  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系
ＣＡＴ  ｍＲＮＡの転写。Ｔ７ポリメラーゼによる転写の際にｍ７ＧｐｐｐＧキャップアナログを加え、以下の反応組成でＣＡＴ  ｍＲＮＡをキャッピングした。
【００６８】
【表２】
2004344008.tif 000009
転写反応後にＤＮａｓｅ  Ｉを加え、３７℃  ３０  ｍｉｎでテンプレートｄｓＤＮＡを分解し、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム処理してタンパク質を除き、エタノール沈澱により目的の長さのＲＮＡのみを精製した。さらに、ＭＱで置換したＳｐｉｎｃｏｌｕｍｎにＲＮＡ溶液を通し、ＮＴＰを完全に除去した。
【００６９】
ウサギ網状赤血球ライセートを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系。キャッピングしたＣＡＴ  ｍＲＮＡを基質とし、以下の組成でｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行なった。
【００７０】
【表３】
2004344008.tif 000010
各反応時間ごとにライセートを３μｌとりＳＤＳ−ＰＡＧＥした後、ゲルを乾燥させてプレートリーダーに８時間感光、ＢＡＳ−２０００  （ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にて解析を行なった。
【００７１】
［実施例８］  末端欠損Ｔｙｐｅ  Ｉアプタマーの作製
以下のプライマーの化学合成を依託し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎと同じ条件でＰＣＲを行なった。
Ｔ４  Ｕｎｉｖ  ５’−Δ４  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＴＧ−３’（配列番号８）
Ｔ４  Ｕｎｉｖ  ５’−Δ８  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＧＡＡＴＧＴＴＣＡＡ−３’（配列番号９）
Ｔ４  Ｕｎｉｖ  ５’−Δ１６  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＧＡＡＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＣＴＣＡＡＴＧＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号１０）
Ｒｅｖ  Ｕｎｉｖ  ３’−Δ４  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＧＧ−３’（配列番号１１）
Ｒｅｖ  Ｕｎｉｖ  ３’−Δ６  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１２）
Ｒｅｖ  Ｕｎｉｖ  ３’−Δ９  ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＧＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号１３）
ＰＣＲ後にＴＢＥゲルによるＰＡＧＥを行ない、切り出し精製をして転写の鋳型とした。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、ｅＩＦ４Ｅに対して結合能を有するＲＮＡアプタマーが提供される。本発明のＲＮＡアプタマーは、ｅＩＦ４Ｅの機能解明、癌などの疾患の診断および治療に利用可能である。
【００７３】
【配列表】
2004344008.tif 000011
2004344008.tif 000012
2004344008.tif 000013
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2004344008.tif 000016
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【００７４】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、ＴｙｐｅＩアプタマーの塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号２】
配列番号２は、ＴｙｐｅＩＩアプタマーの塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号３】
配列番号３は、ＴｙｐｅＩアプタマーのランダム配列部分に対応するｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号４】
配列番号４は、ＴｙｐｅＩＩアプタマーのランダム配列部分に対応するｃＤＮＡの塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号５】
配列番号５は、プライマーＰ１の塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号６】
配列番号６は、プライマーＰ２の塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号７】
配列番号７は、シークエンスプライマーの塩基配列を示す。
【００８１】
【配列番号８】
配列番号８は、Ｔ４  Ｕｎｉｖ  ５’−Δ４  ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
【００８２】
【配列番号９】
配列番号９は、Ｔ４  Ｕｎｉｖ  ５’−Δ８  ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
【００８３】
【配列番号１０】
配列番号１０は、Ｔ４  Ｕｎｉｖ  ５’−Δ１６  ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
【００８４】
【配列番号１１】
配列番号１１は、Ｒｅｖ  Ｕｎｉｖ  ３’−Δ４  ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
【００８５】
【配列番号１２】
配列番号１２は、Ｒｅｖ  Ｕｎｉｖ  ３’−Δ６  ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
【００８６】
【配列番号１３】
配列番号１３は、Ｒｅｖ  Ｕｎｉｖ  ３’−Δ９  ｐｒｉｍｅｒの塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴｙｐｅＩアプタマーの二次構造を示す図。
【図２】ＴｙｐｅＩＩアプタマーの二次構造を示す図。
【図３】ＳＥＬＥＸ法の概略。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列とランダム領域を含むＤＮＡを合成し、Ｐ１，  Ｐ２をプライマーとしてＰＣＲを行いテンプレートを得る。これから合成したＲＮＡを標的物質と会合させ、結合したＲＮＡを回収する。回収したＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより次のラウンドへのテンプレートを得る。本発明ではこれを１４ラウンドを繰り返した。最終ラウンドでのＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニング、シークエンスに回す。
【図４】Ａ．選択されてきた１４ラウンド目のＲＮＡプールから１２０サンプルの塩基配列を決定したところ、ＲＮＡは８タイプの配列に収束していた。配列のシェアは多い配列で１５〜２０  ％、少ない配列は１．６  ％  であった。これらの配列には特徴的な配列やコンセンサスはみられなかった。
Ｂ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎで選択された８種類のＲＮＡの結合実験結果。コントロールとして４０ＮランダムＲＮＡプールを用いた。結合活性の強いＲＮＡから順にＴｙｐｅ  Ｉ、Ｔｙｐｅ  ＩＩと名付けた。
【図５】アプタマーＴｙｐｅ  ＩはヒトｅＩＦ４Ｅに対しても結合活性を示した。その結合活性はＫｄ＝〜１μＭであった。また、Ｈｉｓタグを切断したマウスｅＩＦ４Ｅに対する結合活性はＨｉｓタグの付加しているマウスｅＩＦ４Ｅに対する結合活性と比べて変化がなかった。
【図６】Ａ．  表面プラズモン共鳴解析方法。ストレプトアビジンセンサーチップ上にビオチン化ｐｏｌｙ  ｄＴを結合させた後、３’末端にｐｏｌｙ  Ａ配列を付加したアプタマーをこれに固相化する。チップ上に固相化されたアプタマーとアナライトであるｅＩＦ４Ｅが結合した際には光学的な変化が起る。これを測定し質量的な変化に換算することで二分子間の相互作用を解析する。
Ｂ．  表面プラズモン共鳴解析結果。センサーチップ表面上の質量変化を時間経過で測定した。縦軸は質量変化を示す値であるＲＵ  （Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）  である。センサーチップ上に４００  ＲＵのＲＮＡを固相化し、時間０秒にｅＩＦ４Ｅを流して結合させ、その１分後にＢｕｆｆｅｒを流して解離させた。ａ．  コントロールとして４０ＮランダムＲＮＡを固相化したセンサーチップに対してｅＩＦ４Ｅを流したところ、質量変化はみられなかった。ｂ．  アプタマーＴｙｐｅ  Ｉを固相化したセンサーチップに対してｅＩＦ４Ｅを流したところ、特異的な結合解離反応を示した。アプタマーＴｙｐｅ  ＩはｅＩＦ４Ｅの濃度に依存して結合し、その結合定数はＫｄ  （Ｍ）  ＝  １．０７  ｘ  ±  ０．１５  ｘ  １０−６であった。
【図７】アプタマー存在下でのｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ実験。Ａ．  ｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅによるｐｕｌｌ−ｄｏｗｎアッセイ後、キャップに結合したｅＩＦ４ＥをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＣＢＢ染色した。Ｔｙｐｅ  Ｉ・ＩＩのＲＮＡを０〜１０μＭの範囲で系に加えていくと、ＲＮＡ濃度に依存してキャップに結合するｅＩＦ４Ｅ量は減少した。コントロールとして４０Ｎランダムプールを用いたものに変化はみられなかった。
Ｂ．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から横軸にＲＮＡ濃度、縦軸に結合したｅＩＦ４Ｅをプロットした。アプタマーＴｙｐｅ  Ｉにおいて比較的高い阻害効果が確認された。
【図８】ウサギ網状赤血球ライセート中でのアプタマーのキャップ結合阻害実験。Ａ．  ウサギ網状赤血球ライセートを用いてｍ７ＧＴＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅによるｐｕｌｌ−ｄｏｗｎを行なった後、キャップに結合したｅＩＦ４Ｅを、ヒトｅＩＦ４Ｅ抗体でウェスタンブロットした。アプタマーを０〜１０μＭの範囲で系に加えていくと、ＲＮＡ濃度に依存してキャップに結合するｅＩＦ４Ｅ量は減少した。コントロールとして４０Ｎランダムプールを用いたものに変化はみられなかった。
Ｂ．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から横軸にＲＮＡ濃度、縦軸に結合したｅＩＦ４Ｅをプロットした。その阻害効果はリコンビナントｅＩＦ４Ｅと同程度であった。
【図９】ｅＩＦ４ＥアプタマーＴｙｐｅ  Ｉによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳阻害効果。ｅＩＦ４ＥアプタマーＴｙｐｅ  Ｉが翻訳反応に与える影響をみるため、ウサギ網状赤血球ライセートを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を行なった。
Ａ．  ＣＡＴ  ｍＲＮＡを基質として［３５Ｓ］−Ｍｅｔ存在下で翻訳を行ない、その産物の量を時間経過ごとにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。
Ｂ．  検出されたバンドから縦軸に翻訳産物量、横軸に反応時間、翻訳開始から２５分後のＣＡＴ産物量を１００  ％としてプロットした。この系において、翻訳開始後約１５分で翻訳産物の量は一定となった。この系にアプタマーＴｙｐｅ  Ｉを加えるとＲＮＡ  ０．５μＭで翻訳産物量は  ６０  ％、１．０〜２．０μＭで２０  ％以下に減少し、３．０μＭで産物は検出されなかった。アッセイは各濃度において３回行なった。
【図１０】Ｔｙｐｅ  Ｉアプタマーの５’末端欠損変異体の解析。５’末端を  ４ｎｔ  及び  ８ｎｔ  欠損させると結合活性が大きく減少し１６ｎｔ  欠損させると活性は失われた。（Ａ）はＴｙｐｅ  Ｉアプタマーの予測される二次構造を、（Ｂ）は欠損変異体の結合活性を示す。
【図１１】Ｔｙｐｅ  Ｉアプタマーの３’末端欠損変異体の解析。３’端を  ６ｎｔ  欠損させると結合活性は減少し、９ｎｔ欠損させると活性は失われた。４ｎｔ  の欠損に関しては結合活性に影響はみられなかった。（Ａ）はＴｙｐｅ  Ｉアプタマーの予測される二次構造を、（Ｂ）は欠損変異体の結合活性を示す。
【図１】
2004344008.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004344008.tif 000031
【図９】
2004344008.tif 000032
【図１０】
2004344008.tif 000033
【図１１】
2004344008.tif 000034