(57)【要約】      （修正有）【課題】  ストレス応答性プロモーターの提供。【解決手段】  以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、環境ストレス応答性プロモーター。(a) ９０種類の塩基配列から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNA、(b) ９０種類の塩基配列から選ばれるいずれかの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA、(c) ９０種類の塩基配列から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、環境ストレス応答性プロモーター。
(a) 配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
(c) 配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
【請求項２】
環境ストレスが低温ストレス、乾燥ストレス及び塩ストレスからなる群から選択される少なくとも１つである請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
請求項１又は２いずれか一項記載のプロモーターを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項３記載の発現ベクターに、さらに任意の遺伝子が組み込まれた発現ベクター。
【請求項５】
請求項３又は４記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項３又は４記載の記載の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項７】
植物が、植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞である請求項６記載のトランスジェニック植物。
【請求項８】
請求項６又は７記載のトランスジェニック植物を培養又は栽培することを特徴とするストレス耐性植物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境ストレス応答性プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の配列決定プロジェクトによって、数種の生物について大量のゲノム配列及びcDNA配列が決定されており、植物モデルであるシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)では、２つの染色体の完全なゲノム配列が決定されている(Lin, X. et al., (1999) Nature 402, 761-768.; Mayer, K. et al., (1999) Nature 402, 769-777.)。
【０００３】
EST(expressed sequence tag)プロジェクトも、発現遺伝子の発見に大いに貢献している(Hofte, H. et al., (1993) Plant J. 4, 1051-1061.; Newman, T. et al., (1994) Plant Physiol. 106, 1241-1255.; Cooke, R. et al., (1996) Plant J. 9, 1O1-124. Asamizu, E. et al., (2000) DNA Res. 7, 175-180.)。例えば、dbEST(National Center for Biotechnology Information(NCBI)のESTデータベース)には部分cDNA配列が含まれており、全遺伝子の半分以上(即ち、約28,000遺伝子)が再現されている(完全に配列決定されたシロイヌナズナの２番染色体の遺伝子含有量から推定[Lin, X. et al., (1999) Nature 402, 761-768.])。
【０００４】
近年、ゲノムスケールの遺伝子発現を分析するのにマイクロアレイ（DNAチップ）技術が有用な手段となっている(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-470.; Eisen,
M. B. and Brown, P. O. (1999) Methods Enzymol. 303, 179-205.)。このDNAチップを用いる技術は、cDNA配列をスライドガラス上に1,000遺伝子/cm2以上の密度で配列させるものである。このように配列させたcDNA配列を、異なる細胞型又は組織型のRNAサンプルから調製した２色蛍光標識cDNAプローブ対に同時にハイブリダイズさせることで、遺伝子発現を直接かつ大量に比較分析することが可能となる。この技術は、最初、48個のシロイヌナズナ遺伝子を根及び苗条におけるディファレンシャル発現について分析することで実証された(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-470.)。さらに、マイクロアレイは、熱ショック及びプロテインキナーゼＣ活性化に応答する新規な遺伝子を同定するため、ヒトcDNAライブラリーからランダムに採取した1,000個のクローンを調査するのに使用されている(Schena, M. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10614-10619.)。
【０００５】
一方、このDNAチップを用いる方法によって、各種の誘導条件下における炎症性疾患関連遺伝子の発現プロフィールの分析が行われている(Heller, R. A. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2150-2155.)。さらに、マイクロアレイを用いて、6,000個を超えるコード配列からなる酵母ゲノムの動的発現についても分析が行われている(DeRisi, J.L. et al., (1997) Science 278, 680-686.; Wodicka, L. et al., (1997) Nature Biotechnol. 15, 1359-1367.)。
【０００６】
しかしながら、植物の分野では、マイクロアレイ分析に対しては若干の報告がなされているに過ぎない(Schena, M. et al., (1995) Science 270, 467-470.; Ruan, Y. et al.,
(1998) Plant J. 15, 821-833.; Aharoni. A. et al., (2000) Plant Cell 12, 647-661.; Reymond, P. et al., (2000) Plant Cell 12, 707-719.)。
【０００７】
植物の生育は、乾燥、高塩濃度及び低温等の環境ストレスの影響を顕著に受ける。これらのストレスのうち乾燥又は水分欠乏が、植物の生育及び作物の生産にとって最も厳しい制限因子となる。乾燥ストレスは、植物に様々な生化学的及び生理学的な応答を引き起こ
す。  
【０００８】
植物は、これらのストレス条件下で生き抜くために、ストレスに対する応答性及び順応性を獲得する。近年、転写レベルで乾燥に応答する数種の遺伝子が記載されている(Bohnert, H.J. et al., (1995) Plant Cell 7, 1099-1111.; Ingram, J., and Bartels, D. (1996) Plant Mol. Biol. 47, 377-403.; Bray, E. A. (1997) Trends Plant Sci. 2, 48-54.; Shinozaki. K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (1997) Plant Physiol. 115, 327-334. ； Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (1999). Molecular responses to drought stress. Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants. Edited by Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. R. G. Landes Company.；Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223.)。
【０００９】
一方、遺伝子導入によって植物のストレス耐性を向上させるために、ストレス誘導性遺伝子が使用されている(Holmberg, N., and Bulow, L. (1998) Trends Plant Sci. 3, 61-66.; Bajaj, S. et al., (1999) Mol. Breed. 5, 493-503.)。高等植物のストレス耐性とストレス応答の分子機構をさらに解明するためだけでなく、遺伝子操作によって作物のストレス耐性を向上させるためにも、ストレス誘導性遺伝子の機能を分析することが重要である。
【００１０】
DRE/CRT(乾燥応答性エレメント/C-反復配列)は、乾燥、高塩分濃度及び低温ストレス応答性遺伝子のABA（アブシジン酸：植物ホルモンの一種で種子の休眠や環境ストレスのシグナル伝達因子として機能する。）に依存しない発現において重要なシス作動性エレメントとして同定されている(Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (1994) Plant Cell 6, 251-264.; Thomashow, M.F. et al.,  (1999) Plant Mol. Biol. 50, 571-599.; Shinozaki, K., and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223.)。また、DRE/CRT応答性遺伝子発現に関与する転写因子(DREB/CBF)がクローニングされている(Stockinger. E.J. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1035-1040.; Liu, Q. et al., (1998) Plant Cell 10, 1391-1406.; Shinwari, Z.K. et al., (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 250, 161-170.; Gilmour, S.J.et al., (1998) Plant J. 16, 433-443.)。DREB1/CBFは低温応答性遺伝子発現において機能すると考えられ、DREB2は乾燥応答性遺伝子発現に関与している。カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターの制御下でCBF1(DREB1B)cDNAを過剰発現するトランスジェニック・シロイヌナズナ植物では、凍結ストレスに対する強力な耐性が観察されている(Jaglo-Ottosen, K.R. et al., (1998) Science 280, 104-106.)。
【００１１】
本発明者らは、CaMV 35Sプロモーター又はストレス誘導性rd29Aプロモーターの制御下におけるトランスジェニック植物でのDREB1A(CBF3)cDNAの過剰発現によって、ストレス誘導性DREB1A標的遺伝子の強力な構成的発現が引き起こされ、凍結ストレス、乾燥ストレス及び塩ストレスに対する耐性が向上することを報告している(Liu, Q. et al., (1998) Plant Cell 10, 1391-1406.; Kasuga, M. et al., (1999) Nature Biotechnol. 17, 287-291.)。また、既に本発明者らは、rd29A/lti78/cor78、kin1、kin2/cor6.6、cor15a、rd17/cor47及びerd10等の６個のDREB1A標的遺伝子を同定している(Kasuga, M. et al., (1999)
Nature Biotechnol. 17, 287-291.)。しかしながら、トランスジェニック植物におけるDREB1A cDNAの過剰発現が凍結、乾燥及び塩分に対するストレス耐性をどのように高めているのかは、十分には解明されていない。乾燥及び凍結耐性の分子機構を研究するためには、DREB1Aによって制御される遺伝子をより多く同定・分析することが重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、環境ストレス応答性プロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、cDNAマイクロアレイ分析を応用して、新規な低温ストレス、乾燥ストレス及び塩ストレス応答性遺伝子を同定し、そのプロモーター領域を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)のDNAを含む、環境ストレス応答性プロモーターである。
(a) 配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列において１若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
(c) 配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
【００１５】
環境ストレスとしては、低温ストレス、乾燥ストレス及び塩ストレスからなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００１６】
さらに、本発明は、前記プロモーターを含む発現ベクター、又は該発現ベクターに、さらに任意の遺伝子が組み込まれた発現ベクターである。  
【００１７】
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含む形質転換体である。  
さらに、本発明は、前記発現ベクターを含むトランスジェニック植物（例えば、植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞）である。  
【００１８】
さらに、本発明は、前記トランスジェニック植物を培養又は栽培することを特徴とするストレス耐性植物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ストレス応答性プロモーターが提供される。本発明のプロモーターは、環境ストレス耐性植物の分子育種に使用できる点で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。  
本発明者らは、乾燥処理植物及び低温処理植物等の条件の異なる植物から、ビオチン化CAPトラッパー法(Carninci. P. et al., (1996) Genomics, 37, 327-336.)によってシロイヌナズナの完全長cDNAライブラリーを構築し (Seki. M. et al., (1998) Plant J. 15,
707-720.)、ストレス誘導性遺伝子を含む約1,300個の完全長cDNA及び約7,000個の完全長cDNAを用いてシロイヌナズナの完全長cDNAマイクロアレイをそれぞれ調製した。また、これらの乾燥・低温誘導性の完全長cDNAに加えて、ストレス応答性遺伝子の発現をコントロールする転写制御因子であるDREB1Aの標的となる遺伝子を用いてcDNAマイクロアレイを作成した。そして、乾燥ストレス及び低温ストレス下における遺伝子の発現パターンをモニターし、ストレス応答性遺伝子を網羅的に解析した。その結果、約1,300個の完全長cDNAを含む完全長cDNAマイクロアレイから、新規な環境ストレス応答性遺伝子、すなわち、44個の乾燥誘導性遺伝子及び19個の低温誘導性遺伝子を単離した。44個の乾燥誘導性遺伝子のうち30個、19個の低温誘導性遺伝子のうち10個が新規のストレス誘導性遺伝子であった。さらに、12個のストレス誘導性遺伝子がDREB1Aの標的遺伝子であり、そのうち6個が新規の遺伝子であることがわかった。また、解析の結果、約7,000個の完全長cDNAを含むcDN
Aマイクロアレイから、301個の乾燥誘導性遺伝子、54個の低温誘導性遺伝子及び211個の高塩濃度ストレス誘導性遺伝子を単離した。
【００２１】
そして、これら環境ストレス応答性遺伝子からプロモーター領域を単離することに成功したものである。  
【００２２】
以上のように、完全長cDNAマイクロアレイは、シロイヌナズナの乾燥・低温ストレス誘導性遺伝子の発現様式の解析やストレス関連転写制御因子の標的遺伝子の解析にとって有効なツールである。
【００２３】
１．プロモーターの単離
本発明のプロモーターは、低温、乾燥、高塩濃度などの環境ストレスにより発現されるストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の上流に存在するシスエレメントであり、転写因子と結合して、その下流の遺伝子の転写を活性化する機能を有するものである。前記シスエレメントには、乾燥ストレス応答性エレメント(DRE；dehydration-responsive element)、アブシジン酸応答性エレメント(ABRE；abscisic acid responsive element)、低温ストレス応答性エレメントなどがあり、これらのエレメントに結合するタンパク質をコードする遺伝子として、DRE結合タンパク質1A遺伝子(DREB1A遺伝子ともいう)、DRE結合タンパク質1C遺伝子(DREB1C遺伝子ともいう)、DRE結合タンパク質2A遺伝子(DREB2A遺伝子ともいう)、及びDRE結合タンパク質2B遺伝子(DREB2B遺伝子ともいう)等が挙げられる。
【００２４】
本発明のプロモーターを単離するにあたり、まず、マイクロアレイを用いてストレス応答性遺伝子を単離する。マイクロアレイの作製には、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の全長cDNAライブラリーから単離した遺伝子のほか、RD（Responsive to Dehydration）遺伝子、ERD（Early Responsive to Dehydration）遺伝子、kin1遺伝子、kin2遺伝子、cor15a遺伝子、また内部標準としてα-tubulin遺伝子、さらにネガティブコントロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレセプターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及びマウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝子の計約1300のcDNAを用いることができる。
【００２５】
また、本発明のプロモーターを単離する際のマイクロアレイとしては、シロイヌナズナ（Arabidopsis）の全長cDNAライブラリーから単離した遺伝子のほか、RD（Responsive to
Dehydration）遺伝子、ERD（Early Responsive to Dehydration）遺伝子、内部標準としてλコントロール鋳型DNA断片（TX803、宝酒造株式会社製）から得られたPCR増幅断片、さらにネガティブコントロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレセプターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及びマウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝子からなる計約7000のcDNAを用いることもできる。
【００２６】
Kurabo製プラスミド調製装置を用いて抽出したプラスミドDNAをシーケンス解析に用いて、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3700. PE Applied Biosystems, CA, USA）により配列を決定する。GenBank/EMBLデータベースをもとに、BLASTプログラムを用いて配列のホモロジー検索を行う。
【００２７】
次に、ポリAセレクション後，逆転写反応をおこない2本鎖DNAを合成し、cDNAをベクターに挿入する。
【００２８】
cDNAライブラリ作成用ベクターに挿入されたcDNAを、cDNAの両側のベクターの配列と相補的なプライマーを用いてPCR法により増幅する。ベクターとしては、λZAPII、λPS等が挙げられる。
【００２９】
マイクロアレイは、通常の方法に従って作製することができ、特に限定されるものではない。例えば、gene tipマイクロアレイスタンプマシンGTMASS SYSTEM（Nippon Laser & Electronics Lab.製）を使って、上記PCR産物をマイクロタイタープレートからロードし、マイクロスライドガラスの上に所定間隔でスポットする。その後、非特異的なシグナルの発現を防ぐためにスライドをブロッキング・ソルーションに浸す。
【００３０】
植物材料としては野生型のほか、特定の遺伝子の破壊株等が挙げられるが、DREB1AのcDNAが導入されたトランスジェニック植物を用いることができる。植物種は、シロイヌナズナ、タバコ，イネ等が挙げられるが、シロイヌナズナが好ましい。  
【００３１】
乾燥及び低温ストレス処理は公知方法の方法で行うことができる（Yamaguchi-Shinozaki, K., and Shinozaki, K. (1994) Plant Cell 6, 251-264.）。
【００３２】
ストレス処理にさらした後は、植物体（野生型及びDREB1A過剰発現型形質転換体）をサンプリングし、液体窒素を用いて凍結保存する。野生型及びDREB1A過剰発現型形質転換体を、DREB1Aの標的遺伝子を同定するための実験に用いる。植物体から、公知方法又はキットを用いてmRNAを単離精製する。
【００３３】
標識用Cy3 dUTP又はCy5 dUTP（Amersham Pharmacia）の存在下でそれぞれのmRNAサンプルの逆転写を行い、ハイブリダイゼーションに用いる。  
【００３４】
ハイブリダイゼーション後は、走査レーザー顕微鏡等を用いてマイクロアレイをスキャンする。マイクロアレイのデータ解析用プログラムとして、Imagene Ver 2.0（BioDiscovery）とQuantArray（GSI Lumonics）等を用いることができる。  
【００３５】
スキャン後は、目的とする遺伝子をもつプラスミドを調製することにより、遺伝子が単離される。
【００３６】
プロモーター領域の決定は、上記単離された遺伝子の塩基配列を解析し、データベース（GenBank/EMBL, ABRC）のゲノム情報をもとに、遺伝子解析用プログラムを用いて行われる。単離された遺伝子は、乾燥ストレス誘導性及び低温ストレス誘導性の両性質を有するもの、乾燥ストレス誘導性に特異的なもの、低温ストレス誘導性に特異的なものに分類することができる。遺伝子解析用プログラムによれば、上記遺伝子の中から９０種の遺伝子（FL03-07-F12、FL04-12-F24、FL04-14-N10、FL04-14-P24、FL04-17-I03、FL04-17-M08、FL04-17-M22、FL05-05-A17、FL05-05-F20、FL05-05-G20、FL05-09-N09、FL05-10-J09、FL05-10-M08、FL05-11-H09、FL05-12-H13、FL05-13-I20、FL05-14-E15、FL05-14-E16、FL05-16-F03、FL05-16-H23、FL05-18-M07、FL05-18-O21、FL05-19-F21、FL05-19-O22、FL05-21-K17、FL06-10-F03、FL06-12-H12、FL07-12-I23、FL08-08-H23、FL08-08-O14、FL08-09-M05、FL08-10-K08、FL08-11-P07、FL08-13-F10、FL08-19-D04、FL08-19-G15、FL09-06-B11、FL09-07-G17、FL09-10-A12、FL09-13-P15、FL02-05-I05、FL04-12-N15、FL04-16-P21、FL04-17-N22、FL04-20-P19、FL02-09-H01、FL05-01-D08、FL05-02-G08、FL05-02-O17、FL05-07-L13、FL05-08-B14、FL05-09-N10、FL05-11-L01、FL05-12-J09、FL05-14-D24、FL05-14-F20、FL05-14-I08、FL05-15-C04、FL05-15-E19、FL05-18-A06、FL05-18-H15、FL05-19-C02、FL05-20-M16、FL05-20-N18、FL05-21-E06、FL05-21-L12、FL06-07-B08、FL06-08-H20、FL06-09-N04、FL06-11-K21、FL07-07-G15、FL07-12-D17、FL08-11-C23、FL08-13-G20、FL08-15-M21、FL08-18-N19、FL08-19-C07、FL08-19-P05、FL09-07-G09、FL09-07-G15、FL09-10-J18、FL09-11-I12、FL09-12-B03、FL09-16-I11、FL09-16-M04、FL11-01-J18、FL11-07-D13、FL11-07-F02、FL11-07-N15及びFL11-10-D10）が同定される。これらの遺伝子のプロモーター領域を、それぞれ配列番号１〜９０に示す。
【００３７】
但し、本発明のプロモーターが環境ストレス応答性プロモーターとして機能する限り、配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列において１又は複数個、好ましくは１又は数個（例えば１〜10個、１〜５個）の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を有するものでもよい。さらに、配列番号１〜９０から選ばれるいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNAも、本発明のプロモーターに含まれる。
【００３８】
一旦本発明のプロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたプローブを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明のプロモーターを得ることができる。さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明のプロモーターの変異型であって変異前のプロモーターと同等の機能を有するものを合成することもできる。
【００３９】
なお、プロモーター配列に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００４０】
ここで、「環境ストレス応答性プロモーターとして機能する」とは、所定の環境ストレス条件下にプロモーターをさらしたときに、RNAポリメラーゼがプロモーターに結合し、転写開始させる機能をいう。
【００４１】
「環境ストレス」とは、一般には非生物的ストレスを意味し、例えば乾燥ストレス、低温ストレス、高塩濃度ストレス、強光ストレス等をいう。「乾燥」とは水分が欠乏した状態を意味し、「低温」とはそれぞれの生物種の生活至適温度よりも低い温度にさらされた状態（例えばシロイヌナズナの場合-20〜+21℃の温度を継続的に1時間〜数週間さらすことをいう。また、「高塩濃度」とは、50mM〜600mMの濃度のNaClを継続的に0.5時間〜数週間処理したときの状態を意味する。「強光ストレス」とは、光合成能を超える強光が植物に照射された状態を意味し、例えば5,000〜10,000Lx以上の光が照射した場合が該当する。これらの環境ストレスは、１種類のものを負荷してもよく、複数種類のものを負荷してもよい。
【００４２】
本発明の植物プロモーターは、配列番号１〜９０のいずれかの塩基配列において、これらの３'末端に翻訳効率を上げる塩基配列などを付加したものや、プロモーター活性を失うことなく、その５'末端を欠失したものを含む。  
【００４３】
さらに、本発明のプロモーターは、配列番号１〜９０のいずれかの塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ環境ストレス応答性プロモーターとして機能するDNAを含む。ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００４４】
２．発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、適当なベクターに本発明のプロモーターを連結(挿入)することにより得ることができる。本発明のプロモーターを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。
【００４５】
プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４６】
ベクターに本発明のプロモーターを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。  
【００４７】
本発明においては、任意遺伝子を発現させるため、上記発現ベクターに、さらに当該任意遺伝子を挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法は、ベクターにプロモーターを挿入する方法と同様である。任意の遺伝子は特に限定されるものではなく、例えば表２に示す遺伝子やそれ以外の既知の遺伝子等が挙げられる。
【００４８】
本発明のプロモーターは、その3'末端にレポーター遺伝子、例えば、植物で広く用いられているGUS遺伝子を連結して用いれば、GUS活性を調べることでプロモーターの強さを容易に評価することができる。なお、レポーター遺伝子としては、GUS遺伝子以外にも、ルシフェラーゼ、グリーンフルオレセイントプロテインなども用いることができる。
【００４９】
このように、本発明においては、様々なベクターを用いることができる。さらに、本発明のプロモーターに目的の任意遺伝子をセンス又はアンチセンス方向で接続したものを作製し、これをバイナリーベクターと呼ばれるpBI101(Clonetech社)などのベクターに挿入することができる。
【００５０】
３．形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プロモーター又は目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、植物が好ましい。宿主が植物である場合は、形質転換植物（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。
【００５１】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）
イネ科：トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativa)
マメ科：ダイズ(Glycine max)
【００５２】
上記組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって植物中に導入することができる。  
【００５３】
例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、遺伝子を宿主に導入する。
【００５４】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。
【００５５】
また、植物ウイルスをベクターとして利用することによって、目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。
【００５６】
アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。
【００５７】
Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたいDNAを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNAを植物ゲノム中に組込むことができる。
【００５８】
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００５９】
本発明のベクターは、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、本発明のプロモーター、リボソーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００６０】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。  
【００６１】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられ
る。
【００６２】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。  
【００６３】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００６４】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行われる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００６５】
４．植物の製造
本発明においては、上記形質転換植物細胞等から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。
【００６６】
本発明の「植物体を製造する方法」は、上記植物プロモーターを挿入した植物発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換植物細胞を得て、該形質転換植物細胞から形質転換植物体を再生し、得られた形質転換植物体から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産する工程を含む。
【００６７】
形質転換植物体から植物種子を得るには、例えば、形質転換植物体を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物体上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。このようにして育種された植物は、導入されたプロモーターのストレス応答性に応じた環境ストレス耐性植物となる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。  
【００６９】
〔実施例1〕  プロモーターの単離
１．材料と方法
(1) Arabidopsis cDNAクローン
Arabidopsisの全長cDNAライブラリーから単離した遺伝子に加えて、RD（Responsive to
Dehydration）遺伝子、ERD（Early Responsive to Dehydration）遺伝子、kin1遺伝子、kin2遺伝子、cor15a遺伝子、また内部標準としてα-tubulin遺伝子、さらにネガティブコ
ントロールとしてマウスのニコチン酸アセチルコリンレセプターのエプシロンサブユニット（nAChRE）遺伝子及びマウスのグルココルチコイドレセプターの相同性遺伝子の計約７０００個のcDNAをマイクロアレイ作成に用いた。
【００７０】
陽性対照：乾燥誘導遺伝子（脱水応答性：rd、及び初期脱水応答遺伝子：erd）
内部標準：α-チューブリン遺伝子
陰性対照：非特異的ハイブリダイゼーションを評価するためにArabidopsisのデータベースにある任意の配列とは実質的にホモロジーを有さないニコチン性アセチルコリン受容体εサブユニット(nAChRE)遺伝子及びマウスグルココルチコイド受容体ホモログ遺伝子
【００７１】
(2) Arabidopsis 全長cDNAマイクロアレイ
ビオチニル化CAPトラッパー法を用いて、本発明者はArabidopsisの植物体から、異なる条件（例えば、発芽から成熟種子までの種々の成長段階における乾燥処理、低温処理及び未処理）で全長cDNAライブラリーを構築した。全長cDNAライブラリーから、本発明者は、約７０００個の独立したArabidopsis全長cDNAをそれぞれ単離した。公知の手法（Eisen and Brown, 1999）に従って、PCRで増幅したcDNA断片をスライドグラス上の整列させた。本発明者は、以下の遺伝子を含む約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイを調製した。
【００７２】
(3) cDNAマイクロアレイを用いた乾燥誘導性遺伝子、低温誘導性遺伝子、高塩濃度誘導性遺伝子及びABA誘導性遺伝子の単離
本例では、約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイを用いて、乾燥誘導性遺伝子、低温誘導性遺伝子、高塩濃度誘導性遺伝子及びABA誘導性遺伝子を単離した。
【００７３】
上述した各種ストレスを受けた植物及びストレスを受けていない植物のCy3及びCy5蛍光標識プローブを混合し、約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。一方のmRNAサンプルをCy3-dUTPで標識し、他方のmRNAサンプルをCy5-dUTPで標識するcDNAプローブ対の二重標識によって、マイクロアレイ上のDNAエレメントへの同時ハイブリダイゼーションが可能となり、２種の異なる条件間(即ち、ストレス有り又はストレス無し)における遺伝子発現の直接的な定量測定が容易になる。ハイブリダイズさせたマイクロアレイを、各DNAエレメントからのCy3及びCy5発光について２つの別個のレーザーチャネルによって走査した。次いで、各DNAエレメントの２つの蛍光シグナルの強度比を相対値として測定し、マイクロアレイ上のcDNAスポットで表される遺伝子のディファレンシャル発現の変化を判定した。本実施例では、分析を行う２種の実験条件下で発現レベルがほぼ同等であるα-チューブリン遺伝子を内部対照遺伝子として使用した。  
【００７４】
約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイにおける、乾燥誘導性遺伝子、低温誘導性遺伝子、高塩濃度誘導性遺伝子及びABA誘導性遺伝子の同定手順を示す。
【００７５】
1)上述したストレスのうち１種類のストレスを負荷した植物由来のmRNA及びストレスを受けていない野生型植物由来のmRNAを、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNAプローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混合し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。本実施例では、２種の条件下で発現レベルがほぼ同等であるα-チューブリン遺伝子を内部対照遺伝子として使用した。発現比率(乾燥／ストレス無し、低温／ストレス無し、又は高塩濃度／ストレス無し)がα-チューブリンの２倍を超える遺伝子を、負荷したストレスによって誘導される遺伝子とした。
【００７６】
2)35S:DREB1Aトランスジェニック植物由来のmRNA及びストレスを受けていない野生型植物由来のmRNAを、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNAプローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混合し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。本実施例では、２種の条件下で発現レベルがほぼ同等であるα-チューブリン遺伝子を内部対照遺伝子として使用した。35S:DREB1Aトランスジェニック植物における発現レベルが、ストレスを受けていない野生型植物における発現レベルの２倍を超える遺伝子を、DREB1A標的遺伝子とした。
【００７７】
ストレス処理を行った植物由来のmRNA及びストレスを受けていない野生型植物由来のmRNAを、それぞれCy3-標識cDNAプローブ及びCy5-標識cDNAプローブの調製に使用した。これらのcDNAプローブを混合し、cDNAマイクロアレイとハイブリダイズさせた。マイクロアレイ分析の再現性を評価するため、同様の実験を３回繰り返した。なお、同じmRNAサンプルを様々なマイクロアレイとハイブリダイズさせたところ、良好な相関関係が認められた。発現比率(乾燥／ストレス無し、又は低温／ストレス無し)がα-チューブリン遺伝子の２倍を超える遺伝子を、負荷したストレスによって誘導される遺伝子とした。
【００７８】
(4) 配列の解析
遺伝子配列のホモロジー検索をおこなうため、Kurabo製プラスミド調製装置（NA 100）を用いて抽出したプラスミド DNAを配列解析に用いた。DNAシーケンサー（ABI PRISM 3700. PE Applied Biosystems, CA, USA）を用いてダイターミネーターサイクルシーケンス法によりDNA配列を決定した。GenBank/EMBLデータベースをもとに、BLASTプログラムを用いて配列のホモロジー検索を行った。
【００７９】
(5) cDNAの増幅
cDNAライブラリ作成用ベクターとして、λZAPII（Carninci et al.1996）を用いた。ライブラリー用のベクターに挿入されたcDNAを、cDNAの両側のベクターの配列と相補的なプライマーを用いてPCR法により増幅した。  
プライマーの配列は以下の通りである。
FL forward 1224：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA(配列番号９１)
FL reverse 1233：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA（配列番号９２）
【００８０】
100 μl のPCR混合液（0.25 mM dNTP，0.2 μM PCRプライマー，1 X Ex Taq バッファー，1.25 U Ex Taqポリメラーゼ （宝酒造製））に、テンプレートとしてプラスミド（1-2 ng）を加えた。PCRは、最初に94℃で3分反応させた後、続いて95℃で1分、60℃で30秒及び72℃で3分のサイクルを35サイクル、最後に72℃で3分の条件で行った。PCR産物をエタノール沈澱させた後、25μlの3 X SSCに溶かした。0.7%アガロースゲルを用いた電気泳動により、得られたDNAの質とPCRの増幅効率を確認した。
【００８１】
(6) cDNAマイクロアレイの作成
gene tipマイクロアレイスタンプマシンGTMASS SYSTEM（Nippon Laser & Electronics Lab.製）を使って、0.5μlのPCR産物（100-500 ng／ml）を384穴のマイクロタイタープレートからロードし、６枚のポリ-L-リジンでコートしたマイクロスライドガラス（Matsunami製，S7444）の上に280μmの間隔で5nlずつスポットした。DNAをより等しくスポットするために、プリント後のスライドを、熱した蒸留水を入れたビーカー内で湿らした後、100℃で3秒間乾燥させた。その後、スライドをスライドラックに置きスライドラックをガラスチャンバーに入れ、ブロッキング溶液（15mlの1 Mナトリウムホウ酸塩（pH8.0），5.5g
succinic無水化合物（Wako），及び335mlの1-メチル-2-ピロリドン（Wako）を含む）をガラスチャンバー注いだ。スライドラックを入れたガラスチャンバーを上下に5回振ってさらに15分間静かに震盪し、その後、熱湯を入れたガラスチャンバーにスライドラックを移して5回振った後、2分間静置した。さらにその後、スライドラックを95%エタノールを
入れたガラスチャンバーに移して5回振った後、30分間遠心（800rpm）した。
【００８２】
(7) 植物材料とRNAの単離
植物材料として、寒天培地に播種して3週間栽培した（Yamaguchi-ShinozakiとShinozaki，1994）野生型及びカリフラワーモザイクウイルスの35SプロモーターにDREB1AのcDNA（Kasugaなど，1999）をつないで導入したシロイヌナズナ（コロンビア種）の植物体を用いた。乾燥及び低温ストレス処理はYamaguchi-ShinozakiとShinozaki（1994）の方法で行った。すなわち、寒天培地から引き抜いた植物体をろ紙上に置き，22℃，相対湿度60%の条件で乾燥処理をおこなった。22℃で栽培した植物体を4℃に移すことにより低温処理をおこなった。また、高塩濃度ストレス処理は、250mMのNaClを含む水溶液内で水耕することによりおこなった。
【００８３】
野生型の植物体を2時間又は10時間のストレス処理にさらした後サンプリングし、液体窒素を用いて凍結保存した。また、カナマイシンを加えない寒天培地で栽培した野生型及びDREB1A過剰発現型形質転換体を、DREB1Aの標的遺伝子を同定するための実験に用いた。DREB1A過剰発現型形質転換体に対しては、ストレス処理を行わなかった。植物体から、ISOGEN（Nippon gene, Tokyo, Japan）を用いてトータルRNAを単離し、Oligotex-dT30 mRNA精製キット（Takara，Tokyo，Japan）を用いてmRNAを単離精製した。
【００８４】
(8) プローブの蛍光標識
Cy3 dUTP又はCy5 dUTP（Amersham Pharmacia）の存在下でそれぞれのmRNAサンプルの逆転写を行った。逆転写反応のバッファー（30μl）組成は表１の通りである。
【００８５】
【表１】
2004313197.tif 000002
【００８６】
42℃で1時間の反応を行った後、2つのサンプル（Cy3でラベルしたもの及びCy5でラベルしたもの）を混ぜ、15 μlの0.1 M NaOHと1.5 μlの20 mM EDTAを加えて70℃で10分間処理し、さらにその後15μlの0.1 M HClを加えた後、サンプルをMicro con 30 micro concentrator（Amicon）に移した。400μlのTEバッファーを加えてバッファー量が10〜20μlになるまで遠心し、流出液を捨てた。400μlのTEバッファーと20μlの1mg/ml ヒトCot-1 DNA (Gibco BRL)を加えて再び遠心した。ラベリングの完了したサンプルを遠心によって回収し数μlの蒸留水を加えた。得られたプローブに2μlの10μg/μl 酵母 tRNA 、2μlの1μg／μl pd（A）12-18（Amersham Pharmacia）、3.4mlの20 X SSC、及び0.6μlの10%SDSを加えた。さらに、サンプルを100℃で1分間変成処理し、室温に30分間置いた後ハイブリダイゼーションに用いた。
【００８７】
(9) マイクロアレイハイブリダイゼーション及びスキャニング
プローブをbenchtop micro centrifugeを用いて1分間の高速遠心にかけた。泡の発生を避けるために、プローブをアレイの中央に置きその上にカバースリップをかぶせた。スライドガラス上に5μlの3 X SSCを4滴落として、チェンバーを適度な湿度に保ち、ハイブリダイゼーション中のプローブの乾燥を防いだ。スライドガラスをハイブリダイゼーション
用のカセット（THC-1，BM機器）に入れて密封した後、65℃で12〜16時間処理した。スライドガラスを取り出してスライドラックに置き、溶液１（2 X SSC，0.1%SDS）中でカバースリップを慎重にはずした後ラックを振って洗浄し、ラックを溶液２（1 X SSC）中に移して2分間洗浄した。さらにラックを溶液３（0.2 X SSC）に移して2分間放置し、遠心（800rpm, 1min）にかけて乾燥させた。  
【００８８】
走査レーザー顕微鏡(ScanArray4000; GSI Lumonics，Watertown，MA)を用いて1ピクセルあたり10μmの解像度でマイクロアレイをスキャンした。マイクロアレイのデータ解析用プログラムとして、Imagene Ver 2.0（BioDiscovery）とQuantArray（GSI Lumonics）を用いた。
【００８９】
(10) ノーザン解析
トータルRNAを用いてノーザン解析を行った（Yamaguchi-ShinozakiとShinozaki，1994）。シロイヌナズナの全長cDNAライブラリーからPCR法によって単離したDNA断片をノーザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。
【００９０】
(11) プロモーター領域の決定
データベース（GenBank/EMBL, ABRC）のシロイヌナズナのゲノム情報をもとに、遺伝子解析用プログラムBLASTを用いてプロモーター領域を解析した。
【００９１】
２．結果
(1) ストレス誘導性遺伝子
ストレスを受けていないシロイヌナズナ植物から単離したmRNAから、Cy5-dUTPの存在下で逆転写を行って蛍光標識cDNAを調製した。低温処理(２時間)を行った植物から、Cy3-dUTPで標識した第２のプローブを調製した。両プローブを約７０００個のシロイヌナズナcDNAクローンを含むcDNAマイクロアレイへ同時にハイブリダイズさせた後、疑似カラー像を作成した。
【００９２】
ストレスによって誘導された遺伝子及び抑制された遺伝子は、それぞれ赤色及び緑色のシグナルで表される。両方の処理においてほぼ同レベルで発現した遺伝子は、黄色のシグナルとなる。各スポットの強度は、各遺伝子の発現量の絶対値に相当する。低温誘導性遺伝子(rd29A)は赤色のシグナルでとなり、α-チューブリン遺伝子(内部対照)は黄色シグナルとなる。
【００９３】
(2) プロモーター領域の同定
プロモーター領域を同定した結果、約７０００個のArabidopsisの全長cDNAを含有する全長cDNAマイクロアレイにおいて得られた９０種の遺伝子のプロモーター領域が得られた。これら９０種類の遺伝子名とそのプロモーターの配列を表２にまとめた。
【００９４】
【表２】
2004313197.tif 000003
【００９５】
(3) 各種ストレス処理時間と発現比率との関係
上述したように単離された９０種類の各種ストレス誘導性遺伝子について、以下のように、各種ストレス処理時間と発現比率との関係を検討した結果を図１〜図１０５に示す。なお、９０種類の遺伝子とストレス処理との関係を表３に示した。
【００９６】
【表３】
2004313197.tif 000004
2004313197.tif 000005
【００９７】
図１〜図１０５において、縦軸は遺伝子の発現比率を示しており、以下のように算出される。なお、下記式においてFIは、蛍光強度を示す。  
発現比率＝[（ストレス負荷条件での各cDNAのFI）/（ストレスを負荷しない条件での各cDNAのFI）]÷[(ストレス負荷条件でのα-チューブリンのFI)/(ストレスを負荷しない条件でのα-チューブリンのFI)]
これら図１〜図１０５に示すように、本方法により単離されたストレス誘導性遺伝子は、それぞれ異なるプロファイルであるが、各種ストレスの付加により発現誘導されていることが判る。このことから、これら９０個の遺伝子の上流に位置し、配列番号１〜９０で示される塩基配列は、ストレス応答性プロモーターとして機能していることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】FL03-07-F12について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２】FL04-12-F24について低温処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３】FL04-14-N10について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４】FL04-14-P24について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５】FL04-17-I03について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６】FL04-17-I03について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７】FL04-17-M08について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８】FL04-17-M22について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９】FL05-05-A17について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１０】FL05-05-F20について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１１】FL05-05-G20について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１２】FL05-09-N09について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１３】FL05-10-J09について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１４】FL05-10-J09について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１５】FL05-10-M08について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１６】FL05-11-H09について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１７】FL05-12-H13について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１８】FL05-12-H13について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１９】FL05-13-I20についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２０】FL05-14-E15について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２１】FL05-14-E16について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２２】FL05-14-E16について低温処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２３】FL05-14-E16についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２４】FL05-16-F03について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２５】FL05-16-F03についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２６】FL05-16-H23について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２７】FL05-16-H23について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２８】FL05-18-M07について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図２９】FL05-18-M07についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３０】FL05-18-O21についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３１】FL05-19-F21について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３２】FL05-19-F21についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３３】FL05-19-O22について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３４】FL05-19-O22について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３５】FL05-19-O22についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３６】FL05-21-K17について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３７】FL06-10-F03についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３８】FL06-12-H12について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図３９】FL06-12-H12について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４０】FL07-12-I23について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４１】FL08-08-H23について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４２】FL08-08-O14について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４３】FL08-09-M05について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４４】FL08-10-K08について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４５】FL08-11-P07について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４６】FL08-11-P07について低温処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４７】FL08-13-F10について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４８】FL08-13-F10について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図４９】FL08-13-F10についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５０】FL08-19-D04について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５１】FL08-19-G15について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５２】FL09-06-B11についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５３】FL09-07-G17についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５４】FL09-10-A12についてABA処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５５】FL09-13-P15について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５６】FL02-05-I05について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５７】FL04-12-N15について低温処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５８】FL04-16-P21について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図５９】FL04-17-N22について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６０】FL04-20-P19について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６１】FL02-09-H01について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６２】FL05-01-D08について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６３】FL05-02-G08について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６４】FL05-02-O17について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６５】FL05-07-L13について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６６】FL05-08-B14について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６７】FL05-09-N10について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６８】FL05-11-L01について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図６９】FL05-12-J09について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７０】FL05-14-D24について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７１】FL05-14-F20について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７２】FL05-14-I08について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７３】FL05-15-C04について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７４】FL05-15-E19について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７５】FL05-18-A06について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７６】FL05-18-H15について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７７】FL05-19-C02について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７８】FL05-20-M16について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図７９】FL05-20-N18について低温処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８０】FL05-21-E06について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８１】FL05-21-L12について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８２】FL06-07-B08について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８３】FL06-08-H20について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８４】FL06-09-N04について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８５】FL06-11-K21について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８６】FL07-07-G15について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８７】FL07-12-D17について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８８】FL08-11-C23について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図８９】FL08-13-G20について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９０】FL08-15-M21について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９１】FL08-18-N19について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９２】FL08-19-C07について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９３】FL08-19-P05について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９４】FL09-07-G09について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９５】FL09-07-G15について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９６】FL09-10-J18について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９７】FL09-11-I12について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９８】FL09-12-B03について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図９９】FL09-16-I11について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１００】FL09-16-M04について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１０１】FL11-01-J18について乾燥処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１０２】FL11-07-D13について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１０３】FL11-07-F02について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１０４】FL11-07-N15について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【図１０５】FL11-10-D10について高塩濃度処理時間と発現比率との関係を示す特性図である。
【配列表フリーテキスト】
【００９９】
配列番号９１及び９２は合成プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３９】
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【配列表】
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