(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＭＮ遺伝子の発現制御手段の提供。【解決手段】特定の塩基配列からなるスプライシング調節因子又はそのバリアントの核酸、該核酸を含有した核酸導入用担体、該核酸を用いるＳＭＮ遺伝子の発現制御方法、該核酸又は該核酸導入用担体を有効成分とする医薬組成物、並びに被験物質の存在下及び非存在下に、順に、ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６とＳＭＮ２遺伝子のエキソン７と特定の塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸を含有したＳＭＮ２遺伝子のイントロン７とが配置された核酸構築物が作動可能に結合されたエキソントラップベクター構築物を含む細胞を維持し、被験物質の存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量と、被験物質の非存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量とを測定する、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質の検索方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸。
【請求項２】
配列番号：１又は２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、請求項１記載の核酸のバリアントの核酸。
【請求項３】
バリアントが、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選ばれた塩基配列からなる、請求項２記載の核酸。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項記載の核酸を含有してなる、核酸導入用担体。
【請求項５】
下記ａ）又はｂ）の核酸：
ａ）配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸、又は
ｂ）配列番号：２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、前記ａ）の核酸のバリアントの核酸
の少なくとも１コピーを、染色体に組み込ませることを特徴とする、ＳＭＮ遺伝子の発現制御方法。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項記載の核酸又は請求項４記載の核酸導入用担体を有効成分として含有してなる、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項７】
（Ｉ）被験物質の存在下及び非存在下に、
下記（１）〜（３）：
（１）  ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６と
（２）  ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７と
（３）  配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸を含有したＳＭＮ２遺伝子のイントロン７と
からなり、かつ（１）−（２）−（３）の順に配置された核酸構築物が作動可能に結合されたエキソントラップベクター構築物を含む細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）において、被験物質の存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量と、被験物質の非存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量とを測定するステップ、
を含み、被験物質の存在により、非存在下に比べ、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物が増加することを指標とする、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＭＮ遺伝子の発現制御のための手段に関する。より詳しくは、本発明は、ＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうるスプライシング調節エレメントの核酸及び核酸導入用担体、ＳＭＮ遺伝子の発現制御方法、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬組成物、並びにＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脊髄性筋萎縮症は、常染色体性劣性疾患であり、最終的に、死に至らしめる近位の四肢及び体幹の筋の衰弱をもたらす脊髄における運動ニューロンの欠損を特徴とする。
【０００３】
前記脊髄性筋萎縮症の疾患原因と考えられる遺伝子として、ヒト第５染色体５ｑ１３座に局在するｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ（ＳＭＮ）遺伝子が見出されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
前記ＳＭＮ遺伝子は、ヒトにおいては、スプライシングにより、２種のアイソフォーム、すなわち、エキソン７を含まない「ＳＭＮΔエキソン７」と、エキソン７を含む「ＳＭＮ＋エキソン７」を生じることが知られている。前記エキソン７を含む「ＳＭＮ＋エキソン７」が存在しない場合、前記脊髄性筋萎縮症を発症すると考えられている。
【０００５】
前記脊髄性筋萎縮症の治療法の開発のために、例えば、酪酸塩（酢酸ナトリウム、酪酸アルギニン、酪酸等）、トラポクシン、トリコスタチンＡ等のヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いて、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７の発現を増加させること（特許文献１を参照のこと）、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７を含有したＤＮＡでトランスフェクトされた哺乳動物細胞に、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７の包含を制御する物質をさらし、エキソン７包含とエキソン７スキッピングの割合を調べることにより、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７包含を制御する物質を試験すること（特許文献２を参照のこと）、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７包含を制御する物質として、スプライシング調節因子Ｈｔｒａ２−ｂｅｔａ  １タンパク質をコードする核酸を、哺乳動物細胞にトランスフェクトし、それにより、エキソン７を含まないＳＭＮ２転写産物を減少させ、全長ＳＭＮ２発現をアップレギュレートさせること（前記特許文献２を参照のこと）等が試みられている。
【０００６】
しかしながら、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いる場合、ヒストンの脱アセチル化が阻害されヒストンが有するヌクレオソーム形成に影響を与えるため、細胞の分裂・増殖が障害される可能性があるという欠点がある。また、前記特許文献２に記載の方法によれば、Ｈｔｒａ２−ｂｅｔａ１は、各臓器・組織のすべての細胞で発現し、多くの遺伝子のスプライシングを制御しているため、過剰に発現させれば、Ｈｔｒａ２−ｂｅｔａ１がスプライシングを制御している他の遺伝子のスプライシングに影響を与える可能性があるという欠点がある。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−３３８５０２号公報、実施例４等
【特許文献２】
欧州特許公開第１  １３３  ９９３号明細書（ＥＰ  １  １３３  ９９３  Ａ１）
【非特許文献１】
レフェブレ（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｓ．）ら，Ｃｅｌｌ，第８０巻，第１５５頁−第１６５頁  １９９５年発行
【非特許文献２】
ロシェット（Ｒｏｃｈｅｔｔｅ，Ｃ．Ｔ．）ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，第１０８巻，第２５５頁−第２６６頁，２００１年発行
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させること、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させること、脊髄性筋萎縮症の発症の原因となるＳＭＮ１遺伝子の欠損又は該ＳＭＮ１遺伝子の変異による引き起こされるＳＭＮ１遺伝子産物の機能欠損を補うこと等の少なくとも１つを可能にする、ＳＭＮ遺伝子のスプライシング調節エレメントを有する核酸を提供することを目的とする。また、本発明は、前記スプライシング調節エレメントを有する核酸を、細胞に効率よく導入することができる、核酸導入用担体を提供することを目的とする。さらに、本発明は、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させること、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させること等を可能にする、ＳＭＮ遺伝子の発現制御方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患、特に、脊髄性筋萎縮症の発症を予防又は治療することができる、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、全長ＳＭＮ遺伝子の発現を増強させうる物質、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物の発現を増強させうる物質等を効率よくスクリーニングすることができる、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。なお、本発明の他の課題は、本明細書の記載及び全教示から明らかである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸、
〔２〕  配列番号：１又は２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、前記〔１〕記載の核酸のバリアントの核酸、
〔３〕  バリアントが、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４及び配列番号：２５からなる群より選ばれた塩基配列からなる、前記〔２〕記載の核酸、
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項記載の核酸を含有してなる、核酸導入用担体、
〔５〕  下記ａ）又はｂ）の核酸：
ａ）配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸、又は
ｂ）配列番号：２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、前記ａ）の核酸のバリアントの核酸
の少なくとも１コピーを、染色体に組み込ませることを特徴とする、ＳＭＮ遺伝子の発現制御方法、
〔６〕前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項記載の核酸又は前記〔４〕記載の核酸導入用担体を有効成分として含有してなる、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬組成物、
〔７〕  （Ｉ）被験物質の存在下及び非存在下に、
下記（１）〜（３）：
（１）  ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６と
（２）  ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７と
（３）  配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸を含有したＳＭＮ２遺伝子のイントロン７と
からなり、かつ（１）−（２）−（３）の順に配置された核酸構築物が作動可能に結合されたエキソントラップベクターを含む細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）において、被験物質の存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量と、被験物質の非存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量とを測定するステップ、
を含み、被験物質の存在により、非存在下に比べ、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物が増加することを指標とする、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニング方法、
に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のスプライシング調節エレメントの核酸は、配列番号：１に示される塩基配列（ＲＮＡ）又は配列番号：２に示される塩基配列（ＤＮＡ）からなることに１つの大きな特徴がある。本発明の核酸は、Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ（ＳＭＮ）遺伝子のシスエレメント（以下、エレメント２という）の配列のうち、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節する配列単位であり、ステム−ループ構造を形成する核酸である。
【００１１】
したがって、本発明の核酸によれば、エキソン７を含むＳＭＮ転写産物を生じさせるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸によれば、ＳＭＮ１遺伝子が欠損又は変異している場合であっても、スプライシングにより、ＳＭＮ２からエキソン７を含むＳＭＮ転写産物を生じさせうるという優れた効果を発揮する。
【００１２】
前記ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ（ＳＭＮ）遺伝子には、ＳＭＮ１遺伝子〔ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）  アクセッション番号：ＡＨ００６６３５〕と、該ＳＭＮ１遺伝子と数個のヌクレオチドが異なる塩基配列を有するＳＭＮ２遺伝子との２種のＳＭＮ遺伝子が存在することが知られている。
【００１３】
また、前記ＳＭＮ１遺伝子は、スプライシングにより、通常、エキソン１〜エキソン８までの全てのエキソンの転写産物を生じるが、前記ＳＭＮ２遺伝子は、オルタナティブスプライシングにより、エキソン７を含まない転写産物を生じるという性質を有する。さらに、前記ＳＭＮ２遺伝子の翻訳産物は、前記ＳＭＮ１遺伝子の翻訳産物の機能を補うことができないという性質を有する。したがって、本発明の核酸によれば、ＳＭＮ遺伝子又はＳＭＮ遺伝子の翻訳産物の本来の機能が欠損している場合、あるいは、ＳＭＮ１遺伝子が欠損又は変異している場合であっても、エキソン７を含むＳＭＮ転写産物を生じさせ、ＳＭＮ遺伝子の本来の機能を補うことができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の核酸によれば、エキソン７を含むＳＭＮ転写産物を生じさせることができるため、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患、具体的には、脊髄性筋萎縮症等の疾患の治療に用いられうる。
【００１４】
なお、自然界においては、天然の遺伝子において、自然発生的（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）に変異が起こって生じたバリアントであっても、該バリアントによりコードされる産物が、本来の機能を発揮する場合がある。したがって、本発明のスプライシング調節エレメントの核酸には、ＳＭＮ遺伝子のスプライシング、具体的には、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節、具体的には、正に調節するものであれば、配列番号：１又は２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、バリアントの核酸も含まれる。前記バリアントの核酸は、好ましくは、配列番号：１又は２に示される塩基配列と少なくとも１塩基、すなわち、１又は数個の塩基が、核酸多型を介して異なる塩基配列を有するものであり、ステム−ループ構造を形成する核酸であることが望ましい。
【００１５】
前記バリアントは、人為的に、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等により作製することもできる。
【００１６】
前記配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸のバリアントの塩基配列としては、ＳＭＮ遺伝子のスプライシング、具体的には、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節、具体的には、正に調節するものであればよく、具体的には、例えば、
配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸と中ストリンジェント、好ましくは、高ストリンジェントの条件下にハイブリダイズする核酸のアンチセンス鎖の塩基配列、
配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム〔例えば、ＢＬＡＳＴＮにおいて、期待値１０、ワードサイズ３、ギャップコスト（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）〕により、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上である塩基配列であって、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節、具体的には、正に調節するエレメント、好ましくは、ステム−ループを形成するエレメントの塩基配列であって、
配列番号：１の１位のＧ及び２位のＵが、それぞれ、Ａ及びＡに置換された塩基配列
配列番号：１の３位のＧ及び２０位のＧが、それぞれ、Ｕ及びＵに置換された塩基配列、
配列番号：１の２１位のＡ及び２２位のＡが、それぞれ、Ｕ及びＵに置換された塩基配列、
等が挙げられる。また、前記配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸のバリアントの塩基配列としては、ＳＭＮ遺伝子のスプライシング、具体的には、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節、具体的には、正に調節するものであればよく、具体的には、例えば、
配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸と中ストリンジェント、好ましくは、高ストリンジェントの条件下にハイブリダイズする核酸のアンチセンス鎖の塩基配列、
配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸に対し、ＢＬＡＳＴアルゴリズム〔例えば、ＢＬＡＳＴＮにおいて、期待値１０、ワードサイズ３、ギャップコスト（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１）〕により、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上である塩基配列であって、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節、具体的には、正に調節するエレメント、好ましくは、ステム−ループを形成するエレメントの塩基配列、
配列番号：２の１位のＧ及び２位のＴが、それぞれ、Ａ及びＡに置換された塩基配列
配列番号：２の３位のＧ及び２０位のＧが、それぞれ、Ｔ及びＴに置換された塩基配列、
配列番号：２の２１位のＡ及び２２位のＡが、それぞれ、Ｔ及びＴに置換された塩基配列、
等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、前記「中ストリンジェントな条件」とは、組成：６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と、５×デンハート（０．５％  ＦｉｃｏｌｌＴＭ、０．５％  ポリビニルピロリジン、０．５％  ウシ血清アルブミン）と、０．１％  ＳＤＳとを含む溶液中、配列番号：１又は２に示される塩基配列からなる核酸とともに３７℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジェントには、５０℃以上、よりストリンジェントには、６０℃以上、より一層ストリンジェントには、６５℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件により達成されうる。
【００１８】
前記バリアントとしては、より具体的には、例えば、配列番号：２１に示される塩基配列からなる核酸、配列番号：２２に示される塩基配列からなる核酸、配列番号：２３に示される塩基配列からなる核酸、配列番号：２４に示される塩基配列からなる核酸、配列番号：２５に示される塩基配列からなる核酸等が挙げられる。
【００１９】
なお、核酸が、ステム−ループ構造を形成するものであることは、ＭＦＯＬＤプログラム（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒ  Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）等の慣用のプログラムにより二次構造を解析することにより、評価されうる。
【００２０】
また、核酸が、ＳＭＮ遺伝子のスプライシング、具体的には、エキソン７を生じさせるスプライシングを調節、具体的には、正に調節するものであることは、
（１）  ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６と
（２）  ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７と
（３）  配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸を含有したＳＭＮ２遺伝子のイントロン７と
からなり、かつ（１）−（２）−（３）の順に配置された核酸構築物が作動可能に結合されたエキソントラップベクターを用いることにより評価されうる。具体的には、前記エキソントラップベクター中の前記（３）のイントロン７の塩基配列において、配列番号：２に示される塩基配列の領域を、被験対象の核酸と置換し、得られた構築物を、適切な宿主細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞等に、慣用の遺伝子導入方法により導入し、得られた細胞における前記（２）のエキソン７に対応する転写産物の存在を検出することにより評価されうる（「スプライシング能評価法」という）。
【００２１】
ここで、「エキソン７を生じさせるスプライシングを正に調節する」とは、エキソン７を包含した転写産物（エキソン７含有型）を生じるか、あるいは該転写産物の量を増大させるように、スプライシングを制御することを意味する。
【００２２】
前記エキソントラップベクターとしては、ＳＶ４０プロモーターを持ち、ＨＩＶ−ｔａｔ遺伝子の２つのエキソン間にクローニングサイトを有するベクターが挙げられ、具体的には、ｐＳＰＬ３ベクター〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕等が挙げられる。
【００２３】
前記（１）のイントロン６と、（２）のエキソン７と、（３）のイントロン７は、前記ジーンバンクアクセッション番号：ＡＨ００６６３５の配列に基づき得ることもできる。
【００２４】
前記核酸構築物は、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル  第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄｅｄ．，（１９８９）〕等に記載の慣用の遺伝子操作法により構築されうる。
【００２５】
なお、本発明においては、前記エキソントラップベクター構築物の他、適切なプロモーターの制御下に、ＳＭＮ遺伝子のエキソン６〜エキソン８までの領域のゲノム由来配列を含むプラスミドも用いられうる。かかる態様も本発明に含まれる。
【００２６】
エキソン７の検出は、細胞から抽出された全ＲＮＡを、エキソン７の塩基配列に基づいて作製されたプローブを用いたノーザンブロット解析、用いたベクターに特異的なプライマー対や該エキソン７に特異的なプライマー対を用いたＲＴ−ＰＣＲ解析等に供することより行なわれうる。なお、前記プローブ又はプライマー対は、かかる検出を容易にする標識物質（蛍光物質、放射性同位元素等）によりに標識されていてもよい。
【００２７】
前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、連続した１５ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、１８ヌクレオチド長以上であることが望ましい。前記プローブとしては、例えば、エキソン７の塩基配列からなる核酸又はそのアンチセンス鎖、前記エキソン７の塩基配列のうち、データベースの公知配列に存在しない塩基配列からなる核酸又はそのアンチセンス鎖、エキソン７の塩基配列中の連続した１５ヌクレオチド長以上の塩基配列を有する核酸又はそのアンチセンス鎖等が挙げられる。
【００２８】
また、プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、１５〜４０ヌクレオチド長であり、好ましくは、１７〜３０ヌクレオチド長であることが望ましい。
【００２９】
前記プローブ又はプライマーに適した配列は、例えば、Ｔｍ値等、公知配列、核酸の二次構造の形成等を考慮し、プローブ及び／又はプライマーのデザインを支援する慣用のソフトウェアなどにより得られうる。
【００３０】
本発明の核酸は、前記塩基配列を有するため、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させることができ、ＳＭＮ１遺伝子が欠損又は変異して機能欠損を起こしている場合であっても、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させることができ、脊髄性筋萎縮症の発症の原因となるＳＭＮ１遺伝子の欠損又は該ＳＭＮ１遺伝子の変異による引き起こされるＳＭＮ１遺伝子産物の機能欠損を補うことができる。
【００３１】
また、本発明の核酸は、細胞に導入可能な担体に組み込むこと又は保持させることにより得られた核酸導入用担体により、より効率よく細胞等に導入することができる。したがって、かかる核酸導入用担体も本発明に含まれる。
【００３２】
本発明の核酸導入用担体は、本発明の核酸を含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の核酸導入用担体は、前記塩基配列を有するため、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の核酸導入用担体は、前記塩基配列を有するため、ＳＭＮ１遺伝子が欠損又は変異して機能欠損を起こしている場合であっても、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させることができる。さらに、本発明の核酸導入用担体は、前記塩基配列を有するため、脊髄性筋萎縮症の発症の原因となるＳＭＮ１遺伝子の欠損又は該ＳＭＮ１遺伝子の変異による引き起こされるＳＭＮ１遺伝子産物の機能欠損を補うことができるという優れた効果を発揮する。
【００３３】
また、本発明の核酸導入用担体は、本発明の核酸を含有し、かつ該核酸が、細胞に導入可能な担体に組み込まれていること又は保持されていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の核酸導入用担体によれば、本発明の核酸を、より効率よく、細胞等に導入することができ、さらに、より効率よく染色体上のターゲティング部位（例えば、ＳＭＮ遺伝子のイントロン７等）に組み込むことができるという優れた効果を発揮する。
【００３４】
前記「細胞に導入可能な担体」としては、例えば、導入対象となる細胞等に適したベクター、金粒子、リポソーム等が挙げられる
【００３５】
ベクターとしては、例えば、宿主細胞中で機能するプロモーター〔例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター等〕を含む哺乳動物細胞用のベクター（レトロウイルス系ベクター、セムリキフォレストウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）等が挙げられる。
【００３６】
なお、本発明の核酸導入用担体には、染色体上のターゲティング部位（例えば、染色体上のＳＭＮ遺伝子のイントロン７等）との相同組換えを可能にする配置で、本発明の核酸と、相同組換えに適した配列からなる核酸とが配置された核酸構築物も含まれる。なお、前記核酸構築物は、さらに、前記「細胞に導入可能な担体」に組み込み、又は保持させてもよい。
【００３７】
前記細胞としては、例えば、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＳＹ−５Ｙ細胞、ヒト初代培養神経細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞等が挙げられる。
【００３８】
前記「相同組換えを可能にする配置」としては、特に限定されないが、順に、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７と、
ＳＭＮ遺伝子のイントロン７上に下記ａ）又はｂ）の核酸：
ａ）配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸、又は
ｂ）配列番号：２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、前記ａ）の核酸のバリアントの核酸
の少なくとも１コピーを有する核酸と
ＳＭＮ遺伝子のエキソン８と
を有する配置等が挙げられる。
【００３９】
本発明の核酸及び本発明の核酸導入用担体によれば、ＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節することができ、ＳＭＮ遺伝子の発現制御方法が提供される。
【００４０】
本発明のＳＭＮ遺伝子の発現制御方法は、本発明の核酸を染色体に組み込ませることを１つの大きな特徴とする。したがって、本発明の発現制御方法によれば、本発明の核酸を染色体上のターゲティング部位（すなわち、ＳＭＮ遺伝子のイントロン７）に組み込むため、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させることができ、また、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させることができるという優れた効果が発揮される。
【００４１】
本発明の発現制御方法としては、下記ａ）又はｂ）の核酸：
ａ）配列番号：２に示される塩基配列からなる核酸、又は
ｂ）配列番号：２に示される塩基配列とは、核酸多型を介して異なる塩基配列からなり、かつＳＭＮ遺伝子のスプライシングを調節しうる、前記ａ）の核酸のバリアントの核酸
の少なくとも１コピーを、染色体に組み込ませることを特徴とする、ＳＭＮ遺伝子の発現制御方法が挙げられ、具体的には、
（Ａ）本発明の核酸又は核酸導入用担体を、細胞に導入するステップ、及び
（Ｂ）ステップ（Ａ）で得られた細胞を、スプライシングが行なわれるに適した条件下に維持するステップ
を含む方法等が挙げられる。
【００４２】
なお、本発明のＳＭＮ遺伝子の発現制御方法は、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患、特に、脊髄性筋萎縮症に罹患した個体、発症の可能性がある個体に対して、適用することにより、該疾患の発症の予防又は治療を行なうことができる。
【００４３】
前記ステップ（Ａ）においては、本発明の核酸が、相同組換えにより、ターゲティング部位（すなわち、ＳＭＮ遺伝子のイントロン７）に、効率よく組み込ませる観点から、好ましくは、染色体上のターゲティング部位（例えば、染色体上のＳＭＮ遺伝子のイントロン７等）との相同組換えを可能にする配置で、本発明の核酸と、相同組換えに適した配列からなる核酸とが配置された核酸構築物である核酸導入用担体又は前記核酸構築物を前記「細胞に導入可能な担体」に組み込みこと若しくは保持させることにより得られた核酸導入用担体を用いることが望ましい。
【００４４】
前記細胞としては、例えば、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＳＹ−５Ｙ細胞、ヒト初代培養神経細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞等が挙げられる。なお、前記細胞は、培養細胞であってもよく、個体（ヒト、非ヒト哺乳動物等）の細胞であってもよい。
【００４５】
本発明の核酸又は核酸導入用担体の使用量は、核酸の量として、１００ｎｇ以上であり、好ましくは、１μｇ以上であり、より好ましくは、１０μｇ以上であることが望ましく、１０００μｇ以下であり、好ましくは、１００μｇ以下であり、より好ましくは２０μｇ以下であることが望ましい。
【００４６】
培養細胞細胞への本発明の核酸又は核酸導入用担体の導入法としては、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リン酸カルシウム法、金粒子を用いた遺伝子銃による直接導入法、リポフェクション法等が挙げられる。また、個体への本発明の核酸又は核酸導入用担体の導入法としては、ウイルスベクターやリポソームを介して、直接個体の体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、個体から、ある種の細胞を取り出し、該細胞に対して、前記培養細胞への導入法の例のように、体外で本発明の核酸又は核酸導入用担体を導入し、得られた細胞を体内に戻すというｅｘ  ｖｉｖｏ法等が挙げられる。
【００４７】
ついで、前記ステップ（Ｂ）において、本発明の核酸又は本発明の核酸導入用担体が導入された細胞は、細胞内でスプライシングが行なわれるように維持される。
【００４８】
ここで、細胞が、培養細胞である場合、細胞に応じた培養条件下で該細胞を維持することにより、スプライシングが行われる。また、個体の細胞に直接的に導入する場合には、個体の通常の活動を維持することにより、スプライシングが行なわれる。
【００４９】
本発明の発現制御方法においては、細胞からｍＲＮＡを単離し、エキソン７に対応する転写産物の存在をＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析等で検出すること等により、ＳＭＮ遺伝子の発現制御、具体的には、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシングが評価されうる。
【００５０】
また、本発明の核酸及び核酸導入用担体によれば、前記したように、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させることができるため、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患の予防又は治療のための医薬組成物を提供することができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、本発明の核酸及び核酸導入用担体を有効成分として含有することに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の医薬組成物は、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させること、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させること、脊髄性筋萎縮症の発症の原因となるＳＭＮ１遺伝子の欠損又は該ＳＭＮ１遺伝子の変異による引き起こされるＳＭＮ１遺伝子産物の機能欠損を補うこと等が可能になるため、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患、特に、脊髄性筋萎縮症の発症を予防又は治療することができるという優れた効果を発揮する。
【００５２】
本発明の医薬組成物中の有効成分の含有量は、治療目的の疾患及びその病状の程度、患者の年齢、体重等に応じて適宜設定されうるが、例えば、本発明の核酸の量として、薬効が期待できる投与量の観点から、０．１ｇ以上、好ましくは、１．０ｇ以上、より好ましくは、数ｇ以上であり、１００ｇ以下、好ましくは、３０ｇ以下、より好ましくは、１０ｇ以下であることが望ましい。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、前記有効成分に加え、核酸を安定に保持しうる助剤（例えば、緩衝液）、投与形態に応じた慣用の助剤等を適宜含有していてもよい。
【００５４】
本発明の医薬組成物の投与は、例えば、本発明の発現制御方法における個体への本発明の核酸又は核酸導入用担体の導入法と同様に行なわれうる。具体的には、例えば、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合、ウイルスベクター、リポソーム等を介して、投与対象の組織、器官等に応じて、静脈投与、動脈投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、局所投与等が行なわれうる。また、前記ｅｘ  ｖｉｖｏ法により行なう場合、１）個体より細胞を取り出し、２）該細胞に本発明の医薬組成物を、前記ｉｎ  ｖｉｖｏ法により導入し、３）再度、細胞を個体の体内に戻すことにより行なわれる。
【００５５】
本発明の医薬組成物の薬理評価は、前記スプライシング能評価法を行ない、ＳＭＮ遺伝子の転写産物にエキソン７が包含されていることを確認すること等により行なわれうる。
【００５６】
また、本発明の核酸の動態及び／又はスプライシング能を指標として、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質をスクリーニングすることができる。すなわち、前記スプライシング能評価法は、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニングに適用されうる。本発明には、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニング方法も含まれる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法は、（Ｉ）被験物質の存在下及び非存在下に、下記（１）〜（３）：
（１）  ＳＭＮ２遺伝子のイントロン６と
（２）  ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７と
（３）  配列番号：１又は２に示される塩基配列からなるスプライシング調節エレメントの核酸を含有したＳＭＮ２遺伝子のイントロン７と
からなり、かつ（１）−（２）−（３）の順に配置された核酸構築物が作動可能に結合されたエキソントラップベクターを含む細胞を維持するステップ、及び
（ＩＩ）前記ステップ（Ｉ）において被験物質の存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量と、前記ステップ（Ｉ）において被験物質の非存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量とを測定するステップ、
を含み、被験物質の存在により、非存在下に比べ、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物が増加することを指標とする方法である。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法は、前記核酸構築物を用いることに１つの大きな特徴がある。本発明のスクリーニング方法は、前記核酸構築物を用いるため、本発明の核酸のスプライシング能に作用する物質を効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明のスクリーニング方法は、前記核酸構築物を用いることにより、本発明の核酸のスプライシング能を指標として評価するため、全長ＳＭＮ遺伝子の発現を増強させうる物質、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物の発現を増強させうる物質等を効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞は、前記スプライシング能評価法に用いられるものと同様である。
【００６０】
被験物質としては、例えば、低分子又は高分子の有機化合物、微生物代謝産物等が挙げられる。
【００６１】
前記ステップ（Ｉ）は、被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、前記細胞を維持することにより行なわれうる。ここで、前記培地は、細胞に応じたものが挙げられ、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、α−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０等が挙げられる。
【００６２】
ついで、ステップ（Ｉ）において被験物質の存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量と、前記ステップ（Ｉ）において被験物質の非存在下に得られた細胞中におけるＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物の量とを測定する〔ステップ（ＩＩ）〕。
【００６３】
ステップ（ＩＩ）において、転写産物は、慣用の方法により、ステップ（Ｉ）で得られた細胞から、全ＲＮＡを得、得られた全ＲＮＡについて、前記スプライシング能評価法と同様のプローブ又はプライマー対を用い、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより測定されうる。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法においては、被験物質の存在により、非存在下に比べ、ＳＭＮ２遺伝子のエキソン７に対応する転写産物が増加することが、該被験物質が、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質であることの指標となる。
【００６５】
また、本発明の核酸に結合する物質は、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシングを調節することが期待される。したがって、本発明の核酸により、本発明の核酸に結合する物質、特に、スプライシング能を調節する物質、例えば、結合タンパク質、そのミメティクス、化合物等をスクリーニングすることもできる。この場合、１）本発明の核酸と被験物質（タンパク質含有試料、細胞抽出物等）との結合の有無を検出し、
２）該核酸に結合した被験物質と、前記核酸構築物とが導入された細胞を得、
３）細胞内におけるＳＭＮ遺伝子のエキソン７に対応する転写産物を測定することにより、被験物質が、本発明の核酸に結合し、スプライシング能を調節する物質であるかどうかを評価することができる。なお、対照として、被験物質が導入されていないが、前記核酸構築物が導入された細胞が用いられる。
【００６６】
結合の有無は、ゲル移動度シフトアッセイ、共鳴プラズモン相互作用解析等の慣用の方法により検出できる。
【００６７】
ついで、被験試料から、結合した物質を単離し、その構造（例えば、アミノ酸配列等）を同定する。
【００６８】
その後、得られた構造の情報を基に、該核酸に結合した被験物質と、前記核酸構築物とが導入された細胞を得る。
【００６９】
なお、本発明においては、前記エキソントラップベクター構築物を用いる代わりに、適切なプロモーターの制御下に、ＳＭＮ遺伝子のエキソン６〜エキソン８までの領域のゲノム由来配列を含むプラスミドも用いられうる。かかる態様も本発明に含まれる。
【００７０】
さらに、本発明においては、前記エキソントラップベクター構築物を用いる代わりに、ＳＭＮ遺伝子のエキソン６〜エキソン８までの領域のゲノム由来配列を有するミニジーンをｐｒｅ−ｍＲＮＡとして転写させ、得られた産物を、試験管内で核抽出液若しくは転写系と反応させ、電気泳動等により解析することにより、ＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質をスクリーニングすることもできる。かかる態様も本発明に含まれる。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明を、下記実施例により、具体的に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。また、下記実施例において、培地の組成は、特に明記しない限り、「分子細胞生物学基礎実験法」  第５０頁〜第５１頁、１９９４年９月１日発行、発行所：株式会社  南江堂、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル  第２版〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，（１９８９）〕等の記載に基づく。
【００７２】
実施例１
ＳＭＮ遺伝子について、イン・ビボでのスプライシングを調べるため、ｐＣＩ哺乳動物発現ベクター中エキソン６からエキソン８の領域を含むＳＭＮ１  ミニジーンの構築物及びｐＣＩ哺乳動物発現ベクター中エキソン６からエキソン８を含むＳＭＮ２  ミニジーンの構築物〔エリオット  アンドロフィー（Ｅｌｌｉｏｔ  Ａｎｄｒｏｐｈｙ）博士（Ｔｕｆｔｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）及びクリスチャン  ローソン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｌｏｒｓｏｎ）博士より贈与された〕を用いた。
【００７３】
また、ｐＣＩベクター中ＳＭＮ１  エキソン６からエキソン８の領域を含み、かつエキソン７中にＣからＴへの転位を含むミニジーンの構築物について、部位特異的変異導入方法によりエレメント１に変異導入することにより作製した。
【００７４】
前記構築物のトランスフェクションには、ＣＯＳ−７細胞又はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いた。前記ＣＯＳ−７細胞の培養は、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）上、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で行ない、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の培養は、１０％  ＦＢＳを含むα−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）上、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で行なった。前記細胞を、３．５ｃｍディッシュ上、６０〜８０％コンフルエンシーの密度で播種した。
【００７５】
ついで、商品名：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ｒｅａｇｅｎｔ又は商品名：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＡＣＥ  ｒｅａｇｅｎｔ〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕を用い、製造者のプロトコールに従い、前記構築物（１．０μｇ相当量）を、ＣＯＳ−７細胞又はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にトランスフェクトした。
【００７６】
得られたトランスフェクト細胞を、緩衝液ＲＬＴ〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕に溶解させ、得られた溶解物から、商品名：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用いて、全ＲＮＡを単離した。
【００７７】
得られた全ＲＮＡと、ランダムプライマー（タカラバイオ社製）と、ＭＭＬＶ逆転写酵素〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕とを、２０μｌの反応液〔組成：２．７μＭ  ランダムプライマー  Ｈｅｘａ−デオキシリボヌクレオチドミクスチャー（タカラバイオ社製）、０．５ｍＭｄＮＴＰミクスチャー、１２．５ｍＭ  ＤＴＴ、５×第１鎖緩衝液、２００ＵＭ−ＨＬＶ逆転写酵素）中、３７℃で、６０分間反応させることにより、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００７８】
ついで、前記構築物から生成した前記第１鎖ｃＤＮＡ  １．２μｇと、各０．４μＭのｐＣＩフォワードプライマー〔５’−ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＴＣ−３’  （配列番号：３）〕とｐＣＩリバースプライマー〔５’−ＧＴＡ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＴＣＧ−３’（配列番号：４）〕とからなるプライマー対と、微量の［α−３２Ｐ］  ｄＮＴＰを含む０．２μＭ  ｄＮＴＰと、５Ｕ  ｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼと１０×ＰＣＲ緩衝液（タカラバイオ社製）とを含む全量５０μｌの反応液で、ＰＣＲを行ない、イン・ビボでのスプライシングを調べた。
【００７９】
なお、増幅条件は、９４℃、２分間のインキュベーションによる開始変性ステップの後、９４℃、３０秒間と５６℃、１．５分間と７２℃、１分間とを１サイクルとする３０サイクルの反応ステップを行ない、その後、７２℃、１０分間の最終伸長ステップを行なう条件とした。
【００８０】
得られた反応産物を、５％  ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により、分離した。各バンドの強度の定量化を、商品名：Ｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ〔アトー株式会社製〕を用いて行なった。エキソン７含有型の割合を、全バンドの強度に対するエキソン７含有型の強度の割合として定量化し、表わした。その結果を図１に示す。
【００８１】
その結果、図１に示されるように、エキソン６からエキソン８の領域を含むＳＭＮ１ミニジーン構築物及びＳＭＮ２ミニジーン構築物それぞれの一過性トランスフェクションにより、ＳＭＮ１  ｍＲＮＡは、全長転写産物を発現するが、ＳＭＮ２は、低レベルの全長転写産物と高レベルのエキソン７欠損アイソフォーム（ＳＭＮΔ７）とを産生することが確認された。
【００８２】
また、図１に示されるように、ＳＭＮ１のエキソン７内の６ヌクレオチドに存在するＣからＴへの置換は、エキソン７の排除をもたらし、エキソン７のスプライシングパターンは、野生型ＳＭＮ２のエキソン７に似ていることがわかった。対照的に、変異体ＳＭＮ２（ＳＭＮ２におけるＴからＣへの置換）ミニジーンは、全長ＳＭＮ転写産物を産生することがわかった。
【００８３】
実施例２
ＳＭＮ  エキソン７のスキッピングに応答しうるシス作用エレメントを決定するために、エキソン７と隣接イントロン６及び隣接イントロン７とを含む野生型ＳＭＮ１ミニジーンと変異体ＳＭＮ１（エキソン７におけるＣからＴへの転位）ミニジーンとの両方の種々の欠失変異体を構築し、これらをエキソントラップベクター  ｐＳＰＬ３にクローン化した。かかる欠失変異体の模式図を図２に示す。
【００８４】
イントロン６とエキソン７とイントロン７とを含むＳＭＮ１の種々の欠失変異体を、下記プライマー対：
Ｉ７ＤＭ１について、６００Ｆｗｄプライマー〔５’−ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＡＣ−３’（配列番号：５）〕とＯＲプライマー〔５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＧＴＡ  Ｇ−３’（配列番号：６）〕とからなるプライマー対；
Ｉ７ＤＭ２について、前記６００ＦｗｄプライマーとＯＲ−ＩＲプライマー〔５’−ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  Ｔ−３’（配列番号：７）〕とからなるプライマー対；
Ｉ７ＤＭ３について、前記６００ＦｗｄプライマーとＤＲ−１１Ｒプライマー〔５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣ−３’（配列番号：８）〕とからなるプライマー対；
Ｉ７ＤＭ４について、前記６００ＦｗｄプライマーとＩＲプライマー〔５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＡＣ−３’（配列番号：９）〕を用いたＰＣＲにより作製した。
【００８５】
なお、エキソン７上に転位を含まない野生型ＳＭＮ１から構築された欠失変異体を、それぞれ、Ｉ７ＤＭ１−Ｃ、Ｉ７ＤＭ１−Ｃ、Ｉ７ＤＭ１−Ｃ及びＩ７ＤＭ１−Ｃと表記し、エキソン７上にＣからＴへの転位を含む変異体ＳＭＮ１から構築された欠失変異体を、それぞれ、Ｉ７ＤＭ１−Ｔ、Ｉ７ＤＭ１−Ｔ、Ｉ７ＤＭ１−Ｔ及びＩ７ＤＭ１−Ｔと表記する場合がある。
【００８６】
ついで、得られた各ＰＣＲ産物を、Ｎｏｔ  ＩとＢａｍＨ  Ｉとで消化し、得られた産物を、エキソントラップベクターｐＳＰＬ３〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕に挿入した。
【００８７】
得られたＰＣＲ産物を、商品名：ＢＫＬキット（タカラバイオ社製）を用い、エキソントラップベクターｐＳＰＬ３〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製〕に連結させた。なお、実験前、得られた構築物全てについて、シークエンスした。
【００８８】
前記構築物を用いて、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションして、２４時間後のトランスフェクトＣＯＳ−７細胞から、商品名：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用いて、全ＲＮＡを単離した。
【００８９】
ついで、得られた全ＲＮＡ（３．０μｇ相当量）を、ＳＡ２プライマー〔５’−ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＧＴＧ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧＣ−３’（配列番号：１０）〕と、ＭＭＬＶ逆転写酵素〔ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）〕とを用いて、逆転写させ、スプライシング産物を得た。
【００９０】
逆転写反応により生じたスプライシング産物を、ｐＳＰＬ３ベクター特異的プライマー対、ＳＤ６プライマー〔５’−ＴＣＴ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＣＣ−３’（配列番号：１１）〕及び前記ＳＡ２プライマーを用いたＰＣＲにより検出した。なお、ＰＣＲは、全量４０μｌの反応液〔組成：１．５μｌ  ＲＴ産物、１．０μＭ  ＳＤ６プライマー、１．０ｍＭ  ＳＡ２プライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミクスチャー、１０×ＰＣＲ緩衝液、５Ｕ  ｒＴａｑ（タカラバイオ社製）〕で行なった。増幅は、９４℃で１分間と６０℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった後、７２℃で５分間インキュベーションすることにより行なった。
【００９１】
得られたＰＣＲ産物を５％  ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。
【００９２】
その結果、図３の上部パネルに示されるように、野生型ＳＭＮ１（Ｃ）に関するの種々の欠失変異体をＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした場合、全構築物が、ＳＭＮ  エキソン７を含む全長型のｍＲＮＡ（＋エキソン７）を発現したが、エキソン７を欠損したアイソフォームは発現しなかった。
【００９３】
対照的に、図３の下部パネルに示されるように、ＳＭＮ１  エキソン７におけるＣからＴへの転位と２３５ｂｐの隣接イントロン６と１２４ｂｐの隣接イントロン７とを含む変異体ＳＭＮ１の最長構築物（Ｉ７ＤＭ１）は、エキソン７の含有型及び排除の両方を有するｍＲＮＡ（５１％含有型）を発現した。
【００９４】
図３の下部パネル（Ｉ７ＤＭ１）に示されるように、エキソントラップベクターにクローン化されたエキソン６からエキソン８を含むＣからＴへの転位ミニジーンを用いたエキソン含有型の割合は、ｐＣＩベクターにクローン化されたエキソン６からエキソン８の領域を含むＳＭＮミニジーンを用いたエキソン含有型の割合よりも高かった。かかる差異は、エキソントラップベクターにクローン化されたミニジーンの配列（約４００ｂｐ）とは異なる領域におけるＳＭＮ  エキソン７のスプライシングを調節するいくつかのシス作用エレメントが存在するであろうことを示す。しかしながら、エキソントラップベクターｐＳＰＬ３にクローン化されたＳＭＮ１  エキソン７におけるＣからＴへの転位を含むミニジーンが、エキソン７の排除の顕著な増加を示したので、これらの構築物が、４００ｂｐミニジーンにおけるエキソン７の排除に応答しうるシスエレメントを決定するのに有用であると思われる。
【００９５】
隣接イントロンにおける欠失変異体について、図１に示されるように、Ｉ７ＤＭ１−Ｔの３’隣接領域の６６ｂｐの欠失を含む欠失変異体Ｉ７ＤＭ４−Ｔは、ＳＭＮ  エキソン７の排除を増加した（２３％含有型）が、Ｉ７ＤＭ１−Ｔの５２ｂｐの欠失を含む変異体Ｉ７ＤＭ３−Ｔの欠失のスプライシングパターンは、Ｉ７ＤＭ１−Ｔのものと似ていた。
【００９６】
したがって、隣接イントロン７の＋５９〜＋７２の１４ｂｐ領域は、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ  エキソンの含有型の重要なエレメントであることが示唆される。
【００９７】
イントロン７内の前記エレメント２の位置を、図４に示す。また、図４に示されるように、ＭＦＯＬＤプログラム  ＧＣＧバージョンによる高次構造の解析により、２４ヌクレオチドから構成されるエレメント２（配列番号：１）が、特有のステム−ループ構造を有することがわかった。さらに、前記配列は、ＳＭＮ１とＳＭＮ２との間で完全な適合を示し、エレメント２が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ１  エキソン７及び野生型ＳＭＮ２のスプライシングの調節に重要であることが示唆された。
【００９８】
実施例３
エレメント２におけるステム−ループ構造が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮエキソン７のスプライシングの調節に重要であるかどうかを決定するため、Ｉ７ＤＭ１−Ｔのエレメント２におけるステム−ループ構造に種々の変異を導入した。
【００９９】
ステム−ループ構造の変異は、Ｉ７ＤＭ１−Ｔ  エキソントラップベクターを鋳型とし、変異導入用ヌクレオチド〔５’−ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＡＡＣ  ＡＴＴ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号：１２）及び５’−ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＴＡ−３’（配列番号：１３）〕を用いたＰＣＲにより生じさせた。
【０１００】
前記構築物を用いて、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションして、２４時間後のトランスフェクトＣＯＳ−７細胞から、商品名：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用いて、全ＲＮＡを単離した。
【０１０１】
ついで、得られた全ＲＮＡ（３．０μｇ相当量）を、ＳＡ２プライマーと、ＭＭＬＶ逆転写酵素〔ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）〕とを用いて、逆転写させ、スプライシング産物を得た。
【０１０２】
逆転写反応により生じたスプライシング産物を、ｐＳＰＬ３ベクター特異的プライマー対、前記ＳＤ６及び前記ＳＡ２を用いたＰＣＲにより検出した。なお、ＰＣＲは、全量４０μｌの反応液〔組成：１．５μｌ  ＲＴ産物、１．０μＭ  ＳＤ６プライマー、１．０ｍＭ  ＳＡ２プライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミクスチャー、１０×ＰＣＲ緩衝液、５Ｕ  ｒＴａｑ（タカラバイオ社製）〕で行なった。増幅は、９４℃で１分間と６０℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった後、７２℃で５分間インキュベーションすることにより行なった。
【０１０３】
得られたＰＣＲ産物を５％  ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。
【０１０４】
その結果、図５のパネル（Ｂ）に示されるように、図５のパネル（Ａ）の構築物Ａ及び構築物Ｂを用いた結果から、ループ領域の変異又は欠失は、エキソン７のスプライシングに影響を与えず、エレメント２のループは、スプライシング調節に重要でないことが示唆された。
【０１０５】
対照的に、ステム構造の破壊は、図５のパネル（Ｂ）に示されるように、図５のパネル（Ａ）の構築物Ｃ及び構築物Ｄを用いた結果、Ｉ７ＤＭ１−Ｔの元の構造に比べ、エキソン７含有型の顕著な減少を引き起こし、エキソン７含有型の減少に対する影響は、欠失変異体Ｉ７ＤＭ４−Ｔのものと似ていたため、ステム構造が、エレメント２の活性に重要であることがわかった。
【０１０６】
さらに、ステム構造におけるＧからＣへの点変異は、図５のパネル（Ｂ）に示されるように、図５のパネル（Ａ）の構築物Ｅを用いた結果、エキソン７  含有型の劇的な減少を引き起こしたため、ステム構造におけるＣ−Ｇ塩基対がエレメント２のスプライシング活性にも重要であることがわかった。一方、図５のパネル（Ｂ）に示されるように、図５のパネル（Ａ）の構築物Ｆを用いた結果、ステム構造におけるＡ−Ｕ塩基対がＧ−Ｃ塩基対に置換された場合、エキソン７の含有型を、わずかに減少した。
【０１０７】
かかる知見より、エレメント２の高次ステム構造が重要であるが、Ａ−Ｕ塩基対の配列がそれほど重要でないことが示唆される。
【０１０８】
実施例４
エレメント２が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ  エキソン７のスプライシングを活性化するかどうかを試験するため、Ｉ７ＤＭ１−Ｔベクター中エレメント２のタンデムリピート（３リピート又は４リピート）を含む構築物〔図６のパネル（Ａ）中、エレメント２ｘ３及びエレメント２ｘ４と表記〕を、Ｉ７ＤＭ１ーＴベクターと変異導入用ヌクレオチド〔５’−ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＴＧＡ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＴＴＣ−３’（配列番号：１４）及び５’−ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＡＧＡ  ＴＴＣ  ＡＣ−３’（配列番号：１５）〕を用いたＰＣＲにより作製した。
【０１０９】
前記構築物を用いて、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションして、２４時間後のトランスフェクトＣＯＳ−７細胞から、商品名：ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ〔キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用いて、全ＲＮＡを単離した。
【０１１０】
ついで、得られた全ＲＮＡ（３．０μｇ相当量）を、前記ＳＡ２プライマーと、ＭＭＬＶ逆転写酵素〔ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）〕とを用いて、逆転写させ、スプライシング産物を得た。
【０１１１】
逆転写反応により生じたスプライシング産物を、ｐＳＰＬ３ベクター特異的プライマー対、前記ＳＤ６及び前記ＳＡ２を用いたＰＣＲにより検出した。なお、ＰＣＲは、全量４０μｌの反応液〔組成：１．５μｌ  ＲＴ産物、１．０μＭ  ＳＤ６プライマー、１．０ｍＭ  ＳＡ２プライマー、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰミクスチャー、１０×ＰＣＲ緩衝液、５Ｕ  ｒＴａｑ（タカラバイオ社製）〕で行なった。増幅は、９４℃で１分間と６０℃で１分間と７２℃で１分間とを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった後、７２℃で５分間インキュベーションすることにより行なった。
【０１１２】
得られたＰＣＲ産物を５％  ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。
【０１１３】
その結果、図６のパネル（Ｂ）に示されるように、ＳＭＮのイントロン７における多コピーのエレメント２の挿入は、挿入数に依存して、ＳＭＮ  エキソン７の含有型を増加させることがわかり、エレメント２が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ  エキソン７のイントロンスプライシングエンハンサーであることが示された。
【０１１４】
実施例５
エレメント２の破壊により、ＳＭＮ  エキソン７のスプライシングパターンの劇的な変化が示されるため、トランス作用因子がエレメント２に特異的に結合し、直接結合を介してそのスプライシングを調節することが推測された。
【０１１５】
そこで、３２Ｐ標識オリゴエレメント２と神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の核抽出物とを用いたゲルシフトアッセイを行なった。
【０１１６】
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（１．０×１０７細胞）を、１０ｍＭ  ＫＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと５ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と１ｍＭ  （ｐ−アミジノフェニル）メタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）  １ｍｌ中、４℃でホモジナイズした。なお、本実験で用いた緩衝液及び他の溶液は、使用前に、商品名：Ｓｔｅｒｉｔｏｐ〔孔径：２２０ｎｍ、ミリポアコーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製〕によるろ過により、滅菌した。
【０１１７】
１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（商品名）を終濃度０．６％まで添加した後、ホモジネートを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ペレットを、４００ｍＭ  ＫＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと１ｍＭ  ＤＴＴと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）  １０倍容量中に再懸濁させ、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られたペレットをゲル移動度シフトアッセイ用の核抽出物として−８０℃で保存した。
【０１１８】
ついで、最終容量２０μｌ（結合緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、７２ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７８ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．５２ｍＭ  ＤＴＴ、３．８％  グリセロール、０．７５ｍＭ  ＡＴＰ、１ｍＭ  ＧＴＰ）において、種々の濃度の核抽出物をＲＩ標識ＲＮＡオリゴヌクレオチド（終濃度６ｎＭとして存在）と混合した。なお、前記ＲＩ標識オリゴヌクレオチドとして、オリゴ−エレメント２〔５’−ＧＵＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＵＧＵ  ＵＵＵ  ＵＧＡ  ＡＣＡ−３’（配列番号：１６）〕又はオリゴ変異エレメント２〔５’−ＧＵＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＡ  ＵＧＣ  ＣＣＣ  ＵＧＡ  ＡＣＡ−３’（配列番号：１７）〕を用いた。
【０１１９】
その後、得られた混合物を、室温で２５分間インキュベートし、ついで、ローディング緩衝液（組成：３７．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３１５ｍＭ  グリシン、１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中４％  未変性アクリルアミドゲルに負荷し、定電圧１００Ｖ２時間４℃で泳動した。ついで、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーフィルムに曝した。
【０１２０】
その結果、図７のパネル（Ａ）に示されるように、有効な結合が観察され、結合活性は、核抽出物の量に対応して増加した。
【０１２１】
さらに、結合が特異的であることを確認するため、非標識オリゴエレメント２を用いた競合実験を行なった。
【０１２２】
その結果、図７のパネル（Ｂ）に示されるように、２５倍を超えるモル濃度の非標識オリゴＲＮＡと共に核抽出物をプレインキュベーションすると、活性のほぼ完全な除去をもたらしたが、Ｔ−Ｃの置換により変異を導入したエレメント２の非標識変異導入用ヌクレオチド（オリゴ変異体エレメント２）の等量と共に核抽出物をプレインキュベーションすると、ＲＮＡ核タンパク質の結合を阻害しなかった。これらのデータは、トランス作用因子が、ＳＭＮ  プレｍＲＮＡのイントロン７におけるエレメント２に特異的に結合すること及びシス作用エレメント２への結合が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ  エキソン７のスプライシングを増強するであろうことを示す。
【０１２３】
実施例６
ＳＭＮ遺伝子のイントロン７のエレメント２は、エキソン７  スプライシングの調節に重要な役割を果たすこと及びトランス作用タンパク質が、このエレメントに直接的に結合しうることが示された。そこで、Ｉ７ＤＭ１−Ｔ  エキソントラップベクターによりトランスフェクトされた細胞のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ  エキソン７の含有型の減少を導くに十分であるかどうかを調べた。
【０１２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、２’−Ｏ−メチル骨格修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエート骨格修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｊａｐａｎ  Ｂｉｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｉｎｃで合成したもの）を用いた。用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
エレメント２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド〔図８中、Ａｓ−エレメント２；５’−ＵＧＵ  ＵＣＡ  ＡＡＡ  ＡＣＡ  ＵＵＵ  ＧＵＵ  ＵＵＣ−３’（配列番号：１８）〕、
ＳＭＮ１のイントロン６のポリピリミジントラクトに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド〔図８中、Ａｓ−ｐｙｒ；  ５’−ＧＡＵ  ＡＧＣ  ＵＡＵ  ＡＵＡ  ＵＡＧ  ＡＵ−３’（配列番号：１９）〕
対照として、イントロン６の他の配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
〔図８中、Ａｓ−ｃｏｎ；５’−ＧＡＵ  ＡＧＣ  ＵＡＵ  ＡＵＡ  ＵＡＧ  ＡＵ−３’（配列番号：２０）〕である。
【０１２５】
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ｉ７ＤＭ１−Ｔがクローン化されたエキソントレッピングベクターと共にＣＯＳ−７にコトランスフェクトした。なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、５ｎＭ〜２５ｎＭの範囲となるようにした。
【０１２６】
トランスフェクションから２４時間後、慣用の方法により、全ＲＮＡを抽出した。プライマー対〔ＳＤ６プライマー及びＳＡ２プライマー〕を用いたＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＳＭＮエキソン７のイン・ビボスプライシングに対するこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を調べた。
【０１２７】
その結果、図８のパネル（Ｂ）に示されるように、Ａｓ−エレメント２により、アンチセンスオリゴヌクレオチドの量に依存して、ＳＭＮ  エキソン７の含有型が減少することがわかった。また、図８のパネル（Ｃ）に示されるように、Ａｓ−ｃｏｎにより、ＳＭＮ  エキソン７のスプライシングは、変化しなかった。対照的に、Ａｓ−ｐｙｒにより、含有型のわずかに減少した。
【０１２８】
ポリピリミジントラクトは、プレｍＲＮＡスプライシングに必須であるため、前記Ａｓ−ｐｙｒは、シス作用エレメントをブロックするアンチセンスオリゴヌクレオチドとして効果的に働くことが予想された。
【０１２９】
同様に、Ａｓ−エレメント２は、ＳＭＮ  エキソン７のスプライシングの阻害を引き起こした。
【０１３０】
かかる結果により、エレメント２が、ＣからＴへの転位を含むＳＭＮ  エキソン７のスプライシングの重要なシス作用性エレメントであることが示される。
【０１３１】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、エレメント２の配列単位の配列である。
【０１３２】
配列番号：２は、エレメント２の配列単位の配列である。
【０１３３】
配列番号：３は、ｐＣＩフォワードプライマーの配列である。
【０１３４】
配列番号：４は、ｐＣＩリバースプライマーの配列である。
【０１３５】
配列番号：５は、６００Ｆｗｄプライマーの配列である。
【０１３６】
配列番号：６は、ＯＲプライマーの配列である。
【０１３７】
配列番号：７は、ＯＲ−ＩＲプライマーの配列である。
【０１３８】
配列番号：８は、ＤＲ−１１Ｒプライマーの配列である。
【０１３９】
配列番号：９は、ＩＲプライマーの配列である。
【０１４０】
配列番号：１０は、ＳＡ２プライマーの配列である。
【０１４１】
配列番号：１１は、ＳＤ６プライマーの配列である。
【０１４２】
配列番号：１２は、変異導入用オリゴヌクレオチドの配列である。
【０１４３】
配列番号：１３は、変異導入用オリゴヌクレオチドの配列である。
【０１４４】
配列番号：１４は、変異導入用オリゴヌクレオチドの配列である。
【０１４５】
配列番号：１５は、変異導入用オリゴヌクレオチドの配列である。
【０１４６】
配列番号：１６は、オリゴ−エレメント２の配列である。
【０１４７】
配列番号：１７は、オリゴ−変異体エレメント２の配列である。
【０１４８】
配列番号：１８は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡｓ−エレメント２の配列である。
【０１４９】
配列番号：１９は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡｓ−ｐｙｒの配列である。
【０１５０】
配列番号：２０は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡｓ−ｃｏｎの配列である。
【０１５１】
配列番号：２１は、推定スプライシング調節エレメントの配列である。
【０１５２】
配列番号：２２は、推定スプライシング調節エレメントの配列である。
【０１５３】
配列番号：２３は、推定スプライシング調節エレメントの配列である。
【０１５４】
配列番号：２４は、推定スプライシング調節エレメントの配列である。
【０１５５】
配列番号：２５は、推定スプライシング調節エレメントの配列である。
【０１５６】
配列番号：２６は、エレメント２の変異体Ａの配列である。
【０１５７】
配列番号：２７は、エレメント２の変異体Ｂの配列である。
【０１５８】
配列番号：２８は、エレメント２の変異体Ｃの配列である。
【０１５９】
配列番号：２９は、エレメント２の変異体Ｄの配列である。
【０１６０】
配列番号：３０は、エレメント２の変異体Ｅの配列である。
【０１６１】
配列番号：３１は、エレメント２の変異体Ｆの配列である。
【０１６２】
【発明の効果】
本発明の核酸によれば、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させることができ、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させることができ、脊髄性筋萎縮症の発症の原因となるＳＭＮ１遺伝子の欠損又は該ＳＭＮ１遺伝子の変異による引き起こされるＳＭＮ１遺伝子産物の機能欠損を補うことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の核酸導入用担体によれば、本発明の核酸を、細胞に効率よく導入することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のＳＭＮ遺伝子の発現制御方法によれば、全長ＳＭＮ遺伝子を発現させることができ、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物を発現させることができ、脊髄性筋萎縮症の発症の原因となるＳＭＮ１遺伝子の欠損又は該ＳＭＮ１遺伝子の変異による引き起こされるＳＭＮ１遺伝子産物の機能欠損を補うことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の医薬組成物によれば、ＳＭＮ遺伝子の欠損又は変異により引き起こされる疾患、特に、脊髄性筋萎縮症の発症を予防又は治療することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のＳＭＮ遺伝子のエキソン７のスプライシング増強物質のスクリーニング方法によれば、全長ＳＭＮ遺伝子の発現を増強させうる物質、ＳＭＮ１遺伝子の機能を補いうるＳＭＮ２遺伝子由来産物の発現を増強させうる物質等を効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。
【０１６３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＭＮ１及びＳＭＮ２  エキソンのスプライシングパターンを示す。図中、各レーンの上側のバンドは、エキソン６からエキソン８の領域を含む全長転写産物を示し、下側のバンドは、エキソン７を欠損した転写産物を示す。また、図中、ＷＴ  ＳＭＮ１（Ｃ）は、野生型ミニジーン、変異体ＳＭＮ１（Ｔ）は、エキソン７内部の６ヌクレオチドに位置するＣからＴへの転位を含むＳＭＮ１ミニジーン、ＷＴ  ＳＭＮ２（Ｔ）は、野生型ＳＭＮ２ミニジーン、変異体ＳＭＮ２（Ｃ）は、エキソン７内の６ヌクレオチドに位置するＴからＣへの置換を含むＳＭＮ２ミニジーンを示す。
【図２】図２は、エキソントラップベクターの概略図を示す。図中、ＢＰは、分岐点、ＰＰＴは、ポリピリミジントラクトを示す。
【図３】図３は、インビトロスプライシングアッセイの結果を示す。上部パネルは、野生型ＳＭＮ１（Ｃ）から構築された欠失変異体の結果であり、下部パネルは、ＣからＴへの転位を含む変異体ＳＭＮ１から構築された欠失変異体の結果である。なお、下部パネルに示されるスコアは、全転写産物に対するエキソン７含有型の割合であり、値は、４回の解析の平均を示す。
【図４】図４は、イントロン７内におけるエレメント２の位置（上部パネル）及び構造（下部パネル）の概略図を示す。
【図５】図５は、ＣからＴへの転位を含む変異体ＳＭＮ１のエレメント２のステム−ループにおける変異による、エキソン７を含む転写産物の量に対する影響を調べた結果を示す。パネル（Ａ）のＡ〜Ｆは、Ｉ７ＤＭ１−Ｔミニジーンにおける種々の変異体の構造の概略図である。図中、○は、野生型エレメント２に対して、置換されたヌクレオチドを示す。パネル（Ｂ）は、イン・ビボスプライシング解析の結果を示す。図中、Ｉ７ＤＭ１−Ｔ、エキソントラップベクターにクローン化されたミニジーンＡからＦは、パネル（Ａ）に対応する。パネル（Ｃ）は、各構築物のスプライシングパターンの定量的解析の結果を示す。全転写産物に対するエキソン７含有型の割合は、４回の解析の平均±Ｓ．Ｄで表わされる。
【図６】図６は、エレメント２の挿入数による、エキソン７を含む転写産物の量に対する影響を調べた結果を示す。パネル（Ａ）は、ＳＭＮのイントロンにおけるエレメント２のタンデムリピートを有する構築物の概略図を示す。図中、Ｉ７ＤＭ１−Ｔは、１コピーのエレメント２を含むオリジナル構築物、エレメント  ２−Ｔｘ３は、３コピーのエレメント２を含む構築物、エレメント  ２−Ｔｘ４は、４コピーのエレメント２を含む構築物を示す。パネル（Ｂ）は、エレメント２の挿入数による、エキソン７を含む転写産物の量のＲＴ−ＰＣＲ解析（上部パネル）及び全転写産物に対するエキソン７  含有型の割合（下部パネル）を示す。全転写産物に対するエキソン７  含有型の割合は、４回の解析の平均±Ｓ．Ｄで表わされる。
【図７】図７は、エレメント２に結合する核タンパク質の同定のためのゲル移動度シフトアッセイの結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出物のゲル移動度シフトアッセイの結果を示す。パネル（Ｂ）は、野生型エレメント２又は変異体エレメント２の非標識ＲＮＡオリゴヌクレオチド（１、５、１４モル濃度超）を添加することにより競合アッセイを行なった結果を示す。
【図８】図８は、エレメント２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる、エキソン７を含む転写産物の発現への影響を調べた結果を示す。パネル（Ａ）は、用いた３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｓ−エレメント２、Ａｓ−ｃｏｎ、Ａｓ−ｐｙｒ）のＳＭＮ遺伝子上の位置を示す。パネル（Ｂ）は、Ａｓ−エレメント２について、エキソントラッピング系を用いたイン・ビボスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。エキソン７含有型の割合を、４回の実験の平均で示し、各レーンの下に示す。パネル（Ｃ）は、Ａｓ−ｃｏｎについて、エキソントラッピング系を用いたイン・ビボスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。エキソン７含有型の割合を、４回の実験の平均で示し、各レーンの下に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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