(57)【要約】      （修正有）【課題】新規医薬品の開発、特に探索研究の高効率化を図ることができる、医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】試験Ａ、試験Ｂ及び／又は試験Ｃとからなる、スクリーニング方法であって、試験Ａが、（１）異種タンパク質を発現形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、並びに（３）該酵母の生育状態を測定する工程、試験Ｂが、（１）被験試料中の候補物質と異種タンパク質とを接触させる工程、並びに（２）異種タンパク質と候補物質との相互作用を検出する工程、を含んでなるものであり、試験Ｃが、（１）被験試料中の候補物質を、ヒト由来のチトクロームＰ４５０による酵素反応に供する工程、（２）酵素反応後の候補物質の変化体及び／又は非変化体を解析する工程、並びに（３）解析結果を参照して候補物質の体内動態を評価し、生理活性物質を選択する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示す試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃとからなる、医薬品の製造のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法であって、
試験Ａが、
（１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、
（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、並びに
（３）該酵母の生育状態を測定する工程、
を含み、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下若しくは向上する場合に被験試料中に候補物質が存在すると判定するものであり、
試験Ｂが、
（１）被験試料中の候補物質と異種タンパク質とを接触させる工程、並びに
（２）異種タンパク質と候補物質との相互作用を検出し、異種タンパク質と相互作用しうる候補物質を生理活性物質として選択する工程、
を含んでなるものであり、
試験Ｃが、
（１）被験試料中の候補物質を、ヒト由来のチトクロームＰ４５０による酵素反応に供する工程、
（２）酵素反応後の候補物質の変化体及び／又は非変化体を解析する工程、並びに
（３）解析結果を参照して候補物質の体内動態を評価し、生理活性物質を選択する工程、
を含んでなるものであり、
試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃで選択された生理活性物質を医薬品候補化合物として選択する、スクリーニング方法。
【請求項２】
試験Ａの形質転換酵母が、呼吸能を欠損したものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
試験Ａの形質転換酵母が、異種タンパク質を、少なくとも該タンパク質の活性部位が活性を保持した状態で発現可能なものである、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
試験Ａの異種タンパク質が、その非発現下と比べて発現下に該酵母の生育を低下させうるものである、請求項１〜３いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
試験Ａの異種タンパク質が、ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するものである、請求項１〜４いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
試験Ａの異種タンパク質が、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質である、請求項１〜５いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質が、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質および／またはＣａｆファミリーに属するタンパク質である、請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質が、そのアミノ酸配列のＮ末端領域に、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または
（ｄ）Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域において配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
Ｃａｆファミリーに属するタンパク質が、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または、
（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
試験Ａの工程（３）において酵母の生育状態を、酵母培養液の濁度変化、酵母の形態変化、酵母の湿重量変化、酵母の乾燥重量変化、酵母の内因性酵素活性変化又は酵母の内因性タンパク質量変化をモニターすることにより測定する、請求項１〜９いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
試験Ｂが、
（１）異種タンパク質を、透明基板上に形成された金属薄膜の表面に固定化する工程、
（２）被験試料中の候補物質を、固定化された異種タンパク質と接触させる工程、並びに
（３）異種タンパク質と候補物質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出し、異種タンパク質と相互作用しうる候補物質を生理活性物質として選択する工程、
を含んでなるものである、
請求項１〜１０いずれか記載のスクリーニング法。
【請求項１２】
試験ＣのチトクロームＰ４５０が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜１１いずれか記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれかに記載のスクリーニング方法用の形質転換酵母。
【請求項１４】
プロモーターに発現可能に連結された異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなるものである請求項１３記載の形質転換酵母。
【請求項１５】
請求項１〜１２いずれかに記載のスクリーニング方法により得られうる医薬品候補化合物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の酵母及び／または異種タンパク質を含んでなる医薬品候補化合物のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規医薬品開発のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
新規医薬品の開発は、探索研究、非臨床試験、臨床試験及び製造許可の各段階を経る必要があり、通常、１０年から１５年程度の期間並びに多大な費用を要する。特に、探索研究の段階は、天然物由来の成分や合成化合物などの多数の検体の中から新規医薬品の医薬品候補化合物（新規医薬品の候補となる化合物）を選抜する段階であり、医薬品候補化合物を探索する研究は、新規医薬品の開発プロセスの中で最も重要な過程であると言える。
【０００３】
探索研究においては、一般に、ある疾患にターゲットを定め、治療対象の疾患特有の生理的・生化学的現象等に着目して医薬品候補化合物の選択がなされる。しかしながら、原因が解明されていない疾患も多く、治療効果を有する可能性のある医薬品候補化合物の探索は一般に困難を伴う。そこで、探索研究を効率的に行うため、いくつかの方法が開発されている。例えば、特定の疾患モデルとして働く動物細胞を用いて生理活性を有する化合物を選択する方法（例えば、非特許文献１参照）や、標的分子あるいはその断片と任意の化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出し、生理活性を有する化合物を選択する方法などが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、探索研究においては、ヒトにおける薬物の代謝、効果、毒性を早期に評価する観点から、医薬品候補化合物の薬物動態や毒性を調べることも行われる。例えば、薬物代謝に重要な役割を果たすチトクロームＰ４５０の医薬品候補化合物に対する影響を評価する種々の方法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｄｒｕｋｅｒ，  Ｂ．Ｊ．，  Ｔａｍｕｒａ，Ｓ．，  Ｂｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，  Ｅ．，  Ｏｈｎｏ，  Ｓ．，  Ｓｅｇａｌ，  Ｇ．Ｍ．，  Ｆａｎｎｉｎｇ，  Ｓ．，  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｙｄｏｎ，  Ｎ．Ｂ．  ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｂｌ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｕｔｈ  ｏｆ  Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ２，  ５６１−５６６  （１９９６）
【特許文献１】
特開２００１−２０８７５５号公報
【特許文献２】
特開２００１−８６８１号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記の通り、新規医薬品の開発には多大な時間と費用を要する。それゆえ、より迅速かつ低コストに新規医薬品を開発する方法が求められる。しかしながら、各段階で行なわれる試験の設計の自由度は一般に低く、現状では、新規医薬品の開発に要する時間の短縮、コストの低減は難しい。
【０００６】
そこで、本発明は、迅速かつ低コストな新規医薬品の開発を可能にする、新規医薬品の開発プロセスの内、特に探索研究の高効率化を図ることができる、新規医薬品開発のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、
〔１〕  以下に示す試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃとからなる、医薬品の製造のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法であって、
試験Ａが、
（１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、
（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、並びに
（３）該酵母の生育状態を測定する工程、
を含み、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下若しくは向上する場合に被験試料中に候補物質が存在すると判定するものであり、
試験Ｂが、
（１）被験試料中の候補物質と異種タンパク質とを接触させる工程、並びに
（２）異種タンパク質と候補物質との相互作用を検出し、異種タンパク質と相互作用しうる候補物質を生理活性物質として選択する工程、
を含んでなるものであり、
試験Ｃが、
（１）被験試料中の候補物質を、ヒト由来のチトクロームＰ４５０による酵素反応に供する工程、
（２）酵素反応後の候補物質の変化体及び／又は非変化体を解析する工程、並びに
（３）解析結果を参照して候補物質の体内動態を評価し、生理活性物質を選択する工程、
を含んでなるものであり、
試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃで選択された生理活性物質を医薬品候補化合物として選択する、スクリーニング方法、
〔２〕  試験Ａの形質転換酵母が、呼吸能を欠損したものである前記〔１〕記載のスクリーニング方法、
〔３〕  試験Ａの形質転換酵母が、異種タンパク質を、少なくとも該タンパク質の活性部位が活性を保持した状態で発現可能なものである、前記〔１〕又は〔２〕記載のスクリーニング方法、
〔４〕  試験Ａの異種タンパク質が、その非発現下と比べて発現下に該酵母の生育を低下させうるものである、前記〔１〕〜〔３〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔５〕  試験Ａの異種タンパク質が、ホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するものである、前記〔１〕〜〔４〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔６〕  試験Ａの異種タンパク質が、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質である、前記〔１〕〜〔５〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔７〕  ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質が、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質および／またはＣａｆファミリーに属するタンパク質である、前記〔６〕記載のスクリーニング方法、
〔８〕  Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質が、そのアミノ酸配列のＮ末端領域に、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または
（ｄ）Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域において配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、前記〔７〕記載のスクリーニング方法、
〔９〕  Ｃａｆファミリーに属するタンパク質が、
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、または、
（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列との配列同一性が２０％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、発現下に形質転換酵母の生育阻害をもたらすタンパク質、
である、前記〔７〕記載のスクリーニング方法、
〔１０〕  試験Ａの工程（３）において酵母の生育状態を、酵母培養液の濁度変化、酵母の形態変化、酵母の湿重量変化、酵母の乾燥重量変化、酵母の内因性酵素活性変化又は酵母の内因性タンパク質量変化をモニターすることにより測定する、前記〔１〕〜〔９〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔１１〕  試験Ｂが、
（１）異種タンパク質を、透明基板上に形成された金属薄膜の表面に固定化する工程、
（２）被験試料中の候補物質を、固定化された異種タンパク質と接触させる工程、並びに
（３）異種タンパク質と候補物質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出し、異種タンパク質と相互作用しうる候補物質を生理活性物質として選択する工程、
を含んでなるものである、
前記〔１〕〜〔１０〕いずれか記載のスクリーニング法、
〔１２〕  試験ＣのチトクロームＰ４５０が、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１及びＣＹＰ３Ａ４からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記〔１〕〜〔１１〕いずれか記載のスクリーニング方法、
〔１３〕  前記〔１〕〜〔１２〕いずれかに記載のスクリーニング方法用の形質転換酵母、
〔１４〕  プロモーターに発現可能に連結された異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなるものである前記〔１３〕記載の形質転換酵母、
〔１５〕  前記〔１〕〜〔１２〕いずれかに記載のスクリーニング方法により得られうる医薬品候補化合物、並びに
〔１６〕  前記〔１３〕に記載の酵母及び／または異種タンパク質を含んでなる医薬品候補化合物のスクリーニング用キット、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬品候補化合物のスクリーニング方法は大きく３つの試験（試験Ａ〜Ｃ）を構成要素とするものであり、試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃを含んでなる。従って、本発明のスクリーニング方法においては、試験Ａと試験Ｂを実施するか、試験Ａと試験Ｃを実施するか、或いは試験Ａ、試験Ｂ及び試験Ｃを実施することにより、医薬品候補化合物のスクリーニングを行なう。
【０００９】
試験Ａは、異種タンパク質の遺伝子を導入した形質転換酵母を利用して医薬品候補化合物のスクリーニングを行なうものであり、ヒトと同様な真核生物を用いて、簡便に所望の生理活性を有する医薬品候補化合物をスクリーニングすることができる。また、例えば、従来の動物細胞を用いたスクリーニング系と異なり、抗生物質の非存在下での評価が可能であるので、抗生物質が試験結果に影響を及ぼしている可能性を排除できるという利点を有する。さらに、試験薬物の濃度をかえて試験を行い、その結果を解析するという態様により、医薬品候補化合物の５０％阻害活性を推定することも可能である。なお、試験Ａにおける「被験試料中に候補物質が存在すると判定する」には、被験試料そのものが候補物質であると判定する態様を含む。
【００１０】
試験Ｂは、試験Ａ後の被験試料中の候補物質と異種タンパク質との相互作用を検出して、候補物質の異種タンパク質との相互作用性を確認し、候補物質の中から有効な生理活性物質をさらに絞り込むものである。かかる構成を有することから、微量の被験試料で高感度かつ迅速な評価が可能である。
【００１１】
試験Ｃは、チトクロームＰ４５０（以下、ＣＹＰ４５０という）発現系を利用して候補物質の体内動態を予測するものである。ＣＹＰ４５０発現系に試験Ａ後の被験試料中の候補物質を供し、候補物質に対してＣＹＰ４５０による酵素反応を行い、続いて候補物質の変化体及び／又は非変化体（代謝産物）の解析（同定・定量）を行なう。それにより、候補物質の体内動態を予測することができる。また、候補物質に対するＣＹＰ４５０の反応の程度や、候補物質の代謝を担うＣＹＰ４５０の種類を同定することができる。さらに、候補物質の毒性をも推定することができる。それらの結果を元に有効な生理活性物質を選択する。
【００１２】
以上の試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃで選択された生理活性物質を医薬品候補化合物として選択する。本発明は、このような構成を有することから、本発明によれば、１）少量の被験試料で、２）迅速に、３）感度よく、４）精度よく、また、５）多くの生理活性を検討して、新規医薬品開発のための医薬品候補化合物のスクリーニングを迅速かつ低コストに行なうことができる。従って、例えば、▲１▼短時間で低コストな新規医薬品の開発、▲２▼短時間で低コストな既開発品・開発中断品の再評価、▲３▼スクリーニング結果（特に試験Ｃの結果）に基づく早い段階での医薬品候補化合物の副作用予測、並びに▲４▼医薬品候補化合物の体内動態と、被験者の別途実施される遺伝子検査などの結果との対比による臨床試験での適切な被験者の選択が可能となる。早い段階での副作用予測により、臨床試験での被験者のドロップアウトを回避でき、適切な用量設定が可能となる。なお、得られた医薬品候補化合物を、例えば、Ｃａｃｏ−２細胞を用いた特異的吸収のイン・ビトロスクリーニング（例えば、Ｂｏｈｅｔｓ，  Ｈ．，  Ａｎｎａｅｒｔ，  Ｐ．，  Ｍａｎｎｅｎｓ，  Ｇ．，  Ｖａｎ  Ｂｅｉｊｓｔｅｒｖｅｌｄｔ，  Ｌ．，  Ａｎｃｉａｕｘ，  Ｋ．，  Ｖｅｒｂｏｖｅｎ，  Ｐ．，  Ｍｅｕｌｄｅｒｍａｎｓ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｌａｖｒｉｊｓｅｎ，  Ｋ．  ：  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  １，  ３６７−３８３  （２００１）等参照）、肝・腎・胃・小腸・心臓・肺などの培養細胞系を用いたイン・ビトロ毒性スクリーニング（例えば、Ｂｒａｄｌａｗ，  Ｊ．Ａ．：  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．，  Ｆｕｎｄａｍ．  Ａｐｐｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，  ６，  ５９８−６０６  （１９８６）等参照）、ＤＮＡアレイによる毒性予測（例えば、Ｂａｒｔｏｓｉｅｗｉｃｚ，  Ｍ．，  Ｔｒｏｕｎｓｔｉｎｅ，  Ｍ．，  Ｂａｒｋｅｒ，  Ｄ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｂｕｃｋｐｉｔｔ，  Ａ．  ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｅｎｅ  ａｒｒａｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ３７６，  ６６−７３  （２０００）等参照）等のＡＤＭＥ／Ｔｏｘ試験に供し、副作用の可能性について、さらに評価することも容易である。また、臨床試験の被験者を適切に選択することで治験有効率が向上する。
【００１３】
以下、試験Ａ、試験Ｂ及び試験Ｃを順に説明する。
【００１４】
１．試験Ａ
試験Ａでは、特定の異種タンパク質を発現可能である形質転換酵母を、該異種タンパク質を発現可能な条件下、すなわち、該酵母の生育状態が変化しうる条件下に培養し、その際、該酵母を被験試料と接触させ、被験試料が存在しない場合（非存在下）を対照として被験試料が存在する場合（存在下）に酵母の生育が低下もしくは向上する場合、被験試料中に候補物質が存在するとすると判定する。
【００１５】
本明細書において、「異種タンパク質」とは、酵母の生育状態に変化をもたらしうる酵母にとって異種のタンパク質をいう。「異種タンパク質」には、当該タンパク質と同様の機能を有するものである限り、その断片が含まれる。また、「異種タンパク質を発現可能」とは、該酵母が異種タンパク質をコードする遺伝子を含有しており（すなわち、該酵母が該遺伝子で形質転換されており）、かつ当該タンパク質の発現が実際に可能であることをいう。また、「候補物質」とは、生体に対し何らかの生理作用を発揮しうる物質、例えば、細胞の増殖や分化に作用しうる物質、特にホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に影響を与えうる化合物、例えば、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与する因子と同様な機能または該機能を阻害もしくは増大する機能を有する化合物をいう。
【００１６】
試験Ａでは、例えば、被験試料の非存在下および存在下で異種タンパク質を発現する酵母の増殖曲線をそれぞれ作成し、得られた増殖曲線を対比することで、被験試料の非存在下を対照とした被験試料の存在下での当該酵母の生育状態に対する被験試料の影響を正確に把握することができるので、被験試料中の候補物質の存在を高い信頼性をもって検出することができる。従って、試験Ａによれば、効率的に候補物質をスクリーニングすることができる。
【００１７】
本発明に使用される酵母は、異種タンパク質も発現可能なものである。該酵母は本発明に包含される。該酵母は、異種タンパク質を発現していない状態（非発現下）と比べて発現している状態（発現下）で生育状態の変化、例えば、生育の低下もしくは向上が認められるという性質を有する。また、本発明に使用される酵母としては、呼吸能が欠損したものであるのが好ましい。すなわち、異種タンパク質を発現可能な呼吸能を有する酵母に比べて、呼吸能が欠損した酵母は、（イ）生育状態の変化がより鋭敏であり、（ロ）異種タンパク質の非発現下においてはより安定した生育を示す。このような現象は、酵母の呼吸能の欠損と関係するものと推定されるが未だそのメカニズムの詳細は不明である。しかしながら、前記（イ）は、前記（ロ）が認められるという事実を考慮すると、呼吸能の欠損に伴う、例えば、異種タンパク質の発現量の増大（例えば、特開平２−４１８号公報参照）に単純に依存するものではない、と考えられる。
【００１８】
「生育の低下」とは、異種タンパク質の非発現下および発現下での酵母の増殖曲線を得、それぞれの世代時間を求め、それらを対比した場合に、非発現下に比べて発現下に酵母の世代時間が長くなることをいう。また、世代時間の代わりに増殖速度を求めてもよい。その場合、対数増殖期の増殖曲線の傾きが小さくなることをいう。一方、「生育の向上」とは、非発現下に比べて発現下に酵母の世代時間が短くなることをいう。また、対数増殖期の増殖曲線の傾きが大きくなることをいう。「生育状態の変化がより鋭敏である」とは、同一種の異種タンパク質を発現する酵母個体間でバラツキなく一様な生育状態の変化が認められることをいう。「安定した生育」とは、同一種の異種タンパク質の非発現下にある酵母個体間でバラツキなく一様な生育状態が示されることをいう。
【００１９】
増殖曲線は酵母の培養時間に対して増殖の程度を示す任意のパラメータ（例えば、後述の酵母培養液の濁度等）の値をプロットすることにより作成する。本発明の酵母の性質の具体的な評価方法については後述する。
【００２０】
異種タンパク質としては、酵母の生育状態に変化をもたらしうるタンパク質であれば特に限定されるものではない。当該タンパク質としては、好ましくは酵母の生育を低下もしくは向上させうるタンパク質であり、より好ましくは酵母の生育を低下させうるタンパク質である。また、当該タンパク質としては、好ましくは細胞の増殖や分化に関わるタンパク質、より好ましくはホ乳類細胞の細胞周期調節に関与するタンパク質である。中でも、ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質が特に好ましい。
【００２１】
ここで、「ホ乳類細胞のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質（以下、シグナルタンパク質という）」とは、ホ乳類細胞における細胞周期のうちＧ０期からＧ１期およびＧ１期からＳ期に至る過程に関与し、その進行または停止を制御する機能を有するタンパク質をいう。また、「ホ乳類細胞」とはホ乳類に由来する細胞であればよく、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラット、モルモットなどのげっ歯類、ウシ、ブタなどの偶蹄類、ネコなどの食肉類、ゾウなどの長鼻類、ウマなどの奇蹄類、家兎などのウサギ類、コウモリなどの翼手類、カンガルー、ワラビーなどの有袋類、カモノハシ、ハリモグラなど単孔類等由来の細胞が挙げられる。
【００２２】
シグナルタンパク質は一般に、それが酵母で発現された場合、酵母の生育を低下させる性質を有すると考えられる。かかるシグナルタンパク質としては、例えば、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質、Ｃａｆファミリーに属するタンパク質、サイクリンファミリーに属するタンパク質、ＣＤＫ（ｃｙｃｌｉｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ）ファミリーに属するタンパク質、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ｐ５３ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ｐ２１ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ＧＡＤＤ４５（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｉｃｉｂｌｅ）ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、Ｅ２Ｆファミリータンパク質に属するタンパク質、ｐ１５ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ｐ１６ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、Ａｒｆファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ＩＮＫ４ファミリー遺伝子産物に属するタンパク質、ＴＧＦβファミリーに属するタンパク質、ヒストンジエステラーゼ類等が挙げられる。
【００２３】
Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質は、そのアミノ酸配列のＮ末端領域に、通常、配列番号：１に示すアミノ酸配列と相同性をもつ約１１０アミノ酸残基からなる相同性領域を有する。従って、当該タンパク質としては、▲１▼Ｎ末端領域に配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、もしくは▲２▼該相同性領域を有するタンパク質が好ましい。前記▲２▼のタンパク質としては、その発現下に酵母の生育の低下をもたらしうるものである限り、そのＮ末端領域に、配列番号：１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、また、配列番号：１のアミノ酸配列との配列同一性が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００２４】
さらに、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質の前記相同性領域には、Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域に配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるＢｏｘ  Ａ（ＧＲ  Ｂｏｘともいう）と呼ばれるさらに相同性の高い領域（高度保存領域）が存在することが知られている。また、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質には、前記相同性領域に、当該Ｂｏｘ  Ａに加えて配列番号：３に示すアミノ酸配列からなるＢｏｘ  Ｂと呼ばれる高度保存領域の存在が知られているものもある。Ｂｏｘ  ＡおよびＢｏｘ  Ｂについては、Ｔｉｒｏｎｅ，  Ｆ．，  （２００１）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １８７，  １５５−１６５を参照されたい。例えば、Ｂｏｘ  ＡおよびＢｏｘ  Ｂの存在が知られているＴｏｂファミリーに属するタンパク質について具体的にそれらのアミノ酸配列上の位置を示せば、ｈＴｏｂはＮ末端から４０〜５８位にＢｏｘ  Ａを７６位〜９５位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｈＴｏｂ２はＮ末端から４０〜５８位にＢｏｘ  Ａを７６位〜９６位にＢｏｘ  Ｂを有し、Ｐｃ３はＮ末端から５０〜６８位にＢｏｘ  Ａを１２４位〜１４３位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｈＡｎａはＮ末端から４２〜６０位にＢｏｘ  Ａを８８位〜１１７位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｍＢｔｇ３はＮ末端から４２〜６０位にＢｏｘ  Ａを８８位〜１１７位にＢｏｘ  Ｂを有し、ｈＰｃ３ＢはＮ末端から４２〜６０位にＢｏｘ  Ａを８８位〜１１７位にＢｏｘ  Ｂを有する。よって、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質としては、その発現下に酵母の生育の低下をもたらしうるものである限り、Ｎ末端から１００アミノ酸残基までの領域に配列番号：２のアミノ酸配列との配列同一性が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００２５】
Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質としては、Ｂｏｘ  ＡおよびＢｏｘ  Ｂを共に有するものが好ましい。
【００２６】
Ｃａｆファミリーに属するタンパク質は、ｈＣａｆ１に代表される。ｈＣａｆ１は配列番号：４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質である。Ｃａｆファミリーに属するタンパク質としては、その発現下に酵母の生育の低下をもたらしうるものである限り、配列番号：４のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよく、また、配列番号：４のアミノ酸配列との配列同一性が、好ましくは２０％以上、より好ましくは３５％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６５％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００２７】
なお、前記「少なくとも１つ」とは１もしくは複数の意である。また、本明細書において「Ｎ末端領域」という場合、当該領域はアミノ酸配列でＮ末端から始まり、Ｎ末端から４００残基までの領域をいう。
【００２８】
アミノ酸配列の配列同一性とは、２つのアミノ酸配列間におけるアミノ酸残基の配列類似性をいう。配列同一性は、比較対象のアミノ酸配列の領域に渡って最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定されうる。
【００２９】
配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一のアミノ酸残基を決定して適合部位の数を決定し、次いで、比較対象の配列領域内のアミノ酸残基の総数で、前記適合部位の数を割り、得られた数値に１００を乗ずることにより算出される。配列同一性は、配列解析ソフト、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等のネットワークサービスを利用して求めることができる。
【００３０】
例えば、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質としては、例えば、Ｔｏｂ、Ｔｏｂ２、Ｂｔｇ１、Ｐｃ３／Ｔｉｓ２１／Ｂｔｇ２、Ａｎａ／Ｂｔｇ３、Ｂ９．１０、Ｐｃ３Ｋ、Ｐｃ３Ｂ、Ｂ９．１５等が挙げられる。Ｃａｆファミリーに属するタンパク質としては、例えば、Ｃａｆ１、Ｃａｆ２、ＰＯＰ２等が挙げられる。また、サイクリンファミリーに属するタンパク質としては、例えば、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１，Ｄ２，Ｄ３、サイクリンＥ等が挙げられる。
【００３１】
本発明の酵母としては、本発明の所望の効果の発現の観点から、少なくともその活性部位を活性のある状態で保持してなる異種タンパク質（もしくはその断片）を発現可能であるものが好ましい。なお、本明細書において、断片でない、いわゆる完全タンパク質としての異種タンパク質とは、そのアミノ酸配列の全長からなる完全なタンパク質または１もしくは複数個のアミノ酸残基が欠失、付加等された実質的に完全なタンパク質をいう。一方、その断片とは完全タンパク質としての異種タンパク質の一部分をいう。かかる断片は、好ましくは５残基以上、より好ましくは５〜１００，０００残基、さらに好ましくは１０〜５０，０００残基、特に好ましくは１００〜１０，０００残基のアミノ酸からなるペプチドであるのが好適である。当該断片としては、例えば、シグナルタンパク質の活性部位を含む、好ましくは５残基以上、より好ましくは５〜１００，０００残基、さらに好ましくは１０〜５０，０００残基、特に好ましくは１００〜１０，０００残基のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。
【００３２】
「活性部位」とは、異種タンパク質がその活性を発揮するのに必要な部位をいう。例えば、シグナルタンパク質では、細胞周期のＧ０／Ｇ１期の細胞内シグナル伝達に関与する機能を発現するために必要な部位に相当する。シグナルタンパク質の活性部位のアミノ酸配列上の位置および当該部位を構成するアミノ酸配列については未だ不明であるが、例えば、Ｔｏｂの活性部位は、前記相同性領域に存在するものと推定される。Ｔｏｂの活性部位を構成すると推定される相同性領域のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。
【００３３】
また、「活性を保持した状態」とは、活性部位が活性発現に必要な高次構造を有してなることをいう。例えば、シグナルタンパク質またはその断片の場合、それらが活性部位を活性のある状態で保持してなるものであるか否かは、その発現下に酵母の生育の低下が生ずるか否かにより評価することができる。すなわち、酵母の生育の低下が生じた場合、発現したシグナルタンパク質またはその断片は活性部位を活性のある状態で保持してなるものである、と判定する。
【００３４】
本発明の酵母としては、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質および／またはＣａｆファミリーに属するタンパク質を発現可能なものが好ましく、中でもＴｏｂファミリーに属するタンパク質およびＣａｆファミリーに属するタンパク質の両方を共に発現可能なものがより好ましい。例えば、ＴｏｂとＣａｆ１を酵母において同時に発現させた場合、それらを各々単独で発現させる場合よりも酵母の生育の低下が増大する。それゆえ、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質およびＣａｆファミリーに属するタンパク質の両方を共に発現させることにより、酵母の生育の低下をより明確に捉えることが可能であると考えられる。より具体的には、Ｔｏｂファミリーのタンパク質としてＴｏｂ、Ｔｏｂ２、Ｂｔｇ１、Ｐｃ３／Ｔｉｓ２１／Ｂｔｇ２、Ａｎａ／Ｂｔｇ３、Ｂ９．１０、Ｐｃ３Ｋ、Ｐｃ３Ｂ、Ｂ９．１５を、Ｃａｆファミリーのタンパク質としてＣａｆ１、Ｃａｆ２、ＰＯＰ２を、また、Ｔｏｂファミリーのタンパク質とＣａｆファミリーのタンパク質の組合せとして、ここに具体的に示すそれらのタンパク質の少なくとも１つずつの組合わせを発現可能な酵母が、本発明の所望の効果の発現の観点から、特に好ましい。
【００３５】
本発明において好適に使用される呼吸能が欠損した酵母は、（ｉ）異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子で酵母を形質転換し、得られた酵母の呼吸能欠損株を得ることにより、又は（ｉｉ）呼吸能欠損株を得た後、それを異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子で形質転換することにより、得ることができる。呼吸能を有する酵母については、呼吸能を欠損させる工程を実施することなく、後述するような通常の酵母を用いて同様にして得ることができる。
【００３６】
異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子による酵母の形質転換は、当該遺伝子を含有してなるベクター、好ましくは発現ベクターを酵母に導入することにより行うのが好適である。
【００３７】
発現ベクターは、通常、プロモーター、異種タンパク質をコードする遺伝子およびターミネーターを含んでなる。該遺伝子はプロモーターに発現可能に連結される。ここで、「プロモーターに発現可能に連結される」とは、遺伝子にコードされるタンパク質の発現がプロモーターの制御下に誘導されうるように該遺伝子が該プロモーターに連結されることをいう。また、該発現ベクターは、多くの場合、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、ならびに大腸菌で機能する複製起点を含んでなる。さらに、エンハンサーおよび酵母で機能する複製起点が含まれていてもよい。発現ベクターを構成するこれらの要素の配置関係は所望の効果を奏しうるように適宜決定することができる。
【００３８】
このような発現ベクターは、例えば、酵母ベクターとして知られるＹＩｐ型、ＹＥｐ型、ＹＲｐ型、ＹＣｐ型の任意のプラスミドベクターにプロモーター、マルチクローニングサイト、ターミネーター等をこの順で導入した後、異種タンパク質をコードする遺伝子の上流に翻訳開始コドンを、下流に翻訳終止コドンを付加したものを前記マルチクローニングサイトに導入することにより構築することができる。このような組換え発現ベクターの構築には慣用の組換えＤＮＡ技術を利用できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９等参照）。前記プラスミドベクターとしては、シグナルタンパク質の発現量が多量である方が好ましいという観点から、ＹＥｐ型のプラスミドベクターが望ましい。もしくはプラスミドベクターの宿主内保持安定性が高いという観点からＹＣｐ型のプラスミドベクターが望ましい。当該ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ２４、ＹＥｐ１３等が挙げられる。
【００３９】
前記プロモーターとしては、例えば、誘導可能なＡＯＸ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、ＬＡＣ４、ＰＨＯ５、ＳＵＣ２等のプロモーターが好適に使用される。また、非誘導型のＡＤＨ、ＰＧＫ等の解糖系の酵素のプロモーターを使用してもよい。ターミネーターは使用するプロモーターに応じて任意のものを選択すればよい。選択マーカー遺伝子として使用する抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、大腸菌用としてのアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、酵母用としてのＧ４１８耐性遺伝子等が挙げられる。また、栄養要求性変異を相補する遺伝子としては、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ４、ＡＤＥ２等が挙げられる。
【００４０】
また、本発明の発現ベクターの構築には、予めＧＡＬ１等のプロモーターが組み込まれた種々のベクターを利用することもできる。かかるベクターとしては、例えばｐＥＳＣ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等が挙げられる。さらに、酵母において発現される異種タンパク質にタグ付加を所望する場合においても、前記ｐＥＳＣ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇｇｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓにはタグがついているのでそれを用いればよい。この場合、タグに特異的な抗体もしくは特異的な親和性を用いて目的タンパク質の検出および精製を行うことができるという利点がある。
【００４１】
所望の異種タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列についての情報は、例えば、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）より入手可能である。異種タンパク質の好適な例としてのシグナルタンパク質をコードする遺伝子の例を挙げておく。例えば、Ｔｏｂファミリーに属するタンパク質およびＣａｆファミリーに属するタンパク質をそれぞれコードする遺伝子について、以下に各遺伝子名と対応するアクセッション番号を例示する：ｔｏｂ（アクセッション番号：Ｄ３８３０５（ヒト）；Ｄ７８３８２（マウス））、ｔｏｂ２（アクセッション番号：ＡＢ０３５２０７（ヒト）；ＡＢ０４１２２５（マウス））、ｂｔｇ１（アクセッション番号：Ｘ６１１２３（ヒト）；Ｌ１６８４６（マウス）；Ｘ６４１４６（Ｇ．  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ））、ｐｃ３／ｔｉｓ２１／ｂｔｇ２（アクセッション番号：Ｍ６０９２１（ラット）；Ｍ６４２９２（マウス）；Ｙ０９９４３（ヒト））、ａｎａ／ｂｔｇ３（アクセッション番号：ＮＭ００６８０６．１（ヒト）；Ｚ７２０００（マウス））、ｂ９．１０（アクセッション番号：Ｘ７３３１６（Ｘ．  ｌｅｅｖｉｓ））、ｐｃ３Ｂ（アクセッション番号：ＡＪ２７１３５１．１（ヒト）；ＡＪ００５１２０（マウス））、ｂ９．１５（アクセッション番号：Ｘ７３３１７（Ｘ．  ｌｅｅｖｉｓ））、ｃａｆ１（アクセッション番号：Ｌ４６７２２（ヒト）；Ｕ２１８５５（マウス））、ｐｏｐ２（アクセッション番号：Ｄ１２８０７（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ））。また、ｐｃ３Ｋおよびｃａｆ２については、Ｐｒｅｖｏｔ，  Ｄ．，  Ｍｏｒｒｅｌ，  Ａ−Ｐ．，  Ｖｏｅｌｔｚｅｌ，  Ｔ．，  Ｒｏｓｔａｎ，  Ｍ−Ｃ．，  Ｒｉｍｏｋｈ，  Ｒ．，  Ｍａｇａｕｄ，  Ｊ−Ｐ．，  ａｎｄ  Ｃｏｒｂｏ，  Ｌ．（２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ９６４０−９６４８およびＢｅｋｏ，  Ｚ．，  Ｓｏｐｉｃｚｋｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｃａｒｒ，  Ａ．Ｍ．（１９９８）Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２６０，  ４３４−４４３を参照されたい。
【００４２】
得られた塩基配列についての情報に基づいて一対のプライマーを作製し、鋳型ＤＮＡとして、例えば、ヒトのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、異種タンパク質、例えば、シグナルタンパク質またはその断片をコードする遺伝子を適宜増幅することができる。
【００４３】
例えば、ＴｏｂファミリーもしくはＣａｆファミリーに属するタンパク質として、前記する特定のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の発現を所望する場合には、例えば、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子に対し公知のランダム変異導入法や部位特異的変異導入法により所望の変異を導入し、得られた遺伝子を酵母導入用の遺伝子として用いればよい。また、例えば、シグナルタンパク質の断片の発現を所望する場合には、例えば、所望の断片をコードする遺伝子領域のみが増幅されるように適宜プライマーの配列を選択してＰＣＲを行い、得られた遺伝子を酵母導入用の遺伝子として用いればよい。また、該断片の発現は、シグナルタンパク質をコードする遺伝子の任意の位置にストップコドンを導入して発現させる方法や制限酵素により所望の部分ペプチドに対応する遺伝子領域を切り出し、適切な発現ベクターに導入して発現させる方法等によっても行うことができる。
【００４４】
通常、酵母の形質転換は１種の異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる１種の発現ベクターを用いて行えばよい。例えば、ｔｏｂもしくはｃａｆ１を含有してなる１種の発現ベクターで酵母を形質転換する。他方、それぞれ１種の異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる２種以上の発現ベクターで、あるいは２種以上の異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる１種の発現ベクターで酵母を形質転換してもよい。例えば、ｔｏｂを含有してなる１種の発現ベクターとｃａｆ１を含有してなる１種の発現ベクターとを用いて、或いはｔｏｂとｃａｆ１とが間接的に連結されてなる遺伝子部分を含有してなる１種の発現ベクター（以下、タンデム化発現ベクターという）で酵母を形質転換する。
【００４５】
該タンデム化発現ベクターは、例えば、以下のようにして得られる。例えば、単一の発現ベクター内において、ｔｏｂおよびｃａｆ１の転写がそれぞれ別個のプロモーターによって制御を受けることができるように、ｔｏｂ等の遺伝子とプロモーターとを当該ベクター内に配置する。なお、これらの方法において使用されうるプロモーターやその他の要素等は前記と同様である。
【００４６】
また、異種タンパク質をコードする遺伝子を相同組換えにより酵母の染色体へ挿入してもよい。例えば、該染色体における該遺伝子の所望の標的挿入部位の両側にある２つの塩基配列に各々相同性を有する塩基配列からなるフランキング配列の間に、例えば、ｔｏｂ等の遺伝子を配置してなるベクターを用いて酵母を形質転換すればよい。標的挿入部位としては、当該部位にｔｏｂ等の遺伝子を挿入することで酵母の内因性プロモーターと該遺伝子とが発現可能に連結されうる部位が好ましい。かかる場合には、ｔｏｂ等の遺伝子は、酵母の内因性プロモーターの制御下に発現可能となるため、形質転換に用いるベクター中、該遺伝子はプロモーターと発現可能に連結されている必要は必ずしもない。一方、ベクター中、ｔｏｂ等の遺伝子を、例えば、誘導型のプロモーターと発現可能に連結しておき、プロモーターと共に該遺伝子を染色体に挿入し、外部より発現制御可能となるようにしてもよい。このようなベクターの構築には、ＹＩｐ型ベクターのような組み込み型ベクターが好適に使用される。
【００４７】
前記のベクターによる酵母の形質転換は慣用の手法により行うことができる。例えば、酢酸リチウム法（Ｉｔｏ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５３，  １６３−１６８（１９８３））、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２１，  ３３６−３３９（１９８５））、プロトプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５，  １９２９−１９３３（１９７８））等により、酵母を形質転換することができる。形質転換操作後、好ましくは選択マーカー遺伝子の性質に応じて常法により形質転換された酵母を選抜する。得られた酵母は異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子を含むが、当該遺伝子を含むか否かについては、該酵母からＤＮＡを抽出後、制限酵素を用いて、あるいはＰＣＲ法や公知の塩基配列決定法により確認することができる。本発明の酵母としては、本発明の所望の効果の発現の観点から、プロモーターに発現可能に連結された、異種タンパク質（もしくはその断片）をコードする遺伝子を含むものが好適である。
【００４８】
また、呼吸能が欠損した酵母は公知の方法により容易に得ることができる。酵母は嫌気的条件でも好気的条件でも生育が可能であり、前者の場合は細胞質内の解糖系により、後者の場合には、ミトコンドリア内の酸化的リン酸化により、生育に必要なＡＴＰを獲得している。従って、ミトコンドリアＤＮＡの一部あるいは全部を欠失させることによって呼吸能欠損株（ρ−）が得られる（酵母の解剖、柳島直彦、大嶋泰治、大隅正子編、講談社サイエンティフィク、ｐ１３７〜１４７，１９８１年）。なお、ミトコンドリアＤＮＡの全部が欠失した呼吸能欠損株をρ０と表わすことがあるが、本明細書ではρ−とρ０を総称してρ−と表わす。
【００４９】
呼吸能を有する酵母（親株ρ＋）から呼吸能欠損株（ρ−）を得る具体的な方法は、例えば、Ｂｕｒｋｅ，  Ｄ．，  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｓｔｅａｒｎｓ，  Ｔ．著，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ，  ２０００年版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）に記載されている。すなわち、親株をエチジウムブロマイドを含む培地で培養したのち、炭素源としてグルコースを含む培地では生育できるが、グリセロールを含む培地では生育できな菌株を分離することによって呼吸能欠損株を容易に得ることができる。また、頻度は低いが親株の単一コロニーの中から呼吸能欠損株を得ることができる。
【００５０】
以上のような所望の性質を有する本発明の酵母の調製に使用可能な酵母としては、例えば、Ｂｏｏｎｅ，  Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ  著，Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  第２版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ刊（２０００年）に酵母として記載されている微生物群が挙げられる。酵母の種類は特に限定されるものではないが、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クルイベロマイセス属、ピキア属などの酵母が挙げられる。本発明においては、サッカロミセス属またはシゾサッカロミセス属に属する酵母を使用するのが好ましく、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）などを使用するのがより好ましい。なお、クルイベロマイセス属に属する酵母としては、例えば、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）が、ピキア属に属する酵母としては、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【００５１】
得られた酵母が所望の性質を有する酵母であるか否かは、異種タンパク質の非発現下での生育状態の安定性および／または異種タンパク質の発現下での酵母の生育状態の変化および／または該タンパク質の発現を確認することにより評価することができる。具体的には、例えば、後述の実施例１に記載の方法により評価することができる。なお、非誘導型のプロモーターを使用した場合には発現と非発現のオン・オフができないことから、かかるプロモーターを使用した酵母の性質評価においては、非発現下にある酵母として異種タンパク質をコードする遺伝子を含まないベクターを用いること以外は本発明の酵母と同様の操作により得られた酵母を用いる。一方、当該酵母は誘導型のプロモーターを使用した場合にも非発現下にある酵母として使用可能である。
【００５２】
得られた酵母は、それを使用するまでの間、適宜保存することが可能である。保存条件としては、菌体を液体培地に植菌して定常期に達するまで培養した後、培養液を集菌し、その沈殿を１０％グリセロール溶液に懸濁したものを−８０℃のフリーザーにて保存する、という条件が好適である。
【００５３】
本発明の酵母は異種タンパク質を発現するが、その結果、生育状態に変化が生ずるという性質を有する。そのメカニズムについて詳細は未だ不明であるが、該異種タンパク質が酵母の増殖および／または分化に関する調節機構に作用し該変化が生じているものと考えられる。
【００５４】
本発明の酵母は、試験Ａに使用されるものであるが、以上のような性質を有することから、細胞の増殖や分化に関わる作用因子や、その作用メカニズムについての研究等においても種々の用途が期待される。従って、本発明の一態様として、本発明の酵母からなる、候補物質のスクリーニング用試薬、細胞の増殖や分化に関わる作用因子や、その作用メカニズムについての研究用試薬等が提供される。当該試薬は本発明の酵母そのものからなってもよく、所望により任意に他の成分をさらに含ませてもよい。例えば、前記保存状態にある形態での提供が可能である。
【００５５】
試験Ａは、以上のような本発明の酵母を使用するものであるが、具体的には、
（１）異種タンパク質を発現可能であり、かつ該タンパク質の非発現下と比べて発現下に生育状態の変化が認められる形質転換酵母と被験試料とを接触させる工程、
（２）該タンパク質を発現しうる条件下に該酵母を培養する工程、並びに
（３）該酵母の生育状態を測定する工程、
を含むものである。そして、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に該酵母の生育が低下若しくは向上する場合に被験試料中に候補物質が存在すると判定する。
【００５６】
本発明の酵母では、前記するように、発現する異種タンパク質が増殖および／または分化に関する調節機構に作用して生育状態の変化（例えば、生育の低下もしくは向上）が生ずるものと考えられる。従って、被験試料の存在下に異種タンパク質を発現する酵母を培養した際に、例えば、当該酵母が異種タンパク質の発現で生育が低下する酵母である場合、被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が向上した時、あるいは当該酵母が異種タンパク質の発現で生育が向上する酵母である場合、被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が低下した時、被験試料中の成分が異種タンパク質等に結合し、該タンパク質等の作用に対し何らかの影響を与えているものと考えられる。例えば、酵母で発現する異種タンパク質がＴｏｂの場合、被験試料を存在させることで被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が向上した場合、該被験試料中の成分はＴｏｂの機能を阻害する可能性がある。また、例えば、酵母で発現する異種タンパク質がＴｏｂおよびＣａｆ１の両者である場合、Ｃａｆ１はＴｏｂと相互作用してその効果を発揮することが知られていることから、被験試料を存在させることで被験試料の非存在下に比べて酵母の生育が向上した場合、該被験試料中の成分はＣａｆ１と結合し得、Ｔｏｂ様の作用を発揮する可能性がある。
【００５７】
本発明に使用される本発明の酵母には、前記するように、誘導型のプロモーターまたは非誘導型のプロモーターを使用可能である。以下においては、説明の簡略化の観点から、発現のオン・オフが可能で、異種タンパク質の発現制御が容易である誘導型のプロモーターを使用して得られた酵母を用いる場合について説明する。
【００５８】
被験試料としては特に限定されるものではないが、例えば、化学的に合成された合成化合物、植物や動物の組織から得られた抽出物およびそれらから精製された化合物、微生物や植物・動物細胞の培養液およびそれらから抽出／精製された化合物等が挙げられる。該試料は適宜任意のバッファー等で希釈したものであってもよい。
【００５９】
工程（１）において酵母を被験試料と接触させる方法は特に限定されるものではない。例えば、工程（２）では異種タンパク質を発現する条件下、すなわち、生育状態の変化が生ずる条件下に酵母の培養（本培養）を行うが、本培養前に異種タンパク質等を発現しない条件下、すなわち、生育状態の変化が生じない条件下において該酵母を前培養し、種培養液を得、それを生育状態の変化が生ずる条件下にある培養液に添加して本培養を行う態様（態様１）では、酵母と被験試料との接触は、例えば、種培養液を本培養のための培養液に添加する際に同時に被験試料を添加して行うのが好適である。また、本培養において酵母を数分から数時間程度培養した後、異種タンパク質等の発現を制御するプロモーターに応じた所定の成分を培地に添加して生育状態の変化が生ずる条件とする態様（態様２）では、例えば、該成分を本培養のための培養液に添加する際に同時に被験試料を添加して酵母と被験試料とを接触させるのが好適である。
【００６０】
前培養は、例えば、酵母の培養に適した公知の培地に、適宜保存されていた酵母を接種して行う。培養は通常の酵母用培養条件、例えば、２４〜３７℃にて２〜３日間、好気的または嫌気的条件下で行う。また、培養は、例えば、フラスコ、試験管等で行えばよい。
【００６１】
本培養も前培養と同様の条件で行うことができるが、前記態様１の場合には酵母が生育状態の変化を生ずる条件下にある培地を用いる。例えば、異種タンパク質をコードする遺伝子がＧＡＬ１プロモーターの制御下に連結されている場合には、前培養に使用した培地にガラクトースを添加した培地を用いればよい。また、本培養は、多数の被験試料を同時に試験することができる等の理由から、マイクロタイタープレートのウエル中で行うこともできる。
【００６２】
工程（３）での酵母の生育状態の測定は、酵母の培養過程における菌体の増殖の程度の指標となる任意のパラメータを測定することにより行なう。酵母の生育状態の測定は、具体的には、例えば、酵母培養液の濁度変化、酵母の形態変化、酵母の湿重量変化、酵母の乾燥重量変化、酵母の内因性酵素活性変化または酵母の内因性タンパク質量変化をモニターすることにより行うのが好ましいが、これらの方法に限定されるものではない。酵母培養液の濁度変化は、本培養の際に培養液の濁度を、例えば、分光光度計により経時的に測定することによりモニターすることができる。同様に、酵母の形態変化は、例えば、光学顕微鏡により経時的に酵母の形態を観察することによりモニターすることができる。酵母の湿重量変化は培養液を経時的に回収して集菌（例えば、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離による）し、その重量を測定することにより、また、酵母の乾燥重量変化は集菌した酵母を乾燥（例えば、１０５℃で４時間の維持による）後、その重量を測定することにより、それぞれモニターすることができる。酵母の内因性酵素活性変化のモニターは、例えば、インベルターゼ、ヘキソキナーゼの活性を常法により経時的に測定することにより行うことができる。また、酵母の内因性タンパク質量変化のモニターは、生育段階によって発現量が変化しないタンパク質の量的変化をモニターすることが好ましく、例えば、アクチンやＵＲＡ３の量を当該タンパク質に特異的な抗体によるウェスタンブロッティングにより経時的に測定することにより行うことができる。なお、本発明の酵母の生育状態の変化は種々の原因により培養途中で外れる場合があるため、モニターは１０〜３００時間行うのが好適であり、８０〜２００時間行うのがより好適である。
【００６３】
一方、対照として、工程（１）で酵母と被験試料とを接触させないこと以外は同様の操作を行い、同様に酵母の生育状態の測定を行う。
【００６４】
次いで、得られた結果に基づき、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の低下もしくは向上が認められるか否かについて評価する。評価は、得られた酵母の生育状態の測定結果を時間に対してプロットすることにより酵母の増殖曲線を得、被験試料と接触させた場合に得られた酵母の増殖曲線と対照の増殖曲線とを対比することにより行うのが好適である。具体的には、被験試料の存在下および非存在下での酵母の増殖曲線を得、それぞれ世代時間を求め、それらを対比し、被験試料の非存在下に比べて存在下に酵母の世代時間が長くなる場合、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の低下が認められた、と評価する。一方、被験試料の非存在下に比べて存在下に酵母の世代時間が短くなる場合、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の向上が認められた、と評価する。また、世代時間の代わりに増殖速度を求めてもよい。この場合、増殖速度が遅くなった場合に、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の低下が認められた、と評価する。また、増殖速度が速くなった場合に、被験試料の非存在下を対照として被験試料の存在下に酵母の生育の向上が認められた、と評価する。なお、酵母の生育状態の測定を酵母の形態変化をモニターすることにより行った場合は、形態変化を起こした細胞数をヘマトメーター等でカウントし、それを酵母の培養時間に対してプロットすることにより増殖曲線を得る。
【００６５】
以上の結果、被験試料の存在下に酵母の生育の低下もしくは向上が認められた場合、被験試料中に候補物質が存在すると判定する。当該候補物質は、異種タンパク質の発現に伴う本発明の酵母の生育状態の変化に対し何らかの影響を及ぼしうる、例えば、当該変化を相殺しうるような活性を有することから、該活性を指標として、さらに、所望により、例えば、遠心分離、ろ過、液−液分配、吸着／溶出、クロマトグラフ、再結晶等を組み合わせ、公知の精製方法に従って該物質を単離することができる。
【００６６】
２．試験Ｂ
試験Ｂは、リガンドとして異種タンパク質を用い、該異種タンパク質と相互作用する候補物質を選択して、より有効な生理活性物質を絞り込もうとするものである。具体的には、試験Ｂは、
（１）被験試料中の候補物質と異種タンパク質とを接触させる工程、並びに
（２）異種タンパク質と候補物質との相互作用を検出し、異種タンパク質と相互作用しうる候補物質を生理活性物質として選択する工程、
を含んでなる。試験Ｂを実施する方法としては、候補物質と異種タンパク質との相互作用を検出しうる方法であれば特に限定はなく、以下のような公知の種々の方法で実施することができる。例えば、この試験を実施する方法としては、▲１▼金や銀の薄膜を用いたチップに異種タンパク質分子を固定化し、候補物質をマイクロ流路系により添加することで生ずる２分子間の結合・解離に伴う物質量の変動を表面プラズモン（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；  ＳＰＲ）シグナルとして観察する方法である。この方法は、例えば「化学と生物」３３巻１０号６８５−６９１頁（１９９５）、「細胞工学」別冊実験プロトコールシリーズ・タンパク実験プロトコール機能解析編（秀潤社）１６４−１８６頁（１９９７）、「実験医学」別冊バイオマニュアルシリーズ改訂版分子生物学研究のためのタンパク実験方法（羊土社）２６６−２７１頁（１９９８）に記載されている。ＳＰＲバイオセンサーは、例えばＢｉａｃｏｒｅ社よりＢｉａｃｏｒｅ１０００の名称で市販されている。また他の方法としては、▲２▼電極である水晶発振子に異種タンパク質分子を固定し、候補物質が異種タンパク質分子に付着することによって生ずる電極付着分子の質量変化を、水晶発振子が発振する周波数の変動幅として測定する方法がある。この方法は、例えば「実験医学」２００２年９月号２０巻３号１９２４−１９２５頁”細胞を取り巻く環境変化と分子間相互作用”に記載されており、この方法に用いる生体分子間相互作用定量装置はイニシアム社よりＡｆｆｉｎｉｘＱの名称で市販されている。その他の方法としては、▲３▼タンパク質が他の分子と結合すると結合タンパク質が重くなり、或いは形が変わるため、タンパク質の拡散する動きが遅くなることを利用し、過渡回折格子測定装置を用いることによって拡散が早いか遅いかを検出する方法もタンパク質・分子間相互作用の定量に用いることが文部科学省・科学技術政策研究所・科学技術動向月報２００３年一月号に報告されている（関連特許出願：特願２００２−３５４８０８）。さらに他の方法としては、例えば、▲４▼基板上に固定した異種タンパク質に放射性同位元素で標識するかまたは蛍光標識した候補物質を接触させ、非結合物質を除去した後、候補物質と異種タンパク質との相互作用を検出することによっても実施することができる。さらに試験Ｂを実施する他の方法としては、次のような方法も用いることができる。▲５▼タンパク質が他の分子と結合すると、動的な大きさが増大したり、形が変わったりする。この変化は結合する分子が大きいほど、また結合が強いほど大きいため、このタンパク質の拡散の変化を動的光散乱法で測定する方法。蛍光色素で修飾したタンパク質を使えば、この拡散の変化は蛍光偏光解消法でも測定できる。▲６▼タンパク質の熱変性を利用する方法。タンパク質を加熱すると、ある温度範囲で変性を起こすが、これは走査型熱量計や分光計に昇温装置を付けて測定できる。一般的に低分子化合物が結合すると、タンパク質の熱変性温度が上昇するので、この変性温度変化または変性に伴う熱量の変化から、結合の強さを測定することができる。▲７▼異種タンパク質と候補物質との結合が熱の放出を伴う場合には、滴定型熱量計を用いて結合の測定を行なう方法を用いることもできる。即ち、異種タンパク質の溶液に候補物質を含む溶液を一定速度で添加し、添加ごとに熱の放出を測定する。異種タンパク質が候補物質で飽和される段階で熱の放出が止まるため、結合の強いものほど、低い濃度でこの放出が停止する。該溶液としては、異種タンパク質と候補物質との結合を阻害しないものが特に限定なく使用される。▲８▼候補物質が電荷を持っている場合には、ＳＤＳを含まない電気泳動（ネイティブ電気泳動）で測定する方法を用いることもできる。タンパク質はその電荷、大きさに依存して電場の存在で移動するが、電荷を持つ物質が結合すれば、移動度が変化することになる。さらに▲９▼異種タンパク質の作用機作が他の分子との相互作用に基づく場合には、その相互作用を利用して、候補物質の異種タンパク質との相互作用を調べることもできる。例えば、候補物質が異種タンパク質と前記分子との相互作用を阻害すれば、異種タンパク質の動きが速くなり、偏光解消速度が速くなる。よって、蛍光色素で修飾した異種タンパク質と前記分子との複合体の蛍光偏光解消速度を測定することにより、異種タンパク質と候補物質との相互作用を調べることができる。また、異種タンパク質と前記分子とを蛍光色素間でエネルギー転換が起こるような２種の異なる蛍光色素又は蛍光色素と消光剤で修飾すれば、蛍光強度の変化から異種タンパク質と相互作用しうる候補物質の検索を行なうことができる。この場合、異種タンパク質はビーズに予め結合させておいてもよい。後者の方法の場合、候補物質を蛍光色素、消光剤またはＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）で修飾しておけば、候補物質が低分子化合物であっても、充分に測定することができる。
【００６７】
これらの方法のうち、特に好ましい方法は前記▲１▼の方法であり、例えば、透明基板上に形成された金属薄膜の表面に固定化したリガンドと物質の相互作用を表面プラズモン共鳴により検出する方法である。具体的には、（１）異種タンパク質を、透明基板上に形成された金属薄膜の表面に固定化する工程、（２）被験試料中の候補物質を、固定化された異種タンパク質と接触させる工程、並びに（３）異種タンパク質と候補物質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出し、異種タンパク質と相互作用しうる候補物質を生理活性物質として選択する工程、を含んでなる。
【００６８】
表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、ＳＰＲと略称することがある）とは、金属薄膜でコーティングされたガラス等の透明基板中を光が進み、界面で全反射するとき、界面で生じるエバネッセント波と金属薄膜において生じる表面プラズモン波の波数が一致して起こる共鳴であり、この共鳴が起こると反射光の強度が減少する。表面プラズモン波は金属薄膜表面上で生じるので、その極く近傍の媒質に濃度変化や質量変化があれば、表面プラズモン波が変化し、それに応じて反射光の強度を減少させる入射角が変化する。
【００６９】
このような現象を利用して１９９０年代の初頭に表面プラズモン共鳴バイオセンサーが開発された。典型的なＳＰＲバイオセンサーにおいては、ガラスにコーティングされた金属薄膜（一般的には金薄膜）の表面にリガンドを固定化してなる、これに接するように被測定物質収容用フローセルが配備された使い捨て式の測定用チップ（センサーチップ）を使用する。このセンサーチップを装置本体に挿入（装着）し、ガラスに近赤外のｐ遍光を入射し、前述したような原理に従い反射光の強度を減少させる入射角の変化を共鳴シグナルとして求める〔１０‐４度の変化を１ＲＵ（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）と呼ぶ〕。このようなＳＰＲバイオセンサーについては、例えば、「蛋白質  核酸  酵素Ｖｏｌ３７（１９９２）」の５３〜６０頁および８１〜８７頁に詳述されている。
【００７０】
このようなＳＰＲバイオセンサーを用いれば、金属薄膜の表面に固定化されたリガンドに応じて、該リガンドに特異的に反応したり結合したりする物質の定量や相互作用の測定などを簡便に精度よく行うことができる。試験Ｂにおいては、当該ＳＰＲバイオセンサーを用いるのが好適である。
【００７１】
測定用チップを構成する透明基板としては、光学的透明性を有するガラスや石英、樹脂等が用いられる。金属薄膜は、該透明基板の表面に、気相蒸着、例えば、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の手段によって形成することができる。金属としては、金や銀等の貴金属、アルミニウム等の各種のものが用いられるが、貴金属が好ましく、特に金が好ましい。
【００７２】
金属薄膜が形成された基板の表面は平滑であることが望ましい。表面が平滑な基板とすることで、異種タンパク質を適切に配列させることができ、また、表面プラズモン共鳴の変化の再現性の向上を図ることができる。
【００７３】
金属薄膜の表面には、リガンドの固定化を容易にする観点から、通常、リンカー層が形成される。例えば、アルカンチオールやアルコキシシランは表面上で安定に単層を形成し、リンカーとして機能する。また、これらの分子の末端のアルキル基を介して、樹脂やヒドロゲルを結合させ、さらに樹脂層を形成することができる。そのようにすることでタンパク質等の非特異的な結合を阻止することができるので好ましい。その用には、通常、カルボキシメチルデキストランが使用されるが、ヒアルロン酸、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレートなども使用できる。
【００７４】
例えば、ＳＰＲバイオセンサーのメーカーから、リガンドを固定化する測定用チップの金属薄膜上にアルキル鎖を結合し被覆したもの（ＢＩＡｃｏｒｅ社製センサーチップＨＰＡ等）が提供されている。簡便性の点では、このような市販の測定用チップを用いるのが好適である。
【００７５】
工程（１）における異種タンパク質の金属薄膜の表面への固定化は、好適には、金属薄膜の上に形成されたリンカー層、又はリンカー層と樹脂層とを介して行われる。リンカー層又は樹脂層への異種タンパク質の結合は、共有結合的に若しくは非共有結合的に行うことができる。そのような方法については、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌ．１  ｐ５１５−５２８に記載されている。
【００７６】
以上のようにして異種タンパク質が固定化された測定用チップが得られる。次いで、工程（２）において候補物質を異種タンパク質と接触させるわけであるが、好適には、得られた測定用チップを市販のＳＰＲバイオセンサーに装着し、当該装置の使用様式に従って候補物質と異種タンパク質とを接触させる。例えば、金属薄膜の表面に異種タンパク質が固定化されてなる被測定物質収容用フローセルが配備された測定用チップをＳＰＲバイオセンサーに挿入し、フローセル内に、例えば、任意の緩衝液に溶解された候補物質を流すことにより接触させる。その際、異種タンパク質と候補物質との相互作用を表面プラズモン共鳴により検出し、共鳴シグナル（ＲＵ値）から相互作用の有無又は相互作用の強さを知り、それに応じて目的の生理活性物質を選択すればよい。なお、候補物質と異種タンパク質とを接触させる際の、候補物質を溶解させるための緩衝液や、候補物質を含む緩衝液の流量等の条件については、例えば、永田和宏、半田宏、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京刊（１９９８）を参照して、適宜決定することができる。
【００７７】
ここで、異種タンパク質としては、前記の通り、前記酵母の生育状態に変化をもたらしうるタンパク質であれば特に限定されるものではないが、前記の種々のタンパク質の他、受容体タンパク質が好適である。かかる受容体タンパク質としては、特に限定はなく、評価の目的に応じて公知の受容体タンパク質から選択されるものであり、細胞膜表面受容体タンパク質及び核内受容体タンパク質のいずれであってもよい。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＮＩＨ）のＲｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅに公表されている如く、細胞膜表面受容体タンパク質としては、Ｇタンパク質共役型受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、サイトカイン受容体、ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、成長因子受容体、グルタミン酸受容体、インターフェロン受容体、インターロイキン受容体、ＬＤＬ受容体、ロドプシン受容体、トロンビン受容体、トランスフェリン受容体、ＴＮＦ受容体等のファミリーに属する受容体タンパク質を、また、核内受容体タンパク質としては、アリールハイドロカーボン受容体、ホルモン受容体、核受容体、レチノイン酸受容体、ビタミン受容体等のファミリーに属する受容体タンパク質を挙げることができる。試験Ｂでは、評価の目的に応じて、これらの受容体ファミリーに属するタンパク質から適宜適切に選択された、或いは組み合わされたタンパク質が好適に使用される。試験Ｂによれば、異種タンパク質がこのようなタンパク質である場合、薬物受容体（異種タンパク質）と薬物（候補物質）との結合の仕方や程度を測定でき、或いは標的となりうる遺伝子群の発現を直接制御している核内受容体（異種タンパク質）と薬物（候補物質）との結合の仕方や程度をも測定できるため、候補物質が生体内で発揮するであろう生理活性（薬効）を簡便に評価することが可能である。
【００７８】
３．試験Ｃ
試験Ｃは、薬物代謝の中心を担うＣＹＰ４５０により、被験試料中の候補物質がどのように代謝されるかを評価し、候補物質の体内動態を予測し、ひいてはヒトにおける該物質の代謝、効果、毒性を早期に予測・評価し、新規医薬品開発のリスクを低減しようとするものである。試験Ｃは、具体的には、（１）候補物質を、ヒト由来のチトクロームＰ４５０による酵素反応に供する工程、（２）酵素反応後の候補物質の変化体及び／又は非変化体を解析する工程、並びに（３）解析結果を参照して候補物質の体内動態を評価し、生理活性物質を選択する工程、を含んでなる。
【００７９】
試験Ｃにおいて使用するヒト由来のＣＹＰ４５０の供給源としては、例えば、ヒト肝のホモジネート、ヒト肝ミクロソーム、人工的に作製された当該酵素を発現するヒト肝臓癌細胞由来の培養細胞株、当該酵素を発現する形質転換酵母等が挙げられる。ヒト肝のホモジネートやヒト肝ミクロソームは、例えばＭａｈｍｏｏｄ，  Ｉ．  ：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ．  Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．，  Ｄｒｕｇ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，  １９，  ４９−６４  （２００２）に記載の方法により、調製することができる。前記培養細胞株は、前記特許文献２に記載の方法により調製することができる。また、前記形質転換酵母は、特開平８−５６６９５号公報に記載の方法により調製することができる。
【００８０】
また、前記形質転換酵母を用いる場合、菌体破砕物を使用してもよい。菌体破砕物としては、例えば、ミクロソームを含む菌体破砕液、ミクロソーム画分、またはミクロソームならびに細胞質の両者を含む画分等を挙げることができる。これらの調製法は、例えば、ＤＮＡ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．  ３，ｐ２０３−ｐ２１０（１９８５）等に記載される通常の方法でよい。
【００８１】
工程（１）においては、候補物質をヒト由来のＣＹＰ４５０による酵素反応に供するわけであるが、当該工程は、例えば、前記のＣＹＰ４５０の供給源のいずれかと候補物質とを混合して行う。供給源として、前記形質転換酵母を用いる場合、菌体破砕物を用いるのが好ましい。また、菌体破砕物のなかでも、ミクロソーム画分を用いるのがより好ましい。
【００８２】
ヒトの薬物代謝にかかわるＣＹＰ４５０の分子種は１５種類以上存在すると言われている。中でも、医薬品の代謝に重要な役割を果たしているものは、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４と呼ばれる６つの分子種であり、９５％以上の医薬品についての代謝はこれらの分子種で説明できると言われている。それゆえ、ヒト由来のＣＹＰ４５０としては、ここに具体的に例示したものの少なくとも１種であるのが好適である。
【００８３】
前記したヒト由来のＣＹＰ４５０の供給源と候補物質との接触や酵素反応の条件・方法等については、ヒト肝ホモジネートやヒト肝ミクロソームを用いる場合には、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｊ．Ｂ．，  Ｃａｒｌｉｌｅ，  Ｄ．Ｊ．：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ，  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｓｌｉｃｅｓ．，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｖ．，  ２９，  ８９１−９２２（１９９７）を、前記培養細胞株を用いる場合には、例えば、前記特許文献２を、前記形質転換酵母を用いる場合には、例えば、特開平８−５６６９５号公報を参照すればよい。
【００８４】
続く工程（２）において、酵素反応後の候補物質の変化体及び／又は非変化体を解析する。候補物質の変化体・非変化体の解析は、監修  塩川二郎ら機器分析のてびき（２）  （増補改訂版）第１刷，化学同人発行（１９８５年）、Ｒ．  Ｍ．ＳＩＬＶＥＲＳＴＥＩＮ  ら，有機化合物のスペクトルによる同定法  第４版  第３刷，東京化学同人発行（１９８４年）等に記載される通常の分析方法を用いて行うことができる。
【００８５】
工程（３）においては、工程（２）で得られた解析結果を参照して、候補物質の体内動態の評価を行う。体内動態の評価は、目的に応じて種々の態様により行うことができる。工程（２）で得られた解析結果を組み合わせて評価することにより、候補物質の体内動態を的確に予測することができる。評価の態様の例を以下に示す。
【００８６】
ａ）代謝に関与する酵素についての評価
工程（２）で得られた解析結果に基づき、工程（１）の実施による候補物質の構造の変化を解析する。それにより候補物質の代謝に関与する酵素の特定が可能であり、また、酵素反応機構の解析、基質特異性の解析なども適宜行うことができる（Ｊ．Ｌ．  ．Ｎａｐｏｌｉ  ほか  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  ２０６  ｐｐ．４９１−５０１  Ｅｄ．  ｂｙ  Ｍ．Ｒ．  ＷａｔｅｒｍａｎほかＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１、Ｈ．  Ｋ．  Ｋｒｏｅｍｅｒ  ほか  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  ２７２  ｐｐ．９９−１９８  Ｅｄ．  ｂｙ  Ｍ．Ｒ．  ＷａｔｅｒｍａｎほかＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ  １９９６）。また、各ＣＹＰ４５０に対する特異的阻害剤を用い、候補物質と該阻害剤とを同時に酵素反応に供した場合の候補物質の減少に対する該阻害剤の効果を調べることにより、代謝に関与するＣＹＰ分子種の特定が可能である（Ｒｉｌｅｖ  Ｒｌ：  Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｐ４５０  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．， Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｄｅｖｅｌ，  ４，  ４５−５４（２００１）等参照）。例えば、ヒト由来のＣＹＰ４５０分子種のそれぞれについて知られている特異的阻害剤のそれぞれについて、その存在下に、候補物質をＣＹＰ４５０供給源と混合してＣＹＰ４５０による酵素反応を行う。反応後、候補物質の代謝産物を解析し、いずれの阻害剤を用いた場合に候補物質の代謝が抑制されたかを確認する。すなわち、候補物質の代謝が阻害された場合には実質的に候補物質の非変化体のみが検出されるので、それにより、阻害に関与した阻害剤が特定され、ひいては代謝に関与するＣＹＰ４５０分子種が特定されることになる。さらに、代謝に関与するＣＹＰ４５０分子種の特定は、ＣＹＰ４５０分子種のそれぞれについて知られている特異基質を用いる方法により特定することもできる（Ｒｉｌｅｖ  Ｒｌ：  Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｐ４５０  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｄｒｕｇ．  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｄｅｖｅｌ，  ４，  ４５−５４（２００１）等参照）。例えば、特異基質ごとに、その存在下、候補物質をＣＹＰ４５０による酵素反応に供し、特異基質と候補物質とを競合的に反応させる。反応後、候補物質の代謝産物を解析し、いずれの特異基質を用いた場合に候補物質の代謝が抑制されたかを確認する。すなわち、候補物質の代謝が抑制された場合には候補物質の非変化体が変化体に比し多く検出されるので、それにより、代謝抑制に関与した特異基質が特定され、ひいては代謝に関与するＣＹＰ４５０分子種が特定されることになる。
【００８７】
ｂ）変異原性についての評価
候補物質のＣＹＰ４５０による酵素反応により得られる代謝産物を栄養要求性の微生物に作用させた後、栄養非要求性となった微生物の存在量を測定する。測定の結果、（ａ）栄養非要求性となった微生物が、ＣＹＰ４５０の供給源を用いないこと以外は同様にして処理した候補物質に対して同様の測定を行った場合（対照）と同程度に存在する場合、候補物質を変異原性無と評価し、または、（ｂ）栄養非要求性となった微生物が、前記対照と比較して実質的に多く存在する場合、候補物質を変異原性有と評価する。具体的には、例えば、ヒスチジン要求性のサルモネラ菌株〔Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  （ｈｉｓ  −  ）  〕又はトリプトファン要求性の大腸菌株〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ  （ｔｒｐ  −  ）  〕に代謝産物を作用させ、該菌株のアミノ酸に対して非要求性（Ｈｉｓ  ＋  またはＴｒｐ  ＋  ）  となった菌、すなわち復帰突然変異菌がコロニーを形成するか否（復帰突然変異誘発性の有無）又は形成したコロニーの数（復帰突然変異誘発性の強弱）を調べる生物学的分析方法による評価を挙げることができる。アリールアミン系化合物の多くはヒト肝臓において代謝活性化を受けることにより、変異原性を示すようになるため、上記の生物学的分析方法を用いるのが好適である。また、前記微生物の代わりに哺乳動物由来の細胞を用いた生物学的分析方法を用いてもよい。例えば、米国特許第４５３２２０４号に記載されるヒトＢリンパ芽球細胞ＡＨＨ−１の変異体であるＬ３細胞株から誘導されるＭＣＬ−５細胞株（親株と比較して多くの化合物の細胞毒性に対してより感受性が高い細胞株）に、代謝産物を作用させ、該細胞株の個体数増加を調べる。代謝産物を作用させた細胞株の個体数増加を代謝産物を作用させていない細胞株の個体数増加と比較し、候補物質の毒性を前記の微生物を用いる生物学的分析方法の場合と同様に評価する。さらに、工程（１）において、ＣＹＰ４５０の供給源として、例えば、前記培養細胞株を用いた場合には、工程（１）の後、該培養細胞株を染色体異常試験、小核試験などに付すことによっても候補物質の変異原性について評価することができる。
【００８８】
ｃ）代謝阻害についての評価
工程（２）で得られた解析結果に基づきＣＹＰ４５０酵素活性の阻害について解析することにより、候補物質による代謝阻害を評価することができる  （Ｊ．Ｌ．  Ｎａｐｏｌｉ  ほか  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．  ２０６  ｐｐ．４９１−５０１  Ｅｄ．  ｂｙ  Ｍ．Ｒ．  ＷａｔｅｒｍａｎほかＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）。他方、代謝阻害については、ＣＹＰ４５０のタンパク質量の減少、ｍＲＮＡ量の減少などにより評価することも可能である。かかる場合の検出方法としては、各種ＣＹＰ４５０タンパク質に対応するウエスタンブロッティング、各種ＣＹＰ４５０のｍＲＮＡに対応するノザンハイブリダイゼーション或いはＲＴ−ＰＣＲ法など公知の手法を使用することができる。
【００８９】
ｄ）代謝促進についての評価
工程（２）で得られた解析結果に基づく酵素活性の上昇の解析、他方、ＣＹＰ４５０酵素量（タンパク質量）の増加又は該酵素をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）の上昇などを解析することにより、候補物質による代謝促進を評価することができる（Ｊ．  Ｒｕｅｆｆ  ほかＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５３（１９９６）  １５１−１７６）。酵素量の増加については、各種ＣＹＰ４５０に対応する酵素活性の測定、各種ＣＹＰ４５０タンパク質に対応するウエスタンブロッティングなどにより、転写量の上昇については、各種ＣＹＰ４５０のｍＲＮＡに対応するノザンハイブリダイゼーション或いはＲＴ−ＰＣＲ法などにより評価することができる。
【００９０】
ｅ）代謝による細胞毒性についての評価
工程（１）において、ＣＹＰ４５０の供給源として、例えば、前記培養細胞株を用いた場合には、候補物質の代謝による細胞毒性の評価が可能である。細胞毒性の評価は、例えば、細胞の形態の変化、ＭＴＴアッセイやトリパンブルー染色或いはクリスタルバイオレッド染色など公知の方法による生細胞数の変動、乳酸脱水素酵素などの細胞内酵素の漏出、細胞表層構造の変化或いは細胞内酵素の変動などを観察することにより行うことができる（Ｄ．  Ｗｕ  ほか  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７１，  （１９９６）  ２３９１４−２３９１９）。候補物質の代謝の有無については行程（２）の解析結果により確認することができる。
【００９１】
ｆ）発癌性についての評価
工程（１）において、ＣＹＰ４５０の供給源として、例えば、前記培養細胞株を用いた場合には、工程（１）の後、該培養細胞株を染色体異常試験やＤＮＡの修飾の解析などに付すことにより候補物質の代謝による発癌性の解析が可能である。また、代謝産物を適切な化学物質による発癌評価系で評価することにより、候補物質の発癌性について評価することができる（Ｊ．  Ｒｕｅｆｆ  ほかＭｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５３（１９９６）  １５１−１７６，  Ｋ．  Ｋａｗａｊｉｒｉ  ほかＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ４５０  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｐｐ７７−９８  ｅｄ．  ｂｙ  Ｃ．  Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ  ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ  （１９９６））。候補物質の代謝の有無については行程（２）の解析結果により確認することができる。
【００９２】
最終的に、試験Ｃの結果に基づき、種々の疾患の治療にとって好ましい性質を有する候補物質を生理活性物質として選択する。
【００９３】
上記の試験Ａと、試験Ｂ及び／又は試験Ｃで選択された生理活性物質を医薬品候補化合物として選択する。以上の本発明の医薬品候補化合物のスクリーニング方法によれば、探索研究の高効率化を図ることができる。
【００９４】
また、本発明は前記スクリーニング方法により得られうる医薬品候補化合物を提供する。該医薬品候補化合物は少なくともスクリーニング過程で使用する異種タンパク質の機能に関連した生理活性を有する。例えば、異種タンパク質がシグナルタンパク質であった場合、医薬品候補化合物は細胞周期の制御機構に作用しうると考えられることから、例えば、細胞周期の制御機構の解明等の研究や、細胞周期の制御機構の異常が発症や病態進行の原因のうちの少なくとも１つとなっている疾患等の治療または予防への使用が期待される。例えば、Ｔｏｂの機能を阻害する物質は骨粗鬆症や骨折などの骨疾患の治療剤となる可能性があり、Ｃａｆ１と相互作用してＴｏｂと同様の作用を発揮する物質は抗癌剤となる可能性がある。
【００９５】
該スクリーニング方法により、医薬品候補化合物として、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤が得られうるが、かかる物質はタンパク質のチロシン残基のリン酸化を阻害するという機能を有しており、該阻害剤は、例えば、チロシンキナーゼがかかわる過剰な細胞内シグナル伝達が病態の悪化の原因となっている疾患の治療薬、より具体的には制癌剤などとして使用されうる。
【００９６】
本発明により得られた医薬品候補化合物を医薬製剤とする場合には、例えば、経口または非経口投与に適した公知の有機または無機の担体、腑形剤、その他の添加剤を用いて常法に従って経口または非経口投与の固体状、半固体状または液状の製剤として調製できる。該化合物の投与量は、各物質の性質に応じ、所望の効果が得られうるように適宜調整すればよい。また、該製剤における該化合物の含有量は、その使用方法に応じて該化合物の所定量が投与できるようであれば特に限定されるものではない。
【００９７】
さらに、本発明の一態様として、本発明のスクリーニング方法に使用されうる形質転換酵母、例えば、プロモーターに発現可能に連結された異種タンパク質をコードする遺伝子を含有してなる形質転換酵母及び／または本発明に使用される前記異種タンパク質を含んでなる医薬品候補化合物のスクリーニング用キットを提供する。当該キットは本発明の医薬品候補化合物のスクリーニング方法に好適に用いることができる。キットには、所望により、任意の培地、酵母の生育状態の測定に使用される種々の試薬（例えば、タンパク質定量用試薬、形質転換用のプラスミドベクター、宿主の酵母、Ｔｏｂ等の特異抗体、酵素活性定量試薬等）、および本発明の医薬品候補化合物のスクリーニング方法を実施するための説明書等を含めてもよい。
【００９８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【００９９】
実施例において使用した菌株、培地、試薬、ならびに一般的な実験方法を、以下にまとめて示す。
【０１００】
１．菌株
使用した菌株を表１に示す。
【０１０１】
【表１】
2004313101.tif 000002
【０１０２】
２．培地および試薬
各培地および各試薬の組成については、Ｂｕｒｋｅ，  Ｄ．，  Ｄａｗｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｓｔｅａｒｎｓ，  Ｔ．著，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ，  ２０００年版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照のこと。培地は全てオートクレーブして用いた。
【０１０３】
３．実験方法
（１）大腸菌ＪＭ１０９の形質転換
−８０℃で保存してあるＪＭ１０９のコンピテント細胞１００μｌを氷上で溶解し、５μｌのプラスミドＤＮＡを加えて氷上で３０分間静置した。４２℃、３０秒間ヒートショックを行った後氷上で２分間静置し、ＳＯＣ培地を０．９ｍｌ加えてよく混合し、３７℃で４５分間培養した。それをＡｍｐ濃度１００μｇ／ｍｌのＬＢ＋Ａｍｐ固形培地にまき、３７℃で一夜培養した。
【０１０４】
（２）プラスミドＤＮＡの中量調製法（中量抽出）
３０ｍｌ  ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地で培養した菌体を遠心用チューブに移して室温で８０００ｒｐｍ、５分間遠心することによって集菌した。沈殿物に３ｍｌのリゾチーム溶液（５ｍｇ  リゾチーム／１ｍｌ  グルコースバッファー）を添加、緩やかに溶解した後、氷上に５分間静置した。４ｍｌのＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳ）を加えて緩やかに混合し、氷上に５分間静置した。３ｍｌの３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．８）を加え、緩やかに混合し、氷上に１０分間静置した後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心を行った。上清を新しいチューブに移し、６ｍｌのイソプロパノールを加えて−２０℃に２０分間静置した後、１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心を行った。沈殿を２ｍｌの７０％エタノールで洗浄した後、３００μｌのＴＥに溶解してエッペンドルフ（登録商標）チューブに移し、同じく３００μｌのＴＥで遠心チューブを洗浄してエッペンドルフ（登録商標）チューブに移した（計６００μｌ）。６μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを加えて３７℃で２０分間インキュベートした後、フェノール抽出を３回、クロロホルム抽出を３回、エーテル抽出を３回行った。１２０μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と２４０μｌの３０％  ＰＥＧ＃６０００を加えて混合した後−２０℃で４０分間静置し、４℃で３０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心した後、沈殿を回収してチューブの中の水分を完全に取り除き、８０μｌの滅菌水に溶解した。４．８μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液と１９２μｌのエタノールを加えて混合し、−２０℃で３０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心した後、沈殿に２００μｌの７０％エタノールを加えて緩やかに沈殿を洗った。１４，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心した後沈殿を吸引ポンプで乾燥し、１００μｌのＴＥに溶解した。その後、ＯＤ２６０値および電気泳動によって濃度を測定した。
【０１０５】
（３）ＰＣＲ法
９８℃・３０秒間、６０℃・６０秒間、７２℃・９０秒間のサイクルを２５サイクルという条件で行った。５ｎｇ／μｌのサンプルＤＮＡ  １０μｌに対し５０μＭのプライマーをそれぞれ５μｌずつ、ＮＥＢ×１０バッファーを１０μｌ、４ｍＭ  ４ｄＮＴＰミックスを１０μｌ、ＮＥＢ  Ｖｅｎｔ  ｐｏｌ（２Ｕ／μｌ）を０．５μｌ、滅菌水を５９．５μｌ加えて計１００μｌに調整し、それに１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを１μｌ、ミネラルオイルを６０μｌ加えて反応を行った。
【０１０６】
（４）アガロースゲルの切り出しによるＤＮＡの単離
中量抽出によって調製したプラスミドＤＮＡ  ５μｇ分を１００μｌの系にて制限酵素で処理後、Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ  ２０μｌを加えて１２０μｌとした。電気泳動装置「ミューピッド（登録商標）」（株式会社アドバンス製）の６ｍｍの幅のコーム３つを１つになるようにセロファンテープで巻き、０．７％のアガロースゲルを作製した。１２０μｌのサンプルをゲルにアプライして泳動を行い、泳動終了後３６５ｎｍ長波長ＤＮＡ切り出し用ランプをゲルにあてながらカッターナイフを用いて目的のバンドを切り出した。回収したゲルを２５０μｌの０．５×ＴＢＥ入りの透析チューブに入れ、それをミューピッドにセットして通常の方向に泳動を３０分間行い、その後逆方向に泳動を３０秒間行った。０．５×ＴＢＥを回収してフェノール抽出を２回、エーテル抽出を３回行った。
【０１０７】
（５）プラスミドＤＮＡの小スケール調製法（ミニプレップ）
エッペンドルフ（登録商標）チューブに入った１．２ｍｌ  ＬＢ＋Ａｍｐ液体培地に形質転換した大腸菌のコロニーを接種し、３７℃、一夜培養した。培養液を室温で１２，０００ｒｐｍ、１分間遠心した後、１００μｌのグルコースバッファーを加えてボルテックスし、沈殿を完全に懸濁した。１５０μｌのＮａＯＨ−ＳＤＳ溶液（０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％  ＳＤＳ）を加え、チューブを上下に振って穏やかに混ぜた後、氷中に５分間静置した。１５０μｌの３Ｍ酢酸カリウムバッファーを加えて混合した後、５００μｌのフェノールを加えて混合し、４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。上層（約５００μｌ回収）を別のチューブに移し、等量（５００μｌ）のクロロホルムを加えて４℃で１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。上層（約４００μｌ回収）を別のチューブに移し、二倍量（８００μｌ）のエタノールを加えてよく混ぜ、−２０℃で３０分間静置した後、４℃、１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心を行い、沈殿に２００μｌの７０％エタノールを加えて軽く混合した。４℃、１４，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、沈殿を吸引ポンプで乾燥させた後、２０μｌのＲＮａｓｅ入りＴＥ（１０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  １μｌ−ＴＥ  ２０μｌ）に溶解し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、取得したプラスミドＤＮＡを制限酵素で処理し、電気泳動による確認を行った。
【０１０８】
（６）酵母の形質転換（酢酸リチウム法）
５ｍｌのＹＰＤ液体培地に酵母を植菌し、３０℃、一夜の前培養を行った。培養液のうちの１ｍｌを２０ｍｌのＹＰＤ液体培地に植菌し、３０℃で４〜６時間、ＫＵ（Ｋｌｅｔｔ  ｕｎｉｔ）値が６０前後になるまで培養した。培養液のＯＤ６００値を測定し、測定値から菌体数が２×１０８ｃｅｌｌｓになるように培養液の量を計算して計りとり、５０ｍｌの遠心チューブに移した。室温で３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った後、沈殿を１０ｍｌのＴＥに懸濁し、同様に室温で３，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行った。沈殿を１ｍｌのＴＥに懸濁して１ｍｌの０．２Ｍ  酢酸リチウム溶液を加え、３０℃で１時間培養した（コンピテント細胞作製終了）。作製したコンピテント細胞を２００μｌずつ１．５ｍｌのチューブに分注し、それにそれぞれ５μｇ分のＤＮＡを加え、氷上で３０分間静置した。２００μｌの７０％  ＰＥＧ４０００を加えてよく混合し、３０℃で１時間インキュベートした後、４２℃で５分間のヒートショックを行った。その後すぐに４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、沈殿を前もって氷上で冷やしておいた１ｍｌの滅菌水に懸濁した。４℃、１２，０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、沈殿を冷却した１００μｌの滅菌水に懸濁した後、ＣＳＭ−ＴＲＰ固形培地にまき、３０℃で３〜５日間培養した。なお、ＫＵ値は、Ｋｌｅｔｔ  Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ光電光度計（Ｋｌｅｔｔ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社製）により測定した。
【０１０９】
（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウエスタンブロッティング
▲１▼タンパク質の調製（アルカリ−ＴＣＡ−ＳＤＳ法）
５ｍｌの培養液をエッペンドルフ（登録商標）チューブに移して１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心することによって集菌し、それを２、３回繰り返した。沈殿を１．２５ｍｌの滅菌水に懸濁し、１６０μｌのＭｅ−ＮａＯＨを加えて氷上に１０分間静置した。１４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心後、上清をピペットマンを用いて完全に除去し、沈殿に１．５ｍｌの冷アセトンを加え、ボルテックスおよび超音波処理で菌体を完全懸濁にした。氷上に１０分間静置した後、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して沈殿を回収し、エッペンドルフチューブのふたを開けてしばらく室温に静置し、アセトンをとばした（アセトン洗浄）。アセトン洗浄をもう一度行った後、沈殿を１５０μｌの１％  ＳＤＳ／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  バッファー（ｐＨ６．８）に溶解し、ｐＨ試験紙でｐＨが中性かアルカリ性であることを確認した後、超音波処理で沈殿を溶解した。９５℃、３分間加熱した後、１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収し、Ｌｏｗｒｙ法を用いてタンパク質の量を測定した。
【０１１０】
▲２▼Ｌｏｗｒｙ法
本法については、「Ｌｏｗｒｙ，  Ｏ．  Ｈ．，  Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，  Ｎ．  Ｊ．，  Ｆａｒｒ，  Ａ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｒａｎｄａｌｌ，  Ｒ．  Ｊ．  （１９５１）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３，２６５−２７５」に記載されている。はじめにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いて標準曲線を作成した。ＢＳＡを１０，２０，３０，４０，５０，７０，９０，１１０，１３０μｇ／２００μｌになるようにそれぞれ調整し、そのサンプルに１ｍｌのＣ液を入れてボルテックスし、室温に１０分間静置した。０．１ｍｌのＬｏｗｒｙ試薬を加え、ボルテックス、室温で３０分間静置した後、ＯＤ７５０とＯＤ５００の値を測定し、得られた値から標準曲線を作成した。同様にして目的サンプルのＯＤ７５０とＯＤ５００の値を測定し、標準曲線に照らし合わせてタンパク質の量を決定した。
【０１１１】
▲３▼ゲルの作製、準備および電気泳動
本法の実施には電気泳動装置ＭＯＤＥＬ  ＢＥ−２３０（ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ社製）を用いた。分離ゲルは７％と１０％のものをそれぞれ用いた。ガラス平板、ガラスプレート、パッドを７０％エタノールできれいにふき取った後、それらをクリップでとめ、分離ゲルに１０％  ＡＰＳ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ）を加えてプレートに流し込み、その上に１ｍｌの滅菌水を流し込んだ。室温で３０分間静置した後、滅菌水を捨てて残った水分をろ紙を用いて取り除いた後、濃縮ゲルに１０％  ＡＰＳを加えてプレートに流し込み、コ―ムを差し込んで室温で３０分間静置した。分離ゲルおよび濃縮ゲルの組成はＬａｅｍｍｌｉ，  Ｕ．  Ｋ．  （１９７０）  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５，１９７０もしくは新生化学実験講座１．タンパク質Ｉ  分離・精製・性質，  日本生化学会  編，  東京化学同人（１９９７）に記載されている。
【０１１２】
作製したゲルのコームをはずし、小さい薬さじで残ったゲルをかきとり、コームの穴に残ったゲルを蒸留水で洗った。パッドをはずし、クリップで泳動層の上層と一緒に両端をとめ、泳動層の下層に泳動バッファーを入れて上層を下層にはめた。上層に新しい泳動バッファーを入れ、マーカーとサンプルをアプライした後、コードを接続して３０ｍＡの電流で泳動を行った。泳動終了後、クリップをはずして分離ゲルのみを回収してタッパーに移した。
【０１１３】
▲４▼ウエスタンブロッティング
Ｅｌｅｃｔｒｏ  ｂｌｏｔｔｉｎｇバッファーにひたしたゲルと同じ大きさのろ紙６枚とニトロセルロース膜をウエスタンブロッティング用の電極板にろ紙３枚、ゲル、ニトロセルロース膜、ろ紙３枚の順に重ね、１００ｍＡで１時間、電流を流した。電流を流し終わった後、ニトロセルロース膜をプラスチックケースに移し、ＴＰＢＳ中で一時間振とうし（２０分おきに液を交換）、５ｍｌのＴＰＢＳに５μｌの一次抗体を加えて一時間振とうした。ＴＰＢＳで３０分間振とうした後（１０分おきに液を交換）、５ｍｌのＴＰＢＳに５μｌの２次抗体を加え、１時間振とうした。ＰＢＳで３０分間振とうした後（１０分おきに液を交換）、６ｍｇの４−クロロ−１−ナフトールを２ｍｌのメタノールに溶解し、１０ｍｌのＰＢＳと５μｌのＨ２Ｏ２を加えたものにニトロセルロース膜を入れ、手で振とうして発光させた。滅菌水で１５〜３０分間振とうした後、ろ紙とアルミホイルに包んで保存した。
【０１１４】
（８）酵母の呼吸能欠損株（ρ−）の取得
５ｍｌの２５μｇ／ｍｌ  エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）添加ＳＤ培地（０．６７％  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ＋２％  Ｇｌｕｃｏｓｅ）に酵母親株（ρ＋）を植菌し、ｆｕｌｌ  ｇｒｏｗｔｈまで３０℃で３日間培養した。その培養液から０．１ｍｌとって新しいＥｔＢｒ添加ＳＤ培地に植え継ぎ、ｆｕｌｌ  ｇｒｏｗｔｈまで３０℃で３日間培養した後、滅菌水で希釈してＹＰＤプレートに塗布接種し、３０℃で３日間培養した。得られたシングルコロニーをＹＰＤプレートとＹＰグリセロールプレートに植え継ぎ、呼吸能欠損株（ρ−）の取得を確認した。
【０１１５】
実施例１  酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｔｏｂ（ｈｔ          ｏｂ）遺伝子の発現
本実施例ではｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子を酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｒｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
【０１１６】
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＴＲＰをサブクローニングに使用した。また、ｔｏｂ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂ（ｐＭＥ１８ＳのＥｃｏＲＩ部位にｔｏｂ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
【０１１７】
（１）ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−  ｔｏｂの作製
ｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＴＲＰについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐＭＥ１８Ｓ−ｔｏｂをテンプレートとし、
2004313101.tif 000003
を用いてＰＣＲを行い、ｔｏｂ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＴＲＰについてもＢａｍＨＩとＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｔｏｂ遺伝子とｐＥＳＣ−ＴＲＰの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。
【０１１８】
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＴｏｂタンパク質の発現および生育実験
作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＴＲＰ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってトリプトファン要求性を持つ形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｇｌｃ（２％）培地にコロニーを植菌して前々培養を行った。前々培養を３０℃で１６２時間行った時点で培養液から０．１ｍｌとって５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｒａｆ（２％）培地に植え継ぎ、さらに前培養を１２２時間行った後、培養液から０．１ｍｌとって２本づつの５ｍｌのＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｒａｆ（２％）培地とＣＳＭ−ＴＲＰ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地にそれぞれ植え継ぎ、生育を観察した。ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収を６９時間培養時点で行った。１０％のアクリルアミドゲルを用いて５０μｇ分のタンパク質を泳動し、次いでニトロセルロース膜に転写した。Ｔｏｂタンパク質の検出にはｍｙｃ抗体を用いた。ｍｙｃ抗体とはＴｏｂタンパク質のＣ末端に付与したｍｙｃタグに対する特異的抗体である。
【０１１９】
（３）Ｔｏｂタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
酵母用のタンパク質発現ベクターであるｐＥＳＣベクターはＧＡＬ１プロモーターを持ち、ガラクトースの存在下においてのみ目的遺伝子を発現させる。そこで、ガラクトースの存在下に形質転換酵母を培養しＴｏｂタンパク質の発現を誘導した。
【０１２０】
ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）について培養時間に対してＫＵ値をプロットし増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を図１に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を図２に示す。
【０１２１】
なお、本明細書において図中、各プラスミド名は当該プラスミドにより形質転換した酵母の結果であることを示し、各プラスミド名における数字は当該プラスミドを用いて得られた別個の形質転換酵母であることを示す。
【０１２２】
図１より、Ｔｏｂタンパク質の非発現下（Ｒａｆ）および発現下（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｔｏｂタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−１９、２２、２３（Ｒａｆ）に比べｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−１９、２２、２３（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂ−１９、２２、２３（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、図２に示すように、Ｔｏｂタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＴｏｂタンパク質が捉えられた。
【０１２３】
実施例２  酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｃａｆ（ｈｃａｆ１）遺伝子の発現
本実施例ではｃａｆ（ｈｃａｆ１）遺伝子を酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ    ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＣａｆタンパク質を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｈｃａｆ１遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
【０１２４】
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡをサブクローニングに使用した。また、ｈｃａｆ１遺伝子は、該遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１（ｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位にｈｃａｆ１−ｍｙｃ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
【０１２５】
（１）ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１の作製
ｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１を用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＵＲＡについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したプラスミドｐｃＤＮＡ３−ｈｃａｆ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡについてもＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｈｃａｆ１遺伝子とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。
【０１２６】
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＣａｆタンパク質の発現および生育実験
実施例１と同様にしてＣａｆタンパク質の発現および生育実験を行った。なお、培地はＣＳＭ−ＵＲＡ培地を使用した。また、ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収は４５時間培養時点で行った。
【０１２７】
（３）Ｃａｆタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
実施例１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を図３に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を図４に示す。
【０１２８】
図３より、Ｃａｆタンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｃａｆタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１−１３、１４、１５、１６（Ｒａｆ）に比べｐＥＳＣ−  ＵＲＡ−ｈｃａｆ１−１３、１４、１５、１６（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＥＳＣ−  ＵＲＡ−ｈｃａｆ１−１３、１４、１５、１６（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、図４に示すように、Ｃａｆタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＣａｆタンパク質が捉えられた。
【０１２９】
実施例３  酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子の同時発現
本実施例ではｔｏｂ（ｈｔｏｂ）遺伝子とｃａｆ（ｈｃａｆ１）遺伝子とを酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ    ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に同時に導入することにより菌体内においてＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質とを共に発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、以前構築したｔｏｂ遺伝子導入用プラスミドとｈｃａｆ１遺伝子導入用プラスミドとを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
【０１３０】
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の発現および生育実験
ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）をｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂとｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１で同時に形質転換すること以外は実施例１と同様にしてＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の同時発現および生育実験を行った。なお、ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収は１４４時間培養時点で行った。
【０１３１】
（３）Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質の同時発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
実施例１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を図５に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を図６に示す。なお、図中、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ｔｏｂをｐＴｔｏｂと、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｈｃａｆ１をｐＵｈｃａｆ１と、略して記載する。
【０１３２】
図５より、前記両タンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、両タンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＴｔｏｂ＋ｐＵｈｃａｆ１−１３、１５、１６、１７（Ｒａｆ）に比べｐＴｔｏｂ＋ｐＵｈｃａｆ１−１３、１５、１６、１７（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＴｔｏｂ＋ｐＵｈｃａｆ１−１３、１５、１６、１７（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、Ｔｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質を酵母において同時に発現させた場合、それらを各々単独で発現させる場合よりも酵母の生育の低下が増大することが分かる。図６に示すように、両タンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＴｏｂタンパク質とＣａｆタンパク質が捉えられた。
【０１３３】
実施例４  酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの呼吸能欠損株におけるｌｃｋ遺伝子の発現
本実施例ではｌｃｋ遺伝子を酵母Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ    ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）に導入することにより菌体内においてＬｃｋタンパク質（チロシンキナーゼ）を発現させ、それによって引き起こされる酵母の生育状態の変化を観察した。すなわち、ｌｃｋ遺伝子導入用プラスミドを構築し、構築したプラスミドを用いて、前記方法により得られた酵母の呼吸能欠損株を形質転換し、その生育状態を観察した。
【０１３４】
なお、ベクターとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡをサブクローニングに使用した。また、ｌｃｋ遺伝子は、該遺伝子を含むｐＭＥ１８ＳＨ−ｌｃｋ（ｐＭＥ１８ＳＨ〔ｐＭＥ１８Ｓの元のＨｉｎｄＩＩＩ部位をつぶして、その後ＥｃｏＲＩ部位をＨｉｎｄＩＩＩ部位に改変したベクター〕のＨｉｎｄＩＩＩ部位にｌｃｋ遺伝子を挿入したもの）のものを増幅して用いた。
のものを増幅して用いた。
【０１３５】
（１）ｐＵｌｃｋの作製
ｐＭＥ１８ＳＨ−ｌｃｋを用いて大腸菌ＪＭ１０９の形質転換を行い、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。同様にｐＥＳＣ−ＵＲＡについても大腸菌の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。調製したｐＭＥ１８ＳＨ−ｌｃｋをテンプレートとし、
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を用いてＰＣＲを行い、ｌｃｋ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩで処理した後、ｋｉｎａｓｅによって末端のリン酸化を行い、その後ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。ｐＥＳＣ−ＵＲＡをＢａｍＨＩで処理した後、Ｋｌｅｎｏｗ酵素によって末端の平滑化を行った。それをＳａｌＩで処理した後、ゲルからの切り出しによってＤＮＡを回収した。これらの実験操作によって回収したｌｃｋ遺伝子とｐＥＳＣ−ＵＲＡの断片を用いてライゲーションを行い、大腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体をミニプレップによって確認した後、プラスミドＤＮＡの調製（中量抽出）を行った。遺伝子導入部分の両側からシークエンスを行うことにより、導入遺伝子の塩基配列の確認を行った。
【０１３６】
（２）ＹＰＨ５００−１２株（ρ−）におけるＬｃｋタンパク質の発現および生育実験
作製したプラスミドを用いて酢酸リチウム法によりＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の形質転換を行った。得られた形質転換体を別のＣＳＭ−ＵＲＡ固形培地に植え継いで３０℃で２〜３日間培養し、それによってウラシル要求性を持たない形質転換体を選抜した。そのプレートから５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）培地にコロニーを植菌し、前培養を３０℃で９６時間行った後、培養液から０．１ｍｌとって２本づつの５ｍｌのＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）培地とＣＳＭ−ＵＲＡ  Ｒａｆ（２％）＋Ｇａｌ（２％）培地にそれぞれ植え継ぎ、生育を観察した。ウエスタンブロッティング用のタンパク質の回収を４７時間培養時点で行った。７．５％のアクリルアミドゲルを用いて５０μｇ分のタンパク質を泳動し、次いでニトロセルロース膜に転写した。Ｌｃｋタンパク質の検出にはｍｙｃ抗体を用いた。
【０１３７】
（３）Ｌｃｋタンパク質の発現によるＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の生育の低下の解析
実施例１と同様にしてＹＰＨ５００−１２株（ρ−）の増殖曲線を作成した。当該増殖曲線を図７に示す。また、ウエスタンブロッティングの結果を図８に示す。
【０１３８】
図７より、Ｌｃｋタンパク質の非発現下および発現下で各形質転換酵母が概してバラツキなく一様な生育を示すことが分かる。また、Ｌｃｋタンパク質の非発現下と比べ、発現下で明らかに生育が低下することが分かる。すなわち、ｐＵｌｃｋ  −２、３、４（Ｒａｆ）に比べｐＵｌｃｋ  −２、３、４（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）は、世代時間および増殖速度を求めた場合、世代時間が長くなり、増殖速度が小さくなることから、ｐＵｌｃｋ  −２、３、４（Ｒａｆ＋Ｇａｌ）では生育の低下が生じたと判定できる。また、図８に示すように、Ｌｃｋタンパク質の発現条件下にある酵母では発現したＬｃｋタンパク質が捉えられた。
【０１３９】
配列表フリーテキスト
配列番号：５は、ｔｏｂ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
【０１４０】
配列番号：６は、ｔｏｂ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
【０１４１】
配列番号：７は、ｌｃｋ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
【０１４２】
配列番号：８は、ｌｃｋ遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列である。
【０１４３】
【発明の効果】
本発明により、迅速かつ低コストな新規医薬品の開発を可能にする、新規医薬品の開発プロセスの内、特に探索研究の高効率化を図ることができる、新規医薬品開発のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法が提供される。従って、例えば、▲１▼短時間で低コストな新規医薬品の開発、▲２▼短時間で低コストな既開発品・開発中断品の再評価、▲３▼早い段階での医薬品候補化合物の副作用予測、並びに▲４▼臨床試験での適切な被験者の選択が可能となる。
【０１４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
【図２】図２は、６９時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３】図３は、ｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
【図４】図４は、４５時間培養した時点でのｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５】図５は、ｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
【図６】図６は、１４４時間培養した時点でのｔｏｂ遺伝子とｈｃａｆ１遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図７】図７は、ｌｃｋ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の増殖曲線を示す図である。
【図８】図８は、４７時間培養した時点でのｌｃｋ遺伝子を導入したＹＰＨ５００−１２株（ρ−）形質転換体の培養液のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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