(57)【要約】【課題】スポンジ状培地を補強し、形態保持を可能にする生体材料用多孔性支持体、並びにそれを用いた細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体、細胞の培養方法及び細胞培養キットを提供する。【解決手段】生体適合性材料又は生分解性材料からなる中空円筒形状の生体材料用多孔性支持体；前記生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入してなる細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体；前記生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入する工程、生体材料用多孔性支持体を培養プレートのウェル内に収納する工程、培養すべき細胞をスポンジ状培地に添加する工程、及び前記細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法；並びに前記生体材料用多孔性支持体及びスポンジ状培地を含む細胞培養用キット。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性材料又は生分解性材料からなる中空円筒形状の生体材料用多孔性支持体。
【請求項２】
円筒側面に孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を有する請求項１記載の生体材料用多孔性支持体。
【請求項３】
孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を円筒側面の表面積の０〜８０％を占めるように有する請求項１記載の生体材料用多孔性支持体。
【請求項４】
中空円筒形状の外径が２〜２０ｍｍ、外径と内径の差が平均０．５〜５ｍｍであり、長さが１〜２０ｍｍである請求項１〜３のいずれか１項に記載の生体材料用多孔性支持体。
【請求項５】
生体適合性材料がアパタイトである請求項１〜４のいずれか１項に記載の生体材料用多孔性支持体。
【請求項６】
細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体として用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体材料用多孔性支持体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入してなる細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入する工程、生体材料用多孔性支持体を培養プレートのウェル内に収納する工程、培養すべき細胞をスポンジ状培地に添加する工程、及び前記細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の生体材料用多孔性支持体及びスポンジ状培地を含む細胞培養用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体材料の培養、及び生体への埋め込みに等に用いられる生体材料用多孔性支持体、並びにそれを用いた細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体、細胞の培養方法及び細胞培養キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
最近、高齢化社会に伴い、硬組織代替材料への要望が高まっている。従来のセラミックス材料としては主としてアパタイト焼結体や代謝性アパタイト複合体が用いられてきた。
【０００３】
しかしながら、強度の高い焼結体は代謝性がなく、半永久的に生体内に残存し、代謝性のあるものは強度に乏しい。また、細胞との親和性を増すために、多孔質体が開発されてきた（例えば、特許文献１参照）が、孔径が小さいため、細胞の侵入が困難であった。
【０００４】
また、細胞外マトリックスからなるスポンジ状培地を用いる試みがなされている（例えば、特許文献２参照）が、強度が不十分なため、形態保持が困難であった。
本出願に関する先行技術文献情報として次のものがある。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−２８２２８５号公報
【特許文献２】
特開平６−２７７０３７号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
スポンジ状培地を補強し、形態保持を可能にする生体材料用多孔性支持体、並びにそれを用いた細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体、細胞の培養方法及び細胞培養キットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）生体適合性材料又は生分解性材料からなる中空円筒形状の生体材料用多孔性支持体。
（２）円筒側面に孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を有する前記（１）に記載の生体材料用多孔性支持体。
（３）孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を円筒側面の表面積の０〜８０％を占めるように有する前記（１）に記載の生体材料用多孔性支持体。
（４）中空円筒形状の外径が２〜２０ｍｍ、外径と内径の差が平均０．５〜５ｍｍであり、長さが１〜２０ｍｍである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の生体材料用多孔性支持体。
（５）生体適合性材料がアパタイトである前記（１）〜（４）のいずれかに記載の生体材料用多孔性支持体。
（６）細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体として用いられる前記（１）〜（５）のいずれかに記載の生体材料用多孔性支持体。
（７）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入してなる細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体。
（８）前記（１）〜（６）のいずれかに記載の生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入する工程、生体材料用多孔性支持体を培養プレートのウェル内に収納する工程、培養すべき細胞をスポンジ状培地に添加する工程、及び前記細胞を培養する工程を含む細胞の培養方法。
（９）前記（１）〜（６）のいずれかに記載の生体材料用多孔性支持体及びスポンジ状培地を含む細胞培養用キット。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の生体材料用多孔性支持体は、例えば代用骨、人工歯根、細胞培養プレート等の生体材料に適用することができる。
本発明の生体材料用多孔性支持体は、生体適合性材料又は生分解性材料からなる。
【０００９】
本発明で用いる生体適合性材料としては、際立った炎症反応を起こすものでなければ、特に制限はないが、好ましくはアパタイト、例えば、溶解性がきわめて高い結晶性の低いアパタイト、骨類似の組成や結晶性を有する炭酸アパタイト等が挙げられる。
【００１０】
本発明で用いる生分解性材料としては、生体内で酵素的又は非酵素的に分解され、分解物が毒性を示さず、代謝吸収されるものであれば特に制限はないが、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリα−アミノ酸、コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸が挙げられる。
【００１１】
前記生体適合性材料又は生分解性材料からなる中空円筒形状の多孔性支持体は、例えば、次のようにして製造することができる。
【００１２】
アパタイトのように焼結が可能な材料については、アパタイト粉末とパラフィンワックスを重量比で約１：１の割合で混合し、アセトン等のパラフィンワックスを溶解する溶媒を添加する。更に、加熱して溶媒を蒸発させアパタイト粉末にパラフィンワックスを付着させる。得られたアパタイト粉末を円筒形状の金型に充填し、プレス成形して円筒形状の多孔性支持体の原型を得る。多孔性支持体の原型は６００℃程度で脱脂加熱した後、１０００℃以上で焼結して製造する。また、生分解性材料のように加熱すると分解する材料については、プレス成形のみで製造する。
【００１３】
本発明の多孔性支持体は、円筒側面に孔径５０〜１０００μｍの貫通孔を有することが好ましい。前記貫通孔の孔径を５０μｍ以上にすることにより、細胞が通過するのが容易になり、１０００μｍ以下にすることにより、一定の形態を保持するのが容易になる。前記貫通孔の孔径は、５００〜１０００μｍであることが好ましい。
【００１４】
前記貫通孔を形成する割合は、円筒側面の表面積の０〜８０％を占める程度とすることが好ましく、５０〜８０％を占める程度とすることが更に好ましい。前記表面積は、計算により求めることができる。また、貫通孔の総面積Ｓは、スケール付きルーペ等で円筒の側面を観察し、貫通孔の孔径２ｒと個数ｎを測定し、計算式Ｓ＝πｒ２×ｎにより求めることができる。
【００１５】
前記の貫通孔は、例えば、焼結後の円筒形状多孔性支持体に直接マイクロドリル加工によって形成することが可能であり、また加熱脱脂前の多孔性支持体の原型に直接マイクロドリル加工によって貫通孔を形成した後に脱脂と焼結することにより形成してもよい。
【００１６】
本発明の多孔性支持体は、孔径５０〜１０００μｍの貫通孔以外に孔径が１〜１０００μｍの気孔を０〜８０％の気孔率で有していてもよい。前記気孔率は、［（アルキメデス法により求めた比重ｇ／ｃｍ３）／（アパタイトの理論密度３．１６ｇ／ｃｍ３）］×１００（％）により、あるいは３次元コンピュータ・トモグラフィー（３Ｄ−μＣＴ）により求めることができる。
【００１７】
本発明の多孔性支持体において、中空円筒形状の外径が２〜２０ｍｍ、外径と内径の差（厚み）が平均０．５〜５ｍｍであり、長さが１〜２０ｍｍであることが好ましく、中空円筒形状の外径が３〜１０ｍｍ、外径と内径の差（厚み）が平均０．５〜１ｍｍであり、長さが１〜１０ｍｍであることが更に好ましい。
【００１８】
本発明の多孔性支持体は、細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体として用いることができる。この場合、本発明の多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入して用いることが好ましい。
【００１９】
ここで用いるスポンジ状培地とは、生体親和性が良好で、代謝性を有するポーラスな材料をいう。スポンジ状培地の材質としては、例えばアパタイト・コラーゲン、コラーゲン、ゼラチン、セルロースが挙げられる。
【００２０】
スポンジ状培地の孔径は、好ましくは１００〜３００μｍである。
前記スポンジ状培地は、例えば、次のようにして製造することができる。
【００２１】
コラーゲン溶液を中性にした後、アパタイト粉末を混合する。このゾル状溶液を前述の多孔性支持体に注入した後、凍結乾燥する。
【００２２】
本発明の細胞の培養方法は、前記生体材料用多孔性支持体の中空内にスポンジ状培地を挿入する工程、生体材料用多孔性支持体を培養プレートのウェル内に収納する工程、培養すべき細胞をスポンジ状培地に添加する工程、及び前記細胞を培養する工程を含む。
【００２３】
本発明の細胞の培養方法は、例えば骨芽細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に適用することができる。
【００２４】
本発明の細胞の培養方法においては、培養ウェル内に前記スポンジを挿入した多孔性支持体を固定し、細胞を含む培養液を注入する。場合によっては、予め細胞を吸収させた後、ウェル内に固定し培養液を注入する。
【００２５】
本発明の生体材料用多孔性支持体は、スポンジ状培地、更に必要に応じて培養プレートと組み合わせて細胞培養用キットとして用いることができる。
【００２６】
【実施例】
次に、実施例にて本発明を更に詳細に説明する。
（実施例１）
アパタイト２．５ｇ、パラフィンワックス２．５ｇ及び溶媒２０ｇ（純度９８％のアセトン）を室温にて混合し、溶媒を蒸発除去した後、この混合物を約０．２ｇ取り出しプレス成形により内径４ｍｍ、外径７．４ｍｍ、長さ２．４ｍｍからなるアパタイト支持体原型を作成した。その側面にマイクロドリル加工によって０．６ｍｍ径の細孔を穿孔した後、昇温速度２℃／分で６２０℃に加熱し２時間保持した後、徐冷することで加熱脱脂した。次に、昇温速度１０℃／分で１２００℃に加熱し２時間保持した後、徐冷することで焼結した。最終的に内径４．０ｍｍ、外径６．３ｍｍ、長さ２．０ｍｍの多孔性支持体を作成した。
【００２７】
一方、酸性コラーゲン溶液を水酸化ナトリウムにより中和後、ただちに炭酸アパタイトを混合した。このゾル溶液を前記燒結で得られた多孔性支持体に注入後、凍結乾燥を行い内部をスポンジ化した。
【００２８】
（実施例２）
下記に示す処理手順で、実施例１で作製した円柱状アパタイトフレームに骨芽細胞様細胞の培養を行った。
０．５ｗｔ％酸性アテロコラーゲン水溶液を０．０５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和しゲル化したコラーゲンとｐＨ７．４、６０℃で合成した炭酸アパタイトとの混合物（炭酸アパタイトの配合量は７０ｗｔ％）を、実施例１の円柱状アパタイトフレームに流し込み−８０℃で予備凍結を行った後、１２時間凍結乾燥を行った。
【００２９】
作製された内部にスポンジ状構造を有するフレーム状複合体に、骨芽細胞様細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を各５万個／２００μｌ播種した。１０％血清含有の培養液中（αＭＥＭ、５０ｍｇペニシリン、５０ｍｇストレプトマイシン、１５０ｍｇグルタミン酸）で培養し、培養液交換を２日毎に行った。各培養期間の試料を処理し、光学顕微鏡及び走査型電子顕微鏡観察に供した。その結果、貫通孔及びスポンジ表面に骨芽細胞様細胞が増加しているのが判明した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、強度が不十分であったスポンジ状培地を補強し、形態保持を可能にすることができ、細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体として用いられる生体材料用多孔性支持体、並びにそれを用いた細胞培養培地又は生体材料埋め込み用支持体、細胞の培養方法及び細胞培養キットを提供することができる。