(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なプラスチック分解酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素もしくは該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法を提供する。【解決手段】分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチドを提供するものであり、また、該酵素もしくは該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有する、ペニバチルス属の微生物由来、プラスチック分解酵素：
（ａ）プラスチック分解能を有し；
（ｂ）分子量が、２１６６１であり；
（ｃ）至適温度は、４５〜５５℃であり；
（ｄ）至適ｐＨは、１０である。
【請求項２】
請求項１記載の酵素を生産する方法であって、
ペニバチルス属の微生物を培養する工程：
前記微生物から前記酵素を分離・精製する工程：
からなる、前記酵素の生産方法。
【請求項３】
配列番号１に示すペプチド配列、または該ペプチド配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するペプチド配列であって、プラスチック分解酵素活性を維持したペプチド配列からなる、プラスチック分解酵素。
【請求項４】
請求項３に記載のプラスチック分解酵素であって、配列番号１に示すペプチド配列の最初のアミノ酸からＡｌａ−３１までが欠失したペプチド配列、または該ペプチド配列に１ないし数個のアミノ酸の、欠失、置換、挿入または付加を有するペプチド配列であって、プラスチック分解酵素活性を維持したペプチド配列からなる、プラスチック分解酵素。
【請求項５】
（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）に示す塩基配列を含む、ポリヌクレオチド：
（ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の最初のアミノ酸からＡｌａ−３１までが欠失したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、またはそれらの相補配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）プラスチック分解活性を有するポリペプチドをコードし（ｆ）の塩基配列の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加された配列、またはその相補配列からなるポリヌクレオチド；
（ｈ）ストリンジェントな条件下で（ｆ）または（ｇ）の塩基配列にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
プラスチックが分子構造中にエステル結合を有するものである、請求項１、３または４記載の酵素。
【請求項７】
プラスチックがポリウレタンである、請求項１、３または４記載の酵素。
【請求項８】
プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、またはポリエチレンサクシネートである、請求項１、３または４記載の酵素。
【請求項９】
プラスチックが分子構造中にエステル結合を有するものである、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
プラスチックがポリウレタンである、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、またはポリエチレンサクシネートである、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１、３または４記載の酵素をプラスチックと接触させる工程を含む、プラスチックの分解方法。
【請求項１３】
プラスチックが分子構造中にエステル結合を有するものである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
プラスチックがポリウレタンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、またはポリエチレンサクシネートである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
請求項１、３または４記載の酵素を発現する遺伝子組換え細胞をプラスチックと接触させる工程を含む、プラスチックの分解方法。
【請求項１７】
該細胞が大腸菌である、請求項１６記載のプラスチックの分解方法。
【請求項１８】
プラスチックが分子構造中にエステル結合を有するものである、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
プラスチックがポリウレタンである、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項２０】
プラスチックがポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、またはポリエチレンサクシネートである、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子組換え酵素の生産方法であって、
（ｉ）請求項１、３または４記載の酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを含有する宿主細胞を、該宿主細胞の生育に適した条件下で培養する工程；
（ｊ）該酵素を該宿主細胞から分離・精製する工程；
を含む、遺伝子組換え酵素の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なプラスチック分解酵素およびその酵素をコードするポリヌクレオチド、該酵素もしくは該酵素を発現している微生物を利用したプラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではなく、プラスチックを分解することのできる微生物に関する報告は限られている。
【０００３】
更に、プラスチックを分解することのできる酵素に関する報告は、アシドボラックスデラフィルディ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ）由来のポリブチレンサクシネート分解酵素（Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，  Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ  Ｔ，  Ｓｈｉｇｅｎｏ−Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，  Ｎｏｍｕｒａ  Ｎ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ，  Ｎａｋａｈａｒａ  Ｔ  （２００２）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＳ−３．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９３：  ２４５〜２４７）、コマモナスアシドボランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）由来のポリウレタン分解酵素、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属菌（Ｐｒａｎａｍｕｄａ  Ｈ，  Ｔｓｕｃｈｉｉ  Ａ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ  （２００１）  Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １：  ２５〜２９，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，  Ａｂｅ  Ｎ，  Ｋａｍｉｏ  Ｙ  （２００１）  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｏｉｌ  ｉｓｏｌａｔｅ，  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１０４−１．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．  ６７：  ３４５〜３５３）およびバチラススミッチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）由来（Ｓａｋａｉ  Ｋ，  Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，  Ｉｗａｍｉ  Ａ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｍ  （２００１）  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｏｓｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９２：  ２９８〜３００）のポリ乳酸分解酵素に限られている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，  Ｎａｋａｊｉｍａ−Ｋａｍｂｅ  Ｔ，  Ｓｈｉｇｅｎｏ−Ａｋｕｔｓｕ  Ｙ，  Ｎｏｍｕｒａ  Ｎ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ，  Ｎａｋａｈａｒａ  Ｔ著、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｄｅｌａｆｉｅｌｄｉｉ  ｓｔｒａｉｎ  ＢＳ−３．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９３：  ２４５〜２４７、２００２年
【非特許文献２】
Ｐｒａｎａｍｕｄａ  Ｈ，  Ｔｓｕｃｈｉｉ  Ａ，  Ｔｏｋｉｗａ  Ｙ  著、Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １：  ２５〜２９、２００１年
【非特許文献３】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，  Ｔｏｍｉｔａ  Ｔ，  Ａｂｅ  Ｎ，  Ｋａｍｉｏ  Ｙ  著、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｏｉｌ  ｉｓｏｌａｔｅ，  Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｋ１０４−１．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｌｏｂｉｏｌ．  ６７：  ３４５〜３５３、２００１年
【非特許文献４】
Ｓａｋａｉ  Ｋ，  Ｋａｗａｎｏ  Ｈ，  Ｉｗａｍｉ  Ａ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｍ，  Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｍ  著、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐｏｓｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９２：  ２９８〜３００、２００１年
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、プラスチックを分解することのできる酵素、および該その酵素をコードするポリヌクレオチド、更には該酵素もしくは該酵素を発現する微生物を利用したプラスチックの分解方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する、平成１４年１１月１４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたペニバチルスアミロリチカス  （Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０４）が生産する、プラスチック分解能を有する酵素、該酵素をコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを組み込んだ微生物にプラスチック分解能を有する酵素を発現させ、該酵素を精製取得する方法である。尚、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物がプラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。一方、プラスチック分解活性を有するペニバチルス属菌について、同一出願人による「発明の名称：新規プラスチック分解菌」の同日特許出願に記載されている。
【０００７】
更に本発明は、該酵素もしくは該酵素を発現する微生物を用いるプラスチックの分解方法である。
本発明の酵素は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する。より具体的には、本発明の酵素は、ペニバチルスアミロリチカスに由来する、新規なプラスチック分解酵素であり、エステラーゼの一種である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
酵素
本発明の酵素は、下記の性質を有する。
（ａ）プラスチック分解能を有し：
（ｂ）分子量が、２１６６１であり：
（ｃ）至適温度は、４５〜５５  ℃であり：
（ｄ）至適ｐＨは、１０である。
【０００９】
本発明の酵素は２０１のアミノ酸から構成され、分子量２１，６６１のポリペプチドであり、配列番号１のアミノ酸番号１−２０１で示されるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列は、配列番号２に記載されている塩基配列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１０】
尚、配列番号１のオープンリーディングフレームはシグナルペプチド部分を有しており、その切断点は配列番号１のＡｌａ−３１とＡｌａ−３２の間である。このことから成熟型酵素は１７０のアミノ酸からなる分子量１８，２３２のポリペプチドである。本酵素はプラスチック以外にエステラーゼの活性測定用の基質であるパラ−ニトロフェノールアセテート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）に対しても分解活性が認められることから、エステラーゼの一種であると考えられる。
【００１１】
更に、ＤＤＢＪデータベースを用いた本酵素および、それをコードするポリヌクレオチドのホモロジー解析の結果、本酵素はアミノ酸レベルでバチルスピュミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）のリパーゼ、バチルスサブチルス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリパーゼ、およびガラクトマイセスジェオトリカム（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ）のリパーゼとそれぞれ５１，  ４９，  ４８％の相同性が認められる。また、本酵素にはＢａｃｉｌｌｕｓ属菌のリパーゼに見られる共通配列Ａ−Ｘ１−Ｓ−Ｘ２−Ｇが認められる（配列番号１の配列中の１０７−１１０番  Ｘ１；  Ｈｉｓ，  Ｘ２；  Ｍｅｔ）。
【００１２】
本発明のアミノ酸配列には、配列番号１に示したアミノ酸配列、ならびにその類似体および誘導体が含まれる。さらに、他の微生物に由来する対応するアミノ酸相同配列も本発明に包含される。また、配列番号２のヌクレオチド配列がコードするいかなるポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１３】
配列番号１に示すポリペプチドのアミノ酸の一部が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が置換されたポリペプチドも、同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのペプチドも、本発明の酵素に含まれる。また、その様なポリペプチドと配列番号１に示すアミノ酸配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリペプチドも、プラスチック分解反応を触媒するという特徴を有する限り、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
本酵素が分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、およびポリエチレンサクシネートが挙げられる。
【００１５】
ポリ乳酸とは、乳酸を主要成分とする重合体をさし、ポリＬ−乳酸や、ポリＤ−乳酸等のポリ乳酸ホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸共重合体、およびこれらにε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等の他の成分を共重合させたポリ乳酸共重合体、そして上記ポリマー間、および他の成分ポリマーとのブレンド体を含む。その重合方法としては、乳酸からの直接重合法、ラクタイド（乳酸の環状二量体）を介する開環重合法等が知られている。また、本発明の酵素により分解されるポリ乳酸樹脂の数平均分子量は、特に制限はなく、分子量５，０００〜２０，０００のポリ乳酸の分解については実施例に示している。
【００１６】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の酵素により分解されるポリウレタン樹脂の数平均分子量は特に制限はない。
【００１７】
ポリブチレンサクシネートとは、コハク酸とブタンジオールからなる高分子をいう。ポリプロピレンやＰＥＴなみの機械的強度を有し、融点もポリカプロラクトンより高い。成形加工性もポリエチレンに近く、同種の成形加工機が使用できる。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量１４０，０００のポリブチレンサクシネートの分解については実施例に示している。
【００１８】
ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートとは、ポリブチレンサクシネート合成において原料にアジピン酸を加えることにより調製される高分子をいう。融点は９０℃ぐらいにまで下がるが、柔軟性が向上する。包装材や苗のポット、ゴミ袋などに利用されている。本発明の酵素により分解されるポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量１４０，０００および２５０，０００のポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの分解については実施例に示している。
【００１９】
遺伝子
次に本発明の酵素をコードする遺伝子は、配列番号２のオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。例えば配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−６０６で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドである。尚、配列番号２に示す配列は、ＴＴＧが開始コドンとなる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、その縮重を含むことができる。縮重とは、異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ酸がコードされ得る現象をいう。かくして、本発明のプラスチック分解酵素をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は縮重により変化することができる。
【００２１】
本発明には、配列番号２に示したＤＮＡ配列、配列番号２に示したＤＮＡ配列の相補配列に高度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、６８℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．編，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社，およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，ニューヨーク，ｐ．２．１０．３）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。さらに、配列番号２に示したＤＮＡ配列の相補配列に中程度にストリンジェントな条件下で［たとえば０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中、４２℃で洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，前掲）］ハイブリダイズするヌクレオチド配列により、コードされるタンパク質も同じ酵素活性を示すことがありうる。従って、同じ酵素活性を有する限り、それらのヌクレオチド配列も、本発明の範囲に含まれる。
【００２２】
遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有するポリヌクレオチド、あるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドに関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換、付加を行う事により、天然のポリヌクレオチドと同等のあるいは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明はそのような変異ポリヌクレオチドを含むものである。即ち、配列表の配列番号２に示すポリヌクレオチドの一部が挿入、欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドとは、配列番号２に示す塩基配列において、２０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個以下の塩基が置換されたポリヌクレオチドである。また、その様なポリヌクレオチドと配列番号２に示す塩基配列とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の相同性を有する（相同性の計算は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）検索を用いることにより行うことができる。）。その様なポリヌクレオチドも、プラスチックを分解する能力を有するという特徴を有するポリペプチドをコードしている限り、本発明の範囲に含まれる。
【００２３】
酵素の生産方法
本発明の酵素は、ペニバチルス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物を培養し、該微生物中の酵素を分離・精製することにより、あるいは、本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞を培養し、該宿主から酵素を分離・精製することにより、生産することができる。
【００２４】
ペニバチルス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物は、公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。具体的には、代表例として、平成１４年１１月１４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたペニバチルスアミロリチカス  （Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０４）が挙げられる。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌をポリ乳酸の粉末を含む培地の入った試験管に入れ、３０℃にて振とう培養し、一週間ごとに植え継ぎを繰り返した後、エマルジョン化したポリ乳酸を含んだ寒天平板に希釈塗布し、コロニー周辺にプラスチックの分解に伴うクリヤーゾーンの形成が見られた菌を取得することにより行うことができる。
【００２５】
ペニバチルス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、ペニバチルス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無核酸類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。ペニバチルス属に属する微生物の培養は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養により行うことができる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２６】
本発明の酵素を、遺伝子組換え細胞により生産する方法は以下の通りである。まず、ポリヌクレオチド分子を宿主細胞に導入して組換え微生物を形成することができる何れかのベクターに挿入する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。ベクターは染色体外エレメント（例えば、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込むことができる。組込まれたポリヌクレオチド分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくはプラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下とすることができる。ポリヌクレオチド分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことができる。次に、該ベクターを宿主細胞にトランスフェクトして組換え細胞を形成させる。トランスフェクトするための適当な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫、植物または動物細胞を含む。本発明で使用される好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、例えば大腸菌、ペニバチルス属菌、枯草菌、酵母等を含めた、本発明の酵素の発現に適した何れの微生物細胞も含む。更に、該宿主を、該宿主に適した培養条件にて培養することにより、本発明の酵素を含有した遺伝子組換え細胞を得ることができる。該宿主に適した培養条件は、当業者に周知である。
【００２７】
ペニバチルス属に属しプラスチック分解能を有する微生物、あるいは本発明のポリヌクレオチド配列を組み込んだ宿主細胞からの本発明の酵素の分離・精製は、通常細胞からの蛋白質の分離・精製に用いられる方法を用いることにより行うことができる。具体的には、細胞を破壊後、通常用いられる分離精製手段を用いることにより行うことができる。細胞の破壊には、制限的でない例として、超音波処理、高圧ホモジナイザー処理、浸透圧ショック法が挙げられる。分離精製手段は、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。更に、遺伝子組換えによる酵素の生産では、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出し、組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００２８】
プラスチック分解方法
更に、本発明は、本酵素により、もしくは該酵素を発現する微生物を利用したプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する方法を提供する。つまり、本発明のプラスチックを分解する方法は、酵素のプラスチックを分解する作用を利用するもの、該酵素を発現する微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは該酵素を発現する微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。
【００２９】
あるいは、本発明の酵素を発現する微生物菌体を常法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、該酵素を発現する微生物菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００３０】
本発明の酵素を、該酵素を含有する錠剤等として利用に供することもできる。酵素の粗酵素液、粗酵素粉末、または精製酵素の他に、通常酵素錠剤等に用いられる他の成分、例えば安定化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、増量剤、結合剤等を適宜配合してもよい。また、剤型も特に限定されず、用途に応じて散財、顆粒剤、錠剤等の剤型を選択すればよい。
【００３１】
本発明の方法に用いる酵素は、ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１０４）から調製される酵素に限定されるわけではなく、組換えＤＮＡ技術によって創製された微生物、例えば発現ベクターに接続された該酵素をコードするポリヌクレオチドが導入された宿主、例えば大腸菌、ペニバチルス属菌、枯草菌、酵母等により生産された酵素を使用することも可能である。
【００３２】
組換えＤＮＡ技術による微生物の創製は、当該分野において通常用いられている方法により行うことができる。例えば、プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系の構築は、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるｐＥＴ  ｓｙｓｔｅｍを用いて構築することができる。
【００３３】
本発明の方法で使用する酵素は、必ずしも十分に精製する必要はないが、酵素の精製が望まれるときは、通常蛋白質の精製に用いられる方法、例えば塩析、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて用いればよい。一例を示せば、組み換え型酵素のＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するように生産させ、培養菌体を遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出する。組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。
【００３４】
本発明のプラスチックを分解する方法により分解できるプラスチックは、前記した通り、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート、およびポリエチレンサクシネートが挙げられる。
【００３５】
分解に共されるプラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するプラスチックの投入量は、０．０１〜１０重量％が望ましい。添加する酵素あるいは微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してプラスチックに対して湿重量として、酵素の場合は０．００１重量％以上、微生物の場合は０．１重量％以上が好ましい。また、分解に供するプラスチックは、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００３６】
精製酵素あるいは粗精製酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００３７】
本発明の酵素を発現する微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、用いる微生物に適した培地であれば特に制限はないが、炭素源としては、グルコース等、及び該微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無機塩を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００３８】
微生物の有する酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００３９】
本発明において、酵素を発現する増殖中の微生物をプラスチックの分解に利用する場合は、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばプラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００４０】
プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００４１】
培地中のプラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。
【００４２】
【実施例】本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１  染色体ＤＮＡライブラリの作成
クローニングにおいては、遺伝子供与体として前記ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株を用い、宿主菌としてＥ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１０Ｇｏｌｄを、ベクターとしてｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９を用いた。染色体ＤＮＡ抽出はＳａｉｔｏ  ＆  Ｍｉｕｒａの方法（Ｓａｉｔｏ  Ｈ  ａｎｄ  Ｍｉｕｒａ  Ｋ（１９６３）  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｙ  ｐｈｅｎｏｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２，  ６１９−６２９．）に準じた。得られたＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて完全分解し、２−４  ｋｂのフラグメントを回収して、ＨｉｎｄＩＩＩにて切断したｐＵＣ１８に結合した。このプラスミドをＥ．  ｃｏｌｉ  ＸＬ１０Ｇｏｌｄに導入し、検定培地に塗布した。
【００４３】
検定培地としてエマルジョン化した各種プラスチックを含んだ寒天溶液をＬＢ平板上に重層したものを用いて、各種プラスチックの分解活性をコロニー周辺のクリヤーゾーンの形成にて確認した。尚、エマルジョンの作成は以下の方法に従った。各種プラスチック２ｇ  を４０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、４０ｍｇのアニオン界面活性剤であるＰｌｙｓｕｒｆ  Ａ２１０Ｇを含んだ蒸留水２５０ｍｌに加えてホモジナイザー（１０，０００  ｒｐｍ  １０  ｍｉｎ）にてエマルジョン化した。その後、これを８０℃に加熱してジクロロメタンを揮発させた。
【００４４】
ＴＢ−１３株の染色体ＤＮＡの遺伝子ライブラリーを作成し、プラスチック分解能を持ったクローン１株を得た。本クローンはポリ乳酸（和光純薬工業社製）およびポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペート（昭和高分子（株）製のビオノーレ、分子量１４０００）をエマルジョン化した検定培地にクリヤーゾーンを形成した。本プラスミドをｐＬＡ２９とした。ｐＬＡ２９にはＴＢ−１３株由来の約２．９  ｋｂの断片が挿入されていた。この断片の制限酵素地図を図１に示した。プラスチック分解酵素の位置を特定するため、本断片を各種制限酵素で切断し、サブクローニングを行った。得られたクローンのプラスチック分解活性を検討した結果、ｐＬＡ−ｓｓ中の０．９ｋｂの部分に酵素遺伝子がコードされていることが明らかになった。
【００４５】
実施例２  遺伝子配列の決定
ｐＬＡ−ｓｓ中の挿入断片のうちの７３６  ｂｐについて塩基配列をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  シーケンサー  （米国Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定し、得られた配列はＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  ｐｒｏｇｒａｍによって解析した。データベース解析にはＦＡＳＴＡ  および  ＢＬＡＳＴＡプログラムを用いＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ  の遺伝子データベースを利用した。
【００４６】
塩基配列を決定した全９３０塩基配列を配列表の配列番号３に示した。配列表３の１９５から８００番目の塩基がひとつのＯＲＦをコードしていた。ＴＴＧで始まる開始コドンの８塩基上流にはリボゾーム結合領域と見られる配列が認められた。また、−３５，  −１０と思われる領域も存在していた。さらに終始コドンの下流にはステムループ構造が認められた。本断片中には他に合理的なＯＲＦが存在しないことから、本ＯＲＦがプラスチック分解酵素遺伝子本体である。
【００４７】
遺伝子解析の結果より、本酵素は２０１のアミノ酸から構成され、分子量２１，６６１のポリペプチドであることが明らかとなった。また、本酵素はシグナルペプチドを有しており、その切断点はＡｌａ−３１とＡｌａ−３２の間であると推定された。このことから成熟型酵素は１７０のアミノ酸からなる分子量１８，２３２のポリペプチドであると考えられた。
【００４８】
次に、ＤＤＢＪデータベースを用いて本酵素遺伝子のホモロジー解析を行った。本酵素はアミノ酸レベルでバチルスピュミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）のリパーゼ、バチルスサブチルス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリパーゼ、およびガラクトマイセスジェオトリカムのリパーゼとそれぞれ５１，  ４９，  ４８％の相同性が認められた。また、本酵素にはバチルス属菌のリパーゼに見られる共通配列Ａ−Ｘ１−Ｓ−Ｘ２−Ｇが認められた（配列中の１０７−１１０番  Ｘ１；  Ｈｉｓ，  Ｘ２；  Ｍｅｔ）。しかし、これらの酵素ではプラスチックの分解性は報告されていない。本酵素はプラスチック以外にエステラーゼの活性測定用の基質であるパラ−ニトロフェノールアセテートに対しても分解活性が認められたことから、エステラーゼの一種であると考えられた。
【００４９】
実施例３  高発現系の構築  
プラスチック分解酵素遺伝子の高効率発現系を構築するため、現在最も効率的なポリペプチド発現用宿主−ベクター系の一つであるｐＥＴ  ｓｙｓｔｅｍを用いて構築を行った。
【００５０】
得られたポジティブクローンから、プラスチック分解酵素遺伝子本体（リーダーペプチド部分を除く）を含んだポリヌクレオチド断片をＰＣＲ法によって特異的に取り出した。このとき、ポリヌクレオチド断片の両末端にＥｃｏ  ＲＩ  とＮｈｅ  Ｉ  サイトを組み込んだ。また、本酵素遺伝子中のシグナル配列は大腸菌では機能しなかったため、この部分を削除し、ベクターに存在するｐｅｒＢ配列（ペリプラズム内への分泌を可能にする）の下流に本酵素遺伝子本体を直結し、また、Ｃ末端には精製を簡便にするためのＨｉｓ−ｔａｇ配列（ベクターに含まれる）を付与するようにプライマーを設計した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
フォワード５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＣＡＣＧＣＣＡ−３’  ＜配列番号４＞
リバース  ５’−ＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＣＧＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＣＴＴ−３’  ＜配列番号５＞（Ｅｃｏ  ＲＩとＮｈｅ  Ｉサイトを下線で示した。）
ＰＣＲは、９４℃にて２分１サイクル、それから９６℃でそれぞれ１５秒の３０サイクル、６０℃にて３０秒、６８℃にて１分という条件で行った。これをＥｃｏ  ＲＩ  とＮｈｅ  Ｉ  にて切断し、同酵素で切断したプラスミドｐＥＴ２５ｂ（＋）（米国Ｎｏｖａｇｅｎ製）に結合した。作成したプラスミドをｐＬＡ−ＥＮと呼ぶが、それを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、発現系を構築した。
【００５１】
実施例４  高効率発現系を用いた組み換え型プラスチック分解酵素の発現および精製
ｐＬＡ−ＥＮをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだＬＢ  （Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地１００ｍｌの入った三角フラスコ２本に植菌した。３７℃にて８時間培養後、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を加え、さらに２時間培養した。これを遠心集菌し、ペリプラズム画分を浸透圧ショック法にて抽出した。組み換え型酵素はＣ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有しているため、ニッケルをキレートしたカラムによって容易に精製できる。集めたペリプラズム画分をニッケルを固定したＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  社製）  にてＨｉｓ−ｔａｇと特異的に吸着させて精製した。精製ステップ表を表１に示す。カラムはあらかじめ０．１ＭのＮａＣｌを含んだ２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化しておいた。その後０−２００ｍＭのイミダゾール濃度勾配にて溶出を行った。酵素活性の認められたフラクションを集めて、限外ろ過にて濃縮し、−８０℃にて保存した。
【００５２】
尚、酵素活性の定量には、本酵素はエステラーゼ活性を有するのでパラ−ニトロフェノールアセテートを基質としたエステラーゼ活性を用いた。エステラーゼ活性はＫａｙらの方法（Ｋａｙ  ＭＪ，  ＭｃＣａｂｅ  ＲＷ  ａｎｄ  Ｍｏｒｔｏｎ  ＬＨＧ  （１９９３）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｉｎ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ  ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ．  Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒ．  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，  ３１，  ２０９−２２５）に従ってパラ−ニトロフェノールアセテートを基質として測定した。プラスチック分解酵素の酵素量は１分間に１μモルのｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌを生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）として定義した。
【００５３】
【表１】
2004166540.tif 000002
【００５４】
実施例５  プラスチック分解試験１
組み換え型プラスチック分解酵素による各種ポリエステル型プラスチックの分解精製した組み換え型プラスチック分解酵素を用いて、ポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートに対する分解活性の検討を行った。
【００５５】
分解試験は、エマルジョンを含んだリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに酵素３０マイクログラムを加えて、３０℃にて１時間反応することにより行った。
ポリ乳酸、ポリブチレンサクシネートおよびポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートに対する分解活性は、エマルジョン（ＯＤ５８０ｎｍ＝１）の分解による濁度の減少を５８０  ｎｍ吸光度を測定することによって求めた。その結果を表２に示した。
【００５６】
本酵素は約１８時間でポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの８０％以上を、ポリブチレンサクシネートの５０％以上を分解可能であった。また、ポリ乳酸に対しては、分子量１．５万までのものに対しては１８時間以内に５０％以上分解可能であったが、分子量２万のものでは２５％程度しか分解しなかった。
【００５７】
【表２】
2004166540.tif 000003
【００５８】
実施例６  プラスチック分解試験２
組み換え型プラスチック分解酵素によるポリウレタンの分解
エステル型ポリウレタンは、ポリジエチレングリコールアジペート（平均分子量２，５００）と２，４−トリレンジイソシアネートより合成した物を用いた。ポリウレタンは有機溶媒に不溶なためエマルジョン化できない。そのため、固体を用いて分解試験を行った。４ｘ４ｘ１  ｍｍのポリウレタン片に酵素を加え、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加えて全量を０．５ｍｌとして３０℃、２４時間反応した。ポリウレタンの重量変化およびポリウレタン中のエステル結合の分解によって生じるジエチレングリコールをガスクロマトグラフィーにて定量した。ガスクロマトグラフィーの条件は、カラムにＵｎｉｓｏｌｅ３０Ｔを用い、インジェクション温度２５０℃、カラム温度１９０℃にて行った。検出にはＦＩＤを用いた。分解試験の結果を表３に示した。
【００５９】
本酵素は固体ポリウレタンに対して分解活性を持ち、分解とともに供試ポリウレタンのポリエステル部分の構成成分であるジエチレングリコールの生成が確認された。
【００６０】
【表３】
2004166540.tif 000004
【００６１】
【配列表】
2004166540.tif 000005
2004166540.tif 000006
2004166540.tif 000007
2004166540.tif 000008
2004166540.tif 000009
2004166540.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＬＡ２９の制限酵素地図を示す。
【図２】図２は、高発現型プラスミドの構築の概念図を示す。
【図１】
2004166540.tif 000011
【図２】
2004166540.tif 000012