(57)【要約】【課題】Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子による２型糖尿病のリスクの診断【解決方法】ヒトゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型ＳＮＰ６３のアレルを測定することよりなる２型糖尿病のリスク診断方法。ＳＮＰ６３のＴアレルの存在を２型糖尿病のリスクを有意に上昇すると判断する、日本人の２型糖尿病のリスクの診断に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型ＳＮＰ６３のアレルを測定することを特徴とする２型糖尿病のリスク診断方法。
【請求項２】
遺伝子多型Ｔアレル（アレル２）が２型糖尿病のリスクを有意に上昇させる請求項１記載の診断方法。
【請求項３】
ヒトゲノムＤＮＡがヒト末梢血白血球より抽出されたものである請求項１または２記載の診断方法。
【請求項４】
ヒトゲノムＤＮＡがアジア民族のゲノムＤＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の診断方法。
【請求項５】
ヒトゲノムＤＮＡが日本人のゲノムＤＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトゲノムＤＮＡの糖代謝関連遺伝子のＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型を測定する２型糖尿病の診断方法に関する。特にヒト由来ゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型の検出による日本人における２型糖尿病のリスクの診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は、血液中のブドウ糖濃度を一定範囲に維持する恒常性の破綻によりブドウ糖濃度の慢性的な上昇を引き起こす代謝異常であり、遺伝素因を有する個体に発症する。糖尿病の遺伝形式は常染色体優性遺伝により発症するＭＯＤＹ（ｍａｔｕｒｉｔｙ  ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ）やミトコンドリア糖尿病などの単一遺伝と、複数の遺伝因子と肥満、過食、運動不足、ストレスなどの環境因子により発症する１型糖尿病や２型糖尿病の多因子遺伝に大別できる。
【０００３】
日本の糖尿病患者数は１９９７年の厚生省の調査によると約８００万人と推定されており（非特許文献１参照）、１９６２年の調査時と比較して２６．５倍に増加している。なかでも２型糖尿病が糖尿病患者全体の９５％以上を占めている。この事実は最近３５年間に生じた日本における劇的な環境の変化を反映しており、同時に日本人の２型糖尿病に対する易罹患性を示唆している可能性がある。
【０００４】
糖尿病の多因子遺伝のうち１型糖尿病はすい臓のインスリンを分泌するランゲルハンス島のβ細胞が破壊されることにより、最終的にはインスリンが完全に欠乏し、この過程で血糖値の上昇が認められるようになる。インスリンの絶対的欠乏により生物は食物より得られたブドウ糖を体内の細胞で利用できなくなり、急速に衰弱し、死に至る従って、完成した１型糖尿病ではインスリンを補うことが唯一の治療法となる。
【０００５】
一方で２型糖尿病は、インスリンの相対的不足を特徴とする。つまりインスリンの分泌能力が低下することにより量的な不足状態に陥るインスリン分泌不全の場合、およびインスリンの量的には問題ないが作用が弱まり質的に不足する場合、これをインスリン抵抗性というが、この二つの要因が単独または相互に関連し発症すると考えられている。２型糖尿病において、インスリン分泌不全は主に遺伝因子が関与しており、インスリン抵抗性は遺伝因子と環境因子の両方が関与していると考えられている。これらの２つの要因が単独または相互に関連し糖尿病を発症するといわれている。
【０００６】
糖尿病や糖尿病の合併症に関連して発症する生活習慣病は、一旦発症すると慢性的な経過をたどり、生涯を通して闘病生活を強いられるものが多く、その医療費は高度医療や長期にわたる治療によって高額となる。しかも糖尿病性血管合併症に由来して発症する心筋梗塞、冠動脈疾患や脳血管障害などにかかる医療費を含めると、医療費は莫大なものとなり、患者本人、家族ならびに医療行政の経済的基盤を圧迫する。従って、糖尿病の診断・予防方法ならびに根本的な治療方法の確立が強く望まれている。
【０００７】
糖尿病の診断にはＨｂＡ１ｃや空腹時と食後の尿糖、血糖の測定や糖負荷試験が行われる。これらは日常において測定される機会がほとんどなく、糖尿病の大多数の症例において、患者に自覚がない状態で健康診断などの機会に発見される。しかし、早期に自らの糖尿病の易罹患性を知り、その予防に努めている場合、糖尿病の発症が避けられることが多い。つまり糖尿病の易罹患性を早期に診断できる方法を確立することが、多くのケースにおいて糖尿病の発症を抑えることにつながる。
【０００８】
これらの方法の確立において、糖尿病の遺伝因子を探ることが重要となる。１型糖尿病は免疫細胞であるＴリンパ球が、免疫作用の異常によりすい臓のβ細胞を破壊してしまう自己免疫疾患であることから、Ｔリンパ球の細胞表面に存在する主要組織適合抗原ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）遺伝子が着目された。またインスリン遺伝子も着目され、両者とも１型糖尿病の遺伝因子として相関解析において統計学的に有意な関連が認められた。
【０００９】
日本人糖尿病患者の大部分を占める２型糖尿病においては、すい臓のβ細胞のインスリン分泌障害が大きく関わることから、遺伝因子はすい臓のβ細胞機能に関連する遺伝子であると考えられ、現在までにインスリン分泌に関連する遺伝子異常として、インスリン遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、ＭＯＤＹ遺伝子（１から６まで同定されている）が解析された。しかし、現在までに明らかになっている遺伝子異常による糖尿病は全体の５％にすぎず、１つ１つはそれほど決定的ではなかった。
【００１０】
また、多くの民族においても２型糖尿病の遺伝因子の解明を目的とした全ゲノムアプローチが行われた。フィンランド西側のボツニア湾に面した地域の住民を対象としたＢｏｔｎｉａ  ｓｔｕｄｙやフィンランド人家系を対象としたＦＵＳＩＯＮ  （Ｆｉｎｌａｎｄ  −Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＩＤＤＭ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｕｄｙ）や、フランス、アメリカ（Ａｍｉｓｈ，  Ｕｔａ  ｆａｍｉｌｙなど）の複数チームの報告がある。しかし、いずれも遺伝因子のクローニングには至っていない。
【００１１】
一方で、アメリカ先住民族と白人の混血で、２型糖尿病の発症率の高いメキシコ系アメリカ人においてはクローニングが成功し、２型糖尿病の関連遺伝子として唯一Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子が同定された。Ｃａｌｐａｉｎ１０はカルパイン様のシステイン分解酵素であり、膵臓ランゲルハンス氏島、骨格筋、肝臓などの組織においてあまねく発現している。また、ラットやマウスの膵臓ランゲルハンス氏島細胞や骨格筋、脂肪細胞においてインスリン分泌やインスリン感受性に影響を及ぼすことがわかっている。
【００１２】
Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子は１５個のエクソンで構成される。ＳＮＰ４３（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）はイントロン３に存在するＧ／Ａ遺伝子多型であり、ＳＮＰ１９はイントロン６に存在する繰り返しの１単位が３２塩基である繰り返し配列（ＳＴＲＰ：ｓｉｍｐｌｅ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）における繰り返し回数に基づいた多型であり、ＳＮＰ６３はイントロン１３に存在するＣ／Ｔ遺伝子多型である。
【００１３】
なかでもＳＮＰ４３のＧ／Ａ多型は、メキシコ系アメリカ人において２型糖尿病と有意に相関し、Ｇ／Ｇ遺伝子型において２型糖尿病のリスクを高め、この多型単独で連鎖解析において認められた連鎖をすべて説明し得た（非特許文献２，３参照）。また、ピマインディアンにおいては骨格筋におけるＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子のｍＲＮＡレベルがＳＮＰ４３多型と有意に相関することが示された（非特許文献４，５参照）。さらに、フィンランド人、ドイツ人、イギリス人、インド人においても２型糖尿病のリスクを高め、アフリカ系アメリカ人でもＧ／Ｇ遺伝子型が２型糖尿病疾患感受性を有意に高めることが示された（非特許文献６参照）。一方でデンマーク人単独では２型糖尿病のリスクには影響せず、また糖代謝と関連する遺伝形質とも相関は認められなかったが、程度の差はあるものＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子が人種を超えて一貫して２型糖尿病の疾患感受性に影響することを示唆していると考えられる。
【００１４】
遺伝性疾患において、遺伝素因が人種により異なることは明らかである。しかしながら、アジア民族において、２型糖尿病に対するＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子の影響はほとんど解明されていない。本発明者らはＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子の多型と２型糖尿病発症のリスクとの関係を追及したところ驚くべきことに、アジア民族、特に日本人においてはＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子の遺伝子多型のＳＮＰ４３のアレルではなく、ＳＮＰ６３のアレルが２型糖尿病の発症のリスクと深い関連があることを見出して本発明を完成した。
【００１５】
遺伝子多型とは、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の４種類の塩基の組合せからなる配列において個人ごとに塩基が異なる現象及びその部位のことをさす。遺伝子多型のうち、ＳＮＰとは個人における１塩基（１遺伝子）の違い及びその部位をいい、このような遺伝子の違いが個人ごとの表現型や疾患のリスクに関わると考えられている。従って、疾患に特異的な遺伝子を見出し、その遺伝子を含む塩基配列を固定したＤＮＡチップなどを作成し、医療の現場で利用することは、個人における疾患のリスクを簡便に検出できる方法として期待される。
【００１６】
【非特許文献１】
Ｏｆｆｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ：  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｕｒｖｅｙ  １９９７．  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ，  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆｅｒｅ，  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ
【非特許文献２】
Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｉｅｐｅｎｄｅｎｔ（ｔｙｐｅ２）  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２．  Ｎｅｔ  Ｇｅｎｅｔ  １３：１６１−１６６，  １９９６
【非特許文献３】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｎｅｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：１６３−７５，  ２０００
【非特許文献４】
Ｃａｌｐａｉｎｓ  ｐｌａｙ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：２０１３−２０２０，２００１
【非特許文献５】
Ａ  ｃａｌｐａｉｎ−１０  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：Ｒ６９−Ｒ７３，２０００
【非特許文献６】
ＣＡＰＮ  １０  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎｓ：  Ｔｈｅ  Ａｔｈｅｌｏｓｃｒｅｌｏｓｉｓ  Ｒｉｓｋ  ｉｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  （ＡＲＩＣ）  Ｓｔｕｄｙ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ５１：２３１−２３７，２００２
【００１７】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型がアジア人種、特に日本人における２型糖尿病のリスクに与える効果を解析し、２型糖尿病に特徴的な遺伝子型を明らかにし、その利用方法を提供することを課題とする。より具体的には、ヒト由来ゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型の検出によるアジア民族、特に日本人における２型糖尿病のリスクの診断方法の提供を課題とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために、日本人において２型糖尿病を有する者と正常対照者を対象とし、Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型のケースコントロール解析を行った。また、７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験で正常型であった対象者に対し、生理的解析を行った。その結果、特に、日本人において特徴的なＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型を同定するとともに、その利用方法を提供するに至った。より具体的には、ヒト由来ゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型の検出による２型糖尿病のリスク、特に日本人の２型糖尿病の診断方法である。
【００１９】
すなわち、本発明は、次のとおりの２型糖尿病のリスクを診断する方法に関する。
１．  ヒトゲノムＤＮＡのＣａｌｐａｉｎ１０遺伝子の遺伝子多型ＳＮＰ６３のアレルを測定することを特徴とする２型糖尿病のリスクの診断方法。
２．  前記１の方法において遺伝子多型ＳＮＰ６３のアレルの割合を測定しＴアレル（アレル２）を有する個体では２型糖尿病のリスクを有意に上昇させる前記１記載の２型糖尿病のリスクの診断方法。
３．  ヒトゲノムＤＮＡが、ヒト体液、特にヒト末梢血白血球から抽出されたものを使用する前記１または２に記載の２型糖尿病のリスクの診断方法。
４．  ヒトゲノムＤＮＡがアジア民族のゲノムＤＮＡである請求項１〜３のいずれかに記載の診断方法。
５．  ヒトゲノムＤＮＡが日本人のゲノムＤＮＡである前記１〜３のいずれかに記載の２型糖尿病のリスク診断方法。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
【００２１】
【実施例１】
１．ケースコントロール解析
＜対象＞
ケース（２型糖尿病者）    男性１２１名・女性８４名    合計２０５名
正常対照者                男性１４０名・女性６８名    合計２０８名
正常対照者の条件は、解析時に年齢が６０歳以上で、２型糖尿病の家族暦がなく、過去に高血糖を指摘されたことがなく、さらにＨｂＡ１ｃ（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ１ｃ）＜５．６％であるという項目をすべて満たすものとした。
ケースである２型糖尿病者は、東京女子医科大学糖尿病センターから、正常対照者は東京女子医科大学附属成人医学センターから収集し、遺伝子解析研究に関わる倫理審査委員会を経た上で本解析を行った。参加者には研究開始時に研究内容を説明して同意を得た。ケース並びに対照者の詳細は表１に示した。
【００２２】
【表１】
2004344039.tif 000002
【００２３】
＜ゲノムＤＮＡ増幅反応＞
ケースおよび正常対照者の末梢血白血球よりゲノムＤＮＡを抽出した。該ゲノムＤＮＡより、ＳＮＰ４３、ＳＮＰ１９、ＳＮＰ６３の各変異部位を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。ＳＮＰ４３はミスマッチＰＣＲにより、またＳＮＰ６３はＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  −ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）により、また、ＳＮＰ１９は単純なＰＣＲにより増幅を行った。
ＳＮＰ４３のＰＣＲプライマーはＧ／Ａ多型の部位をはさむようにデザインし、５’側のプライマーの配列（配列表配列番号１）と、Ｇ塩基検出用の３’側のプライマー（配列表配列番号２）とＡ塩基検出用の３’側のプライマー（配列表配列番号３）各々１つ作成した。ＤＮＡ増幅反応は総量２５μｌの系で行い、２．５μｌのＥｘ  ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造）、０．２μｌのＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造）、３．０μｌの４ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭのプライマー各々１μｌずつ用いた。ＰＣＲの条件は、はじめに９５℃で３０秒間ｄｅｎａｔｕｒｅを行い、続いてａｎｎｅａｌｉｎｇは５９℃で３０秒間、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎは７２℃で３０秒間を合計３０サイクル行い、最後に７２℃、１０分間ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを行った。
ＳＮＰ１９のＰＣＲプライマーは繰り返しの１単位が３２塩基である繰り返し配列の部位をはさむようにデザインし、５’側のプライマー（配列表配列番号４）と３’側のプライマー（配列表配列番号５）を各々１つ作成した。ＰＣＲはａｎｎｅａｌｉｎｇ温度が６０℃であること以外はＳＮＰ４３と同様の条件で行った。
ＳＮＰ６３のＰＣＲプライマーは５’側のプライマー（配列表配列番号６）に切断酵素ＨｈａＩで認識される新たな切断部位を導入するために１塩基のミスマッチ配列をもつプライマーを作成した。５’側のプライマーの配列のうち、ミスマッチの個所は大文字のＣで表した。正常ではａとなる。３’側のプライマーは配列表配列番号７に示した。ＰＣＲはＳＮＰ４３と同様の条件で行った。
【００２４】
＜遺伝子型の決定＞
該ＰＣＲにより増幅した産物は、いずれも２％アガロース泳動分離にて変異の遺伝子型を決定した。ＳＮＰ４３のＧ／Ａ多型は反応する３’側のプライマーの違いにより遺伝子型を決定した。また、ＳＮＰ１９の２回／３回繰り返し多型は繰り返しの数によってＰＣＲ産物が１５５ｂｐまたは１８７ｂｐとなることより遺伝子型を決定した。またＳＮＰ６３のＰＣＲ産物は１９２ｂｐであり、該ＰＣＲ産物に５μｌのＢｕｆｆｅｒ、１０μｌの１０×ＢＳＡ、０．２μｌのＨｈａＩおよび９．８μｌのｄｄＨ２Ｏを加えて３７℃で２時間の制限酵素処理を行った。ＳＮＰ６３のアレルがＧの場合にはＰＣＲ産物が１６２ｂｐと３０ｂｐに切断されることより遺伝子型を決定した。
タイピングの誤りを防ぐため、予め塩基配列が確認できているＤＮＡをすべての実験に用いてタイピングの精度管理を行った。
【００２５】
＜統計学的処理＞
アレル、遺伝子型の集団における比較にはχ２ｔｅｓｔを用いた。解析では以下のように各ＳＮＰのアレルを数に変換して用いた。ＳＮＰ４３ではＧを１、Ａを２とした。ＳＮＰ１９では繰り返し配列２回を１とし、３回を２とした。
ＳＮＰ６３ではＣを１、Ｔを２とした。性を独立変数として年齢とＢＭＩを従属変数とした。統計学的な有意水準はｐ＝０．０５以下とした。ＳＰＳＳ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｖｅｒ．１１．０）とＳｔａｔＶｉｅｗ（Ｖｅｒ．５．０）プログラムを用いた。
【００２６】
ＳＮＰ１９、ＳＮＰ４３およびＳＮＰ６３のタイピングはすべてＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡にあった。メキシコ系アメリカ人で２型糖尿病のリスクに関連したＳＮＰ４３のＧアレル（アレル１）の割合は、日本人では２型糖尿病でも正常対照者でも９５％であった。今回の対象ではＳＮＰ４３の遺伝子型がＡ／Ａ（２／２）の個体は存在せず、また２型糖尿病と正常対照者で何ら差は認められなかった。同様に、ＳＮＰ１９のアレルおよび遺伝子型の割合に差は認められなかった。しかしながら、ＳＮＰ６３においてＴアレル（アレル２）の割合が２型糖尿病において有意に高値であることを認めた（ｐ＝０．０４２，ＯＲ＝１．３６０４：１．０１０１−１．９８９９：９５％Ｃ．Ｉ）。一方、遺伝子型がＣ／Ｔ（１／２）あるいはＣ／Ｃ（１／１）であるものの割合は２型糖尿病と正常対照で差がなかった。ケースコントロール解析の結果は表２に示した。
【００２７】
【表２】
2004344039.tif 000003
【００２８】
【実施例２】
２．生理学的解析
＜対象＞
健康なボランティア        男性１４６名・女性１３５名    合計２８１名
健康なボランティア全員に対して７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験を行い、１９９７年のアメリカ糖尿病学会の判定基準により正常型であることを確認した。これらのうち、ＢＭＩが２５以上であった者は全体の１４．２％に過ぎなかった。
このボランティアらは東京女子医科大学糖尿病センター、山口大学医学部附属病院、東京大学医学部附属病院、至誠会第二病院より収集し、遺伝子解析研究に関わる倫理審査委員会を経た上で本解析を行った。対象者には研究開始時に研究内容を説明して同意を得た。この対象者の詳細は表３に示した。
【００２９】
【表３】
2004344039.tif 000004
【００３０】
＜血漿インスリン値と血糖値の測定および７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験＞
各々の施設において対象者の血漿インスリン値、血糖値を測定した。また７５ｇ経口ブドウ糖負荷試験における初期３０分のβ細胞反応性の指標としてＩ．Ｉ．（Ｉｎｓｕｌｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｉｎｄｅｘ）を用いた。空腹時におけるインスリン抵抗性およびβ細胞からのインスリン分泌能の指標としてＨＯＭＡ−モデルのＨＯＭＡ−Ｒ（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）およびＨＯＭＡ−β（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を用いた。補正インスリン分泌能  （ＡＩＳＲ  ：  ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の指標としてＩ．Ｉ．をＨＯＭＡ−Ｒで除した値を用いた。また、Ｉ．Ｉ．を含む以下のパラメーターを糖代謝に関する遺伝形質として解析に用いた。Ｉ．Ｉ．に関しては、分子が負の値をとる個体が存在することから、０分から３０分および０分から１２０分までのインスリン面積（ＡＵＣ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ０−３０、ＡＵＣ−ｉｎｓｕｌｉｎ  ０−１２０  （ＡＵＣ：ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｖｅ））と血糖値面積（ＡＵＣ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ０−３０、ＡＵＣ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ０−１２０）、さらに０分から３０分までの血糖面積を０分から３０分までのインスリン面積で除した値（ＡＵＣ（０−３０））  、同様に０分から１２０分までの両者の比（ＡＵＣ（０−１２０））も遺伝形質として用いた。
【００３１】
＜ゲノムＤＮＡ増幅反応＞
対象者の末梢血白血球よりゲノムＤＮＡを抽出した。該ゲノムＤＮＡより、実施例１に記載の方法で、ＳＮＰ４３、ＳＮＰ１９、ＳＮＰ６３の各変異部位を含むＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅を行った。
【００３２】
＜遺伝子型の決定＞
該ＰＣＲにより増幅した産物は、実施例１に記載の方法でいずれも２％アガロース泳動分離を行い、変異の遺伝子型を決定した。
【００３３】
＜統計学的処理＞
アレル、遺伝子型の集団における比較にはχ２ｔｅｓｔを用いた。解析では実施例１と同様に各ＳＮＰのアレルを数に変換して用いた。血糖値は正規分布を示したが、血漿インスリン値は正規分布ではなかった。同様に、Ｉ．ＩとＡＩＳＲおよびＨＯＭＡ−βも正規分布に従っていなかった。そのため、解析ではこれらの値が平均値の±２ＳＤの範囲から外れた個体は比較の際に除外した。実際に計算に用いられた人数は表４に示した。さらに、血漿インスリン濃度の測定には施設間格差が認められたことから、解析にはＡＮＣＯＶＡを用いた。
性を独立変数として年齢とＢＭＩを共変量とした。統計学的な有意水準はｐ＝０．０５以下とした。ＳＰＳＳ  ｐａｃｋａｇｅ（Ｖｅｒ．１１．０）とＳｔａｔＶｉｅｗ（Ｖｅｒ．５．０）プログラムを用いた。
【００３４】
２８１名のすべてのタイピング結果はＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡にあった。ＳＮＰ４３のＧアレル（アレル１）の割合は、０．９４であった。同様にＳＮＰ１９の２回繰り返しアレル（アレル１）の割合は０．３９で、ＳＮＰ６３では０．６８であった。糖代謝に関連した遺伝形質と体重などの測定値を遺伝子型に１／１型、１／２型および２／２型の３種類の集団別に比較検討した。ＳＮＰ４３では何ら有意の差は認められなかった。また、ＳＮＰ１９においては遺伝子型が３回／３回繰り返し型（２／２型）の集団は（ｎ＝１１２）、ほかの集団と比較して有意に６０分のインスリン値が低値であった（ｐ＝０．０５）が、血糖値は３つの集団で差がなかった。しかしながらＳＮＰ６３に関しては、Ｔアレル（アレル２）を有する個体すなわち、Ｔ／Ｔ型（２／２型）あるいはＴ／Ｃ型（２／１型）  （ｎ＝２５、９２）がＴアレル（アレル２）を有しない集団と比較して３０分と６０分の血糖値が有意に高値であり、ＡＵＣ  −ｇｌｕｃｏｓｅ  ０−３０とＡＵＣ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ０−１２０が有意に大きかった（ｐ＝０．０２，  ０．０３，  ０．０５，０．０１）。生理学的解析の結果は表４に示した。
【００３５】
以上の結果より、Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型のうち、ＳＮＰ６３のＴアレル（アレル２）は日本人における２型糖尿病に対し、優性に作用効果を発揮するといえる。さらに、ＳＮＰ６３の遺伝子多型がＴ／Ｔ型（２／２型）と  Ｃ／Ｔ型（１／２型）  の集団は、  Ｃ／Ｃ型（１／１型）である集団と比較して２型糖尿病のリスクを有意に上昇すると考えられる。メキシコ系アメリカ人やその他の人種において２型糖尿病のリスクを高めるＮＰ４３の遺伝子多型に関して、２型糖尿病との関連は見出せなかったことから、ＳＮＰ６３のＴアレル（アレル２）が２型糖尿病に及ぼす影響は日本人において特徴的に作用すると考えられる。
【００３６】
【表４】
2004344039.tif 000005
【００３７】
【実施例３】
３．日本人における２型糖尿病のリスクの診断方法
対象となる日本人の末梢血白血球より抽出したゲノムＤＮＡを試料とし、ＳＮＰ６３の変異部位を含むＤＮＡ領域をＰＣＲ−ＲＦＬＰにより増幅し、ＨｈａＩによる制限酵素処理後、２％アガロース泳動分離にて変異の遺伝子型を決定する実施例１、２に記載の２型糖尿病のリスクの診断方法を得た。
【００３８】
【発明の効果】
本発明は、糖代謝関連Ｃａｌｐａｉｎ１０遺伝子多型のうち日本人の２型糖尿病においてＳＮＰ６３のＴアレル（アレル２）が優性にかつ特徴的に作用効果を発揮することを明確にしたことにより、ゲノムＤＮＡを試料とし、特にアジア民族、なかでも日本人における２型糖尿病のリスクの診断をすることができる。また、この２型糖尿病に特徴的な遺伝子を含む塩基配列を固定したＤＮＡチップなどを作成することで、医療の現場における２型糖尿病のリスクを簡便に検出する方法として利用できる。その結果、２型糖尿病の予防効果を高めることができる。
【配列表】
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