(57)【要約】【課題】本発明は、遺伝子導入に用いる花粉の最適な発育ステージを特定することにより、遺伝子導入花粉を効率的に取得する方法を提供すると共に、受精能力の高い遺伝子導入花粉を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、開葯前約２時間〜開葯後約２時間の花粉にパーティクルガンで遺伝子を導入した後、遺伝子導入花粉を選抜することを特徴とする遺伝子導入花粉の調製方法と、該方法により得られる遺伝子導入花粉に関する。また、本発明は、上記遺伝子導入花粉を受粉させることを含む、遺伝子組換え種子の調製方法と、該方法で得られる遺伝子組換え種子に関する。更に、本発明は、上記遺伝子組換え種子を育種することを含む、遺伝子組換え植物の作出方法と、該作出方法で得られる遺伝子組換え植物に関する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
開葯前約２時間〜開葯後約２時間の花粉にパーティクルガンで遺伝子を導入した後、遺伝子導入花粉を選抜することを特徴とする遺伝子導入花粉の調製方法。
【請求項２】
パーティクルガンの加速圧力を２０ｋｇｆ／ｃｍ２を超える圧力に設定して遺伝子導入を行う請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パーティクルガンの加速圧力を３０ｋｇｆ／ｃｍ２に設定して遺伝子導入を行う請求項２に記載の方法。
【請求項４】
導入される外来遺伝子をコーティングした、磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子を使用し、花粉にパーティクルガンで遺伝子を導入後、遺伝子導入花粉を磁力選抜する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
磁気に反応する金属又は金属化合物が、鉄又は鉄化合物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
磁気に反応する金属又は金属化合物が、非鉄金属又は非鉄金属化合物である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
非鉄金属が、ニッケルである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子の粒径が、０．１〜１μｍである請求項４〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
花粉に外来遺伝子及びマーカー遺伝子としての蛍光タンパク遺伝子を導入し、蛍光を検出することにより遺伝子導入花粉を選抜する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
蛍光タンパク遺伝子がクラゲ由来の合成蛍光遺伝子ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
レーザーを用いた蛍光励起セルソーターにより蛍光を検出する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
レーザーとしてアルゴンレーザーを使用する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れかに記載の方法により得られる遺伝子導入花粉。
【請求項１４】
花粉がユリ花粉である、請求項１３に記載の遺伝子導入花粉。
【請求項１５】
請求項１３に記載の遺伝子導入花粉を受粉させることを含む、遺伝子組換え種子の調製方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法で得られる遺伝子組換え種子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の遺伝子組換え種子を育種することを含む、遺伝子組換え植物の作出方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法で得られる遺伝子組換え植物。
【請求項１９】
ユリである請求項１８に記載の遺伝子組換え植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パーティクルガンを用いた遺伝子導入花粉のより効率的な調製方法と、該方法により得られる遺伝子導入花粉、及び該遺伝子導入花粉を受粉させることを含む遺伝子組換え種子の調製方法と、該調製方法により得られる遺伝子組換え種子、並びに該遺伝子組換え種子を育種することを含む遺伝子組換え植物の作出方法と、該作出方法で得られる遺伝子組換え植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来は、体細胞に遺伝子を導入し培養することによって組換え植物が作出されていた。しかし、現在でも培養系が確立していない植物種が多数存在し、培養自体に多大な労力と時間を要するため、これに代わる簡便で汎用な遺伝子組換え植物の作出法が求められていた。
遺伝子導入花粉の受粉法は、新たな組換え植物の作出法である。
しかしながら、これまでに報告されているパーティクルガンによる花粉への遺伝子導入効率は極めて低く、新手法による成功例は数種の植物に限られていたため（例えば、非特許文献１参照。当該文献における作出効率は２／３０万である。）、遺伝子導入効率の大幅な向上が求められていた。
そこで、本発明者の一人である堀川及び角田英男は遺伝子導入花粉をストレスを加えずに効率的に選抜するための方法について研究を行い、「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」を新たに見出し、先に特許出願している（特許文献１参照。）。堀川らは、この方法によりトウモロコシとカボチャで２％の高率で遺伝子組換え植物を作出することに成功した（例えば、非特許文献２及び３参照。）。
また、本発明者の一人である堀川は、「レーザー選抜した遺伝子導入花粉の受粉による組換え植物の作出方法」についても先に特許出願している（特許文献２参照。）。
一般に花粉の寿命は極めて短いことが知られているが、受粉法の操作過程において、花粉の採取から遺伝子導入を経て受粉に至るまで、かなりの時間を必要とする。この間に花粉が種々のダメージを受け、受精能力を失った花粉が受粉に用いられている場合が多かったと推察される。従って、受粉法による遺伝子組換え植物の作出効率を向上させるためには、花粉の性状についての更なる検討が必要と考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｌｅｅｄｅ−Ｐｌｅｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，  ７７−８６  （１９９５）
【非特許文献２】
堀川・角田、日本草地学会誌，４４（別），１２４頁（１９９８）
【非特許文献３】
堀川ら、日本草地学会誌，４６（別），１２４頁（２０００）
【特許文献１】
特開２０００−２３２８７９号公報
【特許文献２】
特願２００１−２１７９４７号明細書
【特許文献３】
特許第３１３５９６９号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
花粉は発育ステージの推移によって、細胞壁の硬さが変化し、また発芽率も大きく異なることが知られている。従って、受粉法によって効率的に組換え植物を作出するためには、遺伝子導入に用いる花粉の最適な発育ステージを特定し、受精能力の高い遺伝子導入花粉を獲得することが必要である。斯かる状況に鑑み、本発明は、遺伝子導入に用いる花粉の最適な発育ステージを特定することにより、遺伝子導入花粉を効率的に取得する方法を提供すると共に、受精能力の高い遺伝子導入花粉を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、開葯前約２時間〜開葯後約２時間の花粉にパーティクルガンで遺伝子を導入した後、遺伝子導入花粉を選抜することを特徴とする遺伝子導入花粉の調製方法に関する。
【０００６】
また、本発明は、上記方法により得られる遺伝子導入花粉に関する。
【０００７】
更に、本発明は、上記遺伝子導入花粉を受粉させることを含む、遺伝子組換え種子の調製方法に関する。
【０００８】
更にまた、本発明は、上記調製方法で得られる遺伝子組換え種子に関する。
【０００９】
また、本発明は、上記遺伝子組換え種子を育種することを含む、遺伝子組換え植物の作出方法に関する。
【００１０】
更に、本発明は、上記作出方法で得られる遺伝子組換え植物に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に係る遺伝子導入花粉の調製方法の最大の特徴部は、開葯前約２時間〜開葯後約２時間の花粉にパーティクルガンで遺伝子を導入する点にあるが、この方法をより効果的に実施するには、パーティクルガンの加速圧力を市販の装置の圧力である２０ｋｇｆ／ｃｍ２を超える圧力、例えば、３０ｋｇｆ／ｃｍ２に設定して遺伝子導入を行うことが望ましい。
【００１２】
遺伝子導入花粉の選抜方法としては、種々の方法が知られているが、本発明においてより好ましい方法としては、例えば、本発明者らが先に特許出願している磁力選抜法（特許文献１参照。）が挙げられる。この方法は、導入される外来遺伝子をコーティングした、磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子を使用し、花粉にパーティクルガンで遺伝子を導入後、遺伝子導入花粉を磁力選抜する方法である。
磁気に反応する金属又は金属化合物としては、鉄又は鉄化合物、及び非鉄金属又は非鉄金属化合物が挙げられ、非鉄金属の中では、ニッケルが特に好ましい。これら磁気に反応する金属又は金属化合物からなる微粒子の粒径は、通常０．１〜１μｍ、より好ましくは０．３〜０．８μｍ程度である。
遺伝子導入花粉の磁力選抜法についてのより具体的な手法等については、前記特許文献１に記載があるのでこれを参考にして行えばよい。
【００１３】
また、他の好ましい選抜方法としては、同じく本発明者らが先に特許出願している、蛍光を検出することにより遺伝子導入花粉を選抜する方法（特許文献２参照。）が挙げられる。この方法は、花粉に外来遺伝子及びマーカー遺伝子としての蛍光タンパク遺伝子を導入し、蛍光を検出することにより遺伝子導入花粉を選抜する方法である。
蛍光タンパク遺伝子としては、例えば、クラゲ由来の合成蛍光遺伝子ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）等が好ましいものとして挙げられる。
蛍光の検出は、例えば、レーザーを用いた蛍光励起セルソーター等により行われる。
レーザーとしては、通常アルゴンレーザーが用いられる。
蛍光遺伝子とレーザーを用いた遺伝子導入花粉の選抜法についてのより具体的な手法等については、前記特許文献２に記載があるのでこれを参考にして行えばよい。
【００１４】
本発明で使用する外来遺伝子は、植物に目的とする形質を付与するために使用するものであり、該遺伝子が植物体で発現することによって、目的とする形質が発揮される。このような形質としては、当該技術分野において公知の任意の性質を挙げることが出来、対象となる植物の種類・遺伝子組換えの目的等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１５】
従って、かかる外来遺伝子としては、例えば、ＧＦＰ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、グリホサート抵抗性遺伝子、キチナーゼ遺伝子、アスコルビン酸酸化酵素遺伝子、ポリガラクツロナーゼ抑制遺伝子、卒倒病菌（バチルス菌）ＢＴ毒素タンパク遺伝子、各種ウィルスの外被タンパク質遺伝子、リグニン分解酵素遺伝子、グリシンベタイン関連遺伝子、ＰＥＰＣ遺伝子、チオニン遺伝子、及び、フェリチン遺伝子等を使用することが出来る。
【００１６】
本発明の方法により得られた遺伝子導入花粉を受粉させることによって、遺伝子組換え種子（形質転換種子）を作出することが出来る。受粉操作及びその後の種子を得るまでに必要な操作等は当該技術分野で公知の方法に従って実施することが出来る。
【００１７】
遺伝子が導入される花粉としては、未成熟花粉及び成熟花粉のいずれも使用することが可能である。
【００１８】
本発明で得られた遺伝子組換え種子を育種することによって、目的とする外来遺伝子により形質転換された遺伝子組換え植物を作出することが出来る。育種自体は、当該技術分野で公知の方法に従って実施することが出来る。
【００１９】
かかる形質転換の対象となる植物には、当該技術分野において公知の任意のものを挙げることが出来る。例えば、トウモロコシ，イネ、コムギ、カボチャ、タバコ、ダイズ、ユリ、チューリップ、エンレイソウ、ラン類（ファレノプシス、オンシジュウム、デンドロビュウム、シンビジュウム、パフィオペディウム、カトレア、エビネ等）、キャベツ、ハクサイ、マツ、ポプラ、スギ、ハマナス、リンゴ、ミカン、キュウリ、トマト、コウライシバ、ノシバ、シロクローバ、アカクローバ、オーチャードグラス、チモシー、アルファルファ等を挙げることが出来る。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例は何れも、堀川、角田が先に開発した「微粒子発射装置」（特許文献３）のパーティクルガンを用いて、ニッケル微粒子にコーティングした外来遺伝子を花粉に撃ち込み、その花粉を堀川、角田が開発した「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」（特許文献１）を用いて遺伝子導入花粉を選抜することにより行った。
【００２１】
実施例１  ユリ花粉の発芽率
ユリ花粉の発育ステージの違いによる花粉発芽率の推移を明らかにするために、開葯前後各２，６，１２時間の花粉について調べた。発芽率の測定は、１０％ショ糖（ｗ／ｖ）、寒天１％のＭＳ培地上にユリ花粉を散布し、２５℃で１２時間インキュベートしたものを観察して行った。
発育ステージと花粉発芽率の関係を図１に示す。
図１から明らかなように、花粉発芽率は、開葯前６時間から開葯後６時間にかけて高い値を示し、その前後では減少した。
【００２２】
実施例２  パーティクルガンの加速圧力とユリ花粉への遺伝子導入効率
堀川、角田が先に開発した「微粒子発射装置」（特許文献３）のパーティクルガンにおける加速圧力は、市販のガス（ヘリウム、窒素）圧式のものに比較して、ガス圧を高く設定できる特性がある。本実験では、この「微粒子発射装置」を用いて、パーティクルガンの加速圧力の違いによる遺伝子導入効率を比較するために、ヘリウムガス圧を１０、２０、３０ｋｇｆ／ｃｍ２に設定して、ＧＦＰ遺伝子の導入を行った。導入処理後、「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」（特許文献１）により処理花粉を選抜し、遺伝子発現率を調査した。花粉は開葯２時間後のものを使用した。
結果を表１及び図２に示す。
【００２３】
【表１】
2004166637.tif 000002
【００２４】
表１及び図２から明らかなように、市販の窒素ガス圧式パーティクルガンと同程度の加速圧１０、２０ｋｇｆ／ｃｍ２の遺伝子導入に比べて、「微粒子発射装置」で設定可能な３０ｋｇｆ／ｃｍ２の加速圧力において、ユリ花粉の高いＧＦＰ遺伝子発現率が得られた。
【００２５】
実施例３  発育ステージが異なるユリ花粉の遺伝子導入効率
発育ステージが異なるユリ花粉の遺伝子導入効率を比較するために、パーティクルガンによるＧＦＰ遺伝子の導入を行った。花粉は開葯前後各２、６、１２時間のものを用いた。１０％ショ糖（ｗ／ｖ）、寒天１％のＭＳ培地中に懸濁した花粉をフィルターに吸着させ、１０％ショ糖（ｗ／ｖ）、寒天１％のＭＳ培地上に置床し、遺伝子導入を行った。担体のニッケル微粒子（直径１μｍ）にｓＧＦＰ（６５Ｔ）遺伝子を持つプラスミドをコーティングし、遺伝子導入に用いた。撃ち込む際のＤＮＡ量は１回につき０．２μｇに調製した。パーティクルガンによる担体の撃ち込みは、加速圧３０ｋｇｆ／ｃｍ２で６０ｃｍＨｇに減圧した容器中で行った。１つのフィルターへの撃ち込み回数は３回とした。遺伝子撃ち込み後の花粉を１０％ショ糖（ｗ／ｖ）ＭＳ培地中に懸濁し、「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」（特許文献１）を用いて遺伝子導入花粉の選抜を行った。選抜後の花粉を再度フィルターに吸着させ、１２時間後にスライドガラスに移し、蛍光顕微鏡で観察した。
図３に、各発育ステージのＧＦＰ遺伝子発現率を示す。ＧＦＰ遺伝子発現率は、開葯前後各２時間で最も高い値を示した。その範囲外の発育ステージの花粉では遺伝子発現率が低かった。
また、発育ステージの異なるユリの蕾１個から採取した全花粉を用いて遺伝子導入した時の、遺伝子発現の花粉数と発現率について調べた。蕾から取り出した葯を１０％ショ糖ＭＳ培地１０ｍｌ中で撹拌し、培地中に浮遊してきた花粉数を測定した。その花粉をすべて１回の遺伝子撃ち込みに用いた。
その結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
2004166637.tif 000003
【００２７】
表２から明らかなように、培地中に懸濁された花粉数は、開葯後が開葯前よりも多かった。遺伝子導入処理後に磁力選抜した遺伝子発現の花粉数および発現率共に、開葯２時間後の発育ステージの花粉で最も高い値が得られた。
【００２８】
【発明の効果】
遺伝子導入花粉の受粉法による新品種開発を、今後、広範な植物種においても利用可能にするには、受粉法による組換え植物の作出効率を一段と向上させなければならない。そのためには、ターゲットである花粉の発芽率および遺伝子発現率がともに高いことが基本条件となる。
上記の条件に適合する花粉の発育ステージは、本発明により、ユリ花粉において、開葯前後各２時間以内に特定された。この最適な発育ステージの花粉を対象として、本発明者らが開発した「微粒子発射装置」（特許文献３）と、同じく本発明者らが開発した「遺伝子導入細胞の磁力選抜法」（特許文献１）、或いは特許文献２に記載の、蛍光を検出することにより遺伝子導入花粉を選抜する方法等とを組み合わせることによって、従来技術に比べて、簡便に且つ高い効率で組換え植物を得ることが可能になる。
従来の体組胞への遺伝子導入による組換え植物の作出法では、長期間の培養を必要とするため後代を得るまでにかなりの時間を要していた。これに対して、遺伝子導入花粉の受粉法では、生殖細胞である花粉に目的遺伝子を組み込み受粉させるため、より短期間で後代を得ることができる。
現在、遺伝子組換え植物を実用品種として登録するためには、何代にもわたって後代を作出し、生育特性・安全性等を評価しなくてはならない。従って、受粉法によって簡便に短期間で後代が作出できる新技術を発展させることは、我が国の植物バイオテクノロジー分野における研究開発と国際競争力の強化に大いに貢献するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で得られた、発育ステージとユリ花粉発芽率の関係を示す。
【図２】図２は、実施例２で得られた、ユリ花粉におけるＧＦＰ遺伝子発現を示す。
【図３】図３は、実施例３で得られた、各発育ステージのユリ花粉における磁力選抜後のＧＦＰ遺伝子発現率を示す。
【図１】
2004166637.tif 000004
【図２】
2004166637.tif 000005
【図３】
2004166637.tif 000006