(57)【要約】【課題】ミトコンドリアＤＮＡ３２４３位の変異（ｍｔ３２４３変異）を検出する方法を提供する。【解決手段】ｍｔ３２４３変異を含む領域をＰＣＲで増幅し、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【請求項２】
核酸プローブが、配列番号１３または１４に示す塩基配列を有する請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項３】
一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、ミトコンドリアＤＮＡにおける３２４３位の変異であり、核酸プローブは、請求項１または２に記載の核酸プローブである前記方法。
【請求項４】
試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
増幅をＤＮＡポリメラーゼを用いる方法により行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
増幅を核酸プローブの存在下で行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、請求項３記載の方法のためのキット。
【請求項８】
核酸プローブが、配列番号１３または１４に示す塩基配列を有する請求項７記載のキット。
【請求項９】
ミトコンドリアＤＮＡにおける３２４３位の変異を含む領域を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む請求項７または８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ミトコンドリアにおける３２４２変異の検出法およびそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ミトコンドリアＤＮＡ  ３２４３部位のＡ→Ｇ変異（ｍｔ３２４３）は日本人糖尿病患者の１％に存在する変異で、単一遺伝子異常による糖尿病の中で、最も高頻度である。ミトコンドリア遺伝子異常の特徴の一つは正常と異常のミトコンドリアＤＮＡが様々な割合で共存することであり、この状態をヘテロプラスミーと呼ぶ。ｍｔ３２４３変異のヘテロプラスミーの比率と病状の進行度には相関があるといわれており、病状の進行度や治療効果の測定に用いることが出来るのではないかと考えられる。
【０００３】
ｍｔ３２４３変異は変異が存在するとその部分に制限酵素の認識部位が出現するため、ＰＣＲで変異部分を含むように増幅を行い、制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）で検出を行うことが出来る（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
ＰＣＲは数分子の鋳型から数１０億倍もの分子を増幅するため、増幅産物がほんの少し混入した場合でも偽陽性、偽陰性の原因になり得る。ＰＣＲ−ＲＦＬＰはＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。よって、偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまうことがある。さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
【０００５】
一方、一般に、変異を含む領域をＰＣＲで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（非特許文献２、特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】
臨床病理、１９９６年、第４４巻、第８号、ｐ．７７８−７８２
【非特許文献２】
クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０００年、第４６巻、第５号、ｐ．６３１−６３５
【特許文献１】
特開２００２−１１９２９１号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ｍｔ３２４３変異を検出するのに有効な消光プローブを特定し、ｍｔ３２４３変異を検出する方法およびそのためのキットを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述のプローブを用いる方法に関する文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。本発明者らは、ｍｔ３２４３変異に関し、上記条件を満たす消光プローブを設計し、検出を試みたが、容易に検出を可能とする消光プローブは得られなかった。
【０００９】
本発明者らは、ｍｔ３２４３変異を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりｍｔ３２４３変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【００１０】
（１）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【００１１】
（２）核酸プローブが、配列番号１３または１４に示す塩基配列を有する（１）の核酸プローブ。
【００１２】
（３）一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、ミトコンドリアＤＮＡにおける３２４３位の変異であり、核酸プローブは、（１）または（２）の核酸プローブである前記方法。
【００１３】
（４）試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む（３）の方法。
【００１４】
（５）増幅をＤＮＡポリメラーゼを用いる方法により行う（４）の方法。
【００１５】
（６）増幅を核酸プローブの存在下で行う（５）の方法。
【００１６】
（７）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、（３）の方法のためのキット。
【００１７】
（８）核酸プローブが、配列番号１３または１４に示す塩基配列を有する（７）のキット。
【００１８】
（９）ミトコンドリアＤＮＡにおける３２４３位の変異を含む領域を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む（７）または（８）のキット。
【００１９】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明プローブおよび本発明検出方法
本発明プローブは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されていることを特徴とする。
【００２０】
本発明プローブは、配列番号２に示す塩基配列（ｍｔ３２４３変異における変異型の塩基を有する配列）において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有する他は、特許文献１に記載された消光プローブと同様でよい。本発明に使用される消光プローブの塩基配列の例としては、配列番号１３または１４に示すものが挙げられる。蛍光色素としては、特許文献１に記載されたものが使用できるが、具体例としては、ＦＡＭ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ＦＬ等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１に記載の方法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明検出方法は、一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、ｍｔ３２４３変異であり、核酸プローブは本発明プローブであることを特徴とする。
【００２２】
本発明検出方法は、ｍｔ３２４３変異を含む領域を増幅すること、および、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅および融解曲線分析（Ｔｍ解析）の方法に従って行うことができる。
【００２３】
核酸増幅の方法としては、ＰＣＲポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、ＰＣＲ、ＩＣＡＮ、ＬＡＭＰ等が挙げられる。ＰＣＲポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００２４】
以下、ＰＣＲを用いる場合を例として、さらに説明する。ＰＣＲに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のＰＣＲにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さおよびＴｍは、通常には、１２ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１６ｍｅｒ〜３０ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号２および３に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００２５】
ＰＣＲは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を取り扱う操作を行うことなくＴｍ解析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのＴｍやＰＣＲの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
【００２６】
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００２７】
【表１】
ＤＮＡ断片                １０１〜１０８分子／反応
プライマー                    ２００〜１０００ｎＭ
プローブ                  １００〜１０００ｎＭ
ヌクレオチド            各２０〜２００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ            ０．０１〜０．０３単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．４〜９．０）      ５〜２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                  １．５〜３ｍＭ
ＫＣｌ                    １０〜１００ｍＭ
グリセロール              ０〜２０％
（最終液量：１０〜１００μｌ）
【００２８】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜４０回繰り返す。
（１）  変性、９０〜９８℃、１〜６０秒
（２）  アニーリング、６０〜７０℃、１０〜６０秒
（３）  伸長、６０〜７５℃、１０〜１８０秒
【００２９】
アニーリングおよび伸長を一ステップで行う場合には、６０〜７０℃、１０〜１８０秒の条件が挙げられる。
【００３０】
Ｔｍ解析は、本発明プローブの蛍光色素の蛍光を測定する他は通常の方法に従って行うことができる。蛍光の測定は、蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光波長の光を測定することに行うことができる。Ｔｍ解析における昇温速度は、通常には、０．１〜１℃／秒である。Ｔｍ解析を行うときの反応液の組成は、プローブとその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されないが、通常には、一価の陽イオン濃度が１．５〜５  ｍＭ、ｐＨが７〜９である。ＰＣＲ等のＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、通常、この条件を満たすので、増幅後の反応液をそのままＴｍ解析に用いることができる。
【００３１】
Ｔｍ解析の結果に基づくｍｔ３２４３変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出の他、変異型ＤＮＡの定量、野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの割合の測定も包含する。
【００３２】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）であって、配列番号２に示す塩基配列において塩基番号２３０から始まる１４〜４０塩基長の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、３’末端が蛍光色素で標識されている核酸プローブを含むことを特徴とする。
【００３３】
消光プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
【００３４】
本発明検出キットは、消光プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明検出キットにおいて消光プローブ、プライマーおよびその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３７】
【実施例１】
ヒトミトコンドリア３２４３Ａ→Ｇ変異（ｍｔ３２４３変異）の部位を含む塩基配列（配列番号２、塩基番号２４３がミトコンドリア遺伝子３２４３位に相当）に基づき、ｍｔ３２４３変異を含む部分を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表２中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
次に、表３に示す、末端部にＣを有するプローブを設計した。表３中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、ｍｔ３２４３変異の部位を示し、３’末端の（Ｐ）は、リン酸化されていることを示す。ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ＦＬ又はＴＡＭＲＡ（商標）による標識は、常法に従って行った。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
ｍｔ３２４３変異周辺領域を組み込んだプラスミドをサンプルとして、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｉｅｄ）を用い、以下の条件でＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。Ｔｍ解析における励起波長および検出波長は、それぞれ４５０〜４９５  ｎｍおよび５０５〜５３７  ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）、５２７〜５５５  ｎｍおよび５６５〜６０５  ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）であった。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
各プローブを用いてＰＣＲおよびＴｍ解析を行った結果、プローブ３Ｔ−ｍｔ−Ｒ２−１８、３Ｔ−ｍｔ−Ｒ２−１７、３ＦＬ−ｍｔ−Ｒ２−１８および３ＦＬ−ｍｔ−Ｒ２−１７を用いたときのみ、Ｔｍ解析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。なお、各プローブのｍｔ３２４３変異を含む塩基配列に対する配置を図１および２に示す。図中、Ｗｉｌｄ配列およびｍｕｔａｎｔ配列は、それぞれ配列番号１および２の塩基配列の塩基番号２１４〜２６３である。また、図中、Ｆは蛍光色素を示す。図１および２に示す配置からみて、プローブがＴｍ解析で使用できるかどうかは、蛍光色素を結合させたＣの位置に依存すると考えられ、プローブの長さは、多型部位を含む限り、あまり重要でないと考えられる。
【００４５】
サンプルとして、種々の比率で、変異型配列を有するプラスミドと正常型配列を有するプラスミドを含むサンプルとの混合物を調製し、プローブ３ＦＬ−ｍｔ−Ｒ２−１７を用いて定量を行った。結果を図３に示す。変異型配列の比率にかかわらず、変異型配列と正常型配列が明確に区別して検出できた。
【００４６】
プローブとして、プローブ３Ｔ−ｍｔ−Ｒ２−１８、３Ｔ−ｍｔ−Ｒ２−１７および３ＦＬ−ｍｔ−Ｒ２−１８を用いた場合も同様の結果が得られた。
【００４７】
なお、図３において縦軸は、蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（−ｄＦ／ｄｔ）、横軸は温度（℃）である。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、ｍｔ３２４３変異を検出するのに有効な消光プローブが提供され、さらに、それを用いるｍｔ３２４３変異を検出する方法およびそのためのキットが提供される。Ｔｍ解析は数十秒で完了するため、検出に必要な時間が大幅に短縮出来る。プローブの存在下での核酸の増幅とＴｍ解析を組み合わせる本発明の好ましい態様によれば、核酸の増幅後にプローブのＴｍを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、さらに、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】変異の識別不可能な消光プローブの位置を示す。
【図２】変異の識別可能な消光プローブの位置を示す。
【図３】実施例１の方法による変異遺伝子の割合の異なる試料における検出の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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