(57)【要約】      （修正有）【課題】多様な人間疾患に使用されうる、さらに特異的で安定的で有能なアンチセンスに関する技術が要求されている。本発明は、ＲＮＡおよび蛋白質発現を減少させるのに有効な大環状標的特異的アンチセンス分子に関するものである。大環状アンチセンス分子は、遺伝子発現修飾が疾患の開始および進行を抑制するのに有益な人間疾患を治療するのに使用される。【解決手段】本発明は標的特異的アンチセンス領域、特にバクテリオファージから生産される標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子が遺伝子発現の効果的な除去剤として有用であるという発見に根拠をおいている。本方法において核酸分子は組み換えバクテリオファージやファージミドゲノムの一本鎖型である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子から発現されるＲＮＡ部分に特異的に結合し、上記の遺伝子発現を減少させるのに有効であることを特徴とする標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子。
【請求項２】
上記の分子が少なくても約３千個のヌクレオチド長さであることを特徴とする請求項１記載の大環状核酸分子。
【請求項３】
上記の分子のアンチセンス領域が少なくても約５０個のヌクレオチド長さであることを特徴とする請求項１記載の大環状核酸分子。
【請求項４】
上記のアンチセンス領域が実質的に一つの全体遺伝子配列に対して相補的であることを特徴とする請求項１記載の大環状核酸分子。
【請求項５】
上記の核酸分子が組換えバクテリオファージまたはファージミドゲノムの一本鎖型であることを特徴とする請求項１記載の大環状核酸分子。
【請求項６】
上記のバクテリオファージまたはファージミドが繊維状ファージから由来することを特徴とする第５項記載の大環状核酸分子。
【請求項７】
上記の繊維状ファージがファージＭ１３であることを特徴とする請求項６記載の大環状核酸分子。
【請求項８】
請求項１の大環状核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項９】
上記のベクターが繊維状ファージから由来したことを特徴とする請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項８のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
遺伝子から発現されるＲＮＡの一部分に特異的に結合して、遺伝子の発現を減少させるのに有効なものであることを特徴とする標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子およびその薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項１２】
核酸分子をＲＮＡに標的化して、ＲＮＡとハイブリッドしてＲＮＡとのデュプレックスを形成することからなり、
上記デュプレックスは、選択された蛋白質の発現を抑制することを特徴とする
選択された蛋白質をコード化するＲＮＡを標的にする大環状核酸分子によって選択された蛋白質の発現を抑制させる方法。
【請求項１３】
上記の標的蛋白質の発現は、細胞増殖または癌を誘発することを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
上記の癌は、白血病、肺癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、脳癌、前立腺癌、頚部癌、または乳癌であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記の癌は、白血病、頚部癌、または乳癌であることを特徴とする第１４項記載の方法。
【請求項１６】
上記の標的蛋白質は、腫瘍壊死因子、核因子、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＲＡＳまたは細胞分裂キナーゼであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
上記の蛋白質は、ウイルス蛋白質であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
上記のウイルスは、疱疹（ｈｅｒｐｅｓ）、人間パピロマウイルス（ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘（ｓｍａｌｌ  ｐｏｘ）、単核細胞症（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、肝炎または呼吸性シンシチアルウイルスであることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記の標的蛋白質の発現は、代謝疾患または免疫異常であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
上記の代謝疾患は、フェニルケトン尿症、原発性甲状腺低下症、ガラクトース血症、異常ヘモグロビン、Ｉ型及びＩＩ型の糖尿病または肥満であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
上記の免疫異常は、シェーグレン症候群、抗リン脂質症候群、免疫複合性疾患、紫斑病、シェーンレイン−ヘノホ症候群（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ）、免疫欠乏症候群、全身性紅斑性狼瘡、免疫欠乏、リュウマチ、腎硬変または肝硬変であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
複数の標的遺伝子から発現される複数の標的ＲＮＡに特異的に結合して、遺伝子の発現を減少させるのに有効であることを特徴とする標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子。
【請求項２３】
複数の標的遺伝子から発現される複数の標的ＲＮＡに特異的に結合して、遺伝子の発現を減少させるのに有効であることを特徴とする標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子および薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項２４】
１）複数の標的ＲＮＡに標的化された標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子を生産する段階、２）多数のＲＮＡを標的にしてキメラ大環状核酸分子が上記のＲＮＡとハイブリッドして多数の選択された蛋白質の発現を減少させるデュプレックスを形成する段階を含む、
複数の選択された蛋白質をコード化する複数のＲＮＡ分子を標的にする大環状核酸分子によって多数の選択された蛋白質の発現を抑制させる方法。
【請求項２５】
１）一つ以上の標的遺伝子に対して実質的に相補的な一つ以上のアンチセンス領域を含む大環状核酸分子を細胞に投与する段階からなり、
２）上記遺伝子の発現を抑制して細胞増殖を抑制させる段階を含む、細胞増殖を抑制させる方法。
【請求項２６】
１）目的とする標的特異的ＤＮＡをファージまたはファージミドゲノムに挿入させる段階、  ２）ファージが一本鎖型の大環状核酸分子を生産する段階、および３）ゲル濾過カラムによって上記大環状核酸分子を分離する段階
を含む、選択された蛋白質の発現を抑制させる標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子をつくる方法。
【請求項２７】
１）細胞から発現されるＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンス領域を含む大環状核酸分子を生産する段階、２）細胞が大環状核酸分子と接触することによってアンチセンス分子が細胞に入って細胞内で発現されたＲＮＡとハイブリッドして遺伝子産物の発現を抑制する段階、および３）多様な表現型に関して細胞を分析する段階を含む、遺伝子の機能をスクリーニングする方法。
【請求項２８】
段階１）から３）は、上記の大環状核酸分子のライブラリーに適用されることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
上記の核酸分子は、組換えバクテリオファージまたは  ファージミドゲノムの一本鎖型であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、アンチセンス技術分野に関するものである。また本発明は、アンチセンス技術を治療及び遺伝子機能同定システムに利用することに関するものである。
【０００２】
背景技術
アンチセンス分子は、ワトソン−クリック塩基対（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）にしたがってｍＲＮＡの相補的配列と結合する。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ；  ＡＳ−オリゴ）は、配列特異的に遺伝子発現を減少させることによって遺伝子の機能的研究に有用利用されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４，  ３６３−３６６  （１９８５）；  Ｍｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５１，  ２８９７−２９０１（１９９１）；  Ａｎｆｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６，  ３３７９−３３８３  （１９８９））。    特に、癌の開始及び進行に関連する遺伝子の異常発現を除去するアンチセンス抗癌剤を開発する為に多くの研究が行われてきた（Ｋａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｕｋ．  Ｒｅｓ．，  １４，  ８３１−８３９  （１９９０）；  Ｍｅｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ２２２１−２２３４  （１９９６）；  Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，  １，  ５４３−５４８  （１９９０）；  Ｒａｔａｊｃｚａｋｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ７９，  １９５６−１９６１  （１９９２）；Ｋａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ７４，  １５１７−１５２４  （１９８９）；  Ｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３，  １３５２−１３５６  （１９９６）；  Ｗａｇｎｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７２，  ３３３−３３５，  （１９９４））。
【０００３】
合成ＡＳ−オリゴは、標的遺伝子に対する有能な特異性だけではなく、そのデザインと合成が容易なため幅広く使用されている。遺伝子発現に対するアンチセンスの抑制作用は、アンチセンスＤＮＡ−ｍＲＮＡ  デュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を形成した後、ＲＮａｓｅＨの活性によって分解されたり、リボソーム複合体に結合するｍＲＮＡの移動を立体的に妨害することによって成り立つと知られている（Ｄｏｌｎｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９，  １８５−１９４  （１９９１））。また、オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）領域でトリプル−ヘリックス（ｔｒｉｐｌｅ−ｈｅｌｉｘ）構造を形成することによって、遺伝子の発現を抑制するとも報告されている。さらに、ゲノムＤＮＡのプロモーター領域に競合するデュプレックスオリゴヌクレオチド誘引体もまた形成される（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  １００２３−１００２６，  （１９９１））。
ＡＳ−オリゴの効能は、いくつかの最近の臨床的研究だけではなく、動物モデルにおいても有用性が確認されてきた（Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １２，  １２５７−１２６２，  （１９９３）；  Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，  ２６，  １３１−１３６，  （１９９５）；  Ｎｅｓｔｅｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｎｅｄ．，  １，  ５２８−５３３，  （１９９５）；  Ｒｏｕｓｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，  １１９２−１１９３    （１９９７））。さらに、ＣＭＶ網膜炎に対する最初のアンチセンス医薬品が、米国とヨーロッパで承認された。
【０００４】
しかし、ＡＳ−オリゴに対する期待は、結果が常に明白なものではないために時々失望をもたらす。ＡＳ−オリゴを使用するにあたっては、標的部位への接近困難（Ｆｌａｎａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７２，  ２１３−２２５  （１９９７）；  Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ７，  １０９５−１１０６  （１９９６））、ヌクレアーゼに対する不安定さ（Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，  ４９，  １７９３−１８０１  （１９９１）；  Ｗａｇｎｅｒｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０，  １５１０−１５１３  （１９９３）；  Ｇｒｙａｚｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２４，  １５０８−１５１４  （１９９６））、配列特異性の不足及び生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での多様な副作用等が問題点になっている。ＡＳ−オリゴの安定性は、いわゆる第２世代ＡＳ−オリゴと呼ばれる化学的に修飾したオリゴを使用することによって、ある程度改善された（Ｈｅｌｅｎｅ  Ｅｕｒ  ＪＣａｎｃｅｒ，  ２７（１１），１４６６−７１  （１９９１）；  Ｂａｙｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ３（４），３８３−９０  （１９９３）；  Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．，  １４８９，  ３−１８  （１９９９））。ホスホロチオアート−オリゴ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｏｌｉｇｏ，  ＰＳ−オリゴ）及びメチルホスホナート−オリゴ（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｏｌｉｇｏ，  ＭＰ−オリゴ）は綿密に研究されていて、ヌクレアーゼに対する安定性を増大させるために主に使用される。しかし、修飾したＡＳ−オリゴは、遺伝子の塩基配列に対する特異性が少なくＲＮａｓｅＨ活性に対する疑問が見え、それに  ＤＮＡ複製時突然変異が不適切に導入されたりや加水分解された修飾ヌクレオチドの再利用時に問題が生じうる。
【０００５】
安定性を増加させた一連のアンチセンス分子、いわゆる第３世代ＡＳ−オリゴは、１）ステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造、２）ＣＭＡＳ（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ−ｃｌｏｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）構造、及び  ３）ＲｉＡＳ（Ｒｉｂｂｏｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）構造（Ｍｏｏｎ  ｅｔａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ３４６，  ２９５−３０３  （２０００）；  Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ７，１０９５−１１０６  （１９９６）；  Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ２７５（７），  ４６４７−５３  （２０００））を持つ。ＣＭＡＳ及びＲｉＡＳ−オリゴヌクレオチドは、生体液でエクソヌクレアーゼ及びヌクレアーゼに対する安定性が増加されることが分かる。このアンチセンス分子は、また標的ｍＲＮＡの特異的に減少させるのに効果的に使用される。しかし、さらに容易にアンチセンス分子を開発して結合効率を増加させられるアンチセンス分子を開発する技術が求められている。
Ｍ１３バクテリオファージのようなバクテリオファージは、一本鎖環状ゲノムを持ち、これらは突然変異研究だけではなくＤＮＡ配列分析のためにも使用されている。Ｍ１３プラスミドは、組換えバクテリオファージの構成に利用されるプラスミドに、特異的遺伝子に対するアンチセンス配列を含む大量の環状一本鎖ゲノムＤＮＡを生産するために使用できる。アンチセンスＤＮＡを生産するためのこのようなアプローチは、共有結合的に閉鎖された構造と関連するエクソヌクレアーゼに対する安定性、配列の高い正確性、難しい標的部位研究の除去及びアンチセンスライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）の構造が容易である等の長所を持っている。
【０００６】
腫瘍壊死因子アルファ（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ；  ＴＮＦ−α）は、正常免疫反応（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，  ４１（１２），  ２２０５−１０  （１９９８））、敗血ショック（Ｃａｍｅｎｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２（６），３４９８−５０３（１９９９））、及び過多生成された場合には、移植組織対宿主反応（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４（２），６５６−６３  （２０００））のために必要なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。また、ＴＮＦ−αは典型的な伝染症性サイトカインであり、リューマチ関節炎、アレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）及び敗血症のような炎症現象を含む他の免疫異常に密接に関連する（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．，４１（１２），２２０５−１０  （１９９８））。ＴＮＦ−α発現は、リポポリサッカリド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  ＬＰＳ）が処理された白鼠単核細胞株  ＷＲＴ７／Ｐ２から誘導できる。
【０００７】
核因子κＢ（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  κＢ，  ＮＦ−κＢ）は、サイトカイン（Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．，６８，４９９−５０８  （１９９３）；  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９，８９９−９０９  （１９９５））及び附着受容体（Ｔｈａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８０，５２９−５３２（１９９５））に関する多様な遺伝子を調節する。活性化された  ＮＦ−κＢは、人間動脈硬化組織のマクロファージ、平滑筋細胞及び内皮細胞で同定され（Ｄｅｆｉｌｌｉｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８４，８７−９８（１９９３））、炎症及び増殖過程で重要な役割をするものと考えられている（Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，９７，１７１５−１７２２（１９９６））。
【０００８】
ｒａｓ発癌遺伝子は、ヒト腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍ）でよく活性化される。ＲＡＳ  ｐ２１蛋白質は、ＧＴＰ／ＧＤＰ  結合蛋白質の大きなファミリー（ｆａｍｉｌｙ）の一部として、血漿膜の内部に位置する。ｒａｓ遺伝子の点突然変異は、結合されたＧＴＰを加水分解できないので細胞内に信号を伝達して細胞増殖を調節できなくなり、ＲＡＳ  ｐ２１蛋白質を生産できる（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１２７３−１２９０（１９９４））。
原発癌性遺伝子（ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ）ｃ−ｍｙｂは、造血細胞の増殖及び分化に重要な役割をする。造血細胞は、ｃ−ｍｙｂの分化的な発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を示し、末端分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に関する遺伝子は、ほとんど発現されない（Ｍｅｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ２２２１−２２３４（１９９６）；  Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，１，５４３−５４８  （１９９０））。ｃ−ｍｙｂ遺伝子産物は、白血病細胞で過多発現するのをよく見ることができる（Ｍｅｌａｎｉ  ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５１，２８９７−２９０１（１９９１）；Ａｎｆｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８６，３３７９−３３８３（１９８９）；Ｋａｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，１４，８３１−８３９（１９９０））。
ＭＹＣ発癌蛋白質は、腫瘍細胞の成長に重要な役割をする（Ｐａｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２４２，  １１−２８（１９９５）；  Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８，１０９−１８２（１９９６））。ＭＹＣは、休止細胞を細胞周期に入るように誘導するのに充分な能力があり（Ｅｉｌｅｒｓ  ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４０，６６−６８（１９８９））、継続的な細胞成長のために必要である。反面  ＭＹＳの抑制は、細胞分裂の信号を抑制して細胞が最終的に分化されるように誘導できる（Ｈｅｉｋｋｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８，４４５−４４８（１９８７）；Ｓａｗｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，７０，９０１−９１０（１９９２））。
【０００９】
細胞周期調節性遺伝子の主要な構成要素は、サイクリン依存性キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ，ＣＤＫｓ）と呼ばれる蛋白質キナーゼで代表される。細胞周期のある一段階から次の段階へ進行されることを調節する分子的メカニズムを研究する過程でＣＤＫｓが発見された（ＭｏｒｇｅｎＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ．），３７４，１３１−１３４（１９９５））。ＣＤＫｓは、個別的なサイクリン蛋白質の補助活性剤と結合する時までは、不活性状態である。細胞がＧ１に入ると、初期Ｇ１チェックポイントを通じた進行によってＣＤＫ４及びＣＤＫ６のキナーゼ活性が必須的なものであると見られ（Ｓｈｅｒｒ  Ｃｅｌｌ，７３，１０５９−１０６５（１９９３））、ＣＤＫ２−サイクリンＥ複合体の活性は、Ｇ１からＳ基に進行されることが必須的である（Ｏｈｔｓｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，２６１２−２６２４（１９９４））。ＣＤＫ活性に対して効能があるアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発することは、腫瘍細胞の成長を抑制するための良い方法になるであろう。したがって、多様な人間疾病に使用されうる、さらに特異的で安定的で有能なアンチセンスに関する技術が必要である。
【００１０】
発明の要約
本発明は、上記で言及された問題点を克服して、アンチセンス分子、アンチセンス分子の組成物、アンチセンス分子を作る方法及び、標的遺伝子の発現を抑制したり有為な改良を行う利点を提供するアンチセンス分子及び組成物を使用する方法を提供する。標的遺伝子の発現が癌を誘発させる場合、本発明のアンチセンス分子を細胞に投与すれば標的ＲＮＡが除去され、細胞の増殖を抑制することによって癌を治療したり、少なくても生存を延長させられる。
【００１１】
本発明は、癌を治療することに限定されない。本発明のアンチセンス化合物の  治療原理は、ある特定の標的ＲＮＡを除去するのに適用できる。アンチセンス治療は、ウイルス感染を除去したり代謝疾患および免疫学的疾患等を治療する等の癌を治療する際に現れる上記の化学活性のすべての表現型発現をアンチセンス治療の結果として示す。
本発明は、さらに薬学的に許容可能な担体を含むアンチセンス分子の組成物を提供する。
本発明は、標的特異的なアンチセンス領域を含む大環状核酸分子に関するものである。遺伝子から発現されるＲＮＡ部分に特異的に結合する上記のアンチセンス分子は、上記の遺伝子の発現を減少させるのに効果的である。大環状核酸分子は、少なくても約３千個のヌクレオチド長さを持っていて、その分子のアンチセンス領域は、少なくても約５０個のヌクレオチド長さ、好ましくは少なくても約１００個のヌクレオチド長さを持っている。それにアンチセンス領域は、全体遺伝子配列に実質的に相補的である。
【００１２】
本発明の実施例で、大環状核酸分子は、組換えバクテリオファージまたは繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）及び特にファージＭ１３と同じファージミドゲノムの一本鎖型である。
他の実施例で、上記で説明したように大環状核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、繊維状ファージから由来する。また他の実施例で、ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、また遺伝子から発現されるＲＮＡの特定部分と特異的に結合する標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子で成り立つ組成物及び薬学的に許容可能な担体に関するものである。上記のアンチセンス分子は、上記の遺伝子の発現を減少させるのに効果的である。
【００１３】
また他の実施例で、選択された蛋白質をコード化するＲＮＡを標的にする大環状核酸分子によって選択された蛋白質の発現を抑制できる方法を提供する。上記方法は、核酸分子がＲＮＡを標的にして、核酸分子がＲＮＡとハイブリッドしてＲＮＡとデュプレックスを形成することからなる、上記デュプレックスは、選択された蛋白質の発現を抑制する。その標的蛋白質は、細胞増殖や癌を誘発することがある。上記の癌は、白血病、肺癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、脳癌、前立腺癌、頚部癌、または乳癌等をあげられるが、これに限定されるものではない。特に、上記の癌は、白血病、頚部癌、または乳癌である。
【００１４】
標的蛋白質は、腫瘍壊死因子、核因子、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＲＡＳまたは細胞分裂キナーゼ（ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ）等である。標的蛋白質がウイルス性蛋白質ならそのウイルスは、疱疹（ｈｅｒｐｅｓ）、人間パピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ；  ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘（ｓｍａｌｌ  ｐｏｘ）、単核細胞症（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、肝炎または呼吸性シンシチアルウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ，  ＲＳＶ）等をあげられるが、これに限定されるものではない。
標的蛋白質は、代謝疾患や免疫異常を招来する。代謝疾患には、フェニルケトン尿症、原発性甲状腺低下症、ガラクトース血症、異常ヘモグロビン、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病または肥満等をあげられるが、これに限定されるものではない。免疫異常には、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、抗リン脂質症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、免疫複合性疾患、紫斑病、シェーンレイン−ヘノホ症候群（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ）、免疫欠乏症候群、全身性紅斑性狼瘡、免疫欠乏、リュウマチ、腎臓または肝硬変をあげられるが、これに限定されるものではない。
本発明は、また複数の標的遺伝子から発現される複数の標的ＲＮＡに特異的に  結合する標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子を提供する。上記の核酸分子は、上記の遺伝子の発現を減少させるのに効果的である。さらに、キメラ大環状核酸分子および薬学的に許容可能な担体を含有する組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、また複数の選択された蛋白質をコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）する複数のＲＮＡ分子を標的とする大環状核酸分子によって多数の選択的蛋白質の発現を抑制させる方法に関するもので、１）上記の複数の標的ＲＮＡに標的化された標的特異的アンチセンス領域を含むキメラ大環状核酸分子を生産する段階、２）多数のＲＮＡを標的にしてキメラ大環状核酸分子が上記のＲＮＡとハイブリッドして多数の選択された蛋白質の発現を減少させるデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を形成する段階からなる。
さらに、本発明は、細胞増殖を阻害する方法に関するものである。
一つ以上の標的遺伝子に対して実質的に相補的な一つ以上のアンチセンス領域を含有する大環状核酸分子を細胞に投与すれば、上記遺伝子の発現を抑制して細胞増殖を抑制する。
実施例を見れば、選択された蛋白質の発現を抑制する標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子を作る方法に関するもので、１）目的とする標的特異的ＤＮＡをファージまたはファージミドゲノムに挿入する段階、２）ファージが一本鎖型の大環状核酸分子を生産する段階、３）ゲル濾過カラムによって上記大環状核酸分子を分離する段階からなる。
【００１６】
本発明は、また遺伝子の機能をスクリーニングする方法に関するもので、ａ）細胞から発現されるＲＮＡに対して実質的に相補的なアンチセンス領域を含有する大環状核酸分子を生産する段階、ｂ）細胞が大環状核酸分子と接触することによってアンチセンス分子が細胞に入って細胞内で発現されたＲＮＡとハイブリッドして遺伝子産物の発現を抑制する段階、ｃ）多様な表現型に関して細胞を分析する段階で成り立つ。
上記の方法で  ａ）〜ｃ）段階は、上記の大環状核酸分子のライブラリーに適用できる。それに、その方法において、核酸分子は組換えバクテリオファージやファージミドゲノムの一本鎖型である。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は標的特異的アンチセンス領域、特にバクテリオファージから生産される標的特異的アンチセンス領域を含む大環状核酸分子が遺伝子発現の効果的な除去剤として有用であるという発見に根拠をおいている。
本明細書において、“アンチセンス”は、アンチセンス核酸（ＤＮＡまた  ＲＮＡ）およびその類似体を意味し、アンチセンスは、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合相互作用を通してポリヌクレオチド標的配列や配列部分を認識する一連のヌクレオチド塩基配列を持った一連の化学種を言う。その標的配列は、一本鎖または二重鎖  ＲＮＡや一本鎖または二重鎖ＤＮＡである。
【００１８】
このようなＲＮＡやＤＮＡ類似体は、２‘−Ｏ−アルキル糖修飾（２‘−Ｏ−ａｌｋｙｌｓｕｇａｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、メチルホスホナート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、３’−チオホルムアセタール（３‘−ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、スルホン（ｓｕｌｆｏｎｅ）、スルファメート（ｓｕｌｆａｍａｔｅ）、およびニトロキシド骨格修飾（ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、アミド（ａｍｉｄｅ）および塩基の一部分が修飾された類似体で構成されるが、これに限定されるものではない。加えて、分子類似体は、糖の一部分が異なる適切な一部分によって修飾されたり代替されるポリマーであることが可能で、そのポリマーは、モルホリン（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）類似体およびペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，  ＰＮＡ）類似体を含むが、これに限定されるものではない。このような類似体は、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨによって媒介される分解（ＲＮａｓｅＨ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性および標的特異性を向上させるために連結グループと関連した上記で言及した修飾および糖や塩基の構造的修飾の多様な組み合わせを含む。
【００１９】
本明細書において、“アンチセンス治療”は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）また生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で願わない標的ＤＮＡやＲＮＡ配列を不活性化するために標的遺伝子に関するアンチセンス切片を含む大環状核酸分子の特異的結合を含む一般的な用語である。
本明細書において、“細胞増殖”は、細胞分裂を意味する。“成長”という用語は、速い細胞分裂と遅いアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）つまり細胞死のために増加した細胞数を意味する。調節されない細胞増殖は、癌や異常細胞増殖に対する指標になる。正常的で癌細胞でない細胞は、特定類型の細胞のよくある特徴にしたがって規則的に分裂する。細胞が癌化状態に転移した時、その細胞は、非統制的に細胞分裂をして増殖する。増殖や成長の抑制が細胞の異常な分裂を調節する。
【００２０】
本明細書において、“キメラ大環状核酸分子”は、多数の標的遺伝子に対して実質的に相補的な複数のアンチセンスヌクレオチド切片を含む大環状核酸分子を意味する。  アンチセンス分子の切片は、各切片間に直接またはスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）を利用して間接的にお互いに連結できる。
【００２１】
本明細書において、“繊維状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ）”は、本発明の大環状核酸分子を生産する為の媒介物（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。ファージまたはファージミドが利用できる。例えば、一本鎖がファージまたファージミドによって生産された時、大環状核酸一本鎖が生産されるようにするために目標とする配列が媒介物に挿入されたりクローニングされる。ＤＮＡやＲＮＡバクテリオファージが、このような目的に使用できる。特に、繊維状バクテリオファージが使用できる。Ｍ１３，ｆｄおよびｆ１のような繊維状ファージは、環状ｓｓＤＮＡ分子を持った繊維状カプシド（ｃａｐｓｉｄ）を持つ。これらのライフサイクルは、エンカプシデーション（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）前にｓｓＤＮＡ分子に転換される細胞内でｄｓＤＮＡ中間媒介体複製形と関連がある。このような転換がｓｓＤＮＡを製造する手段を提供する。バクテリオファージＭ１３がクローニングベクターの用途に採択されてきた。
本明細書において、“遺伝子”は、完全なヌクレオチド配列の遺伝子または一部配列の遺伝子を言う。
本明細書において、“抑制”また“減少”は、遺伝子の発現、細胞増殖または  その他の表現型的特徴を低めることを示し、これらは混用して使用される。
本明細書において、“大環状核酸分子”は、“大環状アンチセンス分子”とも称されるが、一本鎖分子であり、実質的に相補的であり、標的遺伝子やＲＮＡ配列と結合する少なくても一つ以上のアンチセンス領域を含み、イソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）だけではなく、遺伝子の発現を抑制または減少させる。環状一本鎖核酸分子は、標的遺伝子に関する配列がアンチセンス型である限りは、一つ以上の遺伝子に関するセンスまたはアンチセンス配列を含む。
【００２２】
大環状核酸分子は、化学的な方法によって合成できる。しかし、典型的にはＭ１３とＭ１３から由来するファージミドを含む繊維状ファージシステムから生産される。大環状核酸分子がファージから生産される時、これを  “ファージゲノムアンチセンス化合物“と呼ぶ。
【００２３】
ある場合には、大環状核酸分子は、約２０ないし３０個のヌクレオチド長さの典型的なオリゴヌクレオチド配列よりもさらに長い。反対に、大環状核酸分子は、少なくても３千個ヌクレオチド長さであることも可能である。典型的にその範囲は、約３千個ないし８千個のヌクレオチド長さである。たとえ約３１００ないし７０００個のヌクレオチドが本発明で有用であるとしても、さらに望ましい長さの範囲は、約３３００ないし６０００塩基である。
【００２４】
大環状核酸分子の長さは、絶対的にさらに高いまたはさらに低い限界を持つ必要は無い。これは、ファージが大環状核酸分子を生産するのに使用される場合に特にそうである。標的遺伝子の少なくても一部分をコード化するファージの大きさと挿入の大きさで生産される一本鎖核酸の長さを調節できる。したがって、実施例の一つとして、上記核酸分子はファージ、例えば繊維状ファージが収容できる程度の長さにすることが可能である。
大環状核酸分子は、外来の配列だけではなく、特異的なアンチセンス配列を含むことができる。外来の配列は、多様な異なる遺伝子のセンスまたアンチセンス形を含むことができる。また、もしファージが核酸分子を生産するために使用されるなら、外来の配列は、ベクター配列であるばずである。大環状核酸分子の標的特異的アンチセンス領域の長さは、約１００個ヌクレオチドよりさらに短いものから約５０００個塩基以上に至るまで、制限が無い。典型的には、その範囲が約２００ないし約３０００個であり、望ましくは、その範囲は、約４００ないし２０００個である。標的特異的アンチセンス領域は、また全体遺伝子に相補的である。
また他の実施例として、アンチセンス分子は、ファージの通常の生活周期の一部としてバクテリオファージゲノムから生産される。
【００２５】
本明細書において、“実質的に相補的な”は、標的ＲＮＡに相補的で特異的に結合するアンチセンス化合物と約８０％程度の相同性を持つアンチセンス配列を意味する。一般的な問題として、絶対的な相補性を必要としないのである。
標的核酸と安定なデュプレックス  またはトリプレックスを形成するのに充分な相補性を持ついかなるアンチセンス分子でも適切であると思われる。安定なデュプレックス形成は、ハイブリッドされたアンチセンス分子の配列および長さとアンチセンス分子および標的配列間の相補性の程度に依存するために大環状分子が持つ相補性が少し充実していなくてもそのシステムは、維持できる。
本明細書において、“標的”また“標的化”は、アンチセンス分子が作られるようにする特別な個別遺伝子を言う。本発明の実施例として、アンチセンス分子は、ＬＣ−アンチセンス化合物の挿入から作られる。いくつかの文段で“標的化”は、標的遺伝子の発現が除去されるようにするために、アンチセンス分子を内因的に発現した転写物に結合させることを意味する。標的核酸配列は、免疫疾患、感染疾患、代謝疾患および遺伝疾患のような多様な疾患、または異常的な遺伝子発現によって招来される他の疾患の開始および進行に関連する遺伝子を含んだ多様な悪性腫瘍に関連する遺伝子から選択されることができる。
【００２６】
本発明のアンチセンス分子は、生化学的、生物学的活性において伝統的な合成  ＡＳ−オリゴよりさらに優れている。伝統的なＡＳ−オリゴがＤＮＡ合成機によって簡単に合成されるというが、これらは、標的部位の選択を必要とする。標的部位の選択過程は、時時、ＡＳ−オリゴデザインとも呼ぶ。この過程は、時間を消費し時々結論が出ない場合もある。それに、合成された  ＡＳ−オリゴは、ヌクレアーゼに不安定で、多くのシークエンス・エラーが起こりやすく、高い生産費用を必要としリポソームと複合体をなした後でも低い細胞内流入を示す。
本発明の実施例でみると、アンチセンスベクターに使用されるバクテリオファージから生産される一本鎖環状ゲノムＤＮＡが提供される。特に、使用されるバクテリオファージは、Ｍ１３ファージやＭ１３ファージの修飾型である。しかし、一本鎖核酸を生産するバクテリオファージまたはプラスミド、ウイルスまたは他のクローニング媒介物も使用できる。さらに望ましいのは、生産される一本鎖核酸は、環状である。アンチセンス分子を生産するＤＮＡ分子は、バクテリオファージのような媒介物のゲノムからクローニングされる。
【００２７】
アンチセンス研究分野で、伝統的に知られている知識によって長いアンチセンス分子を使用しないようにした。それは、さらに長いＡＳ−オリゴは、特異的に欠け、合成がさらに難しく細胞内流入が非効率的な傾向があるためである。事実、ホスホロチオエイト修飾オリゴのように化学的に修飾された第２世代ＡＳ−オリゴは、ＡＳ−オリゴが長くなるほど配列特異性が減少した。それに、直線ＡＳ−オリゴの合成が漸次的にさらに難しくなり、ＡＳ−オリゴ長さが増加するにしたがって目立って配列忠実度が減少する。
ファージベクターは、高い配列忠実度を持ったアンチセンス配列を含む長い一本鎖配列を簡単に生産できる。本発明のアンチセンス分子がたとえ以前とは異なり長い長さであっても標的ｍＲＮＡの発現を除去するのに立派な配列特異性を示した。アンチセンス核酸の独特な作用理論や機構を根拠とせずに、一旦アンチセンス配列の小さい部分が相補的配列と結合さえすれば、アンチセンス配列が相補的な標的配列の全体長さに関して配列の特異性を示す（ｚｉｐｓ）。アンチセンスＤＮＡとセンスＲＮＡの間に形成される長いデュプレックスは、その後ＲＮａｓｅＨ活性に対する基質としてずっと安定に維持される。
【００２８】
本発明のアンチセンス分子の有利な結合に対するまた異なる根拠は、長いアンチセンス分子が構造的に露出している標的部位に結合できる可能性がさらに高いということである。ｍＲＮＡは、それ自身の配列内で、そして細胞の細胞質でＲＮＡ結合蛋白質との相互作用によって広範囲な２次および３次構造を形成する傾向がある。アンチセンス分子に対するオープン標的部位を探すことは、好結果のアンチセンス活性のために必須的である。長い長さとともにファージゲノムアンチセンス分子は、標的ｍＲＮＡの露出された相補的配列にアプローチできる配列を持たなければならず、したがって標的ｍＲＮＡを除去する可能性を向上させることができる。
【００２９】
本発明のアンチセンス分子の原理は、目的とする標的遺伝子に適用されることである。例えば、ＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｋ２およびｋ−ｒａｓが、本発明のアンチセンス分子を利用する例として提供されたが、本発明のアンチセンス分子は目的とするどんな遺伝子に対しても製造できる。事実、本発明のアンチセンス分子は、意味ある程度にヌクレアーゼに対してさらに安定的であり標的除去に効果的である。例示されたＴＮＦ−α、ＮＦκＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｋ２およびｋ−ｒａｓ標的遺伝子の配列特異的減少が、本アンチセンス方法の幅広い活用を裏付けする。したがって、本発明のアンチセンス分子は、ある原料から来る標的ｍＲＮＡ配列に結合するのに使用できる。
アンチセンス活性はまた、標的ｍＲＮＡおよび蛋白質の除去と関連性を保障するために蛋白質レベルで調査された。ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳの投与は、細胞培養培地で  ラットＴＮＦ−αの分泌を有意性を持って減少させることによって効果的なアンチセンス活性を確実にする。反対に、正常ファージゲノム化合物（アンチセンス挿入が無い一本鎖環状分子）ＤＮＡは、ＴＮＦ−α分泌を軽微に減少させただけである。対照群アンチセンス分子の添加による  ＴＮＦ−α分泌の軽微な減少は、特にエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）内にある自由陽イオン性リポソームの細胞毒性によって説明できる。陽イオン性リポソームだけで処理された細胞は、リポソーム−アンチセンス分子複合体を有する細胞より低い生存率を示した。同様に、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの処理もＣＤＫ２発現の除去効果をもたらした。さらに、本発明の遺伝子特異的アンチセンス化合物をｃ−ｍｙｂおよびｃｄｋ２を含む腫瘍細胞株に投与した時、成長阻害を観察することができた。
【００３０】
伝統的なＡＳ−オリゴの細胞内流入は、陽イオン性リポソームと複合体を形成する時ずっと増加させられる。しかし、ＡＳ−オリゴが異った類型のリポソームと複合体を形成する時には、一貫しないで時々非効率的な細胞内流入が見られる。反対に、ファージゲノムアンチセンス分子は、その長い長さのために複数の短いステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成し、まるでプラスミドＤＮＡのように作用する。実際に、いくつかの異った類型のリポソームと複合体をなす時、アンチセンスＤＮＡは、一貫的であり増加された細胞内流入を示した。
合成ＡＳ−オリゴは、一般的に１５ないし２５個のヌクレオチド残基を持ち、一つの標的部位にだけ結合して基質ｍＲＮＡを除去する。しかし、大部分の慢性的な人間疾患等は、その疾患と関連する多様な遺伝子を標的にできるアンチセンス分子を必要とする複合的遺伝異常が見られる。そのような要求を満足させる為に複合的な標的化能力を持ったアンチセンス分子を考案することが望ましい。しかし、そのような分子を化学的に合成することは、化学合成時の多様な障害要因のために実用化が難しい。ファージゲノム  ＤＮＡを使用することによって、複合的なアンチセンス配列が遺伝子クローニングによってたやすく設計できる。さらに複合的なアンチセンス配列を持ったファージゲノムＤＮＡの配列完全度（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は、バクテリア細胞で増幅されたプラスミド  ＤＮＡのものと同一である。
【００３１】
ファージゲノムアンチセンス分子が持つまた他の長所は、配列変化においての幅広い許容性がある。本発明のゲノムアンチセンス分子は、約１５個以上の連続的なヌクレオチドを持つ配列が、異なる遺伝子修飾間で保存される限り効果的である。このような特性は、同一なアンチセンス分子が変異型に対して使用できる  ＨＩＶ  およびＨＢＶのような病原性ウイルスの多形性細胞株を標的にするのに特に有用である。そのうえ、人間のような一つの種から生産されるこのような類型のファージゲノムアンチセンス分子は、出処および標的生物間の配列ダイバージェンス（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）がコーディング配列にしたがって均等に分布していない限り、齧歯類のような異なる種で遺伝子の機能研究のために使用できる。
アンチセンス分子は、またいわゆる“ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）”アプローチ（Ｄｅ  Ｂａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９，  ２３５−２４１  （２００１）；  Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９３，  ２２６６−２２６９  （２００１）  ）によって遺伝子の機能を研究するための効果的な手段になる。ノックダウンアプローチで、その遺伝子を破壊しないで遺伝子機能を明らかにできる。このような方法は、遺伝子機能を同定するために  使用される伝統的な“ノックアウト”  方法よりもっと速い。本発明の実施例を見ると、ゲノムアンチセンス分子は、巨大機能的なゲノム学（ｍａｓｓｉｖｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に対して特に適切である。巨大機能的なゲノム学のためにファージゲノムアンチセンス化合物を利用するいくつかの顕著な特徴は  １）複雑なアンチセンスデザインを必要としないアンチセンス構造、２）大きい個別膜クローンを持ったアンチセンスライブラリーの構造、３）部分的なアンチセンス活性によるデーターの誤訳を避けられるさらに優れたアンチセンス活性を持っているということである。
【００３２】
本発明の実施例を見ると、ファージゲノムアンチセンス方法を利用することによって、巨大機能的ゲノム学で使用されるそのシステムの効能が伝統的なＡＳ−オリゴ方法の効能より何百倍も優れている。それに、ＤＮＡチップ、遺伝子発現連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＳＡＧＥ）、ＴＩＧＲ定方向遺伝子整列（ＴＩＧＲ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，ＴＯＧＡ）データベース、およびプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）のような異なる間接的なシステムを使用することに反して、本発明のファージゲノムアンチセンスシステムを使用する巨大機能的ゲノム学は、直接的な遺伝子機能化システムを使用する。
【００３３】
バクテリオファージシステムからつくられた環状アンチセンス分子、特にＭ１３  バクテリオファージシステムや適切なファージミドシステムからつくられた環状アンチセンス分子は、安定で、標的遺伝子の発現を防ぐのに有効である。ファージゲノムアンチセンス分子は、少ない量で有効であるが、また大量に調製できる。本発明のアンチセンス分子は、多様な類型の癌、ウイルス感染、免疫異常、代謝異常疾患、及び、さらに遺伝子発現を調節することによって疾患の開始および進行を抑制できる、他の人間疾患等に対する有効な治療薬である。
治療薬に適用される場合、大環状核酸分子は、経口、局所又は局在投与を含む多様な投与方法が考案可能である。テクニックおよび処方は、一般的に、レミントン薬学的科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）から探し出した。活性成分、つまりアンチセンス分子は、投与経路や剤形の本質にしたがって充填剤、膨脹剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤、腐蝕させるポリマー（ｅｒｏｄａｂｌｅｐｏｌｙｍｅｒ）、または滑沢剤を含む稀釈賦形剤のような担体と結合して使用する。典型的な剤形は、錠剤、散剤、懸濁剤、乳剤および溶剤を含む液体調製物、顆粒剤、およびカプセル剤を含む。
【００３４】
本発明の大環状核酸化合物は、普遍的な薬物運搬状態下で約４時間まで、薬物維持形を運搬する時には、約１２時間まで胃の酸性環境に薬物の露出される場合の経口投与に特に適当である。特定の条件での治療のためには、アンチセンス化合物で維持形に処方することが有利なことがある。
大環状核酸分子の全身投与は、粘膜透過または経皮透過方法を通して可能である。また上記化合物を経口投与することもできる。粘膜透過または経皮透過の為には、障壁を透過するために適合な透過物が剤形に使用されなければならない。このような透過物は、一般的にその技術分野で知られているものが含まれ、例えば、粘膜透過のためには胆汁酸、フシディン酸（ｆｕｓｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体を含む。それに、界面活性剤が透過を促進するために使用される。粘膜透過投与は、例えば、  吸入や座剤による投与に適切な形態だけではなく、鼻腔スプレーの使用を通してすることもできる。
【００３５】
本発明の大環状核酸分子は、また患者に投与するために薬学的に許容可能な担体と組合わせられる。薬学的に許容可能な担体の例としては、いくつかの種類の陽イオン性脂質、例えば、Ｎ−（１−２，３−ジオレイロキシ）プロピル）−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド  （Ｎ−（１−２，３−ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ）−ｎ，ｎ，ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＤＯＴＭＡ））  およびジオレオイルホスホチディルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｐｈｏｔｉｄｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  （ＤＯＰＥ））があるが、これらに限定されるものではない。リポソームもまた本発明のアンチセンス分子に適合な担体である。また異なる適合な担体は、本発明のアンチセンス分子を含む維持放出ゲルやポリマーである。
大環状核酸分子は、静脈投与、筋肉注射、硬膜投与、鼻腔投与、腹腔投与、腫瘍内投与、皮下注射、ｉｎ  ｓｉｔｕ注入および経口投与を含む効果的な投与経路によって患者に投与できる。経口投与は、本発明のアンチセンス分子および類似体を胃腸管での分解から保護するための腸用コーティングが必要になることもある。大環状核酸分子は、生理的に許容可能な担体または生理食塩水や他の適当な溶液のような賦形剤と混合できる。アンチセンス分子は、また核酸分子またはその類似体がそれらの標的に到達するまで分解するのを防止したり、または組織障壁を透過するアンチセンス分子やその類似体の移動を促進させる他の担体手段等を組合わせることができる。
【００３６】
実施例を見ると、大環状核酸分子は、癌や新生物腫瘍細胞の成長を阻害するのに効果的な量で投与される。また、アンチセンス分子は、ウイルス感染を治療するのに使用できる。上記ウイルスは、疱疹、人間パピロマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ；  ＨＰＶ）、ＨＩＶ、天然痘、単核細胞増加症（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）、肝炎または呼吸性シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）等があげられるが、これに限定されない。それに、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、原発性甲状腺低下症、ガラクトース血症、異常的ヘモグロビン、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病または肥満等のような代謝疾患を標的とすることができるが、これに限定されない。本発明のアンチセンス分子は、ショーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、抗リン脂質症候群（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、免疫複合性疾患、紫斑病、ショーエンレイン−ヘノホ症候群（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、免疫欠乏症候群、全身性紅斑性狼瘡、免疫欠乏、リューマチ等をあげられるが、これに限定されない免疫疾患のような他の疾患を治療するのに使用できる。
特定な大環状核酸分子の実質投与量は、疾患や感染の類型および段階、身体の異なる細胞に対するアンチセンス分子の毒性、細胞内流入速度、および核酸分子が投与される個体の重量および年齢等の要因に依存するであろう。患者のための効果的な用量は、細胞増殖を抑制するのに非効果的な量から効果的な量まで、アンチセンス分子の用量を増加させるのと同様な伝統的な方法によって確定され得る。疾患がある細胞に与えられる濃度は、約０．１ｎＭから約３０μＭの範囲であり、遺伝子発現を抑制するのに効果的で、分析できる表現型を見せる。癌や他の徴候の治療のためのアンチセンス分子の化学療法的適用において薬学的または  薬動力学的パラメータを決定する方法は、従来技術として知られている。
【００３７】
大環状核酸分子は、少なくても望ましい効果を得るのに充分な時間、患者に投与される。効果的なレベルを維持するために一日に何回、毎日、または何日かの間隔を置いてアンチセンス核酸分子を投与する必要がある。癌細胞に対して、アンチセンス分子は、癌細胞がそれ以上検出されなくなる時まで、またはさらに治療するとしても数的に意味ある程度減少されない間または、細胞が手術や治療によって調節できる数に減少される時まで投与される。アンチセンス分子が投与される時間の長さは、癌細胞に対する特定分子の流入速度および細胞がその分子と反応をするために必要な時間のような要因に依存する。
【００３８】
次の実施例は、本発明を具体的に提示するが、これに限定されるものではない。
【００３９】
実施例
実施例１−物質および方法
１．  細胞培養
単核細胞性マウス細胞株のＷＲＴ７／Ｐ２を使用した。人間細胞株のＴＨＰ−１、ＨＬ−６０  （急性前骨髄細胞性白血病）、Ｋ５６２  （慢性  骨髄性  白血病）、ＨｅＬａ（頚部癌）およびＭＣＦ−７（乳癌）は、韓国細胞株銀行から得た（ＫＣＬＢ，韓国）。このような細胞株は、１０％  加熱非活性化されたＦＢＳ（ＪＢＩ，韓国）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を添加したＲＰＭＩ１６４０またはＥＭＥＭ  （ＪＢＩ，  韓国）培地で維持させた。細胞は、３７℃  ＣＯ２（５％）インキュベータで培養され過成長を避けるように注意した。細胞は、リポフェクション  一日前に新鮮な培地に交換され、本実験当日に０．４％  トリパンブルー染色（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）で細胞生存を検査した。
【００４０】
２．ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの誘導発現およびラットのＴＮＦ−αおよび人間  ＮＦ−κＢをコード化する遺伝子のクローニング
ラットＴＮＦ−α発現は、ＷＲＴ７／Ｐ２細胞からリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  ＬＰＳ，  ３０μｇ／ｍｌ）によって誘導された。  細胞（１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）は、４８ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）の各ウェルに分注されＬＰＳで処理した。細胞は、ｍＲＮＡ量を調査するために望ましい時間に回収した。ＴＮＦ−α発現が最高に誘導されるためのＬＰＳインキュベーション時間は、他の実験から選択された。
ラット  ＴＮＦ−α  ｃＤＮＡは、上で説明した通り増幅されたｃＤＮＡ切片から得た。全体コーディング配列を含むＴＮＦ−αのＲＴ−ＰＣＲ切片（７０８ｂｐ）は、一組のＰＣＲプライマーによって増幅された。：  ５’−ＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＴＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１），  および５−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。  ラットＴＮＦ−α  ｃＤＮＡ切片は、ｌａｃＺ  遺伝子と同じ方向にＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ  制限部位を利用してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）ＫＳ（−）ベクターの複合成クローニング部位でクローニングされた（図１）。
同様に、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｋ−ｒａｓ  ａｎｄ  ｃｄｋ２遺伝子のｃＤＮＡ  切片は、一組のＰＣＲ  プライマーによって増幅された（表  １）。その末端を緩慢にした後  ｐＢＳ−ＫＳ  （＋）ベクターのＥｃｏＲＶ部位でクローニングされた。増幅されたｃＤＮＡ切片は、常に制限素化およびＤＮＡ  配列によって確認された。
【００４１】
３．  ファージミドベクター  およびＭ１３ＫＯ７  ヘルパーバクテリオファージを利用した大環状核酸分子の構成
（１）  センスまたはアンチセンス配列を含んでいる一本鎖バクテリオファージゲノムの構成。標的遺伝子に特異的なアンチセンス領域を含む大環状核酸分子は、標準クローニング手順にしたがって構成された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  １９８９）。感応（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ｃＤＮＡを持ったｐＢＳ−ＫＳ（＋）または（−）ファージミドを含む有能なバクテリア細胞（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）が、ヘルパーバクテリオファージＭ１３Ｋ０７（ＮＥＢ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ＵＳＡ）で形質感染された。ファージミドベクターでクローニングされたｃＤＮＡの方向は、センスまたはアンチセンス配列を決定する。２０％ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，  ＰＥＧ  ８０００）は、２×ＹＴで成長したヘルパーファージ感染細胞を夜通し培養した上澄み液に添加された。バクテリオファージ沈澱物は、ＴＥ（ｐＨ  ８．０）で再懸濁され、ファージゲノムＤＮＡは、フェノール抽出およびエタノール沈澱によって分離された。
【００４２】
（２）  ファージゲノムアンチセンス分子の精製
ヘルパーバクテリオファージの残留ゲノムＤＮＡおよび宿主バクテリア細胞からファージゲノムアンチセンス分子の精製は、少ない量の精製に関しては、０．８％  低い融点を持った（ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ，  ＬＭＰ）アガロースゲル、多い量の精製に関しては、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，  １．０×５０ｃｍ）で行った。ゲル濾過のためのカラム樹脂は、最高級セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）（登録商標）Ｓ−１０００（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｕｔｏｆｆ：  ２０，０００ｂｐ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ，  Ｓｗｅｄｅｎ）であり、０．２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ８．３）を含んだ  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）され平衡が維持された。アンチセンス分子の初めの容量は５％ゲル空隙容量（ｇｅｌ  ｖｏｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）で調整して、ＤＮＡ溶出は、樹脂平衡化によって同じ緩衝液で行った（流速：  ０．３  ｍｌ／ｍｉｎ）。試料は、デュアルＵＶ検出システムの２６０／２８０ｎｍでＵＶスキャンして溶出の間、５分毎に収集した。試料分画は、洗浄され７０％冷たいエタノールのによって沈澱され、次の実験のために蒸溜された超精製水およびＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で再懸濁された。精製されたアンチセンス分子は、１％アガロースゲルで定量して純度を検査した。対照群センス分子は、ベクターでｌａｃＺ遺伝子の反対方向にｐＢＳ−ＫＳ（＋）でクローニングされたＴＮＦ−ａ  ｃＤＮＡ切片で構成される。一本鎖センスまたはアンチセンス分子は、配列化のためにＴ７プライマーを使用して配列を確認させた。ＤＮＡ配列は、自動ＤＮＡシークエンサー（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）で行った。
【００４３】
４．  ファージゲノム環状アンチセンス分子の構造的な分析および安定性検査
アンチセンス分子は、一本鎖の環状であり安定であるという事実を、他の方法によって検査した。ＴＮＦ−αをコーディングする遺伝子に対するアンチセンス分子（１μｇ）は、３７℃で３時間ＸｈｏＩ（１０Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）、エクソヌクレアーゼ  ＩＩＩ（１６０Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）、またはＳ１ヌクレアーゼ（１０Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）で処理し、切断パターンだけではなく安定性研究のためにフェノール抽出、エタノール沈澱および１％アガロースゲルでゲル電気泳動（ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。
安定性検査のために、１μｇ  アンチセンス分子だけ、または  ＤＮＡ：リポソームが約１：３（ｗ／ｗ）の比率でリポソーム複合体を形成した後、検査した。非加熱不活性化された３０％  ＦＢＳ溶液がアンチセンス−リポソーム複合体に添加され４８時間の間、多様な時間週期で３７℃で培養した。ＦＢＳおよびヌクレアーゼで培養した後、アンチセンスＤＮＡは、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ１％アガロースゲルで電気泳動を行った。
環状アンチセンス分子（ＴＮＦ−αアンチセンス）および二重鎖プラスミドＤＮＡ（ＴＮＦ−α  ｃＤＮＡ切片を含んだｐＢＳ−ＫＳ（−）ファージミド）の熱変性が１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  および１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ＰＩＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）の溶液で行なわれた。１０μｇ／ｍｌ  （１０ｎＭ）のＤＮＡを９５℃に加熱して変性実験前に室温でゆっくり冷却されるようにした。次に温度は、０．５℃／３分の速度で上昇させた。融点の研究は、ペルチア温度調節器（ｐｅｌｔｉｅｒ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，  ＵＳＡ））を備えたダイオード整列分光光度計で行った。
【００４４】
５．  標的遺伝子転写物の検出
（１）  リポソームと複合化されたアンチセンス分子のトランスフェクション（形質感染）
リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標））、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（登録商標））  またはリポフェクタミンプラス（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（登録商標））（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）と同じ量の陽イオン性リポソームが、アンチセンス分子またはセンス対照群分子と混合された。このリポソーム−ＤＮＡ複合体は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）で混合され、その後製造業者が提案した方法にしたがって細胞に添加された。リポフェクションの細部事項を次に示す。つまり細胞を、１０％ＦＢＳを添加したＰＲＭＩ  １６４０またはＥＭＥＭ培地で培養し、リポフェクション３０分前にＯＰＴＩ−ＭＥＭで２回洗浄した。細胞（１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を４８−ウェルプレートに２００ｍｌずつ分注した。アンチセンス分子は、約１：３（ｗ／ｗ）の倍率で陽イオン性リポソームと混合され、形質転換によって細胞に添加された。細胞は、血清除去培地で３７℃、６時間培養した。リポフェクション後、２×ＦＢＳおよび抗生物質を培養培地に添加し３７℃で１８時間さらに培養した。ラットＴＮＦ−α発現は、ＬＰＳ（３０μｇ／ｍｌ）によって誘導された。細胞等は、ＲＮＡ調製の為に使用され、細胞上澄み液は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）でＩＬ−１０の存在下で検査した。
【００４５】
（２）  逆転写酵素−重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で転写の検出
ＲＮＡ調製は、製造業者に勧められた方法にしたがってトリ試薬（Ｔｒｉ  ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（ＭＲＣ，ＵＳＡ））を利用して行った。上記５−１で形質感染された各ウェルから回収された細胞は、ＲＮＡ精製のために１ｍｌトリ試薬および２００ｍｌクロロホルムで混合された。精製されたＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｃｃｅｓｓ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ））を使用して５０μｌ反応容量でＲＴ−ＰＣＲを行った。精製されたＲＮＡ、一組のプライマー（Ｔａｂｌｅ  ２）、ＡＭＶ逆転写酵素（５  Ｕ／μｌ）、Ｔｆｌ  ＤＮＡ重合酵素（５Ｕ／μｌ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ，１μｌ）およびＭｇＳＯ４（２５ｍＭ，２．５μｌ）をＰＣＲチューブに添加した。逆転写およびＰＣＲ反応は、熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  （Ｈｙｂａｉｄ，  ＵＫ））で連続的に行った。始めに合成されたｃＤＮＡの合成は、４８℃で４５分間実施され、続いてＤＮＡ増幅が９４℃で３０秒（変性）、５９℃で１分（加熱変性）、および６８℃で２分（重合）間、３０回の反復サイクルによって行われた。ＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲルで電気泳動を行って確認され、増幅されたＤＮＡの定量分析は、ゲル文章化プログラム（ｇｅｌ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ，  ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  １２２０（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏ−Ｔｅｃｈ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ））を行った。
【００４６】
（３）  サザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
サザンブロットのためのプローブは、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）オリゴ−標識および検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＫ）によって調製された。ＲＴ−ＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲルで電気泳動した後、０．４Ｍ  ＮａＯＨ溶液でナイロン膜に移転された。ＴＮＦ−αの為のオリゴヌクレオチドプローブは、２２ｍｅｒ：  ５’−ＧＡＴＧＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＴＴＴＧＧＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、およびＮＦ−κＢの為のオリゴヌクレオチドプローブは、２５ｍｅｒ  ５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であった。
【００４７】
１００ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプローブがフルオレセイン−１１−ｄＵＴＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１１−ｄＵＴＰ）、カコディルネイト緩衝液（ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）および末端転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）で混合されＥＬＣ標識の為に３７℃で７０分間培養された。移転されたＤＮＡを持ったナイロン膜に対するプローブハイブリッドは、４２℃で１４時間の間６ｍｌハイブリッド緩衝液（５×ＳＳＣ，０．０２％ＳＤＳ）で行った。ナイロン膜は、４５℃で１５分間０．１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣで二回、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで一回洗浄した。その膜は、３０分間ＨＲＰ抗フルオレセイン接合抗体（ＨＲＰ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理した後、Ｘ線フィルムに露出される前、約５分間ＥＣＬ検出試薬で培養された。
（４）イライザ（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）によるポリペプチドの検出
アンチセンス処理後、標的蛋白質の定量がイライザまたはウエスタンブロット方法によって調査された。イライザ分析の為に、細胞培養上澄み液が５０倍に稀釈されて、ＴＮＦ−αに対する抗体でコーティングされたイライザプレートに添加された。抗ＴＮＦ−αに対するビオチン化された２次抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）がイライザプレートの各ウェルに添加され、９０分間室温で培養された。三回の洗浄後、ストレプタビディン−ペルオキシダーゼ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が添加され、４５分間さらに培養された。そのプレートは、結合されないストレプタビディン−ペルオキシダーゼを除去するために４回洗浄され、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）が添加された。発色のために２０分間培養した後、吸光度４５０ｎｍで測定された。
【００４８】
ウエスタンブロットがＣＤＫ２の存在を調査するために行われた。全体蛋白質量は、細胞をアンチセンスまたはセンスＤＮＡで処理した後、ＢＣＡ（登録商標）蛋白質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）で決定した。２０ｇの蛋白質試料が１２％ポリアクリルアミドゲルに充填（ｌｏａｄ）され、電気泳動した。ゲル電気泳動後、蛋白質は、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）に移転された。その膜が３％無脂肪牛乳および０．０５％  ツィーン２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含むＰＢＳで反応停止のために培養された。膜は、その後人間ＣＤＫ２に対するウサギの複合性クローニングＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）で培養された。２次性抗体の西洋わさびペルオキシダーゼ接合ドンキー抗ラビットＩｇＧ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓｗｅｄｅｎ））が添加され、蛋白質バンドがＥＣＮキットを使用して視覚化された。
【００４９】
（５）  細胞成長の抑制を決定する為のＭＴＴ分析
ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２に対するアンチセンス分子等は、ＭＴＴ分析を利用してその成長抑制効果を研究した。ＭＴＴ試薬は、３−［４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ  （Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）である。Ｋ５６２、ＨＬ−６０、ＨｅＬａおよびＭＣＦ−７細胞（６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで二回洗浄され５０μｌ体積で９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ウェルに分注された。リポフェクタミン２０００またはリポフェクタミンプラス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）は、細胞内流入のために約１：３（ｗ／ｗ）の比率でアンチセンス分子と複合された。細胞は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，  ＵＳＡ）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭで５時間の間アンチセンス−リポソーム複合体と培養され、３７℃で５日間ＣＯ２（５％）培養器で維持された。
【００５０】
ＭＴＴ試薬は、５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳで稀釈し、１００ｍｇのＭＴＴ試薬が  １００μｌの培養培地を含んでいる各ウェルに添加された。細胞は、３７℃で４時間の間ＣＯ２（５％）培養器で維持され、室温で１時間同一の量のイソプロパノール（０．１  Ｎ  ＨＣｌを含有）で処理された。その後、細胞は、イライザリーダー（ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ，  ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＵＳＡ））で吸光度５７０ｎｍで測定された。
【００５１】
実施例２  実験方法および結果
組換えＭ１３バクテリオファージシステムを使用した大環状核酸化合物の構造
Ｍ１３バクテリオファージ（ファージ）の環状ファージゲノムがそのゲノムの部分としてアンチセンス配列を持つことができるのかを調査して新しいアンチセンス  分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成形と関連した問題を克服できるかを調査する為に実験を行った。組換えのＭ１３ファージの生産が、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）ファージミドですでに修飾されたバクテリア細胞にＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを感染させて行われた（Ｊｕｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  ２３，  ５３５−５３６  （１９９５））。標的遺伝子に関するアンチセンスまたはセンス配列を含む一本鎖環状ファージゲノムを生産するためにファージミドのＦ１開始点（Ｆ１  ｏｒｉｇｉｎ）を利用した。ラットＴＮＦａをコード化する遺伝子の場合、アンチセンス配列を生産するためにその遺伝子の全体ｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（−）ベクターに配置された（図１）。一本鎖ゲノムＤＮＡにおいてアンチセンス配列は、Ｔ７配列化プライマーを利用したＤＮＡ配列によって確認された（図２）。ＴＮＦ−αアンチセンス挿入の５′および３′フランク配列（ｆｌａｎｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ファージミドベクターの配列であると現れた。挿入配列は、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの配列と関連するのでアンチセンス配列が存在することを証明した。ＴＮＦ−α、ＮＦ−ｋＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２に関するアンチセンス配列を含む環状ファージゲノムは、各各ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳ、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ、およびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳであると明らかになった。
【００５２】
２．  ファージゲノムアンチセンスＤＮＡのカラムクロマトグラフィー精製
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを持ったラットＴＮＦ−αｃＤＮＡを含んだ組換えファージミドですでに修飾されたバクテリア細胞を感染させた後分離された。アンチセンス配列を持ったファージゲノムＤＮＡがファージミドシステムを使用して生産される時、一本鎖ＤＮＡは、少量のＭ１３ファージの二重鎖複製形やヘルパーファージから由来の野生型一本鎖ゲノムＤＮＡで混入される。それに、アンチセンス調製は、トランスフェクション効率を低めて細胞増殖に影響を与えられ得る高いレベルの混入リポポリサッカリド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，  ＬＰＳ）を含むものと知られている。  アンチセンス配列を含むファージゲノムＤＮＡは、アガロースゲル精製方法を利用して少ない量で分離できる。
【００５３】
ゲル濾過カラムクロマトグラフィーは、環状ファージゲノムアンチセンスＤＮＡの大規模精製のために検査された。セファクリルＳ−１０００最上級ゲルが５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．３，  ０．２ＭＮａＣｌ）で平衡化され、アンチセンス試料（ゲル体積の５％）で充填された。カラムが平衡化緩衝液と同じ溶出緩衝液で溶出された時、主要なピークが７５分から１２０分の保持時間から得られた（図３Ａ）。ピークは、分画  ＩからＶＩＩまで各分画に対する５また１０分の保持時間によって７分画に分けられた。各溶出分画は、アンチセンス鎖の精製量を確認するために１％アガロースゲルにローディングさせた（図３Ｂ）。野生型Ｍ１３バクテリオファージＤＮＡが主バンドとして分画ＩＩＩから探された（保持時間７５分）。分画ＩＶは、主バンドとして大環状アンチセンス分子を含んだ（保持時間８０分）。保持時間８０から１００分までを検出した分画を集めて、エタノールで沈澱させた。アンチセンス沈澱物は、その後、７０％冷エタノールで洗浄し、次の実験のために蒸溜水で再懸濁させた。大環状アンチセンス鎖は、６０％の回収率で得、アンチセンスの吸光度は、２６０／２８０比率で１．８以上であった。ＬＡＬ検査でＬＰＳを測定した時、アンチセンス分子は、大部分ＬＰＳによって混入されなかった。上記の事実から、クロマトグラフィー精製によって混入物の効果的な除去が行われたことが分かった。
【００５４】
３．  ファージゲノムアンチセンスＤＮＡの構造的分析および安定性検査
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの環状構造およびヌクレアーゼに対する安定性に関して調査した。アンチセンス分子は、閉鎖された環状構造のためにエクソヌクレアーゼに対して安定であると予想された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがエンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理される時、アンチセンス分子は、ヌクレアーゼと３時間の培養後であってもほとんど損傷されないと知られている。反対に、ＸｈｏＩが組換えＭ１３ファージＤＮＡの二重鎖複製形に添加される時、ＤＮＡは、予想どうり制限酵素およびエクソヌクレアーゼＩＩＩの組換えによって完全に切断された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが一本鎖環状分子であるという事実は、Ｓ１ヌクレアーゼによってアンチセンス分子を完全に切断させることによって確認された（図４Ａ）。
ファージゲノムアンチセンス分子は、またそれらの構造的真偽（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が血清と培養した後、大きく保全された為に安定であると知られている。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが陽イオン性リポソームと結合した時、アンチセンス分子の大分画は、牛胎児血清（ＦＢＳ）で培養した後、損傷されていないまま残された。本当に、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、３０％ＦＢＳで２４時間培養した後でさえ損傷しなかった。上記の結果から、ファージゲノムアンチセンス分子がリポソームと複合体を形成することによって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）適用の間もっと安定になることが分かった（図４Ｂ）。
【００５５】
一本鎖ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよびＴＮＦ−α挿入を含む二重鎖ファージミドＤＮＡは、また融点（Ｔｍ１／２）を測定することによって調査した。温度が漸進的に増加される時、二重鎖ファージミドＤＮＡに関して吸光度２６０ｎｍがモニターされる時、典型的な色彩変化が８７℃附近で検出された。しかし、ファージゲノムアンチセンス分子が融点によって調査した時、緩和な傾きの色彩変化が５４℃附近で検出され、これは短い細胞内分子デュプレックスを持つ領域が変性されたことを示すものである（図５）。上記の結果から、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが一本鎖であり環状分子であることが分かった。
【００５６】
４．ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳによるラットＴＮＦ−αｍＲＮＡの効果的で特異的除去
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのアンチセンス活性を検査した。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、非特異的アンチセンスファージミドベクター配列とラットＴＮＦ−αｍＲＮＡに特異的なアンチセンス領域を含む長いアンチセンス配列を含む。ファージゲノムアンチセンス分子が大量の非特異的配列を持っているという事実は、アンチセンス活性の標的特異性の徹底した分析を必要とする。ファージゲノムアンチセンス分子が標的遺伝子発現を除去する為に特異的に作用するかを調査するために、複合性対照群遺伝子がｍＲＮＡ除去のレベルを比較する為に利用された。
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの特異的活性を検討するために、０．５μｇ（１．４  ｎＭ）のアンチセンス分子が１．５μｇの陽イオン性リポソームと複合され、１×１０５個の単核細胞株ＷＲＴ７／Ｐ２に添加された。その後細胞は、ＬＰＳ処理によってＴＮＦ−α発現が誘導された。細胞がＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳで処理された時、ＴＮＦ−αｍＲＮＡの誘導レベルは、有意性を持って減少した。反対に、細胞がＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（ＴＮＦ−αのセンス鎖）またはＭ１３ＳＳ（アンチセンス挿入が無い一本鎖ファージゲノム）で処理された時、細胞は、ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの大きな減少を見せなかった（図６Ａ）。ＴＮＦ−αのＲＴ−ＰＣＲバンドが増幅されたＤＮＡ切片の中間と結合されるプローブを利用してサザンブロットによって確認した（図６Ｂ）。
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）およびラクタマーゼ（Ａｍｐ）遺伝子のアンチセンス配列だけではなくラットＴＮＦ−αアンチセンス配列を含み、全体３．７ｋｂ  一本鎖環状ゲノムを含んでいる。ＴＮＦ−α特異的アンチセンス領域は、約７０８塩基長さである。したがって、２０または３０個のヌクレオチドの伝統的な合成アンチセンス分子と比較する時、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳでＴＮＦ−α特異的アンチセンス配列は、それ自体でとても長い。アンチセンス分子が長くなるほど配列特異性が減少すると一般的に信じられているため、これは意味がある。さらに、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのアンチセンス活性が本当に配列特異的であることを示すためにまた異なる実験を行った。
【００５７】
配列特異的アンチセンス活性を証明するために、三つの異なる遺伝子がＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのリポフェクション後、ｍＲＮＡレベルに関して調査された。三種類の遺伝子は、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、およびＩＬ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）である。これら遺伝子の発現は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのリポフェクションによって影響を受けなかった（図６Ａ，Ｃ）。
アンチセンス活性でＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの容量応答がまた調査された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳが０．０１μｇ（０．０３ｎＭ）の濃度で使用された時、ＴＮＦ−α発現がただ軽微に減少された。０．０５μｇ（０．１４ｎＭ）の濃度で、ＴＮＦ−α発現が部分的に除去された。ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの量が、０．１μｇ（０．２８ｎＭ）に増加された時、ＴＮＦ−αｍＲＮＡは、ほとんど無いことが分かった（図６Ｄ）。これらの結果がＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳは、伝統的に使用されるアンチセンス分子よりずっと少ない量を使用して標的ｍＲＮＡの除去のために効果的であることを示している。
【００５８】
５．  ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２遺伝子に対するファージゲノムアンチセンス分子によるｍＲＮＡ発現の特異的除去
ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳの効能を観察する為に、他の遺伝子に特異的に向かうファージゲノムアンチセンス化合物はＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｋ−ｒａｓおよびｃｄｋ２と同じ他の遺伝子の発現を防ぐのかを調査する為に実験を行った。ＮＦ−κＢ（ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ）に対するアンチセンス化合物が有効なアンチセンス活性のためにＴＨＰ−１  細胞から生産され検査した。ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳは、またリポソームと複合させる量を増加させながら細胞に添加した。０．０５μｇ（０．１４ｎＭ）のＮＦｋＢ−Ｍ１３ＡＳがＴＨＰ−１に添加された時、ＮＦ−κＢ  ｍＲＮＡは、約７０％に減少した。ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの量が、０．１μｇ（０．２８ｎＭ）および０．２μｇ（０．５６ｎＭ）に増加された時、ＮＦ−κＢ  ｍＲＮＡは、約９０％以上が除去された。反面、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ（ＮＦκＢのセンス配列を持ったファージゲノムＤＮＡ）またはＭ１３ＳＳで処理された細胞は、ＮＦ−κＢ発現があまり影響を受けなかった（図７Ａ）。ＮＦ−κＢのＰＣＲで増幅されたバンドは、サザンブロットによってさらに信頼できる証明になった（図７Ｂ）。
【００５９】
０．４μｇ（１．１２ｎＭ）のｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳがＫ５６２細胞に添加された時、ｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡは、約８０％程度減少した。反面、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＳＥまたはＭ１３ＳＳで処理されたＫ５６２細胞では、ｃ−ｍｙｃ発現が実質的に影響を受けなかった（図８Ａ）。０．２μｇ（０．５６ｎＭ）  および０．４μｇ（１．１２ｎＭ）のｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳがＨＬ−６０細胞に添加された時、ｃ−ｍｙｂ  ｍＲＮＡは、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥと比較して約７０％程度減少された。反面、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥで処理されたＨＬ−６０細胞では、発現が実質的に影響を受けなかった（図８Ｂ）。
０．３μｇ（０．８４ｎＭ）のｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳがＨｅＬａ細胞に添加された時、ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡは、約８０％程度減少した。反面、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥまたはＭ１３ＳＳで処理されたＨｅＬａ細胞は、ｋ−ｒａｓ発現があまり影響を受けなかった（図８Ｃ）。
最後に、０．１μｇ（０．２８ｎＭ）および０．２μｇ（０．５６ｎＭ）のｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳが、ＨｅＬａ細胞に添加された時、ｃｄｋ２ｍＲＮＡレベルがｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥと比較して各各約７０％および７５％程度減少した。ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの量が０．３μｇ（０．８４ｎＭ）に増加された時、内因性ｃｄｋ２  ｍＲＮＡレベルが９０％以上除去された。反面、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥで処理されたＨｅＬａ細胞では、ｃｄｋ２発現が実質的に影響を受けなかった（図８Ｄ）。
【００６０】
６．ＴＮＦ−αおよびＣＤＫ２活性の減少
標的遺伝子のｍＲＮＡがアンチセンス方法で除去される時、ｍＲＮＡの飜訳生産物は、作られることがない。標的遺伝子の減少または除去された蛋白質の確認は、したがって、アンチセンス分子によって起こる生理学的な効果を裏付けするのに必要である。蛋白質レベルは、細胞をアンチセンス分子で処理した後、二種類の方法で調査した。
ＷＲＴ７／Ｐ２細胞は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳでリポフェクションされ、形質転換体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）から分泌されるＴＮＦ−αは、イライザ分析を利用して測定した。内因性ＴＮＦ−αｍＲＮＡの減少レベルと同様にＴＮＦ−α上澄み液がまたＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ  投与後９０％以上減少した（図９Ａ）。しかし、対照群アンチセンス分子のＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（ＴＮＦ−α遺伝子のセンス鎖を含有）またはＭ１３ＳＳは、ＷＲＴ７／Ｐ２形質転換体でＴＮＦ−α発現を減少させなかった。この結果からＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳがＴＮＦ−αｍＲＮＡの除去および形質転換体からＴＮＦ−αの連続する消滅に効果的であることが分かった。
【００６１】
ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの形質転換体でＣＤＫ２レベルをウエスタンブロットで調査した。ＨｅＬａ細胞は、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳまたはｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥで処理され、形質転換後４８時間が経過した後、上記細胞を利用して全体蛋白質を抽出した。分離された蛋白質は、定量の為にウエスタンブロット技術を利用して分析した。０．８ｎＭ（０．３μｇ／ｗｅｌｌ）の濃度でｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳがＣＤＫ２レベルを７０％以上減少させた反面、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥは、蛋白質の細胞レベルにいかなる影響も与えなかった（図９Ｂ）。この結果から、このファージゲノムアンチセンス分子が標的ｍＲＮＡの特異的除去と連続する形質転換体で標的蛋白質の消滅を導き効果的に機能することが分かった。
【００６２】
７．  ファージゲノムアンチセンス方法による癌細胞の成長抑制
発癌遺伝子は、新生物腫瘍的変形（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および癌細胞の進行に関連する。発癌遺伝子がアンチセンス介入のための良い標的であるため、２個の重要な発癌遺伝子のｃ−ｍｙｂおよびｋ−ｒａｓの発現が、これらの遺伝子に特異的なファージゲノムアンチセンス分子によって特異的に遮断されたなら成長抑制が起きるかどうかを調査するために若干の腫瘍細胞株を検査した。また、ｃｄｋ２遺伝子発現がｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの投与に反応して遮断される為に腫瘍細胞に関する抑制効果を調査した。
ｋ−ｒａｓに対するファージゲノムアンチセンス分子がＭＣＦ−７（乳癌）細胞株に添加されｃ−ｍｙｂに対するアンチセンスがＫ５６２（慢性骨髄性白血病）またはＨＬ−６０（急性前骨髄細胞性白血病）細胞株に添加され、ｃｄｋ２に対するアンチセンス分子がＨｅＬａ（頚部癌）細胞株に添加された。各アンチセンス化合物に関するアンチセンス形質転換体が、その後ＭＴＴエッセイを利用して腫瘍細胞成長の抑制に関して調査した（図１０および１１）。
【００６３】
ｋ−ｒａｓに対するファージゲノムアンチセンス分子（ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ）がＭＣＦ−７細胞に添加される時、形質転換体は、０．１μｇ（０．５ｎＭ）および０．２μｇ（１ｎＭ）のアンチセンス濃度で細胞成長に関して７０％以上の抑制を示した。反面、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥ（Ｒａｓ遺伝子のセンス対照群）は、０．５ｎＭアンチセンス濃度で約９％以下に抑制され、１ｎＭ濃度で約１５％以下に抑制され、最低の細胞成長抑制を示しただけである（図１０Ａ）。ＨｅＬａ細胞は、２ｎＭの濃度でｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳで処理された時、約７０％以上の成長抑制が観察された。反面、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥ（ｃｄｋ２遺伝子のセンス対照群）は、形質転換されたＨｅＬａ細胞の３０％以下の成長抑制を示した（図１０Ｂ）。
ｃ−ｍｙｂに対するアンチセンス分子は、０．５ｋｂ（ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１）および１．５ｋｂ（ｋ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ２）の２個の異なる長さに構成された。白血病細胞株Ｋ５６２およびＨＬ−６０がｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１またはｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ２で処理される時、これら細胞株において約６０％以上成長抑制が観察された（図１１）。反面、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥ（対照センス分子）は、Ｋ５６２およびＨＬ−６０細胞の実質的どんな成長抑制も示さなかった。
【００６４】
ここで引用された全ての引例は、完全に引例として編入される。
本発明の範囲が、上記実施例に限定されるものではなく、本発明が属する技術分野に属する通常の知識を持つ者であれば、請求範囲に記載された本発明の保護範囲内で、多様な補完及び修飾が可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラットＴＮＦαのファージゲノム環状アンチセンス分子（ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ）の模式図である。
ラットＴＮＦαは、ｐＢＳ−ＫＳ（−）というファージミドベクターのマルチプル・クローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）へクローニングされた。一本鎖センス分子は、ｌａｃＺ遺伝子と同じ方向にＴＮＦα挿入を位置させて得られる反面、アンチセンス分子は、ｌａｃＺ遺伝子と逆方向にＴＮＦα遺伝子を位置させて得られる。Ｍ１３Ｋ０７と同じヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）と一緒に感染させると、このような構成物に存在するＴＮＦαの一本鎖アンチセンスやセンス分子が発現される。
【図２】図２は、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳのＤＮＡ配列を示した図である。
ＤＮＡ配列分析は、Ｔ３シークエンシングプライマー（Ｔ３  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ）を使用して、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳでＴＮＦαアンチセンス配列を確認するために行った。センス配列は、ＴＮＦαに関するもので、右側に表示された矢印の下に示される。鋳型の実際のアンチセンス配列は、逆向きであり相補的である。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ファージゲノムアンチセンス分子のクロマトグラフィー精製を示した図である。
Ａ．ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による環状アンチセンス分子に対する溶出状態（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ）。セファクリルＳ−１０００最上級（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００  ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）（１．０×５０ｃｍ）樹脂がＤＮＡ分画に使用された。溶出緩衝液は、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）で、流速は１分当り０．３ｍｌに設定された。各分画の試料用量は、７０μｇ（１ｍｇ／ｍｌで７０μｌ）に設定した。
Ｂ．ゲル濾過カラムクロマトグラフィーから得た分画の電気泳動パターン。レーン１、粗成物ＤＮＡ；  レーン２〜８、保持時間に対応する分画Ｉ〜ＶＩＩ。精製されたＤＮＡは、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）染色で視覚化した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＴＮＦ−α配列を含むファージゲノムアンチセンス分子の生化学的な特性を示した図である。
Ａ．  ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ分子の特性、
レーン１、λ−ＨｉｎｄＩＩＩ、ＤＮＡサイズ・マーカー；レーン２、ＴＮＦ−αｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ＴＮＦα−ｐｌａｓｍｉｄ）；レーン３、ＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ；レーン４、制限酵素ＸｈｏＩで処理したＴＮＦα−プラスミド；レーン５、制限酵素ＸｈｏＩで処理したＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ；  レーン６、Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＴＮＦα−プラスミド；  レーン７、Ｓ１ヌクレアーゼで処理したＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ；  レーン８、制限酵素ＸｈｏＩで処理した後、エクソヌクレアーゼＩＩＩで処理したＴＮＦα−プラスミド；  レーン９、制限酵素ＸｈｏＩで処理した後、エクソヌクレアーゼＩＩＩで処理したＴＮＦ−αＭ１３ＡＳ。ＴＮＦ−α−プラスミドまたはＴＮＦ−αＭ１３ＡＳは、製造業者によって特定される多様な酵素と共に反応を行った。
Ｂ．ＴＮＦ−αＭ１３ＡＳの安定性検査。ファージゲノムアンチセンス分子は、３０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，  ＦＢＳ）で多様な時間間隔で反応させた。
レーン１〜８、異なる時間別に血清で処理した。レーン９は、正常群である。血清で処理したアンチセンス分子は、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）染色で視覚化した。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳおよび二重鎖プラスミド分子の融点を示した図である。
吸光度は、温度が３０℃から９５℃に上がる間、３分間隔で０．５℃増加する度に測定した。
Ａ．  ＴＮＦ−α挿入を含む二重鎖ファージミドのＴｍ１／２プロファイル。
Ｂ．  一本鎖環状アンチセンス分子のＴＮＦ−αＭ１３ＡＳのＴｍ１／２プロファイル。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ＷＲＴ７／Ｐ２細胞でＴＮＦ−αｍＲＮＡレベルに対するＴＮＦ−αＭ１３ＡＳのアンチセンス活性を示す。
Ａ、Ｃ、およびＤで示した結果は、ＲＴ−ＰＣＲから得た。Ｂで示した結果は、サザンハイブリダイゼーションから得た。ＲＴ−ＰＣＲは、全体ＲＮＡを使って行った。細胞は、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）と複合された  ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳ（１．４ｎＭ，１．６５  ｇ／ｍｌ）で処理された。アンチセンス分子のリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）後、ＴＮＦ−αは、ＷＲＴ７／Ｐ２細胞にＬＰＳ処理で誘導されその後、全体ＲＮＡが分離された。
Ａ．  ＲＴ−ＰＣＲは、ＴＮＦ−αプライマーまたはβ−アクチンプライマーの２セットのプライマーで行った。  ＰＣＲで確認した結果は、レーン１、リポソーム；  レーン２、ＴＮＦα−Ｍ１３ＡＳ（アンチセンス）；  レーン３、ＴＮＦα−Ｍ１３ＳＥ（センス）；  レーン４、Ｍ１３ＳＳ（アンチセンス挿入がないファージゲノムＤＮＡ）。
Ｂ．  パネルＡのＤＮＡが、ナイロン膜に移転された２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドでプローブされた。
Ｃ．  非特異的アンチセンスの効果を調査するために、ＩＬ−１βおよびＧＡＰＤＨがＲＴ−ＰＣＲで増幅された。全体ＲＮＡ量とアンチセンス化合物を含む一本鎖環状分子の量は、パネルＡと同じ。増幅ＰＣＲ分画は、１％アガロースゲルで電気泳動してエチジウムブロマイドで染色して視覚化した。
Ｄ．  ＴＮＦ−αｍＲＮＡ発現に関するＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳの用量依存的な効果。レーン１、リポソーム；レーン２〜５、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳ；レーン６、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＳＥ；およびレーン７、Ｍ１３ＳＳ。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＴＨＰ１細胞で人間  ＮＦκＢ  ｍＲＮＡ  レベルに関するＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳの効果を示した図である。
ＴＨＰ１細胞（１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）は、異なる量のＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ、または  Ｍ１３ＳＳで感染させた。リポフェクション後  細胞は、６時間の間ＰＭＡ（１６０ｎＭ）で刺激された。全体ＲＮＡが分離され、ＲＴ−ＰＣＲを行った。
Ａ．  ＮＦκＢのｍＲＮＡレベルは、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ処理によって用量依存的に減少した。レーン１の左側にある表示されないレーンは、分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ  ｍａｒｋｅｒ）、レーン１、正常群；  レーン２〜４、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＡＳ（各各  ０．１４  ｎＭ、０．２８  ｎＭ  および０．５６  ｎＭ）；レーン５〜６、ＮＦκＢ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６  ｎＭ）；レーン７〜８、Ｍ１３ＳＳ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６  ｎＭ）；およびレーン９の右側にある表示されないレーンは、リポフェクタミン。
Ｂ．パネルＡでＤＮＡ  バンドは、ナイロン膜に転移され、サザンハイブリダイゼーションを行った。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、各各遺伝子のｍＲＮＡ発現に対するｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳ、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳおよびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳの効果を示した図である。
Ｋ５６２およびＨＬ−６０細胞は、各各ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳおよびｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ分子で感染させた。
Ａ．Ｋ５６２細胞でのＲＴ−ＰＣＲ  結果。
レーン１〜２、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．５６ｎＭ  および１．１２ｎＭ）；レーン３〜４、ｃ−ｍｙｃ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２ｎＭ）；およびレーン５、Ｍ１３ＳＳ（０．５６ｎＭ）。
Ｂ．ＨＬ−６０細胞でのＲＴ−ＰＣＲ結果。
レーン１〜２、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２ｎＭ）；  レーン３〜４、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．５６ｎＭおよび１．１２  ｎＭ）。
Ｃ  およびＤ．ヒーラ細胞（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ）が各各異なる量のｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳおよびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ分子で処理された。Ｃ．レーン１〜２、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ（各各０．２８ｎＭおよび０．８４  ｎＭ）；レーン３〜４、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）；  レーン５〜６、Ｍ１３ＳＳ（各各０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭ）。
Ｄ．レーン１〜３、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ（各各０．２８ｎＭ、０．５６ｎＭおよび０．８４ｎＭ）；  レーン４〜６、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥ（各各０．２８ｎＭ、０．５６ｎＭおよび０．８４ｎＭ）。増幅されたＰＣＲ分画は、１％アガロースゲルで電気泳動をしてエチジウムブロマイド染色で視覚化した。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ファージゲノムアンチセンス分子を投与することによるＴＮＦ−αおよびＣＤＫ２の発現減少を示した図である。
Ａ．培地から遊離されたＴＮＦ−αは、イライザ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定された。ＷＲＴ７／Ｐ２細胞は、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＡＳ、ＴＮＦ−α−Ｍ１３ＳＥまたＭ１３ＳＳ（各各、レーン１〜３）で感染させた。ＴＮＦ−αは、６時間の間  ３０μｇ／ｍｌ  ＬＰＳで誘導された。細胞培養の上澄み液は、分析直前に５０倍稀釈された。各各の値は、三回の実験に関する平均±標準偏差を示す。統計的有意性は、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで計算した（変動分析、＊ｐ＜０．０５）。
Ｂ．ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ分子の処理後、ＨｅＬａ細胞を使ってＣＤＫ２のサザンハイブリダイゼーション。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＭＣＦ−７およびＨｅＬａ細胞の増殖に対するファージゲノムアンチセンス分子の効果を示した図である。
ＭＴＴ分析を行い、各各ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳおよびｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳで処理された細胞の成長抑制を決定した。
Ａ．ＭＣＦ−７細胞は、１：３（ｗ／ｗ）の比率でリポフェクタミン２０００と複合された０．２８ｎＭおよび０．５６ｎＭのｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳで処理された。□、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ；網状四角、ｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＳＥ；斜線四角、リポソームがないｋ−ｒａｓ−Ｍ１３ＡＳ；および■、リポフェクタミン２０００。
Ｂ．ＨｅＬａ細胞は、リポフェクタミン２０００と複合されたｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ（０．８４ｎＭ）で処理された。カラム１、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ（０．８４ｎＭ）；カラム２、ｃｄｋ２−Ｍ１３ＳＥ（０．８４ｎＭ）；  カラム３、リポソームがないｃｄｋ２−Ｍ１３ＡＳ；および、カラム４、リポフェクタミン２０００。各値は、三回の実験の平均±標準偏差を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｋ５６２およびＨＬ−６０細胞の増殖に関するｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ分子の効果を示す。
ＭＴＴ分析を行いｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳによる成長抑制を調査した。二種類のｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ分子、並びに、各各０．５ｋｂや１．５ｋｂのｃ−ｍｙｂ配列を含むｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ１およびｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ２で構成された。Ｋ５６２（Ａ）およびＨＬ−６０（Ｂ）細胞は、リポフェクタミン２０００と複合されたｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ（０．８４ｎＭ）で処理された。
カラム１、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ  ０．５ｋｂ；  カラム２、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ  １．５ｋｂ；カラム３、ｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＳＥ  １．５ｋｂ；  およびカラム４、リポソームがないｃ−ｍｙｂ−Ｍ１３ＡＳ  １．５ｋｂ。各値は、三回の実験の平均±標準偏差を示す。
【配列表】
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2004313003.tif 000013
2004313003.tif 000014
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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