(57)【要約】【課題】ペプチド合成にて担体とペプチドの安全、簡素、ハイスル−プットな開裂で、かつ他の保護基への影響をきわめて少ない開裂技術の提供。開裂操作がより頻繁に行えるようにし、たとえばＣ末端側へのペプチドの伸長を実用レベルで可能ならしめる。【解決手段】酸化によってキノイド構造となる二つのヒドロキシル基をもつ少なくとも一環の芳香族炭化水素環を有し、ヒドロキシル基の一つがアミノ酸と結合する官能基としてアミノ酸と結合するもので、かつ、酸化によってキノイド構造となってアミノ酸との結合が開裂される液相ペプチド合成法用担体を用いること。特に低電圧の電気分解で上記の反応が実現できる。【選択図】図１９
2004067555.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせを用いて、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である担体に合成すべきペプチドのアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成において使用される、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備することで可溶性であり、かつ、アミノ酸と結合する官能基を具備する担体であって、酸化によって二つのヒドロキシル基がキノイド構造となる二つのヒドロキシル基をもつ少なくとも一環の芳香族炭化水素環を有し、前記ヒドロキシル基の一つがアミノ酸と結合する官能基としてアミノ酸と結合するものであり、かつ、酸化によってキノイド構造となることによって前記アミノ酸との結合が開裂されることを特徴とする液相ペプチド合成法用担体
【請求項２】
第一の溶媒が、シクロアルカン系の化合物からなり、担体が具備する第一の溶媒への溶解性を高める部分が、芳香族炭化水素環に結合した下記の一般式Ｓの（ＲＸ）ｎで表される炭素数が１０以上の炭化水素基をもつ親シクロアルカン系溶媒部分であり、Ｒは、Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基であり、ＸはＯ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する結合部であり、ｎは、芳香族炭化水素環の数をｍとして、２ｍ＋２以下の整数である請求項１の液相ペプチド合成法用担体
【化１】
2004067555.tif 000007
【請求項３】
一般式Ｓの（ＲＸ）ｎのＲの炭素数、および／またはｎが、合成すべきペプチドのアミノ酸の数、ペプチドのアミノ酸種、またはペプチド分子量にもとづいて決定される請求項１の液相ペプチド合成法用液体担体
【請求項４】
酸化が、電気化学反応で行われる請求項１から請求項３のいずれかに記載された液相ペプチド合成法用液体担体
【請求項５】
電気化学反応の印加電圧が、銀／塩化銀参照電極に対して１．５ボルト以下である請求項４の液相ペプチド合成法用液体担体
【請求項６】
温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせを用いて、第一の溶媒に対し可溶性で、第二の溶媒に対し難溶性で、アミノ酸と結合する官能基を有する担体に合成すべきペプチドのアミノ酸または合成すべきペプチドの部分ペプチドを逐次ペプチド結合させるべく、第一の溶媒に担体または担体とアミノ酸の結合物または担体とペプチドの結合物のいずれかを溶解した第一溶媒溶液と、第二の溶媒に結合前アミノ酸または結合前ペプチドを溶解した第二溶媒溶液とを混合する混合ステップと、前記の混合溶液を加熱して相溶状態となる温度以上に保持する混合溶液の相溶状態保持ステップと、前記相溶状態の混合溶液を冷却して相分離状態となる温度以下に保持する混合溶液の相分離状態保持ステップと、前記の相分離状態で第二溶媒溶液を排除する排除ステップが連続した混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程を少なくとも一回は有する、液相ペプチド合成方法であって、担体が、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備することで可溶性であり、かつ、酸化によって二つのヒドロキシル基がキノイド構造となる二つのヒドロキシル基をもつ芳香族炭化水素環を有し、前記ヒドロキシル基の一つがアミノ酸と結合する官能基としてアミノ酸と結合するものであり、前記相溶状態保持ステップにおいて第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相溶状態となった溶液を酸化して、担体をキノイド構造とすることによって、担体とアミノ酸との結合部を開裂する開裂操作を行い、開裂されたペプチドを合成すべきペプチドとして回収することを特徴とした液相ペプチド合成法
【請求項７】
温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせを用いて、第一の溶媒に対し可溶性で、第二の溶媒に対し難溶性で、アミノ酸と結合する官能基を有する担体に合成すべきペプチドのアミノ酸または合成すべきペプチドの部分ペプチドを逐次ペプチド結合させるべく、第一の溶媒に担体または担体とアミノ酸の結合物または担体とペプチドの結合物のいずれかを溶解した第一溶媒溶液と、第二の溶媒に結合前アミノ酸または結合前ペプチドを溶解した第二溶媒溶液とを混合する混合ステップと、前記の混合溶液を加熱して相溶状態となる温度以上に保持する混合溶液の相溶状態保持ステップと、前記相溶状態の混合溶液を冷却して相分離状態となる温度以下に保持する混合溶液の相分離状態保持ステップと、前記の相分離状態で第二溶媒溶液を排除する排除ステップが連続した混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程を複数回繰り返す、液相ペプチド合成方法であって、担体が、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備することで可溶性であり、かつ、酸化によって二つのヒドロキシル基がキノイド構造となる二つのヒドロキシル基をもつ芳香族炭化水素環を有し、前記ヒドロキシル基の一つがアミノ酸と結合する官能基としてアミノ酸と結合するものであり、前記相溶状態保持ステップにおいて第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相溶状態となった溶液を酸化して、担体をキノイド構造とすることによって、担体とアミノ酸との結合部を開裂する開裂操作を行い、前記開裂操作を行った相溶状態保持ステップに続く次の排除ステップで排除された第二溶媒溶液を、該排除ステップに続く次の連続工程の混合ステップにおける第二溶媒溶液とすることを特徴とした液相ペプチド合成法
【請求項８】
混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程が二回の繰り返しであって、第一の連続工程の排除ステップで排除された第二溶媒溶液が、第二の連続工程の混合ステップにおける第二溶媒溶液である請求項７の液相ペプチド合成法
【請求項９】
開裂操作の後に溶液を還元して担体を再生する再生操作を有する請求項６から請求項８のいずれかに記載された液相ペプチド合成法
【請求項１０】
開裂操作の酸化または再生操作の還元が、溶液内に配設された正負の電極間に電圧を印加する電気化学反応で行われる請求項６から請求項９のいずれかに記載された液相ペプチド合成法
【請求項１１】
印加電圧が銀／塩化銀参照電極に対して１．５ボルト以下である請求項１０の液相ペプチド合成法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一・第二の溶媒の組み合わせと第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である担体にアミノ酸を逐次ペプチド結合させる液相ペプチド合成において使用される可溶性担体にて、担体とペプチドの結合の開裂を容易にする改善に関するものである。また、この改善された担体を用いた液相ペプチド合成法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医学、薬学、生物学など広範囲の分野においてペプチドの合成技術の重要性はいうまでもない。アミノ酸を特定の順序でペプチド結合させたペプチドは、抗原−抗体相互作用の研究、臨床診断に利用するペプチド抗原の研究、種々の遺伝子研究などきわめて多くの研究にかかわる。免疫でも感染源でもタンパク質の活性はたかだかアミノ酸５個から１０個が結合したペプチドで決まる。したがって、その部分の合成は非常に重要であり研究用として多くの需要がある。
【０００３】
もちろんアミノ酸１０個以上結合したペプチドも重要である。合成可能とされるペプチドの結合数（残基数）の限界は５０程度であり、このアミノ酸結合数の限界を超えたペプチドの合成技術も望まれている。研究の成果として、特定のタンパクやペプチドの薬効が検証されれば、化学合成ワクチン等の医薬品向けペプチドの大量需要が発生する。よって、商用規模の大量の需要に対応できるペプチド量産技術が強く望まれている。
【０００４】
固体表面に化学的にアミノ酸を連結していく、固相合成法が現在のペプチド合成の主流となっている。しかし、この固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法）には、以下のような欠点がある。まず第一に、固体表面で化学反応を行わなければならないため、試薬が固体表面に接近しにくく、液相反応に比べると反応が起こりにくい。すなわち、固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり、その巨大分子のごく小さな反応部にアミノ酸を結合させる必要があるが、それが確率的に起こりにくい。そのため高価なアミノ酸反応試薬を大量に供給しなければならない。通常反応量の１００倍程度を供給する。その結果として反応に関与できない反応試薬が大量に発生し無駄になる。
【０００５】
第二には、ｎ番目のアミノ酸の未反応部には次の結合工程で、ｎ＋１番目のアミノ酸がｎ番目として結合してしまうので所望のペプチドではない不純物となってしまう。こういった未反応が、個々の結合反応で５％しか発生しないとしても、５０アミノ酸（残基）のペプチドを合成すると、最終的な収率はたったの７．７％となってしまう（０．９５の５０乗）。３０アミノ酸（残基）でも２１．５％である（０．９５の３０乗）。そのため反応時間を十二分に長く取らざるを得ない、という生産効率上の問題があった。この他にも固相ペプチド合成では、目的の反応が進行したことを簡便に確認することができない、固体担体が微小とはいえ数ミクロンの大きさがあるため反応槽をスケールアップすると、巨大なものになってしまう、固相担体が高価で再利用ができない（使い捨て）といった問題があった。
【０００６】
上記のように固相合成法は、固体担体を用いて所望のアミノ酸を確実にひとつずつ結合していくことを可能ならしめる画期的なものではあったが、量産性の面などで欠点が多い。そこで、発明者は固相合成法の長所を確保しながら、液相でペプチド合成する新たな方法を開発した。それは、特願２００１−２５４１０９「相溶性−多相有機溶媒システム」、特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」、特願２００２−１９８２４２「液相ペプチド合成装置」、特願２００２−２２０５６９「液相ペプチド合成用アミノ酸試薬」および”Ａ　ｌｉｑｕｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−ｂａｓｅｄ　ｂｉｐｈａｓｉｃ　ｔｈｅｒｍｏｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｋａｚｕｈｉｒｏ　Ｃｈｉｂａ，　Ｙｕｓｕｋｅ　Ｋｏｎｏ，　Ｓｈｏｋａｋｕ　Ｋｉｍ，　Ｋｏｈｓｕｋｅ　Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，　Ｙｏｓｈｉｋａｚｕ　Ｋｉｔａｎｏ　ａｎｄ　Ｍａｓａｈｉｒｏ　Ｔａｄａ，．Ｃｈｅｍ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２００２，　（Ａｄｖａｎｃｅ　Ａｒｔｉｃｌｅ），Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７６６−１７６７，２００２，．（Ｆｉｒｓｔ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｗｅｂ　１５ｔｈ　Ｊｕｌｙ　２００２）に開示された液相合成法および液相合成装置である。
【０００７】
固相合成法以前にもペプチドの液相合成がなされていた。しかし、固相合成法の普及後は主流ではなくなった。以下「液相合成」「液相ペプチド合成」と記載した場合は、本発明者が上記特許で開示した技術を示すものとする。液相ペプチド合成法を説明する。
【０００８】
＜液相ペプチド合成法の溶媒セット＞
特願２００１−２５４１０９「相溶性−多相有機溶媒システム」にて、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒のセット（組み合わせ）が開示されている。ここで第一の溶媒と第二の溶媒のそれぞれは、複数の溶媒の混合溶媒でもよい。
【０００９】
液相ペプチド合成に好適な溶媒セットは、特願２００１−３８５４９３「相溶性−多相有機溶媒システムによりアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法」に開示されているように、一方の溶媒または混合溶媒（第一の溶媒）を構成する有機溶媒がシクロアルカン系の化合物からなる。
【００１０】
第一の溶媒は、基本的には低極性有機溶媒であり、該溶媒を構成する化合物群としては、アルカン、シクロアルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物などで、中でも好ましいものが、シクロアルカン系の化合物であり、特に好適なものとして「シクロヘキサン」を挙げることができる。シクロヘキサンのイス型−舟形配座異性体の変換が他の溶媒との関連で温度的に比較的穏やかな条件で起こることに関連していると推測できる。シクロヘキサンは融点が６．５℃と比較的高く、反応後の生成物などを固化して分離できるという利点もあり、最終工程である回収工程でもメリットがありこの面からも好ましい。
【００１１】
一方、第一の溶媒と組み合わせる他方の溶媒または混合溶媒（第二の溶媒）を構成する有機溶媒は、基本的には高極性有機溶媒である。好ましいものとしては、ニトロアルカン、ニトリル、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミド化合物およびスルフォキサイドからなる群から選択される少なくとも一種から構成されたものである。
【００１２】
第二の溶媒は、さらに具体的には、ニトロアルカンのアルキル基は炭素数が１、２または３であり、ニトリルのアルキル基の炭素数が１、２または３であり、アミド化合物はＮ−ジアルキルまたはＮ−モノアルキルアミドのアルキル基およびアシル基またはホルミル基の炭素数の合計は６以下であり、アルコールは炭素数が８以下であり、スルフォキサイドのアルキル基は炭素数が１、２または３であり、またハロゲン化アルキルのアルキル基は炭素数が６以下である。
【００１３】
上記の第一の溶媒と第二の溶媒との溶媒セットは、温度により可逆的に均一相溶混合溶媒系の状態（相溶状態）と複数相に分離した分離溶媒系の状態（相分離状態）とを可逆的に取り得る。
【００１４】
＜可溶性担体（液体担体）＞
さて、特願２００１−３８５４９３（液相ペプチド合成法）において上記の溶媒セットを用いてアミノ酸を逐次的に付加する液相ペプチド合成法を提案しているが、この合成法にて溶媒セットと共に重要なものは、固相ペプチド合成の固体担体に相当する「可溶性担体（液体担体）」である。これは、特願２００１−２５４１０９（溶媒システム）において、「第一の溶媒あるいは第二の溶媒いずれか一方のみ溶解する反応に関与する化学成分」と記載したものに相当する。
【００１５】
すなわち、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する液体の担体である。（ここで「アミノ酸系物質」とは、単独のアミノ酸あるいはアミノ酸残基、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドを含む。）この担体は、反応状態で液体であるが、常温で固体であってもよい。機能について固体担体と等価であり、これと対比するため特願２００２−１９８２４２「液相ペプチド合成装置」では「液体担体」と呼称していたが、本明細書では「可溶性担体」と記載する。以下に可溶性担体について説明する。
【００１６】
従来技術の固相表面反応を液相の反応に置換すれば、従来問題であった反応性の悪さ（固体担体がアミノ酸に比べてきわめて巨大な分子であり反応部位に接近しにくい）を改善できる。さらに、前述の相分離する溶媒セットをうまく使えば、得られた反応生成物の分離が極めて容易に実現できる。このように画期的な利点をもつ液相ペプチド合成法の実現には、固相ペプチド合成の固体担体に相当する可溶性担体が必要で、発明者はこれを見出した。その可溶性担体は以下の機能を必要とする。
【００１７】
すなわち可溶性担体は、ペプチドの形成を開始するアミノ酸との結合部を有すること、アミノ酸を順次結合させ伸長させたペプチド鎖を担持できること、さらにアミノ酸と結合した化合物および合成中のペプチド鎖を担持した化合物が、第一の溶媒に溶解されること、という機能である。つまり担体は、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備して可溶性であり、かつ、アミノ酸と結合する官能基を具備していればよい。
【００１８】
これら機能を持つ可溶性担体の候補化合物（親シクロアルカン系溶媒部分とアミノ酸と結合する官能基を有するもの）は、下記の一般式Ａ（化２）で表される芳香族炭化水素環からなる基本骨格化合物である。ここで、担体が具備すべき第一の溶媒への溶解性を高める部分は一般式Ａ（化２）の（ＲＸ）ｎで表される炭素数１０以上の炭化水素基をもつ親シクロアルカン系溶媒部分である。
【００１９】
【化２】
2004067555.tif 000003
【００２０】
（ＲＸ）ｎのＲは、Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基であり、（ＲＸ）ｎのＸはＯ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する結合部であり、（ＲＸ）ｎのｎは、１から５の整数である。Ｒの例を具体的に図３２、Ｘの例を具体的に図３３、図３４に示す。
【００２１】
（ＲＸ）ｎにおいて、炭素数１０以上の炭化水素基とある理由は、担体に結合するアミノ酸を第一の溶媒へ溶解されるのに十分な親シクロアルカン系溶媒部分を形成する必要があるからである。したがって、（ＲＸ）ｎのＲの炭素数、および／またはｎは、合成すべきペプチドのアミノ酸の数、ペプチドのアミノ酸種、またはペプチド分子量にもとづいて決定すべきである。つまり、ペプチド残基の数が多くなったり、親シクロアルカンでない残基をもつアミノ酸が多くなると、それらの数とアミノ酸種に応じて、炭素数、および／またはｎを大きな値として設計製造する。（ＲＸ）ｎの分子量の目安としては合成すべきペプチドの分子量以上であるが、あくまで目安であって溶解実験などを行って実験的に決定するの好適である。
【００２２】
一般式Ａ（化２）において、Ｌ１は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する単結合、該水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基と結合する原子団、または点線とも結合して２環の縮合芳香族環を形成する原子団である。また、一般式Ａ（化２）において、点線はＨとの結合または前記Ｌ１と結合して前記縮合芳香族環を形成する原子団の結合である。
【００２３】
さらにまた、担体が具備すべきアミノ酸と結合する官能基が、前記の炭素数が１０以上の炭化水素基の分枝鎖および／または置換基にあってもよい。
【００２４】
一般式Ａ（化２）は、より具体的には、下記の一般式群Ｂ（化３）から選択される。一般式群Ｂ（化３）において、Ｘ、Ｒおよびｎは一般式Ａ（化２）と同じ。Ｑ１は、単結合または炭化水素基であり、Ｒ２はアミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基であり、Ｒ３およびＲ４は、一般式Ｃ（化４）の基である。また、一般式Ｃ（化４）のＲ５は、アミノ酸と結合する水酸基、チオール基、アミノ基、またはカルボニル基である。（ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は後で記載されるＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５とは同一ではないので注意されたい。）
【００２５】
【化３】
2004067555.tif 000004
【００２６】
【化４】
2004067555.tif 000005
【００２７】
前に説明した第一の溶媒は、分離状態において、上記可溶性担体および可溶性担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解するが、可溶性担体と結合していないアミノ酸（ペプチド結合させるべきアミノ酸）は溶解しない（難溶である）。ここで、アミノ酸系物質とは、単一のアミノ酸あるいはペプチドである。
【００２８】
また逆に、第二の溶媒は、分離状態において、アミノ酸（ペプチド結合させるアミノ酸）を溶解するが、上記可溶性担体および可溶性担体とアミノ酸系物質との結合物質を溶解しない（難溶である）特性を持っている。
【００２９】
可溶性担体の例を図１１の２に示す。２は、前記の一般式群Ｂにおいて、ＲがＣ１８Ｈ３７−であり、ＸがＯであり、ｎが３であり、ＱがＣＨ２であり、Ｒ２がＯＨである。名称は、（３，４，５−トリオクタデシルオキシフェニル）メタン−１−オール、〔（３，４，５−ｔｒｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈａｎ−１−ｏｌ　〕である。この可溶性担体１は、第一の溶媒に対し可溶性であり、第二の溶媒に対し難溶性である化合物から誘導され、かつ、アミノ酸系物質と結合する。
【００３０】
＜液相ペプチド合成法＞
可溶性担体は２に限定されることはなく、本明細書に記載（後述）するような改善物質でもよい。ここでは、この可溶性担体具体例２を用いて、本発明者らが先願特許で開示した液相ペプチド合成法を説明する。図１１から図１４が、液相合成でＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４残基アミノ酸ペプチドを合成する反応フローの説明図である。
【００３１】
図１１は、Ｎ末端を保護され、Ｃ末端を活性化された（活性化基Ｘを結合された）Ｒ１残基アミノ酸１２のＣ末端を、可溶性担体２に結合する反応（図１１中の８）を示す反応フロー図である。ここで、可溶性担体２は、第一の溶媒（Ａ）に２が溶解された第一溶媒溶液（Ａ１）という溶液の状態であり、Ｒ１残基アミノ酸１２は、あらかじめ第二の溶媒（Ｂ）に溶解され、第二溶媒溶液（Ｂ１２）として準備される。（Ａ、Ｂ、Ａ１、Ｂ１２という表記は図１１から図１４では略す。）
【００３２】
前記第一の溶媒（Ａ）に２が溶解された第一溶媒溶液（Ａ１）と、Ｒ１残基アミノ酸１２が第二の溶媒（Ｂ）に溶解された第二溶媒溶液（Ｂ１２）とが混合される。第二溶媒溶液（Ｂ１２）は多少過剰に投入されるのが好ましい。その理由は、相対的に第一溶媒溶液が多いとすべてのペプチド反応が生じても、未反応の末端をもつ担体が残留するからである。これは固相合成法と同様であるが、固相合成法のように必要量の１００倍も過剰に投入する必要はない。
【００３３】
両溶液混合後、それらが相溶状態となる温度に加熱される。すると、可溶性担体２の末端はアミノ酸と結合する水酸基であるので、Ｒ１残基アミノ酸Ｃ末端とペプチド結合反応（図１１中の８）して１ａｆとなる。この１ａｆも、相溶化状態の両溶媒に溶けている。
【００３４】
ペプチド反応後、固相合成では未反応アミノ酸等との分離のために洗浄除去などを行っていたが、液相合成では、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却すればよい。このことで、１ａｆは分離された第一の溶媒（Ａ）に溶解されたＡ１ａｆとして、第二溶媒溶液から分離される。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。
【００３５】
排除される第二溶媒溶液中には、過剰に投入したため未反応で残留したＲ１残基アミノ酸、および反応副生物などが溶解している。この分離操作は、従来と比較にならない単純操作であり、かつ不純物の混入もきわめて少ない。したがってクロマトグラフィ等による精製工程も省略が可能である。
【００３６】
分離状態にある第一・第二溶媒溶液にて、第二溶媒溶液を排除するのであるが、この排除操作で第一溶媒溶液だけが残留することが重要である。したがって歩留まりは悪くなるが、第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。残留した第一溶媒溶液には、１にＲ１残基アミノ酸Ｃ末端が結合した１ａｆが溶解している（Ａ１ａｆ）。
【００３７】
次の工程である図１２では、第一溶媒溶液中の可溶性担体１とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのアミノ末端を保護しているＦｍｏｃを除去して活性化（図１２中の１０）する。図１１同様に、Ｎ末端を保護したＲ２残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液Ｂ１２として準備し、これら第一溶媒溶液Ａ１ａと第二溶媒溶液Ｂ１２とを混合する。同様に第二溶媒溶液Ｂ１２は過剰に混合されるのが好ましい。
【００３８】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ａと、Ｒ２残基アミノ酸Ｃ末端をペプチド結合させる（図１２中の１１）。その結果、相溶化溶液中に可溶性担体１にＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆができる。
【００３９】
上記ペプチド反応後、第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相分離する温度に冷却し、１ｂｆを分離された第一溶媒溶液に溶解されたＡ１ｂｆとし、第二溶媒溶液から分離する。その分離状態で第二溶媒溶液を排除する。同様に第二溶媒溶液と共に、多少の第一溶媒溶液も排除してもかまわない。
【００４０】
次の工程である図１３も同様に、第一溶媒溶液中の可溶性担体２とＲ１、Ｒ２残基ペプチドが結合した物質１ｂｆのアミノ末端を保護しているＦｍｏｃを除去して活性化（図１３中の１０）する。同様に、Ｎ末端を保護したＲ３残基アミノ酸１２を、あらかじめ第二の溶媒に溶解し、第二溶媒溶液Ｂ１２として準備し、これら第一溶媒溶液Ａ１ｂと第二溶媒溶液Ｂ１２とを混合する。
【００４１】
その混合後、再び混合液を相溶化温度に加熱して、相溶状態で溶液中の１ｂと、Ｒ３残基アミノ酸Ｃ末端をペプチド結合させる（図１３中の１１）。その結果、相溶化溶液中に可溶性担体１にＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基ペプチドが結合した物質１ｃｆができる。（図１４も同様であるので説明は略す。）以下同様の操作でペプチドを伸長させていく。
【００４２】
このように一連のペプチド結合を行い、それが完了したら、ペプチドＣ末端を可溶性担体から開裂し、必要に応じて保護基を除去したり付加したりする。このクリーベイジ（ｃｌｅａｖａｇｅ）操作は固相合成と同様である。したがって、開裂操作について問題があるとすると液相合成でも問題解決されていない。これが本発明の「解決しようとする課題」であり、以下に説明する。
【００４３】
【発明が解決しようとする課題】
固相合成、液相合成において、ペプチド合成のあとで担体とペプチドを開裂する必要がある。このクリーベイジ（ｃｌｅａｖａｇｅ）操作は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）やフッ化水素などの弱酸を用いて行われる。一方、合成すべきペプチドの要素であるアミノ酸残基には多様な側鎖があり、なかにはペプチド合成プロセスで反応してしまうような反応性の強いものがある。それゆえ、側鎖の種類に応じた多種多様の保護基をつけて保護している。すなわち合成ペプチドには、Ｃ末端Ｎ末端以外にも上記の保護基が多数結合している。合成の最終段階の開裂操作ならば、これらの保護基も担体とペプチドの開裂とともに脱保護してしまえばよい。しかし、後で述べるような理由で担体とペプチドの開裂だけを行い、その他の保護基はキープしたい場合がある。
【００４４】
開裂操作は、以上のようにＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）やフッ化水素などの腐蝕性あるいは有毒の薬品を使うこと、および、へたをすると必要な側鎖保護基を離脱させてしまい、せっかく合成したペプチドの一部に望まぬ側鎖反応が起こり、純度が落ちてしまう、といったことになりかねない厄介な操作である。それで、開裂操作は頻繁に行えるものではなく、ペプチド合成の最終段階で一回だけ慎重に行う、のが実状であった。
【００４５】
さて本案第一の課題は、上記のような開裂操作が、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）やフッ化水素などの腐蝕性あるいは有毒の薬品を使用する危険を伴う作業であったため、安全な操作に置換する改善が望まれていた。これを実現することが課題である。
【００４６】
第二の課題は、この開裂操作を何度でもできる簡潔な操作、なおかつ温和な操作で、かつ特異性の強く、担体とペプチドの開裂だけを行い、その他の保護基はキープできる操作にすることも課題とする。この第二の課題の理由（ニーズ）はあとで説明する。
【００４７】
開裂操作を簡便なものに置換する公知技術の例としては、特開平０９−１３２５９１「光照射装置を具備するペプチド合成機（株式会社島津製作所）」がある。この開裂技術は、反応槽内で光により開裂するフォトリンカーを介して固体担体に結合させるペプチド合成器、その反応槽内に光を照射する光照射装置が連結されている技術である。これは、ペプチド合成装置の反応槽内でペプチドと固体担体であるレジンの光化学反応による開裂（クリーベイジ）でペプチド回収するものである。具体的には、ペプチド合成後にペプチド合成機内で光反応による開裂を効率よく行なうことを可能とする光照射装置を具備するペプチド合成機、ペプチド固相合成用担体（レジン）としてポリスチエンジビニルベンゼン共重合体を用い、フオトリンカ−として、ｏ−ニトロベンジル型リンカ−を用い、反応槽内で反応液の吸引注入ラインより結合前処理後のアミノ酸、縮合剤等の反応試薬を順次供給してペプチドレジンを合成した後、得られたレジンをＤＭＦ等で膨潤させる。その後、反応槽の底部から窒素ガスをバブリングさせながら、光照射用光源から光フアイバ−を通して紫外線を照射して、ペプチドレジンを効率的にクリ−ベイジする、といった技術である。
【００４８】
上記光開裂技術は、フォトリンカーが不安定であるためにペプチド合成の最中に分解しやすいこと、それで反応装置全体を遮光しなければならない、という実用上の問題がある。特に担体の機能として重要な能力であるペプチド合成中にしっかりと結合している能力に不安がある（光分解しやすい）のが致命的である。光開裂技術以外にも、開裂操作を簡便なものに置換する公知技術は提案されているが、光開裂技術を含め実用に値するものはない。
【００４９】
ここで、第二の課題の理由（ニーズ）を説明する。固相、液相合成ともにＮ末端のＦｍｏｃ保護の技術が確立したこともあって、Ｃ末端からＮ末端へペプチド合成されている。しかしながら、合成後の開裂→開裂されたペプチドＣ末端の活性化は容易であるので、開列さえ簡素化されれば、Ｃ末端側に伸長させるペプチド合成ができるはずである。これが第二の課題の理由（ニーズ）である。具体的なニーズであり、本案方法の実施例でもある課題を以下に挙げる。
【００５０】
＜Ｃ末端に反応保護困難な残基（側鎖）をもつアミノ酸があるペプチド合成＞
たとえば、図６に示すメチオニンエンケファリンは、麻酔作用のある薬理上重要なペプチドであるが、そのＣ末端にサルファ（Ｓ）をもつ残基がある。このサルファが非常に反応性である。にもかかわらず、この部分を保護することが困難である。よって従来のペプチド合成では、まずこのメチオニン（Ｍｅｔ）を担体に結合させ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒの４回のペプチド合成を行う。これはきわめて不利である。なぜなら反応性のメチオニンが４回にわたって反応にさらされるため、望まない反応が起こる確率も４倍になってしまう。
【００５１】
この不利を回避するには、先にメチオニン以外の４残基アミノ酸ペプチドを合成しておき、その後で、かかる４残基アミノ酸ペプチドのＣ末端を活性化してメチオニンと結合させればよい。それには４残基アミノ酸ペプチドの開裂が必須である。一般的に、ペプチドを構成するアミノ酸で、反応性で不安定であるアミノ酸の残基Ｒ０をＣ末端にもつペプチドを合成するには、図７の「ｂ」に示すようにＲ０以外のアミノ酸を結合させ、Ｃ末端を活性化して、別途Ｒ０だけ結合させた図７「ａ」のＲ０残基アミノ酸Ｎ末端に結合させればよい。それにはＲ０以外のアミノ酸残基ペプチド（部分ペプチド）の開裂が必須である。
【００５２】
＜基本ペプチドのＣ末端結合コンビナトリアル合成＞
またたとえば、図８のように基本ペプチドがあって、その両末端にさまざまなアミノ酸を結合させるコンビナトリアル合成において、新規な活性ペプチドを探索的に求める場合にも、同様のニーズがある。図８の「Ｎｊｏｉｎｔ−ｃｏｎｂｉ」に示すＮ末端のコンビナトリアル合成は、基本ペプチドを担体に結合したまま大量に合成し、Ｒｎ１、Ｒｎ２、、、、Ｒｎｎで示す結合すべきアミノ酸残基のアミノ酸を付加合成すれば比較的容易に合成できる。一方、図８の「Ｃｊｏｉｎｔ−ｃｏｎｂｉ」に示すＣ末端のコンビナトリアル合成では、担体結合部であるＲｃ１、Ｒｃ２、、、、Ｒｃｎで示すアミノ酸残基のアミノ酸は個別に異なる試薬で合成していかざるを得ない。そのあとで基本ペプチド部分を付加結合すればよいが、合成される過程の物質はばらばらであって製造上好ましくない（量産できない）。基本ペプチドＣ末端の開裂が確実にできればこの問題は解決する。
【００５３】
＜長鎖ペプチドの分割合成＞
さらにまた、図９のように長鎖（１６残基）のペプチドを合成するにあたって、８残基ペプチドを別途に平行作業で合成して、最後にそれらを結合すれば合成時間の短縮になる。このような長鎖ペプチドの分割合成にも開裂が必須である。また、開裂が簡便で安全、ハイスル−プット（短時間に大量処理可能）であるプロセスであれば、図１０に示すように長鎖ペプチドを２、４、８、１６、３２・・・と倍々で伸長させる合成ストラテジィも成立し実現可能である。以上のように、安全、簡素、ハイスル−プットである担体結合ペプチドの開裂操作が現実のものとなれば、Ｃ末端に反応保護困難な残基（側鎖）をもつアミノ酸があるペプチド合成、基本ペプチドのＣ末端結合コンビナトリアル合成、長鎖ペプチドの分割合成が可能になる。本案は、安全、簡素、ハイスル−プットである担体結合ペプチドの開裂技術を提供する。
【００５４】
【課題を解決するための手段】
＜酸化してキノンとなる基本構造＞
本案は、ベンゼノイド構造とキノイド構造が酸化還元よって可逆変化することを利用する。
この可逆変化の特徴を液相用の可溶化担体に応用することを発明した。キノンとは、芳香族化合物のＣＨ原子団二つをＣＯ原子団に変え、さらに二重結合キノイド構造にするのに必要なだけ動かしてできる化合物の総称である。ここでキノイド構造とは、ベンゼノイド（ｂｅｎｚｅｎｏｉｄ）構造（ベンゼン型構造）に対するもので、ベンゼノイドの環内二重結合が一つ減って、環外二重結合が二つできる。キノイド（ｑｕｉｎｏｉｄ）はキノノイド（ｑｕｉｎｏｎｏｉｄ）ともいう。特に、ｏ位（オルト位）、ｐ位（パラ位）に二つのヒドロキシル基をもつ芳香族化合物は容易に酸化されてキノンになりやすい。
【００５５】
図１から図５が、上記の具体例である。図１が、一環（単一環）芳香族炭化水素環の場合の酸化還元によるベンゼノイドとキノイド構造の変換、図２が、二環芳香族炭化水素環の場合、図３が、三環芳香族炭化水素環の場合、図４が、四環芳香族炭化水素環の場合その１、図５が、四環芳香族炭化水素環の場合その２である。特に容易に酸化されてキノンになりやすい、ｏ位（オルト位）、ｐ位（パラ位）に二つのヒドロキシル基をもつ例を挙げたが、本案はこれに限定されない。
【００５６】
さて、本案の典型的な担体の例を図１５の１に示す。これは、ｐ位（パラ位）に二つのヒドロキシル基をもつもので、酸化されて基本化合物がｐ−（パラ）ベンゾキノンになる例である。本案の担体が具備すべき特性は、特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体のそれと同様である。すなわち、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備することで可溶性であり、かつ、アミノ酸と結合する官能基を具備する担体である。
【００５７】
本案担体の特徴は、酸化によって二つのヒドロキシル基がキノイド構造となる二つのヒドロキシル基をもつ少なくとも一環の芳香族炭化水素環を有し、前記ヒドロキシル基の一つがアミノ酸と結合する官能基としてアミノ酸と結合するものであり、かつ、酸化によってキノイド構造となることによって前記アミノ酸との結合が開裂されることである。
【００５８】
図１５は、図１１の先願特許記載の担体例２を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図であり、図１６も同じく図１２の２を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図であり、図１７も同じく、図１３の２を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図であり、図１８も同じく図１４の２を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図である。これらの合成における説明は従来技術で述べたものと同一であるので略す。
【００５９】
図１９が、本案の可溶性担体１と合成ペプチドの結合を酸化によって開裂する反応フロー図であり、本案が新規性をもつ開裂技術である。従来は、この開裂操作はＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）やフッ化水素などの腐蝕性あるいは有毒の薬品で危険を伴う作業であった。本案では、危険でない任意の温和な酸化反応でそれが可能である。好適な酸化の方法は、溶液内の電気化学反応であって、さらに好適な印加電圧はアミノ酸に影響がない１．５ボルト以下で十分である。したがって、従来問題であった開裂で必要な側鎖保護基を離脱させてしまい、せっかく合成したペプチドの一部に望まぬ側鎖反応が起こることは皆無である。
【００６０】
＜担体構成のバリエーション＞
さて担体の構成に説明を戻す。第一の溶媒が、シクロアルカン系の化合物である場合に、本案担体が具備すべきシクロアルカン系の化合物への溶解性を高める部分については、特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体のそれと同様である。すなわち、第一の溶媒が、シクロアルカン系の化合物からなり、担体が具備する第一の溶媒への溶解性を高める部分が、芳香族炭化水素環に結合した下記の一般式Ｓ（化５）の（ＲＸ）ｎで表される炭素数が１０以上の炭化水素基をもつ親シクロアルカン系溶媒部分であり、Ｒは、Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い炭素数１０以上の炭化水素基であり、ＸはＯ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する結合部であり、ｎは、芳香族炭化水素環の数をｍとして、２ｍ＋２以下の整数である。
【００６１】
【化５】
2004067555.tif 000006
【００６２】
Ｒの例を具体的に図３２、Ｘの例を具体的に図３３、図３４に示す。これらも特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体のそれと同様である。（ＲＸ）ｎにおいて、炭素数１０以上の炭化水素基とある理由は、担体に結合するアミノ酸を第一の溶媒へ溶解されるのに十分な親シクロアルカン系溶媒部分を形成する必要があるからである。したがって、（ＲＸ）ｎのＲの炭素数、および／またはｎは、合成すべきペプチドのアミノ酸の数、ペプチドのアミノ酸種、またはペプチド分子量にもとづいて決定すべきである。つまり、ペプチド残基の数が多くなったり、親シクロアルカンでない残基をもつアミノ酸が多くなると、それら数とアミノ酸種に応じて、炭素数、および／またはｎを大きな値として設計製造する。（ＲＸ）ｎの分子量の目安としては合成すべきペプチドの分子量以上であるが、あくまで目安であって、溶解実験などを行って実験的に決定するのが好適である。これも特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体のそれと同様である。
【００６３】
冗長であるが図２３、図２４は図１９と同じ図であり、図中の記号「ＡＡ」の説明図である。ＡＡは、Ｎ末端Ｎのないアミノ酸あるいはペプチドの一部である。図２５は、ＡＡを用いて図１９の本案担体第一例である１のＲの炭素数を任意（ｎ１、ｎ２）にしたバリエーションである。この担体のバリエーションのｎ１、ｎ２は、前述のように合成すべきペプチドのアミノ酸の数、ペプチドのアミノ酸種、またはペプチド分子量にもとづいて、実験などで検証して決定すればよい。図２６は、図１９の本案担体第一例である１を本案担体第二例である三環芳香族炭化水素環の担体に置換した図である。図２７は、本案第一例の担体１の、一環（単一環）芳香族炭化水素環としての図２５以外のバリエーションを説明する図である。図２８は本案第三例である二環芳香族炭化水素環の担体とそのバリエーションを説明する図である。図２９は、本案第二例の担体のバリエーションを説明する図である。図３０と図３１は本案第四例の四環芳香族炭化水素環の担体とそのバリエーションを説明する図である。このように本案は多彩なバリエーションがある。
【００６４】
これら例以外にも本案の担体は多彩な化合物を用いることができる。芳香族炭化水素環の数ｍは任意であるし、そのｍに従属するが、環に結合する親シクロアルカン系溶媒部の数ｎは、２ｍ＋２以下の任意整数であってよい。さらにＲの例を具体的に図３２、Ｘの例を具体的に図３３、図３４に示したが、これらも任意のバリエーションがあり例示した図に限定されない。
【００６５】
【発明の実施の形態】＜請求項６、７の方法クレーム＞
以上説明した本案担体の利用した液相ペプチド合成法には二通りがある。第一は合成ペプチドの最終的な回収のために開裂操作を容易にした合成法（請求項６）。第二は合成過程において、部分ペプチドのＣ末端を開裂し、これを活性化し、その他のプロセスで合成された他のアミノ酸かペプチドのＮ末端に結合させる合成ストラテジィである（請求項７）。
【００６６】
どちらの方法、ストラテジィにおいても、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒にて、これらを相溶状態にして溶液の酸化を行い、担体をキノイド構造とすることによって、担体とアミノ酸との結合部を開裂する開裂操作を行うことが特徴である。それ以外は特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体のそれと同様である。
【００６７】
すなわち、最終的な回収のために開裂操作を容易にした合成法（請求項６）としては、温度により相溶状態と相分離状態とが可逆的に変化する第一の溶媒と第二の溶媒の組み合わせを用いて、第一の溶媒に対し可溶性で、第二の溶媒に対し難溶性で、アミノ酸と結合する官能基を有する担体に合成すべきペプチドのアミノ酸または合成すべきペプチドの部分ペプチドを逐次ペプチド結合させるべく、第一の溶媒に担体または担体とアミノ酸の結合物または担体とペプチドの結合物のいずれかを溶解した第一溶媒溶液と、第二の溶媒に結合前アミノ酸または結合前ペプチドを溶解した第二溶媒溶液とを混合する混合ステップと、前記の混合溶液を加熱して相溶状態となる温度以上に保持する混合溶液の相溶状態保持ステップと、前記相溶状態の混合溶液を冷却して相分離状態となる温度以下に保持する混合溶液の相分離状態保持ステップと、前記の相分離状態で第二溶媒溶液を排除する排除ステップが連続した混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程を少なくとも一回は有する、液相ペプチド合成方法であって（以上開示特許と同じ）、担体が、第一の溶媒への溶解性を高める部分を具備することで可溶性であり、かつ、酸化によって二つのヒドロキシル基がキノイド構造となる二つのヒドロキシル基をもつ芳香族炭化水素環を有し、前記ヒドロキシル基の一つがアミノ酸と結合する官能基としてアミノ酸と結合するものであり、前記相溶状態保持ステップにおいて第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相溶状態となった溶液を酸化して、担体をキノイド構造とすることによって、担体とアミノ酸との結合部を開裂する開裂操作を行い、開裂されたペプチドを合成すべきペプチドとして回収することを特徴とした液相ペプチド合成方法である。
【００６８】
また、その他のプロセスで合成された他のアミノ酸かペプチドのＮ末端に結合させる合成ストラテジィ（請求項７）としては、担体に合成すべきペプチドのアミノ酸または合成すべきペプチドの部分ペプチドを逐次ペプチド結合させるべく、（この部分ペプチドがあることが請求項６と異なる）相分離状態で第二溶媒溶液を排除する排除ステップが連続した混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程を複数回繰り返す、液相ペプチド合成方法であって、前記相溶状態保持ステップにおいて第一溶媒溶液と第二溶媒溶液とが相溶状態となった溶液を酸化して、担体をキノイド構造とすることによって、担体とアミノ酸との結合部を開裂する開裂操作を行い、前記開裂操作を行った相溶状態保持ステップに続く次の排除ステップで排除された第二溶媒溶液を、該排除ステップに続く次の連続工程の混合ステップにおける第二溶媒溶液とすることを特徴とした液相ペプチド合成方法である。
【００６９】
最終的な回収のために開裂操作を容易にした合成法（請求項６）を説明する図が、図３５である。図３５「ａ」「ｂ」それぞれが、混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程である。この連続工程を少なくとも一回は行って相溶状態でペプチド合成反応する。ペプチド合成反応はアミノ酸がダメージされない６０℃以下の温度でよい。相溶温度も第一・第二溶媒の選定でそのような温度に設定可能である。むしろ３０℃以下の低温でアミノ酸をダメージしないで合成したいので、溶媒の組み合わせ、あるいは第一・第二溶媒どちらも複数の有機溶媒のブレンドでよいのでブレンド比率を工夫して温度を設定できる。これは特願２００２−１９８２４２に詳しく記載されている。
【００７０】
図３６の「ａ」が回収を示す図である。全ペプチドとして合成が完了したら、その相溶状態で溶液を温和に酸化して開裂する。開裂後は図３７のように一度温度を下げて相分離させ、第二溶媒溶液に溶け出した合成ペプチドを回収すればよい。合成したとき用いた第二の溶媒でペプチド回収することが難しい場合には、図３８のような第二溶媒溶液の置換を行えばよい。すなわち、全ペプチドとして合成が完了しても開裂はせず、いったん一度温度を下げて相分離させ、第二溶媒溶液（ペプチド回収することが難しい溶媒）を排除する。その後ペプチド回収しやすい第二の溶媒を加え混同し温度を上げて相溶状態とし、そこで開裂する。そうすればそのあとで相分離温度にしたとき合成ペプチドは、あとで加えたペプチド回収しやすい第二の溶媒に溶解しているので回収容易である。
【００７１】
さて、その他のプロセスで合成された他のアミノ酸かペプチドのＮ末端に結合させる合成ストラテジィ（請求項７）を説明する。図２０が本案によるＣ末端側が反応性で不安定な残基をもつペプチド合成法の説明図であって、図１９で開裂されたＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４残基アミノ酸のＮ末端を活性化したものと、本案担体と反応性で不安定であるアミノ酸残基Ｒ０アミノ酸との結合物質１ｚとを結合させて、Ｃ末端側が反応性で不安定な残基をもつペプチド合成できる。これは従来理想的合成法であって実用的実施が困難であった図７を実施するものである。
【００７２】
図１９で開裂されたＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４残基アミノ酸は、担体から離脱されているので第一溶媒には溶解しない。そのため、相分離状態では第二溶媒溶液に溶解している。そのＣ末端を活性化し、図２０の合成の第二溶媒溶液として混合し相溶化、合成する。ここにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４残基アミノ酸は合成すべきペプチドの部分ペプチドである。これを図２０でも１２ｐと記載した。部分ペプチドから見れば、そのＣ末端にＲ０を伸長することになる。このように、従来は困難だったＣ末端へのペプチド伸長ができるので、上記のようなＣ末端側が反応性で不安定な残基をもつペプチド合成が、部分ペプチドに対してＣ末端アミノ酸を結合する方式で可能になる。
【００７３】
図３６の「ｂ」が部分ペプチドを合成するまでを示す図である。それに続く図３９「ａ」が部分ペプチドを第二溶媒溶液に分離されるまである。この分離された第二溶媒溶液が、開裂操作を行った相溶状態保持ステップに続く次の排除ステップで排除された第二溶媒溶液である。それをＣ末端活性化して、Ｂ１２ｐの矢印として図示されるように、該排除ステップに続く次の連続工程の混合ステップにおける第二溶媒溶液として混合する。それが図３９「ｂ」の混合であり、相溶化、相分離と進む。その後は他のプロセスと同様である。
【００７４】
ここにおいて、次の連続工程の混合ステップとは、あくまで時間的に連続する「次の」であって、混合する第二溶媒溶液を分離した第一溶媒溶液に再結合するのではない。（分離したものをまた同じように混ぜるのではない）　混合させるべき第一溶媒溶液は、その他のプロセスで合成された他のアミノ酸かペプチドが溶解されたものである。たとえば前例の場合、反応性で不安定であるアミノ酸残基Ｒ０アミノ酸と担体の結合物質１ｚが溶解されている（Ａ１ｚ）。
【００７５】
さらにまた、従来は実用的実施が困難であった長鎖ペプチドを２、４、８、１６と多分割して合成する理想的合成法である図１０も、本案の実施例である。簡単な４残基ペプチド合成で説明する。すなわち、図２１にてＲ３、Ｒ４残基アミノ酸を開裂して、そのＣ末端を活性化し、図２２のようにＲ１、Ｒ２残基アミノ酸のＮ末端を活性化したものとペプチド合成する。これは２から４残基ペプチドの合成例である（図１０の２Ｒ→４Ｒ列）が、８、１６、３２・・・であっても全く同様である。図２１のＲ３、Ｒ４残基アミノ酸開裂が、図３９「ａ」で行われ、その第二溶媒溶液が、部分ペプチドをＲ３、Ｒ４残基アミノ酸ペプチドを１２ｐとするＢ１２ｐとして分離される。その後、その第二溶媒溶液が、排除、Ｃ末端活性化され、図３９「ｂ」のＢ１２ｐとして、別プロセスで合成された図２２のＲ１、Ｒ２残基アミノ酸のＮ末端を活性化したものを溶解した第一溶媒溶液と混合、相溶化されペプチド合成される。
【００７６】
同様に、従来実用的実施が困難であった図８の基本ペプチドのＣ、Ｎ末端に多様なアミノ酸を結合させてなるコンビナトリアル合成のＣ末端結合バリエーションも、基本ペプチドを液相合成で量産した後に開裂して、それを第二溶媒溶液中の１２ｐとし、Ｂ１２ｐを排除、それをコンビナトリアル合成したい複数のＣ末端アミノ酸を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液群に振り分け、それぞれ図３９「ｂ」の混合操作をすればよい。ここでは基本ペプチドが量産処理できるので実用的である。
【００７７】
また同様に、従来実用的実施が困難であった図９の長鎖ペプチドを二つに分割して合成し、それらを結合させる理想的合成法もごく容易に実現可能である。説明は略す。どの実施例も、Ｃ末端伸長する部分だけをみれば、混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程が二回の繰り返しであって、第一の連続工程の排除ステップで排除された第二溶媒溶液にＣ末端活性化したアミノ酸あるいは部分ペプチドが溶解し、それを第二の（別の）連続工程の混合ステップにおける第二溶媒溶液として混合している。その第二の（別の）連続工程の混合ステップにおける第一溶媒溶液のアミノ酸またはペプチドのＣ末端での結合（伸長）が実現されている。
【００７８】
本案では、Ｃ末端活性化したアミノ酸あるいは部分ペプチドができるので、そのあとのペプチド合成は本案以外の合成法に、これらＣ末端活性化したアミノ酸あるいは部分ペプチドをもちいても良い（組み合わせプロセスとしても良い）。たとえば、図３９「ｂ」のプロセスは、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体を用いたプロセスでも良い。
【００７９】
＜酸化と還元の電気化学反応＞
以上説明した本案の開裂操作は、図４０から図４２に示す電気化学反応（電気分解）で行うことが好適である。担体の酸化、開裂は電気分解陽極で起こる。図から明らかなように電気分解の初期（図４０）には、溶液中に含有する水分が陰極で反応し水素を発生させる。電気分解中期（図４１）には、酸化されてできたキノンが陰極で還元され担体として再生される。反応の最終段階（図４２）では、還元された担体がさらに陽極で酸化されキノンとなり、キノンと担体の酸化還元の平衡状態となる。
【００８０】
上記のような反応を利用し、陰極にて起こる還元によってキノイド構造をベンゼノイド構造になして担体を再生する再生操作をおこなわせることができる。すなわち、開裂操作の後に担体が含まれる溶液を還元して担体を再生する再生操作を加えることができ、担体の再利用に役立てられる。図４０から図４２に示すように、開裂操作の酸化または再生操作の還元は、溶液内に配設された正負の電極間に電圧を印加する電気化学反応で行われる。好適な印加電圧はアミノ酸、アミノ酸残基、側鎖保護基などに影響をあたえない１．５ボルト以下で十分である。
【００８１】
この印加電圧について補足すると、より正確な電圧を得るため、溶液中に参照電極参照電極を入れてそれを基準に測定している。具体的には、印加電圧が銀／塩化銀（飽和塩化カリウム水溶液）参照電極に対して１．５ボルト以下である。
【００８２】
また、特願２００２−２２０５６９で記載されているように、本案担体のアミノ酸と結合する官能基（ヒドロキシル基の一つ）にアミノ酸が結合した液相ペプチド合成用アミノ酸試薬を提供することは容易である。この試薬は本案担体のアミノ酸と結合する官能基にアミノ酸のＣ末端が結合したものであり、該アミノ酸のＮ末端に保護基が結合されたものであれば好適である。また、同じく特願２００２−２２０５６９で記載されているように、担体と結合したアミノ酸の種類を弁別するために、該アミノ酸の種類に応じて物性の異なる添加物を混合し、好適にはその添加物が色素を含む光学材料物質、または導電物質であり、アミノ酸の種類に応じて変える添加物の物性が、色を含む光学物性、または電気導電度であってもよい。さらにまた、かかる試薬にて、相分離状態の第一の溶媒と第二の溶媒の界面を検出するために、固有の物性を具備し、かつ第一の溶媒または第二の溶媒への溶解性を高める部分を具備した添加物を混合してもよく、好適にはその添加物が色素を含む光学材料物質、または導電物質であり、添加物の固有の物性が、色を含む光学物性、または電気導電度であってもよい。
【００８３】
【発明の効果】
さて本案第一の効果は、開裂操作が、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）やフッ化水素などの腐蝕性あるいは有毒の薬品を使用する危険を伴う作業がなくなり、安全な操作となり、大幅な改善が実現できた。反応容器も腐蝕対策の必要が無くなる。
【００８４】
第二の効果は、開裂操作が何度でもできる簡潔なものとなり、なおかつ温和な低電圧の電解反応であるので、担体とペプチドの開裂だけを行い、その他の保護基には影響がなく保護基をキープできるようになった。それで、Ｃ末端に反応保護困難な残基（側鎖）をもつアミノ酸があるペプチド合成、基本ペプチドのＣ末端結合コンビナトリアル合成、長鎖ペプチドの分割合成の実施が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】酸化還元によるベンゼノイドとキノイド構造の変換（一環芳香族炭化水素環の場合）
【図２】酸化還元によるベンゼノイドとキノイド構造の変換（二環芳香族炭化水素環の場合）
【図３】酸化還元によるベンゼノイドとキノイド構造の変換（三環芳香族炭化水素環の場合）
【図４】酸化還元によるベンゼノイドとキノイド構造の変換（四環芳香族炭化水素環の場合１）
【図５】酸化還元によるベンゼノイドとキノイド構造の変換（四環芳香族炭化水素環の場合２）
【図６】Ｃ末端側が反応性で不安定な残基をもつメチオニンであるメチオニンエンケファリンの固相合成の説明図
【図７】Ｃ末端側が反応性で不安定な残基をもつペプチドの理想的合成法の説明図
【図８】基本ペプチドのＣ、Ｎ末端に多様なアミノ酸を結合させてなるコンビナトリアル合成の説明図
【図９】長鎖ペプチドを二つに分割して合成し、それらを結合させる理想的合成法の説明図
【図１０】長鎖ペプチドを２、４、８、１６と多分割して合成する理想的合成法の説明図
【図１１】可溶性担体２にＲ１残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図１２】可溶性担体２とＲ１残基アミノ酸が結合した物質１ａｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ２残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図１３】可溶性担体２とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸鎖が結合した物質１ｂｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ３残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図１４】可溶性担体２とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸鎖が結合した物質１ｂｆのＦｍｏｃを除去活性化し、Ｒ４残基アミノ酸を結合する反応フロー図
【図１５】図１１を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図
【図１６】図１２を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図
【図１７】図１３を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図
【図１８】図１４を本案の可溶性担体１に置換した反応フロー図
【図１９】本案の可溶性担体１と合成ペプチドの結合を酸化によって開裂する反応フロー図
【図２０】本案によるＣ末端側が反応性で不安定な残基をもつペプチド合成法の説明図
【図２１】本案による長鎖ペプチドを２、４、８、１６と多分割して合成する合成法の説明図１
【図２２】本案による長鎖ペプチドを２、４、８、１６と多分割して合成する合成法の説明図２
【図２３】図１９と同じ図、ＡＡの説明図１
【図２４】図１９と同じ図、ＡＡの説明図２
【図２５】図１９の本案担体第一例をその担体のバリエーションで置換した図
【図２６】図１９の本案担体第一例を本案担体第二例に置換した図
【図２７】本案第一例の担体の、図２５以外のバリエーションを説明する図
【図２８】本案第三例の担体とそのバリエーションを説明する図
【図２９】本案第二例の担体のバリエーションを説明する図
【図３０】本案第四例の担体とそのバリエーションを説明する図１
【図３１】本案第四例の担体とそのバリエーションを説明する図２
【図３２】一般式Ａ（化２）の（ＲＸ）ｎのＲの具体例
【図３３】一般式Ａ（化２）の（ＲＸ）ｎのＸの具体例であってＯ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部、または、エステル基、イミノ基を介して芳香族炭化水素環に結合する例
【図３４】一般式Ａ（化２）の（ＲＸ）ｎのＸの具体例であって、Ｃを介して芳香族炭化水素環に結合する任意の残基があっても良い結合部の例
【図３５】混合、相溶状態保持、相分離状態保持、排除の連続工程の説明図
【図３６】相溶状態保持ステップにおける開裂操作の説明図
【図３７】ペプチドの回収説明図
【図３８】ペプチドの回収で第二の溶媒を回収容易な溶媒に置換する例の説明図
【図３９】部分ペプチドを開裂、Ｃ末端活性化して他のアミノ酸またはペプチドに結合する例
【図４０】溶液内の電極間に電圧を印加して生じる電気化学反応の説明図１
【図４１】溶液内の電極間に電圧を印加して生じる電気化学反応の説明図２
【図４２】溶液内の電極間に電圧を印加して生じる電気化学反応の説明図３
【符号の説明】
１　本案の可溶性担体の例（本案担体第一例）
１ａ　可溶性担体とＲ１残基アミノ酸の結合物質
１ａｆ　１ａのＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
１ｂ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸の結合物質
１ｂｆ　１ｂのＲ２残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
１ｃ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸の結合物質
１ｃｆ　１ｃのＲ３残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃが結合した物質
１ｘ　可溶性担体と任意アミノ酸系物質との結合物質
１ｘｆ　１ｘに保護基を結合した物質
１ｚ　可溶性担体と反応性で不安定であるアミノ酸との結合物質
１ｚｆ　１ｚに保護基を結合した物質
２　特願２００１−３８５４９３、特願２００２−１９８２４２、特願２００２−２２０５６９で開示された可溶性担体の例
８　液相担体にＲ１残基アミノ酸のＮ末端に保護基Ｆｍｏｃを結合したＲ１残基アミノ酸を結合
する反応
９　固相担体（レジンなどの樹脂）
１０　Ｎ末端の保護基であるＦｍｏｃ等を除去して活性化する操作
１１　活性化されたＮ末端部分に１２をペプチド結合反応させる操作
１２　Ｎ末端に保護基Ｆｍｏｃなどを結合した結合前処理後のアミノ酸
１２ｐ　Ｎ末端に保護基Ｆｍｏｃなどを結合した結合前処理後の部分ペプチド
Ａ　第一の溶媒
Ａ０　任意物質を溶解した第一溶媒溶液
Ａ１　可溶性担体を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ａ　可溶性担体とＲ１残基アミノ酸との結合物質（１ａ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ａｆ　１ａに保護基を結合した物質（１ａｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｂ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２残基アミノ酸との結合物質（１ｂ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｂｆ　１ｂに保護基を結合した物質（１ｂｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｃ　可溶性担体とＲ１、Ｒ２、Ｒ３残基アミノ酸鎖の結合物質（１ｃ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｃｆ　１ｃに保護基を結合した物質（１ｃｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
媒溶液
Ａ１ｘ　可溶性担体と任意アミノ酸系物質との結合物質（１ｘ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
Ａ１ｘｆ　１ｘに保護基を結合した物質（１ｘｆ）を第一の溶媒に溶解した第一溶媒溶液
ＡＡ　Ｎ末端Ｎのないアミノ酸あるいはペプチドの一部（詳しくは図２３参照）
ＡＡＮＨ　アミノ酸あるいはペプチドの一部（詳しくは図２３参照）
ＡＡＮＨＦｍｏｃ　Ｎ末端をＦｍｏｃで保護したアミノ酸あるいはペプチドの一部（詳しくは図２３参照）
Ｂ　第二の溶媒
Ｂ０　任意物質を溶解した第二溶媒溶液
Ｂ１２　１２を第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液
Ｂ１２ｐ　１２ｐを第二の溶媒に溶解した第二溶媒溶液
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ５、ｎ６　炭化水素基の数であって、Ｒの条件を満たす整数
Ｒ　炭素数１０以上の炭化水素基（Ｏ、Ｓ、またはＮを結合原子として含んでいても良い）
Ｒ’、Ｒ’’　任意の残基
Ｒ０　ペプチドを構成するアミノ酸で反応性で不安定であるアミノ酸の残基
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４　合成すべきペプチド鎖を構成するアミノ酸残基
Ｒｃ１、Ｒｃ２、、、、Ｒｃｎ　ペプチドのＣ末端にコンビナトリアル合成結合すべきアミノ酸残基
Ｒｎ１、Ｒｎ２、、、、Ｒｎｎ　ペプチドのＮ末端にコンビナトリアル合成結合すべきアミノ酸残基
Ｘ　担体とＲの結合部（Ｏ、Ｃ、Ｓ、またはＮを介して芳香族炭化水素環に結合、任意の残基があっても良い）
ｘ　カルボキシル基側の活性化基
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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