(57)【要約】      （修正有）【課題】一度に大量調製することが可能であり、かつ、類似菌種間における菌種の同定が可能な感染症検出用プローブを提供する。【解決手段】感染症起炎菌遺伝子を検出するための感染症起炎菌検出用プローブセットは、特定のの塩基配列及びその相補配列を含む第1群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第2群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第3群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第4群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第5群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第6群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第7群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第8群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第9群と、特定の塩基配列及びその相補配列を含む第10群より選択された複数群の各々から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症起炎菌遺伝子を検出するための感染症起炎菌検出用プローブセットであって、
SEQ ID No.1〜14の塩基配列及びその相補配列を含む第1群と、SEQ ID No.15〜24の塩基配列及びその相補配列を含む第2群と、SEQID No.25〜36の塩基配列及びその相補配列を含む第3群と、SEQ ID No.37〜47の塩基配列及びその相補配列を含む第4群と、SEQ IDNo.48〜57の塩基配列及びその相補配列を含む第5群と、SEQ ID No.58〜68の塩基配列及びその相補配列を含む第6群と、SEQ ID No.69〜77の塩基配列及びその相補配列を含む第7群と、SEQID No.78〜85の塩基配列及びその相補配列を含む第8群と、SEQ ID No.86〜97の塩基配列及びその相補配列を含む第9群と、SEQ IDNo.98〜106の塩基配列及びその相補配列を含む第10群より選択された複数群の各々から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含むことを特徴とする感染症起炎菌検出用プローブセット。
【請求項２】
請求項１に記載の感染症起炎菌検出用プローブセットに含まれるプローブが化学的に固定されている担体。
【請求項３】
請求項２に記載の担体を用いて感染症起炎菌遺伝子を検出する遺伝子検査方法。
【請求項４】
SEQ ID No.1〜14の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とする黄色ブドウ球菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項５】
SEQ ID No.1〜14の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とする黄色ブドウ球菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項６】
請求項５に記載のプローブセットに含まれる感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項７】
請求項６に記載の担体を用いて黄色ブドウ球菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項８】
SEQ ID No.15〜24の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とする表皮ブドウ球菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項９】
SEQ ID No.15〜24の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とする表皮ブドウ球菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項１０】
請求項９に記載のプローブセットに含まれる感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の担体を用いて表皮ブドウ球菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項１２】
SEQ ID No.25〜36の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る、大腸菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項１３】
SEQ ID No.25〜36の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含む、大腸菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項１４】
請求項１２に記載の感染症検出用プローブのうち、少なくとも１種類の感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項１５】
請求項１３に記載の担体を用いて大腸菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項１６】
SEQ ID No.37〜47の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とする肺炎桿菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項１７】
SEQ ID No.37〜47の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とする肺炎桿菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載の感染症検出用プローブのうち、少なくとも１種類の感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の担体を用いて肺炎桿菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項２０】
SEQ ID No.48〜57の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とする緑膿菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項２１】
SEQ ID No.48〜57の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とする緑膿菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプローブセットに含まれる感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項２３】
請求項２２に記載の担体を用いてセラチア球菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項２４】
SEQ ID No.58〜68の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするセラチア菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項２５】
SEQ ID No.58〜68の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とするセラチア菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項２６】
請求項２５に記載のプローブセットに含まれる感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項２７】
請求項２６に記載の担体を用いてセラチア球菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項２８】
SEQ ID No.69〜77の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とする肺炎連鎖球菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項２９】
SEQ ID No.69〜77の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とする肺炎連鎖球菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項３０】
請求項２９に記載の感染症検出用プローブのうち、少なくとも１種類の感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項３１】
請求項３０に記載の担体を用いて肺炎連鎖球菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項３２】
SEQ ID No.78〜85の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするインフルエンザ菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項３３】
SEQ ID No.78〜85の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とするインフルエンザ菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項３４】
請求項３３に記載の感染症検出用プローブのうち、少なくとも１種類の感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項３５】
請求項３４に記載の担体を用いてインフルエンザ菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項３６】
SEQ ID No.86〜97の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするエンテロバクタークロアカエ菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項３７】
SEQ ID No.86〜97の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とするエンテロバクタークロアカエ菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項３８】
請求項３７に記載の感染症検出用プローブのうち、少なくとも１種類の感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項３９】
請求項３８に記載の担体を用いてエンテロバクター  クロアカエ菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項４０】
SEQ ID No.98〜106の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成ることを特徴とするエンテロコッカウフェカリス菌由来の遺伝子を検出可能な感染症検出用プローブ。
【請求項４１】
SEQ ID No.98〜106の塩基配列及びその相補配列のうちのいずれかを有するオリゴヌクレオチドから成る感染症検出用プローブのうちの１種類以上の感染症検出用プローブを含むことを特徴とするエンテロコッカウフェカリス菌由来の遺伝子を検出可能なプローブセット。
【請求項４２】
請求項４１に記載の感染症検出用プローブのうち、少なくとも１種類の感染症検出用プローブが化学的に固定されていることを特徴とする担体。
【請求項４３】
請求項４２に記載の担体を用いてエンテロコッカス  フェカリス菌由来の遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項４４】
感染症起炎菌の16s rRNA遺伝子配列をＰＣＲ増幅させるのに用いられるプライマーであって、
SEQ ID No.73〜78の塩基配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする感染症起炎菌増幅反応用プライマー。
【請求項４５】
ヒトゲノムDNAの塩基配列と３塩基以上配列が異なることを特徴とする請求項４４に記載の感染症起炎菌増幅反応用プライマー。
【請求項４６】
感染症起炎菌の16s rRNA遺伝子配列をＰＣＲ増幅させるのに用いられるプライマーセットであって、
SEQ ID No.107〜109の塩基配列のうちの少なくとも一つ以上と、SEQ ID No.110〜112の塩基配列のうちの少なくとも一つ以上の複数の塩基配列の各々を有するオリゴヌクレオチドからなる複数のプライマーを含むことを特徴とする感染症起炎菌増幅反応用プライマーセット。
【請求項４７】
ヒト血液検体に対して、該プライマーセットのうちの全てを同時に用いて、PCR反応させることを特徴とする請求項４６記載の感染症起炎菌増幅反応用プライマーセット。
【請求項４８】
請求項４６に記載の感染症起炎菌増幅反応用プライマーセットを用いてＰＣＲ増幅処理を行なってＤＮＡプローブによる感染症起炎菌の検出を行なうことを特徴とする感染症起炎菌検出方法。
【請求項４９】
感染症起炎菌遺伝子を検出するための感染症起炎菌検出用プローブセットであって、
SEQ ID No.1〜9の塩基配列及びその相補配列を含む第1群と、SEQ ID No.15〜21の塩基配列及びその相補配列を含む第2群と、SEQID No.25〜31の塩基配列及びその相補配列を含む第3群と、SEQ ID No.37〜42の塩基配列及びその相補配列を含む第4群と、SEQ IDNo.48〜55の塩基配列及びその相補配列を含む第5群と、SEQ ID No.58〜62の塩基配列及びその相補配列を含む第6群と、SEQ ID No.69〜75の塩基配列及びその相補配列を含む第7群と、SEQID No.78〜84の塩基配列及びその相補配列を含む第8群と、SEQ ID No.86〜92の塩基配列及びその相補配列を含む第9群と、SEQ IDNo.98〜105の塩基配列及びその相補配列を含む第10群より選択された複数群の各々から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含むことを特徴とする感染症起炎菌検出用プローブセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染症疾患の原因菌である感染症起炎菌の検出及び／又は同定に関する。特に、感染症疾患の原因菌の検出および同定に有用な感染症起因菌由来のプローブ及び、プローブセットならびに担体、遺伝子検査方法に関するものである。
【０００２】
また、感染症起炎菌の検出及び／又は同定に好適な感染症起炎菌のＰＣＲ増幅処理に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年、ＤＮＡチップ（またはＤＮＡマイクロアレイともいう。以下同じ）を用いた遺伝子発現解析が創薬を初め種々の領域で行なわれている。それは、各種遺伝子セット（プローブ）が配置されたＤＮＡマイクロアレイに、それぞれ異なった検体ＤＮＡを反応させ、各検体に存在するそれぞれの遺伝子量を比較して、各ステージで大量に存在する（発現量の高い）遺伝子、或いは逆に不活性化している（発現量の低い）遺伝子を分類し、機能と関連付けて解析するものである。
【０００４】
感染症の起炎菌検査はその一例であり、江崎らは特許文献１において、ＤＮＡプローブとして染色体ＤＮＡが固定化されたＤＮＡチップを用いる微生物同定法を提案している。この方法によれば、互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することで検体中の未知微生物を検出することが可能である。
【０００５】
また、大野らは感染症の起炎菌検査のためのＤＮＡチップに用いるプローブとして、特許文献２で制限酵素断片を利用した真菌の検出用プローブを、特許文献３で緑膿菌の検出用プローブを、特許文献４でEscherichia coli（エシェリキア  コリ）菌、klebsiella pneumoniae（クレブシエラ  ニューモニエ）菌ならびにEnterobacter cloacae（エンテロバクター  クロアカエ）菌の制限酵素断片を利用した検出用プローブをそれぞれ提案している。
【０００６】
また、上記マイクロアレイとしては、例えば、スタンフォード法と呼ばれるスタンピング法によるマイクロアレイが知られており、例えば、宝酒造株式会社からがん疾患に関連するヒト由来既知遺伝子のｃＤＮＡ断片をスポット或いはスタンプにより塗布したＤＮＡチップ、ヒト由来既知遺伝子約1000種類のｃＤＮＡ断片をスライドガラスに貼り付けたチップが市販されている。
【０００７】
一方、Affymetrixのチップは、上記既知遺伝子ｃＤＮＡを元にオリゴヌクレオチドプローブセットを設計し、基板上の合成によりプローブを配置したもので、一枚のチップ上に高密度にオリゴプローブが配置され、一度に一万を超える遺伝子の発現レベルを解析できるように設計されている。
【特許文献１】特開２００１−２９９３９６号公報
【特許文献２】特開平６−１３３７９８号公報
【特許文献３】特開平１０−３０４８９６号公報
【特許文献４】特開平１０−３０４８９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記従来技術に示したＤＮＡチップは、染色体ＤＮＡ或いは制限酵素断片等のＤＮＡプローブを利用するものであり、いずれも微生物から直接取り出したＤＮＡを材料としている。このため、一度に大量に調製することは困難であり、臨床診断用には適さないという問題があった。これは臨床診断用に用いるためには、安価で均質なＤＮＡチップの大量生産が必要であり、このためにプローブ溶液として均質なＤＮＡの大量調製が不可欠となってくるところ、ＤＮＡプローブでは、このような大量調製ができないからである。なお、ＤＮＡプローブであっても、ＰＣＲ増幅反応を利用することで当該ＤＮＡを徐々に増加させていくことは可能であるが、ＰＣＲ反応では、一度に大量調製することは困難であることから、臨床診断用に利用することは難しい。
【０００９】
また、ＤＮＡプローブは塩基長が長いため、類似菌種間における菌種の同定が困難であり、例えば感染症検出用には適さないという問題があった。これは、感染症の治療においては菌種の特定とそれに応じた抗生剤の選択・投与が必要であり、このために感染症検出用プローブには、同種内の詳細な区別までは必要としないまでも（つまり同種内は一括検出でき）、類似する他の種の細菌は区別して検出できるような機能が求められるからである。一方、例えば特許文献４で示されているエシェリキア  コリ菌、クレブシエラ  ニューモニエ菌、エンテロバクター  クロアカエ菌の制限酵素断片を用いたＤＮＡチップでは、プローブの塩基長が長いために、これら３菌種相互間に交差反応が生じてしまい、類似する個々の菌を区別することができず、感染症検出用に利用することは難しい。
【００１０】
また、以上のようなマイクロアレイの用途として、感染症の起炎菌検査が注目されており、感染症起炎菌検査を目的としたプローブセットの提案もいくつかなされている。
【００１１】
マイクロアレイを用いた細菌検査における重要なポイントは、感染菌数が少なくても検出できることである。そのために、プライマーを用いたＰＣＲ反応等による感染菌のＤＮＡの塩基配列における特定の部位を増幅することが有効である。例えば、16s rRNA遺伝子配列はおよそ１７００塩基対の情報中に菌種特有な配列を含み、その配列を利用することによりある程度の分類が可能であると考えられている。したがって、細菌の検出／同定においては、細菌のＤＮＡ塩基配列中の16srRNA部分を用いるのが好ましい。したがって、この16s rRNA部分を増幅することが要望されている。
【００１２】
しかしながら、種々の菌の遺伝子配列は部分的には明らかにされていても、16s rRNAの全長が解明されている訳ではなく、ＰＣＲ増幅反応用のプライマーの設計は容易ではない。
【００１３】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、一度に大量調製することが可能であり、かつ、類似菌種間における菌種の同定が可能な感染症検出用プローブを提供することを目的とする。
【００１４】
より具体的には、感染症の複数種の原因菌の種による分類に適した感染症検出用プローブセットを提供することを目的とするものである。
【００１５】
また、これらの類似菌種間の差異がＤＮＡチップ上で精度良く評価可能であるよう、感染症検出用プローブと検体とのハイブリッド体の安定性も考慮したプローブセットを提供することを目的とする。
【００１６】
また、これらの感染症検出用プローブと検体との反応を行なう為に、これらの感染症検出用プローブが固定された担体を提供することを目的とする。
【００１７】
さらに、検体溶液との反応の過程で、これらの感染症検出用プローブが安定に担体上に固定され、再現性の高い検出結果を得るために、化学的に固定された担体を提供することを目的とする。
【００１８】
また、感染症起炎菌の検出及び／又は同定を目的に、検体中の起炎菌の16s rRNAを増幅する為のＰＣＲ反応用プライマーを提供することを目的とする。
【００１９】
また、本発明の他の目的は、複数の菌種に共通に利用可能で、菌種が不明な状態でも効果的に起炎菌の16s rRNAを増幅可能なプライマーセットを提供することにある。
【００２０】
更に、本発明の他の目的は、複数種類の起炎菌の16s rRNAを同一ＰＣＲ条件で増幅可能であるようなプライマーセットを提供することにある。
【００２１】
また、ヒト血液検体に対して、該プライマーセットのうちの全てを同時に用いて、PCR反応を行なうことにより、ヒトゲノム由来の遺伝子を増幅することなく、上記菌種のいずれも増幅可能であることを特徴とするプライマーセットを提供する。具体的には、ヒトゲノム遺伝子と３塩基以上異なる配列を持つプライマーセットを提案する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記の目的を達成するための本発明の一態様によれば、以下の感染症起炎菌検出用プローブセットが提供される。すなわち、
感染症起炎菌遺伝子を検出するための感染症起炎菌検出用プローブセットであって、
SEQ ID No.1〜14の塩基配列及びその相補配列を含む第1群と、SEQ ID No.15〜24の塩基配列及びその相補配列を含む第2群と、SEQID No.25〜36の塩基配列及びその相補配列を含む第3群と、SEQ ID No.37〜47の塩基配列及びその相補配列を含む第4群と、SEQ IDNo.48〜57の塩基配列及びその相補配列を含む第5群と、SEQ ID No.58〜68の塩基配列及びその相補配列を含む第6群と、SEQ ID No.69〜77の塩基配列及びその相補配列を含む第7群と、SEQID No.78〜85の塩基配列及びその相補配列を含む第8群と、SEQ ID No.86〜97の塩基配列及びその相補配列を含む第9群と、SEQ IDNo.98〜106の塩基配列及びその相補配列を含む第10群より選択された複数群の各々から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドで形成される複数種類のプローブを含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、一度に大量調製することが可能であり、かつ、類似菌種間における菌種の同定が可能な感染症検出用プローブを提供することができる。より具体的には、感染症の複数種の原因菌の種による分類に適した感染症検出用プローブセットを提供することが可能となる。
【００２４】
或いは、感染症の原因菌である例えば上記１０種類の菌の検出に適した感染症検出用プローブを提供することが可能となる。
【００２５】
また、これらの類似菌種間の差異がＤＮＡチップ上で精度良く評価可能であるよう、感染症検出用プローブと検体とのハイブリッド体の安定性も考慮したプローブセットを提供することが可能となる。
【００２６】
また、これらの感染症検出用プローブと検体との反応を行なう為に、これらの感染症検出用プローブが固定された担体を提供することができる。
【００２７】
さらに、検体溶液との反応の過程で、これらの感染症検出用プローブが安定に担体上に固定され、再現性の高い検出結果を得るために、化学的に固定された担体が提供できる。
【００２８】
また、本発明によれば、感染症起炎菌の検出及び／又は同定を目的とした、検体中の起炎菌の16s rRNAを増幅する為のＰＣＲ反応用プライマーが提供される。
また、本発明によれば、複数の菌種に共通に利用可能で、菌種が不明な状態でも効果的に起炎菌の16srRNAを増幅可能なプライマーセットが提供される。
更に、本発明によれば、複数種類の起炎菌の16srRNAを同一ＰＣＲ条件で増幅可能であるようなプライマーセットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下の実施形態では、感染症の起炎菌同定の為のオリゴヌクレオチドプローブ、より具体的には、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、エンテロバクター  クロアカエ菌、及びエンテロコッカス・フェカリス菌のいずれか、或いは複数菌を検出する為のプローブが示される。すなわち、上記１０種類の感染症起炎菌の遺伝子のうちの16s rRNA遺伝子配列を過不足なく検出するための核酸プローブ或いは核酸プローブセットが開示される。
【００３０】
本実施形態によれば、上記感染症起炎菌の遺伝子の核酸配列を含む検査溶液と反応せしめるための上記オリゴヌクレオチドプローブは、後述の表示１に示す第１群（添付配列表の配列番号（SEQ ID No.）1〜14）、表２に示す第２群（配列番号15〜24）、表３に示す第３群（配列番号25〜36）、表４に示す第４群（配列番号37〜47）、表５に示す第５群（配列番号48〜57）、表６に示す第６群（配列番号58〜68）、表７に示す第７群（配列番号69〜77）、表８に示す第８群（配列番号78〜85）、表９に示す第９群（配列番号86〜97）、表１０に示す第１０群（配列番号98〜106）のうちの一つの群に属する１つの塩基配列からなる。ここで、第１群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは黄色ブドウ球菌を検出し、第２群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは表皮ブドウ球菌を検出し、第３群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは大腸菌を検出し、第４群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは肺炎桿菌を検出し、第５群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは緑膿菌を検出し、第６群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブはセラチア菌を検出し、第７群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは肺炎連鎖球菌を検出し、第８群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブはインフルエンザ菌を検出し、第９群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブはエンテロバクター  クロアカエ菌（以下、腸球菌）を検出し、第１０群から選択された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブはエンテロコッカス・フェカリス菌を検出する。
【００３１】
なお、これらのプローブ配列の相補的な配列（上記第１群の相補的な配列は添付配列表の配列番号１１３〜１２６、第２群の相補的な配列は配列番号１２７〜１３６、第３群の相補的な配列は配列番号１３７〜１４８、第４群の相補的な配列は配列番号１４９〜１５９、第５群の相補的な配列は配列番号１６０〜１６９、第６群の相補的な配列は配列番号１７０〜１８０、第７群の相補的な配列は配列番号１８１〜１８９、第８群の相補的な配列は配列番号１９０〜１９７、第９群の相補的な配列は配列番号１９８〜２０９、第１０群の相補的な配列は配列番号２１０〜２１８である）もまた、同じ機能を有するためにプローブ配列として有効である。
【００３２】
各菌のプローブの設計は、16s rRNAをコーディングしているゲノム部分より、当該菌に対し非常に特異性が高く、また、それぞれのプローブ塩基配列でばらつきがなく、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように行なった。
【００３３】
これらのオリゴヌクレオチドプローブは、担体上に結合された２種以上のプローブと検体とのハイブリダイゼーション反応において、安定なハイブリッド体を形成し、良好な結果を与えるように設計されている。
【００３４】
さらに、本発明にかかる感染症検出用プローブが固定された担体は、オリゴヌクレオチドをＢＪプリンタを用いて吐出し、化学的に結合させることで作製することを特徴としている。これにより、従来法に比べ、プローブがはがれにくくなるうえ、感度が向上するという付帯的な効果も得られる。つまり、従来から一般的に用いられるスタンフォード法と呼ばれるスタンピング法によりＤＮＡチップを生成した場合（例えば、宝酒造は、がん疾患に関連するヒト由来既知遺伝子のｃＤＮＡ断片をスポット或いはスタンプにより塗布することでＤＮＡチップを生成している）、塗布したＤＮＡがはがれやすいという欠点があった。また、従来のように、ＤＮＡチップ上で合成によりプローブを配置した場合（例えば、AffymetrixのＤＮＡチップ等）は、各プローブ配列毎の合成収量が異なる為に、正確な評価ができないという欠点があった。本発明にかかる担体は、かかる点についても考慮して作製されており、従来に比べ安定に固定されはがれにくく、高感度と高精度の検出ができる点を特徴としている。以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００３５】
本実施形態のＤＮＡチップが検査の対象とする検体としては、ヒト、家畜等の動物由来の血液、髄液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物を対象とする。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような自然環境中の水、空気清浄機や浄水器のフィルタ等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体全てが挙げられる。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象とする。
【００３６】
また、本実施形態のＤＮＡチップが対象とする検体としては、抽出した核酸そのものでも良いが、16s rRNA検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いて調製された増幅検体、或いはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行なって調製された検体、ＰＣＲ以外の増幅方法により調製された検体、可視化のために各種標識法により標識された検体等、いずれの調製法により調製された検体をも含む。
【００３７】
また、本実施形態のＤＮＡチップに用いられる担体は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等あらゆるものを含む。さらに、その基板の表面をプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものも含む。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものは、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。
【００３８】
本発明に用いられる固定化方法としては、例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化する。
【００３９】
マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide  :Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機でＤＮＡを合成する際に、5'-Thiol-ModifierC6（GlenResearch社製）を用いることにより行なうことができる。
【００４０】
固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。
【００４１】
以下、上述した１０種の感染症起炎菌のそれぞれを検出するための感染症起炎菌検出用プローブを用いた実施例により、更に詳細に説明する。
【００４２】
＜実施例１＞  １ Ｓｔｅｐ ＰＣＲ法を用いた微生物の検出
［１．プローブＤＮＡの準備］
上記１０種の起炎菌の株検出用プローブとして表１〜１０に示す核酸配列を設計した。具体的には、各菌の16s rRNAをコーディングしているゲノム部分より、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対し非常に特異性が高く、それぞれのプローブ塩基配列でばらつきのない、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。なお、表１〜１０に示す各プローブ塩基配列はこれに完全に一致したものに限定される必要はなく、各プローブ塩基配列を含む２０から３０程度の塩基長を有するプローブ塩基配列も各表に示す各プローブ塩基配列に含まれるものとする。また、上述のように各表に示した塩基配列の相補的な配列（相補鎖）を用いてもよい。
【００４３】
なお、以下の各表において、Probe No.は便宜的に割り当てた符号であり、配列番号は添付の配列表における配列番号と一致している。また、上述したように、配列番号１〜１０６に対応する相補鎖配列は配列番号１１３〜２１８に示してある。
【００４４】
2004313181.tif 000002
【００４５】
2004313181.tif 000003
【００４６】
2004313181.tif 000004
【００４７】
2004313181.tif 000005
【００４８】
2004313181.tif 000006
【００４９】
2004313181.tif 000007
【００５０】
2004313181.tif 000008
【００５１】
2004313181.tif 000009
【００５２】
2004313181.tif 000010
【００５３】
2004313181.tif 000011
【００５４】
上記各表中に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の5'末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥したプローブは、−３０℃の冷凍庫に保存した。
【００５５】
［２．検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備］
上記の起炎菌検出用の為の16s rRNA遺伝子（標的遺伝子）増幅用PCRPrimerとして以下の表１１に示す核酸配列を設計した。具体的には、16s rRNAをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１４００〜１７００塩基長の16srRNAコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する16s rRNAコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。なお、起炎菌の16srRNAコーディング領域に対して共通にほぼ全長を増幅できるプライマーセットであれば、下記の表１１に挙げたプライマセットに限定する必要はないのは言うまでもない。
【００５６】
2004313181.tif 000012
【００５７】
表１１中に示したPrimerは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、ForwardPrimerを３種、Reverse Primerを３種を混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10pmol/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００５８】
［３．各起炎菌Genome ＤＮＡ（モデル検体）の抽出］
［3-1］微生物の培養  ＆  Genome ＤＮＡ 抽出の前処理
まず、上記各起炎菌の標準株（黄色ブドウ球菌標準株（ATCC12600）、表皮ブドウ球菌標準株（ATCC14990）、大腸菌標準株（ATCC11775）、肺炎桿菌標準株（ATCC13883）、緑膿菌標準株（ATCC10145）、セラチア菌株、肺炎連鎖球菌標準株、インフルエンザ菌株、腸球菌標準株（ATCC13047）、エンテロコッカス  フェカリス菌標準株（ATCC19433））を定法に従って培養し、微生物培養液を生成した。これらの微生物培養液のそれぞれを１．５ml容量のマイクロチューブに1.0ml（OD600=0.7）採取し、遠心分離で菌体を回収した（8500rpm、5min、4℃）。次に、上精を捨てた後、EnzymeBuffer（50mM Tris-HCl：p.H. 8.0、25mM EDTA）300μlを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した（8500rpm、5min、4℃）。上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
【００５９】
2004313181.tif 000013
【００６０】
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、37℃のインキュベーター内で30分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。
【００６１】
［3-2］Genome抽出
以下に示す微生物のGenome DNA抽出は、核酸精製キット（MagExtractor-Genome-：TOYOBO社製）を用いて行った。
【００６２】
具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液750μlと磁性ビーズ40μlを加え、チューブミキサーを用いて、10分間激しく攪拌した（ステップ１）。
次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ２）。
次に、洗浄液900μlを加え、ミキサーで５sec程度攪拌して再縣濁を行った（ステップ３）。
次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ４）。
【００６３】
上記ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄を行なう（ステップ５）。その後、70％エタノール900μlを加え、ミキサーで5sec程度攪拌して再縣濁した（ステップ６）。
次に、分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた（ステップ７）。
ステップ６、７を繰り返して70％エタノールによる２度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水100μlを加え、チューブミキサーで10分間攪拌を行った（ステップ９）。
次に分離用スタンド（Magical Trapper）にマイクロチューブをセットし、30sec静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。
【００６４】
［3-3］回収したGenome ＤＮＡの検査
回収された微生物（各起炎菌株）のGenome ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と260/280nmの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。本実施例では、それぞれの菌において、約9〜10μgのGenomeＤＮＡ が回収され、Genome ＤＮＡのデグラデーションやｒRNAの混入は認められなかった。回収したGenome ＤＮＡは、最終濃度50ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
【００６５】
［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］
ＤＮＡマイクロアレイを、特開平１１−１８７９００号公報に開示された方法に従って用意した。
［4-1］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：25mm×75mm×1mm、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、20分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で20分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に10分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡマイクロアレイ用の石英ガラス基板を用意した。
【００６６】
［4-2］表面処理
シランカップリング剤KBM-603（信越シリコーン社製）を、１%の濃度となるように純水中に溶解させ、2時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、20分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの1:1混合溶媒中に最終濃度が0.3mg/mlとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。
【００６７】
ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で2時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００６８】
［4-3］プローブＤＮＡ
実施例１で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００６９】
［4-4］ＢＪプリンタによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン7.5wt%、チオジグリコール7.5wt%、尿素7.5wt%、アセチレノールEH（川研ファインケミカル社製）1.0wt%を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した７種類のプローブ（表１）の夫々を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェット（登録商標）プリンタ（商品名：BJF-850  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００７０】
なおここで用いたバブルジェット（登録商標）プリンタは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェット（登録商標）プリンタは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約5ピコリットルのＤＮＡ溶液を約120μmピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００７１】
続いて、この改造バブルジェット（登録商標）プリンタを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、ＤＮＡマイクロアレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、30分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００７２】
［4-5］洗浄
30分間の反応後、100mMのNaClを含む10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定した遺伝子チップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を得た。
【００７３】
［５．検体の増幅と標識化（PCR増幅＆蛍光標識の取り込み）］
検体となる微生物遺伝子の増幅、および、標識化反応を以下に示す。
【００７４】
2004313181.tif 000014
【００７５】
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【００７６】
2004313181.tif 000015
【００７７】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCRPurification Kit）を用いてPrimerを除去（精製）した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。
【００７８】
［６．ハイブリダイゼーション］
上述の［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］で作製した遺伝子チップと［５．検体の増幅と標識化（PCR増幅＆蛍光標識の取り込み）］で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
【００７９】
［6-1］ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
BSA（牛血清アルブミンFraction V：Sigma社製）を1wt％となるように100mMNaCl/10mM Phosphate Bufferに溶解し、この溶液に［４．ＤＮＡマイクロアレイの作製］で作製した遺伝子チップを室温で2時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、0.1wt%SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む2xSSC溶液(NaCl300mM 、Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, C6H5Na3・2H2O)30mM、ｐＨ 7.0）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【００８０】
［6-2］ハイブリダイゼーション
水切りした遺伝子チップをハイブリダイゼーション装置（GenomicSolutions Inc.  Hybridization Station）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００８１】
［6-3］ハイブリダイゼーション溶液
6xSSPE / 10% Form amide / Target(2nd PCR Products  全量)
(6xSSPE: NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O60mM、EDTA 6mM、p.H. 7.4)。
【００８２】
［6-4］ハイブリダイゼーション条件
65℃  3min  →  92℃  2min  →  45℃  3hr  →  Wash  2ｘSSC/ 0.1% SDS  at 25℃  →  Wash  2xSSC at 20℃  → (Rinse with H2O :  Manual)  →  Spin dry（65℃で3分、92度で2分、45℃で3時間ハイブリダイゼーション反応させた後、2ｘSSC/ 0.1% SDS、25℃で洗浄、2xSSC、20℃で洗浄後、純水でリンスしスピンドライした）。
【００８３】
［７．微生物の検出（蛍光測定）］
上記ハイブリダイゼーション反応終了後の遺伝子チップを遺伝子チップ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いて蛍光測定を行った。その結果、以下の表１２〜２１に示すように、各菌において、再現性良く、十分なシグナルで各菌を検出することができた。また、他の菌のプローブに対するハイブリッド体は検出されなかった。
【００８４】
なお、本実施例では、２回ずつ蛍光測定を実施しており、それぞれの結果を以下に示した。
【００８５】
2004313181.tif 000016
【００８６】
2004313181.tif 000017
【００８７】
2004313181.tif 000018
【００８８】
2004313181.tif 000019
【００８９】
2004313181.tif 000020
【００９０】
2004313181.tif 000021
【００９１】
2004313181.tif 000022
【００９２】
2004313181.tif 000023
【００９３】
2004313181.tif 000024
【００９４】
2004313181.tif 000025
【００９５】
表１２〜２１の蛍光輝度の数値（フォトマル電圧400V）は、ピクセル平均輝度（解像度5μm）を示した。また、S/N比は、測定機付属の解析ソフト（Axon社製、GenePixPro Ver.3.0）で測定したバックグラウンド平均値で蛍光輝度を除したものを示した。
【００９６】
表１２〜２１で明らかなように、再現性良く、十分なシグナルで各起炎菌を検出することができる。
【００９７】
＜実施例２＞  ２Ｓｔｅｐ  ＰＣＲ法を用いた微生物の検出
実施例１同様に、プローブＤＮＡ、検体増幅用ＰＣＲプライマー、各起炎菌のGenome DNA、ＤＮＡマイクロアレイを用意し、以下の実験を行った。
【００９８】
［１．検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）］
検体となる微生物遺伝子の増幅（1st PCR）、および、標識化（2ndPCR）反応を以下に示す。
【００９９】
［２．増幅反応液組成：1st PCR］
【０１００】
2004313181.tif 000026
【０１０１】
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【０１０２】
2004313181.tif 000027
【０１０３】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCRPurification Kit）を用いて精製した後、増幅産物の定量を行った。
【０１０４】
［３．標識化反応液組成：2nd PCR］
【０１０５】
2004313181.tif 000028
【０１０６】
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【０１０７】
2004313181.tif 000029
【０１０８】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCRPurification Kit）を用いて精製し、標識化検体とした。
【０１０９】
［４．ハイブリダイゼーション］
実施例１と同様に行った。
【０１１０】
［５．微生物の検出（蛍光測定）］
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。測定結果を表２２〜３１に示す。
【０１１１】
なお、本実施例においても、２回ずつ蛍光測定を実施し、それぞれの結果を表２２〜３１に示した。
【０１１２】
2004313181.tif 000030
【０１１３】
2004313181.tif 000031
【０１１４】
2004313181.tif 000032
【０１１５】
2004313181.tif 000033
【０１１６】
2004313181.tif 000034
【０１１７】
2004313181.tif 000035
【０１１８】
2004313181.tif 000036
【０１１９】
2004313181.tif 000037
【０１２０】
2004313181.tif 000038
【０１２１】
2004313181.tif 000039
【０１２２】
表２２〜３１の蛍光輝度の数値（フォトマル電圧400V）は、ピクセル平均輝度（解像度5μm）を示した。また、Ｓ／Ｎ比は、測定機付属の解析ソフト（Axon社製、GenePixPro Ver.3.0）で測定したバックグラウンド平均値で蛍光輝度を除したものを示した。
【０１２３】
表２２〜３１で明らかなように、再現性良く、十分なシグナルで各種起炎菌を検出することができる。
【０１２４】
＜実施例３＞  ２Ｓｔｅｐ  ＰＣＲ法を用いた微生物の検出
実施例１、２同様に、プローブＤＮＡ、検体増幅用ＰＣＲプライマー、各起炎菌のGenome DNA、ＤＮＡマイクロアレイを用意し、以下の実験を行った。
【０１２５】
［１．検体の増幅と標識化（蛍光標識付きＰＣＲプライマーの使用）］
検体となる微生物遺伝子の増幅（1st PCR）、および、標識化（2nd PCR）反応を以下に示す。
【０１２６】
［２．増幅反応液組成；1st PCR］
【０１２７】
2004313181.tif 000040
【０１２８】
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行なった。
【０１２９】
2004313181.tif 000041
【０１３０】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR PurificationKit）を用いて精製した後、増幅産物の定量を行なった。
【０１３１】
［３．標識化反応組成：2nd PCR］
【０１３２】
2004313181.tif 000042
【０１３３】
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【０１３４】
2004313181.tif 000043
【０１３５】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCR PurificationKit）を用いて精製し、標識化検体とした。
【０１３６】
［４．ハイブリダイゼーション］
実施例１と同様に行った。
【０１３７】
［５．微生物の検出（蛍光測定）］
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Axon社製、GenePix 4000B）を用いで蛍光測定を行った。測定結果を表３２〜４１に示す。
【０１３８】
なお、本実施例においては、２回ずつ蛍光測定を実施し、それぞれの結果を表３２〜４１に示した。
【０１３９】
2004313181.tif 000044
【０１４０】
2004313181.tif 000045
【０１４１】
2004313181.tif 000046
【０１４２】
2004313181.tif 000047
【０１４３】
2004313181.tif 000048
【０１４４】
2004313181.tif 000049
【０１４５】
2004313181.tif 000050
【０１４６】
2004313181.tif 000051
【０１４７】
2004313181.tif 000052
【０１４８】
2004313181.tif 000053
【０１４９】
表２２〜３１で明らかなように、再現性良く、十分なシグナルで各種起炎菌を検出することができる。
【０１５０】
以上説明したように、上記実施例によれば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、腸球菌、及びエンテロコッカス・フェカリス菌の１０種菌を検出可能なプローブセットをそれぞれ別々に、或いは組み合わせて固定したマクロアレイを用いて、感染症起炎菌を同定することが可能になり、微生物由来のＤＮＡプローブの問題を解決した。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは、その塩基数の少なさゆえに、化学的に大量合成が可能であり、精製や濃度のコントロールが可能である。また、細菌の種による分類を目的に、同じ種の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の種の細菌は区別して検出できるようなプローブセットが提供できた。
【０１５１】
また、これらの差異がＤＮＡマイクロアレイ上で精度良く評価できるよう、プローブと検体とのハイブリッド体の安定性も考慮したプローブセットを提供することができる。さらにはこれらのプローブＤＮＡと検体との反応を行なう為に、これらのプローブＤＮＡが固定された担体を提供することができる。このプローブ及びプローブセットと検体溶液とを反応せしめる過程で、これらのプローブＤＮＡが安定に担体上に固定され、再現性の高い検出結果を得るために、化学的に固定された担体を提供することができる。
【０１５２】
また、上記実施形態によれば、感染症起炎菌遺伝子の16s rRNA遺伝子配列を過不足なく検出することにより、該感染症起炎菌の存在を効率良く、また高い精度で判定することができる。
【０１５３】
＜実施例４＞  プライマーセットについて
上記実施例において、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、エンテロバクター・クロアカエ菌、及びエンテロコッカス・フェカリス菌のいずれか、或いは複数の16s rRNA遺伝子配列を増幅するのに用いられたプライマーセット（表１１）を説明する。
【０１５４】
本実施形態のプライマーセットは、感染症起炎菌同定のために行なわれるＰＣＲ反応において良好な増幅結果を与えるように設計されている。ここで「良好な」とは、目的の16s rRNAが十分増幅されていることのみならず、16s rRNA以外の産物が無いことを意味する。
【０１５５】
また、ここで「良好な」とは、検体中に含まれる検体由来のヒトゲノム遺伝子を増幅せずに、感染症起炎菌16srRNAのみを増幅することをも意味する。
【０１５６】
本実施形態に用いられる検体としては、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等、細菌が存在すると思われるあらゆる物を対象とする。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような自然環境中の水、空気清浄機や浄水器のフィルタ等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体全てが挙げられる。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となり得る。
【０１５７】
また、本実施形態に用いられるＰＣＲ反応とは、抽出した核酸そのものを鋳型として用いたＰＣＲ反応、或いは該ＰＣＲ増幅物を鋳型として、さらに配列番号107〜109（表１１のＦ１〜Ｆ３）、或いは配列番号110〜112（表１１のＲ１〜Ｒ３）の片側のプライマーを用いた非対称ＰＣＲ反応、可視化のために標識物を取り込ませるＰＣＲ法等いずれの反応をも含む。
【０１５８】
［１．検体増幅用PCR Primer の準備］
起炎菌検出用の為の16s rRNA遺伝子（標的遺伝子）増幅用PCR Primerとして表１１に示す核酸配列を設計した。
【０１５９】
具体的には、16s rRNAをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約1500塩基長の16srRNAコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する16s rRNAコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。
【０１６０】
表１１中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製され、３種のForwardPrimerと３種のReverse Primerの全てを混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度10 pmol/μl となるようにＴＥ緩衝液に溶解した。なお、本実施例では全てのForwardPrimerとReverse Primerを用いたが、Forward PrimerとReverse Primerの夫々から１〜３種類ずつを用いるようにしてもよい。
【０１６１】
以上により生成したForward PrimerとReverse Primerの溶液（ForwardPrimer mix及びReverse Primer mix）を用いて、［３．各起炎菌Genome ＤＮＡ（モデル検体）の抽出］で説明した方法で抽出したGenome DNAを、［５．検体の増幅と標識化（PCR増幅＆蛍光標識の取り込み）］で説明した手法により増幅する。
【０１６２】
反応終了後、精製用カラム（QIAGEN  QIAquick PCR Purification Kit）を用いてPrimerを除去した後、増幅産物をゲル電気泳動により検討した。１５００塩基対領域に１バンドが検出され、良好にＰＣＲ反応が行なわれていることが確認できた。また、副産物は無かった。
【０１６３】
なお、表１１のプライマーを用いることにより、例えば上述した１０種の感染症起炎菌（黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、セラチア菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、腸球菌、及びエンテロコッカス・フェカリス菌）の全てにおいて、良好なＰＣＲ増幅の増幅結果を得ることができた。
【０１６４】
＜実施例５＞  血液と菌液の混合物からの１６ｓRNA遺伝子の増幅
ヒトの血液２００μｌ（採血EDTA血）に実施例１で説明し手順で培養した腸球菌を１０3、１０4、１０5加え、菌血症モデル系とした。この溶液のそれぞれにN-アセチルムラミダーゼ溶液（0.2mg/ml in Enzyme Buffer）を加え、３７℃３０分加温した後、Qiamp Blood mini Kit（キアゲン社製）を用いてDNAを抽出し、PCR反応用のテンプレートとした。
【０１６５】
これらのDNAに対して実施例４と同様、表１１のプライマーセットを用いてPCR反応を行なった。
【０１６６】
その結果、実施例４と同様、１５００塩基対長領域にバンドが検出され、良好にPCR反応が行なわれていることが確認できた。また、副産物はなく、そのバンドから求めたPCR増幅産物の量は、加えた菌量に比例していた。このことは、このプライマーセットを用いた際に、ヒトゲノムのPCR産物はなく、腸球菌の１６ｓRNAのみが増幅されたことを示している。
【０１６７】
以上説明したように、本実施形態によれば、複数種類の感染症起炎菌の遺伝子中の16s rRNA部分を効率良く、また高い純度で増幅することができる。また、ヒトゲノムＤＮＡ存在時においても感染症起炎菌の１６ｓｒＲＮＡのみを効率よく増幅することができる。
【配列表】
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