(57)【要約】【課題】幹細胞療法に有用な幹細胞培養法の提供。【解決手段】人の皮膚を蛋白質分解酵素により消化して、幹細胞を遊離させる工程、キノン誘導体及びヒト・サイトカインを含有する培地において、前記の遊離幹細胞を培養増殖させる工程、及び増殖させた幹細胞を、多能性幹細胞を経て目的組織の体性幹細胞にまで誘導し、他細胞から選別する工程、を具備する幹細胞培養法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人の皮膚を蛋白質分解酵素により消化して、幹細胞を遊離させる工程、
キノン誘導体及びヒト・サイトカインを含有する培地において、前記の遊離幹細胞を培養増殖させる工程、及び
増殖させた幹細胞を、多能性幹細胞を経て目的組織の体性幹細胞にまで誘導し、他細胞から選別する工程、を具備する幹細胞培養法。
【請求項２】
キノン誘導体が一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
2004344007.tif 000005
〔式中、Ａは次式
【化２】
2004344007.tif 000006
で示される基又は次式
【化３】
2004344007.tif 000007
で示される基を意味し、ｎは１〜５の整数を意味する。〕で表されるものである、請求項１記載の幹細胞培養法。
【請求項３】
培地に含まれるキノン誘導体濃度が０．１×１０−７〜１０×１０−７モル／Ｌであり、ヒト・サイトカイン濃度が１×１０−９〜１０×１０−９モル／Ｌである、請求項１記載の幹細胞培養法。
【請求項４】
培養系の酸素濃度が０．５〜２１容量％である、請求項１〜３のいずれかに記載の幹細胞培養法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、幹細胞を損傷組織に自家移植する幹細胞療法に適用できる幹細胞培養法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
社会の著しい高齢化に伴い、血管障害による脳梗塞、心筋梗塞、骨粗鬆による骨折、脊椎損傷等の器質性疾患が増大し、患者は長期療養を余儀なくされており、老人医療費の急増は国家財政上の大きな問題となっている。こうした状況下、疾患の原因療法の開発が切望されている。
【０００３】
非特許文献１には、皮膚再生医療の臨床例についての報告がなされ、非特許文献２では、角膜幹細胞をサイトカイン存在下で培養し、自己角膜を自家移植する報告がなされている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｏｒｇａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，１７７−１８４（２００１）
【非特許文献２】
Ｏｒｇａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，２５９−２６６（２００１）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血管障害による脳梗塞、心筋梗塞、骨粗鬆による骨折、脊椎損傷等の器質性疾患の治療に有用な細胞培養法であり、前記方法により培養された細胞を自家移植することで器質性疾患の治療を行う幹細胞療法にも適用できる細胞培養法を提供することを課題とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
最近では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を利用する研究が盛んになされているが、ＥＳ細胞を利用した場合、倫理性の問題と、核遺伝子と細胞質遺伝子がキメラになった状態での安全性に問題がある。
【０００７】
本発明者は、このようなＥＳを利用した場合の問題は、体性幹細胞を利用した場合には生じないことに着目し、研究を重ねた。
【０００８】
体性幹細胞としては、骨髄に豊富な幹細胞を分画して利用することが考えられ、動物実験による報告もなされている。
【０００９】
しかし、第３者から提供を受けた骨髄幹細胞の利用は、遺伝子の相違から、免疫上の問題がある。このような問題点は、患者自身の骨髄幹細胞を利用すれば解消するが、健康な骨髄提供者でも事故が報告されているように、腰骨からの骨髄採取に伴う手術負担は重く、特に重症患者からの採取は危険であり、臨床的実用性に欠ける。
【００１０】
そこで、本発明者は、数分程度の手術で済む、患者の負担の軽い顔面しわ取り術を施して摘除される余剰皮膚等に少数存在する幹細胞を培養・増殖することで、上記問題点を解消できることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１１】
本発明は、課題の解決手段として、
人の皮膚を蛋白質分解酵素により消化して、幹細胞を遊離させる工程、
キノン誘導体及びヒト・サイトカインを含有する培地において、前記の遊離幹細胞を培養増殖させる工程、及び
増殖させた幹細胞を、多能性幹細胞を経て目的組織の体性幹細胞にまで誘導し、他細胞から選別する工程、を具備する幹細胞培養法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の幹細胞培養法について説明する。本発明の幹細胞培養法は、下記の各工程を具備するものであるが、各工程は別個独立である必要はなく、２つ以上の工程を１つの工程にまとめても良いし、１つの工程を２つ以上の工程に分離しても良いし、１つの工程を分離し、分離した工程を他の工程と組み合わせて１つの工程としても良い。
【００１３】
第１の工程では、人の皮膚を蛋白質分解酵素により消化して、幹細胞を遊離させる。
【００１４】
この工程で用いる人の皮膚は、上記したとおり、簡易な手術で採取できる余剰皮膚を用いることが望ましい。
【００１５】
この工程では、例えば、人の皮膚を細切りし、Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（ＨＢＳＳ）に浮遊させ、トリプシン等の蛋白質分解酵素により、消化する方法を適用できる。
【００１６】
皮膚消化液中のトリプシン等の濃度は、トリプシン１ｍｇ／ｍｌが好ましく、消化条件は、例えば、３７℃、４０分で良い。
【００１７】
第２の工程では、キノン誘導体及びヒト・サイトカイン（繊維芽細胞成長因子及び表皮成長因子）を含有する培地において、前記の遊離幹細胞を培養増殖させる。
【００１８】
この工程で用いる培地は、キノン誘導体及びヒト・サイトカインを含有していれば良く、市販されている幹細胞培養用の培地を使用することができる。このような培地としては、例えば、Ｂ−２７（Ｇｉｂｃｏ社）（１〜３％のウシ胎児血清を含む。）、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ社）、Ｄ−ＭＥＮ（Ｇｉｂｃｏ社）等が知られている。
【００１９】
キノン誘導体は、一般式（Ｉ）又は又は（ＩＩ）：
【００２０】
【化４】
2004344007.tif 000002
【００２１】
〔式中、Ａは次式
【００２２】
【化５】
2004344007.tif 000003
【００２３】
で示される基又は次式
【００２４】
【化６】
2004344007.tif 000004
【００２５】
で示される基を意味し、ｎは１〜５の整数を意味する。〕
で表されるもの、及びその薬理学的に許容できる塩が好ましい。
【００２６】
一般式（Ｉ）で表される化合物は特公平５−６５３３号公報に開示されているものであり、具体的には、次に挙げる前記公報の実施例１〜１０に記載されたものを用いることができる。
【００２７】
（キノン誘導体１）
５−（７−カルボキシ−３−メチル−２，６−オクタジエニル）−２，３，４−トリメトキシ−６−メチルフェノール
（キノン誘導体２）
５−（１１−カルボキシ−３，７−ジメチル−２，６，１０−ドデカトリエニル）−２，３，４−トリメトキシ−６−メチルフェノール
（キノン誘導体３）
５−（１５−カルボキシ−３，７，１１−トリメチル−２，６，１０，１４−ヘキサデカテトラエニル）−２，３，４−トリメトキシ−６−メチルフェノール
（キノン誘導体４）
５−（１９−カルボキシ−３，７，１１，１５−テトラメチル−２，６，１０，１４，１８−エイコサペンタエニル）−２，３，４−トリメトキシ−６−メチルフェノール
（キノン誘導体５）
５−（２３−カルボキシ−３，７，１１，１５，１９−ペンタメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエニル）−２，３，４−トリメトキシ−６−メチルフェノール
（キノン誘導体６）
６−（７−カルボキシ−３−メチル−２，６−オクタジエニル）−２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン
（キノン誘導体７）
６−（１１−カルボキシ−３，７−ジメチル−２，６，１０−ドデカトリエニル）−２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン
（キノン誘導体８）
６−（１５−カルボキシ−３，７，１１−トリメチル−２，６，１０，１４−ヘキサデカテトラエニル）−２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン
（キノン誘導体９）
６−（１９−カルボキシ−３，７，１１，１５−テトラメチル−２，６，１０，１４，１８−エイコサペンタエニル）−２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン
（キノン誘導体１０）
６−（２３−カルボキシ−３，７，１１，１５，１９−ペンタメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエニル）−２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノン
一般式（ＩＩ）で表される化合物は、微生物等において存在が報告されているものである。（Ｌｅｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．  ＆  Ｃｒａｎｅ，Ｆ．Ｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４，２１６９、１９５９）
薬理学的に許容できる塩としては、塩酸、硫酸等の無機酸の塩、酢酸、フマル酸等の有機酸の塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属の塩等を挙げることができる。
【００２８】
培地に含まれるキノン誘導体濃度は、好ましくは０．１×１０−７〜１０×１０−７モル／Ｌであり、より好ましくは１×１０−７〜５×１０−７モル／Ｌである。
【００２９】
培地に含まれるヒト・サイトカイン濃度は、１×１０−９〜１０×１０−９モル／Ｌであり、より好ましくは２×１０−９〜８×１０−９モル／Ｌである。
【００３０】
第３の工程では、増殖させた幹細胞を、多能性幹細胞を経て目的組織の体性幹細胞にまで誘導し、他細胞から選別する。
【００３１】
キノン誘導体は、低酸素環境における細胞代謝に必須であるため（Ｈ．Ｅｓｕｍｉ，Ｔ．Ｏｚａｗａ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３２７９１−３２７９８，２００２）、培養系の酸素濃度及び培地中のキノン誘導体濃度を調節することで、目的組織の体性幹細胞に誘導し、他細胞から選別する。
【００３２】
例えば、肝臓組織の体性幹細胞を誘導、選別するとき、培養系の酸素濃度は４〜６容量％の範囲とし、培地中のキノン誘導体濃度は１×１０−７〜２×１０−７モル／Ｌの範囲とする。
【００３３】
上記した幹細胞培養法により得られた目的組織の体性幹細胞は、患者に自家移植する幹細胞療法に適用できる。
【００３４】
この幹細胞療法は、得られた目的組織の体性幹細胞を、治療対象となる損傷部分を有する目的組織に対して、骨髄移植手術に準じて、体性幹細胞浮遊液を静脈注射することで自家移植する方法が適用できる。
【００３５】
このようにして目的組織に対して体性幹細胞を自家移植することで、体性幹細胞を損傷部分に生着させ、損傷部分を再生・修復する。
【００３６】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３７】
実施例１（幹細胞培養法）
（第１工程）
人の皮膚を蛋白質分解酵素により消化して、幹細胞を遊離させる工程
顔面しわ取り術で摘除された余剰皮膚（５×１ｍｍ）を細切し、ＨＢＳＳに浮遊させ、トリプシン（皮膚消化液中に１ｍｇ／ｍｌ）消化（３７℃、４０分）して、幹細胞を遊離させた。
（第２工程）
キノン誘導体及びヒト・サイトカインを含有する培地において、前記の遊離幹細胞を培養増殖させる工程
遊離幹細胞を、キノン誘導体及びサイトカインを含有する培地（Ｂ−２７培地）において培養し、増殖させた。培地中のキノン濃度は１×１０−７〜２×１０−７モル／Ｌであり、培地中のヒト・サイトカイン濃度は１×１０−９〜１０×１０−９モル／Ｌである。培養・増殖は、恒温恒湿室において、温度３７℃、相対湿度９８％で行った。
（第３工程）
増殖させた幹細胞を、多能性幹細胞を経て目的組織の体性幹細胞にまで誘導し、他細胞から選別する工程
増殖させた幹細胞を、多能性幹細胞を経て、目的組織の体性幹細胞に誘導し、かつ他細胞から選別するため、細胞培養時の細胞培養装置（ナプコ社製，自動Ｏ２／ＣＯ２細胞培養装置  ＭＯＤＥＬ  Ｆ１０１）内の酸素濃度を、上記したキノン誘導体濃度を考慮して、１〜１０容量％に保持した。
【００３８】
このようにして、最終的に肝臓組織の体性幹細胞を誘導・選別した。この肝臓組織の体性幹細胞は、幹細胞療法に適用できる。具体的には、骨髄移植の技術を適用して患者に対して静脈注射することで自家移植し、損傷組織（肝臓）に生着させることで、損傷組織を治癒させることができる。治療効果は、Ｘ線、Ｎ．Ｍ．Ｒ．、超音波等の画像診断法により追跡し、得られたデータのメタナナリシス（ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ）により、確認する。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の幹細胞培養法は、患者自身の体性幹細胞を用いるため、ＥＳ細胞を用いた場合のような倫理面や安全性についての問題がなく、更に余剰皮膚を利用するため、骨髄採取のような臨床上の問題がない。
【００４０】
更に本発明の幹細胞培養法により培養した体性幹細胞は、患者に自家移植できるため、安全性が高く、幹細胞療法において有用である。