(57)【要約】【課題】動物の発症する脳腫瘍細胞において、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する治療方法を提供すること、及び該脳腫瘍細胞好ましくは神経膠芽腫において、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法を提供すること。【解決手段】動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する。グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御するには、脳腫瘍細胞に、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕにＲ２の遺伝子を導入することにより、行うことができる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞のグルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の発症する脳腫瘍細胞において発現するＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。
【請求項２】
グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性の制御を、動物の発症する脳腫瘍細胞に、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。
【請求項３】
ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子が、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２のｃＤＮＡであることを特徴とする請求項２記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。
【請求項４】
動物の発症する脳腫瘍細胞に、発現ベクターを用いて、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を導入し、発現させることを特徴とする請求項２又は３記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。
【請求項５】
発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクターであることを特徴とする請求項４記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。
【請求項６】
脳腫瘍細胞が、神経膠芽腫細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法。
【請求項７】
ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を、脳腫瘍細への遺伝子導入・発現用ベクターに組み込んだことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター。
【請求項８】
発現ベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項７記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター。
【請求項９】
請求項７又は８記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクターをセットしたことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット。
【請求項１０】
動物の発症する脳腫瘍細胞におけるＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することを特徴とする脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性の測定方法。
【請求項１１】
グルタミン酸受容体サブユニットの発現の検出・測定が、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の検出・測定であることを特徴とする請求項１０記載の脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の課題は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、Ｃａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、特には、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、及び動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタミン酸は、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であり、グルタミン酸の受容体であるグルタミン酸受容体は中枢神経における興奮性シナプス伝達の中心的役割を担っている。更に、グルタミン酸受容体は、記憶、学習の細胞レベルにおける基盤と考えられているシナプス可塑性や、発達期のシナプス可塑性すなわち経験依存的な神経回路網の形成に関与していることが知られている。また、虚血など病的条件下における神経細胞死にも関与していることが示唆されている。
【０００３】
グルタミン酸受容体はその構造とシグナル伝達機構から、イオンチャンネルを内蔵して速いシナプス伝達を担うイオンチャンネル型グルタミン酸受容体と、Ｇタンパク質と共役することにより間接的にシグナルを伝える代謝型グルタミン酸受容体とに大別される。イオンチャンネル型グルタミン酸受容体は、グルタミン酸の結合により自身の陽イオンチャンネルを開口する受容体−イオンチャンネル複合体であり、高等動物の中枢神経系（ＣＮＳ）における速い興奮性シナプス伝達を担っている。
【０００４】
イオンチャンネル型受容体は、特異的アゴニストやアンタゴニストに対する反応性と内蔵するイオンチャンネルの電気生理学的特性により、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ：Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ）に感受性のＮＭＤＡ受容体と非感受性の非ＮＭＤＡ受容体に大別される。アゴニストが結合するとＮａ＋、Ｋ＋に加えてＣａ２＋　を通過させる。非ＮＭＤＡ受容体は、カイニン酸、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸：α−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉｓｏｘａｚｏｌｅ　ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）に対する感受性の差により、カイニン酸受容体、ＡＭＰＡ受容体のサブタイプに分類され、アゴニストが結合するとＮａ＋、Ｋ＋を通過させる。
【０００５】
ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）中のほとんどすべての興奮性シナプスにおける迅速な神経伝達を仲介している（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１６，　３５９−３６５，　１９９３；Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１７，　３１−１０８，　１９９４、Ｐｒｏｇ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，　５４，　５８１−６１８，　１９９８）。従来、該受容体は神経細胞にのみ存在すると考えられてきたが、最近、大半のグリア細胞（ｇｌｉａｌ　ｃｅｌｌ）中でも発現していることが明らかとなった（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．，　２１，　２５２−２５８，　２０００）。
ＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡＲ）は、ＧｌｕＲ１〜ＧｌｕＲ４という４つのタンパク質から選択されるサブユニットから構成されていることが知られている。そして、ＡＭＰＡＲのＣａ２＋透過性は、そのサブユニットの組成によって決まる。
【０００６】
ＧｌｕＲ２サブユニットをもつ受容体は、Ｃａ２＋に対してほとんど透過性を示さないが、ＧｌｕＲ２をもたない受容体は、高いＣａ２＋透過性を示す。ＧｌｕＲ２サブユニットが豊富に存在すると、Ｃａ２＋透過性が低下する（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１６，　３５９−３６５，　１９９３；Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１７，　３１−１０８，　１９９４；Ｐｒｏｇ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，　５４，　５８１−６１８，　１９９８）。このＧｌｕＲ２の固有の性質は、第２番目の疎水性領域（Ｍ２）にある１つのアミノ酸残基に起因する。このアミノ酸残基は、ＧｌｕＲ２中ではアルギニン（Ｒ）であるが、他のサブユニットの相当する部位はグルタミン（Ｑ）が占めている。この重要な部位（Ｑ／Ｒ部位）のアルギニンがグルタミンに置換されると、変異したＧｌｕＲ２（Ｑ）から集まった相同的な受容体は高いＣａ２＋透過性を示す。
【０００７】
生体中において、ＡＭＰＡ受容体（ＡＭＰＡＲ）のサブユニットのうち、ＧｌｕＲ２の疎水性領域（Ｍ２）にある１つのアミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）となるメカニズムは、遺伝子の転写後に起こる「ＲＮＡ編集（ＲＮＡ　ｅｄｉｔｉｎｇ）」という現象で知られている。すなわち、遺伝子（ＤＮＡ）がｍＲＮＡに転写された後に１塩基が置換され、その結果、タンパク質レベルでも１アミノ酸残基の置換が生じる。遺伝子では、グルタミン酸（Ｑ）がコードされているのに対して、実際にはアルギニン（Ｒ）に置き換っているという特異な現象である。しかしながら、この変換によって、Ｃａ２＋透過性が低下する。
【０００８】
上記のように、グルタミン酸受容体は神経伝達物質受容体として機能しているので、これまでは主に精神的疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）や、記憶・学習の分野を中心に盛んに研究されてきており、種々の知見や、治療薬等の開発が行われてきた。それらの研究・開発の成果として、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中又はてんかんなどの神経変性疾患に関与する遺伝子を同定するための方法、及び神経変性疾患を有する動物を治療するための治療薬などの開発が行われてきた。
【０００９】
一方で、脳腫瘍として、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）などが良く知られている。特に、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）で最もよく見受けられ、かつ最も悪性の腫瘍である。この種の腫瘍は、遊走性及び浸潤性が高いことで知られている（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｕｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｒｖｏｕｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，　２９−３９，　２０００（ＩＡＲＣ　ｐｒｅｓｓ，　Ｌｙｏｎ，　Ｆｒａｎｃｅ））。遊走細胞は、密集した有髄の経路に沿って優先的な動きを示し、ＣＮＳ中に広範囲に広がっていくため（Ｎｅｕｒｏｌ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｉｒ．，　３４，　９１−９４，　１９９４、Ｎｅｕｒｏｌ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｉｒ．，　３３，　４２５−４２８，　１９９３、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，　１７，　１８６−１８８，　１９９７）、外科的な処置を施しても好結果が得られていない。
【００１０】
また、悪性神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）の二大特徴である細胞の増殖及び遊走は、神経膠腫の起源となる細胞の神経前駆細胞にも認められる（Ｇｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，　２０９−２２０，　１９９６（ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ，　ＵＫ．）、Ｇｌｉａ，　１５，　２２２−２３０，　１９９５）。神経膠腫細胞は、神経伝達物質、ホルモン、及び成長因子（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．，　２１，　２５２−２５８，　２０００）などの各種外部刺激に反応するため、神経膠芽腫の悪性の特徴は表面受容体の活性化を通じて、少なくとも部分的に制御することができる。
近年、グルタミン酸受容体が、神経前駆細胞だけではなく神経膠腫においても発現することが報告されている（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１７，　２２７−２４０，　１９９７、Ｇｌｉａ，　１０，１４９−１５３，　１９９４、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１６，　５１９−５３０，　１９９６、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１０，　２１５３−２１６２，　１９９８、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．，　４６，　１６４−１７８，　１９９６）。しかし、その病理生理学的重要性は、大部分が不明のままである。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、Ｃａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法、特には、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法を提供すること、更には動物の発症する脳腫瘍細胞において、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、確立した脳細胞の培養系を用い、カルシウム透過型ＡＭＰＡ受容体のグリア細胞における役割について解析する中で、強いカルシウム透過性を有するＧｌｕＲ２（Ｑ）遺伝子を強制発現させると細胞の突起形成が促進され、逆にカルシウム非透過性を有するＧｌｕＲ２（ＧｌｕＲ２（Ｒ））遺伝子を導入すると、突起の退縮と細胞の扁平化が生じることを見い出し、報告した（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ　１２（２００１），７４５−７４８）。
【００１３】
そして、本発明者は、ＡＭＰＡＲ（ＡＭＰＡ受容体）がヒト神経膠腫細胞で発現しており、更にＧｌｕＲ２（Ｑ）遺伝子を強制発現させた紡錘形細胞は、培養フラスコ内で重層しながら遊走するグリオーマ細胞や、摘出標本でしばしば認められる白質髄鞘線維内を走行する腫瘍細胞と形態学的に良く似ていることから、カルシウム透過型ＡＭＰＡＲが腫瘍細胞の浸潤性に関与しているのではないかと推測し、更に、解析を進めた結果、（１）ＧｌｕＲ１及び／又はＧｌｕＲ４サブユニットが、ヒト神経膠芽腫細胞のいたるところで発現しており、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲとして作用していること、（２）該神経膠芽腫細胞に、ＧｌｕＲ２（ＧｌｕＲ２（Ｒ））遺伝子を導入し、こうした内在性Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを、Ｃａ２＋非透過性ＡＭＰＡＲに変換すると、腫瘍細胞中で遊走が阻害され、アポトーシスが、誘導されること、及び（３）これに対して、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲが過剰発現すると、腫瘍細胞の増殖だけでなく遊走行動も増大すること、を見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明においては、動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することよりなる。グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御するには、脳腫瘍細胞に、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を導入することにより、行うことができる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定する方法を提供する。
【００１５】
すなわち本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において発現するＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項１）や、グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性の制御を、動物の発症する脳腫瘍細胞に、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことを特徴とする請求項１記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項２）や、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子が、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２のｃＤＮＡであることを特徴とする請求項２記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項３）や、動物の発症する脳腫瘍細胞に、発現ベクターを用いて、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を導入し、発現させることを特徴とする請求項２又は３記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項４）や、発現ベクターが、アデノウイルスを用いたベクターであることを特徴とする請求項４記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項５）や、脳腫瘍細胞が、神経膠芽腫細胞であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制する方法（請求項６）からなる。
【００１６】
また本発明は、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を、脳腫瘍細への遺伝子導入・発現用ベクターに組み込んだことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター（請求項７）や、発現ベクターが、アデノウイルスベクターであることを特徴とする請求項７記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクター（請求項８）や、請求項７又は８記載の脳腫瘍治療用遺伝子発現ベクターをセットしたことを特徴とする脳腫瘍治療用遺伝子導入用キット（請求項９）からなる。
【００１７】
さらに本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞におけるＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することを特徴とする脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性の測定方法（請求項１０）や、グルタミン酸受容体サブユニットの発現の検出・測定が、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の検出・測定であることを特徴とする請求項１０記載の脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性の測定方法（請求項１１）からなる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、発現するグルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することよりなる。動物の発症する脳腫瘍細胞としては、神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）などが挙げられる。グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性の制御には、動物の発症する脳腫瘍細胞に、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を導入し、発現させることにより行うことができる。該ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子としては、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２のｃＤＮＡを用いることができるが、該遺伝子は既に公知のものであり（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９，　１５８０−１５８５，　１９９０）、該遺伝子の塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデーターベースにより、アクセッション・ナンバー：Ｍ３８０６１として検索することができる。
【００１９】
本発明において、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を、動物の発症する脳腫瘍細胞に導入するには、適宜の公知の遺伝子導入手段を用いることができる。その導入手段の好ましい方法としては、アデノウイルス発現用ベクターを用いることができる。そのようなアデノウイルス発現用ベクターとしては、一過性発現に用いられているアデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，　９８８−９９０，　１９９３）が挙げられる。アデノウイルスベクターは、中枢神経系（ＣＮＳ）のグリア細胞に対して、極めて高い親和性を持ち、小脳皮質に注入した場合は、選択的にベルクマングリアにＧｌｕＲ２の遺伝子を発現させることが可能である。また、アデノウイルスベクターに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ発現制御システムを使用した遺伝子導入ベクター（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２３，　３８１６−３８２１，　１９９５）を用いることもできる。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムを用いる理由の一つに、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２のみの感染では、Ｃｒｅが存在しないためＧｌｕＲ２が発現しない状態をつくり出せることを利用して、それをウイルス感染による影響を除外するためのコントロールとして使用できるというメリットがある。
【００２０】
本発明においては、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を、アデノウイルスベクターのような遺伝子発現用ベクターに組み込んで、脳腫瘍治療用遺伝子導入キットとして用意し、これを脳腫瘍の治療に用いることができる。
【００２１】
本発明の他の実施の態様として、本発明の方法により、動物の発症する脳腫瘍細胞におけるグルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することにより脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定することが可能である。中枢神経系（ＣＮＳ）における神経膠芽腫のような脳腫瘍においてはＧｌｕＲ１〜４の４つのタンパク質からなるサブユニットが発現しており、その発現しているサブユニットの組成によって、細胞のＣａ２＋透過性及び非透過性が決定される。そして、この細胞のＣａ２＋透過性及び非透過性によって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性が相違してくる。サブユニットＧｌｕＲ１やＧｌｕＲ４が発現していると、細胞はＣａ２＋透過性となり、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤が促進され、サブユニットＧｌｕＲ２が発現すると、細胞はＣａ２＋非透過性となり、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤が抑制される。
【００２２】
したがって、脳腫瘍細胞に発現するグルタミン酸受容体サブユニットを検出・測定することによって、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定することができる。グルタミン酸受容体サブユニットの検出・測定には、適宜公知の検出・測定手段を用いることができる。サブユニットの遺伝子の測定には、それぞれのサブユニットの遺伝子の検出のためのプローブを用いることができる。また、サブユニットの発現の検出・測定には、それぞれのサブユニットに特異的に結合する抗体を作製し、用いるのが好ましい。グルタミン酸受容体サブユニットに特異的に結合する抗体としては、ポリクロナール抗体及びモノクロナール抗体のいずれもが使用することができ、該抗体は常法により調製することができる。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［グルタミン酸受容体サブユニットの発現、サブユニットＧｌｕＲ２の導入及び腫瘍細胞の増殖と浸潤］
【００２４】
（神経膠芽腫の外科的試料及び細胞培養物におけるＧｌｕＲの発現）
本発明者は、外科的試料のｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究におけるＡＭＰＡＲサブユニットＧｌｕＲ１の発現について調べた（図１；参考写真１を参照）。図１ａは、神経膠芽腫の外科的試料の代表的な組織構造を示しており、浸潤性の腫瘍細胞が認められる。ＧｌｕＲ１のアンチセンスリボプローブでハイブリダイズしたシグナルを、遊走し増殖している未分化細胞中で検出した（図１ｂ）。連続切片では、アフィニティー精製したＧｌｕＲ１抗体で免疫染色したＧｌｕＲ１タンパク質の発現が、腫瘍細胞中で検出された（図１ｃ）。
【００２５】
さらに本発明者らは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ２／３、及びＧｌｕＲ４に対する抗体を選択して免疫組織化学的染色を行うことにより、パラフィン包埋した神経膠芽腫の外科的試料（ｎ＝１６）中のＡＭＰＡＲサブユニットの発現について調べた（表１）。調べた外科的試料（ｎ＝１６）のすべてに、ＧｌｕＲ１タンパク質の発現が認められた。これらの試料では、腫瘍細胞の大半（５２±２１％、ｎ＝１６）に、ＧｌｕＲ１タンパク質が発現していた。１６個の神経膠芽腫の外科的試料のうち１４個で、少数の細胞（２１±７％、ｎ＝１４）にＧｌｕＲ２の発現が観察された。抗ＧｌｕＲ２／３抗体による染色を１６個の外科的試料のうち１４個（３１±５％、ｎ＝１４）で観察した。すべての外科的試料（５５±７％、ｎ＝１６）で、腫瘍細胞はＧｌｕＲ４にも陽性を示していた。
【００２６】
図１ｄからｇは、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、及びＧｌｕＲ４に対する抗体で処理した外科的試料原本の連続切片の一例を示す。これらの切片では、遊走する神経膠芽腫細胞が大脳皮質の軟膜下に広範囲に蓄積していた。これらの細胞はＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ４の両方を発現していたが、ＧｌｕＲ２の発現はごくわずかなものだった（図１ｄ、ｅ、ｆ及びｇ）。隣接する脳組織（図１ｈ、ｉ、ｊ及びｋ）では、浸潤性の未分化腫瘍細胞がＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ４を発現していた（図１ｉ及びｋ）のに対し、正常なニューロンはＧｌｕＲ２を大量に発現していた（図１ｊ）。白質に浸潤していた紡錘状の腫瘍細胞は、未成熟の星状細胞のマーカーであるビメンチンとＧｌｕＲ１を発現していたが、ＧｌｕＲ２の発現はごくわずかなものだった。
【００２７】
本発明者は、外科的試料から神経膠芽腫細胞の一次培養細胞を調製し、ＡＭＰＡＲサブユニットの発現について調べた（表１）。これらの培養細胞では、大半の細胞がＧＦＡＰ免疫応答性を示していた。このことから、それらがグリア細胞に由来するものであり、ニューロンのマーカーであるニューロフィラメントタンパク質（ＮＦＰ）（Ｎａｔｕｒｅ，　２９８，　２７７−２７９，　１９８２、Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，　６４，　３０−３６，　１９８４）、及び小グリア細胞のマーカーであるＫｉ−Ｍ１Ｐ（Ｐａｔｈｏｌ．　Ｉｎｔ．，　４６，　１５−２３，　１９９６）それぞれに対する免疫応答性の欠如からわかるとおり、ニューロンや小グリア細胞によって汚染されていないことがわかる。
【００２８】
ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ４に対する抗体を用いた二重免疫蛍光法においては、大半の培養細胞は、両方のタンパク質を同時に発現していた（図１ｌ、ｍ、及びｎ）。しかし、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２又はＧｌｕＲ４及びＧｌｕＲ２に対する抗体を用いた二重免疫蛍光法においては、ほんの少数のＧｌｕＲ１発現細胞又はＧｌｕＲ４発現細胞が、ＧｌｕＲ２免疫応答性を示すにとどまっていた（図１ｏ、ｐ、及びｑ）。
本発明者らは外科的試料から４つの神経膠芽腫細胞株を確立した。そのうち３つは、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ４、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ３とＧｌｕＲ４をそれぞれ発現していた。１つの細胞株は、ＡＭＰＡＲサブユニットを全く発現していなかった。市販のヒト神経膠芽腫細胞株であるＵ８７　ＭＧについても、ＡＭＰＡＲサブユニットの発現を調べてみた。この細胞株ではＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ３の発現が強く、ＧｌｕＲ２の発現は弱かった（表１）。
【００２９】
神経膠芽腫細胞でのＧｌｕＲ１〜４サブユニットの発現を確認するため、本発明者らは次に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）研究を行った（Ｎｅｕｒｏｎ，　１２，　３８３−３８８，　１９９４）。３つの外科的試料、４つの一次培養細胞、及び５つの細胞株について、逆転写を行い、ついでＧｌｕＲ１〜４に特異的なプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。各ＧｌｕＲ１〜４断片に特異的な酵素を用いた制限酵素分析で、増幅産物を調べた（Ｎｅｕｒｏｎ，　１２，　３８３−３８８，　１９９４）。図１ｒは、腫瘍細胞の一次培養で得られた代表的な結果を示す。この事例では、すべてのＧｌｕＲ１〜４　ｍＲＮＡの発現が検出されている。コントロールである腫瘍に隣接した脳組織でも、ＧｌｕＲ１〜４　ｍＲＮＡの発現が検出された（図１ｓ）。ＧｌｕＲ１〜４　ｍＲＮＡの発現に関しては、ＲＴ−ＰＣＲで得た結果は、免疫組織化学法により得た結果と完全に一致している（表１）。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
これらの結果から、ＡＭＰＡＲサブユニットがヒト神経膠芽腫細胞で発現すること、及び、ＧｌｕＲ１とＧｌｕＲ４サブユニットがＧｌｕＲ２サブユニットよりも大量に、しかも安定的に発現していることがわかる。これらの結果は、ＧｌｕＲ２を除外して集められたＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲがこれらの細胞中で形成することを強く示唆している。
【００３２】
（神経膠芽腫細胞におけるＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの機能的発現）
一次培養物中の神経膠芽腫細胞におけるＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの機能的発現を調べるためｆｕｒａ−２ＡＭを使用してＡＭＰＡが誘導する細胞内［Ｃａ２＋］ｉ（Ｃａ２＋濃度）の変化を測定した（図２；参考写真２を参照）。ＡＭＰＡＲの脱感作を弱める、２００μＭのＡＭＰＡと１００μＭのサイクロサイアザイド（ＣＴＺ）の投与により、培養細胞の［Ｃａ２＋］ｉが増大した（図２ａ、ｂ及びｃ）。８０±２１から２８５±１２０ｎＭ（ｎ＝１５０）への［Ｃａ２＋］ｉの増大は、１６個の個別培養皿の細胞中、６５±１５％の細胞で検出された。［Ｃａ２＋］ｉの急増は、移植片の周縁部に位置する長い突起を持つ細胞において時折認められた（図２ｄ、ｅ及びｆ）。
【００３３】
［Ｃａ２＋］ｉの増大は、ＡＭＰＡのアンタゴニスト、２０μＭの２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）−キノキサリン（ＮＢＱＸ）又は１０μＭの［２，３−ジオキソ−７−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−６−ニトロ−１，２，３，４−テトラヒドロキノキサリン−１−イル］酢酸一水和物（ＹＭ８７２）のいずれかにより、選択的に消滅した（Ｊ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　５０，　７９５−８０１，　１９９８）。これら培養細胞において、１００ｍＭのＫ＋が［Ｃａ２＋］ｉを増大させることはなかった。このことは、電位依存性Ｃａ２＋チャネルがこの［Ｃａ２＋］ｉの増大に関与していないことを示している。ビメンチンとＧｌｕＲ１の発現は、［Ｃａ２＋］ｉ測定用に使われた一次培養細胞において、ともに検出された（図２ｇ、ｈ及びｉ）。
【００３４】
（アデノウィルスが仲介するＡＭＰＡＲサブユニットの発現の作用）
神経膠芽腫細胞におけるＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの病態生理学的意義を明らかにするため、本発明者は、まず、アデノウィルスを介したＧｌｕＲ２　ｃＤＮＡの導入によってＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲをＣａ２＋非透過性受容体に変換することを試みた（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２９２，　９２６−９２９，　２００１、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，　１２，　７４５−７４８，　２００１）。以下の実験を、主に確立した神経膠芽腫細胞株で行った（図３；参考写真３を参照）。かかる細胞株はＣＧＮＨ−８９と称し、ＧｌｕＲ１及び／又はＧｌｕＲ４サブユニットからなるＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを保有していた。
【００３５】
ＧｌｕＲ２　ｃＤＮＡを培養細胞に導入するため、本発明者は２つの組換えアデノウィルスを作製した。一方はＣｒｅリコンビナーゼ発現用の組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ）であり、他方はＣＡＧプロモーター、一対のｌｏｘＰ配列、スタッファー遺伝子及びＧｌｕＲ２　ｃＤＮＡからなり、ＣｒｅによりＧｌｕＲ２の発現を制御するための切替装置を有するＧｌｕＲ２発現用組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２）である。また、アデノウィルス感染細胞のマーカーとして使用されるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡを有する組換えアデノウィルス（ＡｘＣＡＧＦＰ）も作製した。図３ａでは、ＧｌｕＲ１タンパク質を発現する培養細胞（図３ｂ）がＡｘＣＡＧＦＰに感染していた。ＧｌｕＲ１を発現する細胞の大半で、感染の２日後にＧＦＰの蛍光が検出された（図３ｃ）。また、細胞をＡｘＣＡＮＣｒｅ、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２、ＡｘＣＡＧＦＰの３種類の組換えアデノウイルスで感染させると、ＧＦＰの蛍光を発するほとんどすべての細胞で、感染２日後にＧｌｕＲ２タンパク質が検出された（図３ｄ、ｅ及びｆ）。
【００３６】
この結果、本発明者らはＧｌｕＲ２を発現する細胞の形態が著しく変化することに気付いた（図３ｄ、ｅ及びｆ）。細胞体は徐々に膨化し、扁平になり、細胞質の突起はウィルス感染後４日以内に退縮した。こうした特徴的な変化は、ＧｌｕＲ２の発現が誘導されることのないＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２及び／又はＡｘＣＡＧＦＰを細胞に感染させた場合には決して見られないものであった。細胞体表面積の平均値は、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２及び／又はＡｘＣＡＧＦＰを感染させたコントロール細胞では３６０±１３３μｍ２（ｎ＝３０）だったのに対し、ＧｌｕＲ２を発現する細胞では１２３０±３５０μｍ２（ｎ＝３０）に増えていた（Ｐ＜０．０５）。
【００３７】
また、本発明者らはＧｌｕＲ２（Ｒ）発現細胞の細胞骨格が崩壊していること（図３ｇのコントロール細胞に対する図３ｈのＧｌｕＲ２（Ｒ）発現細胞）、及び、核における泡状突起の出現やアポト−シス小体の形成といった、細胞がアポトーシスの徴候を示していることに気がついた（図３ｉ）。こうした特徴的な変化は、ＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２（Ｑ）ｃＤＮＡのいずれかが導入され、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲが過剰発現した場合には、決して起こらないものであった。そのかわり、これらは、長い突起を有していることの多い、膨化した紡錘状細胞が高密度に増殖しているという、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを過剰発現する細胞培養物に共通の特色に、本発明者らは着目した（図３ｊ、ｋ及びｌ）。
【００３８】
アデノウィルスを介したＧｌｕＲ２（Ｒ）及びＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現が誘導した、ＣＧＮＨ−８９細胞における上記の変化は、Ｕ８７　ＭＧ細胞でも見られた。ＧｌｕＲ２（Ｒ）遺伝子が導入されると、Ｕ８７　ＭＧ細胞の細胞体が膨化し、扁平になった。これに対し、ＧｌｕＲ２（Ｑ）遺伝子が導入された場合は、長い突起を有する紡錘状細胞の数が増大した（図３ｍ、ｎ及びｏ）。
図３ｐ〜ｘにおいて、本発明者らは、アデノウィルスを介したＧｌｕＲ２（Ｒ）又はＧｌｕＲ２（Ｑ）の導入が誘導した、ＣＧＮＨ−８９細胞におけるＣａ２＋透過性の変化を確認した。２００μＭのＡＭＰＡと１００μＭのＣＴＺの投与により、１０個の培養皿中の５２±１４％のコントロール細胞で、［Ｃａ２＋］ｉが９７±２１から２７５±５０ｎＭ（ｎ＝３５０）に増大した（図３ｐ、ｑ及びｒ）。これと同じ処理を行っても、４個の培養皿中のＧｌｕＲ２発現細胞（図３ｓ、ｔ及びｕ）では［Ｃａ２＋］ｉに何の作用も及ぼさなかったが、２個の培養皿中のＧｌｕＲ２（Ｑ）発現細胞（図３ｖ、ｗ及びｘ）では［Ｃａ２＋］ｉが７７±２１から１１８５±２４０ｎＭ（ｎ＝４０）に著しく増大した。
【００３９】
本発明者らは、ＧｌｕＲ２（Ｒ）を発現するＣＧＮＨ−８９細胞が、グリア細胞中でＣａ２＋シグナル伝達を仲介することがわかっているＡＴＰに応答して、［Ｃａ２＋］ｉをコントロール細胞と同程度にまで増大させらるかどうかについても調べた（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１８，　８７９４−８８０４，　１９９８）。２５μＭのＡＴＰの投与により、５個の培養皿中のＧｌｕＲ２（Ｒ）発現細胞では［Ｃａ２＋］ｉが７０±２４から１４３８±１７４ｎＭ（ｎ＝５０）に増大した。この増大はコントロール細胞で検出されたものとよく似ていた。コントロール細胞では、同じ処理で［Ｃａ２＋］ｉが７７±２８から１５７４±１６１ｎＭ（ｎ＝５０）に増大した。このことは、ＧｌｕＲ２（Ｒ）遺伝子が導入された細胞が外部刺激に応答可能であることを示している。
【００４０】
次に本発明者らは、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）仲介ｄＵＴＰニック末端ラベリング（ＴＵＮＥＬ）法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６７，　１４４５−１４４９，　１９９５）を用いて、ＧｌｕＲ２（Ｒ）を発現するＣＧＮＨ−８９細胞におけるアポトーシス指数を推定し、この値をＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２（コントロール）だけを感染させた細胞における値と比較した。アポトーシス指数は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を、顕微鏡視野あたりのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性核の合計数で割ったもの、と定義された。各培養皿の平均値を得るため、任意に選択した１０から１５の視野をサンプルにした。この指数は、ＧｌｕＲ２（Ｒ）発現細胞（ｎ＝４）では２０．２±４．３％であり、コントロール（５．２±１．２％、ｎ＝４、Ｐ＜０．０５）よりもかなり大きいものだった。
【００４１】
本発明者らは、Ｋｉ−６７染色指数（Ｋｉ−６７陽性細胞の数を、顕微鏡視野あたりのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性核の合計数で割ったもの）を計算することで、ＧｌｕＲ２（Ｒ）発現細胞の増殖活性についても調べてみた（Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　７０，　１２５−１２９，　１９９４）。この指数は、コントロールでは１２．３±２．３％で、ＧｌｕＲ２発現細胞（Ｒ）では＜０．１％（ｎ＝４、Ｐ＜０．００１）であった。これに対し、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを過剰発現させるためのＧｌｕＲ２（Ｑ）ｃＤＮＡを導入したもの（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，　１２，　７４５−７４８，　２００１）は、Ｋｉ−６７染色指数を２８．３±４．８％（ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）に有意に増大させた。しかし、アポトーシス指数には、有意な変化が検出されなかった（４．３±１．３％）。Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを過剰発現させるための、アデノウィルスを介したＧｌｕＲ１遺伝子の移動によりＧｌｕＲ１が過剰発現した際、アポトーシス指数とＫｉ−６７染色指数はそれぞれ５．３±２．３％と２６．３±４．５％だった。ＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現する細胞と、ＧｌｕＲ１を過剰発現する細胞の間には、これら２つの指数に有意な変化はなかった。
【００４２】
上記結果から、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを介したＣａ２＋の流入遮断によって神経膠芽腫細胞中にアポトーシスの変化が起こることが強く示唆される。そのため本発明者は、ＣＧＮＨ−８９細胞における細胞の形態、アポトーシス指数及びＫｉ−６７染色指数に対するＡＭＰＡＲアンタゴニストの作用を調べてみた。２０μＭのＮＢＱＸ又は１０μＭのＹＭ８７２を２日間用いると、細胞の形態に変化が生じた。つまり、細胞質の突起が退縮し、細胞体が膨化し扁平になり、これはその後のＧｌｕＲ２発現で見られたものと似ていた。さらに、ＮＢＱＸ及びＹＭ８７２は、３．０±１．８％から１３．０±２．０％（ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）、及び３．８±２．３％から１８．０±２．５％（ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）へと、アポトーシス指数をそれぞれ有意に増大させた。それらは、１８．５±３．０％から２．０±１．０％（ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）、及び１６．４±３．５％から＜０．１％（ｎ＝４、Ｐ＜０．０１）へと、Ｋｉ−６７染色指数をそれぞれ著しく低下させた。
【００４３】
Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを発現する他の３つの細胞株（表１のＣＧＮＨ−ＮＭ、ＭＲＣＨ−９２及びＵ８７　ＭＧ）では、ＧｌｕＲ２（Ｒ）発現及び、ＮＢＱＸ又はＹＭ８７２の使用によって、培養細胞における同様の形態的変化が生じ、アポトーシス指数が増大し、Ｋｉ−６７染色指数が減少した。ＧｌｕＲ２（Ｒ）遺伝子を導入した細胞に、こうしたＡＭＰＡＲアンタゴニストを用いると、実験した４つの細胞株すべてにおいて、細胞の形態とこれら２つの指数にそれ以上の変化が生じることはなかった。これは、ウィルスを介したＧｌｕＲ２（Ｒ）の発現とＡＭＰＡＲアンタゴニストが同一の標的に作用することを示している。
【００４４】
（Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲによる細胞遊走の促進）
脳白質の遊走腫瘍細胞は紡錘状の形態を呈しており、長い細胞突起を有している場合が多かった。腫瘍細胞のこうした形態は、細胞の遊走に適していると思われた。実際、腫瘍細胞中のＧｌｕＲ２の発現により細胞が扁平化し、その突起が退縮した際には、細胞の遊走が著しく阻害された。これに対し、アデノウィルスを介したＧｌｕＲ２（Ｑ）の導入によるＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの過剰発現は、細胞突起を伸長させ、細胞遊走挙動を促進しているようだった。細胞遊走の程度を定量的に評価するため、２つの実験を行った（図４；参考写真４を参照）。
【００４５】
まず、トランスウェル二重チャンバー培養皿を用いて、Ｚ軸方向の運動性活動を概算した。この培養皿は、直径８μｍの孔が多数あいている多孔質膜で上下に仕切られたチャンバーを有していた。上部チャンバーの細胞に、ＡｘＣＡＮＣｒｅ（コントロール）を感染させずに、ＡｘＣＡＧＦＰとＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させると、少数の細胞がかかる多孔質膜を通って２４時間以内に下部チャンバーに移動した。顕微鏡下の１０個の２０倍の対物視野で計数した遊走細胞の、別個に行った５回の実験における平均値は、４．２±２．３だった（図４ａ）。しかし、ＧｌｕＲ２（Ｒ）を発現する生存細胞はひとつとして下部に移動せず、ばらばらになった細胞の断片のみが、下部チャンバーで認められた（図４ｂ）。これに対し、ＧｌｕＲ２（Ｑ）を導入したものは、下部チャンバーに移動する細胞の数を増加させた（３１．２±８．３、ｎ＝５、Ｐ＜０．０２）（図４ｃ）。
【００４６】
次に、クローニングリング（直径７ｍｍ）を使用して、培養皿中央部の運動性活動を調べた。リングの内側で細胞を培養し、ウィルス感染の４８時間後にリングを取り除いた。その後２４時間以内にクローニングリングによる境界を横切った細胞の数を計数した。５回の実験の平均値は、ＧＦＰ、ＧｌｕＲ２、及びＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現する細胞で、それぞれ４３．２±５．３、１５．０±３．３、２５０．２±５０．３だった（図４ｄ、ｅ及びｆ）。このように、ＧｌｕＲ２の発現は、細胞の運動性を有意に抑制していた（Ｐ＜０．００２）のに対し、ＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現は細胞の運動性を促進していた（Ｐ＜０．０１）。
腫瘍遊走に対する同様の阻害作用は、１０μＭのＹＭ８７２を用いた場合も観察された。ＧｌｕＲ２遺伝子の導入とＹＭ８７２の使用により、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを発現する他の３つの細胞株でも、細胞遊走が阻害された。
【００４７】
（ヒト神経膠芽腫のヌードマウスモデルにおける、ＧｌｕＲ２発現及びＡＭＰＡアンタゴニストによる腫瘍の浸潤の抑制）
本発明者は最後に、インビボでの神経膠芽腫の遊走及び増殖に、ＧｌｕＲ２（Ｒ）の発現が影響するかどうかについて調べた（図５；参考写真５を参照）。この目的のため、まず本発明者は、ＡｘＣＡＧＦＰを用いてＧＦＰを標識した２×１０５個のＣＧＮＨ−８９細胞をヌードマウスの大脳皮質下に移植したヒト神経膠芽腫のマウスモデルを使用した。これら移植した細胞は細胞の集合体を形成し、ヒトの外科的試料に見られるように脳梁の有髄経路に浸潤し、実験した１５匹のヌードマウスすべてにおいて、脳全体に広範囲に広がっていた。ヌードマウス異種移植片の組織構造は、ヒト神経膠芽腫の特徴、つまり、多形性（図５ａ）、偽柵状配列（ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｉｎｇ）を伴う壊死（図５ｂ）、及び微小血管の増殖（図５ｃ）を示していた。
【００４８】
図５ｄは、ＧＦＰだけを発現させるためにＡｘＣＡＧＦＰ及びＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させた２×１０５個の細胞の移植から９日後に皮質下で形成された、腫瘍細胞集合を示している。細胞核をＰＩで染色したかかる腫瘍細胞は密度が高く、接種部位の細胞中にＧＦＰが検出された（図５ｅ）。これに対し、ＧｌｕＲ２とＧＦＰの両方を発現させるために、ＡｘＣＡＧＦＰとともにＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２とＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させた後で、同数の細胞を接種すると、実験した１３匹のヌードマウスのいずれにも、固形の腫瘍細胞集合は形成されなかった（図５ｆ）。ＰＩ染色後の核形態から判断したとおり、腫瘍細胞は増殖を停止し、アポトーシスが始まった（図５ｇ）。
【００４９】
Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを操作することでインビボでの腫瘍の成長に変化が生じるかどうかをさらに定量的に評価するため、ＣＧＮＨ−８９細胞をヌードマウスの皮下組織に移植して作製した腫瘍の成長に対して、ＧｌｕＲ２とＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現及び／又はＡＭＰＡＲアンタゴニストのＹＭ８７２の使用が及ぼす作用を調べた（図６；参考写真６参照）（図６ａ及びｂ）。アデノウィルスを介したＧｌｕＲ２の発現は、腫瘍にＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させずにＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させた（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）場合と比較して、移植の２２日後の腫瘍のサイズだけではなく腫瘍の成長速度を有意に抑制した。ＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現は、腫瘍の成長を促進する傾向があったが、移植の２２日後の腫瘍のサイズを増大させることはなかった。ＹＭ８７２を腹腔内投与すると、ビヒクル（リン酸緩衝液；ＰＢＳ）（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）を投与した場合と比較して、腫瘍のサイズが有意に縮小した。ＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現する腫瘍（ｎ＝１２、Ｐ＜０．００１）の成長も阻害されたが、ＧｌｕＲ２を発現する腫瘍についてはそれ以上の阻害作用を及ぼさなかった。
【００５０】
組織学的分析により、ビヒクル単独で処理した腫瘍細胞に多数の分裂細胞が存在することがわかった（図６ｃ）。ＹＭ８７２で処理した腫瘍組織（図６ｄ）、又はＧｌｕＲ２を発現する腫瘍組織（図６ｅ及びｆ）において、分裂細胞はほとんど検出されなかった。そのかわり、多数のアポトーシス細胞が観察された。ＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現する腫瘍細胞の増殖はＹＭ８７２の使用により阻害された（図６ｇ、ｈ及びｉ）。また、ＹＭ８７２による処理でＧｌｕＲ２を発現する細胞における腫瘍の増殖がそれ以上阻害されることはなかった（図６ｊ）。
【００５１】
［実験の考察］
神経膠芽腫の患者から得た外科的試料において、有髄経路中の遊走細胞は紡錘状又は両極性の形態を呈しており、ＧｌｕＲ１及び／又ＧｌｕＲ４タンパク質を豊富に発現していた。かかる外科的試料由来の移植体培養物の周辺部に位置する遊走細胞も、長い細胞突起を有する場合が多い紡錘状の形態を呈しており、ＧｌｕＲ１を発現していた。アデノウィルスを介したＧｌｕＲ１又はＧｌｕＲ２（Ｑ）の導入によってＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲが過剰発現すると、長い細胞突起を有する紡錘状の形態を呈している遊走細胞の数が増大した。これに対し、腫瘍細胞の運動性は、ＧｌｕＲ２（Ｒ）の発現によって細胞の形態が多角形化し扁平化した後、著しく抑制された。紡錘状の形態や膨化した突起は、細胞遊走に適していると思われる。紡錘状の形態によって、密集した有髄経路又はＣＮＳ組織中の狭い空間に、腫瘍細胞が浸潤できると考えられるからである。
【００５２】
細胞突起の伸長は、細胞遊走の第一歩と考えられ、その後で細胞体の移動及び後部突起の退縮が続く（Ｃｅｌｌ，　８４，　３７１−３７９，　１９９６）。グリア細胞とＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの形態間の因果関係について、ＧｌｕＲ２（Ｒ）の発現がグリア突起の著しい退縮を引き起こす一方で、ＧｌｕＲ２（Ｑ）の過剰発現が、マウス小脳のベルクマングリア様培養細胞（Ｂｅｒｇｍａｎｎ　ｇｌｉａ−ｌｉｋｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ）におけるそれらの膨化を引き起こすことを、本発明者は以前に示している（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，　１２，　７４５−７４８，　２００１）。しかし、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを介したグリア突起の膨化に関与する詳しい機構は、いまだ解明されていなかった。
【００５３】
本実験において、本発明者は、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲのＣａ２＋非透過性受容体への変換が、アポトーシス指数を増大させ、腫瘍細胞の増殖活性を抑制することを示した。このように、抗アポトーシスシグナル伝達カスケードを刺激するには、こうした受容体を通じたＣａ２＋の流入が必要と思われる。この考察は、適量のＣａ２＋の流入は、小脳顆粒細胞及びＮＢ１０８神経芽細胞腫細胞など、いくつかの培養細胞の生存に必須であるという以前の知見により裏付けられる（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　７，　２２０３−２２１３，　１９８７、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８６，　６４２１−６４２５，　１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，　３９６，　５８４−５８７，　１９９８）。Ｙａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ，　３９６，　５８４−５８７，　１９９８）は、ＮＢ１０８神経芽細胞腫細胞において、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体を介したＣａ２＋の流入により供給されたＣａ２＋が、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣａＭ−ＫＫ）を活性化し、次にはそれがセリン／スレオニンキナーゼ、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢ）をリン酸化することを明確に示した。Ａｋｔの活性化で各種抗アポトーシスシグナルが放出されることは知られており、それにより細胞の生存も促進される（Ｎａｔｕｒｅ，　３９６，　５８４−５８７，　１９９８）。
【００５４】
ＡＭＰＡＲの内在性アゴニストはグルタミン酸である。本実験における培養培地にはウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び最大で１００μＭのグルタミン酸が添加されていた。グルタミン酸の存在は、腫瘍細胞の増殖のみならず、紡錘状の形態を維持するうえでも必須であった。１０％の透析済ＦＣＳを添加したグルタミン酸を含まない培地で細胞を４〜５日培養すると、かかる細胞は多角形の形態を有するようになり、アポトーシス細胞の数が増加した。こうした変化は１００μＭのグルタミン酸を添加すると元に戻った。明らかな疑問点は、Ｃａ２＋透過性ＡＭＰＡＲを活性化するのに充分な濃度のグルタミン酸が増殖し、遊走している脳内の腫瘍細胞に実際に供給されているのか否かということである。移植した神経膠腫細胞が引き続きグルタミン酸を分泌し、その結果、細胞外グルタミン酸が検出可能な程度に増大すること、及び、グルタミン酸の放出が多い神経膠腫は、明らかな成長上の優位性をもつことがわかっている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，　７，　１０１０−１０１５，　２００１）。星状細胞が各種サイトカイン及び成長因子を分泌する場合と同様に自己分泌という形で、神経膠芽腫細胞がグルタミン酸を分泌している可能性が高い（Ｎａｔｕｒｅ，　３９１，　２８１−２８５，　１９９８、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｎｅｕｒｏｌ．，　５７，　６５３−６６３，　１９９８）。
【００５５】
ＮＭＤＡ及びＡＭＰＡ受容体のアンタゴニストはともに、神経膠腫細胞及び神経芽細胞腫細胞を含む多様な型の腫瘍細胞の増殖と遊走を阻害することがわかっている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．，　７，　１０１０−１０１５，　２００１、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９８，６３７２−６３７７，　２００１）。本研究において、本発明者らはＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲがヒト神経膠芽腫細胞の遊走及び増殖を促進するうえで重要な役割を果たしていること、及び、ＧｌｕＲ２の発現又はＹＭ８７２によるＣａ２＋透過性ＡＭＰＡＲの遮断が、腫瘍の成長を効果的に抑制することを示した。このように、Ｃａ２＋透過性グルタミン酸受容体は、脳腫瘍治療の標的となると考えられる。
【００５６】
［実験に用いた手法］
（外科的試料と細胞培養物）
本実験で調べた１６個の外科的試料の組織構造を、ＷＨＯ分類に従って多形性神経膠芽腫と診断した。文献（Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，　９４，　４２５−４３５，　１９９７、Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．　Ｒｅｓ．，　５１，　５２６−５３５，　１９９８）記載のとおり、細胞培養物を調製した。神経膠芽腫の４細胞株のうち、ＣＧＮＨ−８９は高い発ガン性を示すため、ヌードマウスへの異種移植に使用した。１０％のＦＣＳ及び２ｍＭのグルタミンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で、細胞を培養した。酵素循環法により定量したこの培地のグルタミン酸濃度は、１０７±５μＭ（ｎ＝４）だった（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，　５７３，　１９７−２０３，　１９９２）。
【００５７】
（アデノウィルスベクターを用いた遺伝子移植）
本発明者らは、下記の組換え型アデノウィルスを作製した（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　９３，　１３２０−１３２４，　１９９６、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　２３，　３８１６−３８２１，　１９９５）。
（１）ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ１、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２及びＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２（Ｑ）：それぞれ、ラットＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現させるための発現切替ユニットで、ＣＡＧプロモーター、ｌｏｘＰ配列、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）遺伝子（ネオ耐性遺伝子）、ポリ（Ａ）シグナル、第二ｌｏｘＰ部位、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２又はＧｌｕＲ２（Ｑ）コーディング配列、及びもうひとつのポリ（Ａ）シグナルで構成されている（Ｍｏｌ．　ＢｒａｉｎＲｅｓ．，　６５，　１７６−１８５，　１９９９）。ラットＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２ｃＤＮＡは、Ｓ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ博士及びＭ．　Ｈｏｌｌｍａｎｎ博士より供与された。
（２）ＡｘＣＡＮＣｒｅ及びＡｘＣＡＧＦＰ：Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をそれぞれ発現させるための組換え型アデノウィルス。実験の２〜５日前に、感染の多重度（ＭＯＩ）５で、細胞を各組換え型アデノウィルスに感染させた。
【００５８】
（組織構造）
文献（ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，　１２，　７４５−７４８，　２００１、Ａｃｔａ　Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，　９４，　４２５−４３５，　１９９７）記載のとおり、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ２／ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）、ＧＦＡＰ（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　Ａｒｃｈ．　Ａ　Ｐａｔｈｏｌ．　Ａｎａｔ．　Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，　４０５，　２９９−３１０，　１９８５）、及びビメンチン（Ｖ９、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ　Ａ／Ｓ社製）に対する選択性抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行った。ジアミノベンチジンで、免疫応答性を視覚化した。二重免疫蛍光法のため、ＦＩＴＣ、ローダミン、及びＡｌｅｘａ　５９４で標識した二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて、結合した抗体を視覚化した。染色した細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（ＭＲＣ−１０２４Ｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で観察した。Ｋｏｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，　１７，　１５７０−１５８１，　１９９７）が記載したものと同じ方法で、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【００５９】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
試料から調製したＲＮＡの部分標本１００ｎｇをランダムヘキサマー（ロッシュ・ディアグノティクス社製）を用いて逆転写し、ＧｌｕＲ１からＧｌｕＲ４（Ｎｅｕｒｏｎ，　１２，　３８３−３８８，　１９９４）を同時に増幅したプライマー（センスプライマー：５′−ＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＴＧ−３′（配列番号１）、アンチセンスプライマー：５′−ＴＣＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡ−３′（配列番号２））を用いて、逆転写産物を９４℃で２０秒間変性させ、５０℃で２０秒間アニーリングし、７２℃で２０秒間伸長反応させるという条件下でＰＣＲサイクルを３５回繰り返した。
【００６０】
ＧｌｕＲ１（１７１２から１７３３番目の塩基配列：５′−ＡＡＧＡＧＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣ−３′（コーディング配列の最初のヌクレオチドである位置１；配列番号３））、ＧｌｕＲ２（１７３２から１７５５番目の塩基配列：５′−ＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴ−３′（配列番号４））、ＧｌｕＲ３（１７４９から１７７１番目の塩基配列：５′−ＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣ−３′（配列番号５））か、またはＧｌｕＲ４（１７４７から１７６６番目の塩基配列：５′−ＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＣＣ−３′（配列番号６））の特異的なセンスプライマー、及び、１回目の増幅に使用した共通アンチセンスプライマーを用いて、サブユニットを特異的に増幅するための２回目のＰＣＲ（３５サイクル）を行った。この２回目の増幅による産物（ＧｌｕＲ１は６３７ｂｐ、ＧｌｕＲ２は６３８ｂｐ、ＧｌｕＲ３は６５７ｂｐ、ＧｌｕＲ４は６２６ｂｐ）を、ＧｌｕＲ１にはＢｇｌＩ、ＧｌｕＲ２にはＢｓｐ１２８６Ｉ、ＧｌｕＲ３にはＡｖａＩ、及びＧｌｕＲ４にはＰｖｕＩＩというように、特異的な制限酵素を用いて分解した。
【００６１】
（細胞内Ｃａ２＋イメージング）
室温で４０分間、細胞にｆｕｒａ−２ＡＭ（Ｄｏｊｉｎ社製）を負荷した。Ａｒｇｕｓ／ＨｉＳＣＡ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ　Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社製）を使用して、励起波長３４０ｎｍと３８０ｎｍで、蛍光イメージを得た。３４０／３８０の蛍光比を、文献（Ｃｅｌｌ，　８８，　４９−５５，　１９９７）記載のとおりに［Ｃａ２＋］ｉに変換した。
【００６２】
（ＴＵＮＥＬ、増殖及び遊走の分析）
ＴＵＮＥＬ及び細胞増殖の分析のため、標準培養培地を満たしたＬａｂ−Ｔｅｋ　４−ｗｅｌｌガラススライドに、２×１０４個／ウェルの密度で細胞を載せた。載せてから６時間後に培地をグルタミン酸を含まないものと取り替え、細胞にアデノウィルスを感染させた。載せてから４８時間後、グルタミン酸（１００μＭ）を培地に添加し、感染５日後に細胞を固定した。Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＭＢＩ社製）を用いてＴＵＮＥＬ分析を行い、抗Ｋｉ−６７モノクローナル抗体（Ｄａｋｏ社製）染色指数を用いて細胞増殖分析を行った。遊走分析は、トランスウェル・チャンバー（孔径８μｍ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｒｓｔａｒ　Ｃｏｒｐ．社製）中で行った。
【００６３】
上部チャンバーに５×１０４個／ウェルの密度で細胞を載せた。載せてから６時間後に、１０％の透析済ＦＣＳを添加した、グルタミン酸を含まない培地で、かかる細胞に組換え型アデノウィルスを感染させた。感染の４８時間後、グルタミン酸（１００μＭ）を培地に添加した。細胞をさらに２４時間培養し、多孔質膜を通過して遊走した細胞の数を対物２０倍の顕微鏡で計数した。
また、別の遊走分析実験で、一方の端部をシリコングリースでコーティングしたガラス製クローニングシリンダー（直径７ｍｍ）を培養皿の中央に置いた。シリンダーの中に２×１０４個の細胞を入れた。感染の４８時間後、クローニングリングを除去し、細胞をさらに２４時間培養した。その後、クローニングリングによる境界を越えた細胞の数を計数した。
【００６４】
（動物モデル）
培養培地中にＣＧＮＨ−８９細胞を１×１０７／１００μｌで懸濁した。ＡｘＣＡＧＦＰ及びＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させ、さらにＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させた懸濁液、或いは感染させなかった懸濁液の部分標本２μｌを、エーテル麻酔下のヌードマウスの脳に定位的に注入した。そして、注入の９〜１４日後に脳組織を調べた。
また、腫瘍の成長に対するアデノウィルスによるＧｌｕＲ２（Ｒ）及びＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現の効果を、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体拮抗薬であるＹＭ８７２を用いたものと、用いないものについて、皮下腫瘍中で定量的に評価した。細胞懸濁液（１×１０７／１００μｌ）を、５〜６週齢（体重１８〜２０ｇ）のヌードマウスの脇腹に皮下注射した。アデノウィルス（１×１０７ＰＦＵ、全量にして１００μｌのＰＢＳで稀釈）を、腫瘍接種後５日目に、２７番の針を用いて腫瘍内に一度投与した。ＡｘＣＡＮＣｒｅを含まないＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を、コントロール用に投与した。
【００６５】
Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙより供与されたＹＭ８７２をＰＢＳに溶解させた。投与量１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、及び１００ｍｇ／ｋｇでＹＭ８７２を２週間にわたって毎日腹腔内注射した（腫瘍接種の１日後に開始した）ところ、腫瘍の成長が投与量依存的に阻害されているのが観察された。この一連の実験では、１００ｍｇ／ｋｇのＹＭ８７２を使用した。コントロールとして、ＰＢＳ（１００μｌ）を腹腔内に投与した。（縦×横２）／２という公式にしたがい、腫瘍の容積を計算した。各実験の最後に、腫瘍組織の組織学的分析を行った。
【００６６】
（データ分析）
データは、平均±ｓ．ｅ．ｍとして表されている。無対ｔ検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡｓ：　Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｐｏｓｔ−ｈｏｃ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）により、統計上の比較を行った。
【００６７】
［図の説明］
（図１　ヒト神経膠芽腫細胞で発現したＡＭＰＡ受容体を示す図；参考写真１）
ａ〜ｃ；外科的標本原本の連続切片である。ａ；ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）で染色した浸潤腫瘍細胞の軟膜下での蓄積を示す。ｂ；ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで検出したＧｌｕＲ１　ｍＲＮＡの発現（ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、青色）を示す。ｃ；ＧｌｕＲ１の免疫蛍光法（ローダミン、赤色）によるイメージを示す。
ｄ〜ｇ；外科的標本原本の連続切片（ＧＮＳ−３１４８）である。ｄ；浸潤腫瘍細胞の軟膜下での蓄積（ＨＥ染色）を示す。ｅ；抗ＧｌｕＲ１抗体を用いた免疫染色である。ｆ；抗ＧｌｕＲ２抗体を用いた免疫染色である。ｇ；抗ＧｌｕＲ４抗体を用いた免疫染色である。
【００６８】
ｈ〜ｋ；ｄ〜ｇと同じ標本の隣接組織である。ｈ；大脳皮質の浸潤腫瘍細胞（ＨＥ染色）である。ｉ、ｊ及びｋ；抗ＧｌｕＲ１抗体、抗ＧｌｕＲ２抗体及び抗ＧｌｕＲ４抗体をそれぞれ用いた免疫染色を表す。
ｌ〜ｎ；抗ＧｌｕＲ１抗体（Ａｌｅｘａ　５９４、赤色）（ｌ）及び抗ＧｌｕＲ４抗体（ＦＩＴＣ、緑色）（ｍ）を用いた免疫染色、並びに一次培養の腫瘍細胞においてそれらを組み合わせたイメージ（ｎ）を表す。
ｏ〜ｑ；抗ＧｌｕＲ１抗体（Ａｌｅｘａ　５９４、赤色）（ｏ）及び抗ＧｌｕＲ２抗体（ＦＩＴＣ、緑色）（ｐ）を用いた免疫染色、並びに腫瘍細胞においてそれらを組み合わせたイメージ（ｑ）を示す。ｑ中のスケールバーは、ａ〜ｇについては１００μｍ、ｈ〜ｑについては５０μｍ。
【００６９】
ｒ〜ｓ；一次培養の腫瘍細胞（ｒ）及び切除前の腫瘍細胞に隣接していた正常な脳組織（ｓ）における、ＧｌｕＲ１〜４に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析結果である。ｒとｓの両方において、右と左の４レーン（Ｒ１からＲ４）は、各ＧｌｕＲ１〜４ＤＮＡに特異的な制限酵素による分断の前後におけるＰＣＲ産物の電気泳動を、それぞれ示すものである。右側のレーンにある分断した断片の大きさ：ＢｇｌＩで切断したＧｌｕＲ１については１８９及び４４８ｂｐ、Ｂｓｐ１２８６Ｉで切断したＧｌｕＲ２については３６８及び２７０ｂｐ、ＡｖａＩで切断したＧｌｕＲ３については４２０及び２３７ｂｐ、ＰｖｕＩＩで切断したＧｌｕＲ４については３７９及び２４７ｂｐ。レーンφは、密集した５００ｂｐバンドをそなえたＤＮＡサイズマーカーを示す。
【００７０】
（図２　培養腫瘍細胞における、ＡＭＰＡが誘導した［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図；参考写真２）
ａ〜ｃ；ｆｕｒａ−２　ＡＭを負荷した一次培養の腫瘍細胞における、ＡＭＰＡが誘導した［Ｃａ２＋］ｉの増加を示す。励起波長３４０ｎｍでの蛍光イメージ（ａ）、並びに２００μＭのＡＭＰＡ及び１００μＭのＣＴＺに曝露する前（ｂ）及び曝露中（ｃ）における、３４０／３８０ｎｍ比の仮染色イメージを示す。
ｄ〜ｆ；移植片培養物から取り出された単層中の細胞における、ＡＭＰＡが誘導した［Ｃａ２＋］ｉの増加を示す。これは、ａ〜ｃと同じ装置でイメージを撮影した。
ｇ〜ｉ；ビメンチン（ｇ、ＦＩＴＣ、緑色）及びＧｌｕＲ１（ｈ、ローダミン、赤色）の二重免疫蛍光法並びにそれらを組み合わせたイメージ（ｉ）を表す。ｆ中のスケールバーは、ｄ〜ｆについて２０μｍ、ｉ中のスケールバーは、ａ〜ｃ及びｇ〜ｉについて１００μｍを示す。
【００７１】
（図３　アデノウィルスが介するＡＭＰＡ受容体サブユニットの発現の作用を示す図；参考写真３）
ａ〜ｃ；コントロール。培養細胞（ＣＧＮＨ−８９）にＡｘＣＡＧＦＰとＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させ、ＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させなかった。ＧＦＰ蛍光（ａ）、ＧｌｕＲ１の免疫蛍光法（ｂ）、及びそれらを組み合わせたイメージ（ｃ）である。
ｄ〜ｆ；ＧｌｕＲ２を発現する細胞である。ＡｘＣＡＧＦＰ、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２、及びＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させた。ＧＦＰ蛍光（ｄ）、ＧｌｕＲ２の免疫蛍光法（ｅ）及びそれらを組み合わせたイメージ（ｆ）である。
ｇ；コントロール用にＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２のみを感染させ、ビメンチン（ＦＩＴＣ、緑色）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（赤色）で二重染色した細胞である。
【００７２】
ｈ；ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２とＡｘＣＡＮＣｒｅを細胞に感染させ、ビメンチン（ＦＩＴＣ、緑）とＧｌｕＲ２（ローダミン、赤）を対象として二重染色した細胞である。ＧｌｕＲ２タンパク質発現細胞中の分断したビメンチンフィラメントに注目のこと。
ｉ；ＡｘＣＡＧＦＰ、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２及びＡｘＣＡＮＣｒｅを細胞に感染させ、ＰＩで染色した細胞である。アポト−シス小体及び核における泡状突起形成に注目のこと。
ｊ〜ｌ；ＧｌｕＲ１を過剰発現する細胞である。それらの細胞を、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ１及びＡｘＣＡＮＣｒｅを用いて感染させた。ビメンチン（ｊ、ＦＩＴＣ、緑色）及びＧｌｕＲ１（ｋ、ローダミン、赤色）の免疫蛍光法及びそれらを組み合わせたイメージ（ｌ）を示す。
【００７３】
ｍ〜ｏ；ＡｘＣＡＧＦＰ（ｍ）、ＡｘＣＡＧＦＰ、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２及びＡｘＣＡＮＣｒｅ（ｎ）、並びにＡｘＣＡＧＦＰ、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２（Ｑ）及びＡｘＣＡＮＣｒｅ（ｏ）を感染させたＵ８７−ＭＧ細胞である。それらをＧｌｕＲ２（ローダミン、赤色）を対象として染色した。ＧＦＰ及びＧｌｕＲ２の免疫蛍光法の、組み合わせたイメージを示す。ｉ中のスケールバーは、ａ〜ｆ及びｊ〜ｏについては１００μｍ、ｇ〜ｉについては２０μｍ。
ｐ〜ｘ；ｆｕｒａ−２ＡＭを用いた［Ｃａ２＋］ｉの測定の結果を表す。コントロールのＣＧＮＨ−８９細胞（ｐ〜ｒ）並びにＧｌｕＲ２（ｓ〜ｕ）及びＧｌｕＲ２（Ｑ）（ｖ〜ｘ）を発現する細胞である。左から右に向かって、励起波長３４０ｎｍでの蛍光イメージ、２００μＭのＡＭＰＡ及び１００μＭのＣＴＺに曝露する前及び曝露中における、３４０／３８０ｎｍ比の仮染色イメージである。
【００７４】
（図４　ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現が細胞の遊走に及ぼす作用を示す図；参考写真４）
ａ〜ｃ；トランスウェル二重チャンバーを用いて調べた腫瘍細胞の運動性を示す図である。多孔質膜下にある下部チャンバー中の細胞の共焦点顕微鏡像である。抗ＧｌｕＲ２抗体（ローダミン、赤色）及び抗ビメンチン抗体（ＦＩＴＣ、緑色）で細胞を染色した。ａ；ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させ、ＡｘＣＡＮＣｒｅを感染させなかった細胞である。ビメンチンを発現する細胞のいくつかは遊走して、２４時間以内に多孔質膜を通過していた。ｂ；ＧｌｕＲ２を発現させるためにＡｘＣＡＮＣｒｅとＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を感染させた細胞である。２４時間後に下部チャンバーで認められたのは、分断された細胞の断片のみであった。ｃ；ＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現させるためにＡｘＣＡＮＣｒｅ及びＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２（Ｑ）を感染させた細胞である。ａよりも多数の腫瘍細胞が遊走して、２４時間以内に多孔質膜を通過していた。
【００７５】
ｄ〜ｆ；クローニングリングを用いて調べた腫瘍細胞の運動性を表す。ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２のみ（ｄ、コントロール）、ＧｌｕＲ２発現細胞（ｅ）、又はＧｌｕＲ２（Ｑ）発現細胞（ｆ）を感染させた細胞の、クローニングリング除去後２４時間以内の遊走を示す。抗ビメンチン抗体及び抗ＧｌｕＲ２抗体で細胞を染色した。白線はクローニングリングによる境界を示す。ｆ中のスケールバーは、ａ〜ｃについては５０μｍ、ｄ〜ｆについては１００μｍを示す。
【００７６】
（図５　ＧｌｕＲ２の発現が、腫瘍移植に及ぼす作用を示す図；参考写真５）
ａ〜ｃ；培養した神経膠芽腫細胞のヌードマウス皮下への移植により形成された腫瘍の組織病理を表す。かかる腫瘍は、多形性（ａ）、ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｉｎｇを伴う壊死（ｂ）、及び微小血管の増殖（ｃ）を特徴としている。図中「ｖ」は腫瘍血管（ＨＥ染色）を示す。
ｄ；２×１０５個の培養神経膠芽腫細胞の、ヌードマウスの大脳皮質下領域への移植後９日目における腫瘍形成状況を表している。ＧＦＰ（緑色）を発現させるため、移植の２日前に、ＡｘＣＡＧＦＰ及びＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２を培養細胞にそれぞれＭＯＩ　５で感染させ、ＰＩ（赤色）で染色していた。ｅ；ｄのボックス部分の拡大図である。
【００７７】
ｆ；２×１０５個の培養神経膠芽腫細胞の移植後１４日目における細胞である。ＧＦＰとＧｌｕＲ２をともに発現させるため、移植の２日前に、ＡｘＣＡＧＦＰ、ＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２、及びＡｘＣＡＮＣｒｅを培養細胞にそれぞれＭＯＩ　５で感染させていた。
ｇ；ｆのボックス部分の拡大図である。ＧｌｕＲ２の発現により生じた核のアポトーシス状形態に注目のこと。ｇ中のスケールバーは、ａ、ｅ及びｇについては５０μｍ、ｂについては１００μｍ、ｃについては７５μｍ、ｄについては１５００μｍ、及びｆについては１０００μｍを示す。
【００７８】
（図６　ＡＭＰＡ受容体の操作が腫瘍の成長に及ぼす作用を示す図；参考写真６）
ａ；各種の処理が、ヌードマウスの皮下組織に移植した腫瘍の成長速度に及ぼす作用：ＰＢＳの注入（ＹＭ８７２の使用に対するコントロールとしてのビヒクル、（▽）；ＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現（□）；ＡｘＣＡＮＣｒｅを含まないＡｘＣＡＬＮＬＧｌｕＲ２の注入（ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現させるためのコントロールとしてのベクター、（●）；ＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現及びＹＭ８７２の使用（△）；ＧｌｕＲ２の発現（◆）；ＹＭ８７２の使用（■）；ＧｌｕＲ２の発現及びＹＭ８７２の使用（▲）。各処理には、１２匹の動物を使用した。各区画は腫瘍容積の平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１２）を表す。
【００７９】
ｂ；接種の２２日後に測定した腫瘍容積の区画を表す。各処理のため、１２匹の動物から得た生データを割り振った。＊はコントロール（ビヒクル又はベクターのいずれか）に関するｐ＜０．００１での有意な差異を示す。
ｃ〜ｆ；ビヒクル（ｃ）及びＹＭ８７２（ｄ）で処理した腫瘍組織、及びＧｌｕＲ２遺伝子が送達された腫瘍組織（ｅ、ｆ）の組織構造を表す。ｃ、ｄ及びｅ；ＨＥ染色である。ｆ；抗ＧｌｕＲ２抗体を用いた免疫染色である。
ｇ〜ｈ；ＧｌｕＲ２（Ｑ）遺伝子が送達された腫瘍組織におけるＨＥ染色（ｇ）及び抗ＧｌｕＲ２抗体を用いた免疫染色（ｈ）である。
ｉ；ＹＭ８７２で処理した、ＧｌｕＲ２（Ｑ）を発現する腫瘍組織のＨＥ染色を表す。
ｊ；ＹＭ８７２で処理した、ＧｌｕＲ２を発現する腫瘍組織のＨＥ染色を表す。ｃ〜ｊの組織は、腫瘍接種の２２日後に採取したものである。ｊ中のスケールバーは、ｃ〜ｊについて５０μｍを示す。
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、動物の発症する脳腫瘍細胞において、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットによるＣａ２＋透過性を制御することにより脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することができる。特に、本発明により、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＲ２の遺伝子を脳腫瘍細胞に導入することにより、脳腫瘍細胞におけるＣａ２＋透過性を制御し、脳腫瘍細胞の増殖と浸潤を抑制することができるため、最も悪性であり、遊走性及び湿潤性の高い腫瘍として知られている神経膠芽腫のような脳腫瘍の治療に有効な手段となる。更に、本発明は、動物の発症する脳腫瘍細胞において、ＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体サブユニットの発現を検出・測定することにより、脳腫瘍細胞の増殖・浸潤活性を測定することを可能とするため、該方法を用いて、脳腫瘍の悪性度を把握することが可能であり、脳腫瘍の診断や予防或いは治療のための有力な手段となる。
【００８１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において、ヒト神経膠芽腫細胞におけるＡＭＰＡ受容体の発現を示す図である（参考写真１）。
【図２】本発明において、培養腫瘍細胞における、ＡＭＰＡが誘導した［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す図である（参考写真２）。
【図３】本発明において、アデノウィルスが介するＡＭＰＡ受容体サブユニットの発現の作用を示す図である（参考写真３）。
【図４】本発明において、ＧｌｕＲ２及びＧｌｕＲ２（Ｑ）の発現が細胞の遊走に及ぼす作用を示す図である（参考写真４）。
【図５】本発明において、ＧｌｕＲ２の発現が、腫瘍移植に及ぼす作用を示す図である（参考写真５）。
【図６】本発明において、ＡＭＰＡ受容体の操作が腫瘍の成長に及ぼす作用を示す図である（参考写真６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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