(57)【要約】【課題】大量スケールでの乳化製剤の製造方法に関する実用的製造法を提供する。【解決手段】（１）以下の工程を特徴とする、乳化製剤の製造法。以下の工程を特徴とする、乳化製剤の製造法。（ａ）油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液または、溶媒不溶の固形物質を含む油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液を攪拌し乳化した後、（ｂ）曇点以下の温度まで冷却し、非イオン界面活性剤の曇点を下げる物質を含む水溶液を加えて混合撹拌する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を特徴とする、乳化製剤の製造法。
（ａ）油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液または、溶媒不溶の固形物質を含む油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液を攪拌し乳化した後、
（ｂ）曇点以下の温度まで冷却し、非イオン界面活性剤の曇点を下げる物質を含む水溶液を加えて混合撹拌する。
【請求項２】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である請求項１記載の乳化製剤の製造法
【請求項３】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）である、請求項１記載の乳化製剤の製造法。
【請求項４】
非イオン界面活性剤の曇点を下げる物質が電解質である、請求項１〜３のいずれか記載の乳化製剤の製造法。
【請求項５】
電解質がアミノ酸、もしくは無機塩である、請求項４記載の乳化製剤の製造法。
【請求項６】
電解質がアルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩である、請求項４記載の乳化製剤の製造法。
【請求項７】
溶媒不溶の固形物質が、細菌の菌体成分である請求項１〜６のいずれか記載の乳化製剤の製造法
【請求項８】
細菌の菌体成分が、ＢＣＧ−ＣＷＳまたはノカルディア・ルブラー−ＣＷＳである請求項７記載の乳化製剤の製造法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、油状物質と非イオン性界面活性剤、および該界面活性剤の曇点を下げる物質を含む安定な乳化製剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳化製剤とは液状の医薬品に乳化剤と適当な水溶液を加え、適当な方法で乳化し、全体を均等にしたものである。
乳化製剤の製造方法については、多くの方法、形態が知られているが（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，　２４，　１２０−１２６（１９２０）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，　３７，　２７９−３０２（１９３３）、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，　３３，　５９８−６０４（１９５６））、その中の一形態として水中油型エマルションが挙げられる。
水中油型エマルション製剤としては、多くの製剤が知られているが、特に最近では、ＢＣＧの細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ　Ｗａｌｌ　Ｓｋｅｌｅｔｏｎ、以下、ＣＷＳと略す）を用いた免疫賦活剤の乳化製剤が、従来にない優れた効果を示すことから、大いに注目されている。　（Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ．，７０，Ｓｅｒ．Ｂ　２０５−２０９（１９９４）、Ｐｒｏ．Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ．，７４，Ｓｅｒ．Ｂ　２０５５０−５５（１９９８））。
【０００３】
しかし、上記乳化製剤は、安定した良好な品質の製剤を大量スケールで提供できる工業的製造方法が充分確立していなかった。その原因の一つとして、乳化のために使用する非イオン性界面活性剤の使用方法が挙げられる。
非イオン性界面活性剤の使用に際しては、非イオン性界面活性剤は曇点付近の温度でもっとも界面活性能力が高くなることが知られている（界面活性剤便覧、西　市郎他、１６７−１７６（産業図書））。
また、乳化時間は乳化時の温度に依存されるので、大量スケールで効率的に安定した乳化製剤を製造するためには、使用する非イオン性界面活性剤の曇点を考慮した上で可能な限り高温で乳化することが望ましいことが知られていた。
一方、乳化製剤の調製時の溶液中に曇点を下げる物質が共存する場合、非イオン性界面活性剤の曇点が低下し、従来の製造工程における乳化時の温度で界面活性剤が析出する等の現象がおこり、良好な品質の乳化製剤を得ることができなかった。また、高濃度の油を含有した濃縮製剤を調製する際、乳化製剤の安定性を保持するために、同時に曇点を下げる物質も高濃度に共存させておく必要があり、大幅な曇点の低下により乳化効率が顕著に低下した。
そこで、従来公知の乳化製剤製造方法を改良し、工業的製造法を確立することが急務とされた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、従来の乳化製剤の工業的製造方法を改良し、曇点の低下を原因とした製造途中に起こる界面活性剤の析出等による付着物を抑制し、最終的に優れた安定性を有する医薬品として有効な乳化製剤品の実用的かつ恒常的製造法を最適な形で提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意検討を進めた結果、曇点を下げる物質が含まれる乳化製剤の新規な製造方法、および濃縮製剤の希釈による、同一設備における製造スケールの拡大方法を見いだした。
すなわち本発明の製造方法は、まず曇点を下げる物質を加えることなく乳化効率の良い高温で乳化を行った後に乳化液を曇点以下の温度まで冷却し、非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質を含む水溶液を加えて希釈する。このことにより界面活性剤の一部が析出することを防ぎ、不溶物として付着し残存することもなくなった。また、界面活性剤の一部が析出した乳化製剤は、凍結乾燥すると凍結乾燥中のケーキが収縮あるいは浮上してしまうが、これを阻止することができた。
従って、本発明により、医薬品として有効な乳化製剤品の実用的な大量製造法が可能となり、特に細菌の菌体成分を使用した癌免疫療法用の乳化製剤を医薬品として使用することが可能となった。
【０００６】
本発明の要旨は次のように示される。
［１］　以下の工程を特徴とする、乳化製剤の製造法。
（ａ）油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液または、溶媒不溶の固形物質を含む油状物質と非イオン性界面活性剤を含む水溶液の混合液を攪拌し乳化した後、
（ｂ）曇点以下の温度まで冷却し、非イオン界面活性剤の曇点を下げる物質を含む水溶液を加えて混合撹拌する。
［２］　非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類である［１］記載の乳化製剤の製造法
［３］　非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）である、［１］記載の乳化製剤の製造法。
［４］　非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質がアミノ酸、もしくは無機塩である、［１］〜［３］のいずれか記載の乳化製剤の製造法。
［５］　電解質がアミノ酸、もしくは無機塩である、［４］記載の乳化製剤の製造法。
［６］　電解質がアルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩である、［４］記載の乳化製剤の製造法。
［７］　溶媒不溶の固形物質が、細菌の菌体成分である［１］〜［６］のいずれか記載の乳化製剤の製造法。
［８］　細菌の菌体成分が、ＢＣＧ−ＣＷＳまたはノカルディア・ルブラー−ＣＷＳである［７］記載の乳化製剤の製造法
［９］　以下の工程を特徴とする乳化製剤の製造法
（ａ）油状物質と、低濃度の非イオン性界面活性剤を含む水溶液または、溶媒不溶の固形物質を含む油状物質と低濃度の非イオン性界面活性剤を含有する水溶液を加えて４０℃以上で撹拌して粗乳化を行い、
（ｂ）更に非イオン性界面活性剤水溶液を添加し撹拌し単一ピークを得られる粒子径を持つ濃縮水中油型エマルションを製造した後、
（ｃ）曇点以下の温度まで冷却した状態で電解質水溶液を加えて攪拌することによって所望の界面活性剤濃度および原薬濃度の水中油型エマルションを製造する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で使用可能な非イオン性界面活性剤としては特に制限されるものはないが、医薬品製剤に使用される非イオン性の界面活性剤であれば好ましい。例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類または、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類としては例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（ポリソルベート４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（ポリソルベート６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）等が挙げられ、ソルビタン脂肪酸エステル類としてはソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、ソルビタンモノラウレートモノパルミネート（Ｓｐａｎ４０）、ソルビタンモノラウレートモノステアレート（Ｓｐａｎ６０）、ソルビタンモノラウレートモノオレート（Ｓｐａｎ８０）等が挙げられる。特に好ましい非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート類を挙げることができる。さらに好ましくは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ポリソルベート８０）が最も適している。
【０００８】
本乳化製剤の製造方法に使用される非イオン性界面活性剤含有水溶液の濃度は、特に限定されないが、通常非イオン性界面活性剤の含有量として約０．０１％〜１０．０％ｗ／ｗの範囲で用いられる。固形物質が細菌の菌体成分である場合、好ましくは、０．０１％〜４％、更に好ましくは０．１％〜１．５％が挙げられる。
乳化工程は複数回に分けることもできる。例えば、１番目の工程では粗乳化を行い、２番目の工程で細乳化を行う２工程に分けられる。その場合の非イオン性界面活性剤濃度は、粗乳化工程においては必要最小限でよく、０．１％ｗ／ｗ以下の少量が好適である。好ましくは０．０１〜０．０５％ｗ／ｗがあげられる。細乳化工程では、非イオン性界面活性剤濃度は好ましくは０．１％〜１０％ｗ／ｗが挙げられ、固形物質が細菌の菌体成分である場合、好ましくは０．１〜１．５％ｗ／ｗが挙げられる。
また、細乳化工程後に、適宜必要に応じて、さらに非イオン性界面活性剤を加えて、より高含量の非イオン性界面活性剤溶液に調製することもでき、その際、さらに乳化機による攪拌を行うこととで粒度分布をシャープなものにすることも可能である。これら水溶液には必要に応じて適宜安定化剤や等張化剤が加えられていてもよい。また、これら非イオン性界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
【０００９】
本発明に使用可能な非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質としては、医薬品製剤に使用される物質であれば、特に制限されるものはないが、電解質が挙げられる。例えば、有機酸、有機塩基、無機酸、無機塩基、または塩等が挙げられる。有機酸としては例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、アミノ酸、ヒドロキサム酸等が挙げられ、好ましくは、アミノ酸が挙げられる。具体的には、α−アミノ酸であるアラニン、グリシン、バリン、プロリン、リシン、ロイシン、チロシン等のアミノ酸が挙げられる。有機塩基としては、トリエチルアミン等が挙げられる。無機酸としては、硫酸、リン酸、塩酸等が挙げられる。無機塩基としては、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムカリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。塩としては、前記有機酸、有機塩基、無機酸、および無機塩基の各々に対応する塩を用いることができ、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩等が挙げられ、好ましくは、アルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩が挙げられる。具体的には、リン酸一または二水素ナトリウム、リン酸水素一または二カリウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム等が挙げられる。
該電解質は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
また、グルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の糖類、マンニトール、マルトース等のポリアルコール類、またはウレアなどの非電解質を、安定化剤、賦形剤または等張化剤として、曇天を下げる物質とともに用いることができる。
【００１０】
非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質の濃度は、特に限定されないが、水中油型エマルション製剤において０．１〜３０％ｗ／ｗの範囲が適当である。好ましくは、１〜２０％ｗ／ｗの範囲が適当である。
更に非電解質の水溶液を添加する場合、該水溶液の濃度としては、約１．５〜１５％
ｗ／ｗ（浸透圧比０．３〜３）が望ましい。
【００１１】
本発明において、乳化製剤が溶媒不溶の固形物質を含む場合、使用可能な固形物質とは溶媒不溶であれば特に制限されるものはなく、医薬品製剤に使用される物質例えば、医薬品の原薬等が挙げられる。該原薬としては、具体的には、細菌菌体成分が挙げられ、好ましくは微生物死菌や微生物由来の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ），リポ多糖（ＬＰＳ）、マンナン、グルカンおよびこれらの誘導体等が挙げられる。微生物死菌の例としては、ヒト型結核菌の死菌などが挙げられる。ＣＷＳの由来微生物としては、マイコバクテリア属、ノカルディア属、コリネバクテリア属、プロピオニバクテリウム属などが挙げられる。さらに好ましくは、マイコバクテリア属ウシ型結核菌であるＢＣＧおよびノカルデイア・ルブラーを挙げることができる。これらのＣＷＳは、物理的に細菌を粉砕した後、除核酸、除タンパク、脱脂などの精製工程を経て得られる不溶性残渣として得られ、その製法自体は公知である。
なお、本発明で使用される菌体成分の濃度は、好ましくは乳化製剤において０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌが挙げられる。
【００１２】
本発明で使用可能な油状物質としては特に制限されるものはなく、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２７巻、第３１１〜３２９項（１９７４年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、流動パラフィン、バイオール（Ｂａｙｏｌ　Ｆ）、ドラケオール（Ｄｒａｋｅｏｌ−６ＶＲ）、モレスコバイオレスなどが挙げられる。植物油としては、落花生油、ゴマ油、ＡＤ−６５（落花生油とアラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）、オレイン酸エチル、大豆油、ツバキ油等が挙げられる。動物油としては、スクワラン、スクワレンのようなテルペノイド誘導体が挙げられる。好ましい例としては、ドラケオール６ＶＲ、スクワレン、スクワラン、グリセリン、シンセラン４等を挙げることができる。
なお、油状物質の濃度は、水中油型エマルション製剤において０．０１〜３０％ｗ／ｗの範囲が適当であるが、好ましくは０．０１〜１０％ｗ／ｗが挙げられ、より好ましくは０．０１〜５．０％ｗ／ｗが挙げられる。
【００１３】
また、本発明で使用可能な等張液は、エマルション粒子の分散媒体となるものとして、注射用水（注射用蒸留水）、生理食塩水などが挙げられるが、注射可能な分散溶媒であれば特に限定されない。
その他、医薬品製剤に使用しうる安定化剤、酸化防止剤、防腐剤、緩衝剤等を必要に応じて添加することができる。添加濃度としては水中油型エマルション製剤において１０％ｗ／ｗ以下で十分である。
【００１４】
本発明で使用可能な分散・乳化機器としては、例えばＰｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザー、ホモミキサー、超音波ホモジナイザー、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、マントン−ガウリンホモジナイザー型高圧ホモジナイザー、ＩＫＡウルトラタックスＴ−２５（商品名）等の分散・乳化機により、分散もしくは乳化を行って所望の濃縮された水中油型エマルション溶液を得ることができる。調製後、賦形剤、安定化剤等の添加剤を添加し、適宜所望の製剤製造を行う。
乳化のための攪拌条件は製剤調製時の原料の分量および乳化機器によって異なるため、所望の粒度分布が得られたことを目安に回転数を決めることが好ましい。例えば、本発明の乳化製剤の製造法における工程では、概ね回転数１００００〜２５０００ｒｐｍで乳化することが挙げられる。本発明の工程で製造された乳化製剤の粒度分布は０．１〜１０μｍである。
【００１５】
乳化工程は複数回に分けることもできる。例えば、１番目の工程では粗乳化を行い、２番目の工程で細乳化を行う２工程に分けられる。粗乳化は、細乳化よりも低速で行うことが好ましい。
工程を複数回に分けた場合も撹拌速度は原料の分量、乳化機器によって異なるが、例えば、本発明の乳化製剤の製造法における工程での回転数は、粗乳化で約３０００ｒｐｍ〜１００００ｒｐｍであり、好ましくは６０００ｒｐｍ〜８０００ｒｐｍが挙げられ、より好ましくは約７０００ｒｐｍが挙げられる。
また、細乳化工程での撹拌の回転数は好ましくは約８０００ｒｐｍ以上が挙げられ、より好ましくは１００００ｒｐｍ〜２００００ｒｐｍが挙げられ、より好ましくは１２０００ｒｐｍ〜１６０００ｒｐｍが挙げられる。
【００１６】
本発明乳化製剤の製造法での乳化の温度としては、４０℃〜８５℃であればよいが、約６５℃以上の高温であることが望ましい。
本発明の乳化製剤の製造法の乳化時間は乳化温度に依存するが、５〜６０分が挙げられ、好ましくは５〜３０分が挙げられ、より好ましくは５〜１０分が挙げられる。
また、乳化工程は複数回に分けることもできる。例えば、１番目の工程では粗乳化を行い、２番目の工程で細乳化を行う２工程に分けられる。粗乳化、細乳化で乳化温度を変える必要はない。例えば、粗乳化、細乳化共、６５℃〜７０℃でそれぞれ約１０分で乳化を行うことができる。
【００１７】
本発明の乳化製剤の製造法で非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質を含有する水溶液を添加する際の撹拌は低速で良く、乳化後の濃縮エマルションと上記水溶液がまんべんなく混合される程度でよい。ここで低速とは、１０００〜７０００ｒｏｕｎｄ／ｍｉｎの速度を意味する。
上記水溶液の添加は、乳化工程後であればいつでもよいが、乳化製剤を曇点以下の温度に冷却した後に添加することが好ましい。複数回に分けて乳化した場合は、最終の乳化工程が終了した後に、曇点以下まで冷却し添加する。
曇点は、使用する非イオン性界面活性剤によって異なる（界面活性剤便覧、西市郎他、１６７−１７６（産業図書））。曇点の温度変化は、非イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質との組み合わせ且つ、非イオン性界面活性剤の曇点を下げる物質の含有量に依存されるので、適宜その条件での曇点を求める。曇点の測定方法は「新・界面活性剤入門」藤本　武彦（三洋化成工業）、Ｐ９５記載の方法で容易に求められる。
例えば、本発明の乳化製剤の製造法における曇点以下の温度とは、特に限定されないが、本発明の好ましい態様においては、通常４０℃以下が挙げられ、より好ましくは３０℃以下が挙げられる。
乳化製剤の製法の処方での原料の分量は特に制限されない。本発明の乳化製剤の製造法での乳化機器においても特に制限されない。
【００１８】
本発明に係る乳化製剤は、注射など非経口で投与できる。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。例えば細菌の細胞壁骨格成分を非経口的に投与する場合、通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって異なるが、例えば細菌の細胞壁骨格成分を非経口投与する場合、特に注射剤として使用する場合には、通常は成人に対して週１回若しくは４週１回の投与で１回当たり有効成分が０．１〜２５０μｇの範囲、好ましくは１０〜２００μｇの範囲を投与することができる。より好ましくは２５〜２５０μｇの範囲を投与することが出きる。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例、試験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明がこれらによってなんら限定されるものではない。
【００２０】
試薬
スクワラン　　：スーパースクワランＥｘ．（Ｌｏｔ．ＰＣ９Ｆ５４、スクアテック社）
ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）：ＴＯ−１０Ｍ（Ｌｏｔ．９３１６、日光ケミカル）
グリシン　　　：特級グリシン（ナカライテスク）
乳化機器
乳化機　：ロボミックス、攪拌部：ホモミクサーＭＡＲＫＩＩターヒ゛ン蓋一体型（特殊機化工業）
乳化容器：ジャケット付きセパラブルフラスコ（ロボミックス２Ｌ用、特殊機化工業）
恒温槽　：ＥＹＥＬ　ＤＩＧＩＴＡＬ　ＵＮＩ　ＡＣＥ　ＵＡ−１００
乳化条件
処方：有効成分として、ＢＣＧ−ＣＷＳを用いる場合の、１Ｌあたりの原料の組成としては、例えば以下の表１に例示される。
【００２１】
【表１】
2004067536.tif 000002
凍結乾燥
凍結乾燥機：フィンテック社製ＧＴ―６
重鎮容器
バイアル　：ＶＳＣ１８―ＣＳ（不二硝子）
ゴム栓　　：Ｖ１０―Ｆ８（大協精工）
物性評価
粒度分布評価：島津静的光散乱粒度分布計ＳＡＬＤ−３０００
【００２２】
実施例１
菌体成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ６００ｍｇを、スクワラン　　１６ｇとトルエン２００ｍｌの混合液に加え、振とうあるいは超音波により１５分間分散した。その後、窒素気流下で６０℃に加熱しトルエンを留去した。次いで、０．０２％ｗ／ｗポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水溶液７８６ｍＬを添加し、ホモミキサー（ロボミックス）を用い、７０００ｒｐｍ１０分間６５℃で粗乳化を行った。その後、１０％ｗ／ｗポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水溶液１５ｍＬを添加し、ホモミキサー（ロボミックス）を用いて１２０００ｒｐｍ５分間６５℃で本乳化した。本乳化後、粒度分布が所望のものであることを確認後、１０％ｗ／ｗポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）水溶液１８３ｍＬを添加し、ホモミキサー（Ｔ．Ｋ．ＲＯＢＯ　ＭＩＣＳ）を用いて５０００ｒｐｍ１分間６５℃で混合することにより最終的なポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を２．０％ｗ／ｗに調整した。その後、品温を３０℃以下に冷却した後、２４００ｍＭグリシン水溶液１０００ｍＬを徐々に製剤側に添加し、充分混合することにより、最終的に原薬濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、スクワラン濃度０．８％ｗ／ｗ、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度１．０％ｗ／ｗ、グリシン濃度１２００ｍＭの水中油型エマルション製剤を得た。
【００２３】
参考例１　（グリシン共存下でのビークル調製）
乳化中あるいは直後での、不溶性物質の生成製剤の不安定化原因が原薬ではないことを確認するため、以下のようにグリシン共存下ビークルを調製した。さらに、グリシン添加のタイミングの影響についても検討した。
２％ｗ／ｗスクワラン、１％ｗ／ｗ　ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のビークル（１Ｌスケール）を下記の３種の製法にて調製。
▲１▼グリシン・前添加　…０．２％　ｗ／ｗ　ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）／１２００ｍＭグリシン水溶液にて本乳化を行う
▲２▼グリシン・後添加（スラリー）…グリシン無しで本乳化した後、グリシンをスラリー状態（粉末）で直接製剤に投入（この時の品温は約６５℃）
▲３▼グリシン・後添加（溶液）…油、界面活性剤を各２倍量含有した濃縮製剤を調製後、２４００ｍＭグリシン溶液を等量添加（品温２５℃）
尚、特記しない限り、本乳化での設定温度は６５℃である。（品温：６５〜７０℃）
試験の結果を以下に示す。
▲１▼グリシンを含んだポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液にて本乳化を行った結果、０．２％ｗ／ｗ　ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）における従来の乳化では充分シャープな粒度分布は得られず、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を上げて乳化したが改善は見られなかった。さらに、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の最終濃度である１％ｗ／ｗで本乳化を行ったところ、粒度分布が変化し、製剤中に不溶性物質が浮遊しているのが認められた。粒度分布の結果を図１に示す。
▲２▼グリシン非含有ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液にて乳化を行ったところ、１０分間の乳化においては粒度分布が充分にシャープにはならなかった。これはスクワラン４％ｗ／ｗの濃縮製剤での乳化であった為と考えられる。そこで、２０分間の乳化に延長したところ、本来のシャープな粒度分布が得られることが判った。その後、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を１％ｗ／ｗにしても粒度分布は変化しなかった。さらに、グリシン９０ｇ（１２００ｍＭ相当）をスラリーで投入しミキサーにて混合（回転数：３０００ｒｐｍ、乳化ではない）したが、粒度分布には変化は無かった。ところが、その状態からミキサーの回転数を上げ（１２０００ｒｐｍ）、乳化したところ、粒度分布が変化し、▲１▼での結果と同様な不溶性物質が生成し始めた。粒度分布変化の結果を図３に示す。
▲３▼　▲２▼での結果を参考にして、グリシン非存在下での本乳化におけるポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を２倍の０．４％ｗ／ｗにしたところ、１０分間の乳化により▲２▼と同様なシャープな粒度分布が得られた。その後、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）濃度を最終濃度（１％）に調整し、グリシン２４００ｍＭ溶液を製剤と等量添加し混合したが、粒度分布に変化は無かった。さらに、▲２▼の最終工程での結果を参考に、ここでは品温を１５℃付近まで冷却してから、１０分間の細乳化を行ったところ、粒度分布は全く変化せず、不溶性物質の生成も認められなかった。粒度分布変化の結果を図４に示す。
製法▲１▼と▲３▼により調製された製剤比較すると、明らかに製法▲１▼による製剤の上部には不溶性物質が浮遊しているのが判った。
以上の結果から、グリシン共存下での乳化で認めれる製剤の不安定化は、原薬の影響で起こっているのではなく、おそらくグリシンが高濃度化することにより他の成分（ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）あるいはスクワラン）に何らかの影響を及ぼし製剤を不安定化させたものと考えられた。
また、▲２▼、▲３▼の結果から、「高濃度のグリシン」「高温（６５〜７０度）」「高い回転数での乳化」という３つの条件が揃った時に、製剤が不安定化することが示された。
【００２４】
参考例２　グリシン共存下でのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点測定
ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のような非イオン性界面活性剤は、親水基であるポリオキシエチレン基の親水性により溶解している。これは、基中にあるエーテル結合型の酸素原子に水分子が水素結合することにより生ずるものである。この水素結合は水溶液の温度が上昇して水分子の運動が活発になると切れてしまい、それまでミセル状に溶解していた界面活性剤分子は水和性を失って白濁して析出する。この温度を曇点（ｃｌｏｕｄ　ｐｏｉｎｔ）というが、グリシン濃度がポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点に及ぼす影響について検討した。
「新・界面活性剤入門」（藤本　武彦（三洋化成工業）、Ｐ９５）に記載されている方法に従って、グリシン３００ｍＭ〜１２００ｍＭにおけるポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点を測定した。
一般に界面活性剤の曇点は、０．５〜５％　ｗ／ｗ程度の範囲では濃度の影響を受けず一定であることが知られている。ここでの検討では、実際の本乳化での設定濃度である０．２％　ｗ／ｗで測定することにした。
試験結果を以下に示す。
図６に示すように、グリシン濃度と曇点の間には良い相関性が認められ、グリシン濃度の増加に反してポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）の曇点が低下することが判明した。このことから、ＢＣＧ−ＣＷＳエマルション調製時の乳化温度である６５〜７０℃の条件下では、グリシン濃度約６００ｍＭ以上でポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）が析出していた可能性が高いことが判った。
以上の結果から、これまでの製剤調製において、グリシン６００ｍＭ以上での細乳化ではポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）が析出し乳化力が顕著に低下していたことが示された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は乳化製剤の安定化大量製造方法である。その特徴は、溶媒不溶の固形物質、油状物質、非イオン性界面活性剤水溶液のみで濃縮エマルション製剤を調製した後で、非イオン性界面活性剤の曇点を低下させる物質含有の水溶液と混合することにより、付着物の生成と凍結乾燥中のケーキの収縮などの製剤の不安定化を解消することができた。
すなわち、本発明により、医薬品として有効な乳化製剤品の実用的な大量製造法が可能となり、特に細菌の菌体成分を使用した癌免疫療法用の乳化製剤を医薬品として提供することが可能となった。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】参考例１の▲１▼の、グリシン共存下での乳化による粒度分布変化を表すグラフである。
【図２】参考例１の▲２▼の、グリシン非含有ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）溶液で乳化時間を変えて乳化した場合の粒度分布変化と、グリシンをスラリーで乳化後に添加した場合の粒度分布変化を表すグラフである。
【図３】参考例１の▲２▼の、グリシン溶液を乳化後に添加した場合の粒度分布変化を表すグラフである。
【図４】参考例２の雲点とグリシン濃度のとの相関性を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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