(57)【要約】      （修正有）【課題】常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）に関連する遺伝子の変化またはこのような変化が存在しないことを同定するための遺伝子試験方法の提供。【解決手段】ＰＫＤ−１、またはＰＫＤ−２遺伝子の変異の検出のための核酸配列、ならびにＡＤＰＫＤのためのバイオマーカー、さらに、個体におけるＡＤＰＫＤの診断方法、および本発明の方法を実施するためのキット、また、個体における変異ＰＫＤ遺伝子の有無の決定方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選択される配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
図１４に開示された１つまたは複数のヌクレオチド変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２核酸配列を含むＡＤＰＫＤのための核酸バイオマーカー。
【請求項３】
前記１つまたは複数のヌクレオチド変化の少なくとも１つが、図１４に開示された新規のヌクレオチド変化からなる、請求項２の核酸バイオマーカー。
【請求項４】
図１４に開示された１つまたは複数の新規のヌクレオチド変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２核酸配列を含んでなる、ＡＤＰＫＤのための核酸バイオマーカー。
【請求項５】
図１４に開示された１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリペプチド配列を含む、ＡＤＰＫＤのためのポリペプチドバイオマーカー。
【請求項６】
前記１つまたは複数のアミノ酸変化の少なくとも１つが、図１４に開示された新規のアミノ酸の変化からなる、請求項５のポリペプチドバイオマーカー。
【請求項７】
図１４に開示された１つまたは複数の新規のアミノ酸変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリペプチド配列を含んでなる、ＡＤＰＫＤのためのポリペプチドバイオマーカー。
【請求項８】
個体のＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列を同定するステップを含み、図１４に開示されたＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列における１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在が前記個体のＡＤＰＫＤを示す、個体のＡＤＰＫＤの診断方法。
【請求項９】
ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列の同定のために、前記個体からＤＮＡサンプルを得るステップをさらに含む、請求項８の方法。
【請求項１０】
得られた前記ＤＮＡサンプルが、ゲノムＤＮＡサンプルまたはｃＤＮＡサンプルである、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記同定の前に、前記ＤＮＡサンプルからＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子の一部を増幅するステップをさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
前記ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子の前記一部を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記同定が、ＤＮＡ配列決定による、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ配列決定を、配列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選択される配列を含む単離された核酸を使用して行う、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のヌクレオチド変化の少なくとも１つが、図１４に開示された新規のヌクレオチド変化からなる、請求項８の方法。
【請求項１６】
個体における変異ＰＫＤ遺伝子の有無を決定する方法であって、
ａ）前記個体のＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列を同定するステップと、
ｂ）ステップａ）の前記ヌクレオチド配列を、図１４に開示されたＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド配列の変化と比較するステップと、
ｃ）図１４に開示された１つまたは複数の前記ヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップとを含み、
前記少なくとも１つの前記ヌクレオチド配列の変化の存在が、前記個体のＡＤＰＫＤを示し、任意の前記ヌクレオチド配列の変化の非存在が前記変異ＰＫＤ遺伝子の非存在を示す、方法。
【請求項１７】
ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列の同定のために、前記個体からＤＮＡサンプルを得るステップをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
得られた前記ＤＮＡサンプルが、ゲノムＤＮＡサンプルまたはｃＤＮＡサンプルである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記同定の前に、前記ＤＮＡサンプルからＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子の一部を増幅するステップをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２０】
前記ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子の前記一部を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記同定が、ＤＮＡ配列決定による、請求項１７の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ配列決定を、配列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選択される配列を含む単離された核酸を使用して行う、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のヌクレオチド変化の少なくとも１つが、図１４に開示された新規のヌクレオチド変化からなる、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本発明は、２００１年１０月１２日提出の米国特許仮出願第６０／３２８，７３９号の利益を主張する、２００２年２月２６日提出の米国特許出願第１０／０８３，２４６号（その両出願の開示全体を本明細書中に参照することによって組み込むものとする）の一部継続出願である。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、常染色体優性多発性嚢胞腎に関連する遺伝子の変化またはこのような変化が存在しないことを同定するための遺伝子試験方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
常染色体優性多発性嚢胞腎（ＡＤＰＫＤ）は、８００人の生産児あたり約１人発症する非常に一般的な遺伝性腎疾患である。この疾患は、進行性で、多発性嚢胞腎の両側への拡大によって特徴付けられ、典型的には６５歳で末期腎疾患（ＥＳＲＤ）となる。より一般的な合併症には、高血圧、肉眼的血尿、尿管感染症、心臓弁の異常、および前腹壁ヘルニアが含まれる。嚢胞形成は一般的に肝臓でも認められるが、発症は器官の機能障害に関連していない。あまり報告されていないが、さらなる腎外発現には、膵嚢胞症、結合組織異常、および大脳動脈瘤が含まれる。
【０００４】
典型的な発症年齢は中年であるが、年齢層は新生児から８０歳までである。ＡＤＰＫＤの臨床的兆候は、家族間および家族内で異なり、この障害の遺伝学的に異なる性質によって部分的に説明される。ほとんど全てのＡＤＰＫＤの症例で２つの遺伝子ＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２の変異が認められる（例えば、概説については、Ａｒｎａｏｕｔ、２００１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，５２，９３〜１２３；Ｋｏｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌｔａｓ、２０００、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１０７、１１５〜１２６を参照のこと）。ＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２は、機能が完全に解明されていない内在性膜タンパク質をコードする。ＡＤＰＫＤを担う主要遺伝子ＰＫＤ−１は完全に特徴付けられており、細胞−細胞および細胞−基質相互作用に関連すると考えられる内在性膜タンパク質ポリシスチン１をコードすることが示されている。ＰＫＤ−２遺伝子は、非選択性陽イオンチャネル活性を有すると予想される内在性膜タンパク質であるポリシスチン２をコードする。電位活性化カルシウムチャネルのα１サブユニット成分との配列相同性に基づいて、ポリシスチン２は、イオンチャネリングの役割を果たし得ると仮定されている。インビトロ結合アッセイおよび指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）２ハイブリッド相互作用を使用して、ポリシスチン１およびポリシスチン２のＣ末端細胞質テールは相互作用することが認められている。ＰＫＤ−１中のコイルドコイルドメインおよびＰＫＤ−２中のＲ８７２付近の領域を介して相互作用が生じる。ポリシスチン間の相互作用の生物学的関連性は未だ理解されていないにもかかわらず、ＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２はおそらく共通の経路に沿って機能すると示唆されている。
【０００５】
ＡＤＰＫＤ１型および２型は、腎臓および腎外の全発症範囲を共有するが、２型は１型と比較して発症が遅延するようである。高血圧、血尿、および尿管感染を含むＡＤＰＫＤで認められる共通の表現型合併症は、２型患者で臨床的に軽度なようである。死またはＥＳＲＤ発症年齢の中央値は、ＰＫＤ−１を有する個体で５３歳であり、ＰＫＤ−２を有する個体で６９歳と報告されている。女性は、男性（６７歳）より有意に長い生存期間の中央値（７１歳）であると報告されている。ＰＫＤ−１では性別の影響は明確ではない。ＰＫＤ−１遺伝子の変異は、試験した症例の約８５％でＡＤＰＫＤの病因であり、ＰＫＤ−２では１５％である。ＡＤＰＫＤ家族の部分集合が小さいのでＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２のいずれかとの遺伝的関連を証明することができないにもかかわらず、ＡＤＰＫＤの第３の遺伝子の可能性が生じ、第３の疾患関連遺伝子座の存在が厳密に調査されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＫＤ遺伝子の変化とＡＤＰＫＤの発症との間の強力な関連性が発見されたにもかかわらず、日常的な臨床用のＡＤＰＫＤ疾病素質についての遺伝子試験法の開発は、いくつかの技術的障害によって妨げられている。
【０００７】
ＡＤＰＫＤについてのＤＮＡベースの試験法の開発における１つの深刻な障害は、ＰＫＤ転写物に関連する配列（例えば、ＰＫＤ−１）は、ＰＫＤ−１遺伝子座に隣接する第１６染色体上で少なくとも３回重複されてＰＫＤ−１ホモログを形成することである。別の障害は、ＰＫＤ−１ゲノム区間もまた他のゲノム領域中に存在する繰り返しエレメントを含むことである。さらに、ＰＫＤ遺伝子の配列は、非常にＧＣリッチであり、完全な進化について多数のヌクレオチド（１５，８１６ｂｐ）を分析する必要がある。
【０００８】
発現したＰＫＤ遺伝子に固有であり、重複した相同配列中に存在しないこれらの配列のセグメントの同定が必要である。ＰＫＤ遺伝子の変異分析用の感度が高く且つ特異的な遺伝子試験の開発も必要である。このような試験法の開発により、ＡＤＰＫＤの診断および管理が容易になる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様では、本発明は、標的核酸の変異分析法であって、前記方法は、
反応混合物中で前記標的核酸を含むサンプルを少なくとも１つの第１の核酸および少なくとも１つの第２の核酸の存在下でインキュベートするステップであって、前記第１の核酸は配列番号１または２の配列の固有の部位にアニーリングするプライマー配列を含み、前記第２の核酸は前記第１の核酸と逆方向であり、前記インキュベーションにより増幅産物が産生され、
前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップと、
前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出するステップと
を含み、前記ヘテロ二重鎖の存在は前記標的核酸中の潜在的な変異の存在を示し、前記へテロ二重鎖の非存在は前記標的核酸中の変異の非存在を示す方法を提供する。
【００１０】
１つの実施形態では、本方法は、ヘテロ二重鎖領域の配列を決定するステップと、前記ヘテロ二重鎖領域の配列と配列番号１または２とを比較するステップとをさらに含み、前記標的核酸によってコードされるタンパク質の機能変化が予想される配列番号１または２と比較した前記ヘテロ二重鎖領域の配列の相違は前記標的核酸の変異の指標となる。
【００１１】
好ましくは、第１または第２の核酸は、配列番号３〜４９からなる群から選択される配列を含む。
【００１２】
別の実施形態では、本方法は、テンプレートとして前記第１および第２の核酸によって作製された前記増幅産物を使用してネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）増幅反応を行うステップと、前記ネスト化増幅由来の増幅産物中で二重鎖を作製するステップとをさらに含む。
【００１３】
好ましくは、ネスト化増幅反応を、配列番号３〜４９およびその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーを使用して行う。
【００１４】
好ましい実施形態では、二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無をＤＨＰＬＣによって同定する。
【００１５】
好ましい実施形態では、ヘテロ二重鎖領域の配列をＤＮＡ配列決定によって決定する。
好ましくは、本発明の方法の第２の核酸は配列番号１または２の配列内の固有の部位にアニーリングするプライマー配列を含む。
【００１６】
好ましくは、標的テンプレートを含むサンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および細胞サンプルからなる群から選択される。
【００１７】
１つの実施形態では、インキュベーションステップは、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および核酸特異性ベースの増幅からなる群から選択される増幅反応を含む。
【００１８】
本発明の方法は、１つまたは複数の制限酵素を使用して増幅産物がＰＫＤ特異的産物であるかを確認するステップをさらに含み得る。
【００１９】
好ましくは、制限酵素は、ＰＫＤ特異的産物を切断してＰＫＤホモログ産物と区別可能な消化パターンが得られる。
【００２０】
より好ましくは、制限酵素は、ＰｓｔＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩからなる群から選択される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＰＫＤ罹患患者を同定するための診断法であって、前記方法は、
（ａ）個体からサンプルを得るステップと、
（ｂ）反応混合物中で前記サンプルを少なくとも１つの第１の核酸および少なくとも１つの第２の核酸の存在下でインキュベートするステップであって、前記第１の核酸は配列番号１または２中の固有の部位にアニーリングするプライマー配列を含み、前記第２の核酸は前記第１の核酸と逆方向であり、前記インキュベーションにより増幅産物が産生され、
（ｃ）前記増幅産物中で二重鎖を作製するステップと、
（ｄ）前記二重鎖由来のヘテロ二重鎖の有無を検出するステップと、
（ｅ）前記ヘテロ二重鎖領域の配列を決定するステップと
を含み、配列番号１または２と比較した前記ヘテロ二重鎖領域の存在は、前記個体がＰＫＤを罹患していることを示す方法を提供する。
【００２２】
好ましくは、ヘテロ二重鎖の検出をＤＨＰＬＣによって行う。
【００２３】
好ましくは、配列をＤＮＡ配列決定によって決定する。
【００２４】
１つの実施形態では、第２の核酸が配列番号１または２の配列中の固有の部位にアニーリングするプライマー配列を含む。
【００２５】
別の実施形態では、第１または第２の核酸が配列番号３〜４９からなる群から選択されるプライマー配列を含む。
【００２６】
本発明の診断法は、テンプレートとして前記第１および第２の核酸によって作製された前記増幅産物を使用してネスト化増幅反応を行うステップと、前記ネスト化増幅由来の二重鎖を作製するステップとをさらに含み得る。
【００２７】
１つの実施形態では、ネスト化増幅反応を、配列番号３〜４９およびその相補配列からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーを使用して行う。
【００２８】
好ましくは、診断法におけるサンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および細胞からなる群から選択される。
【００２９】
好ましくは、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および核酸特異性ベースの増幅からなる群から選択される増幅反応を含む。
【００３０】
診断方法は、特異的に増幅した産物を１つまたは複数の制限酵素を使用して実証するステップをさらに含み得る。
【００３１】
好ましくは、制限酵素は、ＰＫＤ特異的産物を切断してＰＫＤホモログ産物と区別可能な消化パターンが得られる。
【００３２】
より好ましくは、制限酵素は、ＰｓｔＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩからなる群から選択される。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、各プライマーが配列番号３〜４９またはその相補物からなる群から選択される単離核酸である、１つまたは複数の核酸プライマーを提供する。
【００３４】
本発明はまた、対の少なくとも１つの核酸が配列番号３〜４９〜なる群から選択される、核酸対を提供する。
【００３５】
好ましくは、核酸対は逆方向であり、配列番号１または２の配列を含むテンプレート核酸のフラグメントを増幅する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、第１の核酸が配列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選択され、第２の鎖が第１の核酸と逆方向であり、第１および第２の核酸は配列番号１または２の配列を含むテンプレート核酸のフラグメントを増幅する、少なくとも１つの単離した第１の核酸および少なくとも１つの単離した第２の核酸を含む組成物を提供する。
【００３７】
１つの実施形態では、本発明の成分は、ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、１つまたは複数のコントロールオリゴヌクレオチドプライマー、ｄｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応緩衝液、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む。
【００３８】
好ましくは、組成物中のテンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、第１の核酸が配列番号１〜４９およびその相補的配列からなる群から選択され、第２の鎖が第１の核酸と逆方向であり、第１および第２の核酸は配列番号１または２の配列を含むテンプレート核酸のフラグメントを増幅する、少なくとも１つの単離した第１の核酸および少なくとも１つの単離した第２の核酸、ならびにその封入材料を含む、ＰＫＤ患者を同定するためのキットを提供する。
【００４０】
１つの実施形態では、本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、コントロールオリゴヌクレオチドプライマー、ｄｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応緩衝液、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含む。
【００４１】
好ましくは、キット中のテンプレート核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子である。
【００４２】
本発明は、配列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選択される配列を含む単離された核酸を提供する。
【００４３】
本発明は、１つまたは複数の図１４に開示されたヌクレオチド変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２核酸配列を含むＡＤＰＫＤのための核酸バイオマーカーを提供する。
【００４４】
１つの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド変化の少なくとも１つが、図１４に開示された新規のヌクレオチド変化からなる。
【００４５】
本発明はまた、図１４に開示された１つまたは複数の新規のヌクレオチド変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２核酸配列を含む、ＡＤＰＫＤのための核酸バイオマーカーを提供する。
【００４６】
本発明は、図１４に開示された１つまたは複数のアミノ酸変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリペプチド配列を含んでなる、ＡＤＰＫＤのためのポリペプチドバイオマーカーを提供する。
【００４７】
１つの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸変化の少なくとも１つが、図１４に開示された新規のアミノ酸変化からなる。
【００４８】
本発明は、図１４に開示された１つまたは複数の新規のアミノ酸変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリペプチド配列を含む、ＡＤＰＫＤのためのポリペプチドバイオマーカーを提供する。
【００４９】
本発明は、さらに、個体のＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列を同定するステップを含み、図１４に開示されたＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在が前記個体のＡＤＰＫＤを示す、個体のＡＤＰＫＤの診断方法を提供する。
【００５０】
本発明は、さらに、個体の変異ＰＫＤ遺伝子の有無を決定する方法であって、
ａ）前記個体のＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列を同定するステップと、
ｂ）ステップａ）のヌクレオチド配列を、図１４に開示されたＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド配列の変化と比較するステップと、
ｃ）図１４に開示された１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップとを含み、
少なくとも１つのヌクレオチド配列の変化の存在が個体のＡＤＰＫＤを示し、任意のヌクレオチド配列変化の非存在が前記変異ＰＫＤ−１および／またはＰＫＤ−２遺伝子の非存在を示す方法を提供する。
【００５１】
１つの実施形態では、ＡＤＰＫＤの診断方法および／または変異ＰＫＤ遺伝子の有無の決定方法は、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列の同定のために個体からＤＮＡサンプルを得るステップをさらに含む。
【００５２】
好ましくは、得られたＤＮＡサンプルが、ゲノムＤＮＡサンプルまたはｃＤＮＡサンプルである。
【００５３】
別の実施形態では、ＡＤＰＫＤの診断方法および／または変異ＰＫＤ遺伝子の有無の決定方法は、同定前にＤＮＡサンプルからＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子の一部を増幅するステップをさらに含む。
【００５４】
好ましくは、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子の一部を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。
【００５５】
同様に好ましくは、核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって同定する。
【００５６】
より好ましくは、ＤＮＡ配列決定を、配列番号３〜４９およびその相補的配列からなる群から選択される配列を含む単離核酸を使用して行う。
【００５７】
１つの実施形態では、少なくとも１つまたは複数のヌクレオチド変化の少なくとも１つまたは複数が、図１４に開示された新規のヌクレオチド変化からなる。
【００５８】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照してさらに理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本発明は、ＰＫＤ遺伝子内の固有の部位の同定、ＰＫＤ特異的プライマーのデザイン、およびこれらのＰＫＤ特異的プライマーの使用によって増幅されたＰＣＲ産物のＤＨＰＬＣ分析に基づく。
【００６０】
Ｉ．定義
本明細書中で使用される、「ＡＤＰＫＤ」は、常染色体優性多発性嚢胞腎をいう。ＡＤＰＫＤは、非常に一般的な遺伝性腎疾患であり、腎嚢胞、最終的には腎不全の発症で特徴付けられ、あるいは、またはそれに加えて肝臓および腎臓を含む他の器官中の嚢胞ならびに胃腸、心血管、および骨格筋の異常を含み得る。
【００６１】
用語「ＰＫＤ遺伝子」は、染色体部位１６ｐ１３．３（すなわち、ＰＫＤ−１）または染色体部位４ｑ２１−２３（すなわち、ＰＫＤ−２）にマッピングされるゲノムＤＮＡ配列をいい、ＰＫＤタンパク質をコードする伝令ＲＮＡ分子が得られる。ＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２遺伝子は、イントロンおよび推定調節配列を含む配列番号１および配列番号２の配列をそれぞれ含む。多数の他の遺伝子と同様に、ＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２遺伝子配列は、個体間で比較した場合、配列のばらつきを示す。サイレントである（すなわち、遺伝子産物の遺伝子発現または機能に関して）多型を有するこれらの遺伝子は、本明細書中では「正常」と定義する。
【００６２】
「正常な」ＰＫＤ遺伝子（例えば、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２）は、本明細書中ではＰＫＤ遺伝子（配列番号１または２に記載のものなど）と定義し、サイレント多型を有する任意の遺伝子が含まれる。
【００６３】
「変異」ＰＫＤ遺伝子は、本明細書中では、その配列が１つまたは複数の置換（トランジション、トランスバージョン）、欠失（遺伝子座の欠損を含む）、挿入（重複を含む）、転座、および／または正常なＰＫＤ遺伝子と比較した他の改変を含む変異で改変されているＰＫＤ遺伝子（例えば、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２）と定義する。変異により、ＰＫＤ遺伝子産物の発現または機能が検出可能に変化し、ＡＤＰＫＤの原因である。変異は、１つから数千個ものヌクレオチドを含み、それにより、１つまたは複数の種々のＰＫＤ発現の変化（例えば、発現速度の減少または増加）または欠損ＲＮＡ転写物またはタンパク質産物の発現が得られる。変異体ＰＫＤ遺伝子には、ヒト個体のゲノム中の１つまたは複数のコピーの存在がＡＤＰＫＤに関連する遺伝子が含まれる。
【００６４】
本明細書中で使用される、「バイオマーカー」は、その存在または濃度を検出して、病態（例えば、多発性嚢胞腎症、特にＡＤＰＫＤ）などの既知の条件と相関させることができる生体分子（例えば、核酸またはポリペプチドもしくはペプチドなど）をいう。
【００６５】
「ヌクレオチド配列変化」または「ヌクレオチド変化」は、１つまたは複数の置換（トランジションまたはトランスバージョン）、欠失（遺伝子座の喪失を含む）、挿入（重複を含む）、転座、および／または正常なＰＫＤ遺伝子に関する他の改変を含むヌクレオチド配列の改変をいう。
【００６６】
「アミノ酸変化」は、置換、フレームシフト、欠失、短縮、および挿入を含むアミノ酸改変ならびに／または正常なＰＫＤアミノ酸配列に関する他の改変をいう。
【００６７】
用語「塩基対ミスマッチ」は、配列番号１または２の配列に相補的ではない任意の核酸配列をいう。したがって、本発明の塩基対ミスマッチは、正常なＰＫＤ遺伝子の変化もしくは多型または変異ＰＫＤ遺伝子中に存在する任意の改変によって生じ得る。「塩基対ミスマッチ」は、１つのヌクレオチド塩基対ミスマッチまたは２つまたはそれ以上のヌクレオチド（すなわち、３、４、５、１０、２０、１００、もしくは５００以上、または１０００ヌクレオチドまで）の核酸配列を含み得る。本明細書中で定義のミスマッチの有無は、標的核酸中の潜在的変異の有無を示す。
【００６８】
本明細書中で使用される、用語「真の」は、配列番号１または２のゲノム配列およびこれら由来の配列を示し、これらの真の配列は「ＰＫＤホモログ」を区別するために使用する（以下を参照のこと）。
【００６９】
「ＰＫＤ−１ホモログ」は、ＰＫＤ−１と密接に関連しているが、発現したＰＫＤ−１遺伝子産物をコードしない配列である。染色体部位１６ｐ１３．１または４ｑ２１−２３にマッピングされるこのホモログのいくつかの例を同定および配列決定した。ＰＫＤ−１ホモログは、真のＰＫＤ遺伝子と９５％を超えて同一の配列を共有し得る。
【００７０】
本明細書中で使用される、用語「特異的に増幅された産物」は、真のＰＫＤ遺伝子（例えば、配列番号１または２）内のフラグメントから増幅されるがＰＫＤホモログから増幅されない産物である。「非特異的に増幅された産物」は、増幅反応において完全に相補的ではないテンプレート配列への核酸プライマーのアニーリングによるＰＫＤホモログまたは他の配列から増幅された産物である。
【００７１】
本明細書中で使用される、「固有の部位」は、ＰＫＤホモログ配列または他の配列中のストレッチと異なる少なくとも１つのヌクレオチドを含むＰＫＤ遺伝子中の１０〜５０塩基対長のストレッチをいう。固有部位の１つの例は、５’ＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＣＧＣＴＧＧ３’または５’ＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧ３’またはその相補的配列を含む。
【００７２】
本明細書中で使用される、「ＰＫＤ特異的プライマー」は、特異的なストリンジェンシー条件下でＰＫＤ遺伝子（イントロンおよびエクソンを含む）中の配列にアニーリングする核酸配列をいう。本発明のＰＫＤ特異的プライマーは、特異的なストリージェンシー条件下で真の発現ＰＫＤ−１遺伝子またはＰＫＤ−２遺伝子中に存在する固有の部位にアニーリングするが、ＰＫＤホモログまたは他の配列にはアニーリングしない。ＰＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤ遺伝子内の固有の部位と９５％を超える（例えば、９６％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えるか１００％）配列が同一である。「ＰＫＤ特異的プライマー」は、１０〜６０ヌクレオチド長（例えば、１８〜５２ヌクレオチド長）であり得る。
【００７３】
本明細書中で使用される、用語「特異的ストリンジェンシー条件」は、ＰＫＤ特異的プライマーがＰＫＤ遺伝子内の配列に特異的にアニーリングする増幅条件をいう。「特異的ストリンジェンシー条件」下では、ＰＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤホモログまたは他の配列にアニーリングしない。例えば、本発明に有用な１つの特異的ストリンジェンシー条件は、Ｔａｑ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ緩衝液（ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カタログ番号６００２１０）、５０ｎＭを超えるｄＮＴＰ濃度（例えば、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または３００ｎＭ）を含む。特異的ストリンジェンシー条件におけるアニーリング温度は、最も低いプライマーアニーリング温度（Ｔｍ）である５℃を超えても５℃未満でも５℃でもよい（例えば、Ｔｍよりも１℃、２℃、４℃、５℃、または１０℃高いかＴｍよりも４℃、３℃、２℃、または１℃低い）。
【００７４】
本明細書中で使用される、ＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列内の特定のＤＮＡ配列濃度を増加させるために使用される反応をいう。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸特異性ベースの増幅（ＮＳＢＡ）、または当該分野で公知の任意の他の方法を使用して増幅を行うことができる。
【００７５】
本明細書中で使用される、「ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応との組み合わせをいう。この増幅法は、特異的オリゴヌクレオチド、オリゴｄＴまたはランダムプライマーの混合物を使用してＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡへの逆転写を惹起する最初のステップを使用し、このｃＤＮＡを標準的な増幅技術（例えば、ＰＣＲ）を使用して増幅する。
【００７６】
「テンプレート核酸」または「標的核酸」（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）は、特定の配列（例えば、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子配列）であるかこれを含む正常（例えば、野生型）または変異核酸である。日常的な組換えＤＮＡ操作の一部としてさらなるヌクレオチドを開示の配列の５’および／または３’末端に添加することができることが理解される。さらに、保存的ＤＮＡ置換（すなわち、コードされるアミノ酸配列を変化させないタンパク質コード領域の配列変化）もまた適合し得る。
【００７７】
本明細書中で使用される、「核酸プライマー」は、核酸テンプレートをアニーリングして核酸テンプレートと相補的な伸長産物を産生するための３’末端を得ることができるＤＮＡまたはＲＮＡをいう。核酸テンプレートは、標的核酸テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を産生するように触媒する。開始および伸長条件には、４つの異なるデオキシリボヌクレオシドおよび重合誘導剤（ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素など）、適切な緩衝液（「緩衝液」には、ｐＨ、イオン強度などに影響を与える補因子が含まれる）、および適切な温度が含まれる。本発明のプライマーは、一本鎖であても二本鎖であっても良い。プライマーは、最大の増幅効率のためには一本鎖出あり、プライマーおよびその相補物は二本鎖核酸を形成する。しかしそれは二本鎖であり得る。本発明で有用な「プライマー」は、１００ヌクレオチド長以下である（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、もしくは１５ヌクレオチド長以下、または１０ヌクレオチド長）。
【００７８】
本明細書中で使用される、用語「逆方向」は、プライマーをいう場合、一方のプライマーが標的核酸テンプレートのセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含み、他方のプライマーが同一の標的核酸テンプレートのアンチセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。逆方向プライマーは、相補的な適合核酸テンプレートからＰＣＲ増幅産物を作製することができる。方向の異なる２つのプライマーを、逆方向プライマーおよび正方向プライマーということができる。
【００７９】
本明細書中で使用される、用語「同一の方向」は、プライマーが標的核酸テンプレートの同一の鎖に相補的なヌクレオチド配列を含むことを意味する。同一方向のプライマーでは相補的な適合核酸テンプレートからＰＣＲ増幅産物を作製されない。
【００８０】
あるいは、本発明のプライマーを、検出可能な標識（放射性部分または蛍光標識など）で標識することができるか、増幅反応により標識ヌクレオチドを反応産物に組み込むことができる。したがって、増幅反応産物を、蛍光または放射性標識での「検出」によって「検出」することができる。
【００８１】
本明細書中で使用される、用語「核酸」は、一般に、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得るポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「核酸」には、一本鎖および二本鎖核酸が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用される用語「核酸」には、１つまたは複数の改変塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。したがって、安定性または他の理由のために改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、「核酸」である。本明細書中で使用される、用語「核酸」には、核酸のこのような化学的、酵素的、または代謝的改変形態ならびにウイルスおよび細胞（例えば、単純および複雑な細胞を含む）に特徴的な化学的ＤＮＡおよびＲＮＡ形態が含まれる。
【００８２】
本明細書中で使用される、「単離」または「精製」は、核酸に関して使用する場合、正常な細胞（例えば、染色体）環境から天然に存在する配列が除去されているか、非天然の条件下（例えば、人為的に合成する）で合成されることを意味する。したがって、「単離」または「精製」配列は、無細胞溶液中に存在するか異なる細胞環境下で存在し得る。用語「精製」は、ヌクレオチドのみが存在する配列であることを意図せず、この配列に天然に関連する非ヌクレオチドまたは核酸物質を本質的に含まず（約９０〜９５％、９９〜１００％まで）、単離染色体と区別されることを意図する。
【００８３】
本明細書中で使用される、「ゲノムＤＮＡ」は、ＲＮＡ転写物からコピーされた相補的ＤＮＡに対するものとしての染色体ＤＮＡをいう。本明細書中で使用される、「ゲノムＤＮＡ」は、１つの細胞中に存在する全てのＤＮＡであっても１つの細胞中のＤＮＡの一部であってもよい。
【００８４】
本明細書中で使用される、「相補的」は、核酸（またはその一部）の一本鎖の逆平行核酸一本鎖のヌクレオチド（すなわち、任意の非対合ヌクレオチドによって妨害されない）間の連続する塩基対合によって逆方向核酸鎖（またはその一部）にハイブリッド結合して相補鎖間に二本鎖核酸を形成する能力をいう。第１の各核酸が第２の核酸の相補的領域内のヌクレオチドと塩基対合を形成する場合、第１の核酸は第２の核酸に「相補的」であるという。第１の核酸の一方のヌクレオチドが第２の核酸中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成しない場合、第１の核酸は第２の核酸に完全に相補的ではない。
【００８５】
本明細書中で使用される、「サンプル」は、天然の環境から単離され、標的核酸を含み、精製もしくは単離核酸からなり得る生体物質をいうか、標的核酸を含む組織サンプル、生体流動物サンプル、または細胞サンプルなどの生体サンプルを含み得る。
【００８６】
本明細書中で使用される、「二本鎖ＤＮＡ」は、「二重鎖」ともいう。一方の鎖の塩基配列が他方の鎖の塩基配列に完全相補的である場合、二重鎖を「ホモ二重鎖」と呼ぶ。二重鎖が相補的ではない少なくとも１つの塩基対を含む場合、二重鎖を「ヘテロ二重鎖」と呼ぶ。本発明では、個体から採取したサンプル由来の増幅産物を変性および再アニーリングした場合、ヘテロ二重鎖の形成は、この個体中の潜在的な変異ＰＫＤ遺伝子の存在を示す。
【００８７】
本明細書中で使用される、「ＤＨＰＬＣ」は、同一のｂｐ長を有するヘテロ二重鎖（変異の存在に起因する）およびホモ二重鎖の分離によって配列変異を検出するために使用される「変性高速液体クロマトグラフィー」と呼ばれる分離プロセスをいう。この分離は、ヘテロ二重鎖がホモ二重鎖よりも低い融解温度（Ｔｍ）を有するという事実に基づく。ＤＨＰＬＣは、一定の条件下で１つの塩基対しか異ならないヘテロ二重鎖を分離することができる。ＤＨＰＬＣを使用して、異なるｂｐ長の二重鎖を分離することもできる。
【００８８】
「ヘテロ二重鎖部位分離温度」、「温度中心点」、または「Ｔｍ」を、本明細書中では、１つまたは複数の塩基対がヘテロ二重鎖ＤＮＡフラグメント中の塩基対ミスマッチ部位で変性される（すなわち、分離する）温度を意味すると定義する。
【００８９】
ＩＩ．ＰＫＤ遺伝子の一般的説明
ＰＫＤ−１遺伝子（例えば、ｇｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３９８８９１、配列番号１）は、第１６染色体（１６ｐ１３．３）上に存在する約５４ｋｂのゲノムＤＮＡであり、１４ｋｂ  ｍＲＮＡが転写される４６個のエクソンで分割された１２，９０６ｂｐのコード配列を含む（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２、１３３９〜１３４２；Ｈｕｇｈｅｓら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、１０、１５１〜１６０）。ＰＫＤ−１のタンパク質産物ポリシスチン１は、推定分子量が４６０ｋＤａの４３０３個のアミノ酸からなるタンパク質である。最近まで、第１６染色体（１６ｐ１３．１）に沿ってＰＫＤ−１に隣接してマッピングされる少なくとも３つの相同性の高い遺伝子コピーの存在により、ＰＫＤ−１遺伝子の分析に影響を受けなかった。約７５％のＰＫＤ−１遺伝子が重複しており、その相同性コピーと約９７％同一である。整復領域は、第１の３３エクソンを含む遺伝子の５０ｋｂ（５’）部分を含む。エクソン３４〜４６を含む遺伝子のほとんどの３’（５．７ｋｂ）のみが、ＰＫＤ−１に固有である。ＰＫＤ−１遺伝子の別の顕著な特徴は、２．５ｋｂ長（ヒトゲノム中で最長）であるイントロン２１中のポリピリミジン領域である。ＰＫＤ−２遺伝子（例えば、ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００４８５９−００４８７３、配列番号２）は６８ｋｂのゲノムＤＮＡであり、第４染色体（４ｑ２１−２３）上に存在する（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら、１９９６、前出）。ＰＫＤ−２は１５個のエクソンを含み、約１１０ｋＤａの９６８アミノ酸タンパク質産物が作製される５．４ｋｂの転写物をコードする。ＰＫＤ−２が１コピーの遺伝子であるので、ＰＫＤ−２の変異分析は、ＰＫＤ−１の変異分析よりも非常に容易である。ＰＫＤ遺伝子およびそのタンパク質産物をまとめた表１を参照のこと。
【００９０】
【表１】
2004313194.tif 000002
【００９１】
正常な対立遺伝子上の体細胞変異の発生を支持する証拠に基づいて、多数の家族性癌素因症候群の病因に類似のツーヒットモデルにより、疾患の臨床的な病巣発現が説明されている（Ｑｉａｎら、１９９６、Ｃｅｌｌ、８７、９７９〜９８７；Ｗａｔｎｉｃｋら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．、２、２４７〜２５１）。簡単に述べれば、このモデルにより、ＡＤＰＫＤは細胞レベルで劣性であり、第２の体細胞性変異またはヘテロ接合ＰＫＤ欠損バックグラウンドにおける「ヒット」により罹患尿細管上皮細胞におけるＰＫＤ機能がホモ接合的に喪失することが示唆される。ＰＫＤ機能喪失は、固有細胞分裂に必要なシグナル伝達機構を崩壊する（すなわち、嚢胞構造での罹患細胞の異常増殖を誘導する）と仮定される。
【００９２】
ＰＫＤ−１遺伝子の直接配列決定により、正常な個体における多型の存在およびＡＤＰＫＤ罹患個体における多数の異なる配列変化が明らかとなった。表２は、現在までの文献中に記載のＰＫＤ−１配列変化の概要を示す。
【００９３】
【表２Ａ】
2004313194.tif 000003
【表２Ｂ】
2004313194.tif 000004
【表２Ｃ】
2004313194.tif 000005
【表２Ｄ】
2004313194.tif 000006
【表２Ｅ】
2004313194.tif 000007
【表２Ｆ】
2004313194.tif 000008
【表２Ｇ】
2004313194.tif 000009
【表２Ｈ】
2004313194.tif 000010
【表２Ｉ】
2004313194.tif 000011
【表２Ｊ】
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【表２Ｋ】
2004313194.tif 000013
【００９４】
ＩＩＩ．ＰＫＤ遺伝子中の固有部位の同定
７０％のＰＫＤ−１遺伝子がＰＫＤ−１と９５％を超える配列が同一の非機能的ホモログとして複製されるという事実により、ＰＫＤ−１固有部位の同定は、遺伝子試験法の開発に重要である。ヒトゲノム配列解読の成功により、ＰＫＤ遺伝子中の固有の部位を、ＰＫＤ遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列とＰＫＤホモログを含むゲノムＤＮＡ配列との比較によって同定することができる。有用なデータベースおよびコンピュータプログラムは当該分野で公知である（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮＣＢＩで利用可能なデータベースおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴおよびＤＮＡＳｔａｒ、ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍで利用可能なコンピュータプログラム）。固有部位は、ＰＫＤホモログまたは他の配列と８０％以下（例えば、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％以下）同一であるＰＫＤ遺伝子中の配列をいう。
【００９５】
いくつかの固有部位（例えば、１コピー部位）は、Ｒｏｓｓｅｔｔｉら、２０００、Ａ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６８、４６〜６３（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。本出願の出願人は、ＰＫＤ−１の新規の固有部位（５’ＡＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＣＧＣＴＧＧ３’または５’ＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧ３’またはその相補的配列）を同定している。他の固有部位は、例えば、米国特許第６，２２８，５９１号および同第６，０３１，０８８号（それぞれ、参照することによりその全体を本明細書中に組み込むものとする）に見出すことができる。
【００９６】
同定された固有部位を、真のＰＫＤ遺伝子増幅用のＰＫＤ特異的プライマーのデザインに使用することができる。固有部位の長さは、数個のヌクレオチドから数千個のヌクレオチドまで変化することができる。同定されたほとんどの固有部位は、１００個以下のヌクレオチド（例えば、５０個以下のヌクレオチドまたは３０個以下のヌクレオチド）を含む。ＰＫＤ特異的プライマーを使用した増幅により、増幅反応の特異性が増加し、ＰＫＤホモログから増幅される副産物が減少する。個体中の対立遺伝子変異（例えば、変異ＰＫＤ遺伝子）を同定するための配列決定または他の分析用のクローニングおよび／もしくは発現に特異的に増幅させた真のＰＫＤ遺伝子産物を使用することができる。
【００９７】
ＩＶ．本発明に有用なＰＫＤ特異的プライマー
変異の有無を分析するためのサンプルは、検出できないほど少量の物質を含む場合がある。したがって、第１の変異検出アッセイステップは、サンプル増幅である。本発明の好ましい増幅反応はＰＣＲである。ＰＣＲ増幅は、プライマーデザイン、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の選択、増幅サイクル数、および試薬濃度などのステップを含む。これらの各工程およびＰＣＲプロセスに関連する他のステップは、増幅産物の純度に影響を与える。複製の忠実度および産物の純度に影響を与えるＰＣＲプロセスおよび因子がＰＣＲ分野で周知であるにもかかわらず、以前は本発明の分離法（例えば、ＤＨＰＬＣ）を使用したＰＫＤ遺伝子の変異検出に関するこれらの因子について取り組んでいなかった。
【００９８】
特異的ストリンジェンシー条件下で真のＰＫＤ遺伝子にアニーリングするがＰＫＤホモログまたは他の配列にアニーリングしない任意のプライマーは、本発明の有用なＰＫＤ特異的プライマーである。同定した固有部位配列を、本発明に有用なＰＫＤ特異的プライマーのデザインの基本として使用する。本発明のプライマーを、ＰＫＤ患者同定用の従来のキットに組み込むことができる。
【００９９】
Ａ．プライマーの選択基準
ＰＫＤ種特異的プライマーは、ＰＫＤ遺伝子の固有の部位中に存在する配列に相補的な配列を含むことが好ましい。ＰＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤホモログ以外の真のＰＫＤ遺伝子にアニーリングすることが好ましい限り、正常または変異ＰＫＤ遺伝子の固有の部位に相補的であり得る。
【０１００】
ＰＫＤ種特異的プライマーを、ＰＫＤ遺伝子について同定した固有部位配列の分析によって手動で選択することができる。ＰＣＲで増幅されるＤＮＡフラグメント配列が公知である場合、市販のソフトウェアを使用して全フラグメントまたはフラグメント内の任意の配列を産生するプライマーを作成することができる。フラグメントの融解マップを、ＭａｃＭｅｌｔ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＥＬＴ（Ｌｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５、４８２、１９８７）、またはＷｉｎＭｅｌｔ（商標）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などのソフトウェアを使用して構築することができる。
【０１０１】
約１８〜２５塩基長で５０％のＧ−Ｃ含量のプライマーは約５２〜５８℃のアニーリング温度で良好に作用することが当該分野で公知である。本発明のプライマーをデザインする場合、これらの性質は好ましい。より長いプライマーまたはＧＣ含量がより高いプライマーは、より高い温度でのアニーリングが最適であり、同様に、より短いプライマーまたはＧＣ含有量の低いプライマーはより低い温度でのアニーリングが最適である。プライマー１７〜２５塩基長の融解温度の概算を得るための便利且つ単純化した式は以下である。
融解温度（Ｔｍ（℃））＝４×（Ｇ数＋Ｃ数）＋２×（Ａ数＋Ｔ数）。
【０１０２】
全デザインプロセスは、広範囲（すなわち、第１ラウンドのＰＣＲ）および狭い範囲のプライマー（すなわち、ネスト化ＰＣＲ）デザインからなる。広範囲のプライマーデザインでは、質の良いＰＣＲ産物を産生するプライマーをデザインすることが目的である。「良質」のＰＣＲ産物は、本明細書中では、ＰＣＲ産物が高収率で産生されることおよびプライマー二量体およびＰＣＲ誘導変異などの不純物の量が少ないことを意味すると定義する。良質のＰＣＲは、他の反応パラメータ（使用酵素、ＰＣＲサイクル数、使用緩衝液の濃度および型、サーマルサイクリングの温度、ならびにゲノムテンプレートの質など）にも影響され得る。良質のＰＣＲ産物の作製法は、Ｅｃｋｅｒｔら（「ＰＣＲ：実践アプローチ」、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕｉｒｋｅ，ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、第１巻、２２５〜２４４、１９９１）で考察されている。この引例およびこの引例中の引例は、参照することによってその全体を本明細書中に組み込むものとする。
【０１０３】
狭い範囲のプライマーのデザインは、２つの要件を満たすべきである。第１に、全ての広範囲プライマーデザイン要件を満たし、良質のＰＣＲ産物が得られるべきである。さらに、ＤＨＰＬＣ法により増幅フラグメント内の変異または多型の位置に関係なく変異または多型を検出可能なフラグメントが産生されなければならない。例えば、数千塩基対までを有する巨大ＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって増幅することができる。増幅の目的が所望フラグメントを増幅することのみである場合、この目的で使用することができるプライマーデザインの許容度は大きい。しかし、ＰＣＲ増幅の目的がＤＨＰＬＣによる変異検出分析用のＤＮＡフラグメントを作製することである場合、ＰＣＲ法で作製したフラグメントが検出可能であり且つＤＨＰＬで分析した場合にシグナルを発生するようにプライマーをデザインしなければならない。本発明の好ましい実施形態では、増幅産物の長さは、１５０〜６００ｂｐである。より好ましい実施形態では、ＤＨＰＬＣ変異検出分析用のフラグメント長は、１５０〜４００ｂｐである。
【０１０４】
狭い範囲のプライマーのデザインには２つの目的が存在する。プライマーデザインの１つの目的は、「変異分析」試験として使用する場合である。別の目的は、研究または診断目的（ＰＫＤ患者の同定）のための分析である。本明細書中では、「変異分析」を、フラグメントが集団中にばらつき（すなわち、変異または多型）を含むかどうかを同定し、このばらつきを疾患に関連付けるためのＤＮＡフラグメントの研究または分析と定義する。本発明の文脈内で、用語「変異」には、疾患についてサイレントである多型は含まれない（例えば、正常）と理解される。ＤＨＰＬＣを変異分析技術として使用する場合、本発明の重要な態様は、変異部位がフラグメント内に存在することに関係なく推定変異を検出することができるフラグメントを産生するためのプライマーのデザイン法である。それに対して、変異が公知である場合、分析が至適化される（すなわち、ＤＨＰＬＣにおけるホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ピークが最大になる）ようにプライマーデザインをさらに改良することができる。公知の変異の分析分離度の改良によって、分析を正確にすることができる。変異診断への適用のために分離度の改良が必要である。さらに、改良された分離度を使用して、変異の正の存在の自動同定を、正常および変異ＤＮＡサンプルのピークの重ね合わせおよび比較測定する適切なソフトウェアおよびアルゴリズムによってより容易に行うことができる。
【０１０５】
変異分析に適用するための別のプライマーデザイン法は、目的の領域がフラグメント内のより低い融解ドメインで存在するようにプライマーをデザインすることである。この場合、エクソンに向かって移動するように分析を行うので、測定されるフラグメントが目的の領域に重ね合わせるようにプライマーを設計することが好ましい。これらの場合、高温融解ドメインと低温融解ドメインとの間の温度差は、５℃を超えることが好ましく、１０℃を超えることが最も好ましい。
【０１０６】
一旦目的の変異が同定されると、診断または臨床用のプライマーを再デザインすることができる。これらの場合、末端により近いいずれかの末端の２５％または２５塩基内に変異が存在することが好ましい。フラグメントの他方の末端は、変異が存在する低温ドメインよりも好ましくは５℃、より好ましくは１０℃、最も好ましくは１５℃高い高温融解ドメインを含む。プライマー選択によりフラグメントの反対側の末端に高温融解ドメインが得られない場合、所望の末端（例えば、Ａ−Ｔリッチな末端）で融解温度を増加させるためにＧ−Ｃクランプを適用することができる（Ｍｙｅｒｓら、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３、３１１１）。Ｇ−Ｃクランピングは、プライマーの片側または両側の５’末端上にさらなるＧ−Ｃ塩基を含む技術である。ポリメラーゼ酵素は、増幅フラグメントに組み込むこれらのさらなる塩基を超えて伸長させて、変異周辺の融解温度と比較してフラグメントの末端の融解温度を上昇させる。例えば、変異が増幅フラグメントの中央に存在し、長さが１００ｂｐ未満であり、融解プロフィールの変化がない場合または変異がフラグメントの高温融解領域に存在し、高温融解領域がＧ−Ｃリッチな領域に存在する場合、Ｇ−Ｃクランプが必要であり得る。これらの場合、適切なプライマー選択により、変異を検出することができるフラグメントが得られる。Ｇ−Ｃクランプのサイズは、４０ｂｐまでであっても、４または５ｂｐほど小さくても良い。ＤＨＰＬＣによる変異検出用の最も好ましいＧ−Ｃクランプは、１０〜２０ｂｐである。
【０１０７】
ＰＣＲ増幅の際に十分にＴｍ内のフラグメント中で一定の融点範囲またはドメインを有するドメインを産生するプライマーをデザイン不可能である場合、ＤＨＰＬＣでの首尾の良い変異検出のために目的のドメインのＴｍを下げる必要があり得る。例えば、ｄＧＴＰのＧ−Ｃ塩基対の融解温度を有効に低下させることが公知のアナログ７−デアザ−２’−ｄＧＴＰとの置換によってこれを行うことができる（Ｄｉｅｒｉｃｋら、１９９３、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１、４４２７）。ドメインのＴｍを上昇させる必要がある場合、ＰＣＲ増幅においてｄＧＴＰの代わりに２，６−アミノプリンを使用することができる。
【０１０８】
最も好ましい実施形態では、フラグメントの「低温融解」ドメイン中に変異が存在するようにプライマーを選択する。しかし、高温融解ドメインがフラグメント中の他のドメインと非常に異なる融点ではない場合またはフラグメントの高温融解ドメインを至適化するより高いカラム温度を使用する場合、フラグメントの高温融解ドメイン中の変異をＤＨＰＬＣで検出することもできる。
【０１０９】
上記の広範囲プライマーデザインを、いくつかの他の因子が考慮された局所プライマーデザインによってさらに改良することができる。例えば、非テンプレートテールを有するプライマー（普遍配列決定プライマーまたはＴ７プロモーターなど）を回避する必要があり得る。好ましいプライマーのＴｍは約５６℃である。正方向プライマーと逆方向プライマーとのＴｍ差は、好ましくは約１℃である。プライマーとテンプレートとの間のＴｍ差は、好ましくは２５℃である。各プライマーの３’五量体は、好ましくはΔＧ°＝６ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも安定している（すなわち、よりネガティブ）。任意の可能なプライマー二量体は、好ましくは３’五量体よりも少なくとも５ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定ではない（すなわち、５ｋｃａｌよりポジティブ）。任意のプライマーの自己アニーリングループのＴｍは、１２℃未満であることが好ましい。プライマーは、好ましくは不都合な配列を含まずに純度が高い。分解を回避するために、純水を使用したＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中で保存することが好ましい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、変異のためには５ｋｂまで（例えば、４ｋｂまで、３ｋｂまで、２ｋｂまで、または１ｋｂまで）の長いフラグメント（例えば、エクソン）を直接分離することがより都合がよい。このような長いフラグメントは、一般に、複数の融解温度のドメインを含む。二本鎖ＤＮＡフラグメントは、温度上昇に反応して変性する温度安定性の異なる、異なる領域として一連の不連続なステップで溶解した。これらの温度安定性の異なる領域を「ドメイン」といい、各ドメインは、約５０〜３００ｂｐ長である。各ドメインは、各自それぞれのＴｍを有し、その各Ｔｍに関連する熱力学的挙動を示す。ドメイン内の塩基ミスマッチの存在により、ドメインが不安定化し、ホモ二重鎖中で見出される完全な水素結合区画と比較してヘテロ二重鎖中のドメインのＴｍは減少する。一般に、塩基ミスマッチの存在により、Ｔｍが約１〜２℃低下する。
【０１１１】
好ましい実施形態によれば、１８〜５１個の塩基長のプライマーおよび配列番号３〜４９のプライマーに対するＤＮＡ配列を使用して、最適な結果が得られた（表３および表４）。しかし、当業者は、使用するプライマーの長さを変化させることができることを認識している。例えば、少なくとも１５個、好ましくは１７個の塩基（これらのプライマー（配列番号３〜４９）のヌクレオチド配列の連続的塩基）を含むより短いプライマーが適切であり得ることが想定される。プライマー長の正確な上限は重要ではない。しかし、典型的には、プライマーは、約６０塩基以下、好ましくは５０塩基以下である。さらに、プライマー中に含まれる塩基を、当該分野では通常の改変（ビオチンまたは蛍光標識などの検出可能な標識の組み込みが含まれるが、これに限定されない）を行うことができる。
【０１１２】
【表３Ａ】
2004313194.tif 000014
【表３Ｂ】
2004313194.tif 000015
【表３Ｃ】
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【表３Ｄ】
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【表３Ｅ】
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【表３Ｆ】
2004313194.tif 000019
【０１１３】
【表４Ａ】
2004313194.tif 000020
【表４Ｂ】
2004313194.tif 000021
【０１１４】
Ｂ．ＰＫＤ特異的増幅に有用なプライマーの組み合わせ。
特異的増幅産物を、１つまたは複数のＰＫＤ特異的プライマーの使用によって作製することができる。好ましくは、１つの増幅産物の作成に使用した両プライマーは、ＰＫＤ特異的プライマーである。しかし、１つのＰＫＤ特異的プライマーを、ＰＫＤ遺伝子の固有部位に相補的ではない別の非ＰＫＤ特異的プライマーと組み合わせて使用することができる。非ＰＫＤ特異的プライマーを、ＰＫＤ特異的プライマーについての上記の同一の基準にしたがってデザインすることが好ましく、ＰＫＤ遺伝子中の固有の配列以外の配列に完全に相補的であることが好ましい。非ＰＫＤ特異的プライマーを、コントロール産物を作製するための増幅反応に含まれるコントロールプライマーとして使用することもできる。
【０１１５】
表４および表５に列挙した１つの正方向および１つの逆方向プライマーの使用によって最適な結果を得ることができるが、他の組み合わせを使用することもできる。好ましい実施形態では、増幅産物の長さが１５０〜６００ｂｐであるように、プライマー対を選択する。好ましい実施形態では、ＤＨＰＬＣ変異検出分析用の増幅フラグメント長が１５０〜４００ｂｐであるようにプライマー対を選択する。
【０１１６】
Ｃ．プライマー合成
プライマー合成法は、当該分野で利用可能である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを、任意の従来のＤＮＡ合成法（Ｎａｒａｎｇら（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏ．、６８、９０）またはＩｔａｋｕｒａ（米国特許第４，３５６，２７０号）に記載のリン酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎら（１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８、１０９）に記載のリン酸ジエステル法、またはＭｕｌｌｉｓら（米国特許第４，６８３，２０２号）に記載のその自動化実施形態など）を使用して調製することができる。特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。
【０１１７】
Ｖ．増幅反応用のテンプレートの調製
配列番号１または２またはその変異体（例えば、多型形態または変異形態）の全部または一部を含む核酸を含む任意のサンプルを、本発明の増幅反応のテンプレートとして使用することができる。本発明の有用なテンプレートには、ゲノムＤＮＡ調製物、全ＲＮＡ調製物、粗細胞溶解物、および組織サンプルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明のＰＫＤ特異的増幅用のテンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用することが好ましい。粗細胞溶解物または組織サンプルを使用することができると想定されるが、当業者は、サンプル中に存在する任意の非ＤＮＡ物質がポリメラーゼ反応またはその後の分析を妨害し得ると認識する。
【０１１９】
組織サンプルまたは細胞からゲノムＤＮＡを単離することができる。好ましくは、本発明でテンプレートとして使用されるゲノムＤＮＡを、分解および汚染を回避する条件下で単離する。ＤＮアーゼ活性がほとんどないか全くなくなるように組織サンプルまたは細胞をプロテアーゼで消化することができる。消化物をＤＮＡ溶媒で抽出する。抽出ゲノムＤＮＡを、例えば透析またはクロマトグラフィーによって精製することができる。適切なゲノムＤＮＡ単離技術は、例えば、「現代の分子生物学プロトコール」、Ａｕｓｕｇｅｌ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｅｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に記載のように当該分野で公知である。
【０１２０】
好ましくは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを個体から採取した組織サンプルの細胞溶解物から抽出し、ＰＫＤ増幅のテンプレートとして使用する。組織サンプルの回収はまた、個体組織由来の培養ヒト細胞のインビトロ採取または、例えば採血、脊椎穿刺、組織塗抹標本、または組織生検による被験体からの直接インビボサンプリング手段を含む。任意選択的に、組織サンプルを、分析前に、分析可能な条件下でサンプルの核酸を保管する周知の保存手段（急速凍結、凍結制御レジメ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅ）、凍結防止剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、プロパンジオール−スクロース）の存在下など）によって保存する。組織サンプルを、分析のための増幅の保存の前後にプールすることもできる。いくつかの実施形態では、サンプルは、２人またはそれ以上の個体由来のＤＮＡ、組織、または細胞を含む。
【０１２１】
本発明の方法の実施のために、核酸を含む任意のヒト組織をサンプリングおよび採取することができる。採取に最も好ましく且つ都合の良い組織は血液である。患者は、採血前に準備する必要はない。投薬がサンプル採取または試験を妨害することは知られていない。有用な無菌技術および汚染の回避が必要である。
【０１２２】
好ましくは、採血日に血液からＤＮＡを抽出する。使用前に血液を室温（７２°Ｆまたは２５℃）で保存することが好ましい。しかし、全血を短期間４℃で保存することができるが、室温が推奨される。全血試料は、４８時間安定であり得る。その後の溶血はＤＮＡ回収および完全性に支障をきたす。ＰＣＲアッセイ用のＤＮＡ抽出に至適な血液量は、５ｍｌを超える（例えば、１０．０ｍｌを超える）ことが好ましい。
【０１２３】
ＶＩ．ＰＫＤ特異的プライマーを使用したＰＣＲ増幅
本発明は、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応での標的核酸を含むサンプル由来のＤＮＡの増幅および特異的増幅産物における標的核酸中の変異の有無の検出による、配列番号１または２またはその変異体を含む標的核酸の変異分析法を提供する。
【０１２４】
当該分野で周知の手段（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写ベースの増幅（逆転写）、鎖置換増幅）によって増幅を行うことができる（「現代の分子生物学プロトコール」を参照のこと）。好ましくは、Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）（その内容が本明細書中で参考として援用される）に記載のようなＰＣＲによって増幅を行う。
【０１２５】
ＰＣＲにより、「プライマー」と呼ばれる小さなＤＮＡ鎖を「テンプレート」に沿って伸長させるためにＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる選択性の高い酵素の利用によって、小さなＤＮＡサンプルまたは任意の塩基対の長さ（サイズ）の他の核酸の増幅（複製）が可能である。小さなＤＮＡサンプルを、テンプレートとして使用する。ＰＣＲは、テンプレートまたはその任意の選択部分中に存在するデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の相補配列を再生する。ＰＣＲは、一般に、例えば、検出限界未満の濃度のＤＮＡサンプルをＰＣＲ法によって増幅し、その後このようにして得られた大量のサンプルを分析する診断技術と組み合わせて使用する。
【０１２６】
ＰＣＲ増幅装置（例えば、Ａｉｒ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））および試薬は、多数の業者から市販されている（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒカタログ「ＰＣＲシステム、試薬、および消耗品」、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）。
【０１２７】
典型的には、ＰＣＲはｐＨ５〜８の緩衝液中で行う。緩衝液は、増幅すべき二本鎖ＤＮＡサンプル、正方向プライマー、逆方向プライマー、マグネシウム（例えば、ＭｇＣｌ2）、および一般に「ｄＮＴＰ」と呼ばれる４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ）（ＤＮＡの構築ブロック）を含む。反応混合物を、ＤＮＡサンプルの変性に十分な温度（例えば、＞９０℃）に加熱し、それにより２つの相補核酸鎖が分離する。あるいは、周囲温度でヘリカーゼ酵素を使用して、ＤＮＡを酵素的に変性することができる。変性が熱に影響を受け、且つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、反応開始前にＤＮＡポリメラーゼを添加する。他の変性条件は当業者に周知であり、米国特許第５，６９８，４００号に記載されている。ＤＮＡポリメラーゼは種々の業者から市販されている（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．））。
【０１２８】
ＰＣＲで複製すべき変性ＤＮＡ鎖の同定部分に相補的になるように、プライマー配列をデザインする。反応物の適切なアニーリング温度への冷却の際、各プライマーを複製すべき変性ＤＮＡサンプルの各鎖中の相補塩基配列にアニーリングする。ＤＮＡポリメラーゼ、４つのｄＮＴＰ、およびＭｇ2+の存在下で約７０℃に加熱し、複製により相補ｄＮＴＰの添加によりその３’末端から鎖の長さに沿ってプライマーが伸長する。ｄＮＴＰは種々の業者から市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．））。このプロセスの多数の反復により、本プロセスの初期段階で所望のＤＮＡ鎖数が相乗的に増加するか、反応液中に十分に過剰な試薬が存在する限り増加する。したがって、元のＤＮＡサンプル量が増加する。
【０１２９】
ポリメラーゼ量は、所定の増幅サイクル数を通してＤＮＡ合成の促進に十分でなければならない。実際のポリメラーゼ量に関するガイドラインは、一般に、ＰＣＲ試薬の供給者が提供しており、あるいは当業者によって容易に決定可能である。好ましくは、校正活性（ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【０１３０】
各プライマーの量は、実質的に過剰量の増幅すべき標的ＤＮＡ量でなければならない。当業者は、反応混合物に必要なプライマー量を、反応の終了後に最終的な所望の増幅フラグメント数に関して評価することができる。
【０１３１】
偽陽性の結果を回避するために、当業者は、当該分野で従来のようにアッセイはネガティブコントロールを含むべきであることを認識する。例えば、適切なネガティブコントロールは、プライマーおよびＤＮＡを含まない（すなわち、「水コントロール」）。偽陰性の結果を回避するために、コントロールプライマーによってポジティブコントロールを得る（以下を参照のこと）。
【０１３２】
Ａ．ＰＣＲ条件の至適化
首尾の良い特異的増幅（例えば、本発明による最大量の特異的増幅産物を産生し、且つ最小量の非特異的増幅産物を産生する増幅）は、対応する適合テンプレートへのＰＫＤ特異的プライマーに非常に依存する。プライマーが反応混合物中の多数の異なる配列に非特異的にアニーリングする場合、増幅プロセスは特異的ではない。ほとんどの実施形態で非特異的アニーリングまたは非特異的増幅が回避される可能性が低いにもかかわらず、非特異的増幅が減少する一方で特異的増幅が増加するようにＰＣＲ増幅反応条件を至適化することが望ましい。
【０１３３】
さらに、非相補塩基をテンプレートに添加するＰＣＲ誘導変異が、サンプル増幅中に形成される場合がある。検出された変異がサンプル中に存在するかＰＣＲプロセス中に産生されたかは明白ではないので、このようなＰＣＲ誘導変異は変異検出結果をあいまいにする。出願人は、ＰＣＲ誘導変異の形成を最小にし、推定上の変異含有サンプルの正確且つ明白な分析を確実にするためのＰＣＲサンプル増幅至適化の重要性を認識していた。
【０１３４】
Ｂ．ＰＫＤ特異的プライマーのＰＫＤ特異的アニーリングの特異性の制御
ＰＣＲによるＤＮＡフラグメント複製の忠実度は、当該分野で長く認識されている多数の要因に依存する。これらの要因のいくつかは、１つの要因の量または濃度の増減によって生じるＰＣＲ産物プロフィールの変化を相殺し得るか異なる要因の変化によって逆になるという意味で相関関係がある。例えば、酵素濃度の増加により複製忠実度が減少し得る一方で、反応温度の低下により複製忠実度が増大し得る。マグネシウムイオン濃度またはｄＮＴＰ濃度の増加により、ＰＣＲ忠実度の減少に影響を与え得る反応速度が増加し得る。ＰＣＲ忠実度に寄与する要因の詳細な考察は、Ｅｃｋｅｒｔら（「ＰＣＲ：実践アプローチ」、１９９１、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕｉｒｋｅ，ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、第１巻、２２５〜２４４）、Ａｎｄｒｅら（１９７７、「ゲノム研究」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、８４３〜８５２）に示されている。これらの引例およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で参考として援用される。したがって、ＰＣＲプロセスの産物プロフィールの利用可能性により、ＰＣＲ条件を非常に有効な様式が得られるように改良することができる。
【０１３５】
ＰＣＲ増幅では、アニーリングの特異性は、第１の数サイクルで最も重要である。残りのサイクルは、最初の数サイクルで増幅されたテンプレートのプールを拡大するためだけに使用される。テンプレートへのプライマーアニーリングの特異性を、緩衝液のイオン強度（主に、Ｋ+濃度）、Ｍｇ2+濃度（ｄＮＴＰに結合するのでｄＮＴＰ量の影響を受ける）、および各複製サイクルのアニーリング温度によって制御する。好ましい実施形態では、ｄＮＴＰ濃度は、５０ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ、より好ましくは２００ｎＭである。
【０１３６】
特定のテンプレート標的へのプライマーの特異的アニーリング条件を、通常、アニーリング温度の幾らかの上昇の変化およびアガロースゲル電気泳動による増幅プロセスの特異性および感度の比較によって経験的に決定しなければならない（「現代の分子生物学プロトコール」、前出を参照のこと）。
【０１３７】
ＰＫＤ特異的プライマーに相補的な固有領域はホモログ配列と数個のヌクレオチドのみ（１つのヌクレオチドのみの場合もある）が異なり得るので、増幅反応の特異性は反応で使用した各ＰＫＤ特異的プライマーについて試験する必要がある。
【０１３８】
上記のプライマーアニーリング温度の計算式は、大まかな指針であり、その後の異なるアニーリング温度での試験は、ＰＫＤ特異的増幅反応におけるこの重要なパラメータを至適化する有用な方法である。特定のプライマー−温度対の異なるアニーリング温度の同時試験に装置を利用することができ、これは最適なアニーリング温度を迅速且つ確実に決定することができる（例えば、ロボサイクラー・グラジエント・テンペラチャー・サイクラー、カタログ番号４００８６４、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；エッペンドルフマスターサイクラーグラジエント、カタログ番号５３３１  ０００．０４５、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、プライマー対のＴｍよりも１℃〜１０℃高いアニーリングおよび伸長温度で標的配列を増幅する。この温度での増幅は不十分であるにもかかわらず、得られた任意のプライマー伸長物は標的特異的である。したがって、高温サイクル中、サンプルは特定の標的配列が富化し、任意のサイクル数（すなわち、１〜１５サイクル）で産物特異性が向上する。次いで、アニーリング温度を低下させて増幅効率を上げ、検出可能な量のＰＣＲ産物を得ることができる。テンプレートとして第１のＰＣＲ反応物由来の増幅産物を使用してネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）増幅反応を行うこともできる（以下を参照のこと）。
【０１４０】
あるいは、最少量の非特異的産物を含む高収率の特異的産物を得るための至適条件を定義するために、一定の温度であるがＫＣｌまたはＭｇＣｌ2濃度が異なるか、種々の量のホルムアミド（例えば、０、２、４、６％）、ＤＭＳＯ（１〜１０％）などの変性剤を添加する反応を同時に行うことができる。
【０１４１】
１つの実施形態では、配列番号３〜４９からなる群から選択される少なくとも１つを含むプライマー対を、増幅反応混合物で使用する。１つまたは複数の特異的に増幅する産物が作製されるように、２つのプライマーは逆方向である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ＰＫＤ特異的増幅で使用するプライマーが配列番号３〜４９から選択される場合、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよびＭｇＣｌ2溶液を含むＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ  ＥｌｍｅｒのｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼＸＬ＆ＸＬ緩衝液ＩＩパック、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＴａｑＰｌｕｓ精密ＰＣＲシステムを使用した。ＰＦＵＴｕｒｂｏ（商標）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから提供されているより高い校正を有する別の忠実度の高いＤＮＡポリメラーゼである。
【０１４３】
他の実施形態では、配列番号３〜４９から選択されるプライマーを使用したＰＫＤ特異的増幅に６５℃を超えるアニーリング温度（例えば、６８〜７２℃）を使用する。
【０１４４】
一般に、プライマーおよびテンプレートを添加後にＤＮＡポリメラーゼを増幅反応混合物に添加することが好ましいが必須ではない。あるいは、例えば、酵素およびプライマーを最後に添加するか、反応緩衝液またはテンプレート＋緩衝液を最後に添加する。一般に、重合に不可欠な少なくとも１つの成分がプライマーおよびテンプレートが共に存在するときまで存在せず、酵素が所望のプライマー／テンプレート基質に結合および伸長することができることが望ましい。「ホットスタート」と呼ばれるこの方法は、「プライマー−二量体」の形成を最少にし、増幅特異性を改良する。
【０１４５】
ＤＮＡポリメラーゼの特異性の程度は、使用した反応条件および使用酵素の型で変化する。完全にエラーのないプライマー伸長が得られる酵素は存在しない。したがって、非相補塩基を随時移入することができる。このような酵素関連エラーにより、元のＤＮＡサンプルの正確なコピーではないがＰＣＲ誘導変異を含む二本鎖ＤＮＡ産物が得られる。他のＰＣＲプロセスの特徴（反応温度、プライマーアニーリング温度、酵素濃度、ｄＮＴＰ濃度、Ｍｇ2+濃度、およびその組み合わせなど）は全て本明細書中に記載のＰＣＲプロセスによるＤＮＡ複製の精度または忠実度の低下させる可能性がある。
【０１４６】
Ｃ．ＰＫＤ特異的増幅感度
本発明のＰＫＤ特異的増幅感度は、増幅反応で使用したテンプレートおよびプライマーならびに増幅の各サイクルのイオン強度およびアニーリング温度に依存する。
【０１４７】
テンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用する場合、反応条件が至適化されている場合に首尾の良いＰＣＲ増幅には１つまたは２つほどのテンプレートコピー（約３〜５ｐｇ）を使用することができる。しかし、より高いテンプレート濃度により増幅の特異性および効率を増大することができることが当該分野で公知である。
【０１４８】
長いフラグメントよりも短いフラグメントのほうが増幅効率が高い。好ましくは、１ｋｂ未満、より好ましくは６００ｂｐ長未満、または４５０ｂｐ長未満の増幅産物を作製するプライマーを使用して、増幅アッセイの感度を上げる。
【０１４９】
好ましくは、増幅アッセイの感度は、１００ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。より好ましくは、アッセイ感度は１０ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。より好ましくは、アッセイ感度は１ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。より好ましくは、アッセイ感度は０．１ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。さらにより好ましくは、アッセイ感度は０．０１ｎｇゲノムＤＮＡテンプレート未満である。
【０１５０】
Ｄ．ネスト化増幅
本発明のいくつかの実施形態では、テンプレートとして最初の増幅反応の増幅産物を使用してネスト化増幅を行う。好ましくは、ネスト化増幅反応は、テンプレートとして最初のＰＣＲ反応由来のＰＣＲ増幅産物を使用したネスト化ＰＣＲである。プライマーのアニーリング温度の至適化に加えて、「ネスト化」増幅を使用して、ＰＫＤ特異的増幅アッセイの特異性および感度を上げることができる。
【０１５１】
例えば、ネスト化ＰＣＲを含む方法は、２つの連続するＰＣＲ反応を含む。少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含む第１のプライマー対（例えば、ＰＫＤ特異的プライマーおよびコントロールプライマーまたは２つのＰＫＤ特異的プライマー）を使用した多サイクルのＰＣＲ後（例えば、１０〜４０、１０〜３０、または１０〜２０サイクル）、少量のアリコートの第１の反応物（例えば、５０μｌの反応物のうち１μｌ）を、第１の対の内部または第１の対の間に存在する配列にアニーリングする少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含む新規のプライマー組（例えば、ＰＫＤ特異的プライマーおよびコントロールプライマーまたは２つのＰＫＤ特異的プライマー）を使用した第２の多サイクル（例えば、１０〜４０、１０〜３０、または１０〜２０サイクル）ＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用する。
【０１５２】
ネスト化プライマーのデザインおおびネスト化ＰＣＲ法は、当該分野で公知である（現代の分子生物学プロトコール、前出を参照のこと）。上記のプライマーの一般的な選択基準もまた、ネスト化プライマーのデザインに適用する。両ネスト化プライマーは第１のプライマー対の内部（例えば、プライマー内）の配列および少なくとも１つのネスト化プライマーにアニーリングする必要があるが、本発明によれば、ＰＫＤ特異的であることが必要である。
【０１５３】
ネスト化ＰＣＲ法を使用して、ＰＫＤ特異性が２倍の首尾よく増幅したテンプレートを選択する。１つのプライマー対のみでは失敗する場合、ネスト化ＰＣＲの使用により、種特異的産物の収率も非常に増大し、アッセイ感度を挙げることができる。
【０１５４】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含むサンプルを使用して、増幅反応用のＤＮＡテンプレートを得ることができる。好ましくは、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用する。ゲノムＤＮＡを含むサンプルを反応混合物で使用する場合、配列番号〜４９からなる群から選択される少なくとも１つを含むプライマー対により、少なくとも２つの特異的増幅産物（ゲノムＤＮＡテンプレート中の各ＰＫＤ対立遺伝子由来の産物）が作製される。
【０１５５】
Ｅ．増幅コントロール
コントロールプライマーを、ＰＫＤ特異的増幅のポジティブコントロールとして使用することができる。コントロールプライマーを、ＰＫＤ特異性増幅用の同一の反応混合物に添加するか、同一のパラメーター下の同一のＰＣＲ装置で運転するコントロール反応に添加することができる。コントロールプライマーは、ＰＫＤ遺伝子とＰＫＤホモログとの間の任意の同一の配列に相補的な配列を含み得る。好ましくは、コントロールプライマーによりそのサイズが少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含むプライマー対によって増幅されたサイズと区別することができる１つの増幅産物が作製される。コントロールプライマーによる増幅産物のサイズは、少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含むプライマー対によって作製した増幅産物のサイズより大きくても小さくても良い。好ましくは、少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含むプライマー対によって同一の増幅反応で作製した増幅産物と比較して少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも５００ｂｐ、より好ましくは少なくとも１０００ｂｐサイズが異なるコントロール産物が作製されるようにコントロールプライマーを選択する。
【０１５６】
ＰＫＤ特異的プライマーがアニーリングする位置で欠失したＰＫＤ対立遺伝子を分析する場合、コントロール増幅は特に重要である。増幅コントロール産物の存在下での特異的増幅の欠損は、ＰＫＤ遺伝子の特定の位置での欠失を示し得る。いくつかの実施形態では、反応混合物中に１対を超えるコントロールプライマーを使用する。
【０１５７】
本発明の遺伝子試験法で使用することができる種々のコントロールについては実施例２を参照のこと。
【０１５８】
増幅産物を精製して当該分野で公知の方法による増幅に使用した遊離のプライマーを除去することができる（例えば、「現代の分子生物学プロトコール」、前出）。好ましい実施形態では、Ｅｄｇｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＱｕｉｃｋｓｔｅｐ（商標）の９６ウェルＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ産物を精製する。
【０１５９】
ＶＩＩ．ＰＣＲ増幅産物の存在の検出
ＤＮＡ変性、プライマーアニーリング、およびプライマーの５’末端によって規定されるＤＮＡセグメントの合成のサイクルを、検出に十分な量の種特異的または普遍産物のいずれかが利用可能になるまでテンプレート標的の増幅に必要な回数だけ反復する。増幅反応の完了後、増幅産物の存在を当該分野で従来の技術を使用して検出することができる。
【０１６０】
検出を容易にするために、プライマーを標識することができる。プライマーを、検出可能なタグ（例えば、32Ｐ、35Ｓ、14Ｃ、または125Ｉなどの放射性標識、フルオレセインまたはローダミンなどの蛍光化合物、ペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素、またはアビジンもしくはビオチン）で直接標識することができる。ＰＫＤ特異的産物の作製に使用するＰＫＤ特異的プライマーおよびコントロール産物の作製のみで使用するコントロールプライマーは、同一または異なる標識を有し得る。
【０１６１】
好ましい実施形態では、増幅産物をゲル電気泳動によって分析することが都合がよい。
【０１６２】
フラグメントの所望の分離度をもたらす条件下で電気泳動を行う。通常、約５００ｐｂほど小さいサイズが異なるフラグメントを分離する分離度で十分である。好ましくは、分離度は約１００ｂｐである。より好ましくは、分離度は約１０ｂｐである。フラグメントのサイズを評価するために、サイズマーカーもまたゲル上で電気泳動することができる。特異的増幅産物の予備サイズ分析は、ＰＫＤ遺伝子内の挿入または欠失を示すことができ、その後のＤＨＰＬＣおよび配列分析から得た結果と併せて、得られた情報を解釈することができる。
【０１６３】
増幅産物パターンを視覚化することができる。増幅プライマーを標識した場合、この標識を明らかにすることができる。分離された標識ＤＮＡフラグメントを含む基質を、標識の存在を検出する試薬と接触させる。例えば、放射性標識プライマーから作製された増幅産物を、オートラジオグラフィーで検出することができる。増幅プライマーが検出されない場合、ＰＣＲ産物を有する基質を、臭化エチジウムと接触させて、ＤＮＡフラグメントを紫外線下で視覚化することができる。
【０１６４】
ＶＩＩＩ．ＰＣＲ増幅産物の分離
完全に相補的な配列のみがアニーリングし、１つまたは複数の非相補ヌクレオチドを含む配列はアニーリングしない最もストリンジェントな条件下で、ＰＫＤ特異的プライマーは、真のＰＫＤ遺伝子テンプレートのみとアニーリングし、ＰＫＤホモログとはアニーリングしない。したがって、最もストリンジェントな条件下では、ＰＫＤ特異的プライマーは、ＰＫＤ特異的であるか特異的な逆方向プライマーと組み合わせて、ＰＫＤホモログではなく真のＰＫＤテンプレートから増幅産物のみを作製する。しかし、典型的なＰＣＲ増幅反応の際、ＰＫＤ特異的プライマーは、特にＰＣＲ反応に必要な温度サイクリングによって真のＰＫＤ遺伝子およびＰＫＤホモログを含むテンプレートにアニーリングすることができる。したがって、特異的増幅産物および非特異的増幅産物をの両方を産生することができるにもかかわらず、非特異的増幅産物の量を少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーの使用によって減少させることができる。
【０１６５】
Ａ．ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の形成
本発明の１つの実施形態では、ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物を、ＤＨＰＬＣ分析前に形成する。標準的な核酸ホモ二重鎖（例えば、正常なＰＫＤ対立遺伝子由来の増幅産物）をサンプルに添加し、混合物の約９０℃または約９５℃への加熱によって混合物を変性させることができる。変性プロセスで形成された変性一本鎖核酸を、混合物の周囲温度への緩やかな冷却によってアニーリングする。サンプルが変異を含む場合、ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との新規の混合物が形成される。サンプルが変異を含まない場合、標準的な核酸のホモ二重鎖のみが形成される。好ましい実施形態では、標準的な核酸は、「正常な」核酸である。
【０１６６】
ほとんどの場合、ＰＫＤ患者は、ＰＫＤ遺伝子を含む遺伝子座でヘテロ接合性である。すなわち、キャリアはたった１つのＰＫＤ対立遺伝子および変異形態を有し、正常な形態（例えば、野生型）の他の対立遺伝子を有する。ほとんどのＰＫＤ変異により優性表現型が得られるので、ＡＤＰＫＤの発症リスクの付与には１つの変異対立遺伝子で十分である。両方の対立遺伝子が変異しているが、それぞれ１つまたは複数の異なる変異を有する場合、別のヘテロ接合状況が存在する。ヘテロ接合性ＰＫＤ患者について、少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含むプライマー対を使用したＰＣＲ増幅（ネスト化ＰＣＲ増幅を含む）により、少なくとも２つの特異的増幅ＰＫＤ産物（各対立遺伝子由来の産物）が得られる。２つの特異的増幅ＰＫＤ産物同一の長さであってもなくてもよく（例えば、１つの対立遺伝子上の変異が欠失または挿入を含む場合、異なる長さ）、それぞれの産物由来の少なくとも１つのヌクレオチドで異なる。
【０１６７】
増幅産物を変性し、互いに再アニーリングして二重鎖を形成することができる。正常な対立遺伝子由来の特異的増幅産物または変異対立遺伝子由来の特異的増幅産物が同一の対立遺伝子由来の別の特異的増幅産物にアニーリングする場合、これらはホモ二重鎖を形成する。しかし、正常な対立遺伝子由来の特異的増幅産物が変異対立遺伝子由来の特異的増幅産物にアニーリングする場合、これらはヘテロ二重鎖を形成する。
【０１６８】
まれな場合、変異はホモ接合性形態である（すなわち、個体（例えば、ＰＫＤ患者）中の両対立遺伝子は同一の変異を含む）。ホモ接合性ＰＫＤ患者からサンプルを採取する場合、ＰＣＲ増幅により、変性および再アニーリングの際にヘテロ二重鎖を形成することができる特異的増幅産物は得られない。本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＫＤ特異的プライマーを含むプライマー対を有する増幅により正常なＰＫＤ遺伝子由来の特異的増幅産物が産生されて、ＰＣＲ増幅後の変性および再アニーリングプロセスの際にヘテロ二重鎖の形成が確実になるように、正常な（例えば、野生型）ＰＫＤ遺伝子を含むサンプルをＰＣＲ反応混合物に添加する。
【０１６９】
変性および再アニーリングプロセスで形成されたホモ二重鎖はまた、非特異的増幅産物によって形成されるものを含み得る。非特異的増幅産物が得られるテンプレート対立遺伝子（例えば、ＰＫＤホモログ配列）中の配列が１つまたは複数の変異も含むような非常にまれな場合、ヘテロ二重鎖もまた形成され得る。非特異的増幅産物間で形成されたヘテロ二重鎖を、さらなる同定プロセスの分離にも供する。
【０１７０】
Ｂ．ヘテロ二重鎖の分離および同定
ＰＫＤ特異的増幅産物によって形成されたヘテロ二重鎖の存在は、ＰＫＤ遺伝子中の変異の存在を示す。ヘテロ二重鎖野分離によって、変異対立遺伝子が、（例えば、個体から）採取したサンプル中に存在するかどうかを同定することができる。この分離プロセスにより非特異的増幅産物が除去され、それにより正常な対立遺伝子由来の特異的増幅産物は、変異対立遺伝子およびＰＫＤ患者の同定効率および特異性を改良する。
【０１７１】
ヘテロ二重鎖は塩基対ミスマッチ部位で選択的に変性し、ヘテロ二重鎖の残存物（すなわち、相補塩基対を含むヘテロ二重鎖の一部）の変性に必要な低温で「バブル」を形成することがＤＮＡ分野で周知である。ミスマッチ塩基間の水素結合が相補塩基間の水素結合よりも弱いので、一般に部分変性と呼ばれるこの現象が起こる。したがって、変異部位でのヘテロ二重鎖の変性にはエネルギーはあまり必要ないので、鎖の残存物中よりも塩基対ミスマッチ部位でヘテロ二重鎖を部分的に変性するためには低温を必要とする。
【０１７２】
ヘテロ二重鎖中の少なくとも１つの塩基対が相補的でない場合、その部位の塩基の分離にはホモ二重鎖中の完全に相補的な塩基対アナログと比較して少ないエネルギーを使用する。これにより、ホモ二重鎖と比較してヘテロ二重鎖の融解温度が低下する。局所変性より、塩基対ミスマッチ部位に「バブル」（一般名）が形成される。バブルは、同一の塩基対長の完全に相補的なホモ二重鎖と比較してＤＮＡフラグメント構造が歪んでいる。部分的変性条件下でのこの構造のゆがみを、ヘテロ二重鎖とホモ二重鎖を分離するためのＤＨＰＬＣの基本として使用する。
【０１７３】
「変性ＨＰＬＣ」（ＤＨＰＬＣ）と呼ばれる分離プロセスは、ヘテロ二重鎖（変異の存在から得る）を分離すること、および同一のｂｐ長を有するホモ二重鎖によって変異体が検出された。ＤＨＰＬＣを経に検出に適用する（例えば、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７、９９６；Ｌｉｕら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２６、１３９６を参照のこと）。この分離は、ヘテロ二重鎖がホモ二重鎖よりも融解温度（Ｔｍ）が低いという事実に基づく。ＤＨＰＬＣを部分的変性温度（すなわち、塩基ミスマッチ部位でのヘテロ二重鎖の変性に十分な温度）で行う場合、ホモ二重鎖を、同一の塩基対長を揺するヘテロ二重鎖から分離することができる（Ｈａｙｗａｒｄ−Ｌｅｓｔｅｒら、１９９５、Ｃｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５、４９４；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１９３；Ｄｏｒｉｓら、１９９７、ＤＨＰＬＣ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらの引例およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で参考として援用される。したがって、ＤＨＰＬＣの使用を、変異検出に適用した（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７、９９６；Ｌｉｕら、１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２６、１３９６）。ＤＨＰＬＣは、一定の条件下でわずか１つの塩基対が異なるヘテロ二重鎖を分離することができる。上記の引例およびこの引例中の引例を参照することによってその全体を本明細書に組み込むものとする。
【０１７４】
規則正しい二重鎖由来のＤＮＡ構造の塩基対を含まない無秩序かつ重なっていない構造への変化は、二重鎖−ランダム鎖移行（ｈｅｌｉｘ−ｒａｎｄｏｍ  ｃｈａｉｎ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）（すなわち、融解）と呼ばれる。天然の配列の二本鎖分子についての温度の関数としてこの変化を示す平衡の統計学的機械的分析は、Ｗａｒｔｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｎｔｒｏｌｌ（１９７２、Ａｄｖ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．、２２、１２９）に示されている。この理論は、各塩基対が以下の内２つの可能な状態（積み重ね、らせん、および水素結合または無秩序）でのみで存在することができると仮定する。塩基配列および非常に少数の経験的に較正したパラメーターのみが与えられた場合、任意の温度で各塩基対がらせんまたは融解する可能性を計算可能である。統計的−機械的理論は、各塩基対または塩基付近のクラスターの本来の安定性の相違、隣接塩基対がらせんまたは融解（協同性）している可能性に対する隣接らせん構造の影響、および両末端がらせん構造で区切られた場合の無秩序領域の高次構造自由度の制限を考慮する。
【０１７５】
厳密に区切られた一連の温度工程での可能性の計算および補間法の繰り返しにより、各塩基対がらせんと融解状態との間で５０／５０の平衡を保つ温度中心点が同定される。ＭＥＬＴプログラムにより、温度中間点およびいくつかの他の関数が得られる。分子に沿った位置の関数としての温度中心点のプロットを、融解マップと呼ぶ。これは、隣接塩基対の融解が個体間の安定性の相違にもかかわらず分子の実質的な長さを超えて密接に結合することを明白に示す。ほとんど同一の温度で全ての塩基が融解するドメインと呼ばれるわずかに長い領域（３０〜３００ｂｐ）の存在が典型的である。融解マップは分子の最も低い融解ドメインをそのまま表す。
【０１７６】
部分的変性温度では、サンプル配列中の塩基対ミスマッチを有するヘテロ二重鎖はミスマッチ部位で変性し、残りのサンプル配列は無傷のままである。部分的変性へテロ二重鎖を、ＤＨＰＬＣを使用して分離および検出することができる。
【０１７７】
ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物を分離するための部分変性条件下（例えば、ＤＨＰＬＣ）でＨＰＬＣを使用する場合、ヘテロ二重鎖は、通常、ホモ二重鎖の前に溶出される。
【０１７８】
本発明の特定の実施形態では、ＤＨＰＬＣによってホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離および同定し、ヘテロ二重鎖の存在はＰＫＤ遺伝子中の少なくとも１つの変異（例えば、変異対立遺伝子中に存在する１つまたは複数のヌクレオチドの置換（または１つまたは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失））の存在を示す。
【０１７９】
別の特定の実施形態では、ＤＨＰＬＣ勾配を、Ｔｒａｎｓｆｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）のＷａｖｅｍａｋｅｒ（商標）４．０ソフトウェアによって決定する。
【０１８０】
分離への適用には、変異がフラグメント上のどこに存在するかに関係なく変異を検出することができることが必要である。この状況では、変異はフラグメントの中央または高温融解ドメイン中に存在し得るが、両者とも検出が困難である。フラグメントの融解温度範囲のばらつきは１０℃未満が好ましく、ばらつきの範囲が５℃未満であることが最も好ましい。
【０１８１】
いくつかの変異分析では、ＤＨＰＬＣ分析でたった２つのピークまたは部分的に解析されるピークが認められる。２つのホモ二重鎖ピークは、１つのピークまたは部分的に解析されたピークとして認められ、２つのヘテロ二重鎖ピークは、１つのピークまたは部分的に解析されたピークとして認められ得る。いくつかの場合、部分的変性条件下では広がった最初のピークのみが認められる。
【０１８２】
サンプルがサンプル長のホモ接合性ＤＮＡフラグメントを含む場合、ヘテロ二重鎖が形成されないので、ハイブリッド形成およびＤＨＰＬＣによる分析により任意の温度で１つのピークのみが得られる。本方法の操作では、既知の野生型フラグメントとのホモ接合性サンプルとのハイブリッド形成および部分的変性温度でのＤＨＰＬＣ分析の実施によって変異を同定することができる。サンプルが正常な対立遺伝子を含む場合、ヘテロ二重鎖が形成されないので、ＤＨＰＬＣ分析では１つのピークが認められる。サンプルがヘテロ接合性変異対立遺伝子を含む場合、ＤＨＰＬＣでの分析により、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離が認められる。
【０１８３】
５０％の一定の融解ドメインが変性する温度もまた、温度に対するＤＮＡサンプルのＵＶ（ＵＶ）吸光度のプロッティングによって実験的に贈呈することもできる。吸光度は、温度に伴って増加し、得られたプロットを融解プロフィールと呼ぶ（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、８３、３７４６；Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ、１９８７、「任意の反応分子数の移行についての熱力学的データの計算」、２２１、Ｍａｒｋｙら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。融解プロフィールに対する吸光度の軸の中心点は、融解温度（Ｔｍ）（すなわち、二重鎖中のＤＮＡ鎖の５０％が変性する温度）を示す。本発明の１つの実施形態では、この認められたＴｍを、変異検出用のＤＨＰＬＣの出発温度として使用する。次いで、この温度を、異なるコントロールを使用して認められたパターンにしたがって調整する（以下を参照のこと）。１つの実施形態では、一定のＴｍを使用して、異なるサンプル由来の同一のアンプリコン（すなわち、同一のプライマー対によって産生される）を分析する。
【０１８４】
本発明の別の実施形態では、ＭＥＬＴ（Ｌｅｒｍａｎら、１９８７、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５、４８２）またはＷｉｎＭｅｌｔ（商標）バージョン２．０などのソフトウェアを使用して、変異検出用のＤＨＰＬＣ実施のための出発温度として使用する計算したＴｍが得られる。これらのソフトウェアプログラムは、塩基対の安定性がそれぞれ異なるにもかかわらず、隣接する塩基部位の融解温度は密接に協力している（すなわち、協同効果が存在する）ことを示す。したがって、融解温度が適切に一定している「ドメイン」と呼ばれる３０〜３００塩基対長の領域が存在する。類似の様式では、ソフトウェアＭＥＬＴＳＣＡＮ（Ｂｒｏｓｓｅｔｔｅら、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２２、４３２１）は、ＤＮＡフラグメントにおける融解ドメインおよびその対応する融解温度を計算する。１つのヘテロ変異部位の選択温度での任意のドメイン部分の変異の検出が可能であるので、一定温度の融解ドメインの概念は重要である。
【０１８５】
別の特定のヘテロ二重鎖の分離および同定法は、適合イオン核酸クロマトグラフィー（Ｍａｔｃｈｅｄ  Ｉｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＭＩＰＣ）である。二本鎖核酸と一般的にはＤＮＡとの混合物有効に分離するために、分離が塩基対長に基づくＭＩＰＣを導入した（米国特許第５，５８５，２３６号、同第６，２８７，８２２号；Ｈｕｂｅｒら、１９９３、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、３７、６５３；Ｈｕｂｅｒら、１９９３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１２、３５１）。これらの引例およびこの引例中の引例は、その全体が本明細書中で参考として援用される。ＭＩＰＣ分離は１０分以内に完了し、５分以内に完了することが多い。ＭＩＰＣシステム（ＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡフラグメント分析システム、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）は、カラムおよびカラムインレット部を含むコンピュータ制御のオーブンを備えている。
【０１８６】
ＤＨＰＬＣおよびＭＩＣＰはヘテロ二重鎖の分離および同定について説明した方法であるにもかかわらず、当該分野で公知の他の方法をヘテロ二重鎖の同定に使用することもできることが理解される。例えば、高分離能ゲル基質でのヘテロ二重鎖分析もまた、１つのヌクレオチド多型でさえも検出することができる。（Ｈａｕｓｅｒら、１９９８、Ｐｌａｎｔ．Ｊ．、１６、１１７〜２５）。ヒトＰＫＤ遺伝子の３’末端中のＳＮＰを検出するための増幅産物の分析のためにＰＣＲ／ＯＬＡ法を使用することができる（Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ、１９９４、「分子生物工学：組換えＤＮＡの原理と応用」、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７〜２００）。当業者は、本発明の方法の実施における分析手段として増幅産物の高次構造感受性ゲル電気泳動を使用することもできる。（Ｍａｒｋｏｆｆら、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．、６、１４５〜５０）。１つの塩基の置換、欠失、または挿入を検出することができるＰＣＲ−制限フラグメント−ＳＳＣＰなどの技術によってこれを達成することができる（Ｔａｗａｔａら、１９９６、Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．、１２（３〜４）、１２５〜２７；Ｌｅｅら、１９９２、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０５、２８９〜９３）。従来の任意の種々のスラブまたはキャピラリー電気泳動法の使用によって、増幅産物分析のための電気泳動を迅速且つ高感度に行い、実施者は任意の容易な核酸フラグメント検出手段（放射性核種、ＵＶ吸収、またはレーザー誘導蛍光（Ｋｅｐａｒｎｉｋら、１９９８、Ｅｌｅｃｔｏｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９、２４９〜５５；Ｉｎｏｕｅら、１９９８、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．、８０２、１７９〜８４；Ｄｏｖｉｃｈｉ、１９９７、１８、２３９３〜９９；Ａｒａｋａｗａら、１９９７、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．、１５、１５３７〜４４；Ｂａｂａ、１９９６、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６８７、２７１〜３０２；Ｃｈａｎら、１９９７、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．、６９５、１３〜１５）が含まれるが、これらに限定されない）の使用を任意選択的に選択することができる。任意選択的に任意の種々の蛍光色素を使用して、分析を容易にするために本発明のプライマーまたは増幅産物を標識することができ、この色素には、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＴＩＯ−ＰＲＯ−１、チアゾールオレンジ、Ｈｅｘ（すなわち、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオロセイン）、ピクログリーン、エダンス、フルオレセイン、ＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン）、またはＴＥＴ（すなわち、４，７，２’，７’−テトラクロロ−６−カルボキシフルオロセイン）（例えば、Ｓｋｅｉｄｓｖｏｌｌ  ａｎｄ  Ｕｅｌａｎｄ、１９９５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２３１、３５９〜６５；Ｉｗａｈａｎａら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２１、５１０〜１４、５１６〜１９）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
変異検出の目的でホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離を行うための好ましい実施懈怠における本発明の使用では、上記の混合物の変性およびアニーリングによってＤＮＡサンプルを正常なＤＮＡフラグメントとハイブリッド形成させる。ＤＮＡサンプルを、正常なＤＮＡと直接ハイブリッド形成することができる。ＤＮＡサンプルを、ＰＣＲによって増幅し、その後正常なＤＮＡとハイブリッド形成することもできる。あるいは、ＰＣＲ増幅前に正常なフラグメントをサンプルに添加することができる。次いで、増幅混合物を、増幅後にハイブリッド形成することができる。これら３つの各ハイブリッド形成シナリオでは、サンプル中に変異が存在する場合、ホモ二重鎖とヘテロ二重鎖との混合物が得られる。このようにして調製したサンプルを、本発明の方法を使用した変異の存在について、部分的変性条件下（好ましくは、５６〜５８℃）でのＤＨＰＬＣによって分析する。
【０１８８】
本発明の方法を変異の存在について多数のサンプルの分離のために使用する場合、フラグメント一括範囲のための広範囲勾配を使用した各サンプルの分析の高速化によってサンプル処理量を有意に増加させることができる。
【０１８９】
本発明の全ての実施形態および態様では、ＤＨＰＬＣカラムで分離および溶出されたとき、核酸フラグメントが検出される。核酸を検出することができる任意の検出器を、ＤＨＰＬＣ変異検出法で使用することができる。好ましい検出器は、オンラインＵＶ検出器である。ＤＮＡフラグメントを蛍光標識または放射性標識でタグ化する場合、それぞれ蛍光検出器または放射能検出器を使用することができる。検出後、分離フラグメントを個別にビデオディスプレイ上に表示するかプリンターでプリントする。このようにして表示したフラグメントは、ピークまたはレーン中のバンドとして認められる。
【０１９０】
Ｃ．ＰＫＤ−２およびＰＫＤ−１固有領域についてのＤＨＰＬＣ評価に有益な品質管理
ＤＨＰＬＣでヘテロ二重鎖−ホモ二重鎖混合物とホモ二重鎖のみとを区別する化学的原理により、（１）緩衝液の組成、（２）分析時のオーブン温度、（３）カラム条件、および（４）サンプル注入時のシステム条件に非常に感度の高い方法が得られる。溶出パターンのゆらぎは正常であり、アンプリコンのサイズおよび配列ならびに分析時の特異的ＤＨＰＬＣ条件に依存して変化する。当業者は、例えば、ＤＨＰＬＣ装置の製造者から提供されたプロトコールにしたがって得られた溶出パターンを解釈する知識をもっている。しかし、ゆらぎ範囲の限度は、条件がＤＮＡ変異体を有効に分離すると予想される範囲内であることを確実にするのを援助するのに適切である。以下の品質管理コントロール溶液は、一貫したアッセイパフォーマンスを確実にするための各分析条件について確立した有用な例である。
【０１９１】
１．無ＤＮＡコントロール
このコントロールは、試薬および材料が患者の分析を妨害し得る特定のシグナルを発生しないことを示す。いくつかの実施形態では、コントロールは、例えば組織から抽出したＤＮＡを含むサンプルに同一の処理をした無ＤＮＡサンプルにおいて最小のシグナル（正常なコントロールピークの高さの１０％未満）を示さなければならない。分析システムのハードウェアの全てが各サンプル分析で再利用され、ＤＨＰＬＣ分析は成分の分離であるので、正常なコントロールの１０％までのピークの高さが許容される。異なる配列との実際の汚染により、１０％汚染物質を検出すると予想されない配列決定に反射して惹起される偽りの正のＤＨＰＬＣパターン差が得られる。配列の相違が検出される事象では、フラグメントは、結果を確認するためにＰＣＲポイントから繰り返される。同様に、正常配列の１０％の事実上正の汚染は、存在するＤＮＡの５０％が既に正常であるので、パターンを有意に変化させないと予想される。非常にわずかなパターンの変化が１０％過剰によって混乱されるまれな場合は、注入中の正常なＤＮＡは、感度の推定値が７８〜９６％である。しかし、アンプリコンを分析するたびにＤＮＡシグナルが認められないことは、全体的および持続的なＤＮＡシグナルの消滅を最小にするかなくすために分析条件を変化させる必要がある。
【０１９２】
２．正常コントロール
１つの実施形態では、正常コントロールのパターンは、歴史的パターンに一致しなければならない。確立されたパターンとの一致は、許容可能な増幅、保持時間、ピークの高さ、およびピークの形状を示す。したがって、実施例においてＰＣＲおよびＤＨＰＬＣ条件（機械および緩衝液など）を行う。確立された正常コントロールパターンと比較したところ、ホモログまたは他の非特異的増幅シグナルは存在しない。
【０１９３】
３．ポジティブコントロール
ポジティブコントロールは、確立されたＤＨＰＬＣ分析条件（ポジティブコントロールのヘテロ二重鎖を検出する）が分析時に有効であることを示すために使用された「ＤＨＰＬＣ分析条件のコントロール」である。正常なコントロールと区別され、歴史的パターンと一致するポジティブコントロールパターンは、許容可能な保持時間、ピークの高さ、ピークの形状、およびパターンを示す。ヘテロ二重鎖検出は、各フラグメントに至適な特異的ＤＨＰＬＣ分析条件が患者分析時に有効であることを示す。コントロールは必ずしもＰＫＤポジティブシグナルではないことに留意することが重要である。各８３ＰＫＤフラグメントについての特異的ＰＫＤポジティブサンプルは利用できない。存在しない場合、分析時に適切な分析条件を示すポジティブ指標として別のヘテロ二重鎖（ポジティブおよび正常コントロール）を使用する。
【０１９４】
４．さらなるポジティブコントロール
さらなるポジティブコントロールにより、この特異的変異についての歴史的パターンに一致するパターンが得られ、これを使用して非常に共通する多型を分離することができる。一般に、特異的ＤＮＡ変異体からサンプルからサンプルに高度に再生可能な固有の性質のヘテロ二重鎖パターンが得られる。確立されたパターンに一致するパターンは、許容可能な保持時間、ピークの高さ、ピークの形状、およびパターンを示す。特異的ヘテロ二重鎖パターンは、このＤＮＡ変異体に至適な特異的ＤＨＰＬＣ分析条件が患者の分析の際に有効であるので、これに適合する患者のパターンを共通の多型を有すると見なすことができることを示す。共通多型についてのこの任意選択的な分離法は、固有のアンプリコンおよび変異体に非常に特異的であり、変異体に対して固有の適切な確認研究に依存する。
【０１９５】
Ｄ．ＤＨＰＬＣ結果の分析
ＤＨＰＬＣが分離プロセスであるので、正常コントロールと異なるシグナルを有する任意の検体（例えば、ＤＮＡ、細胞溶解物、または組織サンプル）を、潜在的なポジティブと見なし、環境に依存して利用可能ないくつかのオプションのうちの１つで処理すべきである。いくつかの実施形態のために、弱すぎて解釈できないシグナル（正常コントロールのピーク高さの２５％未満）は、ＰＣＲの失敗、波動輻射（ｗａｖｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）の失敗、またはサンプル特有のいくつかの他の散発的な装置の問題によって発生し得る。オプションには、ＰＣＲポイントの反復、波動輻射（全てのコントロールを使用）の反復、または決定的でない波動の報告、および配列決定が含まれる。正常コントロールとパターンが異なるシグナルを、ポジティブと見なし、「Ｐ」と記録し、配列決定すべきである。正常コントロールパターンとほんのわずか異なるシグナルを「Ｂ」と記録し、配列決定すべきである。正常コントロールシグナルよりもはるかに強力なシグナルを「Ｐ」と記録し、配列決定すべきである。患者の検体はこれらの結果のみに基づいて得ていないことに留意のこと。使用した特異的オプションは、アンプリコンおよびそのＤＨＰＬＣ動作歴ならびに検体についての特異的環境によって変化する。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＤＨＰＬＣから放出された結果のみが波動分析によって「正常」と記録された結果である。正常と記録されるために、検体のＤＨＰＬＣパターンは、以下のＱＣ基準によって正常なコントロールと一致しなければならない。（ａ）ピーク数、（ｂ）ピークの高さ、（ｃ）ピークパターン、（ｄ）保持時間、（ｅ）ベースラインの形状。言い換えれば、個体の検体のパターンは、妥当な推定ばらつき範囲内で正常コントロールの外観でなければならない。必要ならば、検証データ基準パターンを考察する。ＤＨＰＬＣ分離感度を、正常コントロールと実質的に異なるパターンの計数によって評価した。パターンが真に正常コントロールと異なると考えられる場合、疑いの余地がなく、ポジティブと記録して配列決定に移る。特異的アンプリコンの要件を満たし、正常コントロールと一致するパターンを有する配列を記録し、正常とみなす。
【０１９７】
「一致する」と判断するために使用した特定の数値の基準には、（ａ）ピークがシグナル強度の局所的最大を示すピーク数、（ｂ）ピークの高さまたは最大シグナル強度（通常、正常コントロールの高さの０．５倍と２．０倍との間）、（ｃ）ピークの保持時間（対応する正常コントロールと比較して＋／−６０秒でなければならない）が含まれるが、これらに限定されない。ピークパターンは、ピーク内の各傾斜の変化の相対的対応ならびに複合体パターン内の各ピークの相対強度および保持時間によって判断される。ベースラインパターンは、通常、全てのサンプルにおいて滑らかで一貫している。相対的に低いベースラインの変化は、ホモ二重鎖ピークと有意に異なる保持時間で溶出およびおそらく融解するヘテロ二重鎖を示し得る。各アンプリコンについての保持時間およびピークの高さの基準を、実施例に添付の表に明記する。
【０１９８】
１つの実施形態では、ピークパターン評価は、（１）正常コントロールと同一の運転コントロール基準を満たすサンプルシグナルと、（２）運転コントロールとの相対的比較に基づいた正常コントロールと一致するサンプルシグナルパターンとの組み合わせである。正常コントロールパターンは、運転毎にわずかに変化すると予想されるにもかかわらず許容可能であるので、正常と記録した各サンプルは、（１）正常コントロールと同一の運転コントロール基準、（２）上記の正常コントロールと各患者サンプルとの比較において固有の相対コントロール基準を満たす組み合わせである。患者サンプルパターンのわずかな変化は正常コントロールの絶対的運転基準と一致することが明白なようであり、運転内での正常と患者との相対的比較を使用すると明白である。運転内の相対的比較は常に歴史的パターンと交換可能であり、正常コントロールはコントロール基準をパスし、運転は許容されると予想される。
【０１９９】
ＩＸ．ヘテロ二重鎖の検証
任意選択的に、同定したヘテロ二重鎖を、１つまたは複数の制限酵素での増幅産物の消化によって検証することができる。この目的に有用な制限酵素を、真のＰＫＤ遺伝子配列とＰＫＤホモログ配列との比較またはＰＫＤ多型の比較によって選択する。本発明の有用な制限酵素により、真のＰＫＤ遺伝子およびＰＫＤホモログについての区別可能なフラグメントプロフィールが作製される。このような制限酵素の例には、ＰｓｔＩ、ＳｔｕＩ、ＸｍａＩ、ＭｌｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＦｓｐＩ、ＭｓｃＩ、およびＢｌｎＩが含まれるが、これらに限定されない。有用な制限酵素はまた、正常なＰＫＤ遺伝子および変異ＰＫＤ遺伝子についての区別可能なフラグメントプロフィールを作製することができる。ＰＫＤ遺伝子とＰＫＤホモログ遺伝子または正常なＰＫＤ対立遺伝子と変異ＰＫＤ対立遺伝子との単純比較によってより多数の制限酵素を同定することができることが理解される。切断部位を破壊するか作製するために他方の配列中ではなく一方の配列中に認識部位または切断部位を有する制限酵素を、本発明の有用な制限酵素と見なすことができる。核酸の制限後に変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）または上記の電気泳動（制限−キャピラリー電気泳動を含む）における得られたフラグメントの分離およびフラグメントの長さまたは異なるフラグメントの移動度の分析を行う。
【０２００】
Ｘ．ＤＨＰＬＣによって同定されたヘテロ二重鎖の配列決定
ＤＨＰＬＣによって同定された１つまたは複数の変異の存在を示すヘテロ二重鎖を、クローン化し、増幅し、そして／または配列決定することができる。当該分野で公知の任意の配列決定法を使用して、ヘテロ二重鎖を配列決定することができる。いくつかの実施形態では、同定されたヘテロ二重鎖を、ＰＣＲ増幅用のテンプレートとして使用し、増幅産物をＳｅｑｕｅｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって配列決定する。好ましい実施形態では、配列番号３〜４９を含むプライマーの１つを使用して配列決定を行う。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、同定したヘテロ二重鎖を増幅し、プラスミド（例えば、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、カタログ番号４５６０−０１）にクローン化後、配列決定する。ＰＣＲフラグメントを含むプラスミドを、当該分野で周知の方法によって増殖させ、配列決定する。
【０２０２】
ＸＩ．本発明の方法によって同定したＤＮＡ変化
ＡＤＰＫＤと診断された個体で多数のヌクレオチドおよびアミノ酸変化を同定した。図１４は、本発明の１つの実施形態によるＡＤＰＫＤ患者由来のＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２ヌクレオチドならびにアミノ酸配列で同定された変化の非限定的な例のリストをまとめる。図１４に示す配列の位置は、ＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２（イントロンなし）についてそれぞれ図１５および１６で開示したヌクレオチドまたはアミノ酸の位置に対応する。
【０２０３】
図１４に列挙したヌクレオチドおよびアミノ酸変化は、当該分野で公知の変化および本発明の出願人によって初めて同定された新規の変化の両方を含む。本発明で公知および新規の変化をＡＤＰＫＤと診断された個体と関連させるように同定し、それにより、図１４に開示された公知および新規の変化の両方を、ＰＫＤに起因するＡＤＰＫＤの診断または下記の他の臨床的用途のためのマーカーとして使用することができる。各ヌクレオチド配列変化を同定するために使用することができるプライマーも図１４に示す（例えば、ＰＫＤ１Ｘ１、ＰＫＤ１Ｘ３６など）。プライマーの配列を、上記の表３に開示する。
【０２０４】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号３〜４９からなる群から選択されるプライマーを提供する。
【０２０５】
１つの実施形態では、本発明は、図１４に開示された１つまたは複数のヌクレオチド配列変化を含む単離ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０６】
別の実施形態では、本発明は、図１４に開示された１つまたは複数の新規のヌクレオチド配列変化（太字で示す）を含む単離ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０７】
別の実施形態では、本発明は、図１４に開示された１つまたは複数のアミノ酸配列変化を含む精製ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明は、図１４に開示された１つまたは複数の新規のアミノ酸配列変化（太字で示す）を含む精製ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリヌクレオチドを提供する。
【０２０９】
好ましくは、１つまたは複数の配列変化を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、ＡＤＰＫＤのマーカーとして使用する。
【０２１０】
ＸＩＩ．本発明の方法の臨床用途および変化の同定
本出願書類に記載の遺伝子試験法は、ＡＤＰＫＤの病因であると報告されているスプライス連結受容体／供与体配列を含むＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２のコード領域のＤＮＡの変化の同定を目的とする。以下を医師が評価するために本方法を行う。
【０２１１】
Ａ．症状を示す個体のＰＫＤに起因するＡＤＰＫＤの診断。
Ｂ．発症年齢または発症年齢付近の個体における１つまたは２つの嚢胞の存在を示す超音波の結果の追跡。
Ｃ．家族歴、超音波、および他の臨床データからの決定が好ましいかどうか分らないＡＤＰＫＤ（１型および２型）の異なる変異体の診断。
１つの実施形態では、本発明は、個体のＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列を同定するステップを含み、図１４に開示されたＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列中の１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在が前記個体のＡＤＰＫＤを示す、個体のＡＤＰＫＤの診断方法を提供する。
Ｄ．一旦家族にＡＤＰＫＤ発端者が同定された場合の他の危険性のある家族のメンバーの遺伝子カウンセリングの決定および提供。
Ｅ．移植の場合の生存関連ドナーの適合性の決定。
【０２１２】
本発明は、変異ＰＫＤ遺伝子の有無およびＡＤＰＫＤの有無の検出方法を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、個体の変異ＰＫＤ遺伝子の有無を決定する方法であって、ａ）前記個体のＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列を同定するステップと、ｂ）ステップａ）のヌクレオチド配列を図１４に開示されたＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２遺伝子のヌクレオチド配列のヌクレオチド配列の変化と比較するステップと、ｃ）図１４に開示された１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化の存在を検出するステップとを含み、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列変化の存在が前記個体のＡＤＰＫＤを示し、任意の前記ヌクレオチド配列変化の非存在が前記変異ＰＫＤ−１および／またはＰＫＤ−２遺伝子の非存在を示す方法を提供する。
【０２１３】
ＸＩＩＩ．キット
本発明はまた、本発明の変異分析法およびＰＫＤ患者同定法を行うためのキットを提供する。本発明は、変異ＰＫＤ遺伝子の有無およびＡＤＰＫＤの有無を検出するためのキットを提供する。
【０２１４】
本発明の方法による本発明のキットの実施形態には、配列番号３〜４９および／またはその相補的配列からなる群から選択される少なくとも１つの単離した第１の核酸が含まれる。キットは、さらに、第１の核酸と逆方向である第２の核酸であって、第１および第２の核酸が配列番号１または２の配列を含むテンプレート核酸のフラグメントを増幅する少なくとも１つの単離した第２の核酸と、パッケージング材料とを含んでもよい。本発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、テンプレート核酸、制限酵素、コントロールオリゴヌクレオチドプライマー、ｄｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応緩衝液、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含み得る。試薬に加えて、本発明のキットは、本発明の方法の実施のための取扱い説明書を含むことが好ましい。キットは、好ましくは、ユニットコンテナに封入し、所望の結果を得るために相互に操作するようにデザインされた予め測定した量の試薬を含み得る。
［実施例］
【０２１５】
本発明を、以下の材料と方法を使用する以下の非限定的な実施例によって例示する。
【実施例１】
【０２１６】
［試薬、特定の備品、および装置］
Ａ．化学薬品
以下は、ＰＫＤ−１増幅およびＤＨＰＬＣ（ＷＡＶＥ）分析で使用した化学薬品のリストである。
１％アガロース、１×ＴＢＥ、臭化エチジウムを含む５４ウェルゲル（Ｅｍｂｉｔｅｃ、カタログ番号ＧＥ４５８０）
２％アガロース、１×ＴＢＥ、臭化エチジウムを含む５４ウェルゲル（Ｅｍｂｉｔｅｃ、カタログ番号ＧＥ４５８２）
９６ウェルゲル濾過ブロック（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９１７５１）
Ｑｕｉｃｋｓｔｅｐ（商標）９６ウェルＰＣＲ精製キット（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号９９６０５）
ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよびＭｇＣｌ2溶液を含むＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０８−０２４１）
ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＸＬ＆ＸＬ緩衝液ＩＩパック（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号Ｎ８０８−００１９３）
ＴａｐＰｌｕｓ精密ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００２１１）
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｄ−２６５０）
Ｒｅａｄｙ−Ｌｏａｄ  １００ｂｐＤＮＡラダーまたは等価物（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、カタログ番号１０３８０−０１２）
Ｒｅａｄｙ−Ｌｏａｄ  １ｋｂＤＮＡラダーまたは等価物（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、１８００−８２８−６６８６、カタログ番号１０３８０−０１０）
ＢｉｇＤｙｅターミネーターレディ反応キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号４３０３１５０）
ゲル濾過カートリッジ（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４２４５３）
Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｓｉｎｇｅｌ（商標）（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、カタログ番号５０６９１または５０６９３）
オリゴヌクレオチド（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
ＷＡＶＥ変異スタンダード（２０９ｂｐ）（カタログ番号５６００７７）（１８０μｌ）
アセトニトリル−ＨＰＬＣグレード（ＶＷＲ、カタログ番号ＢＪ０１５−１）
ＨＰＬＣグレード水（ＶＷＲ、カタログ番号ＢＪ３６５−４）
酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、カタログ番号ＳＰ５８９０）
【０２１７】
Ｂ．試薬および溶液
１０μＭのオリゴヌクレオチドプライマー：ＴＥ緩衝液に溶解した１０μＭの作業アリコートのＰＣＲプライマーをＰｒｅ−ＰＣＲ冷却装置に４℃で保存すべきであり、配列決定プライマー作業アリコートを、Ｐｏｓｔ−ＰＣＲ冷却装置に４℃で保存すべきである。
【０２１８】
溶液Ｘ−１２７：アップグレードブルーデキストランの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）溶液
１５ｍｌの滅菌遠心分離用コニカルチューブ中で０．５ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８．０）（溶液Ｘ−３５）、５００ｍｇのブルーデキストラン、ＡＮＤ９．５ｍｌの高圧蒸気滅菌し、濾過滅菌したＤｉＨ2Ｏを組み合わせる。ボルテックスによって溶液を完全に混合する。
【０２１９】
溶液Ｘ−１２６：アップグレードゲルローディング緩衝液：１．５ｍｌの滅菌微量遠心分離チューブ中で、２００μｌの脱イオンホルムアミドおよび４０μｌのアップグレードブルーデキストランの５０ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液（溶液Ｘ−１２７）を組み合わせる。完全にボルテックスする。
【０２２０】
ＷＡＶＥ溶液Ａ：溶液Ａ（０．０２５％ＡＣＮ）
２Ｌの調製物：１００ｍｌイオン対合剤（ＴＥＡＡ）
５００μｌアセトニトリル（ＡＣＮ）
ＨＰＬＣグレート水で２Ｌにする。
ＷＡＶＥ溶液Ｂ：溶液Ｂ（２５％ＡＣＮ）
２Ｌの調製物：１００ｍｌイオン対合剤（ＴＥＡＡ）
５００ｍｌアセトニトリル（ＡＣＮ）
ＨＰＬＣグレート水で２Ｌにする。
ＷＡＶＥシリンジ洗浄溶液：シリンジ洗浄液（８％ＡＣＮ）
２Ｌの調製物：１６０ｍｌアセトニトリル（ＡＣＮ）
ＨＰＬＣグレート水で２Ｌにする。
ＷＡＶＥ溶液Ｄ：溶液Ｄ（７５％ＡＣＮ）
２Ｌの調製物：５００ｍｌＨＰＬＣグレート水
アセトニトリル（ＡＣＮ）で２Ｌにする。
【０２２１】
Ｃ．装置および備品
【表５】
2004313194.tif 000022
【実施例２】
【０２２２】
［手順］
段階Ｉ：患者検体由来のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの調製
Ｐｕｒｅｇｅｎｅ（商品名）ＤＮＡ抽出キットを使用して、全血またはリンパ球からＤＮＡを抽出した。これらの試薬を使用して抽出したＤＮＡは、アッセイに特異的な条件下で首尾よくＰＣＲ増幅されるはずである。プロトコール中で特定したアッセイの実行および確認済みのポジティブＤＮＡコントロールを用いて得られた結果との比較によってこれを試験する。
抽出したＤＮＡを定量し、２６０／２８０比は１．４以上得ある。より低い比のサンプルは、ＤＮＡの品質が不十分であり、ＰＣＲ標準を満たさないことを示す。アッセイの最終結果が解釈されない場合、サンプルを再抽出すべきである。
【０２２３】
段階ＩＩ：ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
ＰＣＲ反応混合物およびサイクリングパラメータ（例えば、ＰＫＤ−１遺伝子のエクソン１）を、表５に例示のように調整する。ＰＣＲ条件を同様に調整するが、他のエクソンの特異的且つ行こうな増幅について至適化する。
【０２２４】
【表６−１】
2004313194.tif 000023
【０２２５】
１つのワックスビーズを各ウェルに添加し、８０℃で５分間サーマルサイクラー中でインキュベートしてワックスを溶かし、２５℃でさらに５分間インキュベートし、さらなる操作のために氷上に置く。
【０２２６】
【表６−２】
2004313194.tif 000024
【０２２７】
【表６−３】
2004313194.tif 000025
【０２２８】
【表７】
2004313194.tif 000026
【０２２９】
【表８】
2004313194.tif 000027
【０２３０】
ＰＣＲ増幅フラグメントを、確認済みのポジティブコントロールＤＮＡコントロールと、サイズ、シグナル強度、および移動パターンについて比較することができる。ＰＣＲ増幅フラグメントのサイズを、ゲル上の分子量マーカー（ＤＮＡ  ＭＡＳＳ（商標）Ｌａｄｄｅｒ−Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）との比較によって決定する。範囲の狭いＤＮＡ分子量ラダーにより、臭化エチジウムでのゲルの染色により二本鎖（１００〜２０００ｂｐ）ＤＮＡの６つのバンドが得られる。
【０２３１】
段階ＩＩＩ：ＰＣＲ産物のＤＨＰＬＣ分析
ＰＣＲ増幅産物によって形成されたヘテロ二重鎖を、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｏｍａｈａ、ＮＥ  ６８１６４）のＷＡＶＥ核酸フラグメント分析システムを使用して分析する。
【０２３２】
段階ＩＶ：サイクル配列決定
表９および１０は、本発明の１つの実施形態で使用した配列決定条件の例を提供する。
【０２３３】
【表９】
2004313194.tif 000028
【０２３４】
【表１０】
2004313194.tif 000029
【実施例３】
【０２３５】
［結果のまとめ］
１つの実験では、ＰＫＤ−１遺伝子のエクソン１〜３４中の変異の検出を、以下のサイズのＤＮＡフラグメントを増幅するための８つの異なる第１ラウンドのＰＣＲ反応中の８セットのオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって行った。ａ）ＬＲ１は２．２ｋｂであり、エクソン１を含む、ｂ）ＬＲ２は４．６ｋｂであり、エクソン２〜７を含む、ｃ）ＬＲ３は４．２ｋｂであり、エクソン８〜１２を含む、ｄ）ＬＲ４は４．４ｋｂであり、エクソン１３〜１５を含む、ｅ）ＬＲ５は３．４ｋｂであり、エクソン１５（３’末端）〜２１を含む、ｆ）ＬＲ６は０．３ｋｂであり、エクソン２２を含む、ｇ）ＬＲ７は４．２ｋｂであり、エクソン２３〜２８を含む、ｈ）ＬＲ８は５．８ｋｂであり、エクソン２９〜３４を含む。第１ラウンドの増幅由来の増幅産物を１：１０4または１：１０5に連続希釈して、ゲノム汚染物を除去し、その後第２ラウンドのネスト化ＰＣＲでのテンプレートとして使用した。ネスト化ＰＣＲ産物をヘテロ二重鎖にし、ＤＨＰＬＣにて配列の変化についてスクリーニングした。各フラグメントを、アンプリコンに特異的な温度およびアセトニトリル勾配を使用して正常およびポジティブコントロールに対して分析した。ＤＨＰＬＣ分析によってポジティブな任意の試験サンプルを、精製および配列決定した。サイクル配列決定産物を、ＡＢＩ３７７自動化シークエンサーで分離し、結果を、配列決定ソフトウェアの分類を使用して分析した。表１１〜１２および図１〜１３は、本発明のいくつかの実施形態の結果および手順を示す。
【０２３６】
【表１１】
2004313194.tif 000030
【０２３７】
【表１２】
2004313194.tif 000031
【０２３８】
他の実施形態
上記の実施例は、本発明を構築および実施した本発明者らによって実施および熟慮した実験を示す。これらの実施例には、本発明の実施技術の通告、およびその有用性の証明のために使用する技術の開示が含まれると考えられる。本明細書中に開示の技術および実施形態は好ましい実施形態のみであり、一般に、多数の等価な方法および技術を使用して同一の結果を達成することができることが当業者に認識される。図面および表を含む全ての出願書類、特許書類、および明細書で参照された文献は、その全体を参照することにより本明細書中に組み込むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】本発明の１つの実施形態で使用されるＰＫＤ１  ｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３３２４３）を示す図である。エクソンおよびＰＣＲ産物連結点を、ヌクレオチド配列の上に示す。アミノ酸を、各コドンの中央の下に示す。
【図２】１つの実施形態によるＰＫＤ遺伝子のエクソン配列と２つのホモログ配列との比較を示す図である。ＰＫＤまたはホモログ配列のいずれかのみを切断する制限酵素部位を示す。
【図３】１つの実施形態による４つの正常なサンプルおよびヌクレオチド１１６０６での１９ｂｐ挿入（重複）（コドン３７９９）のＰＫＤ１エクソン４０ＤＨＰＬＣパターンを示すグラフである。
【図４】１つの実施形態による正常なコントロールおよびヌクレオチド１１６０６での１９ｂｐ挿入（重複）配列（コドン３７９９）のＰＫＤ１エクソン４０配列を示すグラフである。
【図５】１つの実施形態によるイントロン５推定多型（ＩＶＳ５−９−＞Ａ）およびヌクレオチド１５０２でのフレームシフト（インサートＧ）のＰＫＤ１エクソン６ＤＨＰＬＣパターンを示すグラフである。
【図６】１つの実施形態によるイントロン５推定多型（ＩＶＳ５−９−＞Ａ）のＰＫＤ１エクソン６配列を示すグラフである。
【図７】１つの実施形態によるヌクレオチド７５１８でのフレームシフト、コドン２４３６（インサートＣ）および共通の多型Ｃ７６５２ＴのＰＫＤ１エクソン１８ＤＨＰＬＣパターンを示すグラフである。
【図８】１つの実施形態による正常なコントロールおよびヌクレオチド７５１８でフレームシフトを有する配列（コドン２４３６（インサートＣ））のＰＫＤ１エクソン１８配列を示すグラフである。
【図９】１つの実施形態によるソフトウェア推定融解プロフィールおよびエクソン末端付近での部分的融解を確立するために必要な多数の温度の例を示すグラフである。
【図１０Ａ】本発明の１つの実施形態において同定された患者のＤＮＡ変異表現型を示すチャートである。
【図１０Ｂ】本発明の１つの実施形態において同定された患者のＤＮＡ変異表現型を示す表である。
【図１１】本発明のいくつかの実施形態において使用したＤＨＰＬＣ（ＷＡＶＥ）をまとめた表である。
【図１２】本発明のいくつかの実施形態において使用したＰＣＲ条件をまとめた表である。
【図１３】本発明の１つの実施形態における患者の検体処理工程を示す略図である。
【図１４】本発明の１つの実施形態によるＡＤＰＫＤ患者由来のＰＫＤ−１およびＰＫＤ−２ヌクレオチドならびにアミノ酸配列において同定された新規および公知のヌクレオチド変化およびアミノ酸変化の非限定的な例を示す表である。本明細書中で使用される、「新規の」には、太字で記載された変化をもたらす未知の予想される疾患（unknown predicted disease; ＵＰＤ）が含まれる。Ｘはエクソンであり、ＩＶＳは介在配列であり、ＫＰは既知の多型であり、ＵＰは未知の多型であり、ＵＡＡは未知のアミノ酸変化である。
【図１５】本発明の１つの態様による野生型ＰＫＤ−１のｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図１６】本発明の１つの態様による野生型ＰＫＤ−２のｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図１−１】
2004313194.tif 000032
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
2004313194.tif 000040
【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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