(57)【要約】【課題】短時間で実験を行うことができる、しかも高い効率の遺伝子導入方法を提供すること。【解決手段】宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、エレクトロポレーション、リポフェクション等の方法により宿主細胞にポリヌクレオチドを導入した後、賦活培地での賦活培養を行わずに選択培地での培養を行うことを特徴とする、簡便且つ高い効率が得られる方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、（Ｉ）宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する工程、（ＩＩ）賦活培地で懸濁する工程、（ＩＩＩ）選択培地における培養を行う工程を、この順序で連続して行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記（Ｉ）の工程をエレクトロポレーション法により行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記（Ｉ）の工程をリポフェクション法により行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
導入されるポリヌクレオチドが、アンピシリン及び／又はクロラムフェニコールに対する耐性遺伝子を含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する簡便な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入し、遺伝子やタンパク質を発現させることは、遺伝子の機能解析のためには必須となる技術である。そのため、種々の宿主細胞にポリヌクレオチドを導入することにより、遺伝子やタンパク質を発現させることを目的として、様々な技術や試薬の改良が試みられている。
【０００３】
例えば、宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する方法としては、主として物理法と化学法とが知られており、化学法が先に発見され普及した。
【０００４】
化学法は、例えば、大腸菌の場合には、塩化カルシウム溶液などで細胞を処理し、氷上でポリヌクレオチドと共存させた後、４２℃で短時間温め、再度氷上で２分程度冷却した後に、賦活培地にて１時間程度３７℃にて培養し、選択培地に植菌するものである。
【０００５】
物理法は、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を含み、例えば、エレクトロポレーション法の場合、大腸菌では対数増殖期の細胞を純水などの塩をほとんど含まない溶液にて洗浄し、氷上にてポリヌクレオチドと共存させた後、短い時間高電圧をかけることで細胞に一時的に小孔を生じさせポリヌクレオチドを導入し、賦活培地にて１時間程度３７℃にて培養し、選択培地に植菌するものである。
【０００６】
また真核細胞、特に培養細胞の場合には、化学法として上記の方法のほかにリポフェクション法が知られている。リポフェクション法は、主に正に荷電しているリポソーム（カチオンリポソーム）とポリヌクレオチドとの複合体を形成させ、該カチオンリポソームを負に荷電している細胞表面に吸着させ、細胞膜と融合させることによって、細胞内にポリヌクレオチドを導入させる方法である（非特許文献１，２参照）。最近、本出願人は、このリポフェクション法が原核細胞にも適用可能であることを見出した（未公開特許出願１参照）。
【０００７】
しかしながら、上記のエレクトロポレーション法又はリポフェクション法において、細胞にヌクレオチドを導入した後、約１時間程度賦活培地で培養し、遺伝子導入操作による細胞のダメージを回復し、導入した薬剤耐性遺伝子の発現を待ってから選択培地で再び培養するのが常識である（例えば、非特許文献１、２等参照）。
【０００８】
また、以下に示すように、市販されている遺伝子導入を行うためのキットの説明書（マニュアル又はプロトコール）等にも、遺伝子を導入した細胞を賦活培地で培養した後に、選択培地で培養するように記載されている。
【０００９】
例えば、宝酒造株式会社の「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ  ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１マニュアル（非特許文献３）」には、「（４）パルスをかけた後、直ちに融解後氷冷しておいた１ｍｌのＳＯＣ培地を加える。（５）３７℃で１時間振盪する（１６０〜２２５ｒｐｍ）。」と記載されている。
【００１０】
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社の「Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ    Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓマニュアル（非特許文献４）には、「６．  Ｐｕｌｓｅ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅｏｎｃｅ，  ｔｈｅｎ  ｑｕｉｃｋｅｌｙ  ｒｅｍｏｖｅ  ｔｈｅ  ｃｕｖｅｔｔｅ．  Ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ａｄｄ  ９６０μｌ  ｏｆ  ３７℃−ｓｔｅｒｉｌｅ  ＳＯＣ  ｍｅｄｉｕｍ  ｔｏ  ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｓ．  ７．  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｓｔｅｒｉｌｅ  １５−ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ  ２０５９  ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｔｕｂｅ．    Ｉｎｃｕｂａｔｅ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ  ａｔ  ３７℃  ｆｏｒ  １  ｈｏｕｒ  ｗｈｉｌｅ  ｓｈａｋｉｎｇ  ａｔ  ２２５−２５０ｒｐｍ．（６．サンプルに一度パルスをかけ、キュベットを取り去る。すぐに３７℃の無菌のＳＯＣ培地を９６０μｌ添加し、再び懸濁する。  ７．細胞懸濁液を無菌の１５ｍｌファルコン２０５９ポリプロピレンチューブに移す。サンプルを２２５〜２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１時間培養する。）」と記載されている。
【００１１】
ニッポンジーン社の「Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｐ．）使用法（非特許文献５）」には、「エレクトロポーレション後、Ｈｉ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ  Ｂｒｏｔｈ  １ｍｌを加え、１．５ｍｌマイクロチューブに移す。３７℃にて１時間放置。選択培地に塗布。」と記載されている。
【００１２】
エピセンターテクノロジー社の「ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（登録商標）ＥＣ１００  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ    エレクトロポーレーションプロトコール（非特許文献６）」には、「４．エレクトロポーレーターのメーカー推奨のセッティングでエレクトロポーレートします。  ５．すぐに室温のＳＯＣ培地９５０μｌを加えます。キュベットの中で細胞懸濁液をピペットで混合します。６．細胞懸濁液を滅菌した培養チューブに移します。ゆっくり振盪（２２５ｒｐｍ）しながら３７℃、１時間インキュベートします。  ７．細胞を１：１０希釈、１：１００希釈し、適当な抗生物質入りのプレートにそれぞれの希釈液を１００μｌプレーティングします。プレートを３７℃ｏｖｅｒｎｉｇｈｔインキュベートします。」と記載されています。
【００１３】
従って、宿主細胞に遺伝子の導入を行った後に賦活培養を行わないと、その細胞に負担がかかり、遺伝子導入効率が悪くなるなどの悪影響が出るものと考えられている。
【００１４】
【非特許文献１】
サムブルック・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ）及びディー．ダブリュー．ラッセル（Ｄ．Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ）著，「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」，（米国），第３版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），２００１年
【００１５】
【非特許文献２】
ウイリアム・ジェイ・ダウアー（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．  Ｄｏｗｅｒ），ジェフ・エフ・ミラー（Ｊｅｆｆ  Ｆ．  Ｍｉｌｌｅｒ）及びチャールズ・ダブリュー・ラグスドール（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｗ．  Ｒａｇｓｄａｌｅ）著：「ハイ・エフィシェンシー・トランスフォーメーション・オブ・イー．コリ・バイ・ハイ・ボルテージ・エレクトロポレーション（Ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）」，「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」，１９８８年，Ｖｏｌ１６，Ｎｏ．１３，ｐ．６１２７−６１４５
【００１６】
【非特許文献３】
「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｃｅｌｌｓ  ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１マニュアル」，宝酒造株式会社，２００２年度版
【００１７】
【非特許文献４】
「Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ    Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓマニュアル」，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
【００１８】
【非特許文献５】
「Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｐ．）マニュアル」，ニッポンジーン社，２００２年度版
【００１９】
【非特許文献６】
「ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（登録商標）ＥＣ１００  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓマニュアル」，エピセンターテクノロジー社，２００２年度版
【００２０】
【未公開特許出願１】
特願２００２−１３２１９７
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、短時間で、効率の高い遺伝子導入方法を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の如き従来技術の問題点を解決するために、鋭意研究を重ねてきた。その結果、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する際に、エレクトロポーレーション法又はリポフェクション法を行った後、賦活培地で懸濁を行い、選択培地に植菌して培養を行っても、従来の方法通りに賦活培養を行った場合と変わらないか、又はそれを上回る遺伝子導入効率が得られることを見出した。
【００２３】
即ち、本発明は、以下のポリヌクレオチドを導入する方法に関する。
【００２４】
１．宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、（Ｉ）宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する工程、（ＩＩ）賦活培地で懸濁する工程、（ＩＩＩ）選択培地における培養を行う工程を、この順序で連続して行うことを特徴とする方法。
【００２５】
２．上記（Ｉ）の工程をエレクトロポレーション法により行うことを特徴とする、上記項１に記載の方法。
【００２６】
３．上記（Ｉ）の工程をリポフェクション法により行うことを特徴とする、上記項１に記載の方法。
【００２７】
４．導入されるポリヌクレオチドが、アンピシリン及び／又はクロラムフェニコールに対する耐性遺伝子を含む上記項１に記載の方法。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子導入方法において、遺伝子を導入され得る宿主細胞としては、細菌類、ラン藻類、菌類、酵母、植物細胞、動物細胞など種々の細胞が挙げられる。本発明においては、大腸菌等の原核生物が好ましい。使用できる大腸菌の種類は限定されず、例えば、通常遺伝子組換えに使用されているＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＢＬ２１（ＤＥ３）等のＫ１２株由来のものが例示できる。
【００２９】
本明細書において、ポリヌクレオチドとは各種ＤＮＡを含み、例えば、自己増殖するプラスミド、ＰＣＲ断片等も含むものとする。ポリヌクレオチドの種類、調製法等は特に限定されず、実験の目的等に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
また、通常、ポリヌクレオチドを導入する際には、選択培地での培養によりポリヌクレオチドが導入されたかどうかを確認するために、薬剤耐性遺伝子を導入するのが好ましい。本発明において細胞に組み込む薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン及び／又はクロラムフェニコールを含む薬剤に対する耐性遺伝子が特に好ましい。
【００３１】
本発明においては種々の遺伝子導入法が使用できるが、その中でも特にリポフェクション法及びエレクトロポレーション法が好ましい。
【００３２】
リポフェクション法に用いるトランスフェクション試薬としては、一般に動物の培養細胞に使用されるトランスフェクション試薬を用いることができ、脂質を主成分とするトランスフェクション試薬を用いることが好ましく、カチオンリポソームを主成分とするものが特に好ましい。
【００３３】
好ましいトランスフェクション試薬としては、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、ＤＯＳＦＥＲ（１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）、Ｔｒａｎｓｏｍｅ（登録商標）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６等を例示することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチドを細胞に導入する際には、例えば、室温でポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とをあらかじめ混合し、複合体を形成させることが好ましい。ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混ぜ合わせる割合は、ポリヌクレオチドの種類、用いるトランスフェクション試薬の種類等に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリヌクレオチド１μｇあたり脂質成分として１〜１０００μｇ程度が例示できる。
【００３５】
また、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを混ぜる方法は、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とが複合体を形成する限り限定されないが、例えば、マイクロチューブのようなケースにカチオンリポソームを含む溶液を予め入れておき、必要量のポリヌクレオチドを含む溶液を添加し、必要に応じて軽く混和し、約１分以上、好ましくは１０〜１５分間程度、例えば室温で静置すればよい。また、その逆でも良い。
【００３６】
上記のようにして得られた複合体を、細胞と接触させてポリヌクレオチドを原核細胞に導入する。複合体と細胞とを接触させる方法としては通常の方法が使用でき、適宜選択することができる。例えば、氷上で大腸菌に複合体を添加してもよいし、単に大腸菌の存在する培地中に例えば３７℃の温度下で複合体を添加してもよい。
【００３７】
エレクトロポレーション法としては、公知の方法が使用でき、実験条件などは適宜選択することができる。
【００３８】
上記のようにして、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法のような公知の方法で、ポリヌクレオチドが導入された細胞が得られる。
【００３９】
本発明においては、得られた（ポリヌクレオチドが導入された）細胞を、賦活培地で懸濁することが特に好ましい。この懸濁に使用できる培地としてはＳＯＣ培地のような賦活培地、ＬＢ培地のような通常の最近を培養するための培地が挙げられる。
【００４０】
懸濁する時間は短時間でよい。例えば、細胞にポリヌクレオチドを導入してから２分程度以内、好ましくは１分程度以内、更に好ましくは３０秒程度以内に選択培地での培養を始めることができるぐらいが好ましい。
【００４１】
好ましい実施態様の１つとしては、ポリヌクレオチドを導入した細胞を、賦活培地で数回、好ましくは２，３回ピペッティングを行った直後に選択培地での培養を始めるのが好ましい。選択培地での培養により、ポリヌクレオチドが細胞に導入されたかどうかを確認することができる。
【００４２】
驚くべきことに、通常では遺伝子導入効率が激減するものと考えられている賦活培養を行わない本発明の方法を用いることによって、従来の方法と全く遺伝子導入効率が変わらないか、又はそれを上回る効率を得ることができるのである。しかも、賦活培養という長時間を要する工程を省くことができるので、忙しい研究者にとっては非常に優れた方法であるといえる。
【００４３】
【実施例】
以下に、実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。
【００４４】
実施例１：エレクトロポレーション法（大腸菌ＤＨ５α市販セル  ＳＯＣ混合直後  ６０分後比較）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９（アンピシリン耐性）、ｐＨＳＧ３９７（クロラムフェニコール耐性）を準備し、大腸菌ＤＨ５αエレクトロコンピテントセル（ＴＡＫＡＲＡ、５０μｌ）にそれぞれ１μｌ加え、氷上でミックスした後、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（１００Ω，  ５０μＦ，  ２．５ｋＶ，  ０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００４５】
終了後、直ちに３７℃のＳＯＣ培地を加え、２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐにその一部を抗生物質を含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。また、コントロールとして、３７℃で６０分間ＳＯＣ培地でインキュベートした後に、抗生物質を含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたものを使用した。
【００４６】
ＳＯＣ培地でピペッティングを行った直後にプレートに塗布したものは、ｐＵＣ１９  ＤＮＡの場合１μｇあたり１．３×１０９株、ＳＯＣ培地で６０分間インキュベートした後にプレートに塗布したものは１．０×１０９株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。
【００４７】
また、ｐＨＳＧ３９７  ＤＮＡの場合は、ＳＯＣ培地でピペッティングを行った直後にプレートに塗布したものは１μｇあたり８．８×１０８株、６０分間  ＳＯＣ培地で培養を行った後にプレートに塗布したものは１．０×１０９株のクロラムフェニコール耐性の形質転換株が得られた。
【００４８】
これらの結果から、アンピシリン耐性株においては、従来の方法で得られる効率よりも高い効率が得られるがわかった。また、クロラムフェニコール耐性株においては、従来の方法とほとんど変わらない効率が得られることがわかった。
【００４９】
実施例２：エレクトロポレーション法（大腸菌ＤＨ５α市販セル  ＳＯＣ混合直後  ６０分後比較）
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９（アンピシリン耐性）、ｐＢＲ３２８（アンピシリン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンに耐性）、ｐＨＳＧ３９７（クロラムフェニコール耐性）、ｐＨＳＧ２９８（カナマイシン耐性）を準備し、大腸菌ＤＨ５αエレクトロコンピテントセル（ＴＡＫＡＲＡ、５０μｌ）に、それぞれ１μｌ加え、氷上でミックスした後、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（１００Ω，  ５０μＦ，  ２．５ｋＶ，  ０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００５０】
終了後、直ちに３７℃のＳＯＣ培地で２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐにその一部を抗生物質（「表１の耐性を示す薬剤名」として記載されたもの）を含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
【００５１】
コントロールとしては、エレクトロポレーションを行い、ＳＯＣ培地で３７℃でそれぞれ３０分間、６０分間インキュベートした後に選択培地での培養を行ったものを使用した。
【００５２】
結果を表１に示す。「ピペッティング」、「３０分培養」及び「６０分培養」の欄の数値は全て、遺伝子１μｇあたりの形質転換株の数を示している。
【００５３】
【表１】
2004166619.tif 000002
【００５４】
表１の結果から、アンピシリン耐性遺伝子（ｐＵＣ１９及びｐＢＲ３２８の両者とも）に関しては、ピペッティングを行った直後に選択培地で培養したもの（ピペッティング）の方が、賦活培地で培養した（３０分培養、６０分培養）ものよりも遺伝子導入効率が高かった。
【００５５】
また、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｐＨＳＧ３９７）に関しては、ピペッティングを行った直後に選択培地で培養したものは、賦活培地での培養を行ったもの（３０分培養、６０分培養）とほとんど差がなかった。
【００５６】
即ち、作用メカニズムが制菌的な抗生物質（アンピシリン等）耐性の遺伝子を導入したものは、エレクトロポレーションした後、賦活培地でピペッティングを行った直後に選択培地のプレートに塗布しても問題なく、一方、殺菌的な抗生物質（カナマイシン等）耐性の遺伝子を導入したものは、エレクトロポレーションした後に賦活培地でピペッティングを行った直後に選択培地に塗布すると、殺菌されコロニーが生じないと考えられる。
【００５７】
実施例３：エレクトロポレーション法（大腸菌ＤＨ１０Ｂ自作セル  ＳＯＣ混合直後  ６０分後比較）
大腸菌ＤＨ１０ＢセルをＬＢ培地にて３７℃で一晩培養した後、ＳＢ培地に植菌した。ＯＤ６００＝０．６まで培養し、遠心分離器にて集菌後ミリＱ水にて数回洗浄し、ＳＢ培地容量の１／１００容量の１０％グリセロール溶液にて懸濁し、５０μｌずつ分注することにより、エレクトロポーレーション用のコンピテント細胞を自作した。
【００５８】
１０ｐｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９（アンピシリン耐性）、ｐＨＳＧ３９７（クロラムフェニコール耐性）を準備し、先の大腸菌ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテントセルにそれぞれ１μｌ加え、氷上でミックスした後、ＢＩＯＲＡＤ社のＧＥＮＥ  ＰＵＬＳＥＲ  ＩＩ（１００Ω，  ５０μＦ，  ２．５ｋＶ，  ０．２ｃｍキュベット）にてエレクトロポレーションを行った。
【００５９】
終了後、直ちに３７℃のＳＯＣ培地を加えて２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐに一部を抗生物質を含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。また、コントロールとして、ＳＯＣ培地で３７℃で６０分間インキュベートした後に抗生物質を含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたものを使用した。
【００６０】
ｐＵＣ１９  ＤＮＡの場合、ＳＯＣ培地でピペッティングした直後にプレートに塗布したものでは１μｇあたり８．０×１０８株、ＳＯＣ培地で６０分間培養した後にプレートに塗布したものでは６．８×１０８株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られ、ｐＨＳＧ３９７  ＤＮＡの場合では、ＳＯＣ培地でピペッティングした直後にプレートに塗布したものでは１μｇあたり５．５×１０８株、ＳＯＣ培地で６０分間培養した後にプレートに塗布したものでは６０分後で６．０×１０８株のクロラムフェニコール耐性の形質転換株が得られた。
【００６１】
これらの結果から、アンピシリン耐性株においては、従来の方法で得られる効率よりも高い効率が得られるがわかった。また、クロラムフェニコール耐性株においては、従来の方法とほとんど変わらない効率が得られることがわかった。
【００６２】
実施例４：リポフェクション法（大腸菌ＤＨ５α定常期セル  ＤＯＴＡＰ    ＳＯＣ混合直後、６０分後比較）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬  ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）  ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００６３】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したもの（ＯＤ６００＝３．０）を集菌し、１／５０量のＳＯＣ培地にて懸濁した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（又はポリヌクレオチドのみ）を加え、直ちに３７℃のＳＯＣ培地を加えて２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐに一部をアンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。また、コントロールとしてＳＯＣ培地で６０分間培養した後にプレートに塗布したものを用いた。
【００６４】
トランスフェクション試薬を混ぜた場合、ＳＯＣ培地でピペッティングした直後にプレートに塗布したものでは、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ  １μｇあたり３．７×１０２株、ＳＯＣ培地で６０分間培養した後にプレートに塗布したものでは、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ  １μｇあたり２．５×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まないものでは、形質転換株は全く検出されなかった。
【００６５】
この結果から、トランスフェクション法においても、アンピシリン耐性遺伝子は、従来の方法で得られる効率よりも高い効率が得られることがわかった。
【００６６】
実施例５：リポフェクション法（大腸菌ＤＨ５α対数増殖期セル  ＤＯＴＡＰ            ＳＯＣ混合直後、６０分後比較）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬  ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）  ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００６７】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したものをＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．６まで培養した後、集菌し、１／５０量のＳＯＣ培地にて懸濁した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（又はポリヌクレオチドのみ）を加え、直ちに３７℃のＳＯＣ培地を加えて２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐにその一部をアンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。また、コントロールとして、ＳＯＣ培地で６０分間インキュベートした後にプレートに塗布したものを使用した。
【００６８】
トランスフェクション試薬を混ぜた場合、ピペッティングした直後にプレートに塗布したものでは、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ  １μｇあたり３．０×１０２株、ＳＯＣ培地で６０分間インキュベートした後プレートに塗布したものでは、２．８×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００６９】
この結果から、トランスフェクション法においても、アンピシリン耐性遺伝子においては、従来の方法で得られる効率よりも高い効率が得られるがわかった。
【００７０】
実施例５：リポフェクション法（大腸菌ＤＨ５α対数増殖期セル  ＤＯＳＦＥＲ ＳＯＣ混合直後、６０分後比較）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬  ＤＯＳＦＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、ダイカチオニックタイプ、１，３−Ｄｉ−Ｏｌｅｏｘｙｌｏｘｙ−２−（６−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｓｐｅｒｍｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置し、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００７１】
大腸菌ＤＨ５αを一晩ＬＢ培地にて培養したものからＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．６まで培養した後、集菌し、１／５０量のＳＯＣ培地にて懸濁した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（もしくはポリヌクレオチド）を加え、３７℃のＳＯＣ培地を加えて２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐに一部をアンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。またコントロールとして、ＳＯＣ培地で６０分間インキュベートした後にアンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたものを使用した。
【００７２】
トランスフェクション試薬を混ぜた場合、ピペッティングした直後にプレートに塗布したものでは、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ  １μｇあたり３．０×１０２株、ＳＯＣ培地で６０分間インキュベートした後にプレートに塗布したものは２．８×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００７３】
この結果から、トランスフェクション法においても、アンピシリン耐性株においては、従来の方法で得られる効率よりも高い効率が得られるがわかった。
【００７４】
実施例７：リポフェクション法（大腸菌ＤＨ１０Ｂ対数増殖期セル  ＤＯＴＡＰ            ＳＯＣ混合直後、６０分後比較）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに５μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬  ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）  ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）３．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００７５】
大腸菌ＤＨ１０Ｂを一晩ＬＢ培地にて培養したものをＳＯＣ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．６まで培養した後、集菌し、１／５０量のＳＯＣ培地にて懸濁した。ここにポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（又はポリヌクレオチドのみ）を加え、３７℃のＳＯＣ培地を加えて２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐにその一部をアンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。また、コントロールとして、ＳＯＣ培地で３７℃で６０分間インキュベートした後に、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたものを使用した。
【００７６】
トランスフェクション試薬を混ぜた場合、ピペッティングの直後にプレートに塗布したものでは、ｐＵＣ１９  ＤＮＡ  １μｇあたり３．０×１０２株、ＳＯＣ培地で６０分間培養した後にプレートに塗布したものでは、２．８×１０２株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られた。なお、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００７７】
この結果から、トランスフェクション法においても、アンピシリン耐性遺伝子においては、従来の方法で得られる効率よりも高い効率が得られるがわかった。
【００７８】
実施例７：（リポフェクション法  ＤＨ５α市販セル  ＤＯＴＡＰ    ＳＯＣ混合直後、６０分後比較）
１０ｎｇ／μｌの自律増殖するプラスミドｐＵＣ１９を準備し、２本のマイクロチューブに２μｌずつ分注した。一方には、トランスフェクション試薬  ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社、モノカチオニックタイプ、Ｎ−［１−（２，３−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ）  ｐｒｏｐｙｌ］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）１．０μｌ、他方にはミリＱ水３．０μｌを加え、室温にて混合し５分放置して、ポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体を得た。
【００７９】
大腸菌ＤＨ５αエレクトロコンピテントセル（ＴＡＫＡＲＡ、５０μｌ）にポリヌクレオチド及びトランスフェクション試薬の複合体（又はポリヌクレオチドのみ）を加え、５分氷上にてインキュベートした後、３７℃のＳＯＣ培地を加えて２，３回軽くピペッティングを行った後、すぐにアンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。またコントロールとして、ＳＯＣ培地で３７℃で６０分間インキュベートしたものを、アンピシリンを含むＬＢ培地プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートしたものを使用した。
【００８０】
トランスフェクション試薬を混ぜた場合、ピペッティングの直後にプレートに塗布したものではｐＵＣ１９  ＤＮＡ  １μｇあたり１．９×１０４株、ＳＯＣ培地で６０分間培養した後プレートに塗布したものでは２．０×１０４株のアンピシリン耐性の形質転換株が得られたが、トランスフェクション試薬を含まない方では全く形質転換株は検出されなかった。
【００８１】
この結果から、トランスフェクション法においても、アンピシリン耐性株においては、従来の方法で得られる効率と同程度の効率が得られるがわかった。
【００８２】
【発明の効果】
本発明のポリヌクレオチドを細胞に導入した後、賦活培養を行わない方法によれば、細胞にポリヌクレオチドを導入した後、直ちに選択培地で培養することにより、短時間に実験を行うことができ、しかも十分に高い遺伝子導入効率を得ることができる。