(57)【要約】【課題】微小領域であったり、複雑なパターンを構成する領域であっても、高精度に、活性を保持した状態で細胞を固定化できる固定化方法を提供する。【解決手段】細胞を基体の表面の内、所望領域に固定化する細胞の固定化方法であって、前記基体の表面の前記所望領域を除く領域にマスク層を形成する工程（Ｓｔ２）、前記基体の表面と前記マスク層の表面に前記細胞を含む溶液を接触させ、前記細胞を固定化する工程（Ｓｔ４，Ｓｔ５）、前記細胞が活性を失うことなく、かつ前記マスク層が前記基体から分離するような条件に前記溶液のｐＨを調整する工程（Ｓｔ６）を包含する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を基体の表面の所望領域に固定化する細胞の固定化方法であって、該方法は以下の工程を包含する：
前記基体の表面の内、前記所望領域を除く領域にマスク層を形成する工程（ａ）、
工程（ａ）の後、前記基体の表面と前記マスク層の表面に前記細胞を含む溶液を接触させ、前記細胞を固定化する工程（ｂ）、および
工程（ｂ）の後、前記細胞が活性を失うことなく、かつ前記マスク層が前記基体から分離するような条件に前記溶液のｐＨを調整する工程（ｃ）。
【請求項２】
前記溶液は培養液である、請求項１に記載の細胞の固定化方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、前記基体の表面に前記マスク層を形成する工程と、前記所望領域の前記マスク層を除去する工程を含む、請求項１に記載の細胞の固定化方法。
【請求項４】
前記マスク層は感光性を有するマスク材料で形成され、前記マスク層を除去する工程が、前記所望領域又は前記所望領域を除く領域のいずれかの前記マスク層を露光した後、現像する工程である、請求項３に記載の細胞の固定化方法。
【請求項５】
工程（ｃ）において、前記溶液のｐＨを工程（ｂ）における前記溶液のｐＨより大きくする、請求項４に記載の細胞の固定化方法。
【請求項６】
工程（ｃ）において、前記ｐＨを７．９以上８．１以下とする、請求項４に記載の細胞の固定化方法。
【請求項７】
工程（ｃ）において、前記溶液の周囲の雰囲気の二酸化炭素濃度を調整することにより、前記溶液のｐＨを調整する、請求項１に記載の細胞の固定化方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において、前記溶液にｐＨ調整剤を添加することにより、前記溶液のｐＨを調整する、請求項１に記載の細胞の固定化方法。
【請求項９】
工程（ａ）の後であり、かつ、工程（ｂ）の前に、前記マスク層を加熱する工程を有し、前記加熱は、前記マスク層中の前記細胞に対する有害な成分の沸点以上の温度にする、請求項１に記載の細胞の固定化方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）において、前記細胞を固定化材料を介して固定化し、
前記固定化材料は、細胞接着性タンパク質、正帯電性高分子、または強塩基性官能基を有する高分子のいずれかを含む材料である、請求項１に記載の細胞の固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基体の表面の所望領域に細胞を固定化する細胞の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命科学分野における研究の急速な発展に伴い、細胞、細胞小器官、タンパク質、核酸、リン脂質等の生体試料の活性、機能、構造に関してミクロ的な解明が要求されている。また、これらの解明に伴い、生体試料の電気素子への適用をはじめとした、各種デバイスへの適用の可能性の検討、ＤＮＡチップ、プロテインチップ等のスクリーニング技術への応用の検討が活発に行われている。各種デバイスとしては、バイオセンサー、スイッチング素子、バイオリアクター、ハイブリッド型人工臓器、ニューロコンピュータ、ＤＮＡコンピュータなどが挙げられる。
【０００３】
上記、生体試料のミクロ的な解明、これらを素子として用いるデバイス技術またはスクリーニング技術いずれにおいても生体試料をその機能を維持した状態で所望の微小領域に固定化する技術が技術発展・普及の端緒となりうる。
【０００４】
例えば、本出願人は、細胞または組織に障害を与えることなく、細胞の電気生理的活動の観察を安定かつ長期間行うことを可能とした電極を備えた細胞外電位測定装置に関し出願を行った（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
【０００５】
神経細胞などが活動する際には、神経細胞のイオン透過性に変化が生じ、これに伴って細胞膜内外のイオン濃度が変化する。上記細胞外電位測定装置においては、電極上に細胞を固定化して、神経細胞近傍のイオン濃度の変化に伴う電極の電位変化を測定することによって、神経細胞の活動を観察することを可能とする。したがって、上記細胞外電位測定装置においても、電極表面のみに細胞を固定化する技術が所望されている。電極表面のみに確実に細胞を固定化することにより、各細胞の電気生理的活動を検出でき、さらには、細胞間の相互作用を複数の細胞の電気生理的計測結果から検出することが可能となる。
【０００６】
生体試料をその機能を維持した状態で基板上の所望の領域に固定化することは非常に難しく、しかも所望の領域が微小である場合にはさらなる困難を伴うものである。特に、細胞を、その活性を検出する用途、その活性を利用する用途に用いる場合、生きたまま固定化することが必要であり、他の化学物質の固定化方法を適用することができず困難であった。
【０００７】
従来より、細胞を活性を保持した状態で所望の領域に固定化する方法として、細胞を接着させようとする領域には、細胞接着性高分子を存在させ、そうでない領域には細胞非接着性高分子を存在させることにより細胞を所望の領域に固定化させる方法が知られている（例えば、特許文献３参照）。また、金属穴空きマスクを基板上に置き、物理的に細胞を定着する領域を限定する方法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。また、帯電ドラムを用いて、静電作用により細胞をパターニングする方法が知られている（例えば、特許文献４参照）。
【０００８】
しかしながら、細胞接着性高分子と細胞非接着性高分子を用いることにより所望の領域に細胞を固定化する方法のような表面改質に伴う細胞の配列のパターニングは、境界領域が不鮮明で、そのため、微小な領域を選択して細胞を接着させることが困難である。また、金属穴あきマスクを用いた方法においては、手作業でなされるマスクの除去の際に細胞を剥がしてしまうなどの問題があり、十分な方法とはいえない。さらに、帯電ドラムを用いた方法においては、ドラム形状に合う基板のみしか用いることができず、また装置も大掛かりになってしまうという欠点を有する。
【０００９】
上記のように、従来の技術はいずれも、高精度で所望の微小領域に細胞を固定化する方法としては十分でなかった。
【特許文献１】特開平６−７８８８９号公報
【特許文献２】特開平６−２９６５９５号公報
【特許文献３】特公平７−５１０６１号公報
【非特許文献１】Yasuhiko Jimbo et al. Simultaneous Measurement of Intracellular Calcium and Electrical Activity from Paterned Neural Networks in Culture. IEEE Transaction on Biomedical Engineering Vol.40、No.8 PP.804-810、1993.
【特許文献４】特公平２−２４５１８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであり、微小領域であったり、複雑なパターンを構成する領域であっても、高精度に、活性を保持した状態で細胞を固定化できる固定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、細胞を基体の表面の内、所望領域に固定化する細胞の固定化方法であって、前記基体の表面の前記所望領域を除く領域にマスク層を形成する工程（ａ）、工程（ａ）の後、前記基体の表面と前記マスク層の表面に前記細胞を含む溶液を接触させ、前記細胞を固定化する工程（ｂ）、  および工程（ｂ）の後、前記細胞が活性を失うことなく、かつ前記マスク層が前記基体から分離するような条件に前記溶液のｐＨを調整する工程（ｃ）、を包含する。
【００１２】
上記固定化方法においては、工程（ｃ）において、前記マスク層が前記基体から分離する。このとき、前記マスク層の表面に固定化されていた細胞も前記マスク層とともに前記基体から分離される。したがって、前記基体の表面の所望領域に固定化された細胞のみが、固定化された状態を維持することになる。このとき、細胞は活性を保持した状態、すなわち生きた状態で、固定化されている。前記溶液としては、例えば培養液、生理食塩水を用いることができるが、好ましくは、培養液を用いる。培養液を用いた場合、細胞の固定化とともに細胞を増殖することができるからである。
【００１３】
例えば、工程（ａ）が、前記基体の表面に前記マスク層を形成する工程と、前記所望領域の前記マスク層を除去する工程を含む。この場合、前記マスク層は感光性を有するマスク材料で形成され、前記マスク層を除去する工程が、前記所望領域又は前記所望領域を除く領域のいずれかの前記マスク層を露光した後、現像する工程であることが望ましい。このような工程でマスク層を形成する場合、複雑なパターンや、微小領域であっても、マスク層を高精細に形成することができる。
【００１４】
感光性を有するマスク材料を用いる場合、例えば工程（ｃ）において、前記溶液のｐＨを工程（ｂ）における前記溶液のｐＨより大きくすることにより、工程（ｃ）で前記マスク層が基体から分離されるようなマスク材料を用いることができる。または、例えば工程（ｃ）において、前記ｐＨを７．９以上８．１以下とすることにより、工程（ｃ）で前記マスク層が基体から分離されるようなマスク材料を用いることができる。
【００１５】
工程（ｃ）において、例えば、前記溶液の周囲の雰囲気の二酸化炭素濃度を調整することにより、前記溶液のｐＨを調整することができる。または、工程（ｃ）において、前記溶液にｐＨ調整剤を添加することにより、前記培養液のｐＨを調整することができる。
【００１６】
工程（ａ）の後であり、かつ、工程（ｂ）の前に、前記マスク層を加熱する工程を有することが好ましく、この場合、前記加熱は、前記マスク層中の前記細胞に対する有害な成分の沸点以上の温度にする。このような処理を施すことにより、マスク層に含まれる細胞に有害な成分を気化させることができる。すなわち、マスク層中の有害な成分により細胞が活性を失ってしまうことを防ぐことができる。
【００１７】
工程（ｂ）において、好ましくは、前記細胞を固定化材料を介して固定化する。前記基体の表面が、細胞が固定化されにくい材料からなる場合であっても、細胞の固定化を容易及び／又は強固にすることができるからである。前記固定化材料としては、例えば細胞接着性タンパク質、正帯電性高分子、または強塩基性官能基を有する高分子を含む材料を用いることができる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の細胞の固定化方法によると、微小領域であったり、複雑なパターンを構成する領域であっても、高精度に、活性を保持した状態で細胞を固定化できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００２０】
（第１の実施形態）
図１、図２を用いて第１の実施形態の細胞の固定化方法を説明する。本実施形態においては、細胞を固定化する基体として基板を用いる。図１は、本実施形態の細胞の固定化方法を示すフローチャートである。図２は、本実施形態の細胞の固定化方法を模式的に示す図である。
【００２１】
本実施形態の固定化方法は、まず、基板１の表面１０３にマスク材料を塗布してマスク層１２を形成する（Ｓｔ１）。次に、基板１の表面１０３の領域１００に対応するマスク層１２を除去する（Ｓｔ２）。このようにして、基板１の表面１０３の所望の領域１００を除く領域１０１にマスク層１２を形成する。マスク材料としては、好適には感光性材料を用いることができる。ポジティブ型の感光性材料を用いる場合は、Ｓｔ２において、領域１００に対応するマスク層１２のみを露光し、一方、ネガティブ型の感光性材料を用いる場合は、領域１０１に対応するマスク層１２のみを露光する。露光後、現像することにより、領域１００に対応するマスク層１２のみを除去することができる。かかる工程における露光及び現像は、通常の方法に従って行うことができる。なお、マスク層１２を形成する材料、後述するＳｔ６に示す処理によりマスク層１２が基板１より分離されるものを使用する。
【００２２】
マスク材料に、細胞に有害な成分が含まれている場合は、マスク層１２形成の後、かかる有害成分を除去する処理を行う。例えば、有害な成分が加熱により気化する場合、マスク層１２を有害な成分の沸点より高い温度まで加熱し、有害な成分を気化させることにより除去する（Ｓｔ３）。
【００２３】
次に、溶液保持部１７を構成した後、溶液保持部１７の底面を固定化材料で被覆し、溶液保持部１７内に培養液５を注入する（Ｓｔ４）。溶液保持部１７は、基板１の表面１０３と、マスク層１２の表面１２１を含む固定化媒体最表面１０３，１２１を底面とする領域内に溶液を保持し得るように隔壁部材４を設置することにより構成する。
【００２４】
そして、培養液５内に細胞６を播種し、細胞６を固定化媒体最表面１０３，１２１に固定化する（Ｓｔ５）。培養液５内に細胞６を播種すると、付着性細胞が、固定化媒体最表面１０３，１２１に自然に固定される。
【００２５】
本明細書でいう固定化材料とは、細胞６の固定化を容易及び／又は強固とする材料をいう。固定化材料は固定化対象となる細胞６の種類に応じて任意に選択できる。例えば、固定化材料として、細胞接着性のタンパク質であるコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等のマトリクス材料が好適に用いられる。または、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリオルニチン（ＰＯ）、ポリリジン（ＰＬ）等の正荷電性高分子、あるいはこれらの材料の組み合わせた材料が好適に用いられる。または、ビグアニド基、もしくはカルバモイルグアニジド基等の強塩基性官能基を持つ高分子が好適に用いられる。具体的にはアリルビグアニド−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＢ）、アリル−Ｎ−カルバモイルグアニジノ−ｃｏ−アリルアミン（ＰＡＣ）がこれに該当する。
【００２６】
細胞は、通常その細胞膜が、負に帯電しているので、正荷電性高分子、強塩基性官能基を持つ高分子との間に静電相互作用が働き、細胞６の固定化媒体最表面１０３，１２１への固定化を容易及び／又は強固することができる。なお、本明細書でいう正荷電性高分子とは、その高分子のｐＫａ以下のｐＨで正に帯電する高分子をいう。
【００２７】
細胞６を固定化した後、領域１０１に対応するマスク層１２を基板１から分離する（Ｓｔ６）。分離方法は、培養液５のｐＨを調整し、所定時間放置する。培養液５のｐＨは、所定時間放置の後、マスク層１２が基板１から分離されるｐＨとする。前記ｐＨは、マスク層１２と基板１との接着強度（マスク層１２の材料、基板１の材料、処理温度等を含む形成条件による）により異なるので、形成条件に応じたｐＨを選択する。なお、前記ｐＨは、細胞６が活性を失わない条件とする。一方、Ｓｔ５における培養液５のｐＨは、マスク層１２が分離しない条件とする。例えば、Ｓｔ５において、培養液５のｐＨは、略中性（６．８以上７．８以下）であり、Ｓｔ６において、培養液５のｐＨは、７．９以上８．１以下であり得る。
【００２８】
Ｓｔ６における、培養液５のｐＨは、培養液５の周囲の雰囲気の二酸化炭素濃度を調整することにより調整したり、培養液５にｐＨ調整剤を添加することにより調整したりすることができる。なお、Ｓｔ６においては、Ｓｔ５の培養液５をそのまま用いているが、例えばＳｔ５の培養液５を細胞６が生存可能な他の溶液に交換し、前記溶液のｐＨに応じて前記マスク層１２を分離させるようにしてもよい。このような溶液として、他の培養液や、生理食塩水を使用し得る。
【００２９】
Ｓｔ６においては、基板１の表面１０３の所望の領域１００外に固定化された細胞６が、マスク層１２とともに基板１上から分離されることになる。以上の方法により、基板１上の所望の領域１００のみに細胞６を固定化することが可能となる。なお、マスク層１２が基板１から分離された後は、分離されたマスク層１２を培養液５中から取り除く。
【００３０】
マスク層１２を形成するマスク材料には、好ましくは、感光性材料を使用する。より好ましくは、アルカリ溶液に浸漬することにより基体から分離され、加熱により細胞に有害な成分を除去され得る材料を使用する。例えば、ポリイミド樹脂を含有する感光性材料を用いることができ、このような材料として、ＣＲＣ−８３００（商品名  住友化学社製）、ＲＮ−９０１（商品名  日産化学社製）等が挙げられる。
【００３１】
尚、マスク材料として感光性材料を用いることにより、マスク層１２の形成工程においてフォトエッチングによるパターン形成を利用することができ、微小かつ複雑な領域に細胞６を固定化することが可能となる。
【００３２】
基板１としては、固定化した細胞６の用途等に応じて任意のものを用いることができる。例えば、固定化した細胞６を電気生理的計測の対象として用いる場合には、電極及び配線が形成された基板を使用し（第２〜５の実施形態で示す）、固定化した細胞を顕微鏡の観察対象とする場合には、透明な基板を使用するとよい。
【００３３】
培養液５としては、固定化対象の細胞６の種類に応じて任意の培養液を選択し得る。例えば、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ジョクリック改変培地（ｊｏｋｌｉｋ）、１９９培地（１９９）、ＲＰＭＩ−１６４０（１６４０）、ハムＦ−１０培地（Ｆ−１０）、ハムＦ−１２培地（Ｆ−１２）、ハムＦ１２Ｋ培地（Ｆ−１２Ｋ）、レイボビッツＬ−１５培地（Ｌ−１５）、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ５Ａ）、ＮＣＴＣ１３５培地（１３５）、ウイリアムズＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍ）、ウェイマウスＭＢ７５２／１培地（Ｗａｙｍｏｕｔｈ）、ＣＭＲＬ−１０６６（１０６６）またはイスコフ改変ダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｓｃｏｖｅ）等を使用し得る。また、上記培地に、種々の栄養素、成長因子、抗生物質などをさらに添加して、培養液５として使用し得る。なお、Ｓｔ５において、細胞６の固定化が完了するまでは、マスク層１２を基板１から分離させる作用を有さない培養液５を選択する。
【００３４】
（第２の実施形態）
本実施形態は、細胞固定化器の電極上に細胞を固定化する固定化方法に係るものである。上記細胞固定化器は、細胞の電気生理的変化に起因する電気信号の検出に用いられる細胞外電位測定装置の構成要素の一つである。以下、本実施形態で用いられる細胞固定化器を備えた細胞外電位測定装置の構成を説明する。
【００３５】
［細胞固定化器の構成］
図３は、本実施形態の細胞外電位測定装置の一部分を構成する細胞固定化器１９の構成を模式的に示す断面図である。図４は、図３のＡ−Ａ矢視断面図である。ただし、図３は細胞固定化器１９に細胞６１が固定化されている状態（すなわち、図２のＳｔ５の状態）を示し、図４は細胞６１が固定化される前の状態（すなわち、図２のＳｔ４の状態）を示す。また、図４においては、センサ部１６の裏面に形成されているリード線９ａを点線で示す。
【００３６】
細胞固定化器１９は、電極１１を備えたセンサ部１６及び溶液保持部１７１とからなる。センサ部１６は、電極１１及びこれに接続するリード線９ａを備えた基板１ａからなる。リード線９ａは外部接続部１０を除いてその上面が絶縁層３で被覆されている。リード線９ａの外部接続部１０の上面は、被覆層２１で被覆されている。被覆層２１は、外部接続部１０が曝される周囲の雰囲気に応じて、かかる雰囲気に対して耐性の強い導電性材料を選択するようにする。外部接続部１０は、被覆層２１で被覆されていることより、その耐久性が向上するが、必ずしも被覆層２１により被覆されていなくてもよい。
【００３７】
電極１１の上面形状は、好ましくは、円形もしくは正方形であって、例えば、直径もしくは一辺の長さが略１μｍ〜２０００μｍの範囲であり得る。電極の大きさが測定対象の細胞より大きい場合、一つの電極で複数の細胞の電気生理的活動に由来する電気信号を検出することができる。
【００３８】
細胞固定化器１９は、センサ部１６上に細胞培養のための溶液保持部１７１を備える。溶液保持部１７１は、センサ部１６上に設置された円筒状の隔壁部材４１、隔壁部材４１の内部領域、及び当該内部領域に設置された参照電極１３からなる。隔壁部材４１は、後述する細胞の固定化工程の一工程である所望パターンにマスク層１２ａを形成する形成工程の後に設置する。
【００３９】
参照電極１３は、測定時に、細胞培養液５１に浸漬されていればよく、予め溶液保持部１７１内に固定されている構成であってもよいし、測定時に培養液５１内に投入され固定される構成であってもよい。例えば、図示しないが、参照電極１３は、隔壁部材４１の内壁に取り付けられている構成であってもよい。
【００４０】
基板１ａとしては、好ましくは、単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表される半導体材料、シリコン・オン・インシュレータ（ＳＯＩ）などに代表されるこれら半導体材料の複合材料、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化ケイ素、酸化ケイ素、および窒化ケイ素からなる群から選択される無機絶縁材料、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、シリコン樹脂、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンからなる群から選択される有機材料により形成された基板を使用する。さらに好ましくは、単結晶シリコン、ＳＯＩ、ＰＥＴ、またはＰＣにより形成された基板を使用する。
【００４１】
電極１１を形成する電極材料としては、好ましくは、白金黒、白金、金、パラジウム、ロジウム、銀、およびタングステンからなる群から選択される金属材料、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛、およびインジウム錫酸化物（ＩＴＯ）からなる群から選択される金属酸化物材料が使用される。これらの材料から選択された１種類の材料を使用して電極１１を形成してもよいし、複数種類の材料を、例えば層状に堆積させて電極１１を形成してもよい。電極１１上面は、さらに導電性高分子、または単分子膜によって被覆されていてもよい。電極１１に接続するリード線９ａを形成するリード線材料にも、上記電極材料と同様の材料を好適に使用することができる。
電極１１からの電気信号は、参照電極１３の電位を基準として測定される。通常、参照電極１３は、その表面積が電極１１の表面積以上であり、好ましくは電極１１の表面積より大きく、好ましくは、金、白金、銀−塩化銀などの材料からなるものとするが、任意の大きさ及び形状であり得る。
【００４２】
隔壁部材４１は、例えばアクリルにより作製し得る。隔壁部材４１は、電極１１上面を含むセンサ部１６の上面を底面とする内部領域に細胞培養液５１を保持できる構成であれば良く、その形状は円筒状に限定されることはない。
【００４３】
［細胞固定化器の作製方法］
細胞固定化器１９の作製方法の一例を示す。まず、電極材料を基板１ａ上に蒸着した後、フォトレジストを用いてエッチングすることにより、電極１１、および対応するリード線９ａを１セットとしてかかるセットを複数セット有する所望のパターンを形成する。その後、外部接続部１０を除くリード線９ａの上面を絶縁層３で被覆する。さらに、リード線９ａの外部接続部１０の上面を被覆層２１で被覆する。その後、基板１ａを所定角の小片に切り出し、一つの小片をセンサ部１６とする。一つの小片には、電極１１及びリード線９ａが１セット形成されているようにする。電極１１のパターンは、予め前記パターンを形成させたステンシルマスクを通じて蒸着するマスク法や、リフトオフ法によって形成してもよい。
【００４４】
［細胞の固定化方法］
上記センサ部１６の電極１１上に、本発明の方法を用いて細胞を固定化する方法について説明する。まずセンサ部１６の最表面のうち、電極１１を除き少なくともその周囲を包含する領域にマスク層１２ａを形成する。このとき、マスク層１２ａは、後の工程で隔壁部材４１を設けることとなる領域にはかからないように形成する。
【００４５】
マスク層１２ａを形成するために、好適に用いられるマスク材料は、第１の実施形態と同様である。なお、マスク材料は、絶縁層３とは異なる材料であり、かつその分離条件下において絶縁層３が除去されないような材料を用いるようにする。
【００４６】
マスク層１２ａに、感光性材料を用いることにより、フォトエッチングによるパターン形成を利用して、電極１１上面を除く領域にマスク層１２ａを形成することができる。センサ部１６上面の電極１１を含む広範な領域にマスク層１２ａを形成した後、フォトエッチングによりセンサ部１６上の電極１１部分のマスク層１２ａを除去し、該電極１１上面を露出させることが可能となる。
【００４７】
マスク層１２ａ形成工程の後、上述したように、隔壁部材４１を電極１１を囲むようにセンサ部１６上に設置し、溶液保持部１７１を構成する。
【００４８】
その後、センサ部１６の最上面のうち、溶液保持部１７１内の領域に固定化材料を塗布する。固定化材料は、細胞の細胞膜を変性させることがない材料を用いる。したがって、固定化材料と細胞膜との間で、架橋反応が生じることにより、細胞を固定化するような材料は使用しない。生体内での状態に近い状態の細胞の電気生理的変化に由来する電気信号を検出するためである。第１の実施形態に示した固定化材料が、好適に使用される。
【００４９】
固定化材料の固定化は、固定化材料を所定の濃度で溶解させた溶液を電極１１上に曝し、所定時間経過の後、電極１１の上面から取り除き、電極上面を少なくとも１回以上洗浄し、乾燥することにより行う。固定化材料を溶解させた溶液を電極１１の上面にスポットすることにより、電極１１上に固定化材料を固定してもよい。なお、固定化材料として、細胞接着性のタンパク質等のマトリクス材料を用いる場合は、公知の方法によりマトリクス材料を電極１１の上面に塗布する。
【００５０】
次に、溶液保持部１７１内に培養液５１を満たす。第１の実施形態に示した培養液が好適に使用される。
【００５１】
その後、培養液５１内に、所望の細胞６１を播種する。細胞６１の培養が進行すると同時に、付着性細胞が、固定化材料を介して、センサ部１６の最上面に固定化される。細胞の固定化後、培養液５１をマスク層１２ａが剥離する条件とし、しばらく放置することにより、マスク層１２ａが自発的にセンサ部１６上面から分離される。かかる工程により、細胞６１が電極１１の上面のみに固定される。
【００５２】
細胞６１が、電極１１の最上面に固定化された状態で細胞６１の電気生理的変化に起因する電気信号の測定を開始する。電気信号の測定は、一対の電極１１、１３から検出される電気信号に基づいて、電極１１と参照電極１３との間の電位差を測定する。細胞は、そのイオンチャンネルの活性に対応して、細胞膜のイオン透過性が変化し、かかる変化に伴って細胞膜内外のイオン濃度が変化する。すなわち、細胞膜内外のイオン濃度勾配が変化する。かかるイオン濃度勾配の変化をうち消し合うように、電極１１と参照電極１３との間の電位差が変化する。したがって、前記電位差を測定することにより、細胞の電気生理的変化を間接的に検出することができる。前記電位差は、例えば、後述する細胞外電位測定装置により測定することができる。
【００５３】
［細胞外電位測定装置の構成］
図５は、本実施形態の細胞外電位測定装置の概略図である。細胞外電位測定装置４０は、制御部３９、これに接続された信号増幅部３３、刺激信号付与部３４及び溶液駆動部３８、撮像部３５、並びに載置部３６からなる。
載置部３６には、細胞固定化器１９が載置される。載置部３６は、載置された細胞固定化器１９を所定の温度、ガス濃度、湿度に保つ機能を備える。制御部３９は、信号増幅部３３から入力される信号に基づいて、細胞固定化器１９の電極１１，１３間の電位差を検出、記録する。また、制御部３９は、設定された刺激条件に基づいて刺激信号付与部３４を制御する。刺激信号付与部３４は、Ｄ／Ａ変換器を備え、当該変換器、及び回線３７を介して、細胞固定化器１９上の細胞に電気的刺激を印加する。細胞固定化器１９からの電気信号は回線３２を介して信号増幅装置３３に導出され、ここで増幅され、周波数帯域を制限され、Ａ／Ｄ変換器を介して制御部３９に入力される。
【００５４】
溶液駆動部３８は、細胞固定化器１９の溶液保持部１７内に保持された培養液５１を排出し、あるいは溶液保持部１７１内に培養液５１を注入する機能を有する。必要に応じて制御部３９により駆動される。撮像部３５を用いて、細胞固定化器１９上の電極１１を撮像もしくは観察することが可能である。また、刺激信号付与部３４は、撮像部３５による撮像データに基づいて、出力する刺激信号を選択する構成であってもよい。
【００５５】
細胞外電位測定装置４０は、刺激信号付与部３４から細胞６１に刺激信号付与し、その応答に対応した細胞６の電気生理的変化を検出することもできるし、刺激信号を与えることなく、細胞において自発的に生じる電気生理的変化を検出することもできる。
【００５６】
（第３の実施形態）
本実施形態は、第２の実施形態とは異なる構成の細胞固定化器にかかるものである。図６は、第３の実施形態の細胞固定化器１９ｂのセンサ部１６ｂの上面を示す図である。細胞固定化器１９ｂは、６行６列の格子状の各交点に電極１１ｂが配置されている構成である。第２の実施形態の細胞固定化器１９は、センサ部１６上に一つの電極１１のみが形成されている構成であるが、本実施形態の細胞固定化器１９ｂは、センサ部１６ｂ上に複数の電極１１ｂとこれに対応するリード線９ｂが形成されている構成である。
【００５７】
図６は、溶液保持部を省略して示すが、溶液保持部を構成する隔壁部材（第２の実施形態の隔壁部材４１と同様の構成）は、一つの電極１１ｂ毎に設置する構成、複数の電極１１ｂ毎に設置する構成いずれであってもよい。一つの電極１１ｂ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｂ上に固定された細胞の薬品応答性を測定する際に有用であり、複数の電極１１ｂ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｂ上に固定化した神経細胞間でネットワークを形成させることができ、ネットワークに関する解析を行う際に有用である。
【００５８】
図６に示すセンサ部１６ｂを用いた場合であっても、上述した細胞の固定化方法を用いることができる。
【００５９】
本実施形態においても、第２の実施形態に示した細胞の固定化方法を用いて細胞を電極１１ｂ上のみに固定化することが可能である。
【００６０】
（第４の実施形態）
本実施形態は、第２、３の実施形態とは異なる構成の細胞固定化器にかかるものである。図７は、本実施形態の細胞固定化器１９ｃの構成を模式的に示す断面図である。図８は図７のＢ−Ｂ矢視断面図である。ただし、図７は細胞固定化器１９ｃに細胞６１が固定化されている状態（すなわち、図２のＳｔ５の状態）を示すが、図８は細胞６１が固定化される前の状態（すなわち、図２のＳｔ４の状態）を示す。また、図８においては、センサ部１６ｃの下面に形成されているリード線９ｃを点線で示す。
【００６１】
本実施形態の細胞固定化器１９ｃは、第２の実施形態の細胞固定化器１９とは、センサ部の構成が異なるのみなので、センサ部以外の構成は同一の符号を付して説明を省略する。
【００６２】
基板１ｃは貫通孔１４ｃを有する。貫通孔１４ｃの孔壁面１４１ｃ、および孔開口部周縁１４２ｃには、電極１１ｃが形成されている。電極１１ｃは、真空蒸着法あるいはスパッタ法を用いて電極材料を貫通孔１４の孔壁面１４１ｃおよび開口部周縁１４２ｃに付着させることにより形成する。
【００６３】
センサ部１６ｃの下面には、電極１１ｃに接続するようにリード線９ｃが形成されている。よって、センサ部１６ｃと隔壁部材４１とは必ずしも別構成である必要はなく、一体で形成することも可能である。尚、リード線９ｃは、センサ部１６ｃの上面に形成されている構成であっても良い。
【００６４】
貫通孔１４ｃは、上面開口部が下面開口部より大きい円錐台形状を有する。貫通孔１４ｃに細胞６１の一部が捕捉され、細胞６１がセンサ部１６ｃ上に密着して保持される。貫通孔１４ｃは、円錐台形状を有することにより、細胞６１との広い密着面積を確保することができるが、貫通孔１４ｃの形状は、円錐台形状に限定されることはなく、細胞６１の一部を捕捉可能な形状であればよい。貫通孔１４ｃの大きさは、捕捉対象となる細胞６１に依存した任意の大きさを採用し得る。例えば、センサ部１６ｃ上面での開口部の直径が５μｍ以上１００μｍ以下の範囲にあり、下面開口部の直径が１μｍ以上１０μｍ以下の範囲にあり、好適な例示としては固定化対象の細胞の長径が略３０μｍの場合、上面開口部の直径が略２０μｍ、下面開口部の直径が略５μｍ、深さが略１５μｍである。
【００６５】
貫通孔１４ｃの形成方法は、基板１ｃの材料によって異なるが、例えば基板１ｃがＰＥＴからなる場合には、エキシマレーザを用いて形成することができる。また、例えば基板１ｃがＳｉウェハーである場合には、エッチングにより形成することができる。
【００６６】
さらに、貫通孔１４ｃの下方から細胞６１を吸引可能な吸引手段を備える構成とすることができる。このように構成することにより、貫通孔１４ｃにおける細胞６１の捕捉をより強固なものとすることができ、浮遊性の細胞であっても貫通孔１４ｃに捕捉することができる。
【００６７】
基板１ｃを形成する基板材料、電極１１ｃを形成する電極材料、また、細胞の固定化工程でマスク層１２ｃの形成に用いられるマスク材料はいずれも第１の実施形態に示した材料を使用することができる。
【００６８】
本実施形態においても、第２の実施形態に示した細胞の固定化方法を用いて細胞を所望の位置に固定化することが可能である。尚、本発明にかかる固定化方法は、貫通孔１４ｃと同じく、細胞６１を電極１１ｃ上に固定するのに寄与するとともに、さらに、所望の領域以外の領域に細胞６１が固定化されることを防ぐ。
【００６９】
（第５の実施形態）
本実施形態は、第２，３，４の実施形態とは異なる構成の細胞固定化器にかかるものである。図９は、本実施形態の細胞固定化器１９ｄのセンサ部１６ｄの上面を示す図である。尚、リード線９ｄは、センサ部１６ｄの下面に形成されているため、上面には現れないが、図９においては、便宜上、リード線９ｄを上面に示す。細胞固定化器１９ｄは、６行６列の格子状の各交点に電極１１ｄが配置されている構成である。第４の実施形態の細胞固定化器１９ｃは、センサ部１６ｃ上に一つの電極１１ｃのみが形成されている構成であるが、本実施形態の細胞固定化器１９ｄは、センサ部１６ｄ上に複数の電極１１ｄとこれに対応するリード線９ｄが形成されている構成である。
【００７０】
図９は、溶液保持部を省略して示すが、溶液保持部を構成する隔壁部材（第２の実施形態の隔壁部材４と同様の構成）は、一つの電極１１ｄ毎に設置する構成、複数の電極１１ｄ毎に設置する構成いずれであってもよい。一つの電極１１ｄ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｄ上に固定された細胞の薬品応答性を測定する際に有用であり、複数電極１１ｄ毎に隔壁部材を設置する構成は、例えば各電極１１ｄ上に固定化した神経細胞間でネットワークを形成させることができ、ネットワークに関する解析を行う際に有用である。尚、センサ部１６ｄは、その上面にリード線９ｄが形成されていないので、センサ部１６ｄと隔壁部材とは必ずしも別構成である必要はなく、一体で形成することも可能である
本実施形態においても、第２の実施形態に示した細胞の固定化方法を用いて細胞を電極１１ｄ上に固定化することが可能である。尚、本発明にかかる固定化方法は、貫通孔１４ｄと同じく、細胞６１を電極１１ｄ上に固定するのに寄与するとともに、さらに、所望の領域以外の領域に細胞６１が固定化されることを防ぐ。
【００７１】
以下、本発明の実施例を示す。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７２】
実施例１は、第１の実施形態にかかる実施例である。基板１としてＳＯＩウェハーを、マスク層１２の材料としてＲＮ９０１を、固定化材料としてＰＥＩ及びコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４５１１）を、固定化対象の細胞６として、ラット大動脈由来平滑筋細胞ＶＳＭＣｓ Ａ−１０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４７６）を用いた。
【００７３】
まず、４インチＳＯＩウェハーを１１０℃で５分間脱水ベイクした。その後、ＲＮ９０１を３００ｒｐｍで５秒間、３５００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。スピンコートしたウェハーを８０℃で１０分間プリベイクした後、直径１００μｍの円状パターンを露光し、現像した。現像後のウェハーを１５０℃で５分間ベイクした後、１７０℃で６０分間、３５０℃で６０分間さらにベイクした。かかるベイク工程において、沸点が略３５０℃以下である有害成分が除去された。
【００７４】
ベイク後、ＲＮ９０１をパターニングしたウェハーを７０％ＥｔＯＨで洗浄した。そのウェハー上に、溶液保持部を形成するための隔壁部材を設置し、０．１重量％ＰＥＩを３時間 コートし、その後、滅菌水で十分にリンスした。そして、細胞接着性タンパク質であるコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｐ−４５１１）を所定の方法により３７℃で３０分間で ウェハーにコートした。
【００７５】
その後、溶液保持部内を培養液で満たし、ラット大動脈由来平滑筋細胞ＶＳＭＣｓ Ａ−１０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１４７６）をウェハー上に播種した。培養液は、ＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭ＋１０重量％ＦＢＳを用いた。３７℃、ＣＯ2の濃度が５重量％の雰囲気下で４日間培養した。その後、ウェハーをＣＯ2の濃度が５重量％の雰囲気下から出し、低ＣＯ2濃度（ＣＯ2の濃度０．４重量％以下）の雰囲気下で３７℃を保つように放置した。４日後、ウェハーからマスク層１２が剥離した。注意深く、剥離したマスク層を取り除いたところ、直径１００μｍ内のみに細胞が固定化された円状パターンが観測された。トリパンブルー染色により、固定化されている細胞が生きていることが確認された。
【００７６】
次に、生きていることが確認された細胞の活動に由来する電位を、パッチクランプにより検出した。パッチクランプは、電流を０アンペア（Ａ）に固定したCurrent-Clampモードで測定した。パッチクランプでの活動電位の測定に際して、培養液を測定液に置換した。測定液は、Ｃａイオンと、緩衝作用を有するＨＥＰＥＳを有するタイロード液を用いた。Ｃａイオン濃度は２ｍＭ、ｐＨは７．４、浸透圧は２７３ｍＯｓｍとなるように調整した。パッチピペットに封入する内液として、塩化カリウム、ＥＧＴＡ、Ｃａイオン、緩衝作用を有するＨＥＰＥＳを含む水溶液を調整した。内液は、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭとして、ｐＨが７．２となるように調整した。ＥＧＴＡは、Ｃａイオンをキレートする。
【００７７】
図１０は、細胞から検出された電位変化を示す図である。横軸は時間、縦軸は電圧（すなわち細胞の活動を表す電位の強さ）を示す。図１０からわかるように、細胞の静止電位は略５０ｍＶであり、細胞は振幅略８０ｍＶｐ−ｐの電位変化を周期的に、連続的に発生させた。一方、測定液をＣａイオンを含まない測定液に置換したところ、図示は省略するが、周期的な電位変化が観測されなくなった。したがって、図１０で観測される周期的な電位変化は、細胞膜に存在し、Ｃａイオン透過性に関係する各々のイオンチャンネルが細胞内の電位に感受して開閉することによって、細胞内の電位を調整し、細胞活動を行っていることを示すものである。よって、固定化されている細胞が活性を有したままであることが確認された。
【００７８】
一方、比較例１−１として、ウェハー上に細胞６を固定化するまで同様の処理を行い、その後、細胞を培養した工程における雰囲気と同様の雰囲気（３７℃、ＣＯ2の濃度が５重量％）下に放置した。８日経過しても、マスク層１２は剥離しなかった。
【００７９】
実施例１において、マスク層１２が剥離したときの培養液５のｐＨを測定したところ、７．９であった。培養中、培養液５はＣＯ2の濃度が５重量％の雰囲気下にあるため、ｐＨは略７．４で中性に保たれていた。実施例１と比較例１−１の結果から、実施例１において、マスク層１２は、培養液５が大気中に放置され、ｐＨの値がアルカリ側に変化したことにより剥離したことがわかる。
【００８０】
尚、マスク材料として上記ＲＮ９０１に代えて、ＣＲＣ８３００を用いて同様の実験を行った。この場合、マスク層１２は、低ＣＯ2濃度（ＣＯ2の濃度０．４重量％以下）の雰囲気下に放置してから７日後にウェハーから剥離した。
【００８１】
尚、比較例１−２として、実施例１とは、ベイク工程の条件のみ違えて実験した。比較例１−２におけるベイク工程は、現像後のウェハーを１５０℃で５分間ベイクした後、１７０℃で６０分間、３２０℃で３０分間さらにベイクした。
【００８２】
比較例１−２では、ウェハー上への細胞の固定化は確認されなかった。比較例１−２の結果から、比較例１−２のベイク工程では、マスク層１２から細胞の有害成分が除去されなかったと推測される。
【実施例２】
【００８３】
実施例２は、第３の実施形態にかかる実施例である。
【００８４】
（図６に示すセンサ部の作製）
まず、４インチＳｉウェハー上にフォトレジストをスピンコートする。６行６列の格子状の各交点に直径５μｍの円形の電極１１ｂが位置し、かつ電極１１ｂの中心間距離が２０μｍであり、各電極１１ｂから放射状に広がるリード線９ｂを有するパターンを複数、Ｓｉウェハーの所定の位置に露光し、現像した。そのウェハーの全面に真空蒸着法により金薄膜を堆積させた。その後、リフトオフにより、Ｓｉウェハー上に金電極のパターニングが完了した。そして、リード線９ｂ部のみに専用現像液を要する絶縁材料であるネガティブ感光性ポリイミド樹脂ＵＲ−８３００（東レ社製）で被覆した後、ダイシングし、４０ｍｍ角の小片に切り出した。各小片は、中心に６行６列で直径５μｍの円形の電極１１ｂが露出し、電極１１ｂから引き出されたリード線９ｂが、四方周囲に配置された配線引出し端子に連通した構成であった。このように作製した各小片を、センサ部１６ｂとした。
【００８５】
（細胞の固定化）
上記のように作製したセンサ部１６ｂの上面にＣＲＣ８３００を８００ｒｐｍで１０秒間、４０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。スピンコートしたセンサ部を１１０℃６分間プリベイクした後、電極１１ｂに対応する直径５μｍの円状パターン（６行６列）を露光し、現像した。このようにして、電極１１ｂ上面を除く領域にマスク層を形成した。現像後のウェハーを１５０℃にて５分間ベイクした後、３００℃で４０分間、４５０℃で４０分間さらにベイクした。
【００８６】
その後、ＣＲＣ８３００をパターニングしたセンサ部１６ｂ上面を７０％ＥｔＯＨで洗浄した。そのセンサ部１６ｂ上面に、溶液保持部を構成する隔壁部材を当該隔壁部材内に全電極１１ａを含むように設置し、溶液保持部内を培養液で満たした。そして、胎生１７日目のラット大脳皮質より、当業者に公知の方法を用いて調整した神経細胞を播種した。センサ部１６ｂへの播種濃度は、５×１０4細胞／ｍＬの濃度とした。播種後、温度３７℃でＣＯ2濃度が５重量％の雰囲気下で５時間培養した後、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）溶液をｐＨ調整剤として培養液内に注入したところ、センサ部１６ｂ上からマスク層が剥離した。注意深く、剥離したマスク層を取り除き、その後、細胞を２週間培養したところ、電極上の神経細胞間でネットワークが再構成されていることを確認した。
【００８７】
このとき神経細胞は、５〜１０個の細胞でクラスターを形成し、クラスター間でネットワークが構成されていた。尚、ネットワークが再構成されていることの確認は、顕微鏡観察により行った。
【００８８】
再構成された神経細胞ネットワーク上の一つのクラスターの一つの細胞に５０μＡの双極性の１００μ秒定電流刺激を印加し、その刺激の伝達を残り６３個のチャンネルより測定した。その結果を図１１に示す。図１１は、各チャンネルで表示したコンピュータの画面のプリントアウトを示すものであり、各チャンネルにおける横軸は時間、縦軸は電圧（すなわち細胞の活動を表す電位の強さ）を示す。刺激を印加した電極はチャンネル３８である。図１１より、円で囲んだチャンネル、つまり６３個中２４個に連動した信号の伝達を観測できた。
【００８９】
一方、比較例２として、ウェハー上に細胞を固定化するまで実施例２と同様の処理を行い、その後、ウェハーを細胞を培養した工程における雰囲気と同様の雰囲気（３７℃、ＣＯ2の濃度が５重量％）下に放置する実験を行った。８日経過しても、マスク層は剥離しなかった。
【００９０】
尚、絶縁層に用いたＵＲ−８３００は、上記マスク層が剥離した条件では剥離しないものであった。また、ＣＲＣ８３００は有害成分として沸点２０３℃のγブチロラクトンを含有するものであるが、２０３℃より高温でベイクを行なったことにより、かかる有害成分は気化し、除去された。したがって、かかる有害成分が、細胞に影響を与えることはなかった。
【００９１】
実施例２においてマスク層が剥離したときの培養液のｐＨを測定したところ、８．１だった。培養中、培養液はＣＯ2の濃度が５重量％の雰囲気下にあるため、ｐＨは略７．４で中性に保たれていた。実施例２と比較例２の結果から、実施例２のマスク層は、上記のように、培養液にＴＭＡＨを注入し、培養液をアルカリ性に変化させたことにより剥離したものであることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の細胞の固定化方法は、細胞の活性を検出する用途の素子に細胞を固定化するために有用である。前記素子を備えた装置は、例えば、薬品スクリーニング、神経細胞間で形成されるネットワークに関する解析を行う際に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、第１の実施形態の細胞の固定化方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の細胞の固定化方法を模式的に示す図である。
【図３】図３は、第２の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す断面図である。
【図４】図４は、第２の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す図３のＡ−Ａ矢視断面図である。
【図５】図５は、第２の実施形態の細胞外電位測定装置の概略図である。
【図６】図６は、第３の実施形態の細胞固定化器のセンサ部の上面図である。
【図７】図７は、第４の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す断面図である。
【図８】図８は、第４の実施形態の細胞固定化器の構成を模式的に示す図７のＢ−Ｂ矢視断面図である。
【図９】図９は、第５の実施形態の細胞固定化器のセンサ部の上面図である。
【図１０】図１０は、実施例１における測定結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例２における測定結果を示す図である。
【符号の説明】
【００９４】
１，１ａ，１ｃ  基板
４，４１  隔壁部材
５，５１  培養液
６，６１  細胞
９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ  リード線
１１，１１ｂ，１１ｃ，１１ｄ  電極
１２，１２ａ，１２ｃ  マスク層
１３  参照電極
１４ｃ，１４ｄ  貫通孔
１６，１６ｂ，１６ｃ，１６ｄ  センサ部
１７，１７１  溶液保持部
１９，１９ｂ，１９ｃ，１９ｄ  細胞固定化器
３３  信号増幅部
３４  刺激信号付与部
３５  撮像部
３６  載置部
３８  溶液駆動部
３９  制御部
４０  細胞外電位測定装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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