(57)【要約】      （修正有）【課題】膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異（ＩＡＰＰＳ２０Ｇ変異）を検出する方法を提供する。【解決手段】ＩＡＰＰＳ２０Ｇ変異を含む核酸について、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、特定の配列に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【請求項２】
核酸プローブが、配列番号１２または１３を有する請求項１記載の核酸プローブ。
【請求項３】
一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異であり、核酸プローブは、請求項１または２に記載の核酸プローブである前記方法。
【請求項４】
試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
増幅をＤＮＡポリメラーゼを用いる方法により行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
増幅を核酸プローブの存在下で行う請求項５記載の方法。
【請求項７】
末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、請求項３記載の方法のためのキット。
【請求項８】
核酸プローブが、配列番号１２または１３を有する請求項６記載のキット。
【請求項９】
膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異を含む領域を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む請求項７または８記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質変異遺伝子の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵ラ氏島アミロイドタンパク質（Ｉｓｌｅｔ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（ＩＡＰＰ））は２型糖尿病患者の膵ラ氏島に高頻度に沈着しているアミロイドの主要構成成分で、膵β細胞からインスリンと共に血中に分泌されている。ＩＡＰＰのアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換するミスセンス変異（Ｓ２０Ｇ変異）は日本人２型糖尿病患者の約２．６％、その中でも若年発症者の約１０％に存在しており、この変異が存在することで糖尿病の発症リスクが高まるといわれている。
【０００３】
ＩＡＰＰにＳ２０Ｇ変異をもたらす塩基の変異（以下、「ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異」ともいう）が存在するとその部分に制限酵素の認識部位が出現するため、ＰＣＲで変異部分を含むように増幅を行い、制限酵素で切断し、その後電気泳動で切断されたかどうかを検出するという方法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）で検出を行うことが知られている（非特許文献１）。
【０００４】
ＰＣＲは数分子の鋳型から数１０億倍もの分子を増幅するため、増幅産物がほんの少し混入した場合でも偽陽性、偽陰性の原因になり得る。ＰＣＲ−ＲＦＬＰはＰＣＲ反応後に増幅産物を取り出して制限酵素処理を行うという必要があるため、増幅産物が次の反応系に混入する恐れがある。よって、偽陽性、偽陰性の結果が得られてしまうことがある。さらに、ＰＣＲ終了後、制限酵素で処理を行い、その後電気泳動を行うため、検出に必要な時間も非常に長くかかってしまう。また、操作が複雑なため、自動化が困難である。
【０００５】
一方、一般に、変異を含む領域をＰＣＲで増幅した後、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を解析する方法が知られている（非特許文献２、特許文献１）。
【０００６】
【非特許文献１】
日本糖尿病学会編、「糖尿病遺伝子診断ガイド」、文光堂、ｐ．５６−５９
【非特許文献２】
クリニカルケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０００年、第４６巻、第５号、ｐ．６３１−６３５
【特許文献１】
特開２００２−１１９２９１号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を検出するのに有効な消光プローブを特定し、ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を検出する方法及びそのためのキットを提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上述のプローブを用いる方法に関する文献においては、プローブの設計に関し、末端部が蛍光色素により標識された消光プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッドの複数塩基対が少なくとも一つのＧとＣのペアを形成するように設計するという教示があるのみである。本発明者らは、ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異に関し、上記条件を満たす消光プローブを設計し、検出を試みたが、容易に検出を可能とする消光プローブは得られなかった。
【０００９】
本発明者らは、ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を含む特定の領域に基づいて消光プローブを設計することにより、消光プローブを用いる融解曲線分析によりＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
【００１０】
（１）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブ。
【００１１】
（２）核酸プローブが、配列番号１２または１３を有する（１）の核酸プローブ。
【００１２】
（３）一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異であり、核酸プローブは、（１）または（２）の核酸プローブである前記方法。
【００１３】
（４）試料に含まれる核酸における一塩基多型の部位を含む領域を増幅して一塩基多型を有する核酸を得ることを含む（３）の方法。
【００１４】
（５）増幅をＤＮＡポリメラーゼを用いる方法により行う（４）の方法。
【００１５】
（６）増幅を核酸プローブの存在下で行う（５）の方法。
【００１６】
（７）末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含む、（３）の方法のためのキット。
【００１７】
（８）核酸プローブが、配列番号１２または１３を有する（６）のキット。
【００１８】
（９）膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異を含む領域を、ＤＮＡポリメラーゼを用いる方法で増幅するためのプライマーをさらに含む（７）または（８）のキット。
【００１９】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明プローブ及び本発明検出方法
本発明プローブは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブであって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されていることを特徴とする。
【００２０】
本発明プローブは、配列番号１に示す塩基配列（ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異における変異型の塩基を有する配列）において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有する他は、特許文献１に記載された消光プローブと同様でよい。本発明に使用される消光プローブの塩基配列の例としては、配列番号１２及び１３が挙げられる。蛍光色素としては、特許文献１に記載されたものが使用できるが、具体例としては、ＦＡＭ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ＦＬ等が挙げられる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法、例えば特許文献１に記載の方法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明検出方法は、一塩基多型の部位を有する核酸について、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて、蛍光色素の蛍光を測定することにより融解曲線分析を行い、融解曲線分析の結果に基づいて変異を検出する方法であって、一塩基多型は、膵ラ氏島アミロイドタンパク質をコードする核酸における、膵ラ氏島アミロイドタンパク質のアミノ酸配列の２０位のセリンがグリシンに置換する変異をもたらす塩基配列の変異であり、核酸プローブは本発明プローブであることを特徴とする。
【００２２】
本発明検出方法は、ＩＡＰＰをコードするＤＮＡのＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を含む領域を増幅すること、及び、本発明プローブを用いることの他は、通常の核酸増幅及び融解曲線分析（Ｔｍ解析）の方法に従って行うことができる。
【００２３】
核酸増幅の方法としては、ＰＣＲポリメラーゼを用いる方法が好ましく、その例としては、ＰＣＲ、ＩＣＡＮ、ＬＡＭＰ等が挙げられる。ＰＣＲポリメラーゼを用いる方法により増幅する場合は、本発明プローブの存在下で増幅を行うことが好ましい。用いるプローブに応じて、増幅の反応条件等を調整することは当業者であれば容易である。これにより、核酸の増幅後にプローブのＴｍを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００２４】
以下、ＰＣＲを用いる場合を例として、さらに説明する。ＰＣＲに用いるプライマー対は、本発明プローブがハイブリダイゼーションできる領域が増幅されるようにする他は、通常のＰＣＲにおけるプライマー対の設定方法と同様にして設定することができる。プライマーの長さ及びＴｍは、通常には、１０ｍｅｒ〜４０ｍｅｒで４０〜７０℃、好ましくは１５ｍｅｒ〜２５ｍｅｒで５５〜６０℃である。プライマー対の各プライマーの長さは同一でなくてもよいが、両プライマーのＴｍはほぼ同一（通常には、相違が２℃以内）であることが好ましい。なお、Ｔｍ値は最近接塩基対（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）法により算出した値である。プライマー対の例としては、配列番号２及び３に示す塩基配列を有するプライマーからなるものが挙げられる。
【００２５】
ＰＣＲは、本発明で使用される本発明プローブの存在下で行うことが好ましい。これにより、増幅反応終了後に増幅産物を取り扱う操作を行うことなくＴｍ解析を行うことができる。用いるプローブに応じて、プライマーのＴｍやＰＣＲの反応条件を調整することは当業者であれば容易である。
【００２６】
代表的なＰＣＲ反応液の組成を挙げれば、以下の通りである。
【００２７】
【表１】
ＤＮＡ断片                １０１〜１０８分子／反応
プライマー                    ２００〜１０００Ｍ
プローブ                  １００〜１０００ｎＭ
ヌクレオチド            各２０〜２００μＭ
ＤＮＡポリメラーゼ            ０．０１〜０．０３単位／μｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．４〜９．０）      ５〜２０ｍＭ
ＭｇＣｌ２                  １．５〜３ｍＭ
ＫＣｌ                    １０〜１００ｍＭ
グリセロール              ０〜２０％
（最終液量：１０〜１００μｌ）
【００２８】
また、代表的な温度サイクルを挙げれば、以下の通りであり、この温度サイクルを通常２５〜４０回繰り返す。
（１）  変性、９０〜９８℃、１〜６０秒
（２）  アニーリング、６０〜７０℃、１０〜６０秒
（３）  伸長、６０〜７５℃、１０〜１８０秒
【００２９】
アニーリング及び伸長を一ステップで行う場合には、６０〜７０℃、１０〜１８０秒の条件が挙げられる。
【００３０】
Ｔｍ解析は、本発明プローブの蛍光色素の蛍光を測定する他は通常の方法に従って行うことができる。蛍光の測定は、蛍光色素に応じた波長の励起光を用い発光波長の光を測定することに行うことができる。Ｔｍ解析における昇温速度は、通常には、０．１〜１℃／秒である。Ｔｍ解析を行うときの反応液の組成は、プローブとその塩基配列に相補的な配列を有する核酸とのハイブリダイゼーションが可能であれば特に制限されないが、通常には、一価の陽イオン濃度が１．５〜５  ｍＭ、ｐＨが７〜９である。ＰＣＲ等のＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅方法の反応液は、通常、この条件を満たすので、増幅後の反応液をそのままＴｍ解析に用いることができる。
【００３１】
Ｔｍ解析の結果に基づくＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異の検出は通常の方法に従って行うことができる。本発明における検出とは、変異の有無の検出の他、変異型ＤＮＡの定量、野生型ＤＮＡと変異型ＤＮＡの割合の測定も包含する。
【００３２】
＜２＞本発明キット
本発明キットは、本発明の検出方法に用いるためのキットである。このキットは、末端が蛍光色素で標識され、ハイブリダイゼーションしたときに蛍光色素の蛍光が減少する核酸プローブ（消光プローブ）であって、配列番号１に示す塩基配列において塩基番号２４７で終わる１３〜３０塩基長の配列に相補的な配列を有し、５’末端が蛍光色素で標識されている前記核酸プローブを含むことを特徴とする。
【００３３】
消光プローブについては、本発明プローブに関し、上記に説明した通りである。
【００３４】
本発明検出キットは、消光プローブの他に、本発明の検出方法における核酸増幅を行うのに必要とされる試薬類、特にＤＮＡポリメラーゼを用いる増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
本発明検出キットにおいて消光プローブ、プライマー及びその他の試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合物とされていてもよい。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００３７】
【実施例１】
ヒトＩＡＰＰ遺伝子のＳ２０Ｇ変異を含む塩基配列（配列番号１）に基づき、Ｓ２０Ｇ変異を含む部分を増幅できるように表２に示すプライマーを設計した。表２中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
次に、表３に示す、末端部にＣを有するプローブを設計した。表３中、位置は、配列番号１に示す塩基配列における塩基番号を示す。また、塩基配列中の大文字は、ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異の部位を示し、３’末端の（Ｐ）は、リン酸化されていることを示す。ＢＯＤＩＰＹ（商標）  ＦＬ及びＴＡＭＲＡ（商標）による標識は、常法に従って行った。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ周辺領域約６００ｂｐ（配列番号１）を組み込んだプラスミドをサンプルとして、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｉｅｄ）を用い、以下の条件でＰＣＲ及びＴｍ解析を行った。Ｔｍ解析における励起波長及び検出波長は、それぞれ４５０〜４９５ｎｍ及び５０５〜５３７  ｎｍ（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）、５２７〜５５５  ｎｍ及び５６５〜６０５  ｎｍ（ＴＡＭＲＡ）であった。
【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
各プローブを用いてＰＣＲ及びＴｍ解析を行った結果、プローブ５ＦＬ−ｍｔ−１−１８、５Ｔ−ｍｔ−１−１８、５ＦＬ−ｍｔ−１−２１および５Ｔ−ｍｔ−１−２１を用いたときのみ、Ｔｍ解析で解析の可能な蛍光強度の変化が認められた。なお、各プローブのＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を含む塩基配列に対する配置を図１及び２に示す。図中、Ｗｉｌｄ配列（配列番号１５）及びｍｕｔａｎｔ配列（配列番号１６）は、配列番号１の塩基配列の塩基番号２１３〜２６２に相当する。また、図中、Ｆは蛍光色素を示す。図１及び２に示す配置からみて、プローブがＴｍ解析で使用できるかどうかは、蛍光色素を結合させたＣの位置に依存すると考えられ、プローブの長さは、多型部位を含む限り、あまり重要でないと考えられる。
【００４５】
以下、プローブ５ＦＬ−ｍｔ−１−２１を用いて、ゲノムＤＮＡの絶対量に関する感度、再現性、及び、変異型の割合に関する検出感度を検討した。
【００４６】
上記プラスミドの代わりに、ゲノムＤＮＡ（野生型）をそれぞれ、０、２０、２００及び２０００コピー含むサンプルを用いて、上記の方法を繰り返した。結果を図３に示す。図３から明らかなように、２０コピーであっても検出可能であることが示された。
【００４７】
次に、野生型の塩基配列（配列番号１の塩基配列において塩基番号２８５がＡである他は上記プラスミドと同じ）を有するプラスミドを調製した。野生型プラスミドとこの変異型プラスミドとを混合したサンプル（ｗｔ／ｍｔ）を１０個調製し、野生型プラスミドのみのサンプル（ｗｔ／ｗｔ）及び変異型プラスミドのみのサンプル（ｍｔ／ｍｔ）とともに、上記の方法を繰り返した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、本方法は再現性に優れることが示された。
【００４８】
さらに、野生型プラスミドと変異型プラスミドとの比率を変えて、上記の方法を繰り返した。結果を図５に示す。比率に応じて、両ピークの高さが変化し、両ピークの高さの比に基づいて、比率を求めることが可能なことが示された。
【００４９】
なお、図３〜５において縦軸は、蛍光強度の一次導関数の逆符号の値（−ｄＦ／ｄｔ）、横軸は温度（℃）である。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、ＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を検出するのに有効な消光プローブが提供され、さらに、それを用いるＩＡＰＰ  Ｓ２０Ｇ変異を検出する方法及びそのためのキットが提供される。Ｔｍ解析は数十秒で完了するため、検出に必要な時間も大幅に短略化出来る。プローブの存在下での核酸の増幅とＴｍ解析を組み合わせる本発明の好ましい態様によれば、核酸の増幅後にプローブのＴｍを解析するだけなので、反応終了後増幅産物を取り扱う必要がない。よって、増幅産物による汚染の心配がない。また、増幅に必要な機器と同じ機器で検出することが可能なので、容器を移動する必要すらない。よって、自動化も容易である。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】変異の識別不可能な消光プローブの位置を示す。
【図２】変異の識別可能な消光プローブの位置を示す。
【図３】実施例１の方法のゲノムＤＮＡの絶対量に関する感度を示す。
【図４】実施例１の方法の再現性を示す。
【図５】実施例１の方法の変異型の割合に関する検出感度、定量性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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