(57)【要約】【課題】  術中のリンパ節アッセイの提供。【解決手段】  微小転移についての術中のリンパ節アッセイにおいて、外科医は既知の方法による外科手術中に、前哨リンパ節を確認する。前哨節は除去され、核酸抽出のために前処理される。核酸（例えばＲＮＡ）は次に前哨節から迅速に抽出される。微小転移を示すマーカーが存在する場合には、次にそれらが増幅され、そして検出される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
患者からリンパ節組織サンプルを得；
核酸の増幅及び検出によって上記サンプルを分析し；そして
２以上のマーカーの存在がカットオフ値を上回るか否かを決定する、
を含む術中の分子診断アッセイの実施方法。
【請求項２】
微小転移を検出するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乳癌転移を検出するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
黒色腫転移を検出するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーが、配列番号１７、並びに配列番号１４〜１６及び配列番号１８から成る群の１以上に対応する遺伝子の発現を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップの全てが外科手術の間に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
核酸の増幅及び検出がＰＣＲにより実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
微小転移を検出するために用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
乳癌転移を検出するために用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
黒色腫転移を検出するために用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記マーカーが、配列番号２１及び配列番号２２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＣＲがＲＴ−ＰＣＲである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記逆転写反応が、９分間未満実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記逆転写反応が、約３分間実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１以上の内部対照試薬が、前記逆転写反応に添加される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
以下のステップ：
（ａ）  着目のＲＮＡを含有する細胞を溶解させ、それらのホモジネートを作製し、
（ｂ）  場合により、上記ホモジネートを希釈し、
（ｃ）  ＲＮＡが結合する材料を含有するか又はそれが付加されている支持体と、加湿し均質化された作業サンプルを接触させ、
（ｄ）  上記サンプルを上記支持体に結合させ、
（ｅ）  夾雑物質及び干渉物質を除去し、
（ｆ）  上記支持体を乾燥させ、そして
（ｇ）  上記支持体からＲＮＡを溶出する、
によって、さらに抽出ステップでろ過を利用することによって、リンパ節からＲＮＡを抽出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
核酸の増幅及び検出試薬を含む、術中のリンパ節アッセイを実施するためのキット。
【請求項１８】
前記試薬が、配列番号１４〜１８及び配列番号２１〜２２から成る群から選択されるマーカー群の存在を検出するための配列を有するプライマーを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記プライマーが、配列番号１〜６、８〜１２、２５〜２８、３０及び３３〜３５から成る群から選択される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＲＴ−ＰＣＲ試薬を含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
術中の分子診断アッセイを実施し、そして当該アッセイの結果に従って患者を処置することを含む方法であって、上記アッセイが、以下のステップ：
上記患者からリンパ節組織サンプルを得；
核酸の増幅及び検出により上記サンプルを分析し；そして
２以上のマーカーの存在がカットオフ値を超えているか否かを決定する、
を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
本発明は、分子診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ節の関与は、数多くの充実性腫瘍における最強の予後因子であり、リンパ節微小転移の検出は、病理学者及び外科医にとって大きな関心事である。現在のリンパ節評価には、Ｈ＆Ｅ染色した組織切片の顕微鏡検査が関与し、３つの主要な制限すなわち、（ａ）単一の腫瘍細胞又は多細胞でも小さな病巣は容易に見逃される；（ｂ）結果は迅速に入手できず、このことはすなわち、前哨リンパ節処置の結果が陽性であればつねに腋窩リンパ節の除去のための第２の外科手術が必要であることを意味している；そして（ｃ）１つか２つの組織切片しか検討されず、かくして各節の大部分が検査されないまま放置される、という制限に苦しめられている。連続切出しは、サンプル採取ミスの問題を克服する助けとなり、又免疫組織化学（ＩＨＣ）は個々の腫瘍細胞を同定する一助となりうる。しかしながらこれらの方法の組合せは、日常的分析にとってはコストが高過ぎかつ時間のかかるものであり前哨リンパ節検査といったような特殊なケースに制限される。
【０００３】
外科的判断は往々にしてリンパ節の術中の凍結切片分析に基づいている。しかしながら、これらの方法の感度は比較的低く、標準的なＨ＆Ｅ病理学に比べ５０〜７０％であり、このため２回目の外科手術率が受容し難いほどに高くなる。リンパ節関与のないステージ０〜Ｉの乳癌患者の５年生存率は、それぞれ９２％と８７％である。一方、リンパ節関与をまさに有するさらに進んだステージの乳癌患者の５年生存率は、著しく低下する。例えばステージＩＩの乳癌の生存率は、わずか７５％、ステージＩＩＩは４６％、ステージＩＶはで１３％である。節陰性の乳癌患者の生存率は改善されているものの、組織学的に節陰性である患者も疾病の再発に苦しんでいる。これは、節のサンプル採取及び個々の腫瘍細胞又は小さな腫瘍病巣の検出の感度が低いことに関係する問題を含めた微小転移の検出における現行の技術の制限に起因することが多いと思われる。
【０００４】
乳癌節における転移のより正確でかつ感度の高い検出に対するニーズに加えて、黒色腫節内での、並びに特に術中環境における外科手術余地のより正確な検出における、高速かつ高感度の試験に対する類似のニーズが存在している。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、この環境において有用でありうる分子生物学の分野での強力な手段である。この技術は、意義深い形で分析可能な量へと少量の核酸フラグメントを複製／増幅させることを可能にする。さらに、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＴＲＰＣＲ）の開発により、この技術は、より信頼性が高くかつ自動化しやすいものとなった。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲは、汚染する可能性が低く、遺伝子発現の定量を提供する。かかる定量は、術中のリンパ節アッセイにおける微小転移の検出に適用可能であった。分子診断におけるＰＣＲは、その複数の利点にもかかわらず、いくつかの制限を有し、そのため、標準的な臨床診断環境内特に術中環境内でそれを応用することは困難になっている。
【０００６】
かかる制限の１つは、ＰＣＲ診断を実施するためのその所要時間にある。標準的なＰＣＲ反応には、分単位ではなく何時間も必要である。該技術が術中で有用とならなくてはならない場合、ＰＣＲ反応を実施するために必要な時間を短縮することが必要である。さらに、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲは定量的結果を提供しうるものの、これまでのところ、かかる技術に基づいて陰性結果と陽性結果を区別するための既知のカットオフ値は全く存在しておらず、又、どの核酸フラグメントが最も良好に検出され微小転移の存在と相関づけされているかは明確ではなかった。核酸フラグメントの増幅及び検出のためのその他の方法も同じく存在しており、各々類似の問題をかかえている。
【０００７】
既存の問題点を克服する術中の分子リンパ節アッセイが、医療共同体により充分受入れられるものと思われる。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約
本発明は、微小転移のための術中のリンパ節アッセイである。外科医は、既知の方法に従って外科手術中に前哨リンパ節を同定する。前哨リンパ節は、以下で記述されている通りに除去され前処理される。核酸（例えばＲＮＡ）は次に前哨節から迅速に抽出される。微小転移を示すマーカーが存在する場合には、次に、それらを増幅し検出する。次に、外科医は、かかるマーカーの検出の結果に基づいて措置を講じる。
【０００９】
該アッセイは、最も好ましくは、数分内で完全なＰＣＲ反応の実施を可能にし、かくして前哨リンパ節内の微小転移を検出するため術中診断においてＰＣＲを使用できるようにする高速ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ方法に基づいている。
【００１０】
本発明の１つの態様においては、術中の分子診断方法は、患者から組織サンプルを得る段階；サンプルからＲＮＡを抽出し核酸の増強及び検出によりサンプルを分析する段階；及び１以上の遺伝子発現マーカーの存在がカットオフ値を上回っているか否かを決定する段階といった、外科手術中に行なわれる段階を内含する。カットオフ値は、絶対値であっても、又は対照遺伝子の発現に比べた値であってもよい。
【００１１】
本発明のもう１つの態様では、遺伝子発現マーカーは、乳癌といったような特定の組織に特異的な核酸フラグメントである。
【００１２】
本発明のさらにもう１つの態様においては、遺伝子発現マーカーは、悪性度を示す核酸フラグメントである。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの態様においては、リンパ節サンプルは均質化され、次に、迅速な抽出方法であるにもかかわらず充分なＲＮＡが確実に抽出されるように希釈される。
【００１４】
本発明のさらにもう１つの態様においては、マーカーは、乳癌の診断の場合にはマンマグロビン（配列番号１７）及びＰＩＰ（配列番号１８）、Ｂ３０５Ｄ（特にイソ型Ｃ、配列番号１４）、Ｂ７２６（配列番号１５）、ＧＡＢＡ（配列番号１６）又はＯ８Ｅ（配列番号＿）そして黒色腫の場合にはチロシナーゼ（配列番号２２）及びＭＡＲＴＩ（配列番号２１）のものである。
【００１５】
本発明のさらにもう１つの態様においては、前哨リンパ節からＲＮＡを得る段階、着目の１以上の遺伝子に特異的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法を実施する段階及びマーカーの存在が予め定められたカットオフを上回るか否かを決定する段階を内含する方法により、術中に微小転移が検出される。
【００１６】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、キットには、微小転移についての術中リンパ節アッセイを実施するための試薬が収納されている。
【００１７】
詳細な説明
癌の診断のための術中の方法が提示されている。これらの方法は、リンパ節から核酸を抽出する迅速な方法及び転移を示す核酸フラグメント（かかるフラグメントは本書で「マーカー」と呼ばれる）を増幅し検出する方法を利用する。
【００１８】
本発明の方法の重要な態様は、或る種の遺伝子の発現を示すマーカーの迅速な増幅及び検出である。かかる方法が術中のアッセイにとって受容可能な期間内で実施できる（すなわち約３５分以下）ことを条件として、信頼性があり感度の良いいかなる特異的方法でも使用することができる。これには、ＰＣＲ方法、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、ストランド変位増幅法（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅方法（ＮＡＳＢＡ）その他が含まれる。関与する高速分子診断は、最も好ましくは、ＱＲＴ−ＰＣＲを含めた定量ＰＣＲ法である。
【００１９】
利用される増幅方法の如何に関わらず、アッセイを実施するのに用いられる組織を適切にサンプル採取することが重要である。これには、前哨リンパ節の適正な切除及び処理、並びにそこからのＲＮＡの抽出が含まれる。ひとたび得られたならば、存在するあらゆる癌細胞が検出されるような形で適正に節を処理することが重要である。
【００２０】
組織サンプルから核酸を抽出するためにさまざまな技術を利用することができる。各々のケースにおける標準的実践方法は、時間のかかるものであり、この目的で設計された市販のキットを用いた場合でさえ困難でありうる。標準的な市販の核酸抽出キットは、核酸を抽出するために少なくとも１５分が必要である。本発明の方法においては、核酸は８分未満、好ましくは６分未満で抽出される。これらの高速抽出方法は、同じ日付のR. Belly、J. Toner及びJ. Backusによる。本書に参考として内含されている「細胞及び組織からのＲＮＡの高速抽出」という題の特許出願の主題である。
【００２１】
無傷のＲＮＡをうまく単離するには、一般に、細胞又は組織の有効な分断、核タンパク質複合体の変性、内因性リボヌクレアーゼ（ＲＮＡａｓｅ）の不活性化、及び汚染性のＤＮＡ及びタンパク質の除去という４つの段階が関与している。細胞抽出物中に存在するリボヌクレアーゼを不活性化するチオシアン酸グアニジニウム（ＧＴＣ）及びＢ−メルカプトエタノールの分断及び保護特性により、これらの物質は、第１段階のための好ましい試薬となっている。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）といったような界面活性剤と合わせて使用された場合、核タンパク質複合体の分断が達成され、ＲＮＡを溶液中に放出させタンパク質を含まずにこれを単離することが可能になる。高濃度のＧＴＣの存在下での細胞抽出物の希釈は、ＲＮＡが溶液中に残っている間に細胞タンパク質の選択的沈殿を発生させる。遠心分離により、沈殿したタンパク質及び細胞ＤＮＡのリゼイトを清澄化することができ、これは、好ましくはカラムを通して実施される。
【００２２】
かかるカラムは同様にＤＮＡをせん断し、サンプルの粘度を低下させる。好ましくは、シリカ及びその他の材料が入ったスピンカラム上でＲＮＡ精製が行なわれる。手動式細胞及び組織分断は、米国特許４，７１５，５４５号に記述されているような使い捨て組織磨砕機を用いて行なうことができる。均質化時間は１〜２分以内であり、好ましくは３０〜４５秒以上である。次に、その粘度を低下させるため、シュレッダカラム（例えばＱＩＡシュレッダ、ＱＩＡＧＥＮ Inc., Valencia, CA又は適切な代用品）又はOmni International (Warrenton, VA) から市販されているＰＣＲ組織均質化キットといったようなＲＮＡ処理装置でサンプルを処理することができる。
【００２３】
ＲＮＡは、上述のとおりのスピンカラムを介して沈殿析出され、遠心分離時間は３０秒未満である。Qiagen Inc.から入手可能なものといった市販のＲＮＡ抽出キットを用いた場合、カラム乾燥段階を除いて全ての段階について遠心の代りにろ過が用いられる。標準的には、サンプルは、カラム上へと適用するに先立ち等しい体積の７０％のエタノールで希釈される。ろ過による洗浄の後、カラムは、遠心分離により乾燥され、ＲＮＡはＲＮＡアーゼを含まない水の中で溶出される。ＲＮＡは、エタノールで溶液から選択的に沈殿析出され、支持体（好ましくはシリカ含有膜又はフィルタ）に結合させられる。支持体に対するＲＮＡの結合は、カオトロピック塩による水分子の分断に起因して急速に発生し、かくしてシリカに対する核酸の吸収に有利に作用する。結合した全ＲＮＡはさらに単純な洗浄段階により汚染性の塩、タンパク質及び細胞不純物から精製される。最終的に、全ＲＮＡはヌクレアーゼを含まない水を添加することにより膜から溶出される。この高速なプロトコルの合計時間は、８分未満、好ましくは６分未満である。
【００２４】
要約すると、高速ＲＮＡ抽出方法には、以下のステップ：
（ａ）  生体系から細胞を含有するサンプルを得、
（ｂ）  場合により、作業サンプルを産生するため着目のＲＮＡを含まない細胞をサンプルから取り出し、
（ｃ）  着目のＲＮＡを含有する細胞を溶解させ、それらのホモジェネートを作製し、
（ｄ）  場合により、上記ホモジネートを希釈し、
（ｅ）  ＲＮＡが結合する材料を含有するか又はそれが付加されている支持体と、加湿し均質化された作業サンプルを接触させ、
（ｆ）  上記サンプルを上記支持体に結合させ、
（ｇ）  夾雑物質及び干渉物質を除去し、
（ｈ）  上記支持体を乾燥させ、そして
（ｉ）  上記支持体からＲＮＡを溶出する、
が関与しており、遠心分離が用いられる場合には、それは段階ｇ，ｈ又はＩの後に行なわれてよく、真空／ろ過は好ましくは抽出ステップの後に適用される。
【００２５】
この高速抽出プロセスに関与する試薬は以下の通りである：
溶解／結合緩衝液（好ましくは、４．５Ｍのグアニジニウム−ＨＣｌ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム）、
洗浄緩衝液Ｉ（好ましくは５Ｍのグアニジン−ＨＣＬ、２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ）、
洗浄緩衝液ＩＩ（好ましくは２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのトリス−ＨＣｌ中の８０％のエタノール）、
溶出緩衝液及び
ヌクレアーゼを含まない無菌２重精製水。
【００２６】
癌細胞の節内分布は不均等であることから、節の多数の切片をサンプル採取することが好ましい。場合により、病理学に基づき１以上の節を検査することもできる。同じ節サンプルの病理学検査及び分子ベースの試験の両方を達成するための１つの方法は、病理学検査に使用される１つの外部及び内部切片及び分子試験に使用される１つの外部及び内部切片の少なくとも計４つの切片に節を切断することにある。組織内の転移及び微小転移の分布は節又はその他の組織内で均等でないことから、転移を見逃さないように充分に大きいサンプルを得なくてはならない。当該方法におけるこのサンプル採取問題に対する１つのアプローチは、大きい組織サンプルを均質化し、その後の分子試験で使用すべき充分混合した均質化済みのサンプルの希釈を次に実施することである。
【００２７】
標準的ＰＣＲ反応には、多数の増幅段階又は、標的核酸種を選択的に増幅するサイクルが内含されている。標準的なＰＣＲ反応は、３つの段階すなわち、標的核酸が変性される変性段階；一組のＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向プライマー）が相補的ＤＮＡストランドにアニールするアニーリング段階；及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる伸長段階、を内含する。この段階を何度も反復することにより、ＤＮＡフラグメントは増幅されて、標的ＤＮＡ配列に対応するアンプリコンを産生する。標準的なＰＣＲ反応には、２０以上の変性、アニーリング及び伸長サイクルが含まれる。数多くの場合において、アニーリング及び伸長段階は同時に実施でき、その場合、サイクルにはわずか２段階しか含まれない。
【００２８】
ＲＴ−ＰＣＲを利用する本発明の方法においては、ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応は、術中診断に適した時間内で実施され、これらの段階の各々の長さは、分単位ではなくむしろ秒単位の範囲内でありうる。特定的に言うと、一秒あたり少なくとも約５℃の温度勾配速度を生成する能力をもつ或る種の新しいサーマルサイクラーでは、３０分以内でのＲＴ−ＰＣＲ増幅が使用される。より好ましくは、２５分未満で増幅が実施される。このことを念頭において、ＰＣＲサイクルの各段階について提供されている以下の時間は、勾配時間を含んでいない。変性段階は、１０秒以下の時間実施可能である。実際、一部のサーマルサイクラーは、変性段階の最適な持続時間でありうる「０秒」設定を有する。すなわち、サーマルサイクラーが変性温度に達するだけで充分である。アニーリング及び伸長段階は、最も好ましくは各々１０秒未満であり、同じ温度で実施された場合、アニーリング／伸長段階の組合せは１０秒未満であり得る。しかしながら一部のホモジニアスプローブ検出方法では、高速アッセイ性能を最大にするべく伸長のための別の段階を必要とする可能性がある。全増幅時間と非特異的副反応の形成の両方を最小限におさえるのには、アニーリング温度は標準的に５０℃を上回る。より好ましくは、アニーリング温度は５５℃を上回る。
【００２９】
実験者が介入しないＲＴ−ＰＣＲのための単一組合せ反応が、次の複数の理由から望ましい：すなわち、（１）実験者のミスの危険性の減少、（２）標的又は産物の汚染の危険性の減少及び（３）アッセイ速度の増大。反応は、１つ又は２つのポリメラーゼのいずれかで構成され得る。２つのポリメラーゼの場合、これらの酵素のうちの１つが標準的にＲＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）であり、１つは、熱安定性のＤＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼである。アッセイ性能を最大にするためには、これらの酵素機能の両方について「ホットスタート」技術の一形態を利用することが好ましい。米国特許５，４１１，８７６号及び５，９８５，６１９号は、異なる「ホットスタート」アプローチの例を提供しており、本書に参考として内含されている。好ましい方法には、効率の良いＤＮＡ重合に必要とされる成分のうちの１以上を固定化する１以上の熱活性化方法の使用が含まれる。米国特許５，５５０，０４４号及び５，４１３，９２４号は、かかる方法において使用するための試薬を調製する方法について記述している。米国特許６，４０３，３４１号は、ＰＣＲ試薬成分の１つの化学的改変が関与する固定化アプローチについて記述している。全てが本書に参考として内含されている。最も好ましい実施形態においては、ＲＮＡ及びＤＮＡ依存性ポリメラーゼ活性の両方が単一の酵素内に備わっている。効率の良い増幅のために必要とされるその他の成分には、ヌクレオシドトリホスフェート、２価の塩及び緩衝液成分が含まれる。一部のケースでは、非特異的核酸及び酵素安定剤が有益であり得る。
【００３０】
任意の与えられた増幅ベースの分子診断の特異性は、プライマーセットに大きく（ただし全面的にではなく）依存する。プライマーセットは、標的配列の増幅を可能にし、かくして標的配列特異的アンプリコンを産生するべく標的ＤＮＡ配列にアニールする正方向及び逆方向オリゴヌクレオチドプライマー対である。プライマーは、着目の疾病状態のマーカーを増幅する能力を有していなければならない。本発明の場合、これらのマーカーは、乳癌及び黒色腫に向けられている。
【００３１】
乳癌の場合、本発明の方法には、乳房組織又は乳癌組織のいずれかに特異的な組織マーカーの増幅が関与している。リンパ節内に乳房及び／又は癌の細胞が存在する場合にそれを臨床的に有意な及び信頼性の高い形で検出するように、少なくとも２つのマーカーの組合せが使用される。好ましくは、マーカーは、単一反応容器内で同時に増幅及び検出される（すなわちそれらは多重化される）。最も好ましくは、プライマーセットは、これらのマーカーに特異的な核酸フラグメントと相補的である。マーカーには、マンマグロビン（配列番号１７）及び以下のものの１以上（好ましくは１つ）が含まれる：Ｂ３０５Ｄ（配列番号１４）、ＰＩＰ（配列番号１８）、Ｂ７２６（配列番号１５）、ＧＡＢＡ（配列番号１６）又は０８Ｅ（配列番号＿）。組織特異的マーカー及び癌特異的マーカーの組合せは、それぞれ９０％及び９５％を超える感度及び特異性を提供する。一部のマーカーは、さまざまなイソ型で存在し、これらのイソ型のうちのいくつかは他のものに増して１つの組織又は癌に特異的である。Ｂ３０５Ｄの場合、最も好ましいイソ型はＢ３０５Ｄイソ型Ｃである。それは又、マンマグロビン・マーカーと組合わせた形で最も好ましいマーカーである。
【００３２】
黒色腫の場合、本発明の方法には、黒色腫癌に特異的なマーカーの増幅が関与する。かくして、プライマーセットは、これらのマーカーに特異的な核酸フラグメントと相補性をもつ。マーカーには、以下のもののうちの１以上（好ましくは２つ以上）が含まれる：チロシナーゼ（配列番号２２）及びＭＡＲＴＩ（配列番号２１）。これらのマーカーは９０％を上回る感度と特異性を提供する。
【００３３】
反応は同様に、特異的シグナルのいくつかの検出手段をも含有しなければならない。これは好ましくは、着目の標的配列の重合から誘導されるＤＮＡ配列の１領域を検出する試薬を使用することを通して達成される。検出のための好ましい試薬は、着目の特異的核酸配列に結合した場合に測定可能なシグナル差を与える。往々にして、これらの方法には、着目の配列に結合した時点で蛍光を増大させる核酸プローブが関与する。本発明の方法のＰＣＲ反応の進捗は、各々のＰＣＲプライマーセットについてのアンプリコン産生の相対的速度を分析することによって監視される。アンプリコン産生を監視することは、制限的な意味なく、蛍光プライマー、蛍光発生プローブ及び２本鎖ＤＮＡを結合させる蛍光染料、モレキュラービーコン、スコーピオンその他を含めた一定数の検出試薬及び方法によって達成可能である。
【００３４】
ＰＣＲ反応を監視する一般的方法では、蛍光５′ヌクレアーゼアッセイが用いられる。この方法は、ＰＣＲプロセス中にオリゴマプローブを分割するべく、或る種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ又はＴｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ）の５´ヌクレアーゼ活性を活用する。オリゴマは、伸長条件下で増幅された標的配列までアニールするように選択される。プローブは標準的にその５′末端上に蛍光リポータを、又３′末端にリポータの蛍光消光剤を有する。オリゴマが無傷であるかぎり、リポータからの蛍光シグナルは消光される。しかしながら、オリゴマが伸長プロセス中に消化された場合、蛍光リポータはもはや消光剤の近くにない。一定の与えられたアンプリコンについての遊離蛍光リポータの相対的蓄積を、対照サンプルについての同じアンプリコンの蓄積と及び／又は制限的な意味なくβ−アクチン及びＰＢＤＧ（ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ）といったような対照遺伝子の蓄積と比較して、ＲＮＡ集団内の一定の与えられたＲＮＡの一定の与えられたｃＤＮＡ産物の相対的発生量を決定することができる。蛍光５′ヌクレアーゼアッセイのための製品及び試薬は、例えばApplied Biosystemsから市販のものを容易に入手することができる。
【００３５】
好ましい検出試薬は、一般に「スコーピオン」と呼ばれ、米国特許６，３２６，１４５号及び５，５２５，４９４号内に記述され、本書に参考として内含されている。これらの試薬は、テイルドプライマー及び組込まれたシグナリング系を含む１以上の分子を内含する。プライマーは鋳型結合領域及びリンカー及び標的結合領域を含む尾部を有する。尾部の中の標的結合領域は、プライマーの拡張産物内の相補的配列にハイブリッド形成する。
【００３６】
この標的特異的ハイブリダイゼーション事象は、ハイブリダイゼーションが検出可能な変更を導くシグナリング系にカップリングされている。ＰＣＲ反応においては、標的結合領域及び尾部領域は有利には、尾部領域が１本鎖つまりコピーされない状態にとどまるような形で配置されている。かくして、尾部領域はＰＣＲ増幅産物内で増幅不可能である。リンカーは、プライマー鋳型上のポリメラーゼで媒介される鎖拡張を防止する遮断部分を含んでいる。
【００３７】
カリフォルニア州サニーベールのCepheidから市販されているSmart Cyclerサーマルサイクラー、及びApplied Biosystemsから市販されているABI Prism7700配列検出システムを含め、ＰＣＲ及びＱＲＴ−ＰＣＲ内でのアンプリコンの蓄積を制御及び監視するための機器及びソフトウェアも同様に利用可能である。
【００３８】
好ましいＲＴ−ＰＣＲ反応においては、或る種の逆転写酵素及びＰＣＲ反応成分の量は、一部のサーマルサイクラーのより速い勾配時間を利用する目的で非定型である。特定的には、プライマー濃度は非常に高い。
【００３９】
逆転写酵素反応のための標準的な遺伝子特異的プライマーの濃度は、約２０ｎＭ未満である。約１〜２分の高速逆転写酵素反応を達成するためには、逆転写酵素プライマー濃度を２０ｎＭ以上、好ましくは少なくとも約５０ｎＭそして標準的には約１００ｎＭ以上まで上昇させた。標準ＰＣＲプライマー濃度は１００ｎＭ〜３００ｎＭの範囲内にある。Ｔｍの変動を補償するため標準ＰＣＲ反応の中で、より高い濃度を使用することができる。しかしながら、本書の目的では、基準となるプライマー濃度は、いかなるＴｍ補償も必要とされない状況についてのものである。Ｔｍ濃度が必要であるか又は望まれる場合、比例して高い濃度のプライマーが実験的に決定され使用される。高速ＰＣＲ反応を達成するためには、ＰＣＲプライマー濃度は標準的に２５０ｎＭ以上、好ましくは約３００ｎＭ以上、標準的には約５００ｎＭ以上である。
【００４０】
商業的に使用される診断は、同様に、好ましくは、陰性結果のための特別の増幅反応の作業を確認する１以上の内部陽性対照の使用という方法を利用する。ＲＴ−ＰＣＲ反応において制御されなくてはならない偽陰性結果の潜在的原因としては、不適切なＲＮＡ量、ＲＮＡの劣化、ＲＴ及び／又はＰＣＲの阻害及び実験者のミスが含まれる。遺伝子発現アッセイの場合には、着目の組織内で構成的に発現される遺伝子を利用することが好ましい。ＰＢＧＤ（配列番号２０）が、ヒトの体内の既知の偽遺伝子を全く含んでいない、ヒトの組織内で構成的に発現される、そして比較的低レベルで発現され従って着目の標的配列の増幅の阻害をひきおこす確率が比較的低いといった複数の要因に起因して、内部対照として一般に使用される遺伝子である。対照としてのＰＢＧＤの使用は、偽陰性結果の潜在的供給源全てから生じる誤った結果の報告を最小限におさえるか又は無くする。
【００４１】
ＱＲＴ−ＰＣＲのための記述された方法の商品化においては、或る種の特異的核酸の検出用キットが特に有用である。１つの実施形態においては、キットはマーカーを増殖し検出するための試薬を内含している。場合により、キットは、リンパ節組織から核酸を抽出するためのサンプル調製試薬及び／又は用品（例えば管）を内含している。これらのキットは又、サンプルの汚染の危険性を最小限にするための用品（例えばリンパ節切開及び調製用の使い捨ての外科用メス及び表面）をも内含しうる。
【００４２】
好ましいキットの中には、以上で記述された１管ＱＲＴ−ＰＣＲプロセスに必要な試薬、例えば逆転写酵素、逆転写酵素プライマー、対応するＰＣＲプライマーセット（好ましくはマーカー及び対照用）、Ｔａｑポリメラーゼといった熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び、制限的な意味なくスコーピオンプローブ、蛍光５′ヌクレアーゼアッセイ用プローブ、モレキュラービーコンプメーブ、臭化エチジウムといった２本鎖ＤＮＡに特異的な蛍光染料といったような適切な検出試薬、が内含されている。プライマーは好ましくは、上述の高濃度を生み出す数量で存在する。熱安定ＤＮＡポリメラーゼが、さまざまなメーカーから一般的にかつ市販の形で入手可能である。キット内の付加的な材料としては、適切な反応用試験管又はガラスびん、標準的には場合によりマグネシウムを含むワックスビーズであるバリヤ組成物；必要なｄＮＴＰといった試薬及び緩衝液を含めた、ＰＣＲ段及び逆転写酵素のための反応混合物（標準的には１０Ｘ）；ヌクレアーゼ又はＲＮアーゼを含まない水；ＲＮアーゼ阻害物質；対照核酸（単複）及び／又はＱＲＴ−ＰＣＲ反応のＰＣＲ段及び／又は逆転写酵素において使用可能な付加的なあらゆる緩衝液、化合物、補因子、イオン構成成分、タンパク質及び酵素、重合体など、がある。場合により、キットは、核酸抽出試薬及び材料を内含する。
【００４３】
以下の制限的意味のない例が、本発明をさらに説明する一助となる。
【００４４】
実施例
リアルタイムＰＣＲ
本発明の中の例は、リアルタイムＰＣＲの使用に基づいている。リアルタイムＰＣＲにおいては、ポリメラーゼ連鎖反応の産物は、終点測定によってではなくむしろＰＣＲの対数期の間にリアルタイムで監視される。従って、ＤＮＡ及びＲＮＡの定量化ははるかに精確でかつ再現可能である。全てのサイクルの間に蛍光値が記録され、これは、増幅反応におけるその時点までに増幅された産物の量を表わす。反応の開始時に多くの鋳型が存在すればするほど、（Ｃｔ）値の定義である統計的に有意な上述の背景として蛍光シグナルがまず第１に記録される点に達するのに必要なサイクルの数は少なくなる。閾値サイクル（Ｃｔ）の概念は、蛍光ベースのＲＴ−ＰＣＲを用いた精確で再現可能な定量化を可能にする。ＰＣＲ産物の均質な検出は、好ましくは、（ａ）２本鎖ＤＮＡ結合染料（例えばＳＹＢＲグリーン）、（ｂ）蛍光発光プローブ（例えばTaqmanプローブ、モレキュラービーコン）及び（ｃ）直接標識づけプライマー（例えばAmplifluorプライマー）に基づいて実施される。
【００４５】
実施例１．Taqmanアッセイを伴うリアルタイムＰＣＲに基づく先行技術及び高速方法により抽出されたＲＮＡの比較
Genomics Collaborativeから、合計１６のＨ＆Ｅ陽性節と１５のＨ＆Ｅ陰性乳房節サンプルを購入した。組織の３０ｍｇ片を２個ずつ、各節から切断した。
【００４６】
パートＩ（先行技術）。３０ｍｇの組織片１個を以下の通りに処理した：すなわち６００μｌのＲＬＴ緩衝液を添加し、組織サンプルを手で２０〜４０秒、使い捨て組織摩砕機（ｃａｔ１５７０４−１２６、ＶＷＲScientific, West Chester, PA）を用いて均質化した。管をEppendorf５４１５Ｃ型マイクロ遠心分離機内で最高速度で３分間遠心分離した。上清流体を新しい管に移し、１体積の７０％エタノールを添加した。
【００４７】
ＱＩＡｖａｃ２４真空マニホルド上に設置されたＲＮｅａｓｙミニカラムに対しサンプル（７００μＬ）を適用し、真空を加えた。緩衝液 ＲＷＩ（７００μＬ）をカラムを通してろ過させた。緩衝液 ＲＰＥ（５００μＬ）をカラム上にピペットで取り、それを通ってろ過させた。緩衝液 ＲＰＥをさらに５００μＬ、カラムに添加し、それを通ってろ過させた。２ｍｌの収集管内にＲＮｅａｓｙカラムを設置し、１分間最大速度でマイクロ遠心分離機内で遠心分離した。その後、ＲＮｅａｓｙカラムを新しい１．５ｍｌ入りの収集管に移し、ＲＮＡａｓｅを含まない水を５０μｌ添加し、８０００×ｇで１分間遠心分離することにより、ＲＮＡをカラムから溶出した。
【００４８】
パートＩＩ（高速抽出）。第２の乳房節組織片３０ｍｇを以下の通りに高速プロトコルで処理した：すなわち：（１）６００μＬの緩衝液 ＲＬＴに組織片を付加し、手で２０〜４０秒間、使い捨て組織摩砕機を用いて均質化した。（２）最高速度で３０秒間ＱＩＡシュレッダカラムを通してホモジネートを遠心分離に付した。（３）リゼイトに７０％エタノールを１体積添加し、ピぺティングで混合した。（４）次にサンプルを、ＱＩＡｖａｃ２４真空マニホルド上に設置したＲＮｅａｓｙミニカラムに適用し、真空を加えた。（５）カラムに７００μｌの緩衝液ＲＷＩを添加し、カラムを通してろ過した。（６）５００μｌの緩衝液ＲＰＥをカラム上に添加し、その中でろ過した。（７）カラムを２ｍｌの収集管に移し、３０秒間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。（８）ＲＮＡアーゼを含まない水２５μＬを膜に加え、カラムを１０，０００ｒｐｍで３０秒遠心分離に付してＲＮＡを溶出させた。高速プロトコル内の全ての遠心分離段階は、１０ＭＶＳＳＶＷＲ型遠心分離機上で実施した。
【００４９】
抽出されたＲＮＡを逆転転写、ＲＮＡ及びｃＤＮＡを以前に記述した通りに定量化した。
Taqmanアッセイについては、Taqman Core試薬キット、Gene Amp １０×ＰＣＲ緩衝液、Amp Erase Uracil Ｎ−グリコシダーゼ及びAmpli Taq Cold ＤＮＡポリメラーゼを、Applied Biosystems、Faster City, CAから購入した。その他全ての試薬は、例１において記述された市販の供給源からのものであった。グリセロールは、Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo)から購入し、Tween２０はEastman Organic Chemicals (Rochester, NY)から購入した。
【００５０】
マンマグロビン・プライマー（配列番号３及び配列番号４）はInvitrogen Corp (Carlsbad, CA)が合成し、マンマグロビンTaqmanプローブ（配列番号７）はEpoch Biosciences (San Diego, CA)製であった。ＰＢＧＤプライマー（配列番号８及び配列番号９）はQIAGEN Operon (Alamada, CA)が合成し、SYNTHEGEN、LLC（Houston, TX）がプローブ（配列番号２３）を合成した。Ｂ３０５Ｄプライマー（配列番号１１及び配列番号１２）は、Invitrogen Corpで合成され、プローブ（配列番号１３）は、Applied Biosystems, Inc.により合成された。全てのTaqmanプローブについて、染料と消光剤の対としてカルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）及びカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を使用した。
【００５１】
【化１】
2004344167.tif 000002
【００５２】
Taqmanアッセイについては、１０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液＃１、１４μＬの２５ｍＭのＭｇＣｌ2、８μＬの１０ｍＭ ｄＴＮＰ、１μＬのAmp Erase ＵＮＧ（１Ｕ／μＬ）、１６μＬのグリセロール、１μＬの１％ｗ／ｖ Tween２０、０．７５μＬのAmpli Taq Gold（５Ｕ／μＬ）、５μＭ原液からの各プライマー６μＬ、１０μＭプローブ原液０．４μＬ、及び最終体積９６μＬとなるまでの水を添加することによって、マスターミックスを調製した。各々の光学反応マイクロタイター平板ウエルに対し、マスターミックス（４８μＬ）と各節サンプルからの２μＬのｃＤＮＡを添加した。光学キャップでキャッピングした後、平板をＡＢＩプリズム７９００ＨＴ配列検出システム（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）内で処理した。Taqman ＰＣＲ Core試薬キット、Taqman ＤＮＡ鋳型試薬及びTaqman Ｂ−アクチン検出試薬を含む市販の試薬をApplied Biosystems (Foster City, CA)から購入し、メーカーが推奨するプロトコルに従ってアッセイを実施した。マンマグロビン・アッセイでの分析のためには０．０２の閾値が使用され、Ｂ３０５Ｄアッセイについては０．０３、Ｂアクチンアッセイについては０．０８、ＰＢＤＧアッセイについては０．１の閾値が使用された。Taqmanアッセイによる３つ組の決定の平均が表３及び４に示されている。
【００５３】
１５のＨ＆Ｅ節サンプル並びに１６のＨ＆Ｅ陽性節におけるハウスキーピング遺伝子Ｂ−アクチン及びＰＢＤＧのリアルタイム測定の比較が表１に示され、２つの対照ｃＤＮＡ サンプルが表１に示されている。これらの実験の結果は、本発明の高速方法及び標準的な商業的方法（ＱＩＡＧＥＮ）で得られたＣｔ値の間の優れた一致を示し、これは高速ＲＮＡ抽出プロトコルによって抽出されたＲＮＡが、標準的な商業的プロトコルに基づいて抽出されたＲＮＡと類似の程度まで逆転写されＰＣＲ増幅される能力をもつということを確認している。
【００５４】
表２は、表１で評価されたものと同じ乳房節サンプルでＢ３０５Ｄ及びマンマグロビンという乳癌マーカーについてのＣｔ値に基づいた遺伝子発現結果を比較している。リアルタイムＰＣＲ結果に基づいてＨ＆Ｅ陽性及びＨ＆Ｅ陰性の乳房節サンプル間で相関関係を樹立できるか否かを見極めるために、マンマグロビン及びＢ３０５Ｄの両方についてＨ＆Ｅ陰性節サンプル中の各マーカーについての最低のＣｒ値が識別された。Ｈ＆Ｅ陰性サンプルの間のこの最低値より低い２．５Ｃｔ値の任意のただし保存的なカットオフを、Ｈ＆Ｅ陽性サンプルに適用した。表２中で影のついたサンプルは、Ｃｔ値が少なくともＨ＆Ｅ陰性サンプルの間で観察されたＣｔ値よりも低い２．５Ｃｔ値であるという点において、これら２つの乳房マーカーについてより高い発現を有するものである。本発明の高速方法及び市販のメーカー推奨プロトコル（ＱＩＡＧＥＮ）の両方を用いたこれらのマーカーの発現には、優れた相関関係が存在していた。
【００５５】
マーカーとしてマンマグロビンを用いると、１５のＨ＆Ｅ節サンプル内の２つのサンプルにおけるＣｔ値は、本発明の高速方法とＱＩＡＧＥＮ ＲＮＡ抽出プロトコルの間で厳密な相関関係を示さなかった。これらのサンプルのうちの１つＧＣＬＮＣ−２４においては、Ｃｔ値の差は０．４であり、これは実験誤差の範囲内である。第２のサンプルは、より大きいＣｔ差を示した。マンマグロビン及びＢ３０５Ｄの両方でのＣｔ値の差が比較的大きい原因は、これらのサンプル内でＲＮＡをスペクトル的に定量化するのが困難であることそして、節内転移の安定した不均等な分布に起因してサンプル採取上の問題が生じる可能性があることにあるかもしれない（Cserni. 1999。集中組織病理学集成により検出される通りの乳癌における腋窩前哨リンパ節内転移．J. Clin Pathol, 52:0922-924）。
【００５６】
【表１】
2004344167.tif 000003
【００５７】
【表２】
2004344167.tif 000004
【００５８】
実施例２：ＱＩＡシュレッダカラムの評価
リンパ節組織の均質化の後にＱＩＡシュレッダカラムを使用できること、及びわずか３０秒間のホモジネートの遠心分離が受容可能なＲＮＡ抽出を生み出すことを実証するのが、この例の目的である。
【００５９】
Ｈ＆Ｅ陰性であった乳房腋窩節をGenomics Collaborative (Cambridge, MA)から入手した。４９０ｍｇの組織薄片を５．５ｍｌの緩衝液 ＲＬＴと混合し、節を均質化した。６００マイクロリットルのホモジネートをとり出し、例１で記述した高速抽出を用いてＲＮＡを抽出した。対照として、ＱＩＡシュレッダカラムの代りに３分の遠心分離を使用するという点を除き同じ高速ＲＮＡ抽出方法を使用して、さらに６００μＬのホモジネートを処理した。各反応からのＲＮＡを逆転転写、例１に記述されている通りに定量化した。リアルタイムＰＣＲを、Taqmanプローブを用いて実施した。
【００６０】
これらの研究の結果は、遠心分離プロトコル内の０．３４μｇ／μＬに比較してＱＩＡシュレッダプロトコルが関与するプロトコルにおける０．３１μｇ／μＬという類似のＲＮＡ収量を明らかにしていた。高品質のＲＮＡを示す両方のサンプルにおいて、２．１という同一の２６０／２８０ｎｍ比が得られた。リアルタイムＰＣＲアッセイは、同様に、（２２．５対２２．０）、並びにＢ３０５Ｄ（２６．７対２６．６）、並びにハウスキーピング遺伝子ＰＢＤＧ（２９．１対２９．０）及びＢ−アクチン（配列番号１９、１８．５対１８．２）が関与するプロトコルと比べて、ＱＩＡシュレッダカラムにより抽出されたＲＮＡでマンマグロビンについて類似のＣｔ値を示した。
【００６１】
要約すると、この実験は、均質化の後の３分間の遠心分離段階の代りにＱＩＡシュレッダが関与するプロトコルで、類似のＲＮＡ収量、品質及びリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示している。こうして、ＲＮＡ抽出を実施するのに必要とされる時間は２．５分だけ短縮され、これは、患者の治療に影響を及ぼすべく迅速な結果が必要とされる術中又はその他の利用分野のために適したプロトコルを開発する上で重要である。
【００６２】
実施例３．ＲＮＡ収量及び精度に対するリゼイトの希釈効果
以下の例は、ＲＮＡ収量及びＲＮＡ回収精度に対するリゼイトの希釈の効果を示している。この例では、２０ｍｇ、１０ｍｇ又は５ｍｇの凍結したブタの節組織を切断した。５０ｍｌの使い捨て組織摩砕機を用いて３０秒間組織を磨砕し、サンプルを渦流に付した。各節重量について、３回反復実施した。各リゼイトを１ｍｌずつ１．７ｍｌのマイクロ遠心分離機管に移し、これを次に３０秒間、最高速度（１４，０００ＲＰＭ）でエッペンドルフマイクロ遠心分離機内で遠心分離した。ＱＩＡシュレッダカラムを通して７００マイクロリットルを遠心分離に付し、サンプルを３０秒間最高速度で遠心分離した。その後カラムを洗浄し、乾燥し、例２、パートＩ、段階４−８内で以前に記述した通りにＲＮＡを溶出した。これらの研究の結果が、表３及び４に示されており、これは、１０ｍｇ及び２０ｍｇの節組織を内含するより高い重量をもつサンプルに比べて、６００ｍｌの均質化緩衝液中で均質化された２．５ｍｇの初期節組織重量での優れた精度を例示している。これらの結果は、比較的低い節重量でＲＮＡ回収精度の改善が得られるということを示している。同様に、カラムを通してより低濃度のホモジネートがより高速でろ過されることになること及びフィルタの目詰りの問題の確率がさらに低くなることが期待されることだろう。
【００６３】
【表３】
2004344167.tif 000005
【００６４】
実施例４：リンパ節サンプルからのＲＮＡのTaqMaN試験
逆転写
５０ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、２０００ＵのSuperscript、４００ＵのRnasin、２μｇのオリゴｄＴプライマー、０．０８ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び各０．２ｍＭのｄＡＣＴ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰを含む２５０μｌの反応の中で６０分間４２℃で２０μｇの合計ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。結果として得られたｃＤＮＡを水中で１：８に希釈した。
【００６５】
ＰＣＲ増幅
２μｌの各希釈ｃＤＮＡを、１ウエルにつき５０ｍｌという合計体積でApplied Biosystems 7900上で増幅させた。増幅は以下のプロトコルで実施した：すなわち、２分間５０℃及び１０分間９５℃、次に１５秒（ｓｅｃ）間９５℃、１分間６０℃（Ｂ７２６については５８℃）及び１分間６８℃のサイクルを４０回。反応混合物成分及び最終濃度は以下の通りである：１×TaqMan 緩衝液Ａ（ＡＢ１）、３．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｃＡＴＰ、０．４ｍＭのｄＵＴＰ（ＡＢＩ）、０．０１Ｕ／μｌのAmp Erase ＵＮＧ（ＡＢＩ）、０．０３７５Ｕ／μｌのAmpli Taq Gold（ＡＢＩ）、８％のグリセロール（Sigma）、０．０１％のTween 20 (Kodak)、各０．３μＭのプライマー（Invitrogen）、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼを含まない水（Sigma）及び４０ｎＭ５′−ＦＡＭ、３′ＴＡＭＲＡオリゴヌクレオチドプローブ（Synthegen）。内部基準染料（ＲＯＸ）との関係におけるシグナル閾値が、ＰＣＲ産物の増加によってひき起こされる蛍光強度の増大の対数線形範囲内で設定されて、各プライマー／プローブに対し割当てられた。結果として得られるＣｔ値を利用して、試験対象の全サンプルを横断した遺伝子の相対的発現を決定した。
【００６６】
利用したプライマー：
マンマグロビン
【００６７】
【化２】
2004344167.tif 000006
【００６８】
【化３】
2004344167.tif 000007
【００６９】
【化４】
2004344167.tif 000008
【００７０】
結果：
添付の表は、１１の組織学陰性リンパ節及び２４の組織学陽性リンパ節について得られたＣｔ値を含んでいる。各マーカーについての陽性度のカットオフを、組織学陰性サンプルで見られた最低のＣｔから２．５サイクルを減算することによって決定した。陽性サンプルは陰影で示されている。これらの基準に基づいて、個々のマーカーの検出速度を決定した。２３／２４の組織学陽性サンプルを検出する組合せであるＢ３０５Ｄ Ａ／Ｃと組合わされたマンマグロビンで、最適の相補性が見られる。マンマグロビン、Ｂ３０５Ｄ及びＧＡＢＡの組合せが全２４のサンプルを検出した。表５を参照のこと。
【００７１】
【表４】
2004344167.tif 000009
【００７２】
実施例５：多重マーカー
逆転写
アンカーオリゴｄＴプライマーを利用して１００μｌの反応の中で６０分間４２℃で２０μｇの合計ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。各々の希釈したｃＤＮＡ２０ｍｇずつを、ウエルあたり５０ｍｌの合計体積でApplied Biosystems 7900上で増幅させた。増幅は、以下のプロトコルで実施した：すなわち、９４℃で２分間、次に、１５秒間９４℃、１５秒間６２℃及び４５秒間７２℃のサイクルを５０回。反応混合物成分及び最終濃度は以下の通りである：１×ＰＣＲ緩衝液（ＡＢＩ）、２．５ｍＭの最終ＭｇＣｌ2、０．０５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｃＡＴＰ及びＴＴＰ、５〜２０×余剰の２抗−Ｔａｑ抗体（ＴＰ４−９及びＴＰ１−１２）を含む０．０５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ、０．２μＭの各プライマー（Invitrogen）、ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼを含まない水（Sigma）及び１：２００００希釈のＳＹＢＲグリーン原液（Sigma）。増幅プライマー配列は、リンパ節のTaqMan試験で利用されたものと同一であった。２７５蛍光単位の共通の閾値を利用してＣｔ値を決定した。次に、Ｃｔ値を定量的遺伝子発現へと変換し、転移性リンパ節をバックグラウンド発現と区別するのに必要とされる遺伝子発現の最低レベルを近似するものと仮定されたカットオフとの関係においてこれをプロットした。
【００７３】
利用したプライマー：
マンマグロビン
【００７４】
【化５】
2004344167.tif 000010
【００７５】
表６−８に表示されたこのデータは、多大な乳癌サンプルを網羅するための組合せ遺伝子マンマグロビン及びＢ３０５Ｄシグネチャーの力を示している。
【００７６】
【表５】
2004344167.tif 000011
【００７７】
【表６】
2004344167.tif 000012
【００７８】
【表７】
2004344167.tif 000013
【００７９】
実施例６：精製されたＲＮＡからの高速ＲＴ−ＰＣＲ
マンマグロビン・インビトロ転写ＲＮＡ（１００，０００コピー）を２０ｎｇの白血球ＲＮＡ中に希釈し、５０ｍＭのビシン／ＫＯＨ、ｐＨ８．２、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％ｖ／ｖのグリセロール、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１５０ｍＭのトレハロース、０．２％ｖ／ｖのTween 20、０．２ｍＭのトリス−Ｃｌ ｐＨ８、３．５ｍＭのＭｎＳＯ4、０．３ｍＭのｄＡＴＰ、０．３ｍＭのｄＣＴＰ、０．３ｍＭのｄＧＴＰ、０．３ｍＭのＴＴＰ、１００Ｕ／ｍｌのＴｔｈ、２０μｇ／ｍｌの抗体ＴＰ６−２５．３、０．４５μＭのマンマグロビンスコーピオン及び０．５μＭのマンマグロビンプライマーを含む反応においてCepheid Smart Cycler IIの中での一段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅に付した。
【００８０】
ＰＣＲ条件は以下の通りであった（星印は、蛍光が測定されたサイクリングの一部分を意味していた）。
【００８１】
条件Ａ  ３秒間９５℃、７分間６０℃、２分間７０℃；その後３秒間９５℃、６秒間５４℃*及び６秒間６８℃でのサイクル４０回−合計時間＝３４分。
【００８２】
条件Ｂ  ３秒間９５℃、３分間６０℃；その後３秒間９５℃、６秒間５４℃*及び６秒間６８℃でのサイクル４０回−合計時間＝３４分。
【００８３】
条件Ｃ  ３秒間９５℃、３分間６０℃；その後３秒間９５℃、６秒間５８℃*及び６秒間６８℃でのサイクル４０回−合計時間＝２６分。
【００８４】
このアッセイの結果は、以下の表内で示されている：
【００８５】
【表８】
2004344167.tif 000014
【００８６】
データを見ればわかるように、逆転写段階の長さを９分から３分まで短縮することは、アッセイの性能に対し認識可能な影響を全く与えない。アニーリング温度を５８℃まで上昇させることは、増幅の最小限の影響しかもたず、かつ全ＲＴ−ＰＣＲ時間を２６分まで短縮する。
【００８７】
実施例７：（予言的な）リンパ節転移の検出のための高速多重ＲＴ−ＰＣＴアッセイ
この例では、精製済みリンパ節ＲＮＡ（陽性結果を生み出すのに必要とされるサイクル数を減少させるために利用される１００μｌの反応につき１００ｎｇ以上の合計ＲＮＡ）を、Cepheid Smart Cycler IIの中での一段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅に付した。反応には以下の成分が含まれている：５０ｍＭのビシン／ＫＯＨ、ｐＨ８．２、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％ｖ／ｖのグリセロール、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、１５０ｍＭのトレハロース、０．２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、０．２ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ８、３．５ｍＭのＭｎＳＯ4又はＭｎ（酢酸塩）、０．３ｍＭのｄＡＴＰ、０．３ｍＭのｄＣＴＰ、０．３ｍＭのｄＧＴＰ、０．３ｍＭのＴＴＰ、１００Ｕ／ｍｌのＴｔｈ、２０μｇ／ｍｌの抗体ＴＰ６−２５．３、各々０．４〜０．８μＭのスコーピオン及びプライマー。スコーピオン及びプライマー配列は、非特異的初回免疫事象が最小限におさえられ、それらが以下の高速ＲＴ−ＰＣＲプロフィールでの多重化された増幅／検出と相容性を有するような形で設計されている：
３秒間９５℃、３分間６０℃；その後１秒間９５℃、６秒間６５℃*及び３秒間７２℃でのサイクル３２回−合計増幅時間＝１６分。
【００８８】
完了まで４分以下の時間しかかからない高速サンプル調製方法（出願内のサンプル調製例を参照）が利用され、２０分以内の合計アッセイ時間が導かれる。
【００８９】
リンパ節への乳癌の転移を検出するために、マンマグロビン、Ｂ３０５Ｄ及びＰＢＧＤといった遺伝子を増幅させる。マンマグロビン及び／又はＢ３０５Ｄシグナルは、転移を指示し、一方ＰＢＧＤはハウスキーピング遺伝子として利用される。この例では、癌陽性リンパ節についてのＣｔ値は、マンマグロビンについては１２〜３０、Ｂ３０６Ｄについては１２〜１８の範囲内にある。このＣ1範囲内のいずれかの遺伝子の検出は、癌陽性リンパ節を示すものである。この例では、癌陰性結果が有効とみなされるためには対照遺伝子ＰＢＧＤについてのＣｔ値は、２４〜３０サイクルの範囲内に入らなくてはならない。
【００９０】
黒色腫癌のリンパ節転移を検出するためには、以下の点を除いて、同じ条件が用いられる：すなわち（１）黒色腫を含む疑いのあるリンパ節が処理されること、そして（２）ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ及びＰＢＧＤといった遺伝子が増幅されること。ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼシグナルは、黒色腫のリンパ節転移を指示し、一方、ＰＢＧＤは、ハウスキーピング遺伝子として利用される。この例では、癌陽性リンパ節についてのＣｔ値は、チロシナーゼについては１８〜３０、ＭＡＲＴ１については１２〜２７の範囲内にある。この範囲内のいずれかの遺伝子の検出は、癌陽性リンパ節を示すものである。この例では、癌陰性結果が有効とみなされるためには対照遺伝子ＰＢＧＤについてのＣｔ値は、２４〜３０サイクルの範囲内に入らなくてはならない。
【配列表】
2004344167000001.app
【外国語明細書】
2004344167000001.pdf