(57)【要約】【課題】免疫試薬の構成成分である物質に対する抗体あるいはその交叉抗体による非特異的反応を排除して偽陽性の削減および特異性の向上を達成し信頼性のより高い臨床検査を可能とする免疫学的測定法および測定用キットを提供すること。【解決手段】ヒト由来の検体中の特定成分を、それに対する特定の抗原または抗体が不溶性担体に担持されてなる免疫試薬と反応させることからなる免疫学的測定法において、ヒト由来の検体を免疫試薬と反応させる前に、該ヒト由来の検体中に存在し且つ該免疫試薬の構成成分に対する抗体あるいは交叉抗体に対する抗原が不溶性担体に担持されてなるブロック試薬と予め反応させることからなる免疫学的測定法並びに上記免疫試薬とブロック試薬の組合せからなるキット。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来の検体中の特定成分を、それに対する特定の抗原または抗体が不溶性担体に担持されてなる免疫試薬と反応させることからなる免疫学的測定法において、ヒト由来の検体を免疫試薬と反応させる前に、該ヒト由来の検体中に存在し且つ該免疫試薬の構成成分に対する抗体あるいは交叉抗体に対する抗原が不溶性担体に担持されてなるブロック試薬と予め反応させることを特徴とする免疫学的測定法。
【請求項２】
上記免疫試薬の構成成分が免疫試薬の安定化のためのポストコーティングに用いられたタンパクである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記タンパクが牛血清アルブミンまたはカゼインである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（１）ヒト由来の検体中の特定成分に対する特定の抗原または抗体が不溶性担体に担持されてなる免疫試薬および（２）該ヒト由来の検体中に存在し且つ該免疫試薬の構成成分に対する抗体あるいは交叉抗体に対する抗原が不溶性担体に担持されてなるブロック試薬との組合せからなる免疫学的測定用キット。
【請求項５】
上記免疫試薬の構成成分が免疫試薬の安定化のためのポストコーティングに用いられたタンパクである請求項４に記載のキット。
【請求項６】
上記タンパクが牛血清アルブミンまたはカゼインである請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫学的測定および測定用キットに関する。より詳細には、ヒト検体中に存在する試薬原料等の物質に対する抗体あるいはその交叉抗体が試薬原料と抗原抗体反応を引き起こすことによる偽反応を抑制するための免疫学的測定方法および測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原と抗体の結合反応を利用したｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイである免疫学的測定方法は、微量成分を特異的に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査に広く応用されている。それらには、標識の仕方等により、凝集法（血球、ラテックス等を担体に使用したもの）、放射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫学的測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫学的測定法（ＣＬＩＡ）、ネフェロメトリーおよび免疫比濁法等がある。
【０００３】
しかしながら、免疫学的測定法の臨床検査への応用においては、患者から採取した、血液、尿などの生物学的流体中に存在するリュウマチ因子（ＲＦ）や補体Ｃｌｑ、ミエローマ、ＨＡＭＡなどによる非特異凝集反応が偽陽性を生じさせるという問題があった。
【０００４】
そこで、ＲＦ等の影響による非特異反応を抑制するために、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールによる検体の前処理または抗ＩｇＭ抗体、各種動物のγ−グロブリンもしくはその変性物の添加のような検体の前処理、抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等のフラグメントの使用、あるいはＦｃ部位がブロックされている抗体を使用するなどの免疫学的測定法の改良が提案されている。
【０００５】
例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｅｂ．１９７６，ｐ．１５７−１６０には、ジチオスレイトールによる検体の前処理が記載されている。また、医学検査４２巻９号１９９３年，ｐ．１５０４−１５０８には、抗ヒトＩｇＭ抗体や抗ヒトＩｇＧ抗体の添加、非働化、加熱処理、２−メルカプトエタノール処理が記載されている。特公昭６１−９４２号公報には、未感作の正常動物γ−グロブリンまたはその変性物を添加し、その存在下で検体中の抗原または抗体を免疫学的に測定する方法を開示している。
【０００６】
抗体のフラグメントの使用については、Ｆｃ部位が非特異的反応に関与することから、特公昭６３−３８６６８号公報は、これを切断した免疫グロブリンのＦ（ａｂ’）２フラグメントを測定用抗体として使用する免疫検定を開示している。
【０００７】
特に、ラテックスを使用した凝集法においては、尿素、ホルムアミド等の誘導体およびジ低級アルキルスルホキシド等を配合してＲＦ等による非特異的反応を防止すること（特公昭６０−４９４１号公報）、および免疫グロブリンのＦ（ａｂ’）２のフラグメント（断片）とＦｃフラグメントないしＦａｃｂフラグメントとｐＦｃ’フラグメントの混合物を感作したラテックス粒子を使用してＲＦ等の干渉を避けること（特公昭６３−６３８６３号公報および特公昭６３−４１４２６号公報）が知られている。
【０００８】
特開平７−２７７６４号公報では、抗体のＦｃ部位と特異的に結合する免疫グロブリンの抗原結合部位を少なくとも含むブロック試薬によってＦｃ部位がブロックされている抗体を使用することにより、ＲＦ等の物質による非特異的反応を排除する方法を開示している。
【０００９】
特開２０００−２９２４２４号または特開２０００−３２１２７９号公報では、血液検体を採血する場合の採血管由来の成分が検体中に溶け出すことによる干渉物質の除去や検体中に存在する例えばある種のタンパク質が、不溶性担体粒子表面に吸着しやすい性状を持つことがあるため、ラテックス免疫比濁法などの粒子凝集反応では非特異凝集反応をおこす場合があったので、これを検出する方法や、検体分中ミスの確認等の手段として、ダミー粒子を用いる方法を開示している。
【００１０】
しかしながら、高感度法が要求される近年、従来から知られている方法では排除できない非特異的反応がまれに発生する問題があった。
【００１１】
本発明者らは、上記のような問題を解決するため鋭意研究した結果、今までに知られていなかった試薬原料等の物質に対する抗体あるいはその交叉抗体がヒト検体中に存在し、その抗原抗体反応による偽反応を引き起こすことを突き止め、ヒト検体中に存在する該抗体を予めブロックすることにより、非特異的反応を排除する方法を知見し本発明に到達した。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒト検体中に存在し且つ免疫試薬の構成成分である物質に対する抗体あるいはその交叉抗体が試薬原料と抗原抗体反応を引き起こすことによる偽反応を抑制するための免疫学的測定用キットを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、上記の免疫学的測定用キットを使用する免疫学的測定法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、ヒト検体中に存在する試薬原料等の物質に対する抗体あるいはその交叉抗体との非特異的反応を排除することができる免疫学的測定法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、ヒト由来の検体中の特定成分を、それに対する特定の抗原または抗体が不溶性担体に担持されてなる免疫試薬と反応させることからなる免疫学的測定法において、ヒト由来の検体を免疫試薬と反応させる前に、該ヒト由来の検体中に存在し且つ該免疫試薬の構成成分に対する抗体あるいは交叉抗体に対する抗原が不溶性担体に担持されてなるブロック試薬と予め反応させることを特徴とする免疫学的測定法によって達成される。
【００１７】
また、本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、（１）ヒト由来の検体中の特定成分に対する特定の抗原または抗体が不溶性担体に担持されてなる免疫試薬および（２）該ヒト由来の検体中に存在し且つ該免疫試薬の構成成分に対する抗体あるいは交叉抗体に対する抗原が不溶性担体に担持されてなるブロック試薬との組合せからなる免疫学的測定用キットによって達成される。
【００１８】
【発明の好ましい実施形態】
以下、本発明を詳述する。本発明の免疫学的測定法について先ず説明する。
【００１９】
本発明において、免疫学的測定方法とは、免疫反応（抗原抗体反応）を利用した測定法であり、定性法および定量法の両方を含む。免疫学的測定法の例として、凝集法（ラックス、血球等の担体を用いた凝集法）、放射免疫学的測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、凝集法に基づいた比濁法、比ろう法および粒度分布測定法等が挙げられる。
【００２０】
本発明のヒト検体中に存在しそして免疫試薬の構成成分である物質に対する抗体あるいはその交叉抗体とは、免疫試薬の構成成分である例えば牛血清アルブミン、カゼイン等のタンパクに対する抗体である。
【００２１】
牛血清アルブミン、カゼイン等のタンパクは、免疫試薬の安定化剤として使用されている。
【００２２】
例えば、凝集法では、ラテックス粒子や血球などの不溶性担体に抗原または抗体を担持させて免疫試薬を調製するが、免疫試薬の安定化のために牛血清アルブミンまたはカゼインなどのタンパクを使用してポストコーティング処理がなされている。このポストコーティング処理した牛血清アルブミンやカゼインに対する抗体がヒト検体中に存在するとき、抗原抗体反応による凝集反応（非特異的凝集反応）が誘発される問題がある。本発明は、この問題を予めポストコーティングに使用したタンパクと同じ材料を不溶性担体に結合させたブロック試薬がヒト検体中の非特異の原因となる該抗体をブロックすることにより解決しようとするものである。
【００２３】
ブロック試薬の使用例としては、主に汎用の自動分析装置や専用機を使用した免疫学的測定法に適用でき、検体に２種類以上の試薬が混合される反応過程において、抗原または抗体が担持されたラテックス試薬が分注される前の工程において、検体とブロック試薬とを予め混合することにより、ブロック試薬がヒト検体中の非特異の原因となる該抗体をブロックする。この工程の後に抗原または抗体が担持されたラテックス試薬が分注されることにより、ヒト検体中に存在する試薬原料等の物質に対する抗体あるいはその交叉抗体との非特異的凝集反応を抑制した測定法が実現できる。
【００２４】
このブロック試薬の例としては、ポストコーティングに牛血清アルブミンが使用されている場合は、これと同一のものを不溶性担体に担持して調製される。
【００２５】
ブロック試薬に使用する不溶性担体としては、一般に免疫学的凝集法に用いられているラテックス粒子を用いることができることは当然として、その前駆体であってもよく、あるいは、リポゾーム、金コロイド等も用いることができる。いずれの場合も、免疫学的測定試薬である抗原または抗体を担持したラテックス粒子よりも小さいことが望ましく、測定の対象となる免疫学的凝集反応および測定の妨げにならない範囲で適用される。例えば、不溶性担体がラテックス粒子の場合は、粒子径が０．５μｍ以下のものを用いることが好ましく、より好ましくは０．２μｍ以下である。さらに好ましくは０．１μｍ以下である。
【００２６】
ラテックス凝集比濁法に適用させる場合は、緩衝液である第一試薬にブロック試薬を混合して製造しておくことが望ましく、あるいは使用する前に混合してもかまわない。免疫学的測定試薬がブロック試薬を含む第一試薬と抗原または抗体を担持させたラテックス試薬である第二試薬の２試薬系である場合、第一試薬に含まれるブロック試薬のラテックス濃度（重量基準）としては、含有量が多い方が効果的であり、０．０００１〜５％が好ましく、より好ましくは０．００５〜１％、さらに好ましくは０．０３〜０．３％である。あまり多すぎると試薬吸光度ブランクが高くなるので好ましくはない。第一試薬の試薬吸光度ブランクとしては、１以下が好ましい。より好ましくは０．００５〜０．５である。また、第一試薬中のブロック試薬の原料である不溶性担体と第二試薬のラテックスの重量比は、０．２〜５０倍量が好ましく、より好ましくは１〜５倍量である。このブロック試薬の原料である不溶性担体がラテックス粒子の場合は、第二試薬のラテックス粒子数の１〜５，０００倍が好ましく、より好ましくは２０〜２００倍である。
【００２７】
本発明の免疫学的測定法においては、検体は特に制限されず、通常の免疫学的測定法で対象となる検体に適用できる。検体としては、ヒト由来のもの、特に、ヒトの血液（血清、血漿、全血）、尿、糞便等が挙げられる。特に、血液のように抗体の含量が高い検体の場合には有利である。
【００２８】
本発明の免疫学的測定法における測定対象の物質は、特に制限されず、通常の免疫学的測定法で測定されるものが測定できる。例としては、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ペプシノーゲンＩおよびＩＩ、フェリチン等の腫瘍マーカー、プロテインＣ、プロテインＳ、ＡＴＩＩＩ、ＦＤＰ、Ｄ−ダイマー等の凝固線溶系マーカー、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、梅毒抗体等の感染症マーカー、ＴＳＨ、プロラクチン、インシュリン等のホルモン、ミオグロビン、ミオシン等の組織成分が挙げられる。
【００２９】
本発明によれば、本発明の免疫学的測定法において用いられる、上記免疫学的試薬とブロック試薬の組合せからなる免疫学的キットが便利に提供される。これらの試薬はそれぞれ別個の容器に保存され、それらの組合せとして本発明の免疫学的キットが提供される。
【００３０】
【実施例】
以下の実施例によって、さらに詳しく本発明の説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
調製例１
ブロック試薬（牛血清アルブミン抗体吸収試薬）の調製
１％牛血清アルブミン−グリシン緩衝液１０ｍＬに、０．０５５μｍポリスチレンラテックス（固形分１０％）１％懸濁グリシン緩衝液１０ｍＬを加えてミキサーでよく混合した後、３７℃で９０分間または５６℃で６０分間インキュベーションを行い牛血清アルブミンを担持させたブロック試薬を調製した。
【００３２】
実施例１
（１）ＴＰ抗原感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
ＴＰリコンビナント抗原溶液（６０μｇ／ｍＬ）０．５ｍＬに０．３μｍポリスチレンラテックス（固形分１０％）２％懸濁リン酸緩衝液０．５ｍＬを加えてミキサーでよく混合した後、３７℃で６０分間インキュベーションした。これに１％ＢＳＡ−リン酸緩衝液４ｍＬを加え、３７℃で９０分間インキュベーションすることによりポストコーティングを行った。次に遠心分離（１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心）を行い、沈殿を０．２％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液に再分散して、ＴＰ抗原感作ラテックス試薬１０ｍＬを調製した（第二試薬）。
【００３３】
（２）ＴＰ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％牛血清アルブミン−グリシン緩衝液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ１００を含有）にブロック試薬を加えて、牛血清アルブミンを担持させたラテックスが０．１６％含有するように調製した。
【００３４】
（３）ＴＰ抗体の測定
自動分析装置として、７１７０型（ＨＩＴＡＣＨＩ）を使用した。第一試薬および第二試薬を装置にセットして、通常の方法により測定した。まず、検体１０μＬと第一試薬１６０μＬが反応セルに分注され、３７℃で４．５分間インキュベーションされた。その後、第二試薬が８０μＬ分注されることにより、検体中存在した梅毒抗体と第二試薬中のＴＰ抗原を担持させたラテックスが抗原抗体反応により凝集を起こし、この５分間を吸光度変化量を測定することにより、この結果から測定値が出力された。その結果を表１に示す。
【００３５】
比較例１
第一試薬として、１％牛血清アルブミン−グリシン緩衝液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ１００を含有）にブロック試薬を加えない他は最終的に同じ組成になるように調製したものを用いた以外は実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００３６】
比較例２
第一試薬として、５６℃で３０分間インキュベーションさせた熱変性牛血清アルブミンを使用した他は、比較例１と同じ組成のものを用いた。その他は実施例１と同様に行った。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
2004012170.tif 000002
【００３８】
検体Ｎｏ．１〜９はＴＰ陰性検体であるが、Ｎｏ．７、８、９は検体中に牛血清アルブミン抗体を持った検体である。Ｎｏ．１０〜１３はＴＰ陽性検体である。比較例１では、牛血清アルブミン抗体を持った検体Ｎｏ．７、８、９において、牛血清アルブミン抗体による非特異的凝集反応が認められる。また、比較例２では、非特異的凝集反応の影響は軽減されたが、検体Ｎｏ．８および９は非特異的凝集反応の影響を受けていると考えられる。一方、本発明の試薬による測定は牛血清アルブミン抗体による非特異的凝集反応は観察されなかった。
【００３９】
実施例２
（１）ＴＰ抗原感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
実施例１と同様に調製した。
（２）ＴＰ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％牛血清アルブミン−グリシン緩衝液（０．０１％Ｔｗｅｅｎ１００を含有）にブロック試薬を加えて、牛血清アルブミンを担持させたラテックスが０．０２５％、０．０５％、０．１０％、０．１６％含有するように調製した。また、対照法（比較例３）はブロック試薬を含まない他は同様な組成である。
（３）ＴＰ抗体の測定
実施例１と同様に測定した。その結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2004012170.tif 000003
【００４１】
検体Ｎｏ．２、３、４、５、８および９はＴＰ陰性検体であるが、Ｎｏ．８および９は検体中に牛血清アルブミン抗体を持った検体である。Ｎｏ．１０〜１３はＴＰ陽性検体である。対照方法（比較例３）は、牛血清アルブミン抗体を持った検体Ｎｏ．８および９において、牛血清アルブミン抗体による非特異的凝集反応が認められる。本発明の試薬による測定は第一試薬中のブロック試薬である牛血清アルブミンを担持させたラテックスが０．０２５％では、検体Ｎｏ．８は判定保留域に軽減でき、Ｎｏ．９は非特異的凝集反応を抑制することができた。同様に０．０５％以上では、牛血清アルブミン抗体による非特異的凝集反応は観察されなかった。
【００４２】
実施例３
（１）ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス試薬（第二試薬）の調製
抗ペプシノーゲンＩＩモノクロナール抗体（Ａ）３ｍｇをリン酸ナトリウム緩衝液９．５ｍＬに溶解し、０．３μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０重量％緩衝液）０．５ｍＬを加え、３７℃で２時間インキュベーションした後、これに２％ＢＳＡ−リン酸緩衝液２ｍＬを加え、３７℃で９０分間インキュベーションすることによりポストコーティングを行った。
次に遠心分離（１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心）を行い、上清を捨て、沈殿を牛血清アルブミン溶液（０．１Ｍグリシン、０．０５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、０．２％ＢＳＡ）に懸濁させ、ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス（Ａ）を調製した。同様に、抗ペプシノーゲンＩＩ抗体（Ｂ）を用いて、ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス（Ｂ）を調製した。（Ａ）および（Ｂ）を混合して、ペプシノーゲンＩＩ抗体感作ラテックス試薬を調製した。
【００４３】
（２）ペプシノーゲンＩＩ測定用緩衝液（第一試薬）の調製
１％牛血清アルブミン−グリシン緩衝液にブロック試薬を加えて、牛血清アルブミンが担持させたラテックスが０．１６％含有するように調製した。また、対照法（比較例４）はブロック試薬を含まない他は同様な組成である。
【００４４】
（３）ペプシノーゲンＩＩの測定
実施例１のＴＰ抗体の測定と同様の操作で測定した。結果を表３に示す。表３中、ＲＩＡの欄の値は放射線免疫測定法による測定値である。
【００４５】
【表３】
2004012170.tif 000004
【００４６】
検体Ｎｏ．１０は、血清検体中に牛血清アルブミン抗体を持った検体である。対照方法は、牛血清アルブミン抗体を持った検体Ｎｏ．１０は非特異的凝集反応により、正に乖離している。一方、本発明の試薬による測定は牛血清アルブミン抗体による非特異的凝集反応は観察されなかった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫試薬の構成成分である物質に対する抗体あるいはその交叉抗体による非特異的反応を排除できるため、偽陽性の削減および特異性の向上が達成され、信頼性のより高い臨床検査が可能になる。