(57)【要約】【課題】少量のサンプルで同定を行う場合や、試行錯誤のための実験を減少させることができ、出現すると考えられる質量スペクトル、ノイズに埋もれているピーク等を付加して、蛋白質同定の高精度・ハイスループット化を行うことができ、蛋白質配列データベースに登録されていないような新規な蛋白質でも、質量分析法を用いた配列決定を行える方法およびシステムの提供。【解決手段】本発明のプロテオーム解析方法は、タンデム型質量分析装置による質量分析において、分子シミュレーション法を用いて結合解離エネルギーを算出して、ペプチドの開裂パターンおよび／または質量スペクトルのピーク位置および／またはスペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙ比の予測情報を、得られた実験情報に加えて、蛋白質の同定に用いることを特徴とする。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンデム型質量分析装置による質量分析において、分子シミュレーション法を用いて結合解離エネルギーを算出して、ペプチドの開裂パターンおよび／または質量スペクトルのピーク位置および／またはスペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙ比の予測情報を、得られた実験情報に加えて、蛋白質の同定に用いることを特徴とするプロテオーム解析方法。
【請求項２】
実験から得られた質量スペクトル中のノイズに埋もれている質量スペクトルおよび／または実験条件によって出現しにくい質量スペクトルの同定及び補正をすることを特徴とする請求項１に記載のプロテオーム解析方法。
【請求項３】
実験データだけで質量スペクトル同定が出来ない配列が既知の同定のための解析がされていない、または同定すべきタンパク質を酵素によりペプチド化したペプチド鎖が２残基以上のペプチド、あるいは実験が出来ないか必要な精度が得られないタンパク質に対して、分子シミュレーションを用いたスペクトルパターンを予測して、質量スペクトルのパターンを予測可能なことを特徴とする請求項１または２に記載のプロテオーム解析方法。
【請求項４】
分子シミュレーションによる結合解離エネルギーの見積値を用いて、質量スペクトルの各Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ比を予測可能とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロテオーム解析方法。
【請求項５】
前記質量スペクトルの各Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ比をマッチングさせて、蛋白質同定を行うことを特徴とする請求項４に記載のプロテオーム解析方法。
【請求項６】
分子シミュレーションにより計算されたイオン系列ごとの結合解離エネルギーをデータベース化し、蛋白質の同定に用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロテオーム解析方法。
【請求項７】
算出対象のペプチド鎖または蛋白質のアミノ酸配列を入力しポリペプチド解離データベースを参照して、当該データベースに存在しないポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列データから、前記ポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列の立体構造を生成して得られたデータを用いて前記立体構造を精緻化する第１の装置を有することを特徴とするプロテオーム解析システム。
【請求項８】
算出対象のペプチド鎖の構成アミノ酸数ｎを入力してペプチド鎖の配列を予想したペプチド鎖を少なくとも１つ構成し、前記ポリペプチド解離データベースを参照して、当該データベースに存在しないポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列データから、前記ポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列の立体構造を生成して得られたデータを、前記立体構造を精緻化する第２の装置を有することを特徴とするプロテオーム解析システム。
【請求項９】
実験から得られた質量スペクトルデータのみを入力し、かつ、前記第１の装置または前記第２の装置により算出された質量スペクトルの位置とスペクトル強度とを入力して、当該実験から得られた質量スペクトルをスキャンさせて当該算出された質量スペクトルの位置とスペクトル強度を用いて当該実験から得られた質量スペクトルを補正する第３の装置をさらに有することを特徴とする請求項７または８に記載のプロテオーム解析システム。
【請求項１０】
実験から得られたペプチド鎖または蛋白質の質量のみを入力し、蛋白質配列データベースを参照して質量のマッチングを行い、算出対象の当該ペプチド鎖または蛋白質のアミノ酸配列の候補を少なくとも出力する第４の装置を有することを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載のプロテオーム解析システム。
【請求項１１】
実験から得られた質量スペクトルデータを入力し、蛋白質配列データベースを参照してマッチング処理を行い、ペプチド鎖または蛋白質のアミノ酸配列候補を出力する第５の装置を有することを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載のプロテオーム解析システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、質量分析装置を用いたプロテオーム解析方法およびプロテオーム解析システムに関し、分子軌道法を始めとする分子シミュレーションによる結合開裂部位の予測結果を用いて、従来の実験情報だけによる蛋白質同定よりも高精度、ハイスループット化された蛋白質同定するためのプロテオーム解析方法およびプロテオーム解析システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンデム型質量分析装置を用いた蛋白質同定では、次のように蛋白質同定が行われる。まず酵素により蛋白質を切断してペプチド化した後、このペプチドを質量分析装置にかけ、各ペプチドの質量が測定される。得られた５〜１５残基程度の各ペプチドを新たに質量分析装置にかけ、Ａｒなどの希ガスの衝突やレーザー照射などで、アミノ酸残基をフラグメント化し、このフラグメント一つずつを解離・イオン化させ、得られた質量スペクトルのピーク位置の質量差から各ペプチドのアミノ酸配列を決定する。通常このピーク位置のパターンは、開裂位置によってａ系列、ｂ系列、ｃ系列やｘ系列、ｙ系列、ｚ系列と呼ばれる。各ペプチドから得られた配列を合わせ、既存あるいは既知の蛋白質配列データベースを参照して、今回の実験データとのマッチングを行い、蛋白質の同定が行われる。通常は１００％の一致（完全一致）は得られないので、実験データと参照データとの一致度がスコア化され、スコア値が最大の候補を採用することになる。もちろんこの場合には、一致度のスコア値が低く、どの候補タンパク質も採用されない場合もあり得る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来の質量分析装置では、一部のピークの位置・出現だけを使って蛋白質の同定を行っており、場合によっては同定の精度が十分でなく、曖昧性を有していたり、あるいは極端な場合には同定ができない虞があった。
特に少量のサンプルで同定を行った場合には、結果は一意に決まらないことが起こりうる。その場合には、サンプル量を増やす必要があったり、また、試行錯誤による多数回の実験を行う必要もあった。
また実験条件によっては、出現すると考えられる質量スペクトルが何らかの原因で出現しない場合や、ノイズに埋もれている多数のピークがあり、蛋白質同定の高精度・ハイスループット化を行う場合に、問題があった。
さらに、同定しようとする蛋白質が、蛋白質配列データベースに登録されていない新規の蛋白質である場合、質量分析法を用いた配列決定を行うことはできなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載のプロテオーム解析方法は、タンデム型質量分析装置による質量分析において、分子シミュレーション法を用いて結合解離エネルギーを算出して、ペプチドの開裂パターンおよび／または質量スペクトルのピーク位置および／またはスペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙ比の予測情報を、得られた実験情報に加えて、蛋白質の同定に用いることを特徴とする。
【０００５】
請求項２に記載のプロテオーム解析方法の発明は、実験から得られた質量スペクトル中のノイズに埋もれている質量スペクトルおよび／または実験条件によって出現しにくい質量スペクトルの同定及び補正をすることを特徴とする請求項１に記載のプロテオーム解析方法。
【０００６】
請求項３に記載のプロテオーム解析方法の発明は、請求項１または２において、実験データだけで質量スペクトル同定が出来ない配列が既知の同定のための解析がされていない、または同定すべきタンパク質を酵素によりペプチド化したペプチド鎖が５残基以上のペプチド、あるいは実験が出来ないか必要な精度が得られないタンパク質に対して、分子シミュレーションを用いたスペクトルパターンを予測して、質量スペクトルのパターンを予測可能なことを特徴とする。
【０００７】
請求項４に記載のプロテオーム解析方法の発明は、請求項１〜３のいずれか１項において、分子シミュレーションによる結合解離エネルギーの見積値を用いて、質量スペクトルの各Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ比を予測可能とすることを特徴とする。
【０００８】
請求項５に記載のプロテオーム解析方法の発明は、請求項４において、前記質量スペクトルの各Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ比をマッチングさせて、蛋白質同定を行うことを特徴とする。
【０００９】
請求項６に記載のプロテオーム解析方法の発明は、請求項１〜５のいずれか１項において、分子シミュレーションにより計算されたイオン系列ごとの結合解離エネルギーをデータベース化し、蛋白質の同定に用いることを特徴とする。
【００１０】
請求項７に記載のプロテオーム解析システムの発明は、算出対象のペプチド鎖または蛋白質のアミノ酸配列を入力しポリペプチド解離データベースを参照して、当該データベースに存在しないポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列データから、前記ポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列の立体構造を生成して得られたデータを、前記立体構造を精緻化する第１の装置を有することを特徴とする。
【００１１】
請求項８に記載のプロテオーム解析システムの発明は、算出対象のペプチド鎖の構成アミノ酸数ｎを入力してペプチド鎖の配列を予想したペプチド鎖を少なくとも１つ構成し、前記ポリペプチド解離データベースを参照して、当該データベースに存在しないポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列データから、前記ポリペプチド鎖あるいは蛋白質の配列の立体構造を生成して得られたデータを、前記立体構造を精緻化する第２の装置を有することを特徴とする。
【００１２】
請求項９に記載のプロテオーム解析システムの発明は、請求項７または８において、実験から得られた質量スペクトルデータのみを入力し、かつ、前記第１の装置または前記第２の装置により算出された質量スペクトルの位置とスペクトル強度とを入力して、当該実験から得られた質量スペクトルをスキャンさせて当該算出された質量スペクトルの位置とスペクトル強度を用いて当該実験から得られた質量スペクトルを補正する第３の装置をさらに有することを特徴とする。
【００１３】
請求項１０に記載のプロテオーム解析システムの発明は、請求項７〜９のいずれか１項において、実験から得られたペプチド鎖または蛋白質の質量のみを入力し、蛋白質配列データベースを参照して質量のマッチングを行い、算出対象の当該ペプチド鎖または蛋白質のアミノ酸配列の候補を少なくとも出力する第４の装置を有することを特徴とする。
【００１４】
請求項１１に記載のプロテオーム解析システムの発明は、請求項７〜１０のいずれか１項において、実験から得られた質量スペクトルデータを入力し、蛋白質配列データベースを参照してマッチング処理を行い、ペプチド鎖または蛋白質のアミノ酸配列候補を出力する第５の装置を有することを特徴とする。
【００１５】
［作用］
本発明は、質量分析法による蛋白質同定の従来法における蛋白質同定の曖昧性の可能な限りの排除や高精度・高度なスループット化を実現するために、分子軌道法（ＭＯ法）や分子動力学法（ＭＤ法）、分子力学法（ＭＭ法）などの分子シミュレーション手法を用いて、ペプチド内の開裂パターンを予測し、得られた質量スペクトルパターンをマッチングに用いる、分子シミュレーション援用プロテオーム解析方法およびシステムを提供する。出現するピークの位置ｍ／ｚ（ｍ：質量　ｚ：荷電数）だけでなく、ピークの相対的強度Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙも質量スペクトルのマッチングに用いることで高精度化することができる。この相対的強度はＭＯ法、ＭＤ法、ＭＭ法などから推計する。その相対的強度は、たとえば、反応速度あるいは反応速度定数（たとえば各フラグメントがＣＩＤ法またはＩＲＭＰＤ法によって分解する速度）を用いて前記相対的強度を求めることができる。なお、実験から得られる質量スペクトルデータと蛋白質配列データベースとのマッチングは、従来から知られている方法を用いる。現状ではいくつかの蛋白質同定プログラムがインターネットのＷＷＷ上で公開されている。これらの少なくとも１つのプログラムを用い、実験で得られた質量スペクトルのピーク位置データを入力することにより、同定候補となる蛋白質が、一致度（マッチング度）に応じたスコア値と共に出力される。本発明におけるマッチング方法は、ユーザが使用するマッチングプログラムに依存する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明を、以下に実施形態により、詳細に説明する。
本発明はタンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ法）に関する新しい解析手法である。
図１は以下に説明する蛋白質同定ステップの流れを示した図である。
最初に、同定したい蛋白質を、酵素などの生物学的手段によって複数のペプチド鎖に分解する手段、たとえば、エドマン分解を用いて切断する。この分解に用いる酵素によって、どのアミノ酸の組合せのペプチド結合が切断されるか、予測できる。
【００１７】
次いで、切断された各ペプチド鎖の質量を分析し、各ペプチド鎖の質量を決定する。この段階では、質量は測定されるが、各ペプチド鎖の配列（ｎ個のアミノ酸残基の配列）はわからない。次に各ペプチド鎖を任意のエネルギー入力法（たとえば、衝突誘起解離法（ＣＩＤ法：ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、ＩＲＭＰＤ法（Ｉｎｆｒａｒｅｄ　Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）などによりフラグメントＰ１、・・・、Ｐｊに分解し、分解されたフラグメントＰ１、・・・、Ｐｊのそれぞれの質量分析を行い、各ペプチド鎖の質量スペクトルの実験データを得る。これらのフラグメントのスペクトルは、ペプチド鎖の切断箇所によって、図２に示すようなａ，ｂ，ｃ系列、ｘ，ｙ，ｚ系列と呼ばれるスペクトル系列に分類することができる。例えばｂ系列の完全なスペクトルが現れていたとすると、各スペクトル位置の差は構成するアミノ酸の質量に対応するので、当該ペプチド鎖のアミノ酸配列がわかる。
通常では、隣接したａ系列、ｂ系列、ｃ系列のスペクトル位置の差は、切断位置に対応して一定の値になる。理想的には、ある系列（ａ、ｂ、ｃ系列、ｘ、ｙ、ｚ系列）に属するフラグメントの質量スペクトルがすべて得られることが望まれる。
【００１８】
しかしながら、存在すべきフラグメントの少なくとも一部がスペクトル上、見えなかったり、観測されたスペクトルが特定の系列に帰属できないために、配列決定が困難な場合が多く存在する。このような場合に、分子シミュレーションを援用して以下のような、実験で得られた質量スペクトルの補正を行う。
【００１９】
▲１▼　分子シミュレーションを用いて結合解離エネルギーを算出するために、計算対象とする分子を選択する。選択方法は、以下の２つのいずれかを選択する（図３参照）。
Ａ．　同定したい蛋白質からペプチド鎖に分解した後、それぞれのペプチド鎖Ｐ１、・・・、Ｐｊの質量は、質量分析によって測定されている。この測定された質量値と、ユーザが指定する誤差範囲内で質量が一致するアミノ酸配列を持つ蛋白質及びペプチド鎖を、蛋白質配列データベースから検索する。検索の結果、候補数が多い場合には、測定されたスペクトルから予測されるアミノ酸配列と蛋白質配列データベース間のマッチングを行い、候補数を絞り込む。この操作は、必要に応じてユーザが選択する。このような方法では既知の情報から構成される蛋白質配列データベースを用いているため、データベースに登録されていないアミノ酸の配列の組や、未知の蛋白質である場合には、同定することが難しい。
Ｂ．　アミノ酸の配列ごとに異なる質量スペクトルのピーク位置と、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙとを分子シミュレーションで予測するために、ペプチド鎖の質量値と同一の範囲と考えられるアミノ酸の配列の組み合わせを作る。各組み合わせｎは、制限されないが、たとえば、ｎは、３以上、あるいはｎは５以上、たとえばｎ＝３〜１５さらに、ｎ＝５〜１５のアミノ酸（ｎ：アミノ酸残基の数）から構成することができる。たとえばｎ＝５の場合は、あらかじめ計算を行っておき、結果を後に述べるデータベースに登録する。計算することができる開裂位置はｎ−１箇所存在するが、たとえばユーザの選択により計算精度を考慮して、計算対象とする開裂位置を選択できる。周囲のアミノ酸の影響を考慮するために、結合解離エネルギーを計算する開裂位置の前後にアミノ酸が１〜２個付加している分子モデルあるいは２個以上付加している分子モデルを考慮するのが望ましいと考えられる。
【００２０】
▲２▼　上記▲１▼で選択したモデル分子の分子構造を決定する。ただし、ペプチド鎖を分解するためのエネルギー入力手段として、衝突誘起解離法（ＣＩＤ法：Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が選択された場合には、分子内で電荷が負に偏った箇所にプロトン（Ｈ＋）が結合した後、希ガスの衝突によって解離が進むことが知られているので、電気陰性度が大きい窒素原子や酸素原子が存在する箇所にＨ＋が結合した形での分子構造を用いる。各分子は幾つかの立体構造を取りうるので、それをサーチするために、分子動力学法（ＭＤ法：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ）、分子力学法（ＭＭ法：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）を用いることによって、局所的に安定な複数の構造が得られる。
【００２１】
さらに、より精緻な構造を得るために、ＭＤ法、ＭＭ法などにより得られた分子構造を初期値として用い、分子軌道法（ＭＯ法：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｏｒｂｉｔａｌ）により構造最適化計算を行う。このステップまでで、計算対象とする分子に関するデータを作成することができる。分子軌道法計算では、任意の近似法と基底関数とを、適宜選択することができる。また、蛋白質同定を行う場合の計算データとして、同様な近似法（Ｈａｒｔｒｅｅ−Ｆｏｃｋ法：ＨＦ法、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　ＳＣＦ法（ＭＣＳＣＦ法）、Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ法（ＣＩ）法など）、基底関数（ＳＴＯ−３Ｇ、３−２１Ｇ、６−３１Ｇ＊など）を用いて計算された結果を用いることが望ましい。後述する計算結果を登録するデータベースには、このような計算で用いた近似法と基底関数を記述する。
【００２２】
▲３▼　当該分子の結合解離エネルギーを計算する。結合解離の位置は、それぞれの系列（ａ，ｂ，ｃ系列、ｘ，ｙ，ｚ系列）ごとに決める（図２参照）。
前記したａ，ｂ，ｃ系列、ｘ，ｙ，ｚ系列は、次のようにして決定される。ペプチド鎖がプロトン化されたペプチドイオンの陽電荷がフラグメントイオンのＮ末端側にあるものを、ｂ系列のイオンと呼び、逆にＣ末端側にあるものをｙ系列のイオンと呼ぶ。また、ｂ系列イオンから−Ｃ＝Ｏが欠落したものをａイオンと呼び、ｙ系列から、−Ｃ＝Ｏが欠落したものをｘ系列のイオンと呼ぶ。
【００２３】
通常、当該分子のａ、ｂ、ｃ、ｘ、ｙ、ｚ系列ごとに結合解離エネルギーを計算する。実際の解離実験では、複数の断片化（Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により、内部断片が生じ、内部アシルイオンやＲ２Ｃ＝Ｎ＋Ｒ２で表される内部インモニウムイオン（イミニウムイオン）が生じている場合もあるので、ユーザが必要であると判断した場合には、これらの結合解離エネルギーも算出する（これらのイオンが生じるための結合解離エネルギーの算出も含む）。
【００２４】
▲４▼　得られた結合解離エネルギーを基に、アミノ酸の各組合せごとに質量スペクトルのピーク位置パターンを予測する。選択するスペクトル位置、あるいはそれぞれの結合解離エネルギーを比較して、ユーザが指定する閾値または最初から設定される標準値以下の結合解離エネルギーを持つペプチド鎖から生じるフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）のピーク位置を採用する。
【００２５】
また結合解離エネルギーから、質量スペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙ比（強度比）を見積る。ここで得られるものは、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ比なので、以下のステップでピーク位置パターンのスキャンを行う際に、測定されたスペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙを参照して、計算された各スペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙをスケーリングする。分子シミュレーションの結果得られた質量スペクトルのパターンを、実験により測定された質量スペクトル上でパターンマッチングさせる。この操作により、各系列において欠落しているスペクトルの補正、系列に属さないスペクトルの同定、ノイズに埋もれているスペクトルの同定、及び由来が不明なスペクトルの同定が行われる。ユーザ及び標準値の設定により、完全一致ｉ　）か、または一部一致ｉｉ）かが選択され、補正された質量スペクトルデータが、上記したようにして得られる（図４参照）。
【００２６】
▲５▼　蛋白質配列データベースを参照して、▲４▼で得られた質量スペクトルデータとのマッチングを行う。このステップは、ＷＷＷ上で公開されている同定プログラムを用いて行うので、既存かつ既知の方法により行われる。同定プログラムは、
ＭＳ−ＦＩＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｕｃｓｆｈｔｍｌ３．４／ｍｓｆｉｔ．ｈｔｍ）
ＰｒｏＦｏｕｎｄ（ｈｔｔｐ：／／１２９．８５．１９．１９２／ｐｒｏｆｏｕｎｄ＿ｂｉｎ／ＷｅｂＰｒｏＦｏｕｎｄ．ｅｘｅ）
などがＷＷＷ上に無料で公開されている。
【００２７】
▲６▼　前記▲５▼により同定されない場合には、▲４▼に戻ってスペクトルの補正のレベルを変えてやり直す。
【００２８】
▲７▼　蛋白質の同定が成功した場合には、各分子に対して計算された結合解離エネルギーと、分子ＩＤ、イオン系列、計算に用いた分子の構成残基数、解離したときのＮ末端側のアミノ酸配列、同じくＣ末端側のアミノ酸配列、計算で用いた近似法名と、基底関数名と、計算から予測された質量スペクトルパターンのスコア値が、データベースに登録される。図５に、登録された各項目について下記に記す。
【００２９】
・分子ＩＤ（図５の第１欄参照）：登録順に番号を付与。
・結合解離エネルギー（図５の第２欄参照）：計算された結合解離エネルギーをｋｃａｌ／ｍｏｌ単位で記載。
・イオン系列（図５の第３欄参照）：開裂位置とイオン化の有無に応じて、ａ，　ｂ，　ｃ，　ｘ，　ｙ，　ｚの系列名を付与。
・分子の構成残基数（図５の第４欄参照）：計算に用いたモデル分子を構成しているアミノ酸数の記載。
・Ｎ末端側のアミノ酸配列（図５の第５欄参照）：開裂位置を示すために、開裂位置から見てＮ末端側の配列を一文字略号で表示（たとえば、グルタミン酸を通常３文字で、Ｇｌｕと表示される場合でも、Ｇと表記する）。
・Ｃ末端側のアミノ酸配列（図５の第６欄参照）：開裂位置を示すために、開列位置から見てＣ末端側の配列を一文字略号で表示。
・近似法名（略称で示す）：例：ＨＦ、ＭＣＳＣＦ、ＣＩ、ＭＰ２など。基底関数名：分子軌道計算において標準的に使われている名称からハイフンを除いた名前を用いる。例：ＳＴＯ３Ｇ、３２１Ｇ、６３１Ｇ＊など（図５の第７欄参照）。
・スコア値（図５の第８欄参照）：分子軌道計算により予測される質量分析スペクトルのパターンと既知の蛋白質の質量分析スペクトルのパターンと既知の蛋白質の質量分析スペクトルパターンとの一致度を示す値である。この値は％（パーセント）で表示される。スコア値を加えるか否かの選択は、任意に設定することもできる。
【００３０】
なお、上記▲１▼のＢで記述したように、計算精度を考慮したために結合解離エネルギーを計算しなかった場合には、データベースに登録しない。また、本発明のシステムでは、用いる質量分析装置の精度に応じて計算対象とするペプチドの残基数ｎを決定し、ｎ個のペプチド鎖についてのデータを事前にすべて計算しておき、データベース化しておく。
【００３１】
このような本発明に係るプロテオーム解析方法は、図９に示すように構成されたシステムを用いて実行される。この図９に示すように、本システムは、以下の装置Ｉ〜装置Ｖから、構成されている。このような図９に示すシステムを用いて、プロテオーム（プロテオームを構成する蛋白質のアミノ酸残基の少なくとも１つ）の解析を、図１０のフローチャートに示すようにして行う。この図１０に示すように、プロテオーム解析方法は、まず、装置Ｉにより、実験結果（実験で得られたデータ）のみを用いて同定を行う（ステップＳ１において、同定可能な場合）。同定ができない（ユーザの求めている精度より低くて同定が不十分な場合も含む）場合（ステップＳ１においてＹｅｓの場合）には、以下に示すパスＩかＩＩかを、好ましくはユーザがいずれのパスで実行するか選択（ステップＳ２）し、以下のように同定を行う。
【００３２】
＜パスＩの選択＞
蛋白質配列データベースに登録されている可能性が高い場合には、パスＩを選択する（ステップＳ２においてＹｅｓの場合）。
このパスＩを選択すると、装置ＩＩにより、計算対象とするペプチド鎖あるいは蛋白質を選択し（ステップＳ３）、次いで、装置ＩＩＩにより、ペプチド鎖の各化学結合の結合解離エネルギーを計算し、質量スペクトルの位置と、Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙとを予測する（ステップＳ４）。次に、装置Ｖにより、実験結果の質量スペクトル上で計算から予測された質量スペクトルのパターンマッチングを行い、必要があれば、実験結果（実験で得られたデータ）を計算により得られたデータを用いて補正を行う（ステップＳ５）。
このようにして行った同定が、前記したような精度が低くて不十分な場合には、装置ＩＶを用いて、ｎ個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖の質量スペクトルを分子（蛋白質分子あるいはペプチド）の結合解離エネルギーを計算により求め（ステップＳ７）、これを用いて装置Ｖにより、実験から得られた質量スペクトルを補正した値（補正データ）を用いて装置Ｉにより、パターンマッチングを行う（ステップＳ８）。
【００３３】
このようにしても、精度が悪い等の理由により、マッチングが不十分であれば（ステップＳ９においてＮｏの場合）、ｎの大きさ（アミノ酸残基数）を変更し（ステップＳ１０）、再度、前記装置ＩＶを用いて行うステップＳ７に戻って、ｍ回処理を繰り返して実行する。この際の構成アミノ酸の数ｎと、繰り返す数ｍは、好ましくは、ユーザが指定する。なお繰り返す回数ｍを、マッチング度（図５の右端の％で表示した値）がある値以上の場合には、同定可能と判断するようにしてもよい。このような場合には、ステップＳ１１を、ｍがある値を超えたときに行うようにすることができ、またステップＳ８を、ある場合には省略したりあるいは付加したり、自在に設定することができる。このようなステップＳ８あるいはＳ１１が省略される場合には、その前段のステップが終了した後にマッチングが十分か否か、あるいはマッチング度がある一定値以上であるかを判定することにより、同定確定か同定不可かを判断する。本発明では、繰り返し回数ｍを何度か変更してもマッチング度が所定値を超えない場合には、同定（プロテオームの解析、アミノ酸の配列の同定あるいは蛋白質の同定）のための操作を終了することができる。この変更の回数は、適宜設定可能である。
【００３４】
＜パスＩＩの選択＞
蛋白質配列データベースに登録されている可能性が低いかあるいはまったく無い場合には、このパスＩＩを選択する。
このパスＩＩは、装置ＩＶを用いて、ｎ個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖の質量スペクトルを、分子（蛋白質分子あるいはペプチド）の結合解離エネルギー計算値を用いて推定し、装置Ｖを用いて実験から得られた質量スペクトルを上記パスＩでしたのと同様にして補正し、装置Ｉにより、パターンマッチングを行う。この際、パスＩのステップＳ６と同様に、構成アミノ酸の数ｎと、繰り返し回数ｍとは、ユーザが指定することができ、この工程（ステップ）は、前記ステップＳ７〜Ｓ１１と同様である。
これらのシステムで用いられる装置Ｉ〜Ｖの詳細を図１１〜図１２を参照しながら、以下に記す。
【００３５】
装置Ｉ
装置Ｉ（第５の装置）は、図１１（Ｂ）の左欄に示すように、入力装置１と、計算装置１と、出力装置１とを有する。入力装置１から実験結果であるフラグメントのマススペクトルデータを入力すると、計算装置２では、前記蛋白質を同定するためのフラグメントのマススペクトルと、蛋白質配列データベースを参照して候補となるデータを抽出し、これらのデータのマッチングを行う。この計算装置１は、既存のものを使用でき、たとえば、インターネット上で装置として公開されたものを使用することができる。また出力装置１は、マッチングの結果得られる、候補蛋白質あるいはペプチド鎖の名称と、アミノ酸配列とを出力する装置である。なお装置は、たとえばパーソナルコンピュータにより、アプリケーションソフトウェア等により、起動させて装置としての機能を発揮するように、設定することができる。
【００３６】
この装置Ｉに使用される入力装置１により、図６に示すように、質量分析器により得られた実験結果である質量スペクトルデータ（Ａｖｅｒａｇｅ　Ｍａｓｓ）と、蛋白質からペプチド鎖を生成するために用いた酵素名（Ｅｎｚｙｍｅ）と、由来する生物分類（Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｃａｔｅｇｏｒｙ）と、マッチング制御パラメータとが入力される。この例では、同定のためにＰｒｏｆｏｕｎｄを用いた例を示す。このような前記に示すパラメータなどの入力により、図７および図８に示す結果が得られる。この同定には、既知の方法を用いている。
【００３７】
計算装置１は、得られた実験結果である質量スペクトルと、蛋白質配列データベースとのマッチングを行う。この計算装置１は、既存のものを使用でき、たとえばインターネット上で、この装置の機能を発揮するアプリケーションを使用することができる。
出力装置１は、前記したマッチングにより得られた結果を用いて、蛋白質あるいはペプチド鎖の配列結果を出力するためのものである。
【００３８】
装置ＩＩ
装置ＩＩ（第４の装置）は、図１１（Ｂ）の右欄に示すように、前記装置Ｉと同様の機能を有する構成となっている。ただし、入力装置２は、第１段目の質量分析装置により得られた、ポリペプチド（Ｐ１、・・・、Ｐｎ）毎の質量値を入力する。そして、計算装置２で、入力装置２から入力された質量値データと蛋白質配列データベースに記載の質量値とを、ユーザが指定した誤差範囲内で一致させるようにして、該当するペプチド鎖あるいは蛋白質のアミノ酸配列と修飾部位及び修飾置換基を出力装置２により出力（選択）する。この装置ＩＩで使用される入力装置２、計算装置２および出力装置２について、以下に説明する。
【００３９】
入力装置２：タンデム型質量分析装置内の第１段目（最初）の質量分析装置によって測定された、同定するための蛋白質を酵素などで分解して生成したペプチド鎖の質量を、入力装置２により、入力するための装置である。
計算装置２：前記入力装置２により入力された質量値データと、蛋白質配列データベースに登録されている質量値とを好ましくはユーザが指定した誤差範囲内で一致させ、該当するペプチド鎖あるいは蛋白質を選択するための装置である。
出力装置２：計算装置２により選択されたペプチド鎖あるいは蛋白質を構成するアミノ酸の配列と、修飾部位の位置と、置換基とを出力するための装置である。
【００４０】
装置ＩＩＩ
装置ＩＩＩ（第１の装置）は、図１２（Ａ）の左欄に示すように、入力装置３と、ポリペプチド解離データベースを参照して計算する計算装置３−１と、計算装置３−２と、出力装置３とを有する。
入力装置３により、計算対象とするペプチド鎖あるいは蛋白質のアミノ酸配列を入力された計算装置３−１では、ポリペプチド解離データベースを参照してこのデータベースにデータが存在しないペプチド鎖あるいは蛋白質を選択する。次いで分子動力学法に基づく立体構造生成計算を行い、さらにこの計算の結果得られた複数の立体構造を精緻化するため、非経験的分子軌道法などを用いて、立体構造最適化計算を実行する。また、該当する部位の全てについて結合解離エネルギーを前記同様に非経験的分子軌道法等を用いて計算し、得られた結合解離エネルギーを用いて、反応速度定数を算出する等して、各解離パターンに対応したＩｎｔｅｎｓｉｔｙを算出する。
【００４１】
この装置ＩＩＩで、使用される入力装置３と、ポリペプチド解離データベースを参照して計算する計算装置３−１と、計算装置３−２と、出力装置３について、以下に説明する。
入力装置３：ポリペプチド鎖を構成するアミノ酸配列を入力するための装置である。
計算装置３−１：入力されたアミノ酸配列を基に、ペプチド鎖あるいは蛋白質の立体構造を生成するための装置である。
計算装置３−２：結合解離エネルギーと質量スペクトルのＩｎｔｅｎｓｉｔｙとを算出するための装置である。
出力装置３：計算から推定された位置とＩｎｔｅｎｓｉｔｙを含む質量スペクトルを出力するための装置である。この装置は、所望により、ポリペプチド解離データベースに計算されたデータを出力することができる。
【００４２】
装置ＩＶ
図１２（Ａ）の右欄にあるように、装置ＩＶは、入力装置４と、計算装置４と、計算装置３−１と、計算装置３−２と出力装置４とからなる。
本装置（第２の装置）は、計算対象とするペプチド鎖が確定しない場合（例えば、最初の質量分析により、ペプチド鎖あるいは蛋白質の質量データは得られているが、この蛋白質データベースに登録されておらず、構成するアミノ酸配列が確定できない場合。）などに用いる。
【００４３】
入力装置４により、計算対象とするペプチド鎖の構成アミノ酸数ｎをユーザが入力する。次いで、計算装置３−１により、ｎ個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖の組を生成し、ポリペプチド解離データベースを参照して、既に計算された組を除く。次いで、未計算のポリペプチドについて、分子動力学法に基づく立体構造生成計算を行い、さらにこれにより得られる複数の立体構造を精密化するために、非経験的分子軌道法を用いて立体構造最適化計算をそれぞれに対して行う。次いで計算装置３−２により、該当する部位全て（解離する可能性のある部位全て）について、結合解離エネルギーを非経験的分子軌道法により計算し、さらに、計算された結合解離エネルギーを前記同様の方法を用いて、各解離パターンに対応した質量スペクトルを算出する。最後に、計算されたスペクトル位置とＩｎｔｅｎｓｉｔｙとを有する質量スペクトルと、ポリペプチド解離データベースに登録するデータとを、出力装置４により、出力する。
【００４４】
上記入力装置４は、計算するペプチド鎖の構成アミノ酸数をユーザの指定により、入力する装置である。また、出力装置４は、計算から推定されたスペクトル位置とＩｎｔｅｎｓｉｔｙとを有する質量スペクトルと、ポリペプチド解離データベースに登録するデータとを、出力する。この装置ＩＶで、使用される入力装置３と、ポリペプチド解離データベースを参照して計算する計算装置４と、出力装置４について、以下に説明する。なお計算装置３−１と、計算装置３−２とは、前記装置ＩＩＩに使用される計算装置３−１と、計算装置３−２と同様のものが用いられる。
入力装置４：計算するポリペプチド鎖を構成するアミノ酸数を、好ましくは、ユーザの指定により入力するための装置である。
出力装置４：計算から推定された位置とＩｎｔｅｎｓｉｔｙを含む質量スペクトルと、ポリペプチド解離データベースに登録するためのデータとを出力するための装置である。
【００４５】
装置Ｖ
図１２の（Ｂ）に示すように、本装置（第３の装置）は、入力装置５と、計算装置５と、出力装置５とからなっている。
まず、入力装置５により、実験から得られた質量スペクトルと、計算から推定された質量スペクトルの位置と強度とを入力する。次いで計算装置５により、実験から得られた質量スペクトル上で計算から得られた質量スペクトルをスキャンさせ、スペクトルパターンをマッチングさせ、ユーザにより設定される基準に基づき、実験から得られたスペクトル位置と強度とを有する質量スペクトルを出力する。
上記計算装置５は、実験からの質量スペクトル上で推定された質量スペクトルをスキャンし、スペクトルパターンをマッチングさせ、実験からの質量スペクトルを入力する。
この装置Ｖで、使用される入力装置５と、計算装置５と、出力装置５について、以下に説明する。
【００４６】
入力装置５：実験から得られた質量スペクトルデータと、算出された推定の質量スペクトルとを入力するための装置である。
計算装置５：実験から得られた質量スペクトル上で、推定された質量スペクトルをスキャンし、スペクトルパターンマッチングさせ、実験からの質量スペクトルを補正するための装置である。マッチングは、たとえば推定された質量スペクトルを、実験から得られた質量スペクトル強度に合わせて補正し、欠損していると推定されるスペクトルのスペクトル位置は変えずに強度を補正して、実験からの質量スペクトルデータに、欠損していると推定されるスペクトルデータ（スペクトル位置、スペクトル強度を含む）を加えることによって、行うことができる。
出力装置５：補正された質量スペクトル（質量スペクトルデータ）を出力するとＩｎｔｅｎｓｉｔｙを含む質量スペクトルと、ポリペプチド解離データベースに登録するためのデータとを出力するための装置である。
【００４７】
本発明に係るプロテオーム解析方法は、上記したシステムを利用することによって行うことができる。このシステムを構成する前記装置Ｉ〜Ｖの構成は、入力装置１〜５の中の複数の入力装置を共通化することもでき、その入力方法は、限定されない。また、出力装置および計算装置についても、入力装置と同様に、適宜、共通化可能である。また、入力装置をユーザ端末としたり、あるいはクライアントとし、計算装置と出力装置をサーバ側とし、蛋白質配列データベースおよびポリペプチド解離データベースを、インターネットにより接続するように構成することも可能である。さらに、入力装置と、計算装置と出力装置とをクライアント側とし、蛋白質配列データベースおよびポリペプチド解離データベースを、サーバ側として、これらを、インターネットを介して接続する構成を採用することもできる。
【００４８】
さらに、入力装置と、計算装置と出力装置と、ポリペプチド解離データベースをクライアント側とし、蛋白質配列データベースを、サーバ側として、これらを、インターネットを介して接続する構成を採用することもできる。また装置Ｉ〜Ｖは、単一でも複数でもよく、これらの装置は、ＬＡＮ、ＷＡＮ等を介して電気的に接続されていてもよく、装置として一体化されていてもよく独立して設定されていてもよい。また装置Ｉ〜Ｖの任意の組み合わせで一装置としてあるいは複数の装置として設置されていても自在に改変可能である。
【００４９】
本システムは、また、前記装置Ｉ〜Ｖの全てを有するシステム構成が好ましいが、装置Ｉ〜Ｖのいずれか１つのみをプロテオーム解析システムとして構成したり、これら装置Ｉ〜Ｖの任意の２以上を組み合わせてプロテオーム解析システムとして構成することができる。たとえば、装置ＩＩ、装置ＩＩＩおよび装置Ｖでプロテオーム解析システムとして構成したり、装置ＩＶ、装置Ｖおよび装置Ｉでプロテオーム解析システムとして構成したり、さらに、装置ＩＩ、装置ＩＩＩおよび装置Ｖと、さらに、装置Ｉとを組み合わせてプロテオーム解析システムとして構成したりすることができる。
【００５０】
また、前記の装置Ｉ〜Ｖは、ハードウェアとして構成されるのではなく、アプリケーションソフトをパーソナルコンピュータ等に内蔵されたハードウェアあるいはＲＯＭ（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどの記録媒体、およびインターネットを介してダウンロードさせた記録媒体）から起動させて、装置Ｉ乃至Ｖの少なくとも１つの機能が発揮できるように、ソフトウェア的に構成することができる。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、従来のように一部の質量スペクトルのピーク位置だけを用いて蛋白質の同定を行うよりも、高い精度でかつ高速に蛋白質同定を行うことが可能となる。また、蛋白質配列データベースだけを参照する従来法では、データベースに登録されている既存・既知の蛋白質でないと同定が不可能であったのに対し、本発明を使用することにより、データベースにペプチド鎖のスペクトルが登録されていない場合であっても、スペクトルパターンを予測することができ、従来同定不可とされた場合でも、蛋白質についても同定できる可能性が大きく広がった。
【００５２】
そして、実験データに、この実験の際の条件等で見えないあるいはノイズと判断されたりしてしまうようなスペクトルが存在するような場合でも、このスペクトル（計算値）を計算してスペクトル位置、強度（強度比）を他の実験データと適合するようにして実験値のデータに当該計算値を用いて補正を行い、この補正値を用いて蛋白質あるいはポリペプチド（フラグメント化されたペプチド）のアミノ酸配列あるいは同定が可能となる。この計算の際に、たとえば、反応速度（反応速度定数）を用いて強度（比）を求める方法を採用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法の流れを示すフローチャートである。
【図２】図２中のａ１〜ｃ１およびｘ１〜ｚ１は、結合解離エネルギーを計算する際の、開裂位置とイオン系列の関係の一例を示し、ａ２〜ｃ２およびｘ２〜ｚ２は、結合解離エネルギーを計算する際の、開裂位置とイオン系列の関係の他の例を示す。
【図３】計算対象とするペプチド鎖の選択方法を示す図である。
【図４】計算による質量スペクトルデータの補正方法を示した図である。
【図５】本発明において用いる分子シミュレーションにより求めた『質量スペクトルデータ』のデータ構造図を示す図である。
【図６】データベースＰｒｏＦｏｕｎｄを一例に使用して蛋白質および／またはポリペプチドの配列を同定するために、その基本的な特定項目を入力して同定を開始した例を示す図である。
【図７】図６に示すようにして、基本的な項目（たとえば、前記Ａｖｅｒａｇｅ　Ｍａｓｓと、Ｅｎｚｙｍｅと、Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｃａｔｅｇｏｒｙと、マッチング制御パラメータを含む）の情報を入力して、得られた結果の１例を示す図である。
【図８】図６に示すようにして、基本的な項目の情報を入力して、マッピングの結果の１例を示した図である。
【図９】本発明に係るプロテオーム解析システムの全体の構成例を示す図である。
【図１０】本発明に係るプロテオーム解析システムを用いてプロテオームまたはペプチド鎖の配列を同定する工程を示すフローチャートである。
【図１１】（Ａ）は、本発明に係るプロテオーム解析システムの全体の構成例を用いて蛋白質の配列および／またはポリペプチドの配列を同定する手順を示す図であり、（Ｂ）は、（Ａ）に示すシステムに使用される装置Ｉおよび装置ＩＩの構成例を示す図である。
【図１２】（Ａ）は、図１１の（Ａ）に示すシステムに使用される装置ＩＩＩおよび装置ＩＶの構成例を示す図であり、（Ｂ）は、図１１の（Ａ）に示すシステムに使用される装置Ｖの構成例を示す図である。
【符号の説明】
Ｉ〜Ｖ　装置
１０　蛋白質配列データベース
１１　ポリペプチド解離データベース
１００　ネットワーク
【図１】
2004012355.tif 000003
【図２】
2004012355.tif 000004
【図３】
2004012355.tif 000005
【図４】
2004012355.tif 000006
【図５】
2004012355.tif 000007
【図６】
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【図７】
2004012355.tif 000009
【図８】
2004012355.tif 000010
【図９】
2004012355.tif 000011
【図１０】
2004012355.tif 000012
【図１１】
2004012355.tif 000013
【図１２】
2004012355.tif 000014