(57)【要約】【課題】細胞のアポトーシスを誘導することができるカスパーゼ９の活性化剤を提供する。【解決手段】ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むカスパーゼ９の活性化剤、及びカスパーゼ９の活性化により細胞のアポトーシスを誘導する上記の活性化剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むカスパーゼ９の活性化剤。
【請求項２】
カスパーゼ９の活性化により細胞のアポトーシスを誘導する請求項１に記載の活性化剤。
【請求項３】
ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質をコードする遺伝子であって、細胞内のカスパーゼ９を活性化する遺伝子。
【請求項４】
ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むミトコンドリアの膜電位低下剤。
【請求項５】
ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むミトコンドリアの傷害剤。
【請求項６】
ミトコンドリア傷害により細胞のアポトーシスを誘導する請求項５に記載の傷害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はカスパーゼ９の活性化剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス（Ａｐｏｔｏｓｉｓ）は、物理的外傷や化学的毒物などにより生じる壊死（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）とは異なり、生理学上の種々の条件下で生じる細胞死であり（Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ　Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２６，ｐｐ．２３９−２５７，１９７２）、プログラム細胞死（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ）とも呼ばれる。アポトーシスは、細胞障害性Ｔ細胞による細胞障害、放射線照射、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン類、抗ＣＤ３抗体などによって誘導されるほか、悪性腫瘍の自然退縮においても確認されている。細胞のアポトーシスを人為的に誘導する遺伝子や遺伝子産物を用いることにより、遺伝子治療や特定の癌細胞の破壊などが可能になると期待される。
【０００３】
カスパーゼはアポトーシスが実行される過程で活性化するシステインプロテアーゼで、現在１４のアイソフォームが確認されている。カスパーゼは不活性化型の前駆体として産生されるが、プロセシングによって活性化されると下流のカスパーゼをプロセシングしてカスケード状に活性化し、最終的に細胞死に関わる基質の分解を行う。虚血や活性酸素、薬物などストレス刺激はミトコンドリアの機能に障害を与え、ミトコンドリアからのチトクロムｃ漏出を引き起こす．このチトクロムｃはＡｐａｆ‐１とカスパーゼ９、ＡＴＰ／ｄＡＴＰと複合体を形成する（この複合体をａｐｏｐｔｏｓｏｍｅと呼ぶ）。ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ形成によって活性化されたカスパーゼ９は下流のカスパーゼを活性化しアポトーシスが進行する。
【０００４】
また、ミトコンドリアから放出される新しい細胞死誘導因子ＨｔｒＡ２の存在も知られている。この因子は、細胞質に放出されるとカスパーゼを活性化してアポトーシスを誘導する作用を有しているが、ＨｔｒＡ２自体はセリンプロテアーゼに属するタンパク質分解酵素であり、その活性によってカスパーゼが関与しないアポトーシスが引き起こされる。カスパーゼを使わずにアポトーシスを誘導するミトコンドリア由来の他の因子の存在も明らかにされている。さらに、アポトーシスを起こすようなシグナルを細胞が受けた場合、ミトコンドリアとは無関係に、細胞がＦａｓやＴＮＦＲを介してカスパーゼ８を活性化するパスウェーの存在も知られている。
【０００５】
このように、アポトーシスの刺激によってはカスパーゼを阻害しても細胞死は抑えられない場合があること分かっており、アポトーシスの過剰によって起こると考えられる痴呆症やパーキンソン病などの神経変性疾患でも、カスパーゼを使わない細胞死が起こっていることが多いことが判明している。一方、カスパーゼが関与するアポトーシスにおいては、ミトコンドリアを経由するものと経由しないものの存在が解明されている。従って、ある因子がアポトーシスを引き起こす場合、そのアポトーシスがどのような経路で誘導されるのかを解明することは極めて重要である。
【０００６】
一方、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるヒト後天性免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、構造遺伝子及び調節遺伝子に加え、自身の複製に必須ではないアクセサリー遺伝子（ｎｅｆ，ｖｐｒ，ｖｐｕ，ｖｉｆ）を有している。アクセサリー遺伝子の一つであるｖｐｒの遺伝子産物（蛋白質Ｖｐｒ）は、ウイルス感染効率の上昇及びＨＩＶ潜伏感染細胞からのウイルス産生を惹起するなど、ＡＩＤＳ発症のキーファクターとして注目されている。さらに、蛋白質Ｖｐｒは、細胞の増殖抑制、分化誘導、アポトーシス誘導、アポトーシス抑制、核の多倍体化誘導などの極めて多様な生理作用を有することも明らかにされている。
【０００７】
本発明者らはＨＩＶ−１のアクセサリー遺伝子ｖｐｒがコードする９６アミノ酸残基からなるＶｐｒ蛋白質のカルボキシル末端の１５アミノ酸残基を欠失した変異体（以下、本明細書において「Ｃ８１変異蛋白質」と呼ぶ場合がある。）が極めて高いアポトーシス誘導活性を有しており、その結果として細胞増殖抑制作用を発揮することを見出している（国際公開ＷＯ　００／１８４２６）。該公報には、該遺伝子をＡＩＤＳの予防及び／又は治療のための遺伝子療法に用いることができこと、及び該遺伝子をＨＩＶ−１ＬＴＲの下流に連結し、抗ＨＩＶ　ｇｐ１２０抗体結合リポソームに封入して生体内に導入することによりＨＩＶ感染細胞を直接的かつ特異的に破壊する可能性についての示唆がある。もっとも、上記刊行物には、この遺伝子がアポトーシスのどのような経路において作用するのかについては示唆ないし教示がない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の課題はカスパーゼ９の活性化剤を提供することにあり、より具体的には、細胞内のカスパーゼ９を活性化することにより該細胞のアポトーシスを誘導することができるカスパーゼ９の活性化剤を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、Ｃ８１変異蛋白質がカスパーゼ９の活性を高める作用を有しており、その結果、細胞内のカスパーゼ３が活性化されて最終的に細胞のアポトーシスが誘導されることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００９】
すなわち本発明は、ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むカスパーゼ９の活性化剤、及び該カスパーゼ９の活性化により細胞のアポトーシスを誘導する上記活性化剤を提供するものである。また、ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質をコードする遺伝子であって、細胞内のカスパーゼ９を活性化する遺伝子が本発明により提供される。
【００１０】
別の観点からは、上記の蛋白質又は上記の遺伝子を用いて細胞内のカスパーゼ９を活性化する方法、及び該活性化により細胞のアポトーシスを誘導する方法；上記の遺伝子を含む組換えベクター；上記の組換えベクターを用いて細胞内のカスパーゼ９を活性化する方法、及び該活性化により細胞のアポトーシスを誘導する方法が提供される。
【００１１】
さらに別の観点からは、癌の治療方法であって、上記蛋白質又は上記組換えベクターの有効量を患者に投与して癌細胞内のカスパーゼ９を活性化する工程を含む方法、ＡＩＤＳの治療方法であって、上記蛋白質又は上記組換えベクターの有効量を患者に投与してＨＩＶ感染細胞内のカスパーゼ９を活性化する工程を含む方法も本発明により提供される。
【００１２】
また、ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むミトコンドリアの膜電位低下剤、ＨＩＶ−１のｖｐｒ遺伝子がコードするＶｐｒ蛋白質のＣ末端側から１５個のアミノ酸残基が欠失した蛋白質を含むミトコンドリアの傷害剤、及びミトコンドリア傷害により細胞のアポトーシスを誘導する上記の傷害剤が本発明により提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
Ｃ８１変異蛋白質のアポトーシス誘導作用については国際公開ＷＯ　００／１８４２６に開示されており、該公報の開示の全てを参照として本発明の開示に含める。Ｃ８１変異蛋白質及び該蛋白質をコードする遺伝子については上記公報の開示を基にして当業者が容易に入手できる。また、Ｃ８１変異蛋白質のアミノ酸配列において、数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び／又は欠失したアミノ酸配列を有し、Ｃ８１変異蛋白質と同様にカスパーゼ９を活性化し、それによりアポトーシス誘導作用を有する蛋白質（以下、「改変蛋白質」と呼ぶ場合がある）も本発明の範囲に包含される。本発明の遺伝子はＣ８１変異蛋白質又は上記改変蛋白質をコードする核酸配列からなるＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれをも包含するが、これらは上記文献記載の方法に従って容易に入手することが可能である。
【００１４】
上記の改変蛋白質は、Ｃ８１変異蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する大腸菌などをＮ−ニトロ−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤を用いて突然変異処理し、菌体から改変蛋白質をコードする遺伝子を回収した後、通常の遺伝子発現操作を行うことによって製造できる。また、前記遺伝子を亜硫酸ナトリウムなどの薬剤で直接処理するか、あるいは部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，１９８７）やリコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　ｐｒｅｓｓ，１９８９）などの手法によってヌクレオチドの欠失、置換、又は付加を直接導入してもよい。
【００１５】
Ｃ８１変異蛋白質及び上記の改変蛋白質は、細胞内でカスパーゼ９を活性化する作用を有しており、その結果として細胞にアポトーシスを誘導する。Ｃ８１変異蛋白質は、例えば、癌細胞内のカスパーゼ９を活性化することができ、その結果、癌細胞にアポトーシスを誘導して癌細胞を死滅させることができる。また、ＨＩＶ感染細胞においてカスパーゼ９を活性化し、その結果としてＨＩＶ感染細胞にアポトーシスを誘導することができる。さらに、Ｃ８１変異蛋白質及び上記の改変蛋白質は細胞内のミトコンドリアの膜電位を低下させ、ミトコンドリアに傷害を与えることができる。この結果、細胞のアポトーシスを誘導することが可能になる。従って、上記蛋白質を含む医薬は、癌の予防及び／又は治療や、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の予防及び／又は治療に用いることができる。本発明の医薬の投与方法、投与量、製剤形態などは、当業者により適宜選択可能であり、特に限定されることはない。
【００１６】
上記の医薬としての利用の目的のために、本発明の蛋白質は、他のポリペプチドと融合されていてもよい。本発明の蛋白質のアミノ酸配列を部分配列として含む融合蛋白質、及び該融合蛋白質をコードする遺伝子も本発明の範囲に包含される。例えば、癌細胞などの標的細胞に対して特異的なモノクローナル抗体やそのフラグメントとの融合蛋白質を製造することにより、標的細胞において特異的にカスパーゼ９を活性化し、その結果としてアポトーシスを惹起させることが可能になる。また、上記蛋白質は、アポトーシス耐性が関与する疾患などの治療への有用性が期待され、生化学、遺伝子工学などの分野における試薬としても有用である。
【００１７】
本発明の遺伝子は、本発明の蛋白質の製造に有用であるほか、アポトーシス耐性が関与する疾患に対する遺伝子治療に用いることができる。例えば、癌やＡＩＤＳの予防及び／又は治療のための遺伝子療法に用いることができ、癌細胞又はＨＩＶ感染細胞内でカスパーゼ９を活性化することにより癌細胞やＨＩＶ感染細胞を死滅させることができる。遺伝子療法の手技は特に限定されないが、通常は、本発明の遺伝子をベクターに組み込み、生体内に該組換えベクターを導入して本発明の遺伝子を発現させればよい。生体内に遺伝子を導入するためのベクターは種々知られており、当業者は適宜のベクターを選択することができる。また、特定の細胞において遺伝子の発現を制御するための手法も当業者に利用可能である。
【００１８】
また、医薬として適用する場合の好ましい形態として、ＨＩＶ感染細胞においてカスパーゼ９を活性化することによりＨＩＶ感染細胞のアポトーシスを誘導するＨＩＶ感染症の治療のための医薬であって、（１）Ｃ８１変異蛋白質又は上記改変蛋白質をコードする遺伝子；及び（２）上記の遺伝子の上流に結合されたＨＩＶ−１ＬＴＲを含む遺伝子発現ベクターを内部に含み、その表面がＨＩＶ関連蛋白質に対するモノクローナル抗体、好ましくはＨＩＶ−１ｇｐ１２０に対するモノクローナル抗体で修飾されたリポソームなどを挙げることができる。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
１．材料と方法
ＨＩＶ−１感染性ＤＮＡクローンｐＮＬ４３２由来のｖｐｒの変異体Ｃ８１をｐＨＩＶ−ＬＴＲｂｓｒベクターのＬＴＲ下流に組み込み、ＨＩＶ−１　Ｔａｔ依存的に発現誘導可能な系を確立した。同様にｖｐｒ（野生型）及びコントロールとしてＣ８１のロイシンジッパー変異体であるＣ８１Ｉ７４Ｐ（アポトーシス能が欠如）をＦｌａｇ−ｔａｇ付きで挿入した。Ｃ８１変異蛋白質をコードする遺伝子の増幅方法、Ｆｌａｇ−Ｔａｇ配列との接続方法、及び該遺伝子を含む発現ベクターの取得方法は基本的に国際公開ＷＯ　００／１８４２６の実施例に記載の方法に従った。また、比較のため、同様の方法で野生型ｖｐｒ及びコントロールベクターをエレクトロポレーション法にてＨｅＬａ細胞に導入した。
【００２０】
Ｈｅｌａ細胞に発現ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、３６時間後に細胞抽出液を調製し、カスパーゼ９、カスパーゼ３、及びカスパーゼ８の酵素活性を測定した。結果を図１に示す。ｖｐｒ変異体Ｃ８１を含む発現ベクターを導入した系においてカスパーゼ９の活性がコントロールに比べて顕著に上昇していた。また、カスパーゼ３についても活性上昇が認められたが、一方、カスパーゼ８の活性はコントロールと同程度であり、活性化は認められなかった。
【００２１】
つぎに、ミトコンドリア膜電位の変化を測定した。ミトコンドリア膜電位の消失により赤色蛍光が緑色蛍光へとシフトする性質を持つＭｉｔｏｃａｐｔｕｒｅ試薬を用い、トランスフェクション後３６時間に染色を行い、モトコンドリア膜電位の変化を共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ｖｐｒ変異体Ｃ８１を導入した細胞では赤い蛍光が消失し、膜電位が低下していることが明らかとなった。
【００２２】
さらにミトコンドリアと細胞質画分とを分画した後、抗−チトクロームｃ抗体によりウェスタンブロッティングを行ったところ、Ｃ８１導入細胞ではミトコンドリア傷害によりチトクロームｃが細胞質に流出していることが判明した。結果を図２に示す。以上のように、ｖｐｒ変異体Ｃ８１によるアポトーシス誘導はミトコンドリアを経由するパスウェーを通じて引き起こされるものであり、そのターゲットはカスパーゼ９であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｖｐｒ変異体Ｃ８１の発現によるカスパーゼ９の活性化を示した図である。
【図２】ｖｐｒ変異体Ｃ８１によるミトコンドリアへの影響を示した図である。
【図１】
2004067531.tif 000002
【図２】
2004067531.tif 000003