(57)【要約】【課題】癌特異発現物質、特に大腸癌や、前立腺癌、膀胱癌、腎癌及び尿管癌といった泌尿器系癌に特異的に発現するブラディオンに関して、遺伝子レベルでその発現を検出、定量するのに有用なプライマーやプローブとなる核酸断片を提供し、さらに、簡便に実施可能で、再現性・信頼性の高い検体中のブラディオン遺伝子の定性検出法および定量測定法を提供する。【解決手段】ブラディオン遺伝子の部分配列を有する核酸断片；該核酸断片を使用するブラディオン遺伝子発現の検出方法及びブラディオン遺伝子発現量の定量方法；該核酸断片を含むキット；及び該核酸断片を使用する癌の診断方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラディオン遺伝子の部分配列を有する核酸断片であって、下記配列１〜１６のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片。
2004166593.tif 000026
【請求項２】
ブラディオン遺伝子発現の検出方法であって、請求項１に記載のいずれかの核酸断片をプライマーとして用い、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ブラディオン遺伝子の発現を検出することを特徴とする方法。
【請求項３】
ブラディオン遺伝子発現の検出方法であって、請求項１に記載の核酸断片からなる下記（１）〜（７）のプライマーセットのいずれかを用い、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ブラディオン遺伝子の発現を検出することを特徴とする方法。
（１）配列１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（２）配列３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（３）配列５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（４）配列７のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列８のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（５）配列９のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１０のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（６）配列１１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（７）配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片
【請求項４】
ブラディオンの遺伝子レベルでの発現量を定量する方法であって、請求項１記載の核酸断片である配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片からなるプライマーセット、並びに、ブラディオン遺伝子ＤＮＡの部分配列に対して１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイゼーションすることができる請求項１記載の核酸断片である配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片と配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片とを蛍光色素標識プローブとして用いて、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、該ＲＴ−ＰＣＲ法の実施の過程で蛍光強度をリアルタイムで測定し、検体中の遺伝子発現量を求めることを特徴とする、ブラディオン遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項５】
配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の５’末端に蛍光色素が結合していて、及び配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の３’末端に蛍光色素が結合していて、蛍光共鳴エネルギー転移により一方の蛍光色素の蛍光強度が、他方の蛍光色素により抑制される、請求項４記載のブラディオン遺伝子の発現量を定量する方法。
【請求項６】
請求項３記載の方法に使用するための検出用キットであって、請求項１に記載の核酸断片からなる下記（１）〜（７）のプライマーセットのいずれかを含有するキット。
（１）配列１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（２）配列３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（３）配列５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（４）配列７のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列８のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（５）配列９のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１０のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（６）配列１１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（７）配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片
【請求項７】
下記の成分を含む請求項４記載の方法に使用するためのキット。
（ｉ）請求項１記載の核酸断片である配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片からなるプライマーセット；並びに
（ｉｉ）ブラディオン遺伝子ＤＮＡの部分配列に対して１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイゼーションすることができる請求項１記載の核酸断片である配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片と配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片とをそれぞれ蛍光色素で標識した２種のプローブ
【請求項８】
請求項７記載のキットであって、成分（ｉｉ）において配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の５’末端に蛍光色素が結合していて、及び配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の３’末端に蛍光色素が結合していて、蛍光共鳴エネルギー転移により一方の蛍光色素の蛍光強度が他方の蛍光色素により抑制される、キット。
【請求項９】
癌の診断方法であって、請求項１に記載の核酸断片からなる下記（１）〜（７）のプライマーセットのいずれかを用い、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ブラディオン遺伝子の発現を検出することを含む方法。
（１）配列１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（２）配列３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（３）配列５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（４）配列７のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列８のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（５）配列９のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１０のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（６）配列１１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（７）配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片
【請求項１０】
癌の診断方法であって、請求項１記載の核酸断片である配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片からなるプライマーセット、並びに、ブラディオン遺伝子ＤＮＡの部分配列に対して１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイゼーションすることができる請求項１記載の核酸断片である配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片と配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片とを蛍光色素標識プローブとして用いて、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、該ＲＴ−ＰＣＲ法の実施の過程で蛍光強度をリアルタイムで測定し、検体中の遺伝子発現量を求めることを含む、癌の診断方法。
【請求項１１】
配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の５’末端に蛍光色素が結合していて、及び配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の３’末端に蛍光色素が結合していて、蛍光共鳴エネルギー転移により一方の蛍光色素の蛍光強度が、他方の蛍光色素により抑制される、請求項１０の癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブラディオン遺伝子に関連した検出に有用な、ブラディオン遺伝子の部分配列を有する核酸断片に関し、及び、そのような核酸断片を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（リバーストランスクリプショナルＰＣＲ、以下ＲＴ−ＰＣＲ法という）を実施してブラディオン遺伝子の発現を検出する方法、あるいはその発現量を定量する方法、さらにそのような方法を実施するためのキットに関する。本発明はさらに、癌の診断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、癌の確定診断は一般に、生検による病理組織学的な手法により行なわれている。この方法では診断医間の診断格差が生じる余地があり、また、組織化学的手法であるがゆえの癌細胞の見落とし等も生じる可能性がある。さらに、癌の進行度判定においても同様のことが言える。従って、患者の治療法、予後を決定する重要なプロセスに、未だに主治医あるいは受診した医院の技術と経験により結果が左右されるというのが現状であり、本来あるべき取得情報の客観的数値化には至っていない。
【０００３】
一方、高感度で特異的なＤＮＡ増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号、第４，９６５，１８８号明細書などに開示されている。）は、現在、疾患の原因である病原体や原因遺伝子そのものの検出のために利用されている。数年前には両末端または片側末端に蛍光色素標識したプローブの存在下でＰＣＲを行ない、核酸の増幅にともなってリアルタイムに増加又は減少する蛍光強度を測定することにより検体中の標的遺伝子発現量の測定を行なう技術（リアルタイム定量ＰＣＲ法ともいう。）が開発され、研究開発現場での特定遺伝子検出用試薬キットや機器類の市販が開始された。リアルタイム定量ＰＣＲ法については、種々の文献に説明されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、このような手法によっても、用いるプライマーおよびプローブの設定によっては検出、測定の感度、特異性、再現性を必ずしも満足できない。
【０００４】
【非特許文献１】
真木寿治  監修「改訂  ＰＣＲ  Ｔｉｐｓ  可能性を広げるコツとヒント」第１版  秀潤社、１９９７年１２月１日、ｐ．９４〜９９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、癌特異発現物質、特に大腸癌や、前立腺癌、膀胱癌、腎癌及び尿管癌といった泌尿器系癌に特異的に発現するブラディオンに関して、遺伝子レベルでその発現を検出、定量するのに有用なプライマーやプローブとなる核酸断片を提供し、さらに、簡便に実施可能で、再現性・信頼性の高い検体中のブラディオン遺伝子の定性検出法および定量測定法を提供することである。本発明はまた、そのような定性検出法および定量測定法の実施に使用するためのキットを提供するものである。本発明はさらに、上記の定性検出法や定量測定法を利用した癌特異的診断法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を利用することにより、癌細胞より抽出された核酸を用いて、癌特異発現物質ブラディオン発現の検出、測定に応用することを考えた。しかしながら、上述のように、用いるプライマーおよびプローブの設定によっては検出、測定の感度、特異性、再現性を必ずしも満足できない。そこで、本発明者らはブラディオン遺伝子配列（日本国特許第３１４１１０７号など）に基づき、種々の合成プライマーおよびプローブを工学設計し、ヒト検体試料により十分な試行錯誤を行った。その結果、特定のプライマーおよびプローブセットにより、再現性の良い信頼しうるＲＴ−ＰＣＲ法およびリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法の結果を得ることができた。この成果により、癌の診断に使用可能な高感度で特異的にブラディオン遺伝子を定性検出、定量測定法を確立した。
【０００７】
従って本発明は、ブラディオン遺伝子の部分配列を有する核酸断片であって、下記配列１〜１６のいずれかの配列のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片に関する。
2004166593.tif 000002
本発明の核酸断片は、上記配列の中の連続した少なくとも１５塩基を含むものがより好ましく、長さは１５〜３５塩基程度が適当である。
【０００８】
本発明はまた、ブラディオン遺伝子発現の検出方法であって、上記のいずれかの核酸断片をプライマーとして用い、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ブラディオン遺伝子の発現を検出することを特徴とする方法に関する。
本発明はまた、ブラディオン遺伝子の発現量を定量する方法であって、上記の核酸断片をプライマー及びプローブとして用いて、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、該ＲＴ−ＰＣＲ法の実施の過程で蛍光強度をリアルタイムで測定し、すなわち、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を実施して、検体中の遺伝子発現量を求めることを特徴とする、ブラディオン遺伝子の発現量を定量する方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
ブラディオンにはブラディオンαとブラディオンβがあり、ブラディオンα遺伝子の配列は配列番号１であり、ブラディオンβ遺伝子の配列は配列番号２である（日本国特許第３１４１１０７号及び  Ｍａｎａｍｉ  Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ−Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｐｔｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｇｅｎｅ，  Ｂｒａｄｅｉｏｎ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２８６，  ｐ．５４７−５５３参照）。
上記配列１（配列番号３）は、配列番号１で示される塩基配列の４６９番目〜４９３番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用である。
上記配列２（配列番号４）は、配列番号１で示される塩基配列のアンチセンス鎖の７４８番目〜７２４番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用である。
【００１０】
上記配列３（配列番号５）は、配列番号１で示される塩基配列の６１４番目〜６３８番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用である。
上記配列４（配列番号６）は、配列番号１で示される塩基配列のアンチセンス鎖の８７３番目〜８４９番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用である。
上記配列５（配列番号７）は、配列番号２で示される塩基配列の４６８番目〜４９２番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用である。
上記配列６（配列番号８）は、配列番号２で示される塩基配列のアンチセンス鎖の８１１番目〜７８７番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用である。
【００１１】
上記配列７（配列番号９）は、配列番号２で示される塩基配列の４７５番目〜５００番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用である。
上記配列８（配列番号１０）は、配列番号２で示される塩基配列のアンチセンス鎖の８００番目〜７７９番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用である。
上記配列９（配列番号１１）は、配列番号１で示される塩基配列の１，３９３番目〜１，４１２番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用である。
上記配列１０（配列番号１２）は、配列番号１で示される塩基配列のアンチセンス鎖の１，６５３番目〜１，６３４番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用である。
【００１２】
上記配列１１（配列番号１３）は、配列番号１で示される塩基配列の１４０番目〜１５９番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用である。
上記配列１２（配列番号１４）は、配列番号１で示される塩基配列のアンチセンス鎖の４００番目〜３８０番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用である。
上記配列１３（配列番号１５）は、配列番号２で示される塩基配列の１，３３７番目〜１，３５９番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は上流プライマーとして有用であり、とりわけリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法に有用である。
上記配列１４（配列番号１６）は、配列番号２で示される塩基配列のアンチセンス鎖の１，４９４番目〜１，４７０番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は下流プライマーとして有用であり、とりわけリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法に有用である。
【００１３】
上記配列１５（配列番号１７）は、配列番号２で示される塩基配列のアンチセンス鎖の１，４０５番目ないし１，３８１番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片は、特にリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法に用いる蛍光色素標識プローブとして有用である。
上記配列１６（配列番号１８）は、配列番号２で示される塩基配列のアンチセンス鎖の１，４３１番目ないし１，４０７番目からなる配列であって、この中の連続した少なくとも１０塩基を含む本発明の核酸断片も、特にリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法に用いる蛍光色素標識プローブとして有用である。
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法の実施において、上記二種の蛍光色素標識プローブを用いる。また、上記２種の標識プローブの配列は、増幅されるブラディオン遺伝子ＤＮＡ断片の部分配列に対して１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイゼーションすることができるように選択する。
上述してきた本発明の核酸断片は好ましくはＤＮＡ断片であって、その長さは１５〜３５塩基が適当である。
【００１４】
本発明のブラディオン遺伝子発現の検出方法はさらに具体的には、上記の本発明の核酸断片からなる下記（１）〜（７）のプライマーセットのいずれかを用い、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、ブラディオン遺伝子の発現を検出することを特徴とする。
（１）配列１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（２）配列３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（３）配列５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（４）配列７のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列８のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（５）配列９のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１０のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（６）配列１１のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１２のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片；
（７）配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片
【００１５】
本発明のブラディオンの遺伝子レベルでの発現量を定量する方法は、具体的に、上記の本発明の核酸断片である配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片からなるプライマーセット、並びに、ブラディオン遺伝子ＤＮＡの部分配列に対して１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイゼーションすることができる本発明の核酸断片である配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片と配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片とを蛍光色素標識プローブとして用いて、検体中のブラディオン遺伝子ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法を行い、該ＲＴ−ＰＣＲ法の増幅反応中に蛍光強度をリアルタイムで測定し、検体中の遺伝子発現量を求めることを特徴とする。
【００１６】
上記のリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を採用したブラディオン遺伝子の発現量を定量する方法では具体的に、配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の５’末端に蛍光色素が結合していて、及び配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の３’末端に蛍光色素が結合していて、蛍光共鳴エネルギー転移により一方の蛍光色素の蛍光強度が、他方の蛍光色素により抑制されるように、蛍光色素を選択する。
配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の５’末端側に、ドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素の一方を結合させ、配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の３’末端側には、ドナー蛍光色素及びアクセプター蛍光色素のうち他方を結合させる。この蛍光色素は特に限定されないが、ドナー蛍光色素としてはＦＡＭのようなフルオレセイン系の蛍光色素が好ましく、アクセプター蛍光色素としてはＣｙ５のようなＣｙ系またはＴＡＭＲＡのようなローダミン系蛍光色素が好ましい。
【００１７】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法における上記ニ種のプローブの機序は次のとおりである。ＰＣＲ反応中、２つのプローブが鋳型ＤＮＡにアニーリングし隣接した場合には、励起されたドナー蛍光色素のエネルギーが蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，  ＦＲＥＴ）によりアクセプター蛍光色素に転移する。これによりアクセプター蛍光色素が励起され、その放射エネルギーを発する。蛍光強度の測定方法は、アクセプター蛍光色素の放射エネルギーの変化（増加）を測定するものである。または、ドナー蛍光色素の放射エネルギーの変化（減少）を測定するものである。プローブが反応液中に遊離の状態である場合（アニーリング状態ではない場合）やアニーリングすべきＤＮＡが存在しない場合には、２つのプローブは隣接せずＦＲＥＴは起きないためドナー蛍光色素が励起されてもドナー蛍光色素が放射エネルギーを発する。
【００１８】
本発明で実施するＲＴ−ＰＣＲ法及びリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法は、上記のような特定のプライマーセットや標識プローブを用いる他は、使用する装置及び操作条件などは通常のものを採用することができる。
検体から、例えば生検試料からｍＲＮＡを抽出する操作は常法に従って行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲ反応液として、上流プライマーおよび下流プライマー、逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）、耐熱性ＤＮＡ合成酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓなどを含む緩衝溶液を調製する。また、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ反応では、上流プライマーおよび下流プライマー、蛍光標識プローブ、逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）、耐熱性ＤＮＡ合成酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓなどを含む緩衝溶液を調製する。上記反応液における各種成分の濃度は適宜選択することができる。
また、ＰＣＲ反応における温度及び時間の条件、サイクル数なども常法に従って適宜選択して実施することができる。
【００１９】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、まず、ＲＮＡに相補的な下流プライマーがハイブリダイズし、逆転写反応により伸長することでＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成する。続いてＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅する。検体中にＲＮＡが存在しない場合は、ＤＮＡの増幅が起こらない。このため、ＰＣＲ反応液中の増幅した標的ＤＮＡの有無を判定することで標的物質を定性検出することができる。
具体的にブラディオン遺伝子発現の検出をするには、ＲＴ−ＰＣＲ反応の終了後、反応液を電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した後、核酸染色剤により染色し、染色されたバンドをＵＶ下で検出する。
【００２０】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法では、上記ＲＴ−ＰＣＲ反応に加えて蛍光標識プローブを用いるが、この標識プローブは増幅するＤＮＡフラグメントに相補的な配列を有するため一本鎖状態のＤＮＡとハイブリダイズする。この時、２つのプローブが隣接するように設定されているため、ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素の間にＦＲＥＴが起こり、蛍光エネルギーの変化が生じる。ＤＮＡの増幅量が大きいほど蛍光エネルギー変化も大きくなる。検体中にＲＮＡが存在しない場合は、ＤＮＡの増幅が起こらず、よって蛍光エネルギーの変化も生じない。
理論的にはＰＣＲは１サイクル毎に２倍ずつ増幅するので、あるサイクル数を過ぎると増幅産物が検出限界以上となり、見かけ上急激にＤＮＡが増幅する。この急激な増幅が起きる時期（サイクル数）は鋳型であるＲＮＡの初期濃度に依存しており、初期濃度が濃い方がサイクル数が少なくなる。測定の際、希釈系列の濃度既知の鋳型を用いてＰＣＲを行い、そのタイムコースをリアルタイムで取ることで、濃度とサイクル数の相関式が得られ検量線を作成することができる。具体的には、縦軸に蛍光強度（ＰＣＲ産物量の指標）、横軸にサイクル数をとり、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数（閾値のサイクル数、ｔｈｒｅｓｈｏｕｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ：Ｃｔ値）を求め、Ｃｔ値を縦軸、核酸量を横軸にプロットし検量線を作成することができる。濃度未知の検体について同じ条件でＰＣＲ反応を行い、Ｃｔ値を求めることにより、検量線を用いＣｔ値から逆算することで濃度を算出できる。したがって、ＰＣＲ反応液中の蛍光強度の変化を測定することにより標的物質を定量検出することができる。
【００２１】
本発明はさらに、上記のブラディオン遺伝子発現の検出方法に使用するための、本発明の核酸断片からなる上記（１）〜（７）のプライマーセットのいずれかを含有するキットに向けられている。
本発明はまた、上記のブラディオンの遺伝子レベルでの発現量を定量する方法に使用するための、下記成分を含むキットに向けられている
（ｉ）本発明の核酸断片である配列１３のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片及び配列１４のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片からなるプライマーセット；並びに
（ｉｉ）ブラディオン遺伝子ＤＮＡの部分配列に対して１〜５塩基の間隔を空けてハイブリダイゼーションすることができる本発明の核酸断片である配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片と配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片とをそれぞれ蛍光色素で標識した２種のプローブ。
上記キットの成分（ｉｉ）において具体的に、配列１５のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の５’末端に蛍光色素が結合していて、及び配列１６のうち連続した少なくとも１０塩基を含む核酸断片の３’末端に蛍光色素が結合していて、蛍光共鳴エネルギー転移により一方の蛍光色素の蛍光強度が他方の蛍光色素により抑制されるように作用するものである。
本発明のキットには上記成分のほかに、逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡ合成酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰｓ、反応緩衝液、純水などをさらに含めてもよい。
【００２２】
本発明はさらに、上記のブラディオン遺伝子発現の検出方法あるいはブラディオンの遺伝子レベルでの発現量を定量する方法を利用した癌の診断方法にも向けられている。
【００２３】
【発明の効果】
本発明の核酸断片をＲＴ−ＰＣＲ法あるいはリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法に使用することによって、癌細胞特異的マーカーであるブラディオン遺伝子の発現の検出が簡便に且つ高い感度及び信頼度をもって可能となり、また再現性の良い方法として定量的に数値化まで可能とすることができるようになった。本発明により、ヒトなどの哺乳類の組織、あるいは培養細胞などで発現するブラディオン遺伝子の定量的な解析が可能となり、医学、生物学分野における研究に有用であり、さらに、癌診断、癌進行度判定、転移巣抽出の用途にも有用である。
【００２４】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
ブラディオン遺伝子の定性測定
癌細胞株およびヒト患者検体から抽出したＲＮＡよりブラディオン遺伝子発現を定性測定するために、逆転写反応（ＲＴ）とＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をワンステップで行なった。
まず、反応に使用するプライマー・セット（上流プライマーと下流プライマー）をブラディオン遺伝子配列をもとに設計し、合成した。合成は、グライナー・ジャパン社の受託合成サービスに依頼しＨＰＬＣ精製グレードとした。多数のプライマーの設計、合成を行なったが、その内の数例のプライマー配列を下表に示す。
【００２５】
【表１】
2004166593.tif 000003
【００２６】
上記配列ａ〜ｄは次のとおりである。
2004166593.tif 000004
【００２７】
癌細胞株は大腸癌、前立腺癌、腎癌、その他の癌を用いた。細胞株はすべて、ＡＴＣＣ（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション）株のオリジナル分譲株であり、規定の諸手続の上、住商ファーマインターナショナル株式会社を通して購入した。下表に癌細胞株をまとめた。
【００２８】
【表２】
2004166593.tif 000005
【００２９】
癌細胞株またはヒト患者検体から全ＲＮＡを抽出し、テンプレートＲＮＡとした。以下に抽出法の一例を示す。抽出方法はこれに限定されるものではなく同様の他法でも代替できる。
癌細胞株からＲＮＡを抽出する場合はＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、以下の手順で行なった。
（１）  細胞が入った２５０ｍｌフラスコ（あるいは１０ｃｍシャーレ）から培地を抜き取る。
（２）  １×ＰＢＳ（商品名  １０×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｌａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）  １０ｍｌで１回洗浄する。
（３）  ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）  を培養フラスコ、シャーレの底面積に従って規定量を加え、細胞を溶解させる。
（４）  溶解液にクロロホルムを２０％加えて懸濁させる。
（５）  １０分間室温にて静置する。
（６）  ２，５００ｒｐｍで２０分間遠心。
（７）  水層（上部の透明分画）に  ２−プロパノール１．２ｍｌを加えてよく混合し、１０分間室温にて静置する。
（８）  １５，０００ｒｐｍで１５分間遠心。
（９）  沈澱を８０％エタノールにて洗浄する。
（１０）  ２〜３分間風乾し、トリスバッファー（商品名  Ｂｕｆｆｅｒ  ＥＢ，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，  ｐＨ  ８．５，  ＱＩＡＧＥＮ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を加えて溶解し、ＯＤ２６０ｎｍ値にて濃度を測定する。
【００３０】
ヒトから摘出した癌組織からのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、以下の手順で行なった。手順は試薬メーカーのプロトコールに準じた。抽出方法はこれに限定されるものではなく同様の他法でも代替できる。
【００３１】
操作
生検材料（ファイバースコープによる採取など）や手術摘出した検体の一部はＲＮＡｌａｔｅｒ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）に浸漬した後（摘出後７日まで）、長期に渡る場合は、冷凍保存しておく。
Ａ）．検体のホモジナイズ（Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３００使用）
１．  Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ＭＭ  ３００に、エッペンドルフチューブ（ベータ・メルカプトエタノール混入バッファーに移した上記保存組織とジルコニアビーズが入っている）を装着、２５  １／ｓで１分間破砕を２度繰り返す。
２．上清溶液をＱＩＡ  ｓｈｒｅｄｄｅｒ  カラムにかけ遠心することにより、破砕断片を除去する。
【００３２】
Ｂ）．ＲＮＡ抽出
１．ＱＩＡ  ｓｈｒｅｄｄｅｒ  カラムの下の組織ライセートに、等量（約６００ｍｌ）の７０％エタノールを加えピペッティングを数回行い、よく混合する。
２．用意しておいたＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのミニスピンカラムを用いて、遠心することにより核酸成分を吸着させる。
【００３３】
Ｃ）．ＤＮａｓｅ処理
１．ＲＮＡが吸着したカラム上を、ＲＷ１  Ｂｕｆｆｅｒで遠心洗浄する。
２．ＤＮａｓｅ  ｓｔｏｃｋ  １０μｌに対して添付のＲＤＤ  Ｂｕｆｆｅｒ  を７０μｌの割合で希釈し、カラム内に注入する。これは、メンブレン吸着核酸分画にある、不要のＤＮＡ成分のみを酵素分解除去するものである。
３．室温で１５分間静置。
４．再びＲＷ１  Ｂｕｆｆｅｒ  にて遠心洗浄する。
【００３４】
Ｄ）．ＲＮＡ抽出
１．最終洗浄過程として、５００μｌの  ＲＰＥ  Ｂｕｆｆｅｒにてカラム内メンブレン吸着ＲＮＡを遠心洗浄する。
２．遠心洗浄を繰り返す。
３．ＲＮＡ成分のみの抽出のため、  ３０〜５０μｌのトリスバッファーＴｒｉ・Ｃｌ  ＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒにて遠心する。この溶液は、ＯＤ２６０ｎｍ値にて濃度を測定し、使用する時以外−２０度にて保存。
Ｅ）．ＲＮＡの濃度測定
１．ＯＤ２６０ｎｍ値にて濃度を測定する。
【００３５】
本出願に用いるヒト由来細胞・組織などヒト検体については、平成１２年度より、ヒト検体を使用するための倫理規定に基づき、外部評価委員の臨席の下、倫理委員会で実験計画が承認されている。検体供与機関である、東海大学医学部、東京女子医科大学、秋田大学医学部においては、所定の「医の倫理委員会」において、認可・検体の受け入れ・インフォームドコンセントの書式完備・検体使用の詳細についての細則の完備を達成している。ここで、ブラディオン遺伝子は胎児期に発現せず、発生・分化期の異常とは異なり、遺伝疾患へのリンクとは考えにくいこと、後天的に病変部・癌細胞においてのみ生じる変化であること等が示されており、倫理規定やプライバシーの保護という観点から問題にならないことが指摘されている。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲは  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、サーマルサイクラーは  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。反応液組成および反応温度条件は以下の通りである。
2004166593.tif 000006
【００３７】
2004166593.tif 000007
【００３８】
ＰＣＲ反応液は、ＧｅｎｅＧｅｌ  Ｅｘｃｅｌ  １２．５／２４  Ｋｉｔ（アマシャム・バイオサイエンス社）を用い、電気泳動に供し、増幅したフラグメントの検知（無機銀染色）により効果判定を施した。
培養癌細胞株より抽出したＲＮＡを鋳型として用い、定性ＰＣＲを行なったときの各プライマーセットの反応性の結果を表３にまとめる。ブラディオン遺伝子は、大腸癌、前立腺癌、腎細胞癌では発現するが、その他の細胞では発現が認められない。プライマー・セットＮｏ．１〜６を使用した場合は良好な結果が得られたが、プライマー・セットＮｏ．７〜８は、擬陰性が生じるものがあった。合成したプライマー・セットのうち、培養癌細胞由来のＲＮＡで擬陽性、擬陰性が生じたものは、使用に不適と判断した。
【００３９】
【表３】
2004166593.tif 000008
【００４０】
実施例２
ブラディオン遺伝子の発現の定量測定
実施例１に示すごとく、ヒト癌培養細胞にてブラディオンの定性検出がその特性を示す良い指標になることが示されたため、さらに、再現性があり、数値化可能な検定方法を開発した。ここで、リアルタイム定量ＰＣＲ反応に使用するプライマー・セット（上流プライマーと下流プライマー）およびプローブをブラディオン遺伝子配列をもとに設計し、合成した。合成は、グライナー・ジャパン社の受託合成サービスに依頼しＨＰＬＣ精製グレードとした。プローブは、アクセプター・プローブとしてオリゴヌクレオチドの５’末端をＣｙ５標識したものとドナー・プローブとして３’末端をＦＡＭ標識したもの、２種類を合成した。
多数のプライマー・プローブの合成を行なったが、そのうち３例のプライマーおよびプローブの配列を下表に示す。
【００４１】
【表４】
2004166593.tif 000009
【００４２】
上記配列ｅ〜ｍは次のとおりである。
2004166593.tif 000010
【００４３】
癌細胞株は、実施例１の定性ＰＣＲに使用したものと同じヒト癌培養細胞株を使用した。
癌細胞株またはヒト患者検体からの全ＲＮＡの抽出は、定性ＰＣＲと同様にＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い抽出した。抽出方法はこれに限定されるものではなく同様の他法でも代替できる。
ヒト摘出癌組織からのＲＮＡ抽出は、実施例１の定性ＰＣＲと同様にＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い行なった。手順は試薬メーカーのプロトコールに準じた。
【００４４】
定量ＰＣＲでは、測定時に検量線を作成する必要があるため濃度既知の標準溶液を準備した。ブラディオン遺伝子をベクタープラスミドｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングしたＤＮＡを用い、１０６ないし１０２コピー／μＬになるように希釈系列を作製した。
また、内部標準物質のハウスキーピング・ジーンを同時に測定するため、ハウスキーピング・ジーンＲＰＬ１０遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）にクローニングしたＤＮＡを用い、１０９ないし１０５コピー／μＬになるように希釈系列を作製した。
リアルタイム定量ＰＣＲは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を試薬として用い、Ｒｏｔｏｒ−ｇｅｎｅ  ２０００  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）で反応を行なった。また、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた場合も同様の結果が得られた。反応液組成および反応温度条件は以下の通りである。
【００４５】
2004166593.tif 000011
【００４６】
2004166593.tif 000012
【００４７】
プライマー・プローブ・セットＮｏ．９を使用した場合は良好な蛍光シグナルが得られ（図１参照）、相関係数が１に近い検量線が得られたが、プライマー・プローブ・セットＮｏ．１０〜１１は良好な蛍光シグナルが得られなかった（図２参照）。そのため、以降の測定はＮｏ．９のみを使用した。
図３にプライマー・プローブ・セットＮｏ．９を使用した場合の検量線を示した。Ｘ軸にブラディオン遺伝子コピー数の常用対数、Ｙ軸に閾値サイクル数をとりプロットした。ＸとＹには直線関係が成り立つため検体の閾値サイクル数を測定することで検体中のブラディオン遺伝子量を測定することができる。
【００４８】
表５に大腸癌細胞株ＳＷ４８０におけるハウスキーピング・ジーンおよびブラディオン遺伝子発現量の測定結果を示す。安定した値が得られ、ハウスキーピング・ジーンが１０８コピー／μｇＲＮＡオーダー、ブラディオン遺伝子が１０５コピー／μｇＲＮＡオーダーであった。
【００４９】
【表５】
2004166593.tif 000013
【００５０】
図４に患者検体における検定結果を示した。
表６に各膀胱癌患者検体の進行度とブラディオン遺伝子発現量の関係を示した。
【００５１】
【表６】
2004166593.tif 000014
【００５２】
表５より大腸癌細胞株  ＳＷ４８０  においてブラディオン遺伝子の発現量が１０５コピー／μｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡオーダーとなったことが判る。一方、ヒト検体における測定値は細胞株と同等の高値を示した（図４参照）。大腸癌細胞株はその１００％が癌細胞であるが、ヒトより摘出した検体は正常細胞が混在している。つまり、癌細胞の存在率が１００％以下にも係わらず、１０３コピー以上の値がコンスタントに得られるところに本発明の優位性がある。
また、癌の進行度とブラディオン発現量には正の相関関係があるために、検体中のブラディオン遺伝子発現量の測定値より進行度を推定することが可能であり、進行度判定の有効な手段となる。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２において、プライマー・プローブ・セットＮｏ．９を使用したときの、サイクル数と蛍光シグナルの関係を表すグラフである。
【図２】実施例２において、プライマー・プローブ・セットＮｏ．１０〜１１で、良好な蛍光シグナルが得られなかったことを表すグラフである。
【図３】実施例２において、プライマー・プローブ・セットＮｏ．９を使用した場合の検量線を示す。
【図４】実施例２における患者検体のブラディオン遺伝子発現量を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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