(57)【要約】      （修正有）【課題】側根を形成しない植物の形質に影響を及ぼし、側根形成を人為的に制御可能にすることが期待される因子を提供すること。【解決手段】イロイヌナズナゲノム由来の特定なアミノ酸配列を有するタンパク質であって、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質、および前記タンパク質をコードする遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体に変異原処理を行ない、変異原処理したｓｌｒ優性変異体の次世代の中から、ｓｌｒ優性変異体の有する形質を保持し側根形成を行なう個体を選抜することにより得られる、配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有するシロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ。
【請求項２】
側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に更に変異を有することにより側根形成能力を回復させた、シロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ。
【請求項３】
側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される一の変異をＳＳＬ２ゲノム遺伝子に更に有することにより側根形成能力を回復させた、シロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ。
（Ａ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の８５２番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｂ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の４７３４番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｃ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１７５７番目の塩基ＧがＡに置換した変異；および
（Ｄ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１５４６番目の塩基ＧがＡに置換した変異。
【請求項４】
配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の一以上の塩基に変異を有する変異遺伝子であって、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能な変異遺伝子。
【請求項５】
配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有する変異遺伝子であって、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能な変異遺伝子。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される、ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の変異遺伝子：
（ａ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の５６６番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の１００５番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；および
（ｃ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の９０１番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。
【請求項７】
以下の（ｄ）〜（ｇ）からなる群より選択される変異遺伝子：
（ｄ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の８５２番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；
（ｅ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の４７３４番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；
（ｆ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１７５７番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；および
（ｇ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１５４６番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。
【請求項８】
以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
【請求項１０】
以下の（ｃ）または（ｄ）の何れかの遺伝子。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、側根を形成しない植物の形質に影響を及ぼし、側根形成を人為的に制御可能にすることが期待される因子に関する。より具体的に、本発明は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
双子葉植物の根は、胚の幼根が発芽後に伸長して形成される主根とそこから分枝して生じる側根からできている。側根の形成に、植物ホルモンのオーキシンが関与することが知られている。側根の形成におけるオーキシンの働きを調節するタンパク質をコードする遺伝子として、シロイヌナズナのＳＬＲ（ｓｏｌｉｔａｒｙ  ｒｏｏｔ）遺伝子が公知である。また、このＳＬＲ遺伝子に変異を有し、側根を全く形成しないシロイヌナズナとして、ｓｏｌｉｔａｒｙ−ｒｏｏｔ優性変異体（ｓｌｒ優性変異体）が公知である（Ｆｕｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２００２，  ２９，  １５３−１６８（非特許文献１））。しかし、このｓｌｒ優性変異体の有する側根欠失表現型に影響を及ぼし、側根形成を人為的に制御可能にすることが期待される因子について、これまで報告されたことはない。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｆｕｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２００２，  ２９，  １５３−１６８
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、側根を形成しない植物の形質に影響を及ぼし、側根形成を人為的に制御可能にすることが期待される因子を提供することを目的とする。より具体的に、本発明は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質とそれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を提供する。
【０００６】
（１）  側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体に変異原処理を行ない、変異原処理したｓｌｒ優性変異体の次世代の中から、ｓｌｒ優性変異体の有する形質を保持し側根形成を行なう個体を選抜することにより得られる、配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有するシロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ。
（２）  側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に更に変異を有することにより側根形成能力を回復させた、シロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ。
（３）  側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される一の変異をＳＳＬ２ゲノム遺伝子に更に有することにより側根形成能力を回復させた、シロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ。
（Ａ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の８５２番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｂ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の４７３４番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｃ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１７５７番目の塩基ＧがＡに置換した変異；および
（Ｄ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１５４６番目の塩基ＧがＡに置換した変異。
【０００７】
（４）  配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の一以上の塩基に変異を有する変異遺伝子であって、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能な変異遺伝子。
（５）  配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有する変異遺伝子であって、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能な変異遺伝子。
（６）  以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される、ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の変異遺伝子：
（ａ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の５６６番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の１００５番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；および
（ｃ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の９０１番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。
（７）  以下の（ｄ）〜（ｇ）からなる群より選択される変異遺伝子：
（ｄ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の８５２番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；
（ｅ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の４７３４番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；
（ｆ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１７５７番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子；および
（ｇ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１５４６番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。
【０００８】
（８）  以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
（９）  以下の（ａ）または（ｂ）の何れかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質。
（１０）  以下の（ｃ）または（ｄ）の何れかの遺伝子。
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の記載は本発明を説明するためのものであって本発明を限定するためのものではない。
【００１０】
［シロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ］
本発明のシロイヌナズナ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ（以下、二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒともいう）は、側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体に変異原処理を行ない、変異原処理したｓｌｒ優性変異体の次世代の中から、ｓｌｒ優性変異体の有する形質を保持し側根形成を行なう個体を選抜することにより得られる、配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）に変異を有する二重変異体である。
別の側面に従えば、本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒは、側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）に更に変異を有することにより側根形成能力を回復させた二重変異体である。
【００１１】
具体的に、本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒには、側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、後述の「ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の変異遺伝子」を有することにより側根形成能力を回復させた二重変異体が含まれる。
一例を挙げれば、本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒは、側根を形成しないシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択される一の変異をＳＳＬ２ゲノム遺伝子に更に有することにより側根形成能力を回復させた二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒである。
（Ａ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の８５２番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｂ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の４７３４番目の塩基ＧがＡに置換した変異；
（Ｃ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１７５７番目の塩基ＧがＡに置換した変異；および
（Ｄ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１５４６番目の塩基ＧがＡに置換した変異。
【００１２】
本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒの作製に使用されるシロイヌナズナｓｌｒ優性変異体（以下、ｓｌｒ優性変異体ともいう）は、側根を全く形成しない変異体である。ｓｌｒ優性変異体は、根毛形成がほとんど起こらず、また根や胚軸の重力屈性が異常であるという性質を有する。ｓｌｒ優性変異体の原因遺伝子、即ちＳＬＲ変異遺伝子を、以下「ＩＡＡ１４変異遺伝子」と称する。
【００１３】
ｓｌｒ優性変異体の種子は、２００３年５月２２日に、ブダペスト上の国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、「ｓｏｌｉｔａｒｙ−ｒｏｏｔ−１  （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）」という名称で国際寄託され、受託番号「ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３８５」が付与された。ｓｌｒ優性変異体は、ｓｌｒ優性変異体を自家受粉し、側根を形成しない個体を選抜することにより、繁殖させることができる。
【００１４】
二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒの作製は、まず、ｓｌｒ優性変異体に変異原処理を施す。変異原処理を施すｓｌｒ優性変異体として、種子、植物体、カルス等を用いることができる。本発明において変異原処理は、公知の手法を用いることができ、変異原として、ＤＮＡの塩基をアルキル化するアルキル化剤等の化学的変異原、紫外線、Ｘ線等のＤＮＡ損傷を起こす電磁波、または放射性物質を用いることができる。あるいは、変異原処理は、公知のアグロバクテリウム感染法により、Ｔ−ＤＮＡの両端に存在する一対の２５塩基対の配列に挟まれた領域のＤＮＡを、ｓｌｒ優性変異体のゲノムＤＮＡのランダムな位置に挿入することにより行ってもよい。好ましくは、化学的変異原（例えば、エチルメタンスルホン酸）を０．２〜０．３重量％の濃度で含有する溶液にｓｌｒ優性変異体の種子を１２〜１６時間浸漬することにより、変異原処理を行う。ｓｌｒ優性変異体として種子を用いた場合、その後、ｓｌｒ優性変異体（種子）を植物体へと成長させる。
【００１５】
次いで、変異原処理したｓｌｒ優性変異体（植物体）を自家受粉し、次世代を作製する。作製された次世代の中から、ｓｌｒ優性変異体の有する形質を保持し側根形成を行なう個体（すなわち、変異原処理による変異をホモ接合で有する個体）を選抜する。ここで、「ｓｌｒ優性変異体の有する形質」とは、側根を形成しない性質以外の当該変異体の有する性質をいい、具体的には、根毛形成がほとんど起こらず、また根や胚軸の重力屈性が異常である性質をいう。
【００１６】
この段階で選抜された個体は、ｓｌｒ優性変異体の側根欠失表現型を抑圧する変異体であるが、この変異体の中には、ｓｌｒ優性変異体の原因遺伝子（ＩＡＡ１４変異遺伝子）領域内に更に変異が生じた「遺伝子内サプレッサー変異体」と、ｓｌｒ優性変異体の原因遺伝子（ＩＡＡ１４変異遺伝子）以外の領域に変異が生じた「遺伝子外サプレッサー変異体」とが含まれる可能性がある。そのため、選抜された個体が、ＩＡＡ１４変異遺伝子の領域内に更に変異を有していない個体であることを確認することが好ましい。この確認についての詳細は、後述の実施例の記載を参照することができ、ＩＡＡ１４変異遺伝子の配列情報は、配列番号４および図８から入手可能である。図８中、エキソン部分は大文字で表示し、イントロン部分は小文字で表示する。
【００１７】
このようにして選抜された個体が、本発明の「二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ」である。本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒは、ｓｌｒ優性変異とｓｓｌ２劣性変異を有する二重変異体である。本発明では、二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒとして４種類の系統（ｓｓｌ２−１、ｓｓｌ２−２、ｓｓｌ２−３、ｓｓｌ２−４）が選抜された。４種類の系統はすべて、同一の遺伝子（以下、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子ともいう）の領域内に変異を有する個体であることが見出された。
【００１８】
従って、本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒの作製は、以下に記載のとおり再現可能である。すなわち、変異原処理したｓｌｒ優性変異体のなかから側根形成を行う個体を選抜し、選抜された個体が、ＩＡＡ１４変異遺伝子の領域内に更に変異を有していないことを確認し、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子内の塩基配列に変異を有することを確認する。なお、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子内の変異を確認する手法については、後述の実施例の記載を参照することができる。
【００１９】
本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒは何れも、ｓｌｒ優性変異体の側根欠失表現型が一部回復し、側根を形成するが、ｓｌｒ優性変異体の他の表現型（根毛形成異常および重力屈性異常）の回復はみられない。このことから、本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒにおいて変異を起こした遺伝子（ＳＳＬ２ゲノム遺伝子）は、ｓｌｒ優性変異体の原因遺伝子（ＩＡＡ１４変異遺伝子）と遺伝的に相互作用すると考えられる。
【００２０】
［ＳＳＬ２遺伝子およびＳＳＬ２遺伝子によりコードされるタンパク質］
本発明の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒにおいて変異を起こした遺伝子（ＳＳＬ２ゲノム遺伝子）は、シロイヌナズナの突然変異マップベースクローニング法により、Ａｔ２ｇ２５１７０遺伝子であると同定された。Ａｔ２ｇ２５１７０遺伝子の遺伝子情報は、以下のホームページから入手できる：ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｇｓｆ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｊ／ｔｈａｌ／ｓｅａｒｃｈ＿ｇｅｎｅ？ｃｏｄｅ＝Ａｔ２ｇ２５１７０。ただし、本願出願時にこのホームページから入手できる情報は、塩基配列としては正しいが、エキソン、イントロンの情報に誤りを有していることが本発明において確認された。すなわち、本発明者らは、二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒにおいて変異を起こしたＳＳＬ２遺伝子のｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を確認し、更に、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子のエキソン、イントロン構造を明らかにした（図１〜７）。
【００２１】
ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列を配列番号１に示し、ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。何れの塩基配列も、変異を有していないものを表示する。また、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の塩基配列（配列番号３）を図１〜７に示し、図中、エキソン部分は大文字で表示し、イントロン部分は小文字で表示する。
【００２２】
ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の変異により、ｓｌｒ優性変異体は側根を形成するようになる。言い換えると、ｓｌｒ優性変異体において側根形成を阻害する突然変異を維持するためには、正常なＳＳＬ２遺伝子が必要である。従って、ＳＳＬ２遺伝子は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが本発明において初めて見出された。
【００２３】
従って、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列を有する遺伝子であって、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードしている限り、配列番号１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００２４】
また、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質であって、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質をコードしている限り、該タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００２５】
更に本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質を提供する。前記タンパク質は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有する限り、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。
【００２６】
更に、本発明において、ＳＳＬ２遺伝子は、染色体のクロマチン構造変換に関わる動物のＣｈｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ−ｈｅｌｉｃａｓｅ−ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ３（ＣＨＤ３）タンパク質と相同性のあるタンパク質をコードしていることが見出された。側根形成とクロマチン構造変換との関係は、従来研究されておらず、本発明により初めて、クロマチン構造変換が側根形成に関わることが示唆された。
【００２７】
［ＳＳＬ２遺伝子の変異遺伝子］
本発明の「ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の変異遺伝子」は、配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の一以上の塩基に変異を有する変異遺伝子であって、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能な変異遺伝子である。
【００２８】
本発明において変異とは、例えば、少なくとも一の塩基の置換、欠失、付加を意味し、当該変異は、側根形成を阻害する突然変異体の表現型に影響を及ぼす。すなわち、このような変異を有する本発明の変異遺伝子は、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能である。
【００２９】
具体的に、本発明の「ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の変異遺伝子」には、以下のものが含まれる。ただし、本発明の「ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の変異遺伝子」は、以下の具体例に限定されない。
１）ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、アミノ酸を指定していたコドンが終止コドンに置換した変異遺伝子。
２）ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、あるアミノ酸を指定するコドンが別のアミノ酸を指定するコドンに置換した変異遺伝子。
【００３０】
より具体的に、本発明において選抜された二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒが有する「ＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の変異遺伝子」は以下のとおりである。なお、変異遺伝子（ａ）〜（ｃ）は、それぞれ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒの系統ｓｓｌ２−１、ｓｓｌ２−３、ｓｓｌ２−４に由来するものである。
（ａ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の５６６番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。この変異により、配列番号２の１８９番目のトリプトファン（ＴＧＧ）が終止コドン（ＴＡＧ）に置換される。
（ｂ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の１００５番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。この変異により、配列番号２の３３５番目のトリプトファン（ＴＧＧ）が終止コドン（ＴＡＧ）に置換される。
（ｃ）配列番号１に記載のＳＳＬ２遺伝子（ｃＤＮＡ）の９０１番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。この変異により、配列番号２の３０１番目のグリシン（ＧＧＡ）がアスパラギン（ＡＧＡ）に置換される。
【００３１】
また、本発明の「ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の変異遺伝子」は、配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の一以上の塩基に変異を有する変異遺伝子であって、該変異遺伝子の発現により、側根形成を阻害する突然変異体の表現型を回復させることが可能な変異遺伝子である。
【００３２】
具体的に、本発明の「ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の変異遺伝子」には、以下のものが含まれる。ただし、本発明の「ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の変異遺伝子」は、以下の具体例に限定されない。
３）ＳＳＬ２ゲノム遺伝子のエキソン部分の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、アミノ酸を指定していたコドンが終止コドンに置換した変異遺伝子。
４）ＳＳＬ２ゲノム遺伝子のエキソン部分の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、あるアミノ酸を指定するコドンが別のアミノ酸を指定するコドンに置換した変異遺伝子。
５）ＳＳＬ２ゲノム遺伝子のスプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ）の一以上の塩基（例えば１ないし数個の塩基）が他の塩基に置換することにより、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子のイントロンが正常に切除されない変異遺伝子。ここでスプライス部位とは、エキソンとイントロンの境界部位、すなわち、スプライシング反応においてイントロンの切除とその前後のエキソンの再結合が行われる部位であって、当該部位の塩基の置換が、スプライシング反応に支障をきたす部位を指す。具体的に、スプライス部位には、イントロンの５’端に位置するスプライス供与部位（ｄｏｎｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ）およびイントロンの３’端に位置するスプライス受容部位（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｔｅ）が含まれる。スプライス部位として、例えば、イントロンの５’端に位置する保存された塩基配列「ｇｔ」およびイントロンの３’端に位置する保存された塩基配列「ａｇ」が挙げられる。
【００３３】
より具体的に、本発明において選抜された二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒが有する「ＳＳＬ２ゲノム遺伝子の変異遺伝子」は以下のとおりである。なお、変異遺伝子（ｄ）〜（ｇ）は、それぞれ二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒの系統ｓｓｌ２−１、ｓｓｌ２−２、ｓｓｌ２−３、ｓｓｌ２−４に由来するものである。
（ｄ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の８５２番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。このＳＳＬ２ゲノム遺伝子のエキソン部分の変異により、配列番号２の１８９番目のトリプトファン（ＴＧＧ）が終止コドン（ＴＡＧ）に置換される。
（ｅ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の４７３４番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。このＳＳＬ２ゲノム遺伝子のスプライス部位の変異により、ＳＳＬ２ゲノム遺伝子のイントロンが正常に切除されず、正常なｍＲＮＡがつくられない。
（ｆ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１７５７番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。このＳＳＬ２ゲノム遺伝子のエキソン部分の変異により、配列番号２の３３５番目のトリプトファン（ＴＧＧ）が終止コドン（ＴＡＧ）に置換される。
（ｇ）配列番号３に記載のＳＳＬ２ゲノム遺伝子の１５４６番目の塩基ＧがＡに置換した変異遺伝子。このＳＳＬ２ゲノム遺伝子のエキソン部分の変異により、配列番号２の３０１番目のグリシン（ＧＧＡ）がアスパラギン（ＡＧＡ）に置換される。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３５】
実施例１：ｓｓｌ２劣性変異とｓｌｒ変異を有する二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒの作製
側根を全く形成しないｓｌｒ優性変異体の種子（５千個）を、０．２％  エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）溶液に１６時間浸すことにより、変異原処理を行なった。二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒは、変異原処理した種子（Ｍ１種子）の次世代（３万個体）の中から、ｓｌｒ優性変異を持ちながらも、側根形成を行なう個体として選抜され、その表現型が次世代にも安定に遺伝することが確認された後に、ｓｓｌ２  ｓｌｒと名付けた。本実施例では、４系統の二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ（ｓｓｌ２−１、ｓｓｌ２−２、ｓｓｌ２−３、ｓｓｌ２−４）を選抜した。
【００３６】
更に、二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒのゲノムＤＮＡが、ｓｌｒ優性変異体の原因遺伝子（ＩＡＡ１４変異遺伝子）領域内に別の変異（本来のｓｌｒ優性変異以外の変異）を有していないことを塩基配列から確認した。この確認は、以下に示すプライマーを用いて、ＩＡＡ１４変異遺伝子を含むゲノム領域を増幅することにより行った。ＩＡＡ１４変異遺伝子を含むゲノム領域（１４７６  ｂｐ）を増幅するためのＰＣＲプライマー配列を以下に記載する。
ＩＡＡ１４−Ｆ１：  ５−ＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＡＧＡＣＡＴＡ−３（配列番号５）
ＩＡＡ１４−Ｒ１：  ５−ＡＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＣＴＣＴ−３（配列番号６）
ＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＩＡＡ１４−Ｆ２：  ５−ＴＴＡＴＧＧＣＴＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＣＧ−３（配列番号７）
ＩＡＡ１４−Ｆ３：  ５−ＴＡＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣ−３（配列番号８）
【００３７】
また、二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒのゲノムＤＮＡが、ＳＳＬ２遺伝子領域内に変異を有していることを塩基配列から確認した。この確認は、以下に示すプライマーを用いて、ＳＳＬ２遺伝子の領域を増幅することにより行った。すなわち、ＳＳＬ２遺伝子領域の塩基配列を決定するには、ＳＳＬ２遺伝子領域（９３５３  ｂｐ）を７つ（Ａ〜Ｇ）の領域に分けて各ゲノム領域をＰＣＲで増幅し、各ＰＣＲ産物の全塩基配列を決定し、野生型のＳＳＬ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列と比較した。変異が見つかればｓｓｌ２変異体であると考えられる。
【００３８】
各ゲノム領域を増幅するためのＰＣＲプライマー配列は以下に記載する。
・ゲノム領域（Ａ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ１：  ５−ａａｔｔｃｇａｃｔｔｃｔｇｇｇｔａｃｔｃａ−３（配列番号９）
ＳＳＬ２−Ｒ１：  ５−ＡＡＡＴＴＡＡＧＴＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧ−３（配列番号１０）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＳＳＬ２−Ｆ２：  ５−ａｃｔｃｔｇａａｔｔｔｇｔａｇＡＡＡＧＡＡ−３（配列番号１１）
ＳＳＬ２−Ｆ３：  ５−ＧＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＡ−３（配列番号１２）
・ゲノム領域（Ｂ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ４：  ５−ＡＡＧＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＣ−３（配列番号１３）
ＳＳＬ２−Ｒ２：  ５−ＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＴＡＧＣＡＴＡ−３（配列番号１４）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＳＳＬ２−Ｆ５：  ５−ＣＡＴＣＣＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＧＧＡ−３（配列番号１５）
ＳＳＬ２−Ｆ６：  ５−ＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣ−３（配列番号１６）
・ゲノム領域（Ｃ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ７：  ５−ＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣ−３（配列番号１７）
ＳＳＬ２−Ｒ３：  ５−ＣＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧＣＴＣＧＴＡＣＴＧＣ−３（配列番号１８）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＳＳＬ２−Ｆ８：  ５−ａｔｇｔｇｃｔｇａａａｃｔｇｔｇｔｇｔａｃ−３（配列番号１９）
・ゲノム領域（Ｄ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ９：  ５−ｃｃａｔｔｇｃｔｔｔｔｇｃｔｇａｃｇｃａｔ−３（配列番号２０）
ＳＳＬ２−Ｒ４：  ５−ｔｔｃｇａｔａｇｃｃａａｃｃａｃａｇｔｃｔ−３（配列番号２１）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＳＳＬ２−Ｆ１０：  ５−ｇｇｃａｔｇｃａａｔａｔｇｇｇｔｇｇｃｇｔ−３（配列番号２２）
・ゲノム領域（Ｅ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ１１：  ５−ＴＣＡＧＧＴＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＧＣ−３（配列番号２３）
ＳＳＬ２−Ｒ５：  ５−ＣＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＣＡＡＣ−３（配列番号２４）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＳＳＬ２−Ｆ１２：  ５−ｇｔｇｃａｃａａｔｃｔｔｇｔｃａａａｔｃａ−３（配列番号２５）
ＳＳＬ２−Ｆ１３：  ５−ＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴ−３（配列番号２６）
・ゲノム領域（Ｆ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ１４：  ５−ｔａｔａｃａｔｔｇｇｔｔｔｇｇｔｃｔｇｃｃ−３（配列番号２７）
ＳＳＬ２−Ｒ６：  ５−ＧＴＡＧＧＧＡＴＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡ−３（配列番号２８）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーに加えて以下のプライマーを用いた。
ＳＳＬ２−Ｆ１５：  ５−ｃｃｃｃｇａｔｇｃａｔｃｔａａａｔｔａｔｃ−３（配列番号２９）
ＳＳＬ２−Ｆ１６：  ５−ＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＡＡＧｇｔｇａｇ−３（配列番号３０）
・ゲノム領域（Ｇ）を増幅するＰＣＲプライマー配列
ＳＳＬ２−Ｆ１７：  ５−ＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴＴＧ−３（配列番号３１）
ＳＳＬ２−Ｒ７：  ５−ｃｇｇａｃｔｔｃａｔｃｇａａｃｃｔａｔｔｃ−３（配列番号３２）
このＰＣＲ産物の全塩基配列を決定するためには、上記２つのプライマーを用いた。
【００３９】
実施例２：ＳＳＬ２遺伝子の単離
実施例１で作製されたｓｓｌ２劣性変異とｓｌｒ変異を有する二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒ（エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）と野生型（エコタイプＬａｎｄｓｂｅｒｇ  ｅｒｅｃｔａ）とを交配させて得たＦ１世代の次世代Ｆ２個体のゲノムＤＮＡを用いて、シロイヌナズナのゲノム情報に基づく詳細なＳＳＬ２遺伝子座のマッピングを行ない、ｓｓｌ２劣性変異が第２染色体の遺伝子Ａｔ２ｇ２５１４０からＡｔ２ｇ２５３００までの１７遺伝子を含むゲノム領域にあることを突き止めた。
【００４０】
次に、独立に単離した４系統のｓｓｌ２劣性変異体（ｓｓｌ２−１，  ｓｓｌ２−２，  ｓｓｌ２−３，  ｓｓｌ２−４）のゲノムＤＮＡを用いて、これらの１７個の候補遺伝子の塩基配列を確認したところ、４系統のｓｓｌ２劣性変異体すべてにおいてＡｔ２ｇ２５１７０遺伝子にコードされるタンパク質の機能を喪失させると思われる突然変異が発見された。このことからＳＳＬ２遺伝子がＡｔ２ｇ２５１７０遺伝子であることを同定した。
【００４１】
実施例３：ＳＳＬ２遺伝子が側根形成の阻害に関与していることを確認した実験
ｓｌｒ優性変異体はオーキシン誘導性タンパク質をコードするＩＡＡ１４の機能獲得変異体であり、通常の寒天培地における生育条件下において側根形成が完全に阻害される。しかし、今回発見したｓｓｌ２劣性変異とｓｌｒ変異を有する二重変異体ｓｓｌ２  ｓｌｒは、同じ条件において野生型ほどではないが、側根形成を行なった。この結果から、ｓｌｒ変異体において観察される側根形成阻害には、正常なＳＳＬ２遺伝子が必要なことが示された。
【００４２】
【発明の効果】
以上説明したとおり、本発明は、側根形成を阻害する突然変異を維持する機能を有するタンパク質とそれをコードするＳＳＬ２遺伝子を提供する。また、本発明者らは、本発明のＳＳＬ２遺伝子の機能がｓｌｒ優性変異体で失われると、ｓｌｒ優性変異体は、側根を全く形成しない性質を失い、側根を形成するようになることを新たに見出した。これにより、ＳＳＬ２遺伝子によりコードされるタンパク質は、植物の根の形成、特に側根形成の新たな調節因子と考えられる。従って、このタンパク質の機能を改変させることにより、植物の根の成長を人為的に制御可能にすることが期待される。すなわち、さまざまな植物においてＳＳＬ２相同遺伝子の機能を改変させることにより、側根や不定根が形成されにくい草本や樹木から根の形成を促進させることが期待される。
【００４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列を示す図。
【図２】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列（図１のつづき）を示す図。
【図３】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列（図２のつづき）を示す図。
【図４】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列（図３のつづき）を示す図。
【図５】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列（図４のつづき）を示す図。
【図６】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列（図５のつづき）を示す図。
【図７】ＳＳＬ２ゲノム遺伝子（野生型）の塩基配列（図６のつづき）を示す図。
【図８】ＩＡＡ１４変異遺伝子の塩基配列を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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