(57)【要約】【課題】糖化ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを選択的に測定する為のプロテアーゼを含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬、方法を大量、安価に提供する。【解決手段】糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりもβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸若しくは糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを糖化ヘモグロビンに作用させ、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸若しくはペプチドを遊離し、生成した糖化アミノ酸及び／または糖化ペプチドを定量する。【効果】糖化ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを選択的に測定する為のプロテアーゼを含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬、方法を提供する事が可能になる。【選択図】    選択図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりもβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬。
【請求項２】
糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを実質的に生じないプロテアーゼを含有することを特徴とする請求項１記載の試薬。
【請求項３】
糖化アミノ酸が糖化バリンであり、プロテアーゼが豚腎臓（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来であることを特徴とする請求項項１及び２に記載の試薬。
【請求項４】
プロテアーゼがロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ，  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ）、アミノペプチダーゼＴ（ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５、Ｇ３０、であることを特徴とする請求項１〜３に記載の試薬。
【請求項５】
α鎖Ｎ末端の糖化ペプチドが糖化バリルロイシンであり、β鎖Ｎ末端の糖化ペプチドが糖化バリルヒスチジンであり、プロテアーゼがアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来であることを特徴とする請求項１及び２に記載の試薬。
【請求項６】
プロテアーゼがプロテアーゼＰ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＫ“アマノ”（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）であることを特徴とする請求項１、２及び５に記載の試薬。
【請求項７】
糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いることを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項８】
糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを実質的に生じなプロテアーゼを用いることを特徴とする請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬及び方法に関し、ヘモグロビンＡ１ｃの定義であるβ鎖Ｎ末端が糖化されたヘモグロビンのみを測定することが出来る試薬及び測定方法に関する。さらに、血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃを酵素を用いて正確、簡便、迅速に定量する目的に有用な糖化ヘモグロビンの測定試薬及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病の診断及び管理を行う上で糖化蛋白質の測定は非常に重要であり、中でもヘモグロビンＡ１ｃは近年の研究により７％以下に値を管理すれば合併症の発症および進展の危険率を優位に低下させることが証明され、臨床の現場では無くてはならない指標として多用されている。ヘモグロビンＡ１ｃの定量法としては、通常電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィ法、免疫法及び酵素法が知られている。しかしながら前記電気泳動法、クロマトグラフィー法は高価な専用装置を必要とし、また処理スピードが遅く、多数の検体を処理する臨床検査には適していない。また前記免疫法は分析方法が比較的簡単で時間も短時間で済むことから近年急速に広まってきたが、抗原抗体反応を用いる為に、再現性や共存物質の影響の点で必ずしも精度が良くない点が問題となっている。
【０００３】
専用装置が不必要であり、処理スピードが速く、高精度、簡便、安価な定量方法としては酵素法が知られている（特許文献１、２）。ヘモグロビンＡ１ｃの定義は、へモグロビンβ鎖Ｎ末端のアミノ酸が糖化されたヘモグロビンであるから、酵素を用いてヘモグロビンＡ１ｃの測定を行う場合、βＮ末端のアミノ酸が糖化されたヘモグロビンからＮ末端の糖化アミノ酸若しくはＮ末端の糖化アミノ酸を含むペプチドを遊離し定量しなくてはならない。
【０００４】
一般的にヘモグロビンの糖化部位はβ鎖アミノ基が約６０％  、α鎖アミノ基が約４０％糖化されていると考えられている。加えて蛋白質のＮ末端が糖化を受け、ふさがれている蛋白質はプロテアーゼに対し耐性である。そのようなプロテアーゼ耐性である糖化アミノ酸残基を加水分解できる酵素（特許文献３〜５）及び方法（特許文献６）も知られている。
【０００５】
但しこれらの酵素はヘモグロビンにプロテアーゼ作用させ、糖化アミノ酸を遊離する方法であり、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端の糖化アミノ酸のみを測定できるかどうかは記載がない。
【特許文献１】
特開平８−３３６３８６号公報
【特許文献２】
ＷＯ９７／１３８７２
【特許文献３】
特開２００１−５７８９７号公報
【特許文献４】
ＷＯ００／５０５７９
【特許文献５】
ＷＯ００／６１７３２
【特許文献６】
特開２０００−３００２９４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬及び方法を提供することにあり、臨床生化学検査、特にヘモグロビンＡ１ｃの測定に有用なプロテアーゼを用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、測定用試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するためには、ヘモグロビン糖化物をα鎖、β鎖に分けこれを基質として、β鎖から選択的にＮ末端の糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドを生成するプロテアーゼを探せばよい。しかしながら、天然に存在するヘモグロビン糖化物の糖化割合は約５％程度と糖化率が低いことから収率が極めて悪かった。さらに、これらの物質を基質として用い、糖化アミノ酸に作用する酵素を用いてプロテアーゼ活性を検出するには、ヘモグロビン本来の真っ赤な色から検出も困難であった。
【０００８】
そこで我々は鋭意検討の結果、糖化ヘモグロビンのＮ末端に存在する糖化ペプチドを合成し、糖化ヘモグロビンからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、糖化ヘモグロビンからβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼをスクリーニングする方法を考案した。
【０００９】
しかしながらこれらの基質を用いて確認した結果、意外にもこれまで糖化ヘモグロビンに作用が確認されているプロテアーゼはほとんどが作用を示さないことから、従来のプロテアーゼは分子内のε位の糖化を測定しているものと思われた。さらに、糖化ヘモグロビンのα位の糖化アミノ酸を切り出す酵素も知られているが、これらの酵素もほとんどが、α鎖とβ鎖のＮ端の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドをどちらも良く切り出すものであった。
【００１０】
そこで本発明者らはこれらの合成基質を用い幅広く自然界や市販のプロテアーゼからスクリーニングを行った結果、糖化アミノ酸が糖化バリンである場合には、ブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｍａｇａｓａｋｉｎａｓｅ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ）、アミノペプチダーゼＴ（  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｇ３０（ｃａｓｅｉ）等に、またα鎖Ｎ末端の糖化ペプチドが糖化バリルロイシンであり、β鎖Ｎ末端の糖化ペプチドが糖化バリルヒスチジンである場合には、プロテアーゼＰ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）、プロテアーゼＫ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ；プロテアーゼＭ“アマノ”）等に糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼの活性があることを見出した。
【００１１】
さらに、またこれらのプロテアーゼ反応液にケトアミンオキシダーゼ等の糖化アミノ酸に作用する酵素を作用させることにより再現性良く、精度良くかつ簡便にヘモグロビンＡ１ｃが測定できることを見出し本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、
１）  糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬。
【００１２】
２）  糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを実質的に生じないプロテアーゼを含有することを特徴とする１）記載の試薬。
【００１３】
３）  糖化アミノ酸が糖化バリンであり、プロテアーゼが豚腎臓（ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来であることを特徴とする１）及び２）に記載の試薬。
【００１４】
４）  プロテアーゼがロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ，  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ）、アミノペプチダーゼＴ（ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５、Ｇ３０、であることを特徴とする１）〜３）に記載の試薬。
【００１５】
５）  α鎖Ｎ末端の糖化ペプチドが糖化バリルロイシンであり、β鎖Ｎ末端の糖化ペプチドが糖化バリルヒスチジンであり、プロテアーゼがアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来であることを特徴とする１）及び２）に記載の試薬。
【００１６】
６）  プロテアーゼがプロテアーゼＰ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＫ“アマノ”（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）であることを特徴とする１）、２）及び５）に記載の試薬。
【００１７】
７）  糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いることを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【００１８】
８）  糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを実質的に生じなプロテアーゼを用いることを特徴とする７）記載の方法。
【００１９】
また、本発明は、特に血液試料中のヘモグロビンＡ１ｃを酵素を用いて正確、簡便、迅速、安価に定量する目的において有用なプロテアーゼ、測定方法、試薬に関する。
【００２０】
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
【００２１】
＜アマドリ化合物＞
本発明に於けるアマドリ化合物とは、タンパク質等のアミノ基をもつ化合物とグルコース等のアルデヒド基を持つ化合物がメイラード反応により、生じる下記の一般式（１）−（ＣＯ）−ＣＨＲ−ＮＨ−（Ｒは、水素原子か水酸基を示す）で表されるケトアミン構造を有する化合物のことを指す。アマドリ化合物には糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンのような糖化タンパク質やペプチドが糖化された糖化ペプチド等が含まれる。
【００２２】
＜糖化ヘモグロビン＞
ヘモグロビンがメイラード反応により糖化されたアマドリ化合物のことを指し、α鎖及びβ鎖Ｎ末端のバリンや分子内のリジンのε位が糖化されていると言われている。糖化ヘモグロビンのフラグメントとはその一部を指し、本発明に於いてはβ鎖Ｎ末端の糖化部位を含むペプチドのことを言う。
【００２３】
＜ヘモグロビンＡ１ｃ＞
糖化ヘモグロビンのうちヘモグロビンβ鎖Ｎ末端のバリンが糖化された分子を指し、安定なアマドリ化合物である。ヘモグロビンＡ１ｃには、アマドリ転移する前のシッフベースである不安定型ヘモグロビンは含まれない。
本発明に使用しうる、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼとは、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントのβ鎖Ｎ末端糖化部位付近に作用し、Ｎ末端の糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドを切り出すことが出来るプロテアーゼであり、かつ、糖化ヘモグロビβ鎖若しくはそのフラグメントへの作用が、糖化ヘモグロビンα鎖への作用よりも大きいプロテアーゼであればいかなるプロテアーゼを用いても良い。
【００２４】
尚本発明に於ける、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸またはペプチドを生じる作用の方が大きいかどうかについては以下の方法で測定できる。
生成物が糖化アミノ酸の場合、後述する合成基質１デオキシフルクトシルバリルヒスチジン及び１デオキシフルクトシルバリルロイシンを基質として、生じる１デオキシフルクトシルバリンをケトアミン構造を認識する酵素を用いて検出することにより測定することができる。
【００２５】
一方生成物が糖化ペプチドの場合、後述する合成基質１デオキシフルクトシルバリルヒスチジルパラニトロアニリド及び１デオキシフルクトシルバリルロイシルパラニトロアニリドを基質として、生じるパラニトロアニリンの黄色を４０５ｎｍ付近の吸収を検出することで測定することができる。
糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドとは、好ましくは最終的にケトアミン構造を認識する酵素にて検出できる長さの糖化アミノ酸又は糖化ペプチドが好ましく、該糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドを生じさせる過程で本発明のプロテアーゼが使用される。
【００２６】
好ましいプロテアーゼの例を具体的に以下に挙げるが、これは１例に過ぎない。ブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼにはサイトゾル由来のものと、ミクロソーム由来のものが知られているがどちらを用いても良い。）、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）以上シグマ社製、Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  タカラ社製）、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｍａｇａｓａｋｉｎａｓｅ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）以上ナガセケムテックス社製、プロテアーゼＰ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）、プロテアーゼＫ“アマノ”（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）以上アマノエンザイム株式会社製、高純度プロテアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来中性プロテアーゼ、合同酒精株式会社製）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ    ＰＩＥＲＣＥ社製）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ＩＦＯ３９５３）、Ｇ３０（ｃａｓｅｉ、ＩＦＯ１２５２１）アミノペプチダーゼＴ（ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＹＴ−１；ＡＴＣＣ２５１０４    和光純薬社製）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ  新日本化学社製）、等。
【００２７】
尚我々はこれらの酵素溶液中に本発明に使用しうる活性を見出したが、コンタミとして混入しているプロテアーゼである可能性もあり、表示されている名称の酵素ではなくとも、表示されている酵素と同じ溶液中に存在し、本発明に使用しうる活性を有しているプロテアーゼであれば使用することが出来る。
糖化ヘモグロビンα鎖またはそのフラグメントへの作用、若しくは糖化ヘモグロビンβ鎖またはそのフラグメントへの作用は、実際に糖化ヘモグロビンのα鎖、若しくはβ鎖またはそのフラグメントをこれらのプロテアーゼにて切断し、ＨＰＬＣ、電気泳動、ＭＡＳＳ等の公知の方法で、それぞれの基質から生成する糖化アミノ酸若しくは糖化アミノ酸を含むペプチドを確認すればよい。
【００２８】
我々は簡便にこの作用を確認する目的で、糖化ヘモグロビンβ鎖のモデルとして１デオキシフルクトシルバリルヒスチジン（以下ＦＶＨと略する。）、１デオキシフルクトシルバリルヒスチジルパラニトロアニリド（以下ＨＶＨｐＮＡと略する。）を、糖化ヘモグロビンα鎖のモデルとして１デオキシフルクトシルバリルロイシン（以下ＦＶＬと略する。）、１デオキシフルクトシルバリルロイシルパラニトロアニリド（以下ＨＶＬｐＮＡと略する。）をハシバらの方法（Ｈａｓｈｉｂａ  Ｈ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２４：７０，１９７６）を用いて合成、精製した。ＦＶＨ，ＦＶＬを用いた場合のプロテアーゼ活性の確認は生じたＦＶを公知のケトアミンオキシダーゼで測定すればよく、ｐＮＡを含む基質の場合、ｐＮＡの遊離を４０５ｎｍ付近の吸収で測定すればよい。
【００２９】
本発明のプロテアーゼは糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼであるから、前述の方法により、糖化ヘモグロビンα鎖またはそのフラグメントへの作用及び糖化ヘモグロビンβ鎖若しくはそのフラグメントへの作用を確認し、その結果が糖化ヘモグロビンβ鎖若しくはそのフラグメントへの作用が、糖化ヘモグロビンα鎖への作用よりも大きいプロテアーゼであれば良く、好ましくは糖化ヘモグロビンβ鎖若しくはそのフラグメントへの作用が、糖化ヘモグロビンα鎖若しくはそのフラグメントへの作用の２倍以上であり、より好ましくは５倍以上であり、更に好ましくは１０倍以上であり、最も好ましくは実質的に糖化ヘモグロビンα鎖若しくはそのフラグメントへ作用しないプロテアーゼである。
【００３０】
尚実質的に糖化ヘモグロビンα鎖若しくはそのフラグメントへ作用しないプロテアーゼとは、α鎖に対し、β鎖への作用が通常２０倍以上、好ましくは５０倍以上であることを言う。
【００３１】
本発明に於けるプロテアーゼの活性測定は、カゼイン−フォリン法で行った。活性の単位１Ｕは３７℃、１分間に１μｇのチロシンに相当するフォリン試薬の発色を示す酵素量を１Ｕと定義した。
【００３２】
本発明の糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いた糖化ヘモグロビンの測定方法としては、前記のプロテアーゼを用いてヘモグロビンβ鎖Ｎ端の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを選択的に切り出し、除タンパク後糖化アミノ酸、糖化ペプチドの還元能を利用して色素等を発色させて定量しても良く、また好ましくは除タンパクすることなくクロマトグラフィー、抗原抗体反応、酵素反応等の手段を用いて定量しても良く、最も好ましくはケトアミン構造を認識する酵素を用いて定量すれば良い。
【００３３】
本発明に使用できるケトアミン構造を認識する酵素としては、前記プロテアーゼの作用により、切り出されたヘモグロビンβ鎖Ｎ端の糖化アミノ酸又は糖化アミノ酸を含むペプチドに良好に作用する酵素であれば如何なるものを用いても良いが、ヘモグロビンβ鎖Ｎ端の糖化アミノ酸はα位のアミノ基が糖化されたアミノ酸であるから、αアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用し、分子内に存在するεアミノ基が糖化されたアミノ酸には実質的に作用しない酵素が最も好ましい。
【００３４】
酵素の種類としてはオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ及びキナーゼ等が挙げられるが、最も良く研究されており、安価に入手できるオキシダーゼが好ましい。また一般にαアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用しεアミノ基が糖化されたアミノ酸には実質的に作用しないオキシダーゼは安定性が悪いことから、安定性の高いαアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸両方に良く作用するオキシダーゼを用いて測定しても良く、さらに安定性が高いεアミノ基が糖化されたアミノ酸に特異的に作用するオキシダーゼを用いてεアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを消去し、安定性の高いαアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸両方に良く作用するオキシダーゼを用いてαアミノ基が糖化されたアミノ酸のみを測定しても良い。
【００３５】
特異性の点から、最も好ましいケトアミン構造を認識するオキシダーゼの例としては、εアミノ基が糖化されたアミノ酸には作用しないαアミノ基糖化アミノ酸特異的な酵素、例えばフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ）：コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）  属由来（ＦＥＲＭ  Ｐ−８２４５）があげられるが本酵素は４５℃−１０分処理で残存活性１０％以下と安定性が悪く、実使用には好ましくない。一方αアミノ基及びεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸両方に良く作用する酵素であり安定性が高いオキシダーゼとしてはギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）  属（例えばＩＦＯ−６３６５、−４２４２、−５７１０等）由来フルクトサミンオキシダーゼ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ）属由来フルクトシルアミンデグリカーゼ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）  属（例えばＩＦＯ−４６５１、−６５８１、−７９０５、−５７４８、−７９９４、−４８９７、−５３３７等）由来フルクトシルアミノ酸分解酵素、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えばＩＦＯ−４４６８、−４４７１、−６３８４、−７７０６、−９９６４、−９９７１、−３１１８０、−９９７２  等）由来、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属由来又はデブリオマイゼス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来ケトアミンオキシダーゼ等のケトアミン構造を認識する酵素が挙げられ、さらに好ましい例としてはプロテアーゼと共存した状態でも十分な活性を有する、遺伝子組み替えケトアミンオキシダーゼ（旭化成社製）が挙げられる。
【００３６】
糖化アミノ酸に作用する酵素の活性は１デオキシフルクトシルＺリジン（以下ＦＺＬと略す。）若しくは１デオキシフルクトシルバリン（以下ＦＶと略す。ＦＺＬ、ＦＶともに前記ハシバらの方法に従って合成、精製した。）より、３７℃、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【００３７】
本発明に基づく糖化タンパク質の定量方法に於いて、ケトアミン構造を認識する酵素を用いる場合に、その作用の検出は、例えばデヒドロゲナーゼを用いた場合には補酵素の変化量を、例えば補酵素としてＮＡＤを用いて生成される変化の量として還元型補酵素である還元型ＮＡＤをその極大吸収波長域である３４０ｎｍ付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、若しくは生じた還元型補酵素を各種ジアフォラーゼ、またはフェナジンメトサルフェート等の電子キャリアー及びニトロテトラゾリウム、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−８（以上同人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリウム塩等の還元系発色試薬を用い間接的に定量してもよく、またこれ以外の公知の方法により直接、間接的に測定してもよい。
【００３８】
また例えばオキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量または反応生成物の量を測定することが好ましい。反応生成物として、例えばケトアミンオキシダーゼを用いた場合には反応により過酸化水素及びグルコソンが生成し、過酸化水素及びグルコソン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。
【００３９】
上記過酸化水素の量は、例えばパーオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色、発光、蛍光等により定量しても良く、また電気化学的手法によって定量しても良く、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒドの量を定量しても良い。
【００４０】
過酸化水素の発色系は、パーオキシダーゼの存在下で４−ＡＡ若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）；以上和光純薬社製等）等を用いることが出来る。
【００４１】
また過酸化水素を電極を用いて測定する場合、電極には、過酸化水素との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金若しくは銀等が挙げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来、さらにオキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或いはその電気量を測定しても良い。
【００４２】
電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量を測定しても良い。
【００４３】
さらに本発明のプロテアーゼを用いた測定方法、試薬において、本発明のプロテアーゼを単独で使用することはもちろんであるが、加えてその反応前後若しくは同時に他のエンドプロテアーゼ、または他のエキソプロテアーゼを作用させても良い。
【００４４】
本発明のプロテアーゼを用いたヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬の液組成については、使用するプロテアーゼの至適ｐＨを考慮し、反応が効率よく進行するようにｐＨ及びプロテアーゼ濃度を決定すればよい。
例えば前記ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来）以上ナガセケムテックス社製を用いる場合には、タンパク質分解活性がｐＨ６．５〜９．０付近で強いことから、反応のｐＨは６．５〜９．０を選択することができる。またプロテアーゼ濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中のタンパク質を十分に分解し得る濃度で有れば良く０．１〜５００ＫＵ／ｍｌが好ましく、０．５〜２５０ＫＵ／ｍｌがさらに好ましい。
【００４５】
ケトアミン構造を認識する酵素を用いて断片化された糖化ペプチドもしくはタンパク質を測定する試薬の液組成については、使用するケトアミン構造を認識する酵素の至適ｐＨを考慮し、反応が効率よく進行するようにｐＨを選択しその後糖化アミノ酸に作用する酵素量を決定すればよい。
【００４６】
例えば遺伝子組換フルクトサミンオキシダーゼ（旭化成社製）の場合、最大活性の５０％以上の活性を示す領域がｐＨ６．５〜１０と広く、反応のｐＨは６．５〜１０を選択できる。また酵素添加濃度は実際に使用される反応時間中に被検液から生成された糖化アミノ酸を十分に測定し得る濃度で有れば良く、０．０１Ｕ〜１０００Ｕ／ｍｌが好ましく、０．１Ｕ〜５００Ｕ／ｍｌがより好ましく、０．５Ｕ〜２００Ｕ／ｍｌが最も好ましい。
【００４７】
本発明に於けるヘモグロビンＡ１ｃ定量試薬としては、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを含有するものとして調製すれば良く、好ましくは該プロテアーゼ及びケトアミン構造を認識する酵素を含有するものとして調整すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供できる。
【００４８】
また、本発明に基づく糖化タンパク質を定量する酵素反応組成には、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
【００４９】
かくして調整された本発明のヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬を用いて、被検液中のヘモグロビンＡ１ｃを測定するには、測定用試薬０．０１〜５．０ｍｌに被検液０．００１〜０．５ｍｌを加え、３７℃の温度にて反応させ、レートアッセイを行う場合には、反応開始後の一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後の１分間、または３分ごと８分後の５分間における変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を直接または間接的に前記の方法で測定すれば良く、エンドポイントアッセイの場合には反応開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成物の量を同様に測定すれば良い。この場合既知濃度の糖化ヘモグロビンを用いて測定した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖化ヘモグロビンの量を求めることができる。
【００５０】
ここで述べた披検液とは、糖化ヘモグロビンを含有する被検液であり、さらに好ましくは、全血、全血の溶血液、遠心分離された赤血球、洗浄赤血球等が挙げられる。また分離された赤血球や糖化ヘモグロビンをあらかじめプロテアーゼにより断片化したプロテアーゼ処理液も好ましい被検液として用いることができる。
【００５１】
【発明の実施の形態】
ついで、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
【００５２】
【実施例】
本発明を実施例に基づいて説明する。
〔実施例１〕
＜ヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのスクリーニング＞
ヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼとは、糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼのことを示す。
【００５３】
糖化ヘモグロビンからＮ末端のＦＶを生成するヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのヘモグロビンα鎖及びβ鎖への作用は下記の基質溶液１）を用いて糖化バリンを生成させ、ケトアミンオキシダーゼにて検出を行った。また、糖化ヘモグロビンからＮ末端の糖化ジペプチドを生成するヘモグロビンＡ１ｃ測定用プロテアーゼのヘモグロビンα鎖及びβ鎖への作用は下記の基質溶液２）を用いてｐＮＡの遊離による４０５ｎｍの増加により測定した。
【００５４】
基質液１）
５ｍＭ  ＦＶＨ若しくはＦＶＬ
発色液１）
2004344052.tif 000002
上記基質液１）を９６穴プレートに９０μｌ、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）９０μｌをとり、プロテアーゼを含有する溶液２０μｌ（  高濃度の方が好ましい）を添加した。室温で２時間反応後、発色液１）を１００μｌ添加、室温で放置し青色の発色（５５０ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。
【００５５】
基質液２）
１ｍＭ  ＦＶＨｐＮＡ若しくはＦＶＬｐＮＡ
上記基質液２）を９６穴プレートに９０μｌ、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）９０μｌをとり、プロテアーゼを含有する溶液２０μｌ（  高濃度の方が好ましい）を添加した。室温で２時間反応させた。黄色の発色（４０５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。結果を表１に示す。
【００５６】
尚プロテアーゼは以下のものを使用した。αキモトリプシン（ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ）、プロナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）以上和光純薬社製、カルボキシペプチダーゼＷ（Ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｗ，  ｆｒｏｍ  Ｗｈｅａｔ）、カルボキシペプチダーゼＹ（酵母由来）、ブタ肝由来ロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ，  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ  サイトゾル由来、ミクロソーム由来）、バチルスリケニフォルミス（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）由来プロテアーゼ、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、プロテアーゼタイプＩ（ｆｒｏｍ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｓ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＶ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、プロテアーゼタイプＸＶＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、プロテアーゼタイプＸＩＸ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、プロテアーゼタイプＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）以上シグマ社製、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｍａｇａｓａｋｉｎａｓｅ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来）以上ナガセケムテックス社製、プロテアーゼＰ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）、プロテアーゼＫアマノ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）以上アマノエンザイム株式会社製）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来中性プロテアーゼ、合同酒精株式会社製）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）スミチ−ムＰ（パパイン）以上新日本化学社製）、Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ；タカラ社製）、アミノペプチダーゼＴ（  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ    和光純薬社製）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ    ＰＩＥＲＣＥ社製）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ＩＦＯ３９５３）、Ｇ３０（ｃａｓｅｉ、ＩＦＯ１２５２１）、
【００５７】
【表１】
2004344052.tif 000003
【００５８】
表１に示したとおり、従来から糖化ヘモグロビンへの作用が知られていたパパイン、キモトリプシン、プロナーゼ、ズブチリシン等ではβ鎖を特異的に認識する事は出来なかった。一方糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化バリンを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼとしてはプロテアーゼがロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌｅｕｃｉｎｅ  ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ，  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）、Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、デオキシン１（ｆｒｏｍ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｍａｇａｓａｋｉｎａｓｅ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、プロテアーゼＳ“アマノ”（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アミノペプチダーゼＭ（ｆｒｏｍ  Ｈｏｇ  ｋｉｄｎｅｙ）、アミノペプチダーゼＴ（  ｆｒｏｍ  Ｔｈｅｒｍｕｓ）、乳酸菌（ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｇ１５（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｇ３０（ｃａｓｅｉ）、に活性が確認された。
【００５９】
また糖化ヘモグロビンからα鎖Ｎ末端の糖化ジペプチドを生じる作用よりも、β鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼとしては、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ  （  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、プロテアーゼＰ“アマノ”（  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）、プロテアーゼＫ“アマノ“（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ  ｆｒｏｍ  Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、ペクチナ−ゼＸＰ−５３４（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スミチームＭＰ（ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｍｅｌｌｅｕｓ）、に活性が確認された。
【００６０】
〔実施例２〕
＜合成基質に対する反応曲線＞
１；基質液としてＦＶＨ若しくはＦＶＬを用いた場合
＜基質溶液＞
実施例１の発色液１に１ｍＭになるようにＦＶＨもしくはＦＶＬを溶解した。別途ブランクとして基質マイナスの発色液も調整した。
＜プロテアーゼ＞  Ｐｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来中性プロテアーゼ、合同酒精株式会社製）
＜操作＞
上記反応液を９４０μｌをキュベットにとり３７℃で３分間予備加温する。適当に希釈したプロテアーゼを含有する溶液６０μｌ添加、撹拌し、３７℃で反応を開始し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。
【００６１】
図１からわかるようにＰｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）はどちらも、ヘモグロビンα鎖のＮ端糖化ペプチドであるＦＶＬには作用せず、ヘモグロビンβ鎖のＮ端糖化ペプチドであるＦＶＨに作用しＦＶを切り出すプロテアーゼであることが明白であり、経時的にその生成量が増加することから確かにプロテアーゼの反応であることが明確であった。このことからＰｆｕ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  Ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ（ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、ＧＯＤＯ高純度プロテアーゼ（ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は糖化ヘモグロビンからβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸を生じる作用が大きいプロテアーゼであり、かつ糖化ヘモグロビンからα鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸又は糖化ペプチドを実質的に生じないプロテアーゼであることが明白であった。
【００６２】
＜合成基質に対する反応曲線２；基質液としてＦＶＨｐＮＡ若しくはＦＶＬｐＮＡを用いた場合＞
＜基質溶液＞  実施例１の基質溶液２と同じ。
＜プロテアーゼ＞  ペクチナーゼＸＰ−５３４（ナガセケムテックス社製）、プロテアーゼＰアマノ（アマノエンザイム株式会社製）
＜操作＞
基質溶液２、２２５μｌに５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５、６７５μｌを添加し３７℃でインキュベートした。適当に希釈したプロテアーゼを含有する溶液１００μｌ添加、撹拌し３７℃で反応を開始し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を図２に示す。
【００６３】
図２からわかるようにペクチナーゼＸＰ−５３４はヘモグロビンα鎖のＮ端糖化ペプチドであるＦＶＬｐＮＡには作用せず、ヘモグロビンβ鎖のＮ端糖化ペプチドであるＦＶＨｐＮＡに作用するプロテアーゼであることが明白であった。また、プロテアーゼＰアマノははヘモグロビンα鎖のＮ端糖化ペプチドであるＦＶＬｐＮＡへの作用よりも、ヘモグロビンβ鎖のＮ端糖化ペプチドであるＦＶＨｐＮＡへの作用の方が大きなプロテアーゼであることが明白であった。
【００６４】
また、ペクチナーゼＸＰ−５３４、プロテアーゼＰアマノ共に経時的に基質の分解が進むことから確かにプロテアーゼの反応であることが明確であった。
このことからペクチナーゼＸＰ−５３４は、糖化ヘモグロビンからβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼであり、かつ糖化ヘモグロビンからα鎖Ｎ末端の糖化ペプチドを実質的に生じないプロテアーゼであることが明白であった。また、プロテアーゼＰアマノは糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからα鎖Ｎ末端の糖化ペプチドを生じる作用よりもβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼであることが明白であった。
【００６５】
〔実施例３〕
＜ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬＞
ヘモグロビンＡ１ｃ測定試薬を下記の組成で調製した。
2004344052.tif 000004
【００６６】
〔実施例４〕
＜本発明のプロテアーゼを用いた糖化ヘモグロビンの測定＞
＜ヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬＞  実施例３に記載の試薬
＜試料＞  市販ヘモグロビン測定用キャリブレーター（協和メデックス社製）低値（表示ヘモグロビンＡ１ｃ値；５％）及び高値（表示ヘモグロビンＡ１ｃ値；１０％）を５：０、４：１、３：２、２：３、１：４、０：５の割合で混合した。
【００６７】
健常者及び糖尿病患者全血（ＥＤＴＡ採血；採血管ベネディクト社製）各５検体を使用。全血試料のＨｂＡ１ｃ値はＨｂＡ１ｃ測定装置（アークレイ社製）にて測定した。
＜全血試料の溶血方法及び溶血試料中のヘモグロビン濃度の測定＞
全血は３０００回転で遠心分離し血球成分を取得した。溶血試薬（０．９％Ｂｒｉｊｉ３５；和光純薬社製を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５）２８０μｌに血球成分２０μｌを添加して溶血させた。市販ヘモグロビン測定用キャリブレーター低値及び高値の混合品はそのまま使用した。
＜反応手順＞
上記Ｒ１試薬０．７ｍｌをセルにとり３７℃にする。試料８０μｌを混合し、３７℃４．５分反応を行いヘモグロビン濃度測定の目的で５７１ｎｍの吸光度を測定し、次いで７５１ｎｍを測光した（Ａ０）。試料添加から正確に５分後上記Ｒ２試薬２２０μｌをセルに分注し３７℃−５分間インキュベーションし７５１ｎｍを測光した（Ａ１）。ブランクの測定は、試料に蒸留水を用いてブランクの吸光度変化（ブランクΔＡ＝Ａ１ブランク−Ａ０ブランク）を測定した。ＨｂＡ１ｃ濃度の算出はキャリブレーターの検量線より算出した。さらにヘモグロビンＡ１ｃ濃度をヘモグロビン濃度で除し、ヘモグロビンＡ１ｃ値を算出した。キャリブレーターの測定結果を図３に、健常者及び患者全血の測定結果を表２に示す。
【００６８】
【表２】
2004344052.tif 000005
【００６９】
図３からわかるようにヘモグロビンＡ１ｃ用キャリブレーターの希釈系列から良好な直線の検量線が作製でき、本測定系にて正確にヘモグロビンＡ１ｃを測定することが可能であった。
また表２から分かるように、本発明のヘモグロビンＡ１ｃを用いた測定方法とＨＰＬＣ法で値が良く一致し、正確にヘモグロビンＡ１ｃを測定していることが明白であった。
【発明の効果】
糖化ヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸及び／又は糖化ペプチドを選択的に測定する為のプロテアーゼを含有するヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬、方法を大量、安価に提供する事が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例２に基づく糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸を生じる作用が大きいプロテアーゼを用いた場合の反応曲線である。
【図２】本発明の実施例２に基づく糖化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントからβ鎖Ｎ末端の糖化ペプチドを生じる作用が大きいプロテアーゼを用いた場合の反応曲線である。
【図３】本発明の実施例４に基づくヘモグロビンＡ１ｃの検量線および測定結果である。
【図１】
2004344052.tif 000006
【図２】
2004344052.tif 000007
【図３】
2004344052.tif 000008