(57)【要約】【課題】一度に複数の蛋白質の性質を検出するための手段を提供する。【解決手段】試料に含まれる複数の蛋白質を同時に検出する方法であって、被検物質と特異的な複合体を形成する複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれると被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程と、被検物質と特異的な複合体を形成する物質を蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質と前記複数の第１の特異的な結合体を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程と、前記複数の第２の特異的な複合体に含まれる標識を検出し、試料に含まれる被検物質を特定する工程を含むことを特徴とする蛋白質検出方法。【選択図】　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれる複数の蛋白質を同時に検出する方法であって、被検物質と特異的な複合体を形成する複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程と、被検物質と特異的な複合体を形成する物質を蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質と前記複数の第１の特異的な結合体を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程と、前記複数の第２の特異的な複合体に含まれる標識を検出し、試料に含まれる被検物質を特定する工程を含むことを特徴とする蛋白質検出方法。
【請求項２】
試料に含まれる抗原および／または抗体である複数の被検物質を検出する方法であって、前記複数の被検物質と特異的な複合体を形成する抗体および／または抗原である複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に抗原抗体反応させ複数の第１の抗原・抗体複合体を形成する工程と、被検物質と特異的な複合体を形成する抗体および／または抗原を蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質と前記複数の第１の抗原・抗体複合体を特異的な抗原抗体反応させ複数の第２の抗原・抗体複合体を形成する工程と、前記第２の抗原・抗体複合体に含まれる標識物質を検出し、試料に含まれる被検物質を特定する工程を含むことを特徴とする蛋白質検出方法。
【請求項３】
前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程の結合反応が、抗体−抗原間の特異的な抗原抗体反応、ペプチドとの結合反応、蛋白質との相互作用、酵素反応、ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応から選ばれ、前記複数の第１の特異的な結合体と蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程の結合反応が、抗体−抗原間の特異的な抗原抗体反応、ペプチドとの結合反応、蛋白質との相互作用、酵素反応、ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の蛋白質検出方法。
【請求項４】
前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程と、前記複数の第１の特異的な結合体と蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程の間に、前記結合反応後に未反応であった前記被検物質を含む試料を洗浄する工程を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに蛋白質検出方法。
【請求項５】
前記複数の第１の特異的な結合体と蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程と、前記複数の第２の特異的な複合体に含まれる標識物質を検出し、試料に含まれる被検物を特定する工程の間に、前記結合反応後に結合しなかった前記蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を除去する工程を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質検出方法。
【請求項６】
被検物質と特異的な複合体を形成する複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程との間に、前記基盤上の前記配列物質がスポットされていない部分をマスキングする工程を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛋白質解析技術の分野における、蛋白質の同定や修飾、発現解析、相互作用、機能解析や定量の研究および検査に役立つ蛋白質検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体反応は分子間の相互作用や分子認識を基本として成り立っており、特に蛋白質は生理機能発現において中心的な役割を果たしている。近年、ヒト遺伝子の解析が進み、機能未知遺伝子が約４０％存在することがわかり、機能未知の蛋白質の解析が進んできている。
【０００３】
現在、蛋白質の同定及び定量は二次元電気泳動及び質量分析法を用いた方法と液体クロマトグラフィー及び質量分析法を用いた方法が主流である。またＤＮＡチップを応用し、抗体を平面上に多数スポットした抗体チップを用いた相互作用検出や、蛋白質の同定も行われはじめている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これまでの電気泳動を用いた方法は分解能や検出感度に問題があった。生体内分子での分子反応を一度に解析するためには、多数の蛋白質を基盤上で競合的に抗原−抗体反応等の結合反応させるという方法が有効であるが、その方法が可能である抗体チップもあらかじめ蛋白質を蛍光標識する必要性があり、より多数の蛋白質の性質を検討するまでには到らなかった。本発明の目的は試料蛋白質をあらかじめ標識することなく、一度に複数の蛋白質の反応性を検出する方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明の蛋白質検出方法は、試料に含まれる複数の蛋白質を同時に検出する方法であって、被検物質と特異的な複合体を形成する複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程と、被検物質と特異的な複合体を形成する物質を蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質と前記複数の第１の特異的な結合体を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程と、前記複数の第２の特異的な複合体に含まれる標識を検出し、試料に含まれる被検物質を特定する工程を含むことを特徴とする。
【０００６】
特に、上記結合反応を抗原−抗体反応であることが好ましく、この場合、本発明の蛋白質検出方法は、試料に含まれる抗原および／または抗体である複数の被検物質を検出する方法であって、前記複数の被検物質と特異的な複合体を形成する抗体および／または抗原である複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に抗原抗体反応させ複数の第１の抗原・抗体複合体を形成する工程と、被検物質と特異的な複合体を形成する抗体および／または抗原を蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質と前記複数の第１の抗原・抗体複合体を特異的な抗原抗体反応させ複数の第２の抗原・抗体複合体を形成する工程と、前記第２の抗原・抗体複合体に含まれる標識物質を検出し、試料に含まれる被検物質を特定する工程を含むことを特徴とする。
【０００７】
また、上記２つの結合反応は抗原−抗体反応に限定されず、どちらかが、または両者がその他の結合反応であっても良い。この場合、本発明の蛋白質検出方法は、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程の結合反応が、抗体−抗原間の特異的な抗原抗体反応、ペプチドとの結合反応、蛋白質との相互作用、酵素反応、ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応から選ばれ、前記複数の第１の特異的な結合体と蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程の結合反応が、抗体−抗原間の特異的な抗原抗体反応、ペプチドとの結合反応、蛋白質との相互作用、酵素反応、ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応から選ばれることを特徴とする上記の蛋白質検出方法である。
本発明では、前記基盤が、平面状基板またはビーズであることが好ましく、その材質は限定されない。
【０００８】
また、本発明では、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程と、前記複数の第１の特異的な結合体と蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程の間に、前記結合反応後に未反応であった前記被検物質を含む試料を洗浄する工程を有することが好ましい。
【０００９】
同様に、前記複数の第１の特異的な結合体と蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を特異的に結合反応させて複数の第２の特異的な複合体を形成する工程と、前記複数の第２の特異的な複合体に含まれる標識物質を検出し、試料に含まれる被検物質を特定する工程の間に、前記結合反応後に結合しなかった前記蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質を除去する工程を有することが好ましい。
【００１０】
さらに、本発明では、被検物質と特異的な複合体を形成する複数の配列物質を基盤上に配列する工程と、前記試料に含まれる被検物質と前記複数の配列物質を前記基盤上で特異的に結合反応させて複数の第１の特異的な結合体を形成する工程との間に、前記基盤上の前記配列物質がスポットされていない部分をマスキングする工程を有することが好ましい。
【００１１】
上記のように、本発明においては、試料蛋白質を標識することなく、被検物質と特異的な複合体を形成する物質に標識することによって、蛋白質を検出することができる。また、平面状またはビーズ上の配列物質を複数にすることにより、一度に複数の蛋白質の反応性を検出することが可能である。
【００１２】
なお、本発明において、「基盤」とはスライドグラス、プラスチック基盤、メンブレン等の平板、またはプラスチックビーズ、ガラスビーズ等のビーズであり、蛋白質をより多く結合させるため補助剤で基盤表面をコーティング処理したものも含む。「被検物質」とは解析する対象となる物質の総称であり、ここでは、抗体、抗原、酵素等も含めた蛋白質である。「被検物質と特異的な複合体を形成する物質」とは抗体などの蛋白質、認識部位であるペプチドやＤＮＡ、ポリヌクレオチド等の生体高分子、リン酸基等の化合物を含む。「被検物質と特異的な結合反応」とは抗体−抗原間の特異的な抗原抗体反応、ペプチドとの結合反応、蛋白質との相互作用、酵素反応、ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応等の生体内反応を示す。「蛍光試薬またはＲＩ試薬で標識した標識物質」は、結合反応前には標識しないで、結合反応後に標識をするものや、酵素反応によって標識したものも含むこととする。
また基盤上には被検物質を含むスポットを多数配置することとし、スポットの形成は種々のアレイ作成用スポッター装置によって行うことができることとする。
【００１３】
【発明実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して具体的に説明する。
図１は本発明の実施の構成を示すフロー図である。また図２は本発明の実施の反応モデル図である。
【００１４】
まず、スライドガラスやメンブラン等の基盤１に被検物質と特異的な複合体を形成する蛋白質、ペプチド等の複数の配列物質２−１〜２−５をスポットする。次に、スポットしていない部分のマスキング作業をおこなう。マスキング作業はマスキング溶液（例えば被検物質と特異的な複合体を形成する物質が蛋白質である場合は０．５％スキムミルクや１％ＢＳＡ溶液等）に基盤を適当時間浸して行う。２−６で表記したものがマスクした状態を示している。（図２ａ）　この基盤１上に被検物質である蛋白質３−１及び３−２を含む試料を流し、所定時間、所定の温度で反応させ、基盤上の配列物質と特異的に結合させる。（図２ｂ）
反応後、未反応の試料を洗浄する。（図２ｃ）
【００１５】
次に配列物質と特異的に結合した蛋白質３−１及び３−２と更に特異的な複合体を形成する物質４−１及び４−２を蛍光試薬またはＲＩ試薬５−１及び５−２で標識する。その後、標識物質を基盤１上で所定時間、所定の温度で反応させ、基盤１上の蛋白質３−１及び３−２と特異的に結合させる。（図２ｄ）
反応後、未反応の標識物質を洗浄した後、励起光の照射により励起された蛍光試薬またはＲＩ試薬の量を測定することにより、配列物質２−１と結合した蛋白質３−１及び配列物質２−５と結合した蛋白質３−２の性質を検出することや該蛋白質を同定することが出来る。
【００１６】
上記図２の反応モデルでは、５種の配列物質を用いて、２種の蛋白質の性質を検出したり該蛋白質を同定したが、本発明はこれに限定されず、複数のサンプル物質を用いて、複数の蛋白質の性質を検出したり該蛋白質を同定する全ての場合が含まれる。
【００１７】
実施例
Ｈｕｍａｎ　ＩＬ２モノクローナル抗体、Ｈｕｍａｎ　ＩＬ４モノクローナル抗体及びＨｕｍａｎ　ＩＬ６モノクローナル抗体それぞれ濃度０．１〜５００μｇ／ｍｌにＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｓ　ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４））で調整し、ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）コートスライドガラス及び、Ｓｉｌｙｌａｔｅコートガラス上にスポットした。
【００１８】
スポット後のガラスを４℃で約１０時間インキュベートした。インキュベート後のガラスを１％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）で約１時間揺らしながら浸すことでマスキングし、マスキング後ＴＰＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０　ＰＢＳ）でよく洗浄し、ＰＢＳでリンスし、遠心分離器を用いて乾燥させた。これを基盤とし、使用するまで４℃で保存した。
【００１９】
次に基盤と被検物質である蛋白質の反応を行った。被検物質である蛋白質（今回はリコンビナントＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６それぞれの溶液及びＩＬ２，　ＩＬ６混合溶液を準備した）１μｇ／ｍｌを含む０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）、１％　ＢＳＡ（ｗ／ｖ）ＰＢＳ溶液を先程の基盤に静かにアプライし、カバーガラスをかけ、４℃で約１０時間反応させた。反応後、基盤をＴＰＢＳ（０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０　ＰＢＳ）でよく洗浄し、ＰＢＳでリンスし、遠心分離器を用いて乾燥させた。
【００２０】
次に標識物質と反応させた。今回はあらかじめ標識せず、試料と特異的な結合をする物質と基盤を反応させ、その後その物質の標識をおこなった。試料と特異的な結合をする物質としてｂｉｏｔｉｎ標識されたそれぞれの抗体液（ｂｉｏｔｉｎ化Ｈｕｍａｎ　ＩＬ２モノクローナル抗体、ｂｉｏｔｉｎ化Ｈｕｍａｎ　ＩＬ４モノクローナル抗体、ｂｉｏｔｉｎ化Ｈｕｍａｎ　ＩＬ６モノクローナル抗体）の混合液を各１μｇ／ｍｌ、全体が０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）、１％　ＢＳＡ（ｗ／ｖ）になるようにＰＢＳ溶液で調整した。調整した被検物質を基盤に静かにアプライし、カバーガラスをかけ、室温（約２５℃）で一時間置いた。反応後の基盤をＴＰＢＳ（０．０５％　　Ｔｗｅｅｎ−２０　　ＰＢＳ）でよく洗浄し、ＰＢＳでリンスし、遠心分離器を用いて乾燥させた。
【００２１】
標識のためにＣｙ３　ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ１０μｇ／ｍｌを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）、１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）になるようにＰＢＳ溶液で調整した。調整した溶液を基盤に静かにアプライし、カバーガラスをかけ、室温（約２５℃）一時間置いた。反応後の基盤をＴＰＢＳ（０．０５％　　Ｔｗｅｅｎ−２０　　ＰＢＳ）でよく洗浄し、ＰＢＳでリンスし、遠心分離器を用いて乾燥させた。
【００２２】
その後、反応後の基盤に励起光を照射し、Ｃｙ３の発光量を透過波長５３２ｎｍのフィルターを配置した蛍光スキャナーを用いて、蛍光シグナル量を測定した。
その結果、サンプルの種類、濃度に応じた蛍光シグナルを検出することができた。
【００２３】
【発明の効果】
以上、説明したように、本発明によれば、被検物質である蛋白質を標識することなく、一度に複数の蛋白質の性質を検出することが可能である。
また、試料中にどのような蛋白質がどの程度含まれているか、どのような反応性を持つのかを同条件下で比較することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の構成を示すフロー図
【図２】本発明の実施の反応モデル図
【符号の説明】
１：　基盤
２−１〜２−５：　被検物質と特異的な複合体を形成する物質、蛋白質、ペプチド等の複数の配列物質
２−６：　マスキング剤
３−１，３−２：　被検物質
４−１，４−２：　被検物質と特異的な物質
５−１，５−２：　標識
【図１】
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【図２】
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