(57)【要約】【課題】嚢胞性肺線維症の管理上有用な評価（ＣＦの重症度や急性度の評価、ＣＦの進行程度の評価など）を高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価に実施できる方法及びこれに用いるキットを提供すること。【解決手段】生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定し、その測定結果と嚢胞性肺線維症とを関連づけるステップを少なくとも含む、嚢胞性肺線維症の評価方法。この評価方法は、次のステップ（１）〜（３）を含むことが好ましい：（１）個体から採取された生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定するステップ、（２）前記（１）で測定されたＣＡＰ１８の量と、対照サンプル中のＣＡＰ１８の量とを比較するステップ、（３）前記（２）で得られた結果と、嚢胞性肺線維症とを関連づけるステップ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定し、その測定結果と嚢胞性肺線維症とを関連づけるステップを少なくとも含む、嚢胞性肺線維症の評価方法。
【請求項２】
下記のステップ（１）〜（３）を含むことを特徴とする、嚢胞性肺線維症の評価方法。
（１）個体から採取された生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定するステップ。
（２）上記（１）で測定されたＣＡＰ１８の量と、対照サンプル中のＣＡＰ１８の量とを比較するステップ。
（３）上記（２）で得られた結果と、嚢胞性肺線維症とを関連づけるステップ。
【請求項３】
「生体サンプル」が、喀痰又は気管支肺胞洗浄液であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の評価方法。
【請求項４】
「ＣＡＰ１８の量」が、抗原抗体反応を利用して測定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項５】
抗原抗体反応を利用した測定が、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を用いて行われることを特徴とする、請求項４に記載の評価方法。
【請求項６】
抗原抗体反応を利用した測定が、固相を用いて行われることを特徴とする、請求項４又は５に記載の評価方法。
【請求項７】
固相を用いて行われる「抗原抗体反応を利用した測定」が、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む方法によって行われることを特徴とする、請求項６に記載の評価方法。
（ａ）固相とサンプルとを接触させ、サンプル中のＣＡＰ１８を固相に固着させる工程。
（ｂ）工程（ａ）で固相に固着させたＣＡＰ１８に、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を結合させて、両者の複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程。
【請求項８】
固相を用いて行われる「抗原抗体反応を利用した測定」が、下記（ａ）’及び（ｂ）’の工程を少なくとも含む方法によって行われることを特徴とする、請求項６に記載の評価方法。
（ａ）’「『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）』が固着された固相」、「サンプル」及び「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−ＣＡＰ１８−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｂ）’工程（ａ）’において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
【請求項９】
「評価」が、「診断」、「リスクの存否又はその程度の評価」、「重症度及び／又は急性度の評価」及び「疾患の進行程度の評価」からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１０】
下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、嚢胞性肺線維症の評価キット。
（Ａ）固相
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体
【請求項１１】
下記の構成成分（Ａ）’及び（Ｂ）’を少なくとも含む、嚢胞性肺線維症の評価キット。
（Ａ）’「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）」が固着された固相
（Ｂ）’配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嚢胞性肺線維症の評価方法及び評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
【０００３】
ＢＡＬＦ：気管支肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavage fluid) 
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＦ：嚢胞性肺線維症(cystic lung fibrosis)
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＨＲＰ：西洋ワサビのペルオキシダーゼ(horseradish peroxidase)
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水(phosphate-buffered saline)
ＴＭＢ：3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)
ＣＦは、肺線維症のうちで嚢胞を形成するものの総称であり、遺伝性疾患（常染色体劣性遺伝；CFTR遺伝子異常）である。全身の外分泌腺（肺、膵臓、消化管、汗腺）などの機能が損なわれ、緑膿菌、ブドウ球菌感染などの難治性感染症を合併しやすい。
【０００４】
また、ＣＡＰ１８（Cationic antimicrobial protein of 18kDa）は、ヒトやウサギの顆粒球から見出された塩基性の抗菌性タンパク質であり、グラム陰性菌及びグラム陽性菌に対して幅広い抗菌活性を示すことが知られている。また、例えばヒト由来のＣＡＰ１８の全アミノ酸配列も知られている（例えば、特許文献１参照）。
しかし、従来、ＣＡＰ１８を測定することによってＣＦを評価できることについては知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特表平８−５０４０８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、ＣＦの診断方法として、genotypic(CFTR mutations)やphenotypic(sweat electrolyte)なものが知られているが、さらに疾患の管理上有用な評価（ＣＦの重症度や急性度の評価、ＣＦの進行程度の評価など）を高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価に実施できる方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定することにより、ＣＦを高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価に評価できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定し、その測定結果とＣＦとを関連づけるステップを少なくとも含む、ＣＦの評価方法（以下、「本発明方法」という）を提供する。
【０００９】
本発明方法は、下記のステップ（１）〜（３）を含むことが好ましい。
（１）個体から採取された生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定するステップ。
（２）上記（１）で測定されたＣＡＰ１８の量と、対照サンプル中のＣＡＰ１８の量とを比較するステップ。
（３）上記（２）で得られた結果と、ＣＦとを関連づけるステップ。
【００１０】
本発明方法において用いる「生体サンプル」は、喀痰又はＢＡＬＦであることが好ましい。
【００１１】
本発明方法における「ＣＡＰ１８の量」は、抗原抗体反応を利用して測定されることが好ましい。この抗原抗体反応を利用した測定は、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を用いて行われることが好ましい。
【００１２】
この、抗原抗体反応を利用した測定は、固相を用いて行われることが好ましい。そして、この固相を用いて行われる「抗原抗体反応を利用した測定」は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む方法（以下、「方法１」という）によって行われることが好ましい。
（ａ）固相とサンプルとを接触させ、サンプル中のＣＡＰ１８を固相に固着させる工程。
（ｂ）工程（ａ）で固相に固着させたＣＡＰ１８に、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を結合させて、両者の複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程。
【００１３】
この、固相を用いて行われる「抗原抗体反応を利用した測定」は、下記（ａ）’及び（ｂ）’の工程を少なくとも含む方法（以下、「方法２」という）によって行われることも好ましい。
（ａ）’「『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）』が固着された固相」、「サンプル」及び「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−ＣＡＰ１８−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｂ）’工程（ａ）’において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
【００１４】
本発明方法における「評価」は、「診断」、「リスクの存否又はその程度の評価」、「重症度及び／又は急性度の評価」及び「疾患の進行程度の評価」からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
【００１５】
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、ＣＦの評価キット（以下、「本発明キット１」という）を提供する。
【００１６】
（Ａ）固相
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）’及び（Ｂ）’を少なくとも含む、ＣＦの評価キット（以下、「本発明キット２」という）を提供する。
【００１７】
（Ａ）’「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）」が固着された固相
（Ｂ）’配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）
以下、本発明キット１及び２をまとめて、単に「本発明キット」という。
【発明の効果】
【００１８】
本発明方法は、ＣＦを高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価に評価できる方法であることから極めて有用性が高い。また、喀痰など侵襲性を伴わずに採取された生体サンプルを用いることができることから、患者に対する負担も大きく軽減され、極めて実用的な方法である。また本発明キットは、本発明方法の実施をさらに簡便・迅速化するものであることから、極めて有用である。
【００１９】
さらに本発明は、ＣＦの状態の把握、治療方針の決定、治療効果の確認、経過観察、医薬品開発の評価等へも応用することができ、この点でも極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明方法
本発明方法は、生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定し、その測定結果とＣＦとを関連づけるステップを少なくとも含む、ＣＦの評価方法である。
【００２１】
この本発明方法は、下記のステップ（１）〜（３）を含むことが好ましい。
（１）個体から採取された生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定するステップ。
（２）上記（１）で測定されたＣＡＰ１８の量と、対照サンプル中のＣＡＰ１８の量とを比較するステップ。
（３）上記（２）で得られた結果と、ＣＦとを関連づけるステップ。
【００２２】
本発明方法において用いる「生体サンプル」は、生体に由来するサンプルであって、かつ、ＣＦとの関連で当該サンプル中に含まれるＣＡＰ１８の量が変動するものである限り特に限定されない。すなわち「生体に由来するサンプル」は、生体に存在する状態のままで直接採取したもののみならず、例えば、液体等を用いて生体から排出させて採取したものや、採取後に液体等で希釈したもの（いずれも、当該液体等で希釈されている）等をも包含する。また、例えば、生体から採取した後に遠心分離することによって得られる上清や沈殿等についても「生体に由来するサンプル」に包含される。
【００２３】
このような「生体サンプル」は、喀痰又はＢＡＬＦであることが好ましい。
【００２４】
また、生体サンプルが採取される個体も、ＣＦに罹患する可能性がある動物の個体である限りにおいて特に限定されないが、哺乳動物の個体が好ましく、なかでもヒトの個体が好ましい。
【００２５】
「ＣＡＰ１８」は、前記の通りそのアミノ酸配列が既に知られているタンパク質である。一例として、ヒト由来のＣＡＰ１８の全アミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００２６】
ただし、天然に存在するタンパク質は、それをコードするＤＮＡの多型や変異のほか、タンパク質生成後の生体内における修飾等によってそのアミノ酸配列中に置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理学的・生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように、本来の（変異を有しない）ＣＡＰ１８とは構造的に若干の差異があっても、その生体内における機能や挙動に大きな違いが認められないタンパク質も、本発明方法の測定対象となる「ＣＡＰ１８」に含まれる。
【００２７】
また、ここにいう「量」は、定性的なもの（ＣＡＰ１８の存否）であっても、定量的なものであってもよい。後者については、具体的な数値で示されるものであってもよく、程度（例えば「高」、「低」等）で示されるものであってもよい。また、この「量」は、濃度、重量、分子数（モル数）等のいずれで示されるものであってもよい。
【００２８】
また、ＣＡＰ１８の測定が、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度等を検出することによって行われる場合には、これらの検出値をそのままＣＡＰ１８の「量」の指標としてもよい。またこれらの検出値と、予め作成しておいた検量線や関係式とを用いて、ＣＡＰ１８の濃度、重量、分子数（モル数）等を算出してもよい。
【００２９】
ＣＡＰ１８の量を測定する方法は、生体サンプル中に存在するＣＡＰ１８を、他の成分と区別して検出・測定しうる方法であればよい。このような方法の一例として、抗原抗体反応を利用して測定する方法が例示される。
【００３０】
すなわち、「ＣＡＰ１８に対して特異的に結合する抗体」を用いた抗原抗体反応を利用して、生体サンプル中に存在するＣＡＰ１８を測定することができる。ここで用いる「ＣＡＰ１８に対して特異的に結合する抗体」は、ＣＡＰ１８に対して選択的に結合する抗体である限りにおいて特に限定されないが、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を用いることが好ましい。この「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」は、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」又は「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」であることが好ましい。
【００３１】
これらの抗体は、ポリクローナル、モノクローナルのいずれであってもよいが、一般に、特異性、均質性、再現性、大量かつ永続的な生産性等の観点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３２】
また、これらの抗体は、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理された、Ｆａｂを含むフラグメント等であっても良い。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、(Ｆａｂ')2等が例示される。本明細書における「抗体」の概念には、このようなものも含まれる。
【００３３】
「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１のペプチド自体）又はその部分ペプチド（以下、これらを「抗原ペプチド」ともいう）を抗原として、通常の抗体の製造方法によって取得することができる。
【００３４】
部分ペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。
【００３５】
このような抗原ペプチドは、その配列に基づいて公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等）によって製造することができる。またこの抗原ペプチドのアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法により製造することもできる。
【００３６】
製造された抗原ペプチドのアミノ酸配列を、公知のアミノ酸配列決定法（例えばエドマン分解法等）により決定し、抗原ペプチドが正しく製造されたか否かを確認することができる。
【００３７】
なお、抗原として配列番号１、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのような比較的低分子量のペプチドを用いる場合には、これにヘモシアニン、オボアルブミン、γグロブリン等の担体を結合させたものを抗原として用いることが好ましい。
【００３８】
抗体の製造は、モノクローナル抗体とするかポリクローナル抗体とするかによって、以下の通り行うことができる。
【００３９】
モノクローナルな抗体は、前記の抗原ペプチドを用いて、KohlerとMilsteinの方法（Nature 256,495-497(1975)）によって製造することができる。
【００４０】
例えば抗原ペプチドをマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠(footpad)等に投与する。これらの被免疫動物のなかでもマウスを用いることが好ましい。すなわちここで用いる抗体は、マウス由来の抗体であることが好ましい。
【００４１】
被免疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末梢血液等を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを調製する。
【００４２】
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、抗原に対して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別する。
【００４３】
こうして選別されたハイブリドーマ株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗体が得られる。なお、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。
【００４４】
またポリクローナルな抗体は、前記の抗原ペプチドを用いて以下の通り製造することができる。
【００４５】
前記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に、抗原ペプチドを被免疫動物に投与する。ここでは被免疫動物としてウサギを用いることが好ましい。
【００４６】
被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。また初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫を行うと力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から約１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、通常の抗体の精製方法によって免疫グロブリン画分を精製してもよい。
【００４７】
製造された抗体が抗原ペプチドに結合するか否か、あるいは特異的に結合するか否かは、抗原ペプチドや抗原となりうる他の物質（例えば、他の種類のペプチド）等を用い、通常の方法によって当業者が容易に決定することができる。
【００４８】
このようにして得られる抗体は、免疫グロブリンサブクラスがIgG1であるものが好ましい。免疫グロブリンサブクラスがIgG1である抗体は、抗IgG1抗体を用いたスクリーニング等によって取得することができる。
【００４９】
このような抗体として特に好ましいものは、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体」である。この抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。またこの抗体の免疫グロブリンサブクラスは、上記の通りIgG1であることが好ましい。
【００５０】
またここで用いる抗体の別の好ましい態様は、「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体」である。この抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。
【００５１】
またここで用いる抗体は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであってもよい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性同位元素（125I、131Iなど）、蛍光色素（Alexa Fluor（登録商標） 488、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)など）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）など）のいずれか一方の物質等が例示される。
【００５２】
抗体を標識物質で標識する方法は、標識物質に適した公知の方法から適宜選択することができる。
【００５３】
抗原抗体反応を利用した測定は、固相を用いて行われることが好ましい。ここで用いる「固相」は、タンパク質（ＣＡＰ１８や抗体）を固着させることができ、かつ、水、生体サンプルまたは測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、マイクロプレートが望ましい。
【００５４】
固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、テフロン（登録商標）、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
【００５５】
このような固相を用いて行われる「抗原抗体反応を利用した測定」は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む方法（方法１）によって行われることが好ましい。
（ａ）固相とサンプルとを接触させ、サンプル中のＣＡＰ１８を固相に固着させる工程。
（ｂ）工程（ａ）で固相に固着させたＣＡＰ１８に、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を結合させて、両者の複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程。
【００５６】
工程（ａ）における、固相とサンプルとを接触させる方法は、当該固相の表面と、サンプル中に存在するＣＡＰ１８分子とが接触する限りにおいて特に限定されない。例えば、固相にサンプルを添加して接触させても良く、またサンプルに固相を添加して接触させても良く、別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこれらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。この接触によって、サンプル中のＣＡＰ１８が固相に固着される。固着を十分なものとするために、４〜３７℃で１時間〜一晩程度インキュベートすることが好ましい。
【００５７】
固相とサンプルとを接触させた後、固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や固着されなかった成分を除去することが好ましい。
【００５８】
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Tween）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）を用いることが好ましい。
【００５９】
工程（ｂ）における、固相に固着させたＣＡＰ１８に「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」を結合させる方法としては、抗原抗体反応させるための通常の条件下で両者を接触させる方法を採用することができる。ＣＡＰ１８に抗体を十分に結合させるために、両者を接触させた後、４〜３７℃、好ましくは２０〜３７℃で１〜４時間程度インキュベートすることが好ましい。これにより、両者の複合体が形成される。
【００６０】
その後、固相と液相を分離して、必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄する。採用しうる洗浄液は、前記と同様である。
【００６１】
工程（ｃ）における、複合体の検出方法も特に限定されない。例えば抗体が標識物質で標識されている場合には、複合体を形成している抗体における当該標識物質を検出することによって、複合体を検出することができる。標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。その他の説明は前記と同様である。
【００６２】
また、固相を用いて行われる「抗原抗体反応を利用した測定」は、下記（ａ）’及び（ｂ）’の工程を少なくとも含む方法（方法２）によって行われることも好ましい。
（ａ）’「『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）』が固着された固相」、「サンプル」及び「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−ＣＡＰ１８−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｂ）’工程（ａ）’において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
【００６３】
工程（ａ）’における「『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）』が固着された固相」は、第１抗体を固相に固着させることによって製造することができる。
【００６４】
固相に第１抗体を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。
【００６５】
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
【００６６】
また、第１抗体を固着させた固相の表面には、第１抗体が固着していない表面部分が残存している場合があり、そこにサンプル中に存在するＣＡＰ１８が非特異的に固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、サンプルを固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して、第１抗体が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、プルロニック等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
【００６７】
方法２において用いる第１抗体及び第２抗体は、いずれも「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」である限りにおいて特に限定されないが、第１抗体としては「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」が好ましく、第２抗体としては「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」が好ましい。
【００６８】
また、工程（ａ）’は、「『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）』が固着された固相」、「サンプル」及び「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）」の３者を同時に接触させてもよく、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させてもよく、また、後２者を接触させた後にこれを前１者に接触させてもよい。なかでも前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させることが好ましい。
【００６９】
これらの接触方法は、当該固相に固着された第１抗体の分子、サンプル中に存在するＣＡＰ１８分子、及び第２抗体の分子とが相互に接触しうる限りにおいて特に限定されず、抗原抗体反応させるための通常の条件下で接触させる方法を採用することができる。ＣＡＰ１８に抗体を十分に結合させるために、接触させた後、４〜３７℃、好ましくは２０〜３７℃で１〜４時間程度インキュベートすることが好ましい。
【００７０】
この接触によって、「固相に固着された第１抗体−ＣＡＰ１８−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体が形成される。
【００７１】
その後、固相と液相を分離して、必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄する。採用しうる洗浄液は、前記と同様である。
【００７２】
工程（ｂ）’における、サンドイッチ状複合体の検出方法も特に限定されない。例えば第２抗体が標識物質で標識されている場合には、複合体を形成している第２抗体における当該標識物質を検出することによって、サンドイッチ状複合体を検出することができる。標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。その他の説明は前記と同様である。
【００７３】
以上のような測定によって、「生体サンプル中のＣＡＰ１８の量」の測定結果が得られる。この測定結果は、そのままＣＦとの関連づけに用いてもよい。またこの測定結果を、対照サンプル中のＣＡＰ１８の量と比較して、その比較結果をＣＦとの関連づけに用いてもよい。「対照サンプル」は、評価の目的に応じて適宜選定することができる。
【００７４】
例えば「診断」や「リスクの存否又はその程度の評価」を目的とする場合には、「健常な個体（ＣＦに罹患していない個体）」や「ＣＦに罹患している個体」の生体サンプルを「対照サンプル」とすることができる。また「重症度及び／又は急性度の評価」や「疾患の進行程度の評価」を目的とする場合には、さらに、評価対象とする特定の個体から経時的に採取した生体サンプルを「対照サンプル」とすることができる。
【００７５】
本発明方法における「評価」は、「診断」、「リスクの存否又はその程度の評価」、「重症度及び／又は急性度の評価」及び「疾患の進行程度の評価」からなる群から選ばれるものであることが好ましい。
【００７６】
本発明者らによって、ＣＦに罹患した個体の生体サンプル中のＣＡＰ１８量が有意に増加することが見出されたことから、「ＣＡＰ１８の量の測定結果」や「対照サンプル中のＣＡＰ１８の量との比較結果」とＣＦとの関連づけは、例えば以下の要領で行うことができる。
【００７７】
生体サンプル中のＣＡＰ１８の測定結果（ＣＡＰ１８の量）が、健常な個体（ＣＦに罹患していない個体）における測定結果（ＣＡＰ１８の量）に比して高い場合には、「ＣＦである」、「ＣＦである可能性が高い」又は「ＣＦのリスクが高い」と関連づけることができる。
【００７８】
生体サンプル中のＣＡＰ１８の測定結果（ＣＡＰ１８の量）が、健常な個体における測定結果（ＣＡＰ１８の量）と同等もしくはそれよりも低ければ、「ＣＦではない」、「ＣＦである可能性は低い」又は「ＣＦのリスクは低い」と関連づけることができる。
【００７９】
また、生体サンプル中のＣＡＰ１８の測定結果（ＣＡＰ１８の量）と、健常な個体における測定結果（ＣＡＰ１８の量）との差の程度を、ＣＦの重症度として関連づけることができる。
【００８０】
さらに、例えばある特定の個体の生体サンプルを定期的に採取してそのＣＡＰ１８の量を測定し、ＣＡＰ１８の量が増加傾向にある場合には「ＣＦが進行している」又は「ＣＦが進行している可能性が高い」と関連づけることができる。逆に、ＣＡＰ１８の量が減少傾向にある場合には「ＣＦが改善方向にある」又は「ＣＦが改善方向にある可能性が高い」と関連づけることができる。またＣＡＰ１８の量に変化がない場合には「ＣＦの進行（改善）に変化がない」又は「ＣＦの進行（改善）に変化がない可能性が高い」と関連づけることができる。
【００８１】
なお、生体サンプルの種類等によっては、ＣＦへの罹患によって生体サンプル中のＣＡＰ１８量が減少することもありうるが、この場合には上記とは逆の要領で関連づけることができる。
＜２＞本発明キット
本発明キット１は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、ＣＦの評価キットである。
【００８２】
（Ａ）固相
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体
（Ｂ）に記載の抗体は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
【００８３】
固相、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、標識物質、測定対象となるＣＡＰ１８、ＣＦの評価等についての説明は、いずれも前記と同様である。このキット１は、本発明方法における「方法１」に従って使用することができる。
【００８４】
本発明キット２は、下記の構成成分（Ａ）’及び（Ｂ）’を少なくとも含む、ＣＦの評価キットである。
【００８５】
（Ａ）’「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第１抗体）」が固着された固相
（Ｂ）’配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体（第２抗体）
（Ｂ）’に記載の第２抗体は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
【００８６】
第１抗体、第２抗体、第１抗体が固着された固相、標識物質、測定対象となるＣＡＰ１８、ＣＦの評価等の説明は、いずれも前記と同様である。このキット２は、本発明方法における「方法２」に従って使用することができる。
【００８７】
本発明キットは、前記の構成成分を少なくとも含む限りにおいて特に限定されず、さらに検量線や関係式作成の標準となる既知濃度のＣＡＰ１８標準品や、標識物質の検出試薬等を構成成分として加えることができる。また、これらの構成成分の他に、ブロッキング物質、洗浄液、生体サンプルの希釈液、酵素反応停止液等を含んでいてもよい。さらに本発明キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール（ＱＣコントロール）を含有させることもできる。
【実施例１】
【００８８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００８９】
製造例
（１）モノクローナル抗体の製造
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（FR KSKEK IGKEF KRIVQ RIKDF LRNLV；以下、「２７アミノ酸ペプチド」という）を合成し、これにヘモシアニン(Keyhold Lympet Hemocyanin)を結合させたものをマウス（Balb/c）の腹腔内に投与して免疫した。（この際、アジュバントとして初回は完全アジュバンド、以後は不完全アジュバンドを用いた）。免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、これとマウス由来のミエローマ細胞（細胞株名：P3-X63-Ag8.653）とをポリエチレングリコール4000（PEG4000）を用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを調製した。
【００９０】
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、２７アミノ酸ペプチドに対して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別した。
【００９１】
選別されたハイブリドーマ株を、無血清培地（商品名：CDハイブリドーマ、インビトロジェン製）を用いて中空糸型細胞培養装置で培養し、その培養上清を採取してＰＢＳで透析後、モノクローナル抗体（Toyo6E3）を取得した。この抗体の免疫グロブリンサブクラスはIgG1であった。
（２）ポリクローナル抗体の製造
リコンビナントのCAP18（ヒト由来）をウサギの皮下に投与して免疫した。（この際、アジュバントとして初回は完全アジュバンド、以後は不完全アジュバンドを用いた）。初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫し、最終免疫から約１週間後に血液を採取して血清を分離した。この血清を熱処理して補体を失活させた後、３３％飽和硫酸アンモニウム沈殿させることによってポリクローナル抗体を取得した。
【００９２】
実施例１  ＣＦの評価
ＣＡＰ１８の測定方法
前記の製造例（２）で製造したポリクローナル抗体（第１抗体）をトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、この溶液をポリスチレン製のマイクロタイタープレートのウエルに添加した。その後２２℃程度で１時間インキュベートすることによって抗体をプレートに物理的に吸着させた。トリス緩衝液でプレートを洗浄後、１％ ＦＢＳを添加したトリス緩衝液でブロッキングした。このプレートに、生体から採取した後に２０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られる上清（生体サンプル）を添加して、２２℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをトリス緩衝液で洗浄した。
【００９３】
次いで、このプレートのウエルに前記の製造例（１）で製造したモノクロナール抗体（Toyo6E3）を添加して、２２℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをトリス緩衝液で洗浄した。
【００９４】
次いでＨＲＰで標識したヤギ抗マウスIgG抗体を添加して同様に反応させた後、ＴＭＢ発色基質を用いて発色させ、450nmの吸光度を測定した。この測定結果と、リコンビナントのCAP18（ヒト由来）を用いて作成した検量線とを用いて、ＣＡＰ１８の量を求めた。
（２）ＢＡＬＦを用いたＣＦの評価
生体サンプルとしてＣＦ患者又は健常人のＢＡＬＦを用い、上記（１）の測定方法によってＣＡＰ１８を測定した。以下に結果を示す。なお、結果は「平均値±ＳＤ」として表示した。
【００９５】
ＣＦ患者から採取したＢＡＬＦ（ｎ＝２３）  １８９．７±１８．７（μg/ml）
健常人から採取したＢＡＬＦ（ｎ＝１２）    １２０．７±２４．７（μg/ml）
ｐ＝０．０３６（unpaired 2-tail t test） 
この結果から、ＣＦ患者から採取したＢＡＬＦ中のＣＡＰ１８量は、健常人に比して有意に高いことが示された。したがって、ＢＡＬＦ中のＣＡＰ１８量が高い患者は、ＣＦである、又はその可能性が高い、と評価できる。
（３）喀痰を用いたＣＦの評価
生体サンプルとしてＣＦ患者の喀痰を用い、上記（１）の測定方法によってＣＡＰ１８を測定した。以下に結果を示す。なお、結果は「平均値±ＳＤ」として表示した。
【００９６】
ＣＦ患者から採取した喀痰（ｎ＝３０）      １７７．４±１４．７（μg/ml）
この結果から、ＣＦ患者から採取した喀痰中のＣＡＰ１８量は、ＢＡＬＦ中のＣＡＰ１８量と同程度の高い値を示すことが明らかとなった。したがって、喀痰中のＣＡＰ１８量が高い患者は、ＣＦである、又はその可能性が高い、と評価できる。
【実施例２】
【００９７】
本発明キット１の作製
以下の構成からなる本発明キット１を作製した。
１．ポリスチレン製のマイクロタイタープレート  １枚
２．前記の製造例で製造したモノクローナル抗体（Toyo6E3）（一次抗体）  １本
３．ＨＲＰで標識したヤギ抗マウスIgG抗体（二次抗体）  １本
４．ＴＭＢ溶液  １本
５．反応停止液（1N HCl）  １本
６．洗浄液（0.05％ Tween20を含有するＰＢＳ）
７．生体サンプルの希釈液（１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ(-)）
８．ＣＡＰ１８標準溶液  １セット
９．ＣＦの評価方法等が記載された説明書
【実施例３】
【００９８】
本発明キット２の作製
以下の構成からなる本発明キット２を作製した。
１．「前記の製造例で製造されたポリクローナル抗体」が固着されたポリスチレン製のマイクロタイタープレート  １枚
２．前記の製造例で製造したモノクローナル抗体（Toyo6E3）（一次抗体）  １本
３．ＨＲＰで標識したヤギ抗マウスIgG抗体（二次抗体）  １本
４．ＴＭＢ溶液  １本
５．反応停止液（1N HCl）  １本
６．洗浄液（0.05％ Tween20を含有するＰＢＳ）
７．生体サンプルの希釈液（１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ(-)）
８．ＣＡＰ１８標準溶液  １セット
９．ＣＦの評価方法等が記載された説明書
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明方法やキットは、ＣＦの高精度、高感度、簡便、迅速かつ安価な評価ツールとして利用することができる。
【配列表】
2004245842000001.app