(57)【要約】【課題】迅速にリウマチを診断する。【解決手段】関節液、血清中のミッドカインを定量する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節液あるいは血清中のミッドカインを免疫化学的に測定することにより、リウマチを診断する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リウマチの診断に関する。
【０００２】
【従来の技術】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）は多発性の関節痛と関節腫張を主症状とする原因不明の破壊性、進行性の炎症性疾患である。当初は滑膜炎であるが、炎症が軽快と増悪を繰り返して、関節軟骨や骨組織が破壊され、関節の変形と機能障害を生じる。ＲＡは一般的に非常によく知られており、患者数も多い疾患にも関わらず、いまだに確定診断を行うには以下のアメリカリウマチ学会診断基準（１９８７年、アメリカリウマチ学会）を４つ以上満たす必要がある。１．朝のこわばり（朝のこわばりは少なくとも１時間以上持続）。２．３関節領域以上の関節炎（少なくとも３つの関節領域で、軟部組織の腫張または関節液の貯留）。３．手の関節炎（手の１カ所の関節領域に腫脹がある）。４．対称性の関節炎。５．リウマトイド結節。６．血清リウマチ因子陽性。７．Ｘ線像の変化。しかし、診断基準の一つであるＸ線的な変化が現れるのは、関節に腫脹を伴う関節炎が現れてから成人で約半年かかるとされており、実際の早期診断の材料としては難しい。１−４の診断基準も症状が６週間以上続くなどの条件があり、関節炎が起きてから診断までは時間がかかるのが普通である。
ＲＡは難治性で、関節の破壊、機能障害が著明なため、知名度が高く、ＲＡを心配して整形外科を訪れる患者も多い。多くは、関節炎は示すもののＲＡであることは少ないため、Ｘ線検査、血液のリウマチ因子検査で陰性であることを示し、除外診断をしている。しかし、現在の診断基準から考えるとこれも完全に除外してよい条件ではない。また、実際ＲＡであった場合、活動性のある症状には早期から積極的に抗リウマチ薬治療を行うべきだと、早期の診断・治療の重要性が主張されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本研究は、迅速にリウマチを診断することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
ミッドカインは細胞の増殖、移動、生存を促進する成長因子である（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｔ．，Ｗｉｌｅｙ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，ｐｐ　２０８６−２０８８，２００２）。ミッドカインの免疫化学的測定法は確立されている（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１７１−１１７５，１９９６）。また、リウマチ性関節炎と変形性関節症でいずれも関節液中のミッドカイン値が上昇することも報告されている（Ｔａｋｅｄａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２，４５３−４５８，１９９７）。しかし、症例数が少なく、病態との関連が不明であり、再検討が必要となった。その結果、本研究は、意外にも高ミッドカイン値がリウマチを特徴づけるものであることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、ミッドカイン値をもってリウマチのマーカーとするものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図１は慢性関節リウマチと変形性関節症の患者の関節液中のミッドカイン値を比較したもの、図２はＲＡ患者の血清中のミッドカイン値を示したものである。
【０００７】
１．ミッドカイン値の定量について説明する。ミッドカインに対する特異抗体を用いて酵素免疫学的に定量できる（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１７１−１１７５，１９９６）。また、ウェスタンブロット（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５９，３９２−４０２，１９９３）後のデンシトメーターによる定量（Ｔａｋｅｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，６１，８４８６−８４９１，２００１）。も可能である。
【０００８】
２．リウマチ因子の判定について説明する。ヒトγ−グロブリンを吸着させたポリスチレンラテックス粒子がリウマチ因子（ＲＦ）と反応して凝集を示すかどうかで判定する。栄研化学株式会社から販売されているＲＡ７７栄研というキットを用いて測定することができる。
【実施例】
以下、実施例により、本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０００９】
（実施例１）　慢性関節リウマチあるいは変形性関節症の患者の関節液のミッドカイン値を測定した。このため、アフィニティー精製した抗ヒトミッドカイン抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１７１−１１７５，１９９６）１μｇを５０μｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０に溶解し、Ｆａｌｃｏｎ　３９１５のマイクロタイタープレートの穴に入れプレート面に吸着させた。溶液を除き、穴を二価イオンを含まぬリン酸緩衝液生理食塩水［ＰＢＳ（−）］で洗い、洗浄緩衝液［１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５，０．４Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＮａＮ３、１ｍＭＭｇＣｌ２］と１時間インキュベイトした。洗浄緩衝液を除いた後、穴にＰＢＳ（−）で２倍希釈した５０ｍｌ関節液検体を加え、３時間室温に保った。検体液を除いた後、５０μｌ洗浄緩衡液中の０．７ｎｇビオチン化抗ミッドカイン抗体（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１９，１１７１−１１７５）を加え、４℃で一夜、反応させた。５ｍＵのストレプトアビジンβ−ガラクトシダーゼ複合体（ベーリンガーマンハイム社）を５０μｌの洗浄緩衝液に溶かし、穴に加え、室温で１時間反応させた。溶液を除き、穴を洗浄したのち、５μｇの４−メチルウンベリフェリルーβ−Ｄ−ガラクトシドを５０μｌの洗浄緩衝液に溶かして加え、室温で反応させた。酵素反応は２００μｌの０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ１０．３で停止し、遊離した４−メチルウンベリフェロンをマイクロプレート蛍光リーダー（サイトフローＩＩ、バイオサーチ社）で測定した。標準ミッドカインを用いた検量線から、この測定値に基づいて関節液中のミッドカイン値を求めた。リウマチ患者をリウマチ因子陽性者と陰性者に分けると、陽性者では、全例、陰性者でも５５％でミッドカイン値は高かった（図１）。また、変形性関節症患者では、ミッドカイン値は低かった（図１）。関節液中のミッドカイン値が高いことをもってリウマチ診断の重要因子とすることができる。
【００１０】
（実施例２）　血清０．１ｍｌを用いて［０００９］の方法で血清ミッドカイン値を測定した。正常人のカットオフ値を３００ｐｇ／０．５ｍｌ（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１７１−１１７５，１９９６）とするとリウマチ因子陰性の患者でも３２例中８例が陽性、リウマチ因子陽性の患者では８８例中８５例が陽性であった。血清中のリウマチ因子測定と組み合わせて、精度が高い（２つの値が高い）あるいは網羅性が高い（どちらかの値が高い）測定を行い得る。なお健常人でも約５％のリウマチ因子陽性者があるがミッドカイン値は健常人では低い。
【００１１】
【図面の簡単な説明】
【図１】慢性関節リウマチの患者と変形性関節症の患者の関節液中のミッドカイン値の比較図である。％は変形性関節症でのミッドカイン値以上のケースのパーセントを示す。リウマチ因子（ＲＦ）陰性（−）、陽性（＋）、強陽性（＋＋）の各群で図示してある。
【図２】血清中のミッドカイン値と血清中のリウマチ因子（ＲＦ）の関連を示す図である。
【図１】
2004012447.tif 000002
【図２】
2004012447.tif 000003