(57)【要約】【課題】  迅速かつ容易に、高感度でβ−ラクタマーゼを判別できるβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物、検出キット及び検出方法を提供すること。【解決手段】  本発明により、β−ラクタマーゼ検出基質として、3-[2,4-ジニトロスチリル]-7-(2-チエニルアセトアミド)-3-セフェム-4-カルボン酸又は7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸を含有し、β−ラクタマーゼ阻害剤として、クラブラン酸、アズトレオナム、エチレンジアミン四酢酸及びクロキサシリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する、β−ラクタマーゼ検出試薬組成物を提供する。本発明はまた、該検出試薬組成物を含む検出キットを提供する。本発明はまた、分析対象物を含有する検体液を、該組成物と接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法を提供する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロモジェニックセファロスポリン法において使用するためのβ−ラクタマーゼ検出基質と、β−ラクタマーゼ阻害剤とを含有するβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物。
【請求項２】
β−ラクタマーゼ検出基質が、下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、又は下記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体である請求項１記載のβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物：
【化１】
2004166694.tif 000007
（一般式（１）において、Ｒは、ホルムアミド基或いは式ＲuＣＨ2ＣＯＮＨ、ＲuＯＣＨ2ＣＯＮＨ、ＲuＣＯＮＨ、ＲuＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＮＨ又はＲuＣ（＝ＮＯＨ）ＣＯＮＨ（式中、Ｒuはチエニル、フェニル又はナフチル基である）で表される基であり；Ａｒは、2-位、4-位又は2，4-位においてシアノ基又はニトロ基により置換されたフェニル基であり；及びＸ1は、−Ｓ−又は−ＳＯ−である。
）
【化２】
2004166694.tif 000008
（一般式（２）において、Ｒ1及びＲ2は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素原子、ニトロ基又はシアノ基を表し；Ｒ3は、カルボキシル基で置換されていてもよいＣ1−Ｃ6アルキル基を表し；Ｒ4は、水素原子又はアミノ基を表し；及びＸ2は、−Ｓ−又は−ＳＯ−を表す。但し、Ｒ1及びＲ2が同時に水素原子であることはない。）。
【請求項３】
β−ラクタマーゼ阻害剤が、クラブラン酸又はそれと同等の作用をする化合物、アズトレオナム、クロキサシリン、亜鉛イオンとキレート可能なキレート剤、スルバクタム、タゾバクタム、チエナマイシン及びカルモナムからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２記載の検出試薬組成物。
【請求項４】
β−ラクタマーゼ阻害剤が、クラブラン酸；アズトレオナム；アズトレオナムとエチレンジアミン四酢酸との組合せ；クラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せ；アズトレオナムとクラブラン酸との組合せ；及びアズトレオナムとクラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せ、からなる群から選ばれる、請求項３記載の検出試薬組成物。
【請求項５】
以下の（a）〜（e）からなる群から選ばれる１以上の検出試薬組成物を含むβ−ラクタマーゼ検出キット：
（a）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物；
（b）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物；
（c）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸を含有する検出試薬組成物；
（d）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物；及び
（e）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物。
【請求項６】
請求項５記載の（c）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに請求項５記載の（a）、（b）、（d）又は（e）群のいずれか１以上の検出試薬組成物を含む請求項５記載のβ−ラクタマーゼ検出キット。
【請求項７】
請求項５記載の（d）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに請求項５記載の（a）、（b）、（c）又は（e）群のいずれか１以上の検出試薬組成物を含む請求項５記載のβ−ラクタマーゼ検出キット。
【請求項８】
請求項５記載の（a）〜（e）群の検出試薬組成物を全て含有する請求項５記載のβ−ラクタマーゼ検出キット。
【請求項９】
以下の（f）、（g）、（h）及び（i）からなる群から選ばれる１以上を含むβ−ラクタマーゼ検出キット：
（f）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムを含有する検出試薬組成物；
（g）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸を含有する検出試薬組成物； 
（h）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムを含有する検出試薬組成物；
（i）β−ラクタマーゼ検出基質として請求項２記載の一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸との組合せを含有する検出試薬組成物。
【請求項１０】
さらに請求項５記載の（c）群の検出試薬組成物を含有する、請求項９記載のβ−ラクタマーゼ検出キット。
【請求項１１】
請求項９記載の（h）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに請求項９記載の（f）、（g）又は（i）群のいずれか１以上を含む請求項９記載のβ−ラクタマーゼ検出キット。
【請求項１２】
請求項９記載の（f）〜（i）群を全て含有する請求項１０記載のβ−ラクタマーゼ検出キット。
【請求項１３】
分析対象物を含有する検体液を、請求項１〜４のいずれか１項記載のβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物に接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法。
【請求項１４】
分析対象物を含有する検体液を、β−ラクタマーゼ検出キットの試料保持部分に保持された請求項１〜４のいずれか１項記載のβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物と接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法。
【請求項１５】
分析対象物を含有する検体液を、請求項５〜１２のいずれか１項記載のβ−ラクタマーゼ検出キットの試料保持部分に保持されたβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物と接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ラクタマーゼ検出試薬組成物、β−ラクタマーゼ検出キット及びβ−ラクタマーゼ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗菌剤の分子内β−ラクタム環を加水分解する一群の酵素であり、酵素タンパクのアミノ酸配列の相同性を基にクラスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤに分類されている。基質拡張型β−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）は、従来のクラスＡ  β−ラクタマーゼよりも分解する基質（β−ラクタム系抗菌剤）の範囲が拡張された酵素である。これらのβ−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗菌剤の抗菌力を失活させ、なかでもＥＳＢＬは院内感染の原因菌として問題視されている。β−ラクタム系抗菌剤に耐性を示す細菌にβ−ラクタム系抗菌剤を投与しても、治療効果が得られないばかりか、新たな耐性菌を蔓延させる原因ともなる。従って、正確な治療方針を定める上で、β−ラクタマーゼを迅速かつ正確に検出する必要がある。
【０００３】
現在用いられているβ−ラクタマーゼ検出法は、1）クロモジェニックセファロスポリン法、2）アシドメトリー法、3）ヨードメトリー法、及び4）ＵＶ法の４つに大別されており、その他、ＭＩＣを比較する培養法があげられる。これまでに市販されている主なβ−ラクタマーゼ検出製品としては、クロモジェニックセファロスポリン法を利用してβ−ラクタマーゼの有無を判別するもの、アシドメトリー法を利用してβ−ラクタマーゼ  クラスＡ並びにクラスＣを検出するもの、培養法を利用してβ−ラクタマーゼ  クラスＢ又はＥＳＢＬを検出するもの等があげられる。
【０００４】
クロモジェニックセファロスポリン法は、β−ラクタマーゼによってβ−ラクタム環が開裂すると変色するセファロスポリンを用いる方法であって、試薬自体が変色するため、検出感度がよいことを特徴とするが、これまでに市販されているクロモジェニックセファロスポリン法を利用した製品は、検出基質としてニトロセフィン（3-[2,4-ジニトロスチリル]-7-(2-チエニルアセトアミド)-3-セフェム-4-カルボン酸、特開昭４８−５０７８７号公報）を使用するものである。この製品は３０分程度の短い検出時間で判別可能である一方、β−ラクタマーゼの全てのクラスに反応してクラスを判別することが不可能であるものであった。さらに、クロモジェニックセファロスポリン法を利用する製品で、ニトロセフィンとβ−ラクタマーゼ阻害剤とを併用することを特徴とする検出製品はこれまで知られていない。
【０００５】
他方、国際公開第０２／２４７０７号パンフレットには、クロモジェニックセファロスポリン法を利用してＥＳＢＬを検出することができる新規化合物が開示されている。しかしながら、当該国際公開パンフレットには、特定のβ−ラクタマーゼ阻害剤との併用については開示されておらず、ＥＳＢＬ以外の他のβ−ラクタマーゼのクラスを検出できる可能性も示唆されていない。
【０００６】
【特許文献１】特開昭４８−５０７８７号公報（請求項１、第５頁右下欄２〜７行）
【特許文献２】国際公開第０２／２４７０７号パンフレット（請求の範囲、試験例１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、β−ラクタマーゼを迅速に判別できるβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物、β−ラクタマーゼ検出キット及びβ−ラクタマーゼ検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定のβ−ラクタマーゼ検出基質とβ−ラクタマーゼ阻害剤とを併用することにより、特に、β−ラクタマーゼ阻害剤として特定の２又は３種類を組合せることにより、上記課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明は、クロモジェニックセファロスポリン法において使用するためのβ−ラクタマーゼ検出基質と、β−ラクタマーゼ阻害剤とを含有するβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、以下の（a）〜（e）からなる群から選ばれる１以上の検出試薬組成物を含むβ−ラクタマーゼ検出キットを提供する：
（a）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物；
（b）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物；
（c）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸を含有する検出試薬組成物；
（d）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物；及び
（e）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せを含有する検出試薬組成物。
【００１０】
本発明はまた、以下の（f）、（g）、（h）及び（i）からなる群から選ばれる１以上を含むβ−ラクタマーゼ検出キットを提供する：
（f）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムを含有する検出試薬組成物；
（g）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸を含有する検出試薬組成物； 
（h）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムを含有する検出試薬組成物；
（i）β−ラクタマーゼ検出基質として下記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸との組合せを含有する検出試薬組成物。
【００１１】
本発明はまた、分析対象物を含有する検体液を、上記β−ラクタマーゼ検出試薬組成物に接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法を提供する。
本発明はまた、分析対象物を含有する検体液を、β−ラクタマーゼ検出キットの試料保持部分に保持された上記β−ラクタマーゼ検出試薬組成物と接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法を提供する。
本発明はまた、分析対象物を含有する検体液を、上記β−ラクタマーゼ検出キットの試料保持部分に保持されたβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物と接触させることを含む、β−ラクタマーゼ検出方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、迅速かつ容易に、しかも高感度でβ−ラクタマーゼを検出することができる。しかも、本発明は特定の検出試薬組成物と特定の阻害剤を併用することから、β−ラクタマーゼのクラスまで判別可能であり、検出誤差も小さい。特に、迅速なクラス判別により、適切な抗菌薬を選択でき、高い治療効果を発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、クロモジェニックセファロスポリン法に基づくものである。
本発明で用いることのできるβ−ラクタマーゼ検出基質としては、特開昭４８−５０７８７号公報に開示されている下記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、又は国際公開第０２／２４７０７号パンフレットに開示されている下記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体があげられる。なお、これらの明細書の内容は全て本明細書に含まれるものとする。
【００１４】
【化１】
2004166694.tif 000002
（一般式（１）において、Ｒは、ホルムアミド基或いは式ＲuＣＨ2ＣＯＮＨ、ＲuＯＣＨ2ＣＯＮＨ、ＲuＣＯＮＨ、ＲuＣＨ（ＮＨ2）ＣＯＮＨ又はＲuＣ（＝ＮＯＨ）ＣＯＮＨ（式中、Ｒuはチエニル、フェニル又はナフチル基である）で表される基であり；Ａｒは、2-位、4-位又は2，4-位においてシアノ基又はニトロ基により置換されたフェニル基であり；及びＸ1は、−Ｓ−又は−ＳＯ−である。
）
【００１５】
【化２】
2004166694.tif 000003
（一般式（２）において、Ｒ1及びＲ2は、同一でも異なってもよく、それぞれ水素原子、ニトロ基又はシアノ基を表し；Ｒ3は、カルボキシル基で置換されていてもよいＣ1−Ｃ6アルキル基を表し；Ｒ4は、水素原子又はアミノ基を表し；及びＸ2は、−Ｓ−又は−ＳＯ−を表す。但し、Ｒ1及びＲ2が同時に水素原子であることはない。）。
【００１６】
一般式（１）で表される化合物としては、β−ラクタマーゼ検出基質が、3-[2,4-ジニトロスチリル]-7-(2-チエニルアセトアミド)-3-セフェム-4-カルボン酸又は生理的に許容されるその塩が好ましい。
【００１７】
一般式（２）で表される化合物としては、式中Ｘ2が−Ｓ−である化合物、式中Ｒ3がカルボキシル基で置換されていてもよいメチル基又はカルボキシル基で置換されたプロピル基である化合物、式中Ｒ4がアミノ基である化合物、又は式中Ｘ2が−Ｓ−であり、Ｒ3がカルボキシル基で置換されていてもよいメチル基又はカルボキシル基で置換されたプロピル基であり、Ｒ4がアミノ基である化合物が好ましい。
【００１８】
中でも、以下の化合物：
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,6-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(4-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジシアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(4-シアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
【００１９】
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2-シアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)-2-(チアゾール-4-イル)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸-1-オキシド；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-メトキシイミノアセトアミド]-3-(4-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-メトキシイミノアセトアミド]-3-(2,4-ジシアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-メトキシイミノアセトアミド]-3-(2,6-ジシアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-メトキシイミノアセトアミド]-3-(2-シアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
【００２０】
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2,6-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(4-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2,4-ジシアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
【００２１】
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-4-(4-シアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-4-(2-シアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-カルボキシメトキシイミノ-2-(チアゾール-4-イル)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸、又は
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸-1-オキシド；
又はそのカルボキシレート誘導体が好ましい。
【００２２】
特に、以下の化合物：
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(4-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(4-シアノスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-メトキシイミノアセトアミド]-3-(4-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；又は
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(4-ニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
又はそのカルボキシレート誘導体が好ましい。
【００２３】
さらに特に、以下の化合物：
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；又は
7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-カルボキシメトキシイミノアセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸；
が好ましい。
【００２４】
本発明で用いることのできるβ−ラクタマーゼ阻害剤としては、β−ラクタマーゼ阻害活性を有する化合物であれば特に限定されない。好ましく使用できる阻害剤としては、クラブラン酸又はそれと同等の作用をする化合物、アズトレオナム、クロキサシリン、亜鉛イオンとキレート可能なキレート剤、スルバクタム、タゾバクタム、チエナマイシン及びカルモナムからなる群から選ばれる少なくとも１種があげられる。亜鉛イオンとキレート可能なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸及びメルカプト化合物等があげられる。メルカプト化合物としては、例えば、特開２０００−２２４９９８号公報及び特開２００１−２９９３８８号公報に開示されている化合物を使用することができる。具体的には、メルカプト酢酸、メルカプトプロピオン酸、特に2-メルカプトプロピオン酸、及びこれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩又は第４級アンモニウム塩、及びメルカプトエタノール等の有機チオール化合物等の含硫黄化合物があげられる。亜鉛イオンとキレート可能なキレート剤としては、ＥＤＴＡが特に好ましい。
特に、β−ラクタマーゼ阻害剤が、クラブラン酸；アズトレオナム；アズトレオナムとエチレンジアミン四酢酸との組合せ；クラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せ；アズトレオナムとクラブラン酸との組合せ；及びアズトレオナムとクラブラン酸とエチレンジアミン四酢酸との組合せとからなる群から選ばれるのが好ましい。
【００２５】
本発明において好ましく使用できるβ−ラクタマーゼ検出基質とβ−ラクタマーゼ阻害剤との組合せとしては、以下のものがあげられる：
β−ラクタマーゼ検出基質が、上記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩であり、β−ラクタマーゼ阻害剤が、クラブラン酸、アズトレオナム、エチレンジアミン四酢酸及びクロキサシリンからなる群から選ばれる少なくとも１種である検出試薬組成物；及び
β−ラクタマーゼ検出基質が、上記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体であり、β−ラクタマーゼ阻害剤が、クラブラン酸、アズトレオナム、エチレンジアミン四酢酸及びクロキサシリンからなる群から選ばれる少なくとも１種である検出試薬組成物。
【００２６】
上記（c）群及び以下の（f）〜（i）からなる群から選ばれる１以上を含む検出試薬組成物もまた好ましい：
（f）β−ラクタマーゼ検出基質として上記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムを含有する検出試薬組成物；
（g）β−ラクタマーゼ検出基質として上記一般式（１）で表される化合物又は生理的に許容されるその塩、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてクラブラン酸を含有する検出試薬組成物； 
（h）β−ラクタマーゼ検出基質として上記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムを含有する検出試薬組成物；
（i）β−ラクタマーゼ検出基質として上記一般式（２）で表される化合物又はそのカルボキシレート誘導体、及び
β−ラクタマーゼ阻害剤としてアズトレオナムとクラブラン酸との組合せを含有する検出試薬組成物。
【００２７】
本発明の検出試薬組成物は、β−ラクタマーゼ検出基質とβ−ラクタマーゼ阻害剤とを、質量比にして１：１０〜１００：１の範囲で使用するのが好ましく、１：１〜５０：１の範囲で使用するのがより好ましく、１：１〜１：１０の範囲で使用するのが更に好ましい。
本発明の検出試薬組成物は、β−ラクタマーゼ検出基質とβ−ラクタマーゼ阻害剤とを、水、リン酸塩緩衝液、ジメチルスルホオキサイド及びこれらの混合物等の溶媒に溶解させて使用することができる。このうち、ジメチルスルホオキサイドとリン酸塩緩衝液との混合物が特に好ましい。混合比は特に限定されない。
具体的には、β−ラクタマーゼ検出基質の濃度が好ましくは0.025mg/mL〜62.5mg/mL、より好ましくは1.25mg/mL〜12.5mg/mL、β−ラクタマーゼ阻害剤の濃度が好ましくは0.0125mg/mL〜12.5mg/mL、より好ましくは1.25mg/mL〜12.5mg/mLになるように溶媒に溶解させることにより、β−ラクタマーゼ検出試薬組成物含有溶液を調製することができる。
【００２８】
本発明の検出試薬組成物は、ｐＨ6.0〜8.0となるように調整して使用するのが好ましい。特に、β−ラクタマーゼ検出基質として上記一般式（１）で表される化合物を使用する場合には、ｐＨ５．５から８．５程度に調整するのが好ましい。β−ラクタマーゼ検出基質として上記一般式（２）で表される化合物を使用する場合には、ｐＨ6.0〜8.0程度に調整するのが好ましい。
このようにして調製した検出試薬組成物含有溶液には、さらに、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、メタアクリル酸コポリマー等の高分子等を、本発明の効果を妨げない範囲の量で添加することができる。これらの高分子等を添加することにより、本発明の検出試薬組成物含有溶液の安定性が向上するので好ましい。このうち、メタクリル酸コポリマーが特に好ましい。
【００２９】
本発明において使用する検体は、例えば患者の咽頭や鼻腔から綿棒等を使用して採取することができる。尿、喀痰、膿汁等についても使用することができる。
検体液は、水、リン酸塩緩衝液、生理食塩液等の溶媒に溶解させて調製することができる。検体液は、該液に含まれる細菌の濃度が104〜1010 CFU/mLとなるように調製するのが好ましい。
このようにして調製した検体液には、さらに、オリゴ糖、界面活性剤、デキストリン等を、本発明の効果を妨げない範囲の量で添加することができる。
【００３０】
本発明のβ−ラクタマーゼ検出キットは、上述の検出試薬組成物を含有するものであれば、ディスク型、ディスクと台紙との併用型、プレート型、短冊型等、その形態は特に制限されない。好ましく使用できる形態としてプレート型があげられる。
また、本発明のキットは、必要に応じ、β−ラクタマーゼ及び本発明の検出試薬組成物を含む溶液からなる陽性コントロール液、β−ラクタマーゼ検出基質を含む溶液からなる陰性コントロール液を含んでいてもよい。
図１に、本発明のβ−ラクタマーゼ検出キットの概略斜視図を示すが、特にこれに限定されるものではない。図１により本発明の検出キットを説明すると、本発明の検出キットは、試料容器１と、その中に収納された、複数の試料保持部分２を有する基体３とを含む。試料保持部分２は、調製した試料（検体液又はコントロール液）を滴下する開口部を有する。なお、本発明の検出キットを構成する試料容器、基体及び試料保持部分を形成する材料は特に限定されない。また、これらの大きさや形状も特に限定されない。
【００３１】
本発明のキットは、上記（c）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに上記（a）、（b）、（d）又は（e）群のいずれか１以上の検出試薬組成物を含有するのがより好ましい。
上記（d）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに上記（a）、（b）、（c）又は（e）群のいずれか１以上の検出試薬組成物を含有するβ−ラクタマーゼ検出キットもまた好ましい。
特に、上記（a）〜（e）群の検出試薬組成物を全て含有するβ−ラクタマーゼ検出キットが好ましい。
【００３２】
本発明のキットはまた、上記（c）及び（f）〜（i）からなる群から選ばれる１以上の検出試薬組成物を含むのも好ましい。
本発明のキットはまた、上記（c）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに上記（f）、（g）、（h）又は（i）群のいずれか１以上の検出試薬組成物を含有するのがより好ましい。
上記（h）群の検出試薬組成物を必須として含有し、さらに上記（c）、（f）、（g）又は（i）群のいずれか１以上の検出試薬組成物を含有するβ−ラクタマーゼ検出キットもまた好ましい。
特に、上記（c）及び（f）〜（i）群の検出試薬組成物を全て含有するβ−ラクタマーゼ検出キットが好ましい。
本発明の検出キットとしては、上記（a）〜（i）群の本発明の検出試薬組成物において、β−ラクタマーゼ検出基質として3-[2,4-ジニトロスチリル]-7-(2-チエニルアセトアミド)-3-セフェム-4-カルボン酸又は7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸（以下、ＨＭＲＺ化合物と称する）を含有するものが特に好ましい。
これらの本発明のキットによれば、β−ラクタマーゼのクラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥＳＢＬを一時に迅速に判別することができる。その結果、本発明のキットを使用すれば、適切な抗菌剤を選択してより高い治療効果をあげることができる。
【００３３】
本発明はまた、分析対象物を含有する検体液を、既述のいずれかのβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物を含む溶液に添加することを含むβ−ラクタマーゼの検出方法に関する。
本発明の方法は、既述のようにして調製した検出試薬組成物含有液体に、分析対象物を含有する検体液を添加することを含む。所定温度において、例えば室温において、添加して所定時間、例えば３０分程度経過したのち、色調が黄色から赤色に変化するか否かで陽性か陰性かの判別を行うことができる。また、特定波長において色調変化を測定することにより、活性を定量することもできる。
本発明の方法を使用することにより、例えば、β−ラクタマーゼ産生微生物により引き起こされる疾患、例えば尿道感染及び肺炎、肺炎桿菌や大腸菌により引き起こされる院内感染症に罹った患者の尿及び喀痰中のβ−ラクタマーゼを迅速に判別することができる。
【００３４】
実施例
１．β−ラクタマーゼ検出試薬組成物を含む溶液の調製
以下の表１に示したβ−ラクタマーゼ検出基質1.25mg及びβ−ラクタマーゼ阻害剤各1.25mgを、0.1ｍＬジメチルスルホオキサイドと0.9ｍＬリン酸塩緩衝液との混合溶媒に溶解させ、β−ラクタマーゼ検出試薬組成物を含む溶液を調製した。
【００３５】
表１
2004166694.tif 000004
表中、
ニトロセフィンは、3-[2,4-ジニトロスチリル]-7-(2-チエニルアセトアミド)-3-セフェム-4-カルボン酸、
HMRZ化合物は、7-[2-(2-アミノチアゾール-4-イル)-2-(1-カルボキシ-1-メチルエトキシイミノ)アセトアミド]-3-(2,4-ジニトロスチリル)-3-セフェム-4-カルボン酸、
AZTはアズトレオナム、EDTAはエチレンジアミン四酢酸、CVAはクラブラン酸を表す。
【００３６】
２．プレートの作製
調製したβ−ラクタマーゼ検出試薬組成物含有溶液を、マイクロプレート１ウェルあたりのβ−ラクタマーゼ検出基質及びβ−ラクタマーゼ阻害剤の量がそれぞれ12.5μｇとなるように塗布した。
３．分析対象物を含有する検体液の調製
β−ラクタマーゼ非産生菌、クラスＡ産生菌、クラスＢ産生菌、クラスＣ産生菌及びＥＳＢＬ産生菌として、以下の表２に記載した細菌を使用し、これらをリン酸緩衝液に接種して各々１０8ＣＦＵ／ｍＬの検体液を調製した。
【００３７】
表２
2004166694.tif 000005
【００３８】
４．β−ラクタマーゼに対する反応性
上で調製したプレートに、マイクロプレート１ウェルあたり５０μＬずつ検体液を接種した。接種して３０分経過後の色調の変化を観察することにより、β−ラクタマーゼに対する反応性を検討した。
【００３９】
表３  β−ラクタマーゼに対する反応性
2004166694.tif 000006
＋；陽性  黄色から赤へ変色した。
−；陰性  黄色のまま変化しなかった。
±；      若干変色を認めた。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明のβ−ラクタマーゼ検出キットの一例の概略斜視図である。
【符号の説明】
【００４１】
１：試料容器
２：試料保持部分
３：基体
【図１】
2004166694.tif 000009