(57)【要約】      （修正有）【課題】従来知られているアルカリプロテアーゼとはアミノ酸配列において相同性が低く、野生型でありながら酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供する。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：（ａ）好アルカリ性バチルス属のアルカリプロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質；該アミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子：
（ａ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３又は４記載のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
【０００１】
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００１】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤へ配合されているアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。洗剤という大量消費剤に用いられることから、アルカリプロテアーゼは工業用酵素の中でも最も大量に生産されている酵素である。
【０００２】
代表的な洗剤用アルカリプロテアーゼとしては、バチルス属細菌由来で、ズブチリシンファミリーに属し、分子量２８ｋＤａ付近の、サビナーゼ（登録商標）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等が知られている。しかし、これらの洗剤用アルカリプロテアーゼは酸化剤に対して非常に感受性が高く、わずかな濃度の酸化剤を添加するだけで短期間に失活するという問題があった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
また最近では、デュラザイム（登録商標；ノボザイムズ、例えば特許文献１参照）のような、タンパク質工学により酵素を改良し、酸化剤に対して抵抗性の高いアルカリプロテアーゼも創製されるに至っている。
【０００４】
しかしながら、タンパク質工学を用いて創製した酵素は生産量の低下、比活性の低下などが認められる場合がある。また、このような改変酵素の使用範囲も限定されることが知られている。
【０００５】
本発明は、従来知られているアルカリプロテアーゼとはアミノ酸配列において相同性が低く、野生型でありながら酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【特許文献１】
特表平６−５０１５０９号公報
【非特許文献１】
Ｓｔａｕｆｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｔｓｏｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２４４，  ５３３３−５３３８  （１９６９）
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌のゲノムＤＮＡから公知のズブチリシンとアミノ酸配列において相同性の低いアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、種々検討したところ、酸化剤に対し影響を受け難い新規なアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、さらにこれを用いて新規なアルカリプロテアーゼを生産することに成功した。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質を提供するものであり、また、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【００１０】
【発明実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、或いは配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１１】
ここで、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１２】
本発明の配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列間の相同性は９８．９％と非常に高い。しかし、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、ズブチリシンＢＰＮ’及びズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇとは６７．６−７２．７％の相同性を示すにすぎない。さらに洗剤用アルカリプロテアーゼとして用いられているサビナ−ゼ、エスペラーゼ、ＫＡＰ（Ｍ−プロテアーゼ）とは５７．７−６２．６％の相同性を示すにすぎない。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＬＤ１株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５７６）由来のアルカリプロテアーゼで酸化剤耐性を有するＬＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＢ０８５７５２）とは６２．２−６３．０％、アルカリプロテアーゼＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＢ０９０３３４）、ＳＢ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ  ＡＢ０９６６８９）とは７４．６−８０．４％の相同性であった。さらに好アルカリ性バチルスＬＧ１２株由来のアルカリプロテアーゼＳｐｒＣとは８３．３％、ＳｐｒＤとは７５．７％の相同性を示した（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ６１，  ４４９０−４４９３，  １９９５）が、完全に一致するものではなかった。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示すものである。
【００１３】
参考までに、配列番号３と４におけるアミノ酸番号−１〜−１０４番の間、即ちプレプロ配列間における相同性は９８．１％と非常に高いが、上記した公知のアルカリプロテアーゼのプレプロ配列と比較した場合、２８．２−５６．０％の相同性を示すにすぎず、相同性の高い配列は見当たらない。
【００１４】
従って、本発明のタンパク質には、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質を包含するものである。斯かるアミノ酸配列における相同性は、より好ましくは９０％以上、さらに９５％以上であることが望ましい。
尚、ここで述べる相同性の検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムやマキシマムマッチング法を用いて算出することができる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、或いは配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、をコードするものであればよいが、（ａ）配列番号３又は４で示される塩基配列又は（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子が好ましい。
【００１６】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  −  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１７】
本発明のアルカリプロテアーゼは、その遺伝子と適当なベクターと宿主菌とを用いることにより大量に生産することができる。
当該遺伝子は、例えばバチルス属に属する微生物、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．  ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．  ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）等から、ショットガン法、ＰＣＲ法を用いクローニングすること、更に必要に応じて、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法、例えば変異導入用キット［Ｍｕｔａｎ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ  キット（タカラ）］等を用いて変異を導入すること、により調製することができる。
【００１８】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
【００１９】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２０】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２１】
斯くして得られた本発明アルカリプロテアーゼの特徴は、後記実施例に示すとおりであるが、特に、分子量が約２８，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）であり、最適反応ｐＨを９付近（グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液あるいはトリス／塩酸緩衝液）、最適温度を５５℃付近に有し、０．１％過酸化水素（ｐＨ１０）中で３０℃、１０分間処理した場合に５０％以上の残存活性を有することが望ましい。
【００２２】
【実施例】
実施例１  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来アルカリプロテアーゼ（ＫＳ）遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
ＫＳＭ−ＫＰ４３株は分子量２８ｋＤａ、４３ｋＤａ、及び７２ｋＤａのアルカリプロテアーゼを菌体外に生産することが判っている。それぞれのプロテアーゼは培養液からカラムクロマトグラフィーにより電気泳動的に均一にまで精製され、Ｎ末アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（４７６Ａ型：アプライドバイオシステムズ）により決定した。分子量２８ｋＤａのプロテアーゼＫＳのＮ末アミノ酸配列はＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅであった。また、バチルス属細菌由来で分子量２８ｋＤａのアルカリプロテアーゼにおいて活性中心に相当し、高度に保存されている２２１番目のＳｅｒ周辺のアミノ酸配列としてＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏが挙げられる（アミノ酸番号はスブチリシンＢＰＮ’を基準とした）。
【００２３】
そこで、本発明のプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングを行うに際し、上記２種類のアミノ酸配列の情報を基にプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を合成した。ＫＳＭ−ＫＰ４３株から斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２，  ６１９−６２９，  １９６３）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマー１と２を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ１０〜１００ｎｇ、各プライマー２０ｎｍｏｌ、Ｐｗｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム）を用いて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、４０〜６０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。
【００２４】
得られたＰＣＲ断片をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  キット（ロッシュ）にて精製し、ＳｍａＩにて消化したｐＵＣ１８に連結し、大腸菌ＨＢ１０１株に導入した。形質転換体よりＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  キット（ロッシュ）を用いてプラスミドを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ    Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）及びＤＮＡシークエンサー（３７７型：アプライドバイオシステムズ）を用いて約６５０ｂｐの塩基配列を決定した。
【００２５】
得られた配列情報を基にインバースＰＣＲにより構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＨｉｎｄＩＩＩにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、反応液と等量のＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  キット  ｖｅｒ．２（タカラ）を加え、１６℃で１昼夜ライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。先の部分遺伝子配列からプライマー３〜６（配列番号７〜１０）を合成し、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型とし、プライマー３及び４を、又、ＨｉｎｄＩＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型とし、プライマー３及び５又はプライマー４及び６を用いＬＡＴａｑ（タカラ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をｐＴ７  Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ  （ノバゲン）へクローニングし、ＥｃｏＲＩ分解物から約２．５ｋｂのＤＮＡ増幅断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ分解物から約０．２及び０．５ｋｂのＤＮＡ増幅断片がそれぞれ得られた。構築されたプラスミド内の挿入断片に関し、それぞれのプライマーを用いてプロテアーゼＫＳをコードする遺伝子〔１１３７ｂｐ：３７９アミノ酸（配列番号３）〕を含む２１６４ｂｐの塩基配列を決定した。
【００２６】
実施例２  アルカリプロテアーゼＫＳの組換え生産
アルカリプロテアーゼＫＳを大量に生産させるためにＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域（Ｓｕｍｉｔｏｍｏら，  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５９，  ２１７２−２１７５，  １９９５）及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｋ１６株由来のＭ−プロテアーゼ遺伝子のＳＤ配列（Ｈａｋａｍａｄａ  ら，  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ７８，  １０５−１０８，  １９９４）を利用したプラスミドを作製した。即ち、プライマー７（配列番号１１）並びにプライマー８（配列番号１２）を合成し、ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切断した後、同様の制限酵素で処理したｐＨＳＰ６４［プライマーＨＭ５（配列番号２１）及びＨＭ６（配列番号２２）を用いて増幅したＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域をｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位に導入したプラスミド］へ連結し（ｐＨＳＰＫＳ）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６６）の変異株（分子量２８ｋＤａ、７２ｋＤａの２種類のアルカリプロテアーゼ遺伝子を破壊した株）をエレクトロポレーション法で形質転換した。
【００２７】
スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（０．０５％炭酸ナトリウム並びに１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。得られた各形質転換体を５ｍＬの種母培地［６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン］に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。次いで３０ｍＬの主培地［８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン］に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００２８】
実施例３  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−９８６５株由来アルカリプロテアーゼ（ＭＳ）遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
【００２９】
実施例１で決定したアルカリプロテアーゼＫＳをコードする遺伝子の塩基配列並びにその上下流域の塩基配列情報を基に、プライマー９〜１５（配列番号１３〜１９）を合成した。ＫＳＭ−９８６５株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー９及び１０又はプライマー９及び１２又はプライマー１１及び１２又はプライマー１２及び１５又はプライマー１３及び１４を用い、実施例１に示した条件によりＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ断片を精製し、プライマー９〜１４を用いたダイレクトシークエンスを行い、アルカリプロテアーゼＭＳをコードする遺伝子〔１１３７ｂｐ：３７９アミノ酸（配列番号４）〕を含む２５５７ｂｐの塩基配列を決定した。
【００３０】
実施例４  アルカリプロテアーゼＭＳの組換え生産
実施例２と同様にアルカリプロテアーゼＭＳの生産を行った。即ち、ＫＳＭ−９８６５株のゲノムを鋳型にプライマー８並びに１６（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物を精製し、ｐＨＳＰ６４のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位に導入し、バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５株の変異株をエレクトロポレーション法で形質転換した。スキムミルク溶解斑の有無から形質転換体を選抜し、ポリペプトンＳ／マルトース系の培地にて振盪培養を行った。
【００３１】
実施例５  プロテアーゼＫＳの調製法
実施例２で得られた培養液５０ｍＬを脱イオン水で３倍に希釈し、２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したスーパーＱトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着し、同緩衝液で洗浄したところ、プロテアーゼ活性は、非吸着部に溶出した。活性画分を集め、最終濃度が１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウム及び２ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＢｕｔｙｌ−トヨパールカラム（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。１Ｍ硫酸アンモニウムから硫酸アンモニウム無添加の濃度まで濃度勾配法にて吸着タンパク質の溶出を行った結果、プロテアーゼ活性は、０．５Ｍ硫酸アンモニウム濃度付近に溶出された。この画分を限外濾過にて加水濃縮し（アミコン：ＹＭ３メンブレン）、予め２ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．６）で平衡化しておいたＣＭ―トヨパールカラム（東ソー：１．５×１４ｃｍ）に添着した。プロテアーゼ活性は非吸着画分として得られたので限外濾過にて加水濃縮を行った。濃縮液について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果、分子量約２８，０００の均一なタンパク質であることを確認した。また、本精製酵素の比活性は１５４Ｕ／ｍｇであった。尚、タンパク質量は牛血清アルブミンを標準とし、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて測定した。
【００３２】
実施例６  アルカリプロテアーゼＫＳの酵素学的性質
実施例５で得られた精製アルカリプロテアーゼＫＳの活性を測定する場合は以下に示す合成基質法により行った。
［合成基質法］
０．０５ｍＬの０．５Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９）、０．４ｍＬの脱イオン水及び０．０２５ｍＬの５０ｍＭ  ＡＡＰＦ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ：シグマ）からなる反応液を３０℃で３分間恒温した後、０．０２５ｍＬの酵素液を加え反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％（ｗ／ｖ）クエン酸を加え反応を停止した。４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１ｕｎｉｔは上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離する量とした。
【００３３】
（１）最適反応ｐＨ
ｐＨ４−１２の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、アルカリプロテアーゼＫＳはｐＨ９のグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液及びトリス／塩酸緩衝液中において最も高い分解活性を示した。さらにｐＨ７−１１．５の範囲で最大活性値の８０％以上の相対活性値を示した。尚、使用した緩衝液は、酢酸（ｐＨ４−６）、リン酸（ｐＨ６−８）、トリス／塩酸（ｐＨ７−９）、グリシン／水酸化ナトリウム（ｐＨ８−１１．５）、炭酸（ｐＨ９−１１）、ホウ酸（ｐＨ９−１１）及びリン酸／水酸化ナトリウム（ｐＨ１１−１２．５）であった。
【００３４】
（２）最適温度
５０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、３０〜８０℃の範囲で酵素反応を行った結果、アルカリプロテアーゼＫＳは５５℃において最も高い分解活性を示した。また、反応液に２ｍＭ塩化カルシウムを添加した場合、最大活性を与える反応温度は６０−６５℃にシフトし、カルシウム無添加系に比べ２０％程度の活性化が認められた。
【００３５】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）あるいはトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７）中、３０〜７５℃の範囲でアルカリプロテアーゼＫＳを１５分間恒温した。その後、氷冷し酵素反応を行った結果、３０℃以上では不安定であった。しかし、５ｍＭ塩化カルシウムを添加したそれぞれの系においては、５０℃まで安定であった。
【００３６】
（４）基質特異性
各種合成基質に対する相対比活性を調べた結果、ＡＡＰＦを１００％とした場合、ＡＡＰＬ（６３％）、ＡＩＰＭ及びＡＡＰＭ（１９％）、ＬＳＴＲ（２．８％）、ＡＡＶＡ（２．６％）、ＡＡＡ（１．３％）であった。
【００３７】
（５）酸化剤耐性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．０１〜５％となるように過酸化水素を添加し、アルカリプロテアーゼＫＳを加え３０℃で恒温した。１０分後、適当量のカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム）を加え余分な過酸化水素を除去し、残存活性を測定した。その結果、アルカリプロテアーゼＫＳは、０．１％の過酸化水素処理では５８％の活性が残存し、０．５〜５％の過酸化水素処理では３０％の残存活性を示した。対照に用いた洗剤用アルカリプロテアーゼＫＡＰは、０．１％の過酸化水素処理では４０％の活性が残存し、０．５〜５％の過酸化水素処理では７−１２％の活性が残存したに過ぎなかった。
【００３８】
以上の諸性質は実施例５に述べた方法にて精製したアルカリプロテアーゼＭＳにおいても同様の結果であった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、酸化剤に対する安定性を有しており、衣料用洗浄剤をはじめ各種産業用の酵素として有用である。
【配列表】
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