(57)【要約】【課題】抗齲蝕性だけでなく、包接能を併せ持つ新規なサイクロデキストランを開発すると共に、微生物を用いて当該サイクロデキストランを製造する方法を提供すること。【解決手段】グルコース１０〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン並びにバチルス属に属し、当該高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から当該高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする高分子サイクロデキストランの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース１０〜１６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン。
【請求項２】
バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から請求項１記載の高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項３】
バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養して得た微生物を溶菌させたものをデキストランと反応させ、反応物から請求項１記載の高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項４】
バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物がバチルス・エスピー３３０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８０）、同３５０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８１）、同３６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８２）又は同８６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８３）である請求項２又は３に記載の高分子サイクロデキストランの製造方法。
【請求項５】
バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストランを産生する能力を有するバチルス・エスピー３３０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８０）、同３５０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８１）、同３６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８２）又は同８６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８３）。
【請求項６】
請求項１記載の高分子サイクロデキストランを有効成分として含有することを特徴とする抗齲蝕剤。
【請求項７】
グルコース１０分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストランを有効成分として含有する包接能を有する水溶性環状オリゴ糖組成物。
【請求項８】
請求項１記載の高分子サイクロデキストランを有効成分として含有することを特徴とする飲食物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高分子サイクロデキストラン、その製造方法及びそれに用いる微生物に関する。詳しくは、グルコース分子がα−１，６結合でつながった構造の高分子サイクロデキストラン、その製造方法及びそれに用いる新規微生物並びにその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、サイクロデキストラン生産菌はバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｔ−３０４０（特許文献１）及びバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｕ−１５５（非特許文献１）の２種類しか報告されていない。しかも、これらはいずれもグルコース７分子がα−１，６結合でつながった環状オリゴ糖ＣＩ−７、グルコース８分子のＣＩ−８、グルコース９分子のＣＩ−９等の比較的低分子のサイクロデキストランを主に生産することが知られている。環状オリゴ糖ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９は、抗齲蝕作用と弱い包接能を有していることが報告されている。抗齲蝕能については、有効性が期待できるものの、包接能については同じ環状オリゴ糖であるサイクロデキストリンよりもかなり弱く、包接物質としての有効性は期待できるものではない（特許文献２）。また、これらＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９に側鎖を付与し、分岐サイクロデキストランを製造する技術も試みられたが、包接能が顕著に向上したものは未だ得られていない。
【０００３】
【特許文献１】
特開平６−１９７７８３号公報
【非特許文献１】
ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ    ＤＮＡデータベース    アクセッション番号Ｄ８８３６０
【特許文献２】
特開平８−５９４８４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
サイクロデキストランはα−１，６結合という構造をとっているため、極めて水溶性が高い。そのため、この物質が包接能を有していれば、食品、医薬品、化成品等への幅広い利用が期待される。
本発明は、前記環状オリゴ糖とは結合したグルコース数が異なり、抗齲蝕性だけでなく、包接能も併せ持つ新規なサイクロデキストランを開発することを目的としている。
さらに、本発明は、かかる新規なサイクロデキストランを産生する微生物の探索と当該微生物を用いて新規なサイクロデキストランを製造する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、製糖工場において採取したサンプルから高分子のサイクロデキストランを生産する能力を有する微生物群を探索することに成功した。そして、これらの微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）属に属し、デキストランから１０個以上のグルコース分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストランを生産することを見出して、本発明を完成するに至った。
【０００６】
請求項１記載の本発明は、グルコース１０〜１６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストランである。
請求項２記載の本発明は、バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養し、培養物から請求項１記載の高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の高分子サイクロデキストランの製造方法である。
請求項３記載の本発明は、バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物をデキストランを含む培地で培養して得た微生物を溶菌させたものをデキストランと反応させ、反応物から請求項１記載の高分子サイクロデキストランを採取することを特徴とする請求項１記載の高分子サイクロデキストランの製造方法である。
請求項４記載の本発明は、バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストラン生産能を有する微生物がバチルス・エスピー３３０Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９０８０）、同３５０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８１）、同３６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８２）又は同８６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８３）である請求項２又は３に記載の高分子サイクロデキストランの製造方法である。
【０００７】
請求項５記載の本発明は、バチルス属に属し、請求項１記載の高分子サイクロデキストランを産生する能力を有するバチルス・エスピー３３０Ｋ株（ＦＥＲＭＰ−１９０８０）、同３５０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８１）、同３６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８２）又は同８６０Ｋ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８３）である。
請求項６記載の本発明は、請求項１記載の高分子サイクロデキストランを有効成分として含有することを特徴とする抗齲蝕剤である。
請求項７記載の本発明は、グルコース１０分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストランを有効成分として含有する包接能を有する水溶性環状オリゴ糖組成物である。
請求項８記載の本発明は、請求項１記載の高分子サイクロデキストランを有効成分として含有することを特徴とする飲食物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
請求項１記載のグルコース１０〜１６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストランは、請求項２、３記載の方法によって製造することができる。
当該高分子サイクロデキストランの生産菌は、いずれもバチルス属に属する。これら微生物は、製糖工場から分離した菌株であり、バチルス・３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株などが挙げられる。
以下において、本発明を詳しく説明する。
【０００９】
本発明の高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩと略記することがある。）は、グルコース１０分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１０という。）、グルコース１１分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１１という。）、グルコース１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１２という。）、グルコース１３分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１３という。）、グルコース１４分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１４という。）、グルコース１５分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１５という。）及びグルコース１６分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストラン（以下、ＣＩ−１６という。）である。
【００１０】
上記ＣＩの生産菌であるバチルス属菌株は、例えば次に示す方法で取得することができる。
製糖工場においてサンプルを採取し、生理食塩水に懸濁して適宜希釈液を作成する。次いで、希釈液を０．２％のブルーデキストランを含む平板培地（ｐＨ７．０）に塗抹し、該平板に生育した多数のコロニーの中から、ブルーデキストランの分解による透明なハローを形成しているコロニーを取得する。
取得した菌株について、さらに選抜試験を行って多分岐デキストラン水解酵素（以下、ＨＢＤａｓｅという）により分解されない環状オリゴ糖であって、しかも既知の環状オリゴ糖であるＣＩ−９よりも高分子のものを中心に生産することできる菌株を選抜する。
【００１１】
取得方法を要約すると、以下の通りである。
（１）自然界よりブルーデキストラン平板培地上でハローを形成する菌の分離、（２）デキストランを含む液体培養液で培養後、溶菌液に再びデキストランを加えてインキュベートし、オリゴ糖を生産する菌の分離、（３）反応液中のオリゴ糖が逆相Ｃ１８カラムに吸着し、２０％エタノールで溶出する菌の分離、（４）前記２０％エタノール溶出画分がＨＢＤａｓｅで分解されない環状オリゴ糖液を生産する菌の分離、（５）前記環状オリゴ糖をＡｍｉｄｅ−８０カラムを用いてＨＰＬＣ分析したとき、ＣＩ−９が溶出するリテンションタイムよりも後ろに検出される高分子サイクロデキストランを主として生産する株を選抜する。
【００１２】
本発明に係るバチルス属菌株の取得方法の詳細について、以下に示す。
製糖工場においてサンプルを採取し、生埋食塩水に懸濁し、適宜希釈液を作成して、該希釈液を１リットル中にブルーデキストラン（ファルマシア社製）２ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇ、寒天（バクト社製）１５ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した平板培地に塗抹し、平板に生育したコロニーの中から、ブルーデキストランの分解によるハローを形成しているコロニーをデキストラナーゼ生産株として一次スクリーニングする。
次に、選抜菌株を１リットル中にデキストランＴ５００（ファルマシア社製）５ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で一晩から２日間振盪培養した後に、菌体を遠心分離で集め、界面活性剤Ｂ−ＰＥＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を加えて溶菌し、これを粗酵素液とする。これにデキストランＴ４０（ファルマシア社製）を加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で４０℃で２４〜４８時間ゆるやかに振盪しながら反応を行う。
【００１３】
これにＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中で３０℃で一晩反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖またはデキストランをすべてグルコースまで分解する。ＨＢＤａｓｅは、特開平１０−２２９８７６号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー  Ｖ−５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０８６）を培養して得られたものでもよく、また、特開２００１−０５４３８２号公報記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１０）等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。
この反応液をＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）などの逆相カラムに通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖又はデキストランを除く。次に、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出する。
なお、逆相カラム処理とＨＢＤａｓｅ処理の順番は入れ換えてもよい。
【００１４】
反応液をＨＢＤａｓｅ処理、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）などの逆相カラム処理したものを高速液体クロマトグラフＰＵ−９８０（日本分光社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速１ｍｌ／分及び噴霧蒸発光散乱検出器ＳＥＤＥＸ５５（ＳＥＤＥＲＥ社製）で、分析ソフトウェアＢＯＷＩＮ（日本分光社製）を用いて分析し、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖のピークがＣＩ−９が溶出するリテンションタイムよりも後ろに検出されれば、高分子環状オリゴ糖生産菌と推定できる。
図１に上記の方法で高分子環状オリゴ糖生産菌として分離されたバチルス属菌株３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株又は同８６０Ｋ株が生産するＨＢＤａｓｅ非分解性オリゴ糖の高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）による測定結果を示す。いずれの菌株においても、ＣＩ−９より後ろのリテンションタイムにオリゴ糖ピークｄ、ｅ、ｆが観察できる。図１は、測定時間２０分までのデータであるが、ピークｆ以降に溶出する高分子環状オリゴ糖が生成している可能性もあると考えられる。
【００１５】
このようにして取得した菌株が、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株である。これらの菌株は、後記する菌学的性質を有しており、さらに菌体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより１６ＳリボソーマルＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の特定領域を増幅し、塩基配列を決定して既知の配列との相同性を検索した結果、いずれの菌株もＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に帰属することが判明した。
これらバチルス属菌株４株は、いずれも新菌種と認められ、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、それぞれの受託番号はバチルス・エスピー３３０Ｋ株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８０、同３５０Ｋ株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８１、同３６０Ｋ株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８２、同８６０Ｋ株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０８３である。
【００１６】
次に、本発明に係るグルコース１０〜１２分子がα−１，６結合により環状構造を形成してなる高分子サイクロデキストランの製造方法について述べる。
上記の高分子サイクロデキストラン生産能を有するバチルス属菌株を前記したデキストランを含む培地に接種し、前記した方法にしたがって培養することによって目的とする高分子サイクロデキストランの生産を行った後、高速液体クロマトグラフＰＵ−９８０（日本分光社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速０．６ｍｌ／分で溶出し、溶出液を０．６ｍｌずつ分取分画する。それぞれの画分を１０μＬ〜５０μＬずつとり、再び高速液体クロマトグラフＰＵ−９８０（日本分光社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速１ｍｌ／分及び噴霧蒸発光散乱検出器ＳＥＤＥＸ５５（ＳＥＤＥＲＥ社製）で分析ソフトウェアＢＯＷＩＮ（日本分光社製）を用いて分析し、目的のオリゴ糖（図１に示したａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）を含むフラクションがどれであるかを分析する。図１に示したａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆを含むフラクションにつき各々、遠心濃縮機によりアセトニトリルを除去する。次いで、凍結乾燥する。なお、上記した本発明に係る高分子サイクロデキストランの製造方法は、１例であり、この方法に限定されるものではない。
【００１７】
本発明に係る高分子サイクロデキストランＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２、ＣＩ−１３、ＣＩ−１４、ＣＩ−１５及びＣＩ−１６は、デキストランスクラーゼ活性やグルコシルトランスフェラーゼ活性の阻害作用を有しているので、当該物質を有効成分として含有させて抗齲蝕剤として用いることができる。例えば、ｐＨが５．５〜７．０、温度３０〜３７℃の条件では、高分子サイクロデキストラン０．２ｍＭもしくはそれ以上の濃度で、ショ糖５％存在下において、齲蝕菌であるミュータンス連鎖球菌のグルコシルトランスフェラーゼが歯垢の原因となるグルカンを合成する作用を阻害する。
さらに、塩基性染料であるビクトリアブルーに対する包接試験の結果、上記の高分子サイクロデキストランのうち、ＣＩ−１０は有効、かつ安定的にビクトリアブルーを包接する作用を有している。しかも、本発明に係る高分子サイクロデキストランは、いずれも水溶性である。ＣＩ−１０の包接能については、０．６ｍＭもしくはそれ以上の濃度で、２５℃において、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で０．０３２ｍＭの濃度のビクトリアブルーの青色の褪色を抑制することができる。
したがって、当該高分子サイクロデキストランを食品、医薬品、化成品に応用し、特定成分の包接に利用することができる。
【００１８】
【実施例】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例１
（１）製糖工場において、粗糖生産工程に生ずる中間産物及び製糖工場内の土壌を採取した。
（２）上記のサンプル５ｇを滅菌生埋食塩水４５ｍｌに懸濁させ、懸濁液を適宜に希釈した。該希釈液を１リットル中にブルーデキストラン（ファルマシア社製）２ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、寒天（バクト社製）１５ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した平板培地に滅菌コンラージ棒で塗抹して３０℃で１晩から２日間培養し、平板に生育したコロニーの中から、ブルーデキストランの分解によるハローを形成しているコロニーをデキストラナーゼ生産株として一次スクリーニングした。
【００１９】
上記で取得したコロニーを白金耳で採り、再び新鮮な上記の０．２％ブルーデキストラン平板培地に塗抹し、３０℃で１晩から２日間培養する操作をさらに２回繰り返して目的とする菌株を純粋分離した。
試験管に、前記０．５％デキストランＴ５００（ファルマシア社製）を含む培地に２％寒天を加えた組成の培地を加え、１２１℃で２０分オートクレーブした後、斜めに静置し、室温で固めて調製した保存培地とした。この保存培地に上記で得られた菌株を白金耳を用いて画線した。これを３０℃で２日間培養し、保存菌株とした。
この保存菌株の１白金耳を、上記の０．５％デキストランＴ５００（ファルマシア社製）を含む液体培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌したものに接種し、振盪しながら３０℃で２４時間培養した。
【００２０】
次いで、上記菌株を、１リットル中にデキストランＴ５００（ファルマシア社製）５ｇ、酵母エキス（バクト社製）５ｇ、トリプトン（バクト社製）１０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇを含み、ｐＨを７．０に調整した液体培地に接種し、３０℃で一晩から２日間振盪培養した後に、菌体を遠心分離（１０，０００ｒｐｍで２０分間）で集め、得られた菌体をいったん−８０℃で凍結し、これに界面活性剤Ｂ−ＰＥＲＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）３ｍｌを加えて溶菌し、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液に、最終濃度が４％になるように、デキストランＴ４０（ファルマシア社製）１．６ｇ及び最終濃度が２０ｍＭになるように、ＣａＣｌ２  ・２Ｈ２  Ｏ  ０．１２ｇ及び８０ｍＭ    酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、全量が４０ｍｌになるように調整し、４０℃で２４〜４８時間ゆるやかに振盪しながら反応を行った。
【００２１】
次いで、１００℃で１０分加熱して反応を終了させた後、冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。遠心上清にＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中にて３０℃で１２時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖又はデキストランをすべてグルコースまで分解した。ここで、ＨＢＤａｓｅは特開平１０−２２９８７６号公報記載のスフィンゴバクテリウム・エスピー  Ｖ−５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０８６）を培養して得られたものでもよく、また特開２００１−０５４３８２号公報記載の大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−３）（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７５１０）等の多分岐デキストラン水解酵素遺伝子を導入した大腸菌形質転換体を培養して得られたものでもよい。これを１００℃で１０分加熱後冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【００２２】
このようにして得た遠心上清を逆相カラムＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖又はデキストランを除いた。次いで、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。これを遠心エバポレーターによってエタノールを取り除き、乾燥させた後、５０％アセトニトリルに溶かして１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、ごみを取り除いた。
【００２３】
上記方法で得た反応液を、高速液体クロマトグラフＰＵ−９８０（日本分光社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速１ｍｌ／分及び噴霧蒸発光散乱検出器ＳＥＤＥＸ５５（ＳＥＤＥＲＥ社製）、分析ソフトウェアＢＯＷＩＮ（日本分光社製）を用いて分析し、ＨＢＤａｓｅによって分解されないオリゴ糖のピークがＣＩ−９が溶出するリテンションタイムよりも後ろに検出されるものを選抜することにより取得した。
その結果、取得した高分子サイクロデキストラン生産株は、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株の４株である。
【００２４】
実施例２
実施例１で得られた４菌株について、それぞれ寒天平板培地上でのコロニー形態、顕微鏡観察による細胞形態、グラム染色、胞子の有無、鞭毛による運動の有無およびカタラーゼ、オキシダーゼ、ブドウ糖の酸化発酵（ＯＦ）などの観察・試験を行った。その結果、いずれもバチルス属菌株に帰属することを分類同定した。第１表に細菌同定第一段階試験結果を示す。
【００２５】
【表１】
第１表
2004166624.tif 000002
【００２６】
上記４菌株のそれぞれをＬＢ  Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）＋寒天培地に植菌し、３０℃で１日培養した。培養物より採取した菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡの抽出には、ＰｒｅｐＭａｎＴＭＭｅｔｈｏｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。
抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより１６Ｓ  リボソーマルＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）のうち５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅し、塩基配列をシーケンスして解析に使用した。ＰＣＲ産物の精製、サイクルシークエンスには、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  ５００  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。
サーマルサイクラーには、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＤＮＡシーケンサーには、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。
また、ゲノムＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの操作に関しては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３０８１３２Ｒｅｖ．Ａ）に従った。
【００２７】
得られた１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を使って相同性検索、系統樹の作成をして検体の近縁種及び帰属分類群の検討を行った。相同性検索及び系統樹の作成には、ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ．１．４．１及びＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｖ．００２３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。ＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ５００  Ｌｉｂｒａｒｙでの相同率が９７％以下であった場合は、ＢＬＡＳＴを用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対して相同性検索を行った。
配列表の配列番号１にバチルス・エスピー３３０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、配列番号２に同３５０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、配列番号３に同３６０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、配列番号４に同８６０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、それぞれ示す。
【００２８】
バチルス・エスピー３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株、同８６０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、互いに一致し、バチルス・エスピー３３０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列は、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株、同８６０Ｋ株の配列に９９．１％の相同性があった。
ＭｉｃｒｏＳｅｑを用いた解析の結果、バチルス・エスピー３３０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は、９２．９１％でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。また、バチルス・エスピー３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分塩基配列は、９３．１０％でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。
【００２９】
ＢＬＡＳＴを用いたＧｅｎＢａｎｋに対する相同性検索の結果、バチルス・エスピー３３０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは９８．１％で、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは９８．７％で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＭＮ−００３株に対し最も高い相同性を示した。
一方、分子系統樹上では、図２に示す通り、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株、同８６０Ｋ株共にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｏｌｅｒｏｎｉｕｓの１６Ｓ  ｒＤＮＡとクラスターを形成したが、帰属種の推定に有効なほどの近縁種は示されなかった。
以上の結果から、現時点では、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株、同８６０Ｋ株の１６Ｓ  ｒＤＮＡと一致する塩基配列は登録されていないと考えられる。これら４株は、いずれもＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．に帰属することが妥当であると結論された。
【００３０】
実施例３
この例では、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株の４菌株を用いて、高分子サイクロデキストランの生産を行った。
まず、前記の０．５％デキストランＴ５００（ファルマシア社製）を含む液体培地５ｍＬを試験管に入れて１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌したものに、各菌株の１白金耳を接種し、振盪しながら３０℃で２４時間培養した。
次に、デキストランＴ５００（ファルマシア社製）０．５％、酵母エキス（バクト社製）０．５％、トリプトン（バクト社製）１．０％、ＮａＣｌ  １．０％を含む液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌したものに、上記の種培養液１ｍｌを加え、３０℃で２４〜４８時間振盪培養した。
【００３１】
培養終了後、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して集めた菌体を−８０℃で凍結し、これに界面活性剤Ｂ−ＰＥＲＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）３ｍｌを加えて溶菌し、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液に４％  デキストランＴ−４０（ファルマシア社製）、２０ｍＭＣａＣｌ２  、８０ｍＭ    酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を加え、全量が４０ｍｌになるように調整し、４０℃で２４〜４８時間ゆるやかに振盪しながら反応を行った。
【００３２】
次いで、１００℃で１０分加熱して反応を終了させた後、冷却し、８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。
遠心上清にＨＢＤａｓｅを加え、２０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中にて３０℃で２４時間反応を行い、残存した直鎖のオリゴ糖又はデキストランをすべてグルコースまで分解した。次いで、１００℃で１０分間加熱後、冷却して８，０００ｒｐｍで２０分間遠心し、沈殿を取り除いた。
【００３３】
このようにして得た遠心上清を逆相カラムＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（ウォーターズ社製）に通し、水で洗浄し、吸着しない直鎖のオリゴ糖又はデキストランを除いた。さらに、２０％エタノールでカラムに吸着している画分を溶出した。
サイクロデキストランを含む画分を高速液体クロマトグラフＰＵ−９８０（日本分光社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速０．６ｍｌ／分で溶出し、溶出液を０．６ｍｌずつ分取分画した。
それぞれの画分を１０μＬ〜５０μＬずつとり、再び高速液体クロマトグラフＰＵ−９８０（日本分光社製）とＡｍｉｄｅ−８０カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）（東ソー社製）を用いて５５％アセトニトリルで流速１ｍｌ／分及び噴霧蒸発光散乱検出器ＳＥＤＥＸ５５（ＳＥＤＥＲＥ社製）で分析ソフトウェアＢＯＷＩＮ（日本分光社製）を用いて分析し、目的のオリゴ糖（図１に示したａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ）を含むフラクションがどれであるかを分析した。
図１に示したａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆを含むフラクションにつき各々、遠心濃縮機によりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥した。
【００３４】
このようにして得られたオリゴ糖の構造を１３Ｃ  ＮＭＲで解析した。具体的には０．５〜１．４ｍｇ／０．６ｍｌの濃度の環状オリゴ糖溶液になるように、重水（Ｄ２  Ｏ）（アルドリッチ社製）に溶かし、指標として０．０２５％  ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＤＳＳ）を加え、６００ＭＨｚのＮＭＲ装置（ＤＲＸ６００）（Ｂｒｕｋｅｒ社製）により２９８Ｋで、完全デカップリングの条件で１３Ｃ一次元スペクトルを測定した。
対象として既に構造解析がなされ、８個のグルコースがα−１，６結合で環状につながった構造をしていると明らかになっているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  Ｔ−３０４０株が生産するＣＩ−８も同じ条件で１３Ｃ  ＮＭＲで解析した。その結果、図３に示すように、本発明に係る４菌株が生産するオリゴ糖のうち、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆは、ＣＩ−８と全く同様のα−１，６結合のグルコースを示すシグナルのみ現れた。また、ピークａについては、収量が少なく夾雑物が多いために、シグナルに乱れが生じたが、概ねα−１，６結合のグルコースを示すシグナルのみであると考えられた。
【００３５】
次に、上記で得られたオリゴ糖の質量分析を行った。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの凍結乾燥標品それぞれ０．１ｇを５μＬのＨ２  Ｏで溶解し、マトリックスにグリセロールを用い、ＨＸ−１１０Ａ／１１０Ａ（ＪＥＯＬ社製）で二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）で測定を行った。測定は、正イオンモード及び負イオンモードで実施した。正イオンモードで測定した結果を図４に示す。
サイクロデキストランは、同じグルコース分子より成る直鎖のイソマルトオリゴ糖よりもＨ２  Ｏが１分子少なく、それぞれのサイクロデキストランの分子量は、ＣＩ−７が１１３４、ＣＩ−８が１２９６、ＣＩ−９が１４５８、ＣＩ−１０が１６２０、ＣＩ−１１が１７８２、ＣＩ−１２が１９４４と計算される。
質量分析によるオリゴ糖ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの推定分子量はａがＣＩ−７、ｂがＣＩ−８、ｃがＣＩ−９、ｄがＣＩ−１０、ｅがＣＩ−１１、ｆがＣＩ−１２の分子量に一致した。
【００３６】
前記１３Ｃ  ＮＭＲ分析及び上記の質量分析の結果、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株が原料のデキストランより生産するオリゴ糖ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆはすべてグルコースがα−１，６結合で環状につながった環状イソマルトオリゴ糖、すなわちサイクロデキストランであり、それらの分子式は下記のように示されることが判明した。
ａ：  Ｃ４２Ｈ７０Ｏ３５
ｂ：  Ｃ４８Ｈ８０Ｏ４０
ｃ：  Ｃ５４Ｈ９０Ｏ４５
ｄ：  Ｃ６０Ｈ１００  Ｏ５０
ｅ：  Ｃ６６Ｈ１１０  Ｏ５５
ｆ：  Ｃ７２Ｈ１２０  Ｏ６０
【００３７】
上記４菌株は、グルコース１０〜１２分子が結合したＣＩ−１０、ＣＩ−１１及びＣＩ−１２のサイクロデキストランを主として生産するが、その他に少量であるが、ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９も生産する。さらに、前記の如く、ピークｆ以降にＣＩ−１３〜ＣＩ−１６などの高分子環状オリゴ糖を生産する可能性もある。
以上の結果から、バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び８６０Ｋ株は、高分子サイクロデキストランを中心に生産する新規のバチルス属菌株であることが明らかになった。
【００３８】
実施例４
次に、本発明に係る高分子サイクロデキストラン（ＣＩ）の機能について調べた。はじめに、ＣＩの抗齲蝕能を調べた。
実施例３で得た高分子サイクロデキストランＣＩ−１０及びＣＩ−１１について、ロイコノストック・メセンテロイデス菌由来のデキストランスクラーゼ阻害効果を測定した。すなわち、反応液２０μｌ中に、終濃度５％スクロースを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）にＣＩを最終濃度０〜１ｍＭになるように添加し、デキストランスクラーゼを加え、３０℃で１０分酵素反応を行った後、スクロースの分解によって生じるフラクトースの量をネルソン・ソモギー法により還元糖量として測定した。ここで用いたロイコノストック・メセンテロイデス由来のデキストランスクラーゼは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＮＲＲＬ  Ｂ−５１２Ｆ株をスクロースを加えた培地中で培養することにより得られた酵素を用いた。
ＣＩ−１０、ＣＩ−１１並びに対照としてのＣＩ−８によるデキストランスクラーゼ阻害試験の結果を図５に示す。図５から明らかなように、ＣＩ−１０及びＣＩ−１１もＣＩ−８と同様に、１ｍＭの濃度で約５０％の阻害が見られ、抗齲蝕性を有すると認められる。なお、ＣＩ−１２以上のものについても、その構造から他のＣＩと同様に、デキストランスクラーゼ活性阻害があるものと推定できる。
【００３９】
次に、ＣＩ−１０及びＣＩ−１１のストレプトコッカス・ミュータンス菌由来のグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）阻害効果について調べた。すなわち、ＣＩによるＧＴＦ活性の阻害は、反応液２０μｌ中に終濃度５％のスクロースを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）又は２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にＣＩを最終濃度０〜２ｍＭになるように添加し、ＧＴＦを加え、３７℃で１８時間酵素反応を行った後、生じた不溶性グルカンを遠心で集めて、該グルカンの量をフェノール硫酸法で全糖量を定量することにより測定した。なお、ここで用いたストレプトコッカス・ミュータンス由来のＧＴＦは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓを培養することによって得られたものである。
ＣＩ−１０、ＣＩ−１１並びに対照としてのＣＩ−８によるグルコシルトランスフェラーゼ阻害試験の結果を図６に示す。図６から明らかなように、ＣＩ−１０及びＣＩ−１１の場合も、ＣＩ−８と同様に、生成するグルカン量の減少が見られ、抗齲蝕性を有すると考えられる。なお、ＣＩ−１２以上のものについても、その構造から他のＣＩと同様にＧＴＦ活性阻害があるものと推定できる。
【００４０】
さらに、ＣＩ−１０、ＣＩ−１１及びＣＩ−１２のビクトリアブルーに対する包接試験を行った。すなわち、反応液５０μｌ中に終濃度０．０３２ｍＭのビクトリアブルーＢ（ワコー社製）、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．２ｍＭのＣＩ、あるいはサイクロデキストリン（ＣＤ）又はグルコース（Ｇｌｃ）を加え、室温で保持して６２０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、図７に示したように、対照として用いたＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９、並びにＣＩ−１１、ＣＩ−１２及びα−ＣＤは、グルコース添加の反応液や無添加の反応液の場合と同様に、６２０ｎｍにおける吸光度の減少が見られ、顕著なビクトリアブルーＢの包接能は見出せなかった。しかし、ＣＩ−１０を加えた反応液は、２２時間経過した後も、反応開始時に比較して、約５０％の吸光度を示した。これはβ−ＣＤ及びγ−ＣＤよりも高い値であり、ＣＩ−１０は有効にビクトリアブルーを包接するものと考えられる。
【００４１】
ＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９などの低分子サイクロデキストランの包接能が低い理由は、同じグルコース分子数のサイクロデキストリンに比べて環の口径が大きく、浅い構造をしているため、物質を保持する力が弱いものと考察される。一方、口径の大きいＣＩ−１０に高い包接能を有している理由として、分子が大きくなったために、よじれた構造をとっている可能性が推定できる。ＣＩ−１１、ＣＩ−１２も、８の字のようなよじれた構造を形成する可能性が推察できることから、包接能を有する物質が今後見出されることが期待できる。すなわち、本発明に係る４菌株は、前記の如く、ＣＩ−１３〜ＣＩ−１６という高分子のＣＩを生産する可能性があり、これらの物質にも包接能が期待できる。
【００４２】
ＣＩ−１０、ＣＩ−１１及びＣＩ−１２にビクトリアブルーを加えて吸収スペクトルの変化を測定した。すなわち、反応液５０μｌ中に終濃度０．０３２ｍＭのビクトリアブルーＢ（ワコー社製）、１００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．２ｍＭのＣＩ、あるいはＣＤ又はグルコースを加え、室温で６時間保持した後に３００ｎｍから８００ｎｍにおける吸収スペクトルの変化を分光光度計  ＵＶ／ＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｖ−５５０）（日本分光社製）を用いて測定した。
その結果を図８に示す。この図から、ビクトリアブルーに対する高い包接能を示したＣＩ−１０を加えた反応液は、吸収スペクトルの形に顕著な変化が見られ、ＣＩ−１０が有効にビクトリアブルーを包接することの裏付けになると考えられた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により新規な高分子サイクロデキストランが提供される。この物質は、バチルス属菌株であるバチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株及び同８６０Ｋ株を培養することにより得られる。
これらの菌株は、従来のサイクロデキストラン生産菌株と比べて、より高分子のサイクロデキストランを中心に生産するので、高分子サイクロデキストランの生産に適している。
【００４４】
しかも、本発明のバチルス属菌株が生産する高分子サイクロデキストランは、抗齲蝕剤として利用できる。また、当該高分子サイクロデキストランのうち、ＣＩ−１０は包接能を持ち、かつ高い水溶性であることから、食品、医薬品、化成品などに応用できる。ＣＩ−１０が包接する化合物は、γ−ＣＤにもよく包接されることから、これまでにγ−ＣＤに包接されることが知られている物質をＣＩ−１０が有効に包接する可能性がある。また、当該高分子サイクロデキストランは、サイクロデキストリンに比べて水溶性が非常に高いことから、不溶性物質の包接による可溶化の効果がサイクロデキストリンよりも高いことが期待できる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）バチルス・エスピー３３０Ｋ株、（ｂ）同３５０Ｋ株、（ｃ）同３６０Ｋ株及び（ｄ）同８６０Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖を示すＨＰＬＣ分析の図である。
【図２】（ａ）バチルス・エスピー３３０Ｋ株、（ｂ）同３５０Ｋ株、（ｃ）同３６０Ｋ株並びに（ｄ）同８６０Ｋ株の分子系統樹を示す図である。
【図３】バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株並びに同８６０Ｋ株がが生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ及び既知のサイクロデキストランＣＩ−８について１３Ｃ  ＮＭＲ分析した結果を示す図である。
【図４】バチルス・エスピー３３０Ｋ株、同３５０Ｋ株、同３６０Ｋ株並びに同８６０Ｋ株が生産する、ＨＢＤａｓｅで分解されないオリゴ糖ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆを質量分析した結果を示す図（（ａ）〜（ｆ））である。
【図５】高分子サイクロデキストランＣＩ−１０及びＣＩ−１１のデキストランスクラーゼ活性の阻害作用を既知のサイクロデキストランＣＩ−８と比較した図である。
【図６】高分子サイクロデキストランＣＩ−１０及びＣＩ−１１のＧＴＦ阻害作用を既知のサイクロデキストランＣＩ−８と比較した図である。（ａ）はｐＨ５．５、（ｂ）はｐＨ７．０での結果を示す。
【図７】高分子サイクロデキストランＣＩ−１０、ＣＩ−１１、ＣＩ−１２のビクトリアブルーの包接能を既知のサイクロデキストランＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９及びα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、グルコースと比較した図である。
【図８】ビクトリアブルーに高分子サイクロデキストランＣＩ−１０、ＣＩ−１１又はＣＩ−１２を加えた溶液の吸収スペクトルを、既知のサイクロデキストランＣＩ−７、ＣＩ−８、ＣＩ−９及びα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、グルコースを加えた場合と比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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