(57)【要約】      （修正有）【課題】デキストランをオリゴ糖に分解する活性のあるデキストラン分解酵素の提供。【解決手段】ブルーチーズの水溶性画分中にデキストランをイソマルトオリゴ糖を主体とするオリゴ糖に分解するデキストラン分解活性があることを見出し、このデキストラン分解酵素を抽出精製した。本発明のデキストラン分解酵素は、分子量：約６５ｋＤａ、等電点：約４．９、至適ｐＨ：約４．５〜６．５、至適温度：約３７℃であり、特定のＮ末端アミノ酸配列を持つ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質を有するブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素。
１）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約６５  ｋＤａを示す。
２）等電点：約４．９
３）至適ｐＨ：約４．５〜６．５
４）至適温度：約３７℃
【請求項２】
Ｎ末端アミノ酸配列が、Ａｌａ‐Ｔｈｒ‐Ｐｒｏ‐Ａｓｐ‐Ｇｌｕ‐Ｔｒｐ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｉｌｅ‐Ｔｙｒ‐Ｐｈｅ‐Ｍｅｔ‐Ｌｅｕ‐Ｔｈｒ‐Ａｓｐ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ａｌａである請求項１記載のデキストラン分解酵素。
【請求項３】
ブルーチーズの水溶性画分からカゼインを除去して硫安沈殿させた後、透析して得た粗酵素をゲルろ過し、等電点電気泳動法及び／又はイオン交換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とするデキストラン分解酵素の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブルーチーズから得られる新規なデキストラン分解酵素に関する。
本発明により、デキストランをオリゴ糖に分解するデキストラン分解酵素を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
デキストランはＤ−グルコースからなる多糖類であって、主として、α−Ｄ１，６結合を持ち、α−Ｄ１，３分枝あるいはα−Ｄ１，２分枝を持つこともある。デキストランは、ロイコノストック・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）あるいはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などの微生物によって分泌される酵素デキストランスクラーゼによってスクロースから合成される（例えば、非特許文献１参照。）。デキストラン分子間を試薬で架橋したゲル状物質を水に懸濁させて膨潤させると、その中に高分子は入り込めないので高分子と低分子を分別することができ、この性質を利用してたん白質の精製などに用いられている。このように架橋させたものがセファデックスやセファロース（いずれも商品名）などのゲル状物質であり、分析や精製に広く使用されている。また、デキストラン及びその部分分解物は代用血漿や血流改善剤などの医薬品、保湿剤などの化粧品、写真用フィルム添加剤や製糖などの幅広い用途を持つ。したがって、デキストランを分解するデキストラン分解酵素も需要が多く，種々の性状を持ったデキストラン分解酵素が求められている。
【０００３】
本発明のデキストラン分解酵素の由来であるブルーチーズは、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）というペニシリウム属のかびをスターターとして製造される。チーズ中に一般に見られる酵素は、これらの微生物によって生成されるが、このような酵素の働きによって、チーズの熟成期間中にチーズ独特の風味を産生する。ブルーチーズ中には、プロテアーゼ（例えば、非特許文献２参照。）、アルカリフォスファターゼ活性（例えば、非特許文献３参照。）、アスパラギン酸プロティナーゼ（例えば、非特許文献４参照。）、フラクトシル基転移酵素（例えば、非特許文献５参照。）などの酵素の存在が報告されている。しかし、デキストラン分解活性を持つ酵素については知られていない。
【０００４】
【非特許文献１】
エス  エー  ウル−カデル（Ｓ．Ａ．Ｕｌ−Ｑａｄｅｒ）外３名、「バイオテクノロジー  アンド  アプライド  バイオケミストリー（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」  ２００１年、第３４巻（パート２）、ｐ．９３−９７
【非特許文献２】
エム  デー  ラーセン（Ｍ．Ｄ．Ｌａｒｓｅｎ）外２名、「インターナショナル  ジャーナル  オブ  フード  マイクロバイオロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、  １９９８年、第４３巻、第３号、ｐ．２１５−２２１
【非特許文献３】
アイ  ローゼンタール（Ｉ．Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）外１名、「ジャーナル  オブ  デアリーサイエンス（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、  １９９６年、第７９巻、第１号、ｐ．１６−１９
【非特許文献４】
イー  ブラック（Ｅ．Ｂｒａｃｑ）外２名、「ジャーナル  オブ  デアリー  リサーチ（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、  １９９７年、第６４巻、第１号、ｐ．１０５−１１３
【非特許文献５】
ケー  ワイ  ヤング（Ｋ．Ｙ．Ｊａｎｇ）外１名、「レター  オブ  アプライド  マイクロバイオロジー（Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、１９９６年、第２２巻、第６号、ｐ．３９７−３９９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
デキストランをオリゴ糖まで分解するデキストラン分解酵素は需要が多く，種々の性状を持ったデキストラン分解酵素が求められている。本発明は、デキストランをオリゴ糖に分解する活性のあるデキストラン分解酵素を提供することを課題とするものである。本発明のデキストラン分解酵素により、可溶性のデキストランをイソマルトオリゴ糖を主体とするオリゴ糖に分解することができ、広い範囲の多糖類の分解に利用することができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ブルーチーズの水溶性画分中にデキストラン分解活性が認められ、この水溶性画分に酵素活性が存在することを見いだした。この酵素がデキストランをオリゴ糖に分解することを見出し、分離精製して、酵素の諸性状を測定し、Ｎ末端アミノ酸配列を決定し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の性質を有するブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素に関する。
１）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約６５  ｋＤａを示す。
２）等電点：約４．９
３）至適ｐＨ：約４．５〜６．５
４）至適温度：約３７℃
さらに、本発明は、配列表配列番号１のＮ末端アミノ酸配列を持つブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素に関する。
さらに、本発明は、ブルーチーズの水溶性画分からカゼインを除去して硫安沈殿させた後、透析して得られた粗酵素をゲルろ過し、等電点電気泳動法及び／又はイオン交換クロマトグラフィーにより精製することを特徴とするデキストラン分解酵素の製造法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ブルーチーズの水溶性画分がデキストランをオリゴ糖に分解することを見出し、この水溶性画分を精製してデキストラン分解酵素を得るものである。
本発明のデキストラン分解酵素の由来となるブルーチーズは、ペニシリウム属のかびであるペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）をスターターとして製造されたものである。ブルーチーズには、国産のブルーチーズのほかに、ロックフォール（フランス）、ゴルゴンゾラ（イタリア）、スティルトン（イギリス）、ダナブルー（デンマーク）など多くの種類があるが、いずれのブルーチーズも使用可能である。
【０００９】
本発明のブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素は以下の性質を有する。
１）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約６５  ｋＤａを示す。
２）等電点：約４．９
３）至適ｐＨ：約４．５〜６．５
４）至適温度：約３７℃
さらに、本発明のブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素は、次のＮ末端アミノ酸配列を有する。
Ｎ末端アミノ酸配列：Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ
Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ（配列表配列番号１参照）
【００１０】
本発明のブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素のＮ末端アミノ酸配列は、ＦＡＳＴＡプログラムにあるすべての酵素とホモロジー（相同性）検索を行ったところ、同じ配列を有する酵素は見つからず、新規の酵素であると判断された。
表１に、本発明のブルーチーズ由来デキストラン分解酵素、及び相同性を持つ他の酵素のＮ末端アミノ酸配列を示す。相同性のある配列を持つ酵素は、種々の微生物のα−アミラーゼもしくはＴａｋａ−アミラーゼである。囲み線付き文字はブルーチーズ由来の酵素と異なるアミノ酸残基を示す。
【００１１】
【表１】
2004313064.tif 000002
【００１２】
表１に示されるように、本発明のブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素Ｎ末端アミノ酸配列に最もホモロジーが高いアミノ酸配列は、セラモマイセス・ラヌギノーサス（Ｔｈｅｒａｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、  アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の産生するα−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）のアミノ酸配列であり、それぞれ８０．０％、  ８０．０％、  ７５．０％のホモロジーを示した。１、４−α−マルトヘキサオシダーゼやプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）とは、５０〜５８％のホモロジーを示した。このことから本発明のブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素は、α−アミラーゼのファミリーに入るものと思われるが、新規の酵素である。
【００１３】
本発明のブルーチーズ由来の酵素は、デキストランおよびデキストランの架橋体であるセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ、アマシャムバイオサイエンス社製）を分解する。本発明のブルーチーズ由来のデキストラン分解酵素は、架橋度の低いセファデックスＧ−１５０、２００を分解するが、架橋度の高いセファデックスＧ−１５、２５などは分解しなかった。
【００１４】
通常、デキストランのようなポリサッカライドが牛乳やチーズ中に存在することは考えられない。デキストランは、前述したように、ロイコノストック・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）あるいはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などの微生物によって産生される酵素デキストランスクラーゼによってスクロースから合成される。カビによって醗酵されるブルーチーズには、これらの微生物が製造工程の初期にスターターカルチャーに混在して用いられたかも知れない。酵母のような他の微生物は、一般にカビ醗酵チーズの表面に生育する。酵母がデキストランを合成し、これにより、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）またはチーズ中に生育する他の微生物がデキストラン分解酵素を産生することを誘発するのではないかと考えられる。チーズ表面を取り除いたチーズで酵素活性が見られることから、チーズ表面に生育する微生物はデキストラン分解酵素の産生に寄与していないと考えられる。
【００１５】
本発明のデキストラン分解酵素は次のような方法で分離・精製することができる。
まず、ブルーチーズにリン酸塩緩衝液を加え、ストマッカー８０などのブレンダーでスラリー化し、これを遠心分離するとペースト状の混合物と上清に分かれるので、その上清液を回収しブルーチーズの水溶性画分を得る（以下、水溶性画分という）。遠心分離条件は３，０００×ｇ、１５℃、１５分が好ましい。
この水溶性画分を希塩酸液等でｐＨ４．５〜４．６に調整し、さらに遠心分離して、カゼインを除去する。遠心分離の条件は１０，０００×ｇ、１５℃、３０分が好ましい。このカゼインを除去した水溶性画分を水酸化ナトリウム液等でｐＨ６．８に中和し、硫安粉末を８０％飽和になるまで加え、４℃で一晩静置する。ついで、４℃、３０分間、１０，０００×ｇ  で遠心分離を行い、沈殿物を回収する。沈殿物を蒸留水で溶解し、ｐＨ７．５の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液に対して透析して粗酵素液を得る。これを凍結乾燥して粗酵素粉末を得る。本発明のデキストラン分解酵素は粗酵素液、粗酵素粉末として使用することが可能であるが、さらに、下記のように精製しても良い。
この粗酵素をトヨパールＨＷ５５カラムを用いて、０．３Ｍ  のＮａＣｌを含むｐＨ７．４の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を移動相としてゲルろ過し、ゲルろ過活性画分を得る（以下、ゲルろ過活性画分という）。
さらに、ゲルろ過活性画分を、等電点電気泳動法やイオン交換クロマトグラフィーにより精製して、精製品を得る。具体的には、ゲルろ過活性画分をＤＥＡＥ‐トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、ｐＨ７．２５の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液の０〜１Ｍ  のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させ精製品を得る（以下、イオン交換クロマト画分という）。
【００１６】
以上のような操作を行うことにより、ＳＤＳ電気泳動で単一な精製酵素を得た。
表２に各精製段階における精製度合を示す。
表２で、ｐＨ  ５．２での基質としてのデキストランの最終濃度が２％として、１時間当たり５５０ｎｍでの吸光度を０．０１増加させる酵素量を酵素活性１単位とした。イオン交換クロマトグラフィー処理により酵素は１４９倍精製された。
【００１７】
【表２】
2004313064.tif 000003
【００１８】
以下に、本発明酵素の性状や酵素活性などの試験例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。しかし、本発明はこの記載内容に限定されるものではない。
【試験例１】
（酵素活性の測定）
酵素活性の測定には、次のように、セファデックス−試験管法と、比色計を用いて遊離の還元糖を測定する方法の２法を用いることができる。
【００１９】
（セファデックス−試験管法）
セファデックスゲルはデキストランがエピクロロヒドリンと架橋した高分子であり、デキストランは主として、α−Ｄ１，６結合を持ち、α−Ｄ１，３分枝あるいはα−Ｄ１，２分枝を持つこともある、Ｄ−グルコースからなる多糖類である。
したがって、本発明においても、可溶性デキストランを酵素活性の測定に用いることができる。
本発明のデキストラン分解粗酵素のゲルろ過活性画分を、セファデックスＧ−１５０またはＧ−２００のスラリー２〜３ｍｌと混合するか、あるいは試験管に入れたセファデックススラリーの頂部に積層した。室温で試験管を２４〜４８時間立てておき、セファデックスゲルの減少を観察した。セファデックスゲルの高さは減少し、５．５時間後の高さは０．５時間後の高さの半分となり、８．５時間後の高さは５．５時間後の高さの半分となり、最後にはゲルは消え、ごく少量の白色の残渣がガラス管の底に残るだけとなった。セファデックスビーズはデキストランゲルからなっており、それゆえ、ブルーチーズの水溶性画分にデキストラン分解酵素が存在していることを示すものである。試験管に入れたセファデックススラリーの頂部に積層したものと、混合したものとの二つの方法の間には、結果として差はなかった。この方法は水溶性画分が濁っている場合でも使用し得る。
【００２０】
（還元糖定量）
本発明のデキストラン分解酵素の活性を測定する２番目の方法である、比色計を用いて遊離の還元糖を測定する方法について次に述べる。
２（ｗ／ｖ）％デキストラン液１ｍｌ、クエン酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ、及び本発明のデキストラン分解粗酵素のゲルろ過活性画分０．５ｍｌを混合し、４０℃で１時間反応させた後、ネルソン及びソモギーの比色法の変法  （Ｎ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１５３，  ３７５〜３８０，１９４４及びＭ．Ｓｏｍｏｇｙｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９５，１９〜２３，１９５２）を用いて、遊離した還元糖を定量した。この方法は、前記混合物０．２ｍｌと銅試薬０．２ｍｌと混合し、１０分間沸騰させ、冷却後、ネルソン試薬（片山化学社製）０．２ｍｌと混合し、容量を５ｍｌに調整し、１５分間冷却して発色させるものである。
前記濃青色溶液の５００または６００ｎｍでの吸光度を測定した。
【００２１】
【試験例２】
（酵素分解生成物の分析）
セファデックス分解活性を示した水溶性画分のセファデックス分解部分を分離するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、酵素活性はセファデックス−試験管法で測定した。セファデックスはデキストランの架橋体であるので、可溶性デキストランも試験に供した。セファデックス−試験管法と、比色計を用いて遊離の還元糖を測定する方法のいずれにおいても、ゲルろ過クロマトグラフィーでのひとつのフラクション（Ｎｏ．２１）に、デキストラン分解活性が認められた。
ゲルろ過クロマトグラフィーによる溶出パターンを図１に示す。矢印を付したものがデキストラン分解活性が認められたフラクションＮｏ．２１である。
粗酵素画分中の夾雑物はデキストラン分解反応や反応物の同定を妨害しないので、デキストランと粗酵素画分混合物とを混合してゲルろ過クロマトグラフィー及び薄層クロマトグラフィーによって生成物を同定することが可能である。
【００２２】
デキストランと粗酵素画分との生成物を、薄層クロマトグラフィーによって同定した。１２時間でいくつかのスポットが鮮明に現れ、グルコースやイソマルトオリゴ糖のパターンと一致したが、マルトオリゴ糖はなかった。１時間でイソマルトトリオースのスポットが現れ、１２時間後にグルコース、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオースのスポットが見られ、イソマルトトリオースのスポットが最強であった。このことから、ブルーチーズの酵素画分によるデキストラン分解生成物の主体はイソマルトトリオースであることが判明した。
【００２３】
【試験例３】
（至適温度測定）
水溶性画分を、基質溶液（クエン酸ナトリウム‐リン酸緩衝液中２％デキストラン溶液、ｐＨ５．０）と混合して反応させ、デキストラン分解活性は比色計を用いて遊離の還元糖を測定する方法で測定した。至適温度は約３７℃であった。
なお、酵素が由来するブルーチーズの種類により、５０℃を超えると失活するものもあり、６０℃まで活性が続くものもあった。
【００２４】
【試験例３】
（等電点測定）
本発明のデキストラン分解粗酵素のゲルろ過活性画分を、ロトフォーシステム（Ｒｏｔｏｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド社製）を用いて等電点電気泳動を行い、本酵素の等電点を測定したところ、約４．９であった。
【００２５】
【試験例４】
（至適ｐＨ測定）
デキストラン分解粗酵素のゲルろ過活性画分を、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液を用いてｐＨ３〜７の間でのｐＨ依存性を測定した。
この粗酵素のゲルろ過活性画分の至適ｐＨは約４．５〜６．５であった。
【００２６】
【試験例５】
（更なる精製と分子量測定）
デキストラン分解粗酵素のゲルろ過活性画分を、ＤＥＡＥ‐トヨパール６５０Ｓを用いたイオン交換クロマトグラフィーで、ｐＨ７．２５の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液に対して、０〜１Ｍ  のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させて精製した。
イオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターンを図２に示す。
なお、矢印を付したフラクションＮｏ．１２を、後述の分子量測定及びＮ末端アミノ酸配列に供した。
【００２７】
イオン交換クロマトグラフィーを繰り返すと酵素活性がなくなることもあるので、このゲルろ過活性画分をロトフォーシステムで等電点電気泳動を行った。
ロトフォーシステムによる分離パターンを図３に示す。矢印を付したフラクションＮｏ．３  に活性が認められた。たん白質のバンド分布はイオン交換クロマトグラフィーとほぼ同様であった。
【００２８】
Ｎ末端アミノ酸配列を決定するには更なる精製が必要である。イオン交換クロマトグラフィーとロトフォー等電点電気泳動の結果から、電荷の相違により分離することが有効であると判明したので、イオン交換クロマトグラフィーで得られた酵素活性の認められたフラクションＮｏ．１２（図２参照）の画分をアクリルアミド濃度１２．５％でＮａｔｉｖｅ−電気泳動を行った。銀染色法により認められたたん白質バンドを図４Ａに示す。同様の条件でＮａｔｉｖｅ−電気泳動して染色しなかったゲルを２０のセグメントに切り分けた。酵素活性を示すセグメントは、同じ条件でさらに電気泳動を行い、分離した（図４Ｂ、レーンＲｅ）。酵素活性を示すバンドが２〜３本見られた。この酵素活性を示すセグメントを５つの１ｍｍ小片に切り、これらからたん白質を抽出した。それぞれのたん白質化合物を含む物質の酵素活性を測定し、さらにそれらの成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。３サンプル（Ｎｏ．２〜Ｎｏ．４レーン）はセファデックス−試験管法及び比色法のいずれにおいてもデキストラン分解活性が認められた。これらのサンプルは、２５、６５、及び＞７５  ＫＤａの分子量を示す３つのたん白質バンドを示したが、主たるたん白質化合物は６５  ｋＤａの分子量を持っていた。
このことから、本発明のデキストラン分解酵素の分子量は約６５  ｋＤａ  であるとした。
それぞれのたん白質化合物を含む物質を次に述べるＮ末端アミノ酸配列の決定に供した。
【００２９】
【試験例６】
（Ｎ末端アミノ酸配列）
前記のＮａｔｉｖｅ−電気泳動で活性を示す画分をクエン酸緩衝液で抽出し、ＰＶＤＦ膜（サンプル調製用カートリッジ：アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）上へ濃縮・脱塩し、Ｎ末端アミノ酸配列の決定に供した。
Ｎ末端アミノ酸配列分析は、Ｐｒｏｃｉｓｅ４９Ｘ  ｃＬＣ  プロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）を使用した。
Ｎ末端アミノ酸配列は、２０残基まで決定したところ、つぎのとおりであった。
Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ（配列表配列番号１参照）
【００３０】
以下に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。しかし、本発明はこの記載内容に限定されるものではない。
【００３１】
【実施例１】
フランス産ブルーチーズであるブルー・ド・コース（Ｂｌｅｕ  ｄｅ  Ｃａｕｓｓｅｓ、ビューレット社製）３００ｇに同量のリン酸塩緩衝液を加え、ブレンダー（ストマッカー８０、オレガノ社製）でスラリー化した。３，０００×ｇ、１５℃、１５分で遠心分離し、その上清液を回収しブルーチーズの水溶性画分を得た。
この水溶性画分を希塩酸液でｐＨ４．５に調整し、さらに１０，０００×ｇ、１５℃、３０分遠心分離して、カゼインを除去した。このカゼインを除去した水溶性画分３００ｍｌを水酸化ナトリウム液でｐＨ６．８に中和し、硫安粉末を８０％飽和になるまで加え、４℃で一晩静置した。ついで、４℃、３０分間、１０，０００×ｇで遠心分離を行い、沈殿物を回収する。沈殿物を蒸留水で溶解し、ｐＨ７．５の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液に対して透析し、本発明のデキストラン分解粗酵素を得た。
【００３２】
【実施例２】
実施例１で得た粗酵素を、トヨパールＨＷ５５カラム（東ソー社製）を用いて、０．３Ｍ  のＮａＣｌを含むｐＨ７．４の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を移動相としてゲルろ過し、ゲルろ過活性画分を得た。このゲルろ過活性画分３．５ｍｌをロトフォーシステム（バイオ・ラッド社製）を用いて等電点電気泳動を行って等電点電気泳動活性画分を得た。さらに、この等電点電気泳動活性画分２ｍｌを、ＤＥＡＥ‐トヨパール６５０Ｓカラム（東ソー社製）に吸着させ、ｐＨ７．２５の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液の０〜１Ｍ  のＮａＣｌ濃度勾配で溶出させて本発明のデキストラン分解酵素の精製品を得た。
【００３３】
【実施例３】
国産のブルーチーズ（雪印ブルーチーズ、雪印乳業社製）を用いたほかは実施例１と同様にして、本発明のデキストラン分解粗酵素を得た。
なお、水溶性画分の温度依存性は、実施例１のものは３７℃以下で最高の活性を示し、５０℃を超えると失活するのに対し、国産ブルーチーズ由来のものは３７℃で最高の活性を示し、活性は６０℃まで続いた。また、粗酵素を、トヨパールＨＷ５５カラム（東ソー社製）を用いて、０．３Ｍ  のＮａＣｌを含むｐＨ７．４の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液を移動相としてゲルろ過し、ゲルろ過活性画分を得た。このゲルろ過活性画分を用いて本発明のデキストラン分解酵素の至適ｐＨを測定したところ、実施例１のものはｐＨ４．５〜６．５であったのに対し、国産ブルーチーズ由来のものはｐＨ  ４．７〜４．８であった。他の性状は実施例１で得られたものとほぼ同じであった。
【００３４】
【発明の効果】
ブルーチーズの水溶性画分から得られる、本発明の新規なデキストラン分解酵素により、デキストランをイソマルトオリゴ糖を主体とするオリゴ糖に分解することができ、多糖類の分解に利用することができる。
デキストランを分解するデキストラナーゼは需要が多く，種々の性状を持ったデキストラン分解酵素が求められており、代用血漿や血流改善剤などの医薬品、保湿剤などの化粧品、写真用フィルム添加剤や製糖工業などにおいて幅広い用途で本発明の新規なデキストラン分解酵素が使用されることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ゲルろ過クロマトグラフィーによる水溶性画分の溶出パターンを示す。
【図２】イオン交換クロマトグラフィーによるゲルろ過活性画分の溶出パターンを示す。
【図３】ロトフォーシステムによるゲルろ過活性画分の分離パターンを示す。
【図４】酵素画分の電気泳動パターンを示す。
パターンＡ：  図２に示したイオン交換クロマトグラフィーで得られたゲルろ過活性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターを示すン。
パターンＢ：  フラクションＮｏ．１２（図２参照）のｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥパターンを示す。Ｒｅは再度の電気泳動により得られたレーンである。
パターンＣ：  Ｒｅ画分より得られたそれぞれのたん白質バンドのＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す。ＭＷは標準たん白質の分子量である。
【配列表】
2004313064.tif 000004
【図１】
2004313064.tif 000005
【図２】
2004313064.tif 000006
【図３】
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【図４】
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