(57)【要約】【課題】本発明は、特異性および感度の非常に高い、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法を提供する。【解決手段】被検物質とｃｙａ−  変異株とを接触させ、ｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少を検出して、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法、それに用いる試薬、キット、抗アルキル化剤のスクリーニング方法、またはスクリーニング方法によって得られる抗アルキル化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質とｃｙａ−  変異株とを接触させ、ｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少を検出して、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法。
【請求項２】
前記ｃｙａ−  変異株がｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  変異を有する細胞株である請求項  １に記載の被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法。
【請求項３】
被検物質とｃｙａ−  変異株とを接触させ、ｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少の度合いを検出して、抗アルキル化作用を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
請求項３に記載のスクリーニング方法によって得られる抗アルキル化剤。
【請求項５】
ｃｙａ−  変異株を含有することを特徴とする被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に分析する試薬。
【請求項６】
前記ｃｙａ−  変異株がｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  変異を有する細胞株である請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
請求項５または６に記載の試薬を有することを特徴とする被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出するキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特異性および感度の非常に高い、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法および、それに用いる試薬、キットに関する。また、抗アルキル化剤のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、様々な研究により、ＤＮＡの損傷が原因でがんが引き起こされることがわかっている。また、このＤＮＡの損傷は、紫外線等の外的要因や、生体内で発生するストレス等の内的要因が関与していることもわかっている。
ここで、例えば内的要因の一つとしてアルキル化が挙げられる。アルキル化により、ＤＮＡ塩基が損傷し、それがもとで遺伝子の非相同組換えが生じることがあり、最近では、この非相同組換えが癌化に大きく関わっているということが知られている（Ｌｅｎｇａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ，
３９６，  ６４３−６４８）。
【０００３】
このような非相同組換えを起こすような物質を体内に摂取すると、それにより癌化が起こると考えられる。
そこで、非相同組換えを阻害・修復するような物質はがん予防作用があると言える。抗アルキル化作用とはすなわち上述したような、非相同組換え、ＤＮＡ損傷を防止する効果を言い、それは老化防止のための抗アルキル化剤、若しくはがん予防剤として有望であると言える。
【０００４】
しかしながら、そのためにはこれらを検出する系の確立が必要であるが、現在のところＤＮＡのアルキル化を検出する系は未だ確立していない。
【０００５】
ＤＮＡの変異を測定するものはいくつか開発されているが、例えばエームズ試験Ａｍｅｓ  Ｔｅｓｔ（非特許文献１）は変異株を検出するためのコロニー増殖テストであり、ｕｍｕテスト（非特許文献２）は試験株のＳＯＳ反応を誘発させ、更にそれを比色法により測定することによりＤＮＡに対する変異要因を検出するテストである。
ところが、これらの系では、様々な変異を検出するため、例えば酸化によるＤＮＡダメージ等も検出してしまい、抗アルキル化作用のみを特異的に検出するということは不可能であるという問題がある。
【０００６】
【非特許文献１】
広栄テクノサービス（株）ホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｏｅｉ−ｔｅｃｈｎｏ．ｃｏ．ｊｐ／ａｎｚｅｎ／ａｍｅｓ／２．ｈｔｍｌ，２００３／０５／０１
【非特許文献２】
（株）日本抗体研究所ホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｊｉｍｒｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／０３．ｕｍｕ−ｌａｃ／０２．ｕｍｕｌａｃ  ＿ｔｏｋｕｃｙｏ．ｈｔｍ，２００３／０１／２７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこのような理由から、ＤＮＡのアルキル化によるダメージによる非相同組換え頻度の変動を精度良く検出し、それにより抗アルキル化剤の検出を行なうことができる細胞株及びそれを用いたＤＮＡのアルキル化作用の検出方法、及びそれに用いられる検出キットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
（１）被検物質とｃｙａ−  変異株とを接触させ、ｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少を検出して、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法。
（２）予め、ｃｙａ−  変異株の非相同組換え頻度を求める上記（１）に記載の方法。
（３）前記非相同組換えの減少の検出は、予め求めたｃｙａ変異株の非相同組換え頻度の減少の度合いの検出である上記（１）に記載の方法。
（４）前記ｃｙａ−  変異株がｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  変異を有する細胞株である上記（１）〜（３）のいづれかに記載の被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法。
（５）ｃｙａ−  変異株の非相同組換え頻度を求め、被検物質とｃｙａ−  変異株とを接触させ、ｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少の度合いを検出して、抗アルキル化作用を有する物質をスクリーニングする方法。
（６）上記（５）に記載のスクリーニング方法によって得られる抗アルキル化剤。
（７）ｃｙａ−  変異株を含有することを特徴とする被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に分析する試薬。
（８）前記ｃｙａ−  変異株がｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  変異を有する細胞株である上記（７）に記載の試薬。
（９）上記（７）または（８）に記載の試薬を有することを特徴とする被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出するキット。
【０００９】
以下に本発明の実施形態を説明する。
【００１０】
本願の方法に用いる細胞株としては、少なくともｃｙａ−  変異を有する株を用いていることを特徴とする。好ましくはｃｙａ−  変異を有する大腸菌株であり、具体的にはｃｙａ−  一重変異株、ｔａｇ−  ／ｃｙａ−  二重変異株、ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  二重変異株、ｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  三重変異株である。
【００１１】
ＣｙａはｃＡＭＰ合成酵素の一つであり、細胞増殖の過程で自然発生するアルキル化によるＤＮＡダメージによって誘導される非相同組換えを抑制している。
ｃＡＭＰは、細胞の増殖制御において様々な役割を果たしている。特にラクトース等の代謝酵素の発現の際にはカタボライトリプレッションによる転写制御がかかり、その中でｃＡＭＰが重要な役割を果たしていることが知られている。
【００１２】
発明者らは、そのような既知の性質のみならず、該ｃＡＭＰが、（自然発生する）ＤＮＡアルキル化によって誘導される非相同組換えを抑制することを見出した。この知見から、発明者らはｃＡＭＰ変異株は恒常的に非相同組換え頻度が上がるため、抗アルキル化作用を有する物質を添加した場合、それにより非相同組換えの頻度が低下することを見出した。
また、ｔａｇ，ａｌｋＡ両遺伝子はＤＮＡでアルキル化が生じたときにそのＤＮＡを修復する酵素をコードする遺伝子である。
これら遺伝子は通常生体内で、何らかのストレスが原因でアルキル化が起こり、ＤＮＡがダメージを受けた場合に該ＤＮＡを修復するという機能を有している。そこで、これら遺伝子に変異が起こると、自己の能力ではＤＮＡダメージを修復することが不可能となり、外的要因でのみ修復が行なわれることになる。
【００１３】
各変異株は以下の所定機関から入手することができる。
機関名称：国立遺伝学研究所
また、それぞれの変異株は大腸菌の野生株のＤＮＡ情報から、該当箇所を欠失させるポイントミューテーション等の方法を用いてＤＮＡを製造し、大腸菌を形質転換し、若しくは形質導入し、培養して得ることができる。
【００１４】
ｃｙａ−  変異株：アルキル化が起こりＤＮＡがダメージを受けた時の非相同組換えを抑制することができず、通常の野生株よりも恒常的に非相同組換え頻度が高頻度で形成される。
ｔａｇ−  、ａｌｋＡ−  変異株：これら遺伝子はアルキル化によりダメージを受けたＤＮＡの修復を行なう機能を有するため、これらが変異して機能しないと自発的にアルキル化ダメージを修復することができず、外的要因でしか修復されなくなる。
よって、これらの変異株を用いることで、被検物質の抗アルキル化作用を検出することが可能となる。
【００１５】
本発明では、ｃｙａ−  変異株の非相同組換え頻度を求め、被検物質とｃｙａ−  変異株とを接触させ、ｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少の度合いを検出して、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法であり、非相同組換え頻度を測定する方法は限定されないが、いわゆるＳｐｉアッセイを用いることが好ましい。
【００１６】
Ｓｐｉアッセイは、λＳｐｉ  −  の検出による非相同的組換え頻度の測定方法であり、ノイズが極めて少ない、信頼性の高い方法で、特開平７−２５０６８２号公報の実施例に記載されている。
【００１７】
＜Ｓｐｉアッセイプロトコル＞
Ｓｐｉアッセイは、図１に示すように、大腸菌に溶原化したλプロファージと大腸菌ｂｉｏ  遺伝子の間の組換えによって非相同組換えの頻度を測定する。
ファージの誘導が起こると通常、ａｔｔＲとａｔｔＬの部位特異的な部分で切り出され、組換えにより正常なファージが形成されるが、紫外線などのストレスによって特定部位と異なる部分で切り出されると、Ｓｐｉ−  ファージを形成する。
これらのファージは共に、野生型大腸菌に感染させると共にプラークを形成するが、Ｐ２溶原大腸菌においては、Ｓｐｉ−  ファージのみがプラークを形成することができる。なお、培地は例えばＴｒｙｐｔｏｎｅ  １％、イースト・イクストラクト０．１％、グルコース（−）を用いることができる。この現象を用いて、非相同組換えの頻度を測定する。
【００１８】
＜被検物質のｃｙａ−  変異株における非相同組換えの減少の度合いの検出が抗アルキル化作用によるものであることの説明＞
１）工程１
非相同的組換えを検出するシステム
溶原化したλファージが誘発される際、通常はプロファージ両端に位置するａｔｔ  部位同志の部位特異的組換えによってファージＤＮＡの切り出しが起こる。しかし低頻度で、ａｔｔ  部位以外の部位での非相同的組換えによるλファージＤＮＡの切り出しも起こる。その結果、プロファージ座近傍の大腸菌のｇａｌ  遺伝子又はｂｉｏ  遺伝子をゲノム内に取り込んだ、形質導入ファージλｇａｌ  又はλｂｉｏ  が形成される。
【００１９】
λファージはＰ２ファージ溶原菌を宿主として増殖できない。この性質は「Ｓｐｉ−  」（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｐ２  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略）といわれる。しかし例外的にλ  ｒｅｄ−  γ−  はＰ２ファージ溶原菌を宿主として増殖できる（λＳｐｉ−  ）。
【００２０】
λＳｐｉ−  の形成頻度を調べれば非相同的組換え頻度の指標となる。
【００２１】
このλＳｐｉ−  の検出による非相同的組換え頻度の測定方法は、ノイズが極めて少ない、信頼性の高い方法である。
【００２２】
２）工程２
溶原菌（λプロファージを溶原化している大腸菌野生株、ｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  変異株、ｃｙａ−  変異株、ｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  変異株のそれぞれ）を、例えばλｙｐ培地（１リットル中バクトトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、イースト・エキストラクト１ｇ、１ＭＭｇＳＯ４    １．５ｍｌとＭ９Ａ液１０ｍｌを加える）中で一晩培養した。この培養液の一部をλｙｐ培地中３０℃で菌数が約０．３〜２．０×１０８  ／ｍｌになるまで成育させた。培養液を回収し、４２℃で１５分間振盪し、その後３７℃で約３時間振盪培養し溶菌させた。溶菌液に数滴のＣＨＣｌ３  を加え、さらに約５分間振盪した後、遠心分離して上清を得た。このファージ液をＭ９培地等の希釈溶液で希釈し、指示菌（Ｙｍｅｌ）一晩培養液０．１ｍｌ、λトップ培地（１リットル中ポリペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、寒天１０〜１２ｇ）２．５ｍｌとともにλプレート（１リットル中ポリペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、寒天４ｇ）にまき、一晩培養し、プラークを形成させ、全ファージ数を測定した。
【００２３】
３）工程３
λＳｐｉ−  ファージ数の測定
野生株、ｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  変異株、ｃｙａ−  変異株、ｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  変異株のそれぞれが形成した全ファージから２×１０７  個になるように、指示菌（ＷＬ９５（Ｐ２）：  ｍｅｔＢ  ｓｕｐＥ  ｓｕｐＦ  ｈｓｄＲｋ  ｔｏｎＡ  ｔｒｐＲ  （Ｐ２））一晩培養物０．１ｍｌ、λトリプティケース培地２．５ｍｌとともにλトリプティケ−スプレート（１ｌ中ＢＢＬトリプティケ−スペプトン  （ＢＢＬ  Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ  社）  １０ｇ、ＮａＣｌ、２．５〜５．０ｇ、寒天１０〜１２ｇ）にまき、一晩培養し、プラ−クを形成させ、λＳｐｉ−  ファージ数を測定した。
【００２４】
４）工程４
λＳｐｉ−  ファージ形成頻度の測定
培養物０．１ｍｌ中の全ファージ数（工程２で測定した値）に対する、培養物０．１ｍｌ中のλＳｐｉ−  ファージ数（工程３で測定した値）を計測し、λＳｐｉ−  ファージの形成頻度とした。
【００２５】
野生株又は変異株におけるλＳｐｉ−  ファージの形成頻度の測定
野生株、ｃｙａ変異株、ｔａｇ  ａｌｋＡ二重変異株、ｔａｇ  ａｌｋＡｃｙａ三重変異株のλＳｐｉ−  ファージ形成頻度を表１に示す。
【００２６】
【表１】
2004344100.tif 000002
【００２７】
表１に示すように、野生株に比べて、ｃｙａ変異株においては、λＳｐｉ−  ファージの形成頻度が１００倍以上（約１６０倍）上昇した。このことから、野生株に比べて、ｃｙａ変異株においては、非相同的組換え頻度が上昇することが判明した。
また、表１に示すように、ｃｙａ／ｔａｇ／ａｌｋＡ三重変異株においては、ｃｙａ変異株に比べて、λＳｐｉ−  ファージの形成頻度が更に約１０倍上昇した。このことから、ｃｙａ変異による非相同組換えの上昇はアルキル化によるものであることが推定された。
【００２８】
抗アルキル化作用を検出するには、非相同組換え頻度を求め、ｃｙａ変異株における非相同組換えの減少の度合いを見ることでその物質が抗アルキル化作用を有しているか否か、あるいはその作用の強さを検出することができる。
【００２９】
＜抗アルキル化検出試薬＞
ｃｙａ−  変異株、具体的にはｃｙａ−  変異株、ｔａｇ−  ／ｃｙａ−  二重変異株、ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  二重変異株、またはｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  三重変異株は、抗アルキル化作用を有する物質を検出することが可能であるため、抗アルキル化検出試薬として有用である。
＜抗アルキル化検出キット＞
本発明の抗アルキル化検出試薬、具体的には、ｃｙａ−  変異株、ｔａｇ−  ／ｃｙａ−  二重変異株、ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  二重変異株、またはｔａｇ−  ／ａｌｋＡ−  ／ｃｙａ−  三重変異株を、単独でまたはそれぞれまたは組み合わせて備えるキットは、本発明の被検物質の抗アルキル化作用を定性的にまたは定量的に検出する方法または、以下で説明するスクリーニング方法を実施する測定装置であるキットとして有用である。このキットは、ｃｙａ−  変異株を、試薬として備えるものであればその構成は限定されない。別に、本発明の試薬を表面に固定化したチップを測定キットとして用いることもできる。
【００３０】
＜抗アルキル化作用を有する物質のスクリーニング方法＞
本発明の被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法を用いれば、効率的に抗アルキル化作用を有する物質を検出するスクリーニング方法とすることができる。
例えば、複数の抗アルキル化作用を有する可能性がある候補物質を、本発明の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法を用いて測定し、測定された抗アルキル化作用を比較して、強い抗アルキル化作用を有する物質を見出すことができる。
【００３１】
さらに、検出した抗アルキル化物質を用いて、例えばがん化につながるＤＮＡのアルキル化を防止し、それにより、がんを未然に防ぐことが可能な「がん予防剤」を提供することが可能となる。
また、アルキル化によるＤＮＡダメージは、生体の老化を促進することにもつながるので、検出した抗アルキル化物質を抗アルキル化剤として用いて食品や化粧品等に添加することで、老化防止作用を有する機能性食品、化粧品等を提供することが可能となる。
【００３２】
【実施例】
ビタミンＡを培地に添加し、大腸菌野生株およびｃｙａ変異株をそれぞれ溶原化したλプロファージを、工程２と同様に、λｙｐ培地（１リットル中バクトトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、イースト・エキストラクト１ｇを滅菌し、１ＭＭｇＳＯ４    １．５ｍｌとＭ９Ａ液１０ｍｌを加える）中で一晩培養した。培養液１／１００容をλｙｐ培地中３０℃で菌数が約１．０×１０８  ／ｍｌになるまで成育させた。培養液を回収し、４２℃で１５分間振盪し、その後３７℃で３時間振盪培養し溶菌させた。溶菌液に数滴のＣＨＣｌ３  を加え、さらに５分間振盪した後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心して上清を得た。このファージ液をＭ９培地で希釈し、指示菌（Ｙｍｅｌ）一晩培養液０．１ｍｌ、λトップ培地（１リットル中ポリペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、寒天１０ｇ）２．５ｍｌとともにλプレート（１リットル中ポリペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、寒天４ｇ）にまき、一晩培養し、プラークを形成させ、全ファージ数を測定した。
【００３３】
次に、工程３と同様に、２×１０７  個のファージを、指示菌（ＷＬ９５（Ｐ２）：  ｍｅｔＢ  ｓｕｐＥ  ｓｕｐＦ  ｈｓｄＲｋ  ｔｏｎＡ  ｔｒｐＲ  （Ｐ２））一晩培養物０．１ｍｌ、λＴトップ培地２．５ｍｌとともにλトリプティケ−スプレート（１ｌ中ＢＢＬトリプティケ−スペプトン  （ＢＢＬ  Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ  社）  １０ｇ、ＮａＣｌ、２．５ｇ、寒天１０ｇ）にまき、一晩培養し、プラ−クを形成させ、λＳｐｉ−  ファージ数を測定した。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2004344100.tif 000003
【００３５】
表２に示すように、抗アルキル化作用を有するビタミンＡは野生株のλＳｐｉ−  ファージの形成頻度を下げないが、ｃｙａ−  変異株の該ファージの形成頻度を下げ本発明の検出方法によって検出できることが証明された。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、被検物質の抗アルキル化作用を定性的に、または定量的に検出する方法、それに用いる試薬、キット、抗アルキル化剤のスクリーニング方法であり、特異性および感度が非常に高い。特異性が高い検出方法の結果を用いれば、より有効な薬剤が開発できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｓｐｉアッセイを説明する模式図である。
【図１】
2004344100.tif 000004