(57)【要約】【課題】不凍タンパク質を容易に入手可能な魚種から採取し不凍タンパク質の利用促進を図る。【解決手段】本発明は、日本国内、日本近海水域、あるいは該水域と同等気候域の水域に生息する魚種のうち廃棄魚であるナガガジあるいはシチロウウオから得た１１種の不凍タンパク質、それらのアミノ酸配列及び塩基配列である。さらに本発明は、得られる遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により前記不凍タンパク質を多量に生産する方法、並びにこれら不凍タンパク質を有効成分とする凍結濃縮阻害剤或いは凝固点降下剤である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項２】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−２
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項３】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−３
（ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項４】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−４
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項５】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−５
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項６】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−６
（ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項７】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−７
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項８】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−８
（ａ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項９】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−９
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１０】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１０
（ａ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１１】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｂ−１
（ａ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１２】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１３】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−２をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１４】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−３をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１５】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−４をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１６】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−５をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１７】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−６をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１８】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−７をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項１９】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−８をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項２０】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−９をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項２１】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１０をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項２２】
次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｂ−１をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
【請求項２３】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，又は２１で表される塩基配列であって、それぞれ不凍タンパク質Ｚ−１、Ｚ−２、Ｚ−３、Ｚ−４、Ｚ−５、Ｚ−６、Ｚ−７、Ｚ−８、Ｚ−９、Ｚ−１０又はＢ−１をコードするＤＮＡ。
【請求項２４】
請求項１２乃至２３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２５】
組換えベクターが発現ベクターである請求項２４に記載の組換えベクター。
【請求項２６】
宿主生物を請求項２５に記載の組換えベクターによって形質転換した形質転換体。
【請求項２７】
宿主生物が大腸菌である請求項２６に記載の形質転換体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の形質転換体を培地中で培養して不凍タンパク質を産生せしめ、該タンパク質を採取することを特徴とする不凍タンパク質の製造方法。
【請求項２９】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のタンパク質をペプチド合成機により化学的に合成することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項３０】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする凍結濃縮阻害剤。
【請求項３１】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする凝固点降下剤。
【請求項３２】
請求項１乃至１２のいずれか１項に記載のタンパク質を含むことを特徴とする氷スラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、日本近海で捕獲される魚種であるナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  Ｋｎｅｒ）またはシチロウウオ（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ  ｒｏｓｔｒａｔｕｓ  （Ｔｉｌｅｓｉｕｓ））の体液及びすり身から新たに調製して得られた不凍タンパク質に関するもので、さらに該タンパク質のアミノ酸配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを含む形質転換体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
凍結温度域においては、水を含むあらゆる物質（含水物）の内部では、自然の法則に従い、水分子同士だけが結びついて氷塊を形成する。このとき水分子以外のあらゆる物質は氷塊形成に伴う物理的な圧迫を受け移動を強いられ、含水物中の氷塊以外の位置に追いやられてしまう（凍結濃縮と呼ばれる）。従って、凍結濃縮が起こった含水物を解凍すると、凍結前の内部構造、生理的活性、あるいは風味などが損なわれる。不凍機能を有するタンパク質、即ち不凍タンパク質（Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＦＰ）は、含水物の凍結濃縮を強く抑制する能力を有し、また氷の再結晶阻害や熱ヒステリシスなどの特性を示す。このため、ＡＦＰの添加は冷凍食品などの品質を保持し凍結に伴う細胞や臓器の生理的活性の消失を妨げる効果があると考えられている。また、氷スラリーを使用する冷熱供給システムあるいは冷熱蓄熱等において、氷の再結晶による配管系の閉塞を解消し得る有効な添加剤としての利用も期待されている。これらの他にも食肉、野菜、加工食品、血液、細胞、卵子、精子、移植臓器などの冷凍保存耐性の向上にＡＦＰを応用する試みがなされている。
【０００３】
しかし、現在までＡＦＰが探索・同定された動物は、主として南極海や北極海周辺の極緯度地方あるいは寒帯域にのみ生息する魚種であった。温帯域である日本の近海で大量に漁獲される魚種についてＡＦＰを探索、同定し、そのＡＦＰを新たに利用することが望まれていた。特に、魚類由来のＡＦＰの回収と精製に費やすコストを低減する目的のために、廃棄魚が有するＡＦＰの利用が強く望まれていた。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｇａｒｔｈ  Ｌ  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｃｈｏｙ  Ｌ  Ｈｅｗ，  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｌ  Ｄａｖｉｅｓ（２００１）  ”Ａｎｔｉｆｒｅｅｚｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｔｅｌｅｏｓｔ  Ｆｉｓｈｅｓ”    Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６３，３５９−３９０
【非特許文献２】
Ｃｈｏｙ  Ｌ．  Ｈｅｗ  ａｎｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｓ．  Ｃ．  Ｙａｎｇ（１９９２）  ”Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｃｅ”Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０３，  ３３−４２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような従来の問題を解決しようとするものであり、日本近海等で大量に漁獲することができ、さらに廃棄の対象となっている魚種について、ＡＦＰを探索し、得られるＡＦＰを精製し、或いは遺伝子発現、化学合成などの手法を用いて年間を通じて安定的に供給し、不凍能力を有する蛋白質あるいはペプチドを新たに提供するものである。
【０００６】
北海道の野付漁業協同組合においては野付湾内で捕獲される北海シマエビ等を中心にした産業振興に勤めているが、同湾内に生息するナガガジあるいはシチロウウオが北海シマエビを食い荒らしてしまうことが問題になっている。ナガガジあるいはシチロウウオは、底引き網を用いて行う漁の際に、北海シマエビと共に大量に網にかかり、分別されて廃棄魚用のカゴにまとめられ廃棄業者により廃棄される。不凍タンパク質を有するワカサギなど他の魚種が１キログラム当たり３００円〜２，０００円以上の原価で取引きされるのに対して、ナガガジあるいはシチロウウオは原価が０円である。したがって、ナガガジあるいはシチロウウオは不凍タンパク質を回収し精製するための原材料としてこれを低価格に抑えるために最適な魚種であると言える。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
かかる状況において、本発明者は、日本、あるいは日本周辺で大量に漁獲されかつ廃棄の対象となっている魚種であるナガガジまたはシチロウウオの組織液および筋肉をすりつぶした液中に存在する不凍タンパク質を見出し、そのアミノ酸配列と遺伝子配列を決定して、本発明を完成させるに至ったものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（２）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−２
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（３）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−３
（ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（４）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−４
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（５）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−５
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（６）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−６
（ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（７）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−７
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（８）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−８
（ａ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（９）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−９
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１０）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１０
（ａ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１１）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｂ−１
（ａ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１２）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１３）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−２をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１４）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−３をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１５）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−４をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１６）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−５をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１７）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−６をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１８）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−７をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（１９）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−８をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（２０）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−９をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号１８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（２１）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｚ−１０をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（２２）次の（ａ）または（ｂ）で表される不凍タンパク質Ｂ−１をコードするＤＮＡ
（ａ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列番号２２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、不凍機能を有するタンパク質。
（２３）  配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，又は２１で表される塩基配列であって、それぞれ不凍タンパク質Ｚ−１、Ｚ−２、Ｚ−３、Ｚ−４、Ｚ−５、Ｚ−６、Ｚ−７、Ｚ−８、Ｚ−９、Ｚ−１０又はＢ−１をコードするＤＮＡ。
（２４）  上記（１２）乃至（２３）のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（２５）  組換えベクターが発現ベクターである（２４）に記載の組換えベクター。
（２６）  宿主生物を（２５）に記載の組換えベクターによって形質転換した形質転換体。
（２７）  宿主生物が大腸菌である（２６）に記載の形質転換体。
（２８）  （２７）に記載の形質転換体を培地中で培養して不凍機能を有するタンパク質を産生せしめ、該タンパク質を採取することを特徴とする不凍機能を有するタンパク質の製造方法。
（２９）  （１）乃至（１２）のいずれか１に記載のタンパク質をペプチド合成機により化学的に合成することを特徴とするタンパク質の製造方法。
（３０）  （１）乃至（１２）  のいずれか１に記載のタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする凍結濃縮阻害剤。
（３１）  （１）乃至（１２）  のいずれか１に記載のタンパク質を有効成分として含むことを特徴とする凝固点降下剤。
（３２）  （１）乃至（１２）に記載のタンパク質を含むことを特徴とする氷スラリー。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
北極、南極あるいはその近海などの局地や深海に生息する魚類の体液は、温度がマイナス２℃程度まで下がっても凍結しない。これに対して普通の魚の体液はマイナス０．８℃で凍結する。なお、海水はマイナス１．９℃で凍結する。
【００１０】
北極、南極等に生息する魚類の体液の不凍性は、これら魚類が自ら生産する不凍タンパク質あるいは不凍糖蛋白質（ＡＦＧＰ）に起因するものであることが明らかになっている。このうち不凍タンパク質には、４つのタイプのタンパク質があり、それぞれ分子量約３，０００〜４，５００のＡＦＰＩ、分子量約２０，０００のＡＦＰＩＩ、分子量約７，０００のＡＦＰＩＩＩ、および分子量約１１，０００のＡＦＰＩＶに分類されている。ＡＦＧＰの分子量は２，２００から３３，０００の間である。不凍タンパク質は各々、タンパク質のアミノ酸組成およびその高次構造において差異があり、また、同一タイプに分類されているものであっても、魚種によりタンパク質のアミノ酸配列および高次構造はそれぞれ相違する（非特許文献１参照）。
【００１１】
一方、不凍タンパク質の機能について述べると、通常の場合、氷結晶は、水溶液中において氷核が表れると、まず扁平な六角の板状に成長する。板状平面に対し垂直方向への成長は、板状平面方向に対する成長に比べ１００倍程度遅い。これに対して、不凍蛋白質（ＡＦＰ）が存在すると円盤平面方向への氷晶の成長は阻止され、最初に形成された板状体を基底面として、この基底面に対し垂直方向に、順次、より小さい板状体が積み重ねられていき、最終的にはピラミッドを二つ重ねたバイピラミッド型の氷晶にゆっくりと成長していく。したがって、注目する検体中にＡＦＰが存在している場合に限り、検体液を０℃以下にした場合、その検体液中には一般にバイピラミッド型氷結晶、結晶学的には六方偏四角面体（図１の左図）あるいは六方両錘体（図２の左図）とよばれる氷の単結晶が、顕微鏡下に観測される。ＡＦＰが存在する結果、氷結晶上の１２枚の氷層平面に特異的な結合が起こり、このようなバイピラミッド型氷結晶が生成する。このことが、巨視的には、検体の非凍結現象（不凍活性）として観測される。この現象は、浸透圧計（オスモメーター）を用いることにより検体液の凝固点降下あるいは温度ヒステリシスとして定量化することもできる。凝固点降下の測定法を用いて不凍活性を評価する為には、高純度のＡＦＰの水溶液を得る必要がある。これに対してバイピラミダル氷結晶観測による不凍活性評価法は、ＡＦＰさえ存在していれば観測される（非特許文献２参照）。
【００１２】
（１）本発明によるナガガジ又はシチロウウオの血液又はすり身から本発明の不凍タンパク質Ｚ−１〜Ｚ−１２の調製法
ナガガジ魚体１匹の頭部と内臓を取り除き、胴体部分をきり身にして０．１Ｍ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝７．９）を加え、ジューサーミキサーに入れて粉砕した。このナガガジすり身に対して０．１Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液を加えてすり身の懸濁液を作製した。これを６，０００回転で３０分間遠心して上澄み液を得た。この上澄み液を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．７）に対して透析した後にこれを１２，０００回転で３０分間遠心して沈殿物を取り除いた。得られた上澄み液に対して陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。この操作には５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．７）を用い溶出には０〜０．５Ｍの塩化ナトリウム勾配を用いた。この操作で得られる２８０ｎｍの吸収が観測される試料液を逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製した。カラムの平衡化と試料液の取り込みには０．１％のトリフルオロ酢酸を用い溶出にはアセトニトリルの直線勾配を用いた。これにより、ナガガジ由来不凍タンパク質を含む複数の溶出液フラクションを得た。得られた不凍タンパク質の活性確認をバイピラミダル氷結晶の観察により行い、純度の確認をＳＤＳ電気泳動により行った。得られた試料を凍結乾燥した後に冷凍保存した。
【００１３】
（２）上記（１）で調製した不凍タンパク質のアミノ酸配列の決定法
プロテインシーケンサーでスタンダードを解析し、  ＨＰＬＣによる分離の際の各アミノ酸に相当する溶出時間を決定した。上記（１）で調製した不凍タンパク質の凍結乾燥粉末を酢酸に溶解し、一般的なエドマン分解法を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端側から順次解析を行った。具体的には、（ｉ）フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）をタンパク質のＮ末端にカップリングしフェニルチオカルバミルタンパク質（ＰＴＣ‐タンパク質）を生成した。次に、（ｉｉ）ＰＴＣ‐タンパク質からトリフルオロ酢酸で２‐アニリノ‐５‐チアゾリノン誘導体（ＡＴＺ‐アミノ酸）としてＮ末端アミノ酸を切り出す。このＡＴＺ‐アミノ酸を酸性下でフェニルチオヒダントイン誘導体（ＰＴＨ‐アミノ酸）に転換した後にＨＰＬＣで分離し、その溶出時間を基にアミノ酸の種類を決定した。Ｎ末端アミノ酸を切り出された残りのタンパク質を原料として（ｉ）と（ｉｉ）のサイクルを繰り返すことで、アミノ酸配列を決定した。
【００１４】
（３）上記で調製した不凍タンパク質の遺伝子のクローニング法及び塩基配列の決定法
ナガガジの肝臓を不凍タンパク質の発現量が増大している厳寒期に生魚から採取した。採取した肝臓を５ｍｍ角に裁断して１０倍量のＲＮＡ安定化剤中に保存した。安定化剤が浸透した肝臓サンプルを素早く低温ですりつぶしＲＮＡを抽出した。このＲＮＡの溶液からオリゴｄＴマトリックスを用いてｍＲＮＡを分離・精製した。精製したｍＲＮＡを鋳型にオリゴｄＴ配列を含むプライマーと逆転写酵素でｃＤＮＡ（１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）を合成し、続いてＲＮａｓｅ  ＨとＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩでｃＤＮＡ（２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ）を合成した。さらにＰｆｕ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  でｃＤＮＡの両末端を平滑化しアダプター配列を付加した。こうして構築したｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、上記（２）で決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマー、オリゴｄＴ配列を含むプライマーを用いてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）を行い、増幅した遺伝子断片をＴＡクローニングした。クローニングした遺伝子断片の配列はオリゴｄＴ配列を含むプライマーを用い、ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により決定した。その際のサイクルシークエンスの条件は９６℃  １０秒、５０℃  ５秒、６０℃  ４分、  ２５サイクルであった。その結果、ナガガジ由来ｃＤＮＡライブラリーの中でも優位な約５００ｂｐ長の遺伝子断片群に不凍タンパク質をコードする塩基配列が含まれていることが示された。この結果を基に、５００ｂｐのｃＤＮＡを鋳型に、付加したアダプター配列にアニールするプライマーとオリゴｄＴ配列を含むプライマーを用いて約５００ｂｐの遺伝子断片を増幅し、ＴＡクローニングした。クローニングした遺伝子断片の配列は同様にＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により決定した。
【００１５】
（４）組換えベクターの調製法
増幅した遺伝子断片を０．８％アガロースで電気泳動し、５００ｂｐ長の遺伝子断片を切り出し、精製した。ＴＡクローニング用ベクター  ５０ｎｇに対し精製した遺伝子断片を２０ｎｇ加え、４℃で一晩  Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅによりライゲーション反応を行った。
【００１６】
（５）形質転換体の調製法
氷上で融解したコンピテントセル（ＤＨ５α）に組換えベクター溶液を加え、氷上に３０分間静置した。これを４２℃で１分間熱処理し、すぐに氷上に移して２分間静置した。これにＳＯＣ培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に広げ、３７℃で一晩インキュベートしてコロニーを形成させた。形成された任意のコロニーを１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  液体培地に植菌し、３７℃で一晩大腸菌を振とう培養した。増殖した大腸菌をアルカリ‐ＳＤＳ  法で破壊し、ＤＮＡ吸着マトリックス及びスピンカラムを用いて組換えベクターを分離・精製した。
【００１７】
（６）形質転換体を使用して不凍タンパク質を製造する方法
プロモーター、ターミネーター配列等を含む組換え体発現用ベクターに不凍タンパク質をコードする塩基配列を組込み、この組換えベクターによる形質転換体を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  液体培地１０ｍｌで前培養した。この培養液１０ｍｌを１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  液体培地１０００ｍｌに加え、さらに培養を続けた。培養の温度として２８℃を設定した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．＝６００）が０．５まで増加した時点でタンパク質の発現誘導物質を添加した。発現誘導後一晩で培養液を回収し、（１）内に記述した陽イオン交換クロマトグラフィーによる方法を用いて不凍蛋白質を精製した。
【００１８】
（７）  不凍タンパク質を凍結濃縮阻害剤及び凝固点降下剤として使用する方法含水物の凍結濃縮阻害剤又は凝固点降下剤としてＡＦＰを使用する際には、ＡＦＰを、含水物中のＡＦＰの濃度が、含水物の質量に対して０．０２重量％濃度以上となる量を添加する。特に、０．０３重量％濃度から０．０５重量％濃度の範囲内であるときにＡＦＰは最大の効果を発揮する。このとき、例えば含水物が液体（水溶液、血液など）である場合には、ＡＦＰの粉末又は水溶液をそのまま混合すれば良い。また、含水物が細胞、組織である場合には、注射器などを用いてＡＦＰの水溶液を含水物内部に注入しても良い。また、含水物をＡＦＰの水溶液に浸した後に５０〜２，０００ｋｇ／ｃｍ２に加圧する等の手段により、含水物内部にＡＦＰを浸透させても良い。
【００１９】
本発明の不凍タンパク質は、前述したように、不凍タンパク質には含水物の凍結濃縮を妨げるはたらきや氷の再結晶化を妨げるはたらきがあるため、上記各魚種から得られた不凍タンパク質がＡＦＰＩ〜ＩＶのどのタイプの不凍タンパク質に分類されるか否かに関わらず、含水物の凍結濃縮阻害剤ないしは氷の再結晶化防止剤として使用でき、例えば冷凍食品あるいは食肉などに混入することによりその品質を持続させるために使用できる。また、この品質維持効果は、細胞（卵子や精子）、組織、臓器、野菜などを長期凍結保存する際にも同様に期待できる。さらに、近年、エネルギー密度が大きい氷スラリーを熱媒体として使用する冷熱供給システムあるいは冷熱蓄熱等が提案されているが、これらにおいては、氷の再結晶による配管系の閉塞の問題があり、本発明の不凍タンパク質は氷の再結晶化を有効に防ぐものであるから、この問題を解決するために有望な手段となりうる。このほか不凍蛋白質をコードする遺伝子を植物体に組み込むことにより、その植物に耐寒性を持たせることも応用技術として期待できる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）
（１）検体試料
不凍タンパク質の採取源として使用した魚種は以下のとおりである。
ナガガジ（Ｚｏａｒｃｅｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ｋｎｅｒ、英名Ｎｏｔｃｈｅｄ−Ｆｉｎ  ｅｅｌｐｏｕｔ）：北海道野付湾で漁獲。
シチロウウオ（Ｂｒａｃｈｙｏｐｓｉｓ  ｒｏｓｔｒａｔｕｓ、英名Ｌｏｎｇｓｎｏｕｔ  ｐｏａｃｈｅｒ）：北海道野付湾で漁獲。
【００２２】
（２）不凍活性の観測
採取したナガガジとシチロウウオの血液それぞれ１ｕｌをライカ社製ＤＭＬＢ１００型顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＬＢ  １００  ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の直径１６ｍｍのカバーガラス上に滴下した。これをそのままもう１枚の直径１２．５ｍｍのカバーガラスによりはさみ、これをＤＭＬＢ１００型顕微鏡のステージ部に設置した冷却箱内にセットした。冷却箱の上下には直径１ｍｍの光取り入れ穴をあけ、顕微鏡光源からの光は下側の穴から箱内を通り上側の穴を抜けてレンズに入光させるようにした。この上下の穴により規定される光軸上に検体液をセットすることで、光軸上にある検体液中の物質が顕微鏡観察される。検体液がセットされた冷却箱の中の温度は、リンカム社製ＬＫ６００温度制御装置（ＬＫ６００  温度コントローラー）により＋／−０．１℃の誤差で制御される。室温下で検体液をセットした後、温度制御装置により冷却箱内の温度を毎秒０．２℃でマイナス２２℃まで下降させた。およそマイナス１．４℃からマイナス４０℃の間の温度のどこかで検体液の全体が凍結する。凍結の後に毎秒０．１℃で冷却箱内温度を上昇させ零℃で上昇を停止し、そのまま１秒〜１０秒程度の間、零℃を維持していると凍結が溶け、無数のきれつの入った氷結晶状態を経たのちに、数えられる程度の氷の単結晶が水中に浮かんだものが観測された。その瞬間に、冷却箱内の温度をマイナス０．１℃〜マイナス１．０℃程度に下降させて止め、氷結晶の形状を観察した。観察結果を図１に示す。試験に使用した魚種のいずれにおいてもバイピラミダル型の氷晶が観察され、これらの魚種は、いずれも不凍タンパク質を有することを確認した。また、魚肉すり身懸濁液１Ｌ、および乾物懸濁液１Ｌを用いて同様の試験を行ったが、これらの試験においても、すべての魚種について、バイピラミダル型の氷晶が観察された。
【００２３】
（３）ナガガジＡＦＰ−  Ｚ−１の調製及びアミノ酸配列決定
ナガガジの身を包丁で切断しミキサーを用いてすり身にした。このすり身２０ｍｌに対して２０ｍｌの０．１Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液を加えることで、すり身の懸濁液４０ｍｌを調製した。これをプラスチック試験管に入れ、６，０００回転で３０分間遠心して、約２０ｍｌの上澄み液を得た。この上澄み液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．７）に対して透析し、共雑タンパク質を凝集させた。これを１２，０００回転で３０分間遠心して取り除き、上澄み液を得た。この上澄み液に対して陽イオン交換クロマトグラフィーを行い、１ｍｌずつの溶出液を２８０ｎｍの吸収を検出しながらフラクションコレクターにより回収した。陽イオン交換クロマトグラフィーにはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｔｅｃｈのＦＰＬＣシステムとＢＩＯ−ＲＡＤのＨｉｇｈ−Ｓカラムを用いた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝３．７）を用いてカラムの平衡化と上澄み液の取り込みをおこない溶出は流速１ｍｌ／分で０〜０．５Ｍの塩化ナトリウムの直線勾配をかけることで行った。ここまでの操作は全て４℃で行った。次に、２８０ｎｍの吸収の観測された試料液をＴＯＳＯのＨＰＬＣシステムとＯＤＳカラムを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。０．１％のトリフルオロ酢酸を用いてカラムの平衡化と試料液の取り込みを行い、溶出にはアセトニトリルの直線勾配を用いた。溶出試料の吸光度は２１４ｎｍと２８０ｎｍで検出し、単一のタンパク質を含む溶出液フラクションを得た後にこれを凍結乾燥した。この凍結乾燥粉末を０．１Ｍの重炭酸アンモニウム水溶液に溶解し、そのバイピラミダル氷結晶の観測をおこなうことで不凍タンパク質であることを確認し、不凍タンパク質Ｚ−１を得た。こうしてナガガジＡＦＰ−Ｚ−１のサンプルを精製した後、これを凍結乾燥したサンプルを用いたアミノ酸配列の決定を行った。乾燥状態のサンプルを酢酸に溶解し、ポリブレン処理したカートリッジフィルターに添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製４９１プロテインシークエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端側から順次アミノ酸配列を決定した。この結果、ＡＦＰ−Ｚ−１のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示すとおりである。
【００２４】
（４）全  ＲＮＡの単離
全  ＲＮＡの単離に関する基本的な操作はプロトコール集（”ＲｎｅａｓｙＲ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｎｄ  ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  及び  ”ＲＮｅａｓｙＲ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  （ＱＩＡＧＥＮ））に従った。また、サンプルとするナガガジの肝臓は不凍タンパク質の発現量が増大している厳寒期に生魚から採取した。採取した１〜２ｇの肝臓を５ｍｍ角に裁断して１０倍量のＲＮＡｌａｔｅｒ  （ＱＩＡＧＥＮ）中に保存した。この肝臓サンプル６０ｍｇを液体窒素中で粉断し３０ｍｇずつＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ６００μｌに懸濁した後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  （ＱＩＡＧＥＮ）  でさらに粉砕した。遠心により回収した上清に等量の７０％エタノールを加え、スピンカラムを通すことでＲＮＡをカラムに吸着させた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥでカラムを洗浄後、ＲＮａｓｅフリー水３０μｌでそれぞれＲＮＡを溶出した。
【００２５】
（５）ｍＲＮＡの単離
ｍＲＮＡの単離は  ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）  を用いて行い、操作は添付されているプロトコールに従った。１．１μｇ／μｌのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  溶液１５０μｌに対し２ｘＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  １５０μｌ、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  １５μｌを加え７０℃で３分間加熱した後、室温で１０分間放置した。遠心操作にてＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞を回収後、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁しスピンカラムでＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞を洗浄した。ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞に吸着したｍＲＮＡを７０℃で加熱しておいたＲＮａｓｅフリー水４０μｌで溶出した。
【００２６】
（６）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーの構築は  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＲ）  で行った。基本的操作は  ”ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ＺＡＰ−ｃＤＮＡＲ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ａｎｄ  ＺＡＰ−ｃＤＮＡＲ  ＧｉｇａｐａｃｋＲ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮ  ＭＡＮＵＡＬ”  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＲ）  に従った。上述のように回収したｍＲＮＡを鋳型としメチル化されたｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ  （ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）  基質として用いＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ  ＲＴａｓｅを加え、４２℃  １時間反応を行うことで  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  を逆転写合成した。次に  ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ  を加え、１６℃  ２．５時間反応を行い、ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  で  ｃＤＮＡ  の末端を平滑化した後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ
でアダプター配列を結合した。
【００２７】
（７）塩基配列の決定
構築したｃＤＮＡライブラリーの一部を０．８％  アガロースで電気泳動したところ、５００ｂｐの遺伝子断片が主として確認された。そこで、プロテインシークエンサーにより決定されたアミノ酸配列を元に縮重プライマーを設計し、このプライマーとｐｏｌｙ  Ａ  配列に相補的なプライマーを用いて５００ｂｐ  の  ｃＤＮＡを鋳型に  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ    （ＴａＫａＲａ）  で  ＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）  を行った。ＰＣＲ産物を  ｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  にクローニングし、このプラスミドで大腸菌を形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  寒天培地上に広げ、形成された任意のコロニーを１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  液体培地に植菌し、３７℃で一晩大腸菌を振とう培養した。増殖した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ  法でプラスミドを分離精製し、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  プライマーと  ＢｉｇＤｙｅＲ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  を用いてシークエンス反応を行い  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  及び  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  で塩基配列を解析した。この解析結果から分離精製した不凍タンパク質Ｚ−１と高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列郡が５００ｂｐ  の  ｃＤＮＡ  に含まれていることが確認された。そこで、この５００ｂｐ  の  ｃＤＮＡ  を鋳型にリンカー配列及びｐｏｌｙ  Ａ  配列にアニールするプライマーを用いてＥｘ  ＴａｑＴＭ    （ＴａＫａＲａ）  で  ＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）  を行い、不凍タンパク質をコードする塩基配列全長を増幅した。これらＰＣＲ産物を  ｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  にクローニングし、遺伝子断片の配列を前述の方法で解析した。得られる不凍タンパク質Ｚ−１の塩基配列は配列表の配列番号１に示すとおりである。
【００２８】
ナガガジ由来の残り９種類の新規なＡＦＰ−Ｚ−２〜Ｚ−１０のアミノ酸配列を上記と同様な方法により調製し、それらの遺伝子のＣＤＳ領域の塩基配列を上記と同様の方法により決定した。新規なＡＦＰ−Ｚ−２〜Ｚ−１０のアミノ酸配列は配列表の配列番号４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８及び２０に、塩基配列は配列番号３，５，７，９，１１，１３，１５，１７及び１９に示す。これらの塩基配列は、既に塩基配列が明らかにされているマクロゾアルケルスアメリカヌス由来のタイプＩＩＩ型不凍タンパク質と約７５〜９０％の相同性を示した。このようにして、ナガガジ由来のタイプＩＩＩ型の新規新規なＡＦＰ−Ｚ−２〜Ｚ−１０が得られた。
【００２９】
（実施例２）
（１）シチロウウオＡＦＰ−Ｂ−１のアミノ酸配列決定
実施例１のナガガジＡＦＰの精製と同様の精製法により、シチロウウオのすり身４０ｍｌからＴＯＳＯＨ  ＨＰＬＣ  システムと  ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＯＤＳ−８０ＴＳ  （４．６ｍｍ（ＩＤ）  ｘ  １５．０ｃｍ（Ｌ）、ＴＯＳＯＨ）  を用いてＡＦＰを高純度に精製した後、不凍活性を確認し（図２参照）、その凍結乾燥したサンプルを用いてアミノ酸配列の決定を行った。乾燥状態のサンプルを酢酸に溶解し、ポリブレン処理したカートリッジフィルターに添加した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製４９１プロテインシークエンサーでエドマン分解し、Ｎ末端側から順次アミノ酸配列を決定した。この結果、ＡＦＰ−Ｂ−１のアミノ酸配列は配列表の配列番号２２に示すとおりである。
【００３０】
（２）全ＲＮＡの単離
全  ＲＮＡの単離の基本的な操作はプロトコール集（”ＲＮｅａｓｙＲ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｎｄ  ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  及び  ”ＲＮｅａｓｙＲ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  （ＱＩＡＧＥＮ））に従った。また、サンプルとする各種魚類の肝臓は不凍タンパク質の発現量が増大している厳寒期に生魚から採取した。採取した１〜２ｇの肝臓を５ｍｍ角に裁断して１０倍量のＲＮＡｌａｔｅｒ  （ＱＩＡＧＥＮ）中に保存した。この肝臓サンプル６０ｍｇを液体窒素中で粉断し３０ｍｇずつＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  ６００μｌにけん濁した後、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ  （ＱＩＡＧＥＮ）  でさらに粉砕した。遠心により回収した上清に等量の７０％エタノールを加え、スピンカラムを通すことでＲＮＡをカラムに吸着させた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥでカラムを洗浄後、ＲＮａｓｅフリー水３０μｌでそれぞれＲＮＡを溶出した。
【００３１】
（３）ｍＲＮＡの単離
ｍＲＮＡの単離は  ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）  を用いて行い、操作は添付されているプロトコールに従った。１．１μｇ／μｌのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  溶液１５０μｌに対し２ｘＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  １５０μｌ、ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞  １５μｌを加え７０℃で３分間加熱した後、室温で１０分間放置した。遠心操作にてＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞を回収後、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒにけん濁しスピンカラムでＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞を洗浄した。ＯｌｉｇｏｔｅｘＴＭ−ｄＴ３０  ＜Ｓｕｐｅｒ＞に吸着したｍＲＮＡを７０℃で加熱しておいたＲＮａｓｅフリー水４０μｌで溶出した。
【００３２】
（４）ｃＤＮＡライブラリーの構築
ｃＤＮＡライブラリーの構築は  ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＲ）  で行った。基本的操作は  ”ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ＺＡＰ−ｃＤＮＡＲ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  ａｎｄ  ＺＡＰ−ｃＤＮＡＲ  ＧｉｇａｐａｃｋＲ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＮＳＴＲＵＣＴＩＯＮ  ＭＡＮＵＡＬ”  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＲ）  に従った。上述のように回収したｍＲＮＡを鋳型としメチル化されたｄＣＴＰを含むｄＮＴＰ  （ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）  基質として用いＳｔｒａｔａＳｃｒｉｐｔ  ＲＴａｓｅを加え、４２℃  １時間反応を行うことで  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  を逆転写合成した。次に  ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰ  を加え、１６℃  ２．５時間反応を行い、ｓｅｃｏｎｄ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  で  ｃＤＮＡ  の末端を平滑化した後、Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ
でアダプター配列を結合した。
【００３３】
（５）塩基配列の決定
プロテインシークエンサーにより決定されたアミノ酸配列を元に縮重プライマーを設計し、このプライマーとｐｏｌｙ  Ａ  配列に相補的なプライマーを用いて  ｃＤＮＡを鋳型に  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ    （ＴａＫａＲａ）  で  ＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）  を行った。ＰＣＲ産物を  ｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  にクローニングし、このプラスミドで大腸菌を形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  寒天培地上に広げ、形成された任意のコロニーを１００μｇ／ｍｌ  アンピシリン含有  ＬＢ  液体培地に植菌し、３７℃で一晩大腸菌を振とう培養した。増殖した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ  法でプラスミドを分離精製し、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  プライマーと  ＢｉｇＤｙｅＲ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  を用いてシークエンス反応を行い  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  及び  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  で塩基配列を解析した。この解析結果から不凍タンパク質のＣ末端をコードする塩基配列を決定し、この配列に相補的なプライマーとリンカー配列にアニールするプライマーを用いてｃＤＮＡ  を鋳型にＥｘ  ＴａｑＴＭ    （ＴａＫａＲａ）  で  ＰＣＲ  （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）  を行い、不凍タンパク質をコードする塩基配列全長を増幅した。このＰＣＲ産物を  ｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）  にクローニングし、遺伝子断片の配列を前述の方法で解析した。この結果、シチロウウオ由来ののＡＦＰ−Ｂ−１の塩基配列は配列番号２１に示すとおりである。シチロウウオ由来ののＡＦＰ−Ｂ−１の塩基配列は配列が明らかにされているリプテルス  アメリカヌス  （ｓｅａ  ｒａｖｅｎ  （Ｈｅｍｉｔｒｉｐｔｅｒｕｓ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ））  由来のタイプＩＩ型不凍タンパク質と約６３％の相同性を示した。このようにして、タイプＩＩ型の不凍タンパク質がシチロウウオのすり身から分離、精製された。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により日本近海で漁獲される魚であって、通常廃棄されているナガガシ或いはシチロウウオから１１種類の新規な不凍タンパク質を採取し、これらのアミノ酸配列及び塩基配列を決定した。また、得られる遺伝子を用いて遺伝子工学的手法により前記不凍タンパク質を多量に生産することを可能とした。
【００３５】
これら不凍タンパク質は、前述のとおり、例えばアイスクリーム、冷凍食品等における氷晶の成長による食味劣化、組織破壊を防止し、また、氷スラリーを使用する冷熱供給システムあるいは冷熱蓄熱等において、氷の再結晶による配管系の閉塞を解消し得る有効な添加剤として期待されているものである。さらに卵子や精子、移植臓器等の低温長期保存冷凍保存においても有望な物質である。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】バイピラミッド型氷結晶の形状を示す模式図および写真である。この図において左は六方両錘体の模式図を、右はナガガジの血液に観測された六方両錘体の氷結晶の写真を示す。
【図２】バイピラミッド型氷結晶の形状を示す模式図および写真である。この図において、左は六方偏四角面体の模式図を右はシチロウウオの血液に観測された六方偏四角面体の氷結晶の写真を示す。
【図１】
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【図２】
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