(57)【要約】【課題】安全にかつ効率良く遺伝子物質の薬物や細胞の疾患部へ導入できる薬物担体を得る。【解決手段】請求項１に（ａ）〜（ｃ）各式で規定されるサクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）、長鎖アルキル基含有単位（ｂ）および未変性ポリグリシドール単位（ｃ）を、（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ａ）〜（ｃ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールと、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む薬物担体。好ましくは、このサクシニル化ポリグリシドールを膜成分として含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入リポソームと、リポプレックスとの複合薬物担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜で形成される閉鎖空間内に薬物を内包する構造体であり、前記膜の構成成分として少なくとも下記（ａ）〜（ｃ）で示される単位を（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ａ）〜（ｃ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールを含み、前記薬物として少なくともヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む薬物担体。
【化１】
2004352619.tif 000005
【請求項２】
診断および／または治療ための薬物をさらに内包する請求項１に記載の薬物担体。
【請求項３】
前記膜の少なくとも一部が、サクシニル化ポリグリシドールで修飾された脂質からなる請求項１または２に記載の薬物担体。
【請求項４】
前記担体の粒径が、０．０２〜２５０μｍである請求項１ないし３のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項５】
前記担体が、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンからなる群より選ばれる少なくとも１種の形態からなる請求項１ないし４のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項６】
前記診断および／または治療ための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２ないし５のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項７】
前記診断および／または治療ための薬物が、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドから選ばれる少なくとも１種である請求項２ないし５のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項８】
前記診断および／または治療ための薬物が、抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項２ないし５のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項９】
前記診断および／または治療ための薬物が、体内診断薬である請求項２ないし５のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項１０】
少なくとも請求項１で規定されるサクシニル化ポリグリシドールで修飾された脂質からなる膜で形成される担体（ｉ）  の閉鎖空間内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包させた第１の薬物担体と、
脂質膜で形成される担体（ｉｉ）の閉鎖空間内に、診断および／または治療のための薬物を内包させた第２の薬物担体とを、それぞれ調製し、
前記第１の薬物担体と、第２の薬物担体とを複合化する請求項２ないし９のいずれかに記載の薬物担体の製造方法。
【請求項１１】
前記第２の薬物担体中に内包させる薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の生理活性物質である請求項１０に記載の薬物担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、病巣部位を確実にターゲッティングして、目的病巣部位の細胞内に薬物を安全にかつ効率良く送達するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）として有用な、特に遺伝子の細胞質伝達・発現に実用的な薬物担体、およびその調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
薬剤、ＤＮＡ（遺伝子）、ペプチドあるいはタンパク質などの治療および／または診断のための薬物投与において、薬効を最大限に引き出すためには、癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、薬物を安全にかつ効率良く送達するために、薬物送達の正確なコントロールが望まれる。近年、このようなドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）における運搬体（担体）として、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小胞を応用しようとする研究が盛んに行われている。
【０００３】
特に細胞内で活性を発現するタンパク質、ＤＮＡ（遺伝子）、アンチセンス分子などの生理活性物質を有効に働かせるためには、これらを細胞質中に導入する必要があるが、細胞膜は、多くの水溶性物質、高分子を透過させないため、薬物を細胞質まで送達するための運搬体（ベクター）を必要とする。遺伝子デリバリーシステムにおいては、ウイルスベクターを用い、感染により遺伝子を細胞内に導入するが、危険性を伴うウイルスベクターに代わる安全な非ウィルス（合成）ベクターの使用が望まれている。
【０００４】
合成ベクターとして、上記リポソームの利用が具体的に検討されており、たとえば遺伝子を補足し、かつ細胞内に高い導入率で取り込ませるために、リポソーム脂質膜成分をカチオン化した脂質ＤＮＡ複合体（以下、リポプレックスと称す）が知られている（たとえば特許文献１〜４など参照）。またすでにＤＣ−ｃｈｏｌ：３−β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−  ジメチルアミノエタン）  カルバモイル）  コレステロールなどのカチオン性脂質の製品を入手することもできる。しかしながら上記カチオン化リポプレックスなど、従来の開発技術によるリポプレックスによる細胞内への遺伝子導入率は充分とはいえず、このため実用的に応用しうるレベルで遺伝子発現させることが困難である。このため細胞内への遺伝子導入率が高く、かつ発現率が高く、遺伝子を効率よくトランスフェクションしうる安全で高機能な合成ベクターの開発が切望されている。
【０００５】
そこで、上記カチオン化リポプレックスに、生体膜と相互作用を示す化合物を組み合わせることで、細胞内への遺伝子導入を促進することも試みられている。このような生体膜と相互作用を示す化合物として、たとえばＨＶＪ（センダイウィルス）の膜エンベロープや、インフルエンザウィルスのＨＡタンパク質等が提案されている。
また一方、核内での遺伝子発現を促進する薬理作用を示す因子として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が知られている。しかしながらリポフレックスの構造は、ＤＮＡで構成される層と脂質で構成される層とが交互に積重なったサンドイッチ状の緻密な層状構造体で、全体として球に近い形態をとることが最近明らかにされている。このようなリポプレックスは、内部に薬物を封入しうるリポソームとは異なって、構造上薬物を封入することは困難である。このためヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が遺伝子発現を促進する薬理作用を示す因子であるとしても、これをリポプレックスに封入することは極めて困難であり、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を遺伝子と同時に細胞内に導入することは困難であった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４８９７３５５号
【特許文献２】米国特許第５３３４７６１号
【特許文献３】特開平２−２９２２４６号公報
【特許文献４】特開平４−１０８３９１号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このため本発明は、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体などの細胞内で薬理作用を示す生理活性物質の細胞へのトランスフェクションを、安全にかつ効率良く行うことができる導入システムを達成できるベクターとして有効な薬物担体、またたとえば腎ガン、肺ガン、肝ガン、膵ガンなどの癌、リンパ腫、肺炎、肝炎、腎炎、血管内皮損傷部位などの病巣部位を確実にターゲッティングし、該部位に、治療および／または診察するための薬物を安全にかつ効率良く送達するＤＤＳ療法の運搬体として有効な薬物担体、さらにはそのような薬物担体と薬物との複合製剤の開発が強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく検討する過程で、生体膜と相互作用を示す化合物として、サクシニル化ポリグリシドール（以下、ＳｕｃＰＧと称することもある。）について検討し、ＳｕｃＰＧがｐＨ感受性の膜融合能をもち、弱酸性下で膜融合能を発現することを見出した。つまりＳｕｃＰＧをリポプレックスの膜成分として含ませることにより、ＳｕｃＰＧの細胞膜あるいはエンドソーム膜との融合により、リポプレックスに捕捉されていた遺伝子は効率よく細胞質内に移行することができる。このＳｕｃＰＧを膜成分とすることにより、細胞内への遺伝子導入を促進することが確認できた。なおサクシニル化ポリグリシドールには核内での遺伝子発現を促進する薬理作用はない。このような結果に基づき検討を続けたところ、上記ＳｕｃＰＧを膜成分として含む担体であれば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包することができ、これと、リポフレックスとは複合体としての薬物担体を形成し、遺伝子導入促進作用と、細胞内での遺伝子発現促進作用との複作用を発現することができ、すなわち上記課題を解決することができることを見出した。
【０００９】
上記のような課題は、下記（１）〜（１１）の本発明により解決することができる。
（１）本発明は、膜で形成される閉鎖空間内に薬物を内包する構造体であり、前記膜の構成成分として少なくとも下記（ａ）〜（ｃ）で示される単位を（ａ）：（ｂ）：（ｃ）＝４０〜９５モル％：０〜３０モル％：０〜３０モル％（ただし（ａ）〜（ｃ）各単位の合計を１００モル％とする）の量比で含むサクシニル化ポリグリシドールを含み、前記薬物として少なくともヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む薬物担体である。
【化２】
2004352619.tif 000002
【００１０】
（２）上記（１）の薬物担体は、通常、上記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とともに診断および／または治療ための薬物をさらに内包する。
【００１１】
本発明の薬物担体は、脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤などの他の成分をさらに含むことができる。特に膜構成材料として、上記ＳｕｃＰＧとともに脂質を含むことが好ましい。脂質は、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、それらの誘導体であってもよい。
（３）具体的には、上記（１）または（２）において、上記膜の少なくとも一部が、ＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる薬物担体は好ましい態様である。
このような本発明の薬物担体の好ましい態様例としては、少なくとも一部がＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる膜から形成される閉鎖空間内にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む第１の薬物担体と、診断および／または治療ための薬物を内包する第２の薬物担体との複合体が挙げられる。
【００１２】
（４）担体の粒径は、０．０２〜２５０μｍ程度である上記（１）ないし（３）のいずれかの薬物担体。
【００１３】
（５）上記（１）ないし（４）のいずれかの薬物担体において、担体は、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンからなる群より選ばれる少なくとも１種の形態から構成されることが望ましい。
【００１４】
（６）上記（２）ないし（５）のいずれかの薬物担体において、診断および／または治療ための薬物として、細胞内で薬理作用を発現する生理活性物質を含む態様が好ましい。具体的には、該薬物として、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む薬物担体は、本発明の特に好ましい態様である。
【００１５】
（７）また上記診断および／または治療ための薬物として、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドから選ばれる少なくとも１種の生理活性物質を含むこともできる。
【００１６】
（８）上記（２）ないし（５）のいずれかの薬物担体において、診断および／または治療ための薬物として薬理的活性物質を含む態様も好ましい。このような薬物としては、抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、酵素阻害剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーからなる群より選ばれる少なくとも１種を挙げることができる。
【００１７】
（９）上記（２）ないし（５）のいずれかの薬物担体において、上記診断および／または治療ための薬物として体内診断薬を挙げることもできる。体内診断薬としては、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬および核磁気共鳴診断用診断薬などが挙げられる。
【００１８】
（１０）本発明は、少なくとも上記（１）で規定されるサクシニル化ポリグリシドールを含む膜で形成される担体（ｉ）  の閉鎖空間内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包させた第１の薬物担体と、脂質膜で形成される担体（ｉｉ）の閉鎖空間内に、診断および／または治療のための薬物を内包させた第２の薬物担体とを、それぞれ調製し、上記第１の薬物担体と、第２の薬物担体とを複合化する上記（２）ないし（９）のいずれかの薬物担体の製造方法を提供する。
【００１９】
（１１）上記（１０）の薬物担体の製造方法において、上記第２の薬物担体中に内包させる薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体からなる群より選ばれる少なくとも１種の生理活性物質である態様例は好ましい。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の薬物担体は、膜で形成される閉鎖空間内に薬物を内包する構造体であり、このような構造体の構成成分として、以下に示すサクシニル化ポリグリシドール（ＳｕｃＰＧ）と、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とを少なくとも含む。具体的には、ＳｕｃＰＧを膜成分として含み、担体に内包される薬物としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む。
本発明における膜構成成分のＳｕｃＰＧは、具体的に、下記で示されるサクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）を必須成分として含み、好ましくは該単位（ａ）とともに長鎖アルキル基含有単位（ｂ）を含む。さらにはこれら（ａ）および（ｂ）とともに未変性ポリグリシドール単位（ｃ）を含んでいてもよい。
【化３】
2004352619.tif 000003
【００２１】
ＳｕｃＰＧは、上記（ａ）〜（ｃ）各単位の合計を１００モル％とするとき、具体的に、サクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）を４０〜９５モル％、好ましくは７０〜９０モル％の量で含む。長鎖アルキル基含有単位（ｂ）を０〜３０モル％、好ましくは５〜３０モル％、より好ましくは５〜１５モル％の量で含むことが望ましい。また未変性ポリグリシドール単位（ｃ）の含有量は、通常０〜３０モル％であり、好ましくは０〜１０モル％である。
ＳｕｃＰＧは、このような構成により、ｐＨ感受性の膜融合能を発現することができる。
【００２２】
ＳｕｃＰＧは、上記構成とすることができれば、ＳｕｃＰＧの製法は特に限定されないが、たとえばポリグリシドールのサクシニル化変性、さらには該サクシニル残基の部分アルキル化によって得られる。
上記ポリグリシドールは、たとえばコーエン，Ｈ．Ｌ．  ：Ｊ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．，  Ｐｏｌｙｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｄ．  １３，１９９３−２００３（１９７５）  の方法に準拠してポリエピクロロヒドリンの転化により合成することができる。これにより得られるポリグリシドールの分子量は、高速液体クロマトグラフィー（Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＳ−５１０  カラム）により、ポリエチレングリコール換算分子量で、通常７６００にピークをもつ分子量として測定される。
【００２３】
ポリグリシドールのサクシニル化、さらにサクシニル残基の部分アルキル化は、たとえばＢｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９４；１１９３：１−９に記載された方法により調製することができる。具体的には、カルボキシル（サクシニル）変性ポリグリシドールは、ポリグリシドールと無水コハク酸とを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中、６０℃で３時間反応させることにより得ることができ、カルボキシル変性量は、無水コハク酸の使用量を変化させることにより調製することができる。
導入したサクシニル残基は、ｐＨメーター（堀場製作所社製Ｍ−８）を使用して、電位差滴定により決定することができる。
カルボキシル変性ポリグリシドールは、そのカルボキシル基の一部と、ｎ−デシルアミンなどの上記（ｂ）中のＲに対応するアルキルアミンとの結合により、長鎖アルキル基をもたせることができる。
【００２４】
上記で使用するポリエピクロロヒドリンおよびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドは、使用前に、蒸留精製することが望ましい。
上記Ｊ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．およびＢｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａの各記載は、これを引用することにより本明細書中にも記載されているものとするが、本発明におけるＳｕｃＰＧの製造方法は、これら方法に限定されるものではない。
【００２５】
薬物担体としては様々な形態が考えられ、特に制限されないが、特にその内部に薬物を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちより選ばれる少なくとも一種以上からなることが望ましい。
【００２６】
本発明の薬物担体は、上記の形態を形成できるものであれば、ＳｕｃＰＧおよびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含むこと以外に特にその構成成分は制限されないが、たとえば膜構成成分として、脂質またはその誘導体、安定化剤、酸化防止剤および表面修飾剤などの他の成分をさらに含むことができる。
特に膜構成材料として、上記ＳｕｃＰＧとともに脂質を含むことが好ましい。脂質は、リン脂質であってもリン脂質以外の脂質であってもよく、それらの誘導体であってもよい。
【００２７】
リン脂質としては、フォスファチジルコリン（＝レシチン）、フォスファジルグリセロール、フォスファチジン酸、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらの常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。
【００２８】
本発明の薬物担体の膜材料として、このような脂質を含む場合、すなわちＳｕｃＰＧリポソームでは、たとえば卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）を膜材料とするリポソームの外側に、ＳｕｃＰＧがその長鎖アルキル基含有単位（ｂ）のアルキル基をアンカーとして覆う構造が考えられ、さらにＳｕｃＰＧが内水相側も覆う構造も考えられる。
【００２９】
安定化剤としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。コトフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
表面修飾剤としては、ＳｕｃＰＧ以外の親水性高分子、グルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
【００３０】
上記他の親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著である。
【００３１】
また上記親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキルまたはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物を結合させた誘導体として用いることができ、これら疎水性化合物部位を、薬物担体（たとえばリポシーム）の膜中へ安定に挿入することができる。そのことにより、薬物担体表面に親水性高分子を存在させることができる。親水性高分子誘導体として、ポリエチレングリコール−ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等を好ましく使用することができる。
【００３２】
本発明の薬物担体中に内包させるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤としては、たとえば酪酸、ＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ、Ｃａイオンなどが挙げられる。
【００３３】
本発明の薬物担体は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に加え、通常、診断および／または治療のための薬物を内包する。この薬物としては、診断および／または治療の目的に応じて薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質である。
【００３４】
治療のための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねない限り特に限定されないが、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、グリコサミノグリカンおよびその誘導体、オリゴ糖、多糖およびそれらの誘導体、タンパク質およびペプチドなどの生理活性的物質；抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り組み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、血管内皮細胞の増殖または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウィルス剤、抗凝固剤、血管拡張剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、ＮＯＳ阻害剤、ＡＧＥｓ阻害剤およびラジカルスカベンジャーの薬理的活性物質が挙げられる。
【００３５】
また診断の薬剤としては、薬物担体の形成を損ねないかぎり特に限定されないが、たとえばＸ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬などの体内診断薬挙げられる。
【００３６】
本発明では、これらのうちでも細胞内で生理的活性を発現する生理活性的物質が好ましく、なかでも核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、とりわけ遺伝子を内包することが好ましい。
【００３７】
このような薬物担体の好ましい実施態様例としては、具体的に、少なくとも一部がＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる膜から形成される閉鎖空間内にヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む第１の薬物担体（ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム）と、診断および／または治療ための薬物を内包する第２の薬物担体（薬物封入リポソーム）との複合体が挙げられる。
本発明の薬物担体は、粒径が０．０２〜２５０μｍ、とりわけ０．０５〜０．４μｍの大きさが好ましい。特に第１の薬物担体（ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム）単独での大きさは、通常粒径５０ｎｍ程度であり、一般的なリポソームよりもかなり小さい。このため、第２の薬物担体（たとえば後述のリポプレックス）が第１の薬物担体よりも大きな粒径を有していることが多く、この場合には大径のリポプレックス球体の外周表面に第１の薬物担体が担持されているような複合構造が考えられる。
【００３８】
本発明では、膜の少なくとも一部が、ＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる薬物担体は好ましい態様であるが、特に上記第１の薬物担体の膜がＳｕｃＰＧで修飾される脂質からなることが好ましい。ここでのＳｕｃＰＧで修飾される脂質としては、リン脂質を好ましく挙げることができる。
また第２の薬物担体は、好ましくは遺伝子を内包するリポプレックスであり、この場合の第２の薬物担体の膜は、たとえばＤＣ−ｃｈｏｌなどのカチオン化コレステロールからなる。すなわち本発明の薬物担体の好ましい態様例として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体が好ましく例示される。この場合、ＳｕｃＰＧリポソーム（第１の薬物担体）の有するマイナスチャージと、リポプレックスとが双方の構造を保ったまま穏やかにチャージで結合するような比で複合体が形成されることが望ましい。
【００３９】
通常生体のｐＨは７以上であるが、細胞内のライソゾーム内では酸性条件になるため、ＳｕｃＰＧリポソームは膜融合性を示す。その作用機序は、次のように説明される。ＳｕｃＰＧリポソームがエンドサイト−シスで細胞に取り込まれた場合、ライソゾーム内で細胞内消化が始まり、プロトンポンプの作用でｐＨが低下する。そのときＳｕｃＰＧリポソームは、膜融合性を発揮してライソゾーム膜と融合し、その結果内包する物質が細胞質内へ放出される。
したがって上記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体において、ＳｕｃＰＧのｐＨ感受性の膜融合能により、ＳｕｃＰＧリポソームに内包されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とリポプレックスを構成するＤＮＡとは、同時に細胞内に導入される。
【００４０】
上記のような第１の薬物担体と、第２の薬物担体との複合体としての薬物担体は、たとえば上記ＳｕｃＰＧで修飾された脂質からなる膜で形成される担体（ｉ）  の閉鎖空間内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を内包させた第１の薬物担体と、脂質膜で形成される担体（ｉｉ）の閉鎖空間内に、診断および／または治療のための薬物を内包させた第２の薬物担体とを、それぞれ調製し、次いで、第１の薬物担体と、第２の薬物担体とを複合化することにより容易に得ることができる。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ複合体としての薬物担体の一例をより具体的に以下に示す。
【００４１】
まず、フラスコ内に、リン脂質等の担体膜構成材料を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次にＳｕｃＰＧのメタノール溶液を加え、有機溶媒を留去後、真空乾燥させることによりフラスコ内壁に脂質−ＳｕｃＰＧ混合薄膜を形成させる。当該フラスコ内に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤水溶液を加え、激しく攪拌することにより、ＳｕｃＰＧ修飾リポソームを形成する。次いでこれをゲルろ過することにより、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム（第１の薬物担体）を得ることができる。
また第１の薬物担体は、上記方法以外にも上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型入乳化機により高圧吐出させる方法によっても得ることができる。
【００４２】
次に、別のフラスコ内に、カオチン化脂質およびリン脂質等の他の担体構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に脂質の薄膜を形成させる。当該フラスコ内に、薬物溶液を加え、激しく攪拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし、封入されなかった薬物を除去することにより、薬物封入リポソーム（第２の薬物担体）を薬物担体の分散液として得ることができる。
また第２の薬物担体は、上記方法以外にも、上記各構成成分を混合し、高圧吐出型入乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。
【００４３】
このようにして得られた、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム（第１の薬物担体）と薬物封入リポソーム（第２の薬物担体）とを複合化することにより、薬物担体、すなわちヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ複合体を形成することができる。
【００４４】
【実施例】
次に実施例および試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例に限定されるものではない。
（実施例１）
下記１）〜３）の工程により、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム・リポプレックス複合体としての薬物担体を調製した。
１）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム（第１の薬物担体）の調製
卵黄フォスファチジルコリン（ＥＹＰＣ）（１０ｍｇ／ｍｌ）のクロロホルム溶液７００μｌをナス型フラスコに装入し、クロロホルムをロータリーエバポレーターで減圧留去してＥＹＰＣの薄膜を形成させた。
【００４５】
これにＳｕｃＰＧ（サクシニル変性ポリグリシドール単位（ａ）：８０モル％、長鎖アルキル基含有単位（Ｒ＝Ｃ１０）（ｂ）：１２モル％、未変性ポリグリシドール単位単位（ｃ）：８モル％で含むサクシニル化ポリグリシードル）のメタノール溶液（３ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加え、再び溶媒を減圧留去し、脂質−ＳｕｃＰＧ混合薄膜を形成させた。
これを約２時間真空乾燥した後、２ｍｌの、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤溶液としてＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎＡ  （２．２ｍＭ）または酪酸（１５０ｍＭ）を加え、バス型超音波照射装置を用いて３０秒間超音波照射して脂質−ＳｕｃＰＧ混合膜を分散させた。この分散液のｐＨを７に調整した後、凍結−融解を３回行って、ＳｕｃＰＧ修飾リポソームを形成した。さらに、エクストルーダーを用いて孔径５０ｎｍのポリカーボネート膜を通して、リポソームの粒径を揃えた。
【００４６】
そしてＳｕｃＰＧ修飾リポソーム分散液のｐＨを６に調製し、４℃においてサクシニル変性ポリグシリドール単位（ａ）に対して０．３当量のＥＤＣ（１−エチル−３−  （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を加えて２時間反応させた後、トランスフェリン水溶液（トランスフェリン３μｇを水５０μｌに溶解させ、５００ｍＭクエン酸（ＩＩＩ  ）溶液５μｌを加えたもの）を加え、４℃で一晩反応させた。
その後、ＳｕｃＰＧ修飾リポソームの分散液のｐＨを７．４に調製し、セファロース４Ｂカラムを用いて遊離トランスフェリンを除去し、さらに、この分散液をろ過滅菌した。
【００４７】
２）リポプレックス（第２の薬物担体）の調製
２−１）カオチン性リポソームの調製
リポプレックス調製のためのカオチン化脂質としてＤＣ−ｃｈｏｌを用いた。
ＤＣ−ｃｈｏｌ（１６５μｇ）および中性脂質ＤＯＰＥ（ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン）（３００μｇ）をクロロホルム（０．３２ｍｌ）に溶解させ、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去して混合脂質の薄膜を形成させた。そして、これにＰＢＳ（２．５ｍｌ）を加え、バス型超音波照射装置で２分間分散させてカオチン性リポソームを得た。
【００４８】
２−２）リポプレックス（第２の薬物担体）の調製
プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（５０μｌ）に溶解させた溶液を、カチオン化脂質とＤＮＡの電化（＋／−）比が６になるように量を調製したカオチン性リポソーム分解液と混合し、氷冷下で１０分間インキュベーションすることによってリポプレックス（第２の薬物担体）を調製した。
【００４９】
３）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体の調製
上記２−２）で得られたリポプレックス分散液に、種々の量のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ修飾リポソーム分散液（ＥＹＰＣ濃度：０．２ｍＭ）を加え、氷冷下で１０分間インキュベーションして、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体を得た。
【００５０】
（試験例１）
上記で得られたヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ・リポプレックス複合体を用いて遺伝子導入試験を行った。
＜細胞の調製とトランスフェクション＞
ＨｅＬａ細胞を２４穴ディッシュに１穴当たり５万個撒き、１０％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル倍地（ＤＭＥＭ）１ｍｌを加えて、３７℃で一晩培養した。その後ＰＢＳで２回洗浄した後１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ１ｍｌを加えた後、１穴当たり０．５μｇのプラスミドＤＮＡを含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤封入ＳｕｃＰＧ複合体またはリポプレックスを加え、１２時間インキュベーションした。その後、再びＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＦＢＳ含有ＭＤＥＭ１ｍｌを加えて１２時間培養した。
【００５１】
＜ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価＞
遺伝子導入の細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり５０μｌの溶解剤を加えて細胞を溶解させた。得られた細胞溶解液を遠心チューブに回収し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して不溶成分を除去した。細胞溶解液１０μｌを用いて、タンパク質の定量を行った。タンパク質の定量はｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた。また、細胞溶解液２０μｌを用いて、ルシフェラーゼ活性を評価した。結果を表１に示す。
【００５２】
2004352619.tif 000004
【００５３】
【発明の効果】
上述した通り、本発明により新規な高効率遺伝子導入ベクターが供給される。本発明の、ＳｕｃＰＧとヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を構成成分とする薬物担体は、試験例に示されように、従来の薬物担体に比べ遺伝子の細胞での導入効率がきわめて高いことが明らかとなった。
このような特徴から、薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を封入させた本発明の薬物担体は、治療および診断という目的に対して非常に効果的である。