(57)【要約】【課題】　医療上有用な組換えシャペロニン１０（cpn 10）を提供すること。【解決手段】　配列【表１】2004067698.tif 000007を有する組換えcpn１０および関連アミノ酸配列を有するペプチドを提供する。また、(ｉ)cpn１０に対する抗体を作り、(ii)この抗体をcpn１０含有の可能性がある生物体液サンプルと反応せしめ(iii)cpn１０−抗体複合体の生成からおきるシグナル増幅によりサンプル中のcpn１０の存在を検出する各工程を含む、血清中または他の生物体液中のcpn１０を検出する方法および哺乳動物にcpn１０を投与する工程を含む細胞成長または免疫抑制を促進する方法も提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬおよび/またはアミノ酸配列ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴから基本的になるペプチド。
【請求項２】
配列
ＧＳＭＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥＲＳＡＡＥＴＶＴＫＧＧＩＭＬＰＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＶＶＡＶＧＳＧＳＫＧＫＧＧＥＩＱＰＶＳＶＫＶＧＤＫＶＬＬＰＥＹＧＧＴＫＶＶＬＤＤＫＤＹＦＬＦＲＤＧＤＩＬＧＫＹＶＤ
を有する組換え cpn１０である、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドがアミノ酸配列ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬを有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬを有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴを有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２(式中、Ａ１およびＡ２はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２(式中、Ａ２はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ(式中、Ａ１はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項９】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａｃ−Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２(式中、Ａ１およびＡ２はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項１０】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２(式中、Ａ２はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項１１】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａｃ−Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ(式中、Ａ１はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項１２】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａ１ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＡ２(式中、Ａ１およびＡ２はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項１３】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＡ２(式中、Ａ２はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【請求項１４】
ペプチドが、単一アミノ酸欠損、添加または置換を含む、アミノ酸配列Ａ１ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ(式中Ａ１はアミノ酸配列である)を有する、請求項１記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、cpn１０とも略称するシャペロニン１０に関する。
【０００２】
（先行技術）
　シャペロニン類は、より広いクラスの分子シャペロン類に属し、翻訳後のひだ形成、ターゲッティングおよび他のタンパク質の集合に含まれる分子であるが、Ellisら, 1991, Annu.Rev.Biochem. 60, 321-347に論じられているように、それ自体は最終的な集合構造の部分を形成しない。大部分のシャペロン類は“熱ショック”または“ストレス”タンパク質(hsp)であり、すなわち、その生成は、種々の細胞傷害(例えば代謝性破壊、酸素ラジカル、炎症、感染および変形)により誘導または増大される。Lindquistら, 1988, Annu.Rev.Genet. 22 631-677で評されているように、熱がよりよい研究ストレスの唯一のものである。特定のタンパク質レベルにおけるこれらの量的変化と同様に、上記のLindquistらに言及されているように、ストレスは本質的に生成したストレスタンパク質の異なる細胞区分への移動を誘導し得る。熱ショック反応は最も高く維持されている遺伝系の一つであり、そして種々の熱ショックタンパク質が最も進化論的に安定なタンパク質の中に存在している。逆境条件の下で細胞が切り抜けられるように、これらの類のあるものは正常細胞内で基本的な機能を果す。
【０００３】
　２つの型のcpn分子、すなわちcpn６０(単量体Ｍｒ 〜６００００)とcpn１０(単量体Ｍｒ 〜１００００)がある。cpn６０はよく研究されてきた。これはすべての細菌、ミトコンドリア、色素体で認められ、そして細胞質型、ＴＣＰ−１は真核細胞中に認められる。いくつかの細胞の表面上でのその存在が報告されている。しかし上記のEllis文献やvan Eden, 1991, Immunol.Reviews 121 5-28では疑問視されて来た。非常に最近までcpn１０は細菌中でのみ認められていたが、構造的および機能的に同等なものが葉緑体中(Bertschら, 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89 8696-8700)、ラット中(Hartmanら, 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89 3394-3398)および牛肝ミトコンドリア中(Lubbenら, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87 7683-7687)で見い出された。
【０００４】
　ＡＴＰの存在下でcpn６０とcpn１０は機能的に相互作用をおこし、タンパク質の集合を仲介する。cpn６０から独立して働くcpn１０の例は報告されていないが、cpn６０は単独で働き、本質的に相違する事象に関係している。例えば、それは細菌感染における抗体とＴ細胞反応の免疫支配標的であり、しかし、タンパク質が高く保持されているので自己反応性が生成される。van Eden, 1991, Immunol.Reviews 121 5-28で論じられているように、健常人は変形および感染自己細胞を排除するためにこの自己認識を用いることができ、かかる認識の調節を欠いている者は自己免疫疾患になり得る。当然のことであるが、cpn６０はリウマチ性関節炎などの状態に関係している。分子シャペロン類は、多様なポリペプチド類の構造と結合したりあるいは変化する能力があり、タンパク質生物発生以外の細胞機能において最も重要な役割をなし得る。Hartmanら, 1993, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90 2276-2280を参照、これはcpn１０およびcpn６０を用いたタンパク質分子の安定化を記載している。
【０００５】
　哺乳動物のcpn１０については、非常に近似した配列相同性であることが確証できた。例えば、ラットcpn１０分子(Hartmanら, 1992)は、J.E.Walker, MRC Lab. of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge, UK提供のMT BTC PN10においてEMBL Data Base Directryに報告されている中のcpn１０の構造と９９％以上の相同性を有している。このことは、細菌cpn１０がラットシャペロニン１０とわずか３４％平均相同性しか有していないことと対照的である。
【０００６】
初期妊娠因子(ＥＰＦ)
　ＥＰＦは最初、妊娠関連物質として言及され(Mortonら, 1976, Proc.R.Soc.B. 193 413-419)、この発見は受精から６−２４時間以内に妊娠の有無を検査できるので非常に興味を呼んだ。最初にＥＰＦは、リンパ球から免疫抑制因子を放出する能力により、免疫抑制剤としての役割が考えられた(Rolfeら, 1988, Clin.exp.Immunol 73 219-225)。これらの抑制因子は、マウスにおいて遅延型の過敏症を低下せしめ、よって、抗原的に異質の胎児に対する母体の免疫反応を抑制するのであろう。さらに最近の研究によると、ＥＰＦの生成は妊娠に限られていない。これは初期および新生細胞増殖の産物であり、これらの状態において成長因子として働く(Quinnら, 1990, Clin.exp.Immunol. 80 100-108；Cancer Immunol. Immunother. 1992, 34 265-271)。ＥＰＦは血小板活性化の産物でもあり、したがって、創傷治癒および皮膚再生に関係することが言われている(Cavanaghら, 1991, Journal Reproduction and Fertility 93, 355-365)。
【０００７】
　ＥＰＦは、Mortonら, 1992、Eary Pregnancy Factor, Seminar in Reproduction Endocrinology 10 72-82で詳細に再検討された。ＥＰＦ生成の場所および調節が記載され、さらに血小板からのＥＰＦの精製および精製物と他の源から導かれたＥＰＦとの関係についても述べている。この再検討は、精製工程のモニタリングおよび生成源の研究を含み、ＥＰＦの生物検定法(すなわち、ロゼット阻害試験)についても論じている。ＥＰＦの生物活性が論じられ、ＥＰＦとそのアンタゴニストの可能な臨床適用が記載されている。
【０００８】
　Mortonら, 1992, Repord.Fertil.Dev. 4 411-422は、ＥＰＦの免疫抑制および成長因子の性質に関して以前なされた発表を再検討している。前胚保持におけるＥＰＦの役割についても、この文献で論じられている。
【０００９】
　今まで、ロゼット阻害試験が複合生物学的混合物中のＥＰＦを検出する唯一の手段であった(Mortonら, 1976, Proc.R.Soc.B. 413-419)。この検定法は、免疫抑制の抗リンパ球血清(ＡＬＳ)がリンパ球と非定型赤血球とのインビトロ自発性ロゼット形成を阻止し得るとのBachおよびAntoine, 1968, Nature(Lond) 217 658-659の最初の知見に基づいている。ＥＰＦを検出するために修正法が導入された。まず、ＥＰＦ中でプレインキュベーションしたリンパ球が同じ提供者のＥＰＦ未処理のリンパ球に比してＡＬＳで有意に高いロゼット阻害価(ＲＩＴ)を有していることが上記の1976文献で示された。この試験は、詳細に、上記の1976文献およびMortonら, 1987, "In Current Topics in  Developmental Biology" Vol.23 73-92, Academic Press, San Diegoに記載されており、簡単には、ＥＰＦがリンパ球に結合し、続いて抑制因子の放出を誘導する一連の流れに関している(Rolfeら, 1988, Clin.exp.Immunol. 73 219-225)(Rolfeら, 1989, Immunol.cell Biol. 67 205-208)。
【００１０】
　Athanasas-Platsisら, 1989, Jornal Reproduction and Fertility 87 495-502およびAthanasas-Platsisら, 1991, Jornal Reproduction and Fertility 92 443-451に、ＥＰＦに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の生成および胚生存の欠如をもたらすこれらの抗体による妊娠ラットの受動免疫法について記載されている。これらの研究で妊娠がうまく成立するためにＥＰＦが必要であることがはっきりした。
【００１１】
　Quinnら, 1990, Clin.exp.Immunol. 80, 100-108に、ＥＰＦが培養腫瘍および変形細胞の成長調節物であることが示されている。これらの細胞は継続成長のためにＥＰＦに依存しており、すなわち、ＥＰＦがオートクリンモードで働く。
【００１２】
　腫瘍細胞の成長が抗ＥＰＦmＡbsでかなり遅延されることから、ＥＰＦが腫瘍の成長促進に役割を演じていることが確証されている。さらに、高い親和力の抗ＥＰＦ抗体を生成するハイブリドーマは本来、不安定であろうことをこの文献は示している。
【００１３】
　Quinnら, 1992, Cancer Immunol.Immunother, 34 265-371に、移植可能マウス腫瘍のインビボ成長に対する抗ＥＰＦのモノクローナル抗体(mＡbs)の作用が記載されている。この文献の要点は、ＥＰＦの中和がインビボ腫瘍の成長を遅らすことにある。
【００１４】
　癌が非常に初期段階にあるとき、抗ＥＰＦmＡbによるＥＰＦの中和が、癌の拡大を止めることはQuinnら、1992の文献により明らかである。しかし、癌が大きくなってしまうと、これらのmＡbsでの処置は癌の成長を止めるが完全に破壊しない。
【００１５】
　腫瘍成長におけるＥＰＦの役割に関する他の文献として、Quinn, 1991, Immunol.Cell.Biol.69 1-6およびQuinn.K.A.の１９９１年オーストラリアのクイーンズランド大学での“初期妊娠因子：細胞増殖に関する新因子”なる博士論文がある。
【００１６】
　上記のことから、ＥＰＦは、胚の存在の指標でありまた必要であり、免疫抑制作用を有していると評価される。最近の研究は、変形、新生および正常細胞の成長調節剤としてのＥＰＦの重要性を示唆しており、血小板中でのその存在は炎症および創傷治癒において役割を演じる。
【００１７】
　この特異な結合作用を保持する分子は大きい意義を有しているが、今まで、この分子の
構造は明らかでなかった。
【００１８】
　意外にも、哺乳動物のシャペロン１０が初期妊娠因子(ＥＰＦ)と同じアミノ酸配列を有することが確証された。
【００１９】
（発明の開示）
　発明の要約
　一つの態様において、本発明は、cpn１０がＥＰＦであることおよびＥＰＦでもって示された未知または未予測の作用を有することの発見にある。cpn１０のこの未知または未予測の作用は、成長因子および免疫抑制因子としての作用活性のような細胞外活性を含んでいる。他の態様において、本発明は、cpn１０の未知または未予測の作用を開発するためにcpn１０を利用して１またはそれ以上の方法を提供する。この方法は成長を促進するためにcpn１０を利用する方法および免疫活性を抑制するためにcpn１０を利用する方法を含んでいる。
【００２０】
　ここで用いられる語“cpn１０”はその範囲に真核cpn１０、groESを含む原核cpn１０およびcpn１０の誘導体を含んでいる。cpn１０は生物体から精製され、合成的にまたは組換えＤＮＡ技法により製造され得る。この用語は生物学的フラグメントも含んでいる。
【００２１】
　本発明はその範囲に、修飾された組換え体、それから誘導される誘導体およびペプチドフラグメントをも含んでいる。
【００２２】
　本発明はその範囲に下記のものを含む。
１.ｃｐｎ１０についての検定
　cpn１０に対する、その修飾体に対する、またはフラグメントに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を単独で、相互に併用してまたはcpn６０と共に(ＡＴＰまたは他のヌクレオチドトリホスフェートの存在下で)、下記の目的のために用いて、血清または他の生物体液中のcpn１０の検出。
　(ａ)すべての哺乳類における妊娠の診断；
　(ｂ)危険にさらされている妊娠における胚の状態の監視；
　(ｃ)腫瘍の診断；および
　(ｄ)腫瘍の外科的摘出後の患者の監視。
【００２３】
２.ｃｐｎ１０による処置
　下記の処置における成長因子または免疫抑制剤としてのcpn１０の使用。
　(ａ)皮膚または臓器移植；
　(ｂ)創傷治癒、組織修復または組織再生；
　(ｃ)自己免疫疾患；
　(ｄ)不妊／流産；
　(ｅ)アレルギー性疾患；および
　(ｆ)炎症状態。
【００２４】
　実験
１.ｃｐｎ１０の精製
　(ａ)ヒト血小板からのヒトＥＰＦの精製(図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ)
抽出
　臨床的に７日まで経過の濃縮血小板(血液銀行より)をチロード(Tyrodes)緩衝液で洗い、Method in Enzymology, 1989, 167 7-11に記載の技法を用い、液体Ｎ２で凍らせて−７０℃で保存した。
【００２５】
　精製の直前に、約１００洗浄血小板単位を水浴で溶かし、７５−８５℃で１５分間断続的に緩やかに撹拌した。氷冷した後、細胞片を遠心分離(８０００ｇ、２０分、４℃)で除き、ペレットを０.０５Ｍ酢酸／０.１Ｍ　ＮａＣｌ／０.１mg／mlナトリウムアジド　ｐＨ３.０で均等化により２度抽出し、次いで遠心分離した(８０００ｇ、１５分、４℃)。この３上清液をためて、全抽出量が５００−６００mlとなった。
【００２６】
イオン交換クロマトグラフィー
　１００血小板単位からの抽出液を濃塩酸でｐＨ３.０に調整し、０.０５Ｍ酢酸／０.１Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ３.０であらかじめ平衡化した２５０ml　ＳＰ−Ｓephadex Ｃ−２５(Pharmacia-LKB)と共に緩やかに一晩、４℃で撹拌した。ゲルを同じ緩衝液２０volで洗ったカラムに入れ、０.５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液／０.０５Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ７.５で溶出した。次いで、ゲルを、捨てた。
【００２７】
親和性クロマトグラフィー
　ＳＰ−Sephadex溶出物を、濃塩酸でｐＨ６.３−６.４に調整し、０．０５Ｍリン酸ナトリム緩衝液／０.０５Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ６.３であらかじめ平衡化したHeparin-Sepharose CL-6Bのカラム(２.５×７.５cm；Pharmacia-LKB)にかけた。カラムを同じ緩衝液５volで洗い、０.０５Ｍトリス−ＨＣｌ／５mＭ　ＣａＣｌ２／０.２Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ７.５の５volで溶出し、サンプル適用のために用いるカラムに逆方向でかけた。
【００２８】
高性能疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC-h.p.l.c.)
　固体の(ＮＨ４)２ＳＯ４をHeparin-Sepharose溶出液に最終濃度が２Ｍになるまで加え、０.４５μmフィルターを通した後、０.１Ｍトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７.０／５mＭ　ＣａＣｌ２／２Ｍ　(ＮＨ４)２ＳＯ４であらかじめ平衡化したTSK Phenyl 5PWカラム(７.５×７５mm、Pharmacia-LKB)上の専用溶媒ラインを通してサンプルをポンプで送った。このカラムを同じ緩衝液１０volで洗い、この緩衝液から０.１Ｍ　トリス−ＨＣｌ　ｐＨ７.０／５mＭ　ＣａＣｌ２／１０％アセトニトリルの５０分直線勾配溶出を行った(図１ａ)。
【００２９】
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−１
　活性ＨＩＣ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.フラクションをプールし、Ａ、０.０４Ｍ　トリス／ＨＣｌ　ｐＨ７.０／５mＭ−ＣａＣｌ２およびＢ、０.０４Ｍ　トリス／ＨＣｌ　ｐＨ７.０／５mＭ　ＣａＣｌ２／８０％(ｖ／ｖ)アセトニトリルからなる溶媒を用いてＣ３カラム(Ultrapore RPSC, Beckman Institute)上で分画した。カラムをサンプル適用する前に溶媒Ａで平衡化し、その後溶媒Ａ５volで洗い、この溶媒から３０分７５％溶媒Ｂまでの直線勾配で溶出を行った(図１ｂ)。
【００３０】
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−２
　いくつかの１００単位血小板のＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−１からの活性フラクションをプールし、ＥＤＴＡとＤＴＴをそれぞれの最終濃度が２０mＭと１mＭになるように加え、この混合物を０.５−１時間４℃で放置した。溶媒Ａの２volで希釈した後、Ｃ３カラムにかけ、この工程および次の工程を行い、ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−１に記載されたように、しかしＣａＣｌ２を除き、分画した(図１ｃ)。
【００３１】
ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−３
　ＲＰ−ｈ.ｐ.ｌ.ｃ.−２からの活性フラクションをプールし、トリフルオロ酢酸(ＴＦ
Ａ)を最終濃度が０.１％になるように加え、０.１％ＴＦＡ２volで希釈し、０.１％ＴＦＡであらかじめ平衡化したＣ３カラムに混合物をかけた。この溶媒と６０％(v/v)アセトニトリル／０.１％ＴＦＡの３０分直線勾配溶出を、次いで９０％(v/v)アセトニトリル／０.１％ＴＦＡの３分直線勾配溶出を行った。活性フラクションをプールした(図１ｄ)。
【００３２】
　１単位は約５００mlである単一の血液提供からの血小板を表す。“活性フラクション”はロゼット阻害試験における活性フラクションであった。
【００３３】
他の供給源からのＥＰＦの精製
　Cavanagh&Morton, 1994, Eur.J.Biochem. 222 551-560；Quinnら, 1994, Hepatology 20印刷中に論じられたように、種々の供給源からＥＰＦを精製した。
【００３４】
　すべての例において、生物活性はヒト血小板について述べられている複合精製スキームを通して同じパターンであった。さらに、すべての供給源からの最終活性フラクションは固定化モノクローナル−抗ＥＰＦにより特に結合され、定量的に回収し得た(図１ｅ)。
【００３５】
　これらの研究は次の理由により重要である：
　Ａ. すべての材料で観察された生化学的および免疫的類似性は、生物検定法が種々の生物的状況において作用する単一の物質または近接する類の物質を検出することの証拠である。
　Ｂ. これらの材料すべてから精製された活性体は、ＥＰＦであるとして以前に報告されたすべての物質よりも多くの程度より強力である。これは、上に論じたＥＰＦの生物検定法の詳細な分析を基に、推定ＥＰＦ製剤に関した活性が非常に少量の不純物の存在を反映しているに違いないとの我々の推測を確認している。
　Ｃ. (活性の妨害として)タンパク質レベルで研究するのに充分なＥＰＦを提供する唯一の供給源材料は血小板と再生肝であり、量はそれぞれ平均１００単位当たり１５μg(〜５０ｌ血に相当)および４０ｇ組織当たり５μg(６匹ラットよりの摘出肝)。ＥＰＦは細胞外に表れるよりも細胞中に多く存在していることは明白である。しかし、蓄積されたＥＰＦについての生物学的知識(上記のMortonら、1992参照)は、この細胞外での出現が思いがけないものでないことを示している。
【００３６】
　ヒト血小板誘導ＥＰＦは、最も豊富であり、かなり詳細に研究されてきた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、Ｍｒの単一バンド約８５００として表れ、生物活性に一致した(図２ａ)；再生ラット肝臓由来のＥＰＦは同様の行動を示した。質量分析計により血小板資料について分子量１０８４３.５±２Ｄａが明確かつ精密に決定され、この高いレベルでの同質性の明白な証拠であった(図２ｂ)。エドマン分解法の後、分子がＮ−ブロックされていることを示すが、約４nmol　ＥＰＦのタンパク質分解分裂が行われた。得たペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣで分離し、エドマン分解法で配列を決めた。１２(フラグメント１)、２７(フラグメント２)および３３(フラグメント３)の残基を含む３配列領域は、ラットのミトコンドリアcpn１０における残基７−１８、２７−５３および６９−１０１(Ｃ末端)に対応することが判明した。フラグメント２の残基５２は異なっていた(cpn１０中のＳ、ラットcpn１０中のＧ；この相違のみでラットcpn１０よりcpn１０が３０Ｄａ大きいことが説明できよう)。他のすべての残基は同一で、シャペロニン類の高く保持された本質に一致した(図２ｃ参照)。
【００３７】
　ＥＰＦとcpn１０の配列の同一性が確認されて以来、ラットミトコンドリアcpn１０、Ｅ.coli　cpn１０(groESとして知られる)およびＥ.coli　cpn６０(groEL)を用いて、機能的な関係についていくつかの研究がなされてきた。最初に、cpn１０がＥＰＦとして働くことが証明されている。ラットcpn１０がＥＰＦ生物検定法で検討され、予測された希釈範囲以上にポジティブであることが見いだされた。この活性はＥＰＦに対するモノクローナル抗体で中和され得た(表１)。興味あることに、ラットcpn１０と〜４０％の相同性を有するＥ.coli　cpn１０は生物検定で活性を示さなかった(表１)。これは、すべての哺乳動物の細胞系および酵母細胞が活性であるのに対し、Ｅ.coliの培地は活性でないとの知見に一致している。cpn６０は生物検定で不活性であり、ＥＰＦ活性に作用しなかった。ＥＰＦはcpn１０のように働き得ることを示していた。ＥＰＦをＡＴＰの存在下または非存在下でcpn６０と混合し、この混合物をTSK G3000SWゲル浸透カラムで分析した。得られたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。cpn６０はデカテトラマー(decatetramer)であり、このカラムの排除体積中に溶出する(排除限界　３０００００)。ＡＴＰの存在下では、ＥＰＦもこのフラクションに存在し、cpn６０と安定な複合物の形成を示す。ＡＴＰの非存在下ではそうでない。このフラクションは生物検定において活性であったが、ＡＴＰ非存在下の実験での同様のフラクション(ＥＰＦがcpn６０と結合していなかった)は活性でない(図３ａ参照)。このようにＥＰＦおよびcpn１０活性は同じ分子に属する。
【００３８】
　これらの研究者は、血小板誘導ＥＰＦがcpn１０と構造的および機能的に相同体である
との明白な証拠を提供する。cpn１０とロゼット阻害試験における活性との関係が試験された(図３ｂ)。ＡＴＰの存在下において、ＡＴＰの非存在下ではそうでないのであるが、固定化cpn６０は原型源資料、妊娠血清からすべての活性を除去し得た。そして固定化複合物からＡＴＰを取り除くと活性は回復し得た。図３ａに記載した実験のように、このＡＴＰの必要性はcpn６０と活性分子との相互関係の特殊性を示している。cpn１０はＥＰＦ生物検定法において反応を司る分子単位である。
【００３９】
　cpn１０とのＥＰＦの同一性の確認は本主題についての研究を進める主段階であり、今日までなされた多くの知見を説明する助けとなった。ＥＰＦ生成がこのように多様な生物的状態、例えば、着床前−後妊娠初期および主要細胞増殖および血小板活性において生じるとの主張に対して批判があった。hsp(heat stress protein：熱ストレスタンパク質)としてのその役割において、ＥＰＦ生成の速い開始が期待されるすべての条件がある。細胞の生存に必須であるhspの機能は、上記のLinquistらに示されているように細胞内である。逆に、今日まで記載のＥＰＦ活性は細胞外である。例えば、Mortonら, 1987, Current Topics in Development Biology, Vol.23 73-92に論じられているように、交配後４−６時間のマウス血清およびQuinn博士論文(1991)に示されているようにラットの部分的肝切除後４−８時間にその活性が表れる。上述のQuinnら1990文献に論じられたようにオートクリン相または上述のRolfeら1988で論じられた外分泌相において、ＥＰＦが働き得ることを我々は示して来た。これらはhspについて以前に記された役割ではない。
【００４０】
　ＥＰＦの構造が知られたので、組換えＤＮＡ技法または化学合成などの適当な技術によって商業的な量でＥＰＦが製造し得るものと評価される。
　(ｂ)cpn１０をコードするヒトｃＤＮＡのクローニングおよびcpn１０の製造
　商業的使用のための製造は、哺乳動物cpn１０遺伝子、望ましくはヒトcＤＮＡcpn１０遺伝子をｐＧＥＸ系、ｐＥＴ系からのプラスミドのような適当なベクターに挿入し、コードされた哺乳動物cpn１０を発現し、組換えcpn１０を精製することにより達成され得る。
【００４１】
略号：
　ＡＮＧＩＳ　　　　　オーストラリア国立遺伝情報サービス
　bp　　　　　　　　　塩基対
　ＢＳＡ　　　　　　　牛血清アルブミン
　cＤＮＡ　　　　　　 相補的ＤＮＡ
　cpn１０　　　　　　 シャペロニン
　ＤＮＡ　　　　　　　デオキシリボ核酸
　Ｅ.coli　　　　　　 大腸菌
　ＧＳＨ　　　　　　　グルタチオン(還元型)
　ＧＳＴ　　　　　　　グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
　ＬＢ　　　　　　　　ルリア−ベルタニブロス
　Ｍ　　　　　　　　　モル
　ＯＲＦ　　　　　　　オープンリーディングフレーム(翻訳領域)
　ＰＣＲ　　　　　　　ポリメラーゼ連鎖反応
　rＥＰＦ　　　　　　 組換え初期妊娠因子
　ＲＳＰ　　　　　　　逆配列プライマー
　ＳＤＳ　　　　　　　ドデシル硫酸ナトリウム
　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気　　　　　泳動
　Ｔris　　　　　　　 トリ(ヒドロキシメチル)アミノメタン
　ＵＳＰ　　　　　　　正配列プライマー
【００４２】
　材料および方法
ヒトcpn１０オープンリーディングフレームのクローニング
　メラノーマ細胞系Ａ２０５８cＤＮＡラムダライブラリー(Stratagene)からのヒトcpn１０cＤＮＡのＯＲＦ(２７４bp)部分を最初に増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いた。変性cpn１０アンプリマー(Ｐ１)は、ヒトcpn１０のアミノ酸残基８３−９１に対応するアミノ酸配列ＶＬＤＤＫＤＹＦＬからつくられた。プライマーＰ１は配列５' ＡＲＲＡＡＲＴＡＲＴＣＹＴＴＲＴＣＲＴＣ３'を有し、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴである。逆配列プライマーは、ＰＣＲ増幅(非特異的プライマー)および配列ＤＮＡ構築に用いられ、配列５' ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ３'を有する。正配列プライマーは配列５' ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ　３'を有している。ファージ・ライブラリーのＰＣＲ増幅は、非特異的上流アンプリマー(ＲＳＰ)およびＰ１を、それぞれ０.５μＭ最終濃度、１.５mＭ ＭgＣl２(Ｐharmacia Ｂiotech)、１Ｘポリメラーゼ緩衝液(Ｂoehringer Ｍannheim)、テルムスアクアティカス(Ｔhermus aquaticus)ＤＮＡポリメラーゼ(Ｂoehringer Ｍannheim)５単位および最終容量の５０μＬ中で用いて、達成された。３０サイクルについてのパラメーターは、９４℃、１分間での変性、４０℃、３０秒間のアニーリングおよび７２℃、３分間のエクステンションであった。７２℃で７分間の最終エクステンションが４℃１０分間のソークサイクルに続いて、なされた。１μＬのアリコートがコピー数を増すために同じ条件で増幅された。
【００４３】
　オープンリーディングフレイムを有する２つのcpn１０特異アンプリマーが作られた。上流プライマーＰ２、ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＧＴＴＴＡＧ−３'が最初のＰＣＲフラグメントの配列から作られた。下流プライマーＰ３、５'−ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＧＴＡＣＴＴＴＣＣ−３'は、Ｅxpressed Ｓequence Ｔag database via ＡＮＧＩＳ(Ａccession Ｎo.ＨＵＭ00ＴＢ037)から得られる配列から作られた。アニーリング温度を５０℃にした以外は上述と同じ反応およびサイクリングの条件を用いてファージ・ライブラリーからＡ３１９bpフラグメントが増幅された。
【００４４】
ＤＮＡ構築および分析
　Ｂoehringer Ｍannheimから得た制限酵素およびバッファーを用いて、Ｓambrookら(Ｓambrookら, 1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)に従って、ＰＣＲ生成物およびベクターのすべての制限酵素による切断を行った。最初ＰＣＲフラグメントをＥcoＲ１で消化し、プラスミドpＲＭ１を形成するpＢluescript ＫＳ(＋)(Ｓtratagene)のＥcoＲ１とＳma Ｉ位でライゲートした(Ｓambrook et al.，1989，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual．２nd Ｅd．Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ)(図４；部分cpn１０挿入２７４bp)。３１９bp生成物をＢamＨＩおよびＥcoＲ１で消化し、プラスミドpＲＭ２を形成する発現プラスミドpＧＥＸ−２Ｔ(Ｐharmacia Ｂiotech)に最初にクローン化した。この同一性を確認するために、ＢamＨＩ−ＥcoＲ１フラグメントをpＢluescript(ＳＫ＋)にサブクローン化し、配列決定した。ＤＮＡを、エチディウムブロマイドを含む０.８−１.０％(w／v)アガローズゲルで分析し、電気泳動の後、ＵＶイルミネーションで観測した。
【００４５】
Ｅ．coliの形質転換
　適格なＥ．coli ＤＨ５αの細胞(１００μＬ)をプラスミドで熱律動法(Ｓambrookら，1989，Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual．２nd Ｅd．Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈarbor，ＮＹ)により形質転換した。細胞とＤＮＡの混合物(１０−１００ng)を３０分間氷の上におき、正確に２分間４２℃で熱律動せしめ、２分間氷の上にもどした。ＬＢの０.９mＬを加えた後１時間後振り、３７℃で細胞を回収した。１００μＬの部分標本を最終濃度１００μg／mＬでアンピシリンを補ったＬＢ寒天プレート上に置いた。３７℃で一夜、培養した後、ランダムコロニーを次の実験に選択した。
【００４６】
ＤＮＡ配列決定
　ＰＣＲ生成物の制限フラグメントをpＢluescript中にクローンし、製造業者(Pharmacia Ｂiotech)の指示に従ってＴ７ポリメラーゼキットを用いてジデオキシチェインターミネーション法によって両定位に配列した。約２μgのプラスミドＤＮＡを変性し、エタノール沈殿し、ＵＳＰ、ＲＳＰまたはＰ３のいずれかにアニーリングした。配列反応を８％アクリルアミド／４６％ウレア　ゲル上で電気泳動した。固定し乾燥した後、Ｘ−線フィルムをゲルに一夜さらし、そして現像した。
【００４７】
Ｅ．coliにおける組換えcpn１０の発現および精製
　Ｓmithら(Ｓmithら，1988，Ｇene 67(1)31−40)に記載された方法により小培地スケール(２ml)でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の発現のためにpＲＭ２で組換えたクローンをスクリーニングした。一夜置いた培地を希釈し、０.１mＭ ＩＰＴＧを加え、３７℃で数時間おいて融合タンパク質を発現せしめた。細胞をペレット化し、ＰＢＳ／０.１％Ｔriton Ｘ−１００に溶解し、溶解質を５０％グルタチオン−アガローゼ　ビーズ(Ｓigma Ｃhemical Ｃompany)と混合した。組換え融合タンパク質をＳＤＳバッファー中で煮沸することにより親和性ビーズから溶出した。サンプルのアリコートを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルを固定し、コーマシーブルー(Ｃoomassie blue)で着色した。融合タンパク質の発現を確認した後ＧＳＴ分子からのrcpn１０の精製がより大きい規模で行われた。
【００４８】
　上述のように細胞を生長、誘導せしめて、細胞ペレットをＰＢＳ中に懸濁し、超音波処理し(output level ４，50％ duty cycle，2×30 sec)そして細胞溶解質を−３０℃で保存した。１０リットル細胞培地からの溶解質を解凍し、rＬＩＦの分離のためにＧearingら(Ｇearingら.，1989，Ｂiotechnology ７，1157−1161)が用いたと同じ方法によりrcpn１０を分離した。直ちに、Ｔriton Ｘ−１００を最終濃度０.１％になるまで加え、そして細胞切片を遠心分離で除いた(１５分、15000rpm、４℃)。１０mlのグルタチオン−セファローズ４Ｂゲル(Pharmacia-LKB Biotechnology)を上清に加え、スラリーを４℃で２時間混合した。ゲルをペレットし、５０mlのＰＢＳ／０.１％ ＴritonＸ−１００で５回、５０mlの０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣlで１回および０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣl／２.５mＭ ＣaＣl２で１回洗った。ゲルを４mlの０.０５Ｍ トリス−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣl／２.５mＭ ＣaＣl２バッファー中に懸濁し、１０００単位のトロンビン(ＳigmaＴ６８８４)を加え、スラリーを振動水浴中、３７℃で１時間混合した。ゲルをペレットし、上清を保持し、ゲルを３回４ml０.０５Ｍ トリス−ＨＣl pＨ８.０／０.１５Ｍ ＮaＣlで洗った。rcpn１０を包有するものである、これらの洗液と上清をプールすると４−５mgの組換えタンパク質が得られた。ゲルと非特異的に結合している追加のrcpn１０は次のように回収された。４mlの０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ８.０／２Ｍ ＮaＣlを加え、そしてスラリーを４℃で２時間混合した。
【００４９】
　ペレットした後、ゲルを３回、２mlのこの０.０５Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ８.０／２Ｍ ＮaＣl bufferで洗い、洗液を最初の上清をプールして、さらに約１mgのrcpn１０が得られた。タンパク質濃度はＬawryらの方法(Ｌawryら.，1951，Ｊ.Ｂiol．Ｃhem．193 265−275)によって測定された。１５％Ｔris−Ｔricineゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質が分析された(Ｓchagger et al.，1987，Ａnal．Ｂiochem．166 368−379)。この組換えｃｐｎ１０は、Ｎ末端で２つの付加アミノ酸を有する。天然タンパク質のＮ末端がＡｃ−Ａｌａであるが、組替え体タンパク質のＮ末端はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａであった。組替え体ｃｐｎ１０のアミノ酸配列は、以下の配列である：ＧＳＭＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＦＤＲＶＬＶＥＲＳＡＡＥＴＶＴＫＧＧＩＭＬＰＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＶＶＡＶＧＳＧＳＫＧＫＧＧＥＩＱＰＶＳＶＫＶＧＤＫＶＬＬＰＥＹＧＧＴＫＶＶＬＤＤＫＤＹＦＬＦＲＤＧＤＩＬＧＫＹＶＤ。
【００５０】
２．哺乳類ｃｐｎ１０の投与
(ａ)cpn１０の検定
抗原
　細菌融合タンパク質、ＧＳＴ／cpn１０を、cpn１０の製造で記載したように、発現させ、グルタチオン−セファロースで単離した。この融合タンパク質を、トリス緩衝化食塩水中の５０mＭ還元グルタチオンをかけることにより、ゲルから溶出させた。溶出フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、最も融合タンパク質を含むフラクションをプールした。タンパク質の濃度をLowryら, 1951, J.Biol.Chem. 193 265-275の方法により測定した。
【００５１】
抗体
　融合タンパク質に対する抗体を、週４回の注射、続く少なくとも月４回の追加免疫からなる免疫化スケジュールによりウサギで発生させた。最初の注射用のフロイド完全アジュバント中およびその後のフロイド不完全アジュバント中に乳濁したタンパク質約１０μgをそれぞれの注射に使用した。ウサギ血清で、最初にcpn１０(５μg／ml)でプレートをコートし、ストレプトアビジン−ビオチン検出系(Amersham)を使用したELISAにより、cpn１０に対する抗体をスクリーニングした。ウサギ＃４２の血清のcpn１０および全融合タンパク質(ＧＳＴ／cpn１０がプレートに結合している場合)に対する抗体(Ａb)力価を図７に示す。このウサギから、４回目の追加免疫後に採取した血清サンプルのcpn１０に対する力価を図８に図説する。
【００５２】
免疫検定
　次いで、抗体を下記のように行うcpn１０検出用競合結合検定に使用した。１：３２０００および１：６４０００(最終希釈；希釈５０mＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７.４、０.２％w／vゼラチン含有)に希釈した抗血清を、別々に、(一晩４℃で)種々の濃度のcpn１０とインキュベーショした。これらの混合物を、図９に図説するように、上記のように、５μg／ml　cpn１０でコートしたプレートでELISAにより試験した。抗体／cpn１０混合物の吸光度を、cpn１０非存在下でインキュベーショした同じ抗体希釈により得られた値と比較する。プレートへの抗体の結合の阻害度が元の抗体−cpn１０混合物におけるcpn１０の量と比例している；これから、標準曲線を、図１０に示すように作ることができる。
【００５３】
　＃４２が血清に存在するcpn１０の非常に低い濃度を検出するのに十分感受性でないため。我々は：
(１)製造超免疫化特性を示す抗−cpn１０の産生；したがって、既知の免疫応答の促進技術と組み合わせて、高い親和性抗体を産生できる；および
(２)標準免疫検定技術における応答の産生
ができる技術を確立する。
【００５４】
　改善された抗体による検出系の促進のための既知の方法の適用ならびに濃縮および部分的精製cpn１０(例えば、Ｃ１８Sep-Pakカートリッジ[Waters]にかけ、トリス緩衝化食塩水中の８０％アセトニトリルで溶出するか、またはＡＴＰ存在下固定化cpn６０にかけ、ＥＤＴＡで溶出する)の両方のための血清の予備処理である、これらの技術は、単独または他の免疫検定技術と組み合わせて、血清中のcpn１０の検出のために開発できる。
【００５５】
ロゼット阻害試験、ＥＰＦ生物検定の感受性
　ロゼット阻害試験は、非定量的であり、正確な血清中cpn１０の濃度測定に使用できない。この検定は、サンプルの限界量を比較することにより、半定量的に使用され、即ち、サンプルの最も高い希釈が生物検定反応における位置を与える。それ自身生物検定に不活性である複合生物学的液体中の他の物質が、活性物質の応答に影響を与えることができるため、この研究には注意が必要である。
【００５６】
　この生物検定が、純粋cpn１０　５−５０ag／ml(Cavanaghら, 1994, Eur.J.Biochem. 202 551-560)程低い濃度を検出できることを我々は調べた。妊婦(妊娠初期血清から既知の阻害物質が除かれている)および癌動物およびヒトならびに部分肝切除２４時間後のラットの血清の限界量の観察に基づき、血清中のcpn１０濃度は０.１−１００pg／mlの範囲であるようである。
【００５７】
３．ｃｐｎ１０による処置
(ａ)器官／皮膚移植片
　ラットの同種皮膚移植片生存における組換えｃｐｎ１０の効果
皮膚移植
　皮膚移植片は、以下のプロトコールを使用して、近交系ルイス(Lewis)およびＤＡラット(〜１００ｇ)の間で交換した。腹部完全厚皮膚を、標準技術を使用して、胸郭側面に作った同じ大きさの欠損部に縫合した。６匹のラットの群に１回で移植し、それぞれのラットが一つの自己移植片および一つの同種移植片を受けた。２匹のルイスおよび２匹のＤＡラットは、毎日２回の組換えcpn１０の注射を受け、一匹のルイスおよび１匹のＤＡに、移植片の回りに緩衝液を注射した。異なった群は異なった用量のcpn１０を投与された。注射は１４日間続けた。移植片をワセリンガーゼ、メロリン包帯、ビニールラップおよび伸縮自在の包帯で覆った。７日後、移植片を毎日壊死の兆候について試験した。拒絶反応の日は、移植皮膚の５０％が壊死分解を示す日とした。
マウスに組換えcpn１０を注射した後の血清におけるcpn活性の寿命
【００５８】
　種々の量の組換えcpn１０(図１１参照)をＢＡＬＢ／ｃマウス(〜２０ｇ)にi.p.注射し、マウスを、注射後１５分に初めて(０時間)種々の時間に殺した。血清のcpn１０活性を、C57BL/６マウスの脾臓細胞と共に、ロゼット阻害試験(Mortonら, 1987, Current Topics in Developmental Biology 23 73-92参照)で試験した。
【００５９】
結果
　結果は表２および図１１に示す。
　組換えcpn１０注射に続いて、有意な移植片生存延長があった(ｐ＜０.００１、スチューデントのｔ検定)。結果は、ベル型用量反応曲線を示し、最も有効な量は２−２０μg　cpn１０×２／ラット／日であった。マウスにおける実験は、この組換えcpn１０が、血小板cpn１０と比較した場合、予期される半減期より短いことを示唆する；マウス血清における組換えcpn１０　１μgおよび１５μgの半減期は、それぞれ僅か３時間および７時間であった；４日間の半減期を有する血小板cpn１０(５μg)と比較。しかしながら、これらの結果は、cpn１０がラットにおいて同種皮膚移植片の生存率を有意に延長できることを示している(表２参照)。
【００６０】
(ｂ)ヒトを含む哺乳類の創傷治癒促進のためのcpn１０による処置
組織修復におけるｃｐｎ１０の掛かり合い
　成長因子は、血小板からのその最初の遊離が創傷修復において基本的に重要であるため、治癒工程に含まれるようである(Falange, 1993, J.Dermatol.Surg.Oncol. 19 716-720)。血小板はcpn１０の豊富な源であることが示され(cpn１０；Cavanaghら, 1994、Eur.J.Biochem. 222 551-560)、従って、創傷治癒に密接に含まれる成長因子の一つであり得る。研究は、マウスで産生した完全厚皮膚欠損の治癒における局所適用組換えcpn１０(rcpn１０)の効果を測定するために行われている。
【００６１】
方法
　非近交系、雄カッケンブッシュ(Quackenbush)マウス(８週齢)をネンブタール麻酔し、毛を剃り、皮膚を７０％ｖ／ｖエチルアルコールで滅菌し、完全厚欠損(直径８mm)を胸郭外側領域に作った。トリス緩衝化０.９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム(食塩水)、ｐＨ７.４、５μl中のrcpn１０　１μg、トリス緩衝化食塩水単独(５μl)または食塩水単独(５μl)を直接創傷に適用し、次いでワセリンガーゼ、メロリン非粘着性包帯で覆い、伸縮自在の包帯で固定した。１日２回、マウスをハロタン(Fluothane, ICI)で軽く麻酔し、包帯を外し、好適な溶液５μlを適用し、再び創傷に包帯をした。種々の間隔、即ち、２４時間、４８時間、３日、４日、５日、６日および７日に、マウス群をハロタンで安楽死させ、創傷および周りの組織を回収し、創傷の領域を測定した。
【００６２】
結果
　rcpn１０処置に続き、緩衝液または食塩水で処置した創傷と比較して、創傷収縮が有意に促進された(図１２)。cpn１０で処置した創傷において、創傷収縮は最初の２４時間以内に開始するが、一方、対照の創傷では、収縮は２日以降に開始する(図１２)。３日目以降、創傷の大きさに有意な差はなかった。
結論
【００６３】
　マウスの完全厚創傷へ局所的に投与したcpn１０は、負傷直後開始するように見える工程により、縮小および治癒を速める。対照マウスにおける創傷収縮は４８時間後まで明白ではなかった。
【００６４】
　通常、創傷治癒は３相からなる。１相、炎症相(０−４８時間)は負傷直後に開始し、その間活性化血小板が成長因子を欠損部に分泌し、繊維芽細胞活性化を助長し、創傷治癒の続く段階に含まれる細胞、例えば、マクロファージの活性化を増加する。２相、増殖相(２−６日)は最初の繊維芽細胞の出現で開始し、表皮細胞が増加し、創傷部位へ移動する。３相は成熟相である。
【００６５】
　創傷縮小は通常１相では開始せず、遅滞期としても知られている。この相の間、切除創傷は、回りの皮膚の弾力により影響を受けている。これらの力は欠損部の最初の大きさを増加させ、皮膚に存在する圧力線に対応して異なった形を与える。我々が緩衝液または食塩水で処置したマウスで示したように、創傷は最初の４８時間で大きくなった。比較して、rcpn１０で処置したマウスの創傷は、この間に収縮し、創傷への直接のrcpn１０の投与が、創傷領域への線維芽細胞の移動およびコラーゲンの付着を促進することを示唆する。この発見は、促進された創傷収縮は体液損失および感染の危険性を非常に減少させるため、熱傷を含む創傷の処置に莫大な重要性を有するであろう。
【００６６】
(ｃ)自己免疫疾患
　ラットにおける、自己免疫疾患の動物モデルである実験的アレルギー性脳脊髄炎の発症におけるｃｐｎ１０の効果
【００６７】
導入
　実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)は、動物にアジュバント中の中枢神経系ミエリン塩基性タンパク質(ＭＢＰ)を接種することにより誘発される神経系の自己免疫性脱髄疾患であり、多発性硬化症の動物モデルとして広く研究された(Raine, 1984, Laboratory Investigation 50 608-635)。広く研究されている種であるラットにおけるＥＡＥの臨床的特徴は、接種後１０日からの劇的一夜体重減少、続く尾弱化および麻痺、後肢弱化およびある場合は麻痺である。前肢弱化は時々発症する(Pender, 1986, Journal of Neurological Sciences 75 317-328)。実験は、接種後のラットへのrcpn１０投与が、疾病の進行に影響を与えるかどうかを測定するために行った。
【００６８】
方法
　ＥＡＥモデル：ＥＡＥは、近交系、雌ルイスラット(年齢〜１０週齢)の一方の足蹠にフロインドアジュバント内のＭＢＰを接種後誘発された。ラット３群が研究に含まれる。全部、０日に接種した。１群(ｎ＝４)は、処置を受けず、動物は疾病の潜伏期間中(０日から８日)抱き上げなかった。２群(対照群；ｎ＝５)はトリス緩衝化食塩水(０.１ml)i.p.×１日２回を０日から２０日に投与された。３群(試験群；ｎ＝５)は、トリス緩衝化食塩水(i.p.)×１日２回を０日から２０日に投与された。８日目から、全てのラットを体重測定し、毎日３０日まで試験した。
【００６９】
　(Ｉ)尾弱化は以下のように等級付した：
０＝弱化なし；
１＝弱化は尾の末端部のみ、尾末端部は試験者の指に巻き付くことができない;
２＝尾全体の弱化であるが、尾の付け根はまた重力に対して垂直に直立できる;
３＝尾が揺れ動くのみの重度の弱化；
４＝尾が完全にぐにゃぐにゃのまひ。
【００７０】
　(II)後肢の弱化は以下のように等級付した：
０＝弱化なし；
１＝両方の後足部の足指の僅かな引きずり；
２＝両方の後足部をひどく引きずるが、後肢の残りは違う；
３＝両方の後肢をひどく引きずり、両方の後肢がしばしば体の一方に置かれる;
４＝後肢が完全にぐにゃぐにゃの麻痺。
【００７１】
　(III)前肢は後肢と同様にして評価した。
　合計得点は(Ｉ)、(II)および(III)の合計である。
【００７２】
結果
　処置を受けていないまたは緩衝液のみ(対照群)を受けている群の体重減少開始時期および最大体重減少期間は有意に異ならなかった(表３)。しかしながら、cpn１０投与群(試験群)は、処置を受けていない群と比較して、最初の体重減少が遅れ、また最大体重減少もそうであった(表３；ｐ＜０.００１％χ２分布)。３群で最大体重減少の平均に有意差はなかった(表３)。
【００７３】
　ラットを必要なだけ抱き上げながら毎日２回i.p.注射して投与することは、疾病の開始または重症度に影響を与えなかったが、疾病の進行を数日間延長した(図１３に示されるように、１７日から１８日)。しかしながら、これらの２群の一つの目立つ差は、対照群において３０日まで続く２２日目の重い疾病の再発であった。処置を受けてない群では、僅かな再発が３匹のラットで２７日および２８日に起こった。
【００７４】
　初期体重減少、尾と肢の弱化および麻痺が試験群、rcpn１０投与群で、対照群と比較して遅延される(図１４：１２日、ｐ＜０.０１：１３日、ｐ＜０.０５、ヘテロセダスティック(Heteroscedastic)ｔ検定)。１４日から１６日の試験群において、一匹のラットのみが対照ラットが発症したのと同程度の重い疾病を発症した。残りの４匹のラットは、この間軽い疾病を発症した(図１５：ｐ＜０.９５、ヘテロセダスティックｔ検定)。試験群で、重い疾病は試験期間中再発しなかった；一匹のラットが２２日、残りのラットが２７日から１０日にに緩和な疾病を発症した。
【００７５】
結論
　処置それ自体、即ちラットへの液体のi.p.１日２回の投与は疾病の開始また重症度に影響を与えないが、その期間を僅かに延ばした。更に、トリス緩衝化食塩水を毎日投与されたラットにおいて、観察期間中重い疾病が再発したが、処置を受けていないラットではしなかった。
【００７６】
　この研究の最も興味深い観察は、cpn１０でのラットの処置が開始を有意に遅らせ、５匹中４匹のラットの臨床的特徴を変化させたことである。これらの動物を観察していた間の重い疾病の再発もまた防止した。
【００７７】
(ｄ)不妊および流産
　本発明の更なる態様は、cpn１０の投与による不妊および／また流産の処置である。この問題がcpn１０の欠乏により起こる場合、重大である。下記の実験的支持は、胚発育中のcpn１０の必要性を証明する。
【００７８】
　減少したcpn１０濃度の状態を作るために、抗cpn１０抗体を開発し使用した。入手可能な動物モデル系はない。従って、この実験的支持から、妊娠中のcpn１０の濃度を増加させるためのcpn１０の投与が、不妊および流産の前記の問題を解決するということなる。
cpn１０由来ペプチドの合成
【００７９】
　ペプチドは、cpn１０のＮ末端フラグメント(Ｎ−ペプチド、即ちＡｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ)および内部フラグメント(Ｉ−ペプチド、即ちＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ)と一致するように合成した。
【００８０】
卵白アルブミンへのペプチドの結合
　ペプチドを、異種２機能性試薬ＳＰＤＰにより、製造者(Pharmacia LKB. Biotechnolkogy, Uppsala, Sweden)の指示に従って、卵白アルブミンに結合させた。
【００８１】
免疫化スケジュール
　成熟非近交系ニュージーランドウサギを、接合体の一つを週４回注射し、続いて数カ月追加免疫することにより免疫化した。
　注射のために、抗原を０.９％食塩水(Ｍｒ１２−１５０００除去透析管、Visking, Union Carbide, IL, USA)で透析し、等量のフロインドアジュバント(一回目は完全、それ以降不完全)に乳濁化した。免疫化はs.c.経路経由であった。
【００８２】
抗血清のスクリーニング
　抗血清を、適当な抗原(即ち、Ｉ−ペプチドまたはＮ−ペプチド；卵白アルブミン)(５mg／ml)に対してELISAで試験した。結合ＩgＧは、ｏ−フェニレンジアミンを基質として、ビオチン−ストレプトアビジン系(Amersham)で検出した。吸光度は４９２nmで読んだ。
【００８３】
　ＩgＧを４５％硫酸アンモニウムで抗血清から沈殿させ、その濃度をLowryおよびゲル電気泳動で測定した。ＩgＧ沈殿は免疫ペプチド、ウシ血清アルブミンに対する結合に対してELISAで試験した(表４)。沈殿は、また、ロゼット阻害試験におけるマウス妊娠血清の中和活性の能力を試験した。種々の濃度の抗体を等量の血清とインキュベーションし、次いで、混合物の活性をロゼット阻害試験で試験した。完全に活性を中和する抗体の最低濃度を決定した(Cavanaghら, 1994, Eur.J.Biochem. 222 551-560参照)。抗−Ｎ−ペプチドＡb　１０pgは妊娠血清１mlの活性を中和するが、完全な中和のために抗−Ｉ−ペプチドＡb　４ngが必要であった。
【００８４】
受動免疫化
　成熟非近交系雄および雌カッケンブッシュマウスを、７：３０a.m.に対でケージに入れ、８：３０p.m.に離した。膣栓のある雌マウスに、妊娠１日目(交配の日)および２日目の９：００a.m.および５：００p.m.に、抗−Ｎ−ペプチド／卵白アルブミン、抗−Ｉ−ペプチド／卵白アルブミンまたは抗−卵白アルブミンＩgＧ製剤を注射した。２用量レジメにおける特異的ＩgＧの注射量は、約１mg／マウス／日と概算した。７日目に、マウスをＣＯ２で安楽死させ、着床胚および計数した黄体(ＣＬ)について子宮を試験した。それぞれの群において、試験ＩgＧで処理したマウスの胚／ＣＬの数を、同量の対照ＩgＧを投与したものの数と比較した(χ２試験)。
【００８５】
　表５に示す結果は、妊娠血清におけるcpn１０の中和が、妊娠初期の胚生存率に不利に作用できることを明らかに証明する。ロゼット阻害試験における抗体の中和活性の能力は、妊娠に不利に作用するインビボ能力のインビトロモニターである。
【００８６】
本発明の他の態様
　本発明の別の態様において、更なる実験が、ラットおよびヒトcpn１０の１−１１および３４−４４残基に対応する分子の２つの領域の生物活性を説明する。
【００８７】
　本発明は、従って、cpn１０の活性中心として機能し得るアミノ酸配列：
(ｉ)ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
(ii)Ａｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ(式中、Ａｃはアセチル)；
(iii)ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ
をその範囲内に含む。
【００８８】
　本発明は、また、１個またはそれ以上の末端配列Ａ１およびＡ２、即ち
(iv)Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２；
(ｖ)ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２；
(vi)Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
(vii)Ａｃ−Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２；
(viii)Ａｃ−ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬＡ２；
(ix)Ａｃ−Ａ１ＡＧＱＡＦＲＫＦＬＰＬ；
(ｘ)Ａ１ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＡ２；
(xi)ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴＡ２；
(xii)Ａ１ＥＫＳＱＧＫＶＬＱＡＴ；
〔式中、Ａ１およびＡ２は分子(ｉ)から(xii)の一端または両端に付加し得るアミノ酸配列であり、Ａｃはアセチルである。〕
を有する分子(ｉ)、(ii)および(iii)をその範囲内に含む。
【００８９】
　上記分子(ｉ)から(xii)において、このような分子が、単一アミノ酸付加、欠失または置換をその範囲内に含むことは認められよう。
【００９０】
　自己免疫疾患の処置におけるcpn１０の使用に関して、cpn１０の投与により処置し得る関連疾病は、インシュリン依存性糖尿病、リューマチ性関節炎、全身性紅斑狼瘡、シェーグレン症候群、グレーブス病および多発性硬化症を含む。これは、本明細書に記載のＥＡＥラットモデルに関する関連支持データにより明白である。
【００９１】
　器官移植、皮膚移植の処置におけるcpn１０の使用に関して、本明細書に記載のラット皮膚移植モデルに関して、関連支持データが提供されている。
【００９２】
　不妊処置または流産予防におけるcpn１０の使用に関して、関連支持データはマウスの胚発育および着床におけるcpn１０抗体の効果に関する。
【００９３】
　創傷治癒および組織修復または組織再生におけるcpn１０の使用に関して、これは、cpn１０が熱傷、手術、外傷、床ずれおよび糖尿病性潰瘍を含む皮膚潰瘍、組織および器官障害を含む感染性疾患(例えば、肝炎)、組織および器官障害を含む代謝性疾患(例えば、肝硬変)および組織または器官障害を含む退行性疾患に使用できることを意味する。この結論の支持は、本明細書に記載のマウス創傷モデルについて、およびQuinnら, 1994, Hepatology 20印刷中記載の部分的肝切除後の肝臓再生データにより与えられる。
【００９４】
　本明細書に記載のデータは、また、炎症性腸疾患および感染性疾患を含む炎症性疾患の処置へのcpn１０の使用を明らかに支持する。本明細書に記載のこのようなデータは、ラットＥＡＥモデルおよび皮膚移植モデルにおける免疫抑制効果から導き出される参考データを含む。これは、また、ＥＰＦがマウスにおける遅延型過敏症を減少できることを示す、Rolfeら, 1983, Clin.Exp.Immunol. 51 45-52およびNature 278 No.5705 649-651により支持される。
【００９５】
　アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性皮膚炎、急性蕁麻疹および薬剤過敏症を含むアレルギー性疾患におけるcpn１０の使用は、また、ラットＥＡＥモデルおよび皮膚移植モデルにおけるcpn１０の免疫抑制効果により十分支持される。この結論は、また、ＥＰＦがマウスにおける遅延型過敏症を減少できることを示す、Rolfeら, 1983, Clin.Exp.Immunol. 51 45-52およびNoonanら, 1979, Nature 278 No.5705 649-651により導き出すことができる。
【００９６】
　癌の診断および／または癌の外科適切所後の患者の追跡におけるcpn１０の使用は、Quinnら, 1992, Cancer Immunol.Immunother. 34 265-271の参考データにより支持される。
【００９７】
　cpn１０の投与に関して使用し得る用量に関して、簡便な量は、１−１０００μg／体重kg、更に好ましくは５０−２００μg／体重kgである。
【００９８】
　　表１
【表１】
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【００９９】
　　表２
【表２】
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【０１００】
　　表３
【表３】
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【０１０１】
　　表４
【表３】
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【０１０２】
　　表５
【表３】
2004067698.tif 000006
【０１０３】
表の説明
表１
　ロゼット阻害試験におけるcpn１０の活性
表２
　皮膚移植片生存時間
　緩衝液のみ投与された対照群と比較したｐ値
　＊ｐ＜０.００１
【０１０４】
表３
　ＥＡＥ経過における３処置群の初期体重減少および最大体重減少の時間
　＃χ２分布
　＊スチューデントのｔ検定
表４
Ｎ−ペプチドおよびＩ−ペプチドに対するELISAで試験した抗−Ｎ−ペプチド、抗−Ｉ−ペプチドおよび対照抗卵白アルブミン抗体
＊１／１０００が試験した最低希釈であった
表５
確認交配マウスのcpn１０由来ペプチドの１日目および２日目p.c.による受動免疫の、p.c.７日目に存在する着床胚および黄体数における効果
＊(ヘテロセダスティックｔ検定)
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１ａ】図１ａは、ＥＰＦの精製。熱抽出ヒト血小板(１００単位)をＳＰ−セファデックスおよびヘパリンセファロースで分画し、次いで、ＴＳＫ−フェニル５ＰＷカラムにかけ、逆塩勾配で溶出した。フラクションはロゼット阻害試験で試験した(免疫抑制抗リンパ球血清のロゼット阻害活性を増大させるＥＰＦの能力を基本にして)。
【図１ｂ】図１ｂは、(ａ)の活性フラクション(┏┓)をＲＰ−ＨＰＬＣ−１で分画した。
【図１ｃ】図１ｃは、(ｂ)の活性フラクション(┏┓)をＲＰ−ＨＰＬＣ−２で分画した。
【図１ｄ】図１ｄは、(ｃ)の活性フラクション(┏┓)をＲＰ−ＨＰＬＣ−３で分画した。
【図１ｅ】図１ｅは、(ｄ)由来の活性フラクションを伴う固定化モノクローナル抗ＥＰＦ抗体５／３４１とヒト妊娠血清、妊娠６日(１０ml)；ヒト妊娠尿、妊娠１カ月まで(１０リットル)；プロラクチンで刺激した発情マウス卵巣(１００)により条件付した培地とマウス胚条件付培地(卵巣ＣＭ)；ウシ腎臓細胞系ＭＤＢＫ(ＭＤＢＫ−ＣＭ；ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２２、１０リットル)により条件付した無血清培地；部分的肝切除後２４時間に得たラット血清(ポスト−ｐＨ、１０ml)；ポスト−ｐＨ２４時間のラット肝臓(４０ｇ)；(ａ)から(ｄ)の全フラクションの等価フラクションの相互作用。抗ＥＰＦ結合および非結合フラクションは、ロゼット阻害試験で試験し、活性が結合しない無関係抗体を使用した平衡実験と比較することにより特異性を証明した。
【図２ａ】図２ａは、図１Ａのように３００単位ヒト血小板から精製したＥＰＦの分析。モノマーサイズの決定。ヨウ素化ＥＰＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥ２９で分画し、ゲルスライス(２mm広さのスライス)し、放射活性および生物活性の分布を比較した。(挿入図)同様の調製物における直接クマーシーブルー染色。
【図２ｂ】図２ｂは、ＥＰＦのイオン噴霧マススペクトル、多重プロトン化分子イオンとして表示。(挿入図)分子質量のコンピューター復元。
【図２ｃ】図２ｃは、ラットcpn１０(下線)と比較した、ヒトＥＰＦ由来のペプチドのアミノ酸配列(１文字標記)。ＥＰＦをエンドプロテイナーゼlys Ｃおよびエンドプロテイナーゼglu Ｃで消化し、残ったペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより分離し、配列決定した。この個々のフラグメントの配列を示す；７４−１０１以外は、lys消化由来である。
【図３】図３は、ＥＰＦとcpn６０(groEL)の相互作用を示す。図３ａは、cpn６０−ＥＰＦ混合物＋Ｍｇ２＋ＡＴＰをかけた後のＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷゲル透過カラムの除去量におけるピークフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Schaggerら, 1987)で分析し、銀染色した(Morrissey, 1981)。左レーン　＋ＡＴＰ、右レーン　−ＡＴＰ。(cpn６０は１４量体、Ｍ　８４００００、カラム溶出限界＞３０００００。ＳＤＳゲルの高い方のＭｒバンドはgroELの多量体形である)。図３ｂは、固定化cpn６０をヒト妊娠血清(妊娠６日目)とＭｇ２＋ＡＴＰ存在下または非存在下で混合した。非結合および結合フラクション(後者はゲルから、ＥＤＴＡによるＡＴＰの除去により回収した)を、次いで、ロゼット阻害試験で試験した。結果は限界量、ロゼット阻害試験で陽性結果となるサンプルの最も高い希釈として示す。
【図４】図４は、ｐＲＭ１を示す。
【図５】図５は、ｐＲＭ２を示す。
【図６】図６は、ｐＲＭ３を示す。
【図７】図７は、cpn１０の抗体の製造を示す。
【図８】図８は、ウサギ血清中の抗cpn１０抗体のELISAによる検出を示す。
【図９】図９は、cpn１０の競合結合検定を示す。
【図１０】図１０は、抗体結合阻害％を示す。
【図１１】図１１は、i.p.注射後のマウス血清における組換えcpn１０および血小板cpn１０活性の時間経過を示す。
【図１２】図１２は、マウスの創傷縮小におけるcpn１０の効果。創傷(〜４５mm２)をマウスに作り、rcpn１０　１μgまたは対照溶液(５μl)を一日２回局所投与し、マウス群の創傷の大きさを指示した時間に測定した(平均±ＳＤ)；０日ｎ＝１０、１日−３日ｎ＝３、４日−７日ｎ＝２＊対照群と比較してｐ＜０.０５を示す。
【図１３】図１３は、ラットのＥＡＥ発病における処置レジメの効果を示す。
【図１４】図１４は、ラットのＥＡＥ発病におけるcpn１０の効果を示す。
【図１５】図１５は、ラットのＥＡＥ発病におけるcpn１０の効果を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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