(57)【要約】【課題】　移植拒絶を処理するための新規な手段の提供。【解決手段】　受容体における細胞、組織又は器官移植片拒絶を処理し、又は防止するための方法であって、前記移植片に対する受容体におけるＴ−細胞介在免疫応答を阻害するために、CD45RB白血球抗原に結合する少なくとも１種の化合物の薬理学的有効用量を投与することを含んで成る方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　受容体における細胞、組織又は器官移植片拒絶を処理し、又は防止するための方法であって、前記移植片に対する受容体におけるＴ−細胞介在免疫応答を阻害するために、CD45RB白血球抗原に結合する少なくとも１種の化合物の薬理学的有効用量を投与することを含んで成る方法。
【請求項２】
　前記細胞、組織又は器官移植片が受容体に対して同種である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
　前記細胞、組織又は器官移植片が受容体に対して異種である請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】
　前記化合物が前記抗原上のノイラミニダーゼ感受性エピトープに結合する請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】
　前記結合が、ホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化を高めることにより白血球シグナルトランスダクションを阻害する請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項６】
　前記化合物が、抗−CD45RBモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらの混合物から成る群から選択される請求の範囲第１，２，３、又は５項記載の方法。
【請求項７】
　前記化合物が抗−CD45RBモノクローナル抗体である請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項８】
　前記化合物がCD45RO白血球抗原に結合しない請求の範囲第６項記載の方法。
【請求項９】
　前記抗−CD45RBモノクローナル抗体が、 MT3又は 6G3の相補的決定領域の少なくとも１つを含んで成るキメラ性抗体である請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】
　前記キメラ性抗体がまた、ヒト免疫グロブリン分子からの少なくとも１つの不変領域も含んで成る請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】
　前記抗−CD45RBモノクローナル抗体がMT3, 6G3又はMB23G2である請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１２】
　白血球の病理学的増殖により特徴づけられる状態を処理するために、哺乳類細胞におけるホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化を高めるための方法であって、白血球上のノイラミニダーゼ感受性エピトープに特異的に結合する、治療的に有効な量の化合物を哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項１３】
　移植片受容体における同種移植片又は異種移植片拒絶を防止するための方法であって、白血球のCD45RBのノイラミニダーゼ感受性エピトープに特異的に結合する、治療的に有効な量の化合物を投与することを含んで成る方法。
【請求項１４】
　前記白血球がＴリンパ球である請求の範囲第12又は13項記載の方法。
【請求項１５】
　哺乳類移植片受容体における移植された細胞、組織又は器官の拒絶を妨げるための方法であって、抗−CD45RBモノクローナル抗体又はその治療的フラグメントの治療的に効果的な量を、前記受容体に投与することを含んで成る方法。
【請求項１６】
　少なくとも１つの抗−炎症薬物又は免疫抑制薬物を投与することをさらに含んで成る請求の範囲第12, 13又は15項記載の方法。
【請求項１７】
　前記抗−炎症又は免疫抑制薬物が、シクロスポリン、FK-506、ラノロマイシン、コルチコステロイド、マイコフェノレートモフェチル、レフルノミド抗−リンパ球グロブリン、デオキシスペルグアリン及び OKT-3から成る群から選択される請求の範囲第16項記載の方法。
【請求項１８】
　自己免疫疾患を処理するための方法であって、Ｔ細胞介在免疫応答を阻害するために、CD45RBリンパ球抗原に結合する少なくとも１種の化合物の薬理学的有効量を、自己免疫疾患を有する哺乳類に投与することを含んで成る方法。
【請求項１９】
　前記化合物が抗−CD45RBモノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント又はそれらの混合物である請求の範囲第18項記載の方法。
【請求項２０】
　前記化合物が抗−CD45RBモノクローナル抗体である請求の範囲第19項記載の方法。
【請求項２１】
　前記抗体がMT3, 6G3又はMB23G2である請求の範囲第20項記載の方法。
【請求項２２】
　前記抗原がCD45RO白血球抗原に結合しない請求の範囲第20項記載の方法。
【請求項２３】
　前記自己免疫疾患が多発性硬化症、全身性エリテマトーデス又はリウマチ様関節炎である請求の範囲第18項記載の方法。
【請求項２４】
　ネズミ起源の可変ドメイン、及びヒト起源の不変ドメインを有し、そしてホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化を高める、 IgGクラスのCD45RBに対するキメラ性モノクローナル抗体。
【請求項２５】
　ネズミ起源の可変ドメイン、及びヒト起源の不変ドメインを有し、そしてCD45RBのノイラミニダーゼ−感受性エピトープに結合する、 IgGクラスのCD45RBに対するキメラ性モノクローナル抗体。
【請求項２６】
　ホスホリパーゼＣ−γ１のチロシンリン酸化を高めることにより白血球シグナルトランスダクションを阻害する、CD45RBのための結合部位を有するリガンドの免疫抑制有効量、及び医薬的に許容できるビークルを含んで成る医薬組成物。
【請求項２７】
　CD45RBのノイラミニダーゼ−感受性エピトープに対する抗体結合ドメインを有するリガンドの免疫抑制有効量、及び医薬的に許容できるビークルを含んで成る医薬組成物。
【請求項２８】
　前記リガンドが、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、又は抗体変異体である請求の範囲第26又は27項記載の組成物。
【請求項２９】
　前記抗体が6G3, MT3、又はMB23G2である請求の範囲第28項記載の組成物。
【請求項３０】
　前記リガンドの量が、少なくとも１種の炎症性サイトカインの発現を阻害する請求の範囲第26又は27項記載の組成物。
【請求項３１】
　前記サイトカインがγ−インターフェロン、腫瘍壊死因子α、又は細胞間付着分子−１である請求の範囲第30項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本出願は、免疫応答の調節に有用である新規化合物及び新規医薬組成物に関する。前記化合物は、アンタゴニスト、及びアゴニスト、特にCD45RB抗原を含んで成る。
【背景技術】
【０００２】
　器官、細胞及び組織の移植拒絶並びに種々の自己免疫疾患は、主に、Ｔ−細胞介在免疫応答の結果であると思われる。このＴ−細胞介在免疫応答は、特定の抗原を認識することができるヘルパーＴ−細胞により開始される。それらのヘルパーＴ−細胞は、前の免疫応答からの残存する記憶細胞、又は胸腺により放出されそしてひじょうに広範囲の種類の抗原受容体のいづれかを有するナイーブな(naive) 細胞であることができる。それらのヘルパーＴ−細胞の１つが抗原−MHC 複合体の形でマクロファージ又は抗原提示細胞(APC）の表面上に存在する抗原を認識する場合、そのヘルパーＴ−細胞は、前記 APC又はマクロファージにより分泌される抗原−特異的Ｔ−細胞受容体、補助受容体(Co-receptor) 及びIL-1から発せられるシグナルにより刺激されてIL-2を生成する。
【０００３】
　次に、前記ヘルパーＴ−細胞が増殖する。増殖は、特定の抗原を認識するためにクローン的に選択されたＴ−細胞の大集団をもたらす。Ｔ−細胞の活性化はまた、Ｂ−細胞の活性化及び非特異的マクロファージ応答を刺激する。それらの増殖する細胞のいくつかは、選択された抗原を有する細胞を破壊する細胞毒性Ｔ−細胞に分化する。抗原がもはや存在しなくなった後、クローン的に選択された成熟細胞は、身体において循環し、そして再び現われる抗原を認識する、記憶ヘルパー及び記憶細胞毒性Ｔ−細胞として存続するであろう。この応答を引き起こす抗原が外来性抗原ではなく、自己抗原である場合、その結果は自己免疫疾患であり；抗原が移植された器官からの抗原である場合、その結果は移植片拒絶である。従って、このＴ−細胞介在の免疫応答を調節できることが所望される。
【０００４】
　CD45抗原（CD45）は、ほとんどの白血球上で発現される。実際、通常のCD45抗原はすべての白血球上で存在するとこれまで思われており、この理由は、その受容体は白血球共通抗原(LCA）として本来知られているからである。CD45に対するモノクローナル抗体は、所望の場合、すべての白血球を効果的に排除し、たとえば移植の前に非特異的CD45モノクローナル抗体を用いて、パッセンジャー白血球の移植されるべき器官を効果的に取り除く手段として提案されている。たとえば、 WO 91／05568 を参照のこと。
【０００５】
　CD45の異るアイソフォームが、CD45遺伝子の単一の一次転写物の交互のスプライシングにより生成される。それらのCD45アイソフォームは、CD45RA, CD45RB及びCD45ROを包含する。CD45RAは、CD45遺伝子のエキソン４，５及び６（時々、Ａ，Ｂ及びＣとしても言及される）の発現生成物を含み；CD45RBは、エキソン６を除く、４及び５の発現生成物を含み；CD45ROは、３種のエキソン４，５又は６のいづれの発現生成物も含まない。Hallなど、"Complete Exon-Intron Organization of the Human Leukocyte Common Antigen (CD45)Gene," J. Immunology, Vol.141, pp.2781-2787 (1988)（引用により本明細書に組込まれる）、及びStreuli など、Characterization of CD45 and CD45R Monoclonal Antibodies Using Transfected Mouse Cell Lines that Express Individual Human Leukocyte Common Antigens," J. Immun., Vol.141, pp.3910-3914, No.11 (1988)( 引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。しかしながら、この可変性の発現の意義はまだ不明である。
【０００６】
　S. Poppema, など., J. Immunology (1991年７月) 141 : 218 (引用により本明細書に組込まれる）は、モノクローナル抗体 MT3をすでに記載している。しかしながら、この出版物は、この抗体を製造するための詳細な方法も、又はこの抗体についてのいづれの医薬用途も開示しておらず、そして従って、当然のことながら、この抗体により認識されるＴ−細胞集団を開示していない。A. Lazarovits,など., Transplantation (1992年10月) 54：724(引用により本明細書に組込まれる）は、この抗体のインビトロ効果を特徴づけている。Lazarovitsは、 MT3 mAbがCD45RB（白血球表面分子）に干渉することによって、Ｔ−細胞の増殖及び発生を阻害することを初めて示した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
　従って、ヒト、特に移植片受容体又は自己免疫疾患を有するヒトにおける免疫応答を効果的且つ選択的に抑制し、又は他方では、調節する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
　従って、最初の態様においては、本発明は、CD45RBサプレッサー、及びCD45RBに対して特異的に結合することによって、ヒトを包含する動物において免疫応答を調節する前記サプレッサー、特にCD45RBに対するモノクローナル抗体及びそのような性質を有する前記モノクローナル抗体のフラグメントを含んで成る医薬組成物に関する。
【０００９】
　本発明は、異るタイプのＴ−細胞がCD45発現のCD45アイソフォームのうち１つの又は他のイソフォームを優先的に発現することができるという発見に基づいている。ナイーブヘルパーＴ−細胞及び記憶Ｔ−細胞はそれぞれ、CD45RA及びCD45ROを優先的に発現する。CD45RBの発現はより可変性であるが、しかしナイーブヘルパーＴ−細胞、そして特に増殖するように刺激されたナイーブ細胞上で発現されると思われる。CD45RBの発現は、前記細胞が活性化されるにつれて、ダウン−レギュレートされる。CD45RBの発現を抑制するが、しかし、CD45ROの発現を抑制しない化合物が、記憶Ｔ−細胞のプールを破壊しないで、Ｔ−細胞介在免疫応答を選択的に阻害することができることが現在示されている。
【００１０】
　CD45RB機能が抑制される場合、その増殖する細胞は成熟せず、そして結果、それらが含む抗原特異的クローンが欠失されるであろうから、CD45RBは特に興味あるものである。従って、CD45RBサプレッサーは、（ｉ）それらが、全体的な免疫抑制効果を有するよりもむしろ特定のＴ−細胞集団に対して作用し、それにより免疫システムの過剰−抑制に関連する副作用の危険性を回避し；そして（ii）それらが抗原への暴露と同時に、たとえば器官移植の直前及び直後、又は自己免疫疾患の急性相の間に投与される場合、それらは特定の抗原に対して長期の寛容を付与することができることにおいて、現在の免疫抑制剤よりも高い利点を有する。
【００１１】
　 MT3 mAbの他に、Lazarovitsは、CD45RBに対するモノクローナル抗体、たとえば Rockville, MDのATCCから入手できる細胞系 HB220により生成される抗体（現在、抗−CD45RB mAb (MB23G2）と命名されている）が、CD45RBに結合し、そしてインビトロ及びインビボでの免疫機能を阻害する上で効果的な剤であることを報告している（引用により本明細書に組込まれる、1993年６月２日に出願されたアメリカ出願番号第08／071,009 号を参照のこと）。
【００１２】
　本発明者は現在、 6G3モノクローナル抗体がCD45RBに結合することを見出した。これは、ヒトCD45RBに対して向けられたネズミIgG1である。それはサルCD45RBと交差反応する。本発明者はまた、MB23G2, 6G3 及び MT3モノクローナル抗体がＴ−細胞包含白血球上のノイラミニダーゼ感受性エピトープに結合し、そして少なくともMB23G2及び 6G3がホスホリパーゼC-r1のチロシンリン酸化を高めることを見出した。HB223(現在、 MB4B4と称する）、すなわち本発明の抗体に類似する抗−CD45RB抗体がノイラミニダーゼ感受性エピトープに結合しないことが見出されることを示すことは興味あることである。 MB4B4 mAbがノイラミニダーゼ非感受性エピトープに結合し、そしてホスホリパーゼC-r1のチロシンリン酸化を変更しないことがまた観察される。 MB4B4はまた、マウスにおける腎同種移植拒絶を妨げることにおいて無効であった。
【００１３】
　それらの抗体が得られるなら、引用により本明細書に組込まれるヨーロッパ特許第 0449769号に記載されるような従来の技法により、クローン化され、そして発現され得る組換え抗体を変更し又は生産することがもちろん可能である。用語、抗体、抗体フラグメント、融合化合物、キメラ化合物及びそれらの誘導体は、本明細書を通して、集合的に命名された化合物又はサプレッサーである。
　第２の態様においては、本発明は、CD45RBとその結合部位についてインビボで競争することによって免疫応答を調節することができるサプレッサー化合物及び医薬組成物を提供する。
【００１４】
　さらにもう１つの態様において、本発明は、ヒト及び他の動物種におけるインビボ免疫抑制の方法に関する。前記方法は、移植された細胞、組織及び器官の拒絶を妨げるための予備処理のインビボ治療、及び免疫応答を逆転するための移植後のインビボ治療を包含する。前記方法はまた、自己免疫疾患のインビボ処理も包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
　本発明のサプレッサーは好ましくは、次の例に記載されるようにして、又は当業者に明らかなような同等の手段により生産される。
【００１６】
　本明細書に言及されるハイブリドーマは、同じ所望する特異性のモノクローナル抗体を生成する能力を保持しながら、遺伝子突然変異又は他の変化にかけられてもよいことが当業者により理解されるであろう。従って、本発明は、ハイブリドーマの変異体、他の誘導体及び子孫を包含する。元のモノクローナル抗体の特異性を保持する、他の誘導体抗体、ヒト化された又はキメラ性分子又は抗体フラグメントを生成するために組換え DNA技法の技術にゆだねられることが当業者によりさらに理解されるであろう。
【００１７】
　そのような技法は、たとえばマウス由来のモノクローナル抗体を十分なヒト免疫グロブリン特徴を有する抗体に転換するために、モノクローナル抗体の免疫グロブリン可変領域又は相補性決定領域(CDR）をコードする DNAと、異なった免疫グロブリンのその不変領域、又は不変領域＋骨格領域をコードする DNAとを組合すことを包含することができる（EP184187A, GB2188638A ；引用により本明細書に組込まれる）。
【００１８】
　ヨーロッパ特許出願第 0120694号（Bossなど／Colltech、引用により本明細書に引用される）は、キメラ抗体のクローニング及び発現を記載する。それらの誘導体においては、１つの免疫グロブリンからの可変ドメインが、他の免疫グロブリンからの不変ドメインに融合されている。通常、可変ドメインは、１つの種、たとえばマウス又はラットからの免疫グロブリン遺伝子に由来し、そして不変ドメインは、異なった種、たぶんヒトからの免疫グロブリン遺伝子に由来する。この技法は現在、当業界においてひじょうに良く知られている。のちのヨーロッパ特許出願第 0125023号(Cabilly／Genetech、引用により本明細書に引用される）、またアメリカ特許第 4,816,567号は、Bossの特許出願とほとんど同じ主題を記載するが、しかし組換え DNA技法を用いての免疫グロブリン型分子の他の変形体の生成についても記載する。
【００１９】
　もう１つの可能性は、誘導体キメラ分子を生成するために他の非−免疫グロブリン分子に、モノクローナル抗体の可変領域を結合せしめることである(WO 86／01533, Neuberger and Rabbits／Colltech（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。さらなる可能性は、その異なった可変領域に異なった特異性を有するキメラ性免疫グロブリン、たとえば本発明のモノクローナル抗体、を生産することである（EP68763aを参照のこと）。さらなるもう１つの可能性は、その必須の特異性を変えることなく、その一定の特徴を変えるために、モノクローナル抗体をコードする DNAにおいて突然変異を生成することであろう。これは、部位特定突然変異誘発又は当業界において知られている他の技法により行なわれ得る。
【００２０】
　Winterの特許出願であるヨーロッパ特許出願第 0239400号（引用により本明細書に組込まれる）は、組換え DNA技法、いわゆる"CDR−移植”を用いて、免疫グロブリンの可変領域の相補的決定領域(CDR）を、異なった特異性の免疫グロブリンからの CDRにより置換することによって、変更された誘導体抗体をいかにして製造することが可能であるかを記載する。これは、抗体の抗原−結合特異性の変更を可能にする（本発明の場合、それはMT3, 6G3, MB23G2、それらの抗−CD45RB抗体と同じ結合特異性を有する抗体、又は他の抗体にトランスファーされる、MT3, 6G3又はMB23G2と交差反応性である抗体の CDRであり得る。）
【００２１】
　従って、 CDR移植は、抗体の“ヒト化”を可能にする。興味ある抗原に対して特異的なゲッ歯類抗体の CDRを含む“ヒト化された”抗体は、ヒトの免疫システムにより外来物としてほとんど認識されない。従って、たとえば MT3もしくは 6G3、又はそれらのいづれかと交差反応する抗体と同じ結合特異性を有する“ヒト化された”抗体は、ヒトの治療及び／又は診断方法に特に使用され得る。本発明の抗体の使用は、本明細書に後で論ずる。モノクローナル抗体のそのようなすべての使用は、本発明により包含される。
【００２２】
　論ぜられるように、当業者は、彼らの特定の必要性に適合する誘導体を生成するために、いづれかの一定の抗体又はそれをコードする遺伝子をいかにして操作し、そして変更するかについて良く知っている。
　抗体、たとえば MT3又は 6G3の供給は、当業者が、結合パートナー、たとえば抗原／エピトープ又は抗体／それに結合するパラトープの獲得を可能にする。従って、本発明はまた、結合パートナー、たとえば抗原及び／又はそれにより供給されるような抗体又はその誘導体と結合する抗体、たとえば MT3及び 6G3も供給する。
【００２３】
　 MT3 mAb及び 6G3 mAbの使用により得られる結合パートナーはまた、追加のリガンド、たとえば MT3又は 6G3以外の抗体（又は抗体のような結合機能を有する分子、たとえば抗体のフラグメント、誘導体及び合成類似体、たとえば一本鎖抗原−結合分子）を生成するためにも使用され得る。従って、リガンド、たとえば MT3 mAb及び 6G3 mAbと結合することができる結合パートナーと結合できる mAbがまた供給される。そのようなリガンド（“交差反応性リガンド”）、たとえば mAbは、前記結合パートナーに基づいて MT3 mAb及び 6G3 mAbにより認識されるのと同じエピトープを認識することができる。
【００２４】
　本発明はまた、上記に言及され、そして論ぜられた組換え DNA技術の１又は複数の技法を用いて生成された、前記交差反応性のリガンドの誘導体、機能的同等物（たとえば、抗体のような結合特異性を有する分子）及びフラグメントも提供する。 WO 90／05144(引用により本明細書に組込まれる）に記載されるような単一のドメインリガンド（mAbs）もまた包含される。
【００２５】
　標準的技法を用いれば、結合パートナー抗原の免疫精製にリガンド、たとえば本発明の抗体及びその誘導体を用いることが可能である。イムノアフィニティーカラム精製のための技法は良く知られている（たとえば、“Current Protocols in Immunology,”ed. J. E. Coligan など、John Wyley and Sons, Unit 8.2(引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）。実際、抗原自体の単離の必要性を伴わないで、上記で論ぜられたような交差反応性リガンドを単離するためにイムノアフィニティーカラムを使用することは可能である。
【００２６】
　始めに、イムノアフィニティー精製は、抗原含有の結合パートナーをサンプルから除去するために、リガンド、たとえばMT3, 6G3、等の mAbを使用し、次に、それらは、リガンドの不均一集団から、MT3 mAb, 6G3 mAb、等と交差反応し、そして同じ結合パートナーを認識するそれらのリガンドを選択するためにカラムに使用され得る。
【００２７】
　リガンド、たとえばMT3, 6G3、等の mAbを用いて単離される結合パートナーは、種々の手段により生成される抗体のレパートリー又は不均一集団から交差反応性リガンドを選択するために使用され得る。１つの方法は、モノクローナル抗体及びそれらを生成する細胞系を、標準のハイブリドーマ技法により選択することである。また、不滅化された細胞、たとえば前記交差反応性リガンドを生成するハイブリドーマが、本発明により供給される。
【００２８】
　リガンド、たとえば MT3 mAb又は 6G3 mAbと交差反応するリガンドを選択するもう１つの手段は、 WO 92／01047(Cambridge Antibody Technology Limited and MRC/McCaffertyなど、引用により本明細書に組込まれる）に開示される特定の結合対のメンバーを生成するための方法を用いる。この出版物は、遺伝的に種々の集団の特定の結合対メンバー、たとえば分泌される複製可能な遺伝子表示パッケージ（RGDP）、たとえばバクテリオファージの成分に融合される抗体のポリペプチド鎖成分の発現を開示する。
【００２９】
　ひじょうに多くのレパートリーの表示される抗体が生成され、そして抗原結合の手段によりスクリーンされ、それらのコードする DNAと共に、興味ある１又は複数の抗体が得られる。RGDPの表面上に表示されるポリペプチドをコードする DNAは、そのRGDP内に含まれ、そして従って、発現のために容易に単離され、そしてクローン化され得る。抗体レパートリースクリーンは、もちろん、ヒト源に由来するものであり得る。
【００３０】
　明らかに、不滅化された細胞系、たとえばハイブリドーマ、又は結合リガンドの少なくともポリペプチド成分をコードする DNAを含むRGDPを有するなら、当業者はリガンド、たとえば細胞により分泌される mAbをコードする完全なヌクレオチド配列を得ることができる（当業界において良く知られている技法に従って）。従って、本発明はまた、リガンド、たとえば上記で定義されたような mAbをコードする一次ヌクレオチド配列、並びにそれらの一次配列及び前記一次ヌクレオチド配列の誘導体、突然変異及びバイブリダイジングパートナーを含んで成る二次ヌクレオチド配列のフラグメントも包含する。
【００３１】
　それらのヌクレオチド配列は、標準技法に従って発現生成物を生成するために組換えシステムに使用され得る。従って、本発明は、前記ヌクレオチド配列を組込むベクター（クローニング及び発現ベクター）、前記ベクターを組込む、形質転換された細胞、及びいづれかのそのようなベクター又は形質転換された細胞を用いて組換えシステムの使用により生成された発現生成物を包含する。
　融合タンパク質の生成もまた企画される。たとえば、Stamenkovic など、"The B Lymphocyte Adhesion Molecule CD22 Interacts with Leukocyte Common Antigen CD45RO on T Cell and α2-6 Sialytransferase, CD75, on B Cells," CELL, Vol.66, pp.11-33-1144 (1991)(引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
【００３２】
　本発明はまた、上記で定義されたようなヌクレオチド配列、ベクター又は形質転換された細胞の使用を含んで成る、リガンド、たとえば mAb、その誘導体、機能的同等物又はフラグメントを発現するための方法も包含する。
　より特定には、ヒトCD45RB抗原に対して向けられた mAbである MT3及び 6G3は、CD45RBを発現するヒト細胞におけるCD45RB上のエピトープに結合するであろう。次に、このエピトープは、たとえばイムノアフィニティーカラム（論ぜられた）を用いて精製され得、そしてたとえばくり返してのエドマン分解を用いて、一部又は完全に配列決定され得る。
【実施例】
【００３３】
例１：CD45RBに対するネズミモノクローナル抗体
　ヒトCD45RBに対するネズミモノクローナル抗体を、Nature 256：49に Kohler and Milsteinにより実質的に記載されるような従来の技法を用いて生成する。雌のBALB／C マウス（20〜25ｇ）は、ヒトCD45RBを含む 100μｇの抗原、たとえば Hodgkin細胞系DEV(公的に入手できる）をそれぞれ、i.p.注射により受ける。（他方、前記抗原は、ヒトCD45RBを発現するよう形質転換されたネズミ細胞を含んで成ることができる）。
【００３４】
　２週間後、50μｇの抗原を含んで成る２回目の追加免疫化注射を、再びi.p.注射により行なう。動物の血液血清における抗原に対して反応性の抗体の存在は、免疫組織学的スクリーニングにより確かめられる。CD45RB抗体の最大の血液血清レベルを示すマウスは、20μｇの抗原を含んで成るさらなる追加免疫注射を受ける。４日後、それらを殺害し、そしてそれらの脾臓細胞を単離し、そして適切な骨髄腫系、たとえば骨髄腫X63(公的に入手できる）により融合せしめる。得られるハイブリドーマを培養し、そしてCD45RBに対して高い親和性を有する抗体の発現について選択する。
【００３５】
　ヒトCD45RBに対するネズミモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ系は、 MT3ハイブリドーマ系であり、これは、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852/U.S.A.のAmerican Type Culture Collection (ATCC）にブダペスト条約に基づいて1993年３月29日に寄託された。
　ネズミCD45RBに対するラットモノクローナル抗体を生成する第２のハイブリドーマ細胞系は、HB220(現在、MB23G2と称する）である。この細胞系はATCCに寄託されており、そしてATCCから入手できる。
【００３６】
　第３のハイブリドーマ細胞系（HB-11873としてATCCに寄託されている）は、本発明の抗体(6G3 mAb) を生成する。このハイブリドーマ細胞系は、骨髄腫細胞系 SP2／0 、及びヒト大Ｂ細胞非−Hodgkin リンパ腫細胞系 VERにより免疫化されたマウスからの脾臓細胞の融合により生成された。得られるクローンを、ヒト扁桃及びアカゲザル脾臓の凍結組織断片に基づくイムノペルオキシダーゼ方法によりスクリーンした。クローン 6G3を、両組織におけるＴ及びＢリンパ球のサブセットと 6G3 mAbとの高い反応性のために選択した。
【００３７】
　 6G3の抗体反応性は、ヒトCD45RBを発現するトランスフェクタントとのその選択的反応性により、及び220, 204及び 190kDの分子量を有する３種のバンドとして 6G3により免疫沈澱される抗原の分子量の特徴化により抗−CD45RBとして特徴化された。抗原のシアル酸依存性を示す抗体の反応性は、ノイラミニダーゼによる組織、細胞又はブロットの予備処理により破壊され得る。
　第４のハイブリドーマ細胞系 HB223は、MB23G2に対する類似するモノクローナル抗体を生成し；それはまた、寄託されており、そしてATCCを通して入手できる。
【００３８】
例２：CD45RBに対するキメラ性モノクローナル抗体
　ａ）Ｈ鎖の可変ドメインをコードする遺伝子のクローニング
　所望するハイブリドーマ、この例においては、例１の MT3又は 6G3ハイブリドーマ、及び前記ハイブリドーマの親骨髄腫細胞系（骨髄腫 X63又は SP2／0)のゲノム DNAを単離し、そしてEcoRＩにより消化する。次に、個々の消化された DNAを同じアガロースゲル上で分別する。
【００３９】
　移動の後、アガロースゲルを、ネズミＨ鎖エンハンサーＥμ（Heinrichなど、J. of Immunol. (1989) 143 : 3589）をコードする、32Ｐラベルされた 0.7kbの XbaＩ−EcoRＩ DNAフラグメントをプローブとして用いて、サザンブロットにより分析し、所望する可変Ｈ鎖フラグメントを同定し、すなわちその所望するフラグメントは MT3及び 6G3ハイブリドーマには存在するが、しかし X63又は SP2／0 骨髄腫には存在しない。次に、このフラグメントのさらなる精製を、分離用アガロースゲル電気泳動により実施する。
【００４０】
　所望するフラグメントと同じサイズの DNAフラグメントを、バクテリオファージZAP(Stratagene）のEcoRＩ制限部位にクローン化する。上記のプローブを用いて、組換えファージをスクリーンし、そしてそのプローブにハイブリダイズするクローンを選択する。その選択されたクローンの DNA挿入体を、ネズミＩ2 遺伝子をコードする第１のオリゴヌクレオチド及び MT3又は6G3 Ｈ鎖の起源部分をコードする第２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ポリメラーゼ鎖反応(PCR）によりファージプレート溶解物上で増幅する。個々の選択されたクローンから得られた DNAフラグメントを、上記Ｅμプローブの一部をコードするオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、サザンブロットにより分析する。
【００４１】
　ｂ）キメラ性Ｈ鎖遺伝子の構成
　EcoRＩフラグメント(MT3又は6G3 Ｈ鎖可変ドメイン（プロモーター及びエンハンサーを包含する）の遺伝子を含んで成る）を、段階ａ）において選択されたファージクローンの１つの DNAの消化により得、次に、真核発現ベクターpSV2 neo−ヒトγ1 、不変部分（Heinrichなど、前記）のEcoRＩ制限部位中にクローン化する。得られるプラスミドの増殖に続いて、 MT3又は6G3 Ｈ鎖可変ドメインをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を再決定し、この遺伝子における突然変異が生じた可能性を除外する。
【００４２】
　ｃ）Ｌ鎖の可変ドメインをコードする遺伝子のクローニング
　 MT3又は 6G3ハイブリドーマ、及び親細胞系 X63又は SP2／0 のゲノム DNAを単離し、そしてEcoRＩにより消化する。次に、個々の消化された DNAを同じアガロースゲル上で分別する。移動の後、アガロースゲルを、５種のマウスＪκ遺伝子及びマウスＣK 遺伝子を含んで成る32Ｐ−ラベルされた DNAフラグメントをプローブとして用いて、サザンブロットにより分析する。所望する MT3又は6G3 Ｌ鎖可変ドメインにサイズ上対応するサイズ分別されたEcoRＩフラグメントを、ファージEMBL4(Stratagene）にクローン化する。
　 MT3又は 6G3Ｌ鎖をコードする DNAフラグメントを含むクローンを、上記プローブにより組換えファージクローンをスクリーンすることによって同定する。次に、所望する DNAフラグメントを、pGEM4 (Promega）のEcoRＩ− XbaＩ部位中にサブクローン化する。
【００４３】
　ｄ）キメラ性Ｌ鎖遺伝子の構成
　ネズミＨ鎖エンハンサー（Heinrichなど、前記）をコードする配列を含む XbaＩ− XbaＩフラグメント、及びヒトκ不変部分(huCκ) のための配列を含むHindIII − SphＩ DNAフラグメントを一緒に、ファージmp18 (Stratagene）中にクローン化する。部位特定突然変異誘発を得られる組換えファージに対して行ない、所望するコード領域におけるHindIII 部位を切断し、そして続いて、EcoRＩ及びHindIII により消化し、（Ｅμ）及び(huCκ) の両者のための配列を含む DNAフラグメントを生成する。
【００４４】
　このフラグメントの末端をフィルインした後、そのフラグメントを、 pSV2-DHFRのブラント末端化されたEcoRＩ−BamHＩ部位中にサブクローン化し、 pSV2-DHFR-Eμ-huCκを生成する。プラスミド pSV2-DHFRを、 pSV2-neo のBamHＩ−HindIII フラグメントを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子をコードするBamHＩ−HindIII フラグメントにより置換することによって得る。
【００４５】
　最後に、 MT3又は6G3 Ｌ鎖配列を含むEcoRＩ− XbaＩ DNAフラグメントを、段階３の組換え pGEM4プラスミドから単離し、そして pSV2-DHFR-Eμ-huCκ中にサブクローン化し、 pSV2-DHFR-Eμ-huCκ-MT3L 又は pSV2-DHFR-Eμ-huCκ-6G3L を生成する。
【００４６】
　ｅ）キメラ抗体の発現
　段階ｂ）及びｄ）で得られたプラスミドを、Bioradからの遺伝子パルサー装置を用いて、エレクトロポレーションによりマウス骨髄腫細胞系 SP2／0(ATCC CRL1581）中に同時トランスファーする。この技法は、高い頻度で安定したトランスフェクタントを創造することが知られている。 SP2／0 細胞系は、内因性Ｈ及びＬ鎖を生成せず、そして 0.8mg／ｌの濃度でGeneticin(G418）に対して感受性である。
【００４７】
　 SP2／0 細胞を、通常の増殖培地（RPMI＋10％ FCS 5×10-5β−メルカプトエタノール）において増殖し、成長の対数相において収穫し、そしてエレクトロポレーション緩衝液(Bio-Rad）により洗浄する。その細胞懸濁液 0.8mlに、個々のプラスミド15〜20μｇを添加する。その混合物を氷上に置き、そして10分間、静置する。次に、細胞を電気的パルス(280ボルト；25°Ｆ）にゆだね、そして再び、15分間、静置する。細胞を通常の増殖培地に移し、そして CO2インキュベーターにおいて37℃でインキュベートする。
【００４８】
　３日間のインキュベーションの後、G418耐性についての選択を開始する。細胞を、 1.4mg／mlのG418を含む新鮮な培地に再懸濁する。その培養物は、G418の存在下での10〜14日間のインキュベーションの後、増殖細胞を生成する。２週間のインキュベーションの後、その集密的培養物の上清液を、サンドイッチ型ELISA(抗ヒトｋ−Ｌ鎖／上清液／抗−ヒト IgG−アルカリホスファターゼ接合体）においてヒト IgG発現について試験する。
【００４９】
　この試験は、完全な抗体分子が50〜 500ng／mlの範囲での種々の濃度ですべての培養物において分泌される。
　DHFR遺伝子が増幅され、そして従って、多量の所望する抗体を分泌する細胞を選択するために、メトトレキセート(MTX）耐性についての２種の選択工程を、下記のようにして実施する。このためには、G418耐性細胞のプールを個々に分け、そして増幅を、工程Ａ（２又は 2.5倍の MTX上昇）又は工程Ｂ（５倍の MTX上昇）のいづれかに従って行なう：
【００５０】
【表１】
2004067700.tif 000002
【００５１】
　個々の増幅段階は、 1.4mg／mlでのG418及び選択濃度での MTXにより補充された通常の増殖培地において２×105 個の細胞／mlの密度で細胞を接種することを含んで成る。72時間のインキュベーションの後、細胞及び上清液を分離する。抗体分泌を、プロテインＡカラムを用いて、 ELISA又はHPLCのいづれかによりモニターする。ほとんどのプールが、一定の MTX濃度で最大の特定の抗体生成に達する。最良の生成プールを限界希釈法によりクローン化する。数百の分析されたクローンのうち、15の最良の生成クローンを選択する。クローンの生産性は、72時間で、30〜50mgの mAb／109 個の細胞である。
【００５２】
　抗体を、プロテインＡ親和性カラム上での溶離により培養上清液から精製する。
【００５３】
　本発明の化合物及び医薬組成物は、免疫調節、特に免疫抑制において、たとえば次の指摘において有用である：
　ａ）たとえば心臓、肺、小島細胞、骨髄、クロム親和性又はドパミン生成細胞、組合された心臓−肺、肝臓、膵臓、皮膚、小腸、又は角膜移植片の受容体の処理のための器官又は組織同種−又は異種移植片拒絶の処理及び予防。それらはまた、移植片対宿主病、たとえば骨髄移植に続いて時々生じる疾病の予防のためにも示される。
【００５４】
　ｂ）自己免疫疾患及び炎症状態、特に自己免疫成分を包含する病因を有する炎症状態、たとえば関節炎（たとえば、リウマチ様関節炎、慢性プログレジエンテ（progrediente）関節炎及び関節炎性変形）、リウマチ性疾患の治療及び予防。本発明の化合物が使用され得る特定の自己免疫疾患は、自己免疫血液学的疾患（たとえば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう及び特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、水腫性硬化症、ヴェーグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、活動性慢性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スチーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎及び Crohn's疾病）、内分泌性眼障害、Graves疾病、サルコイドーシス、多発性硬化症、一次胆汁性硬変、若年型糖尿病（真性糖尿病タイプ１）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季カルタ、間隙性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群、たとえば特発性ネフローゼ症候群又は最少変化のネフロパシーを包含する及びそれらを包含しない）、及び若年型皮膚筋炎を包含する。
【００５５】
　ｃ）Ｔ−リンパ球の過剰増殖により特徴づけられる白血病、たとえばウィルス誘発性白血病、たとえばHTLV-1誘発性白血病の治療。
【００５６】
　本発明の化合物は、拒絶性腎移植片からマウスを防ぐために示され、そして長期の生存性を誘発する。本発明の化合物はまた、ゲッ歯動物及び霊長類における器官移植片の拒絶を逆転し、そして妨げるためにも示される。
【００５７】
　 CD4RB抗体は、標準的免疫抑制剤又は抗−炎症剤と共に与えられ得ることもまた意図される。それらは、サイクロスポリン、FK-506、 Leflunomide、 Rapamycin、マイコフェノレート、モフェチル、 Deoxyspergualin、コルチコステロイド、抗−リンパ球グロブリン、 OKT-3及び同様のもの、並びに他のものを包含する。CD45RB抗体の使用は、そのような薬物の大めの用量必要性を減じ、そしてそれにより、所望しない副作用を減じることが推定される。化合物はまた、特定のリンパ球副集団を特異的に認識する他のモノクローナル抗体又は他の化合物、たとえば CD25 mAbs、CTLA4-Ig融合ペプチド、等と組合しても使用され得る。
【００５８】
　本発明の化合物は、最初に抗原に暴露される場合に、対象が前記化合物により処理される場合、それらの化合物が抗原に対して長期の抗原特異的寛容を誘導することができることにおいて、従来の免疫抑制剤及び抗−炎症剤よりも特定の利点を有する。たとえば、腎同種移植に続いて 100日以上、生存するマウスにおいては、ドナー腎臓と同系の皮膚移植片は寛容を有するが、受容体及びドナーの両者の腎臓と同種の皮膚移植片は拒絶されたことが示された。
【００５９】
　抗原のための受容体を有するＴ−細胞はアネルギー化され、そしてこのＴ−細胞クローンは効果的に欠失されると思われる。すなわち、Ｔ−細胞が外来性タンパク質を認識することは十分ではなく、それは第２のシグナルの存在、すなわちCD45の存在を要する。CD45が認識されない場合、Ｔ−細胞クローンは欠失される。たとえば、マウス腎移植モデルにおいては、抗−CD45RBモノクローナル抗体による初期処理に続く同種移植片の寛容は、十分な 100日以上の生存を伴って、無期限に存続することが示されている。
【００６０】
例３：腎移植片の拒絶のインビボ防止
　この実験においては、右の腎摘出が、同種移植（異なった株のマウスからの腎移植）が行なわれるのと同時に18匹のマウスに対して行なわれた。反対側の腎摘出を、手術後７日（POD7）で行ない、その結果、その点から、動物は同種移植された腎臓のみに依存する。マウスのうち９匹が、細胞系 HB220及び HB223から生成されたラット抗−マウスCD45RBモノクローナル抗体の混合物50μｇによる、最初の２日間（POD0及びPOD1）、i.v.により、続いて９日間（POD2〜POD10)、個々の抗体 100μｇの腹腔内投与により処理された。抗−CD45RB抗体を受けなかった９匹の対照動物のうち、７匹は、第２の腎臓が除去された後、３日で死亡し、そして残りの２匹は１週間後、猛烈な拒絶反応を示した。
【００６１】
　抗−CD45RB抗体により処理された９匹の動物のうち、３人はいづれの免疫応答にも関係しない手術上の合併症のために死亡したが、しかし著しいことには、残りの６匹の動物は、追加のいづれの処理も伴わないで、且つ同種移植片拒絶のいづれの出来事も伴わないで、長期間（たとえば 100日以上）、生存した。10匹の未処理の同系移植片受容体の第３グループにおいては、手術の合併症による死の発生率は同じであった。モノクローナル抗体を受ける同種移植グループと同系グループとの間の血清クレアチニンレベルの有意な差異は存在せず、これは両グループにおける腎臓が正常に機能することを示唆する。
【００６２】
例４：マウスにおける腎移植片の拒絶の逆転(Reversal)
　この実験においては、右の腎摘出が10匹のマウスに対して行なわれ、同時に、同種移植（マウスの異なった株からの腎移植）が行なわれた。
【００６３】
　すべての10匹の動物を、免疫抑制治療を行なわないで、５日間、観察した。それらの動物は、この段階で猛烈な拒絶反応を経験することが知られていた。なぜならば、腎摘出及び同種移植片腎移植にゆだねられた、殺された対照動物は、５日目に猛烈な拒絶反応を示したからであった。
【００６４】
　POD5で、動物の４匹は、次の３日間、毎日、25μｇの用量の抗−CD45RB抗体（細胞系 HB220（抗−CD45RB MB23G2 mAb)及び HB223（抗−CD45RB MB4B4 mAb）からのモノクローナル抗体の混合物）を、腹腔内投与を受けた。すべての４匹の動物は、それらの拒絶徴候の急速な逆転、たとえば正常なクレアチニンレベルへの回帰、及び 100日以上の生存性を経験した。未処理の動物は、器官の拒絶反応のために、９日目までに死亡した。表Ｉは、この実験の結果を要約する：
【００６５】
【表２】
2004067700.tif 000003
【００６６】
　逆転(Reversal)に関するこのデータは、抗体治療が免疫応答を抑制することにおいて真に効果的であることを確認する上で有意である。処理及び治療は抗体療法により達成される。
【００６７】
例５：MB23G2及び MB4B4を別々に用いての効果の確認
　受容体Balb／c(h-2d）マウスは、ドナーC57B1(h-2b）マウスからの移植腎臓を受ける前、右腎臓を除去された。続いて、左の生来の腎の摘出を７日目に行なった。４種のグループの動物が存在した。13匹が同系移植片を受け、17匹が免疫抑制を伴わないで同種移植片を受け（対照のビークル）、44匹が同種移植片を受け、そして精製されたラット抗−マウスCD45RB mAb MB23G2(１mg／kg）30μｇの２回の用量を、０及び１日目に静脈内投与され、そして16匹は同種移植片を受け、そして精製されたラット抗−マウスCD45RB mAb MB4B4（１mg／kg）30μｇの２回の用量により、０及び１日目に処理された。追加の免疫抑制は与えられなかった。
【００６８】
　予測されるように、MB23G2で処理された動物は、未処理のグループに比較して、延長された生存性を有し（Ｐ＜0.002)（図１を参照のこと）、そして同系移植片グループに相当した。著しいことには、抗−CD45RB MB4B4 mAbは、拒絶反応を防ぐことにおいて、ビークルのみよりも良好でなかった。MB23G2及び MB4B4の両者は IgG2aであるが、しかしそれらの間に差異は存在する。両 mAbは、FACSによりアッセイされる場合、Balb／c 白血球に結合する。しかしながら、MB23G2結合は、ノイラミニダーゼにより阻害され、そして MB4B4の結合はそのような処理により影響されない。
【００６９】
　図２は、長期生存体について、殺した時点又は 100日目以上の時点での個々のグループからの動物における血清クレアチニンレベルを示す。同種移植片とMB23G2−処理されたグループとの間に差異は存在せず、そして未処理の及び MB4B4−処理された動物は尿毒症により死亡した。従って、MB23G2のためのグリコシル化されたエピトープは、CD45RBの生化学活性に関与し、又はその活性に関与する部位近くに存在する。 MB4B4のためのグリコシル化されていないエピトープは、CD45RB活性のためには決定的であるとは思われない。
【００７０】
　イムノペルオキシダーゼ顕微鏡研究を、未処理の、 MB4B4−処理された及びMB23G2−処理されたマウスの３種グループにおいて７日目、腎同種移植片に対して行なった。断片を、マウス CD3, CD4, CD8, CD45RB及びIaと反応性のラット抗−マウス mAbにより染色した。スライドを、引用により本明細書に組込まれる、 Ibrahimなど., Transplantation Vol.59, pp.724-728 に記載されるようにして、凝集体及び拡散浸潤物に関して隠された態様で評価した。拡散浸潤物における細胞の数を、グループ当たり５匹のマウスの個々の断片において10倍（×400)の高い倍率の視野(HPF）で計数し、そしてその結果は下記表IIに示される。
【００７１】
【表３】
2004067700.tif 000004
【００７２】
　興味あることには、３種のグループのマウス間の差異は、凝集体及び拡散浸潤物中の細胞を別々に計数した後、明白になった。Iaについての染色は他のグループにおけるよりもMB23G2−処理された同種移植片において明らかに少ないが、しかし他の間隙細胞型の陽性染色のために、リンパ球の数は確かには定量され得なかった。凝集体は、すべての３種のグループにおいて高い数の CD4＋及び CD8＋細胞を含んだ。
【００７３】
　拡散浸潤物中の CD4＋及びCD45RB＋細胞の数はすべての３種のグループにおいてほぼ等しかったが（表II、第２及び第４列）、拡散浸潤物中の CD3＋細胞及び CD8＋細胞の数はMB23G2−処理されたグループと他のグループとの間で統計学的に異なっていた（表II、第１及び第３列）。従って、MB23G2−処理された動物は、 MB4B4−処理された及び未処理の動物に比較して、高められた CD4：CD8 比を示した。著しいことには、少数の浸潤細胞がCD45RB陽性であり、これは、CD45RB mAb MB23G2 が急性拒絶反応を逆転することができる特に注目すべき発見である。
【００７４】
　抗原特異的耐性の可能性を評価するために、皮膚移植を、腎同種移植の時点でMB23G2 mAbの２回の用量を受けた後、 100日以上、腎移植片を維持している13匹の動物に対して行なった。個々の動物は、C57B１／６マウス（腎同種移植のドナーと同系）からの十分な厚さの皮膚同種移植片及び対照の皮膚移植片を受けた：９匹はBalb／c 同系移植片を受け、そして４匹は CBA同種移植片（第３パーティーのドナー）を受けた。追加の免疫抑制は与えられなかった。腎特異的耐性を有する13匹の動物のうち、４匹のサブセットがドナーアロ抗原特異的耐性を示した。なぜならば、それらはC57B１／６皮膚を拒絶しなかったからであった。すべての４匹の動物は第３パーティーの CBA皮膚を拒絶し、そしてすべての９匹のBalb／c 同種移植体は無限に生存した。腎同種移植片拒絶は、皮膚移植片により刺激されなかった。
【００７５】
　MB23G2 mAbが急性拒絶反応を逆転できるかどうかを決定するために、７匹の動物に対する同種移植を上記のようにして行なったが、しかし免疫療法は４日目まで行なわれなかった。未処理の同種移植された腎臓はこの時点で拒絶反応を示した。処理された動物は、４，５及び６日目、毎日、 1.5mg／kg（50μｇ）のMG23G2をi.v.投与され、そしてその後、追加の治療は受けなかった。３匹の動物はMG23G2処理されたグループにおいて尿毒性合併症により死亡し−移植片組織学は８，９及び25日目での死の時点で拒絶反応を示さなかった。すべての動物は逆転されたそれらの拒絶反応を有し、そして残る４匹の動物は、正常な血清クレアチニンを伴って、60日以上、生存した。
【００７６】
　マウスの末梢血液に対するMB23G2の薬理学的効果を、複数パラメーターFACS分析を用いて評価した。マウスを、30μｇのMB23G2 mAbにより、２日間連続して静脈内処理した。図３のＡに示されるように、MB23G2は循環リンパ球の有意な消耗を誘発し、これは mAbを停止した後１週間で正常に戻った。MB23G2は、ほとんどすべての残存する循環Ｔ及びＢリンパ球に結合した（図３のＢ及びＣ）。脾臓のFACS分析は、MB23G2の第２の投与の後24時間で、投与された治療剤がリンパ組織に侵入したことを示した。FACS阻害アッセイは、治療後２週間まで、MB23G2 mAbに対するマウスの感作を示さなかった。
【００７７】
　CD45はタンパク質チロシンホスファターゼであるので、MB23G2 mAbによる同種移植片耐性の誘発がシグナルトランスダクションの発生のために必要なＴ細胞基質のチロシンリン酸化における変更に関連していることを示すための試験が企画された。
【００７８】
例６：CD45RBモノクローナル抗体による寛容誘発の機構：
ホスホリパーゼC-r1の高められたチロシンリン酸化及び炎症性サイトカインの低められた発現
　ネズミＴ細胞ハイブリドーマA1.1細胞を、MB23G2又は MB4B4 mAbの存在又は不在下でCD3 mAb 2C11により刺激した。細胞をBrij96に溶解し、そしてホスホチロシン含有タンパク質を、抗−ホスホチロシンmAb PY72（Dr. G. Mills及び Dr. B. Seftonからの贈与）により免疫沈澱せしめた。免疫沈澱されたタンパク質を抽出し、そして10％ SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、PVDF膜に電気泳動的に移行し、そして抗−ホスホチロシンmAb 4G10(Dr. B. Drukerからの贈与）を用いて、イムノブロット工程（Lazarovitsなど., J.Immunol., Vol.153, pp.3956-3966 (1994) ;引用により本明細書に組込まれる）にゆだねた。
【００７９】
　 CD45RB MB23G2 mAbの存在下で145kDaの基質のチロシンリン酸化の増強が存在することが見出された。 MB4B4 mAbは、この基質のチロシンリン酸化を変更しなかった。PLC-r1としてのこの145kDaバンドの同一性を、前記ブロットから4G10 mAbを取り除き、そしてホスホリパーゼC-r1(PLC-r1)(Upstate Biotech, Lake Placid, NY)に対するモノクローナル抗体により再プローブすることによって確かめた。従って、MB23G2の存在下で、その不在下においてよりも実質的により一層のチロシンリン酸化されたPLC-r1が、同定され、そして MB4B4は免疫沈殿され得る（PLC-r1）の量を変えなかった。（PLC-r1）の高められたチロシンリン酸化は、アネルギー性Ｔ細胞の性質であることが、Gajewskiなど（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.91, pp.38-42 (1994))により言及されている。
【００８０】
　遺伝子活性化はＴ細胞におけるシグナルトランスダクションの結果であるので、MB23G2 mAbが、同種移植片の拒絶を高めることが知られているサイトカイン遺伝子の発現を変えることができるかどうかを研究するための実験を行なった。いわゆる TH1サイトカインプロフィール（IL-2，γ−インターフェロン）は拒絶反応に関連し、そして TH2表現型（IL-4，IL-5，IL-6，IL-10)は非−応答に関連していると一般的に思われている(T. R. Mosmann、など., J. Immunol. Vol.136, pp.2348-2357 (1986) を参照のこと）。
【００８１】
　マウス腎同種移植片における遺伝子発現を試験するために、特定のmRNA転写体の定常レベルを、32Ｐ−ラベルされたcDNAプローブを用いて、ノザンブロット分析により評価した。４グループの動物における遺伝子発現を試験した：操作後７日での同系移植片、操作後７日での未処理動物からの同種移植片、及び操作後７及び28日でのMB23G2−処理された動物からの同種移植片。IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，又は IL-10の特定のパターンは検出されなかった。しかしながら、未処理の同種移植片に比較して、γ−インターフェロン及び腫瘍壊死因子αのためのmRNA転写体の28日目での選択的低下が存在した。７日目に注目される差異は存在しなかった。
【００８２】
　興味あることには、細胞間付着分子−１（ICAM）mRNAはまた、28日でMB23G2−処理された動物において低められ、そして７日目では、差異は観察されなかった。従って、MB23G2治療は、シグナルトランスダクションカスケードによる妨害のために、炎症性サイトカインの発現を阻害することによって耐性を一部、誘発することができる。
　さらに他の実験において、抗−CD45RB抗体の使用が、霊長類に投与される場合、効果的であることが見出された。
【００８３】
例７：霊長類における器官拒絶の防止及び器官拒絶の逆転
　腎同種移植を、免疫サプレッサーとしてCD45RBモノクローナル抗体（ノイラミニダーゼ感受性エピトープに結合する）を用いて、２匹のCynomolgous サルに対して行ない、そしてその詳細は下記に示される：
【００８４】
詳細な実験方法：
１．動物の世話：
　動物は、 University of Western Ontario霊長類施設に収容された。それらは、動物に麻酔をかけないで薬物の注射及びサンプルの収集を可能にする強制かごに収容され、それによりストレスを減じられる。それらは、標準のサル用飼料、及び変化のための他の食料に基づいて維持された。それらは、運動用かごにおいて規則的な運動を可能にされた。動物の世話は、獣医サービスにより提供される非−ヒト霊長類のための標準の操作方法に従った。
【００８５】
　動物を血液グループにタイプ分けした。到着と同時に、動物は少なくとも２週間、安静にされた。動物をアトロピン及びケタミンにより麻酔し、物理的な試験、たとえば口内Ｂウィルスについての検査、TB試験、及びIvernectin 2828 による虫の駆除を行なった。動物は、麻酔の前、その夜は断食を行なわれた。
【００８６】
２．腎移植：
　１．ドナーの処理：
　２匹のドナー動物にケタミンを注射し、ORを取り、挿管し、そしてインソフルオラン／亜酸化窒素を注入した。３段階の手術準備を行なった。２匹の動物の中央切開の後、左の腎動脈、静脈及び尿管を注意して単離し、そして分けた。移植片をエクス−ビボ灌流し、そして４℃の University of Wisconsin溶液に貯蔵した。傷口を閉じ、そして動物を、麻酔から回復せしめるためにかごに戻した。 200〜300ml の塩溶液を、手術の間、連続してi.v.注入した。手術の間、動物は加熱用ランプ、加熱された塩溶液及び加熱用パッド、等を用いて、暖たかく維持された。
【００８７】
　手術後の処理は、標準操作法に従った。手短に言及すれば、動物を、暖たかな水ブランケット上に及び加熱用ランプ下に24時間、とどまった。ブプレノルフィンを、手術の後、24時間、６時間ごとに与えた。動物を毎日、モニターした。十分に回復したドナー動物は、後での移植における受容体として使用される。２回の手術の間隔は少なくとも２週間である。
【００８８】
　２．受容体の処理：
　受容体を、麻酔し、そしてドナーについて記載しているようにして手術前に準備した。中央部の切開の後、腹部大動脈及び下大静脈を暴露した。端と側部とを突合しての吻合を、ドナーの腎動脈と受容体の大動脈との間で、及びドナーの腎静脈と受容体の下大静脈との間で行なった。ドナーの尿管を、受容体の膀胱に縫い合せた。右の腎臓を取り出し、そして傷口を閉じた。
【００８９】
　３．手術後の世話：
　手術後の世話は、ドナーについて記載されるのと同じである。動物を手術後24時間、必要なら、連続してモニターした。それらを、食物の摂取及び身づくろいが正常になるまで、密接して（すなわち、１日当たり数回）、モニターした。その後、それらは、それらのモノクローナル抗体を受ける場合、少なくとも毎日モニターされた。
【００９０】
　動物は、４mgの抗−CD45RB 6G3 mAbを、７日間、１日４回のi.v.投与された。腎移植片の結果が、毎週の経皮生検及び１週当り２度の血液クレアチンレベルの測定により収集された。初期の安楽死(euthanasia)のための基準は、傾眠、身づくろい又は食物の摂取の欠乏、有意な体重の低下（20％以上）及び腎不全（高められたクレアチニンレベル）を包含する。
【００９１】
　上記で論ぜられたように、受容体動物は、手術後７日間、４mg（１mg／kg）の抗−CD45RB 6G3 mAbを受けた。そのような注入に関連する副作用は存在しなかった。両動物は、急性拒絶反応の発症を経験する16日目まで、正常に生存した。最初の動物は、２日後、すなわち18日目に安楽死された。第２動物は、４mg／kg（16mg）の抗−CD45RB 6G3 mAbにより再処理された。この治療は４日間、i.v.により毎日、行なわれた。著しいことには、その拒絶反応の発症が完全に逆転された。
【００９２】
　すなわち、動物は正常な活動を再開し、そしてクレアチンレベルが 738μモル／Ｌの“発症”レベルから 366μモル／Ｌに低下することが観察された。動物は、もう１つの拒絶反応の発症が進行する36日目まで十分に存続した。次に、動物を安楽死せしめた。同種移植片の組織学は、追加の治療が逆転のために行なわれる直前の手術後15日目で、根強い内皮炎が存在することを示した。この動物の同種移植片の生検が手術後23日目で行なわれ、これは内皮炎が無くなったことを示した。
【００９３】
　対照動物は、治療がこのタイプのモデルにおいて行なわれない場合、10日目までには死亡するであろうことが知られている。(Lazaruvits 、など., "A Monoclonal Anti-Act Ｉ Reacts with a Late Lymphocyte Activation," KIDNEY INTER. 25 : 344) 。
　データは次の２つの結論を示唆する：
【００９４】
　〔１〕両サルは対照の既知の日数以上に生存するので、本発明の治療は霊長類において有意な移植片−生存性を示すことが知られている。
　〔２〕抗−CD45RBモノクローナル抗体による急性拒絶反応を逆転できる観察はより一層、劇的である。
【００９５】
例８：追加のサルの実験
　２匹の追加のCynomolgusサル（＃３及び＃４）は、腎同種移植片を受け、そして単一形の免疫抑制としてのCD45RBモノクローナル抗体 6G3により処理された。血液のグループ分けを、 ABO適合性について調整するために行ない、そして主な組織適合性複合体プロフィールを、 PCRに基づく DNA分類を用いて得、同種腎移植が行なわれたことを確かめた。
【００９６】
　ゼロ日目に、腎摘出を受容体動物に行ない、そして腎同種移植を行なった。７日目に、第２の生来の腎臓を取り出し、そしてこの時点から、動物はその移植された腎臓に依存した。免疫抑制を受けていないか、又は無効果の免疫抑制を受ける動物は、平均10±２日で拒絶反応を受けるであろう（Lazarovits、など、1984, "A Monoclonal Antibody Anti-Act Ｉ Reacts with a Late Lymphocyte activation," KIDNEY INTERN. 25 : 344)。
【００９７】
サル＃３
　この動物は、 6G3抗体により２mg／kg／日（８mg）で７日間、処理され、そして次に、次の２週間、月、水及び金曜日に、さらに６回の用量が与えられた。従って、８mgの 6G3抗体が、３週間にわたって与えられるように計画された。動物は14日目で拒絶反応が進行し、そして安楽死せしめられた。
サル＃４
　この動物は、サル＃３と同じ治療を受けた。すなわち、８mgの 6G3抗体が３週間にわたって13回の用量で静脈内注射された。この動物は、著しく良好で、そして70日以上、生存し続けた。拒絶反応は診断されなかった。
【００９８】
　従って、 6G3により処理された動物＃３及び＃４は、図４に示される有意に延長された同種移植片生存性を有した。例８のサル＃２は、抗体がマウス腎移植片実験により推定される急性拒絶反応を都合良く逆転せしめたので、特に興味あるものである。さらなる実験が、サル＃１及び＃３において、それらの両動物はまた、有意に延長された同種移植片生存性を有したけれども、比較的早い移植片不全についての原因を決定するために試みられている。
【００９９】
例９：心臓移植片の拒絶反応のインビボ防止
　BALB／C ドナー中へのC57B１／６マウスからの異所性心臓移植を、 R.L.Kirkmanなど (1985) Transplantation 40 : 719-722に実質的に記載されるようにして行なった。７匹のマウスは、心臓移植に続いて、０及び１日目に、30μｇのラット抗−マウス CD45RB mAb MB23G2をi.v.投与された。他の４匹のマウスは、心臓移植に続いて、０及び１日目に、30μｇ（i.v.）のラット抗−マウス CD45RB mAb MB23G2を、及び２〜11日目、毎日、 100μｇ（i.p.）の前記抗体を受けた。
【０１００】
　14匹の対照のマウスは、抗体を受けなかった。異所性移植片の生存性を、心臓が鼓動している、そして拒絶反応が組織学的分析により確かめられるかどうかにより決定した。すべての対照のマウスは、操作後、14日までにそれらの心臓の拒絶反応を受け、そして平均生存時間は９日であった。２日の間、抗体を受けるグループにおける心臓の平均生存時間は20日であり、そして11日間、抗体を受けるグループにおける心臓の平均生存時間は34日であった。表III は、この実験の結果を要約する。
【０１０１】
【表４】
2004067700.tif 000005
【０１０２】
　抗−CD45RBの可能性ある利用性についての追加の証拠が次の研究において示された：
【０１０３】
例10：ランゲルハンス島同種移植片の拒絶反応のインビボ防止
　 CBA／コドナーからのランゲルハンス島同種移植片を、M.C.Fabianなど（1993）Transplantation 50 : 1137-42に記載しているようにして、ストレプトゾメシン処理されたBALB／C 受容体中の腎カプセル下に移植した。５匹の対照マウスは抗体を受けず、そして11匹のマウスは、操作後０〜１日で、30μｇ（i.v.）のラット抗−マウス CD45RB mAb MB23G2を受けた。拒絶は糖尿の開始として定義された。対照マウスからのすべてのランゲルハンス島同種移植片は、24日目までに拒絶され、そして平均拒絶反応時間は17日であった。抗体−処理されたマウスは、34日の平均拒絶反応時間を示し、そして２匹のマウスは、実験が停止される50日目まで、拒絶反応の徴候は有さなかった。
【０１０４】
　表IVはこの実験からの結果を要約する。
【表５】
2004067700.tif 000006
【０１０５】
例11：ラット対マウスの移植モデルにおける異種移植片寛容の誘発
　抗−CD45RBモノクローナル抗体が異種腎移植片拒絶を妨げるかどうかを評価するために、正常位の腎異種移植を、ドナーとしてLewsラットを用いてBALB／C マウスにおいて行なった。次の５つのグループの受容体を研究した：処理なし（対照）、シクロスポリン(CsA) 処理（５mg／kgのS.C., 毎日）、脾摘出(Spl) 、シクロホスファミド(CyP) 処理（POD ０，２，４及び７での20mg／kg）、MB23G2 mAb処理（毎日 100μｇ×11日、I.P.）及びMB23G2 mAb(100μｇ×11日）及びCyP(POD ０，２，４及び７での20mg／kg、I.V.）の組合せ。
【０１０６】
　下記表Ｖに示されるように、MB23G2 mAb及び CyPにより処理された動物は、 mAbのみ又は CyPのみにより処理された動物よりも有意に長いメジアン生存時間を有し、このことは、CD45RB mAb及び CyPがマウスにおける腎異種移植片を長期生存せしめることに対して相乗効果を有することを示唆する。
【０１０７】
【表６】
2004067700.tif 000007
【０１０８】
　臨床学的な異種移植のための究極的な目的は、異種移植片耐性を誘発することであって、それにより、毒性の高−用量の免疫抑制の連続した使用を排除できる。 CyPによるパルス治療及び連続した CsA処理の組合せが延長された移植片の生存性を誘発したことが、マウス異種移植片モデルに対するハムスター心臓において最近示された。 Hasanなど., "Evidence That Long-Term Survival of Concordant Xenograft Is Achieved By Inhibition of Antispecies Antibody Production," TRANSPLANTATION, Vol.54, pp.408-413 (1992)を参照のこと。しかしながら、シクロスポリン治療が停止される場合、異種移植片は短時間内で拒絶され、すなわちそのメジアン生存時間が３週間以下になった。従って、 CyP及び CsAによる治療は、異種移植片の耐性を誘発することはできなかった。
【０１０９】
　対照的に、上記表Ｖに示されるように、CD45RB mAb及び CyPにより処理された動物における異種移植片は、免疫抑制治療の停止の後、数か月、生存し続けた。さらに、 mAb及び CyPにより処理された長期生存する腎異種移植片は、 POD 100での殺害の時点で、正常な腎機能及び正常な病理学を有した。それらの結果は、CD45RB mAb及び CyPによる処理がラット対マウスモデルにおいて機能的な異種移植片耐性を誘発できることを示唆する。この治療は、ヒトにおける移植片拒絶の防止に適用できる。
【０１１０】
　本発明は、異種移植片を受けた患者への投与のための医薬を含むキットを包含することができる。キットは、先存する抗体により誘発される拒絶反応を抑制するために使用される１又は複数の薬物と共に、CD45RB抗体を適切な医療配合物に含むことができる。そのような薬物は、シクロホスホンアミド、デオキシスペルグアリン及び同様のものを包含する。
【０１１１】
　抗CD45RBは、免疫応答の他の発現の管理において有用である。１つの例は、移植片−対−宿主(GvH) 反応である。他の例は、自己免疫疾患、たとえば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ様関節炎及び同様のものを包含し、それらは自己抗原に対する不適切な免疫応答に起因する炎症により特徴づけられている。
【０１１２】
例12：糖尿病の開始を阻害するために NODマウスのインビボ処理
　５匹の雌の NODマウスを、生後、28, 29及び30日目に、30μｇ（i.v.）のラット抗−マウス CD45RB mAb MB23G2により処理した。５匹の対照のマウスは、抗体処理を受けなかった。27週までに、すべての対照のマウスは、糖尿病の結果として死亡した。抗体処理されたマウスのうち、２匹は糖尿病で死亡し、そして他の３匹は生存し続け、そしてそれらが殺害され、そしてそれらの脾臓が組織学的に試験される時点の35週まで十分に生存し続けた。
【０１１３】
　表VIは、この実験からの結果を要約する。
【表７】
2004067700.tif 000008
【０１１４】
　追加の実験を、この予備実験が行なわれたので、行なった。それらの実験における治療は、２〜35週の間、１週当たり２度の 100μｇのMG23G2の投与を含んで成り、最後に、すべての残るマウスは安楽死せしめた。その結果は、下記の表VII に示される：
【０１１５】
【表８】
2004067700.tif 000009
【０１１６】
　前記データから見出されるように、有意に多くの数の動物が、対照に比較して、無限に、すなわち35週の実験の最後まで生存した。MB23G2により誘発される改良点は、動物の生存性のみでなく、また処理されたグループにおいて35週まで生存したすべての動物が高血症の証拠を有さない血糖においても明白である。MB23G2の有益な効果がまた、脾臓の注意した組織学的評価であるインスリン炎評点により確かめられた。1.81と0.99との間の差異は、生物学的及び統計学的に意義あるものである。
【０１１７】
例13：マウスにおける実験的に誘発されたアレルギー性脳脊髄炎(EAE) の防止
　 EAEは、マウスが脳組織からのミエリン塩基性タンパク質に対して免疫化される多発性硬化症（MS）のたの広く許容される小さな動物モデルである。それらは、MSのためのモデルとして考慮される臨床学的症候群、たとえば尾の麻痺を進行せしめる。この研究のためには、第１日目、２種のグループのマウスは、百日咳毒素を腹腔内注射されると共に、フロイントアジュバントにおけるミエリン塩基性タンパク質により皮下注射される。
【０１１８】
　１つのグループ（６匹のマウス）は、１日目、40μｇのMB23G2 mAbを腹腔内投与され、そして第２のグループ（７匹のマウス）は対照として維持される。百日咳毒素を、３日目、再び腹腔内投与した。第６及び11日目、 mAb−処理されたグループは、合計３回の用量の抗−CD45RB抗体のためにさらに２回の40μｇ用量のMB23G2を受けた。次に、動物は、通常16日以内に進行する疾病（尾及び両後足の麻痺）の徴候を臨床学的に進行せしめた。
【０１１９】
　それらの結果は有意であった。７匹の対照及び６匹の処理された動物から出発して、対照のうち６匹が、尾の麻痺により明らかなように EAEを進行せしめた。６匹のMB23G2−処理された動物のうち１匹は14日目で死亡したが、但し、それは EAEのいづれの臨床学的証拠も決っして表わさなかった。残るMB23G2−処理された動物は、尾の麻痺又は EAEのいづれか他の臨床学的証拠も進行せしめなかった。従って、 CD45RB mAb MB23G2は、多発性硬化症のこの動物モデルにおける自己免疫疾患を防止することに効果的であった。
　前記化合物の医薬的な有用性は、たとえば次のインビボモデルにおいてさらに示され得る：
【０１２０】
皮膚移植片拒絶の防止
　４種のグループのＡ−株マウス（白色）は、 C57BL／10−株マウス（黒色）からの皮膚移植片を受け；グループＩ及びIIはラット抗−マウスCD45RB mAbによる前処理を受け、そしてグループIII 及びIVはラット抗−マウスCD45RB mAbによる前処理を受けない。皮膚移植操作に続いて、グループＩ及びIII は種々の日に、抗−マウスCD45RB mAbにより処理され、そしてグループII及びIVは追加の抗体処理は受けない。皮膚移植片の拒絶を防止する上での抗体処理の有効性を、４種のグループにおける白色の受容体マウス上での黒色の皮膚移植片の生存時間の長さを比較することによって決定する。
【０１２１】
局在化された移植片−対−宿主(GvH) 反応
　本発明の化合物のインビボ効能を、たとえばFordなど, Transplantation 10(1970) 258に記載されるようにして、適切な動物モデルにおいて証明する。生後６週目の雌Wistar／Furth (WF)ラットからの脾臓細胞（１×107 個）を、約 100ｇの体重の雌(F344XWF)Fのラットの後足中に、ゼロ日目、皮下注射する。動物は４日連続して処理され、そして膝窩リンパ節を、７日目に除去し、そして計量する。２つのリンパ節間の重量の差異が、その反応を評価するためのパラメーターとして取られる。
【０１２２】
ラットにおける腎同種移植片反応
　雌の Fisher344ラットからの１つの腎臓を、片側的に（左側）腎摘出されたWF受容体ラットの腎管上に、両端を突合せての吻合を用いて、移植する。処理は移植の日に開始し、そして14日間、続けられる。対側の腎摘出を、移植の７日後に行ない、ここで受容体はドナー腎臓の性能に依存したまま存続する。動物の生存性を、機能的な移植片のためのパラメーターとして取る。
【０１２３】
フロイントアジュバント関節炎
　実験的に誘発された関節炎に対する効能を、たとえばWinter & Nuss, Arthritis & Rheumatism 9 (1966) 394；Billingham Davies, Handbook of Experimental Pharmacol(Vane & Ferreira Eds, Springer-Verlag, Beilin) 50／II(1979) 108-144に記載される方法を用いて示す。 OFA及びWistarラット（雄又は雌、 150ｇの体重）を、 0.6mgの凍結乾燥され、加熱殺害されたマイコバクテリウム　スメグマチス(Mycobacterium smegmatis) を含む鉱油 0.1mlにより、尾の基部又は後足に注射する。
【０１２４】
　進行する関節炎モデルにおいて、処理は、アジュバントの注射の直後（１〜18日目）に開始され；確立された関節炎モデルにおいては、処理は、二次炎症が十分に進行される（14〜20日目）14日目に開始される。実験の最後で、関節の腫張を、マイクロ−カリパスにより測定する。ED50は、対照の腫張の半分にその腫張（一次又は二次）を減じる、mg／kgでの経口用量である。
【０１２５】
狼瘡様自己免疫疾患の開始を阻害するための NZBマウスのインビボ処理
　ニュージーランド産黒色株(NZB) のマウスは、溶血性貧血、糸球体腎炎、及び脈管炎（すべては、ヒト全身性深在性エリテマトーデス(SLE) をひじょうに暗示する）の広く且つ種々の徴候を伴って死亡する。ヒトにおける SLEを処理することにおける本発明の化合物の有効性を、生後、種々の時点で、ラット抗−マウス CD45RB mAb MB23G2により新生 NZBマウスを処理し、そして次に、ヒト SLEの顕著な特徴でもある、自己免疫疾患、特に糸球体腎炎の開始について処理されたマウス及び未処理のマウスを分析することによって評価する。
【０１２６】
　新規化合物の適切な投与量はもちろん、たとえば処理されるべき条件（たとえば疾病タイプ又は耐性の性質）、所望する効果、及び投与のモードに依存して変化するであろう。
【０１２７】
　しかしながら、一般的に、満足のいく結果が、0.01〜 2.5mg／kg（５mg／kgまで）、たとえば0.05又は 0.1mg／kg(1.0mg／kgまで）の用量で、非経口、たとえば静脈内、たとえばi.v.滴下、又は注入による投与に基づいて得られる。従って、患者のための適切な用量は、 0.5〜125mg (250mgまで)(i.v.) 、たとえば 2.5〜50mg（i.v.) である。本発明の化合物は、器官の移植に続いての抗原の挑戦の間、又は自己免疫疾患の急性相の間、血液中に前記化合物の最少レベルを維持するために、毎日、１回ごとに、又はそれ以下の頻度で、減少用量で投与され得る。
【０１２８】
　本発明の医薬組成物は、従来の態様で製造され得る。本発明の組成物は好ましくは、凍結乾燥された形で供給される。即時の投与のためには、それは適切な水性キャリヤー、たとえば注射用無菌水又は無菌緩衝溶液に溶解される。ボーラス注射としてよりもむしろ注入による投与のために多量の溶液を製造することが所望される場合、配合の時点で塩溶液中にヒト血清アルブミン又は患者自身のヘパリン化された血液を導入することが好都合である。過剰のそのような生理学的に不活性のタンパク質の存在は、注入溶液と共に使用される容器及び管の壁上への吸収によりモノクローナル抗体又は融合タンパク質の損失を妨げる。アルブミンが使用される場合、適切な濃度は、塩溶液中、 0.5〜4.50重量％である。
【０１２９】
　臨床試験においては、腎臓、肝臓又は心臓移植を受ける患者は、予防治療のために選択される。移植の日、手術の２時間前、例２のキメラ性CD45RB抗体の最初の静脈内注入が、kg体重当たり 0.2mgの個々の抗体の用量で行なわれる。手術の２日後、 0.4mg／kg体重での抗体の同一の注入が行なわれ、そして次に、１カ月間、１週間隔で反復される。静脈内注入液は次の通りにして調製される：凍結乾燥された抗体が一緒に混合され、そして4.51重量％のヒトアルブミンを含む無菌緩衝溶液 100ml中に分散される。この塩分散液は、30分間にわたって患者に投与される。
【０１３０】
　本発明の化合物は、また特定の副集団の白血球を同定するために診断助剤、診断試薬又は診断キットの成分としても有用である。その化合物は、従来の技法を用いて、ラベルされ、たとえば螢光ラベル又は放射性ラベルされ得る。たとえば、pH 6.8の0.12Ｍのリン酸ナトリウム0.25ml中、モノクローナル抗体25μｇが、２mCi の 125Ｉ及び10μｇのクロラミンＴを用いてヨー素化される。23℃で５分後、反応を、メタ亜硫酸水素ナトリウム20μｇ、 KI ３mg及びBSA１mgの添加により停止する。
【０１３１】
　そのラベルされた化合物は、たとえば、白血球の浸潤を示す、移植片拒絶又は急性自己免疫疾患の徴候を示す患者からの凍結された組織断片に暴露される。過剰の化合物は洗浄され、そして結合された化合物がアッセイされる。組織断片に存在する白血球への化合物の実質的な結合は、包含される大部分の白血球が記憶白血球よりもむしろ純真であることを示唆し、それにより、その化合物、及び／又はＴ−細胞介在の免疫応答に対して主に作用する免疫抑制剤、たとえばシクロスポリン又はFK-506による治療が適切であることを示す。
【０１３２】
　最後に、本発明の化合物は、CD45RBの生物学的活性を調節することができる薬物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。
　従って、本発明によれば、自己免疫疾患を有する人々、及び器官移植片を受ける人々のために実質的に有用である方法及び生成物が提供されることは明らかである。本発明はその特定の態様に関して記載されて来たが、多くの修飾及び変更は当業者に明らかであろう。
【０１３３】
　たとえば、 CD45RB mAb MB23G2により同定されるエピトープが、白血球共通抗原遺伝子のＢエキソンによりコードされることは、現在知られている。エピトープ、及びそのエピトープに結合する化合物の単離は、本発明により企画される。
　従って、本明細書及び請求の範囲内に示されるすべてのそのような修飾、変性及び変更は本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】図１は、未処理のグループに比較しての、MB23G2−処理された動物の延長された生存性を示し；
【図２】図２は、殺した時点での個々のグループからの血清クレアチンレベルを示し；
【図３】図３のＡ，Ｂ及びＣは、MB23G2が循環するリンパ球の消耗(depletion) を誘発し、そして残存するＴ及びＢリンパ球に結合することを示し；
【図４】図４は、同系移植片の受容の後、抗−CD45RB mAb 6G3により処理されたCynomolgusサルの生存を示す。
【図１】
2004067700.tif 000010
【図２】
2004067700.tif 000011
【図３】
2004067700.tif 000012
【図４】
2004067700.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月24日(2003.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
　移植片に対する霊長類受容体の免疫寛容を誘導するように霊長類受容体における当該移植片に対するＴ−細胞介在免疫応答を阻害することにより、当該受容体における細胞、組織又は器官の移植拒絶を予防又は治療するための医薬組成物であって、白血球共通抗原のヒト及び非ヒト霊長類CD45RBアイソタイプに特異的に結合するモノクローナル抗体、その断片、又はそれらの混合物を含んで成る医薬組成物。
【請求項２】
　前記組織又は器官が受容体にとって同種性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
　前記組織又は器官が受容体にとって異種性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
　前記モノクローナル抗体が、抗−CD45RBモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
　前記組織が膵臓小島である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
　前記器官が腎臓である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
　前記器官が心臓である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
　前記組織が皮膚である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
　前記組織が小腸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
　前記器官が肝臓である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
　自己免疫疾患に罹患した哺乳類におけるＴ−細胞介在免疫応答を阻害するための医薬組成物であって、白血球共通抗原のCD45RBアイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体、その断片、又はそれらの混合物を含んで成る医薬組成物。
【請求項１２】
　前記モノクローナル抗体が抗−CD45RBモノクローナル抗体である請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
　前記モノクローナル抗体が6G3 である、請求項12に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
　前記自己免疫疾患が炎症性腸疾患、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデス又はリウマチ様関節炎である、請求項11に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
　白血球共通抗原のCD45RBアイソタイプに特異的に結合するモノクローナル抗体、その断片又はそれらの組合せの医薬組成物、及び免疫抑制剤を含んで成る、異種移植片に対する受容体の寛容性を誘導するためのキット。
【請求項１６】
　抗−CD45RBモノクローナル抗体を含んで成る、請求項15に記載のキット。
【請求項１７】
　前記免疫抑制剤が、サイクロスポリン、サイクロホスファミド、デオキシスペルグリン、FK-506、抗リンパ球グロブリン又はOKT-3 である、請求項14又は15に記載のキット。
【請求項１８】
　ATCC No. HB-11873のハイブリドーマセルラインにより生産される抗体の結合特異性を有する単離されそして精製された抗体又はその断片。
【請求項１９】
　霊長類白血球抗原のCD45RBアイソタイプのCD45RBエピトープに結合する、請求項18に記載の抗体又はその断片。
【請求項２０】
　前記霊長類がヒトである、請求項18に記載の抗体。
【請求項２１】
　前記霊長類は非ヒト霊長類である、請求項18に記載の抗体。
【請求項２２】
　前記霊長類がサルである、請求項21に記載の抗体。
【請求項２３】
　キメラ抗体である、請求項18に記載の抗体。
【請求項２４】
　誘導体キメラ抗体である、請求項18に記載の抗体。
【請求項２５】
　ヒト型化抗体である、請求項18に記載の抗体。
【請求項２６】
　ATCC No. HB-11873のハイブリドーマセルラインにより生産されるモノクローナル抗体6G3．
【請求項２７】
　請求項18〜26のいずれか１項に記載の抗体の１又は複数の相補性決定領域を含んで成るヒト型化抗体。
【請求項２８】
　請求項18〜27のいずれか１項に記載の抗体及び医薬として許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２９】
　ハイブリドーマセルラインATCC N0. HB-11873。