(57)【要約】【課題】遺伝子検査によりＩｉ血液型を判定する方法を提供すること。【解決手段】新規なＮ−アセチルグルコサミン転移酵素であるＩＧｎＴ３の特定の部位が突然変異することによりｉ型が生じる。これらの一塩基多型（ＳＮＰ）を利用することにより、Ｉｉ血液型を遺伝子検査によって判定する。すなわち、生体から分離した試料中のＩＧｎＴ３遺伝子の、配列番号１に示されるそのｃＤＮＡの塩基配列を基準として、１００６ｎｔがｇかａか、及び／又は１０４９ｎｔがｇかａかを調べる。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した試料中のＩＧｎＴ３遺伝子の、配列番号１に示されるそのｃＤＮＡの塩基配列を基準として、１００６ｎｔがｇかａか、及び／又は１０４９ｎｔがｇかａかを調べることを含む、Ｉｉ血液型の判定方法。
【請求項２】
前記試料が、赤血球系細胞を含む試料である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試料が末梢血である請求項２記載の方法。
【請求項４】
ｃＤＮＡを調べることにより行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記１００６ｎｔ及び／又は１０４９ｎｔを含む領域の塩基配列を決定することにより行う請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｉｉ血液型の判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、Ｉｉ血液型の判定方法に関する。
【０００３】
Ｉｉ血液型は、赤血球上にＩ（大文字のアイ）抗原及びｉ（小文字のアイ）抗原のいずれが表れているかに基づいて分類する血液型であり、輸血時の検査として行われている。Ｉ及びｉ抗原は、低温凝集自己抗体により始めて検出されたものであり、ヒトの発生において劇的に変化するものである（非特許文献１〜４）。胎児及び新生児の赤血球は、ｉ抗原を含むがＩ抗原は非常に僅かであるが、生後、ｉ抗原が減少するにつれてＩ抗原の発現が徐々に増大する（非特許文献３及び４）。成人及び生後１８ヶ月以降の子供の大多数は、Ｉ抗原を表し、ｉ抗原は少ない（非特許文献３及び４）。このように、赤血球上のＩ抗原及びｉ抗原は、発生の過程において交代する。Ｉ／ｉ抗原はまた、種々の組織及び体液の細胞表面上にも存在し（非特許文献５及び６）、組織血液型抗原であると認められている（非特許文献７）。
【０００４】
種々の研究により、Ｉ／ｉ抗原は、糖タンパク及び糖脂質上の炭水化物構造として規定されることが明らかにされた（非特許文献８及び９）。ｉ抗原エピトープは、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３  繰り返し単位を有する直線状ポリ−Ｎ−アセチルラクトースアミン鎖であり、一方、Ｉ抗原構造は、分枝したポリ−Ｎ−アセチルラクソースアミノグリカンを含む（図１参照）（非特許文献９及び１０）。Ｉ分枝炭水化物は、発生、分化及び発ガンの過程における細胞間の相互作用において、特に多価糖鎖末端抗原決定基を提示することにより、重要な役割を果たしているかもしれない。
【０００５】
Ｉ分枝ポリ−Ｎ−アセチルラクトースアミンがどのようにして合成されるのかを理解するために、Ｉ−分枝化酵素であるβ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＩＧｎＴ）を研究することは興味深いことである。ＩＧｎＴをコードするｃＤＮＡは、ヒト胎児ガン細胞ＰＡ−１からトランジェント発現法（非特許文献１１）により初めてクローニングされ、ＩＧｎＴと命名された。もう一つのＩ−分枝化酵素が同定され、Ｃ２ＧｎＴ−Ｍ又はＣ２／４ＧｎＴ（後でＣ２ＧｎＴ−２と再命名）と命名された（非特許文献１２、１３）。ＩＧｎＴは、６ｐ２４染色体上に位置し、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を生産する、中心的に作用するＩＧｎＴ活性をコードする。一方、Ｃ２ＧｎＴ−２は、１５ｑ２１−２２に位置し、ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を形成する、プレディスタルに（ｐｒｅｄｉｓｔａｌｌｙ）作用するＩＧｎＴ活性をコードする。
【０００６】
ｉ表現型の成人では、赤血球がｉ抗原を発現し、Ｉ抗原をほとんど発現していない。成人ｉ表現型２２０００人中５人であると報告され（非特許文献１）、この表現型は、常染色体性劣性形質として遺伝する。ｉ表現型では、Ｉ抗原の欠失は、ＩＧｎＴ酵素の不活化の結果であると考えられている。最近、ｉ表現型を示すヒトは、従来のＩＧｎＴ遺伝子中にミスセンス突然変異を有することが報告された（非特許文献１４）。。これらの突然変異は、従来のＩＧｎＴ活性を喪失させ、その結果、赤血球Ｉ抗原がない表現型をもたらすものである。もっとも、かれらは、他の組織におけるＩ抗原の発現については調べていない。これまでの研究により、赤血球の成人ｉ表現型を支援すヒトにおいて、唾液、乳及び血漿では、正常な量のＩ抗原が検出されている（非特許文献１５及び１６）。これらの知見は、組織血液型Ｉ抗原を規定するさらなるＩＧｎＴ遺伝子が存在するかもしれないことを示唆しており、血液型Ｉ遺伝子座をよりよく理解するためにこれらの遺伝子を明らかにすることが強く求められている。
【０００７】
従来、Ｉｉ血液型の判定は、抗体と血球との抗原抗体反応を用いて行われていた。しかしながら、多くの正常なヒト血清中に認められる寒冷凝集素として自己抗Ｉ抗体が知られている。室温でも反応することがあり、血液型判定や交差試験を妨げる。もし、遺伝子検査によりＩｉ血液型を決定することができれば、このような問題が起きず、より正確に、簡便、迅速又はより微量の試料を用いてＩｉ血液型を判定することができ、有利である。
【０００８】
【非特許文献１】
１．    Ｗｉｅｎｅｒ  ＡＳ，  Ｕｎｇｅｒ，  Ｌ．Ｈ．，  Ｃｏｈｅｎ  Ｌ．，  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｊ．  Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｌｄ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ａ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  １９５６；４４：２２１−２４０
【非特許文献２】
２．    Ｍａｒｓｈ  ＷＬ，  Ｊｅｎｋｉｎｓ，  Ｗ．Ｊ．  Ａｎｔｉ−ｉ：  ａ  ｎｅｗ  ｃｏｌｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｎａｔｕｒｅ．  １９６０；１８８：７５３
【非特許文献３】
３．    Ｍａｒｓｈ  ＷＬ．  Ａｎｔｉ−Ｉ：  ａ  ｃｏｌｄ  ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｉ  ｒｅｒａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １９６１；７：２００−２０９
【非特許文献４】
４．    Ｍａｒｓｈ  ＷＬ，  Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＭＥ，  Ｒｅｉｄ  ＭＥ．  Ｔｈｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  １９７１；２０：２０９−２１７
【非特許文献５】
５．    Ｒｏｕｇｅｒ  Ｐ，  Ｊｕｓｚｃｚａｋ  Ｇ，  Ｄｏｉｎｅｌ  Ｃ，  Ｓａｌｍｏｎ  Ｃ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉ  ａｎｄＨ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｉ．  Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａ  ｏｆ  ａ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．  １９８０；２０：５３６−５３９
【非特許文献６】
６．    Ｍａｒｓｈ  ＷＬ，  Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＭＥ，  Ａｌｌｅｎ  ＦＨ，  Ｊｒ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｉ  ｓｅｒａ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  １９７０；１８：１４９−１５４
【非特許文献７】
７．    Ｃｌａｕｓｅｎ  Ｈ，  Ｈａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ．  ＡＢＨ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ａｎｔｉｇｅｎｓ；  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｉｓｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  １９８９；５６：１−２０
【非特許文献８】
８．    Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ，  Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ＳＲ，  Ｋｌｏｃｋ  ＪＣ，  Ｄｅｌｌ  Ａ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｏ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ，  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ，  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９８６；２６１：１２７９６−１２８０６
【非特許文献９】
９．    Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，  Ｈａｋｏｍｏｒｉ  ＳＩ，  Ｃｈｉｌｄｓ  ＲＡ，  Ｆｅｉｚｉ  Ｔ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  Ｉ−ａｃｔｉｖｅ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｉ  ａｎｄ  ｉ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９７９；２５４：３２２１−３２２８
【非特許文献１０】
１０．    Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ，  Ｆｕｋｕｄａ  ＭＮ，  Ｈａｋｏｍｏｒｉ  Ｓ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｎｄ  ３  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９７９；２５４：３７００−３７０３
【非特許文献１１】
１１．    Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ  ＭＦ，  Ｍａｔｔｅｉ  ＭＧ，  Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＩ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ−１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １９９３；７：４６８−４７８
【非特許文献１２】
１２．    Ｙｅｈ  ＪＣ，  Ｏｎｇ  Ｅ，  Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｔａ−１，  ６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｈａｔ  ｆｏｒｍｓ  ｃｏｒｅ  ２，  ｃｏｒｅ  ４，  ａｎｄ  Ｉ  ｂｒａｎｃｈｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９；２７４：３２１５−３２２１
【非特許文献１３】
１３．    Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  Ｔ，  Ｎｏｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｌｅｖｅｒｙ  ＳＢ，  Ｍｅｒｋｘ  Ｇ，  ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ  ＡＧ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＥＰ，  Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ  ＭＡ，  Ｃｌａｕｓｅｎ  Ｈ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎ  ｂｒａｎｃｈ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｔａ１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｏｒｅ  ２  ａｎｄ  ｃｏｒｅ  ４．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９；２７４：４５０４−４５１２
【非特許文献１４】
１４．    Ｙｕ  ＬＣ，  Ｔｗｕ  ＹＣ，  Ｃｈａｎｇ  ＣＹ，  Ｌｉｎ  Ｍ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｉ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００１；９８：３８４０−３８４５
【非特許文献１５】
１５．    Ｄｚｉｅｒｚｋｏｗａ−Ｂｏｒｏｄｅｊ  Ｗ，  Ｓｅｙｆｒｉｅｄ  Ｈ，  Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｍ，  Ｒｅｉｄ  Ｍ，  Ｍａｒｓｈ  ＷＬ．  Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｉ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ．  Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．  １９７０；１８：２２２−２３４
【非特許文献１６】
１６．    Ｍａｒｓｈ  ＷＬ，  Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ，  Ｄｅｃａｒｙ  Ｆ，  Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  Ｋ．  Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｉ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉ  ａｄｕｌｔｓ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．  １９７２；１２：２２２−２２６
【非特許文献１７】
１７．    Ｐｅｔｚｅｒ  ＡＬ，  Ｚａｎｄｓｔｒａ  ＰＷ，  Ｐｉｒｅｔ  ＪＭ，  Ｅａｖｅｓ  ＣＪ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  （ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｆｌｔ３−ｌｉｇａｎｄ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １９９６；１８３：２５５１−２５５８
【非特許文献１８】
１８．    Ｗａｒｒｅｎ  ＭＫ，  Ｒｏｓｅ  ＷＬ，  Ｂｅａｌｌ  ＬＤ，  Ｃｏｎｅ  Ｊ．  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  １９９５；１３：１６７−１７４
【非特許文献１９】
１９．    Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ  Ｍ，  Ｋｕｍａｒ  Ｒ，  Ａｌｂａｎｅｌｌ  Ｊ，  Ｐｅｔｔｅｎｇｅｌｌ  Ｒ，  Ｈａｎ  Ｗ，  Ｍｏｏｒｅ  ＭＡ．  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ，  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  １９９７；９０：１８２−１９３
【非特許文献２０】
２０．    Ｂｒｅｃｋｅｒ  Ｇ  ＳＭ．  Ａ  ｔｉｍｅ  ｓａｖｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １９５０；２０：１０７９−１０８３
【非特許文献２１】
２１．    Ｇｉｂｓｏｎ  ＵＥ，  Ｈｅｉｄ  ＣＡ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＭ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １９９６；６：９９５−１００１
【非特許文献２２】
２２．    Ｈｅｉｄ  ＣＡ，  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ｊ，  Ｌｉｖａｋ  ＫＪ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＭ．  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １９９６；６：９８６−９９４
【非特許文献２３】
２３．    Ｋｙｔｅ  Ｊ，  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ＲＦ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８２；１５７：１０５−１３２
【非特許文献２４】
２４．    Ｃｈｅｎ  ＧＹ，  Ｋｕｒｏｓａｗａ  Ｎ，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｔ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｒｉａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｅｔａ−１，  ６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｂｒａｎｃｈｅｓ  ｉｎ  ｐｏｌｙ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅｓ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２０００；１０：１００１−１０１１
【非特許文献２５】
２５．    Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎ  ＭＦ，  Ｆｕｋｕｄａ  Ｍ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌ  ｂｅｔａ  １−３−ＧａｌＮＡｃ−Ｒ  （ＧｌｃＮＡｃ  ｔｏ  ＧａｌＮＡｃ）  ｂｅｔａ  １−６ＧｌｃＮＡｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｏｍａ  ｌａｒｇｅ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２；８９：９３２６−９３３０
【非特許文献２６】
２６．    Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  Ｈ，  Ｓｉｎｈａ  Ｓ，  Ｂｒｅｗ  Ｋ，  Ｏｋａｙａｍａ  Ｈ，  Ｑａｓｂａ  ＰＫ．  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  （ｂｅｔａ  １−４）ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９８６；８３：４７２０−４７２４
【非特許文献２７】
２７．    Ｌｏ  ＮＷ，  Ｓｈａｐｅｒ  ＪＨ，  Ｐｅｖｓｎｅｒ  Ｊ，  Ｓｈａｐｅｒ  ＮＬ．  Ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｂｅｔａ  ４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ：  ｍｅｓｓａｇｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄａｔａｂａｎｋｓ．  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  １９９８；８：５１７−５２６
【非特許文献２８】
２８．    Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｎ，  Ｎａｔｓｕｍｅ  Ａ，  Ｔｏｇａｙａｃｈｉ  Ａ，  Ｅｎｄｏ  Ｔ，  Ａｋａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｙａｍａｄａ  Ｙ，  Ｉｍａｉ  Ｎ，  Ｎａｋａｇａｗａ  Ｓ，  Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｓ，  Ｓｅｋｉｎｅ  Ｓ，  Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  Ｈ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｋ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｎｏｖｅｌ  ｂｅｔａ  １，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｅｔａ  １，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１；２７６：３４９８−３５０７
【非特許文献２９】
２９．    Ｔｏｇａｙａｃｈｉ  Ａ，  Ａｋａｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｏｏｋｕｂｏ  Ｒ，  Ｋｕｄｏ  Ｔ，  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｓ，  Ｉｗａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｎａｔｓｕｍｅ  Ａ，  Ｍｉｏ  Ｈ，  Ｉｎｏｋｕｃｈｉ  Ｊ，  Ｉｒｉｍｕｒａ  Ｔ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｎａｒｉｍａｔｓｕ  Ｈ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ  ｂｅｔａ  １，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （ｂｅｔａ  ３Ｇｎ−Ｔ５），  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＮＫ−１  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ  Ｘ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２００１；２７６：２２０３２−２２０４０
【非特許文献３０】
３０．    Ｃｈｅｎ  ＧＹ，  Ｋｕｒｏｓａｗａ  Ｎ，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｔ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｅｔａ−１，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．  Ｇｅｎｅ．  ２００１；２７５：２５３−２５９
【非特許文献３１】
Ｏｇａｔａ，  Ｈ．、Ｏｋｕｂｏ，  Ｙ．、Ａｋａｂａｎｅ，  Ｔ．，  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｃａｔａｒａｃｔ  ｉｎ  Ｊａｐａｎｅｓｅ，  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，  １９７９，  １９，  １６６−８
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、遺伝子検査によりＩｉ血液型を判定する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本願出願人は、新規なＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＧｎＴ２及びＩＧｎＴ３並びにこれらをコードする遺伝子について先に特許出願した（特願２００１−４０１８２７）。本願発明者らは、さらに鋭意研究の結果、ＩＧｎＴ３遺伝子の特定の部位が突然変異することによりｉ型が生じることを見出し、これらの一塩基多型（ＳＮＰ）を利用することにより、Ｉｉ血液型を遺伝子検査によって判定することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、生体から分離した試料中のＩＧｎＴ３遺伝子の、配列番号１に示されるそのｃＤＮＡの塩基配列を基準として、１００６ｎｔがｇかａか、及び／又は１０４９ｎｔがｇかａかを調べることを含む、Ｉｉ血液型の判定方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ＩＧｎＴ３遺伝子は、下記実施例に詳述する方法により同定され、クローニングされたものである。その塩基配列を、推定アミノ酸配列と共に配列番号１に示す。また、そのアミノ酸配列をＩＧｎＴ１及びＩＧｎＴ２と対比した図を図２のＡに示し、各エキソンの位置を図２のＢに示す。図２のＡ中、矢印がエキソン２及び３の５’末端の位置を示す。同一のアミノ酸配列を枠で囲み、保存されたシステイン残基を星印で示す。配列番号１に示す塩基配列では、エキソン２の５’末端が、９２６ｎｔ、エキソン３の５’末端が１０１８ｎｔである。上記塩基配列を、ヒトゲノムプロジェクトの第６番染色体のゲノミック遺伝子配列（ＮＴ＿００７２９１）と対比することにより、エクソン部分を決定した。図２のＢに示されるように、ＩＧｎＴ１、ＩＧｎＴ２及びＩＧｎＴ３遺伝子は、エキソン２及びエキソン３が共通であり、エキソン１のみが異なっている。なお、図２のＢは、ＮＴ＿００７２９１の２１９０００ｎｔから３１９０００ｎｔの領域を示す。
【００１３】
本発明の方法では、配列番号１に示されるｃＤＮＡの塩基配列を基準として、１００６ｎｔ（１００６番目の塩基という意味）がｇかａか、及び／又は１０４９ｎｔがｇかａかを調べる（以下、１００６ｎｔのｇがａに変異した遺伝子を「Ｉｉ３」、１０４９ｎｔのｇがａに変異した遺伝子を「Ｉｉ１」ということがある）。下記実施例に具体的に記載するように、これらの部位のいずれか一方が、ｇからａに突然変異した遺伝子が２つ揃うことによりｉ表現型が出現する。したがって、１００６ｎｔ及び１０４９ｎｔのｇがａに変異しているか否かを調べることにより、Ｉｉ血液型を判定することができる。なお、下記実施例で具体的に調べた家系では、ｉ表現型のヒトの遺伝子型は、いずれもＩｉ１とＩｉ３のヘテロ接合であった。なお、下記実施例にも記載されているように、上記した２種類の変異以外にも点突然変異が存在し得る。したがって、「配列番号１に示されるｃＤＮＡの塩基配列を基準として」という文言は、変異部位の位置を特定するために用いている文言であり、被検ＤＮＡが配列番号１と完全に同一の塩基配列を有しなければならないことを意味するものではない。
【００１４】
本発明の方法に供される試料としては、特に限定されないが、赤血球系細胞（赤血球、網状赤血球、赤芽球等）を含む試料であることが好ましく、末梢血が採取が容易で好ましい。
【００１５】
上記突然変異は、常法により試料細胞中のｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡ中の上記各変異を調べてもよいし、上記のように配列番号１の塩基配列中のエキソンの境界がわかっているので、ゲノミック遺伝子中の変異を直接検出してもよい。あるいは、ｍＲＮＡ中の変異や、スプライシング前の前駆ｍＲＮＡ中の変異を検出してもよい。
【００１６】
上記各突然変異の検出自体は、各変異部位の周辺の塩基配列がわかっているので、種々の周知の方法により容易に行うことができる。例えば、下記実施例に記載するように、常法により試料細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、上記変異部分の一方又は両方を含む領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することにより行うことができる。あるいは、試料細胞中のゲノミック遺伝子を鋳型として、上記変異部分の一方又は両方を含む領域をＰＣＲ等の核酸増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することによっても行うことができる。また、ｍＲＮＡをＮＡＳＢＡ法等のＲＮＡ増幅法により増幅し、増幅産物の塩基配列を決定することによっても行うことができる。あるいは、変異部分を含む領域に一方のプライマーを設定して核酸増幅法を行い、増幅が起きるか否かを調べることにより、変異部位の塩基がｇかａかを調べることもできる。この場合、Ｉ型（野生型）の配列と同一又は相補的なＩ型プライマーと、ｉ型（Ｉｉ３又はＩｉ１）の配列と同一又は相補的なｉ型プライマーとの共存下において、増幅を行うことにより、より正確に判定することが可能である。あるいは、Ｉ型とｉ型で切断の有無が生じる制限酵素部位を有するプライマーを用いて増幅を行い、増幅産物をその制限酵素で処理して切断が起きるか否かを調べる（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）ことによっても変異部位の塩基がｇかａかを調べることもできる。なお、ＰＣＲ等の核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、それらの製品の添付文書にしたがって容易に実施することができる。あるいは、プローブを用いて調べることもできる。例えば、上記の増幅産物をサザンブロット又はノーザンブロットにかけることにより調べることができる。これらの場合、Ｉ型の配列と同一又は相補的なＩ型プローブと、ｉ型の配列と同一又は相補的なｉ型プローブとが用いられ、Ｉ型プローブとハイブリダイズすればＩ型、ｉ型プローブとハイブリダイズすればｉ型と判定される。あるいは、プローブをチップ上に固定したＤＮＡチップを用いて検査を行うことも可能である。なお、以上述べた種々の方法は、いずれも一塩基多型の調査方法として周知のものであり、本明細書に記載された情報があれば、当業者が容易に実施できるものである。また、突然変異の調査方法は、上記のものに限定されるものではなく、上記突然変異の有無を調べることができる方法であれば、いずれの方法を採用することもできる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
（１）  ヒトＩＧｎＴ  ｃＤＮＡのクローニング及び発現並びに特徴付け
１．遺伝子データベースの検索とＩＧｎＴ２、ＩＧｎＴ３の塩基配列決定
既存のβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の配列番号（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ）：Ｍ９７３４７，    ＮＭ００４７５１，  ＮＭ００１４９０，  ＮＭ００１４９１である。また検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０（１９９０）］等のプログラムを利用した。
【００１９】
その結果、第六染色体のゲノム配列クローンのＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３９０３９およびＮｏ．ＡＬ３５８７７７が見出された。さらに、この二つの配列を網羅した第六染色体のＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｔｉｏｎ    Ｎｏ．  ＮＴ＿００７２９１が見出された。この部分配列は、既知のＩＧｎＴと相同性が高く、ゲノム上で既知のＩＧｎＴの第一エクソンを挟むように存在していた。この新規の２つの配列について遺伝子領域解析ソフトのＧｅｎｅＳｃａｎ、ＨＭＭｇｅｎｅ等を用いて翻訳領域を解析した。その結果、新規の２つの配列は、別々な第一エクソンであり、この独立した第一エクソンは既知のＩＧｎＴのエクソン２、エクソン３を共用している可能性が認められた。そこで、ここの第一エクソンと第三エクソンにプラマーを設計して、トランスクリプトとして存在するか調べた。また、既知のＩＧｎＴを「ＩＧｎＴ１」とし、新規の２つを「ＩＧｎＴ２」と「ＩＧｎＴ３」と命名した。
【００２０】
具体的には、株化細胞ＰＡ−１（奇形芽腫、ＡＴＣＣより入手）より、総ＲＮＡを抽出し、常法に従ってｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として使用した。用いたプライマーは、ＩＧｎＴ１はフォワードプライマー（５’−ｔｇａｇｇｃａｔｇｃｃｔｔｔａｔｃａａｔｇｃｇｔｔａｃｃ−３’），リバースプライマー（５’−ｔｇａａｔａｇｃｔｃａａａａａｔａｃｃｔｇｃｔｇｇｇｔｔｇｔ−３’：全て共通）、ＩＧｎＴ２はフォワードプライー（５’−ｔｇａａｔｇａｔｇｇｇｃｔｃｔｔｇｇａａｇｃａｃｔｇｔｃ−３’）、ＩＧｎＴ３はフォワードプライー（５’−ｇｔｇａａａａｔａａｔｇａａｃｔｔｔｔｇｇａｇｇｔａｃｔｇｃｔｔ−３’）を用いてＰＣＲ（９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３２サイクル）を行なった。
【００２１】
その結果、約１．２ｋｂａｓｅの増幅産物が得られた。このＰＣＲ増幅産物の配列を調べた。このＰＣＲ溶液をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン）にてＰＣＲ増幅産物を精製した。この精製ＰＣＲ産物を鋳型としてシークエンスを調べた。シークエンスの結果、ＩＧｎＴ２とＩＧｎＴ３の配列（配列番号１、２）が得られた。また、ＩＧｎＴ１とＩＧｎＴ３に関しては、ｐＣＲＩＩベクター（インビトロジェン社）に一般的なＴＡクローニング法により、サブクローニングした。
【００２２】
シーケンスの結果、エキソン２は３１アミノ酸、エキソン３は６２アミノ酸から成ることが判明した（図２Ａ）。またこれらの結果をヒトゲノムプロジェクトのデータベースと比較したところ、上記予想どおりの構造で、それぞれのエキソン１は、ＩＧｎＴ２、ＩＧｎＴ１、  ＩＧｎＴ３の順で、エキソン２の上流に並んでいることが示された（図２Ｂ）。ＩＧｎＴ１エキソンから予想されるアミノ酸配列はＩＧｎＴ２とＩＧｎＴ３それぞれに対し、６５％と６６％の相同性を示した。ＩＧｎＴ２とＩＧｎＴ３の間のエキソン１の相同性は６５％であった。カイトドウリトル・ハイドロパシー（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）分析（２３）ではＩＧｎＴは糖転移酵素に典型的な２型の膜貫通トポロジーを示した。９個のシステインが各ＩＧｎＴで保存されていた。またＩＧｎＴ２はマウスＩＧｎＴ  Ｂのオルソログ（機能が同一のたんぱく質）であったが、ＩＧｎＴ３はこれまでどの種でも報告のなかった新たな遺伝子であることがわかった。
【００２３】
２．ＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３の発現ベクターへの組込み
ＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３の発現系を作成するため、まずＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３をインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムのｐＤＯＮＲ２０１に組込み、さらにインビトロジェン社のＢａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄを作製した。さらに、陽性対照対照としてＩＧｎＴ１も同様に以下に詳細を述べる。
【００２４】
ＧａｔｅｗａｙシステムによるｐＦａｓｔＢａｃへの組込み
▲１▼エントリークローンの作成
ｐＣＲＩＩにサブクローニングしたＩＧｎＴ１およびＩＧｎＴ３を鋳型にした。ＩＧｎＴ２はＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡを鋳型として、ＩＧｎＴ１に対するプライマーＦ１（５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃＣＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＧＡＣＴ−３’），プライマーＦ２（５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃＴＧＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＡＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＡ−３’）、ＩＧｎＴ２に対するプライマーＦ１（５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＣＡ−３’），プライマーＦ２（５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃＴＧＴＣＡＴＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧ−３’）、
ＩＧｎＴ３に対するプライマーＦ１（５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃＣＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＧ−３’），プライマーＦ２（５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｔｃＴＧＴＡＡＴＣＡＣＧＣＣＴＴＡＧＡＧＡＡＡＡＴＧＣＣＡ−３’）
と共通のプライマーＲ（５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃｔｃａＡＡＡＡＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＣＡＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を３０サイクル）により再度ＤＮＡ断片を得た。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−４００  ＨＲ（アマシャムファルマシアバイオテク）にてＤＮＡ断片を精製し、精製後ＢＰ  クロナーゼ  反応によってｐＤＯＮＲ２０１へ組込み、「エントリークローン」を作成した。反応は目的とするＤＮＡ断片１μｌ、ｐＤＯＮＲ２０１１μｌ（１５０ｎｇ）、反応緩衝液２μｌ、ＢＰ  クロナーゼ  ｍｉｘ  ２μｌ、ＴＥ溶液４μｌを２５℃で１時間インキュベートして行った。プロテイナーゼＫを１μｌ加えて３７℃１０分おき反応を終了させた。
【００２５】
その後上記ｍｉｘ全量（１μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＤＯＮＲ−ＩＧｎＴ１−Ｆ１、ｐＤＯＮＲ−ＩＧｎＴ１−Ｆ２、ｐＤＯＮＲ−ＩＧｎＴ２−Ｆ１、ｐＤＯＮＲ−ＩＧｎＴ２−Ｆ２、ｐＤＯＮＲ−ＩＧｎＴ３−Ｆ１、ｐＤＯＮＲ−ＩＧｎＴ３−Ｆ２）を抽出・精製した。
【００２６】
▲２▼発現クローンの作成
上記エントリークローンは挿入部位の両側にラムダファージが大腸菌から切り出される際の組換部位であるａｔｔＬを持つもので、ＬＲクロナーゼ（ラムダファージの組換酵素Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓを混合したもの）とデステイネーションベクターと混合することで、挿入部位がデステイネーションベクターに移り、発現クローンが作成される。具体的工程は以下のとおりである。
【００２７】
まずエントリークローン１μｌ、ｐＦＢＩＨを１μｌ（１００ｎｇ）、ＬＲ反応緩衝液２μｌ、ＴＥ４μｌ、ＬＲ  クロナーゼｍｉｘ  ２μｌを２５℃で１時間反応させ、プロテイナーゼ  Ｋを１μｌ加えて３７℃１０分インキュベートして反応を終了させた（この組換え反応でｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ１−Ｆ１、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ１−Ｆ２、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ２−Ｆ１、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ２−Ｆ２、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ３−Ｆ１、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ３−Ｆ２、が生成される）。ｐＦＢＩＨ  は、ｐＦａｓｔＢａｃ１にＩｇκシグナル配列（ＭＨＦＱＶＱＩＦＳＦＬＬＩＳＡＳＶＩＭＳＲＧ）とＨｉｓタグ（Ｈｉｓ  ６個）のシーケンスを加えたもので、ＯＴ５（５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃａｃｇｔｇｇａｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃ−３’）を鋳型に、プライマーＯＴ２０  （５’−ｃｇｇｇａｔｃｃａｔ  ｇｃａｔｔｔｔｃａａ  ｇｔｇｃａｇ−３’）と、ＯＴ２２  （５’−ｇｇａａｔｔｃｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇ  −３’）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＢａｍ  Ｈ１  とＥｃｏ  Ｒ１  で挿入した。さらに、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。Ｉｇκシグナル配列は発現タンパク質を分泌型にするため、Ｈｉｓタグは精製のため挿入した。
【００２８】
その後上記混合液全量（５μｌ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、アンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。翌日コロニーをとり、直接ＰＣＲで目的ＤＮＡを確認し、ベクター（ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ１−Ｆ１、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ１−Ｆ２、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ２−Ｆ１、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ２−Ｆ２、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ３−Ｆ１、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴ３−Ｆ２、：同様の工程をする場合、ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴｓとする）を抽出・精製した。
【００２９】
またｐＦＢＩＨに変えてｐＦＢＩＦでも同様に実験を行った。即ちｐＦＢＩＦはＨｉｓタグに変えて、精製用にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を入れたもので、ＯＴ３（５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔｔｔｔｃａａｇｔｇｃａｇａｔｔｔｔｃａｇｃｔｔｃｃｔｇｃｔａａｔｃａｇｔｇｃｃｔｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃａｃｇｔｇｇａｇａｔｔａｃａａｇｇａｃｇａｃｇａｔｇａｃａａｇ−３’）を鋳型とし、プライマーＯＴ２０（上記と配列同じ）と、ＯＴ２１  （５’−ｇｇａａｔ  ｔｃｔｔｇｔ  ｃａｔｃｇ  ｔｃｇｔｃ  ｃｔｔｇ−３’）によって得られたＤＮＡ断片を上記と同様にＢａｍ  Ｈ１  とＥｃｏ  Ｒ１  で挿入し、Ｇａｔｅｗａｙ配列を挿入するため、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）を用いてＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅを入れた。
【００３０】
Ｂａｃ−ｔｏ−ＢａｃシステムによるＢａｃｍｉｄの作成
続いてＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（インビトロジェン社）を用いて上記ｐＦＢＩＨ−  ＩＧｎＴｓ又はｐＦＢＩＦ−ＩＧｎＴｓとＢａｃｍｉｄとの間で組換えをさせ、昆虫細胞中で増殖可能なＢａｃｍｉｄにＩＧｎＴｓにその他の配列を挿入した。このシステムはＴｎ７の組換部位を利用して、Ｂａｃｍｉｄを含む大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ）に目的遺伝子を挿入させたｐＦａｓｔＢａｃ（ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴｓまたはｐＦＢＩＦ−ＩＧｎＴｓ）を導入するだけで、ヘルパープラスミドから産生される組換タンパク質によって目的とする遺伝子がＢａｃｍｉｄへとりこまれるというものである。またＢａｃｍｉｄにはｌａｃＺ遺伝子が含まれており、古典的な青（挿入なし）−白コロニー（挿入あり）による選択が可能である。
【００３１】
即ち、上記精製ベクター（ｐＦＢＩＨ−ＩＧｎＴｓ又はｐＦＢＩＦ−ＩＧｎＴｓ）をコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣ）５０μｌと混合し、ヒートショック法の後、カナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ、及びＩＰＴＧを含むＬＢプレートにまき、翌日白い単独コロニーをさらに培養し、Ｂａｃｍｉｄを回収した。
【００３２】
３．  Ｂａｃｍｉｄの昆虫細胞への導入
上記白コロニーから得られたＢａｃｍｉｄに目的配列が挿入していることを確認した後、このＢａｃｍｉｄを昆虫細胞Ｓｆ２１（インビトロジェン社より市販）に導入した。即ち３５ｍｍのシャーレにＳｆ２１  細胞９ｘ１０５  細胞／２ｍｌ  （抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）を加え、２７℃で１時間培養して細胞を接着した。（ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ）精製した  Ｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡ  ５  μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ）ＣｅｌｌＦＥＣＴＩＮ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）  ６μｌに抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）１００μｌ加えた。その後、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡおよびＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを丁寧に混合して１５〜４５分間、室温でインキュベートした。細胞が接着したことを確認して、培養液を吸引して抗生物質を含まないＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）２ｍｌを加えた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＡとＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを混合して作製した溶液（ｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）に抗生物質を含まないＳｆ９００ＩＩ  ８００μｌを加えて丁寧に混和した。細胞から培養液を吸引し、希釈したｌｉｐｉｄ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ溶液を細胞に加え、２７℃で５時間インキュベーションした。その後、トランスフェクション混合物を除き、抗生物質を含むＳｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）培養液２ｍｌを加えて２７℃で７２時間インキュベーションした。トランスフェクションから７２時間後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，  １０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清が一次ウイルス液となる）。
【００３３】
Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞  １ｘ１０７  細胞／２０ｍｌ  Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したら一次ウイルスを８００μｌを添加して、２７℃で４８〜７２時間培養した。培養終了後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，  １０分間遠心し、上清を別のチューブに保存する（この上清を二次ウイルス液とした）。
【００３４】
さらに、Ｔ７５培養フラスコにＳｆ２１細胞  １ｘ１０７  細胞／２０ｍｌ  Ｓｆ−９００ＳＦＭ（インビトロジェン社）（抗生物質入り）を入れて、２７℃で１時間インキュベートした。細胞が接着したらニ次ウイルス液１０００μｌを添加して、２７℃で７２〜９６時間培養した。培養後にピペッティングにより細胞を剥がし、細胞と培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，  １０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を三次ウイルス液とした）。
【００３５】
加えて、１００ｍｌ用スピナーフラスコにＳｆ２１細胞６ｘ１０５細胞／ｍｌ濃度で１００ｍｌを入れ、三次ウイルス液を１ｍｌ添加して２７℃で約９６時間培養した。培養後に、細胞及び培養液を回収した。これを３０００ｒｐｍ，  １０分間遠心し、上清を別のチューブに保存した（この上清を四次ウイルス液とした）。
【００３６】
三次のセルペレットをソニケーションし（ソニケーション緩衝液：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２  ％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）細胞粗抽出液  をＨ２Ｏで２０倍にし、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動についてウエスタンブロッテイングを行い、目的とするＩＧｎＴ１，ＩＧｎＴ２，  ＩＧｎＴ３（３種類同時に示す場合ＩＧｎＴｓ）のタンパク質の発現を確認した。抗体は、ヒスチジンタグのついたＩＧｎＴｓにはモノクローナル抗体６−Ｈｉｓ（ＭＭＳ−１５６Ｐ、ＣＯＶＡＮＣＥ社）、ＦＬＡＧ配列のついたＩＧｎＴｓには抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。
【００３７】
ＦＬＡＧ−ＩＧｎＴｓは、４２Ｋまたは４１Ｋの位置にバンドが検出された。
【００３８】
四次感染のＦＬＡＧ−ＩＧｎＴｓ上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５  ％）、ＮａＣｌ  （１５０  ｍＭ）、ＣａＣｌ２  （２  ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（Ｓｉｇｍａ  社）（５０  μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。翌日遠心して（３０００ｒｐｍ  ５分４℃）ペレットを回収し、２  ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ  ５分４℃）し、ペレットを５０μｌ  の１  ｍＭ  ＣａＣｌ２・ＴＢＳ  に浮遊させ活性測定のサンプル（ＩＧｎＴｓ酵素液）とした。
【００３９】
５．  ＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３の受容体基質の探索
ＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３は、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素である既知ＩＧｎＴ１と相同性が高く、ＩＧｎＴ１とそれぞれ７３．４％、７４．１％であった。そこで、第一に供与体基質（ｄｏｎｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて検討した。
【００４０】
以下の反応系を用いて、ＩＧｎＴｓの受容体基質を調べた。下記反応液の「受容体基質」には、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（ＬＮｎＴ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ（ａｇａｌａｃｔｏ−ＬＮｎＴ）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（２Ｌ１：生化学工業）、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（３Ｌ１：生化学工業）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（ａｇａｌａｃｔｏ−３Ｌ１）を２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）化したものを用いてそれぞれが受容体として機能するかどうかを調べた。２ＡＢ標識糖鎖は、ＨＰＬＣを用いて蛍光検出器で検出した。
【００４１】
反応液（カッコ内は最終濃度）は受容体基質（１０  ｎｍｏｌ）、カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（５０ｍＭ）  、ＥＤＴＡ（３５  ｍＭ）  、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡＣ  （１０ｍＭ）  、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（０．５％）、牛血清アルブミン（２ｍｇ／ｍｌ）から成り、これにＩＧｎＴｓ酵素液を２．５  μｌ加えて、さらにＨ２Ｏを加えて全量１０μｌとした。
【００４２】
上記反応混合液を３７℃で一昼夜反応させ、反応終了後、９７℃５分間過熱して軽く遠心後上清を取得した。この反応溶液５０μｌをＨＰＬＣにて分析した。ＨＰＬＣの分析条件は、カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ＱＡカラム（４．６ｘ２５０  ｍｍ；  Ｔｏｓｏｈ）、溶媒（移動相）は７％メタノールを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）、または受容体基質として３Ｌ１の場合のみ５％メタノールを含む２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）、流速は１ｍｌ／ｍｉｎ、励起波長：３３０ｎｍ、蛍光測定波長：４２０ｎｍで行なった。
【００４３】
その結果、陽性対照として用いたＩＧｎＴ１は、受容基質ＬＮｎＴ（溶出時間１８．６分）を用いた場合、生成物は１７分にピークが認められた。すなわち、この１７分の生成物は、ＬＮｎＴにβ１−６結合でＮ−アセチルグルコサミンが結合したＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃである。ＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３に関しても全く同様の結果が得られた。すなわち、ＩＧｎＴ２およびＩＧｎＴ３は、ポリラクトサミン構造（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃのような構造で基本的には「Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ」の繰り返し構造をポリラクトサミン構造とする）の還元末端ではないガラクトースにβ１−６結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する酵素であることを確認した。そこで、他の基質についても検討した。その結果を以下の表１にまとめた。ａｇａｌａｃｔｏ−ＬＮｎＴを基質とした場合の生成物はＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃである。２Ｌ１を基質としたときは、生成物はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃである。ａｇａｌａｃｔｏ−３Ｌ１を基質としたときは、生成物はＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃである。３Ｌ１を基質としたときは、生成物はＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃおよびＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃである。
【００４４】
【表１】
表１
2004166646.tif 000003
【００４５】
（２）ヒト組織におけるＩＧｎＴの転写量の定量分析
▲１▼方法
Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ  をＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社から購入し、リアルタイムＰＣＲによって組織中のＩＧｎＴ量を測定した（２１、２２）。内部標準としてはＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ）を用いることにした。そこでＩＧｎＴのｃＤＮＡとＧＡＰＤＨのｃＤＮＡの標準曲線を、ＩＧｎＴ遺伝子を含むｐＤＯＮＲ２０１ベクターとＧＡＰＤＨ遺伝子を含むｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社）をそれぞれ段階的に希釈して用いて作成した。プライマーとプローブは以下のものを用いた。ＩＧｎＴ１のフォワードプライマーとして、５’−ａｃａａａ  ｃｔａａｔ  ｇａｔｃｃ  ａｔｇａｇ  ａａｇｔｃ  ｔｔｃ−３’、リバースプライマーとして、  ５’−ｃｃａｔｔ  ａｔａｔａ  ｔｇｃｃａ  ａｇｇｇａ  ａａｇｔｃ−３’、またＩＧｎＴ１のプローブとしては    ５’−ＦＡＭ−ｔｇｃａａ  ｇｇａａｔ  ａｃｔｔｇ  ａｃｃｃａ  ｇａｇｃｃ  ａｃｔ−ＭＧＢ−３’を用いた。ＩＧｎＴ２のフォワードプライマーとしては  ５’−ｇｃｔａｔ  ｇａｇｔａ  ｃａｔｇｇ  ｔｔｃｇａ  ａｇｃｃ−３’を、リバースプライマーは  ５’−ｇｃｃｇａ  ａｇｔｃｔ  ｔｔｇｔｇ  ｇａｔｇｇ  ｔ−３’またプローブは５’−ＦＡＭ−ｔｇａａｇ  ａａｇａｇ  ｇｃｔｇｇ  ｇｔｔｃｃ  ｃｔｔｔａ  ｇｃｔｔａ  ｃａ−ＭＧＢ−３’を用いた。さらにＩＧｎＴ３のフォワードプライマーについては５’−ａａｔｇｃ  ｃａｇｔｃ  ｔｔｔｔｔ  ｇｔｇｇｇ  ａ−３’を、リバースプライマーは５’−ａｔｇｔａ  ｇｔｇａｔ  ｔｃｔｇｇ  ｇｔｃａｇ  ｇｔａａｔ  ｃ−３’を、そしてプローブには５’−ＦＡＭ−ａａｔａｔ  ａｔｔａｃ  ｃａｔｃａ  ｃｃｔｔｔ  ｇｃｇａａ  ｇｔｇｔｃ  ｃｃｔｔｇ−ＭＧＢ−３’を用いた。
【００４６】
ＧＡＰＤＨのプライマーとプローブについてはＰｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社）を用いた。リアルタイムＰＣＲは常法により行った。増幅条件としては５０℃で２分と９５℃で１０分をそれぞれ１サイクルおよび９５℃で１５秒と６０℃で１分を５０サイクル行った。ＰＣＲ産物はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  社）でシーケンスして確認した。これにより同一ｃＤＮＡにおけるＧＡＰＤＨの転写量に対する  ＩＧｎＴの転写の相対量が得られた。
【００４７】
▲２▼結果
その結果は図３に示すとおりである。ＩＧｎＴ２はＩＧｎＴ１やＩＧｎＴ３に比較して、多くの組織でより豊富に発現していることが示された。特にＩＧｎＴ２は胃と小腸で最も強く発現し、腎臓、脾臓、胎盤、膵臓、肝臓、睾丸がそれに続く発現を示した。一方、脳全体、大脳皮質、胎児脳、小脳、骨格筋ではＩＧｎＴ２の発現は非常に低値であった。ＩＧｎＴ１の発現パターンはＩＧｎＴ２と同様であったが、小脳と胎児脳でＩＧｎＴ２より多くの発現が見られた。逆にＩＧｎＴ３の発現はＩＧｎＴ１やＩＧｎＴ２と異なるもので、骨髄、心臓、胃、小腸で強く、その他の組織では非常に低値または検出限界以下であった。
【００４８】
（３）造血細胞におけるＩＧｎＴの転写量の定量分析
▲１▼造血細胞の分化
造血細胞の分化に伴うＩＧｎＴ遺伝子の発現レベルの変化を調べるため、家系特異的な造血細胞（骨髄ＣＤ３４＋細胞）を分化させてｃＤＮＡを調整した。具体的には以下のとおりである。
【００４９】
骨髄球系、赤血球系、巨核球系への分化を促すため、精製したＣＤ３４＋細胞を血清なしの溶液中でいくつか組み合わせた造血成長因子で処理した（１７）。その後細胞を骨髄球の分化にはｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ  （ＳＣＦ；  ５０  ｎｇ／ｍｇ，  Ｓｉｇｍａ社，  米国）  顆粒球−マクロファージ  コロニー活性因子；ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  （１０  ｎｇ／ｍｌ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社，  米国）  を、赤芽球の分化にはＳＣＦ  （５０  ｎｇ／ｍｌ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社，  米国）  とエリスロポエチン；ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  （３Ｕ／ｍｌ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社，  米国）  を、また、巨核球の分化にはＳＣＦ  （５０  ｎｇ／ｍｌ）とトロンボポエチン；ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  （２０  ｎｇ／ｍｌ）を加えて６日間培養した（１８、１９）。
【００５０】
▲２▼方法
定量方法は前記（２）▲１▼と同じである。
【００５１】
▲３▼結果
造血細胞の各分化段階におけるＩＧｎＴ遺伝子の発現を調べたところ、先祖であるＣＤ３４＋細胞ではＩＧｎＴ２が最も多く発現し、ＩＧｎＴ１とＩＧｎＴ３は比較的低値であった。ところが赤血球系（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）に分化するとＩＧｎＴ３が極端に上昇し、ＩＧｎＴ１とＩＧｎＴ２の発現が抑制されていた。また、骨髄球系（ｍｙｅｌｏｉｄ）または巨核球系（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）へ分化するとＩＧｎＴ全体の発現が前者では亢進し、後者では抑制されることが示された（図４）。
【００５２】
赤芽球への分化においてＩＧｎＴ３の発現レベルが上昇することにより、最終的に赤血球へ分化する過程において、Ｉ血液型の合成はＩＧｎＴ３によるものであることが示唆された。
【００５３】
▲４▼網状赤血球におけるＩＧｎＴ発現の検証
そこでこの可能性を検証するため、網状赤血球を濃縮したフラクションを得て、ＩＧｎＴの発現レベルを調べることにした。詳細は以下のとおりである。
【００５４】
Ｏｐｔｉｐｒｅｐ  （Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  社、ノルウエー）を用いて製品添付のマニュアルに従ってヒト抹消血から網状赤血球のフラクションを調整した。最終的にグラジエント遠心で得られた最上部のフラクションをニューメチレンブルー（２０）によって超生体染色し、顕微鏡下で網状赤血球を数え、全体に対する割合を得たところ、末梢血全体では１．０％のところ最上部フラクションでは１２．１％に濃縮されていた。このフラクションには単球や顆粒球などが見いだされず、網状赤血球のみが見いだされた。得られた網状赤血球からＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）を用いてＲＮＡを抽出しさらにｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを用いてリアルタイムＰＣＲでＩＧｎＴの発現レベルを調べたところ、ＩＧｎＴ３は網状赤血球において明らかに発現していたが、ＩＧｎＴ１またはＩＧｎＴ２の発現は見られなかった（表２）。
【００５５】
【表２】
表２    ヒト網状赤血球におけるＩＧｎＴ１，  ＩＧｎＴ２及びＩＧｎＴ３の発現量の比較
2004166646.tif 000004
【００５６】
（４）成人ｉ表現型におけるＩＧｎＴ遺伝子変異の発見
▲１▼方法
成人ｉ家系である家系のひとつから成人ｉ表現型である３名とＩ表現型である１名と、さらに４名のＩ表現型のボランテイアを選択した。ＲＮａｓｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  とＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて  それぞれの抹消血から総ＲＮＡとゲノムＤＮＡを調整した。ゲノムＤＮＡの調整はＰＣＲでＩＧｎＴ遺伝子のそれぞれ３つの第１エキソンと、共通の第２、第３エキソンを増幅して行った。第１エキソンのプライマーセットは、ＩＧｎＴ１用として  ５’−ｔａａｇｇ  ｔｃｔｃａ  ｔａｔａａ  ｃｔｃａｇ  ｔｇｇａｔ  ｇ−３’と５’−ｇｇｇｔｇ  ａｇａａｃ  ｔａｔａｔ  ａｔｇｔｔ  ｃｃａｇｔ  ｔ−３’、ＩＧｎＴ２用として５’−ｔｇｔａｇ  ａｃａｃａ  ｇｇｔｔｇ  ｃａｇｃｔ  ｔａｇｃａ−３’と５’−ｃｔｔｔｔ  ｇｔｃｃｔ  ｇｔｇａａ  ｃａｇａｇ  ｃｇｇｔｔ−３’  、さらにＩＧｎＴ３として５’−ｃｔｇｇｇ  ｃｔｔａｇ  ｃｔｇａｇ  ｃｃｔｔｔ  ｇｃａａ−３’と  ５’−ｃｔｇｇｇ  ｃｔｔａｇ  ｃｔｇａｇ  ｃｃｔｔｔ  ｇｃａａ−３’  である。また共通する第２第３エキソン増幅のプライマーは、それぞれ５’−ｃｔｇａａ  ｇｔｇｇａ  ｇａａａｃｃｃｔｇｇ  ｃｔｔａ−３’と５’−ａａｃｃｃ  ｔｇｇａｔ  ｔｃｃａｃ  ａｇｃｔａ  ｃｃｔｔ−３’、及び    ５’−ａｇｔｔｇ  ｔａｇｔｔａｇｔｃｇ  ｇａｇａｇ  ｔａｃｃｔ−３’  と  ５’−ｔａｔａａ  ｔｔａｃｇ  ｔａｇｃｃ  ａｇｇｔｃ  ｃｔｇａａ−３’を用いた。さらに５’−ｇｃｔｔｔ  ｃａｃｔｃ  ｔｇｃｔｃ  ａｇｃｇｔ  ｇｇｔｃａ  ｔ−３’  と  ５’−ｔａｃｃｃ  ａｇｃｃａ  ｔｃｃｔｇ  ｔｔａｇｔ  ｇｔａｔｔ−３’のプライマー対を用いてＲＮＡサンプルからＩＧｎＴ３を増幅して配列を確認した。この増幅フラグメントをＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  によりｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ  ベクター  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。ＰＣＲ産物はＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社）により精製し、またプラスミドはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ社）により精製して、ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ  とＭｅｇａＢＡＣＥ  ５００  （ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてシーケンスを行った。
【００５７】
▲２▼結果
その結果を図５に示す。図の左側のＩは第１世代、ＩＩは第２世代、ＩＩＩは第３世代を示す。図５中、正方形は男性、円は女性を示す。黒く塗りつぶしたヒトは、ｉ表現型であり、半分だけ塗りつぶしたヒトは、Ｉ型遺伝子（野生型）とｉ型（Ｉｉ１又はＩｉ３）のヘテロで、表現型はＩ型である。遺伝子型を調べたヒトについては遺伝子型を記載した。第１世代は、既に他界しているので、遺伝子型を調べることはできなかった。成人ｉ表現型と一般Ｉ表現型のサンプルを用いたＩＧｎＴ１、ＩＧｎＴ２、及びＩＧｎＴ３  遺伝子のシーケンスを行ったところ、ＩＧｎＴ１、ＩＧｎＴ２のエキソン１では変異は見つからなかったが、ＩＧｎＴ３のエキソン１ではＧ８１６Ｃの置換による変異が見出された。しかしながらこの置換は成人ｉ表現型だけではなく、一般Ｉ表現型においても４名中２名に見られ、無機能なＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と考えられた。一方Ｇ１００６ＡとＧ１０４９Ａの塩基置換はそれぞれ第２エキソンと第３エキソンで成人ｉ表現型においてのみ見出された。
また、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ  ベクターにサブクローニングされたＩＧｎＴ３のｃＤＮＡ配列を検証したところ、成人ｉ表現型である第２世代（Ｇ−ＩＩ）の個人２、５、６（図５Ａ）はＩｉ１／Ｉｉ３アリルのヘテロであり、一般Ｉ表現型である第３世代（Ｇ−ＩＩＩ）の個人１はＩ／Ｉｉ１のヘテロであることが判明した。Ｉｉ１／Ｉｉ３アリルにおけるＧ１０４９ＣとＧ１００６Ｃの核酸置換は、アミノ酸レベルではそれぞれＧｌｙ３５０Ｇｌｕ、Ｇｌｙ３３６Ａｒｇとなる。Ｇ８１６ＣのＳＮＰとＧ１００６Ａは同じＩｉ３アリル上に存在する。
【００５８】
（４）ＩＧｎＴ３上のＧ１０４９ＡとＧ１００６Ａの変異はＣＨＯ細胞でのＩ−抗原の発現を抑制した
Ｇ１０４９Ａを含むＩｉ１アリルと、Ｇ８１６ＣとＧ１００６Ａ変異を含むＩｉ３アリルのｃＤＮＡをＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞に導入してＩＧｎＴ遺伝子の発現を調べた。詳細は以下のとおりである。
【００５９】
▲１▼方法
ＣＨＯ細胞を１０％ウシ胎児血清添加α−ＭＥＭ  （ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）  中で培養した。サブクローニングしたｐＣＲＩＩ−ＩＧｎＴｓ  からオープンリーデイングフレーム全体を取り出して  ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（＋）（インビロゲン社製）へ挿入し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＩＧｎＴｓ  とした。１０４９部位がＡに変異した変異アリルＩｉ１  と１００６部位がＡに変異した変異アリルＩｉ３  をｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（＋）に挿入した。これらのプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  社）を用いてＣＨＯ細胞へ導入し、０．６  ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシンで選択した。細胞表面のＩ／ｉ抗原発現の変化はＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  社）を用いたフローサイトメトリーにおいて、Ｉ−抗原についてはＯＳＫ−２８によって、ｉ−抗原についてはＯＳＫ−１４  によって確認した。
【００６０】
▲２▼結果
ＣＨＯ細胞ではＩＧｎＴ活性とＩ−抗原の発現が見られないが、ｉ−抗原は発現していることが報告されている（１１，  ２５）。上記形質転換細胞を抗Ｉ−抗体と抗ｉ−抗体で染色し、フローサイトメトリー分析を行った（図６）。上記フローサイトメトリーの結果、ＩＧｎＴ１、ＩＧｎＴ２、またはＩＧｎＴ３を導入したいずれのＣＨＯ細胞においてもＩ−抗原の発現が上昇し、同時にｉ−抗原の発現が低下していることが示された。
【００６１】
即ち、野生型ＩＧｎＴ３を導入した細胞ではＩ−抗原の発現とｉ−抗原の抑制が顕著に見られたが、そのようなｉ／Ｉの発現変化はＩｉ１アリルまたはＩｉ３アリルを導入したいずれのＣＨＯ細胞でも見られなかった。野生型または変異型ＩＧｎＴ３のＣＨＯ細胞への導入と発現はリアルタイムＰＣＲによって確認した。これらの結果から、上記突然変異によりｉ表現型が表れることが明らかになった。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、Ｉｉ血液型の遺伝子検査による判定方法が初めて提供された。本発明の方法は、遺伝子検査であるので、従来の免疫反応を利用する方法のように、交差反応等により判定が不正確になる恐れがなく、従来よりも正確、簡便にＩｉ血液型を判定することが可能になる。
【００６３】
なお、日本人（またはアジア人）では、ｉ個体の場合、遺伝性の白内障になると報告（非特許文献３１）されており、今回見つけたｍｕｔａｔｉｏｎが原因である可能性がある。今回調べたｉ個体は遺伝性の白内障である。また、この遺伝子と関連したものも白内障を誘発する因子になりえると考えられる。また、本研究を基にした白内障治療薬の開発や、白内障の他の原因遺伝子の特定にも役立つ可能性があると考えられる。
【００６４】
【配列表】
2004166646.tif 000005
【００６５】
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2004166646.tif 000007
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
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【００７６】
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【００７７】
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【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
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【００９６】
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【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
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【０１００】
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【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｉ抗原及びｉ抗原の構造及びこれらの生合成経路を示す図である。
【図２】Ａは、ＩＧｎＴ３のアミノ酸配列をＩＧｎＴ１及びＩＧｎＴ２と対比した図を示し、Ｂは、各エキソンの位置を示す。
【図３】リアルタイムＰＣＲによる、ＩＧｎＴ転写物のヒト組織中の定量結果を示す図である。
【図４】ＣＤ３４陽性細胞からの造血細胞分化の過程におけるＩＧｎＴ転写物の発現の変化を示す図である。
【図５】成人ｉ型家系におけるＩ型（野生型）、Ｉｉ１型及びＩｉ３型アレルの分離を示す図である。
【図６】Ｉｉ１型及びＩｉ３型アレルｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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