(57)【要約】【課題】ホモジナイザー又はソニケーター等の装置を用いることなく、簡便且つ迅速で、しかも、安全性の高い、組織抽出液の製造方法及び組織中のタンパク質分析方法を提供する。【解決手段】前記製造方法は、組織に対して、ホモジナイズ処理又は超音波処理を実施することなく、細胞分散用酵素処理及び膜可溶化用界面活性剤処理を行うことを特徴とする。また、前記タンパク質分析方法では、前記製造方法により得られる抽出液を、被検試料として用いる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織に対して、ホモジナイズ処理又は超音波処理を実施することなく、細胞分散用酵素処理及び膜可溶化用界面活性剤処理を行うことを特徴とする、組織抽出液の製造方法。
【請求項２】
先ず細胞分散用酵素処理を行い、次いで膜可溶化用界面活性剤処理を行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
細胞分散用酵素処理と膜可溶化用界面活性剤処理とを同時に行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
先ず膜可溶化用界面活性剤処理を行い、次いで細胞分散用酵素処理を行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法により得られる抽出液を、被検試料として用いる、組織中のタンパク質分析方法。
【請求項６】
分析対象としての前記タンパク質が、アルブミン、アルカリホスファターゼ、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、又はチミジル酸合成酵素である、請求項５に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織抽出液の製造方法、及び前記製造方法を用いて調製した抽出液を試料として用いる分析方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【０００２】
【従来の技術】
組織からタンパク質を抽出する場合は一般に、ホモジナイザー又はソニケーター等の装置を用いて、組織に対し物理的な衝撃を与え、組織を破壊することにより、タンパク質を抽出する方法が広く用いられている（非特許文献１）。この場合、試料毎に装置の洗浄が必要であること、及び同時に多検体の処理ができない等、操作は複雑であり、時間を要する。
【０００３】
また、前記方法では、抽出容器にホモジナイザー等の刃を挿入する必要があり、抽出容器を密閉することができず、抽出液の飛沫が発生する。特に、感染性を有する病原体、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、梅毒トレポネーマ、又は結核菌等により汚染された組織を処理する場合、あるいは、狂牛病プリオンタンパク質等、組織中に含まれる危険性の高い病原体を測定する場合、抽出液飛沫中に含まれた病原体が飛散することがあり、作業従事者のみならず、周囲に対し感染被害が発生する恐れがある。
【０００４】
しかしながら、組織を検体として用いる検査項目は多岐に及ぶため、測定用試料として組織抽出液を調製する目的で、ホモジナイザー又はソニケーター等の装置を用いて、タンパク質を抽出する方法が広く用いられている。実例として、ウシ組織中の狂牛病プリオンタンパク質の測定、あるいは、ヒト組織中のアルブミン量、アルカリホスファターゼ量、グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（以下、ＧＯＴと略称する）量、グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（以下、ＧＰＴと略称する）量、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（以下、ＤＰＤと略称する）量（非特許文献２）、又はチミジル酸合成酵素（以下、ＴＳと略称する）量の測定等、多岐に及ぶ診断が行われていることが挙げられる。
【０００５】
【非特許文献１】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８１年，第２５６巻，ｐ．２１９−２２４
【非特許文献２】
「キャンサー・リサーチ（ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）」，（米国），１９９３年，第５３巻，ｐ．５４３３−５４３８
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、ホモジナイザー又はソニケーター等の装置を用いる場合に比べ、試料毎の装置の洗浄等を回避することができ、しかも、同時に多検体の処理が可能な、簡便且つ迅速な、組織抽出液の製造方法、すなわち、組織からのタンパク質抽出法を提供することにある。また、組織に対し物理的な衝撃を与えることによりタンパク質を抽出する場合に頻発する抽出液の飛沫の発生を防ぎ、安全性の高い抽出法を提供することにある。更には、本発明の抽出法を用いて分離したタンパク質抽出液を試料として用いる、組織中のアルブミン測定法、アルカリホスファターゼ測定法、ＧＯＴ測定法、ＧＰＴ測定法、ＤＰＤ測定法、及びＴＳ測定法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、組織に対して、ホモジナイズ処理又は超音波処理を実施することなく、細胞分散用酵素処理及び膜可溶化用界面活性剤処理を行うことを特徴とする、組織抽出液の製造方法により解決することができる。
また、本発明は、前記製造方法により得られる抽出液を、被検試料として用いる、組織中のタンパク質分析方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法は、抽出工程中に飛沫の発生の可能性のある物理的操作、例えば、ホモジナイズ処理又は超音波処理を実施することなく、組織に対し、細胞分散用酵素処理（以下、単に酵素処理と称することがある）及び膜可溶化用界面活性剤処理（以下、単に界面活性剤処理と称することがある）を行うことを特徴とする。
【０００９】
本発明の製造方法を適用することのできる組織には、動物組織及び植物組織が含まれる。
動物組織の場合、前記動物としては、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、又はイルカ等に適用することができ、より好ましくはヒト、ウシ、又はブタ、特にはヒトに適用することができる。動物組織としては、例えば、臓器（例えば、肝臓、胃、肺、腸管、脾臓、又は膵臓など）又はそれらの一部を挙げることができる。
また、植物組織としては、後述のプロトプラスト調製用酵素によりプロトプラストに調製可能な植物の各種組織である限り、特に限定されるものではないが、例えば、ミカン、オレンジ、イネ、コムギ、オオムギ、又はダイズ等を挙げることができる。
【００１０】
本発明の製造方法では、組織に対する酵素処理及び界面活性剤処理を、同時に実施することもできるし、あるいは、酵素処理の後に界面活性剤処理の順序で、あるいは、界面活性剤処理の後に酵素処理の順序で行うこともできる。これらの実施順序は目的に応じて適宜選択することができる。
【００１１】
本発明の製造方法を実施する場合に、組織はそのままの状態で、あるいは、適当な手段（例えば、はさみ等）により細切した後、タンパク質抽出を行うことができる。抽出効率を高めるため、組織は、予めはさみ等を用いて細切（例えば、０．１ｍｍ〜１ｃｍの細片）することが好ましい。あるいは、組織小片（例えば、０．１ｍｍ〜１ｃｍの細片）として採取した場合には、そのまま使用することができるため、好ましい。
【００１２】
本発明に用いる細胞分散用酵素には、動物細胞を処理するために用いる動物細胞分散用酵素と、植物細胞を処理するために用いるプロトプラスト調製用酵素とが含まれる。本発明に用いる細胞分散用酵素は、細胞間を結合している細胞間結合物質（例えば、タンパク質、核酸、糖類、若しくは脂質、又はそれらの複合体等）又は細胞壁などを分解し、細胞をばらばらにすることが可能な酵素である限り、特に限定されるものではない。
本発明に用いる動物細胞分散用酵素としては、例えば、コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エラシターゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、パパイン、バシルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｐｏｌｙｍｉｘａ）由来メタルプロテアーゼ（商品名ディスパーゼ；ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、又はマトリクスメタルプロテアーゼ等を挙げることができる。また、前記マトリクスメタルプロテアーゼとしては、例えば、間質コラゲナーゼ、好中球ラゲナーゼ、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢ、ストロメリシン１、ストロメリシン２、メトリリシン、ストロメリシン３、又はメタロエラスターゼ等を用いることができる。
【００１３】
本発明に用いるプロトプラスト調製用酵素としては、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、又はペクチンリアーゼ等を挙げることができる。
【００１４】
これらの細胞分散用酵素は、目的に応じて、単独で、あるいは、組み合わせて使用することができる。酵素濃度は、例えば、０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬの範囲で目的に応じて設定することができる。また、酵素反応温度は、各酵素の至適温度により、例えば、０℃〜５０℃の範囲で目的に応じて設定することができる。酵素反応時間は、例えば、１分間以上で目的に応じて設定することができるが、作業効率を考慮すれば、３０分間〜２時間程度が好ましい。酵素処理中は、目的に応じて、反応容器を静置及び／又は震盪することができる。
【００１５】
本発明に用いる膜可溶化用界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、又は陽イオン性界面活性剤を挙げることができる。本発明に用いる膜可溶化用界面活性剤は、細胞膜の可溶化により細胞を破壊することが可能な界面活性剤である限り、特に限定されるものではない。
前記非イオン性界面活性剤としては、例えば、
Ｎ，Ｎ−ビス  （３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）  コラミド［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ  （３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｃｈｏｌａｍｉｄｅ；商品名ＢＩＧＣＨＡＰ］、
Ｎ，Ｎ−ビス  （３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）  デオキシコラミド［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ  （３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ；商品名Ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ］、
ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （９）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ］、
オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ；商品名ＭＥＧＡ−８）、
ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ；商品名ＭＥＧＡ−９）、
デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｃａｍｉｄｅ；商品名ＭＥＧＡ−１０）、
ポリオキシエチレン  （８）オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （８）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４］、
ポリオキシエチレン  （９）  オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （９）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名ＮＰ−４０］、
ポリオキシエチレン  （１０）  オクチルフェニルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （１０）  Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ  Ｅｔｈｅｒ：商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノラウレート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ２０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノパルミテート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ４０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノステアレート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ６０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタンモノオレエート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；商品名Ｔｗｅｅｎ８０］、
ポリオキシエチレン  （２０）  ソルビタントリオレエート［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｔｒｉｏｌｅａｔｅ］、
ポリオキシエチレン  （２３）  ラウリルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２３）  Ｌａｕｒｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名Ｂｒｉｊ３５］、
ポリオキシエチレン  （２０）  セチルエーテル［Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  （２０）  Ｃｅｔｈｙｌ  Ｅｔｈｅｒ；商品名Ｂｒｉｊ５８）］、
ｎ−ドデシル−ベータ−Ｄ−マルトピラノシド（ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−ベータ−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−ヘプチル−ベータ−Ｄ−チオグルコピラノシド（ｎ−Ｈｅｐｔｙｌ−ベータ−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド（ｎ−Ｏｃｔｙｌ−ベータ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−チオグルコピラノシド（ｎ−Ｏｃｔｙｌ−ベータ−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、
ｎ−ノニル−ベータ−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−Ｎｏｎｙｌ−ベータ−Ｄ−ｔｈｉｏｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、
ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）、又は
サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎ）
等を用いることができる。
【００１６】
両性界面活性剤としては、例えば、
３−［（３−コラミドプロピル）  ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート［３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ；商品名ＣＨＡＰＳ］、又は
３−［（３−コラミドプロピル）  ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート［３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ；商品名ＣＨＡＰＳＯ］
等を用いることができる。
【００１７】
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、
ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、
ドデシル硫酸リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、
３，５−ジヨードサリチル酸リチウム（Ｌｉｔｈｉｕｍ  ３，５−Ｄｉｉｏｄｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、
ドデシル硫酸トリス［Ｔｒｉｓ  （ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ；Ｔｒｉｓ  ＤＳ］、
コール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｏｌａｔｅ）、
デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、
Ｎ−ラウロイルサルコシン（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、又は
Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔｅ）
等を用いることができる。
【００１８】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、
セチルジメチルエチルアンモニウムブロマイド（Ｃｅｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃｅｔｈｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、
セチルトリメチルアンモニウムクロライド（Ｃｅｔｈｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、又は
グアニジンチオシアネート（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）
等を用いることができる。
【００１９】
これらの界面活性剤は、目的に応じて、単独で、あるいは、組み合わせて使用することができる。界面活性剤濃度は、例えば、０．０１％〜５０％の範囲で目的に応じて設定することができる。また、反応温度は、０℃〜５０℃の範囲で目的に応じて設定することができる。界面活性剤処理時間は、例えば、１秒間以上で目的に応じて設定することができるが、作業効率を考慮すれば、３０秒間〜２分間程度が好ましい。界面活性剤処理中は、目的に応じて、反応容器を静置及び／又は震盪することができる。
【００２０】
酵素処理及び界面活性剤処理の両方の工程を終えた後、得られた抽出液をそのまま、組織抽出液とすることもできるし、あるいは、所望により、直ちに又は静置した後、適当な分離手段、例えば、遠心又は濾過することにより残査を除去し、組織抽出液を得ることができる。
【００２１】
また、界面活性剤処理に用いる溶液には、分析対象物の保護剤としてタンパク質分解酵素阻害剤を添加することもできる。本発明において用いることのできるタンパク質分解酵素阻害剤としては、例えば、大豆トリプシンインヒビター（ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＢＴＩ）、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＴＢ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）、ｐ−ヒドロキシメルクリ安息香酸（ＰＨＭＢ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、Ｎ−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニルメチルケトン（ＴＰＣＫ）、ロイコペプチン（ｌｅｕｋｏｐｅｐｔｉｎ）、ペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）、組織メタロプロテイナーゼインヒビター（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＴＩＰＭ）、ラージメタロプロテイナーゼインヒビター（ｌａｒｇｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＬＩＰＭ）、チキンメタロプロテイナーゼインヒビター（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＣｈＩＰＭ）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＰＡＩ）、プロテアーゼネキシン（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｎｅｘｉｎ；ＰＮ）等を挙げることができる。これらのタンパク質分解酵素阻害剤は、目的に応じて、単独で、あるいは、組み合わせて用いることができる。また、タンパク質分解酵素阻害剤濃度は、目的に応じて、例えば、０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上に設定することができるが、これに限定されるものではなく、目的に応じた濃度を設定することができる。
【００２２】
酵素処理及び界面活性剤処理に用いる反応容器としては、タンパク質抽出に一般に用いられる通常の反応容器、例えば、ガラス製チューブ又は合成樹脂製チューブ等を用いることができる。また、これらの容器の形状は、反応後、直ちに遠心操作を行うことができる形状であることが好ましい。また、取り扱い時の安全性を考慮し、密閉可能な容器を用いることが好ましい。
【００２３】
本発明の製造方法で得られた組織抽出液は、組織中タンパク質分析用試料として用いることができる。すなわち、本発明の製造方法は、組織中タンパク質分析用試料の製造方法でもある。本発明のタンパク質分析方法では、本発明の製造方法により得られた抽出液を被検試料として用いること以外は、分析対象の各タンパク質に応じた公知の分析方法により、分析対象タンパク質を分析することができる。この場合、目的に応じて、組織抽出液を直接測定することもできるし、あるいは、適切な緩衝液を用いて希釈し、測定することもできる。
【００２４】
本発明のタンパク質分析方法で分析可能なタンパク質としては、例えば、アルブミン、アルカリホスファターゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＤＰＤ、又はＴＳ等を挙げることができる。
【００２５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ブタ肝臓中のＤＰＤ測定》
（１）本発明方法によるブタ肝臓抽出液の調製
ブタ肝臓１ｇをハサミにより細切後、蓋の密閉が可能なタイプのチューブに移した。その後、０．０４ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ／２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）（ｐＨ７．４）溶液２ｍＬ、又は０．０４ｍｇ／ｍＬディスパーゼ／２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２ｍＬを添加し、３７℃で１００ｒｐｍにて１時間震盪した。その後、各々に対し、４％ＣＨＡＰＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２ｍＬを添加し、室温にて試験管ミキサーを用いて３０秒間撹拌した。その後、３０分間氷浴し、４℃及び１４０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより残査を除去し、ブタ肝臓抽出液を得た。
【００２６】
（２）比較用ブタ肝臓抽出液の調製
（２−１）ホモジナイザーを用いるブタ肝臓抽出液の調製
対照実験として、ホモジナイザー（ポリトロン）を用いてブタ肝臓抽出液を調製した。すなわち、ブタ肝臓１ｇをハサミにより細切後、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝生理食塩水（以下、ＴＢＳと略称する）（ｐＨ７．４）４ｍＬを添加し、抽出容器を氷冷しながらホモジナイザーを用いて１分間磨砕した。その後、４℃及び１４０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより残査を除去し、ブタ肝臓抽出液を得た。
【００２７】
（２−２）界面活性剤処理のみによるブタ肝臓抽出液の調製
対照実験として、界面活性剤処理のみにより、ブタ肝臓抽出液を調製した。すなわち、ブタ肝臓１ｇをハサミにより細切後、蓋の密閉が可能なタイプのチューブに移した。その後、４％ＣＨＡＰＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）４ｍＬを添加し、室温にて試験管ミキサーを用いて３０秒間撹拌した。その後、３０分間氷浴し、４℃及び１４０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより残査を除去し、ブタ肝臓抽出液を得た。
【００２８】
（３）ブタ肝臓抽出液中ＤＰＤのＥＬＩＳＡ法測定
（３−１）検体希釈液及び標準液の調製
先に調製した各ブタ肝臓抽出液を、２％ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、検体希釈液を調製した。また、ＭＩＡ  Ｐａｃａ細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４２０）抽出物を、２％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、標準液を調製した。
【００２９】
（３−２）ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートの調製
抗ＤＰＤウサギＩｇＧを定法によりペプシン消化し、抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２を調製した。５０ｍｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）を用いて調製した１０μｇ／ｍＬ抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２溶液を、９６穴マイクロタイタープレート（ＭＳ８６９６Ｆ；住友ベークライト）の各ウェルに１００μＬ／ウェルずつ分注し、４℃にて１晩静置した。その後、ウェル中の溶液を抜き取り、次いで、１％ＢＳＡを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２５０μＬ／ウェルずつ分注し、２５℃にて１時間静置し、ブロッキング操作を行うことにより、ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートを調製した。
【００３０】
（３−３）ＤＰＤ測定用酵素標識抗体の調製
抗ＤＰＤウサギＩｇＧを定法によりペプシン消化し、抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２を調製した。これとは別に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略称する）を化学修飾し、ＢＳＡと結合させることにより、ＨＲＰ−ＢＳＡ複合体を調製した。その後、抗ＤＰＤウサギＦ（ａｂ’）２を用いて定法にて抗ＤＰＤウサギＦａｂ‘断片を調製し、同時にＨＲＰ−ＢＳＡ複合体の化学修飾物を調製し、両者を結合することにより、ＤＰＤ測定用酵素標識抗体を調製した。更に、先に調製したＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートと組み合わせることにより、ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡ試薬を調製した。
【００３１】
（３−４）ブタ肝臓抽出液中ＤＰＤのＥＬＩＳＡ法による測定
先に調製したＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートのウェルに、検体希釈液又は標準液を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて１時間静置した。反応終了後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む生理食塩水３００μＬ／ウェルにて３回洗浄した。次いで、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び２０％正常ヤギ血清を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて調製したＤＰＤ測定用酵素標識抗体溶液（５μｇ／ｍＬ）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて１時間静置した。反応終了後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む生理食塩水３００μＬ／ウェルにて３回洗浄した。次いで、０．２６％オルトフェニレンジアミン二塩酸塩（以下、ＯＰＤと略称する）及び０．００６％過酸化水素を含む０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて３０分間静置した。反応終了後、０．０５ｍｏｌ／Ｌ硫酸水溶液を１００μＬ／ウェルずつ分注し、得られた４９０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。なお、検体希釈液中のＤＰＤ濃度は、標準液の測定値から算出した。
【００３２】
（４）ブタ肝臓抽出液中ＤＰＤのタンパク質濃度測定
先に調製した各ブタ肝臓抽出液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈し、検体希釈液を調製した。また、ＢＳＡを、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて適当な倍率に希釈することにより、標準液を調製した。
【００３３】
９６穴マイクロタイタープレート（ＭＳ８６９６Ｆ；住友ベークライト）のウェルに、市販のタンパク質アッセイ試薬（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ；ＰＩＥＲＥＣＥ社）を２００μＬ／ウェルずつ分注した。次いで、検体希釈液又は標準液を１０μＬ／ウェルずつ分注し、室温にて３０分間静置した。反応終了後、得られた６３０ｎｍの吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。なお、検体希釈液中のＤＰＤ濃度は、標準液の測定値から算出した。
【００３４】
（５）ブタ肝臓抽出液中ＤＰＤの測定結果
ブタ肝臓抽出液中ＤＰＤの測定結果を表１に示す。
表１に示すとおり、本発明方法を用いて調製したブタ肝臓抽出液中のＤＰＤ量を測定したところ、対照実験のブタ肝臓抽出液中のＤＰＤ量と、ほぼ同等の比活性値が得られた。また、タンパク質及びＤＰＤの抽出効率も、従来広く用いられている抽出法である対照実験に比べても、遜色ない結果が得られた。
【００３５】
2004313019.tif 000002
【００３６】
【実施例２】
《ヒト組織中のＤＰＤ測定》
（１）本発明方法によるヒト組織抽出液の調製
ヒト組織（肝臓、胃、肺、腸管、脾臓、及び膵臓）を２分割した後、一方の組織片をハサミを用いて細切後、蓋の密閉が可能なタイプのチューブに移した。なお、残る一方の組織片は、後述のとおり、ホモジナイザーを用いるヒト組織抽出液の調製に用いた。
その後、ヒト組織１ｇ当たり、０．０４ｍｇ／ｍＬディスパーゼ／２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２ｍＬを添加し、３７℃で１００ｒｐｍにて１時間震盪した。その後、４％ＣＨＡＰＳ及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２ｍＬを添加し、室温にて試験管ミキサーを用いて３０秒間撹拌した。その後、３０分間氷浴し、４℃及び１４０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより残査を除去し、ヒト組織抽出液を得た。
以下、ヒト肝臓抽出液を用いて各種測定を実施した結果を示すが、肝臓以外の組織抽出物についても同様の結果が得られた。
【００３７】
（２）ホモジナイザーを用いるヒト組織抽出液の調製
対照実験として、先に調製した残る一方のヒト組織片から、ホモジナイザー（ポリトロン）を用いてヒト組織抽出液を調製した。ヒト組織をハサミを用いて細切後、ヒト組織１ｇ当たり、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ及び０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＢＳ（ｐＨ７．４）４ｍＬを添加し、抽出容器を氷冷しながらホモジナイザーを用いて１分間磨砕した。その後、４℃及び１４０００ｒｐｍにて３０分間遠心することにより残査を除去し、ヒト組織抽出液を得た。
【００３８】
（３）ヒト組織抽出液中ＤＰＤのＥＬＩＳＡ法測定
（３−１）検体希釈液及び標準液の調製
ブタ肝臓抽出液の代わりに、ヒト組織抽出液を用いること以外は、実施例１（３−１）の操作を繰り返すことにより、検体希釈液及び標準液を調製した。
【００３９】
（３−２）ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートの調製
実施例１（３−２）の操作を繰り返すことにより、ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートを調製した。
【００４０】
（３−３）ＤＰＤ測定用酵素標識抗体の調製
実施例１（３−３）の操作を繰り返すことにより、ＤＰＤ測定用酵素標識抗体を調製した。更に、先に調製したＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡプレートと組み合わせることにより、ＤＰＤ測定用ＥＬＩＳＡ試薬を調製した。
【００４１】
（３−４）ヒト組織抽出液中ＤＰＤのＥＬＩＳＡ法による測定
実施例２（３−１）で調製した検体希釈液及び標準液を用いること以外は、実施例１（３−４）の操作を繰り返した。
【００４２】
（４）ヒト組織抽出液中ＤＰＤのタンパク質濃度測定
ブタ肝臓抽出液の代わりに、ヒト組織抽出液を用いること以外は、実施例１（４）の操作を繰り返した。
【００４３】
（５）ヒト組織抽出液中ＤＰＤの測定結果
ヒト組織抽出液中ＤＰＤの測定結果を図１に示す。なお、測定値の比較は、比活性値（ｎｇ／ｍｇ）にて行った。
【００４４】
図１に示す結果から、本発明方法を用いて調製したヒト組織抽出液中のＤＰＤ測定値（Ｙ）と、対照実験により調製したヒト組織抽出液中のＤＰＤ測定値（Ｘ）との間には、Ｙ＝１．０５Ｘ、Ｒ＝０．９２のとおり、良好な相関性が認められた。
【００４５】
【実施例３】
《ヒト組織中のアルブミン、アルカリホスファターゼ、ＧＯＴ、及びＧＰＴの測定》
（１）ヒト組織中のアルブミン量測定
先に調製したヒト組織抽出液を用いて、ヒト組織中のアルブミン量の測定を実施した。分析機器として、日立自動分析装置７１７０Ｓを、試薬としてイアトロファイン  ＡＬＢ（ヤトロン）を用いた。また、標準物として、ヒト血清を用いた。
まず、先に調製したヒト組織抽出液又は標準物（２μＬ）に対して、ＡＬＢ  Ｒ−１（２７０μＬ）を添加後、撹拌し、反応を開始した。１０分間の反応を行い、反応時間である１０分間を３４等分（３４ポイント）した、４ポイント目における、主波長６６０ｎｍ及び副波長７００ｎｍにて得られた吸光度を測定することにより、ヒト組織抽出液中のアルブミン量を測定した。
この測定の結果、本発明の製造方法を用いて調製したヒト組織抽出液中のアルブミン量と、ホモジナイザーを用いて調製したヒト組織抽出液中のアルブミン量との間には、良好な相関性が認められた。
【００４６】
（２）ヒト組織中のアルカリホスファターゼ量測定
先に調製したヒト組織抽出液を用いて、ヒト組織中のアルカリホスファターゼ量の測定を実施した。分析機器として、日立自動分析装置７１７０Ｓを、試薬としてイアトロＬＱ  ＡＬＰレート（ヤトロン）を用いた。また、標準物として、酵素キャリブレーター（ヤトロン）を用いた。
まず、先に調製したヒト組織抽出液又は標準物（２μＬ）に対して、ＡＬＰ  Ｒ−１（１６０μＬ）を添加後、撹拌し、５分間予備反応させた。次いで、ＡＬＰ  Ｒ−２（４０μＬ）を添加後、撹拌し、本反応を開始した。１０分間の本反応を行い、反応時間である１０分間を３４等分（３４ポイント）した、２１ポイント目から３４ポイント目における、主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにて得られた吸光度の変化量を測定することにより、ヒト組織抽出液中のアルカリホスファターゼ量を測定した。
この測定の結果、本発明の製造方法を用いて調製したヒト組織抽出液中のアルカリホスファターゼ量と、ホモジナイザーを用いて調製したヒト組織抽出液中のアルカリホスファターゼ量との間には、良好な相関性が認められた。
【００４７】
（３）ヒト組織中のＧＯＴ量測定
先に調製したヒト組織抽出液を用いて、ヒト組織中のＧＯＴ量の測定を実施した。分析機器として、日立自動分析装置７１７０Ｓを、試薬としてイアトロＬＱ  ＧＯＴレート（ヤトロン）を用いた。また、標準物として、酵素キャリブレーター（ヤトロン）を用いた。
まず、先に調製したヒト組織抽出液又は標準物（７．５μＬ）に対して、ＧＯＴ  Ｒ−１（１５０μＬ）を添加後、撹拌し、５分間予備反応させた。次いで、ＧＯＴ  Ｒ−２（５０μＬ）を添加後、撹拌し、本反応を開始した。１０分間の本反応を行い、反応時間である１０分間を３４等分（３４ポイント）した、２１ポイント目から３４ポイント目における、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍにて得られた吸光度の変化量を測定することにより、ヒト組織抽出液中のＧＯＴ量を測定した。
この測定の結果、本発明の製造方法を用いて調製したヒト組織抽出液中のＧＯＴ量と、ホモジナイザーを用いて調製したヒト組織抽出液中のＧＯＴ量との間には、良好な相関性が認められた。
【００４８】
（４）ヒト組織中のＧＰＴ量測定
試薬としてイアトロＬＱ  ＧＰＴレート（ヤトロン）を用いたこと以外は、前記（３）の操作を繰り返した。
この測定の結果、本発明の製造方法を用いて調製したヒト組織抽出液中のＧＰＴ量と、ホモジナイザーを用いて調製したヒト組織抽出液中のＧＰＴ量との間には、良好な相関性が認められた。
また、ＴＳについても、本発明の製造方法により調製した組織抽出液を用いた測定において、良好な結果が得られた。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、組織に対し、酵素処理及び界面活性剤処理を組み合わせることにより、組織から簡便且つ安全性の高いタンパク質抽出を行うことができる。また、従来の抽出法に比べても、遜色ない抽出効率のタンパク質抽出を行うことができる。更に本発明によれば、組織中のアルブミン量、アルカリホスファターゼ量、ＧＯＴ量、ＧＰＴ量、ＤＰＤ量、又はＴＳ量の測定に極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明方法を用いて調製したヒト組織抽出液中のＤＰＤ測定値（Ｙ）と、対照実験により調製したヒト組織抽出液中のＤＰＤ測定値（Ｘ）との相関を示すグラフである。
【図１】
2004313019.tif 000003