(57)【要約】　　　（修正有）【課題】　骨の減少や脆弱化を有意に抑制するリン酸ペプチドを提供する。さらに、該リン酸ペプチドを経口投与または皮経口投与することにより、骨の減少や脆弱化に関わるあらゆる症状を治療または予防する方法を提供することを課題とする。【解決手段】　本発明は、炭素および水素を含みリンを含まない第一モノマーユニットと、炭素、水素、およびリンを含む第二モノマーユニットとを含む、合成の非天然ポリマーであって、第二モノマーユニットが該ポリマーの30%以上を占める、2〜30のモノマーユニットを含むポリマー。【選択図】　図１
2004067687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素および水素を含みリンを含まない第一モノマーユニットと、炭素、水素、およびリンを含む第二モノマーユニットとを含む、合成の非天然ポリマーであって、第二モノマーユニットが該ポリマーの30%以上を占める、2〜30のモノマーユニットを含むポリマー。
【請求項２】
第二モノマーが下記の構造式からなる群より選択される、請求項１記載のポリマー：
2004067687.tif 000021
および
2004067687.tif 000022
式中、X、YおよびZは、それぞれ独立に炭素原子に共有結合する部分である。
【請求項３】
ポリマーが１つのポリペプチドであり、第一モノマーユニットが、天然のアミノ酸および下記の一般構造式（I'）で示されるアミノ酸残基からなる群より選択されるものであり：
2004067687.tif 000023
（式中、R１は炭素原子に共有結合する部分である）、
　第二モノマーユニットが、下記の一般構造式（II）で示されるアミノ酸残基であり：
2004067687.tif 000024
（式中、R２は下記の構造式からなる群より選択され、
2004067687.tif 000025
ここでXは、
2004067687.tif 000026
であり、
式中、R３は1〜7個の炭素原子を含むアルキルである）、
IとIIは同一でなく、（II）が少なくとも30%の量で存在し、該ポリペプチドが2〜30個のモノマーユニットを含むものである、請求項１記載のポリマー。
【請求項４】
R１が下記の式からなる群より選択される、請求項３記載のポリペプチド。
2004067687.tif 000027
【請求項５】
R２が
2004067687.tif 000028
であり、
第一モノマーユニットと第二モノマーユニットとが交互に存在し、ポリマーが2〜14個のモノマーユニットを含む、請求項４記載のポリペプチド。
【請求項６】
天然のアミノ酸および下記の一般構造式（I'）
2004067687.tif 000029
で示されるアミノ酸残基からなる群より選択されるユニット（I）と、
（b）（II）
2004067687.tif 000030
とを含む、骨の治療を目的とする合成性非天然ポリペプチド製剤。
【請求項７】
モノマーユニット（IまたはI'）と（II）とが交互に結合されており、少なくとも４個のモノマーユニットが存在する、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
薬学的に許容される担体と、
炭素および水素を含みリンを含まない第一モノマーユニット、ならびに炭素、水素、およびリンを含む第二モノマーユニットを含む合成性非天然ポリペプチドであって、第二モノマーユニットが該ポリマーの30%以上を占め、該ポリマーが2〜30個のモノマーユニットを含むものである治療的に有効な量の合成性非天然ポリペプチドとを含む、骨の治療を目的とする薬学的組成物。
【請求項９】
第一モノマーユニットが、天然のアミノ酸および下記の一般構造式（I'）で示されるアミノ酸残基からなる群より選択され：
2004067687.tif 000031
（式中、R１は炭素原子に共有結合する部分である）、
　第二モノマーユニットが、下記の一般構造式（II）で示されるアミノ酸残基であり：
2004067687.tif 000032
（式中R２は下記の式からなる群より選択され
2004067687.tif 000033
ここでXは、
2004067687.tif 000034
である）、
IIが少なくとも30%の量で存在し、該ポリペプチドが2〜30個のモノマーユニットを含むものである、請求項８記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明はリン酸化されたアミノ酸残基を高いパーセンテージで含む合成ポリぺプチド、及び骨の減少や脆弱化の予防又は治療に用いる、該合成ポリペプチドを含む薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　骨やカルシウム代謝の障害が健康に数多くの重大な問題を引き起こすことは世界中で実証されている。たとえば、合衆国だけでも骨粗鬆症、腎性骨形成異常症、ページェット氏病のような疾患に悩む患者が、それぞれ200万人、25万人、5万人以上おり、患者の発生率は増加する傾向が見られる。
【０００３】
　大多数の骨疾患の特長は、骨のミネラル（特にカルシウム）が失われ、骨が脆弱化し、そしてその結果として、骨折の頻度や症状の重篤度が増すことである。高齢者層では、骨折患者の多くは行動に弊害をきたし、それがたびたび他の精神的・肉体的機能を衰弱させ、その結果、老人性痴呆症、筋肉の衰え及び／または疲労につながることにより、大きな社会問題にもなっている。さらに股関節や骨盤の骨折の結果としておこる肺（動脈）塞栓症のような血栓症によって、精神的な不安や痛みがますます大きくなる。
【０００４】
　骨は基本的に基質タンパクとカルシウム塩から成る。骨の成長とは単に骨の大きさが増大するだけでなく、同時にその成分量が増加することも含まれている。骨を形成するそれらの物質が増加することによって、骨格全体と部分的な骨の力学的強度が決まる。骨減少の場合は、骨のサイズの減少よりもむしろこれらの成分含有量に著しい減少がよく見られる。これによって骨は力学的強度を失い、より頻繁にそしてより重度の骨折がおこることになる。
【０００５】
　以上に述べたように、力学的強度を持っていることは骨の主要な機能の一つである。言い換えれば、骨格は全身の体重と他の附随する力学的な荷重を支え得るだけの強さを備えていなければならない。したがって骨の大きさ（質量）と強度は常に全身の体重と相関していなくてはならない。骨の形成とカルシウムの貯蔵において、骨は全身と平行して成長する。ヒトでは35歳前後に骨量が最大となりこれを「最大骨量（peak bone mass）」と呼ぶ。最大骨量時には基質タンパクとカルシウムの量も最大になり、結果的には骨の力学的強度も最大となる。
【０００６】
　骨のミネラル含有量と骨密度が骨の力学的強度と相関関係にあることは広く認められている。35歳を過ぎると、骨量、ミネラル含有量、そしてそれに伴って力学的強度が徐々に下降し始める。その結果、力学的強度があるレベルまで下がると、その個体の骨折する危険性が大きくなる。この自然現象が病因となるほど深刻である場合、骨粗鬆症と呼ばれる。
【０００７】
　骨が減少する速度は個体によって、特に性別によって異なる。女性では、健全な骨代謝の維持に重要な役割をはたすホルモンであるエストロジェンの分泌が著しく減少することによって、骨の減少速度が閉経後に急に加速される(図1参照)。非常に多くの女性が閉経後におこる骨粗鬆症に悩まされているため、これは臨床上でも大きな問題となっている。女性の骨粗鬆症の患者が男性患者に対して３：１の比率であることは注目すべきことである。
【０００８】
　もうひとつの重要な骨の機能は、ほとんどの生体機能に重要な陽イオンであるカルシウムを貯蔵することである。哺乳類では、体液（血液など）中のカルシウム濃度は8.5〜11mg/dl（2.1〜2.8 mM）の範囲に保たれている。この水溶性カルシウムのレベルが通常の生体機能を維持するために重要なのである。骨に蓄えられた余分なカルシウムは、体液中のカルシウム濃度を適切に保つために必要に応じて利用される。カルシウム濃度が低くなり過ぎると、身体はまず十二指腸や小腸から食餌中のカルシウムを吸収しようとする。そして、それでもまだ足りなければ骨を溶かしてカルシウムを吸収する。
【０００９】
　食餌中のカルシウムは、主として腎臓で合成されるビタミンＤに刺激され吸収が促進される。腎不全でカルシウムが十分に摂取できない患者の場合、体は骨に蓄えられたカルシウムを使わなくてはならない。これにより、通常は急速な骨減少が起こり、これは腎性骨形成異常症(腎不全による二次的な骨粗鬆症）と呼ばれている。透析を受けているいないに関わらず、ほとんどの腎不全患者がこの症状に悩まされている。
【００１０】
　代謝的には、骨は分解（再吸収）と 再形成（再構築）を絶えず行っている、非常に活動的な器官である。再吸収は、単球／マクロファージ系から分化した破骨細胞によって促進される。破骨細胞が骨の表面に吸着し、酸 と酵素を分泌することによって骨の組織を分解する。骨芽細胞は破壊された骨組織に吸着し、骨基質タンパク(bone matrix protein)を分泌することによって骨の再形成を促進し、さらに骨細胞（Osteocyte）へと分化して骨組織の一部となる。骨の再形成は一生を通じて連続的に行われる。
【００１１】
　骨形成の促進または骨の再吸収を抑制するためにこれまで多くの実験的アプローチがなされてきた。たとえば、BMP(Bone Morphogenetic Protein)、TGF-β（Transforming Growth Factor）、IGF　(Insulin-like Growth Factor)などの因子は骨の形成に重要な役割を果たしていると考えられている。しかしながら、これらの因子は全身的な骨疾患のための治療薬としては開発されていない。さらに、これらの因子は経口で投与できない上に選択的に骨組織に運ばれるわけではないので、治療的用途には適していない。骨の形成と再吸収のプロセスは非常に密接に結び付いているので、どちらか一方の作用を増加させたり減少させたりするのは非常に困難である。
【００１２】
　タイプIコラーゲンは、骨基質タンパク質のほとんどの割合を占め、石灰質を除いた骨の約90％を占めている。タイプIコラーゲンは3つの非常に大きなタンパク鎖（分子量＞100,000）でできており、それらはハイドロキシプロリン(Hydroxyproline、Hyp) とハイドロキシリシン(hydroxylysine、Hyl)の 残基によって互いに架橋している。それ以外の骨基質タンパク質には、オステオカルシン(osteocalcin)、基質Glaタンパク質(Matrix Gla protein、MGP)、オステオネクチン(Osteonectin)、骨シアロタンパク質(Bone Sialoprotein、BSP)、オステオポンチン(Osteopontin)、プロテオグリカンProteoglycans(PG-I、PG-II)が含まれる。これらの基質タンパク質は、石灰質を除いた骨のおよそ10％を占めている。これら微量の基質タンパク質の機能は完全にはわかっていないが、ほとんどが 酸性タンパク質であることから、骨の石灰化及び／または脱石灰化の機能をもっていると考えられている。
【００１３】
　オステオカルシン(osteocalcin) (分子量=5,930）は、３つのGla（Gamma-Carboxyl Glutamic Acid） 残基を含む49のアミノ酸残基からなっている。このタンパク質は骨の総タンパク質量の１〜２％を構成している。これは、ビタミンＤ３に刺激された骨芽細胞によって産生される。また、これは酸性タンパクのひとつで、無機成分を除去した体液中に見られる。このタンパク質の機能は過剰な石灰化の抑制であると考えられている。(Mikuni-Takagaki et al., Journal of Bone and Mineral Research (1995) 10(2) :231-242)。
【００１４】
　基質Glaタンパク質は、５つのGla 残基を含む79のアミノ酸からなる。このタンパク質は、通常、脱塩基質(demineralized matrix)中に見られ、骨形成の開始においてある機能を持っていると考えられている。
【００１５】
　オステオネクチン(osteonectin)は、骨の非コラーゲン性基質タンパクの約20〜25％を占める糖タンパク（分子量=30,000）である。このタンパク質には２ケ所の N-グリコシル化部位があり、タイプIコラーゲンおよびハイドロキシアパタイトと結合する。またこのタンパク質はアスパラギン酸、グルタミン酸、２種類のリン酸化残基などの酸性残基を高い割合で含んでいる。このタンパク質は、骨の石灰化を促進する働きをもつカルシウム結合タンパク質であると考えられている。
【００１６】
　骨シアロタンパク質(Bone Sialoprotein、BSP)は高度にグリコシル化、硫酸化されたリン酸タンパク質(分子量=57,300)である。ハイドロキシアパタイトとの結合を可能にするポリグルタミン酸の連続配列(strech)を２つ有する。このタンパク質は RGD（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列をもっているので、細胞接着を媒介しているのではないかと考えられてきた。セリン、スレオニン、およびチロシンの、リン酸化、O-及びN-グリコシル化部位、ならびにチロシン硫酸化の可能性のある部位がこの分子上に多数存在している。BSP は骨形成部位にある分化した骨芽細胞で発現していることから、骨形成に重要な役割を果たしていると理論付けられている。 (Shapiro et al., Matrix　 (1993)　13(6) : 431 ) 。
【００１７】
　オステオポンチン(osteopontin)(分子量=44,000) は、ＮとＯの両方のグリコシル化部位を有するリン酸化糖タンパク質（シアロタンパク質）であり、石灰化された骨基質中に見られる。301のアミノ酸残基からなり、そのうちの13のアミノ酸はリン酸化された残基である。リン酸化残基のうち、12コはフォスフォセリン(Pse)で１つがフォスフォチロシン(Pty)である。これは細胞によって認識されると考えられているRGD配列を有する。この分子の正確な機能はまだ明らかではない。(Dodds et al.,　Journal of Bone and Mineral　Resarch (1995) 10 (2) : 231-242 )。
【００１８】
　骨にあるプロテオグリカン（proteoglycan）にはPG-IとPG-IIがあり、これらは コラーゲンの形成をコントロールすると考えられている。
【００１９】
　以上、骨基質は約90％のタイプIコラーゲンと10％の他の微量の機能性タンパク質で構成されている。これらのタンパク質（または糖タンパク質) は、酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸、グルタミン酸、およびγ−カルボキシグルタミン酸）を数多く含んでいるため、ほとんどが酸性である。さらに、リン酸化アミノ酸残基を多く含むいくつかのグリコシル化リンタンパク質も骨基質から分離されている。
【００２０】
　タイプIコラーゲンの石灰化における内因性リン酸化の潜在的機能については、これまでいくつかの学説が示されてきた。しかし、それらのリンタンパク質の比較的少数がコラーゲン基質に結合することが判明しているのに対し、リンタンパク質自体の生理学的な役割についてはまだはっきりしていない。
【００２１】
　インビトロの実験で、非常に低濃度でゼラチンに取り込まれたリンタンパク質が、石灰化プロセスの開始を促進するのが観察された(Bosky et al., Bone and Mineral (1990)　11:55-65)。溶液中では、リンタンパク質は非晶性リン酸カルシウムをハイドロキシアパタイトに転換する作用を促進する。(Nowrot et al ., Biochemistry (1976) 51:3445-3449)。しかし濃度が高い場合、溶液中のリンタンパク質は、基質を石灰化する上で重要な段階であると考えられているハイドロキシアパタイトの自然沈殿や培地での結晶成長を抑制する。 (Termine et al.,　Calcified Tissue Research (1976) 22:149-157; Udich et al., Biomed. Biochem. Acta. (1986) 45:701-711; Doi et al., Arch. Oral Biol., (1992) 37:15-21）。
【００２２】
　固定されたリンタンパク質が、それ自体が結合しているキャリア物質の石灰化を促進する可能性があることはこれまでに示されている。インビトロの実験で、セファロース・ビーズと共有結合した少量の象牙質リンタンパク質(dentinal phosphoproteins)または卵黄フォスビチン(egg yolk phosvitin)がミネラルの形成を誘導することが観察されている。( Lussi et al., Arch Oral Biol (1988) 33: 685 - 691; Linde et al., Calcif. Tissue Int. (1989) 44:286-295)。さらにリン酸基が、コラーゲン−リンタンパク質の複合体によるカルシウム−リンの固相の核化を進めるのに重要であることも示された。(Glimcher et al., Anat Rec (1989) 224 : 139-153)。しかしこの研究では、リンタンパク質とコラーゲンとの複合体の性質についての定義が不十分であり、実験の正確な条件などの情報も乏しかった。
【００２３】
　別の論文では、インビトロの実験で、コラーゲン基質に共有結合したリンタンパク質がコラーゲン基質の石灰化を促進することが報告された。このレポートが示唆しているのは、石灰化の速度が、結合した有機リン酸基の量および性質の両方に影響されるということである。(Van den bos et al., Bone and Mineral (1993) 23:81-93)。この研究で、研究者らは、ウシの骨の石灰化を促進する可能性のある物質として、それぞれ異なるリン酸化をしたラットの象牙質リンタンパク質だけを用い、何か特殊な化学構造がそれらの石灰化に関係しているとは推測しなかった。さらに、このグループが使用した 石灰化の分析システムには、通常 ex vivo の骨形成分析でよく使われる物質であるグリセロフォスフェート(glycerophosphate)が含まれていた。そのため、本当の石灰化作用がラットの象牙質リンタンパク質によって行われたのかグリセロフォスフェートによるものであるのかは明らかでない。
【００２４】
　コラーゲンの石灰化とリンタンパク質との関係における学説は、これまですべてインビトロの実験に基づくものであった。インビボの動物モデルでリンタンパク質またはリン酸化ペプチドを用いた研究はない。これは、リンタンパク質が骨の特定の部分現象を通して骨のミネラル化に影響を及ぼすということがこの分野における現在の考え方であることを示唆している。
【００２５】
　今のところ骨減少の効果的な治療法はない。エストロジェン、カルシトニン、ビタミンD、フッ素化合物、イプリフラボン、ビスフォスフォネート、その他いくつかあるような治療薬も、満足のいく治療法を提供するには至らなかった。(Gennari et al., Drug Saf. (1994) 11(3): 179-95)。
【００２６】
　エストロジェンとそのアナログは閉経後骨粗鬆症の患者によく投与される。エストロジェン置換療法は、閉経の直前または直後にエストロジェンを投与することを含む。しかし、ステロイドホルモンによくあるように、エストロジェンの長期間の使用には乳ガンやその他の婦人科系ガンのような重大な副作用が伴う。(Schneider et al., Int. J. fertil. Menopausal Study (1995) 40(1) : 40-53)。　カルシトニンは甲状腺で作られる内因性ホルモンで、受容体を通して破骨細胞と選択的に結合し、破骨細胞を不活性化させる。破骨細胞は骨組織を分解することのできる唯一の細胞なので、カルシトニンとの結合によって、破骨細胞による骨の分解を、阻害または遅延させることが可能である。しかしながら、破骨細胞は比較的すぐにこの薬に対して耐性ができてしまうため、この生物学的メカニズムは非常に短命である。そのためカルシトニンの使用は効果的な治療を提供するものではない。
【００２７】
　フッ素化合物をヒトに投与すると骨量を増やすことはこれまでに観察されている。しかし骨量は増えても力学的強度は大きくならない。したがって、骨量の見かけが増えるにも関わらず骨折の危険性はそのままである。(Fratzel et al., J. Bone Mineral Res. (1994) 9(10) :1541-1549)。さらにフッ素化合物の投与には、健康に大きな危険がある。
【００２８】
　イプリフラボンは、世界の限られた地域では骨粗鬆症の治療に使われてきた。しかしこの化合物の実際の効き目には疑問があり、骨疾患の治療物質として有用であると広く認められてはいない。
【００２９】
　ビスホスホネート(bisphosphonate)はピロリン酸の誘導体である。２つのリン原子の間にある酸素原子を炭素に置き換え、その炭素を色々な置換基で修飾することによって合成される。ビスホスホネートは骨吸収を抑制することが知られているが、またその一方で骨形成を抑えることもわかっている。さらに、ビスホスホネートは骨の表面に吸着して非常に長い間そこに留まり、骨組織の代謝回転を長期的に低下させる。骨組織は常に代謝回転される必要があるのでそれが低下するということは結果的に骨の劣化を引き起こす。(Lufkin et al., Osteoporos. Int. (1994) 4(6) : 320-322; Chapparel et al., J. Bone Miner. Res. (1995) 10(1) : 112-118)。
【００３０】
　以上に述べた物質に関してもうひとつ重要な問題は、フッ素化合物とイプリフラボン以外の物質は経口投与に適さないので、注射で投与しなければならない。骨疾患は慢性的であることが多く、長期間の治療が必要とされるので、治療に使われる物質は経口投与に適していることが重要である。
【発明の開示】
【００３１】
　要するに、骨の減少を予防もしくは治療できる、または、骨組織、ミネラル含有量、および力学的強度を維持もしくは増加させることができる、という治療薬に対する大きなニーズが存在する。さらに、経口で投与することが可能で長期間の使用に適し、かつ大きな副作用のない効果的な治療薬に対する大きなニーズも存在する。本発明者らは、インビボ の骨粗鬆症モデルにおいて、リン酸化アミノ酸残基を高いパーセンテージで含む合成ポリペプチドの経口または注射による投与によって、骨の減少を有意に抑え、骨強度を増加させうることを証明し、そのようなニーズを満たすことに成功した。 
【００３２】
発明の概要
　本発明は、リン酸化ペプチドのようなリンを含有する合成ポリマー化合物、及びそのような物質を含有する、骨の減少または脆弱化を伴うあらゆる症状の予防または治療に用いる製剤を提供する。本物質は、骨の損傷治癒、成長、または再形成にも有用である。この治療の方法論は、インビボの骨粗鬆症モデル実験で、合成された非天然リン酸化ペプチドの経口または注射による投与が骨の減少を抑え、骨強度を著しく増加させる事実の発見に基づいている。
【００３３】
　本発明は、多くのリン酸含有基を含む合成ポリマーの製造に基づく。より具体的には、本発明は、リンを含有するモノマーユニットを３０%以上、好ましくは４０%以上、より好ましくは約５０%含む合成の非天然ポリマーを使用する。このリン酸含有基は、ポリマー鎖の中に含まれていてもよく、ポリマー鎖から分枝していてもよく、及び／または鎖の先端に位置していてもよい。該ポリマーに含まれていてもよいリンを含むモノマーユニットには以下の構造が含まれる：
2004067687.tif 000003
または
2004067687.tif 000004
式中、Ｘ、Ｙ及びＺは、炭素に共有結合するいかなる原子又は残基でもよい。
【００３４】
　本発明における好ましいポリマーは、以下の群より選択されたモノマーユニットからなるポリペプチドを意味する：
　　(a)すべての天然型アミノ酸、及び下記の一般構造式（I'）で示されるアミノ酸残基からなる群より選択されたユニット（I）：
2004067687.tif 000005
　　式中、Ｒ１は炭素原子と結合可能なすべての成分、ならびに
　　　(b)　下記の一般構造式(II）で示されるアミノ酸残基：
2004067687.tif 000006
　　式中Ｒ２は以下の群より選択される
2004067687.tif 000007
　　式中Ｘは、
2004067687.tif 000008
さらに、ここでいうＲ３は１〜７の炭素原子をもつアルキルで、このアルキルは直鎖状、分枝鎖状、または環状のいずれでもよく、IとIIは同一でなく、IIは少なくとも３０％の量で存在しており、このポリペプチドは２〜30のモノマーユニットからなる。より好ましくは、このポリマーは、IとIIのモノマーユニットが交互に配列されている。そのようなポリマーは、５０％のリン酸含有モノマーユニットを含み、骨の損傷治癒、強化、または成長もしくは再形成用に処方され、投与することができる。
【００３５】
　本発明の一つの態様は、すべての天然型アミノ酸および上記の一般構造式（I'）で示されたアミノ酸残基からなる群より選択されるユニット（I）を構成成分とし、Ｒ１が以下の物質からなる群より選択される合成ポリペプチドである：
2004067687.tif 000009
2004067687.tif 000010
【００３６】
　本発明のもうひとつの態様は、すべての天然型アミノ酸および一般構造式（I'）：
2004067687.tif 000011
で示されるアミノ酸残基からなる群より選択されるユニット（I）と、
（ｂ）ユニット（II）
2004067687.tif 000012
とを含む合成された非天然ポリペプチドであり、好ましくはユニットIIを３０%以上含むものである。
【００３７】
　もう一つの局面において、本発明は、骨の減少または脆弱化を伴うすべての症状の治療または予防に有用な、このような合成ポリマーの製剤を目的とする。該製剤は、薬学的に許容される担体と、天然型アミノ酸の鎖からなる合成ポリマーとを含むものであり、該鎖は、その中に、構造式III：
2004067687.tif 000013
の化合物を含有する。
【００３８】
　式中、Ｒ２は上記に定義したとおりで、ｎは１〜30の整数である。この製剤は、骨の減少もしくは脆弱化の治療もしくは予防、及び／又は損傷治癒、骨の成長もしくは再形成をfacilitateするのに有効な量で投与される。
【００３９】
　さらにまた別の局面として、本発明は、骨の減少または脆弱の治療または予防に用いる薬学的組成物に目的とするものでもあり、該組成物は、骨の減少や脆弱の治療または予防に充分な量のポリペプチドまたは上記に示した化合物IIIを含んでおり、薬学的に許容される賦形剤と混合したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の実施の形態
　本発明の化合物と治療方法を述べる前に、本発明が、本明細書で述べられている特定の化合物、用法または製剤は当然変更が可能であるため、本発明はこれらに限定されないことと理解されたい。さらに、明細書で使用される用語は、特定の具体例のみを記述する目的のものであり、添付の請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限するものではないことを理解されたい。
【００４１】
　あらかじめ注記しておくが、明細書および添付の請求の範囲で使用されている単数を表す"a"、"an"および"the"は、文中に特に明記していなければ複数表現の意味も含む。従って、たとえば、"ひとつの剤型"（a formulation）という表現には、異なる剤型（formulation）の混合物も含まれ、"ひとつのアッセイ"（an　assay）という表現には、１つもしくはそれ以上のアッセイが含まれ、"検出の方法"という表現には、手順や方法が含まれる、などである。
【００４２】
　特に明記しない場合、明細書で使用されるすべての技術・科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者が通常理解しているのと同じ意味を持つ。明細書中に述べたのと同様または等価な方法および材料はすべて、本発明を実施または試験する場合に使用できるが、好ましい方法および材料はこれから述べる。本明細書中に引用した出版物はすべて、その文献の出典がどこにあるか、何に関連しているかなどの特定の情報を記述し、開示するために参考として明細書中に組み入れられる。
【００４３】
　本明細書中に記載のは、それらが本特許出願の出願日より前に公開されていることを示しているだけにとどまる。本明細書のいかなる開示も、先行発明に基づいて、本開示が成された日付を早める権利が本発明者にはないと自認したと解釈されるべきではない。
【００４４】
定義
　「合成ポリマー」、「合成非天然型ポリマー」、及びこれらに類似の用語は、天然に存在しないモノマーユニットをつなげることにより、及び／又は、ユニットを天然に存在しない形で結合させることにより化学合成された（即ち天然物から抽出されたものではない)、本発明のポリマーを述べるため、本明細書中において互換性をもって使用される。本発明の合成ポリマーは、３０％以上の量のリン含有ユニットを含み、それは概して天然に見られる割合を上回る。
【００４５】
　「治療」、「治療すること」、「治療する」及び類似の用語は、概して本明細書中においては、望ましい薬理学的及び/又は生理学的効果を得ることを意味して用いられる。効果とは、ある疾患や症状を（特に骨の減少を）完全にもしくは部分的に防ぐという意味あいでの予防的効果でもよく、及び／または、疾病及び／もしくはその疾病に起因する悪弊を部分的もしくは完全に治癒するという意味あいでの治療効果でもよい。本明細書で用いられる「治療」という用語は、哺乳類、特にヒトにおける疾病のいかなる治療をもカバーするものであり、次のものを含む：
　(a)　ある疾病または症状が発生する可能性が予見されているが、まだそうと診断されていない個体において、該疾病又は症状が発生するのを予防すること（たとえば骨減少を予防すること）、
　(b)　疾病の症状を阻害すること、即ちその進展を止めること(たとえば骨減少の進行を止めること)、
　(c)　疾病による症状をなくすこと、つまり疾病又は症状を寛解すること(たとえば骨減少の速度を遅くすること)。治療とは、骨を強化すること、新しい骨の成長及び骨の再形成を起こすことを含む。治療の結果、好ましくは、該治療が施されなかった場合に比べて骨が強化される。
【００４６】
　「骨減少」という用語は、骨量、内容物、基質、またはカルシウムのような骨を構成するいずれかの成分が減少または脆弱化するあらゆる状態を意味する。
【００４７】
　骨粗鬆症という用語は、様々な原因、特に骨塩の減少、閉経前後のエストロジェンの減少、病気または神経損傷などの原因で、骨量または成分の減少があらわれるすべての症状を意味するものとする。
【００４８】
　「患者」（Subject）という用語はヒトを含むすべての哺乳動物を意味する。
【００４９】
　本発明で請求の範囲とされるポリペプチドは、直鎖状または環状のペプチドであり、
　(a) 天然型アミノ酸と下記の一般構造式（I'）のアミノ酸残基からなる群より選択されるユニット（I）：
2004067687.tif 000014
　　（式中Ｒ１は、炭素原子と結合可能なすべての成分）と
　（ｂ）下記の一般構造式（II）のアミノ酸残基
2004067687.tif 000015
であって、Ｒ２が下記の群より選択され、
2004067687.tif 000016
式中Ｘが
2004067687.tif 000017
であり、さらに、Ｒ３が１〜７個の炭素原子を含むアルキルで、直鎖状、分枝鎖状、または環状のいずれであってもよいアルキルであるユニット（II）とを含むモノマーユニットからなるポリペプチドであって、IはIIと同一ではなく、IIは少なくともポリペプチドに３０％以上含まれており、かつ該ポリペプチドは２〜30のモノマーユニットを含む。該ポリペプチド鎖は、直鎖状でも環状でもよい。IとIIとが交互に現れるユニットの直鎖状が好ましい。
【００５０】
　このポリペプチドに含まれるアミノ酸はＤ体あるいはＬ体のどちらでもよいが、天然に存在するL体であることが好ましい。
【００５１】
　ひとつの態様において、モノマーユニット（I）は天然型アミノ酸で、その結果モノマーユニット（I'）のＲ１は、（I'）がアラニン(alanine)、システイン(cystein)、アスパラギン酸(asparatic acid)、グルタミン酸(gultamic acid)、フェニルアラニン(phenylalanine)、グリシン(glycine)、ヒスチジン(histidine)、イソロイシン(iso - leucine)、リジン(lysine)、ロイシン(leucine)、メチオニン(methionine)、グルタミン(glutamine)、プロリン(proline)、アルギニン(arginine)、セリン(serine)、スレオニン(threonine)、バリン(valine)、チロシン(tyrosine)、トリプトファン(tryptophan)、アスパラギン(asparagine)、オルニチン(ornithine)、およびγ−カルボキシルグルタミン酸(γ-carboxyl glutamic acid)と定義される。より好ましいＲ１は、（I'）がグリシン、アラニン、またはセリンで、最も好ましくはグリシンである。
【００５２】
　別の態様において、モノマーユニット(II）は、フォスフォセリン、フォスフォスレオニン、またはフォスフォチロシンであり、最も好ましくはフォスフォセリンである。
【００５３】
　別の態様において、ポリペプチドに含まれるモノマーユニットの数が少なくとも２以上30未満で、より好ましくは、４〜14ユニットである。
【００５４】
　別の態様において、モノマーのユニット（II）、すなわちリン酸化されたアミノ酸が、このポリペプチドに少なくとも50％以上含まれていることが好ましい。
【００５５】
　最も広く述べれば、本発明は、リンを含むモノマーユニットを３０%以上含むすべてのポリマーである。リンを含むユニットよりなる天然型のポリマーは、一般的に、そのようなユニットを３０%未満しか含まない。そのようなポリマーが骨の治療に用いられる場合、該ポリマー中のリンの量が増加するにしたがって効果も増す。
【００５６】
　リンは、モノマーユニットの中にどのような形で存在してもよく、モノマーユニットはポリマーの中にどのような形で含まれてもよい。ポリマーは、好ましくは炭化水素骨格を持ち上記のＸのような形でリンを有する。
【００５７】
　リンを含むモノマーユニットは、ポリマー鎖の中に存在してもよく、ポリマー鎖から分枝していてもよく、及び/又は鎖の末端に位置していてもよい。本発明のポリマーを構成できるリン含有ノマーユニットには以下のものが含まれる：
2004067687.tif 000018
または
2004067687.tif 000019
式中、Ｘ、Ｙ、およびＺは、水素および炭化水素を含む、それぞれ独立に炭素原子に共有結合できる部分である。
【００５８】
製造法
　本発明の合成、非天然型ポリペプチドは、当技術分野で一般的に行われている通常のペプチド合成法によって調製することができる。たとえば次の方法を用いることができる。
【００５９】
　繰り返し配列型のペプチドの合成に必要な保護基をつけたジペプチドを、液相法を用いて調製する。H-Gly-Merrifield 樹脂をBoc - Ser(OPO3Me2)-OHにカップリングさせた後、TFAによってBocをはずして得られた、H-Ser(OPO3Me2 )-Gly-Mrrifield 樹脂に、DCC-HOBtを用いて、保護基をつけたジペプチドをカップリングさせることにより、保護基のついたペプチド樹脂調製物が得られる。保護基をはずした粗精製ペプチドは、完全に保護されたペプチド樹脂 (Boc-(Ser(OPO3Me2)-Gly)n-Merrifield 樹脂、n＞1,　好ましくは、n=2〜7)を、強酸(1M TMSOTf-チオアニソール（thioanisole）を含むTFA溶液, m-クレゾール（cresol）, EDT)と弱酸(1M TMSOTf-チオアニソール（thioanisole）を含むTFA溶液, m-クレゾール（cresol）, EDT + 添加物(TMSOTf + DMS)) の2段階の処理で保護基を除去することによって製造される。純粋なペプチドはこの粗精製ペプチドを、HPLCで精製することによって得られる。こうして合成されたペプチドはイオンスプレー式質量測定(ion- spray mass spectrometry)によって構造を確認する。
【００６０】
　リン酸化アミノ酸を含めて14個以上のアミノ酸からなる長いポリペプチドを調製するには、組換えDNA法と酵素合成法または有機合成法などとの組み合わせがより適していると考えられる。
【００６１】
　たとえばこのポリペプチドは、まず、基本的なポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子によって型質転換された細胞株を培養することにより製造できる。細胞培養で該ポリペプチドを製造した後、適切なアミノ酸のヒドロキシル基を有機合成法、またはキナーゼのようなリン酸化酵素を使った酵素合成法などを用いてリン酸基に置き換える。特殊なリン酸基であるセリンの場合には、セリンキナーゼのようなより特殊な酵素を用いることができる。
【００６２】
処方
　本発明に係るリン酸化ペプチド化合物などの本発明の化合物は、通常このような物質を投与する時に使われる手法で投与されるよう処方される。典型的な処方は 「レミントンの製薬化学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」(Mack Publishing Company, Easton, PA.) の最新刊に記載されている。このような製剤に含まれる有効成分の割合は0.1％〜99％で、担体の割合は1.0〜99.9％である。各成分の含有比の範囲を広く設けたひとつの理由は、先に述べたタイプの化合物の溶解度が高いためである。リン酸化ペプチドは、好ましくは、経口または、筋肉、静脈、皮下、または腹膜経路の注射で投与される。しかし経粘膜製剤、または経皮製剤のように、この化合物を全身循環に入れることができるならば、座剤、貼布剤、または鼻腔内投与など、それ以外の投与法も使用することができる。さらに脳脊髄注射、または骨や骨折部位に直接注射するといった、局所投与も用いることができる。本化合物が血流に入ったり、または局所的に骨に運ばれるのであれば、当然それに適した製剤はすべて使用することができる。
【００６３】
　注射用に適した製剤には、一般的に、生理食塩水、ハンクス液、または安定化剤もしくは他の微量成分を随意に含むその他の緩衝液などを用いた水溶液または懸濁液が含まれる。リポソーム製剤やそれ以外の乳化剤(microemulsion)も用いることができる。この化合物を凍結乾燥して供給し、投与の際に水溶液化することも可能である。経粘膜製剤または経皮製剤として用いる製剤の場合は一般的に、胆汁酸塩、フシジン酸およびその類似体、各種洗浄剤などのような、粘膜または皮膚の関門の通過を容易にする物質が含まれる。
【００６４】
　経口投与に適した賦形剤は、タルク及び／又は炭水化物の担体結合体などを含む錠剤、糖衣剤、またはカプセルで、担体は、好ましくは、ラクトース及び/又はトウモロコシデンプン及び／又はイモデンプンである。シロップ、エリキシル剤などのような物質も甘味を付けるのに用いることができる。成分が一様に溶け出すようにするには、それぞれ異なる分解をするコーティング剤、たとえばマイクロカプセルや多層コートなどで活性成分を保護することによって処方することができる。
【００６５】
　本発明の化合物（たとえばポリペプチド）は、概して水溶性が高いため、経口、注射、または経粘膜投与に用いる水剤として処方することが容易である。溶解度はひとつのポリペプチド分子に含まれるリン酸化残基の数に応じて高くなる。水剤の水溶性と安定性は、多くのペプチド薬を投与する際にはよく大きな問題のひとつとされる。本発明のポリペプチドによりこの点に関してかなりの利点が提供される。
【００６６】
　製剤の性質はある程度は選択された化合物の性質により、適切な製剤は、周知の技術や当業者に周知の処方の原理を用いて調製される。
【００６７】
投与量
　適当な投与量も、治療する患者の性質（年令、性別、体重、など）、治療すべき症状の特性と症状の重篤度、有効成分として使用する特定の化合物、投与方法、製剤、医師の判断など数多くの要素によって変わってくる。一般的には、１回の投与につき100μg/Kg〜50mg/Kg、好ましくは10mg/ Kg〜20mg/Kgの範囲である。上記に述べた応用範囲を斟酌して決められたプロトコルに従って、繰り返しの投与が要求されることもある。典型的には限られた日数内で毎日投与されることか、または静脈を通じての投与が連続して行なわれることである。慢性化した症状には必要に応じてより長期間投与を続けることがある。
【００６８】
　本発明の化合物（たとえばポリペプチド）の投与によって恩恵を受ける患者は、原因が何であれ骨の減少や脆弱化が見られ、骨の強化、損傷治癒、再形成または骨の新成長を必要とする患者である。特に治療に効果があがると思われる症状には、骨粗鬆症、腎性骨形成異常症、骨軟化症、その他の原因による骨形成異常症、ページェット病、またはガンによって引き起こされる骨溶解、および骨折などがあるが、それだけに限定されるわけではない。患者は好ましくはヒトであるが、それ以外のすべての哺乳類も含まれる。
【００６９】
　本発明の方法によって反応が得られるような症状をもつ患者は、簡単に診断することができる。いくつかのケースでは疾病そのものの性質が診断に役に立つ。骨粗鬆症、骨軟化症、腎性骨形成異常症、およびページェット氏病などの内因性的な骨溶解症状は、慣習的に診断できる。大抵の骨溶解は、Ｘ線スキャンを使って骨の障害の存在を確認することによって確かめることができる。患者は好ましくはヒトであり、それ以外のすべての哺乳類も含まれる。このようにさまざまな診断基準によって、本発明の方法により治療可能な特殊な症候群を呈する患者を特定することができる。
【００７０】
　全身投与または直接的な塗布によって本発明の化合物を効果的に投与すれば、ミネラル（カルシウムとリン）および有機基質の含有量、骨の力学的強度は増加される。骨折または骨の破損のケースでは治癒が促進される。骨の損傷治癒、再形成、あるいは成長の過程においては、本発明の化合物を用いない場合に比べて、用いた場合は、より強い骨が形成される。
【００７１】
　実施例１に示されているように、卵巣を摘出したラットの骨粗鬆症モデルの実験で、ミネラルと有機基質の含有量、および骨の力学的強度がこれらのポリペプチドによって有意に上昇した。この効果は、経口投与でも非経口投与でも観察された。ひとつの実験グループに、50％のO-ホスホセリンを含む14個のアミノ酸の直鎖状ペプチドを経口で低投与（一匹につき１日あたり50μｇ）したところ、有意な効果があった。このような大きなペプチドを経口で投与でき、インビボの実験で骨に優れた効果があったのは、予期せぬ発見であった。また、このグループの骨の力学的強度が陽性対照群と同じくらい高かったことも予期せぬことであった。結果的に、このような低投与のポリペプチドで好結果が得られるとは予測していなかった。
【００７２】
　90日間の治療期間中に、本発明者らはいかなる毒性もそれ以外の副作用も、局所もしくは全身の健康に関する障害も観察しなかった。毒性や副作用がないことは、本発明のポリペプチドにより提供された重要な利点であり、慢性疾患に必要とされる長期にわたる投与には特に重要なことである。さらに、皮下の注射部位に石灰化または他のいかなる組織学的問題の痕跡も見られなかった。骨の成長を高める他の化合物は軟組織を石灰化またはミネラル化する原因となることがあるため、これも優れている点である。たとえば、骨形態発生タンパク質は軟組織に著しい石灰化を起こすので、このような化合物は骨に直接塗布する場合にのみ適している。
【００７３】
作用機構
　これらの化合物（たとえばポリペプチド）の作用機構は完全にわかっているわけではない。本発明者らによる他の研究で、代表的なインビトロまたはエクスビボによる骨形成と再吸収の解析系において、O-フォスフォセリンを含むポリペプチドとO-フォスフォセリンの単体のどちらも、骨に対していかなる生物学的効果も及ぼさなかった。この実験結果は、これらのポリペプチドが骨芽細胞または破骨細胞のどちらにも作用しないことを示唆している。これらのペプチドは体液（血清、骨髄液など）に溶け込んでいるカルシウムを引きつけて、骨の形成を高めていると考えられる。さらにこれらのペプチドは、骨の基質タンパク質の上または間にハイドロキシアパタイトを形成することによって、骨の基質タンパクの形成または架橋に影響を与えているのかもしれない。
【００７４】
　本明細書で述べられている治療によって得られる利益は明らかである。この化合物に骨の減少や脆弱化を抑える直接的効果があるということに加えて、さらに骨の減少や脆弱化に対する二次的効果についても明記することができる。つまり、骨の減少または脆弱化を呈する患者には、骨が破壊されることによって二次的に高カルシウム血症が現われることがある。骨溶解の結果として折れたり弱くなった骨は、すぐそばにある神経伝達機能を圧迫し、最終的には全身麻痺や局所麻痺を起こすことがある。病原性骨折（Pathological Fracture）が起こる危険性は明らかであり、悪液質もしばしば起こる可能性がある。さらに骨の破壊は必然的に痛みを伴うものである。これらのことはすべて、直接的または間接的に予後の生存率を低下させる。骨の減少や脆弱化を予防または治療することで、このような好ましくない影響を緩和することができる。
【実施例】
【００７５】
　次に挙げる実施例は、当業者が本発明の方法を実施でき、本発明の化合物を利用できるよう、その完全な方法を開示し記述する目的で提供するもので、本発明の範囲を制限するものではない。使用されている数字（量など）については正確性を期したが、いくつかの実験上の誤差や偏差があることは考慮にいれておくべきである。特に示されていない場合、割合は重量による割合、分子量は分子量の平均値、温度は摂氏で、気圧は大気圧もしくはそれに近い気圧である。
【００７６】
実施例１
骨粗鬆症モデル動物における骨減少の予防
実験材料と方法
　O-フォスフォセリン含有ポリペプチドの効果を研究するため卵巣摘出ラットを選択した。若い雌のHarlan-Sprague-Dawlyラットから外科手術で卵巣を切除した。陽性対照群として偽手術(sham-operated)を施したラットも調製した。
【００７７】
　７日間の適合期間の後、卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットを無作為に各治療群（各群６匹ずつ）に分けた。６匹の偽手術ラットは陽性対照群に入れた。各群とも実験期間中は普通のラット用食餌を与えたが、それぞれ下記に示したような異なる治療を施した。
2004067687.tif 000020
　３、４、５、及び６群の４つのグループの被験試料は、生理食塩水に溶かし、一度に投与した。サンプル溶液の総量は、各１匹に対してそれぞれ経口で１ml、非経口投与で0.1mlを投与した。経口試料は１日に１回投与し、皮下注射(s.c.)は３日おきに行なった。
【００７８】
　皮下投与に際しては各動物の背中の異なる２箇所の注射部位に交互に注射した。実験終了日（90日目）にそれらの注射部位を切除し、組織学的に検査して石灰化が起こっているかどうかを確認した。
【００７９】
　最も大量の経口Pseを投与したグループ（３群）は、PseモノマーとPse含有ポリペプチドとの効果を比較するのに用いられた。
【００８０】
　治療開始から０、45、90日目に、実験に使用した動物の大腿骨を、骨の成長状態を調べる代表的な方法であるＤＥＸＡ(dual energy X-ray absorptiometry)にかけて測定した。ＤＥＸＡスキャンを施す際は動物に麻酔をかけベッドに固定した。90日目にＤＥＸＡで測定した後、さらに死後の測定を行なうためにいくつかのグループを選択して、動物を放血によって安楽死させた。
【００８１】
　安楽死の前に視診によって皮下注射部位における石灰化の有無を調べた。その後、組織病理学検査のためすべての皮下注射部位とその下にある骨格筋組織を採取した。
【００８２】
　動物の大腿骨を採取して軟組織を除去した。左大腿骨は骨の成分分析に供した。はじめに、取り出した大腿骨を水分がなくなるまでゆっくりと乾燥させ、乾燥重量を計測した。次にその大腿骨を灰にし、灰重量を測定した。灰に含まれるカルシウムとリンの量は、原子吸光分析法を用いて定量した。
【００８３】
　各動物の右大腿骨には骨の力学的強度実験(三点折り曲げ試験)を施した。取り出した大腿骨を装置に乗せ、長骨の２箇所の独立した点で支えた。２つの支点の中央に、骨がたわむ方向にそって荷重をかけた。骨にかけた荷重の大きさ（単位：ニュートン：Ｎ）と、荷重前のもとの位置から荷重後に湾曲した骨の位置までの変位（単位：mm)を測定した。荷重の価を、骨の荷重によるひずみ（荷重−変位）に対してプロットした。
【００８４】
　荷重-変異曲線の最初の直線部分の２点は、測定時に測定者によって選ばれた。２点間に直線が引かれ、その傾きは骨の初期強度を表している。次に、実際にかかった荷重が引かれた直線上の同じ変位から予測された荷重を５％越えた点を降伏点（yield point）として算出した。平均強度は、原点と最大の荷重点を結んだ直線の傾きとして計算した。
【００８５】
結果
　図３に示すように、３、4、５、６群の骨ミネラル含有量（ＢＭＣ）を45日目にＤＥＸＡで測定したところ、陽性対照群（１群）と陰性対照群（２群）との間の範囲に収まった。Pse単体群（３群）と(Pse-Gly)3 群（４群）のＢＭＣが陰性対照群に近かったのに対して、( Pse - Gly )6 群（５群）と(Pse-Gly)7 群（６群）のＢＭＣは陽性対照群とほぼ同じであった。一つの分子により多くのPseを含むポリペプチドが骨の成長促進において優れていた。90日目では、(Pse-Gly)3 群（４群）のＢＭＣと、それよりも長いポリペプチド鎖のグループ（6群）のＢＭＣは同じであった（図４参照）。図５は0から90日目の実験期間を通して、骨ミネラル含有量の変化をＤＥＸＡで測定し示したものである。(Pse-Gly)6 群を除いたすべてのグループにおいて、実験期間を通してミネラルの増加が認められた。
【００８６】
　さらに死後の検査を行なうために1、2、４、６群を選択した。図６と７は各群の動物の大腿骨の乾燥重量と灰重量をそれぞれ表している。(Pse-gly)3 群（4群）と(Pse-Gly)7 群（6群）における骨の乾燥重量と灰重量のどちらも陰性対照群（2群）より有意に高く、陽性対照群（1群）と比べても同じかそれ以上であった。より多くのPseを含むより長いポリペプチドは、これらの分析試験においても優れた活性を示した。
【００８７】
　図８と９はラットの大腿骨のカルシウムとリンの含有量を表している。結果は図６や７に示したデータと同様である。
【００８８】
　図10と11はそれぞれ骨の初期強度と全体強度を表している。これらのデータは(Pse-Gly)3 群（4群）と(Pse-Gly)7 群（6群）が大腿骨の力学的強度において、陽性対照群（1群）と同一であったことを示唆している。
【００８９】
　この実験に使用したすべての動物は90日間の実験期間中きわめて健康状態が良く、いかなる合併症、毒性、またはその他の副作用も見られなかった。
【００９０】
　本発明は、最も実践的で好ましい態様と考えられる形で本明細書に示し記載されている。しかし、それらから成される改変も本発明の範囲内であり、本開示を読むことにより当業者には明らかな改変が思いつくであろうことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、年令と骨量との関係を表す。
【図２】図２は、Ｏ−フォスフォセリンの化学構造を示す。
【図３】図３は、骨粗鬆症動物モデルのそれぞれのグループのすべての動物の平均骨ミネラル含有量を、45日目のDEXA (dual energy x-ray absorptiometry)による測定値として示したものである。
【図４】図４は、それぞれのグループのすべての動物の平均骨ミネラル含有量を、90日目のDEXAによる測定値として示したものである。
【図５】図５は、それぞれのグループの動物の骨ミネラル含有量の経時変化を、0日目、45日目、90日目のDEXAによる測定値として示したものである。
【図６】図６は、それぞれのグループのすべての動物の、90日目における右大腿骨の平均乾燥重量を示したものである。
【図７】図７は、それぞれのグループのすべての動物の右大腿骨の平均灰重量の、90日目の測定値を示したものである。
【図８】図８は、それぞれのグループのすべての動物の大腿骨のカルシウム含有量の、90日目の測定値を示したものである。
【図９】図９は、それぞれのグループのすべての動物の大腿骨のリン含有量の、90日目の測定値を示したものである。
【図１０】図10は、それぞれのグループのすべての動物の大腿骨に対する三点折り曲げ力学的強度試験における、骨折り曲げ初期強度の平均値を、90日目の測定値として示したものである。
【図１１】図11は、それぞれのグループのすべての動物の大腿骨に対する三点折り曲げ力学的強度試験における、骨折り曲げ全体強度の平均値を、90日目の測定値として示したものである。
【図１】
2004067687.tif 000035
【図２】
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【図３】
2004067687.tif 000037
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2004067687.tif 000042
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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