(57)【要約】【目的】光学活性アミノ化合物の可逆的分割剤として有用な新規化合物の提供【構成】下記式２で表されるマレイン酸無水物及び前記化合物の光学活性アミノ化合物の可逆的分割剤としての使用。【化２】2004352624.tif 000008式２中Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ互いに異なっており、水素原子、置換されてもよい炭素数１−６の低級アルキル基、水酸基、アルコキシカルボニル基、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基、炭素数１−６の低級アルコキシ、ハロゲン、アシル基、シアノ基、ニトロ基、グリオキシル基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、置換基を有していても良い非縮合又は縮合芳香族炭化水素基、ピリジン、キノリン、クマリン、インドール、ジフェニルイミダゾール、キノキサリン、アクリジン、フルオレセイン、イソルミノールからなる群から選択される基である。【選択図】  図２
2004352624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１で表されるキラル炭素に結合するカルボキシル基とアミノシトラコン酸のアミノ基とがアミド結合で結合した新規な不飽和ジカルボン酸。
【化１】
2004352624.tif 000006
式１中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ互いに異なっており、水素原子、置換されてもよい炭素数１−６の低級アルキル基、水酸基、アルコキシカルボニル基、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基、炭素数１−６の低級アルコキシ、ハロゲン、アシル基、シアノ基、ニトロ基、グリオキシル基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、置換基を有していても良い非縮合又は縮合芳香族炭化水素基、ピリジン、キノリン、クマリン、インドール、ジフェニルイミダゾール、キノキサリン、アクリジン、フルオレセイン、イソルミノールからなる群から選択される基である。
【請求項２】
下記式２で表される式１の化合物から誘導される酸無水物。
【化２】
2004352624.tif 000007
式２中Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、式１におけるＲ１，Ｒ２およびＲ３と同じ意味である。
【請求項３】
前記式２の化合物からなる光学活性アミノ化合物の可逆的分割剤。
【請求項４】
前記式２の化合物と光学活性アミノ化合物とからペプチド結合で結合した反応生成物を得、該化合物をカラムクロマトグラフィーを用いて分離し、分離した化合物の溶液に酸水溶液を加えてペプチド結合を切断し前記光学活性アミノ化合物を単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アミノ化合物を前記アミノ基と温和な条件で結合切断できるペプチド結合で結合した酸無水物の残基を有する可逆的キラル誘導体を形成する新規化合物、前記新規化合物からなる前記光学活性アミノ化合物の可逆的分割剤、前記可逆的分割剤を用いた前記光学活性アミノ化合物を単離する方法及び前記新規化合物の前駆体であるマレイン酸化合物に関する。
【０００２】
【従来技術】
光学異性体は、しばしば生体に対して作用的に極めて顕著な相違があることが知られている。例えば、通常生体内に存在するアミノ酸はＬ体であると考えられていた、しかしながら、昨今Ｄ体においても生体内で独特の生理活性を有するものがあることが見出されてきている。こうした背景から光学的に純粋なアミノ化合物を調製することが、特に、医薬、食品など生物の体内に取り入れられるものに対して求められている。
【０００３】
【非特許文献１】
ぶんせき  １９９９  ６、ｐ４５６−４６６，特に、ｐ４５６―４５７の「２光学異性体分離の工夫」
【非特許文献２】
Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７（７）、ｐ８８１−８８５（１９９４），特にｐ８８１
【特許文献１】
特開平１２−１４３６５３号公報、特許請求の範囲、〔００２０〕
【０００４】
前記光学異性体が混在するものをそれぞれの光学活性体に分離する技術は、光学分割技術として種々の提案がされてきている。その第１は、光学活性な化合物の混合物を前記化合物と反応性を持つ基及び光学活性基を有する化合物と反応させて化合物を形成させたとき、前記生成物がそれぞれ溶媒に対する溶解性に顕著な違いがあると、溶解性が小さい方の化合物が沈澱し、それぞれの化合物に分離できる分別結晶法である。
第２の方法はクロマトグラフィーを基本とする光学異性体の分離法法である。この方法は、ａ．光学活性固定相（Ｃｈｉｒａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  Ｐｈａｓｅ）を用いるキラル固定相法、ｂ．光学活性な化合物を移動相に添加しておき、カラム（通常は光学活性でないシリカゲルや化学結合型シリカゲルカラムを用いる）内を通過する際に、移動相添加キラルセレクターと溶質エナンチオマーとの間にジアステレオメリックな複合体を形成させ、この複合体の熱力学的安定性差、あるいは複合体の固定相に対する親和性の差を増幅させて分割を達成させる、キラル移動相法、及びｃ．分割目的エナンチオマーに対し、クロマトグラフに注入するに先だち、光学活性な誘導体化試薬と反応させ、基本的に共役結合型のジアステレオマーに変換することに基づいている。前記反応により生成したジアステレオマーは、分子エネルギー、溶解性、極性などの物理化学的性質が明らかに異なる化合物であるから、通常の順相や逆相液体クロマトグラフィーで分離可能である（前記非特許文献１参照）。
キラル分離用のカラム充填剤は高価であり、また目的に合う充填剤が必ずしも見つかるとは限らない。各種のカラムで分離条件を設定するにはかなりの費用、時間を要する。従って、通常の順相や逆相液体クロマトグラフィーで精度良く、温和な条件で分離可能な技術の開発が必要である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の課題は、分離手段として非キラル構造の固定相をもつ従来型の液体クロマトグラフィーが使用可能で、かつ分離後に緩和な条件で、被分割化合物であるアミノ基を持つ化合物を、アミド結合を切断して回収できる可逆的キラル誘導体を形成する、新規な前記被分割化合物であるアミノ基を持つ化合物とペプチド結合により結合した前記可逆的キラル誘導体を形成する新規化合物を提供することである。また、第２の課題は、前記可逆的キラル誘導体を形成する新規化合物を利用してアミノ基を持つ光学活性化合物を分離する方法を提供することである。
前記各課題を解決すべく、前記特性を持った可逆的キラル誘導体を形成する新規化合物を設計すべく種々のアミノ基と温和な条件で分解し得るペプチド結合を形成する化学構造を検討する中で、マレイン酸無水物などの不飽和脂肪族ジカルボン酸無水物が化学物質のアミノ基と温和な条件で脱ペプチド結合できるペプチド結合を形成できること（前記非特許文献２及び特許文献１参照）を参酌し、また前記ペプチド結合の形成、クロマトグラフィーによる分離条件においてキラル特性が安定であるキラル構造を持つ化合物を設計する中で、前記式１及び式２の化学構造を持つものが前記各課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１は、ペプチド結合を形成してキラル誘導体化合物を形成する化合物の前駆体である下記の式１で表されるキラル炭素に結合するカルボキシル基とアミノシトラコン酸のアミノ基とがアミド結合で結合した新規な不飽和ジカルボン酸である。
【０００７】
【化３】
2004352624.tif 000003
【０００８】
式１中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ互いに異なっており、水素原子、置換されてもよい炭素数１−６の低級アルキル基、水酸基、アルコキシカルボニル基、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基、炭素数１−６の低級アルコキシ、ハロゲン、アシル基、シアノ基、ニトロ基、グリオキシル基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、置換基を有していても良い非縮合又は縮合芳香族炭化水素基、ピリジン、キノリン、クマリン、インドール、ジフェニルイミダゾール、キノキサリン、アクリジン、フルオレセイン、イソルミノールからなる群から選択される基である。
本発明の第２は下記式２で表される式１の化合物から誘導される酸無水物である。
【０００９】
【化４】
2004352624.tif 000004
【００１０】
式２中Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、式１におけるＲ１，Ｒ２およびＲ３と同じ意味である。
本発明の第３は、前記式２の化合物からなる光学活性アミノ化合物の可逆的分割剤である。
また、本発明の第４は、前記式２の化合物と光学活性アミノ化合物とからペプチド結合で結合した反応生成物を得、該化合物をカラムクロマトグラフィーを用いて分離し、分離した化合物の溶液に酸水溶液を加えてペプチド結合を切断し前記光学活性アミノ化合物を単離する方法である。
【００１１】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ｉ．本発明の前記各課題は、基本的には式１の化合物から誘導される式２の、キラル構造とアミノ化合物と可逆的なペプチド結合を形成するマレイン酸無水物構造を有する化合物を用いることにより、達成することができる。この際前記式２の化合物はキラル基から被分割アミノ化合物が結合する基までの距離が重要であり、キラル基を有する残基は、基本的にはキラル基を持つ有機基であれば良く、前記Ｒ４〜Ｒ６の限定は好ましい基であると解釈すべきである。前記Ｒ４〜Ｒ６の１つは蛍光性の基であることが好ましい。
【００１２】
ＩＩ．式１の前駆体化合物から式２の化合物は、脱水剤、例えば（トリメチルシリル）エトキシアセチレン［（Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｙｌｅｎｅ］、無水酢酸、トリフルオロ酢酸無水物、塩化アセチル、トリフルオロアセチルイミダゾールなどを使用することもできるが、（トリメチルシリル）エトキシアセチレンを特に好ましいものとして挙げることができる。また溶媒として、例えばアセトニトリルを用いて室温〜７０℃に加熱し、２時間〜２４時間反応させることにより得られる。溶媒としてジクロロメタン、１，２−ジクロロエタンも使用可能であるが、環境上好ましくない。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、この例示により本発明が限定的に解釈されるものではない。
実施例１
（Ｓ）−２−｛Ｎ−［２−（６−メトキシナフタレン−２−イル）プロパノイル］マレイン酸〔（Ｓ）−ＭＮＰＡＭと略称〕の合成、すなわち式１においてＲ１が６−メトキシナフタレン−２−イル基、Ｒ２がＣＨ３そしてＲ３がＨの化合物の合成
前記合成の反応は以下の反応式１で表される。
【００１４】
【化５】
2004352624.tif 000005
【００１５】
工程１，（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタレン−２−イル）プロパノイルクロライド（前記化合物２）の合成。
キラルカルボン酸としてはカルボキシル基以外に反応基が無く、強いＵＶ吸収を持つナフタレン環を有する（Ｓ）−（＋）−ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｘｅｎ）を選択した。まず（Ｓ）−（＋）−ナプロキセン（２３０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）にクロロホルム（２０ｍＬを加え、５０℃に加熱して撹拌溶解した。この溶液にピリジン（１６１μＬ）及び塩化チオニル（５８０μＬ，８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１５分反応させた。この反応液を濾過し、溶液を減圧濃縮（室温）した。これにヘキサン（１５ｍＬ）を加えて再び減圧濃縮（室温）した。この残渣についてヘキサンを用いて再結晶し、無色針状結晶を得た。なお、この結晶はヘキサン中に保存した。構造は１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＩ−ＭＳにより確認した。これをアミノシトラコン酸（化合物３）との反応に用いた。
【００１６】
化合物２の物性；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
１．６６（３Ｈ，ｄ），３．９１（３Ｈ，ｓ），４．２３（１Ｈ，ｑ），７．１２（１Ｈ，ｄ）
７．１６（１Ｈ，ｄｄ），７．３３（１Ｈ．ｄｄ），７．６６−７．７４（３Ｈ，ｍ）
ＥＩ−ＭＳ  ［Ｍ］ピーク強度／［Ｍ＋２］ピーク強度＝３、［Ｍ］＝２４８
【００１７】
目的化合物の合成工程；
化合物３（５０ｍｇ、３４５μｍｏｌ）を、５００ｍＭホウ酸バッファー（８ｍＬ、ｐＨ８．０）及びモレキュラーシーブス（４Å）で一晩脱水したアセトニトリル（９ｍＬ）に溶解した。この溶液に前記化合物２（１４１ｍｇ、５６７μｍｏｌ）の脱水アセトニトリル溶液（１．４１ｍＬ）を撹拌しながら３回に分けて滴下した。なお滴下後は２０分室温放置した。この反応液からアセトニトリルを減圧留去し、炭酸ナトリウム（無水）を加えアルカリ性とした。この反応液を酢酸エチル（４ｍＬ×５倍）で洗浄した後、水層に１０％塩酸を加えて酸性にし、生成物を酢酸エチル（３ｍＬ×３倍）で抽出した。有機溶媒層を硫酸マグネシウム（無水）で乾燥した後、減圧留去して得られた残渣を水から再結晶し、無色綿状結晶を得た（６２．７９、１７６μｍｏｌ、５２．１１％）。
【００１８】
図１はこの結晶を重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）に溶解して得た１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。各プロトンのピークは、ＣＨ３（ｂ）がδ＝１．５３ｐｐｍ（３Ｈ，ｄ）、Ｈ（ａ）がδ＝３．８２ｐｐｍ（１Ｈ，ｑ）、ＯＣＨ３（ｃ）がδ＝３．８９ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ）、ＣＨ２（ｆ）がδ＝４．０４ｐｐｍ（２Ｈ，ｄｄ）、Ｈ（ｅ）がδ＝５．７９ｐｐｍ（１Ｈ，ｔ）、ナフタレン環の水素（ｄ）がδ＝７．０９−７．７３ｐｐｍ（６Ｈ，ｍ）に帰属した。原料である前記化合物２の１Ｈ−ＮＭＲと比較して、Ｈ（ａ）のピークのみが高磁場シフトし、ＣＨ２（ｆ）とＨ（ｅ）のピークが新たに認められた。前記化合物３における各プロトンの１Ｈ−ＮＭＲ化学シフトはＣＨ２がδ＝３．７２ｐｐｍ、Ｈがδ＝６．２０ｐｐｍであり、前記反応式１の反応において新たに認められたＣＨ２（ｆ）及びＨ（ｅ）の化学シフトと良く一致した。
【００１９】
ＦＡＢ（−）−ＭＳでは生成物の分子イオンピーク［Ｍ］に基づくｍ／ｚ＝３５６［Ｍ−Ｈ］が認められた。また元素分析の測定値（％）はＣ：６３．６０、Ｈ：５．５０、Ｎ：３．８５であり計算値と良く一致した。これらの結果はこの無色綿状結晶が目的物（Ｓ）−ＭＮＰＡＭであることを示すと考えられる。以上の様にキラルカルボン酸として（Ｓ）−（＋）−ナプロキセンを用いる反応においては、酸塩化物並びに最終目的化合物が単離精製され、シトラコン酸と光学活性中心を同一分子内に併せ持つ新規試薬を得た。
目的化合物の物性；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＯＤ３ＯＤ）  １．５３ｐｐｍ（３Ｈ，ｄ）、３．８２ｐｐｍ（１Ｈ，ｑ）、３．８９ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ）、４．０４ｐｐｍ（２Ｈ，ｄｄ）、５．７９ｐｐｍ（１Ｈ，ｔ）、７．１０（  １Ｈ，ｄｄ）、７．１９（１Ｈ，ｄ）、７．４２（１Ｈ，ｄｄ）、７．７０−７．７３（３Ｈ，ｍ）
ＦＡＢ（−）−ＭＳ  ｍ／ｚ＝３５６［Ｍ−Ｈ］
Ｃ１９Ｈ１９Ｏ６Ｎ      計算値（％）；Ｃ：６３．８６、Ｈ：５．３６、Ｎ：３．９２
実験値（％）；Ｃ：６３．６０、Ｈ：５．５０、Ｎ：３．８５
【００２０】
実施例２
前記目的化合物である（Ｓ）−ＭＮＰＡＭを用いたＤＬ−イソロイシン（ＤＬ−Ｉｌｅと略称する）の光学分割；
下記の反応条件で、（Ｓ）−ＭＮＰＡＭを（トリメチルシリル）エトキシアセチレンを脱水剤として用いて、式２のＲ４が６−メトキシナフタレン−２−イル基、Ｒ５がＣＨ３，及びＲ６がＨの化合物を調製し（以下、無水（Ｓ）−ＭＮＰＡＭとする。）、次いで前記無水（Ｓ）−ＭＮＰＡＭの溶液を用いてＤＬ−Ｉｌｅのキラル誘導体（ジアステレオマー）を得た。
反応条件；
無水（Ｓ）−ＭＮＰＡＭの調製；
２０ｍｍｏｌ（Ｓ）−ＭＮＰＡＭ／脱水アセトニトリル懸濁液１５０μＬに前記脱水剤３μＬ（１８μｍｏｌ）を加え、６０℃で９０分間反応させた。この溶液５０μＬを各１ｍＭＤＬ−Ｉｌｅ／０．４Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）２５０μＬに加え３７℃で３０分反応させてキラル誘導体（ジアステレオマー）を得た。
【００２１】
前記反応溶液を以下のＨＰＬＣ条件で、キラル誘導体（ジアステレオマー）を分離した。誘導体である各ジアステレオマーと考えられるピークが認められた。Ｄ−Ｉｌｅ誘導体と考えられるピークが４５．７分と５３．１分に、Ｌ−Ｉｌｅ誘導体と考えられるピークが４９．７分と５５．９分に検出された（図２）。以上の結果は、（Ｓ）−ＭＮＰＡＭを用いることにより、エナンチオマーの混合物をジアステレオマーの混合物に変換し、光学分割が可能であることを示している。
ＨＰＬＣ条件；
カラム：ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー株式会社製）（４．６ｍｍ内径×１５０ｍｍ）、４０℃
移動相：５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．０）、１３ｖ／ｖ％のアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）含有
流速：１．０ｍＬ／分
検出；ＵＶ２７７ｎｍ
【００２２】
実施例３
前記分離ジアステレオマーからＤ−Ｉｌｅ及びＬ−Ｉｌｅの再生
実施例２で分取した各フラクション５００μＬに１Ｍリン酸水溶液２５μＬを加え、ｐＨ３．０の酸性とし、２５℃で１５時間放置し再生を検討した。再生した各Ｉｌｅは、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−Ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）とＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−Ｃｙｓを用いるプレカラム蛍光誘導体化逆相セミミクロＨＰＬＣにより、下記ＨＰＬＣ条件で分析を行った。再生した反応液１００μＬに０．４Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）１００μＬを加え、そのうちの１６μＬにＯＰＡ試薬（ｏ−Ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ２ｍｇとＢｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ２ｍｇをメタノール２００μＬに溶解した溶液）４μＬを加え、２５℃で２分間放置し、蛍光誘導体化を行った。その結果、図３に示されるようにＬ−Ｉｌｅは１７．５分に、Ｄ−Ｉｌｅは２１．１分にピークが認められた。
【００２３】
前記蛍光誘導体化反応を用いてＤ−Ｉｌｅ及びＬ−Ｉｌｅの再生を検討した結果、１５時間後にはＤ−Ｉｌｅ誘導体のピークを分取したフラクションからはＤ−Ｉｌｅが２１．２分（図４ａ）に、Ｌ−Ｉｌｅ誘導体のピークを分取したフラクションからはＬ−Ｉｌｅが１７．５分（図４ｂ）に認められた。それぞれＤ−又はＬ−Ｉｌｅのピークのみが認められ、ラセミ化が起こることなくＩｌｅの再生が起こっていることが示された。
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ（東ソー株式会社製）（２．０ｍｍ内径×１５０ｍｍ）３５℃
移動相：１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１５ｖ／ｖ％ＴＨＦ及び７．５ｖ／ｖ％のＣＨ３ＣＮ含有
流速：０．２ｍＬ／分
検出：蛍光測定（蛍光励起波長３４４ｎｍ、発光測定波長４４３ｎｍ）
【００２４】
以上の結果は、可逆的反応基と光学活性中心を併せ持つ式１に属する（Ｓ）−ＭＮＰＡＭという新規可逆的キラル誘導体化試薬の合成と、無水（Ｓ）−ＭＮＰＡＭを用いる新規可逆的キラル誘導体化による光学分割が、再生におけるラセミ化のない温和な条件での分離ジアステレオマーからＤ−体及びＬ−体の再生可能であることを示している。
【００２５】
【発明の効果】
以上のように、本発明の提案したアミノ基をもつキラル化合物と可逆的なキラル誘導体を形成する化合物を用いることにより、前記アミノ基をもつキラル化合物を経済的な高速液体クロマトグラフィーなどの分離手段を用いて分離でき、かつ分離したキラル誘導体から温和な条件で前記アミノ基をもつキラル化合物を分離回収できるという、工業的に利用性の高い光学分割手段を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】目的化合物である（Ｓ）−ＭＮＰＡＭの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図２】ＤＬ−Ｉｌｅのキラル誘導体（ジアステレオマー）のＨＰＬＣ
【図３】Ｄ−Ｉｌｅ及びＬ−Ｉｌｅの蛍光誘導体化逆相セミミクロＨＰＬＣ
【図４】本発明の可逆的キラル誘導体形成化合物を用いて分離、回収したＤ−Ｉｌｅ（ａ）及びＬ−Ｉｌｅ（ｂ）の蛍光誘導体化逆相セミミクロＨＰＬＣ
【図１】
2004352624.tif 000009
【図２】
2004352624.tif 000010
【図３】
2004352624.tif 000011
【図４】
2004352624.tif 000012