(57)【要約】【課題】２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子を見い出すことにより、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法、植物を用いた２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法等を提供すること。【解決手段】グルコース転移酵素で保存されているアミノ酸配列を用いて、プライマーを設計し、タバコ培養細胞由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、タバコ培養細胞で構成的に発現しているグルコース転移酵素の遺伝子断片を得て、ホモロジー解析し、グルコース転移酵素に分類されているＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴの完全長ｃＤＮＡを単離し、大腸菌内で発現させて２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化活性を調べる。また播種後４週間のタバコ実生を葉と根に分け、これらの発現量を調べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子。
【請求項２】
配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子。
【請求項３】
請求項１又は２記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１、３又は５に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の全部を含む配列からなり、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１又は２記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子を、ＵＤＰグルコース存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンと接触させることを特徴とする２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化方法。
【請求項７】
２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法であって、植物に請求項３〜５のいずれか記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡを導入し、遺伝子が導入された植物の中から、前記遺伝子導入に用いた植物と同一品種で該遺伝子ＤＮＡが導入されていない植物よりも２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物を選択することを特徴とする育種方法。
【請求項８】
請求項３〜５のいずれか記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡが導入されたことを特徴とする植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織。
【請求項９】
請求項８記載の植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織を用いることを特徴とする２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の持つ２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを配糖化することのできる２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子及び該因子をコードする遺伝子、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化方法、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子が導入された植物、並びに該植物を用いる２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、外因性内分泌攪乱物質による環境汚染の実態が徐々に明らかになっており、人体は勿論、その他の動物に対しても生殖毒性や健康への悪影響が懸念されている。外因性内分泌攪乱物質の一つとして有名な２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン（ビスフェノールＡ、ＢＰＡ；Ｃ１５Ｈ１６Ｏ２、分子量２２８．２９）は、フェノールとアセトンとを酸触媒で縮合して合成される、融点１５５〜１５７℃、沸点２５０〜２５２℃の水不溶、エタノール、アセトンに可溶性のエポキシ樹脂、ポリカーボネート樹脂、酸化防止剤、及び染料の合成原料であり、殺菌剤としても利用されている。この２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンは、弱い女性ホルモン活性を有し、内分泌攪乱物質の候補としてその生理作用などが研究されている。２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンは上記樹脂の分解により環境中に拡散され、河川水中から多く検出されるが、環境中へ流出した低濃度の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率良く安価に回収、分解する技術の開発が必要であり、そのためには生物を利用した分解技術（以下、生分解技術）が有効であると考えられる。
【０００３】
２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの生分解技術に関しては、これまでのところ微生物や酵素を利用した、外因性内分泌攪乱物質を含有する汚染水に、糸状菌などの微生物やペルオキシダーゼなどの酵素を接触させることにより、外因性内分泌攪乱物質を分解する方法（例えば、特許文献１〜３参照。）が見い出されている。しかしながら、微生物を利用した技術は、微生物自身の残存性や移動性から生態系への影響が懸念されており、植物など、容易に移動し得ない生物を利用した浄化法の開発が望まれている。そのため、植物を利用した２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの生分解技術として、植物体または植物培養細胞を利用し、微生物が分解しやすい物質へと誘導する事で、容易に効率よく、しかも安全に内分泌かく乱物質を回収する方法（例えば、特許文献４参照。）が見い出されている。また近年、植物による環境中エストロゲンの代謝経路が明らかになりつつある（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
一方、二次代謝産物をグルコシル化するタバコ培養細胞の遺伝子として、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＮｔＧＴ１ａ及びＮｔＧＴ１ｂが（例えば、非特許文献２参照。）、フラボノイドグルコシルトランスフェラーゼと相同な遺伝子としてＮｔＩＳ１０ａが（例えば、非特許文献３参照。）、タバコ培養細胞のサリチル酸誘導性グルコシルトランスフェラーゼＮｔＳＡＧＴが（例えば、非特許文献４参照。）、それぞれ同定されている。しかしながら、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを基質にし、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを配糖体化する酵素に関する遺伝子の報告は未だない。
【０００５】
他方、本発明者らは２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンが植物細胞内に取り込まれた後、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン−β−Ｄ−グルコピラノシドへ代謝され、エストロゲン活性を失うことを見い出している（例えば、特許文献５参照。）。また、本発明者らは環境中の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンにソルガム、タバコ、ササゲ、スイカ、ニンジン、シロゴマ、アズキ、ピーマン、トウモロコシ、トウゴマ、コムギ、レムナ（アオウキクサ）を作用させることによる環境中の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法を見い出している（例えば、特許文献６参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−０２８６９２号公報
【特許文献２】
特開２００２−７９２６６号公報
【特許文献３】
特開２００２−１８４８０号公報
【特許文献４】
特開２００２−３３１２７９号公報
【特許文献５】
特開２００２−３５６４９４号公報
【特許文献６】
特開２００２−３５５６９２号公報
【非特許文献１】
Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，  Ｏｃｔ，  ４９  （１）  ５１−９，  ２００２
【非特許文献２】
Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６８，  ４０８６−４０９４，  ２００１
【非特許文献３】
Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１  （５），  １０６１−１０７２，  １９９６
【非特許文献４】
Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４  （５１），  ３６６３７−３６６４２，  １９９９
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、低濃度に環境中に拡散した２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを生態系へ影響を最小限に抑えて除去するためには植物を利用することが望ましい。しかしながら、植物は種によって２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを代謝する能力にばらつきがある。植物による環境浄化を目的とし、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率良く吸収・代謝する植物を育種するには、植物細胞に取り込まれた２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンへの代謝に関わる遺伝子を見い出し、その機能を強化することが重要である。そのため本発明の課題は、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの代謝産物の生産に関わる２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子を見い出すことにより、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法や、植物を用いた２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法や、その技術に必要な高い２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化能を持つ植物を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これまでに植物を用いて環境中に流出した２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを回収することができるかどうか、またその流出を予防することを目的として、植物が２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを吸収・代謝することができるかどうかを調べた。その結果、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンは植物体内でグルコシル化されてグルコース配糖体となり、エストロゲン活性を失い、葉に蓄積されることを明らかにした。また、通常の状態でタバコ培養細胞が２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よく配糖化することから、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの配糖化に関わる酵素（Ｂｉｓｐｈｅｎｏｌ  Ａ：ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：以下ＢＧＴ）はタバコ培養細胞において構成的に発現していると考えた。そこで、グルコース転移酵素（ＧＴａｓｅ）で保存されているアミノ酸配列を用いて、プライマーを設計し、タバコ培養細胞由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、タバコ培養細胞で構成的に発現しているグルコース転移酵素の遺伝子断片を１００個得た。これらを塩基配列のホモロジーにより解析した。
【０００９】
その結果、これまで既にタバコからクローニングされている６つのグルコース転移酵素に分類された。次にこれら６つのうち、４つの完全長ｃＤＮＡ、すなわち、ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＪＩＧＴ、ＮｔＳＡＧＴの完全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法で単離し、大腸菌内で発現させてＢＧＴ活性を調べた。その結果、ＮｔＧＴ１ａは強いＢＧＴ活性を有することや、ＮｔＩＳ１０ａとＮｔＳＡＧＴはＮｔＧＴ１ａの半分以下のＢＧＴ活性を有することや、ＮｔＪＩＧＴがＢＧＴ活性をもたないことを見い出した。次に、ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ及びＮｔＳＡＧＴがタバコ植物体で発現していることを確かめるため、播種後４週間のタバコ実生を葉と根に分け、それぞれのＢＧＴ活性とＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ及びＮｔＳＡＧＴの発現量を調べたところ、葉は根の３倍以上のＢＧＴ活性を有し、ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ及びＮｔＳＡＧＴのｍＲＮＡ量は葉と根では大差なく、いずれも構成的に存在していたが、ＮｔＧＴ１ａのｍＲＮＡは葉で強く発現しており、根では殆ど発現が見られないことを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
【００１０】
すなわち本発明は、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子（請求項１）や、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子（請求項２）や、請求項１又は２記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ（請求項３）や、配列番号１、３又は５に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の全部を含む配列からなり、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ（請求項４）や、請求項４記載の遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性を有する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ（請求項５）に関する。
【００１１】
また本発明は、請求項１又は２記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子を、ＵＤＰグルコース存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンと接触させることを特徴とする２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化方法（請求項６）や、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法であって、植物に請求項３〜５のいずれか記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡを導入し、遺伝子が導入された植物の中から、前記遺伝子導入に用いた植物と同一品種で該遺伝子ＤＮＡが導入されていない植物よりも２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物を選択することを特徴とする育種方法（請求項７）や、請求項３〜５のいずれか記載の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡが導入されたことを特徴とする植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織（請求項８）や、請求項８記載の植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織を用いることを特徴とする２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法（請求項９）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子としては、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮｔＧＴ１ａ）、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮｔＩＳ１０ａ）又は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮｔＳＡＧＴ）であって、かつ、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換しうる活性（以下「ＢＧＴ活性」という）を有する配糖化因子や、（２）配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、ＢＧＴ活性を有する配糖化因子であれば特に制限されず、したがって、本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子は、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換するために使用されるＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴ等を意味し、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化の機構解明や、外因性内分泌攪乱物質に対する植物による環境浄化の基礎的知見を得る上で有用である。
【００１３】
本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子（１）は、例えば、ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ又はＮｔＳＡＧＴをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて、常法により組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。また、本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子（２）は、ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ又はＮｔＳＡＧＴをそれぞれコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて、常法により組換えＤＮＡ技術を用いて各種タンパク質を調製し、そのＢＧＴ活性を実施例記載の方法等により測定し、ＢＧＴ活性が認められるタンパク質を選定することにより調製することができる。
【００１４】
本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡ、すなわち２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子ＤＮＡとしては、（Ａ）上記本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡや、（Ｂ）配列番号１に示される塩基配列、その相補的配列（ＮｔＧＴ１ａ遺伝子）、配列番号３に示される塩基配列、その相補的配列（ＮｔＩＳ１０ａ遺伝子）若しくは配列番号５に示される塩基配列、その相補的配列（ＮｔＳＡＧＴ遺伝子）、又はこれらの配列の全部を含む配列からなり、かつ、ＢＧＴ活性を有する遺伝子ＤＮＡや、（Ｃ）本発明の遺伝子ＤＮＡ（Ｂ）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＢＧＴ活性を有する遺伝子ＤＮＡであれば特に制限されるものではなく、したがって、本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子ＤＮＡは、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンをＵＤＰグルコースの存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）−β−Ｄ−グルコピラノシドに変換する２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子を作製するために使用される遺伝子ＤＮＡを意味し、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化の機構解明や、かかる遺伝子ＤＮＡを各種植物に導入して外因性内分泌攪乱物質に対する植物による環境浄化を図る上で有用である。
【００１５】
本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子ＤＮＡ（Ａ）や（Ｂ）は、例えば、実施例記載の方法等によりタバコ培養細胞から常法により調製することができる。また、本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子ＤＮＡ（Ｃ）は、配列番号１、３又は５に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部をプローブとして、ソルガム、タバコ、ササゲ、スイカ、ニンジン、シロゴマ、アズキ、ピーマン、トウモロコシ、トウゴマ、コムギ、レムナ（アオウキクサ）などの各種植物由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離し、常法により発現させ、その発現産物のＢＧＴ活性を実施例記載の方法等により測定し、ＢＧＴ活性が認められるタンパク質をコードするＤＮＡを選定することにより調製することができる。かかるＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００１６】
本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化方法としては、上記本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子を、ＵＤＰグルコース存在下に２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンと接触させる方法であれば特に制限されるものではなく、かかる本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化方法は、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化の機構解明や、外因性内分泌攪乱物質である２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンによる環境汚染を浄化する上で有用である。
【００１７】
本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法としては、ソルガム、タバコ、ササゲ、スイカ、ニンジン、シロゴマ、アズキ、ピーマン、トウモロコシ、トウゴマ、コムギ、レムナ（アオウキクサ）などの各種植物に、上記本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子を導入し、遺伝子が導入された植物の中から、前記遺伝子導入に用いた植物と同一品種で該遺伝子が導入されていない植物よりも２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物を選択する方法であれば特に制限されるものではなく、植物への遺伝子導入方法としては公知の遺伝子導入方法、例えば、選択マーカーを含まない組換え植物の効率的な作出方法（特開２００３−８２号公報）や、遺伝子導入用組織として、生長点を有する少なくとも一端と、かつ、生長点を有さない基部を備えたシュートを採取し、少なくとも一端の生長点を保持させたまま、生長点を有さない基部に目的遺伝子を導入し、不定芽を分化させる方法（特開２００３−３３１２０号公報）や、植物細胞又は植物組織を遠心処理することを伴う、アグロバクテリウム属細菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法（特開２０００−３４２２５６号公報）や、長鎖ＤＮＡをプロトプラストに導入する方法であって、プロトプラスト懸濁液、ポリエチレングリコールおよび長鎖ＤＮＡを、長鎖ＤＮＡの終濃度が５０μｇ／ｍｌ以上になるように混合する工程、プロトプラストを収穫し、洗浄し、培地中で培養する工程、形質転換細胞を選抜する工程を含む方法（特開平１０−２６２６６６号公報）などを挙げることができる。
【００１８】
本発明はまた、前記本発明の２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子をコードする遺伝子ＤＮＡが導入された植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織や、かかる植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織を用いる２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法に関する。かかる植物若しくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫又はそれらの組織や、これらを用いる２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法は、外因性内分泌攪乱物質である２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンによる環境汚染を浄化する上で有用である。
【００１９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：方法
グルコース転移酵素（ＧＴａｓｅ）で保存されているアミノ酸配列を用いてプライマー（ＧＴａｓｅ  Ｆ１、ＧＴａｓｅ  Ｆ２、ＰＳＰＧ  ｂｏｘ）を設計し、タバコ培養細胞由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。ＲＴ−ＰＣＲの反応は以下のように行った。ＲＴ−ＰＣＲ  ｂｅａｄ（アマシャム社製）に、タバコ培養細胞由来のＲＮＡを１μｇと上記プライマーを、ＧＴａｓｅ  Ｆ１と  ＰＳＰＧ  ｂｏｘまたはＧＴａｓｅ  Ｆ２  と  ＰＳＰＧ  ｂｏｘの組み合わせでそれぞれ最終濃度１μＭになるように加え、さらに水を加えて５０μＬとした。反応液に５０μＬのシリコンオイルをのせて４２℃で３０分逆転写反応を行った後、１サイクルあたり９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で３分の反応を３０サイクル行った。増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離したのち、目的のＤＮＡバンドをゲルから切り出し、プラスミドベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙとライゲーションした。次にこれを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーからプラスミドを精製し、塩基配列を決定した。
【００２０】
４つの完全長ｃＤＮＡ（ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＪＩＧＴ、ＮｔＳＡＧＴ）をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅した。ＲＴ−ＰＣＲの方法は上記と同じ条件で行ったが、プライマーは以下のものを用いた。ＮｔＧＴ１ａを単離するためにはＮｔＧＴ１ａ  ＦとＮｔＧＴ１ａ  Ｒを、ＮｔＩＳ１０ａを単離するためにはＮｔＧＴ１０ａ  ＦとＮｔＧＴ１０ａ  Ｒを、ＮｔＪＩＧＴを単離するためにはＮｔＪＩＧＴ  ＦとＮｔＪＩＧＴ  Ｒを、ＮｔＳＡＧＴを単離するためにはＮｔＳＡＧＴ  ＦとＮｔＳＡＧＴ  Ｒをそれぞれ用いた。増幅された全長のＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＤＮＡバンドを切り出し、ＮｔＧＴ１ａについては制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍＨ  Ｉで切断した。その他の３つは制限酵素Ｓａｃ  ＩとＢａｍＨ  Ｉで切断した。切断したＤＮＡを同じ制限酵素で切断したプラスミドベクターであるｐＵＣ１８とライゲーションして、大腸菌ＪＭ１０９へ形質転換した。アンピシリン耐性でかつβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性を失った大腸菌を選抜した。選抜された大腸菌からプラスミドを精製し、挿入されているＤＮＡが目的のＤＮＡと同じ塩基配列を持っていることを確認した。目的のＤＮＡを持っている大腸菌を、ＬＢにアンピシリンを入れた液体培地で３７℃で振とう培養した。対数増殖中期にＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加えた。更に３７℃で３時間培養して、１．５ｍＬの培養液を遠心集菌後、１ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５に菌をサスペンドし、超音波細胞破砕機で菌を破壊した。２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、上清を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐＨ７．５で平衡化しておいた脱塩カラムで脱塩し、溶出液を粗酵素液とした。
【００２１】
ＢＧＴ活性の測定は以下のように行った。１８５μＬの粗酵素液に  ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅと２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンそれぞれ０．９ｍＭおよび０．５ｍＭとなるように加え、３０℃で２０分間保温した。６０％過塩素酸を２０μＬ加えて反応を止めた。変性したタンパク質を２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して除去し、上清を５０μＬ取り、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣの条件は移動相を４０％メタノールで１ｍＬ／ｍｉｎで流した。カラムはＣ−１８（Φ３．９ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いて、４０℃で分析した。また、検出は２１７ｎｍの吸収でおこなった。なお以上の実験で用いたプライマーの塩基配列は以下のとおり
【００２２】
ＧＴａｓｅ  Ｆ１（配列番号７）：ＴＣＡＧＴｎＧＴｎＴｗＣｎＴＡＴｖｍＴＴＴＧＧＡＡＧＣ
ＧＴａｓｅ  Ｆ２（配列番号８）：ＴＣＣＧＴＣＧＴＴＴＡＣｒＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣ
ＰＳＰＧ  ｂｏｘ（配列番号９）：ＴＣｙＡｒｗＧＴｙＧＡＡＴＴＣＣＡｎＣＣＡＣＡｒＴＧ
ＮｔＧＴ１ａ  Ｆ（配列番号１０）：ＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＴＡＧＴＡＴＴＣＡＴＴ
ＮｔＧＴ１ａ  Ｒ（配列番号１１）：ＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＴ
ＮｔＧＴ１０ａ  Ｆ（配列番号１２）：ＡＡＡＴＧＡＧＣＴＣＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴ
ＮｔＧＴ１０ａ  Ｒ（配列番号１３）：ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＡＣＴＡＴＡＴＧ
ＮｔＳＡＧＴ  Ｆ（配列番号１４）：ＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＡＣＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＧＣＴＣＡＴＴＧＣＴ
ＮｔＳＡＧＴ  Ｒ（配列番号１５）：ＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＡ
ＮｔＪＩＧＴ  Ｆ（配列番号１６）：ＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＧＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡ
ＮｔＪＩＧＴ  Ｒ（配列番号１７）：ＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＡＴＧＡＣＣＡＡＧＴＡＡＡＣＡＴＴ
なお上記配列中、ｎはＡＣＧＴのミックスを、ｗはＡＴのミックスを、ｖはＧＣのミックスを、ｍはＣＡのミックスを、ｒはＡＧのミックスを、ｙはＣＴのミックスをそれぞれ示す。
【００２３】
実施例２：結果及び考察
通常の状態でタバコ培養細胞が２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よく配糖化することから、ＢＧＴはタバコ培養細胞においては構成的に発現していると思われる。そこで、グルコース転移酵素（ＧＴａｓｅ）で保存されているアミノ酸配列を用いてプライマーを設計しタバコ培養細胞由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、タバコ培養細胞で構成的に発現しているグルコース転移酵素の遺伝子断片を１００個得た（図１）。これらを塩基配列の類似度により分類したところ、これまで既にタバコからクローニングされていた６つのＧＴａｓｅに分類された。次にこれら６つのうち、４つの完全長ｃＤＮＡ（ＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＪＩＧＴ、ＮｔＳＡＧＴ）を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて単離し、大腸菌内で発現させてＢＧＴの活性を調べた（図２）。その結果、ＮｔＧＴ１ａは強い活性を持ち、ＮｔＩＳ１０ａとＮｔＪＩＧＴはＮｔＳＡＧＴの半分以下の活性を持っていた（図３）。ＮｔＪＩＧＴは活性を持たなかった。また、あらかじめ過塩素酸を加えてタンパク質を変性させた後に、酵素反応を測定した場合、どれも活性を検出できなかった（表１）。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
以上の結果はＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴがどれもＢＧＴをコードするｃＤＮＡであることを証明している。次にＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴがタバコ植物体でも発現していることを確かめるため、播種後４週間のタバコ実生を葉と根に分け、それぞれのＢＧＴ活性とＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴの発現量を調べた。その結果、葉は根の３倍以上のＢＧＴ活性を持っていた。また、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴのｍＲＮＡの発現量は葉と根で大きな差はなく、どちらも構成的に存在していた。それに対しＮｔＧＴ１ａのｍＲＮＡは葉で強く発現しており、根ではほとんど発現が見られなかった。以上の結果から植物体内でＮｔＧＴ１ａ、ＮｔＩＳ１０ａ、ＮｔＳＡＧＴが２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの配糖化に関わっていることがわかった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって見出された２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの代謝産物の生産に関わる２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン配糖化因子遺伝子を利用することにより、２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを効率よくグリコシル化しうる植物の育種方法や、植物を用いた２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンの除去方法や、その技術に必要な高い２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンのグリコシル化能を持つ植物の創出が可能となる。
【００２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】タバコ培養細胞で構成的に発現しているグルコース転移酵素遺伝子のクローニング方法を示す図である。
【図２】単離した遺伝子のＢＧＴ活性を調べる方法を示す図である。
【図３】ベクターのみを導入した菌と、ＮｔＧＴ１ａを導入した菌のそれぞれのＢＧＴ活性の結果を示す図である。図中、ＢＰＡは２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパンを示し、ＢＰＡＧは２，２−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロパン−β−Ｄ−グルコピラノシドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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