(57)【要約】【課題】試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度よく定量分析する方法を提供する。【解決手段】試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料１ｇに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力１００００ユニットから４００００ユニットの範囲である非水溶性セルロースの定量分析法。【選択図】      図１
2004344041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料１ｇに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力１００００ユニットから４００００ユニットの範囲であることを特徴とする非水溶性セルロースの定量分析法。
【請求項２】
下記式（１）により非水溶性セルロース含有量を求めることを特徴とする請求項１に記載の非水溶性セルロースの定量分析法。
非水溶性セルロース含有量［％］＝（（Ａ−Ｂ−Ｃ）×１００）／Ａ    （１）
Ａ：試料の重量
Ｂ：セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量
Ｃ：水溶性成分の重量
【請求項３】
前記試料が、紙製品、製紙工程で発生する異物あるいは、綿リンターであることを特徴とする請求項１または２に記載の非水溶性セルロースの定量分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は非水溶性セルロースを選択的に、しかも精度よく定量分析する方法に関するものである。詳しくは高価な分析機器を使用することなく、簡便な操作で、危険性や環境負荷の大きい試薬を使用しない非水溶性セルロースの定量分析法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の非水溶性セルロースの分析方法は、いずれも、単離されたパルプの純度測定に関する分析法であるので、未知試料を分析する方法としては好ましくないうえ、分析操作が煩雑である（例えば、非特許文献１、２）。
【０００３】
また、例えば非特許文献３には、非水溶性セルロースを溶解する溶媒が記載されており、この溶媒を分析法に応用することが考えられる。すなわち、溶媒に試料中の非水溶性セルロースを溶解させ、分析に使用した試料の乾燥重量からろ過残分の乾燥重量を差し引き、非水溶性セルロースの重量とする方法が考えられる。溶媒としては、例えば、６５％以上の硫酸、３５．５％以上の塩酸、６８％以上の硝酸などの強酸溶媒、６％水酸化リチウム、１０％水酸化ナトリウムなどの強アルカリ溶媒、６４％以上の塩化亜鉛または５０％以上のチオシアン酸カルシウム溶媒、銅、コバルト、カドミウム、ニッケルなどの金属錯体溶媒、ジメチルスルホキシド、Ｎ−ジメチルホルムアミドなどを主成分とする非水系溶媒が知られている。
【０００４】
強酸、強アルカリの場合、非水溶性セルロースのみを選択的に溶解するわけではなく、酸またはアルカリに溶解する成分を含む試料の場合、分析結果は正の誤差を含む可能性がある。しかも、これらの酸、アルカリは反応性が高く取り扱いには細心の注意が必要である。更に６％水酸化リチウム、または１０％水酸化ナトリウムで分解する場合４℃に保つ必要があり、温度コントロールが分析値を大きく左右する。
【０００５】
塩化亜鉛、チオシアン酸カルシウムを使用する方法は、１００℃以上の高温で反応させる必要があり、操作性が悪い。金属錯体を使用する場合、それ自体有害物質であったり、廃液は環境汚染の原因になるおそれがあり、慎重な取り扱いや適切な設備が必要となる。非水系溶媒は、試料中に共存する有機物も溶解し、分析にあたり正の誤差を与える恐れがある。
【０００６】
一方、溶媒を使用しないで非水溶性セルロースを水溶化する方法として、分解酵素であるセルラーゼ処理することによる低分子量化、あるいは、グルコースへの分解が考えられる。酵素であるセルラーゼは反応が選択的かつ温和である。しかも、食品用途にも使用されていることから、分析操作上の安全対策や分析後の廃液処理設備を必要としないうえ、分析残分は形態観察を含めて次の分析ができるという利点がある。
【０００７】
しかし、従来のセルラーゼの使用量では可溶化率が低かったり、仮に可溶化したとしても長時間を要していた。例えば、試料として微粒径セルロース（商品名「アビセル（ＰＨ−１０１）」、旭化成（株）製、平均粒径４０μｍ）を使用し、ろ紙崩壊力（非特許文献４）４００ユニット／ｇのセルラーゼを試料１ｇに対して８００ユニット使用した場合、処理日数２日で可溶化率が８０％と、定量分析に使用できるレベルにはない（非特許文献５）。非特許文献５には９７％分解した例の記載もあるが、処理日数に１０日間を要している。微粒径セルロースであるアビセルは、表面積が大きくセルラーゼにより可溶化されやすいと推定されるが、短時間で高効率に可溶化することは困難である。
【０００８】
分析法として利用するには、長さが数ｍｍレベルの非水溶性セルロース繊維を高効率にしかも短時間で可溶化できることが求められ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｍ．Ｌａｄｉｓｃｈらは、非水溶性セルロースをカドキセンに溶解させ、その後セルラーゼでグルコースユニットに分解し、グルコースを定量分析した例を報告している（非特許文献６）。この方法は、グルコースを定量分析している点では好ましいが、カドキセンは、カドミウムを含むため作業環境や環境汚染対策などが必要であり、使用を避けたい。また、グルコースの定量分析には高価な液体クロマトグラフを使用している。
【０００９】
【非特許文献１】
日本規格協会編、ＪＩＳハンドブック  紙・パルプＪＩＳ規格、１９８８年、ｐ．１１８−１１９
【００１０】
【非特許文献２】
日本分析化学会編、改訂二版  分析化学便覧、丸善株式社、１９７１年、ｐ．１１６１−１１７６
【００１１】
【非特許文献３】
セルロース学会編、セルロースの事典、朝倉書店、２０００年１１月１０日、ｐ．１１３〜１３１
【００１２】
【非特許文献４】
厚生省医薬安全局審査研究会監修、製薬関係通知集１９９７年度版、薬業時報社、１９９７年９月３０日、ｐ．３１７−３１８
【００１３】
【非特許文献５】
林徳子、高結晶性天然セルロースの酵素加水分解残渣の特徴、木材学会誌、１９９５年１２月、Ｖｏｌ．４１  ＮＯ．１２  ｐ．１１３２−１１３８
【００１４】
【非特許文献６】
Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｍ．Ｌａｄｉｓｃｈ，Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｓ  ａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｏｌ，Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９８２年７月、ｐ．４２３−４３３
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度よく定量分析する方法を提供するものである。より詳しくは、高価な分析機器の使用、煩雑な操作、危険性や環境負荷の大きな有害試薬を使用することなく、また、分析後の非セルロース成分の形態観察を含めた分析を可能とする非水溶性セルロースの定量分析法を提供するものである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、前記課題を解決するため、反応が選択的で、穏やかで、しかも環境負荷の少ないセルラーゼに着目し鋭意研究を重ね、試料１ｇに対するセルラーゼの使用量（ユニット数）を公知の使用量の約１０〜５０倍で、しかも、ある特定の範囲とすることにより、非水溶性セルロースをほぼ完全に可溶化できることを見出し本発明に至った。
【００１７】
即ち、本発明の非水溶性セルロースの定量分析法は、試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化して非水溶性セルロース含有量を求める分析法であって、試料１ｇに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力１００００ユニットから４００００ユニットの範囲であることを特徴とする。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の定量分析法について以下に具体的に説明する。
【００１９】
本発明の定量分析法においては、分析対象である試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化し、好ましくは下記式（１）により、非水溶性セルロースの含有量を求める。
【００２０】
非水溶性セルロース含有量［％］＝（（Ａ−Ｂ−Ｃ）×１００）／Ａ    （１）
Ａ：試料の重量
Ｂ：セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量
Ｃ：水溶性成分の重量
【００２１】
具体的には、試料中の非水溶性セルロースをセルラーゼ溶液中で可溶化し、このセルラーゼ溶液をフィルターでろ過し、ろ過残分を水洗した後に１００℃前後で恒量になるまで乾燥して求めたろ過残分の乾燥重量を、試料の乾燥重量からを差し引いて、非水溶性セルロース含有量を求める。
【００２２】
この際、試料が水溶性成分を含む場合には、あらかじめ熱水抽出などにより試料から水溶性成分を除去して１００℃前後で恒量になるまで乾燥するか、他の分析法で求めた試料中の水溶性成分量を差し引く必要がある。
【００２３】
分析対象である試料としては、紙製品、製紙工程で発生する異物あるいは、綿リンター等が挙げられる。
【００２４】
非水溶性セルロースを可溶化する際のセルラーゼの使用量は、試料１ｇに対して、ろ紙崩壊力１００００ユニットから４００００ユニットであり、好ましくは１２０００から３６０００ユニットである。
【００２５】
本発明者は、単位試料重量に対するセルラーゼの使用量をろ紙崩壊性（ユニット）である範囲にすることにより、試料中の非水溶性セルロースを高効率で可溶化することができることを見出した。すなわち、図１に示すように試料１ｇに対するセルラーゼの使用量が、ろ紙崩壊力１００００から４００００ユニットの範囲である場合に、非水溶性セルロースは高効率で可溶化する。
【００２６】
１００００ユニット未満で可溶化率が低下する原因は、次のように考えている。
【００２７】
一般的に酵素は自身が分解した分解生成物と結合し活性を失うことが知られている（例えば、Ｂｅｎｄｅｒら著、伊勢典夫ら訳、酵素と触媒のはたらき、化学同人、１９８５年４月２０日、ｐ．３３）。使用量が１００００ユニット未満では、可溶化した非水溶性セルロース分解生成物によるセルラーゼの不活性化が起こり、非水溶性セルロースの可溶化が円滑に進まなくなる。しかし、１００００ユニット以上のセルラーゼを使用することにより、セルラーゼの一部が不活性化しても、後の反応を維持することが可能な活性を保つことができ、その結果非水溶性セルロースを高効率で可溶化することができるので分析精度が向上する（分析値が真値に近くなる）と考えられる。
【００２８】
一方、４００００ユニットを超えると可溶化率が低下する原因は次のように考えている。
【００２９】
セルラーゼの分子構造は非水溶性セルロースに結合するドメインと触媒中心ドメインを有すると考えられており（例えば、鮫島正浩  木材材学会誌  ｖｏｌ．４２、Ｎｏ．９  ｐ．８１１−８１６  １９９６）、結合ドメインが非水溶性セルロースに接近して吸着あるいは結合し、次いで触媒中心ドメインが非水溶性セルロース中のβ−１，４−グルコシド結合を加水分解すると考えられる。セルラーゼの使用量が４００００ユニットを超えると、セルラーゼが非水溶性セルロースに多量に結合することに起因するセルラーゼ自身の骨格による立体障害により、触媒中心ドメインがβ−１，４−グルコシド結合に近づけなくなり加水分解が進まなくなる。その結果、可溶化率が低下するため、分析法として使用に耐えるものではなくなる（分析値が真値に比べて小さくなる）と考えられる。
【００３０】
ここで、ろ紙崩壊力とは、セルラーゼ活性の指標の一つであり、せんい素崩壊力とも呼ばれる。ろ紙崩壊力は、セルラーゼがろ紙に３７℃で作用するとき、１分間にろ紙を完全に崩壊する酵素量を１０００ユニット／ｇとするものであり、前述の非特許文献４に記載の方法で求める。
【００３１】
セルラーゼとしては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ、Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒのようなカビや、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ、Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓのような白色木材腐朽菌などの糸状菌由来のものが挙げられ、これらのセルラーゼは試薬メーカー、酵素専業メーカーなどから高純度の学術研究用から工業用グレードまで多種類が市販されている。いずれも本発明に使用可能であるが、工業用グレードの中には操作性改善などの目的で増量剤等を添加しているものもあり、本発明で用いる場合、溶解させる粉体の量が増加し、操作性が低下する可能性があるので注意を要する。
【００３２】
セルラーゼ溶液の濃度は、非水溶性セルロースの可溶化速度にかかわる因子と考えられ、高濃度ほど反応が速く進み、結果として分析時間が短くなるので好ましいと思われるが、セルラーゼの溶解度や、セルラーゼ溶液の粘度が高くなり操作性が低下するなどの制約から４０から１３０ユニット／ｍｌの範囲が好ましい。
【００３３】
また、セルラーゼのろ紙崩壊性はｐＨにより大きく変化し、ｐＨが３．０から６．０の範囲外では活性が低いことが知られており（例えば、セルラーゼ  オノズカ３Ｓ技術資料  ヤクルト薬品工業）、セルラーゼを溶解する溶媒のｐＨは３．０から６．０の範囲が良いと考えられる。ｐＨの調整は酢酸などのカルボン酸、塩酸などの鉱酸などにより可能であるが、試料の溶解によるｐＨの変動を心配する必要がない点で緩衝液の使用が好ましい。例えば，ｐＨ４．０緩衝液は０．１Ｍ酢酸水溶液８２重量部と０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液１８重量部を混合することにより簡単に得ることができる。
【００３４】
セルラーゼは一般に粉状で市販されており、セルラーゼ溶液は通常の水溶液の調整方法で調整することができる。未溶解部分が存在する場合は薬さじ等で未溶解部分を分散し、更に、超音波分散器などで数分から数十分処理するとことにより大半は溶解することができるが、正確な分析結果を得るためには、ろ過あるいは減圧ろ過などにより予め未溶解部分を除去しておくことが好ましい。
【００３５】
また、セルラーゼによる非水溶性セルロースの加水分解は好気性反応であることが知られており（村尾沢夫ら  セルラーゼ  講談社サイエンティフィク  １９８７年  ｐ．９９−１０１）、セルラーゼ溶液調整の段階で、超音波分散処理や減圧ろ過をした場合、空気バブリングなどにより溶存酸素濃度を高めておくことが好ましい。
【００３６】
【実施例】
以下に実施例により本発明を説明する。
【００３７】
＜実施例１＞
試料として、キムワイプ  ワイパーＳ−２００（（株）クレシア製、針葉樹由来のバージンウッドパルプ１００％）を９０℃で恒量となるまで乾燥し、約０．０５ｇを下４桁の測定が可能な電子天秤で精秤し、５０ｍｌのサンプルビンにとる。
【００３８】
セルラーゼ（商品名「オノズカＲＳ」、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来、ヤクルト薬品工業（株）製、ろ紙崩壊力２５００ユニット／ｇ）を、ｐＨ＝４．０１の緩衝液（キシダ化学（株）製）に溶解させ、６０ユニット／ｇのセルラーゼ溶液を調整し、孔径１．０μｍのメンブレンフィルターでろ過する。
【００３９】
このセルラーゼ溶液１５ｇを、試料を計量したサンプルビンにとり、よく混合し、４５℃に調整した振盪器付き恒温水槽にセットし、４８時間反応させる。
【００４０】
反応終了後、予め９０℃で乾燥し恒量にした孔径１μｍのメンブレンフィルターで反応液をろ過し、更に、ろ過残分を蒸留水で洗浄する。ついで、ろ過残分の入ったメンブレンフィルターを９０℃で恒量になるまで乾燥し、下４桁の測定が可能な電子天秤で精秤する。
【００４１】
また、水溶性成分の重量を求めるために、セルラーゼを含まないｐＨ＝４．０１の緩衝液（キシダ化学（株）製）で同様の操作を行った。
【００４２】
これらの結果に基づき、式（１）より非水溶性セルロース含有量を計算した。分析結果は表１に示すように良好であった。
【００４３】
非水溶性セルロース含有量［％］＝（（Ａ−Ｂ−Ｃ）×１００）／Ａ    （１）
Ａ：試料の重量［ｇ］
Ｂ：セルラーゼ溶液中で可溶化しなかった成分の重量［ｇ］
Ｃ：水溶性成分の重量［ｇ］
【００４４】
ここで、
Ｂ＝Ｄ−Ｅ
Ｄ：セルラーゼ溶液で処理した後のろ過残分を含むメンブレンフィルターの恒量（乾燥重量）［ｇ］
Ｅ：メンブレンフィルターの恒量（乾燥重量）［ｇ］
【００４５】
Ａ−Ｃ＝Ｇ−Ｈ
Ｇ：セルラーゼを含まない緩衝液で処理した後のろ過残分を含むメンブレンフィルターの恒量（乾燥重量）［ｇ］
Ｈ：メンブレンフィルターの恒量（乾燥重量）［ｇ］
【００４６】
＜実施例２＞
試料として、パルプ含有量８５％、填料（クレー）１５％からなる上質塗工用原紙（坪量７４ｇ／ｍ２）に６８ｇ／ｍ２のポリプロピレンを基材とした粘着テープを両面、あるいは片面に貼り付けたモデルラミネート紙を調製した。
【００４７】
セルラーゼでの処理時間を２４時間とした以外は実施例１と同様に分析した。
【００４８】
分析結果は表１に示すように良好であった。また、ろ過残分はシート状透明樹脂様物であり形態観察を含めた分析を継続するのに十分な形態を保持していた。
【００４９】
＜実施例３＞
試料として、ろ紙Ｎｏ．１（綿リンター  １００％）を使用し、試料１ｇ当たりのセルラーゼ使用量を３６０００ユニット／ｇ（９０ユニット／ｇに調製したセルラーゼ溶液を２０ｇ使用）、セルラーゼでの処理温度を５０℃、処理時間を７日間（振盪なし）とした以外は実施例１と同様に分析した。分析結果は表１に示すように良好であった。
【００５０】
＜比較例１＞
試料１ｇ当たりのセルラーゼ使用量を２４００ユニット／ｇ（８ユニット／ｇに調製したセルラーゼ溶液を１５ｇ使用）とした以外は実施例１と同様に分析した。分析結果は表１に示すように問題があった。
【００５１】
＜比較例２＞
試料１ｇ当たりのセルラーゼ使用量を５１０００ユニット／ｇ（１７０ユニット／ｇに調製したセルラーゼ溶液を１５ｇ使用）とした以外は実施例１と同様に分析した。分析結果は表１に示すように問題があった。
【００５２】
【表１】
2004344041.tif 000003
【００５３】
【発明の効果】
本発明の分析法は、高価な分析機器の使用、煩雑な操作、危険性や環境負荷の大きな有害試薬を使用することなく、試料中の非水溶性セルロースを選択的かつ精度が良く分析することができ、更に分析後の非セルロース成分の形態観察を含めた分析を可能とする効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】セルラーゼ使用量と非水溶性セルロースの可溶化率との関係を示すグラフ。
【図１】
2004344041.tif 000004