(57)【要約】【課題】新規かつ有用なアポトーシス誘導剤を提供する。【解決手段】本発明のアポトーシス誘導剤は、オレンジ精油、グレープフルーツ精油、レモン精油などミカン科の植物から抽出された柑橘系精油を有効成分とする。また、柑橘系精油を中性アルミナに吸着させた後、ｎ−ヘキサンやエーテルで溶出した分画から溶出溶媒を留去して得られた画分を有効成分として用いてもよい。得られたアポトーシス誘導剤は、皮膚の新陳代謝を促したり細菌の感染治療を促し、皮膚外用剤として利用できる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
柑橘系精油を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
柑橘系精油を中性アルミナに吸着させた後、ｎ−ヘキサン若しくはエーテルで溶出して得られた画分を有効成分とすることを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
前記柑橘系精油は、オレンジ精油、グレープフルーツ精油、レモン精油からなる群から選ばれた１種若しくは２種以上であることを特徴とする請求項１又は２の何れかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
請求項１、２又は３の何れかに記載のアポトーシス誘導剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項５】
柑橘系精油をアポトーシス誘導剤として使用することを特徴とする柑橘系精油の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は新規かつ有効なアポトーシス誘導剤及び当該アポトーシス誘導剤を含有する皮膚外用剤並びに柑橘系精油の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシス誘導剤は、細胞の新陳代謝等に深く関係する。アポトーシスは個体の細胞死の一態様であって、物理的要因や化学的要因で引き起こされるネクローシスと対比される概念である。ネクローシスは、一般には、細胞が膨張し、次いで細胞膜が破裂して細胞死に至る過程を意味するが、アポトーシスは、細胞や核が凝縮して、最終的には細胞の内容物を取り込んだまま細胞が断片化して個体から脱落していく現象をいう。このアポトーシスは、現段階では、あらかじめ死ぬようにプログラム化されており、ある一定の分化過程に達すると自らアポトーシスを発揮して、自殺死を遂げると考えられている。つまり、個体の生命を維持するためには、個体を構成する細胞の分化と増殖だけではなく、特定の時期に特定の細胞が死滅することが必要である。従って、外部から侵入した細菌やウイルスのアポトーシスを誘導することによって、細菌などからの感染治癒を促したり、あるいは皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘導することにより、皮膚の新陳代謝を促進することができると考えられる。
一方、精油は古くから医薬品、食品添加物、香料、化粧品、アロマテラピー等に広く用いられている。中でも柑橘系の精油は非常にさわやかな香りを発散し、その使用用途は多岐にわたっている。これまでに、柑橘系精油には抗菌作用やアセチルコリンエステラーゼ阻害作用、ラジカルスカベンジャー活性等が存するとの報告はなされているが、アポトーシス誘導作用については未だその報告はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明の発明者らは、種々の精油について、免疫薬理活性に関して生化学的研究、細胞学的研究を進めた結果、柑橘系精油に優れたアポトーシス誘導作用があることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明のアポトーシス誘導剤は、柑橘系精油を有効成分とすることを特徴としている。また、本発明のアポトーシス誘導剤は柑橘系精油を中性アルミナに吸着させた後、ｎ−ヘキサン若しくはエーテルで溶出して得られた画分を有効成分とすることを特徴としている。
【０００５】
本発明においては、柑橘系精油として、オレンジ精油、グレープフルーツ精油、レモン精油からなる群から選ばれた１種若しくは２種以上を用いるのが好ましい。
【０００６】
また、本発明の皮膚外用剤は、上記本発明のアポトーシス誘導剤を有効成分とすることを特徴とする。
【０００７】
本発明の柑橘系精油の使用方法は、柑橘系精油をアポトーシス誘導剤として使用することを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のアポトーシス誘導剤は柑橘系精油を有効成分とすることを特徴とするものであって、本発明は柑橘類、つまりミカン科の植物から抽出された精油をアポトーシス誘導剤として使用するものである。
【０００９】
精油はエッセンシャルオイルとも呼ばれ、種々の植物から主として水蒸気蒸留などによって得られる特有の芳香を持つ揮発性油状物の総称である。通常、多成分からなり、油脂ではなく、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン及びこれらの酸化還元誘導体が主成分であり、これらに加えて、少量の高級テルペンや非テルペン化合物も含まれる場合がある。精油は、一般には水に不要であり、アルコールに可溶であるのは周知のことである。
【００１０】
本発明においては種々の精油の中でも柑橘系精油がアポトーシス誘導剤として用いられる。柑橘系の精油は、ミカン科の植物、例えば果実、果皮、花、つぼみ、葉、根皮などから抽出される。ミカン科の植物には、例えばオレンジ、ミカン、ダイダイ、タチバナ、カラタチ、ナツミカン、ポンカン、ハッサク、レモン、グレープフルーツ、ライム、ユズ、プチグレイン、マンダリン、ベルガモット、ハクセン等が例示される。この中でも、特にオレンジ、グレープフルーツ、レモンから得られた精油がアポトーシス誘導剤として好適である。また、精油を得るには果皮を用いるのが収率もよく好適である。
【００１１】
精油は、一般には上記したように種々の部位から水蒸気蒸留により得られるが、この他にも使用部位を圧搾し、精油と残渣その他の部分とを分離する圧搾法、また、低沸点の有機溶媒や液体窒素、液体二酸化炭素などの溶媒を用いた溶媒抽出法など各種の方法により得られたものも使用できる。
【００１２】
こうして得られた精油はそのままアポトーシス誘導剤として用いることができるが、通例、市販の精油は蒸留法や圧搾法により得られたものを各種の希釈溶媒で希釈したものであり、任意の希釈溶媒で希釈したものもアポトーシス誘導剤として用いることができる。このような希釈溶媒として、例えばエタノール、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、エーテル、酢酸エチル等が例示されるが、人体への影響を考慮するとエタノールが特に好ましい。また、これらの希釈溶媒として２種以上を用いても差し支えない。
【００１３】
また、本発明のアポトーシス誘導剤は、精油を中性アルミナに吸着させた後、ｎ−ヘキサン若しくはエーテルで溶出して得られた画分を有効成分とするものであって、精油から上記処理によって得られた画分をアポトーシス誘導剤として使用することもできる。精油は、モノテルペンやセスキテルペン等を主成分とする多成分系であるが、精油成分中どの成分がアポトーシス誘導作用を示すのか、現段階では詳細には不明であり、単一成分として誘導作用を示すのか、また２以上の成分の協力作用により誘導作用を発揮するのかは分かっていない。しかし、精油を、例えば中性アルミナを充填したカラムに通過させて吸着させた後、ｎ−ヘキサン若しくはエーテルによって吸着成分を溶出して得られた画分もアポトーシス誘導作用を示し、当該画分も良好なアポトーシス誘導剤として使用できる。この画分（溶出成分）は通例、溶出した溶媒を減圧下において留去して用いられる。この場合、ｎ−ヘキサンとエーテルの溶出順序は問うものではなく、吸着後ｎ−ヘキサンで溶出して得られた成分やその後さらにエーテルで溶出して得られた成分、吸着後エーテルで溶出して得られた成分やその後さらにｎ−ヘキサンで溶出して得られた成分のいずれをもアポトーシス誘導剤として利用できる。
【００１４】
本発明のアポトーシス誘導剤はそのままあるいは上記のような希釈溶媒にて希釈して用いることができるが、通例は皮膚に適用される各種の外用剤にして用いられる。この場合、アポトーシス誘導剤の濃度は精油として、製剤中０．００００１〜１０ｖ／ｗ％が適当であり、特に好ましくは０．００１〜０．１ｖ／ｗ％であるが、この範囲に限定されるものではない。
【００１５】
本発明の皮膚外用剤は、アポトーシス誘導作用によって皮膚の新陳代謝を促進する。また、細菌等による炎症等を抑え、感染治癒を促進し、感染症や潰瘍からの治療効果を発揮するものと期待され、医薬品、医薬部外品はもちろんのこと、化粧用途としても適用可能なものである。皮膚外用剤としての形態は特に問われるものではなく、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、パップ剤、硬膏剤など皮膚に適用されうる種々の製剤として提供される。なお、これらの製剤はそれぞれの常法により得ることが可能である。また、これらの外用剤においては、有効成分としてアポトーシス誘導剤のみを含有するのみならず、抗菌剤、抗生物質、殺菌消毒剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、ビタミン類などの各種有効成分はもちろんのこと、その他界面活性剤や清涼化剤、安定化剤などの種々の助剤を配合することができるのは言うまでもない。
【００１６】
【実施例】
次に本発明について、下記の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
（実施例１）
市販の柑橘系精油を用いて、本発明の効果を確認すべく以下の試験を行った。アポトーシス誘導作用を検討する際には、細胞壊死であるネクローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポトーシスが誘導された細胞は、まず細胞が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化する。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失していく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがてアポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体は、生体内においてマクロファージのような貧食細胞によって除去される。そこで、これらの現象に着目し、ヒト前骨髄性白血病細胞であるＨＬ−６０に柑橘系精油を添加して、数時間後、アポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下の方法にて実験を行った。
【００１７】
ＨＬ−６０のように株化された培養細胞では、細胞周期を解析すると、ＤＮＡ複製を行うＳ期と細胞分裂の起こるＭ期、そしてその２つの間にあるＧ０／Ｇ１期、Ｇ２期にある細胞の割合が一定となる。ここにおいて、アポトーシスが起こると一定であった細胞周期が乱れる。そこで、ヨウ化プロピジウムにより細胞のＤＮＡを染色し、細胞周期の解析を行うことによってアポトーシスが誘導された細胞の割合を求めた。
【００１８】
市販の柑橘系精油（スイートオレンジ精油：ラボラトワール・サノフロール社製：Ｌｏｔ．２１５０７，グレープフルーツ精油：生活の木社製、Ｌｏｔ．１６，レモン精油：生活の木社製，Ｌｏｔ．３９）をエタノールに希釈（２〜２０００倍）にしたものを、１ｖ／ｖ％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　を含有するＲＰＭＩ１６４０（日水製薬社製）培地に添加した。また、ＨＬ−６０細胞は、上記精油を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で最終細胞濃度が５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように調整した。なお、表中には市販の柑橘系精油量を示している。また、コントロールには、エタノールを用いた。
【００１９】
当該細胞を含む培地を、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ２下で３時間培養した。培養後の細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液で洗浄した後、７０ｖ／ｖ％エタノールで固定した。固定後の細胞をヨウ化プロピジウムで染色後、フローサイトメトリー（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＦＡＣＳｃａｎ）で細胞周期の解析を行い、アポトーシスが誘導された細胞の割合を算出した。その結果を表１に示した。
【００２０】
【表１】
2004067523.tif 000002
【００２１】
表１から分かるように、精油を加えた系の方がコントロールに比較して、アポトーシスが誘導された細胞の割合が増大しており、各精油にアポトーシス誘導作用のあることが確認された。
【００２２】
（実施例２）
実施例１で使用した市販の柑橘系精油（３１２．５μｌ）を中性アルミナに吸着させ、その後、３００ｍｌのｎ−ヘキサンで溶出した後、さらに９００ｍｌのエーテルで溶出した。ついで、それぞれの溶出液を減圧下エバポレータにて溶媒を留去した。この残留物を１ｖ／ｖ％　Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　を含有するＲＰＭＩ１６４０（同社製）培地に添加し、実施例１と同様の試験を行った。その結果を表２に示した。なお、得られた残留物はｎ−ヘキサン抽出物で３６０ｍｇ、エーテル抽出物で１０ｍｇであり、表中には残留物の添加量を示している。
【００２３】
【表２】
2004067523.tif 000003
【００２４】
表２から分かるように、精油から上記方法にて分画された分画成分にもアポトーシス誘導作用があることが確認された。
【００２５】
【発明の効果】
本発明によれば、新規でかつ有用なアポトーシス誘導剤を提供できる。特に、柑橘系精油は従来より種々の食品や医薬品、化粧品等に利用されており、その安全性も評価済みである。こうして本発明のアポトーシス誘導剤によれば、皮膚の新陳代謝を促し、感染治療等にも寄与する新規かつ安全性の高い皮膚外用剤を提供することができる。