(57)【要約】【課題】糖尿病性腎症及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧに特異的に認められる新規な一本鎖複合型糖鎖及びそれを含むＩｇＧを検出することによる糖尿病性又は膜性腎症の検査方法を提供する。【解決手段】糖尿病性腎症及び膜性腎症患者血清ＩｇＧに特異的に存在する新しい一本鎖複合型糖鎖又はそれを有するＩｇＧを検出することで糖尿病性及び膜性腎症を診断する。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造（Ｉ）：±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃを有する一本鎖複合型糖鎖。
【請求項２】
構造（ＩＩ）：±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃを有する一本鎖複合型糖鎖。
【請求項３】
請求項１又は２の糖鎖を有するＩｇＧ。
【請求項４】
構造（ＩＩＩ）：±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６／３）［Ｍａｎ（α１−３／６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃの糖鎖を有するＩｇＧ。
【請求項５】
血清ＩｇＧから糖鎖を単離し、請求項１，２又は４に示した糖鎖を検出する方法。
【請求項６】
血清から請求項３又は４に記載のＩｇＧを検出する方法。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の方法を用いる糖尿病性腎症又は膜性腎症の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖尿病性腎症又は膜性腎症を検査するのに有用なオリゴ糖を有するヒト血清イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）に存在するＮ−結合型糖鎖並びにそのヒト血清ＩｇＧのＮ−結合型糖鎖の構造の違いを検出することに基づく、受診者に与える苦痛や危険性のない糖尿病性腎症及び膜性腎症の簡便で新規かつ的確な検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、糖尿病性腎症などの腎症は腎生検が困難なことから持続性蛋白尿、腎機能障害、高血圧などの知見から診断されている。しかし、蛋白尿が出現すると治療が困難であり、腎不全に陥るのが通例である。そこで、早期に診断して治療を行うことが強く望まれている。近年、腎症の早期診断方法が開発されているが、いずれの方法も擬陽性を呈したり操作が煩雑であったりし、簡便で的確な検査方法の開発が望まれていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は糖尿病性腎症又は膜性腎症をより簡便でかつ的確に診断するのに有用な一本鎖複合型糖鎖及びそれを有するＩｇＧ並びにそれを用いる糖尿病性腎症又は膜性腎症の検査方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、構造（Ｉ）：±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃを有する一本鎖複合型糖鎖又は構造（ＩＩ）：±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃを有する一本鎖複合型糖鎖が提供される。
【０００５】
本発明に従えば、また、構造（ＩＩＩ）：±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６／３）［Ｍａｎ（α１−３／６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃの糖鎖を有するＩｇＧが提供される。
【０００６】
本発明に従えば、更に、血清中の前記糖類一本鎖複合型糖類（Ｉ）もしくは（ＩＩ）又はそれを有するＩｇＧ又はそれらを用いる前記糖類（ＩＩＩ）を有するＩｇＧの存在の有無を検出して糖尿病性又は膜性腎症を診断する方法が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ヒトＩｇＧは２本の重鎖と２本の軽鎖及びＦｃ部位に存在する２本のＮ−結合型糖鎖よりなる糖タンパク質である。健常人のＩｇＧの糖鎖は±Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎα１−６［±ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）］［±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）］Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４［±Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃという一連の少なくとも１２種の２本鎖複合型糖鎖から構成されていることがすでに示されている。ここでＧａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、またＦｕｃはフコースを表す。また、このＩｇＧの糖鎖は、さまざまな疾患、特に免疫疾患でその構造に変化が生じることも知られている。特に自己免疫疾患（膠原病）の一つである慢性関節リウマチにおいては糖鎖の非還元末端に存在するガラクトースが減少するという糖鎖構造異常を起こしていることが知られており、すでに患者血清中のＩｇＧのガラクトースを測定することによるリウマチの診断方法が確立されている（例えばアガラクトシルＩｇＧ及び診断薬に関する特許第２７２６５００号参照）。従って、特定の疾患においてＩｇＧの糖鎖構造を詳細に検討し、健常人と糖鎖の構造の違いがあれば、その構造変化を検出することにより特定の疾患の簡便な検出が可能となる。
【０００８】
膜性腎症やＩｇＡ腎症は腎糸球体への免疫グロブリンあるいは免疫複合体の沈着に起因した疾患であり、また糖尿病性腎症患者においても腎臓へのＩｇＧの沈着が認められている。従って、ＩｇＧをはじめとする免疫グロブリンの糖鎖構造が変化している可能性が考えられた。そこで糖尿病性腎症患者、膜性腎症患者、ＩｇＡ腎症患者及び健常人から血清を採取し、それぞれの血清よりＩｇＧを精製した後、ＩｇＧ糖鎖の構造を詳細に比較検討した。その結果、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧには健常人やＩｇＡ腎症患者血清のＩｇＧには検出されない新規な糖鎖が含まれていることを見出した。従って、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者にみられる新規糖鎖又はそれらを有するＩｇＧを検出することで糖尿病性腎症及び膜性腎症の検査に利用することが可能であると考え、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【実施例】
まず、健常人のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）よりＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４，ｐｐ５５−６８，Ｅ．Ｈｏｕｎｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ　ｅｄｓ．Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３に記載の方法に従って、糖鎖をヒドラジン分解により遊離させ、Ｎ−アセチル化後、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１５，６８３−９（１９９８）に記載されている方法に従いパラアミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）で糖鎖を標識し、ＡＢＥＥ化糖鎖をＯＤＳカラム（ワコーパック、ワコーシル５Ｃ１８−２００カラム、Ｗａｋｏｐａｋ，Ｗａｋｏｓｉｌ　５Ｃ１８−２００（０．４６×２５ｃｍ）、和光純薬製）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。溶出はＡ液およびＢ液によるグラジエント法によった。Ａ液は５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸溶液であり、Ｂ液は１５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸溶液である。まずカラムを４０％Ｂ液で平衡化した後、上記ＡＢＥＥ化糖鎖を添加し、その後６０分間でＢ液の割合を４０％から７０％まで上昇させて溶出した。図１（Ａ）に健常人ＩｇＧより調製したＡＢＥＥ化糖鎖の溶出図を示す。横軸は溶出時間であり、縦軸は３０４ｎｍの吸光度を示す。図に示したように健常人のＩｇＧに由来する糖鎖はａ〜ｌの１２種類のピークを与える。これらの糖鎖の構造についてはすでに明らかにされている（例えばＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２９，２０１６−２０（１９８２）に記載されている）。
【００１０】
また、慢性関節リウマチをはじめとするさまざまな疾患においてＩｇＧの糖鎖構造が変化することが知られているが、例えばＮａｔｕｒｅ　３１６，４５２−７（１９８５）に記載されているように、いずれの場合もこれら健常人ＩｇＧで検出される糖鎖の存在比率が変化するのみであり、これら以外の糖鎖がヒトＩｇＧから検出されたという報告はこれまでに存在しない。
【００１１】
一方、糖尿病性腎症患者、膜性腎症患者及びＩｇＡ腎症患者の血清ＩｇＧの糖鎖を同様にＡＢＥＥで標識後、ＯＤＳカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに供すると、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧではａ〜ｌの１２種類以外にも複数の糖鎖ピークが認められた（図１（ｃ））。ついでそれぞれのＩｇＧの糖鎖をβ−ガラクシダーゼで処理した後（条件：クエン酸−リン酸緩衝液を用いてｐＨ３．５及び３７℃で１８時間）、同様にＯＤＳカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。その結果、健常人のＩｇＧは、図１（Ｂ）に示すように、３種の糖鎖ピークを与えた。
【００１２】
これらのピークに含まれる糖鎖は既に以下の構造を有するものであることが知られている。
１）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ，
２）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ，
３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）［ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）］［ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ，
【００１３】
糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者由来のＩｇＧは、図１（Ｄ）に示すように、健常人ＩｇＧで見られる３種の糖鎖ピークに加えて、健常人やＩｇＡ腎症患者にはまったく見られない新しい４種の糖鎖ピークＷ，Ｘ，Ｙ，Ｚを認めた。これらの糖鎖ピークは健常人ＩｇＧの糖鎖から各種グリコシダーゼによる逐次分解によって調製したＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）［Ｍａｎ（α１−６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ，ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）［Ｍａｎ（α１−３）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ，ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ，ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥという構造を有する標準ＡＢＥＥ化糖鎖とＯＤＳカラムからの溶出時間が完全に一致した。また、これらの糖鎖構造をβ−ガラクシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、α−マンノシダーゼを用いた逐次エキソグリコシダーゼ処理や、メチル化分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析などにより詳細に検討した結果、ピークＷ，Ｘ，Ｙ及びＺは、それぞれ、構造：
【００１４】
ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）［Ｍａｎ（α１−６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ；
ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）［Ｍａｎ（α１−３）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ；
ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ；及び
ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ−ＡＢＥＥ
を有する糖鎖であることを確認した。
【００１５】
さらに詳細な検討を加えたところ、上記４種の新規ＩｇＧ糖鎖にはそれぞれガラクトースが付加している糖鎖も存在していた。以上の結果から、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧには健常人には見られない以下の糖鎖が存在することを見出した。
【００１６】
（１）±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ
（２）±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ
（３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）［Ｍａｎ（α１−６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ
（４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）［Ｍａｎ（α１−３）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ
【００１７】
これらのうち、構造：
±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ及び±Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ
の一本鎖Ｎ−結合型糖鎖はこれまで報告の全くない新規な糖鎖であり、また、
ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−３）［Ｍａｎ（α１−６）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ及び
ＧｌｃＮＡｃ（β１−２）Ｍａｎ（α１−６）［Ｍａｎ（α１−３）］Ｍａｎ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）［Ｆｕｃ（α１−６）］ＧｌｃＮＡｃ
もヒトにおいては報告例のない新規な糖鎖であった。
【００１８】
次に、本発明者らはこれらの糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧに見出された新規糖鎖が糖尿病性腎症及び膜性腎症患者の診断に有効であるか否かを試験するために、糖尿病性腎症患者２０例、膜性腎症患者１４例、ＩｇＡ腎症患者１３例、及び健常人１２例より血清を採取し、それぞれから希釈した血清をＤＥＡＥセルロースカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供してＩｇＧを精製後、精製ＩｇＧから糖鎖をヒドラジン分解によって遊離後、ＡＢＥＥ化し、その糖鎖をβ−ガラクシダーゼ処理後（条件：クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ３．５，３７℃１８時間）、ＯＤＳカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーで糖鎖ピークＷ，Ｘ，Ｙ及びＺの存在割合を調べた。
【００１９】
その結果、糖鎖ピークＷ，Ｘ，Ｙ，Ｚは糖尿病性腎症患者２０例及び膜性腎症患者１４例のすべての血清ＩｇＧから検出された。一方、これらの糖鎖は健常人ＩｇＧからは全く検出されず、さらにＩｇＡ腎症患者のＩｇＧからも全く検出されなかった。以上のことから、本発明に係る糖鎖の有無を血清ＩｇＧサンプルについて測定することで、あるいは上記の構造の糖鎖を有するＩｇＧを血清から検出することで、糖尿病性腎症及び膜性腎症の簡便で的確な診断が可能となったのであり、この技術は、糖尿病性腎症及び膜性腎症とＩｇＡ腎症との分別診断にも応用可能である。
【００２０】
本発明に係る上記の新規な糖鎖の存在は血清又は血清ＩｇＧから糖鎖を遊離後標識することで、逆相高速液体クロマトグラフィーで検出することができる。その際に使用されるカラムは、市販されている逆相ＨＰＬＣカラム、例えばＷａｋｏｓｉｌ　５Ｃ１８−２００カラム（和光純薬製）を用いることができる。また糖鎖の遊離にはヒドラジン分解のほかに酵素（例えばＮ−グリカナーゼ）を用いることもできる。さらに糖鎖の標識には２−アミノピリジン（ＰＡ）を用いてもよい。また、新規糖鎖の検出は市販されているマトリックス支援型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、例えばＭｏｄｅｌ　Ｖｉｓｉｏｎ　２０００（ＴｈｅｒｍｏＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｈｅｍｅｌ　Ｈｅｍｐｓｔｅｄ，Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）によっても行うことができる。この方法を用いる場合は、糖鎖を必ずしもＡＢＥＥ化またはＰＡ化する必要はない。また新規糖鎖は上記構造を有する糖鎖を特異的抗体または上記構造を有する糖鎖を認識し、健常人ＩｇＧの糖鎖を認識しないレクチンなどを用いることで、公知であるレクチンエンザイム法または酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によっても行うことができる。また新規糖鎖を有するＩｇＧの検出は上記構造を有する糖鎖あるいは上記糖鎖を有するＩｇＧを特異的に認識する抗体または上記構造を有する糖鎖を認識し、健常人ＩｇＧの糖鎖を認識しないレクチンなどを用いることで、公知であるレクチンエンザイム法または酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）によって行うことができる。
【００２１】
【発明の効果】
以上の通り、本発明によれば、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧに含まれ、健常人の血清ＩｇＧには見られない新規な糖鎖を検出することによって、糖尿病性腎症又は膜性腎症の診断に用いることができる。糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の血清ＩｇＧ中にはこの新規な糖鎖が１００％検出されるのに対し、健常人やＩｇＡ腎症患者には全く検出されないことから、従来法に比べ診断基準がきわめて明確かつ的確であり、また、血清ＩｇＧを試料として用いるため、糖尿病性又は膜性腎症の診断に際し受診者に与える苦痛や危険性もない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによるＡＢＥＥ化中性糖鎖の溶出パターンを示す図面であり、図において図１（Ａ）は健常人ＩｇＧのＡＢＥＥ化中性糖鎖の溶出パターンであり、図１（Ｂ）はβ−ガラクトシダーゼ後の健常人ＩｇＧのＡＢＥＥ化中性糖鎖の溶出パターンであり、図１（Ｃ）は糖尿病性腎症患者ＩｇＧのＡＢＥＥ化中性糖鎖の溶出パターンであり、そして図１（Ｄ）はβ−ガラクトシダーゼ後の糖尿病性腎症患者ＩｇＧのＡＢＥＥ化中性糖鎖の溶出パターンである。
【図２】健常人、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の間でのピークＷの割合を示すグラフ図であり、
【図３】健常人、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の間でのピークＸの割合を示すグラフ図であり、
【図４】健常人、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の間でのピークＹの割合を示すグラフ図であり、
【図５】健常人、糖尿病性腎症患者及び膜性腎症患者の間でのピークＺの割合を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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