(57)【要約】【課題】皮膚黒化を短時間に発症し、効率よく薬剤評価等ができるモデル動物を提供する。【解決手段】アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したＳＫＨＩＩ系へアレスマウス。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したＳＫＨＩＩ系へアレスマウス。
【請求項２】
紫外線照射した場合に、当該照射部位の皮膚がＳＫＨＩＩへアレスマウスよりも黒化する請求項１記載のマウス。
【請求項３】
紫外線照射が、７５〜１３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を２〜４週間連続照射するものである請求項２記載のマウス。
【請求項４】
アロマターゼ遺伝子欠損マウス（ＡｒＫＯ）と有色ヘアレスマウス（ＳＫＨＩＩマウス）を交配させ、アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したへアレスマウスを選抜することを特徴とする請求項１記載のマウスの作出方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のマウスを用いて皮膚黒化の予防又は治療に有効な物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は色素沈着等の皮膚黒化のモデルとなり得る実験動物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
皮膚のしみ、そばかすや日焼け後の皮膚色素沈着、老人性色素斑等の皮膚の黒化は、中高年齢層における肌の悩みの一つになっている。
皮膚の黒化は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン産生が著しく亢進した結果として生ずるものと考えられており、また最近では肌の色素沈着部位における黒化の促進や体毛の黒化等のメラニン合成の促進に、女性ホルモンであるエストロジェンが関与することが示唆されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。しかしながら、未だ明確な解明はなされていない。
従って、皮膚の黒化のメカニズムを解明し、これを防止改善する薬剤や化粧料の研究は重要である。
【０００３】
一般に、病気の発症メカニズムの解明や治療薬・治療方法の開発には病態モデル動物の開発が有効であり、皮膚の黒化を発症する動物としては、有色ヘアレスマウス（ＳＫＨＩＩマウス；非特許文献３）が知られている。斯かるヘアレスマウスは、紫外線（ＵＶＢ）照射部位が黒化するという性質を持ち、メラニン合成の研究に利用されている。
【０００４】
しかしながら、ＳＫＨＩＩマウスでは、激しい炎症が起こらないような穏やかな条件で紫外線（ＵＶＢ）を照射すると、皮膚の黒化が発症するまでに時間がかかる、黒化の度合いが低い、等の点でスクリーニングや薬効試験のためのモデル動物としては必ずしも充分とはいえない。
【０００５】
本発明は、皮膚黒化を短時間に発症し、効率よく薬剤評価等ができるモデル動物を提供することを目的とする。
【０００６】
【非特許文献１】
ＭｃＬｅｏｄ，  Ｓ．  Ｄ．，  Ｒａｎｓｏｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍａｓｏｎ，  Ｒ．  Ｓ．  （１９９４）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４９，  ９−１４．
【非特許文献２】
Ｊｅｅ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｙ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｔ．  Ｊ．  （１９９４）  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １９９，  １４０７−１４１２．
【非特許文献３】
Ｗｅｌｓｈ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｍａｓｏｎ，  Ｒ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈａｌｌｉｄａｙ，  Ｇ．  Ｍ．  （１９９９）  Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｌｌ  −ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １１２，  ２７１−２７８．
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、テストステロンをエストロジェンに変換する酵素アロマターゼを欠損しているアロマターゼ欠損マウス（ＡｒＫＯ）に着目し、これを用いて種々のマウスの作出を試みたところ、意外にもアロマターゼ欠損マウス（ＡｒＫＯ）と有色ヘアレスマウス（ＳＫＨＩＩマウス）を交配させて得られたアロマターゼホモ欠損へアレスマウス（ＡｒＫＯ（−／−）−ＳＫＨＩＩ系マウス）がこれまでのＳＫＨＩＩマウスと比較して、紫外線照射により皮膚が顕著に黒化しやすいことを見出し、これが皮膚黒化モデル動物として有用であることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したＳＫＨＩＩ系へアレスマウスを提供するものである。
【０００９】
また本発明は、アロマターゼ遺伝子欠損マウス（ＡｒＫＯ）と有色ヘアレスマウス（ＳＫＨＩＩマウス）を交配させ、アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したへアレスマウスを選抜することを特徴とする当該マウスの作出方法を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記マウスを用いて皮膚黒化の予防及び／又は治療に有効な物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明のマウスは、アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したＳＫＨＩＩ系へアレスマウスである。
アロマターゼは、テストステロンをエストロジェンに変換する酵素である。アロマターゼは、他のステロイドホルモン水酸化酵素・側鎖切断酵素と同様に、チトクロームＰ−４５０スーパーファミリーの一員であり、細胞内では小胞体膜結合した膜酵素として局在している。最近の研究では、アロマターゼは第一エクソンの違いで複数のタイプが存在し、エストロジェンの機能は局所的に制御されている可能性も示唆されるようになってきた。
アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したとは、アロマターゼ遺伝子のホモ欠損型動物（−／−）であることを意味する。
ＳＫＨＩＩ系へアレスマウスとは、メラニン研究に利用される実験動物であり（非特許文献３参照）、紫外線を照射した皮膚が黒化するという特質を有する。
【００１２】
本発明マウスは、以下のいずれか１以上の性質を示す。
１）紫外線（以下、「ＵＶＢ」という）の連続照射（７５〜１３０ｍＪ／ｃｍ２、２〜４週間）により、通常のＳＫＨＩＩマウス（アロマターゼ（＋／＋））及びアロマターゼヘテロ欠損型マウス（＋／−）と比較して明瞭な色素沈着が認められる。
例えば、１週目７５ｍＪ／ｃｍ２、２週目９０ｍＪ／ｃｍ２、３週目１０８ｍＪ／ｃｍ２、４週目１３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを連続照射し（１週間あたり５日間）、１週間毎に色彩色差計（日本電色工業３００Ａ）にてその黒化度（Ｌ値）を測定すると、２週間以上の照射で、本発明のマウスは、通常のＳＫＨＩＩマウス（アロマターゼ（＋／＋））及びアロマターゼヘテロ欠損型マウス（＋／−）と比較して明瞭な色素沈着が認められ（図１及び図２）、皮膚黒化が起こる。そして、この皮膚黒化の亢進は、４週間照射した時点でも維持される。３週から４週にかけてＬ値が３００〜４００％、好ましくは３５０〜４００％亢進し得る。
【００１３】
２）ＵＶＢの連続照射（７５〜１３０ｍＪ／ｃｍ２、２〜４週間）により、ＤＯＰＡ陽性メラノサイトの数が顕著に増加する。
例えば、ＵＶＢ（７５〜１３０ｍＪ／ｃｍ２）の２週間連続照射（１週間あたり５日間）により、通常のＳＫＨＩＩマウス（アロマターゼ（＋／＋））及びアロマターゼヘテロ欠損型マウス（＋／−）では、１ｍｍ２あたり約６０個ほどのＤＯＰＡ陽性メラノサイトが観察されるのに対し、本発明のマウスでは、２３０個ほどのＤＯＰＡ陽性メラノサイトが観察され、顕著な増加が認められる（図３Ａ，Ｂ）。このように、本発明のマウスは、上記２週間のＵＶＢ連続照射でコントロールと比べ３倍以上、好ましくは４倍以上メラノサイト数が増加し得る。
【００１４】
３）ＵＶＢの連続照射（７５〜１３０ｍＪ／ｃｍ２、２〜４週間）により、皮膚組織にチロシナーゼが発現される。
例えば、ＵＶＢ（７５〜９０ｍＪ／ｃｍ２）を２週間連続照射（１週間あたり５日間）したマウス背部の皮膚を表皮と真皮が含む状態で回収し、タンパクを抽出し、チロシナーゼの発現をウエスタンブロッティングにより解析すると、本発明マウスにのみ明瞭なチロシナーゼの発現が認められる（図４）。通常のＳＫＨＩＩマウス（アロマターゼ（＋／＋）と比較すると約３倍の発現上昇が認められた。
【００１５】
４）皮膚の色がＳＫＨＩＩマウス（アロマターゼ（＋／＋）より若干白い。
【００１６】
５）上記の形質は、常染色体上の優性遺伝子によって子孫に伝えられる。
【００１７】
以上のように、本発明の皮膚黒化マウスは、一定期間の紫外線照射によって、通常のＳＫＨＩＩマウスに比べて、ＤＯＰＡ陽性メラノサイトの数が顕著に増え、チロシナーゼが発現し、ヒト皮膚と同様な色素沈着を形成して皮膚が黒化するという特質を有する。アロマターゼがエストロジェンの合成に関与する酵素であり、エストロジェンがメラニン合成の促進に関与するという報告（非特許文献１、非特許文献２等）から判断すると、アロマターゼ遺伝子がホモ欠損したＳＫＨＩＩ系マウスにおいては色素沈着が形成されにくいと予想されたが、当該マウスが上記の性質を有していたことは全く意外であった。
斯かる性質を有する本発明のマウスは、しみ、そばかす、炎症後の色素沈着、老人性色素斑等の皮膚黒化モデルとして使用することができる。
【００１８】
本発明のマウスは、例えば、アロマターゼ欠損マウス（ＡｒＫＯ）と有色ヘアレスマウス（ＳＫＨＩＩマウス）を交配させることにより作出することができる。
すなわち、２組の染色体のうち、１つのアロマターゼを欠損したマウス（＋／−）とＳＫＨＩＩ系ヘアレスマウスを交配させて得られたマウスのうち、１つのアロマターゼを欠損したマウス（＋／−）同士を交配させ、ＳＫＨＩＩ系の形質を持ち、且つ、アロマターゼを完全に欠損したマウス（−／−）を選抜することにより本発明のマウスを取得できる。
ここで、アロマターゼ欠損マウス（ＡｒＫＯ）は、アロマターゼをコードする遺伝子内のエクソン１と２の一部を薬剤耐性遺伝子（ネオマイシンに耐性を持つ遺伝子）に組み換えることにより得ることができる。すなわち、Ｈｏｎｄａ  Ｓ．，  Ｈａｒａｄａ  Ｎ．，  Ｉｔｏ  Ｓ．，  Ｔａｋａｇｉ  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｍａｅｄａ  Ｓ．  （１９９８）．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２５２，  ４４５−４４９．に記載された方法で作成することにより入手できる。または上記方法で作成したＡｒＫＯマウスは藤田保健衛生大学総合医学研究所分子遺伝学教室原田信弘教授より分譲可能である。
有色ヘアレスマウス（ＳＫＨＩＩマウス）はＴＨＥ  ＪＡＣＫＳＯＮ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ（ＢＡＲ  ＨＡＲＢＯＲ，  ＭＡＩＮＥ）により購入することができる。
【００１９】
本発明マウスは、通常の実験マウスと同様の飼育環境で飼育すればよい。飼料も市販されているマウス用のものを使用し、飲料水としては消毒した水を利用する。
本発明マウスは、ＳＫＨＩＩ系マウスの形質を持ち且つ１つのアロマターゼ遺伝子を欠損したマウス（＋／−）同士を交配させることにより維持することができる。
【００２０】
本発明マウスは、上記のように皮膚黒化のモデルとなり得ることから、これを用いることにより、皮膚黒化を予防又は治療するための薬剤や美白剤、あるいはタンニング剤等の化粧料の素材となる物質のスクリーニングや薬効試験を行うことができる。
すなわち、経皮、注射、経口等の投与経路で被検物質の適量を、本発明マウスに投与し、その経時的作用及び効果を一般的な手段により観察、評価することにより、スクリーニングや薬効試験を行うことができる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。
実施例１  本発明マウスの作出・維持
＜作出＞
２組の染色体のうち、１つのアロマターゼを欠損したマウス（＋／−）とＳＫＨＩＩ系ヘアレスマウスを交配させて得られたマウスのうち、１つのアロマターゼを欠損したマウス（＋／−）同士を交配させ、ＳＫＨＩＩ系の形質を持ち、且つ、アロマターゼを完全に欠損したマウス（−／−）を選抜することにより本発明のマウスを取得できる。
【００２２】
＜維持＞
ＳＫＨＩＩの形質を持ち、且つ、１つのアロマターゼを欠損したマウス（＋／−）同士を交配させ、得られたマウスのうちアロマターゼ（−／−）マウス（ＡｒＫＯ）を本発明のマウスとして用いる。アロマターゼ（＋／−）マウスはさらにそれ同士を交配させることにより、本マウスの維持のために使用する。
【００２３】
実施例２  皮膚黒化度の測定
〔１〕試験方法
（１）試験動物
２組のペアアロマターゼ（＋／−）マウスより生まれた同腹子♀を以下のゲノムチェックによりアロマターゼ（＋／＋）マウス４匹、アロマターゼ（＋／−）マウス４匹、アロマターゼ（−／−）マウス（本発明マウス）４匹に分け、実験に供した。
【００２４】
＜ゲノムチェック＞
アロマターゼ（−／−）マウス（ＡｒＫＯ）は、アロマターゼの遺伝子配列の一部をネオマイシンに耐性を有する遺伝子と組み換えて得られたものであるため、抽出したゲノムをアロマターゼの共通配列とネオマイシンに特異的な下記プライマーをそれぞれ作成してＰＣＲを行い、アロマターゼ（＋／＋）マウス、アロマターゼ（＋／−）マウス、アロマターゼ（−／−）マウス（ＡｒＫＯ）に分けた。すなわち、アロマターゼの共通配列に特異的なプライマーを用いた場合のみバンドが検出されたマウスはアロマターゼ（＋／＋）マウス、ネオマイシンに特異的なプライマーを用いた場合のみバンドが検出されたマウスはアロマターゼ（−／−）マウス、両方のプライマーを用いてバンドが検出されたマウスはアロマターゼ（＋／−）マウスである。
【００２５】
プライマー：
Ａｒｏｍａｔａｓｅ  ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ＣＴＴ−ＧＴＣ−ＴＡＡ−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＡＡＴ−ＣＡＣ−３’（配列番号１）
Ａｒｏｍａｔａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ＴＴＡ−ＣＣＡ−ＴＧＴ−ＣＣＴ−ＡＡＴ−ＣＴＴ−ＣＡＣ−３’（配列番号２）
Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ＧＧＡ−ＴＧＴ−ＧＧＡ−ＡＴＧ−ＴＧＴ−ＧＣＧ−ＡＧ−３’（配列番号３）
Ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ：  Ａｒｏｍａｔａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅと同一
【００２６】
（２）ＵＶＢ照射条件
６ヶ月齢に成長したマウスに１週目７５、２週目９０、３週目１０８、４週目１３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを連続照射した（１週間あたり５日間）。
【００２７】
（３）黒化度の測定
マウス背中の脊椎が突出した部分よりも約５ｍｍほど尾部の方へ移動した部位をＵＶＢ照射前、照射１、２、３、４週後に色彩色差計（日本電色工業３００Ａ）にて測定し、黒化度の指標とした。
【００２８】
（４）ウエスタンブロッティング解析
ＵＶＢを照射したマウス背部の皮膚を表皮と真皮が含む状態で回収し、脂肪組織を切除してからホモジナイズした。さらに超音波破砕後、常法に従いタンパクを抽出し、チロシナーゼ発現のウエスタンブロッティング解析を行った。１レーンあたり１５μｇのタンパク量をアプライした。抗体には抗ヒトチロシナーゼ抗体Ｍ−１９（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いた。なお、陽性コントロールとして、ヒト培養メラノサイト抽出液をアプライした。
【００２９】
（５）ＤＯＰＡ陽性メラノサイトのカウント
ＵＶＢを照射したマウス背部皮膚を回収し、２Ｍ  ＮａＢｒに３７℃の温度下で４０分間浸漬後、表皮のみを回収した。Ｈａｃｈｉｙａ  Ａ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ａ．，  Ｏｈｕｃｈｉ  Ａ．，  Ｔａｋｅｍａ  Ｙ．  ａｎｄ  Ｉｍｏｋａｗａ  Ｇ．  （２００１）．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １１６，  ５７８−５８６．に記載された方法と同様に行った。
【００３０】
〔２〕試験結果
（１）色差計による黒化度の測定
ＵＶＢ照射前の本発明マウスは、アロマターゼ（＋／＋）マウスやアロマターゼ（＋／−）マウスと比較してくすんだような色をしており（図１）、Ｌ値も高い値を示していた（図２）。しかしながら、本発明マウスのＵＶＢ照射による黒化度の亢進は著しく、１週間連続照射した時点でアロマターゼ（＋／＋）マウスやアロマターゼ（＋／−）マウスと同程度のＬ値を示し、２週間連続照射した後では明瞭な色素沈着が認められ、Ｌ値もアロマターゼ（＋／＋）マウスやアロマターゼ（＋／−）マウスを下回った。この色素沈着の亢進は４週間照射した時点でも維持されていた（図２）。なお、本試験でアロマターゼ（＋／＋）マウスやアロマターゼ（＋／−）マウスの間に差は認められなかった。
【００３１】
（２）ＤＯＰＡ陽性メラノサイトのカウント
ＵＶＢ照射前の各マウスにおけるＤＯＰＡ陽性メラノサイトは検出できなかった。しかしながら、ＵＶＢ連続照射２週間後においては、アロマターゼ（＋／＋）マウスやアロマターゼ（＋／−）マウスとも１ｍｍ２あたり約６０個ほどのＤＯＰＡ陽性メラノサイトが観察された。一方、本発明マウスにおいては、２３０個ほどのＤＯＰＡ陽性メラノサイトが観察され、顕著な増加が認められた（図３Ａ，Ｂ）。
【００３２】
（３）ウエスタンブロッティング解析
明瞭なチロシナーゼの発現はＵＶＢを照射した本発明マウスにのみ認められた（図４）。コントロールであるアロマターゼ（＋／＋）マウスは、薄いバンドが認められるものの、本発明マウスとの差は歴然としたものであった。アロマターゼ（＋／−）マウスについては、図中には示していないがアロマターゼ（＋／＋）マウスと同様の結果が得られた。ＵＶＢ照射前においては、本発明マウス、アロマターゼ（＋／＋）マウスやアロマターゼ（＋／−）マウスのいずれにおいてもチロシナーゼの発現は検出限界以下であった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明のマウスは、しみ、そばかす、炎症後の色素沈着、老人性色素斑等の皮膚黒化のモデルとなり、これを用いることにより皮膚黒化を予防又は治療するための薬剤や美白剤、さらにはタンニング剤等の化粧料の素材となる物質のスクリーニングや薬効試験を効率的に行うことができる。
【００３４】
【配列表】
2004344103.tif 000002
2004344103.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＵＶＢ照射後のマウス皮膚色の変化を示す写真である。
【図２】図２はＵＶＢ照射後のマウス皮膚色（Ｌ値）の変化を示す図である。
【図３Ａ】図３ＡはＵＶＢ照射後のマウス表皮におけるＤＯＰＡ陽性メラノサイトを示す写真である（Ａ：コントロール、Ｂ：アロマターゼ（＋／−）マウス、Ｃ：本発明マウス；ＤＯＰＡ染色（×８０））。
【図３Ｂ】図３ＢはＵＶＢ照射後のマウス表皮におけるＤＯＰＡ陽性メラノサイトの数を示す図である。
【図４】図４はＵＢＶ照射後のマウス表皮におけるチロシナーゼの発現を示す写真である。
【図１】
2004344103.tif 000004
【図２】
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【図３Ａ】
2004344103.tif 000006
【図３Ｂ】
2004344103.tif 000007
【図４】
2004344103.tif 000008