(57)【要約】【課題】降圧薬への感受性の遺伝子診断に用いることができる核酸分子の提供。【解決手段】サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター遺伝子におけるＣ１７８４Ｔ多型をサイアザイド系利尿薬による降圧効果を予測するためのファクターとして使用する。また、エンドセリン１遺伝子におけるＬｙｓ１９８Ａｓｎ多型およびＫＬＫ１遺伝子におけるＬｙｓ１８６Ｇｌｕ多型を女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬による降圧効果を予測するためのファクターとして使用する。さらに、Ｎａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子におけるＴ（−２３２００）Ｃ多型をカルシウム拮抗薬による降圧効果を予測するためのファクターとして使用する。さらに、β３アドレナリン受容体遺伝子におけるＴｒｐ６４Ａｒｇ多型をサイアザイド系利尿薬による降圧効果を予測するためのファクターとして使用する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなる、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、第１７９０番目のシトシン残基（Ｃ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター遺伝子における、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる核酸分子であって、
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチド、またはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項６】
サイアザイド系利尿薬への感受性の判定に用いるための、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項７】
サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター遺伝子における、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出するためのプライマーペアであって、
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項８】
サイアザイド系利尿薬への感受性の判定に用いるための、請求項７に記載のプライマーペア。
【請求項９】
サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター遺伝子の変異を検出することにより、サイアザイド系利尿薬への感受性を判定する方法であって、
請求項３〜６のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項７もしくは８に記載のプライマーペアを用いて、サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター遺伝子における第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
請求項３〜６のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項７もしくは８記載のプライマーペアを含んでなる、サイアザイド系利尿薬への感受性の判定用キット。
【請求項１１】
エンドセリン１遺伝子における、エンドセリン１の第１９８番目のリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、
配列番号６で表わされるアミノ酸配列において第１９８番目のリジン残基がアスパラギン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列において、第５６６５番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５で表わされるヌクレオチド配列において、第５９４番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号６中の第１９８番目のリジン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドの、配列番号６中の第１９８番目のリジン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１６】
エンドセリン１遺伝子における、エンドセリン１の第１９８番目のリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号６で表わされるアミノ酸配列において第１９８番目のリジン残基がアスパラギン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記アスパラギン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列において、第５６６５番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１６に記載のプライマーペア。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５で表わされるヌクレオチド配列において、第５９４番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１６に記載のプライマーペア。
【請求項１９】
エンドセリン１遺伝子の変異を検出することにより、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性を判定する方法であって、
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、エンドセリン１遺伝子における、エンドセリン１の第１９８番目のリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定用キット。
【請求項２１】
カリクレイン１遺伝子における、カリクレイン１の第１８６番目のリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、
配列番号９で表わされるアミノ酸配列において第１８６番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７で表わされるヌクレオチド配列において、第３８１２番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８で表わされるヌクレオチド配列において、第５５６番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号９中の第１８６番目のリジン残基に対応するグルタミン酸残基をコードするコドンを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドの、配列番号９中の第１８６番目のリジン残基に対応するグルタミン酸残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２６】
カリクレイン１遺伝子における、カリクレイン１の第１８６番目のリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号９で表わされるアミノ酸配列において第１８６番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記グルタミン酸残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号７で表わされるヌクレオチド配列において、第３８１２番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２６に記載のプライマーペア。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号８で表わされるヌクレオチド配列において、第５５６番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項２６に記載のプライマーペア。
【請求項２９】
カリクレイン１遺伝子の変異を検出することにより、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性を判定する方法であって、
請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、カリクレイン１遺伝子における、カリクレイン１の第１８６番目のリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項３０】
請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定用キット。
【請求項３１】
Ｎａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、
前記変異を有してなるＮａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列において第２６８０１番目のシトシン残基（Ｃ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３５】
Ｎａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、
前記変異を有してなるＮａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、プライマーペア。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列において、第２６８０１番目のシトシン残基（Ｃ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項３５に記載のプライマーペア。
【請求項３７】
Ｎａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子の変異を検出することにより、カルシウム拮抗薬への感受性を判定する方法であって、
請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項３５もしくは３６に記載のプライマーペアを用いて、Ｎａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項３８】
請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項３５もしくは３６に記載のプライマーペアを含んでなる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定用キット。
【請求項３９】
β３アドレナリン受容体遺伝子における、β３アドレナリン受容体の第６４番目のトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、サイアザイド系利尿薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、
配列番号３７で表わされるアミノ酸配列において第６４番目のトリプトファン残基がアルギニン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３５で表わされるヌクレオチド配列において、第１３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３６で表わされるヌクレオチド配列において、第３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、配列番号３７中の第６４番目のトリプトファン残基に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなる、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドの、配列番号３７中の第６４番目のトリプトファン残基に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができる、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４４】
β３アドレナリン受容体遺伝子における、β３アドレナリン受容体の第６４番目のトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、サイアザイド系利尿薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、
配列番号３７で表わされるアミノ酸配列において第６４番目のトリプトファン残基がアルギニン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記アルギニン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３５で表わされるヌクレオチド配列において、第１３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項４４に記載のプライマーペア。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号３６で表わされるヌクレオチド配列において、第３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項４４に記載のプライマーペア。
【請求項４７】
β３アドレナリン受容体遺伝子の変異を検出することにより、サイアザイド系利尿薬への感受性を判定する方法であって、
請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、β３アドレナリン受容体遺伝子における、β３アドレナリン受容体の第６４番目のトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項４８】
請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の核酸分子、および／または請求項４４〜４６のいずれか一項に記載のプライマーペアを含んでなる、サイアザイド系利尿薬への感受性の判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、降圧薬への感受性の遺伝子診断に用いることができるポリヌクレオチドおよび核酸分子に関する。
【０００２】
背景技術
高血圧症患者の９０％以上は、遺伝素因や環境因子がその原因として複雑に関与している本態性高血圧症の患者である。本態性高血圧症は我が国において３０００万人以上が罹患している最も多い疾患と考えられている。本態性高血圧症はそれ自体無症候であることが多いが、脳卒中、虚血性心疾患、腎不全等の発症に強く関与する。従って、本態性高血圧症の制圧により、これらの重篤な疾患の発症を抑制できると考えられる。
【０００３】
本態性高血圧症の治療には塩分制限や減量などの生活習慣の改善が有効であるが、降圧が不十分な場合には種々の降圧薬による薬物療法が施行される。薬物療法を行う際の薬剤の選択は、ガイドラインなどの大まかな目安はあるものの、ほとんど医師の判断に委ねられるのが現状である。主に使用される降圧薬としては、サイアザイド系利尿薬（以下「ＴＺＤ」という）、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（以下「ＡＣＥＩ」という）、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（以下「ＡＲＢ」という）、カルシウム拮抗薬（以下「ＣＣＢ」という）、β受容体遮断薬、およびα１受容体遮断薬が挙げられる。
【０００４】
近年、患者によって個々に異なる遺伝的素因が薬剤の効果にも関連することが知られている。ＴＺＤは、Ｇタンパク質β３サブユニット遺伝子の第１０エクソン上のＣ／Ｔ多型（Ｃ８２５Ｔ）で変異型のホモ接合体であるＴＴ型を有する高血圧患者において、強い降圧効果を示すことが知られている（非特許文献１：Ｔｅｒｎｅｒ  ＳＴ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＧＬ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ＡＢ，  Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ  Ｅ．：  Ｃ８２５Ｔ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  β３−ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｔｈｉａｚｉｄｅ  ｄｉｕｒｅｔｉｃｓ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３７：７３９−７４３，  ２００１）。また、イオンの膜輸送に関与すると考えられている膜骨格タンパク質のα−ａｄｄｕｃｉｎ遺伝子上の、グリシン／トリプトファンのアミノ酸変異を伴う多型（Ｇｌｙ４６０Ｔｒｐ）において変異型を有する高血圧患者は、血漿レニン活性が有意に低く、ＴＺＤの降圧効果が顕著であることが報告されている（非特許文献２：Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  Ｎ，  Ｍｕｎｕｎｔａ  Ｐ，  Ｆｉｌｉｇｈｅｄｄｕ  Ｆ，  Ｔｒｏｆｆａ  Ｃ，  Ｓｔｅｌｌａ  Ｐ，  ＢＡｒｌａｓｓｉｎａ  Ｃ，  Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｃ，  Ｓｏｒｏ  Ａ，  Ｄｅｔｔｏｒｉ  Ｆ，  Ｐａｒｐａｇｌｉａ  ＰＰ，  Ａｌｉｂｒａｎｄｉ  ＭＴＳ，  Ｃｒｕｓｉ  Ｄ，  Ｂｉａｎｃｈｉ  Ｇ：  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆα−ａａｄｕｃｉｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｂｌｌｏｄ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｏｄｉｕｍ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｙ  ｎｏｔ  ｂｅ  ｅｘｃｌｕｄｅｄ  ｂｙ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３４：６４９−６５４，  １９９９）。
【０００５】
また、Ｇ蛋白質αサブユニット遺伝子の第５エクソン上の多型が高血圧患者におけるβ受容体遮断薬の効果に関連することが報告されている（非特許文献３：Ｊｉａ  Ｈ，  Ｈｉｎｇｏｒａｎｉ  ＡＤ，  Ｓｈａｒｍａ  Ｐ，  Ｈｏｐｐｅｒ  Ｒ，  Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  Ｃ，  Ｔｒｕｔｗｗｅｉｎ  Ｄ，  Ｌｌｏｙｄ  ＤＤ，  Ｂｒｏｗｎ  ＭＪ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ（ｓ）α  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｅｅｓｅｎｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  β−ｂｌｏｃｋａｄｅ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３４：８−１４，  １９９９）。
【０００６】
一方、ＡＣＥＩの効果にについては、少ない患者数での検討ではあるが、アンジオテンシン変換酵素遺伝子のＩ／Ｄ多型やアンジオテンシノーゲン遺伝子（ＡＧＴ）のＭ２３５Ｔ多型は関連しないとの報告がある（非特許文献４：Ｄｕｄｌｙ  Ｃ，  Ｋｅａｖｎｅｙ  Ｂ，  Ｃｏｎｗａｙ  Ｊ，  Ｂｉｒｄ  Ｒ，  Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  Ｐ：  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｒｕｇａ  ｕｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ：ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎｉｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｇｅｎｅｓ，  Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １４：２５９−２６２，  １９９６）。
【０００７】
従って、ＣＣＢ、ＡＣＥＩ、またはＡＲＢの効果と明らかな関連を示す遺伝子変異は報告されておらず、ＴＺＤの効果に影響を与える遺伝子多型についての報告も少ないのが現状である。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｔｅｒｎｅｒ  ＳＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３７：７３９−７４３，  ２００１
【非特許文献２】
Ｇｌｏｒｉｏｓｏ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３４：６４９−６５４，  １９９９
【非特許文献３】
Ｊｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ３４：８−１４，  １９９９
【非特許文献４】
Ｄｕｄｌｙ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １４：２５９−２６２，  １９９６
【０００９】
【発明の概要】
本発明者らは、サイアザイドセンシティブＮａ−Ｃｌコトランスポーター（以下「ＴＳＣ」という）遺伝子において、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を見出し、さらにこの変異がＴＺＤへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、エンドセリン１（以下「ＥＤＮ１」という）遺伝子において、ＥＤＮ１の第１９８番目のリジン残基をコードするコドンのアスパラギン残基をコードするコドンへの変異がＡＣＥＩへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、カリクレイン１（以下「ＫＬＫ１」という）遺伝子において、ＫＬＫ１の第１８６番目のリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異が、ＡＣＥＩへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、Ｎａ＋−Ｃａ２＋エクスチェンジャー（以下「ＮＣＸ１」という）遺伝子において、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するＣ／Ｔ多型が、ＣＣＢへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。さらに、本発明者らは、β３アドレナリン受容体（以下「ＡＤＲＢ３」という）遺伝子において、ＡＤＲＢ３の第６４番目のトリプトファン残基をコードするコドンのアルギニン残基をコードするコドンへの変異がＴＺＤへの感受性の判定に利用可能であるとの知見を得た。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１０】
従って、本発明は、降圧薬であるＣＣＢ、ＡＣＥＩ、またはＴＺＤへの感受性の判定に用いることができる変異型ポリヌクレオチド、核酸分子およびプライマーペアの提供を目的とする。
【００１１】
そして、本発明の第一の態様による変異型ポリヌクレオチドは、ＴＳＣ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなるものである。
【００１２】
さらに、本発明の第一の態様による核酸分子は、ＴＳＣ遺伝子における、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる核酸分子であって、本発明の第一の態様による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１３】
さらに、本発明の第一の態様によるプライマーペアは、ＴＳＣ遺伝子における、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明の第一の態様によるポリヌクレオチドの、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。
【００１４】
さらに、本発明の第二の態様による核酸分子は、ＥＤＮ１遺伝子における、ＥＤＮ１の第１９８番目のリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、配列番号６で表わされるアミノ酸配列において第１９８番目のリジン残基がアスパラギン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１５】
さらに、本発明の第二の態様によるプライマーペアは、ＥＤＮ１遺伝子における、ＥＤＮ１の第１９８番目のリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、配列番号６で表わされるアミノ酸配列において第１９８番目のリジン残基がアスパラギン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記アスパラギン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。
【００１６】
さらに、本発明の第三の態様による核酸分子は、ＫＬＫ１遺伝子における、ＫＬＫ１の第１８６番目のリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、配列番号９で表わされるアミノ酸配列において第１８６番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１７】
さらに、本発明の第三の態様によるプライマーペアは、ＫＬＫ１遺伝子における、ＫＬＫ１の第１８６番目のリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、配列番号９で表わされるアミノ酸配列において第１８６番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記グルタミン酸残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００１８】
さらに、本発明の第四の態様による核酸分子は、ＮＣＸ１遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、前記変異を有してなるＮＣＸ１遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００１９】
さらに、本発明の第四の態様によるプライマーペアは、ＮＣＸ１遺伝子における、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、前記変異を有してなるＮＣＸ１遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、前記遺伝子の翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。
【００２０】
さらに、本発明の第五の態様による核酸分子は、ＡＤＲＢ３遺伝子における、ＡＤＲＢ３の第６４番目のトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、サイアザイド系利尿薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、配列番号３７で表わされるアミノ酸配列において第６４番目のトリプトファン残基がアルギニン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。
【００２１】
さらに、本発明の第五の態様によるプライマーペアは、ＡＤＲＢ３遺伝子における、ＡＤＲＢ３の第６４番目のトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、サイアザイド系利尿薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３７で表わされるアミノ酸配列において第６４番目のトリプトファン残基がアルギニン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記アルギニン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。
【００２２】
本発明によれば、ＴＳＣ遺伝子、ＥＤＮ１遺伝子、ＫＬＫ１遺伝子、ＮＣＸ１遺伝子、またはＡＤＲＢ３遺伝子における上記変異の有無を検出することにより、降圧薬であるＣＣＢ、ＡＣＥＩ、またはＴＺＤへの感受性の判定が可能となる。
【００２３】
【発明の具体的説明】
ＴＳＣ遺伝子は、配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードしている。該遺伝子のヌクレオチド配列は、本発明において特に制限されるものではないが、そのゲノム配列は、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなり、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡは、例えば、配列番号２で表されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２４】
ＴＳＣ遺伝子は、第１イントロン中の第１５０２番残基に対応するヌクレオチドにおいて、シトシン残基（Ｃ）とチミン残基（Ｔ）との一塩基多型（以下「Ｃ１７８４Ｔ多型」という。）を有している。この一塩基多型の位置は、配列番号１では第１７９０ヌクレオチド残基に相当する。
【００２５】
ＥＤＮ１遺伝子は、配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードしている。該遺伝子のヌクレオチド配列は、本発明において特に制限されるものではないが、そのゲノム配列は、例えば、配列番号４で表されるヌクレオチド配列を含んでなり、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡは、例えば、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２６】
ＥＤＮ１遺伝子は、これによりコードされる配列番号６のアミノ酸配列の第１９８番残基をコードするコドンにおいて、リジン残基をコードするコドンとアスパラギン残基をコードするコドンとの多型（以下「Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型」という）を有しており、このような多型としては、例えば、前記コドンの第３ヌクレオチド残基におけるグアニン残基（Ｇ）とチミン残基（Ｔ）との一塩基多型（以下「Ｇ５３９７Ｔ多型」という。）が挙げられる。この一塩基多型の位置は、配列番号４では第５６６５ヌクレオチド残基に相当し、配列番号５では第５９４ヌクレオチド残基に相当する。
【００２７】
ＫＬＫ１遺伝子は、配列番号９で表されるアミノ酸配列をコードしている。該遺伝子のヌクレオチド配列は、本発明において特に制限されるものではないが、そのゲノム配列は、例えば、配列番号７で表されるヌクレオチド配列を含んでなり、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡは、例えば、配列番号８で表されるヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２８】
ＫＬＫ１遺伝子は、これによりコードされる配列番号９のアミノ酸配列の第１８６番残基をコードするコドンにおいて、リジン残基をコードするコドンとグルタミン酸残基をコードするコドンとの多型（以下「Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型」という）を有しており、このような多型としては、例えば、前記コドンの第１ヌクレオチド残基におけるアデニン残基（Ａ）とグアニン残基（Ｇ）との一塩基多型（以下「Ａ３７７６Ｇ多型」という。ＮＣＢＩデータベース登録番号：ｒｓ５５１７）が挙げられる。この一塩基多型の位置は、配列番号７では第３８１２ヌクレオチド残基に相当し、配列番号８では第５５６ヌクレオチド残基に相当する。
【００２９】
ＮＣＸ１遺伝子は、例えば、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列を含んでなるプロモーター領域を有する。そして、ＮＣＸ１遺伝子は、そのプロモーター領域中において、翻訳開始点に対して２３２００ヌクレオチド上流に位置するヌクレオチド残基におけるシトシン残基（Ｃ）とチミン残基（Ｔ）との一塩基多型（以下「Ｔ（−２３２００）Ｃ多型」という。ＮＣＢＩデータベース登録番号：ｒｓ２３０１３４０）を有する。この一塩基多型の位置は、配列番号１０では第２６８０１ヌクレオチド残基に相当する。
【００３０】
ＡＤＲＢ３遺伝子は、配列番号３７で表されるアミノ酸配列をコードしている。該遺伝子のヌクレオチド配列は、本発明において特に制限されるものではないが、そのゲノム配列は、例えば、配列番号３５で表されるヌクレオチド配列を含んでなり、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡは、例えば、配列番号３６で表されるヌクレオチド配列を含んでなる。なお、配列番号３５で表されるヌクレオチド配列は、第１エクソンの上流側の１０００ヌクレオチド（プロモーター領域）および第２エクソンの下流側の１０００ヌクレオチド（ターミネーター領域）を含んでいる。
【００３１】
ＡＤＲＢ３遺伝子は、これによりコードされる配列番号３７のアミノ酸配列の第６４番残基をコードするコドンにおいて、トリプトファン残基をコードするコドンとアルギニン残基をコードするコドンとの多型（以下「Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型」という）を有しており、このような多型としては、例えば、前記コドンの第１ヌクレオチド残基におけるチミン残基（Ｔ）とシトシン残基（Ｃ）との一塩基多型（以下「Ｔ７２７Ｃ多型」という。）が挙げられる。この一塩基多型の位置は、配列番号３５では第１３８７ヌクレオチド残基に相当し、配列番号３６では第３８７ヌクレオチド残基に相当する。
【００３２】
ＴＳＣ遺伝子におけるＣ１７８４Ｔ多型は、ＴＺＤによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。従って、その多型部位のヌクレオチドを同定することにより、被験者のＴＺＤへの感受性の判定が可能となる。
【００３３】
さらに、ＥＤＮ１遺伝子におけるＬｙｓ１９８Ａｓｎ多型、例えばＧ５３９７Ｔ多型は、女性におけるＡＣＥＩによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。従って、その多型部位のヌクレオチドを同定することにより、女性被験者のＡＣＥＩへの感受性の判定が可能となる。
【００３４】
さらに、ＫＬＫ１遺伝子におけるＬｙｓ１８６Ｇｌｕ多型、またはＡ３７７６Ｇ多型は、女性におけるＡＣＥＩによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。従って、その多型部位のヌクレオチドを同定することにより、女性被験者のＡＣＥＩへの感受性の判定が可能となる。
【００３５】
さらに、ＮＣＸ１遺伝子におけるＴ（−２３２００）Ｃ多型は、ＣＣＢによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。従って、その多型部位のヌクレオチドを同定することにより、被験者のＣＣＢへの感受性の判定が可能となる。
【００３６】
さらに、ＡＤＲＢ３遺伝子におけるＴｒｐ６４Ａｒｇ多型、例えばＴ７２７Ｃ多型は、ＴＺＤによる降圧効果を予測するためのファクターとして使用できる。従って、その多型部位のヌクレオチドを同定することにより、被験者のＴＺＤへの感受性の判定が可能となる。
【００３７】
ＴＳＣ遺伝子におけるＣ１７８４Ｔ多型は、本発明者らによって見出されたものである。従って、本発明によれば、Ｃ１７８４Ｔ多型部位においてチミン残基（Ｔ）を有する変異型ＴＳＣ遺伝子が提供される。
【００３８】
そして、本発明の第一の態様による変異型ポリヌクレオチドは、ＴＳＣ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、前記遺伝子の第１イントロンの第１５０２番目に位置するシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を有してなるポリヌクレオチドである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、第１７９０番目のシトシン残基（Ｃ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００３９】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても、相補鎖がハイブリダイズした二本鎖であってもよい。
【００４０】
本発明による変異型ポリヌクレオチドは、それぞれの変異を検出する際の標的として有用であり、さらには、降圧薬への感受性を改善する化合物をスクリーニングするためにも有用である。
【００４１】
さらに、本発明によれば、ＴＳＣ遺伝子、ＥＤＮ１遺伝子、ＫＬＫ１遺伝子、ＮＣＸ１遺伝子またはＡＤＲＢ３遺伝子上の上記多型部位におけるヌクレオチドの変異を検出することのできる核酸分子が提供される。
【００４２】
そして、本発明の第一の態様による核酸分子は、ＴＳＣ遺伝子における、Ｃ１７８４Ｔ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる核酸分子であって、本発明の第一の態様による変異型ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。この核酸分子は、好ましくは、ＴＺＤへの感受性の判定に用いるためのものとされる。
【００４３】
本発明の第二の態様による核酸分子は、ＥＤＮ１遺伝子における、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型部位でのリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、女性におけるＡＣＥＩへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、配列番号６で表わされるアミノ酸配列において第１９８番目のリジン残基がアスパラギン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列において、第５６６５番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列、または配列番号５で表わされるヌクレオチド配列において、第５９４番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００４４】
本発明の第三の態様による核酸分子は、ＫＬＫ１遺伝子における、Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型部位におけるリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性におけるＡＣＥＩへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、配列番号９で表わされるアミノ酸配列において第１８６番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号７で表わされるヌクレオチド配列において第３８１２番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるもの、または配列番号８で表わされるヌクレオチド配列において第５５６番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００４５】
本発明の第四の態様による核酸分子は、ＮＣＸ１遺伝子におけるＴ（−２３２００）Ｃ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定に用いるための核酸分子であって、前記変異を有してなるＮＣＸ１遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドとハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列において第２６８０１番目のシトシン残基（Ｃ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００４６】
本発明の第五の態様による核酸分子は、ＡＤＲＢ３遺伝子における、Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型部位でのトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、ＴＺＤへの感受性の判定に用いるための核酸分子であって、配列番号３７で表わされるアミノ酸配列において第６４番目のトリプトファン残基がアルギニン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３５で表わされるヌクレオチド配列において、第１３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列、または配列番号３６で表わされるヌクレオチド配列において、第３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００４７】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、核酸分子を標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズさせることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、あるポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子は、そのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの全部または一部の配列を含んでなるものとされる。
【００４８】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。本発明の好ましい実施態様によれば、核酸分子はＤＮＡである。
【００４９】
本発明による核酸分子のヌクレオチド配列は、当業者により適宜設計されうる。例えば、本発明による核酸分子は、プロモーター領域、ターミネーター領域、エクソン、およびイントロンのいずれにハイブリダイズする部分をも含むことができる。
【００５０】
本発明による核酸分子は、各標的遺伝子（すなわち、ＴＳＣ、ＥＤＮ１、ＫＬＫ１、ＮＣＸ１、またはＡＤＲＢ３）における多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸プローブとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、それぞれの多型部位を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００５１】
従って、本発明の第一の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、ＴＳＣ遺伝子のＣ１７８４Ｔ多型部位のシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第二の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型部位を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第三の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型部位のコドンを含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第四の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型部位のヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。本発明の第五の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドの、Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型部位を含む領域にハイブリダイズするヌクレオチド断片を含んでなることが好ましい。
【００５２】
本発明による核酸分子を核酸プローブとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜１００ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜５０ヌクレオチドとする。
【００５３】
また、本発明による核酸分子は、各標的遺伝子における多型部位のヌクレオチドの同定において、核酸増幅用プライマーとして用いることができる。この目的のためには、本発明による核酸分子は、多型部位を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００５４】
従って、本発明の第一の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、ＴＳＣ遺伝子のＣ１７８４Ｔ多型部位のシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第二の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型部位を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第三の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型部位のコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第四の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型部位のヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。本発明の第五の態様による核酸分子は、上記ポリヌクレオチドの、Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型部位を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものであることが好ましい。
【００５５】
本発明による核酸分子を核酸増幅用プライマーとして用いる場合、核酸分子の鎖長は１０〜５０ヌクレオチドとすることが好ましく、より好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドとする。
【００５６】
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子の鎖長は、１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは１７〜５０ヌクレオチドとする。このような鎖長を有する本発明による核酸分子は、特に夾雑物を含む核酸試料において、各標的遺伝子上の多型部位のヌクレオチドを同定する上で好ましいものである。
【００５７】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。よって、本発明によれば、各標的遺伝子上の上記多型部位におけるヌクレオチドの同定に用いることのできるプライマーペアが提供される。
【００５８】
そして、本発明の第一の態様によるプライマーペアは、ＴＳＣ遺伝子における、Ｃ１７８４Ｔ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出するためのプライマーペアであって、本発明の第一の態様による変異型ポリヌクレオチドの、前記遺伝子のＣ１７８４Ｔ多型部位のシトシン残基（Ｃ）に対応する部分を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。このプライマーペアは、好ましくはＴＺＤへの感受性の判定に用いるためのものとされる。
【００５９】
本発明の第二の態様によるプライマーペアは、ＥＤＮ１遺伝子における、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型部位でのリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、女性におけるＡＣＥＩへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、配列番号６で表わされるアミノ酸配列において第１９８番目のリジン残基がアスパラギン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記アスパラギン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号４で表わされるヌクレオチド配列において、第５６６５番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列、または配列番号５で表わされるヌクレオチド配列において、第５９４番目のグアニン残基（Ｇ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００６０】
本発明の第三の態様によるプライマーペアは、ＫＬＫ１遺伝子における、Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型部位でのリジン残基をコードするコドンのグルタミン酸残基をコードするコドンへの変異を検出しうる、女性におけるアンジオテンシン変換酵素阻害薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、配列番号９で表わされるアミノ酸配列において第１８６番目のリジン残基がグルタミン酸残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記グルタミン酸残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号７で表わされるヌクレオチド配列において第３８１２番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列、または配列番号８で表されるヌクレオチド配列において第５５６番目のアデニン残基（Ａ）がグアニン残基（Ｇ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００６１】
本発明の第四の態様によるプライマーペアは、ＮＣＸ１遺伝子における、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出しうる、カルシウム拮抗薬への感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、前記変異を有してなるＮＣＸ１遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型部位のヌクレオチド残基に対応するチミン残基（Ｔ）を含む領域を核酸増幅法において増幅することができるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは配列番号１０で表わされるヌクレオチド配列において、第２６８０１番目のシトシン残基（Ｃ）がチミン残基（Ｔ）に置換されたヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００６２】
本発明の第五の態様によるプライマーペアは、ＡＤＲＢ３遺伝子における、Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型部位でのトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異を検出しうる、ＴＺＤへの感受性の判定に用いるためのプライマーペアであって、配列番号３７で表わされるアミノ酸配列において第６４番目のトリプトファン残基がアルギニン残基に置換されてなるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの、前記アルギニン残基をコードするコドンを含む領域を核酸増幅法において増幅しうるものである。ここで、前記ポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３５で表わされるヌクレオチド配列において、第１３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列、または配列番号３６で表わされるヌクレオチド配列において、第３８７番目のチミン残基（Ｔ）がシトシン残基（Ｃ）に置換されてなるヌクレオチド配列を含んでなるものとされる。
【００６３】
このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができる。このようなプライマーは、増幅の対象となる領域のヌクレオチド配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖のヌクレオチド配列中における５’末端部分の配列を有するものとすることができる。
【００６４】
本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いることにより、各標的遺伝子における上記多型部位のヌクレオチドを同定することができ、これにより、降圧薬への感受性を判定することができる。従って、本発明によれば、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアを用いる、降圧薬への感受性を判定する方法が提供される。
【００６５】
そして、本発明の第一の態様による方法は、ＴＳＣ遺伝子の変異を検出することにより、ＴＺＤへの感受性を判定する方法であって、本発明の第一の態様による核酸分子、および／または本発明の第一の態様によるプライマーペアを用いて、ＴＳＣ遺伝子における、Ｃ１７８４Ｔ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異の有無を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、Ｃ１７８４Ｔ多型部位におけるＴアレルが検出される。
【００６６】
本発明の第二の態様による方法は、ＥＤＮ１遺伝子の変異を検出することにより、女性におけるＡＣＥＩへの感受性を判定する方法であって、本発明の第二の態様による核酸分子、および／または本発明の第二の態様によるプライマーペアを用いて、ＥＤＮ１遺伝子における、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型部位のリジン残基をコードするコドンがアスパラギン残基をコードするコドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、Ｇ５３９７Ｔ多型部位におけるＴアレルが検出される。
【００６７】
本発明の第三の態様による方法は、ＫＬＫ１遺伝子の変異を検出することにより、女性におけるＡＣＥＩへの感受性を判定する方法であって、本発明の第三の態様による核酸分子、および／または本発明の第三の態様によるプライマーペアを用いて、ＫＬＫ１遺伝子における、Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型部位のリジン残基をコードするコドンがグルタミン酸残基をコードするコドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、Ａ３７７６Ｇ多型部位におけるＧアレルが検出される。
【００６８】
本発明の第四の態様による方法は、ＮＣＸ１遺伝子の変異を検出することにより、ＣＣＢへの感受性を判定する方法であって、本発明の第四の態様による核酸分子、および／または本発明の第四の態様によるプライマーペアを用いて、ＮＣＸ１遺伝子における、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型部位でのシトシン残基（Ｃ）のチミン残基（Ｔ）への変異を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型部位におけるＴアレルが検出される。
【００６９】
本発明の第五の態様による方法は、ＡＤＲＢ３遺伝子の変異を検出することにより、ＴＺＤへの感受性を判定する方法であって、本発明の第五の態様による核酸分子、および／または本発明の第五の態様によるプライマーペアを用いて、ＡＤＲＢ３遺伝子における、Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型部位のトリプトファン残基をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンとなる変異の有無を検出する工程を含んでなるものである。この方法では、好ましくは、Ｔ７２７Ｃ多型部位におけるＣアレルが検出される。
【００７０】
具体的には、本発明による核酸分子または本発明によるプライマーペアは、各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定するための核酸増幅法においてプライマーとして用いることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて、被験者由来の核酸試料を鋳型とする核酸増幅法を行ない、得られた増幅産物中において上記各多型部位のヌクレオチドを同定する工程を含んでなる、降圧薬への感受性を判定する方法が提供される。
【００７１】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、得られた核酸試料を鋳型として、本発明による核酸分子またはプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸増幅法およびこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、核酸増幅法としてはＰＣＲ法等を用いることができる。
【００７２】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【００７３】
上記の核酸増幅法とダイレクトシークエンス法とにより上記各多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、例えば、以下の配列を有するプライマーを用いて核酸増幅法を行ない、同プライマーをシークエンスプライマーとしてダイレクトシークエンス法を行なうことができる。
【００７４】
Ｃ１７８４Ｔ多型用：
フォワード：５’−ＴＧＡＡＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣ−３’（配列番号１１）；
リバース：５’−ＡＣＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号１２）。
【００７５】
Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型用：
フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＡ−３’（配列番号１３）；
リバース：５’−ＴＧＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＣＣＡ−３’（配列番号１４）。
【００７６】
Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型用：
フォワード：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧ−３’（配列番号１５）；
リバース：５’−ＡＧＣＴＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１６）。
【００７７】
Ｔ（−２３２００）Ｃ多型用：
フォワード：５’−ＴＧＡＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＣＴＡＧＡＧＣＡＧ−３’（配列番号１７）；
リバース：５’−ＴＣＴＣＣＣＧＴＴＧＴＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＴＧ−３’（配列番号１８）。
【００７８】
Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型用：
フォワード：５’−ＣＡＣＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡ−３’（配列番号４０）；
リバース：５’−ＧＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号４１）。
【００７９】
本発明による判定法においては、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、一方のプライマーを多型部位に対合できるように設計し、他方のプライマーを多型部位を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に前記多型にかかるいずれかのアレルが存在する場合には増幅産物が得られ、これが存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより特定のアレルの有無を判定することができる。
【００８０】
本発明による核酸分子は、ハイブリダイゼーション法等による各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドの同定にプローブとして用いることができる。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸分子と被験者由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、降圧薬への感受性の判定方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、上記各多型にかかるいずれかのアレルの存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物に対して適用することもできる。
【００８１】
この方法による診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ等の核酸試料を抽出し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる前記ヌクレオチドの同定法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法については、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｓｃｈ，  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）を参照することができる。
【００８２】
各標的遺伝子における上記各多型が一塩基多型である場合において、該一塩基多型部位のヌクレオチドを同定するためには、本発明による核酸分子をプライマーとして使用するプライマーエクステンション法を用いることもできる。プライマーエクステンション法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記のプライマーエクステンション法としては、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法として知られる方法が用いられる。
【００８３】
ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法においては、一塩基多型の部位に隣接するプライマーであって、伸長反応によりその３’末端に付加するヌクレオチドが前記一塩基多型の部位に相補的なものとなるプライマーが用いられる。このようなプライマーを使用し、被験者からの核酸試料を鋳型としてプライマーの伸長反応が行なわれるが、その際にｄｄＮＴＰ（ジデオキシＮＴＰ）を用いることにより、伸長反応は、上記の多型部位に対応する一個のヌクレオチドを取り込んだ時点で終了する。取り込まれたヌクレオチドは、蛍光標識等で予め標識しておくことにより容易に同定され、従って、多型部位のヌクレオチドが同定される。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００８４】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法においては、被験者からの核酸試料を鋳型とするプライマーの伸長反応の際に、４種のｄＮＴＰを１種ずつ反応させる。ｄＮＴＰのいずれかが取り込まれると、等量のピロリン酸塩（ＰＰｉ）が遊離し、遊離したＰＰｉはスルフリラーゼと反応してＡＴＰを生成させ、このＡＴＰによりルシフェラーゼの反応が起こり、発光が起こる。従って、ある特定のｄＮＴＰを加えたときに発光が起こった場合には、そのｄＮＴＰに対応するヌクレオチドが取り込まれたことが明らかとなり、これにより核酸試料中の対象部位のヌクレオチドが同定される。この方法においては、ｄＮＴＰが用いられるため、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法で用いられるような多型部位に隣接するプライマーを用いる必要はなく、数塩基はなれたプライマーを用いてもよい。このような方法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００８５】
各標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定する場合には、さらに、本発明による核酸分子をプローブおよび／またはプライマーとして使用する遺伝子型決定法（タイピング法）を用いることもできる。遺伝子型決定法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプローブおよび／またはプライマーの具体的ヌクレオチド配列は、当業者であれば容易に決定することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、上記の遺伝子型決定法としては、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法として知られる方法が用いられる。
【００８６】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法においては、上記各多型部位のヌクレオチドを含む領域に対して、両アレルのそれぞれに特異的にハイブリダイズする２種のプローブであって、それぞれ別の蛍光標識物質が５’末端に付され、その蛍光標識に対するクエンチャー（消光物質）が３’末端に付されてなるプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられ、これらをＰＣＲ反応液中に添加して、被験者由来の核酸試料を鋳型とするＰＣＲ反応を行なう。ＴａｑＭａｎプローブおよびＰＣＲ用のプライマーとしては、本発明による核酸分子を用いることができ、それらの具体的なヌクレオチド配列は、当業者であれば適宜決定することができるため特に制限されないが、例えば、以下のようなヌクレオチド配列とすることができる。また、２種の蛍光標識物質は、互いに識別可能な組合せであればよく、そのような蛍光標識物質の組合せはそれぞれのクエンチャーとともに当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはＦＡＭ、ＶＩＣ、およびＴＥＴのいずれかの組合せを用いる。
【００８７】
（１）Ｃ１７８４Ｔ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用：  ＦＡＭ−ＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣ−ＭＧＢ（配列番号１９）、
Ｔアレル用：  ＶＩＣ−ＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＣＧＴＣ−ＭＧＢ（配列番号２０）；
プライマー：
フォワード：ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴ（配列番号２１）、
リバース：ＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号２２）。
【００８８】
（２）Ｇ５３９７Ｔ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｇアレル用：  ＦＡＭ−ＡＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡ−ＭＧＢ（配列番号２３）、
Ｔアレル用：  ＶＩＣ−ＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧ−ＭＧＢ（配列番号２４）；
プライマー：
フォワード：ＣＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＴＧ（配列番号２５）、
リバース：ＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＣＧＧＴＴＧＴ（配列番号２６）。
【００８９】
（３）Ａ３７７６Ｇ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ａアレル用：  ＦＡＭ−ＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡ−ＭＧＢ（配列番号２７）、
Ｇアレル用：  ＶＩＣ−ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴ−ＭＧＢ（配列番号２８）；
プライマー：
フォワード：ＴＣＣＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＴ（配列番号２９）、
リバース：ＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＣ（配列番号３０）。
【００９０】
（４）Ｔ（−２３２００）Ｃ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：  ＦＡＭ−ＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＣ−ＭＧＢ（配列番号３１）、
Ｃアレル用：  ＶＩＣ−ＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧ−ＭＧＢ（配列番号３２）；
プライマー：
フォワード：ＴＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＴ（配列番号３３）、
リバース：ＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＡＧＡ（配列番号３４）。
【００９１】
（５）Ｔ７２７Ｃ多型用
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：  ＦＡＭ−ＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＡ−ＭＧＢ（配列番号３８）、
Ｃアレル用：  ＶＩＣ−ＴＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＧ−ＭＧＢ（配列番号３９）；
プライマー：
フォワード：ＣＡＣＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡ（配列番号４０）、
リバース：ＧＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣ（配列番号４１）。
【００９２】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法においては、まず、各アレルにＴａｑＭａｎプローブがハイブリダイズし、プライマーからの伸長反応がそのハイブリダイゼーション領域に到達した際にＴａｑＤＮＡポリメラーゼの作用によって蛍光標識物質が遊離する。遊離した蛍光標識物質はクエンチャーの作用を受けないため、蛍光を発する。従って、この方法によれば、各アレルの存在量に対応する強度の各蛍光を観察することができ、これにより、被験者の遺伝子型が容易に決定される。
【００９３】
本発明による降圧薬への感受性の判定方法においては、ＴＳＣ遺伝子において、Ｔ１７８４Ｃ多型におけるＴアレルが検出されたサンプルは、ＴＺＤを投与した場合の降圧効果が低いものと、あるいはその可能性があるものと判定することができる。また、ＥＤＮ１遺伝子において、Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ多型におけるアスパラギンをコードするコドン、例えばＧ５３９７Ｔ多型におけるＴアレルが検出された女性のサンプルは、ＡＣＥＩ投与による降圧効果が低いものと、あるいはその可能性があるものと判定することができる。ＫＬＫ１遺伝子において、Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ多型におけるグルタミン酸をコードするコドン、例えばＡ３７７６Ｇ多型におけるＧアレルが検出された女性のサンプルは、ＡＣＥＩ投与による降圧効果が高いものと、あるいはその可能性があるものと診断することができる。ＮＣＸ１遺伝子において、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型におけるＴアレルが検出されたサンプルは、ＣＣＢを投与した場合の降圧効果が高いものと、あるいはその可能性があるものと判定することができる。ＡＤＲＢ３遺伝子において、Ｔｒｐ６４Ａｒｇ多型におけるアルギニンをコードするコドン、例えばＴ７２７Ｃ多型におけるＣアレルが検出されたサンプルは、ＴＺＤを投与した場合の降圧効果が低いものと、あるいはその可能性があるものと判定することができる。本発明によれば、出生前および出生直後の診断も可能である。
【００９４】
以上のような降圧薬（すなわち、ＴＺＤ、ＡＣＥＩ、およびＣＣＢ）への感受性を判定するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発明によるキットは、本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを含んでなる。本発明によるキットはさらに、上記各種標的遺伝子における上記各多型部位のヌクレオチドを同定するための具体的方法に応じて、試薬類、反応容器、説明書等を含んでいてもよい。
【００９５】
【実施例】
以下本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるれものではない。
【００９６】
例１：ＴＳＣ遺伝子中の多型とＴＺＤによる降圧効果との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）にて受診中の本態性高血圧患者で、ＴＺＤを処方された男性３８人および女性３７人の計７５人を対象とした（平均年齢６４．７±１０．０歳）。遺伝子解析に先立ち、被験者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結可能匿名化した。
【００９７】
ＴＳＣ遺伝子をダイレクトシークエンスしたところ、両アレルが５％以上の頻度を示す多型として、第１イントロン中のＣ１７８４Ｔ（配列番号１の第１７９０番目のヌクレオチドにおけるＣ／Ｔ多型）が見られた。
【００９８】
次いで、Ｃ１７８４Ｔに関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。
【００９９】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて行なった。このＴａｑＭａｎシステムにおいては、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、６ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全７．５μｌの反応溶液を３８４ウェルプレート上に調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−下記アニーリング温度で１分間の反応を４０サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。
【０１００】
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｃアレル用：  ＦＡＭ−ＣＡＧＡＧＡＣＧＣＣＧＴＣＣ−ＭＧＢ（配列番号１９）（２００ｎＭ）、
Ｔアレル用：  ＶＩＣ−ＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＣＧＴＣ−ＭＧＢ（配列番号２０）（２００ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴ（配列番号２１）（８００ｎＭ）、
リバース：ＡＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧ（配列番号２２）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル。
【０１０１】
次いで、ＴＺＤ（６４．５％のインダパミド、２６．３％のトリクロルメチアジド、７．９％のメフルシドおよび１．３％のヒドロクロロチアジドを含む）の投与により、５ｍｍＨｇ未満の血圧降下、または血圧上昇を示した群（ＮＲ）と、５ｍｍＨｇ以上の血圧降下を示した群（Ｒ）との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表１に示す。
【０１０２】
【表１】
2004313168.tif 000002
【０１０３】
Ｔアレルの頻度はＲ群と比較して、ＮＲ群において有意に高率であった（ＣＣ：ＴＴ＋ＣＴ＝２０：１０ｉｎＮＴ，４０：５ｉｎＨＴ、ｐ＝０．０１８、オッズ比：４．００、９５％ＣＩ：１．２０〜１３．２８、Ｃ  ａｌｌｅｌｅ：Ｔ  ａｌｌｅｌｅ＝４９：１１ｉｎＮＴ，８５：５ｉｎＨＴ、ｐ＝０．０１３、オッズ比：３．８２、９５％ＣＩ：１．２５〜１１．６３）。よって、Ｔアレルを有する被験者は、ＴＺＤを投与した場合に降圧しにくいことが示された。
【０１０４】
以上の解析結果から、本態性高血圧患者において、ＴＳＣ遺伝子における第１イントロン中のＣ１７８４Ｔ多型は、ＴＺＤによる降圧効果を予測するファクターとして使用できることがわかる。
【０１０５】
例２：ＥＤＮ１遺伝子上の多型とＡＣＥＩによる降圧効果との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）にて受診中の本態性高血圧患者で、ＡＣＥＩを処方された男性５６名および女性４２名の計９８人を対象とした（平均年齢６５．６±１０．７歳）。遺伝子解析に先立ち、被験者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結可能匿名化した。
【０１０６】
ＥＤＮ１遺伝子をダイレクトシークエンスしたところ、両アレルが５％以上の頻度を示す第５エクソンの、Ｇ５３９７Ｔ（配列番号４の第５６６５ヌクレオチドにおけるＧ／Ｔ多型）が見られ、該多型はＥＤＮ１の第１９８アミノ酸におけるリジン／アスパラギンのアミノ酸置換を伴うものであった。
【０１０７】
次いで、Ｇ５３９７Ｔに関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は例１と同様に行った。
【０１０８】
ＴａｑＭａｎプローブ
Ｇアレル用：  ＦＡＭ−ＡＧＧＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＡ−ＭＧＢ（配列番号２３）（２０２ｎＭ）、
Ｔアレル用：  ＶＩＣ−ＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＣＴＣＣＡＧ−ＭＧＢ（配列番号２４）（７５５ｎＭ）；
プライマー
フォワード：ＣＡＧＣＧＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＴＧ（配列番号２５）（８００ｎＭ）、
リバース：ＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＣＧＧＴＴＧＴ（配列番号２６）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：６０℃；
サイクル数：４０サイクル。
【０１０９】
次いで、得られたデータをｔ検定によって解析し、各遺伝子型間でＡＣＥＩ投与による平均血圧降下を比較した。その結果を下記の表２に示す。
【０１１０】
【表２】
2004313168.tif 000003
【０１１１】
女性における収縮期の血圧降下の比較において、ＧＧ型を有する者では１３．２±３．１ｍｍＨｇであるのに対し、Ｔアレルを有する者では４．８±２．０ｍｍＨｇであり、有意差が認められた（ｐ＝０．０３）。
【０１１２】
次いで、ＡＣＥＩ投与によるＮＲ群とＲ群との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表３に示す。
【０１１３】
【表３】
2004313168.tif 000004
【０１１４】
表から明らかなように、女性でのみ、ＧＧ型の頻度がＲ群において有意に高率であった（ｐ＝０．０３１、オッズ比：４．００、９５％ＣＩ：１．１１〜１４．４３）。よってＡＣＥＩの効果においてＴアレルを有する女性被験者は、ＡＣＥＩを投与した場合に降圧しにくいことが示された。
【０１１５】
以上の解析結果から、本態性高血圧の女性患者において、ＥＤＮ１遺伝子における、第５エクソン中のＧ５３９７Ｔ（Ｌｙｓ１９８Ａｓｎ）多型は、ＡＣＥＩによる降圧効果を予測するファクターとして使用できることがわかる。
【０１１６】
例３：ＫＬＫ１遺伝子上の多型とＡＣＥＩによる降圧効果との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）にて受診中の本態性高血圧患者で、ＡＣＥＩを処方された男性５６名および女性４２名の計９８人を対象とした（平均年齢６５．６±１０．７歳）。遺伝子解析に先立ち、被験者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結可能匿名化した。
【０１１７】
ＫＬＫ１遺伝子をダイレクトシークエンスしたところ、両アレル頻度が５％以上の頻度を示す第４エクソンのＡ３７７６Ｇ（配列番号７の第３８１２ヌクレオチドにおけるＡ／Ｇ多型；ｒｓ５５１７）が見られ、該多型はＫＬＫ１の第１８６番目におけるリジン／グルタミン酸のアミノ酸置換を伴うものであった。
【０１１８】
次いで、Ａ３７７６Ｇに関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、例１と同様に行った。
【０１１９】
ＴａｑＭａｎプローブ
Ａアレル用：  ＦＡＭ−ＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡ−ＭＧＢ（配列番号２７）（２００ｎＭ）、
Ｇアレル用：  ＶＩＣ−ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴ−ＭＧＢ（配列番号２８）（２００ｎＭ）；プライマー
フォワード：ＴＣＣＧＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＴ（配列番号２９）（８００ｎＭ）、
リバース：ＣＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＣ（配列番号３０）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル。
【０１２０】
次いで、ＡＣＥＩ投与によるＮＲ群とＲ群との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表４に示す。
【０１２１】
【表４】
2004313168.tif 000005
【０１２２】
表４から明らかなように、女性でのみ、Ｇアレルの頻度がＲ群において、有意に高率であった（ｐ＝０．０５、オッズ比：３．９１、９５％ＣＩ：１．０３〜２．７０）。よってＧアレルを有する女性被験者は、ＡＣＥＩを投与した場合に降圧しやすいことが示された。
【０１２３】
以上の解析結果から、本態性高血圧の女性患者において、ＫＬＫ１遺伝子における、第４エクソン中のＡ３７７６Ｇ（Ｌｙｓ１８６Ｇｌｕ）多型は、ＡＣＥＩによる降圧効果を予測するファクターとして使用できることがわかる。
【０１２４】
例４：ＮＣＸ１遺伝子上の多型とＣＣＢによる降圧効果との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）にて受診中の本態性高血圧患者で、新規にＣＣＢを処方された男性８４名および女性８１名の計１６５人を対象とした（平均年齢６５．０±９．２歳）。遺伝子解析に先立ち、被験者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結可能匿名化した。
【０１２５】
ＮＣＸ１遺伝子をダイレクトシークエンスしたところ、両アレルの頻度がともに５％以上となる多型として、プロモーター領域中のＴ（−２３２００）Ｃ（配列番号１０の第２６８０１ヌクレオチドにおけるＴ／Ｃ多型）が見られた。
【０１２６】
次いで、Ｔ（−２３２００）Ｃ多型に関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるタイピングを行なった。ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は例１と同様に行った。
【０１２７】
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：  ＦＡＭ−ＣＣＣＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＣ−ＭＧＢ（配列番号３１）（１００ｎＭ）、
Ｃアレル用：  ＶＩＣ−ＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴＧＴＴＧ−ＭＧＢ（配列番号３２）（１００ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＴＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＧＧＴＴ（配列番号３３）（８００ｎＭ）、
リバース：ＧＧＣＡＧＴＣＡＣＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＡＧＡ（配列番号３４）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：５６℃；
サイクル数：４０サイクル。
【０１２８】
次いで、得られたデータをｔ検定によって解析し、各アレル間でＣＣＢ投与による平均の血圧降下を比較した。その結果を下記の表５に示す。
【０１２９】
【表５】
2004313168.tif 000006
【０１３０】
平均の血圧降下は、Ｃアレルを有する者では９．８±０．９ｍｍＨｇであるのに対し、Ｔアレルを有する者では１６．８±２．９ｍｍＨｇであり、有意差が認められた（ｐ＝０．０１２）。
【０１３１】
さらに、ＣＣＢ投与によるＮＲ群とＲ群との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表６に示す。
【０１３２】
【表６】
2004313168.tif 000007
【０１３３】
表から明らかなように、Ｔアレル頻度がＲ群で有意に高率であった。（ｐ＝０．０５、オッズ比：６．３０、９５％ＣＩ：０．８１〜３．８７）。よって、Ｔアレルを有する被験者は、ＣＣＢを投与した場合に降圧しやすいことが示された。
【０１３４】
以上の解析結果から、本態性高血圧患者において、ＮＣＸ１遺伝子における、プロモーター領域のＴ（−２３２００）Ｃ多型は、ＣＣＢによる降圧効果を予測するファクターとして使用できることがわかる。
【０１３５】
例５：ＡＤＲＢ３遺伝子中の多型とＴＺＤによる降圧効果との関連
以下の遺伝子解析においては、国立循環器病センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）にて受診中の本態性高血圧患者で、ＴＺＤを処方された男性３７人および女性３７人の計７４人を対象とした（平均年齢６５．７±８．８歳）。遺伝子解析に先立ち、被験者全員から遺伝子解析についてのインフォームドコンセントを取得し、連結可能匿名化した。
【０１３６】
次いで、ＡＤＲＢ３遺伝子中のＴ７２７Ｃ多型に関し、被験者全員についてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるタイピングを行なった。
【０１３７】
ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法は、ＴａｑＭａｎシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて行なった。このＴａｑＭａｎシステムにおいては、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ）、６ｎｇのゲノムＤＮＡ、下記のＴａｑＭａｎプローブ、および下記のプライマーを含む全７．５μｌの反応溶液を３８４ウェルプレート上に調製し、９５℃で１０分間の反応の後、９２℃で１５秒間−下記アニーリング温度で１分間の反応を４０サイクル行なった。ＰＣＲ産物の蛍光は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）を用いて測定した。
【０１３８】
ＴａｑＭａｎプローブ：
Ｔアレル用：  ＦＡＭ−ＣＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧＣＧＡ−ＭＧＢ（配列番号３８）（２００ｎＭ）、
Ｃアレル用：  ＶＩＣ−ＴＣＧＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＧ−ＭＧＢ（配列番号３９）（２００ｎＭ）；
プライマー：
フォワード：ＣＡＣＧＴＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡ（配列番号４０）（８００ｎＭ）、
リバース：ＧＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＴＣ（配列番号４１）（８００ｎＭ）；
アニーリング温度：５８℃；
サイクル数：４０サイクル。
【０１３９】
次いで、ＴＺＤ（６４．５％のインダパミド、２６．３％のトリクロルメチアジド、７．９％のメフルシドおよび１．３％のヒドロクロロチアジドを含む）の投与により、５ｍｍＨｇ未満の平均血圧降下、または平均血圧上昇を示した群（ＮＲ）と、５ｍｍＨｇ以上の平均血圧降下を示した群（Ｒ）との間のアレル頻度の比較を、χ２検定により行なった。その結果を下記の表７に示す。
【０１４０】
【表７】
2004313168.tif 000008
【０１４１】
Ｃアレルの頻度はＲ群と比較して、ＮＲ群において有意に高率であった（ＴＴ：ＣＣ＋ＣＴにおいて、ｐ＝０．００２、オッズ比：６．６７、９５％ＣＩ：１．８９〜２３．５３、Ｔアレル：Ｃアレルにおいて、ｐ＝０．００３、オッズ比：４．５９、９５％ＣＩ：１．５４〜１３．６８）。よって、Ｃアレルを有する被験者は、ＴＺＤを投与した場合に降圧しにくいことが示された。
【０１４２】
以上の解析結果から、本態性高血圧患者において、ＡＤＲＢ３遺伝子中のＴ７２７Ｃ多型は、ＴＺＤによる降圧効果を予測するファクターとして使用できることがわかる。
【０１４３】
【配列表】
2004313168.tif 000009
2004313168.tif 000010
2004313168.tif 000011
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