(57)【要約】【課題】肝臓の幹細胞に特異的な細胞表面マーカーを明らかにし、このマーカーにより肝幹細胞を同定し、分離する方法を提供すること。【解決手段】肝幹細胞に特異的な糖鎖の発現を検出することにより、多能性を有する肝細胞前駆細胞を同定する。肝幹細胞に特異的な糖鎖の発現の検出にはレクチンや抗体を使用することができる。さらに、前記の糖鎖の発現が検出された細胞を選択することにより、多能性を有する肝細胞前駆細胞が分離される。分離された細胞は再生治療、遺伝子治療に有用である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖を検出する工程を包含することを特徴とする多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定方法。
【請求項２】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するタンパク質を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するレクチンまたは抗体を用いることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖がインゲンマメレクチン（Ｅ４ＰＨＡ）、小麦胚レクチン（ＷＧＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、あるいはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）から選択される少なくとも一つのレクチンによって認識される糖鎖構造を含むことを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
多能性を有する肝細胞前駆細胞の分離方法であって、前記細胞に発現する糖鎖を指標として細胞の選択を行うことを特徴とする方法。
【請求項６】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するタンパク質を用いることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するレクチンまたは抗体を用いることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖がインゲンマメレクチン（Ｅ４ＰＨＡ）、小麦胚レクチン（ＷＧＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、あるいはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）から選択される少なくとも一つのレクチンによって認識される糖鎖構造を含むことを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定方法であって、前記細胞に発現する糖鎖の合成に関与する酵素の発現を検出する工程を包含することを特徴とする方法。
【請求項１０】
酵素の発現の検出が酵素活性の測定、酵素タンパク量の測定または酵素をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡ量の測定により実施される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、シアリルトランスフェラーゼ、またはα−１，６フコシルトランスフェラーゼの発現を検出することを特徴とする請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項５〜８いずれか記載の方法により多能性肝細胞前駆細胞の分離を行う工程を含有する、多能性肝細胞前駆細胞含有組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定方法およびその分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝臓は非常に再生能の高い臓器として知られているが、近年の細胞生物学の進展によって、幹細胞システムに基づいてその恒常性が制御されている事が明らかになりつつある。肝臓の幹細胞を同定、分離する技術は肝臓の再生治療を実現する上で重要なテクノロジーである。
【０００３】
近年、フローサイトメトリーなど細胞分離技術の発達に伴って幹細胞の分離法が開発され、特に造血系幹細胞に関しては細胞表面のさまざまな抗原を利用した分離法が開発されており、分離された一つの細胞から骨髄が再構築された例も報告されている。肝臓の幹細胞の候補としては、オーバル細胞（ｏｖａｌ  ｃｅｌｌ）、肝芽細胞、骨髄由来細胞などが考えられている。これらの細胞はいずれも肝細胞に分化することが出来、肝障害の病態に関与しているものと考えられる。肝臓の幹細胞に関しても前述したようなフローサイトメトリーを用いた方法が導入され、肝臓中にわずかしか存在しないうえに、形態的に区別できない幹細胞を選択的に分離、回収する方法が考案されている。例えば谷口らはマウス胎仔肝臓中の非血球細胞画分（ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞）に存在するｃ−Ｍｅｔ＋ＣＤ４９ｆ＋／ｌｏｗ  ｃ−Ｋｉｔ−ＣＤ４５−Ｔｅｒ１１９−細胞を各抗原に特異的な蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーによって分離し、この細胞画分中に増殖能が高く、かつ肝細胞と胆管細胞の二種類の異なった細胞に分化可能な多分化能を持っている細胞が含まれていることを報告している（例えば、非特許文献１参照）。あるいは、フェリスはラミニン、デスモプラキンＩ、細胞間接着分子（ＣＣＡＭ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ−４、γグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇＧＴ）、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−５、およびＶＬＡ−６からなる群より選択される抗原を発現する細胞について選択する工程を含む肝実質細胞から肝幹細胞を分離する方法を報告している（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特表２００２−５２００１５号
【非特許文献１】
ザ  ジャーナル  オブ  セル  バイオロジー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１５６巻、第１７３−１８４頁（２００２年）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、現在までのところ、肝臓の幹細胞に関する確実な定義がなされておらず、また幹細胞から成熟細胞に分化していく各段階で、どのような細胞表面抗原が発現しているのかについて十分には解析されていない。
一方、糖鎖は糖タンパク質や糖脂質の形で細胞表面に分布し、細胞同士あるいは細胞と細胞外マトリックスとの相互作用や細胞内シグナリング、タンパク質のターゲティングに重要な役割を果たしている。近年糖鎖の生合成に関与する糖転移酵素が多数クローニングされ、糖鎖の生物学的機能に関する情報が蓄積されつつある。
【０００６】
本発明は、上述の現状に鑑みてなされたもので、肝臓細胞の未分化細胞から成熟細胞に分化する過程における細胞表面糖鎖の構造変化や糖転移酵素活性あるいは遺伝子発現を解析し、多能性を有する肝細胞前駆細胞に特異的な細胞表面糖鎖マーカーを同定し、この糖鎖マーカーにより肝幹細胞を同定し、分離する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、多能性を有する肝細胞前駆細胞の糖タンパク質はインゲンマメレクチン（Ｅ４ＰＨＡ）、小麦胚レクチン（ＷＧＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、あるいはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）との反応性が特異的に高く、初代培養肝細胞や肝癌細胞由来の糖タンパク質と大きく異なっていることを見いだし、これらの細胞表面糖鎖抗原をマーカーとして、多能性を有する肝細胞前駆細胞を同定し、フローサイトメトリーなど細胞分離技術を用いて当該細胞を分離することに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は、
（１）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖を検出する工程を包含することを特徴とする多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定方法、
（２）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するタンパク質を用いることを特徴とする上記（１）記載の方法、
（３）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するレクチンまたは抗体を用いることを特徴とする上記（２）記載の方法、
（４）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖がインゲンマメレクチン（Ｅ４ＰＨＡ）、小麦胚レクチン（ＷＧＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、あるいはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）から選択される少なくとも一つのレクチンによって認識される糖鎖構造を含むことを特徴とする上記（３）記載の方法、
（５）  多能性を有する肝細胞前駆細胞の分離方法であって、前記細胞に発現する糖鎖を指標として細胞の選択を行うことを特徴とする方法、
（６）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するタンパク質を用いることを特徴とする上記（５）記載の方法、
（７）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖に結合するレクチンまたは抗体を用いることを特徴とする上記（６）記載の方法、
（８）  多能性を有する肝細胞前駆細胞に発現する糖鎖がインゲンマメレクチン（Ｅ４ＰＨＡ）、小麦胚レクチン（ＷＧＡ）、レンズマメレクチン（ＬＣＡ）、あるいはヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）から選択される少なくとも一つのレクチンによって認識される糖鎖構造を含むことを特徴とする上記（７）記載の方法、
（９）  多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定方法であって、前記細胞に発現する糖鎖の合成に関与する酵素の発現を検出する工程を包含することを特徴とする方法、
（１０）  酵素の発現の検出が酵素活性の測定、酵素タンパク量の測定または酵素をコードする遺伝子由来のｍＲＮＡ量の測定により実施される上記（９）記載の方法、
（１１）  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、シアリルトランスフェラーゼ、またはα−１，６フコシルトランスフェラーゼの発現を検出することを特徴とする上記（９）または（１０）記載の方法、
（１２）  上記（５）〜（８）いずれか記載の方法により多能性肝細胞前駆細胞の分離を行う工程を含有する、多能性肝細胞前駆細胞含有組成物の製造方法、
に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明における多能性を有する肝細胞前駆細胞とは、肝臓において異なった機能を持つ複数の成熟細胞に分化する事の出来る多分化能と自己と同じ細胞を複製できる自己複製能を兼ね備えた細胞であり、長寿の細胞または不死の細胞であれば細胞の起源に制限は無く、肝臓に局在する細胞には限定されない。例えば、肝臓を構成する細胞集団の中で最も未分化な細胞であり、肝臓における多分化能を有する細胞の候補としては、例えば胆管上皮細胞と肝細胞に分化可能なオーバル細胞と呼ばれる前駆細胞が知られている。また、門脈周囲領域にはより未分化で多分化能を持つ細胞が存在すると考えられている。また、骨髄細胞や末梢血中にも肝細胞に分化可能な幹細胞が存在する可能性も指摘されている。本発明の多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定方法および分離方法は、これらの未分化で多能性を有する肝細胞前駆細胞候補に好適に適用される。
【００１０】
多能性を有する肝細胞前駆細胞を分離するための材料としては、当該細胞を含むことが予想される器官、組織であれば特に限定はなく、例えば成体肝臓組織や胎生肝臓組織、あるいは骨髄細胞や末梢血液細胞などを肝細胞前駆細胞の同定、分離に好適に用いることができる。さらに、本発明の多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定、分離法を既存の細胞分画法によって分画された細胞群に対して適用する事によって、より未分化で多分化能を有する細胞を分離することができる。
【００１１】
本発明の多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定、分離には、例えばレクチンを用いることが出来る。レクチンは免疫反応産物以外の糖結合性タンパク質あるいは糖タンパク質で細胞または複合糖質を凝集する事が出来るものと定義されており、植物性レクチンと動物性レクチンが存在する。本発明に用いられるレクチンとしては多能性を有する肝細胞前駆細胞表面に発現する糖鎖に反応するものであれば特に制限はない。本発明においては、前記細胞において特異的に発現している糖鎖に反応するレクチンが特に好適に使用される。認識する糖鎖構造（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が詳細に調べられた種々のレクチンが糖鎖構造研究用に市販されており、これらを本発明に好適に用いることができる。これらのレクチンの糖鎖認識特異性に関しては例えば、２００２年、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）発行、ウィリアム・Ｊ・レナーツ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．  Ｌｅｎｎａｒｚ）、ジェラルド・Ｗ・ハート（Ｇｅｒａｌｄ  Ｗ．  Ｈａｒｔ）編集、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第２３０巻、第６６−８６頁や新生化学実験講座３、糖質Ｉ、糖タンパク質（上）、第３−２９頁に詳しく記載されている。
【００１２】
例えば、本発明者らが多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定、分離に用いることが出来ることを見いだしたレクチンは以下のものが挙げられる。インゲンマメレクチンは慣用名がＥ４ＰＨＡであり、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造を持つコンプレックス型糖鎖構造を認識して結合する事が知られている。小麦胚レクチンは慣用名がＷＧＡであり、シアル酸やバイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造を持つハイブリッド型あるいはコンプレックス型糖鎖構造を認識して結合する。レンズマメ（レンチル）レクチンは慣用名がＬＣＡであり、例えば２本鎖コンプレックス型糖鎖で還元末端に位置するＮ−アセチルグルコサミン残基にα−Ｌ−フコース残基が結合した構造の糖鎖をもつ糖ペプチドや糖タンパク質、あるいは３本鎖コンプレックス型糖鎖でα−Ｄ−マンノース残基のＣ−２，６で分岐した構造の糖鎖を持つ糖ペプチドや糖タンパク質に強い親和性を有する。ヒイロチャワンタケレクチンは慣用名がＡＡＬであり、フコース残基に特異的なレクチンで、α−１，２およびα−１，３−Ｌ−フコース残基に対しても結合するが、特にα−１，６−Ｌ−フコース残基を持つ糖鎖に対して強い親和性を有する。
【００１３】
レクチンはそのまま、あるいはＦＩＴＣなどの蛍光標識、パーオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識したレクチンを用いることができる。また、複数のレクチンを組み合わせて使用することもできる。
【００１４】
本発明におけるレクチンによる多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定の為には、たとえばレクチンブロッティング法、レクチンカラム法、標識レクチンによる細胞染色法、標識レクチンを用いたフローサイトメトリーなどの方法が用いられる。これらの方法の詳細については例えば、１９９６年、秀潤社発行、グライコバイオロジー実験プロトコール、細胞工学別冊、実験プロトコールシリーズや１９９９年、医歯薬出版株式会社発行、日本電気泳動学会編集、最新電気泳動実験法などに記載されている。
【００１５】
レクチンブロッティングについては例えば以下のように行う。分析対象の細胞を１回ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄後、ＴＮＥバッファー（１％ＮＰ−４０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡとプロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸、ｐＨ  ７．８）で溶解する。８〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで３〜１０μｇのタンパク質を電気泳動後、ニトロセルロース膜にエレクトロブロッティングする。ブロッティング終了後、３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）中で室温、一晩ブロッキングを行う。ビオチン化レクチンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）で１０００倍程度に希釈し、この希釈液中でニトロセルロース膜を室温で３０分から２時間、あるいは４℃で数時間から一晩インキュベーションする。ビオチン化レクチンは、例えば生化学工業株式会社から市販されているものを用いることが出来る。レクチンとのインキュベーションの終了した膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０分間、３回洗浄する。パーオキシダーゼ標識アビジンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで適当に希釈した液に洗浄後の膜を浸して室温で３０分から２時間インキュベーションする。膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０分間、３回洗浄する。ＥＣＬキット（アマシャム  バイオサイエンス社製）などの化学発光基質を用いて発色させ、膜上の糖タンパク質に結合しているレクチンを検出する。
【００１６】
細胞由来の糖脂質を試料とする場合は、クロロホルム、メタノール、水、あるいはこれらの混合溶媒を用いて細胞から糖脂質を抽出し、これを薄層クロマトグラフィーで分離した後、直接薄層クロマトグラフ上でレクチンを用いた糖脂質の検出を行ってもよいし、あるいは、展開後の薄層クロマトグラフからアイロンあるいはＡＴＴＯ社製のＴＬＣサーマルブロッター等を用いて糖脂質をＰＶＤＦ膜に転写し、この膜上の糖脂質を上述した糖タンパク質の場合と同様にレクチンで検出することも出来る。
【００１７】
本発明におけるレクチンによる多能性を有する肝細胞前駆細胞の分離の手段は、特に限定されるものでなく、一般的な細胞分離方法を用いればよい。例えばフローサイトメトリーによる細胞分画法や磁気ビーズによる細胞分画法、レクチンを結合させた樹脂を用いたレクチンカラムクロマトグラフィーによる分離法が用いられる。これらの方法の詳細については例えば最新電気泳動実験法、日本電気泳動学会編集、医歯薬出版株式会社や新細胞工学実験プロトコール、細胞工学  別冊８、秀潤社などに記載されている。
【００１８】
レクチンフローサイトメトリーについては例えば以下のように行う。肝臓細胞をＰＢＳで２回洗浄する。０．０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えて５分ほど放置してからよく懸濁する。２０００ｒｐｍで遠心分離後、上清を捨てて、細胞をＰＢＳで洗浄する。約５μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ標識レクチンを細胞懸濁液に混ぜ、適当な温度で適当な時間放置する。レクチンの糖鎖構造に対する特異性は、インキュベーションの温度で変化する事が知られているので、使用するレクチンごとにインキュベーションの温度と時間を適宜設定する事が好ましい。レクチンとの反応後、細胞をＰＢＳで３回洗浄する。細胞をＰＢＳに懸濁し、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ  （ＦＡＣＳ）にかけ、レクチンで特異的に標識された蛍光強度の強い細胞集団を分画する。
【００１９】
本発明の多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定、分離には、例えば本発明のレクチンによって認識される糖鎖構造に特異的に結合する抗糖鎖抗体、またはその誘導体を用いることも出来る。糖鎖に対する抗体を調製するためには、例えば、本発明のレクチンによって認識される糖鎖構造を有する糖鎖をそのまま動物に免疫して得ることが出来るが、通常、糖鎖自体では抗原性が低いため、キャリアータンパク質などに結合した形で免疫するか、もしくは目的の糖鎖抗原を発現している細胞そのもので免疫する方法が好ましい。キャリアタンパク質としては、アルブミンやＫＬＨ（キーホールリンペットヘマグルチニン）などのタンパク質や、ＭＨＣクラスＩＩペプチドなどが用いられる。一般に市販されているマレイミド活性化タンパク質を用いてもよいし、同じく市販されている適当なリンカーを用いてタンパク質やペプチドと抗原となる糖鎖あるいは糖ペプチド、糖脂質、リゾ糖脂質とを結合させても良い。
【００２０】
本発明の糖鎖抗原に特異的に結合する抗体は、該糖鎖抗原に特異的に結合する能力を有するものであれば、特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでも良い。さらに、公知技術によって修飾された抗体や抗体の誘導体、例えばヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体などを使用することもできる。本発明の抗体は、例えば、１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）発行、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ）編集、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法により、容易に作製され得る。また、遺伝子工学的に抗体を作製することもできる。さらに、得られた抗体を精製後、ペプチダーゼ等によって処理することにより、抗体の断片が得られる。また、得られた精製抗体あるいは、その誘導体を酵素標識や蛍光標識して本発明の多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定、分離のために用いることが出来る。
【００２１】
本発明における抗糖鎖抗体による多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定の為には、たとえばウエスタンブロッティング法、抗体カラム法、標識抗体による細胞染色法、標識抗体を用いたフローサイトメトリーなどの方法が用いられる。
【００２２】
本発明における抗体による多能性を有する肝細胞前駆細胞の分離方法は、特に限定されるものでなく、一般の細胞分離方法を用いればよい。例えば、抗体を用いた磁気ビーズによる分離法、抗体を結合させた樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィーによる分離法、抗体を固定した抗体マトリックスによる分離法、フローサイトメーターによる分離法等が挙げられる。
【００２３】
本発明の多能性を有する肝細胞前駆細胞の同定の為には、前期細胞に特異的に発現する糖鎖構造を合成する糖転移酵素の遺伝子発現やタンパク質発現、あるいは酵素活性レベルを測定しても良い。糖転移酵素としては、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ、シアリルトランスフェラーゼ、またはα−１，６フコシルトランスフェラーゼなどが挙げられる。これらの糖転移酵素の遺伝子発現レベル、酵素タンパク質発現レベル、酵素活性レベルの測定は、例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩに関してはザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１１３巻、第６９２−６９８頁（１９９３年）、シアリルトランスフェラーゼに関してはザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１２０巻、第１−１３頁（１９９６年）、α−１，６フコシルトランスフェラーゼに関してはザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１２１巻、第６２６−６３２頁（１９９７年）、あるいはこれらの文献に引用されている文献に記載されている方法を参考にして実施することができる。遺伝子発現レベルについては各酵素をコードする遺伝子の塩基配列をもとに適切なプローブやプライマーを作製する事によって、ノザンブロッティング法やＰＣＲ法によって測定することが出来る。酵素タンパク質発現レベルについては各酵素を認識する抗体を用いてウェスタンブロッティング法によって測定することが出来る。また、酵素活性については例えば、１９９６年、秀潤社発行、グライコバイオロジー実験プロトコール、細胞工学別冊、実験プロトコールシリーズに記載の方法に従って、適切なアクセプター糖鎖とドナー糖ヌクレオチドを用いて測定することが出来る。
【００２４】
上記の多能性を有する肝細胞前駆細胞の分離方法を用いることにより、当該細胞を含有する組成物を製造することができる。前記組成物中の、多能性を有する肝細胞前駆細胞以外の成分には特に限定はなく、公知の細胞維持用成分、例えば生理食塩水、細胞培養用培地、血漿、血清、あるいはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン、グルコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスなどを使用することができる。特に好適には多能性や肝細胞への分化能を維持した状態で当該細胞を増殖、維持できるものが使用される。
【００２５】
本発明の方法によって分離、同定された多能性を有する肝細胞前駆細胞、ならびに該細胞を含有する組成物の用途としては、肝炎や肝ガンの治療により切除された肝臓に対する再生医療において、外科的にあるいはカテーテルなどを使用して肝細胞前駆細胞を肝臓に投与することができるほか血管内投与を行うこともできる。遺伝子治療においても、治療用遺伝子を本発明の方法によって分離、同定された多能性を有する肝細胞前駆細胞に導入した後、同様に肝臓あるいは血管内に投与する事によって、肝臓において長期に治療用遺伝子を発現させることが期待できる。
【００２６】
【実施例】
以下に本発明をより詳細に説明するため実施例および実験例を示すが本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。
【００２７】
実施例１
多能性を有する肝細胞前駆細胞株としては、ＮＩＨのＴｈｏｒｇｅｉｒｓｓｏｎ博士から供与された２０継代前後のラット肝臓上皮（ＲＬＥ）細胞を用いた。対照細胞として、ヒト肝芽腫細胞  Ｈｕｈ６（ＪＣＲＢ０４０１、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ヒト肝芽腫細胞  Ｈｕｈ７（ＪＣＲＢ０４０３、ＪＣＲＢ細胞バンク）、ラット肝ガン細胞  ｍ３１（ＡＴＣＣ）、マウスメラノーマ細胞  Ｂ１６Ｆ１０、マウス胎生期肝細胞  ＢＮＬ−ＣＬ、マウス胎生期肝ガン細胞  ＢＮＬ−Ａ７を用いた。培地はいずれも１０％のＦＣＳと５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地で、ＲＬＥはＨａｍ−Ｆ１２培地（ＩＣＮ社）、Ｈｕｈ６とＨｕｈ７はＲＰＭＩ−１６４０培地、ｍ３１、Ｂ１６Ｆ１０、ＢＮＬ−ＣＬ、ＢＮＬ−Ａ７はＤ−ＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃で培養した。培養細胞を培養シャーレから回収後、１回ＰＢＳで洗浄し、ＴＮＥバッファー（１％ＮＰ−４０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼンヒビター（１０μＭ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．８）を加えて細胞を溶解した。可溶化したタンパク質２０μｇ相当量を２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー中、１００℃で５分間変性させた後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて電気泳動を行った。泳動終了後、ニトロセルロース膜にブロッティングした。ニトロセルロース膜を３％ＢＳＡ中、室温で一晩ブロッキングした。レクチンは全てホーネン社製ビオチン化レクチンを用いた。用いたレクチンはインゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  Ｖｕｌｇａｒｉｓ）レクチンＥ４ＰＨＡ、小麦胚芽レクチンＷＧＡである。レクチンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０００倍に希釈し、この中にブロッキング後のニトロセルロース膜を浸して３０分間室温でインキュベーションした。その後、膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０分間３回洗浄した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識ａｖｉｄｉｎ（ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで２０００倍に希釈し、この中に洗浄後のニトロセルロース膜を浸して３０分間室温でインキュベーションした。その後、膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１０分間３回洗浄した。最後にＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて発色させた。その結果、多能性を有する肝細胞前駆細胞株であるＲＬＥ細胞由来のタンパク質は肝芽腫細胞や肝癌細胞、胎生期肝細胞由来のものと比較してＥ４ＰＨＡで非常に強く染色された。
【００２８】
実施例２
実施例１で用いた多能性を有する肝細胞前駆細胞株ＲＬＥ細胞、及び対照細胞としてラット腹水肝ガン細胞ＡＨ６６、灌流直後の肝細胞、４８時間培養後の肝細胞、肝非実質細胞を用いて、フローサイトメーターによる解析を行った。
培地はいずれも１０％ＦＣＳと５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地で、ＲＬＥはＨａｍ−Ｆ１２培地（ＩＣＮ社）、培養肝細胞は０．１μＭインスリン、１０μＭデキザメサゾンを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて５％ＣＯ２、３７℃でコラーゲンコートディッシュ上で培養した。
培養細胞を培養シャーレから回収後、１０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌの０．０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えて５分間放置した後、細胞をよく懸濁して１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。５μｇ／ｍｌ  ＦＩＴＣ標識レクチンを１００μｌのＰＢＳに混ぜ、室温で１５分間インキュベーションを行った。その後、１ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、最終的に０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁してＦＡＣＳに供した。何も染色していないサンプルの自家発光の蛍光強度とＦＩＴＣレクチンによる蛍光強度の差でレクチンの結合した細胞を定量した。用いた標識レクチンは、ＬＣＡとＥ４ＰＨＡならびにコントロールとしてタチナタマメレクチン（ＣｏｎＡ）を用いた。ＦＩＴＣ標識Ｅ４ＰＨＡを用いたＦＡＣＳの結果を図１に示す。多能性を有する肝細胞前駆細胞であるＲＬＥは対照細胞である肝ガン細胞ＡＨ６６や灌流肝細胞、肝非実質細胞と比較してＦＩＴＣ標識Ｅ４ＰＨＡによって強く染色された。ＦＩＴＣ標識ＬＣＡを用いたＦＡＣＳの結果を図２に示す。ＲＬＥは肝細胞や肝非実質細胞と比較して、ＦＩＴＣ標識ＬＣＡによっても強く染色された。
【００２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における、ＦＩＴＣ標識Ｅ４ＰＨＡを用いたＦＡＣＳの結果である。
【図２】本発明における、ＦＩＴＣ標識ＬＣＡを用いたＦＡＣＳの結果である。
【図１】
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【図２】
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