(57)【要約】【課題】 ラベル付き電子受容体を利用する微生物の存否を検出する方法を提供する。【解決手段】 試料を密閉された容器に提供する段階と、前記密閉された容器中の空気を同位体ラベル付き電子受容体を含む空気に置換して培養する段階と、密閉された容器中の空気の同位元素を分析して前記同位体ラベル付き電子受容体の代謝産物の含有量を、微生物を含んでいない標準試料の含有量と比較する段階と、を含む試料中の微生物の存否を検出する方法。これにより、同位体ラベル付き電子受容体を利用することによって迅速かつ正確に気体および液体だけでなく固体試料からも微生物の存否を検出できる。【選択図】 図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を密閉された容器に提供する段階と、
前記密閉された容器中の空気を同位体ラベル付き電子受容体を含む空気に置換して培養する段階と、
密閉された容器中の空気の同位元素を分析して前記同位体ラベル付き電子受容体の代謝産物の含有量を、微生物を含んでいない標準試料の含有量と比較する段階と、を含む試料中の微生物の存否の検出法。
【請求項２】
前記微生物は好気性バクテリアまたは好気性真核細胞であることを特徴とする請求項１に記載の試料中の微生物の存否の検出法。
【請求項３】
前記同位体ラベル付き電子受容体は18Ｏ2であり、前記同位体ラベル付き電子受容体の代謝産物はＣ18Ｏ2であることを特徴とする請求項２に記載の試料中の微生物の存否の検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は同位体ラベル付き電子受容体を利用して微生物の存否を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
電子、情報産業（ＩＴ）および精密機械産業の発達につれて各素子をｎｍレベルに製作する技術が要求され、それにより各工程中に発生する極微量の汚染でも全体工程に深刻な問題を引き起こすことがある。特に、微生物などの生物による汚染は経時的に生体量が増加する可能性があるので、これを事前に分析して除去する必要がある。
【０００３】
しかし、清浄作業地域、例えば、半導体またはＬＣＤ（Liquid Crystal Displays：液晶表示装置）のような精密電子部品製作工程中に発生する極微量の汚染物質は有機物であるかまたは微生物であるか判別し難く、さらに、微生物の活性を測定することは非常に困難な場合がある。従来の極微量の汚染物質の活性を測定するためのものとして［ＧＣ／ＭＳ（Ｇａｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ガスクロマトグラフィ）／Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（マススペクトル分析））が利用されてきた。例えば、大気中の環境汚染物質、水質環境中の環境汚染物質および土壌中の残留農薬の分析などに利用されてきた。
【０００４】
従来微生物を含む汚染物質の分析方法において、微生物の個体数が相対的に多い場合、微生物の採取および分析を通じてなされる多様な生物学的方法が開発されている。しかし、電子部品製作のように清浄作業を要する地域では試料採取が難しく、かつ微生物濃度が非常に低いために一般的な生化学的方法を適用し難いだけでなく、分析時間も相対的に長くかかるという短所があった。
従来ＧＣ／ＭＳまたはＬＣ（Liquid Chromatography：液体クロマトグラフィ）／ＭＳを利用した微生物を含む汚染物質の分析は、生体物質を直接分析するか、または微生物の代謝産物を分析する過程によってなされた。前記生体物質には蛋白質、ＤＮＡ、炭化水素などが含まれる。しかし、このような生体物質を分析する方法は、汚染部位から試料を確保し難く、たとえ試料を確保して分析したとしてもその微生物が生物学的活性を維持しているかどうかは区別し難かった。また、ＧＣ／ＭＳを利用して微生物の呼吸代謝産物を確認するとしても、それが汚染微生物から由来したものであるか、あるいは周囲環境から由来したものであるかが区別できず、汚染微生物が生物学的活性を持っているかどうかが分からなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、迅速かつ正確に汚染微生物の存否を検出しながらその微生物の生物学的活性の存否を区別できる微生物の存否を検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これに対して、本発明者は汚染微生物の代謝産物を分析しながらその微生物が生物学的活性を持っているかどうかを判別できる迅速かつ正確な方法を集中的に研究した結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】
前記目的を達成するために本発明は、試料を密閉された容器に提供する段階と、前記密閉された容器中の空気を同位体ラベル付き電子受容体を含む空気に置換して培養する段階と、密閉された容器中の空気の同位元素を分析して前記同位体ラベル付き電子受容体の代謝産物の含有量を、微生物を含んでいない標準試料の含有量と比較する段階と、を含む試料中の微生物の存否の検出方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、同位体ラベル付き電子受容体を利用することによって迅速かつ正確に気体および液体だけでなく固体試料からも微生物の存否を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において、前記微生物は特別な制限はなく、好気性および嫌気性微生物が含まれる。前記微生物は例えば、好気性バクテリアまたは真核細胞である。また、前記微生物は例えば、嫌気性バクテリアまたは真核細胞である。望ましくは、前記微生物はシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、または酵母であるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、前記電子受容体はＯ2、ＮＯ3-、ＣＯ2およびＳＯ42-などがあり、その代謝産物はＣＯ2、ＮＯ2-、ＣＨ4およびＨ2Ｓなどがあるが、これらに限定されるものではない。望ましくは、前記電子受容体はＯ2であり、その代謝産物はＣＯ2である。代表的な電子受容体が微生物代謝過程を反応式として表せば次の通りである。
【００１０】
炭素源＋Ｏ2→ＣＯ2＋Ｈ2Ｏ
ＮＯ3-＋２ｅ-＋２Ｈ+→ＮＯ2-＋Ｈ2Ｏ
【００１１】
本発明において、前記同位元素の分析には関連技術分野で通常的に採用されている方法を使用できる。例えば、ＧＣ／ＭＳまたはＬＣ／ＭＳを適当な条件で使用することによって本発明を実施することが可能である。
図４は、本発明に使用可能な試料採取用容器および本発明の実施過程を図式化して示す図面である。以下、図４を参考として簡単に説明すれば次の通りである。
【００１２】
まず、半導体やＬＣＤ生産工場のような清浄作業空間で試料１を採取する。前記試料を容器内に注入し、前記容器内の空気２を同位体ラベル付き電子受容体（例えば、18Ｏ2）を含む空気３に置換する。この時、前記容器は入口弁および出口弁が設置されたことが望ましい。前記同位体ラベル付き電子受容体（例えば、18Ｏ2）を含む空気で満たされた容器中で前記試料を一定時間培養する。その後、前記培養試料を採取してＧＣ／ＭＳで同位元素分析を通じて前記電子受容体の代謝産物（例えば、Ｃ18Ｏ2）の含有量を分析し、これを微生物が含まれていない標準試料の結果と比較して微生物４の存否を検出する。
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明すれば次の通りである。しかし、下記の実施例は本発明を例示的に説明するためのものであって本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
１００ｃｆｕ／ｍｌの菌株（シュードモナス種）を含む試料０．５ｍｌの２０ｍＭ燐酸緩衝液を１．５ｍｌ容量のガラス材質の容器に投入した。前記０．５ｍｌ試料のヘッド空間を18Ｏ2のラベル付き酸素を含む空気に置換した。次いで、容器が密閉された状態で２８℃で４時間培養し、前記培養物から気体密閉注射器を利用して約０．５ｍｌの培養された空気を捕集した。前記捕集された空気をＧＣ／ＭＳを利用して分析した。その結果を図１ないし図３に示した。
【００１４】
図１および図２に示す通り、微生物のない標準試料の場合、18Ｏ2はほとんど置換されないのに対して、微生物を含む試料の場合には発生するＣＯ2に18Ｏ2が置換されることが分かった。また、その置換量は図３に示す通り、18Ｏ2に置換されたＣＯ2の量が微生物の量により線形的に変化することが分かった。前記結果から、同位体ラベル付き電子受容体と共に微生物を培養することによって微生物の汚染有無を検出できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明の試料中の微生物の存否を検出する方法は、半導体やＬＣＤ生産工場のような清浄作業空間が微生物により汚染されたかどうかを判別するのに有効に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】微生物を含んでいない標準試料に対するＣ18Ｏ2の測定結果を示す図面である。
【図２】微生物を含む試料に対するＣ18Ｏ2の測定結果を示す図面である。
【図３】微生物の量を異にした試料に対するＣ18Ｏ2の測定結果を示す図面である。
【図４】本発明に使われる容器および発明の適用過程を図式的に示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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