(57)【要約】【課題】アレルギー症状、特にアトピー性皮膚炎を予防および治療でき、安全性に優れた保健食品あるいは医薬の提供。【解決手段】担子菌類の菌糸体培養物から抽出された菌糸体エキスを含むことを特徴とする抗アレルギー剤、特にアトピー性皮膚炎用の抗アレルギー剤。上記担子菌類菌糸体エキスが、バガスを基材とする固体培地上に、担子菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を解束し、この解束された固体培地に、水およびセルラーゼまたはプロテアーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５０℃に保ちながら添加し、そして前記固体培地を酵素の存在下に粉砕および擂潰して担子菌類菌糸体エキスを抽出し、次いで９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させかつ滅菌してなる担子菌類菌糸体エキスであることが望ましい。上記担子菌類としては、椎茸菌、山伏茸菌、エノキ茸菌が好ましい。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌類の菌糸体培養物から抽出された担子菌類菌糸体エキスを含むことを特徴とする抗アレルギー剤。
【請求項２】
上記担子菌類が椎茸菌、山伏茸菌、エノキ茸菌のうちの何れか１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の抗アレルギー剤。
【請求項３】
上記担子菌類菌糸体エキスが、
バガス（ｂａｇａｓｓｅ）を基材とする固体培地上に、担子菌類を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を解束し、
この解束された固体培地に、水およびセルラーゼまたはプロテアーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５０℃に保ちながら添加し、そして前記固体培地を酵素の存在下に粉砕および擂潰して担子菌類菌糸体エキスを抽出し、次いで９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させかつ滅菌してなる担子菌類菌糸体エキスであることを特徴とする請求項１〜２の何れかに記載の抗アレルギー剤。
【請求項４】
上記抗アレルギー剤が、アトピー性皮膚炎の予防および／または治療用である請求項１〜３の何れかに記載の抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、抗アレルギー剤に関し、さらに詳しくは椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスを含有する抗アレルギー剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
古来より、椎茸、松茸、エノキ茸などの担子菌類の茸は食用されており、中には、担子菌類サルノコシカケ科に属する茸のように漢方薬として重用されているものもある。
一方で、このような担子菌類から有効成分を抽出する種々の方法が提案されている。例えば、（１）特開昭５４−４６８５９号公報には、担子菌類を主としてバガス（ｂａｇａｓｓｅ）からなる培地に接種し、菌糸を繁殖させた後、この菌糸体繁殖培地を圧搾して、有効成分を採取する、保健食品の製造方法が開示されている。
【０００３】
本願出願人は、（２）特願昭６２−３４１２３号に対応する特開昭６３−２０２３５６号公報にて、「バガスを基材とする固体培地上に、エノキ茸菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を、１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるように解束し、この解束された固体培地に、水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシターゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を添加し、そして前記固体培地を酵素の存在下で粉砕および擂潰してバガス繊維の少なくとも７０重量％以上が１２メッシュ通過分であるようにし、次いで９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させかつ滅菌することを特徴とする、エノキ茸菌糸体およびバガス培地からの有用成分の抽出方法。」を提案している。
【０００４】
また（３）特公昭６０−２３８２６号公報において、本願出願人らは、接種菌として椎茸菌を用いた以外は上記特願昭６２−３４１２３号記載の方法と同様の方法にて保健飲料を製造する方法を提案している。この公報では、得られる保健飲料には、血圧降下作用、利尿作用、疲労回復作用などがあると記載されている。
【０００５】
（４）特開昭５７−１７０１７３号公報には、砂糖きびあるいは砂糖大根等の原糖及び植物繊維を多量に含有する素材を用いて培養基とし、これに椎茸等の食用茸の種菌を接種して、菌糸体を培養させた後、子実体発生寸前または直後の培養基を粉砕、加水、加温して前記菌糸体に自己消化を生じさせて該菌糸体に含有されている有効成分を培養基に溶脱させ、しかる後乾燥させて微細に粉砕した、食用菌糸体の有効成分及び食物繊維を含有した粉末食品の製造方法が開示されている。該公報には、この方法で得られる粉末食品は、大腸癌、動脈硬化症、糖尿病等に有効であると記載されている。
【０００６】
また、本願出願人等は、（５）特許第２５１９７８５号（特開平２−１０７１７１号公報）にて、トウモロコシ随、フスマ及び米糠からなる植物繊維と水とを含む固体培地に、エノキタケ菌糸を接種して培養し、培養終了後この培地を破砕し、乾燥することによる、食物繊維含有食品の製造方法を提案しており、該公報には、この方法により得られる食品を摂取すると、便秘予防、肥満、糖尿病、動脈硬化の予防、食品中の毒性物質の排除促進、自己防御能の向上などが期待できる旨記載されている。
【０００７】
また、（６）特開平２−１３４３２５号公報には、担子菌の１種である椎茸菌の菌糸体培養物から抽出された成分からなるエイズ治療剤が記載されている。
また、（７）「キノコの化学・生化学」（水野、河合編、学会出版センター刊）には、キノコの食物繊維には、薬理作用、結腸癌、直腸癌の予防効果が期待でき、エノキタケ抽出物ではその発癌予防効果が動物実験でも証明されていると記載されている。
【０００８】
（８）「きのこ抗腫瘍研究２０年」（池川等、社団法人　長野県農村工業研究所発行、平成元年３月１日刊）には、エノキタケ菌糸体から分離されたプロフラミンは、制癌剤として機能し、経口投与しても毒性がなく、その他の副作用も認められないと記載されている。
さらに、本発明者らは、（９）特公昭６０−２３８２６号公報に記載の方法と同様の方法にて得られる椎茸菌糸体エキスが、ＨＩＶ型ウイルス活性阻害効果を有することを見出し、特開平７−１７３０７０号公報（特許第３０１７６３０号）において該方法で得られるＨＩＶ型ウイルス活性阻害剤を提案している。
【０００９】
このように、従来より、椎茸菌糸体エキス、エノキタケ菌糸体あるいはその抽出物等には、制癌作用、便秘予防、肥満、糖尿病、動脈硬化の予防、食品中の毒性物質の排除促進、自己防御能の向上など、健康維持、増進に有効な種々の作用があると報告されている。
しかしながら、担子菌類の椎茸（菌糸体培養物）などから抽出される椎茸菌糸体エキスなどの担子菌類菌糸体エキスには、上記のような効果に加えて、他にどのような作用・効果があるかという点については、未だ、知られていないことが多い。
【００１０】
そこで、本発明者は、椎茸菌糸体エキス等の、従来より食用され漢方に利用されている担子菌類の菌糸体エキスの薬理作用について鋭意研究を重ねたところ、椎茸菌糸体エキスなどの担子菌類菌糸体エキスには、驚くべきことに、著しいアレルギー予防・改善効果などが認められることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の目的】
本発明は、上記のような従来技術に伴う問題点を解決しようとするものであって、副作用の恐れがなく安全性に優れた抗アレルギー剤を提供することを目的としている。
特に本発明は、アトピー性皮膚炎の予防・治療効果に優れ、副作用の恐れがなく安全性に優れ、アトピー性皮膚炎の予防・治療用の医薬あるいは保健食品として好適に使用し得るような抗アレルギー剤を提供することを目的としている。
【００１２】
【発明の概要】
本発明に係る抗アレルギー剤は、担子菌類の菌糸体培養物から抽出された担子菌類菌糸体エキスを含むことを特徴としている。
上記担子菌類としては、椎茸菌、山伏茸菌、エノキタケ菌の他、エリンギ菌等が挙げられる。
【００１３】
本発明においては、上記担子菌類の菌糸体エキスとしては、
バガス（ｂａｇａｓｓｅ）を基材とする固体培地上に、椎茸菌などの担子菌類を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を解束し、
この解束された固体培地に、水およびセルラーゼまたはプロテアーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、前記固体培地を３０〜５０℃に保ちながら添加し、そして前記固体培地を酵素の存在下に粉砕および擂潰して椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスを抽出し、次いで９５℃までの温度に加熱することにより酵素を失活させかつ滅菌してなるものであることが望ましい。
【００１４】
このような抗アレルギー剤を、例えば、経口摂取すれば、アトピー性皮膚炎などのアレルギー症状の発症を予防・抑制でき、また発症しているアレルギー症状を治療でき、しかもこの抗アレルギー剤は、副作用の恐れが全くなく安全性に優れている。
【００１５】
【発明の具体的説明】
以下、本発明に係る抗アレルギー剤及びその好適な製造方法について具体的に説明する。
［抗アレルギー剤の製造］
本発明に係る抗アレルギー剤には、担子菌類の菌糸体エキスが含まれている。
【００１６】
担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）としては、古来より我が国で食用菌類として食用され、あるいは漢方で使用されている松茸目あるいはハラタケ目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）の茸、サルノコシカケ目あるいはヒダナシタケ目（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）の茸、キクラゲ目（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）またはシロキクラゲ目（Ｔｒｅｍｅｌｌａｌｅｓ）の茸、アンズタケ目（ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ）の茸が挙げられる。
【００１７】
松茸目あるいはハラタケ目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）の茸としては、具体的には、
松茸（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ　Ｍａｔｓｕｔａｋｅ　Ｉｔｏ　ｅｔ　Ｉｍａｉ．）、
椎茸（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　（Ｂｅｒｋ．）　Ｓｉｎｇ．）、
エノキ茸（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　Ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ　（Ｆｒ．）Ｓｉｎｇ．）、
平茸（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ　（Ｊａｃｑ．Ｅｘ　Ｆｒ）Ｋｕｍｍｅｒ）、
なめこ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ　ｎａｍｅｋｏ（Ｉ．Ｉｔｏ）Ｓ．Ｉｔｏ　ｅｔ　ＩＭＡＩ）、
イグチ属（Ｂｏｌｅｔｕｓ　Ｄｉｌｌ．ｅｘ　Ｆｒ．）、
シメジ（Ｌｙｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｓｈｉｍｅｊｉ　（Ｋａｗａｍ．）Ｈｏｎｇｏ）、
チチタケ（Ｌａｃｔａｒｉｕｓ　ｖｏｌｅｍｕｓ（Ｆｒ．）Ｆｒ．）、
エリンギ（ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉｉ）等が挙げられる。
【００１８】
また、サルノコシカケ目あるいはヒダナシタケ目（Ａｐｈｙｌｌｏｐｈｏｒａｌｅｓ）の茸としては、具体的には、
コフキサルノコシカケ（Ｅｌｆｖｉｎｇｉａ　ａｐｐｌａｎａｔｕｓ（Ｐｅｒｓ．）Ｋａｒｓｔ．）、
ツガサルノコシカケ（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｓ　ｐｉｎｉｃｏｌａ　（Ｆｒ．）Ｋａｒｓｔ．）、
カワラ茸（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ（Ｆｒ．）Ｑｕｅｌ．）、
マンネン茸すなわち霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ　ｌｕｃｉｄｕｍ（Ｗ．Ｃｕｒｔ．ｅｘ　Ｆｒ．）Ｋａｒｓｔ．）、
舞茸（Ｇｒｉｆｏｌａ　ｆｒｏｎｄｏｓａ（Ｆｒ．）Ｓ．Ｆ．Ｇｒａｙ）、
メシマコブ（Ｐ．ｙｕｃａｔｅｎｓｉｓ（Ｍｕｒｒ．）Ｉｍａｚ．，）等が挙げられる。
【００１９】
キクラゲ目（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｌｅｓ）またはシロキクラゲ目（Ｔｒｅｍｅｌｌａｌｅｓ）の茸としては、具体的には、
キクラゲ（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ　ａｕｒｉｃｕｌａ（Ｈｏｏｋ．）Ｕｎｄｅｒｗ．）、
シロキクラゲ（Ｔｒｅｍｅｌｌｉｎｅａ　ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ　Ｂｅｒｋ．）等が挙げられる。
アンズタケ目（ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ）の茸としては、具体的には、
ハリタケ科（Ｈｙｄｎａｃｅａｅ）の山伏茸すなわちハリタケ（ｈｙｄｎｕｍ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明では、これら担子菌類のうちでも、椎茸（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　（Ｂｅｒｋ．）　Ｓｉｎｇ．）、山伏茸、エノキ茸（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　Ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ　（Ｆｒ．）Ｓｉｎｇ．）が好ましく用いられる。
本発明では、これらの担子菌類を、１種または２種以上組み合わせて用いることができる。なお、これらの担子菌類の多くは、「キノコの事典」（中村克哉編、朝倉書店、１９８９年）、「キノコ類の培養法」（岩出亥之助著、地球社、昭和６０年再訂５版）あるいは「原色日本菌類図鑑」（今関等共著、保育社、昭和５８年、２７刷）などに詳説されている。
【００２１】
椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスの製法には特に制限はなく、例えば、椎茸菌糸体エキスでは、特開平２−１３４３２５号公報に記載されているように、椎茸菌糸体培養物を必要により自己消化させた後、熱水抽出し、その熱水抽出物をアルコールに沈殿させて得られるものでもよく、また、必要により、この沈殿物をさらにクロマトカラムにて分画し、エチレングリコール等にて溶出画分を分取して用いてもよい。
【００２２】
本発明では、抗アレルギー効果、特にアトピー性皮膚炎に対する予防・治療効果の点で、特に椎茸菌糸体エキスのうちでは、特公昭６０−２３８２６号公報に記載された方法を利用して調製したものが望ましい。また、椎茸菌糸体エキス以外の上記したような他の担子菌類菌糸体エキスの場合も、椎茸菌糸体エキスと同様の方法にて調製したものが好ましい。
【００２３】
以下、椎茸菌糸体エキスの調製法の例を挙げて、以下に詳説する。
椎茸菌糸体エキスを調製するには、具体的には、まずバガスからなる固体培地に水、好ましくは純水を適度に混ぜた後、椎茸菌を接種する。なお、このバガス培地に、米糠の他、必要によりリン、鉄、ゲルマニウム等のミネラル類、落花生表皮、玄米などを添加してもよい。
【００２４】
次いで、このように椎茸菌が接種された培地を、温度および湿度が調節されさらには照度も調節された培養室内に入れて、菌糸体を増殖させる。
菌糸体が固体培地に蔓延し、子実体の発生直前・直後の時期に、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が３０重量％以下となるようにすることが望ましい。なお、バガス基材培地の解束は、上記のように子実体の発生直前・直後の時期に行うことが好ましいが、子実体がかなり成長した後の時期に行ってもよい。
【００２５】
このように解束された固体培地に、水およびセルラーゼ、プロテアーゼまたはグルコシダーゼから選ばれる酵素の１種またはそれ以上を、固体培地を３０〜５０℃に保ちながら添加する。添加される酵素としては、セルラーゼが好ましい。酵素の添加量は、固体培地１ｋｇに対して０．５〜５ｇ好ましくは１〜３ｇであることが好ましい。また水は、金属イオン等のイオン類を含まない純水が好ましく、この解束された培地１ｋｇに対して、純水１〜１０ｋｇ好ましくは２〜６ｋｇを加えてバガス含有混合物とする。
【００２６】
次いでこのバガス含有混合物から椎茸菌糸体エキスを抽出するが、このように椎茸菌糸体エキスを抽出するには、培地含有混合物を、例えば変速機付ギヤーポンプ等を用いて循環させながら、固体培地に粉砕および擂潰作用を加えてバガス繊維の約７０重量％以上が１２メッシュ通過分となるようにすることが望ましい。
【００２７】
バガス含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物の温度を３０〜５０℃に保ちながら行ってもよく、温度を上記温度より徐々に上昇させながら行ってもよいが、温度を上昇させながら行うことが好ましい。水温が６０℃以上好ましくは７０℃以上となったときに、バガス含有混合物中に室温の空気を噴入させると、空気泡は急激に加熱されて破壊し、バガス繊維に衝撃を与え有効成分の抽出をより効率的に行うことができる。
【００２８】
次いで、このようにして処理されたバガス含有混合物をさらに加熱して９５℃までの温度、好ましくは７５〜９０℃程度の温度に加熱し、この温度で数十分間保持して該混合物中の酵素を失活させるとともに、該混合物を殺菌すると、椎茸菌糸体エキスが得られる。
なお、得られた椎茸菌糸体エキスを必要に応じて、５０〜１２０メッシュ好ましくは６０〜１００メッシュ程度の濾布を用いて濾過してもよい。
【００２９】
このようにして得られる椎茸菌糸体エキスは、濃縮して用いることもでき、また凍結乾燥して粉末状として用いることもできる。
以上、椎茸菌糸体エキスの好ましい調製法の例を詳説したが、本発明で用いられる前記したその他の担子菌類菌糸体エキスも、上記椎茸菌に代えて、霊芝、エノキ茸、メシマコブ、山伏茸、マイタケ、エリンギなどの担子菌類を用いる点以外は、上記と同様にして、調製することができる。
【００３０】
本発明の抗アレルギー剤には、上記椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスは、どのような量で含まれていてもよいが、このような抗アレルギー剤は、該抗アレルギー剤中の担子菌類菌糸体エキス固形分換算量として、体重１ｋｇ当たり、１日につき、通常１〜１００ｍｇ、好ましくは５〜５０ｍｇの量で摂取することが望ましい。
【００３１】
このような抗アレルギー剤は、顆粒状、液状、錠剤、カプセル状など各種剤形にて経口投与してもよく、またアレルギー患者に使用する注射液としての開発も可能である。また、上記の菌糸体エキス原液が含まれた抗アレルギー剤は、希釈せずにそのままアレルギー患者等に投与することもできるが、例えば精製水、アルコール等で適宜希釈して投与することもできる。
【００３２】
上記のように、本発明に係る抗アレルギー剤をアレルギー患者に投与すると、それらの症状を改善することができ、また発症前ではその発症を予防することができる。
このように本発明に係る抗アレルギー剤はアレルギー疾患の発症を予防・抑制するとともに発症しているアレルギー疾患も改善することができるのは、次のような理由によるのであろうと思われる。
【００３３】
すなわち、この椎茸菌糸体エキス等の担子菌類菌糸体エキスからなる抗アレルギー剤には、本発明者らの研究によれば、椎茸菌糸体等の担子菌類菌糸体から抽出される有効成分と、椎茸菌糸体などの担子菌類菌糸体が培養された固体培地とから抽出される有効成分とが多数混在し、これらの成分（未同定である）が総合的に作用し、アレルギー疾患を予防・治療できるのであろうと考えられる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、アレルギー疾患、特にアトピー性皮膚炎の発症を予防・抑制でき、また発症しているアレルギー疾患を治療することができ、しかも、副作用の虞がなく安全性に優れた保健食品あるいは医薬である抗アレルギー剤が提供される。
【００３５】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等制限されるものではない。
【００３６】
【調製例１】
［椎茸菌糸体エキスからなる抗アレルギー剤の調製］
バガス９０重量部、米糠１０重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、椎茸種菌を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に置き、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、１２メッシュ通過分が２４重量％以下になるようにした。この解束された培地１．０ｋｇに、該固体培地の温度を４０℃に保ちながら、純水３．５リットルおよび精製セルラーゼ２．０ｇを加えてバガス含有混合物とした。
【００３７】
次いで培地含有混合物を変速機付ギヤーポンプにより循環させながら、固体培地に該ポンプのギヤー部分において粉砕および擂潰作用を２００分間程度加え、バガス繊維の約８０重量％が１２メッシュ通過分となるようにした。バガス含有混合物の粉砕および擂潰は、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。
その後、バガス含有混合物をさらに加熱して、９０℃として３０分間放置した。
【００３８】
９０℃への加熱により酵素を失活させ、かつ殺菌を施した。
得られた培地含有混合物を６０メッシュ濾布を用いて濾過し、微小浮遊物を含有する椎茸菌糸体エキスを得た。
この椎茸菌糸体エキスをフリーズドライ法にて粉末化した。
【００３９】
【調製例２〜３】
上記調製例１において、椎茸種菌に代えて、エノキ茸種菌（調製例２）、山伏茸種菌（調製例３）を用いた以外は、調製例１と同様にして、エノキ茸菌糸体エキス粉末、山伏茸菌糸体エキス粉末を得た。
次に、これら各種菌糸体エキスを種々の濃度で用いて、ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞における抗アレルギー試験、アトピー性皮膚炎モデル動物であるＮＣマウスにおける抗アレルギー試験等を行った。
【００４０】
試験方法、結果等を以下に示す。
［ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞を用いた椎茸菌糸体エキスの抗アレルギー試験］
即時型アレルギーは、肥満細胞や好塩基球細胞の細胞膜に結合したＩｇＥ抗体と抗原が架橋構造を形成することによりこれらの細胞内にある顆粒が脱顆粒され細胞外へ放出されるｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ等のｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｄｉａｔｏｒにより発症すると考えられている。
【００４１】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで生じる、肥満細胞や好塩基球細胞における即時型アレルギー反応の場合と同様に、抗原の刺激によりβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ、ｈｉｓｔａｍｉｎｅ、ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ等を遊離することが知られている。
そこで、本発明では、椎茸菌糸体エキス（Ｌ・Ｅ・Ｍ）を用いた場合における、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離の抑制作用を調べることにより、椎茸菌糸体エキスによる抗アレルギーの薬理活性の検討を行なった。
【００４２】
【試験例Ａ】
＜実験材料および方法＞
１．　試験品
実験には、上記調製例１で得られた椎茸菌糸体エキスを水溶液（椎茸菌糸体エキス含量：１００、１０、１、０．１ｍｇ／ｍｌ）にして用いた。
２．　β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離抑制作用の試験用反応混合液
反応混合液は、椎茸菌糸体エキスの各濃度の水溶液１００μｌ（椎茸菌糸体エキス含量：１００、１０、１、０．１ｍｇ／ｍｌ）に、ビオチン化マウス抗ＤＮＰ　ＩｇＥ抗体（３μｇ／ｍｌ）と抗原としてのＤＮＰ−ＫＬＨ（ジニトロフェノールを化学的に結合させたＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ））（１μｇ／ｍｌ）を加え、さらにｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（放出媒体）　［１１６ｍＭ：ＮａＣｌ、５．４ｍＭ：ＫＣｌ、０．８ｍＭ：ＭｇＳＯ４、５．６ｍＭ　：Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ、２５ｍＭ：ＭＥＳ（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）Ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　Ａｃｉｄ）、２．０ｍＭ：ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ、１ｍｇ／ｍｌ：ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、ｐＨ７．７］を加えて全量で１ｍｌとすることにより調製した。
３．　β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離抑制作用の検討方法　
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（５×１０５個）を、４８ｗｅｌｌ−反応プレートの各ｗｅｌｌ中において、１０％ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）を含むＭＥＭ（イーグルによる培地。別名：Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　（ＥＭＥＭ）　。）培養液を用いて３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。
次いで、その培養液を除去した後、各ｗｅｌｌに、上記反応混合液２５０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。
【００４３】
その後、各ｗｅｌｌ　から細胞外液（Ａ）１００μｌを分取し、残余の細胞外液を吸引除去した。
次に０．２％の「Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００」（非イオン性界面活性剤、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社　製）溶液　２５０μｌを各ｗｅｌｌに加えて、細胞壁を溶解させ、１０分後に細胞溶解液（細胞内液）（Ｂ）１００μｌを分取した。
【００４４】
β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性の測定は、以下のようにして行った。
すなわち、上記細胞外液（Ａ）と細胞内液（Ｂ）のそれぞれに、基質溶液［ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ　４．５）に溶解して５ｍＭ溶液とした基質溶液］４００μｌを加えて、上記細胞外液（Ａ）および細胞内液（Ｂ）に含まれているβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅと反応させると、当該酵素により基質は分解されてｐ−ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌが生成される。
【００４５】
次いで、得られた反応生成物に、反応停止液として０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．７）１ｍｌを加え、ｐ−ｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌの量を波長４０５ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍ）を測定して求めた。
β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離抑制率は次式により求めた。
まず、「β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率（放出量）」は、下記式で示すように、細胞外（Ａ）のβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ量を、細胞外（Ａ）と細胞内（Ｂ）のβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの合計量（Ａ＋Ｂ）で割り、百分率（％）で表示される。
【００４６】
Ｎｅｔ　％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆ　β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ　　＝｛Ａ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００
また、「椎茸菌糸体エキスによる、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離抑制率」は、下記のようにして算出される。
すなわち、椎茸菌糸体エキスを含む各試料（サンプル）を用いた場合におけるＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率（Ｎｅｔ　％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｓａｍｐｌｅ、（イ））、および椎茸菌糸体エキスを含んでいない反応混合液を用いた「コントロール」におけるＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率（Ｎｅｔ　％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ、（ロ））を求める。
【００４７】
次いで、下記式で示すように、コントロール（ロ）でのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離率を１００％とすると、１（（ロ）／（ロ））から「Ｎｅｔ　％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｓａｍｐｌｅ（イ）／Ｎｅｔ　％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ロ）」を引き、百分率（％）で表示することにより、「椎茸菌糸体エキスによる、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞からのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離抑制率」は算出される。
【００４８】
遊離抑制率（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、％）
＝（１−　Ｎｅｔ％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｓａｍｐｌｅ（イ）　／　Ｎｅｔ％　ｒｅｌｅａｓｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ロ））×１００
なお、実験は、その精度を確保すべく、試料二連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で実施し、併せて、上記ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（放出媒体）に、椎茸菌糸体エキスを上記各反応濃度で溶解させ、上記基質溶液に入れ、上記と同じ時間反応させ、次いで反応停止液を加えたものを試薬ブランクとして用いた。
【００４９】
＜結果＞
上記のように種々の濃度で椎茸菌糸体エキスを反応させた時の細胞内液（Ｂ）と細胞外液（Ａ）それぞれのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性、及び試薬ブランクでのβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ活性を測定した結果を表１に示す。
なお、細胞外液（Ａ）については、椎茸菌糸体エキス成分が残存するため、吸光度（Ｏ．Ｄ．）の補正値「細胞外液（Ａ）−試薬ブランク」で示す。また、細胞内液（Ｂ）については、椎茸菌糸体エキスの影響を受けないため、試料の吸光度（Ｏ．Ｄ．）に及ぼす影響を考慮せず、測定値で示す。
【００５０】
これら吸光度の測定結果から算出された、各椎茸菌糸体エキス濃度におけるβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率（Ｎｅｔ％ｒｅｌｅａｓｅ　ｏｆβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）を併せて表１に示す。
また、求められた上記β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅの遊離率から、椎茸菌糸体エキスを含まない抗アレルギー剤（椎茸菌糸体エキス濃度０ｍｇ／ｍｌ）を用いた場合におけるβ−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離率を１００％とし、種々の椎茸菌糸体エキス濃度における、β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離抑制率（遊離阻害割合、％　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を求めた。
【００５１】
結果を表１に併せて示す。
【００５２】
【表１】
2004067567.tif 000002
【００５３】
この表１によれば、β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離抑制率は、椎茸菌糸体エキス濃度１ｍｇ／ｍｌで約４０％程度、１０ｍｇ／ｍｌで約１００％となっていることが分かる。
４．ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に及ぼす椎茸菌糸体エキスの影響
次に、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に椎茸菌糸体エキス溶液を種々の濃度で反応させた際に、細胞に対する障害が出ているか否かを、Ｃｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔで染色を行い確認した。
＜試験方法＞
椎茸菌糸体エキスそのものがＲＢＬ−２Ｈ３細胞に及ぼす影響は、以下のようにして調べた。
【００５４】
すなわち、椎茸菌糸体エキスの上記水溶液１００μｌを上記ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍで希釈し１ｍｌにした試料を準備し、該試料２５０μｌをＲＢＬ−２Ｈ３細胞（５×１０５個）に添加し、３７℃で１時間反応（保持）させた。その後、上清を除き、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した後、０．１％Ｃｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔ溶液を２００μｌ加えＣｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔを生細胞内に取り込ませることにより生細胞を染色した。１５分染色後、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、界面活性剤）を２００μｌを加えＣｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔを可溶化した。次いで、プレートシェーカーで振盪した後、Ｏ．Ｄ．５００ｎｍを測定し吸光度から生細胞を評価した。
【００５５】
結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2004067567.tif 000003
【００５７】
上記表２に明らかなように、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）濃度が１０ｍｇ／ｍｌであっても細胞が生存していることを確認することが出来た。
なお、椎茸菌糸体エキス濃度が低濃度の０．０１ｍｇ／ｍｌからより高濃度の１０ｍｇ／ｍｌへと上昇した場合に、Ｃｒｙｓｔａｌ　ｖｉｏｌｅｔの吸光度（生細胞量）がより高い値となっているのは、恐らく椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）の残さが細胞膜に吸着し、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）の色素成分が混入いるためであろうと考えられる。
【００５８】
＜考察＞
上記実施例によれば、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）は、ＩｇＥと抗原により感さされたラット好塩基球白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞からの顆粒球放出に対して阻害（抑制）作用・効果を有することが明らかである。
また、その作用・効果の程度は、β−Ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ遊離抑制率から、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）濃度が１ｍｇ／ｍｌで約４０％程度、１０ｍｇ／ｍｌで約１００％であるといえる。
【００５９】
以上詳述したことから明らかなように、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）は、抗アレルギー作用を持っているものと考えられる。
【００６０】
【試験例Ｂ】
上記調製例１で得られた椎茸菌糸体エキス（粉末）からなる、抗アレルギー剤を用いて、アトピー性皮膚炎モデル動物であるＮＣマウスに対するアレルギー疾患の発症予防、改善効果を調べた。
なお、「ＮＣマウス」は、微生物学的統御のなされた環境下では、皮膚病変を発症しないが、通常の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）環境下で飼育すると、６〜７週齢以降にヒトのアトピー性皮膚炎に類似した皮膚疾患を発症し、血中ＩｇＥの増加が見られる。このため、ＮＣマウスは、通常、ヒトのアトピー性皮膚炎のモデル疾患動物として用いられる。
【００６１】
＜実験材料および方法＞
１．　試験用薬剤または保健食品
実験には、抗アレルギー剤として、上記調製例１で得られた椎茸菌糸体エキスを濃度１００ｍｇ／ｍｌの水溶液にして用いた。投与量は、１ｇ／ｋｇ（体重）とした。
２．　試験動物および投与方法
試験動物のマウス（ＮＣ／Ｎｇａ種、雄（♂）、６週齢）をチャールス・リバー社より入手し、１群：１０匹について通常食を自由摂取させながら飼育し、上記調製例に示す各抗アレルギー剤を投与し、各種試験を行った。また、コントロールとして、同様のマウス（１群：１０匹）に水を投与し、上記と同様に試験を行った。
（ａ）「椎茸菌糸体エキスの水溶液」投与群（ＮＣ／Ｎｇａ種、雄（♂）、６週齢、１０匹）
（ｂ）水投与（コントロール）群（ＮＣ／Ｎｇａ種、雄（♂）、６週齢、１０匹）
抗アレルギー剤等の投与による試験は１２０日間行った。その間、４日おきに椎茸菌糸体エキスの水溶液を経口投与した。
【００６２】
また、経口投与の度毎に、マウスの皮膚状態の観察および写真撮影を行ない、皮膚状態を（１）発赤、出血、（２）浮腫、（３）脱毛、潰瘍、組織欠落、（４）乾燥、（５）湿疹かさぶた形成の５項目について、無症状（０点）、軽度（１点）、中等度（２点）、高度（３点）の４段階に分類し、それぞれ上記のように０〜３点で点数化し、その合計を皮膚状態スコアーとして症状の指標とした。
３．　血清中ＩｇＥの測定
上記投与期間中、３週間毎にマウスの血液を採取し、血清中のＩｇＥ濃度を測定した。
【００６３】
血清中のＩｇＥ濃度の測定には、ＥＬＩＳＡ法のマウスＩｇＥ測定キット（レビスＩｇＥ−ＥＬＩＳＡキット（マウス）、株式会社シバヤギ製）を用いた。
＜結果＞
１．体重変化
最終的に、水投与群では、「椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群」に比べ、若干体重が軽い傾向が見られたが、群間で有意差は見られなかった（図１）。
２．皮膚状態スコアー
試験開始後８４日目以降に、水投与群、「椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群」で、マウスの皮膚に異常が見られた。
【００６４】
皮膚状態スコアーを測定した結果、水投与群では「椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群」と比べて皮膚状態の悪化が見られ、スコアーの有意差を検定した結果、ｐ＝０．０１で有意差が認められた（図２）。
このスコアーの有意差は、実験終了時（１２０日）まで、変わらなかった。また、図２に示すように、マウスの皮膚状態は、水投与群と「椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群」の何れの場合も、試験開始後８４日目以降、悪化を続けた。なお、水投与群では９６日目以降、若干の変動はあるが、それ以上アトピー性皮膚炎の症状は進行（悪化）しなかった。
【００６５】
試験に用いた各マウス（合計２０匹）の最終皮膚状態（１２０日目）を、図３〜図４に示す。
３．血清中ＩｇＥ濃度変化
血中ＩｇＥ濃度は、図５に示すように、試験開始後８５日目に若干の上昇が見られ、１０５日目には試験開始時の１０倍以上の濃度に上昇した。水投与群で、ＩｇＥ濃度が「椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群」に比べて若干高い傾向を示しているが、有意差は認められなかった（図５）。
【００６６】
＜考察＞
ＮＣマウスでは、アトピー性皮膚炎が、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｆｒｅｅ）環境から普通（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）の環境へ移すことで、コンベンショナルな環境における何らかの環境因子により発症する。
この実験では、ＮＣマウスでアトピー性皮膚炎の発症に、約３ヶ月近く要した。その理由として、飼育環境が、予想以上に清浄であった可能性が考えられる。
【００６７】
最終的には、実験に用いたＮＣマウスは、アトピー性皮膚炎を発症し、水投与群に比べ「椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群」で発症が抑えられる傾向が見られた。
このことから、椎茸菌糸体エキス（あるいはその水溶液）にアレルギーの発症を、抑制する作用があることが明かとなった。
【００６８】
ところで、Ｔｈ（ヘルパーＴ細胞）０は、Ｔｈ１（細胞性免疫担当）、Ｔｈ２（液性免疫担当）に分化する。これまで、アトピー発症の１つの機構として、Ｔｈ２が優勢になると、抗体の産生が促進され、ＩｇＥ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＥ）が多くなり、アトピーが発症するのではないかと考えられている。そのため、免疫賦活物質のアトピー性皮膚炎発症の抑制機構として、免疫賦活物質がＴｈ１／Ｔｈ２のバランスをＴｈ１側に傾けさせることにより、ＩｇＥ産生を抑制し、アトピー性皮膚炎の発症を抑制するのではないかと考えられている。
【００６９】
今回、本発明者らが、椎茸菌糸体エキスの水溶液をＮＣマウスに経口投与して試験を行った結果、上記実験データからも明らかなように、明らかにアトピー発症を抑制する効果が見られた。しかしながら、血清中ＩｇＥ濃度に関しては、若干、椎茸菌糸体エキスの水溶液を投与した群の方が、コントロール（水投与群）に比して低下しているが、有意差が認められる程までには、椎茸エキス投与群の血清中ＩｇＥ濃度は低下していない。
【００７０】
このことから、椎茸菌糸体エキスなどのような、担子菌類の菌糸体培養物から抽出された担子菌類菌糸体エキスを含む抗アレルギー剤のアトピー性皮膚炎発症抑制機構は、前述の免疫賦活物質で考えられているアトピー性皮膚炎の発症抑制機構とは異なっていると考えられる。
すなわち、椎茸菌糸体エキス（あるいはその水溶液）のアトピー発症抑制機構は、従来いわれているようなＴｈ１／Ｔｈ２のバランス調整のような機構ではないと考えられる。
【００７１】
椎茸菌糸体エキス等の担子菌類の菌糸体エキスを含む本発明の抗アレルギー剤は、上述したように、ラット好塩基球白血病（ＲＢＬ−２Ｈ３）細胞を用いた椎茸菌糸体エキス水溶液の抗アレルギー試験の結果、好塩基球の顆粒放出を阻害する効果があることが本発明者により見出されており、この椎茸菌糸体エキスによる顆粒放出阻害機構が、アトピー発症を阻害している可能性が考えられる。
【００７２】
また、上記試験期間中、ＮＣマウスは頻繁に個体間で争っている（ｆｉｇｈｔｉｎｇ）様子が観察された。これら、争い（ファイティング）の頻度を数値化することはできなかったが、水投与群では、椎茸菌糸体エキスの水溶液投与群に比べてファイティングの頻度が高いように観察された。
このファイティング観察結果から、椎茸菌糸体エキスあるいはその水溶液には、マウス神経の鎮静作用のような効果があり、それによりアトピー性皮膚炎の発症が抑えられている可能性も考えられる。
【００７３】
椎茸菌糸体エキスに代えて、山伏茸菌糸体エキス、エノキタケ菌糸体エキスを用いた場合にも、上記と同様な効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭとも言う）投与群と、水投与群（コントロール）との経時的な平均体重変化を示すグラフである。
【図２】図２は、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）投与群と、水投与群（コントロール）との経時的な平均皮膚状態スコアーを示すグラフである。
【図３】図３は、試験に用いた椎茸菌糸体エキス投与群の各マウス（合計１０匹）の最終皮膚状態を示す図面である。
【図４】図４は、試験に用いた水投与群の各マウス（合計１０匹）の最終皮膚状態を示す図面である。
【図５】図５は、椎茸菌糸体エキス（ＬＥＭ）投与群と、水投与群（コントロール）との血清中ＩｇＥ濃度の経時的変化を示す図面である。
【符号の説明】
図１〜図５中、点線は、椎茸菌糸体エキス投与群を示し、実線は、コントロールを示す。
【図１】
2004067567.tif 000004
【図２】
2004067567.tif 000005
【図３】
2004067567.tif 000006
【図４】
2004067567.tif 000007
【図５】
2004067567.tif 000008