(57)【要約】      （修正有）【解決手段】ヒト由来特定の塩基配列を有するＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型を提供するものである。また、当該ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型同定用ポリヌクレオチドを提供するものである。さらに、当該ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型を同定することを特徴とする前立腺疾患又はその罹患リスクの診断方法を提供するものである。さらにまた、当該ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型同定用試薬を含有することを特徴とする、前立腺疾患又はその罹患リスクの診断キットを提供するものである。【効果】本発明のコドン６２７の遺伝子多型は白人種では見つかっておらず、黄色人種、特に日本人特有の遺伝子多型である可能性が高い。したがって、本発明のコドン６２７を用いることにより、既知のコドン５４１を用いた方法では診断できなかった、黄色人種、特に日本人の前立腺疾患及びその罹患リスクを診断することが出来る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示される塩基配列を有するＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基遺伝子多型。
【請求項２】
請求項１記載のＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基遺伝子多型同定用ポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１中の変異コドンＳｅｒ６２７Ｌｅｕを同定できる塩基長を有するポリヌクレオチドである請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
塩基長が少なくとも１８塩基以上である請求項２又は３記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１記載のＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基遺伝子多型を同定することを特徴とする前立腺疾患又はその罹患リスクの診断方法。
【請求項６】
請求項１記載のＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基遺伝子多型同定試薬を含有することを特徴とする、前立腺疾患又はその罹患リスクの診断キット。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含有するものである請求項６記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は前立腺癌、前立腺肥大症などの前立腺疾患又はその罹患リスクの診断に有用な遺伝子多型及びそれを用いた診断方法、診断キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
前立腺癌は男性ホルモンであるアンドロゲンに対して感受性を有する癌であり、一般的に発症年齢が遅く、癌の発育速度も比較的穏やかなため、癌の憎悪前に患者が寿命を迎える症例がある反面、発見が遅れると骨髄転移を始め全身に移転し、患者を死に至らしめる疾患でもある。また、高齢者では治療後の尿排泄の弊害など、身体的心理的にも生活質（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ：ＱＯＬ）を悪化させている。
【０００３】
欧米では、前立腺癌は発生率・死亡率ともに男性の悪性腫瘍の第１〜３位を占め、米国人男性では最も診断例の多い癌である。また、欧米における癌死亡率の約２０％を占めている。一方、わが国での前立腺癌の死亡率は、これまで約３．５％と比較的少ない癌であったが、食生活の欧米化及び高年齢化社会を背景に、その頻度は増加しており、泌尿器科領域においては、わが国でも最も多い癌となっている。
【０００４】
これらの前立腺癌の診断方法としては、直腸指診、経直腸的な超音波検査、血液中の前立腺特異抗体（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ：ＰＳＡ）の測定の３種の診断方法が用いられ、疾患の疑いが診断された後、生検によって採取した組織の病理診断によって確定診断されるといった方法が用いられていた。
【０００５】
一方、前立腺肥大症は、通常加齢に伴い萎縮して小さくなる前立腺が肥大し、尿道を圧迫することによって生じる疾患であり、肥大に伴い会陰部の圧迫感、頻尿、排尿困難、夜間頻尿といった症状が現れる。症状が悪化すると尿道壁の肥大や肉柱形成が生じ、排尿力が低下、最終的には自立的に排尿ができない状態（閉尿）に陥る。また、排尿後にも膀胱に残る尿の量が増え、感染症や腎不全などを併発する危険性が高い上、症状の進行に伴って、前立腺癌を併発する可能性が高く、初期の治療が重要になっている。
【０００６】
前立腺肥大症の診断としては、主に問診による自覚症状の確認や平均尿流量の測定、触診、或いは超音波による前立腺の大きさの測定などを組み合わせて行われる。また近年では、ＰＳＡ量を前立腺の大きさで割った値、ＰＳＡ密度を指標とした前立腺肥大症の鑑別も行われている。
【０００７】
最近、前立腺癌等の前立腺疾患の関連遺伝子としてＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２が同定された（非特許文献１参照）。この遺伝子には、２種の遺伝子多型、Ｓｅｒ２１７Ｌｅｕ及びＡｌａ５４１Ｔｈｒが存在することが知られている。そして、これらの遺伝子多型の同定により前立腺癌や前立腺肥大症の罹患リスクの診断ができることが知られている（非特許文献２参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２７：１７２−１８０，  ２００１
【非特許文献２】
Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ６８：９１２−９１７，  ２００１、Ｃａｕｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：４９８２−４９８４，  ２００１、他
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの遺伝子多型の同定による診断による相関性は低く、更に他の手段又は他の遺伝子多型による診断方法の開発が望まれていた。
従って、本発明の目的は、前立腺癌、前立腺肥大症などの前立腺疾患の診断に有用な新たな材料を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、従来の遺伝子多型以外の前立腺疾患と関連する遺伝子多型を見出すべく種々検討した結果、ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の６２７番目のＳｅｒをコードするコドン（ＴＣＧ）がＬｅｕをコードするコドン（ＴＴＧ）に変異した遺伝子多型（Ｓｅｒ６２７Ｌｅｕ）が存在し、当該遺伝子多型の同定が日本人などの黄色人種における前立腺癌及び前立腺肥大症の診断に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、配列番号１で示される塩基配列を有するＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型を提供するものである。
また、本発明は、当該ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型同定用ポリヌクレオチドを提供するものである。
さらに本発明は、当該ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型を同定することを特徴とする前立腺疾患又はその罹患リスクの診断方法を提供するものである。
さらにまた本発明は、当該ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の１塩基多型同定用試薬を含有することを特徴とする、前立腺疾患又はその罹患リスクの診断キットを提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の１塩基遺伝子多型は、ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２遺伝子を構成する塩基の１個が、他の塩基に置換しているものであり、配列番号１で示されるように、野生型ＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２の塩基配列において６２７番目のＳｅｒをコードするコドン（ＴＣＧ）が、Ｌｅｕをコードするコドン（ＴＴＧ）に置換しているものである。
【００１３】
本発明の１塩基遺伝子多型は、例えば前立腺癌を罹患している日本人男性の白血球細胞由来のＤＮＡに対して、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析を行い、得られたバンドからシークエンスを行うことにより検出することができる。得られた多型がＰＣＲのエラーでなく遺伝子多型であることは、同称のＳＳＣＰバンドシフトが複数の症例からランダムに検出されることより、明らかである。
【００１４】
本発明の遺伝子多型のうち、Ｌｅｕアレルは前立腺肥大症患者において、正常人よりも高頻度に検出されるだけでなく、前立腺癌患者においても、正常人よりも高い頻度で検出される。さらに、本発明の遺伝子多型は、黄色人種、特に日本人で高い頻度で検出される。従って、本発明の遺伝子多型を同定することにより、既知の遺伝子多型の同定では診断できなかった前立腺疾患又はその罹患リスクを診断することができる。
【００１５】
前立腺疾患又はその罹患リスクの診断をするにあたっては、本発明の遺伝子多型同定用ポリヌクレオチドを用いた種々の同定手段により、遺伝子多型を同定すればよい。同定手段としては、例えば本発明の遺伝子多型部位を増幅するプライマーを用いたＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、前記の変異コドンを含む領域をＰＣＲで増幅してＳｅｒ６２７Ｌｅｕの遺伝子多型の結果生じる制限酵素部位で切断されるか否かによって多型を調べるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。
【００１６】
本発明の遺伝子多型同定用ポリヌクレオチドとしては、配列番号１中の変異コドンＳｅｒ６２７Ｌｅｕ（ＴＴＧ）を同定できる塩基長を有するものであればよく、その塩基長は１８塩基以上、さらには１８〜２５塩基程度のオリゴヌクレオチドが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドプローブとしては、例えば５’−ＧＡＴＣＡＧＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＣＧＡＡＣ−３’（配列番号３）が挙げられる。また、野生型プローブとしては例えば５’−ＧＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＴＧＴＴＧＣＧＡＡＣ−３’（配列番号２）が挙げられる。
【００１７】
ここで本発明の遺伝子多型部位を増幅するプライマーとしては、通常使用される増幅用プライマーであれば特に限定されるものではなく、例えば５’−ＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＧＴ−３’（配列番号４）、５’−ＡＴＧＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＣＴＡ−３’（配列番号５）の２種のプライマーが挙げられる。
【００１８】
上記の２つのプライマーを用いて、被検細胞のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、コドン６２７を含む所望の増幅産物を得ることができる。
【００１９】
本発明の診断キットは、前記本発明の遺伝子多型同定用プライマー（例えば配列４、５）を含有する。また、この診断キットには、他のＰＣＲに必要な緩衝液、デオキシヌクレオチド混合液、ＤＮＡポリメラーゼ、コントロールＤＮＡ、変異コドン同定用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３）、野生型コドン同定用オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号２）、滅菌蒸留水等が含まれる。
また、診断キットに用いる原理としてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を採用する場合には、上記オリゴヌクレオチドプローブに代わり、制限酵素が含まれる。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２１】
実施例１（ＤＮＡの調製）
試験には１０９名の前立腺癌を罹患している日本人男性より採取したＤＮＡを用いた。家族性又は遺伝性前立腺癌家系の判定はＣａｒｔｅｒ等（Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｓ．  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｕｒｏｌ，  １５０，  ７９７−８０２，  １９９３．）の基準に従った。その結果、９名の家族性の癌患者と１名の遺伝性の癌患者が含まれていた。
【００２２】
癌細胞ＤＮＡは、その組織中の８０％以上を前立腺癌細胞によって占められる、患者の前立腺組織から常法に従い抽出した。同時に、癌周囲の正常組織あるいは血液から同様の方法を用いてＤＮＡを抽出した。
即ち、採取した組織片、或いは血液より分離した白血球層にプロテイナーゼＫを最終濃度５００μｇ／ｍｌ、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）を０．５％になるよう添加し、４２℃で撹拌放置した。２４時間ごとに同量のプロテイナーゼＫを添加し、組織片が完全に消化され液の混濁がなくなるまで消化を行った。得られた消化液に等量のフェノールを加え、撹拌後１５，０００ｒｐｍで５分間遠心処理をした。遠心後、３層に分離した最上層に対して等量のフェノール・クロロホルム（１：１）混合液を加え、同様の操作を行った。遠心後、同様に最上層に対して等量のクロロホルムを加え同様の操作を行った。遠心後、同様に最上層に対して２．２倍量の１００％エタノールと０．１倍量の３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えた。混液を穏やかに撹拌し、−２０℃下で２時間以上放置した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心処理をした。遠心後上清を廃棄し、残存エタノールを除去しながら風乾して、ＤＮＡを得た。
【００２３】
実施例２（遺伝子の変異分析）
試験に用いるＤＮＡは、実施例１で調製したものを用い、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析法を用いて解析した。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析法は、ＤＮＡの１本鎖がとる特異的な立体構造の違いにより、ＰＣＲ産物中での１塩基の相違が、電気泳動で得られるバンドの”ずれ”として描出される。解析は次のように行った。即ち、ＤＮＡを適当量のＴＥ（ｐＨ８．０；Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶解し、下記の条件のもと、ＰＣＲ法を用いて目的のＤＮＡ断片を合成した。得られたＰＣＲ産物１０μｌに変性剤として９５％ホルムアミド９０μｌを加え、９５℃で３分間処理し、その後氷冷して１本鎖ＤＮＡを形成された。得られた１本鎖ＤＮＡを、ＳＳＣＰゲルを用いて４０Ｗで１６０分間電気泳動した。（Ｏｒｉｔａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ５：  ８７４−８７９，  １９８９．）検出はオートラジオグラフィーで行った。結果を図１に示す。
【００２４】
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【００２５】
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【００２６】
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【００２７】
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【００２８】
その結果、図１、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ解析に示したように、４名の癌患者において、レーン１とレーン１４に変異（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔｓ）が認められた。更に、ＳＳＣＰゲルからずれが生じたバンド（レーン１４）及びずれが生じなかったバンド（レーン１５）を回収し、シークエンス解析した結果、レーン１４では、コドン６２７の配列がＴＣＧからＴＴＧ（ＳｅｒからＬｅｕ）に置き換わっていることがわかった。また、癌患者の場合、癌細胞由来の遺伝子（癌遺伝子）及び正常細胞由来の遺伝子（正常遺伝子）の両方で同じ変異が認められ、前立腺疾患特有の遺伝子多型であることがわかった。
【００２９】
実施例３（Ｓｅｒ６２７Ｌｅｕ多型の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション）
ＤＮＡの調製は実施例１と同様に行った。９６例の癌患者、前立腺肥大症患者の血液より採取したＤＮＡを対象に、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションで分析した。即ち、実施例２と同様に作成したＰＣＲ産物５μｌを９５℃で５分間加熱し、その後氷上にて５分間放置した後、２０倍のクエン酸ナトリウム−塩化ナトリウム（ＳＳＣ）１５μｌを添加し、１０μｌづつ２枚のナイロン膜にスポットした。スポットしたナイロン膜をまず変性溶液（０．５Ｎ  ＮａＯＨ／１．５Ｍ  ＮａＣｌ）に５分間浸し、次いで中和溶液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／３Ｍ  ＮａＣｌ）に１分間浸した後、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により紫外線を２分間照射した。照射後、以下の組成の溶液に浸し、６５℃、１時間のプレハイブリダイゼーション処理を行った。処理後、別途調整したラベル化オリゴヌクレオチド・プローブ５０μｌを加え、６５℃で一晩ハイブリダイゼーション処理した。
【００３０】
処理後、６５℃下で、ＳＳＰＥ（２倍濃）と０．１％ＳＤＳの混液で１０分間、次いでＳＳＰＥ（１倍濃）と０．１はＳＤＳの混液で３０秒間洗浄し、室温下で一晩オートラジオグラフィー処理した。結果を図２に示す。
【００３１】
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【００３２】
プローブの調整：
下記に示したＳｅｒ及びＬｅｕ特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを、下記の組成条件の下、３７℃、３０分間ラベル化処理をした。
【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
図２に示したように、今回変異分析によって新たに見出された新しい遺伝子多型、コドン６２７では、４名の前立腺癌患者においては少なくとも１つのＬｅｕ対立遺伝子を保有していた。一方、前立腺肥大症の場合、８検体でＬｅｕ対立遺伝子が見出された。この変異は生殖細胞遺伝子に位置し、コントロールに比べ高い発現頻度を示した。
【００３６】
実施例４
Ａｌａ５４１ＴｈｒのＲＦＬＰ解析
試験に用いるＤＮＡは、実施例１で調整したものを用い、既知の遺伝子多型（Ａｌａ５４１Ｔｈｒ）に対して、常法に従いｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）解析を実施した。即ち、下記のコドン５４１プライマーを使用し、実施例２と同様の条件で１９２ｂｐのＰＣＲ産物を作成した。得られたＰＣＲ産物の一部を制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩで処理し、アガロースゲル電気泳動を行った。結果を図３及び表１に示す。
【００３７】
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【００３８】
【表１】
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【００３９】
制限酵素Ｆｎｕ４ＨＩで処理した場合、コドン５４１にＴｈｒ配列に対応するゲノムシークエンスが存在すればＰＣＲ産物は１１２ｂｐ、４９ｂｐ、及び３１ｂｐのフラグメントに分断される。もしＰＣＲ産物にＡｌａの対立遺伝子が存在した場合、１１２ｂｐのフラグメントが更に６０ｂｐと５２ｂｐのフラグメントに分断される。図３及び表１に示したように、全てのケースがＡｌａ／Ａｌａの遺伝子型を有することがわかった。一方、本発明のコドン６２７の遺伝子多型は、日本人の前立腺疾患患者においては高い頻度で存在することがわかった。したがって、黄色人種、特に日本人の前立腺疾患又はその罹患リスクを診断する場合には、白人種において用いられて用いられているコドン５４１ではなく、コドン６２７を用いることが好ましいことがわかった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明のコドン６２７の遺伝子多型は白人種では見つかっておらず、黄色人種、特に日本人特有の遺伝子多型である可能性が高い。したがって、本発明のコドン６２７を用いることにより、既知のコドン５４１を用いた方法では診断できなかった、黄色人種、特に日本人の前立腺疾患及びその罹患リスクを診断することが出来る。
【００４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＳＣＰ法を用いたＨＰＣ２／ＥＬＡＣ２遺伝子の生殖細胞と体細胞の変異スクリーニング及び配列分析結果を示す図である。
【図２】前立腺疾患患者における本発明遺伝子多型の発現頻度を示す図である。
【図３】前立腺疾患患者におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析結果を示す図である。
【図１】
2004166565.tif 000084
【図２】
2004166565.tif 000085
【図３】
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