(57)【要約】【課題】作製が簡便で、遺伝子発現抑制効率がより高い新規ＲＮＡ干渉誘導ベクター、及び、そのＲＮＡ干渉誘導ベクターを用いて遺伝子発現抑制を効率よく行う方法を提供する。【解決手段】本発明のＲＮＡ干渉誘導ベクターは、遺伝子の遺伝情報をコードするセンス鎖配列（Ｔａｒｇｅｔ２）と、そのアンチセンス鎖配列（Ｔａｒｇｅｔ２’）とが組み込まれ、逆方向反復塩基配列構造を有するものであって、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター配列であるｔＲＮＡＴｈｒ１が逆方向反復塩基配列の上流領域に組み込まれているものである。これによれば、ＲＮＡ干渉誘導において、遺伝子発現抑制効率をより高くすることができるため、遺伝子の機能解析に有効に利用することができる。【選択図】  図１
2004166577.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の遺伝情報をコードするセンス鎖配列と、そのアンチセンス鎖配列とが組み込まれ、逆方向反復塩基配列構造を有するＲＮＡ干渉誘導ベクターにおいて、
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター配列であるｔＲＮＡＴｈｒがさらに組み込まれていることを特徴とするＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項２】
前記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、植物細胞に導入されることを特徴とする請求項１記載のＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項３】
前記ＲＮＡ干渉誘導ベクターがｐＵＣ１８ベクターであることを特徴とする請求項１または２に記載のＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項４】
前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間には、１５ｂｐ以上５０ｂｐ以下のスペーサー配列が設けられていることを特徴とする請求項１ないし３の何れか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項５】
前記スペーサー配列は、２０ｂｐからなることを特徴とする請求項４記載のＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項６】
前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖配列は、それぞれ２０ｂｐ以上１００ｂｐ以下であることを特徴とする請求項１ないし５の何れか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項７】
前記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ターミネーター配列ＴＴＴＴＴＴをさらに有することを特徴とする請求項１ないし６の何れか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導ベクター。
【請求項８】
請求項１ないし７の何れか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導ベクターを宿主細胞に導入することによって、前記宿主細胞内で遺伝子の発現を抑制させる方法。
【請求項９】
前記宿主細胞は植物細胞であることを特徴とする請求項８記載の遺伝子の発現を抑制させる方法。
【請求項１０】
請求項１ないし７の何れか１項に記載のＲＮＡ干渉誘導ベクターが導入された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二本鎖ＲＮＡの細胞内への導入によって、その二本鎖ＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制される現象であるＲＮＡ干渉を誘導するベクター、そのベクターを用いて遺伝子の発現を抑制させる方法、及びそのベクターが導入された形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アンチセンスＲＮＡとは、ＤＮＡより転写されるｍＲＮＡ（センスＲＮＡ）に対し、その遺伝情報が裏返しとなった転写物のことを意味する。このアンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子からつくられるｍＲＮＡと構造的に相補性を有しているので、両者は互いに結合してＲＮＡ二重鎖（二本鎖ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡとも称する）を形成する。このように、言わば“フタ”をかぶされたｍＲＮＡは、特異的ＲＮＡ分解酵素によって分解され、タンパク質合成の場への移行ができなくなり、本来の遺伝子の機能が抑制される。
【０００３】
また、アンチセンスＲＮＡのみならず、アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとが互いに結合して形成された上述のｄｓＲＮＡも、細胞内へ導入されることによって、当該ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現を抑制するという現象を引き起こす。このｄｓＲＮＡの導入によって遺伝子の発現が抑制される現象は、ＲＮＡ干渉（或いは、ＲＮＡｉ、ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる。ＲＮＡ干渉は極めて高い配列特異性を持つことから、ある特定の遺伝子の機能を探るためのツールとして線虫を中心に広く利用されている。また、それにとどまらず、上記ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡを標的とした医薬品、農薬品、品種改良、微生物工業、バイオリアクターの開発などに幅広く利用できる可能性を有している。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｓｍｉｔｈ，  Ｎ．  Ａ．，  Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．  Ｐ．，  Ｗａｎｇ，  Ｍ．  Ｂ．，  Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ａ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，  Ｐ．  Ｍ．  （２０００）．  Ｔｏｔａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐｌｉｃｅｄ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，  ３１９−３２０
【０００５】
【非特許文献２】
Ｓｉｎｇｈ，  Ｓ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ａ．，  Ｓｔｏｕｔｊｅｓｄｉｊｋ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｌｉｕ，  Ｑ．  （２０００）．  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｒｅｐｅａｔ  ＤＮＡ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｅｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ２８，  ９２５−９２７
【０００６】
【非特許文献３】
Ｔｈｉｊｎ  Ｒ．  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｒｅｎｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｓ，  Ｒｅｕｖｅｎ  Ａｇａｍｉ，  １９  Ａｐｒｉｌ  ２００２，  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，ＳＣＩＥＮＣＥ，  ｖｏｌ．  ２９６，  ５５０−５５３
【０００７】
【非特許文献４】
Ｂｏｕｒｑｕｅ，  Ｊ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｆｏｌｋ，  Ｗ．  Ｒ．  （１９９２）．  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９，  ６４１−６４７
【０００８】
【非特許文献５】
Ｍｕｒｆｅｔｔ，  Ｊ．，  Ｂｏｕｒｑｕｅ，  Ｊ．  Ｅ．，  ａｎｄ  ＭｃＣｌｕｒｅ，  Ｂ．  Ａ．  （１９９５）．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ−ＲＮａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ−  ａｎｄ  ＩＩＩ−ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９，  ２０１−２１２
【０００９】
【非特許文献６】
Ｐｅｒｒｉｍａｎ，  Ｒ．，  Ｂｒｕｅｎｉｎｇ，  Ｇ．，  Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｅ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｐｅａｃｏｃｋ，  Ｗ．  Ｊ．  （１９９５）．  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９２，６１７５−６１７９
【００１０】
【非特許文献７】
Ｒａｍａｍｏｎｊｉｓｏａ，  Ｄ．，  Ｋａｕｆｆｍａｎｎ，  Ｓ．，  Ｃｈｏｉｓｎｅ，  Ｎ．，  Ｍａｒｅｃｈａｌ−Ｄｒｏｕａｒｄ，  Ｌ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｇ．，  Ｗｉｎｔｚ，  Ｈ．，  Ｓｍａｌｌ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，  Ａ．  （１９９８）．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｂｅａｎ  （Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ：  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｔＲＮＡ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．  ＰｌａｎｔＭｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３６，  ６１３−６２５
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記ｄｓＲＮＡの細胞内への導入方法として、線虫などではマイクロインジェクションによる直接注入方法が頻繁に用いられている。一方、植物では、セルロースやペクチン質からなる強固な細胞壁が存在するため、ｄｓＲＮＡを細胞内へ直接導入することが極めて難しい。そのため、植物では転写後にｄｓＲＮＡが形成されることを期待した逆方向反復塩基配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の構造を持つベクターで形質転換する方法が専ら利用されている。
【００１２】
上記の方法においては通常、逆方向反復塩基配列の間、即ち標的遺伝子のセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列との間に、スペーサーと呼ばれるＲＮＡの二本鎖形成に関与しない配列が挿入される。これは、ベクター作製時用いられる大腸菌において、長いパリンドローム配列は安定に存在できないという理由から実施されるものである。近年、このスペーサーの部分をイントロンと置き換え、転写後にスプライシングによってこの部分が除かれるようにすると、遺伝子発現の抑制効率が上昇するとの報告がある（非特許文献１及び２参照）。
【００１３】
ところで、ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ｍＲＮＡの転写を担うＲＮＡポリメラーゼＩＩ（以下ｐｏｌ    ＩＩと称する）の転写系を使用するのが従来一般的であったが、近年では、ｔＲＮＡなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（以下ｐｏｌ    ＩＩＩと称する）の転写系を用いた発現例が、哺乳類動物細胞において報告されており、特にリボザイムの動物細胞における発現で一定の効果を上げている（非特許文献３参照）。一方、植物細胞においてもｔＲＮＡの下流にターゲット遺伝子のアンチセンス鎖やリボザイムを連結し、遺伝子発現抑制を試みた例がいくつか報告されている（非特許文献４〜６参照）。
【００１４】
しかしながら、植物におけるこのようなベクターの構築においては、遺伝子発現の抑制効率が必ずしも高くないことに加え、作製が面倒で時間がかかるという問題点を有している。そのため、何れの方法もほとんど普及していないのが現状である。
【００１５】
そこで、本発明は、ｔＲＮＡＴｈｒをプロモーターとして使用することによって、遺伝子発現抑制効率がより高い新規ＲＮＡ干渉誘導ベクター、そのＲＮＡ干渉誘導ベクターを用いて遺伝子発現抑制を効率よく行う方法、及びそのベクターが導入された形質転換体を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本願発明者等は、ｐｏｌ    ＩＩＩの転写系の中でも特にｔＲＮＡに注目した。そして、本願発明者等は、ｔＲＮＡの転写系は数百塩基以上の長いＲＮＡの合成には向かないもののその転写量はｐｏｌ    ＩＩの系を上回ること、及び、ｔＲＮＡ自身にプロモーターと細胞質移行シグナルが含まれるということから、インゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のｔＲＮＡＴｈｒの転写系を利用してＲＮＡ干渉誘導ベクターの作製を試みた。その結果、植物細胞において、遺伝子発現抑制が効率よく行われるベクターを構築することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
即ち、本発明に係るＲＮＡ干渉誘導ベクターは、遺伝子の遺伝情報をコードするセンス鎖配列と、そのアンチセンス鎖配列とが組み込まれ、逆方向反復塩基配列構造を有するＲＮＡ干渉誘導ベクターにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター配列であるｔＲＮＡＴｈｒがさらに組み込まれていることを特徴とするものである。即ち、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター配列であるｔＲＮＡＴｈｒがプロモーターとして、上記逆方向反復塩基配列構造の上流域に組み込まれている。
【００１８】
ＲＮＡ干渉誘導ベクターとは、上述のＲＮＡ干渉現象を誘導させるために構築されたベクターである。このＲＮＡ干渉誘導ベクターは、遺伝子の遺伝情報をコードするセンス鎖配列とそのアンチセンス鎖配列とを含み、逆方向に相補的な逆方向反復塩基配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有しているため、細胞内に導入され、その細胞内において転写されて形成された一本鎖のＲＮＡ同士は互いにハイブリッド結合しｄｓＲＮＡを形成する。これによって、上記ｄｓＲＮＡと相同な配列を有する遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１９】
また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ    ＩＩＩ）は、ｔＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、及びいくつかの他の小さな特定のＲＮＡを合成する酵素である。上記ｔＲＮＡは、このＲＮＡポリメラーゼを認識するプロモーターの一つであるととともに、細胞質輸送シグナルとしての機能を果たす。
【００２０】
そして、本発明のＲＮＡ干渉誘導ベクターには、上述のｔＲＮＡＴｈｒの中でも、特にインゲン由来のｔＲＮＡＴｈｒが組み込まれることが好ましい。なお、上記インゲン由来のｔＲＮＡＴｈｒは、配列番号１に示す塩基配列中の第２０番目から第９１番目の塩基配列を有するものであり、その詳細（塩基配列、構造、取得方法、発現など）は、上記非特許文献７に記載の通りである。
【００２１】
上述のように構築されたＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ｔＲＮＡの転写系を利用することで、その構築が簡便であるという利点を有しているとともに、高効率の転写、及び、転写産物の細胞質移行の向上によって、効率のよい遺伝子発現抑制を行うことができる。それゆえ、遺伝子の機能を解析するための手段として有用である。
【００２２】
上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、植物であるインゲン由来のｔＲＮＡＴｈｒをプロモーターとして有していることから、植物細胞に導入されることが好ましい。これによれば、植物において高効率に遺伝子発現を抑制させることができ、植物中のある特定の遺伝子の機能を探るのに有用である。
【００２３】
上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、大腸菌用発現ベクターであるｐＵＣ１８であることが好ましい。これによれば、後述の実施例にも示されるように、より高い確率で遺伝子の発現を抑制させることができる。
【００２４】
ところで、ベクター作製時に一般的に用いられる大腸菌において、上述のようなセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列とが並列して含まれたパリンドローム配列は、安定に存在できない。それゆえ、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターにおいて、上記センス鎖配列と上記アンチセンス鎖配列との間には、１５ｂｐ以上５０ｂｐ以下のスペーサー配列が設けられていることが好ましい。なお、近年、上記スペーサー配列の部分をイントロンと置き換え、転写後にスプライシングによってこの部分が除かれるようにすると、遺伝子発現の抑制効果がより上昇するとの報告がなされている（非特許文献１及び２参照）。
【００２５】
また、上記スペーサー配列は２０ｂｐからなることがより好ましく、このようなスペーサー配列として、例えば、配列番号１に示す塩基配列中の第１３５番目から第１５４番目までの配列を挙げることができる。
【００２６】
上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターにおいて、ｔＲＮＡの転写系があまり長いＲＮＡの転写には向かないことを考慮すると、転写産物のトータルの配列長は３００程度が上限である。そのため、上記センス鎖配列および上記アンチセンス鎖配列は、それぞれ２０ｂｐ以上１００ｂｐ以下であることが好ましい。また、上記センス配列として、発現抑制を行いたい遺伝子のスタートコドンの下流５０〜１００ｂｐを用いることが好ましく、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）は避けることが好ましい。
【００２７】
上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、ターミネーター配列として、ＴＴＴＴＴＴをさらに有することが好ましい。なお、上記Ｔとは、ＤＮＡを構成する４つの塩基のうちのチミンを意味する。従って、上記ターミネーター配列であるＴＴＴＴＴＴは、チミンが６塩基続く配列のことを意味している。
【００２８】
本ＲＮＡ誘導干渉ベクターは、上記ターミネーター配列を含むことによって、目的の領域を確実に発現させることができる。
【００２９】
また、本発明に係る遺伝子発現抑制方法は、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターを宿主細胞に導入することによって、上記宿主細胞内で遺伝子の発現を抑制させる方法である。
【００３０】
この方法によれば、後述の実施例にも示されるように、従来のＲＮＡ干渉誘導ベクターを用いた遺伝子発現抑制方法と比較して、高効率に遺伝子の発現を抑制させることができる。そのため、遺伝子配列はわかっているが、機能が未知の遺伝子の生理的役割を解析するのに有用である。また、本方法は、強固な細胞壁を有するため、アンチセンス鎖配列を直接導入することによってＲＮＡ干渉誘導を行うことが困難な植物細胞において、特に有効に利用することができる。従って、上記宿主細胞は、植物細胞であることが好ましい。
【００３１】
本発明には、上述のＲＮＡ干渉誘導ベクターが導入された形質転換体も含まれる。上記形質転換体は、ＲＮＡ干渉誘導ベクターに含まれる遺伝子の発現が高効率に抑制されるため、その遺伝子の機能（生理的役割）の解析に有用であるとともに、医薬品として利用できる可能性を有している。
【００３２】
上記形質転換体の宿主としては、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターに含まれるプロモーターが植物由来のものであることから、植物（植物細胞を含む）であることが好ましい。これによれば、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターに含まれる逆方向反復塩基配列を高効率で発現させ、二本鎖ＲＮＡを多く形成させることができるため、ＲＮＡ干渉を強く誘導させることができると考えられる。また、植物細胞の他にも、インゲン由来のｔＲＮＡＴｈｒがＨｅＬａ細胞の各抽出液を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されることが確認されている（非特許文献７参照）ため、ヒトの培養細胞も宿主として利用可能である。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下により詳細に説明するが、本発明はこの記載に限定されるものではない。
【００３４】
１．ＲＮＡ干渉誘導ベクターについて
本実施の形態においては、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターの一例として、大腸菌用発現ベクターｐＵＣ１８のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトにインゲン由来ｔＲＮＡＴｈｒとターミネーター配列（ＴＴＴＴＴＴ）とを含む合成ＲＮＡが挿入されたベクターを例に挙げて説明する。
【００３５】
本実施の形態に係るＲＮＡ干渉誘導ベクター（ＲＮＡｉ誘導ベクターとも称する）のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの構造を図１に模式的に示す。図１に示すように、上記ＲＮＡｉ誘導ベクターは、５’側のＥｃｏ  ＲＩサイトの近傍から順に、プロモーターであるｔＲＮＡＴｈｒ１、ターゲット配列であるセンス鎖配列（Ｔａｒｇｅｔ２）、スペーサー配列（Ｓｐａｃｅｒ３）、上記センス鎖配列のアンチセンス鎖配列（Ｔａｒｇｅｔ２’）、ターミネーター配列４（ＴＴＴＴＴＴ）、Ｈｉｎｄ  ＩＩサイトが設けられている。そして、上記ｔＲＮＡＴｈｒ１と上記ｔａｒｇｅｔ２との間には制限酵素（Ｓｐｅ  Ｉ）サイトが設けられ、上記ｔａｒｇｅｔ２’と上記ターミネーター配列４との間には制限酵素（Ｘｈｏ  Ｉ）サイトが設けられている。なお、上記ターゲット配列は、ある遺伝子の部分配列である。
【００３６】
上記のような構造を有するＲＮＡｉ誘導ベクターは、プロモーターであるｔＲＮＡＴｈｒ１をＲＮＡポリメラーゼが認識することによって、ｔＲＮＡＴｈｒ１配列の５’末端より転写を開始する。そして、上記ＲＮＡｉ誘導ベクターのＴａｒｇｅｔ２から下流側の領域は、ＲＮＡポリメラーゼによってターミネーター配列４が認識されるまで順次転写される。それゆえ、この転写反応によって得られるｍＲＮＡは、ある遺伝子の部分配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とが連結された構造を有する。従って、上記ｍＲＮＡは、逆方向反復塩基配列構造を有しており、２本のｍＲＮＡが互いに相補的な構造であるため、ハイブリッド結合し２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成する。
【００３７】
上記ｄｓＲＮＡが細胞内で形成されれば、当該ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現を抑制するというＲＮＡ干渉を引き起こす。それゆえ、上記ターゲット配列として、配列が既知であるが、その機能が未知の遺伝子を用いてＲＮＡｉ誘導ベクターの作製を行い、それを適当な宿主細胞に導入すれば、その遺伝子の発現のみが人為的に抑制された形質転換体を作製することができる。
【００３８】
なお、上記スペーサー配列３は、ＲＮＡの二本鎖形成には関与しないが、ベクター作製時に用いられる大腸菌において、パリンドローム配列を安定化させるために有効である。なお、上記スペーサー配列として具体的には、配列番号１に示す塩基配列の第１３５番目から第１５４番目までの２０ｂｐの塩基配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。しかしながら、パリンドローム配列を安定化させるために、本実施例においては２０ｂｐのスペーサーを用いている。
【００３９】
上記ＲＮＡｉ誘導ベクターの逆方向反復塩基配列（Ｔａｒｇｅｔ２、Ｓｐａｃｅｒ３、及びＴａｒｇｅｔ２’からなる配列）として、例えば、配列番号１に示すものを挙げることができる。しかしながら、本発明に用いられるターゲット配列については、特に限定されることなく、その機能を解析したい目的の遺伝子の部分配列を用いればよい。
【００４０】
続いて、上記ＲＮＡｉ誘導ベクターの作製方法について以下に説明する。
【００４１】
上記ＲＮＡｉ誘導ベクターを作製するために使用することができるベクターとしては、従来から微生物や植物、植物細胞などの形質転換に使用されているベクターを挙げることができる。上記ベクターとして具体的には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを挙げることができ、より具体的には、上述のｐＵＣ１８、あるいはｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＢＩ１２１などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
そして、上記ベクターを適当な制限酵素を用いて切断し、その切断部位にプロモーターとして上述のインゲン由来のｔＲＮＡＴｈｒ１、及び、ターミネーターとしてＴＴＴＴＴＴを挿入すればよい。また、後述の実施例のように、ｔＲＮＡＴｈｒとターミネーターとの間にターゲット配列挿入用の制限酵素サイト（例えば、Ｓｐｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ）をあらかじめ挿入しておけば、この制限酵素サイトに逆方向反復塩基配列を容易に挿入することができる。
【００４３】
また、上記ターミネーター配列としては、上述のＴＴＴＴＴＴに限定されることはなく、一般的に知られたターミネーター配列であるＴが４つ以上連続した配列を用いることができる。
【００４４】
上述のようにして作製されたＲＮＡｉ誘導ベクターは、後述の実施例においても示されるように、従来のプロモーターである３５Ｓプロモーターなどが組み込まれたＲＮＡｉ誘導ベクターと比較して、高効率に遺伝子発現を抑制することができる。それゆえ、上記ＲＮＡｉ誘導ベクターに、目的とする遺伝子の部分配列をターゲット配列として組み込み、さらに、そのアンチセンサ鎖配列も組み込むことによって、逆方向反復塩基配列を構成した後、植物細胞などの宿主細胞に導入することによって、当該宿主細胞内で目的とする遺伝子の発現を抑制させることができる。このようにして、特定の遺伝子の発現を抑制する方法は、機能が未知の遺伝子の機能の同定に利用することができる。
【００４５】
２．形質転換体
続いて、本発明の形質転換体について説明する。本発明の形質転換体は、上記ＲＮＡｉ誘導ベクターが導入されたものである。
【００４６】
このような形質転換体の一例として、実施例に示すようなタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ）の培養細胞のプロトプラストを宿主として、エレクトロポレーション法によって上記ＲＮＡｉ誘導ベクターを導入したものを挙げることができる。上記形質転換体に導入されるＲＮＡｉ誘導ベクターは、ターゲット配列としてホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子の部分配列が挿入されている。そして、上記形質転換体は、上記ＲＮＡｉ誘導ベクターとともに、ホタルルシフェラーゼの全長遺伝子の発現ベクターが導入されており、コントロールと比較してルシフェラーゼの活性が有意に高効率に抑制されることが確認されている。従って、本発明に係るＲＮＡｉ誘導ベクターが導入された上記形質転換体は、目的とする遺伝子の発現を高効率に抑制させることができる。
【００４７】
本発明のＲＮＡｉ誘導ベクターは、植物由来のプロモーターであるｔＲＮＡＴｈｒを使用しているため、特に宿主を植物として導入することが好ましい。ここで、上記植物の範疇には、完全な植物のみならず、その一部、例えば、葉、種子、塊茎、挿木等も含まれるものとする。さらに、上記植物には、予め形質転換された遺伝子組み換え植物やその子孫を起源とする植物組織、プロトプラスト、細胞、カルス、器官、植物種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子などの増殖可能な植物材料；花、茎、実、葉、根などを含む植物の一部；等も含まれるものとする。
【００４８】
また、上記形質転換体を作製する方法としては、上述のエレクトロポレーション法だけでなく、従来公知の種々の形質転換法を用いることができる。このような形質転換法として、具体的には、マイクロインジェクション法、弾道粒子加速法、プロトプラスト形質転換／再生法、アグロバクテリウムによる形質転換法などを挙げることができる。また、上記形質転換方法は、宿主となる植物の種類（例えば、単子葉植物・双子葉植物）に応じて適宜選択されることが好ましい。
【００４９】
【実施例】
本実施例においては、ｐｏｌ    ＩＩＩの転写系を利用したＲＮＡｉ誘導ベクターの作製の一実施例として、ルシフェラーゼをターゲット遺伝子としたＲＮＡｉベクターの作製について説明する。さらに、本実施例においては、タバコＢＹ−２培養細胞を宿主として用いて、上記ＲＮＡｉベクターを導入した形質転換体の作製、及び、その形質転換体における遺伝子発現抑制効果の確認実験結果について説明する。
【００５０】
１．タバコＢＹ−２細胞の培養
タバコＢＹ−２細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ    ｔｏｂａｃｕｍ  Ｌ．  ｃｖ  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２）は、改変ＬＳ培地（１×ＭＳ  ｍｅｄｉｕｍ、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇ／Ｌ  ｍｙｏｉｎｏｓｉｔｏｌ、１ｍｇ／Ｌ  ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ、０．２ｍｇ／Ｌ  ２，４−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ    ａｃｉｄ，  ａｎｄ    ３０ｇ／Ｌ  ｓｕｃｒｏｓｅ、ｐＨ５．８：ＭＬＳと命名）を用い、暗黒条件下、１２０ｒｐｍにて２６℃で培養を行った。植え継ぎは、１週間毎に１００ｍｌの培地に対して５ｍｌの割合で行った。
【００５１】
２．プラスミドの構築
（１）ルシフェラーゼ発現ベクターの作製（ｐＰｌｕｃとｐＲｌｕｃ）
ＣａＭＶ３５Ｓ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ３’ベクターをＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｓＧＦＰ配列を取り除いた。このベクターにＳａｌＩサイト及びＮｏｔＩサイトを付加したプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅したホタルルシフェラーゼ（Ｐｌｕｃ）及びウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の配列を挿入した。ＰＣＲの鋳型には、ｐＧＬ３−Ｂａｃｉｃ    ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びｐＲＬ−ＣＭＶ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇｅ）を用いた。
【００５２】
ここで作製されたルシフェラーゼ発現ベクターのうち、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来ルシフェラーゼ（Ｐｌｕｃ）の配列が組み込まれたものをｐＰｌｕｃと称し、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来ルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）の配列が組み込まれたものをｐＲｌｕｃと称する。
【００５３】
（２）ｔＲＮＡ転写系のプロモーター（ｔＲＮＡＴｈｒ）が組み込まれたベクター（ｔＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｐｔＰｌｕｃ３７とｐｔＧＦＰ３７）の作製
先ず、大腸菌用発現ベクターｐＵＣ１８のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトにインゲン由来ｔＲＮＡＴｈｒとターミネーター配列（ＴＴＴＴＴＴ）を含む合成ＲＮＡを挿入した。ｔＲＮＡとターミネーターとの間には、ターゲット配列挿入用の制限酵素サイト（ＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ）をあらかじめ挿入しておいた。次に、ｔＲＮＡとターミネーター配列との間に存在するＳｐｅＩ／ＸｈｏＩサイトにホタル由来ルシフェラーゼの部分配列を含む逆方向反復塩基配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔ配列）を挿入した。このとき、ターゲット配列の長さ（転写後に二本鎖を形成すると期待される部分の長さ）は３７塩基、スペーサーの長さは２０塩基とした。
【００５４】
上述のようにして構築されたＲＮＡｉ誘導ベクター（ｐｔＰｌｕｃ３７と称する）であるｐＵＣ１８のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの模式図は、図１に示す通りである。また、このｐｔＰｌｕｃ３７のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの塩基配列は配列番号１及び図３に示す通りである。この配列は、その配列中の第９８番目から１３４番目までの３７ｂｐがターゲット配列であるセンス鎖配列（Ｔａｒｇｅｔ２）、第１３５番目から第１５４番目までの２０ｂｐがスペーサー配列（Ｓｐａｃｅｒ３）、第１５５番目から第１９１番目までの３７ｂｐが上記センサ鎖配列のアンチセンス鎖配列（Ｔａｒｇｅｔ２’）である。なお、上記ターゲット配列は、配列番号３に示すホタルルシフェラーゼ遺伝子のＯＲＦの塩基配列の１２８番目から１６４番目に相当する。
【００５５】
配列特異性を確認するためのコントロールとして、ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）の逆方向反復塩基配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列）を含むベクター（ｐｔＧＦＰ３７と称する）も作製した。このｐｔＧＦＰ３のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの塩基配列は配列番号２及び図４に示す通りである。なお、ターゲット配列（Ｔａｒｇｅｔ２に相当する配列）は、配列番号４に示すｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）遺伝子のＯＲＦの塩基配列の１２６番目から１６２番目に相当する。
【００５６】
なお、図３及び図４に示す各ベクターのＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの塩基配列において、図中のａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉで示す各配列は、それぞれ順に、ＥｃｏＲ  Ｉサイト、７２ｂｐからなるインゲン由来のｔＲＮＡＴｈｒ、Ｓｐｅ    Ｉサイト、３７ｂｐからなるｄｓＲＮＡ領域（センス側）、２０ｂｐからなるスペーサー配列、３７ｂｐからなるｄｓＲＮＡ領域（アンチセンス側）、Ｘｈｏ    Ｉサイト、ターミネーター配列、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ配列である。
【００５７】
また、本実施例において作製された各ベクターｐｔＰｌｕｃ３７、ｐｔＧＦＰ３７におけるスペーサー配列は、それぞれホタルルシフェラーゼ遺伝子あるいはｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）のターゲット配列のセンス鎖に由来するものである。より詳しくは、ｐｔＰｌｕｃ３７におけるスペーサー配列は、配列番号３に示す塩基配列中の第１６５番目から第１８４番目に相当する塩基配列を有するものである。つまり、センス鎖がアンチセンス鎖に比べて２０ｂｐ長くなっており、この２０ｂｐの２本鎖形成に関与しない余分な配列がスペーサー配列となっている。
【００５８】
（３）コントロールとしてのＣａＭＶの３５Ｓプロモーターが組み込まれたベクター（３５Ｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ：ｐ３５ＳＰｌｕｃ３７とｐ３５ＳＧＦＰ３７）の作製
ｔＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓのコントロールとして、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターを含むベクターも作製した。ＣａＭＶ３５Ｓ−ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ３’ベクターをＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切断した後、ＳｐｅＩサイト及びＸｈｏＩサイトを含むリンカーを挿入した。次に、このベクターをＳｐｅＩ／ＸｈｏＩで切断した後、ｔＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒの場合と同様に、ホタル由来のルシフェラーゼ及びｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）の部分配列を含むｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ配列を挿入した。二本鎖形成領域及びスペーサーの長さ、そしてターゲットの領域はｔＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒの場合と同じとした。
【００５９】
ここで作製されたベクターのうち、ホタル由来のルシフェラーゼの部分配列が組み込まれたものをｐ３５ＳＰｌｕｃ３７と称し、ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）の部分配列が組み込まれたものをｐ３５ＳＧＦＰ３７と称する。
【００６０】
３．ＢＹ−２プロトプラストの調製
植え継ぎ３日後のＢＹ−２培養細胞懸濁液５０ｍｌをファルコンチューブに移し、１０００ｒｐｍ（４００×ｇ）で３分間遠心して上清を除いた。プロトプラスト洗浄液（０．４Ｍのマンニトールを添加した５ｍＭ  ＭＥＳバッファー、ｐＨ５．８）で１回洗浄した後、酵素液（１％  Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ    Ｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ、０．１％  Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ  Ｙ−２３、５ｍＭ  Ｍａｎｎｉｔｏｌ、ｐＨ５．５）を沈殿した培養細胞に３０ｍｌ加え、３０℃で１時間緩やかに（６０ｒｐｍ）振とうした。８００ｒｐｍ（７０×ｇ）で３分間遠心して酵素液を除いた後、プロトプラスト洗浄液で１回洗浄し、ＢＹ−プロトプラストを得た。
【００６１】
４．エレクトロポレーション法を用いたプラスミドの導入（形質転換体の作製方法）
上記ＢＹ−２プロトプラストをＥＰバッファー（５ｍＭ  ＭＥＳ、７０ｍＭ  ＫＣｌ、０．３Ｍ  ｍａｎｎｉｔｏｌ、ｐＨ５．８）で２回洗浄した。氷冷した０．４ｃｍ幅のキュベットに７００ｍｉｃｒｏ−Ｌのプロトプラスト懸濁液とプラスミド（０．３μｇ  ｐＰｌｕｃ＋０．３μｇｐＲｌｕｃ＋３μｇＲＮＡｉ  ｖｅｃｔｏｒ）を加え、１０分間氷冷した。緩やかなピペッティングで攪拌したのちキュベットを装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）にセットし、電気パルス（３００Ｖ、１５０μＦ、１回）をかけた。１０分間氷冷した後、エレクトロポレーション産物３００μｌ（約１．５×１０６個）を１２穴プレートに移し、１％ｓｕｃｒｏｓｅと０．４Ｍ  Ｍａｎｎｎｉｔｏｌを添加したＭＬＳを２．７ｍｌ加え、２５℃で２４時間遮光下で静地培養した。
【００６２】
５．２つのルシフェラーゼ活性測定（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）
ＢＹ−２プロトプラストを遠心で回収した後、上清を除き、１×Ｐａｓｓｉｖｅ    Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１００μｌ加えた。緩やかなボルテックスにより細胞を溶解させ、そのまま室温で５分間放置した。この細胞溶解液１０ｍｉｃｒｏ−Ｌをルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ    ＴＤ−２０／２０    Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）にセットし、測定を開始した。
６．ルシフェラーゼ活性測定の結果及び考察
ｐｔＰｌｕｃ３７、ｐ３５Ｓｐｌｕｃ３７の各ＲＮＡｉ誘導ベクターは、上述の形質転換体の作製方法に基づいて、ルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＰｌｕｃ、ｐＲｌｕｃ）とともにＢＹ−２プロトプラストに導入され、形質転換体が作製された。これらの形質転換体について、上述の活性測定方法に基づいて、ルシフェラーゼ活性の測定を行った。
【００６３】
その結果を、以下の表１ないし表４、及び図２に示す。
【００６４】
【表１】
2004166577.tif 000003
【００６５】
【表２】
2004166577.tif 000004
【００６６】
【表３】
2004166577.tif 000005
【００６７】
【表４】
2004166577.tif 000006
【００６８】
各表に示すサンプル名はそれぞれ、Ｂｌａｎｋ：ブランク（ＲＮＡｉ  ｖｅｃｔｏｒ導入せず）、ｐｔＰｌｕｃ３７：ｐｔＰｌｕｃ３７（本発明のＲＮＡｉ  ｖｅｃｏｒ）とルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＰｌｕｃ及びｐＲｌｕｃ）が導入されたもの、ｐｔＧＦＰ３７：ｐｔＧＦＰ３７（コントロール）とルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＰｌｕｃ及びｐＲｌｕｃ）が導入されたもの、ｐ３５Ｓｐｌｕｃ３７（比較用のための従来のＲＮＡｉ  ｖｅｃｏｒ）とルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＰｌｕｃ及びｐＲｌｕｃ）が導入されたもの、ｐ３５ＳＧＦＰ３７（コントロール）とルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＰｌｕｃ及びｐＲｌｕｃ）が導入されたもの、を意味する。また、各表において、Ｐｐ−Ｌｕｃはホタル由来ルシフェラーゼの活性、Ｒｒ−Ｌｕｃはウミシイタケ由来ルシフェラーゼの活性を示し、Ｒａｔｉｏ（Ｐｐ−Ｌｕｃ／  Ｒｒ−Ｌｕｃ）は各Ｒｒ−Ｌｕｃに対する各Ｐｐ−Ｌｕｃの割合を示す。
【００６９】
なお、表１に示すように、同種のサンプルはそれぞれ３個づつ調製され、活性の測定が行われ、表２にはその各平均値を示す。さらに表３は、表２に示す各平均値から対応するブランクの数値を引いたものを示し、Ｒａｔｉｏ（Ｐｐ−Ｌｕｃ／  Ｒｒ−Ｌｕｃ）は、ここで得られた各Ｒｒ−Ｌｕｃの値に対する各Ｐｐ−Ｌｕｃの値の割合を示す。また、表４には、各ＲＮＡｉ誘導ベクターを用いた場合のコントロールに対する相対活性を示す。そして、図２は表４に示す結果をグラフで表したものであり、（ａ）には、ｐｔＧＦＰ３７（コントロール）及びｐｔＰｌｕｃ３７の相対活性（％）を、（ｂ）には、ｐ３５ＳＧＦＰ３７（コントロール）及びｐ３５Ｓｐｌｕｃ３７の相対活性（％）を示す。
【００７０】
図２（ａ）に示すように、ｔＲＮＡＴｈｒ付きのＲＮＡｉ誘導ベクターであるｐｔＰｌｕｃ３７を導入したもので最も活性が低く、コントロール（ＧＦＰをコードするＲＮＡｉ誘導ベクター、即ち、ｐｔＧＦＰ３７に対する相対活性は約２０％であった。
【００７１】
一方、３５Ｓプロモーターの構築（ｐ３５Ｓｐｌｕｃ３７）では、図２（ｂ）に示すように、その相対活性が約８０％と、ｔＲＮＡＴｈｒ付きの構築に比べ約６０％高かった。この結果から、本実施例にて作成したｔＲＮＡＴｈｒ付きのＲＮＡｉ誘導ベクターは、従来の構築に比べＲＮＡｉ誘導能が高いことが示された。
【００７２】
この高いＲＮＡｉ誘導能は、ｔＲＮＡＴｈｒの高いプロモーター活性に加え、ｔＲＮＡＴｈｒの細胞質移行シグナルとしての機能によるものであると考えられる。細胞質移行シグナルとしてのｔＲＮＡＴｈｒの有効性は、動物細胞においてｍＲＮＡを切断するリボザイムで既に実証されている（非特許文献３参照）。従来のｐｏｌ    ＩＩの転写系を用いた構築では、逆方向反復塩基配列の間、即ちセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列との間のスペーサーをイントロンと置き換えると、ＲＮＡｉ誘導能が上昇すると報告されている（非特許文献１及び２参照）。この理由は不明であるが、ｍＲＮＡの核から細胞質への効率的な輸送にスプライシングのステップが必要であると報告されていることから、核内で生成したアンチセンス鎖ＲＮＡの細胞質への移行効率がＲＮＡｉ誘導能の移行に大きな影響を及ぼすと考えられる。従って、本実施例の結果は、ｔＲＮＡＴｈｒが細胞質移行シグナルとして機能することによって、ＲＮＡｉが起こる場であると考えられている細胞質におけるアンチセンス鎖ＲＮＡの濃度が上昇し、その結果ＲＮＡｉがより強く起こったことを示しているものと思われる。
【００７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明のＲＮＡ干渉誘導ベクターは、遺伝子の遺伝情報をコードするセンス鎖配列と、そのアンチセンス鎖配列とが組み込まれ、逆方向反復塩基配列構造を有するＲＮＡ干渉誘導ベクターにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター配列であるｔＲＮＡＴｈｒがさらに組み込まれていることを特徴とするものである。
【００７４】
上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、上述の実施例に示す結果からもわかるように、植物細胞において従来の３５Ｓプロモーターなどによってドライブされるベクターに比べ、ある特定の遺伝子発現を高効率に抑制させることができる。さらに、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、作製も簡便に行えるという利点も有している。
【００７５】
ＲＮＡ干渉誘導ベクターは、その機能が未知の遺伝子の機能同定に非常に有用なツールであることから、本発明のＲＮＡ干渉誘導ベクターは、植物細胞におけるＲＮＡ干渉誘導ベクターとして高い利用価値を有している。さらに、上記ＲＮＡ干渉誘導ベクターを植物へ導入し形質転換体を作製するという植物の機能改変への応用も期待できる。
【００７６】
【配列表】
2004166577.tif 000007
2004166577.tif 000008
2004166577.tif 000009
2004166577.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＲＮＡ干渉誘導ベクターの一例であるｐＵＣ１８を用いたｔＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒのＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトを示す模式図である。
【図２】本発明の実施例にてルシフェラーゼ活性測定を行った結果を、グラフで表したものであり、（ａ）は、ｐｔＧＦＰ３７（コントロール）及びｐｔＰｌｕｃ３７の相対活性（％）を、（ｂ）は、ｐ３５ＳＧＦＰ３７（コントロール）及びｐ３５Ｓｐｌｕｃ３７の相対活性（％）を示している。
【図３】本実施例で作製したベクターｐｔＰｌｕｃ３７のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの塩基配列を示す模式図である。
【図４】本実施例で作製したベクターｐｔＧＦＰ３のＥｃｏ  ＲＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩサイトの塩基配列を示す模式図である。
【図１】
2004166577.tif 000011
【図２】
2004166577.tif 000012
【図３】
2004166577.tif 000013
【図４】
2004166577.tif 000014