(57)【要約】      （修正有）【課題】宿主細胞の増殖を低下させず、かつ海洋細菌由来の組換え酵素の産生を増加させる培地の開発を課題とする。【解決手段】本件発明の組換えタンパク質産生培地は、乳酸カルシウム、グリセリン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウムなどの有機酸カルシウムを含むことを特徴とする。多糖分解酵素として利用できるアルギン酸リアーゼによりアルギン酸オリゴ糖などの製造に利用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋性微生物由来のタンパク質を、非海洋性微生物を宿主として遺伝子組換えにより生産させる場合に、培地に有機酸塩を含ませることを特徴とする、海洋性微生物由来のタンパク質の遺伝子組換え生産方法。
【請求項２】
有機酸塩が有機酸カルシウムである請求項１記載の方法。
【請求項３】
有機酸カルシウムが乳酸カルシウム、グリセリン酸カルシウム、又はプロピオン酸カルシウムである請求項２項記載の方法。
【請求項４】
海洋性微生物が、シュードアルテロモナス  エリャコビイ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｅｌｙａｋｏｖｉｉ）又はビブリオ  ハリオティコリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ）である請求項１、２又は３記載の方法。
【請求項５】
海洋性微生物由来のタンパク質がカルシウムにより折り畳まれて活性化するタンパク質である請求項１〜４項いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
海洋性微生物由来のタンパク質がアルギン酸リアーゼである請求項１〜５項いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
海洋性微生物由来のタンパク質を、非海洋性微生物を宿主として遺伝子組換え法により産生するための有機酸塩を含む培地。
【請求項８】
有機酸塩が有機酸カルシウムである請求項７記載の培地
【請求項９】
有機酸カルシウムが、乳酸カルシウム、グリセリン酸カルシウム、又はプロピオン酸カルシウムである請求項８記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物工学技術に関する。より具体的には、本件発明は、海洋性細菌由来のタンパク質を組換え遺伝子を用いて、非海洋性細菌で産生する際の目的遺伝子産物の改良された生産方法に関する。更に、本発明は、アルギン酸オリゴ糖の生産に有用な改良されたアルギン酸リアーゼ生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルギン酸は褐藻に多く含まれ、難分解性多糖として知られる。その分子構造は、マンニュロン酸とそのＣ５エピマーであるグルロン酸を最小構成単位とし、数十のマンニュロン酸がポリマー（ｐｏ１ｙＭ）を構成している領域、グルロン酸がポリマー（ｐｏ１ｙＧ）を構成している領域、および両者が無秩序に結合している領域（ＭＧ）が存在する。
【０００３】
アルギン酸の主要な供給源は、ラミナリア属（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）、フカス属（Ｆｕｃｕｓ）、マクロシスティス属（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）等の大型褐藻で、特にラミナリア属のコンブ類が重要資源である。
【０００４】
アルギン酸は、陸上生物には難消化性であるが、海水、褐藻類表面、魚介類組織内からの分離された細菌には、アルギン酸分解性のものがあることが知られている。本件研究者等は、既に、コンブ穴あき症患部からシュードアルテロモナス・エリャコビイ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｅｌｙａｋｏｖｉｉ）及びエゾアワビ消化管からビブリオ・ハリオティコリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ）の分離に成功している。そして、シュードアルテロモナス・エリャコビイＨ−４株から、アルギン酸分解酵素（アルギン酸リアーゼ）を単離した。この酵素は、３２ｋＤａからなるタンパク質で、アルギン酸分子中のマニュロン酸ブロックとグルロン酸ブロック両者を分解できるという従来知られていない、優れたものである。
【０００５】
他方、近年、アルギン酸リアーゼにより、アルギン酸を分解して得られるアルギン酸オリゴ糖が、魚肉タンパク質の栄養的価値を向上させるタンパク質修飾効果を示すことが明らかとなっている。
【０００６】
アルギン酸オリゴ糖を用いて工業的にアルギン酸オリゴ糖を生産するためには、数リットル規模での精製したアルギン酸分解酵素を調製する必要が生じる。従来からの生化学的精製方法では、５リットルの培養液から、５００μｇ（５０ｍＬ中）の精製酵素が得られるものの、精製に数ヶ月の時間を要していた。そこで、本菌のアルギン酸リアーゼ遺伝子をクローン化し、大腸菌で発現させ、より効率的に本酵素の大量調製を進めることを検討してきた。
【０００７】
本発明者等は、既に、本酵素遺伝子のクローン化に成功し、塩基配列を決定した。しかしながら、大腸菌を宿主として、本酵素を発現させる場合、大腸菌の培養に一般的に用いられるＬＢ培地を用いたところ、本組換え酵素の産生は全く認められなかった。他方、ＬＢ培地に海水を添加することにより、組換え酵素の活性が約１００倍（ｐＴＰＢ３１クローン）増加することを見出した。更に、海水成分の中で硫酸カルシウムが組換え酵素の活性に大きく関与することが明らかとした。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来の培地は、海洋細菌の多糖分解酵素遺伝子を、宿主細胞内で極微量しか産生させられないため、主として、培養量を増加させることで、組換え酵素量を増加させてきた。特に、従来の培地では、海洋細菌の多糖分解酵素が本来の触媒活性を維持する成分量が少なく、宿主細胞内で海洋細菌の組換え酵素を極微量しか産生させられなかった。
【０００９】
また、人工海水又は硫酸カルシウムを添加して海洋生物由来の組換え酵素を大腸菌で発現させると、その酵素活性が増大したことは報告している。これは、カルシウム成分がタンパク質の構造維持が必要なことを示しているものと考えられている。しかしながら、海洋細菌由来の酵素を大量に生産するための、有効な培地成分組成の探求は十分行われていない。
【００１０】
そこで、本発明では、宿主細胞の増殖を低下させず、かつ海洋細菌等海洋性微生物由来の組換えタンパク質の産生を増加させる培地の開発を課題とした。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本件発明者等は、海洋性微生物由来の遺伝子を用いた組換え酵素タンパク質を活性維持した状態で産生量を改善するために、鋭意研究を続けた。特に、海洋微生物の酵素生産が海水中で行われていることから、海水中成分の探索したところ、通常の培地中にカルシウム塩を添加すると、海洋微生物の酵素生産及び活性が増加することを見出した。更に、海水成分よりもより効率的に海洋微生物由来の酵素を発現させる物質を探索したところ、有機酸カルシウムのような有機酸塩を組換え酵素産生培地に加えることにより、単に無機カルシウム塩を添加するよりも、触媒活性を有する当該酵素の産生を更に向上できることを見出して本件発明を完成させたものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本件発明の培地は、遺伝子組み換え法によりタンパク質を生産するための培地であって、有機酸塩を含むことを特徴とする。
【００１３】
本件発明の培地は、特に好適には、海洋性微生物由来のタンパク質を非海洋性微生物を宿主として遺伝子組み換え法を用いて製造するときに用いることができる。
【００１４】
本件発明の海洋性微生物由来のタンパク質生産方法は、海洋性微生物由来のタンパク質を、非海洋性微生物を宿主として遺伝子組換えにより産生させる場合に、培地に有機酸塩を含ませることを特徴とする方法である。
【００１５】
海洋性微生物としては、海洋性細菌が挙げられ、具体的には、シュードアルテロモナス属、又はビブリオ属の属する細菌があげられる。特に好適には、シュードアルテロモナス・エリャコビイに属する細菌及びビブリオ・ハリオティコリに属する細菌をあげることができる。
【００１６】
遺伝子組換えによるタンパク質の産生について、遺伝子の単離、クローニング、遺伝子の宿主への導入、当該遺伝子の発現等は、周知集中の技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を用いることができる。
【００１７】
組換え遺伝子としては、海洋性微生物由来の遺伝子であれば、特に限定されないが、好適には、酵素をコードする遺伝子があげられる。更に好適には、アルギン酸リアーゼをコードする遺伝子があげられる。
【００１８】
又、下記比較例２により示されるように、有機酸カルシウムはアルギン酸リアーゼのような海洋性細菌由来のタンパク質発現に係わるプローモ−タに影響するのではなく、有機酸カルシウムは酵素の３次元構造、つまり、折り込みにも影響すると考えられる。したがって、遺伝子組み換えにより製造するタンパク質としては、例えば、海洋性細菌類由来のタンパク質であって、カルシウムによって折り畳まれて活性化するタンパク質、又はカルシウムがその構造保持に重要な役割を担っているタンパク質が、好適には選択される。
【００１９】
組換え遺伝子は、公知の適宜な発現ベクターに組換えて、種々の宿主に導入し、発現させることができるが、例えば、ｐＣＵ１８，ｐＣＵ１１８、ｐＴｒｃＨｉｓＢ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込むことができる。
【００２０】
宿主微生物としては、例えば、大腸菌、具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株由来のＪＭ１０９、ＤＨ５α、Ｔｏｐ１０を用いることができる。
【００２１】
目的遺伝子は、シグナルベプチドに連結し、宿主細胞外に分泌されるように構築することもできる。或いは、ペリプラズム中および細胞質内に目的タンパク質を蓄積させることもできる。
【００２２】
有機酸塩としては、好適には有機酸カルシウムを挙げることができる。
【００２３】
有機酸カルシウムとしては、カルボン酸カルシウム、ジカルボン酸カルシウム、等種々の有機酸カルシウムを用いることができるが、例えば、好適には、乳酸カルシウム、グリセリン酸カルシウム、及びプロピオン酸カルシウムを挙げることができる。
【００２４】
有機酸カルシウムの添加濃度としては、培地中の有機酸カルシウムの濃度が、０．０１Ｍ以上、更に好適には、０．１５Ｍ以上、より好適には、０．０２Ｍ以上、飽和濃度以下となるように添加することができる。より具体的には、添加濃度を、乳酸カルシウムでは０．２３−３．７％、グリセリン酸カルシウムでは０．２１−０．８４％、プロピオン酸カルシウムでは０．１４−０．７％の範囲にすることが好適である。
【００２５】
上記有機酸を添加する培地としては、種々の微生物の培養用の培地、具体的には、ブイヨン培地、ペプトン培地等を挙げることができるが、好適には、ＬＢ培地を挙げることができる。又、上記ＬＢ培地には、アンピシリン及び遺伝子発現誘導剤はイソプロピル・チオ・ベータ・デイー・ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又はそれに類する遺伝子発現誘導剤を添加することができる。アンピシリン濃度は５０−１００μｇ／ｍｌ、望ましくは１００μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧを、望ましくは５ｍＭ濃度に添加した。
【００２６】
なお、以下の実施例及び比較例においては、大腸菌の細胞破砕液を試料として酵素活性を測定しているため、図中には、試料中のタンパク質１ｍｇ当たりの比活性として表示している。つまり、比活性が高くなるほど、組換え大腸菌内での酵素産生が増加していることを意味する。
【００２７】
【実施例】
［実施例１］
（１）アルギン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
（イ）シュードアルテロモナス・エリャコビイの染色体ＤＮＡを抽出後、ＨｉｎｄＩＩＩで分解し得られたＤＮＡ断片をプラスミッドベクターｐＵＣ１１８又はｐＵＣ１８に挿入し、これらの組換えプラスミッドを宿主大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、組換え大腸菌の中からアルギン酸リアーゼを産生する組換え体ｐＴＰＢ３、及びｐＴＰＢ２４をそれぞれ得た。
【００２８】
他方、ｐＴＰＢ３に形質転換されたプラスミッドＤＮＡを抽出後、ＭｓｐＡ１Ｉで分解し得られたＤＮＡ断片をプラスミッドベクターｐＵＣ１８に挿入し、組換えプラスミッドを得、宿主大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、大腸菌の中からアルギン酸リアーゼを産生する組換え体ｐＴＰＢ３１を得た。
（ロ）同様に、ビブリオ・ハリオティコリの染色体ＤＮＡを抽出後、ＨｉｎｄＩＩＩで分解し得られたＤＮＡ断片をプラスミッドベクターｐＵＣ１１８又はｐＵＣ１８に挿入した。
【００２９】
（２）アルギン酸分解酵素遺伝子の同定と塩基配列の決定
（１）で得られた、アルギン酸リアーゼ産生性陽性の組換え大腸菌（ｐＴＰＢ３１）に挿入されているＤＮＡ断片について、塩基配列を決定し、アルギン酸分解酵素遺伝子であることを確認した。そのコードするアミノ酸配列と共に、図１に示した。
【００３０】
（３）発現ベクターの作成と大腸菌への発現ベクターの導入について
図１に示されるように、本アルギン酸分解酵素遺伝子の酵素タンパク質コード領域は、１．２ｋｂの大きさである。
酵素遺伝子本体の近傍には遺伝子発現の制御配列が付随している。また、本酵素遺伝子の前半０．５ｋｂは酵素の分泌に関与すると考えられる前駆体タンパク質部であり、後半の０．７ｋｂが成熟したアルギン酸リアーゼとして機能する。
【００３１】
上記（１）で作成したｐＴＰＢ２４およびｐＴＰＢ３１に加え、０．７ｋｂの成熟したアルギン酸リア−ゼ配列部分を、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢに挿入し、大腸菌Ｔｏｐ１０を形質転換し、ｐＣＤ１１を得た。
【００３２】
（４）大腸菌における遺伝子組換えアルギン酸リアーゼの製造
アルギン酸リアーゼ遺伝子を発現する大腸菌は、人工海水（ＡＳＷともいう）、アンピシリン、遺伝子発現誘導剤を添加したＬＢ培地にて培養を行った。人工海水の組成は、３％塩化ナトリウム、０．０７％塩化カリウム、０．５３％硫酸マグネシウム、１．０８％塩化マグネシウム、０．１３％硫酸カルシウムである。
【００３３】
人工海水の濃度は２５−９０％、望ましくは５０−７５％、アンピシリン濃度は１００μｇ／ｍｌ、遺伝子発現誘導剤はイソプロピル・チオ・ベータ・デイー・ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は５ｍＭ添加した。組換え大腸菌は３０度で培養を行った。なお、ＬＢ培地に１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び５ｍＭＩＰＴＧを加えた培地を、以下、ＬＢ基礎培地と呼ぶ。
【００３４】
上記（３）で遺伝子導入した大腸菌について、産生された酵素量は次のように計測した。培養液を８０００×ｇ、１０分間、４度で遠心分離し、菌体を集めた。培養上清を除去し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で一度洗浄した。菌体を５０ｍｌのクロロフォルムに懸濁し、ミキサーで攪拌した。これに、１ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加え、良く混ぜた。これを一晩−８０度で凍結保存した。解凍後、１．５ｍｌチューブに移し、遠心分離し、上清を無細胞抽出液とした。これに溶解しているアルギン酸リアーゼの活性はアルギン酸塩の酵素分解反応の結果生じた非還元末端量をチオバルビツール酸法により定量した。
【００３５】
結果を図２に示す。
なお、図に表示する活性１Ｕは、１分間で１ｍＬの酵素が１μｍｏ１のオリゴ糖を産生する活性である。つまり、０．００１Ｕの酵素活性は、１分間に１ｎｍｏ１のオリゴ糖を生成することになる。  活性測定に用いるアルギン酸ナトリウムは３６７．５ｎｍｏ１含まれているが、この酵素（０．００１Ｕ）１ｍＬを用いれば６時間で全てのアルギン酸ナトリウムが切断され、７３５ｎｍｏ１のオリゴ糖が産生することになる。酵素活性０．００１Ｕよりも高くなれば、より短時間にオリゴ糖産生が可能になる。また、図の活性は、菌体増殖量当たりの活性として比較できるよう、無細胞抽出液の菌体タンパク質当たり（牛血清アルブミン）の活性として示してある。
【００３６】
（５）種々の培地中での大腸菌における遺伝子組換えリアーゼの発現
上述の培地の人工海水は塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムおよび硫酸カルシウムから成るので、次に、どの成分が比活性の増加に関与しているかを検討するために、人工海水の成分から、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムおよび硫酸カルシウムのいずれかを除いたものを人工海水に代えて添加し、上記（４）と同様に産生された酵素活性を測定した。その結果硫酸カルシウムを添加しない場合には、酵素活性が検出されないことが分かった。更に、硫酸カルシウムのみを濃度を変えて、上記基礎培地に添加したところ、０．２６％硫酸カルシウムで、最大の酵素活性が検出された。
【００３７】
そこで、次に種々の各塩類のみを上述の培地に添加し、組換えアルギン酸リアーゼの製造を行い、培地成分の、アルギン酸リアーゼ遺伝子の発現に対する影響を以下の通り検討した。
【００３８】
供試カルシウム化合物としては、０．０１５１Ｍの添加でＬＢ培地に完全に溶解し、しかも、０．０１５１Ｍで溶解させ高圧滅菌した時に沈殿を生じないものとして、以下の５種のカルシウム塩を選択した。
塩化カルシウム（ＭＷ１１０．９９；０．１６８ｇ／１００ｍＬ（０．０１５１Ｍの場合））、
臭化カルシウム（ＭＷ２５３．９４；０．３８３ｇ／１００ｍＬ）、
乳酸カルシウム（ＭＷ３０８．３１；０４６６ｇ／１００ｍＬ）
グリセリン酸カルシウム（ＭＷ２８６．２５；０，４０２ｇ／１００ｍＬ）、
硫酸カルシウム（ＭＷ１７２．１７；０．２６０ｇ／１００ｍＬ）
上記５種のカルシウム塩をＬＢ基礎培地に添加した場合の大腸菌における組換えアルギン酸リアーゼの発現活性についての影響を調査した。
【００３９】
（６）組換えアルギン酸リアーゼの活性の定量
上記（３）で遺伝子導入した大腸菌についてｐＴＰＢ３１、（５）記載の塩化カルシウム、臭化カルシウム、乳酸カルシウム又はグリセリン酸カルシウム培地を基礎培地に添加した培地を用いて、３０度で３０時間培養し、産生された酵素量を計測するために、超音波処理により大腸菌を破砕して試料とし、アルギン酸塩の酵素分解反応の結果生じた非還元末端量をチオバルビツール酸法により定量した。結果は図３および表１に示されている。臭化カルシウム、乳酸カルシウム、グリセンリン酸カルシウム及びプロピオン酸カルシウムが特に組換えアルギン酸リアーゼ活性を顕著に増加させることが見出された。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
［実施例２］組換えアルギン酸リアーゼの活性に及ぼす有機酸カルシウム濃度の影響
乳酸カルシウムをそれぞれ０．２６％、０．４６％および０．７％になるようにＬＢ培地に添加し、さらにアンピシリンおよびＩＰＴＧを添加した培地を用いて、３０度で３０時間組換え体を培養し、組換えアルギン酸リアーゼの酵素活性を実施例１同様に測定した。乳酸カルシウムの濃度依存的に酵素活性は増加した。０．２６％乳酸カルシウム添加に比べ０．４６％添加では約１０倍、０．７％添加では約３０倍酵素活性が上昇した（図４）。
【００４２】
また、グリセリン酸カルシウムをそれぞれ０．２１％、０．４３％および０．６４％になるようにＬＢ培地に添加し、さらにアンピシリンおよびＩＰＴＧを添加した培地で３０度で３０時間組換え体を培養し、組換えアルギン酸リアーゼの酵素活性を検討した。乳酸カルシウムの濃度依存的に酵素活性は増加した。０．２１％グリセリン酸カルシウム添加に比べ０．４３％添加では約４倍、０．６４％添加では約１３倍酵素活性が上昇した（図５）。
【００４３】
［実施例３］組み換えリアーゼの生産量に対するグリセリン酸カルシウムの影響
実施例１−２では、アルギン酸リアーゼの酵素活性を定量したが、遺伝子の発現量自体は定量していないので、次に、アルギン酸リアーゼの発現量を確認した。
【００４４】
具体的には、上記実施例１で作成したｐＣＤ１１及びコントロールとしてｐＴｒｃＨｉｓＢにクラコムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ培地基礎培地、１００％人工海水添加ＬＢ基礎培地、０．１３％硫酸カルシウム添加ＬＢ基礎培地、及び０．６４％グリセリン酸カルシウム添加ＬＢ基礎培地を用いて、３０度で３０時間培養した。
【００４５】
その後、遠心分離により菌体を集め、この菌体をドデシル硫酸ナトリウムと還元剤（ジチオスレイトール）を含む緩衝液中で、１００度、５分処理した。これを試料とし、ポリアクリルアミドゲル電気泳動した。電気泳動後、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。電気泳動、タンパク質の転写は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  などに記載されている手法に準じて行った。
【００４６】
組換えアルギン酸リアーゼは、ｐＴｒｃＨｉｓＢベクターに挿入された遺伝子は、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体認識部位を有する組換えタンパク質として発現するため、この抗体を用いた免疫染色を施し、組換えアルギン酸リアーゼを可視化した。その後、免疫染色されたタンパク質の定量を行った（図６）。発現量を、免疫染色により定量したところ、下記表２のようであった。以上の結果から、ＬＢ基礎培地でも本酵素は発現しているものの、海水添加、硫酸カルシウム及びグリセリン酸カルシウムを添加した場合に、酵素生産量が増加し、それぞれ２．２倍、１．５倍および１．９倍に上昇した。
【００４７】
また、同様に乳酸カルシウム及びプロピオン酸カルシウムの酵素産生に及ぼす影響を調べた結果、乳酸カルシウム、グリセリン酸カルシウム及びプロピオン酸カルシウムは、産生酵素量当たりの相対活性が、人工海水添加培地の相対活性に比べて、それぞれ、９倍、８倍および３１倍に増加していることが明らかとなった。特に、プロピオン酸カルシウムは、硫酸カルシウムに比べその効果が３倍向上した（図７）（表３）。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
【表３】
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【００５０】
［実施例４］
（１）アルギン酸分解酵素遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓＢに結合させ、これを組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．  ｃｏｌｉ（ｐＣＤ１１）をＬＢ培地で培養した時のアルギン酸分解酵素の発現量を５０％人工海水（ＡＳＷ）を添加する場合としない場合で実施例３と同様に免疫染色により目視で確認した。
【００５１】
（２）コントロールとして、ｐＴｒｃＨｉｓＢにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ培地で３０度で培養し、組換え大腸菌の菌体内で発現している培養５時間後のＣＡＴの発現量を５０％人工海水（ＡＳＷ）を添加する場合としない場合で免疫染色により確認した。（図８）ＣＡＴ遺伝子産物（コントロール）では、５０％人工海水の添加の有無にかかわらずバンドは同程度の濃さであるが、組み換えアルギン酸リアーゼでは５０％人工海水を添加した場合のバンドが明らかに濃いので、発現量が多いと言える。
【００５２】
［比較例１］
ＬＢ基礎培地（アンピシリンおよびＩＰＴＧを含む）に、それぞれ塩化マグネシウム（５０ｍＭ）および塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を添加し、いずれの組換え体とも３０度で３０時間培養し、産生される組換えアルギン酸リアーゼ活性を測定した結果、酵素活性は検出されず、塩化マグネシウムおよび塩化ナトリウムの添加効果は認められなかった。また、硫酸マグネシウムを除いた人工海水をＬＢ培地に添加し、上記と同様の培地および培養条件で組換え体を培養した結果、人工海水添加培地と酵素産生量が変化しかなったことから、マグネシウム化合物およびナトリウム化合物は、組換え酵素産生に影響を及ぼさなかった。
【００５３】
［比較例２］
実施例１で調製したｐＣＤ１１を０．０１３％，０．０６５％，０．１３％および０．２６％になるように硫酸カルシウムのみを添加したＬＢ基礎培地（アンピシリンおよびＩＰＴＧを含む）にて、３０度３０時間培養し、アルギン酸分解酵素の活性を測定した結果、０．１３％の時が酵素活性が高く、硫酸カルシウム無添加培地では活性は認められなかった（データ示さず）。
【００５４】
【発明の効果】
本件発明の有機酸カルシウム又は有機酸マグネシウムを０．０１Ｍ以上の高濃度で含む培地を用いて、海洋性微生物由来のタンパク質を遺伝子組換え法により非海洋性微生物で効率よく生産することができるようになった。
【００５５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】シュードアルテロモナス・エリャコビイ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｅｌｙａｋｏｖｉｉ）由来のアルギン酸リアーゼのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子配列
【図２】組換えアルギン酸分解酵素活性に及ぼす海水、塩化マグネシウム、及び塩化ナトリウムの添加効果
【図３】組換えアルギン酸リアーゼの活性に及ぼす各種カルシウム化合物の影響
【図４】組換えアルギン酸リアーゼの活性に及ぼす乳酸カルシウムの影響
【図５】組換えアルギン酸リアーゼの活性に及ぼすグリセリン酸カルシウムの影響
【図６】組換えアルギン酸分解酵素タンパク質の発現量に及ぼす有機酸カルシウムの影響
（レーン１−４について）
アルギン酸分解酵素遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓＢに結合させ、これを組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉを各培地で培養した時のアルギン酸分解酵素の発現量を免疫染色により確認した。
Ｌａｎｅ１：ＬＢ培地、Ｌａｎｅ２：１００％ＡＳＷ添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ３：０．２６％硫酸カルシウム添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ４：０．４３％グリセリン酸カルシウム添加ＬＢ培地。
（レーン５−８について）
ｐＴｒｃＨｉｓＢにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉを各培地で培養した時のＣＡＴの発現量を免疫染色により確認した結果。Ｌａｎｅ５：  ＬＢ培地、Ｌａｎｅ６：    １００％ＡＳＷ、Ｌａｎｅ７：０．２６％硫酸カルシウム添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ６：０．４３％グリセリン酸カルシウム添加ＬＢ培地。
【図７】組換えアルギン酸分解酵素タンパク質の発現量に及ぼす有機酸カルシウムの影響
Ｌａｎｅ１：ｐＴｒｃＨｉｓＢにＣＡＴを組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ培地で培養した時のＣＡＴの発現量を免疫染色により確認した結果。
Ｌａｎｅ２−６：アルギン酸分解酵素遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓＢに結合させ、これを組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉを各培地で培養した時のアルギン酸分解酵素の発現量を免疫染色により確認した結果。
Ｌａｎｅ２：ＬＢ培地、Ｌａｎｅ３：１００％ＡＳＷ添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ４：０．１３％硫酸カルシウム添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ５：１．４％乳酸カルシウム添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ６：０．６４％グリセリン酸カルシウム添加ＬＢ培地、Ｌａｎｅ７：０．７％プロピオン酸カルシウム添加ＬＢ培地。
【図８】組換えアルギン酸分解酵素タンパク質の発現量に及ぼす海水の影響
レーン１：ｐＴｒｃＨｉｓＢにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ培地で培養した時のＣＡＴの発現量を免疫染色により確認した。
レーン２：ｐＴｒｃＨｉｓＢ／ＣＡＴを組み込んだ  Ｔｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉを５０％ＡＳＷを添加したＬＢ培地で培養した時のＣＡＴの発現量を免疫染色により確認した。
レーン３：アルギン酸分解酵素遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓＢに結合させ、これを組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ培地で培養した時のアルギン酸分解酵素の発現量を免疫染色により確認した。
レーン４：アルギン酸分解酵素遺伝子をｐＴｒｃＨｉｓＢに結合させ、これを組み込んだＴｏｐ１０  Ｅ．ｃｏｌｉを５０％ＡＳＷを添加したＬＢ培地で培養した時のアルギン酸分解酵素の発現量を免疫染色により確認した。
ＬＢ培地と５０％ＡＳＷ添加ＬＢ培地では、ＣＡＴ遺伝子産物のバンドは同程度の濃さ（ｌａｎｅ１および２）であるのに対し、組換えアルギン酸分解酵素では５０％ＡＳＷを添加したＬＢ培地でバンドが濃い（ｌａｎｅ４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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