(57)【要約】【課題】簡便な方法により血液凝固因子の遺伝子を肝細胞に効率的に導入することができると共に副作用の心配も極めて低い薬剤、及びその薬剤を用いた治療方法を提供する。【解決手段】粒子形成能を有するタンパク質、例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を真核細胞中で発現させることにより得られた中空ナノ粒子に、血友病治療用の血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の遺伝子を包含させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなることを特徴とする血友病治療用薬剤。
【請求項２】
真核細胞でタンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなることを特徴とする血友病治療用薬剤。
【請求項３】
上記真核細胞は、酵母又は遺伝子組換え酵母であることを特徴とする請求項２記載の血友病治療用薬剤。
【請求項４】
上記真核細胞は、昆虫細胞であることを特徴とする請求項２記載の血友病治療用薬剤。
【請求項５】
上記真核細胞は、動物細胞であることを特徴とする請求項２記載の血友病治療用薬剤。
【請求項６】
粒子を形成する上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の血友病治療用薬剤。
【請求項７】
上記血友病治療用の遺伝子は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子又は血液凝固第ＩＸ因子であることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の血友病治療用薬剤。
【請求項８】
静脈注射により人体に投与されることを特徴とする請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の血友病治療用薬剤。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の薬剤を投与することを特徴とする血友病治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、中空ナノ粒子を用いる血友病治療用薬剤及びそれを用いた血友病治療方法に関し、より詳細には、粒子内部に血友病治療用の細胞導入物質を包含し、この細胞導入物質を細胞内に特異的に導入可能な薬剤及びそれを用いた血友病治療方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞や目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【０００３】
また、最近の分子細胞生物学の分野においても、特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞、組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば、遺伝子治療の分野での応用も可能となる。
【０００４】
細胞に遺伝子を導入する方法としては、これまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシスによって遺伝子を取り込ませる方法（リン酸カルシウム法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を導入させる方法（エレクトロポレーション法、遺伝子銃法）が知られており、何れも今日では、分子生物学的実験において一般的に実施されている方法である。
【０００５】
これらの方法は簡便であるが、細胞を直接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に適用できない。また、１００％近い導入率を得ることは難しい。
【０００６】
一方、安全性の高い物質導入方法としてはリポソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つけることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用することが可能である。しかしながら、単純な脂質であるリポソームに高度な細胞及び組織特異性を付与することは困難であり、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ  での遺伝子導入率は、要求される値に比べてはるかに低いという問題がある。
【０００７】
最近になって、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出する必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も１００％近いため、各種遺伝性疾患や後天性疾患に対する遺伝子治療のための画期的な方法として注目されている。
【０００８】
例えば、血友病は血液凝固因子の欠乏により出血を主徴とする遺伝性疾患である。このうち血液凝固第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）の欠乏症が血友病Ａ、血液凝固第ＩＸ因子（クリスマス因子）の欠乏症が血友病Ｂであり、両者ともＸ染色体上にある第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の遺伝子異常が原因とされる。一般に、このような血友病患者に対しては、第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子製剤の静脈内投与による補充療法が行われるが、生理的レベルに近い量の凝固因子を恒常的に発現させるために、例えば下記の特許文献１では、第ＶＩＩＩ因子をコードする配列を含むアデノ随伴ベクターを作製し、これを血友病Ａの患者に投与する技術が提案されている。
【０００９】
しかしながら、このようなウィルスＤＮＡを用いた遺伝子導入では、ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期できぬ副作用を引き起こす可能性がある。さらに、細胞及び組織特異性がないため、この第ＶＩＩＩ因子を肝臓で発現させるためには、例えば門脈投与するか、又は第ＶＩＩＩ因子をコードする配列と組織型により特異的に転写される制御配列とを連結する必要がある。
【００１０】
一方、本件発明者らは、下記の特許文献２において、粒子形成能を有する蛋白質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的且つ安全に運搬、導入するための方法を提案している。
【００１１】
【特許文献１】
特表２００２−５２７４９３号公報
【特許文献２】
特開２００１−３１６２９８号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記特許文献２に記載の技術によれば、中空ナノ粒子により種々の物質を運搬することができるが、この方法を用いる特定疾患、例えば血友病に対する治療薬の開発がさらなる課題となっていた。
【００１３】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、簡便な方法により血液凝固因子の遺伝子を肝細胞に効率的に導入することができると共に、副作用の心配も極めて低い血友病治療用薬剤、及びそれを用いた血友病治療方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本件発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒト肝臓癌細胞を移植した実験動物に、血液凝固第ＶＩＩＩ、第ＩＸ因子の遺伝子を包含したＢ型肝炎ウィルス表面抗原粒子を静脈注射することにより、ヒト肝臓由来組織部分に特異的に遺伝子が導入されて血液凝固因子を発現し、血友病を治療する効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明に係る血友病治療用薬剤は、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなるものである。
【００１６】
また、本発明に係る血友病治療用薬剤は、真核細胞でタンパク質を発現させて得られるタンパク質粒子に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子に、血友病治療用の遺伝子が包含されてなるものである。
【００１７】
粒子を形成する上記タンパク質としては、例えばＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。こうして得られた中空ナノ粒子は、肝細胞を認識し、肝細胞に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができるので、血友病治療用の遺伝子、具体的には血液凝固第ＶＩＩＩ因子又は血液凝固第ＩＸ因子を包含させることにより、肝細胞において特異的にその遺伝子を発現させることができる。
【００１８】
本発明に係る血友病治療用薬剤は、静脈注射という簡便な方法で血友病を効果的に治療することができ、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００１９】
また、本発明に係る血友病治療方法は、本発明に係る血友病治療用薬剤を投与することにより血友病を治療するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本実施の形態における中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子を導入することによって、任意の細胞或いは組織、例えば肝細胞、肝組織に特異的に血液凝固第ＶＩＩＩ、第ＩＸ因子をコードする遺伝子を運搬することを可能とするものである。このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ；ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される。
【００２１】
また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。このとき、真核細胞としては、酵母や遺伝子組換え酵母、昆虫細胞、動物細胞等が適用できる。
【００２２】
本件発明者らは、後述の実施例に示す通り、遺伝子組換え酵母で前記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２６７，  Ｎｏ．３，  １９５３−１９６１，  １９９２）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムやＨＢＶタンパク質を全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、ＨＢＶの肝細胞への極めて高い感染力を担う肝細胞特異的レセプターを粒子表面に提示しているため、肝細胞に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高い。
【００２３】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【００２４】
一方、昆虫細胞や動物細胞は、酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウィルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる牛胎仔血清が大量に混入することで、その精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウィルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものがインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社により開発され、市販されている。したがって、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。
【００２５】
本発明の中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面のレセプターを任意の生体認識分子に改変することにより、肝細胞以外にも、任意の細胞及び組織に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【００２６】
勿論、粒子形性能を有するタンパク質は、前記のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、粒子を形成することができるタンパク質であれば、どのようなものでもよく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを生体認識分子として用いてもよい。
【００２７】
粒子形成能を有するタンパク質に導入される生体認識分子としては、例えば成長因子、サイトカイン等の細胞機能調節分子、細胞表面抗原、組織特異的抗原、レセプターなどの細胞及び組織を識別するための分子、ウィルス及び微生物に由来する分子、抗体、糖鎖、脂質などが好ましく用いられる。これらは、目的とする細胞或いは組織に応じて適宜選択される。
【００２８】
本発明では、以上のような中空ナノ粒子に、任意の細胞又は組織、例えば肝細胞又は肝組織に導入したい血液凝固第ＶＩＩＩ、第ＩＸ因子をコードする遺伝子を内包させることによって、血友病治療治療用の物質運搬体を得る。
【００２９】
この遺伝子を上記の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。例えば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、或いは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。
【００３０】
そして、これらの中空ナノ粒子、或いは物質運搬体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ  或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  で細胞又は組織に特異的に物質を導入することが可能となる。さらには、中空ナノ粒子や物質運搬体を用いて、特定細胞又は組織に物質を導入することを各種疾患の治療法或いは治療法の１ステップとして行うことも可能になる。
【００３１】
本発明の薬剤の効果については、後述の実施例に示す通り、動物実験により実際に確認された。この実施例では、ヒト肝臓癌由来の細胞を移植したヌードマウスに、血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子をコードする遺伝子を包含した本発明の薬剤を投与後、血清中の第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の発現レベルを測定することによって確認した。薬剤の投与は静脈内投与により行ったが、投与方法としては、この他に経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【００３２】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００３３】
【実施例】
以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパク質であり、図１の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇには、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸からなるｐｒｅ−Ｓ２ペプチドが付加したものである。また、Ｌタンパク質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８又は１１９アミノ酸からなるｐｒｅ−Ｓ１ペプチドが付加したものである。このＬタンパク質の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００３４】
ＨＢｓＡｇ  Ｌタンパク質のｐｒｅ−Ｓ１領域は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている（Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．４６，  ４２９−４３６，  １９８６  ；  Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ．，  Ｖｏｌ．７３，  ２０５２−２０５７，  １９９９）。
【００３５】
真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。
【００３６】
以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた。また、図２に以下の実施例に記載されるＨＢｓＡｇ粒子の発現及び精製操作の概略説明図を示した。
【００３７】
実施例１
遺伝子組換え酵母によるＨＢｓＡｇ粒子の発現
本件発明者らによって報告された文献「Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．２６７，  Ｎｏ．３，  １９５３−１９６１，  １９９２」記載の方法に基づいて、Ｌタンパク質発現プラスミドｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴを保持した遺伝子組換え酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２Ｒ−  株）を、合成培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ  及び８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００  中で培養し、Ｌタンパク質粒子を発現させた（図２ａ、ｂ）。定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製）を用いて、ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ  を準備し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離して、銀染色によって試料中のＨＢｓＡｇの同定を行った。これにより、ＨＢｓＡｇは分子量約５２ｋＤａのタンパク質であることが明らかとなった。
【００３８】
実施例２
ＨＢｓＡｇ粒子の遺伝子組換え酵母からの精製
（１）合成培地８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００で培養された遺伝子組換え酵母（湿重量２６ｇ）をｂｕｆｆｅｒ  Ａ溶液（７．５Ｍ  尿素、０．１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０  ）１００ｍｌに懸濁し、グラスビーズを用いてビードビーター（ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ）にて酵母を破砕した。破砕後、上清を遠心分離により回収した（図２ｃ、ｄ）。
【００３９】
（２）次に、上清を０．７５倍容の３３％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００と混合し、３０分間氷冷した。その後、遠心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、ペレットを回収した。同ペレットは、Ｔｗｅｅｎ８０  を含まないｂｕｆｆｅｒ  Ａ溶液中で再懸濁した。
【００４０】
（３）再懸濁した液を、１０〜４０％の勾配をかけたＣｓＣｌに重層し、２８０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を１２画分に分け、ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）（１次抗体は、抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体）によりＨＢｓＡｇを含む画分を同定した。さらに、ＨＢｓＡｇを含む画分をＴｗｅｅｎ８０  を含まないｂｕｆｆｅｒ  Ａ溶液で透析した。
【００４１】
（４）（３）で得られた透析液（１２ｍｌ）を５〜５０％の勾配をかけたショ糖に重層し、２８０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分離後、（３）と同様に、ＨＢｓＡｇを含む画分を同定し、ＨＢｓＡｇを含む画分を尿素とＴｗｅｅｎ８０  は含まず、代わりに０．８５％のＮａＣｌを含むｂｕｆｆｅｒ  Ａ溶液で透析した（（２）〜（４）：図２ｅ）。
【００４２】
（５）（４）と同様の操作を繰り返し、透析後の試料をウルトラフィルター（Ｕｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｅｒ）Ｑ２０００（アドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで４℃にて冷蔵保存した（図２ｆ）。ＣｓＣｌ平衡遠心分離後のウェスタンブロット（３）の結果から、ＨＢｓＡｇは、分子量５２ｋＤａでＳ抗原性を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、培地２．５Ｌ由来、湿重量２６ｇの菌体から、約２４ｍｇの精製ＨＢｓＡｇ粒子を得た。
【００４３】
一連の精製過程における画分を銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。また、精製により酵母由来のプロテアーゼが除去されていることを確認するために、（５）で得られたＨＢｓＡｇ粒子を３７℃で１２時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色により同定を行った。その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一連の精製過程において完全に除去されていることが確認された。
【００４４】
実施例３
ＨＢｓＡｇ粒子へのｈＦＶＩＩＩ、ｈＦＩＸ遺伝子の封入（ｈＦＶＩＩＩ、ｈＦＩＸ遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ粒子の製造）
上記方法により作製したＨＢｓＡｇ粒子内へ、血友病治療用遺伝子としてヒト血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子をコードする遺伝子（ｈＦＶＩＩＩ、ｈＦＩＸ）を封入し、本発明の薬剤としてのｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ粒子を製造した。
【００４５】
本実施例では、ＨＢｓＡｇ粒子内へｈＦＶＩＩＩ遺伝子及びｈＦＩＸ遺伝子を封入するため、それぞれトリノ大学のＬ．Ｎａｌｄｉｎｉ  博士から恵与されたｐＲＲＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ＣＭＶ．ＦＶＩＩＩ．Ｗｐｒｅ  及びｐＲＲＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．Ａｌｂ．ＦＩＸ．Ｗｐｒｅ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｖｏｌ．１３，
２４３−２６０，  ２００２）を発現ベクターとして使用した。
【００４６】
この発現ベクターをエレクトロポレーション法によりＨＢｓＡｇ粒子内に導入することによって、ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子が包含されたＨＢｓＡｇ粒子を作製した。具体的には、５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解されたＨＢｓＡｇ粒子中のＬタンパク質粒子１００μｇに対し、上記発現ベクターを２０μｇ導入した。またこのとき、エレクトロポレーションは、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により、５０Ｖ、７５０μＦで４ｍｍのキュベットを使用して行った。
【００４７】
実施例４
ヒト肝臓癌を移植したヌードマウスに対するｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子包含ＨＢｓＡｇ粒子による血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の発現効果
上記実施例により作製したｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子を包含するＨＢｓＡｇ粒子による血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の発現効果を実験動物により確認した。
【００４８】
本実施例では、実験動物として日本クレアから購入したヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ、メス５週齢）の両側背部皮下に、ヒト肝臓癌由来細胞ＮｕＥを１×１０７個投与し、直径１ｃｍ程度の固形癌になるまで約５，６週間生育させ、担癌マウスを得た。
【００４９】
その後、上記担癌マウスに、約２０μｇのｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子発現ベクターを包含するＨＢｓＡｇ粒子を尾静脈より投与し、血漿中の血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の量をエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により継時的に測定した。ＥＬＩＳＡは、それぞれ第ＶＩＩＩ、第ＩＸ因子に特異的なＡｓｓｅｒａｃｈｏｍ  ＶＩＩＩＣ：Ａｇ  ｋｉｔ、Ａｓｓｅｒａｃｈｏｍ  ＩＸ：Ａｇ  ｋｉｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ社製）を使用して行った。
【００５０】
なお、陰性対照としてはヒト大腸癌由来細胞ＷｉＤｒを１×１０７個投与して得た担癌マウスを用い、上記と同様にして血漿中の血液凝固第ＶＩＩＩ（ＩＸ）因子の量を測定した。
【００５１】
測定した血漿中の血液凝固第ＶＩＩＩ因子量の、上記キットの陽性対照血漿中の血液凝固第ＶＩＩＩ因子量に対する割合（％）の推移を図３に示す。また、血漿中の血液凝固第ＩＸ因子の濃度推移を図４に示す。図３，４に示すように、陰性対照では継時的な変化は見られなかったのに対して、ヒト肝臓由来の腫瘍細胞（Ｎｕｅ）を投与したマウスでは１０日前後経過してから血液凝固第ＶＩＩＩ、第ＩＸ因子の発現が見られ、「重度」のヒト患者を「中度」に改善する程度の発現レベル（Ｃｕｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｖｏｌ．１，  ３０１−３０５，  ２００１）に達した。その後、このレベルが少なくとも１ヶ月維持され、４０日程度経過後に低下した。この発現の低下は、腫瘍細胞（Ｎｕｅ）に由来する癌のネクローシスによるものと考えられる。
【００５２】
このように、本実施の形態における薬剤としてのｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子包含ＨＢｓＡｇ粒子は、ヒト肝細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子導入が可能であり、血友病に対して実際に治療効果があることが確認された。また、本実験により、上記ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子包含ＨＢｓＡｇ粒子による血友病治療のためのプロトコールを実験動物で確立することができた。
【００５３】
なお、上述した実施例では、ｈＦＶＩＩＩ（ｈＦＩＸ）遺伝子を発現するベクターとしてｐＲＲＬｓｉｎＰＰＴＣＭＶＦＶＩＩＩｐｒｅ（ｐＲＲＬｓｉｎＰＰＴＡｌｂＦＩＸｐｒｅ）を使用したが、これに限定されるものではなく、例えば文献「Ｃｕｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｖｏｌ．１，  ３０１−３０５，  ２００１」に記載されているような種々のベクターを利用することができる。また、例えば血液凝固第ＶＩＩＩ因子の軽鎖と重鎖とを別々のベクターに組み込むようにしてもよく、Ｂドメインを欠失させた血液凝固第ＶＩＩＩ因子をベクターに組み込むようにしても、同様の効果を奏することができる。
【００５４】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明に係る血友病治療用薬剤は、静脈注射という簡便な方法で血友病を効果的に治療することができ、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００５５】
【配列表】
2004277355.tif 000002
2004277355.tif 000003
2004277355.tif 000004
2004277355.tif 000005
2004277355.tif 000006
2004277355.tif 000007
2004277355.tif 000008
2004277355.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の各タンパク質領域を表す概略模式図である。
【図２】本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用いたＨＢｓＡｇ粒子の発現及び精製操作を例示した概略説明図である。
【図３】本発明の実施例におけるｈＦＶＩＩＩ遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ粒子による血液凝固第ＶＩＩＩ因子の発現効果を示す図である。
【図４】本発明の実施例におけるｈＦＩＸ遺伝子を包含したＨＢｓＡｇ粒子による血液凝固第ＩＸ因子の発現効果を示す図である。
【符号の説明】
１  粒子形成抑制部位、２  直接的なヒト肝細胞特異的レセプター、３  糖鎖１、４  間接的なヒト肝細胞特異的レセプター（重合ヒト血清アルブミンレセプター）、５  膜貫通領域１、６  膜貫通領域２、７  糖鎖２、８  膜貫通領域３
【図１】
2004277355.tif 000010
【図２】
2004277355.tif 000011
【図３】
2004277355.tif 000012
【図４】
2004277355.tif 000013