(57)【要約】【課題】  観察対象である注目領域の画像の的確な取得を効率良く行えるようにする。【解決手段】  光源４で発生させた照射光を二次元走査させながら観察試料１０６に照射したときに検出される観察試料１０６より到来する光の強度に基づいて、観察試料１０６についての画像が表されているフレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域の抽出を行わせる。走査ユニット１０２で二次元走査させている照射光がこの抽出によって抽出された領域に対応する位置を照射することとなるときにのみ光源４において照射光を発生させるように光源４の制御を行い、この制御がされている光源４によって発生させた照射光が観察試料１０６に照射されたときに検出される観察試料１０６より到来する光の強度に基づいて観察対象としている画像をコンピュータ２で生成させる。【選択図】      図１
2004252414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射する照射光を発生させる光源と、
前記照射光を二次元走査させる走査手段と、
前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が前記試料に照射されたときに該試料より到来する光の強度を検出する検出手段と、
前記検出手段によって検出された光の強度に基づいて前記試料についての画像が表されているフレーム画像を生成するフレーム画像生成手段と、
前記フレーム画像を構成している画素の輝度に基づいて該フレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域を抽出する観察対象画像領域抽出手段と、
前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域に対応する位置を前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させるように該光源の制御を行い、該抽出がされた領域には対応していない位置を該走査手段による二次元走査によって該照射光が照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行う光源制御手段と、
前記光源制御手段による制御がされている前記光源によって発生させた照射光が前記試料に照射されたときに前記検出手段によって検出される光の強度に基づいて前記観察対象としている画像を生成する観察対象画像生成手段と、
を有することを特徴とする走査型光学顕微鏡装置。
【請求項２】
前記光源は、波長の異なる複数の照射光を発生させ、
前記検出手段は、前記光の強度を該光の波長毎に検出し、
前記試料画像領域抽出手段は、前記フレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域を、前記試料より到来する光の波長毎に抽出し、
前記光源制御手段は、前記試料画像領域抽出手段によって前記光の波長毎に抽出された前記領域に基づいた前記制御を、前記光源で発生させる複数の照射光の各々に対して行う、
ことを特徴とする請求項１に記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項３】
前記観察対象画像領域抽出手段によって前記領域が抽出されたときに、該領域に対応する位置のみを前記照射光が走査するように前記走査手段を制御する走査制御手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項４】
前記走査手段は、
第一の軸の方向で前記照射光の主走査を行わせる主走査手段と、
前記第一の軸と交わる第二の軸の方向に前記照射光の副走査を行わせる副走査手段と、
を有し、
前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された第一の領域についての１ラインの前記主走査が完了したとき、前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域であって該第一の領域とは別の領域である第二の領域が該主走査を行ったラインと同一のライン上に存在する場合には、前記走査制御手段は、該第二の領域についての１ラインの前記主走査を前記主走査手段に行わせた後に前記副走査を前記副走査手段に行わせる制御を行う、
ことを特徴とする請求項３に記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項５】
前記走査制御手段は、前記走査手段が１回の二次元走査を行う間に前記副走査手段によって行なわれる前記副走査による走査量が最小となるように前記主走査手段による主走査及び該副走査手段による副走査の方向を回転させることを特徴とする請求項４に記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項６】
前記走査手段は、
第一の軸の方向で前記照射光の主走査を行わせる主走査手段と、
前記第一の軸と交わる第二の軸の方向に前記照射光の副走査を行わせる副走査手段と、
を有し、
前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域が複数存在する場合には、前記走査制御手段は、該領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて前記主走査手段に行わせる制御と該領域の各々に対する該１ライン分の前記副走査を前記副走査手段に行わせる制御とを交互に繰り返す、
ことを特徴とする請求項３に記載の走査型光学顕微鏡装置。
【請求項７】
試料に照射する照射光を発生させる光源と、
前記照射光を二次元走査させる走査手段と、
前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が前記試料に照射されたときに該試料より到来する光の強度を検出する検出手段と、
前記検出手段によって検出された光の強度に基づいて前記試料についての画像が表されているフレーム画像を生成するフレーム画像生成手段と、
前記フレーム画像を構成している画素の輝度に基づいて該フレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域を抽出する観察対象画像領域抽出手段と、
前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域に対応する位置を前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させるように該光源の制御を行い、該抽出がされた領域には対応していない位置を該走査手段による二次元走査によって該照射光が照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行う光源制御手段と、
を有することを特徴とする走査型光学顕微鏡装置。
【請求項８】
光源で発生させた照射光を二次元走査させながら試料に照射したときに検出される該試料より到来する光の強度に基づいて、該試料についての画像が表されているフレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域の抽出を行わせ、
二次元走査させている前記照射光が前記抽出によって抽出された領域に対応する位置を照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させ、二次元走査させている該照射光が該抽出によって抽出された領域には対応していない位置を照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行い、
前記制御がされている前記光源によって発生させた照射光が前記試料に照射されたときに検出される該試料より到来する光の強度に基づいて前記観察対象としている画像を生成させる、
ことを特徴とする走査型光学顕微鏡装置の制御方法。
【請求項９】
走査型光学顕微鏡装置の制御をコンピュータに行わせるためのプログラムであって、
光源で発生させた照射光を二次元走査させながら試料に照射したときに検出される該試料より到来する光の強度に基づいて、該試料についての画像が表されているフレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域の抽出を行わせる処理と、
二次元走査させている前記照射光が前記抽出によって抽出された領域に対応する位置を照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させ、二次元走査させている該照射光が該抽出によって抽出された領域には対応していない位置を照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行う処理と、
前記制御がされている前記光源によって発生させた照射光が前記試料に照射されたときに検出される該試料より到来する光の強度に基づいて前記観察対象としている画像を生成させる処理と、
をコンピュータに行わせるプログラム。
【請求項１０】
試料に照射する照射光を発生させる光源と、
第一の軸の方向で前記照射光の主走査を行わせる主走査手段と、
前記第一の軸と交わる第二の軸の方向に前記照射光の副走査を行わせる副走査手段と、
前記主走査手段及び前記副走査手段による二次元走査によって取得される前記試料についての画像に対して設定される複数の領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて該主走査手段に行わせる制御と該領域の各々に対する該１ライン分の前記副走査を該副走査手段に行わせる制御とを交互に繰り返す走査制御手段と、
を有することを特徴とする走査型光学顕微鏡装置。
【請求項１１】
試料に照射する照射光を第一の軸の方向に主走査させると共に該照射光を該第一の軸と交わる第二の軸の方向に副走査させる二次元走査によって取得される前記試料についての画像に対してなされる複数の領域の設定を取得し、
前記設定に係る複数の領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて行わせ、
前記設定に係る複数の領域の各々に対する前記１ライン分の前記副走査を行わせ、
前記１ラインのみの主走査と前記１ライン分の副走査とを交互に繰り返させる、
ことを特徴とする走査型光学顕微鏡装置の制御方法。
【請求項１２】
走査型光学顕微鏡装置の制御をコンピュータに行わせるためのプログラムであって、
試料に照射する照射光を第一の軸の方向に主走査させると共に該照射光を該第一の軸と交わる第二の軸の方向に副走査させる二次元走査によって取得される前記試料についての画像に対してなされる複数の領域の設定を取得する処理と、
前記設定に係る複数の領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて行わせる処理と、
前記設定に係る複数の領域の各々に対する前記１ライン分の前記副走査を行わせる処理と、
前記１ラインのみの主走査を行わせる処理と前記１ライン分の副走査を行わせる処理とを交互に繰り返す処理と、
をコンピュータに行わせるプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の異なる波長の光を多重染色された蛍光試料へ照射し、各波長に対応して励起された複数の蛍光を観察する走査型光学顕微鏡で用いられる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
異なる蛍光色素により多重染色された試料を波長の異なる複数の光で励起させて発生させた複数の蛍光を複数の検出器で検出する走査型光学顕微鏡がある（例えば、特許文献１参照）。
また、波長の異なる光を、少なくとも二つの座標で偏向する顕微鏡光路に送り込んで試料の観察位置に時間的間隔をおいて順次照準、照射するときに、試料の少なくとも一つの面において各ポイントの切り替え毎に、若しくは走査ライン毎に光を照射し、その被照射位置から出る反射光若しくは放射光を検出して走査面の画像を形成する走査型光学顕微鏡がある（例えば、特許文献２参照）。
【０００３】
また、フレーム画像上に所望する画像領域(マスク画像)を操作者が設定/登録し、試料全体の走査を行うときに、設定された領域だけ励起光を照射しながら画像を取得する共焦点走査型光学顕微鏡がある。
この他、各々の励起波長とその励起波長により励起される各々の蛍光をそれぞれ対応する光検出器へ導くための励起波長及び光路の設定を走査に同期して１フレーム走査毎又は１ライン走査毎又は１画素受光中に切り替えて、２つ以上の蛍光色素により染色された標本の各々の蛍光を、個々に対応する光検出器で検出する共焦点走査型光学顕微鏡がある（例えば、特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００２−１３１６４５号公報
【特許文献２】特開２０００−３５４００号公報
【特許文献３】特開平１０−２０６７４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した走査型光学顕微鏡では、照射ポイント毎、走査ライン毎、若しくは画像上の注目領域毎に、照射する光の波長を操作者が逐次設定する必要があり、例えば１画面内に複数の注目領域が存在するような場合には、照射領域と照射する光の波長との設定に長い時間が費やされてしまっていた。
【０００５】
また、ＲＯＩ（Region Of Interest）などと称される領域作成ツール等を使用して操作者が画像上に照射領域を設定する場合には、実際に注目する細胞のみならずその周囲の領域も照射領域として設定されてしまう。つまり、注目細胞のみを照射領域に設定することは困難であるため不必要な領域へにも励起光を照射してしまうこととなり、結果として無駄な蛍光退色が発生してしまっていた。
【０００６】
また、従来の走査型光学顕微鏡では、注目領域ごとに波長を変えて走査する方法として、画像全体の走査を行い、その走査が注目領域に対して行われるときに励起光のオン／オフ制御や波長の切り替え制御を行っていた。この方法では、画像取得を行わない注目領域以外の領域も走査が行われていたため、画像取得に長い時間を要していた。
【０００７】
ところで、生物顕微鏡を使用したアプリケーションとして、蛍光の退色を利用して細胞内のものの動きを観察するＦＲＡＰ（Fluorescence Recovery After Photobleaching）観察がある。ＦＲＡＰでは、予め注目するたんばく質分子や脂質膜などを蛍光色素で標識しておき、レーザ光などの光を利用して試料を部分的に退色させた後、退色させた部分の蛍光が、拡散によるその周囲との色素の置き換わりによって回復してくる様子を観察する。この退色させる操作をブリーチング処理という。
【０００８】
前述した従来の走査型光学顕微鏡を使用してブリーチング処理を行う場合、注目領域以外の領域も走査が行われていたため、ブリーチング領域以外の領域走査中に細胞内の蛍光の回復作用が発生してしまうことがあり、ブリーチング処理を効率よく行うことが困難であった。
【０００９】
以上の問題を鑑み、観察対象である注目領域の画像の的確な取得を効率良く行えるようにすることが、本発明が解決しようとする課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様のひとつである走査型光学顕微鏡装置は、試料に照射する照射光を発生させる光源と、前記照射光を二次元走査させる走査手段と、前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が前記試料に照射されたときに該試料より到来する光の強度を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された光の強度に基づいて前記試料についての画像が表されているフレーム画像を生成するフレーム画像生成手段と、前記フレーム画像を構成している画素の輝度に基づいて該フレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域を抽出する観察対象画像領域抽出手段と、前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域に対応する位置を前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させるように該光源の制御を行い、該抽出がされた領域には対応していない位置を該走査手段による二次元走査によって該照射光が照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行う光源制御手段と、前記光源制御手段による制御がされている前記光源によって発生させた照射光が前記試料に照射されたときに前記検出手段によって検出される光の強度に基づいて前記観察対象としている画像を生成する観察対象画像生成手段と、を有するように構成することにより、前述した課題を解決する。
【００１１】
上述した構成では、フレーム画像を構成している画素の輝度は、検出手段で検出される光の強度に対応しており、この光の強度が所定の条件に合致する画素からなる領域を、真の観察対象である画像が表されている領域とするので、前述したような領域作成ツールを用いる場合よりもより的確な注目領域の設定がなされる。更に、前述した構成によれば、この観察対象領域のみに照射光が照射され、その他の領域には照射光が照射されないので、観察対象領域の周辺の領域で無駄な蛍光退色が生じない。従って、観察対象である注目領域の画像の的確な取得が効率良く行われる。
【００１２】
なお、上述した本発明に係る走査型光学顕微鏡装置において、前記光源は、波長の異なる複数の照射光を発生させ、前記検出手段は、前記光の強度を該光の波長毎に検出し、前記試料画像領域抽出手段は、前記フレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域を、前記試料より到来する光の波長毎に抽出し、前記光源制御手段は、前記試料画像領域抽出手段によって前記光の波長毎に抽出された前記領域に基づいた前記制御を、前記光源で発生させる複数の照射光の各々に対して行う、ように構成することができる。
【００１３】
この構成によれば、照射光の波長毎に独自の観察対象領域の抽出がされるので、観察対象領域の周辺の領域での照射光の波長の違いに起因する無駄な蛍光退色が生じることがない。
また、前述した本発明に係る走査型光学顕微鏡装置において、前記観察対象画像領域抽出手段によって前記領域が抽出されたときに、該領域に対応する位置のみを前記照射光が走査するように前記走査手段を制御する走査制御手段を更に有するように構成することができる。
【００１４】
この構成によれば、観察対象領域以外のフレーム画像の領域に対応する位置の走査が省略されるので、観察対象領域の画像の取得に要する時間が短縮され、またブリーチング処理も効率良く行うことができるようになる。
なお、この構成において、前記走査手段は、第一の軸の方向で前記照射光の主走査を行わせる主走査手段と、前記主走査手段によって前記主走査をさせている前記照射光が１ラインの走査を完了したときに、前記第一の軸と交わる第二の軸の方向に前記１ライン分の幅の前記照射光の副走査を行わせる副走査手段と、を有し、前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された第一の領域についての１ラインの前記主走査が完了したとき、前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域であって該第一の領域とは別の領域である第二の領域が該主走査を行ったラインと同一のライン上に存在する場合には、前記走査制御手段は、該第二の領域についての１ラインの前記主走査を前記主走査手段に行わせた後に前記副走査を前記副走査手段に行わせる制御を行うように構成することができる。
【００１５】
この構成によれば、照射光の照射位置を主走査１ライン分副走査方向へ移動させながら次回の主走査の走査開始位置へ移動させる動作であるフライバック動作の回数が削減されるので、その分だけ観察対象領域の画像の取得に要する時間が更に短縮され、またブリーチング処理も更に効率良く行うことができるようになる。
【００１６】
なお、この構成において、前記走査制御手段は、前記走査手段が１回の二次元走査を行う間に前記副走査手段によって行なわれる前記副走査による走査量が最小となるように前記主走査手段による主走査及び該副走査手段による副走査の方向を回転させるように構成することができる。
【００１７】
この構成によれば、フライバック動作の回数が更に削減されるので、その分だけ観察対象領域の画像の取得に要する時間が更に短縮され、またブリーチング処理も更に効率良く行うことができるようになる。
また、前述した構成において、前記走査手段は、第一の軸の方向で前記照射光の主走査を行わせる主走査手段と、前記第一の軸と交わる第二の軸の方向に前記照射光の副走査を行わせる副走査手段と、を有し、前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域が複数存在する場合には、前記走査制御手段は、該領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて前記主走査手段に行わせる制御と該領域の各々に対する該１ライン分の前記副走査を前記副走査手段に行わせる制御とを交互に繰り返すように構成することができる。
【００１８】
この構成によれば、観察対象領域毎に生成される画像の取得時刻の同時性が向上する。
本発明の別の態様のひとつである走査型光学顕微鏡装置は、試料に照射する照射光を発生させる光源と、前記照射光を二次元走査させる走査手段と、前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が前記試料に照射されたときに該試料より到来する光の強度を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された光の強度に基づいて前記試料についての画像が表されているフレーム画像を生成するフレーム画像生成手段と、前記フレーム画像を構成している画素の輝度に基づいて該フレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域を抽出する観察対象画像領域抽出手段と、前記観察対象画像領域抽出手段によって抽出された領域に対応する位置を前記走査手段による二次元走査によって前記照射光が照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させるように該光源の制御を行い、該抽出がされた領域には対応していない位置を該走査手段による二次元走査によって該照射光が照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行う光源制御手段と、を有するように構成することにより、前述した課題を解決する。
【００１９】
この構成によれば、試薬や細胞の状態に対して最適な励起光が選択されるので、ブリーチング処理するための励起光の効率的な選択が容易に行えるようになる。
本発明の更なる別の態様のひとつである走査型光学顕微鏡装置の制御方法は、光源で発生させた照射光を二次元走査させながら試料に照射したときに検出される該試料より到来する光の強度に基づいて、該試料についての画像が表されているフレーム画像から観察対象としている画像が表されている領域の抽出を行わせ、二次元走査させている前記照射光が前記抽出によって抽出された領域に対応する位置を照射することとなるときには前記光源において該照射光を発生させ、二次元走査させている該照射光が該抽出によって抽出された領域には対応していない位置を照射することとなるときには該光源において該照射光を発生させないように該光源の制御を行い、前記制御がされている前記光源によって発生させた照射光が前記試料に照射されたときに検出される該試料より到来する光の強度に基づいて前記観察対象としている画像を生成させるようにする。
【００２０】
こうすることにより、前述した本発明に係る走査型光学顕微鏡装置と同様の作用・効果が得られるので、前述した課題が解決される。
本発明の更なる別の態様のひとつである走査型光学顕微鏡装置は、試料に照射する照射光を発生させる光源と、第一の軸の方向で前記照射光の主走査を行わせる主走査手段と、前記第一の軸と交わる第二の軸の方向に前記照射光の副走査を行わせる副走査手段と、前記主走査手段及び前記副走査手段による二次元走査によって取得される前記試料についての画像に対して設定される複数の領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて該主走査手段に行わせる制御と該領域の各々に対する該１ライン分の前記副走査を該副走査手段に行わせる制御とを交互に繰り返す走査制御手段と、を有するように構成することにより、前述した課題を解決する。
【００２１】
この構成によれば、走査された照射光が試料に照射されたときに該試料より到来する光の強度に基づいて観察対象領域毎に生成される画像の取得時刻の同時性が向上し、観察対象である注目領域の画像の的確な取得を効率良く行える。
本発明の更なる別の態様のひとつである走査型光学顕微鏡装置の制御方法は、試料に照射する照射光を第一の軸の方向に主走査させると共に該照射光を該第一の軸と交わる第二の軸の方向に副走査させる二次元走査によって取得される前記試料についての画像に対してなされる複数の領域の設定を取得し、前記設定に係る複数の領域の各々に対する１ラインのみの前記主走査を該複数の領域に対して続けて行わせ、前記設定に係る複数の領域の各々に対する前記１ライン分の前記副走査を行わせ、前記１ラインのみの主走査と前記１ライン分の副走査とを交互に繰り返させるようにする。
【００２２】
こうすることにより、前述した本発明に係る走査型光学顕微鏡装置と同様の作用・効果が得られるので、前述した課題が解決される。
なお、前述した本発明に係る走査型光学顕微鏡装置の制御方法の各々をコンピュータに行わせるプログラムであっても、このプログラムをコンピュータで実行させることにより、前述した課題が解決される。
【発明の効果】
【００２３】
以上のように、本発明によれば、観察対象である注目領域の画像の的確な取得を効率良く行うことができるようになるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
図１は本発明を実施する走査型光学顕微鏡装置の構成を示している。
図１において、走査型光学顕微鏡本体１にはコンピュータ２が接続されている。コンピュータ２は、制御プログラムの実行によって走査型光学顕微鏡装置全体の動作制御を司るＣＰＵ、このＣＰＵが必要に応じてワークメモリとして使用するメインメモリ、走査型光学顕微鏡本体１との各種データの授受を管理するインタフェースユニット、及び各種のプログラムや画像データなどを記憶しておく例えばハードディスク装置などの補助記憶装置を有している、ごく標準的な構成のコンピュータである。このコンピュータ２によって走査型光学顕微鏡本体１の動作が制御される。
【００２５】
また、このコンピュータ２には、観察者よりコンピュータ２へ各種の指示を与えるために操作される各種の操作子が備えられている操作パネル３、観察試料１０６に照射する光を発生させる光源４、観察試料１０６に照射する光の波長を切り替える波長切替え装置５、及びコンピュータ２によって生成された各種の情報を表示する画像モニタ６が接続されている。
【００２６】
走査型光学顕微鏡本体１の構成及び動作について説明する。
光源４で発生させ波長切替え装置５を経由して走査型光学顕微鏡本体１に導かれた光は励起波長切替え装置１０１に入射する。励起波長切替え装置１０１は、例えば、特定波長の光を反射し、その他の波長の光を透過させる測光用ダイクロイックミラーである。
【００２７】
励起波長切替え装置１０１で反射した特定波長の光は、その後、走査ユニット１０２に入射する。
走査ユニット１０２は主走査方向であるＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーと副走査方向であるＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーとを有するものであり、コンピュータ２から送られてくる走査制御信号に従って光源４からの光をＸ軸方向及びＹ軸方向に二次元的に走査する。また、このＸＹ軸方向走査におけるＸ軸方向走査による１ラインの走査毎に走査制御終了信号をコンピュータ２に出力する。
【００２８】
走査ユニット１０２から出射したＸＹ軸方向走査されている光は、レボルバ１０３に取り付けられている対物レンズ１０４を介し、ステージ１０５上に載置されている観察試料１０６上にスポット光として照射されて観察試料１０６を走査する。
測光用ダイクロイックミラー１０７ａ、バリアフィルタ１０８ａ、及び光電変換器１０９ａで特定波長の光の強度を検出する検出器が１ユニット構成される。従って、走査型光学顕微鏡本体１には検出器が計３ユニット設けられている。
【００２９】
前述したスポット光に起因して観察試料１０６から得られる光、例えば反射光または観察試料１０６において発生した蛍光、は入射光路に戻され、励起用ダイクロイックミラー１０１を通過し、測光用ダイクロイックミラー１０７ａ、１０７ｂ、及び１０７ｃとバリアフィルタ１０８ａ、１０８ｂ、及び１０８ｃとからなる測光波長切替え装置を通過することによってその波長が選択される。観察者がコンピュータ２に指示を与えるとこの測光波長切替え装置によって観察者が所望した波長の光が選択される。
【００３０】
測光波長切替え装置によって選択された波長の光は、フォトマルチプライヤなどの光電変換器１０９ａ、１０９ｂ、及び１０９ｃに入射させる。光電変換器１０９ａ、１０９ｂ、及び１０９ｃからは入射した光の強度に対応するアナログ電気信号が出力される。この電気信号は、コンピュータ２に備えておいた図示しないアナログ／デジタル変換器により光の強度に対応するデジタルデータに変換され、コンピュータ２の有するメモリに記憶される。このデジタルデータをコンピュータ２で処理することにより、観察試料１０６に関する画像が画像モニタ６に表示される。
【００３１】
ここで、光源４は少なくとも２種以上の波長の光を発生できるように構成し、且つ波長切替え装置５はＡＯＴＦ（音響光学可変波長フィルタ：Acousto-Optic Tunable Filter）、ＡＯＭ（音響光学変調器：Acousto-Optic Modulator ）、あるいはＥＯＭ（電気光学変調器：Electro-Optic Modulator）などの光学素子を備えるようにして観察試料１０６に照射する光の照射波長をコンピュータ２の制御の下で高速に切り替えることができるようにする。なお、光源４及び波長切替え装置５として複数の半導体レーザを備え、各半導体レーザが生成するレーザ光をコンピュータ２の制御の下で高速に切り替えるようにしてもよい。なお、本実施形態では４８８ｎｍの青色レーザと５４３ｎｍの緑色レーザとを備えることとする。
【００３２】
以下、図１に示した装置を用いて観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を行う手順を説明する。
【実施例１】
【００３３】
まず、コンピュータ２が光源４及び波長切替え装置５を制御して複数の波長の光、本実施形態では青色レーザ光と緑色レーザ光を観察試料１０６に同時に照射させ、フレーム画像(参照画像)を取得する。
次に、図２に示すように、取得されたフレーム画像をチャンネル画像毎、すなわち単一の検出器による検出結果に基づいて作成される画像に分離する。図２の例では、青色レーザ光と緑色レーザ光との照射によって得られたフレーム画像（（ａ）の画像）を、例えば光電変換器１０９ａによって検出された信号に基づいて生成される青色レーザ光で励起される試薬によって染色された画像領域が含まれる画像（（ｂ）に示すチャンネル１の画像）と、光電変換器１０９ｂによって検出された信号に基づいて生成される緑色レーザ光で励起される試薬によって染色された画像領域が含まれる画像（（ｃ）に示すチャンネル２の画像）とに分離する。
【００３４】
なお、複数の波長の光を同時に照射してフレーム画像を取得すると、長波長側の蛍光が、観察試料１０６に染色した複数の試薬のうちの第ー試薬の発する蛍光として検出されるだけでなく第二の試薬の発する蛍光を検出する検出器にも混入してしまう蛍光クロストーク現象が発生してしまうことがある。このクロストーク現象を回避する方法としては、観察試料１０６の走査において、複数の波長の光の同時照射を行わずに、同ーラインを異なる励起光で１回ずつ走査し、各ラインの走査時に各励起光によって生じる蛍光の検出に対応させた検出器のみで蛍光検出を行うようにするラインシーケンシャル走査方法などが知られている。従って、上述した問題が発生した場合には、例えばこのラインシーケンシャル走査を行うようにすることで、蛍光のクロストークを抑えた鮮明なフレーム画像を取得することができ、フレーム画像からチャンネル画像への分離も適切に行うことができる。
【００３５】
次に、得られたチャンネル画像の各画素の輝度（蛍光の強度）を予め設定されている閾値と比較する。この蛍光強度の比較の結果、閾値を超える強度が計測されていた場合には当該チャンネル画像に対応する励起光の照射をオン状態に設定し、蛍光強度が閾値を下回る場合にはその励起光の照射をオフ状態に設定する。
【００３６】
この上述した比較処理を全てのチャンネル画像の全画素に対して行い、画像フレーム内の全ての画素について各励起光の照射を行うか否かの設定をする。この後に行われる励起光の走査においては、画像フレーム内の画素に対応する観察試料１０６の位置が走査されるときに、上述した処理でその画素に対して設定された励起光のみを照射するようにする。
【００３７】
従来、ＲＯＩなどの領域作成ツールを使用して行われていた取得画像に対して励起光の照射位置の設定では、図３の（ａ）に示すような領域を指定してその領域の走査がされるときには励起光をオン状態にし、一方、同図における斜線が付されている領域（マスク領域）の走査がされるときには励起光をオフ状態としていた。このため、注目している細胞以外の領域へも励起光が照射されてしまい、無駄な蛍光を発生させてしまっていた。
【００３８】
これに対し、上述した実施例１の手法によれば、領域作成ツールでは作成することの難しい、図３（ｂ）のようなマスク領域を作成することができる。つまり、画素単位で蛍光強度の比較を行って注目細胞のみに励起光を照射するように設定がされるので、無駄な蛍光を発生させずに済むようになる。
【００３９】
以上までに説明したマスクの生成はチャンネル画像毎に行われる。
次に、このようにして生成されたマスクを用いて行われる細胞観察の方法について図４を用いて説明する。
図４に示す観察試料１０６の例は、青色レーザによって蛍光が発生する試薬で細胞Ａが染色されており、緑色レーザによって蛍光が発生する試薬で細胞Ｂが染色されている。
【００４０】
この観察試料１０６に対して上述したようにしてマスク生成を行うと、細胞Ａのみが存在しているポイント５０１の位置では青色レーザがオン状態に設定され、緑色レーザがオフ状態に設定される。同様に、細胞Ｂのみが存在しているポイント５０２では青色レーザがオフ状態に設定され、緑色レーザがオン状態に設定される。
【００４１】
一方、細胞Ａと細胞Ｂとが重なっているポイント５０３では、青色レーザ及び緑色レーザが共にオン状態に設定される。また、細胞Ａも細胞Ｂも存在していない領域では、青色レーザ及び緑色レーザは共にオフ状態に設定される。
以上の設定に応じて行われる励起光の観察試料１０６への照射に同期させ、励起波長切替え装置及び測光波長切替え装置を適切な光路に高速に切り替える。光路を高速に切り替えるこれらの装置には、前述したＡＯＴＦ、あるいはＡＯＭ／ＥＯＭなどの音響素子や分光用グレーディング装置などを使用するとよい。
【００４２】
これらの装置による光路の切り替えは、試料に導入した蛍光物質により予め一意に決定することができる。励起波長切替え装置として励起用ダイクロイックミラーターレット、測光波長切替え装置として測光用ダイクロイックミラー及びバリアフィルタを使用する場合における、照射光に対する試薬（蛍光物質）、ダイクロイックミラー、バリアフィルタの使用組み合わせ例を［表１］に示す。
【００４３】
【表１】
2004252414.tif 000003
【００４４】
以上のようにして図１に示した装置において観察試料１０６へ照射する光の波長と光を走査する観察試料１０６上の領域とが自動的に設定されることにより、観察者の作業負担が軽減される。更に、照射する光の波長に最適な励起光路及び測光光路が自動的に構築され、これらの光路が高速に切り替えられながら観察試料１０６に対する光の走査及び蛍光計測が行われるので、複数の波長の光を同時に照射したときに生じ得る蛍光クロストークの無い画像がその計測結果からコンピュータ２で作成される。
【００４５】
また、チャンネル間の蛍光強度を比較して試薬や細胞の状態に対して最適な励起光を選択するので、ＦＲＡＰ等の実験において、ブリーチング処理するための励起光の効率的な選択が容易に行えるようになる。
なお、このブリーチング処理の効率化のためには、画像の生成は必ずしも必要ではない。
【００４６】
次に図５について説明する。同図は、上述したマスク生成の処理の処理内容を示すフローチャートである。この処理はコンピュータ２の有するＣＰＵが所定のプログラムを実行することによって行われる処理であり、取得されたフレーム画像をチャンネル画像毎に分離する処理が完了すると開始される。
【００４７】
なお、以下の処理はチャンネル画像毎に行われる。
まず、Ｓ１０１において、観察対象とする蛍光の波長を観察者からコンピュータ２へ設定させる処理が行なわれる。
Ｓ１０２では、現在の処理対象であるチャンネル画像を構成している画素がひとつ抽出されてその画素の輝度値が調べられる。そして、続くＳ１０３の処理において、この画素の輝度値が予め設定されている輝度値の閾値を超えているか否かが判定され、判定結果がＹｅｓならば、Ｓ１０４において観察試料１０６のその画素に対応する位置の走査が行われるときの励起光の照射をオン状態に設定する。一方、Ｓ１０３の判定結果がＮｏならば、Ｓ１０５において観察試料１０６のその画素に対応する位置の走査が行われるときの励起光の照射をオフ状態に設定する。なお、この励起光照射の設定は光源４及び波長切替え装置５の動作設定であり、現在のこの処理の処理対象であるチャンネル画像に対応する蛍光を発生させるための光（本実施形態では青色レーザ光若しくは緑色レーザ光）の照射の設定である。
【００４８】
Ｓ１０４若しくはＳ１０５の処理を終えた後には、Ｓ１０６において、前述したＳ１０２の処理の対象としていた画素が現在の処理対象であるチャンネル画像を構成している最後の画素であるか否か、すなわち、現在の処理対象であるチャンネル画像の全ての画素を対象としてＳ１０２からＳ１０５にかけての処理を行ったか否かが判定され、この判定結果がＹｅｓならばこのマスクの生成処理を終了する。一方、この判定結果がＮｏならばＳ１０２へ処理が戻って上述した処理が繰り返される。
【００４９】
以上までの処理がマスク生成処理であり、コンピュータ２のＣＰＵが、各チャンネル画像を対象としてこの処理を行うことにより、励起光毎のマスクが生成される。
なお、以上までに説明した実施例１においては、各チャンネル画像の画素における蛍光強度と閾値との大小比較の結果に基づいて励起光照射のオン／オフ設定を行っていたが、その代わりに、例えば、図６に示すような、各画素の輝度（蛍光の強度）を示す階調値とその階調値が示されている画素の画素数との関係を示す画素分布を求め、この画素分布において画素数が所定数以上である階調値の範囲を閾値として自動的に決定し、この閾値範囲内に属する画素に対応する観察試料１０６の位置が走査されるときにはそのチャンネル画像に対応する励起光の照射をオン状態に設定し、この閾値範囲内には属さない画素に対応する観察試料１０６の位置が走査されるときにはそのチャンネル画像に対応する励起光の照射をオフ状態に設定するようにしてもよい。また、取得されたフレーム画像やチャンネル画像の状態に基づき、上述したようにして自動設定された閾値の範囲の最大値及び最小値を観察者の所望する値に調整できるようにしてもよい。
【実施例２】
【００５０】
次に、図１に示した装置を用いて観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を実施例１よりも更に効率良く行う手法を説明する。
従来の同種の蛍光観察においては、複数の波長(例えば青色レーザと緑色レーザ)を照射して取得したフレーム画像(参照画像)に対し、図７（ａ）のように画面全体を走査する動作を走査ユニット１０２に行わせており、そのうち同図に示す実線の矢印部分の位置が走査されるときにのみ励起光の照射をオンとしていた。そのため、同図の領域６０１及び６０２のように、試料観察の中心となる注目領域が同一画像上で点在する場合には、光を照射することなく走査ユニット１０２のみが不必要に動作している期間があった。
【００５１】
また、領域６０１に対してブリーチングなどの細胞刺激操作を行いながら上述したような方法による蛍光観察を行った場合には、不必要な領域の走査が行われている間に領域６０１周辺のたんばく質の移動等によって蛍光の回復が発生してしまうため、その後の領域６０１への２度目の励起光照射では、蛍光の回復が進んだ細胞に対してブリーチングすることになる。このようなブリーチング処理では、ブリーチングの収束までに長い時間を要することとなってしまい、観察のための作業効率を低下させる要因のひとつとなっていた。
【００５２】
そこで、実施例２では、同一画像上に注目領域が点在する場合に、その画像を部分的に走査して注目領域のみの走査を行うことにより、効率の良い画像取得及び細胞刺激を可能にする。
まず、設定した注目領域の形状、サイズ、及び位置を観察者がコンピュータ２に登録する。
【００５３】
次に、フレーム画像を分離して得られるチャンネル画像毎に、選択領域内の各画索の蛍光強度を比較し、励起光のオン／オフ及び光路を実施例１と同様にして自動的に設定する。この処理により注目領域が自動生成される。
次に観察試料１０６に対する走査を開始させる。すると、登録した位置情報に従って走査ユニット１０２が制御され、図６（ｂ）に示すように、光の照射位置が注目領域６０３の走査開始位置へ移動し、登録した形状及びサイズ情報に従って領域６０３が走査されて領域６０３についての画像取得処理が行われる。
【００５４】
領域６０３の走査が完了すると、走査ユニット１０２が制御されて光の照射位置が注目領域６０４の走査開始位置へ移動し、登録した形状及びサイズ情報に従って今度は領域６０４が走査されて領域６０４についての画像取得処理が行われる。
その後、領域６０４の走査が完了すると、画像取得処理が終了する。
【００５５】
なお、ブリーチング処理や時系列観察を行うために走査を繰り返す場合には、領域６０４の走査が終了した後に、走査ユニット１０２が制御されて光の照射位置が注目領域６０３の走査開始位置へ移動し、上述した走査が再度開始される。
以上のようにして注目領域のみの走査を行われることにより、従来は励起光の照射がされずに走査機構のみを動作させていた時間が短縮されるので、画像取得時間を短縮することができる。
【００５６】
また、このような走査によるブリーチング処理を行うことにより、蛍光の回復が開始される前又は蛍光がわずかに回復した状態で次のブリーチング処理が開始されるので、図８に示すようにブリーチングの収束時間が短縮され、ブリーチング処理を効率良く行うことができる。
【実施例３】
【００５７】
次に、図１に示した装置を用いて観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を更に効率良く行う手法を説明する。
前述した実施例２では、観察試料１０６のうちの注目領域のみに対して光を照射するように走査を行うという手法を説明した。このような手法は、例えば図９（ａ）に示すような、異なる注目領域７０１と７０２とのＹ座標（副走査の位置）が全く重複しない場合に特に効果的な画像取得効率の向上が期待できる。
【００５８】
しかし、例えば図９（ｂ）に示すように、異なる注目領域７０３と７０４とのＹ座標が重複している場合、前述した手法では注目領域７０３の走査を終えてから注目領域７０４の走査を行うので、フライバック動作、すなわち、光の照射位置を主走査１ライン分副走査方向へ移動させながら次回の主走査の走査開始位置へ移動させる動作が、その重複部分のＸ軸方向（主走査方向）の１ラインに対して２回発生する。そのため、画像の取得時間がその重複したフライバック動作分長くなってしまう。
【００５９】
そこで、実施例３では、この注目領域の位置関係に左右されることなく、注目領域のみを効率よく走査する方法を説明する。
まず、設定した注目領域の形状、サイズ、及び位置を観察者がコンピュータ２に登録する。
【００６０】
次に、コンピュータ２に登録された全ての注目領域の位置及びサイズの比較が行われ、図９の（ｃ）や（ｄ）のように、注目領域の配置状態に適した走査経路の構築が行われる。
この経路構築の条件としては、領域間でＹ座標が重複しない場合には、図９の（ｃ）のように、注目領域を個別に走査し、注目領域内の走査が完了したときには走査を一旦中断し、走査位置を次の走査領域の走査開始位置へ移動させるように走査ユニット１０２の動作を制御する。なお、この場合の走査の手順は、前述した実施例２によるものと同様である。
【００６１】
一方、図９の（ｂ）のように、注目領域７０３と７０４とでＹ座標の重複が存在する場合には、前述した実施例２の手法のように領域毎の走査を行うと同一のＹ座標の主走査ライン上でフライバック動作が２度発生してしまうので、この問題を回避するため、図９の（ｄ）に示すように、まず注目領域７０３の同図に示す一番ラインを走査し、その１ライン走査が完了したときには注目領域７０３に対する走査を一旦中断し、注目領域７０４の同図に示す二番ラインの走査開始位置へ光の照射位置が移動するように走査ユニット１０２を制御し、注目領域７０４の同図に示す二番ラインを走査させる。
【００６２】
その後、注目領域７０４の二番ラインの走査が完了したときには注目領域７０４に対する走査を一旦中断し、今度は注目領域７０３の同図に示す三番ラインの走査開始位置へ光の照射位置が移動するように走査ユニット１０２の動作を制御する。
以降、走査ユニット１０２に対して上述した制御処理を繰り返すことにより、同一のＹ座標でのフライバック動作の重複発生が解消されるので、前述した実施例２の手法では懸念されていた画像取得時間の遅延が発生しなくなる。
【００６３】
次に図１０について説明する。同図は、コンピュータ２の有するＣＰＵによって行われる走査ユニット１０２の制御処理の処理内容を示すフローチャートである。この処理をＣＰＵが行うことにより、上述した観察試料１０６における注目領域のみの効率的な走査が行われる。
【００６４】
この処理は、注目領域の形状、サイズ、及び位置を示す注目領域情報を観察者がコンピュータ２に登録し、続いて、実施例１と同様の、フレーム画像を分離して得られるチャンネル画像毎の励起光及び光路の自動設定が行われた後に開始される。
まず、Ｓ２０１では、走査ユニット１０２に指示を与えてＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーとを動作させ、観察者によって登録された注目領域情報に基づいて、光の照射位置を、フレーム画像における第一の注目領域である注目領域Ａの走査開始位置へ移動させる。
【００６５】
Ｓ２０２では、走査ユニット１０２に指示を与えて主走査方向であるＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーを動作させ、観察者によって登録された注目領域情報に基づき、注目領域Ａの範囲のみを主走査方向に１ラインだけ光走査させる。
Ｓ２０３では、副走査方向であるＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーの現在の位置で光を照射できる場所に、フレーム画像における第二の注目領域である注目領域Ｂが存在するか否かが観察者によって登録された注目領域情報に基づいて判定され、この判定結果がＹｅｓならばＳ２０４に、ＮｏならばＳ２０５に、それぞれ処理が進む。
【００６６】
Ｓ２０４では、走査ユニット１０２に指示を与えてＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーを動作させ、観察者によって登録された注目領域情報に基づき、注目領域Ｂの範囲のみを主走査方向に１ラインだけ光走査させる。
Ｓ２０５では、走査ユニット１０２に指示を与えてＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーを動作させ、Ｘ軸方向走査用のガルバノメータミラーによる主走査のラインを１ライン分だけ副走査方向に移動させる。
【００６７】
Ｓ２０６では、Ｙ軸方向走査用のガルバノメータミラーの現在の位置で光を照射できる場所に注目領域Ａが存在するか否かが観察者によって登録された注目領域情報に基づいて判定され、この判定結果がＹｅｓならばＳ２０２へ処理が戻って注目領域Ａの走査以降の処理が繰り返される。一方、この判定結果がＮｏならばＳ２０７に処理が進む。
【００６８】
Ｓ２０７では、Ｙ軸方向走査用のガルバノメータミラーの現在の位置で光を照射できる場所に注目領域Ｂが存在するか否かが観察者によって登録された注目領域情報に基づいて判定され、この判定結果がＹｅｓならばＳ２０４へ処理が戻って注目領域Ｂの走査以降の処理が繰り返される。一方、この判定結果がＮｏならばこの制御処理を終了する。
【００６９】
以上までの処理が走査ユニット１０２の制御処理であり、コンピュータ２のＣＰＵがこの処理を行うことにより、観察試料１０６における注目領域のみの走査が、主走査方向での領域重複の有無に関わらず効率的に行われる。
【実施例４】
【００７０】
次に、図１に示した装置を用いて観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を更に効率良く行う手法を説明する。
前述した実施例３の手法に示した走査を行う場合、Ｙ軸方向の走査回数(副走査数)が少なくなれば、前述したフライバック動作の回数も減少するので、画像取得時間を短くすることができる。そこで、例えば図１１（ａ）のように注目領域８０１と８０２とがフレーム画像上に配置されている場合には、走査ユニット１０２のＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーに印加する信号の波形を制御して走査方向を回転させるローテーション走査方法を利用し、この例においては９０°の右回転を行って主走査方向と副走査方向を変更することにより、図１１（ｂ）のように走査することができる。この後は前述した実施例３の手法に従って走査を行えばよい。
【００７１】
ここで図１２について説明する。同図は、コンピュータ２の有するＣＰＵによって行われる走査方向決定処理の処理内容を示すフローチャートである。この処理をＣＰＵが行うことにより、観察試料１０６における効率的な走査方向の決定が行われる。
この処理は、注目領域の形状、サイズ、及び位置を示す注目領域情報を観察者がコンピュータ２に登録し、続いて、実施例１と同様の、フレーム画像を分離して得られるチャンネル画像毎の励起光及び光路の自動設定が行われた後に開始される。
【００７２】
まず、Ｓ３０１では、注目領域の形状及びサイズの情報に基づいて、この時点における主走査距離（１以上の注目領域に対する主走査方向の１回のライン走査によって走査される最長の距離）と副走査距離（１以上の注目領域に対する副走査方向の１回のライン走査によって走査される最長の距離）との比較を行い、その距離が長い方向を主走査方向として仮に決定する。
【００７３】
Ｓ３０２では、主走査の方向を＋１°の回転となるように変更する。
Ｓ３０３では、前ステップの処理による変更後の副走査距離を調べ、この副走査距離が最小となったか否かが調べられる。そして、この判定結果がＹｅｓならばこのときのフレーム画像の角度において主走査及び副走査の方向を確定し、この走査方向決定処理を終了する。一方、この判定結果がＮｏならばＳ３０１へ処理が戻って上述した処理が繰り返される。
【００７４】
以上までの処理が走査方向決定処理である。この処理を終えた後には、前述した実施例３の手法により観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を行う。
以上のようにローテーション走査方法を実施することにより、図１１（ａ）に示されている副走査数ｈに比べて図１１（ｂ）に示されている副走査数ｈ'が減少するので、フライバック動作の回数が減少し、画像取得時間が短縮される。
【実施例５】
【００７５】
次に、図１に示した装置を用いて観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を行う更なる別の手法を説明する。この手法は、各注目領域の画像の取得時刻のずれが少なくなるようにするものであり、神経細胞におけるカルシウムの伝播速度の計測などといった場合に好適なものである。
【００７６】
この手法について図１３に沿って説明する。
まず、取得された画像において注目領域が複数点在する場合、設定した注目領域の形状、サイズ、及び位置を観察者がコンピュータ２に登録する。図１３（ａ）の例においては、第一注目領域９０１、第二注目領域９０２、第三注目領域９０３の登録が行われたものとし、第一注目領域９０１では４８８ｎｍの青色レーザ光を用いた走査を行い、第二注目領域９０２及び第三注目領域９０３では５４３ｎｍの緑色レーザ光を用いた走査を行うものとする。
【００７７】
このとき、例えば前述した実施例２に沿った手法では、図１３（ｂ）に示すように、まず第一注目領域９０１の走査開始位置へ光照射位置を移動させて４８８ｎｍのレーザ光走査を開始し、コンピュータ２に登録された形状、サイズの情報に従って第一注目領域９０１の走査を行う。第一注目領域９０１の走査が完了したならば、光照射位置を第二注目領域９０２の走査開始位置へ光照射位置を移動させると共に、波長切替え装置５がレーザ光を５４３ｎｍのものへと切り替え、第二注目領域９０２の走査を行う。その後、第二注目領域９０２の走査が完了したならば、光照射位置を第三注目領域９０３の走査開始位置へ光照射位置を移動させて第三注目領域９０３の走査を行う。
【００７８】
このような走査手順は、ひとつの注目領域についての画像の取得を終えてから他の注目領域の画像の取得を行うというものであるから、画像取得の時刻が他の注目領域毎に異なってしまう。そのため、各注目領域についてほぼ同時刻に得られた画像の観察を望む場合には適していない。例えば、神経細胞のカルシウムの伝播速度を計測するために複数の注目領域の画像を取得しようとする場合、注目領域毎に画像取得のタイムラグを有していたのでは全体的な伝播の様子を捉えることが難しい。
【００７９】
これに対し、本実施例では、図１３（ｃ）に示すように、まず、第一注目領域９０１の走査開始位置へ光照射位置を移動させ、４８８ｎｍのレーザ光で１ライン走査を行う。続いて、第二注目領域９０２の走査開始位置へ光照射位置を移動させると共にレーザ光を５４３ｎｍのものへと切り替えて第二注目領域９０２の１ライン走査を行い、更に第三注目領域９０３の走査開始位置へ光照射位置を移動させて第三注目領域９０３の１ライン走査を行う。
【００８０】
ここで、レーザ光を４８８ｎｍのものへと再度切り替え、第一注目領域９０１の２ライン目の走査開始位置へ光照射位置を移動させて１ライン走査を行う。その次には、レーザ光を４８８ｎｍのものへと再度切り替え、第二注目領域９０２の２ライン目、そして第三注目領域９０３の２ライン目を続けて行う。
【００８１】
このように、注目領域に対し１ライン走査した後に次の注目領域へ移動して１ラインずつ走査する方式を採用することにより、各注目領域の撮像時刻の同時性が向上する。その結果、神経細胞のカルシウムの伝播の様子のような、複数の注目領域で一斉に変化するような観察試料１０６の現象を複数の注目領域でほぼ同時に画像として捉えることができるようになる。
【００８２】
ここで図１４について説明する。同図は、コンピュータ２の有するＣＰＵによって行われる走査ユニット１０２の制御処理の処理内容を示すフローチャートである。この処理をＣＰＵが行うことにより、上述した各注目領域の撮像時刻の同時性を向上させた観察試料１０６の走査が行われる。
【００８３】
この処理は、注目領域の形状、サイズ、及び位置を示す注目領域情報を観察者がコンピュータ２に登録し、続いて、実施例１と同様の、フレーム画像を分離して得られるチャンネル画像毎の励起光及び光路の自動設定が行われた後に開始される。なお、本実施例においては、これらの注目領域には第一、第二、…、と昇順に連続した番号が付されているものとする。
【００８４】
図１４において、まずＳ３０１では、観察試料１０６に対して設定されている注目領域の個数を変数Ｎに代入する処理が行われる。
Ｓ３０２では、変数ｎに初期値「１」を代入する処理が行われる。
Ｓ３０３では、第ｎ注目領域全体を走査するために必要なＹ軸方向（副走査方向）の走査回数を変数Ｋｎに代入する処理が行われる。
【００８５】
Ｓ３０４では、変数ｎの現在の値に「１」を加算した結果の値を改めて変数ｎに代入する処理が行われ、続くＳ３０５において、この変数ｎの値が前述した変数Ｎの値よりも大きくなってしまったか否かを判定する処理が行われる。ここで、この判定結果がＹｅｓならばＳ３０６に処理を進め、ＮｏならばＳ３０３へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。
【００８６】
Ｓ３０６では、観察試料１０６に対して設定されているこれらの注目領域のうち、Ｙ軸方向（副走査方向）の幅が最大であるものを抽出し、この抽出された注目領域全体の走査を行うために必要なＹ軸方向の走査回数（副走査回数）を変数Ｋに代入する処理が行われる。
【００８７】
Ｓ３０７では、変数ｋに初期値「１」を代入する処理が行われる。
Ｓ３０８では、変数ｎに初期値「１」を代入する処理が行われる。
Ｓ３０９では、変数ｋの値が前述した変数Ｋｎの値よりも大きくなってしまったか否か、すなわち第ｎ注目領域の領域全体の走査が完了しているか否かを判定する処理が行われ、未走査の部分が残されている（この判定処理の結果がＮｏ）のときにのみＳ３１０及びＳ３１１の処理が行われる。すなわち、Ｓ３１０において、走査ユニット１０２へ指示を与えてＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーとＹ軸方向走査用のガルバノメータミラーとを動作させ、観察者によって登録された注目領域情報に基づいて、光の照射位置を、フレーム画像における第ｎ注目領域の第ｋラインの走査開始位置へ移動させる処理が行われ、続くＳ３１１において、走査ユニット１０２へ更に指示を与えて主走査方向であるＸ軸方向走査用のガルバノメータミラーを動作させ、観察者によって登録された注目領域情報に基づき、注目領域Ａの範囲のみを主走査方向に１ラインだけ光走査させる処理が行われる。なお、ＣＰＵは、このＳ３１１の処理の実行時には波長切替え装置５へも指示を与えてレーザ光を第ｎ注目領域の走査に用いるものへと切り替えさせる。
【００８８】
Ｓ３１２では、変数ｎの現在の値に「１」を加算した結果の値を改めて変数ｎに代入する処理が行われ、続くＳ３１３において、この変数ｎの値が前述した変数Ｎの値よりも大きくなってしまったか否かを判定する処理が行われる。ここで、この判定結果がＹｅｓならばＳ３１４に処理を進め、ＮｏならばＳ３０８へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。
【００８９】
Ｓ３１４では、変数ｋの現在の値に「１」を加算した結果の値を改めて変数ｋに代入する処理が行われ、続くＳ３１５において、この変数ｋの値が前述した変数Ｋの値よりも大きくなってしまったか否かを判定する処理が行われる。ここで、この判定結果がＹｅｓならばこの制御処理を終了する。一方、この判定結果がＮｏならばＳ３０７へと処理を戻して上述した処理が繰り返される。
【００９０】
以上までの処理が走査ユニット１０２の制御処理であり、コンピュータ２のＣＰＵがこの処理を行うことにより、上述した各注目領域の撮像時刻の同時性を向上させた観察試料１０６の走査が行われる。
以上までに説明した実施例１〜５の他に、図５、図１０、図１２、及び図１４の各々にフローチャートで示した処理をコンピュータ２のＣＰＵに行わせるための制御プログラムを作成してコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録させておき、そのプログラムを記録媒体からコンピュータ２に読み込ませてＣＰＵで実行させるようにしても観察試料１０６で発生させた蛍光の観察を図１に示す装置で行うことができる。記録させた制御プログラムをコンピュータで読み取ることの可能な記録媒体としては、例えば、コンピュータに内蔵若しくは外付けの付属装置として備えられるＲＯＭやハードディスク装置などの記憶装置、フレキシブルディスク、ＭＯ（光磁気ディスク）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどといった携帯可能記録媒体等が利用できる。
【００９１】
また、記録媒体は通信回線を介してコンピュータシステムと接続される、プログラムサーバとして機能するコンピュータが備えている記憶装置であってもよい。この場合には、制御プログラムを表現するデータ信号で搬送波を変調して得られる伝送信号を、プログラムサーバから伝送媒体である通信回線を通じてコンピュータシステムへ伝送するようにし、コンピュータシステムでは受信した伝送信号を復調して制御プログラムを再生することでこの制御プログラムをＣＰＵで実行できるようになる。
【００９２】
その他、本発明は、上述した実施形態に限定されることなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の改良・変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明を実施する走査型光学顕微鏡装置の構成を示す図である。
【図２】フレーム画像のチャンネル画像への分離を説明する図である。
【図３】実施例１の手法によるマスク画像の生成による効果を説明する図である。
【図４】図１に示す装置を用いて行われる細胞観察の方法を説明する図である。
【図５】マスク生成処理の処理内容を示すフローチャートである。
【図６】励起光反射の設定基準となる閾値の設定法の一例を示す図である。
【図７】実施例２を説明する図である。
【図８】実施例２の効果を示すグラフである。
【図９】実施例３を説明する図である。
【図１０】走査ユニット制御処理の処理内容を示すフローチャートである。
【図１１】実施例４を説明する図である。
【図１２】走査方向決定処理の処理内容を示すフローチャートである。
【図１３】実施例５を説明する図である。
【図１４】実施例５における走査ユニット制御処理の処理内容を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００９４】
１  走査型光学顕微鏡本体
２  コンピュータ
３  操作パネル
４  光源
５  波長切替え装置
６  画像モニタ
１０１  励起波長切替え装置
１０２  走査ユニット
１０３  レボルバ
１０４  対物レンズ
１０５  ステージ
１０６  観察試料
１０７ａ、１０７ｂ、１０７ｃ  測光用ダイクロイックミラー
１０８ａ、１０８ｂ、１０８ｃ  バリアフィルタ
１０９ａ、１０９ｂ、１０９ｃ  光電変換器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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