(57)【要約】      （修正有）【課題】骨パジェット病の検出方法、及び骨パジェット病の病態を示す動物を提供する。【解決手段】  複数の特定のアミノ酸配列からなるコンドロイチン／コンドロイチン硫酸合成酵素の遺伝子の変異又はこれらの発現量と、骨パジェット病とを関連づけ、骨パジェット病の検出、及び前記コンドロイチン／コンドロイチン硫酸合成酵素の遺伝子をノックアウトして得られる、ノックアウト動物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異又は発現量と、骨パジェット病とを関連づけることを特徴とする骨パジェット病の検出方法。
【請求項２】
「コンドロイチン合成酵素」が、コンドロイチンの非還元末端の糖残基に対してD-グルクロン酸残基又はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する活性を有する糖転移酵素であることを特徴とする請求項１記載の骨パジェット病の検出方法。
【請求項３】
「コンドロイチン合成酵素」が、「『アミノ酸残基に結合したキシロース残基』にD-ガラクトースをβ1,4グリコシド結合で転移する糖転移酵素」であることを特徴とする請求項１又は２記載の骨パジェット病の検出方法。
【請求項４】
「コンドロイチン合成酵素遺伝子」が配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６５、配列番号６７、又は配列番号６９の何れかに記載の塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の骨パジェット病の検出方法。
【請求項５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号６６、配列番号６８、又は配列番号７０の何れかに記載されたアミノ酸配列又はそれらに相同性を有するアミノ酸配列からなる糖転移酵素の遺伝子の発現が、一部又は完全に抑制されていることを特徴とするノックアウト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨パジェット病の検出方法に関連し、より詳細にはコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の合成に関与する酵素の遺伝子の変異又は発現量と、骨パジェット病とを関連づける骨パジェット病の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨パジェット病は破骨細胞と骨芽細胞とが共に増加し、骨吸収とそれに伴う二次的な骨形成が局所的に異常に亢進し、骨の変形や肥厚を来す疾病である。この疾病はウイルス感染症が引き金となって発症するという説が有力であり、患者の末梢血液と骨髄の単核球から抽出したRNAを使用して逆転写ポリメラーゼチェインリアクション法（RT-PCR法）で麻疹ウイルスを検出できたことが非特許文献１には記載されている。しかし、麻疹ウイルスが直接骨パジェット病を引き起こすことは示されておらず、骨パジェット病の病態を引き起こす原因は不明である。この疾病の患者は我が国に於いては希であるが、欧米には多くの患者がおり、高齢となるほど高い発症率となること、女性よりも男性で発症率が高いことが非特許文献２には記載されている。
【０００３】
また、骨パジェット病の原因となる変異遺伝子座は既に公知で非特許文献３に記載されているが、この遺伝子座にはいくつもの遺伝子が存在し、何れの遺伝子に変異を来した場合に骨パジェット病となるのかは知られていなかった。従って、簡便な方法で骨パジェット病の診断を行うためには、何れの遺伝子に変異を来した場合に当該疾病が発症するのかを解明する必要があった。
【０００４】
【非特許文献１】J. Bone Miner Res., 11(1996), pp.1602-1607
【０００５】
【非特許文献２】Endocr. Metab. Clin. North. Am., 24(1995), pp.437-450
【非特許文献３】Am. J. Hum. Genet., 69(2001), pp.1055-1061
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
骨パジェット病の病態を引き起こす原因遺伝子を解明し、骨パジェット病の簡便な検出方法に対する期待が高まっていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、骨パジェット病の遺伝子変異が何れもコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の合成に関与するDNAの遺伝子座に起こっていることを発見し、これを骨パジェット病の検出に応用して本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨はコンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子の変異又は発現量と、骨パジェット病とを関連づけることを特徴とする骨パジェット病の検出方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、骨パジェット病の新たな検出方法、及び骨パジェット病の病態動物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明検出方法は、コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異又は発現量と、骨パジェット病とを関連づけることを特徴とする骨パジェット病の検出方法である。
【００１１】
本発明検出方法に於ける「コンドロイチン合成酵素」とは、コンドロイチン又はコンドロイチン硫酸の合成に関与する酵素である限りに於いて特に限定はされない。つまりコンドロイチンやコンドロイチン硫酸は通常はプロテオグリカンとして生体内で合成されるので、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸の基本骨格の伸長に関与する酵素のみならず、例えばプロテオグリカンのタンパク質とグリコサミノグリカンの連結部分を合成する酵素等も包含する。このような酵素が変異を起こしたり、発現がなされないとコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の合成がなされない。
【００１２】
このような本発明検出方法における「コンドロイチン合成酵素」は、「コンドロイチン／コンドロイチン硫酸の非還元末端の糖残基に対してD-グルクロン酸残基又はN-アセチル-D-ガラクトサミン残基を転移する活性を有する糖転移酵素」（便宜上、以下「糖転移酵素１」とも記載する）又は「『アミノ酸残基に結合したキシロース残基』にD-ガラクトースをβ1,4グリコシド結合で結合させる糖転移酵素」（便宜上、以下「糖転移酵素２」とも記載する）であることが好ましい。
【００１３】
上述の「糖転移酵素１」とは、「コンドロイチン／コンドロイチン硫酸の非還元末端の糖残基に対してD-グルクロン酸（以下単に「GlcUA」とも記載する）残基又はN-アセチル-D-ガラクトサミン（以下単に「N-アセチルガラクトサミン」又は「GalNAc」とも記載する）残基を転移する活性」を有する限りにおいて特に限定はされない。このような糖転移酵素１はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の伸長に関与しており、このような酵素に変異又は発現の抑制が起こると正常なコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の生合成が妨げられ、骨形成に異常を来す骨パジェット病に繋がると考えられる。
【００１４】
上記「糖転移酵素１」における「コンドロイチン」とは、ウロン酸（以下単に「UA」とも記載する）残基とGalNAc残基とが1,3グリコシド結合で結合した二糖が、β1,4グリコシド結合で繰り返して結合してなる基本骨格（すなわち-[4UA1-3GalNAcβ1-]n：nは2以上の整数を示す）を有するグリコサミノグリカンの一種である。「コンドロイチン」はこの基本骨格に硫酸基が結合していないが、「コンドロイチン硫酸」はGalNAc残基の2位、4位、又は6位、又はウロン酸残基の2位の炭素原子が硫酸化されている。
【００１５】
「コンドロイチン／コンドロイチン硫酸の非還元末端の糖残基」とは、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸の基本骨格を構成するGalNAc残基及びUA残基の何れかであり、「糖転移酵素１」は、上記糖残基がGalNAc残基の場合はUAを転移し、上記糖残基がUA残基の場合はGalNAcを転移するが、何れか一方の転移活性を少なくとも有している酵素である。
【００１６】
このような「糖転移酵素１」の具体例としては、「配列番号２記載のアミノ酸番号1乃至882からなるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むコンドロイチン合成酵素」が挙げられる。
【００１７】
当該酵素は下記式１で示される構造を含むGalNAc受容体にGalNAc供与体基質（例えばUDP-GalNAc）からGalNAc残基を転移し、下記式２で示される構造を含む化合物を合成する活性を有すると共に、下記式３で示される構造を含むGlcUA受容体にGlcUA供与体基質（例えばUDP-GlcUA）からGlcUA残基を転移し、下記式４で示される構造を含む化合物を合成する活性を有する（本明細書中参考例２参照）。
【００１８】
GlcUAβ1−(3GalNAcβ1−4GlcUAβ1)k−(3GalNAc)l    (1)
GalNAcβ1−4GlcUAβ1-(3GalNAcβ1-4GlcUAβ1)k−(3GalNAc)l    (2)
GalNAcβ1−(4GlcUAβ1−3GalNAcβ1)m−(4GlcUA)n    (3)
GlcUAβ1−3GalNAcβ1−(4GlcUAβ1−3GalNAcβ1)m−(4GlcUA)n    (4)
式１乃至４中、「−」はグリコシド結合を示し、数字は前記グリコシド結合が存在する糖環の炭素位置を示す。また「α」及び「β」は糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、5位CH2OH又はCOOHとの位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。k及びmは1以上の整数を示し、l及びnは1又は0を示す。
【００１９】
塩基配列（配列番号１）からなる当該酵素遺伝子はOMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)を使用して遺伝子座を調べると5q31.1に存在することが明かとなった（参考例１参照）。
【００２０】
また「糖転移酵素１」の他の例としては、例えば「配列番号４記載のアミノ酸番号1乃至755からなるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むコンドロイチン合成酵素」が挙げられる。
【００２１】
当該酵素は前記式１で示される構造を含むGalNAc受容体にGalNAc供与体（例えばUDP-GalNAc）からGalNAc残基を転移し、前記式２で示される構造を含む化合物を合成する活性を有すると共に、前記式３で示される構造を含むGlcUA受容体にGlcUA供与体（例えばUDP-GlcUA）からGlcUA残基を転移し、前記式４で示される構造を含む化合物を合成する活性を有する（本明細書中参考例４参照）。
【００２２】
塩基配列（配列番号３）からなる当該酵素遺伝子はOMIMを使用して遺伝子座を調べると遺伝子座を調べると2q36.3に存在することが明かとなった（本明細書中参考例３参照）。
【００２３】
なお、「コンドロイチンの非還元末端の糖残基に対してGlcUA残基又はGalNAc残基を転移する活性」は、例えば放射能などで標識したGlcUA供与体基質又はGalNAc供与体基質と、放射能で標識していないコンドロイチン／コンドロイチン硫酸（これらを低分子化して得られる低分子コンドロイチン／低分子コンドロイチン硫酸（20糖以下の糖鎖）も含む）の受容体基質とを用いて、酵素反応させた後、反応生成物についてゲル濾過とオートラジオグラフやシンチレーションカウンターなどを用いることで容易に検出することができる。上記GlcUA供与体基質としては、GlcUAを有する糖ヌクレオチドであることが好ましく、例えばアデノシン二リン酸-D-グルクロン酸（ADP-GlcUA）、ウリジン二リン酸-D-グルクロン酸（UDP-GlcUA）、グアノシン二リン酸-D-グルクロン酸（GDP-GlcUA）、シチジン二リン酸-D-グルクロン酸（CDP-GlcUA）等が例示され、UDP-GlcUAが最も好ましい。生体内ではUDP-GlcUAがGlcUA供与体基質として働いているからである。
【００２４】
また、上記GalNAc供与体基質としては、GalNAcを有する糖ヌクレオチドであることが好ましく、例えばアデノシン二リン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン（ADP-GalNAc）、ウリジン二リン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン（UDP-GalNAc）、グアノシン二リン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン（GDP-GalNAc）、シチジン二リン酸-N-アセチル-D-ガラクトサミン（CDP-GalNAc）等が例示され、UDP-GalNAcが最も好ましい。生体内ではUDP-GalNAcがGalNAc供与体基質として働いているからである。
【００２５】
上記「糖転移酵素２」は「『アミノ酸残基に結合したキシロース残基』にD-ガラクトース（以下単に「ガラクトース」又は「Gal」とも記載する）をβ1,4グリコシド結合で転移する働きを有する糖転移酵素」である限りに於いて特に限定はされない。このような糖転移酵素２はコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の生成初期の段階に関与しており、このような酵素に変異が起こると正常なコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の生合成が妨げられるため、骨形成に異常を来す骨パジェット病に繋がると考えられる。
【００２６】
上記「糖転移酵素２」に於ける「アミノ酸残基」とは、ペプチド（タンパク質）を形成するアミノ酸であることが好ましく、特に生体内に存在するコンドロイチン／コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの構造中、ペプチド（タンパク質）とコンドロイチン／コンドロイチン硫酸との結合部分に存在する特徴的四糖構造（GlcUAβ1−3Galβ１−３Galβ1−4Xyl：以下「リンケージ四糖」と記載する）の還元末端に存在するキシロースが結合しているアミノ酸が最も好ましい。このようなアミノ酸として最も好ましくはL-セリンが例示される。
【００２７】
すなわち「糖転移酵素２」は下記式５で示される構造を含むGal受容体にGal供与体基質（例えばUDP-Gal）からGal残基を転移し、下記式６で示される構造を含む化合物を合成する活性を有する（本明細書中参考例５参照）。
【００２８】
Xylβ1−Ser    (5)
Galβ1−4Xylβ1−Ser    (6)
上記式５及び６において、「Ser」は上記「Xyl」で示されるキシロース残基がその側鎖に結合したセリン残基（ペプチド鎖中の場合を含む）を示し、「Xyl」は前記「Ser」で示されるセリン残基の側鎖に結合したキシロース残基を示し、「−」、「β」、数字は前記式１乃至４と同じである。
【００２９】
塩基配列（配列番号５）からなる当該酵素遺伝子はOMIMを使用して遺伝子座を調べると5q35に存在することが明かとなった（本明細書中参考例５参照）。
【００３０】
なお、「『アミノ酸残基に結合したキシロース残基』にGalをβ1,4グリコシド結合で転移する活性」は、例えば放射能などで標識したGal供与体基質と、放射能で標識していないキシロース結合ペプチド（例えば配列番号１５：第9番目のアミノ酸残基であるセリン残基に側鎖としてキシロースが結合しているビクニンのN-末端配列：ペプチド研究所製）とを用いて反応させた後、反応生成物についてゲル濾過とオートラジオグラフやシンチレーションカウンターなどを用いることで容易に検出することができる。なお、上記Gal供与体基質としては、Galを有する糖ヌクレオチドであることが好ましく、例えばアデノシン二リン酸-D-ガラクトース（ADP-Gal）、ウリジン二リン酸-D-ガラクトース（UDP-Gal）、グアノシン二リン酸-D-ガラクトース（GDP-Gal）、シチジン二リン酸-D-ガラクトース（CDP-Gal）等が例示され、UDP-Galが最も好ましい。生体内ではUDP-GalがGal供与体基質として働いているからである。
【００３１】
骨パジェット病に於ける遺伝子の変異としては、例えば亜種であるPDB2においては18q22.1、PDB3においては5q35、PDB4においては5q31に変異が起こっていることが知られており（OMIM #602080）、また家族性の骨パジェット病に於ける遺伝子の変異として、2q36、10q13、及び5q35に変異が起こっていることが知られている（Am. J. Hum. Genet. 69(2001), pp.1055-1061）。このような既知の変異部位には数個乃至十数個の遺伝子がコードされているが、上述した各コンドロイチン合成酵素遺伝子の存在位置は配列番号１(K3)が5q31.1、配列番号３(K11)が2q36.3、そして配列番号５(β4GalT7)は5q35であり、上記変異の存在する位置と各々完全に一致している。このようにコンドロイチン／コンドロイチン硫酸の合成に関わるこれらの酵素の遺伝子が全て骨パジェット病の遺伝子変異部位と重複することから、これらの遺伝子の変異は、コンドロイチン／コンドロイチン硫酸の生合成に障害を起こして骨パジェット病の発症に繋がっている蓋然性が極めて高い。
【００３２】
本明細書において使用する用語「コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異又は発現量と、骨パジェット病とを関連づける」とは、コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異が検出された場合、又は該遺伝子の発現量が健常人と比べて低下した場合に骨パジェット病であると判断することをいう。
【００３３】
本明細書において使用する用語「遺伝子の変異」とは、遺伝子の構造変化をいい、「変異」には、点突然変異、逆位、欠失、挿入、重複、転座等が含まれる。また、「変異遺伝子」とは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６５、配列番号６７、又は配列番号６９に示される塩基配列において、１若しくは複数個のヌクレオチドが置換し若しくは欠失し、又は該塩基配列に１若しくは複数個のヌクレオチドが挿入され若しくは付加された塩基配列を意味する。ここで、「複数個」とは、好ましくは２個以上、より好ましくは４個以上、さらにより好ましくは６個以上、最も好ましくは１０個以上である。
【００３４】
コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異の態様は、好ましくは点突然変異、欠失、挿入、逆位、重複、転座、より好ましくは、点突然変異、欠失、挿入、逆位、転座、さらに好ましくは、点突然変異、欠失、挿入、転座、最も好ましくは点突然変異、欠失、挿入である。
【００３５】
本明細書において使用する用語「遺伝子の発現」とは、典型的には、ＤＮＡ又はその一部からＲＮＡへの転写、又は該ＲＮＡ又はその一部からタンパク質への翻訳をいう。従って、「遺伝子の発現量」というときは、遺伝子から転写されるＲＮＡの量、又は該ＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量をいう。
【００３６】
ＲＮＡの発現量は、例えば、後述する実施例１に記載した表１のプライマーを使用したＰＣＲ法を用いて定量することができる。ＰＣＲ法では、定量的ＰＣＲ法の使用が好ましく、キネティックス分析のためのＲＴ−ＰＣＲ法、定量的リアルタイムＰＣＲ法が例示される。本発明によれば、ＲＮＡの定量は、これらに限定されるものではなく、ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイ等を使用することも可能である。一方、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（GAPDH）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。また、タンパク質の発現量は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロットを用いて定量することができる。
【００３７】
本発明検出方法は具体的には以下の様にして行うことができる。
【００３８】
すなわち、例えば遺伝子を含む検体（例えば上皮組織、結合組織等、好ましくは結合組織が挙げられ、採取が極めて容易で、且つ得られた検体が新鮮であることから特に好ましくは血液が挙げられる）から、例えば既存のRNA調製キット（例えばRNA Extraction Kit：アマシャムバイオサイエンス株式会社製など）を用いて全RNAを抽出・精製することができる。抽出・精製された全RNAを用いてK3、K11、及びβ4Gal-T7の発現量を既存のキット（例えばSUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR（インビトロジェン社製）等）を用いてRT-PCR法などの方法で定量することができる。使用する5'プライマー、3'プライマー、及びプローブの組み合わせの例としては、K3の発現量を定量する場合は配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、K11の発現量を定量する場合は配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、β4Gal-T7の発現量を定量する場合は配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４の組み合わせが挙げられるが、当業者であれば定量の目的に応じて適宜選択して調製することが可能である。
【００３９】
そして、例えばこれらの定量の結果、K3、K11及びβ4GalT7の何れかの遺伝子の発現が一部又は完全に抑制されている患者を骨パジェット病の危険性が高い患者とすることができる。また、上記定量は上記で例示したようにK3、K11及びβ4Gal-T7の遺伝子の転写量をRNA量から定量して行うこともできるが、例えば常法に従って調製したK3、K11又はβ4Gal-T7の抗体などを使用してK3、K11又はβ4Gal-T7のタンパク質量を直接定量して行うことも可能であり、また検体中の上記酵素の活性を直接測定して酵素量を定量して骨パジェット病と関連づけることも可能である。
【００４０】
より具体的には、後述する実施例２に記載されているように、骨パジェット病の患者の末梢血単核球と正常な末梢血単核球でのコンドロイチン合成酵素遺伝子の発現量の比を定量ＰＣＲによって測定することによって骨パジェット病と判断することができる。本発明によれば、骨パジェット病であると判断できる発現量の比は、１／２以下、好ましくは１／５以下、さらにより好ましくは１／１０以下である。なお、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、及び半定量のいずれもが包含される。
【００４１】
本発明によれば、コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異の存在を確認することによって骨パジェット病を検出することができる。即ち、骨パジェット病の患者の末梢血単核球から抽出したコンドロイチン合成酵素遺伝子の塩基配列と正常な末梢血単核球から抽出したコンドロイチン合成酵素遺伝子の塩基配列とを比較し、変異の存在を検出することによって骨パジェット病であると判断することができる。より具体的には、後述する実施例１に記載されているように、本明細書配列表に記載されたK3、K11及びβ4Gal-T7の塩基配列を元に適宜調製したプライマーを用いてゲノムのDNAから直接K3、K11又はβ4Gal-T7の遺伝子をPCR法などの手法を用いて増幅し、公知の塩基配列決定法に従って塩基配列を解析し、これらの遺伝子に変異が存在する場合に骨パジェット病であると結論づけることが可能である。
【００４２】
骨パジェット病であると判断できる変異したヌクレオチドの数は、１以上、好ましくは４以上、さらにより好ましくは６以上、最も好ましくは１０以上である。
【００４３】
コンドロイチン合成酵素遺伝子の変異の態様は、好ましくは点突然変異、欠失、挿入、逆位、重複、転座、より好ましくは、点突然変異、欠失、挿入、逆位、転座、さらに好ましくは、点突然変異、欠失、挿入、転座、最も好ましくは点突然変異、欠失、挿入である。
【００４４】
また、本発明によりK3、K11及びβ4Gal-T7が骨パジェット病に関連していることが明かとなったので、実験動物において、これらの遺伝子の発現を一部又は完全に抑制することによって骨パジェット病の病態を示すノックアウト動物を調製することも可能である。ノックアウト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの哺乳動物が好ましく、ノックアウト動物調製の手法がある程度確立していることから、マウス又はラットが最も好ましいが、これに限定はされない。
【００４５】
例えば骨パジェット病の病態を示すノックアウトマウス（病態マウス）は例えばジーンターゲティングの最新技術（八木健編集  羊土社）、ジーンターゲティング（野田哲生監訳  メディカル・サイエンス・インターナショナル社）などの記載に従って行うことができる。
【００４６】
例えば、ノックアウトしたいマウスの遺伝子（K3（mK3：配列番号６５）、K11（mK11：配列番号６７）又はβ4Gal-T7（mβ4Gal-T7：配列番号６９））の活性化ドメインを含むexon（mK3の場合にはORF部分の3番目のexon（1560 bp）を含む断片、mK11の場合にはORF全長に相当する4598bpを含む断片、mβ4Gal-T7の場合にはORFの２から６番目のexonを含む断片）を中心とした染色体断片（約10kb）を挿入した直鎖状ターゲティングベクター80μgをES細胞（E14/129Svマウス由来）にエレクトロポレーション法などの公知の方法により導入し、G418耐性のコロニーを選択し、このG418耐性コロニーを24ウェルプレートに移して培養を行うことができる。細胞の一部を凍結保存した後、残りのES細胞からDNAを抽出し、公知の塩基配列解析方法により組換が起こっているクローンを120コロニー程度選択する。さらに、サザンブロッティング法などの方法を用いて組換が予定通り起こっている確認を行い、最終的に組換体を10クローン程度選択し、そのうちの2クローン程度のES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞内に注入する。このようにしてES細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させることができる。キメラマウスをジャームトランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得ることができる。
【００４７】
また、small interfering RNA法（T.R. Brummelkamp et al., Science, 296, 550-553 (2002)）などの「遺伝子発現を抑制する方法」でもノックアウトマウスを作製することができる。
【００４８】
より具体的には、後述する実施例３に記載されているように、ノックアウトマウスは、コンドロイチン合成酵素遺伝子をＥＳ細胞に導入し、目的とする相同組換えを起こしたクローンを用いて生殖細胞系列に入るマウス系列を樹立することにより作製することができる。
【実施例１】
【００４９】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
参考例１：コンドロイチン硫酸合成酵素（K3）の調製
（１）cDNAのクローニングと発現ベクターの構築
β1,4ガラクトース転移酵素（β4Gal-T）のアミノ酸配列（GenBank accession No.D29805がコードするアミノ酸配列）をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、Expression Sequence Tag(EST:GenBank accession No. AC0004219) が見つかった。しかし、この配列は不完全であったため、ゲノムデータベースから、GenScan（米国スタンフォード大学）によりORFを調べた。その結果、配列番号１記載の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号２）を発見した。配列番号１記載の塩基配列からなる遺伝子は、少なくともヒト脳で発現していることをMarathon-Ready cDNA（クロンテック社製）を鋳型としたRT-PCR法によって確認した（PCR用のプライマーとしては配列番号９及び配列番号１０、並びに配列番号１１及び配列番号１２の5'プライマーと3'プライマーとの組み合わせを使用した）。この遺伝子の膜貫通領域を含む領域（配列番号２のアミノ酸番号1乃至129からなる領域）を除く可溶性領域をクローニングするため、配列番号７及び配列番号８の２種のプライマーを用いて常法に従ってPCRを行った。使用した鋳型cDNAはMarathon-Ready cDNA human brain（クロンテック社製）を使用した。増幅された約2.3kbのバンドを常法に従ってHindIIIとXbaIとで消化し、ほ乳類細胞用の発現ベクターpFLAG-CMV-1（シグマ社製）のHindIIIとXbaI部位に常法に従って挿入して発現ベクター（K3-FLAG-CMV1）を得た。得られた発現ベクターの塩基配列を確認したところ、配列番号１記載の塩基配列の塩基番号388乃至2649の塩基配列からなるDNA断片が挿入されていることを確認した。この塩基配列を有するDNAのゲノム上の位置を、OMIMを使用して確認したところ、5q31.1に存在することが明かとなった。
（２）K3の調製
K3-FLAG-CMV1 15μgをTransFast(プロメガ社製)を用い、プロトコールに従って、100 mm培養皿に70%コンフルエントになるように培養したCOS7細胞に遺伝子を導入した。3日間培養した上清を回収し、0.22μmのフィルターで濾過後、その上清10mlにAnti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel (シグマ社製)100μlを加え、4℃で一晩、転倒混和した。反応後、ゲルを50mM Tris-HCl、pH7.4/20%グリセロールで3回洗浄後、27Gの注射針をつけたシリンジを用い余分な洗浄液を除いた。このゲルを50mmol/L Tris-HCl、pH7.4（20%グリセロール、10mmol/L フェニルメチルスルホニルフルオライド、1μg/ml leupeptin、1μg/ml pepstatin）に50%(v/v)となるように懸濁し、これを遠心分離した後に上清を取り除いて酵素吸着ゲル懸濁液とした。
参考例２
K3を用いたコンドロイチン骨格の伸長
（１）コンドロイチン／コンドロイチン硫酸奇数糖の調製
コンドロイチン（サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化したもの：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製：コンドロイチン硫酸Cとも呼ばれている）をウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定消化後、反応液を10分間100℃で保ち、酵素を加熱失活させた。この反応液をSuperdex 30カラム（60 x 1.6cm: アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NH4HCO3、流速：2ml/分）にかけ、溶出液を225nmの吸光度でモニターしながら2ml毎に分画し、10糖相当画分をプールした。画分をPD10カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により脱塩後、常法に従ってカルバゾール硫酸法によりウロン酸定量を行い、凍結乾燥した。凍結乾燥物を1mMとなるように蒸留水に溶解し、偶数オリゴ糖サンプルとした（コンドロイチン由来の10糖を「CH10」、コンドロイチン硫酸由来の10糖を「CS10」と記載する）。
【００５０】
10nmol/LのMnCl2、171μmol/LのATPナトリウム塩を含む50mmol/L MES緩衝液（pH6.5）に酵素吸着ゲル懸濁液10μl、被検物質（コンドロイチン（CHEL）、コンドロイチン硫酸（CSEL）、CH10又はCS10）を1nmol、[3H]UDP-GalNAcを0.036nmol添加して全量を30μlとした。酵素反応は37℃で1時間行い、その後反応液を100℃で1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
【００５１】
各々の反応液を孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 1.0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速1.0ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した（図１）。その結果、強いGalNAc転移活性がCHEL（17乃至18画分）、CH10（23画分）及びCS10（23画分）をGalNAc受容体基質とした場合に観察され、CSELに対してはGalNAc転移活性は観察されなかった（16画分）。CH10及びCS10から得られた反応生成物の23画分は11糖が溶出する分子量を示す画分だった。CH10から得られた11糖を「CH11(K3)」、CS10から得られた11糖を「CS11(K3)」と記載する。
【００５２】
CS11(K3)の21〜25画分を回収してプールし、PD10カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を30mMの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/LのTrisHCl緩衝液（pH7.4）100μlに溶解し（CS11(K3)A）、他方をコンドロイチナーゼACIIで消化した（100mUのコンドロイチナーゼACII（生化学工業株式会社製）を100μlのCS11(K3)画分に溶解し、37℃で10時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた：CS11(K3)B）。
【００５３】
CS11(K3)AとCS11(K3)Bとを孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 10mm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、CS11(K3)Bにおいて単糖画分に放射能ピークがシフトした（図２）。この結果から、K3はコンドロイチン硫酸由来の10糖の非還元末端のGlcUAに対してGalNAcをβ1,4結合で転移し、11糖を調製することができることが明かとなった。
（２）コンドロイチン／コンドロイチン硫酸偶数糖の調製
コンドロイチン（サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製：コンドロイチン硫酸Cとも呼ばれている）をウシ睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社製）で限定消化後、反応液を10分間100℃で保ち、酵素を加熱失活させた。この反応液を10,000 x gで10分間遠心処理し、上清を回収して更にウシ肝臓由来βグルクロニダーゼ（シグマ社製）で消化した。酵素反応は反応液を10分間100℃で保って停止させた。この反応液をSuperdex 30カラム（60 x 1.6cm: アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NH4HCO3、流速：2ml/分）にかけ溶出液を225nmの吸光度でモニターしながら、2ml毎に分画し、11糖相当画分をプールした。各画分をPD10カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）により脱塩後、常法に従ってカルバゾール硫酸法によりウロン酸定量を行い、凍結乾燥した。凍結乾燥物を1mmol/Lとなるように蒸留水に溶解し、奇数オリゴ糖サンプルとした（コンドロイチン由来の11糖：「CH11」、コンドロイチン硫酸由来の11糖：「CS11」）。
【００５４】
またコンドロイチン（サメ軟骨由来コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化：生化学工業株式会社製）及びコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式社製：コンドロイチン硫酸Cとも呼ばれている）をウシ肝臓由来βグルクロニダーゼ（シグマ社製）で消化してサンプルとした（各々「CHOL」及び「CSOL」と記載する）。
【００５５】
10mmol/LのMnCl2、50mmol/L 酢酸緩衝液（pH5.6）に酵素吸着ゲル懸濁液10μl、被検物質（CHOL、CSOL、CH11又はCS11）を1nmol、[14C]UDP-GlcUAを0.432nmol添加して全量を30μlとした。酵素反応は37℃で1時間行い、その後反応液を100℃で1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
【００５６】
各々の反応液を孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 1.0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した（図３）。その結果、強いGlcUA転移活性がCHOL（17乃至18画分）、CH11（23画分）及びCS11（23画分）をGlcUA受容体基質とした場合に観察され、CSOLに対してはGlcUA転移活性が観察されなかった（16画分）。CH11及びCS11から得られた反応生成物の22〜23画分は12糖が溶出する分子量を示す画分だった。CH11から得られた12糖を「CH12(K3)」、CS11から得られた12糖を「CS12(K3)」と記載する。
【００５７】
CS12(K3)の21乃至25画分を回収してプールし、PD10カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を30mmol/Lの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/LのTrisHCl緩衝液（pH7.4）100μlに溶解し（CS12(K3)A）、他方をコンドロイチナーゼACIIで消化した（100mユニットのコンドロイチナーゼACII（生化学工業株式会社製）を100μlのCS11(K3)画分に溶解し、37℃で10時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた：CS12(K3)B）。
【００５８】
CS12(K3)AとCS12(K3)Bとを孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 1.0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、CS12(K3)Bにおいて二糖画分に放射能ピークがシフトした（図４）。この結果から、K3はコンドロイチン硫酸由来の11糖に対してGlcUAをβ1,3結合で転移し、12糖を調製することができることが明かとなった。
参考例３
コンドロイチン硫酸合成酵素（K11）の調製
(1)cDNAのクローニングと発現ベクターの構築
コンドロイチン硫酸グルクロン酸転移酵素（CSGlcA-T）のアミノ酸配列（GenBank accession No.AB037823がコードするアミノ酸配列）をクエリーとして、BLAST検索を行った。その結果、EST (GenBank accession No. NM_018590) が見つかった。しかし、この配列は不完全であったため、ゲノムデータベースから、GenScan（米国スタンフォード大学）によりORFを調べた。その結果、配列番号３記載の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号４）を発見した。配列番号３記載の塩基配列からなる遺伝子は、少なくともヒト脳で発現していることをMarathon-Ready cDNA（クロンテック社製）を鋳型としたRT-PCR法によって確認した。この遺伝子の膜貫通領域を含む領域（配列番号４のアミノ酸番号１乃至９６からなる領域）を除く可溶性領域をクローニングするため、配列番号１３及び配列番号１４の２種のプライマーを用いて常法に従ってPCRを行った。使用した鋳型cDNAはMarathon-Ready cDNA human brain（クロンテック社製）を使用した。増幅された約2kbのバンドを常法に従ってEcoRIとBamHIで消化し、ほ乳類細胞用の発現ベクターpFLAG-CMV-1（シグマ社製）のEcoRIとBamHI部位に常法に従って挿入してK11-FLAG-CMV1を得た。得られたベクターの塩基配列を確認したところ、配列番号３記載の塩基配列の塩基番号287乃至2328の塩基配列からなるDNA断片が挿入されていることを確認した。この塩基配列を有するDNAのゲノム上の位置を、OMIMを使用して確認したところ、2q36.3に存在することが明かとなった。
(2)K11の調製
K11-FLAG-CMV1 15mgをTransFast(プロメガ社製)を用い、プロトコールに従って100 mm培養皿に70%コンフルエントになるように培養したCOS7細胞に遺伝子を導入した。3日間培養した上清を回収し、0.22μmのフィルターで濾過後、その上清10mlにAnti-FLAG M2-Agarose Affinity Gel (シグマ社製)100μlを加え、４℃で一晩、転倒混和した。反応後、ゲルを50mmol/L Tris-HCl、pH7.4（20%グリセロール）3回洗浄後、27Gの注射針をつけたシリンジを用い余分な洗浄液を除いた。このゲルを50mmol/L pH7.4のTrisHCl緩衝液、（20%グリセロール、10mmol/L フェニルメチルスルホニルフルオライド、1μg/ml leupeptin、1μg/ml pepstatin）に50%(v/v)となるように懸濁し、これを遠心分離した後に上清を取り除いて酵素    吸着ゲル懸濁液とした。
参考例４
K11を用いたコンドロイチン骨格の伸長
(1)コンドロイチン／コンドロイチン硫酸奇数糖の調製
10nmol/LのMnCl2、171μmol/LのATPナトリウム塩を含む50mmol/L MES緩衝液（pH6.5）に酵素吸着ゲル懸濁液10μl、被検物質（CHEL、CSEL、CH10又はCS10）を1nmol、[3H]UDP-GalNAcを0.036nmol添加して全量を30μlとした。酵素反応は37℃で1時間行い、その後反応液を100℃で1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
【００５９】
各々の反応液を孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 1.0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した（図５）。その結果、強いGalNAc転移活性がCHEL（18画分）、CH10（23画分）及びCS10（23画分）をGalNAc受容体基質とした場合に観察され、CSELに対しては弱いGalNAc転移活性が観察された（16画分）。CH10及びCS10から得られた反応生成物の22〜23画分は11糖が溶出する分子量を示す画分だった。CH10から得られた11糖を「CH11(K11)」、CS10から得られた11糖を「CS11(K11)」と記載する。
【００６０】
CS11(K11)の21〜25画分を回収してプールし、PD10カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を30mMの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/LのTrisHCl緩衝液（pH7.4）100μlに溶解し（CS11(K11)A）、他方をコンドロイチナーゼACIIで消化した（100mユニットのコンドロイチナーゼACII（生化学工業株式会社製）を100μlのCS11画分に溶解し、37℃で10時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた：CS11(K11)B）。
【００６１】
CS11(K11)AとCS11(K11)Bとを孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 10mm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、CS11(K11)Bにおいて三糖画分に放射能ピークがシフトした（図６）。この結果から、K11はコンドロイチン硫酸由来の10糖の非還元末端のGlcUAに対してGalNAcをβ1,4結合で転移し、11糖を調製することができることが推測された。
(2)コンドロイチン／コンドロイチン硫酸偶数糖の調製
10nmol/LのMnCl2、50mmol/L 酢酸緩衝液（pH5.6）に酵素吸着ゲル懸濁液10μl、被検物質（CHOL、CSOL、CH11又はCS11）を1nmol、[14C]UDP-GlcUAを0.432nmol添加して全量を30μlとした。酵素反応は37℃で1時間行い、その後反応液を100℃で1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
【００６２】
各々の反応液を孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 1.0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した（図３）。その結果、強いGlcUA転移活性がCHOL（18画分）、CH11（23画分）及びCS11（22画分）をGlcUA受容体基質とした場合に観察され、CSOLに対してはGlcUA転移活性が観察されなかった。CH11及びCS11から得られた反応生成物の22乃至23画分は12糖が溶出する分子量を示す画分だった。CH11から得られた12糖を「CH12(K11)」、CS11から得られた12糖を「CS12(K11)」と記載する。
【００６３】
CS12(K11)の21乃至25画分を回収してプールし、PD10カラムにより脱塩した。このようにして得られたサンプルを二等分して凍結乾燥した。二分した一方を30mmol/Lの酢酸ナトリウムを含む0.1mol/LのTrisHCl緩衝液（pH7.4）100μlに溶解し（CS12(K11)A）、他方をコンドロイチナーゼACIIで消化した（100mユニットのコンドロイチナーゼACII（生化学工業株式会社製）を100μlのCS11(K11)画分に溶解し、37℃で10時間酵素消化し、加熱して酵素を失活させた：CS12(K11)B）。
【００６４】
CS12(K11)AとCS12(K11)Bとを孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム(30 x 1.0cm：アマシャムバイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速0.5ml/分)で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定したところ、CS12(K11)Bにおいて二糖画分に放射能ピークがシフトした（図４）。この結果から、本発明酵素はコンドロイチン硫酸由来の11糖に対してGlcUAをβ1,3結合で転移し、12糖を調製することができることが明かとなった。
参考例５
コンドロイチン硫酸合成酵素（β4Gal-T7）の調製と活性の確認
Almeidaらの方法（J. Biol. Chem.,274, 37, 26165-26171(1999)のEXPERIMENTAL PROCEDURESの記載）に従ってβ4Gal-T7のクローニングを行なった。得られたクローンの塩基配列を常法に従って確認したところ、配列番号５記載の塩基配列からなることが明かとなった。この塩基配列を有するDNAのゲノム上の位置を、OMIMを使用して確認したところ、5q35に存在することが明かとなった。
【００６５】
更に、Gotohらの方法（J. Biol. Chem.,277, 41, 38189-38196(2002)に従ってβ4Gal-T7の発現を行なってβ4Gal-T7が結合したアフィニティー担体の懸濁液を得た後、ゲル10μl、受容体基質（キシロース結合ペプチド（配列番号１５：第９番目のアミノ酸残基であるセリンに側鎖としてキシロースが結合しているビクニンのN-末端配列）：ペプチド研究所製）6.25mg、171μmolのアデノシン三リン酸（ATP）ナトリウム塩、0.036molの[3H]UDP-Galを10nmol/LのMnCl2を含む50mmolのMES緩衝液（pH6.5）に加えて全量を30μlとし、37℃で1時間反応を行なった。その後反応液を100℃で1分間保って酵素を失活させて反応を停止させた。
【００６６】
反応液を孔径0.22μmのマイクロフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、Superdex peptideカラム（30 x 1.0cm：アマシャム  バイオサイエンス株式会社製、クロマトグラフィー条件；移動相：0.2mol/L NaCl、流速1.0ml/分）で分離し、溶出液を0.5mlの画分毎に分取して、シンチレーションカウンターで放射能を測定した。その結果、[3H]UDP-Galの溶出画分とは別の高分子の画分に強い放射能が観察された。このことから、β4Gal-T7が受容体基質にガラクトースを結合させていることが裏付けられた。
【００６７】
実施例１  血液サンプルからのDNA抽出と塩基配列解析
1mlの血液からGFX Genomic Blood DNA Purification Kit（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いてDNAを抽出した。得られる14〜16μgのDNAのうち、250ngを鋳型として、各種プライマー（下記表１参照）によりコンドロイチン硫酸合成酵素（K3、K11、β4Gal-T7）遺伝子のエクソンを増幅した。このようにして得られる断片を鋳型にして、常法により塩基配列を解析し、それを健常な各コンドロイチン合成酵素の遺伝子の塩基配列を対比することで、変異や一塩基多型の有無を容易に調べることができる。
【００６８】
【表１】
2004166702.tif 000002
【００６９】
実施例２  血液サンプルからのRNA抽出と発現量解析
10mlの血液を3,000rpmで10分間遠心分離し、中間層を分取する。さらに、Lympho Prep（Nycomed社）を用いて遠心分離し中間層を分取する。この操作により末梢血中の単核球（PBMC）9x107細胞を得る。全量のPBMCからRNA Extraction Kit（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いて総RNAを調製することができる。総RNA 10ngからSUPERSCRIPT First-Strand Synthesis System for RT-PCR（インビトロジェン社製）により1st strand cDNAを合成した。このcDNAを鋳型にして、real-time PCR法により各遺伝子の発現量を定量することができる。使用するプライマー及びプローブを表２に示す。
【００７０】
【表２】
2004166702.tif 000003
【００７１】
実施例３  病態モデルマウスの調製
ノックアウトマウスはマウスのK3（mK3：配列番号６５）、K11（mK11：配列番号６７）あるいはβ4Gal-T7（mβ4Gal-T7：配列番号６９）の活性化ドメインを含むexon（mK3の場合にはORF部分の3番目のexon（1560bp）を含む約10kb断片、mK11の場合にはORF全長に相当する4598bpを含む約10 kb断片、mβ4Gal-T7の場合にはORFの２から６番目のexonを含む約10 kb断片）を中心とした染色体断片（約10 kb）を挿入した直鎖状ターゲティングベクター80 μgをES細胞（E14 / 129Svマウス由来）にトランスフェクション（エレクトロポレーション）し、G418耐性のコロニーを選択した。G418耐性コロニーを24ウェルプレートに移し、培養を行った。細胞の一部を凍結保存した後、残りのES細胞からDNAを抽出し、PCRにより組み換えが起こっているクローンを120コロニー程度選択した。さらに、サザンブロッティングにより組換が予定通り起こっていることを確認し、最終的に組換体を10クローン程度選択した。選択したうちの2クローンのES細胞をC57BL/6マウスの胚盤胞内に注入した。ES細胞を注入したマウス胚を仮親マウスの子宮内へ移植してキメラマウスを誕生させた。 その後、ジャームトランスミッションによりヘテロノックアウトマウスを得た。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、骨パジェット病の検出及び骨パジェット病の病態動物の産生等に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】K3のGalNAc転移活性による奇数糖の合成を示すクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対するGalNAc転移活性を示すチャートであり、黒丸はコンドロイチンに対するGalNAc転移活性を示す図である。白三角はコンドロイチン硫酸10糖に対するGalNAc転移活性を示すチャートでα、黒三角はコンドロイチン10糖に対するGalNAc転移活性を示すチャートである。
【図２】K3のGalNAc転移活性により調製された11糖とそのコンドロイチナーゼACII消化物のクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼACII未消化の11糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼACII消化後の消化産物のチャートを示す。
【図３】K3のGlcUA転移活性による偶数糖の合成を示すクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対するGlaUA転移活性を示すチャートであり、黒丸はコンドロイチンに対するGlcUA転移活性を示すチャートである。白三角はコンドロイチン硫酸11糖に対するGlcUA転移活性を示すチャートであり、黒三角はコンドロイチン11糖に対するGlcUA転移活性を示すチャートである。
【図４】K3のGlcUA転移活性により調製された12糖とそのコンドロイチナーゼACII消化物のクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼACII未消化の12糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼACII消化後の消化産物のチャートを示す。
【図５】K11のGalNAc転移活性による奇数糖の合成を示すクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対するGalNAc転移活性を示すチャートであり、黒丸はコンドロイチンに対するGalNAc転移活性を示す図である。白三角はコンドロイチン硫酸10糖に対するGalNAc転移活性を示すチャートでα、黒三角はコンドロイチン10糖に対するGalNAc転移活性を示すチャートである。
【図６】K11のGalNAc転移活性により調製された11糖とそのコンドロイチナーゼACII消化物のクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼACII未消化の11糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼACII消化後の消化産物のチャートを示す。
【図７】K11のGlcUA転移活性による偶数糖の合成を示すクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチン硫酸に対するGlaUA転移活性を示すチャートであり、黒丸はコンドロイチンに対するGlcUA転移活性を示すチャートである。白三角はコンドロイチン硫酸11糖に対するGlcUA転移活性を示すチャートであり、黒三角はコンドロイチン11糖に対するGlcUA転移活性を示すチャートである。
【図８】K11のGlcUA転移活性により調製された12糖とそのコンドロイチナーゼACII消化物のクロマトグラフィーのチャートを示す図である。白丸はコンドロイチナーゼACII未消化の12糖のチャートを示し、黒丸はコンドロイチナーゼACII消化後の消化産物のチャートを示す。
【図１】
2004166702.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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