(57)【要約】【課題】多数サンプルを同時に高感度検出する小型で簡便な微生物測定用発光検出装置を提供する。【解決手段】微生物測定用生物発光反応を行う反応槽１と、反応槽１からの発光を検出する光検出部３を１対１で垂直方向で対応するように密着配置する。さらに、反応槽１と試薬注入を行う試薬槽を具備したディスペンサ２を１対１で垂直方向で対応するように配置し、反応槽１への一括同時試薬注入を上部垂直方向から行い、反応槽１からの発光検出を下部垂直方向から行う。【選択図】  図１（ａ）
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内ＡＴＰを生物発光反応で測定する生物発光測定装置において、
実質的に透明な底部を有し試料が入れられる反応容器と、
前記反応容器の上方に位置し、細胞外ＡＴＰを消去するための試薬、細胞内ＡＴＰを抽出するための試薬、発光反応のための試薬を収めた下方にキャピラリーを有する試薬容器を保持し、前記試薬容器を前記反応容器に対して上下方向に駆動する駆動部と、
前記反応容器の下面に近接して配列された光検出素子を有する光検出部とを含み、
前記反応容器内で生じた発光を検出することを特徴とする生物発光測定装置。
【請求項２】
請求項１記載の生物発光測定装置において、前記光検出器の出力をデジタル値に変換するＡ／Ｄコンバータと、前記Ａ／Ｄコンバータの出力したデジタル値を記憶するメモリと、無線通信部と、前記メモリ及び無線通信部を制御する制御部を備え、前記メモリの内容を前記無線通信装置を介して送信する機能を有することを特徴とする生物発光測定装置。
【請求項３】
細胞を含む試料の細胞内ＡＴＰを生物発光反応で測定する生物発光測定装置において、
実質的に透明な底部を有する反応容器と、
前記反応容器の上方に位置し、試料及び試薬を保持する送液部と、
前記反応容器の下面に近接して配列された光検出素子を有する光検出部とを有し、
前記送液部は、サンプル溶液を保持する第１の空間と、細胞外ＡＴＰ消去試薬を保持する第２の空間と、細胞内ＡＴＰ抽出試薬を保持する第３の空間と、発光試薬を保持する第４の空間とを有する容器と、当該容器の上部に配置されたニードルとを備え、前記ニードルを下方に移動させることにより、前記第１の空間に保持された試料に前記第２の空間に保持された細胞外ＡＴＰ消去試薬、前記第３の空間に保持された細胞内ＡＴＰ抽出試薬、前記第４の空間に保持された発光試薬を混合し、混合液を前記反応容器に吐出させることを特徴とする生物発光測定装置。
【請求項４】
細胞外ＡＴＰを消去させるＡＴＰ消去試薬と、
細胞内ＡＴＰを抽出させるＡＴＰ抽出試薬と、
ルシフェリンとルシフェラーゼを含む発光試薬とを含み、
前記ルシフェラーゼの濃度は１ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする細胞内ＡＴＰ測定キット。
【請求項５】
請求項４記載の細胞内ＡＴＰ測定キットにおいて、ニードルによって破ることのできる仕切りによって各々区切られて一直線上に配列された第１から第４の空間を有し、前記第１の空間は試料を入れるための空室であり、前記第２の空間に前記ＡＴＰ消去試薬を保持し、前記第３の空間に前記ＡＴＰ抽出試薬を保持し、前記第４の空間に前記発光試薬を保持すること特徴とする細胞内ＡＴＰ測定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物細胞内のＡＴＰを生物発光法を用いて測定するための生物発光測定装置及び細胞内ＡＴＰ測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
大腸菌、酵母菌、乳酸菌及びその他の生細胞数の測定は、食品衛生、臨床検査、環境等の分野において非常に重要である。特に、食品業界では、食中毒を引き起こす病原性大腸菌Ｏ−１５７、サルモレラ菌、黄色ブドウ球菌等に対する微生物汚染検査が重要であり、ＨＡＣＣＰ（Ｈａｚａｒｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｏｉｎｔ）方式による衛生管理が定着しつつある。
【０００３】
従来の微生物の細胞数測定法には、成長培地中のコロニー計測法、顕微鏡によるセルカウンター法、濁度測定法等がある。培地中のコロニー計測法は、高感度に生細胞を測定でき、さらに選択培地を使用すれば微生物の同定も可能である。しかし、細胞培養に１日以上要する。また、顕微鏡によるセルカウンターは、コロニー培養が必要があり、さらに操作が煩雑で自動化が困難である。濁度測定法は、感度が低く、生細胞と死細胞の区別ができない問題がある。近年、これらの問題を克服し、高感度でかつ簡便に微生物細胞を測定する方法としてＡＴＰ法が注目を集めている。ＡＴＰ法は、生きた細胞には必ず存在するＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）をルシフェラーゼを用いた生物発光法で測定する手法である。
【０００４】
ＡＴＰ法の測定手順は、試料から先ず遊離ＡＴＰを遊離ＡＴＰ消去試薬を用いて分解する。次に微生物細胞内のＡＴＰをＡＴＰ抽出試薬を用いて抽出後、発光試薬を用いて細胞内ＡＴＰを発光反応させることにより、微生物細胞数を計測する。遊離ＡＴＰ消去試薬としては、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、アデノシントリホスファターゼ、ヘキソキナーゼ、アデノシン酸デアミナーゼ等の分解酵素が、単独あるいは複数組み合わせて使用できる。ＡＴＰ抽出試薬としては、界面活性剤、メタノール、エタノール等が一般的である。発光試薬としては、蛍の発光の元であるルシフェラーゼを含んだ試薬が一般的である。これらの試薬は、ＡＴＰ消去剤、及びＡＴＰ測定用試薬キットとして市販されている。例えば、キッコーマン製のＡＴＰ消去剤である「ルシフェールＡＴＰ消去剤ＴＭ」、ＡＴＰ抽出試薬及び発光試薬である「ルシフェールＨＳプラスＴＭ」等がある。その際の生物発光反応は、以下に示すように、ルシフェラーゼとマグネシウムイオン存在下で起こる。
【０００５】
【化１】
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【０００６】
本手法は、細胞に含まれるＡＴＰ量が微生物細胞の個数に比例することを利用するもので、高感度で測定時間が短いため、微生物検査には非常に有効である。
現在、ＡＴＰ法に用いられている一般的な装置（一般名称はルミノメータ）は、光電子倍増管を用いている。本装置を用いて多数のサンプルを同時に測定する場合には、ＸＹＺ駆動式に時分割にスキャンを行なう必要がある。あるいは、ＣＣＤカメラを用いて同時計測を行なう。ＣＣＤカメラを用いる場合には、サンプルプレートとＣＣＤカメラ素子の大きさが違うため、高価なレンズを組み込んだ縮小光学系が必要である。また、測定試薬の添加は手動で行なうのが一般的である。試薬添加を自動で行なう機構も付属で装備されているが、１０μＬ以下の容量には適用できず、順次時系列に添加するようになっている。特に、手動で測定試薬を添加する場合には、反応時間の制御が難しいため、発光反応を行なう酵素反応の速度を制御し、すなわち、反応の時間を遅くして、発光強度が大きく減衰しないようにしている。通常は、発光反応に関与する酵素濃度（あるいいは活性）を低くしてある。
【非特許文献１】
Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３０５  Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐａｒｔ  Ｃ  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｒｉａｍ  Ｍ．Ｚｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓａ  Ｏ．Ｂａｌｄｗｉｎ，  ｐｐ．３５６−３６３
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
微生物検査における測定対象は、食品や飲料水等の固体・液体に存在する微生物、加工環境に存在する微生物（例えば、使用器具・容器やヒトの手指等）、空気中のちり等に存在する微生物と多様である。また、ビール・清涼飲料水・コーヒー等のように含まれる菌数の少ないものもある。すなわち、微生物検査する対象の形状や菌数に大きな違いがある。
【０００８】
例えば、食品や飲料水等の固体・液体に存在する微生物の測定は、測定対象の食品や飲料水の一部をそのまま、あるいは測定溶液に溶解して上記装置で測定できる。しかし、測定対象が使用器具・容器やヒトの手指等の場合には、滅菌した綿棒等で測定対象の表面をふき取り、ふき取った付着微生物を一定量の滅菌水あるいは生理食塩水に溶出させて上記測定装置で測定する。また、空中浮遊微生物の測定は、一定量の空気を適当なフィルターで吸引ろ過してフィルター表面に空中浮遊微生物を捕獲後、フィルター上に直接試薬を添加してＣＣＤカメラあるいは顕微鏡下で発光を測定するか、フィルターに捕獲された微生物を滅菌水あるいは生理食塩水に溶出させて測定する。その際、捕獲空中浮遊微生物が少ない場合には、寒天培地等で培養後、測定しなければならない。菌数の少ないビール・清涼飲料水・コーヒー等の場合も同様に寒天培地等で培養後、測定しなければならない。
【０００９】
上記の操作は、手動で行なわれていたため、試薬添加を含む測定の自動化が望まれていた。特に、空中浮遊微生物の測定は、操作が煩雑なため、自動化が望まれていた。しかし、装置の自動化には、複数のサンプルへの試薬添加や複数の試薬添加のためにＸＹＺ駆動式のディスペンサが必要となり、装置が大型になる問題があった。また、現状の装置では感度が低いため、菌数の少ない測定対象は培養等の操作が必要で自動化が困難であった。培養等の操作を無くすためには、装置を高感度化する必要があるが、ＣＣＤカメラや顕微鏡システムを使用するため装置が大型になる問題があった。さらに、測定場所も食品工場内、レストラン等の調理場、野外等と広範囲にわたり、大型な装置は持ち運びが不便であったり、装置設置のための新たな電源工事や信号線配線工事を必要とする問題があった。
【００１０】
本発明の目的は、多様な測定対象を広範囲な場所で、自動かつ高感度に測定できる小型で簡便な微生物測定用の生物発光測定装置及び細胞内ＡＴＰ測定キットを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明による微生物測定用発光検出装置は、培養等の操作を必要とせずに検出できる感度を有し、試薬添加を自動的に行なう必要がある。測定感度を向上させるためには、酵素濃度（あるいは酵素活性）を上げて反応速度を早くした測定試薬を用い、試薬添加後の測定時間と発光強度を正確に測定する。その際に使用する発光試薬中の酵素の発光反応の半減期が１分以内の酵素濃度で、測定試薬添加後直ちに測定を開始することが望ましい。
【００１２】
酵素濃度（あるいは酵素活性）を上げて反応速度を速くした測定試薬を用いて多数のサンプルを測定する場合には、発光反応を行なう酵素反応を正確に制御するために、順次時系列的な試薬添加及び測定法は使用できず、一括同時試薬添加を行ない、一括同時反応・検出する必要がある。一括同時反応・検出を実現する装置は、１次元的又は２次元的に配列された透明な底部を有する複数の反応セルを備える反応槽と、反応槽の上方に位置し、下面に複数の反応セルと一対一に対応付けられる複数本のキャピラリーを備える送液部と、送液部を反応槽に対して上下方向に駆動する駆動部と、反応セルと一対一に対応して反応槽の下面に近接して配列された複数の光検出素子を有する光検出部とを含み、反応槽の各反応セル内で発生する発光を光検出部の複数の光検出素子によって個別に検出する構成とするのが好ましい。
【００１３】
反応槽の複数の反応セルと反応セルから生じる生物発光等の発光を検出する検出素子を一対一で垂直方向で対応するように密着して配置する構造を採用することにより、複雑な光学系を使用せずに高集光効率で発光を検出できるため、簡便に高感度化が達成できる。また、反応セルへの試薬注入を反応槽の上部垂直方向から行い、反応セルからの生物発光等の発光検出を反応槽の下部垂直方向から行うことにより、装置の小型化及び大きな受光立体角を確保し、小型で高感度な装置を実現できる。更に、複数の反応セルと試薬注入を行う送液部を一対一で垂直方向で対応するように配置することで、複雑な駆動部を用いない簡単な装置構成で一括同時反応・検出を実現できる。その際、反応槽と検出部が密着することにより静電誘導によるノイズ（微小擬似電流）が問題となるが、反応槽と光検出部との間に光透過性の導電膜を配置することによりノイズを除去することができる。送液部は、試薬を入れる試薬容器と、試薬容器と複数本のキャピラリーとを連通する流路と、試薬容器内を加圧する加圧手段とを備え、キャピラリーを流量制御用部材とし、加圧手段によって試薬容器内を所定時間加圧する定圧加圧送液法によって複数本のキャピラリーの先端から複数の反応セルに試薬を均等に送液するのが好ましい。定圧加圧方式は、３気圧以上の高圧ボンベ、またはコンプレッサ等の圧力源からの圧縮空気（１−２気圧程度）を使用して、電磁弁等の圧力切り替え装置により数秒程度の圧力を加えることにより行なうことができる。通常の測定では、遊離ＡＴＰ消去試薬、ＡＴＰ抽出試薬、及び酵素を用いて細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光試薬の３種類の測定試薬が必要であるため、反応セル上に配置した各々の試薬に対応した送液部が一定時間毎に反応セル上に回転移動し自動的に順次試薬添加し、発光反応させることにより自動化ができる。
【００１４】
また、内部にサンプル溶液用容器、細胞外ＡＴＰ消去試薬用容器、細胞内ＡＴＰ抽出試薬用容器、及び発光試薬用容器とを含む試薬トレイを用いて、順次下方に溶液を移動させて反応させることにより、簡単な装置構成で自動化ができる。上記試薬トレイは各容器間の仕切りで仕切られている。この仕切りは、例えば疎水性の膜等を用いてもよい。細胞外ＡＴＰ消去試薬用容器、細胞内ＡＴＰ抽出試薬用容器、発光試薬用容器には予め試薬を充填してあり、これらの試薬は上記の疎水性の膜等で仕切られている。各容器間の仕切りは、治具で簡単に破れる構造になっている。この治具は、例えばガラスや金属等を材料に含むニードル等であり、数グラムの力をかけることによって、各容器間の仕切りを破るものである。試薬トレイがこのような構造をとることにより、サンプル溶液と各種試薬を任意の時に瞬時に、また自動的に混合することが可能となる。尚、本装置で測定に使用するサンプル（例えば、食品や飲料水等の固体・液体やふき取った付着微生物）は、固体、液体、気体のいずれであっても、測定溶液に溶解した状態であれば測定対象となる。
【００１５】
空中浮遊微生物の測定は、反応セルに開閉式の蓋を設け、サンプリング時に一定時間蓋を開いて微生物サンプリングを行なう。サンプリング終了後、反応セルに試薬を添加する際も同様に蓋を開閉し行なう。複数の反応セルを有する装置の場合には、反応槽に設けられた複数の反応セルと同じ位置関係を有する複数の開口を備え反応槽の上面に配置される蓋を用意し、その蓋を、蓋の複数の開口と反応槽の複数の反応セルとが合致する位置と合致しない位置との間に駆動する駆動手段とを備えるのが好ましい。
【００１６】
光センサとしてホトダイオードを使用することにより、電池駆動可能になり、小型な装置とすることができる。さらに、無線通信としてブルーツース等を使用することにより、通信線等の配線が不要なワイヤレスで、かつ小型な微生物測定用の発光検出装置を実現できる。
【００１７】
本発明による細胞内ＡＴＰを生物発光反応で測定する生物発光測定装置は、実質的に透明な底部を有し試料が入れられる反応容器と、反応容器の上方に位置し、細胞外ＡＴＰを消去するための試薬、細胞内ＡＴＰを抽出するための試薬、発光反応のための試薬を収めた下方にキャピラリーを有する試薬容器を保持し、試薬容器を反応容器に対して上下方向に駆動する駆動部と、反応容器の下面に近接して配列された光検出素子を有する光検出部とを含み、反応容器内で生じた発光を検出することを特徴とする。
【００１８】
また、光検出器の出力をデジタル値に変換するＡ／Ｄコンバータと、Ａ／Ｄコンバータの出力したデジタル値を記憶するメモリと、無線通信部と、メモリ及び無線通信部を制御する制御部を備え、メモリの内容を無線通信装置を介して送信する機能を備えることもできる。
【００１９】
細胞を含む試料の細胞内ＡＴＰを生物発光反応で測定する本発明の生物発光測定装置は、実質的に透明な底部を有する反応容器と、反応容器の上方に位置し、試料及び試薬を保持する送液部と、反応容器の下面に近接して配列された光検出素子を有する光検出部とを有し、送液部は、サンプル溶液を保持する第１の空間と、細胞外ＡＴＰ消去試薬を保持する第２の空間と、細胞内ＡＴＰ抽出試薬を保持する第３の空間と、発光試薬を保持する第４の空間とを有する容器と、当該容器の上部に配置されたニードルとを備え、ニードルを下方に移動させることにより、第１の空間に保持された試料に第２の空間に保持された細胞外ＡＴＰ消去試薬、第３の空間に保持された細胞内ＡＴＰ抽出試薬、第４の空間に保持された発光試薬を混合し、混合液を反応容器に吐出させる。
【００２０】
本発明による細胞内ＡＴＰ測定キットは、細胞外ＡＴＰを消去させるＡＴＰ消去試薬と、細胞内ＡＴＰを抽出させるＡＴＰ抽出試薬と、ルシフェリンとルシフェラーゼを含む発光試薬とを含み、ルシフェラーゼの濃度は１ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ以下であることを特徴とする。ルシフェラーゼの濃度を１ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ以下である試薬を含むキットを用いることにより、半減期１分以内とし、添加後に多数検体をほぼ同時に計測することができ、測定の再現性を高めることができる。この細胞内ＡＴＰ測定キットは、ニードルによって破ることのできる仕切りによって各々区切られて一直線上に配列された第１から第４の空間を有し、第１の空間は試料を入れるための空室であり、第２の空間にＡＴＰ消去試薬を保持し、第３の空間にＡＴＰ抽出試薬を保持し、第４の空間に発光試薬を保持するのが好ましい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明による発光検出装置の一例の全体構成を示す説明図であり、図１（ａ）は測定時の断面図、図１（ｂ）は装置の扉を開いた時の断面図である。この発光検出装置は、反応槽１、反応槽１の上方に配置され、反応槽１に試薬を添加する試薬槽を具備したディスペンサ２、反応槽１の下方に密着して配置された光検出部３から構成されている。ディスペンサ２中の発光試薬の送液は、定圧加圧管４を介してディスペンサ２内を一定圧力に加圧して送液を行う定圧加圧送液法により行う。その際の加圧時間の制御は電磁弁５で行なっている。
【００２２】
操作手順を以下に示す。まず最初、密閉扉６を開き、試薬添加部７を上にあげて、反応槽１をセットする。測定を開始するとディスペンサ２を固定したＺステージ８が下方に移動し、ディスペンサ２の先端が反応槽１に浸漬し、反応槽１に一定量の試薬を添加する。反応槽１内の試料は、ディスペンサ２から添加される反応試薬との間で発光反応を起こす。反応槽１内から発生した発光は、反応槽１の下方に密着して配置された光検出部３内の光センサ９によって検出される。図１に示した装置は、複数の反応槽及びディスペンサを有することにより複数の試料を同時に測定できる構成になっている。試料は、反応槽に注入する前に、予め遊離ＡＴＰを遊離ＡＴＰ消去試薬を用いて分解する処理、微生物細胞内のＡＴＰをＡＴＰ抽出試薬を用いて抽出する処理を施してある。あるいは、装置内に遊離ＡＴＰ消去試薬の入った試薬槽及びＡＴＰ抽出試薬の入った試薬槽を装填し、それらの試薬槽の試薬もディスペンサによって反応槽に順次添加できるように構成し、前処理も装置内で行うように構成することもできる。
【００２３】
図２は、試薬槽を具備したディスペンサ１１、反応槽１２、及び光検出部１３の関係を示す詳細図である。ディスペンサ１１は、反応試薬が入った試薬槽１４と流量制御用のキャピラリー１５から構成されている。ディスペンサ１１は、Ｏリング１６を用いて固定治具１７で加圧送液管１８に固定され、取り外し可能でディスポーザブルになっている。キャピラリー１５には、内径２５μｍ×外径３６０μｍ×長さ２０ｍｍのフューズドシリカキャピラリーを使用している。反応槽１２は内径２ｍｍ、深さ３ｍｍで、使用する反応溶液の体積が約４μＬであるので、石英ガラス板１９から試料溶液２０の液面までの長さは約１．５ｍｍである。本発明で使用した光検出素子２１（浜松ホトニクス製Ｓ１１３３−０１）の受光面は２．４×２．６ｍｍである。本実施の形態の条件下では、反応溶液の底面から受光面までの距離は１．４ｍｍであり、約７％の受光効率である（この値は実験値から計算した値とほぼ同じであった）。本装置構成によると、レンズ等を使用した複雑な光学系を必要とすることなく、密着方式という簡便な方式で受光立体角を大きくし（高集光効率）、部品数低減と光軸調整不要な簡単な構造を実現できることが分かる。
【００２４】
図３は、本発明による発光検出装置の他の一例のディスペンサ３１、反応槽３２、及び光センサアレイ３３の関係を示す詳細図である。ディスペンサ３１は、厚さ１０ｍｍ×縦８０ｍｍ×横１２０ｍｍのアクリル板の厚さ方向中央に、縦方向１２本、横方向１本の直径０．８ｍｍの流路３４を加工し、アクリル板に垂直に流量制御用のキャピラリー３５を９６本垂直に差し込んで接着して作製している。流路３４は、アクリル板に、一方の端部から他方の端部に貫通する貫通穴を加工し、その後、両端部の開口をプラグで塞いで形成した。横方向１本の流路は、両端をネジ３７，３８で塞ぐ構造とし、空気抜きの機能を持たせた。キャピラリー３５は、流路３４に連通するように形成されたアクリル板底面の穴に先端を挿入し、接着剤でアクリル板に固定した。キャピラリー３５には、内径２５μｍ×外径３６０μｍ×長さ２０ｍｍのフューズドシリカキャピラリーを使用した。ディスペンサ３１は上部に試薬槽３６を備え、試薬槽３６の１ヶ所から供給する反応試薬を定圧加圧送液法によって９６本のキャピラリー３５の先端から均等に吐出することができる。
【００２５】
本発明で使用した反応槽３２は、微少量（１〜１０μＬ）用に９ｍｍピッチで８×１２列に直径２ｍｍの反応セル用穴３９を９６ヶ所に設けた黒色石英ガラス板と、鏡面に仕上げた透明な石英ガラス板４０を熱融着により張り合わせて作製したものである。石英ガラス板４０の下面にはＩＴＯ又はＳｎＯ２からなる透明導電膜を蒸着してある。透明導電膜は接地される。
【００２６】
光センサアレイ３３は、反応槽３２を用いて９６サンプルを同時測定できるように、光検出素子（浜松ホトニクス製フォトダイオードＳ１１３３−０１）４１を９ｍｍピッチで８×１２列に配置したものである。本発明では、レンズ等を使用した複雑な光学系を使用せず、簡便な方式で集光効率を高めるために、光検出素子４１を反応槽３２に可能な限り近づけて受光角を大きくする密着型とし、部品数低減と光軸調整不要な簡単な構造で高集光効率を達成した。光センサアレイ３３は、反応槽３２の下面に密着して配置される。各光検出素子４１の出力は、電流電圧変換増幅アンプ（ＢＵＲＲ  ＢＲＯＷＮ製ＯＰＡ１２９ＵＢ）及び１０ＧΩの抵抗を用いて、１×１０１０に増幅し、２段目のオペアンプ（ＡＮＡＬＯＧ  ＤＥＶＩＣＥＳ製ＯＰ０７）を用いてトータルゲイン４．５×１０１１に増幅した。
【００２７】
反応セル用穴３９は内径２ｍｍ、深さ３ｍｍで、使用する反応溶液の体積が約４μＬであるので、石英ガラス板４０から反応溶液の液面まで長さは約１．５ｍｍである。本発明で使用した光検出素子４１（浜松ホトニクス製Ｓ１１３３−０１）の受光面は２．４×２．６ｍｍである。本実施の形態の条件下では、反応溶液の底面から受光面までの距離は１．４ｍｍであり、約７％の受光効率である（この値は実験値から計算した値とほぼ同じであった）。本装置構成によると、レンズ等を使用した複雑な光学系を必要とすることなく、密着方式という簡便な方式で受光立体角を大きくし（高集光効率）、部品数低減と光軸調整不要な簡単な構造を実現できることが分かる。
【００２８】
図３には、専用の反応槽３２を用いた装置例を示したが、反応槽として、市販されている通常のマイクロタイタープレートを用いてもよい。その場合には、クロストーク防止用の仕切りを兼ねたセルホルダを使用するとよい。
【００２９】
図４は、反応槽として市販のマイクロタイタープレートを用いた場合の反応槽の部分の分解組立図である。なお、図４には、マイクロタイタープレートの各反応セル（ウェル）に試薬を供給するディスペンサ５１も合わせて図示した。また、図５は、マイクロタイタープレート５２、セルホルダ５３、導電性光透過板５４を組み合わせた状態の断面図である。
【００３０】
クロストーク防止用の仕切りを兼ねたセルホルダ５３は、遮光性の材料からなる板状部材であり、マイクロタイタープレート５２の各反応セル５５に対応する位置に穴５６が設けられている。セルホルダ５３は、セルホルダの各穴５６に反応セル５５の下方突出部が入るようにして、マイクロタイタープレート５２に下方から押し込まれる。導電性光透過板５４は、一方の面にＩＴＯ又はＳｎＯ２からなる透明導電膜を蒸着したガラス板であり、セルホルダ５３の下面に接触配置される。導電性光透過板５４の下には、図３に図示した光センサアレイが設置される。光センサアレイ中のそれぞれの光検出素子には、その直上に位置する反応セルから発生する発光のみが入射し、他の反応セルから発生する発光は遮光性のセルホルダ５３によって遮断されるため入射しない。
【００３１】
次に、本発明による空中浮遊微生物を測定する発光検出装置の一例について説明する。空中浮遊微生物の測定は、通常食品工場のクリーンルームで行なわれる。近年、食品工場にもクリーンルームが導入されているが、性能の維持管理を自動的に行なわなければならない。そのため、サンプリングから測定までの操作を自動で行うことが必要である。空中浮遊微生物のサンプリングは、空中浮遊微生物捕獲槽を兼ねた反応槽の蓋を一定時間を開いて、空中浮遊微生物のサンプリングを行なった後、計測を自動的に行なうようになっている。待機状態（図６ａ）では、空中浮遊微生物捕獲槽を兼ねた反応槽６１の蓋６２は閉じている。反応槽６１内には、ＡＴＰ抽出試薬６３が予め入っている。計測開始後、自動的に蓋６２が開き、空中浮遊微生物６４，６５のサンプリングを行なう（図６ｂ）。一定時間経過後、自動的にディスペンサ６６が発光試薬を反応槽６１内に添加し、発光反応が開始する。反応槽６１内の試料は、ディスペンサ６６から添加される反応試薬との間で発光反応を起こす（図６ｃ）。反応槽６１内から発生した発光は、反応槽６１の下方に密着して配置された光検出部６７内の光センサ６８によって検出される。
【００３２】
本発明による空中浮遊微生物を測定する発光検出装置の他の例について説明する。本発明では、反応槽あるいは反応槽として用いるマイクロタイタープレートの上に、各反応セルの開口部を開閉できる蓋を設ける。
【００３３】
図７は、マイクロタイタープレートの上に開閉式の蓋を設けた例を示す概略図であり、図７（ａ）は概略平面図、図７（ｂ）はその概略側断面図である。なお、セルホルダは図示を省略してある。本例の開閉式蓋は、マイクロタイタープレート７１の上部及び側部を覆う固定蓋７２と、その上を往復移動可能な移動蓋７３から構成される。固定蓋７２は、マイクロタイタープレート７１の各反応セルに対応する位置に反応試薬添加用の穴７４（８×１２＝９６個）を有する。移動蓋７３は、固定蓋７２の穴７４と同じ配置に反応セルの数だけ穴７５を有し、アクチュエータ７６によって矢印方向に往復移動可能になっている。図は、移動蓋７３の穴７５と固定蓋７２の穴７４とが一致しないように移動蓋７３が位置づけられ、各反応セル７７が密閉されている状態を示している。空中浮遊微生物のサンプリングを行なう時は、アクチュエータ７６によって移動蓋７３を、移動蓋７３の穴７５が固定蓋７２の穴７４と一致するように移動する。一定時間サンプリング後、穴７４と７５が重なってできた開口部にディスペンサのキャピラリーを挿入して試薬を注入し発光反応を行う。このように反応セルの密閉を行なうことにより、空中浮遊微生物のサンプリングを行なうことができる。
【００３４】
図８は、図３に示した装置に開閉蓋を設けた例を示す図である。図８（ａ）は待機状態を示しており、図８（ｂ）は空中浮遊微生物のサンプリング及び計測状態を示している。
【００３５】
反応槽８１は、上部に移動式の開閉式蓋８２を有する。開閉式蓋８２には、反応槽８１内の反応セル８３と同じ９ｍｍピッチで同程度の窓用穴８４（直径：約２ｍｍ）が形成されている。開閉式蓋８２はアクチュエータ８５によって図の左右方向に移動可能になっている。反応試薬注入前の状態では、図８（ａ）に示すように、ディスペンサ８６に取り付けられた流量制御用キャピラリー８７は、反応槽８１の上部に位置しており、反応セル８３の中心と開閉式蓋８２の窓用穴８４の中心はずれている。すなわち、開閉式蓋８２は閉じた状態にあり、反応槽８１内の反応セル８３は、開閉式蓋８２により密閉された状態になる。従って、待機時には反応セル８３内の溶液の蒸発は防止される。
【００３６】
空中浮遊微生物のサンプリング時には、図８（ｂ）に示すように、開閉式蓋８２がアクチュエータ８５によって約３ｍｍ横方向にずらされ、反応セル８３の中心と窓用穴８４の中心が一致することにより、反応セル８３の上部が開放される。一定時間後、ディスペンサ８６が下降し、流量制御用キャピラリー８７の先端が反応セル８３中に浸漬し、試薬槽８８から反応試薬が注入される。反応セル８３内から発生した発光は、反応槽８２の下方に密着して配置された光検出部８９によって検出される。反応終了後、ディスペンサ８６は上昇し、開閉式蓋８２が約３ｍｍ横方向にずれて密閉状態となる。
【００３７】
図９は、ＡＴＰ法で使用するルシフェラーゼ濃度（あるいは酵素活性）の発光反応速度依存性を示す図である。酵素であるルシフェラーゼの濃度を増加させると発光強度も大きくなるが、発光強度の変化も大きくなる。従来法では、手動で試薬を混合して反応を行なっていたため、発光強度の変化が少ない、低濃度の酵素濃度で測定を行っていた。すなわち、測定精度を維持するために感度を下げて測定していた。本発明では試薬添加後、直ちに測定を行なうことができ、従来より１０倍以上の高濃度の酵素を使用することが可能である。すなわち、数１０ａｍｏｌレベルの検出感度が達成できる。数１０ａｍｏｌレベルの検出感度は、従来の装置では不可能であった数１０個程度の微生物を測定可能な値である。
【００３８】
図１０に、実際に酵素濃度を変化させて測定を行なった例を示す。ルシフェラーゼ酵素濃度を従来の１０倍以上増加させても、リアルタイムで測定を行うことができ、正確に測定できる。本発明では、試薬添加を自動化し、かつ多数試料を同時計測することにより、従来では困難であった１分以内に終わる反応を正確に測定でき、高感度計測が可能である。図１０に示されるとおり、本測定ではルシフェラーゼ酵素濃度は０．５μｇ／μＬ以上、好ましくは１．０μｇ／μＬ以上とする。この酵素濃度での反応の半減期は約１分で、数１０ａｍｏｌレベルの検出感度を達成することができ、従来の方法では測定困難であった数１０個程度の微生物の測定が可能である。しかし、サンプルと試薬の混合に要する時間は３〜５秒程度であるため、あまり反応が早すぎると混合状態（例えば、攪拌の方法）の影響を受け、発光強度の再現性が悪くなる。そのため、濃度の上限は２０μｇ／μＬ程度である。このような濃度設定とすることにより発光反応を、試薬添加後直ちに測定可能とし、かつ半減期を一分以内とすることが出来る。測定の一例としてＡＴＰの検量線を図１１に示す。本測定では、測定の再現性を表す相関係数は０．９９９以上で良好であった。その際の検出限界は、８０ａｍｏｌ（Ｓ／Ｎ＝５）であった。
【００３９】
本発明で採用した空気加圧送液法を図２を参照して以下に説明する。
空気加圧送液法は定圧状態で流路系内に粘性流を発生させ、送液する方法である。そのため、使用する微小細管以外の部分の圧損が無視できるように微小細管の内径及び長さを設定すれば、加える圧力及び時間を制御することにより容易にサブμＬ以下の溶液を送液できる。本発明では、微小細管としてディスペンサ１１に取り付けた流量制御用キャピラリー１５を用いている。試薬槽を兼ねたディスペンサ１１中の反応試薬１４の送液（添加）は、定圧加圧管１８（図２参照）を介してディスペンサ１１内を一定圧力に加圧して送液を行う定圧加圧送液法により行う。その際の送液量は、次のＨａｇｅｎ−Ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの式に従う。
【００４０】
【数１】
2004313028.tif 000004
【００４１】
ここで、ΔＰ：加えた圧力、ｒ：微小細管の内径、ｔ：圧力を加えた時間、μ
：溶液の粘性、Ｌ：微小細管の長さである。
【００４２】
本発明の一例として、注入量が０．１μＬ以下の場合の実施例を以下に示す。本実施の形態では、大気圧程度（２気圧以下）の低圧力使用、加圧時間２秒以下、及び送液量０．１μＬ以下、の条件を満たすために、内径２５μｍ、長さ２０ｍｍの流量制御用キャピラリー１５を使用した。
【００４３】
本条件下での加圧圧力と加圧時間との関係を図１２に示す。圧力範囲０．５〜２．０×１０５Ｐａで使用すれば、０．１μＬ以下の微小量の送液が定圧加圧時間２秒以下で行うことができる。注入量は１．０μＬ以上の個別再現性は、注入量を重さで計量可能であるが、注入量が０．１μＬ以下である場合には計量できない。そこで、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系の生物発光系（信号ピーク形状を整えるためにＡＴＰ分解酵素であるアピラーゼを加えてある）を応用して同時再現性を測定した。連続測定回数は２０回である。測定は反応液に一定時間間隔（１分間隔）で試薬を注入し、発光強度の再現性を求めた。反応液の体積は４．０μＬで、試薬注入量は（ａ）０．０１μＬ、（ｂ）０．０２μＬ、（ｃ）０．０５μＬ、である。その結果を表１に示す。微少量（０．０１−０．０５μＬ）の注入量再現性は３〜５％と良好であった。
【００４４】
【表１】
2004313028.tif 000005
【００４５】
本発明では反応槽と検出素子が密着し、高倍率のアンプを使用しているため、ディスペンサ１１の上下駆動の際に静電誘導によるノイズ（微小擬似電流）を生じる問題がある。このノイズを除去するために、反応槽１２の下部に取り付けてある石英ガラス板１９の下面にＩＴＯ又はＳｎＯ２からなる透明導電膜をコーティングしてある。透明導電膜は接地してある。本発明で使用した光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板の性能は、波長４５０〜６００ｎｍにおいて透過率９０％以上、面積抵抗１０００〜１５００Ωである。
【００４６】
図１３は、光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板のノイズ除去効果を示す図である。通常の石英ガラス板を使用した場合には、図１３（ａ）に示すようにディスペンサ１１の上下駆動に伴い大きな擬似信号９１，９２が発生するが、光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板を使用した場合には、図１３（ｂ）に示すように擬似信号は全く無かった。
図１４及び１５は、本発明による発光検出装置の他の例を示す模式図である。
【００４７】
これまで説明した装置例は、予め細胞外ＡＴＰ消去等の前処理を行ない、最後に発光試薬を添加する例であった。ここに説明する装置例は、遊離ＡＴＰ消去試薬、ＡＴＰ抽出試薬、及び酵素を用いて細胞内のＡＴＰを発光反応させる発光試薬の３種類の測定試薬を個別に順次添加して反応を行なうものである。ここで説明する測定対象は、液体試料及び容器・器具等である。測定する試料が清涼飲料水やコーヒー等の液体の場合には、一部を分注して使用する。また、食品工場内の容器や器具、厨房のまな板等の場合には、通常ふき取り検査を行なう。ふき取り検査は検査個所を綿棒で用いてふき取った後、測定溶液で溶解して使用する。ふき取り用の綿棒と試薬が一体となった製品も市販させている（例えば、キッコーマン製、「ルシパックＴＭ」）。
【００４８】
図１４は、試薬槽として、細胞外ＡＴＰ消去試薬槽１０１、細胞内ＡＴＰ抽出試薬槽１０２、発光試薬槽１０３の３つから構成され、その下に試料槽１０４が設置してある。試料槽１０４に予め試料溶液１０５をセットし測定を開始すると、細胞外ＡＴＰ消去試薬槽１０１、細胞内ＡＴＰ抽出試薬槽１０２、発光試薬槽１０３が一定時間毎に下降し、先端のキャピラリー１０６が試料槽１０４内の試料溶液１０５に浸漬し、試薬が添加させる。発光試薬添加後、試料槽１０４内の試料溶液１０５から発生した発光は、試料槽１０４の下方に密着して配置された光検出部１０７内の光センサ１０８によって検出される。遊離ＡＴＰ消去試薬、及びＡＴＰ抽出試薬の添加のタイミングは、測定対象に大きく依存する。例えば、遊離ＡＴＰ消去試薬の反応時間は測定対象の汚れ具合に、ＡＴＰ抽出試薬との反応時間は測定対象の微生物に依存する。通常の測定では、遊離ＡＴＰ消去試薬の反応時間は５分程度、ＡＴＰ抽出試薬との反応時間は最大２０分程度である。また、発光試薬は添加・混合後直ちに測定を開始できる。すなわち、遊離ＡＴＰ消去試薬添加５分後にＡＴＰ抽出試薬を添加し、それから２０分後に発光試薬を添加し、直ちに測定を開始すれば良い。
【００４９】
また、図１５（ａ）は、サンプル溶液用容器１１１、細胞外ＡＴＰ消去試薬用容器１１２、細胞内ＡＴＰ抽出試薬用容器１１３、発光試薬用容器１１４の４つの容器、及び容器上部に配置したニードル１１５から構成される試薬トレイ１１６を示している。ニードル１１５は蓋を兼ねた治具１１７に取り付けられている。測定時には蓋を兼ねた治具１１７を試薬トレイ１１６から取り外し、サンプル溶液を試薬トレイ１１６に分注する。試薬トレイ１１６の底部を装置内の反応セル１１８に、上部をＺステージ１１９にセットする。図１５（ｂ）に示すように、試薬トレイ１１６の底部の構造はセル１１８に簡単にはめ込めるようになっている。
【００５０】
試薬溶液の移動方法としては、各試薬トレイは疎水性の膜等で各容器間を仕切られており、上部に配置したニードル１１５がＺステージ１１９により下方に移動して、各々の容器の底、すなわち上記の疎水性の膜等に穴を開けて行なう。この穴を通じて、各種試薬等は下方に向けて移動し、混合される。全ての試薬が混合した溶液は、反応槽１１８に移動して発光反応が開始する。反応槽１１８から発生した発光は、反応槽１１８の下方に密着して配置された光検出部１２０内の光センサ１４０によって検出される。図１５（ａ）（ｂ）に示す本発明例では、定圧加圧送液法を用いたディスペンサが不要で、より簡便な装置構成になる。この試薬トレイは、装置に簡単に取り付け可能で、通常の反応容器のように取り扱える。また、各種試薬が疎水性の膜等で仕切られて各容器に各々充填された状態のキットを使用しても良い。
【００５１】
以下、測定場所が狭く電源や通信線の設置が困難な場所（例えば、食品工場の小さな生産ライン、冷凍保管庫、厨房、野外保管庫、河川等）で本発明の装置を使用する方法を説明する。
【００５２】
測定場所が狭く、設置場所が限られていると大型の装置を設置することが困難である。さらに、追加の装置を設置するとなると電源工事が必要な場合も生じてくる。本装置は、内蔵の電源で動作できるように、光センサとして低消費電力のホトダイオードを使用している。さらに、低消費電力の無線装置を内蔵することにより、電源線と信号線の不要なワイヤレスで計測できる装置になっている。
【００５３】
図１６は、ワイヤレス通信機能を有する本発明の他の例を示す機能ブロック図である。本装置は、光検出装置１２１とワイヤレス制御装置１２２から構成される。光検出装置１２１は、複数の光センサ１２３を有する光検出部１２４、複数の光センサ１２３の出力を順次サンプリングするＳ／Ｈ回路１２５、光センサ１２３で検出したアナログ値をデジタル値に変換するＡ／Ｄコンバータ１２６、Ａ／Ｄコンバータ１２６で変換された値を記憶するメモリ１２７、あるいは表示する表示部１２８、試薬の添加を自動的に行なうディスペンサ制御部１２９、ワイヤレス制御装置１２２との通信を行なう無線装置１３０、電源１３１、及びＣＰＵ１３２から構成されている。ＣＰＵ１３２は、とワイヤレス制御装置１２２からの命令を受け取り、自動的に計測を行なう。計測終了後、計測データは表示部に表示し、無線装置１３０を介してワイヤレス制御装置１２２に転送する。尚、ワイヤレス制御装置１２２に対して複数の光検出装置を制御することも可能である。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によると、小型で簡便な微生物測定用の生物発光測定装置及び細胞内ＡＴＰ測定キットが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１（ａ）】本発明による発光検出装置の一例の全体構成を示す測定時の断面図。
【図１（ｂ）】装置の扉を開いた時の断面図。
【図２】試薬槽を具備したディスペンサ、反応槽、及び光検出部の関係を示す詳細図。
【図３】ディスペンサ、反応槽、及び光センサアレイの関係を示す詳細図。
【図４】反応槽として市販のマイクロタイタープレートを用いた場合の反応槽の部分の分解組立図。
【図５】マイクロタイタープレート、セルホルダ、導電性光透過板を組み合わせた状態の断面図。
【図６】空中浮遊微生物を測定する発光検出装置の概略図であり、（ａ）は待機状態を表す図、（ｂ）はサンプリング時の図、（ｃ）は測定時の図。
【図７】マイクロタイタープレートの上に開閉式の蓋を設けた例を示す概略図であり、（ａ）は概略平面図、（ｂ）はその概略側断面図。
【図８】図３に示した光検出装置に開閉蓋を設けた例を示す概略図であり、（ａ）は待機状態を表す図、（ｂ）は空中浮遊微生物のサンプリング及び計測状態を表す図。
【図９】ＡＴＰ法で使用するルシフェラーゼ濃度（あるいは酵素活性）の発光反応速度依存性を示す図。
【図１０】ルシフェラーゼ酵素濃度と発光強度時間変化の測定値を示す図。
【図１１】本装置を用いて測定したＡＴＰの検量線を示す図。
【図１２】本装置の一例の使用条件下の加圧圧力と加圧時間との関係を示す図。
【図１３】光透過性導電膜をコーティングした石英ガラス板のノイズ除去効果を示す図。
【図１４】本発明による３つの試薬を用いた発光検出装置の他の例を示す模式図。
【図１５（ａ）】本発明によるニードルを用いた一体型試薬トレイの例を示す模式図。
【図１５（ｂ）】本発明による一体型試薬トレイをセットした発光検出装置の他の例を示す模式図。
【図１６】ワイヤレス通信機能を有する本発明の他の例を示す機能ブロック図。
【符号の説明】
１，１２，３２，６１，８１…反応槽、２，１１，３１，５１，６６，８６…ディスペンサ、３，１３，６７，８９，１０７，１１８，１２４…光検出部、４…定圧加圧管、５…電磁弁、６…密閉扉、７…試薬添加部、８，１１９…Ｚステージ、９，６８，１０８，１２３…光センサ、１４，３６，８８…試薬槽、１５，３５，８７，１０６…キャピラリー、１６…Ｏリング、１７…固定治具、１８…加圧送液管、１９…石英ガラス板、２０，１０５…試料溶液、２１，４１…光検出素子、３３…光センサアレイ、３４…流路、３７，３８…ネジ、３９…反応セル用穴、４０…石英ガラス板、５２，７１…マイクロタイタープレート、５３…セルホルダ、５４…導電性光透過板、５５，８３…反応セル、５６…穴、６２…蓋、６３…試薬、６４，６５…空中浮遊微生物、７２…固定蓋、７３…移動蓋、７４…固定蓋の穴、７５…移動蓋の穴、７６，８５…アクチュエータ、８２…開閉式蓋、８４…窓用穴、９１，９２…擬似信号、１０１…細胞外ＡＴＰ消去試薬槽、１０２…細胞内ＡＴＰ抽出試薬槽、１０３…発光試薬槽、１０４…試料槽、１１１…サンプル溶液用容器、１１２…細胞外ＡＴＰ消去試薬用容器、１１３…細胞内ＡＴＰ抽出試薬用容器、１１４…発光試薬用容器、１１５…ニードル、１１６…試薬トレイ、１１７…治具、１２１…光検出装置、１２２…ワイヤレス制御装置、１２５…Ｓ／Ｈ回路、１２６…Ａ／Ｄコンバータ、１２７…メモリ、１２８…表示部、１２９…ディスペンサ制御部、１３０…無線装置、１３１…電源、１３２…ＣＰＵ
【図１（ａ）】
2004313028.tif 000006
【図１（ｂ）】
2004313028.tif 000007
【図２】
2004313028.tif 000008
【図３】
2004313028.tif 000009
【図４】
2004313028.tif 000010
【図５】
2004313028.tif 000011
【図６】
2004313028.tif 000012
【図７】
2004313028.tif 000013
【図８】
2004313028.tif 000014
【図９】
2004313028.tif 000015
【図１０】
2004313028.tif 000016
【図１１】
2004313028.tif 000017
【図１２】
2004313028.tif 000018
【図１３】
2004313028.tif 000019
【図１４】
2004313028.tif 000020
【図１５（ａ）】
2004313028.tif 000021
【図１５（ｂ）】
2004313028.tif 000022
【図１６】
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