(57)【要約】【課題】目的タンパク質を効率的且つ大量に製造するための枯草菌宿主ベクター系及びこれを用いた目的タンパク質の製造法を提供する。【解決手段】１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌、及び当該組換え枯草菌を培養し、当該培養物中から目的タンパク質を分離するタンパク質の製造法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌。
【請求項２】
バチルス属細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０４８２）又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０６７）である請求項１記載の組換え枯草菌。
【請求項３】
プロテアーゼ遺伝子が、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ）である請求項１又は２記載の組換え枯草菌。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え枯草菌を培養し、当該培養物中から目的タンパク質を分離するタンパク質の製造法。
【請求項５】
目的タンパク質が、シスタチン類又はヒト成長ホルモンである請求項４記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換え枯草菌及びこれを用いた目的タンパク質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
今日まで、組換えＤＮＡ技術による異種タンパク質の生産には、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）をはじめとして、酵母や糸状菌、培養動植物細胞、バチルス属細菌等の宿主ベクター系が用いられてきた。このうち、枯草菌やＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ等のバチルス属細菌は、種々の酵素タンパク質を培地中に分泌し蓄積するという性質を有することから、大腸菌に次いで遺伝学的研究が行われ、形質転換効率の高い宿主ベクター系が開発されている。例えば、一部のＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ宿主はタンパク質分泌能力が高く、自身で菌体外にタンパク質分解酵素を生産しないことから、菌体外での異種タンパク質が分解されないといった利点を有し、これまでにヒト成長ホルモンの生産（例えば特許文献１参照）、インスリンの生産（例えば特許文献２参照）等をはじめとする種々の異種タンパク質の生産に用いられている。
【０００３】
また、枯草菌は、産業用酵素の供給源のみならず食品業界でも利用されている菌であり、安全性が極めて高いことに加え、菌体外へのタンパク質の分泌が可能であり、菌体内若しくはペリプラズムで異種タンパク質を生産させる大腸菌の系と比較して異種タンパク質の精製操作が大幅に簡略化できるという利点があり、ヒト成長ホルモンの生産に使用できることが報告されている（例えば非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓは工業用宿主としての使用歴を見てもまだ年数が浅く、宿主の安全性の確認を厳密に行う必要がある。また、タンパク質の種類によっては目的産物が検出されないもの、生産されても生物活性が低かったり活性がなかったりするものもあることが知られていた。
【０００５】
また、枯草菌についても、その宿主ベクター系は適当なプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域がない場合には、目的産物が細胞内に留まったままであったり、分解を受けやすい状態のまま膜に留まることが知られている。更に、枯草菌はタンパク質分解酵素を菌体外に生産することが知られており、分泌生産された異種タンパク質が膜の上や菌体外で分解されるといった問題があり、いまだ実用的な宿主ベクター系が確立されていない。
【０００６】
本発明は、目的タンパク質を効率的且つ大量に製造するための枯草菌宿主ベクター系及びこれを用いた目的タンパク質の製造法を提供することを目的とする。
【０００７】
【特許文献１】
特開平７−５１０７２号公報
【特許文献２】
特開２０００−３１６５７９号
【非特許文献１】
Ｍ，  Ｈｏｎｊｏ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ６：１９１（１９８７）
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、枯草菌の宿主ベクター系を用いたタンパク質の生産方法について種々検討したところ、宿主として１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した枯草菌を用い、バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を含む発現ベクターで形質転換させた組換え枯草菌を用いることにより、シスタチン類やヒト成長ホルモン等の目的タンパク質を効率よく大量に分泌生産できることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記組換え枯草菌を培養し、当該培養物中から目的タンパク質を分離するタンパク質の製造法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の組換え枯草菌は、１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と目的タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなるものである。以下、本発明の組換え枯草菌について説明する。
【００１２】
本発明に用いられる宿主菌株は、プロテアーゼ遺伝子が欠損又は破壊された枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はプロテアーゼの菌体外分泌が低下した枯草菌であれば特に制限されない。例えば枯草菌１６８株は全てのゲノム塩基配列が解析されている点で、本発明のプロテアーゼ欠損株として、特にアルカリプロテアーゼ遺伝子を欠損させた枯草菌株として好適に使用できる。
【００１３】
削除又は不活性化させるプロテアーゼ遺伝子としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の染色体上に存在するプロテアーゼ遺伝子のいずれでもよいが、その中でも菌体外プロテアーゼとして確認されているアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ）［Ｓｔａｈｌ，Ｍ．，Ｌ．，  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｅ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：４１１（１９８４）；Ｗｏｎｇ，  Ｓ．Ｌ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８１：１１８４（１９８４）］、中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＥ）［Ｙａｎｇ，Ｍ．，Ｙ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６０：１５（１９８４）］をはじめとしてｅｐｒ［Ｓｌｏｍａ，Ａ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５５５７（１９８８）；Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｒ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２１：４８６（１９９０）］、ｍｐｒ［Ｒｕｆｏ，Ｇ．Ａ．，  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：１０１９（１９９０）；  Ｓｌｏｍａ，Ａ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：１０２４（１９９０）］、ｂｐｆ［Ｓｌｏｍａ，Ａ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：１４７０（１９９０）；Ｗｕ，Ｘ．，Ｃ．，  ｅｔ．ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６５：６８４５（１９９０）］、ｎｐｒＢ［Ｔｒａｎ，Ｌ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３：６３６４（１９９１）］、ｖｐｒ［Ｓｌｏｍａ，Ａ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７３：６８８９（１９９１）］、ｗｐｒＡ［Ｍａｒｇｏｔ，Ｐ．，  ａｎｄ  Ｋａｒａｍａｔａ，Ｄ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４２：３４３７（１９９６）］のいずれかが好ましい。異種タンパク質、特にシスタチン類及びヒト成長ホルモンを生産する場合には、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ）を削除又は不活性化させるのが好ましい。
【００１４】
斯かるプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化することにより、当該プロテアーゼの機能を消失又は低下させたり、プロテアーゼの菌体外分泌を低下させることができ、分泌生産された異種タンパク質の細胞膜上や菌体外での分解が抑えられる。
尚、削除又は不活性化するプロテアーゼ遺伝子は１以上であればよいが、例えば１〜２、２〜３、３〜４、５〜８、２〜４、２〜６、２〜８のように複数でもよい。
【００１５】
このような、プロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化する方法は、公知の方法、例えば標的遺伝子を順次削除又は不活性化する方法や、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりプロテーゼ生産性の評価及び遺伝子解析を行うことによって遺伝子群を削除又は不活性化する方法等を用いることができる。
【００１６】
標的とする遺伝子を削除又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングした後、通常の遺伝子工学技術を用いて遺伝子の全領域又は一部領域を両側のＤＮＡ断片を残した形で削除する、塩基置換やフレームシフト等によって構造遺伝子中にナンセンス変異を与える、或いはクローニングやＰＣＲ等により単離した目的遺伝子断片中に他のＤＮＡ断片を挿入する等の改変を行った後、改変遺伝子を含むＤＮＡ断片を、親微生物に取り込ませて、親微生物ゲノムとの間で目的遺伝子の外側の両領域で相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。
【００１７】
本発明組換え枯草菌を形質転換するためのベクターは、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と、タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を含むものであればよい。プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１０４８２）由来のＤＮＡ断片（配列番号１、特開平６−２１７７８１号公報）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６０６７）由来のＤＮＡ断片（配列番号２、特開２０００−２１００８１号公報）及び、該配列番号１、該配列番号２で示されるＤＮＡ断片に１又は数個の塩基が欠失、置換もしくは付加したＤＮＡ断片が好適に挙げられ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ由来のＤＮＡ断片（配列番号２）が好ましい。
【００１８】
斯かるプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域のセルラーゼ遺伝子からの単離は公知の方法、例えば  Ｍａｎｉａｔｉｓら［Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．，  ｅｔ．ａｌ．，  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）］に記載の方法で行うことができる。また、公知のポリメラアーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法によって特異的に増幅することにより効率的に取得できる。［Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．，Ａ．，  ｅｔ．ａｌ．，  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）］
【００１９】
目的タンパク質をコードする遺伝子は、上記プロモーター領域及び分泌シグナル領域の下流末端に結合すればよい。当該目的タンパク質としては、各種酵素タンパク質や生理活性ペプチド等、異種のいずれのタンパク質でもよいが、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａのタンパク質、特に１０ｋＤａ〜３５ｋＤａのタンパク質が好ましい。また、生理活性タンパク質が好ましく、中でもヒト由来タンパク質、特にシスタチン類及びヒト成長ホルモンが好適である。
【００２０】
斯かるバチルス属細菌由来アルカリセルラーゼのプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と異種タンパク質をコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持する発現ベクターは、枯草菌に保持され増殖するプラスミドであればよく、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のｐＵＢ１１０、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のｐＢＣ１６、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ由来のｐＡＭα１、ｐＡＭα１の一部を含むシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２１】
斯かるベクターを用いて、宿主枯草菌を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いればよい。
【００２２】
斯くして得られる組換え枯草菌（形質転換体）を、当該組換え枯草菌が生育可能な培地中で適当な培養条件で培養することにより、目的タンパク質を大量に生成させることができる。
【００２３】
斯かる組換え枯草菌を用いた本発明のタンパク質の製造法は、特にシスタチン類及びヒト成長ホルモンの大量分泌生成に適している。
シスタチン類は、システインプロテアーゼ阻害剤の総称であり、ヒト組織及び体液に広く分布し、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ及びＳのようなシステインプロテアーゼと密接かつ可逆的な複合体を形成し、これらのプロテアーゼが関与する正常又は病的な過程の調節に関与している。従って、シスタチンは、後天的な肺炎（肺気腫）、劇症肝炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、細菌毒素に起因するショック様症候群、カテプシンＫの選択的阻害による疾患（骨粗しょう症、パジェット病、悪性高カルシウム血症、代謝性骨疾患等）に関与すると考えられている。
【００２４】
従来、斯かるシスタチン類の製造は、そのアミノ酸構造をコードする遺伝子を用いた組換え生産が試みられており、シスタチンＣを始め、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンα及びシスタチンＳの組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による生産等が知られているが、その生産性は低く実用化されるレベルには至っていなかった。本発明の方法を用いれば、シスタチン類を効率よく且つ大量に生産することができる。
【００２５】
ここで、シスタチン類としては、その起源や種類に限定されず、ファミリー１（ステフィンファミリー）、ファミリー２（シスタチンファミリー）及びファミリー３（キニノーゲンファミリー）に分類される全てのシスタチンスーパーファミリー並びに、システインプロテアーゼに対する阻害活性を有する特開平７−１２６２９４号公報に記載の新規システインプロテアーゼインヒビター、特表２００１−５１２９６６号公報に記載のＣＳＴＩＮのようなシスタチン様タンパク質が挙げられる。
【００２６】
斯かる、１）ファミリー１としては、ヒトシスタチンＡ、ヒトシスタチンＢ、ラットシスタチンα、ラットシスタチンβ、ヒトｃ−Ｈａ−ｒａｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ−ｐ２１、オリザシスタチンＩ、オリザシスタチンＩＩ、コーンシスタチン、ソヤシスタチン等が挙げられ、２）ファミリー２としては、ヒトシスタチンＣ、ヒトシスタチンＳ、ヒトシスタチンＳＮ、ヒトシスタチンＳＡ、ヒトシスタチンＤ、ヒトシスタチンＭ、ヒトロイコシスタチン（シスタチンＦ）、ラットシスタチンＣ、ラットシスタチンＳ、マウスシスタチンＣ、マウスロイコノシスタチン、チキンシスタチン、ウズラシスタチン、ウシ初乳シスタチン、カープシスタチン、タイワンコブラ毒シスタチン、カブトガニシスタチン、チャムサーモンシスタチン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉａシスタチン、サーコシスタチン、マムシ毒シスタチン等が挙げられ、３）ファミリー３としては、ヒト低分子量キニノ−ゲン、ヒト高分子量キニノーゲン、ウシ低分子量キニノーゲン、ウシ高分子量キニノーゲン、ラット低分子量キニノーゲン、ラット高分子量キニノーゲン、ラットＴ−キニノーゲン１、ラットＴ−キニノーゲン２等が挙げられる。
【００２７】
このうち、本発明の組換え枯草菌を用いた製造には、特にファミリー２に属すものが好ましく、特にヒトの唾液由来のシスタチンであるシスタチンＳ、シスタチンＳＡ、シスタチンＳＮが適する。
【００２８】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）はヒトの脳下垂体より分泌されるペプチドホルモンの１種であり、１９１アミノ酸からなり、分子量は２２，０００である。本物質の生理活性としては成長促進、脂肪代謝、糖代謝等が知られており、下垂体性小人症の治療薬として古くから用いられている。また、ｈＧＨには、慢性腎不全による低身長、火傷、骨折、骨粗しょう症等の治療等への適応対象の拡大が検討されている。本発明のタンパク質の製造法は、斯かるヒト成長ホルモンの効率的且つ大量生産にも適している。
【００２９】
シスタチン類又はヒト成長ホルモンの製造は、１以上のプロテアーゼ遺伝子を削除又は不活性化した宿主枯草菌を、バチルス属細菌由来アルカリセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域と、シスタチン類又はヒト成長ホルモンをコードする遺伝子とを含むＤＮＡ断片を保持するベクターで形質転換させてなる組換え枯草菌を用い、これを適当な培地中で適当な培養条件で培養することにより行うことができる。
尚、シスタチン類又はヒト成長ホルモンをコードする遺伝子は、生体からの抽出や増幅、公知のアミノ酸配列に基づく化学的合成等の公知の方法により取得すればよい。
【００３０】
組換え枯草菌の培養に用いる培地の種類としては、適当な窒素源、炭素源、ミネラルを含み、本発明の枯草菌宿主が生育し、目的タンパク質を生産することができるものであればよい。例えば、配列番号２で示されるＤＮＡ断片を含む組換え枯草菌１６８ΔａｐｒＥ（ｐＨ２３７−ＵＳ）株によってシスタチン類を生産する場合、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖等の二糖類又は可溶性澱粉等の多糖類等を配合した培地や、窒素源として、酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を配合したＣＭ培地等を用いることができる。
【００３１】
また、培地のｐＨは、用いる組換え枯草菌が生育し得る範囲のｐＨであれば、よいが、ｐＨ６．０〜８．０に調整するのが好適である。
培養条件は、１５〜４２℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪または、通気撹拌培養すればよい。
【００３２】
【実施例】
１．試験方法
（１）宿主菌株
枯草菌宿主として、枯草菌  １６８株からアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＥ）を欠損させた枯草菌  １６８ΔａｐｒＥ株、比較例として枯草菌  １６８株を用いた。枯草菌  １６８ΔａｐｒＥ株の調製法を以下に示す。
【００３３】
枯草菌  １６８株の染色体ＤＮＡを鋳型としてプライマーＤａｐｒ１ｆ（ＣＴＴＣＴＡＧＡＴＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧ：配列番号３）及びＤａｐｒ３（ＴＴＴＴＡＡＧＴＡＡＧＴＣＴＡＡＡＧＡＴＣＣＧＡＧＣＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＧ：配列番号５）を用いたＰＣＲでａｐｒＥの構造遺伝子（開始コドンを１とする。）の上流（−１４６０から−３３）に相当する遺伝子断片Ａを増幅した。同様に枯草菌  １６８株の染色体ＤＮＡを鋳型としてプライマーＤａｐｒ２（ＣＡＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＣＴＴＴＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧ：配列番号４）及びＤａｐｒ４（ＣＧＴＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＧＧＣＡＣＴＴＣＣＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧ：配列番号６）を用いたＰＣＲでａｐｒＥの構造遺伝子から下流（２６８から１５９０）に相当する遺伝子断片Ｃを増幅した。遺伝子断片Ａ及びＣを鋳型とし、プライマーＤａｐｒ１ｆ及びＤａｐｒ４を用いたリコンビナントＰＣＲでａｐｒＥ遺伝子を含む近傍配列からａｐｒＥのＳＤ配列、開始コドン、シグナル配列等を含む前半３００ｂｐを欠失させたａｐｒＥ欠失用ＰＣＲ断片（ΔａｐｒＥ）を調製した。またプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを鋳型にテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）を増幅した。末端平滑化したＴｃｒ  ＰＣＲ断片をプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造）のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入し、ΔａｐｒＥ  ＰＣＲ断片は両端に付したＸｂａＩ部位で切断後、同プラスミドのＸｂａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＵＣＴｃｒΔａｐｒＥを構築した。プロトプラスト形質転換法によりｐＵＣＴｃｒΔａｐｒＥを枯草菌１６８株へ導入し、１５ｐｐｍのテトラサイクリンを含むＤＭ３再生寒天培地で生育したコロニーを得た。１白金耳をＬＢ培地に植菌・培養（３０℃）し、一晩培養液を同組成の培地で希釈し１％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋを含むＬＢ固体培地に塗布した。３０℃で１日培養して取得したコロニーを同組成の固体培地及び、１５ｐｐｍのテトラサイクリン、１％Ｓｋｉｍ  Ｍｉｌｋを含むＬＢ培地に釣菌した。３０℃で培養したコロニーからテトラサイクリン感受性株となった株が取得され、ＰＣＲによるゲノム解析を行った結果ａｐｒＥ領域に目的の欠失が確認されたため、これを１６８ΔａｐｒＥ株とした。
【００３４】
（２）プラスミドの調製
遺伝子のサブクローニングに用いる大腸菌宿主としてＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株（宝酒造）を使用した。
ヒト顎下腺由来のｃＤＮＡからクローニングしてきたシスタチンＳ遺伝子を含むプラスミドとしてｐＵＳＡ３（Ｓａｉｔｏｈ，Ｅ．，  ａｎｄ  Ｉｓｅｍｕｒａ，Ｓ．，  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，：３９９，（１９９４））を使用した。
ヒト成長ホルモン遺伝子を含むｃＤＮＡライブラリーとしてプラスミドＤＮＡ型ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｇｌａｎｄ（宝酒造）を用いた。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｓ２３７株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を含むプラスミドとしてｐＨＹＥｇｌＳ（Ｈａｋａｍａｄａ，Ｙ．，  ｅｔａｌ，  Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６４：２２８１，（２０００））を使用した。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−６４株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を含むプラスミドとして  ｐＣＬ６４（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ，    Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ５６：８７２，（１９９２））を使用した。
遺伝子をサブクローニングするベクターとしてｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造）を使用した（図１、図２、図３）。
【００３５】
（３）使用培地及び培養条件
組換え菌の培養には、表１に示したＣＭ培地を使用し、以下の培養条件で行った。すなわち、大型試験管（シード培地、５ｍＬ仕込）にて１５時間培養した前培養液を、５００ｍＬヒダつき三角フラスコ（メイン培地、２０ｍＬ仕込）に４％植菌し、培養温度３０℃、回転数２１０ｒｐｍで３〜４日間培養を行った。
【００３６】
【表１】
2004313169.tif 000002
【００３７】
（４）遺伝子工学的手法
遺伝子断片の増幅にはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を用いた。ＰＣＲ法には、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシュー・ダイアグノスティックス社）を用いて、鋳型ＤＮＡ５ｎｇ、順方向プライマー及び逆方向プライマー各２０ｐｍｏｌとして、ＰＣＲ反応（変性温度：９４℃−１分、アニール温度：５４℃−０．５分、ＤＮＡ鎖伸張温度：７２℃−４分を１サイクルとして３０回繰り返す）をＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキン・エルマ社）を用いて行った。増幅された遺伝子断片の塩基配列をサンガー法［Ｆ．Ｓａｎｇａｒ，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，，７４：５４６３（１９８２）］により決定し、ＰＣＲ法による配列のエラーが起こっていないことを確認した。構築した組換えプラスミドの枯草菌への導入にはプロトプラスト法［Ｃｈａｎｇ，Ｓ．，  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．，  Ｓ．，，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１，（１９７９）］を用いた。
【００３８】
（５）組換え菌生産物の解析
培養後の培養液を遠心分離し培養上清と菌体を得た。菌体を菌体破砕緩衝液（５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール）で懸濁し、超音波破砕（ＢＩＯＭＩＣ社７５００型、Ｏｕｔｐｕｔ  ５、Ｄｕｔｙ  Ｃｙｃｌｅ  ５０％、１５分間破砕）後、遠心分離した上清を菌体破砕物とした。
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）はレディゲルＪ（分離ゲル濃度１５％、バイオラッド）を用い、泳動後のゲルをクイックＣＢＢ（関東化学）にてタンパク質染色した。
（ａ）シスタチンＳの検出
抗体染色はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦフィルター（ミリポア、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体に後記参考例に記載の方法により作製した組換え大腸菌由来のシスタチンＳに対する抗シスタチンＳマウス抗体、二次抗体にＨＲＰ標識の抗マウスＩｇ抗体（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を用い、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）によって、シスタチンＳの検出を行った。
（ｂ）ヒト成長ホルモンの検出
抗体染色はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をゲルからＰＶＤＦフィルター（ミリポア、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎトランスファー膜）上へ電気的に転写後、一次抗体にＡｎｔｉ−ＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ抗体（Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＰＲＯＧＥＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＫ  ＧＭＢＨ社）、二次抗体にＨＲＰ標識の抗Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ抗体（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）を用い、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出システム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社）によって、ヒト成長ホルモンの検出を行った。
【００３９】
参考例  抗シスタチンＳ抗体の作製
（１）パパイン阻害活性の測定方法
シスタチンＳのパパイン阻害活性はＢａｒｒｅｔら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８０、ｐｐ７７１（１９８１））に準じて測定した。１０ｍＭベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド（Ｂｅｎｚｏｉｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−４−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）ジメチルスルホキシド溶液を基質とし、２ｍＭのＥＤＴＡを含む、２００ｍＭリン酸緩衝液にＤＴＴを終濃度８ｍＭとなるように添加した。パパイン１ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＴＴを含まない緩衝液に溶解した。また、反応停止用溶液として５％トリクロロ酢酸溶液を使用した。測定は以下の手順で行った。測定用チューブに１ｍＬＤＴＴを含む緩衝液と０．０５ｍＬのパパイン溶液、試料溶液０．５ｍＬおよび全量２ｍＬとなるよう蒸留水を入れ、２５℃で５分間インキュベートした。ついで基質溶液０．０５ｍＬを加え攪拌した。２５℃で１５分反応後、１ｍＬの反応停止液を加え、沈殿が生じた場合は１００００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清の４０５ｎｍの吸光度を測定した。相対阻害活性は次式（１）より求めた。
相対阻害活性（％）＝１００−（（Ａ０−ＡＩ）／Ａ０×１００）    （１）
Ａ０：阻害剤フリーの吸光度
ＡＩ：サンプルの吸光度
【００４０】
（２）シスタチンＳの組換え大腸菌による製造
ヒト唾液由来シスタチンＳは斎藤ら［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，３９９−４０５（１９９４）］の方法に従って製造した。即ち、ヒトシスタチンＳのｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（宝酒造株式会社製）を宿主として組換え操作を行い、組換え体を作成した。組換え大腸菌の培養はアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）添加ＬＢ培地５０ｍＬにて前培養を行った。本培養はＭ９最小培地にシュークロース（４ｇ／Ｌ）、チアミン（２ｍｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４（１ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０．１ｍＭ）とアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えた培地１６Ｌを用い３０−Ｌ容ジャーファーメンターによって、前培養液１６ｍＬを添加後、培養温度３７℃、通気量４Ｌ／ｍｉｎ、攪拌数２５０ｒｐｍの条件で行った。培養４時間後（ＯＤ６００＝０．５）にイソプロピルチオガラクトシド（終濃度０．３ｍＭ）を添加してさらに４時間培養を行い、シスタチンＳを発現した。培養後、Ｆｒｅｉｊｅら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１５７３７−１５７４４（１９９３）］の方法によって菌体処理を行いペリプラズム画分を調製した。
【００４１】
（３）シスタチンＳの精製
シスタチンＳの精製はＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃ（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）によるイオンクロマトグラフィーによって行った。ペリプラズム画分を１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）にて平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｃカラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）にロードする。１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）で溶出洗浄後、１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）（２５０ｍＬ）、４％ＮａＣｌ溶解１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）（２５０ｍＬ）で形成されるグラジエントで溶出する。組換えシスタチンＳを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。
【００４２】
パパイン阻害活性を有するフラクションを凍結乾燥後、再度６０ｍＬの蒸留水に溶解後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にて２０ｍＬに脱塩濃縮を行った。さらに、４０ｍＬの蒸留水を添加して、同様に脱塩濃縮を２回行った。得られた脱塩濃縮液２０ｍＬのうち１０ｍＬをさらにＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３にて濃縮を行い１．５ｍＬとした。得られたシスタチンＳ濃縮液１．５ｍＬをさらに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５Ｆカラム（１．５ｃｍ×９４ｃｍ）によるゲル濾過を行った。組換えシスタチンＳを含むフラクションは（１）に示した方法によってパパイン阻害活性を測定することで検出した。
パパイン阻害活性を有するフラクションをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３にて濃縮を行い２ｍＬとした。得られた濃縮液をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）により牛血清アルブミンを標準として定量した結果、６７８μｇ／ｍＬであった。
【００４３】
（４）抗シスタチンＳマウス抗体の作製
（３）によって得られた精製シスタチンＳを用いて常法に従って抗シスタチンＳマウス抗体を作製した。即ち雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに精製シスタチンＳ溶液６０μＬを１００μＬ  ＦＣＡと混合して腹腔内注射により初回免疫を行った。さらに、１４、２８、４８日後に精製シスタチンＳ溶液６０μＬを１００μＬ  ＭＰＬ＋ＴＤＭエマルジョンと混合して腹腔内注射を行った。５２日後にマウス尾静脈より全血を採取し、抗血清を分離し抗シスタチンＳマウス抗体とした。
【００４４】
比較例１  枯草菌１６８株によるヒト・シスタチンＳの発現
ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。
すなわち、プラスミドｐＨＹＥｇｌＳ５ｎｇを鋳型としＳ２３７ＵＥ（ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＣＡＡＣＡＧＧＣＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧ；配列番号８）及びＣＳ２３７Ｄ（ＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣ；配列番号１０）の２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域をコードする０．６Ｋｂの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドｐＵＳＡ３  ５ｎｇを鋳型とし２３７ＣＳＵ（ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧ；配列番号９）及びｐＳＤ（ＧＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＴＴＣＴＧ；配列番号７）の２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりヒト・シスタチンＳをコードする０．４ｋｂの遺伝子断片を得た。この０．４Ｋｂ断片の塩基配列をサンガー法により決定し構造遺伝子中のＥｃｏＲＩサイトをコドンに影響の無いように（ＡＡＴ→ＡＡＣ）消去したことを確認した。単離した０．６Ｋｂ断片、０．４Ｋｂ断片をそれぞれ５ｎｇを鋳型としてＳ２３７ＵＥ及びｐＳＤの２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト・シスタチンＳをコードする遺伝子が結合した１．０ｋｂ遺伝子断片を得た。得られた１．０Ｋｂ断片とプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。この結合反応物を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［Ｄ．，Ｍ．，Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，（１９８５）］にしたがって調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドｐＨ２３７−ＵＳを得た（図１）。プロトプラスト法にて枯草菌１６８株に組換えプラスミドｐＨ２３７−ＵＳを導入し、得られた枯草菌について培養（３０℃、３日間）を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて菌体破砕物中にヒト・シスタチンＳに相当する分子サイズ（１４Ｋｄ）のタンパク質バンドが検出できたが、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった（図４）。
【００４５】
比較例２  枯草菌１６８株によるヒト成長ホルモンの発現
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＫＳＭ−Ｓ２３７株セルラーゼ由来のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。
すなわち、プラスミドｐＨＹＥｇｌＳ  ５ｎｇを鋳型としＳ２３７ＵＥ（ＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＣＡＡＣＡＧＧＣＴＴＡＴＡＴＴＴＡＧ；配列番号８）及びＧＨ２３７Ｄ（ＧＧＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣ；配列番号１１）の２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域をコードする０．６Ｋｂの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドＤＮＡ型ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｇｌａｎｄ（宝酒造）５ｎｇを鋳型とし２３７ＧＨＵ（ＣＴＴＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣ；；配列番号１２）及びＧＨＤＨ（ＧＡＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣ；配列番号１３）の２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲにより０．６ｋｂの遺伝子断片を得た。この０．６Ｋｂ断片の塩基配列をサンガー法により決定し本断片がヒト成長ホルモンをコードすることを確認した。単離した０．６Ｋｂ断片、０．６Ｋｂ断片をそれぞれ５ｎｇを鋳型としてＳ２３７ＵＥ及びＧＨＤＨの２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト成長ホルモンをコードする遺伝子が結合した１．２ｋｂ遺伝子断片を得た。得られた１．２Ｋｂ断片とプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。この結合反応物を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［Ｄ．，  Ｍ．，  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，（１９８５）］に従って調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドｐＨ２３７−ＧＨを得た（図２）。プロトプラスト法にて枯草菌１６８株に組換えプラスミドｐＨ２３７−ＧＨを導入し、得られた枯草菌について培養（３０℃、３日間）を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった。
【００４６】
比較例３  枯草菌１６８株によるヒト・シスタチンＳの発現
ＫＳＭ−６４株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域を利用した組換えプラスミドを構築した。
すなわち、プラスミドｐＣＬ６４  ５ｎｇを鋳型としＳＰ６４ＵＥ（ＴＡＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＧＧＡＣＡＴＡＡＧＡＡＡ；配列番号１４）及びＣＳ６４Ｄ（ＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣ；配列番号１５）の２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−６４株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域をコードする０．６Ｋｂの遺伝子断片を得た。同様にプラスミドｐＵＳＡ３  ５ｎｇを鋳型とし６４ＣＳＵ（ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧ；配列番号１６）及びｐＳＤ（ＧＡＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＣＴＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＴＴＣＴＧ；配列番号７）の２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりヒト・シスタチンＳをコードする０．４ｋｂの遺伝子断片を得た。この０．４Ｋｂ断片の塩基配列をサンガー法により決定し構造遺伝子中のＥｃｏＲＩサイトをコドンに影響の無いように（ＡＡＴ→ＡＡＣ）消去したことを確認した
。単離した０．６Ｋｂ断片、０．４Ｋｂ断片をそれぞれ５ｎｇを鋳型としてＳＰ６４ＵＥ及びｐＳＤの２種類のプライマー各２０ｎｍｏｌを用いたＰＣＲによりＫＳＭ−６４株由来のセルラーゼ産生遺伝子のプロモーター領域、シグナルペプチド領域の下流末端にヒト・シスタチンＳをコードする遺伝子が結合した１．０ｋｂ遺伝子断片を得た。得られた１．０Ｋｂ断片とプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いて結合した。この結合反応物を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、５μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ培地を用いて形質転換体を選択した。組換え大腸菌の保持する組換えプラスミドを常法［Ｄ．，  Ｍ．，  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，（１９８５）］にしたがって調製し、得られた組換えプラスミドの制限酵素切断点の解析を行って組換えプラスミドｐＨ６４−ＵＳを得た（図３）。プロトプラスト法にて枯草菌１６８株に組換えプラスミドｐＨ６４−ＵＳを導入し、得られた枯草菌について培養（３０℃、３日間）を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果抗体染色にて、培養上清中に抗体に反応するタンパク質バンドは検出できなかった。
【００４７】
実施例１  アルカリアルカリプロテーゼ遺伝子欠損株（ΔａｐｒＥ株）によるシスタチンの発現
組換えプラスミドｐＨ２３７−ＵＳをＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８ΔａｐｒＥ株に導入し、得られた組換え体について培養（３０℃、４日間）を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてシスタチンが大量に菌体外分泌されていることが確認され、タンパク質染色においても充分に生産が確認できる生産レベルであることが認められた（図５）。
【００４８】
実施例２  アルカリプロテアーゼ遺伝子欠損株（１６８△ａｐｒＥ株）によるヒト成長ホルモンの発現
組換えプラスミドｐＨ２３７−ＧＨを枯草菌１６８△ａｐｒＥ株に導入し、得られた組換え体について培養を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてヒト成長ホルモンが菌体外分泌されていることが確認された（図６）。
【００４９】
実施例３  アルカリプロテアーゼ遺伝子欠損株（１６８△ａｐｒＥ株）によるシスタチンの発現
組換えプラスミドｐＨ６４−ＵＳを枯草菌１６８△ａｐｒＥ株に導入し、得られた組換え体について培養を行い、培養上清のＳＤＳ電気泳動的解析を行った。その結果、抗体染色にてシスタチンが菌体外分泌されていることが確認された（図７）。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の組換え枯草菌を用いれば、目的タンパク質を効率よく且つ大量に生産することができる。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】シスタチン組換えプラスミドの構築（Ｓ２３７プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。
【図２】ヒト成長ホルモン組換えプラスミドの構築（Ｓ２３７プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。
【図３】シスタチン組替えプラスミドの構築（６４プロモーター領域、分泌シグナルペプチド領域）を示す図である。
【図４】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト・シスタチンＳ）の解析結果を示す図である（比較例１）。
【図５】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト・シスタチンＳ）の解析結果を示す図である（実施例１）。
【図６】Ｓ２３７プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト成長ホルモン）の解析結果を示す図である（実施例２）。
【図７】６４プロモーター領域及び分泌シグナルペプチド領域を導入した組換え枯草菌生産物（ヒト・シスタチンＳ）の解析結果を示す図である（実施例３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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