(57)【要約】【課題】ＤＮＡを初めとする作用物質の生体内送達用キャリヤーとして有用な材料の提供。【解決手段】ポリ（エチレングリコール）セグメントと特定のアミン残基１種以上を側鎖に有するポリ（アミノ酸誘導体）セグメントからなるブロック共重合体。かような共重合体とポリヌクレオチド等とのポリイオンコンプレックス。【選択図】図３       
2004352972.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールまたはその誘導体からなるＡセグメントと、ポリアミノ酸またはその誘導体もしくはそれらの塩からなるＢセグメントとを有するポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体であって、Ｂセグメント中に、ｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミンを含むか、あるいは一級アミンと二級アミン、三級アミンまたは四級アンモニウム塩との両方を含むことを特徴とする共重合体。
【請求項２】
ブロック共重合体の構造が一般式（Ｉ）または（ＩＩ）またはそれらの塩である請求項１記載の共重合体。
【化１】
2004352972.tif 000015
式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はＲ５と同一であるかまたは開始剤残基であり、Ｒ５はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでＸはそれぞれ独立してｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、ａは１〜５の整数であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であるが、ｘはｎより大きくないとする。
【請求項３】
ブロック共重合体の構造が一般式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）またはそれらの塩である請求項１記載の共重合体。
【化２】
2004352972.tif 000016
式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はＲ５と同一であるかまたは開始剤残基であり、Ｒ５はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでＸはそれぞれ独立してｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内の一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、ａは１〜５の整数であり、Ｒ６はそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは１〜４，９９９の整数であるがｚはｎより小さく、ｙ＋ｚはｎより大きくないとする。
【請求項４】
Ｒ１がメチル基である請求項２または３記載の共重合体。
【請求項５】
Ｒ１が置換された直鎖もしくは分枝Ｃ１−１２アルキル基を表し、ここで置換基がアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である請求項２または３記載の共重合体。
【請求項６】
Ｌ１が−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、ｂが１〜５の整数である請求項２〜５のいずれかに記載の共重合体。
【請求項７】
Ｌ２が−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、ｃが１〜５の整数である請求項２〜５のいずれかに記載の共重合体。
【請求項８】
Ｒ２がメチレン基である請求項２〜７のいずれかに記載の共重合体。
【請求項９】
Ｘが下記のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ群に示す式で表される基である請求項２〜８のいずれかに記載の共重合体。
【化３】
2004352972.tif 000017
式中、Ｘ２は水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、Ｘ３はアミノＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ７は水素原子またはメチル基を表し、ｄは１〜５の整数を表し、ｅは１〜５の整数を表し、ｆは０〜１５の整数を表し、Ｒ８は保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等を表し、ｇは０〜１５の整数を表す。
【請求項１０】
Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基である請求項２〜９のいずれかに記載の共重合体。
【請求項１１】
Ｒ４が−ＮＨ−Ｒ９であり、ここでＲ９は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基を表す請求項２〜１０のいずれかに記載の共重合体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質を含んでなるポリイオンコンプレックス。
【請求項１３】
コア部に核酸または陰イオン性タンパク質を担持し、そしてシェル部にポリエチレングリコールセグメントが主として存在するポリマーミセルの形態にある請求項１２記載のポリイオンコンプレックス。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性セグメントとしてポリエチレングリコール構造部分とカチオン性セグメントとして種々構造のアミン残基側鎖を持つポリアミノ酸構造部分を有するブロック共重合体、ならびに該共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質のポリイオンコンプレックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
カチオン性のブロック共重合体であるポリエチレングリコール−block−ポリ（Ｌ−リシン）に代表されるポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体とアニオン性高分子は、水中で両者間に作用する静電相互作用を駆動力として球状のミセルを自発的に形成する。この粒子は、粒径が数十ナノメータで、コア（または内核）にカチオンとアニオンのポリイオンコンプレックス、シェル（または外殻）にポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧともいう。）層を有するコア−シェル構造を有しており、ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルと呼ばれている（例えば、非特許文献１参照。）。このように、ＰＩＣミセルは内核にアニオン性の高分子を保持することが可能であり、数十ナノメータという粒径とコア−シェル構造により生体の異物認識機構を回避することが期待できるため、現在、天然のアニオン性高分子であるＤＮＡの運搬体（ベクター）としての応用が検討されている。このようにカチオンブロック共重合体を用いた遺伝子ベクターの開発の優位性が明らかとなっているにもかかわらず、現在検討されているカチオン性のブロック共重合体は、合成上の制限などの理由からＰＥＧ−block−ポリ（Ｌ−リシン）、ＰＥＧ−block−ポリ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）（例えば、特許文献１参照。）、ＰＥＧ−block−ポリエチレンイミンにとどまっている。
【０００３】
一般的にこれらのＰＩＣミセルは、生理的条件下で相当安定であるが、実際の使用に際しては、静脈注射による投与後の希釈によってＰＩＣミセルが解離してしまうことや、血清タンパク質と相互作用すること等、生理条件下での安定性が十分でない場合も存在する。このため、確実に目的部位へ到達するまでまたは到達した後、一定期間解離せず安定に存在するように、ＰＩＣミセルの性質を改変する必要がある。このようなＰＩＣミセルの性質を改変する手段として、例えば、上記のＰＥＧ−block−ポリ（Ｌ−リシン）のポリ（Ｌ−リシン）セグメントにおける一定の割合のＬ−リシン単位のアミノ基にメルカプトアルキル基を導入し、該基間でジスルフィド結合を形成することにより、ＰＩＣミセルの安定性を向上させることが提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
【０００４】
また、新たなタイプのものとして、ＰＥＧ−block−ポリ（β−ベンジルアスパルテート）のベンジルを、例えばＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン等でエステル−アミド交換した共重合体も提案されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００５】
ポリカチオンとＤＮＡによって形成されるミセルにおいてポリカチオンブロックの果たす役割はＤＮＡとの静電相互作用部としての役割が主であるが、それ以外の機能も付与することが原理的に可能である。その機能の一つとして、プロトンスポンジ効果が考えられる。プロトンスポンジ効果とは、プロトン化度の低いポリアミンがエンドソーム内に取り込まれた際に、Ｖ型ＡＴＰａｓｅによりエンドソーム内に供給される水素イオンを次々と吸収し、エンドソーム内のｐＨの低下を妨げ、その結果エンドソーム内の浸透圧の上昇に伴う水の浸入でエンドソームが膨張し、結果的にエンドソームの破壊を誘起することを指す。この効果により、ＤＮＡの細胞質への移行が促進され、遺伝子発現効率が高まることが期待される。この効果は、バッファー能を有しているカチオンにおいて見られる効果であり、そのためにはｐＫａの低いカチオンを使用する必要がある。
【０００６】
一方で、遺伝子発現効率にはＰＩＣミセルの安定性や、内包されたＤＮＡの凝縮状態等も影響を与えると考えられ、これらの要因もポリカチオンの性質に依存すると考えられる。しかし、前述の通り、これまではポリカチオンの種類が限られており、また二種類以上のポリカチオンを同時に導入し、役割を分担させるという発想もなかったため、これらの要因をコントロールすることは極めて困難であった。
【特許文献１】国際公開第９８／４６６５５号パンフレット（第２０〜２１頁、実施例１０および１１参照。）
【特許文献２】特開２００１−１４６５５６号公報
【非特許文献１】Harada and Kataoka, Macromolecules, １９９５，２８，５２９４−５２９９
【非特許文献２】Polymer  Preprints,  Japan  Vol.５１，Ｎｏ．５（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
例えば、上記の特許文献２および非特許文献２に記載されているＰＥＧ−block−ポリカチオンは安定にＤＮＡを内包したポリイオンコンプレックスミセル（ＰＩＣミセル）を形成するが、ＤＮＡ等の生理活性物質を送達すべき生体の標的の環境または該環境下での生理活性物質のＰＩＣミセルからの最適な放出速度の多様性を考慮すると、さらなる新たな特性を示すＰＩＣを提供する必要があろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＥＧ−block−ポリカチオン共重合体のポリカチオンセグメントをｐＫａの低い嵩高い側鎖を有するポリカチオンセグメントとすることで、例えば、非特許文献２に記載された共重合体ではＰＩＣミセルにＤＮＡがかなり凝縮された状態で内包されるのに対し、ＤＮＡが、ほぼフリーの状態で内包されることを見出した。また、このようにフリーの状態で内包されたＤＮＡは、例えば、それを送達すべき標的細胞と生理的条件で接触した場合には、凝縮された状態で内包されたものに対して、有意に遅く放出されることも見出した。またポリカチオン中に一級アミンと二級または三級アミンの両方を含む場合、ＤＮＡとの会合体の形成には一級アミンが主として関与し、二級または三級アミンは殆ど関与していないことも見出し、さらに鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、（１）ポリエチレングリコールまたはその誘導体からなるＡセグメントと、ポリアミノ酸またはその誘導体もしくはそれらの塩からなるＢセグメントとを有するポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体であって、Ｂセグメント中に、ｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミンを含むか、あるいは一級アミンと二級アミン、三級アミンまたは四級アンモニウム塩との両方を含むことを特徴とする共重合体；特定の態様として、（２）ブロック共重合体の構造が一般式（Ｉ）または（ＩＩ）またはそれらの塩である上記（１）記載の共重合体：
【００１０】
【化１】
2004352972.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はＲ５と同一であるかまたは開始剤残基であり、Ｒ５はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでＸはそれぞれ独立してｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、ａは１〜５の整数であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｘは０〜５，０００の整数であるが、ｘはｎより大きくないとする。）;特定の態様として、（３）ブロック共重合体の構造が一般式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）またはそれらの塩である上記（１）記載の共重合体：
【００１２】
【化２】
2004352972.tif 000004
【００１３】
（式中、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表し、Ｌ１、Ｌ２は連結基を表し、Ｒ２はメチレン基またはエチレン基を表し、Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表し、Ｒ４はＲ５と同一であるかまたは開始剤残基であり、Ｒ５はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでＸはそれぞれ独立してｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の内一種類または二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、ａは１〜５の整数であり、Ｒ６はそれぞれ独立して水素原子または保護基であり、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等であり、ｍは５〜２０，０００の整数であり、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜４，９９９の整数であり、ｚは１〜４，９９９の整数であるが、ｚはｎより小さく、ｙ＋ｚはｎより大きくないとする。）;より特定の態様として、（４）Ｒ１がメチル基である上記（２）または（３）記載の共重合体;より特定の態様として、（５）Ｒ１が置換された直鎖もしくは分枝Ｃ１−１２アルキル基を表し、ここで置換基がアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基である上記（２）または（３）記載の共重合体;さらにより特定の態様として、（６）Ｌ１が−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、ｂが１〜５の整数である上記（２）〜（５）のいずれかに記載の共重合体、（７）Ｌ２が−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、ｃが１〜５の整数である上記（２）;より特定の態様として、（３）〜（５）のいずれかに記載の共重合体;さらにより特定の態様として、（８）Ｒ２がメチレン基である上記（２）〜（７）のいずれかに記載の共重合体;さらにより特定の態様として、（９）Ｘが下記のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥ群に示す式で表される基である上記（２）〜（８）のいずれかに記載の共重合体：
【００１４】
【化３】
2004352972.tif 000005
【００１５】
（式中、Ｘ２は水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、Ｘ３はアミノＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ７は水素原子またはメチル基を表し、ｄは１〜５の整数を表し、ｅは１〜５の整数を表し、ｆは０〜１５の整数を表し、Ｒ８は保護基を表し、ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等を表し、ｇは０〜１５の整数を表す。）;さらにより特定の態様として、（１０）Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基またはメタクリロイル基である上記（２）〜（９）のいずれかに記載の共重合体;さらにより特定の態様として、（１１）Ｒ４が−ＮＨ−Ｒ９であり、ここでＲ９は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基を表す上記（２）〜（１０）のいずれかに記載の共重合体;別の態様として、（１２）上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質を含んでなるポリイオンコンプレックス;より特定の別の態様として、（１３）コア部に核酸または陰イオン性タンパク質を担持し、そしてシェル部にポリエチレングリコールセグメントが主として存在するポリマーミセルの形態にある上記（１２）記載のポリイオンコンプレックス、に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、ＰＩＣミセル中の遺伝子の凝縮状態、ミセルからの遺伝子の放出速度、プロトンスポンジ効果、ミセルの安定性といった遺伝子導入効率に影響を与える要因のコントロールが可能となる。本発明により高い遺伝子導入効率を有するＰＩＣミセルの提供が可能となる。本発明により有用な非ウィルス性遺伝子ベクターの提供が可能となる。
【００１７】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１８】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）において、Ｒ１は水素原子または未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−１２アルキル基を表すが、Ｃ１−１２アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等が挙げられる。また置換された場合の置換基としてはアセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基またはシリルアミノ基が挙げられる。置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ：またはアルデヒド基）に転化できる。かようなホルミル基、またはカルボキシル基もしくはアミノ基は、例えば、本発明に従う共重合体と核酸または陰イオン性タンパク質とのポリイオンコンプレックスミセルのシェル部に存在することができ、これらの基を介して、抗体もしくはその特異結合性を有する断片（Ｆ(ab')２、Ｆ(ab)、等）およびその他の機能性もしくは標的指向性を該ミセルに付与し得るタンパク質等を該ミセルに共有結合するのに利用できる。このような官能基を片末端に有するＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ  ９６／３２４３４、ＷＯ  ９６／３３２３３、ＷＯ  ９７／０６２０２に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部の製造法によって、都合よく形成できる。
【００１９】
こうして形成されるＰＥＧセグメント部分とポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分とは、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の共重合体の製造方法に応じて、どのような連結様式をもとり得、そして本発明の目的に沿う限り、どのような連結基で結合されていてもよい。
【００２０】
製造方法は特に限定されるものではないが、一つの方法として、末端にアミノ基を有するＰＥＧ誘導体を用いて、そのアミノ末端から、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロック共重合体を合成し、その後側鎖を変換することにより、本発明の共重合体を得る方法が挙げられる。この場合共重合体の構造は一般式（Ｉ）または（ＩＩＩ）となり、連結基Ｌ１は用いたＰＥＧ誘導体の末端構造に由来する構造となるが、好ましくは−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−であり、かつｂは１〜５の整数である。
【００２１】
また、ポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメント部分を合成してから、ＰＥＧセグメント部分と結合させる方法でも、本発明の共重合体は製造可能であり、この場合結果的に上記の方法で製造したものと同一の構造となることもあるが、一般式（ＩＩ）または（ＩＶ）の構造となることもあり、連結基Ｌ２は特に限定されるものではないが、好ましくは−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−であり、かつｃは１〜５の整数である。
【００２２】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、(ＩＩＩ）または（ＩＶ）中のＲ５はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であることができるが、大部分（一般的には、８５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％）が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であることが好ましい。また一般式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）中のＲ６はそれぞれ独立して水素原子または保護基であることができるが、大部分が水素原子であることが好ましい。ここで保護基とは通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等のことである。
【００２３】
Ｘは共重合体が本発明の条件を満たす（または本発明の目的に沿う）限り特に制限されないが、５つの群に分類される残基の中から選ばれる。すなわち、Ａ群：ｐＫａ値が７．４以下の嵩高いアミン化合物残基：
【００２４】
【化４】
2004352972.tif 000006
【００２５】
；Ｂ群：一級アミンと二級アミン、三級アミンまたは四級アンモニウム塩の両方を含むアミン化合物残基：
【００２６】
【化５】
2004352972.tif 000007
【００２７】
；Ｃ群：一級アミンのみを含むアミン化合物残基：
【００２８】
【化６】
2004352972.tif 000008
【００２９】
；、Ｄ群：二級アミン、三級アミンまたは四級アンモニウム塩のみを含むアミン化合物残基でＡ群に含まれないもの：
【００３０】
【化７】
2004352972.tif 000009
【００３１】
；Ｅ群：アミンでない化合物残基：
【００３２】
【化８】
2004352972.tif 000010
【００３３】
である。
【００３４】
一般式（Ｉ）または（ＩＩ）の共重合体の場合、Ａ群およびＢ群の残基から選ばれるいずれか一つの残基のみを含むのでもよく、Ｃ群はＡ群およびＤ群の残基から選ばれる少なくとも一つの残基を同時に含まなければならず、Ｄ群はＢ群およびＣ群の残基から選ばれる少なくとも一つの残基を同時に含まなければならない。またＥ群は共重合体の物性を変化させるために含ませることができるが、Ｅ群を除いた部分で上記の条件を満たしていなければならない。一般式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の共重合体の場合、Ｒ６の少なくとも１個以上が水素原子であるならば、Ａ群、Ｂ群およびＤ群の残基から選ばれるいずれか一つの残基のみを含むのでもよい。Ｃ群およびＥ群は上記の条件と同じである。
【００３５】
それぞれの群について好ましい残基の例を式で示す。式中、Ａ群でＸ２は水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、Ｂ群でＸ３はアミノＣ１−６アルキル基であり、Ｒ７は水素原子またはメチル基であり、ｄ、ｅはともに１〜５の整数であり、Ｃ群でｆは０から１５の整数であり、Ｄ群でｄ、ｅはともに１〜５の整数であり、Ｒ８はＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、トリフルオロアセチル基等の保護基であり、Ｅ群でｇは０〜１５の整数であることができる。
【００３６】
ポリアミノ酸構造の側鎖にこれらの残基を導入する方法であるが、特にポリアスパラギン酸構造の場合には、例えば、特許第２７７７５３０号公報に記載されているようなポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）部分のアミノリシスによるエステルからアミドへの交換反応によって都合よく製造できる。別法としてはベンジルエステルを接触還元、酸、アルカリ等により加水分解しポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸に変換した後、縮合剤等を用いてこれらの残基を有する化合物を結合させるという方法でも製造できる。
【００３７】
これらのカチオン側鎖は塩になっていてもよく、この場合塩を形成する対イオンとしてはＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＦ３ＳＯ３−等が挙げられる。
【００３８】
一般式（Ｉ）、(ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）におけるＲ２はメチレン基またはエチレン基を表すが、メチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、R２がメチレン基およびエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在ずるか、あるいはランダムに存在できる。        
【００３９】
一般式（Ｉ）または（ＩＩＩ）におけるＲ３は水素原子、保護基、疎水性基または重合性基を表すが、保護基としてはＣ１−６アルキルカルボニル基が挙げられ、好ましくはアセチル基である。疎水性基としてはベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ピレン等の誘導体が挙げられる。重合性基としてはメタクリロイル基、アクリロイル基が挙げられ、かような重合性基を一般式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の共重合体が有する場合には、これらの共重合体は、所謂、マクロマーとして使用でき、例えば、ＰＩＣミセルを形成した後、必要により他のコモノマーを用い、これらの重合性基を介して架橋させることもできる。        
【００４０】
これらの保護基、疎水性基、重合性基を共重合体の末端に導入する方法としては、酸ハロゲン化物を用いる方法、酸無水物を用いる方法、活性エステルを用いる方法等、通常の合成で用いられている手法が挙げられる。
【００４１】
一般式（ＩＩ）または（ＩＶ）におけるＲ４はＲ５と同じく水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基であることができるが、低分子の開始剤を用いて保護アミノ酸のＮＣＡを重合させてポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントを合成してからＰＥＧセグメントと結合させる方法でブロック共重合体を製造する場合には、使用した開始剤に由来する構造をとることもできる。すなわち−ＮＨ−Ｒ９であり、Ｒ９が未置換または置換された直鎖もしくは分枝のＣ１−２０アルキル基である。
【００４２】
ＰＥＧセグメントの鎖長およびポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの鎖長を規定する、ｍおよびｎは、それぞれ５〜２０，０００の整数、好ましくは１０〜５，０００、特に好ましくは４０〜５００、および２〜５，０００、より好ましくは５〜１，０００、特に好ましくは１０〜２００であるが、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の共重合体が、核酸または陰イオン性タンパク質とＰＩＣミセルを形成するものであれば、限定されるものではない。したがって、本明細書では便宜上、ポリエチレングリコール、ポリカチオン等と称しているが、「ポリ」の語には、所謂、「オリゴ」に分類されるものも包合される概念として用いている。
【００４３】
またポリ（アミノ酸またはその誘導体）セグメントの構成割合を規定する、ｘ、ｙ、ｚは、それぞれ０〜５，０００の整数（ただしｎより大きくない。）、０〜４，９９９の整数、１〜４，９９９の整数（ただしｚはｎより小さく、ｙ＋ｚはｎより大きくない。）であるが、ｚは１０〜ｎ−１０の範囲であることがより好ましい。また各構成成分はランダムに分布していることもブロック状に分布していることもどちらも可能である。
【００４４】
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で表される共重合体は、核酸、例えば、公知の遺伝子治療等に用いられる遺伝子または治療用必要なタンパク質をコードする遺伝子、かような遺伝子を含むプラスミド等のＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、アンチセンスＤＮＡ等、あるいは陰イオン性（特に、生理的ｐＨにおいてアニオンに荷電しうる）タンパク質（またはペプチド）と水性媒体（水混和性の有機溶媒を含んでいてもよい。）中、室温下に攪拌することにより、共重合体のポリカチオン部と例えば、核酸とのポリイオンコンプレックスをコア部とし、ＰＥＧ層をシェル部とするＰＩＣミセルを、都合よく形成できる。本発明によれば、かようなＰＩＣまたはＰＩＣミセルそれ自体も提供される。        
【００４５】
以下、具体例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらの例は、説明の目的にのみ向けられるものと、理解されている。
【実施例１】
【００４６】
ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）−Ａｃブロック共重合体の合成
片末端メトキシ、片末端アミノプロピルで平均分子量が１２，０００のポリエチレングリコール（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２）を塩化メチレンに溶解し、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と塩化メチレンの混合溶媒に溶解して加え、４０℃で２日間反応させて、ポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロック共重合体（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得、さらに無水酢酸によりＮ末端のアセチル化を行い、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを得た。１Ｈ−ＮＭＲによる解析から、ＰＢＬＡ部分の平均分子量は１４，０００、重合度は６８であった。
【実施例２】
【００４７】
モルホリノプロピルアミンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体の製造
【００４８】
【化９】
2004352972.tif 000011
【００４９】
実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またモルホリノプロピルアミンを水素化カルシウムを乾燥剤として減圧蒸留した。
【００５０】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを乾燥ＤＭＦに溶解し、ＰＢＬＡユニットに対し１０倍量のモルホリノプロピルアミンを加え、アルゴン雰囲気下、４０℃で２４時間攪拌した。２４時間後、反応溶液を１０％酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量３，５００の透析膜で０．０１Ｎ−塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液をエバポレート、凍結乾燥することにより白色固体の目的物（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡ）を得た。
【００５１】
得られたポリマーの構造は、１Ｈ−ＮＭＲにより確認を行った。
【００５２】
その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃのベンジル基に帰属されるピークが完全に消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。
【実施例３】
【００５３】
ジエチレントリアミンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体の製造
【００５４】
【化１０】
2004352972.tif 000012
【００５５】
実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またジエチレントリアミンを水素化カルシウムを乾燥剤として減圧蒸留した。
【００５６】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを乾燥ＤＭＦに溶解し、ＰＢＬＡユニットに対し５０倍量のジエチレントリアミンを加え、アルゴン雰囲気下、４０℃で２４時間攪拌した。２４時間後、反応溶液を１０％酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量３，５００の透析膜で０．０１Ｎ−塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液を凍結乾燥することにより白色固体の目的物（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴ）を得た。
【００５７】
得られたポリマーの構造は、１Ｈ−ＮＭＲにより確認を行った。
【００５８】
その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃのベンジル基に帰属されるピークが完全に消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。
比較例１
【００５９】
Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体の製造
【００６０】
【化１１】
2004352972.tif 000013
【００６１】
実施例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またＮ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンを水素化カルシウムを乾燥剤として減圧蒸留した。
【００６２】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを乾燥ＤＭＦに溶解し、ＰＢＬＡユニットに対し１０倍量のＮ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンを加え、アルゴン雰囲気下、４０℃で２４時間攪拌した。２４時間後、反応溶液を１０％酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量３，５００の透析膜で０．０１Ｎ−塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液をエバポレート、凍結乾燥することにより白色固体の目的物（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＭＡＰＡ）を得た。
【００６３】
得られたポリマーの構造は、１Ｈ−ＮＭＲにより確認を行った。
【００６４】
その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃのベンジル基に帰属されるピークが完全に消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。
比較例２
【００６５】
ジアミノプロパンによるアミノリシスでのポリエチレングリコール−ポリカチオンブロック共重合体の製造
【００６６】
【化１２】
2004352972.tif 000014
【００６７】
例１で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃをベンゼンに溶解し凍結乾燥を行った。またジアミノプロパンを水素化カルシウムを乾燥剤として減圧蒸留した。
【００６８】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを乾燥ＤＭＦに溶解し、ＰＢＬＡユニットに対し５０倍量のジアミノプロパンを加え、アルゴン雰囲気下、４０℃で２４時間攪拌した。２４時間後、反応溶液を１０％酢酸水溶液へ滴下し、これを分画分子量３，５００の透析膜で０．０１Ｎ−塩酸水溶液に対して透析し、透析膜内液をエバポレート、凍結乾燥することにより白色固体の目的物（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＡＰ）を得た。
【００６９】
得られたポリマーの構造は、１Ｈ−ＮＭＲにより確認を行った。
【００７０】
その結果、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃのベンジル基に帰属されるピークが完全に消失し、新たにアミド形成に由来するプロトンシグナルが確認された。積分値より、高分子側鎖のアミノリシスがほぼ定量的に進行したことが確認された。
【実施例４】
【００７１】
ブロック共重合体とプラスミドＤＮＡによるＰＩＣミセルの調製
ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐ−ＤＮＡ，ｐＧＬ３−Ｌｕｃ）はキアゲン社、Ｍａｘｉ  ｋｉｔにより精製し、５０μｇ／ｍｌとなるようにトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）で溶液調製したものを使用した。実施例２、実施例３、比較例１または比較例２で作製した共重合体溶液（トリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ＝７．４））とｐ−ＤＮＡ溶液を各Ｎ／Ｐ比を満たすように混和し、この溶液を室温暗所で一晩静置した。溶液は透明であり、凝集体、沈殿の生成は確認されなかった。なおＮ／Ｐ比とは［ブロック共重合体中のカチオン残基の濃度］／［ｐ−ＤＮＡ中のリン酸基濃度］であるが、実施例３で作製したＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴに限り一級アミノ基のみの濃度で計算している。
【実施例５】
【００７２】
電気泳動によるキャラクタリゼーション
０．９ｗｔ％のアガロースゲルを調整し、ｐ−ＤＮＡ濃度＝０．１７μｇ／ｌａｎｅ、泳動バッファーはトリス−塩酸緩衝液（３．３ｍＭ、ｐＨ＝７．４）を用い、引加電圧５０Ｖ、泳動時間２時間の条件で泳動を行った。終了後、エチジウムブロマイド溶液（０．５ｍｇ／ｌ）で１時間染色を行った。
【００７３】
図１にＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡの混合溶液の結果、図２にＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡの混合溶液の結果を示す。共にＮ／Ｐ比＞１においてフリーのｐ−ＤＮＡに起因するバンドは消失しており、ＰＩＣミセルの形成が示唆された。またＮ／Ｐ比の定義の仕方から考えて、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴでは会合体の形成にはブロック共重合体中の一級アミンが主として関与し、二級アミンは殆ど関与していないことが示唆された。会合体中では二級アミンが脱プロトン状態で系中に残留しており、バッファー能を維持していると考えることができる。
【実施例６】
【００７４】
動的光散乱法（ＤＬＳ）によるキャラクタリゼーション
粒径測定を動的光散乱によって行った。結果を図３〜６に示す。図３、４はＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡの混合溶液についての結果であり、図５、６はＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡの混合溶液についての結果である。図３、５はＮ／Ｐ比が１の時の粒度分布の図であり、図４、６は種々のＮ／Ｐ比における粒径測定の結果である。これらの結果から、どちらの系も粒径が８０〜１００ナノメータの単峰性の会合体粒子を形成しており、Ｎ／Ｐ比にかかわらずほぼ一定の粒径の値を示すことがわかる。
【実施例７】
【００７５】
ゼータ電位測定によるキャラクタリゼーション
ゼータ電位測定の結果を図７、８に示す。図７はＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡの混合溶液についての結果であり、図８はＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡの混合溶液についての結果である。どちらの系も、Ｎ／Ｐ比の上昇に伴い若干正の電荷を帯びる傾向が見られるものの、絶対値は非常に小さく、ほぼ０ｍＶに近いゼータ電位を示した。このことは形成された会合体粒子の表面が電気的に中性に近いということであり、表面にＰＥＧ層を有し、内核にポリイオンコンプレックスを有するコア−シェル型のミセル構造であることを示唆するものである。
【実施例８】
【００７６】
エチジウムブロマイドアッセイによるキャラクタリゼーション
ＰＩＣミセル内部のｐ−ＤＮＡの凝縮の程度を、エチジウムブロマイドアッセイにより評価した。５９０ｎｍの蛍光強度は、ミセル内部のｐ−ＤＮＡの凝縮の度合いを反映している。すなわち、蛍光強度が高いほどｐ−ＤＮＡは緩和された（フリーな）状態であり、蛍光強度が低いほど凝縮した状態にあると言える。なお、プロットにおいては、所定の濃度のｐ−ＤＮＡにエチジウムブロマイドを加えた時の５９０ｎｍの蛍光強度を１００と規格化し、それに対する相対強度としてプロットしている。
【００７７】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなるミセルについての測定結果を図９に示す。Ｎ／Ｐ比の上昇に伴い蛍光強度が若干減少していく傾向は見られるが、Ｎ／Ｐ＝１０においても約７０という値を示した。従来研究されてきたブロック共重合体と比べて、この値は非常に高い値である（通常、ポリリシンなどのＤＮＡを効率よく凝縮させるポリカチオンを用いた場合には、相対蛍光強度はＮ／Ｐ＞１で５程度まで減少する。）。
【００７８】
また、生理的濃度（１５０ｍＭ）の食塩を添加した系で同様に測定を行った結果を図１０に示す。相対蛍光強度はさらに１００に近づき、ミセル内のｐ−ＤＮＡがフリーのｐ−ＤＮＡとほぼ同じ程度まで緩和状態であることがわかる。実際に培養細胞、生体内にミセルを投与する場合には図９よりも図１０に示す結果の状態の方がより近い条件であると考えられる。
【００７９】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡからなるミセルについての測定結果を図１１に示す。Ｎ／Ｐ比が０〜２までの間は、Ｎ／Ｐ比の上昇に伴い急激な蛍光強度の減少が見られ、Ｎ／Ｐ比が２〜１０の間においても、緩やかに蛍光強度が減少していく傾向が見られた。
【実施例９】
【００８０】
遺伝子導入効率の評価
Ｎ／Ｐ＝５でＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡのミセルを調製し、これを培養細胞（２９３Ｔ細胞）と一定時間接触させた後、培地交換を行い、さらに２４時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイ、タンパク質の定量によって遺伝子導入効率を評価した。結果を図１２に示す。ミセルと細胞の接触時間が４時間の場合と２４時間の場合を比較すると、接触時間の延長により飛躍的に遺伝子導入効率が向上しているのがわかる。これは、ミセル中に内包された遺伝子のリリース速度の変化に起因するものであると考えられる。
【００８１】
ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴについては、比較例１、２で作製したＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＭＡＰＡおよびＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＡＰを比較対照試料として評価を行った。ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴは一級アミンと二級アミンを同時に有するもの、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＭＡＰＡは三級アミンのみを有するもの、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＡＰは一級アミンのみを有するものである。三種類の共重合体それぞれとｐ−ＤＮＡのミセルをＮ／Ｐ＝１０で調製し、これらを培養細胞（２９３Ｔ細胞）と２４時間接触させた後、培地交換を行い、さらに２４時間培養した後、ルシフェラーゼアッセイ、タンパク質の定量によって遺伝子発現効率を評価した。結果を図１３に示す。ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴは他の二種類の共重合体に比べ高い遺伝子導入効率を示した。これはコンプレックス形成に関与するアミン（一級）とバッファー能を発揮することが期待されるアミン（二級）とを、一つの共重合体中に導入することによって、細胞内に取り込まれたＰＩＣミセルに内包されたＰ−ＤＮＡの細胞質への移行が、プロトンスポンジ効果によって促進されたことに起因するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡの種々のＮ／Ｐ比で混和した溶液の電気泳動の結果（それぞれ、左から、Ｎ／Ｐ比：０、１０、５、４、３、２、１、０）を示す図に代わる写真である（なお、Ｎ／Ｐ＝０とは、ｐ−ＤＮＡのみを泳動したレーンを指す。）。
【図２】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡの種々のＮ／Ｐ比で混和した溶液の電気泳動の結果（それぞれ、左から、Ｎ／Ｐ比：１０、５、３、２、１、０．５、０．２５、０）を示す図に代わる写真である（なお、Ｎ／Ｐ＝０とは、ｐ−ＤＮＡのみを泳動したレーンを指す。）。
【図３】動的光散乱（ＤＬＳ）により測定されたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなる会合体の粒度分布を示すグラフである。
【図４】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなる会合体の粒径のＮ／Ｐ比依存性の測定結果を示すグラフである。
【図５】動的光散乱（ＤＬＳ）により測定されたＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡからなる会合体の粒度分布を示すグラフである。
【図６】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡからなる会合体の粒径のＮ／Ｐ比依存性の測定結果を示すグラフである。
【図７】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなる会合体のゼータ電位測定結果を示すグラフである。
【図８】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡからなる会合体のゼータ電位測定結果を示すグラフである。
【図９】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなる会合体のエチジウムブロマイドアッセイの結果（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４）を示すグラフである。
【図１０】生理塩濃度条件下におけるＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなる会合体のエチジウムブロマイドアッセイの結果（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４）を示すグラフである。
【図１１】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴとｐ−ＤＮＡからなる会合体のエチジウムブロマイドアッセイの結果（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４）を示すグラフである。
【図１２】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＭＯＰＡとｐ−ＤＮＡからなる会合体ミセル（Ｎ／Ｐ＝５）の２９３Ｔ細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである（それぞれ、４時間および２４時間インキュベーションによる。）。
【図１３】ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＥＴ、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＭＡＰＡまたはＭｅＯ−ＰＥＧ−ＤＡＰとｐ−ＤＮＡからなる会合体ミセル（Ｎ／Ｐ＝１０）の２９３Ｔ細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである（２４時間インキュベーションによる。）。
【図１】
2004352972.tif 000018
【図２】
2004352972.tif 000019
【図３】
2004352972.tif 000020
【図４】
2004352972.tif 000021
【図５】
2004352972.tif 000022
【図６】
2004352972.tif 000023
【図７】
2004352972.tif 000024
【図８】
2004352972.tif 000025
【図９】
2004352972.tif 000026
【図１０】
2004352972.tif 000027
【図１１】
2004352972.tif 000028
【図１２】
2004352972.tif 000029
【図１３】
2004352972.tif 000030