(57)【要約】      （修正有）【課題】イカ由来のミオシン分解性新規酵素の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列から成るヤリイカ及びスルメイカの内臓由来のミオシン分解酵素のうち、ＩＩ型のミオシン分解酵素、好ましくはミオシン重鎖、特にウサギ骨格筋ミオシン重鎖の１０９８位のＧｌｕと１０９９位のＡｓｐの間を特異的に切断するミオシナーゼＩＩまたはその変異体、及びそれをコードする核酸配列、及び該ミオシン分解新規酵素の製造方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列から成るイカ由来ミオシン分解酵素、または配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列から成るミオシン分解酵素活性を有するその変異体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列から成るイカ由来ミオシン分解酵素をコードするＤＮＡ；
配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列から成るミオシン分解酵素活性を有するイカ由来ミオシン分解酵素変異体をコードするＤＮＡ；
配列番号２の塩基配列から成る群から選ばれるＤＮＡ；
配列番号２の塩基配列から成る群から選ばれるＤＮＡにおいて１もしくは複数個のヌクレオチドの欠失、付加及び／もしくは置換により修飾されている、ミオシン分解酵素活性を有するイカ由来ミオシン分解酵素変異体をコードするＤＮＡ；又は
上記ＤＮＡのいずれかと高ストリンジェントな条件下でハイブリダーゼーション可能なＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡとベクター断片とを結合させてなる発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを、宿主となる微生物、動物細胞又は植物細胞に導入してなる形質転換体。
【請求項５】
請求項４に記載の形質転換体を培養することを特徴とする、イカ由来組換えミオシン分解酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規のイカ由来のミオシン重鎖（ＭＨＣ）特異的分解酵素（ミオシナーゼ）及びそれらをコードする核酸配列を提供する。
【０００２】
【従来の技術】
中性のｐＨでミオシンを加水分解する酵素としては、カテプシンＢ、Ｈ、Ｌ、Ｄやカルパインなど、様々な酵素が知られている。スルメイカ外套膜筋には、酸性領域で活性をもち、細胞内のリソソーム系で働いていると考えられるカテプシンＤ様プロテアーゼ、酸性システインプロテアーゼ、中性領域で活性をもち、細胞質で働いていると考えられているカルシウム依存性プロテアーゼ等、様々なプロテアーゼの存在が知られている。このようなプロテアーゼの他に、スルメイカ外套膜筋には、中性のｐＨで金属イオン依存的にミオシンを分解する酵素（ミオシナーゼ）が複数存在していることが示唆されている（Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｑｕｉｄ  ｍａｎｔｌｅ  ｍｕｓｃｌｅ，  Ｍｙｏｓｉｎａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  Ｍｙｏｓｉｎａｓｅ  ＩＩ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１６１，ｐｐ．９７−１０４）。かかるミオシン分解酵素はミオシンに対する基質特異性が高く、筋肉の代謝に関与していると考えられるが、その精製、特性決定がなされていなかったため、生体内での機能はほとんどわかっていない。このようなミオシン分解酵素の同定及び特性決定は、筋代謝機能の解明等の学術的な観点に加え、医薬、食品学的見地から極めて重要視される。
【非特許文献１】
Ｊ．Ｔａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２６，  ９６９−９７４（１９９９）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、イカ由来の中性ｐＨで金属イオン依存的にミオシンを分解する酵素、ミオシナーゼ、及びそれらをコードする核酸配列を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ヤリイカ及びスルメイカ内臓からミオシン分解酵素の単離に成功し、そのアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列の同定に成功した。その結果、イカミオシン分解酵素はその基質特異性に基づき下記の３種類のアイソフォームが存在することが明らかとなった。
【０００５】
【表１】
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本発明者により、ヤリイカ内臓にはミオシン分解酵素Ｉ（以下「ヤリイカミオシナーゼＩ」）及びＩＩＩ（以下「ヤリイカミオシナーゼＩＩＩ」）が存在し、スルメイカ外套筋や内臓にはミオシン分解酵素Ｉ（以下「スルメイカミオシナーゼＩ」）及びＩＩ（以下「スルメイカミオシナーゼＩＩ」）が存在することが解明された。
【０００６】
本発明は、上記各種ミオシン分解酵素のうち、ＩＩ型のミオシン分解酵素、好ましくはミオシン重鎖、特にウサギ骨格筋ミオシンの重鎖（ＭＨＣ）の１０９８位のＧｌｕと１０９９位のＡｓｐとの間を特異的に切断するミオシナーゼＩＩに関する。
【０００７】
従って、本発明は第一の態様において、配列番号１のアミノ酸配列から成るイカ由来ミオシン分解酵素、または配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列から成るミオシン分解酵素活性を有するその変異体、を提供する。
【０００８】
別の態様において、本発明は配列番号１のアミノ酸配列から成るイカ由来ミオシン分解酵素をコードするＤＮＡ；
配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／もしくは付加されたアミノ酸配列から成るミオシン分解酵素活性を有するイカ由来ミオシン分解酵素変異体をコードするＤＮＡ；
配列番号２の塩基配列から成る群から選ばれるＤＮＡ；
配列番号２の塩基配列から成る群から選ばれるＤＮＡにおいて１もしくは複数個のヌクレオチドの欠失、付加及び／もしくは置換により修飾されている、ミオシン分解酵素活性を有するイカ由来ミオシン分解酵素変異体をコードするＤＮＡ；又は
上記ＤＮＡのいずれかと高ストリンジェントな条件下でハイブリダーゼーション可能なＤＮＡ、を提供する。
【０００９】
また、本発明は上記ＤＮＡとベクター断片とを結合させてなる発現ベクター、当該発現ベクターを宿主となる微生物、動物細胞又は植物細胞に導入してなる形質転換体、更には当該形質転換体を培養することを特徴とするイカ由来の組換えミオシン分解酵素の製造方法を提供する。
【００１０】
スルメイカミオシナーゼＩＩのアミノ酸配列は配列番号１及び図１に示し、それをコードする塩基配列は配列番号２及び図２に示す。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
ミオシン分解酵素又はミオシナーゼとは、上述の通り筋肉タンパク質ミオシンの重鎖を特異的に分解する活性を有する酵素をいい、イカ類中に存在する中性メタロプロテアーゼである。本発明者は以前にヤリイカに由来するミオシナーゼＩ及びＩＩの単離精製に成功し、それぞれの部分アミノ酸配列を特定することができた（Ｊ．Ｔａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｍｙｏｓｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｐｅａｒ  Ｓｑｕｉｄ  Ｌｉｖｅｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １２６，  ｐｐ．９６９−９７４）。今回、本発明者はスルメイカにおいて、ウサギＭＨＣを基質とし、ＭＨＣのＧｌｕ  １０９８−Ａｓｐ  １０９９を特異的に切断する新規のＩＩ型ミオシナーゼの単離精製に成功し、またそのアミノ酸配列及びコード塩基配列を特定するに至った。
【００１２】
ミオシンは哺乳動物をはじめ、魚介類、甲殻類等の筋肉中の主たる構造タンパク質で、骨格筋では筋原線維の全タンパク質の約４５％を占める。
【００１３】
イカ類からのミオシン分解酵素の単離精製は本研究室においてはじめて成功が収められたものである。ヤリイカからのミオシン分解酵素の精製は（Ｊ．Ｔａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）前掲）に記載の方法に従い行うことができる。簡単には、ヤリイカの内臓をまず水性溶液による抽出工程にかけて粗酵素溶液を獲得し、次いで硫安分画、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、コバルト金属キレートクロマトグラフィー及び亜鉛金属キレートクロマトグラフィー、ゲル濾過ＨＰＬＣといった一連の操作にかけ、単離精製することができる。
【００１４】
スルメイカからのミオシン分解酵素の単離精製は後述の実施例、実験６に記載の通りに実施でき、簡単には、例えばスルメイカの内臓をまず水性溶液による抽出工程にかけて粗酵素溶液を獲得し、次いで硫安分画、陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、亜鉛キレートクロマトグラフィー、ゲル濾過ＨＰＬＣの一連の操作にかけることで達成できる。
【００１５】
上述した通り、本発明は配列番号１のアミノ酸配列から成るイカ由来ミオシン分解酵素、即ちミオシナーゼＩＩまたはその変異体、更には当該酵素又はその変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１６】
本発明に係るミオシナーゼＩＩ及びその変異体は様々な方法で調製することができる。例えば、スルメイカから実施例に記載の方法に従い単離精製することで調製することができる。
【００１７】
配列番号１のアミノ酸配列情報は、ミオシナーゼＩＩをコードする核酸分子の単離を可能にする。これは、抗ミオシナーゼＩＩ抗体を用いて、当業界で周知の方法にしたがって選定の種からのｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより成し遂げ得る。あるいは、配列番号１の一部または全部をコードする一連の縮重オリゴヌクレオチドプローブをｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。
【００１８】
配列番号２の塩基配列から成るＤＮＡまたはその変異体が精製又は合成できたなら、それをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ベクター、例えばｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５中でクローニングし、その後、適切な無細胞翻訳系、例えば小麦肺がまたはウサギ網状赤血球中で無細胞翻訳させることができる。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳系は、例えばＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎまたはＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄから市販されている。ｐＣＩＴＥｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系（Ｎｏｖａｇｅｎ）も利用され得る。
【００１９】
好適には、適切な原核生物または真核生物系での発現により、大量のタンパク質を製造することができる。例えば、ミオシナーゼＩＩをコードするＤＮＡ分子の一部または全体を、細菌細胞（例えば大腸菌）、酵母細胞（例えばビール酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は哺乳類細胞内での発現に適したベクターの中に挿入してよい。このようなベクターは、宿主細胞中でのＤＮＡの発現に必要な調節因子を、宿主細胞中での当該ＤＮＡの発現を可能とする態様において含む。発現に必要とされるこのような調節因子には、プロモーター配列、転写開始配列、その他任意的なエンハンサー配列が挙げられる。
【００２０】
原核生物または真核生物系における遺伝子発現により産生される組換ミオシナーゼＩＩは、当業界既知の方法により精製し得る。好ましい実施態様では、市販の発現／分泌系が用いられ、それにより組換タンパク質が発現され、その後、宿主細胞から分泌され、周囲媒質から容易に精製し得る。発現／分泌ベクターが用いられない場合、代替的アプローチは、アフィニティー分離により、例えば組換え体タンパク質と特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用により組換え体タンパク質を精製することを包含する。このような方法は、当業者により一般に用いられる。
【００２１】
ＤＮＡ分子
一旦塩基配列情報が得られれば、ミオシナーゼＩＩをコードする核酸分子は、２つの一般的方法により調製され得る：即ち、（１）それらを適切なヌクレオチド三リン酸塩から合成する、または（２）それらを天然資源から単離する。両方法は、当業界周知のプロトコールを利用する。
【００２２】
塩基配列情報は、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の調製を可能にする。合成オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８Ａ  ＤＮＡ合成機または同様の装置で用いられるホスホロアミダイト法により調製し得る。その結果作製される構築体は、当業界で既知の方法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し得る。長い二本鎖ポリヌクレオチド、例えば本発明のＤＮＡ分子は、一般のオリゴヌクレオチド合成法に固有なサイズによる制限を理由に、段階的に合成されねばならない。したがって、例えば長い二本鎖分子は、適切な相補性を有するいくつかの小型セグメントとして合成してよい。このように生成された相補的セグメントを、各セグメントが隣接セグメントの結合のための適切な付着末端を保有するよう、アニーリングしてよい。隣接セグメントは、ＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニーリングすることによりライゲーションさせて、全長二本鎖分子を構築することができる。そのようにして構築した合成ＤＮＡ分子を次にクローニングし、適切なベクター中で増幅させてよい。
【００２３】
ミオシナーゼＩＩをコードする核酸分子は、当業界周知の方法を用いて、イカ類をはじめ、様々な生物から単離され得る。選定の種からの核酸分子は、ミオシナーゼＩＩをコードする遺伝子に特異的な核酸配列に適合するよう設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離し得る。ある種からの遺伝子が望ましい場合には、ゲノムライブラリーがスクリーニングされる。あるいは、タンパク質コード配列が特定当該物を有する場合には、ｃＤＮＡライブラリーがスクリーニングされる。１より多くの核酸残基が適切なアミノ酸残基をコードするために用い得る縮重の位置では、すべての適切な核酸残基が組入れられて、混合オリゴヌクレオチド集団を作製するか、または中性塩基、例えばイノシンを用い得る。オリゴヌクレオチド設計の戦略は、当業界で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹも参照）。
【００２４】
本発明に従うと、適切なストリンジジェンシーを有するハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることにより、ミオシナーゼＩＩをコードする核酸分子と適当な配列相同性を有する核酸が同定し得る。例えばハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９、上記）の方法にしたがって、５ｘＳＳＣ，５ｘデンハード試薬、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリンサンナトリウムおよび５０％までのホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて実施し得る。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で少なくとも６時間実行される。ハイブリダイゼーション後、フィルターを以下のように洗浄する：（１）２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で室温で５分間、（２）２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で室温で１５分間、（３）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で３７℃で３０分〜１時間、（４）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で６５℃で２時間。
好ましくは、ハイブリダイゼーションは３７℃、最終洗浄は４２℃、さらに好ましくは、ハイブリダイゼーションは４２℃、最終洗浄は５０℃、最も好ましくは、ハイブリダイゼーションは４２℃、最終洗浄は６５℃で行うことができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、主に溶液の塩濃度および温度に依存する。概して、標的に対するプローブのアニーリングの速度を最大にするために、ハイブリダイゼーションは通常は、ハイブリッドの算定Ｔｍより２０〜２５℃低い塩および温度条件で実行される。洗浄条件も、標的に対するプローブの同一性の程度を考慮して、同様にストリンジェントにすべきであろう。概して、洗浄条件は、ハイブリッドのＴｍより約１２〜２０℃低くなるように選定される。本発明の核酸に関しては、中ストリンジェントハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，５ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびに２ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で５５℃で１５分の洗浄と定義し得る。高ストリンジェントハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，５ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびに１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６５℃で１５分の洗浄と定義し得る。超高ストリンジェントハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ，５ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃でのハイブリダイゼーション、ならびに０．１ｘＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中で６５℃で１５分の洗浄と定義し得る。
【００２６】
本発明に係る発現ベクターとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、酵母由来プラスミド、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等の動物ウィルスの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ｐＲＣ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。本発明においては市販のベクター、ｐＥＴ２３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の使用が特に好ましい。
【００２７】
本発明に係るＤＮＡを含む発現ベクターは、本発明に係る遺伝子を適当なベクターのプロモーターの下流に、適当な制限部位を介して周知の方法で連結することにより製造できる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に制限されない。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、β−アクチンプロモーター等が挙げられる。宿主が大腸菌等のエシェリヒア属の細菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等、宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎプロモーター、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等を用いるのが好ましい。宿主が昆虫の場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター等が好ましい。
【００２８】
所望により、発現ベクターには更にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点、等を含んでよい。
【００２９】
宿主細胞には、組換タンパク質を産生するための宿主として従来から利用されている原核又は真核細胞のいずれでもよく、例えば限定することなく、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は真菌細胞であり、そして好ましくは細菌又は真菌の如き微生物である。「真菌」なる語は糸状菌及び酵母を包含することを意図する。適当な細菌の例はバチルス属、例えばバチルス・スブチリス、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、例えばストレプトマイセス・リビダンス（Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ）等のグラム陽性菌、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、例えば大腸菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、例えばシュードモナス・セパシア（Ｐ．  ｃｅｐａｃｉａ）等のグラム陰性菌が挙げられる。また、この細胞は真菌、即ち酵母又は糸状菌の細胞であってもよい。酵母は例えばサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の細胞、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であってよい。糸状菌宿主生物は例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種の株、例えばＡ．ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）であってよい。昆虫細胞としては、例えばＳｆ細胞、ＭＧ１細胞、ＢｍＮ細胞等が挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞ＣＯＳ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ等が挙げられる。本発明においては大腸菌細胞を利用するのが特に好ましい。
【００３０】
宿主細胞の形質転換は周知の方法、例えば塩化カルシウム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、リポフェクチン法、プロトプラストポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法等が利用でき、利用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい。
【００３１】
得られる組換宿主細胞を適当な培養培地で培養し、培養液から、慣用の手順、例えば限定することなく、遠心又は濾過により培養液から細胞を分離させ、必要に応じて細胞を破壊し、硫酸アンモニウムの如き塩により上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿させ、次いで様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を行うことにより目的の蛋白質を回収することができる。
【００３２】
所望により、本発明のミオシナーゼＩＩ又はその変異体をコードするＤＮＡの上流に分泌のための微生物用又は動物用の適当なシグナル配列を接続すれば、当該ミオシナーゼＩＩ又はその変異体を培地中に分泌発現させることもできる。このような分泌型に改変したＤＮＡは、培地中に分泌した当該ミオシナーゼＩＩ又はその変異体の精製を容易にする点で有用である。かかるシグナル配列の例としては、大腸菌の場合ｐｅｌＢシグナル（Ｓ．Ｐ．Ｌｅｉ  ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １６９：４３７９−４３８３，  １９８７）、酵母の場合α因子シグナル（Ａ．Ｊ．  Ｂｒａｋｅ，  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ｐ２６９  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  １９８９）、動物細胞の場合イムノグロブリンのシグナルＳＧ−１（Ｈ．Ｍａｅｄａら、Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，  ２：１２４−１３４，  １９９１）、Ｃ２５のシグナル（ＷＯ９４／２０６３２）等が挙げられる。
【００３３】
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例等により、本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００３４】
【実施例】
実験１  ヤリイカからのミオシン分解酵素の分離精製
ヤリイカ内臓５杯分２０ｇに約５倍重量の抽出バッファー（８０ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ４（ｐＨ７．２）、１  ｍＭ  ＰＭＳＦ、１  ｍＭ  ＭＩＡ（モノヨード酢酸）、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０  μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ、１０  μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ  ｐＡＰＭＳＦ）を加え、プレート振とう機上で一晩振とうし、ナイロンゴースでろ過し、ろ液として、１５０ｍｌの粗酵素溶液を得た。
【００３５】
これを飽和硫安濃度  ３５−５５重量％で塩析分画したところ、硫安分画後試料１３０ｍｌを得た。これを陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ５５０Ｃ  （東ソー（株））カラム（２４ｍｍ×１３ｃｍ）；０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ−２０  ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ４  （ｐＨ  ６．５）→０．５  Ｍ  ＮａＣｌ−２０  ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ４  （ｐＨ  ６．５）  の塩濃度勾配溶出；溶出液を６ｍｌずつフラクションコレクターで分取）にかけ、試料は主に３つのピークに分画された。それぞれの画分のＭＨＣ  分解活性を測定したところ、活性は第２ピークと第３ピークの間に見られた。活性のあったフラクション１２−３２を集めた。また、フラクション６８−７７も集めた。
【００３６】
この試料をヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ｔｙｐｅ，  １００  −  ２００  ｍｅｓｈ  （ナカライテスク）カラム（１６ｍｍ×１７ｃｍ））に添加し、５０  ｍＭ  →  ５００  ｍＭのＫ−ＰＯ４濃度勾配で溶出させ、溶出液を３ｍｌずつフラクションコレクターで分取したところ、試料は主に３つのピークに分画された。活性は第１ピークのあたりに認められ、活性のあったフラクション  １４−３２  を集めた。
【００３７】
この試料を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにかけた。金属キレートアフィニティークロマトグラフィーは以下の通りに行なった。Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）  をカラム（１．６ｍｍ×５ｃｍ）を２本用意し、一方のカラムには精製水→０．１  Ｍ  ＣｏＣｌ２→精製水、他方のカラムには精製水→０．１  Ｍ  ＺｎＣｌ２→精製水の順で添加して各金属イオンをキレートさせ、コバルトキレートカラム及び亜鉛キレートカラムを作製した。０．５Ｍ  ＮａＣｌ−５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ  ７．５５）でカラムを平衡化し、コバルトキレートカラム→亜鉛キレートカラムの順番でカラムを連結し、さらに平衡化した。ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー後の試料に最終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）  になるように  ＣＨＡＰＳ  を加え、流速  １．１  ｍｌ／ｍｉｎ  でカラムに添加した。平衡化バッファーで洗浄後、カラムを分離し、それぞれのカラムの吸着画分を０．５Ｍ  ＮａＣｌ−５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ  ４．８）でステップ溶出させた。溶出液を２ｍｌずつフラクションコレクターで分取し、２８０  ｎｍ  における吸光度、及びＭＨＣ分解活性を測定した。活性画分を集め、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー後の試料とした。その結果、コバルトをキレートさせたゲル及び亜鉛をキレートさせたゲルそれぞれに別々のミオシン分解酵素が吸着することがわかった。亜鉛をキレートさせたゲルに吸着するミオシン分解酵素をヤリイカミオシナーゼＩ、コバルトをキレートさせたゲルに吸着するミオシン分解酵素をヤリイカミオシナーゼＩＩＩとした。なお、素通り画分にもまだヤリイカミオシナーゼＩ活性が見られることから、ヤリイカミオシナーゼＩの亜鉛キレートゲルとの親和性はあまり高くないことがわかった。活性のあったフラクション４−８（コバルトキレートカラム、ヤリイカミオシナーゼＩＩＩ），  ４−７  （亜鉛キレートカラム、ヤリイカミオシナーゼＩ）を集めた。
【００３８】
これらをそれぞれ濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ  （東ソー（株））カラム；０．３Ｍ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  （ｐＨ  ７．２））に添加したところ、両者とも最初に溶出される分画範囲外のピークを除くと、ほぼ単一のピークを示し、活性のあったフラクションは８−１８（ヤリイカミオシナーゼＩ）、９−２１（ヤリイカミオシナーゼＩＩ）となり、メインピークと一致した。各フラクションを電気泳動し、銀染色したところ、活性画分は約４５ｋＤａの単一バンドを示した。また、各精製段階の試料を電気泳動し、銀染色した結果、ヤリイカ内臓由来ミオシン分解酵素ＩとＩＩＩの二種類のミオシン分解酵素が存在し、両者の分子量は約４５ｋＤａであることが確認された。
【００３９】
実験２  ヤリイカミオシナーゼＩのＮ 末端アミノ酸配列の決定
ヤリイカミオシナーゼＩをアミノ酸シークエンサーによって解析した結果、Ｎ末端アミノ酸配列は、Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｇｌｎ（配列番号３）と決定された。
【００４０】
実験３  ヤリイカミオシナーゼＩＩＩのＮ末端アミノ酸配列の推定
ヤリイカミオシナーゼＩＩＩをアミノ酸シークエンサーによって解析した結果、Ｎ末端アミノ酸配列は、Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｘａａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ（配列番号４）と決定された。
【００４１】
実験４  ヤリイカミオシナーゼＩのアミノ酸配列決定
実験１で単離精製したヤリイカミオシナーゼＩをリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬（株））で１５時間かけて消化し、その消化産物の配列決定を行い、途中配列Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号５）が決定された。その配列とヤリイカミオシナーゼＩの上記  Ｎ末の配列から以下に示すプローブ＜Ｍａｓｅ−Ｉ−３，  ４＞を設計し、ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行った（Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｖｅｒｓｉｏｎ（宝酒造）；９４℃  １  ｍｉｎ，  ５４℃  ３０  ｓｅｃ，  ７２℃  １  ｍｉｎ３５サイクル）：
2004166657.tif 000004
得られた約４２０  ｂｐの増幅産物（クローンＴＴ１）は５’側ｃＤＮＡ配列７５  ｂｐのうちプライマーの内側４１  ｂｐ全てが上記アミノ酸配列決定の結果と一致した（図３）。従って、この増幅産物がヤリイカミオシナーゼＩに由来し、その結果ヤリイカミオシナーゼＩのＮ末端側１４５残基を決定することができた。
【００４２】
次に、この増幅産物のクローンをプローブにして、ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニングを行った。用いたｃＤＮＡライブラリーのタイターはおよそ１×１０５プラーク／ｍｌであった。スクリーニングでは約１０万個のクローンを調べることによりミオシン分解酵素Ｉを含むと思われる９個のクローンを得た。それらのクローン名をＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４とした。インサートの入ったベクターをＥｃｏ  ＲＩにより酵素処理しアガロース電気泳動でインサートの大きさを確認した。すべてのクローンを両側から塩基配列を確認するとそのうち７クローンがヤリイカミオシナーゼＩ遺伝子を含んでいることが分かった。そこで７クローンのうち最も５’側が長く延びていたクローンＡ５の全長の塩基配列を決定し、その塩基配列を図４に示した。ヤリイカミオシナーゼＩ遺伝子は開始コドンから終止コドンまで１２９６ｂｐであり、アミノ酸にして４３２残基であった（図５）。
【００４３】
実験５  ヤリイカミオシナーゼＩＩＩのアミノ酸配列決定
ヤリイカミオシナーゼＩＩＩの部分配列の決定
ヤリイカミオシナーゼＩＩＩのｃＤＮＡをクローニングし全一次構造を決定することを目的として、まずはヤリイカミオシナーゼＩＩＩの部分配列を決定した。
上記実験３に従い決定されたヤリイカミオシナーゼＩＩＩのＮ末端アミノ酸シークエンス及び実験４に記載のヤリイカミオシナーゼＩをコードする塩基配列をもとに５’プライマーとして＜ＭａｓｅＩＩＩ−６＞を作製した：
2004166657.tif 000005
【００４４】
３’側プライマーとしては＜ＭａｓｅＩＩＩ−３＞（配列番号９）を、ヤリイカミオシナーゼＩの塩基配列（図４）と、スルメイカ肝臓ｃＤＮＡ由来の部分塩基配列（スルメイカ肝臓由来ｃＤＮＡプールを鋳型とし、上記プローブ＜Ｍａｓｅ−Ｉ−３，  ４＞（配列番号６，７）をプローブとして用いて行なうＰＣＲにより得られた約９００  ｂｐの増幅産物（配列番号１５；後述の実験６参照）とで相同性の高い部分を選んで作製した。
2004166657.tif 000006
【００４５】
作製したプライマー＜ＭａｓｅＩＩＩ−６＞（配列番号８）、＜ＭａｓｅＩＩＩ−３＞（配列番号９）を用いてヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡ  ｐｏｏｌを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた増幅産物約５００  ｂｐ（図６〜７）をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、塩基配列を決定した。決定した塩基配列から５’側プライマー＜ＭａｓｅＩＩＩ−４＞（配列番号１０）を設計した。
2004166657.tif 000007
【００４６】
ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡ  ｐｏｏｌより＜ＭａｓｅＩＩＩ−４＞（配列番号１０）、＜ＡＤＡ  プライマー＞（配列番号１１）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、得られた増幅産物約７００  ｂｐをｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒに組み込み、その塩基配列を決定した。
2004166657.tif 000008
【００４７】
得られた産物は、上記決定されたヤリイカミオシナーゼＩＩＩのＮ末端及び部分アミノ酸配列を含んでいたため、これがヤリイカミオシナーゼＩＩＩ由来であることが確認された。
【００４８】
ヤリイカミオシナーゼ  ＩＩＩのスクリーニング
次に、ヤリイカミオシナーゼＩＩＩの全一次構造を決定し、更なる解析を行うため上記の通り＜ＭａｓｅＩＩＩ−６＞（配列番号８）、＜ＭａｓｅＩＩＩ−３＞（配列番号９）を用いて得られた約５００  ｂｐの増幅産物（図６〜７）をプローブにして、ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニングを行った。ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーはヤリイカの肝臓から全ＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡ精製を行い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、Ｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ，  Ｃｏｔ．ＮＯ．  １８０９０−０１９）、λ−ＺＡＰ  ＩＩ／ＥＣＯ  ＲＩ／ＣＩＡＰ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ，  Ｃｏｔ．ＮＯ．  ＳＣ２３６２１１）、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ，  Ｃｏｔ．ＮＯ．  ２００２０１）を用い、添付の説明書に従って作製した。
【００４９】
スクリーニングでは約２万個のクローンを調べる事によりヤリイカミオシナーゼ  ＩＩＩ  ｃＤＮＡを含むと思われる４個のクローンを得た。それらのクローン名をＡ１１、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２５とした。得られたクローンの挿入断片の両端の塩基配列を決定し、比較したところ、クローンＡ２５に５’側が最も長く延びている断片が挿入されていると判断した。そのクローンＡ２５の５’側から塩基配列を決定したところ既に決定した部分配列と数百  ｂｐが一致したので、この部分を重ねヤリイカミオシナーゼ  ＩＩＩ  ｃＤＮＡ全長とした。
【００５０】
ヤリイカミオシナーゼＩＩＩ（クローンＡ２５）の塩基配列を図８に示した。ヤリイカミオシナーゼＩＩＩｃＤＮＡは開始コドンから終止コドンまで１２７２  ｂｐであり、推定アミノ酸は４２４  ａ．ａ．であった（図９）。またＳＭＡＲＴ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ：  ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−  ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）を用いてドメイン構造を解析したところ、ヤリイカミオシナーゼ  ＩＩＩはＭ１−Ｌ１９がシグナル配列、Ｒ５９−Ｅ２５２がプロテアーゼドメイン、Ｍ２６３−Ｃ４２４がＭＡＭ  ドメインであった。また、Ｑ２０−Ｙ５１はプロ−配列であると推定された。そのプロ−配列の推定からヤリイカミオシナーゼＩＩＩの成熟タンパク質の分子量をＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｂｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ  Ｌｔｄ．）により計算したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予測されていた分子量と一致した。
【００５１】
実験６  スルメイカからのミオシン分解酵素の分離精製
スルメイカ５杯の内臓１００ｇを取り出し、８０ｍＭのＮａＰＯ４、０．０２％アザイド（バッファーＡ）（１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ３μｇ／ｍｌペプスタチンＡ，  ３μｇ／ｍｌロイペプチン、０．１ｍＭ  ｐＡＭＳＦインヒビター）２００  ｍｌ中で軽くほぐし、一晩抽出した。
【００５２】
次いで硫安を終濃度３５  重量％になるようにゆっくりと加え、１時間攪拌した。１２０００ｒｐｍで４０ｍｉｎ遠心した後、上清のみを取り出し、終濃度重量７５％になるように再び硫安を加えた。１時間攪拌した後、１２０００ｒｐｍで４０ｍｉｎ遠心し、沈殿を回収し、１００ｍｌバッファーＡ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ入り）に溶かした。バッファーＡ（１ｍＭ  ＥＤＴＡ入り）５ｌで２時間透析した後、溶液を交換し、さらに一晩透析した。
【００５３】
この透析物を、ＳＰ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ−５５０Ｃ（東ソー（株）１．３ｃｍ×２０ｃｍ）カラムに加え、吸光度が０．１になるまでバッファーＡで洗浄した。バッファーＡ及び０．６Ｍ  ＮａＣｌ含有バッファーＡ各々３００ｍｌで勾配溶出を行い、更に後者で１５０ｍｌ溶出した。溶出速度は１．５ｍｌ／ｍｉｎにし、９ｍｌずつフラクションコレクターで分取した。
活性のあった画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ＝６．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（バッファーＢ）、２０ｍＭＫＰＯ４バッファー（ｐＨ＝７．０）、０．０２％アザイド入り５ｌで２回、１．５  時間づつ透析し、さらに一晩透析した。
【００５４】
この透析試料をＡＦ−ブルートヨパール  ６５０ＭＬ（東ソー（株））カラムに加え、吸光度が０．１になるまでバッファーＢで洗浄した。バッファーＢとＫＣｌ  １．０Ｍ含有バッファーＢ各々１００ｍｌで勾配溶出し、更に後者で１００ｍｌ溶出した。溶出速度１．２ｍｌ／ｍｉｎで、９ｍｌずつフラクションコレクターで分取した。
【００５５】
フラクション１２−２０及び２０−３２のそれぞれに活性ピークが認められた。フラクション１２−２０ではウサギＭＨＣを基質とし、９０ｋＤａのフラグメントが認められたところから、ヤリイカミオシナーゼＩ活性に相当するミオシン分解酵素の存在が示唆され、スルメイカミオシナーゼＩとした。ウサギＭＨＣを基質とし、主に６５  ｋＤａのフラグメントが認められたフラクション２１−３４を透析し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ  バッファー  （ｐＨ  ７．５）  ５  ｌで２時間、次いで一晩、そしてさらに２時間透析した。
【００５６】
ウサギＭＨＣを基質とし、フラクション１２−２０及び２０−３２それぞれに含まれる酵素の基質切断部位を調べたところ、フラクション１２−２０はＭＨＣのＡｌａ  １１５９−Ｔｈｒ  １１６０間を特異的に切断し、フラクション２０−３２はＭＨＣのＧｌｕ  １０９８−Ａｓｐ  １０９９を特異的に切断することがわかった。
【００５７】
この透析試料を亜鉛−キレートＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＵＳＡ）カラムに加え、吸光度が０．０１になるまで５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌバッファー（ｐＨ  ７．５）で洗浄した。溶出速度１．２  ｍｌ／ｍｉｎで５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＨ３ＣＯＯＨ  バッファー（ｐＨ４．８）で溶出した。活性のある画分を限外ろ過で０．５  ｍｌまで濃縮した。
【００５８】
上記試料を０．３Ｍ  ＮａＣｌ＋２０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ＰＨ  ７．２）でＴＳＫｇｅｌ  Ｇ２０００ＳＷ（東ソー（株））を用い分離した。溶出速度０．５  ｍｌ／  ｍｉｎで１  ｍｉｎずつ集めた。この精製ミオシン分解酵素をスルメイカミオシナーゼＩＩとした。
【００５９】
スルメイカミオシナーゼＩＩの途中配列のアミノ酸配列決定
ＰＶＤＦ膜状タンパク質の還元Ｓ−アルキル化、Ｓ−ビリジルエチル化とプロテアーゼ消化
精製されたスルメイカミオシナーゼＩＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、転移バッファー（１０  ｍＭ  ＣＡＰＳ，  ｐＨ  １１，  １０％  メタノール）で１０  ｍｉｎ  ｘ  ２洗い、１００  ｍＡ  ｘ  ２  ｈｒでペプチドシークエンス用ＰＶＤＦ膜（島津）に移した。ポンゾーＳで染色された精製物のバンドを切り取り、チューブに入れＭｅＯＨで湿らした。還元バッファー（８Ｍ  グルタチオン−ＨＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．３％  ＳＤＳ、５  ％アセトニトリル）３００μｌを２回加えＤＴＴ  １ｍｇを還元バッファー  ５０μｌに溶かし加え、チューブ内の空気を窒素に置換し、１時間放置した。４−ビニルピリジン  １．５μｌを加え、遮光状態で１５分間緩やかに撹拌した。チューブから膜を取り出し、水、２％  アセトニトリル、０．１％  ＳＤＳ、１０％  アセトニトリルがそれぞれ１００  ｍｌ入ったビーカーで撹拌し、洗った。チューブに膜を入れ、ＰＶＰ−４０溶液（０．５％  ＰＶＰ−４０、１００ｍＭ  アセトニトリル）  ５００μｌを加え、１ｍｇ  メチオニンを加え３０  ｍｉｎ静置した。１０％アセトニトリルで１５  ｍｉｎ洗ってから、１０％アセトニトリルを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中で１／１００モル量のリシルエンドペプチターゼ（和光純薬工業（株））で１５  時間消化した。
【００６０】
上記の消化産物から逆相カラム５Ｃ  １８−Ｐ（ナカライテスク）を用い、流速０．４  ｍｌ／ｍｉｎ、１ｍｉｎごとに分取し、Ａ液（０．１％  ＴＦＡ／水（ｐＨ２））、Ｂ液（０．１％  ＴＦＡ／８０％アセトニトリル＋水（ｐＨ２））により、０→２０  ｍｉｎ  Ａ液  １００％；２０→１４０  ｍｉｎ  Ａ液  １００％からＢ液  １００％に至る勾配溶出を行い、ペプチドを分離した。検出は２３０  ｎｍで行なった。
【００６１】
上記で得られたピークを３０μｌ程度まで減圧乾燥して、もしくは完全に凍結乾燥して３０μｌの２０  ％アセトニトリルに溶かしてから、島津ＰＳＱ−１アミノ酸シークエンサーにかけた。
【００６２】
その結果、途中配列が一カ所（Ｌｙｓ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号１２）と決定された。
【００６３】
スルメイカ肝臓由来ｃＤＮＡプールを鋳型とし、ヤリイカミオシナーゼの一次構造の決定に用いた前述のプローブ＜Ｍａｓｅ−Ｉ−３，  ４＞（配列番号６、７）（上記実験５）をプローブとして用いて行うＰＣＲにより約９００  ｂｐの増幅産物（配列番号１５）が得られた。尚、スルメイカ肝臓由来ｃＤＮＡプールは、まずｍＲＮＡ  精製をＤｙｎａｂｅａｄｓＯｌｉｇｏ  （ｄＴ）２５ｋｉｔを用い、添付の説明書に従って行い、次いで一本鎖  ｃＤＮＡ  合成を、１０  μｇのｍＲＮＡを９  μｌの超純水に溶かし、７０  ℃、１０分間熱した後、氷で急冷し、次いで５  Ｘ  ＲＴＣ  バッファー４  μｌ，  １０  ｐｍｏｌ／ｕｌ  ３’  プライマー１  μｌ，  Ｒｎａｓｉｎ  （和光純薬工業（株））  １  μｌ，  １５  ｍＭ  ｄＮＴＰ  １  μｌ，  ＲＡＶ−２  （宝酒造）  １  μｌを加え３７℃で１０  分間、４２℃で  ６０分間の反応を行い、９５℃で５分、氷上で５分放置後、８０  μｌのナノ超純水を加えることで作製した。プライマーは  ＡＤＡ  プライマー（配列番号１１）を用いた。
【００６４】
約９００  ｂｐの増幅産物（配列番号１５）の配列はスルメイカミオシナーゼＩＩの途中アミノ酸配列を含んでおらず、スルメイカミオシナーゼ  ＩＩの途中アミノ酸配列は上記プローブ相補部位のさらに上流にあると推定された。そこで、上記スルメイカミオシナーゼＩＩのアミノ酸配列、上記ヤリイカミオシナーゼＩ及びヤリイカミオシナーゼＩＩＩの塩基配列をもとに５’側プライマー＜ＭａｓｅＩＩ−９＞（配列番号１３）を、そして上記約９００  ｂｐの増幅産物をもとに３’側プライマー＜  ＭａｓｅＩＩ−５’ＲＡＣＥ−１＞（配列番号１４）を設計し、スルメイカ肝臓由来ｃＤＮＡ  ｐｏｏｌを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行い、約７５０  ｂｐ（配列番号１６）の塩基配列の増幅産物が得られた。
2004166657.tif 000009
【００６５】
しかしながら、その増幅産物に対応するタンパク質の存在はスルメイカにおいて確認されなかった。従って、さらにこの増幅産物をプローブとしてスルメイカ肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーよりスクリーニングを行った。スルメイカ肝臓由来ｃＤＮＡライブラリーはヤリイカの肝臓から全ＲＮＡ抽出、ｍＲＮＡ精製を行い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、Ｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ，  Ｃｏｔ．ＮＯ．  １８０９０−０１９）、λ−ＺＡＰ  ＩＩ／ＥＣＯ  ＲＩ／ＣＩＡＰ  Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ，  Ｃｏｔ．ＮＯ．  ＳＣ２３６２１１）、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ，  Ｃｏｔ．ＮＯ．  ２００２０１）を用い、添付の説明書に従って作製した。
【００６６】
スクリーニングでは約２万個のクローンを調べることにより１１個のポジティブクローンを得た。得られたクローンをＴ７とＴ３をプライマーとしてＰＣＲによりインサートを確認した。その結果１０クローンにインサートが確認された。インサートが確認された全てのクローンの両側をＤＮＡ配列決定して塩基配列を比較したところ、４クローンがスルメイカミオシナーゼＩＩであり、１クローンがスルメイカミオシナーゼＩであると考えられた。それらのクローン名をＴ１２、Ｔ２３、Ｔ２５、Ｔ２６、Ｔ１６とした。スルメイカミオシナーゼＩＩと考えられたクローン４つの中で最も５’側が長く延びていたクローンＴ１２とスルメイカミオシナーゼＩと考えられたクローンＴ１６の塩基配列を決定した。
【００６７】
クローンＴ１２（スルメイカミオシナーゼＩＩ）の塩基配列を配列番号２及び図２に示し、そしてクローンＴ１６（スルメイカミオシナーゼＩ）の塩基配列を図１０に示し。また、決定したそれぞれの塩基配列からアミノ酸を推定した（スルメイカミオシナーゼＩＩ：配列番号１及び図１；スルメイカミオシナーゼＩ：図１１）。アミノ酸を推定したところ、クローンＴ１２に関しては上記精製したスルメイカミオシナーゼＩＩのＮ末端アミノ酸配列及びスルメイカミオシナーゼＩＩの途中アミノ酸配列を含んでいたため、そのクローンがスルメイカミオシナーゼＩＩをコードしていることが確認された。クローンＴ１６に関してはヤリイカミオシナーゼＩに対しＭａｃ  ｖｅｃｔｏｒのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗでのアラインメントをかけた結果、アミノ酸にして７７％の相同性を示し、そのクローンがスルメイカミオシナーゼＩをコードしていると判断した。
【００６８】
スルメイカミオシナーゼＩＩ  ｃＤＮＡは開始コドンから終止コドンまで１２７５  ｂｐであり、推定アミノ酸は４２５  ａ．ａ．であった。スルメイカミオシナーゼＩ  ｃＤＮＡの全長は１２６６  ｂｐであり、推定アミノ酸にして４２２  ａ．ａ．であり、ヤリイカミオシナーゼ  Ｉと比較すると開始コドンのメチオニンまで約５残基足りず、開始コドン部位を含んでいないと考えられた。
【００６９】
ＳＭＡＲＴを用いてドメイン構造を解析した結果、スルメイカミオシナーゼ  ＩＩはＭ１−Ｖ１５がシグナル配列、Ｒ６０−Ｅ２５３がプロテアーゼドメイン、Ｔ２６９−Ｃ４２５がＭＡＭ  ドメインであった。スルメイカミオシナーゼ  Ｉに関してはＳＭＡＲＴの結果とヤリイカミオシナーゼ  ＩにおけるＳＭＡＲＴの結果からＳ１−Ｓ１２がシグナル配列、Ｒ５７−Ｅ２５０がプロテアーゼドメイン、Ｃ２６５−Ｃ４２２がＭＡＭ  ドメインであった。またスルメイカミオシナーゼＩＩ及びスルメイカミオシナーゼＩのＮ末アミノ酸配列の結果とシグナル配列の推定からスルメイカミオシナーゼＩＩ、ＩのそれぞれのＰ１６−Ｙ５２、Ｓ１３−Ｒ４８はプロ配列であると予測された。そのプロ配列の推定から成熟タンパク質の分子量をＤＮＡＳＩＳにより計算したところＳＤＳ  −ＰＡＧＥで予測されていた分子量と一致した。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によって、イカミオシン分解酵素及びそれをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るミオシナーゼＩＩの推定アミノ酸配列。
【図２】本発明に係るミオシナーゼＩＩの塩基配列。
【図３】プライマー＜Ｍａｓｅ−Ｉ−３＞、＜Ｍａｓｅ−Ｉ−４＞を用い、ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にしたＲＴ−ＰＣＲの増幅産物。
【図４】ヤリイカミオシナーゼＩの塩基配列。
【図５】ヤリイカミオシナーゼＩの推定アミノ酸配列。
【図６】プライマー＜ＭａｓｅＩＩＩ−６＞、＜ＭａｓｅＩＩＩ−３＞を用い、ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にして実施したＲＴ−ＰＣＲの増幅産物。
【図７】プライマー＜ＭａｓｅＩＩＩ−６＞、＜ＭａｓｅＩＩＩ−３＞を用い、ヤリイカ肝臓由来ｃＤＮＡを鋳型にして実施したＲＴ−ＰＣＲの増幅産物（図６の続き）。
【図８】ヤリイカミオシナーゼＩＩＩの塩基配列。
【図９】ヤリイカミオシナーゼＩＩＩの推定アミノ酸配列。
【図１０】スルメイカミオシナーゼＩの塩基配列。
【図１１】スルメイカミオシナーゼＩの推定アミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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