(57)【要約】【課題】培養時に細胞の機能が低下し難い細胞の播種方法、細胞の機能を長期にわたり維持できる細胞の培養方法、及び、生体内での機能を高度に維持している細胞培養物を提供する。【解決手段】容器内に入れた細胞に遠心力を加えることにより、細胞が高い接触状態ないしは高い接触頻度が保たれ、かつ、複数の細胞層からなる凝集体を容器内壁に形成する細胞の播種方法。凝集体は透過性膜上に形成することもできる。この凝集体を培養することにより、長期間にわたり細胞が持つ機能を良好に維持しつつ細胞を培養することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内に入れた細胞に遠心力をかけることにより容器内壁に複数細胞層からなる凝集体を形成する細胞の播種方法。
【請求項２】
容器が複数のウェルを有するものであり、１又は複数のウェル内に細胞を入れた状態で細胞に遠心力をかける請求項１に記載の細胞の播種方法。
【請求項３】
細胞が肝細胞である請求項１又は２に記載の細胞の播種方法。
【請求項４】
内部に透過性膜を備えた容器の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより、透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する細胞の播種方法。
【請求項５】
容器が内部に透過性膜を備えた複数のウェルを有するものであり、１又は複数のウェル内の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかける請求項４に記載の細胞の播種方法。
【請求項６】
細胞が肝細胞である請求項４又は５に記載の細胞の播種方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法により播種された細胞を培養することにより得られる細胞培養物。
【請求項８】
底面の全部又は一部が透過性膜で構成された透過性容器内の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する工程と；
透過性容器を内嵌可能な大きさの培養容器内に透過性容器を内嵌した状態で凝集体を培養する工程とを含む細胞の培養方法。
【請求項９】
凝集体形成工程において、透過性容器を培養容器に内嵌した状態で細胞に遠心力をかける請求項８に記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
細胞が肝細胞である請求項８又は９に記載の細胞の培養方法。
【請求項１１】
底面の全部又は一部が透過性膜で構成された複数の透過性ウェルを有する容器の１又は複数の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する工程と；
透過性ウェルを内嵌可能な大きさの複数のウェルを有する培養容器のウェル内に透過性ウェルを内嵌した状態で凝集体を培養する工程とを含む細胞の培養方法。
【請求項１２】
凝集体形成工程において、透過性ウェルを培養容器のウェルに内嵌した状態で細胞に遠心力をかける請求項１１に記載の細胞の培養方法。
【請求項１３】
細胞が肝細胞である請求項１１又は１２に記載の細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養、組織培養等の分野において利用される細胞の播種方法、細胞の培養方法及び細胞培養物に関する。特に、細胞の機能を維持しつつ細胞を培養できる播種方法、この方法で播種した後に得られる細胞培養物および培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、接着性の動物細胞を培養する場合は、細胞が培養容器の底面に自発的に接着し、細胞質を偏平に延ばして増殖または接着する、いわゆる単層培養の形態をとるのが一般的である。
【０００３】
しかし、生体から取り出し培養し始めてすぐのいわゆる初代培養の細胞は、その由来する組織の特性を保持している場合が多いが、ほとんどの場合、生体内で維持していた機能は数日ないしは数週の単位で消失することが知られている。
【０００４】
初代培養細胞の中でも高度に分化した初代肝細胞では、単層培養期間内にその機能が特に失われ易い。例えば、ラット初代培養肝細胞は、フラスコ内で単層培養を行っても、例えば肝細胞の重要な機能のひとつであるアンモニア代謝能が、通常、培養開始から２週間程度で失われてしまう。
【０００５】
この点に関して、中空糸内又は中空糸間に、遠心力を利用して細胞を強制的に充填し細胞間の接触頻度を高めることにより、高機能を有する細胞組織体の形成を誘導できることが報告されている（例えば特許文献１）。
【０００６】
しかし、中空糸を用いず、汎用の培養容器を用いて、機能を維持しつつ細胞を培養できる方法は知られていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００１−１２８６６０（第３欄第４９行〜第４欄第３行）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、培養時に細胞の機能が低下し難い細胞の播種方法、細胞の機能を長期にわたり維持できる細胞の培養方法、及び、生体内での機能を高度に維持している細胞培養物を提供することを主目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、細胞を培養容器に播種する際に遠心力を加えることにより、細胞が高い接触状態ないしは高い接触頻度が保たれているとともに細胞が層状に重なり合った状態の凝集体を形成し、この凝集体の状態で細胞を培養することにより、長期間にわたり細胞の機能を高度に維持しつつ細胞を培養できることを見出した。
【００１０】
前記知見に基づき本発明は、以下の各項の細胞の播種方法、細胞の培養方法及び細胞培養物を提供する。
【００１１】
項１．  容器内に入れた細胞に遠心力をかけることにより容器内壁に複数細胞層からなる凝集体を形成する細胞の播種方法。
【００１２】
項２．  容器が複数のウェルを有するものであり、１又は複数のウェル内に細胞を入れた状態で細胞に遠心力をかける項１に記載の細胞の播種方法。
【００１３】
項３．  細胞が肝細胞である項１又は２に記載の細胞の播種方法。
【００１４】
項４．  内部に透過性膜を備えた容器の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより、透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する細胞の播種方法。
【００１５】
項５．  容器が内部に透過性膜を備えた複数のウェルを有するものであり、１又は複数のウェル内の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかける項４に記載の細胞の播種方法。
【００１６】
項６．  細胞が肝細胞である項４又は５に記載の細胞の播種方法。
【００１７】
項７．  項１から６のいずれかに記載の方法により播種された細胞を培養することにより得られる細胞培養物。
【００１８】
項８．  底面の全部又は一部が透過性膜で構成された透過性容器内の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する工程と；
透過性容器を内嵌可能な大きさの培養容器内に透過性容器を内嵌した状態で凝集体を培養する工程とを含む細胞の培養方法。
【００１９】
項９．  凝集体形成工程において、透過性容器を培養容器に内嵌した状態で細胞に遠心力をかける項８に記載の細胞の培養方法。
【００２０】
項１０．  細胞が肝細胞である項８又は９に記載の細胞の培養方法。
【００２１】
項１１．  底面の全部又は一部が透過性膜で構成された複数の透過性ウェルを有する容器の１又は複数の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する工程と；
透過性ウェルを内嵌可能な大きさの複数のウェルを有する培養容器のウェル内に透過性ウェルを内嵌した状態で凝集体を培養する工程とを含む細胞の培養方法。
【００２２】
項１２．  凝集体形成工程において、透過性ウェルを培養容器のウェルに内嵌した状態で細胞に遠心力をかける項１１に記載の細胞の培養方法。
【００２３】
項１３．  細胞が肝細胞である項１１又は１２に記載の細胞の培養方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）細胞の播種方法
容器内壁への細胞の播種方法
本発明の第１の細胞の播種方法は、容器内に細胞を入れた状態で細胞に遠心力をかけることにより容器内壁に複数細胞層からなる凝集体を形成する方法である。
【００２５】
一般に細胞の播種とは培養基底面（培養面）に細胞を播くことをいい、本発明においては、容器内壁に凝集体状態で細胞を播く。本発明において、容器内壁には、容器底面、側面などが含まれる。
【００２６】
本発明において、細胞の凝集体とは、分散された細胞による自発的な凝集では成し得ない程度に、細胞同士が高度に接着した状態又は高頻度に接着した状態の細胞群をいう。本発明の凝集体においては、細胞は単層ではなく、規則的又は不規則に重なり合って複数細胞層をなしている。
【００２７】
このような凝集体は、細胞を適当な液体培地又はバッファーに懸濁した状態で、通常の遠心機を用いて、細胞の種類に応じて細胞に傷害を与えない範囲の遠心力をかけることにより形成することができる。遠心力は、細胞の種類によっても異なるが、概ね２〜２０００×Ｇ程度、特に４〜５００×Ｇ程度とすることが好ましい。例えば初代ラット肝細胞の場合には、通常１５００×Ｇ以下、特に４００×Ｇ以下の遠心力をかけることが好ましい。また、初代ラット肝細胞の場合には、遠心力の下限値は細胞の凝集体が形成されるのであればよく、特に限定されないが、通常５×Ｇ程度である。培養容器内壁（底面や側壁を含む）や後述する透過性膜上に層状の凝集体を形成させる場合は、遠心力が高すぎると細胞の本来の形態及び機能が失われる。逆に遠心力が低すぎると細胞同士の接触が弱く、高い機能を発現できるような細胞の凝集体を形成するに至らない。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。遠心時間は、細胞凝集体を形成できる範囲で適宜設定すればよい。
【００２８】
遠心力をかけることにより、凝集体は容器内壁に形成されるが、遠心機の種類によって、容器底面に形成される場合もあり、容器底面及び側面に形成される場合もある。
【００２９】
容器内に細胞を入れるに当たっては、上記範囲の遠心力をかけることにより細胞が概ね２〜２０層程度、特に５〜１０層程度重なり合った凝集体が得られるように、容器内に入れる細胞数を調整することが望ましい。凝集体において細胞が多数重なり過ぎている場合には凝集体の中央層部の細胞が栄養不足、ガス交換不充分になり、細胞の重なりが少なすぎる場合には細胞数が少なく充分な機能を発揮する凝集体が形成され難い。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。
【００３０】
凝集体の細胞層数は、例えば層状凝集体の載った容器壁又は後述する透過性膜を切り出し、これをホルマリン固定後、パラフィン包埋切片を作製して顕微鏡観察することにより確認することができる。
【００３１】
細胞を播種する容器は、複数のウェルを有するものであってもよい。複数ウェルを有する容器を用いる場合には、これら複数のウェル内に細胞を入れた状態で細胞に遠心力をかけることにより、一度に細胞の凝集体を複数形成できる。複数ウェル内に複数の凝集体を形成すれば、複数種類の細胞培養を一度に行う場合に好都合である。
【００３２】
容器内壁又は容器のウェル内壁に細胞凝集体を形成した後は、そのまま又は細胞培養液を追加して培養すればよい。或いは、上清を除去し、さらに容器内又はウェル内に細胞培養液を入れた状態で細胞を培養してもよい。これにより、細胞が当初有していた機能を良好に発現又は維持しつつ培養を行うことができる。
透過性膜上への細胞の播種方法
本発明の第２の細胞の播種方法は、内部に透過性膜を備えた容器の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより、透過性膜上に複数細胞層からなる凝集体を形成する方法である。
【００３３】
透過性膜は、細胞は通過させないが水、塩類、蛋白質などの培養液成分は通過させる通孔を多数有する膜であり、通常０．１〜５μｍ程度、特に０．２〜３μｍ程度の通孔を有するものであることが好ましい。
【００３４】
透過性膜の厚さは、膜の適度の強度及び良好な物質透過性が保たれる範囲であればよく、特に限定されないが、通常１０〜２００μｍ程度、特に２０〜１００μｍ程度のものが好適に採用される。
【００３５】
透過性膜の材料は、細胞毒性を有さず、滅菌、洗浄、培養液との接触などにより変質、分解しない材料であればよく、特に限定されない。例えばセルロース系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリオレフィン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、フッ素樹脂、ポリカーボネート、アクリル樹脂等からなる透過性膜を採用できる。
【００３６】
遠心力の大きさ及び遠心力をかける時間、透過性膜上に載せる細胞数については、本発明の第１の細胞播種方法について説明したのと同様である。
【００３７】
透過性膜が設けられた容器は、容器底面の全部又は一部が透過性膜で構成された容器、容器の底面の他に側面の全部又は一部も透過性膜で構成された容器、又は、容器の全面が透過性膜で構成された容器等のいずれであってもよい。これらの場合には、該容器の透過性膜上に細胞凝集体を形成した後に、該透過性容器を別の培養容器内に嵌め、この状態で培養容器内に細胞培養液を入れて細胞を培養することができる。また、後述するように、培養容器内に該透過性容器を嵌めた状態で凝集体を形成することもできる。
【００３８】
さらに、この透過性容器は、容器の深さ方向の中間位置に透過性膜が水平又は略水平に設けられていてもよい。この場合には、透過性膜上に細胞懸濁液を載せ、遠心力をかけることにより透過性膜を通過した液体が容器内に溜まる。凝集体形成後は、そのまま容器内に細胞培養液を入れて培養すればよい。
【００３９】
細胞を播種する容器は、透過性膜を備えたウェルを複数有するものであってもよい。このような複数ウェルを有する容器を用いる場合には、これら複数のウェルの透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより一度に細胞の凝集体を複数形成できる。複数透過性膜上に複数の凝集体を形成すれば、複数種類の細胞培養を一度に行う場合に好都合である。
【００４０】
ウェル内の透過性膜が設けられる位置については、通常の容器内に透過性膜を備える場合と同様である。
【００４１】
透過性膜上に凝集体を形成する場合には、その後の培養において、透過性膜を通して、すなわち凝集体の下面側からも栄養供給を行える。その結果、一層効果的に細胞本来の有する機能を維持しつつ細胞を培養することができる。
（３）細胞培養物
本発明の細胞培養物は、本発明の第１又は第２の細胞播種方法により播種された細胞を培養することにより得られる細胞培養物である。
【００４２】
凝集体の培養時に用いる細胞培養用液体培地は、特に限定されず、例えばダルベッコの改変イーグル培地、ウィリアムズＥ培地、ＨａｍのＦ−１０培地、Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ１５３培地、１９９培地などの従来公知の細胞培養用基礎培地に、必要に応じて各細胞の培養に適合した従来公知の成長因子や抗酸化剤などを加えたものを使用することができる。
【００４３】
さらに、細胞培養用液体培地を含むコラーゲンゲル又はアガロースゲルなどで凝集体を覆った状態で細胞を培養することもできる。これにより、培地交換等の際に細胞に加わる物理的傷害から細胞を保護することができる。
【００４４】
培養時の温度は、細胞の種類によって異なるが、概ね３６〜３７℃程度とすればよい。培養時間は、得られる細胞培養物の用途によっても異なるが、１２時間程度以上、特に２４〜９６時間程度とすることができる。
【００４５】
この程度の培養により、細胞が生体内で保持していた機能を良好に発現している細胞培養物が得られる。
（４）細胞培養方法
本発明の細胞培養方法は、底面の全部又は一部が透過性膜で構成された透過性容器内の透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより透過性膜上に複数細胞層をなす凝集体を形成する工程と；
透過性容器を内嵌可能な大きさの培養容器内に透過性容器を内嵌した状態で凝集体を培養する工程とを含む方法である。
【００４６】
凝集体形成工程において、透過性膜上に載置する細胞の数、遠心力の大きさ及び遠心力をかける時間は本発明の第１の細胞播種方法について前述したとおりである。
【００４７】
透過性容器は、底面の全部又は一部が透過性膜で構成されているが、側面の全部又は一部も透過性膜で構成されていてもよい。さらに、全面が透過性膜で構成されたものであってもよい。
【００４８】
透過性膜の材料、孔径、厚さ等については、本発明の第２の細胞播種方法について前述した通りである。
【００４９】
透過性容器は、底面の全部又は一部が透過性膜で構成された複数のウェルを有するものであってもよい。この場合には、これら複数のウェルの透過性膜上に細胞を載せた状態で細胞に遠心力をかけることにより一度に細胞の凝集体を複数形成できる。複数透過性膜上に複数の凝集体を形成すれば、複数種類の細胞の培養を行う場合に好都合である。
【００５０】
ウェル内の透過性膜が設けられる位置については、通常の容器内に透過性膜を備える場合と同様である。
【００５１】
細胞培養工程においては、透過性容器を内嵌可能な大きさの培養容器内に、細胞凝集体が形成された透過性容器を嵌めた状態で、培養容器内に細胞培養液を充たし、細胞を培養する。
【００５２】
また、予め透過性容器をこのような培養容器に内嵌した状態で、透過性容器内に細胞を入れ、細胞に遠心力をかけることもできる。この場合、透過性膜上に細胞凝集体が形成された後、凝集体が形成された透過性膜を移動させることなくそのまま培養容器内に培養液を充たして培養することができ、簡便である。
【００５３】
具体的には、例えば、複数のウェルを有しウェル底面が透過性膜で構成された透過性容器（いわゆるカルチャーインサート）を、透過性容器のウェルを内部に嵌めることができる大きさの複数のウェルを有する培養容器（いわゆるマルチウェルプレート）に、ウェルどうしがかみ合うように装着し、次いでカルチャーインサートの各ウェル内に細胞懸濁液を入れ、カルチャーインサートを嵌めたマルチウェルプレートごと遠心機にかけて細胞に遠心力をかけることにより、カルチャーインサートの透過性膜上に細胞の凝集体を形成することができる。次いで、マルチウェルプレートの各ウェル内に培養に適した量の細胞培養用液体培地を入れた後、そのまま細胞を培養することができる。
【００５４】
カルチャーインサートをマルチウェルプレートに嵌めた状態で透過性膜上に細胞凝集体を形成した状態の１例の断面を図１に示す。この例では、マルチウェルプレート１に対して底面が透過性膜２１で構成されたカルチャーインサート２が、ウェルどうしを嵌めるようにして装着される。透過性膜２１上には細胞凝集体３が形成されている。
【００５５】
このような透過性膜を有するカルチャーインサートは、例えばメンブレンカルチャーインサート（イワキガラス株式会社製）等の商品名で、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル等の複数ウェルを有するものが市販されている。
細胞
本発明の第１及び第２の細胞の播種方法、本発明の細胞の培養方法、及び、本発明の細胞培養物の対象となる細胞としては、それには限定されないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。本発明方法は、特に、細胞の機能維持が困難な初代培養細胞の保存に適する。初代培養細胞は、肝臓、腎臓、神経、肺等のいずれの組織由来のものであってもよいが、特に、単層培養により急激に分化機能を失うヒト肝細胞が本発明方法の対象細胞として好適である。
【００５６】
【実施例】
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５７】
実施例１
２４個のウェルを有し、ポリカーボネート製の透過性膜を各ウェルの底面に備えた透過性容器（商品名；トランズウェル・２４ウェルプレート用、膜孔サイズ；３．０μｍ、培養面積；０．３３ｃｍ２、コーニング・コースター社製）の各ウェル内に、コラゲナーゼ消化法により調製したラット肝細胞の細胞懸濁液１．８×１０５個／１００μｌを１００μｌ入れた。次いで、５分間細胞を自然沈降させた後、６０×Ｇで９０秒間遠心力をかけることにより、透過性膜上に細胞凝集体を形成した。この凝集体の細胞層数を、層状凝集体の載った透過性膜を切り出し、これをホルマリン固定後、パラフィン包埋切片を作製して顕微鏡観察により確認したところ、５〜２０層程度であっった。
【００５８】
この各透過性膜上に肝細胞の凝集体を形成させたトランズウェルを、そのままの状態で２４ウェルの細胞培養プレート（ファルコン社製）上に、トランズウェルのウェルを細胞培養プレートのウェルに内嵌させるようにして、載置した。
【００５９】
次いで、細胞培養プレートのウェル内に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ    ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；ギブコ社製）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌ  プロリン、５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（東洋紡績社製）、１０ｍｇ／Ｌ  インシュリン（シグマ社製）、７．５ｍｇ／Ｌ  ヒドロコルチゾン（シグマ社製）、５０μｇ／Ｌ  リノール酸（シグマ社製）、１０万Ｕ／Ｌ  ペニシリンＧカリウム（ナカライテスク製）、１００ｍｇ／Ｌ  ストレプトマイシン硫酸塩（ナカライテスク社製）、１．０５ｇ／Ｌ  炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク社製）、１．１９ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）を添加した無血清培地（ＨＳＦＭ）を６５０μｌ入れ、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下、３７℃で１ヶ月静置培養した。
【００６０】
比較例１
実施例１において、遠心力をかけない他は、実施例１と同様の条件で細胞を培養した。
【００６１】
比較例２
実施例１と同様にして調製した初代ラット肝細胞の２．０×１０６個を培養面積２５ｃｍ２のフラスコ（ファルコン社製）に播種して、実施例１と同様の培地（ＨＳＦＭ）を用い、実施例１と同様の培養条件で（５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気下）、３７℃で１ヶ月単層培養を行った。
【００６２】
細胞機能評価
肝細胞は、アルブミン等の蛋白質合成能の他に、アンモニアや薬物を代謝する機能を有している。特に、アンモニア代謝能は、通常、培養経過日数とともにすみやかに消失することが知られている。ここでは、アルブミン産生量及びアンモニア代謝量を経時的に測定した。
【００６３】
実施例１、比較例１および比較例２の各サンプルについて、培養開始１日後、３日後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後にそれぞれアルブミン産生量、アンモニア代謝量を測定した。
【００６４】
アルブミン産生量は、培地中のアルブミン量を抗ラットアルブミンを用いたＥＩＡ法で測定し、アンモニア代謝量は、培地中に負荷したアンモニア消費量を自動分析機で測定して求めた。
【００６５】
アルブミン産生量の測定結果を図２に示し、アンモニア代謝量の測定結果を図３に示す。図２及び図３から明らかなように、透過性膜上に遠心力を利用して肝細胞の凝集体を形成した後、培養を行った実施例１の細胞では、高いアルブミン産生能およびアンモニア代謝能を発現し、維持することが示された。
【００６６】
これに対し、遠心操作をせずに培養を行った比較例２及び単層培養を行なった比較例３の細胞は、培養初期は実施例１の細胞との差が認められないが、培養日数を経るとその機能は速やかに消失していった。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によると、培養時に細胞の機能が低下し難い細胞の播種方法、細胞の機能を長期にわたり維持できる細胞の培養方法、及び、生体内での機能を高度に維持している細胞培養物が提供される。
【００６８】
さらにいえば、遠心力をかけることにより複数細胞層をなす凝集体を形成させ、細胞同士の接触頻度が非常に高まった状態を作り出すことで、細胞が本来持つ機能を良好に発現する細胞凝集体が得られる。この細胞凝集体を培養する場合には、長期間培養しても、通常の単層培養等の場合に比べて細胞の機能低下が起こり難い。
【００６９】
本発明においては、凝集体を容器内壁又は透過性膜上に層状に形成させる。この方法によれば、汎用の容器（マルチウェルプレート等）、器具（カルチャーインサート等）、汎用機器（遠心機）を用いて容易に多数の凝集体を得ることができる。また、広く均一に遠心力を加えることができることから、容器や透過性膜の面積を増やすことにより、多数細胞からなる凝集体を得ることができる。
【００７０】
またこのような凝集体は組織体に誘導され易く、細胞凝集体から形成された組織体は、細胞が本来有する機能を良好に発現する。
【００７１】
また、本発明の細胞培養方法において透過性容器及び培養容器を組み合わせた状態で細胞に遠心力をかけることにより透過性容器の透過性膜上に凝集体を形成する場合には、そのままの状態で培養容器内に細胞培養液を充たして培養を行うことができ、凝集体の培養を簡便に行うことができる。
【００７２】
特に、複数のウェルを有する透過性容器であるカルチャーインサート及び複数のウェルを有する培養容器であるマルチウェルプレートを利用することにより、同時に複数の細胞凝集体を簡便に得ることができ、多種類の細胞培養物を特殊な装置等を使用せず、一度に簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】カルチャーインサートがマルチウェルプレートに装着され、カルチャーインサートのウェル内の透過性膜上に細胞凝集体が形成された状態の１例を示す図である。
【図２】細胞の単位細胞数あたりのアルブミン産生量を示すグラフである。
【図３】細胞の単位細胞数あたりのアンモニア代謝量を示すグラフである。
【符号の説明】
１  マルチウェルプレート
２  カルチャーインサート
２１  透過性膜
３  細胞凝集体
【図１】
2004166603.tif 000003
【図２】
2004166603.tif 000004
【図３】
2004166603.tif 000005