(57)【要約】【課題】細胞内の負の超らせんＤＮＡを簡便かつ効率良く検出する。【解決手段】ビオチン化ソラレン類を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする細胞内の負の超らせんＤＮＡの検出法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン化ソラレン類を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする細胞内の負の超らせんＤＮＡの検出法。
【請求項２】
ビオチン化ソラレン類を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする負の超らせんＤＮＡ含有細胞の検出法。
【請求項３】
細胞が、真核生物細胞である請求項１又は２記載の検出法。
【請求項４】
ビオチン化ソラレン類の細胞への導入が、細胞膜透過性促進剤の存在下にビオチン化ソラレン類を細胞に導入するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の検出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞からＤＮＡを抽出することなしに、細胞内の負の超らせんＤＮＡを簡便かつ効率よく検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡは平均１０．５塩基対毎に一回転する２重らせん構造をしているが、ＤＮＡの末端を拘束した状態で、らせんのピッチをきつくする、あるいは緩める方に回転させると超らせんを生じ、それぞれ正および負の超らせん構造という。当該ＤＮＡの超らせん構造は、転写や複製に重要な役割を担っていると考えられている。特に真核生物における負の超らせんＤＮＡは、転写が活発に起こっている細胞に多く蓄積され、がん細胞などの転写活性の高い細胞で多く存在することが指摘されている。従って、超らせんＤＮＡの検出は、がんの検出等の転写活性の高いＤＮＡの検出に有用であると考えられている。
【０００３】
このような超らせんＤＮＡの検出法としては、ソラレンが負の超らせんＤＮＡに選択的に結合する性質を利用した方法が採用されている。すなわち、細胞にソラレンを取り込ませ、長波長紫外線照射によりＤＮＡに固定化後、ＤＮＡを抽出して制限酵素で切断し、ソラレンが結合したＤＮＡを非結合ＤＮＡから電気泳動を用いて分離し、メンブランに移した後、サザンハイブリダイゼーション法により検出されていた（非特許文献１〜５参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２１２：３１９−３３５（１９９２）
【非特許文献２】
Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２１２：２４２−２６２（１９９２）
【非特許文献３】
ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：１０６７−１０７５（１９９３）
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：６０５５−６０５９（１９９２）
【非特許文献５】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３６：３１５１−３１５８（１９９７）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この従来の超らせんＤＮＡの検出法は、ステップが多く煩雑であるとともに、細胞を破壊しないと検出不可能であった。また、抽出したＤＮＡを制限酵素で切断して、ハイブリダイゼーションするため、ＤＮＡ中のどの部分が超らせん構造をとっているかは、すでに解明されたＤＮＡでなければ不明であり、超らせん構造の解析の妨げとなっていた。
従って、本発明の目的は、より簡便かつ効率よく細胞内の負の超らせんＤＮＡを検出する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、種々検討した結果、細胞にビオチン化ソラレン類を導入して長波長紫外線を照射した後、その細胞に発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、当該細胞の発色、蛍光又は発光を直接測定したところ、負の超らせんＤＮＡが選択的に発色又は発光し、細胞内の負の超らせんＤＮＡがそのまま可視化できること、さらには全く意外にも、従来法では存在が確認できなかった部分にも負の超らせんＤＮＡが存在することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、ビオチン化ソラレン類を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする細胞内の負の超らせんＤＮＡの検出法を提供するものである。
また本発明は、ビオチン化ソラレン類を細胞に導入し、当該細胞に長波長紫外線を照射した後、発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類を反応させ、次いで当該細胞の発色、蛍光又は発光を測定することを特徴とする負の超らせんＤＮＡ含有細胞の検出法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の検出法に用いられる細胞は、真核生物の細胞であればよく、例えばヒト、ラット、マウス等の哺乳類はもとよりショウジョウバエ等の昆虫由来の細胞であってもよい。これらの細胞は、真核生物の組織、体液を利用することができる。ヒトの場合には、がんが疑われる組織、細胞等を用いて検体とすればよい。
【０００９】
ビオチン化ソラレン類は、ソラレンと同様に、負の超らせんをもつＤＮＡの塩基対と塩基対の間へ選択的に挟まりこむ性質を有する。長波長紫外線、例えば３６５ｎｍの光で励起すると、ＤＮＡに取り込まれたビオチン化ソラレン類は共有結合によりＤＮＡを架橋（クロスリンク）する。従って、細胞内において、長波長紫外線照射により超らせんＤＮＡに固定化されたビオチン化ソラレン類に発色性、蛍光性又は化学発光性標識アビジン類を反応させて、当該固定化されたソラレン類部分の発色、蛍光又は発光を測定すれば、細胞内における超らせんＤＮＡ部分のみが選択的に検出できる。
【００１０】
本発明に用いられるビオチン化ソラレン類としては、ビオチン化された光増感作用を有するソラレン類であればよく、例えば次の一般式（１）
【００１１】
【化１】
2004344090.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ６のうちの５個はそれぞれ、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子又はアミノ基を示し、残余の１個はビオチン残基又はビオチン−架橋基を示す）
で表されるビオチン化ソラレン類が挙げられる。
【００１３】
ここで、ビオチン−架橋基としては、次式（２）
【００１４】
【化２】
2004344090.tif 000003
【００１５】
（式中、ｌは０〜４の数を示し、ｍ１及びｍ２は１〜８の数を示し、ｎ１及びｎ２は０又は１の数を示す）
で表される基が好ましい。また、前記アルキル基、アルコキシ基、ハロゲノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシカルボニル基におけるアルキル又はアルコキシ部分の炭素数は１〜４が好ましく、特に１が好ましい。Ｒ１〜Ｒ６におけるビオチン残基又はビオチン−架橋基以外の基としては水素原子、メチル基又はメトキシ基が特に好ましい。
【００１６】
特に好ましいビオチン化ソラレン類としては、４′−ビオチンアミドペンチルアミドヘキシルアミノメチル−４，５′，８−トリメチルソラレン等が挙げられる。これらのビオチン化ソラレン類はＡｍｂｉｏｎ社によって市販されているものを用いることもできる。
【００１７】
ビオチン化ソラレン類を細胞内に導入するには、細胞含有液にビオチン化ソラレン類を添加すればよいが、細胞への導入効率を向上させるためには、細胞膜透過性促進剤の存在下に行うのが好ましい。当該細胞膜透過性促進剤としては、ジギトニン、ＮＰ−４０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，Ｔｗｅｅｎ−２０等が挙げられるが、ジギトニンが特に好ましい。ここで、ビオチン化ソラレン類の濃度は、細胞数にもよるが、０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌ、特に０．０５〜５０ｎｇ／ｍｌが好ましい。また、ジギトニン濃度は０．００１〜０．５％、特に０．０１〜０．０５％が好ましい。
【００１８】
ビオチン化ソラレン類の励起に用いる長波長紫外線としては、紫外部の長波長領域（３２０〜４００ｎｍ）であればよいが、３４０〜３８０ｎｍ、特に３６５ｎｍ付近が好ましい。
【００１９】
紫外線照射により負の超らせんＤＮＡに固定化されたビオチン化ソラレン類に反応させる発色性、蛍光性又は化学発光性の標識アビジン類としては、ストレプトアビジン、アビジンが挙げられるが、ストレプトアビジンが好ましい。
【００２０】
発色性標識体としては、酵素標識が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが挙げられる。これらの酵素標識アビジン類を用いた場合には、さらに、３，３′−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビフェニレン）ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム  クロライド］（ＮＢＴ）等の発色剤を組み合せることにより発色させることができる。これらの発色性標識体を用いた場合には染色体上でソラレンによってクロスリンクされた部位を茶色又は紫色の色素の沈着として検出することができる。
【００２１】
蛍光標識体としては、フルオレセインイソチオシアナート、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、同４３０、同４８８、同５３２、同５４６、同５６８、同５９４、同６３３、同６６０、同６８８、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等が挙げられる。これらの蛍光標識アビジン類を用いた場合には、蛍光顕微鏡により観察でき、かつ容易に画像化できるので特に好ましい。
【００２２】
化学発光標識体としては、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メイチルアクリジニウム  ナイトレート）、アクリジニウム  エステル、アダマンチル１，２−ジオキセタンアリル  リン酸、ナイトリック  オキサイド、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキサレート等が挙げられる。これらの化学発光標識アビジン類を用いた場合には、Ｘ線フィルム上にシグナルを直接記録することが可能である。
【００２３】
かくして発色、蛍光又は化学発光を測定すれば、細胞からＤＮＡを抽出する操作をすることなく、ゲノムのどの領域に負の超らせんＤＮＡが存在するかを検出できる。また、負の超らせんＤＮＡを有する細胞を検出することもできる。
【００２４】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２５】
Ａ．材料と方法
（１）試薬
ビオチン化ソラレンは、Ａｍｂｉｏｎから購入したＢｒｉｇｈｔｓｔａｒＴＭＰｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ（式（１）中、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、Ｒ２＝Ｒ５＝Ｒ６＝ＣＨ３、Ｒ４＝ビオチン−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）６ＮＨＣＨ２−である化合物）を用いた。ジギトニンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入したものを用いた。α−アマニチン、ＢｒＵＴＰ（ブロモウリジン  ５′−トリホスフェート）、４，５′，８−トリメチルソラレンはＳＩＧＭＡから購入した。制限酵素は宝酒造から購入した。
【００２６】
（１）熱ショック及びＸ線照射
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｒ）は１８℃で飼育した。必要に応じて３令幼虫をポリプロピレンチューブに入れて３７℃水浴に１０分間沈めて熱ショック処理した。唾腺は解剖バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％のポリエチレングリコール６０００）の中で幼虫を解剖し、得た。必要に応じて、約３Ｇｙ／ｍｉｎ（ＴＯＲＲＥＸ  ＣＡＢＩＮＥＴ  Ｘ−ＲＡＹ  ＳＹＳＴＥＭモデルＴＲＸ２８００、Ｆａｘｉｔｒｏｎ）の線量率で６０分間唾腺をＸ線照射してＤＮＡにニック（ｎｉｃｋ）を導入した。
【００２７】
（２）唾腺染色体の染色
４−５対の唾腺を０．０１％のジギトニンを含む解剖バッファー４０μｌで処理し、次に、ジギトニンを含まない解剖バッファーでリンスした。続けて０．２ｎｇ／ｍｌのビオチン化ソラレンを含む解剖バッファーで１０分間処理した。その後、唾腺を長波長（３６５ｎｍ）ＵＶランプ（ＵＶＰモデルＵＶＬ−２１）で照射し、ビオチン化ソラレンをクロスリンクした。また、２ｍＭ  ＢｒＵＴＰをジギトニン処理と同時に解剖バッファーに加え、伸長途上のｍＲＮＡを標識した。ジギトニン処理中に解剖バッファーに３μｇ／ｍｌのα−アマニチンを添加し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を阻害した。クロスリンクの後、唾腺を４０％の酢酸で固定し、スライドグラス上に唾腺染色体を展開した。ＢｒＵＴＰは、抗ＢｒｄＵ単クローン抗体（Ｒｏｃｈｅ）及びローダミン標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。
【００２８】
ビオチン化ソラレンは、Ａｌｅｘａ４８８標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）で検出した。ＤＮＡはＤＡＰＩにより染色した。蛍光画像は、カール・ツァイスＡｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡及びＩＰ  ｌａｂソフトウェアで解析した。
【００２９】
（３）サザン法によるクロスリンクの解析
幼虫の熱ショックと解剖は染色の場合と同様に行った。２０対の唾腺をソラレンを含んでいる解剖バッファー中に１０分間入れた後、３６５ｎｍの光線により、クロスリンクを行った。クロスリンクされたＤＮＡは、溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．２、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ）中で５５℃、４時間プロテイナーゼＫ処理した後、フェノール／クロロホルム及びクロロホルム抽出により精製した。精製されたＤＮＡは、制限酵素処理後、さらに精製した後、グリオキサール変性バッファー（１Ｍ  グリオキサール、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、５０％ジメチルスルホキシド）に溶解し、５０℃、１時間加熱することにより変性した。グリオキサールにより変性したＤＮＡを１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中の１％のアガロース・ゲル電気泳動によってクロスリンクされたＤＮＡとされていないＤＮＡに分画した。電気泳動は３．６ボルト／ｃｍで１００分間行った。
【００３０】
電気泳動後、ゲルを変性液（０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌ）中で６５℃、１００分間処理してソラレンによるＤＮＡクロスリンクを解除した。ゲル内のＤＮＡをナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＮ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロットした。ランダムプライム法により３２Ｐ標識したプローブを作製し、ハイブリダイゼーションに使用した。ハイブリダイゼーションのシグナルはＸ線フィルムにより検出した。プローブの鋳型としてプラスミドｐ５６Ｈ８ＲＩＡ（２６）からｈｓｐ７０  ＣＲ及びＤＤＳ領域を切り出した。
【００３１】
Ｂ．結果
（１）Ｊｕｐｅ等はシュナイダー細胞を用いてショウジョウバエゲノムの特定の領域についてソラレンのクロスリンクを定量する手法を開発した（非特許文献４）。唾腺染色体で負の超らせんを検出するため、我々はまず、Ｊｕｐｅ等の手法が唾腺のような組織に適用可能であるかどうか、確認した。
手短かに手法を述べると、熱ショック前、後の幼虫から唾腺を取り出し、様々の濃度のソラレンを含むバッファーに浸漬した後、３６５ｎｍの光線を照射してクロスリンクを行った。ＤＮＡを精製した後、制限酵素処理を行い、グリオキサールにより変性させた。クロスリンクされたＤＮＡとされていないＤＮＡをゲル電気泳動により分画し、ゲルを６５℃でアルカリ処理した後、ナイロン膜にＤＮＡをブロットした。８７Ａ７に位置するｈｓｐ７０（図１、ＣＲ及びＤＤＳ）をプローブとしてサザン法により解析した。高温でのゲルのアルカリ処理はクロスリンクされたＤＮＡの検出に不可欠であり、この処理によりゲル内でのクロスリンクされたＤＮＡの自己アニーリングを防止し、シグナルを再現性良く検出できるようになった。我々はｈｓｐ７０コード領域のクロスリンクのソラレンに対する濃度依存性を確認した（図２）。幼虫を熱ショックすることにより、クロスリンクの頻度は上昇した（図２）。熱ショック後の幼虫から得た唾腺をＸ線照射処理し、ＤＮＡにニックを導入してからソラレンによるクロスリンクを試みた結果、クロスリンクされたＤＮＡはほとんど検出されなかった（図３（レーン３、レーン４））。対照として、ソラレンによるクロスリンクを行った後にＸ線を照射しても結果に変化は見られなかった（図３（レーン５、レーン２））。Ｘ線の照射量はおよそ３０ｋｂに一箇所のニックをＤＮＡに導入すると予想されるので、Ｘ線照射により超らせんが弛緩されている領域はＣＲ領域（２ｋｂ）よりも大きいと考えられる。同様の結果は熱ショックをかけていない幼虫から得られた唾腺染色体についても得られた。対照的に、クロスリンクのレベルはｈｓｐ７０の下流の領域（ＤＤＳ）で低く、熱ショックによってもクロスリンクの頻度の変化は無かった（図３（レーン８、レーン９））。
【００３２】
これらの結果はシュナイダー細胞を使用して得られていた結果（非特許文献４）と一致し、ｈｓｐ７０領域における負の超らせんの蓄積とその熱ショックによる増加を示すものである。これらの結果より、我々はソラレンのクロスリンクによる解析は培養細胞だけでなく唾腺組織にも適用できると結論付けた。
興味深い事には、熱ショック後の染色体であっても、クロスリンク前にα−アマニチン処理を行うとクロスリンクのシグナルはほとんど検出されなかった（図３（レーン６、レーン７））。この結果はＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を阻害した後、負の超らせんの蓄積は速やかに解消されることを示している。
【００３３】
（２）唾腺染色体上での負の超らせん蓄積部位の可視化
我々は唾腺染色体上でゲノム全体にわたって負の超らせんの蓄積部位を可視化することを目的として、ソラレンによるクロスリンクの手法を発展させ、ビオチン化ソラレンを蛍光標識したストレプトアビジンにより検出することを試みた。唾腺を０．０１％ジギトニンにより処理した。ジギトニンは唾腺細胞の膜透過性の向上の目的で使用されており、唾腺染色体での転写研究に適している。ジギトニン処理した唾腺をビオチン化ソラレンを含むバッファーに浸漬し、３６５ｎｍの光線によりクロスリンクし、酢酸固定した後、スライドガラス上に染色体を展開した。ビオチン化ソラレンはＡｌｅｘａ４８８標識したストレプトアビジンにより検出した。唾腺染色体上で、多くのシグナルがバンド状に検出された（図４Ａ）。ゲノム全体のうち、約１５０箇所でシグナルが検出された。これらのシグナルは、ソラレンを含まないバッファーで処理した染色体及びソラレン処理後クロスリンクの操作を行っていない染色体では検出されなかった。ＤＡＰＩの像と比較したところ、ソラレンのシグナルはＤＡＰＩの蛍光が弱くなる中間帯やパフとほぼ一致した（例えば図４、Ｂ及び図４Ｃの中の矢）。一方、ソラレンのシグナルの弱い部分はＤＡＰＩのシグナルと一致した（図４Ｂ及び図４Ｃ）。一部のパフでは、ソラレンのシグナルはパフの両端の部分でのみ観察された（例えば図４Ｂ及び図４Ｃの中の矢頭）。ビオチン化ソラレンでクロスリンク処理する前に１８０ＧｙのＸ線照射によりＤＮＡにニックを導入した染色体では中間帯やパフにおけるソラレンのシグナルは消失した（図５（Ａ〜Ｃ））。α−アマニチン処理した染色体でも同様にソラレンのシグナルは消失した（図５Ｄ、Ｅ）。対照として、Ｘ線照射やα−アマニチン無しで同様の処理を行った染色体では図４に示した結果と同様の像が見られた。これらの結果は、間期のゲノムに転写と共役した負の超らせんの蓄積がゲノムの多くの領域で起こっていることを示している。染色体に沿って見られるぼんやりとした弱いシグナルは負の超らせんに関係なく非特異的にソラレンがＤＮＡをクロスリンクした結果だと考えられる。
【００３４】
（３）熱ショックパフにおける負の超らせんの蓄積
熱ショックパフにおける負の超らせんの蓄積を解析するため、熱ショック処理後の幼虫から解剖して得た唾腺をビオチン化ソラレンでクロスリンクした。熱ショックパフ８７Ｃにおいて強いソラレンのシグナルが観察された（図６（矢８７Ｃ））。一方、熱ショックパフ８７Ａでは、パフの両端の部分でシグナルが検出され、中央部分ではシグナルは消失していた（図６（矢８７Ａ））。熱ショックパフ９３Ｄにおいてもソラレンのシグナルが検出された（図６（矢９３Ｄ））。熱ショック後の幼虫から得た唾腺染色体では、熱ショックをかけていない染色体では多数検出された中間帯におけるシグナルはほとんど検出されなくなった。クロスリンク処理前にＸ線照射（図７（Ａ〜Ｃ））やα−アマニチン処理（図７（Ｄ〜Ｆ））を行うと、熱ショックパフの形態は保たれているが（図７（矢））、ソラレンのシグナルは消失した。
Ｘ線照射により転写がほとんど阻害されていないことは、照射処理後にＢｒ−ＵＴＰにより伸長途上のｍＲＮＡを標識することにより確認した。このことは、Ｘ線照射によるソラレンのシグナルの消失はＸ線照射による二次的な転写阻害によるものではないことを示している。図６に示したデータと同様の結果はＸ線照射やα−アマニチン処理の擬似操作を行っても得られた。これらの結果は熱ショックパフにおける転写と共役した負の超らせんの蓄積の存在を示している。
【００３５】
（４）負の超らせんの蓄積と転写の相関
α−アマニチンに対する感受性から判断すると、中間帯やパフにおける負の超らせんの蓄積は転写と共役していると考えられる。これを検証するため、解剖して得た唾腺をクロスリンク処理の直前にＢｒ−ＵＴＰ処理し、伸長途上の転写産物を標識した。標識されたＲＮＡは多くの中間帯やパフで検出された（図８Ｄ，Ｅ）。像を重ねると、全てのソラレンのシグナルは伸長途上のＲＮＡが存在するパフや中間帯で強く出ていた（図８Ｆ）。
しかし、一部の中間帯やパフでは伸長途上のＲＮＡがはっきりと検出されるにもかかわらず、ソラレンのシグナルはあまり強くなかった（図８Ｆ矢）。熱ショック後では、Ｂｒ−ＵＴＰの取り込みは熱ショックパフ８７Ａと８７Ｃで顕著に見られた。熱ショックパフ９３Ｄにおいても弱いシグナルが検出された（図９）。この結果は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ−末端リン酸化体が熱ショックパフにのみ局在するという報告（Ｎａｔｕｒｅ，  ３７０：７５−７７（１９９４））と一致する。ソラレンの強いシグナルが８７Ｃで検出された一方、８７Ａの中央領域ではソラレンのシグナルは検出されなかった。転写産物と負の超らせんの分布について詳細に調べるため、８７Ａ及び８７Ｃパフの周辺のソラレン、ＲＮＡ、ＤＮＡのシグナル強度を定量した（図９Ｂ、９Ｃ）。ソラレンとＲＮＡのシグナルの分布は８７Ａ及び８７Ｃパフの内部では均一ではないが、よく似たパターンの分布を示した。パフでのＤＮＡのシグナル強度は非常に低かった。定量結果をまとめると、転写と負の超らせんの蓄積ははっきりと関連があることが分かる。負の超らせんは、蓄積と解消の平衡状態にあると考えられる。伸長途上のＲＮＡとソラレンのシグナル強度の比が中間帯やパフによって異なることは、ゲノム上の領域によって平衡状態が一定ではないことを示している。
【００３６】
従来法であるサザン法によれば、負の超らせんの蓄積はゲノム上の２箇所について報告されているのみであることから（非特許文献４）、我々はゲノム上で少数の位置にのみソラレンのシグナルが検出されると予想していた。しかし、驚くべきことに、唾腺染色体上で多数のソラレンのシグナルが検出された。シグナルは転写が活性化された状態の多くの中間帯やパフで検出されたが、全てのパフや中間帯にソラレンのシグナルが局在するわけでは無かった。またソラレンのシグナルはクロスリンク前のＤＮＡにニックを導入する処理や転写の阻害を行うことにより消失した。本発明は間期の染色体上でＤＮＡの負の超らせんの蓄積を可視化した最初の発明である。これらの結果は、本発明のようにゲノムを直接染色できた本発明によってはじめて得られるものである。
【００３７】
【発明の効果】
本発明方法によれば、従来極めて煩雑な操作により、ゲノム上の極く一部の箇所だけしか検出できなかった負の超らせんＤＮＡが、簡便かつ効率良く検出できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】８７Ａ７における遺伝子の位置関係とサザン解析に用いた制限酵素サイトを示す図である。矢は遺伝子の転写方向を示す。８７Ａ７はｓｃｓ及びｓｃｓ’（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に挟まれている。Ｘ、ＸｂａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｂ、ＢｇｌＩＩ。
【図２】唾腺細胞の８７Ａ７のｈｓｐ７０遺伝子におけるソラレンによるクロスリンクのサザン法解析結果を示す図である。レーン１−７は、熱ショック後の唾腺をソラレン処理有り（レーン２−７）、無し（レーン１）の条件で解析した。クロスリンク処理の前（レーン３）及び後（レーン５）にＸ線照射を行った。レーン４はＸ線照射無しで同様の処理を行った。レーン６はソラレン処理の前にα−アマニチン処理を行った。レーン７はα−アマニチン処理を行っていない。
【図３】ソラレンクロスリンクに対するＤＮＡニッキング及び転写阻害結果を示す図である。レーン１〜７は図２と同じ。レーン８は熱ショック処理を行っていない。レーン９は熱ショック処理を行った。
【図４】唾腺染色体でのソラレンシグナルの可視化を示す図である。
（Ａ）ビオチン化ソラレンのシグナルをＡｌｅｘａ４８８標識したストレプトアビジンで検出した（緑）。（Ｂ）ＤＡＰＩのシグナル（青）。（Ｃ）重ねた像。矢は主要な中間帯やパフを示す。いくつかの部位では、中間帯やパフの境界領域でのみソラレンの強いシグナルが検出された（矢頭）。
【図５】ソラレンのシグナルがＤＮＡのニッキングや転写阻害により消失することを示す図である。ビオチン化ソラレンによるクロスリンクの前に、唾腺をＸ線照射してＤＮＡにニックを導入して超らせんを弛緩した結果（Ａ−Ｃ）。また、α−アマニチンにより転写を阻害した（Ｄ−Ｆ）。（Ａ−Ｄ）ビオチン化ソラレン。（Ｂ、Ｅ）ＤＡＰＩ。（Ｃ、Ｆ）重ねた像。主要な中間帯やパフを矢で示した。
【図６】熱ショック後の唾腺染色体におけるソラレンの分布を示す図である。
（Ａ）ビオチン化ソラレン。（Ｂ）ＤＡＰＩ。（Ｃ）重ねた像。主要な熱ショックパフ８７Ａ，８７Ｃ，９３Ｄを矢で示した。矢頭は熱ショック後消失する中間帯におけるソラレンのシグナルを示す。
【図７】熱ショックパフにおけるＤＮＡのニッキング及び転写阻害によるソラレンのシグナルへの影響を示す図である。熱ショック後の唾腺をビオチン化ソラレンによるクロスリンク処理前に、Ｘ線照射（Ａ−Ｃ）もしくはα−アマニチン処理（Ｄ−Ｆ）した。（Ａ、Ｄ）ビオチン化ソラレン。（Ｂ、Ｅ）ＤＡＰＩ。（Ｆ、Ｃ）重ねた像。矢は熱ショックパフ８７Ａ及び８７Ｃを示す。
【図８】唾腺染色体における伸長途上のＲＮＡとソラレンのシグナルの共局在を示す図である。
（Ａ）ビオチン化ソラレン。（Ｂ）ＤＡＰＩ。（Ｃ）ＡとＢを重ねた像。（Ｄ）Ｂｒ−ＵＴＰで標識した伸長途上のＲＮＡ。（Ｅ）ＢとＤを重ねた像。（Ｆ）ＡとＤを重ねた像。矢は伸長途上のＲＮＡが強く検出されるがソラレンのシグナルが弱い部位を示す。
【図９】熱ショックパフにおけるソラレンと伸長途上ＲＮＡのシグナルの共局在を示す図である。
（Ａ）熱ショック後の幼虫から得た唾腺染色体における伸長途上のＲＮＡとソラレンのシグナルの比較。（ＢとＤ）８７Ａ及び８７Ｃにおける詳細な解析。パネルＣはビオチン化ソラレン（緑）、伸長途上のＲＮＡ（桃色）、ＤＡＰＩ（青）の（Ｂ）に示した領域での蛍光強度を定量した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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