(57)【要約】【課題】標的塩基配列を核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標に検出するアプタマー法において、Ｂ／Ｆ分離の不要な均一系で標的塩基配列を簡便かつ迅速に検出することを可能にする新規なリガンドを提供すること。【解決手段】ステロイド骨格を有する化合物に蛍光分子が結合していることを特徴とする蛍光標識ステロイド化合物、例えば下記式：【化１】2004277312.tif 000050（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）で示される蛍光標識ステロイド化合物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイド骨格を有する化合物に蛍光分子が結合していることを特徴とする蛍光標識ステロイド化合物。
【請求項２】
ステロイド骨格を有する化合物がコール酸又はリトコール酸である、請求項１に記載の蛍光標識ステロイド化合物。
【請求項３】
ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の蛍光標識ステロイド化合物。
【請求項４】
スペーサーが、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化１】
2004277312.tif 000042
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される、請求項３に記載の蛍光標識ステロイド化合物。
【請求項５】
下記の一般式（ＩＶ）：
【化２】
2004277312.tif 000043
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される蛍光標識ステロイド化合物。
【請求項６】
下記の一般式（Ｖ）：
【化３】
2004277312.tif 000044
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される蛍光標識ステロイド化合物。
【請求項７】
以下の工程：
（ａ）  官能基としてカルボキシル基を持つステロイド骨格を有する化合物に、下記の一般式（ＶＩ）：
【化４】
2004277312.tif 000045
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｘは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる工程、
（ｂ）  工程（ａ）の反応生成物のアミノ基の保護基を溶媒中、酸又はアルカリ処理によって脱離する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の反応生成物のアミノ基に蛍光分子を導入する工程、
を含む蛍光標識ステロイド化合物の製造方法。
【請求項８】
以下の工程：
（ａ）  官能基としてヒドロキシル基及びカルボキシル基を持つステロイド骨格を有する化合物において、そのカルボキシル基をエステル化する工程、
（ｂ）  上記ヒドロキシル基に一般式（ＶＩＩ）：
【化５】
2004277312.tif 000046
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｙは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の反応生成物のアミノ基の保護基を溶媒中、酸又はアルカリ処理によって脱離する工程、
（ｄ）  工程（ｂ）及び工程（ｃ）を少なくとも１回以上繰り返す工程、
（ｅ）  工程（ｄ）の反応生成物のアミノ基に蛍光分子を導入する工程、
を含む蛍光標識ステロイド化合物の製造方法。
【請求項９】
被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させる工程、
（ｂ）上記核酸アプタマーに蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物を反応させる工程、及び
（ｃ）蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として標的塩基配列を検出する工程、
を含む上記検出方法。
【請求項１０】
蛍光分子から発生するシグナル変化が、蛍光偏光度の変化である請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
ステロイド骨格を有する化合物が、コール酸又はリトコール酸である請求項９に記載の検出方法。
【請求項１２】
ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることを特徴とする、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１３】
スペーサーが、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化６】
2004277312.tif 000047
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される基である、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が下記の一般式（ＩＶ）：
【化７】
2004277312.tif 000048
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示されるものである、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１５】
蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が、下記の一般式（Ｖ）：
【化８】
2004277312.tif 000049
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示されるものである、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１６】
核酸プローブ及び請求項１から６のいずれか１項に記載される蛍光標識ステロイド化合物を含む標的塩基配列検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ステロイド骨格を有する化合物に蛍光分子が結合していることを特徴とする蛍光標識ステロイド化合物に関する。本発明の蛍光標識ステロイド化合物は、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出するアプタマー法においてリガンドとして利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
標的塩基配列の検出方法としては、サザンハイブリダイゼーション法に代表される相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションを利用する方法がある。しかしながら、相補的な塩基配列を持つ核酸は、両者の塩基配列が完全に相補的でなくてもハイブリダイゼーションを起こすため、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＳＮＰと称する）のような１塩基の相違はハイブリダイゼーションを利用する方法では直接検出することはできない。ＳＮＰの検出方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等が知られているが、電気泳動を必要とすることから大量の検体の処理には不向きである。
【０００３】
標的核酸の検出に対するまったく新しいアプローチとして、これまでの相補的な塩基配列間のハイブリダイゼーションを利用せず、この核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を使って標的塩基配列を検出する方法（以下、「アプタマー法」という）が提案されている（特許文献１参照）。アプタマー法は、標的塩基配列とそれにハイブリダイズしうるプローブを含む核酸アプタマーを形成し、該核酸アプタマーとリガンドを反応させてその結合親和性を指標として標的塩基配列を検出する方法である。アプタマー法では、特定の塩基配列とプローブとにより形成されるアプタマーの構造が、標的塩基配列を含む場合と含まない場合とで変化し、アプタマーとリガンドとの結合親和性にも変化をもたらすという現象を利用して標的塩基配列を検出する。核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の大きさは核酸アプタマーの構造を維持する塩基配列に依存しており、塩基配列のわずか一塩基の置換によっても結合親和性は大きく変動するので、これを指標とすれば、標的塩基配列中のＳＮＰなどの変異を検出できる。このように、アプタマー法においては、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標として検出を行うが、その検出は、不均一系、均一系、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により行われている。しかしながら、ＳＰＲによる検出では、リガンドまたは核酸アプタマーを金属薄膜上に固定化する工程だけでなく、Ｂ／Ｆ分離も必要となる。そのため、一箇所の標的塩基配列を検出するだけでも数時間またはそれ以上の時間が必要となる。また、不均一系においては、標識プローブと標的塩基配列とのハイブリダイゼーションの結果生じる核酸アプタマーを固相上のリガンドに捕捉し、このリガンドに標的塩基配列を結合させ、遊離（未結合）物質の洗浄を行ってから検出を行う。このように、不均一系では結合型（Ｂ）と遊離型（Ｆ）とを分離して分析を行うので原理的に高感度が期待できるが、Ｂ／Ｆ分離というステップを経る必要があり、ＳＰＲ同様、分析操作が煩雑で、多くの時間と労力がとられ、スループットを上げることが難しい。一方、均一系では、核酸アプタマーとリガンドが結合することに基づく標識物質から発生するシグナル変化を利用して検出するものであり、例えば、蛍光偏光法が挙げられる。蛍光偏光法は、液体中の蛍光分子が平面偏光により励起されてから蛍光を発するまでの間に回転する度合い（蛍光偏光度）が結合分子により異なることを利用して糖鎖−タンパク質、抗原−抗体、タンパク質間などの物質間の相互作用を解析する方法である。均一系はＢ／Ｆ分離が不要であるため、操作が簡単であり、測定の再現性を確保しやすいというメリットもある。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開番号ＷＯ０１／４４５０９  Ａ１
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、標的塩基配列を核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性を指標に検出するアプタマー法において、標的塩基配列を簡便かつ迅速に、しかも高精度で検出することを可能にする新規なリガンドを提供することにある
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、蛍光物質を結合させたステロイド骨格を有する化合物をリガンドとして用いることによって、アプタマー法における標的塩基配列の検出を簡便かつ迅速に、しかも高精度で行うことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ステロイド骨格を有する化合物に蛍光分子が結合していることを特徴とする蛍光標識ステロイド化合物。
（２）ステロイド骨格を有する化合物が、コール酸又はリトコール酸である上記（１）の蛍光標識ステロイド化合物。
（３）ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることを特徴とする、上記（１）又は（２）の蛍光標識ステロイド化合物。
（４）スペーサーが、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化９】
2004277312.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される、上記（３）の蛍光標識ステロイド化合物。
【０００８】
（５）下記の一般式（ＩＶ）：
【化１０】
2004277312.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される蛍光標識ステロイド化合物。
【０００９】
（６）下記の一般式（Ｖ）：
【化１１】
2004277312.tif 000004
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される蛍光標識ステロイド化合物。
【００１０】
（７）以下の工程：
（ａ）  官能基としてカルボキシル基を持つステロイド骨格を有する化合物に、下記の一般式（ＶＩ）：
【化１２】
2004277312.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｘは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる工程、
（ｂ）  工程（ａ）の反応生成物のアミノ基の保護基を溶媒中、酸又はアルカリ処理によって脱離する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の反応生成物のアミノ基に蛍光分子を導入する工程、
を含む蛍光標識ステロイド化合物の製造方法。
【００１１】
（８）以下の工程：
（ａ）  官能基としてヒドロキシル基及びカルボキシル基を持つステロイド骨格を有する化合物において、そのカルボキシル基をエステル化する工程、
（ｂ）  上記ヒドロキシル基に一般式（ＶＩＩ）：
【化１３】
2004277312.tif 000006
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｙは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の反応生成物のアミノ基の保護基を溶媒中、酸又はアルカリ処理により脱離する工程、
（ｄ）  工程（ｂ）及び工程（ｃ）を少なくとも１回以上繰り返す工程、
（ｅ）  工程（ｄ）の反応生成物のアミノ基に蛍光分子を導入する工程、
を含む蛍光標識ステロイド化合物の製造方法。
【００１２】
（９）被検試料中の標的塩基配列を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させる工程、
（ｂ）上記核酸アプタマーに蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物を反応させる工程、及び
（ｃ）蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として標的塩基配列を検出する工程、
を含む、上記検出方法。
【００１３】
（１０）蛍光分子から発生するシグナル変化が、蛍光偏光度の変化である上記（９）の検出方法。
（１１）ステロイド骨格を有する化合物が、コール酸又はリトコール酸である上記（９）の検出方法。
（１２）ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることを特徴とする、上記（９）の検出方法。
【００１４】
（１３）スペーサーが  下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化１４】
2004277312.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される基である、上記（１２）の検出方法。
【００１５】
（１４）蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が下記の一般式（ＩＶ）：
【化１５】
2004277312.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示されるものである、上記（９）の検出方法。
【００１６】
（１５）蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が、下記の一般式（Ｖ）：
【化１６】
2004277312.tif 000009
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示されるものである、上記（９）の検出方法。
【００１７】
（１６）核酸プローブ及び上記（１）から（６）のいずれかの蛍光標識ステロイド化合物を含む標的塩基配列検出用キット。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
１．蛍光標識ステロイド化合物
本発明によれば、ステロイド骨格を有する化合物に蛍光分子が結合していることを特徴とする蛍光標識ステロイド化合物が提供される。
【００１９】
本発明における「ステロイド骨格を有する化合物」としては、例えば、コール酸、リトコール酸、コール酸メチルエステル、ケノデオキシコール酸、シス−アンドロステソン、トランス−アンドロステロン、５α−ジヒドロテストステロン、プレグナンジオール、アルドステロン、プロゲステロン、エストロン、エストラジオール、エストリオール、プレグナンジオール、コルチコステロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン、１７α−プロゲステロン、ジハイドロエピアンドロステロン、１１−デオキシコルチソール、コルチソール、コルチソーン、１１−デオキシコルチコステロン、１１−ジハイドロコルチコステロン、１８−ヒドロキシコルチコステロン並びにこれらの誘導体等が挙げられる。
【００２０】
本発明において「蛍光分子」とは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の他、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ダンシルクロライド、カスケードイエロースクシンイミドエステル、フルオレスカミン、イオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、オレゴングリーン４８８スクシンイミドエステル、ＮＢＤクロライド、ピレン、テキサスレッドスクシンイミドエステル、パシフィックブルースクシンイミドエステル等が挙げられる。。
【００２１】
本発明の蛍光標識ステロイド化合物は、ステロイド骨格を有する化合物にスペーサーを介して蛍光分子が結合していることが好ましい。
【００２２】
上記「スペーサー」とは、上記ステロイド骨格を有する化合物の側鎖に蛍光分子を結合させることができる基であればその種類は特に限定はされず、例えば、下記の一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）：
【化１７】
2004277312.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される基が挙げられる。
【００２３】
上記スペーサーを介して蛍光分子が結合している蛍光標識ステロイド化合物としては、下記の一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）で示される化合物が挙げられる。これらの化合物は、核酸アプタマーと高い親和性を持ち、その蛍光偏光特性を評価することにより標的塩基配列中の一塩基のミスマッチを検出することが可能である。
【００２４】
【化１８】
2004277312.tif 000011
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【００２５】
【化１９】
2004277312.tif 000012
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
また、上記一般式（ＩＶ）又は（Ｖ）で示される化合物の好ましい例としては、具体的には下記化合物Ｃ、Ｆ、Ｊ、Ｍが挙げられ、化合物Ｆ、Ｍがより好ましい。
【００２６】
【化２０】
2004277312.tif 000013
【００２７】
【化２１】
2004277312.tif 000014
【００２８】
【化２２】
2004277312.tif 000015
【００２９】
【化２３】
2004277312.tif 000016
【００３０】
２．蛍光標識ステロイド化合物の製造方法
本発明の蛍光標識ステロイド化合物である、下記の一般式（ＩＶ）：
【化２４】
2004277312.tif 000017
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）で示される化合物は例えば以下のようにして製造することができる。
【００３１】
まず、下記の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化２５】
2004277312.tif 000018
（式中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表す。）
で示される化合物に、下記の一般式（ＶＩ）：
【化２６】
2004277312.tif 000019
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｘは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させる。次いで、酸又はアルカリ処理によってアミノ基の保護基（Ｘ）を脱離し、下記の一般式（ＩＸ）：
【化２７】
2004277312.tif 000020
（式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して水素原子又は水酸基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示されるアミノ基導入中間体を生成する。次いでこの中間体に蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート）を反応させる。
【００３２】
また、下記の一般式（Ｖ）：
【化２８】
2004277312.tif 000021
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物は、例えば以下のようにして製造することができる。
【００３３】
まず、下記式：
【化２９】
2004277312.tif 000022
で示す化合物にＲ８−ＯＨを反応させ、該化合物中のＣＯＯＨ基をエステル化する。次いでこの反応生成物に下記の一般式（ＶＩＩ）：
【化３０】
2004277312.tif 000023
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｙは保護基を表し、ｎは１〜１０の整数を表す。）
で示される化合物を反応させた後、酸又はアルカリ処理を行ってアミノ基の保護基（Ｙ）を脱離する。
【００３４】
次に、以上の一般式（ＶＩＩ）で示される化合物との反応、保護基の脱離操作をｎ回繰り返すことにより、下記の一般式（Ｘ）：
【化３１】
2004277312.tif 000024
（式中、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して水素原子、水酸基、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、アミノ基、フェニル基、ベンジル基を表し、Ｒ８は水素原子、直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基、フェニル基、ベンジル基を表し、ｎ及びｍはそれぞれ１〜１０の整数を表す。）
で示されるアミノ基導入中間体を生成し、次いでこの中間体に蛍光分子（フルオレセインイソチオシアネート）を反応させる。
【００３５】
上記各式において、炭素数１〜５の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、上記各式においてｎで表される整数は、例えば１〜１０、好ましくは２〜５、ｍで表される整数は、例えば１〜１０、好ましくは１〜５が挙げられる。
【００３６】
上記各式においてＸ，Ｙで表されるアミノ基の保護基としては、例えばＢＯＣ基またはＦＭＯＣ基、Ｚ基、ＣｌＺ基等を用いることができる。
【００３７】
３．標的塩基配列の検出方法
本発明の標的塩基配列の検出方法は、アプタマー法に基づくものであり、被検試料中の標的塩基配列と該塩基配列にハイブリダイズできるプローブによって形成される核酸アプタマーとリガンドとして使用する上記蛍光標識ステロイド化合物との結合親和性を指標に該標的塩基配列を検出する方法である。
【００３８】
本発明の標的塩基配列の検出方法は、以下の工程を含む。
（ａ）被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合することにより、該被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーを形成させる工程、
（ｂ）上記核酸アプタマーに蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物を反応させる工程、及び
（ｃ）蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として標的塩基配列を検出する工程。
【００３９】
工程（ａ）においては、被検試料と、標的塩基配列とハイブリダイズ可能なプローブとを混合する。それにより、該被検試料中に標的塩基配列が存在する場合にはその標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズした核酸アプタマーが形成される。
【００４０】
本発明において「核酸アプタマー」又は「アプタマー」とは、特定のリガンドに対する結合活性を有する核酸であり、分子内又は分子間に少なくとも１組の相補的な塩基配列を備え、この相補的な塩基配列のハイブリダイズによって構成された核酸分子を指す。本発明において好適な構造の核酸アプタマーとしては、例えば、前記相補的な塩基配列のハイブリダイズによる二本鎖部分（ハイブリッド）と、ハイブリッドを形成しない一本鎖部分とで構成され、前記一本鎖部分が水素結合、スタッキング、疎水性相互作用などにより形成されるそのアプタマーに固有の高次構造を有するものが挙げられる。かかる高次構造としては、一般的に知られている、ステム−ループ、ステム−バルジ、及びシュードノット構造のほか、特許文献１に記載されているステム−ループとステム−バルジの両者の特徴を併せ持つステム−ジャンクション構造（スリーウェイジャンクションなど）などをいい、本発明における核酸アプタマーはこれらの高次構造を有するものであれば特に限定はされないが、スリーウェイジャンクション構造を有するものが好ましい。
【００４１】
本発明において「被検試料」とは、標的塩基配列が存在するか否かを判定することが望まれる試料を指し、代表的には、生体試料（例えば全血、血漿、血清、尿、体液、唾液など）や、動物又は植物の細胞又は組織の培養物など、核酸を含有するものであれば特に限定はされない。被検試料は、当技術分野で周知の方法を適宜使用して調製することができる。一般的には、被検試料は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出して調製する。例えば、ＤＮＡを抽出する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法など、またＲＮＡを抽出する場合には、グアニジン−塩化セシウム超遠心法、ホットフェノール法、又はＡＧＰＣ法などを利用することができる。
【００４２】
また「標的塩基配列」とは、検出が望まれる特定の配列を含む塩基配列をいい、そのような検出が望まれる特定の配列としては、例えば変異配列、多型配列などが挙げられる。「多型」とは、遺伝子又はその一部について１種以上の形態が同時に存在することを指し、遺伝子において少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なる塩基配列が存在する部分は、多型領域と呼ばれる。多型領域としては、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）等の遺伝子多型があり、これは種々のアレルにおいて異なる。本発明において標的塩基配列としては、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む配列が好ましい。
【００４３】
また「プローブ」又は「核酸プローブ」とは、被検試料中に含まれる標的塩基配列とハイブリダイズ可能な核酸を指す。
【００４４】
プローブは、標的塩基配列とプローブとにより形成される核酸アプタマーの構造が、標的塩基配列の特定の配列の有無によって変わり、リガンドとの結合親和性が変化するように設計する。例えば、形成される核酸アプタマーの構造がスリーウェイジャンクション構造の場合には、ジャンクション部分にある３つの塩基対の結合が３つとも完全に相補的である必要がある。プローブの設計は、当業者であれば標的塩基配列の種類及びアプタマー構造を考慮して、適切なものを設計することができる。
【００４５】
例えば、標的塩基配列がＳＮＰを含み、形成される核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造をとるとした場合のプローブの設計について、図１に参照しながら簡単に説明する。スリーウェイジャンクションは、３本の核酸鎖が相互に二本鎖を形成することによって、結果的に３つの二本鎖核酸が１ヶ所で交錯した構造をいう（図１Ａ）。すなわち、３本のステム（二本鎖）が１ヶ所で交差しており、６つの塩基による３組の相補塩基対がスリーウェイジャンクションを構成する。標的塩基配列の検出においては、この３本の核酸鎖のうち１本を標的塩基配列とし、２本をプローブとすることによって、アプタマー構造（すなわちスリーウェイジャンクション構造）を形成させる。そして、ジャンクション部分の相補塩基対の結合が３組とも完全に相補的である場合に、このスリーウェイジャンクション構造にリガンドが結合することができる。従って、ジャンクション部分の相補塩基対の結合が完全に相補的になるようにプローブを設計する。
【００４６】
図１Ａに示すように、ポジティブ標的塩基配列のＳＮＰ（塩基Ｇ）が検出対象となる場合、この標的塩基配列と相補的となるようなプローブＡ及びプローブａを設計する。このとき、標的塩基配列におけるＳＮＰに相当する塩基Ｇはスリーウェイジャンクションのジャンクション部分を構成し、かつジャンクション部分の結合は全て完全に相補的となる。プローブＡは、標的塩基配列と相補的である部分と、プローブａと相補的である部分から構成される。プローブａは、標的塩基配列と相補的である部分と、プローブＡと相補的である部分から構成される。このプローブＡとプローブａは、別々の核酸分子であってもよいし、例えばヘアピン構造をもった１本の核酸分子であってもよい。当業者であれば、標的塩基配列の塩基配列に基づいて、手動で又は公知のプローブ設計用ソフトウエアを用いて、特定の条件下にてハイブリダイズ可能なプローブの塩基配列を決定することができる。
【００４７】
以上のように設計したプローブを用いて標的塩基配列と接触させた場合、それらがハイブリダイズして図１Ａに示すアプタマー構造が形成される。このアプタマー構造のジャンクション部分は完全な相補性により結合し、アプタマーの高次構造が特定の構造に保持されるため、この構造にリガンドは結合することができる。一方、標的とするＳＮＰ（塩基Ｇ）とは異なるＳＮＰ（塩基Ｃ）を有する塩基配列（ネガティブ塩基配列）は、図１Ｂに示すように、標的塩基配列により形成されるアプタマー構造とは異なるアプタマー構造を形成する。すなわち、スリーウェイジャンクション構造のジャンクション部分において、ＳＮＰに相当する塩基Ｃが相補性によりプローブと結合していない。このようなアプタマー構造に対するリガンドの結合親和性は、上記図１Ａのものとは異なり、その親和性は低くなる。
【００４８】
また設計するプローブの長さ（サイズ）は、標的塩基配列の種類、核酸アプタマーの構造の種類、ハイブリダイゼーション条件などに応じて適宜変更する必要がある。例えば、標的塩基配列がＳＮＰを含み、核酸アプタマーがスリーウェイジャンクション構造をとるように２本のプローブを設計する場合には、各プローブの長さは、６塩基長以上、好ましくは１０塩基長以上とすることができる。
【００４９】
設計したプローブが標的塩基配列と適切にハイブリダイズするか否かは、公知のプローブ設計用ソフトウエアを用いて確認することができ、そのようなソフトウエアとしては、例えばＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）などが挙げられる。
【００５０】
プローブは、標的塩基配列とハイブリダイズして核酸アプタマーを形成することができるものであれば、どのような核酸分子又はその誘導体であってもよい。具体的には、天然源から単離された核酸分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡなど）又は化学的に合成された核酸分子（例えば増幅産物など）、合成ヌクレオチド誘導体を含む核酸の誘導体、あるいは骨格がペプチド結合又はアルキル鎖などからなる核酸の誘導体などが挙げられる。プローブは、当技術分野で公知の任意の手法、例えば化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、ＰＣＲ、又はこれらの組み合わせにより作成することができる。
【００５１】
本発明において「ハイブリダイズ」又は「ハイブリダイゼーション」とは、２つ以上の核酸がそれらの相補性に基づいて特異的に結合することを指す。従って、標的塩基配列と「ハイブリダイズ可能なプローブ」とは、標的塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する核酸といえる。「相補的」又は「相補性」とは、塩基対合則の関係を有する核酸について用いられる概念であり、相補性は、「部分的」、すなわち核酸中のある程度の数の塩基のみが塩基対合則により一致しているようなものであってもよいし、全体が完全に相補的であってもよい。他の核酸類似体（例えば、ＩｓｏＣ／ＩｓｏＧ塩基対）又は天然の核酸と塩基対を形成するために使用される核酸類似体もまた、上記「相補性」及び「相補的」の定義内に含まれ、塩基対合するパートナーに対し相補的であるといえる。
【００５２】
上述のように調製された被検試料とプローブとを混合する方法は、特に限定されない。例えば被検試料をプローブを含有する溶液に添加する方法、被検試料とプローブ含有溶液とを混合する方法が挙げられる。また混合する条件は、被検試料中の標的塩基配列とプローブとがハイブリダイズ可能な条件下であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーションは、核酸間の相補性、採用する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッドのＴｍなどの要因により影響を受けるため、これらの要因を考慮して適宜ハイブリダイゼーション条件を決定する。「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーションを実施する際の、温度、イオン強度及び他の化合物に関する条件をいう。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的な塩基を高頻度で有する配列からなる核酸の間でのみ塩基対合が起こる。例えばＳＮＰなどの一塩基の差を検出することが必要な場合には、この「高ストリンジェンシー条件」を採用する。ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件とその決定は当技術分野で周知であり、一般的な実験プロトコールに記載されている。
【００５３】
工程（ｂ）においては、上記で形成された核酸アプタマーと、蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物（以下、蛍光標識リガンドという）を反応させる。
【００５４】
ここで、蛍光標識リガンドの量は、反応させる核酸アプタマーの量を考慮して適宜決定することができる。また、核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとを混合する方法・条件は、核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとが結合することが可能な条件下であれば特に限定されない。
【００５５】
工程（ｃ）においては、核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとの結合親和性を指標として標的塩基配列を検出する。ここで、「検出」とは、被検試料中に標的塩基配列が存在しているか否かを判定することを指し、場合により被検試料中に含まれる標的塩基配列の量（又は割合）を測定することをも指す。
【００５６】
本発明においては、核酸アプタマーとリガンドの結合親和性の変化の検出、すなわち標的塩基配列の検出は、蛍光分子から発生するシグナル変化を指標として行うことできる。蛍光分子から発生するシグナル変化とは、蛍光分子と他の分子（ここでは核酸アプタマー）との結合によって生じる蛍光偏光度をいう。蛍光偏光法による検出では、溶液中に（均一系）おいて核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとの相互作用を解析することが可能であり、Ｂ／Ｆ分離の必要もなく、簡便かつ迅速に標的塩基配列を検出することができる。
ここで、蛍光標識リガンドとしては、上記化合物Ｃ、Ｆ、Ｊ、Ｍを用いることができる。
【００５７】
４．標的塩基配列検出用キット
本発明によれば、標的塩基配列検出用キットもまた提供される。本発明の標的塩基配列検出用キットは、アプタマー法にて標的塩基配列を検出するための反応試薬として上記蛍光標識リガンドと核酸プローブを含み、また補助物質として、限定されるものではないが、緩衝液、溶解液、使用説明書などを含んでいてもよい。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１）  蛍光標識ステロイド化合物の製造（１）
コール酸（和光純薬工業社製）（１．２２  ｍｍｏｌ）を無水塩化メチレンに溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−アミノプロピル）  カルバメート  （１．３４  ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下ＨＯＢｔ）（０．１２  ｍｍｏｌ）を加えた。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（以下ＥＤＣ）（１．５９  ｍｍｏｌ）反応液に滴下し、室温にて攪拌した。反応液を水洗し、有機層を乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製することにより下式で示される化合物Ａを得た。
【００６０】
【化３２】
2004277312.tif 000025
【００６１】
化合物Ａの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ  ｍ／ｚ  （％）：５６５（２２）、４６５（１００）、４４７（７２）、４３０（７２）、４１２（６３）、３９４（５３）
次に、化合物Ａ  （３００  ｍｇ）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレン溶液に溶解し、攪拌した後、溶媒留去した。残渣にメタノールと水酸化ナトリウム水溶液を加え、室温にて攪拌し、その後有機溶媒を減圧留去した。有機層を水洗し、乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｂを得た。
【００６２】
【化３３】
2004277312.tif 000026
【００６３】
化合物Ｂの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ  ｍ／ｚ  （％）：４６５（８０）、３０７（１８）
化合物Ｂ（０．０２  ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）に溶解し、フルオレセインイソチオシアネート（以下ＦＩＴＣ）  （７．８  ｍｇ）とジイソプロピルエチルアミン（以下ＤＩＥＡ）０．０４  ｍｌを加え、室温にて攪拌し、反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣を精製し、下式で示される核酸アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｃを得た。
【００６４】
【化３４】
2004277312.tif 000027
【００６５】
化合物Ｃの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ  ｍ／ｚ  （％）：８５４（１２）、３９０（１００）
（実施例２）  蛍光標識ステロイド化合物の製造（２）
リトコール酸（和光純薬工業社製）（２．０  ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶かし、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−アミノプロピル）  カルバメート  （  ２．２  ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２  ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．０  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水洗し、有機層を乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｄを得た。
【００６６】
【化３５】
2004277312.tif 000028
【００６７】
化合物Ｄの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：６．１０１  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．９０７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６１８  （ｍ，  １Ｈ  ），  ３．６３２  （ｍ，  ２Ｈ  ），  ２．３５４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２５０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０７３  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７４〜１．９４４  （ｍ，  １Ｈ），  １．９１６〜０．９６３  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ３７Ｈ），  ０．９３４  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９１７  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．６４１  （ｓ，  ３Ｈ）
次いで、化合物Ｄ（０．５３  ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレン溶液に溶解し、攪拌した後、溶媒留去した。残渣にメタノールと水酸化ナトリウム水溶液を加え、攪拌し、その後有機溶媒を減圧留去した。有機層を水洗し、乾燥した後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｅを得た。
【００６８】
【化３６】
2004277312.tif 000029
【００６９】
化合物Ｅの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：  ３．５９４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．４１〜３．２１  （ｍ，  ３Ｈ  ），  ２．８９８  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ＝６．８  ），  ２．２６５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０８６  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７９〜１．９４８  （ｍ，  １Ｈ），  １．８６２〜０．９７１  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ３０Ｈ），  ０．９５５  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９４１  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．６８７  （ｓ，  ３Ｈ）ＭＳ  ｍ／ｚ  （％）：４３３（１００）、４１６（２０）、１５４（６５）、１３６（４７）
化合物Ｅ（０．０５７ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解し、トリエチルアミン（１６  μＬ）及びＦＩＴＣ  （０．１１４  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。得られた残渣を精製し、下式で示される核酸アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｆを得た。
【００７０】
【化３７】
2004277312.tif 000030
【００７１】
化合物Ｆの物理化学的性質は以下の通りである。
ＭＳ  ｍ／ｚ  （％）：８２２（５０）、４８２（２７）、４６０（６３）、３９０（５５）
【００７２】
（実施例３）蛍光標識ステロイド化合物の製造（３）
リトコール酸（１．３２  ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解させ、塩化アセチル（１．９９  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｇを得た。
【００７３】
【化３８】
2004277312.tif 000031
【００７４】
化合物Ｇの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：３．６６４  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ３．６３２  （ｍ，  １Ｈ  ），  ２．３５４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１５  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７１〜１．９４１  （ｍ，  １Ｈ），  １．８７７〜０．９７２  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ２６Ｈ），  ０．９１７〜０．９０２  （ｍ，  ６Ｈ），  ０．６４１  （ｓ，  ３Ｈ）
化合物Ｇ  （０．５１２  ｍｍｏｌ  ）を塩化メチレンに溶かし、Ｎ−ボックグリシン  （１．２０ｍｍｏｌ）  、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０２  ｍｍｏｌ  ）、４−（ジメチルアミノ）及びピリジン（６２  ｍｇ，  ０．５１２  ｍｍｏｌ  ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｈを得た。
【００７５】
【化３９】
2004277312.tif 000032
化合物Ｈの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：４．９８９  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．７３９  （ｍ，  １Ｈ  ），  ３．６５２  （ｄ  Ｊ＝８．２，  １Ｈ  ），  ３．６６５  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ２．３５３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１６  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７８〜１．９４８  （ｍ，  １Ｈ），  １．８９６〜０．９８３  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ３５Ｈ），  ０．９２８  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９１１  （ｄ，  Ｊ＝６．４，  ３Ｈ），  ０．６４３  （ｓ，  ３Ｈ）
化合物Ｈ（０．１８  ｍｍｏｌ  ）をトリフルオロ酢酸／塩化メチレンに溶かし、攪拌後、溶媒を留去した。そこに水酸化ナトリウム水溶液とメタノールを加え、攪拌した。反応液を水で洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示される化合物Ｉを得た。
【００７６】
【化４０】
2004277312.tif 000033
【００７７】
化合物Ｉの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：４．７８３  （ｍ，  １Ｈ  ），  ３．６６５  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ３．３９４  （ｓ，  ２Ｈ  ），  ２．３５２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１５  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７９〜１．９４９  （ｍ，  １Ｈ），  １．９４０〜０．９９６  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ２８Ｈ），  ０．９３２  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９１０  （ｄ，  Ｊ＝６．４，  ３Ｈ），  ０．６４４  （ｓ，  ３Ｈ）
化合物Ｉ（０．０６７  ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解して、トリエチルアミン（  １９  μｌ）、ＦＩＴＣ（５２  ｍｇ，  ０．１３４  ｍｍｏｌ）を加え、室温にて攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式に示されるスペーサーとしてアミノ酸であるグリシンが１分子付加し、アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｊを得た。
【００７８】
【化４１】
2004277312.tif 000034
【００７９】
化合物Ｊの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：１０．２７９  （ｍ，  １Ｈ  ），  １０．１１３  （ｍ，  ２Ｈ  ），  ８．３１５〜８．２１１（ａｒｏｍ．，  ２Ｈ），  ７．７２５  （ａｒｏｍ．，  １Ｈ），  ７．２１２  （ａｒｏｍ．，１Ｈ），  ６．６７５〜６．５４５（ａｒｏｍ．，  ５Ｈ），  ４．７１２  （ｍ，  １Ｈ  ），  ３．３９４  （ｄ，  Ｊ＝５．１，  ２Ｈ  ），  ３．５７３  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ３．３９４  （ｓ，  ２Ｈ  ），  ２．３０５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２７９  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０９〜１．０４４（ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ２９Ｈ），  ０．９３２  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８４９（ｄ，  Ｊ＝６．４，  ３Ｈ），  ０．６０５  （ｓ，  ３Ｈ）
【００８０】
（実施例４）蛍光標識ステロイド化合物の製造（４）
上記で調製した化合物Ｉ（０．２３  ｍｍｏｌ）  を塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ボックグリシン  （０．２９  ｍｍｏｌ），  ＨＯＢｔ（０．０２３  ｍｍｏｌ）  を加え０℃に冷却した。次にＥＤＣ  （０．３２  ｍｍｏｌ）を添加し、室温に戻し、攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式に示される化合物Ｋを得た。
【００８１】
【化４２】
2004277312.tif 000035
【００８２】
化合物Ｋの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：６．５４５  （ｍ，  １Ｈ  ），  ５．１０８  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．７９５  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．１２１  （ｄ，  Ｊ＝７．０，  ２Ｈ），  ３．８５５  （ｄ，  Ｊ＝５．７，  ２Ｈ），    ３．６６５  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ２．３５８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１５  （ｍ，  １Ｈ），  １．９７９〜１．９５０  （ｍ，  １Ｈ），  １．９０５〜０．９９６  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ３５Ｈ），  ０．９３０  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．９１１  （ｄ，  Ｊ＝６．４，  ３Ｈ），  ０．６４５  （ｓ，  ３Ｈ）
化合物Ｋ（０．２９  ｍｍｏｌ  ）をトリフルオロ酢酸／  塩化メチレン溶液に溶かし、室温にて攪拌した。反応溶媒を減圧留去し、水酸化ナトリウム／  メタノール溶液を加え攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式に示される化合物Ｌを得た。
【００８３】
【化４３】
2004277312.tif 000036
【００８４】
化合物Ｌの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：７．６６４  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．７９０  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．１４９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６６３  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ３．５５１  （ｍ，  ２Ｈ），    ２．３５３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１６  （ｍ，  １Ｈ），  ２．０７８  （ｍ，  １Ｈ），  １．９５１〜１．０７０  （ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ２８Ｈ），  ０．９２７〜０．９０６  （ｍ，  ６Ｈ），  ０．６４５  （ｓ，  ３Ｈ）
化合物Ｌ（０．１０  ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解した後、トリエチルアミン  （０．２０  ｍｍｏｌ）及び  ＦＩＴＣ（  ７８  ｍｇ，  ０．２０  ｍｍｏｌ）  を加え、室温で攪拌した。反応液を水にて洗浄し、有機層を乾燥後、溶媒を留去した。残渣を精製し、下式で示されるスペーサーとしてグリシンが２分子付加し、核酸アプタマー法において蛍光標識リガンドとなる化合物Ｍを得た。
【００８５】
【化４４】
2004277312.tif 000037
【００８６】
化合物Ｍの物理化学的性質は以下の通りである。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）：１０．２９３  （ｍ，  １Ｈ  ），  １０．１０２  （ｍ，  ２Ｈ  ），  ８．５１６  （ｍ，  １Ｈ  ），  ８．３５０  （ｍ，  １Ｈ  ），  ８．１３２  （ｍ，  １Ｈ  ），  ７．７７８（ａｒｏｍ．，  ３Ｈ），  ７．１９０  （ａｒｏｍ．，  １Ｈ），  ７．２１２  （ａｒｏｍ．，１Ｈ），  ６．６７４〜６．５４４（ａｒｏｍ．，  ５Ｈ），  ４．６５８  （ｍ，  １Ｈ  ），  ４．２５４  （ｄ，  Ｊ＝４．９，  ２Ｈ  ），  ４．０９３  （ｄ，  Ｊ＝５．３，  ２Ｈ  ），  ３．５６９  （ｓ，  ３Ｈ  ），  ３．３９４  （ｓ，  ２Ｈ  ），  ２．３１８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１９５  （ｍ，  １Ｈ），  １．９１６〜１．９０９  （ｍ，  １Ｈ），  １．８９９〜０．９８１（ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｔｓ，  ２８Ｈ），  ０．９００  （ｓ，  ３Ｈ），  ０．８５９（ｄ，  Ｊ＝６．４，  ３Ｈ），  ０．６０８  （ｓ，  ３Ｈ）
【００８７】
（実施例５）  核酸アプタマーと蛍光標識リガンドとの結合親和性を蛍光偏光度による測定
下記の標的塩基配列（下線部分がＳＮＰに対応）にそれぞれ下記の２分子のプローブとスリーウェイジャンクション構造を含む核酸アプタマーを結合させ、核酸アプタマーと化合物Ｃ，Ｆ，Ｊ，Ｍとのそれぞれの結合親和性の差異を蛍光偏光度により評価した。
ポジティブ標的塩基配列’（ポジティブコントロール用）：
５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号１）
ネガティブ標的塩基配列（ネガティブコントロール用）：
５’−ＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’  （配列番号２）
プローブａ：  ５’−ＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＴＧＧ−３’  （配列番号３）
プローブＡ：  ５’−ＣＣＡＧＴＴＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＴＡＧＧ−３’  （配列番号４）
【００８８】
操作を簡単に説明すると、上記ポジティブ標的塩基配列又はネガティブ標的塩基配列と、プローブａ及びプローブＡの３分子のＤＮＡをそれぞれ１０μＭ含有するバッファー（組成：ｐＨ＝７．６，  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １Ｍ  ＮａＣｌ，  ３０  ｍＭ  ＫＣｌ，  ５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）溶液を作成し、９５℃で５分間かけて上記ＤＮＡを変性させ、３０分間かけて２０℃まで徐冷することによりスリーウェイジャンクション構造をとるアプタマーを形成した（図１）。このＤＮＡ溶液に実施例１から４の方法で製造したフルオレセインイソチオシアネート  （ＦＩＴＣ）を標識したリガンド（化合物Ｃ，Ｆ，Ｊ，Ｍ）を加え、ＤＮＡとリガンドのモル比が２０対１又は２対１になる溶液を調製した。この溶液の蛍光偏光度を測定したところ、表１のような結果になった。
【００８９】
【表１】
2004277312.tif 000038
【００９０】
ポジティブ標的塩基配列又はネガティブ標的塩基配列の場合により形成されるアプタマーをそれぞれ図１Ａ及び図Ｂに示す。ポジティブ標的塩基配列の場合にはＳＮＰの塩基においてプローブとの結合が起こり、このスリーウェイジャンクション構造にリガンドが結合する。一方、ネガティブ標的塩基配列の場合にはＳＮＰの塩基においてプローブとの結合がおこらず、リガンドは結合しない。したがってポジティブ標的塩基配列とネガティブ標的塩基配列とではリガンドの結合親和性が異なる。表１から明らかなように、ポジティブ配列又はネガティブ配列を用いた場合に、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性の変化が、リガンドを標識した蛍光分子の蛍光偏光度の差により確認できた。すなわち、一塩基の違い（ポジティブ配列とネガティブ配列の差）により、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が変化することが示された。表１の番号１と番号２より、ステロイド骨格の７位と１２位の水酸基を取り除き分子の疎水性を高めることで、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が強くなることが確認された。さらに、番号６と番号７の比較により、ステロイド骨格と蛍光分子の間にスペーサーとしてグリシンを２分子付加したリガンドの方が、グリシンを１分子付加したリガンドよりも、核酸アプタマーとリガンドとの結合親和性が強くなることが確認された。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によれば、アプタマー法を用いて標的塩基配列を均一系において検出するのに適した、蛍光分子を結合させたステロイド骨格を有する化合物が提供される。該化合物をアプタマー法においてリガンドとして用いると、ＳＰＲや不均一系のようにＢ／Ｆ分離を行く、また核酸アプタマーと該化合物を混合するだけで良いことから、操作が簡便で、解析作業を短時間で行うことができ、スループットを飛躍的に向上させることができる。さらに、洗浄の工程で除去しきれない残渣の影響もなく、感度も格段に向上する。
【００９２】
【配列表】
2004277312.tif 000039
2004277312.tif 000040
2004277312.tif 000041
【００９３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜４：合成オリゴヌクレオチド
【図面の簡単な説明】
【図１】標的塩基配列とプローブとにより形成されるアプタマーの構造を示す図である。Ａはポジティブ標的塩基配列の場合、Ｂはネガティブ標的塩基配列の場合のアプタマーの構造を示す。
【図１】
2004277312.tif 000051