(57)【要約】【課題】乳製品製造に適した乳酸菌である、ラクトバチルス属菌の中から、腸内生残性に優れ、腸管上皮に炎症反応を起こすことなく、マクロファージ細胞から炎症性および抗炎症性サイトカインをバランスよく誘導し、生体でのＩｇＥ抗体産生を抑制する抗アレルギー作用を有する免疫機能調節剤を提供する。【解決手段】ラクトバチルス  アシドフィルスＴＭＣ０３５６菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３２）の生菌、死菌または菌体処理物の何れかを有効成分とする免疫調節剤。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス  アシドフィルスＴＭＣ０３５６菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３２）の生菌、死菌または菌体処理物の何れかを有効成分とすることを特徴とする免疫調節剤。
【請求項２】
ラクトバチルス  アシドフィルスＴＭＣ０３５６菌株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３２）の生菌を有効成分として含有することを特徴とする免疫機能調節食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫機能調節剤および免疫機能調節食品に関し、詳しくは、ラクトバチルス属乳酸菌の特定の菌株の生菌、死菌および菌体処理物の何れかを有効成分とする免疫機能調節剤および上記の生菌を有効成分として含有する免疫機能調節食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、食生活や生活習慣などの変化により、リュウマチ、炎症性腸炎、食物アレルギー等の自己免疫疾患の患者が増大している。アレルギー疾患は、その作用機序により・型から・型まで分類されており、この内、Ｉ型アレルギーには、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー等が含まれ、子供から成人まで幅広い年代の人々がアレルギー症状に苦しんでいる。これまで、食物アレルギーの予防や治療には、食物から原因となる物質を除去する方法が主として行われてきた。しかし、原因物質の除去には、本人の負担だけでなく、調理をする側の負担も伴い、問題点も多い。
【０００３】
Ｉ型アレルギー反応では、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｅ抗体産生が重要な役割を果たすとされている。従って、Ｉ型アレルギー反応を抑制するには、ＩｇＥ抗体産生の抑制が重要であり、これまで、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属などの各種の乳酸菌ＩｇＥ抗体産生抑制効果の様な免疫系の調節作用が報告されている（例えば特許文献１）。また、ビフィズス菌についても同様の報告がある。
【０００４】
【特許文献１】
特開平９−２９５９号公報
【０００５】
上記の様な免疫系調節作用は、上記の乳酸菌が生体のＴｈ１型免疫反応を増強することによって成り立っていると報告されている。
【０００６】
炎症性サトカイン、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αは、感染性病原体および異物の侵入に対して、貪食細胞が最初に出すサイトカインである。その内、マクロファージＩＬ−１２は、ナイーブＴ細胞に作用してＴｈ１細胞への分化を誘導し、Ｔｈ１細胞の増殖を促進する。また、ＩＬ−１２はＴｈ１細胞からのインターフェロン（ＩＦＮ）−γの産生を促する。そして、ＩＬ−１２はＴｈ１型免疫反応を促進するには最も重要な因子である。
【０００７】
一方、ＩＦＮ−γは、ＩＬ−１２産生を誘導し、ＩＬ−１２産生量の増加によって炎症反応を更に強化する。この様なＩＦＮ−γを介するＩＬ−１２の増加は生体にとって不利益な面を持っている。すなわち、過度なＩＬ−１２発現は自己免疫バランスを崩す恐れがある。
【０００８】
抗炎症性サイトカインのＩＬ−１０は、抗原提示細胞であるマクロファージ細胞および貪食細胞からのＩＬ−１２産生を抑制する。そして、炎症性サイトカインＩＬ−１２と抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のバランスは生体にとって大変重要なことと考えられる。
【０００９】
乳酸菌を含むグラム陽性細菌はＩＬ−１２産生を誘導するのに対し、グラム陰性細菌はＩＬ−１０を誘導する。アレルギー抑制剤に推奨されている乳酸菌の多くはＩＬ−１２に対する強い誘導性を持っているが、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を誘導する菌株は殆どない。
【００１０】
乳酸菌の性質は、腸内生残性を含め、殆どが菌株特異的であり、同じ種に属する乳酸菌であっても、腸内生残性が異なることが知られている。そのため、乳製品製造において重要な役割を果たしているラクトバチルス属乳酸菌に属し、腸内生残性に優れ、かつ抗アレルギー作用、特にＩｇＥ抗体産生抑制効果が生体レベルで見出されるような乳酸菌株が求められている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、乳製品製造に適した乳酸菌である、ラクトバチルス属菌の中から、腸内生残性に優れ、腸管上皮に炎症反応を起こすことなく、マクロファージ細胞から炎症性および抗炎症性サイトカインをバランスよく誘導し、生体でのＩｇＥ抗体産生を抑制する抗アレルギー作用を有する免疫機能調節剤を提供することである。
【００１２】
【発明が解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく検討を重ねた結果、ラクトバチルス属乳酸菌のうち、ラクトバチルス  アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＭＣ０３５６菌株は、従来公知乳酸菌の菌株に比し、免疫の活性化機能が極めて高く、その反面、過剰な免疫反応を抑制することが出来、従って、免疫機能の調節が可能であるという特異性を有し、しかも、生菌のままで腸まで到達することが出来、経口投与によってマウスのＩｇＥ抗体産生を抑制する作用を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の第１の要旨は、ラクトバチルス  アシドフィルスＴＭＣ０３５６菌株の生菌、死菌および菌体処理物の何れかを有効成分とすることを特徴とする免疫調節剤に存する。
【００１４】
そして、本発明の第２の要旨は、ラクトバチルス  アシドフィルスＴＭＣ０３５６菌株の生菌を有効成分として含有することを特徴とする免疫機能調節食品に存する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係わるＴＭＣ０３５６菌株は、ラクトバチルス属乳酸菌の中から、以下に示す方法によって選抜することが出来る。
【００１６】
すなわち、ヒトの消化管環境（胃酸による低ｐＨ、小腸での胆汁酸の存在）のモデル試験（耐酸性および耐胆汁性）を経て、生残性を有し、ヒト腸管由来の上皮様細胞Ｃａｃｏ−２株（理研細胞銀行  ＲＣＢ０９８８）と培養した際の培養細胞への付着菌数、炎症性サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−８産生量を指標として選抜することが出来る。
【００１７】
選抜したＴＭＣ０３５６菌株は、独立行政法人  産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託さており、その受託番号は「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２３２」である。
【００１８】
本菌株は、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来のマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株（理研細胞銀行  ＲＣＢ０４３４）と共培養したところ、培養細胞から炎症性サイトカインＩＬ−１２と抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を大量に誘導する。しかも、代表的な食物アレルゲンである卵白オボアルブミン（ＯＶＡ）で免疫したマウスに経口投与した場合、血清中ＩｇＥ抗体量の上昇を抑制する作用を有している。更に、消化管環境での生残性（耐酸性および耐胆汁性）が高く、ヒトの腸管上皮に付着することからヒト消化管への定住性が高く、安定した効果を長い間発揮する可能性が高い。本菌株はプロバイオティクスとして重要な性質を有する微生物である。
【００１９】
本菌株は、乳酸菌の培養の常法に従って任意の条件で培養し、培養物から遠心分離などの固−液分離手段によって集菌し、１−２回、生理食塩水などで洗浄し、本発明の目的に使用することが出来る。
【００２０】
製剤化の形態、特に制限されず、所望により、凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁など、使用目的に応じて適宜決定すればよい。具体的には、カプセル剤、顆粒剤、錠剤などの形態が挙げられる。例えば、サプリメント食品として使用することも出来るが、本菌株をスターター等として発酵食品を製造し、本菌株を含む状態で使用することも出来る。斯かる食品の具体例としては、ヨーグルト、その他の乳酸菌飲料、サワークリーム、クリームチーズ、発酵バター等が挙げられる。
【００２１】
本発明によるＩｇＥ抗体産生抑制には、本菌株の経口投与が望ましい。マウス（２０ｇ）の実験において、菌体重量で０．１７１−０．２２０ｍｇ／０．２ｍｌ／日投与で抑制効果が認められたことから、ヒトの場合、体重１ｋｇ当たり菌体重量で８．５５−１１ｍｇ／日程度の投与で十分な効果が表わされるが、これより多量に摂取してもよい。上記の菌体量を１日１回もしくは数回に分けて摂取すればよい。本菌株は、牛乳中でも生育するため、前記した様に、本菌株を使用して製造した発酵乳などの乳製品の形態で摂取することも出来る。
【００２２】
【実施例】
以下、ＴＭＣ０３５６菌株を使用した各種の試験結果に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【００２３】
試験例１
＜腸管上皮の細胞に及ぼすＴＭＣ０３５６菌株の影響の検討＞
ラクトバチルス・アシトフィルスＴＭＣ０３５６菌株とヒト腸管由来のＣａｃｏ−２細胞を共培養して、腸管上皮細胞に対する影響をＣａｃｏ−２細胞のサイトカイン分泌から検討した。
【００２４】
ＴＭＣ０３５６菌株は、ＭＲＳ液体培地（ディフコ社）で培養後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で数回遠心洗浄し、Ｃａｃｏ−２細胞用培養培地である１０％仔牛胎児血清（ＦＢＳ、ギブコ社）を含む改良ＤＭＥＮ培地（ギブコ社。ＭＥＭ非必須アミノ酸１０ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌに添加・調製済み）に懸濁し、菌体濃度が１．０×１０８ｃｆｕ／ｍｌとなる様に調節した。なお、死菌体は殺菌処理（６５℃、３０分間）を行った。バチルス  ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＪＣＭ１４６５（生菌）を陽性対照菌として使用した。
【００２５】
Ｃａｃｏ−２細胞（理化学研究所・細胞開発銀行）は、２４ウェルプレート（ナンク社）に細胞数１〜２×１０５／ウエルで播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養し、２日毎に培地を交換し、約８日でコンフルエントに達したものから培地を除き、ＴＭＣ０３５６菌株の懸濁培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間共培養後、培養上清中の炎症性サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−８を市販の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットでプレートリーダー（ＩＭＭＵＮＯ−ＭＩＮＩＮＪ−２３００、日本インターメッド）を使用して測定した。
【００２６】
図１および図２に示す様に、陽性対照菌はＣａｃｏ−２培養細胞から炎症性サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−８をそれぞれ２．９±１．５ｐｇ／ｍｌ、２６６．９±６３．６ｐｇ／ｍｌ誘導した。ところが、ＴＭＣ０３５６菌株はＣａｃｏ−２細胞からＩＬ−６およびＩＬ−８を誘導しなかった。
【００２７】
試験例２
＜マクロファージ細胞に対するＴＭＣ０３５６菌株の影響の検討＞
マウスのマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株を使用し、マクロファージ細胞の炎症性および抗炎症性サイトカイン産生に対するＴＭＣ０３５６菌株の影響を検討した。Ｊ７７４．１株（理化学研究所・細胞開発銀行）の培養は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＩＭ  １６４０培地（シグマ社）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で行った。サイトカイン試験ではＪ７７４．１細胞の細胞数が５×１０５／ウエルになる様に２４ウェルプレート（ナンク社）に分注した。
【００２８】
試験例１と同様に処理したＴＭＣ０３５６菌株の菌体懸濁液を試験濃度（５０μｇ／ｍｌ相当）になる様に添加し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した。培養終了後、培養上清を回収し、培養上清中に分泌されるサイトカインを市販のＥＬＩＳＡキット（エンドジェン社）を使用し、プレートリーダーで測定した。
【００２９】
図３および図４に示す様に、ＴＭＣ０３５６菌株は、Ｊ７７４．１培養細胞から多くの炎症性サイトカインＩＬ−１２および抗炎症性サイトカインＩＬ−１０を誘導した（５７．５±１４．０ｎｇ／ｍｌおよび４２１±２０３ｐｇ／ｍｌ）。
【００３０】
試験例３
＜マウス脾臓細胞に及ぼすＴＭＣ０３５６菌株の影響の検討＞
ＴＭＣ０３５６菌株は、ＭＲＳ培地（ディフコ社）にて３７℃で２４時間培養後、ダルベッコのリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）で３回遠心（３，０００ｒｐｍ、１０分間）洗浄の後、Ｄ−ＰＢＳに懸濁し超音波破砕した。この菌体懸濁液の濁度が同菌株の凍結乾燥菌体２ｍｇ／ｍｌを処理したものに相当する様に６６０ｎｍの吸光度で調節し、これを殺菌処理（６５℃、３０分間）した後、細胞の最終培養培地で目的の試験濃度に希釈して使用した。
【００３１】
脾臓細胞を調製するマウスには、特定の微生物および寄生虫の存在しない環境（ＳＰＦ）下で飼育されたＣ５７ＢＬ／６マウス６週齢、雌（日本チャールズリバー（株））を使用した。飼育条件は、室温２５±１℃の制御下、ＡＭ７：００からＰＭ７：００点灯、ＰＭ７：００からＡＭ７：００消灯による１２時間明暗サイクルの環境とし、給餌条件は飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業（株）製）を自由摂取、水は水道水を家庭用浄水器（東レ（株））で浄化した浄水を自由給水とした。
【００３２】
以上の条件下プラスチックケージで群飼育し、１〜２週間の順化させた後、７〜８週齢のマウスから脾臓細胞を採取した。脾臓細胞の採取は、マウスを頚椎脱臼にて屠殺後、７０％エタノールで消毒し、クリーンベンチ内で直ちに開腹、無菌的に脾臓を摘出した。
【００３３】
脾臓は、予め準備したシャーレ中の１０％ＦＢＳ（ギルソン社）を含むＲＰＩＭ  １６４０培地（シグマ社のＬ−グルタミン含有ＲＰＩＭ  １６４０培地に２−メルカプトエタノール５０μＭ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加・調製済み）に浮遊させた。
【００３４】
脾臓は、付着した結合組織を取り除き、細断化した後、滅菌ディスポシリンジの背で物理的に押し潰し、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液は、５０ｍｌコニカルチューブ（ファルコン社）にセットしたセルストレーナー（７０μｍ、ファルコン社）に通し、細胞集塊や支持組織などを除去し、細胞液を回収し、液量を培養液で１０ｍｌに調節した。
【００３５】
その後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１０分間）して上清を廃棄し、これを３回繰り返して細胞を洗浄した。細胞液は、トリパンブルー（ギブコ社）で細胞を染色し、改良ノイバイエル型血球計算盤を使用して細胞数を測定し、細胞数を調節して使用した。
【００３６】
本試験は、２４４ウェルプレート（ナンク社）に生細胞数５×１０６／ウエルで細胞懸濁液を播き、試験ウエルに菌体懸濁液を最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加え、全体量を１，０００μｌ／ウエルに調節し、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。２４時間培養後、培養液を回収し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）で細胞残渣を除き、得られた培養上清を測定まで−８０℃で保存した。培養上清中のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０＆ｐ７０）およびＩＮＦ−γを市販のＥＬＩＳＡキット（アマシャム  ファルマシア  バイオテック社およびエンドジェン社）を使用して測定した。
【００３７】
マウス脾臓細胞の炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２）および抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）産生に対するＴＭＣ０３５６菌株の影響を図５および図６に示した。ＴＭＣ０３５６菌株はマウスの脾臓細胞から多くのＩＬ−１２およびＩＬ−１０を誘導した。
【００３８】
試験例４
＜ＩｇＥ抗体産生に対するＴＭＣ０３５６菌株の影響＞
供試マウスは、ＳＰＦのＢＡＬＢ／ｃマウス６週齢、雄（日本チャールズリバー（株））を使用した。試験は、非免疫対照群、免疫対照群、免疫および選抜菌投与の全３群（各ｎ＝５）に分け、プラスチックケージにて試験群毎の群飼育で実施した。基本的な飼育条件は試験例３の場合と同条件とした。
【００３９】
ＴＭＣ０３５６菌株の経口投与は、凍結乾燥菌体の水溶液（１０ｍｇ／２００μｌ−滅菌生理食塩水）を連続４週間、１日おきに、経口ゾンデにより胃内に強制投与した。免疫対照群ではプラセボとしてＰＢＳを２００μｌ経口投与した。
【００４０】
免疫は、抗原に食物タンパク質である卵白アルブミン（以下ＯＶＡ）を使用し、ＯＶＡ２０μｇにアジュバント（抗原と混合または組み合わせることで抗体産生の増大，免疫応答の増強を起こす物質の総称；免疫補助剤）としてＡｌ（ＯＨ）２ｍｇを加えるＡｌｕｍ法で抗原溶液１００μｌを調製し、マウスの腹腔内への注射で行った。免疫回数は選抜菌投与開始１週間後および３週間後の２回行った。
【００４１】
免疫賦活作用の評価は、血清の抗体濃度で行った。ＴＭＣ０３５６菌株の投与開始後２８日目に血液を採取した。血清は、血液を尾静脈より採取し室温で３０分間放置して凝固させた後、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間、５℃）して上清を得た。上清は再度遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２分間、５℃）し、この上清を血清サンプルとした。血清サンプル中の総ＩｇＥの抗体価を市販のＥＬＩＳＡキットで測定した。なお、各試験群間の統計処理はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定で行った。
【００４２】
血清中の総ＩｇＥ抗体価がＴＭＣ０３５６菌株投与群では、免疫対照群に比べ統計学的にも有意（ｐ＜０．０１）に減少した（図７）。
【００４３】
本発明に係るＴＭＣ０３５６菌株は、腸管へ生きたままで到達し、上皮細胞にも付着性があるため、消化管に一定期間留まることが出来るので、生菌としての効果、すなわち抗菌物質の産生や栄養素の競合による有害菌の阻害などが期待でき、整腸効果も期待できる。更に、ＩｇＥ抗体産生抑制作用による免疫機能調節と併せた包括的な生理効果が期待することが出来る。
【００４４】
なお、今回は食物アレルゲンの内で卵白オボアルブミンを使用したが、それ以外のアレルギーを誘導する食品に対しても、ＴＭＣ０３５６菌株の経口投与による効果が期待される。また、食物アレルギーだけでなく、・型アレルギーに属する花粉症、アトピー性皮膚炎の症状の緩和にも、ＴＭＣ０３５６菌株の投与が期待される。
【００４５】
【発明の効果】
以上説明した本発明によれば、乳製品製造に適した乳酸菌である、ラクトバチルス属菌の中から、腸内生残性に優れ、腸管上皮に炎症反応を起こすことなく、マクロファージ細胞から炎症性および抗炎症性サイトカインをバランスよく誘導し、生体でのＩｇＥ抗体産生を抑制する抗アレルギー作用を有する免疫機能調節剤が提供され、本発明はアレルギー治療の分野に寄与するところが大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＭＣ０３５６菌株または陽性対照菌がヒト消化管のモデルＣａｃｏ−２細胞株の炎症性サイトカインＩＬ−６分泌に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図２】ＴＭＣ０３５６菌株または陽性対照菌がヒト消化管のモデルＣａｃｏ−２細胞株の炎症性サイトカインＩＬ−８分泌に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図３】ＴＭＣ０３５６菌株を含む乳酸菌およびビフィズス菌がマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の炎症性サイトカインＩＬ−１２の分泌に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図４】ＴＭＣ０３５６菌株を含む乳酸菌およびビフィズス菌がマウスマクロファージ様細胞Ｊ７７４．１株の抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の分泌に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図５】ＴＭＣ０３５６菌株がマウス脾臓の免疫細胞の炎症性サイトカインＩＬ‐１２産生に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図６】ＴＭＣ０３５６菌株がマウス脾臓の免疫細胞の抗炎症性サイトカインＩＬ−１０産生に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図７】オボアルブミンで免疫したマウスへのＴＭＣ０３５６菌株の経口投与が血中のＩｇＥ抗体産生に及ぼす影響を調べた結果のグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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