(57)【要約】【課題】従来のような遺伝子ライブラリーを作製しなくともＤＮＡを得ることができ、しかもＤＮＡ配列情報というデータからＤＮＡを容易に合成することのできる方法を提供する。【解決手段】（１）合成したいＤＮＡの部分配列と、オブジェクトＤＮＡデータベースに登録されたオブジェクトＤＮＡとを照合して、一致した部分配列（ｐ１〜２、ｖ３〜４）を抽出する工程、および（２）抽出された部分配列（ｐ１、ｐ２、ｖ３、ｖ４）および非抽出の部分配列（ｐ３〜ｐ８）の鋳型一本鎖の塩基配列を用いて、５’末端側のセンス鎖から始めてセンス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本配列し、しかも隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖と５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように配列する工程からなる、ＤＮＡ合成のためのＤＮＡ設計情報の作製方法、ならびに得られたＤＮＡ設計情報を用いたＤＮＡ合成方法。【選択図】    図５
2004313112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）合成したいＤＮＡの部分配列と、オブジェクトＤＮＡデータベースに登録されたオブジェクトＤＮＡとを照合して、一致した部分配列を抽出する工程、ならびに
（２）抽出された部分配列および非抽出の部分配列の鋳型一本鎖の塩基配列を用いて、５’末端側のセンス鎖から始めてセンス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本配列し、しかも隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように配列する工程
からなる、ＤＮＡ合成のためのＤＮＡ設計情報の作製方法。
【請求項２】
工程（１）において、合成したいＤＮＡの部分配列と部分的に一致したＤＮＡもまた抽出することを特徴とする、請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
（１）合成したいＤＮＡの部分配列と、オブジェクトＤＮＡデータベースに登録されたＤＮＡとを照合して、一致した部分配列を抽出する工程、
（２）抽出した部分配列および未抽出の部分配列の鋳型一本鎖を用いて、５’末端側のセンス鎖から始めてセンス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本配列し、しかも隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように配列する工程
（３）前記配列に従って部分ＤＮＡを準備する工程、
（４）２〜１０本の連続した前記部分ＤＮＡを第一のポリメラーゼ連鎖反応によって連結してモジュール化する工程、ならびに
（５）２〜１０本の連続した前記モジュールを第二のポリメラーゼ連鎖反応によって連結して合成ＤＮＡを得る工程
からなるＤＮＡの合成方法。
【請求項４】
工程（１）において、合成したいＤＮＡの一部と部分的に一致したＤＮＡも抽出することを特徴とする、請求項３に記載のＤＮＡ合成方法。
【請求項５】
（６）新規に準備した部分ＤＮＡおよび合成したＤＮＡをオブジェクトＤＮＡデータベースに登録する工程をさらに含む、請求項３または４に記載のＤＮＡ合成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ合成のためのＤＮＡ設計情報の作製方法、および得られた設計情報を用いたＤＮＡ合成方法に関し、詳細にはＤＮＡの塩基配列情報に基づいて遺伝子ライブラリーを用いることなくＤＮＡを合成する方法に関する。
【０００２】
【従来技術の説明】
研究者や技術者が個々のＤＮＡやタンパク質の構造・機能の解析を試みる際の基本的な技術として、遺伝子クローニング技術がある。該技術は、宿主細胞内で自律複製可能なクローニングベクターに、特定の遺伝子区分を挿入し（挿入されたものを「キメラベクター」という）、このキメラベクターを宿主細胞内に導入することで、特定の遺伝子区分を多量に複製する技術である。遺伝子クローニング技術は、複製する遺伝子区分の周辺にＲＮＡ・タンパク質合成ためのプロモーターを配置することにより、挿入ＤＮＡが指令するＲＮＡ・タンパク質の合成を宿主細胞に多量に行なわせることが可能である。そして、ベクターに挿入された特定遺伝子の発現を観察することによって、細胞内での遺伝子の機能を解析することができる。
【０００３】
遺伝子クローニングを行なうには、目的のＤＮＡを含む遺伝子ライブラリーを作製する必要がある。遺伝子ライブラリーとは、対象生物のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをベクターに連結してできたクローニングベクターの集団である。この遺伝子ライブラリーとポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ法」という）とを用いて、目的のＤＮＡを増幅させる。ＰＣＲ法は、増幅したいＤＮＡ配列の両端を相補的なプライマーで挟んで、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼを用いて、相補鎖の乖離→アニール→伸張を繰り返すことで、両プライマーに挟まれた遺伝子区分を多量に増幅させる技術である。最大２００塩基程度のプライマーは、通常、オリゴＤＮＡ合成機で自作するか、またはオリゴＤＮＡ合成メーカーにオーダーメイド発注し、合成したものを購入するのが一般的である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
多くの生物のゲノムや遺伝子の塩基配列が解読され、ポストゲノム時代と呼ばれる現状では、いろいろな遺伝子データベースから遺伝子の塩基配列情報を取得することが極めて容易になった。取得した塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡを実際に取得したいという状況にも遭遇する。
【０００５】
しかし、従来の遺伝子クローニング技術は、遺伝子ライブラリーとＰＣＲ法によるＤＮＡ複製との組み合わせであるため、まず複製元となる遺伝子ライブラリーを準備する必要がある。しかし、遺伝子ライブラリーの作製から始めるとなると、相当の期間（例えば１ヶ月以上）の期間を要する。２種以上の遺伝子区分をクローニングベクターに挿入しようとすると、２回以上の組換え作業が必要となり、作業的にも時間的にも大きな負担となる。しかも、クローニングベクターに長鎖ＤＮＡを挿入したいものの、長鎖ＤＮＡが制限酵素で多数に断片化されやすく、その挿入が非常に難しい。制限酵素が予想外の場所で働かないよう設計する必要もあり、長鎖になるほど設計が困難となる。
【０００６】本発明の目的は、従来のような遺伝子ライブラリーを作製しなくともＤＮＡを得ることができ、しかもＤＮＡの塩基配列情報というデータからＤＮＡを容易に合成することのできる方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、すでにＤＮＡの塩基配列情報のわかっている相補塩基対をなす長鎖ＤＮＡおよび相補塩基対をなさない短鎖ＤＮＡを、合成のためのオブジェクト（部品）としてとらえることによって、上記の課題を解決できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、（１）合成したいＤＮＡの部分配列と、オブジェクトＤＮＡデータベースに登録されたＤＮＡとを照合して、一致した部分配列を抽出する工程、ならびに  （２）抽出した部分配列および未抽出の部分配列の鋳型一本鎖を用い、５’末端側のセンス鎖から始めてセンス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本の鋳型ＤＮＡを配列し、しかも隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように重複させた配列情報を作製する工程からなるＤＮＡ合成のためのＤＮＡ設計情報の作製方法、ならびに、（３）前記配列情報に従って部分ＤＮＡを準備する工程、（４）２〜１０本の連続した前記部分ＤＮＡを第一のポリメラーゼ連鎖反応によって連結してモジュール化する工程、および（５）２〜１０本の連続した前記モジュールを第二のポリメラーゼ連鎖反応によって連結して合成ＤＮＡを得る工程からなるＤＮＡの合成方法を提供するものである。
【０００９】
本発明のＤＮＡ設計情報の作製方法およびＤＮＡの合成方法（以下、「ＤＮＡ設計・合成方法」と略す）において、オブジェクトＤＮＡデータベースとは、各種生物に由来するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、プライマー、ＰＣＲ産物、ベクターなどのＤＮＡの塩基配列情報を、実際に取得された情報・所在と関連させて格納したデータベースである。該オブジェクトＤＮＡデータベースは、従来の遺伝子ライブラリーと異なり、染色体の全遺伝子集団を格納する必要はない。本発明の方法では、由来の異なる部分ＤＮＡを有機的に結合して目的のＤＮＡを作り上げる。
【００１０】
本発明のＤＮＡ設計・合成方法は、ＤＮＡ配列情報に基づく合成方法であるため、合成したいＤＮＡの配列情報は既知である必要がある。ＤＮＡの配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬなどのインターネット上の遺伝子データベース、学術文献などから取得できる。このＤＮＡ配列情報をそのまま合成に用いれば、天然のＤＮＡを合成することができる。さらに、ＤＮＡ配列情報を目的に応じて操作することによってＤＮＡ改変体を合成することもできる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のＤＮＡ設計・合成方法を、添付の図面を参照しながら説明する。図１は、本発明のＤＮＡ設計・合成方法の全工程を示したフローチャートである。ＤＮＡ設計情報の作製方法は、工程（１）および（２）を含み、ＤＮＡ合成方法は工程（１）〜（５）を含む。以下、図１の工程を、順を追って説明する。
【００１２】
（１）配列情報をオブジェクトデータベースで検索する工程
本発明のＤＮＡ設計・合成方法は、まず、合成したいＤＮＡの配列情報をデータベース検索にかける。図２は、ＤＮＡ塩基配列情報からデータベースを検索する概念図である。ＤＮＡは、直鎖状、円環状のいずれでもよい。合成したい塩基配列の長さは、本発明のＤＮＡ設計・合成方法に組み込まれたＰＣＲ法で伸長可能な範囲内にある。ＰＣＲ法の進歩によって塩基長が伸びれば、本発明のＤＮＡ設計・合成方法で合成できる塩基長も伸びる。
【００１３】
まず、図２に示すように、目的のＤＮＡ塩基配列を短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０１で検索する。短鎖オブジェクトＤＮＡとは、プライマーまたは鋳型ＤＮＡとして使用するものである。短鎖オブジェクトＤＮＡの塩基長は、通常、１０〜２００塩基、好ましくは１５〜１２０塩基である。プライマーとして抽出される短鎖オブジェクトＤＮＡは、プライマー同士で互いに塩基配列が異なり、相補的な対（センス鎖とアンチセンス鎖との関係）を形成しない。図２の例では、完全一致する短鎖オブジェクトＤＮＡとして、ｐ１およびｐ３が抽出されている。
【００１４】
次に、目的のＤＮＡ塩基配列を長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２で検索する。長鎖オブジェクトＤＮＡとは、本発明のＤＮＡ設計・合成方法において鋳型ＤＮＡとして使用するものである。長鎖オブジェクトＤＮＡは、ＤＮＡが実際に取得されればその形態に特に制限がなく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ベクターなどである。長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２には、公共の遺伝子構造解析プロジェクトで解明されたヒト、シロイナズナ、ショウジョウバエ、細菌などの各種生物のゲノム・ｃＤＮＡライブラリーの一部または全部、さらに市販のｃＤＮＡ・ゲノムライブラリーの一部または全部を用いることができる。
【００１５】
長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２には、ベクターＤＮＡを登録しておくことが好ましい。従来、遺伝子ライブラリーからのＰＣＲ産物をクローニングベクターにサブクローニングするときには、ベクターとＰＣＲ産物とのライゲーションに先立ち、制限酵素処理が必要であった。しかし、制限酵素処理は、作製したＰＣＲ産物を断片化する恐れがあり、特に長鎖ＤＮＡをベクターに組み込むことを困難にしていた。本発明のＤＮＡ設計・合成方法では、ベクターＤＮＡをオブジェクトとして合成に組み込むことが可能なため、上記の制限酵素処理を必要としない。したがって、長鎖ＤＮＡをベクターに組み込むことも容易となる。さらに、本発明のＤＮＡ設計・合成方法では、既存のクローニングベクターと部分的に異なるもの（例えば塩基置換、デリューション、ＳＮＰ）の作製や、一部省略によるカスタマイズが非常に容易になる。さらに、本発明の方法では、２種以上の遺伝子区分を一個のクローニングベクターに組み込むことも容易である。
【００１６】
クローニングベクターの種類には、プラスミド、ファージ、ウイルス、コスミド、酵母人工染色体などがあり、挿入遺伝子の長さ、用途などに応じて適当なベクターを使い分ける。プラスミドベクターは、多くの細菌に存在する小型の核外遺伝子であって、通常、５〜１０ｋｂｐの外来性ＤＮＡを組み込むことができる。プラスミドベクターは、現在、試薬企業・研究機関により機能別に作製・販売されている。例えば、大腸菌由来のプラスミドにはｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびｐＥＴがあり、枯草菌由来のプラスミドにはｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５およびｐＣ１９４があり、そして酵母由来プラスミドにはｐＳＨ１９およびｐＳＨ１５がある。
【００１７】
λファージは、大腸菌に寄生するウイルスであって、１５〜２０ｋｂｐの外来性ＤＮＡを埋め込めるベクターである。該ファージの代表例には、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰＩＩがある。コスミドは、λファージのｃｏｓ部位をもったプラスミドであって、約４０ｋｂｐまでの外来性ＤＮＡを組み込むことができる。バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターも使用できる。無害化したウイルスベクターは、特に遺伝子治療用のベクターとして有用である。
【００１８】
上記ベクターには、ベクター導入の有無やクローニングの成否を区別するための選択マーカーが組み込まれている。限定するものではないが、大腸菌その他の細菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性；真核細胞培養についてのジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などが挙げられる。
【００１９】
長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２には、本発明のＤＮＡ設計・合成方法で取得されたＰＣＲ産物、モジュール、キメラベクターのＤＮＡもまた、適宜登録されている。これらの再利用は、オリゴオブジェクトＤＮＡ作製のコストと時間の削減に貢献する。
【００２０】
生物種間で機能を同じくする遺伝子であっても、生物進化によって塩基配列が部分的に異なっている。本発明で合成したいＤＮＡの部分配列と長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２との照合作業では、目的ＤＮＡと部分一致したＤＮＡもまた抽出することが好ましい。部分一致するＤＮＡを積極的に利用することで、データベース利用を促進し、オリゴオブジェクトＤＮＡ合成の必要性を一層削減することができる。例えば、部分一致配列が２００塩基以上もあれば、鋳型ＤＮＡとして活用できる。図２の例では、長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２に完全一致するＤＮＡオブジェクトは見つからなかったものの、部分一致する長鎖ＤＮＡオブジェクトｖ３とそのアンチセンス鎖であるｖ４を抽出している。
【００２１】
上記したような合成したいＤＮＡの部分配列とオブジェクトＤＮＡデータベースとの照合作業は、通常、コンピュータに格納されたコンピュータプログラムにより実行される。図３は、データベース抽出処理を実行するシステムの一例である。該システムは、システム全体を統括的に制御するプログラムされた主制御部３０１に、外部記憶装置３０２が接続されてなる。主制御部３０１には、キーボード、マウスなどの入力装置３０６、入力データをモニタする表示装置３０７および演算結果を出力する出力装置３０８が入出力制御部３０５を介して接続されている。主制御部３０１は、ＯＳなどの制御プログラム、ＤＮＡ設計情報の作製プログラム（外部記憶装置から読み込まれるものを含む）、およびデータを一時格納する内部メモリを有し、上記プログラムはデータベース抽出処理制御部３０３および設計情報作製処理制御部３０４からなる。外部記憶装置３０２は、ＨＤ、ＭＯ、ＣＤ、ＤＶＤなどのストレージ手段であり、短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０１および長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２が格納されている。
【００２２】
図４に、データベース抽出処理制御部３０３が実行する手順の一例を示す。まず、合成したいＤＮＡの配列情報をデータベース抽出するための初期処理を行なう。初期処理の一例として、目的ＤＮＡの塩基配列を、５’末端から３’末端方向に１塩基ずつずらしながら１６塩基に分割（Ｓ４０１）した後、各断片の塩基配列を１６進数変換（例えばＡＡ：０、ＡＴ：１  …  ＣＧ：ｅ、ＣＣ：ｆ）や、さらに２５６進数変換することによって情報量を圧縮する（Ｓ４０２）ことなどが挙げられる。次いで、各分割断片（１６塩基）について、短鎖オブジェクトデータベース２０１を検索する（Ｓ４０３）。候補が検索された場合に、目的配列内に完全一致する部分があるか否かを検索する（Ｓ４０４）。複数回一致することを考慮して、全長にわたり検索を繰り返す。完全一致した場合には、一致したオブジェクトを一致情報（塩基配列、方向、一致位置）と関連づけて抽出する（Ｓ４０５）。すべての分割断片について検索したら、Ｓ４０３に戻って、アンチセンス（逆）鎖についても同じ処理を行なう。
【００２３】
短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０１を用いた検索処理が終了したら、長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース２０２の検索を前記短鎖オブジェクトＤＮＡデータベースと同様に行なう（Ｓ４０６〜４０８）。ただし、ここの検索では、目的ＤＮＡの塩基配列の部分配列と部分一致するオブジェクトＤＮＡも抽出する。具体的には、一致情報から一致部品の末端を検出し、データベース登録内容と比較することにより、前方部分一致（５’方向）と後方部分一致（３’方向）を検出し、一致した内容を順次つなげてゆき部分一致情報（塩基配列、方向、一致位置）を作製する。
【００２４】
なお、短鎖および長鎖オブジェクトＤＮＡデータベースの抽出処理は、上記した検索手法以外にも、例えばホモロジー検索として周知の検索手法のアルゴリズム（ＢＲＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を採用することも可能である。ただし、検索の際には、部分的にも一致度１００％のＤＮＡのみを抽出する。
【００２５】
（２）ＤＮＡ設計情報を作製する工程
工程（１）で抽出した部分配列、およびその鎖間情報（すなわち抽出した部分配列の空隙を埋める未抽出の部分配列）の鋳型一本鎖を用いて、ＤＮＡ合成のための設計情報を作製する。図５に設計情報作製の概念図を示す。設計条件として、５’末端を有するセンス鎖（図５のｐ１）から始めて、センス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本の一本鎖を配列する。センス鎖の５’末端は、対になるアンチセンス鎖と少なくとも平滑であるか、またはｐ１のように突出している。オブジェクトＤＮＡデータベースに一致した部分配列（図５のｐ１、ｐ２、ｖ３およびｖ４）があればそれを用い、もしもない場合には、オリゴオブジェクトＤＮＡ（図５のｐ３〜ｐ８）を合成して鎖間を埋める。オリゴオブジェクトＤＮＡは、通常、４０〜２００塩基の範囲で設計する。鎖間が大きく空いているときには、複数のオリゴオブジェクトに割り振り、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖と互い違いに配列する。
【００２６】
隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように一本鎖を配列する。隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が相補的な結合領域は、全体で一本鎖を形成するときの糊代になる。ＰＣＲ法において、糊代部分が起点となって５’→３’方向にＤＮＡ伸長が行なわれ、ＰＣＲサイクルを繰り返すうちに最終的に全体で一本のＤＮＡを得る。糊代の長さはＰＣＲ法のアニール温度に応じて決める。通常、糊代のＴｍ（融解温度）が５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃になるように決める。１モジュール内のＴｍと、モジュール間のＴｍとで温度差をつけることも可能である。例えば１モジュール内のＴｍをモジュール間のＴｍよりも若干低く設定することによって、糊代部分の長さを短くすることができ、その結果、オリゴＤＮＡ作製コストの低減につながる。
【００２７】
上記の設計処理作業は、図３のコンピュータシステムの設計情報作製処理の制御部３０４が実行する。図６に、制御部３０４が実行する内容のフローチャートを示す。まず、糊代のＴｍ（融解温度）を設定する（Ｓ６０１）。各モジュール内の複数の糊代のＴｍは、通常、ほぼ等しく設定する。モジュール間の複数の糊代のＴｍについても同様である。次に、設定Ｔｍを用いて補充鎖算出のための糊代長ａを予測する（Ｓ６０２）。予測には、一般に糊代のＧＣ塩基含量が高いほど糊代の結合力が強くなり、Ｔｍが高くなる関係を利用する。Ｔｍと糊代長の間には、例えば、以下の近似式（１）：
【００２８】
【数１】
2004313112.tif 000003
（式中、ａは糊代の塩基数、ｎは鎖間の塩基数、ＧＣ塩基数は鎖間のＧＣ含量、ＡＴ塩基数は鎖間のＡＴ含量、Ｔｍ’は鎖間のＡＴが最も続く場所のＴｍ値である）が成り立つ。あるいは、近似式（２）：
【数２】
2004313112.tif 000004
（式中、ａは糊代の塩基数、ＧＣ塩基数は糊代のＧＣ含量、ＡＴ塩基数は糊代のＡＴ含量である）
が成り立つ。
【００２９】
次に、抽出した部分配列の隣接鎖間距離Ｘ（例えば、図５のｐ１−ｐ２間）測定する（Ｓ６０３）。ここで、Ｘ≧０ならば隣接鎖は重ならず、Ｘ＜０ならば隣接鎖が重なることを意味する。Ｘ≧０の場合はＳ６０５に進み、それ以外はＳ６０４にて鎖間調整する。短鎖が重なっている場合は、重なっているどちらかの隣接鎖を間引き、長鎖の場合は重なり部分Ｘを設定Ｔｍから予測される糊代長ａ、または０以下まで削る。
【００３０】
Ｓ６０５に進み、鎖間を埋めるための最適な補充鎖（オリゴオブジェクトＤＮＡ）を算出する。個々の予測糊代長ａのＴｍを上記式（１）または（２）で計算し、Ｔｍが設定値からずれていれば、糊代長を変更することで設定Ｔｍに近づける。鎖間が大きく空いていてオリゴＤＮＡ合成機の合成限界（設計時に設定した鎖長）を超えるときには、複数のオリゴオブジェクトＤＮＡを割り当てる。Ｓ６０６に進み、オリゴオブジェクトＤＮＡ、短鎖オブジェクトＤＮＡまたは長鎖オブジェクトＤＮＡの塩基配列の糊代部分の配列が異なるかをチェックする。同一の糊代を作らないことによりミスマッチ増幅を回避する。上記の条件に反する場合には、Ｓ６０４に戻って鎖間調整を繰り返す。Ｓ６０７で、ＤＮＡ合成のための設計情報を出力する。図５に、ＤＮＡ設計情報の処理結果の一例を示す。ここでは、抽出した部分配列（ｐ１、ｐ２、ｖ３およびｖ４）の鎖間を埋めるために、ｐ３〜ｐ８のオリゴオブジェクトＤＮＡを配置している。設計情報の出力方式は、紙媒体でも電子媒体でもよい。
【００３１】
（３）部分ＤＮＡおよびオリゴオブジェクトＤＮＡを準備する工程
上記で得られたＤＮＡ設計情報に基づいて、部品となる短鎖オブジェクトＤＮＡを短鎖オブジェクトＤＮＡ格納庫から出庫する。同じように、部品となる長鎖オブジェクトＤＮＡを長鎖ＤＮＡ格納庫から出庫する。長鎖オブジェクトＤＮＡの一部分が必要な場合には、必要な部分配列をプライマーで挟んでＰＣＲ法で切り出す。
【００３２】
データベースに登録されておらず、合成の必要なオリゴオブジェクトＤＮＡは、オリゴＤＮＡ自動合成機で合成する。オリゴＤＮＡ自動合成機は、入力された塩基配列を基に、チューブで結合され試薬、溶媒を入れたボトルのバルブを開閉させながら固相上に必要な試薬を順に送り出す装置である。ＤＮＡ合成機は、チューブから送り出される、固相上で反応させたい基以外を保護したヌクレオチド同士を、縮合剤を用いて結合させ、五炭糖の３’と５’の間でリン酸ジエステル結合を形成させるサイクルを次々と繰り返すことにより、３’→  ５’へＤＮＡ鎖を合成連結させる。オリゴオブジェクトＤＮＡ合成は、オリゴＤＮＡ受託合成メーカーに依頼して調達することもできる。
【００３３】
（４）モジュール化工程
モジュール化とは、工程（３）のＤＮＡ設計情報に基づいて、部分ＤＮＡおよびオリゴＤＮＡの連続鎖からなる２〜１０本、好ましくは２〜６本のモジュール単位を連結することをいう。本発明のＤＮＡ設計・合成方法では、部分ＤＮＡを一旦モジュール化し、そのモジュールをさらに連結することで、ＤＮＡの増幅に偏りが生じて全長ＤＮＡが得られないなどの事態を回避することができる。図５の設計情報例を用いたモジュール化の概念図を図７に示す。登録された短鎖オブジェクトＤＮＡ（ｐ１〜ｐ２）および合成オリゴオブジェクトＤＮＡ（ｐ３〜ｐ６）でモジュール１を形成し、登録された部分一致長鎖オブジェクトＤＮＡ（ｖ３〜４）でモジュール２を形成し、そして合成オリゴオブジェクトＤＮＡ（ｐ７〜ｐ８）でモジュール３を形成している。
【００３４】
以下に、ＰＣＲ法によるモジュール化を具体的に説明する。短鎖・長鎖オブジェクトＤＮＡおよび合成したオリゴオブジェクトＤＮＡ、ＰＣＲ法の原料であるｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオチド類）、塩、ならびに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで反応液を作る。耐熱性ポリメラーゼは、細菌由来のｐｏｌ  Ｉ型酵素（例えばＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、始原菌由来のα型酵素（例えばｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ）のいずれでもよく、さらにこれらを二種混合したものでもよい。これらは試薬メーカーから市販されているもの、例えばＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上、ＴａＫａＲａ社製）、ＫＯＤ＋（ＴＯＹＯＢＯ社製）などを制限なく使用することができる。ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、通常、０．２５単位／μｌである。バッファーは、前記市販の耐熱性ポリメラーゼに同梱された１０×バッファーを使用すればよい。例えばＴａｑポリメラーゼの１０×バッファーには、通常、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１０〜２５ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、およびＭｇＣｌ２１〜５．０ｍＭが含まれている。
【００３５】
鋳型ＤＮＡの濃度は、通常、数十ｐｇ／μｌ〜数ｎｇ／μｌである。プライマーは、通常、０．２〜１０μＭ用意する。プライマーが少なすぎると反応が進まず、逆に多すぎると非特異的な増幅の原因となる場合がある。ｄＮＴＰｓは各０．２〜２ｍＭ用意する。
【００３６】
上記の反応液を加温し、鋳型ＤＮＡの二本鎖を乖離させる。次に、それぞれの一本鎖の相補的部分に重複するプライマー（隣の鋳型ＤＮＡ）が二本鎖を形成（アニール）する温度に冷却する。最後に、相補部分を起点として耐熱性ポリメラーゼ酵素によって５’→３’方向にＤＮＡ伸長を行なう。このサイクルを繰り返すことにより、連続した部分ＤＮＡおよびオリゴＤＮＡのモジュール化を達成する。
【００３７】
ＰＣＲ法の条件に関して、鋳型兼プライマーＤＮＡのアニール温度は、設計時に設定した糊代のＴｍに設定する。ＰＣＲ法の各ステップ（変性、アニール、伸長）にかける時間と温度は、例えば熱変性（９３〜９７℃）で３０秒、アニール（糊代のＴｍ）で３０秒、伸長反応（６８〜７２℃）で０．５〜１分×増幅する鎖長（ｋｂ）である。サイクル数は、合成したいＤＮＡ量に依存するが、一般に３０〜４０サイクルでよい。
【００３８】
（５）モジュール連結工程
上記で得られた連続するモジュールを、通常、２〜１０本、好ましくは２〜６本ＰＣＲ法で連結する。ＰＣＲ法の手順および条件は、（４）のモジュール化工程と同様である。図７の例では、プライマーとしてｐ１およびｐ８を用いて、モジュール１〜３を連結している。オブジェクトＤＮＡにベクターを使用した場合など、合成ＤＮＡを閉環する必要があるときには、セルフライゲーション操作を行う。Ｔ４ファージのＤＮＡカイネ−スおよびリガーゼが２本鎖ＤＮＡの平滑末端同士を直接結合するのに用いられる。市販のライゲーションキットを使用することもできる。
【００３９】
このように、本発明の設計・合成方法は、目的遺伝子の遺伝子ライブラリーを作製およびスクリーニングする必要がないので、１０ｋｂｐ以上の長鎖ＤＮＡでも３〜４日という短期間で作製可能である。
【００４０】
（６）サブクローニング工程
サブクローニングは、ＤＮＡ合成時にベクターＤＮＡをオブジェクトとして組み込んでおけば省略することができる。しかし、上記合成ＤＮＡにベクターＤＮＡが結合していない場合や、機能解析やタンパク質発現のためにベクターを乗せ換えるなどの必要がある場合には、以下の方法でサブクローニングする。
【００４１】
クローニングベクターの挿入部位に、目的特定遺伝子区分を挿入して使用する。クローニングベクターに挿入する方法は、従来公知の方法を使用することができる。挿入の準備として、クローニングベクターを特定部位で切断する制限酵素により、クローニングベクターの挿入目的部位を切断する。ＰＣＲ法により含成された合成ＤＮＡの末端を、クローニングベクターの挿入目的部位と連結可能なように制限酵素などで加工する。通常は、プライマー設計時にスムースに連結できるように細工する。最後に、ＰＣＲ法により含成されたＤＮＡと特定部位で切断したクローニングベクターとを、ＤＮＡライゲース酵素を用いて連結する。
【００４２】
（７）形質転換工程
次いで、（５）または（６）のキメラベクターを宿主細胞に導入する。宿主細胞は、クローニングベクターが安定かつ自律的に増殖可能なものであれば、制限なく使用することができる。宿主細胞の例には、大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・チフィムリウムなどの細菌；酵母などの真菌；ショウジョウバエＳ２、シロナヨトウＳｆ９などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。
【００４３】
ベクターの細胞への導入方法として、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介融合（リポフェクション）、マイクロインジェクション、複製能のないウイルスによる形質導入などがある。宿主細胞に応じて導入法を使い分ける。
【００４４】
キメラベクターが挿入された宿主細胞は、適当な培地上にプレーティングを行なって培養し、単一のベクターを有する単一宿主細胞由来のコロニーを形成させる。培地中には、細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有させる。炭素源としては、グルコース、シュクロースなどの糖類；グリセロールなどのアルコール類；有機酸などが適宜使用される。窒素源としては、アンモニアまたはアンモニウム塩類、アミン類、その他の窒素化合物、あるいはペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウムがある。添加物として酵母、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。目的のキメラベクターをもった宿主細胞のみを培養するための選択マーカーとして、また雑菌の繁殖を防ぐために、ベクターの薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質を培地中に加える。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するベクターを含む大腸菌を培養するには、大腸菌用ＬＢ培地に抗生物質アンピシリンを添加する。
【００４５】
クローニングベクターは宿主細胞内で多量に自己増幅する。ＤＮＡの合成が適確に行なわれたか否か、目的物の品質はどうかなどをチェックする方法には、宿主細胞コロニーのミニプレップ処理などでクローニングベクターを精製した後、挿入ＤＮＡの全長または部分長をベクターから切り出し、切り出されたＤＮＡを電気泳動でチェックする方法、ＰＣＲ方法によるチェック、コロニーハイブリダイゼーション法、カラーセレクションなどがある。
【００４６】
（８）遺伝子発現工程
宿主細胞に目的の合成ＤＮＡの産物（タンパク質）を作らせたい場合には、ベクターに発現ベクターを使用すればよい。発現ベクターは、プロモーターおよびターミネーターと連結したベクターである。プロモーターは、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰなどが利用でき、動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが利用できる。市販の発現ベクターには、例えばｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴおよびλｇｔ１１がある。合成ＤＮＡはリボソーム結合部位（ＳＤ配列）の後に組み込まれる。
【００４７】
遺伝子発現の形態には、宿主細胞内にタンパク質を生産させる方法、宿主細胞外にタンパク質を分泌させる方法、宿主細胞外膜上にタンパク質を生産させる方法などがある。タンパク質を宿主細胞で発現させた後、培養物から目的タンパク質を単離精製する。公知の分離操作、例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析、溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどを適宜併用することができる。
【００４８】
前記クローニングベクターをマウスなどの動物の受精卵に導入し、または動物に直接注入することにより、トランスジェニック動物やノックアウト動物を作ることも可能である。
【００４９】
（９）ＤＮＡ保管・登録工程
上記工程で得られた新規なオリゴオブジェクトＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＤＮＡを組み込んだキメラベクターは、その一部を格納庫に保管する。例えば、共有を許される物は共有用の格納庫に保管し、一方、共有を許されない物は預かり用の格納庫に保管する。さらに、これらの保管されたオブジェクトＤＮＡの塩基配列情報を、格納情報と関連付けて、短鎖・長鎖オブジェクトデータベースに登録する。登録によって、次回のＤＮＡ合成に既存の資源を有効活用することが可能となる。
【００５０】
次に、本発明のＤＮＡ設計・合成方法の変形例を示す。図８は、ＤＮＡ合成の依頼元、ＤＮＡ設計情報の作製拠点およびＤＮＡの合成拠点が別個に存在する例である。本発明のＤＮＡ設計・合成方法では、短鎖・長鎖オブジェクトＤＮＡデータベースを充実させるほど効果が増すので、図８のようにＤＮＡ設計およびＤＮＡ合成の専門拠点を置くことは好ましい。
【００５１】
この使用態様では、ＤＮＡ合成を希望する依頼者は端末８０１からインターネットあるいは通信回線を介してＤＮＡ合成システムへアクセスする。ＤＮＡ合成システムは、サーバコンピュータ８０３、短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース８０４、および長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース８０５（適宜、共有用データベースと依頼者特定データベースに分かれている）からなり、さらにオブジェクトＤＮＡ格納庫８０７（適宜、共有または依頼者特定格納庫に分かれている）およびオリゴＤＮＡ自動合成機８０８へＤＮＡ設計情報８０６を送付する手段を有する。
【００５２】
図９は、上記ＤＮＡ合成システムにおける上記三者間の手続きの流れを示す図である。研究者、技術者などの依頼者は、依頼者端末８０１からインターネットを介してゲノムネットなどの遺伝子情報データベース８０２にアクセスし、また、学術情報誌を入手することによって、合成したいＤＮＡの配列情報を取得する（Ｓ９０１）。あるいは、用途や研究目的に沿って既知のＤＮＡ配列情報を基に一部改変したＤＮＡ配列情報を作製する。
【００５３】
依頼者は、合成を依頼したいＤＮＡ配列情報をインターネット、通信回線などを通じてＤＮＡ合成システム（サーバコンピュータ８０３）に送る（Ｓ９０２）。ＤＮＡ合成システムのサーバコンピュータ８０３が配列情報を受け取り、短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース８０４および長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース８０５を検索し、一致または部分一致する部分ＤＮＡを抽出する（Ｓ９０３）。得られた部分ＤＮＡの塩基配列情報とそれらの鎖間情報を用いて、ＤＮＡ合成のための設計情報８０６を作製する（Ｓ９０４）。作製されたＤＮＡ設計情報８０６は、依頼者へ送るか、あるいはＤＮＡ合成ために生産拠点へ送付する。ＤＮＡ設計情報の作製の情報拠点、オリゴＤＮＡ合成、ＰＣＲ、シーケンスなどの拠点が離れていてもかまわない。
【００５４】
ＤＮＡ生産拠点では、担当者が設計情報８０６に基づいて、短鎖オブジェクトＤＮＡ格納庫および長鎖ＤＮＡオブジェクトＤＮＡ格納庫から必要なオブジェクトＤＮＡを出庫し、足りないオリゴオブジェクトＤＮＡについてはオリゴＤＮＡ自動合成機で合成する（Ｓ９０５）。得られた部品とＰＣＲ法を用いてオブジェクトＤＮＡのモジュール化とモジュール連結を行なう（Ｓ９０６、Ｓ９０７）。連結された合成ＤＮＡ８１０は、検査後、その状態であるいは凍結乾燥などの処理を施した後に依頼者へ届ける。また、適宜のサブクローニング後（Ｓ９０８）、クローニングベクターを宿主細胞に接種して形質転換し（Ｓ９０９）、形質転換細胞内でベクターを自律増殖させ、あるいは遺伝子を発現させてタンパク質を得て（Ｓ９１０）から、ＤＮＡ、タンパク質などを依頼者に届けてもよい。形質転換したノックアウト動物またはやトランスジェニック動物８１１を供給することもできる。
【００５５】
本発明のＤＮＡ設計・合成方法は、上記の使用態様以外にも応用または変形が可能である。その一例は、オブジェクトＤＮＡデータベース；合成したいＤＮＡの部分配列と、オブジェクトＤＮＡデータベースに登録されたオブジェクトＤＮＡとを照合して、一致した部分配列を抽出するデータベース抽出手段；ならびに抽出された部分配列および非抽出の部分配列の鋳型一本鎖の塩基配列を用いて、５’末端側のセンス鎖から始めてセンス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本配列し、しかも隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように配列する設計情報作製手段を備えたＤＮＡ設計システムである。また別の一例は、（１）合成したいＤＮＡの部分配列と、オブジェクトＤＮＡデータベースに登録されたオブジェクトＤＮＡとを照合して、一致した部分配列を抽出する工程、ならびに（２）抽出された部分配列および非抽出の部分配列の鋳型一本鎖の塩基配列を用いて、５’末端側のセンス鎖から始めてセンス鎖、アンチセンス鎖の順に交互に合計偶数本配列し、しかも隣接するセンス鎖とアンチセンス鎖との５’末端同士および３’末端同士が互いに相補的な結合領域を有するように配列する工程をコンピュータに実行させるためのプログラムである。さらにまた別の一例は、該プログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【００５６】
【実施例】
以下に、実施例を用いて本発明のＤＮＡ設計・合成方法をさらに詳細に説明する。
〔実施例１〕
塩基配列（配列番号１）の概要を図１０に示すＤＮＡの合成を行なった。この塩基配列は、図１１の制限酵素地図に示されるように、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（２９６１ｂｐ、以下「ｐＢＳＫ＋」と略す）のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に、１１２ｂｐのＤＮＡ断片を挿入した全長３０７３ｂｐの環状のＤＮＡである。図１０のＴ７−Ｔ３間がＭＣＳであり、また、下線で示した領域が今回ｐＢＳＫ＋へ挿入する配列である。
【００５７】
（１）データベース抽出
目的の環状ＤＮＡを、図３のシステムのデータベース抽出処理制御部３０３に、図４に示す手順でデータベース抽出処理を実行させた。あらかじめ、短鎖オブジェクトデータベースには、既存の各種プライマーを登録しておき、一方、長鎖オブジェクトデータベースには、ｐＢＳＫ＋を登録しておいた。データベース抽出の結果を図１２に示す。短鎖オブジェクトＤＮＡデータベースからは、図１２のＤＮＡ１（斜線矢印部分）が見つかった。長鎖オブジェクトＤＮＡデータベースからは、図１２のＤＮＡ２（白抜き矢印部分）が見つかった。ＤＮＡ２がｐＢＳＫ＋であることから、本データベース抽出処理が順調に遂行されたことを確認した。
【００５８】
（２）ＤＮＡ設計情報作製
上記抽出された部分ＤＮＡとその鎖間情報とから、図３のシステムの設計情報作製処理制御部３０４に、図６に示す手順でＤＮＡ設計情報作製処理を実行させた。設計条件として、モジュール内およびモジュール間のＴｍを６０℃とし、オリゴオブジェクトＤＮＡの最大設計長を５９塩基とした。短鎖オブジェクトＤＮＡデータベースから抽出したＤＮＡ１を使用すると、糊代が足りなくなるため間引きし、新たにオリゴオブジェクトＤＮＡとしてＰ１〜Ｐ４を作るという演算結果を得た。ＤＮＡ合成のための設計情報の概観を図１３に示す。また、各オブジェクトＤＮＡの塩基配列情報を図１４および１５に示す。オブジェクトＤＮＡのモジュールの組み合わせとＴｍを表１にまとめた。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
（３）オブジェクトＤＮＡの準備
上記設計情報に従ってオブジェクトＤＮＡを準備した。まず、上記Ｐ１〜Ｐ４を、オリゴＤＮＡ合成機を用いて合成した。次いで、Ｐ５およびＰ６の切り出しに用いるプライマーＶ１（配列番号７）およびＶ２（配列番号８）を、オリゴＤＮＡ合成機を用いて合成した。長鎖オブジェクトＤＮＡの格納庫からｐＢＳＫ＋を出庫し、上記プライマー（Ｖ１およびＶ２）を用いてＰＣＲ法でＰ５およびＰ６を切り出した。ＰＣＲ法の反応液の組成および温度サイクルを、それぞれ、表２および図１６に示す。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
（４）モジュール化
Ｐ１〜Ｐ４を鋳型としたＰＣＲ法（プライマーとしてＰ１およびＰ４を使用）によって、モジュール２を作製した。ＰＣＲ法の反応液の組成を表３に示す。温度サイクル条件は図１６と同様に指定した。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
図１７にモジュール１および２の電気泳動結果を示す。図中、レーン▲１▼はｐＢＳＫ＋をプライマーＶ１、Ｖ２でＰＣＲを行った後の産物を電気泳動したものであり、２０００〜３０００塩基あたりにバンドが確認された。レーン▲２▼はＰ１〜Ｐ４をプライマーＰ１、Ｐ４でＰＣＲを行った産物を電気泳動したものであり、５００塩基未満のバンドが確認された。
【００６５】
（５）モジュール１とモジュール２との連結
（４）のモジュール１および２をエタノール沈殿後、サンプル濃度を調整し、次いで、モジュール１および２を鋳型としてＶ１およびＰ１プライマーでＰＣＲを行った。表４および図１８に反応液の組成および温度サイクル条件を示す。
【００６６】
【表４】
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【００６７】
上記ＰＣＲ産物のサンプル濃度を変えて電気泳動した結果を図１９に示す。図１９において、モジュール１、モジュール２、およびモジュール１＋２（モジュール１と２との連結）と予想されるバンドを確認した。
【００６８】
（６）セルフライゲーション
電気泳動結果から、モジュール１＋２のバンドを切り出し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で精製後、末端部ブラントエンド（７１５、７１６）のセルフライゲーション（１６℃×２時間）を行って、直鎖状ＤＮＡを閉環した。ライゲーション反応液の組成を表５に示す。
【００６９】
【表５】
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【００７０】
（７）形質転換
セルフライゲーションによって末端同士を再結合したキメラベクターを、コンピテントな状態の大腸菌（ＤＨ５α株）に形質転換した。形質転換された大腸菌はＬＢ−ＡＭＰ培地で順調に増殖した。培地から１０個の大腸菌コロニーを選択してミニプレップした後、得られた精製物を電気泳動にかけた。その結果を図２０に示す。電気泳動結果の中からレーン▲６▼、▲７▼および▲８▼を選択し、そのシーケンスを行った。その際、ＰＴ７プライマーでインサート部分を順方向にシーケンスし、ＰＴ３プライマーでインサート部分を逆方向にシーケンスした。シーケンスの結果から目的配列がマルチクローニングサイトに挿入されていることを確認した。
【００７１】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ設計・合成方法は、ＤＮＡの複製ではなく合成であるため、従来のような遺伝子ライブラリーを準備して、スクリーニングする必要がない。したがって、所望のＤＮＡを短期間で取得することが可能になる。本発明の方法はまた、合成するＤＮＡ配列情報を変更することによって自由な遺伝子設計が容易になる。さらに制限酵素処理を省略できるので、クローニングベクターの作製が従来方法よりも簡単になる。クローニングベクター自体の加工も可能となる。そして、一度作製したオリゴＤＮＡ、合成ＤＮＡ（ＰＣＲ産物）などの再利用が可能である。オブジェクトデータベースを充実させることによって、ＤＮＡ合成コストの一層の削減が図れる。
【００７２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤＮＡ設計・合成方法の全工程を示したフローチャートである。
【図２】ＤＮＡ塩基配列情報からデータベースを検索する概念図である。
【図３】本発明のＤＮＡ設計情報の作製方法を実行するコンピュータシステムの一例である。
【図４】図３のシステムにおいて、データベース抽出処理制御部が実行する作業のフローチャートである。
【図５】本発明のＤＮＡ設計・合成方法における設計情報作製の概念図である。
【図６】図３のシステムにおいて、設計情報作製処理制御部が実行する作業のフローチャートである。
【図７】本発明のＤＮＡ設計・合成方法におけるモジュール化の概念図である。
【図８】本発明のＤＮＡ設計・合成方法の応用例である。
【図９】図８のＤＮＡ合成システムにおける手続きの流れを示すフローチャートである。
【図１０】本発明に従う実施例１で合成したいＤＮＡの塩基配列の説明図である。
【図１１】図１０の合成したいＤＮＡの塩基配列を制限酵素地図で表したものである。
【図１２】図１０のＤＮＡ塩基配列情報をオブジェクトＤＮＡデータベース検索した結果を示す図である。
【図１３】図１０のＤＮＡ合成のための設計情報を示した図である。
【図１４】ＤＮＡ合成に用いるオブジェクトＤＮＡ（ｐ５）の塩基配列である。
【図１５】ＤＮＡ合成に用いるオブジェクトＤＮＡ（ｐ１〜ｐ４）の塩基配列である。
【図１６】本発明に従う実施例１において、オブジェクトＤＮＡ（ｐ５、ｐ６）を切り出すために行ったＰＣＲ法の温度サイクルを示す図である。
【図１７】実施例１のモジュール１および２の電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図１８】本発明に従う実施例１において、モジュール１と２とを連結するために行ったＰＣＲ法の温度サイクルを示す図である。
【図１９】図１８のＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【図２０】形質転換後のベクター精製物の電気泳動結果を示す図面代用写真である。
【符号の説明】
２０１  短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース
２０２  長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース
３０１  主制御部
３０３  データベース抽出処理制御部
３０４  設計情報作製処理制御部
８０３  サーバコンピュータ
８０４  短鎖オブジェクトＤＮＡデータベース
８０５  長鎖オブジェクトＤＮＡデータベース
８０６  ＤＮＡ設計情報
８０７  オブジェクトＤＮＡ格納庫
８０８  オリゴＤＮＡ自動合成機
８１０  合成ＤＮＡ
８１１  ノックアウト動物またはやトランスジェニック動物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2004313112.tif 000033
【図１８】
2004313112.tif 000034
【図１９】
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【図２０】
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