(57)【要約】【課題】収穫量の増大が望める、植物の栽培方法を提供することを課題とする。【解決手段】以下のステップａ）を含む、形質転換植物の栽培方法、ａ）ＤｎａＫ遺伝子が導入されてなる形質転換植物をストレスのない通常の条件下で生育させるステップ。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップａ）を含む、形質転換植物の栽培方法、
ａ）ＤｎａＫ遺伝子が導入されてなる形質転換植物をストレスのない通常の条件下で生育させるステップ。
【請求項２】
前記通常の条件が、少なくとも温度ストレスが実質的にない条件である、請求項１に記載の形質転換植物の栽培方法。
【請求項３】
前記通常の条件が、少なくとも日照時間ストレスが実質的にない条件である、請求項１に記載の形質転換植物の栽培方法。
【請求項４】
前記通常の条件が、少なくとも塩ストレスが実質的にない条件である、請求項１に記載の形質転換植物の栽培方法。
【請求項５】
以下のステップＡ）を含む、形質転換植物の栽培方法、
Ａ）ＤｎａＫ遺伝子が導入されてなる形質転換植物を高温ストレス又は塩ストレスの存在する条件下で生育させるステップ。
【請求項６】
前記ＤｎａＫ遺伝子がアファノテイーキ・ハロフィチカ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）のＤｎａＫ遺伝子である、請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物の栽培方法。
【請求項７】
前記ＤｎａＫ遺伝子が次の１）又は２）の塩基配列を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物の栽培方法、
１）配列番号１の塩基配列、
２）前記塩基配列の一部が改変された塩基配列であって且つその発現産物が高塩濃度下においても分子シャペロンとして機能する配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は植物の栽培方法に関する。詳しくは特定の遺伝子が導入された形質転換植物の栽培方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、世界の耕作地の約２０％及び全ての灌漑地の約半分が塩害の脅威にさらされている（非特許文献１を参照）。自然界では塩ストレス、干ばつストレス、及び高温ストレスがしばしば複合的に発生する。塩耐性及び高温耐性を備えた穀類植物の育種を目的として多くの研究が行われている。厳しい環境において生育する生物はストレスの多い環境に適応するための特定のメカニズムを獲得しなければならない。そのようなメカニズムの一つとして考えられるのは分子シャペロンや熱ショックタンパク質（ヒートショックプロテイン：ＨＳＰｓ）の導入であろう。これらの分子はＨｓＰ１００（ＣｌｐＢ）やＨｓｐ９０、Ｈｓｐ７０（ＤｎａＫ）、Ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）、及び低分子Ｈｓｐなど、進化の過程で保存されたいくつかのタンパク質ファミリーを構成する（非特許文献２〜４を参照）。最近の研究によって高密度細胞環境下におけるタンパク質の折りたたみミス（ミスフォールディング）及び凝集（アグリゲーション）を回避するために異なる分子シャペロンがそれぞれ固有のストラテジーに従うことが示唆された（非特許文献２〜１０を参照）。例えば単量体のＨｓｐ７０は短い疎水性ペプチド部分を認識し、フォールディングの初期に結合する（非特許文献２〜５を参照）。オリゴマーＨｓｐ６０はより後期のフォールディングを促進するために、タンパク質の大きなドメインを内包し得る二重リング構造を形成する。低分子Ｈｓｐは、折りたたまれていないタンパク質をトラップすることに関与し、その後Ｈｓｐ７０及びＨｓｐ６０によって再び折りたたまれることになる（非特許文献７を参照）。同様に、Ｈｓｐ１００及びＨｓｐ７０による連続的な作用によって凝集したタンパク質は可溶化され、そして再び折りたたまれる（非特許文献８を参照）。Ｈｓｐ９０は多くのシグナル伝達タンパク質の活性化に関与する。
【０００３】
これらＨＳＰの機能が判明しているのにも拘わらず、全ての植物における、熱耐性及び塩耐性に対するＨＳＰの明確な役割については最近になってやっと証明された。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び哺乳類由来のＨｓｐ７０を過剰発現させることによって熱耐性が向上するが（非特許文献１１、１２を参照）、ダイズ由来の低分子Ｈｓｐの過剰発現は形質転換タバコ（トランスジェニックタバコ）における熱耐性を向上させることに十分ではなかった（非特許文献１３を参照）。後になってＨＳＰの熱ショック転写因子（ヒートショックファクター）を構成的に発現する形質転換植物が熱耐性を獲得することが示された（非特許文献１４を参照）。最近になってニンジン低分子Ｈｓｐ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＨｓｐ１０１が熱耐性を向上させる作用を有することが示された（非特許文献１５〜１７を参照）。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの低分子Ｈｓｐの過剰発現がＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの浸透圧耐性を向上させることも示された（非特許文献１８を参照）。本発明者らは耐塩性ラン藻Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ（Ａ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）が形質転換タバコに対して耐塩性及び高温耐性を付与することを示した（非特許文献１９、２０を参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｚｈｕ，  Ｊ．−Ｋ．  Ｐｌａｎｔ  ｓａｌｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ６，  ６６−７１  （２００１）．
【非特許文献２】
Ｈａｒｔ，  Ｆ．Ｕ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３８１，  ５７１−５７９  （１９９６）．
【非特許文献３】
Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｓ．  ，  Ｖｉｉｔａｎｅｎ，  Ｐ．Ｖ．  ＆  Ｖｉｅｒｌｉｎｇ，  Ｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ３２，  １９１−２２２  （１９９６）．
【非特許文献４】
Ｂｕｋａｕ，  Ｂ．  ＆  Ｈｏｒｗｉｃｈ，  Ａ．Ｌ．  Ｔｈｅ  Ｈｓｐ７０  ａｎｄ  Ｈｓｐ６０  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｍａｃｈｉｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ９２，  ３５１−３６６  （１９９８）．
【非特許文献５】
Ｂｕｋａｕ，  Ｂ．，  Ｄｅｕｅｒｌｉｎｇ，  Ｅ．Ｅ．，  Ｐｆｕｎｄ，  Ｃ．  ＆  Ｃｒａｉｇ，  Ｅ．  Ｇｅｔｔｉｎｇ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｓｈａｐｅ．  Ｃｅｌｌ  １０１，  １１９−１２２  （２０００）．
【非特許文献６】
Ｌｅｅ，  Ｇ．Ｊ．，  Ｒｏｓｅｍａｎ，  Ａ．Ｍ．，  Ｓａｉｂｉｌ，  Ｈ．Ｒ．  ＆  Ｖｉｅｒｌｉｎｇ，  Ｅ．  Ａ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｌｙ  ｂｉｎｄｓ  ｈｅａｔ−ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｍａｉｎｔａｉｎａ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｉｎ  ａ  ｆｏｌｄｉｎｇ−ｃｏｍｅｔｅｎｔ  ｓｔａｔｅ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６，  ６５９−６７１  （１９９７）．
【非特許文献７】
Ｖｅｉｎｇｅｒ，  Ｌ．，  Ｄｉａｍａｎｔ，  Ｓ．，  Ｂｕｃｈｎｅｒ，  Ｊ．  ＆  Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆ，  Ｐ．  Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩｂｐＢ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｓｔｒｅｓｓ−ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３，  １１０３２−１１０３７  （１９９８）．
【非特許文献８】
Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｊ．Ｒ．  ＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．  Ｈｓｐ１０４，  Ｈｓｐ７０，  ａｎｄ  Ｈｓｐ４０：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  ９４，  ７３−８２  （１９９８）．
【非特許文献９】
Ｂｕｃｈｎｅｒ，  Ｊ．  Ａ  ｈｏｌｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｆｏｌｄｉｎｇ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２４，  １３６−１４１  （１９９９）．
【非特許文献１０】
Ｙｏｕｎｇ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｍｏａｒｅｆｉ，  Ｉ．，  Ｈａｒｔｌ，  Ｆ．Ｕ．  Ｈｓｐ９０：  ａ  ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｂｕｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｆｏｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５４，  ２６７−２７３  （２００１）．
【非特許文献１１】
Ｓｏｌｏｍｏｎ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｒｏｓｓｉ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｇｏｌｉｃ，  Ｋ．，  ＭｃＧａｒｒｙ，  Ｔ．  ＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｓｐ７０  ａｌｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  １５，  ８２７−８３３  （１９９１）．
【非特許文献１２】
Ｋｉｍ，  Ｄ．，  Ｏｕｙａｎｇ，  Ｈ．  ＆  Ｌｉ，  Ｇ．  Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｓｐ７０  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｔｓ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＨＳＦ１．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２，  ２１２６−２１３０  （１９９５）．
【非特許文献１３】
Ｓｃｈｏｆｆｌ，  Ｆ．，  Ｒｉｅｐｉｎｇ，  Ｍ．  ＆  Ｂａｕｍａｎｎ，  Ｇ．  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｏｙｂｅａｎ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｇｅｎｅ  ｂｙ  ａ  ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ，  Ｄｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ８，  ３６５−３７４  （１９８７）．
【非特許文献１４】
Ｌｅｅ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｈｕｂｅｌ，  Ａ．  ＆  Ｓｃｈｏｆｆｌ，  Ｆ．  Ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｆａｃｔｏｒ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ８，  ６０３−６１２  （１９９５）．
【非特許文献１５】
Ｍａｌｉｋ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｓｌｏｖｉｎ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｈｗａｎｇ，  Ｃ．Ｈ．  ＆  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｌ．  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｒｏｔ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ  ｓｃｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅ，  Ｈｓｐ  １７．７，  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２０，  ８９−９９  （１９９９）．
【非特許文献１６】
Ｑｕｅｉｔｓｃｈ，  Ｃ．，  Ｈｏｎｇ，  Ｓ−Ｗ．，  Ｖｉｅｒｌｉｎｇ，  Ｅ．  ＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｓ．  Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １０１  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２，  ４７９−４９２  （２０００）．
【非特許文献１７】
Ｈｏｎｇ，  Ｓ−Ｗ．  ＆  Ｖｉｅｒｌｉｎｇ，  Ｅ．  Ｈｓｐ１０１  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｈｅａｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｕｔ  ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｅｓｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２７，  ２５−３５  （２００１）．
【非特許文献１８】
Ｓｕｎ，  Ｗ．，  Ｂｅｒｎａｒｄ，  Ｃ．，  ｖａｎ  ｄｅ  Ｃｏｔｔｅ，  Ｂ．，  Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，  Ｍ．  ＆  Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ，  Ｎ．  Ａｔ−ＨＳＰ１７．６Ａ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，  ｃａｎ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｕｐｏｎ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ２７，  ４０７−４１５  （２００１）．
【非特許文献１９】
Ｓｕｇｉｎｏ，  Ｍ．，  Ｈｉｂｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｙ．，  Ｎｉｉ，  Ｎ．，  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  ＆  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤｎａＫ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ  ａｃｑｕｉｒｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｓａｌｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３７，  ８１−８８  （１９９９）．
【非特許文献２０】
Ｏｎｏ，  Ｋ．，  Ｈｉｂｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｋｏｈｉｎａｔａ，  Ｔ．，  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｓ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  ＆  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤｎａＫ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｇｒｏｗｔｈ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  １６０，  ４５５−４６１  （２００１）．
【非特許文献２１】
Ｈｉｂｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｋａｋｕ，  Ｎ．，  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，  Ｈ．，  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  ＆  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤｎａＫ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ  ｆｏｒ  ＡＴＰａｓｅ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ，  ａｎｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｓａｌｉｎｉｔｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０，  ４０９−４１８  （１９９９）．
【非特許文献２２】
Ｌｅｅ，  Ｂ．Ｈ．，  Ｈｉｂｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｊｏ，  Ｊ．，  Ｖｉａｌｅ，  Ａ．Ｍ．  ＆  Ｔａｋａｂｅ，  Ｔ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｎａＫ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ａ  ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｔ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３５，  ７６３−７７５  （１９９５）．
【非特許文献２３】
Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．Ｘ．  ＆  Ｂｌｕｍｗａｌｄ，  Ｅ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｓａｌｔ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｔｏｍａｔｏ  ｐｌａｎｔｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｓａｌｔ  ｉｎ  ｆｏｌｉａｇｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｆｒｕｉｔ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９，  ７６５−７６８  （２００１）．
【非特許文献２４】
Ｓｍｉｄａｎｓｋｙ，  Ｅ．Ｄ．，  Ｃｌａｎｃｙ，  Ｍ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｆ．Ｄ．，  Ｌａｎｎｉｎｇ，  Ｓ．Ｐ．，  Ｂｌａｋｅ，  Ｎ．Ｋ．，  Ｔａｌｂｅｒｔ，  Ｌ．Ｅ．  ＆  Ｇｉｒｏｕｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＡＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｅｄ  ｙｉｅｌｄ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９９，  １７２４−１７２９  （２００２）．
【非特許文献２５】
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．  ＆  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １５，  ４７３−４９７  （１９６２）．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ストレス耐性に対するＨＳＰの潜在的重要性を調べるために、これまでいくつかの形質転換植物が作出されてきた。しかしながら以上の全ての研究によってもＨＳＰの過剰発現が収穫量（作物生産量）に与える影響は明らかにされていない。ここで、収穫量は農業にとって最も重要なファクターの一つである。換言すれば、農作物の安定供給、労働負担の軽減などの観点から、効率的な収穫を可能とする栽培方法の確立が切望されている。そこで本発明は収穫量の増大が望める、植物の栽培方法を提供することを課題とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは以上の課題に鑑み鋭意検討を行った。まず、モデル植物としてイネ及びタバコを選択し、これらにＡ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ由来のＤｎａＫ遺伝子を導入して形質転換体（トランスジェニック植物）を作製した。Ａ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ由来のＤｎａＫは高塩濃度条件下においても極めて高いタンパク質フォールディング活性を示すことが知られている（非特許文献２１を参照）。得られた各形質転換体を用いて高温ストレスや塩ストレスなどの環境因子が生育及び種子の収穫量に与える影響を検討した。その結果、イネでは高温ストレスが存在する条件下で育てた場合に、コントロール（野生型）よりも形質転換体の生育が顕著に良好であった。タバコにおいても同様の現象が認められ、更に検討を進めたところでは種子の収穫量についても形質転換体の方がコントロールよりもはるかに多くなることが確認された。
【０００７】
塩ストレスの影響についてはタバコを対象として検討した。その結果、塩ストレスが存在する条件下で育てた場合に、形質転換体ではコントロールよりも種子の収穫量がはるかに多くなることが確認された。以上の結果から、ＤｎａＫ遺伝子を導入することにより、高温ストレスが存在する条件下、或は塩ストレスが存在する条件下において、植物をより良好に生育させることができ、且つ種子の収穫量の増大も期待できるとの知見が得られた。
一方、形質転換体の性質を検討していく過程において、驚くことに特別のストレスがない環境下で育てることによってコントロールよりも良好に生育すること、及びコントロールよりも多くの種子を収穫できることが判明した。即ち、通常の条件下で栽培する場合においてもＤｎａＫ遺伝子の導入が植物の生育及び種子量に対して良好に作用するとの知見が得られた。
本発明は以上の各知見に基づき完成されたものであって次の構成を提供する。
［１］  以下のステップａ）を含む、形質転換植物の栽培方法、
ａ）ＤｎａＫ遺伝子が導入されてなる形質転換植物をストレスのない通常の条件下で生育させるステップ。
［２］前記通常の条件が、少なくとも温度ストレスが実質的にない条件である、［１］に記載の形質転換植物の栽培方法。
［３］前記通常の条件が、少なくとも日照時間ストレスが実質的にない条件である、［１］に記載の形質転換植物の栽培方法。
［４］前記通常の条件が、少なくとも塩ストレスが実質的にない条件である、［１］に記載の形質転換植物の栽培方法。
［５］以下のステップＡ）を含む、形質転換植物の栽培方法、
Ａ）ＤｎａＫ遺伝子が導入されてなる形質転換植物を高温ストレス又は塩ストレスの存在する条件下で生育させるステップ。
［６］前記ＤｎａＫ遺伝子がアファノテイーキ・ハロフィチカ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）のＤｎａＫ遺伝子である、［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換植物の栽培方法。
［７］前記ＤｎａＫ遺伝子が次の１）又は２）の塩基配列を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換植物の栽培方法、
１）配列番号１の塩基配列、
２）前記塩基配列の一部が改変された塩基配列であって且つその発現産物が高塩濃度下においても分子シャペロンとして機能する配列。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は形質転換植物の栽培方法に関し、ＤｎａＫ遺伝子が導入されてなる形質転換植物をストレスのない通常の条件で育てるステップ（ステップａ））を含んで構成される。
本発明における形質転換植物は野生型の植物にＤｎａＫ遺伝子を外来的に導入すること、即ちＤｎａＫ遺伝子を用いて野生型の植物を形質転換することにより作製される。ここで形質転換に供される植物としては、双子葉植物及び単子葉植物のいずれであってもよい。双子葉植物としては例えば、ナス科（タバコ属、トマト属など）、バラ科（ウメ属、モモ属、リンゴ属など）、マメ科（ダイズ属、エンドウ属など）、アブラナ科（ダイコン属など）、ゴマ科などに分類される植物が挙げられ、一方単子葉植物としては例えば、イネ科（イネ属、コムギ属、ライムギ類、オオムギ類、ハトムギ属、トウモロコシ属、サトウキビ属など）、ユリ科（ネギ属、ニンニク属など）などに分類される植物が挙げられる。
【０００９】
本発明におけるＤｎａＫ遺伝子としては例えば、原核生物由来のＤｎａＫ遺伝子を用いることができる。より具体的には例えば、ラン藻やバクテリア由来のＤｎａＫ遺伝子を用いることができる。特に耐塩性ラン藻由来のＤｎａＫ遺伝子を用いることが好ましい。ここでの「耐塩性」とは、例えばＮａＣｌ濃度が０．２５Ｍ〜３Ｍの条件下で生育可能であることをいう。このような耐塩性のラン藻としてはアファノテイーキ・ハロフィチカ（Ａｐｈａｎｏｔｈｅｃｅ  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）を例示することができる。尚、以上において使用される「〜由来のＤｎａＫ遺伝子」とは、典型的にはその生物から単離されたＤｎａＫ遺伝子を意味するが、その塩基配列が一旦同定された後は当該塩基配列を基に化学合成によって再構築されたをも含む用語として使用される。
【００１０】
ＤｎａＫ遺伝子は例えば、所望のＤｎａＫ遺伝子を保有する植物から常法に従って取得することができる。即ち、各種の抽出、精製手段や遺伝子工学的手法などを必要に応じて適宜組み合わせて使用することにより取得することができる。勿論、所望のＤｎａＫ遺伝子を保持するプラスミドなどが入手可能な場合にはこれを利用することもできる。
【００１１】
本発明において使用可能なＤｎａＫ遺伝子の一例の配列を配列番号１に示す。この配列はアファノテイーキ・ハロフィチカのＤｎａＫ遺伝子（コード領域）の塩基配列である。尚、この配列の一部を改変した塩基配列を有するものであっても、同等の機能を有する限りにおいて本発明におけるＤｎａＫ遺伝子として用いることができる。即ち、ＤｎａＫ遺伝子に特徴的な機能を保持する限りにおいて一部の配列の改変が許容される。ここでの「一部の改変」とは、配列番号１に示される塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位されることをいう。このような改変は複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは改変が行われる位置や改変の種類によっても異なるが例えば２〜４０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個である。以上のような改変ＤＮＡは例えば、部位特異的変異法を用いて特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように配列番号１の配列を有するＤＮＡを遺伝子工学的に改変することによって得られる。
【００１２】
一方ここでの「ＤｎａＫ遺伝子に特徴的な機能」とは、高塩濃度下においても分子シャペロンとして作用するタンパク質をコードしていることをいう。
【００１３】
ＤｎａＫ遺伝子の導入（形質転換）は公知の方法によって行うことができる。例えば導入方法として、導入遺伝子を保有するアグロバクテリウムを植物組織（細胞）に感染させる方法（アグロバクテリウム法）、ポリエチレングリコールを利用して遺伝子を導入する方法、電気的刺激を利用して遺伝子を導入する方法（エレクトロポレーション法）、及び遺伝子を結合させた金属粒子を植物組織（細胞）に打ち込む方法（パーティクルガン法）などを用いることができる。
【００１４】
ＤｎａＫ遺伝子を導入する際に、導入後に当該遺伝子の発現に必要なプロモーター、ターミネータなどの配列を併せて導入することが好ましい。また、形質転換体の選択を容易に行うために抗生物質耐性（或は感受性）遺伝子などの選択マーカーを用いることができる。例えば、ＤｎａＫ遺伝子の５’側上流にプロモーターが位置し、３’側下流にターミネータが位置し、かつ選択マーカーを含むコンストラクト（ベクター）を調製し、これを用いて遺伝子の導入、即ち形質転換を行う。このようなベクターは、植物の種類及び形質転換方法に応じて適当な公知のベクターを利用して構築することができる。
【００１５】
プロモーターなどは遺伝子導入の対象となる植物内で適切に機能するものの中から適宜選択される。例えば、プロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを挙げることができる。同様にターミネーターとしてはノパリン合成酵素（ＮＯＳ）由来のターミネーターを例示することができる。同様に選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ  ＩＩ）やハイグロマイシン耐性遺伝子を例示することができる。
【００１６】
植物をストレスのある条件で生育させれば一般にその生育速度は低下しまた種子収穫量も低減する。即ち、ストレスのある条件とは、本来期待される生育及び収穫量を望めない条件であるということができる。具体的には、野生型を栽培した場合に、ある時点（例えば花をつけるとき）における丈が１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上小さくなる条件、或は種子収穫量が２０％以上、好ましくは３０％以上、更に好ましくは５０％以上減少する条件をストレスのある条件として定義することができる。或は、イネを例に採れば枝梗数が１０％以上、好ましく３０％以上、更に好ましくは５０％以上減少する条件をストレスのある条件として定義することができる。
本発明における「ストレスのない通常の条件」とは、以上のような植物の生育に好ましくない条件ではない条件のことをいい、即ち温度や日照時間、湿度、或は塩濃度等が栽培対象の植物の生育にとって好ましいと通常考えられる範囲内の条件をいう。植物の生育にとっては、特に温度、日照時間、及び塩濃度は極めて重要な環境条件であることから、これらの少なくとも一つについて通常の条件であることが好ましい。より好ましくはこれらの二つ以上について通常の条件であり、更に好ましくはこれらの全てにおいて通常の条件である。
【００１７】
植物の種類によって異なるが、温度ストレスのない条件とは、例えばイネであれば通常１５℃〜３５℃の条件、好ましくは２０℃〜３０℃の条件、またタバコであれば通常１５℃〜４０℃の条件、好ましくは２０℃〜３５℃の条件である。一方日照時間ストレスのない条件についても植物の種類によって異なるが、例えばイネであれば一日当たりの日照時間が例えば１１時間〜１６時間、好ましくは１３時間〜１５時間、またタバコであれば一日当たりの日照時間が例えば１４時間〜１８時間、好ましくは１５時間〜１７時間の場合が日照時間ストレスのない条件に該当する。同様に塩ストレスのない条件についても植物の種類によって異なるが、例えばイネであれば土壌における塩濃度が通常１ｘ１０−２ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは５ｘ１０−３ｍｏｌ／ｌ以下、またタバコであれば土壌における塩濃度が通常１ｘ１０−２ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは５ｘ１０−３ｍｏｌ／ｌ以下の場合が塩ストレスのない条件に該当する。
尚、栽培対象の植物に実質的なストレスが加わらないことを条件として、一時的に上記の範囲外となる場合についても、本発明にいう「ストレスのない通常の条件」に含まれることとする。
【００１８】
本発明における通常の条件で育てるステップは、典型的には栽培期間の実質的全体に亘って継続して行われるが必ずしもこれに限られるものではなく、例えば栽培期間の１／２以上、好ましくは２／３以上、更に好ましくは３／４以上において当該ステップが行われる。尚、当該ステップは必ずしも継続的に行われる必要はなく、即ち数回に分けて行われてもよい。
【００１９】
高耐塩性ラン藻のＤｎａＫ遺伝子などは、これを導入すれば植物に対してストレス耐性を付与し得ることが知られている。したがって、このようなＤｎａＫ遺伝子を導入して得られる形質転換植物を用いた場合には、高塩濃度の環境においても良好な生育、及び収穫を期待できる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００２０】
【実施例】
＜実施例１＞  タバコに対するＤｎａＫ遺伝子の効果
（１）形質転換タバコの作製
既報の方法（非特許文献１９を参照）に従ってアファノテイーキ・ハロフィチカ（Ａ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ）由来のＤｎａＫ遺伝子によるタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）の形質転換を行った。即ち、まず形質転換に使用するベクターを次のように構築した。アファノテイーキ・ハロフィチカのＤｎａＫ遺伝子を有するプラスミドｐＥＡＤＫ１（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３５，  ７６３−７７５（１９９７））を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ＤｎａＫ遺伝子を含むＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片を得た。この断片をバイナリーベクターｐＢＩ１２１（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １１８，  ６２７−６４０（１９８６））に挿入し、得られたプラスミドをｐＢＩ１２１−ＡＤＫとした。
【００２１】
続いてプラスミドｐＢＩ１２１−ＡＤＫを、トリペアレンタルメイティング（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ）でアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４株に導入した。尚、ｐＲＫ２０１３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １２，  ８７１１−８７２１（１９８４））をヘルパープラスミドとして使用した。
次にタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）の葉の一部を切り出し（円形葉片）、これを用いて前記処理を施したアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる形質転換を行った。形質転換処理の後、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ寒天培地（３％シュークロース、及びカナマイシン（５０μｍｇ／ｍｌ）含有）上で無菌的に生育させた。得られた各形質転換体から種子を採取し、Ｔ２、Ｔ３世代を以降の実験に用いた。
【００２２】
（２）形質転換タバコの高温耐性評価
上記のようにして得られた種子を２．５％  ＮａＣｌＯ及び０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２２℃、５分間処理し、種子表面を滅菌した。続いて水で洗浄後、水中で一晩、４℃の条件でインキュベートした。その後、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ寒天培地（非特許文献１４を参照）を満たした培養皿に種子を移した。培養皿を生育用チャンバー内に移し、明暗サイクル条件（１６時間光照射、温度：２７℃、光強度：２００  μＥ  ｍ−２ｓ−１、相対湿度：６０％／８時間暗所、温度：２５℃、相対湿度：６０％）下で生育させた。そして、つぼみが膨らみ始めたときに光照射時の温度の異なる３つの試験群（２７℃、３３℃、及び３７℃）に分け（暗所条件はいずれの群も８時間暗所、温度：２５℃、相対湿度：６０％）、生育状態を比較した。尚、野生型（形質転換処理を行っていないタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１）を同様の方法で生育させたものをコントロール（対照）として用いた。
【００２３】
まず、通常の条件（１６時間光照射、２７℃／８時間暗所、２５℃）下で生育させた場合には、野生型及び形質転換体タバコの間に生育速度の差はなかった（データ示さず）。生育開始から２〜３週間後には、いずれの群の形質転換体も野生型から表現型的に区別可能であった（図１Ａ）。光照射時の温度条件を２７℃にした場合には、野生型の方が形質転換体よりも一植物あたりの花数が僅かに多かった（図１Ｂ）。図１Ｂに示されるように、光照射時の温度を３３℃に上昇させることによって花数は僅かに増加した。これとは対照的に、光照射時の温度を３７℃に上昇させることによって野生型及び形質転換体の両者において花数の著しい増加が認められた。また、光照射時の温度条件に関係なく野生型の花数と形質転換体の花数はほとんど同じであった（図１Ｂ、右パネル）。
【００２４】
一方、光照射時の温度が２７℃又は３３℃の場合における結実数は野生型と形質転換体との間でほとんど差がなかった（図１Ｃ）。光照射時の温度を３７℃に上昇させた場合には野生型と形質転換体の両者において結実数は著しく減少したが、野生型の方が減少の程度はより激しいものであった（図１Ｃ）。その結果、形質転換体の結実数は野生型の約１．８倍であった。
【００２５】
収穫量は種子数及び種子重量に依存するが、野生型及び形質転換体において一種子あたりの乾燥重量が本質的には同一であったので（データ示さず）、乾燥重量についての結果のみを示す。図１Ｄに示されるように、光照射時の温度が２７℃又は３３℃の場合には形質転換体における種子の乾燥重量は野生型に比較して僅かに重い。光照射時の温度を３７℃に上昇させた条件では両者において種子の乾燥重量が減少した。しかし減少の程度は野生型においてより大きく、結果として形質転換体では野生型よりも３倍量の種子が得られた。花柱及び花糸の長さ、並びに生重量は野生型と形質転換体との間で同様であった（データ示さず）。以上の結果は、高温ストレスに起因するタバコの種子収穫量の減少を、耐塩性ラン藻のＤｎａＫが緩和したことを示すものである。
【００２６】
（３）形質転換タバコの耐塩性評価
次に、形質転換タバコの種子収穫量に対する塩ストレスの影響について検討した。上記（１）の方法で得られた形質転換体の種子を上記（２）と同様の方法で発芽処理した後、培養皿を生育用チャンバー内に移し、明暗サイクル条件（１６時間光照射、温度：２７℃、光強度：２００  μＥ  ｍ−２ｓ−１、相対湿度：６０％／８時間暗所、温度：２５℃、相対湿度：６０％）下で生育させた。そして、つぼみが膨らみ始めたとき培地中の塩濃度を０．６Ｍ  ＮａＣｌに変更した。尚、野生型（形質転換処理を行っていないタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  Ｐｅｔｉｔ  Ｈａｖａｎａ  ＳＲ１））を同様の方法で生育させたものをコントロール（対照）として用いた。
【００２７】
形質転換体と野生型との間で花数、結実数、種子重量を比較したグラフを図２に示す。図２Ａに示されるように、一植物当たりの花数は野生型で１２、形質転換体で８であった。これは非ストレス下で栽培した場合とほとんど同じ数であって（図１Ｂ（２７℃））、このことから塩ストレスは花数に影響を与えなかったものと考えられた。これとは対照的に、結実数は塩ストレス条件によって野生型及び形質転換体の両者において顕著に減少し、その減少の程度は野生型の方が大きかった（図２Ｂ）。その結果、形質転換体の結実数は野生型の３．４倍であった。全種子乾燥重量についても同様に野生型及び形質転換体の両者において顕著な減少がみられ、その減少の程度は野生型の方が大きかった（図２Ｃ）。その結果、形質転換体の全種子乾燥重量は野生型の６倍であった。以上の結果から、塩ストレスに起因する種子収穫量の減少が、ＤｎａＫの過剰発現によって抑制されるということが示される。
【００２８】
＜実施例２＞  イネに対するＤｎａＫ遺伝子の効果
（１）形質転換イネの作製
バイナリーベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０１（図６（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｐ．，  Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ａｎｄ  Ｍａｌｉｇａ，  Ｐ．  Ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ，  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐＰＺＰ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２５，  ９８９−９９９（１９９４））の３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーター下流のＮｃｏＩサイトにＤｎａＫ遺伝子を結合させたプラスミドを使用してイネ（Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  ｃｖ  Ｎｏｔｏｈｉｋａｒｉ）の形質転換を行った。イネへのプラスミドの導入はアグロバクテリウム介在法で行った。形質転換処理の後、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ寒天培地（３％シュークロース、及びハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）含有）上で無菌的に生育させた。以降の実験には、４つのホモ接合性Ｔ３形質転換体（Ｄ３−１、Ｄ１５−３、Ｄ２７−１、及びＤ３−３）を栽培実験に使用した。
【００２９】
（２）形質転換イネの生育特性、及び収穫量の検討
まず、各種子を２．５％  ＮａＣｌＯ及び０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２２℃、５分間処理し、種子表面を滅菌した。続いて水で洗浄後、水中で一晩、４℃の条件でインキュベートした。その後、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ＆  Ｓｋｏｏｇ寒天培地（非特許文献２５を参照）を満たした培養皿に種子を移した。培養皿を生育用チャンバー内に移し、明暗サイクル条件（１４時間光照射、温度：２８℃、光強度：２００  μＥ  ｍ−２ｓ−１、相対湿度：６０％／１０時間暗所、温度：２３℃、相対湿度：６０％）下で生育させ、生育特性及び収穫量を検討した。尚、野生型（形質転換処理を行っていないイネ（Ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  ｃｖＮｏｔｏｈｉｋａｒｉ））を同様の方法で生育させたものをコントロール（対照）として用いた。
【００３０】
結果、各形質転換体は野生型から表現型的に区別可能であった（図３Ａ）。また、Ｄ１５−３を除く各形質転換体は野生型に比較してより速く、そしてより大きく成長した（図３Ｂ）。特にＤ３−１及びＤ３−３は野生型に比較して約１．４〜１．５倍の大きさであった。一方、ウエスタンブロット分析の結果、各形質転換体内においてＤｎａＫタンパク質が蓄積していることが示された。野生型ではこのような蓄積は認められなかった（図３Ｃ）。以上の結果から、ＤｎａＫタンパク質の過剰発現によって、通常の条件（１４時間光照射、２８℃／１０時間暗所、２３℃）で生育させた場合においてもイネのサイズが増大することが示される。
尚、ウエスタンブロット分析については以下の手順で行った。まず、乳鉢及び乳棒を用い、４００ｍｌの抽出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ）内で種子をホモジナイズした。ホモジネート内の全タンパク質量を既述のＬｏｗｒｙ法（非特許文献２２を参照）で決定した。一方、既述のＬａｅｍｍｌｉ（非特許文献２２を参照）に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％アクリルアミド）でタンパク質（試料あたり５０ｍｇ）を分離した後、Ａ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ  ＤｎａＫ１に対する抗血清を用いた免疫反応を行った。尚、ウエスタンブロット分析の詳細については既述の方法（非特許文献２２を参照）に従った。
【００３１】
次に本発明者らは、通常の条件下で生育させた場合における形質転換イネの収穫量について検討した。その結果、形質転換イネＤ３−１、Ｄ２７−１、及びＤ３−３はいずれも野生型より多くの枝梗をつけたが、Ｄ１５−３だけはその枝梗数が顕著に減少した（図４Ａ、４Ｂ）。１次枝梗と２次枝梗の割合は形質転換体間で異なるようだった。形質転換イネＤ３−３及びＤ２７−１では１次枝梗よりも２次枝梗の方が多かった。これらの形質転換系統（Ｄ３−１、Ｄ２７−１、及びＤ３−３）では野生型に比較してはるかに多い種子が得られ、その一方で形質転換系統Ｄ１５−３ではその種子数が顕著に減少した（図４Ｃ）。野生型に比較した種子量はＤ３−１、Ｄ２７−１、及びＤ３−３においてそれぞれ約１．４倍、約１．９倍、及び約１．７倍であった。一種子あたりの乾燥重量は野生型と各形質転換イネとの間でほとんど同じであった（データ示さず）。以上の結果から、たとえ通常の条件下で生育させたとしてもＤｎａＫの過剰発現によってイネの収穫量が増大するということが示される。
【００３２】
（３）形質転換イネの高温耐性評価
次に本発明者らは、イネの高温に対するストレス耐性をＤｎａＫの過剰発現が増大するか否かについて検討した。上記の（１）で得られた形質転換体を用いて実験を行った。尚、野生型と形質転換体との生育速度の相違によって生ずる結果の曖昧さを避けるために同じサイズのイネを使用した。
発芽後、通常の明暗サイクル（１４時間光照射、温度：２８℃、光強度：２００  μＥ  ｍ−２ｓ−１、相対湿度：６０％／１０時間暗所、温度：２３℃、相対湿度：６０％）で生育させ、葉が５．５ｍｍに伸長したときに高温条件（１４時間光照射、４２℃／１０時間暗所、２３℃）に変更した。
高温条件に変更した後、野生型は三日間成長を続けたが、その後サイズ（長さ）は増加しなかった。一方、形質転換イネのサイズ（丈）は増加しつづけた（図５Ｂ）。図５Ａは高温で七日間処理された各イネの写真である。植物丈だけでなく根数（ｒｏｏｔ  ｎｕｍｂｅｒ）及び長さについても、形質転換イネは野生型よりも有意に勝っていた。以上の結果から、ＤｎａＫの過剰発現がイネに高温ストレス耐性を付与するということが示される。
【００３３】
以上の各実施例の結果から、ＤｎａＫタンパク質を発現する形質転換タバコ及びイネは野生型よりも多くの種子を産生し、また塩及び熱に対する耐性を獲得するということが明確に示された。
【００３４】
本発明者らはタバコ及びイネの細胞質に耐塩性ラン藻のＤｎａＫ遺伝子を導入することによって種子量を増加させることに成功した。このアプローチが成功したことの理由の一つは、Ａ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａ由来のＤｎａＫとタバコ又はイネ由来のＤｎａＫとの間でアミノ酸配列の相同性が低いことからジーンサイレンシングが起きないことにあると考えられる（非特許文献２２を参照）。また、形質転換植物において、異なるファミリーに属する他のＨｓｐと同様にタバコ及びイネのＨｓｐ７０の発現に対してＤｎａｋの発現が影響を及ぼさなかったものと考えられる（非特許文献２２を参照）。それ故、植物内のＤｎａＫの過剰発現はヒートショック後の最大ＨＳＰｓ量を増加させることになると考えられる。もう一つの可能性としては、非ストレス条件下と同様にストレス条件下でもＡ．  ｈａｌｏｐｈｙｔｉｃａのＤｎａＫが高いフォールディング活性を有していたことによる、ということが考えられる（非特許文献２１を参照）。
【００３５】
耐塩性ラン藻ＤｎａＫを発現している形質転換植物が通常の生育条件下においてその種子量を増加させたことは、おそらく分子シャペロンの多機能性によるものだろう。ストレス条件下での機能に加えて、ＨＳＰｓは非ストレス条件下においてタンパク質のアッセンブリー、タンパク質輸送及びシグナル伝達のプロセスに重要な機能を備えているのであろう（非特許文献２、３、１６を参照）。それ故に高活性ＤｎａＫの構成的発現は上記各プロセスを促進し、それによって植物の成長を加速させるのであろう。
【００３６】
植物におけるシグナル伝達システムを完全に理解した後になって初めてストレス耐性植物の作出が可能になるという考え方では、数多くの余剰の且つ密接に関連した遺伝子が存在しているにもかかわらずＤｎａＫというたった一つのタンパク質の遺伝子操作によって収穫量が向上したことを説明できない。最近の研究によって低分子Ｈｓｐ（非特許文献１５、１８を参照）やＨｓｐ７０（非特許文献１９、２０を参照）及びＨｓｐ１００（非特許文献１６、１７を参照）などの単一遺伝子の過剰発現が熱及び塩に対するストレス耐性を増加させ得るということが示された。また、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの過剰発現によって果実の産生量が増加することも示された（非特許文献２３を参照）。さらに、ＡＤＰ−グルコースの過剰発現がコムギの収穫量を増加することも分っている（非特許文献２４を参照）。これらの事実は単一遺伝子の操作が有効であることを示唆するものである。
【００３７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、栽培対象の植物をより良好な生育状態で栽培することが可能となり、種子収穫量の増大が図られる。特に、例えばイネなどでは特別のストレスのない通常の条件下においても収穫量の増大を期待できる。
【００３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＤｎａＫ遺伝子を導入したタバコについての高温耐性評価試験の結果を示す図である。Ａ）は各タバコの生育状態を示す。Ｂ）は各タバコについて一植物あたりの花数を示すグラフである。Ｃ）は各タバコについて一植物あたりの結実数を示すグラフである。Ｄ）は各タバコについて乾燥種子重量を示すグラフである。
【図２】図２はＤｎａＫ遺伝子を導入したタバコについての耐塩性評価試験の結果を示す図である。Ａ）は各タバコについて一植物あたりの花数を示すグラフである。Ｂ）は各タバコについて一植物あたりの結実数を示すグラフである。Ｃ）は各タバコについて乾燥種子重量を示すグラフである。
【図３】図３はＤｎａＫ遺伝子を導入したイネについてその生育特性を評価した結果を示す図である。Ａ）はコントロール（野生型）と形質転換体（Ｄ３−３）の生育状態を示す。Ｂ）は各イネのサイズを比較して表したグラフである。Ｃ）はウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図４】図４はＤｎａＫ遺伝子を導入したイネの収穫量を、コントロール（野生型）の収穫量と比較して示した図である。Ａ）は各イネの枝梗数を示すグラフである。Ｂ）は各イネの２次枝梗の数を示すグラフである。Ｃ）は各イネの種子数を示すグラフである。
【図５】図５はＤｎａＫ遺伝子を導入したイネについての高温耐性評価試験の結果を示す図である。Ａ）はコントロール（野生型）と形質転換体（Ｄ１−２、Ｄ３−１）の生育状態を示す。Ｂ）は各イネのサイズについて経時的な変化を表すグラフである。
【図６】図６は実施例で形質転換に使用されるプラスミドの構成を模式的に示す図である。３５Ｓ−ＰはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、Ｎｏｓ−ＴはＮｏｓターミネーターを、３５Ｓ−ＴはＣａＭＶ３５Ｓターミネーターを、ＤはＤｒａＩサイトを、ＨはＨｉｎｄＩＩＩサイトをそれぞれ表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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