(57)【要約】【課題】本発明は、多量の殺虫タンパク質を発現し得るように改変された遺伝子を提供することを目的とする。さらに、本発明は、このような遺伝子が導入された形質転換体、とりわけラン藻を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、Ｃｒｙ４Ａタンパク質をコードするコドン改変型遺伝子であって、宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することによって、前記宿主生物の中で高い翻訳効率を有するように改変されたコドン改変型遺伝子を提供する。好ましくは、本発明は、前記遺伝子が導入された形質転換体、とりわけラン藻を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｙ４Ａタンパク質をコードするコドン改変型遺伝子であって、宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することによって、前記宿主生物の中で高い翻訳効率を有するように改変されたコドン改変型遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のコドン改変型遺伝子であって、前記宿主生物がラン藻であるコドン改変型遺伝子。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列を有するコドン改変型遺伝子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子および前記遺伝子に作用可能なように連結された調節配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドであって、前記調節配列が、ｔｒｃプロモーターであるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
前記ベクターがｐＴｒｃ４Ａである請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターが導入されたラン藻。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターが導入されたラン藻。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高発現型殺虫タンパク質遺伝子ｃｒｙ４Ａに関する。
【０００２】
【従来の技術】
害虫の天敵微生物であるグラム陽性土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに由来する特定の害虫のみを殺す結晶性タンパク質が報告されている。数種の特異性の高い優れた殺虫タンパク質（Ｂｔタンパク質）が報告されているが、これらの殺虫タンパク質は、広く農薬として利用されている。また、現在までに、この殺虫タンパク質遺伝子を組み込んだトランスジェニック作物が作製され（トウモロコシ、ワタおよびジャガイモなどが開発されているが、これらの各配列が導入された植物は昆虫耐性を示すことが明らかとなっている）、既に実用化されているものもある。
【０００３】
このグラム陽性土壌細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓでは、様々なＢｔタンパク質をコードする遺伝子（ｃｒｙ遺伝子）が報告されているが、それらはコードするＢｔタンパク質の殺虫性により主に４クラスに分類されており、このなかで、特に双翅目昆虫の幼虫（マラリアなどを媒介するかの幼虫であるボウフラ）に対して強い殺虫活性を有するものには、Ｃｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ４Ａなどが明らかとなっている。
【０００４】
これらのｃｒｙ１１Ａおよびｃｒｙ４Ａ遺伝子を利用して、環境に大きな付加を与えることなくボウフラの効率的防除を可能とする方法が試みられてきた。これまでに殺虫タンパク質をコードする遺伝子に様々なプロモーターを連結して、これらのタンパク質を多量に発現することが試みられてきたが、高い発現が安定して得られることは極めて希であった。
【０００５】
ｃｒｙ４Ａと近縁の殺虫タンパク質遺伝子をラン藻に導入し、発現させた例が数例あるが、殺虫タンパク質のラン藻細胞内蓄積量が不十分であり、ボウフラに対する強い殺虫力を達成できなかった。これは、これらの導入された遺伝子は、元来導入した宿主には存在しない遺伝子であり、導入遺伝子のコドン使用頻度がラン藻と適合しておらず、またプロモーターが十分強力に作動していないためであると考えられる。
【０００６】
従って、高発現型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を構築し、これを利用して作製した遺伝子導入ラン藻をボウフラに投与することが望まれ、ラン藻における発現量を増大させるための方法が必要とされている。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｋ．  Ｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｗｏ  １３０ｋＤａｉｎｓｅｂｔｉｃｉｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ．、“Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．”、（Ｊａｐａｎ）、１９８８年、５２巻、ｐ．８７３−８７８
【０００８】
【非特許文献２】
Ｅ．  Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｉｇｈｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔａｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｅｃｔｅｒｓ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｆｕｓｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．、“Ｇｅｎｅ”、（Ｄｕｔｃｈ）、１９８８年、６９巻、ｐ．３０１−３１５
【０００９】
【非特許文献３】
Ｎ．  Ｔ．  ｄｅ  Ｍａｒｓａｃ  ｅｔ  ａｌ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ  １５９３Ｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｎａｃｙｓｔｉｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  Ｒ２．、“Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．”、（Ｇｅｒｍａｎｙ）、１９８７年、２０９巻、ｐ．３９６−３９８
【００１０】
【非特許文献４】
Ｃ．  Ａｎｇｓｕｔｈａｎａｓｏｍｂａｔ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｐａｎｙｉｍ、Ｂｉｏｓｙｓｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １３０−Ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ｌａｒｖｉｃｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｖｔｅｒｉｕｍ  Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ  ＰＲ−６．、“Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”、（ＵＳ）、１９８９年、５５巻、ｐ．２４２８−２４３０
【００１１】
【非特許文献５】
Ｒ．  Ｃ．  Ｍｕｒｐｈｙ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｅ．  Ｓｔｅｖｅｎｓ，  Ｊｒ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆｔｈｅ  ｃｒｙＩＶＤ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ  ＰＲ−６  ｎａｄ  ｉｔｓ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、“Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”、（ＵＳ）、１９９２年、５８巻、ｐ．１６５０−１６５５
【００１２】
【非特許文献６】
Ｅ．  Ｓｏｌｔｅｓ−Ｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｃｉｄａｌ  ｃｒｙＩＶＢ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７９４２．、“Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”、（ＵＳ）、１９９３年、５９巻、ｐ．２４０４−２４１０
【００１３】
【非特許文献７】
Ｅ．  Ｓｏｌｔｅｓ−Ｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｇ  ｃｒｙＩＶＢ  ｅｘｐｒｅｓｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ  ７９４２．、“Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．”、（Ｇｅｒｍａｎｙ）、１９９５年、２４６巻、ｐ．３０１−３０８
【００１４】
【非特許文献８】
Ｗ．  Ｘｉａｏｑｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｓｑｕｉｏｔｏ  ｌａｒｖｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎａｂａｅｎａ  ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ  ７１２０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ．、“Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．”、（ＵＳ）、１９９７年、６３巻、ｐ．４９７１−４９７５
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存在する上記課題を解決するためになされたものであり、多量の殺虫タンパク質を発現し得るようにコドンが改変されたコドン改変型遺伝子を提供することを目的とする。
【００１６】
さらに、本発明は、このような遺伝子が導入された形質転換体、とりわけラン藻を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
ある遺伝子産物（タンパク質）を効率的かつ大量に調製し、または別の生物に特定の遺伝的機能を付与するには、該当する遺伝子を異種生物に導入して適切に発現させる必要がある。これを達成するには、導入遺伝子の発現の諸過程、すなわち遺伝子の安定保持、転写、翻訳、遺伝子産物（タンパク質）の成熟、または安定性を確保する必要がある。
【００１８】
本発明者らは、上記問題を解決するために、転写と翻訳が、ラン藻および大腸菌細胞内で効率よく行われるようにコドンを改変したコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を構築し、その上流に強力なプロモーターをおくことにより、宿主生物の遺伝的特性に適合するように改造を施したコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を構築し、これを大腸菌およびラン藻に導入して活性型の特異的殺虫タンパク質Ｃｒｙ４Ａを従来達成できなかった高レベルで発現させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、Ｃｒｙ４Ａタンパク質をコードするコドン改変型遺伝子であって、宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することによって、前記宿主生物の中で高い翻訳効率を有するように改変されたコドン改変型遺伝子を提供する。
【００２０】
また、上記記載のコドン改変型遺伝子であって、前記宿主生物がラン藻であるコドン改変型遺伝子を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、配列番号１の塩基配列を有するコドン改変型遺伝子を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、上記記載の遺伝子および前記遺伝子に作用可能なように連結された調節配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、上記記載のポリヌクレオチドであって、前記調節配列が、ｔｒｃプロモーターであるポリヌクレオチドを提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、上記記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、上記ベクターがｐＴｒｃ４Ａである上記記載のベクターを提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、前記遺伝子が導入された形質転換体、とりわけラン藻を提供する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明のコドン改変型遺伝子は、宿主生物内において高い翻訳効率を有することを特徴とする。「高い翻訳効率」とは、下記の実施例に記載されているように、Ｃｒｙ４Ａタンパク質をコードする遺伝子を用いて作製した形質転換体当たりに発現するＣｒｙ４Ａタンパク質の量と、本発明のコドン改変型遺伝子を用いて作製した形質転換体当りに発現するＣｒｙ４Ａタンパク質の量を試験結果に基づいて比較するとき、後者が前者より統計学的に有意に高値を示すことをいう。
【００２８】
本明細書において、「コドン改変型遺伝子」とは、Ｃｒｙ４Ａタンパク質をコードする遺伝子であって、該タンパク質を発現させるべき宿主生物において使用頻度の高いコドンを選択することにより、前記宿主生物内で高い翻訳効率を有するように改変された遺伝子を意味する。すなわち、前記改変遺伝子の塩基配列は、例えば天然のＣｒｙ４Ａタンパク質のアミノ酸配列を基にしてアミノ酸配列を変化させることなく、それぞれのアミノ酸に対応するコドンの種類だけを変化させた遺伝子である。
【００２９】
従って、コドン改変型遺伝子がコードするＣｒｙ４Ａタンパク質は、非改変型遺伝子、すなわち野生型遺伝子がコードする野生型Ｃｒｙ４Ａタンパク質のアミノ酸配列と完全に同一のアミノ酸配列である。
【００３０】
本明細書において、「Ｃｒｙ４Ａタンパク質」とは、天然のＣｒｙ４Ａタンパク質と完全に同一のアミノ酸配列、または実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００３１】
ここで、「実質的に同一である」とは、配列番号１の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列からなるＣｒｙ４Ａタンパク質において、Ｃｒｙ４Ａタンパク質活性を有する限り、当該アミノ酸配列に１または数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよいことを意味する。例えば、その個数は特に限定されないが、通常は本願の出願時において常用される技術、例えば部位特異的変異誘発法によって生じさせることができる個数を意味し、具体的には１〜５個、好ましくは１〜３個のアミノ酸を意味する。
【００３２】
ここで、前記「Ｃｒｙ４Ａタンパク質活性」とは、双翅目特異的な殺虫能力を意味する。
【００３３】
また、本発明のＣｒｙ４Ａタンパク質コドン改変型遺伝子は、Ｃｒｙ４Ａタンパク質全体をコードしてもよく、またはＣｒｙ４Ａタンパク質と実質的に同一の活性を有している限り、より短いペプチド配列だけをコードしてもよい。たとえば、宿主生物内において、少なくとも野生型タンパク質の活性の５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の活性を有する場合をいう。
【００３４】
本発明のコドン改変型遺伝子のコドンは、好ましくは全てのコドンを、前記遺伝子を発現させる宿主生物において最も利用頻度の高いコドンに改変される。従って、本発明のコドン改変型遺伝子は、野生型遺伝子に比べて宿主生物内での翻訳効率が高くなり、それ故、前記遺伝子が導入された形質転換体は、大量のＣｒｙ４Ａタンパク質を発現することができる。
【００３５】
具体的には、宿主生物がラン藻の場合、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％のコドンを以下のコドンに置換する。
【００３６】
以下のコドンは、ラン藻でもっとも使用頻度が高いコドンである（図６参照）。
Ａｌａ：ＧＣＴ，  Ａｒｇ：ＣＧＴ，  Ａｓｎ：ＡＡＣ，  Ａｓｐ：ＧＡＣ，  Ｃｙｓ：ＴＧＣ，  Ｇｌｎ：ＣＡＡ，  Ｇｌｕ：ＧＡＡ，  Ｇｌｙ：ＧＧＴ，  Ｈｉｓ：ＣＡＣ，  Ｉｌｅ：ＡＴＣ，  Ｌｅｕ：ＣＴＧ，  Ｌｙｓ：ＡＡＡ，  Ｐｒｏ：ＣＣＣ，  Ｐｈｅ：ＴＴＣ，  Ｓｅｒ：ＡＧＣ，  Ｔｈｒ：ＡＣＣ，  Ｔｙｒ：ＴＡＣ，  Ｖａｌ：ＧＴＧ
なお、Ｍｅｔ：ＡＴＧとＴｒｐ：ＴＧＧは、１種類のコドンのみによってコードされているので改変されていない。
【００３７】
ラン藻用のコドン改変型遺伝子の中で最も好ましいものは、全てのコドンが対応する上記各コドンに改変された遺伝子である。
【００３８】
また、各コドンの使用頻度が明らかとなっている生物は、大腸菌、ラン藻以外にも多数存在するので、かかるデータに基づけば最も適切なコドンを選択することが可能である。従って、本発明には、配列番号１のポリヌクレオチドのみならず、ラン藻以外の微生物への使用に適するように若干の改変を加えたポリヌクレオチドも含まれることに留意しなければならない。なお、必要とする発現効率の増加量によっては、ポリヌクレオチド中のコドン全てを前記微生物に適したコドンに置換する必要はないが、通常は全てを置換することが好ましい。
【００３９】
さらに、同一の綱に属する異種の生物間では各コドンの使用頻度は殆ど異ならないので、各コドンの使用頻度が不明な生物に対しても、コドン改変型遺伝子を作出することが可能である。例えば、それぞれのコドンの使用頻度の差が小さければ、数種類のコドンのうち何れが最も使用頻度の高いコドンか不明であっても大きな問題は生じない。
【００４０】
本発明は、前記Ｃｒｙ４Ａタンパク質コドン改変型遺伝子に、調節配列、マーカー遺伝子、及びＫｏｚａｋ配列をコードする塩基配列等が連結されたポリヌクレオチドであってもよい。
【００４１】
ここで「調節配列」とは、遺伝子転写効率を増減する作用を示すＤＮＡ上の配列を意味し、プロモーター、エンハンサー、上流活性化配列、サイレンサー、上流抑制配列、及びアテニュエーター等が含まれるが、これらに限定されない。これらの調節配列を改変型遺伝子に連結するときには、作用可能なように連結することが必要である。
【００４２】
改変型遺伝子に連結すべき好ましい調節配列は、プロモーターであり、たとえば大腸菌ｔｒｃプロモーターである。前記大腸菌ｔｒｃプロモーターは、大腸菌における最も強力なプロモーターの一つであることが知られているが、当業者であればさらに宿主生物に適した適切なプロモーターを選択することは極めて容易である。
【００４３】
本発明のコドン改変型遺伝子は、野生型遺伝子に比べて上昇した翻訳効率を有するので、前記適切なプロモーターと共に使用することにより、宿主生物内で多量のＣｒｙ４Ａタンパク質を発現させることが可能となる。
【００４４】
ここで、上述の「適切なプロモーター」とは、異種タンパク質の発現量を増大させるために使用されてきたプロモーターを意味する。
【００４５】
「マーカー遺伝子」とは、コドン改変型遺伝子がドナー生物中に導入され、発現されたことの目印として機能する遺伝子であり、薬剤耐性遺伝子、発光タンパク質の遺伝子等を利用することができるが、これらに限定されない。
【００４６】
「Ｋｏｚａｋ配列」とは、翻訳開始点ＡＴＧのすぐ上流（−６〜−１位）のコンセンサス配列である。−６〜＋４までの配列で最も多い組み合わせは、ＧＣＣＧ／ＡＣＣＡＴＧＧ／Ａであり、Ｋｏｚａｋ配列を保存すれば、生物での翻訳効率が高くなる可能性がある。
【００４７】
一般に、所望の遺伝子を宿主細胞に導入するためには、導入したい遺伝子を宿主細胞での発現に適したベクターに組み込んで、該ベクターを宿主細胞に導入する方法が採られる。そこで、本発明は、前記コドン改変型遺伝子、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。本発明に使用するベクターは、宿主細胞における発現に適したベクターであればいずれを使用してもよい。このようなベクターとしていずれのベクターが最適であるか、当業者であれば容易に判断できるであろう。好ましくは、前記ベクターは、ラン藻発現用ベクターｐＵＣ３０３ｍｃｓである。また、前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、好ましくは以下の実施例に示すｐＴｒｃ４Ａである。
【００４８】
本発明の一つの態様において、コドン改変型遺伝子、コドン改変型遺伝子に調節配列等を連結したポリヌクレオチド、コドン改変型遺伝子が組み込まれたベクターを導入した形質転換体も本発明の範囲に属する。宿主生物内にポリヌクレオチドを導入する方法としては、電気穿孔法、リピッド法、マイクロインジェクション法などの当業者に周知の方法を使用することができる。
【００４９】
本発明の好ましい態様において、上述のベクターが導入されたラン藻を提供する。前記ベクターを導入するラン藻はいずれのラン藻でもよいが、好ましくはＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ７９４２  Ｒ２  Ｓｐｃである。本発明の一つの態様において、前記ｐＴｒｃ４Ａが導入されたラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ７９４２  Ｒ２  Ｓｐｃを提供する。ラン藻に前記ベクターを導入する方法は、上述のポリヌクレオチドを導入する方法と同様の方法を使用することができる。
【００５０】
ここで、本発明のコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子、該遺伝子を含むベクター、および該ベクターを含む形質転換体の作製方法を具体的に記載する。
【００５１】
本発明のコドン改変型遺伝子は、いかなる方法で作製されてもよいが、たとえば以下の方法を使用して、本発明のコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を作製することができる（図１、２）。
【００５２】
ＤＮＡシンセサイザーで５０ヌクレオチド程度の長さの一本鎖ＤＮＡを合成する。一方、これに対する相補鎖を合成し、両者をアニールして二本鎖ＤＮＡを作製する。この時、隣接する約５０ヌクレオチドの領域との連結部分は突出した１５〜２０ヌクレオチド程度の一本鎖とし、そのヌクレオチド配列を隣接領域と相補的となるように設計しておく。隣接領域、さらにその隣の領域を同様にして作製する。それらをアニールすると相補的配列を持つ突出領域は塩基対を形成し、これらの二本鎖ＤＮＡは連結される（＊１）。これを適当なクローニングベクターに挿入する（＊２）。これに続く領域も同様にして作製し（＊３）、それぞれを適切な制限酵素で切断してベクターから切り出し（＊４）、連結してベクターに挿入する（＊５）。これを制限酵素ＡおよびＣで切り出すと、「断片１＋２」が得られ、同様にして作製した隣接領域の断片と連結するとより長い断片が得られる。これを繰り返して全長２２４６ｂｐ（塩基対）のＤＮＡを作製することができる。最終的に得られた合成ＤＮＡは、その全塩基配列を調べ、正しい塩基配列であることを確認する。
【００５３】
本発明のコドン改変型遺伝子およびｔｒｃプロモーターを含むベクターは、いかなる方法で作製されてもよいが、たとえば以下に概説したように作製することができる（図３、４、５）。
【００５４】
合成したＤＮＡ配列上には、最初のアミノ酸Ｍｅｔ（メチオニン）のコドン（ＡＴＧ）上流８〜１２ヌクレオチドに塩基配列ＧＧＡＧＧから成るＲＢＳ（リボソーム結合部位）を、またＯＲＦ（アミノ酸をコードする配列領域）の直下流には、終止コドンＴＡＡを作製しておくことが好ましい。この様に設計することより、ＲＢＳの上流領域にプロモーターを付加すれば、この遺伝子を発現させることができる。たとえば大腸菌の細胞内で作動する最も強力なプロモーターの一つであるｔｒｃプロモーターをＲＢＳ上流領域に付加することができる。合成したコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡは、クローニングベクター上に保持されているので、本発明のベクターの作製は、図３〜５に示した方法で操作すればよい。すなわち、まず前記遺伝子をベクターから切り出して、いったん別のベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）等に挿入する。その後、所望のベクター、たとえばラン藻用ベクターであればｐＵＣ３０３ｍｃｓに挿入し、さらにｔｒｃプロモーターを上流領域に付加すればよい。
【００５５】
上記のように作製されたラン藻コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を含むベクターの一つであるｐＴｒｃ４Ａは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許性物寄託センターに寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３１）。
【００５６】
次に、上記のようにして作製された発現プラスミドを、所望の宿主細胞に、たとえば前記ｐＴｒｃ４Ａであればラン藻に導入することにより、Ｃｒｙ４Ａタンパク質を高発現させることが可能になる。
【００５７】
ラン藻を例に形質転換体の作製方法を概略する。ＢＧ１１培地で培養したラン藻を遠心分離（７００×ｇ、４℃、１０分）して菌体を回収し、菌体を２ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＣｌに懸濁して、１０μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡを添加し、さらに８ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＣｌを添加して穏やかに混合する。再び、遠心分離（７００×ｇ、４℃、１０分）して菌体を回収し、菌体を終濃度ＯＤ７３０ｎｍ＝３．０となるようにＢＧ１１液体培地に懸濁する。この懸濁液に菌体懸濁液３００μｌに２０μｌの改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を保持するプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇのプラスミドＤＮＡを含む）を添加する。遮光して３０℃において約１２時間振盪培養し、この培養液１５０μｌをＢＧ１１寒天培地上に拡げ、３０℃で約７日間培養する。ＢＧ１１寒天培地表面が緑色がかってきたら、寒天培地の底にストレプトマイシンを終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加して培養を続け、単一コロニーを得る。次いで、各単一コロニーのプラスミドＤＮＡを調べ、改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を保持するプラスミドＤＮＡを持つクローンを選抜することによって形質転換体を得ることができる。
【００５８】
上記のように作製したｐＴｒｃ４Ａ（ラン藻コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を含むベクター）を含むラン藻は、ＰＣＣ７９７２  Ｒ２−Ｓｐｃ  ４Ａ７として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許性物寄託センターに寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２３２）。
【００５９】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に説明するが、本実施例は、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６０】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００６１】
材料および方法
１．コドン改変型ｃｒｙ４遺伝子の構築
１．  小断片Ａ１、Ａ２、Ａ３、および（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）をＤＮＡシンセサイザーを使用して合成しておく。（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）は、Ａ１、Ａ２、Ａ３の相補鎖である（図７）。
【００６２】
２．  １８０ｐｍｏｌｅのＡ１と１８０ｐｍｏｌの（Ａ１９を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に溶解し、全量を５０μｌとする。
【００６３】
３．  ７０℃において２分間加熱する。
【００６４】
４．  ３７℃まで徐冷する。
【００６５】
５．  ＤＴＴを終濃度１０ｍＭとなるように添加する。
【００６６】
６．  ＡＴＰを終濃度０．５ｍＭとなるように添加する。
【００６７】
７．  ５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加する。
【００６８】
８．  ３７℃において３０分間反応させる。
【００６９】
９．  小断片Ａ２と（Ａ２）、およびＡ３と（Ａ３）も同様に処理しておく。この操作により、相補鎖どうしがアニールして、各５’末端がリン酸化された３種類の二本鎖ＤＮＡ小断片Ａ１／（Ａ１）、Ａ２／（Ａ２）、Ａ３／（Ａ３）が作製される。
【００７０】
１０．  小断片Ａ１／（Ａ１）、Ａ２／（Ａ２）、Ａ３／（Ａ３）をそれぞれ５ｐｍｏｌｅずつ（約０．０３μｇ）と、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＶ切断して５’末端を脱リン酸化しておいたプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋  ０．５ｐｍｏｌｅ（約１μｇ）にＴ４ＤＮＡリガーゼ反応用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５ｍＭ  ＡＴＰ）を添加し、全量を２０μｌとする。
【００７１】
１１．  ７０℃において２分間加熱した後、４℃まで徐冷する。
【００７２】
１２．  氷上に静置し、ＡＴＰを終濃度０．５ｍＭとなるように添加する。
【００７３】
１３．  Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１０ユニット添加して、１６℃〜２０℃において一晩反応させる。
【００７４】
１４．  このＤＮＡを大腸菌ＤＨ５αに導入して、寒天培地上に得られた単一コロニーから、小断片Ａ１／（Ａ１）、Ａ２／（Ａ２）、Ａ３／（Ａ３）が連結されたＤＮＡを保持する組換えプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｓｋ＋を単離した。
【００７５】
１５．  クローニングされたＤＮＡ断片Ａ１／（Ａ１）、Ａ２／（Ａ２）、Ａ３／（Ａ３）すなわち断片Ａのサイズと塩基配列を確認した。
【００７６】
１６．  断片Ａを保持する組換えプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＤＮＡを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｎａＢＩで切断して断片Ａを切り出し、アガロースゲル電気泳動後、断片ＡのＤＮＡをゲルから回収精製した。
【００７７】
１７．  同様の方法によって、断片Ｂを保持する組換えプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＤＮＡを得て、これを制限酵素ＮａｅＩおよびＫｐｎＩで切断して断片Ｂを回収精製した。
【００７８】
１８．  断片Ａおよび断片Ｂをそれぞれ５ｐｍｏｌｅと、あらかじめＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断して、５’末端を脱リン酸化しておいたプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋の０．５ｐｍｏｌｅをＤＮＡリガーゼ反応用緩衝液に溶解して、全量を２０μｌとした。
【００７９】
１９．  前回と同様の方法で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応を行った。ただし反応温度は１６℃で行った。
【００８０】
２０．  前回と同様にして断片Ａ−Ｂ連結物を保持した組換えプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＤＮＡを得て、これをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断して断片Ａ−Ｂを得た。
【００８１】
２１．  以下、同様の方法で断片Ｃ−Ｄ連結物、断片Ｄ−Ｅ連結物等を構築し、これらを図８に示した組み合わせで順次連結し、改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡを構築した（配列番号１の配列は、得られた改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡを示し、配列番号２の配列は、プロモーターＰｔｒｃの配列を含む改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子の塩基配列を示す）。
【００８２】
２．小断片Ａ１、Ａ２、Ａ３、および（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）の合成
小断片Ａ１、Ａ２、Ａ３、および（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）をＤＮＡシンセサイザーを使用して合成した（図７）。（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）は、Ａ１、Ａ２、Ａ３の相補鎖である。
小断片Ａ１：１Ｇ〜５９Ｃの５’末端にＧを追加したもの
小断片Ａ２：６０Ｇ〜１３２Ｃ
小断片Ａ３：１３３Ｃ〜２００Ｃの３’末端にＧＴＡを追加したもの
小断片（Ａ１）：（７６Ｃ）〜（１Ｃ）の３’末端にＣを追加したもの
小断片（Ａ２）：（１４６）〜（７７Ｇ）
小断片（Ａ３）：（２００Ｇ）〜（１４７Ｇ）の５’末端にＴＡＣを追加したもの
３．改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子のラン藻への導入
１．  ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ７９４２  Ｒ２−ＳＰｃを、１０ｍｌのＢＧ１１液体培地（以下のＡからＧを１ｍｌずつと、Ｈと、Ｉを添加して混合し、ＨＣｌでｐＨを７．４に調整し、全量を１０００ｍｌとする）にてＯＤ７３０ｎｍ＝１．０に達するまで３０℃において振盪培養する。
【００８３】
２．  遠心分離（７００×ｇ、４℃、１０分）して菌体を回収する。
【００８４】
３．  菌体を２ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＣｌに懸濁して、１０μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡを添加し、さらに８ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＣｌを添加して穏やかに混合する。
【００８５】
４．  遠心分離（７００×ｇ、４℃、１０分）して菌体を回収する。
【００８６】
５．  菌体を終濃度ＯＤ７３０ｎｍ＝３．０となるようにＢＧ１１液体培地に懸濁する。
【００８７】
６．  菌体懸濁液３００μｌに２０μｌの組換えｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を保持する）ＤＮＡ溶液（１μｇのプラスミドＤＮＡを含む）を添加する。
【００８８】
７．  遮光して３０℃において約１２時間振盪培養する。
【００８９】
８．  この培養液１５０μｌをＢＧ１１寒天培地上に拡げ、３０℃で約７日間培養する。
【００９０】
９．  ＢＧ１１寒天培地表面が緑色がかってきたら、寒天培地の底にストレプトマイシンを終濃度５μｇ／ｍｌとなるように添加する。
【００９１】
１０．  さらに培養を続け、多数の単一コロニーを得る。
【００９２】
１１．  各単一コロニーのプラスミドＤＮＡを調べ、改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を保持する組換えｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋を持つクローンを選抜する。
【００９３】
ＢＧ１１培地
（Ａ〜Ｇを１ｍｌずつとＨとＩを加えて混合し、ＨＣｌでｐＨを７．４にあわせ、一回蒸留水で１０００ｍｌとした後、オートクレーブする。）
Ａ：Ａ５＋Ｃｏ溶液：滅菌水で１００ｍｌとする。
Ｈ３ＢＯ３            ０．２８６ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ      ０．１８１ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ      ０．０２２ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ    ０．０３９ｇ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ溶液  １００μｌ（０．０７９ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏを１ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ溶液  １００μｌ（０．０４９ｇのＣｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏを１ｍｌ滅菌水に溶解したもの）
Ｂ：Ｋ２ＨＰＯ４のｘ１０００ストック溶液
（２．０ｇのＫ２ＨＰＯ４を５０ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｃ：ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏのｘ１０００ストック溶液
（１．８ｇのＣａＣｌ２を５０ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｄ：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏのｘ１０００ストック溶液
（３．７５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを５０ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｅ：Ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄのｘ１０００ストック溶液
（０．３ｇのＣｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄを５０ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｆ：ＥＤＴＡ・Ｎａ２のｘ１０００ストック溶液
（０．０６ｇのＥＤＴＡ・Ｎａ２を５０ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｇ：Ｆｅｒｒｉｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅのｘ１０００ストック溶液
（０．３ｇのＦｅｒｒｉｃ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅを５０ｍｌの滅菌水に溶解したもの）
Ｈ：ＮａＮＯ３    １．５ｇ
Ｉ：Ｎａ２ＣＯ３    ０．２ｇ
４．ラン藻におけるＣｒｙ４Ａタンパク質の発現
１．  改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を保持する組換えプラスミドベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（以後ｐＴｒｃ４Ａと呼ぶ）を保持するラン藻形質転換株を１０ｍｌのＢＧ１１培地にて３０℃でＯＤ７３０ｎｍ＝１．０に達するまで培養する。
【００９４】
２．  遠心分離（７００×ｇ、４℃、１０分）して菌体を回収する。
【００９５】
３．  菌体を０．５ｍｌの氷冷ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁する。
【００９６】
４．  リゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで添加する。
【００９７】
５．  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（非イオン性界面活性剤）を終濃度０．１％で添加する。
【００９８】
６．  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド：セリンプロテアーゼ阻害剤）を終濃度０．１％で添加する。
【００９９】
７．  ３０℃において１５分間インキュベートする。
【０１００】
８．  超音波処理（５秒ｏｎ、５秒ｏｆｆ、計１分間処理）。
【０１０１】
９．  破砕液１５μｌを採り、ＳＤＳ−１４％ＰＡＧＥを行う。
【０１０２】
１０．  ニトロセルロース膜にブロットする。
【０１０３】
１１．  抗クリスタルタンパク質抗体を使用したウエスタンブロッティングによって、Ｃｒｙ４Ａタンパク質のバンドを検出し、その強度をＣｒｙ４Ａ標準試料と比較してＣｒｙ４Ａタンパク質のラン藻細胞内蓄積量を推定した。
【０１０４】
結果
ラン藻ＰＣＣ７９４２  Ｒ２  Ｓｐｃにコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を導入した遺伝子導入株＃７におけるＣｒｙ４Ａタンパク質の細胞内蓄積量を図９に示した。遺伝子導入株の全可溶性タンパク質のうち９．８％がＣｒｙ４Ａであることが明らかである（図９Ａ、Ｂ）。
【０１０５】
また、ｃｒｙ４Ａ遺伝子導入ラン藻の通常の培養液（すなわち、ラン藻細胞の濃縮などをいっさい行わない）にボウフラを入れると、ボウフラがラン藻を餌として摂取し、２４時間後には８０−９０％が死に至ることが確認された（図１０）。
【０１０６】
さらに、ｃｒｙ４Ａ遺伝子導入ラン藻の稀釈培養液（１〜１／３０）にボウフラを入れた場合の死虫率を、図１１に示した。１／３０まで稀釈した場合（この時のＣｒｙ４Ａ濃度は２．７ｎｇ／ｍｌであった）であっても、４８時間後には８０％以上のボウフラが死に至ることが明らかである。
【０１０７】
【発明の効果】
コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を構築し、その上流に強力なプロモーターをおくことにより、Ｃｒｙ４Ａタンパク質を高発現させることが可能となった。したがって、本発明の遺伝子、ポリヌクレオチドまたはベクターを使用すれば、宿主細胞（特にラン藻）内にＣｒｙ４Ａを高レベルで発現させることが可能となる。
【０１０８】
また、本発明の改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子導入ラン藻の通常の培養液（すなわち、ラン藻細胞の濃縮などをいっさい行わない）にボウフラを入れるだけで、ボウフラがラン藻を餌として摂取し、２４時間後には８０−９０％を死に至らせることが可能となった。従って、本発明の改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子導入ラン藻は、ボウフラの防除および環境保全の点において、優れた効果を有する。
【０１０９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡの作製方法の概略図。
【図２】コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡの作製方法の概略図。
【図３】コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡが組み込まれたベクターの作製方法の概略図。
【図４】コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡが組み込まれたベクターの作製方法の概略図。
【図５】コドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子ＤＮＡが組み込まれたベクターの作製方法の概略図。
【図６】ラン藻とＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓのｃｒｙ遺伝子のコドン使用頻度の違いを示した図。
【図７】断片Ａおよび断片Ｂの構築図。
【図８】改造型ｃｒｙ４Ａ遺伝子の構築図。
【図９】ラン藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ＰＣＣ７９４２  Ｒ２  Ｓｐｃにコドン改変型ｃｒｙ４Ａ遺伝子を導入した遺伝子導入株＃７におけるＣｒｙ４Ａタンパク質の細胞内蓄積量を示した図。
【図１０】改良型ｃｒｙ４Ａ遺伝子導入ラン藻株＃７のボウフラに対する殺虫活性を示した図。
【図１１】改良型ｃｒｙ４Ａ遺伝子導入ラン藻株＃７のボウフラに対する殺虫活性を示した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004166574.tif 000013
【図８】
2004166574.tif 000014
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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