(57)【要約】【課題】白血病阻害因子（ＬＩＦ）を遺伝子工学的に改変することによって、ＥＳ細胞に対する分化抑制活性が高く、さらにその全能性を維持している未分化のＥＳ細胞を効率的に増殖させることのできる改変型高機能ＬＩＦを提供する。【解決手段】細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化するマトリックス結合領域と、ＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性を有する白血病阻害因子領域とを含有するタンパク質は、ＥＳ細胞の分化を強力かつ持続的に抑制することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化するマトリックス結合領域と、
ＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性を有する白血病阻害因子領域とを含有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
さらに、ゼラチン結合領域を含有することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記マトリックス結合領域は、ヒトフィブロネクチン由来であることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
ヒトフィブロネクチンにおけるアミノ末端側のマトリックス結合領域とカルボキシル末端側のマトリックス結合領域との間に、白血病阻害因子領域を含有することを特徴とするタンパク質。
【請求項５】
前記アミノ末端側のマトリックス結合領域が７０ｋＤａであり、前記カルボキシル末端側のマトリックス結合領域が３７ｋＤａであることを特徴とする請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記白血病阻害因子領域は、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＥＳ細胞に対する細胞分化抑制活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含むことを特徴とする細胞分化抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を用いていることを特徴とする細胞分化を抑制する方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含有することを特徴とする細胞培養培地。
【請求項１１】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスへの固相化活性と、ＥＳ細胞に対する細胞分化抑制活性とを有するタンパク質。
【請求項１２】
請求項７または１１に記載の遺伝子を含有することを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項７または１１に記載の遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１４】
請求項７または１１に記載の遺伝子を宿主細胞に導入することにより、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスへの固相化活性と、ＥＳ細胞に対する細胞分化抑制活性とを有するタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＥＳ細胞に対して強力な分化抑制活性を有するマトリックス自己固相型白血病阻害因子（細胞外マトリックス組込型白血病阻害因子を含む）（ｍＦ−ＬＩＦ：ｍｉｎｉ−ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：胚性幹細胞）は、受精卵が胎児になる途中に形成される胚盤胞から分離した内部細胞塊を培養・継代することにより株化した細胞であり、ほとんどすべての細胞に分化しうる能力（全能性）を有する万能細胞として知られている。
【０００３】
このような様々な細胞へ分化する能力と高い増殖能力とを併せ持つＥＳ細胞は、失われた細胞を再生して補うという新しい治療法、即ち、再生医療への応用が期待されている。
【０００４】
ＥＳ細胞はある一定の培養条件の下では未分化状態を保ったまま増殖・継代することができる。しかし、マウスＥＳ細胞を、全能性を維持したまま培養・継代するためには、種々の細胞外マトリックス因子（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）及び可溶性因子を分泌する胎児線維芽細胞をフィーダー細胞として用い、さらに細胞分化を抑制する白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：以下、ＬＩＦと称する）を添加しなければならない（例えば、非特許文献１および非特許文献２参照）。即ち、マウスＥＳ細胞を、全能性を保持した状態で培養するには、マウス胎児線維芽細胞の初代培養細胞をフィーダー細胞層とし、さらにＬＩＦの存在下で培養する必要がある。
【０００５】
また、１〜２日という極めて短期間の培養を行う際は、上記胎児線維芽細胞の代わりにゼラチン・コートディッシュを細胞培養のための足場として用い、ＬＩＦを添加することによって、ＥＳ細胞を培養できる。
【０００６】
ところで、ヒトフィブロネクチンのＮ末端７０ｋＤａ領域とＣ末端３７ｋＤａ領域との間にタンパク質を挟み込んだキメラタンパク質は、ヒトフィブロネクチンのアッセンブリー領域にターゲットできることが知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ，  ３３６，  ｐ６８６−６８７，  （１９８８）
【０００８】
【非特許文献２】
Ｎａｔｕｒｅ，  ３３６，  ｐ６８８−６９０，  （１９８８）
【０００９】
【非特許文献３】
Ｍａｔｓｕｙａｍａ著、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１６，  ｐ８９８−９０４，  （１９９４）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ＬＩＦ存在下でＥＳ細胞の培養を行っても、分化を完全に抑制することは困難であり、未分化のＥＳ細胞を効率よく培養・継代できないという問題点がある。
【００１１】
また、フィーダー細胞を用いないゼラチン・コートディッシュ上でＥＳ細胞を培養する場合、分化は著しく進行し、未分化細胞の割合は極端に低下するという問題点がある。
【００１２】
従って、マウス等のＥＳ細胞を培養する際、通常用いられる市販のリコンビナントマウスＬＩＦ（ｒｍＬＩＦ、商品名ＥＳＧＲＯ、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．）と比較して、より未分化のＥＳ細胞（全能性ＥＳ細胞）の割合を高める高機能の分化抑制のための薬剤等の開発が求められている。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、ＬＩＦを遺伝子工学的に改変することによって、ＥＳ細胞に対する分化抑制活性が高く、さらにその全能性を維持している未分化のＥＳ細胞を効率的に増殖させることのできる改変型高機能ＬＩＦを提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒト由来のフィブロネクチン（以下、ヒトＦＮと称する）のＮ末端側７０ｋＤａ領域とＣ末端３７ｋＤａ領域との間にヒト由来のＬＩＦを挟み込んだキメラタンパク質を作製し、その機能を解析したところ、このキメラタンパク質は、従来のｒｍＬＩＦ（リコンビナントマウスＬＩＦ）と比較して、ＥＳ細胞の分化をより効率よく抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明のタンパク質は、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化するマトリックス結合領域と、ＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性を有する白血病阻害因子領域とを含有するタンパク質である。
【００１６】
マトリックス結合領域と白血病阻害因子領域とを有することにより、持続的かつ強力に白血病阻害因子受容体（以下、ＬＩＦ受容体と称する）に作用することができる。このため、より効果的にＥＳ細胞の分化を抑制することができる。
【００１７】
また、上記タンパク質は、さらに、ゼラチン結合領域を含有することが好ましい。ゼラチン結合領域を有することにより、ゼラチン・コートディッシュ上でＥＳ細胞を培養した場合も、本発明のタンパク質を固相化することができ、より持続的かつ強力にＬＩＦ受容体に作用させることが可能となる。なお、ここでいう、「固相化」とは、細胞の表面または周囲に存在する細胞外マトリックスまたはゼラチン等への結合、組み込み、あるいは保持をいう。
【００１８】
また、前記マトリックス結合領域は、ヒトフィブロネクチン由来であることが好ましい。
【００１９】
また、本発明のタンパク質は、ヒトフィブロネクチンにおけるアミノ末端側のマトリックス結合領域とカルボキシル末端側のマトリックス結合領域との間に、白血病阻害因子領域を含有するタンパク質であってもよい。
【００２０】
上記タンパク質は、上記の構造を有することにより、より効果的に細胞外マトリックスに固相化され、より持続的かつ強力にＬＩＦ受容体に作用することができる。このため、より効率的にＥＳ細胞の分化を抑制することができる。
【００２１】
また、前記アミノ末端側のマトリックス結合領域が７０ｋＤａであり、前記カルボキシル末端側のマトリックス結合領域が３７ｋＤａであることが好ましい。
【００２２】
また、前記白血病阻害因子領域は、以下の（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＥＳ細胞に対する細胞分化抑制活性を有するポリペプチドであることが好ましい。なお、配列番号１は、成熟タンパク質のアミノ酸配列を示している。
【００２３】
また、本発明の遺伝子は、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２４】
また、本発明の細胞分化抑制剤は、上記のタンパク質のいずれかを含む細胞分化抑制剤であり、本発明の細胞分化抑制方法は、上記タンパク質のいずれかを用いた細胞分化を抑制する方法である。上記の細胞分化抑制剤、または細胞分化抑制方法を用いることにより、従来のｒｍＬＩＦと比較して、より効果的にＥＳ細胞の分化を抑制することができる。
【００２５】
また、本発明の細胞培養培地は、上記いずれかのタンパク質を含有する細胞培養培地である。上記細胞培養培地を用いることにより、容易にＥＳ細胞の分化を抑制したまま、増殖させることができる。
【００２６】
また、本発明の遺伝子は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子である。（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスへの固相化活性と、ＥＳ細胞に対する細胞分化抑制活性とを有するタンパク質。なお、配列番号７は、成熟タンパク質のアミノ酸配列を示している。
【００２７】
また、本発明の組換え発現ベクターは、上記の遺伝子のいずれかを含む組換え発現ベクターである。例えば、配列番号８に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００２８】
本発明に係る形質転換体は、上記遺伝子のいずれかが導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。これらは、特に、細胞外マトリックスに結合でき、かつＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性を有するタンパク質の大量生産等に有用である。
【００２９】
また、本発明に係るタンパク質生産方法は、上記の遺伝子のいずれかを宿主細胞に導入することにより、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスへの固相化活性と、ＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性とを有するタンパク質を生産する方法である。上記方法により、容易に細胞外マトリックスへの固相化活性と、ＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性とを有するタンパク質を大量生産することができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質、遺伝子及びその利用法に関する実施の一形態について図１〜８に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
本発明は、白血病阻害因子（以下、ＬＩＦと称する）を遺伝子工学的に改変することによって、従来のＬＩＦと比較して、ＥＳ細胞に対する分化抑制活性がより高く、さらに未分化のＥＳ細胞を効率的に増殖させることのできる改変型ＬＩＦを提供するとともに、この改変型ＬＩＦの機能を解析し、利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明のタンパク質、遺伝子について説明し、次いでこれらタンパク質の利用方法等について説明することとする。
【００３２】
（１）本発明のタンパク質
ＬＩＦは、ＥＳ細胞の分化を抑制する活性を有することが知られているタンパク質である。このＬＩＦのＥＳ細胞に対する分化抑制の作用機序としては、ＬＩＦが、細胞表面のＬＩＦ受容体のβ鎖に結合し、ｇｐ１３０を介して抑制作用を示すと考えられている。
【００３３】
そこで、本発明者は、従来のＬＩＦと比較して分化抑制活性のより優れた高機能型ＬＩＦを開発するためには、前記ＬＩＦ受容体の活性化状態を持続できるような改変ＬＩＦを創製する必要があると考えた。
【００３４】
そして、本発明者は、上記の考えに基づき、高濃度かつ持続的にＬＩＦ受容体に作用できる活性持続型ＬＩＦとして、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化することができる細胞外マトリックスのマトリックス結合領域とＬＩＦ領域とを含むキメラタンパク質を独自に作製し、このキメラタンパク質を詳細に検討した結果、ＥＳ細胞の分化を効率的に抑制することがわかり、本発明を完成させるに至った。
【００３５】
即ち、本発明のタンパク質は、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化することができるマトリックス結合領域と、ＥＳ細胞の分化を抑制できるＬＩＦ領域とを含んでいればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。即ち、換言すれば、本発明のタンパク質は、細胞外マトリックスへの固相化活性と、ＥＳ細胞に対して細胞分化抑制活性を有するタンパク質であるといえる。
【００３６】
本発明のタンパク質に用いられるＬＩＦ領域としては、ＥＳ細胞の分化を抑制する活性を有するものであればよく、その由来生物等は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ヒト由来のＬＩＦ（以下、ヒトＬＩＦと称する）が挙げられる。
【００３７】
ヒトＬＩＦは、１８０個のアミノ酸からなる、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる２０ｋＤａのポリペプチドに２０〜４０ｋＤａの糖鎖が結合した分子量４万〜６万の糖タンパク質である。また、ヒトＬＩＦは、配列番号３に示される塩基配列によりコードされているタンパク質である。
【００３８】
また、本発明のタンパク質に含まれるＬＩＦ領域は、上述したように、細胞の分化を抑制する活性を有するものであればよく、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞分化抑制活性を有するポリペプチドも含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のポリペプチドは、換言すれば、上記（ａ）のポリペプチドの変異ポリペプチドであり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質や変異ポリペプチドであってもよい。
【００３９】
なお、本発明でいう「ポリペプチド」とは、アミノ酸が数個結合した短いペプチド、アミノ酸が数十〜数百結合した長いペプチド、及び組換えタンパク質を含むものである。また、ポリペプチドは、天然に存在するもの、化学的、生物学的方法にて合成、生合成されたものを含む。
【００４０】
また、上記「マトリックス結合領域」としては、細胞表面または周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化できるものであればよく、分子量やアミノ酸配列等は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ヒトフィブロネクチン（以下、ヒトＦＮと称する）のマトリックス結合領域（マトリックスアッセンブリードメイン）が挙げられるが、これについては（１−１）に後述する。
【００４１】
また、本発明のタンパク質は、上記の領域に加えて、さらにゼラチン結合領域を含んでいることがより好ましい。ここでいう「ゼラチン結合領域」とは、ゼラチンに結合（固相化）できる活性を有するものであればよく、分子量やアミノ酸配列等は特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ヒトＦＮ由来のゼラチン結合領域が挙げられる。なお、ヒトＦＮ由来のゼラチン結合領域は、後述するように、ヒトＦＮのマトリックス結合領域に含まれる領域である（図１（ａ）参照）。
【００４２】
上記のように、本発明のタンパク質は、ゼラチン結合領域を有していることにより、フィーダー細胞層を含まないゼラチン・コートディッシュ上でＥＳ細胞を培養する場合でも、ゼラチン・プレートに固相化され、より持続的にＬＩＦ受容体に作用することができる。
【００４３】
また、本発明のタンパク質の作製・取得は、従来公知の方法を用いることができる。例えば、後述する実施例に示すように、まず、従来公知のＰＣＲ法または部位特異的変異法等を利用してキメラタンパク質をコードする遺伝子を作製する。そして、従来公知の発現ベクターに導入し、本発明のタンパク質発現ベクターを作製し、宿主細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）に導入・発現させることにより、本発明のタンパク質を作製・取得することができる。なお、発現ベクター及び宿主細胞については後述する。
【００４４】
また、本発明のタンパク質の精製も、従来公知の方法が利用でき、特に限定されるものではない。例えば、後述する実施例に示すように、本発明のタンパク質は、上記本発明の発現ベクターを細胞に導入し発現させた後、その培養上清からゼラチン・セファロースを用いて精製することができる。
【００４５】
以下では、本発明者が作製した変異ヒトＦＮとヒトＬＩＦとのキメラタンパク質であるｍＦ−ＬＩＦを、本発明のタンパク質の一例として詳細に説明する。
【００４６】
（１−１）ｍＦ−ＬＩＦ
血漿中に存在する糖タンパク質として発見されたヒトＦＮは、強い細胞接着活性をもつ細胞外マトリックス因子であり、細胞表面または周囲に存在する他のＦＮに固相化する性質を有するものである。なお、このタンパク質はヒト以外のＦＮにも固相化することが知られている。
【００４７】
ヒトＦＮは、分子量約２５万のサブユニット鎖がＣ末端部分でのジスルフィド結合によって架橋された二量体として生合成され、細胞外に分泌される。また、図１（ａ）に示すように、ヒトＦＮの各サブユニット鎖はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれる３種類のモジュールから構成されており、このモジュールの組み合わせによって各機能ドメインを構成している。なかでも、ヒトＦＮは、Ｎ末端側のマトリックス結合領域（７０ｋＤａ）とＣ末端側のマトリックス結合領域（３７ｋＤａ）とにより、他のＦＮと固相化する。
【００４８】
本発明者は、上記ヒトＦＮを改変して、他のＦＮに固相化する性質を保持している断片化ＦＮ（ミニフィブロネクチン：以下、ｍＦと称する）を作製し、このｍＦとヒトＬＩＦとを含有するキメラタンパク質（ｍＦ−ＬＩＦ）を作製した。
【００４９】
このｍＦのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ｍＦは、配列番号４に示される塩基配列によりコードされているポリペプチドであって、１１７９個のアミノ酸からなる。
【００５０】
上記ｍＦ−ＬＩＦの具体的な作製は、後述する実施例に示すように、ヒトＦＮの細胞結合領域（ＩＩＩ２〜ＩＩＩ１３）を除去して細胞へのシグナル伝達活性を失わせた不活性型組換えＦＮをｍＦとし（図１（ｂ）参照）、前記欠損させた細胞結合領域に相当する領域にヒトＬＩＦを導入する方法で行った（図１（ｃ）参照）。即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドｍＦにおける１番目のアミノ酸残基〜６９２番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドと６９５番目〜１１７９番目からなるポリペプチドとの間に、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであるヒトＬＩＦを挟み込んで、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるｍＦ−ＬＩＦを作製した。なお、ｍＦ−ＬＩＦの塩基配列は、配列番号８に示すとおりである。
【００５１】
換言すれば、本実施の形態に係るタンパク質は、フィブロネクチンにおけるＮ末端側のマトリックス結合領域（７０ｋＤａ）とＣ末端側のマトリックス結合領域（３７ｋＤａ）との間に、細胞分化抑制活性を有するＬＩＦ領域を含有していればよい。
【００５２】
なお、上記ｍＦは、細胞表面または周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化できるものであればよいため、配列番号２（成熟タンパク質の配列を示す）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、細胞表面または周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化される活性を有するポリペプチドも含まれる。すなわち、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の半分またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失しているポリペプチドであっても、細胞表面または周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化される活性を有するポリペプチドであればよいといえる。ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、上述したものと同義である。
【００５３】
また、上記ｍＦ−ＬＩＦの作製、精製には、後述する実施例に示すように、上記と同様の方法を用いることができ、特に限定されるものではない。
【００５４】
（１−２）ｍＦ−ＬＩＦの機能
後述する実施例に示すように、ｍＦ−ＬＩＦは、マウス胚線維芽細胞の初代培養細胞（Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：以下、ＭＥＦと称する）の表面または周囲に存在するマウスフィブロネクチン（以下、マウスＦＮと称する）に固相化されたことが実験的に示された（図４参照）。ｍＦ−ＬＩＦはＭＥＦの細胞外マトリックスに組み込まれ、不溶化した。即ち、ｍＦ−ＬＩＦは、細胞外マトリックスへの自己固相化能を有することが示された。
【００５５】
また、ｍＦ−ＬＩＦは、マウスＥＳ細胞の表面または周囲に存在するマウスＦＮに固相化されたことが実験的に示された（図５参照）。即ち、ｍＦ−ＬＩＦは、ＥＳ細胞間または周囲のＦＮマトリックスに固相化されることが示された。
【００５６】
また、ｍＦ−ＬＩＦは、フィーダー細胞としてＭＥＦを用いてＥＳ細胞を培養した場合、従来のｒｍＬＩＦと比較して、マウスＥＳ細胞に対して、有意に高い分化抑制活性を示した（図６（ａ）参照）。
【００５７】
ここで、フィーダー細胞として用いたＭＥＦはＥＳ細胞の足場として働くのみならず、種々の可溶性因子を分泌し、ＥＳ細胞の未分化を維持するものである。また、本培養系はＥＳ細胞を未分化のまま維持培養するのに、一般的に利用されている培養系である。このため、この培養系で高い分化抑制活性を示すｍＦ−ＬＩＦは、従来のＬＩＦと比較して、優れた分化抑制能を有していることが実験的に示されたといえる。
【００５８】
また、より単純な系、即ち、フィーダー細胞を用いず、ゼラチン・コートディッシュ上でＥＳ細胞を培養した場合でも、ｍＦ−ＬＩＦは従来のｒｍＬＩＦと比較して、有意に高い分化抑制活性を示した（図７参照）。この高い分化抑制活性はｍＦ−ＬＩＦがＥＳ細胞の表面または周囲の細胞外マトリックスに固相化され、そして、この固相化ｍＦ−ＬＩＦがＬＩＦ受容体を活性化させることによるものであると考えられた。そこで、固相化ｍＦ−ＬＩＦがＥＳ細胞の分化抑制活性を示すか解析した。ＥＳ細胞の培養液中にｍＦ−ＬＩＦを加え、１晩培養後、ｍＦ−ＬＩＦを含まない培地にＥＳ細胞を移し、さらに２日培養後、ＥＳ細胞の分化抑制活性を解析した。この固相化ｍＦ−ＬＩＦのみ存在する条件下でのＥＳ細胞の培養は、従来のｒｍＬＩＦ（可溶性）の存在下での培養と比較して、ＭＥＦをフィーダー細胞として用いて培養した場合においても（図６（ｂ）参照）、またゼラチン・コートディッシュを用いて培養した場合においても、有意に高い分化抑制活性を示した（図８参照）。これは、ＥＳ細胞の細胞間、またはＥＳ細胞の表面または周囲の細胞外マトリックスに固相化されたｍＦ−ＬＩＦが、ＥＳ細胞表面のＬＩＦ受容体に持続的に作用することにより、ＥＳ細胞の分化が効率的に抑制され、未分化のＥＳ細胞の割合が高まったと考えられる。これらのことから、固相化されたｍＦ−ＬＩＦのみで、細胞の分化を効率的に抑制できると考えられる。
【００５９】
またｍＦは、ＦＮアッセンブリードメイン（マトリックス結合領域）を有するのみならず、ゼラチン結合領域（ゼラチン／コラーゲン結合ドメイン：図１（ａ）〜（ｃ）参照）をも有する。従って、ゼラチン・コートディッシュ上でＥＳ細胞を培養した場合、ｍＦ−ＬＩＦは、ＥＳ細胞の細胞間または周囲の細胞外マトリックスに固相化されるだけでなく、ゼラチン・プレートにも固相化される。このため、ゼラチン・コートディッシュ上でＥＳ細胞を培養した場合でも、細胞の周囲及びゼラチン・プレートに固相化されたｍＦ−ＬＩＦにより、強力かつ持続的に、ＥＳ細胞の分化が抑制されたと考えられる。
【００６０】
さらに、ｍＦ−ＬＩＦの強力かつ持続的な分化抑制活性の理由の一つとして、ｍＦ−ＬＩＦが、ＥＳ細胞の細胞間、またはＥＳ細胞の表面または周囲の細胞外マトリックスに固相化されるため、ｍＦ−ＬＩＦが速やかにエンドサイトーシスによって細胞内へ取り込まれることなく、ＬＩＦ受容体に持続的に作用し続けるためと考えられる。
【００６１】
従って、ｍＦ−ＬＩＦは、ＥＳ細胞の全能性を維持したまま、ＥＳ細胞を増殖させることができる、高機能ＬＩＦであることが実験的に示された。
【００６２】
換言すれば、本発明に係るタンパク質は、自己固相化能により、細胞表面または周囲に存在する細胞外マトリックスに取り込まれ、固相化する。このため、上記タンパク質は、一旦培地中で希釈されても細胞表面または周囲に積極的に不溶化され、濃縮される。従って、より高濃度でＥＳ細胞に作用することができる。さらに、上記タンパク質は、従来の可溶性ＬＩＦ（ｒｍＬＩＦ）と異なり、ＬＩＦ受容体に結合した後、直ちにエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれ、分解されることがないと考えられる。このため、ＬＩＦ受容体に対して持続的に作用することができる。
【００６３】
（２）本発明の遺伝子
本発明に係る遺伝子は、以下（Ａ）〜（Ｇ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子であればよい。
【００６４】
（Ａ）細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスに固相化するマトリックス結合領域と、細胞分化抑制活性を有する白血病阻害因子領域とを含有するタンパク質、（Ｂ）上記（Ａ）に、さらに、ゼラチン結合領域を含有するタンパク質、（Ｃ）上記マトリックス結合領域は、ヒトフィブロネクチン由来であるタンパク質、（Ｄ）ヒトフィブロネクチンにおけるアミノ末端側のマトリックス結合領域とカルボキシル末端側のマトリックス結合領域との間に、白血病阻害因子領域を含有するタンパク質、（Ｅ）前記アミノ末端側のマトリックス結合領域が７０ｋＤａであり、前記カルボキシル末端側のマトリックス結合領域が３７ｋＤａであるタンパク質、（Ｆ）前記白血病阻害因子領域が、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞分化抑制活性を有するポリペプチドであるタンパク質、及び（Ｇ）（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または（ｄ）配列番号７に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、細胞表面または細胞周囲に存在する細胞外マトリックスへの固相化活性と、細胞分化抑制活性とを有するタンパク質。
【００６５】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（Ａ）〜（Ｇ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６６】
（３）本発明のタンパク質の利用法
上記のように、本発明に係るタンパク質は、従来のＬＩＦと比較して、より強力かつ持続的に、ＥＳ細胞の分化を抑制する活性を有するものである。従って、本発明に係るタンパク質は以下に示すように利用できる。
【００６７】
（３−１）本発明の細胞分化抑制剤
本発明に係るタンパク質は、ＥＳ細胞の分化を抑制する薬剤として利用することができる。
【００６８】
本発明に係る細胞分化抑制剤の具体的な組成は、上記タンパク質を含んでいればよく、特に限定されるものではない。具体的には、使用対象のＥＳ細胞の種類に応じて、ＥＳ細胞の分化を抑制し、未分化のまま増殖させるために、本発明に係るタンパク質の機能が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。また、本発明の細胞分化抑制剤を用いる際の反応条件、例えば、細胞等の濃度、タンパク質の濃度、反応温度や反応時間、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については特に限定されるものではない。また、本発明の細胞分化抑制剤の使用方法も、特に限定されるものではなく、例えば、ＥＳ細胞の培養液中に直接添加して用いることができる。なお、本発明に係るタンパク質を大量に取得するには、例えば、同種、あるいは異種発現系で大量生産し精製すればよい。
【００６９】
上記の細胞分化抑制剤を用いることにより、効率よくＥＳ細胞の分化を抑制することができ、さらに全能性を維持している未分化細胞のままのＥＳ細胞を効率的に増殖させることができる。従って、ＥＳ細胞を大量に得ることができ、例えば、再生医療等への基礎研究や応用研究に、ＥＳ細胞を容易に利用することができる。
【００７０】
（３−２）本発明の細胞分化抑制方法
本発明に係るタンパク質は、ＥＳ細胞の分化を抑制する方法として利用することができる。即ち、本発明に係る細胞分化抑制方法は、上記タンパク質を用いていればよく、その他の構成手段は特に限定されるものではない。
【００７１】
本発明の細胞分化抑制方法を用いる際の反応条件、例えば、細胞等の濃度、タンパク質の濃度、反応温度や反応時間、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については特に限定されるものではない。
【００７２】
上記の細胞分化抑制方法を用いることにより、効率よくＥＳ細胞の分化を抑制することができ、さらに全能性を維持している未分化のままのＥＳ細胞を効率的に増殖させることができる。従って、ＥＳ細胞を大量に得ることができ、例えば、再生医療等への基礎研究や応用研究に、ＥＳ細胞を容易に利用することができる。
【００７３】
（３−３）本発明の細胞培養培地
本発明の細胞培養培地は、本発明のタンパク質を含有した、細胞生育用の培地であればよく、その他の構成成分等は特に限定されるものではない。本発明の細胞培養培地としては、例えば、目的の細胞を生育、増殖させるために必要な従来公知の細胞培養培地に、本発明のタンパク質を直接添加したものが挙げられる。
【００７４】
本発明の細胞培養培地を用いることにより、ＥＳ細胞の分化を抑制することができ、全能性を維持した未分化細胞のままで細胞を増殖、維持することができる。
【００７５】
（３−４）本発明の組換え発現ベクター及び形質転換体
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種宿主細胞中に導入して、本発明に係るタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、宿主細胞中でベクターとして存在してもよいし、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、宿主細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、宿主細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定の宿主細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加して宿主細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００７６】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００７７】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともに宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００７８】
上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、マウス、ラット、及びヒト等の各種哺乳動物の各種培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００７９】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８０】
（３−５）本発明のタンパク質生産方法
本発明のタンパク質生産方法は、本発明の遺伝子または変異遺伝子を、宿主細胞に導入し、細胞外マトリックスに固相化することができるとともに、細胞の分化を抑制する活性を有するタンパク質を生産できる方法であればよい。
【００８１】
上記宿主細胞への本発明に係る遺伝子等の導入方法としては、例えば、上記（３−４）に記載のベクターを用いる方法等が挙げられる。また、宿主細胞としても、上記（３−４）に記載の宿主細胞を用いることができる。より具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、ヒト２９３Ｔ細胞が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００８２】
なお、上記生産方法により、生産したタンパク質をさらに精製して利用することも可能である。この場合の精製方法も、ゼラチン・セファロース等を用いた従来公知の方法により行うことができる。
【００８３】
本発明の生産方法により、細胞外マトリックスに固相化することができるとともに、細胞の分化を抑制する活性を有するタンパク質、即ち、本発明に係るタンパク質を、容易に、かつ大量に生産することが可能となる。
【００８４】
（３−６）本発明のタンパク質のその他の利用方法
ＬＩＦの生物学的活性（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）として、種々の活性が知られている。従って、ＬＩＦ領域を有する本発明に係るタンパク質（ｍＦ−ＬＩＦを含む）は、以下のように利用できる可能性がある。
【００８５】
例えば、本発明のタンパク質は、Ｍ１細胞（白血病細胞）の分化を誘導（マクロファージの特異的マーカーの誘導）する薬剤または方法等に利用できる可能性がある。また、本発明のタンパク質とＩＬ３（インターロイキン３）とを組み合わせて、巨核球細胞（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）の形成促進、または造血系前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：ｂｌａｓｔ−ＣＦＣ）の増殖、あるいは造血系幹細胞の生存促進等に利用できる可能性がある。
【００８６】
また、ＬＩＦは、神経系に対しても種々の作用を及ぼすことが知られている。このため、本発明のタンパク質は、副交感神経のｐｈｅｎｏｔｙｐｅの変換（例えば、アドレナージックなニューロンからコリナージックなニューロンへの変換）に利用できる可能性がある。また、末梢神経損傷後、ＬＩＦの発現増加、ＬＩＦの逆行性輸送の発現、および生存維持作用等から、ＬＩＦは末梢神経の再生に重要な役割を担っていると考えられている。このため、本発明のタンパク質は、末梢神経の再生のための薬剤または方法等に利用できる可能性がある。
【００８７】
また、筋肉細胞の損傷部位でＬＩＦの産生が増加することが知られている。このため、本発明のタンパク質は、筋肉細胞の増殖および生存維持のための薬剤または方法等に利用することができる可能性がある。
【００８８】
また、本発明のタンパク質は、脂肪前駆体細胞（３Ｔ３−Ｌ１）を脂肪細胞に誘導（脂肪の蓄積やリポプロテインまたはリパーゼの発現を伴う）させるための薬剤または方法等に利用できる可能性がある。さらに、本発明のタンパク質は、造血系、または神経系幹細胞の増殖および生存維持のための薬剤または方法等に利用できる可能性がある。
【００８９】
また、不妊治療の中で治療することのできないものとして、受精卵の子宮への着床が挙げられる。現在、人工受精により精子と卵子とを受精させることは可能であるが、受精卵の子宮への着床は自然に頼るしかない。一方、この受精卵の着床にＬＩＦが関わっていることが報告されている。これらのことから、本発明のタンパク質を受精卵が着床する時期である、ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗの前に子宮上皮細胞の細胞外マトリックスに固相化させ、そこに受精卵を戻すという受精卵の着床補助方法または受精卵の着床補助薬剤等が考えられる。すなわち、上記の受精卵の着床補助方法または受精卵の着床補助薬剤等は、本発明のタンパク質を含んでいればよく、これらの方法または薬剤等を利用することにより、受精卵の子宮への着床を補助できると考えられる。従って、ｍＦ−ＬＩＦ等の本発明のタンパク質は非常に利用価値が高いと考えられる。
【００９０】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
【００９１】
【実施例】
以下に、本発明に係るタンパク質について具体的に説明する。
【００９２】
〔実施例１〕ｍＦ−ＬＩＦ発現ベクターの構築
ｍＦ−ＬＩＦを発現するベクターの構築は、以下のように行われた。
【００９３】
ヒトＦＮのＮ末端７０ｋＤａ領域とＣ末端３７ｋＤａ領域との間にタンパク質を挟み込んだキメラタンパク質は、ＦＮのアッセンブリー領域にターゲットできることを松山らが報告した（非特許文献３参照）。そこで、前記論文に記載されており、配列番号４に記載のｍＦのｃＤＮＡを有するｍＦ発現ベクターであるｐＭＴＸ１（図２参照）における外来ｃＤＮＡ導入部位の制限酵素サイトであるＮｏｔＩサイトとＭｌｕＩサイトとの間に、配列番号３で示されるヒトＬＩＦｃＤＮＡを導入した（図２の矢印参照）。
【００９４】
具体的には、配列番号３に示すヒトＬＩＦｃＤＮＡを、ＮｏｔＩサイトが導入された配列番号５に示すフォワードプライマー、及びＭｌｕＩサイトが導入された配列番号６に示すリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅させた。その後、増幅させたヒトＬＩＦｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩおよびＭｌｕＩで処理し、発現ベクターｐＭＴＸ１のＮｏｔＩサイトとＭｌｕＩサイトとの間に挿入して、ｍＦ−ＬＩＦ発現ベクターｐＭＴＸ１−ＬＩＦを得た。
【００９５】
ＰＣＲ法は９２℃、５分で変性処理をした後、９２℃、３０秒で変性、５６℃、３０秒でアニーリング、７２℃、６０秒で伸長反応させ、この反応を３０サイクル行った。
【００９６】
〔実施例２〕ｍＦ−ＬＩＦの発現および精製
ｍＦ−ＬＩＦの発現および精製は、以下のように行った。
【００９７】
まず、前記発現ベクターｐＭＴＸ１−ＬＩＦを遺伝子導入試薬ＦｕＧＥＮＥ６（ロッシュ）を用いて、ヒト２９３Ｔ細胞に導入して培養を行った。その培養上清を回収し、ゼラチン・セファロースでｍＦ−ＬＩＦを精製した。また同時に、発現ベクターｐＭＴＸ１をヒト２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせ、ヒトＬＩＦを導入しないｍＦ（図１（ｂ）参照）を同様に発現させ、精製した。
【００９８】
そして、精製ｍＦ−ＬＩＦ及び精製ｍＦを、３〜１０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、抗ヒトＦＮ・モノクローナル抗体（Ｔａｋａｒａ）、または抗ＬＩＦ抗体（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を用いたウェスタンブロット解析を行うことにより、ｍＦ−ＬＩＦおよびｍＦを検出した。その結果を図３に示す。
【００９９】
図３（ａ）に示すように、非還元型のｍＦ−ＬＩＦは、高分子量領域に検出された。これは、ヒトＦＮのジスルフィド結合により二量体を形成しているためと考えられる。一方、図３（ｂ）に示すように、還元型ｍＦ−ＬＩＦは、約１８５ｋＤａ、還元型ｍＦは約１６０ｋＤａの位置に検出された。
【０１００】
〔実施例３〕精製ｍＦ及びｍＦ−ＬＩＦの定量
ｍＦ及びｍＦ−ＬＩＦの発現に、ヒト２９３Ｔ細胞を用いたため、精製ｍＦ及びｍＦ−ＬＩＦに、２９３Ｔ細胞自身が産生するヒトＦＮ含まれていると考えられた。そこで、精製ｍＦ及びｍＦ−ＬＩＦの濃度を、総ヒトＦＮ量と細胞結合領域を持つヒトＦＮ量（内在性ヒトＦＮ）との差から求めた。
【０１０１】
具体的には、以下のように行った。まず、総ヒトＦＮ量を定量した。まず、３％アルブミン溶液でブロッキングしたタイプＩコラーゲンコート９６ウェルプレートに精製ｍＦまたはｍＦ−ＬＩＦを１００μｌ加え、室温で２時間振盪した。続いて、ヒトＦＮに対するモノクローナル抗体ＦＮ９−１（１／５００希釈、ヒトＦＮのＮ末端領域を認識する抗体：Ｔａｋａｒａ）を１００μｌ添加し、室温で２時間振盪した。次に、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（１／５００希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加し室温１時間反応させた後、フェニレンジアミンを用いて発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、標準物質としてヒトＦＮを用い、その値から濃度を算出した。
【０１０２】
次に、内在性ヒトＦＮ量を定量した。上記と同様に、まず、３％アルブミン溶液でブロッキングしたタイプＩコラーゲンコート９６ウェルプレートに精製ｍＦまたはｍＦ−ＬＩＦを１００μｌ添加し、室温で２時間振盪した。続いて、ヒトＦＮに対するモノクローナル抗体ＦＮ１２−８（１／５００希釈、ヒトＦＮの細胞結合領域を認識する抗体：Ｔａｋａｒａ）を１００μｌ加え、室温で２時間振盪した。次に、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（１／５００希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加え、室温で１時間反応させた後、フェニレンジアミンを用いて発色させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。なお、標準物質として上記と同様にヒトＦＮを用い、その値から濃度を算出した。
【０１０３】
その結果、精製ｍＦ−ＬＩＦ濃度は８．４μｇ／ｍｌ、ｍＦの濃度は２．０μｇ／ｍｌであった。
【０１０４】
〔実施例４〕ｍＦ−ＬＩＦにおけるマウス胚線維芽細胞の初代培養細胞（ＭＥＦ）の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へのアッセンブリー活性
ｍＦ−ＬＩＦが、ＭＥＦの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）にアッセンブリーできるか否かを調べた。具体的には、以下のように行った。
【０１０５】
まず、ＭＥＦを８ウェル・ガラスチャンバーに０．５×１０５個播種し、２００ｎｇ／ｍｌのｍＦ−ＬＩＦを含むＤＭＥＭ培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ、１０％ウシ胎児血清［１０％ＦＢＳ］、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ）で３日間培養した。その後、細胞をメタノールで−２０℃、１０分間処理することにより固定した。次いで、前記固定した細胞と、マウス抗ヒトＦＮモノクローナル抗体及び家兎抗ＦＮポリクローナル抗体の混合物とを室温にて２時間反応させた。続いてＦＩＴＣ標識抗家兎・イムノグロブリン抗体、およびローダミン標識抗マウス・イムノグロブリン抗体を室温で６０分間反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図４に示す。
【０１０６】
図４（ａ）に示すように、ｍＦ−ＬＩＦはマウス抗ヒトＦＮモノクローナル抗体により検出された。また、図４（ｂ）に示すように、内在性マウスＦＮ及びｍＦ−ＬＩＦは家兎抗ＦＮポリクローナル抗体により検出された。そして、図４（ｃ）にこれらを合成した図を示す。
【０１０７】
これらの結果から、ｍＦ−ＬＩＦは、ＭＥＦ上のマウスＦＮマトリックスに組込まれることがわかった。従って、ｍＦ−ＬＩＦは、細胞外マトリックスへの自己固相化能を有することが実験的に確かめられた。
【０１０８】
〔実施例５〕ｍＦ−ＬＩＦのＥＳ細胞へのアッセンブリー活性
ｍＦ−ＬＩＦが、ＥＳ細胞へアッセンブリーできるか否かを調べた。具体的には、以下のように行った。
【０１０９】
まず、ＥＳ細胞を、ゼラチンにてコーティングした８ウェル・ガラスチャンバーに１０３個播種し、ｍＦ−ＬＩＦ２００ｎｇ／ｍｌを含む培地で３日間培養した。その後、細胞をメタノールで−２０℃、１０分間処理することにより固定した。次いで、前記固定した細胞と、マウス抗ヒトＦＮモノクローナル抗体および家兎抗ＦＮポリクローナル抗体の混合物とを室温にて２時間反応させた。続いてＦＩＴＣ標識抗家兎・イムノグロブリン抗体、およびローダミン標識抗マウス・イムノグロブリン抗体を室温で６０分間反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図５に示す。
【０１１０】
図５（ａ）に示すように、ｍＦ−ＬＩＦは、マウス抗ヒトＦＮモノクローナル抗体により検出された。また、図５（ｂ）に示すように、内在性マウスＦＮ及びｍＦ−ＬＩＦは、家兎抗ＦＮポリクローナル抗体により検出された。そして、図５（ｃ）にこれらを合成した図を示す。
【０１１１】
これらの結果から、ｍＦ−ＬＩＦは、ＥＳの細胞表面または周囲のＦＮマトリックスにアッセンブリーされることが示された。従って、ｍＦ−ＬＩＦは、ＥＳ細胞の表面または周囲に存在する細胞外マトリックスへの自己固相化能を有することが実験的に確かめられた。
【０１１２】
〔実施例６〕ＥＳ細胞の培養
（６−１）マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）処理したＭＥＦの作製
マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）１０μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭにて、ＭＥＦを３７℃、３時間３０分培養することで作製した。このＭＭＣ処理したＭＥＦをＥＳ細胞培養用のフィーダー細胞として用いた。
【０１１３】
（６−２）ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞の培養は以下のように行った。なお、実験には大日本製薬から購入したＥＳ細胞（ＣＭＴ１）を用いた。
【０１１４】
まず、ゼラチンコート６ｃｍディッシュに、上記ＭＭＣ処理したＭＥＦ（１×１０６個）を播種し、一晩培養した。その後、前記ＥＳ細胞（１×１０６個）を１５％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ（ｎｏｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、１％グルタミン酸、１１０μＭメルカプトエタノール、及びｒｍＬＩＦ（リコンビナントマウスＬＩＦ）５００ｕｎｉｔｓを含むＤＭＥＭで培養した。継代は２日毎に行った。
【０１１５】
（６−３）ＥＳ細胞からのフィーダー細胞の除去
培養したＥＳ細胞からフィーダー細胞を除去した。具体的には以下のように行った。
【０１１６】
まず、上記ＭＭＣ処理したＭＥＦ細胞上で培養したＥＳ細胞を、０．２５％トリプシンで３７℃、５分間処理し、ピペッティングでシングル細胞にした。続いて、その培養液を１０ｃｍディッシュに播種し、ＥＳ細胞培養液を８ｍｌ加え、３７℃、１時間培養した。さらに、その培養上清を再度１０ｃｍディッシュに播種し３７℃、１時間培養した。そして、前記培養液中に浮遊しているＥＳ細胞を取得し、以下の実験に用いた。
【０１１７】
〔実施例７〕ｍＦ−ＬＩＦのＥＳ細胞に対する分化抑制活性
ｍＦ−ＬＩＦが、どの程度、ＥＳ細胞の分化を抑制する活性を有するかを調べた。具体的には、ＥＳ細胞培養液中の未分化ＥＳ細胞（全能性ＥＳ細胞）の割合を、ＥＳ細胞の未分化マーカーであるアルカリ・フォスファターゼ（以下、ＡＬＰと称する）活性を指標として、ＡＬＰ陽性細胞のコロニー数、及びＡＬＰ活性を測定することにより調べた。なお、ＡＬＰ活性は、ＥＳ細胞の未分化マーカーとして一般に用いられており、未分化のＥＳ細胞では高い値を示す。
【０１１８】
（７−１）ＥＳ細胞をＭＥＦ上で培養した場合の検討
フィーダー細胞として上記ＭＭＣ処理したＭＥＦを用いてＥＳ細胞を培養した場合、どの程度ｍＦ−ＬＩＦがＥＳ細胞の分化を抑制するかを調べた。具体的には、以下のように行った。
【０１１９】
（７−１ａ）ＡＬＰ陽性コロニー数の解析
まず、ＡＬＰ陽性コロニー数を調べることにより、ｍＦ−ＬＩＦの分化抑制活性を調べた。ＡＬＰ陽性細胞のコロニー数は、ＥＳ細胞のコロニー全体のＡＬＰ活性を細胞染色によって解析する方法、即ち、顕微鏡下でＡＬＰ陽性コロニーを観察することにより測定した。また、併せてＥＳ細胞の形態を観察することにより、未分化細胞と分化細胞とを判別した。
【０１２０】
具体的には、ＥＳ細胞培養液４００μｌに、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ−ＬＩＦ、ｍＦ、及びｒｍＬＩＦとｍＦとの混合物のうち、いずれか一つを０．５×１０−９Ｍとなるように添加し、そこにＥＳ細胞１０００個を加えた。なお、ｒｍＬＩＦは、１０００ｕｎｉｔｓ＝０．５×１０−９Ｍである。次いで、前日にＭＥＦ（１×１０５個）をゼラチンコーティングした２４ウェルプレートに播種し、培養しておいたＭＥＦ上に、前記調製したＥＳ細胞を播種して３日間培養した。その後、前記培養したＥＳ細胞を３．５％ホルマリンにて室温、３０分間処理することにより固定した。続いて、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、前記固定した細胞を染色した。本ｋｉｔにより、ＡＬＰ陽性コロニーは青色に染色される。なお、各群はそれぞれ８ウェルずつ培養し、染色した。
【０１２１】
未分化・分化コロニーの判定は、顕微鏡下でそれぞれのコロニーを観察し、個々の細胞が区別できない程度にまで濃く染色されたコロニーを陽性コロニーとした。一方、▲１▼染色が弱く、個々の細胞の区別ができる細胞のコロニー、▲２▼ほとんど染色されない、または全く染色されない細胞のコロニー、▲３▼明らかに分化した細胞とみられるコロニーをすべて陰性コロニーとした。
【０１２２】
図６（ａ）に、全コロニー数に占める未分化コロニー数の割合を示す。この図６（ａ）に示すように、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ−ＬＩＦ、ｍＦをそれぞれ添加して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は、それぞれ約６５％、約７３％、約４８％であった。またｒｍＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ）とｍＦ（０．５×１０−９Ｍ）との混合物を添加し培養した細胞群中に含まれる未分化細胞の割合は、約６２％であった。これらの結果から、ｍＦ−ＬＩＦは、ｒｍＬＩＦと比較して、フィーダー細胞を用いて培養されたＥＳ細胞に対して、有意に高い分化抑制活性を有することが示された（ｐ＜０．０１）。
【０１２３】
（７−１ｂ）固相化ＬＩＦ存在下で培養したＥＳ細胞のＡＬＰ陽性コロニー数の解析
ＥＳ細胞やＭＥＦの周囲の細胞外マトリックスに固相化されたｍＦ−ＬＩＦが、どの程度、ＥＳ細胞の分化を抑制できるかを調べた。ｍＦ−ＬＩＦが固相化されたＥＳ細胞は、ｍＦ−ＬＩＦの存在下で１晩培養したＥＳ細胞を、ｍＦ−ＬＩＦを含まない培地に換えて、さらに培養することにより得られる。なお、この系では、ｍＦ−ＬＩＦはＥＳ細胞およびＭＥＦに固相化されると考えられる。
【０１２４】
具体的には、上記（７−１ａ）と同様な条件で１日培養したＥＳ細胞を培地で洗浄後、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ−ＬＩＦ、ｍＦ、及びｒｍＬＩＦとｍＦとの混合物を含まない培地に換え、さらに２日間培養した。その後、ＥＳ細胞中の未分化細胞の割合を上記の（７−１ａ）と同様のＡＬＰ陽性コロニー数で解析した。その結果を図６（ｂ）に示す。
【０１２５】
図６（ｂ）に示すように、固相化ｒｍＬＩＦによって未分化のまま維持されたコロニー数の割合は約３７％、固相化ｍＦ−ＬＩＦによって未分化のまま維持されたコロニー数の割合は約５３％、固相化ｍＦによって未分化のまま維持されたコロニー数の割合は約３９％であった。またｒｍＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ）とｍＦ（０．５×１０−９Ｍ）との混合物を固相化した培養群中、未分化のまま維持されたコロニー数の割合は約４５％であった。
【０１２６】
これらの結果から、ｍＦ−ＬＩＦは、ＥＳ細胞やＭＥＦの周囲の細胞外マトリックスに固相化されることにより、ｒｍＬＩＦと比較して、フィーダー細胞を用いて培養されたＥＳ細胞に対して、有意に高い分化抑制活性を有することが示された（ｐ＜０．００１）。
【０１２７】
（７−２）ＥＳ細胞をゼラチン・コートディッシュ上で培養した場合の検討
ｍＦ−ＬＩＦ存在下、フィーダー細胞を用いることなく、ＥＳ細胞をゼラチン・コートディッシュ上で培養した場合、どの程度ＥＳ細胞の分化が抑制されるかを調べた。
【０１２８】
（７−２ａ）ＡＬＰ陽性コロニー数の解析
まず、ＡＬＰ陽性コロニー数を調べることにより、どの程度ｍＦ−ＬＩＦが、ゼラチン・コートディッシュ上で培養したＥＳ細胞の分化を抑制できるかを調べた。
【０１２９】
まず、（７−１ａ）と同様に、ＥＳ細胞培養液４００μｌに、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ−ＬＩＦ、ｍＦ、及びｒｍＬＩＦとｍＦとの混合物のうち、いずれか一つを０．５×１０−９Ｍとなるように添加し、そこにＥＳ細胞を１０００個加えた。そして、ゼラチンコーティングした２４ウェルプレートで３日間培養した。その後、細胞を３．５％ホルマリンで、室温３０分間処理することにより固定した。続いてＶｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて染色した。各群をそれぞれ８ウェルずつ培養し、染色した。なお、未分化・分化コロニーの判定は、上記（７−１ａ）に示した方法と同様に行った。
【０１３０】
全コロニー数に占める未分化細胞のコロニー数の割合を図７（ａ）に示す。同図に示すように、ｒｍＬＩＦを添加して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約１８％、ｍＦ−ＬＩＦを添加して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約２５％、ｍＦを添加して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約４％であった。また、ｒｍＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ）とｍＦ（０．５×１０−９Ｍ）との混合物を添加して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約１６％であった。
【０１３１】
これらの結果から、ｍＦ−ＬＩＦは、ゼラチン・コートディッシュ上で培養されるＥＳ細胞に対しても、ｒｍＬＩＦと比較して、有意に高い分化抑制活性を有することが示された（ｐ＜０．０５）。
【０１３２】
（７−２ｂ）ＡＬＰ活性の測定による解析
次に、ＡＬＰ活性を調べることにより、ｍＦ−ＬＩＦの分化抑制活性を調べた。ＡＬＰ活性は未分化及び分化したＥＳ細胞を含めたすべての細胞のＡＬＰ活性を測定する方法である。具体的には、以下のように行った。
【０１３３】
上記（７−２ａ）と同様な条件で培養したＥＳ細胞のＡＬＰ活性を以下の方法で測定した。まず、培養したプレートを−８０℃、１時間で凍結させ、続いて室温に戻し細胞を破砕した。その後、ＡＬＰの基質のｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ：ＢＩＯ−ＲＡＤ）４００μｌをプレートの各ウェル加え、室温で３０分間放置した。そして４０５ｎｍの吸収を測定した。その結果を図７（ｂ）に示した。
【０１３４】
図７（ｂ）に示すように、ｒｍＬＩＦ添加培養群の吸光度は約０．４、ｍＦ−ＬＩＦ添加培養群の吸光度は約０．８、ｍＦ添加培養群の吸光度は約０．３５であった。また、ｒｍＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ）とｍＦ（０．５×１０−９Ｍ）との混合物を添加し培養した細胞群の吸光度は約０．６５であった。
【０１３５】
吸光度が大きいということは、ＡＬＰ活性が高いということを示しており、未分化細胞の割合が大きいことを示すと考えられる。このため、これらの結果から、ＡＬＰ活性測定においても、ｍＦ−ＬＩＦのＥＳ細胞に対する分化抑制活性は、ｒｍＬＩＦと比較して、有意に高いことがわかった（ｐ＜０．００１）。
【０１３６】
（７−２ｃ）固相化ＬＩＦ存在下で培養したＥＳ細胞のＡＬＰ陽性コロニー数の解析及びＡＬＰ活性測定
ＥＳ細胞周囲の細胞外マトリックスに固相化されたｍＦ−ＬＩＦが、どの程度、ゼラチン・コートディッシュ上で培養されるＥＳ細胞の分化を抑制できるかを調べた。具体的には、以下のように行った。
【０１３７】
上記（７−２ａ）と同様な条件で培養したＥＳ細胞を翌日、培地で洗浄後、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ−ＬＩＦ、ｍＦ、及びｒｍＬＩＦとｍＦとの混合物を含まない培地に換え、さらに２日間培養した。その後、ゼラチン・コートディッシュ上にて培養したＥＳ細胞中の未分化細胞の割合を、上記の（７−１ａ）と同様の方法でＡＬＰ陽性コロニー数、及び（７−２ｂ）と同様の方法でＡＬＰ活性を測定し解析した。このＡＬＰ陽性コロニー数の解析結果を図８（ａ）に示す。
【０１３８】
同図に示すように、ｒｍＬＩＦを固相化して培養した細胞群における未分化細胞のコロニー数の割合は約２％、ｍＦ−ＬＩＦを固相化して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約３２％、ｍＦを固相化して培養した細胞群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約３％であった。また、ｒｍＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ）とｍＦ（０．５×１０−９Ｍ）との混合物を固相化し培養した群中、未分化細胞のコロニー数の割合は約５％であった。
【０１３９】
次いで、ＡＬＰ活性を測定した結果を図８（ｂ）に示す。同図に示すように、ｒｍＬＩＦを固相化し培養した細胞群の吸光度は約０．４８、ｍＦ−ＬＩＦを固相化し培養した細胞群の吸光度は約０．９、ｍＦを固相化し培養した細胞群の吸光度は約０．３５であった。また、ｒｍＬＩＦ（１０００ｕｎｉｔｓ）とｍＦ（０．５×１０−９Ｍ）との混合物を固相化し培養した細胞群の吸光度は約０．７であった。
【０１４０】
これらの結果から、ｍＦ−ＬＩＦはゼラチンやＥＳ細胞表面に存在する細胞外マトリックスと固相化することにより、ゼラチン・コートディッシュ上にて培養されるＥＳ細胞に対しても、固相化されたｒｍＬＩＦと比較して、有意に高い分化抑制活性を示すことがわかった（ともにｐ＜０．００１）。
【０１４１】
【発明の効果】
上述したように、本発明に係るタンパク質、遺伝子、細胞分化抑制剤、細胞分化抑制方法、または細胞培養培地を用いることにより、効率よくＥＳ細胞の分化を抑制することができ、さらに全能性を維持している未分化のままのＥＳ細胞を効率的に増殖させることができるという効果を奏する。従って、ＥＳ細胞を大量に得ることができ、例えば、再生医療等への基礎研究や応用研究に、ＥＳ細胞を容易に利用することができる。
【０１４２】
また、本発明の発現ベクター、形質転換体、またはタンパク質生産方法を利用することにより、容易に、かつ大量に、本発明に係るタンパク質を生産することができるという効果を奏する。
【０１４３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）はヒトフィブロネクチン（ヒトＦＮ）、（ｂ）はミニフィブロネクチン（ｍＦ）、（ｃ）はｍＦ−ＬＩＦの構造の模式図である。
【図２】ｍＦ発現ベクターであるｐＭＴＸ１の構造を模式的に示した図である。
【図３】精製ｍＦ、及びｍＦ−ＬＩＦのウェスタンブロット解析を示す図であり、（ａ）は還元条件で、（ｂ）は非還元条件で泳動し解析した結果を示す図である。
【図４】ｍＦ−ＬＩＦのＭＥＦヘのアッセンブリー活性を蛍光染色で解析した結果を示す図であり、（ａ）はｍＦ−ＬＩＦを抗ヒトＦＮモノクローナル抗体で検出した結果を、（ｂ）はＦＮを抗ＦＮポリクローナル抗体で検出した結果を示し、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）とを合成した図を示したものである。
【図５】ｍＦ−ＬＩＦのＥＳ細胞ヘのアッセンブリー活性を蛍光染色で解析した結果を示す図であり、（ａ）はｍＦ−ＬＩＦを抗ヒトＦＮモノクローナル抗体で検出した結果を、（ｂ）はＦＮを抗ＦＮポリクローナル抗体で検出した結果を示し、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）とを合成した図を示すものである。
【図６】（ａ）は、ｍＦ−ＬＩＦ、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ、ｒｍＬＩＦ及びｍＦ、それぞれの存在下、ＭＥＦ上で培養したＥＳ細胞中の未分化細胞の割合を、ＡＬＰ陽性コロニー数で比較した結果を示す図であり、（ｂ）は、同条件培養後、さらに固相化ｍＦ−ＬＩＦ、固相化ｒｍＬＩＦ、固相化ｍＦ、固相化ｒｍＬＩＦ及びｍＦ、それぞれの存在下で培養したＥＳ細胞中の未分化細胞の割合を、ＡＬＰ陽性コロニー数で比較した結果を示す図である。
【図７】（ａ）は、ｍＦ−ＬＩＦ、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ、ｒｍＬＩＦ及びｍＦ、それぞれの存在下、ゼラチンコート上で培養したＥＳ細胞中の未分化細胞の割合を、ＡＬＰ陽性コロニー数で比較した結果を示す図であり、（ｂ）は、ＡＬＰ活性測定値で比較した結果を示す図である。
【図８】（ａ）は、ｍＦ−ＬＩＦ、ｒｍＬＩＦ、ｍＦ、ｒｍＬＩＦ及びｍＦ、それぞれの存在下、ゼラチンコート上で培養後、さらに固相化ｍＦ−ＬＩＦ、固相化ｒｍＬＩＦ、固相化ｍＦ、固相化ｒｍＬＩＦ及びｍＦ、それぞれの存在下で培養したＥＳ細胞中の未分化細胞の割合を、ＡＬＰ陽性コロニー数で比較した結果を示す図であり、（ｂ）は、ＡＬＰ活性測定値で比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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