(57)【要約】【課題】本発明は哺乳動物ＥＳ細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。【解決手段】本発明は、パラミクソウイルスベクターとＥＳ細胞とを接触させる工程を含む、ＥＳ細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。また本発明は、外来遺伝子が導入されたＥＳ細胞の製造方法であって、パラミクソウイルスベクターとＥＳ細胞とを接触させる工程を含む方法を提供する。また本発明は、この方法により製造された、外来遺伝子が導入されたＥＳ細胞およびその分化および／または増殖細胞および組織を提供する。本発明により、ＥＳ細胞への安定かつ効率的な遺伝子送達が可能となる。ＥＳ細胞への遺伝子導入は、発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用である。また、ＥＳ細胞から所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子または試薬のアッセイおよびスクリーニングに有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと胚性幹細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胚性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
外来遺伝子が導入された胚性幹細胞の製造方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと胚性幹細胞とを接触させる工程を含む方法。
【請求項５】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
胚性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法により製造された、外来遺伝子が導入された胚性幹細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の胚性幹細胞を増殖および／または分化させた細胞。
【請求項９】
胚性幹細胞への遺伝子送達のために用いる、パラミクソウイルスベクター。
【請求項１０】
パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
胚性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、請求項９に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法に関する。また本発明は、外来遺伝子が導入された胚性幹細胞の製造方法に関する。また本発明は、胚性幹細胞への遺伝子導入に用いるウイルスベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞ともいう）とは、多分化能と自己複製能を有する未分化細胞である。また、ＥＳ細胞は損傷後の組織修復力を有することが示唆されている。このため、ＥＳ細胞は、各種疾患の治療用物質のスクリーニング、再生医療分野において有用であるとして、さかんに研究されている。特にサル由来のＥＳ細胞は、マウスのＥＳ細胞に比べてよりヒトに近縁であるため、ヒトの疾患のモデルに利用するにあたって好適であり、期待されている。
【０００３】
将来、ＥＳ細胞をさまざまな疾患治療および損傷治療に応用していくには、ＥＳ細胞の遺伝子操作がきわめて重要になる。ＥＳ細胞の増殖能または分化能などの細胞特性または薬剤感受性などを変更するためには、ＥＳ細胞への遺伝子導入が必要になることが多い。細胞への遺伝子導入のためには、レトロウイルスベクターがよく用いられている。しかし、遺伝子導入に従来広く用いられているモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するレトロウイルスベクターは、マウスＥＳ細胞への遺伝子導入効率は低い上（数％程度）、その遺伝子発現は時間経過とともに減弱する。最近、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）由来のレトロウイルスベクターを用いてマウスＥＳ細胞への遺伝子導入効率の改善が図られたが（５０％以上）、遺伝子発現が時間経過とともに減弱する問題は解決されていない（Ｃｈｅｒｒｙ，  Ｓ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０：７４１９，  ２０００）。最近、ゲノムに組み込まれるもう一つのベクターであるレンチウイルスベクターを用いると、マウスＥＳ細胞にさらに効率よく（８０％以上）遺伝子導入できることが示された（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１０７７８，  ２０００）。しかし、この報告では導入遺伝子発現の観察期間は数日から２週間程度と短く、導入遺伝子の長期発現についての記載はない。また、マウス以外のＥＳ細胞への効率的な遺伝子導入方法の開発も、未だ確立されていない。例えば、霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入はマウスＥＳ細胞への遺伝子導入に比べてさらに困難であると指摘されており、霊長類ＥＳ細胞への遺伝子導入効率は、たとえばＭｏＭＬＶベクターでは１％前後、ＭＳＣＶベクターでは、５〜１０％前後と言われている（ＩＭＳＵＴ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ  ２０００；  Ｋｅｙ  Ｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｉａ，  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｄｕｒａｎｇｏ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，  ＵＳＡ，  ２００１）。最近、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化したサル免疫不全ウイルスが、サルＥＳ細胞に対して効率的に遺伝子を導入できることが報告されている（ＷＯ０２／１０１０５７；  Ａｓａｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ，  Ｔｈｅｒ，  ６（２）：１６２−８，  ２００２）。しかし、ゲノムに組み込まれるタイプのウイルスベクターは、挿入の際にゲノム上の遺伝子の破壊または活性化、および相同組み換えによる複製能を持ったウイルスの生成の危険が伴う。また、一度組み込まれたウイルスゲノムを染色体から除去するのは困難である。
【０００４】
【特許文献１】
国際公開番号第ＷＯ０２／１０１０５７号
【非特許文献１】
Ｃｈｅｒｒｙ，  Ｓ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０：７４１９，  ２０００
【非特許文献２】
Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：１０７７８，  ２０００
【非特許文献３】
ＩＭＳＵＴ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ  ２０００；  Ｋｅｙ  Ｓｔｏｎｅ  Ｓｙｍｐｏｉａ，  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｄｕｒａｎｇｏ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，  ＵＳＡ，  ２００１
【非特許文献４】
Ａｓａｎｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ，  Ｔｈｅｒ，  ６（２）：１６２，  ２００２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、哺乳動物ＥＳ細胞に遺伝子を導入する方法を提供することを課題とする。また本発明は、外来遺伝子が導入された哺乳動物ＥＳ細胞の製造方法を提供することを課題とする。さらに本発明は、哺乳動物ＥＳ細胞への遺伝子導入のためのウイルスベクターを提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ＥＳ細胞へ長期間安定して外来遺伝子を発現させる方法を開発するため、本発明者らはサルＥＳ細胞に対して種々の条件でベクターの導入を行い、導入遺伝子の発現を測定した。その結果、パラミクソウイルスベクターが、ＥＳ細胞に対して非常に高い遺伝子導入効率を示すことを見いだした。驚くべきことに、導入された遺伝子の発現は３７０日以上継代した後でも持続していた。また、ベクターを導入することによって、ＥＳ細胞の未分化状態が有意に影響されることはなく、未分化のまま培養することが可能であった。さらに、ベクターを導入したＥＳ細胞は多分化能を保持しており、分化誘導により軟骨、上皮細胞、腺細胞、神経細胞、および造血細胞などへ分化することができた。パラミクソウイルスベクターは、ＥＳ細胞への遺伝子導入のためのベクターとして好適に用いられる。
【０００７】
ＥＳ細胞を指向した遺伝子治療は、様々な遺伝子疾患に対する治療の可能性を持っているが、これまでＥＳ細胞への安全で効率的な遺伝子導入方法が確立されていないことが大きな制約となっていた。パラミクソウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれない点で安全性が高く、パラミクソウイルスベクターで遺伝子を導入した場合に、ウイルス除去薬剤で細胞からウイルスベクターを除去することも可能である。実施例に示すように、パラミクソウイルスベクターは、非常に単純な手順で、ＥＳ細胞に外来遺伝子を発現させることができ、さらに導入した遺伝子は長期間安定に発現が持続し、分化した組織においても発現が検出された。本発明により、ＥＳ細胞への効率的な遺伝子送達が可能となり、様々な遺伝子疾患に対する治療法および治療薬開発への適用が期待される。
【０００８】
本発明は、ＥＳ細胞に遺伝子を導入する方法に関し、より具体的には、
（１）胚性幹細胞に遺伝子を導入する方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと胚性幹細胞とを接触させる工程を含む方法、
（２）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（１）に記載の方法、
（３）胚性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、（１）に記載の方法、
（４）外来遺伝子が導入された胚性幹細胞の製造方法であって、該遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターと胚性幹細胞とを接触させる工程を含む方法、
（５）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（４）に記載の方法、
（６）胚性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、（４）に記載の方法、
（７）（４）に記載の方法により製造された、外来遺伝子が導入された胚性幹細胞、
（８）（７）に記載の胚性幹細胞を増殖および／または分化させた細胞、
（９）胚性幹細胞への遺伝子送達のために用いる、パラミクソウイルスベクター、
（１０）パラミクソウイルスベクターがセンダイウイルスベクターである、（９）に記載のベクター、
（１１）胚性幹細胞が霊長類胚性幹細胞である、（９）に記載のベクター、に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、パラミクソウイルスベクターを用いるＥＳ細胞への遺伝子導入方法を提供する。この方法は、導入したい遺伝子を保持するパラミクソウイルスベクターを、哺乳動物ＥＳ細胞に接触させる工程を含む方法である。本発明者等は、パラミクソウイルスベクターが高い効率でＥＳ細胞へ遺伝子を導入できることを見出した。ＥＳ細胞は再生医学において様々な細胞および組織を作り出すために重要であり、本発明の方法はＥＳ細胞への所望の遺伝子の導入に好適に用いられ得る。遺伝子導入は培養液、生理食塩水、血液、体液など所望の生理的水溶液中で行うことができる。
【００１０】
単純な手順により高い効率で遺伝子導入が達成できることは、ＥＳ細胞への遺伝子送達の重要な優位性の１つである。例えばレトロウイルスおよびレンチウイルスを介した遺伝子送達は、最適な遺伝子送達のためには遠心で濃縮する必要があるが、遠心操作はしばしばウイルスの力価を低下させる。また、高い効率で感染させるには毒性のある薬剤であるポリブレンを必要とする場合がある（Ｂｕｎｎｅｌｌ，  Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ，  １９９５，  ９２：  ７７３９−７７４３；  Ｃｈｕｃｋ，  Ａ．Ｓ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １９９６，  ７：  ７４３−７５０；  Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ２０００，  ９６：  １３０９−１３１６；  Ｆｅｈｓｅ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，  １９９８，  １０２：  ５６６−５７４）。一方でパラミクソウイルスベクター溶液は特別な薬剤に助けられることなく、単に添加するだけでより優れた遺伝子送達を達成することができた。さらに、ＥＳ細胞へのセンダイウイルスベクター（ＳｅＶ）を介する最適な遺伝子送達は、非常に短い暴露で行うことができた。臨床場面を考えると、パラミクソウイルスベクターを介した遺伝子送達のこれらの特徴は、ＥＳ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝的改変を単純化し、操作に依存した細胞生存性の喪失および分化状態への影響を最小化し得るものである。
【００１１】
ＭＯＩ（ＥＳ細胞１つあたりの感染ウイルス数）は１〜５００のＥＳ細胞とベクターとを接触させることが好ましく、より好ましくは２〜３００、さらに好ましくは３〜２００、さらに好ましくは１０〜１００（例えば１０〜５０、または１０〜２０）である。ベクターとＥＳ細胞との接触は例えば１分〜２４時間、より特定すれば３分〜２時間、より特定すれば５分〜１時間である。さらに短い時間でも十分な感染効率を得ることが可能であり、例えば１〜４５分程度、より特定すれば５分〜３０分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよく、例えば数日間またはそれ以上接触させてもよい。例えば、ＭＯＩ  １０（１つのＥＳ細胞あたり１０  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ  （ＴＵ）  のベクター）で未分化ＥＳ細胞にパラミクソウイルスベクターを感染させた場合、ＥＳ細胞への遺伝子導入率は、例えば約２０％またはそれ以上、約２５％またはそれ以上、あるいは約３０％またはそれ以上である。また例えば、ＭＯＩ  ５０で未分化ＥＳ細胞にパラミクソウイルスベクターを感染させた場合、ＥＳ細胞への遺伝子導入率は、例えば約４０％またはそれ以上、約４５％またはそれ以上、あるいは約５０％またはそれ以上である。本発明の方法の特徴の１つは、ＥＳ細胞へ遺伝子を導入した後、長期間にわたって導入遺伝子の発現が持続することである。本発明の方法により、ベクターをＥＳ細胞に感染させてから１０日間以上、例えば２０日間以上、３０日以上、９０日以上、１８０日以上、２００日以上、２５０日以上、３００日以上、３５０日以上、さらに１年以上にわたって、遺伝子導入したＥＳ細胞の例えば３０％またはそれ以上、好ましくは４０％またはそれ以上、より好ましくは５０％またはそれ以上、より好ましくは６０％またはそれ以上、より好ましくは７０％またはそれ以上、より好ましくは８０％またはそれ以上、より好ましくは９０％またはそれ以上で導入遺伝子の発現を検出することができる。
【００１２】
ＥＳ細胞とは、多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を持つ樹立細胞株のことである。ＥＳ細胞の多分化能は、例えば免疫不全動物にその細胞を移植後、テラトーマが形成されることにより同定することができる。ＥＳ細胞をより具体的に特定すれば、胚盤胞腔中に注入した時に、その胚が発生した個体中の生殖細胞を含む細胞に分化できる細胞である。ＥＳ細胞は例えば線維芽細胞をフィーダー細胞として用い、ＬＩＦなどの添加により分化を抑制して無限に培養することができる。本発明において遺伝子導入の標的とするＥＳ細胞としてはその由来に制限はないが、げっ歯類および霊長類ＥＳ細胞が好適な対象である。
【００１３】
高等霊長類は、以下の２グループに大別される：
（１）新世界霊長類（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ）
マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）が広く知られ、実験用霊長類の一つとして用いられている。新世界霊長類の発生は、胚および胎盤の構造が旧世界霊長類のものと異なる面もあるが、基本的には類似する。
（２）旧世界霊長頼（０ｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ）
旧世界霊長類はヒトに極めて近縁な霊長類である。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）およびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）が知られている。ニホンザル（Ｍａｃａｃａ  ｆｕｓｃａｔａ）はカニクイザルと同じ属（マカカ属）である。旧世界霊長類の発生は、ヒトの発生に酷似する。
【００１４】
本発明に用いられる「サル」とは、霊長類、具体的には、新世界霊長類及び旧世界霊長類をいう。本発明のベクターによる遺伝子導入の対象となるサル由来のＥＳ細胞としては、例えばマーモセットＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ５５，  ２５４−２５９，  （１９９６））、アカゲザルＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９２，  ７８４４−７８４８，（１９９５））、カニクイザルＥＳ細胞などが挙げられる。旧世界霊長類は、ヒトに極めて近縁な霊長類であり、かつヒトの発生に類似しているので、ヒトに近い疾患モデルおよび種々の疾患治療剤のスクリーニング系として利用されることが期待される。したがって、本発明のベクターの導入対象としては、旧世界霊長類が特に望ましく、特にニホンザル、アカゲザル、カニクイザルなどのマカカ属のサル由来のＥＳ細胞が好ましい。
【００１５】
霊長類からのＥＳ細胞の調製は、公知の方法に記載の方法に従ってまたは準じて行うことができる。例えば、胚盤胞期胚を発生させ、ここからＥＳ細胞を得ることができる〔例えば、ＷＯ９６／２２３６２参照〕。具体的には、例えば胚盤胞期胚より得られる内部細胞塊をフィーダー細胞上または白血球増殖抑制因子［ＬＩＦ、分化阻害因子（ＤＩＦ）とも表記される］中で培養することによりＥＳ細胞を樹立することができる。また、ＷＯ０２／１０１０５７の記載に従ってサルＥＳ細胞を調製することもできる。
【００１６】
フィーダー細胞としては、妊娠１２日〜１６日目のマウス胎児の線維芽細胞の初代培養細胞、マウスの胎児線維芽細胞株であるＳＴＯ細胞などをマイトマイシンＣまたはＸ線処理して得られた細胞などが挙げられる。このようなマウス由来のフィーダー細胞は、大量に調製できる点で実験などに有利である。フィーダー細胞の作製は、例えば、後述の実施例に記載の方法などにより行なうことができる。フィーダー細胞は、例えばＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）を用いて、ゼラチンコートした培養容器に播種する。フィーダー細胞は、培養容器を隙間無く覆う程度まで播種すればよい。内部細胞塊は、フィーダー細胞が播種された培養容器中のＭＥＭ培地をＥＳ細胞培養用の培地（ＷＯ０２／１０１０５７）に交換したフィーダー細胞上に播種する。
【００１７】
本発明においてパラミクソウイルスベクターとは、パラミクソウイルスをベースとする感染力を持つウイルス粒子であって、遺伝子を細胞に導入するための担体である。ここで「感染力」とは、パラミクソウイルスベクターが細胞への接着能を保持しており、接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入することのできる能力のことを言う。好ましい態様では、本発明のパラミクソウイルスベクターは、ベクターのゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子が発現できるように組み込まれている。本発明のパラミクソウイルスベクターは、複製能を有していてもよく、複製能を有さない欠損型ベクターであってもよい。「複製能を有する」とは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。
【００１８】
組み換えウイルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウイルス、またはそのウイルスの増幅産物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、その両端が自然の状態と同じようには配置されていないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変（切断および／または結合）されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。組み換えウイルスは、遺伝子操作により構築されたウイルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウイルスを再構築することによって生成することができる。例えば、組換えパラミクソウイルスは、ｃＤＮＡから再構成して生成することができる（Ｙ．  Ｎａｇａｉ，  Ａ．  Ｋａｔｏ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ４３，  ６１３−６２４  （１９９９））。
【００１９】
本発明において遺伝子とは遺伝物質を指し、転写単位をコードする核酸を言う。遺伝子はＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。本発明において蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質をコードしていなくてもよく、例えば遺伝子はリボザイムまたはアンチセンスＲＮＡなどの機能的ＲＮＡをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設計された配列であり得る。また、本発明において「ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードするＯＲＦをセンスまたはアンチセンスに含むことを言う。
【００２０】
本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルスは、非分節型ネガティブ鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスのグループの１つで、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）ウイルスを含む。本発明を適用可能なパラミクソウイルスとしては、具体的にはセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，  ２，  ３型等が挙げられる。本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に属するウイルスまたはその誘導体である。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ−１）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ−３）、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ；  マウスパラインフルエンザウイルス１型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルエンザウイルス１０型（ＳＰＩＶ−１０）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。これらのウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
【００２１】
パラミクソウイルスベクターはゲノムＲＮＡに搭載遺伝子をアンチセンスにコードしている。ゲノムＲＮＡとは、パラミクソウイルスのウイルス蛋白質と共にＲＮＰを形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、このＲＮＡが複製されて娘ＲＮＰが形成される機能を持つＲＮＡである。一般にパラミクソウイルスのゲノムは、３’リーダー領域と５’トレイラー領域の間に、ウイルス遺伝子がアンチセンスとして並んだ構成をしている。各遺伝子のＯＲＦの間には、転写終結配列（Ｅ配列）  −  介在配列（Ｉ配列）  −  転写開始配列（Ｓ配列）  が存在し、これにより各遺伝子のＯＲＦをコードするＲＮＡが別々のシストロンとして転写される。
【００２２】
パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が含まれる。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウイルス属      ＮＰ    Ｐ／Ｃ／Ｖ    Ｍ    Ｆ    ＨＮ    −      Ｌ
ルブラウイルス属        ＮＰ    Ｐ／Ｖ      Ｍ    Ｆ    ＨＮ    （ＳＨ）    Ｌ
モービリウイルス属      ＮＰ    Ｐ／Ｃ／Ｖ    Ｍ    Ｆ    Ｈ      −      Ｌ
【００２３】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子については  Ｍ２９３４３、Ｍ３０２０２，  Ｍ３０２０３，  Ｍ３０２０４，  Ｍ５１３３１，  Ｍ５５５６５，  Ｍ６９０４６，  Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子については  Ｍ３０２０２，  Ｍ３０２０３，  Ｍ３０２０４，  Ｍ５５５６５，  Ｍ６９０４６，  Ｘ００５８３，  Ｘ１７００７，  Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子については  Ｄ１１４４６，  Ｋ０２７４２，  Ｍ３０２０２，  Ｍ３０２０３，  Ｍ３０２０４，  Ｍ６９０４６，  Ｕ３１９５６，  Ｘ００５８４，  Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子については  Ｄ００１５２，  Ｄ１１４４６，  Ｄ１７３３４，  Ｄ１７３３５，  Ｍ３０２０２，  Ｍ３０２０３，  Ｍ３０２０４，  Ｍ６９０４６，  Ｘ００１５２，  Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子については  Ｄ２６４７５，  Ｍ１２３９７，  Ｍ３０２０２，  Ｍ３０２０３，  Ｍ３０２０４，  Ｍ６９０４６，  Ｘ００５８６，  Ｘ０２８０８，  Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子については  Ｄ０００５３，  Ｍ３０２０２，  Ｍ３０２０３，  Ｍ３０２０４，  Ｍ６９０４０，  Ｘ００５８７，  Ｘ５８８８６を参照のこと。
【００２４】
これらのウイルス蛋白質をコードするＯＲＦおよび外来遺伝子のＯＲＦは、ゲノムＲＮＡにおいて上記のＥ−Ｉ−Ｓ配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノムＲＮＡにおいて最も３’に近いＯＲＦは、３’リーダー領域と該ＯＲＦとの間にＳ配列のみが必要であり、ＥおよびＩ配列は必要ない。またゲノムＲＮＡにおいて最も５’に近いＯＲＦは、５’トレイラー領域と該ＯＲＦとの間にＥ配列のみが必要であり、ＩおよびＳ配列は必要ない。また２つのＯＲＦは、例えばＩＲＥＳ等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能である。このような場合は、これら２つのＯＲＦの間にはＥ−Ｉ−Ｓ配列は必要ない。野生型のパラミクソウイルスの場合、典型的なＲＮＡゲノムは、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をアンチセンスにコードする６つのＯＲＦが順に並んでおり、それに続いて５’トレイラー領域を他端に有する。本発明のゲノムＲＮＡにおいては、ウイルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生型ウイルスと同様に、３’リーダー領域に続き、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ蛋白質をコードするＯＲＦが順に並び、それに続いて５’トレイラー領域が配置されることが好ましい。ある種のパラミクソウイルスにおいては、ウイルス遺伝子が異なっているが、そのような場合でも上記と同様に各ウイルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般に  Ｎ、Ｐ、およびＬ遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的にＲＮＡゲノム上の遺伝子が発現し、ゲノムＲＮＡが複製される。さらにＦおよびＨＮ遺伝子等のエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子、およびＭ遺伝子の働きにより、感染性のウイルス粒子が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは複製能を有するウイルスベクターとなる。ＥＳ細胞に導入したい外来遺伝子は、後述するように、このゲノム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。
【００２５】
また、本発明のパラミクソウイルスベクターは、野生型パラミクソウイルスが持つ遺伝子のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、Ｍ、Ｆ、またはＨＮ遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないパラミクソウイルスベクターも、本発明のパラミクソウイルスベクターとして好適に用いることができる。このようなウイルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたウイルスベクターは、野生型ウイルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが、細胞に導入されたベクターゲノムはウイルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同じような感染力を持つ娘ウイルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子導入力を持つ安全なウイルスベクターとして有用である。ゲノムから欠損させる遺伝子としては、例えばＦ遺伝子および／またはＨＮ遺伝子が挙げられる。例えば、Ｆ遺伝子が欠損した組み換えパラミクソウイルスベクターゲノムを発現するプラスミドを、Ｆ蛋白質の発現ベクターならびにＮＰ、Ｐ、およびＬ蛋白質の発現ベクターと共に宿主細胞にトランスフェクションすることにより、ウイルスベクターの再構成を行うことができる（ＷＯ００／７００５５  および  ＷＯ００／７００７０；  Ｌｉ，  Ｈ．−Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（１４）  ６５６４−６５６９  （２０００））。また、例えば、Ｆ遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用いてウイルスを製造することもできる。これらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウイルス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等かそれ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。ゲノムには、ウイルスＲＮＡの複製に必要な遺伝子群（Ｎ，  Ｐ，  およびＬ）が含まれているため、細胞内においてゲノムＲＮＡは増幅され、細胞が分裂しても娘細胞にウイルスＲＮＡが伝達される。これによりＥＳ細胞での持続的な発現が可能となる。
【００２６】
また、本発明のウイルスベクターとして、ベクターゲノムが由来するウイルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを作製することもできる。例えば、ウイルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウイルスのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はない。例えば、他のウイルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；  ＶＳＶ）のＧ蛋白質（ＶＳＶ−Ｇ）を挙げることができる。ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は、任意のＶＳＶ株に由来するものであってよい。例えば  Ｉｎｄｉａｎａ血清型株（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：  ５１９−５２８  （１９８１））由来のＶＳＶ−Ｇ蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また本発明のベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）４０７０Ａ株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、ＭｕＭＬＶ  １０Ａ１由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばｐＣＬ−１０Ａ１（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，  Ｒ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：  ５７０１−５７０５  （１９９６））。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇｐ８５蛋白質、ＥＢウイルスのｇｐ３５０、ｇｐ２２０蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ蛋白質などが挙げられる。このように本発明のウイルスベクターには、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質などのように、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープ蛋白質を含むシュードタイプウイルスベクターが含まれる。ウイルスのゲノムＲＮＡにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように設計すれば、ウイルス粒子が細胞に感染した後は、ウイルスベクターからこの蛋白質が発現されることはない。
【００２７】
また、本発明のウイルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体またはその断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウイルスエンベロープ由来のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。これにより、ベクターのＥＳ細胞への特異性を制御し得る。これらはウイルスゲノムにコードされていてもよいし、ウイルスベクターの再構成時に、ウイルスゲノム以外の遺伝子（例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供給されてもよい。
【００２８】
また本発明のベクターは、例えばウイルス蛋白質による免疫原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意のウイルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えばパラミクソウイルスベクターにおいては、複製因子であるＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、Ｆ蛋白質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質および／またはＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウイルスベクターを作製することもできる。
【００２９】
また本発明のベクターにおいては、アクセサリー遺伝子が欠損したものであってよい。例えばＳｅＶのアクセサリー遺伝子の１つであるＶ遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対するＳｅＶの病原性が顕著に減少する（Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：７２６６−７２７２；  Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：５７８−５８７；  Ｃｕｒｒａｎ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＷＯ０１／０４２７２，  ＥＰ１０６７１７９）。このような弱毒化ベクターは、毒性のない遺伝子導入用ウイルスベクターとして特に有用である。
【００３０】
パラミクソウイルスは遺伝子導入ベクターとして優れており、宿主細胞の細胞質でのみ転写・複製を行い、ＤＮＡフェーズを持たないため染色体への組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）は起こらない（Ｌａｍｂ，  Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ，  Ｄ．，  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，  Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ，  （ｅｄｓ）．  Ｆｉｅｌｄｓ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．  ２．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  −  Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  １９９６，  ｐｐ．  １１７７−１２０４）。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じない。パラミクソウイルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウイルス（ＳｅＶ）を連続多代継代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高く、挿入異種遺伝子を長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Ｙｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２，  ４５７−４６６  （１９９７））。また、カプシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイズまたはパッケージングの柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）など性質上のメリットがある。このように、パラミクソウイルスベクターは、ヒトの遺伝子治療のための高効率ベクターの新しいクラスとなることが示唆される。複製能を有するＳｅＶベクターは、外来遺伝子を少なくとも４ｋｂまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって２種類以上の遺伝子を同時に発現する事も可能である。
【００３１】
またセンダイウイルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られているが、人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウイルスの経鼻的投与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告によっても支持されている（Ｈｕｒｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：  ５３３−５４０，  １９９７）。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターが、ヒトの治療へ応用できることを示唆し、センダイウイルスベクターが、ヒトを含む霊長類ＥＳ細胞を標的とした遺伝子治療の有望な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。
【００３２】
本発明のウイルスベクターは、ゲノムＲＮＡ中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含む組換えパラミクソウイルスベクターは、上記のパラミクソウイルスベクターゲノムに外来遺伝子を挿入することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とするＥＳ細胞において発現させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコードする遺伝子であってもよく、あるいは欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。外来遺伝子の挿入位置は、例えばウイルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えばゲノムＲＮＡの３’リーダー領域と３’端に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間、各ウイルス蛋白質ＯＲＦの間、および／または５’端に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦと５’トレイラー領域の間に挿入することができる。また、ＦまたはＨＮ遺伝子などを欠失するゲノムでは、その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。パラミクソウイルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長が６の倍数となるように挿入することが望ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６７，  Ｎｏ．  ８，  ４８２２−４８３０，  １９９３）。挿入した外来遺伝子とウイルスＯＲＦとの間には、Ｅ−Ｉ−Ｓ配列が構成されるようにする。Ｅ−Ｉ−Ｓ配列を介して２またはそれ以上の遺伝子をタンデムに並べて挿入することができる。
【００３３】
ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流（ネガティブ鎖の３’側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（ＷＯ０１／１８２２３）。また、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することができ、ネガティブ鎖の３’の近くに挿入するほど発現レベルが高く、５’の近くに挿入するほど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の発現量を得るために、また前後のウイルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせが最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得られることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結し、ネガティブ鎖ゲノムの３’端近くに挿入することが好ましい。具体的には、３’リーダー領域と３’に最も近いウイルス蛋白質ＯＲＦとの間に挿入される。あるいは、３’に一番近いウイルス遺伝子と２番目の遺伝子のＯＲＦの間に挿入してもよい。野生型パラミクソウイルスにおいては、ゲノムの３’に最も近いウイルス蛋白質遺伝子はＮ遺伝子であり、２番目の遺伝子はＰ遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましくない場合は、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなるべく５’側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウイルスベクターからの発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能である。
【００３４】
本発明のベクターを製造するには、哺乳動物細胞においてパラミクソウイルスの成分であるＲＮＰの再構成に必要なウイルス蛋白質、すなわちＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下、パラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを転写させる。転写によりネガティブ鎖ゲノム（すなわちウイルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよく、あるいはポジティブ鎖（ウイルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウイルスＲＮＰを再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ鎖を生成させる。ＲＮＡ末端は、天然のウイルスゲノムと同様に３’リーダー配列と５’トレイラー配列の末端をなるべく正確に反映させることが好ましい。転写産物の５’端を正確に制御するためには、例えば転写開始部位としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を利用し、該ＲＮＡポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の３’端を制御するには、例えば転写産物の３’端に自己切断型リボザイムをコードさせておき、このリボザイムにより正確に３’端が切り出されるようにすることができる（Ｈａｓａｎ，  Ｍ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：  ２８１３−２８２０，  １９９７、Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：  ５７８−５８７  及び  Ｙｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：  ４５７−４６６）。
【００３５】
例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウイルスベクターは、Ｈａｓａｎ，  Ｍ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：  ２８１３−２８２０，  １９９７、Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：  ５７８−５８７  及び  Ｙｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：  ４５７−４６６の記載等に準じて、次のようにして構築することができる。
まず、目的の外来遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ試料を用意する。ＤＮＡ試料は、２５ｎｇ／μｌ以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが好ましい。以下、ＮｏｔＩ部位を利用してウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡに外来遺伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とするｃＤＮＡ塩基配列の中にＮｏｔＩ認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするアミノ酸配列を変化させないように塩基配列を改変し、ＮｏｔＩ部位を予め除去しておくことが好ましい。この試料から目的の遺伝子断片をＰＣＲにより増幅し回収する。２つのプライマーの５’部分にＮｏｔＩ部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端をＮｏｔＩ部位とする。ウイルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子のＯＲＦとその両側のウイルス遺伝子のＯＲＦとの間にＥ−Ｉ−Ｓ配列が配置されるように、プライマー中にＥ−Ｉ−Ｓ配列を含めるように設計する。
【００３６】
例えば、フォワード側合成ＤＮＡ配列は、ＮｏｔＩによる切断を保証するために  ５’側に任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側にスペーサー配列として任意の９塩基または９に６の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡの開始コドンＡＴＧからこれを含めてＯＲＦの約２５塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基はＧまたはＣとなるように該所望のｃＤＮＡから約２５塩基を選択してフォワード側合成オリゴＤＮＡの３’の末端とすることが好ましい。
【００３７】
リバース側合成ＤＮＡ配列は５’側から任意の２以上のヌクレオチド（好ましくはＧＣＧおよびＧＣＣなどのＮｏｔＩ認識部位由来の配列が含まれない４塩基、更に好ましくはＡＣＴＴ）を選択し、その３’側にＮｏｔＩ認識部位ｇｃｇｇｃｃｇｃを付加し、さらにその３’側に長さを調節するための挿入断片のオリゴＤＮＡを付加する。このオリゴＤＮＡの長さは、最終的なＰＣＲ増幅産物のＮｏｔＩ断片の鎖長が６の倍数になるように塩基数を設計する（いわゆる「６のルール（ｒｕｌｅ  ｏｆ  ｓｉｘ）」；  Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８９１−８９９，  １９９８；  Ｃａｌａｉｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  Ｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４８２２−４８３０，  １９９３；  Ｃａｌａｉｎ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｒｏｕｘ，  Ｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：  ４８２２−４８３０，  １９９３）。このプライマーにＥ−Ｉ−Ｓ配列を付加する場合には、挿入断片のオリゴＤＮＡの３’側にセンダイウイルスのＳ配列、Ｉ配列、およびＥ配列の相補鎖配列、好ましくはそれぞれ  ５’−ＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴ−３’（配列番号：１）、５’−ＡＡＧ−３’、および  ５’−ＴＴＴＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＧＧ−３’（配列番号：２）を付加し、さらにその３’側に所望のｃＤＮＡ配列の終始コドンから逆に数えて約２５塩基相当の相補鎖の最後の塩基がＧまたはＣになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成ＤＮＡの３’の末端とする。
【００３８】
ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼまたはその他のＤＮＡポリメラーゼを用いる通常の方法を用いることができる。増幅した目的断片はＮｏｔＩで消化した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等のプラスミドベクターのＮｏｔＩ部位に挿入する。得られたＰＣＲ産物の塩基配列をシークエンサーで確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片をＮｏｔＩで切り出し、ゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドのＮｏｔＩ部位にクローニングする。またプラスミドベクターを介さずにゲノムｃＤＮＡのＮｏｔＩ部位に直接挿入し、組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることも可能である。
【００３９】
例えば、組み換えセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡであれば、文献記載の方法に準じて構築することができる（Ｙｕ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ２：  ４５７−４６６，  １９９７；  Ｈａｓａｎ，  Ｍ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：  ２８１３−２８２０，  １９９７）。例えば、ＮｏｔＩ制限部位を有する１８ｂｐのスペーサー配列（５’−（Ｇ）−ＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧ−３’）（配列番号：３）を、クローニングされたセンダイウイルスゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ（＋））のリーダー配列とＮ蛋白質のＯＲＦとの間に挿入し、デルタ肝炎ウイルスのアンチゲノム鎖（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒａｎｄ）由来の自己開裂リボザイム部位を含むプラスミドｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）を得る（Ｈａｓａｎ，  Ｍ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：  ２８１３−２８２０）。ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）のＮｏｔＩ部位に外来遺伝子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウイルスｃＤＮＡを得ることができる。
【００４０】
このようにして作製した組み換えパラミクソウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、上記のウイルス蛋白質（Ｌ、Ｐ、およびＮ）存在下で細胞内で転写させることにより、本発明のベクターを再構成することができる。本発明は、本発明のベクターの製造のための、本発明のベクターのウイルスゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。また本発明は、本発明のベクターの製造に適用するための、該ベクターのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの使用に関する。組み換えウイルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（ＷＯ９７／１６５３９；  ＷＯ９７／１６５３８；  Ｄｕｒｂｉｎ，  Ａ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：  ３２３−３３２；  Ｗｈｅｌａｎ，  Ｓ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ８３８８−８３９２；  Ｓｃｈｎｅｌｌ．  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：  ４１９５−４２０３；  Ｒａｄｅｃｋｅ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：  ５７７３−５７８４；  Ｌａｗｓｏｎ，  Ｎ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：  ４４７７−４４８１；  Ｇａｒｃｉｎ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：  ６０８７−６０９４；  Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：  ５６９−５７９；  Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｔ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：  １２６５−１２７１；  Ｂｒｉｄｇｅｎ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｒ．  Ｍ．，  １９９６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：  １５４００−１５４０４）。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、リンダーペストウイルス、センダイウイルスなどを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスをＤＮＡから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構成させることができる。ウイルスベクターＤＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、および／またはＭ遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウイルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および／または他のウイルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、感染性のウイルス粒子を形成させることが可能である。
【００４１】
具体的な手順は、（ａ）パラミクソウイルスゲノムＲＮＡ（ネガティブ鎖ＲＮＡ）またはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したパラミクソウイルスを含む培養上清を回収する工程、により製造することができる。転写のために、ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノムＲＮＡは  Ｎ、Ｌ、およびＰ蛋白質の存在下で複製されＲＮＰ複合体を形成する。そして  Ｍ、ＨＮ、およびＦ蛋白質の存在下でエンベロープに包まれたウイルス粒子が形成される。ゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えばＴ７プロモーターの下流に連結させ、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼによりＲＮＡに転写させる。プロモーターとしては、Ｔ７ポリメラーゼの認識配列を含むもの以外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させたＲＮＡを細胞にトランスフェクトしてもよい。
【００４２】
ＤＮＡからのゲノムＲＮＡの最初の転写に必要なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、これを発現するプラスミドまたはウイルスベクターの導入によって供給することができるし、または、例えば細胞の染色体にＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、発現を誘導できるように組み込んでおき、ウイルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもできる。またゲノムＲＮＡ、およびベクター再構成に必要なウイルス蛋白質は、例えばこれらを発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウイルス蛋白質の供給において、野生型またはある種の変異パラミクソウイルスなどのヘルパーウイルスを用いることもできるが、これらのウイルスの混入を招くため好ましくない。
【００４３】
ゲノムＲＮＡを発現するＤＮＡを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、▲１▼目的の細胞が取り込めるようなＤＮＡ沈殿物を作る方法、▲２▼目的の細胞による取りこみに適し、かつ細胞毒性の少ない陽電荷特性を持つＤＮＡを含む複合体を作る方法、▲３▼目的の細胞膜に、ＤＮＡ分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルスによって瞬間的に開ける方法などがある。
【００４４】
▲２▼としては、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。▲１▼としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフェクション法が挙げられ、この方法によって細胞内に入ったＤＮＡは貧食小胞に取り込まれるが、核内にも十分な量のＤＮＡが入ることが知られている（Ｇｒａｈａｍ，  Ｆ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｊ．，  １９７３，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：  ４５６；  Ｗｉｇｌｅｒ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｓ．，  １９７７，  Ｃｅｌｌ  １１：  ２２３）。ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａはトランスファー技術の最適化を検討し、１）  細胞と共沈殿物のインキュベーション条件を  ２〜４％  ＣＯ２  、３５℃、１５〜２４時間、２）  ＤＮＡは直鎖状より環状のものが活性が高く、３）  沈殿混液中のＤＮＡ濃度が  ２０〜３０μｇ／ｍｌのとき最適な沈殿が得られると報告している（Ｃｈｅｎ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｈ．，  １９８７，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：  ２７４５）。▲２▼の方法は、一過的なトランスフェクションに適している。古くはＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｄ−９８８５  Ｍ．Ｗ．  ５×１０５  ）混液を所望のＤＮＡ濃度比で調製し、トランスフェクションを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドソームの中で分解されてしまうため、効果を高めるためにクロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，  Ｍ．  Ｐ．，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ３０１５）。▲３▼の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、細胞選択性がないという点で▲１▼または▲２▼の方法に比べて汎用性が高い。効率はパルス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファーの導電率、ＤＮＡ濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
【００４５】
以上、３つのカテゴリーの中で▲２▼の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数の検体を検討することができるので、ベクター再構成のためのＤＮＡの細胞への導入には、トランスフェクション試薬が適している。好適には  Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ３０１３０５）、または  ＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｃａｔ  Ｎｏ．  １８１１１６９）が用いられるが、これらに制限されない。
【００４６】
ｃＤＮＡからのウイルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができる。
２４穴から６穴程度のプラスチックプレートまたは１００ｍｍペトリ皿等で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および抗生物質（１００  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）を用いてサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２をほぼ１００％コンフルエントになるまで培養し、例えば  １μｇ／ｍｌ  ｐｓｏｒａｌｅｎ（ソラレン）存在下、紫外線  （ＵＶ）  照射処理を２０分処理で不活化した、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（Ｆｕｅｒｓｔ，  Ｔ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：  ８１２２−８１２６，１９８６、Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：  ５６９−５７９，  １９９６）を２  ＰＦＵ／細胞で感染させる。ソラレンの添加量およびＵＶ照射時間は適宜調整することができる。感染１時間後、２〜６０μｇ、より好ましくは３〜２０μｇの組換えセンダイウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを、ウイルスＲＮＰの生成に必須なトランスに作用するウイルス蛋白質を発現するプラスミド（０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．２５〜１２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および０．５〜２４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ）（Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：  ５６９−５７９，  １９９６）と共にＳｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法等によりトランスフェクションする。Ｎ、Ｐ、およびＬをコードする発現ベクターの量比は例えば  ２：１：２  とすることが好ましく、プラスミド量は、例えば１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｎ、０．５〜２μｇのｐＧＥＭ−Ｐ、および１〜４μｇのｐＧＥＭ−Ｌ程度で適宜調整する。
【００４７】
トランスフェクションを行った細胞は、所望により１００μｇ／ｍｌのリファンピシン（Ｓｉｇｍａ）及びシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）、より好ましくは４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（ＡｒａＣ）（Ｓｉｇｍａ）のみを含む血清不含のＭＥＭで培養し、ワクシニアウイルスによる細胞毒性を最少にとどめ、ウイルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度を設定する（Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：  ５６９−５７９）。トランスフェクションから４８〜７２時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞を破砕した後、ＲＮＰを含む破砕物をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に再度トランスフェクションして培養する。または、培養上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の培養液に添加して感染させ培養する。トランスフェクションは、例えばリポフェクトアミンまたはポリカチオニックリポソームなどと共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトランスフェクション試薬が利用できる。例えば、ＤＯＴＭＡ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＃３０１３０５）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥ、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８１１１６９）などが挙げられる。エンドソーム中での分解を防ぐため、クロロキンを加えることもできる（Ｃａｌｏｓ，  Ｍ．  Ｐ．，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ３０１５）。ＲＮＰが導入された細胞では、ＲＮＰからのウイルス遺伝子の発現およびＲＮＰの複製の過程が進行しベクターが増幅する。得られたウイルス溶液を希釈（例えば１０６  倍）して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３は完全に除去することができる。再増幅は、例えば３回以上繰り返す。得られたベクターは−８０℃で保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺伝子を欠損した複製能を持たないウイルスベクターを再構成させるには、エンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞をトランスフェクションに使用するか、またはエンベロープ発現プラスミドを共にトランスフェクションすればよい。また、トランスフェクションを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現するＬＬＣ−ＭＫ２細胞を重層して培養することによって欠損型ウイルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号  ＷＯ００／７００５５  および  ＷＯ００／７００７０参照）。
【００４８】
回収されたウイルスの力価は、例えばＣＩＵ（Ｃｅｌｌ−Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｕｎｉｔ）測定または赤血球凝集活性（ＨＡ）の測定することにより決定することができる（ＷＯ００／７００７０；  Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：  ５６９−５７９；  Ｙｏｎｅｍｉｔｓｕ，  Ｙ．  ＆  Ｋａｎｅｄａ，  Ｙ．，  Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｄ．  ｂｙ  Ｂａｋｅｒ  ＡＨ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：  ｐｐ．  ２９５−３０６，  １９９９）。また、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えばＧＦＰ−ＣＩＵとして）。このようにして測定した力価は、ＣＩＵと同等に扱うことができる（ＷＯ００／７００７０）。
【００４９】
ウイルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない。例えば、センダイウイルスベクター等の再構成においては、サル腎由来のＬＬＣＭＫ２細胞およびＣＶ−１細胞、ハムスター腎由来のＢＨＫ細胞などの培養細胞、ヒト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現させることで、そのエンベロープを有する感染性ウイルス粒子を得ることもできる。また、大量にセンダイウイルスベクターを得るために、上記の宿主から得られたウイルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を使ったウイルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編，（１９９３），「神経科学研究の先端技術プロトコールＩＩＩ，  分子神経細胞生理学」，厚生社，  大阪，  ｐｐ．１５３−１７２）。具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ９〜１２日間  ３７〜３８℃で培養し、胚を成長させる。ウイルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば３日間）卵を培養してウイルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み換えセンダイウイルスにより変わり得る。その後、ウイルスを含んだ尿液を回収する。尿液からのセンダイウイルスベクターの分離・精製は常法に従って行うことができる（田代眞人，「ウイルス実験プロトコール」，  永井、石浜監修，  メジカルビュー社，  ｐｐ．６８−７３，（１９９５））。
【００５０】
例えば、Ｆ遺伝子を欠失したセンダイウイルスベクターの構築と調製は、以下のように行うことができる（ＷＯ００／７００５５  および  ＷＯ００／７００７０参照）。
＜１＞  Ｆ欠失型センダイウイルスゲノムｃＤＮＡおよびＦ発現プラスミドの構築
センダイウイルス（ＳｅＶ）全長ゲノムｃＤＮＡ、ｐＳｅＶ１８＋  ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，  Ｍ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：  ２８１３−２８２０）（「ｐＳｅＶ１８＋  ｂ（＋）」は「ｐＳｅＶ１８＋」ともいう）のｃＤＮＡをＳｐｈＩ／ＫｐｎＩで消化してフラグメント（１４６７３ｂｐ）を回収し、ｐＵＣ１８にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１８／ＫＳとする。Ｆ欠損部位の構築はこのｐＵＣ１８／ＫＳ上で行う。Ｆ遺伝子の欠損は、ＰＣＲ−ライゲーション方法の組み合わせで行い、結果としてＦ遺伝子のＯＲＦ（ＡＴＧ−ＴＧＡ＝１６９８ｂｐ）を除いて例えばａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ（配列番号：４）で連結し、Ｆ欠失型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡ（ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ）を構築する。ＰＣＲは、Ｆの上流には［ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ｇｔｔｇａｇｔａｃｔｇｃａａｇａｇｃ／配列番号：５，  ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ｔｔｔｇｃｃｇｇｃａｔｇｃａｔｇｔｔｔｃｃｃａａｇｇｇｇａｇａｇｔｔｔｔｇｃａａｃｃ／配列番号：６］、Ｆ遺伝子の下流には［ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ａｔｇｃａｔｇｃｃｇｇｃａｇａｔｇａ／配列番号：７，  ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ｔｇｇｇｔｇａａｔｇａｇａｇａａｔｃａｇｃ／配列番号：８］のプライマー対を用いたＰＣＲの産物をＥｃｏＴ２２Ｉで連結する。このように得られたプラスミドをＳａｃＩとＳａｌＩで消化して、Ｆ欠損部位を含む領域の断片（４９３１ｂｐ）を回収してｐＵＣ１８にクローニングし、ｐＵＣ１８／ｄＦＳＳとする。このｐＵＣ１８／ｄＦＳＳをＤｒａＩＩＩで消化して、断片を回収してｐＳｅＶ１８＋のＦ遺伝子を含む領域のＤｒａＩＩＩ断片と置き換え、ライゲーションしてプラスミドｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ  を得る。
外来遺伝子は、例えばｐＵＣ１８／ｄＦＳＳのＦ欠失部位にある制限酵素  ＮｓｉＩ  および  ＮｇｏＭＩＶ  部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、ＮｓｉＩ−ｔａｉｌｅｄプライマーおよびＮｇｏＭＩＶ−ｔａｉｌｅｄプライマーで増幅すればよい。
【００５１】
＜２＞  ＳｅＶ−Ｆ蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウイルスのＦ遺伝子（ＳｅＶ−Ｆ）を発現するＣｒｅ／ｌｏｘＰ誘導型発現プラスミドの構築はＳｅＶ−Ｆ遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼにより遺伝子産物が誘導発現されるように設計されたプラスミドｐＣＡＬＮｄｌｗ（Ａｒａｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２，  １９９８，  ｐ１１１５−１１２１）のユニークサイト  ＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを構築する。
Ｆ欠損ゲノムから感染ウイルス粒子を回収するため、ＳｅＶ−Ｆ蛋白を発現するヘルパー細胞株を樹立する。細胞は、例えばＳｅＶの増殖によく用いられているサル腎臓由来細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いることができる。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、１０％の熱処理した不動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリンＧナトリウム  ５０単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン  ５０μｇ／ｍｌを添加したＭＥＭで３７℃、５％  ＣＯ２で培養する。ＳｅＶ−Ｆ遺伝子産物は細胞傷害性を有するため、Ｃｒｅ  ＤＮＡリコンビナーゼによりＦ遺伝子産物を誘導発現されるように設計された上記プラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを、リン酸カルシウム法（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により、周知のプロトコールに従ってＬＬＣ−ＭＫ２細胞に遺伝子導入を行う。
１０ｃｍプレートを用い、４０％コンフルエントまで生育したＬＬＣ−ＭＫ２細胞に１０μｇのプラスミドｐＣＡＬＮｄＬｗ／Ｆを導入後、１０ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、３７℃の５％ＣＯ２  インキュベーター中で２４時間培養する。２４時間後に細胞をはがし、１０ｍｌ培地に懸濁後、１０ｃｍシャーレ５枚を用い、５ｍｌ  １枚、２ｍｌ  ２枚、０．２ｍｌ  ２枚に蒔き、Ｇ４１８  （ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を１２００μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて培養を行い、２日毎に培地交換しながら、１４日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行う。該培地により生育してきたＧ４１８に耐性を示す細胞はクローニングリングを用いて回収する。回収した各クローンは１０ｃｍプレートでコンフルエントになるまで拡大培養を続ける。
Ｆ蛋白質の発現誘導は、細胞を６ｃｍシャーレにてコンフルエントまで生育させた後、アデノウイルスＡｘＣＡＮＣｒｅを斉藤らの方法（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：  ３８１６−３８２１  （１９９５）；  Ａｒａｉ，  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ  ７２，１１１５−１１２１  （１９９８））により例えば  ｍｏｉ＝３  で感染させて行う。
【００５２】
＜３＞  Ｆ欠失ＳｅＶウイルスの再構築及び増幅
上記  ｐＳｅＶ１８＋／ΔＦ  の外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクションする。ＬＬＣ−ＭＫ２  細胞を５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ  で１００ｍｍのシャーレに播く。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによりゲノムＲＮＡの転写を行わせる場合には、細胞培養２４時間後、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）と長波長紫外線（３６５ｎｍ）で  ２０  分間処理したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウイルス（ＰＬＷＵＶ−ＶａｃＴ７：Ｆｕｅｒｓｔ，  Ｔ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３，  ８１２２−８１２６  （１９８６））をＭＯＩ  ２程度で室温で１時間感染させる。ワクシニアウイルスへの紫外線照射には、例えば１５ワットバルブを５本が装備された  ＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００（カタログ番号  ４００６７６  （１００Ｖ），  ストラタジーン社，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いることができる。細胞を無血清のＭＥＭで洗浄した後、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、およびパラミクソウイルスのそれぞれＮ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、およびＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミドを、適当なリポフェクション試薬を用いてこの細胞にトランスフェクトする。プラスミドの量比は、これに限定されないが、好適には順に  ６：２：１：２：２：２  とすることができる。例えば、ゲノムＲＮＡを発現するプラスミド、並びにＮ、Ｐ、Ｌ、および  ＦプラスＨＮ蛋白質を発現する発現プラスミド（ｐＧＥＭ／ＮＰ，ｐＧＥＭ／Ｐ，ｐＧＥＭ／Ｌ及びｐＧＥＭ／Ｆ−ＨＮ；  ＷＯ００／７００７０，  Ｋａｔｏ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １，  ５６９−５７９  （１９９６））を、それぞれ１２μｇ，  ４μｇ，  ２μｇ，  ４μｇ及び４μｇ／ｄｉｓｈの量比トランスフェクトする。数時間培養後、血清を含まないＭＥＭで細胞を２回洗浄し、４０μｇ／ｍＬの  Ｃｙｔｏｓｉｎｅ  β−Ｄ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ  （ＡｒａＣ：Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）及び７．５μｇ／ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を含むＭＥＭで培養する。これらの細胞を回収し、ペレットをＯｐｔｉＭＥＭ  に懸濁する（１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。凍結融解を３回繰り返してｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＤＯＳＰＥＲ  （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ）と混合し（１０６ｃｅｌｌｓ／２５μｌ  ＤＯＳＰＥＲ）室温で１５分放置した後、上記でクローニングしたＦ発現ヘルパー細胞にトランスフェクション（１０６ｃｅｌｌｓ  ／ｗｅｌｌ  １２−ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ）し、血清を含まないＭＥＭ（４０μｇ／ｍｌ  ＡｒａＣ，  ７．５μｇ／ｍｌ  トリプシンを含む）で培養し、上清を回収する。Ｆ以外の遺伝子、例えばＨＮまたはＭ遺伝子を欠損したウイルスも、これと同様の方法で調製することができる。
【００５３】
ウイルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイルスゲノム上で欠損しているウイルス遺伝子が異なる２種またはそれ以上のベクターを同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウイルス蛋白質が、他のベクターからの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウイルス粒子が形成され、複製サイクルがまわりウイルスベクターが増幅される。すなわち、２種またはそれ以上の本発明のベクターを、ウイルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば、それぞれのウイルス遺伝子欠損型ウイルスベクターの混合物を大量かつ低コストで生産することができる。これらのウイルスは、ウイルス遺伝子が欠損しているため、ウイルス遺伝子を欠損していないウイルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大きい外来遺伝子を保持することができる。また、ウイルス遺伝子の欠損により増殖性がないこれらのウイルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔化するため、環境放出管理上の利点がある。
【００５４】
本発明のパラミクソウイルスにより導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、細胞内シグナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもできる。また、外来遺伝子としては、遺伝子の導入効率または発現安定性等を評価するためのマーカー遺伝子であってもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、グリーン蛍光蛋白質（以下、ＧＦＰともいう）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードする遺伝子が挙げられる。
【００５５】
本明細書に記載したウイルス製造方法に従えば、本発明のウイルスベクターは、例えば  １×１０５  ＣＩＵ／ｍＬ以上、好ましくは  １×１０６  ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは  ５×１０６  ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは  １×１０７  ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは  ５×１０７  ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは  １×１０８  ＣＩＵ／ｍＬ以上、より好ましくは  ５×１０８  ＣＩＵ／ｍＬ以上の力価でウイルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウイルスの力価は、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Ｋｉｙｏｔａｎｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７（１），  ６５−７４  （１９９０）；  ＷＯ００／７００７０）。
【００５６】
回収したパラミクソウイルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーション（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウイルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウイルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーまたは安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウイルスベクター由来の蛋白質の割合が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法（特公昭６２−３０７５２号公報、特公昭６２−３３８７９号公報、および特公昭６２−３０７５３号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および／またはその分解物に吸着させる方法（ＷＯ９７／３２０１０）等を例示することができる。
【００５７】
ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。例えばベクターを生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または培養液などで適宜希釈して組成物とすることができる。ベクターを鶏卵で増殖させた場合等においては尿液を含んでよい。またベクターを含む組成物は、脱イオン水、５％デキストロース水溶液等の担体または媒体を含んでいてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤およびその他の添加剤を添加することができる。本発明のベクターを含む組成物は、ＥＳ細胞に遺伝子を導入するための試薬として、さらにＥＳ細胞を標的とする遺伝子治療に用いる医薬として有用である。
【００５８】
また本発明は、本発明のベクターが導入されたＥＳ細胞、および該細胞の増殖および／または分化により生成した細胞に関する。ＥＳ細胞の分化の誘導は、例えばサイトカインなどの公知の分化・増殖因子、細胞外マトリクスなどの基質の添加、他の細胞との共培養、個体への移入などにより行うことができる（丹羽仁史「ＥＳ細胞の分化運命決定機構」蛋白質核酸酵素  ４５：  ２０４７−２０５５，  ２０００；  Ｒａｔｈｊｅｎ，  Ｐ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｄｅｖ．  １０：  ３１−４７，  １９９８）。また、テラトーマ（分化多能性腫瘍）を形成させれば、様々な分化細胞および組織を得ることもできる。テラトーマとは内胚葉、中胚葉、および外胚葉の三胚葉由来の細胞または組織を含む組織塊であり、例えばＥＳ細胞を免疫不全動物の皮下などに移植して形成させることができる。
【００５９】
例えば、胚体外組織起源の細胞種の分化誘導は以下のような方法で行うことができる：
2004344001.tif 000002
2004344001.tif 000003
【００６０】
本発明は、例えば本発明のベクターを導入したＥＳ細胞から分化させた軟骨、上皮（腸管上皮など）、皮膚、皮脂腺などの腺組織を提供する。また本発明は、本発明のベクターを導入したＥＳ細胞から分化させた神経細胞を提供する。例えば本発明のベクターを導入したＥＳ細胞から、Ｍａｐ２  （ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）  陽性細胞、およびＴＵＪ１  （ｃｌａｓｓ  ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）  陽性細胞を分化させることができる。また本発明は、本発明のベクターを導入したＥＳ細胞から分化させた造血細胞を提供する。例えば本発明のベクターを導入したＥＳ細胞から、単球および顆粒球（ＮＢＴ還元活性を持つ細胞）を分化させることができる。
【００６１】
本発明のベクターにより遺伝子導入したＥＳ細胞、および該ＥＳ細胞から分化させた細胞、組織、臓器等は、各種薬剤のアッセイおよびスクリーニングに有用である。例えば哺乳動物ＥＳ細胞への遺伝子導入を通して、組織または細胞、特に好ましくは霊長類由来の組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子または薬剤等の効果を評価したり、スクリーニングすることができる。本発明には、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子または薬剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は、ＥＳ細胞の増殖または分化に対する遺伝子発現の効果を検出する方法であって、（ａ）本発明のベクターとＥＳ細胞とを接触させる工程、（ｂ）該ＥＳ細胞の増殖または分化を検出する工程、を含む方法を提供する。ベクターのＥＳ細胞への導入は、本発明のベクターを目的のＥＳ細胞に接触させる工程により実施することができる。ＥＳ細胞の増殖は、細胞数の計数またはＭＴＴアッセイなどのミトコンドリア活性の測定などの公知の方法により検出することができる。またＥＳ細胞の分化は、公知の分化マーカー遺伝子の発現の検出、あるいは細胞または組織等の形態学的または生化学的測定などにより検出することができる（丹羽仁史「ＥＳ細胞の分化運命決定機構」蛋白質核酸酵素  ４５：  ２０４７−２０５５，  ２０００；  Ｒａｔｈｊｅｎ，  Ｐ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｄｅｖ．  １０：  ３１−４７，  １９９８）。導入ベクターには、効果を検出したい所望の外来遺伝子保持させることができる。また、例えば陰性対照などとして、ＥＳ細胞へのベクター自身の導入による効果を検出する場合においては、外来遺伝子を含まないベクターを用いることができる。上記の検出方法を用いて、ＥＳ細胞の増殖または分化に影響を与え得る遺伝子を評価したりスクリーニングすることが可能である。スクリーニングは、上記の検出方法の工程（ａ）および（ｂ）に続いて、（ｃ）該ＥＳ細胞の増殖または分化を調節する活性を有する導入遺伝子を選択する工程、を含む方法により実施することができる。このようなスクリーニング方法も、上記本発明の遺伝子導入の効果を検出する方法に含まれる。
【００６２】
このような方法を用いたスクリーニングの一例として、ＥＳ細胞から機能細胞を分化させる遺伝子のスクリーニングを挙げることができる。
例えばＥＳ細胞から膵臓β細胞を分化させる際において、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのうちどれが必要か、どの組み合わせがもっともふさわしいか、また、どの順番で遺伝子導入するのがもっとも適切かを調べる際には、これらの遺伝子をＥＳ細胞に効率良くしかも簡単に導入する技術が有用である。本ベクターはその要求を満たす。例えば、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅを発現する本発明のベクターを構築し、これを種々の組み合わせおよび順序でＥＳ細胞またはその分化細胞に導入する。遺伝子が導入された細胞の分化を検出することにより、遺伝子導入の効果を知ることができる。
【００６３】
また、例えばある遺伝子を体内に投与する遺伝子治療における副作用の予見に本発明のベクターを利用することも有用である。
遺伝子Ｘの各臓器および組織への毒性および副作用は、マウスまたはサル個体への投与実験である程度は把握できる。しかし遺伝子Ｘが各組織幹細胞へいかなる影響を及ぼしうるかは今までの方法では検出できない。この遺伝子Ｘはある特定の組織幹細胞から機能細胞への分化を障害する可能性がある。例えば、肝臓幹細胞の分化を障害する場合は、肝炎に罹患した時または肝臓切除術を施行された時に、初めてその障害が明らかになる。すなわち遺伝子Ｘによって肝臓幹細胞の分化が障害され、必要な時に肝臓の再生が進まないという深刻な事態が起こりうる。こうした問題は通常の動物実験では必ずしも予見できない。本ベクターを用いれば、きわめて効率良く遺伝子ＸをＥＳ細胞へ導入でき、この遺伝子導入ＥＳ細胞をさまざまな組織幹細胞に分化させ、さらに機能細胞まで分化させることによって、遺伝子Ｘの安全性をさまざまな分化段階で検出できるようになる。
【００６４】
本発明のベクターを利用したアッセイおよびスクリーニングは、哺乳動物、特にヒトおよびサルを含む霊長類における発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルなどに有用であり、かつ所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な遺伝子および試薬をスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。
上記のスクリーニング法において、ＥＳ細胞から所望の組織または細胞への特異的分化は、例えば、所望の組織または細胞に特異的なマーカーの発現を指標として評価されうる。前記所望の組織または細胞に特異的なマーカーとしては、組織または細胞特異的抗原が挙げられ、例えば、神経系前駆細胞のマーカーとしては、中間径フィラメントであるネスチンなどが挙げられる。このような特異的マーカーは、該マーカーに対する抗体を用い、慣用のＥＬＩＳＡ、免疫染色等により検出してもよく、該マーカーをコードする核酸を用い、慣用のＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション等により検出してもよい。なお、「核酸」とは、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡなどを意味する。本スクリーニング法により得られた遺伝子および試薬は本発明の範囲に包含される。
【００６５】
また、本発明のベクターが導入されたＥＳ細胞、および該ＥＳ細胞から分化した分化細胞または分化組織も本発明の範囲に含まれる。分化細胞及び分化組織は、前記組織又は細胞に特異的なマーカーの発現、形態学的特徴の観察により同定することができる。
本発明のウイルスベクターは、様々な遺伝性疾患の遺伝子治療にも応用が可能である。対象となる疾患は特に制限されない。例えば、対象となり得る疾患とその単一原因遺伝子としては、ゴーシェ病においてはβ−セレブロシダーゼ（第２０染色体）、血友病においては血液凝固第８因子（Ｘ染色体）および血液凝固第９因子（Ｘ染色体）、アデノシンデアミナーゼ欠損症においてはアデノシンデアミナーゼ、フェニルケトン尿症においてはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（第１２染色体）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーにおいてはジストロフィン（Ｘ染色体）、家族性高コレステロール血症においてはＬＤＬレセプター（第１９染色体）、嚢ほう性繊維症においてはＣＦＴＲ遺伝子の染色体への組み込み等が挙げられる。それら以外の複数の遺伝子が関与していると思われている対象疾患としては、アルツハイマー、パーキンソン病等の神経変性疾患、虚血性脳障害、痴呆、またエイズ等の難治性の感染症等が考えられる。
【００６６】
また、遺伝子導入したＥＳ細胞から分化させた細胞、組織、臓器を疾患治療のために用いることも考えられる。例えば、遺伝子の欠損または不足によって発症する疾患に対して、ＥＳ細胞の染色体に当該遺伝子を導入し、これを体内に移植することによって欠損する遺伝子を補い、所望の細胞または組織を再生させることが考えられる。また、本ベクターを用いて遺伝子を導入したＥＳ細胞がサル由来のものである場合は、当該ＥＳ細胞を疾患モデルサルに移植することにより、ヒトの疾患の治療モデルとして有用な系を提供することができる。ヒトの疾患のモデルとして様々な疾患モデルサルが知られており、例えば、ヒトのパーキンソン病のモデルサルは人工的に作出可能であり、ヒトの糖尿病の忠実なモデルとして自然発症の糖尿病サルが多く飼育され、また、サルのＳＩＶ感染症がヒトのＨＩＶ感染症の忠実なモデルとしてよく知られている。このような疾患において、ヒトＥＳ細胞を用いた臨床応用を行う前に、前臨床試験としてサルＥＳ細胞を疾患モデルサルに移植する系は、非常に有用である。
【００６７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書全体を通じて引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
【００６８】
サルＥＳ細胞へのセンダイウイルスベクターを用いた遺伝子導入
１．ＥＳ細胞の培養
カニクイザルＥＳ細胞、ＣＭＫ６（Ｓｕｅｍｏｒｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎ．  ２２２，  ２７３  ２００１）は京大中辻教授より供与されたものを以下のＥＳ培地にて培養して用いた。
ＥＳ  培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２  （Ｓｉｇｍａ），  １５％  ＦＢＳ  （ＥＳ  Ｃｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，  Ｇｉｂｃｏ）、１  ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，  １  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｂａｔｅ，  ０．１  ｍＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ
また、フィーダー細胞として、通常妊娠１３−１４日  ＩＣＲマウスあるいはＢＡＬＢ／ｃマウスよりｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＭＥＦ）を採取し、３〜５継代培養し増殖させた後、分注し凍結保存した。使用時は１０％  ＦＣＳ添加ＤＭＥＭにて解凍後、１００  ｍｇ  ／  １０  ｃｍ  ｄｉｓｈ  Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（ＳＩＧＭＡ）にて２〜３ｈｒ培養し、ＭＥＦの分列を止めた。細胞はトリプシン−ＥＤＴＡで解離した後、先に０．１％ゼラチンでコートした３．５  ｃｍ  ｄｉｓｈに５×１０５細胞播種した。播種後１日以上経過した後ＥＳ細胞を１０４〜１０５細胞／３．５  ｃｍ  ｄｉｓｈをフィーダー上に播種した。２日に一度はＥＳ培地を交換し、３〜４日に一度、継代を行った。ＥＳ培地を除き、Ｈａｎｋｓ’  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  （ＨＢＳＳ，  Ｇｉｂｃｏ）にて洗った後、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ／ＨＢＳＳを加え１〜２分室温にて放置し、ＭＥＦの混入が少なく、ＥＳ細胞のコロニーが多く剥離するように、検鏡しながらｄｉｓｈの底を軽く叩いてＥＳ細胞を集めた。その後細胞は８００  ｒｐｍにて４分遠心後、予め用意したフィーダー上に播種した。
【００６９】
２．ＳｅＶベクターの調製
Ｆ欠失型ＧＦＰＳｅＶベクター：ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ  は、通常の手順に従って、生産、精製後、ＣＩＵの測定をした（１×１０８）。なおＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰは、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＥＧＦＰ、ＳｅＶ１８＋／ｄＦ−ＧＦＰ、ＳｅＶ１８＋／ｄＦ−ＥＧＦＰ、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ΔＦ、ＳｅＶ１８＋ＥＧＦＰ／ΔＦ、ＳｅＶ１８＋ＧＦＰ／ｄＦ、またはＳｅＶ１８＋ＥＧＦＰ／ｄＦなどと表記することもある。
【００７０】
３．ＣＭＫ６への感染
コロニーピックアップと持続発現：ＣＭＫ６を０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ／ＨＢＳＳにて剥離し、遠心管に回収し８００ｒｐｍにて４分遠心後ＥＳ培地を加えタッピングし、細胞を軽くほぐした。ＨＢＳＳで洗浄後、ＭＥＦが混入したまま細胞数をカウントし、６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０５／ｗｅｌｌ  ｍｌとなるようにＥＳ培地で懸濁した。そこにＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを２００μｌ、即ち２×１０７  ＣＩＵ加え、混合し５％  ＣＯ２、３７℃にて一晩培養した。翌日、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ／ＨＢＳＳにて剥離し、遠心管に回収し８００ｒｐｍにて４分遠心した。ＨＢＳＳで洗浄後、ＥＳ培地を加え、予め用意した６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅのＭＥＦフィーダー細胞上に加え、培養した。３日もしくは４日ごとに新フィーダー細胞上に継代を行った。感染後３週後、６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１０４細胞／ｗｅｌｌで継代し、その５日後、蛍光顕微鏡上で構成細胞全てがＧＦＰ陽性であるコロニーを選んで一つずつマイクロピペットで回収し、フィーダー細胞を播いておいた２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移植した。その後、それぞれのｗｅｌｌを蛍光観察し、コロニーを形成するまで生育し構成細胞が全てＧＦＰ陽性であるコロニーを継代し、拡大培養した。そのうちの一つを３７０日以上継代し続けた。
【００７１】
ベクター間の比較：ＧＦＰ遺伝子を搭載したアデノウイルスベクターであるＡｄ５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、アデノ随伴ウイルスベクターであるＡＡＶ２−ＣＡＧ−ＷＰＲＥ−ＥＧＦＰ、Ｆ欠失ＳｅＶベクターであるＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰをそれぞれ、３．４×１０２  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｐｉｅｓ／Ｃｅｌｌ、２．４×１０４  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｐｉｅｓ／Ｃｅｌｌ、５０  ＣＩＵ／Ｃｅｌｌとなるように培地に添加し、４８時間、５％  ＣＯ２、３７℃にて感染した。感染４日後に蛍光観察、撮影を行った。
【００７２】
感染時間の検討：ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを５０  ＣＩＵ／ｃｅｌｌとなるようにＭＥＦを含んだＣＭＫ６に感染し、５％  ＣＯ２、３７℃で１時間、３時間、２４時間培養し感染させた。その後ＨＢＳＳで洗浄後、ＥＳ培地にて感染後４８時間後まで培養し、蛍光観察を行った。
【００７３】
４．継代感染細胞の解析（フローサイトメータによる解析）
ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析する数継代前より、ＭＥＦをＩＣＲ由来のものから、ＢＡＬＢ／ｃ由来に交換して継代しておき、細胞を０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−１  ｍＭ  ＥＤＴＡにて解離した。８００  ｒｐｍにて４分遠心後、細胞を４％  ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した後、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  （ＰＥ）  標識抗マウスＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ抗体Ｈ−２Ｋｄ  にて染色、洗浄後ＦＡＣＳによる解析を行った。ＭＥＦはＨ−２Ｋｄ  陽性、ＣＭＫ６はＨ−２Ｋｄ  陰性細胞として検出されるので、ＣＭＫ６のＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染細胞の割合はＨ−２Ｋｄ  陰性細胞内のＧＦＰ陽性率で表した。
【００７４】
５．テラトーマ形成方法
ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染後１１９日培養したものを１×１０６、１５０μｌの０．２％  ＢＳＡ／ＨＢＳＳに懸濁し、生後８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス左大腿内側皮下に移植した。移植後１７週後に屠殺し、蛍光観察および組織学的検査を行った。
【００７５】
６．胚様体の形成
ＣＭＫ６を０．１％  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＩＶにて３７℃  ８〜１０分インキュベートし、ＣＭＫ６をエンリッチして剥離しＨＢＳＳで洗浄後、バクテリア用プラスティックディッシュ上にＥＳ培地に懸濁し培養する。５日おきに培地交換を行い胚様体を形成させた。
【００７６】
７．継代感染細胞におけるゲノムＲＮＡの検出
感染後２８４日目のＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＭＫ６よりＲＮＡを抽出、Ｔａｑｍａｎｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  （ＰＥ  ＡＢＩ）  を用い逆転写反応を行った後、ＳｅＶゲノム検出用プライマーとしてＦ３２０８（Ｐ遺伝子上、ａｇａｇａａｃａａｇａｃｔａａｇｇ  ｃｔａｃｃ／配列番号：９）とＲ３７８７（Ｍ遺伝子上、ａｃｃｔｔｇａｃａａｔｃｃｔｇａｔｇｔｇｇ／配列番号：１０）を用い、ＥＧＦＰに対するプライマーとしてＧＦＰ−Ｆ３：  ｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃ（配列番号：１１）、ＧＦＰ−Ｒ３  ：  ｇｇｔｃｔｔｔｇｃｔｃａｇ  ｇｇｃｇｇａｃｔ（配列番号：１２）、カニクイザルβ−ａｃｔｉｎに対するプライマー  （２３４ｂｐ）  はＣＢ１  ：  ｃａｔｔｇｔｃａｔｇｇ  ａｃｔｃｔｇｇｃｇａｃｇｇ（配列番号：１３）、ＣＢ２  ：  ｃａｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｇａａｇｔｃｔａｇｇｇｃ（配列番号：１４）を用いた。また、細胞中にＤＮＡとしてＧＦＰ遺伝子、あるいはＳｅＶゲノムが保持されていないことを証明するために、ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＭＫ６よりＤＮＡを抽出し、上記のプライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は９５℃７分の後、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を３０サイクル行い、７２℃５分の処理を行った。
【００７７】
８．血液細胞への分化
マウスｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＯＰ９細胞をα−ＭＥＭ  （Ｇｉｂｃｏ）  にて培養しｍｉｔｏｍｙｃｉｎ処理した後、６ｗｅｌｌにコンフルエントになるよう播種し予め培養しておき、その上にＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＭＫ６を播種し、８％  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ  ８％  ＦＣＳ  ５×１０−６  Ｍ  ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ／  ＩＭＤＭに２０  ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−４，  ２０  ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ，  ２０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３，  １０  ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６，  ２０  ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ，  ２０  ｎｇ／ｍｌ  Ｇ−ＣＳＦ，  １０  ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ．３  ｌｉｇａｎｄ，  ２  ｕ／ｍｌ  ＥＰＯとなるようにサイトカインを加え培養した。
【００７８】
９．血球細胞分析方法
コロニーアッセイ：移植後１４〜１８日目に、分化した非接着細胞をｐｉｐｅｔｔｉｎｇで回収した。セルストレーナーを通した後、２％ＦＢＳ／ＩＭＤＭにｓｕｓｐｅｎｄし、細胞を計数した。ＭｅＣ培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ＋  Ｈ４４３５  ；  ＳｔｅｍｍＣｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、細胞数１×１０４と１×１０５で播種し、３７℃，  ５％  ＣＯ２で培養した。約１４日目にｃｏｌｏｎｙ  ｃｏｕｎｔ、顕微鏡観察した。
サイトスピン：Ｃｏｌｏｎｙ  ａｓｓａｙで形成された造血コロニーを吊り上げ、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ標本を作成し、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色を行い、形態学的評価を行った。
好中球機能検査（ＮＢＴ還元試験）：メチルセルロース半固形培地に播種後１４日目の、ｃｏｌｏｎｙが形成されているｐｌａｔｅにＮＢＴ  （ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）  ｓｏｌｕｔｉｏｎをかけ、好中球機能（貪食能、細胞内殺菌能）を検査した。
【００７９】
ＥＳ細胞への遺伝子導入（結果）
１．マウスＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ抗体を用い、ＦＡＣＳ上でＭＥＦとＣＭＫ６を分離することに成功し、解析が可能になった。（図２下）
２．カニクイザルＥＳ細胞、ＣＭＫ６に対して、ｍｏｉ＝２、１０、５０で遺伝子導入したところ、２４時間後のＦＡＣＳによる解析でＧＦＰ陽性率は、それぞれ６．７％、２２％、４６％、４８時間後はそれぞれ１６．５、３７．８、６３．２％と上昇した。そのあと一度継代し、感染後４日でそれぞれ１７．１、３５．２、６７．０％、感染後７日でそれぞれ７．３、３６．８、５９．４％と遺伝子導入率が維持された。（図４）
３．ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクターおよびＡＡＶ２ベクターをそれぞれｍｏｉ＝３４０、ｍｏｉ＝２４０００でＣＭＫ６に感染させたところ、感染４日後でそれぞれ２０．０％、２５．９％とＳｅＶベクターに比べて低い値であった。７日後にはＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓベクターによる感染細胞は６．１％に低下した。ＡＡＶ２ベクターは１９．６％と感染率を維持したが、ＳｅＶベクターに比べると低かった。（図５、６）
４．感染時間を１、３、２４時間としたところ、感染効率は低いものの感染時間が短くても遺伝子導入可能であった。（図３）
５．コロニーの選択採取により、遺伝子導入細胞をエンリッチしたものでは、その後ほとんど１００％近い細胞がＧＦＰ陽性であり、ＦＡＣＳのデータでも感染後３７０日で９０％の細胞がＧＦＰ陽性であった。（図２：ＦＡＣＳデータは２５３日目のもの、図７）
６．ＮＯＤ／ＳＣＩＤ大腿皮下にＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＭＫ６細胞を移植し１７週後テラトーマが形成された。皮膚の上からもＧＦＰ蛍光が観察され、切開すると強い蛍光が観察された。（図８）
７．１７週後テラトーマが形成されたテラトーマの切片で、ほとんどの細胞がＧＦＰ陽性であり、それらが軟骨、皮膚、腸管上皮、皮脂腺といった組織へ分化していた。（図９）
８．ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＭＫ６細胞は胚様体も形成し、胚様態全体がＧＦＰを発現していた。（図１０）
９．ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ感染ＣＭＫ６細胞は血球に分化させることも可能であり、分化後もＧＦＰ陽性であった。このＧＦＰ陽性細胞は、形態的にも、機能的にも好中球であることを確認した。（図１１）
【００８０】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物ＥＳ細胞に長期間安定に遺伝子を発現させることが可能となった。本発明の方法は、遺伝子導入効率が高く、導入した遺伝子の発現も高レベルである。また、ＤＮＡを介さずに長期間、安定に遺伝子を発現させることができる。さらにＥＳ細胞の分可能に影響を与えない。ＥＳ細胞への遺伝子導入は、ヒトを含む霊長類および他の哺乳動物における発生学的研究、疾患研究、臨床応用、実験モデルにおいて有用である。また、本発明のベクターは、ＥＳ細胞からの組織または細胞の特異的分化を制御する遺伝子および試薬等のスクリーニングを可能にする。このスクリーニング方法によれば、所望の分化細胞または分化組織を得るのに有用な、組織または細胞の特異的分化を行なうための遺伝子および試薬等をスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。また本発明の方法を用いた遺伝子発現によりＥＳ細胞で分化・増殖を調節する遺伝子を発現させ、得られた細胞を再生医学に用いることも期待される。
【００８１】
【配列表】
2004344001.tif 000004
2004344001.tif 000005
2004344001.tif 000006
2004344001.tif 000007
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2004344001.tif 000009
2004344001.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】複製型センダイウイルス（上段）、およびＥＧＦＰ遺伝子を有する複製欠損型センダイウイルス（Ｆ遺伝子欠失）のゲノム構造を示す図である。
【図２】複製欠損型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）でＧＦＰ遺伝子を導入したＣＭＫ６細胞のＧＦＰの発現を示す図である。ＳｅＶ感染の２５３日後のＥＳ細胞の蛍光顕微鏡像およびＦＡＣＳ解析結果を示す。Ｈ−２Ｋｄ  陰性のサルＥＳ細胞の９３％がＧＦＰ陽性であった。
【図３】複製欠損型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）の感染時間を変えた時のＣＭＫ６細胞のＧＦＰ発現を示す図である。
【図４】複製欠損型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）の量（ｍｏｉ）とＧＦＰ陽性率の関係を示す図である。
【図５】アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、複製欠損型ＳｅＶ（ＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰ）のＣＭＫ６に対する遺伝子導入の比較を示す図である。
【図６】図５を数値化した結果およびその時間変化を示す図である。
【図７】遺伝子導入細胞の選別と導入遺伝子の発現を示す図である。上段は選別をせずに継代を続けた場合、下段はコロニーセレクションでＧＦＰ陽性コロニーの選別を１回行い、継代を続けた場合である。
【図８】ＳｅＶベクターのゲノムの自己複製能およびＤＮＡ非依存性を確認した結果を示す図である。ＲＮＡ−ＰＣＲはベクター導入細胞からＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲによりウイルスゲノムを増幅した結果を示す。５８０  ｂｐのバンドはウイルスゲノム由来のバンドである。ｃｍＥＳはサルＥＳ細胞株、ｃｍＥＳ−ＥＧＦＰはエレクトロポレーション法でＥＧＦＰ遺伝子を染色体に組み込んだサルＥＳ細胞株、ｃｍＥＳ／ＳｅＶはＳｅＶ１８＋／ΔＦ−ＧＦＰを導入したサルＥＳ細胞である。ＳｅＶ（＋）は野生型ＳｅＶゲノムｃＤＮＡを鋳型として用いた結果（対照）である。ＳｅＶベクターを導入したＥＳ細胞でウイルスゲノムが複製されていることが証明された。ＤＮＡ−ＰＣＲはベクター導入細胞からＤＮＡを調製し、これを鋳型としてＰＣＲによりウイルスゲノムを増幅した結果を示す。ＳｅＶベクターを導入したＥＳ細胞におけるＧＦＰ発現がＤＮＡを介さないことが示された。
【図９】ＳｅＶベクターにより遺伝子を導入したＣＭＫ６細胞によるテラトーマ形成を示す図である。
【図１０】図９のテラトーマの顕微鏡像を示す図である。
【図１１】ＳｅＶベクターにより遺伝子を導入したＣＭＫ６による胚様体形成を示す図である。
【図１２】ＳｅＶベクターにより遺伝子を導入したＣＭＫ６の血球への分化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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