(57)【要約】【課題】ウェル内に不純物が付着し易い担体を形成する手間がなく、取扱がより簡単で、ＤＮＡ増幅を行うＬＡＭＰ法にも適用できるようにする。【解決手段】サンプル液に接触して反応するプローブ分子が固定されたバイオチップにおいて、ベースプレート（２）に細管状又は凹孔状のウェル（３…）をマトリクス状に配列形成し、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と前記プローブ分子とを混合した反応剤（４）をウェル内面に付着させた。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル液に接触して反応するプローブ分子が固定されたバイオチップにおいて、ベースプレートに細管状又は凹孔状のウェルがマトリクス状に配列形成され、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と前記プローブ分子とを混合した反応剤がウェル内面に付着されたことを特徴とするバイオチップ。
【請求項２】
前記反応剤が、前記各ウェル内に充填されると共に、前記ベースプレートの表面に盛り上がった状態に固化されて成る請求項１記載のバイオチップ。
【請求項３】
前記反応剤を付着させた各ウェル内に、サンプル液を注入する空間が残されて成る請求項１記載のバイオチップ。
【請求項４】
サンプル液に接触して反応するプローブ分子が固定されたバイオチップにおいて、細管状又は凹孔状のウェルが所定ピッチでマトリクス状に配列形成されたサンプルプレートに重ね合わされるベースプレートの表面に、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と前記プローブ分子とを混合した反応剤が、前記各ウェルと対応する位置及び大きさで、その表面から盛り上がった状態に付着されたことを特徴とするバイオチップ。
【請求項５】
前記ホットメルト型凝固剤がアガロースである請求項１乃至４記載のバイオチップ。
【請求項６】
プローブ分子とサンプル液を接触させて反応させる反応方法において、
細管状又は凹孔状のウェルが所定ピッチでマトリクス状に配列形成されたサンプルプレートと、前記各ウェルと対応する位置に、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と前記プローブ分子とを混合した反応剤を付着固化させたバイオチップを用い、
前記サンプルプレートのウェルにサンプル液を充填させた後、前記バイオチップと重ね合せた状態で、雰囲気温度を前記反応温度まで上昇させて反応開始させることを特徴とする反応方法。
【請求項７】
プローブ分子とサンプル液を接触させて反応させる反応装置において、
所定ピッチでマトリクス状に配列形成されたウェル内に、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と前記プローブ分子とを混合した反応剤を付着固化させた反応プレートを前記反応温度まで加熱するヒータと、照明光又は励起光が照射された反応プレートの各ウェル内を撮像する撮像カメラと、前記撮像カメラで撮像された画像データに基づいて各ウェル内の濁度又は蛍光度を計測する演算処理装置とを備えたことを特徴とする反応装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サンプル液に接触して反応するプローブ分子が固定されたバイオチップ、それを用いた反応方法及びそれを用いる反応装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生化学、医学、薬学、食品分野等において、遺伝子の変異、特に塩基配列の変異を検出するため等にＤＮＡチップ（バイオチップ）が用いられている。
このようなＤＮＡチップとして、通常、シリコンもしくはガラス基板上にフォトリソグラフィー技術を用いて、１ｃｍ角あたり１万以上のオリゴＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を作り込んだものが知られている。
【０００３】しかしながら、フォトリソグラフィーを用いてＤＮＡチップを形成する場合、多数のフォトマスクを必要とし、かつ、光リソグラフィー工程、カップリング工程、洗浄工程を何度も繰り返さなければならないため、製造コストが嵩み、また、パターンを変えるためにはそれぞれフォトマスクを変える必要があるため、実験室レベルで必要に応じた各種デザインのＤＮＡチップを簡単に作成することができなかった。
このため最近では、実験室レベルで必要に応じたデザインのバイオチップを簡単に作成できる技術が提案されている（特許文献１参照）。
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−２１８９７４号公報
【０００５】このバイオチップは、ベースプレートに配列形成された直径１ｍｍ前後の貫通孔内に、多孔質又は繊維質の担体を充填し、その担体にプローブ分子を固定化した構造となっている。
【０００６】そして、前記各貫通孔ごとに所望のプローブ分子を含む液体を流せば、そのプローブ分子を担体に担持させることができる。
したがって、実験に必要なプローブ分子を任意の組合せで各担体に担持させたバイオチップを実験室レベルで簡単かつ必要に応じて製造することができ、また、各貫通孔同士が連通するように基板を重ね合わせて液体を流すだけで同じデザインのバイオチップを複数製造することも簡単にできる。
【０００７】そして、このように製造されたバイオチップを、サンプル流路が形成されたセル内に、その流路を塞ぐようにセットし、バイオチップの上流側に蛍光標識入のサンプル液を満たした後、下流側から吸引することにより、サンプル液と各貫通孔内のプローブ分子とを反応させ、洗浄後、蛍光観察するようになっている。
【０００８】これによれば、１ｃｍ角に１万以上のオリゴＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を作り込むというような高密度化はできないものの、研究内容に応じて任意のバイオチップを自由に設計・製造することができる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、このバイオチップは、プローブ分子を固定するために貫通孔内に多孔質又は繊維質等の担体を形成しなければならず、その作業工程が面倒であるという問題があった。
また、担体には不純物が付着し易く、一旦付着すると簡単にはこれを除去することができないので、担体にプローブ分子を固定する前であっても担体に不純物が付着しないように基板を清潔に維持管理しなければならず、その取扱が面倒であるという問題があった。
さらに、担体が充填されているため、濁度によりＤＮＡ増幅の有無を確認するＬＡＭＰ法に適用することはできない。
【００１０】そこで本発明は、担体を形成する手間がなく、したがって不純物も付着しにくく、取扱がより簡単で、ＤＮＡ増幅を行うＬＡＭＰ法にも適用できるようにすることを技術的課題としている。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この課題を解決するために、本発明は、サンプル液に接触して反応するプローブ分子が固定されたバイオチップにおいて、ベースプレートに細管状又は凹孔状のウェルがマトリクス状に配列形成され、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と前記プローブ分子とを混合した反応剤がウェル内面に付着されたことを特徴とする。
【００１２】本発明によれば、ウェルがマトリクス状に配列形成されている場合に、室温では固化し予め設定された反応温度（例えば６５℃）で溶融するアガロースなどのホットメルト型凝固剤とプローブ分子とを混合した反応剤がウェル内に付着固化されている。
【００１３】アガロースは５０℃前後で液状化するので、液状化したアガロースと所望のプローブ分子を混合させた反応剤を生成し、１又は所定数のウェルごとにプローブ分子が異なる反応剤を液状化させて流下又は滴下させれば、夫々の反応剤は表面張力によってウェル内に止まる。
この状態で、室温に放置すれば、アガロースが凝固するのでプローブ分子は各ウェル内面に固定されることとなる。
【００１４】そして、例えば、バイオチップのウェルと対応する位置にウェルを形成したサンプルプレートを用い、そのウェル内にサンプル液を充填する。
細管状のウェルが形成されたサンプルプレートを用いる場合は、これをサンプル液に浸漬するだけで毛管現象によりサンプル液が充填されるので、サンプル液充填後、バイオチップと重ね合せれば、サンプル液と反応剤が接触する。
そして、この状態でバイオチップを反応温度まで加熱すれば、固化されていた反応剤が液状化し、ウェルにサンプル液が充填される。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて具体的に説明する。
図１は本発明にかかるバイオチップを示す説明図、図２はその断面図、図３は発明にかかる反応方法を示す説明図、図４は本発明にかかる反応装置を示す説明図、図５はバイオチップの他の実施形態を示す断面図、図６は反応方法の他の実施形態を示す説明図、図７はバイオチップの他の実施形態を示す断面図、図８はその製造手順及び反応方法を示す説明図である。
【００１６】本発明にかかるバイオチップ１は、図１に示すように、ベースプレート２に凹孔状のウェル３…がマトリクス状に配列形成されている。
ベースプレート２は、例えば一辺３０ｍｍ、厚さ２ｍｍ程度の正方形のアルミニウム板や合成樹脂板で形成されている。
ウェル３は、直径０．５ｍｍ、深さ１ｍｍ程度に形成され、縦横１ｍｍピッチで２０×２０＝４００個形成されている。
そして、ベースプレート２の表面２ａは撥水処理が施され、ウェル３の内面３ａには親水処理が施されている。
さらに、このバイオチップ１は、反応時に濁度観察を行うＬＡＭＰ法などに用いる場合には、白濁を観察しやすいようにウェル３の内面３ａには黒色・暗灰色などの明度の低い色が施され、蛍光標識を付したＤＮＡ等の蛍光観察を行う場合には蛍光観察しやすいように白色などの明度の高い色が施されている。
【００１７】また、ウェル３には、室温では固化し、予め設定された反応温度では溶融するホットメルト型凝固剤と、サンプル液に接触して反応する任意のプローブ分子とを混合した反応剤４が固定されてなる。
このウェル３は、担体などが設けられていない凹孔であるので、不純物が付着したとしても簡単に洗浄除去することができ、反応剤４を固定するまで、ベースプレート２を厳重に管理する必要もない。
【００１８】反応剤４に用いるホットメルト型凝固剤として、本例では５０℃前後で溶融するアガロースが用いられている。
この反応剤４のウェル３への充填量は任意であり、図２（ａ）に示すようにウェル３を反応剤４で満たす場合に限らず、各ウェル内にサンプル液を溜める空間を残すように、図２（ｂ）に示すようにウェル３の半分程度まで充填する場合や、図２（ｃ）に示すようにウェル内面３ａに塗りつけるように付着する場合でもよい。
【００１９】また、図２（ｄ）に示すように、ベースプレート２の表面２ａから盛り上がった状態に固化してもよい。
この場合、例えばウェル３と同じ位置に同径の孔が穿設された厚さ０．２〜０．３ｍｍ程度のプレートやフィルム５をベースプレート２に密着状態に積層し、液状の反応剤４を充填し、室温で凝固させた後にフィルム５を剥がせば、ベースプレート２の表面から盛り上がった状態に固化される。
【００２０】図３は、このバイオチップ１を用いてプローブ分子とサンプル液を接触させる反応方法を示す説明図である。
本例では、図２（ａ）〜（ｄ）に示すバイオチップ１と、サンプル液が充填されるサンプルプレート６を用いる。
サンプルプレート６は、バイオチップ１のウェル３…と対応する位置に、これと同径又はやや大径の細管状のウェル７が所定ピッチでマトリクス状に配列形成されている。
このサンプルプレート６の表面６ａは撥水処理が施され、各ウェル７…の内面７ａは親水処理が施されている。
【００２１】そして、まず、サンプルプレート６の各ウェル７にサンプル液を充填させる。
この場合、サンプルプレート６をサンプル液に浸漬すれば、毛管現象により各ウェル７にサンプル液が充填される。また、サンプルプレート６の表面には撥水処理が施され、各ウェル７…の内面には親水処理が施されているので、サンプル液からサンプルプレート６を斜めに引き上げるだけで、サンプルプレート６の表面の液滴が流下し、ウェル７のみにサンプル液が残る。
【００２２】次いで、このようにサンプル液を充填したサンプルプレート６をバイオチップ１と重ね合わせて隙間なく密着させると、バイオチップ１の各ウェル３と、サンプルプレート６の各ウェル７が上下に連通する。
したがって、外部から振動などを与えれば、サンプル液がサンプルプレート６からバイオチップ１側へ移動し、ウェル３内に固定された反応剤４と接触する。
【００２３】そして、この状態で、雰囲気温度を所定の反応温度（例えば６５℃）まで上昇させれば、バイオチップ１の各ウェル３に固定された反応剤４のアガロースが液状化し、プローブ分子が溶け出すので、サンプル液とプローブ分子が接触されて反応が開始される。
【００２４】なおこの場合に、図２（ｄ）に示すバイオチップ１のように反応剤４をベースプレート２から盛り上げて固化させれば、サンプルプレート６を重ねたときにサンプル液と接触させやすいというメリットがある。
また、図２（ｂ）及び（ｃ）に示すように、反応剤４の充填量が少なく各ウェル３内にサンプル液を充填する空間が残されている場合は、サンプルプレート７を用いることなく、バイオチップ１をそのままサンプル液内に浸漬し、これを斜めに引き上げて余分な水分を落した後、これを所定の反応温度まで加熱するようにしても良い。
【００２５】図４は、このようなバイオチップ１を用いてプローブ分子とサンプル液を接触させて反応させる反応装置１１を示す。
この反応装置１１は、バイオチップ１にサンプルプレート６を重ねた反応プレート１２をセットする台座１３に、必要に応じて振動を与えるバイブレータ１４と反応プレート１２を所定の反応温度まで加熱するヒータ１５が設けられ、反応プレート１２の各ウェル１６内を撮像する撮像カメラ１７と、その撮像光軸Ｘに介装されたハーフミラー１８を介して各ウェル１６内に照明光又は励起光を同軸落射照明する光源１９と、撮像カメラ１７で撮像された画像データに基づいて各ウェル１６内の濁度又は蛍光度を計測する演算処理装置２０とを備えている。
【００２６】反応プレート１２の各ウェル１６…はバイオチップ１及びサンプルプレート６のウェル３及び７が上下に連通されて形成されるので、この反応プレート１２を台座１３にセットして、バイブレータ１４により振動させると、サンプルプレート６のウェル７内のサンプル液がバイオチップ１のウェル３内に流下される。
【００２７】次いで、ヒータ１５により反応プレート１２を反応温度の６５℃に加熱すると、ウェル３内のアガロースが溶けて反応剤が液状化し、プローブ分子がその液中を浮遊してサンプル液と接触する。
これにより、サンプル液に対して反応性を有するプローブ分子を付着させたウェル１６内では反応が進行し、反応性のないプローブ分子を付着させたウェル１６内では反応が起きない。
【００２８】この反応が、例えばＬＡＭＰ法による遺伝子増幅を行う場合は、ウェル１６内で遺伝子（ＤＮＡ）を伸長合成させるときに、副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成されて、ウェル１６内に白濁・白沈を生じる。
したがって、この白濁・白沈を観察することにより遺伝子増幅が行われたか否かを簡単に識別することができる。
本例では、光源１９から照射された照明光がハーフミラー１８を介して各ウェル１６を照明し、全てのウェル１６…が撮像カメラ１７で同時に撮像される。
そして、反応が進行して遺伝子（ＤＮＡ）が伸長合成されたウェル１６は白濁するので、その画像データを演算処理装置２０に取り込むことにより、どのウェル１６でＤＮＡが合成されたか否かを容易に知ることができる。
なお、この場合に、ウェル１６の内面は黒色等の明度の低い色が施されていたほうが白濁の状況を観察しやすい。
【００２９】なお、血液などのように最初から着色のあるサンプルを使用してＬＡＭＰ法でＤＮＡ増幅を行う場合は、サンプル液にエチジウムブロマイドなど、ＤＮＡの塩基対の間に入り込んで蛍光発色する物質を加えておき、その蛍光発色を観察することにより反応をモニターする方法が有効である。
この場合は、光源１９として紫外線レーザなどを用い、必要に応じて蛍光のみを透過するフィルタ（図示せず）を装着した撮像カメラ１７で撮像する。
そして、反応が進行して遺伝子（ＤＮＡ）が伸長合成されたウェル１６では蛍光を発するので、その画像データを演算処理装置２０に取り込むことにより、どのウェル１６でＤＮＡが合成されたか否かを容易に知ることができる。
なお、この場合に、ウェル１６の内面は白色等の明度の高い色が施されていたほうが蛍光の有無を観察しやすい。
【００３０】図５は、本発明に係るバイオチップの他の実施形態を示す。
本例のバイオチップ２１は、ベースプレート２２に反応剤４を充填する細管状の貫通孔から成るウェル２３…がマトリクス状に配列形成されている。
そして、図１に示すバイオチップ１と同様、ベースプレート２２が、一辺３０ｍｍ、厚さ２ｍｍ程度の正方形のアルミニウム板で形成され、ウェル２３は、直径０．５ｍｍ、縦横１ｍｍピッチで２０×２０＝４００個形成されている。
そして、ベースプレート２２の表面２２ａは撥水処理が施され、ウェル２３の内面２３ａには親水処理が施されている。
ウェル２３は、担体などが設けられていない細管状の貫通孔であるので、不純物が付着したとしても簡単に洗浄除去することができ、反応剤４を固定するまで、ベースプレート２２を厳重に管理する必要もない。
【００３１】ウェル２３への反応剤４の充填量は任意であり、図５（ａ）に示すようにウェル２３を反応剤４で満たす場合に限らず、各ウェル２３内にサンプル液を注入する空間を残すように、図５（ｂ）に示すようにウェル２３の半分程度まで充填する場合や、図５（ｃ）に示すように内面２３ａに塗りつけるように充填する場合でもよい。
【００３２】また、図５（ｄ）に示すように、ベースプレート２２の表面から盛り上がった状態に固化してもよい。
この場合、例えばウェル２３と同じ位置に略同径で深さ０．２〜０．３ｍｍ程度の凹穴が形成された厚さ０．２〜０．３ｍｍ程度の型材２５をベースプレート２２に密着させ、液状の反応剤４を充填して、室温で凝固させた後に型材２５を外せば、ベースプレート２２の表面から盛り上がった状態に固化される。
【００３３】図６は、このバイオチップ２１を用いてプローブ分子とサンプル液を接触させる反応方法を示す説明図である。
本例で用いるサンプルプレート２６は、バイオチップ２１のウェル２３…と対応する位置に、例えば凹孔状のウェル２７が所定ピッチでマトリクス状に配列形成されている。
このサンプルプレート２６も、その表面２６ａは撥水処理が施され、各ウェル２７…の内面２７ａは親水処理が施されているので、サンプル液に浸漬して、斜めに引き上げるだけで、サンプルプレート２６の表面に付着した液滴が流れ落ち、各ウェル２７内にサンプル液が残る。
【００３４】次いで、このようにサンプル液を充填したサンプルプレート２６の上にバイオチップ２１と重ね合わせて隙間なく密着させると、バイオチップ２１の各ウェル２３と、サンプルプレート２６の各ウェル２７が上下に連通するので、雰囲気温度を所定の反応温度（例えば６５℃）まで上昇させれば、バイオチップ２１の各ウェル２３に固定された反応剤４のアガロースが液状化してプローブ分子が溶け出し、サンプルプレート２６のウェル２７内に流入するので、サンプル液とプローブ分子が接触されて反応が開始される。
なお、液状化した反応剤４が毛管現象でウェル２３内に止まり、サンプルプレート２６に流れ落ちない場合は、外部から振動などを与えれば良い。
【００３５】なお、図５（ｂ）及び（ｃ）に示すように、各ウェル２３内にサンプル液を注入する空間が残されている場合は、サンプルプレート２７を用いることなく、バイオチップ２１をそのままサンプル液内に浸漬し、これを斜めに引き上げれば表面に残る余分な水分が流れ落ちるので、その後、所定の反応温度まで加熱するようにしても良い。
【００３６】さらに，図７は本発明に係るバイオチップの他の実施形態を示す。
本例のバイオチップ３１は、細管状又は凹孔状のウェル３７（例えば直径０．５ｍｍ）が所定のピッチ（例えば縦横１ｍｍ）でマトリクス状に配列形成されたサンプルプレート３６に重ね合わせて使用するもので、凹凸のないフラットな平板状のベースプレート３２の表面に、反応剤４が、サンプルプレート３６の各ウェル３７と対応する位置及び大きさで、その表面から盛り上がった状態に付着されている。
ベースプレート３２は、プローブ分子を固定する担体が設けられていないだけでなく、ウェルとなる凹凸すら形成されていないフラットな平板状に形成されているので、不純物が極めて付着しにくく、付着しても簡単に洗浄除去することができ、反応剤４を固定するまで、ベースプレート３２を厳重に管理する必要もない。
【００３７】図８はこのバイオチップ３１の製造手順及び反応方法を示す。
まず、サンプルプレート３６のウェル３７と同じピッチで凹孔３３がマトリクス状に配列形成された型材３４を用い、図８（ａ）に示すように夫々の凹孔３３に反応剤４を満たす。
次いで、図８（ｂ）に示すようにベースプレート３２を被せて反応剤を固化させた後、図８（ｃ）に示すように上下反転させて型材３４を外す。
そして、図８（ｄ）に示すように、各ウェル３７にサンプル液を半分くらいまで満たしたサンプルプレート３６に、反応剤４を下向きにしてバイオチップ３１を重ねると、各反応剤４が各ウェル３７のサンプル液に浸漬される。
この状態で、雰囲気温度を所定の反応温度（６５℃）まで上昇させれば、アガロースが溶けで、プローブ分子がサンプル液と接触し、反応を開始する。
【００３８】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、ウェル内にプローブ分子を担持させる担体がないので、不純物が付着しにくく、また、付着しても簡単に除去することができるだけでなく、濁度や蛍光度を観察しながら遺伝子増幅を行わせるＬＡＭＰ法にも適用することができるという大変優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるバイオチップを示す説明図。
【図２】その断面図。
【図３】本発明にかかる反応方法を示す説明図。
【図４】本発明にかかる反応装置を示す説明図。
【図５】バイオチップの他の実施形態を示す断面図。
【図６】反応方法の他の実施形態を示す説明図。
【図７】バイオチップの他の実施形態を示す断面図。
【図８】その製造手順及び反応方法を示す説明図。
【符号の説明】
１、２１、３１………バイオチップ
２、２２、３２………ベースプレート
３、２３………………ウェル
４………………………反応剤
６、２６、３６………サンプルプレート
７、２７，３７………ウェル
１１………………………反応装置
１２………………………反応プレート
１３………………………台座
１４………………………バイブレータ
１５………………………ヒータ
１６………………………ウェル
１７………………………撮像カメラ
Ｘ………………………撮像光軸
１８………………………ハーフミラー
１９………………………光源１９
２０………………………演算処理装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004354140.tif 000009
【図８】
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