(57)【要約】【課題】ゲノムに選抜マーカーが残らない方法において、改変の対象となる遺伝子が限定されずに部位特異的遺伝子改変細胞を簡便、かつ効率的に作製できる方法を提供する。【解決手段】生物の細胞において、染色体上相同組換えを行う過程を６０分間〜７２０分間かけて行い、そののち部位特異的遺伝子改変細胞を作製する方法。【効果】ゲノム上に選抜マーカーが残る、残らないに関わらず、改変の対象となる遺伝子の性質に限定されることなく部位特異的遺伝子改変細胞を簡便、短時間、かつ効率的に作製できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変すべき生物の細胞の染色体上に存在する相同な領域に基づいた相同組換えを行う過程（染色体上相同組換え）を６０分間から７２０分間行うことを特徴とする部位特異的遺伝子改変細胞の作製方法。
【請求項２】
温度感受性プラスミドを用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
染色体上相同組換えを行う過程を２０℃〜３７℃の温度範囲で行うことを特徴とする請求項１〜２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の方法において、生物がエシェリヒア属細菌、コリネ型細菌、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌である方法。
【請求項５】
請求項１〜３の何れか一項に記載の方法において、生物がエシェリヒア・コリである方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の方法により取得された部位特異的遺伝子改変細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、相同組換えを利用した部位特異的な遺伝子破壊や遺伝子導入による変異細胞作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム上の特定遺伝子と相同な部分配列を持つＤＮＡを細胞中に導入すると、導入された外来ＤＮＡはゲノム上の遺伝子と相同部分で組換えを起こし、ゲノム中に取り込まれる現象、つまりゲノム外―ゲノム間相同組換えが起きる。あるいは、染色体上に相同な領域が存在がすると、相同部分で組換えを起こし、相同な領域の一方、及び相同な領域に挟まれた領域が染色体上から脱落する現象、つまり染色体上相同組換えが起きる。これらの現象は生物一般に広く見られ、相同組換えと呼ばれている。近年の遺伝子操作技術の進歩によって、相同組換えを利用して細胞のゲノム上の特定遺伝子を不活化したり、ゲノム上の任意の部位に新たな遺伝子を導入すること、つまり部位特異的な遺伝子破壊や遺伝子導入は、既に大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウム、カビ、酵母、動物細胞などで実施可能となっている。
【０００３】
部位特異的な遺伝子破壊や遺伝子導入は、個々の遺伝子機能を解析する上で大変有用な手法であるが、同時に細胞による有用物質の生産にとっても大変有用である。というのも、細胞に有用物質を生産させる場合、有用物質の生産のために必要なタンパク質をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに組み込んだ組換えプラスミドを作製し、該組換えプラスミドを細胞中に導入することが一般的に行われる。しかし組換えプラスミドが細胞中で安定に保たれない場合があり、そのような場合、細胞の分裂に伴って目的タンパク質の生産性は著しく低下することになる。この問題を回避する手段の一つとして、ゲノム外―ゲノム間相同組換えを利用した遺伝子導入がある。即ち有用物質の生産のために必要なタンパク質をコードする遺伝子を細胞のゲノム中に導入することによって、目的ＤＮＡを該細胞中で安定に保つことが可能となる。
【０００４】
更に有用物質以外の物質の生産を阻害することが有用物質を効率良く生産させるために重要となるが、この目的に相同組換えを利用した遺伝子破壊が有効である。何故なら、細胞は複雑な代謝反応を行うことによって種々の物質を生産しているが、特定の遺伝子を破壊し特定の代謝反応を阻害することで、有用物質以外の物質生産を停止させることができるからである。
【０００５】
相同組換えを利用した遺伝子破壊の方法（Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Habor Lab.(1972)）を用いた方法の一つとして、高温でプラスミドの複製が阻害されることを特徴とする温度感受性プラスミドを用いる方法が良く知られている。具体例として、（特願平９−１９４６０３）に開示されたイノシンーグアノシン・キナーゼ遺伝子（ｇｓｋ）の遺伝子破壊方法の概略を以下に示す。
【０００６】
（操作１）アンピシリン耐性を有する温度感受性プラスミドに、ゲノム上の破壊させたい遺伝子ｇｓｋ構造遺伝子領域を含むＤＮＡ断片の構造遺伝子領域内部に、選抜マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を挿入した遺伝子断片を組み込んだプラスミドを調製する。
（操作２）プラスミドを大腸菌に形質転換しアンピシリン耐性を指標としてプラスミドを有するコロニーを得る。
（操作３）翌日、得られたコロニーをアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、温度感受性プラスミドが大腸菌内に保持される３０℃で一晩培養する。その間にゲノム外―
ゲノム間相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンが出現することを期待する。
（操作４）翌日、得られたコロニーがシングルコロニーになるようにアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、温度感受性プラスミドが大腸菌内に保持されない４２℃で培養することにより、ゲノム外―ゲノム間相同組換えによりプラスミド全体が染色体に組込まれたクローンを選択する。
（操作５）さらにもう一度、４２℃で生育するシングルコロニーを得る操作を繰り返す。（操作６）翌日、このコロニーをＬＢ寒天プレートに塗布し、ゲノム上に存在するｇｓｋ構造遺伝子の相同な領域に基づいた染色体上相同組換えが行われることを期待して３０℃で一晩培養する。このときの染色体上相同組換えの起こり方によって、目的遺伝子がカナマイシン遺伝子の挿入によって破壊された株となるか、元の株に戻るかが決まることになる。
（操作７）翌日、得られたコロニーをＬＢ液体培地に接種し、４２℃で３〜４時間、振とう培養する。
（操作８）これをシングルコロニーが得られるように希釈してＬＢ寒天プレートに塗布し、温度感受性プラスミドが大腸菌内に保持されない４２℃で一晩培養し翌日コロニーを得る。
（操作９）ｇｓｋ遺伝子破壊株はアンピシリン感受性かつカナマイシン耐性になっているので、それを指標に選択すれば目的とするｇｓｋ遺伝子破壊株を得ることが出来る。
【０００７】
しかしながら、この方法によれば部位特異的遺伝子改変細胞のゲノム中に選抜マーカーが残る。ゲノム中に選抜マーカーが残る方法は以下の問題点を有する。
第１の問題点は、遺伝子機能の解析や有用物質の生産を行うためには、部位特異的遺伝子改変を複数回連続して実施することが必要なことが多いにも関わらず、利用し得る選抜マーカーの種類に制限があるために、目的とする部位特異的遺伝子改変が必要回数成立した細胞を作製できない場合がある点である。
【０００８】
第２の問題点は、有用物質の生産のために必要なタンパク質と選抜マーカーにコードされるタンパク質が細胞内で同時に生産されて、部位特異的遺伝子改変成立の判定を混乱させたり、有用物質の生産を抑制するといった好ましからざる結果を招く恐れがある点である。
【０００９】
第３の問題点は、一般にゲノムは組換えプラスミドよりも細胞内で安定に複製されるため、選抜マーカーＤＮＡがゲノムへ組み込まれ、かつセルフクローニングにより非組換え体とみなされた細胞が誤って環境中へ放出された場合に長期に渡り該マーカーが発現することが懸念される点である。
【００１０】
上記の問題を回避するために既にいくつかの技術が開発されている。
第１の方法として、部位特異的遺伝子改変成立時にはゲノム中に選抜マーカーＤＮＡを導入し、部位特異的遺伝子改変成立後、ゲノム中の選抜マーカーＤＮＡを抜き出す方法（Martinez-Morales, F., A. C. Borges, et al. (1999) J Bacteriol 181(22): 7143-8.）を新規遺伝子導入において実施している例を示すことができる。
【００１１】
この方法は酵母が持つフリッパーゼリコンビナーゼを利用して行われる。フリッパーゼリコンビナーゼはＦｌｉｐｐａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ（ＦＲＴ）と呼ばれる特異的な標的配列を有するＤＮＡ塩基部間のＤＮＡ組換えを触媒する酵素である。
【００１２】
この方法は概ね以下のような手順で行われる。
まず、限られた宿主でのみ複製可能であって、部位特異的遺伝子改変を意図する細胞中では複製ができない性質を有するＲ６Ｋオリジンを含むＤＮＡ断片をＰＣＲ等の手法を用いて取得する。これを選抜マーカーをコードするＤＮＡ断片と連結した後、その両端にＦＲＴ領域を連結する。これとは別に、遺伝子導入の際ゲノム外―ゲノム間相同組換えを起こさせる領域となるＤＮＡ断片をＰＣＲ等の手法を用いて取得する。次に、該ＤＮＡ断片と新たに遺伝子導入を意図するＤＮＡ配列を連結する。さらに、該連結ＤＮＡ配列を、先に調製した、Ｒ６Ｋオリジンと選抜マーカーを含み、かつ両端をＦＲＴ領域に挟まれたＤＮＡ断片と連結して環状ＤＮＡとし、部位特異的遺伝子改変用プラスミドとする。
【００１３】
次に該組換えプラスミドを部位特異的遺伝子改変を意図する細胞に導入する。すると導入した組換えプラスミドは本細胞中で複製することができない。しかし、ゲノム外―ゲノム間相同組換えが起きることがあり、その結果、ゲノム中に該組換えプラスミド全長が組み込まれた細胞が現れる。そこで選抜マーカーの発現を指標にすることによってゲノム中に該組換えプラスミド全長が組み込まれた細胞のみを選抜することができる。次に選抜マーカーをゲノムから脱落させるため以下の操作を行う。まず、テトラサイクリン存在下でフリッパーゼリコンビナーゼを発現するように構築した温度感受性ヘルパープラスミドを選抜された該細胞に導入する。
【００１４】
その後、ヘルパープラスミド導入済みの細胞を温度感受性ヘルパープラスミドが複製可能な温度下、テトラサイクリンを含有する培地中で培養すると、誘導発現されたフリッパーゼリコンビナーゼによって、標的配列ＦＲＴ領域に挟まれたＲ６Ｋオリジンと選抜マーカーＤＮＡがゲノムから脱落する。次に培養温度を高くすることでヘルパープラスミドを細胞から脱落させる。更に得られた細胞群の中から選抜マーカーの形質を失った細胞を選抜することで、ようやく部位特異的遺伝子改変が成立し、かつ選抜マーカーを有さない細胞を得ることができる。
このように、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓらの方法は操作が煩雑、かつ、多大の労力と所要時間が必要であり、更なる改善が望ましい。
【００１５】
第２の方法として、前述の特願平９−１９４６０３の改良法として、５’側及び３’側相同配列の間に選抜マーカーを挿入していない遺伝子改変用ベクターを用いる方法が知られている。
（Matsui.H.,et.al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(5),1230-1235(2001)）、(Link.A.H.,et.al.,J.Bacteriology,179(20),6228-6237(1997))
この方法は概ね以下のような手順で行われる。即ちまずゲノム外―ゲノム間相同組換えを行おうとするゲノムＤＮＡ部分と相同なＤＮＡ領域を取得し、その一部を改変、もしくは欠失したＤＮＡ断片を調製する。これを温度感受性プラスミドに挿入して部位特異的遺伝子改変細胞作製用組換えプラスミドを作製するが、前述の特願平９−１９４６０３とは異なり、選抜マーカーの挿入を行わない。そして、前述の特願平９−１９４６０３と同様にして部位特異的遺伝子改変細胞を作製すると部位特異的遺伝子改変を達成でき、かつ選抜マーカーがゲノムに残存することもない。
【００１６】
しかしながら本技術においては目的とする遺伝子改変細胞を薬剤等を用いずに選抜することが前提となるが、実際に選抜してみると、元の細胞に戻る株が極端に多く、その結果、目的とする部位特異的遺伝子改変細胞の出現頻度が非常に低いために目的とする部位特異的遺伝子改変細胞を得ることができない、あるいは得づらいことがある。そのため、本方法で目的を達成しようとし、コロニーＰＣＲ法などによって選抜する場合、時として数百個、数千個のコロニーを調べねばならず多大な労力が必要となる問題点を有していた。ちなみに部位特異的遺伝子改変細胞の出現頻度が非常に低くなる理由は従来においては必ずしも明らかではなかった。
【特許文献１】特願平９−１９４６０３
【非特許文献１】Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Habor Lab.(1972)
【非特許文献２】Martinez-Morales, et al. J Bacteriol 181(22): 7143-8 (1999)
【非特許文献３】Matsui.H.,et.al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,65(5),1230-1235                  (2001)
【非特許文献４】Link.A.H.,et.al.,J.Bacteriology,179(20),6228-6237(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
以上の点に鑑み、本発明が解決すべき技術的課題は簡便かつ効率的な部位特異的遺伝子改変を行う方法を提供することにある。
【００１８】
そして本発明の目的の一つは、ゲノム上に選抜マーカーを残さずに、目的とする遺伝子改変細胞を作製するための簡便かつ効率的な方法を提供することにあり、さらに本発明のもう一つの目的は、選抜マーカーをゲノム上に残す残さないに関わらず、従来法よりも短時間で目的とする遺伝子改変細胞を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記課題の解決のために鋭意検討を行ったところ、これまで部位特異的遺伝子改変細胞作製の際、染色体上相同組換えの過程に、特願平９−１９４６０３（操作６）に示されるように一晩（１６時間以上）以上要すると考えられていたが、実は染色体上相同組換えという現象は一晩（１６時間以上）よりも短時間（６０分間から７２０分間）のうちに高頻度で生じていること、及び、従来の方法では染色体上相同組換えにかけられている時間が長すぎ、その間に元のゲノム配列に戻った細胞が優先的に増殖してしまい、結果的に目的とする遺伝子改変細胞の出現率が顕著に低下することがあるのを発見した。本発明者らはかかる知見に基づき、相同組換えを利用して部位特異的遺伝子改変細胞を取得するに際して、染色体上相同組換えが行われる過程の処理時間を、従来技術において実施されていた時間より短く、６０分間〜７２０分間に限って実施すれば、所望の遺伝子の破壊、導入部位を有するＤＮＡと相同領域を有する細胞、即ち部位特異的遺伝子改変細胞が高頻度で得られることを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
【００２０】
すなわち本発明は以下のとおりである。
［１］遺伝子改変すべき生物の細胞の染色体上に存在する相同な領域に基づいた相同組換えを行う過程（染色体上相同組換え）を６０分間から７２０分間行うことを特徴とする部位特異的遺伝子改変細胞の作製方法。
［２］温度感受性プラスミドを用いることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］ 染色体上相同組換えを行う過程を２０℃〜３７℃の温度範囲で行うことを特徴とする［１］〜［２］の何れか一項に記載の方法。
［４］ ［１］〜［３］の何れか一項に記載の方法において、生物がエシェリヒア属細菌、コリネ型細菌、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌である方法。
［５］ ［１］〜［３］の何れか一項に記載の方法において、生物がエシェリヒア・コリである方法。
［６］［１］〜［５］の何れか一項に記載の方法により取得された部位特異的遺伝子改変細胞。
【発明の効果】
【００２１】
よって、本発明によれば、染色体に選抜マーカーが残らない方法において、改変の対象となる遺伝子が限定されずに部位特異的遺伝子改変細胞を簡便、かつ効率的に取得できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明において、生物の細胞とは、遺伝子改変の対象となり得る全ての生物の細胞を指し、相同組換えの能力を有するものであれば特に限定されず、細胞の相同組換え能力は、細胞が本来有している能力でも、また人為的に付与されたものでも良い。具体的には、昆虫由来の細胞、酵母類、カビ類などの真核生物由来の細胞、バチルス属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、クレビシエラ属細菌、エシェリヒア属細菌（特に、大腸菌即ちエシェリヒア・コリ）、コリネ型細菌又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌等の細菌をはじめとする原核生物由来の細胞が挙げられ、コリネ型細菌としてはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・グルタミカムなどの微生物を例示できる。尚、相同組換えを促進するタンパク質は大腸菌であればＲｅｃＡ，ＲｕｖＡＢＣ、出芽酵母であればＲａｄ５１，Ｒａｄ５２などを例示できる。
【００２３】
本発明において、染色体とは一つの細胞に一つ、ないし複数存在する細胞固有の遺伝情報を担う物体を指す。具体的にはヒト細胞は４６本の染色体を、大腸菌は１本の染色体を有する。
【００２４】
本発明において、ゲノムとは細胞が有する細胞固有の遺伝情報全体を担う物体を指す。具体的にはヒト細胞であれば４６本の染色体全てを、大腸菌であれば１本の染色体を指す。
【００２５】
本発明において、相同な領域とは、塩基配列が相同又は相同性の高いＤＮＡ領域である。この場合、２つのＤＮＡ領域の塩基配列の相同性が５０％から１００％あれば好ましく、更に８０％から１００％であればより好ましいが、特にこれに制限を受けるものではない。
【００２６】
本発明において、相同性とは2配列間の最適アラインメントを求め、次いでアラインした配列の相同性％（すなわち同一残基のみを計算に入れる）を計算する、市販のコンピュータープログラムにより判定できる。そのようなコンピュータープログラムの代表例は、ＧＣＧスイートのプログラムの一部であるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴ（Devereuxet al．（1984）Nuc．Acids Res．，12，387；Wisconsin Package Version 10，Genetics Computer Group，ウィスコンシン州マディソン）、または多重配列アラインメントにも使用できるＣｌｕｓｔａｌＷ（Thompson，J．D．et al．（1994）Nuc．Acids Res．，22，4673−80）である。
【００２７】
本発明に係る相同な領域の長さは上記の生物が相同組換えをし得る長さであれば制限は特にないが、一般的に相同な領域が長い方が相同組換えは生じやすいことから、５０ｂｐ以上が望ましく、好ましくは５００ｂｐ以上、より好ましくは１０００ｂｐ以上、更に１００００ｂｐ以上のＤＮＡ領域でも良い。
【００２８】
染色体上に存在する相同な領域とは、同一の染色体上に相同な領域が存在することを指す。
染色体上に相同な領域を存在させる方法としては、ゲノム上のある領域と相同な塩基配列を有するプラスミド（組換えプラスミド）を形質転換し、該細胞のゲノム外―ゲノム間相同組換え能力によって該組換えプラスミドの全長がゲノムに組み込まれ、その結果、染色体上に相同な領域が存在するようになる方法を例示することができる。或いは酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）或いはある種の大腸菌のように、直鎖状ＤＮＡを形質転換し得る微生物において直鎖状ＤＮＡを常法により形質転換をし、ゲノム外―ゲノム間相同組換えが起きることにより、結果的に染色体上に相同な領域が存在するようになる方法を例示することができる。例えば、染色体上の５’側にＡ、３’側にＢというＤＮＡ領域が並んでいる細胞においては、Ａと相同なＤＮＡ断片をＰＣＲなどにより取得し、これを同方向に２断片連結し、更にその３’側にＢと相同なＤＮＡ断片を連結しＡ、Ａ、Ｂの順に並んだ直鎖状ＤＮＡを作製し、これを形質転換すれば、染色体上のＡ、Ｂ領域と相同組換えが起き、染色体上にＡ、Ａ、Ｂという順の新たなＤＮＡ領域が存在するようになる。もちろん、直鎖状ＤＮＡを作製する際に、ＡとＡの間、あるいはＡとＢの間に新たなＤＮＡを挿入しておくことも可能である。具体的には、ゲノム上のある領域と相同な塩基配列を有するプラスミドで細胞を形質転換し、該細胞のゲノム外―ゲノム間相同組換え能力によってプラスミドの全長がゲノムに組み込まれた細胞を取得することは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の微生物(Takamatsu D.,et.al.,46(2):140-8(2001))、コリネ型細菌であるブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（特願平２−２７３３４８号公報）、エシェリヒア属の微生物である大腸菌、即ちエシェリヒア・コリ(Martinez-Morales, et al. J Bacteriol 181(22): 7143-8 (1999))において行われている方法を利用することが出来る。また、上記の直鎖状ＤＮＡで形質転換することで生物の染色体上に相同な領域を存在する細胞を取得することはキャンディダ  ボイディニイ(Sakai Y.,et.al.174:5988(1992))で行われている方法を採用することが出来る。とはいえ、本発明において染色体上に相同な領域を存在させる方法としては、特にこれらの方法に限定されるものではなく、生物の染色体上に相同な領域が存在するようにできればいかなる方法でも良い。
【００２９】
本発明において、染色体上相同組換えを行う過程とは、相同組換えを行う能力を有する生物の細胞内において、染色体上に存在する任意の相同な領域に基づいたＤＮＡの相同組換えが生じた結果、相同な領域に挟まれているＤＮＡ領域、および染色体上に存在する相同な領域のうちの一方が、染色体から脱落する過程を指す。この過程はフリッパーゼリコンビナーゼとＦＲＴのような、特異的な標的配列とその特異的な標的配列を認識して相同組換えを行うリコンビナーゼによる相同組換えを行う過程は含まない。
【００３０】
具体的に染色体上相同組換えを行う過程とは、染色体上に相同な領域が存在する生物の細胞を、該生物が増殖可能な培地において、かつ、相同組換えを行うに適した温度下で、６０分間、１２０分間、１８０分間、２４０分間、３６０分間、４２０分間、４８０分間、５４０分間、６００分間、６６０分間、７２０分間のいずれか、あるいはその任意の２点間にある時間、培養することを指す。該生物が増殖可能な培地とは、エシェリヒア・コリであれば、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、Ｍ９培地を例示できる。また、酵母であればＹＰＤ培地を例示することができる。とはいえ、本発明に係る培養において使用される培地は特にこれに限定されるものではない。また、染色体上相同組換えを行うに適した温度とは染色体上相同組換えの頻度が高い、各細胞特有の一定の温度領域をさす。例えば、エシェリヒア・コリの実施例で示したように染色体上相同組換えの頻度を実験的に求めると、理由は明らかではないものの、２５℃、３０℃では染色体上相同組換えの頻度が高く、３７℃では実用上問題のないレベルではあるが染色体上相同組換えの頻度が下がる現象を見出すことからもそのような温度領域を知ることができる。また、染色体上相同組換えを行う過程の具体例としては特願平９−１９４６０３に開示されたイノシンーグアノシン・キナーゼ遺伝子（ｇｓｋ）の遺伝子破壊方法の概略に示した中の（操作６）
を示すことができるが、特にこれに限定されるものではない。
【００３１】
本発明において、部位特異的遺伝子改変細胞とは、相同組換えを利用して細胞のゲノム上の特定遺伝子を不活化したり、ゲノム上の任意の部位に新たな遺伝子を導入すること、つまり部位特異的な遺伝子破壊や遺伝子導入が行われた細胞を指す。さらに言えば、細胞の染色体上に相同な領域を存在させることを意図した相同組換えを伴う形質転換を実施した後、染色体上相同組換えを行う過程を経て元の細胞と異なる形質を獲得した細胞をいう。
【００３２】
本発明において、温度感受性プラスミドとは、ある培養温度の下では生物の細胞の中で複製されるが、培養温度がある一定以上の温度になると複製する能力を失い結果的に細胞中から脱落する特徴を有するプラスミドをいう。
【００３３】
本発明において、選抜マーカーとは、部位特異的遺伝子改変を目的としたプラスミド、あるいはＤＮＡ断片による形質転換の成立の有無、あるいは部位特異的遺伝子改変成立の有無、あるいはフリッパーゼリコンビナーゼなどによる特異的な標的配列を認識を利用したＤＮＡ組換え成立の有無を簡便に識別可能な方法を提供するＤＮＡであり、選択マーカーとも呼ぶ。具体的には、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカーを例示することができるがこれに限定されるものではない。
【００３４】
ゲノムＤＮＡの調製、プラスミドの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成、サザンハイブリダイゼーション等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,t.,”Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)、Alison,A.,et.al.,”Methods in Yeast Genetics”、Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1997)、Miller,J.H.,”A Short Course in Bacterial  GeneticsCold Spring Harbor Laboratory Press,(1992)”等に記載されている。
【００３５】
以下、染色体上に相同な領域が存在する細胞の作成方法についてを具体例を挙げて説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
（１）  エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞の作出方法
生物の細胞としてエシェリヒア・コリを用いる。エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number U00096）、エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の塩基配列も公知である（GenBank accession number X08035）。ｐｆｌＢ遺伝子はGenBank accession number U00096の塩基配列情報において、９５２７７７−９５０４９５に記されており、ｐｆｌＢ遺伝子の５’側近傍領域は、GenBank accession number U00096の塩基配列情報の９５２７７７より数の多い領域の塩基配列情報からＰＣＲ法を用いて増幅させて取得することができる。また、ｐｆｌＢ遺伝子の３’側近傍領域は、同様にGenBank accession number U00096の塩基配列情報の９５０４９５より１に近い領域の塩基配列情報からＰＣＲ法を用いて増幅取得することができる。ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとしてはエシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、Ｗ３１１０株、ＡＴＣＣ１１３０３株等のゲノムＤＮＡを例示できる。尚、ＭＧ１６５５株、Ｗ３１１０株、ＡＴＣＣ１１３０３株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。
【００３６】
次に、ＰＣＲによって得られた５’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の３’側と、３’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の５’側をＴ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅなどにより連結する。このとき、５’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片と、３’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の間に新しく導入したいＤＮＡ配列を挿入して連結しても良い。連結して得たＤＮＡ断片を更に、温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１（GenBank accession numberAB019610）、ｐＴＨ１８ｋｓ１  （GenBank accession number AB019604）などから得ることができるｐＳＣ１０１由来複製開始点、及び、ｐＳＣ１０１特異的複製酵素ｒｅｐＡが温度感受性に変異した変異ｒｅｐＡをコードする配列領域、およびアンピシリン、クロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカーと連結して組換えプラスミドを作製する。
【００３７】
上記のようにして得たプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、変異ｒｅｐＡが機能する温度で培養することにより、ｐＳＣ１０１由来複製開始点を有するプラスミドを保持する形質転換体を得る。続いて、プラスミドが有する薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含む培地に該形質転換体を植菌し、変異ｒｅｐＡが機能しない培養温度下で培養する。するとプラスミド全長が染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換体のみが生育する。
得られた形質転換体の染色体上には、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域が存在する。
【００３８】
（２）  エシェリヒア・コリのＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に存在する細胞の作出方法
上記（１）と同様に、エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number U00096）、エシェリヒア・コリのＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）の塩基配列も公知である（GenBank accession number X01067）。ｄｌｄ遺伝子はGenBank accession number U00096の塩基配列情報において、２２２０２０５−２２２１９２０に記されており、ｄｌｄ遺伝子の５’側近傍領域は、GenBank accession number U00096の塩基配列情報の２２２０２０５より１に近い領域の塩基配列情報からＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて増幅取得することができる。また、ｄｌｄ遺伝子の３’側近傍領域は、同様にGenBank accession number U00096の塩基配列情報の２２２１９２０より数の多い領域の塩基配列情報からＰＣＲ法を用いて増幅取得することができる。ＰＣＲの鋳型ＤＮＡとしてはエシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株、Ｗ３１１０株、ＡＴＣＣ１１３０３株等のゲノムＤＮＡを例示できる。
【００３９】
次に、ＰＣＲによって得られた５’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の３’側と、３’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の５’側をＴ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅなどにより連結する。このとき、５’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片と、３’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の間に新しく導入したいＤＮＡ配列を挿入して連結しても良い。連結して得たＤＮＡ断片を更に、上記（１）と同様にｐＳＣ１０１由来複製開始点、及び、ｐＳＣ１０１特異的複製酵素ｒｅｐＡが温度感受性に変異した変異ｒｅｐＡをコードする配列領域、およびアンピシリン、クロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカーと連結して組換えプラスミドを作製する。上記のようにして得たプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、変異ｒｅｐＡが機能する温度で培養することにより、ｐＳＣ１０１由来複製開始点を有するプラスミドを保持する形質転換体を得る。続いて、プラスミドが有する薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含む培地に該形質転換体を植菌し、変異ｒｅｐＡが機能しない培養温度下で培養する。するとプラスミド全長が染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換体のみが生育する。
得られた形質転換体の染色体上には、ＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域が存在する。
【００４０】
（３）  エシェリヒア・コリのｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が同時に染色体上に存在する細胞の作出方法
上記（１）、（２）に記載の具体例と概ね同様の操作で実施する。まず、ゲノム上のａｔｐＡ−ａｔｐＩ近傍領域をＰＣＲにより取得する。
【００４１】
次にＰＣＲにより得られた５’側近傍領域、及び３’側近傍領域をＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅなどにより連結する。このとき、５’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片と、３’側近傍領域をコードするＤＮＡ断片の間に新しく導入したいＤＮＡ配列を挿入して連結しても良い。連結して得たＤＮＡ断片を更に、上記（１）と同様にｐＳＣ１０１由来複製開始点、及び、ｐＳＣ１０１特異的複製酵素ｒｅｐＡが温度感受性に変異した変異ｒｅｐＡをコードする配列領域、およびアンピシリン、クロラムフェニコール耐性遺伝子などの薬剤耐性マーカーと連結して組換えプラスミドを作製する。  上記のようにして得たプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、変異ｒｅｐＡが機能する温度で培養することにより、ｐＳＣ１０１由来複製開始点を有するプラスミドを保持する形質転換体を得る。続いて、プラスミドが有する薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含む培地に該形質転換体を植菌し、これを変異ｒｅｐＡが機能しない培養温度下で培養するとプラスミド全長が染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換体のみが生育する。
得られた形質転換体の染色体上には、ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域が同時に存在することとなる。
更に以下に、生物の細胞において、染色体上相同組換えを行う過程を６０分間〜７２０分間で行い、そののち選抜マーカーを用いることなく部位特異的遺伝子改変細胞を取得する方法を例を挙げて説明するが、この過程が６０〜７２０分間の間であれば、これらの例に限定されるものではなく、また、選抜マーカーの使用を制限するものではない。
【００４２】
（４）エシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞を用いて、ｐｆｌＢ遺伝子が染色体から消失した部位特異的遺伝子改変細胞を取得する例
上記（１）において得られたエシェリヒア・コリのピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞をＬＢ培地に植え、２０−３７℃で培養する。この培養の間に染色体上相同組換えが進行する。培養開始から６０分間〜７２０分間の間に培養液を希釈し、ＬＢ寒天培地に播き、これを温度感受性プラスミドが細胞に保持されない４４℃で培養する。生育してきたコロニーをＬＢ寒天培地、および温度感受性プラスミドが有していた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含むＬＢ寒天培地のそれぞれにレプリカし、薬剤に感受性を示した株を染色体上相同組換えが成立した株として得る。
上記のようにして得られた株についてピルベートホルメートリアーゼの活性消失、または低減、あるいはゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりｐｆｌＢを含む断片を増幅させ、増幅されたＤＮＡ断片のサイズがｐｆｌＢ遺伝子が消失した場合と一致することなどを指標として、ｐｆｌＢ遺伝子が染色体から消失した部位特異的遺伝子改変細胞を取得することができる。
【００４３】
（５）  エシェリヒア・コリにおいて、ＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に存在する細胞を用いてｄｌｄ遺伝子が染色体から消失した部位特異的遺伝子改変細胞を取得
する例
上記（２）において得られたＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在するエシェリヒア・コリ株をＬＢ培地に植え，２０−３７℃で培養する。この培養の間に染色体上相同組換えが進行する。培養開始から６０分間〜７２０分間の間に培養液を希釈し、ＬＢ寒天培地に播き、これを温度感受性プラスミドが細胞に保持されない４４℃で培養する。生育してきたコロニーをＬＢ寒天培地、および温度感受性プラスミドが有していた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含むＬＢ寒天培地のそれぞれにレプリカし、薬剤に感受性を示した株を相同組換えが成立した株として得る。
上記の様にして得られた細胞株についてＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼの活性消失、または低減、あるいはゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりｄｌｄを含む断片を増幅させ、増幅されたＤＮＡ断片のサイズがｄｌｄ遺伝子が消失した場合と一致することなどを指標として、ｄｌｄ遺伝子が染色体から消失した部位特異的遺伝子改変細胞を取得することができる。
【００４４】
（６）エシェリヒア・コリにおいて、ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に存在する細胞を用いて、遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞を用いて，ａｔｐＡ−ａｔｐＩ遺伝子が染色体から消失した部位特異的遺伝子改変細胞を取得する例
上記（３）において得られたｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在するエシェリヒア・コリ株をＬＢ培地に植え，４０−４４℃で３時間培養する。そののち、培養液の一部を再度ＬＢ培地に植え、２０−３７℃で培養する。２０−３７℃での培養開始から６０分間〜７２０分間の間に培養液を希釈し、ＬＢ寒天培地に播き、これを温度感受性プラスミドが細胞に保持されない４４℃で培養する。生育してきたコロニーをＬＢ寒天培地、および温度感受性プラスミドが有していた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含むＬＢ寒天培地のそれぞれにレプリカし、薬剤に感受性を示した株を、染色体上相同組換えが成立した株として得る。
以上の様にして得えられた株について、ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅの活性消失、または低減、或いはゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりａｔｐＡ−ａｔｐＩを含む断片を増幅させ、増幅されたＤＮＡ断片のサイズがａｔｐＡ−ａｔｐＩ遺伝子が消失した場合と一致することなどを指標として、ａｔｐＡ−ａｔｐＩ遺伝子が染色体から消失した部位特異的遺伝子改変細胞を取得することができる。
【００４５】
（７）コリネ型細菌ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて、３―デオキシー アラビノヘプツロソネートー７−ホスフェートシンターゼ遺伝子（以下「ＤＳ遺伝子」と記す）、およびチロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異ＤＳ遺伝子を染色体上に同時に存在する細胞の作製方法および染色体上相同組換えにより染色体上からのＤＳ遺伝子消失及び変異ＤＳ遺伝子導入が生じた部位特異的遺伝子改変細胞を取得する例
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいてチロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異ＤＳ遺伝子は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型の株にフェニルアラニンのアナログであるｍ−フロロフェニルアラニンの耐性と、フェニルアラニン、およびチロシンの生産能を付与することが知られている。（特開昭６１−１２４３７５参照）。
【００４６】
ＤＳ遺伝子、およびチロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異ＤＳ遺伝子を染色体上に同時に存在する細胞の作製方法は米国特許５６１６４８０を示すことができる。染色体上相同組換えの方法も米国特許５６１６４８０
を示すことができ、Ｍ−ＣＭ２Ｇ培地（グルコース５ｇ、ポリペプトン１０g、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ１５ｇ、ＤＬ-メチオニン０．２ｇを純水１Lに含む、ｐH７．２）の液体培地に植菌し、２０℃で培養を行うことで達成できる。部位特異的改変細胞の取得は、培養液を希釈したものをＭ−ＣＭ２Ｇ寒天培地（寒天１．５％）に植菌し、３４℃で培養したあと、得られたコロニーを５μｇ/ｍLのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇ寒天培地、およびｍ−フルオロフェニルアラニンを含む寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性の有無とｍ−フロロフェニルアラニン耐性の有無を調べ、クロラムフェニコール感受性があり、ｍ−フロロフェニルアラニン耐性を有する株を選抜することで達成することができる。
【００４７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００４８】
エシェリヒア・コリにおいて、ピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞の作出
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを調製し、これを以下のＰＣＲの鋳型として用いた。
まずエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡ情報、およびピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）の塩基配列情報を元に、ｐｆｌＢ遺伝子の５’側近傍領域を増幅するためのプライマーとして配列番号１と配列番号２、３’側近傍領域を増幅するためのプライマーとして配列番号３と配列番号４を設計した。
【００４９】
ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として配列１、２のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩにより消化し、約１７７０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。また、同様に配列３、４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＳｐｈＩとＰｓｔＩにより消化し、約１３４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１をクローニングサイトＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩで消化して得られるフラグメントと上記の２種のＤＮＡフラグメントを同時に混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で３０℃で培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
【００５０】
このプラスミドを大腸菌ＭＧ１６５５株、および大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３株に形質転換し、細胞が温度感受性プラスミドを保持できる３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ液体培地で３０℃で３時間〜一晩培養後、ＬＢ液体培地または生理食塩水で適当に希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このＬＢ寒天プレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４４℃で培養し、生育した形質転換体をゲノム外―ゲノム間相同組換えによりプラスミド全長が染色体に組み込まれた株として得た。
【００５１】
この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子がゲノム上に存在すること、およびピルベートホルメートリアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び、３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域が染色体上に存在することをもってプラスミド全長が染色体に組み込まれた株であることを確認した。
【実施例２】
【００５２】
エシェリヒア・コリにおいてＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞の作出
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを調製し、これを以下のＰＣＲの鋳型として用いた。
まずエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡ情報、およびＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）の塩基配列情報を元に、ｄｌｄ遺伝子の５’側近傍領域を増幅するためのプライマーとして配列番号５と配列番号６、３’側近傍領域を増幅するためのプライマーとして配列番号７と配列番号８を設計した。
【００５３】
ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として配列５、６のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩにより消化し、約１１４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。また、同様に配列７、８のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩにより消化し、約１１４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１をクローニングサイトＨｉｎｄＩＩＩ，ＸｂａＩで消化して得られるフラグメントと上記の２種のＤＮＡフラグメントを同時に混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
【００５４】
このプラスミドをＭＧ１６５５株に形質転換し、３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養して、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ液体培地で３０℃で３時間〜一晩培養後、ＬＢ液体培地または生理食塩水で適当に希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このプレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４４℃で培養をし、生育した形質転換体をプラスミド全長が染色体に組み込まれた株として得た。
【００５５】
この株からゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子がゲノム上に存在すること、およびＮＡＤＨ非依存性−Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び、３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域が染色体上に存在することをもってプラスミド全長が染色体に組み込まれた株であることを確認した。
【実施例３】
【００５６】
エシェリヒア・コリにおいてｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）  遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域が染色体上に同時に存在する細胞の作出
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを調製し、これを以下のＰＣＲの鋳型として用いた。
まずエシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡ情報、およびｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域をコードする遺伝子（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）の塩基配列情報を元に、５’側近傍領域を増幅するためのプライマーとして配列９、配列１０、３’側近傍領域を増幅するためのプライマーとして配列１１、配列１２を設計した。
【００５７】
ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として配列９、１０のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩにより消化し、約５５０ｂｐのＤＮＡ断
片を得た。また、同様に配列１１、１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩにより消化し、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する温度感受性クローニングベクターｐＴＨ１８ｃｓ１をクローニングサイトＨｉｎｄＩＩＩ，ＢａｍＨＩで消化して得られるフラグメントと上記の２種のＤＮＡフラグメントを同時に混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。
【００５８】
このプラスミドをＭＧ１６５５株に形質転換し、３０℃でクロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をＬＢ液体培地で３０℃で３時間〜一晩培養後、ＬＢ液体培地または生理食塩水で適当に希釈して、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレート上に塗布した。このプレートを、温度感受性プラスミドを保持できない４２℃で培養をし、ここで生育する形質転換体をプラスミド全長が染色体に組み込まれた株として得た。
【００５９】
この株について、ゲノムＤＮＡを取得し、これを鋳型としたＰＣＲを実施して、ｐＴＨ１８ｃｓ１が有するクロラムフェニコール耐性遺伝子がゲノム上に存在すること、およびｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅをコードする遺伝子（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）遺伝子の５’側近傍領域、及び、３’側近傍領域のそれぞれと相同な領域が染色体上に存在することをもってプラスミド全長が染色体に組み込まれた株であることを確認した。
【実施例４】
【００６０】
染色体上相同組換えによるｐｆｌＢ遺伝子破壊株の作製（１）
実施例１においてピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域とそれぞれに相同な領域が染色体上に同時に存在することが確認されたＭＧ１６５５株形質転換体をＬＢ液体培地２０ｍLを入れた１００ｍLのバッフル付きフラスコ９本に植え、これを２５℃、３０℃、３７℃、４２℃でそれぞれ３本ずつ振とう培養した。これを培養開始から時間を追ってサンプリングし、ＬＢ液体培地で希釈したものをＬＢ寒天培地に塗布し、これを細胞が温度感受性プラスミドを保持できない４４℃で培養した。染色体に組み込まれている温度感受性プラスミドはクロラムフェニコール耐性を有しているので、染色体上相同組換えが成立して温度感受性プラスミドが染色体から抜け出れば、その細胞はクロラムフェニコール感受性を示し、まだ染色体上相同組換えが起きていなければクロラムフェニコール耐性を示す。そこで、４４℃で生育してきたコロニーを、ＬＢ寒天プレート、および、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートのそれぞれにレプリカを取りコロニーを生育させ、双方の生育コロニー数を測定し、全生育コロニーを１００％としたとき染色体上相同組換えが成立していたコロニーの占める割合を求めた。また、染色体上相同組換えが成立してクロラムフェニコール感受性を示すようになったコロニーのコロニーＰＣＲを行い、クロラムフェニコール感受性を示すコロニー数を１００％としたとき、ｐｆｌＢ遺伝子が消失して部位特異的遺伝子改変が成立した割合を求めた。  また、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニー数をカウントした。最後に温度条件の同じ３本のフラスコで得られたデータの平均値を求めた。
【００６１】
その結果、培養温度２５℃では表１に示したように、２４０分間で全コロニーの５８％は既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち７６％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは４４コロニーであった。１３５０分間では全コロニ
ーの１００％が染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち４７％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは４７コロニーであった。
【００６２】
【表１】
2004313174.tif 000003
【００６３】
培養温度３０℃では表２に示したように、２４０分間で全コロニーの８６％は既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち７５％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは６５コロニーであった。４２０分間では全コロニーの９７％が染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち７３％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは８１コロニーであった。
【００６４】
１２００分間では全コロニーの９９％が染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち２６％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは２６コロニーであった。
【００６５】
【表２】
2004313174.tif 000004
【００６６】
培養温度３７℃では表３に示したように、２５０分間で全コロニーの７％は染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち８５％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは６コロニーであった。３１０分間では全コロニーの２９％が染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち８２％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは２３コロニーであった。
【００６７】
１１６０分間では全コロニーの１００％が染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち９５％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは９５コロニーであった。
培養温度４２℃では、６０分間〜１２００分間の培養後、染色体上相同組換えが成立した株を得ることはできなかった。
【００６８】
【表３】
2004313174.tif 000005
【実施例５】
【００６９】
染色体上相同組換えによるｐｆｌＢ遺伝子破壊株の作製（２）
実施例１においてピルベートホルメートリアーゼ（ｐｆｌＢ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域がそれぞれ染色体上に同時に存在することが確認されたＡＴＣＣ１１３０３株形質転換体をＬＢ液体培地２０ｍLを入れた１００ｍLのバッフル付きフラスコ３本に植え、これを３０℃で培養した。以降の処理は実施例４と同様に行った。    
【００７０】
その結果、表４に示したように、２４０分間で全コロニーの６５％は既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち１０％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成
立したコロニーは７コロニーであった。
【００７１】
【表４】
2004313174.tif 000006
【実施例６】
【００７２】
染色体上相同組換えによるｄｌｄ遺伝子破壊大腸菌株の作製
実施例２においてＮＡＤＨ非依存性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ｄｌｄ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域がそれぞれ染色体上に同時に存在することが確認されたＭＧ１６５５株形質転換体をＬＢ液体培地２０ｍLを入れた１００ｍLのバッフル付きフラスコ３本に植え、これを３０℃で培養した。以降の処理は実施例４と同様に行った。    
【００７３】
その結果、表５に示したように、２４０分間で全コロニーの８０％は既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち５８％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは４６コロニーであった。
【００７４】
【表５】
2004313174.tif 000007
【実施例７】
【００７５】
染色体上相同組換えによるａｔｐＡ−ａｔｐＩ遺伝子破壊株の作製
実施例２においてｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ周辺領域（ａｔｐＡ−ａｔｐＩ）遺伝子の５’側近傍領域、及び３’側近傍領域と相同な領域がそれぞれ染色体上に同時に存在することが確認されたＭＧ１６５５株形質転換体をＬＢ液体培地２０ｍLを入れた１００ｍLのバッフル付きフラスコ３本に植え、これを３０℃で培養した。以降の処理は実施例４と同様に行った。    
【００７６】
その結果、表６に示したように、２４０分間で全コロニーの３１％は既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち５０％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは１５コロニーであった。６００分間では全コロニーの１００％が既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち１％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニー１００コロニー中の部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーは１コロニーであった。１２００分間では全コロニーの１００％が既に染色体上相同組換えが成立してプラスミドが脱落しており、そのうち０．０９％は部位特異的遺伝子改変が成立していた。このとき、全生育コロニーを１０００コロニー選ぶと、染色体上相同組換えはほぼ１００％成立しているが、求める部位特異的遺伝子改変が成立したコロニーの数は１コロニーしかない。
【００７７】
【表６】
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【実施例８】
【００７８】
染色体上相同組換えによる変異３―デオキシー アラビノヘプツロソネートー７−ホスフェートシンターゼ遺伝子導入ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいてチロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異３―デオキシー アラビノヘプツロソネートー７−ホスフェートシンターゼ遺伝子は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型の株にフェニルアラニンのアナログであるｍ−フロロフェニルアラニンの耐性と、フェニルアラニン、およびチロシンの生産能を付与することが知られている。（特開昭６１−１２４３７５参照）。
【００７９】
３―デオキシー アラビノヘプツロソネートー７−ホスフェートシンターゼ遺伝子（以下「ＤＳ遺伝子」と記す）、およびチロシンおよびフェニルアラニンによるフィードバック阻害が実質的に解除された変異ＤＳ遺伝子が染色体上に同時に存在する細胞の作製方法は米国特許５６１６４８０を示すことができる。
【００８０】
以下にＤＳ遺伝子および変異ＤＳ遺伝子が染色体上に同時に存在するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞、ＡＪ１２５７３株の作製方法を示す。
まず、変異ＤＳ遺伝子を含むプラスミドであるｐＡＲ−１（特開昭６１−１２４３７５参照）をＳａｕ３ＡＩによって部分分解し、制限酵素ＢａｍＨＩにより完全消化したｐＨＫ４（特開平５−７４９１参照）と接続したプラスミドを取得する。
【００８１】
これをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６株に電気パルス法にて導入する。５００μｇ／ｍＬのｍ−フルオロフェニルアラニンを含む最少培地プレート（グルコース２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ、尿素２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ１０ｍｇ、ビオチン５０μｇ、サイアミン塩酸塩２０００μｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含む。ｐＨ６．６）上で形質転換体を選択する。形質転換体よりプラスミドを調製し、大きさの最も小さいものを選択する。このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨｌ及びＳａｌｌで切断し、変異ＤＳ遺伝子を含む１．９キロベースの断片を回収する。この断片を、エシェリシア・コリと、コリネ型細菌中で自律増殖でき、宿主にカナマイシン耐性を付与する特徴を有する温度感受性プラスミドｐＨＳＣ４（特開平５−７４９１参照）をＢａｍＨｌおよびＳａｌｌで消化した断片と接続する。作製したプラスミドをｐＨＳＣ４Ｄと命名する。
【００８２】
以下に該ｐＨＳＣ４Ｄのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムへの導入と該プラスミドが染色体へ組み込まれた株の選択方法について説明する。
ｐＨＳＣ４Ｄをプラスミドとして含むエシェリシア・コリＡＪ１２５７２株（ＦＥＲＭ−Ｐ１１７６４、特開平５−７４９１号公報参照）よりプラスミドｐＨＳＣ４Ｄを調製し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＪ１２０３６株に電気パルス法で導入する。形質転換体の選択は、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートで、２０℃にて行う。導入後、得られた株をＭ−ＣＭ２Ｇプレート培地にて培養した後、５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇプレートに、プレートあたり１０３〜１０５ｃｆｕとなるよう希釈し、塗布する。プレートを３４℃にて培養する。温度感受性プラスミド をプラスミドの形態で保持する株は、この温度ではプラスミドの複製が阻害されるため、クロラムフェニコール感受性となり、コロニーを形成できないが、ゲノム外―ゲノム間相同組換えによりゲノムにプラスミドＤＮＡを組み込んだ株はクロラムフェニコール耐性を示しコロニーを形成する。該プラスミドが染色体へ組み込まれた形質転換体は上記のようにして得ることができる。本形質転換体の染色体のＤＳ遺伝子の近傍に、ベクタープラスミド由来の変異型ＤＳ遺伝子が相同的な組換えにより組み込まれていることは、サザンハイブリダイゼーション、あるいは組み込み菌のｍ−フロロフェニルアラニンの耐性により確認できる。その結果得られるＤＳ遺伝子、変異ＤＳ遺伝子が染色体上に同時に存在する細胞株例として、米国特許５６１６４８０記載のＡＪ１２５７３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３５２６）を示すことができる。
本菌株は上記の寄託番号により、茨城県つくば市東１丁目１番地１号中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づいて寄託されていて、請求により有償にて分譲される。
【００８３】
本菌株ＡＪ１２５７３株をＭ−ＣＭ２Ｇ培地（グルコース５ｇ、ポリペプトン１０g、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ１５ｇ、ＤＬ-メチオニン０．２ｇを純水１Lに含む、ｐＨ７．２）の液体培地に植菌し、２０℃で培養を行った。培養中に経時的にサンプリングし、希釈したものをＭ−ＣＭ２Ｇ寒天培地（寒天１．５％）に植菌し、３４℃で培養した。
【００８４】
得られたコロニーを５μｇ/ｍLのクロラムフェニコールを含むＭ−ＣＭ２Ｇ寒天培地、およびｍ−フルオロフェニルアラニンを含む寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性の有無とｍ−フロロフェニルアラニン耐性の有無を調べた。クロラムフェニコール感受性は、ＡＪ１２５７３株の染色体上に存在するＤＳ遺伝子と変異ＤＳ遺伝子にはさまれた領域にコードされていたクロラムフェニコール耐性遺伝子がＤＳ遺伝子間の染色体上相同組換えに伴って染色体上から脱落したことを意味する。また、ｍ−フェニルアラニン耐性は変異ＤＳ遺伝子が染色体上に存在することを意味する。
【００８５】
その結果、表７に示したように２４０分間で１０％において染色体上相同組換えが成立し、そのうち変異ＤＳ遺伝子のみが存在するようになった株は４５％だった。６００分で間は１５％において染色体上相同組換えが成立し、そのうち変異ＤＳ遺伝子のみが存在するようになった株は５５％だった。１２００分間では８５％において染色体上相同組換えが成立し、そのうち、変異ＤＳ遺伝子のみが存在するようになった株は０．０６％だった。
【００８６】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】本発明の工程の概略を示す模式図である。ＡとＡ’、ＣとＣ’は相同な配列を表す。点線は相同組換えが起きうることを示す。《状態２》は配列Ａ，Ａ’間で相同組換えが起きた状態を示す。《状態４》の左図は配列Ａ，Ａ’間で相同組換えが起きた状態を示す。右図は配列Ｂ，Ｂ’間で相同組換えが起きた状態を示す。
【図１】
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【配列表】
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