(57)【要約】【課題】蛍光物質などの標識物質を簡単に導入することができるコレステロール検出試薬およびそれを用いたコレステロールの検出方法を提供すること。【解決手段】標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを含む、コレステロール検出試薬。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを含む、コレステロール検出試薬。
【請求項２】
標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルが、親和性物質又は蛍光物質で標識されている、請求項１に記載のコレステロール検出試薬。
【請求項３】
標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを用いることを特徴とする、コレステロールの検出方法。
【請求項４】
親和性物質又は蛍光物質で標識されているポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを用いる、請求項３に記載のコレステロールの検出方法。
【請求項５】
下記式（式中、ｎは１０〜１０００の整数を示す）で表される化合物。
【化１】
2004354284.tif 000006
【請求項６】
ｎが２１又は４９である、請求項５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コレステロール検出試薬、及びそれを用いたコレステロールの検出方法に関する。より詳細には、本発明は、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを含むコレステロール検出試薬、及びそれを用いたコレステロールの検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内コレステロールの含量および分布は厳密に調節されている。細胞内において、コレステロールはゴルジ後膜に蓄積する（Ｍ．Ｓ．Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１２８０−１．（１９９３））。原形質膜上で、コレステロールはスフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質と一緒になってミクロドメインを形成する（Ａ．Ｒｉｅｔｖｅｌｄ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３７６，４６７−７９．（１９９８）；及び、Ｒ．Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１１，１−９．（１９９８））。カベオリン、及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合糖タンパク質および二重にアシル化された非受容体型チロシンキナーゼ等の他のクラスのタンパク質がこのドメインに存在する（Ｔ．Ｖ．Ｋｕｒｚｃｈａｌｉａ，他、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，４２４−３１．（１９９９）；及びＥ．Ｉｋｏｎｅｎ，他、Ｔｒａｆｆｉｃ  １，２１２−７．（２０００））。このドメインは脂質ラフトとして知られている。脂質ラフトは、シグナリング、接着、運動および膜通過などの細胞機能において重要な役割を果たす（Ｄ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，他、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４，１１１−３６（１９９８）；及び、Ｋ．Ｓｉｍｏｎｓ，他、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １，３１−９．（２０００））。メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）により表面のコレステロールを除去するか、または代謝阻害剤を用いることにより細胞のコレステロール含量が減少すると、このドメインの分解が引き起こされる（Ｌ．Ｊ．Ｐｉｋｅ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，２２２９８−３０４．（１９９８）；Ａ．Ｐｒａｌｌｅ，他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４８，９９７−１００８．（２０００）；及び、Ｋ．Ｒｏｐｅｒ，他、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，５８２−９２．（２０００））。
【０００３】
細胞のコレステロール含量は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成と、リポタンパク質のエンドサイトーシスにより外部から得られるコレステロールとの均衡を通して調節される（Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，１１０４１−８．（１９９９）；Ｋ．Ｓｉｍｏｎｓ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，１７２１−６．（２０００）；及び、Ｙ．Ａ．Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，６５７−６８．（２００１））。この調節が破綻すると、動脈硬化またはニーマン−ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）のような病態が引き起こされる（Ｐ．Ｇ．Ｐｅｎｔｃｈｅｖ  他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２２５，２３５−４３．（１９９４）；及び、Ｌ．Ｌｉｓｃｕｍ，Ｔｒａｆｆｉｃ  １，２１８−２５．（２０００））。後期エンドソームのリゾビスホスファチジン酸リッチな内膜ドメインは収集および分配装置として作用することにより、コレステロール輸送の調節に関与する（Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  他、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １，１１３−８．（１９９９））。しかし、コレステロールおよび／またはコレステロールリッチな膜ドメインの細胞内輸送については、ほとんど知られていない。
【０００４】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテル（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌｓ）は、疎水性のコレステリル部分および親水性のポリエチレングリコール部分からなる非イオン性かつ両親媒性の一群の分子である（Ｈ．Ｉｓｈｉｗａｔａ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５９，１２３−３５（１９９７））。ＰＥＧ（５０）−Ｃｈｏｌ（分子量は２５８７、括弧内の数字である５０はエチレングリコールの反復数を示す）は、培地中の生細胞に添加すると、クラスリンを介したトランスフェリンのインターナリゼーションに影響を与えない条件下において、クラスリンとは無関係であるカベオラ様エンドサイトーシスを阻害することが知られている（Ｔ．Ｂａｂａ  他、Ｔｒａｆｆｉｃ  ２，５０１−１２．（２００１））。しかしながら、ＰＥＧ−Ｃｈｏｌが細胞の如何なる成分と相互作用するのかは不明であった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｍ．Ｓ．Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１２８０−１．（１９９３）
【非特許文献２】
Ａ．Ｒｉｅｔｖｅｌｄ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３７６，４６７−７９．（１９９８）
【非特許文献３】
Ｒ．Ｅ．Ｂｒｏｗｎ，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１１，１−９．（１９９８）
【非特許文献４】
Ｔ．Ｖ．Ｋｕｒｚｃｈａｌｉａ，他、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１，４２４−３１．（１９９９）
【非特許文献５】
Ｅ．Ｉｋｏｎｅｎ，他、Ｔｒａｆｆｉｃ  １，２１２−７．（２０００）
【非特許文献６】
Ｄ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，他、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １４，１１１−３６（１９９８）
【非特許文献７】
Ｋ．Ｓｉｍｏｎｓ，他、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １，３１−９．（２０００）
【非特許文献８】
Ｌ．Ｊ．Ｐｉｋｅ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，２２２９８−３０４．（１９９８）
【非特許文献９】
Ａ．Ｐｒａｌｌｅ，他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４８，９９７−１００８．（２０００）
【非特許文献１０】
Ｋ．Ｒｏｐｅｒ，他、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，５８２−９２．（２０００）
【非特許文献１１】
Ｍ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，１１０４１−８．（１９９９）
【非特許文献１２】
Ｋ．Ｓｉｍｏｎｓ，他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，１７２１−６．（２０００）
【非特許文献１３】
Ｙ．Ａ．Ｉｏａｎｎｏｕ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２，６５７−６８．（２００１）
【非特許文献１４】
Ｐ．Ｇ．Ｐｅｎｔｃｈｅｖ  他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２２５，２３５−４３．（１９９４）
【非特許文献１５】
Ｌ．Ｌｉｓｃｕｍ，Ｔｒａｆｆｉｃ  １，２１８−２５．（２０００）
【非特許文献１６】
Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  他、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １，１１３−８．（１９９９）
【非特許文献１７】
Ｈ．Ｉｓｈｉｗａｔａ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５９，１２３−３５（１９９７）
【非特許文献１８】
Ｔ．Ｂａｂａ  他、Ｔｒａｆｆｉｃ  ２，５０１−１２．（２００１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コレステロールと特異的に結合することによりコレステロールを検出することができる物質を含む新規なコレステロール検出試薬およびそれを用いたコレステロールの検出方法を提供することを解決すべき課題とした。特に本発明は、蛍光物質などの標識物質を簡単に導入することができるコレステロール検出試薬およびそれを用いたコレステロールの検出方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは先に、ＰＥＧ（５０）−Ｃｈｏｌによりクラスリンとは無関係のエンドサイトーシスが特異的に阻害されるという以前の知見を考慮して、ＰＥＧ−Ｃｈｏｌが一以上の脂質ラフト成分と特異的に相互作用している可能性があるものと推測し、オーバーレイ・アッセイを使用して、ＰＥＧ−Ｃｈｏｌが様々な脂質とｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合することを確認した。さらに細胞内でＰＥＧ−Ｃｈｏｌが相互作用する物質を検討した結果、ＰＥＧ−Ｃｈｏｌがコレステロールに特異的に結合することができることを見出した（特願２００２−１６０２７７）。特願２００２−１６０２７７に記載した試薬（ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）を用いることにより、簡便かつ迅速にコレステロールを検出することが可能になった。コレステロールを含む細胞内のステロールの動態を追跡することは基礎研究および診断において重要であるが、そのためには安定な蛍光物質をＰＥＧ−Ｃｈｏｌに結合させる必要がある。そこで、本発明者らは今回、ＰＥＧ−Ｃｈｏｌのポリエチレングリコール末端にアミノ基を導入することにより、蛍光物質を簡単に導入できるＰＥＧ−Ｃｈｏｌを製造することを試みた。本発明者らはアミノ基の導入のために、新しい有機合成ステップを構築した。このようにして合成されたアミノ基誘導体（Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ）に安定な蛍光物質を導入することにより、細胞内のステロールの動態をリアルタイムで追跡することが可能になった。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを含む、コレステロール検出試薬が提供される。
本発明の別の側面によれば、標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを用いることを特徴とする、コレステロールの検出方法が提供される。
【０００９】
本発明において、好ましくは、標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルは、親和性物質又は蛍光物質で標識されている。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、下記式（式中、ｎは１０〜１０００の整数を示す）で表される化合物が提供される。好ましくは、ｎは２１又は４９である。
【００１１】
【化２】
2004354284.tif 000002
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のコレステロール検出試薬は、標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを含むものである。
本発明で用いるポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルとは、具体的には、下記式で表される化合物であり、疎水性のコレステリル部分および親水性のポリエチレングリコール部分からなる化合物である（Ｈ．Ｉｓｈｉｗａｔａ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５９，１２３−３５（１９９７））。
【００１３】
【化３】
2004354284.tif 000003
【００１４】
ｎはポリエチレングリコール部分におけるエチレングリコールの反復数を示す。本発明で用いるポリ（エチレングリコール）ｎ２−アミノエチルコレステリルエーテルにおけるｎの数は、コレステロールとの結合性に悪影響を与えない限り特に限定されないが、例えば、１０〜１０００、好ましくは２０〜２００、より好ましくは２０〜１００程度である。好ましく使用できる一例としては、ｎが２１又は４９のポリエチレングリコール部分を含むポリ（エチレングリコール）ｎ２−アミノエチルコレステリルエーテルを挙げることができる。
【００１５】
本発明で用いる、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルは新規の化合物であり、例えば、本明細書の実施例に記載の方法により合成することができる。
【００１６】
ポリエチレングリコールコレステリルエーテルは、コレステロールを溶媒に溶かしエチレングリコールガスを注入し反応させることにより製造することができる（Ｉｓｈｉｗａｔａ他、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ４３，  １００５−１０１１（１９９５））。この他、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルは、コレステロールのトルエンスルホン酸エステルとポリエチレングリコールとを反応させる方法により製造することもできる（Ｐａｔｅｌ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９７：２０−２６（１９８４））。
【００１７】
さらに、ポリエチレングリコールコレステリルエーテルを既報（Ｉｓｈｉｗａｔａ他、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ４３，  １００５−１０１１（１９９５））の通りメシル化してメシル化ＰＥＧ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを製造する。次いで、メシル化ＰＥＧ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、アジ化ナトリウム及び炭酸カリウムの混合物を適当な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミドなど）の存在下で反応させることにより、アジド体（アジド化ＰＥＧ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を製造する。続いて、得られたアジド化ＰＥＧ−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌのメタノール溶液をＬｉｎｄｌａｒ触媒（５％  Ｐｄ  ｏｎ  ＣａＣＯ３）存在下にＨ２気流中において還元反応を行なうことにより目的とするポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを取得することができる。
【００１８】
本発明で用いるポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルとしては、検出のための標識物質が結合しているものを使用することが好ましい。このような標識物質の種類は特に限定されないが、例えば、親和性物質、蛍光物質、放射性物質などが挙げられる。
【００１９】
親和性物質としては、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどを使用することができる。蛍光物質としては、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＦＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  、ジアルキルアミノクマリン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、Ｘ−ローダミン、ＮＢＤ、ＴＲＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＩＲ１４４、ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなどを使用することができる。放射性物質としては、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃなどを使用することができる。この他、酸化ストレス検出剤  （同仁）ｃａｒｂｏｘｙ−ＰＴＩＯ、ＤＴＣＳ；ＮＯ発生剤（同仁）ＢＮＮ５；種々のｃａｇｅｄアミノ酸；キレート剤（例えば、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＮＴＡなど）、種々のｃａｒｂｏｘｙ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ（（カルボン酸）Ｓ−Ｓ（カルボン酸）の構造を有する）等を使用することができる。
【００２０】
本発明のコレステロール検出試薬は、上記したように標識されていてもよい、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを含む限り、その形態は特に限定されず固体でも液体（溶液、懸濁液など）でもよい。液体の場合には適当な溶媒（好ましくは、該ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルが一定の溶解度を示す有機溶媒など）に溶解または懸濁することによって試薬を調製することができる。上記した形態で提供される本発明の試薬には、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテル以外の助剤（例えば、保存剤、安定化剤、ｐＨ緩衝剤など）を適宜添加することもできる。
【００２１】
本発明によれば、標識されていてもよいポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを用いてコレステロールを検出する方法も提供される。検出はインビトロで行ってもよいし、細胞内で行ってもよいし、あるいは生体内で行ってもよい。先ず、検出すべきコレステロールを含む試料と、（好ましくは標識されている）ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルとを一定条件下で接触させることにより、両者を結合させる。
【００２２】
結合後に、コレステロールに結合したポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルの検出を行う。検出は、用いた標識の種類に応じて適宜行うことができる。
例えば、ビオチンを標識として用いた場合には、ビオチンに特異的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出を行うことができる。例えば、コレステロールに結合したビオチン標識ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルに対して、アビジンまたはストレプトアビジンを反応させ、次いで、ビオチン化したアルカリホスファターゼを結合させると、ビオチンを介して酵素が結合する。未結合の酵素を除去した後、アルカリホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）と反応させると、ビオチン標識ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルが存在する場合には紫色の発色が見られ、検出することができる。ジゴキシゲニンを標識として用いた場合には、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を用いて上記の方法と同様に検出を行うことができる。なお、発色用の酵素としては、アルカリホスファターゼ以外にも西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる系も知られている。
【００２３】
フルオレセインなどの蛍光物質を使用した場合には、コレステロールとの反応後に蛍光を測定することによりコレステロールと結合したポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルを検出することができる。蛍光は一定の励起光を照射して発生する蛍光エネルギーを測定することにより、蛍光の定性的または定量的な検出を行うことができる。定量に際しては、蛍光エネルギーの強度をコレステロールの存在量の指標として評価することもできる。蛍光エネルギーまたは蛍光は、市販の適当な検出器や蛍光顕微鏡などを用いて測定することができる。
【００２４】
放射性物質を使用した場合には、コレステロールとの反応後にコレステロールに結合した放射活性を当業者に公知の方法により測定することにより、コレステロールの検出を行うことができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００２５】
【実施例】
合成例１：（エチレングリコール）２１−２−アジドエチルコレステリルエーテル  （アジド化ＰＥＧ２２Ｃｈｏｌと略す）の合成
【００２６】
【化４】
2004354284.tif 000004
【００２７】
ＰＥＧ２２−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを既報（Ｉｓｈｉｗａｔａ他、Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ４３，  １００５−１０１１（１９９５））の通りメシル化して得たメシル化ＰＥＧ２２−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（３．８ｇ，  ２．６５  ｍＭ）、アジ化ナトリウム（０．５１７ｇ）、炭酸カリウム（１．１ｇ，  ７．９５  ｍＭ）を含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（２０ｍｌ）を攪拌下、１００℃で５時間反応させた。減圧下にＤＭＦを除去し、残渣をクロロホルムで抽出後、５％炭酸水素ナトリウム液で洗浄し、有機層はＭｇＳＯ４で乾燥後濃縮することにより、淡褐色の残渣（４．３ｇ）を得た。シリカゲルによるカラムクロマトグラフィーを行い、アジド体（３．１５ｇ）を得た。
【００２８】
元素分析Ｃ７１Ｈ１３３Ｎ３Ｏ２２）
Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ；  Ｃ  （６１．７６），  Ｈ  （９．７１），  Ｎ  （３．０４）
Ｆｏｕｎｄ；  Ｃ  （６１．８１），  Ｈ  （９．９５），  Ｎ  （３．３１）
ＮＭＲ  （ｄ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３）；  ０．６７  （３Ｈ，  Ｓ，  ＣＨ３），  ３．１６  （１Ｈ，  ｍ，  ＞ＣＨ−Ｏ−），  ３．３９  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ），  ５．３４  （１Ｈ，  −ＣＨ＝Ｃ＜）
ＩＲ  （ν  ｃｍ−１  ｉｎ  ＣＨＣｌ３）：  ２１０６
ＴＬＣ：  ０．６  （ＭｅＯＨ：  ＣＨＣｌ３  ＝２：  １．５）
【００２９】
合成例２：（エチレングリコール）２１−２−アミノエチルコレステリルエーテル  （アミノ−ＰＥＧ２２Ｃｈｏｌと略す）の合成
【００３０】
【化５】
2004354284.tif 000005
【００３１】
アジド化ＰＥＧ２２−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（２．９５ｇ，  ２．１３  ｍＭ）のメタノール溶液（５０ｍｌ）をＬｉｎｄｌａｒ触媒  （１．５ｇ，  ５％  Ｐｄ  ｏｎ  ＣａＣＯ３）存在下にＨ２気流中一夜還元反応を行なった。得られた還元成績体（２．７ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３  ＝１／３）に供して、目的物（１．６ｇ）を結晶性残渣として得た。
【００３２】
元素分析Ｃ７１Ｈ１３３ＮＯ２２）
Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ；  Ｃ  （６２．７４），  Ｈ  （１０．０４），  Ｎ  （１．０３）
Ｆｏｕｎｄ；  Ｃ  （６２．７９），  Ｈ  （９．９４），  Ｎ  （１．３３）
ＮＭＲ  （ｄ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３）；  ０．６８  （３Ｈ，  Ｓ，  ＣＨ３），  ２．８６  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ），  ３．１８  （１Ｈ，  ｍ，  ＞ＣＨ−Ｏ−），  ３．４６  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ），  ５．３４  （１Ｈ，  −ＣＨ＝Ｃ＜）
ＩＲ  （ν  ｃｍ−１  ｉｎ  ＣＨＣｌ３）：  ２１０６
ＴＬＣ：  ０．４５  （ＮＨ４ＯＨ飽和ＣＨＣｌ３：  ＭｅＯＨ：  ＣＨＣｌ３  ＝３０：１）
【００３３】
合成例３：（エチレングリコール）４９−２−アミノエチルコレステリルエーテル  （アミノ−ＰＥＧ５０Ｃｈｏｌと略す）の合成
メシル化ＰＥＧ２２−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（３．８ｇ）の代わりにメシル化ＰＥＧ５０−Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（３ｇ）を使用する以外は実験例１及び２と同様の方法により、目的物（１．２ｇ）を結晶性残渣として得た。
【００３４】
元素分析Ｃ１２７Ｈ２４７ＮＯ５０）
Ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ；  Ｃ  （５８．９３），  Ｈ  （９．６２），  Ｎ  （０．５４）
Ｆｏｕｎｄ；  Ｃ  （５７．９４），  Ｈ  （９．４９），  Ｎ  （０．５５）
ＮＭＲ  （ｄ  ｉｎ  ＣＤＣｌ３）；  ０．６７  （３Ｈ，  Ｓ，  ＣＨ３），  ３．９２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝５．０Ｈｚ），  ３．１８  （１Ｈ，  ｍ，  ＞ＣＨ−Ｏ−），  ５．３４  （１Ｈ，  −ＣＨ＝Ｃ＜）
ＩＲ  （ν  ｃｍ−１  ｉｎ  ＣＨＣｌ３）：  ２１０６
ＴＬＣ：  ０．３（ＮＨ４ＯＨ飽和ＣＨＣｌ３：  ＭｅＯＨ：  ＣＨＣｌ３  ＝３０：１）
【００３５】
合成例４：アミノ−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ  の蛍光色素ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ＳＥ  による修飾
ＡＦ４８８ＰＥＧＣｈｏｌ等の調製は以下のように行なう。実験例２及び３で調整したアミノ−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌを、トリエチルアミン０．２％を含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かし（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）、２倍モル濃度のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ＳＥ（米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含むＤＭＦを等量加え、遮光し室温３０分反応させる。反応物を、セファデックスＬＨ２０カラムクロマトグラフィー（１ｘ７０ｃｍ；メタノール）にかける。ボイドボリューム付近に産物であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−  ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ、ついで未反応のアミノ−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ、未反応のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ＳＥ関連物質の順に溶出される。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ＳＥをはじめ市販の蛍光試薬は非蛍光性不純物を含むことがある。そこでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−  ＰＥＧ−Ｃｈｏｌを含む分画を集め、シリカゲル薄層クロマトグラフィーにて展開分離する（メルク社Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０、メタノール：クロロホルム＝２：１、Ｒｆ＝０．６）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−  ＰＥＧ−Ｃｈｏｌは主要な蛍光スポットで、他の僅かなスポットと分離される。これをかきとり、メタノール：クロロホルム（ＮＨ４ＯＨ飽和）＝１：１液にて抽出する。これを、濃縮後メタノールに溶かし遮光保存する。
【００３６】
蛍光物質として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ＳＥの代わりに、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  ＳＥ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ  ＳＥ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＦＡＭ  ＳＥ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、Ｃｙ３  （英国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、Ｃｙ３．５  （英国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ＴＲＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に変えて同様の操作で蛍光標識化アミノ−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌを調製した。
【００３７】
試験例１：各種の蛍光標識ＰＥＧ−Ｃｈｏｌによる細胞内コレステロールの染色
カバーグラス上に正常ヒト皮膚由来繊維芽細胞を培養する。伸展を確認した後、細胞を３％パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２、ＰＢＳと略記）にて室温１０分固定する。細胞をＰＢＳで洗浄後、５０μｇ／ｍｌジギトニンのＰＢＳ溶液にて室温１０分処理し、膜を透過性にする。各種の蛍光標識ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−ＰＥＧ−Ｃｈｏｌなど）を５０ｎＭにて投与する。試料をＰＢＳにてよく洗浄し、包埋観察する。蛍光標識ＰＥＧ−Ｃｈｏｌは細胞内に浸透し、コレステロールの濃度の高い後期エンドソーム、リソゾーム、ゴルジ体等に分布し蛍光を発する  （図１）。
【００３８】
試験例２：ＰＥＧ−Ｃｈｏｌの安定な蛍光誘導体を用いた細胞内のコレステロール動態の追跡
カバーグラス上に正常ヒト皮膚繊維芽細胞を培養する。伸展を確認した後、蛍光標識ＰＥＧ−Ｃｈｏｌ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−（ＰＥＧ）５０−Ｃｈｏｌ）を培養液ダルベッコ変法ＭＥＭ−１０ｍＭ  Ｎａ  Ｈｅｐｅｓ  （ＤＭＥ−Ｈｅｐｅｓ）  ｐＨ７．２中にて２００ｎＭ室温１分投与する。細胞を、ＤＭＥ−Ｈｅｐｅｓで洗浄し３７℃でチェイスする。蛍光標識ＰＥＧ−Ｃｈｏｌは、細胞表面に分布し、一部がスポット状に集中し蛍光を発する（図２）。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、蛍光団の安定性および量子効率が高く、バックグラウンド染色が低く、細胞毒性が低く、さらにサイズが比較的小さいために実施濃度での構造摂動が少ないといった利点を有する新規なコレステロール検出試薬が提供されることになった。また、本発明のコレステロール検出試薬は、蛍光物質による標識を容易に行うことができる。安定な蛍光物質で標識した本発明のコレステロール検出試薬を利用することにより、ステロールの細胞内動態をリアルタイムで追うことが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、各種の蛍光標識ＰＥＧ−Ｃｈｏｌを用いて細胞内コレステロールを染色した結果を示す。図１において、括弧内の数字が２２とあるのは、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルとして、アミノ−ＰＥＧ２２Ｃｈｏｌと使用したことを示し、括弧内の数字が５０とあるのは、ポリエチレングリコール２−アミノエチルコレステリルエーテルとして、アミノ−ＰＥＧ５０Ｃｈｏｌを使用したことを示す。なお、ｆＰＥＧ−Ｃｈｏｌは、ＰＥＧ鎖の遠位末端にフルオレセインを含むフルオレセインＰＥＧ−Ｃｈｏｌ（Ｈ．Ｉｓｈｉｗａｔａ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １３５９，１２３−３５（１９９７））を示す。
【図２】図２は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（５０）を用いて細胞内のコレステロール動態を追跡した結果を示す。
【図１】
2004354284.tif 000007
【図２】
2004354284.tif 000008