(57)【要約】【課題】作製の操作が簡便で、かつ実際の正常眼圧緑内障の病態を反映した正常眼圧緑内障動物モデルを開発すること。【解決手段】本発明歯は、アルミニウム化合物を動物に投与することにより、視神経軸索に障害が惹起され、これにより、眼圧上昇を伴わない優れた正常眼圧緑内障動物モデルを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルミニウム化合物を投与することにより、視神経軸索障害を惹起せしめた正常眼圧緑内障動物モデル。
【請求項２】
アルミニウム化合物が三塩化アルミニウムである請求項１記載の動物モデル。
【請求項３】
投与部位が眼周囲組織である請求項１記載の動物モデル。
【請求項４】
眼周囲組織が結膜である請求項３記載の動物モデル。
【請求項５】
動物にアルミニウム化合物を投与することにより、動物の視神経軸索に障害を惹起させることを特徴とする正常眼圧緑内障動物モデルの作製法。
【請求項６】
請求項１記載の動物モデルを用いることを特徴とする正常眼圧緑内障治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑内障治療薬のスクリーニングに好適な動物モデルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、眼圧の上昇に起因して視神経線維が視神経乳頭部で器質的に障害され、乳頭陥凹と網膜神経線維欠損が起こり、最終的に視野障害をきたす疾患である。最近、眼圧が正常範囲（２１ｍｍHg以下）でありながら、緑内障性視神経障害を生ずる疾患が注目されてきている。この疾患は正常眼圧緑内障と呼ばれ日本では最も頻度の多い緑内障の一型となっている。正常眼圧緑内障治療薬の開発には、眼圧の上昇なしに緑内障性の視神経の障害が起きる動物モデルを用いてスクリーニングすることが望まれているが、未だ適切な正常眼圧緑内障モデルが存在しない。
【０００３】
従来、正常眼圧緑内障動物モデルとしては、視神経軸索に物理的に障害を起こさせたモデルが汎用されている（非特許文献１）。この方法では、マウスの視神経をピンセットでつまんで圧迫することによって障害を起こしているが、圧迫の調節が難しく、得られる結果に差が生じ易いという欠点がある。さらに、この方法では物理的に視神経を障害するため、得られたモデルは実際の病態を反映したものとは言いがたい一面がある。また、薬物の投与により得られた正常眼圧緑内障モデル動物も知られている（非特許文献２）。このモデルは、エンドセリン−１を投与することにより眼血流を低下させ視神経に障害を起こさせたものであるが、この方法では血流を低下させるので、実際の病態とは必ずしも一致しない。
【０００４】
一方、アルミニウム化合物は神経に障害を起こすことが知られている。例えば、非特許文献３には、アルツハイマーにおける神経変性の観察を目的として、ウサギに三塩化アルミニウムを眼内注射し、網膜の神経節細胞内に神経繊維濃縮体（neurofibrillary tangles）が観察されたことが報告されている。非特許文献４には、アルミニウムの眼における毒性研究を目的として、ラットに三塩化アルミニウムを腹腔内投与したところ、網膜色素細胞の薄層化および光受容体細胞の消失が観察されたことが報告されている。しかし、これらの文献には正常眼圧緑内障に関することは一切述べられおらず、正常眼圧緑内障に見られる乳頭陥凹および網膜神経線維欠損も観察されていない。
【非特許文献１】Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2000, 41/13, 4169-4174
【非特許文献２】Survey of Ophthalmology,1995, 39,supplement1, S49-S56
【非特許文献３】Neuroscience letters, 1991, 124,216-220
【非特許文献４】Toxicological Sciences, 2002, 66, 253-260。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような実情から、作製の操作が簡便であり，かつ実際の正常眼圧緑内障の病態を反映した正常眼圧緑内障動物モデルの開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、作製の操作が簡便で実際の正常眼圧緑内障の病態を反映した正常眼圧緑内障モデル動物について鋭意研究した結果、アルミニウム化合物を動物に投与すると、視神経軸索に障害が惹起され、それにより、眼圧上昇を伴わない優れた正常眼圧緑内障動物モデルを作製できることを見出した。
【０００７】
神経軸索の主要な構成蛋白である重分子型ニューロフィラメント（ＮＦ−Ｈ）は通常の視神経軸索においてほとんどリン酸化されているが、緑内障眼においては高度に脱リン酸化を示している。ＮＦ−Ｈの脱リン酸化は軸索流に影響を与える可能性が高く、緑内障では軸索流障害が神経脱落や乳頭陥凹の機序と考えられており、視神経軸索の脱リン酸化が緑内障発症に関与していると考えられる。
【０００８】
そこで、種々検討した結果、アルミニウム化合物がリン酸化状態を効果的に調整し、視神経軸索の障害を惹起することを見出した。
【０００９】
さらに、アルミニウム化合物は眼圧上昇を伴わないことも分かり、本発明の動物モデルが正常眼圧緑内障モデルとして特に優れたものであること見出し本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、アルミニウム化合物を動物に投与することにより、視神経軸索に障害を惹起せしめた正常眼圧緑内障動物モデル、その作製法およびその動物モデルを用いた正常眼圧緑内障治療薬のスクリーニング方法に関するものである。
【００１１】
本発明における動物としては、通常実験動物として用いられているものであれば特に制限は無く、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ブタ等が挙げられるが、比較的ヒトの視神経乳頭に形態が類似しているモルモットまたはサルが好ましい。
【００１２】
本発明で使用するアルミニウム化合物としては、市販の無機または有機のアルミニウム化合物を使用すればよいが、投与および取り扱いの利便性から水溶性のものが好ましい。特に好ましい例としては三塩化アルミニウムが挙げられる。アルミニウム化合物は、生理的に許容される基剤に溶解または懸濁して投与することができる。基剤は生理的に許容されるものであればよく、生理食塩水が好ましい。基剤には、必要に応じて塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、リン酸水素二ナトリウム等の緩衝剤、塩酸、水酸化ナトリウム等のｐH調整剤を加えることができる。
【００１３】
アルミニウム化合物は、１眼あたり１μｇ〜１０００μｇを投与すればよく、動物種、体重、週令、性別等によって適宜増減することができる。投与回数は、１〜４週間に１回でよいが、動物種、体重、週令、性別等によって適宜増減することができる。モルモットの場合は、１眼あたり１０〜２０μｇを週１回投与することが好ましい。
【００１４】
アルミニウム化合物の投与方法には特に制限はないが、これを眼周囲組織に注入するのが好ましい。眼周囲組織とは、結膜またはテノン嚢等の球後組織を示す。より好ましくは結膜下への注入である。これらの投与法は、眼内組織への侵襲度が低く、且つ、視神経に効率よく薬物を送達することが出来、複数回投与が可能な方法である。投与回数は多くなるが、点眼による投与も可能である。これに対し、静脈注射等の全身投与は、視神経への送達量が極めて少なく、効果的な方法ではない。また、眼内に直接投与する硝子体内投与は、眼球への侵襲度が高く複数回投与が困難なのでモデルの作製方法としては好ましくない。
【００１５】
本発明の動物モデルを用いた正常眼圧緑内障治療薬のスクリーニングは、動物モデルに試験薬物を投与し、公知の検定方法に従って行うことができる。
【発明の効果】
【００１６】
後述する正常眼圧緑内障モルモットモデルの作製の項で詳述するが、三塩化アルミニウムの結膜下への週１回・６週間の投与により、視神経軸索の脱リン酸化が進み、神経線維の脱落が観察される。これらの変化は慢性眼圧上昇によって作製されたサルの実験緑内障と同等であり、また、ヒトの摘出緑内障眼における組織変化と類似するものである。さらに、投与前後で眼圧に変化は無く、注射部位にも異常はみられない。従って、本動物モデルは、簡便な方法で作製でき、実際の緑内障性の視神経障害に類似した症状を呈するので、優れた正常眼圧緑内障モデル動物であるといえる。また、本モデル動物を用いたスクリーニングは、正常眼圧緑内障治療薬の開発に非常に有用な手段となりうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１８】
［正常眼圧緑内障モルモットモデルの作製］
＜実験方法＞
１）モルモットが飼育環境に十分慣れたことを確認後、細隙灯にて眼科的異常のないことを確認し、基礎眼圧値の測定を以下の要領で両眼において行った。
【００１９】
測定方法：トノペンを用いて、昼間（午前１０時から午後２時くらい）の間に眼圧を測定した。０．４％塩酸オキシブプロカインの点眼によりモルモットを麻酔した後、眼瞼が測定に障害にならないよう、また、眼球を強く圧迫して眼圧値に影響を及ぼさないように注意して、該眼圧測定を行った。測定眼圧値として変動値５％未満の値を採用した。この測定を１日２回以上繰り返し、得られた値の平均をその測定日の眼圧値とした。眼圧測定は２日間行い、その平均を基礎眼圧値とした。
【００２０】
２）基礎眼圧値測定と同じ要領で、三塩化アルミニウム投与前の眼圧を測定した。
【００２１】
３）三塩化アルミニウムを５ｍＭになるように生理食塩水に溶解し、得られた投与液を任意の片眼の外側結膜下に０．１ｍＬ注入した。他眼の外側結膜下に三塩化アルミニウムの基剤である生理食塩水を同量注入した。
【００２２】
４）上記のような三塩化アルミニウムの投与を毎週１回施行した。毎投与前には上記２）と同様に眼圧値を測定した。
【００２３】
５）投与６週間目に、５％塩酸ケタミンの大量投与(体重１ｋｇあたり１．０〜１．５ｍＬ)にて安楽殺を行った。
【００２４】
６）その後直ちに、視神経が眼球に可能な限り長く付着した状態で、眼球を摘出し、４％パラフォルムアルデヒドにて固定した後、包埋した。
【００２５】
７）網膜および視神経の切片標本を作製し、ＮＦ−Ｈに反応する抗体で染色した。リン酸化されたＮＦ−Ｈに特異的抗体であるＳＭＩ３１および、リン酸化に拘わらず全てのＮＦ−Ｈを認識する抗体であるＮＦ２００によって二重染色を行った。
【００２６】
８）共焦点レーザー顕微鏡を用い、標本を観察した。
【００２７】
＜実験結果＞
１．標本の染色結果
共焦点レーザー顕微鏡では、リン酸化ＮＦ−Ｈは特異的ＳＭＩ３１により緑色に染色され、全てのＮＦ−ＨはＮＦ２００により赤色に染色される。したがって、二重染色により、リン酸化ＮＦ−Ｈ部はＳＭＩ３１およびＮＦ−Ｈの両方に染色されるので、赤色および緑色の２色が合わさって黄色に染色される。脱リン酸化ＮＦ−Ｈ部はＮＦ２００にのみ染色されるので、赤く染色される。
【００２８】
正常眼（基剤投与眼）の網膜標本では、神経線維層は黄色に染色され、ほとんどのＮＦ−Ｈがリン酸化されていることが分かった。一方、三塩化アルミニウム投与眼の網膜標本では、神経線維層の多くが赤く染色され、脱リン酸化ＮＦ−Ｈが増加していることが観察された。さらに、染色量自体の低下も観察された。これはＮＦ−Ｈの総量の低下、即ち、神経線維が脱落していることを示す。神経線維層を除く他の網膜の形態は変化なく、正常眼と同等であった。
【００２９】
視神経標本においても、三塩化アルミニウム投与眼では赤色に染色された部分が増加し、脱リン酸化ＮＦ−Ｈが増加していることが観察された。
【００３０】
２．眼圧の測定結果
上記１）で測定した基礎眼圧は１０〜２０ｍｍＨｇであり、ヒトの眼圧とほぼ同程度であった。アルミニウム投与後も眼圧に変化は見られなかった。
【００３１】
また、三塩化アルミニウム結膜注射部には炎症所見などの異常所見は認められなかった。