(57)【要約】【課題】ウイルス夾雑の危惧のあるフィブリノーゲン溶液のウイルス除去法において、より濾過効率がよく、工業的に有利なウイルス除去方法の提供。【解決手段】フィブリノーゲン溶液をウイルス除去膜処理する前に、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過処理を行うことにより前記課題を解決した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液に濾過助剤を加えて濾過膜により予備濾過し、得られた濾液をウイルス除去膜により濾過するウイルス除去法。
【請求項２】
濾過助剤が珪藻土、パーライトおよびベントナイトから選ばれる少なくとも１種である請求項１記載のウイルス除去法。
【請求項３】
濾過助剤を加えたウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液の予備濾過に用いる濾過膜が、深層濾過膜である請求項１記載のウイルス除去法。
【請求項４】
ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液中に濾過助剤を１．０〜５．０重量％添加して予備濾過を行う請求項１記載のウイルス除去法。
【請求項５】
深層濾過膜の濾過孔径が０．１〜０．５μｍである請求項３記載のウイルス除去法。
【請求項６】
ウイルス除去膜が中空糸フィルターまたはメンブランフィルターである請求項１記載のウイルス除去法。
【請求項７】
中空糸フィルターまたはメンブランフィルターの平均孔径が２０〜６０ｎｍである請求項６記載のウイルス除去法。
【請求項８】
ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液がヒト血漿由来の画分である請求項１記載のウイルス除去法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過工程を行った後ウイルス除去膜処理することにより、単位面積当たりの濾過液量を増加させ、効率的にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【０００２】
【従来の技術】
フィブリノーゲンはプラスミノーゲン、トロンビン、フィブロネクチンおよび血小板のような多くの生理学的に重要なタンパク質と相互作用することが知られており、中でもトロンビンにより限定分解され不溶性のフィブリンとなり、血小板の凝集とともに血餅を生成し、血管障害部位にフィブリン塊となって止血に働くことがよく知られている。このフィブリノーゲンはフィブリノーゲン製剤あるいはフィブリン糊の成分として配合されているもので、ヒトのプール血漿あるいは血漿の寒冷沈殿物より精製される。
フィブリノーゲンを含有する製剤など、ヒト血漿、その誘導画分等の血液製剤は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９などのウイルスに汚染されている可能性がある。従って血液製剤の製造に際しては、ウイルスを十分に不活化及び／又は除去する工程を組み込むことが必須である。
血液製剤に夾雑してくる危惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加熱処理法（以下、液状加熱という。）が提案され、それ以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用されている（非特許文献１）。
【０００３】
一方ウイルスを除去する方法としては血液凝固ＶＩＩＩ因子製剤中に意図的に添加したウイルスを再生セルロース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除去する方法が記載されている（特許文献１）。
また免疫グロブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルターによるウイルス除去工程を導入する方法が関口らによって報告されている（非特許文献２）。
しかしながら、これらのウイルス除去フィルターを用いたウイルス除去法は蛋白質がフィブリノーゲンである場合は特に濾過性が悪く、収率の低下及び使用膜量の増大などの問題点があり、工業的生産性の点で大きな課題となっている。また、血漿蛋白質のなかでもフィブリノーゲンは他の蛋白質製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと言われている。このためウイルスの不活化や除去については他の蛋白製剤より更に厳重に行う必要がある。
【０００４】
ウイルスの不活化法としては、液状加熱法、乾燥加熱法、ソルベントデタージェント（ＳＤ）法などがあり、ウイルス除去法としてはウイルス除去フィルターによるウイルス除去法がある。またエタノール沈澱法及びカラムクロマトグラフィー法においてもウイルス除去が可能であることが知られている。ウイルスを吸着除去する目的でたんぱく質溶液に珪藻土、ベントナイトなどの吸着剤を混合して遠心分離又は濾過によりウイルスを分離する方法も提案されている（特許文献２）。
ウイルス除去膜を用いる処理時に、フィブリノーゲン含有溶液に塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン）および塩化ナトリウムを含有させることによって、ウイルス除去膜処理の濾過性を改善させることも知られている（特許文献３）。
ＳＤ処理後に界面活性剤の濃度を調整して、ウイルス除去膜処理する際のタンパク質の濾過性を改善する報告もなされている（特許文献４）。
【０００５】
【特許文献１】特開平２−１６７２３２号
【特許文献２】特許２９８７５５４号
【特許文献３】特開２００１−３３５５０９号
【特許文献４】特表２００１−５２１９４１号
【非特許文献１】Ｍｕｒｒａｙら，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３１巻（５）３４１〜３５８（１９５５）
【非特許文献２】Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４巻（６）６１５〜６１７（１９８８）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べた各種の方法を複数組み合わせることはウイルスの不活化、ウイルス除去の完璧を期すための有効な手段であると考えられるが、そのためには各処理工程においてフィブリノーゲンの収率低下を最小限に抑え、効率的に処理することが重要な課題となってくる。
本発明の課題はウイルス夾雑の危惧のあり、かつアルブミン、グロブリン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、トロンビンなどの他の血漿蛋白と比べウイルス除去膜を用いる際の濾過工程の濾過性が特に低いフィブリノーゲン溶液から産業的有利にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため種々の研究を重ねた結果、フィブリノーゲンを含有する溶液をウイルス除去膜処理する際に、予備濾過を行うことによりウイルス除去膜処理の濾過性が著しく改善されることを知見した。そこでこの予備濾過について種々の条件を検討した結果、濾過助剤を添加して深層濾過膜による予備濾過を行うと、フィブリノーゲンが安定的且つ効果的に濾過されることを見いだし、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【０００８】
すなわち本発明は
（１）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液に濾過助剤を加えて濾過膜により濾過し、得られた濾液をウイルス除去膜により濾過するウイルス除去法、
（２）濾過助剤が珪藻土、パーライトおよびベントナイトから選ばれる少なくとも１種である（１）記載のウイルス除去法、
（３）濾過助剤を加えたウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液の濾過に用いる濾過膜が深層濾過膜である（１）記載のウイルス除去法、
（４）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液中に濾過助剤を１．０〜５．０重量％添加して濾過を行う請求項１記載のウイルス除去法、
（５）深層濾過膜の濾過孔径が０．１〜０．５μｍである（３）記載のウイルス除去法、
（６）ウイルス除去膜が中空糸フィルターまたはメンブランフィルターである（１）記載のウイルス除去法、
（７）中空糸フィルターまたはメンブランフィルターの平均孔径が２０〜６０ｎｍである（６）記載のウイルス除去法、および
（８）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液がヒト血漿由来の画分である（１）記載のウイルス除去法、
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の方法における出発原料は、ヒト血漿由来のコーンフラクションＩまたはクリオペーストをクエン酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使用して濾過し、濃度の異なるエタノールによる精製によって得られたものが好ましい。
フィブリノーゲン含有溶液の蛋白濃度は１．０重量％以下、好ましくは０．５重量％に調製して濾過助剤を添加する。また、フィブリノーゲン含有溶液には必要により緩衝剤、安定化剤を添加することができ、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが用いられ溶液のｐＨとしては５．５〜７．５、好適には６．０〜６．５に調製しておくことが好ましく、フィブリノーゲンを安定化するための安定化剤としては、糖、アミノ酸、有機酸などを任意に配合することができ、特に塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、酸性アミノ酸であるグルタミン酸を含んでいることが好ましい。
【００１０】
本発明において使用する濾過助剤としては、珪藻土、パーライト、ベントナイトなどから選ばれる１種以上の混合物を添加することができ、中でも珪藻土を含むセライト（セライト社製）がより好適に用いられる。
濾過助剤の添加濃度は、通常０．５〜５．０重量％、好ましくは１．０〜２．０重量％、さらに好ましくは１．０重量％である。濾過助剤を添加した後にフィブリノーゲン含有溶液を攪拌して予備濾過を施した後ウイルス除去膜処理を施す。また、濾過助剤は予め予備濾過膜上にプレコートしておくことも有効である。ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液に濾過助剤を加えたものを予備濾過する濾過膜は、通常たんぱく質の濾過に用いられるものであればどのようなものでも利用できるが、特に深層濾過膜の使用が望ましい。濾過膜は濾過孔径が０．１〜０．５μｍ程度のものが用いられ、より好ましくは０．１〜０．２μｍのものが用いられる。このような濾過膜としては、例えば、ゼータプラス９０（キュノ社製）、ＳＥＩＴＥＳＵＰＲＡＥＫＳ（Ｐ）（ザイツ社製）などが挙げられる。さらに、深層濾過膜による濾過後、濾過口径０．４５μｍ以下、好ましくは０．１μｍ以下の多孔質膜やメンブランフィルターまたは６０ｎｍ以上の中空糸膜フィルターでの濾過を行うことが好ましい。
【００１１】
本発明に用いるウイルス除去フィルターは、ウイルスを通過させない多孔性膜であれば平膜状でも中空糸状でもよく、またその材料としては銅アンモニア法、ビスコース法、セルロースエステルのけん化法などの再生セルロース、アセテートなどの酢化セルロース、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリスルホン（ＰＳ）及びポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）等の合成高分子化合物があげられる。その中でも銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸及びＰＶＤＦ製メンブランフィルターが特に好ましい。また、銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸は該中空糸の内壁面から外壁面への膜厚方向に層状構造を有しているので、高い蛋白の透過性と高いウイルスの阻止性能を併せ持っている。この中空糸の膜厚は１０〜１００μｍが好ましく、５０〜９０μｍがさらに好ましい。ウイルス除去フィルターの平均孔径は、通常１０〜８０ｎｍ、好ましくは１５〜７５ｎｍ、より好ましくは２０〜６０ｎｍである。平均孔径が２０ｎｍ以下のフィルターを用いると、パルボウイルスＢ１９のような粒子径の小さなウイルスも除去することができる。しかしながら実際の工業スケールで生産する場合にはフィブリノーゲンが短時間で通過できるサイズでなければならず、且つ膜の透過率、透過時間等より２０〜６０ｎｍ程度が好ましく、より好適には３０〜５０ｎｍ程度のものが好適に用いられる。好適に用いられる具体的なフィルターは、プラノバ３５Ｎ（平均孔径  ３５±２ｎｍ、旭化成製）またはＤＶ５０（ポール社製）である。また、場合によってはウイルス除去膜の孔径を７５〜１００ｎｍのウイルス除去膜処理後にさらに３０〜５０ｎｍのウイルス除去膜を使用することも可能であり、当該２段階のウイルス除去膜操作は膜の濾過液量を増加させることができ、フィルターの目詰まりを防止する観点で好ましいが、濾過助剤を用いた予備濾過工程を経ることで、必ずしも２つのウイルス除去フィルターを用いる必要はない。
本発明の各工程は、０〜３０℃の温度で実施することができるが、蛋白の安定性の観点より２〜２５℃が好ましく、より好適には１５〜２５℃で実施することが好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下に実施例、比較例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
ヒト血漿由来のコーンフラクションＩ  １００ｇを７．５％エタノール含有５５ｍＭのクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ６．４）２リットルにて洗浄し、得られた沈殿物を５５ｍＭクエン酸水溶液ｐＨ６．４にて溶解した。ついで液を０℃まで冷却し、エタノール濃度が２．０ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加した。遠心分離で得られた上清画分に、さらにエタノール濃度８．０ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加し、沈殿物として精製フィブリノーゲン画分を得た。上記フィブリノーゲン画分沈殿物を５５ｍＭ、ｐＨ６．４のクエン酸水溶液に溶解し、得られたフィブリノーゲン溶液に塩化ナトリウム、Ｌリジン塩酸、Ｌアルギニン塩酸をそれぞれ０．９ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％の濃度になるように添加して薬液を調製した。
【００１３】
実施例２
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライトＨＳＣを１．０ｗ／ｖ％濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、濾過孔径０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．０６ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させ、ウイルス除去を行った。
【００１４】
実施例３
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライトＨＳＣを１．０ｗ／ｖ％濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール製）を通過させウイルス除去を行った。
【００１５】
実施例４
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライト酸洗浄ＨＳＣを１．０ｗ／ｖ％濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターを用いて濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール（株）製）を通過させ、ウイルス除去を行った。
【００１６】
実施例５
実施例１で得られた薬液１００ｍＬに濾過助剤セライト“Ｃｅｌｐｕｒｅ  ３０００”を１．０ｗ／ｖ％濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターを用いて濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール（株）製）を通過させ、ウイルス除去を行った。
【００１７】
比較例１（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．０６ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成製）を通過させウイルス除去を行った。
【００１８】
比較例２（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として０．４５μｍ、０．１μｍのメンブランフィルターで順次濾過した後、０．０６ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成製）を通過させウイルス除去を行った。
【００１９】
比較例３（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として９０ＬＡ（キュノ社製）フィルター、０．１μｍメンブランフィルターで濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール製）を通過させウイルス除去を行った。
【００２０】
比較例４（濾過助剤処理なし）
実施例１で得られた薬液１００ｍＬを予備濾過として０．４５μｍ、０．１μｍのメンブランフィルターで順次濾過した後、０．１４ＭＰａの一次圧でウイルス除去フィルター（ＤＶ５０、日本ポール製）を通過させウイルス除去を行った。
【００２１】
試験例１
実施例２〜５および比較例１〜４において、ウイルス除去膜処理前のフィブリノーゲン濃度およびウイルス除去膜処理後のフィブリノーゲン濃度をＬａｋｉ法及びＢｌｏｍｂａｃｋ法を組み合わせて測定した。ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度から、濾過前の濃度を１００とした時の処理後の濃度を濃度回収率（％）として示した。また、ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度に容量を乗じたフィブリノーゲン量から、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収量を算出した。さらに、使用したウイルス除去膜の膜面積と濾過できた液量からウイルス除去膜１ｍ２当たりの液量を濾過液量として算出した。それらの結果を〔表１〕に示す。
【００２２】
【表１】
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〔表１〕に示すように、実施例２〜５のフィブリノーゲン溶液は、同条件で濾過助剤添加を行わない比較例１〜４の溶液に比してウイルス除去膜を用いた時の濾過性が遙かに優れていた。
【００２３】
【発明の効果】
このようにして濾過助剤を添加して予備濾過調製したフィブリノーゲンを含有する溶液は、従来にない高い濾過性並びにフィブリノーゲン回収性を示す。これはフィブリノーゲン含有溶液中に含まれる凝集体が濾過助剤と深層濾過膜の組み合わせにより高度に吸着除去され、かつフィルターを目詰まりさせることなく効率的にウイルスが除去されるからである。また、単なる予備濾過だけでは予備濾過後にウイルス除去膜処理する工程において新たな凝集体が生成してくることがあるが、本発明の濾過助剤を用いた予備濾過処理後にウイルス除去膜を通過させることにより、この問題点も解決された。