(57)【要約】【課題】物質導入装置及び物質導入システムに関し、細胞の種類及び導入物質の種類を問わないインジェクション方式のスループットを向上する。【解決手段】細胞入力部１と、細胞出力部２と、前記細胞入力部１と前記細胞出力部２とを連結する流路３と、前記流路３中に設けられ、前記細胞入力部１より前記流路３に導入された細胞６を捕捉する捕捉部４と、前記捕捉部４で捕捉された細胞６に遺伝子溶液もしくは薬剤溶液を導入する針７を備えた挿入部５とを少なくとも有し、前記細胞出力部２より導入済細胞を得る機能を具備する。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞入力部と、細胞出力部と、前記細胞入力部と前記細胞出力部とを連結する流路と、前記流路中に設けられ、前記細胞入力部より前記流路に導入された細胞を捕捉する捕捉部と、前記捕捉部で捕捉された細胞に遺伝子溶液もしくは薬剤溶液を導入する針を備えた挿入部とを少なくとも有し、前記細胞出力部より導入済細胞を得る機能を具備することを特徴とする物質導入装置。
【請求項２】
上記細胞入力部、細胞出力部、及び、捕捉部が、外部配管との接続部分に着脱構造を有することを特徴とする請求項１記載の物質導入装置。
【請求項３】
上記捕捉部は、前記流路の底面と該底面と反対側に形成された開口部との間に形成されるとともに導入された細胞よりも十分小さい径を持つ捕捉穴を有し、且つ、前記開口部において吸引装置によって負圧を発生させることを特徴とする請求項１または２に記載の物質導入装置。
【請求項４】
上記挿入部は、上記捕捉部と反対側の流路の天井面と該天井面と反対側に形成された開口部との間に形成されるとともに、上記針が通過できる程度に細い径を持つ通過穴を有し、且つ、上記捕捉穴が前記通過穴に投影的に包含されることを特徴とする請求項３記載の物質導入装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の物質導入装置の細胞入力部と接続された送液装置と、上記細胞出力部と接続された培養装置と、上記捕捉部と接続された吸引装置と、上記挿入部と接続された針及び駆動装置と、前記捕捉部及び挿入部を観察する観測部及び光源とを少なくとも備えたことを特徴とする物質導入システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は物質導入装置及び物質導入システムに関するものであり、例えば、ライフサイエンス分野、特に、再生医療及びゲノム創薬に関連する分野において細胞内に遺伝子溶液或いは薬剤溶液を高スループットで導入するための構成に特徴のある物質導入装置及び物質導入システムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、再生医療及びゲノム創薬等の分野において、遺伝子及び薬剤を導入した細胞を利用する機会が増加している。
研究用途において、すでに多くの遺伝子導入技術が用いられているが、医療用への適用においては、研究用途とは異なる要求が存在する。
【０００３】
それは、主に、
（１）細胞及び導入物質の種類を問わないこと、
（２）導入効率が高いこと、
（３）導入済細胞を大量に供給できること
の３点と言われている。
特に、細胞の大量供給は重要であり、再生医療では一度に１０５  〜１０６  個の細胞を用いると言われている。
【０００４】
このような遺伝子導入の方法としては、多くの技術が知られているが、議論の前提として、前述の（１）及び（２）の要求を満足する手法であるインジェクション法（例えば、特許文献１或いは特許文献２参照）を取り上げる。
【０００５】
このインジェクション法は、１００％に近い導入成功率の高さが特色である。
導入は顕微鏡下で行われ、熟練した作業者または分解能の高い制御装置を用いることにより、細胞へのダメージを最低限に抑える針先制御が行われている。
このインジェクション法の欠点は、熟練した作業者でも１時間あたり数百個と言われているように、スループットが低いことである。
【０００６】
そこで、この欠点を補うために、いくつかの提案がなされている（例えば、特許文献３或いは特許文献４参照）。
例えば、特許文献３においては、細胞を１次元乃至２次元のアレイ型に整列してから、キャピラリアレイを用いて一度にインジェクションを行う方式が提案されている。
【０００７】
また、特許文献４においては、導入細胞を個別に顕微鏡で観察しながら遺伝子導入を行える方式を意図して、シリコン基板側面に１次元アレイ状に形成した捕捉部に細胞を捕捉し、上部から観察しながら焦点深度内でキャピラリを動かし、遺伝子導入を行う方法が提案されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開平０５−１９２１７１号公報
【特許文献２】
特開平０６−３４３４７８号公報
【特許文献３】
特開２０００−０２３６５７号公報
【特許文献４】
特開２００２−０２７９６９号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述の特許文献３においては、アレイ上に整列された細胞は様々な形状を持つために、キャピラリアレイを用いるとキャピラリが細胞に刺さらなかったり、逆に細胞を破壊してしまう場合があるという問題がある。
【００１０】
また、特許文献４の場合は、基礎研究や人工授精などの分野では有効であるが、細胞供給及び取り出しの自動化は意図されていないため、再生医療やゲノム創薬などの産業応用には、スループットの点で問題がある。
【００１１】
したがって、本発明は、細胞の種類及び導入物質の種類を問わないインジェクション方式のスループットを向上することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
図１は本発明の原理的構成の説明図であり、ここで、図１を参照して本発明における課題を解決するための手段を説明する。
図１参照
上記目的を達成するため、本発明は、物質導入装置において、細胞入力部１と、細胞出力部２と、前記細胞入力部１と前記細胞出力部２とを連結する流路３と、前記流路３中に設けられ、前記細胞入力部１より前記流路３に導入された細胞６を捕捉する捕捉部４と、前記捕捉部４で捕捉された細胞６に遺伝子溶液もしくは薬剤溶液を導入する針７を備えた挿入部５とを少なくとも有し、前記細胞出力部２より導入済細胞を得る機能を具備することを特徴とする。
【００１３】
この様な構成により、遺伝子或いは薬液導入前細胞６の配給と、導入後細胞６の取り出し、インジェクションの自動化が可能になり、スループットを大幅に向上することができる。
【００１４】
この場合、物質導入装置の少なくとも捕捉部４及び挿入部５を、透明材質で構成することが望ましく、捕捉された細胞６が挿入部５より挿入される針７によって遺伝子溶液もしくは薬剤溶液を導入される過程を透過方式にて観察しながら操作することができる。
【００１５】
また、細胞入力部１、細胞出力部２、及び、捕捉部４が、外部配管との接続部分に着脱構造を有することが望ましく、それによって、装置の交換を容易にし，メンテナンス性を向上することができる。
【００１６】
また、捕捉部４は、流路３の底面と底面と反対側に形成された開口部との間に形成されるとともに導入された細胞６よりも十分小さい径を持つ捕捉穴を有し、且つ、開口部において吸引装置１０によって負圧を発生させるように構成することが望ましく、それによって、捕捉部４に細胞６が接近したことを確認したのちに、捕捉部４に接続された吸引装置１０を操作して、細胞６を捕捉穴にて捕捉することができる。
【００１７】
特に、捕捉部４の近傍において、流路３の幅を広くしたり、流路３を蛇行させたり、或いは、流路３の底面に段差を設けることがのぞましく、それによって捕捉部４の近傍において細胞６の移動速度を遅くすることができるので、捕捉穴における細胞６の捕捉効率を高めることができる。
【００１８】
また、挿入部５は、捕捉部４と反対側の流路３の天井面と該天井面と反対側に形成された開口部との間に形成されるとともに、上記針７が通過できる程度に細い径を持つ通過穴を有し、且つ、捕捉穴が通過穴に投影的に包含されるように構成することが望ましい。
【００１９】
この様な構成を採用することにより、通過穴の中心線の延長が捕捉した細胞６の中心を通るため、針７の軸方向の挿入動作のみで導入操作を完了することができる。
【００２０】
また、上述の物質導入装置を用いて物質導入システムを構築するためには、周辺機器として、細胞入力部１と接続された送液装置８と、細胞出力部２と接続された培養装置９と、捕捉部４と接続された吸引装置１０と、挿入部５と接続された針７及び駆動装置と、捕捉部４及び挿入部５を観察する観測部及び光源とを少なくとも設ければ良い。
【００２１】
この場合、観測部としては、３０ｍｍ以上の作動距離のレンズユニットと、物質導入装置を固定するステージと、物質導入装置内の流路３に垂直で、捕捉部４及び挿入部５を通過し且つステージ面上を通る直線を回転軸とする支柱から構成され、捕捉部４において捕捉された細胞６に対して作動距離を同一に保ちながら仰角を一定の範囲で任意に設定することが望ましく、それによって、捕捉部４にて捕捉された細胞６と挿入部５から挿入される針７との同時観察を行うことが可能になる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
ここで、図２及び図３を参照して、本発明の第１の実施の形態の細胞用物質導入システムを説明する。
図２（ａ）参照
図２（ａ）は、本発明の第１の実施の形態の細胞用物質導入システムの概略的構成図であり、細胞用物質導入装置２０、細胞用物質導入装置２０を載置するステージ２１、ステージ２１に固定されるとともにレンズユニット２３を支持固定する支柱２２、細胞用物質導入装置２０に設けた細胞導入部にキャリア液とともに細胞を導入する送液装置５０、細胞用物質導入装置２０に設けた捕捉部において流れてきた細胞を吸引することによって捕捉する吸引装置６０、細胞用物質導入装置２０に設けた捕捉部において捕捉した細胞に遺伝子溶液或いは薬液溶液を導入する針７１を備えるとともに、針７１を一軸方向に駆動する針駆動装置７０、遺伝子溶液或いは薬液溶液を導入した細胞を取り出して培養する培養装置８０、細胞用物質導入装置２０に設けた捕捉部を照明する光源９０から構成される。
【００２３】
この場合、レンズユニット２３の差動距離は、３０ｍｍ以上、好適には４０〜５０ｍｍであり、また、レンズユニット２３を保持・固定する支柱２２は、ステージ面を通る直線を回転軸とし、捕捉された細胞に対して作動距離を同一に保ちながら仰角を一定の範囲で任意に設定することができる。
【００２４】
この様に長い差動距離を有することによって、針７１による導入操作に障害を与えることなく、捕捉部における細胞捕捉や、針７１による導入操作を観察することができる。
また、レンズユニット２３を支柱２２を軸として回転可能にしているので、任意の仰角から捕捉部の観察が行えるようになり、観察と遺伝子導入を同時に実現することができる。
【００２５】
図２（ｂ）参照
図２（ｂ）は、細胞用物質導入装置を中心とした拡大図であり、細胞用物質導入装置２０には、流路３１が設けられており、流路３１の一端に細胞入力部４１が設けられ、送液装置５０から伸びるチューブ５１の端部には着脱部材５２が設けられており、着脱部材５２はネジ構造を利用して細胞入力部４１に装着される。
【００２６】
また、流路３１の他端には細胞出力部４２が設けられ、培養装置８０から伸びるチューブ８１の端部には着脱部材８２が設けられており、着脱部材８２はネジ構造を利用して細胞出力部４２に装着される。
【００２７】
また、流路３１の中央部近傍の下側に捕捉部３２が設けられ、この捕捉部３２に設けられた開口部に、吸引装置６０から伸びるチューブ６１の端部には着脱部材６２が設けられており、着脱部材６２はネジ構造を利用して開口部に装着され、流路２３を流れるキャリア液を吸引することにより細胞を捕捉する。
【００２８】
また、捕捉部３２の上側には捕捉部３２を覆う大きさの開口部を有する挿入部４３が設けられ、挿入部４３から針７１が挿入され、捕捉部３２に捕捉された細胞１１に針７１を突き刺して遺伝子溶液或いは薬液溶液を注入する。
【００２９】
次に、図３を参照して、本発明の第１の実施の形態の細胞用物質導入装置の捕捉部近傍の具体的構成を説明する。
図３（ａ）及び（ｂ）参照
図３（ａ）は本発明の第１の実施の形態の細胞用物質導入装置２０の流路３１に沿った概略的要部断面図であり、また、図３（ｂ）は細胞用物質導入装置２０を構成する下板３０の概略的要部平面図である。
【００３０】
この細胞用物質導入装置２０は、透明なポリカーボネートからなる厚さが、例えば、下板３０と上板４０とにより構成され、下板３０には流路３１が設けられており、例えば、幅が５０μｍで深さが５０μｍの流路３１の中央部近傍の捕捉部３２において流路３１の幅を１５０μｍに拡張し、キャリア液の流れを遅くして細胞１１の捕捉を容易にする。  なお、この流路３１の幅及び深さは、細胞１１の外径（１５〜２０μｍ）を考慮して設定している。
【００３１】
この捕捉部３２において、直径が０．５ｍｍの開口部３３を形成するとともに、膜薄になった流路３１の底部にエキシマレーザを用いたレーザ加工によって例えば、直径が５μｍの捕捉穴３４を設ける。
【００３２】
捕捉穴３４の直径は細胞１１が抜け出ることがなく且つ確実に捕捉できるように、５μｍとしており、開口部３３に嵌合された上述の着脱部材６２を介して吸引装置６０で吸引され、細胞１１を捕捉穴３４に捕捉する。
【００３３】
一方、上板４０の捕捉部３２に対向する領域に針７１を挿通するための開口部４４を形成するとともに、膜薄部にエキシマレーザを用いたレーザ加工によって例えば、直径が１０〜２０μｍの挿通穴４５を設けて挿入部４３を構成する。
【００３４】
この挿通穴４５の直径は、先端部の直径が１μｍ程度の針が容易に通過できるとともに、キャリア液が吹き出さないように、１０〜２０μｍとしている。
なお、ここでは、図示を省略しているが、上板４０には、図２（ｂ）に示した細胞入力部４１及び細胞出力部４２が設けられている。
【００３５】
次に、この細胞用導入システムを用いたインジェクション方法を説明すると、まず、細胞を分散させたキャリア液からなる細胞懸濁液を液体クロマトグラフ用ポンプ等を用いた送液装置５０から細胞入力部４１へ導入し流路３１を介して捕捉部３２へ輸送する。
なお、細胞懸濁液とは、細胞が液体培地中に浮遊しているものを指す。
【００３６】
流路３１に入った細胞１１が捕捉部３２に接近すると、捕捉部３２の付近で流路３１の幅に広くなっているので細胞１１の移動が遅くなり、この速度の遅くなった細胞１１をレンズユニット２３を介して画像処理装置（図示を省略）で検出し、吸引装置６０を動作させてキャリア液とともに吸引することによって、細胞１１を捕捉穴３４に捕捉する。
この場合、細胞用物質導入装置は透明部材で構成されているので、下側から光源９０によって照射することにより、細胞１１の捕捉状態を良好に観察することができる。
【００３７】
この捕捉穴３４に細胞１１が捕捉されたことを、同じ画像処理装置（図示を省略）で検出し、制御装置（図示を省略）を介して針駆動装置７０に指令して針７１を一軸方向に移動させて挿入部４３に設けた挿通穴４４を挿通させて細胞１１を突き刺し、細胞１１の内部の遺伝子溶液或いは薬剤溶液を注入する。
この場合、挿通穴４４の中心線の延長が捕捉した細胞１１の中心を通るように設計されているために、針７１の一軸方向の挿入動作のみで導入操作が完了する。
この場合、レンズユニット２３の差動距離は３０ｍｍ以上であるので、このレンズユニット２３の存在が、針７１の挿入動作等に影響を与えることはない。
【００３８】
次いで、同じ画像処理装置（図示を省略）で注入操作の完了を確認したのちに、捕捉部３２に接続された吸引装置６０を操作して、細胞１１を捕捉部３２に設けた捕捉穴３４から開放する。
【００３９】
捕捉部３２から開放された細胞１１は、キャリア液とともに、幅の狭くなった流路３１に流れ込んで移動速度が速くなる。
そして、細胞出力部４２から、注入済の細胞１１が細胞懸濁液の状態で吐出され、吐出された細胞懸濁液は細胞出力部４２に接続された着脱部材８２及びチューブ８１を経て培養装置８０に取り込まれて培養が行われる。
【００４０】
なお、この場合、流路３１の幅及び深さを５０μｍ程度にしているので、ほぼ完全に細胞１１を捕捉できるが、仮に捕捉できずに遺伝子溶液或いは薬剤溶液が注入されずに培養装置８０に取り込まれても、最終的に取り出す細胞は注入した遺伝子溶液或いは薬剤溶液によって作用が発現した細胞のみであるので問題はない。
【００４１】
以上、説明したように、本発明の第１の実施の形態においては、全ての工程を自動化して行っており、また、流路３１に幅の変化を設けて捕捉部３２以外における細胞１１の移動速度を速くしているので、インジェクション工程を高スループットで行うことができる。
また、本発明においては、細胞用物質導入装置２０を樹脂材料で構成することにより、比較的安価かつ大量に製造することができる。
【００４２】
次に、図４を参照して、本発明の第２の実施の形態の細胞用物質導入システムを説明するが、細胞用物質挿入装置に設ける流路の形状が異なるだけであるので、流路の構成のみを説明する。
【００４３】
図４参照
図４は、本発明の第２の実施の形態に用いられる細胞用物質挿入装置を構成する下板の概略的要部平面図であり、流路３１の幅は、例えば、ほぼ一定の５０μｍとし、捕捉部３２において屈曲させて蛇行部３５を設けたものである。
この場合も、細胞懸濁液は蛇行部３５において流れる方向が変化するので流速が遅くなり、細胞１１を容易に捕捉することが可能になる。
【００４４】
次に、図５を参照して、本発明の第３の実施の形態の細胞用物質導入システムを説明するが、この場合も細胞用物質挿入装置に設ける流路の形状が異なるだけであるので、流路の構成のみを説明する。
【００４５】
図５参照
図５は、本発明の第３の実施の形態に用いられる細胞用物質挿入装置の流路に沿った概略的要部断面図であり、流路３１の幅はほぼ一定の５０μｍであるが、捕捉穴３４の近傍以降の下流において、流路３１を浅くして段差部３６を設けたものである。
【００４６】
この場合は、流れてきた細胞１１は段差部３６で引っ掛かりやすくなるので、この段差部３６近傍に細胞１１が流れたきたことを画像処理装置で検出して、吸引装置６０を動作させることによって、細胞１１を捕捉穴３４によって捕捉することができる。
【００４７】
以上、本発明の各実施の形態を説明してきたが、本発明は各実施の形態に記載した構成に限られるものではなく、各種の変更が可能である。
例えば、各周辺装置のチューブと細胞用物質導入装置の接続は、チューブ終端に設けたネジ構造を利用して細胞用物質導入装置の本体と接続しているが、細胞用物質導入装置に接して図示していない治具を作成し、この治具とねじ等とを接続しても良いものである。
【００４８】
また、接続はネジ構造に限られるものではなく、例えば、着脱部材に弾性を持たせて、弾性を利用して開口部に嵌合するようにしても良いものである。
【００４９】
また、上記の各実施の形態においては、画像処理装置及び制御装置を用いて、全ての作用を自動化して行っているが、少なくとも一部を手動によって行っても良いものである。
【００５０】
また、上記の各実施の形態においては、細胞用物質導入装置をポリカーボネートで構成しているが、ポリカーボネートに限られるものではなく、他の透明樹脂を用いても良いものであり、さらには、ガラスを用いても良いものである。
【００５１】
また、上記各実施の形態においては、細胞用物質導入装置を構成する上板及び下板を単層構造として説明しているが、設ける開口の深さ等に応じて多層構造にしても良いものである。
【００５２】
また、上記の各実施の形態においては、流路を下板側に形成しているが、上板側に細胞入力部及び細胞出力部と一体に設けても良いものである。
【００５３】
ここで、再び、図１を参照して、改めて本発明の詳細な特徴を説明する。
再び、図１参照
（付記１）  細胞入力部１と、細胞出力部２と、前記細胞入力部１と前記細胞出力部２とを連結する流路３と、前記流路３中に設けられ、前記細胞入力部１より前記流路３に導入された細胞６を捕捉する捕捉部４と、前記捕捉部４で捕捉された細胞６に遺伝子溶液もしくは薬剤溶液を導入する針７を備えた挿入部５とを少なくとも有し、前記細胞出力部２より導入済細胞を得る機能を具備することを特徴とする物質導入装置。
（付記２）  上記物質導入装置の少なくとも捕捉部４及び挿入部５が、透明材質で構成されることを特徴とする付記１記載の物質導入装置。
（付記３）  上記細胞入力部１、細胞出力部２、及び、捕捉部４が、外部配管との接続部分に着脱構造を有することを特徴とする付記１または２に記載の物質導入装置。
（付記４）  上記捕捉部４は、前記流路３の底面と該底面と反対側に形成された開口部との間に形成されるとともに導入された細胞６よりも十分小さい径を持つ捕捉穴を有し、且つ、前記開口部において吸引装置１０によって負圧を発生させることを特徴とする付記１乃至３のいずれか１に記載の物質導入装置。
（付記５）  上記流路３の幅が、上記捕捉部４の近傍において前記近傍以外の部分より広いことを特徴とする付記４記載の物質導入装置。
（付記６）  上記流路３が、上記捕捉部４の近傍部分において前記付近以外の部分より屈曲していることを特徴とする付記４記載の物質導入装置。
（付記７）  上記流路３の底面が、上記捕捉部４において段差部を有することを特徴とする付記４記載の物質導入装置。
（付記８）  上記挿入部５は、上記捕捉部４と反対側の流路３の天井面と該天井面と反対側に形成された開口部との間に形成されるとともに、上記針７が通過できる程度に細い径を持つ通過穴を有し、且つ、上記捕捉穴が前記通過穴に投影的に包含されることを特徴とする付記４乃至７のいずれか１に記載の物質導入装置。
（付記９）  付記１乃至８のいずれか１に記載の物質導入装置の細胞入力部１と接続された送液装置８と、上記細胞出力部２と接続された培養装置９と、上記捕捉部４と接続された吸引装置１０と、上記挿入部５と接続された針７及び駆動装置と、前記捕捉部４及び挿入部５を観察する観測部及び光源とを少なくとも備えたことを特徴とする物質導入システム。
（付記１０）  上記観測部が、３０ｍｍ以上の作動距離のレンズユニットと、上記物質導入装置を固定するステージと、前記物質導入装置内の流路３に垂直で、上記捕捉部４及び挿入部５を通過し且つ前記ステージ面上を通る直線を回転軸とする支柱から構成され、前記捕捉部４において捕捉された細胞６に対して作動距離を同一に保ちながら仰角を一定の範囲で任意に設定可能とすることによって、前記捕捉部４にて捕捉された細胞６と前記挿入部５から挿入される針７との同時観察を行う機能を有することを特徴とする付記９記載の物質導入システム。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、細胞用物質導入装置に細胞をほぼ完全に捕捉する捕捉部を設けるとともに、全ての工程を自動化して行うことができるので、細胞の種類及び導入物質の種類を問わないインジェクション方式でありながら、高スループットを実現することができ、ひいては、再生医療・ゲノム創薬等の事業の発展に寄与するところが大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理的構成の説明図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態の細胞用物質導入システムの説明図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態の細胞用物質導入装置の捕捉部近傍の具体的構成の説明図である。
【図４】本発明の第２の実施の形態に用いられる細胞用物質挿入装置を構成する下板の概略的要部平面図である。
【図５】本発明の第３の実施の形態に用いられる細胞用物質挿入装置の流路に沿った概略的要部断面図である。
【符号の説明】
１  細胞入力部
２  細胞出力部
３  流路
４  捕捉部
５  挿入部
６  細胞
７  針
８  送液装置
９  培養装置
１０  吸引装置
１１  細胞
２０  細胞用物質導入装置
２１  ステージ
２２  支柱
２３  レンズユニット
３０  下板
３１  流路
３２  捕捉部
３３  開口部
３４  捕捉穴
３５  蛇行部
３６  段差部
４０  上板
４１  細胞入力部
４２  細胞出力部
４３  挿入部
４４  開口部
４５  挿通穴
５０  送液装置
５１  チューブ
５２  着脱部材
６０  吸引装置
６１  チューブ
６２  着脱部材
７０  針駆動装置
７１  針
８０  培養装置
８１  チューブ
８２  着脱部材
９０  光源
【図１】
2004344036.tif 000003
【図２】
2004344036.tif 000004
【図３】
2004344036.tif 000005
【図４】
2004344036.tif 000006
【図５】
2004344036.tif 000007