(57)【要約】【課題】水への溶解性が高く、優れた保存性、取扱い性、安定性等を発揮することができるグラブリジン配糖体及びその製造方法を提供するとともに、グラブリジン配糖体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤及びグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤を提供する。【解決手段】アノマー位の水酸基に脱離基（例えばトリクロロアセトイミド基）が導入され、他の水酸基に保護基が導入された糖誘導体とグラブリジンとを活性化剤（例えば三フッ化ホウ素錯体）の存在下で縮合反応させることにより、グラブリジン配糖体を製造し、製造されたグラブリジン配糖体をチロシナーゼ阻害剤及び皮膚外用剤に配合する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるグラブリジン配糖体。
【化１】
2004277309.tif 000010
［式中、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方又両方が糖残基を表し、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方が糖残基を表すとき、他方は水素原子を表す。］
【請求項２】
グラブリジンと前記糖残基との結合がβ−グリコシド結合である請求項１記載のグラブリジン配糖体。
【請求項３】
前記糖残基がグルコース残基である請求項１又は２記載のグラブリジン配糖体。
【請求項４】
グラブリジンと糖供与体とを活性化剤の存在下で縮合反応させる工程を含むグラブリジン配糖体の製造方法。
【請求項５】
前記糖供与体が、アノマー位の水酸基に脱離基が導入され、他の水酸基に保護基が導入された糖誘導体である請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
前記脱離基がトリクロロアセトイミド基である請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記活性化剤が三フッ化ホウ素錯体である請求項４〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記一般式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２の両方が糖残基であるグラブリジン配糖体に糖質分解酵素を作用させて、前記一般式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２のいずれか一方が糖残基であり、他方が水素原子であるグラブリジン配糖体を生成させる工程を含むグラブリジン配糖体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のグラブリジン配糖体を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グラブリジン配糖体及びその製造方法、並びにグラブリジン配糖体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤及びグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グラブリジンは、甘草中に含まれる美白作用の指標の一つであるメラニン産生抑制作用を有する化合物の一つとして既に知られている（特許文献１）。また、強いチロシナーゼ阻害活性を有することに関しての報告もある（特許文献２）。しかしながら、グラブリジンは熱、光等により劣化を受けやすい上に、アルコール等への溶解性が悪く、特に水への溶解性が極めて低いため、保存性、取扱い性、安定性等に欠けるという問題があり、使用量や使用範囲が限定されていた。グラブリジンの誘導体としては、そのジメチルエーテル体やジアセチル体及び脂肪酸の結合した誘導体が既に報告されているが（特許文献３及び４）、水溶性に欠ける等の問題は解決されていない。このためにグラブリジンの新規誘導体の開発が望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】
特開平１−３０１１０１１号
【特許文献２】
特願平１１−６１５６２号
【特許文献３】
特開平５−３２０１５２号
【特許文献４】
特開平６−２５６３５３号
【０００４】
【発明を解決しようとする課題】
本発明は、第一に、水への溶解性が高く、優れた保存性、取扱い性、安定性等を発揮することができるグラブリジン配糖体及びその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、第二、グラブリジン配糖体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤、及びグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤を提供することを目的とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するべく検討を行った結果、新規グラブリジン配糖体の合成に成功し、このグラブリジン配糖体が優れたチロシナーゼ阻害作用を保持しつつ、水への優れた溶解性を有することを見出した。また、このグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤が優れたチロシナーゼ阻害作用、メラニン産生抑制作用、美白作用等を有し、しかも製剤の保存安定性及び安全性が良好であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下のグラブリジン配糖体、グラブリジン配糖体の製造方法、チロシナーゼ阻害剤及び皮膚外用剤を提供する。
（１）下記一般式（Ｉ）で表されるグラブリジン配糖体。
【０００７】
【化２】
2004277309.tif 000002
［式中、Ｒ１及びＲ２は、いずれか一方又両方が糖残基を表し、Ｒ１及びＲ２のいずれか一方が糖残基を表すとき、他方は水素原子を表す。］
【０００８】
（２）グラブリジンと前記糖残基との結合がβ−グリコシド結合である前記（１）記載のグラブリジン配糖体。
（３）前記糖残基がグルコース残基である前記（１）又は（２）記載のグラブリジン配糖体。
【０００９】
（４）グラブリジンと糖供与体とを活性化剤の存在下で縮合反応させる工程を含むグラブリジン配糖体の製造方法。
（５）前記糖供与体が、アノマー位の水酸基に脱離基が導入され、他の水酸基に保護基が導入された糖誘導体である前記（４）記載の製造方法。
（６）前記脱離基がトリクロロアセトイミド基である前記（５）記載の製造方法。
（７）前記活性化剤が三フッ化ホウ素錯体である前記（４）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
【００１０】
（８）前記一般式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２の両方が糖残基であるグラブリジン配糖体に糖質分解酵素を作用させて、前記一般式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２のいずれか一方が糖残基であり、他方が水素原子であるグラブリジン配糖体を生成させる工程を含むグラブリジン配糖体の製造方法。
【００１１】
（９）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のグラブリジン配糖体を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
（１０）前記（１）〜（３）のいずれかに記載のグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のグラブリジン配糖体は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物である。一般式（Ｉ）において、Ｒ１又はＲ２で表される糖残基としては、例えば、単糖残基、オリゴ糖残基等が挙げられる。単糖残基としては、例えば、Ｄ，Ｌ−グルコース、Ｄ，Ｌ−フルクトース、Ｄ，Ｌ−マンノース、Ｄ，Ｌ−ガラクトース、Ｄ，Ｌ−キシロース、Ｄ，Ｌ−アラビノース、Ｄ，Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−ラムノース、Ｄ，Ｌ−リキソース、Ｄ，Ｌ−リボース、Ｄ，Ｌ−アロース、Ｄ，Ｌ−アルトロース、Ｄ，Ｌ−イドース、Ｄ，Ｌ−タロース、Ｄ，Ｌ−デオキシリボース、Ｄ，Ｌ−２−デオキシリボース、Ｄ，Ｌ−キノボース、Ｄ，Ｌ−アベクオース等の残基が挙げられ、オリゴ糖残基としては、上記単糖が２〜４個結合したオリゴ糖、例えば、マルトース、セロビオース、ゲンチオビオース、ルチノース、ラフィノース、キシロビオース、スクロース等が挙げられる。これらの糖残基のうち、好ましい糖残基としてはグルコース残基が挙げられ、特に好ましい糖残基としてはＤ−グルコース残基が挙げられる。
【００１３】
糖残基に含まれる水酸基の水素原子は、低級アルキル基又は低級アシル基で置換されていてもよい。
低級アルキル基は特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、その具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｔ−ペンチル基、ネオペンチル基等が挙げられ、特に好ましいアルキル基としてはメチル基が挙げられる。
【００１４】
低級アシル基は特に限定されるものではないが、好ましくは炭素数１〜８のアシル基であり、その具体例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基等が挙げられ、特に好ましいアシル基としてはアセチル基が挙げられる。
【００１５】
一般式（Ｉ）で表されるグラブリジン配糖体は、糖受容体であるグラブリジンと糖供与体とを活性剤の存在下で縮合反応させることにより得ることができる。グラブリジン（３−（２’，４’−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−８−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｎｏ［８，７−ｅ］ｃｈｒｏｍａｎ）は、次式で表される化合物である。
【００１６】
【化３】
2004277309.tif 000003
【００１７】
グラブリジンは、天然には、甘草の一種である  Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ  ｇｌａｂｒａ  Ｌｉｎｎｅ  ｖａｒ．（通称ロシア・アフガン・トルコカンゾウ）に含まれている。グラブリジンは、ｇｌａｂｒａ種に特有の成分であって、根部、根茎部等に含まれているが、ｇｌａｂｒａ種であっても、グラブリジンを含有しない場合があるので、甘草からグラブリジンを抽出する場合には原料甘草の選択に注意が必要である。
【００１８】
グラブリジンを甘草から抽出する場合、まず甘草の根部、根茎部又はそれらの水抽出残渣（例えばグリチルリチンを抽出した残渣）を有機溶媒で抽出する。抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等の低級脂肪族アルコール；アセトン等の低級脂肪族ケトン；ジオキサン、エチルエーテル等のエーテル類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル類；ヘキサン、ベンゼン等の炭化水素類；及びこれら有機溶媒の２種以上の混合物を使用することができる。なお、水や弱アルカリ性の水ではグラブリジンを抽出できないので注意が必要である。
【００１９】
抽出処理は、例えば、抽出原料である甘草の約５〜１５倍量の抽出溶媒に浸漬し、常温で静置するか還流下に加熱することによって行うことができる。抽出液から抽出溶媒を留去して得られる抽出物は、通常５〜１０％程度のグラブリジンを含有している。抽出物の精製は、例えば、順相シリカゲルクロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーにより処理した後、アセトンから結晶化させる方法により行うことができ、この方法によれば、比較的容易にグラブリジンの純品を得ることができる。この他、合成吸着体によるカラムクロマトグラフィー、液−液向流抽出等の任意の有機化合物精製手段を採用することができる。
【００２０】
糖供与体は、縮合反応によりグラブリジンを配糖化し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アノマー位（１位）の水酸基に脱離基が導入され、他の水酸基に保護基が導入された糖誘導体が挙げられる。
【００２１】
アノマー位の水酸基に導入される脱離基としては、例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子等のハロゲン原子、チオメチル基、チオエチル基、チオフェニル基、トリクロロアセトイミド基、ジフェニルホスフィンイミド基等が挙げられ、好ましい脱離基としては、トリクロロアセトイミド基が挙げられる。トリクロロアセトイミド基を使用する場合には、他の脱離基を使用する場合よりも、グリコシル化反応を効率よく進行させることができる。
【００２２】
アノマー位の水酸基以外の水酸基に導入される保護基としては、例えば、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基等のアシル系保護基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基、トリチル基等のエーテル系保護基が挙げられ、好ましい保護基としてはアセチル基が挙げられる。
【００２３】
アノマー位の水酸基に脱離基が導入され、他の水酸基に保護基が導入された糖誘導体は、糖の全ての水酸基に保護基を導入した後、アノマー位の水酸基に導入された保護基を脱離基に置換することにより調製することができる。
【００２４】
糖誘導体の具体的調製方法を以下に示す。
糖をピリジンに加えた後、無水酢酸を加えて溶解し、２０〜６０℃で１０〜１５時間攪拌する。次いで、水を添加して過剰の無水酢酸を除去し、全ての水酸基がアセチル基で保護された糖（以下「アセチル基導入糖」という。）を塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、エーテル等の有機溶媒で抽出する。抽出液を減圧下で濃縮することにより、アセチル基導入糖が得られる。得られたアセチル基導入糖を塩化メチレン、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等に溶解させた後、ヒドラジンアセテート（アセチル基導入糖１重量部に対して０．１〜０．３重量部）を添加して、１０〜４０℃で２〜１５時間攪拌する。この反応液を塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、エーテル等の有機溶媒で抽出する。抽出液を減圧下で濃縮することにより、アノマー位の水酸基が脱保護され、他の水酸基がアセチル基で保護された糖誘導体が得られる。得られた糖誘導体１ｇをジクロロメタンに溶解し、炭酸カリウムを加えた後、トリクロロアセトニトリル１０ｇを添加して１０〜４０℃で３０〜１２０分間攪拌する。この反応液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧下で濃縮することにより、アノマー位の水酸基にトリクロロアセトイミド基が導入され、他の水酸基にアセチル基が導入された糖誘導体が得られる。
【００２５】
活性化剤は、グリコシド結合の形成に先立って求核置換を受ける糖供与体を活性化できる限り特に限定されず、例えば、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル等の三フッ化ホウ素錯体、過塩素酸銀、トリフルオロメタンスルホン酸銀、臭化水銀、シアン化水銀、Ｎ−ヨードコハク酸イミド−トリフルオロメタンスルホン酸、ジメチルメチルチオスルホニウムトリフラート、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられ、好ましい活性化剤としては、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体等の三フッ化ホウ素錯体が挙げられる。
活性化剤の使用量は、糖供与体１重量部に対して通常０．０５〜０．３重量部、好ましくは０．１〜０．２５重量部である。
【００２６】
縮合反応を行う際に使用する溶媒としては、グラブリジン及び糖供与体の両者を溶解し得る溶媒、例えば、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、プロピオニトリル、トリメチルアセトニトリル、ニトロメタン、ニトロエタン、ジエチルエーテル等の有機溶媒が挙げられ、好ましい溶媒としてはジクロロメタンが挙げられる。
【００２７】
縮合反応は無水条件下で行われる。無水条件は、無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム、無水硫酸カルシウム、無水塩化カルシウム、モレキュラーシーブ等の脱水剤を反応液中に添加することにより作り出すことができる。
【００２８】
縮合反応の際の反応温度は通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜３０℃であり、反応時間は通常０．５〜１０時間、好ましくは１〜５時間である。
【００２９】
縮合反応の具体的態様を以下に示す。
グラブリジン及び糖供与体（グラブリジンに対する糖供与体のモル比は０．５〜５、好ましくは１〜３）をジクロロメタン等の有機溶媒に溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ  ５００〜１０００ｍｇ及び三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体  １００〜２５０μＬを添加して、２０〜３０℃で０．５〜２時間撹拌する。反応液を水中に加え、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出した後、抽出液を無水硫酸マグネシウム等の乾燥剤で乾燥させる。乾燥剤を濾別後、減圧下で溶媒を留去することにより、全ての水酸基がアセチル基で保護されたグラブリジン配糖体（以下「アセチル基導入グラブリジン配糖体」という。）が得られる。
【００３０】
水酸基の脱保護は、水酸化ナトリウム等を用いたアルカリ分解法、メタノール性塩酸等を用いた酸分解法、エステラーゼ等を用いた酵素分解法等の公知の方法を用いて行うことができる。アルカリ分解法においては、例えば、アセチル基導入グラブリジン配糖体を０．５〜２％ナトリウムメトキシドに溶解した後、２０〜３０℃で０．５〜２時間攪拌し、次いで、反応液を中和し、減圧下で溶媒を留去することにより、一般式（Ｉ）で表されるグラブリジン配糖体を得ることができる。
【００３１】
糖供与体として、アノマー位の水酸基にトリクロロアセトイミド基が導入され、他の水酸基にアセチル基等のアシル系保護基が導入された糖誘導体を使用し、活性化剤として、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を使用する場合には、グラブリジンと前記糖残基との結合がβ−グリコシド結合であるグラブリジン配糖体を選択的に得ることができる。
【００３２】
一般式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２のいずれか一方が糖残基であり、他方が水酸基であるグラブリジン配糖体は、一般式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２の両方が糖残基であるグラブリジン配糖体を糖質分解酵素で処理することにより得ることができる。糖質分解酵素としては、例えば、セルラーゼ、β−グルコシダーゼ、グルカナーゼ、フルクトシダーゼ、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシラーゼ、フコシダーゼ、ラムノシダーゼ等が挙げられる。
【００３３】
グラブリジン配糖体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
グラブリジン配糖体の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアーその他任意の助剤を添加して粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形に製剤化することができる。
【００３４】
グラブリジン配糖体は、チロシナーゼ阻害作用を有するので、チロシナーゼ阻害剤の有効成分として利用することができる。メラニンは、色素細胞の中で生合成されるチロシナーゼの働きによって、チロシンからドーパ、ドーパからドーパキノンに変化し、ついで５，６−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。従って、グラブリジン配糖体は、メラニン産生に関与するチロシナーゼの活性を阻害することにより、メラニンの産生を抑制することができる。また、グラブリジン配糖体は、メラニン産生の抑制を通じて、美白作用を発揮することができる。さらに、グラブリジン配糖体は、皮膚に適用した場合の安全性に優れている。
【００３５】
グラブリジン配糖体は、チロシナーゼ阻害作用、メラニン産生抑制作用、美白作用等を有するとともに、皮膚に適用した場合の安全性に優れているので、皮膚外用剤に配合するのに好適である。
【００３６】
「皮膚外用剤」とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、その種類は特に限定されるものではないが、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等が挙げられる。グラブリジン配糖体を配合し得る皮膚外用剤の具体例としては、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、石鹸、ボディシャンプー、入浴剤、リップクリーム、口紅等が挙げられる。皮膚外用剤の剤型は特に限定されるものではなく、例えば、化粧水等の可溶化系、クリーム、乳液等の乳化系、カーマインローション等の分散系の剤形を採ることができる。噴射剤と共にエアゾールの剤型を採ることもできる。
【００３７】
皮膚外用剤におけるグラブリジン配糖体の配合量は、皮膚外用剤の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、通常０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００３８】
皮膚外用剤には、グラブリジン配糖体の作用効果の妨げにならない限り、その皮膚外用剤の製造に通常使用される各種主剤および助剤、その他任意の助剤を使用することができる。グラブリジン配糖体と共に皮膚外用剤構成成分として利用可能なものとしては、例えば、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、経皮吸収促進剤、界面活性剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤、油脂、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、増粘剤、香料、樹脂、アルコール等が挙げられ、グラブリジン配糖体と上記構成成分を併用した場合、グラブリジン配糖体と併用された構成成分との間の相乗作用が、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。また、皮膚外用剤のチロシナーゼ阻害作用、メラニン産生抑制作用、美白作用等に関し、グラブリジンのみが主剤となるものに限られるわけではない。
【００３９】
【実施例】
以下、製造例、試験例及び配合例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はそれらに制限されるものではない。
【００４０】
〔製造例１〕グラブリジン２’，４’―Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造
糖をピリジンに加えた後、無水酢酸を加えて溶解し、２５℃で１５時間攪拌した。次いで、水を添加して過剰の無水酢酸を除去し、全ての水酸基がアセチル基で保護された糖（以下「アセチル基導入糖」という。）を酢酸エチルで抽出した。抽出液を減圧下で濃縮することにより、アセチル基導入糖が得られた。得られたアセチル基導入糖を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解させた後、ヒドラジンアセテート（アセチル基導入糖１ｇに対して０．２５ｇ）を添加して、２５℃で１５時間攪拌する。この反応液を酢酸エチルで抽出した。抽出液を減圧下で濃縮することにより、アノマー位の水酸基が脱保護され、他の水酸基がアセチル基で保護された糖誘導体が得られた。得られた糖誘導体１ｇをジクロロメタンに溶解し、炭酸カリウムを加えた後、トリクロロアセトニトリル１０ｇを添加して室温で１時間攪拌した。この反応液を酢酸エチルで抽出し、抽出液を減圧下で濃縮することにより、アノマー位の水酸基にトリクロロアセトイミド基が導入され、他の水酸基にアセチル基が導入された糖誘導体が得られた。
グラブリジン（１００ｍｇ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、これに三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（１００μＬ）及びモレキュラーシーブス４Ａ（１００ｍｇ）を加え、室温で５分間撹拌した。次いで、アノマー位の水酸基にトリクロロアセトイミド基が導入され、他の水酸基にアセチル基が導入されたグルコース誘導体（５００ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌した。
【００４１】
反応液を水中に加え、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾別後、減圧下で溶媒を留去し、固形物を得た。得られた固形物を０．１％ナトリウムメトキシドに溶解し、室温で１時間撹拌した。これにダウエックスＨＣＲＷ−２（５００ｍｇ）を加えて中和し、濾別後、減圧下で溶媒を留去し、粗生成物（３００ｍｇ）を得た。この粗生成物をクロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（容量比，下層）の混合溶液に溶解し、ＳｉＯ２（商品名：シリカゲル６０、富士シリシア化学（株））を充填したガラス製のカラム上部より流入して、ＳｉＯ２に吸着させた。移動相としてクロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（容量比，下層）を流し、その溶出液を集め、減圧下で溶媒を留去して、グラブリジン２’，４’−Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシド濃縮物（１５０ｍｇ）を得た。得られたグラブリジン２’，４’−Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシド濃縮物を下記の条件で液体クロマトグラフィーを用いて分画した。
【００４２】
＜液体クロマトグラフィー条件＞
固定相：ＪＡＩＧＥＬ  ＧＳ−３１０（日本分析工業製）
カラム径：２０ｍｍ
カラム長：２５０ｍｍ
移動相流量：９ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ
【００４３】
ここで、保持時間６０分〜７０分に流出する画分を、リサイクルにより精製し、グラブリジン２’，４’−Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシドを単離した。
この単離したグラブリジン２’，４’−Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシドについて、ＥＳＩ−マススペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。  結果を以下に示す。
【００４４】
ＥＳＩ−マススペクトル：ｍ／ｚ  ６７１（Ｍ＋Ｎａ）＋
１Ｈ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属水素）：
１．３６（３Ｈ，ｓ，４’’−Ｈ３），１．３７（３Ｈ，ｓ，５’’−Ｈ３），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，１５．８Ｈｚ），２．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５，１５．８Ｈｚ）（４−Ｈ２），４．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｇｌｃ’−１−Ｈ），４．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｇｌｃ−１−Ｈ），５．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，２’’−Ｈ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，６−Ｈ），６．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１’’−Ｈ），６．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．６Ｈｚ，５’−Ｈ），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−Ｈ），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，３’−Ｈ），６．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，６’−Ｈ）
【００４５】
１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：
２７．８（４’’−Ｃ），２８．０（５’’−Ｃ），３１．５（４−Ｃ），３２．６（３−Ｃ），６２．８（Ｇｌｃ−６−Ｃ），６２．８（Ｇｌｃ’−６−Ｃ），７１．３（２−Ｃ），７１．６（Ｇｌｃ’−４−Ｃ），７１．７（Ｇｌｃ−４−Ｃ），７４．８（Ｇｌｃ−２−Ｃ），７４．８（Ｇｌｃ’−２−Ｃ），７６．５（３’’−Ｃ），７７．９（Ｇｌｃ’−３−Ｃ），７８．０（Ｇｌｃ−３−Ｃ），７８．１（Ｇｌｃ’−５−Ｃ），７８．３（Ｇｌｃ−５−Ｃ），１０１．９（Ｇｌｃ’−１−Ｈ），１０２．０（Ｇｌｃ−１−Ｃ），１０４．８（３’−Ｃ），１０９．５（６−Ｃ），１１０．９（８−Ｃ），１１１．６（５’−Ｃ），１１５．８（１０−Ｃ），１１８．０（１’’−Ｃ），１２５．１（１’−Ｃ），１２８．６（６’−Ｃ），１２９．７（２’’−Ｃ），１３０．２（５−Ｃ），１５０．９（９−Ｃ），１５２．９（７−Ｃ），１５７．１（２’−Ｃ），１５８．５（４’−Ｃ）
【００４６】
ＥＳＩ−マススペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析の結果から、単離された化合物が次式で表されるグラブリジン２’，４’−Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシドであることが確認された。
【００４７】
【化４】
2004277309.tif 000004
【００４８】
〔製造例２〕グラブリジン２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドの製造
グラブリジン２’，４’−Ｏ−ジ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１００ｍｇ）を緩衝液（ｐＨ４，１０ｍＬ）に溶解し、これにセルラーゼＴ「アマノ」（２００ｍｇ）を加え、５０℃で１時間撹拌した。この粗生成物を凍結乾燥後、５０％メタノールに溶解し、ＯＤＳ（富士シリシア化学（株））を充填したガラス製のカラム上部より流入した。移動相として５０％メタノールを流し、分画した。その溶出液を集め、減圧下溶媒留去して、グラブリジン２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（７３ｍｇ）を得た。
【００４９】
この単離したグラブリジン２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドについて、ＥＳＩ−マススペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。
結果を以下に示す。
【００５０】
ＥＳＩ−マススペクトル：ｍ／ｚ  ４８７（Ｍ＋Ｈ）＋
１Ｈ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属水素）：
１．４６（３Ｈ，ｓ，４’’−Ｈ３），１．４７（３Ｈ，ｓ，５’’−Ｈ３），２．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，１５．４Ｈｚ），３．０５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．０，１５．４Ｈｚ）（４−Ｈ２），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｇｌｃ−１−Ｈ），５．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，２’’−Ｈ），６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，６−Ｈ），６．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１’’−Ｈ），６．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．３Ｈｚ，５’−Ｈ），６．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，５−Ｈ），６．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，３’−Ｈ），７．０７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，６’−Ｈ）
【００５１】
１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトδ（帰属炭素）：
２７．８（４’’−Ｃ），２８．０（５’’−Ｃ），３１．７（４−Ｃ），３２．５（３−Ｃ），６２．６（Ｇｌｃ−６−Ｃ），７１．３（２−Ｃ），７１．６（Ｇｌｃ−４−Ｃ），７４．８（Ｇｌｃ−２−Ｃ），７６．５（３’’−Ｃ），７８．２（Ｇｌｃ−３−Ｃ），７８．３（Ｇｌｃ−５−Ｃ），１０２．７（Ｇｌｃ−１−Ｃ），１０４．３（３’−Ｃ），１０９．５（６−Ｃ），１１０．９（８−Ｃ），１１０．４（５’−Ｃ），１１６．１（１０−Ｃ），１１８．０（１’’−Ｃ），１２２．６（１’−Ｃ），１２８．６（６’−Ｃ），１２９．７（２’’−Ｃ），１３０．２（５−Ｃ），１５０．９（９−Ｃ），１５２．９（７−Ｃ），１５７。５（３’−Ｃ），１５８．２（４’−Ｃ）
【００５２】
ＥＳＩ−マススペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析の結果から、単離された化合物が次式で表されるグラブリジン２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドであることが確認された。
【００５３】
【化５】
2004277309.tif 000005
【００５４】
〔試験例１〕
製造例１及び製造例２で得られたグラブリジン配糖体について、室温における水１００ｇへの溶解度（ｇ／水１００ｇ，室温）を評価した。
表１に示すように、製造例１及び製造例２で得られたグラブリジン配糖体はグラブリジンよりも水への溶解度が大きく、特に製造例１で得られたグラブリジン配糖体の水への溶解度が顕著に大きかった。
【００５５】
【表１】
2004277309.tif 000006
【００５６】
〔試験例２〕
製造例１及び製造例２で得られたグラブリジン配糖体について、チロシナーゼ阻害作用を評価した。
試験管に、マックルパイン緩衝液（ｐＨ６．８）１ｍＬ、チロシン溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍＬ、製造例１及び製造例２で得られたグラブリジン配糖体それぞれ５ｍｇを５０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯ溶液５ｍＬに溶解して得た試料溶液０．９ｍｌを加え、３７℃で１０分間プレインキュベーションした。その後、チロシナーゼ溶液（シグマ製  ５０，０００ｕｎｉｔマッシュルーム由来  １ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬを加えて、３７℃で１５分間インキュベーションした。  反応終了後、  波長４７５ｎｍにおける吸光度を測定した。同様の操作と吸光度測定を、酵素を添加せずにマックルパイン緩衝液（ｐＨ６．８）を添加して行った。さらに、試料溶液を添加せずに試料を溶かす溶媒を添加して同様の測定を行い、次式によりチロシナーゼ活性の阻害率を算出した。
【００５７】
阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００
上記式中、「Ａ」は酵素溶液添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｂ」は酵素溶液無添加・試料溶液添加時の吸光度、「Ｃ」は酵素溶液添加・試料溶液無添加時の吸光度、「Ｄ」は酵素溶液無添加・試料溶液無添加時の吸光度を表す。
【００５８】
製造例１及び製造例２で得られたグラブリジン配糖体のチロシナーゼ阻害率（％）、及び代表的なチロシナーゼ阻害剤であるアスコルビン酸のチロシナーゼ阻害率（％）を表２に示す。
表２に示すように、製造例１及び２で得られたグラブリジン配糖体がチロシナーゼ阻害作用を有することが確認された。
【００５９】
【表２】
2004277309.tif 000007
【００６０】
〔試験例３〕
表３に示した処方にて、実施例化粧水１、実施例化粧水２及び比較例化粧水１を調製した。
【００６１】
【表３】
2004277309.tif 000008
【００６２】
これらの実施例化粧水１、実施例化粧水２及び比較例化粧水１について、以下の試験を行った。
２５〜４５代の女性２０名を４名ずつ５群に分け、朝夕１日２回、２週間、洗顔後に、右顔面に実施例化粧水を、左顔面に比較例化粧水を塗布した。その際、使用時の感触、使用後のべたつき、シミ・ソバカスの改善効果、くすみの改善効果の４項目について評価を行った。
【００６３】
評価は、１〜５点の５段階評価によって行い、「５点」が「非常によい」（使用時の感触が非常によい、使用後のべたつきが全くない、シミ・ソバカス改善効果が非常に高い、くすみ改善効果が非常に高い）、「４点」が「よい」（使用時の感触がよい、使用後のべたつきがほとんどない、シミ・ソバカス改善効果が高い、くすみ改善効果が高い）、「３点」が「ふつう」（使用時の感触はふつう、使用後のべたつきはあまりない、シミ・ソバカス改善効果はややある、くすみ改善効果はややある）、「２点」が「ややわるい」（使用時の感触はややわるい、使用後のべたつきがややある、シミ・ソバカス改善効果はあまりない、くすみ改善効果はあまりない）、「１点」が「わるい」（使用時の感触がわるい、使用後のべたつきがかなりある、シミ・ソバカス改善効果が全くない、くすみ改善効果が全くない）とした。評価点の平均を表４に示す。
【００６４】
【表４】
2004277309.tif 000009
【００６５】
表４に示すように、製造例１及び製造例２で得られたグラブリジン配糖体を含有する化粧水は、使用時の感触がよく、使用後のべたつきが少なく、保湿の持続性及び肌荒れ改善効果に優れていることが確認された。
【００６６】
〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
ホホバオイル                                          ４．０ｇ
プラセンタエキス                                      ０．１ｇ
オリーブオイル                                        ２．０ｇ
スクワラン                                            ２．０ｇ
セタノール                                            ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル                            ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ）          ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）    ２．０ｇ
１，３−ブチレングリコール                            ３．０ｇ
ヒノキチオール                                        ０．１５ｇ
黄杞エキス                                            ０．１ｇ
イチョウ葉エキス                                      ０．１ｇ
コンキオリン                                          ０．１ｇ
オウバクエキス                                        ０．１ｇ
カミツレエキス                                        ０．１ｇ
香料                                                  ０．０５ｇ
グラブリジン配糖体（製造例１）                        １．０ｇ
精製水                                    残部（全量を１００ｇとする）
【００６７】
〔配合例２〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
流動パラフィン                                        ５．０ｇ
サラシミツロウ                                        ４．０ｇ
セタノール                                            ３．０ｇ
スクワラン                                          １０．０ｇ
ラノリン                                              ２．０ｇ
ステアリン酸                                          １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）    １．５ｇ
油溶性甘草エキス                                      ０．１ｇ
海藻エキス                                            ０．１ｇ
キシロビオースミクスチャー                            ０．５ｇ
クジンエキス                                          ０．１ｇ
モノステアリン酸グリセリル                            ３．０ｇ
１．３−ブチレングリコール                              ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル                              １．５ｇ
香料                                                  ０．１ｇ
グラブリジン配糖体（製造例２）                          ５．０ｇ
精製水                                    残部（全量を１００ｇとする）
【００６８】
〔配合例３〕
下記組成のパックを常法により製造した。
ポリビニルアルコール                                １５．０ｇ
ポリエチレングリコール                                ３．０ｇ
プロピレングリコール                                  ７．０ｇ
エタノール                                          １０．０ｇ
セージ抽出液                                          ０．１ｇ
トウキ抽出液                                          ０．１ｇ
ニンジン抽出液                                        ０．１ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム                            ０．１ｇ
パラオキシ安息香酸エチル                              ０．０５ｇ
香料                                                    ０．０５ｇ
グラブリジン配糖体（製造例２）                        ５．０ｇ
精製水                                      残部（全量を１００ｇとする）
【００６９】
〔配合例４〕
下記組成の化粧水を常法により製造した。
エタノール                                            ５．０ｇ
プロピレングリコール                                  ５．０ｇ
親水性界面活性剤（ポリオキシエチレンセチルエーテル）  ０．５ｇ
ヒアルロン酸ナトリウム                                ０．０５ｇ
香料                                                  適量
防腐剤（ヒノキチオール、パラオキシ安息香酸エチル）    ０．１ｇ
マロニエエキス                                        ０．１ｇ
グラブリジン配糖体（製造例１）                        ０．５ｇ
精製水                                      残部（全量を１００ｇとする）
【００７０】
【発明の効果】
本発明により、新規グラブリジン配糖体及びその製造方法、並びにグラブリジン配糖体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤及びグラブリジン配糖体を配合した皮膚外用剤が提供される。本発明により提供されるグラブリジン配糖体は、水溶性が高く、優れたチロシナーゼ阻害作用を発揮することができ、また保存性、取扱い性、安定性等を発揮することができる。したがって、グラブリジン配糖体は、チロシナーゼ阻害剤の有効成分、皮膚外用剤の美白成分として有用である。