(57)【要約】【課題】二本鎖ＤＮＡ水溶液中に高濃度の塩またはアルコールを添加することなく、ポリカルバゾール誘導体および酸を利用して、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法、およびその利用方法等を提供する。【解決手段】二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法において、二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質を混合させる工程を有しているＤＮＡらせん構造変化誘導方法によって、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化させることができる。また、このＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチングシステムへの応用や特定の塩基配列を検出する方法等への応用が可能である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法において、
二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質を混合させる工程を有していることを特徴とするＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項２】
上記ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質は、酸であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項３】
上記酸とは、塩酸であることを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項４】
上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（１）、
【化１】
2004313025.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜３０のアルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基から選ばれる基を示し、上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は当該分子中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよく、さらに上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、およびアンモニウム基等から選ばれる置換基を有していてもよく、また、ｎは１以上の正の整数を示す。）
で表される化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項５】
上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（２）、
【化２】
2004313025.tif 000009
（Ｒ９は、水素原子、メチル基、エチル基から選ばれる基を示し、ｍ、ｎはそれぞれ１以上の正の整数を示す。）
で表されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項６】
上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（３）、
【化３】
2004313025.tif 000010
（ｎは１以上の正の整数を示す。）
で表されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項７】
上記二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化とは、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、またはＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項８】
上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列を有していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していることを特徴とするＤＮＡスイッチ。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出キットであって、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを含んでいることを特徴とする塩基配列検出キット。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することにより、疾患の発症または疾患の発症危険性を判定する方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することにより、疾患の発症または疾患の発症危険性を判定する疾患判定キットであって、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを含んでいることを特徴とする疾患判定キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリカルバゾール誘導体および酸を利用して、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法、およびその利用方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、ほとんどの生物体または細胞内小器官において、遺伝情報を担っている物質として知られている。
ウイルスゲノムは、一本鎖ＤＮＡ、または一本鎖あるいは二本鎖ＲＮＡからなるものも存在するが、ほとんどの生物において、ＤＮＡは二本鎖として存在している。
【０００３】
かかる二本鎖ＤＮＡにおいては、二つのＤＮＡ鎖は反対向きに走り（逆平行）、互いの周りに二重らせん構造を形成している。このＤＮＡの二重らせん構造は、一方のＤＮＡ鎖の上のプリン塩基と他方のＤＮＡ鎖のピリミジン塩基とが、特異的に水素結合することによって形成されている。すなわち、ワトソン−クリック則に従って、アデニン（ｄＡ）とチミン（ｄＴ）とが対をなし、グアニン（ｄＧ）とシトシン（ｄＣ）とが対をなすことによって二本鎖ＤＮＡの二重らせん構造は形成されている。なお、「ｄ」は、デオキシの意である。
【０００４】
このような二本鎖ＤＮＡは、その塩基配列や、水溶液の条件等を変化させることによって、様々な構造多型を示すことが知られている。その中でも特に、図８（ａ）に示すように、グアニンとシトシンとの繰り返し配列（例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列）を有する二本鎖ＤＮＡは、通常は右巻きのらせん構造（Ｂ型ＤＮＡ構造）を示すが、高塩雰囲気下では通常の右巻きらせん構造（Ｂ型ＤＮＡ構造）とは逆の左巻きらせん構造（Ｚ型ＤＮＡ構造）を示すことがＰａｕｌら（１９７２）によって報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
上記の方法の他にも、図８（ｂ）に示すように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法としては、二本鎖ＤＮＡの水溶液中にエタノール等のアルコールを添加する方法、ポリアミンを添加する方法、および二本鎖ＤＮＡ水溶液を単純に加熱する方法等が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、このような二本鎖ＤＮＡのらせん構造の反転が、どのような生物学的意義で行われているのかについては、未だによくわかっておらず、活発な議論が専門家の間でなされているところである（例えば、非特許文献１、２参照）。
【０００７】
このように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造反転の詳細な生物学的意義は不明であるが、ＤＮＡらせん構造反転（例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、以下単にＢ−Ｚ転位と称する）という現象は、ナノバイオマテリアル等のスイッチングシステムへの応用が可能ではないかと考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００８】
また、側鎖の第３位に四級アンモニウム基を有するアルコキシポリチオフェンが二本鎖ＤＮＡと静電的相互作用によって複合体（ポリイオンコンプレックス）を形成することが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。この複合体は、ポリチオフェン側鎖の四級アンモニウム基とＤＮＡのリン酸アニオンとが静電的相互作用によって形成されるものであり、これによって、ＤＮＡの検出を行っている。
【０００９】
【非特許文献１】
ウォルフラム  ゼンガー著、西村  善文訳、「核酸構造（下）」、シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社発行、ｐ２６４−２６５、ｐ２７５−２７８
【００１０】
【非特許文献２】
箱島  敏雄著、「Ｚ−ＤＮＡの復権−左巻きＺ−ＤＮＡ結合蛋白質複合体の構造解析とその生物学的意義−」、蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４５、Ｎｏ．４、（２０００）、ｐ５９５−５９９
【００１１】
【非特許文献３】
Ｃｈｅｎｇｄｅ  Ｍａｏ他著、「Ａ  ｎａｎｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂ−Ｚ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．  ３９７、１４  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９９、ｐ１４４−１４６
【００１２】
【非特許文献４】
Ｈｏａｎｇ−Ａｎｈ  Ｈｏ他著、「Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｐｏｌｙｔｈｉｏｐｈｅｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００２，  ４１，  ９，  ｐ１５４８−１５５１
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のＢ−Ｚ転位のような二本鎖ＤＮＡらせん構造の反転現象は、一般的には高塩濃度雰囲気下、またはある一定の濃度下によってはじめて誘導されることから、実用的なスイッチングシステムへの応用が困難であるとともに、可逆的なスイッチングシステムの構築が困難であるという問題があった。
【００１４】
したがって、二本鎖ＤＮＡ水溶液中の塩濃度を高めることなく、またはアルコールを添加等することなく、二本鎖ＤＮＡにおけるＢ−Ｚ転位を誘導する方法の開発が強く求められていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、二本鎖ＤＮＡ水溶液中に高濃度の塩またはアルコールを添加することなく、ポリカルバゾール誘導体および酸を利用して、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する方法、およびその利用方法を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、高濃度の塩またはアルコールの添加による二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化誘導に代わる手法として、ポリカルバゾール誘導体および塩酸と二本鎖ＤＮＡとの相互作用を利用したスイッチングシステムを構築し、これを詳細に解析したところ、ＤＮＡ−ポリカルバゾール誘導体複合体間における電荷移動等によって、二本鎖ＤＮＡにおけるＢ−Ｚ転位が誘導されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記の課題を解決するために、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法において、二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質を混合させる工程を有していることを特徴としている。
【００１８】
上記の方法によれば、詳細は不明であるが、ポリカルバゾール誘導体がポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質の働きによってカチオン化すると考えられる。一方、二本鎖ＤＮＡはアニオンである。このため、カチオン化したポリカルバゾール誘導体とアニオンである二本鎖ＤＮＡとが静電的に結合し、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体とが複合体を形成すると考えられる。このとき、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体との間で電荷移動が発生し、二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化すると考えられる。したがって、本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、高濃度の塩やアルコールを添加することなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を簡便、かつ効率的に変化させることができる。
【００１９】
なお、ＤＮＡのらせん構造が変化したか否かについては、円二色信号（ＣＤスペクトル）、または紫外・可視吸収スペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）を測定することで、簡便に検出できる。
【００２０】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質は、酸であることが好ましい。なかでも特に、上記酸は、塩酸であることが好ましい。
【００２１】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（１）、
【００２２】
【化４】
2004313025.tif 000002
【００２３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜３０のアルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基から選ばれる基を示し、上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は当該分子中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよく、さらに上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、およびアンモニウム基等から選ばれる置換基を有していてもよく、また、ｎは１以上の正の整数を示す。）
で表される化合物であることが好ましい。なかでも、特に上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（２）、
【００２４】
【化５】
2004313025.tif 000003
【００２５】
（Ｒ９は、水素原子、メチル基、エチル基のいずれかを示し、ｍ、ｎはそれぞれ１以上の正の整数を示す。）
で表されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールであることが好ましい。
【００２６】
また、上記ポリカルバゾール誘導体は、下記の化学式（３）、
【００２７】
【化６】
2004313025.tif 000004
【００２８】
（ｎは１以上の正の整数を示す。）
で表されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールであることがより好ましい。
【００２９】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化とは、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、またはＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることを特徴としている。
【００３０】
上記の方法によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと、またはＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へと大きく変化させることができる。
【００３１】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列を有していることを特徴としている。
【００３２】
二本鎖ＤＮＡの塩基配列中に、上記の塩基配列を有していれば、確実、かつ効率的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。
【００３３】
また、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していることを特徴としている。
【００３４】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化という現象をスイッチの切換（スイッチのオン−オフ切換）として利用することで、二本鎖ＤＮＡをスイッチとして利用することができる。これによって、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、例えば、極微細な構造体であるナノマテリアル、特にナノマテリアル中に生体物質の特徴を利用したナノバイオマテリアルのスイッチングシステムとして利用することができる。
【００３５】
また、本発明にかかる塩基配列検出方法は、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することを特徴としている。また、本発明にかかる塩基配列検出キットは、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量する塩基配列検出キットであって、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを含んでいることを特徴としている。
【００３６】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出または定量することが可能である。すなわち、調査対象である二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化の有無、および／または、らせん構造の変化の程度等を指標として、その二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出・定量することができる。さらに、二本鎖ＤＮＡ中のどの位置に、当該特定の塩基配列がどの程度の鎖長で存在しているのかといった情報も取得することが可能となる。なお、らせん構造の変化の有無や変化の程度を調べるための方法としては、例えば、ＣＤスペクトルまたはＵＶスペクトルを測定する等の従来公知の方法を利用できる。
【００３７】
なお、この「特定の塩基配列」としては、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等が挙げられる。
【００３８】
また、本発明にかかる疾患の発症等の判定方法は、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することにより、疾患の発症または疾患の発症危険性を判定することを特徴としている。また、本発明にかかる疾患の発症等の判定キットは、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して、二本鎖ＤＮＡ中の特定の塩基配列を選択的に検出または定量することにより、疾患の発症または疾患の発症危険性を判定する疾患判定キットであって、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを含んでいることを特徴としている。
【００３９】
上記の構成によれば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等を有することが原因の１つとなって引き起こされる種々の疾患の発症を、または発症の危険性を、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等を有するか否かを検出することにより、非常に簡便に、判定することができる。
【００４０】
【発明の実施の形態】
本発明は、塩強度依存的あるいはアルコール強度依存的にのみ、らせん構造の変化や構造多型を示すと考えられていた塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡと、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを混合させることによって、該二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造を簡便かつ効率的に変化させることのできる手段を提供するとともに、この手段の利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法について説明し、次いでこれらＤＮＡらせん構造変化誘導方法の利用方法について説明することとする。
【００４１】
本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法、およびその利用方法に関する実施の一形態について図１〜図９に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
（１）本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法
本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を誘導するためのＤＮＡらせん構造変化誘導方法であって、二本鎖ＤＮＡと、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを混合させる工程を有していればよく、その他の工程や条件については特に限定されるものではない。
【００４３】
本発明でいう「ポリカルバゾール誘導体」とは、いわゆるポリジベンゾピロール誘導体をいい、炭素原子（Ｃ）と窒素原子（Ｎ）とを分子中に含む複素環式化合物（五員環または六員環構造を含む）の多量体であり、共役二重結合またはこれに近い結合様式を有するものであればよく、特に限定されるものではない。
【００４４】
上記ポリカルバゾール誘導体の構造を下記化学式（１）に示す。
【００４５】
【化７】
2004313025.tif 000005
【００４６】
上記化学式（１）中のＲ１〜Ｒ７は、それぞれ水素原子、炭素数１〜３０のアルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基から選ばれる基を示し、上記アルコキシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、フェニル基またはナフチル基等の芳香族基は当該分子中の１個又はそれ以上の炭素原子が酸素原子、窒素原子、及び／又は硫黄原子で置換されていてもよく、さらにこれらの基は、水に溶解または分散しやすいように、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、およびアンモニウム基等から選ばれる置換基を有していることが好ましい。また、ｎは１以上の正の整数であればよく、特に限定されるものではない。なお、分子量としては、特に１０００〜数千万の範囲であることが好ましい。
【００４７】
上記ポリカルバゾール誘導体としては、アルキルエーテル側鎖を有するポリカルバゾール誘導体であることが好ましい。例えば、下記化学式（２）、（３）に示す構造を有するアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールが挙げられる。
【００４８】
【化８】
2004313025.tif 000006
【００４９】
（Ｒ９は、水素原子、メチル基、エチル基のいずれかを示し、ｍ、ｎはそれぞれ１以上の正の整数を示す。）
【００５０】
【化９】
2004313025.tif 000007
【００５１】
（ｎは１以上の正の整数を示す。）
また、上記ポリカルバゾール誘導体の製造方法としては、後述する実施例に示す合成方法のほか、従来公知の化学合成によって製造することができ、また、市販のものを使用することも可能であり、特に限定されるものではない。
【００５２】
また、本発明でいう「ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質」とは、ポリカルバゾール誘導体をカチオン化させる物質であればよい。また換言すれば、ポリカルバゾール誘導体の分子中の窒素分子（Ｎ）の非共有電子対と静電的に相互作用し、当該窒素原子をＮＲ４＋（アンモニウム化合物、Ｒは任意の置換基）構造へと変化させる物質であればよく、特に限定されるものではない。また、「ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質」とは、ポリカルバゾール誘導体に水素イオン（Ｈ＋）を付与する物質と換言できる。
【００５３】
かかる物質としては、例えば、「酸」が挙げられる。ここでいう「酸」とは、蟻酸、酢酸、クエン酸等の有機酸、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸を含み、特に限定されるものではない。なかでも、特に塩酸が好ましい。
【００５４】
また、本発明に用いられる「二本鎖ＤＮＡ」は、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびオリゴＤＮＡ等であればよい。また、二本鎖ＤＮＡの鎖長は特に限定されるものではない。
【００５５】
上記二本鎖ＤＮＡは、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列の塩基配列を有していることが好ましい。これは、後述する実施例に示すように、上記の塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡは、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によって、効率的にらせん構造の変化を誘導することができるためである。なお、「ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列」とは、グアニン（ｄＧ）−シトシン（ｄＣ）配列の２以上の繰り返し配列をいい、単なる（ｄＧ−ｄＣ）・（ｄＧ−ｄＣ）配列をも含むものである。
【００５６】
また、「二本鎖ＤＮＡのらせん構造」には、例えば、図８（ｂ）に示すように、Ｂ型ＤＮＡ構造、Ｚ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、Ｃ型ＤＮＡ構造等が挙げられる。
【００５７】
また、「二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化」としては、図８（ｂ）に示すように、上記Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、またはＣ型ＤＮＡ構造への変化、あるいは逆の、Ｚ型ＤＮＡ構造、Ａ型ＤＮＡ構造、またはＣ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化等が挙げられるが、特に、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造への変化、またはその逆のＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造への変化であることが好ましい。
【００５８】
また、「二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質を混合させる工程」とは、ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを相互作用させ、ポリカルバゾール誘導体をカチオン化させることにより、アニオンの二本鎖ＤＮＡと上記カチオン化したポリカルバゾール誘導体との複合体を形成させ、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体との間に電荷移動を発生させる工程であればよい。
【００５９】
このため、本発明でいう「ポリカルバゾール誘導体」は、例えば、カチオン化することにより、静電的相互作用によって二本鎖ＤＮＡと複合体を形成でき、二本鎖ＤＮＡとの間で電荷移動を行うことができる導電性高分子であると換言できる。なお、「電荷移動を行う」とは、例えば、ポリカルバゾール誘導体から二本鎖ＤＮＡに対して電子が供給される場合でも、逆に、二本鎖ＤＮＡからポリカルバゾール誘導体に対して電子が供給される場合のどちらであってもよい。
【００６０】
また、通常二本鎖ＤＮＡは水溶液に溶解するため、本発明における二本鎖ＤＮＡと、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質とを混合する工程も、原則として水溶液中で行われる。しかし、何らかの処理により、二本鎖ＤＮＡおよびポリカルバゾール誘導体が水溶液以外の極性または非極性の有機溶媒に溶解可能となる場合、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、極性または非極性の有機溶媒中でも行うことができる。例えば、後述する実施例でも示すように、ポリカルバゾール誘導体を溶解または分散させるためにＴＨＦ（テトラヒドロフラン）等の従来公知の溶媒を用いることもでき、これらの溶媒の下で、またはこれらの溶媒と水溶液とを混合した状態でも本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を実施することができる。
【００６１】
さらに、本発明のＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、固体フィルム、またはキャストフィルム中でも行うことができる。すなわち、上記ポリカルバゾール誘導体を担体に固定した状態で、ＤＮＡと混合することによっても、本発明を実施することができる。なお、ポリカルバゾール誘導体を担体に固定する方法としては、例えば、カルバゾール誘導体の分子中の側鎖部分等から担体に固定化するための「枝」を伸長させ結合させる等の従来公知の化学的、物理的な方法を利用することができ、特に限定されるものではない。
【００６２】
また、「担体」とは、ポリカルバゾール誘導体をチップ、センサー、またはプレート等の担体（化合物の機能を阻害しないもの）に固定化したもの又は固定化され得るように「枝」をのばした状態の化合物をいう。なお、上記のように、硫黄を含む化合物（例えば、メルカプト基を含む化合物）は、その分子を固定化（例えばチップなどに固定化）するときに、その固定化が容易となる。
【００６３】
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法、すなわち、本発明における二本鎖ＤＮＡと、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを混合する工程の条件は、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、ポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とが相互作用し、ポリカルバゾール誘導体がカチオン化されることにより、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体とが静電的相互作用によって複合体を形成し、二本鎖ＤＮＡとポリカルバゾール誘導体との間で電荷移動が発生するような緩衝液等が含まれていればよい。また、その他の反応条件、例えば、二本鎖ＤＮＡの濃度や種類、ポリカルバゾール誘導体（例えば、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール等）の濃度や種類、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の濃度や種類、混合時の反応温度や反応時間、ｐＨ、塩の濃度（使用するバッファーの種類）等については適宜設定可能であり、特に限定されるものではない。なお、二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体（例えば、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール）、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、塩酸）を混合する比率としては、例えば、後述する実施例に示すように、Ａ２６０＝１．０となるように調製した二本鎖ＤＮＡを２．４ｍｌ、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール１×１０−３Ｍ／ＴＨＦを５０μｌ、１ｍＭのＨＣｌを５０μｌ〜３００μｌの範囲で加えることにより、効果的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。その他にもポリカルバゾール誘導体と、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、ＨＣｌ）とは、モル比１：０．０１〜１０の範囲で混合することが好ましく、また、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、ＨＣｌ）と、ＤＮＡとは、モル比１：３０〜９０の範囲で混合することが好ましい。上記のモル比でポリカルバゾール誘導体、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、ＨＣｌ）ＤＮＡを混合することにより、効果的に二本鎖ＤＮＡのらせん構造を変化させることができる。
【００６４】
さらに、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の添加量を変化させることにより、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化の程度を調整することができる。例えば、後述する実施例に示すように、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質として使用している塩酸の添加量を増加させるにつれ、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化が大きくなっている。したがって、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の添加量を調整することにより、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化を制御でき、用途に応じたらせん構造の変化を誘導できると考えられる。
【００６５】
また、二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、およびポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）を混合させる工程では、ポリカルバゾール誘導体中にカチオンが発生することが非常に好ましく、例えば、酸性領域のｐＨであることが好ましいが、特に限定されるものではない。この他にも、例えば、ポリカルバゾール誘導体がカチオン化する物質を添加剤として用いることによっても、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を実施することが可能である。
【００６６】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、塩強度依存的あるいはアルコール強度依存的に構造変化や構造多型を示す塩基配列（例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列等）を有する二本鎖ＤＮＡであっても、塩濃度やアルコール濃度を高めることなく、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を簡便かつ効率的に変化させることができる。すなわち、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、例えば、図１（ａ）に示すように、二本鎖ＤＮＡのらせん構造を、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位のように変化させることができる。また、その他にも、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法を用いることによって、例えば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造をＢ−Ａ転位またはＡ−Ｂ転位のように変化させることもできる可能性がある。
【００６７】
したがって、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、以下のように利用することができる。
【００６８】
（２）本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法の利用方法
（２−１）ＤＮＡスイッチ
本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチとして利用することができる。
【００６９】
すなわち、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。
【００７０】
上記の構成によれば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化という現象を、スイッチのオン−オフ切換として利用し、ＤＮＡスイッチとして利用することができる。このＤＮＡスイッチとしては、例えば、Ｂ型ＤＮＡ構造をスイッチオフ状態とした場合に、図１（ａ）に示すように、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造にＤＮＡのらせん構造が変化した場合にスイッチオン状態に切り替わるＤＮＡスイッチ等を挙げることができるが、この逆も可能であり、これに限定されるものではない。
【００７１】
また、本発明にかかるＤＮＡスイッチは、図１（ａ）に示すように、可逆的なＤＮＡスイッチとして利用することも可能である。すなわち、従来のように塩濃度を高めることによってＢ−Ｚ転位を発生させる場合は可逆的なスイッチングが困難であるが、本発明のようにポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを用いてＤＮＡのらせん構造の変化を誘導する場合は、ポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）の濃度の変化や、電場等の外部刺激によってもポリカルバゾール誘導体の荷電状態をコントロールすることができるため、ＤＮＡらせん構造を可逆的に変化させることが可能であり、その結果として可逆的なスイッチングが可能となる。
【００７２】
このようなＤＮＡスイッチは、二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化（例えば、Ｂ−Ｚ転位、Ｚ−Ｂ転位、Ｂ−Ａ転位、またはＡ−Ｂ転位等）といった、大きな構造変化をスイッチングシステムとして利用するものである。このため、スイッチのオン−オフを確実に切り換えることが可能である。さらに、上記ＤＮＡスイッチは、非常に微細なスイッチであるため、例えば、本発明にかかるＤＮＡスイッチングシステムは、極微細な構造体であるナノマテリアル、特にナノマテリアル中に生体物質の特徴を利用したナノバイオマテリアルのスイッチングシステムとして利用することができる。
【００７３】
（２−２）塩基配列検出方法、塩基配列検出キット、疾患等の判定方法、及び疾患等の判定キット
また、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、塩基配列検出方法および塩基配列検出キットとして利用することもできる。
【００７４】
すなわち、本発明にかかる塩基配列検出方法は、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の工程、条件等は特に限定されるものではない。また、本発明に係る塩基配列検出キットも、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用していればよく、その他の構成は特に限定されるものではない。
【００７５】
すなわち、本発明にかかる塩基配列検出方法または塩基配列検出キットは、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用することによって、二本鎖ＤＮＡのらせん構造の変化の有無、および／または、らせん構造の変化の程度等を調べ、その二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を選択的に検出・定量する方法またはキットであればよい。
【００７６】
具体的には、本発明にかかる塩基配列検出方法または塩基配列検出キットを利用することによって、調査対象となる二本鎖ＤＮＡ中に、特定の塩基配列、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列が含まれているか否かを選択的に検知、判断することができる。
【００７７】
これは、後述の実施例に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列は、上記ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とともに混合することによって、ＤＮＡのらせん構造を変化させる特性を有しているためである。
【００７８】
したがって、例えば、調査対象となる二本鎖ＤＮＡと上記ポリカルバゾール誘導体とを混合させ、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造に変化する場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列が含まれていると判断できる。逆に、当該二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化しない場合は、上記ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列が含まれていないと判断できる。これは、後述の実施例に示すように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列は、Ｂ−Ｚ転位またはＺ−Ｂ転位を起すと推測されるためである。
【００７９】
さらに、調査対象である二本鎖ＤＮＡにおけるらせん構造の変化の程度を指標とすることにより、当該二本鎖ＤＮＡ中に特定配列が、どの位置に、どの程度（鎖長、塩基数等）含まれるかを選択的に検出（特定）・定量することも可能である。
【００８０】
すなわち、上記ポリカルバゾール誘導体と特定の塩基配列とを混合した場合、特定の塩基配列がどのような挙動を示すのか、例えば、特定の塩基配列のらせん構造がどの程度変化するのか等の特徴的な情報を予め調べておくことにより、調査対象となる二本鎖ＤＮＡ中に、当該特定配列がどの位置に、どの程度の鎖長の塩基配列として存在するのか調べることが可能となる。なお、特定の塩基配列と上記ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを混合した際に生じる、特定の塩基配列（ＤＮＡ）／ポリカルバゾール誘導体複合体の示す挙動を調べるための方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、特定の塩基配列（ＤＮＡ）／ポリカルバゾール誘導体複合体についての円二色信号（ＣＤスペクトル）、または紫外・可視吸収スペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）を測定する方法等の従来公知の方法が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００８１】
具体的には、例えば、後述する実施例に示すように、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列と、上記ポリカルバゾール誘導体であるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを混合することによって生じるＤＮＡのらせん構造の変化は、ＵＶスペクトル測定における２９０ｎｍのピークを指標に鋭敏に検出することができるという点で特徴的である。
【００８２】
したがって、本発明の塩基配列検出方法等によれば、例えば、ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）・ｐｏｌｙ（ｄＧ−ｄＣ）配列を簡便かつ選択的に検出・定量することができる。
【００８３】
ここで、例えば、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる（ｄＧ−ｄＣ）配列の量、すなわち（ｄＧ−ｄＣ）塩基配列の含有量は、二本鎖ＤＮＡにおける一塩基多型（ＳＮＰｓ）の発生の主要因の一つと考えられている。この理由の一部として、ＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化されたシトシン（ｄＣ）が脱アミノ化を受けてチミン（ｄＴ）に変異する傾向があることが挙げられている。これにより、ＣｐＧジヌクレオチドの変異速度は、他のジヌクレオチドに比べて約１０倍程度高くなっている。
【００８４】
そのため、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットにより、例えば、二本鎖ＤＮＡ中における（ｄＧ−ｄＣ）塩基配列の含有量を定量的に検出することによって、ＳＮＰｓの発生や、ＳＮＰｓによって引き起こされる遺伝子疾患の簡便な検出方法等を開発できる可能性がある。
【００８５】
さらに、図８（ｂ）に示すような、Ｂ型ＤＮＡ構造やＺ型ＤＮＡ構造をはじめとした構造多型等についての二本鎖ＤＮＡのコンフォメーション情報を得ることができる。
【００８６】
上記二本鎖ＤＮＡのコンフォメーションの一つである、Ｚ型ＤＮＡ構造（左巻きらせんＤＮＡ構造）は、全身性紅斑性狼瘡等の自己免疫疾患に関与していると考えられている。したがって、本発明にかかる塩基配列検出方法、または塩基配列検出キットによって、Ｚ型ＤＮＡ構造になり得る塩基配列を簡便に検出することにより、これらの疾患の早期検出デバイス、早期発見方法、治療方法、および治療剤等の開発に寄与することができる可能性がある。
【００８７】
すなわち、本発明には、上記のＤＮＡらせん構造変化誘導方法を利用して塩基配列を検出または定量することにより、疾患の発症または発症危険性の判定を行う方法や判定デバイス（判定キット等）も含まれる。なお、ここでいう、「疾患」には、上記ＤＮＡらせん構造変化誘導方法によってＤＮＡのらせん構造が変化する特定の塩基配列を有することを指標として、発症を予測できる疾患であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、上述した自己免疫疾患（例えば、全身性紅斑性狼瘡等）、または一塩基多型による種々の遺伝子の機能変化によって引き起こされる疾患（例えば、癌等）が挙げられる。また、本発明でいう「判定キット」とは、疾患の判定等を行うことができる物であればよく、特に限定されるものではない。具体的には、紙、チップ、センサー、またはプレート等の担体（化合物の機能を阻害しないもの）にポリカルバゾール誘導体を固定化したもの、試薬を組み合わせた物等が挙げられる。
【００８８】
なお、「疾患の発症を判定する」とは、疾患が発症しているか否かを検出することをいい、「疾患の発症危険性を判定する」とは、疾患が発症する危険性があるか否か、および／または、その危険性がどの程度あるのかについて判定することをいう。
【００８９】
また、従来、ＤＮＡ中の特定の塩基配列を検出する方法としては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ法（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ７２，  ｐ３７１７−３７２４）、ＲＩ法、ＰＣＲによる増幅後ＤＮＡシークエンサーによる解読する方法、制限酵素による選択的切断と電気泳動法（野島  博著、「遺伝子工学の基礎」、東京化学同人）、およびマススペクトロメトリー法（質量分析法）（Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００１，  ７３，  ｐ２１２６−２１３１）等が知られていたが、これらの方法は、いずれも操作等が煩雑、難解であったり、複雑な機器等を利用する必要があったりと、簡便な方法とはいい難いかった。
【００９０】
しかし、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットは、上述したように、調査対象の二本鎖ＤＮＡと上記ポリカルバゾール誘導体とポリカルバゾール誘導体から電子を受容する物質（例えば、酸）とを混合させ、ＣＤスペクトル、またはＵＶスペクトル等を測定して、ＤＮＡらせん構造の変化の有無、および／または変化の程度等を調べるのみで特定の塩基配列を検出・定量することができる。したがって、本発明にかかる塩基配列検出方法、および塩基配列検出キットは、従来のＤＮＡ中の特定の塩基配列検出方法と比較して、より簡便、かつ容易に、二本鎖ＤＮＡ中に含まれる特定の塩基配列を検出・定量することができるといえる。
【００９１】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００９２】
【実施例】
まず、本実施例に用いた二本鎖ＤＮＡ、ポリカルバゾール誘導体、および簡単な実験方法について図２を用いて説明する。
【００９３】
図２に示すように、本実施例では、二本鎖ＤＮＡとして（ｄＧ−ｄＣ）８を用いた。また、ポリカルバゾール誘導体は、上記化学式（３）に示されるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールをＴＨＦ（テトラヒドロフラン）と混合し、１×１０−３Ｍに調整して用いた。
【００９４】
なお、本実施例で用いたアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールの合成方法を図９の合成スキームに従って、以下に簡単に説明する。
【００９５】
まず、１−Ｃｈｌｏｒｏ−３，６，９，１２−ｔｒｅｔｒａｏｘｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅを合成した（Ｍ．  Ｆｕｊｉｋｉ，  Ｓ．  Ｔｏｙｏｄａ，  Ｃ．−Ｈ．  Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｔａｋｉｇａｗａ，  Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ，  １０，  ６６７−６７５  （１９９８））。続いて、１−Ｂｒｏｍｏ−３，６，９，−ｔｒｉｏｘｏｕｎｄｅｃａｎｅを合成した（Ｃａｒｌ  Ｄ．  Ｐｅｒｃｈｏｎｏｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２９，  １４４２−１４５２  （１９８６））。次に、９−Ｎ−（３’，６’−ｄｉｏｘｏｏｃｔｙｌ）−３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅを合成した（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｅ．  Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｙｕｎｇ−Ｊｏｎｇ  Ｊｉｎ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９８９，  ５４，  ９６５−９６８）。そして、９−Ｎ−（３’，６’９’−ｔｒｉｏｘｏｎｕｄｅｃｙｌ）−３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅを合成した。具体的には、１−Ｂｒｏｍｏ−３，６，９，−ｔｒｉｏｘｏｕｎｄｅｃａｎｅ（２．４１ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）に、Ｋ２ＣＯ３（２．００ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）と、３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅ（３．２５ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を添加した。上記混合溶液を５０℃まで加温し、２４時間反応させた。室温まで混合溶液を冷却させた後、混合溶液を減圧下で濾過し、溶媒を除去した。残留物をクロマトグラフィーカラム（Ｈｅｘａｎｅ／ｅｔｈｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ  ｆｒｏｍ  ２０  ：  １  ｔｏ  ３  ：  １）にて精製した。
【００９６】
続いて、９−Ｎ−（３’，６’９’−ｔｒｉｏｘｏｎｕｄｅｃｙｌ）−３，６−ｄｉｂｒｏｍｏｃａｒｂａｚｏｌｅをポリマー化させた。具体的には、Ｎｉ（ＣＯＤ）２（１．００ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、ＣＯＤ（３２８ｍｇ、３．０３ｍｍｏｌ）、およびＢｐｙ（５６９ｍｇ、３．６４ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下、水和ＤＭＦ３０ｍＬに溶解させた。上記混合溶液を０．５時間６０℃にて加温し、非水和ＤＭＦ溶液８ｍＬに溶解させたカルバゾールモノマー（１．３３７ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応は、６０℃、２４時間、暗所にて行った。反応生成物は、マグネチックスターラーの入った５００ｍＬのメタノールに添加した。グレーの固形物を減圧濾過にて得て、室温、１晩、バキュームにて乾燥させた。上記生成物は、ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。透明な黄色液体を得るために、不溶性の固形物は、０．５μｍのポアサイズのメンブレンフィルターにて濾過して除去した。イソプロパノール（５０ｍＬ）を添加後、白色の固形物が沈殿し、上記固形物を遠心分離して、１晩、室温にてバキューム乾燥させて、生成物を得た（Ｚｈ．  Ｂ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．  Ｆｕｊｉｋｉ，  Ｈ．  Ｚｈ．  Ｔａｎｇ，  Ｍ．  Ｍｏｔｏｎａｇａ  ａｎｄ  Ｔｏｒｉｍｉｔｓｕ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ３５  （６）  １９８８  （２００２））。
【００９７】
また、二本鎖ＤＮＡはＳＩＧＭＡ社より購入し、精製は行わずそのまま用いた。ＤＮＡは、Ａ２６０＝１．０になるようにｍｉｌｌｉＱで調整して、ＤＮＡ水溶液として実験に用いた。
【００９８】
また、各実験で行ったＣＤスペクトルは、温度：２５℃、開始波長：５００ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、感度：５０−１００ｍｄｅｇ、データ間隔：０．５ｎｍ、積算回数：５、バンド幅：２．０ｎｍ、レスポンス：１．０ｓｅｃ、走査速度：５０ｎｍ／ｍｉｎの条件で測定した。
【００９９】
また、ＵＶスペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）は、温度：２５℃、レスポンス：Ｆａｓｔ、バンド幅：５．０ｎｍ、走査速度：２００ｎｍ／ｍｉｎ、開始波長：５００ｎｍ、終了波長：２００ｎｍ、データ間隔：１．０ｎｍ、繰り返し：１の条件で測定した。
【０１００】
以下具体的な実験結果について説明する。
【０１０１】
（１）高塩濃度に伴うＤＮＡのらせん構造の変化の確認
まず、高塩濃度に伴う二本鎖ＤＮＡのＢ−Ｚ転位を確認した。具体的には、（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液２．４ｍｌ中に、ＮａＣｌを５Ｍとなるように加え、ＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。その結果をそれぞれ図５、図６に示す（図中、（ｄＧ−ｄＣ）８／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す線）。なお、コントロールとして、上記ＤＮＡのみの水溶液についてのＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行い、その結果も併せて図示する。
【０１０２】
図５に示すように、（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液に５ＭとなるようにＮａＣｌを加えた場合のＣＤスペクトル（図中、（ｄＧ−ｄＣ）８／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す）は、（ｄＧ−ｄＣ）８のみの水溶液のＣＤスペクトル（（ｄＧ−ｄＣ）８  ｏｎｌｙ）と異なる波形を示すことがわかった。これは、（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液中の塩濃度を５Ｍという高塩濃度に変化させた場合、これらの二本鎖ＤＮＡのらせん構造が変化したことを示している。
【０１０３】
また、図６に示すように、（ｄＧ−ｄＣ）８／ＮａＣｌ  ５Ｍ水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、（ｄＧ−ｄＣ）８のみの水溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルに比べて、約２９０ｎｍ付近にピークを有する。これは、フーグスティン型のスタッキング（図７参照）によるものであり、ＤＮＡのらせん構造の反転（Ｂ−Ｚ転位）がおこったときに出現するものである。
【０１０４】
以上のことから、高塩強度に伴って、（ｄＧ−ｄＣ）８の塩基配列は、Ｂ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化することが確認できた。
【０１０５】
（２）アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールの添加によるＤＮＡのらせん構造変化について
次に、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと、二本鎖ＤＮＡ（ｄＧ−ｄＣ）８とを混合した溶液に、ＨＣｌを添加した場合、二本鎖ＤＮＡ（ｄＧ−ｄＣ）８のらせん構造が変化するか否かを調べた。
【０１０６】
具体的には、上述の方法で合成したアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール１×１０−３Ｍ／ＴＨＦを５０μｌ添加混合した（ｄＧ−ｄＣ）８溶液に、ＨＣｌを５０μｌずつ添加していった場合の溶液についてＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定を行った。なお、コントロールとして、上記（ｄＧ−ｄＣ）８のみの水溶液についてもＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルを測定し、これらの結果も併せて図３、４に示す。また、塩濃度が５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液についてのＣＤスペクトル、およびＵＶ−ｖｉｓスペクトルの測定結果（図中、（ｄＧ−ｄＣ）８／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す線）を併せて示した図を図５、図６に示す。
【０１０７】
まず、図３および図５に示すように、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール存在下の（ｄＧ−ｄＣ）８溶液にＨＣｌを５０μｌずつ３００μｌまで添加していった場合のＣＤスペクトル（（ｄＧ−ｄＣ）８／ｐｏｌｙＣｚ＋ＨＣｌ量で示す線）は、ＨＣｌの添加量が多くなるにつれ、５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液についてのＣＤスペクトル（図中、（ｄＧ−ｄＣ）８／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す線）により近い波形を示すことがわかった。
【０１０８】
これは、ＨＣｌとアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを添加することにより、ＤＮＡ水溶液を高塩濃度にしなくても、ＨＣｌの濃度依存的に、ＤＮＡらせん構造の変化が誘導されることを示している。すなわち、ＨＣｌとアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと二本鎖ＤＮＡを混合することにより、ＤＮＡらせん構造の変化が引き起こされることがわかった。
【０１０９】
また、図４および図６に示すように、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾール存在下の（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液にＨＣｌを５０μｌずつ３００μｌまで添加していった場合のＵＶ−ｖｉｓスペクトル（（ｄＧ−ｄＣ）８／ｐｏｌｙＣｚ＋ＨＣｌ量で示す線）は、ＨＣｌの添加量が多くなるにつれ、５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した（ｄＧ−ｄＣ）８水溶液についてのＵＶ−ｖｉｓスペクトル（図中、（ｄＧ−ｄＣ）８／ＮａＣｌ  ５Ｍで示す線）により近い波形を示すことがわかった。
【０１１０】
すなわち、ＨＣｌとアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとを添加することにより、ＤＮＡ水溶液を高塩濃度にしなくても、ＨＣｌの濃度依存的に、約２９０ｎｍ付近にピークを有することがわかった。これは、上述したようにフーグスティン型のスタッキング（図８参照）によるものであり、ＤＮＡのらせん構造の反転（Ｂ−Ｚ転位）がおこっていると考えられる。
【０１１１】
さらに、結果は図示しないが、（ｄＧ−ｄＣ）８と、ＴＨＦと、ＨＣｌとを混合した溶液、およびアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと、ＨＣｌと、水とを混合した溶液のＣＤスペクトル、ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを測定したが、いずれもＤＮＡの構造変化が認められなかった。
【０１１２】
以上の結果より、（ｄＧ−ｄＣ）８と、アルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールと、ＨＣｌとを混合させることによって、二本鎖ＤＮＡ（ｄＧ−ｄＣ）８におけるらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へと変化することが明らかとなった。
【０１１３】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法によれば、塩濃度やアルコール濃度を高めることなく、ＤＮＡのらせん構造を効率的に変化させることができるという効果を奏する。
【０１１４】
それゆえ、本発明にかかるＤＮＡらせん構造変化誘導方法は、ＤＮＡスイッチングシステム、塩基配列検出方法、塩基配列検出キット、および疾患または疾患の発生危険性の判定等に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】二本鎖ＤＮＡのらせん構造がＢ型ＤＮＡ構造からＺ型ＤＮＡ構造へ、またＺ型ＤＮＡ構造からＢ型ＤＮＡ構造へ変化する現象を模式的に示した図である。
【図２】本実施の形態における実験にて用いた材料および実験方法を簡単に説明する図である。
【図３】本実施例におけるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図４】本実施例におけるアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図５】本実施例における高濃度の塩またはアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＣＤスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図６】本実施例における高濃度の塩またはアルキルエーテル側鎖ポリカルバゾールとＨＣｌとを添加した場合におけるＤＮＡ構造変化をＵＶ−Ｖｉｓスペクトル測定にて調べた結果を示す図である。
【図７】二本鎖ＤＮＡ中における塩基のフーグスティン型のスタッキングを示す図である。
【図８】（ａ）は、従来の高塩濃度によるＤＮＡらせん構造の変化を模式的に示す図であり、（ｂ）は、従来のＤＮＡらせん構造の変化を誘導する方法について簡単に説明する図である。
【図９】本実施例におけるポリカルバゾール誘導体の合成スキームを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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