(57)【要約】【課題】本発明は、オルガネラゲノムＤＮＡの全長が挿入されたゲノムＤＮＡを有する微生物細胞、該微生物細胞から調製されるオルガネラゲノムＤＮＡを有するプラスミド、該プラスミドをオルガネラゲノムＤＮＡに導入することにより得られる形質転換体等を提供する。【解決手段】オルガネラゲノムＤＮＡの全長を重複配列を有する複数の断片として調製し、これらを微生物ゲノムベクターへ相同組み換えを誘導することにより挿入した後、所望により変異を導入し、これを環状プラスミドとして切り離し、植物体等に導入する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルガネラゲノムＤＮＡの全長が挿入されたゲノムＤＮＡを有する微生物細胞。
【請求項２】
オルガネラゲノムＤＮＡが、変異が導入されたＤＮＡであることとを特徴とする請求項１に記載の微生物細胞。
【請求項３】
変異の導入が、１若しくは数個のＤＮＡの置換、欠失または付加であることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物細胞。
【請求項４】
変異の導入が、外来遺伝子ＤＮＡの挿入であることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の微生物細胞。
【請求項５】
微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌又は高度好熱菌であることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の微生物細胞。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の微生物細胞から調製されるオルガネラゲノムＤＮＡを有する環状プラスミドＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のプラスミドＤＮＡを、オルガネラに導入することにより得られる形質転換体、該形質転換体を再分化させた個体およびその子孫。
【請求項８】
目的蛋白質の製造方法であって、（ｉ）微生物細胞のゲノムにオルガネラゲノムＤＮＡの全長を挿入し、（ｉｉ）該オルガネラゲノムＤＮＡに、外来の目的蛋白質をコードするＤＮＡを、導入するオルガネラ内で有効な発現制御領域の制御下となるように挿入し、（ｉｉｉ）得られたオルガネラゲノムＤＮＡをプラスミドとして回収した後に、（ｉｖ）該プラスミドをオルガネラに導入し、（ｖ）該オルガネラＤＮＡを保持する形質転換体中で目的蛋白質を発現させることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オルガネラゲノムＤＮＡの全長が挿入されたゲノムＤＮＡを有する微生物細胞、該微生物細胞から調製されるオルガネラゲノムＤＮＡを有するプラスミド、該プラスミドをオルガネラゲノムＤＮＡに導入することにより得られる形質転換体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オルガネラゲノムＤＮＡとは、核外自己増殖器官として存在する葉緑体やミトコンドリアなどのオルガネラ（細胞小器官）中に存在するゲノムＤＮＡであり、細胞質遺伝を支配し、核遺伝子に対して自律性をもち、形質発現を行う性質を有する。植物等が有するゲノムＤＮＡに変異を導入したり、外来の遺伝子を導入したトランスジェニック植物等を作製する場合、オルガネラＤＮＡに導入する方法は、核ＤＮＡへ変異等を導入する方法と比べて、花粉飛散による導入遺伝子または改変遺伝子の他植物等への伝搬のリスクが低いため、非常に有利な手段となる。また、オルガネラは主要な生合成経路の中心部分を構成し、非常に多くのタンパク質を合成する器官であることから、オルガネラゲノムＤＮＡに導入した外来遺伝子は、これをオルガネラ内で発現させることにより大量の目的タンパク質を合成することができる。
【０００３】
そこで、さまざまなオルガネラゲノムＤＮＡの形質転換方法が開発されてきている。例えば、タングステンなどの微粒子にＤＮＡをコートした後に該微粒子を粒子銃（パーティクルガン）により細胞または組織に打ち込む方法（例えば、クラミドモナス葉緑体については非特許文献１、高等植物については非特許文献２および非特許文献３をそれぞれ参照）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ介在形質転換方法、プロトプラスト形質転換方法、ＤＮＡを含む培地中において植物組織、細胞またはプロトプラストを超音波処理する方法、ＤＮＡを全能性植物材料へｍｉｃｒｏｉｎｓｅｒｔｉｏｎ（必要であれば、公知の炭化ケイ素技術を用いる）する方法、あるいはエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【０００４】
しかし、これらの方法においては、導入する遺伝子は相同組み換えなどを利用してオルガネラゲノムＤＮＡに導入されるため、導入効率が低いことや、大きなサイズのＤＮＡは導入が困難であるなどの問題点があった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｂｏｙｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０，  １５３４−１５３８（１９８８）
【非特許文献２】
Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ８７，８５２６−８５３０
【非特許文献３】
Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９０，９１３−９１７
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は、オルガネラゲノムＤＮＡへの変異の導入および外来遺伝子の導入などを効率良く行うこと、また大きなサイズからなる外来遺伝子をオルガネラゲノムＤＮＡへ導入すること、さらに該変異や新規遺伝子をオルガネラゲノムＤＮＡに導入することにより該オルガネラやオルガネラを有する細胞および個体に新規の形質を付与することなどを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、タバコ葉緑体ＤＮＡを枯草菌ゲノムベクターへ挿入した後に、挿入されたタバコ葉緑体ＤＮＡを環状プラスミドとして回収し、さらに該環状プラスミドにより葉緑体を形質転換することができること、さらに、枯草菌ゲノムベクターはＤＮＡに変異や挿入を付加すること、特に大きなサイズのＤＮＡを挿入することに適していることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、
（１）オルガネラゲノムＤＮＡの全長が挿入されたゲノムＤＮＡを有する微生物細胞、
（２）オルガネラゲノムＤＮＡが、変異が導入されたＤＮＡであることとを特徴とする上記（１）に記載の微生物細胞、
（３）変異の導入が、１若しくは数個のＤＮＡの置換、欠失または付加であることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の微生物細胞、
（４）変異の導入が、外来遺伝子ＤＮＡの挿入であることを特徴とする上記（１）〜（３）の何れかに記載の微生物細胞、
（５）微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌又は高度好熱菌であることを特徴とする上記（１）〜（４）の何れかに記載の微生物細胞、
（６）上記（１）〜（５）に記載の微生物細胞から調製されるオルガネラゲノムＤＮＡを有する環状プラスミドＤＮＡ、
（７）上記（６）に記載のプラスミドＤＮＡを、オルガネラに導入することにより得られる形質転換体、該形質転換体を再分化させた個体およびその子孫、
（８）目的蛋白質の製造方法であって、（ｉ）微生物細胞のゲノムにオルガネラゲノムＤＮＡの全長を挿入し、（ｉｉ）該オルガネラゲノムＤＮＡに、外来の目的蛋白質をコードするＤＮＡを、導入するオルガネラ内で有効な発現制御領域の制御下となるように挿入し、（ｉｉｉ）得られたオルガネラゲノムＤＮＡをプラスミドとして回収した後に、（ｉｖ）該プラスミドをオルガネラに導入し、（ｖ）該オルガネラＤＮＡを保持する形質転換体中で目的蛋白質を発現させることを特徴とする方法、
が、提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
（１）オルガネラゲノムＤＮＡの全長が挿入されたゲノムを有する微生物細胞の取得
本発明においては、まずオルガネラゲノムＤＮＡを微生物ゲノムへ挿入する。本発明のオルガネラゲノムＤＮＡを有するオルガネラとしては、ミトコンドリア、および葉緑体などの色素体等が挙げられる。これらオルガネラは何れの個体あるいは細胞のものでもよいが、微生物ゲノム中で組み換えを行った後に該ＤＮＡをオリジナルのオルガネラへ導入する工程を行う目的がある場合には、オルガネラへのＤＮＡの導入方法が知られているものが好ましい。また、オルガネラゲノムＤＮＡの塩基配列が解析されているものや、オルガネラゲノムＤＮＡクローンが既にあるものも微生物ゲノムへ挿入する操作において好ましい。具体的には、例えば、タバコ、イネ、シロイヌナズナなどの植物細胞、ヒト、マウス、ショウジョウバエ、線虫等の動物細胞、およびこれらの培養細胞のオルガネラ等が挙げられる。
【００１０】
オルガネラゲノムＤＮＡの取得方法は、特に制限はなく、オルガネラに適した公知の方法を適宜選択して用いることができる。具体的には、例えば、タバコの葉緑体ゲノムを取得する方法としてはＳｈｉｎｏｚａｋｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ５，  ２０４３−２０４９（１９８６）に記載の方法等が用いられる。また、市販のオルガネラゲノムＤＮＡの部分断片がクローニングされたプラスミドなどを用いることもできる。ミトコンドリアゲノムＤＮＡは、市販のマウスＧｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を用いることもできるし、ＩＳＯＨＡＩＲキット（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）を用いて毛髪あるいは爪等の細胞から抽出して用いることもできる。
【００１１】
微生物ゲノムへ挿入するオルガネラゲノムＤＮＡの全長とは、必ずしも全長を含む必要はなく、オリジナルのオルガネラ中でゲノムＤＮＡとして機能し得るものであれば如何なるものであってもよい。また、本発明で用いる微生物細胞の種類は特に限定されず、細菌、真菌、酵母などの任意の微生物細胞を使用できる。これらの中で、好ましくは細菌の細胞、特に好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌又は高度好熱菌の細胞である。
【００１２】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌の種類は特に限定されず、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（脾脱疽菌）、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度好熱菌）などが挙げられる。好ましくは、ＤＮＡ取り込み能力と組換え能力に優れたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）である。高度好熱菌とは高温下でのみ生育できる細菌の総称である。
【００１３】
オルガネラゲノムＤＮＡの微生物細胞への導入方法としては、それぞれの細胞に適した公知の方法を適宜選択して用いることができる。微生物細胞として、枯草菌を用いる場合には、（ａ）オルガネラゲノムＤＮＡの全長（本明細書中では、これを「オルガネラゲノムＤＮＡ」と称することがある）を、互いに重複する塩基配列を有する複数のＤＮＡ断片として調製し、該ＤＮＡ断片を枯草菌ゲノムベクターへ相同組み換えを利用して導入する方法（Ｉｔａｙａ，  Ｍ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｔ．，  ２４８，  ９−１６（１９９５））、および（ｂ）オルガネラゲノムＤＮＡを枯草菌ゲノムベクター中に「尺取り虫法」と称される手法で連続したＤＮＡを組み込む方法（Ｉｔａｙａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２８，  ８６９−８７５（２０００））等が挙げられる。
【００１４】
このうち（ａ）の方法においては、まず、オルガネラゲノムＤＮＡを互いに重複する塩基配列を有する複数のＤＮＡ断片（以下、これを「部分断片」と称することがある）として調製する。部分断片の長さは約１０ｋｂ程度が好ましいが、相同組み換えが誘導されない等の不都合があった場合には、これを重複配列を有するように分割した断片を調製して部分断片として用いる。各ＤＮＡ断片の重複配列は、１ｋｂ程度が好ましいが、適宜調整して用いられる。ＤＮＡ断片の調製方法としては、ポリメラーゼチェインリアクションを用いた方法が好ましく用いられるが、この限りではない。取得されたＤＮＡ断片は、共通の大腸菌等の菌体内で増幅されるベクターにクローニングする。ここで、共通のベクターに既にクローニングされたＤＮＡ断片を用いることもできる。取得された部分断片の微生物ゲノムへの挿入は、微生物ＤＮＡ断片がクローニングされているベクター配列中でこの部分断片をはさむ２つの塩基配列（以下、これを「共通配列」と称することがある）を微生物ゲノムへ導入した後に、この微生物を部分断片を有するプラスミドで形質転換し、この共通配列において相同組み換えを生じさせることにより部分断片を微生物ゲノムへ導入する方法が用いられる。さらに、オルガネラゲノム中で隣接する塩基配列を有する部分断片（以下、これを「第２の部分断片」と称することがある）を微生物ゲノムに挿入された部分断片と連結させる場合には、該微生物を第２の部分断片を含むプラスミドで形質転換し、部分断片の重複配列と共通配列において相同組み換えを生じさせることにより連結させる方法が用いられる。この連結方法を繰り返すことによりオルガネラゲノムＤＮＡの全長が挿入されたゲノムＤＮＡを有する微生物ＤＮＡ細胞を取得することができる。
【００１５】
（２）微生物ゲノムへ挿入されたオルガネラＤＮＡへの変異の導入
微生物ゲノムへ挿入されたオルガネラゲノムＤＮＡには、種々の変異を導入することができる。変異の種類としては、１または数個のＤＮＡを置換、欠失または付加するものや、外来遺伝子ＤＮＡを挿入するもの等が挙げられる。このような変異の導入によりオルガネラ、オルガネラを有する細胞および個体に新規の形質を付与することができるため、植物および動物の育種に極めて有効な手段となる。
【００１６】
１または数個のＤＮＡに変異を誘導する方法は、それ自体既知の通常用いられる方法から適宜選択して用いることができる。具体的には、Ｇｅｎｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｉｔａｙａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２２３，  ２６８−２７２（１９９０））などが挙げられる。また、外来遺伝子ＤＮＡを挿入する場合、導入するオルガネラ内で有効な発現制御領域の制御下となるように外来遺伝子ＤＮＡを挿入する必要がある。具体的には、導入するオルガネラ内で有効なプロモーターの下流に外来遺伝子ＤＮＡを連結し、さらにその下流に導入するオルガネラ内で有効なターミネーターを連結したＤＮＡ等を挿入する。
【００１７】
導入するオルガネラ内で有効なプロモーターとしては、例えば導入するオルガネラが葉緑体の場合、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター、ｒｂｃＬプロモーター、あるいはｐｓｂＡプロモーター等が好ましく用いられる。また、導入されたオルガネラ等に外来遺伝子により付与される形質を、誘導調節が可能なものにしようとする場合には、誘導性のプロモーターを用いることも好ましい。
【００１８】
外来遺伝子としては、特に制限はなく、これを導入したオルガネラを有する個体等に付与する所望の形質により選択して用いることができる。具体的には、例えば、除草剤などの薬剤耐性遺伝子、病虫害抵抗性遺伝子、選抜マーカー遺伝子、活性強化型葉緑体酵素遺伝子、低温でも高活性を有するラジカルスカベンジャー（カタラーゼ等）遺伝子等が挙げられるが、この限りではない。
【００１９】
（３）オルガネラゲノムＤＮＡを有する環状プラスミドの取得およびオルガネラの形質転換
かくして微生物ゲノムに挿入されたオルガネラゲノムＤＮＡ、または変異を有するオルガネラゲノムＤＮＡは、特開２０００−９３号公報に記載の方法、またはオルガネラゲノムＤＮＡの５’または３’末端にレアカッター認識配列を予め導入しておき、これを切り出して回収する方法等を適用することにより、微生物ゲノムから切り離され、環状プラスミドとして微生物細胞内で自律複製ができるようになる。この環状プラスミドＤＮＡを微生物細胞内から公知の方法により回収することによりオルガネラゲノムＤＮＡを有する環状プラスミドを取得することができる。
【００２０】
次に取得されたオルガネラゲノムＤＮＡを有する環状プラスミドにより上記オルガネラを形質転換する。形質転換するオルガネラとしては、導入するオルガネラゲノムＤＮＡを取得したオルガネラと同種のものが好ましいが、オルガネラゲノムＤＮＡにより形質転換され得る限り特に制限はない。
形質転換の方法は、それ自体公知であり、形質転換するオルガネラに適した方法を選択して用いることができる。具体的には、例えば、タングステンなどの微粒子にＤＮＡをコートした後に該微粒子を粒子銃（パーティクルガン）により細胞または組織に打ち込む方法（クラミドモナス葉緑体：Ｂｏｙｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０，  １５３４−１５３８（１９８８）；高等植物：Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ８７，８５２６−８５３０、Ｓｖａｂ，  Ｚ．  ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，  ９０，９１３−９１７）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ介在形質転換方法、プロトプラスト形質転換方法（この場合、必要であればポリエチレングリコールの存在下で行う）、ＤＮＡを含む培地中において植物組織、細胞、またはプロトプラストを超音波処理する方法、ＤＮＡを全能性植物材料へｍｉｃｒｏｉｎｓｅｒｔｉｏｎする方法、（この場合、必要であれば、公知の炭化ケイ素技術を用いる）、あるいはエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２１】
このうち、パーティクルガンにより形質転換する方法においては、上記（２）で調製したオルガネラゲノムＤＮＡを含む環状プラスミドを適当な方法で精製し、これをタングステン等の微粒子の表面にセシウム、スペルミジン等の存在下で付着させる。この微粒子をプラスチック製の弾等の先端に充填し、パーティクルガンに装填する。オルガネラは、これを含む細胞または組織として調製し、これに上記パーティクルガンにより微粒子を撃ち込む。この後、該細胞または組織を培養して、オルガネラゲノムＤＮＡが導入されたオルガネラを有するものを選択すれば、形質転換体を取得することができる。
【００２２】
ここで、オルガネラ中には多コピーのオルガネラゲノムＤＮＡが存在するため、形質転換体の選択は慎重に行うことが好ましい。具体的には、導入するオルガネラゲノムＤＮＡに、導入されたオルガネラ内で発現可能なようにマーカー遺伝子を挿入し、形質転換操作後、このマーカー遺伝子の発現により形質転換体を選択する方法等が好ましい。複数のマーカー遺伝子を挿入しておくとさらに正確な選択が可能となる。
【００２３】
（４）形質転換体の利用
上記（３）で取得された形質転換体は、その内部に所望により様々な目的の変異が導入されたオルガネラゲノムＤＮＡを有するオルガネラを保持するものである。従って、これを個体に再分化させることによればミュータントあるいはトランスジェニック生物を作製することができる。本方法は特に植物体に有効であり、所望の性質を有する植物の育種に用いることができる。
【００２４】
また、オルガネラは生合成が活発であるので、例えば挿入した目的蛋白質をコードする遺伝子を形質転換体が保持するオルガネラ内で発現させ、該遺伝子がコードする蛋白質を大量に合成することにも用いられる。目的蛋白質のオルガネラ内での発現は、形質転換体を培養するか、該形質転換体を再分化させた個体を育成する等して行うことができる。合成される目的蛋白質としては、例えば、微生物由来の抗原用ワクチン蛋白質、動物と植物に共通な細胞質蛋白質の機能阻害蛋白質あるいはペプチド抗体等が好ましく挙げられるが、この限りではない。
【００２５】
かくして合成された目的蛋白質は、培養物か個体から採取し、所望によりさらに精製し、食品か医薬品等の有用物質として用いることができる。上記した形質転換体の培養、個体への再分化、個体の育成、目的蛋白質の採取や精製等は、それ自体既知の通常用いられる方法を用いて行うことができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、下記実施例において、  枯草菌ＲＭ１２５株（Ｕｏｚｕｍｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，１５２，６５−６９（１９９７））は、当研究室で受け継がれているものを使用した。枯草菌ＢＥＳＴ７００３株は、上記ＲＭ１２５株のゲノムにおいて、ｐｒｏＢ遺伝子中に存在するＮｏｔＩ部位に、ｐＢＲ３２２（Ｉｔａｙａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １２８，  ８６９−８７５（２０００））ベクターＤＮＡ断片とテトラサイクリン耐性遺伝子ＤＮＡ断片を挿入した構造のゲノムを有している。これはｐｒｏＢ：：ｐＢＲＴｃ（Ｉｔａｙａ，Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４１，  ２８７−２９７（１９９３））に由来する。タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡは、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ５，  ２０４３−２０４９（１９８６）に記載のとおおりに取得したものを用いた。
【００２７】
枯草菌ゲノムベクターにＤＮＡ断片を挿入するために使用するベクタープラスミドｐＣＩＳＰ４０１（クロラムフェニコール耐性）、ｐＣＩＳＰ４０２（エリスロマイシン耐性）は以下のように構築した。プラスミドｐＣＩＳＰ３１０Ｂ、およびｐＣＩＳＰ３１１Ｂ（Ｉｔａｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２８，８６９−８７５（２０００））を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで完全消化することにより、ｃＩ８５７遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子を削除し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ−ＢａｍＨＩリンカー（配列番号１、２：アデコンセプト社に依頼して作製した）を挿入した。ｐＣＩＳＰ３１０Ｂから上記のようにして得られたプラスミドをｐＣＩＳＰ４０１、またｐＣＩＳＰ３１１Ｂから得られたものをｐＣＩＳＰ４０２とした（図１）。
【００２８】
枯草菌ゲノムベクター中のｐＢＲ３２２ベクターの塩基配列に挟まれた領域を回収するベクター、ｐＧＥＴＳ１１２は、ｐＢＲＤＨｒｅｐＡＴ１Ｆ（特願２００２−２７３７４７明細書）をＳｍａＩで消化し脱リン酸化後、ｐＢＥＳＴ７０３（Ｉｔａｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ，１７４，  ５４６６−５４７０（１９９２））をＰｓｔＩで消化し末端を平滑化して得られたエリスロマイシン耐性遺伝子のカセットを連結して、プラスミドｐＧＥＴＳ１１２を構築した。
【００２９】
アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシンは、シグマ社から購入した。ブラストサイジンＳはフナコシから購入した。制限酵素ＮｏｔＩ、Ｓｓｅ８３８７Ｉは宝酒造から購入した。Ｉ−ＰｐｏＩはｐｒｏｍｅｇａから購入した。Ｉ−ＣｅｕＩはＮＥＢから購入した。それ以外の制限酵素は東洋紡から購入した。
ＰＣＲによるＤＮＡ増幅には宝酒造社のＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳを用いた。ＰＣＲの条件は、９５℃−３分の後、９５℃−３０秒、６０℃−４５秒、７２℃−２．５〜５分（２ｋｂにつき１分）を３０サイクル行った。
【００３０】
ＰＣＲ産物のクローニングにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いた。特記以外のプラスミドの構築には、大腸菌ＪＡ２２１株（ＡＴＣＣ３７４３６株としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能）を用いた。
構築したプラスミドの抽出、検定、調製等の操作法は、標準プロトコールに従った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９））。大腸菌、枯草菌の形質転換は、既報に従って行った（Ｉｔａｙａ，Ｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２４１，２８７−２９７（１９９３））。
【００３１】
実施例１ ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ベクターを用いたタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ整列クローンの作成
タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡを分割して、ぞれぞれが約２ｋｂずつ重複するようなＤＮＡ断片を以下のようにして作製した。タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー００３７６７Ｆ（配列番号１）と０１０２３９Ｒ（配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ベクターにクローニングし、プラスミドｐＣＲ００３−０１０  を作製した。同様に、表１に記載の２５組のプライマー（配列番号３〜５０）を用いてＰＣＲを行い、それぞれ増幅された断片をｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ベクターにクローニングした（表１；以下これらを総称して「整列クローン」と称することがある）。ここで、全てのｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒにはＳｓｅ８３８７Ｉ  認識配列を、またｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒにはＮｏｔＩ  認識配列を付加して設計した。表１に記載したプライマー名の数字は、タバコ葉緑体ゲノム配列の塩基番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｚ０００４４    Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ）を示している。この手法で合計１８クローンを得たが、残りの８断片のクローンは得られなかった。
【００３２】
実施例２ ｐＣＩＳＰ４０１、ｐＣＩＳＰ４０２ベクターを用いたタバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ整列クローンの作成
実施例１で得られたプラスミドから挿入された葉緑体ＤＮＡ断片を切り出し、枯草菌ゲノムベクターに組み込むためのベクタープラスミドｐＣＩＳＰ４０１、ｐＣＩＳＰ４０２（図１）に移した。お互いに相同配列を有する隣り合ったクローンを薬剤耐性の異なるプラスミドへの移行は以下の手法で行った。
【００３３】
エリスロマイシン耐性遺伝子を有するｐＣＩＳＰ４０２を、制限酵素ＮｏｔＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化した断片と、実施例１で得たプラスミドｐＣＲ００３−０１０（葉緑体ゲノム塩基配列番号：３７６７番〜１０２３９番）をＮｏｔＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化した断片を結合し、ｐＥ［００３−０１０］を構築した。ｐＥ［００３−０１０］はエリスロマイシン耐性プラスミドである。
ｐＣＲ００７−０１７（葉緑体ゲノム塩基配列番号：７４１８番〜１７９９９番）中の１０ｋｂの断片はｐＣＲ００３−０１０と約３ｋｂの相同配列があるため、これはクロラムフェニコール耐性のｐＣＩＳＰ４０１に組み込む必要がある。ｐＣＩＳＰ４０１を制限酵素ＮｏｔＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化した断片と、実施例１で得たプラスミドｐＣＲ００７−０１７をＮｏｔＩとＳｓｅ８３８７Ｉで消化した断片を結合し、ｐＣ［００７−０１７］を構築した。
【００３４】
実施例１で得たプラスミドすべてを、表１に示すようにクロラムフェニコール耐性、エリスロマイシン耐性が交互に重なり合うように、上記と同様にしてｐＣＩＳＰ４０１、およびｐＣＩＳＰ４０２に移した。
【００３５】
【表１】
2004166569.tif 000002
【００３６】
【表２】
2004166569.tif 000003
【００３７】
実施例３ ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクタークローンが得られなかったＤＮＡ断片のクローニング
実施例１でｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ  ベクターにクローニングできなかった８つのＰＣＲ断片は、枯草菌ゲノムベクターに挿入可能なベクタープラスミドｐＣＩＳＰ３１０Ｂ、ｐＣＩＳＰ３１１Ｂ、ｐＣＩＳＰ４０１、ｐＣＩＳＰ４０２に直接クローニングを試み、それぞれ以下の要領で得た。
【００３８】
プライマー０２７４７２  Ｆ（配列番号１１）と０３６８１３  Ｒ（配列番号１２）を用いたＰＣＲ断片は、内在性の２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位を利用して、ｐＣＩＳＰ３１０ＢのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＣ［０２７−０３６］を得た。
プライマー０９３１６３  Ｆ（配列番号３１）と１０００１２  Ｒ（配列番号３２）を用いたＰＣＲ断片は、内在性の２つのＢａｍＨＩＩ部位を利用してｐＣＩＳＰ４０１のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＣ［０９４−０９９］Ｂを得た。
【００３９】
プライマー０９７７９１  Ｆ（配列番号３３）と１０７２１８  Ｒ（配列番号３４）を用いたＰＣＲ断片は、内在性の２つのＨｉｎｄＩＩＩ部位を利用してｐＣＩＳＰ３１１ＢのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＥ［０９７−１０７］Ｈを得た。
プライマー１１９７２５  Ｆ（配列番号３９）と１２９１３４  Ｒ（配列番号４０）を用いたＰＣＲ断片は、２つに分割した。一つはプライマー１１９７２５  Ｆ中に設計したＢａｍＨＩ部位と、ＰＣＲ断片中に存在するＢｇｌＩＩ部位を利用して、ｐＣＩＳＰ４０１のＢａｍＨＩ部位に挿入し、ｐＣ［１１９−１２５］とした。他は、ＰＣＲ断片中に存在する２カ所のＥｃｏＴ２２Ｉ  部位を利用してｐＣＩＳＰ４０２のＳｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、ｐＥ［１２４−１２８］Ｅを得た。
【００４０】
プライマー１３４４１７  Ｆ（配列番号４３）と１４３７９８  Ｒ（配列番号４４）を用いたＰＣＲ断片は、プライマー１３４４１７  Ｆ中に設計したＰｓｔＩ部位と、ＰＣＲ断片中に存在するＰｓｔＩ部位を利用して、ｐＣＩＳＰ４０２のＳｓｅ８３８７Ｉ  部位に挿入し、ｐＥ［１３４−１４３］Ｐを得た。
プライマー１４１０４４  Ｆ（配列番号４５）と１５０１２５  Ｒ（配列番号４６）を用いたＰＣＲ断片は、プライマー１４１０４４  Ｆ中に設計したＥｃｏＴ２２Ｉ  部位と、ＰＣＲ断片中に存在するＥｃｏＴ２２Ｉ  部位を利用して、ｐＣＩＳＰ４０１のＳｓｅ８３８７Ｉ  部位に挿入し、ｐＣ［１４１−１５０］Ｅを得た。
【００４１】
プライマー１４７０６５  Ｆ（配列番号４７）と００００７９  Ｒ（配列番号４８）を用いたＰＣＲで得た断片は、内在性の２つのＰｓｔＩ  部位を利用して、ｐＣＩＳＰ４０２のＳｓｅ８３８７Ｉ  部位に挿入し、ｐＥ［１４７−１５４］Ｐを得た。
【００４２】
実施例４ 整列クローンの枯草菌ゲノムベクターへの導入
実施例２で作成したプラスミドｐＥ［００３−０１０］を用いて枯草菌ＢＥＳＴ７００３株を形質転換し、エリスロマイシン耐性のＢＥＳＴ９００５株を得た。この形質転換ではｐＥ［００３−０１０］内のｐＢＲ３２２配列と、ＢＥＳＴ７００３ゲノムに組み込んであるｐＢＲ３２２配列で相同組み換えをおこし、ｐＥ［００３−０１０］中の葉緑体ＤＮＡ（塩基番号３７６７から１０２３９まで６４７２塩基対）がＢＥＳＴ７００３のｐＢＲ３２２中に組み込まる。得られたＢＥＳＴ９００５から抽出したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＲ００３−０１０をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、葉緑体ＤＮＡがＢＥＳＴ９００５ゲノムに組み込まれていることを確認した。さらにＤＮＡプラグのＩ−ＰｐｏＩ  消化物をパルスフィールドゲル電気泳動し、約７．５ｋｂ（挿入された葉緑体ＤＮＡとエリスロマイシン耐性遺伝子を含む大きさ）の断片を確認した。
【００４３】
ＢＥＳＴ９００５株中の葉緑体ＤＮＡを延長するためににプラスミドｐＣ［００７−０１７］を用いて形質転換し、クロラムフェニコール耐性のＢＥＳＴ９００７株を得た。この形質転換ではプラスミドとゲノムの両方に存在するｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を含む領域と、葉緑体ＤＮＡ同士の相同配列（塩基番号７４１８〜１０２３９）間で組み換えを起こし、ｐＣ［００７−０１７］中の７４１８から１７９９９までが新たにゲノム中に組み込まれる。ＢＥＳＴ９００７ではＢＥＳＴ９００５株に比較すると葉緑体ＤＮＡが７７６０塩基対（塩基番号１０２３９〜１７９９９）延長したことを、ＢＥＳＴ９００７ＤＮＡを鋳型にしてプライマーに００７４１８Ｆ（配列番号３）と０１０２３９Ｒ（配列番号２）、０１５６１１Ｆ（配列番号５）と０１７９９９Ｒ（配列番号４）を用いた２カ所のＰＣＲで確認した。さらにｐＥ［００３−０１０］をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、葉緑体ＤＮＡがＢＥＳＴ９００７ゲノムに組み込まれていることを確認した。また、ＤＮＡプラグのＩ−ＰｐｏＩ消化物をパルスフィールドゲル電気泳動し、約１５ｋｂ（挿入された葉緑体ＤＮＡとクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む大きさ）の断片を確認した。
【００４４】
このように実施例２、実施例３で作製した整列クローンを交互に形質転換に使用し、エリスロマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性の株を交互に選択した。合計２５回行った後、最後に得られたＢＥＳＴ９０４３株はタバコ葉緑体ゲノム全てがそのゲノム中に組み込まれていた。このことは、葉緑体ＤＮＡのＰＣＲ産物をプローブにしたサザンハイブリダイゼーションと、ＤＮＡプラグをＩ−ＰｐｏＩ  、Ｉ−ＣｅｕＩで消化したものをパルスフィールドゲル電気泳動することによって確認した。
【００４５】
実施例５ ｐＧＥＴＳベクターを用いたタバコ葉緑体ＤＮＡの回収
ｐＧＥＴＳベクター（ｐＧＥＴＳ１１２）  を用いて、以下のようにタバコ葉緑体ＤＮＡを回収した。
タバコ葉緑体ゲノム１５５ｋｂのＤＮＡをゲノム中にクローンしたＢＥＳＴ９０４３に、ｐＧＥＴＳ１１２のＨｉｎｄＩＩＩ完全消化断片を用いて形質転換し、エリスロマイシンで選択した。ＢＥＳＴ９０４３のｐＢＲ３２２中にクローンされたタバコ葉緑体ＤＮＡ領域をコピーしてプラスミドとして保持する菌だけがエリスロマイシン耐性菌となり、得られた菌をＢＥＳＴ９０４９と命名した。この株が有するプラスミド  をｐＢＥＳＴ９０４９と命名し、塩化セシウム密度勾配超遠心法により調製した。ｐＢＥＳＴ９０４９がタバコ葉緑体ＤＮＡを保持することは、タバコ葉緑体ゲノムＤＮＡ整列クローンをプローブにしたサザンハイブリダイゼーションにより確認した。さらにＤＮＡプラグのＩ−ＰｐｏＩ  消化物をパルスフィールドゲル電気泳動することにより、約１５０ｋｂの断片を確認し、タバコ葉緑体ゲノムの全長を有する環状プラスミドを取得した。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、オルガネラゲノムＤＮＡに所望の変異を付加する操作を非常に効率良く行うことができる。また、巨大サイズのＤＮＡをオルガネラゲノムＤＮＡに挿入しようとする場合にも効率よく簡単な操作により行うことができる。この技術は、植物の育種、蛋白質の大量合成方法等に応用可能である。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】枯草菌ゲノムベクターにＤＮＡ断片を挿入するために使用するベクタープラスミドｐＣＩＳＰ４０１（クロラムフェニコール耐性）、ｐＣＩＳＰ４０２（エリスロマイシン耐性）の構造を示す図である。
【図１】
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