(57)【要約】    【課題】  ＦＩＰＶ感染症の動物を治療するのに有用な蛋白質の提供が望まれている。    【解決手段】  選択されたコロナウイルス由来の少なくとも１個の非連続コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントと融合した同じ選択されたコロナウイルス由来の第一コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントからなるキメラコロナウイルスＳ蛋白質であって、該フラグメントが任意のアミノ酸リンカーによりいかなる順序でも融合され、該コロナウイルスがＩ型ＦＩＰＶ株、ＩＩ型ＦＩＰＶ株、ＦＥＣＶ株、ＣＣＶ株、ＰＲＣＶ株、トリコロナウイルス株、ヒトコロナウイルス株、ウシコロナウイルス株およびネズミコロナウイルス株からなる群より選択されるキメラコロナウイルスＳ蛋白質を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択されたコロナウイルス由来の少なくとも１個の非連続コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントと融合した同じ選択されたコロナウイルス由来の第一コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントからなるキメラコロナウイルスＳ蛋白質であって、該フラグメントが任意のアミノ酸リンカーによりいかなる順序でも融合され、該コロナウイルスがＩ型ＦＩＰＶ株、ＩＩ型ＦＩＰＶ株、ＦＥＣＶ株、ＣＣＶ株、ＰＲＣＶ株、トリコロナウイルス株、ヒトコロナウイルス株、ウシコロナウイルス株およびネズミコロナウイルス株からなる群より選択され、ここに該コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントが該選択されたコロナウイルス株のＳ蛋白質のアミノ酸残基１−３５０、４４−５７、９６−１４４、１６０−１７３、３４４−３８６、３５０−４５０、３７７−３８６、３７８−３９０、４００−６５０、４５０−６５０、５４２−５９７、６５０−１４５４、１３４４−１４０４、１４０９−１４１８、１４２６−１４３８、７７−８９、４０８−４２７、４８２−４９６、９２２−９３４、１１３３−１１４７、１３０８−１３２２、１３６８−１３９１、１３７９−１３９１、１１１５−１２３８、１−３１１、３１１−８７２および１−８７２からなる群より選択され、ここに該キメラコロナウイルスＳ蛋白質が該コロナウイルスの天然の完全長Ｓ蛋白質ではないキメラコロナウイルスＳ蛋白質。
【請求項２】
２以上のコロナウイルスＳ蛋白質フラグメントからなるキメラコロナウイルスＳ蛋白質であって、該フラグメントのうち少なくとも１個が免疫応答を誘起する能力を有する請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
該蛋白質フラグメントの融合により完全長よりも大きなＳ蛋白質が形成される請求項１記載の蛋白質。
【請求項４】
該蛋白質フラグメントの融合により少なくとも１６個のアミノ酸の長さの蛋白質が形成される請求項１記載の蛋白質。
【請求項５】
該ＦＩＰＶ株コロナウイルスが、ＷＴ ＦＩＰＶ ＤＦ２、ＷＴ ＦＩＰＶ ＷＳＵ １１４６、ＴＳ ＦＩＰＶ、ＷＴ ＦＩＰＶ ＵＣＤ−２、ＷＴ ＦＩＰＶ ＵＣＤ−３、ＷＴ ＦＩＰＶ ＵＣＤ−４、ＷＴ ＦＩＰＶ ＴＮ４０６、ＷＴ ＦＩＰＶ ＵＣＤ−１、ＦＩＰＶ ＤＦ２−ＨＰおよびＦＩＰＶ ＴＳ−ＢＰからなる群より選択される請求項１記載の蛋白質。
【請求項６】
ワクチン接種した動物において１種以上のコロナウイルスに対する免疫応答を誘起できる能力を特徴とする請求項１記載の蛋白質。
【請求項７】
該コロナウイルスＳ蛋白質が、配列番号:１２、２、４、６、８、１４、１６および１８からなる群より選択される請求項１記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質。
【請求項８】
該蛋白質フラグメントが、Ｓ蛋白質Ｂ細胞部位およびＳ蛋白質Ｔ細胞部位から選択される請求項１記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質。
【請求項９】
請求項１記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
免疫原性量の請求項１に記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質からなる、動物におけるコロナウイルス感染症を予防するのに有用なワクチン組成物。
【請求項１１】
さらに、１またはそれ以上の別の抗原からなる請求項１０記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
有効な免疫原性量の請求項１記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質をヒトを除く動物に内部投与することからなる、コロナウイルスに対する動物のワクチン接種方法。
【請求項１３】
有効量の請求項１に記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質からなる、動物におけるコロナウイルス感染症の治療用医薬組成物。
【請求項１４】
コロナウイルスに自然に曝露されている動物と、請求項１に記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質でワクチン接種されている動物とを区別するための診断キットであって、該キメラコロナウイルスＳ蛋白質を含む、診断キット。
【請求項１５】
コロナウイルスに自然に曝露されている動物と、請求項１に記載のキメラコロナウイルスＳ蛋白質でワクチン接種されている動物とを区別するための診断キットであって、該キメラコロナウイルスＳ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
同時出願の相互参照
本発明は、アメリカ合衆国特許出願第０７／６１３０６６号（１９９０年１１月１４日出願）の一部継続出願である、アメリカ合衆国特許出願第０７／６９８９２７号（１９９１年５月１３日出願）の一部継続出願である、係属中のアメリカ合衆国特許出願第０７／８８２１７１号（１９９２年５月８日出願）の一部継続出願である。
発明の分野
本発明は、コロナウイルス感染症に対するワクチン接種、治療に有用な組成物、およびこれらの組成物の使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）はコロナウイルスであり、これはネコにおいて致死性の高い免疫複合体病を引き起こす。ＦＩＰ病の病原性の正確な機構はわかっていないが、免疫複合体の沈積により、すべての主要内臓器官において病巣が見いだされる。数種のＦＩＰＶ株が病気にかかったネコから単離されている。毒性が高く、一次感染の後病気を引き起こすものもある（ＩＩ型）。他の毒性株（Ｉ型）は、ネコがあらかじめＦＩＰＶに暴露されていなければ病気を引き起こすことはできない。
ＦＩＰＶ以外の他のネココロナウイルスも公知である。ネコ小腸コロナウイルス(ＦＥＣＶ)はネコから単離されているが、発生病理においてＦＩＰＶと異なる。例えば、ＦＥＣＶは、ＦＩＰＶと対照的に、特異的に腸管上皮細胞に感染し、ネコにおいて軽い腸炎しか引き起こさない。加えて、ＦＥＣＶはＦＩＰＶでの攻撃感染の後にネコを感作して病気にするという報告はない。
他のコロナウイルス、即ち、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、トリコロナウイルス（ＡＣＶ）、ネズミコロナウイルス（ＭＣＶ）およびヒトコロナウイルス（ＨＣＶ）が他の動物種から単離されている。しかし、これらのコロナウイルスはＦＩＰＶと同じ発生病理を共有しない。ＦＥＣＶと同様、これらのコロナウイルスは呼吸器または軽い胃腸炎のいずれかを引き起こす。
【０００３】
コロナウイルスは、３種の構造蛋白質：Ｓ−表面糖蛋白質またはスパイク；Ｍ−エンベロープマトリックス蛋白質；およびＮ−ＲＮＡゲノムと相互作用してウイルスカプシドを作る核蛋白質をコードする。Ｓ蛋白質は感染後の中和抗体の生成を包含する免疫応答を誘発する。これはまた感染細胞への付着の一因となり、細胞融合を媒介し、ウイルスの拡散を助ける。かくして、Ｓ蛋白質はウイルス中和抗体の標的であり、感作エピトープを含有するので、有効なコロナウイルスワクチンを開発する第一目標である。特に、他のＦＩＰＶ遺伝子産物（ＭまたはＮ）は、そのウイルスに対する有効な免疫性を刺激しないことが判明している。
【０００４】
ＦＩＰＶの野生型ＷＳＵ１１４６株のＳ遺伝子の配列は開示されている
［デグルート（DeGroot）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー
（J.Gen.Virol.），６８：２６３９−２６４６（１９８７）］。ＩＩ型野生型ＦＩＰＶ株はネコにおいて毒性が高く、毒性ＦＩＰＶのＳ遺伝子単独でネコを感作して病気にすることができる。Ｓ遺伝子に対する強い体液性応答は病気のネコにおける免疫複合体が原因であると考えられる。しかしながら、抗原／中和エピトープのＦＩＰＶ Ｓ遺伝子上の存在位置についてはほとんど知られていない。
他のコロナウイルスＳ遺伝子の部分配列は同定されている。例えば、ＰＲＣＶＳ遺伝子の配列［カリフォルニア州、マウンテン・ビュー、インテル・ジェネティックス、ジンバンクＲデータベース（GenbankＲ database, Intell Genetics, Mountain View, ＣＡ］；ＢＣＶ Ｍebus株Ｓ遺伝子［アブラハム（Abraham）ら、ウイロロジー（Virol.），１７６：２９６−３０１（１９９０）］；Ｆ１５株  Ｓ遺伝子［ボイリュ（Boireau）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J. Gen. Virol.），７１：４８７−４９２（１９９０）］；ＡＣＶ Ｓ遺伝子［エム・ビンネス（M.Binnes）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），６６：７１９−７２６（１９８５）］；ＭＣＶ Ｓ遺伝子［アイ・シュミット（I.Schmidt）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），６８：４７−５６（１９８７）］およびＨＣＶ  Ｓ遺伝子［ティー・ラアベ（T.Raabe）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），７１：１０６５−１０７３（１９９０）］参照。ＴＧＥＶスパイク蛋白質についてのみ、４個の主要な抗原性および中和部位が決定されている［コーレア（Correa）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），７１：２７１−２７９（１９９０）］および［デルマス（Delmas）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー(J.Gen.Virol.),７１：１３１３−１３２３（１９９０）］参照。
【非特許文献１】デグルート（DeGroot）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），６８：２６３９−２６４６（１９８７）
【非特許文献２】アブラハム（Abraham）ら、ウイロロジー（Virol.），１７６：２９６−３０１（１９９０）
【非特許文献３】ボイリュ（Boireau）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J. Gen. Virol.），７１：４８７−４９２（１９９０）
【非特許文献４】エム・ビンネス（M.Binnes）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），６６：７１９−７２６（１９８５）
【非特許文献５】アイ・シュミット（I.Schmidt）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），６８：４７−５６（１９８７）
【非特許文献６】ティー・ラアベ（T.Raabe）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），７１：１０６５−１０７３（１９９０）
【非特許文献７】コーレア（Correa）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.），７１：２７１−２７９（１９９０）
【非特許文献８】デルマス（Delmas）ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー(J.Gen.Virol.),７１：１３１３−１３２３（１９９０）
【非特許文献９】ヴェンネマ（Vennema）らは、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）、６４：１４０７−１４０９（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＦＩＰＶに対する安全で有効なワクチンを製造する試みはほとんど失敗に終わっている。亜致死量の毒性ＦＩＰＶウイルス、非毒性ＦＩＰＶ株または他の抗原関連のコロナウイルスの投与は有効ではない。予めウイルスに暴露すると、ＦＩＰＶ感染に対する強い体液性応答のために病気が典型的に増悪する。最近、ＤＦ２ＦＩＰＶの温度感受性株の生ウイルスからなるワクチンが製造されている［プリムセル・ＦＩＰＲ（Primucell FIPＲ）；スミスクライン・ビーチャム（SmithKline Beecham）］。このワクチンを口鼻的に投与した場合、該ワクチンは野生型ＤＦ２ ＦＩＰＶに対してネコを防御するが、感作しない。しかし、このワクチンは強い株間反応を誘起しない。
【０００６】
不均質発現系において産生されたＦＩＰＶ遺伝子産物からなる組み換えワクチンが産生されている。ヴェンネマ（Vennema）らは、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.）、６４：１４０７−１４０９（１９９０）においてＦＩＰＶ（ＩＩ型、ＷＳＵ１１４６株）のＳ、ＭおよびＮ遺伝子を発現するワクシニアウイルス組み換え体を構築した。Ｓ遺伝子を発現する組み換えワクチンウイルスで免疫化したネコはＦＩＰを発病し、ＦＩＰＶ攻撃の後ワクチン接種をしていない動物よりも早く死亡した。ＦＩＰＶ ＭまたはＮ蛋白質を発現するワクシニア組み換え体は、結果的に、ネコをＦＩＰＶに対して防御しないし、感作もしない。攻撃からの防御は何ら観察されないが、これらの結果からＳ遺伝子がＦＩＰ病の発病に関係していることは明らかである。
ＦＩＰＶおよび血清学的に関連した感染症に対する動物の治療およびワクチン接種において用いるための効果的な組成物についての要求が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
一態様において、本発明はコロナウイルス感染症の治療および予防において有用なキメラコロナウイルススパイク（Ｓ）蛋白質を提供する。本発明のキメラＳ蛋白質は、単一のコロナウイルス株に対する応答の強化を誘発するか、または１以上のコロナウイルス株および／または種に対する免疫応答を誘起することができる。
別の態様において、本発明は、本発明のキメラＳ蛋白質またはＳフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
別の態様において、本発明は選択された宿主細胞においてその複製および発現を行う調節配列と操作上関連したキメラＳ遺伝子ポリヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド分子を提供する。
【０００８】
さらに別の態様において、本発明は前記の組み換えポリヌクレオチド分子で形質転換された宿主細胞を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、有効量または免疫原性量の１またはそれ以上の本発明のキメラコロナウイルスＳ蛋白質またはＳ蛋白質フラグメントあるいはそのフラグメントを適当な担体中に含む医薬組成物またはワクチン組成物を提供する。これらのキメラコロナウイルスＳ蛋白質はそのフラグメントが由来し、株間および種間応答を誘発するコロナウイルスにより引き起こされる病気の治療および予防において有用である。
従って、別の態様において、本発明はコロナウイルスに対する投薬を受けていない動物のワクチン接種法、またはコロナウイルス感染症に感染した動物の治療法を提供するものであり、両方とも有効量の本発明の医薬組成物を動物に投与することによる。
【０００９】
別の態様において、本発明は、臨床検査室において、本発明のキメラＳ蛋白質でワクチン接種した動物とキメラＳ蛋白質からなるコロナウイルス（または複数）に自然に暴露した動物を区別するための方法および診断キットを提供する。
本発明の他の態様および利点は、さらに、以下の発明の詳細な記載および好ましい具体例において記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な記載
本発明は、コロナウイルス感染症に対するワクチン接種および治療に有用な新規キメラコロナウイルスＳ蛋白質、ならびにこれらの蛋白質およびこれらを含有する医薬組成物の製造法を提供する。これらの新規キメラ蛋白質をコロナウイルススパイク蛋白質の免疫感作および防御エピトープの同定において用いる方法も開示する。
【００１１】
Ｉ．定義
本明細書において定義する場合、「キメラコロナウイルスＳ蛋白質」、「本発明のキメラ蛋白質」「キメリクス」などの語は、選択されたコロナウイルス由来のＳ遺伝子配列の全部または一部によりコードされる１またはそれ以上の別のアミノ酸配列といずれかの順序で融合した選択されたコロナウイルス由来のＳ遺伝子配列の全部または一部によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質を包含する。所望により、これらのキメラ蛋白質はまた、キメラ蛋白質、Ｓ蛋白質アミノ酸配列またはそのフラグメントと融合した１またはそれ以上の非Ｓ蛋白質または非コロナウイルス蛋白質配列を含有してもよい。
【００１２】
一具体例において、本発明のキメラコロナウイルスＳ蛋白質は、選択されたコロナウイルスからの第一コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントおよび選択されたコロナウイルスからの少なくとも１個の別のコロナウイルスＳ蛋白質フラグメントを含有し、該フラグメントは任意のアミノ酸リンカーにより所望の順序で融合し、所望のキメラ蛋白質を形成する蛋白質フラグメントは少なくとも２つのコロナウイルスの異なる株または種より単離されたかまたは由来のものである。
別の具体例において、本発明のキメラコロナウイルスＳ蛋白質は、同じ選択されたコロナウイルスからの少なくとも１個の非連続コロナウイルスＳ蛋白質フラグメント（即ち、フラグメントはＳ遺伝子の異なる領域によりコードされる）といずれかの順序で融合した選択されたコロナウイルスからの第一コロナウイルスＳ蛋白質フラグメントを含有し、該フラグメントに関与するコロナウイルスは、Ｉ型ＦＩＰＶ株、ＩＩ型ＦＩＰＶ株、ＦＥＣＶ株、ＣＣＶ株、ＰＲＣＶ株、トリコロナウイルス株、ヒトコロナウイルス株、ウシコロナウイルス株およびネズミコロナウイルス株である。
【００１３】
望ましくは、キメラ蛋白質を形成するこれらのアミノ酸配列は、同じ解読フレーム中に翻訳され、蛋白質を形成するように融合される、即ちフレーム中に融合される。例えば、エイ・シャッツマンおよびエム・ローゼンベルク（A.ShatzmanおよびM.Rosenberg）、ヘパトロジー（Hepatology）、７（１）：３０Ｓ−３５Ｓ（１９８７）およびジイ・エム・ワインストック（G.M.Weinstock）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、８０：４４３２−４４３６（１９８３年７月）参照。融合は、直接的、即ち、Ｓ蛋白質アミノ酸配列をＳ蛋白質アミノ酸配列に、または間接的、即ち、スペーサーまたはリンカーの供することができる他のアミノ酸配列を介してすることができる。
【００１４】
本明細書において定義する場合、アミノ酸フラグメントはＳ蛋白質のアミノ酸配列に関する場合、少なくとも約８アミノ酸の長さから約全長Ｓ遺伝子蛋白質（約１４５４アミノ酸）までのあらゆるアミノ酸配列のことを言う。ヌクレオチドフラグメントは、コロナウイルスＳ遺伝子のヌクレオチド配列に関する場合、少なくとも約８個のアミノ酸の長さから、約全長Ｓ遺伝子蛋白質までのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と定義する。好ましくは、これらのフラグメントは免疫原性である。
本明細書において用いる場合、「免疫原性」なる語は、導入された宿主において防御免疫応答を誘起することができるあらゆる分子、蛋白質、ペプチド、炭水化物、ウイルスまたはその領域を意味する。「抗原性」なる語は、分子、蛋白質、ペプチド、炭水化物、ウイルスまたはその領域の、宿主において抗体形成を誘起することができる能力（必ずしも防御的である必要はない）だけを意味する。
本明細書において用いる場合、「領域」なる語は、遺伝子または蛋白質の全部または一部を意味する。このような領域は、前記定義の１またはそれ以上のフラグメントを含有していてもよい。
本明細書において用いる場合、「エピトープ」なる語は、その免疫原性に関与する蛋白質の領域をいい、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答を誘発する領域を包含することができる。
本明細書において用いる場合、「Ｂ細胞部位またはＴ細胞部位」なる語は、Ｂ細胞またはＴ細胞結合についての部位である蛋白質領域を定義する。好ましくは、この語は蛋白質の免疫原性に関与する部位をいう。
本明細書において用いる場合、感作領域は、免疫原として用いる場合、攻撃の後に、理論的には強い体液性応答を起こすことにより、病気を悪化させるコロナウイルスＳ遺伝子の領域であると定義される。
【００１５】
ＩＩ．本発明のキメラ蛋白質において用いるためのＳ蛋白質配列源
防御（または治療）することが望ましい病気の種類およびコロナウイルスの種に応じて、当業者は適当なＳ蛋白質フラグメントを所望のコロナウイルスから選択して本発明のキメラ蛋白質を構築することができる。本発明のキメラ蛋白質へのＳ蛋白質フラグメントの供給における使用に関して特に望ましいコロナウイルスは、ＦＥＣＶ、およびＤＦ２、ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳ−ＢＰ、ＴＳ、ＴＮ４０６、ＵＣＤ−２、ＵＣＤ−１、ＵＣＤ−３、ＵＣＤ−４と称するＦＩＰＶ株を包含する。
【００１６】
他のＦＩＰＶ株もまたＳ蛋白質フラグメントを提供するのに有用である。加えて、ＣＣＶ、ＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、ＢＣＶ、ＡＣＶ、ＭＣＶまたはＨＣＶを包含する他のコロナウイルス種は本発明のキメラＳ蛋白質にＳ蛋白質フラグメントを供給するのに有用であると考えられる。本発明の教示を考慮した場合、当業者は、本明細書において同定されたのと類似の免疫原性フラグメントを用いることにより、適当なキメラコロナウイルスＳ蛋白質を構築することができる。
前記コロナウイルスのいくつかのＳ蛋白質配列または部分Ｓ蛋白質配列および対応するヌクレオチド配列ならびにそれぞれの配列番号を以下の第Ｉ表に示す。対応点を得るために、各株について得られるＳ蛋白質配列のアミノ酸位を第Ｉ表の第２列に示す。アミノ酸１はＳ蛋白質の１番目のアミノ酸を意味する。１４５４（またはイヌＣＣＶの場合、１４５２）のアミノ酸を有する蛋白質は、完全長Ｓ蛋白質である。残りの蛋白質は部分Ｓ蛋白質である。
【００１７】
第Ｉ表
Ｓ蛋白質／遺伝子                                  配列番号
寄与株                     ＡＡ              ＡＡ    ヌクレオチド
ＦＥＣＶ                １−１４５４          １２          １１
ＦＩＰＶ  ＤＦ２        １−１４５４            ２            １
ＦＩＰＶ  ＤＦ２−ＨＰ  １−７４８              ４            ３
ＦＩＰＶ  ＴＳ−ＢＰ    １−７４８              ６            ５
ＦＩＰＶ  ＴＳ          １−１４５４            ８            ７
ＦＩＰＶ  ＴＮ４０６    １０２−２２３        １０            ９
ＦＩＰＶ  ＵＣＤ−２    １−１２５            １４          １３
コンセンサス配列        １−１４５４          １６          １５
イヌ  ＣＶ              １−１４５２          １８          １７
【００１８】
本発明者らは本発明のキメラ蛋白質において用いるため、ＤＦ２  ＦＩＰＶ  Ｓ蛋白質上に数個の免疫原性部位を決め、同様に有用であると考えられる他の関連したコロナウイルス中に対応する領域を同定した。本明細書の配列表および表を含む以下の情報により、本明細書に示すコロナウイルススパイク遺伝子の免疫原性領域が推定される。本開示および推定される領域により、当業者は容易に望ましいコロナウイルスから本発明のキメラ蛋白質において用いるための適当な免疫原性領域を選択することができる。
読みやすくするために、アミノ酸位置に基づくフラグメントおよびフラグメント由来のＳ蛋白質の配列番号を第ＩＩ表においてＢ細胞およびＴ細胞部位フラグメントについて示す。
【００１９】
Ａ．Ｂ細胞部位
ＦＩＰＶへあらかじめ暴露することにより病気が悪化するので、Ｂ細胞または体液性応答を誘発するＳ蛋白質上のエピトープはウイルス誘起性病原性に関連すると考えられる。保存されたアミノ酸残基の大部分は本明細書において記載され、第ＩＩ表および添付の配列表において示すコロナウイルスのＳ蛋白質の２／３のカルボキシ末端、例えば、アミノ酸位置の約３５０から４５０、および約６５０から１４５４に位置する。不均質性は主にＮ末端残基、およそコロナウイルスの始めの３５０個のアミノ酸に限定される（第ＩＩ表参照）。他の中程度の異種領域は、アミノ酸位置の約４５０から約６５０間に位置する。ネコに関するコロナウイルスＳ遺伝子上ならびに他の種類のコロナウイルスの感作領域は無毒性ＦＥＣＶおよび毒性ＦＩＰＶ間に位置する抗原性領域内にあると考えられる。この領域に対する抗体が防御性であると判明すれば、これらの領域はワクチン組成物において有用とすることができる。
【００２０】
１つの抗原性領域はＤＦ２ ＦＩＰＶのアミノ酸残基＃５２５〜６５０の領域中の主要な中和部位である。この配列およびＦＥＣＶ、ＦＩＰＶ（ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳおよびＴＳ−ＢＰ）、ＣＣＶおよび他のコロナウイルス上の類似の配列は、本発明のキメラ蛋白質において用いるのに望ましいＳ蛋白質フラグメントである。他の主要な抗原性部位は、ＤＦ２−ＦＩＰＶの＃３５０〜５５０および＃１１７０〜１１９０のアミノ酸に位置付けされた。また、ＦＩＰＶ（ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳおよびＴＳ−ＢＰ）、ＦＥＣＶおよび他のコロナウイルスは、これらの領域中に抗原性部位を含有すると考えら得る。したがって、これらの配列は、本発明のキメラ蛋白質において用いるＳ蛋白質フラグメントに関する別の望ましい領域である。
加えて、ネコ、イヌまたは関連するコロナウイルスの他の適当なフラグメントを、本発明のキメラ分子において用いてもよい。これらの部位は抗原性であり、単クローン性抗体により位置付けされたので、Ｂ細胞部位であると考えられる。
【００２１】
本発明者らは、これらの部位の全部または一部に対する抗体がＦＩＰＶ感染症の免疫感作特性に関与すると考える。ＴＧＥＶとの類比により、ＦＩＰＶ  Ｓ上の抗原性部位の一部のみがウイルス中和抗体の形成を引き起こす。ウイルス中和（ＶＮ）はウイルス複製の制御に重要であることが多いので、ＶＮ抗体の誘起は感染ウイルスの浄化に重要で、感作に寄与しない。非中和抗原エピトープに対する抗体は、病気の悪化の原因である。中和であっても非中和であっても、感作に関与するいずれの部位も本発明のキメラＳ遺伝子から削除するのに望ましい領域である。
【００２２】
Ｂ．Ｔ細胞部位
本発明のある種のキメラ蛋白質は抗体産生を刺激しないで、むしろＴ細胞免疫を誘起することができるエピトープ、即ちＴ細胞部位を含有する。本発明者らにより予想され、以下の第ＩＩ表において同定するＴ細胞部位の大部分は表面糖蛋白質のＣ末端に位置する。他のコロナウイルスはほぼこれらの領域中にＴ細胞部位を有すると考えられる。
当業者は、本発明のキメラＳ蛋白質において用いるのに適した他のＳフラグメントを、本開示において示される情報および数個のパラメータを用いた蛋白質上のＴ細胞を予想する通常のコンピュータープログラムを用いて選択できる。適当なプログラムの例としては、EpiPlot（Louis Menendez−Arias，University of Madrid）、ＧＣＧプログラム、およびRobert Lew（マサチューセッツ大学）より入手可能なＴ細胞予想プログラムが挙げられる。
【００２３】
第ＩＩ表と関連させて添付した配列表からわかるように、示したＳ蛋白質Ｔ細胞部位において、ＤＦ２−ＨＰ配列はＤＦ２−ＨＰが配列決定されている範囲においてＤＦ２と同一であり；ＴＳ−ＢＰ配列はＴＳ−ＢＰが配列決定されている範囲においてＴＳと同一である。全ての株に関して（以下に示したＴＮ４０６を除いては）示したアミノ酸位置はＳ蛋白質および配列番号と一致する。ＴＮ−４０６に関しては、配列番号:１０において報告されているＳ蛋白質フラグメントは実際はＳ蛋白質のアミノ酸１０２〜２２３である。しかし、配列番号:１０において、これらのアミノ酸位置は１〜１２２であると報告されている。したがって、配列番号:１０のアミノ酸３８〜５０と同定されるフラグメントはＴＮ４０６  Ｓ蛋白質のアミノ酸１３９〜１５１に対応する。配列番号:１０のアミノ酸５９〜７２と同定されるフラグメントはＴＮ４０６  Ｓ蛋白質のアミノ酸１６０〜１７３に対応する。
【００２４】
【表１】
2004313196.tif 000002
【００２５】
【表２】
2004313196.tif 000003
【００２６】
【表３】
2004313196.tif 000004
【００２７】
【表４】
2004313196.tif 000005
【００２８】
【表５】
2004313196.tif 000006
【００２９】
【表６】
2004313196.tif 000007
【００３０】
【表７】
2004313196.tif 000008
【００３１】
Ｃ．コロナウイルスＳ遺伝子蛋白質の他の免疫原性フラグメント
前記したように、別のＢおよびＴ細胞部位は本発明の配列との類比に基づいて予想できる。例えば、これらのフラグメントはネココロナウイルスの予め増幅された領域から選択される。増幅法および適当なフラグメントは共有の係属中のアメリカ合衆国特許出願第０７／６９８９２７号およびこれに対応する国際特許出願公開第ＷＯ９２／０８４８７号（１９９２年５月２９日公開）により詳細に記載されている。
本発明のキメラ蛋白質を形成するのに有用なフラグメントの他の例は、実施例中に同定されているフラグメントおよび他のフラグメントを包含し、これら全てを以下の第ＩＩＩ表に示す。第ＩＩＩ表のフラグメントに類似のフラグメントは、他の関連したコロナウイルスにおいて同定できる。
【００３２】
【表８】
2004313196.tif 000009
【００３３】
【表９】
2004313196.tif 000010
【００３４】
【表１０】
2004313196.tif 000011
【００３５】
ＩＩＩ．本発明のキメラ蛋白質
本発明のキメラ蛋白質は、前記したように、１つのコロナウイルス株に対する免疫応答の強化および／または１以上のコロナウイルス株または種に対する免疫応答を誘発できる。これらのキメラ蛋白質はまた、１以上の動物種において免疫応答を誘起できると考えられる。
現在、本発明のキメラ蛋白質の産生において、キメラ蛋白質が完全長Ｓ蛋白質であるのが望ましい。しかし、本発明のキメラ蛋白質は約１６個のアミノ酸長であってもよく、または少なくとも２倍の完全長Ｓ蛋白質の大きさであってもよい。有用なキメラ蛋白質は前記下限および上限のアミノ酸長の範囲内であると考えられる。
【００３６】
キメラ蛋白質の一例は、ＦＥＣＶ Ｓ蛋白質の１またはそれ以上の蛋白質またはペプチドセグメントと融合して完全長のキメラＳ蛋白質を形成するＦＩＰＶ Ｓ蛋白質の１またはそれ以上の蛋白質またはペプチドセグメントを含む。関連する配列番号については第Ｉ表、第ＩＩ表または第ＩＩＩ表参照。キメラ蛋白質の一例は、ＦＩＰＶ Ｓ蛋白質の選択された株の１〜３１１アミノ酸由来のＳ遺伝子蛋白質フラグメントと、ＦＥＣＶ Ｓ蛋白質の３１１〜１４５４カルボキシ末端アミノ酸の融合により形成される。別のこのようなキメラ蛋白質は、ＦＥＣＶ Ｓ蛋白質のＮ末端フラグメント（アミノ酸約１〜３１１）と選択されたＦＩＰＶ株のカルボキシ末端蛋白質配列（アミノ酸約３１１〜１４５４）の融合により形成される。このような融合において、アミノ酸３１１は１回だけ存在する（即ち、全キメラ蛋白質は長さが１４５４個のアミノ酸である）。これらのキメラ構造物は以下の実施例３において説明する。
他の例において本発明のキメラ蛋白質はＦＩＰＶ  Ｓ蛋白質中にその相同性フラグメントと置き換えるために挿入されたＦＥＣＶ Ｓ蛋白質のフラグメントを含むので、両方のアミノおよびカルボキシ末端領域は両方ともＦＩＰＶ Ｓ蛋白質フラグメントである。さらに別の例においては、逆の構造が形成でき、アミノおよびカルボキシ末端Ｓ蛋白質フラグメントは両方ともＦＥＣＶ Ｓ遺伝子蛋白質フラグメントである。このようなキメラ構造は以下の実施例４において説明する。
【００３７】
別の本発明のキメラ蛋白質の好ましい例は、前記したように、望ましいＢおよびＴ細胞部位の融合からなる。特に適したネコまたはイヌコロナウイルスの領域は前記第ＩＩ表に示したＢ細胞部位を含む。このように、キメラＳ遺伝子の例は、ＦＥＣＶ５９８〜１４５４と融合した、選択されたＦＩＰＶ株アミノ酸５４２〜５９７と融合したＦＥＣＶアミノ酸１〜５４２を含む。前記のように、キメラ蛋白質は１４５４アミノ酸の長さである。
他のキメラ蛋白質は１個のコロナウイルス由来の１またはそれ以上の前記アミノ酸領域を他のコロナウイルスの対応する領域に挿入することにより構築される。他の本発明のキメラＳ蛋白質は、本明細書に記載のいかなるネココロナウイルス株を用いても形成でき、あるいは前記の構築物のいずれかのコロナウイルスＳ蛋白質フラグメントを他のコロナウイルス種と置換することにより形成される。
【００３８】
さらに別の例において、本発明のキメラＳ蛋白質は第ＩＩ表に記載の以下の１以上のＴ細胞アミノ酸領域と融合したＦＩＰＶアミノ酸１〜３１１の選択された株を含む。これらのＴ細胞領域は大部分が保存されたＣ末端に由来するので、特にＴ細胞部位がＢ細胞部位と融合した場合、強い種間のＴ細胞応答が誘起されると考えられる。このように、これらのＢおよびＴ細胞部位が同じコロナウイルス株由来の場合であっても、キメラ蛋白質は種間応答を誘起する。
【００３９】
完全長より短いＳ蛋白質からなる本発明の他のキメラ蛋白質は、１以上のＢ細胞部位に対応する欠失、感作領域、または他の本明細書記載のＳ蛋白質の非限界フラグメントを含むものである。あるいは、Ｓ遺伝子蛋白質の免疫原性が失われたと仮定すると、本発明のキメラＳ蛋白質はアミノまたはカルボキシ末端で切断されたＳ蛋白質である。例えば、蛋白質が細胞外媒体中に分泌されるのを促進し、精製を容易にするために、Ｓ遺伝子のトランスメンブラン領域を除去するのが望ましい。これらのキメラ蛋白質の例は：
ＦＩＰＶ５９４〜１４５４（例えば、ＤＦ２またはＴＳ）と融合したＦＥＣＶアミノ酸１〜５４２（その結果、５４２〜５９７アミノ酸残基領域に欠失を有するＳ蛋白質が得られる）；
ＦＩＰＶ３８７〜１４５４と融合した、ＣＣＶ１５２〜３７６と融合したＦＥＣＶアミノ酸１〜１３８（その結果、１３９〜１５１および３７７〜３８６領域に欠失を有するＳ蛋白質が得られる）；
アミノ酸１４０５〜１４５２と融合したＣＣＶアミノ酸１〜１３４３（その結果、１３４４〜１４０４アミノ酸残基領域に欠失を有するＳ蛋白質が得られる);および
ＦＩＰＶアミノ酸６５１〜１４５２と融合したＦＩＰＶアミノ酸３５２〜３９９（その結果、１〜３５０および４００〜６５０アミノ酸残基領域に欠失を有するＳ蛋白質が得られる）を包含する。
【００４０】
現在、好ましいキメラコロナウイルスＳ蛋白質は、ＦＩＰＶ（Ｉ型、ＩＩ型または両方）およびＦＥＣＶ Ｓ蛋白質フラグメントの融合により得られ、ネコに投与する組成物に用いられる。他の有用と考えられる組成物はキメラネコ／イヌコロナウイルスＳ蛋白質である。このようなキメラ蛋白質はフレーム中ＣＣＶ蛋白質と融合したＦＩＰＶおよび／またはＦＥＣＶ蛋白質からなる。動物、特に１種以上の動物においての病気の予防（種間防御）に有用である他のキメラ蛋白質は、ＦＩＰＶ／ＴＧＥＶ、ＦＥＣＶ／ＴＧＥＶ、ＦＥＣＶ／ＣＣＶ、ＦＩＰＶ／ＦＥＣＶ／ＴＧＥＶ、ＦＩＰＶ／ＴＧＥＶ／ＰＲＣＶ、ＡＣＶ／ＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ／ＡＣＶ／ＴＧＥＶ、またはＢＣＶ／ＡＣＶ／ＴＧＥＶ由来のＳ蛋白質フラグメントの融合物を包含する。しかし、本発明の範囲において、当業者は以下に記載するような所望の治療またはワクチンの使用に関して適当な他のキメラコロナウイルスＳ蛋白質を構築できる。
【００４１】
本発明の他の例において、本発明のキメラＳ蛋白質は融合相手、例えばより大きなキャリア分子と融合できる。融合相手は、好ましいシグナル配列、即ち選択された宿主系において分泌の向上を特徴とする配列、またはＳ−誘導ペプチドの安定性を向上する配列であってもよい。このような融合相手は、例えば、酵母発現系については、ユビキノンおよびα−交配因子、および細菌系についてはβ−ガラクトシダーゼおよびインフルエンザＮＳ−１蛋白質を包含するが、これに限定されない。当業者は容易に適当な融合相手を選択できる。本発明は、特定の融合相手の使用に限定されない。
【００４２】
キメラ蛋白質において有用である前記Ｓ蛋白質は、所望により、相互に、あるいは通常のリンカー配列（即ち約１〜５０個のアミノ酸、より好ましくは約２〜約２０個のの長さのアミノ酸を含む）を介して融合相手と融合してもよい。この任意のリンカーは２個の結合した配列間にスペースを与える。あるいは、このリンカー配列は、所望により、通常の化学的または酵素的方法により選択的に開裂可能なまたは消化可能なポリペプチドをコードできる。例えば、選択された開裂部位は、蛋白質分解酵素、例えばエンテロキナーゼ、ファクターＸa、トリプシン、コラゲナーゼおよびトロンビンなどによる開裂部位を含む酵素開裂部位であってもよい。あるいは、リンカーにおける開裂部位は、選択された化学物質、例えば臭化シアンまたはヒドロキシルアミンへの暴露により開裂されうる部位である。開裂部位は、本発明の融合配列中で有用なリンカー中に挿入された場合、本発明を制限しない。いかなる所望の開裂部位も、その大部分は当業者には公知であるが、この目的に用いられる。
【００４３】
ＩＶ．修飾アミノ酸およびヌクレオチド配列
本明細書中に記載し、添付の配列表に例示した本発明のキメラ蛋白質のアミノ酸配列および対応するヌクレオチド配列に加えて、本発明は他の本発明のキメラ蛋白質の他のＤＮＡおよびアミノ酸配列も包含する。このような他の核酸配列は本明細書に開示した関連するＳ遺伝子フラグメントと少なくとも８５％の厳密性、即ちキメラ蛋白質の一部をコードする選択されたＳ遺伝子フラグメントと少なくとも８５％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは９５％の相同性でハイブリダイゼーション可能な配列を含む。例えば、例示したコロナウイルスから種々のＳ遺伝子アミノ酸またはＤＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列のアレリック変種（自然発生的種集団中の塩基の変化であり、アミノ酸の変化を起こす場合も起こさない場合もある）も、その類似体または誘導体と共に本発明に包含される。
【００４４】
同様に、本発明の蛋白質をコードするが、点突然変異または誘起された修飾により起こり、その結果活性、半減期またはこれによりコードされるペプチドの産生を向上するこれらの蛋白質をコードするＤＮＡ配列における遺伝子コードまたは変種の縮重のためにコドン配列が異なるＤＮＡ配列も本発明に包含される。
【００４５】
本発明のアミノ酸配列における変種は典型的にはヌクレオチドレベルで１〜約４個のコドンの変化により異なる類似体を含む。類似体の他の例は、Ｓ遺伝子蛋白質の天然のアミノ酸配列および／または融合相手、特に保存的アミノ酸置換による若干のアミノ酸変化を有するポリペプチドを包含する。保存的置換は、その側鎖において関連するアミノ酸の種類中において起こる。遺伝学的にコードされたアミノ酸は一般に４種類：（１）酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは芳香族アミノ酸として分類される場合もある。例えば、ロイシンの、イソロイシンまたはバリンとの置換、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩との置換、トレオニンのセリンとの置換、あるいはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸との同様の置換は、特に置換が本発明のポリペプチドのエピトープでのアミノ酸が関与しない場合、その活性に関して著しい効果を示さない。
【００４６】
Ｖ．キメラ蛋白質およびフラグメントの産生方法
本発明のキメラ蛋白質またはコロナウイルスフラグメントは、化学的合成技術により調製できる。しかし、好ましくは、これらは公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて、宿主微生物または細胞中選択されたキメラ蛋白質に関するコーディング配列を有するＤＮＡフラグメントをクローニングまたは発現することにより調製される。コロナウイルスのＳ遺伝子蛋白質フラグメントおよび他のウイルス蛋白質、例えば融合相手などに関するコーディング配列は、合成により調製されるか公知の技術によりウイルスＲＮＡから、または入手可能なｃＤＮＡ−含有プラスミドから誘導される。
【００４７】
種々のウイルスベクター、微生物および細胞中のワクチンポリペプチドのクローニングおよび発現系は公知であり、私立および公立研究所および寄託所ならびに商業機関から入手可能である。現在、最も好ましい発現系はウイルスベクター、特に牛痘または豚痘等のポックスウイルスベクターを含むものを包含する。ネコヘルペスウイルスベクターも有用である［例えば、アール・ワードリー（R.Wardley)ら、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー(J.Gen.Virol.),７３（７）：１８１１−１８１８（１９９２）およびジェイ・ヌンバーグ（J.Nunberg）ら，ワクチンズ（Vaccines），９１：１９１−１９６（１９９１）参照］。他の好ましい発現系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ)またはＣＯＳ−１細胞などの哺乳類細胞を包含する。他の望ましい発現系は、バクロウイルス発現系など昆虫細胞系を包含する。他の適当な宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の産生および精製方法の選択は、公知の技術にしたがって当業者により行うことができる。例えば、ゲーシングおよびサムブルック（GethingおよびSambrook）、ネイチャー（Nature)，２９３：６２０〜６２５（１９８１）参照。
【００４８】
通常の組み換え手段により産生した場合、キメラ蛋白質は、通常の溶解技術により細胞内容物から単離されるかまたは通常の方法、例えばクロマトグラフィーにより細胞培地から単離される。例えば、サムブルック（Sambrook）ら、モレキュラ・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning．A Laboratory Manual.）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory），New York）（１９８９）参照。
得られたキメラ蛋白質を、選択されたコロナウイルスの遺伝子産物を毒性ＦＩＰＶ株を用いて発現するワクシニア組み換え体で免疫化した動物に抗原投与することを含む動物モデル系におけるワクチンまたは治療薬としての効果的であるようにスクリーニングする［ヴェンネマ（Vennema）ら、ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol.),６４：１４０７−１４０９（１９９０）参照］。
【００４９】
ＶＩ．ワクチン組成物
本発明は、免疫原性量のキメラ蛋白質を投与に適した担体と一緒に含む、コロナウイルス感染症の予防的治療薬用組成物としてのワクチン組成物を提供する。本発明の蛋白質は、単独で用いることもできるし、あるいは別の抗原、例えば他の本発明のキメラまたは組み換えコロナウイルスＳ遺伝子蛋白質、適当なコロナウイルス由来の他の蛋白質、あるいは他の病原体由来の他の蛋白質またはペプチドを含むワクチン組成物中で用いることもできる。
別法として、選択されたコロナウイルスキメラＳ遺伝子またはフラグメントを生ベクター、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルスなどに組み込むこともできる。このような生ベクター中のワクチン蛋白質の発現は当該分野において周知である［例えば、アメリカ合衆国特許第４９２０２０９号参照］。また、以下の実施例７〜９も参照。
【００５０】
例えば、ＦＩＰＶ／ＦＥＣＶキメラＳ蛋白質を含有するワクチン組成物は、さらに共有の同時係属中の出願である続出願中のアメリカ合衆国特許出願第０７／４２８７９６号（１９８９年１０月３０日出願）に詳細に記載されている温度感受性ＦＩＰＶワクチンを含むように処方されてもよい。また、このようなワクチンは、さらに、例えばネコ白血病に対する抗原も含んでもよい。他の適当なネコ抗原は、狂犬病、ネコカリチウイルス、クラミジア、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコパーボウイルスおよびネコ鼻気管炎を包含する。ブタのワクチン接種に用いられるキメラ蛋白質の場合、他の適当な抗原は、例えば偽性狂犬病、ブタパーボウイルス、および細菌抗原を包含する。イヌのワクチン接種に用いられるキメラ蛋白質の場合、他の適当な抗原は、中でも狂犬病、イヌジステンパー、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、イヌボルデテラ、イヌパーボウイルス、イヌロタウイルス、イヌパラインフルエンザ、イヌアデノウイルスおよびレプトスピラ種を包含する。
【００５１】
適当なpＨ等張性、安定性および他の通常の特性を有する、医薬上許容されるワクチン組成物の調製は、当業者の技術範囲内である。従って、このようなワクチンは他の通常の成分、例えばアジュバントおよび／または担体、例えば水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウムの水性懸濁液、リポソームなどを含有するのが最適である。
本発明のコロナウイルスキメラＳ蛋白質を含有するワクチン組成物は特定の実験を受けていない動物（即ち、あらかじめコロナウイルスに暴露していない動物）を、最低キメラ蛋白質が由来するるコロナウイルスに関連した症状に対してワクチン接種するのに用いることができる。例えば、ＦＩＰＶ／ＣＣＶキメラ蛋白質は、ＦＩＰまたはイヌコロナウイルスでの感染症に対するワクチン接種において有用である。しかし、本発明のキメラ蛋白質は、また、コロナウイルス感染症に対して種間防御を与える。本発明のワクチンは、適当な経路、例えば、経口、鼻腔内、皮下、腹腔内または筋肉内経路などにより投与することができる。現在好ましい投与方法は、皮下および鼻腔内経路である。
【００５２】
各ワクチン用量内に存在する本発明のキメラコロナウイルスＳ蛋白質の量は、動物の年令、体重、性別、全般的体調などを考慮して選択される。動物内で著しい副作用を起こすことなく免疫防御応答を誘起するのに要する量は、免疫原として用いた組み換え体蛋白質および任意のアジュバントの存在により変化する。一般に、各容量は、滅菌溶液１ｍＬあたり０.０５〜５０００マイクログラム、好ましくは０.１〜１００マイクログラムの本発明の免疫原性量の蛋白質またはペプチドを含有する。初回投与の後、所望により繰り返し追加抗原投与をする。
【００５３】
本発明のワクチン組成物は特定の実験を受けていない動物をコロナウイルス感染症に対して防御するのに用いられる。これらのワクチン組成物は、１またはそれ以上のコロナウイルスでの感染症に対してネコを防御できるのが望ましい。さらに、これらのワクチン組成物は他の種、特にイヌおよびブタにおいてコロナウイルスに関連した病気に対して防御できることが期待される。
本発明の他のワクチン剤は、キメラ蛋白質の配列に対して生成したアンチセンスＲＮＡ配列である。この配列は、当業者であれば容易に合成または組み換えにより産生できる。適当な技術は公知である［例えば、エス・クルーク(S.Crooke)、バイオテクノロジー（Biotechnology），１０：８８２−８８６（１９９２年８月）参照］。適当なデリバリーにより、感染動物に投与した場合のこのようなアンチセンスＲＮＡ配列は、選択されたコロナウイルスとのＲＮＡ結合能を有し、それにより細胞中のウイルス複製を防止する。
【００５４】
ＶＩＩ．医薬組成物
本発明はまた本発明に従って調製されたキメラコロナウイルスＳ蛋白質および医薬上有効な担体を含むコロナウイルスで感染した動物の治療において有用な医薬組成物を提供する。また、あるいはさらに、これらの医薬組成物は本明細書において定義した、あるいは同時係属中の出願であるアメリカ合衆国特許出願第０７／６９８９２７号および対応する公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９２０８４８７号に記載の組み換えＳ遺伝子蛋白質を含有してもよい。
内部投与に適した医薬上有効な担体は、当業者には周知である。選択された担体の一例は滅菌食塩水である。他の抗ウイルス剤もコロナウイルス感染症の治療用組成物に用いることができる。医薬組成物は適当ないかなる経路での投与にも適用できるが、注射または鼻腔内投与による投与に優先的にデザインされる。
【００５５】
ＶＩＩＩ．本発明の抗体
本発明は、選択されたキメラＳ蛋白質またはＳ蛋白質フラグメントに対する抗体を提供する。これらの抗体は通常の単クローン［ダブリュー・ディー・ヒューズ（W.D.Huse）、サイエンス（Science）、２４６：１２７５−１２８２（１９８９）；コーラーおよびミルシュタイン（KohlerおよびMilstein）］または多クローン抗体の産生法を用いて産生できる。
診療の目的で、抗体をそれぞれ標識と結合させ、また診断法において１以上の抗体を用いる場合、標識は、検出可能なシグナルを産生できるように相互作用するのが望ましい。標識は視覚的に検出可能であるのが最も好ましい。本発明の診断検定において有用な抗体と結合させるための検出可能な標識は、また診断検定の分野の熟練者により容易に選択できる。視覚的に検出可能な標識は、シグナルが迅速であり、読み取りが容易であるので臨床的用途に用いるのに好ましい。熱量法での検出のために、種々の酵素系が記載されている。測熱酵素系は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を包含する。グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびヘキソキナーゼを含む他の近接した酵素系は当業者には周知である。また、生物発光または化学発光は、それぞれＮＡＤ酸化還元酵素とルシフェラーゼおよび基質ＮＡＤＨおよびＦＭＮまたはペルオキシダーゼとルミノールおよび基質過酸化物を用いて検出できる。他の通常の用いられる標識系は、蛍光化合物、放射性化合物または放射性元素、またはイムノエレクトロードを包含する。これらのおよび他の適当な標識系およびこれらの抗体またはペプチドとのカップリング法は当業者には公知である。
【００５６】
抗体はまた、ウイルス毒性または感染細胞毒性剤を感染細胞にデリバリーする治療薬として治療に用いられる。診断用標識と結合させるよりは、治療薬は、ウイルスの複製メカニズムを不可能にするか、ウイルス感染細胞を破壊することができる物質またはリガンドと結合した抗体を用いることができる。毒性リガンドは本発明を制限するものではない。本明細書に記載のキメラＳ蛋白質によりコードされるペプチドに対する好ましい抗体は、感染細胞中に内部移行し、リガンドを細胞中にデリバリーする能力についてスクリーンできる。
【００５７】
ＩＸ．診断キット
本発明は、自然のコロナウイルス暴露および本発明のキメラまたは組み換え分子でワクチン接種した動物間の区別を可能にする診断キットも提供する。このようなキットは十分な量の少なくとも１種のキメラＳ蛋白質または少なくとも１種の本発明の組み換えＳ蛋白質を含有し、このような成分は検定を実施するのに必要である。キメラＳ蛋白質のうち、完全長より短いＳ蛋白質を含み、１またはそれ以上のエピトープの欠失を有するものが、このようなキットにおいては特に有用であると考えられる。このような検定は常習され、このようなキットに必要な試薬および他の成分は当業者には周知である。
このようなキット、および本発明のキメラＳ蛋白質または組み換えＳ蛋白質フラグメントを用いた診断様式は本発明のキメラ蛋白質をワクチン接種した動物およびコロナウイルスまたはキメラＳ蛋白質を含むコロナウイルスに自然にさらされた動物間の区別に有用である。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例で本発明のキメラ分子を調製するのに好ましい方法を例示する。これらの実施例は例示のためだけのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。例えば、これらの実施例ではＦＥＣＶを用いるが、他の無毒性または非感作コロナウイルス、即ち、ＦＩＰＶ  ＵＣＤ−２、ＰＲＣＶ、ＢＣＶ、またはＡＣＶ株をこれらのキメラ蛋白質の代わりに用いることができる。あるいは、ＣＣＶまたはＴＧＥＶ等のコロナウイルスをこれらのキメラ蛋白質において用いることができる。さらに、Ｉ型ＦＩＰＶ配列（即ち、ＴＮ４０６）をＷＴ ＤＦ２  ＦＩＰＶ（ＩＩ型）と置き換えて、株間防御を拡大してもよい。
【００５９】
実施例１−ＰＣＲ増幅
Ａ．細胞およびウイルス源
ノーデンラボラトリーズネコ腎臓（ＮＬＦＫ）［クリスチャンソン（Christianson）ら、アーカイブズ・オブ・ウイロロジー（Arch.Virol.）、１０９：１８５−１９６（１９８９）］細胞を５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０ｍＭ Ｈepesを追加した基礎イーグル培地（ＢＭＥ）中で成育させる。ワクシニアウイルス感染症に関しては、ヒトチミジン-キナーゼ陰性（ＨuＴＫ−）［ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８３０３］およびアフリカミドリザル腎臓（ＣＶ−１）細胞系［ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０］を用い、１０％ウシ胎仔血清を含むＤulbecco修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持する。
【００６０】
ＤＦ２野生型ＦＩＰＶウイルスが、ネコ肝臓移植片からＳＢＡＨ（Lincoln）で最初に単離された。特異性病原体不含（ＳＰＦ）ネコにおける組織ホモジネートを数回継代した後、ウイルスを感染一次脾臓との共培養によりＮＬＦＫ細胞に加え、その後プラーク精製した。ネコ小腸コロナウイルス、ＦＥＣＶ（ＷＳＵ−１６８３）はワシントン州立大学から入手した。ワクシニアウイルスＷＲ株をバーナード・モス（Dr.Bernard Moss）博士（ＮＩＨ）より入手した。
【００６１】
Ｂ．オリゴヌクレオチド設計および合成
１．ＡＡ１−３５２／ＡＡ３５２−１４５４キメラ蛋白質のクローニング用プライマー
ＤＦ２ ＦＩＰＶスパイク遺伝子配列はアミノ酸３５２にＰstＩサイトを含有するが、ＦＥＣＶおよびＣＣＶスパイク遺伝子は含有しなかった。アミノ酸領域１〜３５２および３５２〜１４５４でＦＥＣＶおよびＣＣＶスパイク蛋白質のＰＣＲ増幅ができるようにオリゴヌクレオチドプライマーを特異的に設計する。ＰＣＲプライマーは、長さが３０〜４０個の塩基対で、上流（５'）プライマー中にＳmaＩサイトおよび下流（３'）プライマー（１〜３５２アミノ酸）中にＰstＩサイトおよび上流プライマー中にＰstＩサイトおよび下流プライマー（３５２〜１４５４アミノ酸）中にＳtuＩサイトを含有する。これらのサイトをプライマー中に組み込むと、ＰstＩサイトの結紮により完全長のキメラＦＥＣＶ／ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子が再構築される。
【００６２】
オリゴヌクレオチドプライマーは、アプライド・バイオシステム３８０Ｂ型ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystem Model 380B DNA Synthesizer）上でホスホルアミジト法を用いて合成する。プライマーを使用前にゲル精製する。使用したプライマーは以下のとおりである。
完全長ＦＥＣＶ Ｓの増幅に関して特異的なトップ／レフトストランドＰＣＲプライマーはＸmaＩの認識部位に融合したアミノ酸１〜９を含有する。この初めの６ｂｐは制限部位であり、非特異性配列である。７番目の塩基対は、プライマーが確実に正確に翻訳されるようにするためのスペーサーである。ＦＥＣＶ特異性配列はプライマーの第８番目のｂｐ位置から始まり、これは以下に示す配列番号:１９である
5'-CCCGGGCATG ATTGTGCTCG TAACTTGCC TCTTGTTGTTA TGC
【００６３】
ＦＥＣＶ Ｓに関して特異的なトップ／レフトストランドＰＣＲプライマーはまたＳmaＩ／ＸmaＩ部位の上流に消化を助けるために別の安定化配列を含有し、このプライマーは、配列番号:２０である
5'-GTGCCCCGGG CATGATTGTG CTCGTAACTT GCCTCTTGTT GTTATGC
【００６４】
以下の２個のプライマーはＦＥＣＶ Ｐstプライマーであり、ＦＥＣＶおよびＣＣＶ中にＰstＩ部位を再生するために用いられ、これによりＷＴ ＷＳＵ １１４５株と比べた場合にアミノ酸に変化は起こらない。これらのプライマーは、真中にＰstＩ部位を含有し、ＦＥＣＶ特異性塩基対を１個含有する。トップストランドプライマーは配列番号:２１
5'-CAATCTTAAT TTCACTGCAG ATGTACAATC TGGTATGGGT GCT
であり、ＳtuＩボトムプライマーと一緒に用いられる。ボトムストランドプライマーは、配列番号:２２
5'-AGCACCCATA CCAGATTGTA CATCTGCAGT GAAATTAAGA TTG
であり、ＸmaＩトッププライマーと共に用いられる。
【００６５】
以下のＦＥＣＶ Ｐstプライマーは、ＦＥＣＶおよびＣＣＶにおいてＰstＩ部位を再生するのにも有用で、ＷＳＵ株と比較した場合にアミノ酸変化は起こさない。ＰstＩ部位を含有するトップストランドプライマーは配列番号:２３
5'-CTGCAGATGT ACAATCTGGT ATGGGTGCTであり、
ＳtuＩボトムプライマーと共に用いられる。ＰstＩ含有のボトムストランドプライマーは、配列番号:２４
5'-CTGCAGTGAA ATTAAGATTG AATCTAATA
であり、ＸmaＩトッププライマーと共に用いられる。
【００６６】
２．ＡＡ１−３１１／ＡＡ３１１−８７２／ＡＡ８７２−１４５４キメラ蛋白質のクローニング用プライマー
親出願（アメリカ合衆国特許出願第０７／６９８９２７号）中に同定されている以下の第ＩＶ表のプライマーも有用である。以下の第ＩＶ表のプライマーはＤＦ２ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶから完全長Ｓ遺伝子をＰＣＲ増幅するのに用いられる（第Ｉ表参照）。完全長ＤＦ２ ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子の増幅用トップストランドプライマーはＸmaＩの認識部位に融合したアミノ酸１〜９をコードするヌクレオチド配列［配列番号:２５］を含有する。ＦＥＣＶ Ｓのトップストランドプライマーは、前記の配列番号:１９である。完全長ＦＩＰＶ ＳおよびＦＥＣＶ Ｓボトムストランドプライマーは、各Ｓ配列に関してＳtuＩの認識部位に融合したアミノ酸１４５０〜１４５４の配列を含有する［配列番号:４２］。
【００６７】
第ＩＶ表
５'（Ｘma部位を含む、ＷＳＵ１１４６と同じポーラリティーの配列）
位置（ＢＰ） 位置（ＡＡ） 配列
５'Ｘma／３'Ｘma
Xma
65-69/70-96(開始)      1-9    GTGCCCCCGGGTATGATTGTGCTCGTAACTTGCCTCTTG 
配列番号:25                                開始コドン
・
351-355/356-380      95-104    AATACCCGGGGCACTGGTAATGCACGTGGTAAACC
配列番号:26
・
705-709/710-733      213-219    GTATTCCCGGGCACGCTCAAGCACTGCTACCTGGG
配列番号:27
・
1121-1125/1126-1150  352-360    CAGATCCCGGGGTACAATCTGGTATGGGTGCTACAG
配列番号:28
・
1698-1702/1703-1730  544-554    GCTTACCCGGGGTGGTTATGGTCAACCCATAGCCTCGAC
配列番号:29
・
2277-2281/2282-2309  737-746    TGTGACCCGGGCGCCATGTGATGTAAGCGCACAAGCGGC
配列番号:30
2749-2753/2754-2779  894-903    GCAATCCCGGGGGGTGCCAGACTTGAAAACATGGAGG
配列番号:31
・
3155-3159/3160-3185  1030-1038    CATTACCCGGGGGTGCACTTGGTGGTGGCGCCGTGGC 
配列番号:32
・
3642-3646/3647-3674  1192-1201    TAGGTCCCGGGCTCAGTCTCAGAGATTCGGATTCTGTGG 
配列番号:33
【００６８】
３'（StuＩ部位を含む、ＷＳＵ１１４６と逆の補体の配列）
位置（ＢＰ） 位置（ＡＡ） 配列
５'StuＩ／３'StuＩ
StuI
385-381/380-356      97-105      ATAATAGGCCTGGTTTACCACGTGCATTACCAGTGC 
配列番号:34
738-734/733-710      213-223    GTATTAGGCCTCCCAGGTAGCAGTGCTTGAGCGTG 
配列番号:35
1155-1151/1150-1126  353-362    AAATAAGGCCTCTGTAGCACCCATACCAGATTGTAC 
配列番号:36
1735-1731/1730-1703  546-555    TTAGTAGGCCTGTCGAGGCTATGGGTTGACCATAACCAC 
配列番号:37
2314-2310/2309-2282  739-748    TAACAAGGCCTGCCGCTTGTGCGCTTACATCACATGGCG 
配列番号:38
2784-2780/2779-2754  896-905    ATCAAAGGCCTCCTCCATGTTTTCAAGTCTGGCACCC 
配列番号:39
3190-3186/3185-3160  1031-1040    GTATAAGGCCTGCCACGGCGCCACCACCAAGTGCACC 
配列番号:40
3679-3675/3674-3647  1194-1203    CATTAAGGCCTCCACAGAATCCGAATCTCTGAGACTGAG 
配列番号:41
4433-4429/4428-4405  1444-1452   TAAATAGGCCTTTAGTGGACATGCACTTTTTCAATTGG 
（停止）                                      ・停止コドン
配列番号:42
【００６９】
Ｃ．ＲＮＡ精製
ローラーボトルの融合ＮＬＦＫ細胞を以下の方法を用いてＦＩＰＶまたはＦＥＣＶウイルスのいずれかに感染させる。増殖培地を除去し、ウイルス（ＭＯＩ＝０.１）を５０ｍＬの２％ＦＢＳを追加したＢＭＥ中に吸着させる。ＦＩＰＶ感染は血清不含培地中で行う。ウイルスを２時間吸収させ、つぎに２５０ｍＬの増殖培地を添加する。培養を細胞変性効果（ＣＰＥ）に関してモニターし、感染後２４〜３６時間に収穫する。全細胞質RNAを感染単分子層からグアニジンイソチシアネート抽出により調製する［チャーグィン（Chirgwin）ら、バイオケミストリー（Biochem.）、１８：５２９４（１９７９）］。
【００７０】
Ｄ．ＰＣＲ増幅フラグメントの生成
全ＰＣＲ 試薬はPerkin Elmer-Cetus（Norwalk,CT）により製造されたものである。ＰＣＲ増幅フラグメントを以下の方法を用いて産生する。特定のコロナウイルスに感染した細胞から単離した全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、各ウイルスに関して行う。
最終容積２０μＬの１Ｘ ＰＣＲ緩衝液（１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液；１００ｍＭ Ｔris−ＨＣl、  ５００ｍＭ ＫＣl、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０.０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で、以下の成分をＲＮＡse不含のシリコーン加工した５００μＬの微遠心管中で混合する：１.０ｍＭの各ｄＮＴＰ、２０単位のＲＮＡsin（Promega Corporation, Madiosn, WI）、１００ピコモルのランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド（Pharmacia, Milwaukee, WI)、１００ピコモル／μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔris−ＨＣl、１ｍＭ ＥＤＴＡ、pＨ７.５）中溶液、２００単位の逆転写酵素（Moloney MuLV,Bethesda Research Labs,Gaithersburg,MD）および１.０μｇの前記のようにして単離した各ＲＮＡ。ピペット誤差および汚染を避けるために、全溶液をジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水を用いて調製し、最後に添加するＲＮＡを除いた全反応成分を含有するマスターミックスから分割する。混合物をプログラム可能なサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT）中で２０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間、次に９５℃で５時間培養し、最後にＰＣＲ増幅まで４℃に維持する。
【００７１】
ｃＤＮＡの増幅は、基本的にサイキ（Saiki）ら、サイエンス（Science），２３０：１３５０−１３５４（１９８５）の方法にしたがって、Ｔaqポリメラーゼを用いて行う。簡単には、２０μＬの前記のｃＤＮＡ反応ミックスに以下のものを添加する：８.０μＬの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液、各１.０μＬの水中で予め３０ピコモル／マイクロリットルに希釈した上流および下流プライマーおよび５.０単位のＴaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT）。最終容積を鉱油で１００μＬにする。前記のように、マスターミックスを調製して汚染を避ける。反応はPerkin-Elmer Cetusサーマルサイクラー中で、９５℃で１分間変性し、３７℃で２秒間アニールし、続いて７２℃で４０分間エクステンションする１サイクル行う。この初回サイクルを一次鎖ＤＮＡ合成ができるまで増やす。標準的ＰＣＲプロフィルを次に９５℃で１分間変性、３７℃で２分間アニール、７２℃で３分間エクステンションを４０サイクルすることにより行う。最終のエクステンションサイクルを９５℃で１分間変性、３７℃で２分間アニール、７２℃で１５分間エクステンションすることにより行い、分析するまで４℃に維持する。
【００７２】
Ｅ．ＰＣＲ生成物の分析
ＰＣＲ生成物を１.２％アガロースゲル上で５.０μＬの反応物を１６−１７時間電気泳動に付すことにより分析する。増幅されたフラグメントをクローニングに使用する前に、PrimeErase Quik法（Stratagene, LaJolla, CA）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製する。ゲルの臭化エチジウム染色および２５６ｎｍでのＵＶ照射による蛍光によりバンドを可視化する。ポラロイド５５型フイルムを用いた写真により、各ゲル上のサンプルの凝集距離を計測し、マーカーに対して比較できるネガを得る。バンドの実際の寸法を、ＩＢＭ  ＡＴで動作させるBeckman Microgenie softwareを用いて計算する。
【００７３】
実施例２−ＤＦ２ ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ Ｓ蛋白質のクローニング
攻撃モデルにおいて用いる場合、完全長の野生型（ＷＴ）ＤＦ２ ＦＩＰＶ Ｓ蛋白質を感作の正の対照として用い、完全長ＦＥＣＶ  Ｓ蛋白質も試験する。
完全長のＤＦ２ ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ Ｓ遺伝子をワクシニアベクターｐＳＣ１１［Chakrabarti et al, Mol. and Cell Biol.,５：３４０３−３４０９（１９８５）］中で以下のようにしてクローンする：
【００７４】
Ａ．ｐＳＣ１１
クローニング法は、前記サムブルック（Sambrook） らにより記載されたとおりであり、全プラスミドをイー・コリ宿主株ＨＢ１０１中に形質転換する。ｐＳＣ１１はワクシニアウイルスのｐ７.５プロモーターのＳmaＩ部位下流に挿入されたクローンされた遺伝子の発現を可能にするようデザインされた対象となるベクターである。ｐＳＣ１１はウイルス中への相同性組み換えのためのワクシニアＴＫ遺伝子配列およびイー・コリ中での選択のためのアンピシリン遺伝子を含有する。このベクターはイー・コリｌａｃＺ遺伝子を調節する、ｐ１１ワクシニアプロモーターも含有する。このプロモーターからの発現により、ベータ−ガラクトシダーゼ蛋白質が合成される。ｐＳＣ１１プラスミドを含有する組み換えウイルスは、したがってＸ−ｇａｌまたはＢｌｕｏ−ｇａｌ［Sigma］の存在下で青色のプラークに見える。全てのクローンを平滑末端フラグメントとしてこのベクターのＳmaＩサイトに導入し、得られたクローンは、ｐ７.５プロモーターに関して配向する。
【００７５】
Ｂ．ｐＯＴＳＫＦ３３
クローニング法は、前記サムブルック（Sambrook）らにより記載されたとおりである。本出願の第１図に略図を示した細菌発現ベクターｐＯＴＳＫＦ３３はスミスクライン・ビーチャム・ラボラトリーズ（SmithKline Beecham Laboratories）に保存されており、該社を通して入手可能である。
このプラスミドは、ｐＢＲ３２２［Bethesda Research Laboratories］の誘導体であり、バクテリオファージラムダ由来の調節シグナルを有する。この系により、調節可能なプロモータ（λＰＬ）が得られ、また全ての遺伝子挿入物にわたる有効な転写を確実にするアンチターミネーション機構、高いベクター安定性、抗生物質選択、および調節配列のあらゆる遺伝子下流の挿入用の可変部位が得られる。ｐＯＴＳＫＦ３３ベクターはまたλＰＬプロモーターのすぐとなりの酵素ガラクトシダーゼの５２個のアミノ酸のコーディング配列を含有する。この酵素の配列は、外来遺伝子の挿入および融合蛋白質の構築を可能にするように操作されている。
【００７６】
３個の解読フレームのいずれかにおける融合に関する制限部位、各フレームに関する停止コドンおよび３個の解読フレームいずれかにおける融合用の別のクローニング部位を含有するリンカーを、ガラクトシダーゼの最初の５２個のアミノ酸の後に導入する。
ＰＬプロモーターからの転写は、ｃ１＋受容蛋白質を発現するバクテリア中にプラスミドを維持することにより厳密に制御される。外来蛋白質発現の導入は、リプレッサー蛋白質を除去することにより得られる。本研究において用いる細菌株において、リプレッサー蛋白質は温度感受性である。許容温度、３２℃では、リプレッサーは普通ＰＬ調節配列からの転写を抑制するように機能する。成長温度の上昇（４２℃まで）の結果、リプレッサーは減成し、融合ポリペプチドの発現が誘起される。
【００７７】
完全長のＤＦ２ ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶスパイク蛋白質１〜１４５４アミノ酸挿入物は、確立されたｐＯＴＳＫＦ３３プラスミドクローンから、プラスミドＤＮＡのＳmaＩ／ＳtuＩ消化により単離され（前記親出願中に記載）、切断された遺伝子をｐＳＣ１１／ＳmaＩ消化された、脱ホスホリル化ベクター中に通常の技術を用いてクローン化する。挿入物を担うクローンをmini-prep ＤＮＡのＢamＨＩ消化により同定する。完全長のクローンをＸbaＩ（ＦＥＣＶ）およびＮcoＩ（ＦＩＰＶ）での消化によりベクターに関して配向させる。
【００７８】
以下の実施例における全てのキメラ蛋白質の記載に関して、各フラグメントの融合は重複アミノ酸が一度だけ現われるように行う。例えば、以下の実施例３の配列番号:４５において、ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶの３１１の位置の重複アミノ酸は、キメラ蛋白質中に一度だけ現われ、ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶの８７２位のアミノ酸も同様であり、その結果、１４５４個のアミノ酸の長さのキメラ蛋白質が得られる。
【００７９】
実施例３−ｐＳＣ１１中のＡＡ１−３１１／ＡＡ３１１−１４５４  ＦＩＰＶ／ＦＥＣＶをコードするキメラＳ遺伝子のクローニング
完全長のキメラＳ遺伝子を（ａ）ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶの３１１〜１４５４個のアミノ酸と融合したＦＥＣＶの１〜３１１個のアミノ酸（キメラ蛋白質は配列番号:４３により同定される）；および（ｂ）ＦＥＣＶの３１１〜１４５４個のアミノ酸と融合したＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶの１〜３１１個のアミノ酸（キメラ蛋白質は配列番号:４４により同定される）をコードするように操作する。アミノ酸３１１はキメラ蛋白質中１度だけ現われ、したがって、Ｓ遺伝子は全長で１４５４個のアミノ酸である。
【００８０】
ＦＥＣＶおよびＤＦ２ ＦＩＰＶ ＳmaＩ／ＭscＩ１〜３１１挿入物およびＳmaＩ／ＭscＩ１〜３１１アミノ酸プラスミドＤＮＡフラグメントを完全長のＤＦ２ＦＩＰＶまたはＦＥＣＶスパイク遺伝子を含有する確立されたｐＳＣ１１プラスミドから単離する。消化物を調製したアガロースゲルにかけ、Ｔris−Ｂorate−ＥＤＴＡ緩衝液中で操作する。ＤＮＡフラグメントを単離し、ＧeneＣlean（Bio101 Inc.,La Jolla,CA）を用いて製造業者の指示にしたがって溶出する。
対応するプラスミドおよびＡＡ１〜３１１挿入フラグメントを一夜１５℃にて結紮する。ＨＢ１０１宿主細胞［ＡＴＣＣ］を結紮ミックスで形質転換し、完全長クローンをmini prep ＤＮＡのＢamＨＩ消化により同定する。
キメラクローン中のＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ特異性スパイク遺伝子領域を診断制限酵素消化により同定する：（１）１〜３１１アミノ酸ＦＩＰＶ、ＮcoＩ；（２）３１１〜１４５４アミノ酸ＦＩＰＶ、ＸbaＩ；（３）１〜３１１アミノ酸ＦＥＣＶ、ＸbaＩ；および（４）３１１〜１４５４アミノ酸ＦＥＣＶ、ＸmnＩ。制限酵素は、ニューイングランド・バイオラブズ（New England Biolabs（Beverly, MA））またはベゼスダ・リサーチ・ラブズ（Bethesda Resarch Labs（Gaithersburg, MD））より購入し、製造業者の説明書にしたがって用いる。
【００８１】
実施例４−ｐＳＣ１１中のＡＡ１−３１１／ＡＡ３１１−８７２／ＡＡ８７２−１４５４  ＦＩＰＶ／ＦＥＣＶ／ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ／ＦＩＰＶ／ＦＥＣＶをコードするキメラＳ遺伝子のクローニング
ＡＡ８７２−１４５４ ＦＩＰＶと融合したＡＡ３１１−８７２ ＦＥＣＶと融合したＡＡ１−３１１ ＤＦ２ ＦＩＰＶを有するキメラ蛋白質を配列番号:４５により同定する。ＡＡ８７２−１４５４ ＦＥＣＶと融合した、ＡＡ３１１−８７２ ＤＦ２ ＦＩＰＶと融合したＡＡ１−３１１ ＦＥＣＶを有するキメラ蛋白質を本明細書において配列番号:４６により同定する。前記実施例３と同様に、キメラ蛋白質は全長１４５４アミノ酸である。
ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ ＭscＩ／ＢstＥＩＩ ＡＡ３１１−８７２アミノ酸挿入フラグメントおよびＭscＩ／ＢstＥＩＩ ＡＡ１−３１１／８７２−１４５４プラスミドフラグメントをコードするヌクレオチドフラグメントをｐＳＣ１１中完全長のＦＩＰＶまたはＦＥＣＶスパイク遺伝子を含有する確立されたクローンから単離する。
【００８２】
適当な単離されたフラグメントを次に１５℃で一夜結紮する。完全長のクローンをmini prep ＤＮＡのＢamＨＩ消化により同定する。これらのクローンを次にベクター中で７.５Ｋプロモーターに関して配向させ、ＰstＩ（ＦＩＰＶ中のヌクレオチド位置１０５６、アミノ酸位置３５２に存在するが、ＦＥＣＶ中では存在しない）消化により交換した３１１−８７２アミノ酸の存在に関して確認する。キメラクローン中のＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ挿入領域の特異性を診断制限酵素消化により同定する：（１）１〜３１１アミノ酸ＦＩＰＶ、ＮcoＩ；（２）８７２〜１４５４アミノ酸ＦＩＰＶ、ＸbaＩ；（３）１〜３１１アミノ酸ＦＥＣＶ、
ＸbaＩ；および（４）８７２〜１４５４アミノ酸ＦＥＣＶ、ＸmnＩ。
【００８３】
実施例５−ｐＳＣ１１中のＡＡ１−８７２／８７２−１４５４ ＦＩＰＶ／ＦＥＣＶをコードするキメラＳ遺伝子のクローニング
ＤＦ２ ＦＩＰＶおよびＦＥＣＶ ＳmaＩ／ＢstＥII１−８７２アミノ酸挿入物およびＳmaＩ／ＢstＥII８７２−１４５４アミノ酸プラスミドフラグメントをそれぞれ完全長のＦＩＰＶおよびＦＥＣＶスパイク遺伝子を含有する確立されたｐＳＣ１１遺伝子から単離する。適当な単離フラグメントを次に１５℃で一夜結紮する。完全長のクローンをmini prep ＤＮＡの ＢamＨＩ消化により同定する。これらのクローンを次に配向させ、特異的挿入領域をＰstＩ（ＤＦ２ ＦＩＰＶ ＡＡ１−８７２）、ＡccＩ（ＦＥＣＶ ＡＡ１−８７２）、ＸbaＩ（ＤＦ２ ＦＩＰＶ ＡＡ８７２−１４５４）、およびＸmnＩ（ＦＥＣＶ ＡＡ８７２−１４５４）制限酵素消化物により同定する。
８７２−１４５４アミノ酸ＤＦ２ ＦＩＰＶと融合した１−８７２ＦＥＣＶを有するキメラ蛋白質を配列番号:４７により同定する。８７２−１４５４ＤＦ２ ＦＩＰＶと融合した１−８７２アミノ酸ＦＥＣＶを有するキメラ蛋白質を配列番号:４８により同定する。これらのキメラ蛋白質は長さが１４５４個のアミノ酸である。
【００８４】
実施例６−ｐＳＣ１１中のＴ細胞に富む領域のクローニングおよび組み換え体発現
１．ＦＩＰＶ ＡＡ８９４−１０４０、ＡＡ８９４−１２０３およびＡＡ１０２９−１４５４のクローニング
以下の実施例は、アミノ酸領域８９４−１０４０（ＤＦ２、ＴＳ、ＦＥＣＶ）および８９４−１２０３が、細胞免疫応答を刺激できるＴ細胞部位に富むことを示す。
ＦＩＰＶ ＳmaＩ／ＳtuＩ挿入物をＤＦ２ ＦＩＰＶスパイク蛋白質の８９４−１０４０アミノ酸領域を含有する確立されたプラスミド［ｐＯＴＳＫＦ３３］から単離した。単離されたフラグメントをＧeneＣlean（Bio 101 Inc., LaJolla, CA）を用いて製造業者の指示に従って精製する。精製された挿入物をｐＳＣ１１ ＳmaＩ消化し、脱ホスホリルしたベクターと１５℃で一夜結紮する。挿入物を有するクローンをmini prep ＤＮＡのＢamＨＩ消化により同定する。完全長のクローンをベクター中の７.５Ｋプロモーターに関してＤraIII、ＸhoＩ／ＤraIII、およびＢamＨＩ／ＤraIII消化物により配向させる。ＤＦ２ Ｓ ＦＩＰＶ ８９４−１２０３アミノ酸フラグメントをコードするＰＣＲ ＤＮＡをＰrime Ｅrase Ｑuick Ｃolumns（Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA）を用いて精製する。精製したＰＣＲ  ＤＮＡを次にＳmaＩ／ＳtuＩ消化し、アガロースゲルから切断し、ＧeneＣleanで精製する。精製された挿入物をｐＳＣ１１／ＳmaＩ消化し、脱ホスホリルしたベクターと１５℃で一夜結紮する。完全長のクローンをmini prep ＤＮＡのＢamＨＩ消化により同定し、ベクターに関して、ＨindIIIおよびＸhoＩ／ＨindIII消化物により配向させる。
【００８５】
ｇａｌＫ融合蛋白質として発現され、マウスを免役するのに用いられるＴＳ  ＦＩＰＶ １０２９−１４５４アミノ酸領域は、これらの動物からの脾細胞を不活化ＴＳ ＦＩＰＶウイルスで刺激した場合、強いＣＭＩ応答を誘発する。ＳmaＩ／ＳtuＩ挿入物を、ＴＳ ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子の１０２９〜１４５４アミノ酸領域を含有する確立されたプラスミド（ｐＯＴＳＫＦ３３）から単離する。フラグメントをＧeneＣleanを用いて精製し、ｐＳＣ１１ ＳmaＩ消化し、脱ホスホリルしたベクターと前記のように結紮する。完全長のクローンをそれぞれmini prep ＤＮＡの ＢamＨＩおよびＨindIII消化により同定し、配向させる。
【００８６】
２．予想されるＴ細胞部位のみの発現
本出願の親出願において記載されているように、ＴＳ ＦＩＰＶの８９４〜１０４０アミノ酸を含有するイー・コリ融合蛋白質に関する前記実験によりマウスにおいて細胞免疫応答が誘発され、ＦＩＰＶ攻撃から５０％のネコが防御された。他の領域、ＴＳ ＦＩＰＶ ＡＡ１０２９〜１４５４も、不活化ワクチンウイルス（ＴＳ）で刺激されたマウスにおいて強いＣＭＩ応答を示す。したがって、以下の組み換えウイルスは、細胞免疫応答が、ワクシニアウイルス組み換え体中に発現されたＤＦ２  ＦＩＰＶ  Ｓ遺伝子上の１以上の予想される主要Ｔ細胞部位でネコを免疫化することにより選択的に刺激することができるかどうか調べるためのものである。
予想されるＦＩＰＶ  Ｔ細胞部位をコードするＷＴ  ＤＦ２  Ｓ遺伝子の選択された領域を含有するように組み換えワクシニアウイルスを操作する：（ａ）８９４〜１０４０アミノ酸（９２２〜１０４０アミノ酸にＴ細胞部位を含有すると考えられる）；（ｂ）８９４〜１２０３アミノ酸（前記クローンを拡大して、１１３３〜１１４７残基に強いＴ細胞部位を添加する）；および（ｃ）ＴＳ１０２９〜１４５４アミノ酸。
【００８７】
実施例７−組み換えワクシニアウイルスの産生
標準的ワクシニアウイルストランスフェクション法を用いて、完全長ＤＦ２  ＦＩＰＶ Ｓ、ＦＥＣＶ Ｓ、ＤＦ２およびＦＩＰＶ Ｓの選択された領域およびキメラＦＩＰＶ／ＦＥＣＶスパイク遺伝子を発現する組み換えウイルスを単離する［ディー・エム・グロバー（D.M.Glover）、ディー・エヌ・エイ・クローニング、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA Cloning, A Practical Approach）、第２巻，ＩＲＬ Ｐress（１９８５）］。簡単には、部分的（実施例６）、完全長（実施例２）またはキメラＳ（実施例３〜５）／ｐＳＣ１１クローンから調製したプラスミドＤＮＡを用いて、ワクシニアウイルスのＷＲ株に感染したＣＶ−１［ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０］単分子層をトランスフェクションする。トランスフェクションされた単分子層を感染後（p.i.）２日目に収穫し、６０ｍｍディッシュ中ＨuＴＫ−細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８３０３］単分子層に関してプラーク検定する。感染後３日目に、皿を３００μｇ／ｍｌのＢｌｕｏ−ｇａｌ［Ｓigma］を含有するアガロース重層で染色する。４〜６時間後、ｂｌｕｅ βＧａｌ＋プラークを同定し、滅菌パスツールピペットで０.５ｍｌ ＤＭＥＭ＋５％ウシ胎仔血清中に移す。初回プラークをＨuＴＫ−細胞に関して２回以上プラーク精製し、Ｔ２５フラスコ中ＣＶ−１およびＨuＴＫ-単分子層を感染させるのに用いる。感染単分子層を感染後２日目に収穫し、粗ウイルスストックとして用いるために―２０℃で凍結する。
【００８８】
実施例８−組み換えワクシニアウイルスの特質化
３回プラーク精製したウイルスストック中のＤＮＡの存在をＤＮＡドットブロットにより標準的方法を用いて特定する［ディー・エム・グロバー（D.M.Glover）、ディー・エヌ・エイ・クローニング、ア・プラクティカル・アプローチ（DNA 
Cloning, A Practical Approach）、第２巻、ＩＲＬ Ｐress（１９８５）］。組み換えＳ遺伝子の発現をウェスタンブロットにより評価する。組み換えウイルスに感染したＨuＴＫ−またはＣＶ−１単分子層を感染後２日目に培地中にかきおとすことにより収穫する。ペレット化した細胞をＰＢＳで洗浄し、０.６  ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（０.１５ｍＭ ＮaＣl、０.１％ＳＤＳ、１.０％デオキシコール酸Ｎa、１.０％Ｔriton Ｘ−１００、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ Ｔris、pＨ７.４）中に再懸濁する。ＲＩＰＡリゼートを３回凍結／解凍し、短期間超音波処理する。非還元サンプル緩衝液（２％ＳＤＳ、８０ｍＭ  Ｔris、pＨ６.８、１０％グリセロール、０.０２％  ブロモフェノールブルー）を添加し、サンプルをＬaemmliにより記載されているように１０％ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する前に１０分間煮沸する。蛋白質をＴris／グリシン／メタノール緩衝液中２０〜２５ ｍＡで１８時間Ｉmmobilon−Ｐ（Millipore）に移す。フィルターを２％脱脂粉乳、１％ゼラチンおよびＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔris、pＨ７.５、５００ｍＭ ＮaＣl）で１〜２時間室温（ＲＴ）でブロックし、ＴＴＢＳ（ＴＢＳ＋０.０５％  Ｔween−２０）ですすぎ、抗ネコ血清と共にＴＴＢＳおよび１％ゼラチン中１：５０の希釈度で１〜２時間室温で培養する。
【００８９】
抗ＦＩＰＶ血清をＳmithKline Ｂeecham Ａnimal Ｈealth, Ｌincoln, Ｎebraskaで２回温度感受性ＤＦ２ ＦＩＰＶを含有するＰrimcell（SmithKline Ｂeecham）ワクチンを３週間間隔で鼻腔内接種し、３回目のワクチン接種の２週間後に１ｍＬのＤＦ２ ＦＩＰＶを経口投与したネコにおいて産生する。動物を通常の手段で採血する。
フィルターをＴＴＢＳ中３回、各１０分ずつ洗浄し、１：１０００の希釈度で１時間ヤギ抗ネコアルカリホスファターゼ標識ＩｇＧともに培養する
［Ｋirkegaard−Ｐerry Ｌaboratories, Ｉnc.］。フィルターを前記のようにして洗浄し、製造業者の指示［Ｋirkegaard−Ｐerry Ｌaboratories, Ｉnc.］に従ってＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質中で５〜１５分間培養する。フィルターを次に水中ですすぎ、風乾する。
【００９０】
実施例９−キメラＦＥＣＶ／ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子を発現するワクシニア組み換え体で免疫化したネコ
これらの分子の免疫原性を評価するために、ＦＩＰＶ Ｓ（ｖ／ＦＩＰＶ Ｓ）、ＦＥＣＶ Ｓ（ｖ／ＦＥＣＶ Ｓ）、またはＦＩＰＶ／ＦＥＣＶキメラＳ遺伝子（ｖ／ＦＩＰＶ＋ＦＥＣＶ Ｓ）を用いて仔ネコを免疫する。１４週令の特異的病原体をもたない仔ネコを、１群１０匹（５匹はＬiberty Ｌabsから、５匹はＳprague Ｄawleyから入手）を５×１０７ＰＦＵの組み換えワクシニアウイルスで皮下投与により免疫化する。１０匹の仔ネコの１群は、負の対照として野生型ＷＲワクシニアウイルス（ｖ／ＷＲ）を受ける。仔ネコを毎日臨床的に検査し、直腸温度を調べる。同量のウイルスでの２回目の免疫化を３週間後に行う。第２免疫化の２週間後、仔ネコに、１.２５×１０４ＰＦＵ（低）または１×１０６ＰＦＵ（高）のいずれかのＷＴ  ＤＦ２  ＦＩＰＶを経口投与し、生存率をモニターする。ウイルス中和価を抗原投与の日および抗原投与の１および２週間後に測定する。血清サンプルを第１および第２回ワクチン接種の日、抗原投与の日、および抗原投与の３、７、１４、２１、および２８日後に採取する。
【００９１】
結果を以下の第Ｖ表に示す。
【表１１】
2004313196.tif 000012
【００９２】
実施例１０−キメラＦＥＣＶ／ＦＩＰＶ遺伝子
ネココロナウイルスＳ上の主な中和エピトープの予想される位置は、およそアミノ酸５２５〜６５０（ＤＦ２、ＤＦ２−ＨＰ、ＴＳ、ＴＳ−ＢＰ、ＦＥＣＶ）である。ＦＩＰＶに対する免疫における中和エピトープの役割を評価するために、アミノ酸３１１〜８７２ＦＩＰＶ ＤＦ２がＦＥＣＶの類似の領域と置換するかまたは逆にＦＥＣＶのアミノ酸３１１〜８７２がＦＩＰＶ ＤＦ２のアミノ酸３１１〜８７２と交換した、完全長の「キメラ」Ｓ蛋白質を構築する。
【００９３】
（ａ）ＦＥＣＶの８７２〜１４５４アミノ酸と融合した、ＷＴ  ＤＦ２ ＦＩＰＶの３１１〜８７２アミノ酸と融合したＦＥＣＶの１〜３１１アミノ酸、このキメラ蛋白質は配列番号:４６により同定される；および（ｂ）ＷＴ ＤＦ２ ＦＩＰＶの８７２〜１４５４アミノ酸と融合した、ＦＥＣＶの３１１〜８７２アミノ酸と融合したＷＴ  ＤＦ２  ＦＩＰＶの１〜３１１アミノ酸、このキメラ蛋白質は配列番号:４５により同定されるを含有する完全長Ｓ蛋白質を構築し、処理する。
アミノ酸６５０および８７２間の交互クローニング部位をＢstＥＩＩ（即ち、ＰvuＩＩ、ＨgaＩ）の代わりに用いて、ＶＮエピトープを含むＳ遺伝子の中間部を切断することができる。
【００９４】
実施例１１−キメラＣＣＶ／ＦＩＰＶ遺伝子
ＣＣＶ Ｓ蛋白質のＡＡ１〜３５２およびＤＦ２ ＦＩＰＶスパイク蛋白質の３５２〜１４５４をそれぞれをコードする完全長キメラＳ遺伝子を以下のようにして構築する。簡単にｈａ、１０μｌのＣＣＶ Ｓ蛋白質のアミノ酸１〜３５２をコードするＰＣＲ ＤＮＡをＸmaＩ／ＰstＩで消化し、ＤＦ２ ＦＩＰＶスパイク遺伝子プラスミドから単離したＡＡ３５２〜１４５４をコードする精製挿入フラグメントＰstＩ／ＳtuＩと１５℃で一夜結紮する。ＤＦ２ ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子クローンは、これより３５２〜１４５４個のアミノ酸ＰstＩおよびＳtuＩ挿入物が単離されるが、ＤＦ２ ＦＩＰＶ Ｓ ＡＡ１〜１４５４をコードするＰＣＲ ＤＮＡを、ＸmaＩおよびＳtuＩで消化することによりこれをクローンする。結紮生成物を次に４時間室温でｐＯＴＳＫＦ３３ベクター［ＳmithKline Ｂeecham Ｐharmaceuticals, Ｓwedeland, PA］と結紮し、ＸmaＩ／ＳtuＩで消化し、脱ホスホリル化する。イー・コリＡＲ１２０株における形質転換体［ＳmithKline Ｂeecham］をmini prep ＤＮＡのＢamＨＩおよびＳphＩ消化物によりスクリーンして挿入物を担うクローンを同定する。
ＣＣＶおよびＤＦ２ ＦＩＰＶ結紮の結紮生成物を前記と同様の条件下で
ｐＯＴＳＫＦ３３ベクター中に結紮する。ＡＲ１２０形質転換体をmini prep  ＤＮＡのＢamＨＩ／ＳphＩおよびＰstＩ消化物によりスクリーンする。ＣＣＶ  Ｓ遺伝子の＃１２８アミノ酸でのユニークなＳtuＩ部位の存在をＳｔｕＩ消化により確かめる。クローン＃２３２４はＣＣＶのＡＡ１〜３５２およびＤＦ２ ＦＩＰＶのＡＡ３５２〜１４５４をコードする完全長キメラスパイク遺伝子を含有すると確認される。
【００９５】
実施例１２−in vitro Ｔ細胞増殖検定
免疫化抗原を同時係属中の共有出願であるアメリカ合衆国特許出願第０７／６９８９２７号の実施例７に記載のように、ｐＯＴＳＫＦ３３ ｇａｌＫ／ＴＳ ＦＩＰＶ Ｓ融合蛋白質のペレット３−バクテリアリゼートを投与する。対応する出願は１９９２年５月２９日に公開され（公開番号第ＷＯ９２／０８４８７号）、本明細書において引例とする。
ペレット３フラクションを基本的に以下に記載したようにして得る。不活化抽出物を２７０００×ｇで３０分間（ＪＡ２０）遠心分離する。上清を捨て、ペレットを１０分間２００ｍｌの緩衝液Ａ＋０.２％デオキシコール酸ナトリウムおよび１％Ｔriton Ｘ−１００中で１０分間撹拌することにより再懸濁する。緩衝液Ａは５０ｍＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ８.５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、および５％グリセロールを含有する。抽出物を２７０００×ｇで３０分間（ＪＡ２０）遠心分離し、再び得られた上清を捨てる。ペレットを、１０分間２００ｍｌのＴriton Ｘ−１００（１％）および０.５Ｍ ＫＣlを含有する緩衝液Ａ中で１０分間撹拌することにより再懸濁する。
遠心分離（２７０００×ｇ、３０分間）の後、ペレットを撹拌し、５〜１０ｍｌのＰＢＳ中で短時間均質化（１.１５ｇ二塩基性燐酸ナトリウム、０.２ｇ 一塩基性燐酸ナトリウムおよび８.５ｇ ＮaＣl／Ｌ pＨ７.４）することにより再懸濁する。これによりペレット−３抗原が完成する。各ペレット−３リゼート中の特異性ｇａｌＫ／ＴＳ ＦＩＰＶ融合蛋白質の量をｇａｌＫ蛋白質標準に対するウェスタンブロットにより定量する。
【００９６】
Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１群１０匹、１２週令）を２５μｇのＱuil Ａおよび５％アルヒドロゲル［Ｓuperfos Ｂiosectorals, Ｄenmark］を含有するアジュバントエマルジョン中に配合した１５〜４０μｇのペレット３抗原で免疫する。これらの抗原はアミノ酸１〜１０５、９４〜３６２、３５２〜７４８、７３７〜１０４０、８９４〜１０４０および１０２９〜１４５４からのＴＳ ＦＩＰＶ Ｓ遺伝子を表わす。２回の免疫を、１および２１日に０.１ｍＬの量腹腔内投与（i.p.）して行う。（ＡＡ３５２〜７４８ペレット−３抗原を接種したマウスに各服用量あたり１０μｇの融合蛋白質を投与する。）
第２免疫化の１０日後（３１日）、脾臓を滅菌的に前記抗原で免疫化したマウスから摘出する。各群につき５匹のマウスからの脾臓をプールする。脾細胞を９６ウェルポリスチレンプレートの各ウェル中に３セット、合計２００μＬ ＲＰＭＩ１６４０［Ｓigma］＋１０％ウシ胎仔血清、２０ｍｍ ＨＥＰＥＳ、Ｐen Ｓtrep（１００単位／ｍＬペニシリン；１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０.１％  ＩＴＳ増殖培地（インシュリン５μｇ／ｍＬ、トランスフェリン５μｇ／ｍＬ、セレニアス酸５μｇ／ｍＬ）、および２ｇ炭酸水素ナトリウム／Ｌ、およびマイトジェンまたは特定の抗原（ビエチルイミン不活化ＴＳＦＩＰＶまたはペレット−３抗原）中に接種する（５×１０６細胞／ｍＬ）。マイトジェンは、コンカナバリンＡ（ＣonＡ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を含み、ポークウィードマイトジェンを対照として用いる。
【００９７】
培養物を３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で培養する。７２時間（マイトジェン）または９６時間（抗原）後、培養物を三重水素で標識したチミジン（０.５μＣi／ウェル）［Ｎew Ｅngland Ｎuclear（ＮＥＮ）、２ｃｉ／ｍｍｏｌ］で標識化する。培養物をさらに１８および２４時間培養する。培養物をガラス繊維紙上に収穫し、βカウンターで計測する。結果を各培養物に関して１分あたりの３回のカウントの平均値（ｃｐｍ）として表わし、定量値を以下に示す。（ｐＯＴＳＫＦ３３負対照ペレット−３リゼートから計算される基底数を引く。）
以下の第ＶＩ表は、in vitro増殖検定におけるマウス脾臓細胞の、ＢＥＩ処理またはペレット−３抗原により不活化されたＴＳ ＦＩＰＶに対する反応性を示す。第ＶＩ表の第１列の免疫化抗原は、前記の配列番号:８のＳ蛋白質フラグメントを含有するｇａｌＫ融合蛋白質である。第３、４および５列の刺激抗原は、ペレット−３抗原において同定されるＳ蛋白質領域を示す。１個のプラス（＋）は１０〜１５０００ｃｐｍを表わし、２個のプラス（＋＋）は１５〜２００００ｃｐｍを表わし、＋＋＋は３００００ｃｐｍ、＋＋＋＋は３５〜５００００ｃｐｍ、―は≦１０Ｋｃｐｍを表わす。
【００９８】
【表１２】
2004313196.tif 000013
【００９９】
ＦＩＰＶ ＴＳ ＡＡ２１３〜３６２、ＡＡ８９４〜１０４０およびＡＡ１０２９〜１４５４融合蛋白抗原を投与したマウスから得た脾臓細胞は、Ｔ細胞増殖検定においてＴＳ ＦＩＰＶ抗原によく応答した。これらの抗原の後者の２つは、強いＴ細胞エピトープを含有すると考えられるＴＳ ＦＩＰＶスパイク遺伝子の領域を表わす。Ｔ細胞エピトープを予想するのに用いられるコンピュータープログラムは典型的には８０％の精度である。ＡＡ２１３〜３６２融合蛋白質でのワクチン接種は明らかに増殖性Ｔ細胞応答を刺激し、したがってＴ細胞部位も含有する。ワクチン接種したマウスのＥＬＩＳＡ、ＶＮおよびウェスタンブロットにより測定される血清学的応答も評価する。
本発明の多くの修飾および変形も本明細書に含まれ、これは当業者には明らかである。このような本発明の組成物および方法の修飾および変法も請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
2004313196000001.app