(57)【要約】【課題】  遺伝子レベルでの変異の解明が進んでいるが、その変異と機能発現の関係の解明が今だ不十分或いは困難な遺伝子の変異に伴う発現タンパク質の異常を迅速に簡便に測定する方法を提供することである。【解決手段】  本発明は、遺伝子工学技術を利用したタンパク質合成系を使う。生体系における生理活性物質（例えば酵素）をコードする特定遺伝子を分取し、これを人工的に発現させ、そして発現された該生理活性物質との相互作用を評価するシステムを構築することにより、生体系における生理活性物質の機能が明らかになる。生理活性物質の機能の有無により、遺伝子レベルでの変異が明らかにされ、遺伝子変異を迅速に測定することができる。例えば、菌体内にある生理活性物質の遺伝子を有していても、その機能が発揮されるか否かによって、薬剤耐性か否かを判別するのに有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、遺伝子機能の変異の迅速測定方法：
１）測定検体から遺伝子を抽出し、測定標的生理活性タンパク質をコードする特定遺伝子領域の増幅を行う；
２）得られた産物を、タンパク質発現ベクターに組み込む；
３）発現系を利用して、測定標的生理活性タンパク質又は類似物質の産生を行う。；
４）産生された測定標的生理活性タンパク質又は類似物質を測定系に導く；
５）測定結果の対照値との比較から当該特定遺伝子領域の機能を判定する。
【請求項２】
以下の工程を含む、遺伝子機能の変異の迅速測定方法：
１）測定検体から遺伝子を抽出し、測定標的生理活性タンパク質をコードする特定遺伝子領域の増幅を行う；
２）得られた産物を、タンパク質発現ベクターに組み込む；
３）発現系を利用して、測定標的生理活性タンパク質又は類似物質の産生を行う；
４）産生された特定タンパク質に対して相互作用を有する物質を系に導入する。
５）相互作用を有する物質における相互作用の結果を測定系に導く。
６）測定結果の対照値との比較から当該特定遺伝子領域の機能を判定する。
【請求項３】
特定タンパク質が酵素である請求項１又は２に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法：
【請求項４】
相互作用が、酵素−基質反応、抗原−抗体反応、タンパク質−受容体反応から選ばれる請求項２又は３に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
【請求項５】
測定検体が、病原体を含有する請求項１〜４いずれか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
【請求項６】
測定検体の遺伝子機能の変異が、薬剤耐性である請求項１〜５のいずれか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
【請求項７】
薬剤が結核菌に対する化学療法剤である請求項６の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
【請求項８】
タンパク質発現系が、大腸菌、枯草菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）、昆虫細胞、動物細胞、無細胞から選ばれる請求項１〜７の何れか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
【請求項９】
ピラジナミド耐性結核菌の迅速測定方法であって、測定標的生理活性物質がピラジナミダーゼであり、タンパク質発現系がピラジナミダーゼ活性が極めて低い大腸菌の系であり、相互作用を有する物質がピラジナミダーゼの基質であるピラジナミドであり、このピラジナミドが大腸菌培養液中に添加され、添加されたピラジナミドが菌体内に取り込まれことでピラジナミダーゼによる代謝が行なわれ、その後菌体外に分泌される代謝産物を測定することによって、結核菌のピラジナミド代謝能を判定することを含む請求項１〜４のいずれか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１に記載の測定方法に使用される試薬を含む遺伝子機能の変異の迅速測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子機能の変異、特に遺伝子の変異に伴う発現タンパク質の異常を迅速に簡便に測定する方法及びそれに利用する測定用キットに関する。さらに詳しくは、感染症に対する耐性化の判別系に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核の治療は、化学療法を中心とする内科的療法が基本であり、外科療法の適応は多剤耐性例、慢性膿胸例などで全身状態が手術に耐えられる例に限られる。病巣内の結核菌を排除するためには長期にわたる抗結核薬による治療が必要である。そこで問題となる耐性菌の発生を防ぐために複数の薬剤による併用療法が取られている。
【０００３】
わが国の結核発病者の半数以上は抵抗力の衰えてくる６０歳以上の高齢者であり、これらの多くは数十年前に感染した菌による発病の場合が多く、原因となる菌は薬剤耐性菌である可能性が高い。このような場合は、使用する薬剤を耐性ではない薬剤に変更する必要があり、効果的な治療を行う上で迅速に薬剤感受性を判定することは重要である。
【０００４】
現在、イソニアジド(INH)、リファンピシン(RFP)、ストレプトマイシン(SM)又はエタンブトール(EB)等の抗結核化学療法剤の薬剤感受性判定は、培養法を使用した薬剤感受性試験が主要である。結核菌は成長が遅いため、分離菌株を使用してもその薬剤感受性を判定するのに１ヶ月以上を必要とする。
ピラジナミド(PZA)も短期化学療法に使用される主要な薬剤で、わが国では1996年に標準治療法に加えられた薬剤である。しかし、既に耐性菌の報告もされており、PZAに対する薬剤感受性も迅速に判定することが求められる。
【０００５】
PZAの薬剤感受性判定方法として、ウェルパック培地（日本BCG）、結核菌感受性PZA液体培地（極東）が市販されており、PZA感受性試験が可能ではあるが、多くの課題が残されている。
ウェルパック培地は絶対濃度法で判定までに２〜３週間を必要とし、耐性の過大評価傾向があるという問題点がある。結核菌感受性PZA液体培地の方法は、判定までに１週間を必要とし迅速性に欠ける。これらの原因としては、結核菌の成長が遅いという他にPZAの抗菌活性がpH5.5付近にあるため、培地を酸性条件であるpH5.5まで低下させなければならないということが挙げられる。pH5.5という酸性条件下では、菌の発育自体が抑制されてしまい、PZAの作用により菌の発育が抑制されたのか、発育条件が悪いことで菌の発育が抑制されたのか判断することができず、感受性検査の結果判定が困難とされている。
【０００６】
結核菌の薬剤耐性機序の解明に伴い、PZA耐性はピラジナミダーゼをコードしているpncA遺伝子の変異と90%以上関連しており、ピラジナミダーゼ活性の欠落とPZA耐性に相関があることが明らかにされた（非特許文献１）。今日、pncA遺伝子の塩基配列を解読し変異部位を確認することは可能であるが、確認した変異がピラジナミダーゼの活性を欠落させているか否かを確認する文献報告は少なく、変異が認められたからといって必ずしもPZA耐性であると判定できないのが現状である。
【０００７】
そこで、2000年に結核病学会抗酸菌検査法検討委員会よりPZA感受性検査法としてピラジナミダーゼ試験が提案された（非特許文献２）。この方法は、多量の培養菌をPZA添加培地に接種し４日間培養後、１％硫酸第一鉄アンモニウム溶液を加え30分放置後、培地表層にピンク〜褐色のバンドが見られたら感受性、見られなかったら耐性と判定するものである。現在のPZA感受性検査として最も速く判定することができるのは本方法であるが、それでも分離菌株の状態から４日を必要とする。また、感受性菌と耐性菌が混在する場合は、ピラジナミダーゼ活性を有している感受性株と判定される可能性が高く、耐性菌であってもそのピラジナミダーゼ活性の低下度合いを判別することは難しい。
【０００８】
以上の先行技術は、結核菌の化学療法剤への耐性を元に説明した。本発明の以下に説明する技術は、上記と同様に、遺伝子レベルでの変異の解明が進んでいるが、その変異と機能発現の関係の解明が今だ不十分或いは困難な遺伝子の変異に伴う発現タンパク質の異常を迅速に簡便に測定する方法に広く応用可能である。
【非特許文献１】Scorpio, A., Zhang, Y. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculous drug pyrazinamide in tubercle bacillus. 2, 662-667, 1996.
【非特許文献２】日本結核病学会  抗酸菌検査法検討委員会、新結核菌検査指針、p.70, 財団法人結核病予防会、2000.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
解決しようとする問題点は、遺伝子レベルでの変異の解明が進んでいるが、その変異と機能発現の関係の解明が今だ不十分或いは困難な遺伝子の変異に伴う発現タンパク質の異常を迅速に簡便に測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、遺伝子工学技術を利用したタンパク質合成系を利用することにより、遺伝子変異が迅速に測定測定できることを見出した。より詳しくは、生体系における機能について評価を所望する測定標的生理活性物質をコードする特定遺伝子を分取し、これを人工的に発現させ、そして発現された測定標的生理活性物質とマーカー物質との相互作用を評価するシステムによる、遺伝子変異の迅速測定法を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含む、遺伝子機能の変異の迅速測定方法：
１）測定検体から遺伝子を抽出し、測定標的生理活性タンパク質をコードする特定遺伝子領域の増幅を行う；
２）得られた産物を、タンパク質発現ベクターに組み込む；
３）発現系を利用して、測定標的生理活性タンパク質又は類似物質の産生を行う。；
４）産生された測定標的生理活性タンパク質又は類似物質を測定系に導く；
５）測定結果の対照値との比較から当該特定遺伝子領域の機能を判定する。
２．以下の工程を含む、遺伝子機能の変異の迅速測定方法：
１）測定検体から遺伝子を抽出し、測定標的生理活性タンパク質をコードする特定遺伝子領域の増幅を行う；
２）得られた産物を、タンパク質発現ベクターに組み込む；
３）発現系を利用して、測定標的生理活性タンパク質又は類似物質の産生を行う；
４）産生された特定タンパク質に対して相互作用を有する物質を系に導入する。
５）相互作用を有する物質における相互作用の結果を測定系に導く。
６）測定結果の対照値との比較から当該特定遺伝子領域の機能を判定する。
３．特定タンパク質が酵素である前項１又は２に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法：
４．相互作用が、酵素−基質反応、抗原−抗体反応、タンパク質−受容体反応から選ばれる前項２又は３に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
５．測定検体が、病原体を含有する前項１〜４いずれか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
６．測定検体の遺伝子機能の変異が、薬剤耐性である前項１〜５のいずれか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
７．薬剤が結核菌に対する化学療法剤である前項６の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
８．タンパク質発現系が、大腸菌、枯草菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）、昆虫細胞、動物細胞、無細胞から選ばれる前項１〜７の何れか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
９．ピラジナミド耐性結核菌の迅速測定方法であって、測定標的生理活性物質がピラジナミダーゼであり、タンパク質発現系がピラジナミダーゼ活性が極めて低い大腸菌の系であり、相互作用を有する物質がピラジナミダーゼの基質であるピラジナミドであり、このピラジナミドが大腸菌培養液中に添加され、添加されたピラジナミドが菌体内に取り込まれことでピラジナミダーゼによる代謝が行なわれ、その後菌体外に分泌される代謝産物を測定することによって、結核菌のピラジナミド代謝能を判定することを含む前項１〜４のいずれか１に記載の遺伝子機能の変異の迅速測定方法。
１０．前項１〜９の何れか１に記載の測定方法に使用される試薬を含む遺伝子機能の変異の迅速測定用試薬キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の、薬剤耐性菌が保有するタンパク質を遺伝子工学技術を利用して人工的に発現させ、発現したタンパク質を測定することにより、その活性の有無を測定でき、遺伝子機能の変異が迅速に測定され、薬剤に対する感受性を迅速に判定することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の基本原理は、以下の工程を含む、遺伝子機能の変異の迅速測定方法からなる。
１）測定検体から遺伝子を抽出し、測定標的生理活性物質をコードする特定遺伝子領域の増幅を行う。
測定検体は、生物材料であり、微生物、生体細胞等の測定の標的とする生理活性物質をコードする遺伝子を担持するものが対象となる。本発明の具体例で示した結核菌等では、喀痰が好適に例示されるが、血液、尿、糞便等各測定の標的とする生理活性物質に応じて変更可能である。無論、対象が菌体であれば、これのコロニー化したものを生物材料としてもよい。
【００１４】
微生物としては、病原体であり、薬剤耐性病原体が好適に例示される。病原体としては結核菌、緑膿菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、ウイルス等が例示されるが特に限定されるものではない。特に好ましい事例は結核菌である。測定検体は、このような菌体を含有する。好ましい測定標的としては、菌体の遺伝子機能の変異が、薬剤耐性である場合が例示される。薬剤耐性とは、化学療法剤による場合が殆どであり、各菌体を化学療法剤で治療しても、菌体は薬剤に反応せず生存を継続する例が好適に例示される。耐性は、遺伝子変異による酵素活性の損失等が例示される。具体的には、好適な事例として、結核菌におけるピラジナミド（PZA）耐性菌が挙げられる。PZA耐性菌はピラジナミダーゼを保持しても、該ピラジナミダーゼはPZAをPyrazinoic acid（POA）に変換する機能を有しないと考えられる。該ピラジナミダーゼをコードする遺伝子を抽出し、増幅を行う。他の例として、大腸菌が保有するβ-グルクロニダーゼの例が挙げられる。同様に、該β-グルクロニダーゼをコードする遺伝子を抽出し、増幅を行う。
生物材料からの遺伝子の抽出法は、自体公知の可溶化、分離、核酸抽出等の工程を経て達成される。
【００１５】
遺伝子の増幅手段は、今日多様な方法が確立され、今後も開発されていくであろうが、本発明は特に限定されるものではない。具体的にはポリメラーゼ・チェイン・リアクション法（ＰＣＲ法、Science,230:1350-1354,1985）やＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification 法、Nature,350,91-92,1991、特許第 2648802号公報及び特許第 2650159号公報記載）及びＬＡＭＰ法（Loop mediatedisothermal amplificaiton of DNA増幅法、特開2001-242169号公報）などの核酸増幅方法を適用することができる。
【００１６】
２）得られた産物を、タンパク質発現ベクターに組み込む。
前記１）で増幅され、精製された遺伝子は、タンパク質発現ベクターに組み込まれる。ベクターの組み込みは、タンパク質発現系に応じて自体公知の方法が確立しており、格別の限定はない。組み込み手段は、各ベクター・異種又は同種タンパク質発現系の推奨手段に準ずれば十分である。
【００１７】
タンパク質を発現するためのベクターとしてはこれを導入する宿主内で、測定標的生理活性物質等をコードする遺伝子のポリヌクレオチド若しくはそれを含むポリヌクレオチドが発現されるものであれば特に制限はないが、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販のタンパク質発現ベクターを用いることができる。また、プラスミドベクター、ファージベクターともに使うことができる。具体的には、pQE-30UA（QIAGEN社製）、ZAP Express（ストラタジーン社製）、pSVK3（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、pEGFP-C1（クロンテック社製）等が挙げられる。また、pMKITNeo（丸山和夫、細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール、p.259,秀潤社、(1993)）等も好ましく用いられる。
【００１８】
目的とする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはT3、T7、tac、lacプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはnmt1プロモーター、Gal1プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはSV40プロモーター、CMVプロモーター等が挙げられる。
【００１９】
これらのベクターへの目的遺伝子のポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチド又はこれを含むDNA断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行う。また、プロモーターとポリヌクレオチドとの間にコザック配列（Kozak,M., Gene, 234, 187, (1999)）を挿入したり、ポリヌクレオチドの下流にタグとなるポリペプチドをコードするDNAを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、FLAGタグ（BioTechniques,7, 580, (1989)）等が挙げられる。
【００２０】
このようにして得られた本発明の組換えベクターは、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551(1983)）、DEAEデキストラン法（Science,215, 166(1982)）、電気パルス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161(1984)）、インビトロパッケージング法（Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581(1975)）、ウィルスベクター法（Cell, 37, 1053(1984)）、あるいはリポフェクション法（LipofectionReagent(GibcoBRL社製））等によって適当な宿主に導入される。
【００２１】
このとき、該組み換えベクターを導入する宿主としては、該ベクターが体内で複製可能であり、かつ目的遺伝子のポリヌクレオチドがコードするタンパク質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではM15（QIAGEN社製)、BL21、XL-2Blue（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばSP-Q01（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばAcNPV（J.Biol. Chem., 263, 7406(1988)）とその宿主であるSf-9（J. Biol. Chem., 263, 7406(1988)）等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞C127（J.Viol. , 26, 291(1978)）やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,4216(1980)）やアフリカミドリザル腎臓由来COS-7（ATCC CRL1651：アメリカン タイプ カルチャー コレクション）等が挙げられる。また、目的遺伝子のポリヌクレオチドがコードするタンパク質の生成は宿主を用いずとも小麦胚芽抽出物、赤血球ライセートのような公知の無細胞タンパク質合成系であってもよい。
【００２２】
３）測定標的生理活性物質又は類似物質の固有的産生は、タンパク質とタンパク質発現細胞が同種又は異種のものを使用することができる。
タンパク質発現系とは、タンパク質発現系に使用する宿主系、細胞系、無細胞系が固有的に産生する以外のタンパク質を発現することを意味し、生物分類における種の定義を超えて広く対象とする。タンパク質発現系としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、無細胞から選ばれるが、本発明では好適な具体例として大腸菌系を例示した。
そして、タンパク質発現系は、所望の遺伝子を組込んだ場合の測定標的生理活性物質又は類似物質の産生量が、遺伝子を組込んでいない場合の産生量に比べて測定系において明確に差異が認められるような系を選択することで本発明の効果を達成することができる。より簡便な測定のために、測定標的生理活性物質又は類似物質を実質的に固有的に産生しない、或いは無視できる程度の極めて低い産生量である系を選択するのが好適である。
特定タンパク質である測定標的生理活性物質は、広く生理活性物が対象となるが、好適には酵素が例示される。
具体的には、上記１）で例示した結核菌が保有するピラジナミダーゼ、大腸菌のβ-グルクロニダーゼが挙げられる。類似物質とは、機能的にこれらのタンパク質と各々同等の目的効果を達成しうる物質群を意味する。
【００２３】
４）産生された特定タンパク質に対して相互作用を有する物質を系に導入する。
産生された特定タンパク質とは、測定標的生理活性物質であり、上記２）〜３）の手法で発現されたタンパク質であり、具体的には同種又は異種タンパク質合成系で産生されるタンパク質である。
相互作用とは、酵素−基質間、タンパク質−受容体間、抗原−抗体間等の相互作用を意味する。相互作用を有する物質とは、例えば酵素がタンパク質合成系で産生されれば、当該酵素に対する基質や酵素を抗原とした場合の抗体等が挙げられ、好ましくは基質が挙げられる。
系に導入するとは、例えば酵素と基質の反応、或いは抗原抗体反応のような相互作用がおこる場に、相互作用を有する物質を導入することである。例えば、産生された特定タンパク質が産生系から分泌されれば、基質は分泌される培地中に添加される。非分泌系であるならば、導入される相互作用を有する物質は特定タンパク質の産生系内に吸収或いは通過されることが必要である。無細胞タンパク質合成を用いる場合は、合成系に直接導入可能である。
【００２４】
具体的には、例えばピラジナミダーゼに対して相互作用を有する物質として基質のPZAが挙げられ、これを大腸菌を利用したタンパク質合成系に導入すると、PZAは大腸菌の細胞膜を通過して、大腸菌内に産生されたピラジナミダーゼと接触し、相互作用が起こり、PZAがPOAへ変換する。
産生された特定タンパク質に対して相互作用を有する物質を系に導入しなくても、測定標的生理活性物質が容易に測定可能な場合は、この工程を省略することもできる。例えばβ-グルクロニダーゼを大腸菌内で発現させ、合成した後に容易に大腸菌外へ放出されるので、β-グルクロニダーゼに相互作用を有する物質を系に導入する工程を省略することができる。
【００２５】
５）測定
上記４）によって、特定タンパク質と相互作用を有する物質の接触がおこり、相互作用が達成され、相互作用の結果が得られる。遺伝子組換えの手法によるタンパク質合成系外で相互作用の結果が得られれば、当該結果を量的に測定する手段を選択すればよい。タンパク質合成系内で相互作用の結果が得られれば、当該結果をタンパク質合成系外に反映させる手段の導入が必要である。タンパク質合成系内で相互作用により得られた反応産物を、例えば分泌、細胞膜通過或いは細胞膜破砕等によりタンパク質合成系外に導くことが必要である。
具体的には、例えば大腸菌内で合成されたピラジナミダーゼによってPZAがPOAに変換され、それに続いてPOAは大腸菌外へ通過し、POAは培地中に検出される。ついで、相互作用の結果を測定系に導くことができる。
上記４）の工程を省略する場合の例として、例えば大腸菌内で合成されたβ-グルクロニダーゼが挙げられる。この場合は、β-グルクロニダーゼ発現細胞である大腸菌の培養上清をそのまま測定系に導くことができる。ここにおいて測定系とは、例えば色原体等による対象タンパク質の定量を可能にすることを意味し、具体的には、例えばPOAやβ-グルクロニダーゼが、色原体物質の作用により量的に評価されることをいう。
【００２６】
６）測定結果の対照値との比較から当該特定遺伝子領域の機能を判定する。
得られた測定値は、対照との対比によって、測定標的生理活性物質の当該検体における機能レベルが判定可能となる。
例えば、POA量を測定することでPZAからPOAへの変換レベルを判定可能とし、検体である結核菌のPZAからPOAへの変換レベル、つまりピラジナミダーゼの機能レベルが量的に判定される。そして、OD値の対比で決定される感受性菌と同等量のPOAが検出されれば、ピラジナミダーゼ活性は正常であり、PZA感受性菌であると判定され、一方、OD値の対比で決定されるPOA産生量が感受性菌と同等量以下であれば、ピラジナミダーゼ活性は異常であり、ひいては当該結核菌はPZAに対する耐性が担持されていると判定されるのである。
【実施例】
【００２７】
以下本発明を実施例を示して具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）PZA耐性結核菌の大腸菌系を用いた測定系
本具体例では、結核菌のPZA耐性菌の測定を例示する。PZAの作用機序は以下のように進行する。PZAが結核菌内に取り込まれた後、結核菌が保持しているピラジナミダーゼによりPOAへと代謝され、その後菌体外へ排出される。この時の菌体外（外部）が酸性条件（pH5.5）であると、排出されたPOAは電荷を失いConjugateacid formを形成する。この物質は容易に細胞膜を通過できるため再び菌体内へと取り込まれる。次々と菌体内に取り込まれ蓄積することで、細胞質が酸性化する。その結果、菌の各種酵素の活性が低下し菌の発育が阻害される（図１参照）。pncA遺伝子の変異によりピラジナミダーゼ活性が低下した結核菌は、PZAをPOAへと代謝することができず、細胞質の酸性化が起こらないために菌は発育し続けることが可能で、PZA耐性を獲得する。
【００２９】
本発明では、結核菌が保有するPZA代謝酵素であるピラジナミダーゼにより代謝された産物であるPOAの産生量を測定することで、ピラジナミダーゼ活性の低下度合いを判断し、ついてはPZAに対し感受性であるか迅速に判定した。
【００３０】
まず、結核菌からDNAを抽出し、ピラジナミダーゼをコードするpncA遺伝子領域をPCR法で増幅した。PCR産物を精製後、QIAexpressUA-cloning kit（QIAGEN）を使用してタンパク質発現ベクターpQE-30 UAに組込んだ。その後、pQE-30 UAベクターをコンピテント細胞（ピラジナミダーゼ活性が極めて低い大腸菌）M15へトランスフォーメーションし、IPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加して大腸菌内でピラジナミダーゼの発現を誘導した。この時に培養液中にPZAを加えることで、PZAは大腸菌内に取り込まれ、発現したピラジナミダーゼによりPOAへと代謝され培養液中へ排出された。その後、培養液を遠心して菌体を除去した上清に、POAと反応すると赤色変化する指示薬である硫酸第一鉄アンモニウムを加え、POAの産生量をOD450nmで測定した。POAの産生量を測定することからPZAの代謝量が予測でき、ピラジナミダーゼ活性の低下度合いが判断できる（図２参照）。
【００３１】
（１）  検体からのDNA抽出（図３参照）
アンプリコアマイコバクテリウム用検体前処理用試薬セットII（ロシュ・ダイアグノスティックス）を使用し、添付文書に従って検体からDNAを抽出した。
1）喀痰等の体液は、等量のNALC溶解液（0.05M Na3citrate, 2%NaOH）を加え撹拌し、室温にて可溶化した。
2）PBS（pH6.8）を適当量加え、3,000×g以上で20分以上遠心、上清を除去した。
3）沈渣にPBS（pH6.8）1 mlを加えた。
4）検体洗浄液*1 500μlに上記前処理済み検体100μlを加えた。
5）3,000gで10分間遠心し、上清を除去した。
6）沈渣に溶菌試薬*1 100μlを加えて良く撹拌し、60℃で45分間インキュベートした。
7）中和試薬*1 100μlを加えてDNA抽出液とした。
8）菌株の場合は、コロニーを適当量のPBS（pH6.8）に懸濁し、前処理済み検体として4）の操作から実施した。
*1：アンプリコアマイコバクテリウム用検体前処理用試薬セットII
【００３２】
（２）  pncA遺伝子の増幅（図３参照）
GeneAmp PCR System9600（PRKIN ELMER）を用いて、95℃、15分保温後、95℃30秒で変性、55℃30秒でアニーリング、72℃60秒で伸長を50サイクル行い、結核菌pncA遺伝子領域を増幅した。
増幅に使用するプライマーは、結核菌のpncA遺伝子全領域（スタートコドンからストップコドンまでを含む561bp）を増幅かつ変異の検出が可能なように設計し、pncA遺伝子領域の両外側に20mer程の長さで設定した。具体的には、配列表の配列番号１及び２に記載の配列を有するプライマーを使用して、pncA全領域561bpを含む597bpを増幅した。
【００３３】
pncA-D-UA（5'-CGA ACG TAT GGT GGA CGT AT-3'）（配列番号１）
pncA-U-UA（5'-CCC GGT TCG GCG GTG CCA TC-3'）（配列番号２）
【００３４】
（３）  PCR増幅産物の精製
PCR増幅産物を1 ％アガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンド（597bp）を切り出した。UltrafreeTM-DA（MILLIPORE）を用いて5,000×gで10分遠心し、ゲル中よりPCR増幅産物を抽出した。抽出したPCR増幅産物をMicroconYM-100（MILLIPORE）を使用して1,000×gで15分遠心し精製濃縮した。
【００３５】
（４）  PCR増幅産物の発現ベクターへの組込み（図３参照）
QIAexpress UA-cloning kit（QIAGEN）の添付文書に従い、精製濃縮したPCR増幅産物ををpQE-30 UAベクターに組込んだ。
1）pQE-30 UAベクター 1 μl、PCR増幅産物 4 μl、2× Ligation Master Mix 5 μlを混合し、16℃で2hrインキュベートした。続いてライゲーション産物を付属の大腸菌コンピテントM15細胞にトランスフォーメーションした。
2）凍結したコンピテントM15細胞を氷上で解凍した。
3）1.5 mlマイクロ遠心チューブにライゲーション産物10μlと細胞懸濁液100μlを加え注意深く混合し、氷上で20分間放置した。
4）このチューブを42℃のウォーターバスで90秒間熱処理した。
5）500μlのPsi brothを細胞に添加し、37℃で60〜90分間インキュベートした。
6）アンピシリン100μg/mlを含有するLB寒天プレートにバクテリア懸濁液の200μlをプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートした。
【００３６】
（５）  ピラジナミダーゼ発現の誘導と活性の測定（図４参照）
添付文書に従い、pQE-30 UAベクターに組込んだ増幅産物の発現を誘導した。
1）トランスフォーメーションした単一コロニーをピックアップし、一部をアンピシリン100μg/mlを含有するLB brothに植菌し、OD600nmの値が0.5になるまで培養した。残りはPCRチューブに懸濁し、pncAのForwardプライマー（pncA-D-UA）とベクターの配列表の配列番号に記載するReverseシークエンスプライマーを用いてPCRを実施し、増幅産物の有無でpncA遺伝子が正しい向きでベクターに組込まれたか確認した。
（TypeIII/IV 5'-CGG ATA ACA ATT TCA CAC A-3'）（配列番号３）
2）正しい向きで組込まれたことを確認したベクターを持つコロニーの培養液に、最終濃度が3mg/mlになるようにPZA(Pyrazinamid)を添加後、最終濃度が1mMになるようにIPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加し、ピラジナミダーゼの発現を誘導した。
3）培養液をさらに１時間培養し、そのうちの上清250μlをマイクロ遠心チューブに移した。12,000×gで2分遠心し上清の200μlを吸光度の測定が可能なマイクロプレートに移した。
4）最終濃度が25mMになるように硫酸第一鉄アンモニウムを添加し、PZAの代謝産物であるPOA（Pyrazinoic acid）の増加量をOD450nmで測定した。
5）pncA遺伝子領域に変異のない標準株は測定したOD 値が3.000以上となった。それよりも低い値を示した場合は、pncA遺伝子領域に変異が認められ、ピラジナミダーゼの活性が低下していると考えらた。
【００３７】
（実験例１）
上記実施例に示した方法で具体的に臨床分離株を用いて測定した。
薬剤感受性試験で、＞800μg/ml耐性と判定された９株、400μg/ml耐性と判定された１株、感受性と判定された３株、薬剤感受性試験未実施１株を上記実施例に従って、ピラジナミダーゼを発現させ、その活性を吸光度（OD450nm）により測定した。対照として、ピラジナミダーゼ未発現大腸菌の培養上清についても測定した。その結果を表１に示した。
【表１】
2004166688.tif 000002
【００３８】
1）薬剤感受性試験で＞800μg/ml耐性と判定された９株のピラジナミダーゼ活性を測定したところ、９株のOD 値は0.039〜0.125となり、未発現の大腸菌0.015〜0.132と同程度で、ピラジナミダーゼの活性がほとんど失われており、耐性であると判定した。
2）薬剤感受性試験で400μg/ml耐性と判定された１株のピラジナミダーゼ活性を測定したところ、OD 値は2.358となり、ピラジナミダーゼの活性が低下していると考えられた。
3）薬剤感受性試験で感受性と判定された３株のピラジナミダーゼ活性を測定したところ、OD 値が3.000以上となり、ピラジナミダーゼの活性は認められ、PZAに感受性であると判定した。
4）薬剤感受性試験未実施１株のピラジナミダーゼ活性を測定したところ、OD 値が3.000以上となり、ピラジナミダーゼの活性は認められ、PZAに感受性であると判定した。
【００３９】
（実施例２）大腸菌β-グルクロニターゼ測定系
大腸菌β-グルクロニターゼの活性測定法は以下の通りである。
大腸菌からDNAを抽出し、β-グルクロニターゼをコードする遺伝子のuidA遺伝子領域をPCR法で増幅した。PCR産物を精製後、pCR T7 TOPO TA 発現キット（インビトロジェン社製）を使用してタンパク質発現ベクターpCR T7/CT-TOPOに組込んだ。その後、pCR T7/CT-TOPOベクターをコンピテント細胞BL21(DE3)pLysSへトランスフォーメーションし、IPTGを添加して大腸菌内でβ-グルクロニターゼの発現を４〜６時間誘導した。発現したβ-グルクロニターゼは培養液中にも放出されており、発現誘導後培養液を遠心して菌体を除去した上清に、β-グルクロニターゼ活性を測定できる既知の基質p-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドを加え、活性をOD415nmで測定する。コンピテント細胞のみの場合でもβ-グルクロニターゼ活性を有しているが、β-グルクロニターゼ発現を４〜６時間誘導させることで有意な差が認められ、発現させたβ-グルクロニターゼの活性を測定することができた（図５，６参照）。
【００４０】
β-グルクロニターゼの発現
（１）  uidA遺伝子の増幅
公知の手法により大腸菌から抽出したDNAをテンプレートとして使用し、GeneAmp PCR System9600（PRKIN ELMER）を用いて、95℃、４分保温後、95℃30秒で変性、53℃30秒でアニーリング、72℃90秒で伸長を40サイクル行い、大腸菌uidA遺伝子領域を増幅した。増幅に使用するプライマーは、大腸菌のuidA遺伝子全領域（スタートコドンからストップコドンまでを含む1812bp）を増幅することができ、かつ変異の検出が可能なように20mer程の長さで設定した。配列表の配列番号４及び５に記載の配列を含むプライマーを使用し、uidA全領域1812bpを増幅した。
【００４１】
E.coli/uidA-D（5'-CAT ATG TTA CGT CCT GTA GAA ACC CC-3'）配列番号４
E.coli/uidA-U（5'-AAG CTT TCA TTG TTT GCC TCC CT-3'）    配列番号５
【００４２】
（２）  PCR増幅産物の精製
1）上記により得られたPCR増幅産物を、１％アガロースゲル電気泳動を行い、目的のバンド（1812bp）を切り出した。
2）UltrafreeTM-DA（MILLIPORE）を用いて5,000×gで10分遠心し、ゲル中よりPCR増幅産物を抽出した。
3）抽出したPCR増幅産物をMicrocon YM-100（MILLIPORE）を使用して1,000×gで15分遠心し精製濃縮した。
【００４３】
（３）  PCR増幅産物の発現ベクターへの組込み
pCR T7 TOPO TA 発現キットの添付文書に従い、精製濃縮したPCR増幅産物を付属のpCR T7/CT-TOPOベクターに組込んだ。
1）pCR T7/CT-TOPOベクター 1μl、PCR増幅産物 4μl、緩衝液 1μlを混合し、室温で30分ライゲーションした。
【００４４】
（４）  ライゲーション産物のトランスフォーメーション
1）凍結したTOP10F'細胞を氷上で解凍した。
2）50μl のTOP10F'細胞を解凍したチューブにライゲーション産物6μlを加え、注意深くミックスし、氷上で30分間放置した。
3）このチューブを42℃のウォーターバスで60秒間熱処理した。
4）400μlのS.O.C.を細胞に添加し、37℃で60〜90分間インキュベートした。
5）アンピシリン100μg/mlを含有するLB寒天プレートにバクテリア懸濁液を適当量播種し、該プレートを37℃で一晩インキュベートした。
6）TOP10F'細胞にトランスフォーメーションした単一コロニーを採取し、アンピシリン100μg/mlを含有するLB brothに植菌して37℃で一晩インキュベートした。
【００４５】
（５）  発現細胞へのトランスフォーメーション
1）QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)の添付文書に従い、上記（４）で採取したコロニーを一晩インキュベートした。LB brothより組込みpCR T7/CT-TOPOベクターを精製した。
2）凍結したBL21(DE3)pLysS細胞を氷上で解凍した。
3）50μl のBL21(DE3)pLysS細胞を解凍したチューブに精製した組込みpCR T7/CT-TOPOベクター 1μlを加え注意深く混和し、氷上で30分間放置した。
4）このチューブを42℃のウォーターバスで60秒間熱処理した。
5）400μlのS.O.C.を細胞に添加し、37℃で60〜90分間インキュベートした。
6）アンピシリン100μg/mlを含有するLB寒天プレートにバクテリア懸濁液を適当量プレーティングし、該プレートを37℃で一晩インキュベートした。
【００４６】
（６）  β-グルクロニターゼ発現の誘導と活性の測定（図５、６参照）
添付文書に従い、pCR T7/CT-TOPOベクターに組込んだ増幅産物の発現を誘導した。
1）BL21(DE3)pLysS細胞にトランスフォーメーションした単一コロニーをピックアップし、一部をアンピシリン100μg/mlを含有するLB brothに植菌し、OD600nmの値が0.5になるまで培養した。
2）LB brothに最終濃度が 1mMになるようにIPTGを添加し、β-グルクロニターゼの発現を誘導した。
3）LB brothをさらに4〜6時間培養後、12,000×gで2分遠心した上清200μlを吸光度の測定が可能なマイクロプレートに移した。
4）最終濃度が3.2mMになるようにp-ニトロフェニル-β-D-グルクロニドを添加し、37℃で10分間インキュベートした。
5）β-グルクロニターゼ活性をOD415nmで測定した。
6）LB brothの遠心沈渣をSDS-PAGEで展開し、70kDa付近の発現タンパク質バンドを確認した。ベクターへのインサート方向が逆向きに組込まれた場合は70kDa付近の発現タンパク質バンドは確認できず、β-グルクロニターゼ活性は発現に使用した大腸菌のみの活性値となった。
【００４７】
（実験例２）活性測定
大腸菌より抽出したDNAを用いて、本発明に従いβ-グルクロニターゼを発現し、その活性を測定した。
1）uidA遺伝子を増幅させ、pCR T7/CT-TOPOベクターに組込んで得られたクローン１のβ-グルクロニターゼ活性を測定したところ、反応時間 5分間のOD値は1.406、10分間では2.541、15分間では3.000overとなった。未発現の大腸菌BL21(DE3)pLysSのβ-グルクロニターゼ活性を測定したところ、反応時間 5分間のOD値は0.440、10分間では0.973、15分間では1.244であり、β-グルクロニターゼを発現した場合とは優位な差が認められ、発現したβ-グルクロニターゼの活性を測定することが可能であった（図７）。
【００４８】
2）uidA遺伝子を増幅させ、pCR T7/CT-TOPOベクターに組込んで得られたクローン２のβ-グルクロニターゼ活性を測定したところ、反応時間 5分間のOD値は0.890、10分間では1.966、15分間では2.375となった。未発現の大腸菌BL21(DE3)pLysSのβ-グルクロニターゼ活性を測定したところ、反応時間 5分間のOD値は0.236、10分間では0.596、15分間では0.800であり、β-グルクロニターゼを発現した場合とは優位な差が認められ、発現したβ-グルクロニターゼの活性を測定することが可能であった（図７）。
【００４９】
本発明は、結核菌が保有するPZA代謝酵素であるピラジナミダーゼを大腸菌内で人工的に発現させ、その活性の有無を測定することでPZAに対する感受性を迅速に判定する手法を他の酵素活性測定でも応用できることが明らかにされた。さらに、β-グルクロニダーゼを、大腸菌内で人工的に発現させ、その活性の有無を測定することも容易であった。
このことにより、他のあらゆる酵素においても活性を測定することが可能となり、遺伝子変異による活性の低下を迅速に調べることができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上説明したように、菌が保有するタンパク質、例えば酵素を発現細胞で人工的に発現させ、その活性、即ちタンパク質の機能の有無を測定することで、薬剤に対する感受性を迅速に判定することができることが確認された。
具体的には、結核菌が保有するPZA代謝酵素であるピラジナミダーゼを大腸菌内で人工的に発現させ、その活性の有無を測定することでPZAに対する感受性を迅速に判定することが可能となった。通常のPZA感受性試験では、分離菌株の状態から判定までに最短でも 4日間を必要とするのに比べ、本発明を用いた場合は 2日で薬剤感受性を判定できる。さらにPCR法を用いることから、菌を分離すること無く喀痰等の臨床検体から直接pncA遺伝子を増幅し、2日で薬剤感受性を判定することが可能である。
また、菌株のクローニングも可能なので、感受性株と耐性株が混在する場合や様々な変異を有した耐性株が混在する場合でも、容易にそれら個々のピラジナミダーゼ活性の低下度合いを測定することができ、薬剤感受性を判定することができる。
他の例であるβ-グルクロニダーゼの活性も迅速に測定しうることが確認されたため、この手法は他の酵素活性測定にも応用できることが明らかにされた。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】ピラジナミダーゼの作用機序を示す図である。（実施例１）
【図２】ピラジナミダーゼ活性測定原理を示す図である。（実施例１）
【図３】ピラジナミダーゼの活性測定方法を示す図である。（実施例１）
【図４】ピラジナミダーゼの活性測定方法を示す図である。（実施例１）
【図５】β−グルクロニダーゼの大腸菌での発現を示す図である。（実施例２）
【図６】β−グルクロニダーゼの活性測定を示す図である。（実施例２）
【図７】β−グルクロニダーゼ活性を示す図である。（実験例２）
【図１】
2004166688.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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