(57)【要約】【課題】甘しょ焼酎蒸留粕から生理活性物質すなわちＤＰＰＨラジカル消去能を有するとともに、特にがん細胞増殖抑制作用を有する物質を製造する。【解決手段】甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌抽出物を作用させ、圧搾ろ過し、得られた液体部分を必要があれば中空糸膜でろ過して精製する。また、麹菌又は麹菌抽出物を甘しょ焼酎蒸留粕に添加しただけではろ過が困難な場合は、麹菌又は麹菌抽出物を添加するとき、さらにセルラーゼ系酵素を添加する。【選択図】          図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させた後、固液分離を行って分離された液体からなることを特徴とするがん細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させた後、固液分離を行って液体を分離することを特徴とするがん細胞増殖抑制剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、甘しょ焼酎蒸留粕から得られた生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本格乙類焼酎の消費の増加が続くなかで、製品量の約２倍量発生する焼酎蒸留粕は、常圧蒸留でＢＯＤ約６００００ｐｐｍ、減圧蒸留でＢＯＤ約１０００００ｐｐｍと高濃度の汚染物質が含まれ、その処理が問題となっている。
【０００３】
焼酎蒸留粕の処理として海洋投棄が規制されている現在、農地還元や肥料化、飼料化などが検討され、一部で実施されている。農地還元では悪臭の発生や地下水の汚染が心配され、肥料化については処理効率が必ずしも十分期待できないという問題があった（例えば、特許文献１参照。）。
また、飼料化に際しては、処理施設や処理経費からみてコスト高が懸念される。（例えば、特許文献２参照。）
【０００４】
ところで焼酎蒸留粕中には、食物繊維類、非発酵性糖類、蛋白質、脂肪等のほか、麹菌・酵母等の菌体、有機酸、ミネラル分、ビタミン類及びポリフェノール等が含まれており、これらの中には生理活性を示す物質の存在が期待される。
【０００５】
また、乙類焼酎蒸留粕のなかで甘しょ焼酎蒸留粕は著しく固液分離が困難なため、その処理が難しかったが、甘しょ焼酎蒸留粕にセルラーゼ系酵素と麹を作用させることで固液分離を容易にする方法が開発された（例えば、特許文献３参照。）。
上記の方法で固液分離された液体部分に特に生理活性物質が存在することが鋭意研究の結果明らかとなり、本発明がなされることとなった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１０−２８７４８５号公報
【特許文献２】
特許第２９７６０７２号公報
【特許文献３】
特願２００２−２２５６２３号明細書
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来、処理が困難とされていた甘しょ焼酎蒸留粕から生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤を得ることを本発明の目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させた後、固液分離を行って分離された液体からなることを特徴とする生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤である。
【０００９】
甘しょ焼酎蒸留粕の固液分離を容易に実施するため、必要な場合はセルラーゼ酵素及び麹菌又は麹菌抽出物を添加するが、固液分離が比較的容易な場合はセルラーゼ系酵素の添加は省略できる。麹菌又は麹菌の抽出物を添加することは、単に固液分離を容易にするだけでなく、甘しょ焼酎蒸留粕中の生理活性物質の増加をもたらす効果が認められたためである。
【００１０】
本発明において用いられる麹菌は、通常焼酎製造に用いられる白麹菌又は黒麹菌が適当である。これらの麹菌はクエン酸生成能力が高く、雑菌汚染に対する抵抗性が大きいからである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の生理活性物質であるがん細胞増殖抑制剤は、甘しょ焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌の抽出物を作用させ、甘しょ焼酎蒸留粕に含まれる生理活性物質を増加させることで得られるものである。生理活性物質の含有量の変化をＤＰＰＨラジカル消去能で検討した。その結果を図１に示した。
【００１２】
ラジカル消去能は安定ラジカルであるＤＰＰＨを用いて測定した。活性はＩＣ５０（ＤＰＰＨの吸光度を５０％減少させるに必要な試料の量）でトロロックス換算により示した。
【００１３】
ラジカル消去能の測定：
（１）サンプル７５μｌ採取
（２）０．１Ｍ  ＭＥＳ溶液（ｐＨ６．０）：添加，０．１Ｍ  ＭＥＳ溶液は０．２Ｍ  ＭＥＳ溶液（ｐＨ６．０）：１００％  ＥｔＯＨ＝１：１混合して調製する。
（３）７５μｌＤＰＰＨ溶液  添加
３．９４ｍｇＤＰＰＨを５０％ＥｔＯＨ２５ｍｌに溶解
（４）撹拌（２分間）
（５）ＯＤ５２０測定
【００１４】
ポリフェノール含量の測定：フォーリン・チオカルトウ法により測定した。
【００１５】
サツマイモもろみ酢（甘しょ焼酎蒸留粕を酵素と２０％麹を添加して処理したもの）と、その原料である焼酎粕液（甘しょ焼酎蒸留粕を酵素処理した液）を前記の方法でラジカル消去能を測定し、その結果を図１に示した。
焼酎粕液及びもろみ酢のラジカル消去能（ＩＣ５０）はそれぞれ３．９，４．３でもろみ酢が焼酎粕液より明らかに高い値を示した。
【００１６】
サツマイモもろみ酢と前記焼酎粕液のポリフェノール含量の測定結果を図２に示した。焼酎粕液は約７７ｍｇ（クロロゲン酸相当／１００ｍｌ）でもろみ酢は約１３４ｍｇ（クロロゲン酸相当／１００ｍｌ）であり、焼酎粕液に麹を添加して処理することにより、ポリフェノール含量が約１．７倍ほど増加することを示している。
【００１７】
甘しょ焼酎蒸留粕を麹菌又は麹菌の抽出物で処理することで生理活性物質の含量が増加する可能性が前記ラジカル消去能やポリフェノール含量の測定で十分推測されたので、サツマイモもろみ酢のがん細胞増殖抑制機能を解析することとし、がん細胞増殖の測定を行った。
【００１８】
サツマイモもろみ酢によるがん細胞の増殖抑制効果は、ヒト急性前骨髄性白血病がん細胞（ＨＬ−６０）を用いてＭＴＴアッセイで検討した。また、対照細胞群としてマウス正常皮膚由来細胞（ＪＢ６）を用いた。ＭＴＴ（３−Ｃ４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２ｙｌ）−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）は帯黄色の化合物で、生細胞のミトコンドリアの呼吸鎖に作用し、存在する酵素によってテトラゾリウム環が開裂し、青色のフオルマザンを生成する。この生成量は細胞数とほぼ比例関係にあり、フオルマザンは酸性イソプロパノールにより分解し、呈色するので、その比色値を測定し、比較することによって細胞増殖の指標とすることができる。その測定ステップとして、まず細胞を９６−ウエルプレートに分注し、２４時間培養した。その後、各種濃度のサツマイモもろみ酢を添加し、さらに４８時間培養した。サツマイモもろみ酢無添加の細胞をコントロールとした。また、もろみ酢のバックグランドを除去するため、培地のみの９６−ウエルプレートに同量のもろみ酢を添加した。細胞増の測定はＣａｍｉｃｈａｅｌらの方法に従って行った。
【００１９】
急性前骨髄性白血病がん細胞（ＨＬ−６０）の増殖抑制効果は次の細胞生存率（％）＝「（実験区の吸光度−サンプルの吸光度）／コントロールの吸光度」×１００で表した。その結果を図３に示した。
【００２０】
図３によると、ＨＬ−６０細胞に各種濃度のサツマイモもろみ酢を添加し、４８時間培養後の測定結果は、０．２５，０．５，０．７５および１．００ｍｇ／ｍｌの添加ではＨＬ−６０の生存率は無添加のコントロール（１００％）に対して、それぞれ９６．０％，６９．５％，３０．６％及び１９．６％となった。これらの結果、サツマイモもろみ酢には、がん細胞増殖を抑制する成分が存在することがわかった。
【００２１】
同様の方法でサツマイモもろみ酢を正常皮膚細胞（ＪＢ６）に添加し、４８時間培養後、細胞生存率を測定した。その結果を図４に示す。０．２５，０．５，０．７５及び１．００ｍｇ／ｍｌの添加ではＪＢ６細胞の生存率は、無添加のコントロール（１００％）に対して、それぞれ９７．７％，８７．４％，８５．１％及び７２．２％であった。これらの結果は、サツマイモもろみ酢は正常細胞の増殖にはほとんど影響を与えないことがわかった。
【００２２】
抗がん能実験：抗がん能は、マウスにマウスの腹水がん細胞（サルコーマ１８０）を皮下投与し、同時にサツマイモもろみ酢を経口投与してサルコーマ１８０による腫瘍組織重量の増殖抑制効果で検討した。また、上記の実験に用いたマウス脾臓中のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を測定し、生体防御能の亢進と腫瘍組織の増殖抑制との関連を検討した。
【００２３】
マウスの腹水がん細胞１８０の準備：腹水がん細胞サルマーユ１８０をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ，雄、５週令）の腹腔に注入し、約２〜３週間飼育すると、注入されたサルコーマは増殖を開始し、多量の腹水が溜まってくる。かなり溜まった時点で腹水を抜き取る。この中に多量のサルコーマ細胞が存在する。得られた腹水は多量の血液を含むので、低調緩衝液中で赤血球を除去し、さらにサルコーマ細胞密度を計測する。
【００２４】
サルコーマ１８０の皮下投与：マウス（Ｂａｌｂ／ｃ，雄、６週令）にサルコーマ１８０（５×１０６／マウス）を腰部に皮下投与する。その後、サツマイモもろみ酢５％を含む精製飼料で２０日間飼育し、腫瘍重量を測定した。
また、脾臓をとり、ＮＫを含む脾臓細胞を集め、ＮＫ活性測定試料とした。
【００２５】
脾臓ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性の測定：
（１）脾細胞の調製：Ｂａｌｂ／ｃマウスの実験飼料投与期間終了の翌日に頚椎脱臼し、脾臓を採取する。ハンクス液を入れたディッシュ中で周囲結合組織を除く。はさみで細切し、ＲＰＭＩ１６４０培地を加えながらスチールメッシュを通し、細胞の浮遊液を得る。さらに細かいメッシュを通し組織片を除く。細胞浮遊液を遠沈（１５０×ｇ，５分）して細胞を集め、２ｍｌの０．１４４Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ−０．０１７Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）を加えてピペッティングし、赤血球を溶血させる。１５００ｒｐｍ，２分遠心分離し、リンパ球を集める。ＲＰＭＩ１６４０培地を１０ｍｌ加えて洗浄、遠心分離してリンパ球を集める。前記培地を５ｍｌ加え、細胞数を測定する。
【００２６】
得られた脾細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で５×１０６／ｍｌとし、６ｃｍディッシュに４ｍｌずつ分注し、３７℃，５％炭酸ガスで３時間培養する。培養後、細胞浮遊液を回収し、さらにＲＰＭＩ１６４０培地（３７℃）で軽くピペッティングし、浮遊細胞を回収する。これを遠心分離（１５０×ｇ，５分）し、得た細胞をＮＫ細胞を含む非接着性脾リンパ球とした。
【００２７】
培地の調製：ＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ製薬）
使用説明書にもとづいて作製した培地に、Ｌ−グルタミン０．３ｍｇ／ｍｌ，ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ，ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍｌを加え、１０％ＮａＨＣＯ３でｐＨ７．４に調整した。
【００２８】
（２）ＹＡＣ−１細胞（リンパ腫細胞、ターゲット細胞）の調製
ＮＫ細胞（エフェクター細胞）のターゲットとなるＹＡＣ−１細胞（ターゲット細胞）をＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞数を１×１０５／ｍｌに調整する。ＹＡＣ−１は対数増殖期にあるものを使用した。
凍結したＹＡＣ−１を融解し、６ｃｍディッシュに加え、３日後のＹＡＣ−１を試験に用いた。
【００２９】
（３）ＮＫ活性の測定
ＮＫ活性の測定は、障害を受けた細胞の放出するＬａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）をマーカーとする細胞障害性ＥＬＩＳＡアッセイシステム（Ｃｙｔｏｔｏｘ９６，Ｐｒｏｍｅｇａ）による。
【００３０】
９６穴プレート（岩城硝子）にエフェクター細胞として脾細胞１００μｌ分注する。これにＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させたターゲット細胞であるＹＡＣ−１（リンパ腫細胞）１×１０５／ｍｌ，１００μｌずつ分注し、３７℃，５％炭酸ガスインキュベーターで４時間培養する。この時のエフェクター細胞とターゲット細胞の細胞数の比を１００：１，５０：１，３０：１，２０：１，１０：１，５：１に調整する。マイクロプレート用の遠心機で遠沈（２５０×ｇ，４分）し、細胞を沈殿させ、各上清５０μｌを別のプレートに取り、基質混合液を５０μｌずつ添加し、遮光し、室温静置する。３０分後、反応停止液、５０μｌを加え、直ちにＥＬＩＳＡリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定することによりＬＤＨ放出量を算出する。以上の操作は全て無菌的に行った。
【００３１】
前項００２４記載の方法でサツマイモもろみ酢の抗がん能を腫瘍重量の測定によって行った。その結果を図５に示す。
すなわち、マウスにがん細胞を皮下投与し、同時にサツマイモもろみ酢を経口投与して２０日間飼育し、解体し、腫瘍重量を測定した。コントロールとして通常の餌だけを与えた区分と腫瘍重量の比較を行った。サツマイモもろみ酢を与えた区分の腫瘍重量がコントロールに比べて低い結果が得られた。これによりサツマイモもろみ酢に抗がん能を持つ成分が含まれており、腫瘍の増殖抑制が示唆された。
【００３２】
ヒトは腫瘍細胞（がん細胞）が３千〜数千個・日も生じるといわれている。この異常細胞が生き残るとがん組織化する確率が高いといわれている。この異常細胞を早期に見つけて処理しているのがナチュラルキラー細胞と言われるものであり、このナチュラルキラー細胞活性が高く維持されていると、異常細胞の消去が早期に行われ、がん組織化が未然防止されることになる。マイクロプレートでサツマイモもろみ酢を添加した区分とコントロール区分を比較した結果、もろみ酢を添加した区分のＮＫ活性が亢進した結果を図６に示した。
【００３３】
図６に示した結果は、前項００２９，００３０に記載した方法で測定したものである。ＮＫ活性は次式により算出した。
（実験ＬＤＨ放出量−自然放出量）／（最大放出量−自然放出量）×１００％
自然放出量：ターゲット細胞からエフェクタ細胞の作用なしに放出されるＬＤＨ量。
最大放出量：ターゲット細胞中に存在する全ＬＤＨ量。
【００３４】
【実施例１】
甘しょ焼酎蒸留粕からがん細胞増殖抑制剤として使用することができるサツマイモもろみ酢は、次の方法で製造する。ただし、この実施例は単に本発明の説明のため、具体的な態様を説明するものであり、本願の開示する発明の範囲を限定するものではない。
甘しょ焼酎蒸留粕（２０ｋｇ）にセルラーゼ系酵素（甘しょ焼酎蒸留粕に対し０．１重量％：トリコデルマ  ビリデ由来のセルラーゼ，商品名セルロシンＴ２，阪急バイオインダストリー社製造）と米麹４ｋｇを添加し、約３０〜４０℃で少なくとも６時間撹拌しながら可溶化処理を行い、繊維質を分解して、ろ過性を向上させる。
【００３５】
次に、圧搾ろ過機（東洋商会製）を使用して２ｋｇ／ｃｍ２荷重で固液分離した。得られた液体部分はポリスルホン製の中空糸膜で２時間ろ過後、殺菌して、サツマイモもろみ酢とした。
【００３６】
【実施例２】
本発明における麹菌の抽出物は下記の方法で製造した。
すなわち、麹４ｇに酢酸緩衝液（８６ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））２０ｍｌを加え、２０℃で３時間、シェーカーで撹拌・抽出し、上清を０．４５μｍフィルターでろ過して調製した。
【００３７】
【発明の効果】
以上、説明したように本発明によれば、甘しょを原料とする焼酎製造において副成する焼酎蒸留粕に麹菌又は麹菌抽出物を作用させた後、固液分離して得られた液体成分がＤＰＰＨラジカル消去能を有するとともにがん細胞増殖抑制作用を有することが明らかとされたため、甘しょ焼酎蒸留粕の有効利用の途が開かれることとなった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＰＰＨラジカル消去能を示す図である。
【図２】ポリフェノール含量を示す図である。
【図３】もろみ酢のヒト急性前骨髄性白血病細胞（ＨＬ−６０）の増殖抑制効果を示す図である。
【図４】もろみ酢のマウス正常皮膚由来細胞（ＪＢ６）の増殖への影響を示す図である。
【図５】もろみ酢の抗がん能試験の結果を示す図である。
【図６】もろみ酢のＮＫ亢進作用（ＮＫ：ＹＡＣ−１＝１０：１）の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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