(57)【要約】【課題】平板状フローセルと光学系の位置合わせ作業を容易に高精度に行うことができる平板状フローセル測定装置を提供する。【解決手段】（ａ）少なくとも１つの測定部を有する流路を備えた平板状フローセルと、（ｂ）測定部に光ビームを照射する手段と、（ｃ）測定部からの散乱光を検出し、出力する手段と、（ｄ）試料のない状態で（ｃ）からの出力と、平板状フローセルまたは光ビームの位置出力とを関連付けて、平板状フローセルまたは光ビームの移動量を算出して、移動を指示する手段と、（ｅ）（ｄ）からの移動指示に基づいて、平板状フローセルまたは光ビームを移動させる手段を備えた平板状フローセル測定装置。【選択図】　図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの測定部を有する流路を備えた平板状フローセルと、（ｂ）測定部に光ビームを照射する手段と、（ｃ）測定部からの散乱光を検出し、出力する手段と、（ｄ）試料のない状態で（ｃ）からの出力と、平板状フローセルまたは光ビームの位置出力とを関連付けて、平板状フローセルまたは光ビームの、予め指定された位置への移動量を算出して、移動を指示する手段と、（ｅ）（ｄ）からの移動指示に基づいて、平板状フローセルまたは光ビームを移動させる手段を備えた平板状フローセル測定装置。
【請求項２】
平板状フローセルは交換可能である請求項１記載の平板状フローセル測定装置。
【請求項３】
平板状フローセルがシースフローセルである請求項１又は２記載の平板状フローセル測定装置。
【請求項４】
光ビームがレーザー光である請求項１〜３のいずれか１項記載の平板状フローセル測定装置。
【請求項５】
検出器が０．５°以上４５°以下の範囲内の角度の散乱光を測定するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の平板状フローセル測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、平板状フローセル測定装置に関するものであり、特に、光学系と流路の位置合わせ機構を備えた平板状フローセル測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｓｉ、ガラス、樹脂等からなる平板内に微細な流路を備えたマイクロチップ上でさまざまな分析や反応を行うことが近年盛んに研究されている。マイクロチップを用いると、分析、反応等に用いる試薬量が極めて少なくてすみ、低コストのマイクロチップを使い捨てにすることにより、分析、反応等のバッチ間の汚染を防ぐことができる等の特徴がある。
【０００３】
このようなマイクロチップ上で試料を測定する方法として、光学的又は電気的な検出方法が一般に用いられている。特に、光学的検出方法は、高感度で、マイクロチップに対して非接触で測定が行えることから、広く用いられている。光学的検出方法においては、測定のための光ビームを正確にマイクロチップ上の流路に位置合わせしなければならない。特に、シースフローセルを用いて粒子や細胞を１個ずつ分析するフローサイトメーターでは、粒子や細胞の流れの幅は１０〜３０μｍ程度に絞られ、測定精度を上げるために光ビームは数μｍ以下の精度で位置合わせすることが要求される。平板状フローセルを使い捨て使用とする場合、新しいフローセルを装置にセットする毎に位置合わせ作業が必要となり、これを簡単、かつ、正確に行えるようにすることが非常に重要である。
【０００４】
従来、光学系とフローセルの位置合わせ方法として、特開平３−１４６８４８号公報には、光ビームを流路横断方向に走査し、被検部を通過する試料からの信号を検出し、その検出信号が最大となるようにビーム位置を設定する方法が開示されている。
交換可能な平板状フローセルと光学系の位置合わせ方法として、米国特許第５７４８８２７号明細書には、マイクロチップとステージのキネマティック・マウントが用いられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上に述べた特開平３−１４６８４８のように、フローセルに試料を流し、試料に光ビームを照射し、試料からの散乱光等の信号を計測し、信号が最大となるように光ビーム位置を調整する方法では、位置合わせをとるために試料を流さなければならず、微量で貴重な試料には不向きである。また、測定用試料ではなく、調整用に、異なる試料を流すことにより位置合わせ作業を行うこともできるが、試料切り替え時のコンタミの可能性等、フローセルを使い捨てにするメリットが失われてしまう。
【０００６】
米国特許第５７４８８２７号明細書のようなマイクロチップとステージの形状を利用した位置合わせ方法では、位置合わせのためのピンや溝等の構造は一般に機械加工で形成される。その位置精度は通常あまり高くなく、精度を上げると製造コストが高くなる。樹脂製マイクロチップの場合、一体成型で位置合わせのための構造を作成することができるが、成型時の樹脂の膨張・収縮等の影響で数μｍレベルの精度を達成することは困難である。
【０００７】
このように、従来技術は、調整の容易性やコストの面で十分ではなく、特に、交換可能な平板状フローセルを用い、頻繁に位置合わせ作業が必要となる平板状フローセル測定装置において、改善が望まれていた。
本発明は、このような問題点を解決し、高精度の位置合わせ作業を容易に行うことができる平板状フローセル測定装置を提供することを目的としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記の課題を解決するため、新たな位置合わせ装置を検討した結果、平板状フローセルにおいて、マイクロ流路壁からの散乱光を測定することにより流路位置を知ることができ、その情報から正確な位置合わせが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）　（ａ）少なくとも１つの測定部を有する流路を備えた平板状フローセルと、（ｂ）測定部に光ビームを照射する手段と、（ｃ）測定部からの散乱光を検出し、出力する手段と、（ｄ）試料のない状態で（ｃ）からの出力と、平板状フローセルまたは光ビームの位置出力とを関連付けて、平板状フローセルまたは光ビームの、予め指定された位置への移動量を算出して、移動を指示する手段と、（ｅ）（ｄ）からの移動指示に基づいて、平板状フローセルまたは光ビームを移動させる手段を備えた平板状フローセル測定装置。
（２）　平板状フローセルが交換可能である（１）に記載の平板状フローセル測定装置。
（３）　平板状フローセルはシースフローセルである（１）又は（２）に記載の平板状フローセル測定装置。
（４）　光ビームがレーザー光である（１）〜（３）のいずれか１つに記載の平板状フローセル測定装置。
（５）　検出器が０．５°以上４５°以下の範囲内の角度の散乱光を測定するものである請求項（１）〜（４）のいずれか１つに記載の平板状フローセル測定装置。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を図面を参照しながら説明する。
本発明の平板状フローセル測定装置の１例を図１に示す。図１において、測定部に光を照射する手段は、光源２２及びレンズ郡２３で構成されている。光源２２より出た光ビーム３２は、レンズ群２３により集光され、光ビームを透過させるための開口部を持った電動マイクロステージ３３上の平板状フローセル１を照射する。
【００１０】
平板状フローセル１は、後で図２により詳細に説明するように、少なくとも１つの測定部を有する流路を備えている。
光源２２は、高出力でコヒーレンシーの高いレーザーが望ましいが、その他の光源でもよい。平板状フローセルは、ガラスや透明樹脂等で作成することができる。平板状フローセル内を流れる試料に光ビームがあたると、試料から散乱光や蛍光が発生する。試料がない場合でも、フローセル自身から弱い散乱光が生じている。
【００１１】
散乱光又は蛍光３３は、レンズ２５によりコリメートされ、ビームスプリッター２６により２つの光路に分かれる。１方は、レンズ２７により集光され、光センサー２８に導かれ、前方散乱光が測定される。他方は、光学フィルター２９で必要な波長の光のみ透過させ、レンズ３０により集光され光センサー３１に導かれ、蛍光測定に用いられる。
図１において、測定部からの散乱光を検出し出力する手段は、レンズ２５、ビームスプリッター２６、レンズ２７、光センサー２８で構成されている。レンズ２５の手前にアパーチャー２４を置くことにより、平板状フローセルを透過したレーザー光をカットし、光センサー２８に入射する散乱光角度を規定する。図７は、アパーチャー２４の一例の正面図である。円ａの大きさで検出器に入射する最小の散乱光角度を規定し、円ｂの大きさで検出器に入射する最大の散乱光角度を規定している。
【００１２】
光センサー２８、２９からの出力信号は、増幅器３４で増幅され、ＡＤ変換器３５でデジタル変換されてパーソナルコンピューター３６でデータ収録、信号処理・制御が行われる。
このような装置において、光ビームと平板状フローセルの測定部との位置合わせをとる方法について説明する。
平板状フローセルのデザインにより流路中の最適測定位置は決まっており、予め、パーソナルコンピューター３６にその位置座標を入力しておく。電動マイクロステージを矢印Ａに示したように流路の流れに垂直方向に移動させて、試料が流れていない状態で散乱光の測定を行う。電動マイクロステージ３３は、パーソナルコンピューター３６の移動指示に基づいて，ステージコントローラ３７を介して移動させられる。電動マイクロステージの代わりに、ガルバノ・ミラー等を用いて光ビームを走査してもよい。パーソナルコンピューター３６は、ステージ位置と光センサー２８からの出力信号とを関連付けて、両者を対応付けられながら記録すると共に、平板状フローセルの、予め指定された位置への移動量を算出して、電動マイクロステージ３３の移動を指示する。
【００１３】
先に述べたように、試料がなくても、平板状フローセルの部材自身や流路の壁面のわずかな荒れ等から散乱光が生じている。特に、流路側壁で強く散乱される。流路横断方向の散乱光強度変化を見ると、２つの流路側壁に対応する位置に散乱光強度の極大点がそれぞれ現れる。この測定結果から、パーソナルコンピューター３６により、ソフトウエア処理により極大点位置を計算することによって、光ビームを基準とした流路の位置座標が求まる。その情報から、流路中の適切な位置、通常は流路中央に光ビームがくるよう、必要なステージ移動量を計算し、パーソナルコンピューター３６からステージコントローラー３７を制御して、電動マイクロステージ３３を所定量駆動する。このような操作により、光ビームと平板状フローセルの位置合わせをとることができる。
【００１４】
散乱光の測定角度は０．５°から４５°の範囲が好ましい。測定角度が０．５°未満になると、透過光と散乱光の切り分けが難しくなり、４５°を越えると、流路側壁に由来する散乱信号が弱くなり、極大点の検出が難しくなる。
本発明は、平板状フローセルが使い捨てで新しいフローセルをセットする毎に位置合わせ作業をしなければならない場合、特に効果的である。また、流路内の所定の位置に高精度に位置合わせすることができる。例えば、平板状フローセルがシースフローセルの場合、フローセルの中心を流れる細い試料流に光ビームを正確に位置合わせさせる必要がある。また、光ビームがレーザー光の場合、その強度分布はガウシアン分布をもつので、ビームの中心を正確に測定対象に合わせる必要がある。本発明によれば、このような用途で数μｍ以下の精度を容易に実現できる。
【００１５】
本発明の、平板状フローセルについて説明する。
図２は、平板状シースフローセルの構造及び送液機構を示す斜視図である。平板状フローセルは、透明アクリル樹脂で作成されており、細胞や粒子を含む試料液を収納する試料液ポート２とシース液を収納するシース液ポート３、４を備え、各ポートは平板内に形成されている流路５、６、７にそれぞれ接続している。流路５，６、７は、合流点８で試料液がシース液に両側から挟まれるように合流し、流路９に接続している。流路９の末端は、廃液ポート１０に接続している。
【００１６】
試料液ポート２、シース液ポート３、４の開口部はカップラー１１で覆われ、カップラー１１と平板状フローセル１の間は、気密が保たれている。カップラー１１は、チューブ１２を介して、陽圧源に接続している。カップラー１１に陽圧がかかることにより、試料ポート２、シース液ポート３、４の液が流路中へと押し流される。
図２の平板状フローセルの合流部の流れの様子を図３に示す。合流部で液流れは層流となるような流速で流され、試料液１３、シース液１４，１５は、図に示すように層状に流れ、試料液の流れは縮流される。流路９における試料液とシース液の流量比は、カップラー１１にかけられる圧力によらず、流路５、６、７の圧力損失の比、すなわち、流路形状とそこを流れる液の粘度で決まる。圧力損失を適当に設計することにより、試料流が流路の中央を安定して流れるようにしている。
【００１７】
平板状シースフローセルの作成方法を図４にしたがって説明する。図４の各図は断面を表している。工程（Ａ）において、フォトマスク１６上の流路パターンをフォトリソグラフィー工程でＳｉ基板１８上の感光性レジスト１７に転写する。続いて、工程（Ｂ）に示すように、感光性レジスト１７の未感光のレジスト部を除去し、次いで、Ｓｉ基板１８のエッチングを行って、流路パターンの溝３８をＳｉ基板１８上に形成する。流路パターンの溝３８は、図２における、流路５，６，７，８，９に該当するものである。
【００１８】
次に、工程（Ｃ）において、Ｓｉ基板１８上にＮｉを電鋳し、流路パターンが凸状になったＮｉプレート１９を作成する。その後、Ｓｉ基板１８とＮｉプレート１９を分離する。工程（Ｄ）において、Ｎｉプレート１９を型として透明樹脂基板２０を熱圧縮成形することにより、流路パターンの溝３８を透明樹脂基板上に転写する。工程（Ｅ）において、透明樹脂基板２０の液ポート３９となる部分を穴あけ加工し、流路パターンが形成されている面に別の樹脂基板２１を貼り合わせることにより、工程（Ｆ）に示すような平板状シースフローセルを作成する。なお、工程（Ｆ）の図は、工程（Ｅ）の状態から反転した形で表示している。液ポート３９は、図２の試料ポート２、シース液ポート３、４、廃液ポート１０に該当するものである。
【００１９】
【実施例１】
図１の光散乱測定装置により、平板状シースフローセルの前方散乱光の測定を行った。
フローセルの流路内はシースバッファーで満たされているが、試料を流していない状態で、光ビームが測定部の流路を横断するように電動マイクロステージを駆動し、前方散乱信号を測定した。光源にはレーザーを使用し、前方散乱受光器は２°〜８°の範囲の散乱光を受光するように設置した。パーソナルコンピューター３６に記録された信号強度とステージ位置座標、すなわち、フローセル位置の関係を図５に示す。このチャート上で、２つの極大点ａ及びｂが現れ、その位置は流路側壁の位置に一致していた。
【００２０】
前に述べたように、図２のシースフローセルは、その流路形状と送液方法により、常に試料流が合流部において、その中央を流れるようになっているので、流路の位置がわかれば、試料を直接測定しなくても、流路の中心に光ビームがくるように平板状フローセルを移動させることにより、光ビームを試料流に正確に位置合わせさせることができ、精度の高い測定が可能となる。
図５の２つの極大点の中心ｃに光ビームの中心がくるように、電動マイクロステージを駆動し、その位置で今度は、市販のフローサイトメーター調整用標準ビーズ（ポリスチレン製、粒径６μｍ）を流し、ビーズの散乱信号を測定した。その測定結果を図６に示す。図６から、従来のように標準ビーズの測定信号を見ながら位置合わせを合わせた時とほぼ同じ信号強度及び低分散の良好なデータが得られることがわかる。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の平板状フローセル測定装置は、光ビームの照射位置を流路の横断方向に移動させながら、試料の流れていない平板状フローセルの散乱光を測定することにより、流路の側壁位置を知ることができ、その情報から光ビームを流路中央に正確に位置合わせすることができる。
本発明によると、従来の技術に比べて、調整用の試料を必要とせず、安価な使い捨てフローセルに対して、容易に再現性よく、高精度の位置合わせ作業を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の平板状フローセル測定装置の一例の配置図。
【図２】本発明に用いる平板状シースフローセルと送液機構の一例を示す斜視図。
【図３】本発明のシースフローセルの合流部の流れの平面模式図。
【図４】本発明の平板状シースフローセルの作成の一例を示す工程図。
【図５】実施例の、試料を流さない状態でのフローセルからの散乱信号と測定位置の関係を示すグラフ。
【図６】実施例における、標準ビーズの散乱信号のヒストグラム。
【図７】図１のアパーチャーの一例を示す正面図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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