(57)【要約】【課題】パルスジェネレータを必要とせず定電圧電源のみを用いた簡便なシステムにおいて，標的細胞に対して印加される電場をできるだけ均一にすることが可能なエレクトロポレーションを行うこと。【解決手段】流路１５から１６の方向へ標的細胞および目的導入物質の懸濁液を流すと同時に，電極１２および１３に対して直流電圧を印加することによって電極１２および１３の間の流路内に定電場を形成し，電極１２および１３の間を流れていく標的細胞に対して矩形波のパルス電場を印加する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の方向に延長される流体流路を形成する管と，前記流路壁あるいは前記流路内部において前記流路の方向に対し一定の間隔を置いて存在する複数の電極を有し，これらの電極に対して直流電圧を印加することによって前記流路内の一部区間に流路の延長方向に勾配を有する電場を形成する手段を備えたことを特徴とする流通型エレクトロポレーション用電極装置，および，それを用いた細胞への物質導入方法。
【請求項２】
請求項１に記載の前記電極間に絶縁体からなるスペーサーを備え，請求項１に記載の前記管，前記電極，前記スペーサー，前記電極，前記管を順につないで密着させるとともに固定化する支持体を有することを特徴とする，請求項１に記載の装置。
【請求項３】
請求項２に記載の前記管の一部あるいは全体が導体で構成され，かつ前記管の導体部分と請求項２に記載の前記電極が接している構造を有し，前記管と電源を接続することにより前記電極に電圧が印加され，前記電極間にのみ電場を形成する手段を備えたことを特徴とする，請求項２に記載の装置。
【請求項４】
請求項３に記載の前記管が請求項３に記載の前記電極を兼ねている構造を有する，請求項３に記載の装置。
【請求項５】
微小径の貫通孔を多数もつ平板導体を請求項１に記載の前記流路の伸長方向に対して垂直に，流路の断面をすべて覆う状態で複数設置したものを請求項２，請求項３のいずれか一項に記載の前記電極として用いることにより，前記電極間における電場の均一化および流体の整流化を可能とすることを特徴とする，請求項２，請求項３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
請求項２に記載の前記スペーサーの幅，請求項１に記載の前記印加電圧，請求項１に記載の前記標的細胞および目的導入物質懸濁液の流速，請求項２，請求項３，請求項４，請求項５のいずれか一項に記載の前記電極の数のいずれかあるいはすべてを変化させることにより，請求項１に記載の前記矩形波パルス電場の強度，パルス幅およびパルスの印加回数を制御可能であることを特徴とする，請求項２，請求項３，請求項４，請求項５のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は細胞に対する物質の導入に際して用いる装置に関するものであり，さらに詳しくはエレクトロポレーションに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に細胞に対して物質を導入する手法としては，マイクロインジェクション法・エレクトロポレーション法・パーティクルガン法といった物理的手法，リン酸カルシウム法・リポフェクション法といった化学的手法，レトロウィルス・アデノウィルスといったウィルスベクターを利用した生物的手法がある。
【０００３】
しかしマイクロインジェクション法・エレクトロポレーション法・リポフェクション法を除く手法では遺伝子以外の物質を導入することはできず，マイクロインジェクション法は操作が困難，リポフェクション法は導入効率が低いといった問題点がある。
【０００４】
またエレクトロポレーション法は遺伝子以外の物質も導入することができる上，簡便で再現性が高いという利点がある一方で，高価なパルスジェネレータが必要，装置の発熱による細胞に対する悪影響，目的物質導入のための最適条件の検討が煩雑といった問題点がある。
【０００５】
さらに微小チャネル内で電極間に細胞を流しながら前記電極間に電圧を印加することにより細胞の形質転換を可能とする流通型エレクトロポレーション法があるが，この方法はパルスジェネレータが不要であり，界面−体積比が大きいために発熱の影響が軽減されるといった利点がある一方で，印加される電場やサンプルの流速が不均一であり，また微小チャネルに電気分解によって生じる気泡がサンプルの流れを阻害するといった問題点がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記のような従来技術の問題点に鑑みて，パルスジェネレータを必要とせず，定電圧電源のみを用いた簡便なシステムでのエレクトロポレーションを可能とする流通型エレクトロポレーション用電極装置を提供することを目的とするものである。
【０００７】
また，本発明は細胞に対して印加される電場やサンプルの流速が均一である流通型エレクトロポレーション用電極装置を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明のうち請求項１に記載の発明は，所定の方向に延長される流体流路を形成する管と，前記流路壁あるいは前記流路内部において前記流路の方向に対し一定の間隔を置いて存在する複数の電極を有し，前記流路に標的細胞および目的導入物質の懸濁液を流すと同時に，前記電極に対して直流電圧を印加することによって前記流路の延長方向に対して平行な電場を前記流路内に形成し，前記流路を流れていく前記標的細胞に対して矩形波のパルス電場を印加する手段を備えたことを特徴とする，流通型エレクトロポレーション用電極装置，を提供するものである。
【０００９】
したがって本発明のうちの請求項１に記載の発明によれば，直流電圧を印加することによって標的細胞に対してパルス電場を印加することができるため，パルスジェネレータを必要とせずに定電圧電源のみを電源として用いることによってエレクトロポレーションによる細胞への物質導入が可能となる。
【００１０】
ここで標的細胞としては，細菌，酵母，真菌，動物細胞あるいは植物細胞などがあるが，これらがすべてではなく，またこれらに限定されるものではない。また導入する物質としては，核酸，アミノ酸，ポリペプチド，蛋白質，あるいは薬剤などが挙げられるが，これらがすべてではなく，またこれらに限定されるものではない。
【００１１】
また本発明のうち請求項２に記載の発明は，前記電極間に絶縁体からなるスペーサーを備え，前記管，前記電極，前記スペーサー，前記電極，前記管を順につないで密着させるとともに固定化する支持体を有することを特徴とする，請求項１に記載の流通型エレクトロポレーション用電極装置，を提供するものである。
【００１２】
したがって本発明のうちの請求項２に記載の発明によれば，前記スペーサーの厚さを変更するによって前記電極間距離を自由に決定することが可能となる。
【００１３】
ここでスペーサーとは，前記流体が流れることのできるだけの貫通孔をもち，表面が絶縁体で構成されたものであればいかなるものでも良い。具体的には，例えばリング状のポリスチレンなどを使用することができる。
【００１４】
また本発明のうち請求項３に記載の発明は，前記管の一部あるいは全体が導体で構成され，かつ前記管の導体部分と前記電極が接している構造を有し，前記管と電源を接続することにより前記電極に電圧が印加され，前記電極間にのみ電場を形成する手段を備えたことを特徴とする，請求項２に記載の流通型エレクトロポレーション用電極装置，を提供するものである。
【００１５】
したがって本発明のうちの請求項３に記載の発明によれば，前記電極に直接電源を繋ぐことなく前記電極間に電場を形成可能となる。
【００１６】
また本発明のうち請求項４に記載の発明は，前記管が前記電極を兼ねている構造を有する，請求項３に記載の流通型エレクトロポレーション用電極装置，を提供するものである。
【００１７】
したがって本発明のうちの請求項４に記載の発明によれば，前記管，前記スペーサー，前記管を順につないで密着させるとともに前記支持体によって固定化することにより，前記管の間に電場を形成可能となる。
【００１８】
また本発明のうち請求項５に記載の発明は，微小径の貫通孔を多数もつ平板導体を前記流路の伸長方向に対して垂直に，流路の断面をすべて覆う状態で複数設置したものを前記電極として用いることにより，前記電極間における電場の均一化および流体の整流化を可能とすることを特徴とする，請求項２，請求項３のいずれか一項に記載の流通型エレクトロポレーション用電極装置，を提供するものである。
【００１９】
したがって本発明のうちの請求項５に記載の発明によれば，前記電極間において印加される定電場や前記流路を流れる流体の流速の乱れを抑制し，前記標的細胞に対して印加される前記矩形波パルス電場の強度やパルス幅を均一にすることが可能となる。
【００２０】
ここで微小径の貫通孔を多数もつ平板導体とは，前記標的細胞が通過するのに十分な大きさの貫通孔を多数もち，表面が導体で構成された平板なものであればいかなるものを用いても良い。
【００２１】
また本発明のうち請求項６に記載の発明は，前記スペーサーの幅，前記印加電圧，前記標的細胞および目的導入物質懸濁液の流速，前記電極の数のいずれかあるいはすべてを変化させることにより，前記矩形波パルス電場の強度，パルス幅およびパルスの印加回数を制御可能であることを特徴とする，請求項２，請求項３，請求項４，請求項５のいずれか一項に記載の流通型エレクトロポレーション用電極装置，を提供するものである。
【００２２】
【発明の効果】
上記のように構成された本発明の流通型エレクトロポレーション用装置によれば，直流定電圧を印加することによって標的細胞に対してパルス電場を印加することができるため，パルスジェネレータを必要とせずに定電圧電源のみを電源として用いることによってエレクトロポレーションによる細胞への物質導入が可能となる。
【００２３】
なお，微小径の貫通孔を多数もつ平板導体を前記流路の伸長方向に対して垂直に，前記流路の断面をすべて覆う状態で複数設置したものを前記電極として用いたときは，前記電極間において印加される定電場や前記流路を流れる流体の流速の乱れを抑制し，前記標的細胞に対して印加される前記矩形波パルス電場の強度やパルス幅を均一にする効果がある。
【００２４】
【発明の実施の形態】
図１には本発明の一実施の形態による流通型エレクトロポレーション用電極装置が示されており，図１（ａ）は装置の電極近傍を示す分解斜視図であり，図１（ｂ）は装置の電極近傍を示す斜視図であり，図１（ｃ）は図１（ｂ）における部分Ｃの拡大断面図である。
【００２５】
この流通型エレクトロポレーション用電極装置は，標的細胞及び目的導入物質の懸濁液が流れるための流路１５および１６を構成する管１０および１１と，微小径の貫通孔を持つ電極１２および１３と，絶縁体からなるスペーサー１４と，これらを固定化する支持体２０によって構成されている。
【００２６】
管１０，電極１２，スペーサー１４，電極１３，管１１は順に密着してつながっており，支持体２０はこれらを覆う形で全体を固定している。標的細胞及び目的導入物質の懸濁液は管１０が構成する流路１５，電極１２の貫通孔１７，スペーサー１４の貫通孔１９，電極１３の貫通孔１８，管１１が構成する流路１６を順に流れる。
【００２７】
直流電源２３と管１０は導線２１で接続されており，直流電源２３と管１１は導線２２で接続されている。管１０は電極１２と電気的に接続されており，管１１は電極１３と電気的に接続されているため，直流電源２３によって直流電圧を印加すると電極１２と電極１３の間，すなわちスペーサー１４の貫通孔１９が構成する流路内に定電場が形成される。
【００２８】
流路内に導入された標的細胞および目的導入物質の懸濁液は，スペーサー１４の貫通孔１９において形成された定電場を通過する際に，直流電源２３の印加電圧を電極１２と電極１３の間隔，すなわちスペーサー１４の厚さで割ったものを電場強度，スペーサー１４の貫通孔１９が構成する流路における滞留時間をパルス幅とした矩形波パルス電場を受けることになる。この矩形波パルス電場により標的細胞に対するエレクトロポレーションがなされ，目的物質が標的細胞へ導入される。
【００２９】
電極１２の貫通孔１７および電極１３の貫通孔１８は微小で電極１２および１３の表面全体に多数存在しており，また電極１２および１３は流路１５および１６の延長方向に対して垂直に，流路１５および１６の断面をすべて覆う状態で設置されている。このため，スペーサー１４の貫通孔１９が構成する流路において印加される定電場や流路を流れる流体の流速の乱れが抑制され，標的細胞に対して印加される矩形波パルス電場の強度やパルス幅が均一となる。
【００３０】
【実施例】
管１０，電極１２，スペーサー１４，電極１３，管１１を順につなげ，支持体２０によってこれらを密着させると共に固定化した。管１０および１１として外径２．１ｍｍ，内径１．５ｍｍのステンレスキャピラリーを，電極１２および１３として１００ｍｅｓｈのステンレスメッシュを，スペーサー１４として内径１．５ｍｍの単一貫通孔をもつ厚さ１１０μｍのポリスチレン製のリングを，支持体２０として外径３．０ｍｍ，内径２．０ｍｍのシリコンチューブをそれぞれ用いた。
【００３１】
更に流路１５および１６内を流れる流体が管１０および１１と支持体２０の間から漏れるのを防ぐために，支持体２０の端と管１０および１１が表面に露出している箇所をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）によってシールした。さらに作製した装置をより強固に固定化するために，支持体２０をＰＤＭＳによってスライドガラス上に固定化した。管１０および１１の電極の反対側の端はシリコンチューブを介してテフロンチューブと接続し，管１０と接続したテフロンチューブの反対側にはシリコンチューブを介してシリンジを接続した。シリコンチューブと管１０および１１の境界もＰＤＭＳによってシールした。
【００３２】
標的細胞としてはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α，目的導入物質としてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＳＫ＋を用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αは液体ＬＢ培地中でＯＤ６００＝０．５−０．６程度に培養したものを５００倍に濃縮し，オートクレーブ滅菌した１０％グリセロール水溶液にて懸濁した。細胞濃度は１０１０／ｍｌ程度であった。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋は終濃度５ｎｇ／ｍｌ程度になるように細胞懸濁液に加えた。
【００３３】
標的細胞および目的導入物質の懸濁液はシリンジからシリンジポンプによって送液して装置内の流路を通した後，管１１と接続したテフロンチューブの反対側に予め設置した液体ＬＢ培地にて回収した。直流電源２３によって印加した電圧は２００Ｖであり，標的細胞および目的導入物質の懸濁液の流速は３．８９ｍｌ／ｍｉｎであった。すなわち標的細胞に対して印加されたパルス電場強度は１．８ｋＶ／ｍｍ，パルス幅は３．０ｍｓであった。なお，電圧をかけて標的細胞および目的導入物質の懸濁液を導入する際には電極装置全体を氷上に設置して０℃程度の温度になるようにした状態で行った。
【００３４】
標的細胞および目的導入物質の懸濁液は，回収後液体ＬＢ培地上で３７℃にて１時間インキュベートした後，アンピシリンを終濃度５０μｇ／ｍｌになるように加えた固体ＬＢ培地上で３７℃にて１日インキュベートした。インキュベート後に発生した形質転換体のコロニー数から，１μｇのプラスミドＤＮＡあたり３．０ｘ１０７の形質転換体が得られたことが計算された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態による流通型エレクトロポレーション用電極装置を示す。図１（ａ）は装置の電極近傍を示す分解斜視図であり，図１（ｂ）は装置の電極近傍を示す斜視図であり，図１（ｃ）は図１（ｂ）における部分Ｃの拡大断面図である。
【符号の説明】
１０  管
１１  管
１２  電極
１３  電極
１４  スペーサー
１５  流路
１６  流路
１７  電極１２の貫通孔
１８  電極１３の貫通孔
１９  スペーサー１４の貫通孔
２０  支持体
２１  導線
２２  導線
２３  直流電源
【図１】
2004248653.tif 000003