(57)【要約】【課題】煩雑な処理を必要とせず、かつ、擬陽性等の不確定要因を考慮して精度の向上を図り得る微生物検出方法及び装置を提供する。【解決手段】検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉するステップと、捕捉された固形物を固定化プレート上に固定するステップと、検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体を固定化プレート上の固形物に接触させるステップと、染色された固形物を判別するための光を照射して二次元画像を得るステップと、検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、標識抗体と異なる標識をした核酸プローブを用いたｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するステップと、二本鎖が形成された固形物を判別するための光を照射して二次元画像を得るステップと、２つの二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識するステップとを備える。【選択図】　図１
2004101360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出方法において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉するステップと、
捕捉された前記固形物を固定化プレート上に固定するステップと、
前記検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体を前記固定化プレート上の前記固形物に接触させるステップと、
染色された前記固形物を判別するために発光もしくは蛍光による二次元画像を得るステップと、
前記検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、前記標識抗体と異なる標識をした核酸プローブを用いたｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するステップと、
二本鎖が形成された前記固形物を判別するために発光もしくは蛍光による二次元画像を得るステップと、
前記２つの二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識するステップと、
を備えたことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項２】
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出方法において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉するステップと、
前記固形物と、前記検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体と、前記検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、前記標識抗体と異なる標識をした核酸プローブとを液相中で接触させて複合体を形成するステップと、
前記複合体を固定化プレート上に固定するステップと、
前記標識抗体により染色された前記固形物を判別するために、前記固定プレート上に発光もしくは蛍光により第１の二次元画像を得るステップと、
前記核酸プローブにより二本鎖が形成された前記固形物を判別するために前記固定プレート上に発光もしくは蛍光により第２の二次元画像を得るステップと、前記第１及び第２の二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識するステップと、
を備えたことを特徴とする微生物検出方法。
【請求項３】
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出装置において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉する手段と、
捕捉された前記固形物を固定化プレート上に固定する手段と、
前記検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体を前記固定化プレート上の前記固形物に接触させる手段と、
染色された前記固形物を判別するため発光もしくは蛍光による二次元画像を得る手段と、
前記検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、前記標識抗体と異なる標識をした核酸プローブを用いたｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成する手段と、
二本鎖が形成された前記固形物を判別するために発光もしくは蛍光による二次元画像を得る手段と、
前記２つの二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識する手段と、
を備えたことを特徴とする微生物検出装置。
【請求項４】
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出装置において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉する手段と、
前記固形物と、前記検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体と、前記検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、前記標識抗体と異なる標識をした核酸プローブとを液相中で接触させて複合体を形成する手段と、
前記複合体を固定化プレート上に固定する手段と、
前記標識抗体により染色された前記固形物を判別するため発光もしくは蛍光による第１の二次元画像を得る手段と、
前記核酸プローブにより二本鎖が形成された前記固形物を判別するために、前記固定プレート上に発光もしくは蛍光により第２の二次元画像を得る手段と、
前記第１及び第２の二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識する手段と、
を備えたことを特徴とする微生物検出装置。
【請求項５】
認識した対象微生物の映像を観察者に提示するための画像表示手段を備え、観察者による形状的認証を可能にしたことを特徴とする請求項３又は４に記載の微生物検出装置。
【請求項６】
前記ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検出対象核酸として、検出対象微生物内に含まれるｒＲＮＡを対象とすることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【請求項７】
前記ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検出対象核酸として、検出対象生物の特異的配列を含む核酸を対象とすることを特徴とする請求項３乃至５のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【請求項８】
前記固定化プレートとして生物濾過に使用されるメンブランフィルタを用いることを特徴とする請求項３乃至７のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【請求項９】
前記検出対象微生物がクリプトスポリジウム等の原虫類であることを特徴とする請求項３乃至８のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【請求項１０】
前記検出対象微生物を特異的に染色するために用いる標識抗体、及び核酸プローブは、複数を使用して検出することを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の微生物検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、浄水場原水、浄水水処理後の水道水、ダムや湖沼等の水源池水、地下水等に含まれている微生物検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
浄水場では浄水処理工程において、原水中に含まれる微生物を凝集沈殿、塩素消毒、膜濾過等によって除去又は不活化することにより、水系を介しての感染症の伝染を防止するといった、生物学的リスクの低減を図っている。従来は塩素消毒により、原水中に含まれる細菌等の微生物を不活化し、給配水においても残留塩素により微生物の増殖を妨げることにより、水道水の安全性が確保されている。
【０００３】
しかし、近年、塩素により不活化することが困難なクリプトスポリジウム等の原虫類による、水系を介しての感染が発生したという事例が報告されている。また、給排水管系では末端部や滞留部において塩素濃度の低減に伴って、再び微生物が繁殖する可能性があることも指摘されている。
【０００４】
浄水場では、従来から浄水処理後の水道水の水質検査項目として、大腸菌群及び一般細菌を対象とした微生物検査を取り入れており、浄水処理による糞便由来の病原菌の除去効果を確認し、水系を介しての拡散を防止している。しかし、上記のような状況から、これらの項目の試験だけでは、生物学的リスクを十分に評価しているとは言えなくなってきている。
【０００５】
また、従来の試験方法は培養によるコロニー形成を観察する方法であり、この方法は簡便に試験が行えるという利点はあるものの、その結果が得られるまでには時間がかかり、操作に熟練を要するというような問題があった。
【０００６】
一方、クリプトスポリジウム等の原虫は培養による検出は困難であり、現状の検出方法では前処理から検出を行うまでに、多くの煩雑な工程が必要である。そのため、操作には熟練を要する。特に最終的に原虫の存在を確認するためには、検鏡による観察が不可欠であり、形状因子、及び微分干渉像による内部構造の観察を含めて、総合的に判断をする必要があった。
【０００７】
近年、核酸、免疫といった分子生物学的な手法を、これら微生物の検知や同定に適用する方法が提案されている。これら分子生物学的手法では、対象微生物に固有の塩基配列、抗原を選択的に識別することが可能であり、特異的に対象微生物を検知することが可能である。
【０００８】
しかし、対象微生物以外の微生物、もしくは鉱物質の濁質等の夾雑物等にも非特異的に吸着することがあり、この場合には誤認識の原因となる。一般的にＤＮＡにより微生物の検出を行う場合、細胞を破砕してＤＮＡもしくはＲＮＡ（ＲｉｂｏＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）を取り出し、場合によってはこれらをＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）もしくはＲＴ−ＰＣＲにより増幅した上で、検出対象ＤＮＡと相補プローブとの結合を検知することにより、対象とする生物が存在することを確認する。しかし、この場合も擬陽性の可能性があるが、既に微生物の構造は破壊されており、形状因子や内部構造等の情報から検証することは不可能である。
【０００９】
本発明は上記の課題を解決するためになされたもので、分子生物学的手法を取り入れることにより、煩雑な処理を必要とせず、かつ、擬陽性等の不確定要因を考慮して精度の向上を図り得る微生物検出方法及びこの方法を実施する微生物検出装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
請求項１に係る発明は、
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出方法において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉するステップと、
捕捉された固形物を固定化プレート上に固定するステップと、
検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体を固定化プレート上の固形物に接触させるステップと、
染色された固形物を判別するために固定プレート上に発光もしくは蛍光により二次元画像を得るステップと、
検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、標識抗体と異なる標識をした核酸プローブを用いたｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するステップと、
二本鎖が形成された固形物を判別するため発光もしくは蛍光による二次元画像を得るステップと、
２つの二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識するステップと、
を備えたことを特徴とする。
【００１１】
請求項２に係る発明は、
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出方法において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉するステップと、
固形物と、検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体と、検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、標識抗体と異なる標識をした核酸プローブとを液相中で接触させて複合体を形成するステップと、
複合体を固定化プレート上に固定するステップと、
標識抗体により染色された固形物を判別するための光を固定プレート上に照射して第１の二次元画像を得るステップと、
核酸プローブにより二本鎖が形成された固形物を判別するために固定プレート上に発光もしくは蛍光により第２の二次元画像を得るステップと、
第１及び第２の二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識するステップと、
を備えたことを特徴とする。
【００１２】
請求項３に係る発明は、
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出装置において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉する手段と、
捕捉された固形物を固定化プレート上に固定する手段と、
検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体を固定化プレート上の固形物に接触させる手段と、
染色された固形物を判別するため発光もしくは蛍光による二次元画像を得る手段と、
検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、標識抗体と異なる標識をした核酸プローブを用いたｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成する手段と、
二本鎖が形成された固形物を判別するために固定プレート上に発光もしくは蛍光により二次元画像を得る手段と、
２つの二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識する手段と、
を備えたことを特徴とする。
【００１３】
請求項４に係る発明は、
試料水中の特定の微生物を検出する微生物検出装置において、
検出対象微生物を含む試料水中の微生物の固形物を捕捉する手段と、
固形物と、検出対象微生物を特異的に染色する標識抗体と、検出対象微生物に含まれる核酸と相補的な塩基配列を持ち、標識抗体と異なる標識をした核酸プローブとを液相中で接触させて複合体を形成する手段と、
複合体を固定化プレート上に固定する手段と、
標識抗体により染色された固形物を判別するため発光もしくは蛍光による第１の二次元画像を得る手段と、
核酸プローブにより二本鎖が形成された固形物を判別するために固定プレート上に発光もしくは蛍光により第２の二次元画像を得る手段と、
第１及び第２の二次元画像のうち、同一の座標上に現れた像を対象微生物として認識する手段と、
を備えたことを特徴とする。
【００１４】
請求項５に係る発明は、請求項３又は４に記載の微生物検出装置において、認識した対象微生物の映像を観察者に提示するための画像表示手段を備え、観察者による形状的認証を可能にしたことを特徴とする。
【００１５】
請求項６に係る発明は、請求項３乃至５のいずれか１項に記載の微生物検出装置において、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検出対象核酸として、検出対象微生物内に含まれるｒＲＮＡを対象とすることを特徴とする。
【００１６】
請求項７に係る発明は、請求項３乃至５のいずれか１項に記載の微生物検出装置において、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検出対象核酸として、検出対象生物の特異的配列特異的配列を含む核酸を対象とすることを特徴とする。
【００１７】
請求項８に係る発明は、請求項３乃至７のいずれか１項に記載の微生物検出装置において、固定化プレートとして生物濾過に使用されるメンブランフィルタを用いることを特徴とする。
【００１８】
請求項９に係る発明は、請求項３乃至８のいずれか１項に記載の微生物検出装置において、検出対象微生物がクリプトスポリジウム等の原虫類であることを特徴とする。
【００１９】
請求項１０に係る発明は請求項１乃至４のいずれか１項に記載の微生物検出装置において、検出対象微生物を特異的に染色するために用いる標識抗体、及び核酸プローブは、複数を使用して検出することを特徴とする。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の概要を説明した後で、具体的な実施形態について説明することとする。
【００２１】
本発明は、始めに試料水中に含まれる微生物を固定化プレート上に捕捉する。このとき、検出対象微生物を含め、検出対象でない他種の微生物、その他鉱物質，有機質の固形物が同時に固定化プレート上に固定化されることになる。固定化プレート上に固定化された固形物の中から検出対象微生物を選択的に検出する手法として、免疫系の反応を利用する。対象微生物に特有の抗原を特異的に識別する標識抗体を発光色素、蛍光色素等で標識し、標識抗体を固定化プレート上に固定化された固形物と接触させることにより、対象微生物を特異的に標識する。
【００２２】
このとき対象微生物を抗原としてモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体を作製することになるが、抗体の認識部位は細胞壁や細胞膜に含まれる蛋白質や糖である。よって、上記抗体による検出では微生物を破砕する必要はなく、形状を維持したまま検知することができる。
【００２３】
本発明では、さらに核酸の塩基配列の相補性から対象微生物の検出を同時に行う。ここでは、検出対象とする微生物を破砕せずに、酵素，蛍光色素等で標識した核酸プローブを対象微生物に接触させ、核酸プローブと対象とする塩基配列とのハイブリダイゼーションによる二本鎖形成を検出する、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手法を適用する。この手法を用いることにより、微生物の形状を維持しつつ、塩基配列の特異性から対象微生物の存在の有無を判別することが可能となる。
【００２４】
対象微生物が存在する場合、固定化プレート上の変色点又は発光点として識別されることになり、二次元画像上でその存在を確認することができる。このとき抗体、核酸プローブをそれぞれ異なる色素で標識しておくことにより、抗体による二次元画像、及び核酸プローブによる二次元画像をそれぞれ別個に得ることができる。
【００２５】
両画像の同一座標上で同時に染色されている場合、同座標上に対象微生物が存在すると判定する。もし仮に片方の画像でのみ染色されている座標では、擬陽性の可能性があるとして、微生物の存在を棄却する。上記の判定ルーチンを採用することにより、擬陽性による誤検出の確率を低減し、精度の向上を図ることが可能となる。また、本手法では細胞の破砕によるＤＮＡもしくはＲＮＡの抽出過程、及び増幅過程が不必要であり、検出工程の自動化が容易であり、検出時間の短縮についても有効である。
【００２６】
また、固定化プレート上に固定化する前に、標識抗体及び標識核酸プローブと試料水中の微生物を含む固形物とを液相中で接触させ、対象微生物と標識抗体及び標識核酸プローブとの複合体を形成した後、固定化プレート上に捕捉することも可能である。この場合、固相上での接触に比較して、液相中での均一反応になることから、複合体の形成をより効率的に行うことができ、接触反応時間を短縮することができる。
【００２７】
さらに精度を向上させるために、抗体及び核酸プローブにより染色された部位の形状を観察し、対象とする微生物の特徴と合致するか否かを確認する。特に原虫類では比較的細胞体が大きく、形状も特徴的な場合が多いことから、形状因子も合わせて確認することにより、さらに擬陽性による誤検出を防止することができる。
【００２８】
また、浄水場で運用する場合、病原性微生物を検知した場合に、浄水工程の検査、場合によっては取水や給水の停止等の措置をとる必要があることから、最終的に微生物の存在の有無を判定するのに、人による判断を行うことが望ましい。そこで抗体と核酸プローブとで同時に染色された微生物について、抗体及び核酸プローブによる二次元画像の染色点を画像として取得しておき、この画像を監視者に表示すると共に、自動的に座標を合わせ、明視野像、微分干渉像を表示する。この方法により、監視員が染色された微生物の画像、及び実際の微生物の実像を観察することが可能となり、判別が容易に実施できるようになる。
【００２９】
ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を適用する場合、検出対象とする核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡである。このとき検出対象としてｒＲＮＡを利用する。ｒＲＮＡはｍＲＮＡの情報を基に蛋白質合成を行う場であり細胞内に多く存在していることから、多くの標識核酸プローブと結合し、発光強度や蛍光強度が大きくなる。その結果、微生物の存在部位とそれ以外の部位の信号強度比を大きくすることができるため、精度の向上を図ることに有効である。特に、本発明ではＰＣＲもしくはＲＴ−ＰＣＲによる増幅過程を実施しないことから、検知するのに十分な量の核酸を検出目標とする上で、ｒＲＮＡを対象とすることが望ましい。
【００３０】
また同一種の微生物であっても、塩基配列の一部において配列が異なっている領域が存在する。これらの特異的配列を含む部位の塩基配列を認識するように核酸プローブを設計することにより、特定の変異型の対象微生物を検出することが可能になる。これら変異型の特徴を検出することの利点として、汚染源の特定がある。基本的に取水口より上流の畜産廃水施設，下水処理場等が汚染源となっている場合が多く、それぞれの汚染源に特有の変異型の特徴が存在する場合がある。そこで、特定の変異型のみを検出することにより、汚染源が特定できる可能性があり、病原性微生物が検出された場合の迅速な対応を行うことが可能となる。
【００３１】
固定化プレートの材質としては、スライドガラス等、一般的には透明で均質な材質が望ましいが、メンブランフィルタ等の濾過膜を用いることも可能である。スライドガラスを使用する場合、一旦、濾過した固形物を再び液中に誘出させて、ガラス上に展開する必要がある。それに対して、メンブランフィルタ等の濾過膜上で直接観察することにより、工程を省略、測定時間を短縮することが可能となる。
【００３２】
以上説明してきた検出手法を、クリプトスポリジウムに適用することが有効である。クリプトスポリジウムは外殻に耐塩素性を持つオーシスト壁を備えており、これに特徴的な成分を抗原とした抗体による検出が可能である。また、適切な前処理を施すことにより、オーシスト壁を透過して細胞内部の核酸とｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施することも可能である。
【００３３】
また形状因子についても、直径約５μｍの球形という特徴があることから、判別のための判断因子となる。さらにクリプトスポリジウムの特徴としてオーシスト壁内にスポロゾイトという、細長い形状の組織が４個存在している点がある。微分干渉像の観察により、この内部状況を観察することにより、さらに高精度なチェックが可能である。
【００３４】
次に、本発明を図面に示す好適な実施形態に基づいて詳細に説明する。図１は本発明に係る微生物検出方法の基本原理図である。同図において、対象微生物１は、対象外微生物２とともに固定化プレート３上に捕捉されている。この固定化プレート３上に標識抗体４を供給し、対象微生物１を特異的に染色する。続いて、標識核酸プローブ５を供給し、同じく対象微生物１を染色する。このとき対象外微生物２の中に、非特異的に染色されるものも存在する。また、ここでは標識色素として、それぞれ異なる蛍光色素を用いるものとする。
【００３５】
このようにして染色した固定化プレート３の蛍光画像を取得する。標識抗体４を対象とした蛍光画像である抗体染色画像６、及び核酸プローブを対象とした蛍光画像である核酸プローブ染色画像７を取得すると、対象微生物１とともに非特異的に染色された対象外微生物２も蛍光により発光する。ここで、抗体染色画像６及び核酸プローブ染色画像７を画像処理することにより二重染色画像８を得る。これにより、同時に発光している固形物のみを対象微生物と判定することができ、誤認識することなく対象微生物のみを検出することができる。
【００３６】
図２は図１を用いて説明した微生物検出方法を実施する装置のうち、検出対象微生物の捕捉及び染色を行う処理系統図である。同図において、試料水に含まれる対象微生物１を含む固形物を生物濾過膜９によって捕捉する濾過ユニットを備えている。この濾過ユニットと反応槽１１とが、途中にバルブＶ１を有する生物供給流路１０によって接続されている。そこで、バルブＶ１を開き、濾過ユニットに誘出液を供給することによって生物濾過膜９から対象微生物１を含む固形物が剥離されて反応槽１１に導入される。反応槽１１はその底部に固定化プレート３を備え、検出対象微生物１を含む固形物を誘出液と共に蓄えると共に、必要に応じて加熱、冷却処理を施すようになっている。
【００３７】
反応槽１１は一般的な構成として、試薬供給流路１６と排水流路１７とを備えている。このうち、排水流路１７にバルブ２が設けられている。一方、試薬供給流路１６には各種の試薬の供給が可能になっており、特に、本実施形態では試薬供給流路１６に対して、バルブＶ３を介して標識抗体供給手段１２が、バルブＶ４を介して標識核酸プローブ供給手段１３がそれぞれ接続されている。さらに、試薬供給流路１６に対して、バルブＶ５を介して反応溶液供給手段１４が、バルブＶ６を介して洗浄液供給手段１５がそれぞれ接続されている。
【００３８】
そこで、バルブＶ３を開いて標識抗体供給手段１２から標識抗体を、バルブＶ３を開いて標識核酸プローブ供給手段１３から標識核酸プローブをそれぞれ試薬供給流路１６を通じて反応槽１１に供給し、免疫反応及び核酸ハイブリダイゼーション反応を起こさせた後、固定化プレート３上に試料水中の固形物を捕捉する。このとき、予め固定化プレート３上に固形物を捕捉した後、標識抗体及び標識核酸プローブを供給しても構わない。
【００３９】
いずれの手順においても、免疫反応及び核酸ハイブリダイゼンーション反応は反応溶液中で実施する。そのための反応溶液については、標識抗体供給手段１２から標識抗体を、標識核酸プローブ供給手段１３から標識核酸プローブを供給するときに同時に供給することも可能であるが、別途、バルブＶ５を開いて反応溶液供給手段１４から供給する方法を採ることもできる。
【００４０】
標識、固定化した後、バルブＶ６を開いて洗浄液供給手段１５より洗浄液を固定化プレート３上に供給し、さらに、バルブＶ２を開いて固定化プレート３上の未反応試薬を排水流路１７より排出する。この状態の固定化プレートを画像取得手段１８により、蛍光画像、もしくは明視野像、微分干渉像を撮像する。
【００４１】
図３は蛍光画像を取得するための装置の構成例である。同図において、蛍光画像取得手段１９は、励起光源２０を備え励起光の照射を行う。励起光源２０としてはキセノンランプ等の広帯域の白色光やレーザー光源等を利用することが可能である。白色光源を利用する場合に照射した励起光は、標識蛍光色素の励起波長を選択的に透過させる励起フィルタ２１により、照射光の波長をが限定されるて照射される。
【００４２】
励起光はハーフミラー２２及びレンズ２３を通過して固定化プレート３に到達する。対象微生物１からの蛍光発光は再びレンズ２３により集光され、蛍光色素より発光する波長域の光を選択的に透過させる蛍光フィルタ２４を通して、撮像手段２５に到達する。ここで蛍光フィルタ２４の代わりに、種々の波長光を含む複合光から、所望の特定波長をだけを取り出すことができる、モノクロメータを用いてもよい。
【００４３】
この方法では、撮像手段２５で撮影された固定化プレート３上の画像を一括して取得し、は画像記録手段２６に保存される記憶される。得られた画像に対して画像解析手段２７により画像処理を施すことにより、微生物の存在点を抽出する。このようにして解析した画像は画像表示手段２８により表示される。監視員に提示される。
【００４４】
図３に示す構成例の他、励起光源２０のスポット径を絞り、照射位置を順次走査することにより、二次元画像データを取得するようにしても良い。この場合、機械駆動部が必要になるが、光源の制御を厳密に行うことにより、高精度な画像を取得することが可能である。
【００４５】
図４は蛍光画像に加えて、明視野像及び微分干渉像を取得する場合の装置の構成例である。これは励起フィルタ２１、ハーフミラー２２及び蛍光フィルタ２４からなる蛍光フィルタシステム３０、微分干渉フィルタ３１及びこれらを切り替えるためのフィルタ切り替え手段３２を固定化プレート３から撮像手段２５までの光路上に設ける。適用するフィルタを順次変更するか、あるいは、外すことにより、蛍光画像、明視野像、微分干渉像を取得することができる。なお、ここでも図３の場合と同様に、蛍光フィルタ２４の代わりに、種々の波長光を含む複合光から、所望の特定波長をだけを取り出すことができる、モノクロメータを用いてもよい。
【００４６】
この場合も、取得した画像は画像記録手段２６に保存され、得られた画像に対して画像解析手段２７により画像処理を施すことにより、微生物の存在点を抽出する。こうして解析した画像は画像表示手段２８により表示される。監視員に提示される。
【００４７】
図５（ａ），（ｂ），（ｃ）はスライドガラス上に固定化した微生物の、明視野像及び、標識抗体、標識核酸プローブによる蛍光画像である。このうち、（ａ）は固定化プレート３上の微生物の明視野像であり、クリプトスポリジウム（Ｃ．ｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）と酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が混在して存在している様子が分かる。この微生物の混合溶液に対して、始めにｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション反応を実施する。オーシストを１６％ホルマリン溶液にて１時間固定化し、５００Ｗで２分間マイクロウェーブ処理し，８０℃にて１０分間加熱処理を実施したサンプルについて、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ｂｕｆｆｅｒ中で、ＦＩＴＣ標識した１８ＳｒＲＮＡユニバーサルプローブと、４０℃、１時間ハイブリダイゼーションを実施する。続いて、固定化プレート３上に捕捉し、これに標識抗体として、Ｃｙ３標識したＩｇＧクラスのモノクローナル抗体を供給し、１時間暗室にて放置して染色した。
【００４８】
（ｂ）はＣｙ３蛍光画像であり、抗体によりクリプトスポリジウムが特異的に染色されている。また（ｃ）はＦＩＴＣ蛍光画像であり、標識プローブによっても同様にクリプトスポリジウムが特異的に染色されている。このように、抗体及び核酸プローブによって二重染色が可能であることが分かる。
【００４９】
ここで用いている核酸プローブはｒＲＮＡを対象としたものであり、蛍光発光強度を増強するのに有効である。図５では１８ＳｒＲＮＡの共通領域を使用しているが、クリプトスポリジウム特異領域を適用することにより他の原虫類との識別が可能であり、なおかつクリプトスポリジウムの中でも種特異的な領域を適用することにより、他種のクリプトスポリジウムと識別可能である。さらに、特定のクリプトスポリジウム種の中でも変異が含まれる領域を適用することにより、変異種の識別も可能である。
【００５０】
固定化プレート３としては、上記のスライドガラスの他に、親水性ＰＴＦＥ膜，ポリカーボネート膜等が適用可能である、特に、親水性ＰＴＦＥは水吸収時の透明性に優れていることから、明視野、微分干渉像の観察も可能である。
【００５１】
かくして、第１の実施形態によれば、分子生物学的手法を取り入れることにより、煩雑な処理を必要とせず、かつ、擬陽性等の不確定要因を考慮して精度の向上を図ることができる。
【００５２】
図６は図１を用いて説明した微生物検出方法を実施する他の装置の処理系統図である。図中、図２と同一の要素には同一の符号を付してその説明を省略する。この実施形態は、固定化プレート上に固定化する前に、標識抗体及び標識核酸プローブと試料水中の微生物を含む固形物とを液相中で接触させ、対象微生物と標識抗体及び標識核酸プローブとの複合体を形成した後、固定化プレート上に捕捉するものである。
【００５３】
ここで、標識抗体供給手段１２、標識核酸プローブ供給手段１３及び反応溶液供給手段１４が、試薬供給流路１６を介して、反応槽１１に接続されている。さらに、対象微生物１を含む固形物を導入する生物供給流路１０も反応槽１１に接続されている。この反応槽１１の下流側にバルブ７を介して乾燥機４０が接続されている。この乾燥機４０は固定化プレート３を備え、その出口にバルブＶ６を有する洗浄液供給手段１５が接続され、さらに、バルブＶ２を有する排水流路１７を備えている。
【００５４】
この構成により、先ず、反応槽１１の下流のバルブＶ７を閉じた状態で、バルブＶ１を開いて検出対象微生物１を含む固形物を誘出液と共に反応槽１１に導入して、バルブＶ１を閉じる。次に、バルブＶ３を開いて標識抗体供給手段１２から標識抗体を、バルブＶ３を開いて標識核酸プローブ供給手段１３から標識核酸プローブを、バルブＶ５を開いて反応溶液供給手段１４から反応溶液をそれぞれ試薬供給流路１６を通じて反応槽１１に供給し、免疫反応及び核酸ハイブリダイゼーション反応を起こさせる。次に、免疫反応及び核酸ハイブリダイゼンーション反応が行われた反応溶液を、バルブＶ７を開いて乾燥機４０に導き、この乾燥機４０で乾燥させることにより、標識、固定化された試料水中の固形物を固定化プレート３上に捕捉する。次に、バルブＶ６を開いて洗浄液供給手段１５より洗浄液を固定化プレート３上に供給し、さらに、バルブＶ２を開いて固定化プレート３上の未反応試薬を排水流路１７より排出する。この状態の固定化プレートを画像取得手段１８により、前述したように蛍光画像、もしくは明視野像、微分干渉像を撮像する。
【００５５】
かくして、図６に示す第２の実施形態によれば、分子生物学的手法を取り入れることにより、煩雑な処理を必要とせず、かつ、擬陽性等の不確定要因を考慮して精度の向上を図ることができるという効果に加えて、複合体の形成をより効率的に行うことができ、接触反応時間を短縮することができるという効果も得られる。
【００５６】
なお、上記の各実施形態では、濾過ユニットの生物濾過膜９によって固形物を捕捉し、その誘出液と合わせて固形物を反応槽１１に導入したが、例えば、図２に示す固定化プレート３の代わりにメンブランフィルタ等の濾過膜を用い、生物供給流路１０から直接試料水を導入して、対象微生物１を含む固形物を捕捉し、上述したと同様な処理をすることによって、工程を省略、測定時間の短縮が可能となる。
【００５７】
なおまた、上記の各実施形態では１種数の標識抗体及び１種数の核酸プローブを用いたが、２種数以上の標識抗体及び２種数以上の核酸プローブを用いて検出対象微生物を染色するようにしても良い。
【００５８】
【発明の効果】
以上の説明によって明らかなように、本発明によれば、分子生物学的手法を取り入れることにより、煩雑な処理を必要とせず、かつ、擬陽性等の不確定要因を考慮して精度の向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る微生物検出方法の基本原理図。
【図２】図１を用いて説明した微生物検出方法を実施する装置の第１の実施形態に係る処理系統図。
【図３】図２に示す第２の実施形態に適用して蛍光画像を取得するための装置の概略構成図。
【図４】蛍光画像に加えて、明視野像及び微分干渉像を取得する場合の装置の概略構成図。
【図５】スライドガラス上に固定化した微生物の、明視野像及び、標識抗体、標識核酸プローブによる蛍光画像。
【図６】図１を用いて説明した微生物検出方法を実施する装置の第２の実施形態に係る処理系統図。
【符号の説明】
１　対象微生物
２　対象外微生物
３　固定化プレート
４　標識抗体
５　標識核酸プローブ
６　抗体染色画像
７　核酸プローブ染色画像
８　二重染色画像
９　生物濾過膜
１０　生物供給流路
１１　反応槽
１２　標識抗体供給手段
１３　標識核酸プローブ供給手段
１４　反応溶液供給手段
１５　洗浄液供給手段
１６　試薬供給流路
１７　排水流路
１８　画像取得手段
１９　蛍光画像取得手段
２０　励起光源
２１　励起光フィルタ
２２　ハーフミラー
２３　レンズ
２４　蛍光フィルタ
２５　撮像手段
２６　画像記録手段
２７　画像解析手段
２８　画像表示手段
２９　制御手段
３０　蛍光フィルタシステム
３１　微分干渉フィルタ
３２　フィルタ切り替え手段
４０　乾燥機
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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