(57)【要約】【課題】タンパク質試料からの一次構造情報取得の自動化を可能とするタンパク質の断片化方法を含むタンパク質の一次構造情報収集方法、及びこの方法に使用するための装置及びタンパク質試料の一次構造情報自動解析システムを提供する。【解決手段】タンパク質を変性し、還元し、かつアルキル化する工程、得られた還元アルキル化タンパク質を疎水性微細粒子担体に固定化する工程、得られた固定化タンパク質を化学的、または酵素的に断片化する工程、及び断片化されたペプチドの一次構造情報を取得する工程、を含むペプチドの一次構造情報収集方法。還元アルキル化タンパク質を自動的に断片化するための自動断片化部、断片化したペプチドの質量分析を自動的に行うための自動質量分析部、及び自動質量分析部で得られたデータを解析するためのデータ解析部を含むタンパク質一次構造情報自動取得システムであって、前記還元アルキル化タンパク質の自動的断片化を、疎水性微細粒子担体を用いて行う。【選択図】図１
2004301715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を変性し、還元し、かつアルキル化する工程（１）、
工程（１）で得られた還元アルキル化タンパク質を疎水性微細粒子担体に固定化する工程（２）、
工程（２）で得られた固定化タンパク質を化学的、または酵素的に断片化する工程（３）、及び
工程（３）で断片化されたペプチドの一次構造情報を取得する工程、
を含むタンパク質の一次構造情報収集方法。
【請求項２】
工程（３）で得られた断片ペプチドを担体から回収する工程（４）、及び工程（４）で回収した断片化ペプチドを分離する工程（５）をさらに含み、
工程（５）で分離されたペプチドの一次構造情報を取得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疎水性微細粒子担体が疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
疎水性微細粒子担体は、平均粒子径が１〜５０μｍの範囲である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
還元アルキル化タンパク質を固定化し、固定化した還元アルキル化タンパク質を断片化し、生じた断片化ペプチドを回収するために用いられる疎水性微細粒子担体。
【請求項６】
疎水性微細粒子担体が疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスである請求項５に記載の疎水性微細粒子担体。
【請求項７】
疎水性微細粒子担体は、平均粒子径が１〜５０μｍの範囲である請求項５または６に記載の疎水性微細粒子担体。
【請求項８】
還元アルキル化タンパク質を自動的に断片化するための自動断片化部、断片化したペプチドの質量分析を自動的に行うための自動質量分析部、及び自動質量分析部で得られたデータを解析するためのデータ解析部を含むタンパク質一次構造情報自動取得システムであって、前記還元アルキル化タンパク質の自動的断片化を請求項４〜６のいずれか１項に記載の疎水性微細粒子担体を用いて行うことを特徴とする前記システム。
【請求項９】
前記の自動断片化部が、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、請求項４〜６のいずれか１項に記載の疎水性微細粒子担体を保持したピペットチップ、前記ピペットチップ内に前記容器中の液体を吸入及び排出するためのピペット、前記ピペットチップを恒温状態に置くための恒温槽、及び前記ピペットを移動可能とするためのＸＹＺアームを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
溶出する断片化ペプチドを受けるための容器をさらに含む請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記の自動断片化部が、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、請求項４〜６のいずれか１項に記載の疎水性微細粒子担体を保持したカラム、前記カラムを恒温状態に置くための恒温槽、及び前記容器から前記カラムに溶液を移送するためのポンプを含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
自動質量分析部は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析計またはエレクトロスプレーイオン化／質量分析計を含む請求項８〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
前記データ解析部は、質量データを用いて配列データベースを検索し、ペプチドを同定する検索エンジンソフトウェアと配列データベースとこれらのソフトウェアやデータを演算するハードウェアから構成される請求項８〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、タンパク質試料を、固相に吸着した状態で、断片化してペプチドを生成する方法と、そのための装置、および、その装置と生じたペプチドの一次構造情報を得る装置を含む自動解析システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノムを含む多くの生物のゲノムがシーケンシングされつつある現在、ポストゲノムシーケンシングとして、ゲノムがコードするタンパク質の機能決定が大きな課題となっている。タンパク質の機能決定のためには、まず、タンパク質の一次構造を解析する必要があり、タンパク質の一次構造解析のためには、タンパク質を切断して、ペプチド化する必要があるが、タンパク質は多様であり、必ずしも画一的にペプチド化はできないのが現状である。
【０００３】
多くのモデル生物種でゲノムシークエンスが完了しているが、シークエンスの信頼性は必ずしも高くない。また、オープンリーディングフレーム（タンパク質の読枠）の予想も、特に真核生物では、困難である。したがって、タンパク質レベルでの解析により、ゲノムシークエンスの評価、校正および読枠の確認が可能であれば、ゲノムサイエンスの基礎となる情報を得ることが出来るため有用である。
【０００４】
いわゆるポストゲノムシークエンス時代の遺伝子・タンパク質機能解析においては、細胞内外のタンパク質の機能解析および細胞系や無細胞系で人為的に発現したタンパク質の系統的な機能解析へのニーズが増進している。これらのタンパク質が設計通り合成されているかどうかの確認は機能解析を行う上で基本となる重要な情報である。
【０００５】
以上のような多種・大量のタンパク質解析ニーズに対応するためには、現状の労働集約的な方法ではなく、自動化された解析システムが必要である。
【０００６】
タンパク質を効率よく分解し、ペプチドを収量良く回収するためには、以下の３点が重要である。
（１）タンパク質を変性させ立体構造障害による分解の不均一性を減少させる。
（２）還元してタンパク質分子内あるいは分子間のＳ−Ｓ結合を切断し、生成した反応性に富むシステイン残基ＳＨ基を保護する。
（３）残基特異性の高いタンパク質分解酵素を用いる。
このため、タンパク質化学では、タンパク質試料を変性、還元アルキル化した後にタンパク質分解酵素により消化することで断片化ペプチド試料を調製することが一般的である（非特許文献１、新生化学実験法、タンパク質ＩＩ一次構造、東京化学同人、１９９０）。
【０００７】
変性剤やアルキル化剤などは、多くのタンパク質分解酵素を阻害する。このため、溶液状態で操作を行う場合には、
（１）酵素が許容できる変性剤・アルキル化剤濃度まで希釈すること、あるいは
（２）逆相液体クロマトグラフィー法、透析法、有機溶媒沈殿法などで変性剤、アルキル化剤を除去することが必要であった。
しかし、これらの方法では、多くの場合、変性剤を除くとタンパク質が不溶化または器壁等に吸着しやすくなるためタンパク質の回収率が悪くなり、断片化の効率も低くなるという問題点があった。
【０００８】
タンパク質試料の化学反応、酵素消化、脱塩の各処理を行うロボットが、市販されている。これらのロボットは、基本的には溶液ハンドリングロボットである。すなわち、ピペットを使って溶液を複数の容器間で排出、吸入する操作の組み合わせにより、液相反応を行う。したがって、上述の溶液反応の問題点を解決できていない。
【０００９】
一方、タンパク質をニトロセルロース膜またはポリビニリデンジフルオライド膜に吸着させ、膜上で化学的、酵素的にタンパク質を断片化する方法が報告されている（非特許文献２、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ＲＨ，  Ｌｅａｖｉｔｔ  Ｊ，  Ｓａａｖｅｄｒａ  ＲＡ，  Ｈｏｏｄ  ＬＥ，  Ｋｅｎｔ  ＳＢ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９８７  Ｏｃｔ；８４（２０）：６９７０−４．）。この方法では、疎水性相互作用により膜上にタンパク質を固定化し、膜上で各種反応を行った後に過剰の試薬等を除去し、化学的、酵素的にタンパク質を断片化する。しかし、この方法は、膜の扱いが煩雑な手作業であり、しかも熟練が必要であった。
【００１０】
【非特許文献１】新生化学実験法、タンパク質ＩＩ一次構造、東京化学同人、１９９０
【非特許文献２】Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ＲＨ，  Ｌｅａｖｉｔｔ  Ｊ，  Ｓａａｖｅｄｒａ  ＲＡ，  Ｈｏｏｄ  ＬＥ，  Ｋｅｎｔ  ＳＢ．
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９８７  Ｏｃｔ；８４（２０）：６９７０−４．
【００１１】
【発明が解決すべき課題】
このようにタンパク質断片化過程は煩雑であり、また、個々のタンパク質の性質に依存した熟練を要する手法であるため一般的な自動化方法は確立していなかった。
【００１２】
そこで本発明は、タンパク質試料からの一次構造情報取得の自動化を可能とする、タンパク質の断片化方法を含むタンパク質の一次構造情報収集方法を提供することを目的とする。
さらに本発明は、この方法に使用するための装置及びタンパク質試料の一次構造情報自動解析システムを提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために種々検討し、従来の方法に、酵素消化部分を固相に固定して行うことで、タンパク質試料からの一次構造情報取得の自動化が可能になることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明では、タンパク質断片化過程を疎水性微細粒子担体にタンパク質を固定化して各操作を行うことで、タンパク質試料からの一次構造情報取得の自動化が可能となった。
【００１４】
本発明は以下の通りである。
［１］タンパク質を変性し、還元し、かつアルキル化する工程（１）、
工程（１）で得られた還元アルキル化タンパク質を疎水性微細粒子担体に固定化する工程（２）、
工程（２）で得られた固定化タンパク質を化学的、または酵素的に断片化する工程（３）、及び
工程（３）で断片化されたペプチドの一次構造情報を取得する工程、
を含むタンパク質の一次構造情報収集方法。
［２］工程（３）で得られた断片ペプチドを担体から回収する工程（４）、及び工程（４）で回収した断片化ペプチドを分離する工程（５）をさらに含み、
工程（５）で分離されたペプチドの一次構造情報を取得する、［１］に記載の方法。
［３］疎水性微細粒子担体が疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスである［１］または［２］に記載の方法。
［４］疎水性微細粒子担体は、平均粒子径が１〜５０μｍの範囲である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］還元アルキル化タンパク質を固定化し、固定化した還元アルキル化タンパク質を断片化し、生じた断片化ペプチドを回収するために用いられる疎水性微細粒子担体。
［６］疎水性微細粒子担体が疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスである［５］に記載の疎水性微細粒子担体。
［７］疎水性微細粒子担体は、平均粒子径が１〜５０μｍの範囲である［５］または［６］に記載の疎水性微細粒子担体。
［８］還元アルキル化タンパク質を自動的に断片化するための自動断片化部、断片化したペプチドの質量分析を自動的に行うための自動質量分析部、及び自動質量分析部で得られたデータを解析するためのデータ解析部を含むタンパク質一次構造情報自動取得システムであって、前記還元アルキル化タンパク質の自動的断片化を［４］〜［６］のいずれかに記載の疎水性微細粒子担体を用いて行うことを特徴とする前記システム。
［９］前記の自動断片化部が、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、［４］〜［６］のいずれかに記載の疎水性微細粒子担体を保持したピペットチップ、前記ピペットチップ内に前記容器中の液体を吸入及び排出するためのピペット、前記ピペットチップを恒温状態に置くための恒温槽、及び前記ピペットを移動可能とするためのＸＹＺアームを含む、［８］に記載のシステム。
［１０］溶出する断片化ペプチドを受けるための容器をさらに含む［９］に記載のシステム。
［１１］前記の自動断片化部が、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、［４］〜［６］のいずれかに記載の疎水性微細粒子担体を保持したカラム、前記カラムを恒温状態に置くための恒温槽、及び前記容器から前記カラムに溶液を移送するためのポンプを含む、［８］に記載のシステム。
［１２］自動質量分析部は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析計またはエレクトロスプレーイオン化／質量分析計を含む［８］〜［１１］のいずれかに記載のシステム。
［１３］前記データ解析部は、質量データを用いて配列データベースを検索し、ペプチドを同定する検索エンジンソフトウェアと配列データベースとこれらのソフトウェアやデータを演算するハードウェアから構成される［８］〜［１２］のいずれかに記載のシステム。
【００１５】
【発明の実施の形態】
［ペプチドの一次構造情報収集方法］
工程（１）
工程（１）では、タンパク質を変性し、還元し、かつアルキル化する。タンパク質の変性、還元、及びアルキル化は、公知の方法をそのまま用いて行うことができる。
例えば、変性は、塩酸グアニジンや尿素により行うことができる。
還元は、ジチオスレイトールなどのチオール類、トリブチルフォスフィンなどのフォスフィン類により行うことができる。
アルキル化は、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、４−ビニルピリジン、アクリルアミド、エチレンイミンなどにより行うことができる。
【００１６】
本発明の方法に供するタンパク質は、特に限定はなく、どのようなタンパク質でも本発明の方法の対象とする事ができる。
そのようなタンパク質は、例えば、可溶性タンパク質、膜タンパク質、繊維タンパク質、糖タンパク質、タンパク質複合体、タンパク質と核酸を含む複合体等である事ができる。
【００１７】
工程（２）
工程（２）では、工程（１）で得られた還元アルキル化タンパク質を疎水性微細粒子担体に固定化する。
疎水性微細粒子担体は、例えば、疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスであることができる。疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスは、具体的には、疎水性官能基として、例えばフェニル基などの芳香族官能基あるいはメチル、エチル、プロピル、ブチル、オクチル、オクタデシルなどの直鎖アルキル基を結合させた有機ポリマー、シリカまたはガラスを挙げることができる。また、有機ポリマーとしてはポリスチレン、スチレンジビニルベンゼンポリマー、ポリビニルアルコール等を挙げることができる。
疎水性微細粒子担体は、平均粒子径が１〜５０μｍの範囲であることができる。
【００１８】
還元アルキル化タンパク質の疎水性微細粒子担体への固定化は、例えば、以下の方法により行うことができる。
固定化方法は、保持する容器の形態によりほぼ規定される。例えば、ピペット型カラムを用いる場合には、ピペッター（ＧＩＬＳＯＮ社のピペットマン）などにより、タンパク質試料を吸入・排出を繰り返すことにより行う。液体クロマトグラフィーとのオンライン化に用いる小型のカラム（材質はステンレスなど）に保持する場合には、注入器からの注入とクロマトグラフ装置のポンプによる送液により試料をカラムに導入することによりタンパク質を固定化出来る。
【００１９】
本発明のタンパク質断片化方法では、取り扱いが容易で、保持する容器等の形状も自由な担体として、前述の膜の代わりに、疎水性微粒子担体を用いる。
【００２０】
疎水性微粒子担体にタンパク質を固定化することにより、上述の膜法と同様に、酵素活性や質量分析を阻害する物質を容易に洗浄することが出来る。従来法では、この操作は容器内の溶媒を手作業で出し入れしていた。それに対して、本発明では、この操作を、ピペット型あるいはプレカラム型の容器に保持した疎水性微粒子担体を用いることにより、溶液ハンドリングロボット（図１参照）あるいは電動バルブをもちいた自動送液システム（図２参照）に容易に組み込むことが可能である。したがって、従来法では、煩雑な手作業が必要であったこの過程を、自動化することが可能である。
【００２１】
工程（３）
工程（３）では、工程（２）で得られた固定化タンパク質を化学的、または酵素的に断片化する。
固定化タンパク質の化学的断片化は、例えば、以下の方法で行うことができる。
希塩酸による酸加水分解法（アスパラギン酸のカルボキシル基側を優先的に切断）、臭化シアン分解法（メチオニン特異的）、酸化的ブロモ化反応法（２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチル−３−ブロモインドールなどを用いるトリプトファン特異的切断）
【００２２】
固定化タンパク質の酵素的断片化は、例えば、以下の酵素を用いて行うことができる。
トリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの基質特異性の高い酵素を用いることが多いが、タンパク質を断片化出来る酵素であればどのようなものでも用いることが出来る。
【００２３】
本発明の方法は、上記工程（１）〜（３）の後に、工程（４）及び（５）を含むことができる。
工程（４）
工程（４）は、工程（３）で得られた断片ペプチドを担体から回収する工程である。担体からの断片ペプチドの回収は、例えば、以下のように行うことができる。
アセトニトリル、メタノール、２−プロパノールなどの極性有機溶媒の水溶液に担体を曝すことにより、断片ペプチドを回収することが出来る。
【００２４】
工程（５）
工程（５）は、工程（４）で回収した断片化ペプチドを分離する工程である。回収した断片化ペプチドの分離は、例えば、以下のように行うことができる。炭化水素化学結合シリカを充填したカラムをもちいた逆相液体クロマトグラフィーにより分離することが出来る。溶離液としては、トリフルオロ酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ酪酸を含んだ水溶液とトリフルオロ酢酸、蟻酸、ヘキサフルオロ酪酸を含んだアセトニトリル、メタノール、２−プロパノールなどの極性有機溶媒をもちいた２液混合による濃度勾配溶離法を用いることができる。
【００２５】
工程（３）で断片化されたペプチドまたは工程（５）で分離されたペプチドから、その一次構造情報を取得する。一次構造情報の取得は、例えば、以下のように行うことができる。
（１）タンパク質・ペプチドのアミノ末端からフェニルイソチオシアネートをもちいてアミノ酸を１残基ずつ段階的に切り離し、生じたフェニルチオヒダントイン−アミノ酸を同定するエドマン法。
（２）ペプチドの質量情報を質量分析法により取得し、配列データベースとの照合を行う方法。Ａ．単一あるいは単純な混合物の場合には、ペプチドの分子量情報のセットにより配列データベースを検索し、元のタンパク質を同定することが出来る。Ｂ．ペプチドを質量分析計内で単離し、アルゴン、ヘリウムなどの希ガス分子との衝突により開裂させ、得られた生成イオンスペクトルをもちいて、配列データベースを検索し、元のタンパク質を同定することが出来る。
（３）タンパク質自体は同定されており、その修飾構造情報を得たい場合には、ペプチドの分子量を質量分析法により得ることで、修飾構造を検出することが出来る。
【００２６】
本発明は、還元アルキル化タンパク質を固定化し、固定化した還元アルキル化タンパク質を断片化し、生じた断片化ペプチドを回収するために用いられる疎水性微細粒子担体を包含する。この担体としては、上記のように、例えば、疎水性表面を有する有機ポリマー、シリカまたはガラスである疎水性微細粒子担体であって、平均粒子径が１〜５０μｍの範囲である疎水性微細粒子担体を挙げることができる。
本発明のこの疎水性微粒子担体は、ピペットチップまたはカラムのような液体を吸入及び排出できる機能を有する容器に保持することができる。
【００２７】
本発明は、還元アルキル化タンパク質を自動的に断片化するための自動断片化部、断片化したペプチドの質量分析を自動的に行うための自動質量分析部、及び自動質量分析部で得られたデータを解析するためのデータ解析部を含むタンパク質一次構造情報自動取得システムを包含する。そしてこのシステムにおいて、前記還元アルキル化タンパク質の自動的断片化は、上記本発明の疎水性微細粒子担体を用いて行うことを特徴とする。
【００２８】
前記の自動断片化部は、より具体的には、例えば、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、前記本発明の疎水性微細粒子担体を保持したピペットチップ、前記ピペットチップ内に前記容器中の液体を吸入及び排出するためのピペット、前記ピペットチップを恒温状態に置くための恒温槽、及び前記ピペットを移動可能とするためのＸＹＺアームを含むものであることができる。この自動断片化部は、溶出する断片化ペプチドを受けるための容器をさらに含むことができる。
【００２９】
また、前記の自動断片化部が、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、前記本発明の疎水性微細粒子担体を保持したカラム、前記カラムを恒温状態に置くための恒温槽、及び前記容器から前記カラムに溶液を移送するためのポンプを含むものであることができる。
【００３０】
自動質量分析部は、例えば、自動インジェクター、液体クロマトグラフおよび分離カラム、質量分析計から構成されることができる。質量分析計は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析計またはエレクトロスプレーイオン化／質量分析計であることができる。エレクトロスプレーイオン化法と組み合わせることの出来る質量分析計としては、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換イオンサイクロトロン型、磁場型およびこれらのハイブリッド装置を利用することができる。
【００３１】
前記データ解析部は、質量データを用いて配列データベースを検索し、ペプチドを同定する検索エンジンソフトウェアと配列データベースとこれらのソフトウェアやデータを演算するハードウェアから構成される。
【００３２】
上記各種溶液を充填した容器は、複数の容器を含むマルチウェルプレートであることができ、かつ１つの装置は複数のピペットを有し、これら複数のピペットを同時にＸＹＺアームで移動させ、かつ複数のピペットに装着したピペットチップについて溶液の吸入及び排出操作並びに恒温状態への放置を同時に行うことができる。
【００３３】
以下、疎水性微粒子担体を保持するピペットチップを用いるシステムを図１に従ってさらに説明する。
このシステムは、疎水性微粒子担体保持ピペットチップとＸＹＺアーム及び多連ピペットを備えた溶液ハンドリングロボットを用いる。
【００３４】
図１には、各種溶液を充填した容器として、９６ウェルプレートを用い、かつ８つのピペットチップを同時に操作できる多連ピペットを用いた場合について説明する。図１には、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、溶出溶液を充填した容器、疎水性微粒子担体を充填したピペットチップ、ピペットチップを恒温状態にするための恒温槽、及び前記ピペットチップを移動可能とするためのＸＹＺアームが示されている。以下にこの装置の動作について説明する。
【００３５】
１）タンパク質試料溶液を溶液ハンドリングロボットにより変性・還元・アルキル化する（図示せず）。
２）還元アルキル化したタンパク質の溶液を疎水性微粒子担体保持ピペットに吸入し、タンパク質を微粒子表面に固定化する。・・・▲１▼
３）ピペットで緩衝液を吸入・排出することにより、変性還元アルキル化にもちいた試薬を洗浄する。・・・▲２▼
４）疎水性吸着点をマスクするためにブロッキング溶液を吸入・排出する。・・・▲２▼
尚、この工程は、省くこともできる。
５）ピペットで緩衝液を吸入・排出することにより、過剰のブロッキング試薬を洗浄する。尚、この工程は、省くこともできる。・・・▲２▼
６）ピペットでタンパク質分解酵素溶液を吸入。・・・▲３▼
７）恒温室でピペットチップをピペットから脱離して、酵素反応を数時間行う。・・・▲４▼
８）ピペットは新しい、ピペットチップを装着して、上述の１）のタンパク質吸着から繰り返す。
９）酵素反応時間が終了したら、恒温室のピペットチップを再度ピペットに装着して、有機溶媒（アセトニトリル・メタノール）／水溶液を吸入・排出し生成したペプチドを容器に溶出。・・・▲５▼、▲６▼
１０）溶出液中の有機溶媒濃度を窒素ガスを吹き付けることで蒸発させ、溶液の有機溶媒濃度を減少させる。・・・▲６▼
１１）溶出液を、例えば、自動注入器により高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置に注入（図示せず）。
１２）高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置により、ペプチドは分離され、個々のペプチドの分子量を測定する（図示せず）。
【００３６】
以下に、疎水性微粒子担体を保持するカラムを用いたシステムを図２に従ってさらに説明する。
図２に示すシステムは、疎水性微粒子担体を保持したプレカラム型容器と、自動送液システムを含む。
図２には、試料タンパク質溶液を充填した容器、洗浄溶液を充填した容器、酵素溶液を充填した容器、または溶出溶液を充填した容器から自動インジェクターによって、各種溶液が疎水性微粒子担体を充填したカラムに供給され、かつこのカラムは恒温槽中に備えられている。各カラムは、流路切り替えバルブによって、自動インジェクターと接続あるいは切り離される。目的の溶液が自動インジェクターにより供給され、かつ、排出される。また、最終的に断片化されたペプチドは、６方２位置切替バルブによって、位置２にバルブを切り替えることにより、断片化ペプチドを保持したカラムと分離カラムはタンデムに接続される。送液装置（ポンプ）２台をもちいた高圧混合方式により有機溶媒濃度を上昇させることにより、ペプチドはタンデム接続されたカラムから溶出分離され、オンラインで質量分析計へと導入される。
【００３７】
以下にこの装置の動作について説明する。
１）タンパク質試料溶液を溶液ハンドリングロボットによる変性・還元・アルキル化する。
２）６方２位置切り替え電動バルブを位置１に切り替えておく。還元アルキル化したタンパク質の溶液を、自動注入装置をもちい送液システム内に注入し、あらかじめ緩衝液で平衡化してあった、疎水性微粒子担体保持プレカラムに通液する。３）自動注入装置を用いブロッキング試薬溶液を注入する。
尚、この工程は、省くこともできる。
４）自動注入装置をもちいタンパク質分解酵素溶液を注入後、流路切り替えバルブを切り替えてプレカラムを送液から切り離す。
５）酵素反応を数時間行う。酵素反応の間に次のプレカラムで２）〜４）までを行う。
６）酵素反応時間が終了したら、６方２位置切り替え電動バルブを位置２に切り替え、高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置と接続。
７）高速液体クロマトグラフィー−質量分析装置により、ペプチドは分離され、個々のペプチドの分子量を測定する。
【００３８】
ペプチドの一次構造情報収集装置における、断片化ペプチドから一次構造情報を取得するためのユニットは、例えば、質量分析計であることができるが、それ以外に、自動エドマン法等も挙げることができる。
【００３９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００４０】
疎水性微粒子担体としては、アプライドバイオシステム社のＰｏｒｏｓＲ２（粒径２０μｍ）が保持されたピペット型カラムであるポロスチップＲ２（アプライドバイオシステム社）を用い、図１に示す装置を用いた。この疎水性ビーズ上でのタンパク質のトリプシン消化について、以下に説明する。
【００４１】
１．試薬および消耗品
１−１．９６ウェルプレート
プレート１        Ｖ字底プレート（少量の試薬や試料用、ＡＢｇｅｎｅ社ＴｈｅｒｍｏＦａｓｔ９６，Ｓｋｉｒｔｅｄなど）
プレート２        深底プレート（洗浄溶液など１００μＬ以上用、）
【００４２】
１−２．保存溶液
試薬は特に指定しない場合には手に入る最も高純度なものを用いる。水は全て超純水を用いる。
平衡化溶液        ０．０８５％トリフルオロ酢酸水溶液
溶出溶液            ５０％アセトニトリル／０．０８５％トリフルオロ酢酸
洗浄溶液１        アセトニトリル（高速液体クロマトグラフィーグレード）
洗浄溶液２        ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
【００４３】
１−３．用時調製溶液
酵素溶液            ＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社のＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔｒｙｐｓｉｎなど）を１−８ｐｍｏｌ／μＬとなるように２０ｍＭ酢酸に溶  解する。
タンパク質溶液              溶液ハンドリングロボットによりＶ字底９６ウェルプレート内で６Ｍグアニジン塩酸により変性、ジチオスレイトールにより還元、ヨード酢酸によりアルキル化（カルボキシメチル化）した牛血清アルブミン（最終濃度１〜４ｐｍｏｌ／μＬ、各ウェル５０μＬ程度までの容量）を用いる。
【００４４】
２．準備操作
２−１．９６ウェルプレートの設置および試薬の分注
タンパク質試料が入ったプレートと新しいＶ字底プレート２枚、深底プレート３枚を所定の位置に設置する。（図１参照、洗浄溶液１のプレートは図示せず）ピペットラックに２００μＬピペットチップおよびポロスチップＲ２ピペット型カラムを設置する。
【００４５】
液体ハンドリングロボットにより以下の分注作業を行う。
洗浄溶液１をプレート１に１ウェル当たり４００μＬずつ分注する。
洗浄溶液２をプレート１に１ウェル当たり４００μＬずつ分注する。
酵素液をプレートに１ウェル当たり１０μＬずつ分注する。
溶出液をプレートに１ウェル当たり４０μＬずつ分注する。
【００４６】
２−２．前処理
８連ピペッターにポロスチップＲ２を装着して以下の作業を行う。
洗浄溶液１を１００μＬ吸入後廃液だめに排出する。２回繰り返して行う。
洗浄溶液２を１００μＬ吸入後廃液だめに排出する。２回繰り返して行う。
【００４７】
３．試料タンパク質の吸着と変性剤などの夾雑物洗浄
試料溶液を吸入、排出する。１０回繰り返して行う。
洗浄溶液２を１００μＬ吸入後廃液だめに排出する。３回繰り返して行う。
【００４８】
４．酵素による断片化
酵素溶液１０μＬを吸入後、緩衝液中に排出する。その場で２回吸入、排出を繰り返した後に、再度吸入する。
吸入した状態のまま、３７℃の恒温室に用意した９６ウェルプレート上でピペットを脱離。３時間待機する。（試料が８検体以上ある場合には、２−２．から４までを繰り返す。）
【００４９】
５．断片化ペプチドの回収
時間が経過したら、ピペットを装着して酵素溶液を回収用９６ウェルプレートに排出する。分注しておいた溶出液４０μＬを吸入し、その場で２回吸入、排出を繰り返す。再度吸入して回収用９６ウェルプレートに排出する。
回収用９６ウェルプレートの各ウェルに窒素ガスを吹き付け、アセトニトリルを揮発させ溶出液を１０μＬ程度まで濃縮する。（あらかじめ窒素ガスの流量を変えて、１０分程度で濃縮出来る流量を設定する）
【００５０】
６．高速液体クロマトグラフィー質量分析法
自動インジェクターからペプチド試料を注入してＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析し、得られた結果をデータベース検索して解析する。
【００５１】
上記操作方法により牛血清アルブミンをトリプシンにより断片化して得られたベースピーククロマトグラムを図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】疎水性微粒子担体保持ピペットチップを用いた断片化ペプチド作製装置の説明図。
【図２】疎水性微粒子担体保持カラムを用いた断片化ペプチド作製装置の説明図。
【図３】疎水性微粒子担体上でトリプシンにより断片化した牛血清アルブミンのベースピーククロマトグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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