(57)【要約】【課題】生体の定常的に生体電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受ける臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の活性を維持もしくは取り戻す方法を提供すること、および機能馴化された臓器、または組織あるいは構成する細胞を医薬品の薬効評価および毒性試験のための検体として提供すること。【解決手段】生体の定常的に生体電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受ける臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞を、０．５〜５０Ｈｚ、１０ｍＶ〜１０Ｖのパルス電気信号、または、０．５〜５０Ｈｚ、０．１ｍＴ〜１０ｍＴのパルス磁気信号入力下で培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体の定常的に生体電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受ける臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞を、０．５〜５０ＨＺ、１０ｍＶ〜１０Ｖのパルス電気信号、または、０．５〜５０ＨＺ、０．１ｍＴ〜１０ｍＴのパルス磁気信号入力下で培養することを特徴とする臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法。
【請求項２】
臓器が心臓であることを特徴とする請求項１記載の臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法。
【請求項３】
組織が、心筋であることを特徴とする請求項１記載の臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法。
【請求項４】
機能馴化は、臓器、または組織を移植する前に行うことを特徴とする請求項１〜３記載の臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法。
【請求項５】
請求項１〜４の方法で機能馴化された組織、または細胞からなる薬効評価および毒性試験用検体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、生体での組織の移植方法に関する。本発明は特に、常時電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受けている臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法、好ましくは心筋組織の機能馴化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
再生医学の進歩により、胚幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、更に成熟細胞組織中に僅かに存在する組織特有の幹細胞あるいは残存組織そのものを用いて、多くの組織が再生されるようになった。このことは、臓器移植のためのドナー不足という問題の解決に新たな可能性をもたらすものである。
【０００３】
今後の課題として、（１）組織再生のための細胞の増殖、分化効率の向上と、（２）移植のための再生組織の適合性強化が挙げられる。
【０００４】
これらのうち、課題（２）の再生組織の適合性の強化については、現在、一部の臓器、例えば、心筋、神経、骨格筋のようなその組織を構成する細胞自体が生体内で特有の電気活動を行って、臓器特有の電気的環境から常に細胞が電気的入力を受けている臓器、特に心臓を構成する心筋移植の試みは、充分に成功しているとは言いがたい。心筋に対する再生・移植に関しては、例えば、次のような特許文献が報告されている。
【０００５】
【特許文献１】
特表平９−５０５４７１号公報
【特許文献２】
特表２００１−５０２７２０号公報
【特許文献３】
特開２００２−１２８６７６号公報
【特許文献４】
特表２００２−５３５３５８号公報
【０００６】
特許文献１は、心筋細胞または骨格筋芽細胞を哺乳動物の心筋組織に注入した心筋組織を移植体として用いるものであり、移植体の心機能への適応能力について不明な点が多く、必ずしも実験医学の域を出ているとは言えない。特許文献２は、心臓組織に粘膜下組織を培養する方法に関する発明である。特許文献３と特許文献４は、免疫抑制剤に関する発明である。
【０００７】
臓器に対する組織の移植がうまくいかない原因は、主として免疫系による拒絶反応が挙げられている。他の臓器は免疫抑制剤によりかなりの成果が得られているが、心筋組織では、かなりの割合で定着せず、壊死や心臓が不整脈を起こすことがしばしば認められている。特許文献２の技術も組織移植で好結果が得られているものの、移植された心臓は自然収縮が遅い、あるいは心臓が細動する等のトラブルを生じている。
【０００８】
発明者は、生体の定常的に生体電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受ける臓器、または組織を構成する細胞、特に心筋細胞が培養中に次第に外部からの高頻度電気刺激に対する追従能力を失う現象に着目し、その対策について鋭意検討した結果、本発明に到達した。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、生体の定常的に生体電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受ける臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の活性を維持もしくは取り戻す方法を提供することを目的としている。本発明はまた、そのようにして機能馴化された臓器、または組織あるいは構成する細胞を医薬品の薬効評価および毒性試験のための検体として提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、  生体の定常的に生体電気信号を発生し、構成細胞が互いに電気信号を受ける臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞を、０．５〜５０Ｈｚ、１０ｍＶ〜１０Ｖのパルス電気信号、または、０．５〜５０ＨＺ、０．１ｍＴ〜１０ｍＴのパルス磁気信号入力下で活性化することを特徴とする臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法である。
【００１１】
本発明では臓器として、特に心臓を対象とする。
【００１２】
本発明では組織として、特に心筋組織を対象とする。
【００１３】
機能馴化は臓器、または組織を移植する前に行うことが好ましい。
【００１４】
本発明はまた上記方法で機能馴化された組織、または細胞からなる医薬品の薬効評価および毒性試験用検体である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞の機能馴化方法につき詳しく説明する。
【００１６】
本発明の機能馴化方法の対象とする生体とは、人間を始め、犬、ねこ、馬、豚、羊、マウス、ラット等の哺乳動物をはじめ、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、細菌、ウイルス等の微生物、植物をも包含する概念である。これらのうちでは、神経及び心臓を有する動物、好ましくは哺乳類、特に好ましくは人間を対象とする。
【００１７】
本発明で機能馴化方法の対象とされる臓器・組織としては、生体のあらゆる組織、臓器を包含する。これらのなかでは特に、生体内で興奮性の電気刺激が常在する臓器、組織または組織、例えば心臓、骨格筋、平滑筋、末梢神経、脳等の中枢神経、とりわけ心臓と末梢および中枢の神経組織を対象とする。
【００１８】
本発明において移植のために機能馴化する組織としては、上記生体の組織、臓器のうち、常時臓器特有の生体電気信号に晒されている臓器の一部を形成する心筋、すなわち特殊心筋と固有心筋組織を特に対象とする。
【００１９】
本発明で機能馴化するための臓器、組織、あるいは細胞は、生体から摘出・採取したものに限定されず、例えば、胚幹細胞（ＥＳ細胞）、造血幹細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞から分化・培養して得た組織も、用いることができる。
【００２０】
本発明で移植のために機能馴化する臓器、組織、または細胞は、生体、例えばＭＨＣを人間のそれに適合させたトランスジェニックブタ等の哺乳類の臓器の一部から摘出した臓器、組織、または細胞でありうる。
【００２１】
本発明で機能馴化するための組織は、例えば生体、例えば哺乳動物、例えば人間から採取した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させて得た組織でありうる。
【００２２】
本発明では、上記方法で得た組織を培養条件下で機能馴化を行なう。この機能馴化は、対象の臓器、組織または細胞を、培地を含有する容器に入れて行なう。
【００２３】
なお、本発明における機能馴化とは、移植用に培養・増殖させたあるいは摘出した臓器、組織または細胞が、本来の臓器、組織と同様に生体の電気的興奮入力に適応できるように、一定期間電気的刺激雰囲気内に晒す操作をいう。なお、以後、本案件におけるこれらの操作を一括して「機能馴化」という。
【００２４】
本発明の機能馴化方法において用いることのできる培地としては、通常はＮａ、Ｍｇ、Ｃａ等の金属イオンを含んだ生理食塩水に各種アミノ酸、例えばＬ−アルギニン，  Ｌ−シスチン，  Ｌ−グルタミン，  Ｌ−ヒスチジン、及び各種ビタミン、例えば葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド、ピリドキサール、リボフラビン等を含んだ培地、好ましくはＥａｇｌｅの  ＭＥＭ培地あるいはＤｕｌｂｅｃｃｏ＆Ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ  培地としてバイオフルイド社から入手できる培地等を用いることができる。
【００２５】
対象を機能馴化するための温度は、通常１０℃から４５℃、好ましくは３０℃から３７℃の範囲である。
【００２６】
上記培地に従来から組織の再生において提案されている各種サイトカイン類、例えばインターロイキン類，ニューロトロピン類，血小板由来成長因子，上皮成長因子，線維芽細胞成長因子を１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの範囲の量で配合することが好ましい。
【００２７】
本発明の機能馴化方法では、機能馴化中に対象に対して電気信号を与える。電気信号はパルス電気信号もしくはパルス磁気信号であることが好ましい。機能馴化する際、電気信号は連続的に与えてもよいし、断続的に与えてもよい。
【００２８】
対象に電気信号を与える方法としては、培地および／または機能馴化対象に電極を接触させて０．５〜５０ＨＺ、好ましくは１〜１０ＨＺ、１０ｍＶ〜１０Ｖ、好ましくは１００ｍＶ〜１Ｖのパルス電気信号を与えることが必要である。
【００２９】
本発明における機能馴化方法においては、電気的刺激は、最初は低電圧とし、徐々に強度を増加させるようにすることが好ましい。
【００３０】
上記方法において与える電流は、パルス信号として流すことが必要である。このため、上記方法において電気流を与える装置は、一定の間隔で電流をパルス状に変化させうる、すなわちパルス電流を発生させうるファンクションジェネレーターと連結されていること好ましい。
【００３１】
機能馴化すべき対象に電気信号を与える他の方法としては、図．１に示したように機能馴化すべき対象、好ましくは機能馴化すべき対象の入った容器を磁場、好ましくは磁束密度を変動させうる磁場におき、磁場の磁束密度を変化させることにより機能馴化すべき対象内部に渦電流を発生させる方法を挙げることもできる。
【００３２】
上記の磁束密度を変動させうる磁場としては、例えば電磁石で知られているように電線をコイル状にまき、その中心部に移植すべき対象、好ましくは機能馴化すべき対象の入った容器を置き、コイルに電流、好ましくはパルス電流を与えてコイル内の磁束密度を変化させることにより機能馴化すべき対象内の渦電流の強度をパルス的に変化させる、すなわちパルス信号として与えることができる。この後者の方法は機能馴化すべき対象に電極等の異物を接触させることなく刺激が可能である点からより好ましい。
【００３３】
このとき機能馴化すべき対象に与える磁気信号は０．５〜５０ＨＺ、好ましくは１〜１０ＨＺ、０．１ｍＴ〜１０ｍＴ、好ましくは０．５ｍＴ〜５ｍＴ範囲のパルス信号とすることが必要である。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の機能馴化方法で興奮性入力に慣らされた臓器、または組織、あるいはこれらを構成する細胞は、生体電気信号に馴らされているため、例えば、移植後直ちに移植されて臓器において生体電気信号を受けても周囲組織と協調した興奮伝導を行うことができる。特に心筋組織の移植において、従来の方法で作成された移植体より極めて高い適応能を有しかつ、移植体が不整脈等の発生源となることを極力防止できる。また、本発明の機能馴化方法による処置を受けた組織、または細胞、特に心筋組織や心筋細胞は常に生理的条件に近い刺激追従能力を保持しているので、より信頼性の高い循環器作用薬の薬効評価および毒性試験用の検体として利用することができる。
【００３５】
【実施例】
以下に、本発明の好適な実施例を示す。なお、下の実施例に示される材料、使用量、割合、手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００３６】
（機能馴化細胞の観察）
以下の実施例、比較例における機能馴化心筋の電気刺激に対する応答性の変化と磁気刺激による機能回復については、位相差顕微鏡に取り付けたデジタルム−ビ−カメラを用いて１例ごとに３５秒間の動画デ−タを取得保存し、心拍数の測定と集計を行った。
【００３７】
（磁気発生装置）
図１に示した磁気発生装置を用いた。
【００３８】
（心筋組織の摘出／活性化）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（３〜４週令）より心臓を摘出し、カナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）を含む無カルシウム・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））にて２〜３回洗浄後、３ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（ｔｙｐｅ１，Ｓｉｇｍａ）を含む同ＰＢＳ（−）にて３７℃，３０ｍｉｎ、ランゲンドルフ法による灌流処置を行った。
【００３９】
【参考例１】
コラゲナーゼ処置した心臓切片を同ＰＢＳ（−）にて２〜３回洗浄後、先端径をバーナー炎で小さくした（２００〜４００ｍｍ）パスツールピペットを用いて、ピペツテイングにより細胞を単離した。そのようにして作った細胞懸濁液を遠心分離し、沈降した細胞塊を、カルシウムを含む通常のＰＢＳに懸濁し、適量をプレインキュベーション済みの培養用ｄｉｓｈに２０００〜３０００／ｄｉｓｈの細胞数で播いて温度３７℃、湿度９９％、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養を開始した。培養開始２４ｈ後、ＥＡＧＬＥｓ培地を交換し培養をつづけた。なお、プレインキュベーションは、１０％ウシ胎児血清を含むＥＡＧＬＥｓ培地（日本水産）１．５ｍｌを、３５ｍｍカルチャーｄｉｓｈ（ＦＡＬＣＯＮ，３８０１）に入れ、０．５〜１時間行った。
【００４０】
（機能馴化結果）
培養の時間経過とともに、活性化心筋の心拍数が、本来のマウスの心拍数（４８６〜７３８回／分、すなわち８．１〜１２．３ＨＺ）から低下し、さらに培養二週間目には電気刺激（強度３Ｖ，持続３ｍｓｅｃ）に対する刺激応答性、すなわち培養した心筋細胞の追従可能な刺激頻度が２〜５Ｈｚにまで低下した。
【００４１】
【実施例１】
（移植前機能馴化操作）
上記活性化二週間目の心筋細胞で構成された組織に対し、上記磁気刺激装置を用いて、６ｍＴの磁気刺激を応答性の強さに応じて１〜１０ＨＺの頻度で３日間与えた。図２に培養中の心筋細胞の写真を示す。１２例全ての刺激応答性が回復し、１０ＨＺの上記電気刺激に追従可能であった。
【００４２】
【比較例１】
実施例１において、磁気刺激を与えないで実施例１と同様にして、二週間の心筋細胞の培養を行った。
【００４３】
（刺激応答性の検討結果）
培養１４日目の心筋組織の電気刺激（強度３Ｖ，  持続３ｍｓｅｃ）に対する追従可能な頻度は、検討した全例（１１例）において僅か２〜５ＨＺであり、１０ＨＺ以上の刺激に対する応答性の回復は全く見られなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の馴化方法で用いられる装置の１例を示した概略図である。
【図２】図２は、本発明の馴化方法で培養中の心筋細胞の１例の写真である。
【図１】
2004305120.tif 000002
【図２】
2004305120.tif 000003