(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒ素汚染土壌において、低コストで簡単にヒ素を除去することが可能な方法を提供する。【解決手段】Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）は、ヒ酸を還元して亜ヒ酸にしてヒ素を溶出することが可能である。したがって、前記菌株を用いれば、ヒ素汚染土壌のバイオレメディエーションプロセスを構築することができ、その結果、低コストで簡単にヒ素を除去できる。また、ＳＦ−１株はヒ酸を可溶性の亜ヒ酸に変えることができるから、ヒ素汚染土壌を水洗浄することができ、これによってヒ素濃度を低下させることができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒ酸を還元して亜ヒ酸にする方法であって、ヒ酸をBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）で処理することにより、亜ヒ酸にすることを特徴とする方法。
【請求項２】
Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）によるヒ酸の還元が、pH7.2〜9.4の範囲で行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）が、酸素抵抗性である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）が、硝酸抵抗性である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
固相中に存在するヒ酸の溶出方法であって、請求項１〜４のいずれかに記載の方法により、前記ヒ酸を還元して亜ヒ酸にして固相から溶出する方法。
【請求項６】
前記固相が、ヒ酸と、他の物質とから形成される化合物である請求項５に記載の固相から溶出する方法。
【請求項７】
前記固相中のヒ酸が、他の物質に吸着しているヒ酸である請求項５に記載の固相から溶出する方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により、ヒ酸を亜ヒ酸に還元して、ヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれかに記載の固相から溶出する方法により、ヒ酸を亜ヒ酸に還元して、亜ヒ酸を溶出させるヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１０】
亜ヒ酸を、回収して濃縮する請求項８または９に記載のヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１１】
Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含むヒ素汚染土壌の浄化剤。
【請求項１２】
ヒ酸を亜ヒ酸に還元するバイオリアクターであって、担体の表面上に担持されたBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含むバイオリアクター。
【請求項１３】
さらに、カラムを含み、前記カラムの中に、前記担体の表面上に担持されたBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）が配置されている請求項１２記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
ヒ素汚染土壌を浄化する方法であって、
請求項１２または１３に記載のバイオリアクターに、ヒ素汚染土壌を供給し、
前記バイオリアクター中で、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元し、ついで、
亜ヒ酸を前記汚染土壌から溶出することによりヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１５】
ヒ素汚染土壌が配置されたカラムを準備し、このカラムの一端から、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含む液を通水し、前記カラム中で、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元し、かつ前記亜ヒ酸を前記水に溶解させ、ついで、亜ヒ酸を含む前記水を、前記カラムの他端から排出することによりヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１６】
前記ヒ素汚染土壌がスラリー状であり、前記スラリーの固形分濃度が５０重量％以下である請求項１５に記載のヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１７】
前記ヒ素汚染土壌が、硝酸を含む請求項１４〜１６のいずれかに記載のヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１８】
前記ヒ素汚染土壌中のヒ酸の還元が、静置して行われる請求項１５〜１７のいずれかに記載のヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【請求項１９】
前記ヒ素汚染土壌中のヒ酸１ｇに対し、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を１．０×１０10cells以上用いる請求項１５〜１８のいずれかに記載のヒ素汚染土壌を浄化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒ酸を還元して亜ヒ酸にする方法およびそれを用いたヒ素汚染土壌の浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、主に先進国において都市部の再開発等が進む中、しばしば工場跡地等から高濃度のヒ素が検出され問題となっている。米国では、2001年度版有害物質優先リストにおいて、第1位に指定されており(非特許文献１)、わが国においても平成10年3月までの土壌環境基準超過件数に占める割合が鉛についで第2位と高い位置を占めている(非特許文献２)。また、土壌中へのヒ素の人為的排出源のうち約40%を商業製品の廃棄が占め(非特許文献３)、最近では半導体産業においてはガリウムヒ素の使用量が増加傾向を示していることから(非特許文献４、非特許文献５)、土壌を中心とした環境汚染の危険性は益々高くなるものと懸念されている。さらに、金属という性質上、有機物による汚染とは異なり、分解による無害化は期待できないため、なんらかの対策を施さない限り汚染現場に蓄積し、半永久的に残存することになる。現在、このような汚染土壌に対しては、主に撤去や封じ込め、キレート剤の添加による不溶化などの対策がとられているが、これらの処理は高コストであるうえ処理後の安全性についても疑問視する声がある。そのため、低コストで汚染土壌中のヒ素を除去することのできる効率の良い汚染土壌浄化プロセスの構築が望まれている。
【非特許文献１】Agency for Toxic Substances and Disease Registry(ATSDR), U. S. Department of Health and Human Services(HHS) (2001) Federal Register 66(207) 54014-54016
【非特許文献２】森澤眞輔 (2000) 地下水・土壌汚染の生物利用浄化修復技術の現状と課題 環境技術 29(5) 361-366
【非特許文献３】Nriagu O. J., J. M. Pacyna (1988) Quantitative assessment of worldwidecontamination of air, water and soils by trace element Nature 333(12) 134-139
【非特許文献４】石黒三郎, 田辺誠 (1999) 高純度ヒ素,リン 工業レアメタル 115 28-30
【非特許文献５】前田滋 (1999) ヒ素・アンチモン化合物の環境影響 別冊化学工業：化学物質とダイオキシン対策 42(2) 68-71
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、ヒ素汚染土壌から低コストで容易にヒ素を除去できる方法の提供を、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明は、ヒ酸を還元して亜ヒ酸にする方法であって、ヒ酸をBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）で処理することにより、亜ヒ酸にすることを特徴とする方法である。
【０００５】
このように、前記菌株を用いれば、鉄、アルミニウム酸化物等の土壌粒子への吸着性が低い亜ヒ酸にすることができる。従って、本発明の方法により、ヒ酸を還元して亜ヒ酸にすれば、ヒ素汚染土壌からヒ素を容易に除去でき、しかも微生物を使用するため、そのコストも低い。
【０００６】
つぎに、本発明の固相中に存在するヒ酸の溶出方法は、前記本発明の方法により、前記ヒ酸を還元して亜ヒ酸にして、固相から溶出する方法である。
【０００７】
このように、前記菌株を用いれば、不溶性のヒ酸を可溶化することができる。したがって、本発明の方法により、ヒ酸を還元して亜ヒ酸にすれば、ヒ素汚染土壌からヒ素を容易に除去でき、しかも微生物を使用するため、そのコストも低い。
【０００８】
つぎに、本発明のヒ素汚染土壌の浄化方法は、前記本発明の方法により、ヒ酸を亜ヒ酸に還元して、ヒ素汚染土壌を浄化する方法である。また、本発明のヒ素汚染土壌の浄化方法は、前記本発明の固相から溶出する方法により、ヒ酸を亜ヒ酸に還元して溶出させることによりヒ素汚染土壌を浄化する方法である。溶出させた亜ヒ酸は、回収して濃縮して処理してもよい。濃縮物は、ヒ素資源として利用可能である。
【０００９】
つぎに、本発明のヒ素汚染土壌の浄化剤は、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含むものである。この浄化剤は、例えば、それ単独で、若しくは所定の培地とともに、ヒ素汚染土壌に散布する等して使用できる。
【００１０】
つぎに、本発明のバイオリアクターは、ヒ酸を亜ヒ酸に還元するバイオリアクターであって、担体の表面上に担持されたBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含むバイオリアクターである。
【００１１】
つぎに、本発明のヒ素汚染土壌を浄化する方法は、本発明のバイオリアクターに、ヒ素汚染土壌を供給し、前記バイオリアクター中で、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元し、ついで、亜ヒ酸を前記汚染土壌から溶出することによりヒ素汚染土壌を浄化する方法である。
【００１２】
つぎに、本発明のヒ素汚染土壌を浄化する方法は、ヒ素汚染土壌が配置されたカラムを準備し、このカラムの一端から、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含む液を通水し、前記カラム中で、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元し、かつ前記亜ヒ酸を前記水に溶解させ、ついで、亜ヒ酸を含む前記水を、前記カラムの他端から排出することによりヒ素汚染土壌を浄化する方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ酸を亜ヒ酸に、特に、固相中のヒ酸を亜ヒ酸に還元することが可能である。また、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）は、酸素および硝酸に対し抵抗性を有し、多用な物質を炭素源として利用することができ、弱酸性からアルカリ性の領域の広いｐＨ領域において、ヒ酸を還元して可溶型の亜ヒ酸にできる。したがって、本発明の方法を、ヒ素汚染土壌の浄化に適用すれば、有用なバイオレメディエーションプロセスの構築が可能であり、これによって低コストで簡単にヒ素を除去できる。また、本発明によれば、ヒ酸を還元して可溶性の亜ヒ酸にすることができるから、例えば、ヒ素汚染土壌を水洗浄することができ、ヒ素濃度を低下させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１５】
本発明において、前記Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）によるヒ酸の還元は、例えば、pH7.2〜9.4の範囲で実施することが可能である。したがって、本発明が適用できる土壌汚染の範囲は広い。
【００１６】
本発明において、前記Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）は、酸素抵抗性である。したがって、この菌株は、取り扱いが容易であり、汚染土壌の浄化が簡単に実施できる。
【００１７】
本発明において、前記Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）は、硝酸抵抗性である。従って、汚染土壌から硝酸を予め除去する必要はなく、汚染土壌の浄化が簡単に実施できる。
【００１８】
本発明において、前記固相は、ヒ酸と、他の物質とから形成される化合物であってもよいし、または前記固相中のヒ酸は、他の物質に吸着しているヒ酸であってもよい。土壌中のヒ酸は、他の物質と化合物を形成していたり、他の物質に吸着していたりするが、前記菌株は、いずれの状態であってもヒ酸を還元して亜ヒ酸にすることが可能である。土壌中において、例えば、ヒ酸は、鉄と塩を形成し、ヒ酸鉄（FeAsO4）を形成していたり、オキシ水酸化鉄（Fe(III)x(O)y(OH)z）や、水酸化アルミニウム（Al(OH)3）等に吸着しているが、前記菌株によれば、これらの形態のヒ酸を、還元して、可溶性の亜ヒ酸にすることができる。
【００１９】
本発明のバイオリアクターは、前述のように、ヒ酸を亜ヒ酸に還元するバイオリアクターであって、担体の表面上に担持されたBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含むバイオリアクターである。このバイオリアクターは、さらに、カラムを含み、前記カラムの中に、前記担体の表面上に担持されたBacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）が配置されているのが好ましい。図１に、本発明のバイオリアクターの一例の模式図を示す。図１において、１はバイオリアクターであり、２はSF-1株が担持された担体であり、３はカラムである。図１において前記バイオリアクター１は、１箇所の入口と１箇所の出口を備えているカラム３を含み、前記カラム３の内部には、前記担体２が配置されている。図１における前記バイオリアクターは、例えば、前記入口から、ヒ素汚染土壌を供給し、前記バイオリアクター中で、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元し、ついで、亜ヒ酸を前記汚染土壌から溶出することにより、ヒ素汚染土壌を浄化することができる。
【００２０】
前記バイオリアクターにおいて用いられる担体としては、例えば、多孔質担体とゲル担体が挙げられる。多孔質担体としては、ポリウレタン多孔体、セルロース担体、ポリプロピレン多孔体、ポリビニルホルマール多孔体、セラミックス多孔体などがある。ゲル担体としては、ポリアクリルアミドゲル担体、ポリエチレングリコールゲル担体、ポリビニルアルコールゲル担体、アルギン酸ゲル担体、さらには熱可塑性吸水ゲル担体などがある。前記Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、生化学的特異結合法等により、前記担体上に、担持されることができる。
【００２１】
本発明の別のヒ素汚染土壌を浄化する方法は、前述のように、ヒ素汚染土壌が配置されたカラムを準備し、このカラムの一端から、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を含む液を通水し、前記カラム中で、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元し、かつ前記亜ヒ酸を前記水に溶解させ、ついで、亜ヒ酸を含む前記水を、前記カラムの他端から排出することによりヒ素汚染土壌を浄化する方法である。この汚染土壌を浄化する方法において、前記ヒ素汚染土壌がスラリー状であり、前記スラリーの固形分濃度は５０重量％以下であるのが好ましい。前記スラリーの含水率を低く保てるので、ヒ素汚染土壌を含むカラムの容積を小型化できるからである。
【００２２】
前記ヒ素汚染土壌を浄化する方法において、前記ヒ素汚染土壌は、硝酸を含んでいてもよい。前記ヒ素汚染土壌から硝酸を除去しなくとも、前記Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ酸を亜ヒ酸に還元することができ、ヒ素汚染土壌を簡単に浄化でき、好ましい。
【００２３】
前記カラムを用いるヒ素汚染土壌を浄化する方法において、前記ヒ素汚染土壌中のヒ酸の還元は、静置して行われてもよい。攪拌しなくとも、前記Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）により、ヒ酸を亜ヒ酸に還元することができ、ヒ素汚染土壌を簡単に浄化できるので、好ましい。
【００２４】
前記カラムを用いるヒ素汚染土壌を浄化する方法において、前記ヒ素汚染土壌中のヒ酸１ｇに対し、Bacillus spp. SF-1株（FERM P-15431）を１．０×１０10cells以上用いてもよい。前記SF-1株を高濃度で含む液を通水しなくとも、ヒ素汚染土壌中のヒ酸を亜ヒ酸に還元することができるので、ヒ素汚染土壌を簡単に浄化できるので、好ましい。
【実施例１】
【００２５】
以下、本発明の実施例について、説明する。
【００２６】
（実施例１）
本実施例では、以下に示す材料および方法により、Bacillus sp.SF-1株によるヒ酸還元の基本的特性について確認した。
【００２７】
（供試培地）
本実施例では、下記表１に示した無機塩培地に炭素源として20mM乳酸(乳酸無機塩培地)、もしくは2g/Lグルコース(グルコース無機塩培地)を添加したものを液体培地として用いた。ここで、特に記載のない限り、培地の調製には50mM トリス-HClバッファーを用い、pH を8.0としている。また、菌体の短期的保存に用いる固形平板培地として、セレン酸をナトリウム塩として5mM含むCGY培地(Casitone 5g/L, Glycerol 5g/L, Yeast extract 1.0g/L, Agar 18g/L)を、NaOHによりpH 8.0に調整して用いた。
【００２８】
【表１】
2004305213.tif 000003
【００２９】
（増殖を伴う培養系）
50mL容量バイアルビン内に分注したグルコース無機塩培地20mLに、セレン酸5mMを含むCGY平板培地上のSF-1株を1白金耳接種し、綿栓でふたをした好気条件下において回転振盪培養(120rpm, 30℃)を12時間行った(前々培養)。さらに、培養液1mLを同組成の培地に植え継ぎ、同様の条件下で8時間培養(前培養)後、菌体を遠心分離で回収し(6010×g, 10min.)、3.0mLのトリス-HClバッファー(pH 8)に懸濁したものを植種源としてヒ酸還元試験に用いた。本試験ではこれを、所定濃度のヒ酸塩(Na2HAsO4)を含む乳酸無機塩培地20mLに0.2mLずつ接種し(初期菌体濃度：約3-5×107 cells/mL)、嫌気条件下(ブチルゴム栓およびアルミキャップでバイアルビンを密栓、気相部を窒素置換)において回転振盪培養した(120rpm, 30℃)。なお、本実施例用の培養系バイアルビンはサンプリングの数に応じて用意し、各サンプリング時に溶液全量を回収して分析に供した。
【００３０】
（Resting cell系）
上記増殖を伴う培養系と同様に前々培養を12時間行った後、培養液1mLを10mMヒ酸塩を含む乳酸無機塩培地20mLに植え継ぎ、嫌気条件下(ブチルゴム栓およびアルミキャップでバイアルビンを密栓、気相部を窒素置換)において8時間回転振盪培養(120rpm, 30℃)を行った。培養終了後、菌体を遠心分離(6010×g, 10min.)で回収し、5mLトリス-HClバッファー(pH 8)に懸濁した。その後、同様に作成した5mL菌体懸濁液5本を1つにまとめボルテックスで攪拌し遠心分離を行うことによって菌体の洗浄・回収を行い、3mLトリス-HClバッファーで懸濁したものを植種源としてヒ酸還元試験に用いた。本実施例ではこれを、所定濃度のヒ酸塩と5mM乳酸ナトリウムを含むトリス-HClバッファー(pH 8)に0.2mLずつ接種し、嫌気条件下において回転振盪(120rpm, 30℃)を行った。サンプリングは培養を伴う系と同様とした。
【００３１】
（pHの影響の検討）
ヒ酸還元試験において、pHを変化させる場合には、試験に供する溶液をトリス-HClバッファー(pH 7.2-9.0)、あるいはグリシン-NaOHバッファー(pH 9.4-10.0)を用いて調製した(阿南ら, 1976)。また、pH6.5の条件にするため、リン酸バッファー、及びクエン酸Na-NaOHバッファーにより試験を試みたが、高濃度のリン酸、及びクエン酸がヒ酸測定を妨害したため、バッファーを加えずにpHを調整した(実験開始前pH:6.51−終了時:6.61)。なお、植種源の調製にも所定pHのバッファーを使用した。
【００３２】
（分析）
溶液中の全ヒ素濃度は原子吸光度計(Seiko SAS 7500A フレーム分析)を用いて測定した。ヒ酸の分析はイオンクロマトグラフィー(ダイオネクス社 DX-300、分離カラム：Ion Pac AS4A-SC、ガードカラム：AG4S-SC、サプレッサー：ASRI-ULTRA、検出器：CDM-3 conductivity detector、溶離液：17mM NaHCO3-18mM Na2CO3もしくは30mM Na2CO3、溶離液流量：1.0ml/min)を用いて行った。また、溶液中の亜ヒ酸濃度は、サンプルに9.1mM H2O2を添加して全量をヒ酸に酸化し、酸化したサンプルと未酸化サンプル中のヒ酸濃度の差からを算出した。サンプルはマイクロフィルター(DISMIC-25cs Disposable syringe filter unit :Cellulose acetate 0.45μm、ADVANTEC)でろ過し、懸濁物質を除去して分析に供した。
【００３３】
（菌体数の計測）
総菌数はカウンティングチャンバーの60〜100区画内の菌数を位相差顕微鏡AFX-DX(NiKon)により直接計測し、その平均値によって示した。また、菌体増殖の指標として分光光度計(UV-1200 SHIMADZU)により測定したOD650を用いた。
【００３４】
（ヒ酸還元能の確認）
増殖を伴う培養系において、SF-1株のヒ酸還元能の確認を行った。その結果を、図２のグラフに示す。図示のように、ヒ酸初期濃度1mMで実験を行った結果、実験開始6時間以内に、ほぼすべてのヒ酸［As(Ｖ)］が亜ヒ酸［As(III)］に還元された。しかし、SF-1株は、ヒ酸を亜ヒ酸に還元する能力は有しているが、亜ヒ酸をさらに還元することはできなかった。なお、菌体を加えていないコントロール系では、溶液中のヒ酸の減少及び亜ヒ酸の増加は認められなかった。
【００３５】
（ヒ酸還元及び増殖特性）
SF-1株のヒ酸還元能、及びヒ酸還元に伴う菌体増殖を確認した結果を図３のグラフに示す。初期ヒ酸濃度5、及び10mMで実験を行った系（図３Ａ）では、実験開始16時間後にはほぼ全てのヒ酸が還元された。また、還元の進行に伴って菌体の増殖が認められ、還元終了とともに増殖が停止したことから、SF-1株はヒ酸を嫌気呼吸の最終電子受容体として利用し、還元しているものと推測された。さらに、初期ヒ酸濃度20、及び50mMで実験を行った系においてもヒ酸の還元が確認された(図３Ｂ)。これまで、50mMという高濃度下での還元試験の報告例はないことから、これらの結果から、SF-1株が高いヒ酸還元能を有していることが示唆された。また、SF-1株はわずか2〜4時間の誘導期の後速やかにヒ酸還元を開始し、10mMのヒ酸を実験開始16時間後にほぼすべて還元し終えるという高い活性を示した。このことから、SF-1株は、取り扱いが容易であり、かつ高いヒ酸還元能を有していることが確認されたものといえ、バイオレメディエーションプロセスへ導入する菌株として適している可能性が示された。
【００３６】
（ヒ酸還元に及ぼす濃度の影響）
前述のように、SF-1株によるヒ酸還元が50mMという高濃度下においても進むことが明らかとなったが、高濃度域において増殖の低下が認められ、それに伴ってヒ酸還元が低下する傾向が示された。そのため、還元に及ぼすヒ酸濃度の影響を確実に評価するため、resting cell系により実験を行い、各濃度におけるヒ酸還元速度を算出した。その結果を図４のグラフに示す。図示のように、ヒ酸濃度13mM付近までは濃度の上昇に伴い還元速度の増加が確認されたが、約20mMから低下が見られ、その後はほぼ一定となった。このことから、高濃度域においてもヒ酸還元は進むものの、20mM以上では、ヒ酸の還元割合が一定になることが明らかとなった。
【００３７】
（ヒ酸還元に及ぼすpHの影響）
SF-1株のヒ酸還元に及ぼすpHの影響について、resting cell系を用い評価した。その結果を、図５のグラフに示す。図示のように、SF-1株は、pH7.2〜9.4の範囲でヒ酸の還元能力が高く、ヒ酸還元反応の最適pHは9.0であった。また、pH6.5においても若干の還元が確認され、pH7.2及び9.4においてもヒ酸還元が確認されたことから、中性付近や高アルカリ域においても菌体濃度を高く保つことによって、効率の良い還元が可能である。
【００３８】
（実施例２）
本実施例では、以下の手法および条件により、Bacillus sp. SF-1株のヒ酸還元に影響を及ぼす因子等について確認した。
【００３９】
（resting cell系：炭素源の影響）
前述の実施例１のresting cell系と同様にして用意した植種源を、ヒ酸塩1mM、及び各種炭素源5mM(合成下水を炭素源とした場合はTOC 1.0g/L 成分：肉エキス0.4g/L ペプトン0.6g/L 尿素0.1g/L 、またYeast extractを炭素源とした場合は1.0g/L)を含むトリス-HClバッファー(pH 8)に0.2mL接種し(初期菌体濃度：3.1-3.7×107 cells/mL)、嫌気条件下において回転振盪(120rpm, 30℃)を行った。サンプリング方法は、前述の実施例１に準じた。
【００４０】
（増殖を伴う系培養：酸素の影響）
前述の実施例１の増殖を伴う培養系と同様に用意した植種源を、1mMのヒ酸塩を含む20mL乳酸無機塩培地に0.2mLずつ接種し(初期菌体濃度：約3-5×107 cells/mL)、好気培養(綿栓でふたをして回転振盪:120rpm、30℃)、静置培養(綿栓でふたをして30℃インキュベーターに静置)、及び嫌気培養(前記実施例１参照)により実験を行った。なお、共存物質の影響を調べる場合は、1mMヒ酸、硝酸、亜硝酸、セレン酸をそれぞれ組み合わせて添加した乳酸無機塩培地を用い、嫌気培養により実験を行った。ここで、培地に加えたヒ酸、硝酸、亜硝酸、セレン酸はナトリウム塩として加えた。サンプリング及び供試培地は、前述の実施例１に準じた。
【００４１】
（固相中のヒ酸の還元的可溶化）
50mL容バイアルビンに分注した2mMヒ酸塩を含むトリス-HClバッファー(pH8)に、塩化第二鉄(FeCl3)10mMもしくは硫酸アルミニウム(Al2(SO4)3・16H2O)5mMを加え全量を10mLとした後、約1時間振盪し共沈殿作用により溶液中のヒ酸を全量固相へ移行させた。その後、2倍濃度の乳酸無機塩培地を10mL加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓して気相部を窒素置換した後、約12時間静置した。手法は、前記実施例１の増殖を伴う培養系と同様に用意した植種源0.2mLを、上記のバイアルビンに接種し、嫌気条件下において回転振盪培養を行った(120rpm、30℃)。なお、バイアルビン内のヒ酸、Fe及びAlの終濃度は、それぞれ1mM、及び5mMとした。サンプリング方法は、前記実施例１に準じた。
【００４２】
（分析）
溶液中の全ヒ素及び全鉄濃度は原子吸光度計(Seiko SAS 7500A フレーム分析)を用いて測定した。ヒ酸、硝酸、亜硝酸、セレン酸、亜セレン酸、Fe(III)、Fe(II)の分析はイオンクロマトグラフィー(ダイオネクス社 DX-300 分析条件：Table.3-1)を用いて行った。サンプルはマイクロフィルター(DISMIC-25cs Disposable syringe filter unit :Cellulose acetate 0.45μm、ADVANTEC)でろ過し、元素態セレンの蓄積の見られるものについてはさらに遠心分離を行い、懸濁物質を除去して分析に供した。以下の表２に、クロマトグラフィの条件を示す。
【００４３】
【表２】
2004305213.tif 000004
【００４４】
(菌体数の計測)
総菌数はカウンティングチャンバーの60〜100区画内の菌数を位相差顕微鏡AFX-DX(NiKon)により直接計測し、その平均値によって示した。
【００４５】
（炭素源の影響）
これまでの研究により、SF-1株は、Yeast extractを増殖の炭素源として用いている可能性が示されている。そのため、培地中のYeast extract濃度を0.1g/Lにおさえ、増殖を伴う培養系においてヒ酸還元に及ぼす炭素源の影響を検討したところ、炭素源を加えていないコントロール系においても培養開始8時間後に60%程度のヒ酸が還元された。よって、炭素源の影響を確実に評価するために、バッファーに炭素源とヒ酸のみを加えたresting cell系を用いて実験を行った。その結果を、図６のグラフに示す。図示のように、乳酸等の有機酸やグルコース等の糖類を添加した系ではヒ酸の還元が見られるものの、炭素源を添加していないコントロール系やフェノール、エタノール、メタノールを添加した系ではヒ酸還元が確認されなかった。このことから、SF-1株は有機酸や糖類を幅広くヒ酸還元の電子供与体として利用することができるが、フェノール等芳香族化合物やエタノール、メタノール等は利用できないことが明らかとなった。また、効率は必ずしも高くなかったが、発酵の最終代謝産物である酢酸を利用できたうえ、合成下水を添加した系においても速やかな還元が見られたことから、実際の汚染土壌に適用する際には、比較的容易に炭素源を確保することができるといえる。
【００４６】
（酸素の影響）
ヒ酸還元に及ぼす酸素の影響を検討するため、好気、静置、嫌気の各条件下で増殖を伴う培養系により1mMヒ酸の還元試験を行った。その結果を図７に示す。同図左は、ヒ酸還元における酸素の影響を示すグラフであり、同図右は、１ｍＭヒ酸含有培地におけるSF-1株の増殖を示すグラフである。図７に示すように、好気条件下では菌体の大幅な増殖がみられるものの、ヒ酸還元はほとんど進まなかった。また、静置条件下では嫌気条件下と比べると若干のラグが認められたものの、実験開始12時間後までには1mMのヒ酸がほぼ全量亜ヒ酸に還元された。このことから、SF-1株によるヒ酸の還元は、酸素の存在により阻害を受けるといえるが、厳密に嫌気条件を保つ必要は無いことが明らかとなった。また、好気条件下においては、菌体は増殖したが、ヒ酸の還元はほとんど認められなかったことから、SF-1株によるヒ酸の還元はヒ素耐性機構によるものではなく、嫌気呼吸によるものであることが裏付けられた。これまでに報告されているヒ酸還元菌は、酸素への抵抗性が低いため、微好気条件下でのヒ酸還元の報告例はない。これに対し、SF-１株は、酸素存在下でも増殖可能であり、しかも厳密な嫌気条件にしなくてもヒ酸を還元できるため、SF-1株は、ヒ素汚染土壌の浄化において、実用上優れた特性を有しているといえる。
【００４７】
（固相中のヒ酸の還元的可溶化）
Fe(III)-As(Ｖ)共沈殿物を含む培地にSF-1株を加え、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認実験を行った結果を図８のグラフに示す。実験期間中、時間の経過とともに溶液中の全ヒ素濃度が増加し、実験開始170時間後には固相中に含まれていたヒ酸の32.2%が溶液中へと可溶化された。また、溶液中にはヒ酸が検出されなかったことから、ほとんどが亜ヒ酸として溶出しているものと考えられた。さらに、図９のグラフに示すように、亜ヒ酸の溶出に伴いFeの溶出が確認され、そのほとんどがFe(III)として検出された。一般に、Fe(III)塩を用いたヒ酸の共沈殿反応には、難溶性のヒ酸鉄(FeAsO4)の沈殿生成反応と、オキシ水酸化鉄(III)（Fe(III)xOy(OH)z）コロイドへの吸着の二通りのメカニズムが考えられている。以上の結果を総合すると、SF-1株は、Fe(III)をFe(II)へ還元する能力は有しておらず、ヒ酸鉄鉱物中のヒ酸を直接還元することで溶出しているものといえる。なお、図８および図９に示すように、菌体を加えていないコントロール系ではヒ素及びFeの溶出は確認されなかった。また、図１０に、Al-As共沈殿からのヒ酸の溶出のグラフを示す。図示のように、Al-As(Ｖ)共沈殿物を用いた系でも同様に、ヒ酸の還元に伴う亜ヒ酸の溶出が確認された。アルミニウム塩によるヒ酸の共沈殿反応は、ほとんどがヒ酸の水酸化アルミニウムフロックへの吸着によるものであると考えられ、水中のヒ酸の除去率にはフロックの生成量が関係しているとされている。このことから、SF-1株は、ヒ酸鉄のような化合物を形成している状態のヒ酸だけでなく、吸着状態のものをも還元することが可能であるといえ、固相中のヒ酸を全般的に還元し、溶出させ得ることが確認できた。
【００４８】
（実施例３）
本実施例では、以下に示す材料、手法および条件により、Bacillus.sp.SF-1株の固相からのヒ酸還元に影響を及ぼす因子について確認した。
【００４９】
（供試培地）
本実施例では、下記表３に示した無機塩培地に炭素源として20mM乳酸(乳酸無機塩培地（Ａ）)、もしくは2g/Lグルコース(グルコース無機塩培地（Ａ）)を添加したものを液体培地として用いた。ここで、特に記載のない限り、培地の調製には50mM トリス-HClバッファーを用い、pH を8.0としている。また、菌体の短期的保存に用いる寒天平板培地として、セレン酸を5mM含むCGY培地(Casitone 5g/L, Glycerol 5g/L, Yeast extract 1.0g/L, Agar 18g/L)を、NaOHによりpH 8.0に調整して用いた。また、特に記載のない限り、培地はオートクレーブによる高温高圧滅菌処理を行った後で用いた。
【００５０】
【表３】
2004305213.tif 000005
【００５１】
（増殖を伴う培養系）
50mL容量バイアルビン内に分注したグルコース無機塩培地（Ａ）20mLに、セレン酸5mMを含むCGY平板培地上のSF-1株を1白金耳接種し、綿栓でふたをした好気条件下において回転振盪培養(120rpm, 30℃)を12時間行った(前々培養)。さらに、培養液1mLを同組成の培地に植え継ぎ、同様の条件下で8時間培養(前培養)後、菌体を遠心分離で回収し(6010×g, 10min.)、3.0mLのトリス-HClバッファー(pH 8)に懸濁したものを植種源としてヒ酸還元試験に用いた。
【００５２】
（固相中のヒ酸の還元的可溶化：活性アルミナを用いた可溶化）
予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中の活性アルミナ粉末0.3gに、4mMヒ酸塩を含むトリス-HClバッファー(pH8)10mlを加えた後、約24時間回転振盪して（120rpm, 30℃）、溶液中のヒ酸を固相へ吸着させた。その後、2倍濃度の滅菌乳酸無機塩培地（Ａ）を10mL加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓して気相部を窒素置換した。前記植種源0.2mL（初期菌体濃度：3.9×107cell/mL）を、上記のバイアルビンに接種し、嫌気条件下において回転振盪培養を行った(120rpm、30℃)。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。なお、前記植種源を接種しない以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００５３】
（モデル汚染土壌）
モデル汚染土壌の作成には、大阪大学吹田キャンパス内の森林および大阪府箕面市内の水田で採取した土壌を用いた（森林土壌：２００１年１２月１２日採取、ｐＨ５．２９、含水率１２．７％、強熱減量３．０５％；水田土壌：２００３年１月８日採取、ｐＨ５．２９、含水率２１．７％、強熱減量５．４８％）。採取したそれぞれの土壌は、70℃で乾燥させた後、2mmのふるいにかけた。それぞれの土壌に対して、ヒ酸溶液を1124mg/kg D.W.となるように添加し、室温下で往復振盪器を用いて約12時間（森林土壌）もしくは70時間（水田土壌）撹拌した（340min-1）。その後、それぞれの土壌を、再び70℃で乾燥させ、乳鉢にて撹拌して粒子を均一にそろえ、モデル汚染土壌として試験に用いた。なお、作成したモデル汚染土壌中の適量を採取し、HNO3-HCl消化法（Marin A., A.Lopez-Gonzalvez, C.Barbas, "Development and validation of extraction methods for determination of zinc and arsenic speciation in soils using focused ultrasound: Application to heavy metal study in mud and soils", Anal. Chim. Acta, 2001, 442（2）, p. 305-318参照）によりヒ素の全量抽出を数回行ったところ、99%程度の高い抽出率が認められたため、添加したヒ素は土壌中で均一に分散していることが確認された。
【００５４】
（モデル汚染土壌を用いた可溶化）予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中の前記モデル汚染土壌1gに、乳酸無機塩培地（Ａ）（pH8.0）20mLを加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓した後、気相部を窒素置換した。このバイアルビンに、前記植種源0.2mLをシリンジで接種し(初期菌体濃度：5.8×107 cells/mL)、嫌気条件下において回転振盪培養を行った(120rpm, 30℃)。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。なお、前記植種源を接種しない以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００５５】
（分析）
溶液中の全ヒ素及び全鉄濃度は原子吸光度計(Seiko SAS 7500A フレーム分析)を用いて測定した。ヒ酸、Fe(II)及びFe(III)の分析は、イオンクロマトグラフィー(ダイオネクス社 DX-300、分析条件：表４)を用いて行った。以下の表４に、クロマトグラフィーの条件を示す。
【００５６】
【表４】
2004305213.tif 000006
【００５７】
（菌体数の計測）
総菌数はカウンティングチャンバーの60〜100区画内の菌数を位相差顕微鏡AFX-DX(NiKon)により直接計測し、その平均値によって示した。
【００５８】
（pHの測定）
pHの測定には、TOA pHメーター（東亜電波工業株式会社, ガラス電極式水素イオン濃度系, HM-30S）を用いた。
【００５９】
（固相中のヒ酸の還元的可溶化）
活性アルミナを含む培地にSF-1株を加え、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認実験を行った結果を図１１のグラフに示す。実験期間中、時間の経過と共に溶液中の全ヒ素濃度の増加と、ヒ酸濃度の減少が認められた。また溶液中にはヒ酸が検出されなかったことから、ほとんどが亜ヒ酸として溶出しているものと考えられた。さらに、SF-1株を加えていないコントロールでは、実験期間中、ヒ素濃度およびヒ酸濃度の顕著な変化が認められなかった。このことから、SF-1株は、ヒ素への吸着性が高いと知られている活性アルミナに吸着させたヒ酸に対しても、還元することが可能であることが確認できた。なお、活性アルミナは、土壌環境中において、ヒ酸の吸着に大きく寄与していることが知られている、鉄（ＩＩＩ）およびアルミニウム酸化物のモデルとして用いた。
【００６０】
（モデル汚染土壌を用いた可溶化）
モデル汚染土壌（森林土壌）を含む培地にSF-1株を加え、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認実験を行った結果を図１２のグラフに示す。同図（ａ）は、モデル汚染土壌（森林土壌）からのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフであり、同図（ｂ）は、モデル汚染土壌（森林土壌）のヒ素の０時間及び１２０時間後の還元的溶出の一例を示すグラフである。モデル汚染土壌（水田土壌）を含む培地にSF-1株を加え、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認実験を行った結果を図１３のグラフに示す。同図（ａ）は、モデル汚染土壌（水田土壌）からのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフであり、同図（ｂ）は、モデル汚染土壌（水田土壌）のヒ素の０時間及び１２０時間後の還元的溶出の一例を示すグラフである。図１２および図１３から、一部のヒ酸がモデル汚染土壌に取り込まれていなかったことが確認できるが、実験期間中、時間の経過と共に溶液中の全ヒ素濃度が増加し、実験開始後１２０時間後にはモデル汚染土壌中に含まれていたヒ酸の約６０％（森林土壌）及び約６０％（水田土壌）が溶液中へと可溶化された。また、溶液中のヒ酸濃度は、実験期間中、時間の経過と共にほとんど検出されなくなったことから、ほとんどが亜ヒ酸として溶出しているものと考えられた。
【００６１】
さらに、SF-1株を加えていないコントロールでは、実験期間中、ヒ素濃度及びヒ酸濃度の顕著な変化が認められなかった。なお、これらの濃度は、実験期間中、時間の経過と共にわずかに上昇しているが、これは、培地に更に塩化水銀（1mM）を加えて、さらに確実に滅菌を行った場合でも、同様な上昇が認められたこと（図示せず）から、モデル汚染土壌からの緩やかな脱着に由来すると考えられる。
【００６２】
このことから、SF-1株は、森林および水田から採取した、２種類の土壌を用いたモデル汚染土壌において固定、吸着等されているヒ酸に対しても、還元することが可能であることが確認できた。
【００６３】
（実施例４）
本実施例では、以下の手法及び条件により、Bacillus sp. SF-1株のヒ酸還元に影響を及ぼす因子等について確認した。
【００６４】
（植種濃度の影響）
3.0mLのトリス-HClバッファー（pH8）の代わりに、0.1、0.3、0.6、1.5又は3.0mLのトリス-HClバッファー（pH8）で、前培養及び遠心分離後に、懸濁した以外は、前述の実施例３の増殖を伴う培養系と同様にして用意した植種源を、各実験の植種源として用いた。
【００６５】
予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中のモデル汚染土壌（森林土壌。実施例３と同様にして用意）1gに、乳酸無機塩培地（Ａ）（pH8.0）20mLを加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓した後、気相部を窒素置換した。このバイアルビンに、それぞれ、前記植種源0.2mLをシリンジで接種し(初期菌体濃度：それぞれ、5.8×107、7.3×107、1.3×108、2.0×108及び1.0×109 cells/mL)、嫌気条件下において回転振盪培養を行った(120rpm, 30℃)。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。なお、前記植種源を接種しない以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００６６】
（硝酸の影響）
予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中のモデル汚染土壌（森林土壌。実施例３と同様にして用意）1gに、1mMの硝酸を含む乳酸無機塩培地（Ａ）（pH8.0）20mLを加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓した後、気相部を窒素置換した。このバイアルビンに、前述の実施例１の増殖を伴う培養系と同様に用意した植種源0.2mLをシリンジで接種し(初期菌体濃度：3.9×107 cells/mL)、嫌気条件下において回転振盪培養を行った(120rpm, 30℃)。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。なお、前記硝酸を含まない乳酸無機塩培地（Ａ）を用いた以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００６７】
（攪拌の影響）
予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中のモデル汚染土壌（森林土壌。実施例３と同様にして用意）1gに、乳酸無機塩培地（Ａ）（pH8.0）20mLを加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓した後、気相部を窒素置換した。このバイアルビンに、前述の実施例１の増殖を伴う培養系と同様に用意した植種源0.2mLをシリンジで接種し(初期菌体濃度：3.9×107 cells/mL)、嫌気条件下において、静置又は回転振盪培養(120rpm, 30℃)もしくは前記バイアルビン中に６個のガラスビーズを添加した回転振盪培養(120rpm, 30℃)を行った。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。なお、前記植種源を接種しない以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００６８】
（酸素の影響）
予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中のモデル汚染土壌（森林土壌。実施例３と同様にして用意）1gに、乳酸無機塩培地（Ａ）（pH8.0）20mLを加え、綿栓で蓋をした（好気条件）。このバイアルビンに、前述の実施例１の増殖を伴う培養系と同様に用意した植種源0.2mLをシリンジで接種し(初期菌体濃度：3.9×107 cells/mL)、静置培養（30℃インキュベーターに静置)を行った。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。別途、前記綿栓で蓋をする代わりにブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓した後、気相部を窒素置換した（嫌気条件）以外は前記と同様にしたものも、調製した。なお、前記植種源を接種しない以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００６９】
（モデル汚染土壌のスラリー濃度の影響）
予めオートクレーブ処理した、50mL容量バイアルビン中のモデル汚染土壌（森林土壌。実施例３と同様にして用意）1.0g、2.0g、4.0g又は10.0ｇ（スラリー濃度としては、それぞれ5、10、20及び50重量%）に、乳酸無機塩培地（Ａ）（pH8.0）20mLをそれぞれ加え、ブチルゴム栓及びアルミキャップで密栓した後、気相部を窒素置換した。それぞれのバイアルビンに、前述の実施例１の増殖を伴う培養系と同様に用意した植種源0.2mLをシリンジで接種し(初期菌体濃度：3.9×107 cells/mL)、嫌気条件下において回転振盪培養を行った(120rpm, 30℃)。サンプリング方法及び供試培地は、前記実施例１に準じた。なお、前記植種源を接種しない以外は前記と同様にしたものを、コントロールとして調製した。
【００７０】
（植種濃度の影響）
ヒ酸還元に及ぼす植種濃度の影響を確認するため、SF-1株の初期菌体濃度５種類を用いて、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認実験を行った結果を図１４のグラフに示す。実験期間中、時間の経過と共に、どの植種濃度のSF-1株も、ヒ素溶出がほぼ一定であったことから、植種濃度は、ヒ酸還元によるヒ素溶出に対する影響が低いことが確認できた。このことから、汚染土壌の浄化において、低濃度のSF-1株を用いることができ、実用的に有用である。
【００７１】
（硝酸の影響）
ヒ酸還元に及ぼす硝酸の影響を確認するため、硝酸を含む培地及び含まない培地を用いて、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認試験を行った結果を図１５のグラフに示す。図１５に示すように、硝酸の有無に関わらず、同様にヒ素が溶出されたことから、ヒ酸還元はほとんど硝酸の影響を受けなかった。このことから、高濃度の硝酸を含む可能性のある農用地等の汚染土壌にも、硝酸除去のための前処理等なしに、SF-1株を適用することができ、実用的に有用である。
【００７２】
（攪拌の影響）
ヒ酸還元に及ぼす攪拌の影響を確認するため、静置、回転振盪、ガラスビーズを用いた強度な振盪の各条件下でヒ酸還元によるヒ素溶出の確認試験を行った結果を、図１６のグラフに示す。図１６（ａ）は、SF-1株を接種した系、図１６（ｂ）はSF-1株を接種していない系（コントロール系）の、ヒ素の還元的溶出を示す図である。図１６（ａ）に示すように、実験開始２４〜４８時間後において、静置の場合と、ガラスビーズを用いた強度な振盪の場合とのヒ素の還元的溶出の差が、最大となったことが確認できた。図１６（ｂ）に示すように、実験開始２４〜４８時間後において、静置の場合と、ガラスビーズを用いた強度な振盪の場合とのヒ素の還元的溶出の差が、ほとんどないことを考慮すると、強度な振盪により、汚染土壌の浄化が促進され、浄化時間を短縮することができ、実用的に有用である。
【００７３】
一方、実験開始１２０時間後においては、図１６（ａ）および（ｂ）に示すように、攪拌の強度に関わらず、同様にヒ素が溶出されたことから、ヒ酸還元は攪拌の影響を受けなかった。このことから、汚染土壌の浄化において、浄化時間を長くすることにより、攪拌を必要とせず、攪拌に係るコストを削減することができ、実用的に有用である。
【００７４】
（酸素の影響）
ヒ酸還元に及ぼす酸素の影響を検討するため、好気及び嫌気並びにSF-1株接種有り及び無し（コントロール）の各条件下で、ヒ酸の還元試験を行った。その結果を図１７に示す。図１７に示すように、好気条件かつSF-1株接種無し条件下におけるヒ素の溶出に比べて、好気条件かつSF-1株接種有り条件下におけるヒ素の高い溶出が認められた。このことから、SF-1株は、好気条件下においても、良好にヒ酸を還元することができることが確認できた。また、好気条件下及び嫌気条件下におけるヒ素の溶出が、ほとんど同程度であることから、汚染土壌の浄化において、嫌気性条件下に保つ必要がなく、実用的に有用である。
【００７５】
（モデル汚染土壌のスラリー濃度の影響）
ヒ酸還元に及ぼす、モデル汚染土壌のスラリー濃度の影響を検討するため、前記スラリー濃度４種類（5重量％、10重量%、20重量％、50重量%）を用いて、ヒ酸還元によるヒ素溶出の確認実験を行った結果を図１８（ａ）のグラフに示す。SF-1株を接種した系及びSF-1株を接種していないコントロール系の両方において、実験開始後120時間後に、ヒ素溶出率が、スラリー濃度の増加に伴い、低くなることが確認された。そこで、SF-1株を接種した系の結果から、SF-1株を接種していないコントロール系の結果を差し引いた、溶出率の差を図１８（ｂ）のグラフに示した。図１８（ｂ）に示すように、実験開始後１２０時間後のヒ素溶出率の差は、スラリー濃度にかかわらず、ほとんど一定であることが確認できた。このことから、汚染土壌の浄化において、高いスラリー濃度の汚染土壌であっても、SF-1株を適用することができ、実用的に有用である。なお、推測であるが、実験開始後120時間後に、ヒ素溶出率がスラリー濃度の増加に伴い、低くなったのは、SF-1株によるヒ酸還元が抑制されたのではなく、液相へのヒ素の蓄積によって溶出が抑制されたためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は、例えば、工場跡地等の再利用や再開発の際の、ヒ素汚染土壌洗浄にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、本発明のバイオリアクターの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、SF-1株によるヒ酸還元の継時的変化の一例を示すグラフである。
【図３】図３ＡおよびＢは、SF-1株の増殖とヒ酸還元の継時的変化の一例を示すグラフである。
【図４】図４は、SF-1株のヒ酸還元におけるヒ酸濃度の影響の一例を示すグラフである。
【図５】図５は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼすｐＨの影響の一例を示すグラフである。
【図６】図６は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼす炭素源の影響の一例を示すグラフである。
【図７】図７左は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼす酸素の影響の一例を示すグラフであり、図７右は、1mMヒ酸含有培地におけるSF-1株の増殖の一例を示すグラフである。
【図８】図８は、SF-1株のFe-As共沈殿物からのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフである。
【図９】図９は、前記例におけるヒ素溶出物からの鉄の溶出の一例を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Al-As共沈殿物からのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフである。
【図１１】図１１は、活性アルミナからのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフである。
【図１２】図１２（ａ）は、モデル汚染土壌（森林土壌）からのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフであり、図１２（ｂ）は、モデル汚染土壌（森林土壌）のヒ素の０時間及び１２０時間後の還元的溶出の一例を示すグラフである。
【図１３】図１３（ａ）は、モデル汚染土壌（水田土壌）からのヒ素の還元的溶出の一例を示すグラフであり、図１３（ｂ）は、モデル汚染土壌（水田土壌）のヒ素の０時間及び１２０時間後の還元的溶出の一例を示すグラフである。
【図１４】図１４は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼす植種濃度の影響の一例を示すグラフである。
【図１５】図１５は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼす硝酸の影響の一例を示すグラフである。
【図１６】図１６（ａ）は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼす攪拌の影響の一例を示すグラフであり、図１６（ｂ）は、コントロール系のヒ酸還元に及ぼす攪拌の影響の一例を示すグラフである。
【図１７】図１７は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼす酸素の影響の一例を示すグラフである。
【図１８】図１８は、SF-1株のヒ酸還元に及ぼすモデル汚染土壌のスラリーの影響の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７８】
１    バイオリアクター
２    SF-1株が担持された担体
３    カラム
【図１】
2004305213.tif 000007
【図２】
2004305213.tif 000008
【図３】
2004305213.tif 000009
【図４】
2004305213.tif 000010
【図５】
2004305213.tif 000011
【図６】
2004305213.tif 000012
【図７】
2004305213.tif 000013
【図８】
2004305213.tif 000014
【図９】
2004305213.tif 000015
【図１０】
2004305213.tif 000016
【図１１】
2004305213.tif 000017
【図１２】
2004305213.tif 000018
【図１３】
2004305213.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
2004305213.tif 000021
【図１６】
2004305213.tif 000022
【図１７】
2004305213.tif 000023
【図１８】
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