(57)【要約】【目的】細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質、及びその利用方法等を提供する。【解決手段】細胞周期がＳ期で停止している細胞を被検物質の存在下で培養し、該細胞においてＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞周期がＳ期で停止している細胞を被検物質の存在下で培養し、該細胞においてＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
細胞が、ＤＮＡ複製阻害物質によりＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進される培養癌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞周期がＳ期で停止している細胞を被検物質の存在下で培養し、該細胞においてＣｈｋ１蛋白質の機能を阻害せず、かつ、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法。
【請求項４】
Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化が、最終的にＣｄｋ２蛋白質により行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質。
【請求項６】
請求項３又は４に記載の方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質とＤＮＡ複製阻害物質とが併用されることを特徴とする癌治療用薬剤。
【請求項７】
請求項３又は４に記載の方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質を有効成分とすることを特徴とする、ＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果の増強用薬剤。
【請求項８】
ＤＮＡ複製阻害物質がＤＮＡ合成阻害物質である請求項６又は７に記載の薬剤。
【請求項９】
Ｃｄｋ２蛋白質の阻害物質を有効成分とすることを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除用薬剤。
【請求項１０】
Ｃｄｋ２蛋白質の阻害物質が、プルバラノールＡ又はロスコビチンである請求項９に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質、及びその利用方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞の成長及び分裂は、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、及びＭ期の４つの期から成る細胞周期に基づいており、この細胞周期は、すべての真核細胞種にわたって機能的に保存されている。Ｇ１期、Ｓ期、及びＧ２期は、細胞周期の間期と称される。第１のギャップ期であるＧ１期では、細胞の様々な生合成活性が急速に高まってＳ期に備える。ＤＮＡ合成期であるＳ期は、ＤＮＡ合成の開始とともに始まり、２組の同じゲノムが複製されて終了する。続くＧ２期は、有糸分裂の開始前までの第２のギャップ期である。次いで、有糸分裂が行われ、それに引き続いて直ちに細胞質分裂を生じるのがＭ期（有糸分裂期）である。
【０００３】
このような細胞周期におけるゲノムに関連した「チェックポイント機構」とは、細胞の複製においてゲノムの完全性を維持するための様々な事象を意味し、その実体は検出されたＤＮＡ損傷や複製異常をＤＮＡ修復や細胞周期の進行の阻害に結びつける様々な細胞内シグナル伝達カスケードであって、ＤＮＡ損傷チェックポイント機構とＤＮＡ複製チェックポイント機構に大別される。ＤＮＡ損傷チェックポイント機構はＧ１期、Ｓ期、及びＧ２期に存在するが、主要なのはＧ１期に存在するチェックポイント機構である。これらのＤＮＡ損傷チェックポイント機構とは、ＤＮＡに生じた何らかの損傷を感知して、Ｇ１期で細胞周期を遅延もしくは停止させてＳ期への導入を阻止し、誤った遺伝情報を有するＤＮＡの合成やゲノムの構造異常の発生を防ぐための、一連のシグナル伝達カスケードから成り立っている（以下、これを「ＤＮＡ損傷チェックポイントカスケード」と称することがある）。
【０００４】
一方、ＤＮＡ複製チェックポイント機構はＳ期に存在し、複製フォークの進行の異常を感知してＤＮＡ複製の開始や進行を遅延もしくは停止し、細胞周期をＳ期で停止すること（以下、これを「細胞のＳ期集積作用」と称することがある）によって異常な複製によるゲノムの構造異常等を防ぐ一連のシグナル伝達カスケードから成り立っている（以下、これを「ＤＮＡ複製チェックポイントカスケード」と称することがある）。正常な細胞では、これらのカスケードが必要に応じて機能し、ＤＮＡの損傷や複製異常が修復されるまで細胞周期を積極的に遅延もしくは停止して、誤った遺伝情報やゲノムに構造異常を有する細胞の発生を阻止している（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
これに対し、多くのヒト癌細胞ではＧ１期に存在するＤＮＡ損傷チェックポイント機構が損なわれており、損傷されたＤＮＡが修復されることなく複製されることによってＤＮＡの構造異常が生じ、最終的に異常な増殖能等を獲得した癌細胞が発生することが知られている（例えば、非特許文献２参照）。一方で、従来癌治療用薬剤として用いられているＤＮＡ複製阻害物質等のみでは癌細胞を完全に死滅させるのは困難であることが知られ、その原因の一つがＤＮＡ複製チェックポイント機構における種々のカスケードにあると考えられている。これらのことから、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードを作用点とした副作用の小さい薬剤が開発されることが期待され、これらのカスケードに関与する分子の解析が多数行われつつある。
【０００６】
ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードには、少なくとも３つのグループの分子が関与していると考えられている。第１のグループは、細胞周期におけるＤＮＡ複製異常等を認識するセンサーとして働く蛋白質のファミリーである。第２のグループは、第１のグループによって発せられたシグナルを増幅し、伝達する蛋白質のファミリーである。最後に、第３のグループは、実質的な細胞の応答、すなわち、ＤＮＡ合成の停止、ＤＮＡ複製の停止等に関与する蛋白質のファミリーである。これらの分子が連動して機能することにより、細胞周期がＳ期で遅延もしくは停止される。例えば、第１のグループに属する蛋白質の一つとして、ＡＴＭ／ＡＴＲ蛋白質（例えば、非特許文献３参照）を中心とした蛋白質複合体群が知られている。ＡＴＭ／ＡＴＲ蛋白質は、Ｇ１又はＧ２期においてＤＮＡ損傷の認識に関与することでも知れているが、Ｓ期においては主にＡＴＲ蛋白質が複製異常の感知に関与すると考えられている。また、第２のグループに属する蛋白質の一つとして、Ｃｈｋ１／Ｃｈｋ２蛋白質（例えば、非特許文献４〜６参照）が知られ、主にＳ期で機能すると考えられているのはＣｈｋ１蛋白質である。これらの蛋白質は、いずれも蛋白質キナーゼとして働くことが知られ、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードを構成している。
【０００７】
このような知見から、ＡＴＲ蛋白質又はＣｈｋ１蛋白質の阻害剤をＤＮＡ複製阻害物質と併用する癌治療用薬剤として使用する研究が行われている。これらの中には、Ｃｈｋ１蛋白質の阻害を主たる作用機序とし、すでに臨床開発が進められている化合物もある（ＵＣＮ−０１；例えば、非特許文献７参照）。しかし、これらの蛋白質はＤＮＡ複製チェックポイントカスケードの上流に位置して他にも多くの働きを有する蛋白質である。従って、該カスケードの下流で最終的にＤＮＡ複製に直接寄与する因子を阻害する方が、高い効果を得られ、かつ副作用を軽減することができると期待されていた。しかし、このカスケードの下流において最終的に実質的な細胞の応答を担う分子については未だ十分な解析がなされておらず、ＤＮＡ複製機能因子となる蛋白質が不明であったこと等から、このような蛋白質の解析が強く望まれていた。
【０００８】
一方、Ｍｃｍ（Ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）蛋白質は、Ｍｃｍ２からＭｃｍ７までの６種類の蛋白質として存在し、そのすべてのメンバーがゲノムの複製に必須の役割を果たすことで知られる蛋白質群である。Ｍｃｍ蛋白質は、複製の過程で二本鎖ＤＮＡを解離させるＤＮＡヘリカーゼとして機能すると考えられており（例えば、非特許文献８参照）、本発明者らは、このＭｃｍ蛋白質が、Ｍｃｍ４／６／７複合体を形成し、一本鎖ＤＮＡ上を３’末端から５’末端方向へ移動することによりヘリカーゼ活性を示すこと（例えば、非特許文献９参照）等を報告している。このように、Ｍｃｍ蛋白質は直接的に複製に関わる蛋白質であることから、癌化との関係や癌細胞における働きについて、さらに詳細な解析が望まれていた。
【０００９】
【非特許文献１】
松影昭夫・正井久雄編、「ゲノムの複製と分配」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１８６−１９３（２００２）
【非特許文献２】
Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ”，  ４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）
【非特許文献３】
Ｋｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．，  １０，  ２４２３−２４３７（１９９６）
【非特許文献４】
Ｗａｌｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６３，  ３６８（１９９３）
【非特許文献５】
Ｋｈｏｄａｉｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，  ５，  １４７−１６０（１９９４）
【非特許文献６】
Ｃａｒｒ，Ａ．Ｍ．，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６，  ６５，  ７２（１９９５）
【非特許文献７】
赤羽浩一、実験医学・増刊、Ｖｏｌ．２１，  Ｎｏ．２，  １９８−２０５（２００３）
【非特許文献８】
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６８，  ６４９（１９９９）
【非特許文献９】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  ２４５０８（１９９７）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質、及びその利用方法等を提供するためになされたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、培養癌細胞にある種のＤＮＡ複製阻害物質を添加すると、ＤＮＡ複製チェックポイント機構の働きによってＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が高度に亢進することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【００１２】
すなわち本発明によれば、
（１）細胞周期がＳ期で停止している細胞を被検物質の存在下で培養し、該細胞においてＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、
（２）細胞が、ＤＮＡ複製阻害物質によりＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進される培養癌細胞である上記（１）に記載の方法、
（３）細胞周期がＳ期で停止している細胞を被検物質の存在下で培養し、該細胞においてＣｈｋ１蛋白質の機能を阻害せず、かつ、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、
（４）Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化が、最終的にＣｄｋ２蛋白質により行われることを特徴とする上記（３）に記載の方法、
が提供される。
【００１３】
また、本発明の別の態様によれば、
（５）上記（３）又は（４）に記載の方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質、
が提供される。
また、本発明のさらに別の態様によれば、
（６）上記（３）又は（４）に記載の方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質とＤＮＡ複製阻害物質とが併用されることを特徴とする癌治療用薬剤、
（７）上記（３）又は（４）に記載の方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質を有効成分とすることを特徴とする、ＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果の増強用薬剤、
（８）ＤＮＡ複製阻害物質がＤＮＡ合成阻害物質である上記（６）又は（７）に記載の薬剤、
（９）Ｃｄｋ２蛋白質の阻害物質を有効成分とすることを特徴とする、細胞のＳ期集積作用解除用薬剤、
（１０）Ｃｄｋ２蛋白質の阻害物質が、プルバラノールＡ又はロスコビチンである上記（９）に記載の薬剤、
が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
１．ＤＮＡ複製チェックポイントカスケード
本発明の細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質、及びその利用方法は、細胞にＤＮＡ複製阻害物質を添加したときに、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードの働きによりＭｃｍ４蛋白質がリン酸化されることに基づいている。以下、まず、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードについて説明する。
【００１５】
Ｓ期に存在し、異常な複製によるゲノムの構造異常等を防ぐ機能を有するＤＮＡ複製チェックポイント機構は、蛋白質リン酸化カスケードであるＤＮＡ複製チェックポイントカスケードより成り立っている。ＡＴＲ蛋白質やＣｈｋ１蛋白質は該カスケードの主要なメンバーであるが、これらの蛋白質が関与する該カスケードにより最終的にリン酸化されるＤＮＡ複製機能因子は長く不明のままであった。本発明者らは、該因子がＭｃｍ４蛋白質であること、Ｍｃｍ４蛋白質を最終的にリン酸化する蛋白質の一つがＣｄｋ２であること等を解明し、本発明の細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により得られる細胞のＳ期集積作用解除物質、及びその利用方法を提供するに至ったものである。
【００１６】
ここで、本明細書においてＭｃｍ蛋白質とは、Ｍｃｍ（Ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）遺伝子によりコードされる蛋白質を意味する。Ｍｃｍ蛋白質としては、Ｍｃｍ２〜７までの６つの遺伝子によりコードされる６つの蛋白質があり、これらが共同してＤＮＡ複製時にＤＮＡを解離させる働きを有するヘリカーゼとして機能している。Ｍｃｍ蛋白質は、Ｍｃｍ２〜７までの各メンバーを１分子ずつ含む不活性型複合体と、各２分子ずつのＭｃｍ４／６／７より成る活性型複合体とを形成することが知られている。不活性型複合体は主に細胞周期がＧ２、Ｍ、及びＳ期の核質において、複製が進行していない領域に存在するが、活性型複合体は特にＳ期にクロマチンの複製が進行している領域に結合して存在し、ＤＮＡ複製に直接的に関与していると考えられている。これらの複合状態及びヘリカーゼ活性は、主にＭｃｍ４蛋白質におけるリン酸化反応により制御されており、Ｍｃｍ４蛋白質がリン酸化を受けるとヘリカーゼ活性が抑制され、逆にリン酸化を受けないとヘリカーゼ活性が上昇する。Ｍｃｍ遺伝子及びＭｃｍ蛋白質の詳細は、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６８，  ６４９（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  ２４５０８（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ３７，  ３４４２８−３４４３３（２００１）等に開示されている。
【００１７】
Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化は、該蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：１）におけるアミノ酸番号７のスレオニン、アミノ酸番号１９のスレオニン、アミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、アミノ酸番号１１０のスレオニン等のリン酸化部位で起こることが知られているが、中でもアミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、アミノ酸番号１１０のスレオニンにおけるリン酸化は重要である。ここで、本明細書において単に「Ｍｃｍ４蛋白質がリン酸化される」、「リン酸化が亢進する」等という場合には、これらのリン酸化部位のいずれか１箇所以上がリン酸化されていればよいが、「高度にリン酸化される」という場合には、これらのリン酸化部位の複数、好ましくは２箇所以上、特に好ましくは３箇所以上がリン酸化されることを意味する。
【００１８】
まず、本発明者らは、培養癌細胞にＤＮＡ合成阻害物質であるヒドロキシウレアを添加すると、Ｃｈｋ１蛋白質及びＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が顕著に亢進されることを確認した。また、Ｃｄｋ２蛋白質のリン酸化も亢進していた。このようなＣｈｋ１蛋白質及びＭｃｍ４蛋白質のリン酸化の亢進は、トポイソメラーゼ阻害物質であるカンプトテシンや、アルキル化物質であるメチルメタンサルフェートでも若干見られた。
【００１９】
本発明者らは、さらに、ＡＴＲ蛋白質の非特異的阻害剤として知られるカフェイン（Ｆｅｉｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１５４，５，９１３−９２３（２００１））、及び、Ｃｈｋ１蛋白質の非特異的阻害剤として知られるＧｏ６９７６（Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６３，３１−３５（２００３））を用いて、これらによりＡＴＲ蛋白質又はＣｈｋ１蛋白質を阻害すると、ヒドロキシウレアによるＭｃｍ４蛋白質及びＣｄｋ２蛋白質のリン酸化が抑制されることを示した。すなわち、Ｍｃｍ４蛋白質及びＣｄｋ２蛋白質が、ＡＴＲ蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質をメンバーとするＤＮＡ複製チェックポイントカスケードの働きによりリン酸化されることを明らかにした。
【００２０】
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験系を用いて、Ｃｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体がＭｃｍ４蛋白質を直接的にリン酸化する活性を有するが、Ｃｈｋ１蛋白質には、Ｍｃｍ４蛋白質を直接的にリン酸化する活性はないことを解明した。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏの実験系を用いて、癌細胞においてヒドロキシウレアを添加することにより亢進されるＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が、少なくとも、配列表の配列番号：１に記載のＭｃｍ４蛋白質のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、アミノ酸番号１１０のスレオニンにおいて起こっていることを確認した。
【００２１】
これらの解析により確認されたＤＮＡ複製チェックポイントカスケードを図８に示す。細胞周期がＳ期にある細胞でＤＮＡ複製チェックポイントカスケードが作動した場合には、主に（１）複製フォークの安定化（複製フォーク進行の停止）、（２）他の複製開始点の停止（新たな複製開始の阻止）、（３）細胞周期の停止の３つの反応が起こると考えられている。細胞は、このような反応により細胞周期をＳ期で停止し（細胞のＳ期集積作用）、異常複製を回避する。Ｍｃｍ４蛋白質はヘリカーゼ活性を有することから、これらのうちで（１）及び（２）に関与すると考えられる。
【００２２】
以下に詳述する発明は、このようなＤＮＡ複製チェックポイントカスケードに基づいて完成されたものである。
２．細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法
本発明の細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法は、細胞周期がＳ期で停止している細胞を被検物質の存在下で培養し、該細胞においてＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することを特徴とする方法である。
（１）細胞
本発明のスクリーニング方法には、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードの働きによってＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進され、細胞周期がＳ期で停止している細胞が好ましく用いられる。具体的には、例えば、ＤＮＡ複製阻害物質により細胞周期がＳ期で停止された細胞や、同調培養等の方法により細胞周期がＳ期に調整された細胞、何らかの異常等により細胞周期がＳ期で停止している細胞等が挙げられるが、中でも、ＤＮＡ複製阻害物質により細胞周期がＳ期で停止された培養癌細胞が特に好ましく用いられる。
【００２３】
ここで、癌細胞とは、無限増殖能を獲得した悪性の細胞を意味し、細胞の形態、配列、機能等が種々の点で発生母地のもとの細胞と異なり、無限増殖能に加えて浸潤性、生体内での転移性等を有する細胞である。本発明のスクリーニング方法において用いられる癌細胞としては、発癌の誘因や機構、癌の種類、組織型、細胞の種類、由来等いかなるものでも用い得るが、その中でも、ヒト癌組織由来の株化（ライン化）された培養癌細胞が好ましく用いられる。このような培養細胞としては、例えば、ヒト子宮頸癌由来の培養癌細胞（ＨｅＬａ細胞：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １２，  ２６４−２６５（１９５２））、ヒト皮膚癌由来の培養癌細胞（Ａ４３１細胞：Ｇｉａｒｄ  ＤＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ５１，１４１７−１４２３（１９７３））、ヒト繊維肉腫由来の培養癌細胞（ＨＴ１０８０細胞：Ｂａｒｂｅｒ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．、米国特許公報５，５９１，６２４（１９９７））、ヒト白血病血液細胞由来の培養癌細胞（ＨＬ−６０細胞：Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ５４，７１３−７３３（１９７９））、ヒトバーキットリンパ腫由来の培養癌細胞（Ｒａｊｉ細胞：Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ５３，  ３４７−３６０（１９７４））、大腸癌由来の培養癌細胞（ＨＴ２９細胞：Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ５５，  ５５５−５６０（１９７５））、肺癌由来の培養癌細胞（Ａ５４９細胞：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，  １７，  ６２−７０（１９７６））、等が挙げられ、これらの中でもヒト子宮頸癌由来の培養癌細胞（ＨｅＬａ細胞）が特に好ましく用いられる。また、これらの他に、ウィルス等による形質転換により無限増殖能を獲得させた培養癌細胞等も用いることができ、例えば、ＳＶ４０ウィルスにより形質転換された繊維芽細胞（ＶＡ−１３細胞：Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  １６３，  ３０９−３１６（１９８６））、ＳＶ４０ウィルスにより形質転換された繊維芽細胞（ＧＭ００６３７細胞：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ３６１９４−３６１９９（２００１）等：Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）等が挙げられる。このような培養癌細胞は、それ自体公知の通常用いられる方法で培養され、対数増殖期になったところで実験に供されることが好ましい。また、培養、被検物質の添加、Ｍｃｍ４蛋白質の解析等が可能なものであれば、培養組織等も同様にして用いることができる。
【００２４】
このような培養癌細胞の細胞周期をＳ期で停止させたものが、特に好ましくスクリーニングに用いられる。細胞周期をＳ期で停止させる方法としては、前述のとおり、例えば、ＤＮＡ複製阻害物質による方法、同調培養による方法等が挙げられる。
本明細書において「ＤＮＡ複製阻害物質」とは、ＤＮＡ複製過程に関与する種々の因子を阻害する物質の総称である。このような物質は、様々な作用、機序によってＤＮＡ複製を停止して、ＤＮＡ複製チェックポイント機構を作動させ、Ｍｃｍ４蛋白質をリン酸化して細胞周期をＳ期で停止させる能力（細胞のＳ期集積作用）を有する。このような物質としては、例えば、ＤＮＡ合成を阻害する物質（以下、これを「ＤＮＡ合成阻害物質」と称することがある）、複製フォークの進行を阻害する物質（以下、これを「ＤＮＡ複製フォーク進行阻害物質」と称することがある）等が挙げられる。本発明においては、ＤＮＡ複製阻害物質であればいかなるものでも用い得るが、中でも、細胞のＳ期集積作用の強いＤＮＡ合成阻害物質が好ましく用いられる。
【００２５】
ＤＮＡ合成阻害物質とは、ＤＮＡ複製の一過程であるＤＮＡ合成を阻害する能力を有する物質を意味する。すなわち、ＤＮＡ合成阻害物質とは、ＤＮＡ複製の過程において生じる多数の反応のうちＤＮＡ合成反応に関わる種々の蛋白質や基質等を阻害することによりＤＮＡ合成を阻止し、ＤＮＡが新しい二本鎖ＤＮＡを形成することを阻害して一本鎖ＤＮＡを蓄積させる能力を有する物質である。このような物質としては、例えば、ＤＮＡ合成に必要な基質に拮抗して該基質のＤＮＡポリメラーゼへの結合を阻害したり、もしくはこれらの合成を阻害して枯渇させる能力を有する物質（以下、これらを「代謝拮抗物質」と称することがある）、ＤＮＡポリメラーゼを直接的に阻害する物質（以下、これを「ＤＮＡポリメラーゼ阻害物質」と称することがある）等が挙げられる。
【００２６】
ＤＮＡ合成においては、塩基であるプリン（アデニン及びグアニン）、ピリミジン（シトシン及びチミン）が合成され、これらが五炭糖及びリン酸と結合してリボヌクレオチドが合成される。これがさらにリボヌクレオチド還元酵素により還元されてデオキシリボヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）が合成され、ＤＮＡ合成の最終基質となる。本明細書において「ＤＮＡ合成の基質」という場合には、最終基質のデオキシリボヌクレオチドだけでなく、プリン、ピリミジン、リボヌクレオチド等をすべて含む。
【００２７】
代謝拮抗物質としては、例えば、上記したプリン、ピリミジン、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド等に拮抗する物質又は合成阻害物質が挙げられる。また、これらの誘導体又はプロドラッグ等も同様に用いることができる。より具体的には、すでに繁用されている抗癌剤のうち代謝拮抗剤と呼ばれるもの等の中から選択して用いることができる。繁用されている代謝拮抗剤としては、例えば、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、カルモフール、シタラビン（サイトシンアラビノシド）、ゲムシタビン、メトトレキサート、メルカプトプリン等が挙げられ、これらの中でも本発明においては、ヒドロキシウレア等が好ましく用いられる。ヒドロキシウレアは、リボヌクレオチドを還元するリボヌクレオチド還元酵素を阻害する作用を有する。
【００２８】
本発明においては、上記のＤＮＡ合成阻害物質のうち、代謝拮抗物質が好ましく用いられる。また、代謝拮抗物質の中でも、ヒドロキシウレアのようにＤＮＡ複製の基質の合成を阻害する物質が特に好ましく用いられる。ヒドロキシウレアは、培養細胞に添加されることにより同調培養を行う作用をも有していることから特に好ましく用いられる。また、ヒトに投与する薬剤の有効成分としては用い得ないものであっても、実験的に培養癌細胞等に添加し、該細胞におけるＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を亢進させる能力を有する物質であれば、用いることができる。このような物質としては、例えば、アフィディコリン等が挙げられる。アフィディコリンは代謝拮抗物質であり、デオキシリボヌクレオチドの一つであるｄＣＴＰの拮抗物質となる。
【００２９】
真核生物のＤＮＡ複製に関わるＤＮＡポリメラーゼには、α、β、γ、δ、及びε等のサブタイプがあり、本発明のＤＮＡポリメラーゼ阻害物質としては該サブタイプのいずれか又は複数を阻害する物質であればよいが、ＤＮＡポリメラーゼαを阻害するものが好ましく用いられる。ＤＮＡポリメラーゼ阻害物質としては、公知の物質等を用いることができ、例えば、Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ  （Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７７，９１−９６（１９８８））、Ｓｕｒａｍｉｎ  （Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７２，  ３４９−３５３（１９８８））、Ａｕｒｉｎｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  （Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７７，  ９１−９６（１９８８））、ＫＮ−２０８（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，  ７６，  ：５１２−５１８（１９９８））、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４０，  １１５７１−１１５５７（２００１））等が挙げられる。
【００３０】
また、ＤＮＡ複製フォーク進行阻害物質としては、例えば、ＤＮＡをアルキル化して架橋や変異を生じさせることによりＤＮＡ合成を阻害する物質（以下、これを「アルキル化物質」と称することがある）や、ＤＮＡ複製の進行にともなって生じるＤＮＡのスーパーコイルを解消するトポイソメラーゼの阻害物質（以下、これを「トポイソメラーゼ阻害物質」と称することがある）等が挙げられる。アルキル化物質は、その作用により二本鎖ＤＮＡの巻き戻しや一本鎖化の進行を早い段階で阻止することから、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化は亢進されるがやや低レベルである。また、トポイソメラーゼ阻害物質も、二本鎖ＤＮＡの巻き戻しが進行しないために一本鎖ＤＮＡ部分が生成しないことから、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化は亢進されるがやや低レベルである。また、アルキル化物質と同様の作用を示す抗腫瘍金属製剤として、シスプラチン等も用いることができる。
【００３１】
上記したようなＤＮＡ複製阻害物質による方法の他に、同調培養によってＳ期に細胞周期が調整された細胞を用いることもできる。同調培養とは、培養細胞を細胞周期の一定時期にそろえることにより個々の細胞で起きている現象を細胞集団全体の現象として反映させることのできる方法であって、例えば、周期がＳ期にある細胞集団を調製する方法としては、ＤＮＡ合成の基質の合成を阻害する方法の他に、血清要求性の高い細胞の培養液から血清を除去し、一定時間後に血清を添加してＤＮＡ合成を同時に起こさせる方法等が挙げられる。また、公知の方法に従って細胞周期をＳ期痛いの期に調整した後、再び細胞周期を進行させてＳ期になったところで用いる方法も挙げられる。
【００３２】
（２）被検物質
被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。これらの投与量、投与方法、処理時間等は、用いる癌細胞の種類に従って適宜選択すればよいが、例えば、前記培養癌細胞に添加する場合には、被検物質を適当な濃度の溶液等として調製し、該細胞の培養上清に直接添加する方法等が好ましく用いられる。
【００３３】
（３）細胞のＳ期集積作用解除物質のスクリーニング方法
上記被検物質を前記細胞周期がＳ期で停止している細胞に添加し、該細胞においてＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択する。また、このとき、さらにＣｈｋ１蛋白質の機能を阻害しない物質を選択することが好ましい。Ｃｈｋ１蛋白質は、上記１に詳述したＤＮＡ複製チェックポイントカスケード（図８）において、Ｍｃｍ４蛋白質より上流に位置し、他に多くの機能を有することから、特異的にＭｃｍ４蛋白質を抑制する物質を得るためには、Ｃｈｋ１蛋白質の機能を阻害せず、かつ、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することが好ましい。
【００３４】
以下、ＤＮＡ複製阻害物質によりＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進される培養癌細胞を用いる場合を例に挙げて、より具体的に説明する。
まず、公知の方法に従って該培養癌細胞を培養し、好ましくは対数増殖期に調製する。これに、被検物質とＤＮＡ複製阻害物質とを添加する。このとき、これらの添加は同時でもよいし、順不同で時間をずらして添加してもよい。すなわち、ＤＮＡ複製阻害物質を先に添加してＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進された細胞に被検物質を添加してもよいし、予め被検物質を添加しておき、一定時間後にＤＮＡ複製阻害物質を添加してもよい。Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化抑制物質としては、後述するように種々の作用機序を有する物質が考えられることから、複数の添加方法を試みることも好ましい。
【００３５】
一定時間処理した後、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化の程度を解析し、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化の程度が十分に低かった場合に、該被検物質はＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有すると判定することができる。ここで、「Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化の程度が十分に低い」とは、Ｍｃｍ４蛋白質に存在する複数のリン酸化部位において、リン酸化されている箇所が十分に少ないこと、及び／又は、ある細胞集団等に含まれる多数のＭｃｍ４蛋白質について、リン酸化の程度が低いものが十分に多いことを意味する。結果の判定には、被検物質を添加していない培養癌細胞における該蛋白質のリン酸化の程度を解析し、これと比較して十分にリン酸化の程度が低いことを確認することが好ましい。
【００３６】
Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化の程度の解析は、一般的に蛋白質のリン酸化の程度の解析に用いられる方法の中から、適宜選択して行うことができる。解析は、例えば、必要に応じて培養液から細胞を回収して細胞抽出液を調製し、これについて行ってもよいが、クロマチン結合画分のみを分画して、この画分に含まれるＭｃｍ４蛋白質について行うことが好ましい。クロマチン結合画分の取得方法は、公知の細胞分画方法に準じて行うことができるが、例えば、後記実施例２に詳述する方法等が挙げられる。
【００３７】
該画分に含まれるＭｃｍ４蛋白質のリン酸化の程度は、Ｍｃｍ４蛋白質に対する抗体又はＭｃｍ４蛋白質のリン酸化部位に対する抗体等を用いて解析すればよい。これらの抗体を用いて解析を行う場合には、例えば、該抗体を用いるウエスタンブロット法等を行ってＭｃｍ４蛋白質を検出し、その結果を解析する。Ｍｃｍ４蛋白質のバンドは、該蛋白質の分子量である１００ｋＤ（ダルトン）付近に検出されるが、リン酸化の程度が高いとバンドが上部へシフトし、リン酸化の程度が低いと１本のバンドとして検出される。一般に、蛋白質がリン酸化されると、蛋白質の立体構造が変化したりリン酸基の分子量が増加するために上部へシフトすることが知られ、Ｍｃｍ４蛋白質の場合、複数のリン酸化部位において高度にリン酸化されるほど上部へシフトする。
【００３８】
また、さらに、Ｃｈｋ１蛋白質の機能を阻害しないことを確認して、該蛋白質の機能を阻害せず、かつ、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質を選択することが特に好ましい。用いた被検物質がＣｈｋ１蛋白質の機能を阻害するか否かは、例えば、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化の程度を解析する場合と同様に、細胞抽出液又はクロマチン結合画分を調製し、該抽出液中に含まれるＣｈｋ１蛋白質のリン酸化の程度を抗Ｃｈｋ１蛋白質抗体又はＣｈｋ１蛋白質のリン酸化部位に対する抗体等を用いて解析すればよい。
【００３９】
３．細胞のＳ期集積作用解除物質
本発明の細胞のＳ期集積作用解除物質は、上記２に詳述した本発明のスクリーニング方法により選択される物質のうち、Ｃｈｋ１蛋白質の機能を阻害せず、かつ、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有する物質である。該物質は、ＤＮＡ合成において直接複製機能因子として機能するＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を特異的に抑制する能力を有し、細胞のＳ期集積作用を解除する物質である。すなわち、細胞周期がＳ期で停止している細胞に投与することにより、細胞周期を再び進行させる能力を有する。該物質としては、Ｃｈｋ１蛋白質は阻害せず、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制する能力を有してさえいれば、いかなる作用機序によるものでもよい。
【００４０】
このような物質としては、例えば、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を阻害する物質（以下、これを単に「リン酸化阻害物質」と称することがある）、すでにリン酸化されているＭｃｍ４蛋白質のリン酸基を離脱させる脱リン酸化物質（以下、これを単に「脱リン酸化物質」と称することがある）等が挙げられる。さらに、前者のリン酸化阻害物質としては、例えば、Ｍｃｍ４蛋白質をリン酸化するリン酸化酵素を阻害する物質（以下、これを単に「リン酸化酵素阻害物質」と称することがある）、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化部位におけるリン酸化反応を直接的に阻害する物質（以下、これを単に「リン酸化部位阻害物質」と称することがある）等が挙げられる。これらは、単独で用いてもよいし、複数組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
リン酸化酵素阻害物質としては、例えば、サイクリン依存性キナーゼの阻害物質等が挙げられる。これらの中でも、細胞周期のＳ期で活性の高いサイクリン依存性キナーゼの阻害物質が好ましく用いられ、特にＣｄｋ２蛋白質等のサイクリン依存性キナーゼの阻害物質が好ましく用いられる。Ｃｄｋ２蛋白質の阻害物質としては、例えば、プルバラノールＡ（Ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ  Ａ）、ロスコビチン等が挙げられる。また、Ｃｄｋ２蛋白質のようなサイクリン依存性キナーゼはＣｙｃｌｉｎＡ又はＣｙｃｌｉｎＢと複合体を形成することにより活性を示すことから、形成された複合体を解離させる能力を有する物質も同様に用いることができる。特に、Ｃｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体を解離させる能力を有する物質が好ましく用いられる。
【００４２】
また、リン酸化酵素阻害物質としては、例えば、上記１に詳述したＤＮＡ複製チェックポイントカスケードにおいて、Ｃｈｋ１蛋白質よりも下流に存在する蛋白質の機能を阻害する物質も同様に用い得る。このような蛋白質としては、例えば、前記Ｃｄｋ２蛋白質の他に、ＣＡＫ蛋白質等が挙げられる。ＣＡＫ蛋白質は、Ｃｄｋ２蛋白質のアミノ酸配列における１６０番目のスレオニンをリン酸化し、該蛋白質を活性化することで知られるキナーゼである（Ｇｕ，Ｙ．，  Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．Ｏ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，３９９５−４００５（１９９２））。
【００４３】
リン酸化部位阻害物質としては、例えば、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化部位に結合する能力を有する抗体等が挙げられる。具体的には、例えば、Ｍｃｍ４蛋白質のアミノ酸番号７のスレオニン、アミノ酸番号１９のスレオニン、アミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、アミノ酸番号１１０のスレオニン等に対する抗体等が挙げられる。これらの中でも、アミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、アミノ酸番号１１０のスレオニン等に対する抗体等が好ましく用いられる。また、該リン酸化部位に直接何らかの変異や修飾等を生じさせることによりリン酸化酵素の結合を妨げる能力を有する物質も、同様に用いることができる。
脱リン酸化物質としては、例えば、蛋白質脱リン酸化酵素の活性化物質等が挙げられる。
【００４４】
４．本発明の癌治療用薬剤又はＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果の増強用薬剤
（１）本発明の薬剤の作用機序
本発明の薬剤は、ＤＮＡ複製阻害物質と上記３に詳述した細胞のＳ期集積作用の解除物質とが併用されることにより、ＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果が増強されることを特徴としている。
【００４５】
真核生物のＤＮＡ複製の過程では、まず、二重らせんが巻き戻され、生じた一本鎖ＤＮＡ部分にヘリカーゼが結合して、その上を移動しながらＤＮＡの二本鎖をさらに解離させる。次いで、一本鎖になったＤＮＡにプライマーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種蛋白質が結合し、それぞれの一本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡが合成され、二本鎖ＤＮＡとなる。ここで、二本鎖ＤＮＡは生化学的にも生物学的にも安定であるが、一本鎖ＤＮＡは変異、切断、組換え等が生じやすく不安定であって、細胞障害や細胞死等の確率を上昇させる。従って、例えば、複製活性が高まり細胞増殖が盛んになっている癌細胞に抗癌剤としてＤＮＡ複製阻害物質を投与すると、何らかの機構により複製を停止させ、癌細胞の増殖を抑制することが期待される。より具体的には、例えば、ＤＮＡ複製阻害物質の１種であるＤＮＡ合成阻害物質を投与すると、ヘリカーゼによりＤＮＡが一本鎖化されてもＤＮＡ合成が行われず、一本鎖ＤＮＡが蓄積されて、最終的には癌細胞に細胞死を誘導することが期待される。
【００４６】
しかし、Ｓ期のＤＮＡ複製チェックポイント機構が存在している細胞では、合成や複製フォークの進行等の複製の各過程に何らかの異常があると、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードが機能して複製を停止し、細胞周期をＳ期で停止すること（細胞のＳ期集積作用）により細胞死を回避している。同様に、癌細胞においても、ＤＮＡ複製チェックポイント機構が存在すると細胞周期が停止して細胞がＳ期に集積されるため、抗癌剤として投与されたＤＮＡ合成阻害物質の効果が半減されてしまう症例が少なくない。
【００４７】
このような癌細胞におけるＤＮＡ複製阻害物質による細胞のＳ期集積作用は、ＡＴＲ蛋白質、Ｃｈｋ１蛋白質等を介したＤＮＡ複製チェックポイントカスケード（図８）を経てＭｃｍ４蛋白質がリン酸化され、最終的にヘリカーゼとして機能するＭｃｍ蛋白質複合体の活性が阻害されることにより引き起こされる。上記３に詳述した本発明の細胞のＳ期集積作用解除物質は、このようにしてＳ期に集積された細胞に投与すると、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制し、再び細胞周期を進行させる能力を有する。従って、該物質をＤＮＡ複製阻害物質と併用することにより、ヘリカーゼ活性を維持させて癌細胞に効果的に細胞死を誘導することができ、抗癌剤として投与されるＤＮＡ複製阻害物質の効果を増強することができる。ＡＴＲ蛋白質又はＣｈｋ１蛋白質の阻害物質をＤＮＡ複製阻害物質と併用する方法も知られているが、これらの蛋白質は該カスケードにおいて上流に位置し、他にも多くの働きを持つ蛋白質であることから、該カスケードにおいてＣｈｋ１蛋白質よりも下流の蛋白質の機能を阻害する方法、特に、最終的にＤＮＡ複製に直接寄与するＤＮＡ複製機能因子であるＭｃｍ４蛋白質を阻害する方法は非常に効果的であり、副作用も軽減することができる。
【００４８】
（２）本発明の癌治療用薬剤
本発明の癌治療用薬剤は、上記３に詳述した本発明の細胞のＳ期集積作用解除物質とＤＮＡ複製阻害物質とが併用されることを特徴としている。該薬剤は、癌患者に投与され、各種の癌の治療に用いられる。
本明細書において癌とは、悪性腫瘍全般、あるいはそれによる疾病状態を意味するが、これらの中でも、いわゆる抗癌剤により治療が可能とされる癌が本発明の癌治療用薬剤の好ましい対象である。具体的には、例えば、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、精巣（睾丸）腫瘍、卵巣癌、絨毛性疾患、小細胞肺癌、小児急性リンパ性白血病、頭頸部癌、食道癌、非小細胞肺癌、乳癌、胃癌、大腸癌、膵癌、膀胱癌、子宮癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌（悪性黒色腫）、軟部腫瘍等が挙げられる。
【００４９】
本発明の薬剤において併用されるＤＮＡ複製阻害物質としては、上記２の（２）に詳述したものやこれらの誘導体又はプロドラッグ等のうち、ヒトに投与可能な物質が用いられる。また、ＤＮＡ複製阻害物質の中でも、特にＤＮＡ合成阻害物質が好ましく用いられる。これらの物質の中から、患者の罹患している癌の種類、組織、進行状態、患者の年齢、性別等に鑑みて任意に選択して用いることができる。例えば、ＤＮＡ合成阻害物質では、ヒドロキシウレアは慢性骨髄性白血病等に適応する薬剤として、フルオロウラシルは頭頸部癌、乳癌、胃癌、大腸癌等に適応する薬剤として、メトトレキセートは急性白血病や乳癌等に適応する薬剤として、さらにシタラビンは急性骨髄性白血病等に適応する薬剤として選択され得る。このような繁用されている薬剤は、それぞれ公知の適応症に応じ選択されればよい。ＤＮＡ合成阻害物質以外のＤＮＡ複製阻害物質についても、同様に選択して用いることができ、例えば、シスプラチンは精巣腫瘍、膀胱癌、卵巣腫瘍等に適応する薬剤として選択され得る。また、これら薬剤の含有量等も、それぞれ選択された物質に応じて、患者の罹患している癌の種類、組織、進行状態、患者の年齢、性別等に鑑みて任意に決定することができる。
【００５０】
また、細胞のＳ期集積作用解除物質としては、上記３において詳述したものの中から、ＤＮＡ複製阻害物質との相互作用等を鑑みて適当なものを選択すればよい。これらの含有量等は、それぞれ選択された物質に応じて、患者の罹患している癌の種類、組織、進行状態、患者の年齢、性別等に鑑みて任意に決定することができる。
【００５１】
ここで、本発明において「ＤＮＡ複製阻害物質と細胞のＳ期集積作用解除物質を併用する」とは、例えば、合剤として両方を有効成分として含む薬剤を調製してこれを用いてもよいし、それぞれを有効成分として含む別の薬剤を調製してこれらを同時又は順不同で用いてもよく、いずれの形態のものも本発明の薬剤に含まれる。これらの薬剤の調製方法、投与方法等は、それ自体公知の通常用いられる方法に従って行うことができるが、例えば、注射剤として調製してこれを静脈内注射により投与する方法、錠剤又はカプセル剤等として調製してこれを経口投与する方法等が挙げられる。投与に際しては、血中濃度のモニタリング、副作用のモニタリング等が随時行われることが好ましい。さらに、治療に際しては、対象となる癌や患者に適した他の公知の薬剤や治療方法を併用することもできる。
【００５２】
このような本発明の癌治療用薬剤を用いることにより、ＤＮＡ複製阻害物質を単独で用いる場合に比較して、より効果的に癌の治療を行うことができる。癌患者にＤＮＡ複製阻害物質のみを投与した場合、癌患者の体内に存在する癌細胞でＤＮＡ複製チェックポイントカスケードが機能することによってＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進され、細胞周期がＳ期で停止することにより細胞死が回避されて、ＤＮＡ複製阻害物質の有する癌細胞を死滅させたり増殖を抑制する効果が半減してしまう。しかし、これに細胞のＳ期集積作用解除物質を併用すれば、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制してヘリカーゼとして機能するＭｃｍ蛋白質複合体の活性を維持させ、細胞周期を進行させて癌細胞の細胞死を促し、増殖を抑制することができる。このことは、抗癌剤として投与されるＤＮＡ複製阻害物質の効果が増強されることを意味し、所望の効果を得るための投与量を減量したり、ＤＮＡ複製阻害物質による副作用を最小限に抑えることができる。
【００５３】
（３）ＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果の増強用薬剤
上記（１）及び（２）において詳述したとおり、細胞のＳ期集積作用解除物質は、ＤＮＡ複製阻害物質が投与される癌細胞においてＭｃｍ４蛋白質のリン酸化を抑制してヘリカーゼとして機能するＭｃｍ蛋白質複合体の活性を維持させ、細胞周期を進行させて癌細胞の細胞死を促し、癌細胞の増殖を抑制する効果を有する。従って、該物質を有効成分とする薬剤は、ＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果の増強用薬剤として用いることができる。
【００５４】
該薬剤に有効成分として含まれる細胞のＳ期集積作用解除物質としては、上記３に挙げたもの等を用いることができ、これらの製剤化等についても、上記（２）に詳述した方法と同様に、対象とされる癌や患者等に鑑みてそれ自体公知の通常用いられる方法により行うことができる。
かくして調製される薬剤は、上記２の（３）に詳述したようなＤＮＡ複製阻害物質とともに癌に罹患している患者に投与され、該物質の効果を増強させる能力を有する。投与は、ＤＮＡ複製阻害物質と同時でもよいし、順不同に時期をずらして行われてもよい。ＤＮＡ複製阻害物質を投与した後にその治療効果を検討して、治療効果に比較して副作用が大きく該物質の投与量を増量できない場合や、ＤＮＡ複製阻害物質の投与量を増量しても効果の増強が観察されない場合等には、本増強用薬剤の投与は特に有効である。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、下記実施例において、「ＰＢＳ」とはＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅを、「ＤＭＳＯ」とはＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅを意味する。
実施例１．抗体の調製
（１）抗Ｍｃｍ４抗体
Ｍｃｍ４蛋白質のカルボキシ末端領域に対する抗体（以下、これを「抗Ｍｃｍ４抗体」と称することがある）は、木村らによって作製されたものを分与された。該抗体に関する詳細は、Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ，  １，  ９７７−９９３（１９９６）等に開示されている。
【００５６】
（２）抗リン酸化抗体
ヒトＭｃｍ４蛋白質（配列番号：１）のアミノ酸番号３２のセリンに対する抗リン酸化抗体（以下、これを「抗Ｐ−Ｓｅｒ３２抗体」と称することがある）、アミノ酸番号５４のセリンに対する抗リン酸化抗体（以下、これを「抗Ｐ−Ｓｅｒ５４抗体」と称することがある）、及びアミノ酸番号１１０のスレオニンに対する抗リン酸化抗体（以下、これを「抗Ｐ−Ｔｈｒ１１０抗体」と称することがある）は、次のようにして作製した。
【００５７】
まず、抗Ｐ−Ｓｅｒ３２抗体作製用の抗原ポリペプチド（配列番号：２）、抗Ｐ−Ｓｅｒ５４抗体作製用の抗原ポリペプチド（配列番号：３）、及び抗Ｐ−Ｔｈｒ１１０抗体作製用の抗原ポリペプチド（配列番号：４）を調製し、これらのアミノ末端に、それぞれｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔを結合させて免疫原を調製した。また、これらの抗原ポリペプチドと同じ配列を有し、かつセリンもしくはスレオニンがリン酸化されていない非リン酸化ポリペプチドをそれぞれ調製した。次いで、前記免疫原をそれぞれウサギに免疫し、それ自体公知の通常用いられる方法により抗血清を得た後、該抗血清をそれぞれの抗原ポリペプチドを予め吸着させておいたカラムにより精製した。これをさらに、それぞれの抗原ポリペプチドに対応する前記非リン酸化ポリペプチドを予め吸着させておいたカラムに供して、非リン酸化ポリペプチドに結合しなかった画分を回収し、抗Ｐ−Ｓｅｒ３２抗体、抗Ｐ−Ｓｅｒ５４抗体、又は抗Ｐ−Ｔｈｒ１１０抗体とした。
【００５８】
各ペプチドカラムは、前記ポリペプチドをＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマーシャム社製）に０．５〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で結合させて作製した。カラムからの抗体の溶出は、０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ  ２．５），  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌの溶液で行い、溶出液にはすぐにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を最終濃度１００ｍＭとなるように加えて中和した。
【００５９】
（３）抗Ｃｈｋ１抗体
抗Ｃｈｋ１抗体（ウサギ抗体）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．社より購入した。
【００６０】
（４）抗Ｃｄｋ２リン酸化抗体
抗Ｃｄｋ２リン酸化抗体としては、Ｃｄｋ２蛋白質の主要なリン酸化部位である、該蛋白質のアミノ酸配列において１６０番目のスレオニンに対する抗リン酸化抗体（以下、これを「抗Ｐ−Ｃｄｋ２抗体」と称することがある）を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製のものを購入して用いた。１６０番目のスレオニンは、該蛋白質のキナーゼとしての活性を発現させるリン酸化部位であることが知られている。
【００６１】
実施例２．各種薬剤により誘導されるＭｃｍ４蛋白質のリン酸化の解析
（１）培養細胞の調製
ヒト子宮頚部癌由来のＨｅＬａ細胞は、東北大学・榎本武美教授より供与された。ＨｅＬａ細胞の培養は、１０％ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３０あるいは５０ｍｍのプレートで行った。ヒト正常繊維芽細胞のＨＵＣ−Ｆ細胞は、ヒトのへその緒由来の細胞であって、理研細胞バンクより購入した。ＨＵＣ−Ｆ細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地を用いて、３０あるいは５０ｍｍのプレートで行った。いずれの細胞も、二酸化炭素７．５％を含む３７℃の培養器中で１−２日間程度培養し、対数増殖期になったところで実験に用いた。
【００６２】
各培養細胞の薬剤による処理は、下記のようにして行った。
ＤＮＡ合成阻害物質であるヒドロキシウレア（ＨＵ）は、シグマ社から購入し、ＰＢＳに適当な濃度で溶解してストック溶液とした。これを、最終濃度２ｍＭとなるようにＨｅＬａ細胞及びＨＵＣ−Ｆ細胞の培養上清に添加して処理した。処理時間は２４時間とした。
【００６３】
ＤＮＡ合成阻害物質であるアフィディコリンは、和光純薬社から購入し、１５ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解してストック溶液とした。これを、最終濃度１５μＭ又は３０μＭとなるようにＨｅＬａ細胞の培養上清に添加して処理した。処理時間は、２４時間とした。
トポイソメラーゼ阻害物質であるカンプトテシン（ＣＰＴ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入し、３ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解してストック溶液とした。これを、最終濃度０、１、３、１０、３０μＭとなるようにＨｅＬａ細胞の培養上清に添加して処理した。処理時間は２４時間とした。（「０μＭ」とは、ＣＰＴを添加していない細胞を意味する。）
アルキル化物質であるメチルメタンサルフェート（ＭＭＳ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．社から購入し、２０ｍｇ／ｍｌとなるように水に溶解してストック溶液とした。これを、最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるようにＨｅＬａ細胞の培養上清に添加して処理した。処理時間は、０、４、６、１４時間とした。（「０時間」とは、ＭＭＳを添加していない細胞を意味する。）
【００６４】
（２）細胞の分画
上記（１）で調製した各細胞を溶解し、分画を行った。
まず、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いてプレートからはがした細胞液に、培養液を加えて反応を停止した後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行って細胞を集めた。集めた細胞をＰＢＳで一回洗浄し、これに２×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度になるように、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＡＴＰ、蛋白質分解阻害剤（×５０  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ：Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）とホスファターゼ阻害剤（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  Ｎａ−ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  Ｎａ−ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ，  ＮａＦ）を含むＣＳＫ溶液（１０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ  ６．８），  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  １ｍＭ  ＥＧＴＡ）を加え、氷上で１５分間おいて溶解した。
【００６５】
この溶液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を分取し、この上清画分を「Ｓ１」とした。再び、上記ＣＳＫ溶液で細胞を懸濁した後、再び同条件で遠心分離を行い、上清画分を回収して「Ｓ２」とした。沈殿として得られたクロマチン画分を、元の細胞数から４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌの濃度になるよう換算して上記ＣＳＫ溶液に懸濁し、これを「Ｐ」とした。
【００６６】
（３）ウエスタンブロット法による解析
上記（２）で調製したＳ１、Ｓ２、及びＰの各画分に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用の試料用溶液（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），  ２％  ＳＤＳ，  １０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．０１％  ＢＰＢ  の３倍濃縮溶液）を加えて、０．１％のＳＤＳを含む１０％アクリルアミドゲル電気泳動（２００Ｖ、１時間）に供した。ＨＵ又はアフィディコリンを添加した細胞の場合は、Ｓ１及びＰ画分のみを用いた。泳動後、ゲル上の蛋白質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）上に転写した。転写は、転写用溶液（５．８ｇ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ，  ２．９ｇ  ｇｌｙｃｉｎｅ，  ０．３７ｇ  ＳＤＳ  ａｎｄ  ２００ｍｌ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｉｎ  １  ｌｉｔｅｒ）中で、１５Ｖ、室温で１時間行った。転写後の膜は、１時間、室温でブロック溶液（Ｂｌｏｃｋａｃｅ：大日本製薬社製）に浸し、ブロッキングした。
【００６７】
上記実施例１で調製した各抗体をブロック溶液に添加し、これに転写膜を３７℃で１時間３０分間浸して、抗原抗体反応を行った。抗Ｍｃｍ４抗体は抗血清を４０００倍希釈、抗Ｃｈｋ１抗体は最終濃度０．５μｇ／ｍｌ、抗Ｐ−Ｃｄｋ２抗体は１０００倍希釈となるように添加して反応させた。反応後の膜を、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）溶液を用いて５分間ずつ３回洗浄した後、これをペルオキシダーゼ結合型抗ウサギ抗体（Ｂｉｏｒａｄ社製）を含むブロック溶液中に浸し、３７℃、１時間３０分間保温してさらに反応させた。反応後の膜を、上記ＴＢＳ溶液で再び洗浄した後、膜にペルオキシダーゼ反応試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ：Ｐｉｅｒｓｅ社製）を添加して反応させ、生じた化学発光をＣｏｏｌ  Ｓａｖｅｒ  ＡＥ−６９３５（Ａｔｔｏ社製）を用いて検出した。
【００６８】
（４）結果
得られた結果を図１〜４に示す。
結果より、ＨＵ又はアフィディコリンを添加したＨｅＬａ細胞において、Ｍｃｍ４蛋白質の高度なリン酸化が見られることがわかった（図１及び図２）。これは、ＨＵ又はアフィディコリンを添加したＨｅＬａ細胞から調製したクロマチン画分（図１又は２において「Ｍｃｍ４」と示された枠内の「Ｐ」で示されるレーンのうち、ＨＵ又はアフィディコリンが「＋」となっているレーン）におけるＭｃｍ４蛋白質のバンドが、Ｍｃｍ４蛋白質の本来のバンド位置（ＨＵ又はアフィディコリンが「−」となっているレーンに見られるバンドの位置）よりも上部にシフトし、縦に長くスメアなバンドを形成したことにより確認された。このようなバンドのシフトが、上清画分（図１又は２において「Ｍｃｍ４」と示された枠内の「Ｓ」で示されるレーン）ではなくクロマチン画分において顕著に見られることも確認された。
【００６９】
一方、ＣＰＴ又はＭＭＳを添加したＨｅＬａ細胞では、Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化は若干観察された（図３又は図４）。すなわち、該細胞から調製したクロマチン画分（図３又は４において「Ｍｃｍ４」と示された枠内の「Ｐ」で示されるレーン）において、ＨＵ又はアフィディコリンを添加した場合に比べれば低レベルではあるものの、同様のＭｃｍ４蛋白質のバンドのシフトが観察されたことにより確認された。
【００７０】
これらの結果より、ＤＮＡ合成阻害物質であるＨＵ及びアフィディコリンを癌細胞に投与するとＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が強く亢進されること、及び、トポイソメラーゼ阻害物質であるＣＰＴ及びアルキル化物質であるＭＭＳでは若干Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化が亢進されることが確認された。
一方、正常な繊維芽細胞であるＨＵＣ−Ｆ細胞では、ＨＵを投与してもＭｃｍ４蛋白質のリン酸化の亢進はほとんど見られないことが確認された（図１の「ＨＵＣ−Ｆ」で示される枠内の「Ｐ」で示されるレーン）。この結果は、正常細胞と癌細胞とではＤＮＡ合成阻害物質に対する反応が異なり、Ｓ期のＤＮＡ複製チェックポイント機構やその働きのレベル等に違いがあることを示している。このことから、例えば、癌の患者にＤＮＡ複製阻害物質とともにＭｃｍ４蛋白質のリン酸化抑制物質を投与した場合に、正常細胞への副作用が非常に小さいことが期待できる。
【００７１】
また、Ｃｈｋ１蛋白質についても、ＨＵやアフィディコリンの投与によりリン酸化が亢進され、活性化されることが示された（図１及び図２）。また、ＣＰＴ及びＭＭＳでも低レベルながら活性化が見られた（図３及び図４）。Ｃｈｋ１蛋白質は、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードにおいて、ＤＮＡの損傷が検知されて発せられたシグナルを増幅し伝達する蛋白質のファミリーの一つとして知られていたものの、この蛋白質からのシグナルを最終的に受け取って稼働する蛋白質は解明されていなかった。しかし、上記の結果においてＣｈｋ１蛋白質のリン酸化（活性化）とＭｃｍ４蛋白質のリン酸化には相関が見られ、これらのリン酸化が同一のカスケード中に存在することが示唆された。
【００７２】
さらに、抗Ｍｃｍ４抗体、抗Ｃｈｋ１抗体と同時に抗Ｐ−Ｃｄｋ２抗体を用いた解析を、ＨＵを投与した細胞からの抽出液について行った結果からは、Ｃｄｋ２蛋白質の１６０番目のスレオニンにおけるリン酸化が亢進していることが示された。このリン酸化は、Ｍｃｍ４蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質のリン酸化と相関していた。すなわち、これらの結果より、Ｓ期で特に活性化されることで知られるＣｄｋ２蛋白質のリン酸化が、Ｍｃｍ４蛋白質やＣｈｋ１蛋白質と同様にＨＵ投与により亢進されることが確認された（図５）。
【００７３】
実施例３．Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化カスケードの解析＜１＞
上記実施例２において、Ｍｃｍ４蛋白質、Ｃｈｋ１蛋白質、及びＣｄｋ２蛋白質のリン酸化には相関性があり、ＤＮＡ複製チェックポイント機構において、同じＤＮＡ複製チェックポイントカスケードに関与する可能性が示唆された。そこで、このリン酸化カスケードについてさらに解析を行った。解析対象は、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードに関与し、Ｃｈｋ１蛋白質をリン酸化することで知られるＡＴＲ蛋白質、Ｃｈｋ１蛋白質、及びＣｄｋ２蛋白質とした。
【００７４】
（１）試薬
ＤＮＡ合成阻害物質であるヒドロキシウレア（ＨＵ）は、上記実施例２と同じものを用いた。
ＡＴＲ蛋白質の非特異的な阻害剤として知られるカフェインはシグマ社から購入し、ＰＢＳに溶解してこれをストック溶液とした。
Ｃｈｋ１蛋白質の非特異的な阻害剤として知られるＧｏ６９７６は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入し、３００μｇ／ｍｌで溶解してこれをストック溶液とした。
【００７５】
（２）培養細胞の調製
ＨｅＬａ細胞の培養は、上記実施例２の（１）と同様にして行った。
調製された細胞の培養上清に、最終濃度２ｍＭとなるようにＨＵを添加し、これに、カフェイン又はＧｏ６９７６を同時に加えた。カフェインは最終濃度５ｍＭとなるように添加し、Ｇｏ６９７６は最終濃度０．１５、０．３、０．６、１μＭとなるように添加した。処理時間はいずれも２４時間とした。
【００７６】
（３）細胞の分画及びウエスタンブロット法による解析
細胞の分画、及び、Ｓ及びＰ画分を用いたウエスタンブロット法による解析は、すべて上記実施例２と同様にして行った。ウエスタンブロット法における蛋白質の検出には、上記実施例１の（１）で作製した抗Ｍｃｍ４抗体をブロック溶液に抗血清を４０００倍希釈となるように加えて用いた。抗Ｃｈｋ１抗体は最終濃度０．５μｇ／ｍｌ、抗Ｐ−Ｃｄｋ２抗体は１０００倍希釈となるようにして用いた。なお、抗Ｐ−Ｃｄｋ２抗体による解析はＧｏ６９７６による処理を行った細胞についてのみ行った。
【００７７】
（４）結果
結果を図１及び図６に示した。
解析の結果、ＡＴＲ蛋白質の非特異的な阻害物質であるカフェイン、又はＣｈｋ１蛋白質の非特異的な阻害物質であるＧｏ６９７６を添加したＨｅＬａ細胞では、いずれにおいてもＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が抑制されることがわかった。このことは、図１のＨＵ及びＣａｆｆｅｉｎｅを添加した細胞（「ＨＵ」及び「Ｃａｆｆｅｉｎｅ」がいずれも「＋」と示されているレーン）において、Ｍｃｍ４蛋白質のバンドの上部へのシフトが抑制され、ＨＵが添加されていない細胞と同程度の大きさのバンドが検出されたことから確認された。図６においては、Ｇｏ６９７６を添加することによりＨＵによるＭｃｍ４蛋白質のバンドの上部へのシフトが抑制されることが示された。
【００７８】
また、Ｃｈｋ１蛋白質については、カフェインの投与によってリン酸化が抑制されるが（図１）、Ｇｏ６９７６の投与ではリン酸化は抑制されないことがわかった（図６）。しかし、Ｇｏ６９７６は、Ｃｈｋ１蛋白質のリン酸化は抑制しないが、その下流に存在すると考えられるＣｄｋ２蛋白質のリン酸化は抑制していた（図６）。すなわち、カフェインはＣｈｋ１蛋白質をリン酸化する機能を有するＡＴＲ蛋白質を阻害することによりＣｈｋ１蛋白質のリン酸化を抑制すること、及び、Ｇｏ６９７６がリン酸化抑制以外の機構によりＣｈｋ１蛋白質の機能を阻害し、その下流にあるＣｄｋ２蛋白質のリン酸化（活性化）を抑制することが示された。
【００７９】
これらの結果から、Ｍｃｍ４蛋白質及びＣｄｋ２蛋白質は、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードの上流において機能することがよく知られているＡＴＲ蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質をメンバーとするリン酸化カスケードによりリン酸化されることが示された。
【００８０】
実施例４．Ｍｃｍ４蛋白質のリン酸化カスケードの解析＜２＞
上記実施例３で、Ｍｃｍ４蛋白質及びＣｄｋ２蛋白質がＡＴＲ蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質をメンバーとするリン酸化カスケードによりリン酸化されることが示されたことから、このＣｄｋ２蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質が、Ｍｃｍ４蛋白質を直接的にリン酸化する活性を有するか否かをｉｎ  ｖｉｔｒｏで検討した。Ｃｄｋ２蛋白質は、ＣｙｃｌｉｎＡ蛋白質との複合体を形成し、細胞周期のＳ期において特に活性化されることで知られていることから、解析にはこの複合体を調製して用いた。
また、同時に、細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＨＵによるＭｃｍ４蛋白質のリン酸化部位についても検討した。
【００８１】
（１）ヒトＣｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体の調製
ヒトＣｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体は、Ｉｓｈｉｍｉ，Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７６，  ３４４２８（２００１）に記載の方法に従って調製した。
【００８２】
（２）ヒトＣｈｋ１蛋白質の調製
ヒトＣｈｋ１蛋白質は、次のようにして調製した。
まず、ヒトＣｈｋ１遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １８，  ３６７３−３６８１（１９９９））の組換えバキュロウィルスは、名古屋市大・中西真先生より供与された。これを昆虫細胞Ｈｉｇｈ５（インビトロジェン社製）に感染させ、ヒスチジンタグが付いた融合蛋白質（Ｈｉｓ−Ｃｈｋ１）としてＣｈｋ１蛋白質を過剰発現させた。Ｈｉｓ−Ｃｈｋ１は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー（キアゲン社製）を用いて、キットに収載の説明書に記載の方法に従って精製した。
【００８３】
（３）ヒトＭｃｍ４／６／７複合体の調製
Ｍｃｍ４蛋白質は、細胞内でＭｃｍ４／６／７複合体を形成することによりヘリカーゼ活性を示すことが知られている。この活性型複合体は、バキュロウィルス発現系で産生した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムクロマトグラフィー及びグリセロール密度勾配遠心法により精製した。これらの方法の詳細は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  ２４５０８（１９９７）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９，  ８００３−８０１５（１９９９）等に開示されている。
【００８４】
（４）ヒトＭｃｍ４蛋白質のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるリン酸化
上記（３）で調製したＭｃｍ４／６／７複合体５０ｎｇを、それぞれ４０、１２０、２００ｎｇのＣｈｋ１蛋白質とともに反応溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０），  １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ２．５ｍＭ  ＥＧＴＡ，  １ｍＭ  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，  １００ｍＭ  ＡＴＰ）に添加し、３７℃、１時間反応させた。また、同じくＭｃｍ４／６／７複合体５０ｎｇを、それぞれ２０、６０、２００ｎｇのＣｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡとともに別の反応溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），  ３０ｍＭ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．０１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，  １００ｍＭ  ＡＴＰ）に添加し、３７℃、１時間反応させた。
【００８５】
（５）ヒトＭｃｍ４蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリン酸化
培養細胞の調製、ヒドロキシウレア（ＨＵ）の添加は、上記実施例２と同様にして行った。細胞の分画は、上記実施例２と同様にしてＳ２画分を得た後、沈殿を元の細胞に換算して４×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μｌとなるようにＣＳＫ溶液で均一に溶解し、Ｐ画分としてから、これにさらにＤＮａｓｅ  Ｉ（宝酒造社製）を１．４ｕｎｉｔｓ／μｌを加えて３０℃で２０分間保温して反応させた。これを遠心分離して、その上清を「Ｓ４」とし、沈殿を再びＣＳＫ溶液で均一に溶解した画分を「Ｐ’」とした。
【００８６】
（６）ウエスタンブロット法による解析
反応後の溶液をそれぞれ８μｌずつ分取して、０．１％のＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、ウエスタンブロット法による解析を行った。電気泳動、ＰＶＤＦ膜への転写、及び抗体による検出は、すべて上記実施例２の（３）と同様にして行った。抗体は、抗Ｍｃｍ４抗体を抗血清が４０００倍希釈となる濃度で、抗Ｐ−Ｓｅｒ３２抗体、抗Ｐ−Ｓｅｒ５４抗体、及び抗Ｐ−Ｔｈｒ１１０抗体は０．５μｇ／ｍｌの濃度でブロック溶液に添加して、反応させた。
【００８７】
（７）結果
結果を図７に示した。左図は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体又はＣｈｋ１蛋白質を加えた実験の結果を示し、右図は、ＨｅＬａ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｖｏの実験の結果である。
左図より、Ｃｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体を添加した場合には、すべての抗体によりリン酸化されたＭｃｍ４蛋白質のバンドが検出された。このことから、Ｃｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体が、配列番号：１に示すＭｃｍ４蛋白質のアミノ酸配列の、アミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、及びアミノ酸番号１１０のスレオニンにおけるリン酸化を直接的に行う活性を有することが確認された。一方、Ｃｈｋ１蛋白質を添加した場合には、抗Ｍｃｍ４抗体で検出されるバンドに上部へのシフトは見られず、また、各抗リン酸化抗体により検出されるバンドもほとんどなかったことから、Ｃｈｋ１蛋白質には直接的にＭｃｍ４蛋白質のアミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、及びアミノ酸番号１１０のスレオニンをリン酸化する活性は無いことがわかった。
【００８８】
また、右図のＨＵの添加によりＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が誘導された細胞を用いた実験の結果より、ＨＵにより誘導されるＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が、少なくともアミノ酸番号３２のセリン、アミノ酸番号５４のセリン、アミノ酸番号１１０のスレオニンにおいて強く見られることが示された。このことからも、ＤＮＡ複製チェックポイントカスケードにおいて最終的にＭｃｍ４蛋白質をリン酸化する蛋白質が主にＣｄｋ２／ＣｙｃｌｉｎＡ複合体であることが確認された。
【００８９】
これらについて、さらにリン酸化の程度を解析するためにＣｏｏｌ  ｓａｖｅｒ  ＡＥ−６９３５（アトー社製）を用いてバンドのシグナル強度の定量を行った。抗Ｍｃｍ４抗体により検出されたクロマチン画分中のＭｃｍ４蛋白質のバンド（「Ｍｃｍ４」で示される枠内の図の「Ｐ」で示されるレーン）では、約１００ｋＤに検出されるＭｃｍ４蛋白質本来のバンドと、その上部に見られるリン酸化されたＭｃｍ４蛋白質によるスメアなバンドとを定量して比較した。その結果、ＨＵを添加していない細胞とＨＵを添加した細胞とでは、リン酸化された蛋白質の量が約４倍に上昇していた。また、各抗リン酸化抗体により検出されたクロマチン画分中のＭｃｍ４蛋白質のバンドについては、検出されたバンド全体を定量してＨＵ添加の有無による差を比較した。その結果、抗Ｐ−Ｔｈｒ１１０抗体ではＨＵの添加によりシグナルが約７倍に、抗Ｐ−Ｓｅｒ３２抗体では約２．５倍に上昇していた。これらの結果より、ＤＮＡ合成阻害物質であるＨＵの添加によりＭｃｍ４蛋白質のリン酸化が顕著に亢進されることが確認された。
【００９０】
以上の解析により確認された、Ｍｃｍ４蛋白質をリン酸化するＤＮＡ複製チェックポイントカスケードを、図８に示した。
【００９１】
【発明の効果】
本発明のスクリーニング方法により、細胞のＳ期集積作用を引き起こすＭｃｍ４蛋白質のリン酸化の抑制に着目して、効果的な細胞のＳ期集積作用解除物質を取得することができる。該スクリーニング方法により得られる物質は、ＤＮＡ複製阻害物質による癌の治療効果を増強する能力を有することから、ＤＮＡ複製阻害物質を増量することなく高い治療効果を得ることができ、副作用を軽減することができると期待される。
【００９２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｅＬａ細胞又はＨＵＣ−Ｆ細胞にヒドロキシウレア及び／又はカフェインを添加して培養した後、該細胞の細胞抽出液から調製した各画分に含まれるＭｃｍ４蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質についてウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図中、「Ｓ、Ｐ、Ｓ１、Ｓ２」は細胞抽出液の各画分を示す。「Ｍｃｍ４」は抗Ｍｃｍ４抗体による検出の結果であり、「Ｃｈｋ１」は抗Ｃｈｋ１抗体による検出の結果を示す。
【図２】ＨｅＬａ細胞にアフィディコリンを添加して培養した後、該細胞の細胞抽出液から調製した各画分に含まれるＭｃｍ４蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質についてウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図中、「＋」はアフィディコリンを１５μＭ添加した場合、「＋＋」は３０μＭ添加した場合を示す。
【図３】ＨｅＬａ細胞にカンプトテシンを添加して培養した後、該細胞の細胞抽出液から調製した各画分に含まれるＭｃｍ４蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質についてウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図中の数字はカンプトテシンの添加濃度（単位・μＭ）を示す。
【図４】ＨｅＬａ細胞にメチルメタンサルフェートを添加して培養した後、該細胞の細胞抽出液から調製した各画分に含まれるＭｃｍ４蛋白質及びＣｈｋ１蛋白質についてウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図中の数字はメチルメタンサルフェートの処理時間（単位・時間）を示す。
【図５】ヒドロキシウレアによるＨｅＬａ細胞中のＭｃｍ４蛋白質、Ｃｈｋ１蛋白質、及びＣｄｋ２蛋白質のリン酸化について、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。
【図６】ヒドロキシウレアによるＨｅＬａ細胞中のＭｃｍ４蛋白質、Ｃｈｋ１蛋白質、及びＣｄｋ２蛋白質のリン酸化について、Ｇｏ６９７６の添加効果をウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。
【図７】左図は、Ｃｄｋ２とＣｈｋ１蛋白質がＭｃｍ４蛋白質をリン酸化する作用を有するか否かを、ウエスタンブロット法により検出した結果を示す写真である。右図は、ＨｅＬａ細胞にヒドロキシウレアを添加して培養した場合の、Ｍｃｍ４蛋白質の各リン酸化部位におけるリン酸化の様子をウエスタンブロット法により解析した結果を示す写真である。図中、「Ｍｃｍ４」は抗Ｍｃｍ４抗体による検出の結果を示し、「Ｐ−Ｓｅｒ３２」、「Ｐ−Ｓｅｒ５４」、「Ｐ−Ｔｈｒ１１０」は各リン酸化抗体による検出の結果を示す。
【図８】Ｍｃｍ４蛋白質をリン酸化するＤＮＡ複製チェックポイントカスケードについて示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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