(57)【要約】【課題】  種々の疾患（例えばウイルス性疾患、癌、遺伝性疾患等）を治療するための新規の組成物及び方法の提供、およびさらにその他の関連した利益の提供。【解決手段】  ヒト細胞に感染するレトロウイルスベクターであって、該レトロウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を毒性物質へと活性化する生成物をコードする遺伝子であり、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードする、ベクター。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞に感染するレトロウイルスベクターであって、該レトロウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を毒性物質へと活性化する生成物をコードする遺伝子であり、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードする、ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターであって、前記プロドラッグは、プリンベースの薬物またはピリミジンベースの薬物である、ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のベクターであって、前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびγ−インターフェロンからなる群より選択される、ベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物が、チミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターであって、前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスチミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、ガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ、ＡＺＴ、およびｄｄＣからなる群より選択される、ベクター。
【請求項８】
請求項３に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物が、シトシンデアミナーゼである、ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、５−フルオロシトシンである、ベクター。
【請求項１０】
請求項３に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物が、大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼである、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、チオキサンチンである、ベクター。
【請求項１２】
請求項４に記載のベクターであって、前記サイトカインが、γ−インターフェロンである、ベクター。
【請求項１３】
ヒト細胞に感染するレトロウイルスベクターであって、該レトロウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、チミジンキナーゼをコードする遺伝子を含み、該チミジンキナーゼは、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を細胞毒性物質へと活性化し、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードする、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、プリンベースの薬物またはピリミジンベースの薬物である、ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のベクターであって、前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスチミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項１６】
請求項１３に記載のベクターであって、前記サイトカインが、γ−インターフェロンである、ベクター。
【請求項１７】
ヒト細胞に感染する複製欠損性組換えレトロウイルスベクターであって、該複製欠損性組換えレトロウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、チミジンキナーゼをコードし、該チミジンキナーゼは、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を細胞毒性物質へと活性化し、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードし、該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子は、該レトロウイルスベクターがヒト細胞に感染した場合に発現される、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターであって、前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスチミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、ガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ、ＡＺＴ、およびｄｄＣからなる群より選択される、ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載のベクターであって、前記制御配列が、組織特異性プロモーターまたはイベント特異性プロモーターである、ベクター。
【請求項２１】
請求項１７に記載のベクターであって、前記サイトカインが、γ−インターフェロンである、ベクター。
【請求項２２】
請求項４に記載のベクターであって、前記サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦである、ベクター。
【請求項２３】
請求項４に記載のベクターであって、前記サイトカインがＩＬ−２である、ベクター。
【請求項２４】
ヒト細胞に感染するレトロウイルスベクターであって、該レトロウイルスベクターは、転写制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、条件致死遺伝子生成物をコードする条件致死遺伝子であり、該条件致死遺伝子生成物は、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物を細胞毒性物質へと転換し、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードし、該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子の発現は、該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子に作動可能に連結された該転写制御配列によって制御され、該転写制御配列のうちの１つは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、ベクター。
【請求項２５】
ヒト細胞に感染するレンチウイルスベクターであって、該レンチウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を毒性物質へと活性化する生成物をコードする遺伝子であり、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードする、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターであって、前記プロドラッグは、プリンベースの薬物またはピリミジンベースの薬物である、ベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼからなる群より選択される、ベクター。
【請求項２８】
請求項２５に記載のベクターであって、前記サイトカインが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびγ−インターフェロンからなる群より選択される、ベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物が、チミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載のベクターであって、前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスチミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、ガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ、ＡＺＴ、およびｄｄＣからなる群より選択される、ベクター。
【請求項３２】
請求項２７に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物が、シトシンデアミナーゼである、ベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、５−フルオロシトシンである、ベクター。
【請求項３４】
請求項２７に記載のベクターであって、前記第１の組換え遺伝子の生成物が、大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼである、ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、チオキサンチンである、ベクター。
【請求項３６】
請求項２８に記載のベクターであって、前記サイトカインが、γ−インターフェロンである、ベクター。
【請求項３７】
ヒト細胞に感染するレンチウイルスベクターであって、該レンチウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、チミジンキナーゼをコードする遺伝子を含み、該チミジンキナーゼは、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を細胞毒性物質へと活性化し、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードする、ベクター。
【請求項３８】
請求項３７に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、プリンベースの薬物またはピリミジンベースの薬物である、ベクター。
【請求項３９】
請求項３７に記載のベクターであって、前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスチミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項４０】
請求項３７に記載のベクターであって、前記サイトカインが、γ−インターフェロンである、ベクター。
【請求項４１】
ヒト細胞に感染する複製欠損性組換えレンチウイルスベクターであって、該複製欠損性組換えレンチウイルスベクターは、制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、チミジンキナーゼをコードし、該チミジンキナーゼは、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物（プロドラッグ）を細胞毒性物質へと活性化し、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードし、該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子は、該レンチウイルスベクターがヒト細胞に感染した場合に発現される、ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のベクターであって、前記チミジンキナーゼが、単純ヘルペスチミジンキナーゼである、ベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載のベクターであって、前記プロドラッグが、ガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ、ＡＺＴ、およびｄｄＣからなる群より選択される、ベクター。
【請求項４４】
請求項４１に記載のベクターであって、前記制御配列が、組織特異性プロモーターまたはイベント特異性プロモーターである、ベクター。
【請求項４５】
請求項４１に記載のベクターであって、前記サイトカインが、γ−インターフェロンである、ベクター。
【請求項４６】
請求項２８に記載のベクターであって、前記サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦである、ベクター。
【請求項４７】
請求項２８に記載のベクターであって、前記サイトカインがＩＬ−２である、ベクター。
【請求項４８】
ヒト細胞に感染するレンチウイルスベクターであって、該レンチウイルスベクターは、転写制御配列に作動可能に連結された、第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子を含み、該第１の組換え遺伝子は、条件致死遺伝子生成物をコードする条件致死遺伝子であり、該条件致死遺伝子生成物は、ほとんどまたは全く細胞毒性を持たない化合物を細胞毒性物質へと転換し、該第２の組換え遺伝子は、ヒトサイトカインをコードし、該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子の発現は、該第１の組換え遺伝子および第２の組換え遺伝子に作動可能に連結された該転写制御配列によって制御され、該転写制御配列のうちの１つは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にウイルスベクター、特にベクター構築物を感染し易い標的細胞に供給することができる組換え体ウイルスベクターに関する。これらのベクター構築物は典型的には、殆ど又は全く活性を持たない化合物を活性物質に活性化することができる遺伝子物質を供給するよう意図される。
【背景技術】
【０００２】
多くの細菌性疾患は概して抗生物質で容易に治療されるけれども、遺伝性疾患を含めた多数のウイルス性、癌性及び他の疾患に対しては有効な治療法は極わずかしかない。例えば癌は今日では米国の総死亡率の５分の１を占め、死因の第二位である。要するに癌は一般的には細胞の一集団の非制御分裂を特徴とする。この非制御分裂は一般的に腫瘍の形成を引き起こし、これはその後他の部位に転移し得る。
【０００３】
癌は、概して治療が非常に難しいある種の疾患を表す。例えば原発性固体腫瘍は外科的切除により処置し得るが、しかし固体腫瘍を有する相当数の患者が原発性腫瘍部位の範囲外に微小転移を有する。外科的処置だけの場合、これらの患者の多数が癌を再発する。したがって外科的処置の他にさらに、今日、多数の癌が細胞毒性化学療法薬（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチン、メトトレキセート、５−ＦＵ等）、及び／又は放射線療法で処置される。しかしながらこのアプローチに伴う困難の１つは、放射線療法及び化学療法薬が正常組織に対して毒性を有し、しばしば生命を脅かす副作用を生じることである。さらにこれらのアプローチはしばしば、非常に高い不全／緩解率を示す（癌の種類により９０％まで）。
【０００４】
したがって、癌細胞を除去するために個々人の免疫系を補強又は増強する努力において、種々の他の療法が試みられてきた。いくつかのこのような療法は、免疫系を刺激して腫瘍細胞を破壊するために、アジュバントとして細菌又はウイルス成分を利用した。このような成分の例としては、  ＢＣＧ、内毒素、混合細菌ワクチン、インターフェロン（α，β及びχ）、インターフェロン誘導体（例えばＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ及び種々のウイルス）、及び胸腺因子（例えばチモシン分画５及びチモシン  アルファ−１）が挙げられる（一般に「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ」  Ｏｌｄｈａｍ  （ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７参照）。このような作用物質は一般に、動物腫瘍モデルにおけるアジュバントとして及び非特異的刺激剤として有用であるが、しかしヒトにおいて一般的に有効であることは未だ立証されていない。
【０００５】
リンフォカインも癌の治療に利用されている。手短にいえば、リンフォカインは種々の細胞により分泌され、一般に免疫反応の発生において特定の細胞に作用を及ぼす。リンフォカインの例としては、インターロイキン（ＩＬ）−１，−２，−３及び−４、並びにコロニー刺激因子、例えば  Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ及び  Ｍ−ＣＳＦが挙げられる。近年、あるグループが、腫瘍細胞に対して細胞毒性を有する大量の細胞を伸展及び産生するために、ＩＬ−２を用いて末梢血細胞を刺激した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３：１４８５−１４９２，１９８５）。
【０００６】
他のものは、抗体媒介性抗癌療法の使用を示唆している。手短にいえば、独特の又は正常細胞に比して癌細胞上でより優勢なある種の細胞表面抗原を認識する抗体を開発し得る。これらの抗体、あるいは“魔法の小球”は、腫瘍細胞を特異的に標的にし殺すために、単独で又は毒素と抱合させて用い得る（Ｄｉｌｌｍａｎ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｏｌｄｈａｍ  （ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７参照）。例えばＢａｌｌ等（Ｂｌｏｏｄ  ６２：１２０３−１２１０，１９８３）は、数名の急性骨髄性白血病患者を１つ又はそれ以上の白血病に特異的ないくつかのモノクローナル抗体で処置し、その結果処置中に循環白血病細胞の顕著な減少を生じた。同様に、他のものは、例えば黒色腫、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌及び肺癌を含めた種々の腫瘍を治療的に処置するために毒素抱合抗体を用いた（Ｄｉｌｌｍａｎ（上記）参照）。しかしながら１つの難しい点は、殆どのモノクローナル抗体がネズミ起源であり、したがってネズミ抗体に対する過敏性が、特に反復治療後にその効力を限定するおそれがあることである。一般的副作用としては、発熱、発汗及び悪寒、皮膚発疹、関節炎及び神経麻痺が挙げられる。
【０００７】
したがって癌は、一般原則として、慣用的又は実験的製剤組成物を用いて治療するのが非常に難しかった。
【０００８】
同様に、ウイルス性疾患は、慣用的製剤組成物で治療するのが非常に難しかった。概してこのような製剤は特異性を欠き、高い全般的毒性を示し、そして一般に治療的に有効でないことが判明している。
【０００９】
ウイルス性疾患を治療するために開発された他の技術は、非感染形態（例えば死ウイルス）のウイルスの投与により病原因子（即ちウイルス）に対する免疫反応を引出し、それにより免疫刺激剤として作用する抗原を提供することを包含する。このようなアプローチはある種のウイルス（例えばポリオ）に有用であることが立証されているが、しかし他のウイルス（例えばＨＩＶ）には有効ではない。
【００１０】
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のようなウイルス性疾患に対するより最新のアプローチは、ウイルスエンベロープタンパク質との複合体を受容するか又は形成することから  ＨＩＶによる感染を受け易い細胞上の受容体を遮断することを包含する。例えばＬｉｆｓｏｎ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１１２３−１１２７，１９８６）は、ＣＤ４（Ｔ４）受容体に対する抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染及び非感染ＣＤ４表示細胞間の細胞融合（シンシチウム）を阻害することを立証した。モノクローナル抗体を用いた同様のＣＤ４遮断作用は、ＭｃＤｏｕｇａｌ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１：３８２−３８５，１９８６）により示唆されている。あるいはＰｅｒｔ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９２５４−９２５８，１９８６）は、合成ペプチドを用いてＴ４受容体を結合し、ヒトＴ細胞の  ＨＩＶ感染を遮断することを報告し、そしてＬｉｆｓｏｎ等（    ）は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質と相互作用するレクチンを用いてシンシチウム及びウイルス／Ｔ４の両細胞融合を遮断し、それによりそれがＣＤ４受容体に受容されないようにすることを報告した。
【００１１】
例えばウイルス（ＲＮＡを転写する）のような病原因子を阻害するための別の技法は、転写  ＲＮＡの少なくとも１つのタンパク質を補足するアンチセンス  ＲＮＡを提供し、それにより翻訳を阻害することである（Ｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：７５８，１９８６）。
【００１２】
しかしながら上記の技法の大きな欠点は、それらが、薬剤、抗原、遮断剤又はアンチセンス  ＲＮＡが用いられる時間、位置又は程度をそれ自体容易に制御させないことである。特に上記の技法は治療薬の外生的適用（即ちｉｎ  ｖｉｔｒｏ情況での試料に対して外生的な）を要するため、病原因子の存在に対してそれらは直接反応しない。例えば病原因子による感染直後に漸増量で発現される免疫刺激剤を有するのが望ましい。さらにアンチセンス  ＲＮＡの場合、動物における有用な治療のためには多量を要し、これは最新技術下では、それが実際に必要とされる、即ち病原因子に感染された細胞における位置とは関係なく投与される。
【００１３】
外生的適用の代替物として、治療剤を内生的に産生するための技法が示唆された。さらに  ＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、サルウイルス４０、ウシ乳頭腫及びワクシニアウイルスを基礎にしたウイルスベクターから発現されるタンパク質が研究された。例として、Ｐａｎｉｃａｌｅ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：５３６４，１９８３）はワクシニアゲノム中にインフルエンザウイルスヘマグルチニン及びＢ型肝炎表面抗原を導入し、このような組換え体遺伝子から産生されたウイルス粒子で動物を感染させた。感染後、動物は、ワクシニアウイルスとＢ型肝炎抗原の両方に対する免疫を獲得した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら今日までに  ＤＮＡウイルスを基礎にしたウイルスベクターに関しては多数の困難が伴った。これらの困難の例を以下に挙げる：（ａ）病原又は所望のタンパク質の抑制を引き起こす他のウイルスタンパク質の産生；（ｂ）宿主中で非制御的に複製するベクターの能力及びこのような非制御複製の病原的作用；（ｃ）ウイルス血症を引き起こす野性型ウイルスの存在；並びに（ｄ）これらの系における発現の一時的性質。これらの困難は、遺伝性疾患を含めたウイルス性、癌性及び他の非細菌性疾患の治療における  ＤＮＡウイルスを基礎にしたウイルスベクターの使用を事実上妨げた。
【００１５】
感染標的細胞中でのそれらの非一時的性質のために、レトロウイルスが遺伝性疾患の治療のための有用なビヒクルとして示唆されている（例えば、Ｆ．Ｌｅｄｌｅｙ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１０  ：  １，１９８７参照）。しかしながら多数の問題を顧慮して、遺伝性疾患の治療におけるレトロウイルスの使用は未だ広範には受け入れられていない。このような問題は、以下のことがらに関する：（ａ）容易に入手できない組織（例えば脳）において多数の細胞を感染させる明らかな必要性；（ｂ）これらのベクターを非常に制御された恒久的様式で発現させる必要性；（ｃ）クローン化遺伝子の欠如；（ｄ）代謝異常のための組織及び器官に対する不可逆的損傷；並びに（ｅ）ある場合に他の部分的に有効な療法の利用の可能性。
【００１６】
本発明は、種々の疾患（例えばウイルス性疾患、癌、遺伝性疾患等）を治療するための新規の組成物及び方法を提供し、そしてさらにその他の関連した利益を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
１．そうでなければ不活性な前駆体を病原因子の活性化阻害剤に活性化し得る遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
２．そうでなければ不活性な前駆体を病原因子の活性化阻害剤に活性化し得る遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
３．上記病原因子がウイルス感染細胞である項目１又は２記載の組換え体ベクター。
４．上記遺伝子物質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼである項目１又は２記載の組換え体ベクター。
５．上記遺伝子物質が水疱帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼである項目１又は２記載の組換え体ベクター。
６．上記不活性前駆体がＡＺＴである項目１又は２記載の組換え体ベクター。
７．殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
８．病原因子の存在下で殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示し、それにより病原因子に局所療法を作用させるベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
９．殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
１０．病原因子の存在下で殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示し、それにより病原因子に局所療法を作用させるベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
１１．上記遺伝子物質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼである項目７，８，９又は１０記載の組換え体ベクター。
１２．上記遺伝子物質が水疱帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼである項目７，８，９又は１０記載の組換え体ベクター。
１３．上記遺伝子物質がアルカリ性ホスファターゼ、真菌類シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２及びペニシリン−Ｖアミダーゼから成る群から選択される項目７，８，９又は１０記載の組換え体ベクター。
１４．上記病原因子がウイルス感染細胞である項目８又は１０記載の組換え体ベクター。
１５．上記病原因子が細菌に感染された細胞である項目８又は１０記載の組換え体ベクター。
１６．上記病原因子が腫瘍細胞である項目８又は１０記載の組換え体ベクター。
１７．上記病原因子が寄生生物に感染された細胞である項目８又は１０記載の組換え体ベクター。
１８．病原因子に由来するタンパク質によるプロセッシング又は修飾時に毒性を示すタンパク質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
１９．病原因子に由来するタンパク質によるプロセッシング又は修飾時に毒性を示すタンパク質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
２０．プロセッシング又は修飾時に毒性を示す上記タンパク質がプロリシンである項目１８又は１９記載の組換え体ベクター。
２１．イベント特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、イベント特異性プロモーターの転写制御下で上記細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
２２．イベント特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、イベント特異性プロモーターの転写制御下で上記細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
２３．上記イベント特異性プロモーターが細胞性チミジンキナーゼプロモーターである項目２１又は２２記載の組換え体ベクター。
２４．上記イベント特異性プロモーターがチミジル酸シンターゼプロモーターである項目２１又は２２記載の組換え体ベクター。
２５．上記イベント特異性プロモーターがホルモンにより活性化される項目２１又は２２記載の組換え体ベクター。
２６．上記細胞毒性遺伝子がリシンｒｉｃｉｎ、アブリンａｂｒｉｎ、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニンｇｅｌｏｎｉｎ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌毒素及びプソイドモナス属外毒素Ａから成る群から選択される項目２１又は２２記載の組換え体ベクター。
２７．組織特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、組織特異性プロモーターの転写制御下で上記細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
２８．組織特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、組織特異性プロモーターの転写制御下で上記細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
２９．上記組織特異性プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである項目２７又は２８記載の組換え体ベクター。
３０．上記組織特異性プロモーターがＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター及びカゼインプロモーターから成る群から選択される項目２７又は２８記載の組換え体ベクター。
３１．上記組織特異性プロモーターがＩｇＧプロモーター、絨毛膜性胚抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター、インシュリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、α又はβグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター及びオステオカルシンプロモーターから成る群から選択される項目２７又は２８記載の組換え体ベクター。
３２．上記細胞毒性遺伝子がリシンｒｉｃｉｎ、アブリンａｂｒｉｎ、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニンｇｅｌｏｎｉｎ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌毒素及びプソイドモナス属外毒素Ａから成る群から選択される項目２７又は２８記載の組換え体ベクター。
３３．イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターを活性化した場合にのみ細胞毒性遺伝子が最大限発現されるように、イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターの両方の転写制御下で上記細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
３４．イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターを活性化した場合にのみ細胞毒性遺伝子が最大限発現されるように、イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターの両方の転写制御下で上記細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
３５．上記イベント特異性プロモーターがチミジンキナーゼであり、上記組織特異性プロモーターがカゼインプロモーター及びＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーターから成る群から選択される項目３３又は３４記載の組換え体ベクター。
３６．上記細胞毒性遺伝子がリシンｒｉｃｉｎ、アブリンａｂｒｉｎ、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニンｇｅｌｏｎｉｎ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌毒素及びプソイドモナス属外毒素Ａから成る群から選択される項目３３又は３４記載の組換え体ベクター。
３７．細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質を包含するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクターであって、イベント特異性プロモーターを活性化すると上記遺伝子物質が発現されるように、遺伝子物質がイベント特異性プロモーターの転写制御下にある組換え体レトロウイルスベクター。
３８．細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質を包含するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクターであって、イベント特異性プロモーターを活性化すると上記遺伝子物質が発現されるように、遺伝子物質がイベント特異性プロモーターの転写制御下にある組換え体アデノウイルスベクター。
３９．上記イベント特異性プロモーターが細胞性チミジンキナーゼプロモーターである項目３７又は３８記載の組換え体ベクター。
４０．上記組織特異性プロモーターがチミジル酸シンターゼプロモーターである項目３７又は３８記載の組換え体ベクター。
４１．上記イベント特異性プロモーターがホルモンにより活性化される項目３７又は３８記載の組換え体ベクター。
４２．上記遺伝子物質が大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、真菌類シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２及びペニシリン−Ｖアミダーゼから成る群から選択される項目３７又は３８記載の組換え体ベクター。
４３．細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を細胞毒性物質に活性化する遺伝子物質を包含するベクター構築物を保有する組換え体レトロイルスベクターであって、組織特異性プロモーターを活性化すると上記遺伝子物質が発現されるように、遺伝子物質が組織特異性プロモーターの転写制御下にある組換え体レトロウイルスベクター。
４４．細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を細胞毒性物質に活性化する遺伝子物質を包含するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクターであって、組織特異性プロモーターを活性化すると上記遺伝子物質が発現されるように、遺伝子物質が組織特異性プロモーターの転写制御下にある組換え体アデノウイルスベクター。
４５．上記組織特異性プロモーターがＰＥＰＣＫプロモーターである項目４３又は４４記載の組換え体ベクター。
４６．上記組織特異性プロモーターがＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター及びカゼインプロモーターから成る群から選択される項目４３又は４４記載の組換え体ベクター。
４７．上記組織特異性プロモーターがＩｇＧプロモーター、絨毛膜性胚抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター、インシュリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、α又はβグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター及びオステオカルシンプロモーターから成る群から選択される項目４３又は４４記載の組換え体ベクター。
４８．上記遺伝子物質が大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、真菌類シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２及びペニシリン−Ｖアミダーゼから成る群から選択される項目４３又は４４記載の組換え体ベクター。
４９．イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターを活性化した場合にのみ遺伝子物質が最大限発現されるように、遺伝子物質がイベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターの両方の転写制御下にある、細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質を包含するベクター構築物を保有する組換え体レトロウイルスベクター。
５０．イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターを活性化した場合にのみ遺伝子物質が最大限発現されるように、遺伝子物質がイベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターの両方の転写制御下にある、細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質を包含するベクター構築物を保有する組換え体アデノウイルスベクター。
５１．上記イベント特異性プロモーターがチミジンキナーゼであり、上記組織特異性プロモーターがカゼインプロモーターである項目４９又は５０記載の組換え体ベクター。
５２．上記遺伝子物質がアルカリ性ホスファターゼ、真菌類シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２及びペニシリンＶアミダーゼから成る群から選択される項目４９又は５０記載の組換え体ベクター。
５３．上記ベクター構築物が付加的非ベクター由来遺伝子の発現を指示する項目１，２，７，８，９，１０，１８，１９，２１，２２，２７，２８，３３，３４，３７，３８，４３，４４，４９又は５０のいずれかに記載の組換え体ベクター。
５４．上記付加的遺伝子がタンパク質をコードする項目５３記載の組換え体ベクター。
５５．上記タンパク質が免疫補助分子である項目５４記載の組換え体ベクター。
５６．上記免疫補助分子が、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，Ｂ７，Ｂ７−２，ＧＭ−ＣＳＦ，ＣＤ３，ＩＣＡＭ−１，β−ミクログロブリン、ＬＦＡ−３，ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩ分子から成る群から選択される項目５５記載の組換え体ベクター。
５７．上記タンパク質がガンマ−インターフェロンである項目５４記載の組換え体ベクター。
５８．温血動物における病原因子の阻害に用いるための項目１〜６のいずれかに記載の組換え体ウイルスベクター。
５９．温血動物における病原因子の破壊方法に用いるための項目７〜５７のいずれかに記載の組換え体ウイルスベクター。
６０．上記病原因子がウイルス感染細胞及び細菌に感染された細胞から成る群から選択される項目５８又は５９記載の組換え体ウイルスベクター。
６１．上記病原因子が腫瘍細胞である項目５８又は５９記載の組換え体ウイルスベクター。
６２．上記病原因子が自己反応性免疫細胞である項目５８又は５９記載の組換え体ウイルスベクター。
６３．項目１〜５７のいずれかに記載の組換え体ウイルスベクターを生成するプロデューサー細胞。
６４．温血動物における病原因子の破壊方法に用いるための項目６３記載のプロデューサー細胞。
６５．項目１〜５７のいずれかに記載の組換え体ウイルスベクター、及び製薬上許容可能なキャリアー又は希釈剤を包含する製剤組成物。
本発明の要約
手短にいえば、本発明は、組換え体ウイルスベクター及び広範な病原因子の治療のためのこのようなベクターの使用方法を提供する。本発明の一態様内では、そうでなければ不活性な前駆体を病原因子の活性阻害剤に活性化し得る遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。本発明の一態様内では、病原因子はウイルス感染細胞である。別の態様では、遺伝子物質は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又は水疱帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼである。さらに別の態様では、不活性前駆体は  ＡＺＴである。
【００１８】
本発明の別の態様内では、殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。別の態様では、病原因子の存在下で殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示し、それにより病原因子に局所療法を作用させるベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。一態様内において、遺伝子物質は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又は水疱帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼである。他の態様では、遺伝子物質は大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、大腸菌  Ｄｅｏ  Ｄ、大腸菌    ｌａｃＺ、シトクロム  Ｐ４５０２Ｂ１遺伝子、アルカリ性ホスファターゼ、真菌類シトシンデアミナーゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２及びペニシリン  Ｖアミダーゼから成る群から選択される。さらに別の態様では、病原因子はウイルス感染細胞、細菌に感染された細胞、腫瘍細胞又は寄生生物に感染された細胞である。
【００１９】
本発明の別の態様では、病原因子に由来するタンパク質によるプロセッシング又は修飾時に毒性を示すタンパク質の発現を指示する組換え体ウイルスベクターが提供される。一態様内で、プロセッシング又は修飾時に毒性を示すタンパク質は、プロリシンである。
【００２０】
本発明のさらに別の態様では、イベント特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、イベント特異性プロモーターの転写制御下で細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。種々の態様において、イベント特異性プロモーターが細胞性チミジンキナーゼプロモーター又はチミジル酸シンターゼプロモーターである。別の態様では、イベント特異性プロモーターはホルモンにより活性化される。さらに別の態様では、細胞毒性遺伝子はリシン  ｒｉｃｉｎ、アブリン  ａｂｒｉｎ、ジフテリアトキシン、コレラトキシン、ゲロニン  ｇｅｌｏｎｉｎ、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌毒素及びプソイドモナス属外毒素Ａから成る群から選択される。
【００２１】
本発明の別の態様において、組織特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、組織特異性プロモーターの転写制御下で細胞毒性遺伝子を包含する組換え体ウイルスベクターが提供される。種々の態様において、組織特異性プロモーターは  ＰＥＰＣＫプロモーター、ＨＥＲ２／  ｎｅｕプロモーター、カゼインプロモーター、  ＩｇＧプロモーター、絨毛膜性胚抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ＥＲＢ  Ｂ２プロモーター、ポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター、インシュリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、α又はβグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター、オステオカルシンプロモーター、ＩＬ−２プロモーター、ＩＬ−２受容体プロモーター、ホエー（ｗａｐ）プロモーター及びＭＨＣ  クラスＩＩプロモーターである。
【００２２】
本発明のさらに別の態様では、イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターを活性化した場合にのみ細胞毒性遺伝子が最大限発現されるように、イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターの両方の転写制御下で細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有するウイルスベクターが提供される。代表的イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターは上記の通りである。好ましい一態様では、イベント特異性プロモーターはチミジンキナーゼであり、組織特異性プロモーターはカゼインプロモーター及びＨＥＲ２／  ｎｅｕプロモーターから成る群から選択される。
【００２３】
本発明の他の態様では、細胞毒性遺伝子の発現を指示するベクター構築物の代わりに（の他に）、ウイルスベクターが細胞毒性を殆ど又は全く持たない化合物を有毒物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する以外は上記と同様のウイルスベクターが提供される。
【００２４】
本発明の他の態様において、上記のベクター構築物は付加的非ベクター由来遺伝子の発現を指示し得る。一態様において、非ベクター由来遺伝子は免疫補助分子のようなタンパク質をコードする。免疫補助分子の代表的例としては、ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，Ｂ７，Ｂ７−２，ＧＭ−ＣＳＦ，ＣＤ３，ＩＣＡＭ−１、β−ミクログロブリン、ＬＦＡ−３  、ＨＬＡ  クラスＩ及びＨＬＡ  クラスＩＩ分子が挙げられる。好ましい一態様において、タンパク質はガンマ−インターフェロンである。
【００２５】
本発明の他の態様では、病原因子が阻害又は破壊されるように上記組換え体ウイルスベクターを温血動物に投与することを包含する、温血動物における病原因子を阻害又は破壊するための方法が提供される。本明細書中で用いる場合、“破壊される”という用語は、疾病状態に寄与する細胞の破壊を意味し、破壊は疾病の部分的破壊を引き起こすに過ぎない（例えば腫瘍は部分的に破壊されるだけである）と理解されるべきである。種々の態様において、組換え体ウイルスベクターは  ｉｎ  ｖｉｖｏに、あるいは  ｅｘ  ｖｉｖｏに投与される。さらに他の態様では、病原因子はウイルス感染細胞、細菌に感染された細胞、又は腫瘍細胞である。
【００２６】
本発明の他の態様では、上記のような組換え体ウイルスベクターを生成するプロデューサー細胞が提供される。別の態様においては、病原因子を破壊するために、このようなプロデューサー細胞を動物に投与することを包含する、温血動物における病原因子の破壊方法が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様では、病原因子が破壊されるように、殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質をコードする核酸を温血動物に投与する工程から成る温血動物における病原因子の破壊方法が提供される。
【００２８】
本発明のさらに別の態様では、上記のような組換え体ウイルスベクターを製薬上許容可能なキャリアー又は希釈剤と組み合わせて包含する製剤組成物が提供される。
【００２９】
以下の詳述及び添付の図面を参照すると、本発明のこれらのそして他の態様が明らかになる。さらにより詳細な手法又は組成物（例えばプラスミド等）を記載する多数の特許、特許出願及び他の印刷物を以下に開示する（その記載内容は参照により本明細書中に含まれるものとする）。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によって、種々の疾患（例えばウイルス性疾患、癌、遺伝性疾患等）を治療するための新規の組成物及び方法が提供され、そしてさらにその他の関連した利益を提供した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の詳しい説明
本発明を説明する前に、それを理解しやすくするために下記で用語の定義を先ず行うことにする。
【００３２】
“ベクター構築物”という用語は、問題の配列（単数又は複数）又は遺伝子（単数又は複数）の発現を指示することができる集合体を意味する。ベクター構築物は転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座限定要素（単数又は複数）、あるいは交互スプライシング、核  ＲＮＡ輸出、メッセンジャーの翻訳後修飾、又はタンパク質の転写後修飾といったような他の手段により遺伝子発現を制御するその他の要素を含まねばならない。さらにベクター構築物は、転写された場合に問題の配列（単数又は複数）又は遺伝子（単数又は複数）と操作可能的に結合され、翻訳開始配列として作用する配列を含まねばならない。任意に、ベクター構築物はポリアデニール化、  Ｎｅｏ，ＴＫ、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノール又はＤＨＦＲのような選択性マーカー、並びに１つ又はそれ以上の制限部位、及び翻訳終結配列を含んでもよい。さらにベクター構築物がレトロウイルス中に入れられた場合には、ベクター構築物は使用するレトロウイルスに適したパッケージングシグナル、ＬＴＲ（長末端反復）、並びに正及び負鎖プライマー結合部位を含まねばならない（これらがすでに存在してはいない場合）。
【００３３】
“病原因子”という用語は、疾病状態に関与する細胞を意味する。病原因子の代表例としては、腫瘍細胞、自己反応性免疫細胞、ホルモン分泌細胞、それらが一般に有している機能を欠く細胞、その種の細胞では一般には起きない付加的不適切遺伝子発現を有する細胞、及び細菌、ウイルス又は他の細胞内寄生生物に感染された細胞が挙げられる。さらに本明細書で用いる場合、“病原因子”という用語はレトロウイルスベクターを過剰に発現するか又は不適切に発現する（例えば悪細胞型の）、あるいは宿主細胞のゲノム中への不適切な挿入により腫瘍化した細胞を意味する。
【００３４】
“組織特異性プロモーター”は、転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座限定要素、あるいは上記のような遺伝子発現を制御し、好ましくは限定数の組織型において活性であるその他の要素を意味する。このような組織特異性プロモーターの代表例としては、  ＰＥＰＣＫプロモーター、ＨＥＲ２／  ｎｅｕプロモーター、カゼインプロモーター、  ＩｇＧプロモーター、絨毛膜性胚抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ＥＲＢ  Ｂ２プロモーター、ムチンプロモーター、  ＰＥＭプロモーター、ポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター、インシュリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、α又はβグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター、あるいはオステオカルシンプロモーターが挙げられる。
【００３５】
“イベント特異性プロモーター”は、転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座限定要素、あるいは上記のような遺伝子発現を制御し、その転写活性が細胞刺激に反応して変化するその他の要素を意味する。このようなイベント特異性プロモーターの代表例としては、チミジンキナーゼ又はチミジル酸シンターゼプロモーター、α又はβインターフェロンプロモーター、あるいはホルモン（天然の、合成の又は他の非宿主生物からのホルモン、例えば昆虫ホルモン）の存在に反応するプロモーターが挙げられる。
【００３６】
上記のように、本発明は、組換え体ウイルスベクター及び広範な病原因子の治療のためのこのようなベクターの使用方法を提供する。本発明の一態様において、そうでなければ不活性な前駆体を病原因子の活性阻害剤に活性化し得る遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。本明細書の開示により当業者には明らかなように、広範な不活性前駆体は、病原因子の活性阻害体中に変換し得る。例えば抗ウイルスヌクレオシド類似体、例えば  ＡＺＴ又は  ｄｄＣは、レトロウイルス逆転写酵素したがってウイルス複製を特異的に阻害するために、細胞機序によりヌクレオチドトリホスフェート形態に代謝される（Ｆｕｒｍａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８３３３−８３３７，１９８６）。抗ウイルスヌクレオシド類似体をそれらの活性形態に代謝するのを助ける単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）又は水疱帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ＶＺＶＴＫ）のような遺伝子物質（例えばタンパク質）の発現を指示する組換え体ウイルスベクターは、したがってその活性化形態にヌクレオシド類似体前駆体（例えば  ＡＺＴ又はｄｄＴ）を活性化するのに有用である。
【００３７】
本発明の一態様では、  ＨＳＶＴＫ遺伝子は構成マクロファージ又はＴ細胞特異性プロモーターの制御下で発現され、マクロファージ又はＴ細胞中に導入される。  ＨＳＶＴＫの構成性発現は、  ＡＺＴ又は  ｄｄＣのようなヌクレオチド類似体のそれらの生物学的活性ヌクレオチドトリホスフェート形態へのより有効な代謝を引き起こし、それによりさらに大きな効力を提供し、低用量を供給し、毒性の生成を低減し、生産的感染に対する可能性を高める。そのヌクレオチドトリホスフェート形態がレトロウイルス逆転写酵素に対する選択性を示すがしかし細胞ヌクレオシド及びヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果としてリン酸化されない付加的ヌクレオシド類似体も、本発明の情況においては利用し得る。いくつかの代表的ウイルスベクターの詳細は、実施例１に後述する。
【００３８】
本発明の関連する態様において、殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。手短にいえば、本発明の情況では、殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に直接的に又は間接的に活性化する広範な遺伝子物質を利用し得る。このような遺伝子物質の代表例としては、あるプリンアラビノシド及び置換ピリミジン化合物を選択的に  リン酸化して、それらを細胞毒性又は細胞増殖抑制性代謝物質に変換する  ＨＳＶＴＫ及び  ＶＺＶＴＫが挙げられる。さらに薬剤ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ａｃｙｃｌｏｖｉｒ又はそれらのあらゆる類似体（例えばＦＩＡＵ，ＦＩＡＣ，ＤＨＰＧ）を  ＨＳＶＴＫに曝露すると、薬剤がその対応する活性ヌクレオチドトリホスフェート形態にリン酸化される。
【００３９】
本発明に利用し得る他の遺伝子物質の代表例としては、以下のものが挙げられる：チオキサンチンを毒性チオキサンチンモノホスフェートに変換する大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｂｅｓｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４１３９−４１４１，１９８７）；ミトマイシンホスフェート及びドキソルビシンホスフェートのような不活性リン酸化化合物を毒性二リン酸化化合物に変換するをアルカリ性ホスファターゼ；５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロウラシルに変換する真菌（例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）又は細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ，ＰＮＡＳ  ８９：３３，１９９２）；非毒性プロドラッグ６−メチルプリン−２′−デオキシリボヌクレオシド（ＭｅＰ−ｄｒ）を毒性プリン類似体６−メチルプリンに変換する大腸菌ＤｅｏＤ  （Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １  （４）：２７９−２８７，１９９４）；シクロホスファミド（ＣＰＡ）を細胞毒性代謝物質に変換するシトクロム  Ｐ４５０２Ｂ１  （Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １  （４）：２７９−２８７，１９９４）；ａｒａＣ及びデオキシシトシンのガラクトシドを細胞毒性因子に変換するベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子（Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １  （４）：２７９−２８７，１９９４）；パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンジルグルタミン酸からグルタミン酸を切断し、それにより毒性安息香酸マスタードを生成するヌカルボキシペプチダーゼＧ２；及びドキソルビシン及びメルファランのフェノキシアセタビド誘導体を毒性化合物に変換するペニシリン−Ｖアミダーゼ（一般的には、Ｖｒｕｄｈｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６  （７）：９１９−９２３，１９９３  ；  Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃ．Ｉｍｍｕｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１  （４）：２０２−２０６，１９９０  参照）。
【００４０】
本発明の関連した態様において、病原因子の存在下で殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性する遺伝子物質の発現を指示し、それにより病原因子に局所療法を作用させるベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。この場合、組換え体ウイルスベクターからの遺伝子物質の発現は、病原的状態を同定する細胞内シグナルのような病原因子に関連した存在物が存在し、それにより非病原性細胞が破壊されない情況に限定される。この細胞型特異性は、病原状態を有するか又はかかりやすい細胞に組換え体ウイルス保有ベクターの標的を合わせることにより、感染のレベルで関与し得る。
【００４１】
本方法の一態様において、イベント特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、イベント特異性プロモーターの転写制御下で細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。例えば細胞増殖により活性化される（又は別の方法で細胞周期依存性である）プロモーター、例えばチミジンキナーゼ又はチミジル酸シンターゼプロモーター（Ｍｅｒｒｉｌｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４９８７  １９１，１９８９；Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９  ：  ４０７９−８２，１９８９）；細胞がウイルスに感染した場合に活性化されるα又はβインターフェロンプロモーターのようなプロモーター（Ｆａｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ，８  （１）：１０１−１１０，１９８９  ；  Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４５  ：  ６０ｊ１−６１０，１９８６）；並びにホルモンの存在により活性化されるプロモーター（例えばエストロゲン反応プロモーター；Ｔｏｏｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６  ：  ４５２６−３８，１９８６  参照）を含めた多数のイベント特異性プロモーターが、本発明に用い得る。
【００４２】
好ましい態様において、組換え体ウイルスベクター（好ましくは、しかし必然的ではないが、組換え体  ＭＬＶレトロウイルス）は、腫瘍のような急速に増殖中の細胞において主に転写的に活性である細胞周期依存性プロモーター（例えばヒト細胞チミジンキナーゼ又はトランスフェリン受容体プロモーター）のようなイベント特異性プロモーターから発現される細胞毒性遺伝子を含有するベクター構築物を保有する。このように、これらのプロモーターからの転写を活性化できる因子を含有する急速に複製中の細胞は、好ましくはベクター構築物により生成される細胞毒性剤により破壊される。
【００４３】
本発明の別の態様では、組織特異性プロモーターを活性化すると細胞毒性遺伝子が発現されるように、組織特異性プロモーターの転写制御下で細胞毒性遺伝子を包含する組換え体ウイルスベクターが提供される。本発明の情況では広範な組織特異性プロモーターを使用し得る。このようなプロモーターの代表例を以下に挙げる：肝特異性プロモーター、例えばホスホ  エノール−ピルベートカルボキシキナーゼ（「ＰＥＰＣＫ」）（Ｈａｔｚｏｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３  ：  １７７９８  ８０８，１９８８  ；  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６  ：  １１１８  ２２，１９８９  ；  Ｖａｕｌｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４４０９−１５，１９８９）；Ｂ細胞特異性プロモーター、例えば  ＩｇＧプロモーター；乳癌又は肝細胞癌特異性プロモーター、例えば癌胚性抗原プロモーター（ＣＥＡ）（Ｓｃｈｒｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２７３８，１９９０）；膵臓腺房細胞特異性プロモーター、例えばエラスターゼプロモーター（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：６８７−９６，１９８９）；胸上皮特異性プロモーター、例えばカゼインプロモーター（Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１０４−０８，１９８９）；赤血球細胞中で活性な赤血球特異性転写プロモーター、例えばポルホビリノーゲンデアミナーゼプロモーター（Ｍｉｇｎｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６４５８−５２，１９９０）；α又はβグロビン特異性プロモーター（ｖａｎ  Ａｓｓｅｎｄｅｌｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：９６９−７７，１９８９；Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４３９−４３，１９８９）；膵臓のβ細胞に特異的なプロモーター、例えばインシュリンプロモーター（Ｏｈｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４２２８−３１，１９８８  ；  Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９  ：  ８２３−２７，１９８９）；下垂体に特異的なプロモーター、例えば成長ホルモン因子プロモーター（Ｉｎｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５５：５１９−２９，１９８８；Ｂｏｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５５：５０５−１８，１９８８）；メラノソームに特異的なプロモーター、例えばチロシンヒドロキシラーゼプロモーター；肝特異性プロモーター、例えばアルブミンプロモーター及びアルファフェトタンパク質プロモーター（Ｆｅｕｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：４２０４  １２，１９８９  ；  Ｃａｍｐｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．３  ：  ５３７  ４６，１９８９）；乳癌特異性プロモーター、例えばＨＥＲ２／  ｎｅｕプロモーター（Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２５９７，１９８７）；肝特異性プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（Ｆｅｌｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａ��ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５９０３−０７，１９８９）；Ｔ細胞特異性プロモーター、例えばＴ細胞受容体プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３５５１−５４，１９８８  ；  Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−３３，１９８９）；骨特異性プロモーター、例えばオステオクラシンプロモーター（Ｍａｒｋｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１７０１−１７０５，１９９０  ；  ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：３５１７−２３，１９８９  ；  Ｋｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６  ：  ４４５５−５９，１９８９）；ＩＬ−２  プロモーター、ＩＬ−２受容体プロモーター、ホエー（ｗａｐ）プロモーター、並びにＭＨＣ  クラスＩＩプロモーター。
【００４４】
例えば遺伝子座限定要素、例えばβグロビン遺伝子及びＴ細胞マーカーＣＤ２を含めた、遺伝子発現を制御する種々の他の要素が、本発明の情況では用い得る。さらにスプライシング及び核輸出のレベルで発現を制御する要素は、βグロビンイントロン配列、  ＨＩＶニオケル  ｒｅｖ及び  ｒｒｃ要素、Ｄ型  ｍａｓｏｎｐｆｉｚｅｒサルレトロウイルス中の  ＣＴＥ要素である。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、細胞毒性剤を生成する遺伝子は、組織特異性プロモーターの制御下にあり、この場合、組織特異性は腫瘍オリジンの組織に対応する。ウイルスベクターは好ましくは複製中の細胞のゲノムに組み込むため（例えば正常肝細胞は複製中ではないが、一方肝癌の場合は複製中である）、特異性のこれら２つのレベル（ウイルス組み込み／複製及び組織特異性転写調節）が腫瘍細胞の選択的死を引き起こす。
【００４６】
本発明のさらに別の態様では、イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターを活性化した場合にのみ細胞毒性遺伝子が最大限発現されるように、イベント特異性プロモーター及び組織特異性プロモーターの両方の転写制御下で細胞毒性遺伝子を包含するベクター構築物を保有するウイルスベクターが提供される。特にこのようなベクターを用いることにより、細胞毒性遺伝子物質は両判定基準を満たす細胞型においてのみ発現される（例えば、上記の例では、併合プロモーター要素は急速に分裂中の肝細胞においてのみ機能する）。本発明の好ましい態様において、転写プロモーター要素の数は、細胞型特異性の厳格さを改良するために、増大される。
【００４７】
上記のような転写プロモーター／エンハンサー要素は、内部プロモーターとして必ずしも存在する（レトロウイルスに関するウイルス  ＬＴＲ間にある）必要はないが、しかし条件特異性（即ちイベント又は組織特異性）転写発現が修飾ウイルス  ＬＴＲから直接起きるように、それ自体が転写プロモーターであるウイルス  ＬＴＲにおいて転写制御要素に加えられるか又は取り替えられる。この場合、最大発現のための条件はレトロウイルスパッケージング細胞株で模倣される必要はなく（例えば成長条件を変え、発現に必要なトランスレギュレーターを供給し、又はパッケージング株用の親として適切な細胞株を用いることにより）、あるいは  ＬＴＲ修飾は３′ＬＴＲ  Ｕ３領域に限定されて最大組換え体ウイルス力価を得る。後者の場合、１回感染／組み込み後は、３′ＬＴＲ  Ｕ３はここでは５′ＬＴＲ  Ｕ３となり、所望の組織特異性発現を示す。同様に、他のウイルスベクターに関しては、プロモーターは外生的であるか、又は正常ウイルスプロモーター要素とのハイブリッドである。
【００４８】
本発明の情況では、広範な細胞毒性遺伝子を用い得る。代表例としては、リシン  ｒｉｃｉｎ（Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８：２６５−２７０，１９８５）、アブリン  ａｂｒｉｎ（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：７２３−７３２，１９９１  ；  Ｅｖｅｎｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６  ：  ６８４８−６８５２，１９９１  ；  Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８６６５−８６６９，１９９０  ；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｅｄ．ｏｆ  Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３０９  ：  １１５−１１８，１９９２）、ジフテリアトキシン（Ｔｗｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０３９２−１０３９４，１９８５）、コレラトキシン（Ｍｅｋａｌａｎｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：５５１−５５７，１９８３  ：  Ｓａｎｃｈｅｚ  ＆  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，ＰＮＡＳ  ８６  ：  ４８１−４８５，１９８９）、ゲロニン  ｇｅｌｏｎｉｎ（Ｓｔｉｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６９４７  ６９５３，１９８０）、ヨウシュヤマゴボウ（Ｉｒｖｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２１：３７１−３８７，１９８３）、抗ウイルスタンパク質（Ｂａｒｂｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０３：５５−５９，１９８２  ；  Ｉｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００：４１８−４２５，１９８０  ；  Ｉｒｖｉｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６９  ：  ５２２−５２８，１９７５）、トリチン、赤痢菌毒素  （Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８４：４３６４−４３６８，１９８７  ；  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２：１４７−１５３，１９８７）及びプソイドモナス属外毒素Ａ（Ｃａｒｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８７０７−８７１１，１９８７）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ  （ＨＳＶＴＫ）（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１１５−１２４，１９８０）、及び大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのようなタンパク質が挙げられる。
【００４９】
本発明の他の態様において、細胞毒性遺伝子は、細胞成長に必要な重大なタンパク質の細胞合成を防止することにより、例えば腫瘍細胞成長、ウイルス複製又は遺伝性疾患を阻害するアンチセンス配列である。このようなアンチセンス配列の例としては、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロフォレート（Ｍａｈｅｒ  ａｎｄ  Ｄｏｌｎｉｃｋ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５３：２１４−２２０，１９８７  ；  Ｂｚｉｋｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８４  ：  ８３６０−８３６４，１９８７）、アンチセンスＨＥＲ２  （Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２３０：１１３２  １１３９，１９８５）、アンチセンス  ＡＢＬ  （Ｆａｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１４７７−１４８１，１９８９）、アンチセンス  Ｍｙｃ  （Ｓｔａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：４２３−４２５，１９８４）、及びアンチセンス  ｒａｓ、並びにヌクレオチド生合成経路のあらゆる酵素を遮断するアンチセンス配列があげられる。さらに細胞毒性遺伝子は、腫瘍増殖阻害物、例えばｐ５３、網膜芽腫（Ｒｂ）、並びに結腸直腸癌に関する  ＭＣＣ及び  ＡＰＣをコードする。
【００５０】
本発明のさらに別の態様では、強力なクラスＩ制限反応を誘発するために、アンチセンス  ＲＮＡを細胞毒性遺伝子として用いる。手短にいえば、  ＲＮＡを結合し、それにより特異的ｍＲＮＡの翻訳を阻止する他に、多量の二重鎖  ＲＮＡの生成のために、高レベルの特異的アンチセンス配列を用いてインターフェロン（ガンマ−インターフェロンを含む）の発現増大を誘発する。ガンマインターフェロンの発現増大は、次いで  ＭＨＣクラスＩ抗原の発現を増強する。これに関して使用するのに好ましいアンチセンス配列としては、アクチン  ＲＮＡ、ミオシン  ＲＮＡ及びヒストン  ＲＮＡが挙げられる。アクチン  ＲＮＡとの不適合を形成するアンチセンス  ＲＮＡが特に好ましい。
【００５１】
本発明の他の態様では、殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示するベクター構築物を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。本発明の好ましい態様において、組換え体ウイルスベクターは、病原因子の存在下で、殆ど又は全く細胞毒性を持たない化合物を毒性物質に活性化する遺伝子物質の発現を指示し、それにより病原因子に局所療法を作用させる。
【００５２】
例えば、本発明の一態様においては、組換え体ウイルスベクターは、  ＨＩＶプロモーター（ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質により活性化される場合を除いては転写的にサイレントであることが公知である）の下流での、且つ転写制御下での単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ＨＳＶＴＫ」）遺伝子の発現を指示するベクター構築物を保有する。要するに、  ＨＩＶに感染され、ベクター構築物を保有するヒト細胞中の  ｔａｔ遺伝子物質の発現は、  ＨＳＶＴＫの産生増大を起こす。次に細胞をｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ａｃｙｃｌｏｖｉｒ又はその類似体（ＦＩＡＵ，ＦＩＡＣ，ＤＨＰＧ）のような薬剤に曝露する。上記のように、これらの薬剤は  ＨＳＶＴＫにより（細胞チミジンキナーゼによらずに）それらの対応する活性ヌクレオチドトリホスフェート形態にリン酸化されることは公知である。  Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ及びＦＩＡＵトリホスフェートは細胞ポリメラーゼを阻害し、概してトランスジェニックマウスにおいて  ＨＳＶＴＫを発現する細胞の特異的破壊を引き起こす（Ｂｏｒｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７５７２，１９８８）。組換え体ベクターを含有し、  ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質を発現する細胞は、特異的用量のこれらの薬剤の存在により、選択的に殺される。
【００５３】
本発明の一態様において、条件致死  ＨＳＶＴＫ遺伝子の発現は、転写体（「ＣＲＳ／ＣＡＲ」）に  ｃｉｓ作用要素を含めることにより、より  ＨＩＶ特異性にし得るが、これには最適活性のための付加的  ＨＩＶ遺伝子物質  ｒｅｖを要する（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２０７１，１９８８）。このような  ｔａｔ及び  ｒｅｖ反応性ベクター（ＲＲＫＴＶＩＨ）が構築され（図１７参照）、両栄養性ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃウイルスが生成された。さらにｍＲＮＡ中に存在する  ｃｉｓ要素は、いくつかの場合にはｍＲＮＡ安定性又は翻訳可能性を調節することが示されている。ベクター遺伝子発現のイベント−又は組織特異性調節のために、この種の配列（即ち遺伝子発現の翻訳後調節）を用い得る。さらに、より大きな特異性を生じるために、これらの配列（即ち  ＨＩＶに関する  ｒｅｖ反応「ＣＲＳ／ＣＡＲ」又は  ｔａｔ反応性「ＴＡＲ」  要素）のマルチメライゼーションを用い得る。
【００５４】
細胞中での不活性前駆体の活性物質へのこれらの種類の条件活性化はすべて、短期効力を有するものを含めたアデノ関連ウイルスベクターのような他のウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター及び下記のものを用いて達成し得る。このようなベクターは、効率的に細胞に入り、一両日から一ヵ月やそこらの期間中、ベクターによりコードされるタンパク質を発現する。この期間は、  ＨＩＶ及び組換え体ウイルスの両方により感染された細胞を殺させるのに十分であることが必要で、これにより組換え体ウイルスに保有される遺伝子の発現の  ＨＩＶ依存性活性化が生じる。この遺伝子発現は、次に不活性前駆体を活性（例えば致死）物質に変換させる。さらに、それらが十分に有効である場合には、遺伝子転移の物理的方法を用いてもよい。
【００５５】
前述の態様と同様の方法で、プリン−又はピリミジン−ベースの薬剤のリン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化又は他の代謝のための遺伝子を保有するベクター構築物を生成し得る。このような遺伝子は哺乳類細胞における等価物を有さず、ウイルス、細菌、真菌又は原生動物のような生物から得られる。代表例を以下に挙げる：チオキサンチンをチオキサンチンモノホスフェートに変換する大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ｇｐｔ」）遺伝子物質（Ｂｅｓｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４１３９−４１４１，１９８７  参照）；ミトマイシンホスフェート及びドキソルビシンホスフェートのような不活性リン酸化化合物を毒性二リン酸化化合物に変換するアルカリ性ホスファターゼ；５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロウラシルに変換する真菌（例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）又は細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ，ＰＮＡＳ  ８９：３３，１９９２）；パラ  Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンジルグルタミン酸からグルタミン酸を切断し、それにより毒性安息香酸マスタードを生成するヌカルボキシペプチダーゼＧ２；及びドキソルビシン及びメルファランのフェノキシアセタビド誘導体を毒性化合物に変換するペニシリン  Ｖアミダーゼ。この種の条件致死遺伝子物質は、現在公知の多数のプリン−又はピリミジンベースの抗ガン剤に有望な用途を有するが、有効な細胞毒性剤となるためには、細胞内リボシル化又はリン酸化をしばしば要する。条件致死遺伝子物質はさらに、プリン又はピリミジン類似体ではない非毒性剤を細胞毒性形態に代謝し得る（Ｓｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５３：３７７−３８４，１９８６  参照）。
【００５６】
哺乳類ウイルスは、概して他のウイルスプロモーター要素からのその後の転写活性化に必要な“直前”遺伝子を有する傾向がある。この性質の遺伝子物質は、ウイルス感染の細胞内シグナル（又は“同定剤”）の優れた候補である。したがってこれらのウイルス“直前”遺伝子物質に反応する転写プロモーター要素からの条件致死遺伝子は、任意の特定ウイルスに感染させた細胞を特異的に殺し得る。さらにヒトα及びβインターフェロンプロモーター要素は広範な非関連ウイルスによる感染に反応して転写的に活性化されるため、例えばこれらのウイルス反応性要素（ＶＲＥ）からの  ＨＳＶＴＫのような条件致死遺伝子物質を発現するベクターの導入は、種々の異なるウイルスに感染された細胞の破壊を引き起こす。
【００５７】
本発明の他の態様では、それ自体は毒性ではないが、しかしタンパク質、例えばウイルス又は他の病原に特異的なプロテアーゼによりプロセッシング又は修飾された場合に、毒性形態に変換される物質を特定する遺伝子を保有する組換え体ウイルスベクターが提供される。例えば組換え体レトロウイルスは、  ＨＩＶプロテアーゼでプロセッシングシンすると毒性になるリシンＡ鎖に対するプロタンパク質をコードする遺伝子を保有する。さらに合成不活性プロタンパク質形態の毒性リシン又はジフテリアＡ鎖を、  ＨＩＶウイルスコード化プロテアーゼに関して並べて、適切な“プロ”要素を認識し、切り離すことにより、活性形態に切断し得る。
【００５８】
本発明のさらに別の態様において、細胞中の同定剤（例えばＨＩＶｔａｔタンパク質）の存在に反応して標的細胞の表面に“リポーティング物質”を発現するウイルスベクターが提供される。この表面タンパク質は、細胞毒性剤、例えばリポーティング物質に対する抗体により、又は細胞毒性Ｔ細胞によって認識し得る。同様の方法で、このような系を検出系として用いて、同定タンパク質を発現する特定の遺伝子、例えばＨＩＶｔａｔ遺伝子を有する細胞を簡単に同定し得る。
【００５９】
本発明の他の態様では、ベクター感染細胞の生存能力に必須の  ＲＮＡ分子を切断し、不活性化するリボザイムをコードするベクター構築物の発現を指示する組換え体ウイルスベクターが提供される。リボザイムをＨＩＶｔａｔのような病原状態に対応する細胞内シグナルに依って産生させることにより、毒性は病原状態に特異的となる。
【００６０】
組換え体ウイルスベクターの生成
上記のように、本発明は組換え体ウイルスベクターを包含する組成物及び方法を提供する。本発明に用いるのに特に好ましい組換え体ウイルスベクターとしては、組換え体レトロウイルスベクター及び組換え体アデノウイルスベクターが挙げられる。組換え体レトロウイルスベクターの構築は、“組換え体レトロウイルス”という表題の出願（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／５８６，６０３  、１９９０年９月２１日提出）（この記載内容は参照によりホン明細書に含めるものとする）に詳述されている。これらの組換え体レトロウイルスベクターを用いて、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することにより、形質導入コンピテントレトロウイルスベクター粒子を生成し得る（Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／８００，９２１  参照）（この記載内容は参照によりホン明細書に含めるものとする）。同様に、本明細書に開示されたアデノウイルスベクターも容易に調製し、使用し得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７，１９８８  及び  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４，１９９１，ＷＯ  ９３／０７２８３，ＷＯ  ９３／０６２２３  及び  ＷＯ  ９３／０７２８２  参照）（この記載内容は参照によりホン明細書に含めるものとする）。
【００６１】
本発明のベクター構築物は、例えばポリオウイルス（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：３８５−３８８，１９８９  及び  Ｓａｂｉｎ，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １：１１５−１１８，１９７３）；ライノウイルス（Ａｒｎｏｌｄ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１−４０５，１９９０）；ポックスウイルス、例えばカナリアポックスウイルス又はワクシニアウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８６：３１７−３２１，１９８９  ；  Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６−１０３，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒｅｔａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ８  ：  １７−２１，１９９０  ；  米国特許第  ４，６０３，１１２号及び第  ４，７６９，３３０号  ；  ＷＯ  ８９／０１９７３）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８−１１４，１９７９）；インフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９：１１０７−１１１３，１９８９  ；  ＭｃＭｉｃｈｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０９  ：  １３−１７，１９８３  ；  及びＹａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：２３８−２３９，１９７８）；パロウイルス、例えばアデノ関連ウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６３：３８２２−３８２８，１９８９  及びＭｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６６：１５４−１６５，１９８８）；ヘルペス（Ｋｉｔ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２１５：２１９−２３６，１９８９）；ＳＶ４０；ＨＩＶ  ；麻疹（欧州特許第  ０４４０２１９号）；コロナウイルス及び  Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１１８８−１１９１，１９８９  ；  米国特許第  ５，０９１，３０９号及び第  ５，２１７，８７９号）を含めた他のウイルスベクターとともに用い得る。
【００６２】
本発明の別の態様では、上記のベクター構築物は、別の非ベクター由来遺伝子の発現を指示し得る。一態様において、非ベクター由来遺伝子はタンパク質、例えば免疫補助分子をコードする。免疫補助分子の代表例を以下に挙げる：ＩＬ−１，ＩＬ−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７（米国特許第  ４，９６５，１９５号），ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，Ｂ７，Ｂ７−２，ＧＭ−ＣＳＦ，ＣＤ３  （Ｋｒｉｓｓａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２６：２５８−２６６，１９８７），ＩＣＡＭ−１  （Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：６２４  ６２７，１９８８）、β−ミクログロブリン（Ｐａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ７８：２２５３−２２５７，１９８１）、ＬＦＡ３  （Ｗａｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６  （４）：９２３−９３２，１９８７）、  ＨＬＡクラスＩ及び  ＨＬＡクラスＩＩ分子。好ましい態様において、非ベクター由来遺伝子はガンマインターフェロンをコードする。
【００６３】
上記の非ベクター由来遺伝子（例えば免疫補助分子）、並びに上記の細胞毒性遺伝子をコードする配列は、種々の供給源から容易に得られる。例えば免疫補助分子をコードする配列を含有するプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような保管所から、又はＢｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｍｉｔｅｄ  （Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的供給元から得られる。上記の抗腫瘍剤をコードする代表的供給源配列としては、ＢＢＧ１２  （１２７アミノ酸の成熟タンパク質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有）、ＢＢＧ６（ガンマインターフェロンをコードする配列を含有する）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９６５６（ＴＮＦをコードする配列を含有）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２０６６３（アルファ−インターフェロンをコードする配列を含有）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１９０２及び３９５１７（ベータインターフェロンをコードする配列を含有）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７０２４（インターロイキン−１をコードする配列を含有）、  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３９４０５，３９４５２，３９５１６，３９６２６及び３９６７３（インターロイキン−２をコードする配列を含有）、  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９３９９，５９３９８及び６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含有）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含有）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５９３９４及び５９３９５（インターロイキン−５をコードする配列を含有）、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．６７１５３（インターロイキン−６をコードする配列を含有）が挙げられる。タンパク質の全配列、又は生物学的活性を有するタンパク質をコードするその適切な部分を用い得ることは、当業者には明らかである。
【００６４】
あるいは、細胞毒性遺伝子又は他の非ベクター由来遺伝子をコードする公知のｃＤＮＡ配列は、このような配列を発現又は含有する細胞から得られる。要するに、一態様においては、問題の遺伝子を発現する細胞からのｍＲＮＡを、オリゴｄＴ又は無作為プライマーを用いて逆転写酵素により逆転写する。次にＰＣＲ（米国特許第  ４，６８３，２０２号、第  ４，６８３，１９５号及び第  ４，８００，１５９号参照）により一本鎖ｃＤＮＡを増幅する。所望の配列の一端上の配列と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｒｌｉｃｈ  （ｅｄ．），Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９  も参照（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含めるものとする）。特に熱安定性  Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的  ＤＮＡプライマー、  ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ及び  ＴＴＰの存在下で加熱することにより、二重鎖  ＤＮＡを変性する。二重鎖  ＤＮＡは、合成が完了すると生成される。この周期を何度も反復すると、所望の  ＤＮＡが階乗増幅される。
【００６５】
上記の遺伝子をコードする配列は、例えば  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＤＮＡ合成機（例えば  ＡＢＩ  ＤＮＡ合成機  ３９２型（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））で合成し得る。
【００６６】
製剤組成物
本発明の別の態様では、上記のような組換え体ウイルスベクターを製薬上許容可能なキャリアー又は希釈剤と組み合わせて包含する製剤組成物が提供される。このような製剤組成物は、液体溶液として、又は投与前に溶液中に懸濁される固体形態（例えば親液化）として調製し得る。さらに本組成物は、表面投与、注射、経口又は直腸投与に適したキャリアー又は希釈剤とともに調製し得る。
【００６７】
製薬上許容可能なキャリアー又は希釈剤は、使用する用量及び濃度では受容者には非毒性である。注射溶液のためのキャリアー及び希釈剤の代表例としては、水、好ましくは生理学的ｐＨに緩衝される等張食塩水（例えばリン酸塩緩衝食塩水又はＴｒｉｓ緩衝食塩水）、マンニトール、デキストロース、グリセロール及びエタノール、並びにヒト血清アルブミンのようなポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。特に好ましい組成物は、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．２及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中にベクター又は組換え体ウイルスを包含する。この場合、組換え体ベクターは約１ｍｇの物質を示すため、それは高分子物質の１％未満、及び総物質（水を含む）の１／１００，０００  未満である。この組成物は、−７０℃で少なくとも６か月間安定である。
【００６８】
本発明の製剤組成物は、細胞分裂、並びにその後の組換え体レトロウイルスベクターの摂取及び組み込むを刺激する因子を付加的に含んでもよい。代表例としては、黒色腫に対するメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、あるいは乳癌又は上皮性癌に対する表皮成長因子が挙げられる。
【００６９】
組換え体ベクターを保存するための特に好ましい方法及び組成物は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖｉｒｕｓｅｓ”と表題が付けられた米国出願に記載されている（１９９３年１０月１２日提出の米国特許第０８／１３５，９３８  号及び１９９３年１１月１５日提出の米国特許第            号）（これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中に含めるものとする）。
【００７０】
投与方法
本発明の他の態様において、病原因子が阻害又は破壊されるように、温血動物に上記のような組換え体ウイルスベクターを投与することを包含する、温血動物における病原因子を阻害又は破壊するための方法が提供される。本発明の種々の態様においては、組換え体ウイルスベクターは下記に詳述するように  ｉｎ  ｖｉｖｏで又は  ｅｘ  ｖｉｖｏで投与し得る。あるいは本発明の細胞毒性遺伝子、遺伝子物質、ベクター構築物又はウイルスベクターを、種々の方法により患者に投与し得る。代表例としては、種々の物理的方法によるトランスフェクション、例えばリポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３  ７４１７，１９８９）；直接  ＤＮＡ注入（Ａｃｓａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５−８１８，１９９１）；微小発射ボンバード  （Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８８：２７２６  ２７３０，１９９１）；いくつかの型のリポソーム（例えばＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７  参照）；ＣａＰＯ４（Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８１：７５２９−７５３３，１９８４）；  ＤＮＡ配位子（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）；核酸単独投与（ＷＯ  ９０／１１０９２）；又は死アデノウイルスと結合させた  ＤＮＡの投与（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２）が挙げられる。
【００７１】
本発明の一態様において、非転移性の、しかしそうでなければ治療不可能な腫瘍、例えばグリア芽腫、星状細胞腫又は他の脳腫瘍に罹患した患者は、精製濃縮  ＨＳＶＴＫベクターを腫瘍に直接注入することにより治療し得る。成長中の細胞だけがレトロウイルスベクターで形質導入可能であるために、ベクターは、好ましくは腫瘍に組み込まれ、発現される。ベクターは非調節様式で  ＨＳＶＴＫを発現するか、又は腫瘍特異性をより大きくするために、組織からの  ＨＳＶＴＫを又は好ましくは腫瘍中で発現される特異的プロモーターをさえ発現する。例えば  ＣＥＡプロモーターからの  ＨＳＶＴＫを発現するベクターを用いて、乳癌又は肝癌を治療し得る。精製ベクターが非免疫原性量のタンパク質（＜１ｍｇタンパク質／１ｘ１０７ｃｆｕ）を含有するために、時間を延長して多数回（＞１０）に分けてベクター（約１ｍｌで力価は１ｘ１０７  〜１ｘ１０８ｃｆｕ）を供給する。したがって注射は、大分画の腫瘍細胞が形質導入されるまで継続する。ベクターは、脱塊手術又は化学療法の前後に定位的に供給する。  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入が生じた後に、  ＨＳＶＴＫにより活性化されるプロドラッグ、例えば  ａｃｙｃｌｏｖｉｒ又は  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで患者を治療して、形質導入化腫瘍細胞を排除する。
【００７２】
本発明の別の態様では、病原因子を破壊するために、動物にベクター産生細胞（「ＶＣＬ」  又は「プロデューサー細胞」と呼ぶ）を投与することを包含する、温血動物における病原因子を破壊するための方法が提供される。好ましい態様においては、  ＶＣＬを腫瘍に直接注入し、それより  ｉｎ  ｖｉｖｏでのレトロウイルスベクターを継続的に産生させて、形質導入の効率を増大させる。
【００７３】
しかしながら  ＶＣＬの直接注入に伴う困難の一つは、ある場合に非常に強力な免疫反応が生じ、したがってこのような療法を非常に短期間（＜２週間）だけ実行可能にする。したがって本発明の好ましい態様においては、  ＶＣＬに対する免疫反応は、自系の又は  ＨＬＡ適合ヒト細胞から作られるパッケージング細胞株を選択することにより最小限にされる。さらに  ＶＣＬにより発現されるウイルス構造タンパク質に対する免疫反応をもっと限定するために、半透性膜を有するビーズ又は袋のような構造中に細胞を封入して、ベクター粒子を腫瘍中に拡散させるが、しかし宿主免疫細胞は膜を通過しないようにして、それにより免疫反応を招じる。免疫反応を低減する方法により  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入のための時間をさらに取って、療法を改良する。各々の場合、  ＶＣＬは好ましくは、細胞の  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入におけるその役割を成し終えたのちに、アシル又は  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置することにより破壊される。
【００７４】
本発明の別の態様において、転移性ではあるがしかし高度に局在化された癌、例えば卵巣癌、神経芽腫及び頸部癌（これらは転移性ではあるがしかし一般に腹腔に局在化されたままである）は、本発明の方法により処置し得る。この態様において、ベクター又は  ＶＣＬは腹腔内に直接注入する。特に好ましいアプローチにおいて、急速に増殖中の腫瘍は、好ましくは  ＨＳＶＴＫベクターにより  ｉｎ  ｖｉｖｏに形質導入されて、その後患者に  ａｃｙｃｌｏｖｉｒ又は  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを投入することにより破壊される。
【００７５】
本発明のさらに別の態様において、肺癌、乳癌又は結腸癌から生じる胸膜癌腫症の治療のために、ウイルスベクター又は  ＶＣＬを胸膜腔中に注入するか、あるいは髄膜癌腫症の治療のためには鞘内注入による。
【００７６】
本発明の別の態様では、転移性散在性癌患者も本発明の方法により治療し得る。例えば肝臓に転移した原発性膵臓癌又は結腸直腸癌には、定位法で狙いを定めて体壁を通して注射器を挿入して、本発明のウイルスベクター又は  ＶＣＬを直接注入する。肺又は結腸の腫瘍も同様に、それぞれ気管支鏡検査又はＳ状結腸鏡検査により査定し得る。例えば  ＨＳＶＴＫを発現するベクターにより  ｉｎ  ｖｉｖｏに形質導入された腫瘍細胞を、次に  ａｃｙｃｌｏｖｉｒ又は  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを患者に投与することにより破壊する。
【００７７】
本発明の好ましい態様では、上記のような細胞毒性遺伝子又は遺伝子物質（例えばＨＳＶＴＫ）の投与の他に、病原因子を阻害又は破壊するために、種々の付加的治療組成物を動物に同時投与するか又は引き続き投与する。このような治療組成物は、直接投与し得るか、又は他の態様においては別々のベクター構築物から発現される。あるいは、病原因子を阻害又は破壊するために、細胞毒性遺伝子又は遺伝子物質の両方の発現を指示する単一ベクター、又は治療組成物をコードする遺伝子（例えば上記の非ベクター由来遺伝子）を温血動物に投与する。特に好ましい態様においては、  ＨＳＶＴＫ遺伝子及びヒトχ−ＩＦＮ  のような免疫補助分子をコードする遺伝子の両方を供給及び発現するベクター又は  ＶＣＬを患者に投与する。このような構築物においては、ある遺伝子はベクター  ＬＴＲから発現され、他のものはＬＴＲｓ間に見出される付加的転写プロモーターを利用するか、あるいは、おそらくは内部リボソーム結合部位を用いて、ポリシストロニックｍＲＮＡとして発現される。このようなプロベクターの一例は実施例１０に認められる。  ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子転移後、患者の免疫系はχ−ＩＦＮ  の発現により活性化される。これが起きた後に、全体的腫瘍の苦しみそれ自体は患者を  ａｃｙｃｌｏｖｉｒ又は  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで治療することにより低減され、腫瘍をより有効に免疫攻撃できる。炎症細胞を伴う死腫瘍の浸潤は、次いで免疫表出（例えば  ＭＨＣクラスＩＩ又は  ＨＬＡ表出）を増大し、腫瘍に対する患者の免疫反応をさらに改良する。さらに免疫表出は腫瘍の再発に対する患者の耐性を改良する。
【００７８】
癌の他に、上記のように本発明の方法を使用して他の病原因子を破壊又は阻害し得る。ウイルスベクター処置を用いない同一細胞と比較した場合の、  ＡＺＴ又は  ｄｄＣの存在下で  ＨＩＶに対するそれらの耐性を増大するために、例えば本発明のウイルスベクターをヒトＴ細胞及び／又はマクロファージ／単核球株に投与する。  ＡＺＴによる処置は、毒性副作用を避けるためには正常レベルより低レベルであるが、しかし依然として効率よく  ＨＩＶの拡散を阻害する。
【００７９】
本発明の好ましい態様においては、ベクター粒子のＣＤ４＋  細胞への吸収を指示するために、感染し易いＴ細胞又は単核球を  ＶＳＶＧ，ＨＩＶ  ｅｎｖ又はハイブリッド  ｅｎｖを保有するベクターで標的にする。例えば受容体として  ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質（ｇｐ１２０）を用いて細胞を感染させるベクター粒子を産生することにより、ウイルスベクターを標的化する。このような  ＨＩＶ向性ウイルスは、好ましい態様においては、その細胞膜中に高レベルのＣＤ４タンパク質を天然に有する細胞（例えばＳｕｐ  Ｔ１細胞）及び／又はＣＤ２６タンパク質を有する細胞から、あるいはこのようなタンパク質を発現するために“遺伝子工学的に処理される”任意の細胞型から構築される  ＭＬＶベースのパッケージング細胞株から産生される。その結果生じるビリオン（細胞膜それ自体からの出芽によりできる）は、その膜中にＣＤ４（及び／又はＣＤ２６）タンパク質を含有する。ＣＤ４（及びＣＤ２６）を含有する膜はＨＩＶｅｎｖを保有する膜と融合することが公知であるため、これらのビリオンはＨＩＶｅｎｖを含有する細胞と融合すべきであり、それらの表面に  ｇｐ１２０を有する  ＨＩＶ感染細胞の特異的感染を引き起こす。このようなパッケージング細胞株は、適切なビリオン集合体及び出芽を感染性ビリオン中に生じさせるためには、ＭＬＶｅｎｖタンパク質の存在を必要とする。そのような場合、ウイルス進入がＣＤ４（及び／又はＣＤＣＣ）／ＨＩＶｅｎｖ相互作用によってのみ生じ、ＭＬＶｅｎｖ細胞受容体によっては生じないように（これは恐らくは感染に対するＨＩＶｅｎｖの存在に依るものではない）、ヒト細胞に感染しないＭＬＶｅｎｖ（例えばエコトロピックｅｎｖ）を用いる。あるいは、ＭＬＶｅｎｖの要件は、ハイブリッドエンベロープにより満たされるが、この場合アミノ末端結合ドメインはＣＤ４及び／又はＣＤ２６のアミノ末端ＨＩＶｅｎｖ結合ドメインに置き換えられていた。正常ウイルス受容体相互作用のこの逆は、その対応する細胞受容体が同定されている全種類のウイルスに関して用い得る。
【００８０】
本明細書に提示された開示を示せば当業者には理解されるように、本明細書に記載のベクター構築物はすべて、ウイルスベクターとしてだけでなく、直接核酸ベクターとして供給される。このようなベクターは、遺伝子転移の任意の適切な物理的方法を用いて供給し得る。
【００８１】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ベクターの構築
Ａ．ベクター  ＬＴＲ配列を含有するプラスミドの構築
以下のレトロウイルスベクターはすべて、Ｎ２ベクターを基礎にしている（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：１４９−１５４，１９８５）。手短にいえば５′及び３′ＥｃｏＲＩ  ＬＴＲ断片（それぞれ  ２．８及び１．０ｋｂ）（Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｊ．Ｖｉｒ．６１：１６４７，１９８７；Ｂｇｌｉｔｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５，１９８５）を最初にプラスミドＳＫ＋  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及び  ｐＵＣ３１のＥｃｏＲＩＶにサブクローニングする、  ｐＵＣ３１は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩ及び  ＳａｃＩ間に別の制限部位（ＸｈｏＩ，ＢｇｌＩＩ  及び  ＮｃｏＩ）を保有するｐＵＣ１９  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の修飾体である。それによりＳＫ＋  プラスミドと１．０ｋｂ  ３′ＬＴＲ  断片との結紮からプラスミドＮ２Ｒ３＋／  を作る。プラスミド  ｐ３１Ｎ２Ｒ５＋／−及び  ｐ３１Ｎ２Ｒ３＋／−は、それぞれ  ｐＵＣ３１と２．８ｋｂ  ５′ＬＴＲ  及びパッケージングシグナル  （Ω）又は１．０ｋｂ  ３′ＬＴＲ  断片との結紮から構築される。各々の場合、Ｎ２はベクター源を示し、Ｒは断片がＥｃｏＲＩ断片であるという事実を示し、５及び３は、５′又は３′ＬＴＲｓを示し、そして＋又は−は挿入体の配向を示す（ＬＴＲサブクローンの例に関しては図１〜６参照）。
【００８３】
ある場合には、  １．２ｋｂ  ＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ５′ＬＴＲ  及びＮ２からのφ断片をＳＫ＋  ベクターの同一部位にサブクローニングする。このベクターをｐＮ２ＣＲ５と呼ぶ。いま一つの場合、スプライスドナー配列の６ｂｐ欠失を含有する５′ＬＴＲ（Ｙｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＱｕａｎＬｉｔａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５１：１０２１，１９８６）を１．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ断片として  ｐＵＣ３１中にサブクローニングする。このベクターをｐ３１Ｎ２５Δ〔＋〕と呼ぶ（図６）。
【００８４】
Ｂ．ＨＳＶＴＫ及び  ＨＩＶプロモーターを含有するプラスミドの構築
ＨＳ部位−１チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶＴＫ）のコード領域及び転写終結シグナルを、ｐＢＲ３２２  （ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１３４４）中にクローニングしたプラスミド３２２ＴＫ（ＨＳ部位−１  （ＭｃＫｎｉｇｈｔ等）の３．５ｋｂ  ＢａｍＨＩ断片）から１．８ｋｂ    ＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩ  断片として単離し、そして  ＢｇｌＩＩ／  ＳｍａＩ消化  ｐＵＣ３１中にクローニングした。この構築物を  ｐＵＣＴＫと呼ぶ。ターミネーターシグナルの欠失を要する構築物のために、  ｐＵＣＴＫを  ＳｍａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、（Ａ）ｎ  シグナルを含有する  ０．３ｋｂ断片を除去した。以下のオリゴマーから作られる二重鎖オリゴヌクレオチドで残りのコード配列及び付着端ＢａｍＨＩオーバーハングを再構築する：
５′ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＣＴＡ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ３′（配列番号１）
５′ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＴＴＡ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  Ｃ  ３′（配列番号２）
その結果生じる構築物を  ｐＴＫΔＡ（図７）と呼ぶ。
【００８５】
診断のために、オリゴ体は  ＳｍａＩ部位を破壊するよう意図され、一方翻訳タンパク質を変えずに  ＡｖａＩ部位を保持する。
【００８６】
ＨＳＶＴＫプロモーター及びコード配列（（Ａ）ｎシグナルを欠く）を含有するプラスミド  ｐＴＫΔＡ（図８）を以下のように構築する。
【００８７】
１．ｐＴＫΔＡ  をアルカリ性ホスファターゼで処理した  ＢｇｌＩＩで線状化し、ゲル精製する。
【００８８】
２．ＨＳＶＴＫ翻訳プロモーターを含有した  ０．８ｋｇ断片をｐ３２２ＴＫからＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ  断片として単離する。
【００８９】
３．（１）及び（２）からの生成物を結紮し、細菌中に形質転換して、プロモーター領域の適切な配向に関して陽性クローンをスクリーニングする。その結果生じるクローンを  ｐＰｒＴＫΔＡ（図８）と呼ぶ。
【００９０】
０．６ｋｂ  ＨＩＶプロモーター配列をｐＣＶ−１（Ａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：６９−７３，１９８５）からの  ＤｒａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片としてＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  −切断  ＳＫ＋  中にクローニングする。その結果生じる構築物を  ｐＳＫＨＬと呼ぶ。
【００９１】
Ｃ．構成プロモーターからの  ＨＳＶＴＫを発現するレトロウイルスプロベクターの構築
レトロウイルスプロベクター  ｐＴＫ−１，ｐＴＫ−２及び  ｐＴＫ−３を、本質的には下記のように構築する：
１．５ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ５′ＬＴＲ  及びプラスミド配列をｐ３１Ｎ２Ｒ５（＋）（図１）から単離する。
【００９２】
２．転写終結配列を欠く  ＨＳＶＴＫコード配列を  １．２ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として  ｐＴＫΔＡ（図２）から単離する。
【００９３】
３．３′ＬＴＲ  配列を１．０ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片としてｐＮ２Ｒ３（−）（図２）から単離する。
【００９４】
４．工程１〜３からの断片を混合し、結紮して、細菌中に形質転換し、個々のクローンを制限酵素分析により同定する。構築物をＴＫ  １  （図９）と呼ぶ。
【００９５】
５．ｐＴＫ  ３をＢａｍＨＩでＴＫ−１を線状化することにより構築し、５′オーバーハングに充填し、細菌  ｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、Ｓ部位４０初期プロモーター＋ｐＡＦＶＸＭレトロウイルスベクターから得られた  Ｔｎ５  Ｎｅｏ′遺伝子を含有する５′充填  ＣｌａＩ／  ＣｌａＩ断片を盲端結紮する（Ｋｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３９：４８３，１９８４  ；  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８５：３１５０，１９８８）。カナマイシン耐性クローンを単離し、個々のクローンを適切な配向に関して制限酵素分析によりスクリーニングする（図９参照）。
【００９６】
本質的に下記のように  ｐＴＫ  ２を構築する（図１０参照）：
１．プラスミドｐ３１Ｎ２Ｒ５（＋）（図１）を  ＸｈｏＩ及び  ＨｉｎｄＩＩＩで切断する。
【００９７】
２．ＨＳＶＴＫコード配列（その（Ａ）ｎ配列を欠く）を含有する２．０ｋｂ  断片及び  ＨＳＶＴＫ転写プロモーターを  ＸｈｏＩ／  ＨｉｎｄＩＩＩ切断  ｐＰｒＴＫΔ（図８）から単離する。
【００９８】
３．３′ＬＴＲ  を  １．０ｋｂ断片としてＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片ｐＮ２Ｒ３（−）（図２）から単離する。
【００９９】
４．上記の１，２及び３からの断片を結紮し、細菌中に形質転換して、適切な構造の  ａｍｐ′クローンを制限酵素分析により同定する。
【０１００】
これらの構築物を用いて感染性組換え体ベクター粒子をパッケージング細胞株とともに生成する。
【０１０１】
Ｄ．ｐＫＴＶＩＨＡＸの構築
レトロウイルスベクターｐＫＴＶＩＨＡＸを本質的に下記のように構築する（図１１参照）。
【０１０２】
１．９．２ｋｂ  ＡｓｕＩＩ／  ＸｈｏＩ断片をＮ２ベクター  ＤＮＡから単離する（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：１４９，１９８５）。
【０１０３】
２．０．６ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ    プロモーター断片を実施例１Ｂからのプラスミド  ｐＳＫＨＬから単離する。
【０１０４】
３．０．３ｋｂ  ＢｇｌＩＩ／  ＡｃｃＩ及び  １．５ｋｂ  ＡｃｃＩ／  ＡｃｃＩ断片を実施例１Ｂからの  ｐＵＣＴＫから精製する。
【０１０５】
４．１，２及び３からの断片を結紮し、細菌中に形質転換して、既知の構造を有する適切なアンピシリン耐性クローンを制限酵素分析により同定する。
【０１０６】
Ｅ．ｐＫＴＶＩＨ−５及び  ｐＫＴＶＩＨ５  Ｎｅｏレトロウイルスベクターの構築
レトロウイルスベクターｐＫＴＶＩＨ  ５及び  ｐＫＴＶＩＨ５  Ｎｅｏを本質的に下記のように構築する（図１２参照）。
【０１０７】
１．５′ＬＴＲ  及びベクター断片を、  ４．５ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片としてベクターｐ３１Ｎ２５Δ  （＋）（図６）から単離する。
【０１０８】
２．３′ＬＴＲ  を  １．０ｋｂ  ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ断片としてｐＮ２Ｒ３（＋）（図４）から単離する。
【０１０９】
３．０．６ｋｂ  ＨＩＶプロモーター要素を  ＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片として実施例１Ｂから単離する。
【０１１０】
４．ＨＳＶＴＫコード配列及び転写終結配列を１．８ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／  ＳａｌＩ断片として実施例１Ｂからの  ｐＵＣＴＫから単離する。
【０１１１】
５．１〜４からの断片を併合し、細菌中に形質転換して、所望の構造のクローンを制限酵素分析により同定する。構築物をｐＫＴＶＩＨ−５  （図１２）と呼ぶ。
【０１１２】
６．ｐＫＴＶＩＨ５を  ＣｌａＩで線状化し、細菌  ｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びｐＡＦＶＸＭから得られるＴｎ５Ｎｅｏ′マーカーを含有する  １．８ｋｂ  ＣｌａＩ断片と混合して、結紮し、細菌を形質転換し、カナマイシン耐性に関してスクリーニングして、プラスミドｐＫＴＶＩＨ５Ｎｅｏを構築する。指示された配向に挿入物を有するクローンを制限分析により同定する（図１２）。
【０１１３】
Ｆ．ＭＨＭＴＫ  Ｎｅｏレトロウイルスベクターの構築
レトロウイルスベクター  ＭＨＭＴＫ  Ｎｅｏを本質的に下記のように構築する（図１４参照）。
【０１１４】
１．中間生成物プラスミド  ＭＨＭ−１  ＬＴＲの構築
ａ）実施例１ＡからのプラスミドｐＮ２ＣＲ５を  ＦｏｋＩで消化して線状化し、クレノウ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて５′オーバーハングをデオキシヌクレオチドトリホスフェートで充填し、  ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを挿入する。細菌に形質転換後、ＭＬＶ  ＬＴＲＦｏｋＩＶに挿入した  ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを有するクローンを、制限酵素分析により同定する。このプラスミドをｐＮ２ＣＲ５ＦＨと呼ぶ。
【０１１５】
ｂ）プラスミドｐＮ２ＣＲ５ＦＨを  ＮｈｅＩで線状化し、クレノウポリメラーゼで５′オーバーハングを充填し、  ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、プロモーター無含有  ＬＴＲ配列の  ４．３ｋｂ断片を単離する。
【０１１６】
ｃ）０．５ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＨＩＶ  プロモーター配列を実施例１Ｂからの  ｐＳＫＨＬから単離する。
【０１１７】
ｄ）ｂ及びｃを混合し、結紮して、細菌中に形質転換するのに用い、  ＭＨＭ−１の構造を制限酵素分析により確証する（図１３参照）。
【０１１８】
２．ＭＨＭ−１から単離した０．７ｋｂ  ＥｃｏＲＶ／  ＢａｌＩ断片を修復し、プラスミドＩ３０ＢのＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングする。Ｉ３０Ｂは、ポリリンカー中に付加的  ＢｇｌＩＩ，ＢｓｔＩＩ，ＮｃｏＩ及び  ＮｄｅＩ部位を含有する修飾化  ＩＢＩ３０プラスミドである。細菌に形質転換後、所望の配向のクローンを制限腔嘘分析により同定する。この構築物を  ｐＭＨＭＢと呼ぶ。                                        
【０１１９】
３．プラスミド  ｐＭＨＭＢを  ＡｐａＩ及び  ＸｈｏＩで消化して、  ０．８ｋｂ断片（３′ＬＴＲ  として用いられる）をゲル精製する。
【０１２０】
４．ＭＨＭ−１  ＬＴＲを  ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩで消化し、１．８ｋｂ  ＭＨＭ−１  ＬＴＲ（図１３）パッケージング配列をゲル精製する。
【０１２１】
５．ＳＶ４０初期プロモーター駆動  Ｎｅｏ′の上流の  ＨＳＶＴＫコード領域を含有する  ２．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩ／  ＳａｌＩ断片を  ｐＴＫ−３から得る（図９参照）。
【０１２２】
６．３〜５をと混合し、結紮して、細菌を形質転換するのに用い、所望のクローンを制限分析により同定する。
【０１２３】
このベクター及びそれらの  ＬＴＲに誘導要素を含有する同様のベクターは、安全性を付加する。要するに  ＬＴＲは  ＨＩＶの非存在下では不活性であるため、望ましくない宿主遺伝子（例えばプロト腫瘍遺伝子）の挿入性下流活性化は起きない。しかしながらパッケージング細胞株における  ｔａｔ発現は、組織培養におけるビリオンの操作を楽にする。
【０１２４】
Ｇ．ＲＲＫＴＶＩＨレトロウイルスベクターの構築
レトロウイルスベクター  ＲＲＫＴＶＩＨを本質的に下記のように構築する（図１７参照）。
【０１２５】
１．９．２ｋｂ  ＡｓｕＩＩ／  ＸｈｏＩ断片をＮ２ベクター  ＤＮＡから単離する（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：１４９，１９８５）。
【０１２６】
２．０．６ｋｂ  ＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ    プロモーター断片を実施例１Ｂからのプラスミド  ｐＳＫＨＬから単離する。
【０１２７】
３．ＨＩＶｒｅｖ反応性ＨＳＶＴＫ  （ＲＲＴＫ）を以下の方法で構築する：
ａ）ＨＳＶＴＫ遺伝子を１．８ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩ／ＰｖｕＩＩ  断片としてベクターＳＫ＋  のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングする。この構築物をｐＳＴＫ  （−）（図１５）と呼ぶ。
【０１２８】
ｂ）ＨＩＶ  ＩＩＩＢｅｎｖからの  ＣＲＳ／ＣＡＲ  要素を含有する  １．８ｋｂ  ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  断片を修復し、ベクターＩ３０Ｂの  ＳｍａＩ部位に盲端結紮する。この構築物をｐＣＲＳ／ＣＡＲ（−）と呼ぶ。Ｉ３０Ｂは、  ｐＵＣ３１と同じ付加的制限部位を含有する修飾  ＩＢＩ３０プラスミドで、ＩＢＩ３０ＸｈｏＩ部位の代りに  ＮｄｅＩ部位を有する。
【０１２９】
ｃ）ベクター及び  ＨＳＶＴＫポリアデニル化シグナルを含有する３．６ｋｂ  ＢｓｓＨＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐＳＴＫから単離する。
【０１３０】
ｄ）１．８ｋｂ  ＢａｍＨＩ／ＢｓｓＨＩＩ  ＣＲＳ／ＣＡＲ  断片をｐＣＲＳ／ＣＡＲ−  （図１６）から単離する。
【０１３１】
ｅ）１．２ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩコード配列断片を  ｐＴＫΔＡ（図７）から単離する。
【０１３２】
ｆ）ｃ，ｄ及びｅを結紮し、所望の組換え体ベクター構築物を制限酵素分析によりスクリーニングする。
【０１３３】
４．Ｒｅｖ反応性  ＨＳＶＴＫを３．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ／  ＣｌａＩ断片として単離する。
【０１３４】
５．１，２及び４を結紮し、適切な組換え体を制限酵素分析により同定する。
【０１３５】
Ｈ．ｔａｔ及び抗  ｔａｔ発現ベクターの構築
発現ベクター  ｔａｔ及び抗  ｔａｔを本質的に下記のように構築する（図１８参照）。これらのベクターを擬  ＨＩＶとして用いて  ｔａｔ依存性  ＨＳＶＴＫベクターを試験活性化する。
【０１３６】
１．Ｈｉｓ′発現ベクター  ｐＢａｍＨｉｓをＢａｍＨＩで線状化し、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理する。
【０１３７】
２．ｐＣＶ−１（Ａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：６９−７３，１９８５）の  ＳａｃＩ部位を突然変異化してＢａｍＨＩ部位とし、ＨＩＶｔａｔの３５０ｂｐ  ＢａｍＨＩコード配列を単離する。
【０１３８】
３．工程１及び２で精製した断片を混合し、結紮して、細菌を形質転換するのに用い、両配向で  ｔａｔを有するクローン（ｔａｔ又は「アンチセンス」ｔａｔを発現する）を制限酵素分析で同定する。
【０１３９】
これらの構築物を用いて、本質的に以下のようにして、パッケージング細胞株、例えばＰＡ３１７  （ＡＴＣＣ  Ｎｏ．９０７８）とともに感染性組換え体ベクター粒子を生成する。要するに１０μｇのプラスミドプロベクターをφ２細胞上でのリン酸カルシウム沈降によりトランスフェクトさせて、上清を用いて  ＰＡ３１７を感染させる。これらのベクターは一般に安定で、感染細胞の個々のクローンからの制限酵素消化ゲノム  ＤＮＡのサザーンブロット分析で判定した場合に予測可能なプロウイルス構造を生じる  （試験した３９／４０クローンが予測したサイズのプロウイルスを有した）。
【０１４０】
実施例２
ベクター構築物のパッケージング
これらのレトロウイルスベクターの生物学的特性を以下に記載する。  ＨＩＶ  ｔａｔ遺伝子  （「ｔａｔｈｉｓ」ベクター：図１８参照）をマウス  ＰＡ３１７細胞中にトランスフェクトする。５つの個々のヒスチジノール耐性サブクローンを生成し、ＴＨ１−５  と名付けたが、これらはＨＩＶｔａｔを発現する。これらの細胞はしたがって  ＨＩＶ感染細胞の実験的見積もりである。  次いでベクターＫＴＶＩＨＡＸ（実施例１Ｄから）、ＫＴＶＩＨ５Ｎｅｏ（実施例１Ｅから）及びＭＨＭＴＫＮｅｏ  （実施例１Ｆから）をこれらの  ｔａｔ発現細胞株並びに  ｔａｔを欠いたその親細胞株への感染により導入する。次に細胞生育能力を種々の濃度の  ＨＳＶＴＫ特異的細胞毒性剤ａｃｙｃｌｏｖｉｒ  （ＡＣＶ）で確定する。データはここではＬＤ５０  （５０％毒性が観察される薬剤濃度）として報告し、生育可能細胞対  ＡＣＶ濃度のグラフに内挿した。  ＨＳＶＴＫを含有するがしかし  ｔａｔを欠いた親細胞株  （非  ＨＩＶ感染モデル）は、試験濃度では  ＡＣＶによる検出可能な毒性を示さなかった。したがってこれらの細胞は細胞毒性に関しては  １００μＭ又はそれ以上の  ＡＣＶを要する。これは、ベクターを欠いたこれらの細胞に関して真実である。したがってベクター単独、  ＡＣＶ単独、又はベクター＋ＡＣＶ  でさえも細胞毒性を示さない。しかしながらＨＩＶｔａｔを発現する（ＨＩＶ感染の実験的表出）細胞株は、  ＡＣＶに有効に殺される  （図２１）。これは、試験した３つのベクター全てに関する程度を変えるのが正しい。これらのデータは、  ＨＩＶ感染細胞が  ＡＣＶ及び“ポテンシエイター”ベクターの存在下で殺されることを示す。
【０１４１】
同様の実験では、ベクター  ＫＴＶＩＨＡＸ及び  ＫＴＶＩＨ５Ｎｅｏを、ヒトＴ細胞及び単核球細胞株  Ｓｕｐ  Ｔ１（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１１２３），  Ｈ９，ＨＬ６０  （ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ２４０），Ｈ９  （ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ１７６）及びＵ９３７  （ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５９３）細胞への感染により導入する。次にこの細胞をｔａｔｈｉｓ又は抗  ｔａｔベクターに感染させて、ヒスチジノール中で選択し、種々の濃度の  ＡＣＶ類似体    フルオロ−ヨード−アラビノシド−ウリジン  （ＦＩＡＵ）で細胞生育能力を確定する。表１（下記）に報告したＬＤ５０は、ＦＩＡＵ中でのベクター依存性増大がＨｉｓｔａｔの非存在下で起きたが、しかし  ｔａｔが存在する場合にはさらに１０倍〜２０倍増大することを示す。これは、ＨＬ６０細胞以外の全てで基準  ＨＳＶＴＫ発現が認められるが、しかし発現はＨＩＶｔａｔ存在下ではより大きくさえある。  ＨＳＶＴＫベクター単独を付加しても、ＨＩＶｔａｔの非存在下ではＨＬ６０における  ＡＣＶ毒性の検出可能な増大は認められなかった。
【０１４２】
【表１】
2004305227.tif 000002
【０１４３】
同様に、  ＨＳＶＴＫベクター  ＫＴＶＩＨＡＸ＋／−ＦＩＡＵを含有するヒトＴ細胞株Ｈ９の  ＨＩＶ感染は、ＦＩＡＵの存在下で感染の５倍の選択的阻害（細胞死による）を示す。培養を先ずベクターで処理し、次いで  ＨＩＶを用いて  （ＦＩＡＵ含有又はなしで）４日間試験する。次にウイルス上清を、下記の可溶性アルカリ性ホスファターゼ検定を用いて滴定する。
【０１４４】
可溶性アルカリ性ホスファターゼ検定
培地を感染細胞から除去し、１０秒間微小遠心分離して、次に６８℃に１０分間加熱して、内生的ホスファターゼを破壊した。次いで培地を２分間微小遠心分離して、検定のためにアリコート（１０〜５０μｌ）を取り出した。緩衝液（１Ｍ  ジエタノールアミン、ｐＨ  ９．８；０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ；    １０ｍＭ  Ｌ−ホモアルギニン）１００μｌを加え、その後、  １２０ｍＭ  Ｐ    ニトロフェニルホスフェート（緩衝液中）を２０μｌ加えた。反応混合物のＡ４０５を自動プレート読み取り機を用いてモニタリングした。
【０１４５】
図７及び８は、種々の濃度の抗ウイルス剤の存在下でのアルカリ性ホスファターゼ検定を用いたＳｕｐ  Ｔ１細胞の  ＨＩＶ感染の時間経過の典型的結果を示す。６日目の“＋”及び“−”は、それぞれシンシチウムの存在又は非存在を示す。
【０１４６】
実施例３
ｐＢＨ−１及びｐＭχ−ＩＦＮ／ＴＫベクターの構築
ＨＳＶＴＫ遺伝子を含有する１．２ｋｂ  断片を得るために、実施例１Ｇからの  ｐＲＲＴＫを  ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩで消化する。この断片を、ポリリンカー中に見出される  ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限部位でｐＳＰ７２  （Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に結紮する。このプラスミドを  ｐＲＲＴＫ  Ｂと呼ぶ。  ｐＲＲＴＫ−Ｂを  ＸｈｏＩ及び  ＣｌａＩで消化して、  ＨＳＶＴＫ遺伝子を含有する１．２ｋｂ  断片を得る。次に、  ＸｈｏＩ及び  ＣｌａＩ部位で消化後に、この断片をＫＴ  ３  （このベクターの構築物は  ＷＯ  ９１／０２８０５  に記載されている）に結紮する。ゲル精製によりＫｂＨＩＶｇａｇ／ｐｒｏｔ断片を取り出す。このプラスミドを  ｐＢＨ  １と呼ぶ。
【０１４７】
実施例４
ＤＡ／ＴＫ−３，ＤＡ／ＢＨ−１，ＤＡ  Ｍχ−ＩＦＮ／ＴＫ及びＨＡ  Ｈχ−ＩＦＮ／ＴＫの構築
プロデューサー細胞株
ｐＴＫ−３ＤＮＡ  （図９）１０μｇ及びｐＭＬＰ−Ｇ  ＤＮＡ  （このベクターの構築物は  ＷＯ  ９２／１４８２９  に記載されている）１０μｇを、標準  ＣａＰＯ４を用いて２９３  ２  ３  （２９３細胞  （ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １５７３，ＷＯ  ９２／０５２６６）に由来する細胞株）にトランスフェクトする。４８時間トランスフェクション後、上清を収集し、０．４５μｍの円筒濾紙を通して濾過する。この上清は、新たに調製されたＤＡ  （Ｄ  １７  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  １８３，ＷＯ  ９２／０５２６６  由来の細胞株）細胞を感染させるのに用いられるＧ−擬似型ＴＫ−３ベクターを含有する。ウイルス上清付加後２４時間目にＤＡ細胞を  Ｇ−４１８選択（８００μｇ／ｍｌ）下に置く。７〜９日後、  Ｇ−４１８選択非クローン性プールが得られ、これをＤＡ／ＴＫ  ３と呼ぶ。ベクターが  ＨＳＶＴＫを発現する最高力価に関して個々の単離物を限定希釈クローニング及びスクリーニングにより高力価クローンを同定する。これは、  ３  Ｔ３  ＴＫ−  又は  Ｈｅｌａ  ＴＫ−  のような細胞チミジンキナーゼを欠いた細胞株を形質導入し、細胞をゲネチシン及び  ＨＡＴ培地中に入れるすることにより  Ｎｅｏコロニー形成を測定して達成し得る。これらの条件下で成長するコロニーの数は、  Ｎｅｏ及び  ＨＳＶＴＫを発現する形質導入細胞の数を反映する。
【０１４８】
ＤＡ／ＢＨ−１  ＶＣＬはＤＡ／ＴＫ−３と同様に生成されたが、  ｐＴＫ−３の代わりに  ｐＢＨ−１が入る。ｍχ−ＩＦＮ  及びｈχ  ＩＦＮに対する  ＶＣＬの生成は、ベクターが容易に選択可能な薬剤耐性マーカー  （例えばＮｅｏ）を含有しないという事実によると考えられる。  ＨＳＶＴＫに対する唯一の公知の選択は、内生的ＴＫを欠いた  （ＴＫ−）細胞を含有する  ＨＡＴ培地を用いる。ｍχ−ＩＦＮ  及びｈχ−ＩＦＮ  のようなプロベクターに対するＶＣＬｓを生成する方法がある。
【０１４９】
１．ＶＣＬを生成するために用いられる  ＰＣＬは、ＴＫ−である。例えばＤＡ細胞  （ＴＫ＋）はプロモデオキシウリジンの存在下で増殖し得る。このヌクレオチド類似体は、特にＴＫを発現する細胞に対して有毒で、したがってＤＨのＴＫ遺伝子における滅多にない突然変異体が培養のために選択される。この突然変異体の頻度は、ＵＶ又はＸ線照射といった物理的手段により、又は化学的突然変異原への曝露といった化学的手段により突然変異誘発前までに増大する。ＤＡのＴＫ変異体が一旦生成されると、ｍχ−ＩＦＮ  又はｈχ−ＩＦＮ  のようなベクターで形質導入された細胞が  ＨＡＴ培地中に選択される。
【０１５０】
２．相対的に低レベルの内生的ＴＫを含有し、相対的に高レベルでベクター  ＨＳＶＴＫを発現し得るＴＫ＋細胞の選択がいくつかの細胞で考え得る。非常に活性の高い転写プロモーターを用いて  ＨＳＶＴＫが発現される、例えばプロモーター直前の  ＬＴＲ又は  ＣＭＶから発現されるＴＫの場合には、これは特に確かである。この場合、標準レベル以下のチミジンを含む修飾  ＨＡＴ培地は、形質導入細胞を  ＨＡＴ培地のアイニノペルテリンから選択的に救出する。
【０１５１】
３．ＨＳＶＴＫの基質特異性が細胞性ＴＫの場合よりも広いために、  ＨＳＶＴＫを発現する細胞の選択は、細胞ＴＫ（ドメイン選択）を発現する細胞においてさえ生じ得る。この差異は、Ｅｃｏ  ｇｐｔ  （Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８１：７１５１，１９８４）の選択に用いたのと同様の選択培地を用いて  ＨＳＶＴＫを選択するのに活用し得る。この洗濯培地は、ミコフェノール酸  （Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を利用して、細胞死を引き起こすプリンヌクレオチド生合成を阻害する。細胞が  ＨＳＶＴＫを発現する場合、プリンヌクレオチド、例えばキサントシンを  ＨＳＶＴＫによりリン酸化して、ＡＭＰ  及び  ＧＭＰの両方の前駆体である  ＸＭＰを産生する。したがって  ＨＳＶＴＫを発現する細胞は、  Ｅｃｏ  ｇｐｔ選択に用いられるのと同一（キサンチンの代わりにキサントシン）培地中で選択し得る。
【０１５２】
４．ＶＣＬｓは、  ＨＳＶＴＫ遺伝子以外のベクター遺伝子の発現に対する選択により生成し得る。例えば膜結合タンパク質を発現するベクター（ＫＴ１／ＫＴ）を含有する  ＶＣＬは、蛍光活性化細胞分類により分類される。あるいはｈχ−ＩＦＮ  形質導入ＶＣＬｓハ、  ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの公知の増大により分類し得る（ＰＣＬがヒトであるかぎりは、χ−ＩＦＮ  は高度種特異的であるため）。
【０１５３】
５．さらにクローン性ＶＣＬｓは、選択の非存在下で生成し、同定し得る。このアプローチは、上記のように  ２９３  ２−３で生成去れるＶＳＶＧ擬似型化ベクターを用いたが、但しＤＡ細胞は高Ｍ．Ｏ．Ｉ．で形質導入する。例えば一時的トランスフェクションにより生成されるベクター１ｍｌ（３Ｔ３ＴＫ−で約１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌ）を用いて１ｘ１０４  個の細胞を１回、３回又は１０回形質導入して、多数の細胞が少なくとも１回の培養で形質導入されるのを確実にする。次に限定希釈により細胞をクローニングし、  ＨＡＴ培地中で  ３Ｔ３ＴＫ−細胞（又はキセノ向性ベクターの場合は  Ｈｅｌａ  ＴＫ−）の高力価に関して個々の単離物をスクリーニングする。
【０１５４】
実施例５
ＴＫ−３を含有する場合又は含有しない場合のＣＴ２６に及ぼす  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの作用の測定
ＤＡ／ＴＫ  ３で形質導入したＣＴ２６細胞  （ＣＴ２６  ＴＫｎｅｏ）に  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒが作用を及ぼすか否かを調べるために、  ＣＴ２６ＴＫｎｅｏ細胞を６つの  １０ｃｍ２プレートに  ２．５ｘ１０６  ／プレートで植え付けた。対比した場合、２つの他の細胞型  ＣＴ２６及びＣＴ２６Ｂｇａｌ  （この細胞株は大腸菌からの受容体遺伝子βガラクトシダーゼを保有するウイルスで形質導入された）を各々、対照として６つの  １０ｃｍ２プレートに植え付けた。各細胞型の５つのプレートを１日２回、４連続日間、  １００μｇ／ｍｌ，５０μｇ／ｍｌ，２５μｇ／ｍｌ，１２．５μｇ／ｍｌ及び６．２５μｇ／ｍｌの濃度の  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置した。各細胞型の１つのプレートは未処置のままにしておいた。その後、トリプシン処理して各皿から細胞を取り出し、１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに再懸濁して、計数した。図２２に示したデータは、最低用量の  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒでも  ＣＴ２６ＴＫｎｅｏ細胞に劇的な細胞毒性作用を及ぼすことを示す。この用量  （６．２５μｇ／ｍｌ）又は次に高い用量  （１２．５μｇ／ｍｌ）の  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒでもＣＴ２６及びＣＴ２６Ｂｇａｌ細胞に作用しなかった。しかしながら２５μｇ／ｍｌの用量で開始すると、細胞成長に用量依存性減少が認められたが、しかし  ＣＴ２６ＴＫｎｅｏ細胞は常に薬剤に対して感受性がより高かった。
【０１５５】
実施例６
ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ  細胞を注入されたマウスの治療のための  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ用量の確定
ネズミ腫瘍の  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入を用いて疾患を治療し得るか否かを調べるために、形質導入され、  １００％形質導入を保証するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択された腫瘍を排除するのに必要な  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの最適濃度を確定するための実験を実施した。結腸腫瘍２６即ちＣＴ２６（Ｂｒａｔｔａｉｎ，Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）細胞をＧ擬似型ＴＫ−３ベクターて形質導入した。ウイルス上清を付加後２４時間目に  Ｇ−４１８選択（４５０μｇ／ｍｌ）下に置いた。１０日間インキュベーション後、  Ｇ−４１８選択プールを得て、  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏと名付けた。各３匹１２群のマウスに２ｘ１０５  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ  細胞を注入した。６群のマウスにこれらの細胞を腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注入し、６群のマウスには皮下  （Ｓ．Ｃ．）注入した。各３匹の他の２群にはＩ．Ｐ．又はＳ．Ｃ．で２ｘ１０５  個の未修飾ＣＴ２６細胞（対照として）を注入した。
【０１５６】
ＣＴ２６又は  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ細胞のこれらの群のマウスに注入後１０日目に、いくつかの濃度の  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ治療を開始した。各投与レジメンは、１日２回午前と午後に  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒをＩ．Ｐ．注入するものであった。実線を下の表Ａに要約する。
【０１５７】
【表Ａ】
2004305227.tif 000003
【０１５８】
５日後に、  １２５ｍｇ／ｋｇ、  ２５０ｍｇ／ｋｇ及び  ５００ｍｇ／ｋｇ処置群のマウスすべてが、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの毒性作用のために死亡した。  １５．６３ｍｇ／ｋｇ，  ３１．２５ｍｇ／ｋｇ及び６２．５ｍｇ／ｋｇ処置群のマウスはさらに７日間処置され、治療に耐容できた。２３日目に腫瘍測定をおこなった（図２３）。  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏは未修飾ＣＴ２６より僅かにゆっくり増殖しただけであった。完全腫瘍退行は、６２．５ｍｇ／ｋｇレジメンで処置したマウスの群に認められた。部分的腫瘍退行は、  ３１．２５ｍｇ／ｋｇ処置群に観察された。２つの未処置対照群と比較した場合、  １５．６３ｍｇ／ｋｇ処置群では作用は殆ど又は全く認められなかった。６２．５ｍｇ／ｋｇ群では多少の毒性が観察されたけれども、生命を脅かすものではなく、治療を中断すると元に戻ったので、この濃度を用いてさらに調べた（図２３）。２４日後、Ｉ．Ｐ．注入動物を屠殺し、評価した。図２４及び２５に示すように、抗腫瘍作用に関する最適濃度は腫瘍がＩ．Ｐ．で増殖したか又はＳ．Ｃ．であったかにかかわらず同様であった。
【０１５９】
実施例７
ＣＴ２６及び  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏにおける細胞毒性の比較
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍成長
Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒが  ｉｎ  ｖｉｖｏで未修飾ＣＴ２６腫瘍細胞の成長に作用を及ぼすか否かを調べるために、各７匹の２群に２ｘ１０６  個の未修飾ＣＴ２６細胞をＳ．Ｃ．注入し、各７匹の２群には２ｘ１０５  個の未修飾  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ細胞をＳ．Ｃ．注入した。腫瘍を植え付けて数日後に、ＣＴ２６注入マウスの１群及び  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ注入マウスの１群に、６２．５ｍｇ／ｋｇでのＩ．Ｐ．ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの１日２回（午前と午後）レジメンを施した。これらのマウスを１２日間、又は  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ注入動物が検出可能な腫瘍の苦しみを示さなくなるまで、処置した。３週間に亘って腫瘍成長をモニタリングした。ＣＴ２６を注入し  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置したマウスはＣＴ２６を注入した未処置マウスよりもいくぶん小さい腫瘍を有したが、これは腫瘍成長の  ＨＳＶＴＫ非依存性阻害が小さいことを示す（図２６）。しかしながら  ＣＴ２６ＴＫｎｅｏ含有マウスを  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置した場合に、そしてこの場合にのみ、腫瘍の苦しみの劇的減少が観察された（図２６）。
【０１６０】
実施例８
ＣＴ２６腫瘍細胞注入マウスへのβ−ＧＡＬ  直接ベクターの注入
ベクターの直接注入により腫瘍細胞が  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入去れたか否かを査定するために、大腸菌β  ガラクトシダーゼ遺伝子を発現するリポーターベクター（ＣＢ  β−ｇａｌ）を用いた。各２匹の５群に２ｘ１０５  個のＣＴ２６腫瘍細胞をＳ．Ｃ．注入した。各２匹の別の群には、β−ｇａｌ  染色の対照として、２ｘ１０５  個のＣＴ２６β−ｇａｌ  発現細胞を注入した。各マウスの注入領域を耐水性マーカーで丸く印を付けた。腫瘍細胞接種２日後、マウスに  ＰＢＳ＋ポリブレン（４μｇ／ｍｌ）、ポリブレン含有又は無しの場合のＣＢβ−ｇａｌ  （５ｘ１０６  コロニー形成単位（ＣＦＵ）ｍｌ）、あるいはポリブレン含有又は無しの場合の  ＤＡｈχ−ＩＦＮ＃１５を注入した。各群のマウスにそれぞれの接種物を２日毎に耐水性マーカーで印を付けた領域内に注入した。各群は、合計４回の注射を受けた。最終注射の２日後、各群のマウスの腫瘍を取り除き、細かく切って、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ及び抗生物質を含有する  １０ｃｍ２の２つのプレートに植え付けた。これらの腫瘍外植片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで１週間増殖させた。１週間後、細胞を収穫し、２％ホルムアルデヒドで固定して、  Ｘ−ｇａｌで一夜染色した。この実験の結果を以下に示す。
【０１６１】
【表Ａ−１】
2004305227.tif 000004
【０１６２】
一夜染色により、未修飾ＣＴ２６又は染色対照としてｈχ−ＩＦＮ  ベクターを注入したＣＴ２６（３％）の実質的バックグラウンド染色が認められた。これらの条件下で、最大正味量１７％の細胞が染まった（２０分  ３％バックグラウンド）。陽性対照（１００％形質導入）は２８．６％染まっただけで、１７％染色は  （１７／２８．６）ｘ１００  又は６０％の細胞が  ｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入されたことを示す。形質導入された腫瘍細胞は対数相であり、したがって複数同感染  （Ｍ．Ｏ．Ｉ．）は腫瘍成長に伴って減少するということに留意することは重要である。この実験からのこれらの結果を用いて、次の実験を計画した。
【０１６３】
実施例９
ＴＫ−３直接ベクターによるＣＴ２６腫瘍細胞の  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入
ＴＫ−３ベクターが  ｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞に  ＨＳＶＴＫ遺伝子を供給し、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの存在下で腫瘍成長を阻害し得ることを調べるために、本実験を計画した。要するに、各１０匹の６群に１ｘ１０５  ＣＴ２６腫瘍細胞をＳ．Ｃ．注入した。さらに各１０匹の１群に、対照として１ｘ１０５  ＣＴ２６ＴＫＮｅｏ  細胞をＳ．Ｃ．注入した。Ｓ．Ｃ．注入領域を耐水性マーカーで丸く印を付けた。腫瘍接種２４時間後、ポリブレン（４μｇ／ｍｌ）とともに処方したＴＫ−３又はβ−ｇａｌ  ウイルス上清を耐水性マーカーで印を付けた領域内に注入した。１日１回のベクター投与を４連続日間継続した。各ベクター用量は、２ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌを含有した。最終ベクター処置の２４時間後、これらのマウスに８日間、１日２回（午前と午後）、６２．５ｍｇ／ｋｇで  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒをＩ．Ｐ．注入した。最後に、実験終了まで、６２．５ｍｇ／ｋｇの  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒをマウスに１回投与した。４週間に亘って腫瘍成長を測定した（図２７）。実験を下記の表Ｂに要約する。
【０１６４】
【表Ａ−２】
2004305227.tif 000005
【０１６５】
データは、動物にＴＫ−３及び  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを注入した場合にのみＣＴ２６の相当率の成長が生じたことを示す。阻害レベルは、  ｉｎ  ｖｉｖｏ  １００％未満形質導入のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入され、選択されたＣＴ２６に関して観察されたものほど大きくはなかった。意外にも、対照ベクター、ＣＢ−β−ｇａｌ  及び  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置した場合に腫瘍成長の低減が認められた。これは、付加された上清無含有ベクターによる腫瘍成長の何らかの阻害を示し、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ単独により引き起こされる小減少は予め観察された（図２６）。観察にかかわらず、平均腫瘍サイズはＣＢ−β−ｇａｌ  ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  処置動物よりもＴＫ−３／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  処置動物で有意に小さかった（それぞれ１４及び２１日の時点で７倍及び１０倍及び７５倍小さい）。したがって  ＨＳＶＴＫ発現レトロウイルスベクターの直接注入による  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入は、ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ投与と組み合わせて腫瘍成長の阻害を引き起こすと思われる。
【０１６６】
ベクターの直接注入を用いた問題の遺伝子の  ｉｎ  ｖｉｖｏ供給の他に、ＤＡのような  ＰＣＬからのベクタープロデューサー細胞株を腫瘍中に又は腫瘍周囲に（あるいはその両方に）注入することによりマウスを処置し得る。種々の数の照射又は未照射ベクタープロデューサー細胞を、ポリ陽イオン試薬とともに又は伴わずに注入して形質導入効率を改良し得る。対照マウスにはＴＫ−３及びＣＢ−β−ｇａｌ  ＶＣＬ  で形質導入した希釈Ｄ１７（親非ＰＣＬ）を注入した。十分時間を掛けて  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入（約２週間）後、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ注入を開始し、腫瘍測定及び／又は全体生存率により効力を調べた。
【０１６７】
実施例１０
耐性マーカー以外の随伴遺伝子を含有する  ＨＳＶＴＫベクターの構築
ＨＳＶＴＫのような条件致死遺伝子を含有する不全−安全能力を伴うレトロウイルスベクターを設計する目的は、患者に投与された後に、治療遺伝子の発現を制御させることである。単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞は  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに感受性に鳴り、一方正常細胞は影響を受けない（Ｍｏｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４６：５２７６，１９８６）。治療遺伝子が発現される時間の長さは、修飾細胞が有害になった場合には限定されるか打ち切られる。
【０１６８】
ベクターによる  ＨＳＶＴＫの発現は、感受性（例えばベクター産生細胞株における  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに対する）を付与する。  ＶＣＬが  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入のために直接注入された場合、それらは次いでその目的達成後に  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに破壊される。
【０１６９】
Ａ．ＨＩＶ  ＩＩＩ／Ｂｅｎｖ及びＨＳＶＩチミジンキナーゼを発現するレトロウイルスプロベクター  ｐＫＴ１  ＴＫの構築
先ずＴＫ−２を  ＸｈｏＩで消化し、その後クレノウ処理して、子牛腸アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化することにより、レトロウイルスプロベクター  ｐＫＴ１−ＴＫを構築した。処置線状化ＴＫ−２を次にリン酸化  ＣｌａＩリンカーと結紮し、その後細菌を形質転換した。制限酵素分析により正しい個々のクローンを同定し、ＴＫ−２と名付けた（ＣｌａＩ（図１０））。ＴＫプロモーター及びＴＫコード配列の両方を含有する  ２．０ｋｂ  ＣｌａＩ断片を次に手  Ｋ−２から単離した（ＣｌａＩ）。  ＣｌａＩで消化し、その後子牛腸アルカリ性ホスファターゼで処理して、１％アガロースゲル上でゲル精製して、  ＨＩＶ  ＩＩＩＢｅｎｖを含有するＫＴ１レトロウイルスベクター  （ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓＰａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＃５８６，６０３）を調製した。ＴＫ  ２からの  ２．０ｋｂ単離  ＣｌａＩ断片を次に前処理ＫＴ１ベクターと結紮し、細菌中に形質転換して、制限酵素分析により正しい個々のクローンを同定した。その結果生じたレトロウイルスベクターをＫＴ１−ＴＫと名付けた  （図２８参照）。もちろん他のプロモーター、例えば  ＣＭＶ直前プロモーターを  ＨＳＶＴＫプロモーターの代わりに用い得る。この性質のベクターを用いて、ＨＩＶｅｎｖに対する免疫反応を誘発し得る一方、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの投与により何時でも形質導入細胞を破壊し得る。
【０１７０】
Ｂ．ＨＢＶコア遺伝子及びＨＳＶＩチミジンキナーゼを発現するレトロウイルスプロベクターｐＫＴＨＢｃ／ＴＫの構築
ｐＫＴ１−ＨＢｃ「Ｎｅｏｌｅｓｓ」プロベクターＤＮＡ（１９９３年８月４日提出の米国特許出願第０８／１０２，１３２  号参照）を  ＣｌａＩで切断してレトロウイルスプロベクター  ｐＫＴ−ＨＢｃ／ＴＫを生成した。次にこれをｐＴＫ−２  （ＣｌａＩ）からの  ２．０ｋｂ  ＣｌａＩ断片と結紮し、細菌の形質転換に用いて、個々のクローンを正しい配向に関してスクリーニングした（図２９参照）。
【０１７１】
Ｃ．それぞれヒト又はネズミχ  ＩＦＮ及び  ＨＳＶＴＫ遺伝子を発現するレトロウイルスベクターｐｈχＴＫ及びｐｍχＴＫの構築
レトロウイルスプロベクターｐｍχＴＫ及びｐｈχＴＫを、以下の工程で生成した。
【０１７２】
１．ｐＫＴ−１を  ＣｌａＩで切断した。線状プラスミドを次に子牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、  ＣｌａＩ部位でホスホリル部分を取り出した。フェノール：クロロホルム抽出による  ＣＩＰの抽出後、プラスミドを  ＸｈｏＩで切断した。その結果生じた  ｐＵＣベクター  ５′及び３′ＬＴＲｓ及びパッケージング配列を含有する５ｋｂ断片を小ＨＩＶｅｎｖ及び  ＳＶＮｅｏ′断片からゲル精製した。
【０１７３】
２．プラスミドｐＳＰ７２ｍχ−ＩＦＮ  又はｐＳＰ７２ｈχ  ＩＦＮ  （１９９３年３月１７日提出の米国特許出願第０８／０３２，８４６  号  参照）をそれぞれ  ＣｌａＩで切断後に、ネズミ又はヒトχ−ＩＦＮ  に関するコード配列をゲル精製した。次に線状化プラスミドを  ＣＩＰで処理して  ＣｌａＩ部位からホスホリル部分を取り出した。フェノール：クロロホルム抽出による  ＣＩＰの抽出後、プラスミドを  ＸｈｏＩで切断し、その結果生じた  ０．５ｋｂ断片をゲル電気泳動で精製した。
【０１７４】
３．ＨＳＶＴＫプロモーター及びコード領域を  ＣｌａＩ切断ｐＴＫ−２  （ＣｌａＩ）から単離した。
【０１７５】
４．１，２及び３をよく混合し、結紮して、細菌の形質転換に用い、プラスミドをクローニングして、クローン性形質転換体を  ＨＳＶＴＫプロモーター／遺伝子の適切な配向に関してスクリーニングした（図３０参照）。
【０１７６】
実施例１１
ＴＫベクター及び  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置したマウスにおける免疫反応の誘発
Ａ．ＴＫレトロウイルスベクター構築物の構築
単純ヘルペス１型ウイルスのチミジンキナーゼをコードする原遺伝子は、プラスミド  ３２２ＴＫからの  １．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩ  断片であった  （ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ）（実施例１参照）。５′プロモーター及び３′ポリアデニル化シグナルを取り出し、遺伝子をさらに修飾して５′  ＸｈｏＩ部位並びに３′  ＣｌａＩ部位を有した。この新規の修飾ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を次に、  ｇａｇ発現を阻害するために  ＡＴＴに対して突然変異を起こさせた  ｇａｇ発現に対する正常  ＡＴＧメチオニン    イニシエーターコドンを有するＭｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓから得たＮ２ベースのベクター骨格の  ＸｈｏＩ及び  ＣｌａＩ部位にクローニングした  （ＢＨＩ−ＴＫ構築物）。レトロウイルス  ＬＴＲはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の発現を制御し、下流ＳＶ４０プロモーターはネオマイシン耐性マーカーの発現を駆動する。これらのベクターを、本質的には実施例４と同様に、パッケージング細胞（ＤＡ及びＨＸ。  ＷＯ  ９２／１４８２９  参照）に導入した。
【０１７７】
Ｂ．細胞毒性検定
ネズミ脾臓エフェクター細胞に関する  ５１Ｃｒｍ放出細胞毒性検定を以下のように実施した。要するに、ＣＴ２６ＴＫを注入し、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置したマウスにおける完全腫瘍切除後種々の時間に、マウスを屠殺し、脾臓細胞（３ｘ１０６  ／ｍｌ）を未修飾照射ＣＴ２６細胞（６ｘ１０４  ／ｍｌ）とともに  Ｔ−２５ｃｍ２フラスコ  （Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で  ｉｎｖｉｔｒｏ培養した。培地は  ＲＰＭＩ−１６４０、５％加熱不活性化ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭ  グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１ｘ  非必須アミノ酸、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ゲンタマイシン  （５０ｍｇ／ｍｌ）、及び２−メルカプトエタノール（１０−６Ｍ）で構成された。エフェクター細胞を４〜７日後に収穫し、幾つかのエフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ    １００：１，３０：１，１０：１，３：１及び１：１．各比率は３通りウエルに用意した）を９６ウエル微小滴定プレートに入れて標準４−６時間検定に用いて試験した。検定は、最終容積  ２００ｍｌ中にＮａ２５１  ＣｒＯ４  （Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｙｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）−標識化ＣＴ２６又はＣＴ２６ＴＫ標的細胞（１ｘ１０４  細胞／ウエル）を用いた。インキュベーション後、検定培養上清を採集し、特異的５１クロミウム放出（計数／分）に関して  Ｂｅｃｋｍａｎガンマ分光計を用いて検定した。標的１培地からの１分当たりの計数として自発性放出を測定し、典型的には最大放出の１０〜２０％であった。最大放出値を標的＋１Ｍ  ＨＣｌからの１分当たりの計数として測定した。パーセント標的細胞溶解を（実験放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）ｘ  １００として算出した。
【０１７８】
Ｃ．結果
ＣＴ２６ＴＫ細胞を注入し、  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置したマウスにおける完全腫瘍切除後に、それぞれの脾臓細胞を収穫し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激して、その結果生じたエフェクター細胞を、未修飾ＣＴ２６又はＣＴ２６ＴＫ細胞を溶解するその能力に関して分析した。ＣＴ２６及びＣＴ２６ＴＫ細胞の両方に対する有意の細胞毒性反応が、ＣＴ２６ＴＫ腫瘍を  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒにより取り除かれたマウスから得た脾臓細胞で観察された（図３２参照）、一方ＣＴ２６腫瘍保有マウスからの脾臓細胞をＣＴ２６で再刺激すると、極わずかの溶解を示した（図３）。これらの結果は、ＴＫプロドラッグベクター、その後のプロドラッグ自体の導入による腫瘍細胞の除去は、未修飾腫瘍細胞に対する有効且つ強力な  ＣＴＬ反応を生じた。
【０１７９】
前述のように、本発明の説明のために特定の態様を記載したが、本発明の精神及び範囲を逸脱しないかぎり、種々の修正が成されうる。したがって本発明は、添付の請求の範囲以外には限定されない。
（配列表）
一般情報：
出願人：Ｂａｒｂｅｒ，Ｊａｃｋ
Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈａｒｒｙ  
Ｊｏｌｌｙ，Ｄｏｕｇ  
発明の名称：条件致死遺伝子を用いるための組成物及び方法
配列数：２
住所：
受信人：Ｓｅｅｄ  ａｎｄ  Ｂｅｒｒｙ
番地：５番街７０１  コロンビアセンター６３００
市：シアトル
州：ワシントン
国：アメリカ合衆国
ＺＩＰ  ：９８１０４  
コンピューター読み取り形態：
媒体：フロッピー（登録商標）ディスク
コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
操作系：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ＃１．２５  
最新出願データ：
出願番号：
提出日：
分類：
代理人／代理店情報：
名称：ＭｃＭａｓｔｅｒｓ，Ｄａｖｉｄ  Ｄ
登録番号：３３，９６３
参照／審理番号：９３００４９．４２２
電信情報：
電話：（２０６）６２２−４９００  
テレファックス：（２０６）６８２−６０３１  
配列番号：１
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
ＧＡＧＡＧＡＴＧＧＧ  ＧＧＡＧＧＣＴＡＡＣ  ＴＧＡＧ
配列番号：２
配列の長さ：２８
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
ＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴ  ＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣ  ＣＡＴＣＴＣＴＣ
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】図１は、ｐ３１Ｎ２Ｒ５（＋）の模式図である。
【図２】図２は、ｐＮ２Ｒ３（−）の模式図である。
【図３】図３は、ｐ３１Ｎ２５Δ（＋）の模式図である。
【図４】図４は、ｐＮ２Ｒ３（＋）の模式図である。
【図５】図５は、ｐＮ２Ｒ５（−）の模式図である。
【図６】図６は、ｐ３１Ｎ２５Δ（＋）の模式図である。
【図７】図７は、  ｐＴＫΔＡ  の模式図である。
【図８】図８は、  ｐＰｒＴＫΔＡ  の模式図である。
【図９】図９は、  ｐＴＫ−１及び  ｐＴＫ−３の模式図である。
【図１０】図１０は、  ｐＴＫ−２及びｐＴＫ−２  （ＣｌａＩ）の模式図である。
【図１１】図１１は、ｐＫＴＶＩＨＡＸの模式図である。
【図１２】図１２は、ｐＫＴＶＩＨ−５及び  ｐＫＴＶＩＨ５  Ｎｅｏの模式図である。
【図１３】図１３は、ｐＭＨＭ−１  ＬＴＲ及び  ｐＭＨＭＢの模式図である。
【図１４】図１４は、ｐＭＨＭＴＫ  Ｎｅｏの模式図である。
【図１５】図１５は、ｐＳＴＫ（−）の模式図である。
【図１６】図１６は、ｐＣＲＳ／ＣＡＲ（−）の模式図である。
【図１７】図１７は、ｐＲＲＫＴＶＩＨの模式図である。
【図１８】図１８は、ｔａｔｈｉｓ及びアンチ−ｔａｔ  の模式図である。
【図１９】図１９は、条件致死ベクターを含有する細胞における  ＡＣＶ毒性の作用を示す棒グラフである。
【図２０】図２０は、  ＨＩＶ感染に及ぼす  ｄｄＣの作用を示す棒グラフである。
【図２１】図２１は、  ＨＩＶ感染に及ぼす  ＡＺＴの作用を示す棒グラフである。
【図２２】図２２は、  ＣＴ２６，ＣＴ２６  βｇａｌ  及びＣＴ２６ＴＫ  Ｎｅｏ細胞に及ぼす  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの作用を示す棒グラフである。
【図２３】図２３は、ＣＴ２６ＴＫ  Ｎｅｏに感染させたマウスの  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ投与試験における時間中の腫瘍容積の作用を示す棒グラフである。
【図２４】図２４は、腹腔内腫瘍成長に及ぼす  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの異なる投与レジメンの作用を示すマウスの４枚組写真である。
【図２５】図２５は、皮下腫瘍成長に及ぼす  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの異なる投与レジメンの作用を示すマウスの４枚組写真である。
【図２６】図２６は、ＣＴ２６対ＣＴ２６ＴＫ  Ｎｅｏ細胞における  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの作用を示すグラフである。
【図２７】図２７は、  ＨＳＶＴＫ遺伝子を含有するＴＫ−３ウイルスの注入による  ｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入化ＣＴ２６細胞に及ぼす  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの作用を示すグラフである。
【図２８】図２８は、  ｐＫＴ１−ＴＫの模式図である。
【図２９】図２９は、ｐＫＴ１／Ｈｂｅ  ／ＴＫの模式図である。
【図３０】図３０は、ｐｍχＴＫ及びｐｈχＴＫの模式図である。
【図３１】図３１は、ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおけるＣＴ２６腫瘍細胞に対する極わずかなレベルの活性を示すグラフである。
【図３２】図３２は、ＣＴ２６ＴＫ＋  細胞に感染させ、  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処置したマウスにおける溶菌活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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