(57)【要約】【課題】あらゆるオルガネラを対象として、簡便かつ正確にタンパク質局在を解析することのできる新しい方法と、この方法に使用する解析用材料を提供する。【解決手段】試験タンパク質がオルガネラに局在するか否かを解析する方法であって、（ａ）インテインの一方のハーフペプチド、蛍光タンパク質の一方のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入するステップ；（ｂ）前記蛍光タンパク質の他方のハーフペプチドおよび前記インテインの他方のハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）に結合した試験タンパク質を真核細胞内に導入するステップ；および（ｃ）前記蛍光タンパク質の発する蛍光信号を検出するステップ、を含むことを特徴とするオルガネラ局在タンパク質の解析方法と、この方法に使用する融合ペプチドおよび／またはその発現ベクター等の材料。【選択図】　図１
2004108943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験タンパク質がオルガネラに局在するか否かを解析する方法であって、以下のステップ：
（ａ）インテインの一方のハーフペプチド、蛍光タンパク質の一方のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入するステップ；
（ｂ）前記蛍光タンパク質の他方のハーフペプチドおよび前記インテインの他方のハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）に結合した試験タンパク質を真核細胞内に導入するステップ；および
（ｃ）前記蛍光タンパク質の発する蛍光信号を検出するステップ、
を含むことを特徴とするオルガネラ局在タンパク質の解析方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、信号特性の異なる蛍光タンパク質のそれぞれ一方のハーフペプチドと異なるオルガネラ標的シグナルペプチドを含む２種以上の融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入し、ステップ（ｂ）において、前記蛍光タンパク質のそれぞれ他方のハーフペプチドを含む２種以上の融合ペプチド（ｂ）のそれぞれに結合した試験タンパク質を真核細胞内に導入し、ステップ（ｃ）において蛍光信号の特性を検出する請求項１の解析方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）において、融合ペプチド（ａ）を発現する組換えベクター（Ａ）を真核細胞にトランスフェクションすることによって融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入する請求項１または２の解析方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）において、融合ペプチド（ｂ）と試験タンパク質とを一体として発現する組換えベクター（Ｂ）を真核細胞にトランスフェクションすることによって試験タンパク質および融合ペプチド（ｂ）を真核細胞に導入する請求項１または２の解析方法。
【請求項５】
インテインのハーフペプチド、蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）。
【請求項６】
蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびインテインのハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）。
【請求項７】
インテインのハーフペプチド、蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を発現する組換えベクター（Ａ）。
【請求項８】
蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびインテインのハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）と、任意の試験タンパク質とを一体として発現する組換えベクター（Ｂ）。
【請求項９】
請求項５の融合ペプチド（ａ）または請求項７の組換えベクター（Ａ）と、請求項６の融合ペプチド（ｂ）または請求項８の組換えベクター（Ｂ）とを含むことを特徴とするオルガネラ局在タンパク質の解析用プローブセット。
【請求項１０】
融合ペプチド（ａ）または組換えベクター（Ａ）が発現する融合ペプチド（ａ）が、信号特性の異なる蛍光タンパク質のそれぞれ一方のハーフペプチドと異なるオルガネラ標的シグナルペプチドを含む２種以上であり、融合ペプチド（ｂ）が、前記蛍光タンパク質の他方のハーフペプチドを含む２種以上である請求項９のプローブセット。
【請求項１１】
インテインのハーフペプチド、蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を保有する真核細胞。
【請求項１２】
請求項１１の真核細胞を２以上有する細胞キット。
【請求項１３】
信号特性の異なる蛍光タンパク質のそれぞれ一方のハーフペプチドと異なるオルガネラ標的シグナルペプチドを含む２種以上の融合ペプチド（ａ）を保有する真核細胞。
【請求項１４】
請求項１３の真核細胞を２以上有する細胞キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、オルガネラ局在タンパク質の解析方法と解析用材料に関するものである。さらに詳しくは、真核細胞の各種オルガネラに局在するタンパク質を簡便かつ正確に解析する方法と、この方法に用いる材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞、特に哺乳類細胞における最もはっきりした特徴の一つは、各タンパク質が個々のオルガネラ（細胞小器官）に局在しているということである。このタンパク質局在化はタンパク質の機能に密接な関連があり、そのため、あるタンパク質の優先的な局在化が機能を決定するための重要な指標となる場合も多い。従って、タンパク質の細胞内局在を解析することによって、そのタンパク質の機能が特定され、さらには新しい生物学的意義が形成される可能性がある。
【０００３】
オルガネラ局在化タンパク質を解析するための従来技術としては以下が知られている。
（ｉ）　　細胞分画技術と二次元電気泳動／質量分析法からなる方法（非特許文献１）。この方法は、細胞を個々の器官ごとに分画し、それぞれで発現しているタンパク質を二次元電気泳動して比較し、器官特異的なタンパク質の質量分析結果からそのタンパク質を同定する方法であり、タンパク質の系統的な解析に役立つ。しかしながら、この従来技術（ｉ）は細胞内オルガネラの個々の収率と濃度に完全に依存しており、さらに重要な点としては、分画精製の難しいオルガネラには用いることができない。
（ｉｉ）　発現クローニング（非特許文献２、３）。この方法は、細胞核内で発現が活性化するレポーター分子を組み込んだ細胞内に転写因子を連結した試験タンパク質を導入し、レポーター分子の信号を検出する方法である。試験タンパク質に機能的な核局在シグナルが含まれている場合には試験タンパク質および転写因子が細胞核内に移行し、レポーター分子の信号を検出することができる。しかしながら、この従来技術（ｉｉ）はレポーター分子の発現が核内転写因子に依存しているため、核以外の器官には適用できない。
（ｉｉｉ）　　視覚的スクリーニング（非特許文献４−６）。この方法は、信号を発する蛍光タンパク質と試験タンパク質との融合タンパク質を高等真核細胞内で発現させ、蛍光タンパク質の蛍光信号を顕微鏡により観察することによって試験タンパク質の細胞内局在を調べる方法である。この従来技術（ｉｉｉ）は様々なオルガネラ局在化タンパク質を同定するための強力なツールであるが、蛍光顕微鏡下で蛍光タンパク質の細胞内局在を分析および同定するためには多大な労力と時間を必要とする。
【０００４】
一方、この出願の発明者等は、タンパク質スプライシングの原理（非特許文献７、８）を用いて２種類のタンパク質の相互作用（タンパク質−タンパク質相互作用）を解析する方法とそのためのプローブを発明し、すでに特許出願している（特許文献１）。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開ＷＯ０２／０８７６６号パンフレット
【非特許文献１】
Ｌｏｐｅｚ，　Ｍ．　Ｆ．　ａｎｄ　Ｍｅｌｏｖ，　Ｓ．，　Ｃｉｒｃ．　Ｒｅｓ．　２００２，　９０，　３８０−３８９
【非特許文献２】
Ｕｅｋｉ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１９９８，　１６，　１３３８−１３４２
【非特許文献３】
Ｒｈｅｅ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２００２，　１８，　４３３−４３７
【非特許文献４】
Ｂｅｊａｒａｎｏ，　Ｌ．　Ａ．　ａｎｄ　Ｇｏｎｚａｃｚ，　Ｃ．　Ｊ．，　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　１９９９，　１１２，４２０７−４２１１
【非特許文献５】
Ｍｉｓａｗａ，　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　２０００，　９２，９１４６−９１５０
【非特許文献６】
Ｓｉｍｐｓｏｎ，　Ｊ．　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｒｅｐｏｒｔ　２０００，　３，　２８７−２９２
【非特許文献７】
Ｇｉｍｂｌｅ，　Ｆ．　Ｓ．，　Ｓｃｉ．　Ｂｉｏｌ．　１９９８，　５，　Ｒ２５１−２５６
【非特許文献８】
Ｏｚａｗａ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌ．　Ｃｈｅｍ．　２００１，　７３，　５８６６−５８７４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、オルガネラ局在化タンパク質の解析のための従来技術（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、解析対象となるオルガネラの種類が限定されることや、その解析に多大な労力や時間を必要とするなどの問題点を有している。このため、特に大規模なタンパク質ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを対象とする広範囲はスクリーニング（ハイスループットスクリーニング）には全く適さない方法であった。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、あらゆるオルガネラを対象として、簡便かつ正確にタンパク質局在を解析することのできる新しい方法と、この方法に使用する解析用材料を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（１４）の発明を提供する。
（１）　　試験タンパク質がオルガネラに局在するか否かを解析する方法であって、以下のステップ：
（ａ）インテインの一方のハーフペプチド、蛍光タンパク質の一方のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入するステップ；
（ｂ）前記蛍光タンパク質の他方のハーフペプチドおよび前記インテインの他方のハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）に結合した試験タンパク質を真核細胞内に導入するステップ；および
（ｃ）前記蛍光タンパク質の発する蛍光信号を検出するステップ、
を含むことを特徴とするオルガネラ局在タンパク質の解析方法。
（２）　　ステップ（ａ）において、信号特性の異なる蛍光タンパク質のそれぞれ一方のハーフペプチドと、異なるオルガネラ標的シグナルペプチドとを含む２種以上の融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入し、ステップ（ｂ）において、前記蛍光タンパク質のそれぞれ他方のハーフペプチドを含む２種以上の融合ペプチド（ｂ）のそれぞれに結合した試験タンパク質を真核細胞内に導入し、ステップ（ｃ）において蛍光信号の特性を検出する前記発明（１）の解析方法。
（３）　　ステップ（ａ）において、融合ペプチド（ａ）を発現する組換えベクター（Ａ）を真核細胞にトランスフェクションすることによって融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入する前記発明（１）または（２）の解析方法。
（４）　　ステップ（ｂ）において、融合ペプチド（ｂ）と試験タンパク質とを一体として発現する組換えベクター（Ｂ）を真核細胞にトランスフェクションすることによって試験タンパク質および融合ペプチド（ｂ）を真核細胞に導入する前記発明（１）または（２）の解析方法。
（５）　　インテインのハーフペプチド、蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）。
（６）　　蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびインテインのハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）。
（７）　　インテインのハーフペプチド、蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を発現する組換えベクター（Ａ）。
（８）　　蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびインテインのハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）と、任意の試験タンパク質とを一体として発現する組換えベクター（Ｂ）。
（９）　　前記発明（５）の融合ペプチド（ａ）または前記発明（７）の組換えベクター（Ａ）と、前記発明（６）の融合ペプチド（ｂ）または前記発明（８）の組換えベクター（Ｂ）とを含むことを特徴とするオルガネラ局在タンパク質の解析用プローブセット。
（１０）　融合ペプチド（ａ）または組換えベクター（Ａ）が発現する融合タンパク質（ａ）が、信号特性の異なる蛍光タンパク質のそれぞれ一方のハーフペプチドと、異なるオルガネラ標的シグナルペプチドとを含む２種以上であり、融合ペプチド（ｂ）が、前記蛍光タンパク質のそれぞれ他方のハーフペプチドを含む２種以上である前記発明（９）のプローブセット。
（１１）　インテインのハーフペプチド、蛍光タンパク質のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を保有する真核細胞。
（１２）　前記発明（１１）の真核細胞を２以上有する細胞キット。
（１３）　信号特性の異なる蛍光タンパク質のそれぞれ一方のハーフペプチドと、異なるオルガネラ標的シグナルペプチドとを含む２種以上の融合ペプチド（ａ）を保有する真核細胞。
（１４）　前記発明（１３）の真核細胞を２以上有する細胞キット。
【０００９】
すなわち、前記発明（１）〜（４）の解析方法は、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）のタンパク質スプライシング（非特許文献７、８）による蛍光タンパク質の再構築を基礎としており、前記発明（５）〜（１４）の各種材料を用いて実施することができる。
【００１０】
なお、この出願の発明において、「タンパク質」および「ペプチド」とは、細胞から単離精製されたもの、遺伝子工学的に製造されたもの、合成されたもの、またはそれらと構造的に類似の生物活性等価物であって、ペプチド結合として知られるアミド型の連結により連なっているアミノ酸のポリマーを意味するのに使用する。
【００１１】
「試験タンパク質」は、生物細胞（特に真核細胞）において発現する機能既知または機能未知のタンパク質であり、特にオルガネラの局在が不明のタンパク質である。アミノ酸配列構造が既知であるものが好ましく、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列が既知であるものがさらに好ましい。この試験タンパク質は、例えば公知のタンパク質ライブラリーから選択して用いることができ、あるいはｃＤＮＡライブラリー（既存ライブラリー、または任意細胞のトータルＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリー）の各ｃＤＮＡクローンから遺伝子工学的に作製したタンパク質を用いることができる。
【００１２】
「真核細胞」は、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞等であり、特にヒトを含めた哺乳動物細胞である。
【００１３】
「オルガネラ」は、真核細胞膜の内部に存在し、細胞の各種機能を分業している構造単位であって、例えば細胞核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌顆粒、分泌小胞、リソソーム、ファゴソーム、エンドソーム、ペルオキソームなどを包含する。
【００１４】
「オルガネラ標的シグナルペプチド」とは、各オルガネラに特異的に局在化するタンパク質の全長、またはそれら局在化タンパク質に存在してそれぞれの局在化のために働く移行シグナル（または局在化シグナル）ペプチドであり、公知のものを使用することができる。例えば、核標的シグナルペプチドとしては核内タンパク質（例えばヒストンやウイルス性タンパク質等）またはその部分シグナルペプチドを適宜に使用することができる。また、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、ペルオキソーム等のオルガネラの場合には、細胞分画法等において各オルガネラの標識酵素として使用される酵素（例えば、ミトコンドリアではシトクロムｃオキシダーゼ、小胞体ではグルコース−６−ホスファターゼ、ゴルジ体ではガラクトシルトランスフェラーゼ、ペルオキシソームではカタラーゼなど）またはそのシグナルペプチドを使用することができる。これらのオルガネラ標的ペプチドは、公知のタンパク質データベース（例えば、ＵＲＬ：　　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ”　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ）等からアミン酸配列やそれをコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報を得ることができる。
【００１５】
「インテイン」は、翻訳後のタンパク質からスプライシングによって切り出される内部タンパク質セグメントであり、各種生物由来の野性型インテインおよびタンパク質スプライシングに関与する「機能的部分」であってもよい。インテインとしては、具体的には、例えば酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、カンジダ菌Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉａｌｌｉｓまたは古細菌Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｓｉｄｏｐｈｉｌｕｍ等に由来のＶＭＡ、結核菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のｒｅｃＡおよびｐｐｓ１、藍藻類Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ由来のＤｎａＢおよびＤｎａＥ等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。使用可能なインテインの種類やアミノ酸配列および塩基配列はＩｎＢａｓｅ：　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｉｎ　Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２００２，　３０（１），　３８３−３８４；　ＵＲＬ：　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／　ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ”　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂ／　ｉｎｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌ）から詳しく知ることが出来る。
【００１６】
「蛍光タンパク質」とは、励起光を照射すると蛍光を発するタンパク質またはその機能的部分であり、例えば、発光クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）や、その変異体であるＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ（黄色蛍光）、ＥＣＦＰ（青色蛍光）、ＤｓＲｅｄ１やＤｓＲｅｄ２（赤色蛍光）、ウミシイタケ由来の緑色蛍光タンパク質ｈｒＧＦＰなどが例示できる。これらの蛍光タンパク質のアミノ酸配列やそれをコードする塩基配列についても、公知のタンパク質データベース（例えば、ＵＲＬ：　　ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ　”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ”　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ）等から情報を得ることができる。
【００１７】
「ハーブペプチド」とは、前記のインテインおよび蛍光タンパク質のそれぞれのＣ端側およびＮ端側アミノ酸配列を有するペプチドであり、Ｃ端側ハーフペプチドとＮ端側ハーフペプチドが一体化するとインテインおよび蛍光タンパク質の全長タンパク質または全長タンパク質の機能性部分となる。一方のハーフペプチドがＣ端側の場合には、他方のハーフペプチドはＮ端側であり、一方がＮ端側の場合、他方はＣ端側である。また「ハーフ」は必ずしも半分を意味する訳でなく、ある特定のアミド結合を切断することにより、タンパク質の機能的部分を二分することを意味する。
【００１８】
「融合ペプチド」とは、前記の各ハーフペプチドや標的シグナルペプチドが縦列一体化したペプチドであり、各ペプチドのＣ端とＮ端がペプチド結合によって連結されたものである。また各ペプチドが「リンカーペプチド」によって連結されたものであってもよい。例えば、前記のインテインＶＤＥでは、エンドヌクレアーゼドメインを削除し、屈曲性のドデカペプチドリンカーで置き換えた変異体が高いスプライシング活性を示すことが知られている（Ｃｏｏｐｅｒ，　Ａ．　Ａ．，　Ｃｈｅｎ，　Ｙ．　Ｊ．，　Ｌｉｎｄｏｒｆｅｒ，　Ｍ．Ａ．，　ａｎｄ　Ｓｔｅｖｅｎｓ，　Ｔ．　Ｈ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．，　１２，　２５７５−２５８３，　１９９３；　Ｃｈｏｎｇ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｘｕ，　Ｍ．−Ｑ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７２，　１５５８７−１５５９０，　１９９７）。
【００１９】
この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。また、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，　１９８９）等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００２０】
以下、前記の各発明の実施形態を詳しく説明する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
発明（１）は、以下のステップを行うことによって、試験タンパク質が任意のオルガネラに局在するか否かを解析する方法である。
ステップ（ａ）：　　インテインの一方のハーフペプチド、蛍光タンパク質の一方のハーフペプチドおよびオルガネラ標的シグナルペプチドを含む融合ペプチド（ａ）を真核細胞内に導入する。
ステップ（ｂ）：　　前記蛍光タンパク質の他方のハーフペプチドおよび前記インテインの他方のハーフペプチドを含む融合ペプチド（ｂ）に結合した試験タンパク質を真核細胞内に導入する。
ステップ（ｃ）：　　前記蛍光タンパク質の発する蛍光信号を検出する。
【００２２】
この発明（１）の方法は、この発明によって提供される融合ペプチド（ａ）（発明（５））と融合ペプチド（ｂ）（発明（６））を用いて実施することができる。それぞれの融合ペプチドに使用するインテインのハーフペプチドおよび蛍光タンパク質のハーフペプチドは、同一のインテインおよび蛍光タンパク質からそれぞれ調製する。また、それぞれのハーフペプチドはＣ端側同士、Ｎ端側同士を連結する。融合ペプチド（ａ）がＣ端側ハーフペプチド同士の組み合わせの場合には、融合ペプチド（ｂ）はＮ端側ハーフペプチド同士とし、その逆であってもよい。ただし、インテインのＮ端側ハーフペプチドとＣ端側ハーフペプチドがオルガネラ内で連結してスプライシング活性を持つように、蛍光タンパク質のＮ端側ハーフペプチド（ＦＰｎ）およびインテインのＮ端側ハーフペプチド（ＩＮＴｎ）の組み合わせ（Ｎ−ＦＰｎ／ＩＮＴｎ−Ｃ）、インテインのＣ端側ハーフペプチド（ＩＮＴｃ）および蛍光タンパク質のＣ端側ハーフペプチド（ＦＰｃ）の組み合わせ（Ｎ−ＩＮＴｃ／ＦＰｃ−Ｃ）とする。以下では、融合ペプチド（ａ）がＮ−ＩＮＴｃ／ＦＰｃ−Ｃであり、融合ペプチド（ｂ）がＮ−ＦＰｎ／ＩＮＴｎ−Ｃである場合を例として説明する。
【００２３】
融合ペプチド（ａ）におけるオルガネラ標的シグナルペプチド（ＯＴＳ）は、Ｎ−ＩＮＴｃ／ＦＰｃ−ＣのＣ端側に連結してもよく（Ｎ−ＯＴＳ／ＩＮＴｃ／ＦＰｃ−Ｃ）、Ｎ端側に連結してもよい（Ｎ−ＩＮＴｃ／ＦＰｃ／ＯＴＳ−Ｃ）。また、融合ペプチド（ｂ）に連結する試験タンパク質（ｔｅｓｔＰ）も、そのいずれの側に位置してもよい（Ｎ−ｔｅｓｔＰ／ＦＰｎ／ＩＮＴｎ−ＣまたはＮ−ＦＰｎ／ＩＮＴｎ／ｔｅｓｔＰ−Ｃ）。
【００２４】
融合ペプチド（ａ）、および融合ペプチド（ｂ）／ｔｅｓｔＰは、それぞれのペプチド／タンパク質を公知の方法によってペプチド結合させて作製することができる。また、公知の固相合成法等によって化学合成して作製することもできる。あるいは、それぞれのペプチドをコードするポリヌクレオチドを連結して融合ポリヌクレオチドを作製し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系や適当な宿主−ベクター系で発現させることによっても作製することができる。
【００２５】
例えば融合ペプチドをｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳で作製する場合には、前記の融合ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加する。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７　１８、ｐＴ７／３　１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩなどが例示できる。
【００２６】
融合ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに前記のＤＮＡ断片を組換えた発現ベクターを作成し、培養物から融合ペプチドを単離する。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００２７】
また融合ペプチドを真核細胞で発現させる場合には、前記の融合ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、融合ペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、目的とする融合ペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００２８】
融合ペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２９】
ステップ（ａ）および（ｂ）において、融合ペプチド（ａ）および融合ペプチド（ｂ）／ｔｅｓｔＰを細胞内に導入するには、例えば、脂質（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社、米国）等）を用いた細胞内導入法を採用することができる。また、細胞膜通過ペプチドであるＨＩＶ−１・ＴＡＴのＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ）や、ショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアのＰＴＤを前記の融合ペプチドに連結させることによって、融合ペプチドを細胞内に導入することもできる。
【００３０】
あるいはまた、この発明によって提供される組換えベクター（Ａ）（発明（７））および組換えベクター（Ｂ）（発明（８））を用いる方法（発明（３）、（４））によっても目的の融合ペプチドを細胞内に導入することができる。この発明（７）および（８）の方法は、融合ペプチドの細胞内導入をより簡便かつ確実に行うことができるという点において好ましい方法である。組換えベクター（Ａ）および（Ｂ）は、融合ペプチドの遺伝子工学的作製について説明した真核細胞発現用ベクターと融合ポリヌクレオチドを用いて作製することができる。これらの組換えベクターを真核細胞内に前記の公知方法によって導入すれば、融合ポリヌクレオチドがコードする融合ペプチドを細胞内で発現させることができる。
【００３１】
ステップ（ａ）において、以上の方法により細胞内に導入された融合ペプチド（ａ）は、そのＯＴＳによって指定のオルガネラ内に移行する（図１）。また、ステップ（ｂ）において細胞内に導入された融合ペプチド（ｂ）／ｔｅｓｔ　Ｐは、そのｔｅｓｔ　Ｐが指定のオルガネラ局在性を有している場合には、そのオルガネラ内に移行し、そこに存在する融合ペプチド（ａ）と相互作用し、会合したＩＮＴｎとＩＮＴｃがタンパク質スプライシングによって切り出され、ＦＰｎとＦＰｃが再構築されて蛍光信号を発する（図１）。
【００３２】
従って、ステップ（ｃ）において細胞の蛍光信号を検出することによって、ｔｅｓｔ　Ｐが指定のオルガネラ局在性を有しているか否かを判定することができる。蛍光信号の検出は、細胞を蛍光顕微鏡で観察することによって行うことができる。あるいは、蛍光活性化セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）法によって蛍光信号を発する細胞を選択するようにしてもよい。このＦＡＣＳを用いる方法は、その簡便性によって、例えば大規模なタンパク質ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを対象とする広範囲なスクリーニング（ハイスループットスクリーニング）を可能とするために、好ましい方法である。
【００３３】
この出願の発明（２）は、前記発明（１）の別形態の解析方法である。すなわち、この発明（２）の方法では、ステップ（ａ）において、一つの細胞の異なる２以上のオルガネラにそれぞれ融合ペプチド（ａ）を導入する。それぞれの融合ペプチド（ａ）は、オルガネラ標的シグナルペプチドがそれぞれ異なるオルガネラを標的とするペプチドであり、蛍光タンパク質がそれぞれ異なる特性（色調等）を有している。例えば、ミトコンドリアには緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、小胞体には黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、ゴルジ体には青色蛍タンパク質（ＥＣＦＰ）のそれぞれのハーフペプチドを有する融合ペプチド（ａ）を存在させる。そして、ステップ（ｂ）において、前記各蛍光タンパク質の他方のハーフペプチドを有する融合ペプチド（ｂ）に試験タンパク質を結合させて細胞内に導入し、細胞が発する蛍光信号の色調（緑、黄、青）または色調変化に対応する吸光度を検出すれば、試験タンパク質がミトコンドリア、小胞体およびゴルジ体のいずれに局在性を有するかを判定することができる。
【００３４】
なお、この発明（１）および（２）は、この出願によって提供されるプローブセット（発明（９）、（１０））を用いることによって効率よく実施することができる。さらには、この出願によって提供される細胞（発明（１１）および（１３））を用いることによって、それぞれのステップ（ａ）を省略することができる。また、これらの細胞は、それぞれ２以上の細胞集団からなる細胞キット（発明（１２）および（１４））とすることもできる。この発明（１２）の細胞キットは、全ての細胞が同一オルガネラに融合ペプチド（ａ）を備えている複数個の細胞集団であってもよく、あるいはそれぞれに異なるオルガネラに融合ペプチド（ａ）を備えている複数個の細胞集団であってもよい。また、発明（１４）の細胞キットでは、全ての細胞が２種以上の同一オルガネラにそれぞれ融合ペプチド（ａ）を備えている複数個の細胞集団であってもよく、あるいはそれぞれに２種以上の異なるオルガネラに融合ペプチド（ａ）を備えている複数個の細胞集団であってもよい。なお、この細胞キットでは、細胞が浮遊細胞の場合には適当な液体培地中に各細胞を浮遊させた状態とすることができ、接着性の細胞の場合には、いわゆる「細胞チップ」の形態とすることもできる。さらには、これらの細胞キットを構成する細胞は同一種の細胞であってもよく、あるいは異なる細胞であってもよい。例えば、正常細胞と疾患細胞（例えば癌細胞など）とを組み合わせて細胞キットを構成することもできる。
【００３５】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３６】
【実施例】
１．方法
１．１．発現ベクターの作成
アミノ酸１−１５７を強化したＥＧＦＰ　ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ（配列番号１）をｓｐＥＧＦＰのＣ端に導入した。このｃＤＮＡをＤｎａＥインテインのＮ端スプライシングドメインのｃＤＮＡに融合させ、原核ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でサブクローニングした。ＰＣＲ産物をシーケンス解析して塩基配列を確認し、ｐＭＸベクター内のＳａｌＩ制限部位にサブクローニングした。ミトコンドリア標的シグナルペプチド（ＭＴＳ）またはカルモジュリンと結合したＥＧＦＰＮ端側ハーフペプチド（ＥＧＦＰｎ）とＤｎａＥのＮ端側ハーフペプチド（ＤｎａＥｎ）からなる融合ペプチド（ｂ）を作成するため、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅し、ＢａｍＨＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）制限部位に導入した。このＰＣＲ産物をｐＭＸ−Ｍｉｔｏ／ＬＩＢ中のフレーム内に挿入し、これらのシーケンスを検証した（図２参照）。
１．２．安定クローンの選別
ＭＴＳを結合したＤｎａＥのＣ端側ハーフペプチド（ＤｎａＥｃ）のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＥＧＦＰの１５８−２３８に対応するカルボキシル末端の半分のｃＤＮＡを、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号２）のペプチドをアミノ末端に伸張しつつ、ＰＣＲにより増幅した。これら２つのＰＣＲ産物をＭｕｎＩ部位で結合させて融合ペプチド（ａ）を作製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中でサブクローニングを行った（図２参照）。この産物をシーケンス解析して塩基配列を確認し、ｐＭＸベクター内のＢａｍＨＩ（５’）およびＳａｌＩ（３’）制限部位に導入した。ＤＨ５α’大腸菌中で増幅した後、融合遺伝子をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰｌａｔＥ細胞内にトランスフェクションした。２日培養後、高力価のレトロウイルスを収集し、ＢＮＬ１ＭＥ細胞内にトランスフェクションした。成長因子を含むＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中での約１０日間にわたる選択培養後に、安定した発現細胞を取得した（図３参照）。
１．３．ｃＤＮＡライブラリーの構築
１×１０８　ＢＮＬ１ＭＥ細胞からのＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの精製は、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。ランダムヘキサマーを用いたｐｏｌｙ（Ａ）＋　ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。結果的に得られたｃＤＮＡに対して、カラムクロマトグラフィーとアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画を行い、Ｑｉａｅｘ　ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて６００ｋｂｐ以上の長さのｃＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから抽出した。ｐＭＸ−Ｍｉｔｏ／ＬｉＢのＢｓｔＸＩ部位へのｃＤＮＡ断片の挿入は、ＢｓｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。結合ＤＮＡをエタノール沈殿し、その後ＤＨ１０Ｂ−コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中にトランスフェクションした。プラスミドＤＮＡの精製はＱｉａｅｘ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、１６時間にわたる２００ｍＬの培養後に行った。パッケージ細胞株であるＰｌａｔＥへのプラスミドのトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。２日間の培養後、高力価のレトロウイルスが収集された（図３参照）。
１．４．ソーティング戦略
サブコンフルーエント（７０％）なＢＮＬ１ＭＥ細胞レイヤーを、構築したレトロウイルスライブラリーに、感染効率が２０％以下となるように感染させた。感染効率の評価はｐＭＸ−ＥＧＦＰを用いた対象実験により行った。細胞は感染の４８時間後に分離し、直径６ｃｍのシャーレ４枚に展開した。７２時間のインキュベーション後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞をはがし、ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）中に溶解した。ＦＡＣＳ分析の実施はＡＬＴＲＡフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ社）上で行い、これによりＧＦＰ−陽性単一細胞をソーティングした。これらの細胞は９６ウェルのプレートでインキュベートするか、直径１０ｃｍのシャーレに蒔き、その後チップを用いてサブクローニングを行った（図３参照）。
１．５．組み込みｃＤＮＡの同定
ＢＮＬ１ＭＥクローンから抽出したゲノムｃＤＮＡをネステッドＰＣＲ法により増幅し、組み込まれたｃＤＮＡを回収した。プライマーは、５’−ＡＧＧＡＣＣＴＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３）および５’−ＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧ−３’（配列番号４）のセットと、５’−ＣＣＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＡＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＣＡＧＣ−３’（配列番号５）および５’−ＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＡＴ−３’（配列番号６）のセットを用いた。ＰＣＲはＬＡ　Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ　Ｓｈｕｚｏ社）を用いて３０サイクル行った（９８℃３０秒で変性、５８℃３０秒でアニーリング、７２℃２分で伸張）。結果として得られた二次ＰＣＲフラグメントのシーケンス解析を、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行い、分析を自動シーケンサ（３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により行った（図３参照）。
１．６．遺伝子配列および遺伝子の機能的解析
それぞれのｃＤＮＡシーケンス比較は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰＤＢ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦを含むデータベース中のｃＤＮＡシーケンスにより、ＢＬＡＳＴｎを用いて行った。ｃＤＮＡ鎖の方向の同定はＲＩＫＥＮクローンセットにより行ったが、これらはいくつかの段階に分類されており、それらの機能は解析されている。相同性分析の実施はＢｌａｓｔプログラムを用いて行った。
１．７．蛍光信号の画像化
ＢＮＬ１ＭＥクローンをガラス製シャーレ上に蒔き、生育培地の存在下で２４時間にわたりインキュベーションを行った。培地を５％　ＦＣＳ添加ＰＢＳ溶液に置換し、共焦点レーザースキャニング顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ社）を使用して生細胞の直接映像撮影を行った。映像撮影後にミトコンドリアの染色をテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて行った。ＰＢＳ緩衝液中のＴＭＲＥの最終濃度は１μＭに調節した。インキュベーション時間は１０分であった。細胞は５４３ｎｍの波長で照射し、５６０ｎｍ　ＬＰフィルターを用いて映像を撮影した。
２．結果
２．１．ミトコンドリアタンパク質の選択的および高感度検出
このライブラリースクリーニングを正確に行うためには、以下の２点の要件を満たす必要がある。１）ミトコンドリア内で再構成されるＥＧＦＰの蛍光強度が、ＦＡＣＳ分析による検出を受けるに足りるだけ高感度かつ強力であること。２）ＭＴＳ存在下でタンパク質を含む細胞を、ＭＴＳの存在しない細胞から選択的に分離して収集することが可能であること。この選択性および高感度検出を検査するため、細胞内局在について十分に特徴が分かっているタンパク質の試験を、マウス肝細胞（ＢＮＬ１ＭＥ）内部で行った。ＥＧＦＰおよびＤｎａＥｃのＣ端側ハーフペプチドに対応するｃＤＮＡと、チトクロームＣオキシダーゼＶＩＩＩサブユニットの前駆物質に対応するミトコンドリアの標的シグナルをコードするｐＭＸ−ＭＴＳ／ＤＥｃ（Ｎｅｏ）プラスミドを構築した（図４）。スプライシング部分ではさらに５個のアミノ酸をコードするｃＤＮＡをインサートし、効率的なスプライシングが生じるようにした（図２）（Ｅｖａｎｓ，　Ｊ．　ｅｔａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２０００，　２７５，９０９１−９０９４）。このプラスミドをレトロウイルスに変換し、これらをＢＮＬ１ＭＥ細胞に感染させ、それぞれの試験タンパク質をミトコンドリア内で発現する安定細胞株が開発された（ＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ）。試験タンパク質として、既知の細胞質タンパク質であるカルモジュリン、またはシグナルペプチドであるＭＴＳを用いた。これらのｃＤＮＡはＥＧＦＰｎおよびＤｎａＥｎをコードするｃＤＮＡと連結し、それらの融合ペプチドをＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞内で発現させた（図４）。細胞のウエスタンブロットにより、タンパク質スプライシングが生じて未変化ＥＧＦＰが産生されたことが確認されたが、この産生物は野生型ＥＧＦＰよりわずかに分子量が多く、スプライシング部分における１０個のアミノ酸の添加を反映している（図５）。タンパク質スプライシングがミトコンドリア内で生じていることを確認するため、ＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ生細胞の蛍光イメージを調べた。ＥＧＦＰの局在は、細胞透過性のあるミトコンドリア選択的色素であるテトラメチルローダミンのエチルエステルにより染色したミトコンドリアの場合と、実質的に同じであることが確認された（図６）。しかも、タンパク質スプライシング後のＥＧＦＰ形成が、Ｎ端側にＭＴＳを連結した融合ペプチドに特異的に生じていることも確認された。
【００３７】
再構築されたＥＧＦＰの蛍光強度がセルソーターによる蛍光細胞の単離に足りるほど強力であることを確認するため、ここではさまざまな感染多重度（ＭＯＩ、細胞あたりのｃＤＮＡ数により定義される）で、ＭＴＳ−ＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎを産生するレトロウイルスをＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞に感染させた。ＭＯＩの調節は特に重要であるが、これはＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞中でｃＤＮＡの多重集積が生じた結果、セルソーティング後に擬陽性のｃＤＮＡが単離される可能性があるためである。このため、感染効率を１細胞１遺伝子として調節することが必要であった。そのため、様々なＭＯＩを用いた感染の４８時間後に、再構成されたＥＧＦＰを含む細胞数の評価をフローサイトメトリーにより行った。ＭＯＩが５の場合には、全ての細胞が強い蛍光を示した（図７）。ＭＯＩが０．０１の場合には１．６±０．１％、ＭＯＩが０．０２の場合には、３．６±０．３％、ＭＯＩが０．０６の場合には９．４±０．６％、ＭＯＩが０．１の場合には、１５．４±１．１％、ＭＯＩが０．２の場合には、３６．７±１．４％、ＭＯＩが０．５の場合には、６０．５±１．３％、そしてＭＯＩが１．０の場合には、７１．１±１．０％の細胞が蛍光を示した。０から０．２のＭＯＩ範囲では、蛍光細胞はＭＯＩの増加に比例して増加しており、０から０．２のＭＯＩ範囲では感染は細胞あたり１個のｃＤＮＡとして生じていることが示された。この単回ヒット感染でのＥＧＦＰの蛍光強度は、ＭＴＳが存在または非存在である細胞を十分に分離するものであり、これは蛍光強度の２個のピーク幅が証拠となっている。これらのデータから、単一のＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞中で再構築されたＥＧＦＰ量は、ミトコンドリアタンパク質の高感度検出とセルソーターを用いた選択的単離を可能とするに十分であることが確認された。
２．２．ｃＤＮＡライブラリーからのミトコンドリアタンパク質の選別
ミトコンドリアタンパク質をコードする遺伝子が、大規模ｃＤＮＡライブラリーから選択的に単離可能であるかどうかを検討した。ＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞に由来する各ｃＤＮＡを、ＥＧＦＰｎおよびＤｎａＥｎのｃＤＮＡフラグメントの上流にある２箇所のＢｓｔＸＩ部位にクローニングして、ｃＤＮＡ−ＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎ融合ライブラリーを作成した（図３）。縦列融合フラグメントであるｃＤＮＡ−ＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎの順序はその細胞内局在を分析するために重要であるが、これはほとんどのＭＴＳがミトコンドリアタンパク質のアミノ末端に結合するためである（Ｒｏｉｓｅ，　Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１９８８，　７，　６４９−６５３；　Ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，　Ｇ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１９８６，　５，　１３３５−１３４２９，１０）。このように構築されたｃＤＮＡライブラリーには１．１×１０６個の独立したクローンが含まれており、ｃＤＮＡのサイズは平均して１．４ｋｂｐである。このライブラリーを高力価レトロウイルスパッケージ化細胞株であるＰｌａｔ−Ｅ細胞（Ｍｏｒｉｔａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２０００，　７，　１０６３−１０６６）を用いて、レトロウイルスに変換した。予備試験では、１×１０７個の細胞に５０μＬのレトロウイルス上清を感染させて、２０％の感染効率を達成した。感染処理の３日後、１×１０５個の細胞の蛍光強度をＦＡＣＳ分析によって測定した。感染細胞の母集団は、再構築ＥＧＦＰの存在あるいは非存在下にある、細胞の混合物により構成されている（図８。Ｌ領域の蛍光細胞の比率は、全細胞数の０．０８９±０．００８％（ｎ＝１０）であることが判明した。
【００３８】
次に、ＦＡＣＳ分析によってＬ領域の蛍光細胞の母集団を収集した。１秒あたりの分析細胞数として定義されたデータ率は（１．０±０．１）×１０３になるように調整した。このデータ率の設定では１０７個の細胞を数時間以内に検査することが可能であった。この実験では、１×１０３個の細胞がＬ領域での蛍光細胞として計数されたが、細胞の半数は回収されなかった。このため、蛍光細胞の実際の収集量は５００〜１０００個の細胞となり、このようなＦＡＣＳと組み合わせたＥＧＦＰ再構築技術によって、ＭＴＳ−結合融合ペプチドを高速で収集できることが示された。
【００３９】
またセルソーティングの精度を評価するために、ここでは各単離クローンの蛍光強度と細胞内局在の分析を行った。ｃＤＮＡがホストゲノム中に組み込まれているならば、ＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞内では対応するタンパク質が構成され発現している筈であり、そのためＥＧＦＰの再構築はミトコンドリア内に留まる。これを確認するため２００個の収集されたクローンの蛍光強度をＦＡＣＳにより分析したが、このうち１６９個のクローンが様々な強度で蛍光を発していた（図９）。残り３１個のクローンは蛍光を発せず、これらのｃＤＮＡはゲノムＰＣＲにより回収されなかったことから、ｃＤＮＡが核ゲノムに組み込まれなかったか、あるいは一度組み込まれたとしても細胞分裂途中に核ゲノムから脱落したことが示される。次に１００個の蛍光細胞クローンをランダムに選択し、再構築されたＥＧＦＰの細胞内局在を調べた。ＥＧＦＰはミトコンドリア内に限局していることが判明し（図９）、これらの細胞内ではミトコンドリアタンパク質をコードするｃＤＮＡがそれぞれのクローン内部に組み込まれており、ｃＤＮＡシーケンスが即座に解析可能であることが示された。
２．３．個別のｃＤＮＡクローンに対する分析
個々のｃＤＮＡの特徴を調べるため、それぞれのクローンから核ゲノムを抽出し、組み込まれたｃＤＮＡをＰＣＲ増幅により回収し、これをシーケンス分析に供した。分析対象となった最初の１５０個のクローンのうち得られた発現シーケンスタグ（ＥＳＴｓ）には、１度だけ発現したタグが３２個、複数回同定されたタグが２８個含まれていた。冗長ではない合計６０個のｃＤＮＡのうち、５６個のクローンがＧｅｎＢａｎｋ中で同定された。残りの４個の遺伝子が新しく同定され、これにはミトコンドリアの標的シグナルが含まれていた。それぞれの新規遺伝子産物のミトコンドリア内における局在は、共焦点顕微鏡によって確認された。
【００４０】
合計５６個のＧｅｎＢａｎｋに存在するクローンのうち、良く特徴の知られたミトコンドリアタンパク質が多数同定されたが、これらは例えばＡｃａｄ１、Ｇｃｄｈ、Ｃｏｘ５ｂ、ＡＴＰシンターゼ、Ｕｃｐ２、マレイン酸デヒドロゲナーゼなどである（表１）。これらのタンパク質は全てミトコンドリア基質または内膜に存在している。特徴が不明な残りのクローンのうち、いくつかの遺伝子産物の機能については新しく次のように説明されている。例えば、Ｎｏ．１０クローンに由来するｃＤＮＡは公開シーケンスデータベースのＤＤＢＪ（ＲＩＫＥＮ全長ｃＤＮＡクローン）において同定されている（Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　２００１，　４０９，　６８５−６９０）。Ｎｏ．１０クローンとデータベースに由来するｃＤＮＡのリーディングフレームと予想される開始コドンはいずれも完全に一致している。公開データベースを用いた相同性分析によれば、クローニングされたｃＤＮＡ断片と、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅから誘導した推定チトクロームｃオキシダーゼ組み立てタンパク質の間には、ＤＮＡレベルで２３％の相同性が存在した。このためマウスクローンＮｏ．１０はチトクロームｃオキシダーゼ組み立てタンパク質か、関連機能を持つタンパク質に属している。同様にクローンＮｏ．９２に由来するｃＤＮＡはヒトミトコンドリアの２８Ｓリボソームタンパク質（Ｓ１８−１）のｃＤＮＡに対して７６％の相同性があることが判明した。このような高い相同性と、この実験で得られたミトコンドリア局在化から、クローンＮｏ．９２のｃＤＮＡはマウスミトコンドリアのリボソームタンパク質であることが確認された。他のリボソームタンパク質であるＳ１８（クローンＮｏ．５１）は、マウスのリボソームタンパク質であることが既に同定されているが、局在化については詳しい考察がなされていない。ＭＴＳは２０〜６０程度のアミノ酸残基により構成されており、一つの疎水性面と一つの陽性荷電面との間に両親媒性のα−らせんを形成する能力がある。アミノ末端およびミトコンドリア内のアミノ末端断片に塩基性および疎水性アミノ酸が存在しているという事実から、ｃＤＮＡの転写産物はマウスのミトリボソームに特異的であることが示される。新規に注釈された他の遺伝子は、遺伝子名称と共に表１にまとめた。加えて表１に示した３個のクローンのｃＤＮＡは、リーディングフレームと開始コドンがＲＩＫＥＮの全長ｃＤＮＡクローンに完全に一致することが分かっているが、他の真核細胞に対して著しい類似性はみられない。そのため、これらの３種類のクローンはミトコンドリア内に局在化する新規タンパク質であることが示される。
【００４１】
【表１】
2004108943.tif 000003
【００４２】
３．結論
以上の結果から、この発明の解析方法によって、ミトコンドリアに局在化する新規遺伝子産物を同定し、それによってこれらの機能を注釈するための迅速なアプローチが提供可能であることが示される。また、ハイスループットスクリーニング技術によって、核、小胞体、ゴルジ体、ペルオキシソーム等の各オルガネラに局在化しているタンパク質グループの同定も、それぞれのシグナルを用いることによって容易に行うことができる。この発明の方法は単純であるため、ｃＤＮＡライブラリーを構築する能力がありＦＡＣＳ設備を持つ当業者ならば、過度の試験を行うことなく、容易に実施することが可能である。さらに、この方法をｃＤＮＡサブトラクション法と組み合わせることによって、例えば正常状態と疾患状態、または異なる組織の発現遺伝子との比較を行うなどといった柔軟性がさらに付与される。
【００４３】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、あらゆるオルガネラを対象として、簡便かつ正確にタンパク質局在を解析することのできる新しい方法と、この方法に使用する解析用材料を提供が提供される。
【００４４】
【配列表】
2004108943.tif 000004
2004108943.tif 000005
2004108943.tif 000006
2004108943.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明方法の基本的原理を示した模式図である。
【図２】実施例で作製した融合ペプチド（ｂ）および（ａ）の構造と、タンパク質スプライシング後に再構築されるＥＧＦＰの構造を示した模式図である。塩基配列およびアミノ酸配列は、ＤｎａＥｎとＥＧＦＰｎ、ＤｎａＥｃとＥＧＦＰｃ、ＥＧＦＰｎとＥＧＦＰｃの間のリンカーペプチド配列である。
【図３】実施例での解析プロセスの模式図である。
【図４】実施例で作製した組換えベクターの構造を示した模式図である。ＬＴＲは末端反復配列、ψはレトロウイルスパッケージングシグナル、ＩＲＥＳは内部リボソーム導入部位、ＮＥＯはネオマイシン耐性遺伝子を示す。
【図５】カルモジュリン（ＣａＭ）またはＭＴＳを連結したＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎを発現しているＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞の全細胞溶解物のウエスタンブロッティング分析の結果である。ＥＧＦＰｃに特異的なモノクローナル抗体を用いて行った。
【図６】ＭＴＳ−ＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎ融合ペプチドが発現し、ミトコンドリアに局在化していることを示す顕微鏡写真である。。ＭＯＩ値５でｐＭＸ−Ｍｉｔｏ／ＬＩＢ−ＭＴＳに感染させたＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞を２日間培養し、細胞をガラス底シャーレに蒔いた。生細胞の造影を行い（ａ；透過型）、ＥＧＦＰの蛍光の記録を共焦点顕微鏡により行った（ｂ）。映像の撮影後、テトラメチルローダミンエチルエステルを用いて生細胞内のミトコンドリアを染色した（ｃ）。（ｄ）は、ＥＧＦＰがミトコンドリアに特異的に局在していることを示すスーパーインポーズ画像である。
【図７】再構築されたＥＧＦＰを内包するＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞のＦＡＣＳプロフィールである。左グラフは、ＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞に対して、ＣａＭ−ＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎを発現しているレトロウイルスをＭＯＩ値５で、ＭＴＳ−ＥＧＦＰｎ−ＤｎａＥｎを発現しているものをＭＯＩ値５またはＭＯＩ値０．２で、それぞれ感染させた。コントロールとして未感染細胞を用いた。右グラフは、対照としてのレトロウイルス感染を測定した結果である。レトロウイルス感染の単回ヒット動態が、Ｌ領域のＥＧＦＰ陽性細胞の比率に対するＭＯＩの相関により示されている。全てのデータ点は１０，０００個の測定細胞から取得し、測定は３回繰り返した。挿入図は一次相関範囲の拡大グラフである。
【図８】ＦＡＣＳにより蛍光細胞を選別した結果である。（Ａ）はＢＮＬ１ＭＥ細胞に感染効率２０％でｃＤＮＡレトロウイルスライブラリーを感染させ、５日間のインキュベーション後、細胞を剥離させ、ＦＡＣＳによりソートした結果である。未感染細胞を挿入し、バックグラウンド蛍光を示した。（Ｂ）は、（Ａ）のＬ領域付近の拡大ＦＡＣＳプロフィールである。
【図９】代表的なクローン細胞のフローサイトメトリープロフィールと蛍光画像である。左グラフは、クローンされた細胞と未感染ＢＮＬ１ＭＥｍｉｔｏ細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果である。分析対象となる全細胞数は１０５個であった。右蛍光画像は、各クローン細胞をガラススライド上で培養し、再構築されたＥＧＦＰを内包する生細胞の共焦点画像を撮影したした結果である。ＴＭＲＥを用いて細胞染色を行い、個々の細胞のミトコンドリアの局在を示した。積層共焦点画像により、ＥＧＦＰの再構築がミトコンドリア内で生じていることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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