(57)【要約】【課題】検出用分子を適度な密度で固定することにより、分子間の相互反応作用の際における立体障害による反応効率低下を防止する。【解決手段】メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有する検出用分子Ｄとこれに特異的に反応する標的分子Ｔとの間の分子間相互反応作用の場を提供する反応領域Ｒに臨む基板２上に形成された検出表面１上に、金等の金属薄膜部１１を、島様に点在するように間隔を置いて形成し、この金属薄膜部１１に前記メルカプト基又はジスルフィド基を介して前記検出用分子Ｄを固定するように工夫した分子間相互反応作用の検出表面１を提供する。【選択図】  図１
2004294383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有する検出用分子と標的分子との間の分子間相互反応作用の場を提供する反応領域に臨む基板上に形成された検出表面であって、
前記検出表面には金属薄膜部が間隔を置いて設けられ、該金属薄膜部に前記メルカプト基又はジスルフィド基を介して前記検出用分子が固定化される分子間相互反応作用検出表面。
【請求項２】
前記金属薄膜部は、金薄膜から形成されたことを特徴とする請求項１記載の分子間相互反応作用検出表面。
【請求項３】
前記金属薄膜部は、金属蒸着膜又は金属スパッタ膜から形成されたことを特徴とする請求項２記載の分子間相互反応作用検出表面。
【請求項４】
前記金属薄膜部は、メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）と結合しない有機化合物膜から形成された表面に形成されたことを特徴とする請求項１記載の分子間相互反応作用検出表面。
【請求項５】
前記検出用分子は、一本鎖又は二本鎖のヌクレオチド分子であることを特徴とする請求項１記載の分子間相互反応作用検出表面。
【請求項６】
前記分子間相互反応作用は、ハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載の分子間相互反応作用検出表面。
【請求項７】
請求項１記載の分子間相互反応作用検出表面を少なくとも備えることを特徴とする分子間相互反応作用検出基板。
【請求項８】
検出用分子と標的分子との間の分子間相互反応作用の場を提供する反応領域に臨む基板上に形成された検出表面上に、蒸着又はスパッタリングのいずれかの手法を用いて、金属薄膜部が間隔を置いて島様に点在させる工程を少なくとも含む分子間相互反応作用検出表面の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリダイゼーションその他の分子間相互反応作用を検出するための検出表面に関する。より詳しくは、検出用分子が固定される金属薄膜部を、間隔を置いて形成して、前記検出用分子を適度な密度で固定し、これにより、分子間相互反応作用の際の立体障害による反応効率低下を防止するように工夫した分子間相互反応作用検出表面に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。
【０００３】
このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
【０００４】
ここで、特許文献１には、フォトリソグラフィ技術及びエッチング技術を用いて、金属基板を含む基板の表面のプローブ生体分子を付着させたい特定部位のみに、アビジン分子を単層に固定した固相化膜を形成した表面処理基板が開示されている。
【０００５】
また、特許文献２には、検査対象物質の検出に用いるプローブを予め微粒子に捕捉して、この微粒子を基板の表面に格子状に区画された部分に固定し、各区画にプローブを捕捉した前記微粒子を単層で細密に固定する技術が開示されている。
また、添付した従来技術を模式的に示す図７に示すように、合成樹脂等の基板１００の表面全体に、金等の金属薄膜１０１を形成し、この金属薄膜１０１に対して、この金属に化学結合する検出用分子を固定化することが一般に行われている。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−１５３２７２号報
【特許文献２】
特開２００２−２５３２３２号報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来のＤＮＡチップ技術では、ＤＮＡプローブ等の検出用ヌクレオチド鎖は、検出表面部位（スポット部位）にランダムコイル状に絡まったり、丸まったり等して固定化され、なおかつ集積密度が高いので、標的分子とのハイブリダイゼーションその他の相互反応作用の際に立体障害が発生している。
【０００８】
このため、前記相互反応作用の効率が悪く、反応にも長時間を要し、更には、擬陽性又は偽陰性を示してしまう可能性があるという問題があった。とくに、検出表面全体に検出用分子を固定化する技術（図７参照）では、該検出用分子の集積密度が高いので前記問題が顕著であった。
【０００９】
そこで、本発明は、検出用分子が固定される金属薄膜部を、検出表面に間隔を置いて形成して、前記検出用分子を適度な密度で固定することにより、分子間の相互反応作用の際における立体障害による反応効率低下を防止することを主な目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記技術的課題を解決するために、本願においては、まず、メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を有する検出用分子と標的分子との間の分子間相互反応作用の場を提供する反応領域に臨む基板上の検出表面であって、前記基板上に、金属薄膜部を間隔を置いて設け、この金属薄膜部に前記メルカプト基又はジスルフィド基を介して前記検出用分子を固定するように工夫した分子間相互反応作用検出表面及び該検出表面を備える分子間相互反応作用検出基板を提供する。
【００１１】
即ち、本発明に係る分子間相互反応作用検出表面においては、この検出表面の全体に前記検出用分子が固定化される構成を採用するのではなく、前記検出表面上に、島の如きに点在するように、間隔を置いて形成された金属薄膜部（の表面）にのみ前記検出用分子が固定化されるように工夫している。
【００１２】
この結果、検出表面上における（固定化された）検出用分子の集積密度を低く抑制することができるため、ランダムコイル状に絡まったり、丸まったり等している検出用分子に対して、後に添加又は送られてくる標的分子が接近し易い反応場環境が形成される。即ち、分子間の反応の際に、立体障害の影響が少ない環境が形成されるので、検出用分子と標的分子との間のハイブリダイゼーションその他の相互反応作用が効率良く進行することになる。
【００１３】
本発明の分子間相互反応作用検出表面では、検出表面上に形成された金属薄膜部一個当りの面積と検出表面単位面積あたりの金属薄膜部の形成個数とを調整することにより、検出表面における固定化検出用分子の集積密度を自在に調整することができる。
【００１４】
前記金属薄膜部は、メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）と反応する金属材料で薄膜状に形成すればよく、例えば、金薄膜から形成することができる。金等の金属は、メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）と反応して、いわゆるメルカプチドを形成し、検出用分子を化学吸着して固定化するという機能を有する。
【００１５】
この金属薄膜部は、前記検出表面上に、蒸着又はスパッタリングのいずれかの手法を用いて、金属薄膜部が間隔を置いて島様に点在させる工程を少なくとも含む分子間相互反応作用検出表面の製造方法によって形成できる。即ち、前記金属薄膜部は、前記製造方法によって、島様に点在する金属蒸着膜又は金属スパッタ膜として形成される。なお、この金属薄膜部が形成される基板は、メルカプト基（−ＳＨ）又はジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）と結合しない、ステアリン酸単結晶基板その他の有機化合物結晶基板で形成することもできる。
【００１６】
金属蒸着膜からなる金属薄膜部は、公知の種々の蒸着技術を適宜選択して形成すればよく、例えば、エピタキシー現象を用いた蒸着も好適に採用できる。前記エピタキシー現象を使用すると、検出表面上に略規則正しく配列された金属薄膜部（エピタキシャル膜）を形成できるため、検出用分子を検出表面上にむらなく（規則正しく）、均一に固定化できるという利点がある。
【００１７】
ここで、本願における主たる技術用語の定義付けを行う。まず、本願における「分子間相互反応作用検出表面」は、検出用分子を固定化できる機能を有する、基板上の表面領域を意味する。
【００１８】
「検出用分子」は、前記検出表面に固定化される、ＤＮＡプローブその他のヌクレオチド鎖、ペプチド、タンパク質、脂質等を含むプローブ分子である。なお、前記ヌクレオチド鎖とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体を意味し、ＤＮＡプローブを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃＤＮＡプローブ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
【００１９】
「標的分子」は、前記検出用分子と特異的に反応する性質を有する分子である。例えば、前記検出用ヌクレオチド鎖と相補的な塩基配列を備えるヌクレオチド鎖であって、場合によっては、蛍光物質等により標識される。
【００２０】
「分子間相互反応作用」とは、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二重鎖）形成反応であるハイブリダイゼーション、抗原抗体反応、酵素応答反応その他の分子間（高分子、低分子を問わない。）の相互反応作用等を、化学的な反応形式を問わず広く含む。
【００２１】
「反応領域」は、主に液相中でのハイブリダイゼーションその他の前記分子間相互反応作用の場を提供できる試料溶液貯留領域であり、基板上に形成された検出表面上に形成される空間又は領域である。
【００２２】
「立体障害（ｓｔｅｒｉｃ  ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の分子間相互反応作用が起こりにくくなる現象を意味する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面に基づいて、本発明に係る分子間相互反応作用検出表面（以下、単に「検出表面」と言う。）の好適な実施形態について説明する。まず、図１は、本発明に係る検出表面の構成を示す斜視図、図２は、同検出表面部分の断面図である。符号１で示された検出表面は、ガラス、石英、シリコン等の材料によって形成された基板２上に形成され、分子間相互反応作用の検出部の一部を構成する。
【００２４】
この検出表面１には、金等からなる金属薄膜部１１が、島様に点在するように形成されており、検出表面１の上方領域には、分子間の相互反応作用の反応場を提供する反応領域Ｒが設けられる（図２参照）。
【００２５】
検出表面１における金属薄膜部１１の形成方法は、本発明においては特に限定されることない。即ち、金属薄膜部１１を検出表面１全体にではなく、島の如きに点在するように形成できる方法であれば適宜採用可能である。
【００２６】
例えば、基板１上に予めメルカプト基またはジスルフィド基のパターンを形成しておいてから、このパターン上に、金等の金属のナノ粒子、マイクロ粒子を化学吸着させて形成することができる。
【００２７】
また、図３（Ａ）に示すように、検出表面１の全面に金属Ｘを、エピタキシー蒸着その他の蒸着又はスパッタすることによって積層しておき、その後、この金属Ｘを公知のエッチング技術によって部分的に剥がすことによって、検出表面１に金属薄膜部１１を島様に分布させることができる（図３（Ｂ）参照）。なお、金属薄膜部１１の形成の際には、蒸着またはスパッタの量を調整したり、基板１を冷却したりしても良い。また、濡れ性が悪い基板２を用いても良い。
【００２８】
ここで、金属薄膜部１１が島様に分布した上記構成を備える検出表面１は、図４（Ａ）に模式的に例示した、メルカプト基を有する一本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ１又はジスルフィド基を有する一本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ２を、金属薄膜部１１の表面に選択的に化学吸着させて、固定化させることができる。この固定化された状態を、図５（Ａ）に模式的に示している。なお、図５（Ｂ）は、金属薄膜部１１に固定化された一本鎖の前記検出用ヌクレオチド分子Ｄ１（又はＤ２）に対して、一本鎖の標的ヌクレオチド分子Ｔがハイブリダイゼーションして、二本鎖（相補鎖）を形成している様子を模式的に示している。
【００２９】
また、図４（Ｂ）に模式的に示した、メルカプト基を有する二本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ３又はジスルフィド基を有する二本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ４を、金属薄膜部１１の表面に選択的に化学吸着させて、固定化させることができる。この固定化された状態を、図６に模式的に示す。なお、二本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ４は、固定化後に二本鎖のまま使用して酵素応答反応等の検出用分子として用いてもよく、あるいは固定化後に変性して一本鎖とした後にハイブリダイゼーション反応等を検出するための検出用分子として用いてもよい。
【００３０】
なお、検出用分子Ｄは、一本鎖又は二本鎖のヌクレオチド分子（Ｄ１〜Ｄ４）に限定されるものではなく、金属薄膜部１１に化学吸着するメルカプト基又はジスルフィド基を有する分子であれば、高分子、低分子を問わず選択可能である。
【００３１】
図５、図６に示されているように、本発明に係る検出表面１では、検出用分子Ｄ（Ｄ１〜Ｄ４）が、検出表面１上に島様に点在するように形成された金属薄膜部１１にだけ固定化されている結果、検出表面１全体に検出用分子Ｄが固定化されている場合と比較して、検出表面１上における検出用分子Ｄの集積密度が低い。
【００３２】
このため、反応領域Ｒに対して後から添加又は送り込まれてくる標的分子Ｔが、固定化された検出用分子Ｄに接近する際の立体障害の影響が少ない。この結果、ハイブリダイゼーションその他の分子間相互反応作用の効率を向上させることができる。即ち、反応時間を短縮できる。
【００３３】
検出表面１の金属薄膜部１１に固定化された検出用分子Ｄが、リン酸イオンを有し陰電荷に荷電しているヌレオチド鎖である場合には、反応領域Ｒに図示しない対向電極を配置しておき、これに高周波電圧を印加して対向電極間の反応領域Ｒに均一電界（電気力線が一部に集中しない電界）を形成する構成も採用できる。この電界の作用によって検出用分子Ｄを伸長させることができるので、集積密度を低くする構成に加えて、更に立体障害の影響を排除することが可能なる。
【００３４】
なお、対向電極の電界の条件は、約１×１０６Ｖ／ｍ、約１ＭＨｚという条件が、好適である（Ｍａｓａｏ  Ｗａｓｈｉｚｕ  ａｎｄ  Ｏｓａｍｕ  Ｋｕｒｏｓａｗａ：“Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２６，ｐ．１１６５−１１７２（１９９０）参照）。
【００３５】
上記構成の検出表面１は、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）や分子間の相互反応作用を検出するための各種センサーチップの基板２上に設けることができる。
なお、検出表面１に固定化された検出用分子Ｄと標的分子Ｔとの間に相互反応作用があったか否かの検出は、光学的方法、水晶発振子原理、表面プラズモン共鳴原理等の公知慣用の方法によって実施すればよい。標識された蛍光色素や二重鎖ヌクレオチドの塩基間に特異的に結合するＰＯＰＯ−１やＴＯＴＯ−３等の蛍光インターカレータに励起光を照射し、得られる蛍光を慣用のディテクタを用いて検出することもできる。
【００３６】
例えば、レーザー光（例えば、青色レーザー光）を照射して反応領域Ｒを励起し、蛍光強度の大きさを検出器（図示せず。）によって検出し、検出用分子Ｄと標的分子Ｔとの間のハイブリダイゼーションの状態を判断する。最後に、各反応領域Ｒに対する蛍光強度をＡ／Ｄ変換し、結合反応割合をコンピュータの画面に分布表示することによって、視覚化することができる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、基板の検出表面上に固定化される検出用分子の集積密度を低く抑えることができる結果、検出表面上の反応領域における検出用分子と標的分子との間のハイブリダイゼーションその他の分子間相互反応作用を高効率化することができる。
【００３８】
検出用分子の検出表面での集積密度の制御は反応時間を短縮することでも可能であるが、反応時間による制御では反応温度や反応環境の厳密な制御が必要である。このため、検出用分子が固定化される検出表面での相互反応作用間を制御する方がより容易である。本発明では、検出表面での金属薄膜部の島様パターンの面積や形成密度によって検出用分子の分布を制御できる構成であるので、検出表面上に任意の集積密度で検出用分子を固定化できる。
【００３９】
本発明は、ＤＮＡチップ等のセンサーチップの検出表面において、ハイブリダイゼーションその他の分子間相互反応作用の効率の向上、反応時間の短縮、偽陽性又は偽陰性の発生防止等を確実に達成できる。
【００４０】
本発明は、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等において必須となるハイブリダイゼーションの検出や抗原抗体反応等を含む分子間相互反応作用の検出を、効率良く実施できるので、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の関連産業界に提供するという技術的意義を有している。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る検出表面（１）の構成を示す斜視図
【図２】同検出表面（１）部分の断面図
【図３】（Ａ）検出表面１の全面に金属Ｘを蒸着又はスパッタして積層した状態を示す図
（Ｂ）前記金属Ｘを公知のエッチング技術によって部分的に剥がした後の状態を示す図
【図４】（Ａ）メルカプト基を有する一本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ１又はジスルフィド基を有する一本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ２を模式的に示す図
（Ｂ）メルカプト基を有する二本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ３又はジスルフィド基を有する二本鎖の検出用ヌクレオチド分子Ｄ４を模式的に示す図
【図５】（Ａ）一本鎖の検出用ヌクレオチド分子（Ｄ１）が検出表面（１）上に島様に点在するように形成された金属薄膜部（１１）に固定化されている様子を示す図
（Ｂ）固定化された一本鎖の前記検出用ヌクレオチド分子（Ｄ１又はＤ２）に対して、一本鎖の標的ヌクレオチド分子Ｔがハイブリダイゼーションして、二本鎖（相補鎖）を形成している様子を模式的に示す図。
【図６】二本鎖の検出用ヌクレオチド分子（Ｄ２）が検出表面（１）上に島様に点在するように形成された金属薄膜部（１１）に固定化されている様子を示す図
【図７】従来の検出表面の構成を模式的に示す図（断面図）
【符号の説明】
１  検出表面
２  基板
１１  金属薄膜部
Ｄ  検出用分子
Ｒ  反応領域
Ｔ  標的分子
【図１】
2004294383.tif 000003
【図２】
2004294383.tif 000004
【図３】
2004294383.tif 000005
【図４】
2004294383.tif 000006
【図５】
2004294383.tif 000007
【図６】
2004294383.tif 000008
【図７】
2004294383.tif 000009