(57)【要約】【課題】モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物に対して、細胞内のモノオキシゲナーゼを抽出しなくとも反応の補欠因子いわゆる補酵素である還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）をその細胞の外部から供給し、これによって細胞の代謝に依存した還元力を必要としない酵素的酸化反応を達成する。【解決手段】モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を、陽イオン界面活性剤を含んだ溶液に浸漬するなどの処理をすることによりに、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの透過性を付与し、次いで当該微生物へＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを供給することにより、モノオキシゲナーゼに対する還元力を供給する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物に、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の透過性を付与し、次いで当該微生物へ還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を供給することを特徴とする、モノオキシゲナーゼに対する還元力の供給方法。
【請求項２】
モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を界面活性剤を含んだ溶液に浸漬することにより、当該微生物に還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の透過性を付与することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤が陽イオン界面活性剤であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤が第４級アンモニウムまたはその塩であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
界面活性剤が、炭素数１１個から２７個のものであること特徴とする、請求項２〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
界面活性剤が、ｎ−オクチルトリメチルアンモニウム、ｎ−デシルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメチルアンモニウム、ｎ−テトラデシルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンジルセチルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、ラウリルピリジニウム、及びセチルピリジニウムからなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項２〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、又はＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属のいずれかの属の細菌であることを特徴とする、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物が、外来のモノオキシゲナーゼ遺伝子で形質転換されたＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、若しくはＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属のいずれかの属の細菌、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、若しくはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のいずれかの属の酵母、又はＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属のシアノバクテリアであることを特徴とする、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物の還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨ）又は還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨ）の透過性を変えた後に、当該微生物にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを供給する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
モノオキシゲナーゼは、分子状の酸素の酸素一原子を基質に添加する反応を触媒する酵素である。モノオキシゲナーゼには、アルカンや片末端が置換されているアルカンのアルキル末端を水酸化する反応を触媒するもの、アルカンや片末端が置換されているアルカンやシクロアルカンの分子内の２級炭素を水酸化する反応を触媒するもの、オレフィンやその誘導体の炭素と炭素２重結合をエポキシ化する反応を触媒するもの、芳香族化合物あるいは複素環化合物の環に水酸基を導入する反応を触媒するものなどが知られている。たとえば、メタンモノオキシゲナーゼ、ブタンモノオキシゲナーゼ、プロパンモノオキシゲナーゼ、シクロヘキサンモノオキシゲナーゼ、テトラヒドロフランモノオキシゲナーゼ、アルケンモノオキシゲナーゼ、イソプレンモノオキシゲナーゼ、フェノールヒドロキシラーゼ、トルエン２−モノオキシゲナーゼ、トルエン３−モノオキシゲナーゼ、トルエン４−モノオキシゲナーゼ、スチレンモノオキシゲナーゼなどがある。また各種生物のシトクロムＰ−４５０とそのシトクロムＰ−４５０のレダクターゼからなる酵素系もモノオキシゲナーゼに分類される酵素である。
【０００３】
モノオキシゲナーゼをもつ微生物としては例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、又はＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属などに属する細菌などがあげられる。また、それ以外の属の細菌であっても、メタン資化菌、エタン資化菌、プロパン資化菌、ブタン資化菌などのアルカン資化菌や、エチレンやプロピレンなどのアルケンを資化するアルケン資化菌、ベンゼン資化菌、トルエン資化菌、キシレン資化菌、フェノール資化菌などの芳香族化合物の資化菌や、あるいは、トリクロロエチレン分解菌は、資化や分解の対象となる化合物を酸化するモノオキシゲナーゼをもつことが多い。さらにへム鉄を分子内にもつモノオキシゲナーゼであるシトクロムＰ−４５０とそのレダクターゼは真菌類を含め広く生物界に分布しており、広汎な酸化反応を触媒する。
【０００４】
またさらには人工的にラットＰ−４５０とそのレダクターゼを融合させた酵素遺伝子を組み込んだ酵母（例えば特許文献１参照）なども知られている。
【０００５】
ところでモノオキシゲナーゼの反応には、基質に添加されなかったもう一原子の酸素を還元するための還元力が必要である。細胞内においては、酵素反応の補欠因子（一般的には補酵素と呼ばれる）の一種であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが還元力の供給源となっていることが多い。自然界の多くのモノオキシゲナーゼは、基質に酸素を添加するヒドロキシラーゼコンポーネントと、補酵素から電子を引き抜きヒドロキシラーゼコンポーネントに電子を伝達するレダクターゼコンポーネントからなっており、その他に両者の結合や両者間の電子伝達のためのコンポーネントを含むものもあり、こうした場合にはさらに多種類のコンポーネントから構成されている。
【０００６】
メタンモノオキシゲナーゼ、トルエン２−モノオキシゲナーゼ、トルエン４−モノオキシゲナーゼなどの非へム鉄を分子内にもつモノオキシゲナーゼや、シトクロムＰ−４５０のようにへム鉄を分子内にもつモノオキシゲナーゼでは、生物細胞外の反応において、分子状酸素の代わりに過酸化水素を用いることでヒドロキシラーゼコンポーネントだけで基質の酸化が行なえることが知られている。しかし過酸化水素は分子状酸素に比べて高価であり、またモノオキシゲナーゼのコンポーネントは蛋白質であるので過酸化水素により変性させられ易いなどの理由から分子状酸素を用いる反応系が望まれる。一方で、生物細胞外にモノオキシゲナーゼを取り出して分子状酸素を用いて反応を効率よく行なうためには、モノオキシゲナーゼを構成するコンポーネントが最適な割合でかつ最適な濃度で反応系になくてはならないため、それを実現するためにはモノオキシゲナーゼを生産する生物からモノオキシゲナーゼを精製して用いることが理想的である。しかし複数のコンポーネントからなるモノオキシゲナーゼにおいては、それを構成するコンポーネントを個別に精製したのちにモノオキシゲナーゼを再構成しなければならず煩雑である。そのためモノオキシゲナーゼを用いた反応の多くは、精製酵素ではなく生物自体を用いた細胞内の反応として行なわれることが多い。
【０００７】
モノオキシゲナーゼの反応では、還元型の補酵素が消費し尽くされれば反応は停止する。そのため生きた細胞での反応を持続するためには細胞が代謝可能なエネルギー源（たとえばグルコースや乳酸など）を外部から与えて取り込ませて、それを代謝する酵素反応系で、直接的にあるいは間接的に酸化型の補酵素を還元型に再生させることが必要であり、モノオキシゲナーゼの反応の基質以外に何らかの代謝可能な炭素源を供給し続けなければならない。
【０００８】
モノオキシゲナーゼの反応を担う生物に還元型の補酵素の再生を担わせなくても、酸化型の補酵素から還元型の補酵素を生成しうる酵素たとえばアルコールデヒドロゲナーゼや蟻酸デヒドロゲナーゼなどを用いた反応系や、電気化学的な反応を利用した反応系で、還元型の補酵素が再生できることが知られている。したがってモノオキシゲナーゼの反応を持続するための還元型の補酵素を再生する目的で、細胞が代謝可能なエネルギー源を外部から与える代わりに還元型の補酵素を直接供給してもよいのであるが、生きた細胞を用いた反応では、通常は補酵素が生体膜を通過して細胞内に至らないため、細胞内のモノオキシゲナーゼに対して外部から直接に還元型の補酵素それ自体を供給することはできない。しかし、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞などの細胞における低分子物質の透過性を変えるさまざまな方法が知られており、例えばアルコール、エーテル、ベンゼン、トルエン、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒、界面活性剤、抗生物質、ＥＤＴＡなどのキレート化合物などの溶液に細胞を晒すことで細胞の低分子物質に対する透過性を変化させることができる（例えば非特許文献１参照）。
【０００９】
酵母や植物細胞などの真核細胞への透過性付与にはジメチルスルホキシドを含んだ溶液が使用できることが知られており、植物細胞であるＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓの例では、細胞外から加えたＮＡＤＰＨでカテナミンレダクターゼがカテナミンをアジマリシンとその異性体に還元する反応を触媒することが知られている（例えば非特許文献２参照）。
【００１０】
また陽イオン性界面活性剤であるセチルトリメチルアンモニウムブロミドを含んだ溶液で処理した酵母で、細胞内酵素であるアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、β−ガラクトシダーゼが外部から加えた基質や補酵素と反応することが知られている（例えば非特許文献３参照）。
【００１１】
細菌の低分子物質に対する透過性を変える方法としては、エーテル、フェネチルアルコール、トルエンなどの有機溶媒を含んだ溶液やキレート剤であるＥＤＴＡを含んだ溶液やそれらの組み合わせ、非イオン性界面活性剤であるトリトンＸ−１００を単独で用いたりトルエンやＥＤＴＡとの混合物を含んだ溶液、陽イオン性界面活性剤であるセチルトリメチルアンモニウムブロミドを含んだ溶液などに菌を浸漬する方法が知られている。Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓの例では、５ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下で２．４％トルエンを含んだ緩衝液での処理、あるいは５ｍＭ  ＥＤＴＡ存在下で３％トリトンＸ−１００（非イオン性界面活性剤）を含んだ緩衝液で処理で、細胞外部から加えたＮＡＤＨで２−ケトレダクターゼが２−ペンタノンを、（Ｓ）−２−ペンタノールに還元する反応を触媒することが知られている（例えば非特許文献４参照）。
【００１２】
またセチルトリメチルアンモニウムブロミド溶液で処理したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの例では、ペニシリンアシラーゼの反応（例えば非特許文献５参照）や、Ｄ−ヒダントイナーゼの反応（例えば非特許文献６参照）や、グルタチオンシンテターゼの反応（例えば非特許文献７参照）が知られている。ペニシリンアシラーゼやＤ−ヒダントイナーゼでは反応の基質の透過性の付与が成されており、グルタチオンシンテターゼの反応では、アデノシン５´−三リン酸（ＡＴＰ）の透過性の付与が成されている。しかしこれまでに細菌の細胞内にあるモノオキシゲナーゼに細胞外から還元型の補酵素を供給して、モノオキシゲナーゼの酸化反応に利用させる方法は知られていなかった。
【００１３】
【特許文献１】
特許第２５６９４３４号
【非特許文献１】
Ｆｅｌｉｘ  Ｈ．（１９８２）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２０，２１１−２３４
【非特許文献２】
Ｆｅｌｉｘら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６，４６２−４７０
【非特許文献３】
Ｂｈａｔ  Ｎ．ら（１９９３）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１５（９），７９６−８００
【非特許文献４】
Ｎａｎｄｒｉ  Ｖ．Ｂ．ら（２０００）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，１７１−１７５
【非特許文献５】
Ｎａｇａｌａｋｓｈｍｉ  Ｖ．ら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８（６），４３１−４３４
【非特許文献６】
Ｙｉｎ  Ｂ．ら（２０００）Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，９１５−９２１
【非特許文献７】
Ｍｕｒａｔａ  Ｋ．ら（１９８０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０，１１−２１
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物に対して、細胞内のモノオキシゲナーゼを抽出しなくとも反応の補欠因子いわゆる補酵素であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをその細胞の外部から供給し、これによって細胞の代謝に依存した還元力を必要としない酵素的酸化反応を達成することにある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはモノオキシゲナーゼ活性を有する微生物にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの透過性を付与したのちに、その微生物を含んだ溶液に、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ（以下ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）と表記する）を供給し、この操作によって所望の還元力が供給されることを見出し本発明を完成した。
【００１６】
即ち本発明は、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの透過性を付与し、次いで当該微生物へＮＡＤ（Ｐ）Ｈを供給することを特徴とする、モノオキシゲナーゼに対する還元力の供給方法である。以下に本発明を詳細に記述する。
【００１７】
微生物のモノオキシゲナーゼには、そのヒドロキシラーゼコンポーネントが細胞膜に貫通し細胞質に存在するものと、膜とゆるく結合しているものとがあるが、本発明が適用できるモノオキシゲナーゼは可溶性のヒドロキシラーゼコンポーネントをもったものであり、以下これを可溶性のモノオキシゲナーゼと呼ぶ。可溶性のモノオキシゲナーゼはその微生物がもともと有しているものであっても、遺伝子組換えを行なって他の生物に由来したＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性モノオキシゲナーゼの遺伝子を発現させて生産されたものであっても、さらには遺伝子組換えにより、改変されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性モノオキシゲナーゼ遺伝子を発現させて生産されたものであってもよい。例えば、細菌や真菌や動物や植物などからモノオキシゲナーゼの遺伝子を得て、例えば大腸菌やシュードモナスなどの細菌あるいはサッカロミセスやシゾサッカロミセスなどの酵母あるいはシネココッカスなどのシアノバクテリアに、その得られたモノオキシゲナーゼ遺伝子を組み込んでモノオキシゲナーゼ活性を持つ微生物を得て、その微生物を使用してもよい。また微生物は必要に応じて培養して増殖させた後に、又は必要に応じてモノオキシゲナーゼの生産を誘導しながら培養した後に使用すればよい。
【００１８】
微生物にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの透過性を付与する方法としては、例えば有機溶媒（トルエン、エーテルなど）、界面活性剤、キレート試薬（ＥＤＴＡなど）等を適当な濃度含んだ溶液に浸漬すればよい。特に界面活性剤は溶液を均一化しやすく、また細胞内に試薬が浸透したときにも金属原子が活性に必須であるモノオキシゲナーゼの金属原子をキレートする恐れも少ないため、好ましいものである。使用される界面活性剤には例えば非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤などがあるが、陽イオン性界面活性剤とくに第４級アンモニウムまたはその塩を用いると比較的低濃度の溶液で細菌に透過性を付与することができる。
【００１９】
第４級アンモニウム塩の例としては、ｎ−オクチルトリメチルアンモニウム、ｎ−デシルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメチルアンモニウム、ｎ−テトラデシルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルジメチルエチルアンモニウム、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンジルセチルジメチルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、ラウリルピリジニウム、及びセチルピリジニウムなどがあげられる。
【００２０】
微生物に透過性を付与するために用いることができる界面活性剤の濃度は界面活性剤の種類、微生物の種類や微生物の調製の際の培養条件、処理の温度や時間によって異なる場合があるが、たとえば微生物を浸漬する温度が０〜４０℃では、界面活性剤の濃度は０．１〜１０ｍＭであればよく、好ましくは０．３ｍＭ〜３ｍＭである。
【００２１】
微生物を浸漬する界面活性剤溶液の温度は、０℃からその微生物が増殖可能な上限温度程度の範囲内であればよい。また界面活性剤の析出がなければ、凝固点降下を加味して０℃以下の凍結しない温度でそれを発現している微生物を浸漬しても良い。モノオキシゲナーゼの微生物体内での安定性や耐熱性が未知である場合は０〜１０℃程度の低温での処理をまずこころみるとよい。しかし微生物体内での安定性や耐熱性が高いモノオキシゲナーゼをもつ微生物、および／または、熱安定性が高い膜をもつ微生物も存在しうるので、それらのような微生物または人為的に熱安定性等が改良されたモノオキシゲナーゼをもつ微生物であるならば適宜、実験的に温度を定めればよい。界面活性剤溶液のｐＨは微生物が透過性を付与された後のモノオキシゲナーゼの安定性に配慮したものであれば良く、ｐＨ５からｐＨ９、より好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８である。
【００２２】
界面活性剤溶液に浸漬する微生物の濃度は、処理後の微生物の利用の仕方によるが、界面活性剤溶液と均一にまざり温度が制御できる範囲で高濃度であることが望ましい。例えば波長６００ｎｍの吸光度を指標として微生物の濃度の目安とする場合で、かつ、界面活性剤溶液と微生物懸濁液とを等量ずつ混合する方法で界面活性剤処理を開始する方法をとる場合では、界面活性剤溶液を加える前の時点での微生物懸濁液の濃度が波長６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）の値で１〜２００になるような微生物濃度とすればよく、浸漬処理前や浸漬処理後の取り扱いのうえからは、より好ましくは４０〜１００である。また透過性付与に用いた界面活性剤の量と微生物の量の割合は、微生物の種類によっては透過性付与後の微生物の細胞内のモノオキシゲナーゼの活性に影響する場合もあるので、界面活性剤処理条件を検討する上で界面活性剤の量と微生物の量の割合を把握しておくとよい。
【００２３】
界面活性剤溶液に微生物を浸漬する時間は１分から３時間であればよく、透過性を付与された微生物の補酵素依存性のモノオキシゲナーゼ活性が高くなる条件を実験して定めればよい。
【００２４】
また界面活性剤溶液に微生物を浸漬している間は菌が沈殿しない程度にゆるやかに、振とうあるいは攪拌を行い、微生物が均一に懸濁するようにするのが望ましい。
【００２５】
界面活性剤溶液での浸漬を施した微生物は、その後、適当な緩衝液で界面活性剤を希釈したり、遠心分離やろ過などの方法で界面活性剤と微生物とを分離したり、分離した微生物をさらに緩衝液で洗浄したりすることが好ましいが、モノオキシゲナーゼの反応に支障がなければこの限りではない。しかし界面活性剤処理された微生物の細胞外部から加えられた補酵素に依存したモノオキシゲナーゼ活性を確認するためには、界面活性剤処理された微生物のモノオキシゲナーゼがその処理された微生物の細胞内部に保持されており、かつ、内在性の補酵素を低減したうえで分析するのが望ましい。そのための方法として界面活性剤処理された微生物を洗浄したのちにモノオキシゲナーゼの活性を分析する方法が例示できる。
【００２６】
モノオキシゲナーゼ活性の分析に用いる基質は、用いたモノオキシゲナーゼの基質になり得るものであればよい。反応系には必要に応じて酸素を加えればよく、大気中から反応溶液に溶け込んだ酸素だけでも十分な場合もある。反応は開放系でも密閉系でもよいが、基質や生成物が揮発しやすいものであれば密閉系がこのましく、その際には反応に十分な酸素が供給されるように工夫すればよい。
【００２７】
モノオキシゲナーゼの活性測定の反応に用いる微生物の濃度はＯＤ６００の値で０．５〜１０、反応温度は実験に用いた微生物の生育温度程度、反応時間は０．５時間から２４時間が例示できるが、モノオキシゲナーゼの反応の条件は実験して適宜設定すればよい。
【００２８】
補酵素の透過性の評価はモノオキシゲナーゼ活性測定系に補酵素を加えない場合の活性と加えた場合の活性とを比較して行なう。補酵素はモノオキシゲナーゼの性質に応じてＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨのいずれかまたは両方を用いればよい。活性測定に使用する補酵素の濃度は、例えば０．１ｍＭ〜２０ｍＭの濃度で実験して定めればよいが、補酵素や反応の結果生じたＮＡＤやＮＡＤＰが反応を阻害しなければ特に上限はない。
【００２９】
補酵素添加の場合の活性から補酵素無添加の場合の活性を差し引いた値が正の値となるときに、その値が透過性を付与された微生物の活性と考えられ、補酵素無添加での活性は界面活性剤による処理で透過性を付与されなかった微生物のモノオキシゲナーゼが内在性の補酵素を使って反応したものと考えられる。したがって補酵素無添加の場合では活性がなく、補酵素を添加すると活性が現れるような界面活性剤処理の条件を設定すればよい。
【００３０】
【実施例】
発明を更に詳細に説明するために以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１
ナフタレンを酸化して１−ナフトールを生成する活性を有するトルエン２−モノオキシゲナーゼを生産する事が知られているＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４（ＤＳＭ１１７３７）を、Ｙｅａｇｅｒ  Ｃ．Ｍ．ら：Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、６５（２）、６３２−６３９に記載のｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（以下ではＢａｓａｌ  Ｓａｌｔｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＢＳＭと呼ぶ）に５．５ｍｌの２０ｍＭ乳酸を加えた培地（以下ＢＳＭ−ｌａｃｔａｔｅ培地と呼ぶ）を加えた試験管で温度３０℃で１６時間振とうして前培養した。得られた前培養液の菌密度は波長６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）の値で２．０５であった。
【００３２】
２１μｌのトルエンを加えたＢＳＭ−ｌａｃｔａｔｅ培地１２０ｍｌと前培養した液５ｍｌとを５００ｍｌサイズのバッフル付三角フラスコにいれ、温度３０℃で２００ｒｐｍの回転速度で振とう培養（４時間）した。得られた培養液の菌密度はＯＤ６００値が０．３７８であった。
【００３３】
これを遠心分離して菌を回収したのち、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）でリンスした。すなわち菌を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に再懸濁したのち再び遠心分離して菌を集めた。この操作を２度おこなったのち、同緩衝液でＯＤ６００値が５０になるように菌懸濁液を調製した。
【００３４】
マイクロ遠心チューブに菌懸濁液０．５ｍｌを加えて、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に２ｍｇ／ｍｌになるようにセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）を溶かした溶液を０．５ｍｌ加えて、マイクロ遠心チューブを横にして４℃で３０分間振とう（１００ｒｐｍ）した。それを遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１分間、４℃）して沈殿画分を得た。それを５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）０．５ｍｌで２回リンスしたのち、同緩衝液１ｍｌに再懸濁して、ＣＴＡＢ処理されたＢ．ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４の懸濁液を得た。
【００３５】
ＣＴＡＢ処理されたＢ．ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４のトルエン２−モノオキシゲナーゼ活性はナフタレンを基質に用いて生成する１−ナフトールを以下のようにして定量して調べた。
【００３６】
栓付ガラス試験管（８ｍｌ容）にＮＡＤＨ水溶液５００μｌとジメチルホルムアミドを溶媒にして調製した１０ｍＭ  ナフタレン溶液１０μｌおよびＣＴＡＢ処理されたＢ．ｃｅｐａｃｉａの懸濁液５００μｌを加えて、栓をして２５℃で１６時間往復振とう（毎分２８０往復）した。
【００３７】
その反応液を遠心分離して得た上清８００μｌに酢酸エチル８００μｌおよび塩化ナトリウム０．４ｇを加えて室温で１時間振とうした。それを遠心分離して酢酸エチルの画分を採取した。得られた酢酸エチル画分の６４０μｌに、メタノール：Ｈ２Ｏ＝７：３の溶媒で調製した０．２％ｗ／ｖテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩溶液１６０μｌ（氷冷）を加えて、室温で１時間反応させた。１−ナフトールとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの反応で生じた色素は波長５２８ｎｍの吸光度で測定し、既知濃度の１−ナフトールで作成した検量線から１−ナフトールの濃度を定量した。
【００３８】
また得られた酢酸エチル画分をＯＤＳ−１２０Ｔカラム（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ、東ソー株式会社製の逆相カラム）を用いてＨＰＬＣにより分析した。操作は、カラム温度を５０℃として、溶離液には試料ロードから５分間はメタノール／水＝６／４の溶液、次の５分間でメタノール／水＝６／４から９５／５の溶液への直線濃度勾配、次の４分間はメタノール／水＝９５／５の溶液で、流速０．８ｍｌ／分で実施した。検出には波長２７０ｎｍの吸光度を用いた。
【００３９】
その結果、ＣＴＡＢ処理されたＢ．ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４にＮＡＤＨを加えないでおこなったナフタレンの酸化反応では、ナフタレン（ＨＰＬＣでの保持時間１３．７分）が残存し、１−ナフトールや２−ナフトール（ＨＰＬＣでの保持時間はそれぞれ７．７分と７．２分）の生成は認められなかった。一方ＮＡＤＨを加えて行なった反応ではＮＡＤＨの濃度が１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭのときには、１−ナフトールが生成しており、それぞれ５μＭ、９μＭ、９μＭの濃度であり、細胞外部に添加したＮＡＤＨに依存した活性が認められた。以上から細菌細胞内のモノオキシゲナーゼに細胞外からＮＡＤＨを供給して酸化反応を行なえることがわかる。
【００４０】
実施例２
Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｍ．Ｓ．らの報告（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９１、５７、１９３５）を参考にしてＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ  Ｇ４からＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化して得た約１０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ部位に組み込んで、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９に導入した。その中から、トルエン２−モノオキシゲナーゼの活性とカテコール２，３−ジオキシゲナーゼの活性をもつ大腸菌を得て、それをＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１と命名した。
【００４１】
ついでＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１から得たプラスミドを鋳型にして、配列番号１のプライマーＦと配列番号２のプライマーＲとを用いたＰＣＲで増幅したのち、制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化してＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を得た。またＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１から得たプラスミドをＳａｌＩとＫｐｎＩとで消化してＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片を得、これを前述のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片とともに、プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア  バイオテク社製）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ部位に組み込んでプラスミドｐＴ２ＭＯ１２を構築した。そのｐＴ２ＭＯ１２を用いて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換してトルエン２−モノオキシゲナーゼの活性をもち、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼの活性はないＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２を得た。
【００４２】
ＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２を１％ペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンナトリウムからなるｐＨ７の培地（以下、ＬＢ−Ｃａｒｂ培地という）２５ｍｌに植菌して温度３７℃で１６時間振とうして前培養した。得られた前培養液の菌密度はＯＤ６００値で３．４２であった。
【００４３】
５００ｍｌサイズのバッフル付三角フラスコにＬＢ−Ｃａｒｂ培地１２０ｍｌに加えて、前培養液をＯＤ６００値が０．２になるように添加して温度３７℃で１８０ｒｐｍの回転速度で振とう培養した。培養から１．５時間後（ＯＤ６００値が１．０９）に１ｍＭになるようにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えてさらに２時間培養した。その結果得られた培養液の菌密度はＯＤ６００値が２．１９であった。
【００４４】
それを遠心分離して菌を回収したのち、１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ））−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）で２回リンスしたのち同緩衝液でＯＤ６００値が２４になるように菌懸濁液を調製した。その菌体懸濁溶液の一部に等体積の０．５ｍＭ  ＣＴＡＢ水溶液を加えて２５℃で１時間振とう（１００ｒｐｍ）した。
【００４５】
それを遠心分離して得た沈殿画分を５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回リンスしたのち、同緩衝液を用いてＯＤ６００値が１０になるように再懸濁して、ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の懸濁液を得た。
ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２のトルエン２−モノオキシゲナーゼ活性はナフタレンを基質に用いて生成する１−ナフトールを以下のようにして定量して調べた。
【００４６】
栓付ガラス試験管に、イオン交換水（対照）、２％グルコース、２ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液、または２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ水溶液を５００μｌと、ジメチルホルムアミドを溶媒にして調製した１０ｍＭ  ナフタレン溶液１０μｌを加えたのち、ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の懸濁液５００μｌを加えて、栓をして３７℃あるいは４２℃で１時間往復振とう（毎分１６０往復）した。
【００４７】
その反応液に酢酸エチル１ｍｌおよび塩化ナトリウム０．５ｇを加えて室温で１時間振とうした。それを遠心分離して酢酸エチルの画分を採取した。得られた酢酸エチル画分の６４０μｌに、メタノール：Ｈ２Ｏ＝７：３の溶媒で調製した０．２％ｗ／ｖテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩溶液１６０μｌ（氷冷）を加えて、室温で１時間反応させた。１−ナフトールとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの反応で生じた色素は波長５２８ｎｍの吸光度で測定し、既知濃度の１−ナフトールで作成した検量線から１−ナフトールの濃度を定量した。
【００４８】
結果は図１に示したように、３７℃と４２℃のいずれの反応温度においても、ＮＡＤＰＨ、あるいはＮＡＤＨに依存した１−ナフトールの生成が認められた。以上から、細胞内のモノオキシゲナーゼに対して細胞の外部から補酵素であるＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨを供給して酸化反応が行なえることが分かる。
【００４９】
実施例３
ＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２を実施例２と同様に前培養し、前培養液を植え継いでから１．５時間後（ＯＤ６００値が０．９６６）に１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えてさらに３．５時間培養した。その結果、得られた培養液の菌密度はＯＤ６００値が３．３６であった。
【００５０】
それを遠心分離して菌を回収したのち、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で２回リンスしたのち同緩衝液に菌懸濁液を調製した。このとき菌懸濁液ＯＤ６００値は５０．７であった。その菌体懸濁溶液の０．５ｍｌずつに等体積のＣＴＡＢ水溶液を加えて、ＣＴＡＢ濃度０ｍＭ，１．３７ｍＭ，２．４７ｍＭ，又は５．４９ｍＭで４℃で３０分間振とうした。
【００５１】
それを遠心分離して得た沈殿画分を５０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．５ｍｌで２回リンスしたのち、同緩衝液１ｍｌを用いて再懸濁して、ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の懸濁液を得た。
ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２のトルエン２−モノオキシゲナーゼ活性はナフタレンを基質に用いて生成する１−ナフトールを以下のようにして定量して調べた。
【００５２】
栓付ガラス試験管に濃度０ｍＭ〜１０ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液５００μｌとジメチルホルムアミドを溶媒にして調製した１０ｍＭ  ナフタレン溶液１０μｌを加えたのち、ＣＴＡＢ処理されたＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の懸濁液５００μｌを加えて、栓をして３７℃で２時間往復振とう（毎分１６０往復）し、ＮＡＤＨ濃度０ｍＭ，１ｍＭ，２．５ｍＭ，又は５ｍＭの存在下でナフタレン酸化反応を行った。
【００５３】
その反応液に酢酸エチル１ｍｌおよび塩化ナトリウム０．５ｇを加えて室温で１時間振とうした。それを遠心分離して酢酸エチルの画分を採取した。得られた酢酸エチル画分の１−ナフトールの濃度を実施例２と同様にして定量した。
【００５４】
結果は図２に示したように、１．３７ｍＭのＣＴＡＢを含んだ溶液中で処理した菌は、細胞外部から供給されたＮＡＤＨに依存した１−ナフトールの生成、すなわち外部からナフタレン酸化活性があることがわかる。またその活性はＮＡＤＨが５ｍＭのときにＣＴＡＢ非処理（０ｍＭ）の菌と同程度の活性を示したことから、細胞内のモノオキシゲナーゼに対して細胞の外部から補酵素を供給して酸化反応が行なえることが分かる。
【００５５】
実施例４
実施例２と同様に培養してＩＰＴＧで誘導したＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２を得た。それを１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回リンスしたのち同緩衝液で菌懸濁液を調製した。その菌懸濁液（ＯＤ６００値が４８．９）を、０．７５ｍｌずつ用いて菌数は一定にしたうえで、表１に示した菌密度（ＯＤ６００値）、ＣＴＡＢ濃度、体積になるように、ＣＴＡＢと１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したのち、３７℃で１時間振とう（１６０ｒｐｍ）した。
【００５６】
ＣＴＡＢ溶液で処理されたそれぞれの菌を遠心分離して集菌したのち１ｍｌの１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回リンスしたのち、１．２ｍｌの同緩衝液を用いて再懸濁して、ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の懸濁液を得た。
ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２のトルエン２−モノオキシゲナーゼ活性はナフタレンを基質に用いて生成する１−ナフトールを以下のようにして定量して調べた。
【００５７】
栓付ガラス試験管にイオン交換水又は１０ｍＭ  ＮＡＤＨ水溶液を５００μｌとジメチルホルムアミドを溶媒にして調製した１０ｍＭ  ナフタレン溶液１０μｌを加えたのち、ＣＴＡＢ処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の懸濁液５００μｌを加えて、栓をして３７℃で１時間往復振とう（毎分１６０往復）した。
【００５８】
その反応液に酢酸エチル１ｍｌおよび塩化ナトリウム０．５ｇを加えて室温で１時間振とうした。それを遠心分離して酢酸エチルの画分を採取した。得られた酢酸エチル画分の６４０μｌに、メタノール：Ｈ２Ｏ＝７：３の溶媒で調製した０．２％ｗ／ｖテトラゾ化ｏ−ジアニシジン亜鉛塩溶液１６０μｌ（氷冷）を加えて、室温で１時間反応させた。１−ナフトールとテトラゾ化ｏ−ジアニシジンの反応で生じた色素は波長５２８ｎｍの吸光度で測定し、既知濃度の１−ナフトールで作製した標準曲線から１−ナフトールの濃度を定量した。
【００５９】
なおＣＴＡＢ処理に供する前の菌懸濁液中の菌数およびＣＴＡＢ溶液浸漬１時間後の菌懸濁液中の生菌濃度を、それぞれの懸濁液を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈したのち、ＬＢ−Ｃａｒｂ寒天培地に植菌して３７℃で一晩培養してからコロニー数を計測して算出した。その結果、ＣＴＡＢ処理に供する前の菌懸濁液（ＯＤ６００値が４８．９）の菌数は２．９×１０９個／ｍｌであった。またＣＴＡＢ処理後の菌懸濁液中の菌の生存率は、いずれも１％未満であった。
【００６０】
【表１】
2004305016.tif 000003
表１に結果を示したように、ＣＴＡＢで処理されたＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２はいずれもＮＡＤＨに依存したナフタレン酸化活性を示した。また表１から、本実施例であるＪＭ１０９／ｐＴ２ＭＯ１２の３７℃、１時間のＣＴＡＢ処理において、処理開始時の菌数１０９個あたりのＣＴＡＢ量が０．３５μｍｏｌのときに、調製された菌の活性が高くなることが分かる。
【００６１】
実施例５  各種カチオン界面活性剤処理大腸菌の調製
実施例２に記載の配列番号１のプライマーＦの代わりに、配列番号３のプライマーを用いた以外は、実施例２と同様にしてプラスミドｐＴ２ＭＯ１１を得た。そのｐＴ２ＭＯ１１を用いて大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換してトルエン２−モノオキシゲナーゼの活性をもち、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼの活性はないＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１を得た。
【００６２】
ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１を、実施例１に記載のＢＳＭにチアミン塩酸、グルコース、カルベニシリンナトリウムをそれぞれ１０μｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌになるように加えた培地（ＢＳＴＧ−Ｃａｒｂ培地）に植菌して温度３７℃で２０時間振とうして前培養した。得られた前培養液の菌密度はＯＤ６００値で１．９１であった。
【００６３】
５００ｍｌサイズのバッフル付三角フラスコに、ＯＤ６００値が０．２８になるように前培養液をＢＳＴＧ−Ｃａｒｂ培地で希釈して、その１２５ｍｌを加えて、温度３７℃で１６０ｒｐｍの回転速度で振とう培養した。培養から２時間後（ＯＤ６００値が０．３７）に１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えてさらに２時間培養した。その結果得られた培養液の菌密度はＯＤ６００値が１．１８であった。
【００６４】
これを遠心分離して菌を回収したのち、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回リンスしたのち同緩衝液でＯＤ６００値が２４になるように菌懸濁液を調製した。その菌体懸濁溶液を８００μｌずつ小分けにして、それに等体積の界面活性剤の水溶液を加えて０℃で１時間振とう（１００ｒｐｍ）した。
【００６５】
それを遠心分離して得た沈殿画分を５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２回リンスしたのち、同緩衝液１．９ｍｌを用いて再懸濁して、界面活性剤溶液でそれぞれ処理されたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１の懸濁液を得た。界面活性剤はＣＴＡＢ、ラウリルトリメチルアンモニウムブロミド（ＬＴＡＢ）、又はセチルピリミジニウムクロリド（ＣＰＣ）をそれぞれ０．２５ｍＭ，０．５ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭで処理した。また対照として界面活性剤なしでも同様に行った。
【００６６】
界面活性剤溶液で処理されたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１のトルエン２−モノオキシゲナーゼ活性を、実施例２と同様にしてナフタレンを基質に用いて生成する１−ナフトールを定量して調べた。ただしＮＡＤＨ水溶液の濃度は１０ｍＭ（対照試料にはイオン交換水）とし、それを５００μｌと、ジメチルホルムアミドを溶媒にして調製した１０ｍＭ  ナフタレン溶液１０μｌおよび０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）４００μｌを加えたのち、界面活性剤処理されたＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＴ２ＭＯ１１の懸濁液１００μｌを加えて、栓をして３７℃で１時間往復振とう（毎分１６０往復）した。
【００６７】
結果は図３に示したようにＣＴＡＢ以外にも、ＬＴＡＢやＣＰＣのような陽イオン性界面活性剤で処理した菌でも、細胞外部から供給されたＮＡＤＨに依存した１−ナフトール生成が認められた。
【００６８】
【発明の効果】
本発明で提供されるモノオキシゲナーゼに対する還元力の供給方法は、モノオキシゲナーゼ活性をもつ微生物にＮＡＤ（Ｐ）Ｈの透過性を付与することで、微生物細胞内部のモノオキシゲナーゼが分子状酸素を使って酸化反応するときに必要な還元力を微生物細胞外部から供給することを可能にした。すなわちモノオキシゲナーゼ活性をもつ微生物をそのまま用いて行なう酸化反応では微生物細胞外部からは供給できなかったＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、微生物を陽イオン性界面活性剤溶液に浸漬する処理を施すことで、その細胞外部からその内部のモノオキシゲナーゼに供給して酸化反応に利用する方法を提供できた。本発明の方法はモノオキシゲナーゼ用いて行う酸化反応への応用に道を開くものである。
【配列表】
2004305016.tif 000004
2004305016.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２の反応条件と生成した１−ナフトール濃度の関係を示す図である。
【図２】実施例３の反応条件と生成した１−ナフトール濃度の関係を示す図である。
【図３】実施例５の反応条件と生成した１−ナフトール濃度の関係を示す図である。
【図１】
2004305016.tif 000006
【図２】
2004305016.tif 000007
【図３】
2004305016.tif 000008