(57)【要約】【課題】植物の成長を促進するための新たな手段を提供することが、本発明の課題である。【解決手段】本発明により、植物由来のサイクリンＢ２遺伝子を植物に導入することを特徴とする、新たな植物の成長促進方法が与えられた。サイクリンＢ２遺伝子の過剰発現によって細胞分裂が活性化するために、根などの成長器官の伸長が促進するものと考えられる。植物の成長を促進することができるために、本発明の技術は、生物資源の増産などに資するものと考えられる。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来のサイクリンＢ２遺伝子を植物に導入することを特徴とする、植物の成長を促進させる方法。
【請求項２】
前記サイクリンＢ２遺伝子が、イネ由来のサイクリンＢ２；２遺伝子である、請求項１記載の植物の成長を促進させる方法。
【請求項３】
前記植物が単子葉植物である、請求項１記載の植物の成長を促進させる方法。
【請求項４】
前記植物がイネである、請求項３記載の植物の成長を促進させる方法。
【請求項５】
植物由来のサイクリンＢ２遺伝子を植物に導入することを特徴とする、成長が促進した形質転換植物の生産方法。
【請求項６】
前記サイクリンＢ２遺伝子が、イネ由来のサイクリンＢ２；２遺伝子である、請求項５記載の形質転換植物の生産方法。
【請求項７】
前記植物が単子葉植物である、請求項５記載の形質転換植物の生産方法。
【請求項８】
前記植物がイネである、請求項７記載の形質転換植物の生産方法。
【請求項９】
植物由来のサイクリンＢ２遺伝子が導入されることにより成長が促進していることを特徴とする、形質転換植物。
【請求項１０】
前記サイクリンＢ２遺伝子が、イネ由来のサイクリンＢ２；２遺伝子である、請求項９記載の形質転換植物。
【請求項１１】
前記植物が単子葉植物である、請求項９記載の形質転換植物。
【請求項１２】
前記植物がイネである、請求項１１記載の形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物由来のサイクリンＢ２遺伝子を植物に導入することを特徴とする、植物の成長促進方法に関する。更に本発明は前記方法により作製された形質転換植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
将来において人口が増加して食糧危機が起こることが予想されるために、穀物を初めとした種々の作物の収量増加を図ることが求められている。食糧増産のためのアプローチの一つとして、細胞増殖や細胞分裂に関与している因子を制御することによって植物の成長を促進させるという、分子育種学的な手法が多様な観点から試みられてきている。また近年の研究の進歩によって、細胞増殖や細胞分裂に関与する因子についての知見が急速に増加してきた。
【０００３】
ところで、真核細胞における細胞周期の進行は、セリン／スレオニン蛋白質キナーゼであるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって駆動していることが知られている。そしてＣＤＫの酵素触媒活性はサイクリンとの結合により制御され、サイクリンはＣＤＫのいわば調節サブユニットに相当している。即ち、ＣＤＫは細胞周期の進行の鍵となるキナーゼであり、ＣＤＫとサイクリンが活性型の複合体を形成することが細胞分裂において必須である。サイクリン／サイクリン依存性キナーゼ系は、現在注目されている細胞分裂の制御系の一つであって、サイクリン／サイクリン依存性キナーゼ系による細胞分裂の制御機構の詳細については、いくつかの総説において解説されている（非特許文献１−３）。
【０００４】
ＣＤＫの同定は元々酵母や動物において行われたが、酵母や動物の遺伝子との相同性を利用して、植物由来のＣＤＫも採取されている。同一の植物種に複数のＣＤＫが存在しており、細胞周期のステージなどに合わせてＣＤＫを使い分けている。そしてこれらのＣＤＫは発現時期が重なるサイクリンと複合体を形成し、特定の基質をリン酸化すると考えらえている。
【０００５】
なお、植物から単離されたサイクリンは、動物のサイクリンとの類似性を基に３種類（サイクリンＡ，  サイクリンＢ，  サイクリンＤ）に大別される。更に最近の研究の進歩により、イネにおいてサイクリンＣ，  サイクリンＨも同定された。サイクリンＡとサイクリンＢは主としてＳからＭ期で発現するサイクリンであるが、更にそれぞれ、３種類（サイクリンＡ１，  サイクリンＡ２，  サイクリンＡ３）と２種類（サイクリンＢ１，  サイクリンＢ２）のサブクラスに分類されている。サイクリンＡとサイクリンＢの遺伝子は、組織中において分裂組織を中心に発現することが知られている。
【０００６】
細胞周期の中でもＧ１／Ｓ期とＧ２／Ｍ期は細胞分裂の速度を制御する上で重要なステージである。よって、Ｇ１／Ｓ期またはＧ２／Ｍ期でおいて作用するサイクリンをコードする遺伝子を過剰発現することにより、植物の成長が促進することが報告されている。そのような例として、Ｄｏｅｒｎｅｒらはシロイヌナズナ由来のサイクリンＢ１；１の遺伝子によってシロイヌナズナの形質転換を行うことにより、サイクリンＢ１；１を過剰発現した植物体を作製したところ、根の伸長が促進したことを示している（Ｄｏｅｒｎｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ，“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｏｏｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  Ｎａｔｕｒｅ，  （１９９６）  ３８０，  ｐ５２０−５２３：非特許文献４）。更にＣｏｃｋｃｒｏｆｔらは、シロイヌナズナ由来のサイクリンＤ２遺伝子をタバコに導入して過剰発現させることにより、地上部・根共に成長速度が速くなることを明らかにした（Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ  Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ，“Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ”  Ｎａｔｕｒｅ，  （２０００）  ４０５，  ｐ５７５−５７９：非特許文献５）。
【０００７】
上記の文献においてＣｏｃｋｃｒｏｆｔらが用いたサイクリンＤ２は細胞周期の主としてＧ１／Ｓ期に機能するサイクリンである。また、Ｄｏｅｒｎｅｒらが用いたサイクリンＢ１；１はＧ２／Ｍ期に機能するサイクリンであるが、サイクリンＢ１；１の植物の成長促進効果は再現性という意味で必ずしも満足のいくものではない。よって、サイクリンの植物成長を促進させる効果については、更に検討を行う必要があった。
【０００８】
【非特許文献１】
梅田正明「サイクリン依存性キナーゼによる細胞周期の制御と分裂組織の維持機構」「細胞工学」別冊  植物細胞工学シリーズ１３  秀潤社  ｐ３７−４８
【非特許文献２】
梅田正明「器官形成による細胞分裂の制御機構」蛋白質  核酸  酵素  ２００２年  Ｖｏｌ．４７    ｐ１６２８−１６３２
【非特許文献３】
Ｕｍｅｄａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，“Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｉｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ”  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （２０００）  １７，  ｐ１７７−１８６
【非特許文献４】
Ｄｏｅｒｎｅｒ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｏｏｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  Ｎａｔｕｒｅ，  （１９９６）  ３８０，  ｐ５２０−５２３
【非特許文献５】
Ｃｏｃｋｃｒｏｆｔ  Ｃ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ”  Ｎａｔｕｒｅ，  （２０００）  ４０５，  ｐ５７５−５７９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、サイクリン／サイクリン依存性キナーゼの経路を操作することにより、植物の成長促進を行うことができる新たな手段を提供することが、本発明の課題である。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
サイクリンには多様性があり、例えばシロイヌナズナには３０種類以上のサイクリンが知られているが、異なったサイクリンはそれぞれ異なった機能を有していると考えられる。そのような多様なサイクリンの中で本発明者らは、Ｇ２／Ｍ期で特異的に発現するサイクリンＢ２；２（ＣｙｃＢ２；２）遺伝子に注目してこの遺伝子の担っている機能を検討した。なお、イネ由来のＢ２型のサイクリンが細胞分裂のＧ２／Ｍ期に作用することがＵｍｅｄａらにより示されている（Ｍ．Ｕｍｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｙｃｌｉｎｓ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ｐｌａｎｔｓ”  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  （１９９９）  ２６２，  ｐ２３０−２３８）。
【００１１】
その結果、イネ由来のＣｙｃＢ２；２遺伝子を過剰発現させることにより細胞分裂を活性化させて植物の成長を促進することに成功した。具体的には、下記の実施例において示すように、グルココルチコイドにより転写が誘導されるベクターに上記のＣｙｃＢ２；２遺伝子を導入して発現ベクターを作製した。アグロバクテリウム法を用いてこの発現ベクターをイネに導入したところ、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現はイネの根の伸長を促進させることが示された。よって本発明は、植物由来のサイクリンＢ２（ＣｙｃＢ２）遺伝子を植物に導入することを特徴とする、植物の成長促進方法である。更に、本発明の方法により作製された形質転換植物も本発明の範囲内である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明において植物の成長を促進させるために、ＣｙｃＢ２遺伝子を植物に導入して過剰発現させる。イネ由来のＣｙｃＢ２遺伝子にはＣｙｃＢ２；１遺伝子とＣｙｃＢ２；２遺伝子のサブタイプが存在し、ＣｙｃＢ２；１蛋白質とＣｙｃＢ２；２蛋白質は共に、サイクリン依存性キナーゼＢ２；１（ＣＤＫＢ２；１）に結合することを本発明者は初めて見出した（未公開データ）。この相互作用に依存してＣＤＫＢ２；１のキナーゼ活性が活性化して細胞分裂を促進し、よって植物の成長が促進すると考えられる。
【００１３】
下記の実施例においてはイネ由来のＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現によるイネの成長促進を示しているが、本発明において使用できるサイクリンはその範囲に限定されるものではない。他の種に由来するＣｙｃＢ２；２遺伝子、或いは種々の植物種に由来するＣｙｃＢ２；１遺伝子など他のＣｙｃＢ２遺伝子を過剰発現することによっても植物の成長を促進できる可能性が考えられる。よって、本発明の範囲はそのような態様もまた含むものである。
【００１４】
また宿主となる植物についても種々の植物種を用いることが可能である。用いられる植物種として、それらに限定されるものでないが、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、アスパラガスなどの単子葉植物や、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、トマト、ジャガイモなどの双子葉植物を挙げることができる。中でも、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシなどの主要穀物の成長を促進させることは食糧の増産という意味で好ましく、下記の実施例で使用しているイネを用いることは特に好ましい。
【００１５】
植物細胞においてＣｙｃＢ２遺伝子を過剰発現させるために、市販の酵素試薬を使用してバイナリーベクターにＣｙｃＢ２遺伝子をクローニングすることによって発現ベクターを構築する。クローニングの手法は本分野の当業者によく知られており、市販の制限酵素試薬やキットなどを使用して当業者はＣｙｃＢ２遺伝子をクローニングすることができる。
【００１６】
本発明の好適な態様において、発現ベクターを構築する目的のために適切なベクターを選択する。下記の実施例においてはＣｙｃＢ２；２遺伝子が過剰発現した形質転換体を作製しているが、該植物体においてＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現が植物体に悪影響を及ぼす可能性を考えて、グルココルチコイド誘導性ベクターであるｐＴＡ７００２を用いて発現ベクターを構築した。しかし、実際にはＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現は植物体に害を与えなかったため、誘導発現系のベクターのみならず、恒常発現系のベクターも使用することが可能である。使用することができるその他のベクターの例として、ｐＢＩ１２１やｐＢＩ１２２などのプラスミドベクターを挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、本技術分野で汎用されている種々のベクターを使用することができる。
【００１７】
この様にして構築した発現ベクターを大腸菌に形質転換し、形質転換された大腸菌を培養することによりその発現ベクターを増幅することができる。そしてその発現ベクターを形質転換する宿主植物に導入することにより、該植物の形質転換を行う。形質転換を行う方法として、本技術分野において汎用されている種々の手法を用いることができる。その様な手法として最も好適であるのはアグロバクテリウム法である。好適な態様としては、下記の実施例で行っているように、エレクトロポレーション法を用いて発現ベクターをアグロバクテリウム菌に導入し、その後にそのアグロバクテリウム菌を植物のカルスに感染させることにより、植物の形質転換を行うことができる。その他の植物の形質転換方法としては、例えばエレクトロポレーション法やＰＥＧ法なども使用することができる。
【００１８】
カルスから根やシュートの再生を行った後、遺伝子が導入された形質転換個体を選抜することができる。形質転換個体の選抜は種々の方法により行うことができるが、例えば、発現ベクターに抗生物質に対する耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を組み込み、抗生物質を含む培地で培養して抗生物質の存在下で生育することにより、遺伝子導入個体を選抜することができる。
【００１９】
上記の手法により作製されたＣｙｃＢ２；２遺伝子を導入した形質転換植物において、明らかな根の成長促進が認められた。植物の生育は根からの栄養分の吸収によって成り立つことや、根の発達は様々な環境条件下で植物がその体制を維持する上で重要であることを考えると、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現によって根の発達が見られた意義は大きい。根は基本的に無限に成長する器官であるために、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現による効果が顕著に見られたものと考えられる。細胞周期を制御するというサイクリン／サイクリン依存性キナーゼ系の機能を考えると、成長促進効果は根のみならず、茎や葉などの他の成長組織においても認められるものと考えられる。本発明の方法は、植物体において種々の組織の成長を促進させる方法を与えるものであって生物資源を増やすことに資することを考えると、本発明の意義は大きいと考えられる。
以下、本発明を実施例により更に説明するが、これら実施例のみによって限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
（実施例１）
（植物細胞での発現ベクターの構築）
グルココルチコイド誘導性ベクターｐＴＡ７００２はロックフェラー大学のＮａｍ−Ｈａｉ  Ｃｈｕａ博士より分与された。この実施例では、既に本発明者らによって単離されたイネ由来のＣｙｃＢ２；２遺伝子のｃＤＮＡ断片を用いた。ここで使用したイネ由来のＣｙｃＢ２；２の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。ｃＤＮＡの開始コドンから終止コドンまでの１２６０塩基対にわたる領域を制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩによって切り出し、その断片をｐＴＡ７００２ベクターのＳｐｅＩとＸｈｏＩ部位にクローニングし、これにより発現ベクターを構築した。
【００２１】
（イネヘの遺伝子導入）
まず、発現ベクターをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５株にエレクトロポーレション法により導入し、抗生物質カナマイシン耐性のクローンに発現ベクターが導入されていることを確認した。植物材料はイネ（Ｏｚｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．  ｖａｒ．  Ｎｉｐｐｏｎｂａａｒｅ）の胚由来のカルスを用い、これに発現プラスミドをもつアグロバクテリウムを感染させた。その後、抗生物質ハイグロマイシンでＣｙｃＢ２；２遺伝子が導入された系統を選抜し、根とシュートを再生させ独立個体を得た。得られた種子を改めてハイグロマイシンを含む培地で発芽・生育させることにより形質転換個体を選抜し，  以下のアッセイに用いた。
【００２２】
（実施例２）
（ＣｙｃＢ２；２遺伝子の発現解析）
イネに導入したＣｙｃＢ２；２遺伝子が実際にグルココルチコイド誘導的に発現するか否かを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ；逆転写ＰＣＲ）法により転写産物を増幅した。形質転換イネの幼植物体を、グルココルチコイド誘導体の一種である１μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含む培地上で２４時間培養し、全ＲＮＡをＳＤＳ−フェノール法により抽出した。アマシャムバイオサイエンス社のＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓを使用してＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。なお、以下の２本のＣｙｃＢ２；２特異的な配列をプライマーとして用いた。
５’−ＡＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＡＣＴＴＴ−３’
５’−ＴＧＴＡＣＡＴＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴ−３’
【００２３】
ＰＣＲの反応条件として、４２℃，１５分、９５℃，５分の反応を行った後に、９５℃，１分；５５℃，１分；７２℃，４５秒という反応を２５サイクル行い、最後に７２℃，７分間反応するという条件を採用した。ＰＣＲ反応産物は、電気泳動後にエチジウムブロミド染色により検出した。その結果、ＤＥＸで処理したサンプルでｃＤＮＡ断片がより多く増幅された、即ち、導入したＣｙｃＢ２；２遺伝子がＤＥＸ依存的に発現していると考えられる個体を、５系統単離した。
【００２４】
図１に、ＲＴ−ＰＣＲによるＣｙｃＢ２；２遺伝子の発現解析の写真を示す。１μＭ  ＤＥＸで２４時間処理した（＋）幼植物体または処理していない（−）幼植物体から全ＲＮＡを抽出し、それを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲ反応を行なった。ＣｙｃＢ２；２特異的なプライマーによりＣｙｃＢ２；２のｃＤＮＡ断片を増幅した（図１：上段）。またコントロールとして、発現量が変化しないβ−チューブリンのｃＤＮＡを増幅した（図１：下段）。５系統の形質転換体（図１：レーン１〜５）でＤＥＸ依存的な転写産物量の増加が見られたが、対照とした野生型のイネ（図１：Ｃ）ではＤＥＸ処理による増加は見られなかった。
【００２５】
（実施例３）
（ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現による根の伸長促進効果）
ＤＥＸ依存的にＣｙｃＢ２；２遺伝子を発現する形質転換イネを用いて、根の伸長を測定した。２日間暗所下で発芽させた種子をガラス管に移し、１μＭ  ＤＥＸを含む水、又は含まない水のみを与えて、明状態で１６時間と暗状態で８時間の日周期の条件下で、２８℃で無菌的に培養した。根の長さを２４時間おきにプロットし、その変化をグラフ化した（図２）。
【００２６】
図２は、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現による根の伸長促進を示すグラフである。１μＭ  ＤＥＸで処理した場合（図２：黒いカラム）と処理しない場合（図２：横線灰色のカラム）の根の長さ（ｃｍ）を発芽後から日を追って７日目まで測定した。コントロールとして、野生型（図２：白いカラム）のデータを示した。いずれも７個体の根の長さの平均値を棒グラフで示した。この結果より、ＤＥＸ処理により形質転換イネの根の伸長が著しく促進されることが明らかになった。この結果より、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現によって植物の根系の発達を人為的に促進することができるために、栄養分の吸収力を高めて植物体全体の成長促進をもたらすことが期待できる。
【００２７】
（根端分裂組織における細胞分裂の活性化）
ＤＥＸ処理後７日目の根を用いて、根端から５ｍｍまたは１５ｍｍの位置の組織をＦＡＡ（３．７％ホルムアルデヒド、５％酢酸、５０％エタノール）で固定し、エタノール（５０，７０，８０，９０，９５，９９．５，１００％）で脱水した後、テクノビット７１００に包埋して６ｎｍ厚の切片を作成した。０．０１％トルイジンブルーで染色した切片を顕微鏡で観察し、皮層細胞の長さを測定した。その結果、ＤＥＸ処理の有無に関わらず皮層細胞の縦方向の長さは野生型と変わらないことが明らかとなった。よって、形質転換イネにおける根の伸長促進効果は主に根端分裂組織の細胞数の増加によることが示された。つまり、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現により細胞分裂が活性化されたことが明らかになった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明により、植物由来のサイクリンＢ２遺伝子を植物に導入することを特徴とする、新たな植物の成長促進方法が与えられた。サイクリンＢ２遺伝子の過剰発現によって細胞分裂が活性化するために、根などの成長器官の伸長が促進するものと考えられる。植物の成長を促進することができるために、本発明の技術は、生物資源の増産などに資するものと考えられる。
【００２９】
【配列表】
2004305051.tif 000002
2004305051.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＲＴ−ＰＣＲによるＣｙｃＢ２；２遺伝子の発現解析を示す写真である。
【図２】図２は、ＣｙｃＢ２；２遺伝子の過剰発現による根の伸長促進を示すグラフである。
【図１】
2004305051.tif 000004
【図２】
2004305051.tif 000005