(57)【要約】【課題】（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの提供。【解決手段】バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られる、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、および（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物により、上記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけたときの酵素の比活性が２．９付近である、バリオスペルマム由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
【請求項２】
バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて得ることができる、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物。
【請求項３】
バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけることを特徴とする、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１記載の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ又は請求項２記載の酵素組成物を用いてカルボニル化合物及びシアン化合物を処理することを特徴とするシアノヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性シアノヒドリンは、光学活性有機合成中間体として有用であり、例えば医薬品等を得るために使用される。
【０００３】
光学活性（Ｓ）−シアノヒドリンをシアン化合物とカルボニル化合物とから合成する手段の一つとして、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと呼ばれる酵素を使う合成方法が知られている（特開平２−２２３５４６号公報：特許文献１、特開平７−５１０７６号公報：特許文献２、特開平９−２２７４８８号公報：特許文献３、特開平１１−２４３９８４号公報：特許文献４、特表２００１−５１３６２５号公報：特許文献５）。例えば、ベンズアルデヒドとシアン化カリウムとを、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ触媒により反応させると、（Ｓ）−マンデロニトリルが生成する（図１）。
【０００４】
（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼには、例えばトウダイグサ科に属する植物であるキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来のもの（ＥＣ  ４．１．２．３７）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のもの（ＥＣ  ４．１．２．３９）、あるいはイネ科に属する植物であるモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）由来のもの（ＥＣ  ４．１．２．１１）などが知られており、これらの酵素をコードする遺伝子配列も知られている。
【０００５】
通常、上記酵素を使用する光学活性シアノヒドリンの合成は、当該酵素並びに基質であるシアン化合物及びカルボニル化合物を必須要素として、水系、水−有機溶媒二相系、有機溶媒−微水系、有機溶媒系等で実施されるが、その際に、非対称のシアノヒドリンのエナンチオマー混合物が生じる。一般に、生物活性エナンチオマー混合物においては、二種類のエナンチオマーのうちの一方だけが生物活性を示すため、光学活性シアノヒドリンの（Ｓ）−エナンチオマーをできるだけ高純度で製造する必要がある。
しかし、得られた（Ｓ）−シアノヒドリンの光学純度は、必ずしも満足のいくものではない。
【０００６】
【特許文献１】
特開平２−２２３５４６号公報
【特許文献２】
特開平７−５１０７６号公報
【特許文献３】
特開平９−２２７４８８号公報
【特許文献４】
特開平１１−２４３９８４号公報
【特許文献５】
特表２００１−５１３６２５号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを提供することを目的とする。また、本発明は、該酵素を用いた（Ｓ）−シアノヒドリンの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、バリオスペルマムの植物体の懸濁液から（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ組成物を得、これにより光学活性なシアノヒドリンを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけたときの酵素の比活性は２．９付近である、バリオスペルマム由来の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ。
（２）バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて得ることができる、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物。
（３）バリオスペルマムの植物体の懸濁液を硫安分画及びイオン交換クロマトグラフィーにかけることを特徴とする、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する酵素組成物の製造方法。
（４）前記（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ又は酵素組成物を用いてカルボニル化合物及びシアン化合物を処理することを特徴とするシアノヒドリンの製造方法。
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、「（Ｓ）−ｈｎｌ」という。）は、シアン化合物とカルボニル化合物とから（Ｓ）−シアノヒドリンを合成する活性を有するものを意味し、バリオスペルマム（Ｂａｌｉｏｓｐｅｒｍｕｍ）から得ることができる。
【００１２】
１．酵素の調製
本発明の酵素組成物の供給源としては、バリオスペルマムの植物体が挙げられる。バリオスペルマムとは、中国（雲南省）等に産するトウダイグサ科植物でる。バリオスペルマムの植物体は、直接採木したものでも市販のものでもよく、茎、葉、種子等が用いられる。本発明においては、採取しやすい点で葉（若葉）が好ましい。
【００１３】
本発明の酵素組成物は、以下の調製方法により得ることができる。すなわち、上記バリオスペルマムの葉、茎を液体窒素等により凍結してすりつぶした後、リン酸バッファー等の緩衝液に懸濁する。
この懸濁液について、酵素の精製に常用される（１）沈澱による分画、（２）各種クロマトグラフィー、（３）透析、限外濾過等による低分子物質の除去方法などを、単独で、又は適宜組み合わせて使用することにより得ることができる。
【００１４】
（１）の沈澱による分画に使用される物質は、水に対する溶解度が高く、溶解度の温度変化が少ない点で硫酸アンモニウム（硫安）が好ましい。添加する濃度は特に制限はないが、（Ｓ）−ｈｎｌを収率良く回収でき、しかも他の蛋白質成分と分離できる条件が好ましい。例えば、３０−７０％硫酸アンモニウムを用いることにより、（Ｓ）−ｈｎｌ成分を効率よく分画することができる。
【００１５】
（２）のクロマトグラフィーとしては、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１６】
▲１▼  ゲルろ過法は、タンパク質を分子量の大きさで分ける手法であり、ゲル粒子が持つ網目構造により、目的とするタンパク質の分子量に応じて選択することができる。ゲルろ過に使用されるカラムとしては、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０、  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１００又はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２００（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
▲２▼イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質が両性電解質であることを利用した分離法であり、陽イオン交換クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーがある。陽イオン交換クロマトグラフィーのための交換基にはカルボキシメチル（ＣＭ）が用いられ、例えばＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）、ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業）、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム等が挙げられる。また、陰イオン交換クロマトグラフィーのための交換基にはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）が用いられ、例えばＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー）、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（生化学工業）、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム等が挙げられる。但し、これらのカラムに限定されるものではない。
【００１８】
▲３▼  疎水性クロマトグラフィーは、タンパク質とゲルに結合したリガンド間の疎水的相互作用に基づく分離手法である。また、移動相を極性有機溶媒、固定相を長鎖の無極性リガンドとし、両相間で溶質の分配を行う逆相クロマトグラフィーを利用することもできる。
【００１９】
▲４▼  コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）クロマトグラフィーは、糖鎖を持つタンパク質とレクチンであるコンカナバリンＡの相互作用に基づく分離手法である。例えばＣｏｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム等が挙げられる。
【００２０】
（３）透析、限外濾過等
透析は、セロハン製の透析チューブに試料液を入れ、大量の純水又は低濃度の緩衝液に浸すことにより低分子化合物をセロハンチューブの外側に透過させる手法である。
限外ろ過法は、限外ろ過膜（平板膜、中空繊維ホロファイバー）を用いて、目的のタンパク質を濃縮する手法である。カットオフ分子量は５００〜５００，０００程度の範囲である。手法としては加圧撹拌法、強制循環式濃縮法（ホロファイバー）、遠心法がある。
【００２１】
本発明においては、上記精製手法のうち硫安分画及び陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて用いることが好ましい。
【００２２】
２．酵素の性質
本発明の酵素組成物は、複数の酵素活性物質を含む混合物であってもよく、それらの活性物質が単離された個別の活性物質からなる酵素組成物（又は酵素自体）をも包含する。
葉の懸濁液を硫安分画した後の酵素組成物の比活性は１．２（Ｕ／ｍｇ）であり、その後さらにＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ陰イオン交換クロマトグラフィーにかけた後の比活性は２．９（Ｕ／ｍｇ）付近である。
ここで、「比活性」とは、標準的アッセイ条件下でベンズアルデヒドから、酵素１ｍｇ中、１分あたり１  μｍｏｌの光学活性マンデロニトリルを生成する酵素の量（Ｕ／ｍｇ）をいう。
【００２３】
３．シアノヒドリンの製造
本発明においては、光学活性シアノヒドリンの製造原料としてカルボニル化合物及びシアン化合物を用い、本発明の（Ｓ）−ｈｎｌを作用させてシアノヒドリンを製造する。
ここで、カルボニル化合物とは、アルデヒド又はケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２        （Ｉ）
で示される化合物をいう。
【００２４】
式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は、互いに異なり、それぞれ水素原子又は炭素数１〜２０（Ｃ１〜Ｃ２０）の炭化水素基、置換基を有していてもよい炭素数１〜２０（Ｃ１〜Ｃ２０）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい炭素数６〜２０（Ｃ６〜Ｃ２０）のアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０（Ｃ７〜Ｃ２０）のアルキルアリールオキシ基、置換基を有していてもよい炭素数２〜２０（Ｃ２〜Ｃ２０）のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいアミノ基、置換基を有していてもよいシリル基又は水酸基である。但し、Ｒ１及びＲ２が同時に水素原子となることはない。また、置換基を有していてもよいアルキルチオ基、置換基を有していてもよいアリールチオ基、置換基を有していてもよいアルキルスルホニル基、置換基を有していてもよいアリールスルホニル基であってもよい。
【００２５】
前記炭化水素基中、−ＣＨ２−及び−ＣＨ３のＣＨ２はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−又は−Ｓ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ２は＝Ｏ又は＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ２−のＣ−Ｈ、−ＣＨ３のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈ及び＝ＣＨ２のＣ−Ｈは、Ｎ又はＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ１及びＲ２は、共同して非対称の２価の基を表してもよい。ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
【００２６】
炭化水素基は、飽和又は不飽和の非環式であっても飽和又は不飽和の環式であってもよい。炭化水素基が非環式の場合には、直鎖状でも分岐状でもよい。炭化水素基には、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル基、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ６〜Ｃ１８アリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ６〜Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基などが含まれる。
【００２７】
Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基であることが好ましい。アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が挙げられる。
【００２８】
Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル基であることが好ましい。アルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、プロペニル基、イソプロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチルアリル基、２−ブテニル基等が挙げられる。
【００２９】
Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル基であることが好ましい。アルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基等が挙げられる。
Ｃ４〜Ｃ２０アルキルジエニル基は、Ｃ４〜Ｃ１０アルキルジエニル基であることが好ましい。アルキルジエニル基としては、例えば１，３−ブタジエニル基等が挙げられる。
【００３０】
Ｃ６〜Ｃ１８アリール基は、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基であることが好ましい。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、インデニル基、ビフェニル基、アントリル基、フェナントリル基等が挙げられる。
Ｃ６〜Ｃ２０アルキルアリール基は、Ｃ６〜Ｃ１２アルキルアリール基であることが好ましい。アルキルアリール基としては、例えばｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、２，３−キシリル基、２，４−キシリル基、２，５−キシリル基、ｏ−クメニル基、ｍ−クメニル基、ｐ−クメニル基、メシチル基等が挙げられる。
【００３１】
Ｃ６〜Ｃ２０アリールアルキル基は、Ｃ６〜Ｃ１２アリールアルキル基であることが好ましい。アリールアルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、ジメチルベンジル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルフェネチル基、ジエチルベンジル基等が挙げられる。
【００３２】
Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基は、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルキル基であることが好ましい。シクロアルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルケニル基は、Ｃ４〜Ｃ１０シクロアルケニル基であることが好ましい。シクロアルケニル基としては、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基等が挙げられる。
【００３３】
Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ基は、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基であることが好ましい。アルコキシ基としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ６〜Ｃ２０アリールオキシ基は、Ｃ６〜Ｃ１０アリールオキシ基であることが好ましい。アリールオキシ基としては、例えばフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基、ビフェニルオキシ基等が挙げられる。
Ｃ７〜Ｃ２０アルキルアリールオキシ基は、Ｃ７〜Ｃ１２アルキルアリールオキシ基であることが好ましい。アルキルアリールオキシ基としては、例えばメチルフェニルオキシ基、エチルフェニルオキシ基、プロピルフェニルオキシ基、ブチルフェニルオキシ基、ジメチルフェニルオキシ基、ジエチルフェニルオキシ基、ジプロピルフェニルオキシ基、ジブチルフェニルオキシ基、メチルエチルフェニルオキシ基、メチルプロピルフェニルオキシ基、エチルプロピルフェニルオキシ基等が挙げられる。
【００３４】
Ｃ２〜Ｃ２０アルコキシカルボニル基は、Ｃ２〜Ｃ１０アルコキシカルボニル基であることが好ましい。アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、２−メトキシエトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
【００３５】
置換基を有していてもよいアミノ基としては、例えばアミノ基、ジメチルアミノ基、メチルアミノ基、メチルフェニルアミノ基、フェニルアミノ基等が挙げられる。
【００３６】
置換基を有していてもよいシリル基としては、例えばジメチルシリル基、ジエチルシリル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリメトキシシリル基、トリエトキシシリル基、ジフェニルメチルシリル基、トリフェニルシリル基、トリフェノキシシリル基、ジメチルメトキシシリル基、ジメチルフェノキシシリル基、メチルメトキシフェニル基等が挙げられる。
【００３７】
前記式Ｉで示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００３８】
本発明においては、反応原料の濃度を高めて生産性を良くするために、反応溶媒として有機溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状又は環状の、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、飽和又は不飽和芳香族炭化水素等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば芳香族炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）；ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）；アルコール系溶媒（例えばｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど）；エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）；エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。
【００３９】
前記有機溶媒は、水又は水性緩衝液で飽和されていてもよく、更に過剰の水又は水性緩衝液を加えて、有機溶媒相と水相との二相系を形成する溶液状態としたものでもよい。前記の有機溶媒を水又は水性緩衝液で飽和する方法としては、例えば前記の有機溶媒と水又は水性緩衝液を二相を形成する割合で混合及び撹拌し、静置した後、その有機層を用いる方法が挙げられる。
【００４０】
本発明において使用されるシアン化合物としては、例えばシアン化水素又はその塩（シアン化カリウム、シアン化ナトリウム）などが挙げられる。
【００４１】
本発明の（Ｓ）−ｈｎｌは、粉末状、液状、又は適当な担体に固定化してなる固定化酵素などの状態のものを使用することができる。固定化担体としては、例えば多孔性の無機担体、セルロースなどの繊維状の担体、高分子化合物からなる担体などが挙げられ、具体的には、多孔性のセラミック粒子、多孔性のシリカゲル粒子、ゼオライト系粒子、寒天、アルギン酸カルシウム、キトサンなどの天然高分子ゲル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールなどの合成高分子ゲルなどが挙げられる。酵素を固定化するには、例えば担体に酵素液を吸収させる方法、酵素液と担体とを混合し、酵素を吸着固定する方法、酵素を包括固定化する方法、酵素を架橋剤で架橋する方法等の任意の手法を採用することができる。
【００４２】
固定化酵素及び基質の使用量又は反応条件は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、固定化酵素の使用量は基質であるカルボニル化合物１ｍｍｏｌに対して０．１〜５００単位、好ましくは１〜１００単位である。基質の濃度は、カルボニル化合物の場合は通常１〜５００ｇ／Ｌの範囲に設定し、シアン化合物は用いるカルボニル化合物に対して０．１〜１０倍モル、好ましくは０．５〜５倍モルの濃度で添加する。反応時間は、基質であるカルボニル化合物の転換率が６０％以上、好ましくは８０％以上に達するまでの時間が適当である。但し、反応時間はこれらに限定されるものではない。反応温度は酵素の活性が十分発揮される温度であれば特に限定されるものではなく、通常０〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃である。
【００４３】
本発明の方法によって生成された（Ｓ）−シアノヒドリンは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって、測定又は定量することができ、必要に応じて、抽出、減圧蒸留、カラム分離などの通常の手段によって分離精製することができる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕バリオスペルマム酵素液の調製及び酵素活性の測定
（１）  粗酵素液の調製
バリオスペルマムの若葉（３５  ｇ）を液体窒素中で凍結し、乳鉢及び乳棒を用いてホモジナイズした。得られた粉末を１２０  ｍｌの５０  ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ  ６．０）に約３−４時間懸濁し、次に数層のガーゼを通して濾した。濾液を２８，０００  ｘｇで２５分間２回遠心した。得られた溶液を１０  ｍＭバッファーに対して４時間透析し（バッファーは３回交換）、１００  ｍｌの酵素溶液を得た。この酵素溶液をＡｍｉｃｏｎセル（ＰＭ  １０フィルター）により１．０  ｍｌに濃縮した。マンデロニトリルリアーゼ活性の検出には、この濃縮溶液を使用した。
【００４６】
タンパク質（酵素）濃度は、ウシ血清アルブミンを標準品とするＢｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  ＵＳＡ）を用いて、あるいは５９５  ｎｍにおける吸光度を測定することによって求めた。
その結果、酵素濃度は７．１９  ｍｇ／ｍｌであった。
【００４７】
（２）ベンズアルデヒドを基質とした活性測定
次に、ベンズアルデヒドからの（Ｓ）−マンデロニトリルの生成を測定することによって酵素活性をアッセイした。
１００  μｌの酵素溶液を添加することによって反応を直ちに開始し、２５℃で１２０分間インキュベートした。種々の反応時間に対して、１００  μｌの反応混合物を分取した。
９００  μｌの有機溶媒（ヘキサン：イソプロパノール＝  ９：１）を添加して反応を停止させ、遠心（１５，０００  ｘ  ｇ、１０  分）により得た上清をＨＰＬＣによりアッセイした。
各成分の量はＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈカラムを用いてヘキサン：イソプロパノール＝  ９０：１０  を移動相として流量１．０  ｍｌ／分で流し２５４  ｎｍで測定し、それらの標準曲線を用いて算出した。
標準アッセイ溶液は、最終容量０．９  ｍｌ中に３００  ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ  ６．０）、５０  ｍＭベンズアルデヒド及び１００  ｍＭシアン化物溶液を含有する。
なお、上記分析条件で図２に示すように活性測定が可能となる。
標準的アッセイ条件下でベンズアルデヒドから１分あたり１  μｍｏｌの光学活性マンデロニトリルを生成する酵素の量を酵素活性の１単位（Ｕ／ｍｇ）を定義したところ、比活性は０．６３  Ｕ／ｍｇであった（図３）。
【００４８】
（３）  硫安沈殿
バリオスペルマムの若葉（４８  ｇ）を液体窒素中で凍結し、乳鉢及び乳棒を用いてホモジナイズした。得られた粉末を１２０  ｍｌの５０  ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ  ６．０）に約３−４時間懸濁し、次に数層のガーゼを通して濾した。濾液を２８，０００  ｘｇで２５分間２回遠心した。得られた溶液を１０  ｍＭバッファーに対して４時間透析し（バッファーは３回交換）、１２０  ｍｌの酵素溶液を得た。
この酵素溶液をＡｍｉｃｏｎセル（ＰＭ  １０フィルター）により５２  ｍｌに濃縮した。
上記の酵素液（５２  ｍｌ）に、氷上で撹拌しながら固形硫安を３０％飽和になるまで添加した。３０分撹拌後、生成した沈殿物を４℃で３０分間遠心することにより分離し、廃棄した。その後、上清の硫安濃度を７０％飽和まで上げた。生成した沈殿物を４℃で３０分間遠心することにより回収し、１０  ｍＭ  バッファーに溶解した。この溶液を１０  ｍＭバッファーに対して１２時間透析した（バッファーは３回交換）。
前記（２）と同様にして酵素活性を測定したところ、３０−７０％飽和固形硫安画分に活性が認められた。
【００４９】
（４）  ＤＥＡＥ−トヨパールを用いたカラムクロマトグラフィー
酵素溶液を１０  ｍＭリン酸カリウムバッファーで平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラム（０．７  ｘ  ３  ｃｍ）に供した。２０  ｍｌのバッファーでカラムを洗浄した後、２００  ｍＭ  ＮａＣｌを含有するバッファーで溶出を行った。溶出後、ＹＭ−１０メンブレンを備えたＡｍｉｃｏｎフィルター装置（米国Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いて濃縮を行い、２．０  ｍｌの酵素溶液を得た。
タンパク質濃度は１．６８  ｍｇ／ｍｌであった。比活性は２．９１  Ｕ／ｍｇであった。この活性はホモジネートの活性よりも約４．６倍高かった（図４）。
【００５０】
（５）  まとめ
各精製段階における酵素組成物の収量、活性を表１の通り示す。
【表１】
2004248579.tif 000002
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが提供される。（Ｓ）−ヒドロキシニトリルヒアーゼは、その触媒作用によりアルデヒドをニトリルに生成する触媒活性を有するため、工業的に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ベンズアルデヒドとシアン化カリウムから（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ触媒により（Ｓ）−マンデロニトリルを生成する反応を示す図である。
【図２】本発明の（Ｓ）−ｈｎｌのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】本発明の（Ｓ）−ｈｎｌによる（Ｓ）−マンデロニトリル生成活性を示す図である。
【図４】ＤＥＡＥ−トヨパールを用いたイオン交換クロマトグラフィーを行ったときの溶出画分による（Ｓ）−ｈｎｌ活性を示す図である。
【図１】
2004248579.tif 000003
【図２】
2004248579.tif 000004
【図３】
2004248579.tif 000005
【図４】
2004248579.tif 000006