(57)【要約】【課題】生体中の微量ヘムタンパク質の精製と標識を迅速かつ簡便に行うことのできるビオチニル基含有ポルフィリン化合物、そのようなビオチニル基含有ポルフィリン化合物を用いたヘムタンパク質の精製方法、ヘムタンパク質用標識試薬、その試薬を用いるヘムタンパク質関連疾患の診断薬、さらには光力学療法用治療薬等を提供する。【解決手段】本発明の課題は、下記式（Ｉ）：Ｐｏｒ−Ａ−Ｂｉ（式中、Ｐｏｒは金属錯体を形成してもよいポルフィリン残基；Ｂｉは置換されていてもよいビオチニル基；そして、Ａは１〜２０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基、又は酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる１〜５個のヘテロ原子を有し、かつ合計で１〜２０個の原子を有するヘテロヒドロカルビル基を示す）で表されるビオチニル基含有ポルフィリン化合物、これを用いたヘムタンパク質の精製方法、ヘムタンパク質用標識試薬、これを用いたヘムタンパク質関連疾患の診断薬、光力学療法用治療薬などによって解決される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
Ｐｏｒ−Ａ−Ｂｉ
（式中、Ｐｏｒは、金属錯体を形成してもよいポルフィリン残基；Ｂｉは置換されていてもよいビオチニル基；そして、Ａは１〜３０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基、又は、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる１〜１０個のヘテロ原子を有し、かつ１〜３０個の炭素原子を有するヘテロヒドロカルビル基を示す）
で表されるビオチニル基含有ポルフィリン化合物。
【請求項２】
前記Ｐｏｒが、ヘムａ、ヘムｂ、ヘムｃ、バリアントヘムｃ、ヘムｄ、ヘムｄ１、シロヘム及びヘムｏから選択される金属錯体を形成したポルフィリンの残基である前記請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｐｏｒが、ヘムｂの残基である前記請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｐｏｒが、ウロポルフィリン（Ｉ型）、ウロポルフィリン（ＩＩ型）、コプロポルフィリン（ＩＩＩ型）、プロトポルフィリン（ＩＸ型）及びヘマトポルフィリン（ＩＸ型）から選択されるポルフィリンの残基である前記請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｂｉが、ビオチニル基である前記請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
前記Ａが、炭素原子１個から２０個を有する直鎖状又は分枝鎖状アルキレン基であり、そのアルキレン基中の１又は２以上の隣接しないＣＨ２基が−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）−、−Ｏ−、―Ｓ―、−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ（ハロゲン）−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−又は−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−で置換されていてもよい基である、前記請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
前記Ａが、
−ＮＨ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、及び
−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−
（これらの式中、各ｎは独立して１〜１０）から選択される、前記請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、金属錯体を形成してもよいポルフィリンと末端アミノ化ビオチニル基含有化合物とカップリング剤の存在下反応させることを含む、ビオチニル基含有ポルフィリン化合物の製造方法。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、ヘムタンパク質の精製方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の化合物、及びアビジン化合物を結合させてなる担体ビーズを含むヘムタンパク質の精製キット。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物であるヘムタンパク質用標識化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の標識化合物を用いてヘムタンパク質を検出する方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の標識化合物を含有する、ヘムタンパク質関連疾患の診断薬。
【請求項１４】
請求項４に記載の化合物を含有する、光力学療法用治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビオチニル基含有ポルフィリン化合物に関し、より詳しくは、生体中の微量ヘムタンパク質の精製を迅速かつ簡便に行うことのできるビオチニル基含有ポルフィリン化合物に関する。本発明は、そのようなビオチニル基含有ポルフィリン化合物を用いた、ヘムタンパク質の精製方法及び精製装置、ヘムタンパク質用標識試薬、その試薬を用いるヘムタンパク質の検出方法及びヘムタンパク質関連疾患の診断薬、並びに上記ビオチニル基含有ポルフィリン化合物を含有する光力学療法用治療薬にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
「プロトヘム」あるいは単に「ヘム」と呼ばれる鉄プロトポルフィリンＩＸは、酵素、酸素運搬体、さらにはバイオセンサーのような数多くのタンパク質の活性中心として種々の役割を演じている（Ａ．  Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｒ．  Ｈｕｂｅｒ，  Ｔ．  Ｐｏｕｌｏｓ，  Ｋ．  Ｗｉｅｇｈａｒｄｔ  （Ｅｄｓ）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１等参照）。そのため、これらの生理的機能を研究するにはヘムタンパク質の検出と分離が重要である。
【０００３】
従来、アフィニティ−クロマトグラフィーの担体としてヘミンアガロースが、ヘムタンパク質の精製に用いられてきた（Ｔｓｕｔｓｕｉ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２１，  ２４４−２５０，  １９８２：非特許文献１）。しかしながら、このような従来法には、ヘミンに結合しているアガロースとタンパク質との非特異的結合が無視できないという問題がある。その上、アガロースが大きく粒子状であるために、容量あたりのタンパク質結合容量が小さく、ヘムタンパク質との特異的結合を分光学的に検出するのが困難である。また、ヘミンアガロースは、ヘムタンパク質の標識には利用することができないという欠点もある。
一方、最近では、ポルフィリンなどの光活性化剤を患者に投与した後に、治療部位に光を照射してそのポルフィリンを活性化することによって悪性腫瘍や慢性関節リウマチなどの疾患を治療するという、光力学療法（ＰＤＴ）も開発されている（特表平１０−５０８５７７号公報：特許文献１）。しかしながら、治療部位に効率的に光活性化剤を供給することができるＰＤＴ用治療薬は未だ知られていない。
【０００４】
【特許文献１】
特表平１０−５０８５７７号公報
【非特許文献１】
Ｔｓｕｔｓｕｉ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２１，  ２４４−２５０，  １９８２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような事情から、ヘムタンパク質の精製を簡易かつ迅速に行うことができるヘムタンパク質の精製法が望まれている。また、生体中のヘムタンパク質（又はヘムタンパク代謝酵素）などの挙動を研究するために、これらのタンパク質を標識化し得る試薬が望まれている。さらに、より効率的な光力学療法用治療薬も望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記従来技術の問題を解決するためになされたもので、
本発明の第１の態様によれば、下記式（Ｉ）：
Ｐｏｒ−Ａ−Ｂｉ
（式中、Ｐｏｒは金属錯体を形成してもよいポルフィリン残基；Ｂｉは置換されていてもよいビオチニル基；そして、Ａは１〜３０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基、又は、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる１〜１０個のヘテロ原子を有し、かつ１〜３０個の炭素原子を有するヘテロヒドロカルビル基を示す）
で表されるビオチニル基含有ポルフィリン化合物が提供される。好ましくは、前記Ｐｏｒは、ヘムａ、ヘムｂ（プロトヘムＩＸ）、ヘムｃ、バリアントヘムｃ、ヘムｄ、ヘムｄ１、シロヘム（Ｓｉｒｏｈａｅｍ）、ヘムｏ等の鉄−ポルフィリン誘導体から選択される金属錯体を形成したポルフィリン（ヘム）の残基である。さらに好ましくは、前記Ｐｏｒは、ヘムｂの残基である。また、他の好ましい態様によれば、前記Ｐｏｒは、ウロポルフィリン（Ｉ型）、ウロポルフィリン（ＩＩ型）、コプロポルフィリン（ＩＩＩ型）、プロトポルフィリン（ＩＸ型）及びヘマトポルフィリン（ＩＸ型）から選択されるポルフィリンの残基である。なお、前記Ｂｉは、好ましくはビオチニル基である。
【０００７】
本発明において、前記Ａは、好ましくは、炭素原子１個から２０個を有する直鎖状又は分枝鎖状アルキレン基であり、そのアルキレン基中の１又は２以上の隣接しないＣＨ２基が−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）−、−Ｏ−、―Ｓ―、−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ（ハロゲン）−、−ＣＨ（ＣＮ）、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−又は−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−で置換されていてもよい基である。
【０００８】
本発明において、前記Ａは、より好ましくは、
−ＮＨ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−、
−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−、及び
−ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−
（これらの式中、各ｎは独立して１〜１０、好ましくは３〜７を示す）から選択される。
【０００９】
本発明の第２の態様によれば、上記式（Ｉ）のビオチニル基含有ポルフィリン化合物を製造する方法であって、金属錯体を形成してもよいポルフィリンと末端アミノ化ビオチニル基含有化合物とカップリング剤の存在下反応させることを含む、ビオチニル基含有ヘム化合物の製造方法が提供される。
また、本発明の第３の態様によれば、上記式（Ｉ）のビオチニル基含有化合物を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行う工程を含む、ヘムタンパク質の精製方法が提供される。
また、本発明の第４の態様によれば、上記式（１）の化合物、及びアビジン化合物を結合させてなる担体ビーズを含むヘムタンパク質の精製キットが提供される。
また、本発明の第５の態様によれば、上記式（Ｉ）のビオチニル基含有化合物に標識物質を結合させてなるヘムタンパク質用標識化合物が提供される。
また、本発明の第６の態様によれば、上記標識化合物を用いてヘムタンパク質を検出する方法が提供される。
また、本発明の第７の態様によれば、上記標識化合物を含有する、ヘムタンパク質関連疾患の診断薬も提供される。
さらに、本発明の第８の態様によれば、式（Ｉ）においてＰｏｒがポルフィリン残基である化合物を含有する、光力学療法用治療薬が提供される。
【００１０】
なお、本発明は、ストレプトアビジンとの高い親和性によって生体高分子の標識と単離に広く利用されているビオチンを、多くのタンパク質中で補欠分子として働いているヘムに結合させた化合物に関するものである。この分子を利用することによって、生体中のヘムタンパク質の標識、単離、微量精製をそれぞれワンステップで迅速に行うことができる。本発明のビオチン基含有ポルフィリン化合物は、単独でタンパク質に結合させた後、種々のアビジン誘導体と結合できるので、上記したヘミンアガロースを用いた従来法の問題を全て解決できる。
【００１１】
本明細書中、「ポルフィリン」とは、環状テトラピロールで、４個のピロールが、４個のメチン基により結合閉環したポルフィンの誘導体をいい、例えば、ウロポルフィリン（Ｉ型）、ウロポルフィリン（ＩＩＩ型）、コプロポルフィリン（ＩＩＩ型）、プロトポルフィリン（ＩＸ型）、ヘマトポルフィリン（ＩＸ型）などが挙げられる。金属錯体を形成したポルフィリンとしては、ヘムが好適なものとして例示される。
【００１２】
本明細書中、「ヘム」とは、ボルフィリン類（誘導体）と主にＩＩ価又はＩＩＩ価の鉄の配位化合物をいい、鉄ポルフィリン、ヘマチンと呼ばれることもある。本発明において使用されるヘムとしては、特に限定されないが、例えば、下記に示すような、ヘムａ、ヘムｂ（プロトヘムＩＸ）、ヘムｃ、バリアントヘムｃ、ヘムｄ、ヘムｄ１、シロヘム（Ｓｉｒｏｈａｅｍ）、ヘムｏ等の天然ヘムが用いられる（Ａ．  Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｒ．  Ｈｕｂｅｒ，  Ｔ．  Ｐｏｕｌｏｓ，  Ｋ．  Ｗｉｅｇｈａｒｄｔ  （Ｅｄｓ）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１等参照）。
【化１】
2004323363.tif 000002
【００１３】
上記式中の、Ｘ、Ｙ及びＺはそれぞれ下表に示すとおりである。
2004323363.tif 000003
【００１４】
また、本発明においては、上記天然ヘムに限られず、各種の公知の合成ヘムを用いることもできる。そのような合成ヘムは、例えば、Ｄａｖｉｄ  Ｄｏｌｐｈｉｎ  ｅｄ．，  Ｔｈｅ  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ，  Ｖｏｌ．  １−５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７８に記載されている。
【００１５】
本明細書中、「ヘムタンパク質」は、上記のようなヘムに結合し得るタンパク質（ヘムタンパク代謝酵素を含む）をいい、例えば、ヘモグロビン、ミオグロビン、シトクロム、ペルオキシダーゼ、カタラーゼなどが挙げられる。
【００１６】
本明細書中、「ヒドロカルビル基」は、飽和若しくは不飽和の非環式であってもよいし、飽和若しくは不飽和の環式であってもよい置換又は非置換の炭化水素基をいい、非環式の場合には、線状でもよいし、枝分かれしていてもよい。Ｃ１〜Ｃ２０炭化水素基としては、例えば、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル基、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ２０アシル基、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルジエニル基、Ｃ４〜Ｃ２０ポリエニル基、Ｃ６〜Ｃ１８アリール基、Ｃ７〜Ｃ２０アルキルアリール基、Ｃ７〜Ｃ２０アリールアルキル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルキル基、Ｃ４〜Ｃ２０シクロアルケニル基、（Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基などが挙げられる。なお、本発明においてヒドロカルビル基がスペーサーとして用いられる場合は、上記基から１個の水素原子が除かれた２価の基をいう。
【００１７】
本明細書中、「アルキル基」とは、線状でもよいし、枝分かれしてもよいアルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。なお、式中のＡとして、アルキル基が選択される場合は、実際にはこれらの基から１個の水素原子が除かれたアルキレン基がスペーサーとして用いられる。アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などが挙げられる。
【００１８】
本明細書中、「アルケニル基」としては、１〜３個の２重結合を有する炭素数２〜２０、より好ましくは２〜１０の直鎖または分岐鎖のアルケニル基が挙げられ，具体的には、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチルエテニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ヘキセニル、２−ヘキセニル、１−ヘプテニル、２−ヘプテニル、１−オクテニル、２−オクテニル、１，３−オクタジエニル、２−ノネニル、１，３−ノナジエニル、２−デセニル等が挙げられる。
【００１９】
「アリール基」としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基または２−ナフチル基などのナフチル基、２−インデニル基などのインデニル基、２−アンスリル基などのアンスリル基、２−トリル基、３−トリル基、４−トリル基などのトリル基、ビフェニル基などが挙げられる。
【００２０】
本明細書中、「ヘテロヒドロカルビル基」は、上記ヒドロカルビル基に、さらに、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選ばれる１以上のヘテロ原子を含む基をいい、例えば、炭素原子１個から２０個を有する直鎖状又は分枝鎖状アルキレン基であり、そのアルキレン基中の１又は２以上の隣接しないＣＨ２基が−ＮＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１−３アルキル）−、−Ｏ−、―Ｓ―、−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯＯ−、−ＣＯ−Ｓ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ（ハロゲン）−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−又は−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−で置換されていてもよい基等が挙げられる。
【００２１】
また、炭化水素基、複素環基などに置換され得る基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基等が挙げられる。
【００２２】
本明細書中、「ビオチニル基」とは、下記に示すビオチンの如何なる残基をも示すが、狭義では、下記ビオチンの水酸基を除いたビオチン残基をいう。
【化２】
2004323363.tif 000004
本発明におけるビオチン残基は、ヘムタンパク質の精製・標識化などの妨げとならない限り、如何なる置換基を有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基が挙げられる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（製造方法）
本発明のビオチニル基含有ポルフィリン化合物は、例えば、下記スキーム（１）に示す方法によって合成することができる。
【００２４】
スキーム（１）
【化３】
2004323363.tif 000005
（式中、Ｐｏｒ’は、金属錯体を形成してもよいポルフィリンからカルボキシ基１個を除いた残基を示し；Ａ’はスペーサ−基を示し；そして、Ｂｉはビオチニル基を示す。）
【００２５】
上記スキーム（１）において、化合物（１）と末端アミノ化ビオチニル化合物（２）とを、カルボジイミド類等のカップリング剤の存在下反応させて、目的とするビオチニル基含有ポルフィリン化合物（３）を得る。末端アミノ化ビオチニル化合物としては、ビオチンヒドラジド、６−ヒドラジドヘキシル−Ｄ−ビオチンアミド、６−（６−ヒドラジドヘキシル）アミドヘキシル−Ｄ−ビオチンアミド（これらは市販の公知化合物）等のヒドラジド化ビオチニル化合物が好ましい。この反応は、通常、適当な溶媒の存在下、０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜４０℃、０．５時間〜４８時間、好ましくは１〜２４時間行う。
ここで、最終生成物として金属錯体（例えば、ビオチニル基含有ヘム化合物）を得る場合には、ポルフィリンの金属錯体（例えば、ヘム）と末端アミノ化ビオチニル化合物とをカップリング剤の存在下で反応させてもよく、あるいは、ポルフィリンと末端アミノ化ビオチニル化合物とをカップリング剤の存在下で反応させた後に金属（イオン）と反応させて金属錯体とすることもできる。
なお、スキーム（Ｉ）では、ポルフィリン（１）は、カルボキシ基を１個有するように模示したが、実際には、複数のカルボキシ基を有する場合がある。例えば、本発明が目的とするヘム化合物は、ビオチニル基が１個ヘムに結合することが好ましい。したがって、対象とするヘムが有するカルボキシ基の数に応じて、出発物質の使用量を調整する必要がある。例えば、鉄プロトポルフィリンＩＸは、２個のカルボキシ基を有している。ゆえに、ポルフィリン（１）として鉄プロトポルフィリンＩＸを用いる場合は、ヒドラジド化ビオチニル化合物（２）に対して、ポルフィリン（１）を２当量以上、好ましくは２．５当量以上用いると鉄プロトポルフィリンＩＸのカルボキシ基１個のみにビオチニル化合物がヒドラジド基を介して結合した化合物が得られる。
【００２６】
参考のため、上記カップリング反応のメカニズムを説明するために、鉄プロトポルフィリンＩＸと６−ヒドラジドヘキシル−Ｄ−ビオチンアミドを、ジカルボキシイミドの存在下に反応させて、ビオチニル基含有ポルフィリン化合物を得た例をスキーム（２）に示す。
【００２７】
スキーム（２）
【化４】
2004323363.tif 000006
【００２８】
この反応において用いられるカップリング剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−アリル−Ｎ’−（β−ヒドロキシエチル）カルボジイミド、Ｎ−（α―ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−（β−ブロモアリル）カルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−（６−ベンゾイルアミノヘキシル）カルボジイミド、シクロヘキシル−β−（Ｎ−メチルモルフォリノ）エチルカルボジイミド、エチル−１，２−ジヒドロ−２−エトキシキノリン−１−カルボキシラート（ＥＥＤＱ）、イソブチル−１，２−ジヒドロ−２−イソブトキシ−１−キノリンカルボキシラート（ＩＩＤＱ）、１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−｛〔シアノ−（エトキシカルボニル）−メチリデン〕−アミノ｝−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロボラート（ＴＯＴＵ）、プロパンホスホン酸無水物（ＰＰＡ）、３−ジメチルアミノホスフィノチオイル−２（３Ｈ）−オキサゾロン（ＭＰＴＯ）等が挙げられる。
【００２９】
また、この反応で用いられる適当な溶媒は、この反応で使用される溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、例えば、ピリジン、ルチジン、キノリン等の芳香族アミン類；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジフェニルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン等のエーテル類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド類またはこれら二種以上の混合物等が挙げられる。上記反応で特に好ましい溶媒は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びこれらの混合物である。
【００３０】
上記反応において、「塩基」が用いられる場合は、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸セシウム、などの塩基性塩類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの無機塩基類、ピリジン、ルチジンなどの芳香族アミン類、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、シクロヘキシルジメチルアミン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどの第３級アミン類、水素化ナトリウム、水素化カリウムなどのアルカリ金属水素化物類、ナトリウムアミド、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムヘキサメチルジシラジドなどの金属アミド類、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシドなどの金属アルコキシド類などから選択される。
【００３１】
なお、上記の反応によって得られる最終生成物は、濃縮、溶媒抽出、分溜、結晶化、再結晶、クロマトグラフィーなどの公知の手段によって反応混合物から単離、精製することができる。
【００３２】
上記した末端アミノ化ビオチニル基含有化合物（２）は、例えば、下記スキーム（３）に示す反応で合成することができる。
【００３３】
スキーム（３）
【化５】
2004323363.tif 000007
【００３４】
上記スキーム（３）において、ビオチン（４）とヒドラジド化合物（５）を、カルボジイミド類等のカップリング剤の存在下反応させることによって、末端アミノ化ビオチン化合物（２’）を得ることができる。ヒドラジド化合物（５）の代りに、式：ＮＨ２−ＮＨ−ＣＯ−Ａ’−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ２で表されるジヒドラジド化合物あるいは式：ＮＨ２−Ａ’−ＮＨ２で表されるジアミン化合物（式中、Ａ’は１〜３０個の炭素原子を有するヒドロカルビル基、又は、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる１〜６個のヘテロ原子を有し、かつ１〜３０個の炭素原子を有するヘテロカルビル基を示す）なども用いることもできる。これらの反応は、スキーム（１）に示したカップリング反応と同様な反応条件下行うことができる。
【００３５】
このようにして、式：Ｐｏｒ−Ａ−Ｂｉにおいて、Ａのスペーサー基の両末端がアミノ基である化合物を合成することができる。Ａのスペーサー基がこれ以外の基である化合物は、当業者であれば公知の有機合成手法を用いて合成することができる（Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ａｎａｌ．  ２６  （１９８０），  １−４５参照）。
【００３６】
（ヘムたんぱく質の精製法）
試料中に存在するヘムタンパク質の精製は、上記ビオチニル基含有ポルフィリン化合物を用いて、アフィニティークロマトグラフィーを利用して行う。ここで、「アフィニティークロマトグラフィー」とは、抗原と抗体、酵素と基質、あるいは受容体とリガンドといった物質間の相互作用（親和性）を利用することにより試料（例えば、血清及び血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる目的物質を分離または精製する方法を意味する。本発明の精製法においては、上記ビオチニル基含有ポルフィリン化合物とヘムタンパク質との特異的親和性と、ビオチニル基とアビジン化合物との特異的親和性を利用することにより、試料中に含まれるヘム結合蛋白質を分離または精製する。本発明のポルフィリン化合物は、公知のアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて種々の態様で試料中に存在するヘムタンパク質を精製することができる。例えば、本発明のポルフィリン化合物とアビジン化合物を結合させてなる担体ビーズを含むヘムタンパク質の精製キットによって、ヘムタンパク質を精製することができる。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様によれば、まず、標的ヘムタンパク質を含む試料に、上記ビオチニル基含有ポルフィリン化合物を加え、標的ヘムタンパク質とポルフィリン化合物とを結合させる。次いで、この標的ヘムタンパク質がポルフィリン化合物に結合した化合物（以下、「ヘムタンパク・ポルフィリン複合体」という）に、ビーズ等の担体にアビジン等のアビジン化合物を結合させたもの（以下、「アビジンビーズ」という）を加え、このアビジンビーズにアビジン−ビオチン結合を利用して、ヘムタンパク・ポルフィリン複合体を結合させる。そして、アビジンビーズにヘムタンパク・ポルフィリン複合体が結合したものを公知の手段で回収し、イミダゾール、酸、塩酸グアニジンなどの変性剤等のタンパク質からヘムを脱離させる働きを有している化合物を含む溶液に懸濁させることによって、標的タンパク質を分離、回収することができる。なお、上記担体は、アビジン化合物を結合できる担体であれば特に限定されることはなく、例えば、ベクター・ラボラトリーズ社およびピアス社から市販されているストレプトアビジン磁気ビーズ、ストレプトアビジンアガロース等を用いることができる。また、磁気を帯びた磁気ビーズを用いれば、磁石によって回収が容易となるメリットがある。
【００３８】
（ヘムタンパク質用標識化合物及びそれを用いた用途）
上記のようにして得られたビオチニル基含有ポルフィリン化合物は、これ単独で、あるいはこれに標識物質を結合させることによってヘムタンパク質用の標識化合物として用いることができる。ここで、本明細書中、「標識物質」とは、ビオチニル基含有ポルフィリン化合物に物理的あるいは化学的に結合させることによりそれらの存在を検出し易くするために用いられる物質を意味する。具体的には、アビジン、ストレプトアビジン等のアビジン化合物を結合したフルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質；３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体などが挙げられる。この中で、アビジン化合物は入手し易いし、アビジン−ビオチンの特異的結合を利用して簡単にビオチニル基含有ポルフィリン化合物を標識できるので好都合である。
このような標識化合物あるいはこの化合物を含む診断薬を用い、公知の技術を利用して、試料（例えば、血清や血漿等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれるヘムタンパク質を検出、定量することができる。また、このような標識化合物を用いて、ヘムタンパク質の生体内における挙動などを観察することもできる。診断薬は、上記化合物を安定に保存する溶液の形態とすることもできる。試料中に存在するある特定のヘムタンパク質の検出量を、正常値の範囲と比較することによって、その特定のヘムタンパク質が関与している疾患に罹患しているか否か診断することができる。そのようなヘムタンパク質関連疾患として、ヘムオキシゲナーゼ欠損症、バッチ（ｂａｃｈ）と称されるヘム結合性転写因子が関与する白血病などが知られている。また、近年、大腸癌などの消化器系の疾患を検査する方法として、消化器官からの出血に起因する糞便中のヒトヘモグロビン（便潜血）の検出が広く行われているが、本発明の診断方法はこのような大腸癌の診断にも利用することができる。
【００３９】
（光力学療法（ＰＤＴ）用治療薬）
本発明に係るビオチニル基含有ポルフィリン化合物は、ＰＤＴ用治療薬として用いることができる。このポルフィリン化合物（有効成分）をＰＤＴ用治療薬として用いる場合には、これに薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを混合し、通常は、注射剤の形態で投与する。製剤中、有効成分は、例えば０．１ないし３０重量％、より好ましくは１〜５重量％配合される。この治療薬の投与量は、対象患者の症状、年齢、体重などにより異なるが、例えば、１日あたりに投与される有効成分の量は、患者の体重１ｋｇあたり０．０５ｍｇ〜３０ｍｇであり、好ましくは０．０５ｍｇ〜５ｍｇ、さらに好ましくは、０．０５ｍｇ〜１ｍｇである。なお、有効成分の配合量及び投与量は、上記範囲に制限されることなく、使用する有効成分、担体、賦形剤、希釈剤の種類などに応じて適宜調整される。ＰＤＴ治療を行う場合は、好ましくは、投与前に、腫瘍が存在する患部組織をアビジンで標識する。このようなアビジン標識は、腫瘍細胞で特異的に発現しているタンパク質（腫瘍マーカー等）に対する抗体を用いることによって行うことができる。そして、患部組織に上記有効成分を含む注射剤を投与する。すると、ビオチンとアビジンとの高い親和性により、その患部組織に部位特異的に必要なポルフィリン化合物を効率良く供給することができる。その後、その患部組織に光を照射し、ポルフィリンを活性化することによって病巣を破壊することができる。照射される光は、そのポルフィリンを活性化するのに適当な波長（例えば、６００〜７９０ｎｍ）及び強度（例えば、１〜５０Ｊ／ｃｍ２）を有する。光の照射は、例えば、１分〜２時間、好ましくは、１０分〜６００分間行われる。光の照射は、必要に応じて、カテーテルに挿入された光ファイバーなどを用いて行うことができる。
【００４０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。
【００４１】
実施例  １：  ビオチニル基含有ポルフィリン化合物の合成
実験材料として、鉄プロトポルフィリンＩＸクロリド（ヘミン）はシグマ社から購入したものを用いた。６―ヒドラジドヘキシル−Ｄ−ビオチンアミドはベクター・ラボラトリーズ社から購入したものを用いた。
まず、脱水したＤＭＦとＤＭＳＯにヘミンと６―ヒドラジドヘキシル−Ｄ−ビオチンアミドとを溶解させてそれぞれ６．７ｍＭおよび２．７ｍＭとした。２０μｌのビオチンヒドラジド溶液と５．６ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とを１ｍｌのヘミン溶液に加えた。反応混合物を穏かに振り混ぜて暗黒中で３時間、室温でインキュベートした。プロトヘムの２つのプロピオナート基の一つだけをビオチンヒドラジドと結合させるために、約２．５当量の過剰量のヘミンを反応のために用いた。
【００４２】
このようにして作成した反応混合物に約５％（ｖ／ｖ）ピリジンを加えてからＣ１８逆相調製用ＨＰＬＣカラム（ナカライ・テスク製のＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲＩＩ）にかけた。０．１％ＴＦＡの存在下で４０〜６０％アセトニトリル勾配を用いてビオチニル基含有ポルフィリン化合物（以下、「ビオチンヘム」という）を溶出させた。ビオチンヘムを含有するピーク画分を集めてからすぐに暗黒中で凍結乾燥させた。試料を最少量のＤＭＳＯに溶解させ、−８０℃で貯蔵した。試料の純度は、Ｃ１８逆相分析用ＨＰＬＣカラム（ナカライ・テスク製のＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ３００）を用いて検定した。精製した分子の同定のためにレーザー脱着質量分析法（ＭＡＬＤＩ／  ＴＯＦＭＳ）によって評価を行なった。質量分析の結果を図１示す。
【００４３】
この分析によって得られた化合物が約９６９．４Ｄａの質量を持つことがわかった。これは、プロトヘムの２つのプロピオナート基の一つがビオチンヒドラジドと共役しているビオチンヘムの質量の計算値（９６９．９８Ｄａ）に対応する。従って、得られた化合物は、前述のスキーム（２）中に示した最終化合物のビオチンヘムであることが確認された。
【００４４】
実施例２：ビオチンヘムを用いたヘム蛋白質の精製
マッコウクジラ・ミオグロビン（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４  （１９８７），  ８９６１−８９６５）、設計したグロビン−１（ＤＧ１）（Ｉｓｏｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９  （２９９９），  ５６８３−５６９０参照）、ならびに設計した４本螺旋（ヘリックス）束ヘムタンパク質（ｄＡ１）をコードする合成遺伝子をｐＲＳＥＴ−Ｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。二量体中で４本螺旋束を生成させ、Ｇｉｂｎｅｙらの方法［（Ｇｉｂｎｅｙ    ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７  （１９８８），  ４６３５−４６４３）に従って２螺旋間のｂｉｓ−Ｈｉｓライゲーションによって単量体当たり１ヘムを結合させるように、ｄＡ１のアミノ酸配列（ＭＬ・ＫＫＬＲＥＥＡ・ＬＫＬＬＥＥＦ・ＫＫＬＬＥＥＨ・ＬＫＷＬＥＧＧＧＧＧＧＧＧＥＬＬＫＬ・ＨＥＥＬＬＫＫ・ＦＥＥＬＬＫＬ・ＡＥＥＲＬＫＫ・Ｌ：配列番号１）を設計した。ｐＵＣ１９にクローン化したマッコウクジラ・ミオグロビンをコードする合成遺伝子Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４  （１９８７），  ８９６１−８９６５）を用いて天然ミオグロビンを含む細胞抽出物を得た。これらのヘムタンパク質をコードしているベクターについては、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入してから、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを加えたＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（液体培地）中でＩＰＴＧを用いてＴ７プロモーターのコントロール下に発現させた。細胞群については、遠心して集めてから１０  ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，  ｐＨ  ８．０と１  ｍＭ  ＥＤＴＡとで洗浄した。生成したペレットは、６Ｍ  ウレア，  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ，  １  ｍＭ  ＥＤＴＡ，  および０．１  ％  ＯＤＰ（ｏｃｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を含む溶解緩衝液中に懸濁させてから音波破砕処理によって溶解させた。遠心による不溶性画分を除いた後で、上清を集めてＴＮ緩衝液に対して透析した。細胞抽出物中でタンパク質に結合しているほとんどすべてのヘムがこれらの処理過程中に取り除かれ、該タンパク質類が再び折り畳まれた。遠心して不溶性画分を除いた後で、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて該タンパク質類を適切な濃度にまで濃縮した。ビオチン化ヘムを用いて組換えアポヘムタンパク質を精製するための出発物質として、上記のようにして得た細胞抽出物を用いた。
【００４５】
前述のようにして得た細胞抽出物に、終濃度１０〜４０μＭとなるように少しずつビオチン化ヘムを加え、その後、４℃で、３０分以上インキュベートした。図２に、人工ヘム蛋白質ｄＡ１を含む細胞抽出液にビオチンヘムを加えたときの紫外可視光吸収スペクトル変化を示す。図２において、一番下のスペクトルがビオチンヘムなしのものを示し、下から上へビオチンヘムを段階的に添加することによってヘム結合型ｄＡ１濃度が増加していることが分かる。縦軸は吸光度を示す。
【００４６】
次いで、遠心して不溶性物質を除いてから、２０ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ８．０）、５００ｍＭのＮａＣｌ及び０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含む洗浄用緩衝液で事前に洗浄しておいたストレプトアビジン・アガロース（Ｓｉｇｍａ）またはストレプトアビジン磁石ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を入れたサンプルチューブに該溶液を移した。得られたタンパク質・ビオチン・ヘム・ストレプトアビジン複合体をアガロース複合体の場合は遠心によって、また磁石ビーズ複合体の場合は磁石を用いて回収した。洗浄用緩衝液で該ペレットを二回洗浄してから１０Ｍイミダゾール（ｐＨ８．０）でインキュベートして結合タンパク質を溶出させた。アガロースまたは磁石ビーズを取り除いてから該溶液を脱塩して凍結乾燥させた。凍結乾燥させた試料を少量のＴＮ緩衝液中に溶解させてから１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分析した。図３に、ビオチンヘムによって精製されたヘム蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図３において、レーン１は分子量マーカー（上から９４、６７、４３、３０，２０．１，１４．４  ｋＤａ）、レーン２及び３は、それぞれ、組換えミオグロビンの細胞抽出液及びその精製画分、レーン４及び５は、それぞれ、ｄＡ１の細胞抽出液及びその精製画分、そしてレーン６及び７は、それぞれ、ＤＧ１の細胞抽出液及びその精製画分を示す。
上記のようにして、マッコウクジラ・ミオグロビン、設計したグロビン（ＤＧ１）、または設計した４本螺旋束ヘムタンパク質（ｄＡ１）をそれぞれ含む３種類の試料を調製したが、これらにビオチン化ヘムを添加することによって、これらタンパク質内の結合ヘムに特徴的である強いソレー吸収帯が生じ、この吸収帯によって、生体分子の濃厚混合物中でさえも結合ヘムがタンパク質に効果的に組み込まれていることがわかった。これら混合物からの再構成ヘムタンパク質の回収は、ストレプトアビジン磁石ビーズを使うと容易であったし、他のタンパク質による重大な汚染を生じなかった（図３参照）。
【００４７】
比較例１
緩衝液で磁石ビーズを洗浄してからイミダゾールを添加してアポヘムタンパク質を溶出させる代わりに、酸を添加したり、塩酸グアニジンのような変性剤を添加したりする方法によっても該タンパク質を溶出させた。ところがこの場合には、該ビーズにもビオチン化ヘムにも結合しない変性ストレプトアビジン・サブユニットがヘムタンパク質と共溶出した。ストレプトアビジン・アガロースを用いることによっても該ヘムタンパク質を精製した。ところが、アガロースとタンパク質の非特異的相互作用のために、アガロースを使うと汚染の増加が生じた。
結論として、ビオチン化ヘムは、天然及び人造のヘムタンパク質の検出と精製に有用な試薬であることが分かった。また、上記のように、ビオチン化ヘムの調製は、簡単であるし、天然あるいは人造のヘムタンパク質を用いるその特異的なライゲーションをＵＶ−Ｖｉｓ吸収分光法によってモニターすることも容易であることが確認された。
【００４８】
実施例３：  ビオチンヘムのミオグロビンへの結合（標識化）
アスコリら（Ｆ．  Ａｓｃｏｌｉ，  Ｍ．Ｒ．  Ｆａｎｅｌｌｉ，  Ｅ．  Ａｎｔｏｎｉｎｉ，  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｐｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ，  ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．  ７６  （１９８１），  ７２−８７）に記述してあるメチルエチルケトン抽出法を適用してウマ心臓メトミオグロビンからアポミオグロビンを調製した。１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）と２００ｍＭ塩化ナトリウムとを含むＴＮ緩衝液に対して４℃でヘム除去アポ・タンパク質を透析した。遠心によって不溶性の画分を除いた後に、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０（Ａｍｉｃｏｎ製）を用いて上清を１〜２ｍＭに濃縮した。ビオチンヘムによるミオグロビンの再構成は、アポミオグロビン溶液にビオチンヘム溶液を、そのタンパク質に対して０．１〜０．２当量にあたる少量の過剰量ずつ添加して行なった。本混合物を４℃で３０分超の時間でインキュベートしてから２０，０００×ｇで３０分間遠心した。ビオチンヘム結合ミオグロビンを上清中に集め、ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを測定したところ、天然メトミオグロビンのそれとほぼ同等に有意な安定性を保持した。
【００４９】
なお、ビオチンヘムによって再構成したミオグロビンをＴＮ緩衝液で１０〜２０μＭに希釈し、さらに光路長１．０ｃｍの石英キュベットを用いてＨｉｔａｃｈｉ  Ｕ−３０００分光光度計でＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを記録した。上記アスコリらの文献に従った分光学的な測定用に第ニ鉄、デオキシ第一鉄、ならびに第一鉄ＣＯフォームを調製した。
第二鉄（実線）、デオキシ第一鉄（破線）、ならびに第一鉄ＣＯフォーム（点線）においてビオチンヘム結合ミオグロビンのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを図４に示す。これらのスペクトルは、天然ミオグロビンの該スペクトルから区別できなかった。さらに、ビオチンヘム結合ミオグロビンのＯ２結合能は安定に保たれていたことを確認した。これらの結果から、ミオグロビン中の正常なプロトヘムと同じようにしてビオチンヘムがミオグロビンのヘムポケットに組込まれていることが分かった。
【００５０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、本発明は、生体中の微量ヘムタンパク質の精製を迅速かつ簡便に行うことのできるビオチニル基含有ヘム化合物を提供することができる。また、本発明は、そのようなビオチニル基含有ヘム化合物を用いた、ヘムタンパク質の簡便な精製方法も提供できる。また、本発明によれば、ヘムタンパク質用標識試薬、及びその試薬を用いるヘムタンパク質関連疾患の診断薬をも提供することができる。さらに、本発明によれば、新規な光力学療法用治療薬をも提供することができる。
【００５１】
【配列表】
2004323363.tif 000008
2004323363.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１で得られたビオチニル基含有ヘム化合物の質量分析結果を示す。
【図２】図２は、実施例２において、人工ヘム蛋白質ｄＡ１を含む細胞抽出液にビオチンヘムを加えたときの紫外可視光吸収スペクトル変化を示す。
【図３】図３は、実施例２における、ビオチンヘムによって精製されたヘム蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】図４は、実施例３における、ビオチンヘムによって再構成されたミオグロビンのＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを示す。
【図１】
2004323363.tif 000010
【図２】
2004323363.tif 000011
【図３】
2004323363.tif 000012
【図４】
2004323363.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月31日(2004.5.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本明細書中、「ヘム」とは、ボルフィリン類（誘導体）と主にＩＩ価又はＩＩＩ価の鉄の配位化合物をいい、鉄ポルフィリン、ヘマチンと呼ばれることもある。本発明において使用されるヘムとしては、特に限定されないが、例えば、下記に示すような、ヘムａ、ヘムｂ（プロトヘムＩＸ）、ヘムｃ、バリアントヘムｃ、ヘムｄ、ヘムｄ１、シロヘム（Sirohaem）、ヘムｏ等の天然ヘムが用いられる（A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, K. Wieghardt (Eds) Handbook of Metalloproteins Vol. 1, John Wiley & Sons, New York, 2001等参照）。
【化１】
2004323363.tif 000014
平成１６年５月２０日付けにて代理人受任届を提出しております。