(57)【要約】【課題】慢性関節リウマチや歯周病等の炎症性骨破壊に起因する疾患や骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防や治療に用いることが可能な破骨細胞形成抑制剤を提供する。【解決手段】硫酸化グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤であり、より好ましくは、硫黄含量が３％〜１６％（Ｗ／Ｗ％）である硫酸化ＧＡＧや、グリコサミノグリカンの構成二糖単位を構成するウロン酸残基が主にＬ−イズロン酸である硫酸化グリコサミノグリカンから選択される硫酸化ＧＡＧ又はその塩から成る破骨細胞形成抑制剤である。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンを有効成分とし、代謝性骨疾患や炎症性骨疾患の予防と治療に好適な破骨細胞形成抑制剤に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
骨組織は、骨吸収と骨形成から成る骨代謝が繰り返されている動的組織である。骨吸収と骨形成の均衡は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の両者により厳密に調節されており（非特許文献１）、この均衡が崩れると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈する。
【０００３】
骨吸収と骨形成の均衡の異常により引き起こされる疾患の一例としては、骨粗鬆症が挙げられる（非特許文献２、非特許文献３）。他にも、炎症性骨破壊を伴う慢性関節リウマチや歯周炎が挙げられる。これら骨疾患は、特に破骨細胞の機能が異常に亢進した結果生じると考えられており、この様な背景の下、破骨細胞の形成と破骨細胞による骨吸収の調節に関する研究が盛んに行われており、破骨細胞による骨吸収過程や破骨細胞の形成を特異的に抑制する物質は、これら骨疾患の有効な治療薬として期待され、研究されてきている（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００４】
これまでに、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の酸性化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化グリコサミノグリカンのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウムイオン遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献１）や硫酸化グリコサミノグリカンナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウムイオン遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献２）及びインシュリン、プロタミン及びグリコサミノグリカンから選択される少なくとも１種を含む石灰化促進剤と骨補填材からなる骨疾患治療剤（特許文献３）等の報告があるが、いずれもカルシウムや骨補填剤の様な骨の修復に効果があると見なされている物質が併用されており、硫酸化グリコサミノグリカン単独での効果ではない。更に、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩の投与によるカルシウム吸収率や骨強度の増強作用に基づく経口用骨粗鬆症予防及び治療剤（特許文献４）等の報告もされているが、いずれも血液幹細胞から破骨細胞へ向かう分化過程に作用して破骨細胞の形成を阻止する事に関する示唆は無い。
【０００５】
また、破骨細胞分化誘導のメカニズムは、活性型ビタミンＤ（１α、２５（ＯＨ）２Ｄ３）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、インターロイキン（ＩＬ６）、ＴＮＦα、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）など骨吸収促進因子による骨芽細胞への作用により骨芽細胞表面上に破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）が発現し（非特許文献６、非特許文献７）、一方、破骨細胞の表面にはＯＤＦの受容体であるＲｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ（ＲＡＮＫ）が発現しており、ＯＤＦとＲＡＮＫが結合することが破骨細胞の形成に必要であることが報告されている（非特許文献８）。抑制系としては、種々の細胞より可溶性の骨吸収抑制因子（ＯＣＩＦ）が産生されており、ＯＤＦとＲＡＮＫとの結合を競合的に阻害する事により破骨細胞の形成を抑制させることが報告されている（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。
【０００６】
更に、慢性関節リウマチや歯周病における骨破壊のメニズムも明らかにされつつあり、特に、これら骨疾患は、免疫系の関与が大きいことが示唆されており、活性化Ｔ細胞によるＯＤＦの発現とそれに伴う破骨細胞形成の亢進に起因することが指摘されている（非特許文献１２、非特許文献１３）。また、この様な骨疾患に対しては、ＯＤＦとＲＡＮＫとの結合を遮断する物質が有効な治療薬となる可能性があると示唆されている（非特許文献１４）。しかし、ＯＤＦのＲＡＮＫへのシグナルを遮断するＯｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）は未だ治療剤として上市に至っていない。
【０００７】
【特許文献１】特開平６−８０５４６
【特許文献２】特開平７−５３３８８
【特許文献３】特開昭６２―２０１８２５
【特許文献４】特開平７―１０９２２２
【非特許文献１】Ｃｈａｍｂｅｒｓ，  Ｔ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ４６，  ４１−８６
【非特許文献２】Ｓｕｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｅｎｄｏｃｒ．  Ｒｅｖ．，  １３，  ６６−８０
【非特許文献３】Ｓｕｄａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９６）  Ｉｎ  ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｂｉｌｅｚｉｌｉａｎ，  Ｊ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ）”  ｐｐ．８７−１０２
【非特許文献４】Ｍｏｒｅｌａｎｄ  ＬＷ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．，  ３０５  （１）  ４０−５１
【非特許文献５】Ｍｅｂｉｏ．  ，１１（２），  ｐ．２４  （１９９４）
【非特許文献６】Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５，  ３５９７−３６０２  （１９９８）
【非特許文献７】Ｌａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ９３，  １６５−１７６  （１９９８）
【非特許文献８】Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ，  ２５３，  ３９５−４００
【非特許文献９】Ｔｓｕｄａ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９６）  生化学  ６８，  ６８３
【非特許文献１０】Ｔｓｕｄａ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３４，  １３７−１４２
【非特許文献１１】Ｙａｓｕｄａ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９，  １３２９−１３３７
【非特許文献１２】Ｔｅｎｇ，  ＹＴＡ．，  ｅｔ  ａｌ  （２０００）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  １０６（６），  Ｒ５９−Ｒ６７
【非特許文献１３】Ｋｏｎｇ，  ＹＹ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ４０２  （６７５９），  ３０４−３０９
【非特許文献１４】Ｓｉｍｏｎｅｔ．，  ｅｔ  ａｌ  （１９９７），  Ｃｅｌｌ，  ８９，  ３０９−３１９
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、慢性関節リウマチや歯周病等の炎症性骨破壊に起因する疾患や骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防や治療に用いることが可能な破骨細胞形成抑制剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、硫酸化グリコサミノグリカン（以下、硫酸化ＧＡＧともいう）に破骨細胞の形成を抑制する作用を見出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発明の要旨は以下の通りである。本発明は、硫酸化グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤である。より好ましくは、本発明は、硫黄含量が３％〜１６％（ｗ／ｗ％）である硫酸化ＧＡＧや、グリコサミノグリカンの構成二糖単位を構成するウロン酸残基として主にＬ−イズロン酸を含む硫酸化ＧＡＧから選択される硫酸化ＧＡＧ又はその塩から成る破骨細胞形成抑制剤である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を更に詳細に説明する。
本発明の破骨細胞形成抑制剤の有効成分である硫酸化グリコサミノグリカンとは、破骨細胞の形成を抑制する効果を有する硫酸化ＧＡＧ（以下、本発明物質とも言う）である限り特に限定されない。当該破骨細胞の形成抑制効果は、例えば、マウス骨髄細胞を用い、ＰＧＥ２等の骨吸収促進因子を添加することにより破骨細胞の形成を惹起させた実験系を用い、この実験系に被検物質を共存させて破骨細胞数を計測することで確認する事が出来るが、特にこの実験系でのみ確認される効果では無く、他の破骨細胞分化誘導モデルの実験等においても確認することが可能である。
【００１１】
本発明物質は、Ｌ−イズロン酸又はＤ−グルクロン酸（以下、ＧｌｃＡと略すこともある）から選択されるウロン酸残基とＤ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン又はＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（以下、ＧａｌＮＡｃと略すこともある）から選択されるヘキソサミン残基から成る二糖単位（以下、構成二糖単位とも言う）の繰り返し構造を基本骨格として有し、更に、ウロン酸残基及びヘキソサミン残基におけるウロン酸残基とヘキソサミン残基とのグリコシド結合に関与していない部位のヒドロキシル基若しくはアミノ基が部分的に硫酸化されている構造を有する。
【００１２】
好ましくは、構成二糖単位を構成するウロン酸が主にＬ−イズロン酸である硫酸化ＧＡＧや、ウロン酸がＬ−イズロン酸及び／又はＤ−グルクロン酸であり硫黄含量が３％〜１６％（ｗ／ｗ％）である硫酸化ＧＡＧや、ヘキソサミン残基のＯ−４位とＯ−６位にのみ硫酸基を有しているヘキソサミン残基１分子とウロン酸残基１分子から成る二糖単位構造を構成二糖単位の繰り返し構造中に有する硫酸化ＧＡＧ等が挙げられる。更に別の観点では、例えば、マウスの骨髄細胞と１０％牛胎児血清含有Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ培地を用いたＰＧＥ２刺激下での破骨細胞の培養（培養条件：３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で７日間）に硫酸化ＧＡＧ５０μｇ／ｍＬを培地に添加する事により、硫酸化ＧＡＧを添加しないで同様に培養したコントロールに比して破骨細胞の形成が７０％以下となる様な当該硫酸化ＧＡＧが挙げられる。
【００１３】
最も好ましくは、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ、以下ＤＳとも言う）、ヘパリン、ヘパラン硫酸（以下、ＨＳとも言う）、コンドロイチン硫酸Ｅ（以下、ＣＳ−Ｅとも言う）、硫酸化コンドロイチン硫酸Ｂ（硫酸化デルマタン硫酸とも称される。以下、硫酸化ＣＳ−Ｂとも言う）、硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ（以下、硫酸化ＣＳ−Ａとも言う）、硫酸化コンドロイチン硫酸Ｃ（以下、硫酸化ＣＳ−Ｃとも言う）、コンドロイチンポリ硫酸（以下、ＣＰＳとも言う）等が挙げられる。
【００１４】
以下、更に具体的に説明する。
構成二糖単位を構成するウロン酸が主にＬ−イズロン酸である硫酸化ＧＡＧとしては、ＤＳ、ヘパリン及びＨＳ等が挙げられる。
【００１５】
また、構成二糖単位を構成するウロン酸がＬ−イズロン酸及び／又はＤ−グルクロン酸であり硫黄含量が３％〜１６％（ｗ／ｗ％）である硫酸化ＧＡＧとしては、構成二糖単位を構成するウロン酸残基及びヘキソサミン残基における、ウロン酸残基とヘキソサミン残基とのグリコシド結合に関与していない部位のヒドロキシル基及び／又はアミノ基が部分的に硫酸化されている硫酸化ＧＡＧが挙げられ、当該硫黄含量はヒドロキシル基及び／又はアミノ基を硫酸化している硫酸イオンに由来している。この様な硫酸化ＧＡＧとしては、ウロン酸が主にＬ−イズロン酸であるＤＳ、ヘパリン及びＨＳや、他にはＣＳ−Ｅ、硫酸化ＣＳ−Ｂ、硫酸化ＣＳ−Ａ、硫酸化ＣＳ−Ｃ、ＣＰＳなどが挙げられる。
更に、本発明物質としては硫黄含量が６％〜１４％（ｗ／ｗ％）である硫酸化ＧＡＧがより好ましく、この様な硫酸化ＧＡＧとしては、ＣＳ−Ｅ、硫酸化ＣＳ−Ｂ、硫酸化ＣＳ−Ａ、硫酸化ＣＳ−Ｃ及びＣＰＳが挙げられる。
【００１６】
例えば、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から成る構成二糖単位を有し、ＧｌｃＡのＯ−１位とＧａｌＮＡｃのＯ−３位とがβ−グリコシド結合しているコンドロイチン硫酸（以下、ＣＳとも言う）においては、硫黄含量６％〜１５％（ｗ／ｗ％）が好ましく、硫酸化されうる部位としては、ＧａｌＮＡｃのＯ−４位、Ｏ−６位及びＧｌｃＡのＯ−２位、Ｏ−３位のヒドロキシル基が挙げられる。
【００１７】
更に、ヘキソサミン残基のＯ−４位とＯ−６位にのみ硫酸基を有している構成二糖単位を有する硫酸化ＧＡＧの一例としては、コンドロイチナーゼＡＢＣ（以下、Ｃ−ＡＢＣとも言う）による分解とイオン交換高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとも言う）による分析を組み合わせた二糖組成分析にて、ＧａｌＮＡｃのＯ−４位とＯ−６位にのみ硫酸基を有している不飽和二糖（以下、ΔＤｉ（４，６）Ｓとも表す）が検出されるＣＳが挙げられる（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７７，  ３２７−３３２  （１９８９）  参照）。また、本発明物質としては、Ｃ−ＡＢＣにより分解されＨＰＬＣにて検出された構成二糖単位全体のうち、ΔＤｉ（４，６）Ｓが１０％〜８０％であるＣＳがより好ましく、ΔＤｉ（４，６）Ｓが１０％〜７０％であるＣＳが更に好ましい。この様なＣＳとしては、ＣＳ−Ｅ、硫酸化ＣＳ−Ｂ、硫酸化ＣＳ−Ａ、硫酸化ＣＳ−Ｃ、ＣＰＳなどが挙げられる。
【００１８】
尚、硫酸化ＣＳ−Ｂとは、天然物由来の通常のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸とも称される。以下、ＣＳ−Ｂとも言う）に硫酸基を導入して得られる生成物で、好ましくはＧａｌＮＡｃのＯ−６位が特異的に硫酸化されたものであり、ＣＳ−Ｂよりも高い硫酸含量を有している。同様に、硫酸化ＣＳ−Ａとは、天然物由来の通常のコンドロイチン硫酸Ａ（以下、ＣＳ−Ａとも言う）に硫酸基を導入して得られる生成物で、好ましくはＧａｌＮＡｃのＯ−６位が特異的に硫酸化されたものであり、ＣＳ−Ａよりも高い硫酸含量を有している。また、硫酸化ＣＳ−Ｃとは、天然物由来の通常のコンドロイチン硫酸Ｃ（以下、ＣＳ−Ｃとも言う）に硫酸基を導入して得られる生成物で、好ましくはＧａｌＮＡｃのＯ−４位が特異的に硫酸化されたものであり、ＣＳ−Ｃよりも高い硫酸含量を有している。一方、ＣＰＳとは、通常用いられるコンドロイチン硫酸を位置非特異的に硫酸化させたコンドロイチンポリ硫酸である。
【００１９】
通常の硫酸化グリコサミノグリカンに人為的に硫酸基を導入して前記の様な硫酸含量の高い硫酸化グリコサミノグリカンを得る方法は、意図する位置に硫酸基が導入されさえすれば、特に限定されないが、化学的に硫酸化する方法や適当な硫酸基転移酵素を用いて硫酸基を転移する方法等を用いる事が可能であり、例えば、特公平６−９９４８５号公報やＣａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１５８，  １８３  （１９８６）に記載の方法を利用する事が出来る。
【００２０】
別の観点からは、本発明物質は、マウスの骨髄細胞と１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を用いたＰＧＥ２刺激下での破骨細胞の培養（培養条件：３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で７日間）において硫酸化ＧＡＧ５０μｇ／ｍＬを培地に添加する事により、硫酸化ＧＡＧを添加しないで同様に培養したコントロールに比して、破骨細胞の形成が７０％以下となる様な当該硫酸化ＧＡＧとも表すことが出来る。また、本発明物質としては、この方法において破骨細胞の形成が６０％以下となる硫酸化ＧＡＧがより好ましく、５０％以下となる硫酸化ＧＡＧが更に好ましく、３５％以下となる硫酸化ＧＡＧが最も好ましい。上記培養方法の具体的な手段については、後述の実施例に記載の通りである。
【００２１】
本発明物質の分子量は限定されるものではないが、その平均分子量は（ゲル濾過法によると）１，５００〜１５０，０００であることが好ましく、５，０００〜１００，０００がより好ましい。尚、多糖類の平均分子量は、重量平均分子量で示すのが一般的であるが、グリコサミノグリカンの平均分子量は、同一試料でも測定方法や測定条件などによって多少異なることは当業者にとって常識であり、本発明物質においても上記平均分子量の範囲に厳密に限定されるものでは無い。本発明物質は、その起源、由来、製法等により特に限定されるものでは無く、本発明物質が有する特性を満たすものであれば、天然資源から抽出精製して得るものでも、また、天然資源から抽出精製して得られた物質を原料として化学的手法により改変したもの、また、人工的に合成したものや、遺伝子工学的に動物細胞、植物細胞、微生物等により合成させたものでも構わない。
【００２２】
本発明物質又は本発明物質の合成原料としての硫酸化グリコサミノグリカンを天然資源より単離精製する場合に用いられる天然資源としては、例えば、鶏冠、鯨軟骨、鮫軟骨、イカ軟骨、豚皮、豚小腸、牛腎などが挙げられるが、目的とする硫酸化ＧＡＧが得られさえすれば、種、属及び部位など特に限定されない。
本発明物質の塩としては、本発明物質の有する破骨細胞の形成を抑制する作用を失わせることのない塩であれば、特に限定されない。例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩などが挙げられ、ナトリウム塩が好ましい。
【００２３】
本発明物質は、マウス骨髄細胞を用いた破骨細胞形成の実験系において、破骨細胞の形成を有意に抑制する。この結果より、本発明物質は、破骨細胞の形成抑制作用を有し、破骨細胞の形成抑制剤として用いる事が可能であることが確認される。破骨細胞の形成を抑制すると、骨組織における骨吸収が抑制される為、本発明の破骨細胞形成抑制剤は、骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患やリウマチ、歯周病の様な炎症性骨疾患など、特に破骨細胞が異常に亢進することにより引き起こされる疾患の予防と治療に用いることも可能である。尚、本発明物質の塩を上記疾患の予防や治療に用いる場合には、前述の塩のなかでも特に薬理学的に許容される塩が好ましい。
【００２４】
本発明物質を上記疾患の予防や治療に用いる場合には、本発明物質の作用を実質的に損なわず、又、投与対象に対し悪影響を示さない限りにおいて、他の薬効成分や製剤時に通常用いられる賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤などを適宜用いる事が可能である。剤型や投与経路としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、注射剤、軟膏剤等に製剤化し、経口、注射、塗布等の投与方法が考えられるが、治療対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択する必要がある。
【００２５】
また、本発明物質の多くは、医薬品、食品等として既に人体に投与されている物質であり、安全性も十分に確認されている。更に、本発明の破骨細胞形成抑制剤は、骨代謝等を研究する為の研究用試薬としても用いられる。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２７】
試験法１  塩酸水解とイオンクロマトグラフィーによる分析を組み合わせた硫黄含量分析方法
被験物質（後述の実施例に用いた本発明物質）１ｍｇ／ｍＬ水溶液２００μＬと４Ｎ塩酸２００μＬを混合後封入し、１１０℃で２時間加水分解した。これを減圧乾固し、蒸留水１ｍＬを加え、０．４５μｍフィルターで濾過し、被験物質の塩酸水解溶液を得た。
同塩酸水解溶液３０μＬを陰イオン分析用カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＩＣ−Ａｎｉｏｎ、内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍ、東ソー（株）製）を装着したイオンクロマトグラフィーに付し、１２分間にわたり、陰イオン分析専用溶離液（ＴＳＫｅｌｕｅｎｔＩＣ−Ａｎｉｏｎ−Ｓ、東ソー（株）製）による溶出を行い、電気伝導度について硫酸イオン標準品における溶出時間を指標として検出し、ＨＰＬＣチャートを得た。得られたＨＰＬＣチャートの硫酸イオン標準品及び各ピーク面積から被験物質の硫酸イオン含量を算出し、それを元に硫黄含量を算出した。
【００２８】
試験法２  コンドロイチナーゼＡＢＣによる分解とイオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖組成分析方法
被験物質を１０ｍｇ／ｍＬとなる様に蒸留水に溶解し、そのうち２０μＬを０．５ＵのコンドロイチナーゼＡＢＣ（生化学工業（株）製）を含む酵素溶液２０μＬ（０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））に添加し、３７℃で３時間、酵素消化反応を行った。沸騰水中で３０秒加熱後、遠心分離することにより上清を得た。
この酵素消化物を含む上清を、ＹＭＣ  ＰＡカラム（１２０Å、５μｍ、内径４ｘ２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）を装着したイオン交換−ＨＰＬＣに付し、６０分間に亘り、１６ｍＭから８００ｍＭのリン酸二水素ナトリウム溶液によるリニアーグラジェント溶出を行い、紫外部（ＵＶ）２３２ｎｍの吸収を指標として検出し、ＨＰＬＣチャートを得た。得られたＨＰＬＣチャートの各ピーク面積から、被験物質のコンドロイチナーゼＡＢＣにより分解されＨＰＬＣにて検出された二糖単位全体に対するΔＤｉ（４，６）Ｓ〔２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−グルコ−β−Ｄ−グルコ−４−エノピラノシルロン酸）−４，６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース〕の割合を算出した。
【００２９】
参考例１
コンドロイチン硫酸Ｅ（ＣＳ−Ｅ）の製造
マイカの軟骨２４０ｇを細断し、２０分間煮沸した後、水２４０ｍＬとアクチナーゼ（科研製薬（株）製）２．４ｇを加え、ｐＨ７．５、５５℃の条件下で一晩抽出した。この抽出液に炭酸ナトリウム１．２ｇを添加し、ｐＨ１０．５、５０℃の条件下で１時間攪拌した後、濾過し、得られた濾液を２００ｍＬにまで濃縮した。この濃縮液に０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液及び０．２％亜硫酸水素ナトリウム水溶液を添加し、３５℃で２時間アルカリ処理を行った後、エタノール２００ｍＬ、エタノールと３％酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．８）合わせて２００ｍＬ及びエタノールと３％酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ４．８）合わせて２４０ｍＬにより３回分画し、その溶液をレジンＨＰＡ−１１Ｍ（三菱化成（株）製）に吸着させた。塩化ナトリウム濃度を３．７Ｍにした時の溶出液を集め、濃縮、濾過し、純水に対して透析した後、更に２００ｍＬまで濃縮した。この濃縮溶液に活性炭０．５ｇを加え、ｐＨ４．８、５０℃の条件下で１時間攪拌した。その後、濾過を行い、４倍量のエタノールを加えて得た沈殿物を乾燥することにより、ＣＳ−Ｅ（乾燥重量：２ｇ）を得た。得られたＣＳ−Ｅは、光散乱光法により分子量を測定したＣＳ−Ａ及びＣＳ−Ｃの標準標品をスタンダードとして用いたゲル濾過クロマトグラフィー（以下、ＧＰＣとも言う）において、平均分子量約６０，９００であり、上記試験法１により測定した硫黄含量は１１．４％であり、上記試験法２による二糖組成分析にてΔＤｉ（４，６）Ｓの割合は６７．９％であった。
【００３０】
参考例２
硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ（硫酸化ＣＳ−Ａ）の製造
コンドロイチン硫酸Ａ（以下ＣＳ−Ａとも言う。鯨由来、生化学工業（株）製）３ｇを水１５０ｍＬに溶解し、６℃にてＤｏｗｅｘ５０［Ｈ＋］カラム（ダウケミカル製）を用いイオン交換を行った後、１０％トリ−ｎ−ブチルアミン／エタノールでｐＨ５．０に調整し、ジエチルエーテル３００ｍＬで２回洗浄した。２０℃、減圧下にてジエチルエーテルを留去した後、残った水層を凍結乾燥し、更に五酸化リンの存在下で減圧乾燥を行い、ＣＳ−Ａのトリ−ｎ−ブチルアミン塩を得た。この塩をジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦとも言う）３００ｍＬに溶解した後、０℃でピリジン−ＳＯ３複合体（アルドリッチ社製）７．５ｇ／ＤＭＦ１００ｍＬをゆっくり滴下し、１時間攪拌して硫酸化を行った。水１００ｍＬを加えて反応を止め、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整した後、流水で透析し、４０℃下にて減圧濃縮した。得られた濃縮液をイオン交換（ＳＡ−１２Ａ（三菱化学（株）製）：１５０ｍＬ及びＰＫ−２２０（三菱化学（株）製）：１５０ｍＬ）に付した。溶出液を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて中和した後、４０℃にてエバポレーターで濃縮し、５％になるように酢酸ナトリウムを加え、５倍量のエタノールを加えて得られた沈殿物を乾燥し、ガラクトサミン６位硫酸化ＣＳ−Ａ（乾燥重量：２ｇ）を得た。得られた硫酸化ＣＳ−Ａに関し参考例１と同様に平均分子量、硫黄含量、ΔＤｉ（４，６）Ｓの割合を測定した。その結果、平均分子量は１６，９００、硫黄含量１２％、ΔＤｉ（４，６）Ｓの割合は６６．８％であった。
【００３１】
参考例３
硫酸化コンドロイチン硫酸Ｂ（硫酸化ＣＳ−Ｂ）の製造
コンドロイチン硫酸Ｂ（鶏冠由来、生化学工業（株）製）３ｇを上記製造例２と同様に処理し、ガラクトサミン６位硫酸化ＣＳ−Ｂを得た。得られた硫酸化ＣＳ−Ｂに関し、参考例１と同様に平均分子量、硫黄含量、ΔＤｉ（４，６）Ｓの割合を測定した。その結果、平均分子量２７，５００、硫黄含量１３．６％、上記試験法２による二糖組成分析にて△Ｄｉ（４，６）Ｓの割合は６８．５％であった。
【００３２】
参考例４
硫酸化度の異なるコンドロイチンポリ硫酸（ＣＰＳ）の製造
冷却した濃硫酸２．４Ｌにコンドロイチン硫酸Ｃ（鮫軟骨由来、生化学工業（株）製）６００ｇを加え、攪拌しながら１時間反応させた。この反応液を希釈し、炭酸カルシウム４．７５ｋｇを加えて中和した後、珪藻土を用いて濾過し、減圧加熱処理により３Ｌまで濃縮した。得られた濃縮液に炭酸ナトリウム１４６ｇを添加した後、珪藻土を用いて濾過し、濾液に酢酸ナトリウム１６２ｇ、６０％酢酸１８０ｍＬを加えて、終濃度４０％となる様にエタノールを添加した。このエタノール分画により生じた沈殿物を水３．３Ｌに溶解し、活性炭１５０ｇを添加した。更に、これを珪藻土で濾過し、濾液に酢酸ナトリウム、６０％酢酸、エタノール４Ｌを加え、得られた沈殿物を水１．２Ｌに溶解し、クエン酸ナトリウム２ｇ、水酸化ナトリウム１．２５ｍＬを加えて、ｐＨ６．０とした。同溶液を乾燥させた後、微粉処理し、２２７ｇのＣＰＳ試料粉末を得た。
【００３３】
上記ＣＰＳ５ｇを０．５％（ｖ／ｖ）塩化アセチル含有メタノール１Ｌに溶解し、５℃にて攪拌しながら脱硫酸化反応を行った。異なる硫酸化度のＣＰＳを得る為に、反応時間は、５時間、１０時間、１５時間４５分、２０時間、２５時間３０分、３１時間の６通りの条件により行った。反応後の試料を遠心分離し、上清を除き、エタノール、エーテルで洗浄後、減圧乾燥した。得られた白色沈殿を１００ｍＬの０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、同試料を室温で加水分解後中和し、流水下で透析した。透析試料を濃縮し、０．２２μｍフィルターで濾過後、凍結乾燥し、硫酸化度の異なるＣＰＳを得た（尚、５時間、１０時間、１５時間４５分、２０時間、２５時間３０分、３１時間の各反応時間の違いにより、各々ＣＰＳ１、ＣＰＳ２、ＣＰＳ３、ＣＰＳ４、ＣＰＳ５、ＣＰＳ６と称する。）。
【００３４】
上記試験法１に従い測定した硫黄含量は、ＣＰＳ１、ＣＰＳ２、ＣＰＳ３、ＣＰＳ４、ＣＰＳ５、ＣＰＳ６のそれぞれについて、１１．３％、７．８％、７．７％、７．９％、５．９％、５．５％であり、平均分子量は各々６，１００、６，０００、６，７００、６，５００、５，８００、６，１００であった。また、上記試験法２による二糖組成分析にて、ＣＰＳ１、ＣＰＳ２、ＣＰＳ３、ＣＰＳ４、ＣＰＳ５、ＣＰＳ６の△Ｄｉ（４，６）Ｓの割合は各々１２．８％、１１．５％、１０．９％、１１．６％、８．１％、４．７％であった。
【００３５】
実施例１
ｄｄＹマウス（六週齢雌）の脛骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５ｘ１０６細胞／穴となる様に播種し、１０−６モル／ＬプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＧＥ２という。ＳＩＧＭＡ社製）刺激下において、１０、１００、１０００μｇ／ｍＬとなる様に参考例１で得られたイカ軟骨由来ＣＳ−Ｅを２４穴細胞培養用プレートのウェルに添加し、１０％牛胎児血清（べーリンガー社製、以下、ＦＣＳと言う。）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下αＭＥＭと言う。）培地にて７日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。培養中２、３日おきにＰＧＥ２、ＣＳ−Ｅ並びに１０％ＦＣＳを含有するαＭＥＭ培地にて培地交換を行った。７日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びｆａｓｔ  ｇａｒｎｅｔ  ＧＢＣ  ｓａｌｔを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ」（商品名：ＳＩＧＭＡ社製、以下、Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｅ，  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅと言う）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
【００３６】
結果を図１に示す。尚、結果は各穴内における破骨細胞の数により示した。また、コントロール（−）は被験物質の代わりに同量の１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加したものである。
図１よりマウス骨髄細胞を用いたＰＧＥ２刺激下破骨細胞形成実験系において、ＣＳ−Ｅは用量依存的に破骨細胞の形成を有意に抑制することが判明した。
【００３７】
実施例２
参考例１で得られたＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来）と参考例１で得られたＣＳ−ＥをコンドロイチナーゼＡＢＣで分解した分解物を各１００μｇ／ｍＬ用いるほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。結果を図２に示す。尚、コントロール（−）は、被験物質の代わりに同量の１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加したものである。
【００３８】
実施例１においてＣＳ−Ｅについては用量依存的破骨細胞形成抑制作用が確認されたが、図２より、ＣＳ−ＥをコンドロイチナーゼＡＢＣにより処理した分解物（主に不飽和二糖）には有意な破骨細胞形成抑制作用は確認されなかった。つまり、破骨細胞形成抑制作用は、二糖単位の繰り返し構造からなるＣＳ−Ｅ構造、若しくは分子のサイズが大きく関与していると示唆される。
【００３９】
実施例３
参考例１で得られたＣＳ−Ｅ（マイカ軟骨由来）、参考例２で得られたガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ（硫酸化ＣＳ−Ａ）、同様に参考例３で得られたガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｂ（硫酸化ＣＳ−Ｂ）、ヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製）を図３に示す濃度となる様に用いるほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
結果を図３に示す。尚、コントロール（−）は、被験物質の代わりに、同量の１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加したものである。
【００４０】
図３より明らかな様に、天然物より抽出されたＣＳ−Ｅだけでなく、特異的に硫酸基を導入することによって作成したＣＳ−Ｅの特徴であるΔＤｉ（４，６）Ｓを多く含有する硫酸化ＧＡＧにも有意な破骨形成抑制作用が確認された。これより、硫酸化ＧＡＧによる破骨細胞形成抑制作用には、ΔＤｉ（４，６）Ｓ含量も関与していると示唆される。
【００４１】
実施例４
参考例４で得られた硫酸化度の異なるコンドロイチンポリ硫酸（ＣＰＳ１〜ＣＰＳ６）を各々５０μｇ／ｍＬとなる様に用いるほかは実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
結果を図４に示す。尚、コントロール（−）は、被験物質の代わりに、同量の１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加したものである。
【００４２】
図４より、硫酸化度の高さに依存する様に破骨細胞形成抑制作用が確認され、硫酸化度が低いと殆ど破骨細胞抑制効果は殆ど確認されなかった。これより、硫酸化ＧＡＧの破骨細胞形成抑制作用には硫酸基含量が関係していると示唆される。
【００４３】
実施例５
豚皮由来コンドロイチン硫酸Ｂ（生化学工業（株）製）を図５に示す濃度（１０、１００、１０００μｇ／ｍＬ）となるように用いたほかは、実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
結果を図５に示す。尚、コントロール（−）は、被験物質の代わりに、同量の１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加したものである。
【００４４】
実施例６
牛腎由来ヘパラン硫酸（生化学工業（株）製）を図６に示す濃度（３０、３００μｇ／ｍＬ）となるように用いたほかは実施例１と同様に操作し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
結果を図６に示す。尚、コントロール（−）は、被験物質の代わりに、同量の１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地を添加したものである。
【００４５】
実施例５、実施例６の結果（図５、図６）より、ＣＳ−Ｂとヘパラン硫酸にも用量依存的破骨細胞形成抑制作用が確認され、また、実施例３（図３）においてＣＳ−Ｅとは異なる構造であるヘパリンにも破骨細胞形成抑制作用が確認されている。これら３つの化合物はいずれも構成二糖単位を構成する成分としてＬ−イズロン酸を含有しており、硫酸化ＧＡＧの破骨細胞形成抑制作用には構成二糖単位のウロン酸が主にＬ−イズロン酸であるものも有効であると考えられる。
【００４６】
更に、実施例３（図３）において、ＣＳ−Ｂの構成二糖単位を構成するＧａｌＮＡｃのＯ−６位に特異的に硫酸基を導入して得られる硫酸化ＣＳ−Ｂは、構成二糖単位としてＬ−イズロン酸を含有しないＣＳ−Ａを特異的に硫酸化して得た硫酸化ＣＳ−Ａと比較して顕著に強い破骨細胞形成抑制作用を示しており、また、構成二糖単位を構成するウロン酸としてＬ−イズロン酸を含有するが、ＣＳ−Ｅとは構造が異なるヘパリンと比較して同等以上の破骨細胞形成抑制作用を示している。この結果より、本発明物質としては、ＣＳ−Ｅの特徴であるＣＳ−Ｅ構造〔ΔＤｉ（４，６）Ｓ〕を多く含有し、及び、構成二糖単位を構成するウロン酸としてＬ−イズロン酸を含有するものが、より有効であると思われる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により破骨細胞形成抑制剤が提供され、当該破骨細胞形成抑制剤は慢性関節リウマチや歯周病等の炎症性骨破壊に起因する疾患や骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防や治療に用いることが可能である。
【００４８】
【図面の簡単な説明】
【図１】コンドロイチン硫酸Ｅの用量依存的な破骨細胞形成抑制作用を示す。（−）はコントロールを示す。
【図２】コンドロイチン硫酸Ｅとコンドロイチン硫酸ＥをコンドロイチナーゼＡＢＣで分解した分解物の破骨細胞形成抑制作用を示す。（−）はコントロールを示す。
【図３】コンドロイチン硫酸Ｅ、ガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ、ガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｂ及びヘパリンの破骨細胞形成抑制作用を示す。図において、ＣｈＥはコンドロイチン硫酸Ｅ、Ｓ化ＣｈＡはガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ａ、Ｓ化ＣｈＢはガラクトサミン６位硫酸化コンドロイチン硫酸Ｂ、（−）はコントロールを示す。
【図４】硫酸化度の異なるコンドロイチンポリ硫酸（ＣＰＳ１〜ＣＰＳ６）の破骨細胞形成抑制作用を示す。ＣＰＳ１、ＣＰＳ２、ＣＰＳ３、ＣＰＳ４、ＣＰＳ５、ＣＰＳ６は各々硫酸化度の異なるコンドロイチンポリ硫酸を示し、ＣｈＥはコンドロイチン硫酸Ｅを、（−）はコントロールを示す。
【図５】コンドロイチン硫酸Ｂの用量依存的な破骨細胞形成抑制作用を示す。（−）はコントロールを示す。
【図６】ヘパラン硫酸の用量依存的な破骨細胞形成抑制作用を示す。（−）はコントロールを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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