(57)【要約】      （修正有）【課題】骨粗鬆症の処置方法、及び化学療法によって引き起こされる副作用の緩和方法を提供する。【解決手段】本方法によって調製されるＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物及びそのさらなる抽出画分が、骨髄細胞の増殖及び分化を増強することを示し、骨粗鬆症の処置方法への適用を提供する。さらには、本抽出物は、化学療法によって減少したマクロファージ、白血球、及び赤血球の数を増加及び回復させることから化学療法によって引き起こされる副作用の緩和方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物を有効成分として含む薬学的組成物の有効量を、そのような処置を必要とする患者に経口投与することを含む、骨粗鬆症の処置方法。
【請求項２】
前記抽出物が、酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎（ｔｕｂｅｒ）を抽出する工程を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調製プロセスにおいて使用される前記アルコールベースの溶媒が、メタノール、エタノールベースの溶媒、またはこれらの混合物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記調製プロセスにおいて使用される酸が、１％酢酸である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出物が、（ａ）酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程、ならびに（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られた該抽出物を抽出し、該水相中に存在する前記水抽出物から前記酢酸エチル抽出物を分離する工程を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抽出物が、（ａ）酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程、（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られた前記抽出物を抽出し、該水相中に存在する前記水抽出物から前記酢酸エチル抽出物を分離する工程、及び（ｃ）ｎ−ブタノール溶媒を工程（ｂ）から得られた該水相に添加して更なる抽出を行い、該水相中に残存している水抽出物からブタノール抽出物を分離する工程を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抽出物が、（ａ）酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程、（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られた該抽出物を抽出し、該水相中に存在する前記水抽出物から前記酢酸エチル抽出物を分離する工程、（ｃ）ｎ−ブタノール溶媒を工程（ｂ）から得られた前記水相に添加して更なる抽出を行い、該水相中に残存している水抽出物からブタノール抽出物を分離する工程、ならびに（ｄ）工程（ｃ）から得られた前記水相へ７５％アルコール溶媒を添加してポリサッカリドを抽出しそして更に除去し、精製水抽出物を得る工程を含むプロセスによって調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学療法で処置されている患者に、化学療法アジュバントとしてＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物を含む薬学的組成物の有効量を経口投与することを含む、化学療法によって引き起こされる副作用を緩和する方法。
【請求項９】
前記抽出物が、酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程を含むプロセスによって調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記調製プロセスにおいて使用されるアルコールベースの溶媒が、メタノール、エタノールベースの溶媒、またはこれらの混合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記調製プロセスにおいて使用される前記酸が、１％酢酸である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出物が、（ａ）酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程、ならびに（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られた前記抽出物を抽出し、該水相中に存在する前記水抽出物から前記酢酸エチル抽出物を分離する工程を含むプロセスによって調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記抽出物が、（ａ）酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程、（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られた前記抽出物を抽出し、該水相中に存在する前記水抽出物から前記酢酸エチル抽出物を分離する工程、及び（ｃ）ｎ−ブタノール溶媒を工程（ｂ）から得られた該水相に添加して更なる抽出を行い、該水相中に残存している前記水抽出物からブタノール抽出物を分離する工程を含むプロセスによって調製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出物が、（ａ）酸の存在下においてアルコールベースの溶媒でＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎を抽出する工程、（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られた前記抽出物を抽出し、該水相中に存在する前記水抽出物から前記酢酸エチル抽出物を分離する工程、（ｃ）ｎ−ブタノール溶媒を工程（ｂ）から得られた該水相に添加して更なる抽出を行い、該水相中に残存している該水抽出物からブタノール抽出物を分離する工程、ならびに（ｄ）工程（ｃ）から得られた該水相へ７５％アルコール溶媒を添加してポリサッカリドを抽出しそして更に除去し、精製水抽出物を得る工程を含むプロセスによって調製される、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．技術分野
本発明は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の活性抽出物を含む経口組成物、特に、細胞の増殖及び分化を増強すること、ならびに化学療法によって誘発される副作用を緩和することが可能な経口組成物に関する。本発明は、骨粗鬆症の処置方法及び化学療法によって引き起こされる副作用の緩和方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連分野
“野生ヤマノイモ（ｗｉｌｄ  ｙａｍ）”としても知られる、ヤマノイモ（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）は、熱帯及び亜熱帯地方に分布する、単子葉植物ヤマノイモ科の一種である。世界中におよそ６５０種が存在し、うち９３種及び９変種が中国で見出され、ならびに１４種及び５変種が台湾で見出されている。
【０００３】
Ｄｉｏｓｃｏｒｅａは、漢方（ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で使用される非常に重要な薬用植物の１種であり、その医学的効果が何年もの間研究されてきた。１９３６年、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらは、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ科の植物から、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａのステロイドサポニンであるジオスゲニンを単離し、その後、医療用ステロイドの迅速合成原料として使用した。１９９２年のＡｒａｄｈａｎａ，  Ｒａｏ  Ａｒ．  Ｋａｌｅ  ＲＫ．の研究において、ジオスゲニンがラットの乳腺上皮細胞の増殖を促進することを示した。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０７（１）：３９８−４０４，  Ｆｅｂ／１９９５において、Ｊ．Ｌ．  Ｂｅｎｅｙｔｏｕｔらは、ヒト赤白血病（ＨＥＬ）細胞培養にジオスゲニンを加えた場合、ジオスゲニンが巨核球細胞の形態的及び生化学的な特徴の変化を誘発し、したがって、ジオスゲニンがＨＥＬ細胞の巨核球分化誘導物質として使用され得ることを報告した。Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５９（１１）：１４７−５７，  １９９６において、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａのステロイド抽出物は、血清脂質レベルを調節するために、抗酸化剤としての顕著な活性を有することが示唆されている。
【０００４】
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）は、ジオスゲニンと類似の化学構造を有し、骨量制御の効果だけでなく、抗癌、抗酸化、及び抗糖尿病効果を有することが知られている。血清ＤＨＥＡレベルは、加齢に伴って徐々に減少し、老化に関係する。様々な研究から、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａのジオスゲニン抽出物は、ヒト体内においてＤＨＥＡに変換され、このようにして加齢に伴って減少するＤＨＥＡを補うのかもしれないと、推測されている。しかし、これらの研究は、ジオスゲニンが、血清脂質の過剰酸化（ｏｖｅｒ−ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を減少させ、血清中のトリグリセリドの低下及びＬＤＬの過剰酸化の損傷を減少させる一方、ＨＤＬレベルを増加させることができるか否かを調べるために、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ中に存在するジオスゲニンを摂取する高齢者に対して行われただけである。
【０００５】
ＤＨＥＡの骨量の制御における効果に関し、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６２（１）：５９−６８，  １９９８においてＢｅｎ  Ａ．Ａ．  Ｓｃｈｅｖｅｎらは、ＤＨＥＡ及びそのサルフェート誘導体（ＤＨＥＡ−Ｓ）は、ヒト骨芽細胞の増殖及び分化において、それ自身、直接的、独立的に有意な効果を発揮することはできなかったが、該細胞を骨細胞調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、１，２５（ＯＨ）2Ｄ3を併用して処置すると、骨芽細胞成熟の特異的マーカーである、特定のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性の増強を生じたことを報告した。この研究は、ＤＨＥＡ／ＤＨＥＡ−Ｓの骨芽細胞増殖及び分化における効果が、骨細胞内での１，２５（ＯＨ）2Ｄ3−誘導性の変化に対する効果を介して成立し得るということを示した。
【０００６】
本発明に従い、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分は、細胞再生における生物学的活性を有するということが見出された。特に、いかなる骨細胞調節剤の存在もなしに、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分それ自体が、骨における骨原性細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を補うように骨原性細胞の増殖及び分化を刺激して、骨芽細胞の成熟及び骨芽細胞の石灰化を促進し、それによって骨修復（ｂｏｎｅ  ｒｅｐａｉｒ）、回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）及び再生を達成し、言い換えれば骨粗鬆症を予防及び治療することを見出した。さらに、該Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．抽出物は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で骨髄における造血幹細胞の増殖及び分化を刺激するだけでなく、抗癌薬処置（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）によって引き起こされた白血球及び赤血球の欠乏に苦しむ患者の回復を促進し、従って、化学療法アジュバントとして抗癌薬と組み合わせて使用され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約（Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）
したがって、本発明の目的は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物を有効成分として含む、骨原性細胞の増殖及び分化を増強するための経口組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物を有効成分として含む、抗癌薬アジュバントとしての使用のための経口組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、骨粗鬆症の予防及び処置に有用な経口組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、抗癌薬によって引き起こされる副作用を緩和するためのアジュバントとして有用な、経口組成物を提供することである。
【００１１】
さらに他の目的において、本発明は、処置を必要とする患者に薬学的に活性なＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物の有効量を経口的に投与することを含む骨粗鬆症の治療方法を提供する。
【００１２】
また、さらなる目的において、本発明は、化学療法で処置されている患者に、薬学的に活性なＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物の有効量を経口的に投与することを含む、化学療法薬アジュバント（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｊｕｖａｎｔ）を使用する化学療法によって引き起こされた副作用緩和のための方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の添付図面に関する好ましい実施態様の詳細な説明において明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．抽出物の生物学的活性、特に、細胞の再生に対する活性の発見に基づく。本発明の方法に従って調製された、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール又はエタノール抽出物及びさらなる抽出画分は、マウス骨髄前駆細胞の増殖及び分化を増強する活性物質を含むことが、実験によって確認された。特に、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール又はエタノール抽出物及びさらなる抽出画分は、それ自身、機能的骨原性細胞の細胞増殖を増強し、ならびに骨原性細胞の骨芽細胞への分化を広範囲にわたって誘導し、そして骨芽細胞の石灰化をも増強する。さらに、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、抗癌薬によって引き起こされる副作用を緩和することができる。特に、該メタノール抽出物は、シクロフォスファミド（ＣＹ．）で処置されたマウスの末梢血中に存在する白血球及び赤血球を回復させる。従って、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、加齢過程において一般的な疾病である骨粗鬆症の予防及び処置において有用であり、また、化学療法アジュバントとして抗癌薬と組み合わせて使用され得るであろう。
【００１５】
自己再生及び分化が可能な細胞を、幹細胞と呼ぶ。幹細胞は、胎児期の間、最大レベルに存在し、そして加齢と共に徐々に数が減少する。従って、幹細胞と老化の間には、重要な相関関係／関連があると推測されていた。成人における幹細胞は、新たな幹細胞が産生され又は特定の細胞に分化する、微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の変化を通して伝達される、特定のメッセージに対する特定の応答を生み出すことができる。前記幹細胞が分化のメッセージを受け取った場合、該幹細胞は、素早く多量に再生し、そしてその後、ついに分化に進む。これらの幹細胞は、成人における細胞のバランスを維持するため、及び自然原因又は傷害が原因で死ぬ細胞の数を補充するために使用される。
【００１６】
骨髄中の幹細胞は、２つのタイプの細胞、即ち造血幹細胞｛これは２つのさらに特殊化したタイプの幹細胞、すなわちリンパ系前駆細胞（これはＴ及びＢリンパ球を生じる）及び骨髄系前駆細胞（これは白血球、赤血球及び巨核球を生じる）｝、及び骨髄において支持構造を形作る細胞の源であるストローマ細胞に分けられる。該ストローマ細胞は、培養中、プラスチック培養プレートの底面、及び筋芽細胞にさえも接着する性質を有する。ストローマ細胞は、造血幹細胞の増殖及び分化に必要とされる。
【００１７】
幹細胞の産生及び数は、老化が起こるにつれて大幅に減少して老化の様々な問題をもたらし、中でも骨粗鬆症が最も一般的である。骨粗鬆症の原因は、骨形成と再吸収の間のバランスの喪失を含む。骨原性細胞に由来する骨芽細胞は、骨マトリクス及び骨格の石灰化からなる骨形成に寄与する。骨原性細胞は、骨髄のストローマ細胞に由来する。デキサメタゾン及びアスコルビン酸は、骨原性細胞の増殖及び成長を促進することができ、また、該細胞の成熟骨芽細胞への分化を可能にする。前記分化過程の間、骨芽細胞の異なるマーカーが発現される：最初にコラーゲンマトリクスの蓄積（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）があり、そして１０〜１４日後、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）が発現される。アルカリフォスファターゼは、骨芽細胞活性の識別用の生化学的マーカーとして広く使用され、その実際の機能はまだ知られていないが、最近では、骨格石灰化過程に関与すると考えられている。２１日の連続培養の後、該細胞は、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｅｉｎ）を分泌し、そして最終的に、骨結節を形成するために石灰化する。
【００１８】
本発明において、本発明者は、予想外にもＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール又はエタノール抽出物、もしくはさらなる抽出画分を含む経口組成物を、骨細胞調節剤の非存在下に骨原性細胞の増殖及び分化を増強するために使用でき、したがって、該活性抽出物を含む組成物を、骨粗鬆症の処置に使用できることを見出した。
【００１９】
本発明において、細胞の増殖及び分化を増強するための経口組成物は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物を活性成分として含む。該抽出物は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のルートチューバー部分（ｒｏｏｔ  ｔｕｂｅｒ  ｐａｒｔ）から調製され、抽出溶液としてアルコールベース（ａｌｃｏｈｏｌ−ｂａｓｅｄ）溶媒を使用して得られる。この調製プロセスは、（ａ）酸の存在下、好ましくは１％酢酸の存在下でアルコールベースの溶媒（ここでアルコールベースの溶媒が、メタノール、エタノールベース溶媒、又はこれらの混合物である）Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の塊茎（ｔｕｂｅｒ）を抽出することを包含する。
【００２０】
加えて、得られた抽出物は、薬理学的に活性な画分を得るように、極性に基づいてさらに抽出され得る。本発明の好ましい実施態様の１つとして、該メタノール抽出物は、さらに、以下の工程を含む分配クロマトグラフィーにかけられる：
（ｂ）酢酸エチルと水の溶媒混合物を使用して工程（ａ）から得られたメタノール抽出物を抽出し、該水相中に存在する該水抽出物から該酢酸エチル抽出物を分離する工程；
（ｃ）ｎ−ブタノール溶媒を該水相に添加して更なる抽出を行い、該水相中に残存している該水抽出物の残りからブタノール抽出物を分離する工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）から得られた該水相へ７５％アルコール溶媒を添加してポリサッカリドを抽出しそして更に除去し、精製水抽出物を得る工程。
【００２１】
Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の成分の生物学的活性を確認するため、健常マウス及びグルココルチコイド誘発性骨粗鬆症に苦しむヒト患者から得られた細胞に対して、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ塊茎のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分の生物学的活性についての解析を行った。
【００２２】
図１に示される実験的結果より、本発明者は、予想外にも、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分が、骨細胞調節剤の助けなしに、骨原性細胞の増殖を増強することを見出した。同じ濃度下で、ＤＨＥＡは、骨原性細胞の増殖に全く増強効果を示さなかった。図２において、この結果は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．抽出物が、正常細胞において発現したアルカリフォスファターゼの量を有意に増加させ、すなわち、本発明に従って調製された該抽出物が、骨原性細胞の成熟骨芽細胞への分化を刺激できることを示した。
【００２３】
本発明者は、さらに、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症に苦しむヒト患者から得られた異常骨髄細胞に対する効果を確認した。グルココルチコイドは、様々な炎症及び自己免疫疾患に不可欠な治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）である。しかし、長引くグルココルチコイドの使用は、骨粗鬆症の最も一般的な医原性原因の１つである。グルココルチコイドは、骨芽細胞に対する様々な効果、すなわち、骨芽細胞系統の複製の阻害、新たな骨芽細胞の産生低下、及び骨芽細胞死の誘導、を通して骨損失を増加し得る。図３に示される結果より、本発明者は、本発明の活性抽出物が、この様な細胞でのアルカリフォスファターゼの発現量を増加させることから、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症に苦しむ患者を該活性抽出物で処置することによって、骨芽細胞の機能を回復することができることを見出した。
【００２４】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨粗鬆症の処置において、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物の有効性をさらに確認するため、本発明者は、本発明の抽出物を経口投与された、正常マウス及び骨粗鬆症を誘発するために卵巣摘出を行ったマウスに対して実験を行った。
【００２５】
図４−５において、この結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物が、アルカリフォスファターゼの発現量、ならびに正常マウス及び卵巣摘出マウスから得られた骨芽細胞の石灰化を増加することを実証した。従って、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物は、骨原性細胞の増殖及び分化を制御するだけでなく、骨形成及び再構築もコントロールすることから、該活性抽出物は、骨粗鬆症を予防及び処置することが可能である。
【００２６】
一方、骨髄細胞の増殖及び分化は、ＢＭＰ−２（骨形成因子−２（ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２））、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、ＥＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ等の特定の因子によって支配されているであろうことが知られていた。培養環境においてこの因子が変化すると、幹細胞は、前記因子の特異性に従って異なる細胞に分化する。例えば、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＥＧＦは、骨髄ストローマ細胞の骨芽細胞系統への増殖及び分化にポジティブに関係する。この研究において、本発明者は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物のＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−４の遺伝子発現に対する効果、ならびにＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分のＥＧＦ及びＧＭ−ＣＳＦの存在下での骨髄幹細胞の増殖及び分化に対する効果を確認するために実験を行った。
【００２７】
図６において、このデータは、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−４の遺伝子発現、特にＢＭＰ−２及びＴＧＦ−βのそれを増加することを明らかにした。さらに、図７及び表２に示される実験結果より、本発明者は、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物が、ＥＧＦの存在下において、マウス骨髄細胞の分化を刺激することを見出した。該メタノール抽出物のさらなる抽出画分、ＤｉｏＭＰｗは、マウス骨髄細胞の増殖を増強する。
【００２８】
ＧＭ−ＣＳＦに関しては、ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄造血を刺激するために造血前駆細胞上に存在する特異的受容体コンプレックスに働きかけることができることから、骨髄中の造血前駆細胞の単球、好中球、マクロファージ等への増殖及び分化を促進することができる。従って、ＧＭ−ＣＳＦは、化学療法で治療される患者のマクロファージを回復するための治療法において可能性があると考えられる。この研究において、本発明者は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下において、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分の刺激のもとで、骨髄細胞の増殖が増強されたことを見出した（表３参照）。加えて、この結果は、幹細胞の分化が、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のさらなる抽出画分によって増強されたことを示す。同じ条件下において、ＤＨＥＡは、細胞分化の増強効果を現したが、細胞増殖を増強し得なかった。従って、この研究は、本発明に従って調製されたＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物及びさらなる抽出画分は、増殖を通して化学療法によって減少したマクロファージ数の回復及び骨髄細胞の増殖においてＧＭ−ＣＳＦを補助する可能性があり、化学療法アジュバントとして使用され得る。
【００２９】
さらに、本発明者は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、化学療法アジュバントとしての化学療法に対するＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物の応用を確認した。シクロフォスファミド（ＣＹ）は、多くの癌の治療に使用される薬物である；しかし、それは、骨髄機能を破壊し、白血球、マクロファージ、及び赤血球等の血液細胞を減少させ、多くの他の副作用を引き起こす。本発明において、化学療法アジュバントとして本発明の活性抽出物の機能測定に使用する動物モデルを作製するためにマウスに白血球減少症を引き起こすため、シクロフォスファミドを用いた。得られた結果は、本発明の活性抽出物は、白血球数の減少を防止し、ならびに赤血球細胞数及びヘモグロビン含有量を正常レベルに維持し、ＣＹ−処置マウスにおける白血球減少症からの回復を促進した。従って、本発明の活性抽出物は、抗癌薬によって誘発された副作用の緩和のために、化学療法アジュバントとして使用され得る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に従って行われた実験は、明らかにＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物及びそのさらなる抽出画分が、骨細胞調節剤の非存在下で骨原性細胞の増殖及び分化を増強することを示したことから、本発明は、骨粗鬆症の処置におけるＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の適用を提供する。さらに、本発明に従って調製された抽出物は、化学療法によって減少したマクロファージ、白血球、及び赤血球の数を増加及び回復させることから、化学療法アジュバントとして使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供される。本実施例は、本発明を限定するものではなく、またそのように解されるべきである。
【００３２】
本発明の実施例
予備工程１：Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の調製
台湾にあるＹａｎｇ−Ｍｉｎｇ  Ｍｏｕｎｔａｉｎから採取したＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の皮をむいた塊茎４ｋｇを、１％酢酸溶液中に一晩浸漬した。次いで、得られた固形部分を−７０℃で凍結させ、そして凍結乾燥した。凍結乾燥した部分を、１％酢酸の存在下でメタノール溶液中に浸漬した。撹拌しそして４０容積％にメタノール濃度を調整した後、混合溶液を一晩静置させ、そして次いで遠心分離によって分離した。得られた可溶性画分を凍結乾燥し、そしてＤｉｏＭｓと呼ぶ。
【００３３】
更に、ＤｉｏＭｓを、以下の工程を含む分配クロマトグラフィーに供した：酢酸エチルと水の溶媒混合物（１：１）を使用してＤｉｏＭｓを抽出し、該水相中に存在する水抽出物から酢酸エチル抽出物（ＤｉｏＭＰｅと呼ぶ）を分離する工程；ｎ−ブタノール溶媒を該水相に添加して更なる抽出を行い、該水相中に残存している水抽出物からブタノール抽出物（ＤｉｏＭＰｂと呼ぶ）を分離する工程；ならびに該水相へ７５％アルコール溶媒を添加してポリサッカリドを抽出しそして更に除去し、精製水抽出物を得ること（ＤｉｏＭＰｗと呼ぶ）。
【００３４】
予備工程２：Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物を含有するマウス用飼料の調製
市販のマウス飼料であるＰｕｒｉｎａ  Ｃｈｏｗ  ５００１を、粉末にすり潰した。Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の凍結乾燥メタノール抽出物を、該すり潰した飼料からの同量を置換する量で、該すり潰した飼料中に添加し、飼料混合物を形成した。飼料混合物を、蒸留水と均一に混合し、押出し成形によって再成形し、好適な出力で電子レンジにおいて２分間ベークし、そして室温まで冷却した後、−７０℃で冷凍した。凍結乾燥後、該飼料混合物を、Ｐｕｒｉｎａ  Ｃｈｏｗ飼料の特徴と非常に類似したペレットに形成した。該形成化ペレットを−２０℃冷凍機において保存する。該ペレットを食餌供給の日に室温まで加温し、そして滅菌作業テーブル上においてＵＶランプ照射によって滅菌する。異なる濃度のメタノール抽出物を有する飼料混合物を調製した。
【００３５】
予備工程３：骨髄細胞の単離および培養
滅菌条件下で、ＳＰＦグレードＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを犠牲にし、そして大腿骨にＤＭＥＭ／Ｆ１２の液体培養物を注入して、骨髄細胞を取り出した（ｆｌｕｓｈ  ｏｕｔ）。細胞を、滅菌Ｎｏ．５３ナイロンメッシュを通して濾過した。このようにして得た単一細胞懸濁液に、Ｎ２を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を添加し、好適な濃度へ調節した。
【００３６】
予備工程４：マウス由来の骨原性細胞の調製
滅菌条件下で、ＳＰＦグレードのＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスの大腿骨を得、そしてＤＭＥＭ／Ｆ１２を注入した。骨髄細胞を取り出し、そしてＮｏ．５３滅菌ナイロンメッシュを通して濾過した。得られた単一細胞懸濁液に、１５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を添加し、細胞の濃度を調節した。
【００３７】
細胞を、６日間、Ｔフラスコ中、１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養し、培養培地は３日毎で取り換えた。細胞濃度は１０6細胞／ｃｍ2であった。第６日に、懸濁した細胞および培養培地を抜き取った（ｄｒａｗｎ  ｏｕｔ）。付着している細胞層を、室温まで加温された１×ＰＢＳで洗浄し、そして次いで、５〜１０分間３７℃で０．０１％ＥＤＴＡを用いて処理した。ＥＤＴＡを除去し、そして反応を、ＦＣＳを含有する培養培地において停止させた。続いて、５分間３７℃でＴＥＧを用いて処理した。反応を、ＦＣＳを含有する培養培地において同様に停止させた。細胞を全て回収し、そして１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【実施例１】
【００３８】
実施例１：Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物および更に抽出した画分で処理したマウス骨原性細胞の増殖性応答
予備工程４で得られた細胞を、２２Ｇゲージ針を使用して分散させ、そして１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁させて、４．５×１０4細胞／ｍｌの濃度にした。２２５μｌ細胞懸濁液を、９６−ウェルマイクロプレートの各ウェルへ添加した。３時間後、各ウェル中の細胞懸濁液に、２５μｌ  メタノール抽出物、更に抽出した画分の各々およびＤＨＥＡを添加し、そして７２時間インキュベートした。次いで、ＭＴＴアッセイを行った。１ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、そして４時間反応させた。ＭＴＴ溶解緩衝液（２０％ＳＤＳ−５０％ＤＭＦ）を、１５０μｌ／ウェルの量で各ウェルに添加し、そして１６時間反応させ、そして吸光度を各ウェルにおいて得られた細胞懸濁液についてＯ．Ｄ．５７０ｎｍで測定した。
【００３９】
図１に示されるように、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の刺激下で、骨原性細胞の増殖が増強され、ここで、０．０１および０．１μｇ／ｍｌ濃度が、顕著な増強効果を示す。同一濃度下で、ＤＨＥＡは、骨原性細胞の増殖を増強する効果を示さない。抽出された画分、ＤｉｏＭＰｅおよびＤｉｏＭＰｂは、１０〜４００μｇ／ｍｌで細胞増殖を増強し、ここでＤｉｏＭＰｅは優れた効果を示す。
【実施例２】
【００４０】
実施例２：インビトロにおけるアルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）によって測定された、マウスの成熟骨芽細胞の分化に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物および種々の抽出された画分の効果
予備工程４において回収した骨原性細胞を、６日間、Ｔ−フラスコ中でインキュベートした。細胞を２２Ｇゲージ針で分散させ、そして細胞濃度を５×１０3細胞／ｃｍ2に調節した。次いで、細胞を６−ウェルプレート（ここに、４．５ｍｌの細胞培養培地を各ウェルに添加した）中でインキュベートし、そして０．５ｍｌメタノール抽出物および該抽出された画分の各々を翌日添加した。１４日間のインキュベーション後、次いで、アルカリホスファターゼ活性アッセイを、以下に記載のように行った。
【００４１】
培養培地を抜き取り、細胞層をＰＢＳで数回洗浄した。ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、各ウェルへ添加した。得られた懸濁液を、それぞれ−７０℃および３７℃の温度で凍結および解凍プロセスに供する。処理を２回行って、テストサンプルを得る。５０μｌのテストサンプルを、各ウェルからＥＬＩＳＡプレートへ移した。次いで、５０μｌ  ＡＭＰ−基質緩衝液（蒸留水中２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ、０．５Ｍ）、ｐＨ１０；２ｍＭ  塩化マグネシウムおよび９ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルホスフェート）を該ＥＬＩＳＡプレートへ添加して、１０〜２０分間室温でテストサンプルと反応させた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４１０ｎｍ波長で吸光度を測定した直後に、各ウェルの蛋白質濃度を定量的に測定した。測定されたアルカリホスファターゼ活性を、単位／μｇで示す。
【００４２】
図２において示されるように、骨髄前駆細胞の１４日インキュベーション後、アルカリホスファターゼ（これは、成熟骨芽細胞に対して特異的な発現されるマーカーである）の発現が示された。Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の該メタノール抽出物および該メタノール抽出物の更に抽出された画分の各々は、発現されるアルカリホスファターゼの量を有意に増加させ、ここで０．１μｇ／ｍｌのメタノール抽出物、０．１μｇ／ｍｌのＤｉｏＭＰｂ、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌのＤｉｏＭＰｅ、および０．１μｇ／ｍｌのＤｉｏＭＰｗが、最大増強効果を示した。
【実施例３】
【００４３】
実施例３：グルココルチコイド誘発化骨粗鬆症に罹患する患者から誘導された骨髄細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性に対する、メタノール抽出物Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の効果
Ｔｈｅ  Ｔａｉｐｅｉ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た患者の骨髄細胞を、７日間、１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養した。次いで、アルカリホスファターゼ活性アッセイを行った。
【００４４】
図３に示されるように、アルカリホスファターゼの発現が示された。コントロールグループおよび陽性グループ（１ｎＭエストロゲン、これは骨粗鬆症についての公知の処置である）と比較すると、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、発現されるアルカリホスファターゼの量を増加させ、ここで１０μｇ／ｍｌのメタノール抽出物が最大増強効果を示した。
【実施例４】
【００４５】
実施例４：インビボにおける骨髄細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性および石灰化に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の効果
異なる濃度（０、４０、２００、および１０００ｍｇ／ｍｌ）のメタノール抽出物を、経口投与のために調製した。５日間の異なる投薬量（容積）のメタノール抽出物の経口投与後、マウスを犠牲にし、その骨髄細胞を得た。
【００４６】
（１）アルカリホスファターゼ活性アッセイ
得られた骨髄細胞を、２×１０5細胞／ウェルで９６−ウェルマイクロプレート［ここに、１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するα−ＭＥＭ培地２５０μｌを添加した］において培養し、そして２日間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいてインキュベートした。１２５μｌ／ウェルの培養培地を抜き取り、そして１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有する新鮮な培地（１２５μｌ／ウェル）で置換した。４日間インキュベーション後、アルカリホスファターゼ活性アッセイを行った。
【００４７】
図４（Ａ）に示されるように、アルカリホスファターゼの発現が示された。図４（Ａ）において、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、発現されるアルカリホスファターゼの量を増加させ、ここで、１０００ｍｇ／ｋｇのメタノール抽出物は、コントロールグループと比較して、３倍増強まで達し得る。
【００４８】
（２）結節（ｎｏｄｕｌｅ）形成アッセイ
このアッセイは、骨量（ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ）の石灰化を分析するために使用する。異なる濃度（０、４０、２００、および１０００ｍｇ／ｍｌ）のメタノール抽出物を経口投与したマウスから得られた骨髄細胞を、１×１０6細胞／ウェルで２４−ウェルプレート中に接種し、１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するα−ＭＥＭ培地において培養し、そして２４時間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいてインキュベートした。５００μｌ／ウェルの培養培地を抜き取り、そして１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有する新鮮な培地（５００μｌ／ウェル）で置換した。骨量の石灰化を分析するために、細胞を更に１５日間インキュベートし、そして培養培地を４日毎で取り換えた。次いで、結節形成アッセイ（Ｎｏｄｕｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を、以下に示すように行った。
【００４９】
培養培地を抜き取り、細胞を、３７℃で５％ＣＯ2インキュベーター中３０分間、５００μｌ／ウェル  ホルマリンと反応させることによって、固定した。ホルマリンを除去しそして該細胞を滅菌水で３回リンスし、２００μｌ／ウェルの２％アリザリンレッドＳ溶液（Ａｌｉｚａｒｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（これは、カルシウムと反応する）を該ウェル中へ添加し、そして該細胞を１０分間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいて更にインキュベートした。次いでアリザリン溶液を除去し、そして該細胞を無水アルコールで３回リンスした。骨量の石灰化された領域を、Ｍｅｔａイメージによって測定した。
【００５０】
図４（Ｂ）に示されるように、コントロールグループと比較すると、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、骨量の石灰化を促進し、ここで、１０００ｍｇ／ｋｇ濃度のメタノール抽出物が、３．５倍までの最大増強効果を示した。
【実施例５】
【００５１】
実施例５：卵巣摘出した（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ）マウスモデルにおける骨髄細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性および石灰化に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の効果
滅菌条件下で、ＳＰＦグレードＣ５７ＢＬ／６ｊマウスのグループを、外科手術に供し卵巣を除去して、骨粗鬆症の発生を誘発させ、そして別のグループを、コントロールグループとしての使用のために、卵巣を除去しないで手術のみを行った（偽手術したマウスと呼ぶ）。
【００５２】
異なる濃度（０、４０、２００、および１０００ｍｇ／ｍｌ）のメタノール抽出物を、経口投与のために調製した。４２日間異なる投薬量（容積）のメタノール抽出物を経口投与した後、マウスを犠牲にし、その骨髄細胞を得た。
【００５３】
（１）アルカリホスファターゼ活性アッセイ
異なる濃度（０、４０、２００、および１０００ｍｇ／ｍｌ）のメタノール抽出物を経口投与したマウスおよび偽手術したマウスから得られた骨髄細胞を、２×１０5細胞／ウェルで９６−ウェルマイクロプレート［ここに、１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するα−ＭＥＭ培地２５０μｌを添加した］において培養し、そして２日間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいてインキュベートした。１２５μｌ／ウェルの培養培地を抜き取り、そして１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有する新鮮な培地（１２５μｌ／ウェル）で置換した。４日間インキュベーション後、アルカリホスファターゼ活性アッセイを行った。
【００５４】
図５（Ａ）に示されるように、アルカリホスファターゼの発現が示された。図５（Ａ）において、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、発現されるアルカリホスファターゼの量を増加することが示され、ここで、１０００ｍｇ／ｋｇのメタノール抽出物が最大増強効果を示した。
【００５５】
（２）結節形成アッセイ
異なる濃度（０、４０、２００、および１０００ｍｇ／ｍｌ）のメタノール抽出物を経口投与したマウスおよび偽手術したマウスから得られた骨髄細胞を、１×１０6細胞／ウェルで２４−ウェルプレート中に接種し、１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有するα−ＭＥＭ培地において培養し、そして２４時間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいてインキュベートした。５００μｌ／ウェルの培養培地を抜き取り、そして１５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸ナトリウムおよび１０ｎＭデキサメタゾンを含有する新鮮な培地（５００μｌ／ウェル）で置換した。骨量の石灰化を分析するために、細胞を更に１５日間インキュベートし、そして培養培地を４日毎で取り換えた。結節形成アッセイを行った。
【００５６】
図５（Ｂ）に示されるように、コントロールグループと比較すると、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物は、骨量の石灰化を促進し、ここで、１０００ｍｇ／ｋｇのメタノール抽出物が、最大増強効果を示した。
【実施例６】
【００５７】
実施例６：骨髄細胞におけるサイトカインの遺伝子発現に対するメタノール抽出物Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐの効果
全ＲＮＡを、ＵｌｔｒａｓｐｅｃTMＲＮＡ単離キット（Ｂｉｏｔｅｘ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＩＮＣ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して、実施例４から得られた骨髄細胞から抽出した。５μｇ全ＲＮＡおよび２．５μｇオリゴｄＴを１０分間７０℃で加熱し、１０分間室温まで冷却し、次いで４μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌ  ｒＲＮａｓｉｎ、１μｌ（１０単位）ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓウイルス）逆転写酵素およびその緩衝液を添加し、そして最終反応容積は２６．５μｌであった。６０分間４２℃でそして次いで５分間９０℃で前記反応溶液を反応させることによって、ｃＤＮＡを得た。２．５μｌの得られたｃＤＮＡに、０．５μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μｌポリメラーゼ（２単位）およびその緩衝液、１μｌの１０μＭ標的化プライマーを添加し、そして反応混合物の最終容積は２５μｌであった。ＰＣＲを好適なサイクルについて行い、各サイクルは、９４℃での４５秒の変性、好適なアニーリング温度での４５秒のアニーリング、および７２℃での１分間の伸張からなった。反応産物を、２％アガロースゲルにおける電気泳動によって可視化させた。ＰＣＲプライマーの配列を表１に示した。実験結果を図６に示す。
【００５８】
図６に示されるように、ＢＭＰ−２、ＴＧＦ−β、およびＩＬ−４の遺伝子発現が、増加される（特に、ＢＭＰ−２およびＴＧＦ−β）。
【００５９】
【表１】
2004210784.tif 000002
【実施例７】
【００６０】
実施例７：上皮増殖因子（ＥＧＦ）の存在下でのＣ３Ｈマウスの骨髄細胞の形態学的変化に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の効果
予備工程３において得られたマウスの骨髄細胞（１×１０4細胞／ウェル）を、Ｎ２および１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を含有する９６−ウェルマイクロプレート中に接種し、そして２４時間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいてインキュベートした。メタノール抽出物およびＤＨＥＡを、それぞれ、異なるウェルへ添加した。メタノール抽出物およびＤＨＥＡが添加されずそして同一インキュベーション手順へ供した純粋培養培地を含有するウェルを、コントロールとして使用した。さらに、陽性コントロールとしての使用のために、５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを使用した以外はコントロールと同一の手順を繰り返した。増殖応答を、ＭＴＴアッセイによって測定した。ＭＴＴアッセイに従って、各々のウェルに１ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を添加し、そして４時間の反応後、ＭＴＴ溶解緩衝液（２０％ＳＤＳ−５０％ＤＭＦ）を、１５０μｇ／ウェルの量でそこへ添加した。得られた混合物を１６時間反応させた。吸光度をＯ．Ｄ．５７０ｎｍで測定した。
【００６１】
図７に示されるように、ＥＧＦで誘発した骨髄中の前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）が増殖する事象において、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物が、骨髄前駆細胞を更に刺激して有意に分化させることがわかった。より望ましい最適な結果が、使用されるメタノール抽出物の濃度が１０μｇ／ｍｌであった場合に得られたことに、注意され得る。１０μｇ／ｍｌのＤｉｏＭＰｗが刺激のために使用された場合に、細胞は、有意に増強された増殖効果を示したことが、表２において更に示される。１００μｇ／ｍｌのＤｉｏＭＰｗが使用される事象において、表２に示されるように、細胞の増殖率は、コントロールの１．９倍まで達し得る。
【００６２】
【表２】
2004210784.tif 000003
【実施例８】
【００６３】
実施例８：ＧＭ−ＣＳＦの存在下におけるＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物および更に抽出した画分で処理したマウスの骨髄細胞の増殖性応答
予備工程３において得られた１×１０4細胞を、９６−ウェルマイクロプレートの各ウェルへ接種し、Ｎ２および４ｎｇ／ｍｌ  ｍＧＭ−ＣＳＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養した。異なる濃度を有するＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物を、それぞれ、異なるウェルにおいて得られた培養細胞へ添加した。次いで、異なるウェル中の得られたメタノール抽出物含有培養細胞を、１４日間３７℃で５％ＣＯ2インキュベーターにおいてインキュベートした。Ｎ２および２０ｎｇ／ｍｌ  ｍＧＭ−ＣＳＦを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養した細胞を、陽性コントロールとして使用する。ＭＴＴアッセイを行った。この点で、１ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を各ウェルに添加して、４時間そこにおいて該培養細胞と反応させた。ＭＴＴ溶解緩衝液（２０％ＳＤＳ−５０％ＤＭＦ）を、１５０μｌ／ウェルの量で添加した。得られた混合物を１６時間反応させた。吸光度をＯ．Ｄ．５７０ｎｍで測定した。
【００６４】
表３に示されるように、０．００１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの範囲の濃度における、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の刺激下で、骨髄細胞の増殖率が有意に増加された。増殖増強の点で、メタノール抽出物についての濃度の最も好ましい範囲は０．０１〜１０００μｇ／ｍｌであることに気付かれ得る。メタノール抽出物の更なる抽出から得られた画分は、全て、細胞増殖を増強する能力を有するとわかる。それらの中でも、ＤｉｏＭＰｂおよびＤｉｏＭＰｅは、特に、増殖の増強に対して優れた効果を有するとわかった。更に、２０週齢成体マウス骨髄細胞は、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度のＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物による刺激時に、分化し得るとわかった。メタノール抽出物の抽出された画分［これらは、水および酢酸エチルの溶媒混合物によって、或いは続いて順にブタノールおよび７５％アルコールを使用して該水抽出物を抽出することによって、抽出された］の中でも、該酢酸エチル抽出された画分および該水抽出物を該７５％アルコールで更に抽出することから得られる該７５％アルコール抽出画分は両方とも、２０週齢の成体マウス骨髄細胞の分化を促進するとわかる。しかし、同一条件下で、ＤＨＥＡは、対照的に、細胞分化を増強する効果のみを示し、そして細胞増殖を増強しない。従って、幹細胞の再生および分化の両方に対する優れた効果を示すＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．の抽出物は、化学療法によって減少されたマクロファージの数を回復させることにおいてＧＭ−ＣＳＦを補助し得、そして化学療法アジュバントとして使用され得る。
【００６５】
【表３】
2004210784.tif 000004
【００６６】
【表４】
2004210784.tif 000005
【実施例９】
【００６７】
実施例９：シクロホスファミドによって誘発された白血球減少症マウスの末梢血中の白血球および赤血球およびヘモグロビン含有量の数に対する、メタノール抽出物の効果
異なる濃度（０、２０、１００、および５００ｍｇ／ｍｌ）のメタノール抽出物を、経口投与のために調製した。マウスに、２００および１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド（ＣＹ）を第０日および第５日に腹腔内注射して、白血球減少症を引き起こし、そして血液を定期的に採血して、貧血（ａｎｅｍｉｅ）状態を引き起こした。マウスが犠牲になるまで、マウスに、第１日に異なる投薬量（容積）のメタノール抽出物を経口投与した。後眼窩洞（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から回収した末梢血を、第０、４、８、および１２日にサンプル化した。
【００６８】
第０、４、８、および１２日に得られた血液（０．１ｍｌ）に、２５μｌ  ＥＤＴＡ溶液（７２ｍｇ／ｍｌ）を添加して血液凝固を防止し、そしてチュルク液（０．０１％クリスタルバイオレットを含む２％酢酸）で１０×または２０×稀釈した。白血球の数を顕微鏡でカウントした。
【００６９】
第８日に得られた血液（０．１ｍｌ）に、２５μｌ  ＥＤＴＡ溶液（７２ｍｇ／ｍｌ）を添加して血液凝固を防止し、そして生理食塩水で２０００×稀釈した。赤血球の数をカウントした。ヘモグロビン（Ｈｂｇ）含有量を、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＲＥら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１５：８５−９２，１９８７によって記載されるように測定した。
【００７０】
図８〜１０に示される結果から、本発明の活性な抽出物は、末梢血中の白血球数の減少を軽減しそして白血球の回復を促進し、そして赤血球およびＨｂｇ含有量を正常レベルへ維持することが示される。
【００７１】
本発明の特定の形態が例示および記載されているが、種々の変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく成され得ることが、上記より明らかであろう。従って、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、本発明は限定されないことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、（Ａ）Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐのメタノール抽出物及びＤＨＥＡ、ならびに（Ｂ）それぞれのさらなる抽出画分のＣ３Ｈマウスの骨原性細胞の分化に対する効果を図示する棒グラフを示す；
【図２】図２は、（Ａ）Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐのメタノール抽出物、および（Ｂ）それぞれのさらなる抽出画分の、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性によって測定された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのマウスの骨原性細胞の成熟骨芽細胞への分化に対する効果を示す棒グラフを含む；
【図３】図３は、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症に苦しむ患者から得られた骨髄細胞のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐのメタノール抽出物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効果を示す棒グラフである；
【図４】図４は、（Ａ）アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性によって測定されたマウスの骨原性細胞の成熟骨芽細胞への分化、及び（Ｂ）結節形成によって測定された健常マウスの骨髄細胞における骨量の石灰化に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐのメタノール抽出物のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を示す棒グラフを含む；
【図５】図５は、（Ａ）アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性、及び（Ｂ）卵巣摘出マウスの骨髄細胞における骨量の石灰化に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐのメタノール抽出物のｉｎ  ｖｉｖｏでの効果を示す棒グラフを含む；
【図６】図６は、本発明によるＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物を経口的に投与されたマウスから単離された骨髄細胞における、サイトカインのＲＴ−ＰＣＲの結果を示す；
【図７】図７は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の存在下での、マウス骨髄細胞の初代培養の形態的変化に対するＤｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物の効果を示した、フェーズコントラストマイクログラフ（ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ）から成る；
【図８】図８は、シクロフォスファミド（ＣＹ）によって誘発された白血球減少症マウスの末梢血中の白血球数（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｕｎｔ）に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す；
【図９】図９は、重度の貧血に苦しむシクロフォスファミド（ＣＰ）誘発性白血球減少症マウスの末梢血中の赤血球（ＲＢＣ）数（ｃｏｕｎｔ）に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す棒グラフである；ならびに
【図１０】図１０は、重度の貧血に苦しむシクロフォスファミド（ＣＰ）誘発性白血球減少症マウスの末梢血中のヘモグロビン含有量に対する、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐ．のメタノール抽出物のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す棒グラフである。
【配列表】
2004210784000001.app
【外国語明細書】
2004210784000001.pdf