(57)【要約】【課題】制癌作用に優れ、かつ安全性が期待できる新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を提供する。【解決手段】下記の式（Ｉ）で表されるＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体が、制癌作用に優れ、かつ安全性が期待できる【化１】2004323478.tif 000004前記式（Ｉ）において、                Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに異なっていてもよいし、同じであってもよく、水素原子、ハロゲン、炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数３〜８のシクロアルキル基であり、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記アリール基または前記シクロアルキル基は、置換基により置換されていてもよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表されるＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体。
【化１】
2004323478.tif 000003
前記式（Ｉ）において、                Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに異なっていてもよいし、同じであってもよく、水素原子、ハロゲン、炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数６〜３０のアリール基または炭素数３〜９のシクロアルキル基であり、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記アリール基または前記シクロアルキル基は、置換基により置換されていてもよい。
前記式（Ｉ）において、Ｒ４は、保護基を示す。
【請求項２】
前記Ｒ４の保護基が、−Ｒ５，もしくは−ＣＯ−Ｒ６である請求項１記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体。
前記Ｒ５およびＲ６は、炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数６〜３０のアリール基または炭素数３〜９のシクロアルキル基であり、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記アリール基または前記シクロアルキル基は、置換基により置換されていてもよい。
【請求項３】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、水素原子若しくはメチル基であり、Ｒ４が、
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３［ｎは０〜５の整数］、
−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７［ｎは１〜５の整数，Ｒ７は、Ｈ、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ若しくは炭素数１〜５のアルキル基］または
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３［ｎは０〜５の整数］
である請求項１記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体。
【請求項４】
前記式（Ｉ）において、Ｒ４が、
−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ
である請求項３記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含むアポトーシス促進剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む癌治療薬。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む肺腺癌治療薬。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む腎細胞癌治療薬。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含むコレステロール代謝改善剤。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む骨代謝改善剤。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む食品添加剤。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む飲料水添加剤。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む栄養補助剤。
【請求項１４】
請求項１から４のいずれかに記載のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を含む健康食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体に関し、詳しくは、アポトーシス促進作用を有し、制癌活性を発揮する新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の制癌剤若しくは抗癌剤は、癌細胞の発育、増殖を抑制することを目的としており、具体的には、癌細胞の核酸合成の阻害、代謝の抑制などにより、制癌作用等を発揮するものである。従来の制癌剤等としては、例えば、シクロフォスファミド、ブスルファン、チオテパ（テスパミン）などのアルキル化剤、メトトレキセート（アメトプテリン）、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、スポンゴシチジンなどの核酸合成阻害剤、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ネオカルチノスタチンなどの抗生物質、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの植物アルカロイドなどがある。しかしながら、従来の制癌剤等は、その効果が未だ不十分であり、また副作用も強く、その使用に制限があった。
【０００３】
他方、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌは、制癌作用を持つことが知られており、また、天然物であり、今までの経験から安全性に優れていることもわかっている。しかしながら、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌは、その制癌作用が低いという問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、優れた制癌作用を有する新規物質の提供を、その目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のＴｏｃｏｔｏｒｉｅｎｏｌ誘導体は、下記の式（Ｉ）で表されるＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体である。
【０００６】
【化２】
2004323478.tif 000002
【０００７】
前記式（Ｉ）において、                Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、互いに異なっていてもよいし、同じであってもよく、水素原子、ハロゲン、炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数６〜３０のアリール基または炭素数３〜９のシクロアルキル基であり、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記アリール基または前記シクロアルキル基は、置換基で置換されていてもよい。
前記式（Ｉ）において、Ｒ４は、保護基を示す。
【０００８】
この新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、ｔｏｃｏｔｏｒｉｅｎｏｌに比べて優れた制癌作用を有し、またＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌの基本構造をベースにしているため、安全性の点でも期待できる。なお、本発明の新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、後述のように、アポトーシス促進作用を有し、これによって制癌作用を発揮するものである。したがって、本発明のアポトーシス促進剤、癌治療薬、肺腺癌治療薬、腎細胞癌治療薬は、前記本発明の新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体を有するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明について、さらに詳しく説明する。
【００１０】
本発明のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、前記の構造であるが、その特徴は、フェノール性水酸基に基づく抗酸化性をブロックした点である。本発明者等による研究によれば、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌの制癌作用は、ｃｈｒｏｍａｎ  ｒｉｎｇと側鎖の不飽和のｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ構造に起因していると考えられる。一方、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌのｃｈｒｏｍａｎ  ｒｉｎｇに結合しているフェノールの水酸基は、抗酸化作用を持つが、これがアポトーシスを抑制することが知られている。これらの知見から、本発明者等は、前記フェノールの水酸基の抗酸化性をブロックすれば、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌの制癌作用が向上するという着想を得、これに基づき研究を行ったところ、前記式（Ｉ）のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、制癌作用に優れることを突き止め、本発明に到達したのである。なお、本発明の新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、前記アポトーシス促進作用およびこれに起因する制癌作用を有するが、これに限定されず、その構造から、例えば、コレステロールや骨代謝の改善作用等が期待できる。また、本発明のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、その用途は制限されず、医薬品の用途の他、例えば、食品添加剤、飲料水添加剤、栄養補助剤、健康食品等の用途がある。
【００１１】
前記式（Ｉ）のＲ１，Ｒ２およびＲ３において、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などがある。
【００１２】
前記式（Ｉ）のＲ１，Ｒ２およびＲ３において、前記アルキル基とは、直鎖状または分岐状のアルキル基であり、例えば１〜１０の炭素原子を含むものである。前記アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。
【００１３】
前記式（Ｉ）のＲ１，Ｒ２およびＲ３において、前記アルコキシ基とは、直鎖状または分岐状のアルキル基であり、例えば１〜１０の炭素原子を含むものである。前記アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ等が挙げられる。
【００１４】
前記式（Ｉ）のＲ１，Ｒ２およびＲ３において、前記シクロアルキル基とは、脂環炭化水素基であり、例えば３〜９の炭素原子を含むものである。前記シクロアルキル基の例としては、シクロピロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル等が挙げられる。
【００１５】
前記式（Ｉ）のＲ１，Ｒ２およびＲ３において、前記アリール基とは、芳香族炭化水素残基であり、例えば、６〜３０の炭素原子を含むものである。前記アリール基の例としては、単環式アリール基、例えば、フェニル等および、縮合多環式アリール基、例えば、ナフチル、インデニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、テトラセニル等が挙げられる。
【００１６】
前記アルキル基、アルコキシ基、アリール基、シクロアルキル基の置換基としては、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、アミノ基、モノもしくはジアルキルアミノ基（メチルアミノ、ジメチルアミノ基等）、アルキル基（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等）、アルコキシ基（メトキシ、エトキシ、プロポキシ、メトキシエトキシ等）、ハロアルキル基（トリフルオロメチル、ジクロロメチル、トリフルオロエチル基等）、アルキルチオ基（メチルチオ、エチルチオ、ブチルチオ基等）、  アルキルスルホニル基（メタンスルホニル、エタンスルホニル、ブタンスルホニル基等）、脂環炭化水素基（シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル基等）、アリール基などが挙げられる。ただし、アルキル基の置換基としては、アルキル基を除く。
【００１７】
前記式（Ｉ）において、Ｒ４の保護基は、特に制限されないが、例えば、−Ｒ５，もしくは−ＣＯ−Ｒ６がある。前記Ｒ５およびＲ６は、炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数６〜１４のアリール基もしくは炭素数３〜８のシクロアルキル基であり、前記アルキル基、前記アルコキシ基、前記アリール基または前記シクロアルキル基は、置換基により置換されていてもよい。
【００１８】
前記Ｒ４において、前記アルキル基とは、直鎖状または分岐状のアルキル基であり、例えば１〜１０の炭素原子を含むものである。前記アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等が挙げられる。
【００１９】
前記Ｒ４において、前記アルコキシ基とは、直鎖状または分岐状のアルキル基であり、例えば１〜１０の炭素原子を含むものである。前記アルコキシ基の例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ等が挙げられる。
【００２０】
前記Ｒ４において、前記シクロアルキル基とは、脂環炭化水素基であり、例えば３〜９の炭素原子を含むものである。前記シクロアルキル基の例としては、シクロピロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル等が挙げられる。
【００２１】
前記Ｒ４において、前記アリール基とは、芳香族炭化水素残基であり、例えば、６〜３０の炭素原子を含むものである。前記アリール基の例としては、単環式アリール基、例えば、フェニル等および、縮合多環式アリール基、例えば、ナフチル、インデニル、アントリル、フェナントリル、ピレニル、テトラセニル等が挙げられる。
【００２２】
前記アルキル基、アルコキシ基、アリール基、シクロアルキル基の置換基としては、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、ヒドロキシ基、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基、メルカプト基、アミノ基、モノもしくはジアルキルアミノ基（メチルアミノ、ジメチルアミノ基等）、アルキル基（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等）、アルコキシ基（メトキシ、エトキシ、プロポキシ、メトキシエトキシ等）、ハロアルキル基（トリフルオロメチル、ジクロロメチル、トリフルオロエチル基等）、アルキルチオ基（メチルチオ、エチルチオ、ブチルチオ基等）、  アルキルスルホニル基（メタンスルホニル、エタンスルホニル、ブタンスルホニル基等）、脂環炭化水素基（シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル基等）、アリール基などが挙げられる。ただし、アルキル基の置換基としては、アルキル基を除く。
【００２３】
前記式（Ｉ）の誘導体において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、水素原子若しくはメチル基であり、Ｒ４が、
−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３［ｎは０〜５の整数］、
−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＲ７［ｎは１〜５の整数，Ｒ５は、Ｈ、Ｌｉ、Ｋ、Ｎａ若しくは炭素数１〜５のアルキル基］または
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３［ｎは０〜５の整数］
であることが好ましい。
【００２４】
Ｒ７のアルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルがある。
【００２５】
前記式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、水素原子若しくはメチル基であり、Ｒ４が、
−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ
であることが特に好ましい。また、Ｒ１が水素原子、Ｒ２が水素原子およびＲ３がメチル基であり、Ｒ４が、−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨであることが、さらに好ましい。
【００２６】
つぎに、本発明の新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体の合成方法は、特に制限されず、例えば、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌのフェノール水酸基のＨを、上述の保護基に置換すればよい。例えば、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ類とｎ−ハロアルキルニトリル又はｎ−ハロアルキルカルボン酸エステルを、アセトンなどの溶媒中でアルカリ存在下に室温で攪拌し、溶媒を減圧下に留去する。残渣を水酸化ナトリウムで加水分解し、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ類の４−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ誘導体を得る。但し、前記式においてｎは１以上である。
【００２７】
つぎに、本発明のアポトーシス促進剤、癌治療薬、肺腺癌治療薬、腎細胞癌治療薬は、本発明の新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体に加え、その他の成分を含有していてもよい。例えば、賦型剤、ｐＨ調整剤、安定剤などがある。また、本発明のアポトーシス促進剤、癌治療薬、肺腺癌治療薬、腎細胞癌治療薬は、他の医薬品を含んでいてもよく、例えば、他の制癌剤等を含んでいてもよい。
【００２８】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について説明する。
【００２９】
（１）Ｔｃｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体の合成
ａ−Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ（１．０  ｇ），４−ｂｒｏｍｏｂｕｔｙｒｏｎｉｔｒｉｌｅ（０．５  ｇ），ＮａＯＨ（１．０  ｇ）を氷冷下にアセトン（７．０  ｍＬ）中で混和し，室温で４日間攪拌する。沈殿物をろ去した後，溶媒を減圧で留去し，残渣に１２％  ＮａＯＨ（７  ｍＬ）とイソプロピルアルコール（７  ｍＬ）を加え，９０  ℃で２日間攪拌し，濃塩酸（５  ｍＬ）で中和した後，エーテルで抽出する。エーテル層を飽和食塩水で洗い，ＭｇＳＯ４で乾燥後溶媒を留去すると，暗赤色の油状物が得られる。これをＳｉＯ２クロマトグラフィー（溶媒：ヘキサン−エーテル  １：１）で精製して淡赤色油状物質を０．７  ｇを得た。この物質について、ＮＭＲおよびＩＲで構造を調べたところ、目的のＴｃｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体が得られたことがわかった。
【００３０】
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  ｄ：  １．２７（３Ｈ，  ｓ），  １．５９  （９Ｈ，  ｓ），  １．６７  （３Ｈ，  ｓ），  ２．００  （３Ｈ，  ｓ），  ２．０９（３Ｈ，ｓ），  ２．１２（３Ｈ，ｓ），  １．７０−２．１５（１６Ｈ，  ｍ），  ２．５７  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．８Ｈｚ），  ２．６５  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．５Ｈｚ），  ３．６８  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．７Ｈｚ），  ４．９５−５．２５  （３Ｈ，  ｍ），  ８．５（１Ｈ，  ｂｒｏａｄ）．  ＩＲ  ｃｍ−１  （ｆｉｌｍ）：  ３２００−２４００（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ＯＨ），  １７１０（Ｃ＝Ｏ）
【００３１】
（２）Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体の活性評価
前記のようにして得られたＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体について、下記に示すようにして、その活性を評価した。
【００３２】
（殺細胞効果）
肺腺癌細胞（Ａ５４９細胞）を使用して、前記Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体（Ｔ３Ｅ）の癌細胞の殺細胞効果を評価した。なお、コントロールとして、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ（Ｔ３）および６−Ｏ−ｃａｒｂｏｘｙｌｐｒｏｐｙｎｙｌ−ｔｏｃｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＥ）をコントロールとして用いた。この評価は、具体的には、以下のようにして、行った。
【００３３】
Ａ５４９細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）＋１０％  ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ  （ＦＣＳ）の培地で、３７℃、５％二酸化炭素の条件で培養した。殺細胞効果の評価は以下の通りに行った。９６穴プレートに細胞（１００００細胞／ｗｅｌｌ）をまき、一晩培養後、ＤＭＥＭ＋２％  ＦＣＳの培地に各濃度の薬剤を含んだ培養液を各ｗｅｌｌに１００ｕｌづつ加え４８時間培養後、ＷＳＴ−１試薬（ＭＢＬ）を１０ｕｌづつ加え、３７℃で数分間保温して発色させ、５７５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。尚、各薬剤はエタノールに可溶化しＦＣＳと混合し、３７℃で一晩反応後ＤＭＥＭを加え、各濃度の薬剤を含んだ培養液として使用した。その際、エタノールのみ含んだ培養液を調製し、コントロールとして用いた。
【００３４】
前記殺細胞効果の評価結果を、図１のグラフに示す。図示のように、前記Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ（Ｔ３）およ６−Ｏ−ｃａｒｂｏｘｙｌｐｒｏｐｙｎｙｌ−ｔｏｃｏｐｈｅｎｏｌ（ＴＥ）に比べて、肺腺癌細胞に対し、顕著な殺細胞効果を示した。
【００３５】
（アポトーシス誘発作用の評価）
つぎに、前記Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌのｃａｓｐａｓｅ３およびｃａｓｐａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅに及ぼす影響について、調べた。この結果を、図２−１および図３に示す。この評価は、つぎのようにして行った。すなわち、まず、６ｃｍプレートにＡ５４９細胞を１００，０００個まき、一晩培養し、各薬剤８０ｍＭ，  ４８時間処理後Ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ    （Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）  に添付されているｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで可溶化し、Ｃａｓｐａｓｅ−３活性を上記のａｓｓａｙ  ｋｉｔのマニュアルに従って、４０５ｎｎの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することにより評価し、
各ｃａｓｐａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅの活性化は各ｐｒｏｃａｓｐａｓｅの分解を各抗体（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で測定した。各バンドの定量はＥＣＬｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とＣＣＤ−ｃａｍｅｒａ  （Ａｔｔｏ）を組み合わせて行った。つぎに、前記Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体について、ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを評価した。この結果を、図２−２に示す。この評価は、ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｏｎｉｓｔｉｃｓ）を用いて行った。その操作は、６ｃｍプレートにＡ５４９細胞をまき、３７℃で一晩ＢｒｄＵをラベルした後、９６穴プレートに細胞（１００００細胞／ｗｅｌｌ）をまき、各薬剤８０ｍＭ，  ４８時間処理後、細胞よりＤＮＡを抽出し、抗ＢｒｄＵ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法でＢｒｄＵ標識されたＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを測定した。
【００３６】
図２−１、図２−２および図３に示すように、Ｔ３ＥのみがＡ５４９に対して強いアポトーシス誘発作用があることが判明した。従って、Ｔ３の抗酸化性をブロックすることがＡ５４９に対してアポトーシスを介した効果的な細胞死を誘発するのに有効であることが示された。
【００３７】
（アポトーシス誘発シグナル伝達の評価）
用いた細胞株、培養条件、薬剤処理等の条件は、前記と同じである。各抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎより購入したものを用いた。まず、Ａ５４９の生存・増殖に必要なＡｋｔ，  Ｅｒｋシグナル伝達系に対するＴ３Ｅの作用を各蛋白分子のリン酸化（活性化）をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で評価することにより行った。この結果を図４に示す。図示のように、Ａ５４９の生存・増殖に必要なＡｋｔ，  Ｅｒｋシグナル系の活性化をＴ３Ｅが顕著に抑制することが明らかになった。次に、Ａｋｔ，  Ｅｒｋシグナル系の下流にあると考えられる抗アポトーシス蛋白（ＢＣＬ−ＸＬ，  ＢＣＬ−２）およびアポトーシス関連蛋白（ＢＡＸ）の発現レベルに対するＴ３Ｅの作用をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  法で検討した。この結果を、図５−１に示す。図示のように、ＢＣＬ−ＸＬ蛋白の発現レベルのみがＴ３Ｅにより顕著に低下していることが明らかとなった。そこで、このＢＣＬ−ＸＬの低下がＥｒｋシグナル系の抑制に起因しているかを、Ｍｅｋ阻害剤であるＰＤ９８０５９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）２０ｍＭでＡ５４９を処理することによるＢＣＬ−ＸＬレベルの変化をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で検討した。その結果を図５−２に示す。図示のように、ＢＣＬ−ＸＬの低下が認められ、Ｔ３Ｅによるアポトーシス誘発のシグナルの１つは、ＢＣＬ−ＸＬ蛋白レベルの低下で説明できる。
【００３８】
最後に、Ｔ３Ｅのアポトーシス誘発を介した殺細胞効果の作用点の１つを明らかにするために、Ｅｒｋシグナル系の上流に位置するＲａｓ蛋白の活性化に対するＴ３Ｅの作用を検討した。図６に示したように、Ｔ３Ｅ処理によって、Ｒａｓ蛋白の電気泳動移動度の短縮が認められた。このことは、Ｒａｓ蛋白の活性化に必要なファンネシル化を抑制していることを示唆している。このことを確認するためにファンネシル化に必要なファンネソール（４０ｍＭ）を加えることにより、Ｔ３ＥによるＲａｓ蛋白のファンネシル化抑制の解除が可能か検討したところ（図７参照）、その抑制は完全に解除され、Ｔ３ＥによるＲａｓ蛋白の活性化抑制が確認された。最後に、Ｔ３ＥによるＲａｓ蛋白の活性化抑制と殺細胞効果の関連性の検討を行ったところ、図８に示したように、Ｔ３ＥによるＲａｓ蛋白のファンネシル化抑制を介した活性化阻害とその殺細胞効果に相関が認められた。以上まとめると、Ａ５４９に対するＴ３Ｅの強力な殺細胞効果の作用点の１つがＲａｓ蛋白の活性化抑制にあることが明らかになった。固形癌の多くにＲａｓシグナル伝達系の異常が認められることから、Ｔ３Ｅは肺腺癌以外の広範囲な癌の治療に有効である可能性が推察される。
【００３９】
【発明の効果】
以上のように、本発明の新規Ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体は、アポトーシス促進作用を有し、これにより制癌作用を発揮し、しかも、この誘導体は、安全性が確認されているＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌをベースとしているから、安全性の面でも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、肺腺癌細胞における本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体の殺細胞効果を示すグラフである。
【図２−１】図２−１は、肺腺癌細胞における本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体のＣａｓｐａｓｅ３活性に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２−２】図２−２は、肺腺癌細胞における本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体のＤＮＡ断片化に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体のＣａｓｐａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅに及ぼす影響を示す電気泳動写真ある。
【図４】図４は、本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体のＲａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに及ぼす影響を示す電気泳動写真である。
【図５−１】図５−１は、本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体のＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、Ｂａｘのレベルに及ぼす影響を示す電気泳動写真である。
【図５−２】図５−１は、Ｍｅｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒのＢＣＬ−ＸＬ、ＢＣＬ−２、Ｂａｘのレベルに及ぼす影響を示す電気泳動写真である。
【図６】図６は、本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体による処理のＲａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇに及ぼす影響を示す電気泳動写真である。
【図７】図７は、本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体依存性のＲａｓの不活性に及ぼす、Ｆａｒｎｅｓｏｌ（ＦＦＯ）の影響を示す電気泳動写真である。
【図８】図８は、本発明の一実施例のＴｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ誘導体が誘導する殺細胞性に及ぼす、Ｆａｒｎｅｓｏｌ（ＦＦＯ）の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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