(57)【要約】【課題】毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質を細胞表層に持つ微生物、及びそれを利用した毒性物質の検出方法を提供することを課題とする。【解決手段】分泌シグナル配列ならびに細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質の構造遺伝子配列またはそのリガンド結合能を有する部分をこの順で有する発現ベクターを酵母に導入し、レセプタータンパク質を細胞表層に有する酵母を得、その酵母と毒性物質とを接触させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列（２）特定の化合物と結合しうるレセプタータンパク質の構造遺伝子配列またはそのリガンド結合能を有する部分、をこの順で有するＤＮＡであって、レセプタータンパク質を細胞表層に発現し得るＤＮＡ。
【請求項２】
前記レセプタータンパク質が毒性物質と結合しうるタンパク質である請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記レセプタータンパク質がアリルハイドロカーボンレセプター（Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である請求項１または２記載のＤＮＡ。
【請求項４】
前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列が哺乳動物由来である請求項１から３のいずれか１項記載のＤＮＡ。
【請求項５】
前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列が、ヒトまたはマウス由来である請求項４記載のＤＮＡ。
【請求項６】
前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列が、前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列により翻訳されるアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸であって、該レセプタータンパク質と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、リガンド結合能を有するアミノ酸配列をコードする構造遺伝子配列である請求項１から５のいずれか１項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
前記細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列が酵母の凝集性タンパク質因子の配列である請求項１から６のいずれか１項記載のＤＮＡ。
【請求項８】
前記細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列が、出芽酵母サッカロマイセス・セレビゼ（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦｌｏ１タンパク質のＣ末端の一部を欠失した配列である請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項９】
前記細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列が、出芽酵母サッカロマイセス・セレビゼ（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦｌｏ１タンパク質のＮ末端から１０９９アミノ酸をコードする配列である請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項記載のＤＮＡを挿入した発現ベクター。
【請求項１１】
発現ベクターが酵母細胞内において、プラスミドとして、もしくは染色体上にて安定に保持される請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれか１項記載のＤＮＡによりコードされた融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１から９のいずれか１項記載のＤＮＡまたは請求項１０または１１に記載の発現ベクターを有する形質転換細胞。
【請求項１４】
前記形質転換細胞が酵母である請求項１３記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求項１５に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
請求項１３から１６のいずれか１項記載の細胞を、レセプタータンパク質と結合する化合物を含む試料と接触させることを特徴とするレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項１８】
レセプタータンパク質と結合する化合物が、毒性物質である請求項１７記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項１９】
前記毒性物質が多環芳香族炭化水素類である請求項１８記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項２０】
前記毒性物質が芳香族塩素化合物または芳香族臭素化合物である請求項１８または１９記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項２１】
レセプタータンパク質と結合する化合物とレセプターが結合した複合体と結合しうるタンパク質を系内に加えることを特徴とする請求項１７から２０のいずれか１項記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項２２】
レセプタータンパク質と結合する化合物とレセプターが結合した複合体と結合しうるタンパク質が、アリルハイドロカーボンレセプター核移行因子（Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｒｏｃａｔｏｒ）またはそのリガンド結合能を有する部分である一部であるレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【請求項２３】
請求項１３から１６のいずれか１項記載の形質転換細胞を含む検出キット。
【請求項２４】
請求項１３から１６のいずれか１項記載の形質転換細胞を、レセプタータンパク質と結合する化合物を含む試料と接触させることによりレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【請求項２５】
レセプタータンパク質と結合する化合物が、毒性物質である請求項２４記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【請求項２６】
前記毒性物質が多環芳香族炭化水素類である請求項２５記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【請求項２７】
前記毒性物質が芳香族塩素化合物または芳香族臭素化合物である請求項２５または２６記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【請求項２８】
請求項１３から１６のいずれか１項記載の形質転換細胞を用いたレセプタータンパク質と結合する化合物の吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物の細胞表層に特定の化合物と結合しうるレセプタータンパク質またはそのリガンド結合能を有する部分を発現させることができる組換えベクター、該ベクターにより形質転換された微生物、及びその利用に関するものである。さらに詳しくは、細胞表層にＡｈＲを有する微生物を用いて、毒性物質を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ダイオキシン類をはじめとした毒性物質が生体に及ぼす影響が解明されてきたが、これらの毒性物質は非常に低濃度で生体に影響を及ぼす。そのため、これらの毒性物質の測定には高感度が要求される。
【０００３】
これらの物質の検出には通常、クロマトグラフィーなどの機器分析が多く用いられる。機器分析では異性体を含む数多くの物質を分離・検出することができる。しかしながら、未知の物質の測定は困難であり、また一般には高価な分析装置を必要とする。
【０００４】
また、これらの測定を簡便に行うための手法として、抗体を用いた免疫反応を利用した検出も行われている。しかし、特定の物質を抗原として抗体を作製するため、抗原となる毒性物質との結合性は高いが、試料中に数多くの異性体が存在する場合には、異性体との結合性は低くなるために試料全体の毒性等量との相関を得ることが困難である。
【０００５】
上記のような欠点を補う測定として、バイオアッセイが挙げられる。バイオアッセイとは生物の反応を指標として化合物の検出や測定を行う方法である。例えば、レポータージーンアッセイでは、目的のレセプタータンパク質とコアクチベーターをコードする遺伝子で形質転換した酵母を用い、レセプターのシグナルによってレポーター遺伝子の発現が誘導されることを利用して測定を行う（非特許文献１）。しかし、これらの手法ではレセプターは細胞内で発現していることから、基質となる毒性物質が細胞膜を通過する必要があり、各物質の細胞膜透過性の違いによって測定結果が影響をうけてしまう。
【０００６】
一方、細胞膜透過性の影響を受けない手法としてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレセプター結合アッセイがあるが、レセプタータンパク質の精製、固定化が必要となり、簡便な方法とは言い難い。
【０００７】
ところで、酵母は基礎生物学に於ける真核生物のモデル細胞として研究対象となってから久しいが、さらに古くは清酒、ビール等に代表されるアルコール醸造に広く用いられており、近年興隆したバイオテクノロジー産業にとっも重要な真核生物として注目を集めている。
【０００８】
前述の通り、酵母細胞の研究の進展は目覚ましく、例えば出芽酵母サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、その生活環の特徴から遺伝学的解析が容易に行える。更に、出芽酵母に於ける宿主ベクター系に代表される遺伝子工学的手法を用いた遺伝子産物の解析は、分子生物学分野に於いては定法となっており、外来遺伝子の導入・発現方法も確立されつつあり、タンパク質、各種化合物等の生産などのバイオテクノロジー産業への応用がなされている。最近になり、酵母の細胞表層に任意のタンパク質を提示する技術が紹介されている（例えば、非特許文献２，３参照）。
【０００９】
そこで発明者らは、用いるべきレセプター、例えば本発明に於けるアリルハイドロカーボンレセプター（以下、ＡｈＲと略す）を酵母などの微生物の細胞表層に局在化させれば、細胞膜透過性の問題がなくなり、より効率的に結合基質と接触することが可能となり、高感度測定が可能となると考えた。
【００１０】
【非特許文献１】
白石他  環境化学、２０００年、第１０巻、ｐ．５７〜６４
【００１１】
【非特許文献２】
植田他  アプライド・エンバイアルメンタル・マイクロバイオロジー、１９９７年、第６３巻、ｐ．１３６２−１３６６（Ｕｅｄａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ６３：  １３６２−１３６６  （１９９７））
【００１２】
【非特許文献３】
佐藤他  アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー、２００２年、第６０巻、ｐ．４６９−４７４（Ｓａｔｏ  ｅｔ．  Ａｌ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６０：４６９−４７４（２００２））
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質を細胞表層に発現するベクターを提供することである。より具体的には、簡便かつ高感度に毒性物質を検出するための前記レセプタータンパク質を細胞表層に発現した細胞を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質を細胞表層に発現するベクターを用いて前記レセプタータンパク質を細胞表層に発現させた細胞を用いることにより、簡便かつ高感度に毒性物質を検出することができることを見出し本発明に至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
【００１５】
（１）（１）細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列（２）特定の化合物と結合しうるレセプタータンパク質の構造遺伝子配列またはそのリガンド結合能を有する部分、をこの順で有するＤＮＡであって、レセプタータンパク質を細胞表層に発現し得るＤＮＡ。
【００１６】
（２）前記レセプタータンパク質が毒性物質と結合しうるタンパク質である（１）に記載のＤＮＡ。
【００１７】
（３）前記レセプタータンパク質がアリルハイドロカーボンレセプター（Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）である（１）または（２）２記載のＤＮＡ。
【００１８】
（４）前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列が哺乳動物由来である（１）から（３）のいずれか記載のＤＮＡ。
【００１９】
（５）前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列が、ヒトまたはマウス由来である（４）記載のＤＮＡ。
【００２０】
（６）前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列が、前記レセプタータンパク質の構造遺伝子配列により翻訳されるアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸であって、該レセプタータンパク質と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、リガンド結合能を有するアミノ酸配列をコードする構造遺伝子配列である（１）から（５）のいずれか記載のＤＮＡ。
【００２１】
（７）前記細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列が酵母の凝集性タンパク質因子の配列である（１）から（６）のいずれか記載のＤＮＡ。
【００２２】
（８）前記細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列が、出芽酵母サッカロマイセス・セレビゼ（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦｌｏ１タンパク質のＣ末端の一部を欠失した配列である（７）記載のＤＮＡ。
【００２３】
（９）前記細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列が、出芽酵母サッカロマイセス・セレビゼ（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦｌｏ１タンパク質のＮ末端から１０９９アミノ酸をコードする配列である（８）記載のＤＮＡ。
【００２４】
（１０）（１）から（９）のいずれか記載のＤＮＡを挿入した発現ベクター。
【００２５】
（１１）発現ベクターが酵母細胞内において、プラスミドとして、もしくは染色体上にて安定に保持される（１０）記載の発現ベクター。
【００２６】
（１２）（１）から（９）のいずれか１項記載のＤＮＡによりコードされた融合タンパク質。
【００２７】
（１３）（１）から（９）のいずれか記載のＤＮＡまたは（１０）または（１１）に記載の発現ベクターを有する形質転換細胞。
【００２８】
（１４）前記形質転換細胞が酵母である（１３）記載の形質転換細胞。
【００２９】
（１５）前記酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である（１４）に記載の形質転換細胞。
【００３０】
（１６）前記酵母がサッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である（１５）に記載の形質転換細胞。
【００３１】
（１７）（１３）から（１６）のいずれか記載の細胞を、レセプタータンパク質と結合する化合物を含む試料と接触させることを特徴とするレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【００３２】
（１８）レセプタータンパク質と結合する化合物が、毒性物質である（１７）記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【００３３】
（１９）前記毒性物質が多環芳香族炭化水素類である（１８）記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【００３４】
（２０）前記毒性物質が芳香族塩素化合物または芳香族臭素化合物である（１８）または（１９）記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【００３５】
（２１）レセプタータンパク質と結合する化合物とレセプターが結合した複合体と結合しうるタンパク質を系内に加えることを特徴とする（１７）から（２０）のいずれか記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【００３６】
（２２）レセプタータンパク質と結合する化合物とレセプターが結合した複合体と結合しうるタンパク質が、アリルハイドロカーボンレセプター核移行因子（Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｒｏｃａｔｏｒ）またはそのリガンド結合能を有する部分である一部であるレセプタータンパク質と結合する化合物を検出する方法。
【００３７】
（２３）（１３）から（１６）のいずれか記載の形質転換細胞を含む検出キット。
【００３８】
（２４）（１３）から（１６）のいずれか１項記載の形質転換細胞を、レセプタータンパク質と結合する化合物を含む試料と接触させることによりレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【００３９】
（２５）レセプタータンパク質と結合する化合物が、毒性物質である（２４）記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【００４０】
（２６）前記毒性物質が多環芳香族炭化水素類である（２５）記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【００４１】
（２７）前記毒性物質が芳香族塩素化合物または芳香族臭素化合物である（２５）または（２６）記載のレセプタータンパク質と結合する化合物を吸着させる方法。
【００４２】
（２８）（１３）から（１６）のいずれか記載の形質転換細胞を用いたレセプタータンパク質と結合する化合物の吸着剤。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより具体的に詳述する。
【００４４】
本発明のＤＮＡは、分泌シグナル配列ならびに細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質の構造遺伝子配列またはそのリガンド結合能を有する部分をこの順で有するＤＮＡであって、レセプタータンパク質を細胞表層に発現し得るＤＮＡである。
【００４５】
本発明における毒性物質とは微量であっても生体内に取り込まれることによって生体に悪影響を及ぼすと考えられている物質であり、多環芳香族炭化水素類などが挙げられる。その中でも特に生体に対する毒性が強い物質として芳香族有機塩素化合物であるＰＣＤＤやＰＣＤＦなどのいわゆるダイオキシン類、また芳香族有機臭素化化合物である臭素化ダイオキシン類などが挙げられる。
【００４６】
これらの毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質としては、特に種類を限定しないが、例えば核内レセプターであるＡｈＲが挙げられる。本発明におけるＡｈＲとしては、特に由来は問わないが、好ましくは哺乳動物由来のものが使用でき、さらに好ましくはヒトまたはマウス由来のものである。
【００４７】
ＡｈＲなどのレセプター遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。例えばＡｈＲ遺伝子を取得するためにヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ法を用いてＡｈＲをコードする遺伝子をクローニングすることができる。特に好ましくは、配列番号２に示したＤＮＡ配列である。さらにこれらの遺伝子は、コードされたアミノ酸配列がリガンド結合能を有していれば、そのアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸であって、該レセプタータンパク質と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００４８】
分泌シグナルとは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ−末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列であり、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。
【００４９】
本発明においては、レセプタータンパク質を酵母の細胞外に分泌（移動）させることができる分泌シグナルであれば、どのような分泌シグナルでも用いられ、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列としては、酵母のＦｌｏ１タンパク質のシグナル配列、分泌型タンパク質の一種であるグルコアミラーゼの分泌シグナル等が挙げられる。
【００５０】
細胞表層局在タンパク質は、その大部分が酵母の細胞表層に集中的に存在するタンパク質をいう。例えば、酵母の凝集タンパク質因子であるＦｌｏ１タンパク質が挙げられる。
【００５１】
ここで、Ｆｌｏ１タンパク質のアミノ酸配列から予想される本タンパク質の性質を列挙する。Ｆｌｏ１タンパク質は、細胞表層に局在するタンパク質で、酵母細胞の凝集性に係わる因子である（ボニー他  ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１９９７年、第１７９巻、ｐ．４９２９−４９３６，Ｂｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４９２９−４９３６（１９９７））。そのＮ末端側から、分泌シグナル領域、酵母細胞の凝集性に係わる領域、そしてＣ末端領域にＧＰＩアンカー結合領域を有している。また、このアミノ酸配列中には１３個所の糖鎖結合部位がある。
【００５２】
本発明に於ける分泌シグナル配列ならびに細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とは、例えば上述のＦｌｏ１タンパク質のような酵母の細胞表層タンパク質の一部をコードする配列をいい、Ｆｌｏ１タンパク質に於いての主にＮ末端部分をコードする配列をいうが、ＡｈＲの活性に悪影響を与えなければ、どのような配列でもよいが、この配列にはＣ末端領域に存在するＧＰＩアンカー結合部位は含まれない。好適には、Ｆｌｏ１タンパク質のＮ末端から１４４７アミノ酸の配列をコードする配列が用いられる。更に好適には、Ｆｌｏ１タンパク質のＮ末端から１０９９アミノ酸の配列をコードする配列が用いられ、本発明であるころのＤＮＡである分泌シグナル配列ならびに細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列、ＡｈＲの構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを酵母細胞に導入することで、ＡｈＲを細胞表層に局在せしめることが出来る。具体的に分泌シグナル配列ならびに細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列とは、配列番号１に示すＤＮＡ配列が挙げられる。
【００５３】
分泌シグナル配列ならびに細胞表層局在タンパク質の一部をコードする配列およびＡｈＲの構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡの合成は、当業者には周知の技術である。
【００５４】
本発明のＤＮＡはプラスミドの形態であることが望ましい。ＤＮＡ取得の簡易化の点からは、大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。本発明のＤＮＡの出発材料としては、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製開始点を有しており、また、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２等）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）を有することがさらに好ましい。また、ＡｈＲ構造遺伝子を発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。例えば、ＩＣＬ（イソクエン酸リアーゼ）プロモーターおよびＩＣＬターミネーターが挙げられる。
【００５５】
本発明の発現ベクターは、通常酵母で利用する発現ベクターに前記ＡｈＲ遺伝子を導入することにより得ることができる。上記発現ベクターの好適な例として、例えば、ｐＷＩＦＳ、或いはｐＷＩＦＬ（松本他  アプライド・エンバイアルメンタル・マイクロバイオロジー、２００２年、第６８巻、ｐ．４５１７−４５２２（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：４５１７−４５２２（２００２）））、等を挙げることができる。なおｐＷＩＦＳ、ｐＷＩＦＬともにＴＲＩ１遺伝子を選択マーカーとし、複製開始点として２μｍプラスミド由来の配列を用いたベクターである。
【００５６】
本発明のＡｈＲを細胞表層に有する酵母は、本発明のＤＮＡを酵母に導入することにより得られる。ＤＮＡの導入とは、酵母の中にＤＮＡを導入し、発現させることを意味する。ＤＮＡの導入は、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーション等の方法があり、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法等がある。得られた形質転換体の培養方法もまたすでに公知であり、例えば、「ローズ他  メソッヅ・イン・イースト・ジェネティクス、１９９０年コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｍ．Ｄ．  Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ  （１９９０））」等に記載されている。
【００５７】
本発明の発現ベクターを導入する酵母として、好ましくはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属であり、より好ましくは、サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００５８】
導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態で、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００５９】
ＤＮＡが導入された酵母は、選択マーカー（例えばＴＲＰ１）で選択される。ＡｈＲが細胞表層に局在しているかどうかは、酵母破砕液の細胞壁および膜粗画分に対するウエスタンブロッティング、蛍光顕微鏡下での蛍光抗体染色で確認し得る。
【００６０】
このようにして得られた形質転換細胞は、その細胞表層に毒性物質と結合しうるレセプタータンパク質を発現しており、毒性物質は細胞膜を透過することなくレセプタータンパク質と結合することができるため、毒性物質の検出や吸着に利用できる。
【００６１】
本発明の毒性物質の検出方法とは、上記形質転換細胞に試料を接触させ、毒性物質がレセプターに結合した状態を測定するものである。結合状態の測定は様々な方法で行うことができる。例えば、毒性物質に対する抗体を用いてレセプターに結合した毒性物質量を測定することができる。また他の方法としては、毒性物質を標識し、試料中の毒性物質との競争的結合阻害により検出することもできる。レセプタータンパク質としてＡｈＲを用いる場合には、毒性物質と結合して変形した状態のＡｈＲと結合することができるＡｈＲ核移行因子（以下、ＡＲＮＴと略す）を利用することができる。この場合、形質転換細胞と毒性物質を接触させた後、さらに標識したＡＲＮＴを加えることにより、形質転換細胞表面においてＡｈＲ／毒性物質／標識ＡＲＮＴ複合体が形成される。その後、標識されたＡＲＮＴ量を測定することによって毒性物質も測定できる。ＡＲＮＴの標識はＦＩＴＣのような蛍光物質でも良いし、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼのような酵素でも良い。さらにはホタルルシフェラーゼやウミシイタケルシフェラーゼのような生物発光タンパク質またはＧＦＰのような蛍光タンパク質との融合タンパク質としても良い。
【００６２】
また、本発明の形質転換細胞を毒性物質の吸着を目的として用いることも可能である。この場合、吸着後の試料からの細胞の分離は非常に容易であり、これらの形質転換細胞は毒性物質の吸着剤として用いることも可能である。
【００６３】
上記の形質転換細胞を用いて毒性物質の検出や吸着を行うに当たって、細胞は生きたまま利用することもできるし、適当な方法によって殺菌あるいは不活化した細胞を利用することもできる。
【００６４】
本発明の検出方法で必要な形質転換細胞などを組み合わせることによって検出キットとすることができる。測定キットにはそのほかに必要な緩衝液や標準物質を加えることもできる。
【００６５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６６】
（１）表層提示用ベクターの作製
本発明の、ＡｈＲを酵母細胞表層に提示し得る発現ベクターを作製するために、ヒトＡｈＲ遺伝子のクローニングを行った。
【００６７】
クローニングには鋳型としてヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを用い、ヒトＡｈＲ遺伝子の全長をプライマーセット（配列番号３，４）を用いて、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ用プライマーにはＢｇｌＩＩ切断部位とＸｈｏＩ消化部位がそれぞれ付加されている。
【００６８】
この増幅断片をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩにより消化後、ｐＷＩＦＳ（松本他  アプライド・エンバイアルメンタル・マイクロバイオロジー、２００２年、第６８巻、ｐ．４５１７−４５２２（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：４５１７−４５２２（２００２）））のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ間隙に挿入し、ＡｈＲ表層提示用ベクターｐＮＹ４０６を作製した（図１）。
【００６９】
（２）酵母サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換
（１）のようにして得られたｐＮＹ４０６でＴＲＰ１遺伝子が欠損しトリプトファン要求性を示す酵母サッカロマイセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ＡＴＣＣ２０４６７９株に形質転換した。形質転換は酢酸リチウム法により行った。  発現ベクターを導入した酵母細胞を、トリプトファン非添加平板培地上で培養することにより、トリプトファン非要求性の形質転換体が得られた。
【００７０】
トリプトファン非要求性の形質転換体への目的のＤＮＡ導入の確認は、形質転換体よりプラスミドを単離し、再度大腸菌に形質転換し、そこから再びプラスミドを単離することにより確認した。
【００７１】
（３）ウェスタンブロット、および蛍光抗体染色による細胞表層提示の確認
まず、ウェスタンブロットによりＡｈＲが細胞表層に存在するかどうかを調べた。ｐＮＹ４０６を持つ形質転換体をトリプトファン非添加の完全培地１０ｍＬ中に植菌し、３０℃にて約２４時間培養した。その細胞を集菌し、ＴＢＳ緩衝液に再懸濁した。グラスビーズ法により細胞を破砕し、破砕液を遠心分離（１０００Ｇ、１０分）した。その上清を溶解性タンパク質粗抽出画分とし、沈殿を細胞壁および膜粗画分とした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、それら画分をを分離し、ウェスタンブロッティング解析に供した。一次抗体として抗ＡｈＲウサギ抗体、二次抗体としては、アンチラビット・モノクローナルＩｇＧ  ＨＲＰ  コンジュゲート（アマシャム・ファルマシア社）を用いて解析した。その結果、細胞壁および膜粗画分のみから、ＡｈＲを示すシグナルを検出した。一方、対照実験として、ＡｈＲ遺伝子を持たないｐＷＩＦＳで形質転換した株のいずれの画分からも、シグナルは検出されなかった。
【００７２】
次に蛍光抗体標識法により確認を行った。一次抗体として抗ＡｈＲウサギ抗体、二次抗体としてＡｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＴＭ４８８  ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ抗体を使用した。ｐＮＹ４０６による形質転換体では、細胞表層に蛍光が観察されたが、ＡｈＲ遺伝子を持たないｐＷＩＦＳで形質転換した株からは蛍光が観察されなかった。これらのことから、目的通りＡｈＲが細胞表層提示されていることが明らかになった。
【００７３】
（４）ＡｈＲ表層提示酵母の結合活性確認
（２）のようにして得られた形質転換体の毒性物質との結合活性の確認を行った。ｐＮＹ４０６を持つ形質転換細胞をトリプトファン非添加の完全培地５ｍＬ中に植菌し、３０℃にて約２４時間培養した。得られた培養液を遠心することにより細胞のみを回収した後、５ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄し、残存していた培地成分を完全に除いた。その後細胞を、５ｍｌのリン酸緩衝液に懸濁した。
【００７４】
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ、以下ＴＣＤＤと記載）（和光純薬より入手）５０μｇ／ｍｌをジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと記載）で５０倍、５００倍、５０００倍に希釈した。これらの希釈液を上記細胞懸濁液に２μｌずつ添加した（溶液中のＤＭＳＯ最終濃度０．０４％、ＴＣＤＤ最終濃度４，４０，４００ｐｇ／ｍｌ）。コントロールとしてはＤＭＳＯのみを２μｌ添加した。室温にて１時間反応させた後、５ｍＬのリン酸緩衝液で３回洗浄した。その後、検出用タンパク質であるＦＩＴＣコンジュゲートＡＲＮＴを最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加え、室温で一時間反応させることにより、ＡｈＲ／ＴＣＤＤ／ＡＲＮＴ複合体を形成させた。
【００７５】
反応終了後の複合体を含む溶液を蛍光プレートリーダーにて励起波長３５５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定した。その結果、ＤＭＳＯのみを添加したコントロールに対してＴＣＤＤ濃度依存的に蛍光強度が増大したことから、ＡｈＲを細胞表層に有する酵母が毒性物質との結合活性を有することが確認できた。
【００７６】
比較例として、ｐＷＩＦＳでトリプトファン非要求性の形質転換した細胞（ＡＴＣＣ２０４６７９／ｐＷＩＦＳ）に対しても、上記（４）と同様の操作を行ったところ、蛍光強度はＴＣＤＤ添加量に関わらず上記（４）のＤＭＳＯのみを添加した場合と同程度であり、この細胞からはＴＣＤＤとの結合活性は確認されなかった。
【００７７】
【発明の効果】
本発明であるＤＮＡを含む発現ベクターは、特定の化合物と結合しうるレセプタータンパク質を細胞表層に発現させることができる。このレセプタータンパク質が表層発現した細胞を用いることにより、簡便かつ高感度に特定の化合物を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＡｈＲ細胞表層提示用発現ベクターｐＮＹ４０６のフィジカルマップを示す図である。ＩＣＬ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ，  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ：イソクエン酸リアーゼ遺伝子由来プロモーター、及びターミネーター、Ｎ−ｈａｌｆ  ｏｆ  ＦＬＯ１：Ｆｌｏ１タンパク質のＮ末端から１０９９アミノ酸をコードする配列（配列番号１）、ＡｈＲ：ＡｈＲ構造遺伝子（配列番号２）、及びＢＬＡ：アンピシリン耐性遺伝子をそれぞれ示す。
【配列表】
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2004305097.tif 000005
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【図１】
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