(57)【要約】【課題】酵素の失活を伴わずかつ簡便な酵素活性の調節が可能となる方法、試薬を提供する。【解決手段】補因子のモノエステルリン酸部分に、キレート化合物を、選択的かつ可逆的に結合させることを特徴とする、酵素活性を調節する方法、補因子のモノエステルリン酸部分に、キレート化合物を、選択的かつ可逆的に結合させることを特徴とする、物質を酵素的に測定する方法、ならびに、少なくとも補因子と酵素および基質、ならびに当該補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を含む物質を酵素的に測定するための試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補因子のモノエステルリン酸部分に、キレート化合物を、選択的かつ可逆的に結合させることを特徴とする、酵素活性を調節する方法。
【請求項２】
補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物が、少なくとも当該補因子と酵素および基質を有する溶液中に含まれることを特徴とする請求項１記載の酵素活性を調節する方法。
【請求項３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補因子とする、請求項１または２記載の酵素活性を調節する方法。
【請求項４】
キレート化合物としてポリアミン亜鉛錯体を用いる、請求項１〜３記載の酵素活性を調節する方法。
【請求項５】
キレート化合物としてポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いる、請求項１〜３記載の酵素活性を調節する方法。
【請求項６】
補因子のモノエステルリン酸部分に、キレート化合物を、選択的かつ可逆的に結合させることを特徴とする、物質を酵素的に測定する方法。
【請求項７】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合し、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と酵素および基質を少なくとも含有する溶液中に無機リン酸を添加することを特徴とする、請求項６記載の無機リン酸の酵素的測定方法。
【請求項８】
少なくとも補因子と酵素および基質、ならびに当該補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を含む物質を酵素的に測定するための試薬。
【請求項９】
補因子がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である、請求項８記載の物質を酵素的に測定するための試薬。
【請求項１０】
補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物がポリアミン亜鉛錯体である、請求項８または９記載の物質を酵素的に測定するための試薬。
【請求項１１】
補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物がポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体である、請求項８または９記載の物質を酵素的に測定するための試薬。
【請求項１２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合し、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と酵素および基質を少なくとも含有する、無機リン酸を酵素的に測定するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を用いた酵素活性を調節する方法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体用いた無機リン酸の酵素的測定方法、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を含む酵素的測定用試薬、ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を含有する無機リン酸の酵素的測定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酵素は、改めて記すまでもなく、生体触媒として種々の産業分野において応用されている。例えば、デンプンを原料とした単糖や二糖の生産には微生物由来のアミラーゼが使用されている。また、洗剤用酵素としてアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼなどが汚れの原因分子を分解する反応の触媒として既に商業的に成功している。一方、診断薬やライフサイエンス研究用の各種試薬などにも酵素は役立てられている。例えば、血糖測定用診断薬にはグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼなどが使用されており、中性脂肪測定用診断薬にはリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロール３リン酸オキシダーゼなどが使用されている。また、ＤＮＡポリメラーゼやＤＮＡリガーゼ、フォスファターゼ、各種制限エンドヌクレアーゼなどが研究用試薬として、あるいはＤＮＡ診断用試薬として使用されている。
【０００３】
酵素反応に限らず、全ての化学反応において反応状態の制御は反応基質から生成物への流れを潤滑に進めるために重要な要素である。特に、産業分野においては品質管理面、製造効率面等さまざまな面から反応の制御が重視される。酵素反応を用いた種々のプロセスにおいて、反応を制御する直接の方法は酵素活性の調節になる。従来より、酵素的性質の情報を基に、温度、ｐＨ、圧力など外的条件を特定の値にすることにより酵素活性を調節する方法が、理論的あるいは経験的にとられてきた。例えば、デンプンからのグルコースの生産では初期反応を９０℃以上、第二反応を６０℃程度と用いる酵素に合わせて条件を調節しシステムを最適化している。また、アルカリ性フォスファターゼや制限エンドヌクレアーゼなどのライフサイエンス研究用酵素も後工程に対する影響を考慮して、熱処理等の方法で活性を抑制することが一般的に行われている。
【０００４】
しかしながら、このような方法では酵素活性を所望の状態に変化させる際に、変化の度合いが大きい場合は多くの時間がかかり、エネルギー的にもコストがかかることになる。一例として、酵素活性を実質的にオフにする場合、高温へのシフトあるいはｐＨを酸性またはアルカリ性へ大きくシフトする必要がある。しかも、一般的にこのような方法では酵素の失活を伴うため、再度酵素活性をオンにすることができない。
【０００５】
このような背景から、酵素自身の失活を伴わず、簡便に酵素活性を調節する方法、試薬の開発が望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記の状況を鑑み、本発明の目的は、酵素の失活を伴わずかつ簡便な酵素活性の調節が可能となる方法、試薬を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討を行い、補因子が反応に関与する酵素においては補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を用いることにより、酵素活性の調節が可能となることを見い出した。また、本発明者らは上記発明を基に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と酵素および基質を少なくとも含有する溶液中に無機リン酸を添加することによる無機リン酸の酵素的測定方法を開発した。本発明を用いることにより、補因子が関与する酵素活性を調節する方法の基礎研究分野及び産業分野への応用が可能となった。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．    補因子のモノエステルリン酸部分に、キレート化合物を、選択的かつ可逆的に結合させることを特徴とする、酵素活性を調節する方法。
項２．    補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物が、少なくとも当該補因子と酵素および基質を有する溶液中に含まれることを特徴とする  項１記載の酵素活性を調節する方法。
項３．    ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補因子とする、  項１または２記載の酵素活性を調節する方法。
項４．    キレート化合物としてポリアミン亜鉛錯体を用いる、  項１〜３記載の酵素活性を調節する方法。
項５．    キレート化合物としてポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いる、  項１〜３記載の酵素活性を調節する方法。
項６．    補因子のモノエステルリン酸部分に、キレート化合物を、選択的かつ可逆的に結合させることを特徴とする、物質を酵素的に測定する方法。
項７．    ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合し、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と酵素および基質を少なくとも含有する溶液中に無機リン酸を添加することを特徴とする、  項６記載の無機リン酸の酵素的測定方法。
項８．    少なくとも補因子と酵素および基質、ならびに当該補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を含む物質を酵素的に測定するための試薬。
項９．    補因子がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である、  項８記載の物質を酵素的に測定するための試薬。
項１０．    補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物がポリアミン亜鉛錯体である、  項８または９記載の物質を酵素的に測定するための試薬。
項１１．    補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物がポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体である、  項８または９記載の物質を酵素的に測定するための試薬。
項１２．    ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合し、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と酵素および基質を少なくとも含有する、無機リン酸を酵素的に測定するための試薬。
【０００９】
本発明は、酵素反応を調節する試薬として補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を用いるが、ポリアミン亜鉛錯体を用いることが好ましい。更に、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることがより好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。このような化合物の典型としては、１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏ−    ｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし，プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛（２＋）イオンの架橋配位子になっている）
【００１０】
【化１】
2004305024.tif 000002
【００１１】
があるが、本発明はこの化合物に限定されるものではない。
【００１２】
本発明は、モノエステルリン酸部位を有する補因子が酵素活性に関与している際の酵素活性の調節方法を提供するものである。ここでいう酵素活性への関与とは、酵素反応の基質としての働きや電子やプロトン、特定の官能基などを伝達するメディエーターとしての働きを示している。
【００１３】
本発明は、従来の方法が、酵素活性を所望の状態に変化させる際に、変化の度合いが大きい場合は多くの時間がかかり、エネルギー的にもコストがかかることや、酵素の失活を伴うため、再度酵素活性をオンにすることができないなどの問題点があることに鑑みなされたという側面がある。本発明により、温度やｐＨを変化させる必要のない、かつ直接酵素に変化を与えることがないので酵素の失活を伴わず再度酵素活性をオンにすることができる、酵素活性の調節方法を提供することができる。
【００１４】
本発明の効果については予期し得るものではないが、ポリアミン亜鉛錯体、具体的にはポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体、より具体的には実施形態に含まれる二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体、更にこのような化合物の典型としては、１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし，プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛（２＋）イオンの架橋配位子になっている）
【００１５】
【化２】
2004305024.tif 000003
【００１６】
が、補因子のモノエステルリン酸部位と可逆的に結合するという性質に基づいている。ポリアミン亜鉛錯体が補因子のモノエステルリン酸部分に結合すると、その部分はプラス電荷を持つ亜鉛錯体がぶら下がった構造をとると予想される。この立体障害により酵素反応が阻害されると考えられる。
【００１７】
このような化学原理に基づいて、最適な酵素活性調節条件を確立し、本発明を完成させるに至った。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において、対象となる酵素としては、モノエステルリン酸部位を有する補因子が反応に関与するものであれば特に制限はないが、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、カルボキシラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ等に属する各種酵素が好ましい。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、リンゴ酸酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、リブロース１，５二リン酸カルボキシラーゼ、プロテインキナーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、プロテインホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなど多種多様な酵素が好ましい範疇に入る。
【００１９】
本発明において、酵素活性を調節する条件としては特に限定されず、対象となる酵素にとって一般的な酵素反応条件が好ましく用いられる。すなわち、本発明では、対象となる酵素及びモノエステルリン酸部位を有する補因子を含む反応系に特定の性質を有するキレート化合物を添加することで、該キレート化合物が補因子のモノエステルリン酸部位と可逆的に結合し、酵素反応を抑制する。したがって、温度、ｐＨなどの外的条件を変化させる必要はない。例えば、３７℃、ｐＨ７の条件にて行われている酵素反応を所望のレベルへと抑制するためには、この条件のまま、本発明のキレート化合物を添加すればよい。
【００２０】
本発明における基質としては、対象となる酵素によって反応を受ける化合物全般を指す。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼではグルコースが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼではグルタミン酸が挙げられる。
【００２１】
本発明において、対象となる補因子としては、モノエステルリン酸部位を有するものであれば特に制限はないが、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、トランスフェラーゼ、カルボキシラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ等に属する各種酵素が一般的に利用する補因子が好ましい。そのようなものとしては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、アデノシントリリン酸、アデノシンジリン酸、アデノシンモノリン酸、グアノシントリリン酸、デオキシアデノシントリリン酸などが挙げられる。本発明の実施例においては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸が用いられている。
【００２２】
本発明で用いられる、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物としては、補因子のモノエステルリン酸部位に対して結合能を有する錯体であればよく、特に制限はないが、好ましくは、ポリアミン亜鉛錯体が挙げられる。具体的には、例えば、ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体が挙げられる。更に具体的には、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体が挙げられる。更に具体的には、本発明者らが製作した１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏ−    ｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし，プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛（２＋）イオンの架橋配位子になっている）
【００２３】
【化３】
2004305024.tif 000004
【００２４】
が挙げられる。
【００２５】
本発明で用いられる錯体は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、化合物１（Ｚｎ２Ｌ）は，市販の１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。
【００２６】
１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え，次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後，１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し，加熱乾燥することにより化合物１
【００２７】
【化４】
2004305024.tif 000005
【００２８】
の構造式であらわされる酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ２Ｌ−ＣＨ３ＣＯＯ−・２ＣｌＯ４−・Ｈ２Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。
【００２９】
元素分析，核磁気共鳴分析，および赤外線分析により，上記化学構造を確認することができる。下記にそのデータの事例を示す。
元素分析の理論値・・・Ｃ２９Ｈ３４Ｃｌ２Ｎ６Ｏ１２Ｚｎ２：  Ｃ，  ４０．４９；  Ｈ，  ３．９８；  Ｎ，  ９．７７
元素分析の実測値・・・Ｃ，  ４０．４３；  Ｈ，  ３．８６；  Ｎ，  ９．８５
１Ｈ  ＮＭＲ  （５００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）の結果
δ２．０４  （２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．１  ａｎｄ  １２．３  Ｈｚ，  ＣＣＨＮ），  ２．５３  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＨ３），  ３．０６  （２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．１  ａｎｄ  １２．３  Ｈｚ，  ＣＣＨＮ），  ３．７４  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  １０．４  Ｈｚ，  ＣＣＨＣ），  ４．０２  −  ４．３４  （８Ｈ，  ｍ，  ＡｒＣＨ２），  ７．５４  −  ７．６５  （８Ｈ，  ｍ，  ＡｒＨ），  ８．０６  −  ８．１２  （４Ｈ，  ｍ，  ＡｒＨ），  ８．５８  （４Ｈ，  ｍ，  ＡｒＨ）
１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）の結果
δ５８．０，  ６０．１，  ６２．０，  ６４．６，  １２２．７，  １２４．３，  １２４．４，  １２４．４，  １３９．９，  １４０．４，  １４７．０，  １４７．２，  １５４．７，  １５５．１
赤外線分析の結果
１６０９，  １５７６，  １５５６（Ｃ＝Ｏ），  １４８５，  １４３９，  １２６６，  １１０８（ＣｌＯ４−），  １０９０（ＣｌＯ４−），  ７７０，  ６２５  ｃｍ−１
【００３０】
上記のデータは，化合物１に対して酢酸イオンが１当量と過塩素酸イオンが２当量をカウンターイオンとしてもつ物質であることを示している。
【００３１】
なお、本発明におけるキレート化合物の使用濃度としては特に限定されず、用いる酵素、補因子及び基質の濃度に依存して変更されるべきものであるが、通常０．０１〜１００ｍｍｏｌ／ｍｌ、特に０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｍｌの範囲とすることが好ましい。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（錯体の合成）
補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物として、１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏ−    ｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（フォスタグ）を、以下のように調製した。
１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え，次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加えた。溶媒を減圧留去して褐色のオイルを得た。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解した後，１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加えた。析出する無色の結晶を濾取し，加熱乾燥して化合物１の酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ２Ｌ−ＣＨ３ＣＯＯ−・２ＣｌＯ４−・Ｈ２Ｏ）を得た。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。収量は３．０ｇ，収率は７９％であった。
元素分析，核磁気共鳴分析，および赤外線分析により，上記化学構造を確認した。下記にそのデータを示す。
元素分析によると，元素分析の理論値はＣ２９Ｈ３４Ｃｌ２Ｎ６Ｏ１２Ｚｎ２：  Ｃ，  ４０．４９；  Ｈ，  ３．９８；  Ｎ，  ９．７７であるが，元素分析の実測値はＣ，  ４０．４３；  Ｈ，  ３．８６；  Ｎ，  ９．８５であった。
１Ｈ  ＮＭＲ  （５００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）の結果は，δ２．０４  （２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．１  ａｎｄ  １２．３  Ｈｚ，  ＣＣＨＮ），  ２．５３  （３Ｈ，  ｓ，  ＣＨ３），  ３．０６  （２Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．１  ａｎｄ  １２．３  Ｈｚ，  ＣＣＨＮ），  ３．７４  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  １０．４  Ｈｚ，  ＣＣＨＣ），  ４．０２  −  ４．３４  （８Ｈ，  ｍ，  ＡｒＣＨ２），  ７．５４  −  ７．６５  （８Ｈ，  ｍ，  ＡｒＨ），  ８．０６  −  ８．１２  （４Ｈ，  ｍ，  ＡｒＨ），  ８．５８  （４Ｈ，  ｍ，  ＡｒＨ）であった。
１３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）の結果は，δ５８．０，  ６０．１，  ６２．０，  ６４．６，  １２２．７，  １２４．３，  １２４．４，  １２４．４，  １３９．９，  １４０．４，  １４７．０，  １４７．２，  １５４．７，  １５５．１であった。
赤外線分析の結果は，１６０９，  １５７６，  １５５６（Ｃ＝Ｏ），  １４８５，  １４３９，  １２６６，  １１０８（ＣｌＯ４−），  １０９０（ＣｌＯ４−），  ７７０，  ６２５  ｃｍ−１であった。
【００３４】
（実施例１）
基質にＤ−グルコース、酵素にグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ−３１１，東洋紡製）、補因子にモノエステルリン酸部位を有するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰと略す）、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物に１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ）  ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（フォスタグ）を用いた系にて検討を実施した。使用したグルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性測定方法と酵素活性の定義は以下の通りである。
０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．６ｍｌ、１．５Ｍ  Ｄ−グルコース水溶液０．３ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水溶液０．１ｍｌをキュベットに調製し、３７℃で約５分間予備加温する。次いで、酵素溶液０．０５ｍｌを添加し、ゆるやかに混和後、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を５〜６分間記録し、その初期直線部分から１分間あたりの吸光度変化を測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、同様にして吸光度変化を測定する。このようにして求めた吸光度変化速度から次式に従い酵素活性を算出する。上記条件下で１分間に１マイクロモルの還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
2004305024.tif 000006
Ｖｍａｘ・Ｋｍ
Ｖｍａｘ及びＫｍは、常法に従いラインウィーバーバークプロット等から求める。
本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨと略す）濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１２秒ごとに記録することにより行った。
まず、第一試薬として、１５０ｍＭのＤ−グルコース、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む水溶液を調製した。第二試薬としては、１．５ｍＭのフォスタグ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）を含む水溶液を調製した。また、酵素水溶液として０．０２Ｕ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含むトリス−塩酸（ｐＨ７．５）水溶液を調製した。
第一試薬：２５０μｌと酵素試薬：５μｌを混合し、３７℃で５分間反応させた後、第二試薬：５０μｌを添加、混合し、更に３７℃で５分間反応させた。一連の酵素反応を、３４０ｎｍの吸光度変化として記録した。
結果を図１に示す。
これにより、酵素反応系に第二試薬、すなわちモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物（この場合はフォスタグ）を加えることにより、酵素活性を低下させることが可能であることが分かる。
【００３５】
（比較例１）
補因子としてＮＡＤＰではなく、モノエステルリン酸部位を有しないニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと略す）を用い、実施例１と同様の検討を実施した。本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨと略す）濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１２秒ごとに記録することにより行った。
結果を図１に示す。
これにより、補因子がＮＡＤの場合は酵素反応系に第二試薬、すなわちモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を加えても、酵素活性を低下させることは不可能であることが分かる。
【００３６】
（実施例２）
基質にＤ−グルコース、酵素にグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ−３１１，東洋紡製）、補因子にＮＡＤＰ、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物にフォスタグを用いた系にて検討を実施した。
本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、ＮＡＤＰＨ濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１０秒ごとに記録することにより行った。
まず、第一試薬として、１５０ｍＭのＤ−グルコース、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．３ｍＭのフォスタグを含む水溶液を調製した。第二試薬としては、５ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）を含む水溶液を調製した。また、酵素水溶液として０．０２Ｕ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含むトリス−塩酸（ｐＨ７．５）水溶液を調製した。
第一試薬：２５０μｌと酵素試薬：５μｌを混合し、３７℃で５分間反応させた後、第二試薬：５０μｌを添加、混合し、更に３７℃で５分間反応させた。一連の酵素反応を、３４０ｎｍの吸光度変化として記録した。
結果を図１に示す。
これにより、モノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物（この場合はフォスタグ）を含む酵素反応系では酵素活性が阻害されているが、ここに第二試薬、すなわち無機リン酸を加えることにより、酵素活性を回復させることが可能であることが分かる。
【００３７】
（実施例３）
基質にＤ−グルコース、酵素にグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ−３１１，東洋紡製）、補因子にＮＡＤＰ、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物にフォスタグを用いた系にて検討を実施した。
本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、ＮＡＤＰＨ濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１２秒ごとに記録することにより行った。
まず、第一試薬として、２５０ｍＭのＤ−グルコース、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、および０．１〜１ｍＭのフォスタグをそれぞれ含む水溶液を調製した。第二試薬としては、蒸留水を用いた。また、酵素水溶液として５Ｕ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含むトリス−塩酸（ｐＨ７．５）水溶液を調製した。
第一試薬：２００μｌと第二試薬：５μｌを混合し、３７℃で５分間反応させた後、酵素試薬：１００μｌを添加、混合し、更に３７℃で５分間反応させた。一連の酵素反応を、３４０ｎｍの吸光度変化として記録した。
結果を図２に示す。
これにより、モノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物（この場合はフォスタグ）による酵素活性の阻害は、キレート化合物の濃度により調節することが可能であることが分かる。
【００３８】
（実施例４）
基質にＤ−グルコース、酵素にグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ−３１１，東洋紡製）、補因子にＮＡＤＰ、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物にフォスタグを用いた系にて検討を実施した。
本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、ＮＡＤＰＨ濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１２秒ごとに記録することにより行った。
まず、第一試薬として、２５０ｍＭのＤ−グルコース、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．２３ｍＭのフォスタグを含む水溶液を調製した。第二試薬としては、０〜４ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）をそれぞれ含む水溶液を調製した。また、酵素水溶液として５Ｕ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含むトリス−塩酸（ｐＨ７．５）水溶液を調製した。
第一試薬：２００μｌと第二試薬：５μｌを混合し、３７℃で５分間反応させた後、酵素試薬：１００μｌを添加、混合し、更に３７℃で５分間反応させた。一連の酵素反応を、３４０ｎｍの吸光度変化として記録した。
結果を図３に示す。
これにより、モノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物（この場合はフォスタグ）による酵素活性の阻害は、無機リン酸の濃度により調節することが可能であることが分かる。
また、図３におけるそれぞれの酵素反応の初期速度を計算し、無機リン酸濃度に対してプロットした。
結果を図４に示す。
これにより、酵素反応速度が無機リン酸濃度に依存することが分かる。すなわち、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いて、酵素反応溶液中に無機リン酸を添加することによる無機リン酸の酵素的測定方法を提供することができる。
【００３９】
（実施例５）
基質にＤ−グルコース、酵素にグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ−３１１，東洋紡製）、補因子にＮＡＤＰ、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物にフォスタグを用いた系にて検討を実施した。
本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、ＮＡＤＰＨ濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１２秒ごとに記録することにより行った。
まず、第一試薬として、２５０ｍＭのＤ−グルコース、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．２４ｍＭのフォスタグを含む水溶液を調製した。第二試薬としては、０〜４ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）をそれぞれ含む水溶液を調製した。また、酵素水溶液として５Ｕ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含むトリス−塩酸（ｐＨ７．５）水溶液を調製した。
第一試薬：２００μｌと第二試薬：５μｌを混合し、３７℃で５分間反応させた後、酵素試薬：１００μｌを添加、混合し、更に３７℃で５分間反応させた。一連の酵素反応を、３４０ｎｍの吸光度変化として記録した。
結果を図５に示す。
これにより、モノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物（この場合はフォスタグ）による酵素活性の阻害は、無機リン酸の濃度により調節することが可能であることが分かる。
また、図５におけるそれぞれの酵素反応の初期速度を計算し、無機リン酸濃度に対してプロットした。
結果を図６に示す。
これにより、酵素反応速度が無機リン酸濃度に依存することが分かる。すなわち、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いて、酵素反応溶液中に無機リン酸を添加することによる無機リン酸の酵素的測定方法を提供することができる。
【００４０】
（実施例６）
基質にＤ−グルコース、酵素にグルコースデヒドロゲナーゼ（Ｃｏｄｅ：ＧＬＤ−３１１，東洋紡製）、補因子にＮＡＤＰ、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物にフォスタグを用いた系にて検討を実施した。
本系における酵素活性の検出は、蒸留水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、ＮＡＤＰＨ濃度を反映する３４０ｎｍの吸光度の変化を１２秒ごとに記録することにより行った。
まず、第一試薬として、２５０ｍＭのＤ−グルコース、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、５０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．２５ｍＭのフォスタグを含む水溶液を調製した。第二試薬としては、０〜４ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．５）をそれぞれ含む水溶液を調製した。また、酵素水溶液として５Ｕ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含むトリス−塩酸（ｐＨ７．５）水溶液を調製した。
第一試薬：２００μｌと第二試薬：５μｌを混合し、３７℃で５分間反応させた後、酵素試薬：１００μｌを添加、混合し、更に３７℃で５分間反応させた。一連の酵素反応を、３４０ｎｍの吸光度変化として記録した。
結果を図７に示す。
これにより、モノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物（この場合はフォスタグ）による酵素活性の阻害は、無機リン酸の濃度により調節することが可能であることが分かる。
また、図７におけるそれぞれの酵素反応の初期速度を計算し、無機リン酸濃度に対してプロットした。
結果を図８に示す。
これにより、酵素反応速度が無機リン酸濃度に依存することが分かる。すなわち、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いて、酵素反応溶液中に無機リン酸を添加することによる無機リン酸の酵素的測定方法を提供することができる。
【００４１】
【発明の効果】
このように、本発明は、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を用いた酵素活性を調節する方法、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体用いた無機リン酸の酵素的測定方法、補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を含む酵素的測定用試薬、ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を含有する無機リン酸の酵素的測定試薬を開示するものである。
【００４２】
本発明によれば、安価であり、かつ簡便に、酵素の失活を伴わず酵素活性の調節が可能となる方法、試薬を提供することができる。すなわち、補因子が反応に関与する酵素においては補因子のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合するキレート化合物を用いることにより、酵素活性の調節を行う方法、試薬を提供することができる。また、本発明によれば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸のモノエステルリン酸部分に選択的かつ可逆的に結合しポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いて、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸と酵素および基質を少なくとも含有する溶液中に無機リン酸を添加することによる無機リン酸の酵素的測定方法を提供することができる。
【００４３】
本発明を用いることにより、補因子が関与する酵素活性を調節する方法の基礎研究分野及び産業分野への応用が可能となる。また、本発明は手法が簡潔であるため、各種自動分析装置への適用も容易であり、多数の検体処理にも適している。
【００４４】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１、比較例１、実施例２の結果を示す。
【図２】実施例３の結果を示す。
【図３】実施例４における酵素反応の吸光度変化の結果を示す。
【図４】実施例４における酵素反応の初速度と無機リン酸濃度との関係を示す。
【図５】実施例５における酵素反応の吸光度変化の結果を示す。
【図６】実施例５における酵素反応の初速度と無機リン酸濃度との関係を示す。
【図７】実施例６における酵素反応の吸光度変化の結果を示す。
【図８】実施例６における酵素反応の初速度と無機リン酸濃度との関係を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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