(57)【要約】【課題】本発明により、オペレータ間のバラツキを抑え一定条件での実験を可能とし、さらに最低限の陰圧で細胞膜を破壊することが可能となり、よりダメージの少ない状態の細胞を実験に使用できるような方法等を提供すること。【解決手段】パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜を破壊する方法であって、（ａ）被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる工程、及び（ｂ）圧力校正器により制御された陰圧を、前記パッチクランプピペットを介して前記細胞に加える工程を有することを特徴とする方法、及び、当該方法を実行する装置であって、制御された陰圧を、パッチクランプピペットを介して被験細胞に加えるための圧力校正器を含むことを特徴とする装置等が提供可能になった。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜を破壊する方法であって、
（ａ）被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる工程、及び
（ｂ）圧力校正器により制御された陰圧を、前記パッチクランプピペットを介して前記細胞に加える工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）が、被験細胞の懸濁液を含む細胞槽内において、前記パッチクランプピペットの先端口を前記細胞槽内の分散系細胞と接触させる工程であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記被験細胞が、脊椎動物由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載の方法を実行する装置であって、制御された陰圧を、パッチクランプピペットを介して被験細胞に加えるための圧力校正器を含むことを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パッチクランプ法における細胞における細胞膜破壊方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電圧ゲート制御イオンチャンネル（ｖｏｌｔａｇｅ    ｇａｔｅｄ    ｉｏｎ    ｃｈａｎｎｅｌ）及びそれによるイオン電流の状態或いは活動電位を測定する方法は、細胞膜の性質を解析するために極めて有用な方法であり、全細胞（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ）におけるイオンチャンネルの機能及び薬理学的特性等に係る研究調査のための強力な方法として利用されてきた。
その中でも、パッチクランプ法として知られる実験方法は代表的なものであり、現在では多くのバリエーションが加えられて、トランスポータ機能の解析や単一細胞の遺伝子解析や環境因子に対するバイオセンサーにも応用され、生命科学分野で広く用いられている。
【０００３】
【非特許文献１】
標準生理学  第５版  （株）医学書院（２０００年１２月１日発行）  第６８頁〜第７３頁
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、当該パッチクランプ法は、電圧ゲート制御イオンチャンネルに対する潜在的な活性を有する薬剤の調査およびスクリーニングのための的確な方法を提供するが、この方法は、かなりの手先の器用さと高度のオペレータ技能とを必要とする。例えば、陰圧を加える方法としては、一般的には、シリンジでの吸引、真空ポンプでの吸引等が用いられているが、これらの方法では陰圧の加減を感覚（職人）的要素に基づき実施する必要があり、実験者間のバラツキを抑え一定条件での実験が容易ではなかった。このため、薬剤スクリーニングのためには非常に時間を要したり、実験者間等で実験結果にバラツキが生じる傾向があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、パッチクランプ電極としてパッチクランプピペットを用いながら、かつ、陰圧を加える方法として圧力校正器を使用することにより陰圧の加減を数値化に成功し、これによりオペレータ間のバラツキを抑え一定条件での実験を可能とし、さらに最低限の陰圧で細胞膜を破壊することが可能となり、よりダメージの少ない状態の細胞を実験に使用できるようになった。
本発明は、
１．パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜を破壊する方法であって、
（ａ）被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる工程、及び
（ｂ）圧力校正器により制御された陰圧を、前記パッチクランプピペットを介して前記細胞に加える工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記すこともある。）；
２．前記工程（ａ）が、被験細胞の懸濁液を含む細胞槽内において、前記パッチクランプピペットの先端口を前記細胞槽内の分散系細胞と接触させる工程であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．前記被験細胞が、脊椎動物由来の心筋細胞であることを特徴とする前項１又は２記載の方法；
４．前項１又は２記載の方法を実行する装置であって、制御された陰圧を、パッチクランプピペットを介して被験細胞に加えるための圧力校正器を含むことを特徴とする装置（以下、本発明装置と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜を破壊する方法であって、（ａ）被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる工程、及び（ｂ）圧力校正器により制御された陰圧を、前記パッチクランプピペットを介して前記細胞に加える工程を有することを特徴とする。
【０００７】
パッチクランプ法の成功は、細胞膜の一区域とパッチクランプピペットの先端口との間に「ぴったりとした（ｔｉｇｈｔ）」（即ち、高抵抗：ギガオーム）電気シールを形成することが可能であることに基づいている。
【０００８】
本発明方法で使用されるパッチクランプ電極としては、例えば、先端口の開口部直径が、例えば、約１〜５μｍ程度以下のガラス製のピペットであるパッチクランプピペット等をあげることができる。
【０００９】
高抵抗（ギガオーム）電気シールの形成は、このようなパッチクランプピペットを、例えば、脊椎動物由来の心筋細胞等の被験細胞の細胞膜表面に押し付け、当該被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる。この状態では記録器の電流雑音は通常１ｐＡ以上にある。
勿論、被験細胞は、１つまたは複数の細胞であってもよく、また当該被験細胞は液体媒質中に浮遊している状態のものであってもよい。
【００１０】
次いで当該パッチクランプピペットの内部を、圧力校正器を用いて、例えば、約４０〜５０ｍｍＨｇ程度の陰圧に制御することにより細胞膜表面とガラス面とを密着させる。このように細胞膜表面とガラス面とを密着させると、接触抵抗が数メグオームから数ギガオームに増大する。これを高抵抗（ギガオーム）電気シールといい、このプロセスは、高抵抗（ギガオーム）電気シール形成全体に適用される小さな電圧ステップに応答して記録される電流パルスの表示によって電気的に監視されることが一般的である。具体的には、通常、この状態では記録器の電流雑音が約０．２〜０．５ｐＡ程度となる。
勿論、被験細胞は、液体中に浮遊させられている細胞に対し液体／空気界面において高抵抗電気シールを形成させることも、例えば、特表２００２−５３２６８４公報等に記載されるような公知な方法を用いることにより可能になる。
【００１１】
さらに、陰圧吸着により高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で、当該シール部分の細胞膜を引き上げることなくさらに圧力校正器を用いて陰圧を徐々にかけると、吸着した細胞膜の微小部分が破れ、当該パッチクランプピペット内の液体が細胞内液と交換するとともに電気的にも当該パッチクランプピペット内と細胞内電位が等電位となり、当該パッチクランプピペットを細胞内電極として細胞全体に膜電位固定を行うことができる。この状態を、全細胞記録モード（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ    ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ    ｍｏｄｅ）といい、また、このような方法は、一般的には、全細胞（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ）記録法と呼ばれ、小型で球形の細胞に最もよく適用され、細胞外液条件だけではなく、細胞内液条件を変化させながら細胞膜の性質を解析するために極めて有用な方法である。これによって、各種の細胞、例えば、ニューロン、筋芽細胞、血球細胞、内分泌細胞、外分泌細胞等の殆ど全ての種類の細胞についての解析が行われる。
【００１２】
本発明方法において、（ａ）被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる工程、及び（ｂ）圧力校正器により制御された陰圧を、前記パッチクランプピペットを介して前記細胞に加える工程を実現するための事象のシーケンスは、例えば、次の通りである。
１．適切な細胞を選択する。
２．パッチクランプピペットをその細胞の上方に位置させる。因みに、パッチクランプピペットは３次元軸マニピュレータ上に装着すればよい。これを、パッチクランプピペットを動かすために使用してよい。
３．細胞膜表面がパッチクランプピペットによって僅かに変形させられるまでパッチクランプピペットを接触させる。
４．パッチクランプピペットの先端口と細胞膜との間に高抵抗（ギガオーム）電気シールが形成されるまでパッチクランプピペットの内部に圧力校正器を用いて陰圧を加える。
５．パッチクランプピペットの先端口の区域内で細胞膜を破壊する陰圧を、圧力校正器を用いてさらに加えることによって全細胞記録モードを確立する。
【００１３】
本発明で用いられる圧力校正器としては、例えば、約−３００〜＋３００ｍｍＨｇ程度の範囲で静的な圧力を計測できるように設計されているような、圧力計・真空計等をキャリブレーションするための工業計器等をあげることができる。これらの機器は正確な圧力トランスデューサ（例えば、±１％）及びモニタを備えたものがよい。当該機器は市販のものでよく、小型・軽量であって実験での作業が容易なものが適している。具体的には、ＸＣＡＬＩＢＥＲ（商標登録）トランスデューサキャリブレーションシステム（Ｏｈｍｅｄａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ社製）等をあげることができる。
当該機器は、例えば、下記手順により用いることができる。
１．まず圧力トランスデューサを大気に開放する。
２．モニタにてゼロ補正する。
３．パッチクランプピペットと圧力トランスデューサとを圧力チューブを介して接続する。
４．圧力トランスデューサの圧力調節ノブを減圧の方向に回し、モニタを観察しながら任意の陰圧を作り出す。
【００１４】
このような機器を用いることにより、高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜を最低限の陰圧で破壊することが可能となり、よりダメージの少ない状態の細胞を再現性よく調製できるようになった。加えて細胞膜が破壊された時の陰圧が数値化されているため、調製された細胞の細胞膜の状態（硬さ）も把握でき、使用ロットの比較や細胞の良し悪しも同時に判断できるようになった。その結果として実験の効率化及び精度向上が図られるようになった。
【００１５】
本発明は次の添付図面に例示されている。
図１を参照する。電極ホルダー（１）内に保持されたパッチクランプピペット（２）を移動させるために電動式３次元マニピュレータが使用される構成を示している。当該システムには、さらに圧力校正器（３）が備えられており、電極ホルダー（１）と適切な圧力チューブ（４）で接続され、細胞へ加える圧力を制御している。
【００１６】
図２を参照する。パッチクランプピペット（２）の先端口に保持されかつ細胞内に置かれている高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態にある細胞（５）が示されている。
【００１７】
例えば、化合物のイオンチャンネル遮断／作用活性をスクリーニングする目的で本発明を使用するためには、パッチクランプピペットに付着させられている細胞に対象の化合物を適用する必要がある。これは様々な方法で、例えば、高抵抗（ギガオーム）電気シール形成の前または後に細胞槽内の細胞外液体にその化合物を添加することによって行うことが可能であることが容易に理解できる。
【００１８】
また、例えば、化合物の催不整脈作用を評価する目的で本発明を使用するためには、心筋細胞の活動電位持続時間（ＡＰＤ）を測定すればよい。これは、心電図のＱＴ間隔が心筋細胞の活動電位持続時間（ＡＰＤ）を反映することから、化合物によるＱＴ間隔延長作用の予測にはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の活動電位持続時間（ＡＰＤ）の測定が有効であるからである。さらに、心筋細胞の急速活性型遅延整流Ｋ電流（Ｉｋｒ）を測定すると尚良い。Ｉｋｒの阻害活性を示す化合物はＱＴ間隔を延長させる可能性が高いからである。
薬物の初期評価段階において催不整脈作用の薬活性を明らかにすることは、より低リスクな化合物を選択するうえで極めて重要であり、本発明は化合物の安全性評価の精度を向上させる等の点からその利用価値は大きなものである。
実際に本発明を使用するためには、上記同様に、パッチクランプピペットに付着させられている細胞に対象の化合物を適用する必要がある。これは様々な方法で、例えば、高抵抗（ギガオーム）電気シール形成の前または後に細胞槽内の細胞外液体にその化合物を添加することによって行うことが可能であることが容易に理解できる。
【００１９】
化合物の効果を調べる方法の具体例（図面を含む）により、さらに詳細に説明する。
図１には、さらに、細胞懸濁液（６）を含む細胞槽（７）と、パッチクランプピペット（２）の先端口に位置する細胞（５）から全細胞記録を得るための記録位置にあるパッチクランプピペット（２）とが示されている。当該細胞槽（７）は、実験目的や、被験細胞の種類等の実験条件等に応じて適宜その形状、容量等を選択すればよいが、例えば、細胞外生理溶液や調査対象の薬液等を適量保持又は充填することができるものがよい。当該細胞槽（７）は、通常、細胞外生理液や調査対象の薬液等を外部から流入させるための流入ライン（８）及び細胞外生理液や調査対象の薬液等を外部へ流出させるための流出ライン（９）を備えていることがよい。
【００２０】
パッチクランプシステムから得られた電流と電圧の記録は、電極ホルダー（１）から電気コードを通じて、ＡＤコンバーター（１０）、パッチクランプアンプ（１１）を経て、コンピュータ（１２）にて行われる。パッチクランプ法を使用する高抵抗（ギガオーム）電気シールの形成（細胞付着パッチモード）の後に得られた記録と、パッチクランプピペット内部に圧力校正器（３）により制御された陰圧を加えることによって、当該シール部分の細胞膜を破壊して得られる全細胞記録とは明らかに異なるパターンを示し、全細胞記録モードの確立は、電流軌跡上の大きな容量性過渡現象の存在によってコンピュータ（１２）上のモニタによって確認できる。
【００２１】
本発明装置は、本発明方法を実行する装置であって、制御された陰圧をパッチクランプピペットを介して被験細胞に加えるための圧力校正器を含むことを特徴とする装置であればいかなるものであってもよいが、具体的には、例えば、（１）被験細胞の広域像を観察する光学顕微鏡部と、（２）パッチクランプピペットと被験細胞を接触させる手段と、（３）制御された陰圧を、パッチクランプピペットを介して被験細胞に加えるための圧力校正器、（４）パッチクランプピペットを通して電圧を印加して、その結果生じた電流を検出するとともに、被験細胞中の単一の生細胞又は生体膜の微小な領域から生体膜を横切る電流を電極液を介して導出して記録するパッチクランプ測定部と、（５）パッチクランプ測定部から得られた電気生理学的情報とを収集し、記録し、解析するとともに、装置全体を制御する解析制御部とを備えることがよい。
【００２２】
また、パッチクランプピペットと被験細胞を接触させる手段には、細胞槽、及び、油圧式マニュピレーター又は電動式３次元マニュピレーター等を好適に採用できる。さらに、シールドボックス、除振台等を併せて用いてもよい。
【００２３】
また、光学顕微鏡部では、コントラスト増強が可能な、ホフマンモジュレーションシステム、位相差顕微鏡又は微分干渉顕微鏡を好適に使用できる。
【００２４】
本発明装置では、まず、光学顕微鏡部で被験細胞（５）の広域像を得る。こうして得られる被験細胞（５）の広域像に基づいて、パッチクランプピペット（２）を形態観察の対象である被験細胞等の生体被験細胞上の位置に移動する。引き続き、パッチクランプピペット（２）の先端口を被験細胞表面の近接場領域である初期位置まで接近させる。パッチクランプピペット（２）の近接場領域への移動にあたっては、油圧式マニュピレーター又は電動式３次元マニュピレーターを好適に使用できる。このようにして、被験細胞の近接場顕微観察による形態観察にあたっての幾何学的準備が完了し、形態観察を開始する。
【００２５】
次に、上記の顕微観察像に基づいて、パッチクランプピペット（２）を、例えば、電動式３次元マニュピレーターを用いて電気生理測定点の上方に移動する。
【００２６】
次いで、電動式３次元マニュピレーターを用いて、パッチクランプピペット（２）を被験細胞（５）表面に接触させる。また、これと同時に、パッチクランプピペット（２）を通して電圧を印加し、生じる電流をモニタする。
【００２７】
次に、パッチクランプピペット（２）内を圧力校正器（３）により制御された陰圧にして、細胞懸濁液（６）中の被験細胞（５）の膜を電極内に引き込み、高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成する（図２参照）。このとき、高抵抗（ギガオーム）電気シールの形成までの過程を電気的にモニタするため、高抵抗（ギガオーム）電気シール抵抗値の測定、膜電位固定及び膜電流固定するための指令パルスを、主増幅器を介して前置増幅器に出力するために、解析制御部の制御を受けたパルスジェネレータを用いる。尚、パッチクランプピペット（２）の外周には絶縁膜が形成されているので、高抵抗（ギガオーム）電気シールが確実に形成される。さらに、圧力校正器（３）により制御された陰圧を加える（４）ことによって、当該シール部分の細胞膜を破壊し、全細胞記録モード（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ    ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ    ｍｏｄｅ）を形成させる。次いで、パッチクランプ電極内部に電解液を導入する。
【００２８】
このようにして、細胞懸濁液（６）中の被験細胞（５）の電気生理学的観察にあたっての幾何学的準備が完了する。そして、当該被験細胞中の単一の生細胞膜を横切る電流を、パッチクランプピペット（２）から導出してパッチクランプ測定部で測定する。
バッチクランプ測定部は、例えば、（１）パッチクランプピペットで検出された生体電気信号である生体膜を横切る電流信号を入力し、電圧信号に変換し、増幅して出力する前置増幅器と、（２）解析制御部からの指示により、シール抵抗の測定、膜電位固定又は膜電流固定に関する指令信号を出力する電気信号発生装置と、（３）前置増幅器から出力された電圧信号を入力し、増幅し、処理して解析制御部へ向けて出力するとともに、電気信号発生装置から出力された指令信号を入力し、演算処理して前置増幅器へ向けて出力する主増幅器とを備えるとよい。
測定された電流信号に、電圧信号への変換（図１中では、ＡＤコンバーター（１０）の役割）や増幅（図１中では、パッチクランプアンプ（１１）の役割）等を施して解析制御部（図１中では、コンピュータ（１２）の役割）へ通知する。尚、上述のように、パッチクランプピペット（２）で導出された電流・電位は、前置増幅器内の電流電圧変換器（ＡＤコンバーター（１０））により電圧信号に変換されるが、当該信号は微小信号なので増幅、演算、電流雑音の低減等の処理を行う主増幅器（パッチクランプアンプ（１１））を介して解析制御部（コンピュータ（１２））に通知すればよい。
次いで、解析制御部では、パッチクランプ測定部から通知された電気生理学的情報を収集し、記録し、解析する。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、オペレータ間のバラツキを抑え一定条件での実験を可能とし、さらに最低限の陰圧で細胞膜を破壊することが可能となり、よりダメージの少ない状態の細胞を実験に使用できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明方法に関する装置についての模式図（但し、顕微鏡、除振台、電動式３次元マニピュレータ、シールドボックス等を省略した。）である。
電極ホルダー（１）内に保持されたパッチクランプピペット（２）を移動させるために電動式３次元マニピュレータが使用される構成を示している。当該システムには、さらに圧力校正器（３）が備えられており、電極ホルダー（１）と適切な圧力チューブ（４）で接続され、細胞へ加える圧力を制御している。
その他として、細胞（５）、細胞懸濁液（６）、細胞槽（７）、流入ライン（８）、流出ライン（９）、ＡＤコンバーター（１０）、パッチクランプアンプ（１１）、コンピュータ（１２）を併せて示している。
【図２】図２は、パッチクランプピペット（２）の先端口に保持されかつ細胞内に置かれている、高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態にある細胞を示す図である。
【符号の説明】
１      電極ホルダー
２      パッチクランプピペット
３      圧力校正器
４      圧力チューブ
５      細胞
６      細胞懸濁液
７      細胞槽
８      流入ライン
９      流出ライン
１０    ＡＤコンバーター
１１    パッチクランプアンプ
１２    コンピュータ
１６    クリップ
１９    細胞外生理液
２０    薬液
【図１】
2004294211.tif 000002
【図２】
2004294211.tif 000003