(57)【要約】【課題】消化管上皮細胞を、増殖能を失わせることなく培養可能な増殖促進剤を提供する。【解決手段】本発明の増殖促進剤は、消化管間充織由来細胞培養液を含む。前記培養液には、消化管上皮細胞の増殖促進因子が含まれており、前記増殖促進剤を培地に添加して消化管上皮細胞を培養すれば、図１に示すように、増殖能を失うことがなく、安定性および再現性もよい。また、前記促進剤には、ビタミンＡやＨＧＦ等のその他の増殖促進因子を含有させてもよい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管上皮細胞の増殖促進剤であって、消化管間充織由来細胞培養液およびその抽出物の少なくとも一方を含む増殖促進剤。
【請求項２】
前記消化管間充織由来細胞培養液が、消化管間充織由来細胞を１〜７日間培養した後の培養液である請求項１記載の増殖促進剤。
【請求項３】
前記消化管間充織由来細胞培養液が、前記消化管間充織由来細胞を、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびインターロイキン１（ＩＬ−１）からなる群から選択される少なくとも１種類以上の増殖促進因子を含む培地で培養した培養液である請求項１または２記載の増殖促進剤。
【請求項４】
さらに、ビタミンＡおよび肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の少なくとも一方を含む請求項１から３のいずれかに記載の増殖促進剤。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の増殖促進剤を含む消化管上皮細胞用培養培地。
【請求項６】
消化管上皮細胞の培養方法であって、培地として、請求項５記載の培養培地を使用する培養方法。
【請求項７】
消化管上皮細胞の培養方法であって、消化管間充織由来細胞をフィーダー細胞として使用し、消化管上皮細胞を前記フィーダー細胞との共存下で培養する培養方法。
【請求項８】
培地に、ビタミンＡおよび肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の少なくとも一方を添加する請求項７に記載の培養方法。
【請求項９】
薬物吸収動態評価に使用する二次元細胞シートの製造方法であって、請求項１から４のいずれかに記載の増殖促進剤を使用して、消化管上皮細胞を培養する工程を含む製造方法。
【請求項１０】
多孔質膜の上で消化管上皮細胞を培養する請求項９記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、消化管上皮細胞増殖促進剤およびそれを用いた培地等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品等の研究開発において、薬物の体内吸収を評価することは重要である。薬物は、一般に、脂溶性と分子量に依存する受動拡散とによって生体膜を透過するが、腸・肝・腎組織では細胞膜に局在する輸送体（トランスポーター）を介して輸送されることが多い。そこで、薬物の吸収動態を評価する場合、例えば、薬物の腸管吸収モデルとして培養細胞を多孔性膜上に培養した二次元細胞シートを用い、一方の側に薬剤を添加し、一定時間経過後に他方の側に透過した薬物量を測定して、腸管吸収を予測する。
【０００３】
近年、前記薬物吸収動態の評価系に用いる培養細胞として、ＣａＣｏ２等の消化管細胞由来の株化細胞が利用されている。しかし、前記株化細胞は、正常細胞と異なる反応を示す場合もあり、より生体に近い評価を行うためには、正常消化管上皮細胞を用いる必要がある。前記消化管上皮細胞の培養方法としては、種々の文献に記載されている方法がある（例えば、非特許文献１から３参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
日本組織学会編、「組織培養の技術（第３版）基礎編」、（株）朝倉書店発行、１９９７年、ｐ．１３９−１４２
【非特許文献２】
三井ら編、「機能細胞の分離と培養」、丸善（株）発行、１９８７年、ｐ．２６２‐２６８。
【非特許文献３】
フォールマンら（Ｆｏｌｌｍａｎｎ  ｅｔ．  ａｌ．）、「Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ」、２０００年、第１４巻、ｐ．４３５−４４５
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の培養方法では、消化管上皮細胞は、培養開始から数日で増殖能を失う傾向にあり、また、培養の安定性・再現性が十分ではなかった。そこで、本発明は、消化管上皮細胞を、増殖能を失うことなく、安定かつ再現性良く培養可能な増殖促進剤の提供を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の消化管上皮細胞増殖促進剤は、消化管間充織由来細胞培養液およびその抽出物の少なくとも一方を含む。
【０００７】
本発明者等は、消化管上皮細胞の培養に関して鋭意研究を重ねた結果、消化管間充織由来細胞の培養液中に、消化管上皮細胞の増殖促進因子が存在することを突き止め、さらに研究を重ねた。その結果、消化管上皮細胞を培養する培地に、前記消化管間充織由来細胞培養液若しくはその抽出物を添加すれば、消化管上皮細胞を、増殖能を失うことなく、安定かつ再現性よく、培養可能であることを見出し、本発明に到達した。
【０００８】
【発明の実施の形態】
つぎに、本発明の消化管上皮細胞増殖促進剤について、さらに詳細に説明する。
【０００９】
本発明において、消化管上皮細胞とは、例えば、食道、胃、小腸、大腸等の消化管組織の上皮層を構成する細胞である。前記消化管組織の由来としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ラット、ウサギ等が好ましい。これらの消化管上皮細胞は、例えば、前記消化管組織を成体または胎児から摘出した後、トリプシン、コラゲナーゼ等の消化酵素、あるいは、ＥＤＴＡ溶液等のキレート剤等で処理する等して調製することができる。
【００１０】
本発明において、前記消化管間充織由来細胞とは、例えば、食道、胃、小腸、大腸等の消化管組織の結合組織に由来する細胞であって、例えば、繊維芽細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞等の均一細胞あるいはこれらの２種以上の混合細胞をいう。前記結合組織としては、例えば、粘膜固有層、粘膜筋板、粘膜下組織、固有筋層、漿膜等があげられる。前記消化管組織の由来としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ラット、ウサギ等が好ましく、より好ましくは、前記上皮細胞が由来する動物種と同種のものである。これらの消化管間充織由来細胞は、例えば、前記消化管組織を、成体または胎児から摘出して上皮層を除去した後、トリプシン、コラゲナーゼ等の消化酵素、あるいは、ＥＤＴＡ溶液等のキレート剤等で処理する等して調製できる。
【００１１】
本発明の消化管上皮細胞増殖促進剤は、前記消化管間充織由来細胞培養液およびその抽出物のいずれか、もしくは双方を含む。前記消化管間充織由来細胞液は、例えば、前記消化管間充織由来細胞を培養して得られる馴化培養液（コンディションドメディウム）等がある。本発明の促進剤に添加する前記培養液は、前記細胞を培養した培養液から培地のみを回収したもの（上清）が、好ましい。なお、本発明の増殖促進剤において、前記消化管間充織由来細胞培養液およびその抽出物の割合は、特に制限しないが、例えば、０．０００１〜１００体積％の割合である。本発明の増殖促進剤に添加するその他の成分としては、ビタミンＡ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コルチゾン等があげられ、このなかで、ビタミンＡおよびＨＧＦが好ましい。本発明において、ビタミンＡとは、生物学的にビタミンＡ活性を有する物質の全てを意味し、例えば、レチノイン酸、レチナール、３−デヒドロレチナール等があり、このなかで、レチノイン酸が好ましく、以下も同様である。
【００１２】
前記消化管間充織由来細胞を培養する培地としては、特に限定されないが、市販の培地、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍＦ１２等の基本培地に各種成長因子を添加したものが使用でき、その中でも、角化細胞増殖培地が好ましい。さらに、前記培地に、ＥＧＦ、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）等の増殖促進因子を添加すると、消化管上皮細胞に対してより高い増殖促進活性を有する消化管間充織由来細胞培養液が得ることが可能となる。また、前記消化管間充織由来細胞培養液を得るための前記細胞を培養する培養期間としては、特に限定されないが、例えば、１〜７日間であって、好ましくは、２〜３日間である。
【００１３】
前記抽出物は、前記消化管間充織由来細胞培養液からの抽出物であり、前記消化管上皮細胞増殖因子を含んでいれば特に制限されない。抽出手段としては、例えば、例えば、フィルターろ過、濃縮、クロマトグラフィー等の方法が使用できる。
【００１４】
本発明の消化管上皮細胞用培養培地は、前記本発明の増殖促進剤を、消化管上皮細胞の培養に一般的に使用される培地に添加混合することで作製できる。その添加混合比率は、特に制限されず、培地に対する前記促進剤の割合は、例えば、前記促進剤が前記消化管間充織由来細胞培養液のみからなる場合に換算して、１０〜９０体積％であって、好ましくは、３０〜７０体積％、より好ましくは５０体積％である。前記一般的な培地は、特に制限されず、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＨａｍＦ１２、ＭＤＣＫ１５３、角化細胞増殖培地等がある。これらの培地は、調製したばかりの新鮮培地が好ましい。
【００１５】
本発明の消化管上皮細胞用培養培地は、さらに、ビタミンＡおよびＨＧＦの少なくとも１種類を含むことが好ましい。前記因子の使用濃度としては、特に限定されないが、ビタミンＡであれば、例えば、１ｎＭ〜１ｍＭであって、好ましくは、０．１μＭ〜１０μＭであり、また、ＨＧＦであれば、例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは、１〜１００ｎｇ／ｍｌである。
【００１６】
本発明の消化管上皮細胞の培養方法は、前記本発明の消化管上皮細胞用培養培地を用いて、消化管上皮細胞を培養する方法である。その他の培養条件としては、特に制限されず、従来の培養条件を適用できる。
【００１７】
また、その他の本発明の消化管上皮細胞の培養方法は、消化管間充織由来細胞をフィーダー細胞として使用し、消化管上皮細胞を前記フィーダー細胞と共存下で培養する方法である。予め消化管間充織由来細胞を培養して細胞層を得て、これをフィーダー細胞として使用すれば、これから消化管上皮細胞増殖促進因子が分泌され、これによって消化管上皮細胞が、増殖能を失うことなく、安定かつ再現良く培養可能となる。前記フィーダー細胞と消化管上皮細胞との共存は、まず、前記フィーダー細胞を播種、培養した後に、つぎに、前記消化管上皮細胞を播種して行うことが好ましい。本発明の培養方法において、前記フィーダー細胞は、マイトマイシンＣ処理などにより分裂能を失わせた状態で使用してもよく、または、分裂能を有する状態でも使用してもよい。
【００１８】
本発明の薬物吸収動態評価に用いられる二次元細胞シートの製造方法は、本発明の消化管上皮細胞用培養培地または消化管上皮細胞増殖促進剤を使用して、消化管上皮細胞の培養をする工程を含む。この製造方法において、多孔性膜上に消化管上皮細胞を培養することが好ましい。この二次元細胞シートは、従来の方法に準じて使用できる。
【００１９】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されない。
【００２０】
（細胞の調製）
胎齢２０日目のラット胎児より消化管組織（胃、小腸、大腸を含む）を摘出しし、その消化管組織を切開した後、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａを含むＰＢＳに、４℃で１時間、浸漬した。その後、消化管上皮細胞を、前記消化管組織から、マイクロピンセットで扱くようにして分離し、回収した。残った消化管間充織は、１ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼを含むＤＭＥＭにより、３７℃で３０分処理し、消化管間充織由来細胞として分離回収した。
【００２１】
（消化管間充織由来細胞培養液およびフィーダー細胞の調製）
前記消化管間充織由来細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで、コンフルエント（密集状態）になるまで培養した。その後、１％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含むＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）で３日間培養し、消化管間充織由来細胞培養液を得た。また、コンフルエントになった消化管間充織由来細胞は、無処理のままフィーダー細胞として使用した。
【００２２】
（消化管上皮細胞の培養）
前記消化管上皮細胞を、以下の培地（ａ）〜（ｅ）に播種し、培養した。
（ａ）    前記消化間充管織由来細胞培養液（馴化培地）と、新たに調製した１％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含むＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）とを等量混合して作製した培地。
（ｂ）    （ａ）の培地に、さらに、１０μＭ  ビタミンＡ（レチノイン酸）を添加した培地。
（ｃ）    （ａ）の培地に、さらに、１０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（東洋紡績社製）を添加した培地。
（ｄ）    前記コンフルエントとなったフィーダー細胞上に添加された、新たに調製した１％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含むＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）培地。
（ｅ：比較例）    新鮮な１％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを含むＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）。
【００２３】
前記培養の開始から５日後、各培養物を、メタノール固定し、ギザム染色した後、占有細胞面積を計測することにより細胞数を評価した。その結果を図１に示す。図１に示すとおり、前記比較例の培地（ｅ）に対し、馴化培地を含む培地（ａ）では、２．６倍、前記（ａ）にさらにビタミンＡを添加した培地（ｂ）では、３．９倍、前記（ａ）にさらにＨＧＦを添加した培地（ｃ）では、４．３倍、フィーダー細胞を使用して場合（ｄ）では、１．８倍の細胞数が得られた。同様の評価を、独立して３回行ったが、その結果は、図１に示す結果とほぼ同じであった。
【００２４】
【発明の効果】
以上のように、本発明の消化管上皮細胞増殖促進剤を使用すれば、消化管上皮細胞を、増殖能を失わせることなく、安定かつ再現性良く培養することができる。したがって、本発明によれば、例えば、正常な消化管上皮細胞を用いた薬物動態試験が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の消化管上皮細胞増殖促進剤の一実施例を使用して消化管上皮細胞を培養した結果を示すグラフである。
【図１】
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