(57)【要約】【課題】複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことのできる高性能で、低コストな蛍光分光分析装置を提供することを目的とする。【解決手段】試料に照射する励起光を発生する励起光源（１）と、励起光を通過させる少なくとも１つの光ファイバ（２）と、励起光が射出する光ファイバの射出端部を移動するファイバ端駆動機構（４０）と、射出端部から射出する励起光を試料に導く励起光学系（４、５、６）と、励起光を照射された試料が発する蛍光を検出する少なくとも１つの検出器（１５）と、検出器に試料が発する蛍光を導く検出光学系（２、３）とを備える蛍光分光分析装置である。【選択図】    図１
2004301730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射する励起光を発生する励起光源と、
前記励起光を通過させる少なくとも１つの光ファイバと、
前記励起光が射出する前記光ファイバの射出端部を移動するファイバ端駆動機構と、
前記射出端部から射出する前記励起光を前記試料に導く励起光学系と、
前記励起光を照射された試料が発する蛍光を検出する少なくとも１つの検出器と、
前記検出器に前記試料が発する蛍光を導く検出光学系と
を備えたことを特徴とする蛍光分光分析装置。
【請求項２】
前記検出光学系は、前記試料が発する蛍光を前記光ファイバを通過させて前記検出器に導くことを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項３】
前記ファイバ端駆動機構は、前記光ファイバの射出端部を前記励起光学系の光軸方向、該光軸に垂直な方向の内少なくとも１つの方向に移動可能であり、
前記励起光学系は、前記試料の任意の位置に前記励起光を集光して照射するとともに、前記試料の照射部位から発する蛍光を前記ファイバの射出端部に導くこと
を特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項４】
前記ファイバ端駆動機構は、前記光ファイバの射出端面を前記励起光学系の光軸に垂直な面内で回転する回転機構を備えたこと
を特徴とする請求項３に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項５】
前記励起光学系は、前記試料を観察するための光学系である顕微鏡光学系の一部を共有することを特徴とする請求項１乃至４の内いずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項６】
前記光ファイバの射出開口数を小さくする光学系を前記光ファイバの射出端部と前記励起光学系との間に設けたことを特徴とする請求項１乃至５の内いずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項７】
前記励起光学系の倍率が０を超え１０倍以下であることを特徴とする請求項１乃至６の内いずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項８】
前記励起光源は、半導体レーザを用いて構成されることを特徴とする請求項１乃至７の内いずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項９】
前記励起光源は、それぞれ異なる波長のレーザ光を発生する複数のレーザ光源であり、
前記複数のレーザ光源から発せられるレーザ光をビームコンバイナによって混合して前記光ファイバに入射する光混合器を備えたことを特徴とする請求項１乃至８の内いずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項１０】
前記検出光学系と前記検出器との間に分光手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至９の内いずれか１項に記載の蛍光分光分析装置。
【請求項１１】
前記分光手段は、回折格子であり、
前記検出器は、マイクロチャネルプレートであることを特徴とする請求項１０に記載の蛍光分光分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、蛍光分光分析装置に関し、特に複数点の蛍光統計分布解析を行う蛍光分光分析装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ塩基配列の解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）解析、蛋白質相互作用の解析など、ゲノム関連解析に蛍光種の統計分布解析の技術を用いた方法が用いられている。統計分布解析には、蛍光相関分光分析法、蛍光強度分布解析法などが知られている。
【０００３】
蛍光相関分光分析法は蛍光強度の揺らぎを解析し、分子毎の拡散時間や平均分子数を求める手法である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
また、蛍光強度分布解析法は、蛍光揺らぎデータから観測領域内の分子毎の光子計数（明るさ）や平均分子数を求める手法である（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００５】
その他、蛍光寿命解析法は、蛍光の減衰時間を解析することにより、分子毎の蛍光寿命や平均の分子数を求める手法である（例えば、非特許文献１参照）。
【０００６】
従来、このような解析は、溶液中で行われていたが、バイオ技術の進展に伴って、細胞内において同様の解析を行うことが求められてきている。図９は、従来の蛍光分光分析装置の構成を示す図である。この装置は、顕微鏡にレーザを導入しそのレーザ光によって励起された溶液中の蛍光分子から発生する蛍光を測定し統計分布解析を行うものである。
【０００７】
光学顕微鏡の上部に蛍光色素励起用のレーザ光源７０を設けてレーザ光を入射する。レーザ光は対物レンズ７１によって集光され試料容器７２中に観測領域を作り出す。試料容器７２中には、観察する蛍光標識された被観察分子（あるいは小胞などの被観察物質）の溶液が入れられている。観測領域中に存在する試料の蛍光標識から発生した蛍光は再び対物レンズ７１を通過してビームスプリッタ７３により検出器７４へと導かれる。検出器７４の前には集光レンズ７５とピンホール７６が設けられており、コンフォーカル検出を行う。
【０００８】
この構成により非常に小さな観測領域のみからの蛍光を検出することができる。検出器７４で得られた蛍光信号は解析装置７７で解析され、例えば蛋白質の相互作用の測定など、所望の測定が行われる。
【０００９】
細胞に対して統計分布解析を行うためには、この蛍光分光分析の手法を溶液の替わりに細胞に適用することが考えられる。即ち、この装置で試料容器７２に替えてシャーレ等を用い、細胞を光学顕微鏡で観察して測定部位を特定する。そして、図示していないステージ移動機構によりシャーレを移動することで、特定した測定部位をレーザによる観測領域に移動させて観測する。
【００１０】
従来技術をこのようにして適用すれば、統計分布解析の技術を細胞内の測定に応用することができる。しかしながら、従来技術を適用した場合は、測定点が１個所であるため十分な観測ができない。そこで、この問題を解決するため、複数のレーザビームを形成して複数点の蛍光統計分布解析を行う方法が提案されている。
【００１１】
この方法は、レーザビームをコリメータレンズによって一旦平行光束にし、その平行光束を集光レンズによって集光するときに集光レンズの直後に回折格子（ＤＯＥ）を配置し４点の集光点を得て、この４点の二次光源を光源として４本の光束を形成するものである（例えば、非特許文献４参照）。
【００１２】
【非特許文献１】
Ｃｈ．  Ｚａｎｄｅｒ，  Ｊ．  Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎｇ，  Ｒ．  Ａ．  ｋｅＩｌｅｒ（ｅｄｓ．），  Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  ６９Ｐ．及び  ５９Ｐ．（ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ，  ２００２）
【００１３】
【非特許文献２】
Ｙａｎ  Ｃｈａｎ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｓｔｏｇｒａｍ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１７７  Ｊｕｌｙ  １９９９  ５５３−５６７．
【００１４】
【非特許文献３】
Ｈｏｎｇ  Ｑｉａｎ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔ  Ｌ．  Ｅｌｓｏｎ，  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  ｍｏｍｅｎｔｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ，  Ｖｏｌ．８７，  ｐｐ．５４７９−５４８３，  Ｊｕｌｙ  １９９０．
【００１５】
【非特許文献４】
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ，  ｖｏｌ．４１，  Ｎｏ．１６，  ｐｐ３３３６−３３４２（２００２）．
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこの方法では、回折を利用しているため、必要とする４点の集光点以外に光の不均一な広がりであるサイドローブが生じノイズの原因になるという問題が生ずる。また、回折格子を用いるため色収差が生じ、複数の励起波長を利用して分布解析を行う際には不利となる。また、この方法では、蛍光検出系と一体に構成することができず、調整が複雑になるという問題点もある。
【００１７】
更に、この方法では複数の集光点をそれぞれ任意の位置に移動することができない。非特許文献４には、顕微鏡画像の観察に基づいて測定したい任意の位置に集光点を移動する手法を示唆する記載はない。即ち、非特許文献４には、顕微鏡ステージ上の試料を移動して観測部位を特定する方法が提案されているが、その方法は、１点のみの移動を可能とするものであり、複数の集光点を移動させる方式には適用することができない。
【００１８】
本発明は、係る事情に鑑みてなされたものであって、複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことのできる高性能で、低コストな蛍光分光分析装置を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための、請求項１に係る蛍光分光分析装置は、試料に照射する励起光を発生する励起光源と、励起光を通過させる少なくとも１つの光ファイバと、励起光が射出する光ファイバの射出端部を移動するファイバ端駆動機構と、射出端部から射出する励起光を試料に導く励起光学系と、励起光を照射された試料が発する蛍光を検出する少なくとも１つの検出器と、検出器に試料が発する蛍光を導く検出光学系とを備える。
【００２０】
また、請求項２に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、検出光学系は、試料が発する蛍光を光ファイバを通過させて検出器に導く。蛍光検出系が照射のための光学系と一体で構成されているため、光学調整の手間を低減することができる。更に、励起光が通過する光ファイバを経由して蛍光を検出するためコンフォーカル（共焦点）検出も同時に達成できる。
【００２１】
また、請求項３に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、ファイバ端駆動機構は、光ファイバの射出端部を励起光学系の光軸方向、該光軸に垂直な方向の内少なくとも１つの方向に移動可能であり、励起光学系は、試料の任意の位置に励起光を集光して照射するとともに、試料の照射部位から発する蛍光をファイバの射出端部に導く。
【００２２】
また、請求項４に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、ファイバ端駆動機構は、光ファイバの射出端面を励起光学系の光軸に垂直な面内で回転する回転機構を備えた。これによって、測定部位を試料中の任意の位置に設定することができる。
【００２３】
また、請求項５に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、励起光学系は、試料を観察するための光学系である顕微鏡光学系の一部を共有する。励起光学系が、顕微鏡光学系の一部を共有することによって、顕微鏡画像の観察に基づいて、光ファイバ射出端を移動し、少なくとも一つの励起光を試料中の任意の位置に集光照射し、蛍光信号を得ることができる。このことによって観察者が、試料中の測定したい部位に蛍光測定位置を容易に合わせることができる。
【００２４】
また、請求項６に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、光ファイバの射出開口数を小さくする光学系を光ファイバの射出端部と励起光学系との間に設けた。光ファイバ射出端の直後に開口数を小さくする光学系を設けることで、通常光通信等で使われる開口数０．１程度の光ファイバ（ファイババンドル含む）を使用することができる。
【００２５】
また、請求項７に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、励起光学系の倍率が０を超え１０倍以下である。通常のシングルモードファイバの射出開口数は通常０．１程度であり、統計分布解析に適した観測領域を作り出すのに最適な開口数１以上の対物レンズを用いる場合、レーザ光の利用効率を最適にするには光ファイバによって形成される二次光源を試料に照射する励起光学系の倍率が１０倍以下に設定するのが望ましい。レーザ光の有効利用により小型化・低コスト化に貢献する。
【００２６】
また、請求項８に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、励起光源は、半導体レーザを用いて構成される。ファイバの入射に適した半導体レーザを使用するのが好ましく、小型化・低コストが達成できる。
【００２７】
また、請求項９に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、励起光源は、それぞれ異なる波長のレーザ光を発生する複数のレーザ光源であり、複数のレーザ光源から発せられるレーザ光をビームコンバイナによって混合して前記光ファイバに入射する光混合器を備えた。異なる励起波長の複数のレーザ光源より発せられるレーザビームをビームコンバイナにより一つの光軸に混合することで、容易に複数励起波長による統計分布解析を行うことができる。更に分岐光学系により複数の光ファイバにレーザ光を導入することにより、多点同時に統計分布解析を行うこともできる。このことにより高性能な統計分布解析のできる蛍光分光分析装置を提供できる。
【００２８】
また、請求項１０に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、検出光学系と検出器との間に分光手段を備えた。光ファイバの蛍光射出端に分光器を設けることにより構成が簡単になり、小型化、低コスト化に寄与する。
【００２９】
また、請求項１１に係る蛍光分光分析装置は、上記記載の蛍光分光分析装置において、分光手段は、回折格子であり、検出器は、マイクロチャネルプレートである。回折格子により小型化、マイクロチャンネルプレートにより小型化、低コスト化ができる。
【００３０】
【発明の実施の形態】
［第１の実施の形態］
図１は、本発明に係る蛍光分光分析装置の第１の実施の形態を示す構成図である。
【００３１】
任意箇所の一分子蛍光分光測定による統計分布解析を行うため、本蛍光分光分析装置はレーザ光源１を用いて構成されている。このレーザ光源１には、半導体レーザを用いる。レーザ光源１はビームスプリッタ３を介して光ファイバ２に接続され、光ファイバ２はその端面が結像レンズの結像面に位置するように設置される。そして、光ファイバ２の射出端は、光ファイバ２を任意に移動させることができるファイバ端駆動機構４０に設置されている。すなわち、レンズの結像面にファイバ端が配置され、そのファイバ端面に形成される二次光源が顕微鏡光学系（５、６、７、１０、１２、１３）によって試料内に縮小投影され任意の位置に観測領域を作り出す。尚、ファイバ端駆動機構４０は、ファイバ端を光軸に垂直な面内のみでなく、光軸方向（図中左右方向）にも移動させることが可能である。
【００３２】
ファイバ端を発したレーザビームは、結像レンズ４、眼視観察用の分岐ビームスプリッタ５を透過し、対物レンズ６により試料容器７中の試料内に縮小投影される。この様子は、眼視光学系によって試料の透過画像と重ねて観察できる。観察者はこの透過画像を観察しながら試料中の任意の位置に、観測領域を移動することができる。この観察は、カメラ８を通して表示装置９で行っても良い。また、移動は電動ステージ１０によって行うこともできる。
【００３３】
このように、本蛍光分光分析装置では、試料を観察するための顕微鏡光学系の一部を、ファイバ端面から射出するレーザビームを試料に導いて照射するための励起光学系（４、５、６）が共有している。
【００３４】
試料中に形成された観測領域で発生した蛍光は、再び対物レンズ６、ビームスプリッタ５、結像レンズ４、光ファイバ２を透過した後、ビームスプリッタ３を介して検出器１５に入射され蛍光強度が検出される。
【００３５】
本第１の実施の形態では、光源系（１、２、３）と検出系（２、３、１５）が一体になって構成され、光源を形成するファイバ（ファイババンドルを含む）を通して蛍光を検出する。このように構成することにより、光ファイバ２の端面を共役の位置に一致させる調整を行うことなくコンフォーカル（共焦点）検出が実現できる。
【００３６】
図１には、一本の光ファイバ２に対する構成のみが詳細に記入されているが、他の光ファイバ２についてもビームスプリッタ３とレーザ光源１、検出器１５が組み合わされている。尚、レーザ光を光ファイバ２にカップリングするレンズは図１では省略してある。
【００３７】
また、図１では５本の光ファイバを用いているが、ファイバの数は１本でも良い。更に、該複数の光ファイバはファイバ端駆動装置４０によって、別々に移動しても良いし、同時に移動しても良い。
【００３８】
このように本実施の形態の蛍光分光分析装置は、所謂倒立型顕微鏡を構成しており、観察用光源１２とコンデンサ１３で照明された試料容器７中の被観察細胞等の試料を対物レンズ６で拡大して観察できる。そして、通常の生物観察用顕微鏡に備わっている位相差検鏡、微分干渉検鏡（ＤＩＣ）なども観察可能であり、眼視観察だけでなくカメラ８によって撮像し表示装置９上に表示も可能となっている。すなわち通常の顕微鏡の機能を備えている。
【００３９】
図２は、２本の光ファイバを個別に移動することのできるファイバ端駆動機構を、結像レンズ４の結像面付近の光軸方向から見た図である。
【００４０】
２本の光ファイバ２の端部２ａは、それぞれアーム４１を介して別々のＸＹＺステージ４２に固定されている。そしてファイバ端位置は、ＸＹＺステージ４２によって、それぞれ視野内の任意の位置に移動される。また、上述のようにファイバ端位置は結像面内のみでなく、結像面の前後方向にも移動可能である。従って、顕微鏡画像に基づいて試料内の計測したい任意の位置に、蛍光分光測定用の励起光を集光することができる。
【００４１】
このようにして得られた複数の蛍光強度信号を用いて、解析装置１６によって蛍光相関分光、蛍光強度分布解析などの統計分布解析処理が行われる。そして、観測領域内の蛋白質反応の様子、特定の蛋白質濃度の測定、特定分子の検出などに関する情報を得ることができる。
【００４２】
図３は、試料容器中の細胞の観測領域の様子を示す図である。
試料容器７中の細胞２２の中に４つの観測領域２３ａ、２３ｂ、２３ｃ，２３ｄがある。上述のように、顕微鏡光学系による観察を行いながら任意の位置に観察領域２３ａ〜２３ｄを移動することができる。複数の観測領域２３ａ〜２３ｄにより同時に各点の統計分布解析情報を得ることができるため、例えば、観察領域Ａ２３ａと観測領域Ｂ２３ｂを比較することによって生化学反応の進行方向や速度などを分析することが可能となる。
【００４３】
一分子検出による統計分布解析を行うためには、観測領域当たり観測時間中に１個程度の分子が存在することが望ましい。また、統計分布データ解析には非常に多くの測定数が必要となるので、分子のブラウン運動によって移動する時間を短時間で観測できる条件が好ましい。
【００４４】
例えば、蛍光強度分布解析では、一観測時間４０μ秒程度が使用される。また、蛍光相関分光法でもほぼ同等の観測時間が用いられる。この時間内に１分子が存在する観測領域の大きさは約１μｍ立方程度である。従って、励起用のレーザビーム２４の径は０．５〜１μｍに集光する必要がある。通常励起に用いられる可視光の波長は０．５μｍ程度であり、集光用の対物レンズ６の開口数は１．０程度が必要となる。通常のシングルモードファイバは、開口数は約０．１であり、ガウシアンビーム形状を保って対物レンズ６に入射するには、系の倍率を５倍程度にする必要がある。また、開口数を一致させる場合は、系の光学系を１０倍にする必要がある。
【００４５】
［第２の実施の形態］
次に、本発明に係る第２の実施の形態の蛍光分光分析装置について説明する。第２の実施の形態では、光ファイバ２の構成が第１の実施の形態と異なっている。その他の構成は第１の実施の形態と同様であるため、その詳細の説明と図示を省略し、同一の部分には同一の符号を付して参照する。
【００４６】
図４は、本発明に係る第２の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源部の構成を示す図である。本図の光源部は、光ファイバ２として一般的なシングルモードファイバをバンドル状に束ね、その端面にマイクロレンズアレイ２８を設けた構成である。
【００４７】
シングルモードファイバのコア２５の径は通常数μｍ程度であり、クラッド２６の径は１２５μｍが用いられる。これは、通常の光ファイバは長距離の光伝送に用いられるので、できるだけ漏洩光を減らし光の減衰を少なくする為である。従って、この一般的なシングルモードファイバを用いて複数光源を構成すると、ファイバを直接束ねたファイババンドル２７として構成しても光源の相互の間隔は、０．１２５ｍｍが最小となる。
【００４８】
第１の実施の形態で説明したようにファイバと対物レンズの開口数を考慮すると励起光学系の倍率は５〜１０倍が望ましい。従って、試料中に投影される複数観測領域の間隔は、１２．５〜２５μｍとなる。これは、試料の細胞の大きさから考えると大き過ぎ、２〜３μｍ程度に間隔を縮める必要がある。図４に示す光源部の構成はこの点を解決するためのものであり、光ファイバ２の射出開口数をレンズによって小さくすることにより顕微鏡の光学系の倍率を大きくすることができる。
【００４９】
図４に示すマイクロレンズアレイ２８によって、光ファイバ２の開口数０．１を０．０１にすると、対物レンズ６の開口数１に合わせる光学系の倍率を５０〜１００倍にすることができる。すなわち試料中の観測領域の間隔を１．２５〜２．５μｍとすることができる。なお、ファイババンドル２７は１次元に配列されている必要はなく、２次元に配列されていても良い。
【００５０】
また、上述の説明では複数の二次光源を作る場合を示したが、単一の二次光源を形成する場合には、単一の光ファイバと単一のマイクロレンズで構成すれば良い。更に、図５の（１）に示すように、光ファイバ２本を束ねて間隔の狭い二つの観察領域を構成し、その光ファイババンドルをＸＹＺステージ４２による三次元移動に加えて図示しない回転機構によって回転可能とすることで、図５の（２）に示すように、試料中の任意の接近した測定領域の測定も可能とすることができる。
【００５１】
以上の第２の実施の形態によれば、一般的なシングルモードファイバを用いても、複数の観測領域をμｍレベルに接近できる。また、光ファイバとしてファイババンドルを用いて複数の接近した観測領域を作ることもできる。
【００５２】
［第３の実施の形態］
次に、本発明に係る第３の実施の形態の蛍光分光分析装置について説明する。第３の実施の形態では、蛍光励起光源と検出部の構成が第１の実施の形態と異なっている。その他の構成は第１の実施の形態と同様であるため、その詳細の説明と図示を省略し、同一の部分には同一の符号を付して参照する。
【００５３】
図６は、本発明に係る第３の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源・検出部の構成を示す図である。本実施の形態では、蛍光励起光源として複数波長のレーザ光源１を用い、蛍光も複数波長領域で検出を行うように構成した点が異なっている。複数の波長を使うことによって、一度に複数の蛍光色素についての計測が可能となり、複数の物質（蛋白質など）の量やその変化、生化学反応などを同時に観測することが可能になる。
【００５４】
それぞれ波長の違うレーザ光源１から発生したレーザはダイクロイックミラー１７などのビームコンバイナを用いて効率的に一本のビームに合成される。合成された励起光ビームは、ビームスプリッタ１８によって分割されカップリングレンズ１９により複数の光ファイバ２に導入される。
【００５５】
こうして結像レンズの結像面に設けられたファイバ端面で多波長の複数の二次光源が形成されることになる。尚、各ファイバ端面は実施例１と同様にファイバ端駆動機構４０に取り付けられている。
【００５６】
この光ファイバ２の端面で形成される多波長の二次光源が対物レンズ６によって試料に照射されて、試料中に複数の観測領域を形成する。試料から発生した蛍光は再び対物レンズ６、結像レンズ４を通過して光ファイバ２の端面に入射する。このとき光ファイバ２のコアによってピンホールと同等の共焦点効果が生じる。即ち、共焦点検出が行われる。
【００５７】
試料からの蛍光は、光ファイバ２を通過した後、ビームスプリッタ１８を介して検出器２０に入射する。図７は、検出器の詳細を示す図である。複数の蛍光波長領域を含んだ蛍光は、ダイクロイックミラー２０ａによって励起波長に対応する各蛍光波長領域の蛍光に分けられ、それぞれの励起波長毎に検出器２０ｂによって検出される。ここで、検出器２０ｂには、アバランシェフォトダイオードや光電子増倍管などが用いられる。
【００５８】
尚、分光には、ダイクロイックミラー２ａに代えて、図８に示す回折格子（グレーティング）４５を用いても良い。検出器には、上述のようにアバランシェフォトダイオードや光電子増倍管などが用いられる。また、図８に示すように検出器として、マイクロチャンネルプレート４６を用いることもできる。
【００５９】
検出器２０で検出された蛍光強度信号は、解析装置１６に送られ統計分布等の必要なデータが計算される。また、得られた複数のデータは、その空間分布に従って、通常顕微鏡画像に重ねて表示することもできる。これによって、例えば細胞のどの位置にどのような変化が生じているかなどをリアルタイムに表示することが可能となる。
【００６０】
尚、上記実施形態には種々の段階の発明が含まれているため、開示される複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明を抽出することができる。例えば、実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【００６１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、複数のレーザビームを用いて複数点の蛍光統計分布解析を行うことのできる高性能で、低コストな蛍光分光分析装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る蛍光分光分析装置の第１の実施の形態を示す構成図。
【図２】ファイバ端駆動機構を光軸方向から見た図。
【図３】試料容器中の細胞の観測領域の様子を示す図。
【図４】本発明に係る第２の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源部の構成を示す図。
【図５】ファイバ端駆動機構を光軸方向から見た図。
【図６】本発明に係る第３の実施の形態の蛍光分光分析装置の光源・検出部の構成を示す図。
【図７】検出器の詳細を示す図。
【図８】検出器の詳細を示す図。
【図９】従来の蛍光分光分析装置の構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源、２…ファイバ、２ａ…ファイバ端、３…ビームスプリッタ、４…結像レンズ、６…対物レンズ、７…試料容器、９…表示装置、１０…電動ステージ、１１…検出光学系、１５…検出器、１６…解析装置、１７…ダイクロイックミラー、１８…ビームスプリッタ、１９…カップリングレンズ、２０…検出器、２２…細胞、２３…観測領域、２４…集光レーザビーム、４０…ファイバ端駆動機構、４１…アーム、４２…ＸＹＺステージ、４５…グレーティング、４６…マイクロチャネルプレート。
【図１】
2004301730.tif 000003
【図２】
2004301730.tif 000004
【図３】
2004301730.tif 000005
【図４】
2004301730.tif 000006
【図５】
2004301730.tif 000007
【図６】
2004301730.tif 000008
【図７】
2004301730.tif 000009
【図８】
2004301730.tif 000010
【図９】
2004301730.tif 000011