(57)【要約】【課題】細胞医療用バイオマテリアルをスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】バイオマテリアルとの相互作用を測定すべき細胞を決定してその細胞に特異的に結合するレクチンを選定し、次にそのレクチンに親和性を有する糖鎖を含むバイオマテリアルスクリーニング用プローブを選定する。続いてそのバイオマテリアルスクリーニング用プローブと候補材料との相互作用を測定することによって、最終的に目的のバイオマテリアルを選出する一連の方法よりなる。このバイオマテリアルは、輸血用白血球除去フィルター等の医療機器の材料として有用である。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むバイオマテリアルスクリーニング方法。
（１）　　バイオマテリアルとの相互作用を測定すべき細胞を決定する。
（２）　　該細胞に特異的に結合するレクチンを選定する。
（３）　　該レクチンに親和性を有する糖鎖を含むバイオマテリアルスクリーニング用プローブを選定する。
（４）　　該バイオマテリアルスクリーニング用プローブと候補材料との相互作用を測定し、該測定結果に基づき候補材料からバイオマテリアルをスクリーニングする。
【請求項２】
請求項１記載の方法を用いてスクリーニングされたものであることを特徴とするバイオマテリアル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、合成高分子等の材料をバイオマテリアルとして使用する際に望ましいバイオマテリアルをスクリーニングする方法に関する。本発明により選択されたバイオマテリアルは、輸血用白血球除去フィルターをはじめ、医療用具、医用機器の製造に利用でき、細胞保存バックや細胞分離膜、細胞培養器など再生医療の分野においても利用できる。
【０００２】
【従来の技術】
血液透析器、輸血用白血球吸着除去フィルター、人工血管等の各種医療用具は、いわゆるバイオマテアリアルから構成されている。このバイオマテリアルは生体関連物との相互作用が重要で、バイオマテリアルに要求される性質に応じてより適切なものが選択されなければならない。昨今、これらの各種医療用具に要求される性質はより高度になり新たな材料の研究開発が盛んに行われているが、細胞医療用バイオマテリアルの研究開発に、生体関連物の中でも特にヒト細胞を用いなければならない場合、倫理的な問題以外にも幾つかの重大な課題が発生する。たとえば輸血用白血球除去フィルターの場合、第一は、医療に不可欠な血液製剤を多量に入手することは極めて困難であること。第二は、仮に入手できたとしても、血液製剤は含有する成分の量や保存された日数等が必ずしも同じではないため血液製剤間の個体差が大きく、この個体差が材料評価の結果を変動させる可能性があり、また、国、施設によっては血液製剤の作成方法が異なることも血液製剤の個体差の一因となりうるものであること。第三には、梅毒、肝炎（Ｂ型、Ｃ型）、ＡＩＤＳ等の病原体の検査がなされ、陰性のものが血液製剤となってはいるが、未知の病原体やいわゆるウインドウピリオドの観点から感染の危険性はやはり存在することなどが挙げられる。
【０００３】
これらの課題を克服するために種々の試みがなされている。例えば、特許文献１では特定の粒子径を有する粒子（人工物）を特定の粘度を有する液体に分散させた擬似血液を用いて、血液を用いずに白血球除去フィルターの性能を評価する方法が開示されている。しかしながら、この方法では確かに血液を用いた評価との相関はとれてはいるものの、原理的裏付けの無い、極めて間接的・限定的な方法であり、もちろん、血液細胞以外に適用できるものではない。実際の臨床実験を含む医療材料開発の最終段階では、製品としてのスペックを満たすか否かの実スケールの検討が必要になる。しかしながら、その段階に至るまでは、できる限り小スケールでの実験が組まれることになる。しかし、たとえ少量でも血液を用いた技術であれば、前述の第一、第二の課題は解決される可能性があるものの、第三の問題である感染については解決され得ない。またこれらの課題は、たとえヒト以外の異種の細胞を用いたとしても、第一の数量的な課題と、最近、問題となっている狂牛病のような異種感染を含む第三の課題は残り、バイオマテリアル研究開発の大きな妨げとなっている。
【０００４】
ところで、真核細胞の膜のいちばん外側の表層は“糖衣”と呼ばれる糖類を多量に含む層から成り、こうした糖類は、膜タンパク質や脂質と共有結合して糖タンパク、糖脂質として存在しているものと、膜内在性プロテオグリカン分子の中の多糖類として存在しているものがある。近年、糖鎖−レセプター間の相互作用異常による病変や、エイズなどのウイルス感染における糖鎖の役割解明など、糖鎖工学の研究の進歩はめざましく、これらの研究の道具としてレクチンが使われていることは注目すべきことである。糖鎖に対して特異的結合性を示すレクチンは、主に植物を起源としていて、これまでに　１００種類以上のレクチンが見つかっていて、そのうちの多くが糖鎖研究用試薬として市販されている。レクチンの利用については、例えば、非特許文献１に、レクチンの一種である大豆凝集素がより分化した細胞に親和性が高いことから、より分化した細胞を捕捉除去し、結果として未分化細胞を濃縮する細胞分離方法が示され、例えば、特許文献２ではレクチンを固定して細胞分離などに用いる基材、およびレクチンを固定化する方法が開示されているが、これらはいずれもレクチン自体を材料に固定するというもので、バイオマテリアルスクリーニング用プローブの選択にレクチンを用いるという本発明の主旨とは本質的に異なる。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１１−７６３９６号公報
【特許文献２】
特開平８−３１９３００号公報
【非特許文献１】
Ｅｘｐ．　Ｈｅｍａｔｏｌ　１９９４，　２２（１２）：１１３４−４０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、実際に細胞を用いる際に問題となる、（１）数量制限、（２）個体差あるいはロット差、（３）感染の危険性　を無くし、かつ細胞医療用バイオマテリアルのスクリーニングを可能にする方法及びこのようにしてスクリーニングしたバイオマテリアルを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる課題を解決すべく鋭意検討を進め、まずバイオマテリアルと細胞が相互作用を持つ場合、直接的に影響を受けるのは細胞の最表面に存在する糖鎖であることに着目し、それら糖鎖を表面に含有する物質こそが細胞の代用に成り得るという仮説を立てた。次に、レクチンを用いた従来の細胞研究法から目的の細胞膜表面上の糖鎖を同定し、さらに、それら高結合親和性レクチンの特異性糖鎖を含有する物質が細胞の代用と成り得るかを実証し、本発明の完成に至った。
【０００８】
すなわち本発明は、（１）バイオマテリアルとの相互作用を測定すべき細胞を決定する、（２）該細胞に特異的に結合するレクチンを選定する、（３）該レクチンに親和性を有する糖鎖を含むバイオマテリアルスクリーニング用プローブを選定する、（４）該バイオマテリアルスクリーニング用プローブと候補材料との相互作用を測定し、該測定結果に基づき候補材料からバイオマテリアルをスクリーニングする、という４つの工程から成るバイオマテリアルのスクリーニング方法、及びこの方法によって選択されたバイオマテリアルに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいうバイオマテリアルとは、細胞の採取、分離、保存、培養など、既述の医療用具、医用機器を構成する材料のことである。
【００１０】
本発明でいうレクチンとは糖と特異的に結合するタンパク質のことで、細胞膜複合糖質（糖蛋白質や糖脂質）の糖鎖と結合することによって細胞凝集、分裂誘発、機能活性化、細胞障害などの効果を及ぼす物質として一般的に知られているものである。代表的なものとしてはヒイロチャワンタケレクチン、マッシュルームレクチン、コンカナバリンＡ、ドリコス豆レクチン、チョウセンアサガオレクチン、デイゴ豆レクチン、レンズ豆レクチン、ロータスレクチン、イヌエンジュレクチン、インゲン豆レクチン、ピーナッツレクチン、エンドウ豆レクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、ヒママメレクチン、大豆レクチン、ニホンニワトコレクチン、ハリエニシダレクチン、小麦胚芽レクチンなどがある。
【００１１】
細胞とレクチンの親和性の検出には、組織染色法以外にも酵素免疫法やフローサイトメトリーによる方法があり、用いるレクチンに、あらかじめビオチンやＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）、Ｈｏｒｓｅ　Ｒａｄｉｓｈ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅなどの標識を付した標識レクチンを用いることができる。
【００１２】
本発明の最初の工程は、バイオマテリアルとの相互作用に起因する細胞表面の性質を、レクチンを用いて特徴づけることである。この工程で得られた糖特異性の情報からバイオマテリアルスクリーニング用プローブが選定され、次の工程に利用される。レクチンを用いて特徴づけされる細胞表面の性質とは、糖鎖分子の種類や数のことで、例えば、ヒイロチャワンタケレクチンはα−Ｌ−Ｆｕｃ、マッシュルームレクチンはβ−Ｄ−Ｇａｌ、コンカナバリンＡはα−Ｄ−Ｍａｎやα−Ｄ−Ｇｌｃ、ドリコス豆レクチンはＤ−ＧａｌＮＡｃ、チョウセンアサガオレクチンはβ−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ、デイゴ豆レクチンはＤ−ＧａｌＮＡｃやＤ−Ｇａｌ、レンズ豆レクチンはＤ−ＭａｎやＤ−Ｇｌｃ、ロータスレクチンはＬ−Ｆｕｃ、イヌエンジュレクチンはＳｉａα２−３Ｇａｌ、インゲン豆レクチンはＤ−ＧａｌＮＡｃ、ピーナッツレクチンはＤ−Ｇａｌ、エンドウ豆レクチンはＤ−ＧｌｃやＤ−Ｍａｎ、アメリカヤマゴボウレクチンはキトオリゴ糖、ヒママメレクチンはβ−Ｄ−Ｇａｌ、大豆レクチンはＤ−ＧａｌＮＡｃ、ニホンニワトコレクチンはＳｉａα２−６Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ、ハリエニシダレクチンはα−Ｌ−Ｆｕｃ、小麦胚芽レクチンはＤ−ＧｌｃＮＡｃが主な糖特異性と知られている。
【００１３】
レクチンを用いて細胞表面を特徴づけるために、細胞は様々なレクチンと反応させることになるが、その際の反応条件は、目的とするバイオマテリアルの使用形態に合わせることが望ましい。例えば血液と接触させる白血球吸着除去フィルター用バイオマテリアルをスクリーニングする目的においては、白血球とレクチンの反応は、白血球を分離せず血液中に存在する形態を保持し、かつ白血球吸着除去フィルターの使用温度で行うことが望ましい。
【００１４】
レクチンによって特徴づけられた細胞表面の糖特異性から、細胞代用の糖鎖含有物質は選定される。糖鎖含有物質として、合成高分子に糖鎖を組み込んだ様々な市販の糖鎖研究試薬を利用することができ、生化学工業（株）（日本国）からはビニル系モノマーに単糖を誘導して高分子化したものや、合成ポリアクリルアミドに糖を組み込んだものが販売されている。また、目的の糖鎖によって、キトオリゴ糖やマンナンなどの天然多糖類や、血清タンパクの一種であるオロソムコイド、ニワトリ卵白中のオボアルブミンやオボムコイドなど、糖鎖構造がその分子の特徴を表す物質を糖鎖含有物質として用いることができる。
【００１５】
本発明でいうバイオマテリアル候補材料とバイオマテリアルスクリーニング用プローブの相互作用とは、例えば双方の吸着性あるいは非吸着性であり、バイオマテリアルの使用形態に依存する。
【００１６】
本発明でいうスクリーニング方法とは、細胞などの生体関連物質と接触する界面に存在する最適なバイオマテリアルを選択する方法で、バイオマテリアル候補材料が最表面に固定された形態であれば、平板や平膜あるいは粒子などいずれでもよく、より好ましくは比較する材料間で吸着表面積を一定に制御しやすい基材にコートした形態である。本発明で選定されたバイオマテリアルスクリーニング用プローブとの相互作用の測定は、直接あるいは間接法のいずれの方法でも可能である。例えば、材料と吸着反応させた前後のプローブの濃度変化をＵＶ測定やＥＬＩＳＡ法で定量的にスクリーニングしたり、プローブをあらかじめ蛍光色素やアイソトープで標識することにより直接的に材料とプローブの相互作用を測定することで成し得る。
【００１７】
本発明の方法によってスクリーニングされた材料は、そのまま、あるいは各種形状に成型加工などの処理を経て、バイオマテリアルとして利用される。
【００１８】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
本実施例では、白血球吸着除去フィルター用のバイオマテリアルについて、４つの工程から成るスクリーニング方法を示す。
１．バイオマテリアルとの相互作用を測定すべき細胞の決定
輸血製剤用の白血球吸着除去フィルターは末梢血液と相互作用させることから、血液中の白血球および赤血球、血小板を相互作用を測定すべき細胞と決定した。
【００１９】
２．レクチンの選定
白血球、赤血球、血小板の各細胞膜表面の糖鎖を認識させるレクチンとして、生化学工業（株）（日本国）から購入したＦＩＴＣ標識されたコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、チョウセンアサガオレクチン（ＤＳＡ）、イヌエンジュレクチン（ＭＡＭ）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）、ヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−Ｉ）、小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）を選定した。
【００２０】
３．バイオマテリアルスクリーニング用プローブの選定
血液は、抗凝固剤としてＣＰＤ（ｃｉｔｒａｔｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を用い、健常人より採血した。リン酸塩バッファー（ＫＨ２ＰＯ４　０．１４４　ｇ／ｌ、　ＮａＣｌ　９．００　ｇ／ｌ、　Ｎａ２ＨＰＯ４　０．７９５　ｇ／ｌ　（ｐＨ　７．４））（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ、　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．，　米国）で１０分の１に希釈した血液　１００μｌを試験管に取り、ＦＩＴＣ標識された各種レクチン０．１３〜０．２０　ｍｇ／ｍｌをそれぞれ２０μｌずつ添加し、遮光して室温にて３０分間静置することで、血球とレクチンを反応させた。レクチンの代わりに同バッファーを２０μｌ添加し、以下と同様の操作を行ったものをネガティブコントロールとした。各反応は、同バッファー１　ｍｌを各反応試験管に添加することで終了させた。
赤血球、血小板、白血球の各種レクチン親和性は、フローサイトメーターで測定した。フローサイトメーターはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ，米国）を用い、データ収集解析ソフトウェアはＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（ＢＤ，米国）を用いた。まず前方および側方散乱光検出系にて赤血球と血小板および白血球のゲーティングを行い、それぞれのゲートについてレクチンに標識されたＦＩＴＣの蛍光強度を比較した。
【００２１】
図１には各血球とレクチン７種のそれぞれの親和性を比較した。白血球と赤血球、あるいは白血球と血小板の間でレクチン親和性を比較したところ、ＭＡＭとの親和性に対し、血球間で大差が認められた。
ＭＡＭはＳｉａα２−３Ｇａｌに糖特異性を示すことから、この糖鎖構造を有し、分子内にＦＩＴＣを含有する合成高分子、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−ＰＡＡ−ｆｌｕ（以下、２３６ＦＰと略称で記す。）（Ｓｙｎｔｅｓｏｍｅ、ドイツ）をバイオマテリアルスクリーニング用プローブとして選定した。
【００２２】
４．バイオマテリアルスクリーニング
スクリーニングの対象となるバイオマテリアル候補ポリマーとして、ポリヒドロキシエチルメタクリレートあるいは２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、ジメチルアミノメタクリレート、メチルメタクリレートを様々な組成比の組み合わせで合成した分子量３０〜５０万のコポリマーを用いた。各ポリマーは４０℃に加温したエタノール中に溶解させることにより、２重量％の高分子溶液を調製した。その高分子溶液１　ｍｌ中に直径１０　μｍのポリスチレン粒子（ＰｏｌｙｂｅａｄＴＭ　ＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，　Ｐｏｌｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社、米国）約５０　ｍｇを分散させることにより、粒子濃度が１重量％の懸濁液を調製した。この粒子懸濁液に、４０　℃にて超音波を５　分間照射した。その後、粒子懸濁液の入った容器をロテーター（小型回転培養機ＲＴ−５、ＴＡＩＴＥＣ、日本）に取り付けて、毎分３．４　ｍの速度で回転させたまま恒温装置内で４０　℃に加温し、５５　分間反応させた。反応後は遠心分離にて粒子を分離し、得られた粒子を蒸留水にて洗浄した後、凍結乾燥させることに各ポリマーで被覆された粒子を得た。それぞれの粒子表面は、Ｘ線光電子分光装置（ＥＳＣＡ　５４００，　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，　Ｉｎｃ．，　米国）と飛行時間型二次イオン質量分析装置（ＴＲＩＦＴ　ＩＩ，　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，　Ｉｎｃ．，　米国）にて最表面の分子分布状態を観察し、それぞれの粒子表面全体にポリマーが被覆していることを確認した。
【００２３】
各ポリマーコート粒子は５　ｍｇを秤量し、１　％ヤギ血清（Ｃａｐｐｅｌ、米国）含リン酸塩バッファー３００　μｌ中に懸濁し、そこへ３．の工程で選定されたバイオマテリアルスクリーニング用プローブの２３６ＦＰ　０．２ｍｇ／ｍｌを５　μｌ添加した。ポリマー粒子への２３６ＦＰの吸着はフローサイトメーターを用いて測定した。フローサイトメーターの測定は、はじめに前方散乱光の検出系にて単一に存在する粒子をゲーティングし、その画分を１万個カウントするように設定した。各ポリマー粒子への２３６ＦＰ吸着率は、粒子１万個のＦＩＴＣ蛍光強度の平均値から、２３６ＦＰ未添加の各ポリマー粒子の同測定値をネガティブコントロールとして差し引き、２３６ＦＰ吸着率＝Ｌｏｇ（ＦＩＴＣ蛍光強度−ネガティブコントロール）で示し、この結果から、各種ポリマーの中から２３６ＦＰの親和性の高いものが白血球吸着除去フィルター用のバイオマテリアルとして選ばれた。
【００２４】
白血球吸着除去フィルター開発を目的としたバイオマテリアルスクリーニング方法において、本発明と比較するため、以下に白血球吸着除去率を測定する従来法を示し、図２には本発明と従来法のデータの相関図を示す。
【００２５】
バイオマテリアル候補ポリマーコート不織布の作製
各ポリマー１０　ｇをエタノール１９０　ｇに溶解させ、５　ｗｔ％コート溶液を調製した。該コート溶液に平均繊維直径１．２　μｍのポリエチレンテレフタレート繊維よりなる不織布（４０　ｇ／ｍ２目付、厚さ０．２０　ｍｍ、幅１５０　ｍｍ）を連続的に浸漬させた後、ニップロールに挟んで通過させることにより、余分なコート溶液を除去した。コーティングされた不織布は、排気ダクトを備えた乾燥室内で室温にて一昼夜乾燥させた後、回収した。
【００２６】
白血球吸着除去率の測定
各ポリマーコート不織布から任意に直径２０　ｍｍの円形状に切り抜き、その３２枚をフィルターホルダーに充填（充填密度０．２　ｇ／ｃｍ３）した。このカラムに上述の健常人血液１５　ｍｌを、シリンジポンプを用いて一定流速０．７４ｍｌ／分で流し、その１３．３　ｍｌを回収した。
【００２７】
濾過前の血液、および濾過した後の回収液について、その一定量の血液を採取し、白血球濃度は残存白血球測定用試薬システムＬｅｕｃｏＣＯＵＮＴＴＭ　ＫＩＴ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて測定した。なお、白血球の吸着除去率＝−Ｌｏｇ（濾過後回収液中の白血球濃度／濾過前血液中の白血球濃度）で算出した。
【００２８】
白血球表面を特徴づけたＭＡＭの糖特異性から選定したバイオマテリアルスクリーニング用プローブの２３６ＦＰとバイオマテリアル候補ポリマーの吸着率は、図２に示すように、同ポリマーの白血球吸着除去率と相関が見られた（相関係数０．８１２３）。
【００２９】
【発明の効果】
以上示したように本発明によれば、実際に血液などを用いることなくバイオマテリアルのスクリーニングができるので、時間、コストの節約になり、また感染の危険性と皆無になるため、バイオマテリアルを用いた医療器具などの設計開発に貢献すること極めて大である。
【００３０】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の各種レクチンの血球親和性を比較した図。
横軸はレクチンの種類、縦軸はレクチンを標識しているＦＩＴＣの蛍光強度のポリマー粒子１万個の平均値を示す。
【図２】実施例１の２３６ＦＰ吸着率と、従来法の白血球吸着除去率の相関性を示した図。
横軸はポリマーコート不織布の白血球吸着率を、縦軸はポリマーコート粒子への２３６ＦＰ吸着率を、示す。
【図１】
2004101256.tif 000002
【図２】
2004101256.tif 000003