(57)【要約】【課題】蛋白質もしくは不溶性担体に結合させた蛋白質の凝集を抑制することで、前記蛋白質を安定化させること。さらに、前記蛋白質を含有する溶液の安定性を向上させることで、測定精度が高く、長期安定性に優れた測定試薬並びに標準液を提供すること。【解決手段】蛋白質及び／又は蛋白質結合担体を含む試薬組成物に、アミノ酸エステル及び／又はポリアミンを１０ｍＭ〜２Ｍの範囲で共存させることを特徴とする蛋白質の安定化方法と蛋白質含有溶液、そして前記溶液からなる生体成分測定用試薬と生体成分測定のために用いる標準液。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質及び／又は蛋白質結合担体を含む試薬組成物に、アミノ酸エステル及び／又はポリアミンを共存させることを特徴とする蛋白質の安定化方法。
【請求項２】
アミノ酸エステルがアルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステル、グリシンベンジルエステル、及びグリシンｔ−ブチルエステルから選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸エステル、またはそれらの塩であることを特徴とする請求項１記載の蛋白質の安定化方法。
【請求項３】
アミノ酸エステルの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする請求項２記載の蛋白質の安定化方法。
【請求項４】
ポリアミンがスペルミン及び／又はスペルミジンであることを特徴とする請求項１記載の蛋白質の安定化方法。
【請求項５】
ポリアミンの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする請求項４記載の蛋白質の安定化方法。
【請求項６】
蛋白質及び／又は蛋白質結合担体を含む試薬組成物に、蛋白質の安定化剤としてアミノ酸エステル及び／又はポリアミンを共存させることを特徴とする蛋白質含有溶液。
【請求項７】
アミノ酸エステルがアルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステルグリシンベンジルエステル、及びグリシンｔ−ブチルエステルから選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸エステル、またはそれらの塩であることを特徴とする請求項６記載の蛋白質含有溶液。
【請求項８】
アミノ酸エステルの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする請求項７記載の蛋白質含有溶液。
【請求項９】
ポリアミンがスペルミン及び／又はスペルミジンであることを特徴とする請求項６記載の蛋白質含有溶液。
【請求項１０】
ポリアミンの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする請求項９記載の蛋白質含有溶液。
【請求項１１】
請求項６から１０記載の蛋白質含有溶液からなる生体成分測定用試薬。
【請求項１２】
請求項６から１０記載の蛋白質含有溶液からなる、生体成分測定のために用いる標準液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、溶液に含まれる蛋白質の安定化に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と問題点】
現在、臨床診断、食品衛生、環境衛生等の多岐にわたる方面で、目的とする特定物質の分析が広く行われている。例えば、臨床診断分野においては、生体内に存在する酵素、脂質、電解質、蛋白質、ホルモン等の内在性物質や、病原菌、ウイルス等の外来性物質の検査が挙げられ、食品衛生分野では、食中毒の原因となる細菌検査や特定微生物を探索するための遺伝子検査、そして、環境衛生分野では、水質検査、特に近年、ビスフェノールＡで代表される内分泌攪乱物質（環境ホルモン）の検査が注目されつつある。
【０００３】
検査に利用される測定法には、化学反応を利用した測定系が広く用いられているが、測定系の種類としては、１）酵素とその酵素の基質となる物質との反応により酵素活性を測定する系、２）生体内に存在する蛋白質や病原菌を検出するための抗原抗体反応（免疫学的反応）を利用した系、３）１）と２）の原理を組み合わせた系で、抗原（抗体）に対して酵素標識した抗体（抗原）を用いて抗原抗体反応を行い、その標識酵素活性を測定する酵素免疫学的測定（ＥＩＡ）系、４）ＤＮＡ等の核酸とこれに相補的な塩基配列を有す核酸を結合させて目的とする遺伝子を増幅させ、電気泳動等で検出する系等が挙げられる。
【０００４】
このような測定系を利用して、臨床的意義が高い多くの種類の生体由来の蛋白質が、特異的かつ精度良く測定されるようになってきた。蛋白質を測定するためには、使用される試薬の成分として、酵素、抗原、抗体等の蛋白質を用いることが必要となるが、近年、蛋白質、特に酵素や生理活性を持つ有用な蛋白質等は遺伝子組換え技術等により量産できるようになっていることから、特に医薬、臨床検査の分野で広く用いられるようになってきている。
【０００５】
ここで、臨床診断の分野では、測定の正確性、精度を高めるために、使用される蛋白質を含む試薬を安定化させておくことが求められ、特に標準物質として用いる場合には、繰り返し測定しても、日差・日内変動なく、常に一定の検量線が得られることが要求される。ＥＩＡやラテックス凝集法等に用いられる免疫学的測定試薬においては、不溶性担体等に固相化された抗体または抗原を安定化させることが望まれ、酵素法を利用する生化学的測定試薬では、用いられる酵素の活性を維持させることが望まれる。また、最近では、測定技術の進歩に伴い、微量蛋白質の高感度測定が可能になってきており、微量な活性を有する蛋白質を失活させないようにすることが重要な要素となる。このように、様々な測定法において用いられる蛋白質の安定性を高めることは、測定精度や、試薬あるいは標準物質の長期安定性の向上に欠かすことができない。
【０００６】
ところが、この蛋白質の中には、きわめて保存安定性の悪い物質が存在する。例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼ等の酸化還元酵素が挙げられる。一般的に、蛋白質は、温度、光、ｐＨ、酸化等の外的因子により、容易にその高次構造が崩され、機能（生理活性）を失ってしまうため、保存に際しては、それら外的因子から蛋白質を保護し生理活性を維持させることが求められる。したがって、試薬に蛋白質を含有させる場合は、使用する蛋白質の精製工程や試薬調合には十分注意を払い、また、試薬を安定化させるためには、蛋白質分子の規則的な構造を保持できるよう、常にｐＨ、塩濃度、温度といった因子を十分に考慮に入れておくことが重要である。
【０００７】
外的因子から蛋白質を守る条件として、蛋白質を含む試薬を低温でかつできるだけ生理的条件下で保存しておくことが望ましいが、長期間にわたりその蛋白質の安定性を保持し続けることは至難の技である。蛋白質の変性は、凝集物、不溶性微粒子や沈殿物の発生、あるいは生理活性の低下等、多くの負の要因に繋がる。
【０００８】
そこで、これらの現象を解消するために様々な手段が講じられている。最も汎用されている方法としては、凍結乾燥を行って蛋白質の安定化を図ることである。蛋白質の多くは熱によって失活しやすい性質を有するが、凍結乾燥法では、熱をかけずに蛋白質を安定化することができる。また、絶乾状態までに乾燥されるためバクテリア等の活性が抑制でき、防腐効果という利点も有しており、医薬品や臨床診断薬では凍結乾燥製剤が数多く利用されている。
【０００９】
しかしながら、凍結乾燥法にも、脱水により変性する蛋白質には使えないこと、吸湿や酸化による変質があること、あるいは水溶液に復元すると不溶性微粒子が生成する場合があること等の難点がある。このような蛋白質凝集体の形成を防止するための方法として、その蛋白質の水溶性緩衝剤としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムおよびナトリウムのイオンの比を１０：１とする技術もある（例えば、特許文献１参照。）。しかし、製造面からは、凍乾設備の投資、凍乾工程の煩雑さ、あるいは包装方法や形態に注意を払う必要がある等コスト・デメリットの面も否めない。また、凍結乾燥製剤は、使用時に溶解して用いられるため、溶解液と組み合わせとして供給される場合、試薬調製の煩雑さに加えて、調製時のミスにより誤った測定結果が得られるといった問題が存在する。そこで、蛋白質を溶液中で安定させる技術が公開されている。
【００１０】
イオンは分子間の静電相互作用の抑制により、蛋白質同士の会合を阻止すると言われているが（例えば、非特許文献１参照。）、濃厚な塩濃度では蛋白質の変性が起こる。また、塩酸グアニジンや尿素は蛋白質を可溶化させることが知られており、これは、蛋白質を変性させない程度の低濃度では、構造のゆらぎに伴って露出する疎水相互作用を妨げるためである。しかし、高濃度では蛋白質をランダムコイルの状態まで変性させる。
【００１１】
一方、遺伝子工学的に蛋白質を発現させる場合に、しばしば封入体の生成に出くわすことがある。この場合、巻き戻し（リフォールディング）過程での蛋白質凝集を防ぐために低分子化合物を添加することがある。最も良く使われる添加剤としてはＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）がある（例えば、非特許文献２及び３参照。）。Ｌ−Ａｒｇがなぜ蛋白質凝集の抑制に効果的に働くかはいまだに明らかになっていないが、グアニジウム基が分子間の疎水的相互作用を防いでいるものと推定されている。
【００１２】
Ｌ−Ａｒｇをはじめとした１分子内にアミノ基を２個以上有するアミノ酸を９〜４０％添加して、ラテックス凝集反応における自己凝集を抑制する方法等、アミノ酸が、蛋白質を結合した高分子担体同士の凝集を防ぐことにも効果があることが示されている（例えば、特許文献２参照。）。しかしながら高濃度のＬ−Ａｒｇを添加すると、抗原抗体反応が阻害されることが多く、測定系が低感度になる場合がある。このように試薬保存安定性が確保できたとしても、正確な測定系が構築できない場合がある。
【００１３】
同様に、ＣＨＡＰＳやＴｗｅｅｎ等の界面活性剤やポリエチレングリコール等の水溶性高分子化合物を用いて巻き戻しの際の蛋白質凝集を抑制することが行われている（例えば、特許文献３及び非特許文献４参照。）。しかしながら、これらの界面活性剤や高分子が高濃度で存在した場合に抗原抗体反応を行うと、反応抑制または非特異反応を引き起こすことがあり、安定性を確保しようとすると反応阻害が起こり、反応性を向上させようとすると安定性が低下する等調整がきわめて難しかった。
【００１４】
一方、目的とする特定物質の測定に用いる試薬中に含まれる酵素あるいは蛋白質の安定化方法として、（１）尿酸測定で使用するウレアーゼ−パーオキシダーゼの安定化剤として、試薬溶液中で多価非芳香族性アルコールを含有させる（例えば、特許文献４参照。）、（２）コレステロールオキシダーゼを含む溶液に、牛血清アルブミン及びグルコース等の糖類あるいはリジン等のアミノ酸を添加することによって、酵素活性の保持と変性等による酵素剤からの濁り生成の抑制させる（例えば、特許文献５参照。）（３）血液中の蛋白質と結合する性質を有する抗原含有溶液の安定化剤として、ポリビニルアルコール等の水溶性合成高分子化合物を共存させる（例えば、特許文献６参照。）、（４）酸化還元反応を利用した測定系において、血液、尿等の生体試料に含まれるビリルビン等の還元性物質の妨害を防ぐために使用されるアスコルビン酸オキシダーゼは精製すると安定性が著しく低下するため、スキムミルクを共存させて安定化させる（例えば、特許文献７参照。）等が挙げられる。しかし、これらはいずれも試薬中の特定の蛋白質を安定化するための方法であって、汎用性があるとは言いがたい。
【００１５】
【特許文献１】
特開平１１−２４０８９５号公報（第３−４頁）
【特許文献２】
特公平６−１７９１１号公報（第２頁）
【特許文献３】
米国特許５，６５０，４９４号公報
【特許文献４】
特許２８５４９９５号公報（第２−３頁）
【特許文献５】
特開平８−１８７０９５号公報（第３−４頁）
【特許文献６】
特開平９−２３６６０３号公報（第２−３頁）
【特許文献７】
特公平３−２８１９２公報（第２頁）
【００１６】
【非特許文献１】
Ｍａｅｄａ　Ｙ、ｅｔ．ａｌ．「　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　」１９９６年、１９巻、ｐ．４６１−４６５
【非特許文献２】
Ｔｓｕｍｏｔｏ　Ｋ、ｅｔ　ａｌ．　「Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ」１９９８年、２１９巻、ｐ．１１９−１２９
【非特許文献３】
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｕ、ｅｔ　ａｌ．「Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ」１９９２年、８９巻、ｐ．３０７５−３０７９
【非特許文献４】
Ｃｌｅｌａｎｄ　ＪＬ、ｅｔ．ａｌ．「　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　」１９９２年、２６７巻、ｐ．１３３２７−１３３３４
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の第一の課題は、蛋白質もしくは高分子等の不溶性担体に結合させた蛋白質の凝集を抑制し、前記蛋白質を安定化させることを目的とする。また、本発明の第二の課題は、前記蛋白質を含有する溶液の安定性を向上させることにより、測定精度が高く、長期安定性に優れた測定試薬並びに標準液を提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、蛋白質を含む測定試薬において、特定のアミノ酸エステル及び／又はポリアミンを蛋白質安定化剤として使用することにより、上記目的を達成しうることを見出し、本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）蛋白質及び／又は蛋白質結合担体を含む試薬組成物に、アミノ酸エステル及び／又はポリアミンを共存させることを特徴とする蛋白質の安定化方法。
（２）アミノ酸エステルがアルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステル、グリシンベンジルエステル、及びグリシンｔ−ブチルエステルから選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸エステル、またはそれらの塩であることを特徴とする（１）記載の蛋白質の安定化方法。
（３）アミノ酸エステルの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする（２）記載の蛋白質の安定化方法。
（４）ポリアミンがスペルミン及び／又はスペルミジンであることを特徴とする（１）記載の蛋白質の安定化方法。
（５）ポリアミンの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする（４）記載の蛋白質の安定化方法。
（６）蛋白質及び／又は蛋白質結合担体を含む試薬組成物に、蛋白質の安定化剤としてアミノ酸エステル及び／又はポリアミンを共存させることを特徴とする蛋白質含有溶液。
（７）アミノ酸エステルがアルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステル、グリシンベンジルエステル、及びグリシンｔ−ブチルエステルから選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸エステル、またはそれらの塩であることを特徴とする（６）記載の蛋白質含有溶液。
（８）アミノ酸エステルの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする（７）記載の蛋白質含有溶液。
（９）ポリアミンがスペルミン及び／又はスペルミジンであることを特徴とする（６）記載の蛋白質含有溶液。
（１０）ポリアミンの濃度が１０ｍＭ〜２Ｍであることを特徴とする（９）記載の蛋白質含有溶液。
（１１）（６）から（１０）記載の蛋白質含有溶液からなる生体成分測定用試薬。
（１２）（６）から（１０）記載の蛋白質含有溶液からなる、生体成分測定のために用いる標準液。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明において使用される蛋白質とは、例えばパーオキシダーゼ等の酸化還元酵素、エステラーゼ等の加水分解酵素等の酵素、例えばアルブミン、血液凝固因子、免疫グロブリンや、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、リューマチ因子（ＲＦ）等の血漿蛋白質、例えば前記蛋白質に対する抗体、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ等のウイルスに対する抗体、さらには遺伝子組み換え等で作製された蛋白質が挙げられるが、特に限定されるものではない。また、蛋白結合担体とは、前記蛋白質をラテックス、ビーズ、マイクロプレート及びチューブ等、あるいは磁性粒子等の担体に結合したものが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２１】
本発明において使用される蛋白質及び／又は蛋白質結合担体を含む試薬組成物とは、蛋白質の機能例えば酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ特に限定されないが、通常は、例えば生化学的あるいは免疫学的測定法において緩衝液として用いられるようなものが好ましい。具体的には、例えばリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、グッド緩衝剤、トリス緩衝剤等のｐＨ緩衝剤、例えば塩酸、水酸化ナトリウム等のｐＨ調整剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の無機塩類、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤等、さらに例えばアジ化ナトリウム等の防腐剤等から目的とする測定物質あるいは測定法に応じて適宜選択して調製された、通常ｐＨ２〜１２、好ましくはｐＨ４〜１０の緩衝液である。
【００２２】
本発明において蛋白質の安定化剤として使用されるアミノ酸エステルは、アルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステル、グリシンベンジルエステル、及びグリシンｔ−ブチルエステルから選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸エステル、またはそれらの塩単独もしくはその組み合わせでもよい。
【００２３】
本発明で使用される蛋白質の安定化剤として使用されるポリアミンは、スペルミン、スペルミジン単独もしくはその組み合わせでもよい。
【００２４】
本発明において使用されるアミノ酸エステル及びポリアミンの濃度は、いずれも１０ｍＭ〜２Ｍが好ましい。より好ましくは２０ｍＭ〜６００ｍＭ、さらに好ましくは４０ｍＭ〜２００ｍＭである。濃度が１０ｍＭ未満では、蛋白質の安定化が不十分となる。逆に２Ｍを超える濃度では、溶解性が悪くなる、抗原抗体反応を阻害する等の理由で好ましくない。
【００２５】
本発明による安定化された蛋白質を含む溶液の使用法は、特に限定されるものではないが、例えば生体成分を測定するための生化学的あるいは免疫学的測定試薬、例えば前記測定法で使用される標準液としても有用である。
【００２６】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２７】
実施例１．蛋白質の経時的凝集変化
５０ｍＭリン酸緩衝液（　ｐＨ６．５　）にニワトリリゾチーム（　Ｓｉｇｍａ社　）を溶解し、０．２　ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。この溶液を９８℃で加熱した後、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離（　Ｔｏｍｙ社ＭＲＸ−１５０　使用）後、経時的な蛋白質の凝集変化を、分光光度計（　Ｊａｓｃｏ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ｍｏｄｅｌ　Ｖ−５５０：日本分光製　）を用いて、波長２８０ｎｍによる吸光度にて測定した。図１に、加熱開始前の吸光度を１００とした場合の、蛋白質の熱による経時的凝集変化を示す。その結果、リゾチームは時間と共に凝集が増加し、４０分経過後は約８０％の凝集変性率（以下変性率）であった。
【００２８】
実施例２．各種添加物による蛋白質の凝集抑制効果
実施例１．で調製した　０．２ｍｇ／ｍｌ　のニワトリリゾチーム溶液（　５０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ６．５　）にＮａＣｌを０〜１５０ｍＭ添加した溶液を作製した。同様に　ＰＥＧ２０００（　和光純薬製　）、塩酸グアニジン（　和光純薬製　）をそれぞれ０〜１５０ｍＭ加えた蛋白質溶液を作製した。各々の溶液を９８℃で３０分間加熱し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離後、上清画分を分光光度計（波長２８０ｎｍ）で測定した。図２に、無添加の加熱開始前の吸光度を１００とした場合の、各種添加物による蛋白質の変性率を示す。ＮａＣｌ、ＰＥＧ２０００ならびに塩酸グアニジンいずれを添加した場合でも、蛋白質の凝集抑制効果はほとんど認められなかった。
【００２９】
実施例３．アミノ酸添加による蛋白質の凝集抑制効果
実施例２．同様、０．２ｍｇ／ｍｌのニワトリリゾチーム溶液に、それぞれグリシン、Ｌ（＋）−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ（＋）−リジン（　いずれも和光純薬製　）を０〜１５０ｍＭ添加した溶液を作製し、蛋白質の凝集抑制効果を調べた。その結果、図３に示す通り、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ（＋）−リジンを添加した溶液は、１５０ｍＭで変性率５０％以上で抑制効果は弱かった。一方、Ｌ（＋）−アルギニンを１５０ｍＭ添加したものは、変性率が２０％程度の凝集抑制効果を認めたが、蛋白質の変性を完全に抑制することはできなかった。
【００３０】
実施例４．アミノ酸エステル添加による蛋白質の凝集抑制効果
実施例２．同様、０．２ｍｇ／ｍｌのニワトリリゾチーム溶液に、それぞれアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル（　いずれもＳｉｇｍａ社製　）を０〜８０ｍＭ添加した溶液を作製し、蛋白質の凝集抑制効果を調べた。その結果、図４に示す通り、どのアミノ酸エステル添加においても、約５０ｍＭの濃度で変性率０となり、これは蛋白質の凝集を完全に抑制していると判断された。
【００３１】
実施例５．各種アミノ酸添加による蛋白質の経時的凝集変化
実施例２．同様、０．２ｍｇ／ｍｌのニワトリリゾチーム溶液に、それぞれアルギニン、アルギニンメチルエステル及びスペルミン（　いずれもＳｉｇｍａ製　）１００ｍＭ添加した溶液を、９８℃で０〜４０分間加熱し、経時的凝集変化を分光光度計（　波長２８０ｎｍ　）にて測定した。その結果、図５に示す通り、アルギニン添加溶液は経時的に蛋白質凝集が起こり、４０分後では変性率約４０％の凝集を認めた。一方、アルギニンメチルエステル、スペルミンでは、ほとんど蛋白質の凝集を認めなかった。
【００３２】
実施例６．蛋白質の等電点付近のｐＨでの、各種アミノ酸添加による蛋白質の凝集抑制効果の比較
５０ｍＭホウ酸緩衝液（　ｐＨ１０．０　）にニワトリリゾチームを溶解し、０．２ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。この溶液に、それぞれグリシン、Ｌ（＋）−アルギニン、アルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステルを０〜１５０ｍＭ添加し、各々の蛋白質溶液を９８℃で３０分間加熱後、分光光度計（　波長２８０ｎｍ　）にて蛋白質の変性率を測定した。その結果、図６に示す通り、蛋白質が最も凝集しやすい等電点付近（　ニワトリリゾチーム：ｐＩ＝１１．０　）においてもアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステルでは顕著な蛋白質の凝集抑制効果を認め、特にエチルエステルの方が効果的であった。しかし、グリシン及びＬ（＋）−アルギニンでは抑制効果が弱く、変性率は６０％以上であった。
【００３３】
実施例７．各種アミノ酸添加による蛋白質Ｔｍ値の比較
実施例２．同様、０．２ｍｇ／ｍｌのニワトリリゾチーム溶液に、それぞれアルギニンエチルエステル、グリシンエチルエステル、Ｌ（＋）−アルギニン、グリシンを０〜６００ｍＭまで添加し、各々の蛋白質溶液を９８℃で３０分間加熱後、示差走査型熱量分析装置（　ｎａｎｏ−ＤＳＣ　ＩＩ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ　６１００；Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製　）にてニワトリリゾチームのＴｍ値を測定した。その結果、図７に示す通り、グリシンやアルギニンでは全くＴｍ値に変動を認めなかったが、アルギニンエチルエステルやグリシンエチルエステルでは６０ｍＭ添加までは、アミノ酸エステルを加えていない５０ｍＭリン酸緩衝液（　ｐＨ６．５　）中でのリゾチームＴｍ値７７．５℃から８０℃までの上昇を認め、それ以上の濃度ではＴｍ値が減少した。これは、アミノ酸誘導体を至適な濃度で蛋白質溶液に添加することにより蛋白質のＴｍ値を上昇させ、すなわち熱による凝集変性を抑制することができることを示唆している。
【００３４】
実施例８．ポリアミン添加による蛋白質の凝集抑制効果
５０ｍＭリン酸緩衝液（　ｐＨ６．５　）にニワトリリゾチームを溶解し、０．４　ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。この溶液に、それぞれ０〜２００ｍＭのスペルミン、スペルミジン（　いずれもＳｉｇｍａ社製　）を添加し、９８℃で３０分間加熱後、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、分光光度計（波長２８０ｎｍ）にて蛋白質の変性率を測定した。その結果、図８に示す通り、スペルミン、スペルミジンともに、約１００ｍＭの濃度で変性率０となり、これは蛋白質の凝集を完全に抑制していると判断された。
【００３５】
実施例９．アミノ酸エステル添加による蛋白質の残存活性
５０ｍＭリン酸緩衝液（　ｐＨ６．５　）にニワトリリゾチームを溶解し、０．３　ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。この溶液に、濃度が６０ｍＭになるように、それぞれグリシン、リジン、アルギニン、グリシンエチルエステル、アルギニンエチルエステル、アルギニンメチルエステル、リジンメチルエステル溶液を調整し、９８℃で３０分間加熱した。なお、アミノ酸を添加しない蛋白質溶液も同様に加熱した。次に０．５　ｍｇ／ｍｌの　Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ（　Ｓｉｇｍａ社製　）溶液（　１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５　）２００μＬに、加熱終了後の蛋白質溶液４μＬをそれぞれ添加し、分光光度計（　波長　６００ｎｍ　）にてリゾチームの活性測定を行った。コントロールとして加熱前の蛋白質溶液の活性を１００％とした。その結果、表１に示すように、無添加溶液ならびにグリシン、リジン、アルギニンを添加した場合の蛋白質の活性がほとんど消失していたのに対し、グリシンエチルエステル、アルギニンエチルエステル、アルギニンメチルエステルならびにリジンメチルエステル添加溶液では７０％以上の残存活性を認めた。以上のように、蛋白質溶液にアミノ酸エステルを添加すると、熱変性による蛋白質凝集を抑制するだけでなく、蛋白質の活性も維持できることが可能であると示唆された。
【表１】
2004108850.tif 000002
【００３６】
実施例１０．高分子担体に保持された蛋白質の保存安定性
０．５％自家製抗ヘモグロビン・モノクローナル抗体（　ｎａｓ３−１８　）の５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（　ｐＨ７．０　）をポリスチレンラテックス（　平均粒径０．１０９μｍ　）に３７℃で１時間物理吸着させ、最終的にラテックス濃度が０．１％になるように分散媒（　１％ＢＳＡを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４　）に懸濁させた。また、分散媒にアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステルの濃度が各々１００ｍＭになるよう添加した溶液を作製し、モノクローナル抗体結合ラテックス液と混合した。調整された抗体結合ラテックス試薬の、調整当日と４℃保存１０日目について、分光光度計を用いて、波長６５０ｎｍによる吸光度を測定した。その結果、表２に示すように、無添加のラテックス試薬は４℃保存１０日目において、ラテックス粒子の沈殿が目視的にも認められ、測定不可能であった。一方、アルギニンメチルエステルとアルギニンエチルエステル添加のラテックス試薬は調整当日と４℃保存１０日目の吸光度に差がなく、すなわち均一なラテックス懸濁液として保存可能であった。これは、アミノ酸エステルの添加により安定なラテックス試薬として保持できるため、試薬の長期安定性に寄与できることが示唆される。
【表２】
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【００３７】
実施例１１．高分子担体に保持された蛋白質の熱安定性
０．５％自家製抗ヘモグロビン・モノクローナル抗体（　ｎａｓ３−１８　）の５０ｍＭリン酸緩衝液溶液（　ｐＨ７．０　）をポリスチレンラテックス（　粒径１．００μｍ、比重１．５　）に３７℃で１時間物理吸着させ、最終的に０．４％になるように分散媒（　０．４％ＢＳＡを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４　）に懸濁させた。また、アルギニンメチルエステル添加ラテックス試薬及びアルギニンエチルエステル添加ラテックス試薬も実施例１０．同様に調整し、それぞれのラテックス試薬を６０℃で２４時間加熱した。加熱後のそれぞれのラテックス試薬０．３５ｍｌに、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０　）で８０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（　ＤＡＫＯ社製　）を０．０５ｍｌ加えた。この溶液を室温で１時間放置した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（　ｐＨ７．０　）で１ｍｌ×３回洗浄した。その後、オルト−フェニレンジアミン（　ＯＰＤ　）と過酸化水素を含む基質液０．５ｍｌ加え、室温で１０分間反応させた。反応後０．５Ｍ硫酸を０．１ｍｌ加え、発色した上清液の吸光度を分光光度計（　波長４９０ｎｍ　）にて測定した。同様に加熱していないラテックス試薬についても測定を行った。図３に、加熱していないラテックス試薬の吸光度を１００％とした時の、加熱後のラテックス試薬の吸光度の割合を示す。その結果、アミノ酸エステルを添加したラテックス試薬では、ラテックス担体上に吸着した抗体の活性は加熱後も９０％以上の残存を有しているのに対し、無添加ラテックス試薬では６０％以上の失活を認めた。
【表３】
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【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、アミノ酸エステル及び／又はポリアミンを蛋白質の安定化剤として使用することにより、蛋白質もしくは不溶性担体に結合させた蛋白質の自己凝集、熱変性等を抑制できる。その結果、前記蛋白質を含有する溶液として、測定精度が高く、長期安定性に優れた測定試薬並びに標準液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】熱による無添加の蛋白質（リゾチーム）溶液の凝集の経時的変化を示したグラフである。
【図２】各種添加物による蛋白質の凝集抑制効果を示したグラフである。
【図３】アミノ酸添加による蛋白質の凝集抑制効果を示したグラフである。
【図４】アミノ酸エステル添加による蛋白質の凝集抑制効果を示したグラフである。
【図５】熱による各種アミノ酸添加の蛋白質溶液の凝集の経時的変化を示したグラフである。
【図６】蛋白質の等電点付近のｐＨでの、各種アミノ酸添加による蛋白質の凝集抑制効果を比較したグラフである。
【図７】各種アミノ酸添加による蛋白質溶液のＴｍ値を比較したグラフである。
【図８】ポリアミン添加による蛋白質の凝集抑制効果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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