(57)【要約】【課題】２光子励起により光アフィニティラベルを活性化して被標識化合物に結合させるための光標識組成物を提供する。【解決手段】光照射により被標識体と反応して共有結合を形成し得る活性種に変化する光アフィニティ−ラベル化合物及び、２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上である化合物を含む光標識組成物。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
光照射により被標識体と反応して共有結合を形成し得る活性種に変化する光アフィニティ−ラベル化合物と被標識化合物との存在下に、２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上である化合物を２光子励起することにより、該光アフィニティ−ラベル化合物の分解を誘起して該被標識化合物を標識することを特徴とする光標識方法。
【請求項２】
光照射により被標識体と反応して共有結合を形成し得る活性種に変化する光アフィニティ−ラベル化合物及び、２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上である化合物を含む光標識組成物。
【請求項３】
２光子吸収断面積が１０００ＧＭである化合物が下記一般式（ＩＩ）で表される請求項１に記載の光標識方法。
【化１】
2004301681.tif 000010
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し、Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。
【請求項４】
２光子吸収断面積が１０００ＧＭである化合物が上記一般式（ＩＩ）で表される請求項２に記載の光標識組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然もしくは人工の化学物質あるいは生体組織の検出や状態の分析を容易にするために、２光子励起により、これらの物質に蛍光を発する化合物などの検出可能な化合物を結合せしめて標識するための方法およびこの方法に有効に用いられる２光子励起光標識組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
化学物質に蛍光を発する化合物を共有結合させて標識し、その物質の存在を検出することは広く行われている。標識される化合物の例としては、抗体、蛋白、ペプチド、酵素基質、ホルモン、リンフォカイン、代謝産物、レセプター、抗原、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、多糖類、核酸、デオキシ核酸、核酸誘導体、誘導デオキシ核酸、ＤＮＡフラグメント、ＲＮＡフラグメント、誘導ＤＮＡフラグメント、誘導ＲＮＡフラグメント、天然薬物、ウイルス粒子、バクテリア粒子、ウイルス成分、イースト成分、血液細胞、血液細胞成分、バクテリア、バクテリア成分、天然ないし合成樹脂、合成薬物、毒物、環境汚染物質、重合体、重合体粒子、硝子粒子、プラスチック粒子、重合体膜等が挙げられる。これらに結合される蛍光を発する物質としては、種々の蛍光物質が用いられ、有機色素が特に頻繁に用いられる。有機色素の中でも、蛍光が強く、蛍光の波長も容易に選べるシアニン色素が特に有用である。シアニン色素は水中で会合体を形成し易く、蛍光強度が弱くなるという欠点がある。この点を克服するために、例えば特許第２７５７９６５に記載されているような、アリールスルホン酸基を有するシアニン色素が開発されている。すなわちシアニン色素の末端基を構成する塩基性核と呼ばれるヘテロ環に縮合した芳香族環に直接結合したスルホン酸基の存在が、陰イオン間の静電的反発により色素同士が重なる配置を妨げるため、会合が阻害されると主張されている。
【０００３】
しかしながら、不均一溶液状の試料中の物質特に生体組織など三次元的分布を持つ試料中の物質の三次元座標を区別して標識する場合には、上述の標識色素を用いる方法は都合が悪い。なぜなら標識化反応が試料中の色素が分布する全領域で起こり得るから特定の位置の情報だけを分別して得ることが出来ないからである。従って、三次元空間中の任意の位置にある標識物質だけを選択的に励起する方法およびこれに適した化合物が求められていた。
【０００４】
三次元空間中の任意の位置にある物質だけを選択的に励起する方法としては、２光子吸収現象が２次の光強度依存性を示すこと利用して、光強度の高い焦点付近でのみ励起状態を生ぜしめる方法が利用できる可能性がある。
【０００５】
通常、物質は励起エネルギーに相当するエネルギーの１光子を吸収して励起され、このエネルギーに満たないエネルギーの光子は吸収されない。しかし光の強度が非常に強い場合には、光子エネルギーの和が励起エネルギーに相当する２光子が同時に吸収されることがある。この性質を利用すると光をレンズで絞り込んだ焦点付近のみで光反応を起こすことができ、空間の任意の位置を選択して励起状態を作って利用することができる。この励起状態のエネルギーをいわゆる光アフィニティーラベルに移して活性化し、被標識化合物と反応させれば空間の任意の位置を選択して標識できるはずである。しかし２光子吸収の効率は通常非常に低いので、非常に強力かつ大型のレーザー光源を必要とし、普及の障害となっていた。従って、２光子励起効率が高い物質が求められていた。２光子吸収の起こり易さを示す２光子吸収断面積は通常非常に小さく１ＧＭ（ただし１ＧＭ＝１×１０−５０  ｃｍ４  ｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｈｏｔｏｎ−１）程度であるが、近年数百ないし数千ＧＭ程度の比較的大きな２光子吸収断面積を示すと主張されている物質も報告されている。しかしながらこの値は測定条件により大きく異なり、特に測定に用いるレーザーのパルス幅が比較的長いナノ秒オーダーの場合には、フェムト秒レーザーを用いる実際の態様とかけ離れた、見かけ上非常に大きな値が得られるので、文献値を吟味する際に注意が必要である。
２光子吸収断面積が比較的大きいと主張されている化合物の例は、例えば以下の非特許文献１ないし１０に記載されている。しかし実用的には更に大きな２光子吸収断面積を持つ化合物が求められていた。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｒｅｉｎｈａｒｄｔほか、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ誌，１９９８年発行，１０巻，１８６３  頁．
【非特許文献２】
Ｍ．  Ａｌｂｏｔａほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌、１９９８年発行、２８１巻、１６５３頁．
【非特許文献３】
Ｍ．  Ｒｕｍｉほか、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ誌、２０００年発行、１２２巻、９５００頁．
【非特許文献４】
Ｊ．  Ｄ．  Ｂｈａｗａｌｋａｒほかの著した、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ誌、１９９６年発行、１２４巻、３３頁．
【非特許文献５】
Ｓ．Ｇ．Ｈｅ  ほか、Ａｐｐｌｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、１９９５年発行、６７巻、２４３３頁．
【非特許文献６】
Ｐ．  Ｎ．  Ｐｒａｓａｄ  ほか、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ誌、１９９９年発行、２１巻、３９頁．
【非特許文献７】
Ｇ．  Ｓ．  Ｈｅほか、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ誌、１９９７年発行、８１巻、２５２９頁．
【非特許文献８】
Ｓ．  −Ｊ．  Ｃｈｕｎｇほか、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  誌、１９９９年発行、１０３  巻、１０７４１頁．
【非特許文献９】
Ｓ．  Ｇ．  Ｈｅ  ほか、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ誌、１９９５年発行、２０巻、４３５頁．
【非特許文献１０】
Ｊ．  Ｗ．  Ｐｅｒｒｙ  ほか、Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ誌、１９９９年、２１巻、２２５頁．
【特許文献１】
特開平２−１９１６７４号公報
【特許文献２】
特許第２７５７９６５号明細書
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明が解決しようとする課題は、２光子励起により光アフィニティラベルを活性化して被標識化合物に結合させるための光標識組成物を提供することであり、他の課題は、この化合物を用いて被標識物質を標識する方法を提供することである。これにより、被標識試料の三次元空間中の任意の位置にある被標識物質だけを選択的に励起し、検出することができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の課題は下記の手段により解決された。
（１）光照射により被標識体と反応して共有結合を形成し得る活性種に変化する光アフィニティ−ラベル化合物と被標識化合物との存在下に、２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上である化合物を２光子励起することにより、該光アフィニティ−ラベル化合物の分解を誘起して該被標識化合物を標識することを特徴とする光標識方法。
（２）光照射により被標識体と反応して共有結合を形成し得る活性種に変化する光アフィニティ−ラベル化合物と、２光子吸収断面積が１０００ＧＭ以上である化合物との混合物からなる光標識組成物。
（３）２光子吸収断面積が１０００ＧＭである化合物が上記一般式（ＩＩ）で表される上記（１）に記載の光標識方法。
【０００９】
【化２】
2004301681.tif 000002
【００１０】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し、Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。
（４）２光子吸収断面積が１０００ＧＭである化合物が上記一般式（ＩＩ）で表される上記（２）に記載の光標識組成物。
【００１１】
（作用効果の説明）
本発明の光標識組成物およびこれを用いた光標識方法の態様を以下に詳しく述べる。物質に光が当たると通常１光子分に相当するエネルギーが吸収される。この１光子吸収が起こらない波長の光であっても、強度が非常に強い場合には光子エネルギーの和が励起エネルギーに相当する２光子が同時に吸収されることがある。２光子吸収の起こり易さを示す２光子吸収断面積は通常非常に小さく１ＧＭ（ただし１ＧＭ＝１×１０−５０ｃｍ４  ｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｈｏｔｏｎ−１）程度であるが、近年数百ないし数千ＧＭ程度の比較的大きな２光子吸収断面積を示す物質も見出されている。このような物質を用いると、光吸収帯が無い波長域の光でも、高パワーレーザーのように非常に強度が強い光源を用いれば２光子分のエネルギーを吸収する。例えば４００ｎｍに１光子の吸収極大波長を示し、８００ｎｍには吸収帯が無い化合物に８００ｎｍの波長の高パワーレーザーを照射することにより、４００ｎｍの光を照射した場合に生じる励起状態に近い励起状態を作ることができる。もしこの化合物を４００ｎｍの光で励起した場合に例えば４３０ｎｍの蛍光を発するなら、８００ｎｍの光を吸収した場合にも４３０ｎｍの蛍光を発する。さらに４３０ｎｍの光を吸収して４６０ｎｍの蛍光を発する化合物が共存すれば、８００ｎｍの高パワーレーザーの照射により４６０ｎｍの蛍光を発する。レーザービームをレンズで絞って照射すれば、光路全体が発光するのではなく、光子密度の高い焦点付近でのみ蛍光を発するという、三次元的な位置選択制を付与できるという特徴がある。また絞ったレーザービームの強度はビームの中心から離れるにしたがって低下するので、２光子励起を起こすに足る光強度を有する部分はビーム径よりも小さく、およそ１／√２倍、すなわち約０．７倍になる。したがって光の波長で決まるビーム径の最小値よりも微細な領域のみを励起することができるという利点を有する。
【００１２】
非共鳴２光子同時吸収により励起されて蛍光を発する化合物は、たとえば本来４００ｎｍの光で励起される場合、その約２倍の波長である８００ｎｍの光でも光子密度が非常に高い場合には光子２個を同時に吸収して、４００ｎｍで励起された場合と同様の蛍光を発することが可能である。しかしこの２光子吸収効率は一般に極めて低いので高感度の検出系が要求されるが、本発明の化合物を用いることにより感度が改善される。光子エネルギーの小さい長波長の近赤外光を励起光として励起が可能なので、試料の光化学的損傷が少なくて好ましい。また近赤外光はレイリー散乱によるボケが少なく、生体透過性が高く深奥部まで到達し得る点でも好ましいので、組織の深奥部の位置選択的な励起が可能であるなどの利点がある。
【００１３】
このような２光子励起によって生じた励起状態のエネルギーを、光アフィニティ−ラベル化合物に移すことにより、光アフィニティ−ラベル化合物を活性化して近傍にある化合物を標識するというのが本発明の作用機構であり、これにより生体深部への到達性や三次元的空間分解能などの２光子吸収現象の特徴を活かした標識が可能になる。
【００１４】
しかし本発明の目的に適合し得るほどに、しかも共存物の２光子吸収よりも効率よく２光子吸収が起きるためには２光子吸収断面積は、便宜上ＧＭ単位（Ｇｏｐｐｅｒｔ−Ｍａｙｅｒｓ単位すなわち、１×１０−５０  ｃｍ４  ｓ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｈｏｔｏｎ−１）で表すと、１，０００ＧＭ以上、特に好ましくは１０，０００ＧＭないし１，０００，０００，０００ＧＭである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明に使用する光アフィニティラベル化合物について説明する。
【００１６】
本発明の光標識組成物において、光照射により光アフィニティラベル化合物から発生する活性種としては、ナイトレン、カルベン、ラジカル、イオンラジカル、ジラジカル、励起三重項、カルボカチオン等の炭素求電子試薬などが挙げられる。
【００１７】
光照射によりこれらの活性種を発生する光アフィニティラベル化合物の例は、例えば１９９５年発行のテトラへドロン誌（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）第５１巻、１２４７９乃至１２５２０ページのＳ．Ａ．Ｆｌｅｍｉｇの著した総説、および１９９８年発行の有機合成協会誌、第５６巻５８１乃至５９０ページの畑中保丸の著した総説に記載されている。すなわち、ナイトレンを発生する化合物としては、芳香族アジド、アルキルアジド、ヘテロ環アジドなどのアジド基を有する化合物であり、カルベンを発生する化合物としてはジアゾ基またはジアジリン環を有する化合物であり、ラジカルを発生する化合物としてはベンゾフェノン類やエノン類のような共役ケトン類、芳香族ハロゲン化物類、オレフィン類などであり、炭素求核試薬を発生する化合物としては芳香族ジアゾニウム塩、ニトロベンゼン類、スルホニウム塩、ホスホニウム塩、アンモニウム塩などである。これらの光反応性化合物はそれぞれ特徴があるので、使用条件に応じて選択して用いることができるが、安定性が比較的高い点では、ジアジリン環を有する化合物が好ましい。
【００１８】
安定性と合成の容易さの点では、共役ケトン類、芳香族ハロゲン化物類、オレフィン類などが好ましい。陰イオン性の核酸との親和性が高い点ではジアゾニウム塩などの陽イオン性の化合物が好ましい。
【００１９】
本発明で用いられる、光反応性基を有する光アフィニティラベル化合物のうち、下記一般式（Ｉ）で表される化合物が好ましい。
【００２０】
一般式（Ｉ）
Ｇ−Ａ
上記式中、Ｇは、アジド基（Ｎ＝Ｎ＝Ｎ）、ジアゾ基（Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ＝Ｎ）、ジアジリニル基（Ｃ（＊）（Ｒ２）Ｎ＝Ｎ＊、式中、＊同士は連結して三員環を形成することを表す。）、ジアゾニウム基（Ｎ２＋Ｘ）を表し；Ｒ１は、アシル基、アルキルもしくはアリールスルホニル基、アルキル基、またはアリール基を表し；Ｒ２は、水素原子、アルキル基、またはアリール基を表し；Ａは、アリール基を表す。
【００２１】
一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ１で表される基は、好ましくは炭素原子数が２乃至１０のアシル基または炭素原子数が６乃至１２のアリール基であり、これらの基は電子吸引基で置換されていることが特に好ましい。Ｒ２で表される基は好ましくは炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が６乃至１２の置換基を有していてもよいフェニル基であり、特に好ましくはフッ素原子などの電子吸引基で置換されたアルキル基である。Ａで表されるアリール基は、Ｇ以外の置換基を有していてもよいフェニル基であることが好ましく、Ｇ以外の置換基はＧに対してパラ位にあることが特に好ましい。
【００２２】
以下に、本発明で用いる光アフィニティラベル化合物の具体例を挙げるが、本発明の範囲はこれらのみにて限定されるものではない。
【００２３】
【化３】
2004301681.tif 000003
【００２４】
以下に本発明に使用する２光子吸収化合物について説明する。その例としては上記従来の技術に引用した文献に記載されたものの他、好ましくは特開２００２−１７２８６４号公報中に記載の一般式（１）で表される化合物、および下記一般式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
一般式（ＩＩ）
【００２５】
【化４】
2004301681.tif 000004
【００２６】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し、Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。
【００２７】
２光子吸収化合物はは少なくとも１個の酸基で置換されていることが好ましく、酸基の例としてはスルホン酸基、カルボキシル基、ホスホン酸基が挙げられる。これらの酸基は、２光子吸収化合物の部分構造としての芳香族環に脂肪族基を介さず直接結合していることが好ましく、特に好ましい酸基はスルホン酸基である。
【００２８】
一般式（ＩＩ）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ独立に、水素原子または置換基を表し、置換基として好ましくは、アルキル基（好ましくは炭素原子数（以下Ｃ数という）１〜２０、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ベンジル、３−スルホプロピル、４−スルホブチル、カルボキシメチル、５−カルボキシペンチル）、アルケニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、ビニル、アリル）、シクロアルキル基（好ましくはＣ数３〜２０、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル）、アリール基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニル、２−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−メチルフェニル、１−ナフチル）、ヘテロ環基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ）である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６としてより好ましくは水素原子またはアルキル基である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のうちのいくつかが互いに結合して環を形成してもよい。特に、Ｒ１とＲ３が結合して環を形成することが好ましく、その際カルボニル炭素原子と共に形成する環が６員環、５員環または４員環であることが好ましく、５員環または４員環であることがより好ましく、５員環であることが最も好ましい。
Ｒ１とＲ３が結合して６員環、５員環または４員環を形成し、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６  がいずれも水素原子である場合が好ましい。Ｒ１とＲ３が結合して環を形成しない場合はＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６  がいずれも水素原子であることが好ましい。
【００２９】
一般式（ＩＩ）において、ｎおよびｍはそれぞれ独立に１〜４の整数を表し、好ましくは１〜３の整数を表す。なお、ｎおよびｍが２以上の場合、複数個のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一でもそれぞれ異なってもよい。
【００３０】
Ｒ７、Ｒ８はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロ環基を表し（好ましい各基の例はＲ１〜Ｒ６と同じ）、好ましくはアルキル基を表し、より好ましくは無置換アルキル基、またはスルホ基もしくはカルボキシル基が置換したアルキル基を表し、さらに好ましくはＣ数１〜６の無置換アルキル基またはＣ数１〜４のスルホアルキル基を表す。
【００３１】
Ｚ１、Ｚ２はそれぞれ独立に５または６員環を形成する原子群を表す。形成されるヘテロ環として好ましくは、インドレニン環、アザインドレニン環、ピラゾリン環、ベンゾチアゾール環、チアゾール環、チアゾリン環、ベンゾオキサゾール環、オキサゾール環、オキサゾリン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾール環、チアジアゾール環、キノリン環、ピリジン環であり、より好ましくはインドレニン環、アザインドレニン環、ピラゾリン環、ベンゾチアゾール環、チアゾール環、チアゾリン環、チアジアゾール環、キノリン環であり、特に好ましくは、インドレニン環、アザインドレニン環である。
【００３２】
Ｚ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環は置換基を有しても良く、置換基として好ましくは、アルキル基（好ましくは炭素原子数（以下Ｃ数という）１〜２０、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ベンジル、３−スルホプロピル、４−スルホブチル、カルボキシメチル、５−カルボキシペンチル）、アルケニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、ビニル、アリル）、シクロアルキル基（好ましくはＣ数３〜２０、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル）、アリール基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニル、２−クロロフェニル、４−メトキシフェニル、３−メチルフェニル、１−ナフチル）、ヘテロ環基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ピリジル、チエニル、フリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピロリジノ、ピペリジノ、モルホリノ）、アルキニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、エチニル、２−メチルエチニル、２−フェニルエチニル）、ハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アミノ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジブチルアミノ）、シアノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホ基、アシル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、アセチル、ベンゾイル、サリチロイル、ピバロイル）、アルコキシ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メトキシ、ブトキシ、シクロヘキシルオキシ）、アリールオキシ基（好ましくはＣ数６〜２６、例えば、フェノキシ、１−ナフトキシ）、アルキルチオ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メチルチオ、エチルチオ）、アリールチオ基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、フェニルチオ、４−クロロフェニルチオ）、アルキルスルホニル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、メタンスルホニル、ブタンスルホニル）、アリールスルホニル基（好ましくはＣ数６〜２０、例えば、ベンゼンスルホニル、パラトルエンンスルホニル）、カルバモイル基（好ましくはＣ数１〜２０、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ−フェニルカルバモイル）、アシルアミノ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えばアセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、イミノ基（好ましくはＣ数２〜２０、例えばフタルイミノ）、アシルオキシ基（好ましくはＣ数１〜２０、例えばアセチルオキシ、ベンゾイルオキシ）、またはアルコキシカルボニル基（好ましくはＣ数２〜２０、例えば、メトキシカルボニル、フェノキシカルボニル）であり、より好ましくは、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ハロゲン原子、カルボキシル基（その塩も含む）、スルホ基（その塩も含む）、アルコキシ基、カルバモイル基、またはアルコキシカルボニル基である。
【００３３】
一般式（ＩＩ）で表される化合物は、より好ましくは一般式（ＩＩＡ）で表される。
一般式（ＩＩＡ）
【００３４】
【化５】
2004301681.tif 000005
【００３５】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｎ、ｍは一般式（１）と同義である。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４はそれぞれ独立にアルキル基またはアリール基を表す。Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立に＝Ｎ−または＝ＣＲ１７−を表し、Ｒ１７は水素原子または置換基を表す。Ｒ１５、Ｒ１６はそれぞれ独立に置換基を表し、ａ１、ａ２はそれぞれ独立に０〜３の整数を表す。なお、ａ１、ａ２が２以上の時Ｒ１５、Ｒ１６は同じでも異なっても良く、互いに連結して環を形成しても良い。
【００３６】
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４はそれぞれ独立にアルキル基またはアリール基を表し（好ましい例はＲ１〜Ｒ６と同じ）、好ましくはアルキル基を表し、より好ましくは無置換アルキル基（好ましくはエチル基、またはメチル基）を表し、さらに好ましくはメチル基を表す。
【００３７】
Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立に＝Ｎ−または＝ＣＲ１７−を表し、Ｒ１７は水素原子または置換基（好ましい例はＺ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環上の置換基の例と同じ）を表し、より好ましくはＲ１７は水素原子である。
【００３８】
Ｒ１５、Ｒ１６はそれぞれ独立に置換基（好ましい例はＺ１、Ｚ２により形成されるヘテロ環上の置換基の例と同じ）を表す。
ａ１、ａ２はそれぞれ独立に０〜３の整数を表し、より好ましくは０または１を表す。
なお、ａ１、ａ２が２以上の時、Ｒ１５、Ｒ１６は同じでも異なっても良く、互いに連結して環を形成しても良く、形成する環としてはベンゼン環が好ましい。
ａ１、ａ２が共に１であり、Ｒ１５、Ｒ１６が共に水素原子、カルボキシル基、またはスルホ基である場合が好ましい。
【００３９】
以下に本発明の一般式（ＩＩ）で表される化合物の具体例を挙げるが、本発明の範囲はこれらのみにて限定されるものではない。
【００４０】
【化６】
2004301681.tif 000006
【００４１】
【化７】
2004301681.tif 000007
【００４２】
【化８】
2004301681.tif 000008
【００４３】
【化９】
2004301681.tif 000009
【００４４】
本発明の光標識組成物における光アフィニティラベル化合物と２光子吸収化合物とは任意に組み合わせることができるが、光アフィニティラベル化合物の１光子吸収スペクトルにおける吸収帯の少なくとも一部が、２光子吸収化合物の１光子吸収スペクトルにおける吸収帯より長波長に及んでいるような組み合わせが好ましい。
【００４５】
本発明の光標識組成物は、光アフィニティラベル化合物と２光子吸収化合物のほかの成分を含有してもよい。この成分の例としては、溶媒、界面活性剤、ｐＨ調節剤、イオン強度調節剤、酸化防止剤などが挙げられる。
【００４６】
【実施例】
以下に本発明の標識組成物およびこれを用いる標識方法の利点を、実施例によって示すが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００４７】
実施例１
本発明の組成物１および比較組成物Ａを４０℃の２％ゼラチン水溶液と混合した後、冷却して幅が約１ｃｍ厚さ約２ｍｍの帯状に固化させ、試料とする。この試料に、波長７８０ｎｍ、平均パワー４０ｍＷ尖頭パワー７ｋｗ、パルス幅１００ｆｓ、繰り返し周波数４８ＭＨｚのレーザーをレンズで試料の中央部分に集光して暗所で照射する。この固体をｐＨ１０．５の冷ＮａＯＨ水溶液、次いで冷蒸留水で洗浄することにより未反応の光アフィニティラベル化合物を除去する。この試料に紫外線ランプの光を照射し、本発明の組成物を用いた帯状試料の場合に限り、レーザー光を照射したの中央付近でのみ蛍光が観測されることを確認する。このことから、本発明の組成物は、比較組成物に比べて長波長の光に対する感度が高く、しかも高い三次元的空間分解能でゼラチンを標識できることを確認できる。
【００４８】
本発明の組成物１の組成は、２光子吸収化合物Ｄ−１（１００ｍｇ）、光アフィニティラベル化合物Ａ−１１（１０ｍｇ）、ジメチルスルホキシド  １０ｍｌであり、比較組成物Ａの組成は、上記本発明の組成物から２光子吸収化合物Ｄ−１を除いた組成である。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、２光子励起により光アフィニティラベルを活性化して被標識化合物に結合させるための光標識組成物を提供することができ、該化合物を用いて被標識物質を標識する方法を提供することができる。