(57)【要約】【課題】多量の有機酸を有する２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造工程における２，６−ピリジンジカルボン酸を迅速且つ高感度に定量し、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法を提供すること。【解決手段】本発明は、製造工程で多量の有機酸を有する複合的な試料中の２，６−ピリジンジカルボン酸を分析することを特徴とする２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法に関する。この方法は、試料中の微量の２，６−ピリジンジカルボン酸を前処理などの煩雑で複雑な工程を必要とせずに発酵や精製などの各製造工程における２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を迅速且つ高感度に定量することができる。これにより、各工程で数時間ずつを要した律速段階であるモニタリングのための分析時間を大幅に短縮し、迅速な製造方法を提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含有する組成物を、酸性緩衝液を移動相として液体クロマトグラフィーにより分析することを特徴とする２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項２】
酸性緩衝液が、ｐＨ４以下であることを特徴とする請求項１に記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項３】
酸性緩衝液が、過酸化水素、塩酸、硫酸または硝酸を含有することを特徴とする請求項２に記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項４】
酸性緩衝液が硫酸を含有することを特徴とする請求項３に記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項５】
液体クロマトグラフィーに用いるカラムがイオン排除カラムであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項６】
２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含有する組成物が、バリン、アラニン、α−ケトグルタル酸および２，３−ジヒドロジピコリン酸から選ばれる少なくとも一つの不純物を含有することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項７】
２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含有する組成物が、
ｉ  ）  ２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させて得られる菌体の培養上清、または
ｉｉ  ）  増殖させた２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物をアスパラギン酸またはピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を産生させた反応水溶液、
であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項８】
２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属から選ばれるいずれか一つの属に属する微生物であることを特徴とする請求項７に記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法。
【請求項９】
ｉ  ）  ２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させて得られる菌体の培養上清、または
ｉｉ  ）  増殖させた２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物をアスパラギン酸またはピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を産生させた反応水溶液、
に蓄積させて２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を得る際に、請求項１から８のいずれかに記載の分析方法により、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の純度を分析する工程を含む、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法。
【請求項１０】
ｉ  ）  ２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させる工程において、発酵培地中にカルシウムイオンを、培養液中に蓄積した２，６−ピリジンジカルボン酸に対して０．８から２倍モル添加することを特徴とする、請求項９に記載の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法およびその分析方法を含む製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２，６−ピリジンジカルボン酸は、天然物であり生分解性が高いことで知られた有用化合物であり、用途としては、漂白促進剤（例えば、特許文献１参照）や金属隠蔽剤（例えば、特許文献２参照）として、写真処理用途や各種洗浄剤で使用できることが知られている。２，６−ピリジンジカルボン酸は、胞子を形成する微生物であるバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などの細菌類やカビなどの真菌類（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  属）の体内に蓄積されることが知られている。また、胞子を形成する能力を持たない微生物による２，６−ピリジンジカルボン酸の製造方法は、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩、製造方法ならびにキレート剤（例えば、特許文献３参照）に詳しく述べられている。
【０００３】
２，６−ピリジンジカルボン酸は、カビなどの芽胞形成時に胞子中に蓄積される特徴的な成分であり、金属イオンとキレートするという特徴を活かし、鉄イオンとキレートを形成させてＵＶ吸収により測定する比色法（例えば、非特許文献１参照）  や、カルシウムイオンとキレートを形成させる方法（例えば、非特許文献２参照）、２，６−ピリジンジカルボン酸ナトリウム塩を過剰の塩化カルシウムを加えることにより２，６−ピリジンジカルボン酸カルシウム塩に変換し、得られたスペクトルの差によって定量する差スペクトル法  （例えば、非特許文献３参照）などが知られていた。また近年、キレート作用のある物質の分離に適した高純度シリカゲルを用いた液体クロマトグラフィーによる２，６−ピリジンジがカルボン酸の測定方法（例えば、非特許文献４参照）なども報告されている。
【０００４】
【特許文献１】特開平６−２１４３６５号公報
【特許文献２】特開平５−１５８１９５号公報
【特許文献３】特開２００２−３７１０６３号公報
【非特許文献１】ヤンセンら（Ｊａｎｓｓｅｎ，  Ｆ．  Ｗ．  ｅｔ．ａｌ）  サイエンス「Ｓｃｉｅｎｃｅ」  １９５８年発行１２７号２６頁
【非特許文献２】ルイス（Ｌｅｗｉｓ．Ｊ．Ｃ．）アナリティカル  バイオケミストリー  「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」  １９６７年発行１９号３２７頁
【非特許文献３】スコット  アンド  デビット  （Ｓｃｏｔｔ  Ｉ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ｅｌｌａｒ）  ジャーナルオブバクテリオロジー  「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」  アメリカ  １９７８年発行１３５号１番１３３頁
【非特許文献４】ヘンリー（Ｈｅｎｒｙ  Ｐ．）  アナリティカルバイオケミストリー「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」  １９８１年発行１１４号４０７頁
【非特許文献５】ダニエル  アンド  エリングトン  （Ｄａｎｉｅｌ  Ａ．  ａｎｄ  Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｊ．）    ジャーナルオブモレキュラバイオロジー  「Ｊｏｕｒａｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  １９９３年発行２３２号４６８頁
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の技術では、複合的な有機酸を含む２，６−ピリジンジカルボン酸の定量が困難であった。
【０００６】
具体的には、例えば２，６−ピリジンジカルボン酸のナトリウム塩及びカルシウム塩のＵＶ吸収スペクトルの差を利用した差スペクトル法を用いて大腸菌が最少培地（ＦｅＣｌ２、  ＭｇＣｌ２、  ＭｎＣｌ２、  ＮＨ２Ｃｌ、  Ｎａ２ＳＯ２、  ＫＨ４ＰＯ４、  ＮＨ４ＮＯ３、  グルタミン酸、  Ｄ−グルコース  ）中に蓄積する２，６−ピリジンジカルボン酸の測定法（例えば、非特許文献５参照）が知られているが、この方法を用いて測定を行ったところ、２，６−ピリジンジカルボン酸産生微生物の製造工程における発酵培地中の２，６−ピリジンジカルボン酸の測定には、副生成物として含まれる有機酸が阻害して定量が困難であった。
【０００７】
また、キレート作用のある物質の分離に適した高純度シリカゲルを用いた液体クロマトグラフィーによる２，６−ピリジンジがカルボン酸の測定方法を用いて有機酸含有試料中の２，６−ピリジンジカルボン酸の分析を行ってみたところ、カラムへの２，６−ピリジンジカルボン酸の保持時間が短く２，６−ピリジンジカルボン酸産生微生物の増殖工程または菌体培養上清、または反応水溶液中などに存在する複合的な有機酸とピークが重なり、２，６−ピリジンジカルボン酸に特異的なピークを検出は不可能だった。
【０００８】
また、これらの方法は煩雑な前処理の工程を含むものであり、２，６−ピリジンジカルボン酸の製造工程における分析にはいずれも時間がかかりすぎるという欠点もあった。
【０００９】
すなわち、これら従来の測定方法を用いて、２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物の発酵または菌体の培養上清または反応水溶液に２，６−ピリジンジカルボン酸を蓄積させる製造工程を経時的にモニタリングすることは極めて困難であり、したがって、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を提供する製造工程を、定量的に監視することが望まれていた。また、微生物の生育に伴う迅速で経時的な製造工程の監視のための、分析時間の短縮が強く望まれていた。本発明は、有機酸含有試料中の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の迅速な分析法に関するものであり、本分析法により２，６−ピリジンジカルボン酸を分析する工程を含む、２，６−ピリジンジカルボン酸の製造方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者はかかる状況に鑑み、酸性緩衝溶液下での有機酸分析カラムを用いた２，６−ピリジンジカルボン酸分析法が、有機物の多く含まれる複合的な組成物中の２，６−ピリジンジカルボン酸の濃度を迅速に測定に適していることを見出し、創意工夫の結果、２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物の産生した複合的な組成物中の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の迅速な分析法を利用した２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含有する組成物を、酸性緩衝液を移動相として液体クロマトグラフィーにより分析することを特徴とする２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法および、ｉ  ）  ２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させて得られる菌体の培養上清、または  ｉｉ  ）  増殖させた２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物をアスパラギン酸またはピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を産生させた反応水溶液、に蓄積させて２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を得る際に、請求項１から８のいずれかに記載の分析方法により、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の純度を分析する工程を含む、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法に関するものである。
【００１２】
より具体的には、本発明は２，６−ピリジンジカルボン酸を含む複合的な組成物を、Ｉ  ）  ｐＨ４以下の酸性緩衝液を移動相に用い、ＩＩ  ）有機酸分析用のイオン排除カラムを用いて２，６−ピリジンジカルボン酸を液体クロマトグラフィーによって分析することにより、迅速に製造工程で得られる複合的な組成物中の２，６−ピリジンジカルボン酸を分析することで、ＩＩＩ  ）製造工程を適正化することによって達成される。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明では、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含有する組成物を、酸性緩衝液を移動相として液体クロマトグラフィーにより分析することが重要である。酸性緩衝液を用いることで、試料溶液中でイオンとして解離している２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の解離を抑制し、充填剤との保持力を高めてピークの分離が向上する。
【００１４】
本発明で、２，６−ピリジンジカルボン酸の塩としては、ナトリウム塩、カルシウム塩などがあげられる。
【００１５】
ここで、酸性緩衝液としては、ｐＨ４以下のものが好ましく使用される。２，６−ピリジンジカルボン酸の酸解離定数以下となるような酸性緩衝液が好ましく使用される。有機酸やアミン類はそれぞれ固有の酸解離定数をもっており、移動相である溶媒のｐＨや試料濃度により解離・非解離状態の平衡が変化する。ピリジンジカルボン酸は２価のカルボキシル基を持ち、ピリジン基中にアミンを持つという構造を持っている。有機酸分析では、移動相のｐＨと試料の酸解離定数が離れるほど解離度が大きくなり、有機酸はほぼ完全に解離した状態で分離される。すなわち、分析時の移動相のｐＨが２，６−ピリジンジカルボン酸の解離定数とある程度離れていると２，６−ピリジンジカルボン酸の解離が抑えられた状態となり、検出および分離が良好となる。２，６−ピリジンジカルボン酸はｐＨ４．０以上で解離状態となる。このため、酸性緩衝液はｐＨ４以下が好ましい酸性緩衝液に含まれる酸としては、過酸化水素、塩酸、酢酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、硝酸、硫酸などが好ましく、より好ましくは硫酸である。
【００１６】
また、液体クロマトグラフィーに用いるカラムはイオン排除カラムが好ましく用いられ、特に有機酸分析用カラムが好ましい。具体的には、Ｓｈｉｍｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０１Ｈ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、ＴＳＫｇｅｌ  Ｏａｐａｋ−Ａ（東ソー社製）などが挙げられる。特に好ましくは、Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０１Ｈ（  Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製  ）で、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体にスルホン酸基を結合させた陽イオン交換樹脂が充填された有機酸分析カラムである。上記有機酸分析では、分子中に少なくとも１個のカルボキシル基を有する低分子の有機酸を分析することができる。カラムを通過する移動相は、ｐＨをリン酸などの酸性緩衝液で下げ、有機酸の解離を抑えることにより逆送分配カラムへ目的有機酸の保持を誘導させる。有機酸分析の方法には、逆送分配カラムを用い移動相にＰＩＣＡなどのイオンペア試薬を添加することにより該有機酸を保持させることもできる。また、カラムにスルホン化スチレンジビニルベンゼン等のスルホン酸を充填剤として用い移動相にリン酸やＨＣｌＯ４等の緩衝液を添加して有機酸と充填剤の間の分配を利用する方法なども知られている。イオンペア試薬とは、例えば該測定物質が試料溶液中でイオンとして解離している場合や試料中にイオン性物質が混在しているサンプルの測定時に、良好な分離が得られない場合などに用いられるもので、試薬の非極性アルキル基が試料中の検出したい目的イオン性物質に結合し、充填剤との保持力を高めて分離を向上するものである。
【００１７】
これらの方法を用いると、たとえば、シュウ酸、マレイン酸、α−ケトグルタル酸、クエン酸、酒石酸、ピルビン酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、乳酸、フマル酸、ギ酸、酢酸、アジピン酸、アクリル酸、メタクリル酸などが分析できる。
【００１８】
有機酸分析カラムには、２，６−ピリジンジカルボン酸のカルボキシル基を直接的に検出することができるものもある。カルボキシル基を検出するカラムとしては、例えば、専用カラムとしてジカルボン酸分析カラム（ＹＭＣ−ＰａｃｋＣＡ  ワイエムシイ）などが知られているが、上記カラムを用いる場合、高価なラベル試薬を用いて試料のカルボキシル基を２−ニトロフェニルヒドラジドへと変換しなくてはならないという欠点があった。
【００１９】
移動相に酸性緩衝液を用いることで高価なイオンペア試薬などを必要とせず、試料溶液中の２，６−ピリジンジカルボン酸の解離を効率的抑制し分析が可能となる。移動相には例えば、ｐＨ２．２５の０．２５％硫酸水溶液を用いるのが好ましい。試料の検出には、２，６−ピリジンジカルボン酸が吸収を持つ２６０−２８５  ｎｍの波長を用いることができる。さらに好ましくは、２，６−ピリジンジカルボン酸最大吸収波長である２７２ｎｍである。移動相として、０．２５％硫酸を用い、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で検出を行い、２，６−ピリジンジカルボン酸の含量が１ｐｐｍ以上のとき、ピーク強度と２，６−ピリジンジカルボン酸濃度比の相関を得ることができる。また、それ以下の濃度でも、検出が可能である。具体的には、試料中に存在する０．０５ｎｇ以下の２，６−ピリジンジカルボン酸でも検出することができる。従来の分析方法を用いた、２，６−ピリジンジカルボン酸の定量結果は、本発明による分析方法の定量限界と有意に差を持つものではないが、従来法は非常に煩雑な手順を用いて分析に数時間を要するにもかかわらず、本発明による分析方法では非常に迅速に、３０分以内に２，６−ピリジンジカルボン酸を測定することが可能である。また、本分析法を用いれば、２，６−ピリジンジカルボン酸の濃度だけでなく複合的な組成物中のアミノ酸、核酸、タンパク質、多糖などの有機酸も同時に検出することができる。
【００２０】
本発明の分析方法は、
ｉ  ）  ２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させて得られる菌体の培養上清、または
ｉｉ  ）  増殖させた２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物をアスパラギン酸またはピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を産生させた反応水溶液、
の分析に好適である。これらの培養上清または反応水溶液には、通常、バリン、アラニン、α−ケトグルタル酸および２，３−ジヒドロジピコリン酸などの不純物が含まれている。また、これらの方法で２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を単離採取する際の、イオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理による不純物の除去など工程で得られる組成物の分析にも適している。
【００２１】
２，６−ピリジンジカルボン酸の産生能力を有する微生物としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属から選ばれるいずれかの属に属する微生物が好ましい。製造工程で得られる２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を含む組成物としては、例えば、２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物の発酵上清に含有する複合的な有機酸などがある。例えば、アミノ酸、核酸、タンパク質、多糖など、天然に生産されているような物質は、安価に製造する目的で簡便な精製法を採用することによって含まれることもあるし、また、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を用いる用途に応じて、安定性を付与し機能を向上させる目的のために人為的に添加されることもあり得る。特に、バリン、アラニンなどのアミノ酸、α−ケトグルタル酸、コハク酸、乳酸などの有機酸や２，３−ジヒドロジピコリン酸などは、２，６−ピリジンジカルボン酸のキレート作用を妨害することもなく、安価な製造方法を達成するために含まれることもある。また、微生物を増殖させる工程で使用される培地成分として、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含む通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんおよび、セルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、グリセロール、エタノール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸である。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などが不純物として含まれる。さらに、有機微量栄養源としてビタミン類、アミノ酸などの要求物質、酵母エキス、コーンスティープリカーなどが含有することがある。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、銅イオン、鉄イオン、マンガンイオンなどが添加されている。場合によっては、消泡剤などが含有される。
【００２２】
さらに、本発明は、ｉ  ）  ２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させて得られる菌体の培養上清、または  ｉｉ  ）  増殖させた２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物をアスパラギン酸またはピルビン酸を含む水溶液中に懸濁させ２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を産生させた反応水溶液、に蓄積させて２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を得る際に、請求項１から８のいずれかに記載の分析方法により、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の純度を分析する工程を含む、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法である。また、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を単離採取する工程において、例えば、イオン交換樹脂による吸脱着、晶析による固液分離、膜処理による不純物の除去などを組み合わせが考えられるが、各工程において上記のような複合的な組成物中の２，６−ピリジンジカルボン酸の品質および純度を把握する分析工程は必須であり、製造工程におけるこの律速工程を迅速化することは極めて重要であった。
【００２３】
本発明では、２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物を増殖させる工程において、発酵培地中にカルシウムイオンを培養液中に蓄積した２，６−ピリジンジカルボン酸に対して、０．８から２倍モル添加することが好ましい。
【００２４】
微生物の発酵培養中、２，６−ピリジンジカルボン酸が培養中に高濃度に存在すると、静菌作用などにより、菌体が発酵培地中に２，６−ピリジンジカルボン酸を著量蓄積させることができない。また、発酵初期からカルシウムイオンを一時に大過剰に加えると、発酵が阻害されることから、発酵中の２，６−ピリジンジカルボン酸を含む組成物中に適宜２，６−ピリンジカルボン酸とキレートを形成するカルシウムイオンを培養液中に蓄積した２，６−ピリジンジカルボン酸に対して、０．８から２倍モル加えることが好ましい。
【００２５】
培養は、振盪または通気撹拌によって通常好気条件で１６から１２０時間行うのが好ましい。培養の間ｐＨは４〜８に、培養温度は２０℃から４５℃に制御する。尚、ｐＨ調整には、無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガスなどを使用することができる。より好ましくは、５０ｍｌのブイヨン培地（ニッスイ製）を５００ｍｌ容エーレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したのち、ブイヨン寒天培地（ニッスイ製）に生育させた白金耳量を植菌し、３０℃で一晩回転振盪培養した培養液を、表１に記載した２，６−ピリジンジカルボン酸生産培地１リットルを仕込んだ２リットル容ミニジャーファーメンターに植菌し、通気量１ｖｖｍ、回転数８００ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７．０の条件で通気撹拌培養を行う。その後、２，６−ピリジンジカルボン酸の蓄積がみられた段階でカルシウムイオンを蓄積終濃度の０．８から２倍モル加える。本発明によれば、発酵前に培地中にカルシウムイオンを加えた場合よりも最終蓄積量を向上することができる。
【００２６】
すなわち、本発明により、２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物の産生した有機酸含有試料中の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を３０分以下で迅速に分析する方法を提供することができる。２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物の産生した２，６−ピリジンジカルボン酸を含む組成物は、アミノ酸や有機酸および２，３−ジヒドロジピコリン酸などいずれも本分析方法に影響を与えない。本発明により、迅速且つ定量的に２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩を分析する工程を含む２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の製造方法を提供できる。
【００２７】
【実施例】
（ピークの帰属）
２，６−ピリジンジカルボン酸の標準品（和光純薬特級）を１０  ｐｐｍ、５  ｐｐｍ、１  ｐｐｍの濃度になるように調製した標準液１０マイクロリットルを、有機酸分析用イオン排除カラム（Ｓｈｉｍｐａｃｋ−ＳＣＲ１０１Ｈ  ；  Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いた。移動相には、０．２５  ％  の希硫酸緩衝液（ｐＨ２．２５）を用い、カラム温度４０℃、液量  １ｍｌ  ／  ｍｉｎ  で測定した。検出には、検出器は紫外可視分光光度検出器ＳＰＤ−１０Ａｖｐ  （  Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製  ）を用い、検出波長は２７２  ｎｍ、検出パラメーターはＡｕｘ  Ｒａｎｇｅ  ２，  Ｒｅｃ  Ｒａｎｇｅ  １レスポンス４に設定しておこなった。データ収集には、サンプリング時間５００  ｍｓｅｃ、検出ピーク幅０．１６７  ｍｉｎ、分析時間４０ｍｉｎを用いた。図１は、上記分析方法を用いて分析した１０  ｐｐｍの濃度の標準２，６−ピリジンジカルボン酸の分析のクロマトグラムを示す図である。保持時間３３分に２，６−ピリジンジカルボン酸に特異的なピークを検出することができた。
【００２８】
（検量線の作成）
表１に示す発酵培地を作製し２，６−ピリジンジカルボン酸産生菌の親株で２，６−ピリジンジカルボン酸産生能力のないコリネバクテリウム  グルタミカム（  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３２８６  ）株を生育させ、そこに２  ｐｐｍから１０  ｐｐｍ  の濃度になるように標準２，６−ピリジンジカルボン酸を加えた試料を作製し、上記分析条件と同様にして分析を行った。
【００２９】
なお、複合的な有機酸を含む組成物の試料溶液は、微生物菌体などから放出される高分子のタンパクや多糖類によって分離カラムに高分子が吸着し測定を妨害するのを防ぐために、カラム導入前にはあらかじめ０．４５マイクロメートル孔系のフィルターを用いて試料の濾過を行ったのち、濾液を分析した。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
図２に、各試料に含まれる標準２，６−ピリジンジカルボン酸の濃度とピーク強度値の相関を表す。複合的な組成物中の標準２，６−ピリジンジカルボン酸濃度が２ｐｐｍから１０ｐｐｍの範囲でも非常によい相関を示している。この結果、本分析法は従来の煩雑な分析方法を用いなくとも、複合的な有機酸を含む組成物中の非常に低濃度の２，６−ピリジンジカルボン酸を検出できるがことが示された。
【００３２】
（実施例１）
特開２００２−３７１０６３号の実施例１で得た、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ）ＴＲ−ＤＡＰ１を表２で示す培地で発酵した。５０ｍｌのブイヨン培地（ニッスイ製）を５００ｍｌ容エーレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃、２０分間滅菌したのち、ブイヨン寒天培地（ニッスイ製）に生育させた白金耳量を植菌し、３０℃で一晩回転振盪培養した培養液を、表２に記載した２，６−ピリジンジカルボン酸生産培地１リットルを仕込んだ２リットル容ミニジャーファーメンターに植菌し、通気量１ｖｖｍ、回転数８００ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ７．０の条件で通気撹拌培養を行った。培養開始後、適宜培養上清に蓄積した２，６−ピリジンジカルボン酸濃度を本発明記載の分析方法でモニタリングし、２，６−ピリジンジカルボン酸蓄積濃度が３  ｇ／Ｌ  、６ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌに達した時点で、培養液中に蓄積した２，６−ピリジンジカルボン酸と２倍モル量になるように培地中に塩化カルシウムを加えた。ここで得られた培養上清を上記分析条件で分析した結果を図３に表す。
【００３３】
発酵により２，６−ピリジンジカルボン酸を産生した結果、適宜塩化カルシウムを加えた発酵上清１２ｇ／Ｌの２，６−ピリジンジカルボン酸の蓄積がみられ、発酵開始前から過剰量の塩化カルシウムを加えた培地で発酵した発酵上清１０ｇ／Ｌに比べて有意に最終蓄積量が向上した。
【００３４】
【表２】
2004301584.tif 000003
【００３５】
（比較例１）
標準２，６−ピリジンジカルボン酸を水に溶解した試料および上記（検量線の作成）で得られた複合的な有機酸を含む組成物中に標準２，６−ピリジンジカルボン酸（和光純薬特級）を加えた試料を以下の方法で分析した。
【００３６】
分析カラムには、分離カラムとしてＢｏｎｄａｐａｋＮＨ２（  Ｗａｔｅｒｓ社製）、試料の有機物等を除去するガードカラムとしてＢｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８／Ｃｏｒａｓｉｌ  （Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。移動相には、２０  ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ  （リン酸でｐＨ３．４に調製）  とアセトニトリルを等量ずつ混合した溶液を用いた。カラム温度は４０℃、液量１ｍｌ  ／  ｍｉｎ  、検出器は紫外可視分光光度検出器ＳＰＤ−１０Ａｖｐ  （  Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製  ）を用い、検出波長は２７０  ｎｍを用いた。クロマトグラムはＳＬＯＰＥ  ３００  ＷＩＤＴＨ  ５  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ａｒｅａ  １００００  Ｓｔｏｐ  Ｔｉｍｅ  ３０  Ｓｐｅｅｄ  ２で行った。標準２，６−ピリジンジカルボン酸を水に溶解して上記分析条件で測定したところ、保持時間９分にピークが検出されたものの、図４に示すように微生物の発酵培地である複合的な有機酸を含む組成物中の２，６−ピリジンジカルボン酸ピークは、夾雑物のピークと重複し帰属困難であった。
【００３７】
以上のことから、本分析方法は２，６−ピリジンジカルボン酸を産生する能力を有する微生物が、発酵培地中に蓄積する２，６−ピリジンジカルボン酸を分析する方法として不適であった。
【００３８】
（比較例２）
実施例１で得られた培養上清を、以下の方法で分析した。
【００３９】
発酵上清５ｍｌに１規定酢酸水溶液を０．１ｍｌ加え、サンプル濃度がｐＨ４．０からｐＨ６．０の間に来るよう調製し、室温で１時間放置した。サンプルはｐＨ４．０以下では発色せず、ｐＨ６．０以上では沈澱を生じて測定に誤差が生ずるため、特に正確に調製を行った。１時間後、生じた沈殿物を除去するため１５００ｇで１０分間遠心した。得られた上清４ｍｌを新しい試験管に移し、あらたに調製した０．５Ｍ酢酸中に１％  Ｆｅ（ＮＨ４）２ＳＯ４・６Ｈ２Ｏおよび１％  アスコルビン酸を含む発色試薬（ｐＨ５．５）を１ｍｌ加え、反応終了後ＵＶスペクトロメーターを用いて波長２７０ｎｍで吸光度を測定した。上記分析法で測定したところ、かかる分析に数時間もの分析時間を要した。このことから、発酵培養上清に蓄積する２，６−ピリジンジカルボン酸のモニタリングには適していないことが示された。
【００４０】
【発明の効果】
本発明では、製造工程で迅速且つ定量的な新規の２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の分析方法を用いて、２，６−ピリジンジカルボン酸またはその塩の迅速な製造方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２，６−ピリジンジカルボン酸の標準品のクロマトグラムを示す図である。
【図２】標準２，６−ピリジンジカルボン酸を用いた場合のピーク強度との相関を表す図である。
【図３】実施例１における分析のクロマトグラムを示す図である。
【図４】比較例１における分析のクロマトグラムを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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