(57)【要約】【課題】アポトーシスと異なる神経細胞死を抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質を発現させ、該細胞に被験化合物を接触させ、アポトーシスとは異なる神経細胞死に対する抑制作用を検出することにより、神経細胞死抑制効果を有する化合物をスクリーニングする方法であり、たとえば、（１）ラット大脳皮質初代培養神経細胞を培養し、（２）初代培養神経細胞に、組換えウイルスベクターを用いてポリグルタミン鎖が伸長したハンチンチン変異タンパク質を発現させ、（３）該細胞に被験化合物を接触させ、（４）認められる神経細胞死に対する抑制作用を検出し、それを指標として化合物を選別する工程よりなる化合物のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質を発現させ、被験化合物を接触させ、アポトーシスとは異なる神経細胞死の抑制を検出することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞の細胞死（以下、神経細胞死という）を抑制する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハンチントン病は、運動障害、認識喪失および精神医学症状発現を特徴とする進行性の神経変性疾患である［ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第３１５巻、第１２６７〜１２７６頁（１９８６年）］。ハンチントン病の顕著な特徴は、通常、人生の３５年から５０年にわたる潜行性の症状を有し、死亡するまでの１０年から２０年にわたり徐々に悪化していく特有の舞踏運動障害である。ときには、硬直およびより迅速な経過をたどる重篤な症状を伴って若年期に発現される場合がある。本症でみられる知能・精神障害は、大脳皮質の広範な萎縮にもとづくものであり、舞踏運動を起こす病理変化は、線状体（尾状核と被殻）、とりわけ、尾状核の萎縮であると考えられている［ジャーナル・オブ・ニューロパソロジー・アンド・エクスパーリメンタル・ニューロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）第４４巻、第５５９〜５７７頁（１９８５年）］。現在までのところ、障害の発現および進行を遅らせる予防法または有効な治療法は存在しない。
【０００３】
ハンチントン病は、ハンチンチンタンパク質におけるポリグルタミン鎖の伸長によって惹起される遺伝性の神経変性疾患であり、脊髄小脳変性症などとともにポリグルタミン病の一つである。ポリグルタミン病では、病因遺伝子内のタンパク質への翻訳領域に存在するＣＡＧリピート数が増加し、ＣＡＧリピートは、グルタミンをコードしているため、異常伸長したポリグルタミン鎖を有する変異タンパク質が発現する。ハンチントン病では、ハンチンチンタンパク質のポリグルタミン鎖は、正常では３７個以下であるが、ハンチントン病患者では３７個から１５０個以上にまで伸長するという報告がある［カレント・オピニオン・イン・ニューロバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第５巻、第６５６−６６２頁（１９９５年）］。異常伸長したポリグルタミン鎖を有する変異ハンチンチンタンパク質は、神経細胞内においてタンパク質の塊（以下、封入体と呼ぶ）となり蓄積する［セル（Ｃｅｌｌ）、第９０巻、第５３７〜５４８頁（１９９７年）；セル（Ｃｅｌｌ）、第９０巻、第５４９〜５５８頁（１９９７年）］。神経細胞に対する障害は、このタンパク質封入体によりもたらされると考えられている［ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、第３５１巻、第１３１〜１３３頁（１９９８年）；ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）、第１９巻、第１１４７〜１１５０頁（１９９７年）］。タンパク質封入体は、他のポリグルタミン病である歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病：脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）においてもみられ、さらに、ポリグルタミン病以外の神経細胞の変性・脱落を伴なう神経変性疾患においても確認されている。たとえば、α−シヌクレインの変異によりレビィー小体（Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｙ）と呼ばれる封入体を形成するパーキンソン病および明らかな封入体は形成しないがタウの変異によって神経原繊維変化をきたすアルツハイマー病などが例として挙げられる。こうしたことから、タンパク質封入体と神経細胞死との関係が注目され精力的な研究が行われているが、現在までに封入体の生理的意義や神経細胞死の機構は、未だ明らかにされていない。
【０００４】
ところで、神経変性疾患における神経細胞死を実験で再現する試みは、数多く存在する。ハンチントン病における神経細胞死は、神経細胞内にポリグルタミン鎖を有する変異ハンチンチンを発現させることなどにより試みられており、こうした報告の多くは、変異ハンチンチンタンパク質により生じる神経細胞死がアポトーシスであるとの報告がみられる。しかし、これらの実験の多くは非神経系細胞株を用いたものであり、神経細胞において同様なアポトーシスが起きるかどうかは確実ではない。例外的に神経細胞におけるアポトーシスを示唆した実験結果として、セル（Ｃｅｌｌ）、第９５巻、第５５〜６６頁（１９９８年）には、ラット線条体の初代培養神経細胞にマウスの変異ハンチンチンを発現させ、神経細胞死を認めたことの報告がある。この神経細胞死は、神経細胞の突起の減少あるいは崩壊、クロマチンの凝縮および核の萎縮と断片化といったアポトーシスに特徴的な形態変化に加え、ＴＵＮＥＬ法によるアポトーシス細胞の検出、Ｂｃｌ−ＸＬの共発現およびＡｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯの培養液への添加によるアポトーシスの抑制により細胞死が完全に抑制されるなどの試験結果から、アポトーシスであると報告している。
【０００５】
しかしながら、近年、ヒトにおけるハンチントン病などのポリグルタミン病の疾患、さらには、神経変性疾患は、アポトーシスとは異なる神経細胞死が、疾患の原因として重要であると考えられるようになってきた。たとえば、ヒトのハンチントン病において、アポトーシスとは異なる神経細胞死が確認されている。プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、第９７巻、第１４号、第８０９３〜８０９７頁（２０００年）においては、ハンチントン病患者の剖検脳および変異ハンチンチンのトランスジェニックマウスにみられる神経細胞死が、アポトーシスでもなくネクローシスでもないことが報告されている。
【０００６】
ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）、第２１巻、第６３３〜６４２頁（１９９９年）においても類似した細胞死が報告されている。この報告では、ショウジョウバエの光受容器神経細胞（Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｅｕｒｏｎｓ）にポリグルタミン鎖を有するヒトの変異ハンチンチンを発現させたときに起こる神経細胞死が、一部アポトーシスに類似するものの、典型的なアポトーシスとは異なることが示されている。
こうした報告におけるアポトーシスとは異なる神経細胞死を抑制する化合物は、ハンチントン病などの未だそのメカニズムが定かではない神経細胞死に伴なう神経変性疾患の治療薬として有用である。しかし、トランスジェニックマウスやショウジョウバエを用いたインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における実験は、大量に繁殖することによる効率の悪さなどの問題があり、大量の化合物のスクリーニングに用いるには不適当である。
【０００７】
ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、第１９巻、第７０５〜７１５頁（１９９９年）においては、初代培養小脳顆粒神経細胞にポリグルタミン鎖を導入し、認められる細胞死が一部アポトーシスの特徴を有するものの、アポトーシスとは異なることが報告されている。しかし、通常、中年期（３５歳から５０歳）に発症するハンチントン病では、神経細胞死は主に線条体および大脳皮質に認められることから、小脳の初代培養神経細胞を使用しているこの報告は、ヒトのハンチントン病における神経細胞死を再現しているとはいえない。さらに、アポトーシスでない細胞死を利用した大脳皮質を用いたハンチントン病のモデルは、今までに知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、アポトーシスとは異なる神経細胞死を抑制する化合物の簡便なスクリーニング方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトのハンチントン病にみられる神経細胞死をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において再現すべく、研究を重ねた。その結果、大脳皮質初代培養神経細胞に、組換えウイルスベクターを用いてポリグルタミン鎖が伸長したハンチンチン変異タンパク質を発現させることで、ハンチントン病に特徴的な核内タンパク質封入体が形成され、ネクローシスとは異なる形態の神経細胞死が生じることを見出した。さらに、この神経細胞死が、アポトーシスとも明らかに異なる形態の細胞死であることを見出した。これらの知見を基に、ハンチントン病などのポリグルタミン病、さらには、神経変性疾患の治療剤となる化合物のスクリーニング方法の発明を完成するに至った。
【発明の実施の形態】
【００１０】
本発明は、大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質を発現させ、該細胞に被験化合物を接触させ、アポトーシスとは異なる神経細胞死に対する抑制作用を検出することにより、神経細胞死抑制効果を有する化合物をスクリーニングする方法に関する。
より具体的には、たとえば、（１）ラット大脳皮質初代培養神経細胞を培養し、（２）初代培養神経細胞に、組換えウイルスベクターを用いてポリグルタミン鎖が伸長したハンチンチン変異タンパク質を発現させ、（３）該細胞に被験化合物を接触させ、（４）認められる神経細胞死に対する抑制作用を検出し、それを指標として化合物を選別する工程よりなる化合物のスクリーニング方法である。
【００１１】
大脳皮質初代培養神経細胞にハンチンチン変異タンパク質を発現させることを特徴とする本発明方法により、該細胞をネクローシスともアポトーシスとも異なった神経細胞死に導くことが可能となった。これは、近年、ハンチントン病などの神経変性疾患の原因として考えられている、アポトーシスとは異なる神経細胞死を適切に反映したインビトロのモデルであり神経変性疾患に対し有効性を示す化合物のスクリーニングに利用可能である。
したがって、本スクリーニングは、上記のアポトーシスとは異なる神経細胞死を抑制する化合物をスクリーニングできる。さらに、スクリーニングで選択された化合物は、神経細胞の細胞死が原因となる疾患、すなわち、神経変性疾患の予防・治療剤として有用である。
本発明における神経変性疾患としては、たとえば、アルツハイマー病、虚血性脳障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、ハンチントン病および脊髄小脳変性症などの神経細胞の変性、脱落を伴なう疾患が挙げられ、好ましくは、ハンチントン病などのポリグルタミン病が挙げられ、さらに好ましくは、ハンチントン病が挙げられる。
【００１２】
本発明における大脳皮質初代培養神経細胞は、たとえば、ヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物から得られ、好ましくは、ラット、より好ましくは、ラット胎仔から得られる。
大脳皮質神経細胞の初代培養は、たとえば、公知の方法に準じて行えばよい［実験医学別冊  バイオマニュアルＵＰシリーズ  分子生物学研究のための新培養細胞実験法、第２版、第８１〜８７頁］。具体的には、以下の手順で実施すればよい。
ラットは、数日間の馴化飼育を行ってから使用するのが好ましい。健康状態の良好な妊娠ラットの子宮から胎仔を切り離し、胎仔から全脳を摘出する。摘出した全脳は、氷冷した培地に浸漬する。浸漬した全脳から大脳半球を切り離し、さらに海馬および線条体を取り除いて調製した大脳皮質を培地に入れる。その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、酵素反応により細胞を分散する。使用する酵素反応溶液としては、トリプシン溶液が好ましく、反応条件としては、３０〜４０℃、好ましくは、３６〜３８℃で５〜６０分間、好ましくは、１５〜２５分間の反応を行えばよい。牛胎児血清（ＦＣＳ）などを添加し、酵素反応を止めた後、たとえば、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）を加えピペットで分散する。これをナイロンメッシュなどで組織片や細胞凝集塊を除去し、細胞を回収する。回収した細胞は、血球計算盤で生細胞密度を算出し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地などに懸濁して培養プレートあるいは培養ディッシュに捲けばよい。この際、播種する細胞密度は、およそ１．０×１０５〜２．５×１０５個／ｃｍ２が好ましい。播種後は、５％二酸化炭素、３６〜３８℃の条件で培養すればよい。
【００１３】
上記の培養で混入するアストロサイト、ミクログリアなどのグリア細胞は、たとえば、アラビノシルシトシンなどの増殖阻害剤の添加により除くことができる。具体的には、アラビノシルシトシンであれば、最終濃度４μｍｏｌ／Ｌとなるよう調製して添加すればよい。
【００１４】
変異ハンチンチン遺伝子の取得方法しては、たとえば、以下の方法が挙げられる。
ハンチンチンは、ヒト、マウスなどのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が既に報告されている［ヒトハンチンチン／ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第６９巻、第７２頁−第８５頁（２０００年）；  ＧｅｎＢａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号  ＡＢ０１６７９４］［ヒトハンチンチン・エクソン１／ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２０巻、第２７頁−第３８頁（１９９４年）；  ＧｅｎＢａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号  Ｌ２７３５０］、［マウスハンチンチン／ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第１０巻、第１０４頁−第１１０頁（１９９５年）；  ＧｅｎＢａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号  Ｕ２４２３３］。
これらの配列情報をもとに、常法により、同種または異種由来のハンチンチン遺伝子の相同遺伝子およびその遺伝子産物を取得することができる。具体的には、アミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は既知であるので、それらの遺伝子やｃＤＮＡは、既知配列情報をもとに設計した合成プライマーやプローブを用い、適当なＤＮＡライブラリを利用し、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、コロニーハイブリダイゼーションおよび／またはプラークハイブリダイゼーションなどにより単離できる。なお、これらは、たとえば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｓ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）などに準じて実施すればよい。
【００１５】
変異ハンチンチン遺伝子は、ハンチンチン遺伝子のエクソン１にポリグルタミンをコードする遺伝子（たとえば、ＣＡＧトリプレットリピート）を挿入したものが望ましい。ポリグルタミンをコードする遺伝子の挿入により発現する変異ハンチンチンタンパク質のポリグルタミン数は、神経細胞死を誘発する数であればよく、好ましくは、ポリグルタミン数として３７個から１５０個が望ましい。また、さらに好ましくは、１００〜１４５個が望ましく、よりさらに好ましくは、１０５〜１１５個が望ましい。
【００１６】
神経細胞への遺伝子の導入は、エレクトロポレーションなどの物理的方法やＤＥＡＥ−デキストラン、リポソームおよびリン酸カルシウムなどを用いる化学的方法、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法などの常法が挙げられるが、好ましくは、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子導入法が挙げられる。たとえば、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子導入法において、遺伝子導入に使用するベクターは、特に限定されないが、神経細胞に顕著な毒性がなく、効率よく遺伝子を導入できるものであればよく、たとえば、ヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスおよびワクシニアウイルスなどが挙げられ、好ましくは、アデノウイルスが挙げられる。アデノウイルスを用いた感染は、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）＝１００で効率的に感染させることが好ましい。
また、変異ハンチンチンを含むウイルスベクターの調製は、公知の方法に準じて行えばよい。たとえば、「ゲノム解析実験法、中村祐介、ラボ・マニュアル、羊土社、第１９１−２００頁」や市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施できる。
【００１７】
細胞における変異ハンチンチンタンパク質の発現の有無は、変異ハンチンチンタンパク質に対する抗体を用い、ウエスタンブロッティング、他の公知の免疫測定方法などを行うことにより確認することができる。
【００１８】
本発明のスクリーニング方法において、変異ハンチンチンタンパク質を発現した細胞と被検物質とを接触させる方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上記細胞を培養中の培地に、被検物質を添加することにより、あるいは、通常の培地（すなわち、被検物質不含培地）を、予め被検物質を添加した培地に、置き換えることにより、あるいは、予め被検物質を添加した培地に、上記細胞を加えることにより、実施することができる。
【００１９】
アポトーシスとは異なる神経細胞死に対する抑制作用を検出する方法としては、たとえば、細胞傷害の度合あるいは生細胞数などを指標として評価することができる。細胞傷害の度合を指標とする場合、たとえば、一定時間細胞を培養後、培地中に漏出したＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）などの活性を測定することによるＬＤＨ法、膜損傷により溶解した死細胞を定量する５１Ｃｒ遊離法およびクリスタルバイオレットを用いて接着面より遊離した死細胞を定量する色素抽出法などが挙げられる。
生細胞数を指標とする場合は、たとえば、エリスロシンＢやアクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイドなどの色素を用いて生細胞と死細胞を染め分ける分染法、トリパンブルーなどを用いた色素排除試験などによる評価、コハク酸脱水素酵素活性を測定するＭＴＴ法やＸＴＴ法および［３Ｈ］チミジンまたは［１２５Ｉ］デオキシウリジンの取り込みによりＤＮＡ合成能を定量する生合成能測定法などが挙げられる。その他、顕微鏡などにより、細胞の変形、萎縮および／または変性などを観察し、評価することができる。
【００２０】
スクリーニングに用いる被験化合物としては特に制限はなく、どのような被験化合物であってもよく、精製された被験化合物であっても、混合物であってもかまわないが、たとえば、合成低分子化合物のライブラリー、精製タンパク質、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清などが挙げられる。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｓ．）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年））に記載の方法に準じて実施した。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に記載の方法に従って使用した。
【００２２】
実施例１  変異ハンチンチンによる神経細胞死
大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞に、２０個または１１１個のグルタミンをコードするトリプレットリピート（ＣＡＧの１８回繰り返し配列にＣＡＡＣＡＧを付加した配列およびＣＡＧの１０９回繰り返し配列にＣＡＡＣＡＧを付加した配列）を含むヒトハンチンチン遺伝子エクソン１のｃＤＮＡ（以下、それぞれＨｔｔ２０  ｃＤＮＡ、Ｈｔｔ１１１  ｃＤＮＡと呼ぶ）をアデノウイルスを用いて導入し、免疫染色によるハンチンチンの発現確認および細胞死の評価を行った。詳細は、以下の手順で実施した。
【００２３】
１．コスミドの構築
プラスミド：ｐＴＬ−１に、Ｈｔｔ２０  ｃＤＮＡ、Ｈｔｔ１１１  ｃＤＮＡのいずれかを導入したものから、制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ）処理により各々のｃＤＮＡを切り出した。その後、Ｈｔｔ２０  ｃＤＮＡ、Ｈｔｔ１１１  ｃＤＮＡは、コスミドベクター：ｐＡｘＣＡｗｔ（宝酒造社製）にサブクローニングした。コスミドベクターに挿入されたインサートの向きは、制限酵素（ＢａｍＨＩ）処理後のアガロース電気泳動により分解産物の大きさを確認することで行った。
選択されたクローンは、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ−７（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製）を用いてλファージにパッケージングし、その後、大腸菌株ＤＨ５αに感染させた。ＤＨ５αからのコスミドＤＮＡの精製は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）を使用して行った。
【００２４】
２．組換えアデノウイルスの調製
組換えアデノウイルスは、Ｈｔｔ２０  ｃＤＮＡを含むアデノウイルス（以下、Ａｄ／Ｈｔｔ２０と呼ぶ）、Ｈｔｔ１１１  ｃＤＮＡを含むアデノウイルス（以下、Ａｄ／Ｈｔｔ１１１と呼ぶ）の２種類を調製した。
組換えアデノウイルスの調製は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて以下の手順で実施した。
８μｇのコスミドＤＮＡと１０μＬのＤＮＡ−ＴＰＣを２９３細胞に同時にトランスフェクションした。トランスフェクションには、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）あるいはＣｅｌｌＰｈｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）を使用した。組換えアデノウイルスのインサートが入っていることは、制限酵素（Ｃｌａ  Ｉ）処理後のアガロース電気泳動により分解産物の大きさを確認することで行った。
【００２５】
３．大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞調製とアデノウイルスベクターの感染
（１）初代培養神経細胞の調製
大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞の調製は、以下の手順で実施した。（１−１）大脳皮質初代培養神経細胞の調製
推定胎齢１５日齢の胎仔を有するウィスター（Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ）雌性ラット（日本クレア社または日本ＳＬＣ社）を２日間馴化飼育し、胎齢１７日で健康状態の良好な妊娠ラットを実験に使用した。妊娠ラットの子宮から胎仔を切り離した後、全脳を摘出し、氷冷したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地とリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の等量混和液に浸漬した。その後、浸漬した全脳から大脳半球を切り離し、さらに大脳半球から海馬および線条体を取り除き大脳皮質を切り離した。大脳皮質は氷冷したＤＭＥＭに浸漬した。その後、ＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン（ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製）を含むＰＢＳ溶液中で、３７℃、２０分間の酵素反応を行った。牛胎児血清（ＦＣＳ）（大日本製薬社製）を５０％含むＤＭＥＭを等量加えることでトリプシン処理を止めた後、０．１ｍｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）を添加しピペッティングにより細胞を分散した。分散後の液は、７０μｍのナイロンメッシュに通すことで組織片や細胞凝集塊を除去し、その後遠心操作（１０００ｒｐｍ、１０分間）により細胞を回収した。回収した細胞は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに懸濁後遠心操作（１０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで再び懸濁した。調製した細胞懸濁液の生細胞密度（細胞懸濁液１ｍＬあたりの生細胞数）は、Ｎｅｕｂａｕｅｒ血球計算盤（エルマー（Ｅｒｍａ）社製）を用いて算出した。細胞は、組織培養１００ｍｍディッシュ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製）１枚あたり１×１０７個となる様に、また６穴の組織培養プレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製）１穴当たり１．７×１０６個となる様に、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で希釈して播種した。組織培養１００ｍｍディッシュおよび６穴の組織培養プレートは、使用前に１０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）を含む０．１５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．４）を用い、一晩、室温でコーティング処理を行った。培養は、５％二酸化炭素、３７℃の条件下で行った。
（１−２）小脳初代培養神経細胞の調製
方法は、大脳皮質初代培養神経細胞の調製方法に準ずるが、ラットは生後７日目のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ）ラット（日本クレア社または日本ＳＬＣ社）を用いた。また、ＤＭＥＭに代えて、２５ｍＭ  ＫＣｌを含むＤＭＥＭを使用した。
上記、（１−１）および（１−２）において培養で混入するアストロサイト、ミクログリアなどのグリア細胞は、播種２４時間後にアラビノシルシトシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を最終濃度４μＭ（ｍｏｌ／Ｌ）となるよう培養液に添加することで除去した。
【００２６】
（２）アデノウイルスの感染
アデノウイルスの感染は、培養３日後あるいは４日後に行った。初代培養神経細胞に組換えアデノウイルスＡｄ／Ｈｔｔ２０、Ａｄ／Ｈｔｔ１１１を感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）＝１００になるように添加し、５％二酸化炭素、３７℃の条件下で培養した。ｍ．ｏ．ｉは、アデノウイルスの力価［プラーク形成単位：ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ（ｐ．ｆ．ｕ）］／細胞数で算出した。対照として、アデノウイルス非感染細胞を調製した。
【００２７】
４．初代培養神経細胞における変異ハンチンチンタンパク質の発現
Ａｄ／Ｈｔｔ１１１を感染させた大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質が発現していることを、抗ハンチンチン抗体を用いた免疫染色により確認した。
変異ハンチンチンタンパク質の免疫染色は、以下の手順で実施した。
初代培養神経細胞が接着した組織培養プレートを０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を加え、４℃で３０分間、固定処理を行った。その後、ＰＢＳで４回洗浄した後、一次抗体と反応させた。
一次抗体は、０．５％スキムミルクを含むＰＢＳで１００倍希釈した抗ハンチンチン抗体Ｎ１８（サンタクルズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製）を用い、室温で１時間反応させた。
二次抗体は、ＰＢＳで１０００倍希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）  ４８８  ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  ＩｇＧ（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）社製）を用い、室温で３０分間反応させた。ついで、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００２８】
結果を図１に示す。
変異ハンチンチンタンパク質は、非感染細胞に発現せず（図１ａ、ｃ）、Ａｄ／Ｈｔｔ１１１感染細胞において発現していた（図１ｂ、ｄ）。さらに、変異ハンチンチンタンパク質は核に特異的に発現し、核内部には変異ハンチンチンタンパク質の封入体が観察された（図１ｂ）。この変異ハンチンチンの核内封入体は、ハンチントン病患者の神経細胞にも認められることから、本実施例のアデノウイルスが感染した大脳皮質初代培養神経細胞は、ヒトのハンチントン病と類似した病理変化を有することが示された。
【００２９】
５．細胞死の評価
細胞死の評価は、アデノウイルス感染２日後および４日後の感染細胞ならびに感染細胞と同一の個体より調製した非感染細胞を用い、以下の手順で実施した。
ラット大脳皮質または小脳由来の初代培養神経細胞が接着しているプレートは、ＰＢＳで１回洗浄後、０．４％トリパンブルー（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を加えて室温で５分間放置した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、位相差顕微鏡を用い、トリパンブルー陽生細胞（生存する神経細胞）およびトリパンブルー陰性細胞（死滅した神経細胞）の計数を行った。計数は、プレート１穴あたり１０から２０視野を観察し７００個以上の細胞を数えることで行った。また、統計処理（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）により、非感染細胞群、Ａｄ／Ｈｔｔ２０感染群およびＡｄ／Ｈｔｔ１１１感染群それぞれの各群間における有意差（有意水準：５％）を検討した。
【００３０】
結果を図２および図３に示す。
大脳皮質初代培養神経細胞にＡｄ／Ｈｔｔ１１１を感染させた場合では、感染後の経過日数とともに計数した全細胞に対する死細胞の割合が増加し、感染４日後ではＡｄ／Ｈｔｔ１１１感染群と非感染群間およびＡｄ／Ｈｔｔ１１１感染群とＡｄ／Ｈｔｔ２０感染群間に有意な差が認められた。しかし、Ａｄ／Ｈｔｔ２０感染群と非感染群における死細胞の割合は同程度であった（図２）。
大脳皮質初代培養神経細胞にＡｄ／Ｈｔｔ１１１を感染させた場合では、死細胞の割合は非感染細胞と比べて１．６倍増加しており有意な差が認められたが、小脳由来の初代培養神経細胞にＡｄ／Ｈｔｔ１１１を感染させた場合では、死細胞の割合は非感染細胞と比べて有意な差は認められなかった（図３）。
ヒトのハンチントン病においても、アポトーシスと異なる神経細胞死は小脳よりも大脳皮質において顕著に観察されることから、図２の結果は、本実施例がヒトのハンチントン病における神経細胞死を再現していることを示している。
以上より、アデノウイルスを用いて大脳皮質初代培養神経細胞に変異ハンチンチンタンパク質を発現させることで、ヒトのハンチントン病に類似したアポトーシスと異なる神経細胞死が生じることが判明した。
【００３１】
６．核の電子顕微鏡観察
核の電子顕微鏡観察は、アデノウイルス感染３日後の感染細胞および感染細胞と同一の個体より調製した非感染細胞を用い、以下の手順で実施した。
大脳皮質初代培養神経細胞が接着した組織培養プレートを０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄後、遠心操作（１７００×ｇ、３分間）により細胞を回収した。回収した細胞を１％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液に懸濁し、室温で１時間処理した。その後、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で洗浄し、１％四酸化オスミウムを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液で４℃、１時間処理した。その後、１％アガーでペレットを保持し、包埋用サイズに細切した後、エタノール系列（５０％、７０％、８０％、９０％および１００％を各１０分間、１００％は３回処理）での脱水を行った。１５分間のプロピレンオキサイド処理を２回行った後、５０％  Ｑｕｅｔｏｌ８１２（日新ＥＭ社製）／５０％プロピレンオキサイドで３０分間、１００％  Ｑｕｅｔｏｌ８１２で６０分間処理し、脱気後に１００％  Ｑｕｅｔｏｌ８１２で４８時間包埋した。包埋物より厚さ７０ｎｍの超薄切片を作製し、ホルムバール支持膜メッシュに貼り付けた。これを飽和酢酸ウランで２５分間、０．３％クエン酸鉛で３分間の処理を行い電子染色した。調製した試料は、電子顕微鏡により観察した。
【００３２】
結果を図４に示す。
Ａｄ／Ｈｔｔ１１１感染細胞の核（図右（ｂ））は、非感染細胞（正常細胞）の核（図左（ａ））にみられるクロマチンの網状構造が観察されず、変性していることが確認された。さらに、アポトーシスの特徴であるクロマチンの凝縮は、観察されなかった。これは、変異ハンチンチンによる神経細胞死はアポトーシスとは異なることを示している。
【００３３】
７．アポトーシス細胞の計数
アポトーシス細胞は、アデノウイルス感染４日後の感染細胞および感染細胞と同一の個体より調製した非感染細胞を用い、以下の手順のアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖを用いた染色により確認した。
大脳皮質初代培養神経細胞が接着した組織培養プレートを氷冷したＰＢＳで洗浄した後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄した。その後、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで２０倍希釈したアネキシンＶおよびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８Ｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）社製）を加え、室温で１５分間放置した。再度、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄後、トリパンブルー（最終濃度０．４％）で染色し、蛍光顕微鏡および位相差顕微鏡を用いて観察した。
【００３４】
結果を図５に示す。
大脳皮質初代培養神経細胞にＡｄ／Ｈｔｔ１１１を感染させた場合では、図３の結果と同様にトリパンブルー陽性の死細胞が非感染群およびＡｄ／Ｈｔｔ２０感染群に比べ増加した。しかし、アネキシン陽性およびトリパンブルー陰性のアポトーシス細胞を計数したところ、Ａｄ／Ｈｔｔ１１１感染群、Ａｄ／Ｈｔｔ２０感染群および非感染群のアポトーシス細胞の割合は同程度であった。このことは、非感染群、Ａｄ／Ｈｔｔ２０感染群およびＡｄ／Ｈｔｔ１１１感染群それぞれにおいてアポトーシス細胞は存在するが、変異ハンチンチンタンパク質により生じる神経細胞死はアポトーシスとは異なることを示している。
【００３５】
以上より、本実施例で示されるアデノウイルスを用いた変異ハンチンチンタンパク質の発現による大脳皮質初代培養神経細胞の神経細胞死は、アポトーシスとは明らかに異なることが確認された。
この大脳皮質初代培養神経細胞の神経細胞死は、ヒトのハンチントン病における神経細胞死を反映したモデルであり、被験化合物の存在下に本実験を実施することで、目的とする神経細胞死を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、アポトーシスと異なる神経細胞死を抑制する化合物を、的確に効率よくスクリーニングすることができる。また、本発明の方法によってスクリーニングされる化合物は、ハンチントン病における神経細胞死に対する治療・予防効果および他の神経変性疾患に対し、治療・予防効果が期待される。
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】大脳皮質初代培養神経細胞の蛍光顕微鏡像（図１ａ、図１ｂ）および位相差顕微鏡像（図１ｃ、図１ｄ）。
図１ａおよび図１ｃは非感染細胞、図１ｂおよび図１ｄはＡｄ／Ｈｔｔ１１１感染４日後の細胞を示す。
【図２】トリパンブルー染色により全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果のグラフ。
感染２日後および４日後の大脳皮質初代培養神経細胞において、全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果である。縦軸は計数した全細胞に対する死細胞（トリパンブルー陽性細胞）の存在比率を示す。アスタリスク（＊）は、有意差検定により有意差（ｐ＜０．０５）が認められた場合を示す。
【図３】トリパンブルー染色により全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果のグラフ。
感染４日後の大脳皮質および小脳由来の初代培養神経細胞において、全細胞数に対する死滅した細胞の存在比率を求めた結果を示す。縦軸は計数した全細胞に対する死細胞（トリパンブルー陽性細胞）の存在比率を示す。アスタリスク（＊）は、有意差検定により有意差（ｐ＜０．０５）が認められた場合を示す。
【図４】アデノウイルス感染３日後における大脳皮質初代培養神経細胞の核の電子顕微鏡像。
図中の（ａ）は、非感染細胞（正常細胞）の核を；（ｂ）は、Ａｄ／Ｈｔｔ１１１が感染した大脳皮質初代培養神経細胞の核を示す。
【図５】アポトーシス細胞を計数した結果のグラフ。
黒いカラムはトリパンブルー陽性細胞、斜線のカラムはアネキシン陽性およびトリパンブルー陰性細胞の全細胞数に対する存在比率を示す。縦軸は計数した全細胞に対する死細胞（トリパンブルー陽性細胞）の存在比率を示す。＊は、有意差検定により有意差（ｐ＜０．０５）が認められた場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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