(57)【要約】【課題】ペプチド中のリン酸化ペプチドの有無を簡便にかつ効率的に判定する方法を提供し、更にリン酸化ペプチド含有物中のリン酸化ペプチドのアミノ酸配列を簡便に且つ効率的に決定する方法を提供する。【解決手段】（１）ペプチド含有液を、ペプチド毎に分離可能な手段により分析し、分析データを取得する工程、（２）該ペプチド含有液を、鉄を主として含有し、さらに少なくともクロムを含有する合金に接触させる工程、（３）該接触後の液を、（１）と同じ方法により分析し、分析データを取得する工程及び（４）（１）の工程で取得される分析データと（３）の工程で取得される分析データとを比較する工程を含むことを特徴とするペプチド中におけるリン酸化ペプチドの有無の判定方法、及びリン酸化ペプチドのアミノ酸配列決定方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ペプチド含有液を、ペプチド毎に分離可能な手段により分析し、分析データを取得する工程、
（２）該ペプチド含有物を、鉄を主として含有し、さらに少なくともクロムを含有する合金に接触させる工程、
（３）該接触後の液を、（１）と同じ方法により分析し、分析データを取得する工程及び
（４）（１）の工程で取得される分析データと（３）の工程で取得される分析データとを比較する工程
を含むことを特徴とするペプチド中におけるリン酸化ペプチドの有無の判定方法。
【請求項２】
ペプチド毎に分離可能な手段が液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動または質量分析である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）リン酸化ペプチド含有液の質量分析を行い、質量スペクトルを取得する工程、
（２）該リン酸化ペプチド含有液を、鉄を主として含有し、さらに少なくともクロムを含有する合金に接触させる工程、
（３）該接触後の液の質量分析を行い、質量スペクトルを取得する工程、
（４）（１）の工程で取得される質量スペクトルと（３）の工程で取得される質量スペクトルを比較し、（１）で得られる質量スペクトルに存在し（３）で得られる質量スペクトルには存在しないピークを特定する工程及び
（５）該特定されたピークの質量分析を行い、そのフラグメントイオン質量スペクトルを取得し、そのアミノ酸配列を決定する工程
を含むことを特徴とするリン酸化ペプチドのアミノ酸配列決定方法。
【請求項４】
該合金が、鉄を５０％〜８７％、クロムを１３％〜３５％含有する合金である請求項１から３に記載の方法。
【請求項５】
該合金がステンレス鋼である請求項１〜４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ペプチド中におけるリン酸化ペプチドの有無の判定方法及びリン酸化ペプチドのアミノ酸配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リン酸化ペプチドの解析は生命現象において細胞内の情報伝達等の重要な制御の解明に重要である。
真核生物に由来するペプチド中のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等でリン酸化が生じるが、遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列では、リン酸化の有無やリン酸化部位の特定はできないため、リン酸化ペプチドの直接的な解析が必要となる。
複雑な混合試料からリン酸化ペプチドを特定する方法として、例えば、金属固定化アフィニティークロマトグラフィーを用いる方法（Ｆｉｃａｒｒｏら：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（２００２）３０１〜３０５貢）、特異的化学修飾による精製法（小田ら：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．１９（２００１）３７９〜３８２貢）などが知られている。
【０００３】
金属固定化アフィニティークロマトグラフィーを用いる方法では、３価の鉄イオンもしくはガリウムイオンを使用し、それをキレート担体に固定化した金属イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを用いる。この方法では３価の鉄イオンあるいはガリウムイオンにリン酸基が結合する性質を有することを利用して、ＩＭＡＣカラムにリン酸化ペプチドを結合させて精製することにより行われる。しかしながら、金属固定化担体の安定性の問題やキレート担体自身に非特異的に結合するペプチドがあり、リン酸基への特異性が十分でないという問題であった。
特異的化学修飾を用いる方法では処理工程が多く煩雑であるなどの問題がある。
【０００４】
また、リン酸化ペプチド含有試料を質量分析によりペプチド種別に分離し、該分離したペプチド全てについて質量分析を行ってフラグメントイオン質量スペクトルを取得し、全てを解析すれば各ペプチドのリン酸化の有無及びその配列を決定することは原理的に可能ではあるものの、ペプチド種が多数混じっている場合には分析及び解析に多大の労力と時間が必要となるという問題があり、簡便かつ効率的にリン酸化ペプチドを解析する方法が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決しようとする課題は、従来の問題点を解決し、ペプチド中のリン酸化ペプチドの有無を簡便にかつ効率的に判定する方法を提供し、更にリン酸化ペプチド含有物中のリン酸化ペプチドのアミノ酸配列を簡便に且つ効率的に決定する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、リン酸化ペプチドを解析する方法について鋭意研究を行った結果、リン酸化ペプチドがある種の合金に特異的に吸着されることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、（１）ペプチド含有液を、ペプチド毎に分離可能な手段により分析し、分析データを取得する工程、（２）該ペプチド含有液を、鉄を主として含有し、さらに少なくともクロムを含有する合金に接触させる工程、
（３）該接触後の液を、（１）と同じ方法により分析し、分析データを取得する工程及び（４）（１）の工程で取得される分析データと（３）の工程で取得される分析データとを比較する工程を含むことを特徴とするペプチド中におけるリン酸化ペプチドの有無の判定方法（以下、本判定方法と記す。）、及び
（１）リン酸化ペプチド含有液の質量分析を行い、質量スペクトルを取得する工程、（２）該リン酸化ペプチド含有液を、鉄を主として含有し、さらに少なくともクロムを含有する合金に接触させる工程、（３）該接触後の液の質量分析を行い、質量スペクトルを取得する工程、（４）（１）の工程で取得される質量スペクトルと（３）の工程で取得される質量スペクトルを比較し、（１）で得られる質量スペクトルに存在し（３）で得られる質量スペクトルには存在しないピークを特定する工程及び（５）該特定されたピークの質量分析を行い、そのフラグメントイオン質量スペクトルを取得し、そのアミノ酸配列を決定する工程を含むことを特徴とするリン酸化ペプチドのアミノ酸配列決定方法（以下、本決定方法と記す。）に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ペプチドとは、２個以上のα−アミノ酸がペプチド結合により結合した高分子化合物を言い、蛋白質も含む。リン酸化ペプチドとは、ペプチドを構成するセリン、スレオニン、またはチロシン残基のヒドロキシル基の少なくとも１個にリン酸がエステル結合しているペプチドを言う。
【０００８】
ペプチド含有液は、通常、１種のペプチドまたは２種以上のペプチドからなる混合物を水、酢酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、ギ酸水溶液、グリシン−塩酸水溶液等に溶解することにより調製される。ペプチド含有液におけるペプチドの濃度は使用するペプチドを分離可能な手段により変わるが、通常は０．０１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｍｇ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【０００９】
また、ペプチド含有液のｐＨは、含有されるペプチドが分解されない状態であれば特に限定されないが、どちらかといえば酸性の方が好ましく、例えばｐＨ  ２〜５が好ましく、更には好ましくは２〜３である。
【００１０】
本発明において、鉄を主として含有し、さらに少なくともクロムを含有する合金（以下、本合金と記す。）は、合金中の金属総量に対し、通常は、鉄を５０％〜８７％、クロムを１３％〜３５％含有する。本合金は、鉄及びクロムの他に、ニッケル、モリブデン、銅、ニオブ等の金属を含むものであってもよいし、かかる金属の他、炭素を含んでいてもよい。
【００１１】
本合金として、好ましくはステンレス鋼を挙げることができる。ステンレス鋼は一般に、表面に不動態皮膜を形成してさびにくさを維持する合金であり、クロムを約１２〜３２％程度含有する鉄系の合金と定義される。また、不動態皮膜は、非常に薄い鉄とクロムを含む酸化物（水酸化物）であり、その厚さは通常数十オングストロームと言われている。かかるステンレス鋼としては、例えばＳＵＳ３０４（１８％Ｃｒ、８％Ｎｉ含有）、ＳＵＳ３１６Ｌ（１８％Ｃｒ、１２％Ｎｉ、２％Ｍｏ含有）等のオーステナイト・ステンレス、ＳＵＳ４３０（１８％Ｃｒ含有）等のフェライト・ステンレス鋼、ＳＵＳ４１０（０．１％Ｃ、１３％Ｃｒ含有）等のマルテンサイト・ステンレス鋼を挙げることができ、好ましくはオーステナイト・ステンレス鋼を挙げることができ、オーステナイト・ステンレス鋼の中でもクロムを１８％以上、ニッケルを８％以上含有するものが好ましい。またＳＵＳ３０４は、これを使用した器具、材料、例えばステンレス針付きシリンジ、ステンレス粒等として広く市販されており、かかる器具、材料を使用することは、その入手性、使用時の簡便性の点でさらに好ましい。
【００１２】
本合金は、合金単独で使用することもできるし、例えば鉄、他の金属、合成樹脂等の表面を本合金で被覆した形態で使用することもできる。
【００１３】
ペプチド含有液を、ペプチド毎に分離可能な手段により分析し、分析データを取得し、該ペプチド含有液を、本合金に接触させ、該接触後の液を、上記と同じ方法により分析して分析データを取得し、本合金への接触の前後の分析データを比較することによりペプチド中におけるリン酸化ペプチドの有無を判定することができる。
【００１４】
本判別方法において、ペプチド含有液と本合金との接触は、ペプチド含有液中のペプチドと本合金とが接触できる方法であれば特に限定されない。例えば、ペプチド含有液とステンレス粉とを混合することにより接触させる方法、ステンレス製の針が付いたシリンジにペプチド含有液を該針を介して吸引することにより接触させる方法、カラムにステンレス粒子を充填し、ペプチド含有液を通過させることにより接触させる方法、ステンレス鋼微細管にペプチド含有液を通過させることにより接触させる方法等が挙げられる。
【００１５】
ペプチド含有液と本合金との接触における温度は、ペプチド含有液が液体の状態を保持でき、ペプチドが変性しない温度であれば許容できるが、通常は特に加熱または冷却を要しない室温条件で行うことができる。
【００１６】
接触時間は特に制限されず、ペプチド含有液を本合金と瞬間的に触れさせるだけでもよく、長時間接触させても良い。
【００１７】
接触後処理後、接触形態により必要であれば、本合金を除去することによりペプチド含有液を本合金と接触処理した液が得られる。
【００１８】
本判別方法おけるペプチドごとに分離可能な手段は、ペプチド含有液中のペプチド種毎に分離し得る手段であれば特に限定されないが、具体的には液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、質量分析等の分析手段が挙げられる。これらの手段は夫々が通常使用される方法によって、ペプチド含有液に含まれるペプチド種毎に分離することができる。
【００１９】
かかる手段による分析は具体的には以下のようにして行われる。
（１）質量分析手段を用いた分析
質量分析装置の種類やイオン化法は特に限定されない。例えば、イオントラップ質量分析装置や四重極−飛行時間型の質量分析装置を用いてＥＳＩイオン化法にて、あるいは、ＭＡＬＤＩイオン化法を用いた飛行時間型質量分析装置にて質量スペクトルを取得することができる。
【００２０】
（２）液体クロマトグラフィー分析手段を用いた分析
液体クロマトグラフィーの種類や検出器は特に限定されない。液体クロマトグラフィーの種類としては、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマトグラフィーなどを挙げることができ、検出器としては、例えば、ＵＶ検出器、蛍光検出器などを挙げることができる。例えば逆相クロマトグラフィーとＵＶ検出器を組み合わせて、逆相クロマトグラフィーによりペプチドを分離し、ＵＶ検出器にてクロマトグラムを取得すればよい。
【００２１】
（３）キャピラリー電気泳動分析手段を用いた分析
キャピラリー電気泳動分析も液体クロマトグラフィー分析と同様に、キャピラリー電気泳動でペプチドを分離し、ＵＶ検出器や蛍光検出器にてエレクトロフェログラムを取得すればよい。
【００２２】
（４）ポリアクリルアミド電気泳動分析手段を用いた分析
ゲルを担体としたクロマトグラフィーであるポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を使用して分離し、ペプチドを染色することで検出することができる。
【００２３】
本判定方法におけるリン酸化ペプチドの有無の判定は、ペプチド含有液を前記手段により分析して得られる分析データと、前記接触済液を同じ手段により分析して得られる分析データとを比較し、接触前液には存在し、接触後液には存在しない成分の有無を確認することにより行うことができる。
【００２４】
具体的には、分析データが液体クロマトグラフィー分析手段によって得られたクロマトグラムであれば、接触前のペプチド含有液を分析して得られたクロマトグラムには存在し、接触後液を分析して得られたクロマトグラムには存在しないピークの有無を確認することにより、かかるピークがあればリン酸化ペプチドが存在し、かかるピークが無ければ（接触前後で変化が無ければ）リン酸化ペプチドが存在しないと判定することができる。
【００２５】
キャピラリー電気泳動分析手段によって得られたエレクトロフェログラムにおいても、液体クロマトグラフィーと同様に、接触前のペプチド含有液を分析して得られたクロマトグラムには存在し、接触後液を分析して得られたエレクトロフェトグラムには存在しないピークの有無を確認することにより、かかるピークがあればリン酸化ペプチドが存在し、かかるピークが無ければ（接触前後で変化が無ければ）リン酸化ペプチドが存在しないと判定することができる。
【００２６】
ポリアクリルアミド電気泳動分析によって得られたゲルイメージの場合には、接触前のペプチド含有液を分析して得られたゲルイメージには存在し、接触後液を分析して得られたゲルイメージには存在しないバンドの有無を確認することによりリン酸化ペプチドの有無を判定することができる。
【００２７】
質量分析分析手段によって得られた質量スペクトルの場合には、接触前のペプチド含有液を分析して得られた質量スペクトルには存在し、接触後液を分析して得られた質量スペクトルには存在しないピークの有無を確認することによりリン酸化ペプチドの有無を判定することができる。
【００２８】
リン酸化ペプチド含有液の質量分析を行うことにより質量スペクトル▲１▼を取得し、該リン酸化ペプチド含有液を本合金と接触させ、該接触後の液の質量分析を行い質量スペクトル▲２▼を取得し、質量スペクトル▲１▼には存在し、質量スペクトル▲２▼には存在しないピークを特定し、該特定されたピークに対して、衝突活性化解離法などによるペプチドのフラグメントイオン質量スペクトルを取得することによってアミノ酸配列を決定することにより、リン酸化ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。
【００２９】
リン酸化ペプチド含有液の質量分析による質量スペクトル▲１▼の取得及び接触後の液の質量分析による質量スペクトル▲２▼の取得は、前記した本判定方法において使用した手段を用いて同様に行うことができる。また、リン酸化ペプチド含有液と本合金との接触は、前記した本判定方法におけるペプチド含有液と本合金との接触処理と同様の処理により行うことができる。
【００３０】
質量スペクトル▲１▼と質量スペクトル▲２▼とを比較することによる質量スペクトル▲１▼には存在し、質量スペクトル▲２▼には存在しないピークの特定も本判定方法の場合と同様に行うことができる。
【００３１】
そしてこのようにして特定されたピークはリン酸化ペプチドのピークであると判定できるので、該特定されたペプチドのフラグメントイオン質量スペクトル、例えば、衝突活性化解離スペクトル（ＭＳ／ＭＳスペクトル）を取得することにより、そのアミノ酸配列を決定することができる。
【００３２】
アミノ酸配列決定の具体的な方法としては、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９３（１９９０）に記載の方法により、ＭＳ／ＭＳスペクトル上で質量の順にたどり、その質量差からアミノ酸の特定およびその配列順序を決める方法を上げることができる。また、特定したピークはリン酸化アミノ酸を含んでいることから、その質量差がリン酸化アミノ酸の残基質量に相当する場合、これをリン酸化アミノ酸と特定することができ、アミノ酸配列中のリン酸化部位を決めることができる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）リン酸化ペプチドを含むペプチド混合物試料（ベータカゼインのトリプシン消化物）の調製
リン酸化ペプチド混合試料としてベータカゼイン（シグマ社製）のトリプシン消化物を用いた。ベータカゼイン２００μｇを１％炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．９）２００μｌに溶解し、トリプシンを４μｇ添加して、３７℃、２４時間反応させた。これによってリン酸基を持つベータカゼインはトリプシンによってリン酸化ペプチドを含むペプチド混合物試料となった。
【００３４】
（２）  リン酸化ペプチドを含むペプチド混合物水溶液の調製
上記（１）の試料のうち１μｌを、０．１％蟻酸を含有するＡｃＣＮ／水（１／１（ｖ／ｖ））溶液９９μｌと混和した。これを試料▲１▼とした。
【００３５】
（３）  本合金への接触
ステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）製のニードルを装着したガラス製シリンジを使用した。上記試料▲１▼のうち２μｌをシリンジで吸引し、シリンジ内に充填した後、別の容器内に吐き出す操作を行って２μｌの本合金と接触した試料を調製した（試料▲２▼）。
【００３６】
（４）  質量スペクトルの解析
試料▲１▼と試料▲２▼をそれぞれ、四重極−飛行時間型の質量分析装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、Ｑｔｏｆ２）を用いてＮａｎｏｓｐｒａｙイオン化法にて質量スペクトルを取得した。図１及び図２に示すように、試料▲１▼の質量スペクトルと試料▲２▼の質量スペクトルを比較すると、試料▲１▼のスペクトルで検出されたピークｍ／ｚ＝１０３１は、試料▲２▼では消失し、このピークが試料▲１▼でのみ検出されるピーク、即ちリン酸化ペプチドとして特定できた。
【００３７】
（５）  ＭＳ／ＭＳスペクトルの解析
特定したピークｍ／ｚ＝１０３１に関して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得し、アミノ酸配列を決定したところ、本ペプチドは、ベータカゼインの４８番目から６４番目のアミノ酸配列を有するペプチド（アミノ酸配列：ＦＱＳＥＥＱＱＱＴＥＥＤＥＬＱＤＫ）であり、さらに、５０番目のセリンがリン酸化されていることがわかった。
【００３８】
実施例２
（１）リン酸化ポリペプチド混合物の調製
リン酸化ポリペプチドであるベータカゼイン１００μｇ（Ｓｉｇｍａ社製）、ウシ血清アルブミン１００μｇ（Ｓｉｇｍａ社製）及びリゾチーム１００μｇ（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１％酢酸水溶液１ｍｌに溶解した。これを試料▲３▼とした。
【００３９】
（２）本合金への吸着
ステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）製の球（１／１６インチ径）を２０粒１．５ｍｌチューブに入れた。上記試料▲３▼１００μｌをチューブに入れ、室温下で該球と１０分間接触混合させた後、試料溶液のみを回収した。回収した試料を試料▲４▼とした。
【００４０】
（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）サンプル処理
上記試料▲３▼１００μｌと試料▲４▼の全量を乾固した後、それぞれ水５μｌに再溶解した。さらにサンプル処理液（第一化学薬品社製）をそれぞれ５μｌ加えて、１００℃で煮沸し、冷却して、試料▲３▼由来及び試料▲４▼由来それぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを得た。
【００４１】
（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ゲルとして１０−２０％の密度勾配のついたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品社製）を用い、トリス−グリシン泳動緩衝液中、４０ｍＡの定常電流で１時間電気泳動を行った。電気泳動終了後、ゲルを染色試薬キットＱｕｉｃｋＣＢＢ（和光純薬工業製）に３０分浸した後、水で洗った。
【００４２】
（５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果の解析
電気泳動結果（図３）を見るとＢＳＡとリゾチームは試料▲３▼と▲４▼に存在していたが、ベータカゼインは試料▲３▼にしか存在しなかった。この結果よりベータカゼインはリン酸化ペプチドであり、ＢＳＡとリゾチームはリン酸化ペプチドでないことが判定できた。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、簡便かつ効率的にリン酸化ペプチドか否かを判定でき、また、リン酸化ペプチドのアミノ酸配列及びリン酸化部位を簡便かつ効率的に決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試料▲１▼の質量スペクトルを示す図である。
【図２】試料▲２▼の質量スペクトルを示す図である。
【図３】試料▲３▼及び試料▲４▼のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動結果を示す図でる。
【符号の説明】
○：ｍ／ｚ＝１０３１のピークを示すための印である。
↓：ｍ／ｚ＝１０３１のピークが無いことを示すための印である。
【図１】
2004294378.tif 000002
【図２】
2004294378.tif 000003
【図３】
2004294378.tif 000004