(57)【要約】【課題】  酢酸菌の増殖促進機能を有する新規な遺伝子を提供すること、及び該遺伝子を含む微生物、特に酢酸菌の酢酸醗酵速度を向上させる方法、さらに酢酸醗酵速度が向上した酢酸菌を用いて、高酢酸濃度の食酢をより効率良く製造する方法を提供する。【解決手段】  酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーから、酢酸含有培地で生育に必要な時間の短縮を可能にさせる遺伝子を取得する方法により、グルコンアセトバクター属およびアセトバクター属に属する実用酢酸菌から酢酸醗酵を実用レベルで向上させる機能を有する新規な遺伝子をクローニングした。また、該遺伝子を酢酸菌に導入した形質転換株においては、エタノール存在下で形質転換株を培養した場合、酢酸醗酵速度を顕著に向上させることができた。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ１。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ１。
【請求項２】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ１をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ１。
【請求項３】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ２。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ２。
【請求項４】
下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ２をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ２。
【請求項５】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８７〜１７４３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８７〜１７４３からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８７〜１７４３の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８６〜１６３６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８６〜１６３６からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８６〜１６３６の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２、４、５、又は請求項６に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項２、４、５、又は請求項６に記載のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、増殖促進機能が増強された微生物。
【請求項１０】
微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１の記載の方法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
【請求項１３】
酢酸濃度が９〜１３％である請求項１２の記載の食酢。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来する増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、これのコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率良く製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
【０００３】
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００４】
特に、発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始し、酢酸の蓄積が確認できるようになるまでの期間、すなわち増殖誘導期と呼ばれる期間は、酢酸濃度が高くなればなるほど長くなる傾向が認められている。
【０００５】
そのため、酢酸発酵においては、高い酢酸濃度でも増殖誘導期をより短くすることが求められており、その一手段として、発酵液中にＰＱＱ（４，５−ジヒドロ−４，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｆ］キノリン−２，７，９−トリカルボン酸）を添加して増殖を促進し、いわゆる増殖誘導期を短縮する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
しかし、ＰＱＱを大量に入手することは難しく、かつ、高価であるため、工業的な規模での実施には障害がつきまとうなどの問題があったことから、酢酸菌の高濃度酢酸存在下での増殖（酢酸耐性）を促進して、いわゆる増殖誘導期を短縮できる機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（増殖促進遺伝子）をクローニングし、その増殖促進遺伝子を用いて酢酸菌を育種、改良することが試みられてきた。
【０００７】
しかし、これまでに酢酸菌の増殖促進遺伝子については、全く分離されたことがなく、このような実情から、酢酸菌の高濃度酢酸存在下での増殖（酢酸耐性）を実用レベルで促進し、増殖誘導期を短縮する機能を有するタンパク質をコードする新規な増殖促進機能を有する遺伝子の分離、及びこの増殖促進遺伝子を用いてより強い増殖機能を有する酢酸菌を育種することが望まれていた。
【０００８】
【特許文献１】特開昭６１−５８５８４号公報
【特許文献２】特開昭６０−９４８８号公報
【特許文献３】特開昭６０−９４８９号公報
【非特許文献１】「アプライド・オブ・エンバイロメト・アンド・マイクロバイオロジー（Applied of Environment and Microbiology）」，５５巻，ｐ．１７１−１７６，１９８９年
【非特許文献２】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural and Biological Chemistry）」，５２巻，ｐ．３１２５−３１２９，１９８８年
【非特許文献３】「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural and Biological Chemistry）」，４９巻，p.２０９１−２０９７，１９８５年
【非特許文献４】「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」，８７巻，ｐ.８１３０−８１３４，１９９０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のとおり、これまでに酢酸菌の増殖促進機能を遺伝子レベルで解明し、高い増殖促進機能を有する実用酢酸菌の開発に成功した例は報告されていない。
【００１０】
そこで、本発明者らは、実用レベルで高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）を向上させ、いわゆる誘導期を短縮させ得るタンパク質をコードする新規な増殖促進機能を有する遺伝子を分離すること、この増殖促進機能を有する遺伝子を用いて、より優れた増殖促進機能を有する酢酸菌を育種すること、この酢酸菌を用いてより高酢酸濃度の食酢を効率良く製造する方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖し、発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない特異的な増殖促進機能を有する遺伝子が存在するとの仮説を立て、こうした遺伝子を用いれば、従来以上に微生物の増殖促進機能を向上させることができ、さらには高濃度の酢酸を含有する食酢を従来よりも効率的に製造する方法を開発することが可能になるとの新規着想を得、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は次のとおりである。
（１）  下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ１。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ１。
（２）  下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ１をコードする遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ１。
（３）  下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ２。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ２。
（４）  下記の（Ａ）、又は（Ｂ）に示すタンパク質ＳＵＣＢ２をコードする遺伝子のＤ
ＮＡ。
（Ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ２。
（５）  下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８７〜１７４３からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８７〜１７４３からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号４８７〜１７４３の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）  下記の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）のＤＮＡからなる遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８６〜１６３６からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８６〜１６３６からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち、塩基番号３８６〜１６３６の塩基配列からなるＤＮＡの一部から作製したプローブとなりうる塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）  （２）、（４）、（５）、又は（６）に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（８）  （７）に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（９）  （２）、（４）、（５）、又は（６）に記載のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、増殖促進機能が増強された微生物。
（１０）  微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする（９）に記載の微生物。
（１１）  （９）又は（１０）に記載の微生物をアルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
（１２）  （１１）の記載の方法により得られる、酢酸を高濃度に含む食酢。
（１３）  酢酸濃度が９〜１３％である（１２）の記載の食酢。
【００１３】
本発明によれば、微生物に対して、増殖促進機能を付与し増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、増殖誘導期が顕著に短縮して、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、増殖促進機能を有する新規な遺伝子が提供され、さらに該遺伝子を用いて、高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、増殖誘導期が短縮されて、より高酢酸濃度の食酢を高効率で製造可能な育種株を取得することができ、該育種株を用いたより高酢酸濃度の食酢を高効率で製造する方法が提供できた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明者らは、酢酸菌から増殖促進機能を有する遺伝子を見出す方法について、鋭意研究を行った結果、酢酸菌の染色体ＤＮＡライブラリーを構築し、この染色体ＤＮＡライブ
ラリーを酢酸菌に形質転換し、通常寒天培地上で１％の酢酸の存在下で生育に４日必要な株を、同培地上で３日での生育を可能にする遺伝子をスクリーニングすることによって酢酸菌から増殖促進機能を有する遺伝子を分離する方法を開発した。
【００１６】
この方法によって、実際に食酢製造に用いられているグルコンアセトバクター属の酢酸菌から、実用レベルで高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）を向上させて増殖誘導期を短縮させる増殖促進機能を向上させうる新規な増殖促進機能を有する遺伝子をクローニングすることに初めて成功した。
【００１７】
得られた増殖促進機能を有する遺伝子は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索した結果、大腸菌（Escheirchia coli）で見出されているｓｕｃＢ遺伝子や枯草菌（Bacillus subtilis）のｏｄｈＢ遺伝子などによって生産される一群のタンパク質とある程度の相同性を有しており、酢酸菌のジハイドロリポアミド・スクシニルトランスフェラーゼ（ｓｕｃＢ）遺伝子であると推定された。
【００１８】
また、大腸菌のｓｕｃＢ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４６％の、また枯草菌のｏｄｈＢ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４９％の相同性であり、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、他の原核生物のｓｕｃＢ遺伝子やｏｄｈＢ遺伝子などとはある程度は似ているものの、酢酸菌に特異的な新規タンパク質（タンパク質ＳＵＣＢということもある）をコードする新規遺伝子（ｓｕｃＢ遺伝子ということもある）であることが確認された。
【００１９】
本発明において、ｓｕｃＢ遺伝子をプラスミドベクターに連結して酢酸菌に形質転換して作製した、コピー数を増幅させた形質転換株においては、顕著に酢酸耐性が向上した。さらに、エタノール存在下で通気培養した場合に、酢酸発酵能、特に増殖促進機能が著しく向上し、高濃度酢酸存在下での増殖機能（酢酸耐性）が向上し、誘導期が短縮されて、高酢酸濃度の食酢を効率的に製造できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、大腸菌などのｓｕｃＢ遺伝子とある程度の相同性を有し、且つ増殖促進機能を向上させうる機能を有する配列表の配列番号２又は４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし得る塩基配列を包含し、該塩基配列の調製要素、及び該遺伝子の構造部分を含むものである。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。
【００２２】
まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特許文献３参照）により取得する。
【００２３】
次に得られた染色体ＤＮＡから増殖促進機能を有する遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。
【００２４】
次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHIを温度７℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。
【００２５】
次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。
【００２６】
得られた組換えベクターを用いて、通常は寒天培地上で１％濃度の酢酸の存在下では増殖に４日必要な酢酸菌、例えばアセトバクター・アセチ１０２３株（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）を形質転換し、その後１％酢酸含有寒天培地に塗布し、3日間培養する。生じたコロニーを液体培地に摂取して培養し、得られる菌体からプラスミドを回収することでsucB遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができる。
【００２７】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列表の配列番号１又は配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡが挙げられるが、その内、配列番号１の塩基番号４８７〜１７４３からなる塩基配列及び配列番号３の塩基番号３８６〜１６３６からなる塩基配列はコーディング領域である。
【００２８】
配列表の配列番号1に示す塩基配列もしくは配列番号２に示すアミノ酸配列（図３：塩基番号４８７〜１７４３に対応）及び配列番号２に示す塩基配列もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列（図４：塩基番号３８６〜１６３６に対応）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ／ＰＩＲにおいてホモロジー検索したところ、大腸菌（Escheirchia coli）のｓｕｃＢ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４６％の、また枯草菌（Bacillus subtilis）のｏｄｈＢ遺伝子とはアミノ酸配列レベルで４９％の相同性を示し、タンパク質ＳｕｃＢをコードする遺伝子であることが推定されたが、いずれも５０％以下の低い相同性であり、これらの遺伝子とは異なる新規なものであることが明白であった。
【００２９】
本発明のＤＮＡはその塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として酢酸菌グルコンアセトバクター・エンタニイのゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列にに基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。
【００３０】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）製のサーマルサイクラーGene Amp PCR System 2400を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３１】
本発明の増殖促進機能を向上させうる機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ１又はＳＵＣＢ２をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の増殖促進機能を向上させうる機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された、あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであっても良い。
【００３２】
このような増殖促進機能を向上させうる機能を有するタンパク質ＳＵＣＢ１又はＳＵＣＢ２と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００３３】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることも可能である。
【００３４】
具体的には、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基配列番号４８７〜１７４３からなる塩基配列と相補的な塩基配列又は塩基配列番号４８７〜１７４３からなる塩基配列の一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、増殖促進を増強する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいうストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００３５】
（２）本発明の酢酸菌
本発明の酢酸菌はアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属の細菌を指し、増殖促進機能が増強されたアセトバクター属細菌及びグルコンアセトバクター属細菌である。
【００３６】
アセトバクター属の細菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株  （特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７として寄託）が例示される。
【００３７】
また、グルコンアセトバクター属の細菌としては、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、現在特許生物寄託センターにＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託されているアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株が例示される。
【００３８】
増殖促進機能の増強は、例えば増殖促進機能を有する遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、又は、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌を形質転換することによって増強することができる。
【００３９】
また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなど、酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても増殖促進機能を増強することができる。
【００４０】
該遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。
【００４１】
マルチコピーベクターとしては、ｐＭＶ２４（例えば、非特許文献１参照。）やｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特許文献２参照。）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１（例えば、非特許文献２参照。）も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などが挙げられる。
【００４２】
アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌へのＤＮＡの導入は、塩化カルシュウム法（例えば、非特許文献３参照）やエレクトロポレーション法（非特許文献４参照）等によって行うことができる。
【００４３】
形質転換体は少なくとも配列表の配列番号1又は３に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでなる組換えベクターであって、例えば、酢酸菌−大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＭＶ２４にこのＤＮＡ断片を挿入してなる組換えベクターｐSUCB1及び／又はｐSUCB2をアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）Ｎｏ．１０２３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）に導入することによりえられる。
【００４４】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において、上記のようにしてその増殖促進機能を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。
【００４５】
（３）食酢製造法
上記のようにして、増殖促進機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより増殖促進機能が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であってアルコール酸化能を有するものを、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。
【００４６】
本発明の製造法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行なえば良い。酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でも良い。
【００４７】
炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。
【００４８】
また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸が蓄積する。この方法による食酢の酢酸濃度は９〜１３％である。
【００４９】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）グルコンアセトバクター・エンタニイからの増殖促進機能を有する遺伝子の
クローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特許文献３参照。）により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００５１】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＭＶ２４を制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で完全消化して、切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製）を用いて連結してグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを構築した。
【００５２】
（２）増殖促進機能を有する遺伝子のクローニング
上記のようにして得られたグルコンアセトバクター・エンタニイの染色体ＤＮＡライブラリーを、通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要なアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株に形質転換し、１％酢酸、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＰＧ寒天培地にて、３０℃で３日間培養した。
【００５３】
３日で生じたコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含むＹＰＧ培地に接種して培養し、得られた菌体からプラスミドを回収したところ、図１に示した約２．２ｋｂｐのＳａｕ３ＡＩ断片がクローン化されており、このプラスミドをｐＳ２と命名した。
【００５４】
このようにして通常は１％酢酸を含有する寒天培地上で増殖に４日間必要なアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株を、１％酢酸含有寒天培地において３日間で増殖を可能にする増殖促進機能を有する遺伝子断片を取得した。
【００５５】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５６】
配列番号１記載の塩基配列中には、塩基番号４８７から塩基番号１７４３にかけて、配列番号２に記載したような４１９個のアミノ酸（図５）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
【００５７】
（実施例２）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（例えば、非特許文献１参照。）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＳＵＣＢ１を作製した。ｐＳＵＣＢ１に挿入された増幅断片の概略を図１に示した。
【００５８】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１（その塩基配列を配列番号５（図７）に示す）及びプライマー２（その塩基配列を配列番号６（図８）に示す）を用いて、KOD−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００５９】
このｐＳＵＣＢ１をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献４参照。）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００６０】
選択培地上で３日で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００６１】
（２）形質転換株の増殖促進効果
上記のようにして得られたプラスミドｐＳＵＣＢ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００６２】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。
【００６３】
その結果、図３に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、増殖促進効果が確認できた。
【００６４】
（実施例３）アセトバクター・アセチからの増殖促進機能を有する遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の決定
アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２２８７）をＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて２４時間振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特許文献３参照。）により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００６５】
上記で調製したＤＮＡを鋳型にし、TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit （タカラバイオ社製）を用いて、クローニングした。
【００６６】
具体的には、アセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株で得られたＤＮＡ配列（配列表１）より、他の生物種と比較して保存性の高いと思われた領域よりプライマー３（その塩基配列を配列番号７（図９）に示す）、プライマー４（その塩基配列を配列番号８（図１０）に示す）、プライマー５（その塩基配列を配列番号９（図１１）に示す）、プライマー６（その塩基配列を配列番号１０（図１２）に示す）を合成した。次に、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株の染色体ＤＮＡを制限酵素HindIIIで完全切断し、これを鋳型にし、プライマー３、４または、プライマー５、６を用いてＰＣＲを行ない、それぞれ約２ｋｂｐのアミノ末端側断片、約１ｋｂｐのカルボキシル基末端側断片を取得した。
【００６７】
これらの断片の塩基配列を、上記プライマーを用いてサンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号３に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行なった。
【００６８】
（実施例４）アセトバクター・アセチ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにして塩基配列が決定されたアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２８７）由来の増殖促進機能を有する遺伝子を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＭＶ２４（例えば、非特許文献１参照。）の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＳＵＣＢ２を作製した。ｐＳＵＣＢ２に挿入された増幅断片の概略を図２に示した。
【００６９】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アセチNo．１０２３株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー７（その塩基配列を配列番号１１（図１３）に示す）及びプライマー８（その塩基配列を配列番号１２（図１４）に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、下記するＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
すなわち、ＰＣＲ法は９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １分を１サイクルとして、３０サイクル実施した。
【００７０】
このｐＳＵＣＢ２をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、非特許文献４参照。）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。
【００７１】
選択培地上で３日で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００７２】
（２）形質転換株の増殖促進効果
上記のようにして得られたプラスミドｐＳＵＣＢ２を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育を、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを導入した元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と比較した。
【００７３】
具体的には、酢酸３％、エタノール３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１００ｍｌのＹＰＧ培地にて、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定することで比較した。その結果、図４に示すように、形質転換株では３％酢酸と３％エタノールを添加した培地でも増殖が可能であったのに対して、元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株は増殖できないことが確認でき、増殖促進効果が確認できた。
【００７４】
（実施例５）グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株の酢酸発酵試験
実施例２で得られたプラスミドｐＳＵＣＢ１を有するアンピシリン耐性の形質転換株について、シャトルベクターｐＭＶ２４のみを有する元株アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株と酢酸発酵能を比較した。
【００７５】
具体的には、５Ｌのミニジャー（三ツワ理化学工業社製；ＫＭＪ−５Ａ）を用いて、酢酸１％、エタノール４％、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む２．５ＬのＹＰＧ培地に
て、３０℃、４００ｒｐｍ、０．２０ｖｖｍの通気攪拌培養を行ない、酢酸濃度３％まで発酵させた。その後、７００ｍＬの培養液をミニジャー中に残して培養液を取り出し、残った７００ｍｌに対して酢酸、エタノール、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含む１．８ＬのＹＰＧ培地を添加して、酢酸３％、エタノール４％の濃度に調整し、再び酢酸発酵を開始させ、途中培地中のエタノール濃度が１％を維持するようににエタノールを添加しつつ通気攪拌培養を継続して、形質転換株と元株の酢酸発酵能を比較した。その結果を表１にまとめた。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
表１の結果から、形質転換株の方が、増殖誘導期が顕著に短縮され、効率的に酢酸発酵を行えることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の遺伝子断片（ｐＳ２）の制限酵素地図等の概略図である。
【図２】アセトバクター・アセチ由来の遺伝子断片の制限酵素地図等の概略図である。
【図３】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のジハイドロポリアミド・スクシニイルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。
【図４】アセトバクター・アセチ由来のジハイドロポリアミド・スクシニイルトランスフェラーゼ遺伝子のコピー数を増幅した形質転換株の培養経過を示す図である。
【図５】グルコンアセトバクター・エンタニイ由来のジハイドロポリアミド・スクシニイルトランスフェラーゼ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図６】アセトバクター・アセチ由来のジハイドロポリアミド・スクシニイルトランスフェラーゼ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図７】プライマー１の塩基配列を示す図である。
【図８】プライマー２の塩基配列を示す図である。
【図９】プライマー３の塩基配列を示す図である。
【図１０】プライマー４の塩基配列を示す図である。
【図１１】プライマー５の塩基配列を示す図である。
【図１２】プライマー６の塩基配列を示す図である。
【図１３】プライマー７の塩基配列を示す図である。
【図１４】プライマー８の塩基配列を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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