(57)【要約】【課題】従来の回転モーター分子とは特性の異なった新しい回転モーター分子を提供する。【解決手段】ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶｏ部分を構成するＧサブユニット、Ｉサブユニット、Ｌサブユニット、Ｅサブユニット、ＣサブユニットおよびＶ１部分を構成するＡサブユニット、Ｂサブユニット、Ｄサブユニットを有する複合体分子であって、ＡＴＰ存在下で回転運動することを特徴とする回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶｏ部分を構成するＧサブユニット、Ｉサブユニット、Ｌサブユニット、Ｅサブユニット、ＣサブユニットおよびＶ１部分を構成するＡサブユニット、Ｂサブユニット、Ｄサブユニットを有する複合体分子であって、ＡＴＰ存在下で回転運動することを特徴とする回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項２】
耐熱性を有する請求項１の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項３】
好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である請求項２の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項４】
Ｇサブユニットに相当する配列番号２のポリペプチド、Ｉサブユニットに相当する配列番号３のポリペプチド、Ｌサブユニットに相当する配列番号４のポリペプチド、Ｅサブユニットに相当する配列番号５のポリペプチド、Ｃサブユニットに相当する配列番号６のポリペプチド、Ａサブユニットに相当する配列番号８のポリペプチド、Ｂサブユニットに相当する配列番号９のポリペプチドおよびＤサブユニットに相当する配列番号１０のポリペプチドを有する複合体である請求項３の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項５】
配列番号８における第２３２番目Ｓｅｒ残基のＡｌａ残基への置換、および第２３５番目Ｔｈｒ残基のＳｅｒ残基への置換の少なくとも一方を有する請求項４の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項６】
ＡサブユニットおよびＢサブユニットの少なくとも一方が基板上に固定されている請求項１から５のいずれかの回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項７】
ＡサブユニットのＮ端に結合したＨｉｓタグを介して基板上に固定されている請求項６の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項８】
Ｌサブユニットにジョイント部材が結合している請求項１から７のいずれかの回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【請求項９】
配列番号４における第２２番目のＧｌｕ残基を置換したＣｙｓ残基にジョイント部材を結合している請求項８の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、マイクロマシンやナノマシンの駆動部（ナノアクチュエータ）等として有用な新規回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
分子サイズの大きさで機械的な動きをするマイクロマシンやナノマシンの開発が注目されている。このようなマイクロマシンやナノマシンは、例えば、分子コンピューターの配線を加工する分子ロボットや体内で治療作業を行う医療用ロボットとして有望視されているからである。
【０００３】
マイクロマシンやナノマシンを作成するためには、個々の要素デバイス（センサ、アクチュエータ、ミニチュア機械）や、それらの組立方法（マイクロマシニングやナノマシニング）に至るまで、様々な技術開発が必要とされている。特に、マイクロマシン駆動部であるマイクロアクチュエータやナノアクチュエータ（回転モーター）の開発は、マシンの自律運動にとって不可欠であり、様々な微細加工技術を利用したモーターデバイスの開発が進められている。しかしながら微細加工技術を応用した方法で作成できるマイクロアクチュエータは、小さいものでも１００μｍ程度であり、マイクロマシンやナノマシンに装備するには、モーター装置の更なる微小化が求められている。
【０００４】
そこで、微細加工技術によってモーターを構築するのではなく、回転運動能を有する単一分子をモーターとして利用することが提案されている。
【０００５】
一般に、モーターとして利用できる分子は、外部エネルギーを回転運動に変換する動力機構があること、および１方向の回転を実現できることの２点を満たすことが求められている。そして、このような条件を満たす低分子有機化合物としては、例えば（３Ｒ，３’Ｒ）−（Ｐ，Ｐ）−ｔｒａｎｓ−１，１’，２，２’，３，３’，４，４’−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−３，３’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４，４’−ｂｉｐｈｅａｎｔｈｒｙｄｉｅｎｅ（非特許文献１）とＴｒｉｐｔｙｃｙｌ（４）ｈｅｌｉｃｅｎｅ（非特許文献２）が知られている。前者は、炭素−炭素二重結合を挟んで左右対称的な形を持っているが、立体的な込み合いのためねじれた構造となっている。これに適当な熱や光を加えると４つのプロセスを経て１方向に回転させることができる。また２回の光反応と熱異性化反応で１サイクルを完了し、１方向のみに進行する。すなわち、この有機化合物は、熱異性化反応と光反応とによって回転運動を行う。光反応による回転は非常に速い（ピコセカンドのレベル）が、熱異性化反応による回転には数分以上かかるため、実用化に適していない。また、駆動力が極めて弱いという問題点を有してもいる。一方、後者はフォスゲン付加反応とウレタン結合形成、開裂という化学反応を利用して分子の一方向の回転を示す。しかしながら、この分子は繰り返し回転ができないという、アクチュエータとしての致命的な欠陥を有している。
【０００６】
一方、マイクロマシンやナノマシン等に利用可能な単一分子モーターとしては、鞭毛モーター（非特許文献３、４）、ＡＴＰ合成酵素（非特許文献５）、ミオシンモーター（非特許文献６、７）、微小管系モーター（非特許文献８）、核酸合成酵素の運動タンパク質（非特許文献９）等の生体分子も知られている。
【０００７】
このうち、ＡＴＰ合成酵素は、真核生物のミトコンドリア内膜、葉緑体のチラコイド膜、原核細胞膜などに普遍的に存在する膜タンパク質であり、細胞の消費するＡＴＰの大部分を合成している。ＡＴＰ合成酵素（ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素）は分子量約５０万にも及ぶ巨大膜タンパク質複合体であり、膜中に存在するＦｏ部分と膜の外に存在するＦ１部分からなる。Ｆｏ部分は膜をプロトン（Ｈ＋）が通過するために通り道になっており、Ｆ１部分にはＡＴＰを合成／加水分解する触媒部位がある。Ｆ１部分の分子量は約３８万であり、例えばバクテリア由来のＡＴＰ合成酵素におけるＦ１部分のサブユニット組成はα３β３δγ１ε１である。αとβサブユニットはどちらにも似たようなＡＴＰ結合部位を有するが、触媒活性はβサブユニットにある。両者は交互に並んでリングを形成しており、このα３β３リングの中心部にγサブユニットが存在している。δサブユニットはα３β３リングの頂上に結合し、ＡＴＰ加水分解活性を制御しているεサブユニットはγサブユニットに結合している。一方、Ｆｏ部分は分子量約１０万であり、そのアミノ酸組成は、プロトンの移動に必須なグルタミン酸およびアスパラギン酸を多く含んでいる。サブユニット組成はａ１ｂ２ｃ９−１２であり、ｃサブユニットは膜の中でリング状に配列し（ｃリング）、それにａサブユニットと、膜の外に長く突き出した腕を持つｂサブユニット２個が結合している。従って、ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素は、Ｆ１部分とＦｏ部分とが、γε−ｃリング、δ−ｂ２の２箇所で結合している。さらに特筆すべきは、このＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素分子が２種類のトルク発生装置を備えている点である。一つはＦ１部分に存在するＡＴＰ駆動型装置であり、他方はＦｏ部分に存在するプロトン駆動型装置である。すなわち、Ｆｏ部分がプロトンを細胞膜内に取り込む場合にはｃリングが時計回りに回転し、プロトンを細胞膜外に排出する場合にはｃリングは反時計回りに回転する。一方、Ｆ１部分は、ＡＴＰ合成時にはそのγサブユニットがＦｏ側からみた場合に時計回りに回転し、ＡＴＰ分解時には反時計回りに回転する。そして、このような２種類のトルク発生装置を備えることによって、ＡＴＰ合成酵素が生み出すトルクは数十ピコニュウトン・ｎｍであり、分子モーターとしての十分な駆動力を有している。また水系で作動するため体内でのアクチュエータとして最適であり、アクチンを充分に動かす力があるために生体内の蛋白質、糖質、脂質、核酸を操作することも可能である。
【０００８】
そしてこの出願の発明者らは、このＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素分子を改良して、広範な回転速度の制御が可能な改変型ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素分子とその利用発明を既に発明し、特許出願している（特願２００２−１４８２３２：出願日２００２年５月２２日）。また、最近になって、Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素分子に亜鉛結合部位を導入し、亜鉛によって回転の開始・停止を制御することのできる回転モーター分子が報告されてもいる（非特許文献１０）。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１５２−１５５，  １９９９
【非特許文献２】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：１５０−１５２，  １９９９
【非特許文献３】
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６：１−１８，  １９６７
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ  ２４５：３８０−３８２，  １９７３
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９９−３０２，  １９９７
【非特許文献６】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  １９９：１０５７−１０６３，  １９９４
【非特許文献７】
Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７：  ８９−９３，  １９９５
【非特許文献８】
Ｃｅｌｌ  ４２：３９−５０，  １９８５
【非特許文献９】
Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  １１３−１１９，  ２００１
【非特許文献１０】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １：１７３−１７７，  ２００２
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、様々な回転モーター分子がマイクロマシンやナノマシン等の駆動部材として提案されており、回転の形態や回転数、トルク、回転の制御方法等においてそれぞれに特徴を有している。従って、実際にマイクロマシンやナノマシンを作成するためには、その用途やマシン構成に応じて多くの候補分子から適切なものを選択する必要がある。しかしながら、これまでに報告されている回転モーター分子のそれぞれは、マイクロマシンやナノマシンの他種多様な用途や構成の全てに対応可能であるとは言い難い。そのため、マイクロマシンやナノマシン等の開発に当たっては、回転モーター分子のラインナップを一つでも多く充実させることが望まれている。
【００１１】
従って、この出願は、従来の回転モーター分子とは特性の異なった新しい回転モーター分子を提供することを課題としている。
【００１２】
またこの出願は、その回転運動をさらに円滑なものにするために、さらには回転運動の伝達手段等を分子に付加するために改良された新規回転モーター分子を提供することを課題としてもいる。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶｏ部分を構成するＧサブユニット、Ｉサブユニット、Ｌサブユニット、Ｅサブユニット、ＣサブユニットおよびＶ１部分を構成するＡサブユニット、Ｂサブユニット、Ｄサブユニットを有する複合体分子であって、ＡＴＰ存在下で回転運動することを特徴とする回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを提供する。
【００１４】
この発明のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、Ｖｏ部分とＶ１部分との２つの部位から構成されている。Ｖｏ部分は、プロテオリピッドとも呼ばれるＬサブユニットを含み、２つの膜貫通へリックスからなり、リング構造を形成する。また、膜蛋白質であるＩサブユニットを含み、Ｌサブユニットと相互作用しプロトン輸送に重要な役割を果たしている。なお、このＩサブユニットは、酵母のＶｐｈｌｐとホモログである。Ｖ１部分は、触媒部位のＡサブユニットを含み、ＡとＢサブユニットは交互に配列し、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰａｓｅのα３β３のように六量体の円筒を形成するものであって、ＤサブユニットはＡ３Ｂ３の円筒の中央の空洞を埋めており、Ｆサブユニットは、Ｄサブユニットに結合しており、ＤサブユニットとＦサブユニットは、回転子（回転シャフト、回転軸）として働く。
【００１５】
この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、耐熱性分子であることを一つの態様としており、その場合に好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の分子であることを好ましい態様としている。
【００１６】
さらにこの好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、Ｇサブユニットに相当する配列番号２のポリペプチド、Ｉサブユニットに相当する配列番号３のポリペプチドおよびＬサブユニットに相当する配列番号４のポリペプチド、Ｅサブユニットに相当する配列番号５のポリペプチド、Ｃサブユニットに相当する配列番号６のポリペプチド、Ａサブユニットに相当する配列番号８のポリペプチド、Ｂサブユニットに相当する配列番号９のポリペプチドおよびＤサブユニットに相当する配列番号１０のポリペプチドを有する複合体であることを一つの好ましい態様としている。
【００１７】
さらにこの発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、配列番号８における第２３２番目Ｓｅｒ残基のＡｌａ残基への置換、および第２３５番目Ｔｈｒ残基のＳｅｒ残基への置換の少なくとも一方を有する改変型分子であることを別の態様としている。
【００１８】
この改変されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、触媒部位であるＡサブユニットを改変することによりＭｇＡＤＰ阻害が解消され、ＡＴＰ加水分解活性が亢進する。すなわち野生型ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅはＭｇＡＤＰ阻害によって回転した抑制される傾向にあるが、ＭｇＡＤＰ阻害が解消された変異型ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、効率よい回転運動を示す。
【００１９】
またさらに、この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの少なくとも一方が基板上に固定されている改変型分子であることを別の態様としている。そしてこの場合には、ＡサブユニットのＮ端に結合したＨｉｓタグを介して基板上に固定されていることを好ましい態様としている。
【００２０】
この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅはまた、Ｌサブユニットにジョイント部材が結合していることを別の態様としている。そしてこの場合には、配列番号４における第２２番目Ｇｌｕ残基を置換したＣｙｓ残基にジョイント部材を結合していることを好ましい態様としている。
【００２１】
すなわち、この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、細菌や真核生物のオルガネラ（液胞、リソソーム、ゴルジ体、細胞膜、被覆小胞、分泌顆粒等）に存在するＶ型（液胞膜型）ＡＴＰａｓｅ（ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ）の、Ｖｏ部分（Ｃサブユニット、Ｅサブユニット、Ｇサブユニット、Ｉサブユニット、Ｌサブユニットからなる複合体）およびＶ１部分（Ａサブユニット、Ｂサブユニット、Ｄサブユニットからなる複合体）である。従来、ＦｏＦ１−ＡＴＰ合成酵素が回転モーター分子として機能することは知られていたが、この発明のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、Ｖｏ部分におけるリング構造を形成するプロテオリピッドであるＬサブユニットが、ＡＴＰ依存的回転シャフトとして機能することを初めて可視化および見出して完成されたものに基づいてなされたものである。
【００２２】
なお、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶｏ部分は、ＩサブユニットやＣサブユニットが会合しており、さらにはＩサブユニットにはＥサブユニットやＧサブユニットが会合されており、これらサブユニットを結合した分子も包含する。Ｖ１部分においても、ＤサブユニットにＦサブユニットを結合しているが、この発明のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅはこのＦサブユニットを結合した分子をも包含する。また、この発明のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは野性型だけでなく、前記のとおりの各種変異体をも包含する。さらに、前記の非特許文献１０に開示されているような亜鉛認識部位の導入変異体をも包含する。
【００２３】
以下、発明の実施形態を示し、前記各発明について詳しく説明するが、この発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等の記載を参考にすることができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、各種細菌や真核生物が産生するＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＶｏ部分およびＶ１部分であり、このＶｏ部分およびＶ１部分をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片。好ましくはｃＤＮＡ断片。以下「ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチド」と記載することがある）を用いて遺伝子工学的に製造することができる。すなわち、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅをコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ断片）の配列は公知のデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋデータベース：ＵＲＬ：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ等）において多数公開されており、これらの配列情報を利用したプローブハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によって既存のｃＤＮＡライブラリー等から容易に取得することができる。
【００２５】
そして、このＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを公知の遺伝子工学的方法で発現させることによって、Ａサブユニット、Ｂサブユニット、ＤサブユニットおよびＬサブユニットからなる複合体ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを取得することができる。例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する発現ベクターにＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを組換え、この組換えベクターをプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、回転能を有するＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。また、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを適当な宿主−ベクター系において発現させれば、回転モーターＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などで生産することができる。例えば、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターにポリヌクレオチドを組換えて発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養すれば、その培養物から目的のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ分子を大量生産することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。さらに、ポリヌクレオチドを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドをプロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクターをトランスフェクトした真核細胞から目的のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ分子を得ることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、ヒト胎児腎臓細胞ＨＥＫ２９３、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、あるいはヒト臓器から単離した初代培養細胞などが使用できる。出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞なども使用できる。発現ベクターを細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。形質転換細胞で発現させたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆���クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２６】
またこのこの発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、工業的な利用の観点から、耐熱性分子であることが好ましい。従って、６５℃以上で生育するＴｈｅｒｍｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属やＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属等の細菌由来のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを使用することが好ましい。さらに、７０℃以上でも生育することができる好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドを使用することが特に好ましい。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドは配列番号１に示した塩基配列を有している。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｇサブユニット）、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｉサブユニット）、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｌサブユニット）、配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｅサブユニット）、配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｃサブユニット）、配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｆサブユニット）、配列番号８のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ａサブユニット）、配列番号９のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｂサブユニット）および配列番号１０のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｄサブユニット）をコードしている。従って、配列番号１の１−１１０６４  ｎｔ配列を前記の遺伝子工学的方法により発現させることにより、Ｖｏ部分を構成するＣサブユニット、Ｅサブユニット、Ｇサブユニット、Ｉサブユニット、ＬサブユニットおよびＶ１部分を構成するＡサブユニット、Ｂサブユニット、Ｄサブユニット、Ｆサブユニットからなる耐熱性ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを得ることができる。
【００２７】
この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのさらに別の好ましい態様は、配列番号８における第２３２番目Ｓｅｒ残基のＡｌａ残基への置換、および第２３５番目Ｔｈｒ残基のＳｅｒ残基への置換の少なくとも一方、さらに好ましくはこれらの置換の両方を有する改変型分子（以下、両方の置換を有する分子を「ＴＳＳＡ変異体」と記載することがある）である。すなわち、真核細胞のＶ−ＡＴＰａｓｅと異なり、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の細菌由来のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは触媒の代謝回転の間、いわゆるＭｇＡＤＰ阻害によって反応が中断するという傾向を有しており（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  ２０５０４−２０５１０，  １９９８）、通常はＡＴＰを基質として加えてから５分以内にこのＡＤＰ抑制を示し、約１０分間でＡＴＰ加水分解を停止する。そこでこの出願の発明者らは幾つかの変異体を作成してＡＤＰ抑制の効果を検討した結果、前記のＴＳＳＡ変異体が、ＡＴＰを基質として加えてから１時間もＡＴＰ活性を持続させることを見出した。
【００２８】
この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのさらにまた別の好ましい態様は、ＡサブユニットまたはＢサブユニットの少なくとも一方が基板上に固定されている改変型分子である。すなわち、この固定によって、Ｌサブユニットの回転を効率よく伝達することが可能となる。このようなＡおよび／またはＢサブユニットの基板への結合は、例えば共有結合を用いた各種の方法によって行うことができるが、好ましくは、ＡサブユニットのＮ端にＨｉｓタグ（ヘクタヒスチジン）を結合させ、このＨｉｓタグをＮｉ−ＮＴＡスライドに結合する方法（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９９−３０２，  １９９７；  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７０：２４４−２４８，  ２０００）を採用することができる。
【００２９】
この発明の回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅはまた、Ｌサブユニットにジョイント部材が結合していることを別の好ましい態様としている。この場合の「ジョイント部材」とは、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅにおけるＬサブユニットの回転運動を他の部材（例えば、ギアや運動機関のシャフト等）に伝達するための部材である。またこのジョイント部材は他の部材との連結用としてではなく、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転を観察するための「プローブ」、あるいは「プロペラ」としても利用することができる。このようなジョイント部材としては、例えば後記実施例に例示したようなビーズを複数個連結したもの（マイクロスフェア）や、あるいはアクチンフィラメント（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６：２９９−３０２，  １９９７）等の微細繊維を利用することができる。そして、このようなジョイント部材は、ＬサブユニットのＣｙｓ残基に、例えばマレイミド、ジスルフィド結合等によって結合することができる。
【００３０】
なお、前記の各変異体ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅは、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸残基をコードするトリプレットを、ミューテーション・キット等を使用する方法、変異導入型のＰＣＲ法、ポリヌクレオチド合成法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０−３４４４，  １９９７等）によって置換し、この変異型ポリヌクレオチドを遺伝子工学的方法によって発現させることによって取得することができる。
【００３１】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
１．  材料と方法
１−１．  ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ変異体の調整および精製
好熱菌Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ変異体（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／Ｌ−Ｅ２２Ｃ）は、インテグレーションベクターシステムを用いて作製した。ＰｙｒＥ遺伝子カセットを保有するｐＵＴｐｙｒＥは以下のとおりに作製した。すなわち：
（１）ＰＴ８ｌｅｕＢのｌｅｕＢを含むＸｂａ  Ｉ−ＥｃｏＲ  ＩフラグメントをｐＵＣ１１９にクローニン  グし、Ｎｄｅ  Ｉ−ＥｃｏＲ  ＩフラグメントをｐＩＮＶのｐｙｒＥ遺伝子カセットを含むＮｄ      ｅ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉフラグメントに置換した。
（２）ａｔｐＡ遺伝子の上流１５５０ｂｐに対応する配列を、ｐＵＴｐｙｒＥのＳｐｈ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉサ    イトにクローニングした。
（３）Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列がある変異体ａｔｐＡ遺伝子（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／      Ａ−Ｔ２３５Ｓ）をｐＵＴｐｙｒＥのＥｃｏＲ  Ｖ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉサイトにクローニングした。
なお、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｐｙｒＥ株（ＴＴＹ１）を、公知文献の宿主として用いた（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９９９  Ａｐｒ  １５；１７３（２）：４３１−７）。
【００３３】
形質転換体は、ウラシルを含まない最少培地プレートにて選択され、その後、ＬサブユニットにＣｙｓ残基を導入するため、別のインテグレーションベクターを調製した。すなわち：
（１）ａｔｐＧ遺伝子の終止コドンを含んだａｔｐＬ遺伝子の上流である１２８０ｂｐ領域に  対応する配列をｐＢＨＴＫ１のＳｐｈ  Ｉ−Ｓａｌ  Ｉサイトにクローニングした。
（２）Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列がある変異体ａｔｐＬ遺伝子（Ｌ−Ｅ２２Ｃ）を含む１３５０ｂｐ領  域に対応する配列を、ｐＢＨＴＫ１のＥｃｏＲ  Ｖ−ＥｃｏＲ  Ｉサイトにクローニングし    た。
（３）ａｔｐＡ変異体を含む形質転換体は、変異ａｔｐＬ遺伝子を含むプラスミドによ  る形質転換によって得られた。
（４）形質転換体は、０．１ｍＭ  カナマイシンを含む最少培地にて選択培養し、シ  ークエンサーで配列の確認を行った。
【００３４】
なお、Ｖｏ部分のＣ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｌの各サブユニットをコードするＤＮＡ配列およびＶ１部分のＡ、Ｂ、Ｄ、Ｆの各サブユニットをコードするＤＮＡ配列には、以下の変異体作成のための改変を加えた（アミノ酸位置は配列番号２−１０に対応する）。
・ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／Ｌ−Ｅ２２Ｃ）
（１）  ＡサブユニットのＮ端にＨｉｓタグを結合（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ）
（２）  Ａサブユニットの第２３２番目ＳｅｒがＡｌａに置換（Ａ−Ｓ２３２Ａ）
（３）  Ａサブユニットの第２３５番目ＴｈｒがＳｅｒに置換（Ａ−Ｔ２３５Ｓ）
（４）  Ｌサブユニットの第２２番目ＧｌｕがＣｙｓに置換（Ｌ−Ｅ２２Ｃ）
形質転換細胞をｌｏｇ−ｐｈａｓｅ（２００ｇ）まで増殖させた後、集菌し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に懸濁してソニケーション破砕した。膜画分を１００Ｋ×ｇ、６０分間の遠心によって集め、同じ緩衝液２００ｍｌで洗浄した。次に、２０ｍＭ  Ｎａ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０％  ｏｃｔａｅｔｈｙｌｅｎ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｏｎｏｄｏｄｅｃｙｌｅｔｈｅｒ（Ｃ１２Ｅ８）を含有した緩衝液に懸濁し、再度ソニケーションを行った。菌体の残骸等を除去した後、このサンプルを２０ｍＭ  Ｎａ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％  Ｃ１２Ｅ８を含有する緩衝液で平衡化したＮｉ２＋−ＮＴＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  カラム（ＱＩＡＧＥＮ：３×１０ｃｍ）に供し、カラムを洗浄して、２０−１００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅのリニア勾配によって溶出した。このＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの画分を集め、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび０．０５％  Ｃ１２Ｅ８を含有した緩衝液に３時間、透析を行った。透析液をＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供し、０−０．５Ｍ  ＮａＣｌリニア勾配によって溶出した。この精製過程を４℃、８時間以内で行った。この精製されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを１０モル過剰の６−［Ｎ’−［２−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］  −Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌａｍｉｄｏ］ｈｅｘｙｌ  Ｄ−ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｅ  （ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＡＣ５−ｍａｌａｉｍｉｄｅ，  Ｄｏｊｉｎｄｏ）でビオチン化した。２５℃で１５分間インキュベーションした後、タンパク質をＰＤ−１０  Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に供し、未反応試薬を除いた。Ｌサブユニットのビオチン化は、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ウエスタンブロッティングにより確認した（図２）。
１−２．  回転観察
５μｌのフローセルを、２枚のカバースリップ（５０μｍ厚のスペーサーを介在）から作成した。底のガラス表面はＮｉ２＋−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄでコートし、ビオチン化したＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ（０．１−１μＭ）を緩衝液５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、  ２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  Ｃ１２Ｅ８および０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡからなるＡ溶液と混合し、フローセルに注入し、Ｈｉｓタグをガラスに結合させることによりＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを固定した。
【００３５】
Ｎ’Ｎ’−ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣＤ）の阻害効果を確認するため、ビオチン化されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ  １μＭを、ＤＣＣＤを含んだＡ溶液に２５℃、３０分間インキュベートした。そして、０．１％（ｗ／ｖ）のＳｔｅｒｅｐｔａｖｉｄｉｎでコートしたビーズ（φ＝０．５６μｍ、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）溶液をフローセルに満たし、未結合ビーズは洗浄除去して、ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅ結合によってＬサブユニットにビーズを結合した。
【００３６】
ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ分子の回転は、所定濃度のＡＴＰ中（０．２ｍｇ／ｍｌ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  と２．５ｍＭ  ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＡＴＰ再生システム中）で、ビーズの回転を明視野顕微鏡（倍率１０００：ＩＸ７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、）を使用して観察した。また回転の状態はＣＣＤカメラでビデオ記録した。なお、このＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転観察システムは、Ｆ１−ＡＴＰａｓｅの回転システム（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，  １３６４９−５４，  ２００１）と同様である。すなわち、回転はＬサブユニットに結合したビーズにより、斜めに結合された形で観察された。
１−３．その他のアッセイ
タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。ＡＴＰ加水分解活性は、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅとｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅとをカップリングさせたＮＡＤＨ酸化により測定した。
【００３７】
ＤＣＣＤ感受性は、１μＭの酵素を２５℃で前記のＡ溶液中で反応させ、ＡＴＰａｓｅ活性を測定することによって確認した（図３Ａ）。
【００３８】
ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅによるＡＴＰ駆動のＨ＋輸送は、２５℃の条件下で、９−ａｍｉｎｏ−６−ｍｅｔｈｏｘｙａｃｒｉｄｉｎｅ（ＡＣＭＡ）の蛍光消光によって確認した。精製されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを含む再構成ベシクルは、１０μタンパク質／ｍｌの濃度にして測定した。使用した溶液には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．３μｇ／ｍｌｎＡＣＭＡが含まれている。４ｍＭ  ＡＴＰの添加によって、反応を開始し、その後、１μｇ／ｍｌ  ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｐ−ｔｒｉｆｌｕｏｒｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ−ｈｙｄｒａｚｏｎｅ（ＦＣＣＰ）を添加した（図３Ｂ）。
２．結果
２−１．回転の観察
ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ（Ａ−Ｈｉｓ８−ｔａｇｓ／Ａ−Ｓ２３２Ａ／Ａ−Ｔ２３５Ｓ／Ｌ−Ｅ２２Ｃ）の変異体について回転を観察した。この変異体のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ活性は、ＡＴＰを加えてから１０分間ほど持続した。また、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  ＭｅｎｔｅｎタイプのＫｉｎｅｔｉｃｓを示し、Ｋｍ＝４５０±８０μＭ、Ｋｃａｔ＝９．５±１ｓｅｃ−１を示した。野生型のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ活性は、Ｍｇ−ＡＤＰの阻害によって急速に落ち、活性の持続する時間は非常に短く、回転の観察が困難であった。そのため、変異体ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅでは、ＡサブユニットをＳ２３２Ａ／Ｔ２３５Ｓとし、Ｍｇ−ＡＤＰの阻害に対して抑制的な効果が得られた。
【００３９】
界面活性剤Ｃ１２Ｅ８で精製されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの活性は、ＤＣＣＤ感受性であり３０分のインキュベーションで活性を消失することが確認された。一方、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを精製した場合は、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの活性は阻害されなかった（図３Ａ）。また、このＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅはホスホリピッドリポソーム再構成されるとＡＴＰ依存性のプロトン輸送活性が確認され、ＤＣＣＤによりその活性が消失されることが確認された（図３Ｂ）。
２−２．Ｌサブユニットの回転
ＡＴＰを含む緩衝液をフローセルに注入させる場合に、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＬサブユニットに結合したビーズの回転が観察された（図４Ａ−Ｃ）。一つのフローセルでは、８−１０個の回転ビーズが観察された。
【００４０】
回転は一方向であり、Ｖ１−ＡＴＰａｓｅの回転方向と同様に、細胞膜側からみると常に反時計回りであった。ＡＴＰを含まない緩衝液中では、ブラウン運動との区別のつく一方向の回転は観察されなかった。
【００４１】
アジド（Ａｚｉｄｅ）はＦ１−ＡＴＰａｓｅのＡＴＰａｓｅ活性も回転も阻害するが（Ｎａｔｕｒｅ  ３８６，  ２９９−３０２，  １９９７）、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転は阻害されていないことが確認できた。アジド（Ａｚｉｄｅ）は４ｍＭ  ＡＴＰ存在下（図４Ｂ）や０．１ｍＭ  ＡＴＰ存在下でのＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転に影響を与えなかった。
【００４２】
４ｍＭ  ＡＴＰ存在下での平均回転数は、〜３．０  ｒｐｓ  （ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｐｅｒ  ｓｅｃ：回転数／秒）であった。１ｍＭ  ＡＴＰ存在下での平均回転数は〜２．７  ｒｐｓであった。この回転は、２秒以上の停止がなく、２０秒間の持続回転をした。１回転にＡＴＰ１分子が使用されると仮定すれば、上記の回転速度は、Ｋｃａｔ値＝〜１０ｓｅｃ−１に相当し、バルクの酵素反応速度論から観察されるＡＴＰ加水分解速度に良く一致している。また、０．２ｍＭ  ＡＴＰでは、平均回転数は低下している（図４Ｃ）。
【００４３】
ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅにＤＣＣＤを３０分間インキュベーションすることによって、回転しているビーズの個数は、未処理の場合と比較して５％台まで低下する（図５）。
【００４４】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、新規の回転モーター分子としてのＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅが提供される。また、この回転モーター分子ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのさらに実用的形態としての各種変異体ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅが提供される。これらは、マイクロマシンやナノマシン等の作成に大きく寄与する。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅの回転観察の状態を示した模式図である。矢印は回転方向を示す。
【図２】Ｌサブユニットのビオチン化を確認したウェスタンブロット分析の結果である。左側（レーン１および２）はＣＢＢ染色、右側（レーン３および４）はａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｅコンジュゲート染色である。レーン１および３はＬサブユニットがビオチン化されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ、レーン２および４は分子量マーカー（２５０、１５０、１００、７５、５０、３７、１５、１０：いずれも単位は、ＫＤａ）である。
【図３】ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅのＤＣＣＤの感受性を検討した結果である。Ａは、ＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅに対するＤＣＣＤの効果を示した。○は、Ｃ１２Ｅ８の存在下で単離・精製されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを、●は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下で単離・精製されたＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅをそれぞれ示した。Ｂは、ＡＴＰ駆動プロトン輸送に対するＤＣＣＤの効果を示した。４ｍＭ  ＡＴＰおよび１μｇ／ｍｌ  ＦＣＣＰの添加のタイミングは、矢印で示した。レーン１ではＤＣＣＤ未処理のＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅを、レーン２では前処理として１００ｍＭ  ＤＣＣＤで３０分間行ったＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅをそれぞれ示した。
【図４】Ｌサブユニットに固定したビーズ回転の経時変化を測定した結果である。Ａは４ｍＭ  ＡＴＰの存在下、Ｂは４ｍＭ  ＡＴＰおよび０．５  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅの存在下、Ｃは０．２ｍＭ  ＡＴＰの存在下でのそれぞれのビーズの回転の結果である。
【図５】回転に対するＤＣＣＤ効果の結果である。白抜きの棒グラフは、コントロールとしてＤＣＣＤ未処理を、黒塗りの棒グラフは、ＤＣＣＤ処理の結果をそれぞれ示した。なお、左側はＶｏＶ１−ＡＴＰａｓｅ、右側はＶ１−ＡＴＰａｓｅを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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