(57)【要約】【課題】化学発光を光電的に検出する際の時間を短縮し、再現性、定量性に優れたデータを得る。【解決手段】リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、この標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させる。生化学解析用ユニット２を載置台３に載置し、化学発光基質溶液１３を生化学解析用ユニット２に接触させる。生化学解析用ユニット２の吸着性領域４に超音波印加手段５によって超音波を印加する。印加後、吸着性領域４のそれぞれから発せられる化学発光を光ファイバ７で検出し、光電変換手段１０によって化学発光を光電的に変換してデータを得る。【選択図】          図１
2004294104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体の前記リガンドまたはレセプタに、酵素標識によって標識された酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドを特異的に結合させ、該酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドに化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、
前記化学発光を検出する際に前記吸着性領域に対し超音波を印加することを特徴とする化学発光法。
【請求項２】
リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体の前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを酵素によって標識された標識体と特異的に結合させ、該標識体に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、
前記化学発光を検出する際に前記吸着性領域に対し超音波を印加することを特徴とする化学発光法。
【請求項３】
リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体の前記リガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させ、前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、
前記化学発光を検出する際に前記吸着性領域に対し超音波を印加することを特徴とする化学発光法。
【請求項４】
リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体を保持する保持手段と、該保持手段に保持された前記支持体の吸着性領域に超音波を印加する超音波印加手段と、前記保持手段に保持された前記支持体の吸着性領域から発せられる化学発光を検出する検出手段とを備えていることを特徴とする化学発光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標識レセプタまたは標識リガンドを化学発光法（ケミカルルミネッサンス法）により検出する方法、および化学発光を検出する検出装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロアレイ解析システムやマクロアレイ解析システムにおいては、メンブレンフィルタなどの生化学解析用ユニットの表面の異なる位置に、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなど、生体由来の物質と特異的に結合可能で、かつ、塩基配列や塩基の長さ、組成、特性などが既知のリガンドまたはレセプタを含む溶液を滴下して多数の吸着性領域を形成し、放射線標識物質、蛍光物質、化学発光基質と接触させることによって化学発光を生じさせる標識物質などによって標識されたレセプタまたはリガンド（ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質）を、吸着性領域に含まれているリガンドまたはレセプタにハイブリダイズ等させてリガンドまたはレセプタと特異的に結合させ、多数の吸着性領域に選択的に含まれている放射性標識物質によって蓄積性蛍光体シートの輝尽性蛍光体層を露光し、露光された輝尽性蛍光体層を励起光によって走査して、輝尽性蛍光体層に含まれている輝尽性蛍光体を励起し、輝尽性蛍光体から放出された輝尽光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数の吸着性領域を励起光によって走査して多数の吸着性領域に選択的に含まれている蛍光物質を励起し、蛍光物質から放出された蛍光を光電的に検出して生化学解析用データを生成し、あるいは、多数の吸着性領域に選択的に含まれている標識物質を化学発光基質と接触させ、標識物質から放出される化学発光を光電的に検出して生化学解析用データを生成するシステムが開発されている（特開２００２−３５５０３６号公報）。
【０００３】
これらのシステムによれば、生化学解析用ユニット上に数多くのリガンドまたはレセプタを結合した吸着性領域を高密度に形成して、標識物質によって標識されたレセプタまたはリガンドをハイブリダイズ等させることによって、短時間でレセプタまたはリガンドを解析することが可能になるという利点がある。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３６号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、吸着性領域に含まれているリガンドまたはレセプタに標識物質によって標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、続いてこの標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させ、この酵素に化学発光基質を接触させる化学発光法においては、化学発光基質から放出される化学発光を検出することが必要であるが、酵素標識抗体の酵素によって分解された化学発光基質は一旦励起状態になった後に発光するため、励起状態から検出できる発光量に達し、発光を検出するまでには数十分オーダーの時間が必要である。
【０００６】
化学発光法は放射線物質を使用する必要がないという利点を有するアッセイ法であるが、上記のように発光を検出するまでの時間が長くかかると、発光量が未だ充分でない状態で化学発光を検出して生化学解析用データを生成してしまう場合も生じ、再現性、定量性に優れたデータを得ることができない。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、化学発光法における化学発光を検出する場合に、化学発光基質の分解後、化学発光を検出するまでの時間を短縮することが可能であって、再現性、定量性に優れたデータを得ることが可能な化学発光法、および化学発光検出装置を提供することを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の化学発光法は、リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体の前記リガンドまたはレセプタに、酵素によって標識された酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドを特異的に結合させ、該酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドに化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、前記化学発光を検出する際に前記吸着性領域に対し超音波を印加することを特徴とするものである。
【０００９】
本発明の化学発光法の別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体の前記リガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、該レセプタまたはリガンドを酵素によって標識された標識体と特異的に結合させ、該酵素に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、前記化学発光を検出する際に前記吸着性領域に対し超音波を印加することを特徴とするものである。
【００１０】
本発明の化学発光法さらに別の態様としては、リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体の前記リガンドまたはレセプタに標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、該標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させ、前記標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した前記酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、前記化学発光を検出する際に前記吸着性領域に対し超音波を印加することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明の化学発光検出装置は、リガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する支持体を保持する保持手段と、該保持手段に保持された前記支持体の吸着性領域に超音波を印加する超音波印加手段と、前記保持手段に保持された前記支持体の吸着性領域から発せられる化学発光を検出する検出手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００１２】
【発明の効果】
本発明の化学発光法は、酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンド、あるいは酵素標識体、あるいは酵素標識抗体抗体に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において、化学発光を検出する際に吸着性領域に対して超音波を印加するので、酵素によって化学発光基質が分解された後、化学発光を検出するまでの時間を短縮することができる。
【００１３】
また、発光量が充分でない状態で化学発光を検出して生化学解析用データを生成すると再現性、定量性に優れたデータを得ることができないが、本発明の化学発光法は超音波を印加することによって発光状態に達していない励起状態の化学発光基質を発光状態にすることができるので、再現性、定量性に優れたデータを得ることが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の化学発光法を具体的に説明する。本発明の化学発光法に用いられる吸着性領域を有する支持体は、支持体全体が吸着性領域であってリガンドまたはレセプタを支持するものであってもよいし、吸着性領域が支持体上に別個に設けられたものであってもよい。ここでは後者の例として、複数の孔を有する基板と、この複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する多孔性の吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットを例にとって説明する。なお、前者の支持体全体が吸着性領域の場合には、後述する吸着性領域を形成する材料を塗布や流延し、徐々に乾燥すること等により作製するか、または市販のメンブレンを用いることもできる。
【００１５】
基板の材質としては、光の散乱を防止するために光を透過させないか、減衰させる材質が好ましく、金属、セラミックが好ましい。また、孔を開ける加工が容易であるプラスチックを基板として用いる場合は、光をより一層減衰させるために、粒子をプラスチック内部に分散させることが好ましい。
【００１６】
金属としては、銅、銀、金、亜鉛、鉛、アルミニウム、チタン、錫、クロム、鉄、ニッケル、コバルト、タンタルあるいは、ステンレス鋼や黄銅などの合金が好ましくあげられる。セラミックとしては、アルミナ、ジルコニア、マグネシア、石英などが好ましくあげられる。プラスチックとしては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのアクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンナフタレートやポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ナイロン−６やナイロン−６，６などの脂肪族ポリアミド、ポリイミド、ポリスルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリジフェニルシロキサンなどのケイ素樹脂、ノボラックなどのフェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、酢酸セルロースやニトロセルロースなどのセルロース類、ブタジエン−スチレン共重合体などのコポリマー、さらにはプラスチックをブレンドしたものなどが好ましくあげられる。
【００１７】
吸着性領域を形成する材料としては、多孔質材料あるいは繊維材料が好ましく使用される。また、多孔質材料と繊維材料とを併用して吸着性領域を形成することもできる。本発明において、吸着性領域を形成するために使用される多孔性材料は、有機材料、無機材料のいずれでもよく、有機／無機複合体でもよい。
【００１８】
吸着性領域を形成するために使用される有機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、活性炭などの炭素多孔質材料あるいはメンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料が好ましく用いられる。メンブレンフィルタを形成可能な多孔質材料としては、溶媒に溶解可能なポリマーが好ましく用いられる。溶媒に溶解可能なポリマーとしては、セルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース、再生セルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、酪酸酢酸セルロースなど）、脂肪族ポリアミド類（例えば、ナイロン６、ナイロン６，６、ナイロン４，１０など）、ポリオレフィン類（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、含塩素ポリマー類（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素樹脂類（例えば、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオライドなど）、ポリカーボネート、ポリスルフォン、アルギン酸及びその誘導体（例えば、アルギン酸、アルギン酸カルシウム、アルギン酸／ポリリシンポリイオンコンプレックスなど）、コラーゲンなどがあげられ、これらポリマーの共重合体や複合体（混合体）も用いることができる。
【００１９】
また、吸着性領域を形成するための繊維材料としては、特に限定されるものではないが、好ましくは前述したセルロース誘導体類、脂肪族ポリアミド類などがあげられる。
【００２０】
吸着性領域を形成するために使用される無機多孔質材料は、特に限定されるものではないが、好ましくは、金属（例えば、白金、金、鉄、銀、ニッケル、アルミニウムなど）、金属等の酸化物（例えば、アルミナ、シリカ、チタニア、ゼオライトなど）、金属塩（例えぱ、ヒドロキシアパタイト、硫酸カルシウムなど）及びこれらの複合体などがあげられる。
【００２１】
基板に複数の孔を開ける方法としては、ピンで打ち抜くパンチング、電極に高電圧をパルス状に印加して基板を揮発する放電加工、エッチング、レーザー照射などがあげられる。基板の材料が、金属材料またはプラスチック材料の場合は、基板の表面にコロナ放電またはプラズマ放電を施して接着剤を塗工した後、吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスなどの手段により貼り合わせることで生化学解析用ユニットが作製される。貼り合わせる際に、吸着性領域を形成するための多孔性材料を加熱して軟化すると、孔内部に吸着性領域が容易に形成される。また、基板に吸着性領域を形成するための多孔性材料をプレスする場合には、基板と吸着性領域を形成するための材料を、事前に１枚毎に分割してから間欠的にプレスしてもよいし、基板と吸着性領域を形成するための材料をそれぞれ長尺帯状としたものを２つのロール間に連続搬送してもよい。
【００２２】
なお、本発明の化学発光法においては、生化学解析用ユニットを上記の材料や方法によって作製することも可能であるが、市販されている支持体上に吸着性領域が複数設けられたものを用いてもよく、また吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されているものを用いることも可能である。
【００２３】
第１の態様として、本発明の化学発光法はリガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、酵素標識によって標識された酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドを特異的に結合させ、この酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドに化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において利用することができる。
【００２４】
吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定することができる。なお、上述したように、多孔性の吸着性領域にリガンドまたはレセプタがすでに結合されている生化学解析用ユニットを用いる場合には、この段階は省略される。
【００２５】
酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。標識によって標識された酵素標識レセプタまたは酵素標識リガンドは、このような酵素によって標識され、吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合することが可能なホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施されたものである。
【００２６】
化学発光基質としては、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【００２７】
また、第２の態様として、本発明の化学発光法はリガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、レセプタまたはリガンドを特異的に結合させ、このレセプタまたはリガンドを酵素によって標識された標識体と特異的に結合させ、標識体に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において利用することができる。
【００２８】
これは、検出するレセプタまたはリガンドを、吸着性領域のリガンドまたはレセプタと酵素によって標識された標識体によって挟み込む、いわゆるサンドイッチ法と呼ばれる手法に適用したものである。ここでいう、レセプタまたはリガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施された物質である。
【００２９】
酵素によって標識された標識体とは、前述の酵素によって標識され、レセプタまたはリガンドの反応部位に特異的に結合することができる抗原、抗体の他、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものを意味する。
【００３０】
さらに、第３の態様として本発明の化学発光法はリガンドまたはレセプタが結合された吸着性領域を有する生化学解析用ユニットのリガンドまたはレセプタに、標識物質により標識された標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させ、標識レセプタまたは標識リガンドと酵素標識抗体を特異的に結合させ、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させて化学発光を検出する化学発光法において利用することができる。以下、この第３の態様を例にとって、より詳しく説明する。
【００３１】
吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタは、上記したように、ホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどであって、特性、組成、構造あるいは塩基配列や塩基の長さなどが既知のものである。リガンドまたはレセプタは、吸着性領域に滴下した後、紫外線の照射などによって吸着性領域に固定される。
【００３２】
吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させる。標識レセプタまたは標識リガンドは、多孔性の吸着性領域に結合されるリガンドまたはレセプタと特異的に結合するホルモン類、腫瘍マーカー、酵素、抗体、抗原、アブザイム、その他のタンパク質、核酸、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどの抽出、単離などによって生体から採取された、あるいは、採取された後に化学的処理が施され、標識物質によって標識されたものである。レセプタまたはリガンドを標識する標識物質としては、ジゴキシゲニン、ビオチン、アビジン、フルオロセインなどの抗原、及びこれらの抗原に対する抗体などを好ましくあげることができる。また、ビオチンに対するアビジンのような生物学的結合パートナーであってもよい。
【００３３】
吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させるには、吸着性領域にリガンドまたはレセプタが結合された生化学解析用ユニットと、標識レセプタまたは標識リガンドが添加された反応液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて、標識レセプタまたは標識リガンドを対流あるいは拡散によって移動させる方法によって行うことができる。
【００３４】
なお、ここでは吸着性領域に結合されたリガンドまたはレセプタに標識レセプタまたは標識リガンドを特異的に結合させるためハイブリダイゼーションバッグを用いる、いわゆる振盪方式によって行う場合について説明したが、反応液を吸着性領域を横切るように強制的に流動させることが可能なポンプやシリンジなどを有するリアクタを用いて特異的結合を行ってもよい。
【００３５】
生化学解析用ユニットは、多孔性の吸着性領域に結合されているリガンドまたはレセプタに特異的に結合しなかった標識レセプタまたは標識リガンドを除去するために、ハイブリダイゼーションバッグ内に洗浄液を入れ、ハイブリダイゼーションバッグに振動を加えて洗浄することが好ましい。
【００３６】
なお、この洗浄工程は、後述する酵素標識抗体を吸着性領域を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、特異的に結合しなかった酵素標識抗体を除去する場合にも行うことが好ましい。これによって、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合していない酵素標識抗体を、効率的に剥離させ、除去することが可能になり、洗浄効率を大幅に向上することができる。
【００３７】
吸着性領域に結合したリガンドまたはレセプタに特異的に結合した標識レセプタまたは標識リガンドに酵素標識抗体を結合させる前に、酵素標識抗体に対するブロッキングバッファで吸着性領域をブロッキングすることが好ましい。ブロッキングによって、酵素標識抗体が標識レセプタまたは標識リガンドの抗原とではなく、吸着性領域に直接結合することを防止することができる。
【００３８】
次に、酵素標識抗体が添加された反応液をハイブリダイゼーションバッグ内に入れ、酵素標識抗体と標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させる。酵素標識抗体は、標識レセプタまたは標識リガンドの標識物質に対する抗体（標識レセプタまたは標識リガンドが抗体である場合には抗原）を酵素で標識したものである。酵素標識抗体の酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素を好ましく用いることができる。
【００３９】
酵素標識抗体を標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合させた後、生化学解析用ユニットをハイブリダイゼーションバッグから取り出して、標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体に化学発光基質を接触させる。酵素標識抗体に反応させる化学発光基質は、酵素がアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、特に限定するものではないが、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
【００４０】
化学発光基質を接触させる際には生化学解析用ユニットを化学発光検出時に超音波を印加することが可能な化学発光検出装置に取り付ける。図１は本発明の化学発光検出装置の一の実施の形態を示す概略断面図及び一部拡大図である。
【００４１】
図１に示す化学発光検出装置１は、生化学解析用ユニット２を保持する載置台３と、生化学解析用ユニット２の吸着性領域４に超音波を印加する超音波印加手段である超音波トランスデューサ５と、生化学解析用ユニット２の吸着性領域４から放出される化学発光の横拡散を防ぐ金属マスク６と、吸着性領域４から発せられる化学発光を検出する検出手段として吸着性領域４のそれぞれに光入射面８が配置された光ファイバ７および光ファイバ７の光出射面９に接続されたＣＣＤ等の光電変換手段１０と、光ファイバ７の光入射面８を保持するファイバ光入射端保持部１１と、温度を調整するペルチェ素子１２とを備えてなる。光ファイバ７の光入射面８はファイバ光入射端保持部１１によって、吸着性領域４のそれぞれに固定されている。
【００４２】
生化学解析用ユニット２が載置台３に載置されると、生化学解析用ユニット２の表面に化学発光基質が添加された発光基質溶液１３が供給される。発光基質溶液１３はペルチェ素子１２によって、酵素標識抗体の酵素が化学発光基質の結合を切る（分解する）ために適した温度となるように調整される。発光基質溶液１３が供給されると、吸着性領域４では標識レセプタまたは標識リガンドと特異的に結合した酵素標識抗体の酵素によって、発光基質溶液１３に含まれる化学発光基質が分解される。図１の部分拡大図に示すように、この状態では化学発光基質は励起状態ａとなっているだけで発光するまでには至っていない。
【００４３】
この励起状態ａから発光状態ｂとなり、発光量が検出可能になるまでには通常３０〜６０分の時間が必要である。本発明の化学発光法では、化学発光を検出する際に吸着性領域４に対し超音波トランスデューサ５により超音波を印加することで、励起状態ａの化学発光基質を速やかに発光状態ｂとすることができる。この状態で、光ファイバ７の光入射面８から入射した光は光ファイバ７の中を伝わって光出射面９から出射し、ＣＣＤ１０で電気信号に変換される。このように化学発光を検出する際に、吸着性領域に対し超音波を印加することによって、化学発光基質を酵素標識抗体に接触させてから化学発光を検出するまでの時間を短縮することが可能となり、再現性、定量性に優れたデータを得ることができる。
【００４４】
化学発光基質の発光基質溶液１３中には水溶液中で発光を促進させる物質、例えばエンハンサ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ−ＩＩＴＭ、ＥｍｅｒａｌｄＩＩＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社商標）などを添加することが好ましい。酵素標識抗体は吸着性領域４に結合されているリガンドまたはレセプタと特異的結合したレセプタまたはリガンドに結合しており、従って、酵素標識抗体の酵素によって分解された化学発光基質は吸着性領域４の近傍に存在していると考えられる。しかし、超音波の印加によって吸着性領域４から発光基質溶液１３中に分解された化学発光基質が移動すると、水分子が誘導する消光（クエンチング）によって吸着性領域４の近傍に存在する場合よりも発光は弱くなると考えられる。エンハンサを添加するとエンハンサが仕切りとなって水溶液中の化学発光基質の化学発光生成部分を水分子から遮断するため、水溶液中の基質の発光をより増強することができる。
【００４５】
なお、図１では、複数の孔を有する基板と、複数の孔内に充填されて吸着性領域を形成する多孔性の吸着性材料とからなる生化学解析用ユニットを用いた例を示したが、市販のメンブレンを用いても実施することが可能である。図２は本発明の化学発光検出装置の別の実施の形態を示す概略断面図である。図２に示す化学発光検出装置は、メンブレン２４を収容する容器２５と、この容器２５の底面に設置された超音波を印加する超音波印加手段である超音波トランスデューサ２６と、メンブレン２４のスポット２７から発せられる化学発光をレンズ２８で検出し電気信号に変換する冷却ＣＣＤカメラ２９とから構成されている。
【００４６】
容器２５内にはメンブレン２４を所定の位置に固定するメンブレン固定手段３０が設けられており、メンブレン２４をこのメンブレン固定手段３０によって固定し、ここに基質溶液３１を供給した後、図１に示した化学発光検出装置と同様に、超音波トランスデューサ２６で超音波を印加し、スポット２７から発せられる化学発光をレンズ２８で検出し冷却ＣＣＤカメラ２９で測定する。
【００４７】
図３は、支持体の吸着性領域にＤＩＧ標識ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社：ＤＩＧ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ）を約０．０５ｐｇスポットし、これに上記エンハンサを添加することなく抗ＤＩＧ−ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）抗体を抗原抗体反応により結合し、３８ｋＨｚ、８０Ｗの超音波を印加した場合の吸着性領域からの１秒間当たりのフォトン数すなわち発光量変化（実線）及びＳ／Ｎ比変化（点線）を示したグラフである。Ｓ／Ｎ比は、スポットの１秒間当たりのフォント数と、スポットのない部分のメンブレンのスポットと同面積の領域の１秒間当たりのフォント数との比である。グラフ中、▲２▼で示す太実線で超音波を１０分間印加している。この部分でフォトン数が急増し、またＳ／Ｎ比が急増しているのがわかる。超音波を止めた後▲３▼ではフォトン数が減少して超音波を印加する直前よりもフォトン数は少なくなっているが、これは酵素によって分解され蓄積されていた未発光の励起状態で留まっている基質が一気に発光したためであり、励起状態で留まっている基質の量が酵素反応を始めた初期にリセットされたものと考えられる。
【００４８】
図４は、図３と同様に支持体の吸着性領域にＤＩＧ標識ＤＮＡを約０．０５ｐｇスポットし、これに上記エンハンサを添加した抗ＤＩＧ−ＡＰ抗体を抗原抗体反応により結合し、３８ｋＨｚ、８０Ｗの超音波を印加した場合の吸着性領域からの１秒間当たりのフォトン数、すなわち発光量変化（実線）及び温度変化（点線）を示したグラフである。グラフ中、▲２▼で示す太実線では超音波を１０分間印加、▲５▼で示す太実線では超音波を５分間印加、▲６▼で示す太実線では超音波を２分３０秒間、３回印加、▲９▼で示す太実線では超音波を１７分間印加している。いずれの場合も超音波印加後、フォトン数（発光量）が急増しているのがわかる。エンハンサがない状態の図３の▲２▼と、エンハンサが存在している状態の図４の▲２▼を比較すると、エンハンサが存在している状態の図４に示す方がフォトン数が大きく、発光がより増強されていることがわかる。
【００４９】
▲４▼では、基質の酵素反応が再び進んで未発光の励起状態で留まっている基質が再び増えてきている状態にある。超音波を印加しない場合の基質の励起状態から発光状態への遅い移行により、超音波を印加する前の▲１▼の状態と同じ傾きで発光が増加していることがわかる。すなわち、超音波を印加すると、発光しない励起状態で留まっている基質も一気に発光するので、反応初期から超音波を印加した後までのフォトン数を積分すれば、酵素で分解された基質の量に正確に対応するフォトン数を求めることができ、再現性、定量性に優れたデータを得ることができる。
【００５０】
▲８▼では、超音波を印加することなくペルチェ素子によって発光基質溶液を１０分間加温しているが、加温のみでは発光量はわずかしか上昇しない。このことから、フォトン数の急増は温度上昇によるものではなく、超音波の印加によるものであることが明らかである。
【００５１】
以上のように、本発明の化学発光法は、化学発光を検出する際に吸着性領域に対して超音波を印加するので、酵素標識抗体の酵素によって化学発光基質が分解された後、励起状態となりその後検出できる発光量に達するまでの時間を短縮することができる。また、超音波を印加することによって、未だ発光状態に達していない分解された励起状態の化学発光基質も発光させることができるので、再現性、定量性に優れたデータを得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の化学発光検出装置の一の実施の形態を示す概略断面図及び一部拡大図
【図２】本発明の化学発光検出装置の別の実施の形態を示す概略断面図
【図３】エンハンサのない状態で超音波印加した場合の発光量変化を示すグラフ
【図４】エンハンサがある状態で超音波印加した場合の発光量変化を示すグラフ
【符号の説明】
１    化学発光検出装置
２    支持体（生化学解析用ユニット）
３    保持手段（載置台）
４    吸着性領域
５    超音波印加手段（超音波トランスデューサ）
７    光ファイバ
１０  光電変換手段
１３  発光基質溶液
２４  メンブレン
２９  冷却ＣＣＤカメラ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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