(57)【要約】【課題】新しい抗腫瘍剤、抗菌剤又は抗真菌剤を提供する。【解決手段】式（１）で表わされる化合物。【化１】2004210648.tif 000010［式中、Ｒは水素原子または式（２）を表す。］【化２】2004210648.tif 000011【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（１）で表される化合物。
【化１】
2004210648.tif 000008
［式中、Ｒは水素原子または式（２）を表す。］
【化２】
2004210648.tif 000009
【請求項２】
請求項１記載の式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤、抗菌剤又は抗真菌剤。
【請求項３】
ストレプトミセス属に属し、式（１）で表される化合物生産菌を培養して、その培養物から式（１）で表される化合物を採取することを特徴とする式（１）で表される化合物の製造方法。
【請求項４】
ストレプトミセス属に属し式（１）で表される化合物の生産菌がストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＰＡ−６９５２株又はそれらの誘導株である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＰＡ−６９５２株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍活性及び抗菌、抗真菌活性を有する新規な化合物、該化合物の微生物学的製造方法、及び該化合物を有効成分として含有する医薬等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より各種の抗腫瘍剤や抗菌剤、抗真菌剤が開発され、癌や感染症の治療に用いられてきたが、有効性や副作用等の面からみて満足し得るものは少なく、新規な薬剤の開発が要望されている。
一方、これまでに微生物から見い出された生理活性化合物の一群として、スピロ環側鎖を持った２４員環マクロライド化合物が知られている。そのような２４員環マクロライド化合物としては、dunaimycin類、ossamycin、及びNK154183類等がいずれも放線菌から単離され、公知となっている（非特許文献１、２、３）。
【０００３】
【非特許文献１】
J.E.Hochlowskiら著, Journal of Antibiotics vol.44: 1318-1330, 1991
【０００４】
【非特許文献２】
H.A.Kirstら著, Journal of Antibiotics vol.49: 162-167, 1996
【０００５】
【非特許文献３】
K.Tsuchiyaら著, Journal of Antibiotics vol.49: 1281-1283, 1996
【０００６】
【発明が解決すべき課題】
本発明の課題は、抗腫瘍、抗菌、抗真菌活性を有する新規な化合物、該化合物の微生物学的製造方法、及び該化合物を有効成分として含有する医薬等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはこれらの背景のもと、抗腫瘍、抗菌或いは抗真菌活性を示す新規な化合物を探索した結果、本発明者らが単離した放線菌ＳＰＡ−６９５２株が新規な２４員環マクロライド化合物を生産すること、該化合物は抗腫瘍活性、抗菌活性、抗真菌活性を示すことを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、
【０００８】
［１］次式（１）で表される化合物、
【化３】
2004210648.tif 000002
［式中、Ｒは水素原子または式（２）を表す。］
【０００９】
【化４】
2004210648.tif 000003
【００１０】
［２］前記１記載の式（１）で表される化合物又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤、抗菌剤又は抗真菌剤、
［３］ストレプトミセス属に属し、式（１）で表される化合物生産菌を培養して、その培養物から式（１）で表される化合物を採取することを特徴とする式（１）で表される化合物の製造方法、
［４］ストレプトミセス属に属し式（１）で表される化合物の生産菌がストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＰＡ−６９５２株又はそれらの誘導株である請求項３記載の製造方法、
［５］ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＰＡ−６９５２株
に関する。
【００１１】
前記式（１）で表される化合物、又はその薬学上許容される塩は、ストレプトミセス属に属する放線菌ＳＰＡ−６９５２株の培養により製造することができる。該ＳＰＡ−６９５２株は大阪府内で採取した土壌から本発明者らによって単離されたものである。ＳＰＡ−６９５２株は次のような菌学的性質を有する。
【００１２】
（ａ）形態的性質
ＩＳＰ培地Ｎｏ．２〜５にて２７℃、２週間培養したときの形態的性質は、次のようなものである。基生菌糸はよく伸長し単純分岐をなし、気菌糸を形成する。気菌糸の先端には、２０個以上の胞子が連鎖した胞子鎖が形成される。胞子鎖の形状は曲状又はゆるい曲状である。胞子は、表面はしわ状で、大きさは直径０．５〜０．７μｍ、長さ０．８〜１．０μｍほどである。気菌糸及び基生菌糸の分断、及び胞子のう、鞭毛胞子、菌核等の特殊な構造は認められない。
（ｂ）培養的性質
ＩＳＰ培地Ｎｏ．２〜５にて２７℃、２週間培養したときのＳＰＡ−６９５２株の培養的性質を以下に示す。
【００１３】
2004210648.tif 000004
【００１４】
（ｃ）生理学的性質
１．メラニン様色素の生成
ペプトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ培地Ｎｏ．６）    陽性
チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地Ｎｏ．７）                  陽性
２．炭素源の利用性
Ｌ−アラビノース              ＋＋
Ｄ−フルクトース              ＋
Ｄ−グルコース                ＋
イノシトール                  ＋＋
Ｄ−マンニトール              −
ラフィノース                  ＋
Ｌ−ラムノース                ＋
シュクロース                  ＋
Ｄ−キシロース                ＋
【００１５】
３．化学分類学的性質
全菌体加水分解物中にＬＬ−ジアミノピメリン酸が検出された。
以上の菌学的性質より、ＳＰＡ−６９５２株はストレプトミセス属に属する放線菌であると同定し、ストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）ＳＰＡ−６９５２と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６４）。
上記放線菌の培養に使用される培地は液状でも固体でもよいが、通常は液体培地による振盪培養又は通気攪拌培養が有利である。使用する培地は、特に限定されるものではないが、該物質生産菌が資化しうる炭素源及び窒素源を含む栄養培地が用いられる。炭素源としては、例えばグルコース、ラクトース、グリセリン、デンプン、デキストリン、糖蜜等が挙げられる。窒素源としては、例えばポリペプトン、カザミノ酸等の蛋白質加水分解物、肉エキス、酵母エキス、大豆粕、コーンスティープリカー、アミノ酸類等の有機窒素源やアンモニウム塩や硝酸塩等の無機窒素源が挙げられる。その他、浸透圧調整、ｐＨ調整、微量成分の補給等のために、各種リン酸塩、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム等の無機塩類を培地に添加することも可能である。さらに菌の生育を促進する目的で、各種ビタミン類、核酸関連化合物等を培地に添加してもよい。なお、培養期間中に、シリコン、ポリプロピレングリコール誘導体、大豆油等の消泡剤を培地に添加することも可能である。
【００１６】
培養温度としては、好ましくは２０〜３７℃の範囲、更に好ましくは２５〜３０℃の範囲の温度が挙げられる。培養期間としては例えば、４〜８日間の範囲が挙げられる。培地のｐＨとして例えば、中性付近の範囲が挙げられる。
培養物から本発明の化合物を単離するには、微生物の生産する代謝物についての、通常使用される単離手段が使用できる。培養液上清中からの単離法としては、培養濾液からの通常の単離法、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法又は吸着もしくは分配クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。これらの単離法は単独又は組み合わせて行うことができる。また高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や薄層クロマトグラフィーなどにより単離精製もできる。培養菌体から目的物を単離する場合は、濾過もしくは遠心分離等の手段で集めた菌体を、アセトンやメタノール等の親水性有機溶媒を用いて直接、菌体から抽出できる。抽出物からは、培養液上清からの単離精製法と同様の方法で、目的物を得ることができる。
【００１７】
本発明の化合物においては、それらの塩、好ましくは医薬的又は獣医薬的に許容される塩も本発明の範疇に含まれる。ここで、塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、リン酸等）との塩、或いは有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ケイ皮酸、フマル酸、リンゴ酸、シュウ酸等）との塩などを挙げることができる。
本発明の化合物又はその塩には水やエタノール等の医薬品として許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
また、本発明化合物又はその塩は不斉炭素原子を含み立体異性体が存在するが、本発明の範疇にそれら異性体や、それらの混合物も含まれる。
【００１８】
本発明医薬は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば、その溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる。坐剤の型で直腸投与することもできる。前記の適当な投与剤型は、例えば、許容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、希釈剤等に有効成分を配合することにより製造することができる。注射剤型で用いる場合には、例えば、薬学的に許容される緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。
投与量及び投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、経口投与の場合は、通常、成人の一日当たり投与量は０．１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜５００ｍｇの範囲で選択すればよい。
【００１９】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
ＳＰＡ−６９５２株の培養と活性物質の単離精製
Ｄ−グルコース１．５％、可溶性デンプン１．５％、綿実粉１．２％、酵母エキス０．０５％、塩化カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．００７％、炭酸カルシウム０．２％を含み、ｐＨ７．２に調整した培地７５ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注してオートクレーブで滅菌した。これに、斜面培養したストレプトミセス・エスピーＳＰＡ−６９５２株を１白金耳接種し、２７℃で４日間１３０ｒｐｍにて振盪培養して前培養とした。２リットル容坂口フラスコ２４本に同組成の培地を３００ｍｌずつ分注し、オートクレーブ滅菌後、上記前培養液を２％接種し、２７℃で７日間１１０ｒｐｍにて振盪培養した。培養終了後、培養液を２０℃、９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、菌体画分と上清液画分とに分離した。
【００２０】
菌体画分に３リットルのアセトンを加え、室温にて１時間攪拌抽出後、抽出液を濾過により回収した。上清液画分は、等量の１−ブタノールを加え、室温にて１時間攪拌抽出後、静置分液により抽出液を回収した。両抽出液を減圧濃縮して褐色油状物８．５ｇを得た。これを５０ｍｌのメタノールに溶解し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＨＷ−４０Ｆ（東ソー製）を用いるカラムクロマトグラフィー（φ３×５０ｃｍ）に付し、メタノールで溶出した。活性画分を減圧濃縮し、１．３ｇの褐色粉末の画分Ｉと４．２ｇの褐色粉末の画ＩＩとを得た。画分Ｉを２ｍｌのメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣに注入した。分取ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ−Ｐｒｅｐ（φ３×１０ｃｍとφ３×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％ギ酸、同Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液濃度７０％から１００％へ４０分の直線グラジエント、流速：２０ｍｌ／分、検出：２２５ｎｍにおける紫外吸収、とした。保持時間２４分のピークを回収し、減圧濃縮することにより無色固体粗物質１６ｍｇを得た。
【００２１】
これを０．５ｍｌのメタノールに溶解し、再度分取ＨＰＬＣに注入した。分取ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＲＳ（φ２×５ｃｍとφ２×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％ギ酸、同Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：Ｂ液濃度５０％から５５％へ６０分の直線グラジエント、流速：７ｍｌ／分、検出：２２５ｎｍにおける紫外吸収、とした。保持時間１８分のピークを回収し、減圧濃縮乾固することにより無色固体のＳＰＡ−６９５２−１を５．９ｍｇ取得した。一方、画分ＩＩを４ｍｌのメタノールに溶解し、分取ＨＰＬＣに注入した。分取ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＨＧ−Ｐｒｅｐ（φ５×１０ｃｍとφ５×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％ギ酸、同Ｂ：メタノール、グラジエント：Ｂ液濃度７０％から１００％へ４５分の直線グラジエント、流速：３０ｍｌ／分、検出：２２５ｎｍにおける紫外吸収、とした。保持時間４５分のピークを回収し、減圧濃縮することにより無色固体粗物質１８ｍｇを得た。これを０．５ｍｌのメタノールに溶解し、再度分取ＨＰＬＣに注入した。分取ＨＰＬＣの条件は、カラム：Ｗａｋｏｐａｋ（登録商標）Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ５Ｃ１８ＲＳ（φ２×５ｃｍとφ２×２５ｃｍを連結、和光純薬工業製）、溶出液Ａ：１％ギ酸、同Ｂ：アセトニトリル、グラジエント：Ｂ液濃度６０％から１００％へ７２分の直線グラジエント、流速：７ｍｌ／分、検出：２２５ｎｍにおける紫外吸収、とした。保持時間３５分のピークを回収し、減圧濃縮乾固することにより無色固体のＳＰＡ−６９５２−２を４．０ｍｇ取得した。
取得した各化合物の物理化学的性状は以下のようであった。
【００２２】
（ＳＰＡ−６９５２−１）
外観：無色固体
整数分子量：８９３
分子式：Ｃ４９Ｈ８３ＮＯ１３
高速電子衝撃質量スペクトル(FAB-MS、小数点以下を四捨五入した整数値)
m/z（positive）：895(M+H)+
m/z（negative）：893(M-H)-
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル(HRFAB-MS)m/z(M+H)+：
実測値：894.5966
計算値：894.5943（Ｃ４９Ｈ８４ＮＯ１３）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：257(11300)
【００２３】
１Ｈ―ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：
0.85(3H,d,6.7), 0.97(3H,d,7.0), 0.99(3H,t,7.3), 1.10(3H,s), 1.20〜2.15(27H,m), 1.33(3H,s), 1.35(3H,d,7.0), 1.35(3H,s), 1.38(3H,s), 2.20(1H,m), 2.27(1H,m), 2.49(1H,dd,14.4,2.2), 2.55(1H,d,14.4), 2.70(1H,dd,13.7,10.6),2.74(6H,s), 3.16(1H,m), 3.19(1H,brs), 3.75(1H,m), 3.80(1H,d,4.0), 3.80(1H,t,5.4), 3.88(1H,d,8.0), 4.03(1H,dt,10.4,2.4), 4.10(1H,ddd,11.3,4.3,1.8), 4.57(1H,m), 5.09(1H,dd,7.0,4.0), 5.17(1H,m), 5.24(1H,m), 6.02(1H,d,15.4), 6.14(1H,d,15.5), 6.98(1H,d,15.4)
１３Ｃ―ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：
5.2, 7.9, 10.6, 15.3, 18.9, 20.1, 22.8, 24.2, 27.1, 27.9, 28.8, 28.9, 29.4, 29.9, 30.3, 31.9, 32.2, 33.4, 34.4, 35.7, 36.8, 37.7, 40.7, 42.7(2C), 44.3, 44.6, 64.3, 67.7, 68.1, 68.4, 70.8, 72.7, 75.5, 75.7, 76.7, 77.2, 79.6, 80.3, 84.9, 99.1, 99.1, 111.6, 120.3, 125, 126.8, 149.1, 153.4, 167.3
溶解性：水、ヘキサンに不溶、メタノール、ＤＭＳＯに可溶
【００２４】
これらからＳＰＡ−６９５２−１の構造式を、次式（１−ａ）と決定した。
【化５】
2004210648.tif 000005
【００２５】
（ＳＰＡ−６９５２−２）
外観：無色固体
整数分子量：７５２
分子式：Ｃ４１Ｈ６８Ｏ１２
高速電子衝撃質量スペクトル(FAB-MS、小数点以下を四捨五入した整数値)
m/z（positive）：753(M+H)+
m/z（negative）：751(M-H)-
高分解能高速電子衝撃質量スペクトル(HRFAB-MS)m/z(M)+：
実測値：752.4724
計算値：752.4711（Ｃ４１Ｈ６８Ｏ１２）
紫外可視吸収スペクトルλｍａｘ（メタノール中）ｎｍ（ε）：
206(11200)、257(12900)
【００２６】
１Ｈ―ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：
0.85(3H,d,7.0), 0.93(3H,d,7.0), 0.99(3H,t,7.3), 1.18(3H,s), 1.20〜1.70(18H,m), 1.32(3H,s), 1.35(3H,s), 1.37(3H,s), 1.71(2H,m), 1.86(1H,m), 2.02(2H,m), 2.20(1H,m), 2.26(1H,m), 2.48(1H,dd,14.0,2.2), 2.54(1H,d,14.0), 2.69(1H,dd,13.7,10.6), 3.20(1H,brs), 3.72(1H,d,7.3), 3.76(1H,d,4.0), 3.77(1H,d,4.0), 3.77(1H,m), 3.85(1H,brt,10.3), 4.09(1H,ddd,9.4,3.0,1.8), 5.20(1H,m), 5.24(1H,m), 6.02(1H,d,15.8), 6.16(1H,d,15.5), 6.99(1H,d,15.8)１３Ｃ―ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：
5.3, 8.0, 10.7, 20.1, 22.7, 23.7, 26.8, 28.8, 28.9, 29.3, 29.9, 30.8, 31.9, 32.3, 33.2, 34.3, 35.6, 36.7, 37.6, 39.9, 44.3, 44.6, 68.0, 68.3, 70.8, 71.8, 72.4, 76.1, 76.47, 76.52, 78.6, 80.1, 84.9, 99.2, 111.8, 120.5, 124.6, 127.1, 149.0, 153.1, 167.1
これらからＳＰＡ−６９５２−２の構造式を、次式（１−ｂ）と決定した。
【００２７】
【化６】
2004210648.tif 000006
【００２８】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の測定
本発明化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性をヒト前骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０を被験細胞として測定した。すなわち、ＨＬ−６０細胞を２×１０５cell/mlの濃度で９６穴プレートに９０μｌずつ分注した。培地は牛胎児血清を１０％添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた。あらかじめ培地で希釈した本発明化合物１０μｌを、培養開始と同時に添加した。５％炭酸ガス培養器内で３７℃にて３日間培養した後、生細胞数を測定し、試料濃度と細胞増殖阻害率から、ＩＣ50値（５０％阻害のための濃度）を求めた。結果は以下の通りとなり、本発明化合物は強い抗腫瘍活性を示した。
被験化合物                            ＩＣ50（μｇ／ｍｌ）
ＳＰＡ−６９５２−１                  ０．５
ＳＰＡ−６９５２−２                  ０．４
【００２９】
実施例３
抗菌・抗真菌活性の測定
本発明化合物の抗菌・抗真菌活性をBacillus subtilis ATCC 6633、Candida utilis NBRC 10707、Aspergillus niger JCM 10254を被験菌として測定した。すなわち、オートクレーブ後５０℃に冷却した寒天培地に本発明化合物を種々の濃度になるよう混合し、平板に固めた。これに上記被験菌を接種し、３０℃で１〜２日間インキュベートして生育の有無を観察した。培地は、細菌用には栄養寒天培地（ペプトン１％、肉エキス１％、ＮａＣｌ  ０．５％、寒天１．５％、ｐＨ７．２）、真菌用にはサブロー寒天培地（Ｄ−グルコース４％、ポリペプトン１％、ｐＨ５．６）を用いた。生育阻止が認められた最小濃度をＭＩＣとして示した。結果は以下の通りとなり、本発明化合物は抗菌活性及び糸状菌に対する抗真菌活性を示した。
2004210648.tif 000007
【００３０】
【発明の効果】
前記式（１）で表される新規マクロライド化合物又はその塩は、抗腫瘍活性及び抗菌、抗真菌活性を示し、抗腫瘍剤、抗菌剤又は抗真菌剤として有用である。