(57)【要約】【課題】マウス、ラット等の脊椎動物におけるＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制方法として好適に使用される、より簡便かつ安価な方法を提供すること。【解決手段】脊椎動物に、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、ＲＮＡ干渉誘導因子を肝臓以外の臓器又は組織で発現させることを特徴とする、遺伝子発現抑制方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物に、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、ＲＮＡ干渉誘導因子を肝臓以外の臓器又は組織で発現させることを特徴とする、遺伝子発現抑制方法。
【請求項２】
脊椎動物に、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、その結果、当該動物の肝臓に遺伝子抑制が惹起された後、更に、その他の臓器又は組織に遺伝子抑制効果が発現するまでの相当期間、当該動物を飼育することを特徴とする請求項１記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項３】
脊椎動物が、哺乳類である請求項１又は２に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項４】
哺乳類がげっ歯類である請求項３に記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項５】
ＲＮＡ干渉誘導因子が、少なくとも一部が２本鎖であるＲＮＡであり、標的遺伝子の塩基配列の一部を有するものである請求項１乃至４の何れかに記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項６】
ＲＮＡ干渉誘導因子の導入方法が、注射による全身投与であることを特徴とする請求項１乃至５の何れかに記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項７】
ＲＮＡ干渉誘導因子の導入方法が、マウス又はラットの尾静脈への投与であることを特徴とする請求項６記載の遺伝子発現抑制方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れかに記載の遺伝子発現抑制方法を用いることを特徴とする遺伝子機能解析方法。
【請求項９】
ＲＮＡ干渉誘導因子が、肝臓以外の臓器又は組織で発現することにより、標的遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導因子導入脊椎動物。
【請求項１０】
脊椎動物にＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、肝臓以外の臓器又は組織で発現させることにより、標的遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導因子導入脊椎動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脊椎動物に、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉誘導因子を導入することによる簡便かつ安価な遺伝子発現抑制方法及び当該方法を用いる遺伝子機能解析方法並びにＲＮＡ干渉誘導因子導入脊椎動物及びその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポストゲノムシークエンス時代においては、遺伝子機能解析方法として、遺伝子の配列がわかればその機能を解析できるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；  以下「ＲＮＡｉ」と記載する。）における逆遺伝学的手法が注目されている。ＲＮＡｉは、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同な３０塩基以下のセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡからなる短鎖二重鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；  以下「ｓｉＲＮＡ」と記載する。
）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊し、ｍＲＮＡを分解させる結果、標的遺伝子の発現量を低下させる現象である。ＲＮＡｉを引き起こすｓｉＲＮＡは、合成ＲＮＡをアニールし、作製していたが、現在においては、プラスミドベクターから同様の構造や同様の機能を誘導するヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ；  以下「ｓｈＲＮＡ」と記載する。）を発現させることも可能となった。
【０００３】
とりわけ、ｓｉＲＮＡ或いはｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉ誘導因子を含む溶液を、マウスやラット等の尾静脈に直接投与することによりＲＮＡｉ効果を起こさせる方法（以下「ＴＶＩ法」と記載する。）は、尾静脈へのＲＮＡｉ誘導因子導入という簡便な方法で遺伝子発現量が低下することから、注目すべき技術であり、たとえば、成体マウスに、ルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターと同時に同遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ或いはｓｈＲＮＡを発現するベクターをＴＶＩ法で導入し、３日後に観察したところ、肝臓においてルシフェラーゼ遺伝子発現の低下が確認された。
【０００４】
しかし、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を調べたところ、その発現は、実質的に、肝臓に限られており、他の臓器においては、発現抑制以前に、そもそものルシフェラーゼ発現量自体が、肝臓の次に発現量の高い腎臓においてさえ、肝臓の１／１，０００〜１０，０００程度の発現に限られていた。更に、他の臓器においては、腎臓よりも低い発現レベルであった。また、遺伝子発現量は、８時間後を最大として低下することが報告されている。
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  （２００２）  ４１８：３８−３９
【０００６】
すなわち、ＴＶＩ法によるＲＮＡｉ効果は、上記の通り、実質的に肝臓においてのみ、観察されるものと考えられており、他の臓器において発現する遺伝子や個体全体に発現する遺伝子の解析においては、全く考慮さえされていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的とするところは、マウス、ラット等の脊椎動物におけるＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制方法として好適に使用される、より簡便かつ安価な方法，及びＲＮＡｉ誘導因子導入脊椎動物及びその作製方法を提供するにある。
【０００８】
本発明を完成させる前段階として、まず本発明者等は、下等生物においてのみ知られていた下記の現象に注目した。
【０００９】
まず、アカパンカビや植物においては、ＲＮＡｉには、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；  以下「ＲｄＲＰ」と記載する。）が関与することが，また線虫やハエにおいては、ＲｄＲＰ活性により新しいｓｉＲＮＡが産出されることが報告されている。
【００１０】
また、線虫において、ＲＮＡｉ効果が細胞間で伝達すること，及びＲＮＡｉ効果が、ＳＩＤ−１（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＲＮＡｉ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）膜蛋白質の膜孔を通じて伝播している可能性があるということが示唆されている。
【００１１】
これらの結果は、線虫等の下等動物においては、ＲｄＲＰとｓｉｄ−１が、それぞれｓｉＲＮＡの増幅と細胞間のｓｉＲＮＡ伝播に寄与し、ＲＮＡｉ誘導因子をあたかも自己増幅させ、或いは効果を伝播させる重要な役割を果たしているという可能性を示している。
【００１２】
しかしながら、ＲｄＰＲおよびｓｉｄ−１、あるいは両因子のような機能を有するものが、マウスのような高等動物にも存在しているか否かについて  は、全く知られていなかった。
【００１３】
本願出願者等は、この下等動物におけるＲＮＡｉ誘導因子の自己増幅モデルに注目し、仮にマウスにも、ＲｄＰＲおよびｓｉｄ−１のような機能を有するものが存在するのであれば、ＲＮＡｉ誘導因子（ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを合成するプラスミドベクターなど）を用いたＴＶＩ法の実施（以下、「ＴＶＩ処理」と記載する。）後に、時間経過とともに、ＲＮＡｉ効果は増幅し、マウス全身へ伝播するのではないかとの作業仮説を立てた。
【００１４】
本願発明者等は、上記の作業仮説を確かめるべく、鋭意研究を重ねた結果、マウスへ、検出し易い遺伝子（以下、「インディケーター遺伝子」と記載する。）に対するＲＮＡｉベクターをＴＶＩ処理により導入し、ほぼ全身に発現し有るインディケーター遺伝子の発現を確認した。そして、ＴＶＩ処理３日後に、肝臓において、インディケーター遺伝子発現量が著しく低下することを確認した。さらに、ＴＶＩ処理１０日後に、脳、肺、肝臓、腎臓、精巣、皮膚といった広い範囲で、インディケーター遺伝子の発現が抑制されることを新たに見出した。
【００１５】
このことは、ＴＶＩ処理において、ＲＮＡ干渉誘導因子を、肝臓以外の臓器又は組織で発現させることによって、マウス全身にもＲＮＡｉ効果が引き起こされることを初めて示したものであり、ＴＶＩ処理後、ＲＮＡｉ効果が増幅される可能性のあることを示す初めての知見である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
従って上述の本発明の目的は、脊椎動物に、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、ＲＮＡ干渉誘導因子を肝臓以外の臓器又は組織で発現させることを特徴とする、遺伝子発現抑制方法，脊椎動物に、標的遺伝子に対するＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、その結果、当該動物の肝臓に遺伝子抑制が惹起された後、更に、その他の臓器又は組織に遺伝子抑制効果が発現するまでの相当期間、当該動物を飼育することを特徴とする当該遺伝子発現抑制方法，脊椎動物が、哺乳類である当該遺伝子発現抑制方法，哺乳類がげっ歯類である当該遺伝子発現抑制方法，ＲＮＡ干渉誘導因子が、少なくとも一部が２本鎖であるＲＮＡであり、標的遺伝子の塩基配列の一部を有するものである当該遺伝子発現抑制方法，ＲＮＡ干渉誘導因子の導入方法が、注射による全身投与であることを特徴とする当該遺伝子発現抑制方法，ＲＮＡ干渉誘導因子の導入方法が、マウス又はラットの尾静脈への投与であることを特徴とする当該遺伝子発現抑制方法，当該遺伝子発現抑制方法を用いることを特徴とする遺伝子機能解析方法，ＲＮＡ干渉誘導因子が、肝臓以外の臓器又は組織で発現することにより、標的遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導因子導入脊椎動物，及び、脊椎動物にＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、肝臓以外の臓器又は組織で発現させることにより、標的遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、ＲＮＡ干渉誘導因子導入脊椎動物の作製方法によって達成される。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
（ＲＮＡｉ誘導因子の導入による個体全身における遺伝子発現抑制方法）
本発明に用いることのできる動物としては、ＲＮＡｉ効果が認められる脊椎動物が挙げられる。脊椎動物としては、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類等の動物が挙げられるが、この中で哺乳類が好ましく、さらに好ましいものとしては、ラットやマウス等のげっ歯類が挙げられる。
【００１８】
本発明においてＲＮＡｉ誘導因子とは、少なくとも一部が二本鎖であるＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡ或いはｓｈＲＮＡ等があるが、一般に発現を抑制しようとする標的遺伝子の塩基配列と相補的な配列を持つことを特徴とする。また、標的遺伝子の塩基配列の一部を有するものであれば本発明に用いることができる。ＲＮＡｉ誘導因子は、試験管内や大腸菌細胞などで合成されたＲＮＡ鎖、あるいは導入されたプラスミドから合成されるＲＮＡ鎖であっても、結果的にＲＮＡｉを誘導するものであれば本発明に利用することができる。このほか、本発明で言うＲＮＡｉ誘導因子には、ｓｉＲＮＡ或いはｓｈＲＮＡを合成し、ＲＮＡｉを引き起こしうるプラスミド等のベクター自体も含まれる。
【００１９】
本発明のＲＮＡｉ誘導因子において使用されるプロモーターとしては、例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとは、ｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡを合成するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩが、転写開始時に結合する配列であるが、例えば、転写開始点より上流に転写制御領域を持つ、Ｈ１  ＲＮＡ遺伝子のプロモーター及びＵ６  ＲＮＡ遺伝子のプロモーターなどが用いられ、ヒト由来又はマウス由来などのプロモーターの何れもが使用できる。
【００２０】
臓器又は組織に特異的な遺伝子について、発現抑制・機能解析を行う場合には、特願２００３−４０９６５に記載されているプロモーターを使用することが好ましい。これは、ＰＳＥとＴＡＴＡボックスの機能を損なわないように、一部の配列が、Ｃｒｅ組換え酵素によって特異的ＤＮＡ組換えが起こるような配列で置換されているＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。Ｃｒｅ組み換え酵素の発現によって初めてＲＮＡｉが起こるため、Ｃｒｅ組み換え酵素の発現し得る臓器又は組織に特異的な遺伝子についての、発現抑制及び機能解析が可能となる。
【００２１】
標的遺伝子としては、遺伝子機能が未知なもの、既知のもの、また、細胞内在性のもの、外来性のもの、さらには、染色体性のもの、非染色体性のもの等いずれのものでも良い。
【００２２】
本発明における、ＲＮＡｉ誘導因子の導入方法としては、注射等による全身投与の他、局部投与が挙げられるが、全身投与が好ましい。中でも、尾静脈に投与するＴＶＩ法が、簡便であるため特に好ましい。
【００２３】
注射による全身投与の際には、血中でＲＮＡｉ誘導因子が分解されないような処理をすることが好ましく、例えば、プラスミド等のベクターとして導入することが好ましい。
【００２４】
ＴＶＩ処理等の注射による全身投与において、リンゲル液や生理食塩水とともに、ＲＮＡｉ誘導因子を導入するが、生体にショックを与えない溶液であるならば、どのようなものでも良い。好ましいのは、よりショックが少ないリンゲル液である。
【００２５】
ＴＶＩ処理等の注射による全身投与の場合、ＲＮＡｉ誘導因子含む溶液の注入は、５〜１０秒の短時間に行うことが好ましい。
【００２６】
また、ＴＶＩ処理等の注射による全身投与の場合、ＲＮＡｉ誘導因子を含む溶液の注入量は、対象動物の体重の５〜１５％程度が好ましく、特に好ましくは８〜１２％である。
【００２７】
このように大量な溶液を短期間に投与するのは、血中でＲＮＡｉ誘導因子が分解されるのを防止し、全身の臓器又は組織における、ＲＮＡｉ誘導因子の発現効率を高めるためである。
【００２８】
本発明は、肝臓以外の臓器又は組織において、初めて標的遺伝子の発現抑制に成功したことに基づくものであるが、もちろん肝臓での発現が同時に起こっていても良い。
【００２９】
ＲＮＡｉ誘導因子を導入した後、適切な遺伝子抑制効果が得られるまでの期間は、個体や臓器，組織によって様々であり、特に限定されていないが、例えばマウスへのＴＶＩ法によるＲＮＡｉ誘導因子の導入の場合、およそ１０日以上飼育することにより、肝臓以外の臓器でも、ＲＮＡｉの標的遺伝子の発現を低下させることが可能である。
【００３０】
ＲＮＡｉ誘導因子が導入された個体の、その変化を解析すべき方法は特に制限されないが、例えば個体の行動や形態、寿命、また、個体内の組織や細胞の形態、寿命、細胞および個体内物質量、分泌物質量、内在物質の動態などが挙げられる。
行動や形態の変化に関しては、肉眼および顕微鏡により観察ができる。また、物質としては、蛋白質は抗体との反応性や酵素活性を測定する方法等、ｍＲＮＡはＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ解析やＲＴ−ＰＣＲ、あるいはＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎなどが挙げられる。このようにして解析した、ＲＮＡｉ誘導因子が導入された個体にのみ現れる形質は、標的遺伝子の発現抑制に直接的あるいは間接的に付随することから、標的遺伝子の機能を同定することができる。
【００３１】
本発明のＲＮＡｉ誘導因子導入脊椎動物とは、肝臓以外の臓器又は組織でＲＮＡｉ誘導因子が発現しているものであれば良く、発現したＲＮＡ干渉誘導因子による標的遺伝子の発現抑制が起こる前のものと、起こったもののいずれの状態の動物をも含むものである。ＲＮＡｉ誘導因子の発現は、もちろん肝臓でも同時に起こっていても良い。
【００３２】
本発明のＲＮＡｉ誘導因子導入脊椎動物は、脊椎動物にＲＮＡ干渉誘導因子を導入し、肝臓以外の臓器又は組織で発現させるという、簡便・迅速・安価な方法で作ることができる。この動物は、トランスジェニックマウスやノックアウトマウス同様、遺伝子の機能解析に用いることができる。またこの動物は、全身の臓器又は組織での、標的遺伝子発現抑制の経時的な観察が可能であるため、ＲＮＡｉの機構そのものの研究に用いることもできる。
【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得るための一助とみなすべきであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。
【００３４】
実施例    ＥＧＦＰ発現トランスジェニックマウスにおけるＴＶＩ処理によるＥＧＦＰ遺伝子の発現抑制
【００３５】
以下に、実験に使用した材料と手法を示す。
（１）  ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現トランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇＮ（ＡＣＴｂＥＧＦＰ）１０ｓｂ；以下「ｅＧＦＰマウス」と記載する。）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ  Ｉｎｃ．より購入した。
【００３６】
（２）  ＲＮＡｉ誘導プラスミドの作製：
（マウスＵ６プロモーターの作製）
マウスＵ６プロモーターは、マウスゲノムＤＮＡと次のＤＮＡプライマー（ＤＮＡプライマー（ｍＵ６／＃１  ５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｃｃｇａｃｇｃｃｇｃｃａｔｃｔｃｔａ、ｍＵ６／＃２  ５’−ｇｇｇａｔｃｃｇａａｇａｃｃａｃａａａｃａａｇｇｃｔｔｔｔｃｔｃｃａａ）を用いて、ＰＣＲ増幅した。増幅した断片は、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩで切断し、ｐＺＥｒＯ  ＩのＥｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩ部位へクローニングした（ｐＵＮＯ１１７プラスミド）
【００３７】
（ｐＵＮＯ１２９プラスミドの作製）
Ｕ６プロモーターに依存して、ＥＧＦＰ遺伝子に対するＲＮＡｉを起こすｐＵＮＯ１２９プラスミドを作製するために、ＤＮＡプライマー（ＥＧＦＰ＿ＫＯ１  ５’−ｃｇｇａｔｃｃａａａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｔｃｔｔｇａａｃａｃｇｃｔｇａａｃｔｔｇｔｇｇｃｃｇａａａｃａａｇｇｃｔｔｔｔｃｔｃ，  ｍＵ６／＃１  ５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｃｃｇａｃｇｃｃｇｃｃａｔｃｔｃｔａ）とｐＵＮＯ１１７プラスミドを用いて、ＰＣＲ増幅した。増幅した断片は、制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩで切断し、ｐＺＥｒＯ  ＩのＥｃｏ  ＲＩとＢａｍ  ＨＩ部位へクローニングした。
【００３８】
（３）  マウスへの遺伝子導入（ＴＶＩ処理）：
プラスミドＤＮＡをマウスの体重の１／１０のリンゲル溶液（大塚製薬）に溶解した。
これをマウスの尾静脈に、２７−ｇａｕｇｅ翼状針を通して、７−１０秒で注入した。
【００３９】
（４）  ＥＧＦＰ蛋白質の蛍光強度の観察と蛋白質量の測定：
マウス生体より組織を摘出し、ＵＶランプの下で、各組織のＥＧＦＰ蛍光を観察し、写真を撮った。また、マウスの尾も、同じ方法で観察した。各組織をＰＢＳ溶液中でホモジェナイズし、１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を分離し、抽出液を得た。
蛋白質量を測定し、それぞれの各組織から得た抽出液中の蛋白濃度が、０．１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈した。溶液中のＥＧＦＰ量は、ＰＯＬＡＲｓｔａｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、蛍光強度を測定した。リンゲル溶液のみを注入したｅＧＦＰマウスからの組織抽出液の蛍光強度を１００とし、ＲＮＡｉ誘導プラスミドを注入したｅＧＦＰマウスからの組織抽出液の蛍光強度を相対値で表した。
【００４０】
以下に、ｅＧＦＰマウスにＲＮＡｉ誘導プラスミドをＴＶＩ法により投与した場合の各組織におけるＥＧＦＰ遺伝子の発現抑制を示す。
【００４１】
ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを含むリンゲル溶液、またはリンゲル溶液のみをＴＶＩ法により導入し、３日後に肝臓を観察した。また同様に、Ｃ５７ＢＬ（野生型；以下「ＷＴ型」と記載する。）へ、リンゲル溶液のみをＴＶＩ処理により導入し、３日後に肝臓を３日後に観察した。
【００４２】
ｅＧＦＰマウスにリンゲル溶液のみを注入したマウスでは、ＷＴ型にリンゲル溶液のみを注入した肝臓（図１Ｃ）と比較して、明らかにＥＧＦＰの存在が確認できた（図１Ａ）。
【００４３】
次に、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを、ｅＧＦＰマウスに導入したところ、ＥＧＦＰの発現の低下を肝臓にて観察できた（図１Ｂ）。
【００４４】
また、ＥＧＦＰ量を定量した時、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを注入したｅＧＦＰマウスの肝臓におけるＥＧＦＰ量は、リンゲル溶液のみを注入したｅＧＦＰマウスの肝臓におけるＥＧＦＰ量と比べて、４９％低下していた（図２）。
【００４５】
また、上述の３匹より、脳を抽出し観察した。
【００４６】
ｅＧＦＰマウスにリンゲル溶液のみを注入したマウスでは、ＷＴ型にリンゲル溶液のみを注入した脳（結果示さず。）と比較して、明らかにＥＧＦＰの存在が確認できた（図３Ａ）。
【００４７】
次に、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを、ｅＧＦＰマウスに注入したところ、肝臓においてはＥＧＦＰの発現の低下を観察できたが、脳においては明らかなＥＧＦＰ発現量の低下は観察できなかった（図３Ｂ）。
【００４８】
また、ＥＧＦＰ量を定量した時、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを注入したｅＧＦＰマウスの脳におけるＥＧＦＰ量は、リンゲル溶液のみを注入したｅＧＦＰマウスの脳におけるＥＧＦＰ量と比べて、わずかに１％低下していたのみであり、明らかな低下は認められなかった（図４）。
【００４９】
これらの結果は、ｐＵＮＯ１２９プラスミドのＴＶＩ処理３日後に、肝臓においてＥＧＦＰ遺伝子量が低下していることを示し、ｐＵＮＯ１２９プラスミドは肝臓においてＲＮＡｉを誘導したと考えられる。しかし、脳においては、ｐＵＮＯ１２９プラスミドは、ＥＧＦＰ遺伝子の低下をほとんど示さず、ＲＮＡｉを誘導していないと考えられる。
【００５０】
次に、ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを含むリンゲル溶液、またはｐＵＮＯ１１７プラスミドを含むリンゲル溶液をＴＶＩ法により導入した。また、対照として、ＷＴ型マウスにリンゲル溶液のみを同様に導入した。そして、１０日後にマウスの肝臓と脳を観察した（図５と７）。
【００５１】
ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肝臓と脳は、ともにリンゲル溶液のみを導入したＷＴ型マウスに比べ、強い蛍光が認められ、ＥＧＦＰ遺伝子が発現していることが観察された。
【００５２】
一方、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肝臓は、明らかに、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肝臓に比べて、発光度の低下が観察された（図５）。また、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肝臓抽出液の蛍光強度は、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肝臓抽出液に比べて、７１％もの低下が認められた（図６）。
【００５３】
さらに、脳においては、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの脳は、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入した脳に比べて、蛍光度が低下していることが観察された（図７）。また、蛍光強度は、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスは、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスに比べて、３０％の低下が認められた（図８）。
【００５４】
これらの結果より、ｐＵＮＯ１２９プラスミドのＴＶＩ処理１０日後において、脳と肝臓において、ＥＧＦＰ遺伝子の発現が明らかに低下することが示された。このことは、ＲＮＡｉ効果が、ＴＶＩ処理１０日後においても、持続していることを示している。
【００５５】
しかも、プラスミドのＴＶＩ法による導入、３日後と１０日後のＥＧＦＰ遺伝子発現低下量を比較すると、肝臓においては、３日後において４９％、１０日後において７１％であり、脳においては、３日後において１％、１０日後において３０％であった（図９）。両組織において、ＥＧＦＰ遺伝子発現は、ｐＵＮＯ１２９プラスミド導入３日後よりも１０日後の方が、低いことが明らかであった。これらの結果は、ＲＮＡｉ効果が導入後３〜１０日後において持続していることに加えて、ＲＮＡｉ効果が増強している。
【００５６】
これらの結果は、ｐＵＮＯ１２９プラスミド導入後３〜１０日後において、ＲＮＡｉ効果がマウス全体の組織に広まっていることを示唆するので、各組織の観察を行うことにした。
【００５７】
＜尾＞
ｐＵＮＯ１１７プラスミドとｐＵＮＯ１２９プラスミドをＴＶＩ法により導入したｅＧＦＰマウスの尾の蛍光を比較した。ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの尾は、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスに比べてＥＧＦＰ蛍光が低下していることが認められた（図１０）。この結果より、ｐＵＮＯ１２９プラスミドのＴＶＩ処理により、皮膚においてもＥＧＦＰ遺伝子発現の低下が引き起こされており、皮膚においてもＲＮＡｉ効果が広がっていることが示唆された。
【００５８】
＜肺＞
ｐＵＮＯ１１７プラスミドとｐＵＮＯ１２９プラスミドをＴＶＩ法により導入したｅＧＦＰマウスの肺の蛍光を比較した。ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肺は、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの肺に比べて明らかにＥＧＦＰ蛍光が低下していることが認められた（図１１）。蛍光強度を測定すると、ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスは、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスに比べて、５４％の蛍光強度の低下が認められた（図１２）。
【００５９】
＜その他の臓器＞
ｐＵＮＯ１１７プラスミドとｐＵＮＯ１２９プラスミドをＴＶＩ法により導入したｅＧＦＰマウスの心臓、精巣及び腎臓の発光を比較した。ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスは、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したマウスに比べてＥＧＦＰ発光がわずかに低下していた（心臓；図１３、精巣；図１５、腎臓；図１７）。ｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスの心臓、精巣及び腎臓の蛍光強度は、ｐＵＮＯ１１７プラスミドを導入したｅＧＦＰマウスに比べて、それぞれ約１５％の低下が認められた（心臓；図１４、精巣；図１６、腎臓；図１８）。
【００６０】
これらの結果より、ｐＵＮＯ１２９プラスミド導入１０日後に、肝臓と肺のＥＧＦＰ遺伝子発現は５０％以上低下することが明らかとなった。また、脳、心臓、精巣、腎臓、皮膚においても、ＥＧＦＰ遺伝子発現は１５〜３０％低下することが示された。
【００６１】
これらの結果は、ｐＵＮＯ１２９プラスミド導入１０日後に、ＲＮＡｉ効果がほぼ全身において、観察されることを意味する。したがって、ＴＶＩ処理によりＲＮＡｉ誘導因子を導入することにより、ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制は、全身の臓器又は組織で行うことができ、これらの遺伝子発現抑制された臓器または組織は、遺伝子機能の解析に用いることができる。
【００６２】
【発明の効果】
本願発明の方法を用いることにより、トランスジェニックマウスやノックアウトマウスを作製するよりも、迅速であることに加えて、特段の技術や機材を必要としない簡便・迅速かつ安価な方法により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。また、肝臓のみならず、全身の臓器または組織において、標的遺伝子の発現を抑制することができるため、肝臓以外の各臓器や組織に特有の遺伝子発現の抑制及びその機能の解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、リンゲル溶液のみを注入した、３日後の肝臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（１００マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、３日後の肝臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、３日後の肝臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は下での観察である。
【図２】図１のマウス生体（肝臓）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図３】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、リンゲル溶液のみを注入した、３日後の脳を示す図である。ＵＶランプ下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（１００マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、３日後の脳を示す図である。ＵＶランプ下での観察である。
【図４】図３のマウス生体（脳）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図５】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の肝臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の肝臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、１０日後の肝臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
【図６】図５のマウス生体（肝臓）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図７】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の脳を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の脳を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、１０日後の脳を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
【図８】図７のマウス生体（脳）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図９】ＴＶＩ処理によりｐＵＮＯ１２９プラスミドを導入、３日後あるいは１０日後のＥＧＦＰ発現量を、肝臓と脳において比較した。それぞれの値は、図２、４、６と８より得た。
【図１０】ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）あるいはｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）をＴＶＩ処理により導入したマウス尾をＵＶランプを当てて観察した結果である。左はｐＵＮＯ１１７プラスミド、右はｐＵＮＯ１２９プラスミド。
【図１１】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の肺を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の肺を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、１０日後の肺を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
【図１２】図１１のマウス生体（肺）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図１３】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の心臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の心臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、１０日後の心臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
【図１４】図１３のマウス生体（心臓）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図１５】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の精巣を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の精巣を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、１０日後の精巣を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
【図１６】図１５のマウス生体（精巣）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図１７】（Ａ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１１７プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の腎臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｂ）ｅＧＦＰマウスへ、ｐＵＮＯ１２９プラスミド（２０マイクログラム）を含むリンゲル溶液を注入した、１０日後の腎臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
（Ｃ）Ｃ５７ＢＬマウス（ＷＴ型マウス）へ、リンゲル溶液のみを注入した、１０日後の腎臓を示す図である。上段はＵＶランプ下での観察、下段は普通照明下での観察である。
【図１８】図１７のマウス生体（腎臓）におけるＥＧＦＰ発現量を、リンゲル溶液のみを注入した時の蛍光強度を１００とした場合の、相対値で示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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