(57)【要約】【課題】本発明は、液体培地によるアサガオの効率的な組織培養の方法を、年間通じて維持し、不定胚を増殖する方法を、さらに固体培地による大量の再生植物体を得ることを提供しようとするものである。【解決手段】アサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）の未熟胚を液体培地で振とう培養してカルスを形成せしめ、その中から緑色のカルスを選抜することで不定胚形成カルスを誘導・増殖させ、増殖した不定胚形成カルスを固体培地で培養して大量の不定胚を発生させ、発生した不定胚を培養して発芽、発根させ、順化を行い、アサガオの植物体を大量に作出することに成功した。【選択図】          図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アサガオの未熟胚を液体培地で振とう培養し、カルスを形成せしめ、その中から緑色のカルスを選抜し、不定胚形成カルスを誘導・増殖する工程と、
誘導し、増殖した不定胚形成カルスを固体培地で培養し、不定胚を発生する工程と、
発生した不定胚を培養し、発芽し、発根し、順化し、アサガオの植物体を作出する工程とから成るアサガオの増殖方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、アサガオの未熟胚を液体培地で振とう培養する効率的な増殖方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アサガオの組織培養による増殖に関してはアサガオの未熟胚を材料として、不定胚を経由した植物体再生が報告されている（非特許文献１、ＪｉａとＣｈｕａ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、８７：２１５−２２３、１９９２）。同じく未熟胚を使い、アサガオの未熟胚からの不定胚形成カルスの誘導と植物体の再生も報告されている（非特許文献２、ＯｈｔａｎｉとＳｈｉｍａｄａ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：１２７−１２９、１９９８）。また、アサガオの不定胚を継代培養で増殖させている報告もある（非特許文献３、清水他、育種学研究、第４巻、別１：１７３、２００２）。
【０００３】
ここで不定胚は、植物体で受精を経た接合子から形成される通常の胚と異なり、体細胞などから形成される胚のことである。植物のクローン増殖を行う場合この不定胚を経て行われる場合も多い。不定胚形成カルスは、この不定胚を形成する能力を有するカルスのことである。
【０００４】
従来の方法はすべて固体培地での増殖法と植物体再生法である。固体培地では培養組織が培地の養分を吸収する際、培地と培養組織が接している面だけから栄養を摂取する。そのため、培養組織の性質に培地に接する面とそうでない所とで偏りが生じ、培養物が均質でなくなり、培養物の生長が阻害されたり、培養物の性質を調べるのが困難になったりする。また、培養物を増殖させる際には、培養物を新しい培地に植え継いでいく必要があるが、固体培地の場合ピンセットなどを使って移植するため時間と手間がかかる。
【０００５】
これに対して液体培地では培養組織の全体から培地の養分を吸収するため、培養物の性質は均一になりやすく生理学の実験に便利である（非特許文献４、Ｏｚａｗａ  とｋｏｍａｍｉｎｅ、Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、７７：２０５−２１１、１９８９）。また、増殖速度も速く、ピンセットを使わずにピペットなどで一度にたくさん数の培養物を取り扱うことができるため、大量増殖や培養組織への遺伝子導入などの操作に有利である。アサガオでは、未熟胚の液体培養を行った報告はあるが（非特許文献５、ＭａｔｓｕｂａｒａとＮａｋａｈｉｒａ、Ｎａｔｕｒｅ  ２２１：１２０８−１２１０、１９６６）、植物体の再生には至っていない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｊｉａ、Ｓ．  Ｒ．とＣｈｕａ．Ｎ．Ｈ．、「Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ．」、  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．、１９９２年、第８７巻、２１５−２２３。
【非特許文献２】
Ｏｔａｎｉ、Ｍ．とＳｈｉｍａｄａ、Ｔ．、「Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃａｌｌｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｅｍｂｒｙｏ  ｏｆ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｍｏｒｎｉｎｇ  ｇｌｏｒｙ  （Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｎｉｌ  Ｃｈｏｉｓｙ）」、  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９８年第１５巻、Ｐ．１２７−１２９。
【非特許文献３】
清水圭一他４名、「Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたアサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）の効率的な形質転換法の確立」、育種学研究、２００２年、第４巻、別冊１号、Ｐ．１７３。
【非特許文献４】
Ｏｚａｗａ、Ｋ．とＫｏｍａｍｉｎｅ、Ａ．、「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｉｃｅ  （Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）」、Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．、  １９８９年、第７７巻、Ｐ．２０５−２１１。
【非特許文献５】
Ｍａｔｓｕｂａｒａ、Ｓ．とＮａｋａｈｉｒａ、Ｒ．、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ｏｒｇａｎｓ  ｂｙ  Ｐｈａｒｂｉｔｉｓ  ｅｍｂｒｙｏｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、１９６６年、第２２１巻、Ｐ．１２０８−１２１０。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、アサガオの組織培養における植物体の再生はすべて固体培地に限られている。また、非特許文献５のように液体培養を行っても胚様体（不定胚）の形成効率も悪く、植物体の再生には至っていない。すなわち、従来の技術では液体培養で大量にアサガオの植物体を再生させる方法は知られていない。
【０００８】
本発明は、液体培地によるアサガオの効率的な組織培養の方法を、年間通じて維持し、不定胚を増殖する方法を、さらに固体培地による大量の再生植物体を得ることを提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、アサガオの組織培養における液体培地の組成を検討し、再生能力を持ったカルスを選抜することにより発明を完成し、上記課題を解決した。
【００１０】
本発明のアサガオとは、ヒルガオ科に属し、学名をＩｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌと称される植物または、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌと他の植物種との雑種の総称であって、大輪アサガオ、変化アサガオ、曜白アサガオ、肥後アサガオ等の品種群があり、江戸時代から園芸種として発達したものと日本とアジア、アフリカ、南米に野生状態で生息しているものを含む。
【００１１】
本発明のアサガオの不定胚を増殖する方法は、アサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）の未熟胚を液体培地で振とう培養し、カルスを形成せしめ、その中から緑色のカルスを選抜し、不定胚形成カルスを誘導し、増殖する工程と、誘導・増殖された不定胚形成カルスを固体培地で培養し、大量の不定胚を発生する工程とから成る。
【００１２】
本発明のアサガオの増殖方法は、アサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）の未熟胚を液体培地で振とう培養し、カルスを形成せしめ、その中から緑色のカルスを選抜し、不定胚形成カルスを誘導し、増殖する工程と、誘導し増殖した不定胚形成カルスを固体培地で培養し、大量の不定胚を発生する工程と、発生した不定胚を培養し、発芽し、発根し、順化し、アサガオの植物体を大量に作出する工程とから成る。
【００１３】
本発明のアサガオの増殖方法は、アサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）の未熟胚を液体培地で振とう培養し、カルスを形成せしめ、その中から緑色のカルスを選抜し、不定胚形成カルスを誘導・増殖する工程と、誘導し、増殖された不定胚形成カルスを固体培地で培養し、大量の不定胚を発生する工程と、これら不定胚形成カルスを誘導し、増殖する工程と不定胚を発生する工程とを年間通じて維持し、不定胚を増殖する工程と、発生した不定胚を培養し、発芽し、発根し、順化し、アサガオの植物体を大量に作出する工程とから成る。
【００１４】
本発明の液体培地の組成は、組織を培養するための、常用の、任意の基本培地（ＭＳ、Ｎ６、Ｂ５、ＮＮなど）に、植物ホルモンとしてナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、炭素源として糖類を加えたものを主成分とする。
【００１５】
本発明の不定胚を形成する固体培地の組成は、組織を培養するための、常用の、任意の基本培地（ＭＳ、Ｎ６、Ｂ５、ＮＮなど）に、炭素源として糖類、固化剤としてゲランガムを加えたものを主成分とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を図１のフロー図に示す。図１の（１）において、先ずアサガオの未熟胚を摘出し、ＮＡＡを含む液体培地で培養を行う。図１の（２）に示したように３〜４週間未熟胚を懸濁培養し、緑色と黄色の２種類のカルスを形成させる。そして、図１の（３）のように緑色のカルスのみを選抜し、同じ培地に１週間ごとに継代培養することで緑色のカルスのみを選抜し増殖させる。次に、図１の（４）のようにこの緑色カルスを固体培地に移して培養し不定胚を形成せしめる。
【００１７】
図１の（５）のように、形成した不定胚をオーキシンとサイトカイニンを含む培地にて培養しシュートを発芽させ、植物ホルモンを含まない培地で発芽したシュートを培養することにより発根させ、植物体を再生させる。上記のように培養することで多数の植物体を再生させることができる。
【００１８】
本発明の出発材料として、使用する組織としては例えば、種子、胚軸、子葉、子葉柄、茎、生長点、葉、葉柄、根、花弁、萼片、葯、花糸、柱頭、子房、胚珠、未熟胚、などの組織が挙げられる。未熟胚が好ましく、多くの再生植物体が得られる。
【００１９】
先ず、ＮＡＡを含む培地で未熟胚を培養する。培養に適したＮＡＡの培地濃度は１〜９ｍｇ／ｌであり、２〜４ｍｇ／ｌが好ましい。この培地にはＭＳ、Ｎ６、Ｂ５、ＮＮなど組織を培養するための常用で任意の基本培地を用いることができ、Ｎ６培地が特に好ましい。この培地には炭素源として糖類、例えばスクロース、フラクトース、グルコース、トレハロースなどが挙げられ、スクロースが好ましい。糖の培地濃度は、例えば１０〜９０ｇ／ｌが望ましく、６０ｇ／ｌが特に好ましい。この液体培地で振とう培養し、振とう速度を例えば８０〜１５０ｒｐｍで培養する。培養の温度条件として２０〜３０℃が望ましく、２４〜２６℃が特に好ましい。なお、培養を光照射のもとで行う。例えば１００〜８０００ｌｕｘの光照射のもとで行う。この培養期間として２〜５週間、好ましくは３〜４週間で行う。
【００２０】
上記のように未熟胚を培養すると、緑色（図２の１）と黄色（図２の２）の２種類のカルスを得た（図１の（２）または図２の１及び２）。これらのカルスのうち、本発明においては緑色のカルスを選別する。選抜された緑色のカルスを、未熟胚を培養した培地、温度及び光条件で培養する。継代培養はカルスピペットで行う。その間隔は１〜２週間毎に行うことが望ましく、１週間毎に行うことが特に好ましい。継代培養を行う量は細胞容積０．５〜２ｍｌが望ましい。
【００２１】
上記のようにして増殖させた緑色カルスを、固体培地で培養し、多数の不定胚を形成せしめる。この培地にはＭＳ、Ｎ６、Ｂ５、ＮＮなど組織を培養するための常用で任意の培地を用いることができる。培地には植物ホルモンを加えても、加えなくても不定胚を得ることができる。低濃度で加える方が望ましい。この培地には炭素源として糖類、例えばスクロース、フラクトース、グルコース、トレハロースなどが挙げられ、スクロースが望ましい。糖の培地濃度は、例えば１０〜９０ｇ／ｌが望ましく、６０ｇ／ｌが特に好ましい。培養は２０〜３０℃、好ましくは２４〜２６℃において静置培養として、光照射のもとで、例えば１００〜８０００ｌｕｘの光照射のもとで行われる。培地の支持体としての固化剤には、例えば寒天やゲランガムなどがあげられ、ゲランガムがより好ましい。固化剤の培地濃度は、例えばゲランガムの場合０．２〜５ｇ／ｌで行うことが望ましいが、３〜４ｇ／ｌが特に好ましい。
【００２２】
不定胚からのシュート形成の培地としては、組織培養に常用的に用いられる培地であればよく、例えばＭＳ、ＭＳ、Ｎ６、Ｂ５、ＮＮ培地などが挙げられる。培地の植物ホルモンは加えなくても、あるいは加えてもシュートが得られる。オーキシンとサイトカイニンを組み合わせて培地に加えることが望ましく、インドール酢酸０．１〜０．５ｍｇ／ｌ、ベンジルアミノプリン１〜２ｍｇ／ｌの濃度と組み合わせで培養を行うことが好ましい。培地の糖濃度は通常の組織培養で行われる条件、たとえば、２５〜３５ｇ／ｌ程度のスクロースを加える。培養の温度及び光条件は不定胚形成と同じ条件のもとで行なう。培地の支持体としての固化剤は寒天、ゲランガムどちらでもかまわないが、寒天がより好ましい。固化剤の培地濃度は例えば、寒天であれば８〜１５ｇ／ｌで行うことが好ましい。
【００２３】
上記のように得られたシュートを発根させるため、組織を培養するための常用で任意の培地、例えばＭＳ培地で培養し発根を促し、幼植物体を再生させた。培地の糖濃度は通常の組織培養で行われる条件、たとえば、３０ｇ／ｌ程度のスクロースを加える。培養の温度及び光条件は不定胚形成と同じ条件のもとで行われる。培地の支持体としては、例えば寒天やゲランガム、バーミキュライト、ロックウール等を使用することができる。
【００２４】
【実施例】
［実施例１］
アサガオの未熟種子中から未熟胚を摘出し、ＮＡＡ３ｍｇ／ｌ及びスクロース６０ｇ／ｌを含むＮ６液体培地で振とう培養した。培養は１３０ｒｐｍ、２５℃、２００ｌｕｘの条件で行った。未熟胚を液体培地で振とう培養し、緑色と黄色の２種類のカルスを形成せしめた（図２）。次に、緑色のカルスのみを選抜し、継代培養を行った。緑色のカルス上にはしばしば不定胚状の構造物が観察され、植物ホルモンを含まないＭＳ培地に緑色のカルスを移植すると不定胚の形成がみられた（図１または図２）。
【００２５】
ＮＡＡ濃度が緑色カルスの形成率に与える影響を表１に示した。この表から、液体培地でのカルスの増殖にはＮＡＡが必要であることを明らかにした。なお、「未熟胚あたりの緑色カルス形成率」の値は３回の実験の平均値±標準偏差を示している。スクロース濃度は６０ｇ／ｌの条件で培養を行った。
【００２６】
緑色のカルスを選抜して、未熟胚を培養したものと同じＮ６液体培地に移植、１３０ｒｐｍ、２５℃明条件で培養した。継代培養は１週間毎に約１ｍｌ容積のカルスをカルスピペットで移植することで行った。緑色のカルスは継代培養することで、１週間あたり約２倍の増殖率が得られた。
【００２７】
【表１】
2004305101.tif 000003
【００２８】
［比較例１］
実施例１において、ＮＡＡ３ｍｇ／ｌ及びスクロース６０ｇ／ｌを含むＮ６液体培地で未熟胚を培養した場合と、この液体培地のＮＡＡ濃度を０にして培養した場合とを比較した。その結果、ＮＡＡを０にした場合では、緑色のカルスは形成されず、増殖はできなかった。
【００２９】
［比較例２］
実施例１において、液体培地にＮＡＡ以外の植物ホルモン、例えば、４−フルオロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、ピクロラムなどを用いて未熟胚を培養した。その結果、いずれの植物ホルモンの場合も、緑色のカルスは形成さず、大量増殖はできなかった。
【００３０】
［実施例２］
実施例１において増殖した緑色カルスを、様々な培地濃度のＮＡＡを含んだＭＳ固体培地にて培養し、不定胚の形成せしめた。培地にはスクロース６０ｇ／ｌ及びゲランガム３．２ｇ／ｌを含み、培養は２５℃、２００ｌｕｘの条件で行った。
この培養の結果を表２に示した。この表から、不定胚形成に良好な条件はＮＡＡが低濃度であること、少なくとも０〜０．５ｍｇ／ｌであることを明らかにした。なお、表２の組織塊あたりの不定胚数の値は３回の実験の平均値±標準偏差を示している。
【００３１】
【表２】
2004305101.tif 000004
【００３２】
［実施例３］
実施例１において増殖した緑色カルスを、様々な培地濃度のスクロースを含んだＭＳ固体培地にて培養し不定胚を形成せしめた。培地は植物ホルモンを含まず、ゲランガム３．２ｇ／ｌで固化し、培養は２５℃、２００ｌｕｘの条件で行った。この培養の結果を表３に示した。この表から、不定胚形成に良好なスクロース濃度は、３０〜９０ｇ／ｌが好ましく、６０ｇ／ｌあたりがよいことがわかる。なお、表３の組織塊あたりの不定胚数の値は３回の実験の平均値±標準偏差を示している。
【００３３】
【表３】
2004305101.tif 000005
【００３４】
［比較例３］
実施例１において、黄色のカルスを緑色のカルスと同様に処理して、不定胚を形成せしめようとしたが、不定胚はほとんど形成されなかった（図３）。
【００３５】
［実施例４］
形成された不定胚をインドール酢酸０．２ｍｇ／ｌ、ベンジルアミノプリン２ｍｇ／ｌ、スクロース３０ｇ／ｌ及び寒天１０ｇ／ｌを含むＭＳ培地にて培養し、不定胚からシュートを形成せしめた。植物ホルモンを含まないＭＳ培地に形成せしめたシュートを移植すると、発根した植物体が得られた。シュート形成及び発根の培養は２５℃、２００ｌｕｘの条件で行った。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように本発明により、液体培養によって液体培地によるアサガオの効率的な組織培養の方法を確立し、年間通じて維持し、不定胚を増殖する方法を確立し、固体培地による大量の再生植物体を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】未熟胚の液体培養から植物体再生に至る一連の流れ図である。
【図２】アサガオの未熟胚を液体培養して形成された、緑色（１）と黄色（２）の２種類のカルスである。
【図３】未熟胚の液体培養から植物体再生に及ぼすカルスの色の影響を示した体細胞胚形成率のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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