(57)【要約】【課題】本発明は、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するポリペプチド及び、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。【解決手段】ヒト２２番染色体長腕の塩基配列を決定し、新規遺伝子の同定をするなかで、ＰＡＺドメインとＰＩＷＩドメインを有するＡｒｇｏｎａｕｔｅ群に属するタンパク質をコードする新規遺伝子ＰＩＷＩＬ３を同定し、そのｃＤＮＡを単離した。ＰＩＷＩＬ３タンパク質とＤｉｃｅｒタンパク質を培養細胞で発現させたところ、これらタンパク質同士が結合することが明らかになった。そこで、本発明はＰＩＷＩＬ３ｃＤＮＡ及びタンパク質を単離することにより、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するポリペプチド及び、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストリンジェントな条件下で、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、
Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合することを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを保持する細胞。
【請求項７】
請求項３または４に記載のポリペプチドとＤｉｃｅｒタンパク質を含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するポリペプチド及び、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ある遺伝子のアンチセンスＲＮＡやアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入すると、その遺伝子の発現を抑制することができる現象が知られていたが、長い間、そのメカニズムは明らかではなかった。最近、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれる技術が開発され、ある遺伝子に対応する二重鎖ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入することにより、発現抑制の効率が上がることが見いだされた。この現象の発見が突破口になり、ｄｓＲＮＡが細胞内に存在すると、それが外因性であっても内在性であっても、対応するｍＲＮＡの特異的な分解を誘導し、最終的な遺伝子の発現を抑制すること、さらにこの現象が広範囲の生物種で進化的に保存されていることが明らかになってきた。こうして、遺伝子発現の転写後抑制（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ、またはＰＴＧＳ）がＲＮＡを介して起きる現象のメカニズムの解明がすすんできた。
【０００３】
ＲＮＡｉの場合、まず、細胞内に導入されたｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ｂｐのオリゴヌクレオチドに分解され、最終的に、対応するｍＲＮＡの特異的な分解に至る。線虫やショウジョウバエ、ヒトでは、この過程に、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるヌクレアーゼ複合体が関与すると考えられている。この複合体にはＤｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ類似のＲＮａｓｅが存在し、これがｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡに分解する（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００４】
Ｄｉｃｅｒは、ＤＥＸＨ／ＤＥＡＨ  ＲＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅ／ＡＴＰａｓｅドメイン、ＰＡＺドメイン、ＲＮａｓｅＩＩＩ様ドメイン、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を持ち、Ｃ末端側に存在するＲＮａｓｅＩＩＩ様ドメインとｄｓＲＢＤがｄｓＲＮＡの結合と分解に関与する。一方、ＰＡＺドメインは、ＰＡＺドメインとＰＩＷＩドメインを有するＡｒｇｏｎａｕｔｅ群に属するタンパク質との結合に関与していると考えられている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
Ａｒｇｏｎａｕｔｅ群に属するタンパク質においては、ＰＩＷＩドメインがＲＮＡとの結合やＤｉｃｅｒとの結合に関与していることが報告されている（例えば、非特許文献４及び５）。
しかし、ＲＩＳＣの詳細な構成分子やその機能に関しては、現在明らかではない。
【０００６】
【非特許文献１】
「ジ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、（イギリス）、２００２年、２１巻、２１号、ｐ．５８６４−５８７４
【０００７】
【非特許文献２】
「ジ・エンボ・ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、（イギリス）、２００２年、２１巻、２１号、ｐ．５８７５−５８８５
【０００８】
【非特許文献３】
「ジーンズ・アンド・ディヴェロップメント（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、（アメリカ）、２００２年、１６巻、９号、ｐ．１０２５−１０３１
【０００９】
【非特許文献４】
「メカニズム・オブ・ディヴェロップメント（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、（イギリス）、２００１年、１０８巻、１−２号、ｐ．１２１−１３３
【００１０】
【非特許文献５】
「カレント・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、（アメリカ）、２００３年、１３巻、１号、ｐ．４１−４６
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ＲＮＡｉを初めとするＰＴＧＳは、これまで遺伝子をノックアウトすることによる遺伝子機能の解析などに用いられてきたが、それ以外にも応用性は極めて広く、特にヒトの病気を治療するためのＲＮＡ医薬品の開発に多大な貢献をすることが期待されている。例えば、癌細胞特異的に発現し、癌細胞の増殖に関与する遺伝子に対応するｓｉＲＮＡを、癌細胞に導入することにより、その遺伝子の発現を転写後抑制し、癌細胞の増殖を止め得るであろう。しかし、そうしたＰＴＧＳの利用に際し、ＰＴＧＳをうまく制御するためには、ＰＴＧＳのメカニズムを詳細に明らかにする必要がある。
【００１２】
そこで、本発明は、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するポリペプチド及び、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒト２２番染色体長腕の塩基配列を決定し、新規遺伝子の同定をするなかで、ＰＡＺドメインとＰＩＷＩドメインを有するＡｒｇｏｎａｕｔｅ群に属するタンパク質をコードする新規遺伝子ＰＩＷＩＬ３を同定し、そのｃＤＮＡを単離した。ノーザン・ハイブリダイゼーション法を用いて、ヒトＰＩＷＩＬ３遺伝子の発現を調べたところ、ヒト生体組織では、精巣特異的に発現が検出された。さらに、ＰＩＷＩＬ３タンパク質とヒトＤｉｃｅｒタンパク質を培養細胞で発現させたところ、これらタンパク質同士が結合することが明らかになり、本発明が完成するに至った。
【００１４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列からなる。
また、ストリンジェントな条件下で、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズし、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するタンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチドであってもよい。
【００１５】
構造上は、例えば、遺伝子多型、クローニングの際のエラー、あるいは人為的変異導入等により、配列番号１の塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失するか、置換するか、または付加されたポリヌクレオチドであることが考えられる。また、他の構造上の特徴を持つ例として、配列番号１のポリヌクレオチドや、配列番号１の塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失するか、置換するか、または付加されたポリヌクレオチドについて、それらのポリヌクレオチドの一部からなるポリヌクレオチド、またはそれらのポリヌクレオチドに不特定な塩基配列のポリヌクレオチドが付加されたポリヌクレオチドであって、最低限Ｄｉｃｅｒと結合するドメインをコードしているポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１６】
ここで、ハイブリダイゼーションの際のストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件とは、５ｘＳＳＣの塩濃度において約６５℃以上でハイブリダイズさせることと同じストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件をいう。実際上、ホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えるか、ハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度を変え、二本鎖ＤＮＡの変性温度Ｔｍを調節することによって、ハイブリダイゼーションの温度を変えてもよい。即ち、ホルムアミドを１％添加することにより約０．５℃だけＴｍは下がるので、例えば、５０％ホルムアミド存在下で５ｘＳＳＣの塩濃度では、ストリンジェントな条件は約４０℃以上となる。また、塩濃度を約二分の一にするとＴｍは約１０℃上がるので、例えば、２ｘＳＳＣの塩濃度では、ストリンジェントな条件は約５５℃以上となる。
【００１７】
さらに、本発明に係るポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）である。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加したアミノ酸配列からなり、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合することを特徴とするポリペプチド。
【００１８】
さらに、本発明に係るベクターは、上記いずれかのポリヌクレオチドを含み、本発明に係る細胞はこのベクターを保持する細胞である。この細胞は、例えば、大腸菌のような原核生物でも、酵母のような単細胞真核生物でも、昆虫や哺乳類などの培養細胞でもよい。
【００１９】
さらに、本発明に係る複合体は、上記ポリペプチドとＤｉｃｅｒタンパク質を含む。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２１】
なお、  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＆  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ  （Ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）や、Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．Ｇ．  Ｓｅｉｄｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｋ．  Ｓｔｒｕｈｌ  （Ｅｄ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集は、当業者が当然に参考にするものであり、そこに記載の方法は当業者であれば容易に実施できると考えられる。そこで、本明細書の実施の形態及び実施例に特に詳細な説明をしていない場合、これら標準的なプロトコールに記載の方法や、あるいはそれを修飾、若しくは改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合、当業者は通常それらに添付のプロトコールを用いるため、特に説明が無い場合は、添付のプロトコールを用いるものとする。
【００２２】
また、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。当業者であれば、本明細書で開示されている本発明の意図並びに技術的範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができる。
【００２３】
＜ＰＩＷＩＬ３遺伝子の同定とｃＤＮＡの単離＞
本発明者らは、ヒト２２番染色体長腕の全塩基配列を決定し、新規遺伝子の同定をするなかで、ＰＩＷＩＬ３遺伝子を同定した。この遺伝子を含む染色体領域で、エキソン／イントロン構造を予測し、エキソン領域に相補的なＰＣＲプライマー・ペアを用いたＰＣＲによってＰＩＷＩＬ３ｃＤＮＡを増幅させた。さらに、５’末端及び３’末端にＲＡＣＥ法を適用し、ＰＩＷＩＬ３完全長ｃＤＮＡを得て、塩基配列を決定した（配列番号１）。
【００２４】
なお、ｃＤＮＡを得るには、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよく、ＰＣＲで増幅してもよく、ＲＡＣＥ法等によってＤＮＡを伸張させてもよく、上記の様に、これらを組み合わせてもよい。また、ｃＤＮＡを化学合成してもよい。
【００２５】
＜Ｄｉｃｅｒタンパク質との複合体＞
ＰＩＷＩＬ３遺伝子とＤｉｃｅｒ遺伝子をそれぞれ組み込んだ発現ベクターを、同時に適当なホストに導入し、発現させると、ホスト内でＰＩＷＩＬ３タンパク質とＤｉｃｅｒタンパク質は結合し複合体が生じる。発現ベクターは、導入するホストで機能するプロモーターを備えていれば、どんなベクターでもよく、プラスミドベクターでも、ウイルスベクターでもよい。ホストは、ほ乳類や昆虫などの培養細胞、イーストなどの単細胞真核生物、大腸菌等の原核生物など、遺伝子導入できれば、どんな細胞でもよい。また、一過的発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の系を用いてもよく、また、ネオマイシン耐性遺伝子などを同時に導入し、Ｇ４１８等の薬剤を用いて発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞のクローンを選択する永久発現（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の系を用いてもよい。遺伝子導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ウイルス感染法など、常法に従って行う。
【００２６】
このようにして、これらのタンパク質を発現させた細胞を常法により破壊する。これらのタンパク質を含み、細胞内で形成された複合体は、どちらかのタンパク質に対する抗体を用いた免疫沈降法で回収することができる。あるいは、どちらかのタンパク質がタグ付きの融合タンパク質として発現するように、あらかじめタグをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターの中でｉｎ  ｆｒａｍｅになるように遺伝子と融合させておき、タグに対する抗体を用いた免疫沈降法を利用して、これらのタンパク質を含んだ複合体を回収することも可能である。
【００２７】
また、それぞれの発現ベクターを別々にホストの細胞に導入し、そのポリペプチド自体あるいはタグに対する抗体を用いた免疫沈降法を利用して、発現させたポリペプチドを別々に単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより、複合体を形成することも可能である。
【００２８】
また、ヒト組織やヒト培養細胞から、どちらかのタンパク質に対する抗体を用いた免疫沈降法で回収することもできる。この場合、細胞を破壊する時の条件などを調整することにより、複合体を回収するか、それぞれのポリペプチドを単独で回収するかを選択することができる。単独で回収した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合することにより、複合体を形成することができる。
【００２９】
以上のような発現系を用いて、ＰＴＧＳのメカニズムを明らかにすることができる。例えば、ＲＩＳＣの詳細な構成分子は、回収した複合体に結合して回収される他の因子を解析することにより、明らかになる。また、ＲＮＡｉを実施する際、ＰＩＷＩＬ３を同時に発現させ、ＲＮＡｉに対する効果を調べることにより、ＰＩＷＩＬ３がＰＴＧＳでどのような機能を担っているか、明らかになる。
【００３０】
【実施例】
＜ヒトＰＩＷＩＬ３遺伝子の同定とｃＤＮＡの単離＞
発明者らは、ショットガン配列決定の戦略により、ヒト２２番染色体の全塩基配列を決定した。２２番染色体領域で、ＧＥＮＳＣＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｓｃａｎ．ｈｔｍｌ）、ＧＲＡＩＬ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／）、ＭＺＥＦ（ｈｔｔｐ：／／ａｒｇｏｎ．ｃｓｈｌ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｆｉｎｄｅｒ／）のプログラムによって、エキソン予測を行い、タンパク質をコードする新規遺伝子の存在が推定された。この新規遺伝子は、ＰＡＺドメインとＰＩＷＩドメインを有するＡｒｇｏｎａｕｔｅ群に属することが予測された。そこで、この遺伝子をＰＩＷＩＬ３と名付けた。
【００３１】
以下、図１を参照しながら、ＰＩＷＩＬ３ｃＤＮＡの単離について詳細に述べる。
新規遺伝子ＰＩＷＩＬ３に対応するｃＤＮＡをクローニングするため、まず、この遺伝子が発現している組織を調べた。Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、予測されたエキソン中に存在するＰＩＷＩＬ３−Ｆ３ａとＰＩＷＩＬ３−１７６６Ｒのプライマーペアを用いて、９４℃で２分間処理後、９４℃  １０秒−６２℃  ５秒−７２℃  １５秒のサイクルを３０回繰り返し、７２℃で５分間処理する条件でＰＣＲを行ったところ、精巣特異的に特定のｃＤＮＡ断片が増幅した。なお、ＰＣＲポリメラーゼは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）を用いた。以下にプライマーの配列を示す。
ＰＩＷＩＬ３−Ｆ３ａ：      ５’−  ＴＧＴＧＣＣＡＣＡＴＧＡＣＡＧＧＴＣＴＡＡＣ  −３’    ［配列番号：３］
ＰＩＷＩＬ３−１７６６Ｒ：    ５’−  ＡＡＣＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＣＡ  −３’    ［配列番号：４］
【００３２】
次に、全長ｃＤＮＡを単離するため、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の精巣ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＰＩＷＩＬ３−１ＦとＬＬＮ１１のプライマーペア及び１６２５Ｆと３ＲＡＣＥ−３０２Ｒのプライマーペアを用いて、上記と同条件でＰＣＲを行った。以下にプライマーの配列を示す。
ＰＩＷＩＬ３−１Ｆ：  ５’−  ＧＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＴＴＡＧＡＣ  −３’    ［配列番号：５］
ＬＬＮ１１：      ５’−  ＡＡＣＡＡＴＣＡＡＴＧＣＣＡＡＣＧＡＡＣＡ  −３’      ［配列番号：６］
１６２５Ｆ：      ５’−  ＧＣＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＧＴＧ  −３’        ［配列番号：７］
３ＲＡＣＥ−３０２Ｒ：  ５’−  ＧＴＧＡＣＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＴＣＴＴＴＴＣ  −３’    ［配列番号：８］
増幅されたＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングし、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製ＡＢＩ３７７  ＤＮＡ  シークエンサーを用いて、塩基配列を決定したところ、ゲノムＤＮＡ配列と一致し、予測されたエクソンが実際にｃＤＮＡをコードしていることが明らかになった。
【００３３】
完全長ｃＤＮＡを単離するため、Ｍａｒａｔｈｏｎ  Ｒｅａｄｙヒト精巣ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）法によって、ｃＤＮＡの５’末端及び３’末端を得、全長の塩基配列を同様に決定した。ＲＡＣＥに用いたプライマーは、それぞれ、ＰＩＷＩＬ３−ＲＡＣＥ１６７Ｒ及びＰＩＷＩＬ３−３ＲＡＣＥ−１９３Ｆで、塩基配列は以下の通りである。
ＰＩＷＩＬ３−ＲＡＣＥ−１６７Ｒ  ：      ＡＣＡＴＧＣＴＴＣＡＴＡＴＣＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴ  ［配列番号：９］
ＰＩＷＩＬ３−３ＲＡＣＥ−１９３Ｆ  ：      ＡＧＡＡＣＴＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＧＧＣＴＴＧ      ［配列番号：１０］
こうして得られた部分的なｃＤＮＡを、常法の遺伝子組換えの手法によって、一続きのＤＮＡに融合し、完全長のＰＩＷＩＬ３ｃＤＮＡとした。このｃＤＮＡがコードしているポリペプチドのアミノ酸配列に対し、Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｆａｍ／）  のプログラムを用いてモチーフ構造を決定したところ、ＰＡＺドメインとＰＩＷＩドメインを有することが確認された。
【００３４】
＜免疫沈降アッセイ＞
ＰＩＷＩＬ３  タンパク質がヒトＤｉｃｅｒ  タンパク質と結合することは、以下のように免疫沈降アッセイによって確認された。
まず、ＰＩＷＩＬ３  タンパク質のアミノ酸配列の１アミノ酸目からストップコドンまで  をコードするＤＮＡを増幅させるため、ｃＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーペアを用いて上記と同条件でＰＣＲを行い、  増幅したコード領域をｐＴｒｉＥＸ１．１に組み込んだ。
ＰＩＷＩＬ３−ｐＴｒｉ／ＢｓａＩ−Ｆ  ：
ＣＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＣ        ［配列番号：１１］
ＰＩＷＩＬ３−ｐＴｒｉ／ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｒ  ：
ＴＴＣＴＧＴＡＴＡＣＣＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＡＧＴＴＧ          ［配列番号：１２］
同様に、Ｄｉｃｅｒも、アミノ酸配列の１アミノ酸目からストップコドンまで  をコードするＤＮＡを増幅させるため、ヒトＤｉｃｅｒ  ｃＤＮＡを鋳型とし、下記のプライマーペアを用いて上記と同条件でＰＣＲを行い、  ｐ３ＸＦＬＡＧ７．１に組み込んだ。
ＤＩＣＥＲ−ＦＬＡＧＲ４  ：
ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧ            ［配列番号：１３］
ＤＩＣＥＲ−ＦＬＡＧＦ２  ：
ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧ            ［配列番号：１４］
これらのベクターｐＴｒｉＥＸ１．１及びｐ３ＸＦＬＡＧ７．１は、挿入遺伝子をほ乳類細胞中で発現させるためのエンハンサー／プロモーターを有し、さらに挿入遺伝子がコードするタンパク質を、それぞれＨｉｓタグあるいはＦｌａｇタグと融合した形で発現させることができるように設計されている。従って、ここでは、ＰＩＷＩＬ３  タンパク質はＨｉｓ  タグと、Ｄｉｃｅｒタンパク質はＦｌａｇタグと融合した形で発現する。
【００３５】
これら発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にＦｕｇｅｎｅ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔし、３６時間培養後、細胞を回収する。回収した細胞を破砕して、得られた粗抽出物を抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降し、沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウエスタン・ブロッティングを行った。
【００３６】
図２に示すように、抗Ｆｌａｇ抗体でＦｌａｇ−Ｄｉｃｅｒ融合タンパク質  を免疫沈降すると、Ｈｉｓ−ＰＩＷＩＬ３が共沈することから、ＰＩＷＩＬ３はＤｉｃｅｒの結合タンパク質であることがわかる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、Ｄｉｃｅｒタンパク質と結合するポリペプチド及び、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することができる。
【００３８】
【配列表】
2004305129.tif 000003
2004305129.tif 000004
2004305129.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＰＩＷＩＬ３ｃＤＮＡの構造と一実施例に使用されたプライマーの位置と合成したＤＮＡ断片を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、Ｄｉｃｅｒタンパク質とＰＩＷＩＬ３タンパク質が結合していることを示す図である。
【図１】
2004305129.tif 000021
【図２】
2004305129.tif 000022