(57)【要約】【課題】金コロイドと抗体の結合体を効率よく作製する方法、及び抗原の検出を感度良く行う免疫測定法を提供すること。【解決手段】金コロイド溶液のｐＨを弱酸性に調整し、その後抗体溶液と混合することを特徴とする、金コロイドと抗体の結合体を作製する方法、及び前記方法により作製した結合体を使用することを特徴とする免疫測定方法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
金コロイド溶液のｐＨを酸性に調整し、その後抗体溶液と混合することを特徴とする、金コロイドと抗体の結合体を製造する方法。
【請求項２】
該ｐＨが４．２〜６．７の範囲内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該抗体が抗インフルエンザウイルス抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該抗インフルエンザウイルス抗体が抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法により金コロイドと抗体の結合体を製造し、これを使用することを特徴とする、免疫測定法。
【請求項６】
フロースルーアッセイ方法である、請求項５に記載の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金コロイドと抗体の結合体を製造する方法、該方法により作製される結合体を使用する免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫測定法等において、試料中のウイルス等の抗原を視覚的に検出するため、抗体が結合した金コロイド結合体が利用されている。従来、金コロイドと抗体との結合体の調製はｐＨ７〜１０程度の中性から弱アルカリ状態で行われていた（例えば、非特許文献１参照）。しかし、従来の方法で作成した金コロイド−抗体結合体を使用して、免疫測定法により前記抗体の抗原の検出を行うと、十分な感度が得られないという問題があった。この原因として金コロイドと抗体の結合効率が悪いという点が推測された。
【０００３】
【非特許文献１】
イムノゴールド法、横田貞記、藤森修  編、ソフトサイエンス社発行、平成４年４月２０日、ｐ．３６−４３
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率よく結合された金コロイドと抗体との結合体を製造する方法及び抗体により抗原の検出を感度良く行える免疫測定方法、を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、金コロイド溶液のｐＨを酸性に調整し、その後抗体溶液と混合することを特徴とする、金コロイドと抗体の結合体を製造する方法により解決されることが見出された。
上記方法は、ｐＨが４．２〜６．７の範囲内であることが特に好ましい。
また、本発明は、上記抗体が抗インフルエンザウイルス抗体である、上記方法に関する。また本発明は、上記抗インフルエンザウイルス抗体が抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体である、上記方法に関する。
また、上記課題は、上記方法により金コロイドと抗体の結合体を製造し、これを使用した免疫測定方法により解決される。
従来の方法で作成した金コロイド−抗体結合体を使用して、免疫測定法により前記抗体の抗原の検出を行うと、十分な感度が得られないのに対し、本発明の方法により、金コロイド−抗体結合体を高い効率で製造することができる。また、本発明の方法により製造される金コロイドと抗体との結合体を免疫測定法において使用することにより、感度の高い測定を行うことができる。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下本発明の方法を説明する。
（金コロイド溶液）
本発明の方法は、金コロイド溶液と抗体溶液とを混合して金コロイドと抗体の結合体を作製する方法において、金コロイド溶液を、弱酸性、好ましくは４．２〜６．７に調製することを特徴とする。
例えば、金コロイド溶液は通常、ｐＨ３．５〜４．５程度の酸性溶液で販売されているので、これに緩衝液、例えばクエン酸緩衝液、燐酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を加えて、室温において、弱酸性、好ましくは４．２〜６．７、より好ましくは５．７〜６．７、さらに好ましくは６．２〜６．７に調製する。上記ｐＨの範囲内では、金コロイドと抗インフルエンザウイルス抗体の結合効率がより高くなるため好ましい。使用する金コロイド溶液の濃度は特に限定されないが、例えば塩化金酸として０．０１（ｗ／ｖ）％程度である。金コロイド溶液を作製する溶媒は、水であることが好ましい。
【０００７】
（抗体溶液）
本発明の方法において、金コロイドと結合させて結合体を作成する抗体としては、抗インフルエンザウイルス抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＨＡＶ抗体、抗ＨＢｃ抗体、ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ＥＢＶ抗体、抗ＮＬＶノーウォーク様ウイルス抗体等のウイルス抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗溶連菌抗体、抗百日咳菌抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗レプトスピラ抗体、抗トレポネーマ・パリダム抗体、抗トキソプラズマ・ゴンディ抗体、抗ボレリア抗体、抗炭疽菌抗体、抗ＭＲＳＡ抗原等の細菌抗体、抗マイコプラズマ脂質抗体、抗大腸菌抗体、抗サルモネラ抗体、抗ブドウ球菌抗体、抗カンピロバクター抗体、抗ウェルシュ菌抗体、抗腸炎ビブリオ菌抗体、抗ベロトキシン抗体、抗ヒトトランスフェリン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、抗ヒト免疫グロブリン抗体、抗マイクログロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗トロポニン抗体、抗ＨＣＧ抗体、抗クラミジア・トラコマティス抗体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体、抗β−グルカン抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗ＨＩＶ抗体、抗ロタウイルス抗体、抗パルボウイルス抗体、抗ＲＳウイルス抗体、抗ＲＦ抗体、あるいは、ヒト繊毛製ゴナドトロピン等のペプチドホルモン、ステロイドホルモン等のステロイド、エピネフリンやモルヒネ等の生理活性アミン類、ビタミンＢ類等のビタミン類、プロスタングランジン類、テトラサイクリン等の抗生物質、細菌等が産生する毒素、各種腫瘍マーカー、農薬などに対する抗体、または、病原微生物に由来する核酸成分に相補的なヌクレオチド等を挙げることができるが、これらに限定されない。抗インフルエンザウイルス抗体としては、抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体、抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が挙げられる。これらの中で、抗インフルエンザウイルス抗体、特に抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体と金コロイドの結合体との結合体の作成の効率が従来の方法よりも非常に良好となるため、好ましい。
【０００８】
抗体の濃度は、抗体の種類等により適宜決定することができる。例えば、公知の方法により作製した抗インフルエンザウイルス抗体は、適当な濃度、好ましくは５０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００μｇ／ｍＬになるように調製する。使用する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など、どのような抗体であってもよい。このとき使用する溶媒は特に限定しないが、例えばホウ酸ナトリウム溶液で透析してもよい。
【０００９】
（金コロイド溶液と抗体溶液の結合）
弱酸性に調製した金コロイド溶液に、上述した抗体溶液を加える。例えば、抗インフルエンザウイルス抗体を使用した場合、抗体の最終濃度が１〜１０μｇ／ｍＬとなるような量の抗インフルエンザウイルス抗体を加えることが好ましい。１μｇ／ｍＬ以下であると感度不足となり、また１０μｇ／ｍＬ以上であると、抗体が架橋し合い金コロイドが凝集する場合がある。また金コロイドに結合しなかった抗体が残った場合、抗体が結合した金コロイドと抗原の取り合い（競合）してしまい感度低下の原因となる。
上記方法により、金コロイド溶液と抗体溶液の結合体の溶液が得られる。この溶液から金コロイド溶液と抗体溶液の結合体を例えば以下のようにして単離することができる。
【００１０】
溶液を一定時間置いた後、ブロッキング剤としてＢＳＡ等を添加し、穏やかに攪拌した後、全量を遠心管に移し、遠心する。遠心後、上清を吸引廃棄し、沈殿している抗体結合金コロイドを得ることができる。この抗体結合金コロイドに緩衝液を加え、浮遊させて、フロースルーアッセイ法等の免疫測定法に使用することができる。
【００１１】
（免疫測定法）
免疫測定法とは、免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を免疫学的手法により検出または定量する分析方法の総称として用いられる。具体的には、免疫拡散法、酵素免疫測定法等種々の方法が実用化されている。このような免疫測定法の中で、フロースルーアッセイ方法は、ラテラルフロー式、タンジェンシャルフロー式等と並ぶメンブランを使用したイムノクロマトグラフィー法の１種であり、操作が簡便で一般的な検査の場に普及している。本発明の方法により製造される金コロイドと抗体との結合体は、フロースルーアッセイ方法のような簡易式の免疫測定法において非常に有用である。
フロースルーアッセイ方法による免疫測定方法についての詳細は、例えば“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｅｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｓａ  Ｖｉｃｋｅｒｓ，  ｐ６−８、及び特公平７−３４０１６号（ハイブリテックの特許）に記載されている。
本発明の結合方法により作製された金コロイドと抗体との結合体は、上記免疫測定法において標識化抗体として使用すると、高い結合効率で結合体が生成しているため、低濃度の抗原を感度良く検出することができる。
【００１２】
【実施例】
［実施例１］
１．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．２５６，  ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）は、３７℃でインキュベーター中で維持し、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いた。ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したたＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からアフィニティークロマトグラフィー法によってＩｇＧを精製した（クローン名９Ｄ１２）。
【００１３】
２．金コロイドのｐＨによる抗体の結合効率
以下のようにして、ｐＨによる金コロイドと抗体の結合効率を調べた。
Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原（ＮＰ：Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、インフルエンザウイルスの核タンパク）を３μｇ／ｍＬになるように調整し、９６穴プレートに１００μＬ／穴づつ入れ、４℃で１７時間静置した。１７時間後、プレートに吸着しなかった余分なＢ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を除去、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳ（−）ｐＨ７．０で洗浄しＢＳＡ，ＰＢＳを含む緩衝液０．５％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含むＰＢＳ（−）ｐＨ７．０でブロッキングを行った。ブロッキングは４℃で１７時間静置することにより行った。
【００１４】
９ｍＬの金コロイド液に１００ｍＭのクエン酸緩衝液、燐酸緩衝液、又はホウ酸緩衝液のいずれかの液１ｍＬ加え、表１に示される各ｐＨに調整した金コロイド溶液を調製した。次に、１００μｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体２００μＬ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）を混ぜ合わせ、５分間室温で放置した。５分後、ブロッキング剤としてＢＳＡを最終濃度が１％となるような量において添加し、１０分間穏やかに撹拌した。１０分後、遠心管に移し、７３００ｒｐｍにて３０分間の遠心を行い、遠心上清を一定間隔で希釈したものを、上記光源を吸着させたプレートに入れた。
また、測定吸光度から抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の量を波長２８０ｎｍにおける吸光度からもとめ、一定間隔で希釈したものを、上述したように抗原を吸着させたプレートに入れた。
【００１５】
上記遠心上清サンプルまたは検量線作成のための抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の希釈液１００μＬをプレートに入れた後、３７℃で、３０分間反応を行った。３０分後、未反応物を除去、洗浄した。次にペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を２０００倍に希釈し１００μＬづつ各穴に入れ、３７℃で、３０分間反応させた。３０分後、未反応物を除去、洗浄した。次に基質液ＴＭＢ（テトラメチルベンチジン）を１００μＬづつ各穴に入れ、３７℃で、１５分間反応させた。１５分後、０．６Ｍ硫酸を１００μＬづつ各穴に入れ、反応を停止した。反応停止後、吸光光度計にて４５０ｎｍ，６３０ｎｍの吸光を測定した。
【００１６】
検量線作成のためにアッセイを行った抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の各希釈での吸光度を横軸に、また各希釈での抗体量を縦軸に取り検量線を作成した。
作成した検量線から金コロイド溶液に抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を感作した後の、遠心上清に存在する抗体量を求めた。感作する時の抗体の最終濃度（初期抗体量）が２．０μｇ／ｍＬであることから、２．０μｇ／ｍＬから未感作抗体量（遠心上清サンプル中の抗体量）を引くことで金コロイドに結合した抗体量を算定した。
その結果、表１に示すように従来の方法（ｐＨ９．２）に比べ、本発明の方法（ｐＨ４．２〜６．７）により、約１．３〜約２．３倍の抗体量が金コロイドに結合した。
【００１７】
表１
2004294157.tif 000002
【００１８】
［実施例２］
フロースルー型デバイスを用いた、Ｂ型インフルエンザウイルスの検出
▲１▼固相デバイスの作成
図１のようなデバイス装置のアダプターホールＡを通して、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（クローン名Ａ３）を１２μＬ塗布し、４５℃、４０分間乾燥器で乾燥させた。クローンの製作と精製は実施例１で示した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製と同一の方法で行なった。
▲２▼抗体結合金コロイドの作成
９ｍＬの金コロイド溶液に１００ｍＭクエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．７、６．２）、１００ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．７），１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）をそれぞれ１ｍＬ加えた。次に、１００μｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体２００μＬ（最終濃度２μｇ／ｍＬ）を混ぜ合わせ、５分間室温で放置した。５分後、ブロッキング剤として１０％ＢＳＡを１ｍＬ添加し、１０分間穏やかに撹拌した。１０分後、遠心管に移し、７３００ｒｐｍにて３０分間の遠心を行い、遠心後上清を吸引除去し沈渣を１％ＢＳＡ＋１５０ｍＭＮａＣｌ＋含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）０．９ｍＬで浮遊させた。
【００１９】
▲３▼サンプル
Ｂ型インフルエンザウイルスの希釈系列を５％ＢＳＡ＋４．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋０．１ｍｇ／ｍＬ  ＨＢＲ１＋１５０ｍＭＮａＣｌ含むリン酸緩衝Ｂｆ（サンプル希釈液）で調製した。
▲４▼評価
サンプル５００μＬにＰＢＳ（−）で１０倍希釈した抗体結合金コロイド液を１２５μＬ加え混合し１０分間静置した。１０分後０．２２μｍろ過し、デバイスへ５００μＬ滴下した。液が全てメンブランへ吸収された後アダプターを外しシグナルの有無を判定した。
▲５▼判定結果
2004294157.tif 000003
【００２０】
【発明の効果】
本発明の方法により、金コロイドと抗体との結合を効率よく行うことができ、インフルエンザウイルスの検出を感度良く行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で用いたフロースルー型デバイスの平面図である。
【図２】図１のＩ−Ｉ’切断端面図である。
【符号の説明】
Ａ：穴
ａ：アダプター
ｂ：シート状担体
【図１】
2004294157.tif 000004
【図２】
2004294157.tif 000005