(57)【要約】【課題】従来技術と全く異なった発想からの新規な動物細胞培養用培地、及びそれを利用した動物細胞培養方法を提供すること。【解決手段】動物細胞培養開始から終了までの全ての期間、もしくはその一部の期間で、常法で用いられる動物細胞培養用培地の代わりに、シスタチン、もしくはそのスーパーファミリーに属する単独、もしくは複数のものを含む動物細胞培養用培地を使用して動物細胞を培養する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
システインプロテアーゼ阻害剤を含む動物細胞培養用培地。
【請求項２】
シスタチン、もしくはそのスーパーファミリーに属する単独、もしくは複数のものを含む動物細胞培養用培地。
【請求項３】
システインプロテアーゼ阻害剤が、シスタチン、もしくはそのスーパーファミリーに属する単独、もしくは複数のものである請求項１記載の動物細胞培養用培地。
【請求項４】
シスタチン、もしくはそのスーパーファミリーに属するものが、シスタチンＣである請求項１〜３記載の動物細胞培養用培地。
【請求項５】
培地中のシスタチンＣの濃度が０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌである請求項１〜４記載の動物細胞培養用培地。
【請求項６】
さらに成長因子が含まれることを特徴とする請求項１〜５記載の動物細胞培養用培地。
【請求項７】
動物細胞培養開始から終了までの全ての期間、もしくはその一部の期間で、常法で用いられる動物細胞培養用培地の代わりに請求項１〜６のいずれか１項記載の動物細胞培養用培地を使用することを特徴とする動物細胞培養方法。
【請求項８】
培養される細胞が表皮系細胞、上皮系細胞、もしくはそれぞれの幹細胞であることを特徴とする請求項７記載の動物細胞培養方法。
【請求項９】
細胞が、皮膚、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、口腔粘膜から取り出される細胞であることを特徴とする請求項８記載の動物細胞培養方法。
【請求項１０】
培養方法が重層化するためのものである請求項７〜９記載の動物細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】
本発明は、生物学、医学等の分野における動物細胞培養用培地、それを利用した動物細胞培養方法に関する。
【従来の技術】
医療技術の著しい発展により、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。しかしながら、未だにドナー数が少なく、角膜移植を例にとると、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人出てくるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため、次なる医療技術が求められているのが現状である。
このような背景のもと、以前より、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植しようという技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚及び培養皮膚があげられよう。ここで、合成高分子を用いた人工皮膚は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用皮膚としては好ましくない。一方、培養皮膚は本人の正常な皮膚の一部を所望の大きさまで培養したものであるため、これを使用しても拒絶反応等の心配がなく、最も自然なマスキング剤と言える。
特公平２−２３１９１号公報には、ヒト新生児由来表皮角化細胞を、ケラチン組織の膜が容器表面上に形成される条件下で培養し、生成したケラチン組織膜を酵素を用いて剥離させることを特徴とする移植可能な培養細胞膜を製造する方法が記載されている。具体的には、３Ｔ３細胞をフィーダーレイヤーとして用いることで、播種した表皮細胞は増殖し、しかもそのまま重層化してしまうというものである。この方法は、今や表皮角化細胞を培養する方法の主流にまでなっている。しかしながら、この方法には欠点があり、すなわち上記３Ｔ３細胞がマウス由来の細胞である点がよく指摘される。一般的には、表皮角化細胞を培養している間にこの３Ｔ３細胞は消失すると言われているが、未だに１００％消失したことを証明することができていないのが現状である。
この点を解決すべく、これまでに種々の検討がなされてきた。例えば、別の培養基材上で３Ｔ３細胞を培養し、表皮角化細胞に有効な物質を培地中に出させ、その上清だけを表皮角化細胞を培養している系に移す方法があげられる（特開平９−３１３１７２号、特開２００１−１４９０７０号）。しかしながら、この方法でも、異種動物の細胞自身の混入は防げても、異種動物細胞が産生するさまざまな蛋白質を分割している訳でなく、基本的に同様な問題が残されている。その他に、ヒト由来の細胞をフィーダーレイヤーとして利用しようとする試みもなされているが、未だに上記３Ｔ３細胞並みの活性を持った細胞が得られておらず、３Ｔ３細胞に代わる有効な技術が強く望まれていた。
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な動物細胞培養用培地、及びそれを利用した動物細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、システインプロテアーゼ阻害剤、並びにシスタチン、もしくはそのスーパーファミリーが生体内の各組織に存在する幹細胞の活性を維持させ、その結果、活発にコロニーを形成させ、増殖させる機能を持つことを見出した。そして、このものにより、細胞は重層化することも見出した。
本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。本発明は、システインプロテアーゼ阻害剤を含む動物細胞培養用培地を提案する。加えて、本発明は、シスタチン、もしくはそのスーパーファミリーに属する一つ、もしくは複数のものを含む動物細胞培養用培地を提案する。更に加えて、本発明は、その培地を用いた動物細胞培養方法を提案する。
【発明の実施の形態】
本発明において、「動物細胞」とはヒトの細胞及びヒト以外の動物の細胞の双方を意味する。
本発明の動物細胞培養用培地としては、システインプロテアーゼ阻害剤が含まれる。システインプロテアーゼ阻害剤とは、システインプロテアーゼを特異的に阻害するタンパク質であり、恒常性維持機構、免疫防御機構に深く係わるものだが、本発明者らは、作用機構は不明だが、このものを含む培地を用いると動物細胞培養時のコロニー形成能が良好となることを見出した。このシステインプロテアーゼ阻害剤としては、具体的には、シスタチン、及びそのスーパーファミリー、ブロメラインインヒビターなどがあげられるが、システインプロテアーゼ阻害剤としての機能を有していれば特に限定されるものではない。本発明では、その中の単独を用いても、もしくは複数個を併用して用いても良い。
本発明の動物細胞培養用培地には、また、シスタチン、及びそのスーパーファミリーが含まれることが好適である。ここでのシスタチン、及びそのスーパーファミリーとは、上記のシステインプロテアーゼ阻害剤としての機能を持つものでも良く、機能を持たないものでも良い。具体的には、オリザシスタチンなどのフィトシスタチン、シスタチン、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、モネリンなどがあげられるが、シスタチン  スーパーファミリーに属するものならば特に制約されるものではない。また、本発明では、その中の単独、もしくは複数個を併用して用いても良い。
本発明では、システインプロテアーゼ阻害剤、シスタチンＣ、及びそのスーパーファミリーに属する物質等の中から選択される１種以上の物質が動物細胞培養用培地に添加されるが、それらの物質の総量は培地量に対し、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌであることが望ましく、好ましくは０．６ｎｇ／ｍｌ〜９ｎｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．８ｎｇ／ｍｌ〜８ｎｇ／ｍｌの濃度であることが望ましい。０．５ｎｇ／ｍｌより小さい濃度の場合、動物細胞幹細胞の活性を維持するには不十分である。また、１０ｎｇ／ｍｌより高い濃度のとき、活性は阻害され逆効果である。
本発明では、さらに各種成長因子を加えても良い。具体的には、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦなどがあげられるが特に限定されるものではない。添加する濃度は２ｎｇ／ｍｌ以上であることが望ましく、好ましくは４ｎｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度であることが望ましい。２ｎｇ／ｍｌより小さい濃度の場合、添加効果は認められないため、不十分である。
本発明は、こうした培地を利用することで動物細胞培養時のコロニー形成能が向上する。この培地を利用する時期は特に限定されるものではないが、培養開始から終了まで全ての期間でも良く、また一部の期間だけ、常法で用いられる培地と置き換えても良い。しかしながら、培養される細胞の活性を維持させるには前者の全ての期間で用いる方が好都合である。
培養基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。例えば、培養する細胞の基材への付着性を高める等の目的でコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、マトリゲルなどが被覆されている培養基材を用いても良い。
本発明に使用される好適な細胞としては、皮膚などの表皮系細胞、角膜、肝臓、消化器官、乳腺、前立腺、毛根、気管、口腔粘膜などの上皮系細胞、並びにそれぞれの幹細胞などがあげられるが、その種類は何ら制約されるものではない。その他の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
本発明の動物培養用培地を利用すれば、細胞や幹細胞の活性を維持できる。また、この培地を利用すれば重層化する細胞であれば重層化し、上述したような異種動物の細胞を使わなくても良くなる。これらの技術は組織再生、細胞分化に係わる再生医療の技術として極めて有効なものと考えられる。
【実施例】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１〜４】
深麻酔下の白色家兎角膜輪部から常法に従って角膜上皮組織を採取し、０．１％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ処理することで得られた細胞を、市販のポリスチレン製９６穴マルチウェル（ベクトン・ディッキンソン・ラブウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）社製ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）３０７２）上に播種した。その際の細胞播種濃度は１ウェル当たり５００個となるようにした（使用培地：ＭＣＤＢ１５１、５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレニウム、０．３ｍＭＣａ２＋配合、３７℃、５％ＣＯ２下）。さらに、表１に示す物質をそれぞれ添加した。播種後、培養８日目の培養の様子をそれぞれ図１〜４、評価結果を表２に示す。その際、コロニー形成能は式（１）に従って求めた。
コロニー形成能（％）＝（コロニー数／播種細胞数）×１００    式（１）
【表１】
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【表２】
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【比較例１〜３】
実施例１と同様に、深麻酔下の白色家兎角膜輪部から角膜上皮細胞を得て、市販のポリスチレン製９６穴マルチウェル（ＦＡＬＣＯＮ３０７２）上に播種した。その際の細胞播種濃度は１ウェル当たり５００個となるようにした（使用培地：ＭＣＤＢ１５１、５μｇ／ｍｌインスリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌセレニウム、０．３ｍＭＣａ２＋配合、３７℃、５％ＣＯ２下）。さらに、表３に示す物質をそれぞれ添加した。播種後、培養８日目の培養の様子をそれぞれ図５〜７、評価結果を表４に示す。その際のコロニー形成能は実施例１と同様にして求めた。
【表３】
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【表４】
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実施例１〜４の結果より、培地中にシスタチンＣが含まれていた方がコロニー形成能が高いことが分かる。また、１コロニー内の細胞数は、シスタチンＣにさらに成長因子を加えた培地の方が良好な結果が得られた。
【実施例５】
実施例３（培養８日目）をそのまま延長して培養を行った。４週間後、培養細胞を観察したところ、細胞は重層化していた。以上の結果から、本発明の培養法に従えば、３Ｔ３細胞を使わなくても重層化できるものと考えられる。
【実施例６】
白色家兎から摘出した眼球から、角膜輪部を含む角膜組織を切除した。その切除した組織に存在するシスタチンＣに対し、常法である抗体を用いた免疫染色を行った。その結果、角膜輪部にシスタチンＣが局在化していることが分かった。角膜幹細胞は角膜輪部に多く存在することが知られている。そのことは、シスタチンＣが角膜輪部に局在化し、幹細胞を安定にさせている結果と考えられる。
【発明の効果】
本発明の動物培養用培地を利用すれば、細胞や幹細胞の活性を維持できる。また、この培地を利用すれば重層化する細胞であれば重層化し、上述したような異種動物の細胞を使わなくても良くなる。これらの技術は組織再生、細胞分化に係わる再生医療の技術として極めて有効なものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図２】実施例２によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図３】実施例３によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図４】実施例４によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図５】比較例１によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図６】比較例２によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図７】比較例３によって得られた培養８日目の培地のコロニー形成の様子を示す顕微鏡写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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