(57)【要約】【課題】リポプレックスを始めとする遺伝子治療用ベクターに対して、分画を行うことなく試料全体としての現実的な形状を数量的に表現することができる形状因子測定装置を提供する。【解決手段】形状因子測定装置１は、リポプレックス試料液の粘度を測定する毛細管粘度計２、試料液の流下時間を自動測定するためのレーザセンサ装置３、毛細管粘度計２内の圧力を調整する圧力調整装置４、及び測定された計測値をもとに形状因子を算出する制御演算装置５から構成されている。制御演算装置５は、レーザセンサ装置３、圧力調整装置４を制御して、試料液の粘度を自動測定させ、この測定された結果から演算をして試料液の形状因子を決定する。【選択図】　　　図２
2004069540.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なった容積分率の遺伝子治療用ベクターが含まれる複数の試料液の粘度を毛細管粘度計によりそれぞれ測定し、その測定結果から前記遺伝子治療用ベクターの形状因子を測定する形状因子測定装置であって、
前記複数の試料液それぞれが前記毛細管の所定の標線間を通過する時間を測定する流下時間測定手段と、
前記流下時間測定手段で測定された複数の前記時間からそれぞれの容積分率における相対粘度を算出する相対粘度算出手段と、
前記相対粘度から還元粘度を算出する還元粘度算出手段と、
前記還元粘度と容積分率の関係から固有粘度を算出する固有粘度算出手段と、
シムハ（Ｓｉｍｈａ）の数表における数値から導き出された、前記固有粘度と回転楕円体の長径／短径の軸比の換算式に基づいて、前記固有粘度から前記軸比を前記遺伝子治療用ベクターの形状因子として決定する形状因子決定手段と、
を有することを特徴とする形状因子測定装置。
【請求項２】
前記形状因子決定手段は、
前記遺伝子治療用ベクターの形状が紡錘形回転楕円体の場合は、
Ｖ＝０．０５７（ａ／ｂ）２＋０．６１（ａ／ｂ）＋１．８３
（Ｖ：固有粘度、ａ／ｂ：回転楕円体の長径ａと短径ｂの軸比）
に基づいて、扁平回転楕円体の場合は、
Ｖ＝０．００１（ａ／ｂ）２＋０．５９（ａ／ｂ）＋１．９０
（Ｖ：固有粘度、ａ／ｂ：回転楕円体の長径ａと短径ｂの軸比）
に基づいて、ａ／ｂ＜１００の範囲で、形状因子を決定することを特徴とする請求項１記載の形状因子測定装置。
【請求項３】
光源及び受光部を備えるレーザセンサ装置を有し、
前記流下時間測定手段は、前記レーザセンサ装置を用いることにより、前記試料液が前記所定の標線を通過することを検出することを特徴とする請求項１又は２記載の形状因子測定装置。
【請求項４】
前記毛細管粘度計内の圧力を調整する圧力調整装置を有し、
前記流下時間測定手段は、前記レーザセンサ装置により前記試料液が前記所定の標線の中の最下部の標線以下に流下したことを検出した場合は、前記圧力調整装置により前記毛細管粘度計内を加圧して前記試料液を持ち上げ、前記レーザセンサ装置により前記試料液が前記所定の標線の中の最上部の標線以上に持ち上がったことを検出した場合には、前記圧力調整装置により前記毛細管粘度計内を大気圧にすることを特徴とする請求項３記載の形状因子測定装置。
【請求項５】
前記レーザセンサ装置は、レーザ伝達媒体として光ファイバを有することを特徴とする請求項３又は４記載の形状因子測定装置。
【請求項６】
前記レーザセンサ装置は、前記光ファイバを前記毛細管粘度計の前記所定の標線位置に前記光ファイバの光源側および受光側の中心軸が一致するように固定する光ファイバ支持装置を有することを特徴とする請求項５記載の形状因子測定装置。
【請求項７】
前記複数の試料液を前記毛細管粘度計に順次自動的に供給する自動試料液供給装置を有することを特徴とする請求項１乃至６記載の形状因子測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えばＤＮＡ−脂質複合体（Ｌｉｐｏｐｌｅｘ、以下、リポプレックスという）の形状因子を測定する形状因子測定装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リポプレックスは遺伝子治療用非ウイルスベクターのうち有望な物質の１つである。このリポプレックスの形状は標的細胞に対するＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）感染効率に影響する重要な因子であることが知られており、その形状は連珠状、線状、管状、六法充填体状（豆状）、スパゲッティ・ミートボール状、マップ・ピン状等と様々な形状が報告されている（Ｐ．Ｌ　Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｔ．Ｒ．Ｇａｄｅｋ，Ｍ．Ｈｏｌｍ，Ｒ．Ｒｏｍａｎ，Ｈ．Ｗ．Ｃｈａｎ，Ｍ．Ｗｅｎｚ，Ｊ．Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｇ．Ｍ．Ｒｉｎｇｏｌｄ　ａｎｄ　Ｍ．Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，７４１３（１９８７）、Ｈ．Ｒ　Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｒ．Ｇｈｉｒｌａｎｄｏ，Ｓ．Ｂ．Ｇｕｔｔｍａｎ　ａｎｄ　Ａ．Ｍｉｎｓｋｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２，７１４３（１９９３）、Ｂ．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ，３９５（１９９８）、Ｖ．Ｏｖｅｒｌｅ，Ｕ．Ｂａｋｏｗｓｋｙ，Ｉ．Ｓ．Ｚｕｈｏｒｎ　ａｎｄ　Ｄ．Ｈｏｅｋｓｔｒａ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９，１４４７（２０００））。これらの形状は、これまで電子顕微鏡や原子間力顕微鏡によって観察されているが、これらの形状測定は観察された部分のみの局部的情報を与えるのみであるため、試料全体の平均像を数量的に示してはいるものではない。
【０００３】
一方、リポプレックス形状の数量的表現に活用可能な従来技術として光散乱法、Ｘ線小角散乱法は有力であるが、装置が高価である上に、その解析に高度な専門技術を要するという欠点がある。
【０００４】
これに対して、毛細管による粘度測定法は遙かに単純であり、リポプレックスの平均形状は、リポプレックス稀薄懸濁液の粘度から、マーク−ホウインク（Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ）の式により、以下のように決定できる（Ｈ．Ｍａｒｋ，Ｄｅｒ　ｆｅｓｔｅ　Ｋｏｅｒｐｅｒ，Ｈｉｒｚｅｌ，Ｌｅｉｐｚｉｇ（１９３８）ｐ１０３、Ｒ．Ｈｏｕｗｉｎｋ，Ｊ．ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍ．１５７，１５（１９４１））。
【０００５】
ｌｏｇ［μ］＝ｌｏｇＫ＋αｌｏｇＭ　　　　　　　　　　　　　　（１）
ここで、［μ］は固有粘度、Ｋは粒子と溶媒の組み合わせ及び温度によって定まる定数、αは懸濁粒子の形状を示す形状因子、Ｍは粒子の大きさをダルトン単位で表した量であり、α＝０は固い球状を、α＝２は剛直な線状を示し、０＜α＜２はその中間の形状を示す。マーク−ホウインクの方法によれば、リポプレックス懸濁液を分画（粒子径の大きさによりクラス分け）し、各分画の粒子のＭを決定し、それぞれの懸濁液分画の固有粘度の対数をＭの対数に対してプロットすると、プロットは直線上に並ぶので、この直線から勾配を求めればαを求めることができる。しかしながら、この方法においては、
・α決定のためにいくつかの粒径を異にする分画が必要であるが、各分画で得られた形状が相似形とは限らない、
・各分画でＭを決定する必要があるが、このために別個Ｍを測定する装置が必要となる。また、このために多大な労力と試料量を要する、
・０＜α＜２の中間的形状には円筒状、折れ曲がり線状、円盤状のように様々な形状が考えられる上、αは粒子の固さによっても影響を受ける、という問題点がある。
【０００６】
これに対して、シムハ（Ｓｉｍｈａ）は回転楕円体粒子懸濁液の粘度が粒径に関わらず以下の式で表されることを見出している。
【０００７】
η＝η０（１＋νφ）　　　　　　　　　　　　　　　　（２）
ここで、ηは懸濁液の粘度、η０は分散媒の粘度、νは回転楕円体の長径／短径の軸比（ａ／ｂ）によって定まる定数、φは懸濁粒子の容積分率（懸濁粒子の容積／懸濁液の容積）である。そして、シムハはさらにａ／ｂ＞５０の領域においては、次式が成り立つことを明らかにした（Ｒ．Ｓｉｍｈａ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．４４，２５（１９４０））。
【０００８】
ν＝Ｊ２／１５（ｌｎ２Ｊ−１．５）＋Ｊ２／５（ｌｎ２Ｊ−０．５）＋（１４／１５）　　（３）
ν＝（１６／１５）（Ｊ／ｔａｎ−１Ｊ）　　　　　　　　　　　　　　　　　（４）
ここで、Ｊはａ／ｂであり、式（３）は、紡錘形回転楕円体の場合に成立する式であり、式（４）は、扁平回転楕円体の場合に成立する式である。また、ａ／ｂ＜５０の領域に対しては、個々のａ／ｂにつきνを計算し、ａ／ｂとνに関する数表を報告した（Ｒ．Ｓｉｍｈａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ９２，１３２（１９４０））。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
シムハの理論を用いれば分画を行うことなく、ａ／ｂを求めることができるが、この方法においても以下のような問題点がある。
【００１０】
・ａ／ｂ＞５０は大きすぎる数字であり、現実的なリポプレックス形状ではない。
【００１１】
・ａ／ｂ＜５０での数表は不連続データであるため、単純な演算素子においては粘度測定値をａ／ｂに換算することは難しい。
【００１２】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、リポプレックスを始めとする遺伝子治療用ベクターに対して、分画を行うことなく試料全体としての現実的な形状を数量的に表現することができる形状因子測定装置を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、請求項１記載の本発明は、異なった容積分率の遺伝子治療用ベクターが含まれる複数の試料液の粘度を毛細管粘度計によりそれぞれ測定し、その測定結果から前記遺伝子治療用ベクターの形状因子を測定する形状因子測定装置であって、前記複数の試料液それぞれが前記毛細管の所定の標線間を通過する時間を測定する流下時間測定手段と、前記流下時間測定手段で測定された複数の前記時間からそれぞれの容積分率における相対粘度を算出する相対粘度算出手段と、前記相対粘度から還元粘度を算出する還元粘度算出手段と、前記還元粘度と容積分率の関係から固有粘度を算出する固有粘度算出手段と、シムハ（Ｓｉｍｈａ）の数表における数値から導き出された、前記固有粘度と回転楕円体の長径／短径の軸比の換算式に基づいて、前記固有粘度から前記軸比を前記遺伝子治療用ベクターの形状因子として決定する形状因子決定手段と、を有することを要旨とする。
【００１４】
ここで、「形状因子測定装置」とは、プログラムによって本発明の機能を実現することが可能な演算処理装置を用いて形状因子を測定する機器を総称しており、演算処理装置としてはマイコン、パソコン、スーパーコンピュータ、汎用コンピュータ、オフィス・コンピュータ、ワークステーション、ＰＤＡ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ）などあらゆる形態を含む。また、構成としては、一つからなる演算処理装置、分散されて複数の演算処理装置がネットワーク接続されたシステムなどのいずれの構成であっても良い。
【００１５】
請求項１記載の本発明においては、異なった容積分率の遺伝子治療用ベクターが含まれる試料液を複数用意し、この複数の試料液それぞれが毛細管粘度計の所定の標線間を通過する時間を測定し、測定された複数の時間からそれぞれの容積分率における相対粘度を算出し、また、相対粘度から還元粘度を算出する。そして、還元粘度と容積分率の関係から固有粘度Ｖを算出し、シムハ（Ｓｉｍｈａ）の数表に与えられた数値から導き出された換算式に基づいて、固有粘度から形状因子である回転楕円体の軸比を決定する。これにより、遺伝子治療用ベクターに対して、分画を行うことなく試料全体としての現実的な形状を数量的に表現することができるので、この形状を遺伝子治療に役立てることができる。
【００１６】
請求項２記載の本発明は、請求項１記載の発明において、前記形状因子決定手段は、前記遺伝子治療用ベクターの形状が紡錘形回転楕円体の場合は、Ｖ＝０．０５７（ａ／ｂ）２＋０．６１（ａ／ｂ）＋１．８３（Ｖ：固有粘度、ａ／ｂ：回転楕円体の長径ａと短径ｂの軸比）に基づいて、扁平回転楕円体の場合は、Ｖ＝０．００１（ａ／ｂ）２＋０．５９（ａ／ｂ）＋１．９０（Ｖ：固有粘度、ａ／ｂ：回転楕円体の長径ａと短径ｂの軸比）に基づいて、ａ／ｂ＜１００の範囲で、形状因子を決定することを要旨とする。
【００１７】
請求項２記載の本発明においては、遺伝子治療用ベクターの形状が紡錘形回転楕円体の場合及び扁平回転楕円体の場合には、固有粘度Ｖと回転楕円体の軸比ａ／ｂの関係式が２次の多項式として表現されるので、この式に基づいて簡単に遺伝子治療用ベクターの形状因子を決定することができる。
【００１８】
請求項３記載の本発明は、請求項１又は２記載の発明において、光源及び受光部を備えるレーザセンサ装置を有し、前記流下時間測定手段は、前記レーザセンサ装置を用いることにより、前記試料液が前記所定の標線を通過することを検出することを要旨とする。
【００１９】
請求項３記載の本発明においては、レーザセンサ装置を用いることにより、試料液が所定の標線を通過することを検出する。これにより、正確かつ自動的に試料液の液面が所定の標線を通過する時を把握できるので、以て、精度よく流下時間を測定することができる。
【００２０】
請求項４記載の本発明は、請求項３記載の発明において、前記毛細管粘度計内の圧力を調節する圧力調整装置を有し、前記流下時間測定手段は、前記レーザセンサ装置により前記試料液が前記所定の標線の中の最下部の標線以下に流下したことを検出した場合は、前記圧力調整装置により前記毛細管粘度計内を加圧して前記試料液を持ち上げ、前記レーザセンサ装置により前記試料液が前記所定の標線の中の最上部の標線以上に持ち上がったことを検出した場合には、前記圧力調整装置により前記毛細管粘度計内を大気圧にすることを要旨とする。
【００２１】
請求項４記載の本発明においては、レーザセンサ装置により試料液が所定の標線の中の最下部の標線以下に流下したことを検出した場合は、圧力調整装置が、毛細管粘度計内を加圧して試料液を持ち上げ、レーザセンサ装置により試料液が所定の標線の中の最上部の標線以上に持ち上がったことを検出した場合には、圧力調整装置が、毛細管粘度計内を大気圧にする。これにより、同一試料液において複数回の流下時間の測定を繰り返す場合においても、圧力調整装置が毛細管粘度計内の圧力を自動的に調整するので、試料液を連続的に自動測定することができる。
【００２２】
請求項５記載の本発明は、請求項３又は４記載の発明において、前記レーザセンサ装置は、レーザ伝達媒体として光ファイバを有することを要旨とする。
【００２３】
請求項５記載の本発明においては、レーザセンサ装置は、レーザ伝達媒体として光ファイバを用いてレーザを照射する。これにより、ノイズの影響を回避し、精度高く試料液の液面が所定の標線を通過する時を把握することができる。
【００２４】
請求項６記載の本発明は、請求項５記載の発明において、前記レーザセンサ装置は、前記光ファイバを前記毛細管粘度計の前記所定の標線位置に前記光ファイバの光源側および受光側の中心軸が一致するように固定する光ファイバ支持装置を有することを要旨とする。
【００２５】
請求項６記載の本発明においては、光ファイバ支持装置は、レーザセンサ装置の光ファイバを毛細管粘度計の所定の標線位置に光源側および受光側の中心軸が一致するように固定する。これにより、光ファイバの放射光軸と受光軸が完全に一致するので、さらに精度高い測定が可能となる。
【００２６】
請求項７記載の本発明は、請求項１乃至６記載の発明において、前記複数の試料液を前記毛細管粘度計に順次自動的に供給する自動試料液供給装置を有することを要旨とする。
【００２７】
請求項７記載の本発明においては、自動試料液供給装置が複数の異なった容積分率の試料液を毛細管粘度計に順次自動的に供給する。これにより、異なった容積分率の遺伝子治療用ベクターが含まれる複数の試料液の測定を連続かつ自動的に行うことができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を用いて説明する。
【００２９】
１．固有粘度と形状因子（回転楕円体の軸比）の関係式
まず、実験的に得られるリポプレックス懸濁液の固有粘度とリポプレックスの形状因子（回転楕円体の軸比）の新たな関係式について説明する。
【００３０】
シムハがａ／ｂ＜５０の範囲で与えた数表は、上述した通り不連続なものであり、このままでは、粘度測定値から回転楕円体の軸比ａ／ｂを連続的に求めることはできないので、新たな関係式を得るために、リポプレックスの形状を回転楕円体に近似させ、シムハの数表に与えられた数値に基づいて、ニュートンの近似法を繰り返す。これにより、以下の関係式を得ることができる。
【００３１】
Ｖ＝０．０５７（ａ／ｂ）２＋０．６１（ａ／ｂ）＋１．８３　　　（５）
Ｖ＝０．００１（ａ／ｂ）２＋０．５９（ａ／ｂ）＋１．９０　　　（６）
ここで、Ｖは無次元化された固有粘度であるが、無次元化された固有粘度Ｖ（以下、固有粘度Ｖという。）は式（３）におけるν（無次元数）に他ならないことから、式（５）及び（６）はνとａ／ｂの関係をＶとａ／ｂの関係に置き換えたものである。
【００３２】
式（５）はリポプレックスが紡錘形回転楕円体である場合の関係式であり、式（６）は扁平回転楕円体である場合の関係式であり、回転楕円体の軸比ａ／ｂがａ／ｂ＜１００の範囲で、粒径に如何にかかわらず、成立する。
【００３３】
図１４（ａ）は式（５）及び（６）により求められたＶとａ／ｂの関係を示す表であり、図１４（ｂ）はシムハの数表により与えられたνとａ／ｂの関係を示す表（ａ／ｂ＞５０においては、式（３）及び（４）による）であり、図１５は図１４をグラフに表したものであるが、両者の値を比較すると、良く近似していることがわかる。これにより、リポプレックス懸濁液の粘度を測定し固有粘度Ｖを求めることができれば、この固有粘度Ｖから形状因子である軸比ａ／ｂを決定することができる。
【００３４】
ここで、固有粘度Ｖ、還元粘度ηｒｅｄ、相対粘度ηｒｅｌは一般に次式の関係が成り立つ。
【００３５】
Ｖ＝ｌｉｍ（φ→０）ηｒｅｄ　　　　　　　　　　　（７）
ηｒｅｄ＝（ηｒｅｌ−１）／φ　　　　　　　　　　（８）
ηｒｅｌ＝η／η０　　　　　　　　　　　　　　　（９）
ここで、φは懸濁粒子の容積分率（懸濁粒子の容積／懸濁液の容積）であり、ηは懸濁液の粘度、η０は分散媒の粘度である。また、相対粘度ηｒｅｌは、毛細管粘度計により、懸濁液及び分散媒のそれぞれの流下時間の比ｔ／ｔ０によって求めることができる。即ち、相対粘度ηｒｅｌは、
ηｒｅｌ＝η／η０＝ｔ／ｔ０　　　　　　　　　（１０）
以上の式（７）乃至（１０）に従えば、図１のフローチャートに示すように、毛細管粘度計にてリポプレックス試料液の流下時間を測定して（ステップＳ１）、相対粘度ηｒｅｌを算出し（ステップＳ２、式（１０））、さらに相対粘度ηｒｅｌから還元粘度ηｒｅｄを算出する（ステップＳ３、式（８））。そして、各容積分率における還元粘度ηｒｅｄから固有粘度Ｖを算出し（ステップＳ４、式（７））、この算出された固有粘度Ｖと式（５）及び（６）から形状因子ａ／ｂを決定することができる（ステップＳ５、式（５）及び（６））。また、この方法によれば、試料液の分画、各分画における粒径測定を行う必要がないので、リポプレックス試料液の必要量を大幅に減少することができる。
【００３６】
尚、上記方法においてはいかなる回転楕円体であるかは決定できないので、最終的にリポプレックスの形状が紡錘形回転楕円体であるか、扁平回転楕円体であるかは電子顕微鏡や原子間力顕微鏡を用いた観察により判断することになる。
【００３７】
２．形状因子測定装置
次に、上述した方法に基づいてリポプレックスの形状因子を測定する形状因子測定装置１の構成について図２乃至図６を用いて説明する。
【００３８】
尚、図２は、本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置１の概略構成図である。図３は、本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置１の計測点である標線７ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）の近傍を説明する図である。図４は、本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置１の光ファイバ支持装置３４ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）を説明する図である。図５及び６は、本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置１の制御演算装置５を説明する図である。
【００３９】
形状因子測定装置１は、大別して試料液の粘度を測定する毛細管粘度計２、試料液の流下時間を自動測定するためのレーザセンサ装置３、毛細管粘度計２内の圧力を調整する圧力調整装置４、及び測定された流下時間をもとに形状因子を算出する制御演算装置５を備えている。
【００４０】
毛細管粘度計２は、図２に示す通りガラス製Ｕ字管の一方の下方部に試料溜め２１が設けられ、他方の管の上方部に２つの液溜め２２及び２３が設けられており、液溜め２２及び２３間、試料溜め２１と液溜め２３間は毛細管で連結されている。そして、試料溜め２１に入れられた一定容積の試料液を液溜め２２の上方まで吸い上げて、流下させ、試料液の液面が予め定められた標線７ａ−７ｂ間及び７ｂ−７ｃ間を流下する時間を測定することより、試料液の粘度を求めるものである。尚、毛細管粘度計２は、一定温度で粘度を測定する必要があるため、恒温槽（図示せず）の中に設置されるようになっている。
【００４１】
レーザセンサ装置３は、レーザ光により試料液の液面が標線７ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）を通過する時を検知する装置であり、レーザ光の光源であるレーザダイオード３１、発光されたレーザ光を受ける受光部３２、レーザダイオード３１と受光部３２を接続する光ファイバ３３ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）、及び光ファイバ３３ｉを毛細管粘度計２の標線７ｉ部分に固定する光ファイバ支持装置３４ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）を有する構成となっている。
【００４２】
さらに詳しくは、図３に示す通り、レーザダイオード３１の３つの光源３１０ａ、３１０ｂ及び３１０ｃから３本の光ファイバ３３ａ、３３ｂ及び３３ｃがそれぞれ光ファイバ支持装置３４ａ、３４ｂ及び３４ｃの一端に接続されており、光ファイバ支持装置３４ａ、３４ｂ及び３４ｃは毛細管粘度計２の計測点である標線７ａ、７ｂ及び７ｃ部分にそれぞれ固定されている。そして、光ファイバ支持装置３４ａ、３４ｂ及び３４ｃの他端からは、光ファイバ３３ａ、３３ｂ及び３３ｃが制御演算装置５の光ファイバ挿入口５０１ａ、５０１ｂ及び５０１ｃを介して受光部３２のレーザセンサ３２０ａ、３２０ｂ及び３２０ｃにそれぞれ接続されている。
【００４３】
レーザダイオード３１は、制御演算装置５のレーザダイオード電源コネクタ５０２と接続されて、電源の供給を受けることで、レーザ光を発光するような装置である。
【００４４】
受光部３２は、制御演算装置５内に組み込まれており、光センサ３２０ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）の受光量を電気的な信号に変換し、増幅して、この信号を後述する制御演算装置５のマイコン５４に送るものである。ここで、光センサ３２０ｉが受光する光量は、試料液が計測点（標線）を通過するか否かでレーザ光の透過率が異なるので、変化するものであり、この光量の相対的な変化をマイコン５４は検出するようになっている。
【００４５】
光ファイバ３３ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）は、毛細管粘度計２の管内以外においてレーザ光を伝達させる光伝達媒体であるが、光伝達媒体として光ファイバ３３ｉを用いることにより、外部の迷光や外部電気雑音の影響がなくなり、試料液の液面通過に伴う光信号のわずかな変化を精度高く計測することが可能となっている。
【００４６】
光ファイバ支持装置３４ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）は、図２及び３をＡ方向から見た図４に示すように、光ファイバ３３ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）を毛細管粘度計２の標線７ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）に着脱可能とするクリップ状の装置（洗濯バサミのようなもの）であり、毛細管粘度計２の計測点において、容易に光ファイバ３３の放射光軸と受光軸とを完全に一致させることができるような構成となっている。また、毛細管粘度計２への着脱が容易なので、毛細管粘度計２における送受光端面の汚れの除去も容易となっている。
【００４７】
圧力調整装置４は、電磁弁４１と加圧ポンプ４２を備えており、毛細管粘度計２の試料溜め２１がある管の上方とビニールチューブ管で連結されている。
【００４８】
電磁弁４１は、制御演算装置５と加圧ポンプ電磁弁用電源コネクタ５０３（４つのコネクタのうち電磁弁用のコネクタ２つ）で接続されており、制御演算装置５からの電源制御により、電磁弁を大気圧側もしくは、加圧ポンプ４２側に切り替えるようになっている。
【００４９】
加圧ポンプ４２は、制御演算装置５と加圧ポンプ電磁弁用電源コネクタ５０３（４つのコネクタのうち加圧ポンプ用のコネクタ２つ）で接続されており、制御演算装置５からの電源制御により加圧ポンプ４２を作動させ、毛細管粘度計２内の圧力を大気圧より若干高めに設定するようになっている。
【００５０】
そして、このような圧力調整装置４の構成においては、制御演算装置５からの指示により毛細管粘度計２内は容易に大気圧もしくは大気圧より加圧された状態にすることができるので、圧力調整装置４は、自動的に毛細管粘度計２内の試料液を管の上方まで吸い上げたり、試料液を流下させたりすることができるようになっている。
【００５１】
制御演算装置５は、レーザセンサ装置３、圧力調整装置４を制御して、リポプレックス試料液の粘度を自動測定させ、この測定された結果から演算をして試料液の形状因子を決定する装置である。制御演算装置５は、図５及び６に示すように、３つのプッシュスイッチにより構成された入力部５１、液晶表示器から構成された表示部５２、電源部５３、マイコン５４、電磁弁制御部５５、及びポンプ制御部５６を備えている。
【００５２】
入力部５１は、測定を行うに際しての各種設定パラメータを受け付けるものであり、例えば、試料液の濃度（容積分率）、測定回数、光センサのしきい値（試料液が存在するときに受光する光量を試料液が存在しないときに受光する光量の何倍に設定するか）、電磁弁を切り替えるタイミング（標線７ａを越えてから何秒後に加圧ポンプ４２を止めて大気圧にするか、標線７ｃを下回ってから何秒後に加圧するかなど）、加圧ポンプを自動に稼動させるか手動で稼動させるか等を事前に入力設定するものである。
【００５３】
また、入力部５１は、レーザセンサ装置３を用いずに目測で液面が標線７ｉ（ｉ＝ａ，ｂ，ｃ）を通過するときを検出する場合には、入力部５１のプッシュスイッチを押下することにより、そのタイミングをマイコン５４に記憶させることができるようにもなっている。
【００５４】
表示部５２は、入力部５１から入力された各種設定値を液晶表示の画面を通して確認できるものであり、また、３つのプッシュボタンの役割を表示し、入力操作を手助けする機能をも有するものである。
【００５５】
電源部５３は、外部からの交流電源を電源入力用コネクタ５０４を介して直流電源に変換して、レーザダイオード３１、マイコン５４、電磁弁制御部５５及び加圧ポンプ制御部５６のそれぞれに適切な電源を与えるものである。
【００５６】
マイコン５４は、制御演算装置５の中枢部分であり、組み込まれたソフトウェア及び設定パラメータにより所望の制御演算を行うものである。具体的には、入力部５１を介してマイコン５４に記憶された設定パラメータに基づいて、電磁弁４１及び加圧ポンプ４２に対する制御指示をそれぞれ電磁弁制御部５５及びポンプ制御部５６に送るものであり、また、受光部３２からの信号及び設定パラメータに基づき、試料液の液面が標線７ｉを通過する時を感知し、流下時間を測定するものである。また、マイコン５４に記憶された測定データに基づいて、リポプレックス試料液の形状因子を決定するものである。
【００５７】
電磁弁制御部５５は、マイコン５４からの制御指示により、加圧ポンプ電磁弁用コネクタ５０３を介して加圧電磁弁４１を大気圧側か加圧ポンプ側にするかの切り替え制御をするものであり、ポンプ制御部５６は、同じくマイコン５４からの制御指示により、加圧ポンプ電磁弁用コネクタ５０３を介して加圧ポンプ４２を作動させるか否かの制御をするものである。
【００５８】
次に、本実施の形態に係る形状因子測定装置１の作用を制御演算装置５の動作を示す図７乃至１２を用いて説明する。尚、図７、９乃至１２は、それぞれ、図１におけるステップＳ１乃至Ｓ５を具体的に説明するフローチャートであり、図８は、図７におけるステップＳ１０８をさらに詳細に説明するフローチャートである。
【００５９】
まず、事前にリポプレックスを分散媒で希釈し、容積分率φが異なる数種類の懸濁液を用意し、これを試料液Ａｉ（ｉ＝ａ，ｂ，…，ｎ）とする。尚、式（２）はシムハによって、φ＜０．０１の範囲で成立することが確かめられているので、試料液Ａｉはφ＜０．０１の範囲で作成する。そして、制御演算装置５の入力部５１より予め測定のための設定パラメータを入力し、試料液Ａｉを毛細管粘度計２の試料溜め２１に入れる。
【００６０】
そして、測定準備ができたところで入力部５１のプッシュスイッチ（測定スタートボタンに相当）を押すと、電磁弁４１が加圧ポンプ側４２に切り替わり、加圧ポンプが稼動する（ステップＳ１０１〜Ｓ１０３）。これにより、試料液Ａｉの液面は上昇し、液溜め２２の上方に設定された標線７ａを越える（ステップＳ１０４）。そして、標線７ａを通過後所定の時間が経過すると、加圧ポンプ４２は停止し、電磁弁４１が大気圧側に切り替わる（ステップＳ１０５〜Ｓ１０７）。これにより、試料液Ａｉの液面は流下するので、標線間の流下時間を測定する（ステップＳ１０８）。この流下時間測定ステップＳ１０８については、後述する。そして、試料液Ａｉの液面が液溜め２３の下方に設定された標線７ｃを下回ると、１回分の測定は終了する（ステップＳ１０９）。尚、この測定はマイコン５４に予め定められた測定回数分実施されるため、標線７ｃを通過後、所定の時間が経過すると（ステップＳ１１０〜Ｓ１１２）、上述した動作を繰り返す（ステップＳ１０２〜Ｓ１０９）。
【００６１】
尚、流下時間の測定に関しては、試料液Ａｉだけではなく、分散媒の流下時間も測定する。また、容積分率が異なる数種類の試料液Ａｉ（ｉ＝ａ，ｂ，…，ｎ）すべてに対して流下時間の測定を行う。
【００６２】
ここで、流下時間測定ステップ（ステップＳ１０８）について詳しく説明する。流下時間の測定に関しては、液溜め２２の上方に設けられた標線７ａと下方に設けられた標線７ｂの間の流下時間ｔ１（分散媒についてはｔ１０）、液溜め２３の上方に設けられた標線７ｂと下方に設けられた標線７ｃの間の流下時間ｔ２（分散媒についてはｔ２０）を測定する（ステップＳ１０８１、Ｓ１０８２）。この測定は、受光部３２が受光する光量の相対的変化から試料液Ａｉの液面が標線７ｉを通過する時（マイコン５４に設定された光センサしきい値に基づき液面通過を判断）を制御演算装置５に記憶し、この値からｔ１及びｔ２を求めるものである（Ｓ１０８３）。そして、この流下時間の測定を設定された測定回数分行い、流下時間ｔ１、ｔ２の平均ｔ１ＡＶ、ｔ２ＡＶを求め、これをマイコン５４に記憶する（ステップＳ１０８４〜Ｓ１０８６）。
【００６３】
次に、このようにして測定された流下時間から形状因子を決定するまでを説明する。相対粘度ηｒｅｌは、それぞれ、ηｒｅｌ１＝ｔ１ＡＶ／ｔ１０ＡＶ、ηｒｅｌ２＝ｔ２ＡＶ／ｔ２０ＡＶと表されるが、試料液Ａｉがニュートン流体であれば、相対粘度ηｒｅｌは流速に依存しないので、ｔ１ＡＶ／ｔ１０ＡＶ＝ｔ２ＡＶ／ｔ２０ＡＶ、非ニュートン流体であれば、ｔ１ＡＶ／ｔ１０ＡＶ≠ｔ２ＡＶ／ｔ２０ＡＶである。
【００６４】
式（５）（６）はニュートン流体を想定して導かれているので、本実施の形態においては、制御演算装置５は、ηｒｅｌ１＝ｔ１ＡＶ／ｔ１０ＡＶ、ηｒｅｌ２＝ｔ２ＡＶ／ｔ２０ＡＶを計算し、ηｒｅｌ１＝ηｒｅｌ２であるか否か判断する（ステップＳ２０１〜Ｓ２０３）。そして、ηｒｅｌ１≠ηｒｅｌ２であれば、相対粘度ηｒｅｌの流速依存性が消滅するまで、毛細管粘度計２を傾け、標線間の落差を減少させていき、再度ステップＳ１０１に戻って、試料液Ａｉの流下時間を測定する（ステップＳ２０４）。そして、ηｒｅｌ１＝ηｒｅｌ２（実験値であるので、例えば、誤差３％以内であれば等しいと見なす）であれば、ｔ１ＡＶ／ｔ１０ＡＶとｔ２ＡＶ／ｔ２０ＡＶの平均値ｔ／ｔ０より相対粘度ηｒｅｌを算出し、マイコン５４に記憶する（ステップＳ２０５）。
【００６５】
ηｒｅｌ＝ｔ／ｔ０
尚、毛細管粘度計２の傾けに関しては、毛細管粘度計２を自動的に傾けるように制御演算装置５で制御するようにしてもよいし（一度に傾ける角度をパラメータ設定しておく）、手動により毛細管粘度計２を傾けてもよい。
【００６６】
従って、本実施の形態の形状因子測定装置１の毛細管粘度計２においては、液溜め２２及び２３を備えて、２回流下時間を測定することにより、測定の正確を期すと同時に試料液Ａｉのニュートン性を確かめることができる。
【００６７】
次に、相対粘度ηｒｅｌから還元粘度ηｒｅｄを求める。式（８）を用いて、各試料液Ａｉにおける還元粘度ηｒｅｄを計算し、この値を制御演算装置５に記憶する（ステップＳ３０１、Ｓ３０２）。ここで、容積分率φｉ（ｉ＝ａ，ｂ，…，ｎ）を横軸、これに対応するηｒｅｄｉ（ｉ＝ａ，ｂ，…，ｎ）を縦軸にプロットすると、ハギンズの式（Ｈｕｇｇｉｎ’ｓ　ｅｑｕａｔｉｏｎ：ηｒｅｄ＝Ｖ＋ｋ’　Ｖ２φ、ｋ’はハギンズの定数）により、各プロットは直線上に並ぶはずである。そして、式（７）より、この直線の延長線と縦軸との交点の値が固有粘度Ｖとなる。各プロットが直線上に並ばないときは各プロットにできるだけ近い回帰直線を最小２乗法により引き、この回帰直線と縦軸との交点より、固有粘度Ｖを求めることができる。そして、制御演算装置５のマイコン５４においても、上述した方法をそのままプログラミングしてもよいが、マイコンのような小規模な演算素子でも計算が可能なように、以下のような近似をして固有粘度Ｖを算出する（ステップＳ４０１）。
【００６８】
Ｖｎ＝ηｒｅｄｎ−φｎ（ηｒｅｄｎ＋１−ηｒｅｄｎ）／（φｎ＋１−φｎ）　　　（１１）
Ｖ＝ΣＶｎ／ｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１２）
そして、式（１１）及び（１２）により算出された固有粘度Ｖをマイコン５４に記憶する（ステップＳ４０２）。
【００６９】
次に、式（５）及び（６）に基づいて、固有粘度Ｖから形状因子を表す回転楕円体の軸比ａ／ｂを求める。
【００７０】
式（５）及び（６）より軸比ａ／ｂを求めるには、２次方程式の根の公式を解く必要がある。そして、制御演算装置５のマイコン５４においても、上述した方法をそのままプログラミングしてもよいが、小規模な演算素子でも計算が可能となるように、図１３における近似をして軸比ａ／ｂを計算する（ステップＳ５０１）。そして、このような近似計算の結果、算出された軸比ａ／ｂをマイコン５４に記憶し、表示部５２に表示する（ステップＳ５０２）。
【００７１】
従って、本実施の形態の形状因子測定装置１によれば、リポプレックス粒子の回転楕円体の軸比ａ／ｂが、ａ／ｂ＜１００という現実的な形状範囲においても、簡単にリポプレックス試料全体としての形状を数量的に表現することができる。
【００７２】
また、本実施の形態の形状因子測定装置１によれば、試料液の分画を行う必要がないので、少量の試料液にて形状因子を測定することができ、測定にかかるコストを抑えることができる。
【００７３】
また、レーザセンサ装置３、圧力調整装置４を備えることにより、リポプレックス試料液の粘度測定を自動化することができるので、人的負担を軽減することができると同時に、測定の精度を高めることができる。
【００７４】
以上、本発明の実施の形態について説明してきたが、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、本発明の実施の形態に対して種々の変形や変更を施すことができる。例えば、本実施の形態の形状因子測定装置１においては、遺伝子治療用ベクターとしてリポプレックスを例として説明したが、本発明はこれに限定されるわけではなく、ＤＮＡ−高分子複合体、凝縮ＤＮＡ（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ　ＤＮＡ）、これらを含有するリポゾームなど非ウィルスベクター、アデノウィルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウィルス（ａｄｅｎｏａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウィルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ）、レトロウィルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）などのウィルスベクター、タンパク質複合体などの形状因子測定にも適用できることは言うまでもない。
【００７５】
また、本実施の形態では、形状因子を決定する式として、式（５）及び（６）（さらに簡略化した式である図１３）を用いているが、本発明は、この式に限定されるわけではなく、シムハの数表に基づいて得られる換算式であれば、同一もしくは他の近似法により得られた式であってもよいのはもちろんである。例えば、２次より高次（ｎ＝３，４，５，…）の多項式であってもよいし、また、初等関数で表現されていてもよい。
【００７６】
また、本実施の形態では、光源としてレーザ光源を用いるレーザダイオード３１を使用しているが、これに限るものではなく、放射ビーム角の揺らぎがなく、出力光として安定かつ小型なタングステン光源、紫外線光源、赤外線光源、及び発光ダイオード光源であってもよい。
【００７７】
また、試料液の流下時間測定に関しても、本実施の形態においては、制御演算装置５からの制御により自動的に測定されるが、測定方法はこれに限定されるわけではなく、上述した制御演算装置５のパラメータ設定において、手動で加圧ポンプを稼動させ（入力部５１のプッシュスイッチ押下にて加圧ポンプの稼動停止を制御する）、液面が標線を通過する時間を手動で測定する（入力部５１のプッシュスイッチ押下にて通過時刻をマイコン５４に記憶する）ように設定すれば、手動での測定も可能である。
【００７８】
さらに、複数の異なった容積分率の試料液を測定する場合において、自動試料液供給装置を用いて、人手を介さずに連続かつ自動的にそれぞれの試料液を供給するようにしてもよい。この自動試料液供給装置とは、具体的には、ターンテーブル上に一定間隔で試料溶液を容れたガラス瓶が並んでいて、１つの試料液の測定が終わると次のガラス瓶が試料吸い取り管（ピペット）の真下に回転して、ガラス瓶内の試料液がピペットにより採取され、毛細管粘度計２に供給されるようになっているオートフィーダーである。
【００７９】
この場合、自動試料液供給装置と形状因子測定装置１との連携は以下のようになっている。試料液は、濃度の薄い順に毛細管粘度計２に供給されるようになっており、ある濃度の試料液（例えば濃度Ａ）の粘度測定が終わると、次の試料液（例えば濃度Ｂ）をまず毛細管粘度計２内の洗浄用として供給する。そして、毛細管粘度計２内の圧力調整により試料液を上下させて、毛細管粘度計２内を洗浄し、洗浄後、この試料液をピペットにより採取、廃棄し、今度は粘度測定用として同じ濃度の試料液（濃度Ｂ）を供給する。そして、この試料液の測定が終わると次の試料液（例えば濃度Ｃ）を供給し、同様の流れを繰り返す。尚、このような制御はマイコン５４にプログラミングされたソフトウェアにより実現するようになっている。従って、複数の異なった容積分率の試料液の毛細管粘度計２への供給においても、自動化が可能となるので、さらなる省力化を図ることができる。
【００８０】
【実施例】
本実施の形態の形状因子測定装置１を用いて、植物ＤＮＡ−陽イオン脂質複合体懸濁液の粘度を測定し、形状因子を求めた。その結果を図１６及び図１７に示す。この植物ＤＮＡ−陽イオン脂質複合体懸濁液は、植物ＤＮＡを超音波照射により０．５〜２ｋｂｐとし、ジ−ステアリル−ジ−メチル塩化アンモニウム（ｄｉｓｔｅａｒｙｄｉｍｅｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）とモル比１：４で４０℃で２０分反応させ、複合体とし、０．０１ＭのＴｒｉｓＨＣＬ緩衝液に懸濁させたものである。ここで、複合体の化学式当量は２４９０、正味密度は１．００１であり、この原液の濃度は塩基単位でｃ＝０．５７ｍＮ、容積分率はφ＝０．００１４２であった。この原液を０．０１ＭのＴｒｉｓＨＣＬ緩衝液で希釈し、ｃ＝０．１４０、０．２９７、０．４４６ｍＮとした。この場合、それぞれに対応する容積分率はφ＝０．０００３７、０．０００７４、０．００１１１、０．００１４２であった。この結果、図１７より、無次元固有粘度Ｖは、３３０を得た。そして、式（５）及び（６）より紡錘形回転楕円体軸比ａ／ｂ＝７０、扁平回転楕円体軸比ａ／ｂ＝３５０を得た。
【００８１】
尚、ｔ１０は０．０１ＭのＴｒｉｓＨＣＬ緩衝液の標線７ａ−７ｂ間の流下時間、ｔ２０は０．０１ＭのＴｒｉｓＨＣＬ緩衝液の標線７ｂ−７ｃ間の流下時間、ｔ１は植物ＤＮＡ−陽イオン脂質複合体懸濁液の標線７ａ−７ｂ間の流下時間、ｔ２は植物ＤＮＡ−陽イオン脂質複合体懸濁液の標線７ｂ−７ｃ間の流下時間であり、還元粘度μｒｅｄ＝ηｓｐ／ｃ、無次元還元粘度ηｒｅｄ＝ηｓｐ／φである。
【００８２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の形状因子測定装置によれば、毛細管粘度計を用いて試料液の粘度を測定すれば、分画を行わなくても、簡単に粘度から試料液に含まれる粒子の形状因子を求めることができるので、遺伝子治療用ベクターの形状を把握でき、以て遺伝子治療におけるＤＮＡ感染効率を高めることに寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置の動作を説明するフローチャートである。
【図２】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置の概略構成図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置の流下時間測定部の近傍を説明する図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置の光ファイバ支持装置を説明する図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置の制御演算装置の外観図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置の制御演算装置の機能ブロック図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置における毛細管粘度計の制御を説明するフローチャートである。
【図８】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置において試料液の流下時間を測定する方法を説明するフローチャートである。
【図９】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置において相対粘度を算出する方法を説明するフローチャートである。
【図１０】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置において還元粘度を算出する方法を説明するフローチャートである。
【図１１】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置において固有粘度を算出する方法を説明するフローチャートである。
【図１２】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置において形状因子を算出する方法を説明するフローチャートである。
【図１３】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置において形状因子を算出する近似式を説明する図である。
【図１４】式（５）（６）とシムハの数表を比較する表である。
【図１５】式（５）（６）とシムハの数表を比較するグラフである。
【図１６】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置を用いて、植物ＤＮＡ−陽イオン脂質複合体懸濁液の粘度を測定した場合の、測定結果である。
【図１７】本発明の実施の形態に係る形状因子測定装置を用いて、植物ＤＮＡ−陽イオン脂質複合体懸濁液の粘度を測定した場合の、無次元還元粘度と容積分率の関係を表すグラフである。
【符号の説明】
１　形状因子測定装置
２　毛細管粘度計
３　レーザセンサ装置
４　圧力調整装置
５　制御演算装置
７ａ、７ｂ、７ｃ　標線
２１　試料溜め
２２、２３　上部液溜め
３１　レーザダイオード
３２　受光部
３３ａ、３３ｂ、３３ｃ　光ファイバ
３４ａ、３４ｂ、３４ｃ　光ファイバ支持装置
４１　電磁弁
４２　加圧ポンプ
５１　入力部
５２　表示部
５３　電源部
５４　マイコン
５５　電磁弁制御部
５６　ポンプ制御部
３１０ａ、３１０ｂ、３１０ｃ　光源
３２０ａ、３２０ｂ、３２０ｃ　レーザセンサ
５０１ａ、５０１ｂ、５０１ｃ　光ファイバ挿入口
５０２　レーザダイオード電源コネクタ
５０３　加圧ポンプ電磁弁用電源コネクタ
５０４　ＡＣ１００Ｖ電源入力用コネクタ
５０５　電源スイッチ
【図１】
2004069540.tif 000003
【図２】
2004069540.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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