(57)【要約】【課題】固相の表面積の増加、拡散距離の低下、および固相間の励起光源に対する光学的結合ならびに固相と検出物との結合の強化により反応速度および感度が向上した改善された光学的分析システムを提供するものである。【解決手段】液体サンプルを検定するための装置であって、　その中の液体流のために適合された実質的に均一の断面寸法の中空の光透過性導管手段；および　導管手段の一部の内側から放射する電磁線を定量するように、導管に対して適切に配置された定量性検出システムとを、組み合わせて含む上記装置。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプルを検定するための装置であって、
　その中の液体流のために適合された実質的に均一の断面寸法の中空の光透過性導管手段；および
　導管手段の一部の内側から放射する電磁線を定量するように、導管に対して適切に配置された定量性検出システム
とを、組み合わせて含む上記装置。
【請求項２】
集束光学レンズ手段を含む、請求項１記載の装置。
【請求項３】
レンズ手段が複数のレンズを含みそして導管手段がレンズの一つを通って伸びる、請求項１記載の装置。
【請求項４】
導管手段に設けられた光透過性物の多孔性塊状物を含み、透過性物の塊状物の多孔度をサンプルの流れを許すよう選択し、塊状物はリガンド／結合複合体の少なくとも一部をその表面上に固定している、請求項１記載の装置。
【請求項５】
導管手段を通る予め決められた大きさの粒子の流れを遮断するように寸法を決められそして焦点領域に隣接して設けられた機械的、流動性多孔質バリヤー手段を含む、請求項１記載の装置。
【請求項６】
レンズ手段中の第一の細長い半−管状チャンネル、および第二の細長い半−管状チャンネルを含むが、但し、チャンネルは互いに合わさって導管手段を画成する、請求項１記載の装置。
【請求項７】
第二の半−管状チャンネルがその凹面部において光反射性表面を有する、請求項６記載の装置。
【請求項８】
第一のチャンネルの一つの端部（edge）が第二のチャンネルの端部と蝶番式に接続している、請求項６記載の装置。
【請求項９】
中空導管手段が円筒状通路内に位置する光透過性管を有する円筒状通路を含み、バリヤー手段が前記管内に設けられている、請求項５記載の装置。
【請求項１０】
バリヤー手段が相互に間隔を空けた一対のスクリーンを含み、これにより管内に反応室を画成し；そして
　特定範囲の直径に寸法が決められた複数の粒子を含み、スクリーンのメッシュは前記直径範囲より十分小さく、これにより粒子が前記室のスクリーンにより捕捉されて実質的に焦点領域に実質上配置可能な多孔性塊状物を形成する、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
レンズ手段と管の屈折率が実質的に適合している、請求項９記載の装置。
【請求項１２】
管の周囲、そして管と通路の中間に配置された屈折率適合性液体を含む、請求項１１記載の装置。
【請求項１３】
導管手段の一部がレンズ手段中の細長い半管状の第一のチャンネルとして形成され、そして導管手段の残りの部分が第一のチャンネルと適合する細長い半管状の第二のチャンネルとして形成される、請求項３記載の装置。
【請求項１４】
第二のチャンネルが導管手段の内側表面の少なくとも一部を形成する反射性表面を有する、請求項１３記載の装置。
【請求項１５】
特定範囲の直径に寸法が決められた複数の粒子を含み、流動性多孔質手段が前記直径範囲より小さな直径の孔を有し、これにより粒子がバリヤー手段に対向して導管手段に付着して実質的に焦点領域に設けられた多孔性塊状物を形成する、請求項５記載の装置。
【請求項１６】
粒子が実質的に光透過性である、請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
粒子がその表面の少なくとも一部においてリガンド／結合複合体の少なくとも一部で被覆された、請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
レンズ手段が屈折により光線に焦点を合わせる、請求項２記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、化学的および生化学的検定に関し、さらに詳しくは蛍光分析のための改善された光学的装置および方法に関する。
　試験下のサンプルおよび１種以上の試薬のアリコートを高い特異的反応で様々に反応させてリガンド／結合複合体たとえば抗原／抗体または類似の複合体を形成し、次いでサンプルからの予め決められた部分の力価についてサンプルを調べるために観察するという検定がよく知られている。代表的なものとしては、抗体を用いてこの抗体と特異的な抗原の存在について検定するが、しかしこのような検定はハプテンたとえばホルモン、アルカロイド、ステロイド、抗原、抗体、核酸およびそのフラグメントの量を決めることにまで広げられ、ここで使用される用語“リガンド／結合”は広い意味に理解されるべきである。
【０００２】
　感受性免疫検定は、一般には複合体の標識化成分をたとえば試薬中に混入し、非複合化標識試薬を次いで複合化試薬から分離するトレーサー技術を使用する。複合化物はその後標識物からのシグナルを観察することにより定量することができる。放射性同位元素、蛍光および化学ルミネッセント分子、比色標識物および他のマーカーを用いて複合体の成分または一部を標識化しそして適当な装置を使用して標識物からの輻射線を検定しそして測定する。
【０００３】
　結合複合体の少なくとも一の成分を複合体の形成に先立って最初に固体支持体へ結合するような検定では、支持体にこの成分を結合するために必要とされる時間が一般に長いため基本的問題が生じる。蛍光分析、たとえば普通の９６凹部微量滴定板において実施されるようなものは固相に成分を結合するために何時間という程度の時間を必要とし、これにもかかわらず加熱、振盪等のような手段も講じる。リガンドと結合または被覆するために利用可能に作られた固相の表面積が増加すると、結合の遅れはかなり減るということはわかるであろう。したがって、このような固相分析（たとえば微量滴定凹部分析、ディップスティック分析等）に関連する先行技術もまた固相として小さな粒子またはビーズを使用することを示している。
【０００４】
　充填された粒子ベッドを通してサンプルを流すと、検定されるサンプルリガンドと粒子の表面に固定化された結合体との間の反応を促進する。たぶん幾つかの要因がこの強化された反応性：低下する拡散距離、乱流のためのサンプルの定期的攪拌および暴露される表面積が高いための反応容量における結合部位の高密度に寄与するであろう。
【背景技術】
【０００５】
　公知の粒子分析は、機械的フィルターを介して通過させることにより凝集したビーズを非凝集したビーズから分離する定量的または半定量的スライド凝集および技術を含むよく知られたビーズ凝集試験を含む。別の公知の粒子分析は米国特許第4,780,423号に開示されており、これはその上に固定化されたリガンドを有する調節された多孔度の粒子を懸濁液中でインキュベートして洗浄するものである。洗浄は粒子の沈降および再懸濁を含むことができる。得られた蛍光度を濃縮または懸濁粒子からのいずれかから読み取ることができる。さらに別の公知分析で、粒子を膜またはフィルターに結合させ次いでサンプルをこれに通して注入する。この技術は酵素比色検出に制限されると考えられる。粒子を水性懸濁液中でインキュベートする場合、サンプルにおける遊離リガンドが横断しなければならない平均拡散距離および複合体の形成が完了するまでに必要な時間が非常に大きくなるという傾向がある。
【発明の開示】
【０００６】
　それ故、本発明の原則的目的は、固相の表面積の増加、拡散距離の低下、および固相間の励起光源に対する光学的結合ならびに固相と検出物との結合の強化により反応速度および感度が向上した改善された光学的分析システムを提供するものである。本発明の別の目的は、サンプルと検出物との間の望ましい強化をもたらす新規フローセルを提供するものである。さらに本発明の別の目的は、少量のサンプルを必要としそして特に全血の分析に適するような検定システムを提供すること；リガンド／結合反応を、フローセルの光学的システムから容易に挿入および取り外し可能である使い捨てアイテム内に制限するような分析システムを提供すること；および分析されるサンプル部分以外の所望の複合体の成分の全てを前もって準備するような分析システムを提供することである。
【０００７】
　本発明の他の目的は、一部は明らかであり一部は以後明らかになるであろう。一般に、本発明の前述のそして別の目的は励起すると電磁線を放出する予定の標識物(tagまたはlabel)を用いて、液体サンプルを検出するためのシステムにより達成され、該システムは液体流れを通すのに適する中空の光透過性導管手段と、該導管手段に設けられた光透過性物質の一つ以上の分かれた多孔性塊状物とを含み、光透過性物質の塊状物の多孔度はサンプルの液体流れがその中を流れることを許すように選択され、それぞれのリガンド／結合複合体、たとえば特異的結合リガンドの少なくとも一部は各塊状物の表面に予備被覆する等のようにして固定化されてなるものである。
【０００８】
　一実施態様において、塊状物は、好ましくは実質的に光透過性の、特に形成された複合体が蛍光標識物を含む場合、蛍光を励起するのに必要な輻射線および励起された蛍光の両方とも透過する複数の粒子を含む。粒子は一般に特定の範囲内の直径の寸法のビーズであり、焼結等により予備形成される。これに代わり、導管手段に設けられた流動性多孔質バリヤー手段に対し付着することにより塊状物を形成することができる。後者の場合、バリヤー手段を導管手段内に設けこれにより室の少なくとも一つの壁を画成し、該バリヤー手段の多孔度は前記範囲より十分小さくこれにより導管手段を通る液体流れに混入している粒子がバリヤー手段により捕捉されそして付着して室に多孔性塊状物を形成する。
【０００９】
　本発明の好ましい実施態様は、これを通る導管手段がレンズ手段の光学軸を横断して伸びそしてその焦点領域を通過する中空の管状通路を形成する集束光学レンズ手段を含む。一般的には、レンズ手段は複数のレンズを含み、そして導管手段はこれらレンズの一つを通って伸びる。励起すると電磁線を放出する予定の標識物またはラベルを用いてシステムを使用する場合、レンズ手段は励起および放出輻射線の両方ともを集めることができるに違いない。
【００１０】
　したがって、本発明は、構成品、要素の組み合わせおよび部品の配置を有する装置、および幾つかの工程とこのような工程の一つ以上とその他のものそれぞれとの関係を含む方法を含むものであり、全ては以下の詳細な記載に例示したものおよび請求の範囲に示される出願の範囲である。
【００１１】
　本発明の性質および目的をさらに十分理解するために、添付の図面と関連する以下の詳細な説明を参照すべきであり、幾つかの図面中同じ数字は同じ部分を示すために用いられている。
【００１２】
　図１は、本発明の原理を具体化する分析装置の横断面模式図であり；
　図２は、本発明のフローセルの一実施態様の概略横断面図であり；
　図３は、図２のフローセルの横断面図であり；
　図４は、図２の変形フローセルの概略的横断面図であり；
　図５は、本発明の別の変形フローセルの概略的横断面図であり；
　図６は、図５の変形フローセルの概略的横断面図であり；
　図７は、図５の別の変形フローセルの概略的横断面図であり；
　図８は、本発明のさらに別のフローセルの実施態様の概略的な横断面図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
　図１では、液体サンプルを分析するための例示的装置20を示し、これは励起線を提供するための光源22、励起線により刺激された光を検知するための光検知器24、たとえば二色性ミラーまたは半透明ミラーのようなビームスプリッター手段26およびコリメーター手段28を含む光学システムを使用する。図１、図２および図３の実施態様は、説明の容易性のために、蛍光免疫検定法の関係で特に使用することについて記載しているがしかしこれに限定されるべきではないことは理解されるべきである。ここで使用する用語“光”とは、可視スペクトルならびに赤外線および紫外線付近の波長も含むものと理解されるであろう。同様に、用語“励起”とは、蛍光の励起、照射によるような偏光されるかたまたはされない化学薬品による化学ルミネッセンスの励起、クロモゲンからの光の反射による放出等を含むものと理解されるであろう。
【００１４】
　光学システムの前述の要素は一般に相互に固定された光学的関係でフレーム（図示せず）に設けられており、これは後にさらに十分に記載される。さらに、本発明は特に図２および図３で拡大形で示されているフローセル30を含み、この実施態様では、一般にガラス、高分子量ポリマーまたは類似物で作られる固体集束レンズ33を含む複合レンズシステムとして示される集束光学レンズ手段32から形成される。レンズ33は、レンズ32の光学軸を横断する方向に向かう細長い中空チャンネルまたは液体流れを案内する導管34を有しそしてレンズ33を通る一般に円形断面の管状通路からなることを特徴とする。このような円筒形導管状の反応室36の少なくとも一部はレンズ手段32の焦点領域に設けられている。
【００１５】
　すなわち、たとえばそれ自体でまたは適切な標識物を介して励起したたとえば蛍光を発光することができるリガンドを含む液体が室34を横断しそしてレンズ手段32により室34上へ集められた励起輻射線によりここで適切に励起されて発光すると仮定する。この蛍光発光を次いでレンズ手段により検出器24へ向かわせ、ここでたとえば検出器が電気的な場合、適当な電気信号が起きて蛍光を調べるために評価することができる。
【００１６】
　より良い信号−リガンド比を提供するために、図４で示す実施態様は寸法が決められそしてレンズ手段32の焦点領域に隣接する導管34に設けられた機械的流動性多孔質バリヤーまたはスクリーン38を含み、これにより導管を通る流れ中にある予め決められたサイズの粒子またはビーズ40の輸送を阻止する。このようなビーズは励起輻射線および励起した蛍光の両方に対し実質的に透過性であり、そのためにはポリメチルメタクリレート、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー等で形成されている。ビーズ40は、ビーズの表面の少なくとも一部に設けられた抗原／抗体複合体たとえば特異的結合リガンドたとえば抗原とこれに対する抗体の少なくとも一部で被覆されている。
【００１７】
　スクリーン38のメッシュまたは多孔度は、サンプル液体とその構成成分を自由に流すが被覆ビーズの流れを阻止するように選択され、これによりビーズ40の塊状物をスクリーンに対しそしてレンズ手段32の焦点領域において付着させる。ビーズの粒径は最小であるように選択されるが、しかしながらビーズの塊状物がスクリーン38に対し付着する場合サンプル構成成分は付着塊状物を未だに自由に通過させるようにする。一般に、サンプルとして全血に十分に作用するビーズ径は５０−２５０μｍの範囲、好ましくは約９８μｍである。もちろん、ビーズ径はある程度サンプルの性質による（たとえば、血液、食物、尿、プロセス流れ等）。もちろん、メッシュ径はシステムで使用されるべきビーズの直径範囲によるが、しかし一般には、直径約９８μｍのビーズに対してメッシュ径約５０μｍが適当である。すなわち、サンプル液体が導管34を流れるとこれは被覆されたビーズ40の付着した塊状物を通らなければならないので、その結果、検定部分がビーズ上の皮膜と複合化するために通らなければならない拡散距離が非常に小さくなる。この小さな拡散距離は、付着した塊状物を通るサンプルの長く湾曲した通路およびビーズの高い表面／容量比と組み合わせてサンプルからの検定部分の非常に有効な捕捉を可能にする。本発明のこの特性は、拡散時間が拡散距離の二乗により減少するので重要である。また完全な固相が付着した塊状物中に非常に少量（たとえば、直径０．１８ｃｍの代表的導管に対し約０．０２ｃｍ3）含まれ、そしてレンズ３２中に“浸漬”されすなわち励起および検出システムの間に高い開口数の光学的結合を提供する。蛍光シグナルは四番目の力である開口数により増加されるので、高い開口数の光学的結合が非常に重要である。
【００１８】
　図４に示す本発明の操作において、多数のビーズ40は好ましくは吸着または他の公知の固定化技術によりビーズ表面に固定化された適当なリガンドとともに予め添加され、そして懸濁する液体中に懸濁される。ビーズが普通は懸濁する液体中に安定な懸濁液を容易には形成しない場合、これらをボルテクサー（図示せず）または同様のミキサーに入れ、懸濁液中のビーズを撹拝により水性に維持するようにしてもよい。ビーズ懸濁液の所望の部分をポンプ（図示せず）によりボルテクサーから吸い出し、導管34へ注入し、ここでビーズの流れをスクリーン38により阻止し、反応室36内にビーズ40の付着物または塊状物を作る。検定されるサンプル溶液のアリコートを次いで導管34に通して流し、そして反応室36中のビーズ40の塊状物はビーズの表面上にリガンド／結合複合体を形成する効果がある。よく知られているように、競合型分析については、サンプル溶液をフローセルに流す前に、一般にサンプル溶液を最初に標識試薬で処理し、インキュベートする。検定がサンドイッチ型検定の場合、サンプル溶液をフローセルに通し、次いで標識化抗体をセルヘ通し、そしてビーズ塊状物に洗浄工程を行う。当該技術でよく知られているように、標識化された一般に蛍光の成分は、競合型またはサンドイッチ型検定のいずれが実施されるかにより、固定化リガンドに対する補体もしくは結合体またはその類似物のいずれかでよい。標識物(Tagまたはlabel)は一般に蛍光染料たとえばフルオレスセイン染料、アクリジン染料等であり、すべて当該技術でよく知られている。いずれのケースにおいても、得られたリガンド／結合複合体は複合体に対し結合する所望の染料部分を含む。ビーズ塊状物に洗浄用緩衝液を通して洗浄後、いずれの未反応物質および特にいずれの遊離染料成分も洗い出して、ビーズ上に固定化されているような染料部分のみを残す。次いで、光源22を活性化して励起光ビーム23（破線で示す）を発生させ、次いでこれをコリメーターレンズ28により鏡26へ向けさせ、コリメートされたビームをレンズ手段32へ反射させる。後者の焦点を合わせて、反応室36におけるビーズ40の塊状物を位置させている焦点領域へ励起ビームを集め、そして励起輻射線がビーズ40の上の蛍光運搬体を励起して蛍光にする。この蛍光をレンズ32を通して伝達し、ビームスプリッターミラー26を介して容易に検出することができる。測定を行ったのち、ビーズ40の塊状物を導管34を通って簡単にフラッシュ−バックすることにより反応室36から直ちに除くことができる。
【００１９】
　こうして記載したように、予め添加されたビーズの懸濁液またはプールから反応室を充填する技術は明らかに自動化を受け入れることができ、その際、特異的検定に対する成分、たとえば予め添加されたビーズ、サンプル溶液、標識試薬等は、それぞれの貯蔵容器から物質の流れを調節する適当なバルブにより選択可能である。しかしながら、本発明はまたビーズ塊状物および試薬を直ちに使い捨て可能にする持ち運び自由のシステムにも簡単に適用可能である。
【００２０】
　たとえば、導管34を図３に示し、ここではレンズの光学軸を横断するレンズ手段32の焦点領域を通って簡単に通路とするが、一方、図５に示す実施態様において、導管34は同様にレンズ33を通るように設けられた均一直径の細長い孔34Aおよび孔34Aよりやや小さい均一直径を有する細長い光透過性管42とからなり、管42は孔に挿入したり取り外したりすることができる。スクリーン38は管42内に設けられているので、後者はレンズの焦点領域に隣接して孔34A内に位置することができる。
【００２１】
　図６に示すように、本発明のフローセルのさらに別の実施態様において、導管34は同様にレンズ33を通る均一直径の細長い孔34Aおよび孔34Aのものよりやや小さい均一直径を有する細長い光透過性管42Aとからなり、これにより管42は孔へ挿入したり取り外したりすることができる。スクリーン38Aおよび38Bは相互に間隔をあけて管42内に設けられ、これにより管内部に反応室44を画成するすることができる。図５の実施態様におけるように、反応室44はレンズの焦点領域に隣接する孔34A内に位置することができる。室44の中には特定範囲の直径に寸法が決められた複数のビーズ40が含まれ、スクリーンのメッシュがビーズ直径の範囲より十分小さいので後者は室44においてスクリーンにより捕捉され実質的にレンズ焦点領域に配置可能に多孔性塊状物を形成する。図６の実施態様におけるビーズは室44に設ける前に所望の特定の結合リガンドを予め塗布しておくのが好ましい。
【００２２】
　図５および図６の実施態様の両方において、管42は孔34または34Aに直ちに挿入したり取り外し可能であり、それゆえこのケースは“使い捨て可能”であると考えられることがわかるであろう。特に、図６に示す“使い捨て司能”は、密封容器に検査により予め添加され充填されるのに適し配布および使用に便利である。図５および図６の実施態様の両方において、レンズ32および管42Aの両方を形成する物質は、そのそれぞれの屈折率が実質的に適合するように選択される。管42Aおよびレンズ32の間の最適光学結合をもたらすために、屈折率−適合液体を管の周囲で管と孔34Aの内壁の間の間隔に設けることが好ましい。
【００２３】
　図６の実施態様のビーズ塊状物40を、たとえば図５のビーズ塊状物を作りだすめに使用したのと同じ技術、すなわち導管42にビーズ懸濁液を流したとえば38Bのようなスクリーンに対向して付着させ、次いで別のスクリーンをビーズ塊状物を捕らえるために据えつけることにより形成される。これに代わり、多孔性ビーズ塊状物はまた焼結または接着剤により相互に軽く接着した複数のビーズから形成されてもよい。たとえば、ビーズ塊状物は、自立しているかまたは多孔性支持体を塗布するかもしくは一対の多孔性支持体の間にサンドイッチを形成することによりビーズの厚い層をもたらすことにより形成することができ、この厚い層は、得られる塊状物の多孔度を実質的に減らさないであろう少量の接着剤を含む。硬化後、皮膜を適当な特異的反応性リガンドで予め塗布し、皮膜の小さい円形を打ち抜き、そして適当な寸法の管42へ挿入する。これに代わり、所望の多孔度の高分子量ポリマー物質のシートが市販されており、多孔性構造体内に必要なリガンドを固定化するための処理後、これを打ち抜き、管42へ挿入するための所望の円形を作ることができる。すなわち、複数個のビーズ塊状物を準備し、各々を異なったリガンドで塗布する。得られた複数個のビーズ塊状物を、図７に示すように一本の管42に置き、これにより幾つかの異なったリガンドについて別々にしかしほぼ同時に管を通るサンプル流れを検定する。
【００２４】
　図８に示すように、導管34を浅く細長いチャンネル34Bまたは断面半円形カットの半管状部分として部分的に形成するかまたはレンズの光学軸に垂直にそしてレンズ手段32の焦点領域を通過して伸びるレンズ33の平面48へ型作りを行う。導管34の残りは、プレート50に設けられた半円形断面の別の半管状の細長いチャンネル34Cにより形成される。後者は一般にヒンジ52により表面48に隣接するレンズ32に接続し、これによりプレート50を回転して同軸関係にチャンネル34Cおよび34Bを適合させ、実質的に円形断面の組合せ導管を形成することができる。好ましい実施態様において、チャンネル34Cの内側表面は高度に反射性の皮膜54が設けられている。
【００２５】
　ここに含まれる本発明の範囲から逸脱することなく上記方法および装置において一定の変化を行うことができるので、上記記載に含まれるかまたは添付の図面に含まれる全ての事柄は説明におけるもので限定するものではないと解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の原理を具体化する分析装置の横断面模式図である。
【図２】図２は、本発明のフローセルの一実施態様の概略横断面図である。
【図３】図３は、図２のフローセルの横断面図である。
【図４】図４は、図２の変形フローセルの概略的横断面図である。
【図５】図５は、本発明の別の変形フローセルの概略的横断面図である。
【図６】図６は、図５の変形フローセルの概略的横断面図である。
【図７】図７は、図５の別の変形フローセルの概略的横断面図である。
【図８】図８は、本発明のさらに別のフローセルの実施態様の概略的な横断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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