(57)【要約】【課題】還流液体の温度変化に基づく細胞活動電位変化がより小さい状態の細胞を実験に使用できる方法等を提供すること。【解決手段】高抵抗電気シール形成状態で細胞に対して薬液曝露させる方法であって、（ａ）Ｙ字チューブ接続流入ラインと流出ラインとの液流路を有する細胞槽内に、該チューブの一液流路から流入出ラインへ細胞外生理液を還流させるとともに細胞懸濁液を保持等する工程、（ｂ）該ピペットの先端口を細胞槽内の分散系細胞と接触させ、該ピペットを介して陰圧を細胞に加える工程、（ｃ）該チューブの他液流路から流入出ラインへ薬液を還流させることにより、細胞槽内において薬液を細胞に接触させる工程、及び（ｄ）前記チューブの該一液流路から流入出ラインへ細胞外生理液を再び還流させることにより、細胞槽内において細胞に対する薬液の曝露を停止させる工程を有することを特徴とする方法等。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜が破壊されてなる細胞に対して薬液を曝露させる方法であって、
（ａ）Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽内に、当該Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を還流させるとともに、被験細胞の懸濁液を保持又は充填する工程、（ｂ）パッチクランプ電極であるパッチクランプピペットの先端口を前記細胞槽内の分散系細胞と接触させ、前記パッチクランプピペットを介して陰圧を前記細胞に加える工程、
（ｃ）前記Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させることにより、前記細胞槽内において当該薬液を被験細胞に接触させる工程、及び
（ｄ）前記Ｙ字チューブの前記一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を再び還流させることにより、前記細胞槽内において被験細胞に対する当該薬液の曝露を停止させる工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記Ｙ字チューブが、Ｙチューブの合流点の直前箇所においてＴ字チューブがＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインに接続されてなるＴ字チューブであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記被験細胞が、脊椎動物由来の心筋細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法を実行する装置であって、Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽を含むことを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項５記載の装置であって、前記Ｙ字チューブが、Ｙチューブの合流点の直前箇所においてＴ字チューブがＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブであることを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項６記載の装置であって、前記Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインに接続されてなるＴ字チューブであることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、パッチクランプ法における細胞における薬液の曝露方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電圧ゲート制御イオンチャンネル（ｖｏｌｔａｇｅ    ｇａｔｅｄ    ｉｏｎ    ｃｈａｎｎｅｌ）及びそれによるイオン電流の状態或いは活動電位を測定する方法は、細胞膜の性質を解析するために極めて有用な方法であり、全細胞（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ）におけるイオンチャンネルの機能及び薬理学的特性等に係る研究調査のための強力な方法として利用されてきた。
その中でも、パッチクランプ法として知られる実験方法は代表的なものであり、現在では多くのバリエーションが加えられて、トランスポータ機能の解析や単一細胞の遺伝子解析や環境因子に対するバイオセンサーにも応用され、生命科学分野で広く用いられている。
【０００３】
【非特許文献１】
標準生理学  第５版  （株）医学書院（２０００年１２月１日発行）  第６８頁〜第７３頁
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、当該パッチクランプ法は、電圧ゲート制御イオンチャンネルに対する潜在的な活性を有する薬剤の調査およびスクリーニングのための的確な方法を提供するが、この方法は、かなりの手先の器用さと高度のオペレータ技能とを必要とする。例えば、単純なシリコンチューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽を含む装置等が用いられているが、これらの方法では細胞外生理液と薬液との切り替えを明確に行うことが難しく、例えば、上記シリコンチューブ内の液体の温度が外気温により低下した際に、当該液体がそのまま当該シリコンチューブの液体流路から流入ラインを経て細胞槽内に導入されるために、当該細胞槽内の温度変化を生じ、それに伴い、還流液体の温度変化に基づく細胞の活動電位の変化が発生したり、当該シリコンチューブの液体流路からの流入ラインをできるだけ短くしたり、デッドボリュームを減らすために管径を小さくしたりする実験条件を経験的要素に基づき実施する必要があり、実験者間のバラツキを抑え一定条件での実験が容易ではなかった。このため、薬剤スクリーニングのためには非常に時間を要したり、実験者間等で実験結果にバラツキが生じる傾向があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、細胞槽としてＹ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽を含む装置の使用等を見出し、これによりオペレータ間のバラツキを抑え一定条件での実験が可能となり、還流液体の温度変化に基づく細胞における活動電位の変化がより小さい状態の細胞を実験に使用できるようになった。また、シリコンチューブ内の液体の交換時間を短縮させ、それに伴い、薬物の曝露時間の延長が可能となり、薬物応答に比較的長時間を要する薬物の評価も可能となった。その結果、実験の効率化及び精度向上が図られるようになった。
【０００６】
本発明は、
１．パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜が破壊されてなる細胞に対して薬液を曝露させる方法であって、（ａ）Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽（以下、本細胞槽と記すこともある。）内に、当該Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を還流させるとともに、被験細胞の懸濁液を保持又は充填する工程、
（ｂ）パッチクランプピペットの先端口を前記細胞槽内の分散系細胞と接触させ、前記パッチクランプピペットを介して陰圧を前記細胞に加える工程、
（ｃ）前記Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させることにより、前記細胞槽内において当該薬液を被験細胞に接触させる工程、及び
（ｄ）前記Ｙ字チューブの前記一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を再び還流させることにより、前記細胞槽内において被験細胞に対する当該薬液の曝露を停止させる工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明方法と記す。）；
２．前記Ｙ字チューブが、Ｙチューブの合流点の直前箇所においてＴ字チューブがＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブであることを特徴とする前項２記載の方法；
３．前記Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインに接続されてなるＴ字チューブであることを特徴とする前項２記載の方法；
４．前記被験細胞が、脊椎動物由来の心筋細胞であることを特徴とする前項１記載の方法；
５．前項１記載の方法を実行する装置であって、Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽を含むことを特徴とする装置（以下、本発明装置と記すこともある。）；
６．前項５記載の装置であって、前記Ｙ字チューブが、Ｙチューブの合流点の直前箇所においてＴ字チューブがＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブであることを特徴とする装置；
７．前項６記載の装置であって、前記Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインに接続されてなるＴ字チューブであることを特徴とする装置；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、測定時間の短縮化及び測定精度の向上のための改良であって、分散系細胞における薬液の曝露方法、即ち、パッチクランプ電極に付着させられた細胞における細胞膜の一区域と前記電極の先端口の間に高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で当該シール部分の細胞膜が破壊されてなる細胞に対して薬液を曝露させる方法であって、（ａ）Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽内に、当該Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を還流させるとともに、被験細胞の懸濁液を保持又は充填する工程、（ｂ）パッチクランプピペットの先端口を前記細胞槽内の分散系細胞と接触させ、前記パッチクランプピペットを介して陰圧を前記細胞に加える工程、（ｃ）前記Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させることにより、前記細胞槽内において当該薬液を被験細胞に接触させる工程、及び（ｄ）前記Ｙ字チューブの前記一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を再び還流させることにより、前記細胞槽内において被験細胞に対する当該薬液の曝露を停止させる工程を有することを特徴とする。
【０００８】
本発明方法において、（ａ）Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブが接続された流入ラインと、流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽内に、当該Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を還流させるとともに、被験細胞の懸濁液を保持又は充填する工程を実現するための事象のシーケンスは、例えば、次の通りである。
１．適切な細胞を選択する。
２．選択された細胞の懸濁液を本細胞槽内に入れる。
３．Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を還流させる。
（尚、上記２及び３は同時であってもよく、又は逆の順序であってもよい。）
【０００９】
流入ラインと流出ラインとの２系統の液体流路を有する細胞槽内の液体の交換時間を短縮するために、保温した細胞外生理液及び薬液を別々に独立して導く２つのシリコンチューブとしてＹ字チューブを採用し、かつＹ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点付近で当該チューブを細胞槽が有する流入ラインに接続する。
Ｙ字チューブは、例えば、生理学的実験や医療用途で通常用いられるＹ字チューブであればいかなるものであってよいが、より具体的には、例えば、Ｙチューブの合流入口側（液体供給側）の２つの液体流路のうち、一方の液体流路が薬液のための液体流路であって、かつ、他方の液体流路が細胞外生理液のための液体流路であるＹ字チューブ等をあげることができる。
このようなＹ字チューブは、上記の如く、シリコンチューブ内の液体の交換時間を短縮させ、それに伴い、薬物の曝露時間の延長が可能となり、薬物応答に比較的長時間を要する薬物の評価も可能となる。
【００１０】
さらにまた、Ｙ字チューブは、例えば、Ｙチューブの合流点の直前箇所においてＴ字チューブがＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブであることがより好ましい。ここで、Ｔ字チューブとしては、具体的には、例えば、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路がＴチューブの合流入口側（液体供給側）から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインであるＴ字チューブ等を好ましくあげることができる。
このようなＴチューブがＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブは、上記シリコンチューブ内の液体の温度が外気温により低下した際に、当該液体を上記Ｔ字チューブが有するＹ字チューブ外に排出させるための液体流路から迅容易にかつ迅速に除去した直後に保温状態が維持された液体を上記シリコンチューブ内に充填してこれを還流することにより、細胞槽内の被験細胞の懸濁液の温度変化を抑制させ、それに伴い、還流液体の温度変化に基づく細胞の活動電位の変化を発生させることなく、より高精度での薬物の評価も可能となる。
【００１１】
尚、上記の如く、シリコンチューブ内の液体の交換時間を素早く実施するために、Ｙ字チューブの一方の液体流路にはクリップが存在しているとよい。また、薬液廃液ラインや、Ｙ字チューブの合流点とＴ字チューブの合流点との間にもクリップ、クリップが存在しているとよい。
【００１２】
本発明方法において、（ｂ）パッチクランプ電極であるパッチクランプピペットの先端口を前記細胞槽内の分散系細胞と接触させ、前記パッチクランプピペットを介して陰圧を前記細胞に加える工程を実現するための事象のシーケンスは、例えば、次の通りである。
１．パッチクランプピペットをその細胞の上方に位置させる。因みに、パッチクランプピペットは３次元軸マニピュレータ上に装着すればよい。これを、パッチクランプピペットを動かすために使用してよい。
２．細胞膜表面がパッチクランプピペットによって僅かに変形させられるまでパッチクランプピペットを接触させる。
３．パッチクランプピペットの先端口と細胞膜との間に高抵抗（ギガオーム）電気シールが形成されるまでパッチクランプピペットの内部に陰圧を加える。
４．パッチクランプピペットの先端口の区域内で細胞膜を破壊する陰圧をさらに加えることによって全細胞記録モードを確立する。
【００１３】
パッチクランプ法の成功は、細胞膜の一区域とパッチクランプピペットの先端口との間に「ぴったりとした（ｔｉｇｈｔ）」（即ち、高抵抗：ギガオーム）電気シールを形成することが可能であることに基づいている。
【００１４】
本発明方法で使用されるパッチクランプ電極としては、例えば、先端口の開口部直径が、例えば、約１〜５μｍ程度以下のガラス製のピペットであるパッチクランプピペット等をあげることができる。
【００１５】
高抵抗（ギガオーム）電気シールの形成は、このようなパッチクランプピペットを、例えば、脊椎動物由来の心筋細胞等の被験細胞の細胞膜表面に押し付け、当該被験細胞をパッチクランプピペットの先端口に接触させる。この状態では記録器の電流雑音は通常１ｐＡ以上にある。
勿論、被験細胞は、１つまたは複数の細胞であってもよく、また当該被験細胞は液体媒質中に浮遊している状態のものであってもよい。
【００１６】
次いで当該パッチクランプピペットの内部を陰圧に制御することにより細胞膜表面とガラス面とを密着させる。このように細胞膜表面とガラス面とを密着させると、接触抵抗が数メグオームから数ギガオームに増大する。これを高抵抗（ギガオーム）電気シールといい、このプロセスは、高抵抗（ギガオーム）電気シール形成全体に適用される小さな電圧ステップに応答して記録される電流パルスの表示によって電気的に監視されることが一般的である。具体的には、通常、この状態では記録器の電流雑音が約０．２〜０．５ｐＡ程度となる。
勿論、被験細胞は、液体中に浮遊させられている細胞に対し液体／空気界面において高抵抗電気シールを形成させることも、例えば、特表２００２−５３２６８４公報等に記載されるような公知な方法を用いることにより可能になる。
【００１７】
さらに、陰圧吸着により高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態で、当該シール部分の細胞膜を引き上げることなくさらに陰圧を徐々にかけると、吸着した細胞膜の微小部分が破れ、当該パッチクランプピペット内の液体が細胞内液と交換するとともに電気的にも当該パッチクランプピペット内と細胞内電位が等電位となり、当該パッチクランプピペットを細胞内電極として細胞全体に膜電位固定を行うことができる。この状態を、全細胞記録モード（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ    ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ    ｍｏｄｅ）といい、また、このような方法は、一般的には、全細胞（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ）記録法と呼ばれ、小型で球形の細胞に最もよく適用され、細胞外液条件だけではなく、細胞内液条件を変化させながら細胞膜の性質を解析するために極めて有用な方法である。これによって、各種の細胞、例えば、ニューロン、筋芽細胞、血球細胞、内分泌細胞、外分泌細胞等の殆ど全ての種類の細胞についての解析が行われる。
【００１８】
本発明方法において、（ｃ）前記Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させることにより、前記細胞槽内において当該薬液を被験細胞に接触させる工程を実現するための事象のシーケンスは、例えば、次の通りである。
１．Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させる。
２．上記１により、細胞槽内に流入した薬液が被験細胞に接触する。
【００１９】
例えば、Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインに接続されてなるＴ字チューブである場合、Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへの細胞外生理液の還流を、Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへの薬液の還流に切り替える前に、まず、Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインが閉鎖された状態で、薬液廃液ラインを利用してＴチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させる。これにより、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体を新鮮な液体に交換した後、直ちに薬液廃液ライン及びＹ字チューブの一方の液体流路の両者をクリップ等により閉鎖するとともに、Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを開放することにより、Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させることが可能となる。このようにして、本細胞槽内において薬液を被験細胞に接触させることができる。
【００２０】
本発明方法において、（ｃ）前記Ｙ字チューブの前記一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を再び還流させることにより、前記細胞槽内において被験細胞に対する当該薬液の曝露を停止させる工程を実現するための事象のシーケンスは、例えば、次の通りである。
１．Ｙ字チューブの前記一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ細胞外生理液を再び還流させる。
２．上記１により、速やかに細胞槽内に存在していた薬液が全て細胞槽外に排出され、当該細胞槽内において被験細胞に対する当該薬液の曝露を停止させる。
【００２１】
例えば、Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ラインに接続されてなるＴ字チューブである場合、Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへの薬液の還流を、Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへの細胞外生理液の還流に切り替えるには、Ｙ字チューブの他方の液体流路から流入ラインを閉鎖するとともに、Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを開放することにより、Ｙ字チューブの一方の液体流路から流入ラインを経て流出ラインへ薬液を還流させることが可能となる。このようにして、本細胞槽内において被験細胞に対する当該薬液の曝露を停止させることができる。
【００２２】
本発明は次の添付図面に例示されている。
図１を参照する。Ｙ字チューブ（１４）の合流出口側（液体排出側）における合流点（１５）付近で当該チューブが接続された流入ライン（８）と、流出ライン（９）との２系統の液体流路を有する細胞槽（７）が示されている。当該Ｙ字チューブの一方の液体流路にはクリップ（１６）が存在している。また、当該Ｙチューブの合流点の直前箇所においてＴ字チューブ（２１）がＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されている。当該Ｔ字チューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ライン（１３）に接続されている。当該薬液廃液ライン（１３）にはクリップ（１８）が存在している。Ｙ字チューブの合流点（１５）とＴ字チューブの合流点との間にクリップ（１７）が存在している。さらに、電極ホルダー（１）内に保持されたパッチクランプピペット（２）を移動させるために電動式３次元マニピュレータが使用される構成を示している。当該システムには、さらに圧力チューブ（４）が備えられており、細胞へ加える陰圧を制御している。その他として、細胞（５）、細胞懸濁液（６）、細胞槽（７）、流入ライン（８）、流出ライン（９）、ＡＤコンバーター（１０）、パッチクランプアンプ（１１）、コンピュータ（１２）を併せて示している。
【００２３】
図２を参照する。パッチクランプピペット（２）の先端口に保持されかつ細胞内に置かれている高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態にある細胞（５）が示されている。
【００２４】
例えば、化合物のイオンチャンネル遮断／作用活性をスクリーニングする目的で本発明を使用するためには、パッチクランプピペットに付着させられている細胞に対象の化合物を適用する必要がある。これは様々な方法で、例えば、高抵抗（ギガオーム）電気シール形成の前または後に細胞槽内の細胞外液体にその化合物を添加することによって行うことが可能であることが容易に理解でき、この場合において本発明方法が効果的であることが分かる。
【００２５】
また、例えば、化合物の催不整脈作用を評価する目的で本発明を使用するためには、心筋細胞の活動電位持続時間（ＡＰＤ）を測定すればよい。これは、心電図のＱＴ間隔が心筋細胞の活動電位持続時間（ＡＰＤ）を反映することから、化合物によるＱＴ間隔延長作用の予測にはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの心筋細胞の活動電位持続時間（ＡＰＤ）の測定が有効であるからである。さらに、心筋細胞の急速活性型遅延整流Ｋ電流（Ｉｋｒ）を測定すると尚良い。Ｉｋｒの阻害活性を示す化合物はＱＴ間隔を延長させる可能性が高いからである。
薬物の初期評価段階において催不整脈作用活性を明らかにすることは、より低リスクな化合物を選択するうえで極めて重要であり、本発明は化合物の安全性評価の精度を向上させる等の点からその利用価値は大きなものである。
実際に本発明を使用するためには、上記同様に、パッチクランプピペットに付着させられている細胞に対象の化合物を適用する必要がある。これは様々な方法で、例えば、高抵抗（ギガオーム）電気シール形成の前または後に細胞槽内の細胞外液体にその化合物を添加することによって行うことが可能であることが容易に理解でき、この場合において本発明方法が効果的であることが分かる。
【００２６】
化合物の効果を調べる方法の具体例（図面を含む）により、さらに詳細に説明する。
図１には、さらに、細胞懸濁液（６）を含む細胞槽（７）と、パッチクランプピペット（２）の先端口に位置する細胞（５）から全細胞記録を得るための記録位置にあるパッチクランプピペット（２）とが示されている。当該細胞槽（７）は、実験目的や、被験細胞の種類等の実験条件等に応じて適宜その形状、容量等を選択すればよいが、例えば、細胞外生理液や調査対象の薬剤を適量保持又は充填することができるものがよい。当該細胞槽（７）は、通常、細胞外生理液や調査対象の薬液等を外部から流入させるための流入ライン（８）及び細胞外生理液や調査対象の薬液等を外部へ流出させるための流出ライン（９）を備えていることがよい。
【００２７】
パッチクランプシステムから得られた電流と電圧の記録は、電極ホルダー（１）から電気コードを通じて、ＡＤコンバーター（１０）、パッチクランプアンプ（１１）を経て、コンピュータ（１２）にて行われる。パッチクランプ法を使用する高抵抗（ギガオーム）電気シールの形成（細胞付着パッチモード）の後に得られた記録と、パッチクランプピペット（２）内部に陰圧を加える（４）ことによって、当該シール部分の細胞膜を破壊して得られる全細胞記録とは明らかに異なるパターンを示し、全細胞記録モードの確立は、電流軌跡上の大きな容量性過渡現象の存在によってコンピュータ（１２）上のモニタによって確認できる。
【００２８】
本発明装置は、本発明方法を実行する装置であって、Ｙ字チューブの合流出口側（液体排出側）における合流点（１５）付近で当該チューブが接続された流入ライン（８）と、流出ライン（９）との２系統の液体流路を有する細胞槽（７）を含むことを特徴とする装置であればいかなるものであってもよいが、具体的には、例えば、（１）被験細胞の広域像を観察する光学顕微鏡部と、（２）パッチクランプピペットと被験細胞を接触させる手段と、（３）陰圧をパッチクランプピペットを介して被験細胞に加えるための圧力チューブ、（４）パッチクランプピペットを通して電圧を印加して、その結果生じた電流を検出するとともに、被験細胞中の単一の生細胞又は生体膜の微小な領域から生体膜を横切る電流を電極液を介して導出して記録するパッチクランプ測定部と、（５）パッチクランプ測定部から得られた電気生理学的情報とを収集し、記録し、解析するとともに、装置全体を制御する解析制御部とを備えることがよい。
【００２９】
また、パッチクランプピペット（２）と被験細胞（１５）を接触させる手段には、細胞槽（７）、及び、油圧式マニュピレーター又は電動式３次元マニュピレーター等を好適に採用できる。さらに、シールドボックス、除振台等を併せて用いてもよい。
【００３０】
また、光学顕微鏡部では、コントラスト増強が可能な、ホフマンモジュレーションシステム、位相差顕微鏡又は微分干渉顕微鏡を好適に使用できる。
【００３１】
好ましい本発明装置としては、例えば、本発明装置であって、前記Ｙ字チューブが、Ｙチューブの合流点（１５）の直前箇所においてＴ字チューブ（２１）がＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されたＹ字チューブ（１４）であることを特徴とする装置等をあけることができる。さらにより好ましい本発明装置としては、例えば、前記の好ましい本発明装置であって、前記Ｔ字チューブが、Ｔチューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ライン（１３）に接続されてなるＴ字チューブ（２１）であることを特徴とする装置等があげられる。
【００３２】
本発明装置では、まず、光学顕微鏡部で被験細胞（１５）の広域像を得る。こうして得られる被験細胞（１５）の広域像に基づいて、パッチクランプピペット（２）を形態観察の対象である被験細胞（１５）等の生体被験細胞上の位置に移動する。引き続き、パッチクランプピペット（２）の先端口を被験細胞表面の近接場領域である初期位置まで接近させる。パッチクランプピペット（２）の近接場領域への移動にあたっては、油圧式マニュピレーター又は電動式３次元マニュピレーターを好適に使用できる。このようにして、被験細胞の近接場顕微観察による形態観察にあたっての幾何学的準備が完了し、形態観察を開始する。
【００３３】
次に、上記の顕微観察像に基づいて、パッチクランプピペット（２）を例えば、電動式３次元マニュピレーターを用いて電気生理測定点の上方に移動する。
【００３４】
次いで、電動式３次元マニュピレーターを用いて、パッチクランプピペット（２）を被験細胞表面に接触させる。また、これと同時に、パッチクランプピペット（２）を通して電圧を印加し、生じる電流をモニタする。
【００３５】
次に、パッチクランプピペット（２）内を陰圧にして、細胞懸濁液（６）中の被験細胞（５）の膜を電極内に引き込み、高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成する（図２参照）。このとき、高抵抗（ギガオーム）電気シールの形成までの過程を電気的にモニタするため、高抵抗（ギガオーム）電気シール抵抗値の測定、膜電位固定及び膜電流固定するための指令パルスを、主増幅器を介して前置増幅器に出力するために、解析制御部の制御を受けたパルスジェネレータを用いる。尚、パッチクランプピペット（２）の外周には絶縁膜が形成されているので、高抵抗（ギガオーム）電気シールが確実に形成される。さらに陰圧を加える（４）ことによって、当該シール部分の細胞膜を破壊し、全細胞記録モード（ｗｈｏｌｅ    ｃｅｌｌ    ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ    ｍｏｄｅ）を形成させる。次いで、パッチクランプ電極内部に電解液を導入する。
【００３６】
このようにして、細胞懸濁液（６）中の被験細胞（５）の電気生理学的観察にあたっての幾何学的準備が完了する。そして、当該被験細胞中の単一の生細胞膜を横切る電流を、パッチクランプピペット（２）から導出してパッチクランプ測定部で測定する。
バッチクランプ測定部は、例えば、（１）パッチクランプピペットで検出された生体電気信号である生体膜を横切る電流信号を入力し、電圧信号に変換し、増幅して出力する前置増幅器と、（２）解析制御部からの指示により、シール抵抗の測定、膜電位固定又は膜電流固定に関する指令信号を出力する電気信号発生装置と、（３）前置増幅器から出力された電圧信号を入力し、増幅し、処理して解析制御部へ向けて出力するとともに、電気信号発生装置から出力された指令信号を入力し、演算処理して前置増幅器へ向けて出力する主増幅器とを備えるとよい。
測定された電流信号に、電圧信号への変換（図１中では、ＡＤコンバーター（１０）の役割）や増幅（図１中では、パッチクランプアンプ（１１）の役割）等を施して解析制御部（図１中では、コンピュータ（１２）の役割）へ通知する。尚、上述のように、パッチクランプピペット（２）で導出された電流・電位は、前置増幅器内の電流電圧変換器（ＡＤコンバーター（１０））により電圧信号に変換されるが、当該信号は微小信号なので増幅、演算、電流雑音の低減等の処理を行う主増幅器（パッチクランプアンプ（１１））を介して解析制御部（コンピュータ（１２））に通知すればよい。
次いで、解析制御部では、パッチクランプ測定部から通知された電気生理学的情報を収集し、記録し、解析する。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、オペレータ間のバラツキを抑え一定条件での実験が可能となり、還流液体の温度変化に基づく細胞における活動電位の変化がより小さい状態の細胞を実験に使用できるようになった。また、シリコンチューブ内の液体の交換時間を短縮させ、それに伴い、薬物の曝露時間の延長が可能となり、薬物応答に比較的長時間を要する薬物の評価も可能となった。その結果、実験の効率化及び精度向上が図られるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明方法に関する装置についての模式図（但し、顕微鏡、除振台、電動式３次元マニピュレータ、シールドボックス等を省略した。）である。
Ｙ字チューブ（１４）の合流出口側（液体排出側）における合流点（１５）付近で当該チューブが接続された流入ライン（８）と、流出ライン（９）との２系統の液体流路を有する細胞槽（７）が示されている。当該Ｙ字チューブの一方の液体流路にはクリップ（１６）が存在している。また、当該Ｙチューブの合流点（１５）の直前箇所においてＴ字チューブ（２１）がＹチューブの液体流路の一部として接続又は挿入されている。当該Ｔ字チューブの液体流路のうち、Ｙ字チューブの液体流路の一部を構成していない液体流路が、Ｔチューブの合流入口側（液体供給側）の液体流路から合流点の直前箇所までの液体流路に存在する液体をＹ字チューブ外に排出させるための薬液廃液ライン（１３）に接続されている。当該薬液廃液ライン（１３）にはクリップ（１６）が存在している。Ｙ字チューブの合流点（１５）とＴ字チューブの合流点との間にクリップ（１７）が存在している。さらに、電極ホルダー（１）内に保持されたパッチクランプピペット（２）を移動させるために電動式３次元マニピュレータが使用される構成を示している。当該システムには、さらに圧力チューブ（４）が備えられており、当該チューブを通じて細胞へ陰圧が加える。その他として、細胞（５）、細胞懸濁液（６）、細胞槽（７）、流入ライン（８）、流出ライン（９）、ＡＤコンバーター（１０）、パッチクランプアンプ（１１）、コンピュータ（１２）を併せて示している。
【図２】図２は、パッチクランプピペット（２）の先端口に保持されかつ細胞内に置かれている、高抵抗（ギガオーム）電気シールを形成させた状態にある細胞を示す図である。
【符号の説明】
１      電極ホルダー
２      パッチクランプピペット
４      圧力チューブ
５      細胞
６      細胞懸濁液
７      細胞槽
８      流入ライン
９      流出ライン
１０    ＡＤコンバーター
１１    パッチクランプアンプ
１２    コンピュータ
１３    薬液廃液ライン
１４    Ｙ字チューブ
１５    Ｙ字チューブの合流点
１６    クリップ
１７    クリップ
１８    クリップ
１９    細胞外生理液
２０    薬液
２１    Ｔ字チューブ
【図１】
2004294212.tif 000002
【図２】
2004294212.tif 000003