(57)【要約】      （修正有）【課題】温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列を提供する。【解決手段】温州萎縮様症状を示したカンキツ葉から全ＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として相補ＤＮＡを合成し、その後、ＰＣＲ法により、ウイルス遺伝子のＬａｒｇｅｒ外被タンパク質遺伝子のＣ末端領域から、Ｓｍａｌｌｅｒ外被タンパク質遺伝子の全領域及び３‘非翻訳領域までの２本鎖ｃＤＮＡを合成し、目的とするウイルス遺伝子領域についてプラスミドに連結酵素を用いて連結し、それらのウイルス遺伝子領域をクローニングし、それらのウイルス遺伝子領域について塩基配列を解読して、温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列を決定する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表に示される温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列。
【請求項２】
温州萎縮様症状を示したカンキツ葉から全ＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として相補ＤＮＡを合成し、その後、ＰＣＲ法により、ウイルス遺伝子のＬａｒｇｅｒ外被タンパク質遺伝子のＣ末端領域から、外被タンパク質遺伝子の全領域及び３‘非翻訳領域までの２本鎖ｃＤＮＡを合成し、目的とするウイルス遺伝子領域についてプラスミドに連結酵素を用いて連結し、それらのウイルス遺伝子領域をクローニングし、それらのウイルス遺伝子領域について塩基配列を解読して、請求項１記載の温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列の決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列に関する。
【０００２】
【従来の技術】
温州萎縮病ウイルス（ＳＤＶ，ｓａｔｓｕｍａ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）と近縁のウイルスとして、カンキツモザイク病ウィルス（ＣｉＭＶ，ｃｉｔｒｕｓｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ネーブル班葉モザイク病ウイルス（ＮＩＭＶ，Ｎｅｖｅｌ  ｏｒａｎｇｅ  ｉｎｆｃｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ）、ナツカン萎縮病ウイルス（ＮＤＶ，ｎａｔｓｕｄａｉｄａｉ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓ）が存在する。船型葉を呈して樹勢低下を引き起こすのがこれらウイルス病の特徴である。いずれのウイルスについても外被タンパク質および３’末端非翻訳領域をコードするＲＮＡの塩基配列が明らかにされ、ジーンバンクで公開されている。
【０００３】
なお、カンキツの病原体については、例えば非特許文献１に開示されている。
【０００４】
【非特許文献１】
北島  博，  果樹病害各論  ｐ．７８−８８，１９８９年  養賢堂発行
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
カンキツウイルスのうち、温州萎縮病ウイルス（ＳＤＶ）とその近縁ウイルス（ＣｉＭＶ，ＮＩＭＶ，ＮＤＶ）の検出については、ジーンバンクで公開されたウイルスの塩基配列をもとに遺伝子診断法の開発をすすめていたが、ＳＤＶ様症状を示すにもかかわらずウイルスを検出できない場合があった。
【０００６】
そこで、本発明は、温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列表に示される温州萎縮病（ＳＤＶ）様症状を示すカンキツ樹のウイルスの塩基配列を特徴とするものである。
【０００８】
また、本発明の塩基配列の決定方法は、温州萎縮様症状を示したカンキツ葉から全ＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを鋳型として相補ＤＮＡを合成し、その後、ＰＣＲ法により、ウイルス遺伝子のＬａｒｇｅｒ外被タンパク質遺伝子のＣ末端領域から、外被タンパク質遺伝子の全領域及び３‘非翻訳領域までの２本鎖ｃＤＮＡを合成し、目的とするウイルス遺伝子領域についてプラスミドに連結酵素を用いて連結し、それらのウイルス遺伝子領域をクローニングし、それらのウイルス遺伝子領域について塩基配列を解読することを特徴とする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明によるウイルスの塩基配列は次の方法により得られた。
【００１０】
（１）全ＲＮＡの抽出：佐賀県のカンキツ栽培地から温州萎縮様症状を示したカンキツ葉を採集後、その葉を磨砕し、植物ＲＮＡ抽出キット「ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）」を用いて全ＲＮＡを抽出した。
【００１１】
（２）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法：後述のＰＣＲを実施するために、抽出したＲＮＡを鋳型として逆転写酵素キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。その後、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）法により、ウイルス遺伝子のＬａｒｇｅｒ外被タンパク質遺伝子のＣ末端領域から、外被タンパク質遺伝子の全領域及び３‘非翻訳領域までの２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００１２】
（３）塩基配列の解析：目的とするウイルス遺伝子領域についてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結酵素（ロシュ）を用いて連結し、それらのウイルス遺伝子領域をクローニングした。その後、３１０ジェネティクアナライザー（ＡＢＩ）を用いてそれらのウイルス遺伝子領域について塩基配列を解読した。また、ＰＣＲ産物についても同様に塩基配列を解読し、クローニングし得た塩基配列と同様であることを確認した。
【００１３】
また、各所のＳＤＶ様症状を示す他県のカンキツサンプルについても同様の調査を行った。供試したサンプルのリストについては表１のとおりである。
【００１４】
【表１】
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表１に示す既知ウイルスとＳＤＶ様症状を示すカンキツ樹から分離されたウイルスの相同性について検討した。その結果を表２に示す。表２において、数値が高いほど相同性が高いことを示し、９９％以上で同種のウイルスと判断される。
【００１５】
【表２】
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表２に示すように、佐賀県内のカンキツから検出された４ウイルスのうち３ウイルス（ＳＤＳＡ２、ＳＤＳＡＹ１、ＳＤＳＡＴ１２）については、表２に示すように、９５％以上の高い相同性を示すＣｉＭＶ−ＡＺ１系統に分類されることが明らかになった。
【００１６】
しかし、残りの１ウイルスＳＤＳＡ１１の既知ウイルスとの相同性は５５〜８３％で、別の系統に分類されることが明らかになった。
【００１７】
佐賀県内カンキツから検出されたＳＤＳＡ１１の塩基配列については配列表に示すとおりである。
【００１８】
供試ウイルスの分類学的位置について明らかにするために、解読した塩基配列をもとに、近隣結合法で解析した。図１はＳＤＶ様症状を示すカンキツ樹から検出された新系統ウイルスＳＤＳＡ１１の外被タンパク質をコードするＲＮＡ領域における塩基配列を示す図である。なお、系統樹における線の長さについては遺伝的距離を表し、線の長さが長いほど遺伝的に遠い関係であることを示す。その緒果、図１に示すように、佐賀県内で採取したＳＤＳＡ１１は、ＳＤＶ、ＣｉＭＶ−ＡＺ１系統、ＣｉＭＶ−ＬＢ１系統、ＮｉＭＶ、ＮＤＶとは異なる系統に分類された。
【００１９】
【発明の効果】
カンキツウイルスは植物体内での濃度が低く精度の高い抗血清を作製するのが困難であるため、大腸菌内で人工的に発現させたタンパク質を抗原として用いる手法で精度の高い抗血清を人工的に作製することができる。この場合、対象となるウイルスの塩基配列が解明されておく必要があるため、本発明で明らかになった新しい系統のウイルスの塩基配列は新しい診断薬を作製する方法として有効である。
【００２０】
さらに、新しいウイルスを既知ウイルスと同時に検出する診断薬を作製することで、無毒の苗木および穂木を生産農家に供給できるシステムが強化される。
【００２１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】カンキツ樹から検出したウイルスの系統を示す図である。
【図１】
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