(57)【要約】【課題】未知のペプチドを含む広範囲のペプチドに対してプロダクトイオンへの分解の効率及び分解が起こる部位の選択性に優れ、得られるプロダクトイオンを高感度かつハイスループットに検出することができる、質量分析装置を用いたペプチドのアミノ酸配列決定方法を提供する。【解決手段】解析すべきペプチド、又は前記解析すべきペプチドを必要に応じ断片化して得られたペプチド断片のＮ末端に、側鎖に酸性基を有するアミノ酸のアミノ基が保護基で保護されたアミノ酸誘導体を結合させ、質量分析法によってペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析すべきペプチド、又は前記解析すべきペプチドを必要に応じ断片化して得られたペプチド断片のＮ末端に、側鎖に酸性基を有するアミノ酸のアミノ基が保護基で保護されたアミノ酸誘導体を結合させ、質量分析法によってペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項２】
前記酸性基が、カルボキシル基、スルホ基、ホスホノ基、硫酸基、及びリン酸基からなる群から選ばれる、請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項３】
前記アミノ酸が、システイン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リン酸化スレオニン、リン酸化セリン、硫酸化チロシン、及びリン酸化チロシンからなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項４】
前記保護基が塩基性基以外の官能基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項５】
前記保護基が、ビオチニル基、アセチル基、ホルミル基、及びフェニルイソチオカルバミル基からなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項６】
前記保護基がビオチニル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項７】
前記アミノ酸誘導体がＮ−ビオチニルシステイン酸である、請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項８】
前記断片化を、塩基性アミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を特異的に加水分解する酵素を用いて行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項９】
前記アミノ酸誘導体が結合したペプチド又はペプチド断片をイオン化させると共に分解イオンを発生させ、質量分析法により分離検出する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸誘導体が結合したペプチド又はペプチド断片をマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によってイオン化させる、請求項９に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【請求項１１】
飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）によって、イオンを分離検出する、請求項９又は１０に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドのアミノ酸配列の決定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、質量分析法によるペプチドのアミノ酸配列決定方法としては、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で、解析すべきペプチドをイオン化させ、発生したイオン（プレカーサーイオン）が飛行途中で自然に分解した種々のポストソース分解（Post Source Decay；ＰＳＤ）イオンを分離検出することによって行うポストソース分解法（ＰＳＤ法）を用いてＭＳ／ＭＳ分析を行う方法や、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析装置でＭＳ／ＭＳ分析を行う方法等がある。これらの方法においては、ペプチドのプレカーサーイオンを選択し装置内でプロダクトイオンに分解し、得られたペプチド断片からアミノ酸配列情報を得る。しかし、これらの方法による分解においては、ペプチド結合が分解されるだけでなく、ペプチド結合以外の部位でも分解が起こり、複雑なペプチド断片混合物が得られることがある。そして、得られるスペクトルにおいては、それら断片のそれぞれのスペクトルが混合する上に、もとの解析すべきペプチドのＮ末端を含む断片のスペクトルとＣ末端を含む断片のスペクトルとが混合してあらわれる。このようなスペクトルは、一般的に複雑であり解析が困難である。最近では、「Ｍａｓｃｏｔ」（http://www.matrixscience.com/）等の検索エンジンを用いたデータベース検索を行い、このような複雑なスペクトルのパターンからペプチドの配列を決定することも行われているが、データベースに登録されているペプチドにしか適応できないため、解析できるペプチドに限界がある。
【０００３】
また、特開平１０−９０２２６号公報においては、ペプチドのＮ末端やＣ末端に予め化学修飾を行い、プロダクトイオンを発生しやすくして得られるペプチド断片を簡素化し、ＭＳ／ＭＳ分析において修飾末端を含むペプチド断片を高感度に検出し、ペプチド断片の分子量差から直接アミノ酸配列を決定することも行われている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−９０２２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来の化学修飾による方法は、プロダクトイオンへの分解の効率に限界があること、分解が起こる部位の選択性が不十分であること、ペプチドの内部配列によってはプロダクトイオンへの分解の効率及び分解が起こる部位の選択性が大きく左右されるため、解析できるペプチドに限界がある等の問題があった。
【０００６】
そこで本発明の目的は、未知のペプチドを含む広範囲のペプチドに対してプロダクトイオンへの分解の効率及び分解が起こる部位の選択性に優れ、得られるプロダクトイオンを高感度かつハイスループットに検出することができる、質量分析装置を用いたペプチドのアミノ酸配列決定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、解析すべきペプチド、又は前記解析すべきペプチドを必要に応じ断片化して得られたペプチド断片のＮ末端に、保護基で保護されたアミノ基と酸性基を有する側鎖有機基とを有するアミノ酸誘導体をカップリングし、ＰＳＤ法やＭＳ／ＭＳ分析を行うことによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は以下の発明を含む。
【０００９】
（１）解析すべきペプチド、又は前記解析すべきペプチドを必要に応じ断片化して得られたペプチド断片のＮ末端に、側鎖に酸性基を有するアミノ酸のアミノ基が保護基で保護されたアミノ酸誘導体を結合させ、質量分析法によってペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
なお、本明細書においてペプチドとは、タンパク質を含む意味で用いる。
（２）前記酸性基が、カルボキシル基、スルホ基、ホスホノ基、硫酸基、及びリン酸基からなる群から選ばれる、（１）に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（３）前記アミノ酸が、システイン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リン酸化スレオニン、リン酸化セリン、硫酸化チロシン、及びリン酸化チロシンからなる群から選ばれる、（１）又は（２）に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００１０】
（４）前記保護基が塩基性基以外の官能基である、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（５）前記保護基が、ビオチニル基、アセチル基、ホルミル基、及びフェニルイソチオカルバミル基からなる群から選ばれる、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（６）前記保護基がビオチニル基である、（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（７）前記アミノ酸誘導体がＮ−ビオチニルシステイン酸である、（１）に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００１１】
（８）前記断片化を、塩基性アミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を特異的に加水分解する酵素を用いて行う、（１）〜（７）のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（９）前記アミノ酸誘導体が結合したペプチド又はペプチド断片をイオン化させると共に分解イオンを発生させ、質量分析法により分離検出する、（１）〜（８）のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（１０）前記アミノ酸誘導体が結合したペプチド又はペプチド断片をマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によってイオン化させる、（９）に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
（１１）飛行時間型質量分析法（ＴＯＦＭＳ）によって、イオンを分離検出する、（９）又は（１０）に記載のペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、未知のペプチドを含む広範囲のペプチドに対してプロダクトイオンへの分解の効率及び分解が起こる部位の選択性に優れ、得られるプロダクトイオンを高感度かつハイスループットに検出することができる、質量分析装置を用いたペプチドのアミノ酸配列決定方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のペプチドのアミノ酸配列決定方法は、解析すべきペプチドを必要に応じペプチド断片に断片化し、解析すべきペプチド又はペプチド断片のＮ末端に、後述のアミノ酸誘導体を結合させ、質量分析を用いて解析することによって行う。
【００１４】
なお、本発明において前記アミノ酸誘導体は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸のいずれの誘導体であっても良い。
【００１５】
本発明において、解析すべきペプチドがタンパク質等の大きな分子である場合、断片化することが好ましい。断片化は、酵素消化によって行うことが好ましい。酵素を用いる場合は、塩基性アミノ酸残基のＣ末端側のペプチド結合を特異的に加水分解するものを用いることがより好ましい。このような酵素としては、トリプシン、プラスミン、トロンビン、リジルエンドペプチダーゼ、アルギニンエンドペプチダーゼ等が挙げられる。従って、断片化を行うことによって、Ｃ末端残基に塩基性基を有する形態のペプチド断片が得られる。得られたペプチド断片はＣ末端残基が塩基性であるため、Ｃ末端残基は水中でプロトン付加により正電荷を有する。ペプチド断片が前記形態を有することは、質量分析でペプチド断片のイオン化とともに分解イオンを発生させた際に、Ｃ末端残基がプロトン付加により正電荷を有するため、そのようなＣ末端残基を含むプロダクトイオンの発生が促    本発明においては、解析すべきペプチド、又は上記断片化を行った場合は断片化により得られたペプチド断片のＮ末端に、側鎖に酸性基を有するアミノ酸のアミノ基が保護基で保護されたアミノ酸誘導体を結合させる。このアミノ酸誘導体は、水中で、前記酸性基の解離による負電荷を有する。負電荷を有するアミノ酸誘導体をペプチド又はペプチド断片のＮ末端に結合させることによって、正電荷を有するプロダクトイオンの発生を容易にする効果がある。
【００１６】
酸性基としては、カルボキシル基（ＣＯ2Ｈ基）、スルホ基（ＳＯ3Ｈ基）、ホスホノ基（ＰＯ3Ｈ2基）、硫酸基（ＯＳＯ3Ｈ基）、リン酸基（ＯＰＯ3Ｈ2基）等が挙げられる。
【００１７】
従って、前記アミノ酸誘導体としては、システイン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、；リン酸化スレオニン、リン酸化セリン、硫酸化チロシン、リン酸化チロシン等の、水酸基含有アミノ酸の水酸基が硫酸化又はリン酸化されたアミノ酸等の誘導体が挙げられる。
【００１８】
保護基としては、理論上、水中で前記アミノ酸誘導体が分子全体として負電荷を失わないものであれば特に限定されないが、塩基性基以外の官能基、すなわち塩基性基を有しない官能基が好ましい。塩基性基は、前記酸性基と電荷を中和しアミノ酸誘導体分子全体として電荷を打ち消す場合があるためである。塩基性基を有しない官能基としては、具体的には、ビオチニル基、アセチル基、ホルミル基、フェニルイソチオカルバミル基等が挙げられる。本発明においては、特にビオチニル基が好ましい。
【００１９】
本発明において、上記保護基は、前記アミノ酸誘導体のアミノ基における正電荷の発生を抑え、アミノ酸誘導体をカップリングさせたペプチドを質量分析する際に、前記アミノ酸誘導体が結合していない、正電荷をもつプロダクトイオンの発生を容易にする。上記保護基で保護されていないアミノ酸誘導体を用いると、前記アミノ酸誘導体のアミノ基の正電荷と側鎖の負電荷とが電荷を打ち消す場合があり、上記のような正電荷を有するプロダクトイオンの発生が困難となる。
【００２０】
本発明において特に好ましい前記保護基で保護されたアミノ基と酸性基を有する側鎖有機基とを有するアミノ酸誘導体は、下記式（Ｉ）で表されるＮ−ビオチニルシステイン酸である。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
本発明において、前記アミノ酸誘導体を結合させるには、従来から公知のペプチド合成法を適用することができる。すなわち、液相法、固相法のいずれの合成法によってもアミノ酸を結合させることができる。これらの方法によって、前記アミノ酸誘導体が結合したペプチド又はペプチド断片（以下、単にペプチド分子と記載する）を得る。得られたペプチド分子は、質量分析によって解析を行う。
【００２３】
ペプチド分子のイオン化方法としては、特に限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、液体二次イオン質量分析法（ＬＳＩＭＳ）、液体イオン化法（ＬＩ）等が挙げられる。
【００２４】
ＭＡＬＤＩ法、ＦＡＢ法、ＬＳＩＭＳ法、ＬＩ法ではマトリックスを用いるので、マトリックスのみがレーザー光を吸収すれば良く、ペプチド分子自身が直接レーザー光を吸収する必要がないため、極めて多種類の化合物をイオン化することができるため好ましい。本発明においては、以下の特徴点を有することからＭＡＬＤＩ法が特に好ましい。
【００２５】
(i) 瞬時の（パルス）イオン化を行う。(ii) 効率の高いイオン化が可能である。(iii) 広範囲の化合物のイオン化が可能である。(iv) 未精製や混合物状態の化合物のイオン化が可能である。
【００２６】
また、ＥＳＩ法も、ペプチド分子を壊さずにイオン化し、プロダクトイオンを発生させることができるため好ましい。
【００２７】
本発明においては、ペプチド分子をイオン化させるとともにプロダクトイオンを発生させ、これらのイオンを質量分析法により分離検出することが好ましい。そこで本発明においては、ペプチド分子を好ましくはＭＡＬＤＩ法でイオン化させ、発生したプリカーサーイオンが分解したポストソース分解イオンを飛行時間型質量分析法（time of flight mass spectrometry, ＴＯＦＭＳ）によって分離検出することができる。ＴＯＦ  ＭＳ法は、飛行時間で質量分離を行い、高感度・高分解能で測定できるために、パルス状にイオンを発生するＭＡＬＤＩとの相性が良く、これらを組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳは、好ましい方法の一つである。すなわち本発明においては、ペプチド分子をＭＡＬＤＩ法でイオン化させ、ＴＯＦ  ＭＳによって、ポストソース分解で生成したプロダクトイオンを分離検出することが特に好ましい。
【００２８】
本発明において、前記したアミノ酸誘導体を用いて、好ましくはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるＭＳ／ＭＳ分析を行うことにより、前記解析すべきペプチドのＣ末端を含む断片（ｙ系列）が選択的に高感度で検出可能となり、断片の分子量差から容易にアミノ酸配列を決定することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００３０】
［実施例１］
スルホスクシンイミドビオチン３．４ｍｇを２０μｌの蒸留水に溶解したもの、システイン酸１．１ｍｇを１５μｌの蒸留水に溶解したもの、及び１．６５μｌのトリエチルアミンを混合し、６０℃で３０分間反応させた。反応生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、目的のＮ−ビオチニルシステイン酸をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで確認した。
【００３１】
（２）Ｎ−ビオチニルシステイン酸のペプチドへのカップリング
モデルペプチドとしてラミニンペンタペプチド（（株）ペプチド研究所社製）を用いた。ラミニンペンタペプチドのアミノ酸配列は、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2である。上記配列においては、アルギニン残基がアミド化されており、アミド化されたアルギニン残基をArg-NH2と表している。１ｍＭ  Ｎ−ビオチニルシステイン酸のジメチルホルムアミド溶液２μｌ、０．５Ｍ  ＨＢＴＵ（2-[1H-benzotriazole-1-yl]-1,1,3,3-tetramethyl uronium hexafluorophosphate）と０．５ＭＨＯＢｔ（N-hydroxybenzotriazole）とを含むジメチルホルムアミド溶液０．６μｌ、及び１Ｍ  ジイソプロピルエチルアミンのジメチルホルムアミド溶液０．６μｌを予め混合し、２ｍＭ  ラミニンペンタペプチドのジメチルホルムアミド溶液２μｌに加え、室温で３０分間反応を行った。反応終了後、反応溶液を０．１重量％トリフルオロ酢酸水溶液で希釈し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによってＰＳＤ分析を行った。
【００３２】
図１に、ビオチニルシステイン酸がカップリングしたラミニンペンタペプチドのＰＳＤスペクトルを示す。一方、図２には、Ｎ−ビオチニルシステイン酸が結合していないラミニンペンタペプチドを、ＰＳＤ分析を行ったときのスペクトルを示す。図１及び図２において、横軸はイオンの質量／電荷（；Mass/Charge (m/z)）、縦軸はイオンの相対強度（Int.）を表す。分解物ピーク上に示された［アルファベット１文字＋括弧付数字］は、ペプチド結合が分解を受けた部位を表すものであり、アルファベットｙは、Ｃ末端側のペプチド断片を表し、数字は残っているアミノ酸残基の数を表す。
【００３３】
図１においては、ラミニンペンタペプチドに結合したＮ−ビオチニルシステイン酸に由来するビオチン（Biotin）及びシステイン酸（Cysteic Acid）がそれぞれ脱離しており、ビオチニルシステイン酸での修飾を行わなかった図２に比べて、ペプチド分子のｙ系列の断片が選択的に高感度に検出されている。
【００３４】
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これに限定されることなく他のいろいろな形態で実施することができる。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｎ−ビオチニルシステイン酸がＮ末端に結合したラミニンペンタペプチドのＰＳＤスペクトルである。
【図２】Ｎ−ビオチニルシステイン酸がＮ末端に結合していないラミニンペンタペプチドのＰＳＤスペクトルである。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１は、ラミニンのガン転移抑制活性部位の配列を有するペプチドがアミド化されたものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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