(57)【要約】【課題】本発明の課題は、従来の１−デオキシノジリマイシン測定方法における欠点を克服し、安定性、再現性及び感度において優れ、かつ分析単価の安価な１−デオキシノジリマイシン測定方法を提供することである。【解決手段】式Ｉで表される１−デオキシノジリマイシンの測定方法であって、試料を液体クロマトグラフィーで分離し、１−デオキシノジリマイシンを光散乱検出器で検出することを特徴とする上記測定方法。【化１】2004294384.tif 000007【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される１−デオキシノジリマイシンの測定方法であって、試料を液体クロマトグラフィーで分離し、１−デオキシノジリマイシンを光散乱検出器で検出することを特徴とする上記測定方法。
【化１】
2004294384.tif 000006
【請求項２】
液体クロマトグラフィーが、親水性相互液体クロマトグラフィーである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液体クロマトグラフィーにおいて、アミド基を有する固定相を用いる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
液体クロマトグラフィーにおける移動相が水及び有機溶媒の混合溶液であって、該混合溶液が揮発性塩を含有しｐＨが２〜８である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
移動相が、水とアセトニトリルの混合溶液であって、揮発性塩としてのアンモニウム塩を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
試料が植物抽出物である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
植物抽出物が、水及び有機溶媒を含む抽出液を用いて抽出されたものであり、該抽出液が揮発性塩を含有しｐＨが２〜８である請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品産業分野、医学分野等において有用な１−デオキシノジリマイシンの測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１−デオキシノジリマイシンは、ブドウ糖の類縁化合物であり、摂食時に糖質の分解酵素であるグルコシダーゼの阻害剤として働き、血糖値の上昇を抑える。
桑葉は植物由来の１−デオキシノジリマイシンを豊富に含むことが知られ、国内養蚕業の衰退に伴う遊休桑園の新たな桑樹の利用法として期待されている。このような背景の下、現在、茶、サプリメントなど種々の形態の「桑１−デオキシノジリマイシン含有製品」が商品化され、市場に販売されている。しかし、これら商品の多くは、１−デオキシノジリマイシンの効能を謳っているにもかかわらず、１−デオキシノジリマイシンを定量することが困難であり、経済的かつ簡便な測定方法が存在しないため、その含量については明記していない。
【０００３】
１−デオキシノジリマイシンは、一般的な分析で多用されるＯＤＳ（オクタデシルシラン）カラムのような逆相カラムで保持されない他、配位子交換カラムにおいても保持されない。また、１−デオキシノジリマイシンは、その分子内に特徴的な官能基を持たないことから通常のＵＶ検出器などを利用した分析機器で定量することが特に難しく、さらに、試料中における含量が微量であるため示唆屈折計で検出することも困難であった。
【０００４】
このため従来では、他の夾雑物質の混在条件下で高速液体クロマトグラフィー／質量分析計（以下ＬＣ／ＭＳと称する）により、１−デオキシノジリマイシン該当分子イオンピークを抽出し、定量分析が行われた例がある。しかし、ＬＣ／ＭＳによる分析は、ＬＣ／ＭＳが非常に高額な機器であること、分析にかかる費用が高価であること、ＭＳでの定量分析は不安定であり再現性が得にくいことから、問題を有していた。また、ＬＣ／ＭＳによる分析においては、夾雑物質混在下での１−デオキシノジリマイシンの分析と純粋な１−デオキシノジリマイシン標準品の分析とで、イオン化条件が異なり、イオン化効率が異なると考えられるため正しい定量結果を得られているか不明であった。さらに、質量分析計（ＭＳ）の試料導入部が汚れやすく多数試料の連続分析が不可能であること等の難点も有していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来の１−デオキシノジリマイシン測定方法における欠点を克服し、安定性、再現性及び感度において優れ、かつ分析単価の安価な１−デオキシノジリマイシンの測定方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、１−デオキシノジリマイシンが親水性相互液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を原理とする分離カラムに十分に保持されること、そして光散乱検出器により試料中の１−デオキシノジリマイシンの定量に必要とされる十分な感度及び安定性が得られることを見出した。また、分離カラム、検出条件、分離条件、試料溶液の調製法を鋭意検討した結果、１−デオキシノジリマイシンを夾雑物質と分離し、かつ効果的に測定できる条件を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）式Ｉで表される１−デオキシノジリマイシンの測定方法であって、試料を液体クロマトグラフィーで分離し、１−デオキシノジリマイシンを光散乱検出器で検出することを特徴とする上記測定方法。
【化２】
2004294384.tif 000002
【０００８】
（２）液体クロマトグラフィーが、親水性相互液体クロマトグラフィーである（１）に記載の方法。
（３）液体クロマトグラフィーにおいて、アミド基を有する固定相を用いる（１）又は（２）に記載の方法。
（４）液体クロマトグラフィーにおける移動相が水及び有機溶媒の混合溶液あって、該混合溶液が揮発性塩を含有しｐＨが２〜８である（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）移動相が、水とアセトニトリルの混合溶液であって、揮発性塩としてのアンモニウム塩を含む（４）に記載の方法。
（６）試料が植物抽出物である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）植物抽出物が、水及び有機溶媒を含む抽出液を用いて抽出されたものであり、該抽出液が揮発性塩を含有しｐＨが２〜８である（６）に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において、１−デオキシノジリマイシンとは、下記の式Ｉ：
【化３】
2004294384.tif 000003
で表される化合物を意味する。１−デオキシノジリマイシンは桑科植物に含まれることが知られており、小腸二糖類分解酵素であるスクラーゼやマルターゼの阻害物質であること、血糖値上昇抑制効果があることが報告されている（Ｙ．  Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  ：  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５２，  （１），  １２１  （１９８８））。
【００１０】
本発明の測定方法は、液体クロマトグラフィーによって試料から１−デオキシノジリマイシンを分離することを特徴とする。本発明においては、親水性相互液体クロマトグラフィーを使用するのが好ましい。親水性相互液体クロマトグラフィーとは、担体に結合させた極性導入基と分析物質との間の親水的相互作用により、分析物質を保持及び分離する順相クロマトグラフィーの一種である。一般の順相クロマトグラフィーでは、カロチノイドのような疎水性物質を、担体に極性基を結合させた固定相を用い、ヘキサンなどの非極性溶媒で溶出するのに対し、親水性相互液体クロマトグラフィーは、担体に極性基を結合させた固定相に対し、ＯＤＳの逆相クロマトグラフィーで用いるような含水性極性溶媒（例えば、水／メタノールや水／アセトニトリル）を移動相として溶出を行うことを特徴とする。
【００１１】
上記クロマトグラフィーで使用する固定相は、担体に極性基を化学結合させたものであれば、特に制限されない。結合させる極性基としては、例えば、アミド基（カルバモイル基）、ポリハイドロキシエチルアスパルトアミド基、α−シクロデキストリン、ポリスルホエチルアスパルトアミド基及び水酸基等が挙げられ、本発明においては、分離能の観点から、アミド基（カルバモイル基）を結合させた担体を固定相として用いるのが好ましい。
【００１２】
担体としては、クロマトグラフィーにおいて通常用いられるものを使用でき、例えば、無機系シリカ、アルミナ、有機高分子系樹脂（例えば、親水性ビニルポリマー）等が挙げられる。本発明においては、無機系シリカを使用するのが好ましい。
【００１３】
具体的には、本発明のクロマトグラフィーにおける分離カラムとしては、例えば、アミド基をゲル基剤に結合させたＴＳＫ  ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー社製）、ポリハイドロキシエチルアスパルトアミド（ＰｏｌｙＬＣ社製）等を使用することができ、特に、ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（東ソー社製）を使用するのが好ましい。
【００１４】
本発明におけるクロマトグラフィーでは、移動相として、１−デオキシノジリマイシンが溶解するような水及び有機溶媒の混合溶液を使用する。有機溶媒としては、水と混和できるものであれば特に制限されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどの低級アルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等が挙げられる。本発明においては、極性溶媒、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール等を使用するのが好ましい。特に、移動相として、水とアセトニトリルの混合溶液を使用するのが好ましい。水と有機溶媒の混合比率は、通常、７：３〜１：９、好ましくは、５：５〜１：９である。あるいは、移動相において、有機溶媒と水の濃度勾配、例えば、アセトニトリル／水の９／１〜５／５の濃度勾配を使用することもできる。水としては、検出系に影響を与えないものであれば特に制限されず、冷水、温水のいずれも用いることができる。
【００１５】
また、移動相は、イオン強度を調整するための塩を含有するのが好ましい。このような塩としては、揮発性塩であれば特に制限されない。本発明において揮発性塩とは、加熱、減圧又はその両方によって、液体又は固体状態から気体又は蒸気の状態に変わる塩を意味し、例えば、常圧下、５０〜１５０℃で揮発・分解する塩が挙げられる。具体的には、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウム、などのアンモニウム塩等が挙げられる。本発明においては、アンモニウム塩、特に酢酸アンモニウムもしくはギ酸アンモニウムを使用するのが好ましい。移動相における揮発性塩の濃度は、通常、５ｍＭ以上が望ましく、ＥＳＩ−ＭＳ、光散乱検出器（ＥＬＳＤ）での検出の際には５〜１０ｍＭが望ましい。
【００１６】
また、移動相のｐＨは、通常、２〜８、好ましくは４〜６である。ｐＨは、移動相に酸を添加することにより調整することができ、酸としては、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸などの有機酸及び無機酸を使用することができる。本発明においては、有機酸、特に酢酸を用いるのが好ましい。
【００１７】
クロマトグラフィーにおける移動相の流速は、当業者であれば分離能等に合わせて適宜選択することができ、通常、０．１〜３．０ｍｌ／分、好ましくは０．５〜１．０ｍｌ／分である。分離カラムの温度は、分離の対象となる１−デオキシノジリマイシンの検出に影響を及ぼさない範囲であれば特に制限されず、通常、２０〜６０℃、好ましくは３５〜４０℃である。
【００１８】
上記のような親水性相互クロマトグラフィーにより、１−デオキシノジリマイシンを十分にカラムに保持させ、また試料中の他の夾雑物質から効果的に分離することが可能である。
【００１９】
本発明はまた、試料から上記クロマトグラフィーによって分離した１−デオキシノジリマイシンを光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を用いて測定することを特徴とする。本発明で用いられる光散乱検出器は、カラムより溶出する溶離液を圧縮ガスとの混合によりネブライザーにて霧状とし、その霧を加温することにより揮発性化合物を除去し、不揮発性化合物を検出できるものであれば、いずれのものでもよい。具体的な光散乱検出器としては、例えば、Ｌｏｗ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＬＡＬＬＳ）、Ｍｕｌｔｉ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  （ＭＡＬＬＳ）、Ｒｉｇｈｔ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  （ＲＡＬＬＳ）、Ｔｗｏ  Ａｎｇｌｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  （ＴＡＬＬＳ）等が挙げられる。
【００２０】
圧縮ガスとしては、窒素、ヘリウム、空気等の不活性ガスを用いることができる。当該ガスは、通常、１．０〜５．０Ｌ／分、特に１．５〜２．０Ｌ／分で混合するのが好ましい。噴霧ガス圧は、通常、０．８〜４．０ｂａｒ、好ましくは０．８〜２．０ｂａｒである。加温条件（ヒートチューブ温度）は、通常、３０〜８０℃、好ましくは５０〜７０℃である。
【００２１】
上記のような光散乱検出器を用いることにより、試料から優れた感度と安定性で、１−デオキシノジリマイシンを検出することができる。
【００２２】
また、本発明の１−デオキシノジリマイシンの測定方法は、測定誤差をなくすため自動化されていることが好ましい。本発明の方法を実施するための自動化された分析装置の光学的機序の説明については、例えば、Ｋｉｍ  ＆  Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，  １９８３，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ３：４１９−４２７；Ｏｒｎｓｔｅｉｎ及びＫｉｍの米国特許第４，４１２，００４号明細書；Ｔｙｃｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ａｐｐｌ．  Ｏｐｔｉｃｓ，  ２４：１３５５−１３６５；Ｔｙｃｋｏの米国特許第４，７３５，５０４号明細書；並びにＭｏｈａｎｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，Ｂｌｏｏｄ，  ６８：５０６−５１３を参照されたい。
【００２３】
試料としては、１−デオキシノジリマイシンを含みうるものであれば特に制限されないが、植物試料が好適である。特に、１−デオキシノジリマイシンは、桑科植物に含有されていることが知られており、このような桑科植物としては、例えば、ヤマグワ（Ｍｏｒｕｓ  ｂｏｍｂｙｃｉｓ  Ｋｏｉｄｚｕｍｉ）、マグワ（Ｍｏｒｕｓ  ａｌｂａ  Ｌ．）、シマグワ（Ｍｏｒｕｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ  Ｐｏｉｒ）、ロソウ（Ｍｏｒｕｓ  ｌａｔｉｆｏｌｉａ  Ｐｏｉｒ）、モウコグワ（Ｍｏｒｕｓ  ｍｏｎｇｏｌｉｃａ  Ｓｃｈｎｅｉｄ）、アカミグワ（Ｍｏｒｕｓ  ｒｕｂｒａ  Ｌ．）などが挙げられる。
【００２４】
本発明の方法は、１−デオキシノジリマイシンを含みうる食品、医薬品、農産物等の製品における１−デオキシノジリマイシンの含有量を測定するためにも、好適に使用できる。
【００２５】
１−デオキシノジリマイシンの測定にあたっては、試料となる植物及び食品等の抽出物を使用するのが好ましい。試料となる抽出物の調製方法は特に制限されないが、クロマトグラフィーにおける移動相と同じ成分を有する溶液を抽出液として使用し、抽出を行ったものが好ましい。
【００２６】
すなわち、抽出液として水及び有機溶媒の混合溶液を使用するのが好ましい。
有機溶媒としては、水と混和できるものであれば特に制限されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどの低級アルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等が挙げられる。本発明においては、極性溶媒、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール等を使用するのが好ましい。特に、抽出液として、水とアセトニトリルの混合溶液を使用するのが好ましい。水と有機溶媒の混合比率は、通常、７：３〜１：９、好ましくは５：５〜１：９である。水としては、抽出及び検出系に影響を与えないものであれば特に制限されず、冷水、温水のいずれも用いることができる。
【００２７】
また、抽出液は、揮発性の塩を含有するのが好ましく、このような塩としては、特に制限されないが、例えば、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウム及び酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩等が挙げられる。本発明においては、特に酢酸アンモニウム又はギ酸アンモニウムを使用するのが好ましい。抽出液における揮発性塩の濃度は、通常、５ｍＭ以上、好ましくは５〜１０ｍＭである。クロマトグラフィーにおける移動相に使用するのと同じ塩を用いるのが好ましい。
【００２８】
また、抽出液のｐＨは、通常、２〜８、好ましくは４〜６である。ｐＨは、抽出液に酸を添加することにより調整することができ、酸としては、トリフルオロ酢酸、ギ酸、酢酸などの有機酸及び無機酸を使用することができる。本発明においては、有機酸、特に酢酸を用いるのが好ましい。ｐＨについても、クロマトグラフィーにおける移動相と同じｐＨに調整するのが好ましい。水のみ及び有機溶媒のみで抽出を行うこともできる。
【００２９】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００３０】
【実施例】
試薬及び材料
１−デオキシノジリマイシン標準品、酢酸アンモニウムは和光純薬、アセトニトリル、水、酢酸は関東試薬より購入した。桑葉は福島県農業試験場において栽培された桑樹より、２００２年の６月に採取した。また桑１−デオキシノジリマイシン製品は一般に市販されているものを購入した。
【００３１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置及び光散乱検出器
ＨＰＬＣは、島津製作所製のＬＣ１０システム（ポンプ：ＬＣ１０ＡＤ、カラム恒温槽：ＣＴＯ−１０Ａ、オートサンプラー：ＳＩＬ−１０Ａ、データ処理装置：Ｃ−Ｒ６Ａ）を使用した。分離カラムは、東ソー社製のＴＳＫ  ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ）を使用した。また検出器は、Ｓｅｄｅｒｅ社製の光散乱検出器ＳＥＤＥＸ５５、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＡＰＩ  ＴＯＦ型質量分析計を使用した。
【００３２】
ＨＰＬＣ分析条件
カラムは東ソー社製ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ）を使用し、カラム温度を４０℃に設定し、移動相はアセトニトリル／水＝８１／１９の溶液（６．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、ｐＨ５．５）を使用し、流速１ｍｌ／分で、アイソクラティック条件で溶出した。光散乱検出器は、ドリフト管温度を６０℃に設定し、窒素噴霧ガス圧を１．０ｂａｒに設定した。質量分析計は、ポジティブモード、スプレー電圧２９００Ｖ、ノズル電圧２２０Ｖ、ノズル温度１４０度、窒素噴霧ガス０．３ｍｌ／分に設定し、質量分析計データは、分子量１００〜１０００の範囲で３秒ごとにスキャンし、データの取り込みを行った。
【００３３】
（実施例１）試料の調製及び測定
収穫した桑葉を水で洗浄し、真空凍結乾燥した後、粉末化した。凍結乾燥粉末１００ｍｇにアセトニトリル／水＝５０／５０の溶液（６．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、ｐＨ５．５）１ｍｌを加え、超音波破砕機で１分間抽出を行い、１５０００×ｇで遠心し、上清を４５μｍポアサイズのＰＴＦＥメンブランで濾過した濾過液を測定試料溶液とした。桑葉製品についても、粉末０．１ｇを同様に処理し、測定試料とした。
【００３４】
これらの試料をＨＰＬＣ―ＥＬＳＤ分析装置及びＨＰＬＣ−ＭＳ分析装置で、それぞれ測定した。
【００３５】
図１に桑葉抽出液のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤ分析装置の分離パターンを示す。この分析におけるＨＰＬＣ溶離液を、質量分析計を用いて、１−デオキシノジリマイシンの分子量（１６４．０９、Ｍ＋Ｈ＋）にて測定したクロマトグラフを図２に示す。図２において、１−デオキシノジリマイシンのピークは他の夾雑物質ピークと比べ、ベースラインより完全に分離し、その保持時間は図１と２で完全に一致した。このことにより図１で得られたクロマトグラフにおいて矢印で示されたピークは、１−デオキシノジリマイシンのものと確認された。すなわち、本発明の方法により、試料中に微量にしか含まれない１−デオキシノジリマイシンが高感度に検出できることがわかる。
【００３６】
また、１−デオキシノジリマイシンのピーク部分に相当する画分のＭＳスペクトルを図３に示す。これにより、分子量１００〜１０００までの間に１−デオキシノジリマイシンに相当するピークを得、他の夾雑物質を含まない純粋なものであることが分かった。
【００３７】
１−デオキシノジリマイシンの含有量を、桑葉において測定した結果を表１に、桑葉関連製品において測定した結果を表２に示す。測定値のばらつきは、ｎ＝３において２％程であり、本発明の方法による測定結果は信頼性及び再現性が高いことが分かった。
【００３８】
【表１】
2004294384.tif 000004
【００３９】
【表２】
2004294384.tif 000005
【００４０】
（実施例２）１−デオキシノジリマイシンの検量線の作製
１−デオキシノジリマイシン標準品を試料溶液と同じくアセトニトリル／水＝５０／５０の溶液（６．５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む、ｐＨ５．５）を使用し、０．０１０、０．０３２、０．１０、０．３２、１．０及び３．２ｍｇ／ｍｌの濃度に調製し、各１０μｌをＨＰＬＣにインジェクトし、１−デオキシノジリマイシン導入量と光散乱検出器で検出されたピーク面積により、検量線を作成した。
【００４１】
１−デオキシノジリマイシンの検量曲線を図４に示す。１−デオキシノジリマイシンは本発明において１００〜３２００００ｎｇの広い範囲において良好な相関を得ることができた。桑葉においては１−デオキシノジリマイシンの含量はおよそ０．１〜０．２％（乾燥重量あたり）であるが、本発明の１−デオキシノジリマイシン測定方法が、桑葉に含まれる１−デオキシノジリマイシンの定量に必要十分な感度を有することが明らかである。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、安定性、再現性及び感度において優れ、かつ分析単価の安価な１−デオキシノジリマイシン測定方法が提供される。そして、本発明の方法により、桑科植物及び桑科植物含有食品等における１−デオキシノジリマイシン含有量の定量が可能になるとともに、１−デオキシノジリマイシン含有植物のスクリーニングを行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られた桑抽出液のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤの分離パターンである。横軸は保持時間（分）、縦軸は相対強度（％）を示す。１−デオキシノジリマイシンに相当するピークを矢印で示す。
【図２】ＨＰＬＣ溶離液を、質量分析計を用いて、１−デオキシノジリマイシンの分子量（１６４．０９、Ｍ＋Ｈ＋）にて測定したクロマトグラフを図２に示す。横軸は保持時間（分）、縦軸は相対強度（％）で示す。
【図３】図１の分析における１−デオキシノジリマイシンのピーク部分に相当する画分の、１００〜１０００の分子量範囲におけるＭＳスペクトルを示す。横軸は分子量（ｍ／ｚ）、縦軸は相対強度（％）で示す。
【図４】１−デオキシノジリマイシンの検量曲線を表す。横軸は１−デオキシノジリマイシン量（ｎｇ）、縦軸はピーク面積を示す。
【図１】
2004294384.tif 000008
【図２】
2004294384.tif 000009
【図３】
2004294384.tif 000010
【図４】
2004294384.tif 000011