(57)【要約】【課題】心筋梗塞、不安定狭心症、虚血性突然死などの急性冠症候群の発症を予知するための診断用キットを提供することを目的とする。【解決手段】本発明の急性冠症候群の発症を予知するために用いられる診断用キットは、ヒトから採取した血液中のリポ蛋白中に存在し、ミスフォールディングによる会合体が形成された蛋白を発症予知マーカーとして、この発症予知マーカーを検出するための測定手段を備えるものとして構成される。かかる測定手段としては、リポ蛋白と発症予知マーカーよりなる複合体の濃度測定手段が好適に用いられる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性冠症候群の発症を予知するために用いられる診断用キットであって、ヒトから採取した血液中のリポ蛋白中に存在し、ミスフォールディングによる会合体が形成された蛋白を発症予知マーカーとして、この発症予知マーカーを検出するための測定手段を備える診断用キット。
【請求項２】
急性冠症候群の発症を予知するために用いられる診断用キットであって、ヒトから採取した血液中のリポ蛋白中に存在し、かつＳＤＳ抵抗性を示す蛋白を発症予知マーカーとして、この発症予知マーカーを検出するための測定手段を備える診断用キット。
【請求項３】
発症予知マーカーが、アミロイド蛋白、アミロイド前駆体及びアミロイド形成能を有する蛋白から選ばれる少なくとも１種以上の蛋白を前駆体とする蛋白である請求項１または請求項２に記載の診断用キット。
【請求項４】
発症予知マーカーが、血清アミロイドＡ蛋白、アミロイドＡ蛋白、アポＡ１、アポＡ２、アポＣ２、アポＣ３及びアポＥから選ばれる少なくとも１種以上の蛋白を前駆体とする蛋白である請求項１または請求項２に記載の診断用キット。
【請求項５】
リポ蛋白がＨＤＬ分画である請求項１から請求項４のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項６】
リポ蛋白がＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬ分画である請求項１から請求項４のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項７】
リポ蛋白がＨＤＬ分画とＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬ分画の複合体である請求項１から請求項４のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項８】
発症予知マーカーを検出するための測定手段として、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体の濃度測定手段を備える請求項１から請求項７のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項９】
酵素免疫法、ラテックス凝集法及びイムノクロマト法などの免疫測定手段を前記複合体の濃度測定手段として備える請求項８に記載の診断用キット。
【請求項１０】
発症予知マーカーを検出するための一次抗体とリポ蛋白中存在する天然型もしくは変性アポ蛋白を検出するための二次抗体とから構成される免疫測定手段を備える請求項９に記載の診断用キット。
【請求項１１】
一次抗体が抗ヒト血清アミロイドＡ蛋白抗体と抗ヒトアミロイドＡ蛋白抗体から構成され、二次抗体が抗ヒトａｐｏＢ１００抗体とから構成される請求項１０に記載の診断用キット。
【請求項１２】
免疫測定手段に加えて、リポ蛋白中に存在する天然型のアポ蛋白と発症予知マーカーの前駆体蛋白とを架橋剤により結合させた複合体を、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体の濃度算出用の測定手段として備える請求項９から請求項１１のいずれかに記載の診断用キット。
【請求項１３】
アポ蛋白がアポＢ１００であり、発症予知マーカーの前駆体蛋白が血清アミロイドＡ蛋白である請求項１２に記載の診断用キット。
【請求項１４】
免疫測定手段に加えて、ヒトから採取した血液からＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬを分画、分取するためのデキストラン硫酸試薬を測定手段として備える請求項９から請求項１３のいずれかに記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、心筋梗塞、不安定狭心症、虚血性突然死などの急性冠症候群の発症予知が可能な診断用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
粥状動脈硬化の発症、進展並びに急性冠症候群の発症のメカニズムは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及び動物を用いたｉｎ　ｖｉｖｏの研究成果から徐々に明らかにされつつある。
しかし、臨床的には、どのような症例の場合にいつプラークが破綻するのか、どのようなマーカーが予知に使えるのか、診断技術の進歩など命題が多い（北　徹、日本臨牀，　６０：　８５１−８５９，　２００２）。したがって、急性冠症候群の発症を予知する診断技術は無い状況にある。しかも、心筋梗塞症の臨床例での発症の瞬間については、その事実の集積例が乏しいため、発症機序研究の焦点を定めるのは安易ではない（平盛勝彦、他：　動脈硬化、２７：　１５９−１６４，　２０００）。
【０００３】
ここで、心筋梗塞の発症機序は、心筋壊死巣の成立過程から、第１段階として心筋梗塞の発症の下地成立、第２段階として心筋梗塞の発症、第３段階として心筋壊死巣の拡大と完成の３段階に分けて考えると理解しやすいとされている（Ｈｉｒａｍｏｒｉ　Ｋ　：　Ｊｐｎ　Ｃｉｒｅ　Ｊ，　５０：　２１３，　１９８６）。冠危険因子や冠硬化症は第１段階の心筋梗塞症の下地の成立に関わってくるが、現在知られている冠危険因子だけでは心筋梗塞の発症を説明することは出来ないとも言われている（平盛勝彦，　他：　動脈硬化，　２７：　１６０，　２０００）。
【０００４】
結局のところ、冠動脈硬化症とか冠動脈病変と、心筋梗塞症との関連性は意外に乏しいのではないか、未知の真の大きな危険因子が存在する可能性が示唆されている。それは、心筋梗塞症が心筋の疾患であるから、心筋そのものに発症の原因があるのではないかとの考えすら主張されている状況にある（平盛勝彦，　他：　動脈硬化，　２７：　１６３，　２０００）。
【０００５】
この様に、急性冠症候群の発症機序が全く不明であることから、真の発症予知の技術はなく、マーカーの代用として一部の急性相反応蛋白、酸化ＬＤＬ、レムナント様リポ蛋白、ｐｒｅβ１−ＨＤＬなどが用いられているにすぎない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
心筋梗塞症の臨床例での発症の瞬間に関する事実の集積は乏しいが、急性冠症候群発症後の状況については、多くの観察データが存在する。その事例をいくつか挙げると、Ｆｕｓｔｅｒらは、心筋梗塞患者の約４０％は冠動脈が高度に狭窄しているが、プラークの破綻は起らず、びらんと凝固亢進状態が認められることを発見している（Ｆｕｓｔｅｒ　Ｖ　ｅｔ　ａｌ：　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｈａｅｍｏｓｔ　７８：　２４７−２５５，　１９９７）。また、Ｆａｒｂらも、冠動脈血栓症により突然死した症例の約４０％がプラークの破綻を伴わず、比較的狭窄度の低いプラークの表在性びらんにより、血栓症が引き起こされていたと報告している。さらに、プラークびらんは、プロテオグリカンと平滑筋細胞に富むプラークに多く認められている（Ｆａｒｂ　Ａ　ｅｔ　ａｌ：　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９４：　１３５４−１３６３，　１９９６）。
【０００７】
従来、心筋梗塞は冠動脈硬化による管腔の狭窄によると考えられていたが、実際は上述のごとく、びらんと凝固亢進状態による血栓形成によることが多いことがわかってきている。また、これらの現象と密接に関連する事実も多く観察されている。即ち、インターフェロンγを分泌するＴリンパ球は、不安定狭心症、心筋梗塞などの発生に極めて重要と考えられているが、どのような因子がＴリンパ球を活性化させるかは現時点では明らかではない（北　徹：　日本臨牀　６０：　８５１−８５９，　２００２）。さらに、内皮細胞の損傷による表在性びらんにより、動脈壁のコラーゲンをはじめとするプロテオグリカン類が露出し、血小板凝集を誘発することから血栓形成病変となることも考えられている。また、酸化変性リポ蛋白（酸化ＬＤＬ、酸化ＨＤＬ）が血小板を凝集させることも報告されている（高橋行広，　他：　臨床病理，　４４：　１６９，　１９９６）。
【０００８】
さらに最近の研究の進歩から、冠動脈の攣縮（冠攣縮）は異型狭心症のみならず、その他の安静狭心症や労作狭心症および急性心筋梗塞など、虚血性心疾患全般の発生上も重要な役割を果たしていることが明らかにされてきた（Ｙａｓｕｅ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｃｉｒｃ　Ｒｅｓ，　５２：　１４７−１５２，　１９８３）。
【０００９】
冠攣縮における血液凝固系の関与を調べる目的で、トロンビンによるフィブリノーゲンの分解産物であるｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ａ（ＦＰＡ）を指標として検討された成績から、冠攣縮時の血漿ＦＰＡ値の上昇が主として冠循環内で生じること、即ち、冠攣縮により凝固カスケードの亢進が引き起こされ、冠攣縮から冠動脈血栓の形成、ひいては急性心筋梗塞発症へと進展する可能性も示唆されている（小川久雄：　動脈硬化，　２７：　２５７−２６１，　２０００）。
【００１０】
一方、酸化ＬＤＬやリゾフォスファチジルコリン（Ｌｙｓｏ　ＰＣ）が血管内皮依存性の血管弛緩反応を障害したり（Ｋｕｇｉｙａｍａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：　１６０，　１９９０）、（Ｔａｎｎｅｒ　ＦＣ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８３：　２０１２，　１９９１）、血管平滑筋細胞の過剰な収縮反応を誘発することも知られている（Ｇａｌｌｅ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ：　６６：　１２８７，　１９９０）。また、異型狭心症患者の血清ＬＤＬは健常者に比べて酸化変性を受けやすいことが知られ、異型狭心症における酸化ＬＤＬの関与が示唆されている（Ｍｉｗａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ　Ａｍ　Ｃｏｌｌ　Ｃａｒｄｉｏｌ．　２６：　６３２，　１９９５）。
【００１１】
さらに、ＬＤＬよりも易酸化性のＨＤＬの酸化変性がｉｎ　ｖｉｖｏにおける冠攣縮の発生に関与することも報告されている。酸化ＨＤＬは血管内皮保護作用の低下に加えて、それ自身が直接に内皮機能障害もしくは血管平滑筋の過剰反応を引き起こし、冠攣縮の発生に関与している可能性があるとしている（大村寛敏，　ほか：　フリーラジカルの臨床，　１５：　６１−６６，　２０００）。
これらの結果から、ＬＤＬおよびＨＤＬが酸化変性を受けることで、両者がともに、冠攣縮に関与している可能性が大きいとみられている。
【００１２】
一方、近年、慢性関節リウマチ（ＲＡ）や全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者には動脈硬化や血栓症による心血管病変の合併が多いことが報告されている（Ｗｏｌｆｅ，　Ｆ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．　３７：　４８１−４９４，　１９９４）、（Ｍａｎｚｉ，　Ｓ　ｅｔ　ａｌ：　Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１４５：４０８−４１５，　１９９７）。血清脂質に関しては、ＲＡではＨＤＬコレステロールの低下、ＳＬＥではＶＬＤＬの上昇とＨＤＬコレステロールの低下が認められている。このＨＤＬコレステロールの低下は炎症の治療に伴って正常化することが確認されている（浅沼ゆう，　他：　炎症と免疫，　９：　１６５−１７２，　２００１）。
【００１３】
現在、動脈硬化の発生および進展の機序を説明する仮説として、Ｒｏｓｓが提唱した障害反応仮説が広く受け入れられているが、このＲｏｓｓの説では、動脈硬化は血管内皮細胞の傷害に始まるが、何がどのように内皮細胞を傷害するかについては、さまざまな原因が列挙されているにすぎない。
【００１４】
Ｎａｇａｓａｗａらは、冠攣縮誘発部位の内皮細胞の形態について電子顕微鏡を用いて検討した結果、攣縮部では内皮細胞間に多数のｂｒｉｇｅやｇａｐの形成を認めるとともに、多数の白血球が付着している事実を報告し、冠攣縮が内皮細胞傷害を引き起こし、動脈硬化進展のｉｎｉｔｉａｔｏｒとなる可能性を述べている（Ｎａｇａｓａｗａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｃｉｒｃ．　Ｒｅｓ．　６５：　２７２−２８２，　１９８９）、（長澤一成：　日本臨牀５２：　１１７−１２０，　１９９４）。
【００１５】
この様な急性冠症候群の発症にかかわる周辺状況からみて、本症の発症にかかわる未知な原因物質もしくは誘因物質は冠攣縮（虚血状態）により、虚血部位で産生される可能性が大きいと考えられる。
すなわち、急性冠症候群の発症にかかわる原因物質もしくは誘因物質は虚血部位に集積した活性化白血球が産生する活性酸素やプロテアーゼの作用により形成される。また、この時、現場に居合わせるＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬやＨＤＬも同時に酸化され、酸化ＨＤＬや酸化ＶＬＤＬ、酸化ＩＤＬ、酸化ＬＤＬ、若しくは酸化ＨＤＬと酸化ＶＬＤＬ、酸化ＩＤＬ、酸化ＬＤＬの複合体が形成されると考えられる。
【００１６】
この様な状況下で本発明者は、ＨＤＬとＬＤＬからなる複合体中に存在する血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、アポＣ２、アポＣ３、アポＡ２、時にアポＥがミスフォールディングした状態で存在すること、若しくはこれらの蛋白がａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓの特性を有することを発見し、これらの物質が急性冠症候群の発症にかかわるのではないかと考えた。蛋白質のミスフォールディングは、外部ストレスにより変性や化学修飾を受けることで引き起こされる。本発明のケースでは、リポ蛋白中に存在する各種アポ蛋白が酸化変性を受けてミスフォールディング状態の構造に変化し、致死的会合体を形成すると考えられる。また、従来から、動脈硬化では消化困難な変性リポ蛋白の存在が重要視されてきたが、本発明者らが発見した本物質がそれに相当する可能性が大きい。
【００１７】
冠イベント発症局所の冠動脈では、この致死的会合体による血管内皮細胞傷害と、ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性化能を有するＨＤＬが短時間のうちに消費されるため、ＮＯによる内皮依存性の血管弛緩反応の急速な減少が同時に起こり、冠攣縮がさらに誘発されると同時に血管内皮に傷害をもたらし、これがプラークの破裂や亀裂、あるいはびらんを引き起こし、血栓形成の引き金になると考えられる。これが血管内腔側からの冠イベント発症シナリオの推測である。
【００１８】
この急性冠症候群の発症にかかわる原因物質もしくは誘因物質を推測するに当って、さらに勘案すべき条件として、Ｔリンパ球の集積に関わる物質で、かつ、慢性関節リウマチ（ＲＡ）における心血管病変の合併の多さを説明しうる物質でなければならない。この点に関しては、ＳＡＡをはじめとするａｍｙｌｏｉｄｇｅｎｅｓｉｓな蛋白、もしくは、これらの蛋白のうちでミスフォールディングな特性を呈した蛋白（致死的会合体）の関与が大きいと本発明者は考えている。
【００１９】
さらに、別の視点から、冠動脈硬化病変および急性冠症候群の発症、冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後病変（再狭窄）に関して、特に炎症の場としての冠動脈外膜が重要であるとする考えがある（岡本栄一，　他：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　３８：　臨時増刊号，　２６５−２７０，　２００１）。この場合、冠動脈外膜にＳＡＡ、アポＣ２、アポＣ３、アポＡ２、低分子化アポＥなど、ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓもしくはミスフォールディングした特性を有する蛋白がｐｅｒｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅとして、外膜の膠原繊維周辺から沈着し、アミロイドによる冠動脈病変が心アミロイドーシスの発現にかかわる可能性も考えられ、心筋原因説も説明できると考えている。
【００２０】
この様に、本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、急性冠症候群の発症を予知するという、今日まで存在しなかった診断用キットを提供することを目的とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、急性冠症候群の発症時に観察された諸現象や、本症の発症と関連性が大きい他疾患の病態特性を総合化することにより、急性冠症候群の発症予知マーカーを発見したことにより完成したものである。
【００２２】
すなわち、本発明の診断用キットは、急性冠症候群の発症を予知するために用いられる診断用キットであって、ヒトから採取した血液中のリポ蛋白中に存在し、ミスフォールディングによる会合体が形成された蛋白を発症予知マーカーとして、この発症予知マーカーを検出するための測定手段を備えるものとして構成される。
上記の発症予知マーカーは、具体的にはＳＤＳ抵抗性を示す蛋白として観察されるものである。すなわち、診断用キットの測定対象となる発症予知マーカーは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した場合に、本来の分子量に相当するバンド位置に比べて、移動度が少ない側にバンドがシフトする蛋白として観察されるものである。
【００２３】
また、上記の発症予知マーカーは、アミロイド蛋白、アミロイド前駆体及びアミロイド形成能を有する蛋白から選ばれる少なくとも１種以上の蛋白を前駆体とする蛋白であり、具体的には、血清アミロイドＡ蛋白、アミロイドＡ蛋白、アポＡ１、アポＡ２、アポＣ２、アポＣ３及びアポＥから選ばれる少なくとも１種以上の蛋白を前駆体とする蛋白である。
すなわち、リポ蛋白中には、上記の如く多種類の発症予知マーカーが存在するので、発症予知マーカーの検出にあたっては、その中から最低１種類の発症予知マーカーを選択すればよいのである。
なお、上記以外のアポＢ１００、アポＢ４８のアポ蛋白にはミスフォールディングによる会合体の形成が認められないので、発症予知マーカーの対象からは除外される。
【００２４】
また、本発明では、上記のリポ蛋白は、ＨＤＬ分画、ＶＬＤＬ分画、ＩＤＬ分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ分画とＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ分画の複合体のうち、いずれの分画であってもよい。なお、本発明において「ＨＤＬ分画」とは、ヒトから採取した血液からＨＤＬを分画、分取したものをいい、この中には酸化ないし変性を受けたＨＤＬと天然型ＨＤＬのいずれか１種以上が含まれている。また、本発明において、「ＶＬＤＬ分画」、「ＩＤＬ分画」、「ＬＤＬ分画」とは、ヒトから採取した血液からＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬを分画、分取したものをいい、この中には酸化ないし変性を受けたＶＬＤＬやＩＤＬ，　ＬＤＬ及び天然型ＶＬＤＬ、天然型ＩＤＬ、天然型ＬＤＬのいずれか１種以上が含まれている。
【００２５】
また、本発明では、上記の発症予知マーカーを検出するための測定手段としては、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体の濃度測定手段を備えたものが好ましい。かかる複合体の濃度測定手段としては、酵素免疫法、ラテックス凝集法及びイムノクロマト法などの免疫測定手段を備えたものが好適に使用できる。
上記の免疫測定手段としては、発症予知マーカーを検出するため一次抗体と、リポ蛋白中に存在する天然型もしくは変性アポ蛋白を検出するための二次抗体とから構成されるものが好ましく使用できる。
具体的には、一次抗体としては、抗ヒト血清アミロイドＡ蛋白抗体と抗ヒトアミロイドＡ蛋白抗体を用いることが好ましく、二次抗体としては、アポＢ１００を検出するための抗体を用いることが好ましい。
【００２６】
また、本発明の診断用キットは、上記の免疫測定手段に加えて、リポ蛋白中に存在する天然型のアポ蛋白と発症予知マーカーの前駆体蛋白とを架橋剤により結合させた複合体を、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体の濃度算出用の測定手段として備えることが好ましい。かかる測定手段を備えることにより、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体の標準サンプルとすることができ、濃度算出用の検量線の作成を簡易に行なうことができる。具体的には、アポ蛋白としてはアポＢ１００を用いることが好ましく、発症予知マーカーの前駆体蛋白としては血清アミロイドＡ蛋白を用いることが好ましい。
【００２７】
また、本発明の診断用キットは、上記の免疫測定手段に加えて、ヒトから採取した血液からＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬを分画、分取するためのデキストラン硫酸試薬を測定手段として備えることが好ましい。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の診断用キットは、上述した発症予知マーカーの検出にあたり、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体の濃度測定手段を備えたものとして構成される。この複合体の濃度測定手段としては、▲１▼複合体を検出するための免疫測定手段を備えることが好ましく、必要に応じて、▲２▼検出された複合体の濃度を算出するための標準サンプル、▲３▼ヒトから採取した血液から特定のリポ蛋白を分画、分取するための試薬を備えることが好ましい。
【００２９】
診断用キットに備えられる免疫測定手段は、複合体濃度を簡便、迅速、確実に測定できるものであれば、酵素免疫法、ラテックス凝集法及びイムノクロマト法等の公知の免疫測定手段を採用することができる。
かかる免疫測定手段としては、リポ蛋白中に存在する発症予知マーカーを検出するための一次抗体と、天然型もしくは変性アポ蛋白を検出するための二次抗体とから構成されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法による測定手段が好適に使用できる。
【００３０】
本発明者の検討によれば、急性冠症候群の発症前の患者から採取した血液中には、上記のリポ蛋白―発症予知マーカー複合体が存在し、この複合体にはミスフォールディングによる会合体が形成されていない天然型のアポ蛋白若しくはその一部が断片化された蛋白が存在し、さらにこの蛋白は、この蛋白を検出するための抗体と反応する特性を有する。したがって、かかる蛋白を検出するための抗体は、上記免疫測定手段の二次抗体として利用することができる。本発明では、具体的には、アポＢ１００が上記の性質を有する蛋白に該当するので、二次抗体としてアポＢ１００抗体が好適に使用できる。
【００３１】
また、本発明者の検討によれば、発症予知マーカーはミスフォールディングによる会合体を形成する一方で、その前駆体となる蛋白に対する抗体と結合する特性を有する。したがって、その前駆体蛋白に適用できる抗体であれば一次抗体としてそのまま用いることができる。かかる一次抗体としては、アミロイド蛋白、アミロイド前駆体及びアミロイド形成能を有する蛋白から選ばれる少なくとも１種以上の蛋白に対する抗体を用いることができ、具体的には血清アミロイドＡ蛋白、アミロイドＡ蛋白、アポＡ１、アポＡ２、アポＣ２、アポＣ３及びアポＥから選ばれる蛋白に対する抗体を挙げることができる。上記の中では、血清アミロイドＡ蛋白に対する抗体とアミロイドＡ蛋白に対する抗体が特に好適に使用できる。
【００３２】
本発明の診断用キットには、分析の便宜を考慮して、リポ蛋白−発症予知マーカー複合体濃度を算出するための標準サンプルを備えることができる。この標準サンプルは、具体的には、上述した免疫測定手段によりリポ蛋白―発症予知マーカー複合体が検出された場合において、その検量線を作成することによって、上記複合体濃度を算出するために用いられるものである。かかる標準サンプルとしては、上記複合体のリポ蛋白中に存在する天然型のアポ蛋白であって、上記の免疫測定手段に用いた二次抗体に対応する抗原であるアポ蛋白と、発症予知マーカーの前駆体蛋白とをＥＭＣＳ等の架橋剤により結合させた複合体を用いることが好ましい。
本発明では、かかる複合体を構成するアポ蛋白としてはアポＢ１００が好適に使用でき、発症予知マーカーの前駆体蛋白としては血清アミロイドＡ蛋白が好適に使用できる。
【００３３】
本発明の診断用キットには、分析の便宜を考慮して、特定のリポ蛋白を分画、分取するための試薬を備えることができる。例えば、血清からＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬ分画を分画して測定試料とする場合には、ＣａＣｌ２を含有するデキストラン硫酸試薬を備えるようにすればよい。実際の分画は、デキストラン硫酸試薬に対して血清を添加、混和した後、室温で３０分程度放置し、次いで遠心処理を施してから上清をデカンテーションして捨て、沈殿をＮａＣｌ溶液で溶解することにより行なう。
【００３４】
【実施例】
（実施例１；高脂血症患者から採取した血液中に存在するＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体中の血清アミロイドＡ蛋白の性状）
［１−１．複合体からの電気泳動用サンプルの調製法］
４例の正脂血清と４例の高脂血清それぞれ約２ｍｌから、また３例の高脂ｐｏｏｌ血清それぞれ約１０ｍｌから超遠心分離法によりＬＤＬを分取し、抗ＳＡＡポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）固定化アフィニティーカラムでＳＡＡとＬＤＬの複合体（ＳＡＡ−ＬＤＬ）を精製した。
次いで精製した各ＳＡＡ−ＬＤＬ溶液１００μｌにｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｍｅｔｈａｎｏｌ混合溶液（２：１，Ｖ／Ｖ）２００μｌを添加し１分間撹拌後、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心し下層のｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを静かに除去した。そして更に３．０００ｒｐｍで　５分間遠心後、上清を除去し、ｂｏｔｔｏｍの蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（４％ＳＤＳ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，
０．０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．８）５０μｌで溶解後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元試料とした。また、非還元試料に２−メルカプトエタノールを５％となるように添加し、１００℃で５分間煮沸して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元試料とした。
【００３５】
［１−２．電気泳動条件］
ゲル濃度２〜１５％のポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品（株））を泳動槽にセットし、ゲルの各ｗｅｌｌに調製した非還元試料と還元試料を各々１０μｌアプライした。そして泳動槽の陽極側と陰極側に泳動用ｂｕｆｆｅｒ（０．０２５ＭＴｒｉｓ，０．１９２Ｍ
ｇｌｙｃｉｎｅ，０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．４）を注ぎ、ゲル１枚あたり４０ｍＡ　、１時間泳動した。次いでゲルをｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．１９２ＭＧｌｙｃｉｎｅ、２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ）中でナイロンメンブレンと重ね、水槽型ブロッティング装置に移しｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを注ぎ、４５Ｖ、２時間通電しメンブレンに転写した。その後メンブレンをＴＢＳ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）５０ｍｌに浸し、５分間振盪した。次いでＴＢＳを捨て、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬（株））２０ｍｌを加え、４℃、ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔでブロックキングを行った。
【００３６】
［１−３．メンブレンの染色条件］
ＢｌｏｃｋＡｃｅを捨て、抗体希釈溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，ＢｌｏｃｋＡｃｅ１／１０量を含む０．１Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．０）で抗ＳＡＡポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を１μｇ／ｍｌに希釈した溶液２０ｍｌにメンブレンを浸し、室温で１時間振盪しながら反応させた。次に抗体溶液を捨て、メンブレン洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０，０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む　０．０２Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．０）１００ｍｌで５分間１回、１５分間２回それぞれ洗浄液を新しいものに替えて洗浄した。
そして抗体希釈溶液でＧｏａｔ　Ｆ（ａｂ’）２　Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ　Ｉｇ’ｓ，ＨＲＰ（Ｎｏ．ＡＭＩ４４０４　ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を５０００倍に希釈した溶液２０ｍｌを加え、室温で１時間振盪しながら反応させた。抗体溶液を捨て、メンブレン洗浄液１００ｍｌで５分間１回、１５分間２回それぞれ洗浄液を新しいものに替えて洗浄した。
次いでメンブレンの水分を軽く除いた後、発光用基質液（Ｎｏ．３４０７５　ＰＩＥＲＣＥ社）をメンブレン全体に浸透させ、気泡が入らないようにナイロン袋でメンブレンを包み、Ｘ線フィルム用カセットにセットした。暗室でオートラジオグラフィー用フィルムをセットし、数分間露光した後、現像した。得られた結果を図１に示した。
【００３７】
図１（Ｂ）から、血清アミロイドＡ蛋白（１２ｋＤａ）はほとんど認められず、ＳＤＳ抵抗性を呈し、約５０　ｋＤａの分子量のものが大半であった。この結果から、血清アミロイドＡはａｍｙｌｏｉｄｇｅｎｅｓｉｓ若しくはミスフォールディングの状態で存在するか又は他の蛋白をまき込んでいるものと考えられる。
また、上記の複合体中に存在する他のアポ蛋白についても同様の実験を行なった。その結果、アポＡ２、アポＣ２、アポＣ３の各蛋白が特にＳＤＳ抵抗性を呈し、本来の分子量よりはるかに大きいサイズを呈した。
【００３８】
（実施例２；高脂血症患者から採取した血液中に存在するＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体中のアポＢ１００の特徴）
［２−１．複合体からの電気泳動用サンプルの調製法］
２例の正脂血清と２例の高脂血清それぞれ約２ｍｌから、また３例の高脂ｐｏｏｌ血清それぞれ約１０ｍｌから超遠心分離法によりＬＤＬを分取し、抗ＳＡＡポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）固定化アフィニティーカラムに吸着したＳＡＡとＬＤＬの複合体（ＳＡＡ−ＬＤＬ）と吸着しなかったスルーＬＤＬを精製した。
次いで精製した各ＳＡＡ−ＬＤＬ溶液１００μｌと各スルーＬＤＬ溶液１００μｌにｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｍｅｔｈａｎｏｌ混合溶液（２：１，Ｖ／Ｖ）２００μｌを添加し１分間撹拌後、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心し、下層のｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍを静かに除去した。
そして更に３，０００ｒｐｍで　５分間遠心後、上清を除去しｂｏｔｔｏｍの蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（４％ＳＤＳ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，０．０６２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ６．８）５０μｌで溶解後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元試料とした。
【００３９】
［２−２．電気泳動条件］
ゲル濃度２〜１５％のポリアクリルアミドゲル（第一化学薬品（株））を泳動槽にセットし、ゲルの各ｗｅｌｌに調製した非還元試料を１０μｌアプライした。そして泳動槽の陽極側と陰極側に泳動用ｂｕｆｆｅｒ（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．１９２ＭＧｌｙｃｉｎｅ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．４）を注ぎ、ゲル１枚あたり４０ｍＡ　、１時間泳動した。
次いで、ゲルをｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（０．０２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、０．１９２ＭＧｌｙｃｉｎｅ、２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ）中でナイロンメンブレンと重ね、水槽型ブロッティング装置に移しｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを注ぎ４５Ｖ、２時間通電しメンブレンに転写した。
その後、メンブレンをＴＢＳ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）５０ｍｌに浸し、５分間振盪した。次いで、ＴＢＳを捨て、ＢｌｏｃｋＡｃｅ（大日本製薬）２０ｍｌを加え、４℃、ｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔでブロックキングを行った。
【００４０】
［２−３．メンブレンの染色条件］
ＢｌｏｃｋＡｃｅを捨て、抗体希釈溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，ＢｌｏｃｋＡｃｅ１／１０量を含む０．１Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．０）で抗ａｐｏＢポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を１μｇ／ｍｌに希釈した溶液２０ｍｌにメンブレンを浸し、室温で１時間振盪しながら反応させた。
次に抗体溶液を捨て、メンブレン洗浄液（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０，０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む　０．０２Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ８．０）１００ｍｌで５分間１回、１５分間２回それぞれ洗浄液を新しいものに替えて洗浄した。そして抗体希釈液でＧｏａｔ　Ｆ（ａｂ’）２　Ａｎｔｉ−ＲａｂｂｉｔＩｇ’ｓ，ＨＲＰ（Ｎｏ．ＡＭＩ４４０４　ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社）を５０００倍に希釈した溶液２０ｍｌを加え、室温で１時間振盪しながら反応させた。抗体溶液を捨て、メンブレン洗浄液１００ｍｌで５分間１回、１５分間２回それぞれ洗浄液を新しいものに替えて洗浄した。
次いでメンブレンの水分を軽く除き、発光用基質液（Ｎｏ．３４０７５　ＰＩＥＲＣＥ社）をメンブレン全体に浸透させ、気泡が入らないようにナイロン袋でメンブレンを包み、Ｘ線フィルム用カセットにセットした。暗室でオートラジオグラフィー用フィルムをセットし、数分間露光した後、現像した。得られた結果を図２に示した。
【００４１】
図２から、アミロイドＡ蛋白と複合体を形成していない通常のＬＤＬは変性度が少ない（すなわち断片化が少ない）のに対して、血清アミロイドＡ蛋白と複合体を形成しているＬＤＬでは、アポＢ１００蛋白の変性度が大きく、断片化が認められた。
【００４２】
（実施例３；急性冠症候群の発症予知マーカーとしてのＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体の有用性の検討）
下記に示す測定手段を備えた診断用キットを用いて、１４３症例の安定状態にある冠動脈硬化症患者を対象にして、冠危険因子をはじめとする表１と表２に示す関連検査項目および患者特性についてｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｈｏｒｔ　ｓｔｕｄｙを実施した。結果、１年間の経過追跡中に１５症例において心血管事故死をはじめとするイベントが発生し、この予知には年齢とＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体の濃度測定が有効とする成績を得た。
【００４３】
【表１】
2004069621.tif 000002
【００４４】
【表２】
2004069621.tif 000003
【００４５】
［３−１．血清中のＶＬＤＬ，ＩＤＬ，ＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体の濃度測定］
上記複合体の濃度測定は下記のプロトコールにしたがって行なった。
（３−１−１．試料の調製）
１）　デキストラン硫酸液（０．０５Ｍ　ＣａＣｌ２）１．５ｍｌに対して血清５０μｌを添加し、混和した後室温で３０分間放置する。
２）　３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をデカントで捨てる。
３）　１ｍｌの２．５％ＮａＣｌ溶液で沈澱を溶解し、この溶解液を試料とする。
【００４６】
（３−１−２．ＥＬＩＳＡによる測定）
１）　抗ヒト血清アミロイドＡ及びアミロイドＡ抗体を０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ　ｐＨ８．０緩衝液に１０μｇ／ｍｌで溶解し、マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで分注する。
２）　４℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で３回洗浄し、０．１％ショ糖と牛血清アルブミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ、ｐＨ７．５で調製したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し、室温で３０分以上静置した後、液を廃棄し４℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水２５０μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄する。
３）　マイクロプレートに５５ｍｇ／ｍｌ　Ｍｏｕｓｅ　Ｇａｍｍａ　ＧｌｏｂｕｌｉｎとＲａｂｂｉｔ　Ｇａｍｍａ　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ含有１％ＢＳＡ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、これに上述の試料あるいは標準液を５０μｌ添加する。
４）　室温下一晩反応させる。
５）　０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
６）　ビオチン標識Ｆａｂ′化ＩｇＧ−アポＢ１００抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μｇ／ｍｌとし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
７）　３７℃下１．５時間反応させる。
８）　５）と同様、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
９）　ＨＲＰ標識アビジンＤ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈とし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
１０）　３７℃下３０分間反応させる。
１１）　５）と同様、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
１２）　発色試薬を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温下３０分間反応させる。
１３）　１Ｍリン酸水溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、反応を停止する。
１４）　主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍで測光する。
１５）　下記に示すプロトコールにしたがって人工的に調製したリコンビナントＳＡＡ−アポＢ１００複合体により求めた検量線から試料中のＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬ−血清アミロイドＡ（アミロイドＡ）複合体濃度を算出する。
なお、本プロトコールでは、一次抗体として抗ヒト血清アミロイドＡ抗体に加えて、抗ヒトアミロイドＡ蛋白抗体も使用している。これは、ＶＬＤＬ，　ＩＤＬ，　ＬＤＬと複合体を形成している血清アミロイドＡ蛋白（アミノ酸残基数１０４）の一部がＣ末端から２８残基が切断されたＮ末の７６残基からなるアミロイドＡ蛋白に変化しているためである。
【００４７】
［３−２．血清アミロイドＡ蛋白−アポＢ１００複合体の作製法］
（３−２−１．ＥＭＣＳ修飾リコンビナントＳＡＡ（ｒＳＡＡ）の調製）
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したｒＳＡＡ１００μｇ／ｍｌ溶液５００μｌにＤＭＦで溶解したＥＭＣＳ（同仁化学）を０．６２ｍｇ添加し３７℃、３０分間反応させた。その後、ＰＤ−１０を用いて０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でゲル濾過し、ＤＭＦと非結合のＥＭＣＳを除いた。
（３−２−２．還元アポＢ１００の調製）
０．０１％ＥＤＴＡ−２Ｋを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＷａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ　ａｐｏＢ−１００　５００μｇ／ｍｌ溶液５００μｌにＤＴＴを１０ｍＭ添加し３７℃、９０分間反応させた。その後、ＰＤ−１０を用いて０．０１％ＥＤＴＡ−２Ｋを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でゲル濾過し、ＤＴＴを除いた。
（３−２−３．ｒＳＡＡ−アポＢ１００複合体の調製）
還元ａｐｏＢ１００　４５μｇ／ｍｌ、２００μｌにＥＭＣＳ修飾ｒＳＡＡを３μｇ／ｍｌ、１．５μｇ／ｍｌ、０．７５μｇ／ｍｌ、０．３７５μｇ／ｍｌ、０．１８７μｇ／ｍｌ添加し混合比の異なる各試料を調製し、４℃、１８時間反応させた。
（３−２−４．ＥＬＩＳＡによる複合体形成の確認）
各試料中のｒＳＡＡ濃度を０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で１６０ｎｇ／ｍｌに調製した。次にこの試料を０．１Ｍ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で倍々希釈して、固相抗体に抗ＳＡＡ抗体、二次抗体に抗ａｐｏＢ１００抗体を用いたＥＬＩＳＡで測定した。
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の測定用キットの測定対象となる発症予知マーカーは、急性冠症候群の発症予知マーカーとして優れて有用なものであり、かかる発症予知マーカーを免疫測定手段により検出するための測定手段を備えた本発明のキットは、急性冠症候群の発症を予知するための診断用キットとして好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】高脂血症患者から採取した血液中に存在するＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体中の血清アミロイドＡ蛋白の性状を電気泳動により分析した結果を示す図である。
【図２】高脂血症患者から採取した血液中に存在するＬＤＬ−血清アミロイドＡ蛋白複合体中のアポＢ１００の特徴を電気泳動により分析した結果を示す図である。
【図１】
2004069621.tif 000004
【図２】
2004069621.tif 000005