(57)【要約】【課題】環境中の化学物質による毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するための、新たな方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍＲＮＡにより遺伝子発現を観察するＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法において、その遺伝子発現解析データに対して照合される遺伝子発現解析のデータベースであって、
（１）種々の毒性物質について希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の毒性物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた発現レベルを遺伝子発現解析データとしてまとめる、
ことによって作成されるデータベース。
【請求項２】
微生物が酵母である、請求項１記載のデータベース。
【請求項３】
毒性物質の適当な濃度が、毒性物質不存在下での微生物の生菌数と比較して５０−９５％を与える濃度である、請求項２記載のデータベース。
【請求項４】
ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法において、その遺伝子発現解析データに対して照合する、請求項１から３までのいずれか記載のデータベースの使用方法。
【請求項５】
被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定するための微生物を用いる方法であって、
（１）被検試料の希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える、被検試料中の化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた特定遺伝子の発現レベルをデータ化し、遺伝子発現解析データを収集し、
（５）それを、請求項１から３までのいずれか記載のデータベースと照合し、
それにより、該データベースにおけるデータと同じデータを示す該被検試料中の化学物質を、該データベース中の該当する毒性物質と同定する方法。
【請求項６】
微生物が酵母であり、データベースが請求項２記載のものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定するための微生物を用いる方法であって、
（１）被検試料の希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える、被検試料中の化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた特定遺伝子の発現レベルをデータ化し、遺伝子発現解析データを収集し、
（５）その遺伝子発現解析データに基づいて、該被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
人類がこれまでに作りだした化学物質は膨大な数にのぼり、さらに年々新しい化学物質が開発されている。これら化学物質は現代生活のあらゆる面で利用され、人類の生活向上に役立っている。その反面、化学物質の中には、その製造、流通、使用、廃棄等の様々な段階で環境中に放出され、環境中での残留、食物連鎖による生物学的濃縮などを通じ、人の健康や生態系に有害な影響を及ぼすものがあり、環境汚染は社会問題化している。よって、化学物質について人体や生態系に与える影響を評価する要請がある。
【０００３】
その評価方法として、従来、主として魚類やミジンコ、貝等の個体、細胞の生育阻害や特定の生体反応を指標とするバイオアッセイが行われている。しかし、これらの方法は、環境中の化学物質による毒性の有無が判定できるに過ぎない。環境中の化学物質による毒性の有無のみならず、毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するアプローチとして、種々の濃度の複数種の指標化学物質とその存在下における複数種の指標微生物の生育状態との関係付けを利用する手法が報告されている（特許文献１：特開２００１−２３８６９４）。また、特定の毒性指標（エンドポイント）を検出するために開発されたバイオアッセイ法もある。例えば、既知発がん性物質の９割以上が陽性となる遺伝子突然変異試験であるａｍｅｓ法（非特許文献１：「生理活性物質のバイオアッセイ」、講談社、１９８９第３刷、ｐ．３１９）、および内分泌撹乱物質のスクリーニングのため、生体内ホルモンが受容体に結合したときに起きる遺伝子転写活性を測定する試験法（非特許文献２：Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｔａｋｅｙｏｓｈｉ  Ｍ，  Ｙａｋａｂｅ  Ｙ，  Ｓａｗａｋｉ  Ｍ，  Ｉｍａｔａｎａｋａ  Ｎ，  Ｔａｋａｔｓｕｋｉ  Ｍ．：  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｒａｔ  ｕｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｔｗｅｎｔｙ−ｔｈｒｅｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．  ２００２  Ｊａｎ  １５；１７０（１−２）：２１−３０．）である。しかし、これらの方法は、特定の毒性を有する化学物質の検出には有効ではあるが、その毒性指標以外の毒性を有する化学物質の検出を行うことは出来ない。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイ法とは、数千から数万の遺伝子をスライドガラスもしくはシリコン基板上に異なるスポットとして固定させたものに、ＤＮＡあるいは細胞由来のｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、ＤＮＡもしくはＲＮＡの発現状態を定量的もしくは定性的に解析する方法である。（非特許文献４：ＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル  羊土社、２０００、ｐｐ１３）
【０００５】
【特許文献１】
特開２００１−２３８６９４号公報
【非特許文献１】
「生理活性物質のバイオアッセイ」、講談社、１９８９第３刷、ｐ．３１９
【非特許文献２】
Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．  ２００２  Ｊａｎ  １５；１７０（１−２）：２１−３０．
【非特許文献３】
Ｍａｏ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｊｕｌ；４５（１）：３７−４０
【非特許文献４】
ＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル  羊土社、２０００、ｐｐ１３
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、環境中の化学物質による毒性の性質やその毒性が環境中のいずれの化学物質に起因するかを判定するための方法を提供する。さらに本発明は、合成化学物質の毒性の程度および性質の評価、浄化処理の効果確認の方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる膨大な遺伝子発現情報を利用すれば、環境中の毒性物質が簡便に同定できることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
即ち、本発明は一つの態様として、ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法を提供する。
本発明の毒性物質同定方法においては、被検試料についてデータ化された遺伝子発現解析データに対し、照合される遺伝子発現解析のデータベースが重要である。本発明は別の態様として、そのようなデータベースおよびその使用方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の毒性物質同定方法を行うには、被検試料についてデータ化された遺伝子発現解析データに対して照合されるデータベースが用いられる。
Ｉ．データベース
本発明のデータベースを作成するには、
（１）種々の毒性物質について希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の毒性物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた発現レベルを遺伝子発現解析データとしてまとめる。
以下、各工程について説明する。
【００１０】
（１）毒性物質の適当な濃度の決定
毒性物質の毒性を測定するには、希釈系列を作成し、適当な濃度の試料を選択する。これは、毒性物質によって毒性を示す濃度が異なるため、同じ重量％またはモル濃度の試料を試験しても意味の有る結果が得られない為である。また、微生物の生育に影響を与える濃度は、厳密には実験ごとに異なる。そこで、同じ毒性の影響を与える濃度を厳密に比較するという観点から、遺伝子発現解析データを収集する同一試料について毒性物質の適当な濃度を決定する。
【００１１】
毒性物質の濃度は、濃すぎると抽出するｍＲＮＡの状態が悪く、ＤＮＡマイクロアレイ解析の結果が得られないという問題を生じる。
よって、本発明において毒性物質の適当な濃度は、「微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える」適当な濃度である。ここに、「ｍＲＮＡが抽出可能」とは、ｍＲＮＡの抽出が困難ではない状態を示す。過度の化学物質負荷はｍＲＮＡの抽出を困難とし、マイクロアレイの結果が得られない場合がある。これは、化学物質負荷により細胞の代謝速度が変わること、ＲＮＡ分解酵素活性が高くなること、また化学物質がｍＲＮＡに直接損傷を与える等、さまざまな理由が考えられる。毒性物質の適当な濃度は、毒性物質不存在下での微生物の生菌数と比較して５０−９５％を与える濃度が好ましい。
この濃度は例えば、微生物のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定することにより決定できる。微生物を適当な培地、例えばＹＰＤ培地にて対数増殖期（ＯＤ６６０＝０．８〜１．０）となるまで培養し、この時のＣＦＵを測定する（このＣＦＵをＣＦＵ−ｂｅｆｏｒｅと呼ぶ）。
毒性物質の希釈系列を作成し、対数増殖期にある細胞（ＯＤ６６０＝０．８〜１．０）に負荷し、培養する。希釈系列は、通常、２倍または３倍希釈し、異なる濃度のものを作成する。
化学物質を負荷しない細胞も同様に培養し対照区とする。２時間後、各希釈系列の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りＹＰＤ寒天培地に播種し、数日後にＣＦＵを測定する（化学物質負荷試料のＣＦＵをＣＦＵ−ｃｈｅｍ、および対照区の試料ＣＦＵ−ｃｏｎｔと呼ぶ）。
【００１２】
酵母の場合、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）は２時間程度なので、ＣＦＵ−ｃｏｎｔは２時間培養によりＣＦＵ−ｂｅｆｏｒｅの２倍程度になる。希釈系列の化学物質を負荷した場合、細胞の生育に影響を与える程度のＣＦＵ、すなわちＣＦＵ−ｃｏｎｔの５０％から９５％を与える濃度、望ましくは７５．５％に近くなる濃度を化学物質の濃度として選択する。細胞が死滅する濃度ではＣＦＵは０％であり、生育に影響を与えない濃度ではＣＦＵは対照区と等しく１００％となる。ＣＦＵにより定めた濃度の化学物質を負荷し凍結した細胞試料について以下のようにしてＤＮＡマイクロアレイ解析を行う。
【００１３】
あるいは、ＣＦＵは結果が出るまで時間がかかるので、「微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える」適当な濃度は、他の方法により生細胞のみを計数できる方法で決定できる。例えば、染色により生細胞のみを染色できるキットが市販されており（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｙｅａｓｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ  Ｌ−７００９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社）、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを用いて計数できる。
【００１４】
データベース作成に用いる「毒性物質」は、農薬、医薬品、染料、塗料、接着剤等の産業用途を有し環境に放出され可能性の高い化学物質および消毒・焼却の過程により非意図的に生成される化学物質であり、毒性を有することが懸念されるものである。これらの物質の毒性作用として、内分泌撹乱物作用、変異原性、発がん性、遺伝毒性、生態毒性、免疫毒性、細胞機能障害毒性等が知られている。例えば、図１に示す物質が挙げられる。
データベース作成の際には、選択する毒性物質は多ければ多い方が良いが、好ましくは２０個から３０個以上、選択する。
【００１５】
（２）微生物の培養
次に、先に決定した適当な濃度の毒性物質とともに微生物を一定期間培養する。
データベース作成に用いる「微生物」は、天然に存在する野生株または野生型株、例えばヒト、マウスその他の哺乳類由来の動物細胞および動物細胞の樹立株、これまでバイオアッセイに用いられている魚類、線虫等の細胞、昆虫細胞、酵母等の真菌細胞、および大腸菌等の細菌細胞の何れであっても良い。ここに、野生株は天然に存在する組換えを行っていない微生物である。野生型株は注目する遺伝子に手をつけていない微生物である。樹立株は動物細胞で継代培養できるもの、例えばガン細胞などの組換えが施されていないものも含む。
「微生物の培養」は通常、２時間、２５℃にて行う。
【００１６】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ法による特定遺伝子の発現レベル測定
ＤＮＡマイクロアレイは１枚のスライドガラス上に数千から数万の遺伝子を異なるスポットとして固定させたものである。ここに、細胞由来のｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型にして合成したｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、遺伝子の発現パターンを同時に観察する。
遺伝子発現解析に用いるマイクロアレイはスポット用ＤＮＡとしてクローン、ＰＣＲによる増幅断片、合成オリゴヌクレオテチドなどを使用して作製できる。また、マイクロアレイはａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社、株式会社ＤＮＡチップ研究所、宝酒造株式会社などから市販されている。
【００１７】
本発明のデータベース作成の際には、常法により上記培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、当該微生物の特定遺伝子の発現レベルをＤＮＡマイクロアレイ法により測定する。特定遺伝子は、用いるマイクロアレイにより異なるが、特定遺伝子は、用いるマイクロアレイにより異なるが、酵母細胞は約６０００の全遺伝子が一枚のスライドグラス上にスポットされているものが市販されている。
ＤＮＡマイクロアレイ法のさらなる説明はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒｔ．ｋｙｕｓｙｕ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ／ａｒｒａｙ−ｄｏｃ／ａｒｒａｙ．ｈｔｍに詳しい。
【００１８】
（４）遺伝子発現解析データの収集とまとめ
対照区との遺伝子発現を比較する場合、対照区と処理区のｍＲＮＡをそれぞれ異なる蛍光波長を有する蛍光色素で蛍光標識したヌクレオチドを用いて逆転写し、逆転写の際に異なる蛍光色素を取り込ませた標識ｃＤＮＡを得る。こうして得られた２種類のｃＤＮＡを１枚のＤＮＡマイクロアレイ上で同時にハイブリダイズさせ、マイクロアレイ用のスキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、等）で画像データとして読み取り、マイクロアレイ上の蛍光発光量を測定する。
測定されたマイクロアレイの画像データから各スポットの定量を行わなければいけない。一般的にはスキャナーに定量化のソフトウェアが付随されている。そのソフトウェアの使い勝手は様々であるが、一般にはスポット測定のためのゲージの作成や、バックグラウンド測定法の指定などを行う。各々のスポット上の対照区と処理区の蛍光強度を別々に測定し、スポット以外の場所の蛍光強度からバックグラウンドを算出してノイズとして差し引く。処理区の蛍光強度と対照区の蛍光強度を求め、発現ｍＲＮＡの強度比すなわち処理区における発現ｍＲＮＡ量／対照区における発現ｍＲＮＡ量を算出するという解析を行う。ここで得られた数値データを蓄積して、データベース化する。本明細書の最後尾の表がデータ例である。このようにして、収集・解析により得られる遺伝子発現情報は大量なので、遺伝子発現データを分析、視覚化するにはワークベンチソフトウェア（ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｘ社）など）を用いる。これは、実験を行った処理区と対照区の間の発現の違いを求める、さらに遺伝子名と機能を関連づけたデータベースを用いてより生物学的な解析を行うといった機能を有するソフトウェアである。
【００１９】
マイクロアレイで得られたデータの解析手法の一つとして、クラスタリングが挙げられる。クラスタリングとは多くのデータをグループに分ける統計的手法であり、ＤＮＡマイクロアレイの遺伝子発現情報解析以外にも広く用いられている方法である（ＤＮＡマイクロアレイ実践マニュアル  羊土社、２０００、ｐｐ１３４）。データ間の類似度（例えばユークリッド距離あるいは相関係数など）を定義し、その類似度を用いてクラスタリングを行えば、同じような性質を持つ遺伝子の集合を得ることができる。図２はＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇを用いたデータ解析により得られた化学物質負荷時の遺伝子発現データをクラスタリングして得られた系統樹である。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇでは系統樹と一緒に遺伝子ごとの誘導、抑制が色分けされ遺伝子発現状態を視覚化した図も示される。
【００２０】
電子情報化されたデータベースはコンピューター等に入力すれば、被検試料から得られるデータとの照合に当たり簡便に利用できる。この態様において、本発明は、本発明のデータベースが入力された装置をも提供する。
【００２１】
本発明は、上記のようにして作成された本発明データベースの使用方法であって、ＤＮＡマイクロアレイ法によって得られる遺伝子発現解析データに基づいて毒性物質を同定するための微生物を用いる方法においてその遺伝子発現解析データに対して照合する方法をも提供する。
【００２２】
２）毒性物質の同定方法
本発明はさらに、被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定するための微生物を用いる方法であって、
（１）被検試料の希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える、被検試料中の化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた特定遺伝子の発現レベルをデータ化し、遺伝子発現解析データを収集し、
（５）それを、本発明のデータベースと照合し、
それにより、該データベースにおけるデータと同じデータを示す該被検試料中の化学物質を、該データベース中の該当する毒性物質と同定する方法、に関する。
【００２３】
本発明はまた、被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定するための微生物を用いる方法であって、
（１）被検試料の希釈系列を作成し、微生物のｍＲＮＡが抽出可能でありかつ微生物の生育に影響を与える、被検試料中の化学物質の適当な濃度を決定し、
（２）適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、
（３）培養した微生物からｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、
（４）得られた特定遺伝子の発現レベルをデータ化し、遺伝子発現解析データを収集し、
（５）その遺伝子発現解析データに基づいて、該被検試料中の化学物質のなかから毒性物質を同定する方法に関する。
【００２４】
本発明の毒性物質の同定方法において「化学物質の適当な濃度」の決定は上記本発明のデータベース作成の説明と同様である。ただし、ここでは、被検試料の希釈系列の作成に際し、必要なら試料を一旦濃縮した後に希釈系列を作成することができる。
本発明の毒性物質の同定方法において「毒性物質」、「微生物およびその培養」、「ＤＮＡマイクロアレイ法」は、上記本発明のデータベース作成の説明と同様である。
【００２５】
【実施例】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２６】
実施例１
酵母におけるデータベースの作成
１．化学物質濃度の決定
酵母細胞はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８Ｃ  （ＩＦＯ１１３６，  αＳＵＣ２  ｍａｌ  ｍｅｌ  ｇａｌ２  ＣＵＰ１）を使用した。酵母細胞をＹＰＤ培地（２％  ポリペプトン、１％  酵母エキスおよび２％グルコース）  を用いて２５℃で対数増殖期（ＯＤ６６０＝０．８〜１．０）となるまで培養した。培養液の一部を取り、ＹＰＤ寒天培地（ＹＰＤ培地に２％の寒天を加えてオートクレーブで加熱滅菌し、プラスチックシャーレに注ぎ固まらせた固体培地）に播種し、コロニー形成単位（以下、ＣＦＵ）を測定した。この時のＣＦＵをＣＦＵ−ｂｅｆｏｒｅとする。
化学物質の希釈系列をそれぞれ作成し、対数増殖期にある細胞（ＯＤ６６０＝０．８〜１．０）に負荷し、２５℃で２時間培養した。この時、化学物質を負荷しない細胞も同様に培養し対照区とした。２時間後、各希釈系列の化学物質を添加したものおよび対照区の培養液の一部を取りＹＰＤ寒天培地に播種し、２日後にＣＦＵを測定した。化学物質負荷試料のＣＦＵをＣＦＵ−ｃｈｅｍ、および対照区の試料ＣＦＵ−ｃｏｎｔと呼ぶ。
【００２７】
試料の残りについて遠心を行い細胞を収集し、−８０  ｏＣで凍結保存する。酵母の倍加時間は２時間程度なので、ＣＦＵ−ｃｏｎｔは通常ＣＦＵ−ｂｅｆｏｒｅの２倍程度になる。希釈系列の化学物質を負荷した場合、細胞の生育に影響を与える程度のＣＦＵ、すなわちＣＦＵ−ｃｏｎｔの７５．５％に近くなる濃度を化学物質の濃度として選択する。ＣＦＵにより定めた濃度の化学物質を負荷し凍結した細胞試料について以下のようにしてＤＮＡマイクロアレイ解析を行った。
【００２８】
２．ＤＮＡマイクロアレイ解析
細胞試料に、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）を加え、６５℃で５分間振とうし、室温に戻した後上澄みを得るという操作を２回繰り返した。これにフェノール／クロロホルム１：１溶液を１／２容量加えて遠心し上澄みを得、これに上澄みと等容量のクロロホルムを加え遠心し、上澄みを得た。この上澄みに等容量の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを含むイソプロパノールを加え室温にて３０分放置後遠心を行ない全ＲＮＡの沈殿物を得た。この沈殿物に７０％エタノールを加え遠心し再度沈殿させ、乾燥後水に溶解させた。
この全ＲＮＡから次の方法によりｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡは３’末端にポリＡ鎖が付加されているため、ラテックス粒子の表面上に固定されたポリＴ構造を持ったポリヌクレオチドによりｍＲＮＡをトラップした後に、スピンカラムで洗浄、溶出を行なった（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｔａｋａｒａ）。このｍＲＮＡを蛍光標識したヌクレオチドを用い逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；  カタログ番号１８０６４−０１４，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて逆転写し、逆転写の際にＣｙ３−ｄＵＴＰまたはＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を取りりこませて標識ｃＤＮＡを得た。
【００２９】
この標識ｃＤＮＡをＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ｐＨ８．０）に溶解し、ＤＮＡマイクロアレイに滴下し、６５℃で１２時間以上ハイブリダイズさせた。酵母のすべての遺伝子を有するＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ研究所製）を用いた。  このアレイは５８８０のｃＤＮＡプローブ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のプライマーを用いてＰＣＲ増幅したもの）がスライドグラス上に載っている。にこのＤＮＡマイクロアレイの蛍光強度を共焦点レーザースキャナー（  ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ４０００
ｓｙｓｔｅｍ：ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）で読み取った。
得られたイメージデータはＧｅｎｅＰｉｘ  （Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により解析を行った。それぞれのスポットの蛍光強度からバックグランウンドを差し引き、化学物質を負荷しない場合の蛍光強度に対する比、即ち化学物質存在下における発現ｍＲＮＡ量／化学物質不存在下における発現ｍＲＮＡ量とした。得られたデータを明細書の最後尾に表として示す。
表中のデータをさらにＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社、Ｒｅｄｗｏｏｄ  ）を用いて解析を行った。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇは統計学的な手法の一つであるクラスター解析機能を有する。クラスター解析により、各化学物質負荷時の遺伝子発現パターンの類似性を視覚化できる（図２）。図２はいずれかの化学物質負荷により１０倍以上誘導された遺伝子についてクラスター解析を行い得られたクラスター解析図である。なお、図２には表には無いデータもあわせてクラスタリングしている。
【００３０】
酵母に対する毒性作用が似ている化学物質は、同じような遺伝子発現パターンを有することが予想される。カドミニウムとヒ素は共に酵母では小胞へ輸送されることにより無毒化されることが知られている（Ｌｉ  ＺＳ，  Ｌｕ  ＹＰ，  Ｚｈｅｎ  ＲＧ，  Ｓｚｃｚｙｐｋａ  Ｍ，  Ｔｈｉｅｌｅ  ＤＪ，  Ｒｅａ  ＰＡ．：  Ａ  ｎｅｗ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｖａｃｕｏｌａｒ  ｃａｄｍｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：  ＹＣＦ１−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ｂｉｓ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎａｔｏ）ｃａｄｍｉｕｍ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９７  Ｊａｎ  ７；９４（１）：４２−７．）（Ｒｏｓｅｎ  ＢＰ．  ：  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ａｒｓｅｎｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９９  Ｍａｙ；７（５）：２０７−１２．）。ＳＤＳ（ＣＡＳ：１５１−２１−３）は界面活性剤であり、ラウンドアップ（図中ＲＵと表示）はその成分の５９％は界面活性剤である（ラウンドアップ：（Ｎ−ホスホメチル）グリシナートアンモニウム４１．０％、界面活性剤５９％）。さらに、チウラム（ＣＡＳ：１３７−２６−８）、マネブ（ＣＡＳ：１２４２７−３８−２）、ジネブ（ＣＡＳ：１２１２２−６７−７）はいずれもチオカルバメート構造を有する農薬である。図２は、これらの組みはいずれも似た遺伝子発現パターンを有することを示している。
【００３１】
実施例２
被検試料中の毒性物質同定
被検試料について、実施例１と同様、適当な濃度を決定し、適当な濃度の化学物質とともに微生物を一定期間培養し、ｍＲＮＡを単離し、ＤＮＡマイクロアレイ法により特定遺伝子の発現レベルを測定し、データ化し、遺伝子発現解析データを収集する。それを実施例１により作成したデータベースと照合することにより、同じ遺伝子発現パターンを示す化学物質が特定でき、被検試料中に存在し得る化学物質が推定される。
「照合」するには、表の化学物質のデータのうち、５倍以上誘導される遺伝子を抽出し、実験間の階層型クラスタリングを行う。
【００３２】
被検試料中に複数の毒性物質が含まれる場合、毒性の種類の組合わせによって微生物が示す応答は相加もしくは相乗されることがある。しかし、実際的には同じ影響濃度の複数の毒性物質という条件は非常に稀であるため、一番毒性の強い状態の化学物質が検出されると考えられる。また必要に応じて一定の割合で複数化学物質を混合したものを被験試料として希釈系列を作成し、単一の化学物質の場合と同様に遺伝子発現解析を行い、データベース化を行う。このデータベースを用いれば、複合毒性を有する化学物質または複数の毒性物質を含む試料の毒性評価に有用である。
【００３３】
以下の表は、ＤＮＡマイクロアレイ法による得られる遺伝子発現解析データの例である。左端の列は特定遺伝子名であり、一列に一種類の化学物質（一番上の行に記載）の遺伝子発現データを記載している。数値は、化学物質負荷時のｍＲＮＡ発現量を化学物質を負荷しないｍＲＮＡ発現量で割った値である。表中、括弧内の数字は図１の数字に対応する。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
2004248634.tif 000018
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
2004248634.tif 000034
【表３４】
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【表３５】
2004248634.tif 000036
【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
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【表８４】
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【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
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【表１１４】
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【表１１５】
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【表１１６】
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【表１１７】
2004248634.tif 000118
【表１１８】
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【表１１９】
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【表１２０】
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【表１２１】
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【表１２２】
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【表１２３】
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【表１２４】
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【表１２５】
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【表１２６】
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【表１２７】
2004248634.tif 000128
【表１２８】
2004248634.tif 000129
【表１２９】
2004248634.tif 000130
【表１３０】
2004248634.tif 000131
【表１３１】
2004248634.tif 000132
【表１３２】
2004248634.tif 000133
【表１３３】
2004248634.tif 000134
【表１３４】
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【表１３５】
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【表１３６】
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【表１３７】
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【表１３８】
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【表１３９】
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【表１４０】
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【表１４１】
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【表１４２】
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【表１４３】
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【表１４４】
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【表１４５】
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【表１４６】
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【表１４７】
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【表１４８】
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【表１４９】
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【表１５０】
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【表１５１】
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【表１５２】
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【表１５３】
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【表１５４】
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【表１５５】
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【表１５６】
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【表１５７】
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【表１５８】
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【表１５９】
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【表１６０】
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【表１６１】
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【表１６２】
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【表１６３】
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【表１６４】
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【表１６５】
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【表１６６】
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【表１６７】
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【表１６８】
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【表１６９】
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【表１７０】
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【表１７１】
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【表１７２】
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【表１７３】
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【表１７４】
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【表１７５】
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【表１７６】
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【表１７７】
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【表１７８】
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【表１７９】
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【表１８０】
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【表１８１】
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【表１８２】
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【表１８３】
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【表１８４】
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【表１８５】
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【表１８６】
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【表１８７】
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【表１８８】
2004248634.tif 000189
【表１８９】
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【表１９０】
2004248634.tif 000191
【表１９１】
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【表１９２】
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【表１９３】
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【表１９４】
2004248634.tif 000195
【表１９５】
2004248634.tif 000196
【表１９６】
2004248634.tif 000197
【表１９７】
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【表１９８】
2004248634.tif 000199
【表１９９】
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【表２００】
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【表２０１】
2004248634.tif 000202
【表２０２】
2004248634.tif 000203
【表２０３】
2004248634.tif 000204
【表２０４】
2004248634.tif 000205
【表２０５】
2004248634.tif 000206
【表２０６】
2004248634.tif 000207
【表２０７】
2004248634.tif 000208
【表２０８】
2004248634.tif 000209
【表２０９】
2004248634.tif 000210
【表２１０】
2004248634.tif 000211
【表２１１】
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【表２１２】
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【表２１３】
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【表２１４】
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【表２１５】
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【表２１６】
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【表２１７】
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【表２１８】
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【表２１９】
2004248634.tif 000220
【表２２０】
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【表２２１】
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【表２２２】
2004248634.tif 000223
【表２２３】
2004248634.tif 000224
【表２２４】
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【表２２５】
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【表２２６】
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【表２２７】
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【表２２８】
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【表２２９】
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【表２３０】
2004248634.tif 000231
【表２３１】
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【表２３２】
2004248634.tif 000233
【表２３３】
2004248634.tif 000234
【表２３４】
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【表２３５】
2004248634.tif 000236
【表２３６】
2004248634.tif 000237
【表２３７】
2004248634.tif 000238
【表２３８】
2004248634.tif 000239
【表２３９】
2004248634.tif 000240
【表２４０】
2004248634.tif 000241
【表２４１】
2004248634.tif 000242
【表２４２】
2004248634.tif 000243
【表２４３】
2004248634.tif 000244
【表２４４】
2004248634.tif 000245
【表２４５】
2004248634.tif 000246
【表２４６】
2004248634.tif 000247
【表２４７】
2004248634.tif 000248
【表２４８】
2004248634.tif 000249
【表２４９】
2004248634.tif 000250
【表２５０】
2004248634.tif 000251
【表２５１】
2004248634.tif 000252
【表２５２】
2004248634.tif 000253
【表２５３】
2004248634.tif 000254
【表２５４】
2004248634.tif 000255
【表２５５】
2004248634.tif 000256
【表２５６】
2004248634.tif 000257
【表２５７】
2004248634.tif 000258
【表２５８】
2004248634.tif 000259
【表２５９】
2004248634.tif 000260
【表２６０】
2004248634.tif 000261
【表２６１】
2004248634.tif 000262
【表２６２】
2004248634.tif 000263
【表２６３】
2004248634.tif 000264
【表２６４】
2004248634.tif 000265
【表２６５】
2004248634.tif 000266
【表２６６】
2004248634.tif 000267
【表２６７】
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【表２６８】
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【表３４０】
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【表３４９】
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【表３５０】
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【表３６０】
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【表３６１】
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【表３６２】
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【表３６５】
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【表３６６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の毒性物質同定方法およびデータベース作成に用いることのできる毒性物質の例示である。
【図２】遺伝子発現解析データのクラスター解析図である。
【図１】
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【図２】
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