(57)【要約】【課題】金コロイド凝集法を用いる免疫分析において、操作の熟練性、時間や経費のかかる検量線の作成を必要とせずに自動分析機器による定量分析を行う。【解決手段】分析に必要な一回分の反応試薬を物理化学的に安定な状態であらかじめ封入した分析用光学セルを用いて、測定直前に試薬溶解液および測定試料を添加して分析する。測定に必要な情報をあらかじめ入力する方式により、分析の都度、検量線を作成する必要なしに自動分析機器による定量分析が行える。【選択図】　　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析において、分析に必要な一回分の抗体または抗原を感作した金コロイド試薬が物理化学的に安定な状態であらかじめ封入されている使い捨て光学セルを使用し、測定直前に金コロイド試薬溶解液および測定試料を添加することを特徴とする定量分析方法。
【請求項２】
使い捨て光学セルに封入した抗体または抗原を感作した金コロイド試薬の溶解液中に反応促進剤を含有させることを特徴とする請求項１記載の定量分析方法。
【請求項３】
金コロイド試薬は、凍結乾燥されて物理化学的に安定な状態とされることにより、測定ごとの検量線作成を不要としたことを特徴とする請求項１記載の定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析において、測定ごとの検量線作成が不要な定量分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析は、尿、糞便、血液等に含まれる生体成分の分析に幅広く応用されている。その測定原理は、測定対象物質に対する抗体又は抗原が結合した金コロイド粒子と測定対象物質とを反応させた場合に、金コロイド粒子の色調変化が生じることにある。
【０００３】
金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析は、液層における金コロイド粒子の色調変化を光学セルを用いて経時的に読みとり、同時に作成した既知濃度の検量線プロットに外挿して被検試料中の測定対象物質濃度を算出する方法が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、金コロイド凝集法に用いる反応試薬は、一般に液状では不安定であり、定量分析に際してはその都度、ブランクを含めた検量線を作成する必要があった。
【０００４】
このため、最近では、凍結乾燥すると試薬は安定になる技術を利用して、一旦、試薬を凍結乾燥し、使用前に溶液に戻す凍結乾燥タイプの金コロイド凝集法が用いられている。しかし、このようにしても液状に戻した後は不安定であることに変わりはなく、試薬は測定毎に使い切るか、あるいは使い残した場合、検量線を作成し直して検体を分析する必要があった。
【０００５】
また、反応容器が比色用セルである自動分析装置が知られ（特許文献２参照）、自動分析装置用に開発されたセルシートも提案されている（特許文献３参照）。しかしながら、これらはいずれも液状試薬をセル内に分注する方式であり、金コロイド凝集法に用いられる反応試薬の不安定さは、今日までなんら解消されていなかった。そのため、これらのセルシートを使用する自動分析装置においても、測定ごとの検量線作成が不可欠であった。
【０００６】
さらに、金コロイド凝集法の検量線は、非直線の多点検量線であるため、測定検体数が少数の場合、分析の都度、ブランクを含めた複数の既知濃度標準液を用いた検量線を作成することは、操作の熟練性を要し、また測定所要時間や経費の面で多大な問題があった。
【０００７】
【特許文献１】
特開平６−９４７１９号公報
【０００８】
【特許文献２】
特開平４−２３０８５９号公報
【０００９】
【特許文献３】
特開平８−３５９６９号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析におけるこれらの問題点を解決し、分析の都度、検量線を作成する必要がない定量分析方法を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の定量分析方法は、金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析において、分析に必要な一回分の抗体または抗原を感作した金コロイド試薬が物理化学的に安定な状態であらかじめ封入されている使い捨て光学セルを使用し、測定直前に金コロイド試薬溶解液および測定試料を添加することを特徴とするものである。
【００１２】
前記使い捨て光学セルに封入した抗体または抗原を感作した金コロイド試薬の溶解液中に、反応促進剤を含有させるのが好適である。
【００１３】
前記金コロイド試薬は、凍結乾燥されて物理化学的に安定な状態とされることにより、測定ごとの検量線作成を不要とするのが好適である。
【００１４】
溶解液と測定試料の添加順序はどちらが先でもよいが、溶解液を先に添加したほうが好ましく、場合によっては、液状の測定試料だけの添加で反応させることも可能である。
【００１５】
セルに封入する試薬の形態としては、粉末、顆粒、錠剤等の乾燥状態のものが利用可能であるが、溶解性の点から凍結乾燥したものが好ましい。
【００１６】
【発明の効果】
上記のような本発明定量分析方法によれば、金コロイド凝集法を用いる定量的免疫分析において、分析に必要な一回分の反応試薬を物理化学的に安定な状態であらかじめ封入した分析用光学セルを用意することによって、測定毎の検量線作成が不要となり、操作の熟練性、時間や経費のかかる検量線の作成を分析の都度行うことを必要とせずに自動分析機器による定量分析を行うことが可能になった。
【００１７】
すなわち、１回分の試薬を封入した光学セルを、測定時に開封し、直ちに、溶解液および測定試料を添加し反応を開始するようにして、光学セルを開封した後直ちに反応させることにより、開封した後の吸湿等による溶解性の不良および溶液化した後の試薬の劣化を回避できる。
【００１８】
また、反応開始前の試薬は液状となっている時間が短いため、溶解液中に反応促進剤を予め加えておくと、通常の凍結乾燥試薬を用いる場合より、操作を１ステップ省略することができる。凍結乾燥試薬の溶解液に反応促進剤を入れると、直ちに試薬は不安定となるため、通常、溶解液には反応促進剤を入れず、反応開始時に添加するのが一般的である。
【００１９】
光学セルに封入された上記試薬は安定性が高いため、最初に作成した検量線を作り直す必要はなく、必要な測定試料だけを測定すればよいので、分析所要時間が短縮され、測定コストの面でも著明な改善ができる。検量線作成は試薬利用者が行ってもよいが、試薬製造者が作成した検量線を試薬利用者がそのまま利用することによって、いわゆるノンキャリブレーション試薬とすることができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明に用いる光学セルには、分析に必要な一回分の反応試薬が物理化学的に安定な状態であらかじめ封入されている。反応試薬は、測定対象物質に対する抗体又は抗原を結合させた金コロイド粒子およびこれを安定化させるための物質から構成される。
【００２１】
本発明の測定対象物質は、その抗体または抗原が金コロイドに結合しうるものであれば特に限定されない。より具体的には、例えばアルブミン、ヘモグロビン、トランスフェリン等のタンパク質、リポタンパク質、核酸、生体酵素、免疫グロブリン、血液凝固因子及び抗ウイルス抗体、リウマチ因子等の抗体等が挙げられる。抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体あるいはそれらの混合物を使用することができる。
【００２２】
また、本発明に用いる光学セルの材質としては、取り扱いが容易な光透過性プラスチック、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル、塩化ビニルを使用することができるが、反応試薬を物理化学的に安定な状態に保つためには、水分透過性が少ないポリプロピレンが特に好ましい。必要な場合はガラス容器も使用できる。
【００２３】
本発明において、分析に必要な一回分の反応試薬を物理化学的に安定な状態で封入する例として、感作金コロイドにショ糖、乳糖、トレハロース等の糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、ウシ血清アルブミン、ニワトリ卵白アルブミン等の蛋白質、グリシン、アラニン等のアミノ酸等を適宜添加した溶液を上記セル内に分注して凍結乾燥する方法が挙げられる。必要に応じて界面活性化剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００など）を添加することもできる。セル内部を乾燥した不活性ガスで置換するとさらに安定な状態を確保できる。
【００２４】
また、セル上部は、気密性の高分子フィルムやアルミニウム等の金属フィルムを有する多層フィルムを熱で密着シールする。さらに、シールされたセルは、輸送中の吸湿を防ぐために、アルミニウムをラミネートした防湿袋に、シリカゲル等の防湿剤とともに入れることが好ましい。
【００２５】
光学セルに封入した感作金コロイドの溶解液は、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のＧＯＯＤ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等が利用できるが、これらにポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等の高分子重合体を反応促進剤として添加すると、反応量が増加するので好都合である。
【００２６】
測定機については、シールされたセルを剥がすか、穴をあける等の自動装置が組み込まれた測定機を用いることが好ましいが、測定直前にシールを手で剥がすことにより既存の測定機を用いることもできる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１（感作金コロイドの作製）
フレンス（Ｆｒｅｎｓ）らによる（Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．２４１，ｐ２０−２２，（１９７３））に記載された方法により、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元し、金コロイド溶液を調製した。金コロイド溶液を０．２Ｍ炭酸カリウム溶液により、ｐＨ６．６に調整し、特開平２−１４１６６５号公報に記載の抗ヒトヘモグロビン・マウスモノクローナル抗体を金コロイド溶液１ｍＬあたり６μｇ添加した後、０．５ｍＬの１％カーボワックス２０Ｍ溶液を加えた。次いで、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離することにより暗赤色沈殿である感作金コロイドを回収し、５％ショ糖および１％ウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に、波長５４０ｎｍにおける吸光度が４．７になるように溶解した。
【００２９】
感作金コロイド溶液を反応セルに０．１ｍＬずつ分注し、凍結乾燥した。反応セルとして、日本電子社製ＪＩＡ−ＨＢ２０１０型自動分析装置用の専用セルの材質をポリスチレンからポリプロピレンに置き換えたものを用いた。凍結乾燥後、直ちに、アルミ・ラミネートシール（フナコシ社；商品番号ＪＪ−０３１３−００）を用い熱シールし、シリカゲルとともに、アルミ・ラミネート袋に入れた。
【００３０】
実施例２（測定）
自動分析装置（日本電子社製；ＪＩＡ−ＨＢ２０１０型）を用いて、ヒトヘモグロビンを測定した。すなわち、実施例１の方法で作成した感作金コロイドの入ったセルの熱シールを剥がし、直ちに、装置に並べ、感作金コロイド溶解液２００μＬ、測定試料２０μＬの順に入れ、反応開始直後と終了後の吸光度差を、主波長５４０ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。感作金コロイドを溶解する液として、３％ポリエチレングリコール６，０００および０．１％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を用いた。
【００３１】
図１に、標準ヘモグロビンとして合同酒精社製キャリブレーターＩＧを用いて測定して、得られた吸光度を検量線Ａとして示した。検量線Ａの吸光度を自動分析装置に入力して、測定試料２点（合同酒精社製コントロール２０１０ＩＧ−Ｌ、およびコントロール２０１０ＩＧ−Ｈ）を測定した結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】
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実施例３（保存安定性）
実施例１の方法で作成した感作金コロイドのセルを、シリカゲルとともにアルミ・ラミネート袋に入れて１５℃で１年間保存した。この１年保存したセルを用いて、図１に示した検量線Ａの吸光度を測定機に入力後、測定試料２点（合同酒精社製コントロール２０１０ＩＧ−Ｌおよびコントロール２０１０ＩＧ−Ｈ）を測定したところ、感作金コロイドの作成時つまり保存開始時（表１）と同様の値が得られた。その結果を、表２に示した。
【００３３】
【表２】
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さらに、１５℃で１年保存した感作金コロイドのセルを用いて、標準ヘモグロビン（合同酒精社製キャリブレーターＩＧ）による吸光度を調べた結果、図１の検量線Ｂに示すように、保存開始時の検量線Ａと同様の値が得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】セルに封入された感作金コロイドを用いた測定によりヘモグロビン量と吸光度の関係を求めた検量線を保存の前後で示すグラフ
【図１】
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