(57)【要約】【課題】動物の細胞に対して、任意の箇所で、かつ、任意のタイミングで成長抑制効果および抗酸化作用を実現することのできるキノコ由来の動物細胞成長抑制剤および／または抗酸化剤を提供する。【解決手段】動物細胞の成長抑制剤であって、ロクショウグサレキンまたはその類似菌類によって木質部中に産生された色素、またはロクショウグサレキンまたはその類似菌類の菌体に含まれる色素を有効成分として含有することを特徴とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞の成長抑制剤であって、ロクショウグサレキンまたはその類似菌類によって木質部中に産生された色素、またはロクショウグサレキンまたはその類似菌類の菌体に含まれる色素を有効成分として含有することを特徴とするキノコ類由来の色素物質含有の動物細胞成長抑制剤。
【請求項２】
薬理学的成分を含有する請求項１の動物細胞成長抑制剤。
【請求項３】
動物が、ヒトである請求項１または２の動物細胞成長抑制剤。
【請求項４】
活性酸素消去作用を有した抗酸化物であって、ロクショウグサレキンまたはその類似菌類によって木質部中に産生された色素、またはロクショウグサレキンまたはその類似菌類の菌体に含まれる色素を有効成分として含有することを特徴とするキノコ類由来の色素物質含有の抗酸化剤。
【請求項５】
薬理学的成分を含有する請求項４の抗酸化剤。
【請求項６】
動物が、ヒトである請求項４または５の抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、キノコ由来の色素物質を含有する、動物細胞の成長を抑制することのできる新しい動物細胞成長抑制剤と強い抗酸化作用を有する新しい抗酸化剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、ガン細胞に対する治療方法としての化学療法に用いられる抗ガン剤として、アルキル化剤や代謝拮抗剤、抗生物質のほかに、微生物由来の生体反応修飾物質が知られている。
【０００３】
アルキル化剤を初めとする化合物は本来、細胞毒性を利用するものであり、少なからぬ副作用のために使用がかなり限定されたのに比べ、たとえば、ピシバニール等の生体反応修飾物質は生体の免疫機能を高めて、ガン細胞を駆逐するという特徴を有している。
【０００４】
抗ガン剤は正常な細胞まで傷つけ、副作用として患者に対して身体的および精神的に大きな負担を与えることかから、ガン細胞のみを特異的に標的として、他の正常細胞には影響を与えず、かつ、従来の生体反応物質よりも効果的にガン細胞を駆逐しうる新しい抗ガン剤修飾の実現が望まれている。
【０００５】
このような新しい抗ガン剤の探索の過程において、食用キノコの抗ガン活性に関する研究が以前から行われてきており、キノコの子実体、菌糸体等に抗ガン性物質が存在することが知られている。たとえば、食用キノコであるタモギタケからの抗ガン作用を有するタンパク質（特許文献１）が提案されている。このタモギタケ由来の抗ガン性タンパク質は、ガン細胞に対する選択的に増殖抑制活性を有するタンパク質であり、タモギタケから単離・精製されたものである。
【０００６】
ガン細胞に対する選択的な増殖抑制活性を有するこの抗ガンタンパク質は、キノコ由来の新しい抗ガン剤や、動物細胞の成長を抑制することのできる新しい細胞成長抑制剤の開発に希望を与えるものとして注目されている。
【０００７】
しかしながら、現状においてはキノコ由来の新しい抗ガン剤や、細胞の増殖抑制活性物質を実現することはあまり成功していない。たとえば、前記のタモギタケ由来の抗ガンタンパク質の場合でも、任意の病因箇所への導入が困難であり、また任意のタイミングでの成長阻害効果（抗ガン作用）の実現が困難であった。
【０００８】
また近年では、活性酸素が、不飽和脂肪酸と反応し、過酸化脂質を形成して、生体（特に人）に悪影響を及ぼすことが明らかになってきており、注目されている。この活性酸素は、細胞の酸素呼吸過程にて発生するが、他にも放射線や紫外線照射による発生、発ガン物質の代謝過程等において発生する。活性酸素は、水や酸素から生成され、不安定な不対電子を有する反応性に富んだ分子であり、スパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、そして一重項酸素が一般的である。前記の人体への悪影響とは、具体的には、過剰量の活性酸素によって、核酸、タンパク質、脂質等の生体成分に酸化障害を誘引し、その結果、発ガン、動脈硬化、糖尿病等の発症や細胞老化の促進の原因となる。そのため、このような活性酸素を除去・消去する効果を有する抗酸化物質、あるいは、抗酸化物質を含有する食品等に大きな期待がもたれており、ポリフェノールや各種フラボノイド類が一般的に知られている。そして、より強い抗酸化作用を有する抗酸化剤として、アガリクス由来の成分とクロレラ等を組み合わせた抗酸化剤が提案されている（特許文献２）。この抗酸化剤では、アガリクスの抗酸化の作用機序とクロレラ等（他に、プロポリスおよびメシマコブが記載されている）の抗酸化の作用機序とが異なることに基づいて、両者を組み合わせて、相補的、かつ、相加的に抗酸化作用を向上させている。
【０００９】
しかしながら、前記の抗酸化剤では、抗ガン作用や細胞の増殖抑制活性作用は有しておらず、また任意箇所への導入および任意のタイミングでの抗酸化作用の発揮が困難であった。
【００１０】
【特許文献１】
特開平１１−３１５０９６号公報
【特許文献２】
特開２００２−２３５０８４号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこでこの出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、キノコ由来の物質として、抗ガン剤をはじめとする動物細胞の増殖抑制剤として有用な新しい動物細胞成長抑制剤、さらには抗酸化剤としても有用な新しい抗酸化剤を提供することを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、第１には動物細胞の成長抑制剤であって、ロクショウグサレキンまたはその類似菌類によって木質部中に産生された色素、またはロクショウグサレキンまたはその類似菌類の菌体に含まれる色素を有効成分として含有することを特徴とするキノコ類由来の色素物質含有の動物細胞成長抑制剤を提供する。また第２には、薬理学的成分を含有する動物細胞成長抑制剤を、そして第３には、動物が、ヒトである動物細胞成長抑制剤を提供する。
【００１３】
さらにまた、この出願の発明は、第４には、活性酸素消去作用を有した抗酸化物であって、ロクショウグサレキンまたはその類似菌類によって木質部中に産生された色素、またはロクショウグサレキンまたはその類似菌類の菌体に含まれる色素を有効成分として含有することを特徴とするキノコ類由来の色素物質含有の抗酸化剤を提供し、第５には、薬理学的成分を含有する抗酸化剤を、第６には、動物が、ヒトである抗酸化剤を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものである。以下にその実施の形態について詳しく説明するが、この出願の発明はこれらによって、当然に限定されるものではない。
【００１５】
この出願の発明のキノコ由来の色素物質による、動物細胞抑制剤および／または抗酸化剤における有効成分の色素は、ロクショウグサレキン、またはその類似菌類（以下、ロクショウグサレキン系類菌）によって木質部中に産生された色素、あるいはロクショウグサレキン系類菌体に含まれる色素（以下、キシリンデインともいうことがある）である。このものは、次の一般式［Ｉ］に示したとおり、「アセチル化」と「脱アセチル化」を可逆的なものとする性質を有していると考えられる。この可逆的な反応が関与することで、任意のタイミングで抑制活性等が実現されるものと推定される。
【００１６】
【化１】
2004238293.tif 000002
【００１７】
ロクショウグサレキンの色素については、このものが植物の成長抑制作用を有し、特に藻類の成長を阻害・抑制して、その除去を有効とすることがこの出願の発明者によってすでに見出されている（特開２００２−２９１４９３号公報）。だが、動物細胞に対しての成長抑制の作用および抗酸化作用に関係している色素については、全く予期されていなかったことである。
【００１８】
さらにまた、前記のとおり、抗酸化剤の有効成分として、担子菌類に属するアガリクスおよび／またはメシマコブを利用したものが知られているが、この出願の発明者らの鋭意研究によって、担子菌類よりも子嚢菌類に属するロクショウグサレキン由来の色素物質の方が抗酸化作用が強いことを見出されていた。
【００１９】
なお、「抗酸化作用」とは、活性酸素（スパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカルおよび一重項酸素等）の消去作用のことを意味する。
【００２０】
この出願の発明の上記の色素については、その調整は抽出分離が好ましく、特に熱水抽出分離により行われる。また、従来から公知である液体培地による培養方法あるいはおがくずに液体培地を含浸させた培養方法によって産生された培地成分を有機溶剤等を用いて抽出し、有機溶剤成分を蒸発させる、あるいは適当なカラムを利用してフィルトレーションを行うことによって色素を回収することによってもよい。
【００２１】
ロクショウグサレキンの類似菌類としては、たとえばロクショウグサレキンもどきである、ヒメロクショウグサレキン等が挙げられる。
【００２２】
上記の熱水抽出分離は、ロクショウグサレキン系類菌により産生された色素を含む木質部、あるいはロクショウグサレキン系類菌を原料として、これを好ましくは粉末形態で用い、気体あるいは液体状態の熱水による腐朽成分や易溶性成分の抽出除去処理後、加圧熱水、好ましくはアルカリが添加された加圧熱水での色素の選択的抽出分離処理によるか、さらに必要に応じて採択される、これらの処理で得られた色素水溶液への酸添加による色素の沈析分離処理によるのが好ましい。
【００２３】
この熱水抽出分離についてさらに詳細に説明すると、適当に粉砕された、上記色素を含む木質部試料あるいは菌体試料を、試料が流出しないようメッシュ等でカバーした抽出容器内に充填し、これに圧力解放下１００〜１４０℃、好ましくは１２０〜１３５℃の熱水を接触させて、まず腐朽成分あるいはロクショウグサレキン系類菌の菌体由来の易溶性成分の抽出除去を行う。この処理は抽出溶液の色が透明になるまで行う。
【００２４】
次いで、抽出容器内の抽出残留物に対し、１００℃より高温、好ましくは１２０〜１３５℃の加圧熱水で更に抽出を行う。この際に負荷する圧力は熱水が完全な液体状態となるように蒸気圧以上の加圧、好ましくは０．５〜２ＭＰａ程度でよい。この加圧熱水によって難溶性の色素が抽出されるが、加圧熱水に少量のアルカリ、たとえば水酸化ナトリウムや水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物等を添加することによって抽出速度を大幅に上げることができる。その添加量としては加圧熱水のアルカリ濃度が０．００１〜０．１Ｎ（規定度）となるように調製するのがよい。なお、アルカリ濃度が０．１Ｎを超えるとヘミセルロースのような残留分として除去されるべき成分までが抽出され、有用な色素の純度が低下し、また０．００１Ｎ未満ではその添加効果が十分ではなく、抽出速度が十分には上がらない。この加圧熱水抽出処理により色素を含む水溶液が得られるが、フェノール性水酸基を持つ色素あるいはカルボン酸誘導体色素は、これに水溶液のｐＨが３以下になるよう酸を添加すると沈析するので、この沈析色素を通常のろ過法や遠心分離法で回収することにより固体状の色素粉末が得られる。
【００２５】
この出願の発明のキノコ由来の色素物質による、動物細胞抑制剤および／または抗酸化剤は、有効成分としての色素（キシリンデイン）を含まれていれば、特にその組成や組成比は限定されることはない。ロクショウグサレキン系類菌の菌体自体であってもよいし、ロクショウグサレキン系類菌を培養させた培地、たとえば、液体培地等であってもよいし、ロクショウグサレキン系類菌を繁殖させた原木やそれを適宜形状に裁断、切断、粉砕等で加工処理した木質材、たとえばおがくず等であってもよいが、好ましくは上記色素（キシリンデイン）の回収物、たとえば抽出液や、色素単体、製剤等が用いられる。特に、この出願の発明のキノコ由来の色素物質による、動物細胞抑制剤および／または抗酸化剤を抗ガン剤や抗酸化剤等としてヒト等へ投与する場合、薬理学的成分を含んだ製剤が好ましい。
【００２６】
前記のような薬理学的成分を含んだ抗酸化剤は、紫外線、放射線、化学物質、タバコ、ストレス等により過剰な活性酸素が発生した際に関わると考えられる各種疾患（たとえば、ガン、心筋梗塞、動脈硬化、脳梗塞、糖尿病やアトピー性皮膚炎、高コレステロール血症、冷え性、肩こり、腰痛等）の予防および治療にも効果を発揮する。特にこの出願の発明の抗酸化剤としては、化粧品に含有させることもできる。このような化粧品類としては、たとえば、洗顔料、乳液、化粧水、クリーム類（スキンクリーム等）、ヘアケア製品（シャンプーやリンス、コンディショナー等）等が例示できる。そして、このような化粧品類には、適宜に香料や保湿剤、防腐剤、美白剤等を配合してもよい。
【００２７】
もちろん、この出願の発明は、食品に含有させることもできる。マーガリン、植物性油等の油脂類（活性酸素により酸化され、過酸化脂質になりやすい不飽和脂肪酸を多く含むので、抗酸化剤としては特に有効）をはじめ、米飯類、菓子類、麺類、カマボコ・チクワ等の水産練り製品、ハム・ソーセージ等の畜肉加工品、清涼飲料・果実飲料等の飲料類、マヨネーズ、ドレッシングや味付け調味料等の調味料等が例示することができる。
【００２８】
上記の「薬理学的成分」とは、通常の薬剤製造に用いられる各種の担体を指す。「担体」は、利用目的等や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜に選択できる。たとえば、経口投与や注射による投与等が挙げられる。経口投与では、懸濁剤やシロップ剤のような液体調整物（水、シュクロース、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油や大豆油等の油類、また防腐剤やペパーミント、ストロベリー等の各種フレーバー等から調整・製剤される）として、また散剤、丸剤、カプセル剤や錠剤（ラクトース、グルコース、マンニトール等の賦形剤、デンプン等の崩壊剤、マグネシウムステアレート等の潤沢剤、ゼラチン等の結合剤、また表面活性剤、可塑剤等から調整・製剤される）として投与することができる。また、注射による投与には、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等の方法が選択することができる。特に、この出願の発明の動物細胞成長抑制剤および／または抗酸化剤を任意の箇所に投与・注入するには、注射による投与が好ましい。
【００２９】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合溶液、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化して、使用時に前記の注射用溶液担体と混合して注射液を調整してもよい。「投与量」としては、成長抑制剤あるいは、抗酸化剤に関わらず、この出願の発明の効果を発揮する量であれば、特に限定しないが、１回の投与当たり、色素換算で５００μｇ〜１ｍｇの範囲が好ましい。
【００３０】
また、薬理学的成分は、動物細胞成長抑制剤および／または抗酸化剤を細胞内に導入可能な形態とするための成分であり、たとえば動物細胞成長抑制剤（あるいは、抗酸化剤）の機能等を変更することなく、かつ、薬理学的に許容される溶液にこの動物細胞成長抑制剤（あるいは、抗酸化剤）を混合して組成物とすることができる。このような組成物は、たとえば、目的物質を細胞内に導入することができるマイクロインジェクション法や脂質を用いた細胞内導入法によって標的細胞に導入することができる。これによって、任意に病因箇所を標的にして、抗ガン作用、抗酸化作用を実現することができる。
【００３１】
そして、ロクショウグサレキン系類菌由来の色素（キシリンデイン）を有効成分とする動物細胞成長抑制剤および／または抗酸化剤は、前記の反応式に示したとおり、キシリンデインをアルカリ性で無水酢酸または酸塩化物と反応させること（たとえば、ピリジンと無水酢酸、ピリジンと塩化アセチル等、またアルカリ性溶液をクロロホルム等で希釈して反応の程度をコントロールすることもできる）によって、キシリンデインのフェノール水酸基を容易にアセチル化反応させることができ（メチル化反応も可能）、またこの反応は、可逆的に脱アセチル化（またはメチル化）も可能であり、この脱アセチル化等によって細胞抑制の活性（もしくは、抗酸化作用）が復活する。脱アセチル化は、プロトン性溶媒である水やアルコール中でナトリウムやカリウム等を反応させることによって脱アセチル化は進行する。
【００３２】
キシリンデインおよび／またはキシリンデイン化合物は、上記のとおり、アセチル化前は強い動物細胞抑制作用および／または抗酸化作用を発揮し、アセチル化後は成長抑制作用および／または抗酸化作用は消失し、細胞に対して全くの無害なものとなることが推定できる。このことは、ガン細胞やウイルス等に感染した感染細胞等を含めた細胞の成長抑制作用（あるいは、抗酸化作用）が、アセチル化後には停止することを示唆する。すなわち、この特性を利用して、ガン細胞や感染細胞等の病因となっている細胞のみを標的として、また、脱アセチル化等の発現タイミングを制御することによって、任意に細胞の抑制・制御することができ、また抗酸化作用においても同様に発揮することが期待できる。
【００３３】
この出願の発明の動物細胞成長抑制剤および／または抗酸化剤を適用しうる動物の種類については特に限定されるものではないが、特にヒトが好ましい。
【００３４】
以下、動物細胞を用いた実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明する。もちろん、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００３５】
【実施例】
（実施例１）キシリンデインの抽出
ロクショウグサレキン（腐朽木材）から、ソックスレー抽出法によって抽出し、クロロホルムで２４時間処理をした。抽出された、青緑色を呈した色素（すなわち、キシリンデイン）を可視吸収スペクトル測定を行った。結果は、図１に示したとおりであった。
【００３６】
なお、図２にアセチル化キシリンデインを、図３にアセチル化したキシリンデインを脱アセチル化させたキシリンデインの可視吸収スペクトルを示した。
【００３７】
図１、図２および図３に示したとおり、キシリンデインと脱アセチル化キシリンデインの波形は類似しており、一方アセチル化キシリンデインにおいては、波形が異なっていることが確認された。
（実施例２）動物細胞へのキシリンデインの添加
液体培地Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（５ｍｌ）を用いて、マウス卵巣由来のＣＨＯ細胞（５×１０４ｃｅｌｌ）を培養し、キシリンデイン０．０２ｍｇ／ｍｌ＋５０μｌ  ＤＭＳＯを添加した。なお、培地のキシリンデイン濃度は、６×１０−８Ｍである。
【００３８】
結果は、図４に示したとおりである。コントロールとしてＤＭＳＯのみを添加した場合およびアセチル化キシリンデイン（３０×１０−８Ｍ）を添加した場合は、細胞は増殖し、一方キシリンデイン（６×１０−８Ｍ）を添加した場合は、細胞増殖を抑制することが確認された。
【００３９】
また、図５では、脱アセチル化キシリンデイン（６×１０−８Ｍ）を添加した結果も示した。アセチル化キシリンデイン（３０×１０−８Ｍ）の場合は、細胞は増殖し、キシリンデイン（６×１０−８Ｍ）を添加した場合と同様に、脱アセチル化キシリンデイン（６×１０−８Ｍ）を添加した場合も、細胞増殖を顕著に抑制することが確認された。
（実施例３）キシリンデインの過酸化物価（ＰＯＶ）の測定
加圧熱水法によって抽出したロクショウグサレキン由来の色素（キシリンデイン）、カラスタケ由来の色素および食紅の過酸化物価（ＰＯＶ）の測定・検討を行った。
【００４０】
抽出された色素２０ｍｇを２０ｍｌのドデシル硫酸ナトリウム（ＤＭＳＯ）に添加し、４０℃で２４時間攪拌した。その後、ろ過を行い、このろ液をサンプル溶液として用いた。ＰＯＶ測定は、Ｋａｓｕｇａらによる方法（Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．、６０、５、ｐ１１１３−１１１５、１９９５）に従った。すなわち、リノール酸メチルを酢酸エチルに溶解し、５００ｍｇ／ｍｌの溶液を調整し、この溶液２０μｌにサンプル溶液１０μｌを加え、５０℃で２４時間反応させた。この反応溶液を別容器に移し、クロロホルム：酢酸（割合２：３）の混合溶液１１ｍｌを加えた。次に、飽和ヨウ化カリウム水溶液０．３ｍｌを加え、０．０１Ｎチオ硫酸ナトリウムで、Ｉ２の逆適定を行ってＰＯＶを算出した。抗酸化作用の評価は、抽出液添加サンプルのＰＯＶＳと、抽出液添加サンプルの代わりにＤＭＳＯを加えたコントロールであるＰＯＶＣとの比（ＰＯＶＳ／ＰＯＶＣ）を算出することによって求めた。
【００４１】
結果は図６に示したとおりである。食紅におけるＰＯＶＳ／ＰＯＶＣは、約０．９を示し、カラスタケ由来の色素抽出液におけるＰＯＶＳ／ＰＯＶＣは、約０．６を示し、食紅よりも強い抗酸化作用を有することが確認された。一方、ロクショウグサレキン由来の色素（キシリンデイン）のＰＯＶＳ／ＰＯＶＣにおいては、約０．５を示し、最も強い抗酸化作用を有することが確認された。
【００４２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、動物の細胞に対して効果があり、任意の箇所で、かつ、任意のタイミングで成長抑制効果、また抗酸化作用を実現することのできるキノコ由来の新しい動物細胞成長抑制剤および／または抗酸化剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】抽出したキシリンデインの可視吸収スペクトル測定の結果を例示した図である。
【図２】アセチル化キシリンデインの可視吸収スペクトル測定の結果を例示した図である。
【図３】脱アセチル化キシリンデインの可視吸収スペクトル測定の結果を例示した図である。
【図４】コントロールとしてＤＭＳＯのみ添加、アセチル化キシリンデイン添加およびキシリンデイン添加の場合の細胞増殖の様子を例示した図である。
【図５】アセチル化キシリンデイン、脱アセチル化キシリンデインおよびキシリンデインをそれぞれ添加した場合の細胞増殖の様子を例示した図である。
【図６】食紅、カラスタケ由来の色素およびキシリンデイン、それぞれのＰＯＶＳ／ＰＯＶＣ値を比較例示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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