(57)【要約】【課題】  蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定法、該法を利用するリアルタイム定量的ＰＣＲ法、及び該リアルタイム定量的ＰＣＲ法により得られるデータを解析する方法において、短時間かつ正確に目的が達成できる方法を提供する。【解決手段】  蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定する核酸の新規測定法、該法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、及び該ＰＣＲ法で得られるデーターの解析の際、アニーリング反応時の蛍光強度値を、変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（７）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（１）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部において、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした末端塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ。
（２）核酸プローブが３’末端において蛍光色素で標識されている前記（１）に記載の核酸測定用核酸プローブ。
（３）核酸プローブが５’末端において蛍光色素で標識されている前記（１）に記載の核酸測定用核酸プローブ。
（４）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分においてハイブリダイゼーションの塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ。
（５）核酸プローブの３’末端塩基がＧまたはＣで、かつ３’末端が蛍光色素で標識されている前記（４）に記載の核酸測定用核酸プローブ。
（６）核酸プローブの５’末端塩基がＧまたはＣで、かつ５’末端が蛍光色素で標識されている前記（４）に記載の核酸測定用核酸プローブ。
（７）核酸プローブが、３’末端のリボース若しくはデオキシリボースの３’炭素の水酸基、または３’末端のリボースの３’炭素の水酸基がリン酸化されている前記（３）または（６）に記載の核酸測定用核酸プローブ。
【請求項２】
下記の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（８）核酸測定用核酸プローブのオリゴリボヌクレオチドが、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２−ｏ−ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＰＮＡ、または、他の化学的に修飾した核酸である前記（１）〜（７）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブ。
（９）核酸測定用核酸プローブのオリゴリボヌクレオチドが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドを含むチメリックオリゴヌクレオチド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である前記（１）〜（７）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブ。
（１０）リボヌクレオチドが、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドである前記（９）に記載の核酸測定用核酸プローブ。
【請求項３】
標的核酸または遺伝子の多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）または／および変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を解析若しくは測定する方法において、請求項１に記載の（１）〜（７）、及び請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸プローブを標的核酸または遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する方法。
【請求項４】
標的核酸または遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、請求項１に記載の（１）〜（７）、及び請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定するキット。
【請求項５】
請求項３に記載の方法により得られるデータを解析する方法において、標的核酸または遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法。
【請求項６】
標的核酸または遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定装置において、請求項５に記載のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とする標的核酸または遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定装置。
【請求項７】
請求項５に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション反応前にハイブリダイゼーション反応実施のためのハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加する下記に記載の核酸測定方法。
核酸測定方法：請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
【請求項９】
ＰＣＲ方法において、請求項１に記載の（１）、（２）、（４）、（５）、（７）、及び請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系または核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定方法。
【請求項１０】
ＰＣＲ方法において、請求項１に記載の（３）または（６）に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定方法。
【請求項１１】
ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である請求項９または１０に記載のＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定方法。
【請求項１２】
下記の何れか１項に記載の核酸測定方法で得られたデーターを解析する方法において、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正することを特徴とする核酸測定方法のためのデータ解析方法。
（１１）請求項１に記載の（１）〜（７）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（１２）請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸測定用核酸プローブを、標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（１３）ハイブリダイゼーション反応前にハイブリダイゼーション反応実施のためのハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加する前記（１２）に記載の核酸測定方法。
（１４）標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる前記（１２）に記載の核酸測定方法。
（１５）標的核酸がＲＮＡである前記（１１）、（１２）、（１３）、（１４）の何れか１項に記載の核酸測定方法。
（１６）下記（ａ）〜（ｄ）の何れか１項に記載の核酸測定用デバイスを用いて標的核酸を測定することを特徴とする核酸の測定方法。
（ａ）請求項１に記載の（１）〜（７）、及び請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸プローブ、または一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーションすると発光若しくは消光するように設計された構造をもつ核酸プローブを固体支持体表面に結合させ、それに標的核酸をハイブリダイゼーションさせて標的核酸を測定することができるようにしたことを特徴とする核酸測定用デバイス。
（ｂ）前記（ａ）に記載の核酸測定用デバイスにおいて、核酸プローブが固体支持体表面にアレー状に配列、結合させた核酸測定用デバイス（チップ）。
（ｃ）固体支持体表面に結合させられた核酸プローブ毎に、反対側の表面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設置され、核酸プローブ結合領域が最適温度条件になるように温度調節され得る前記（ａ）、または前記（ｂ）に記載の核酸測定用デバイス。
（ｄ）核酸プローブを蛍光色素で標識していない端部で固体支持体表面に結合させた前記（ａ）〜（ｃ）の何れか１項に記載の核酸測定用デバイス。
（１７）前記（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）の何れか１項に記載の核酸の測定方法において、標的核酸が、純粋分離して得た微生物由来、または動物由来であることを特徴とする核酸の測定方法。
（１８）標的核酸が、複合微生物系、または共生微生物系の細胞内若しくは細胞のホモジネートの核酸である前記（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）の何れか１項に記載の核酸の測定方法。
（１９）ＰＣＲ方法において、請求項１に記載の（１）、（２）、（４）、（５）、（７）、請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸プローブを用いて反応を行い、核酸伸長反応時当該プローブがポリメラーゼにより分解除去されている反応系または核酸変性反応時若しくは核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値と標的核酸若しくは増幅標的核酸が該核酸プローブとハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定方法。
（２０）ＰＣＲ方法において、請求項１に記載の（３）または（６）に記載の核酸プローブをプライマーとして反応を行い、当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸がハイブリダイズしていない反応系の蛍光強度値と該核酸プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸とハイブリダイズしているときの反応系の蛍光強度値を測定し、前者の蛍光強度値の減少率を算出することを特徴とするＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定方法。
（２１）ＰＣＲ方法がリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である前記（１９）または（２０）に記載のＰＣＲ方法で増幅された核酸の測定方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程（以下、補正演算処理過程という。）を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の補正演算処理過程が、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕によるものである請求項１１に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n          〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。
【請求項１５】
請求項１１に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕における補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
Ｆn＝ｆn／ｆa          〔数式３〕
Ｆn＝ｆa／ｆn          〔数式４〕
〔式中、
Ｆn：ｎサイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値
ｆa：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のもの〕。
【請求項１６】
請求項１１に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法において、
１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用いて、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理する過程、
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn）          〔数式５〕
ｌｏｇb｛（１−Ｆn）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆn）×Ａ｝      〔数式６〕
ｌｏｇb｛（Ｆn−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆn−１）×Ａ｝      〔数式７〕
〔式中、
Ａ、ｂ：任意の数値、
Ｆn：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出されたｎサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
２）前記１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法。
【請求項１７】
標的核酸について請求項１に記載の（１）〜（７）、及び請求項２に記載の（８）〜（１０）の何れか１項に記載の核酸プローブを用いてＰＣＲ方法を行い、増幅核酸について核酸の融解曲線の分析を行ってＴｍ値を求めることを特徴とする核酸の融解曲線の分析方法。
【請求項１８】
標的核酸について請求項１に記載の（３）または（６）に記載の核酸プローブをプライマーとして用いてＰＣＲ方法を行い、その増幅核酸について核酸の融解曲線の分析を行ってＴｍ値を求めることを特徴とする核酸の融解曲線の分析方法。
【請求項１９】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデーター解析方法において、請求項１７および／または１８に記載の核酸の融解曲線の新規分析方法により、核酸の融解曲線を分析する過程、即ち、本発明のＰＣＲ方法により増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程、この過程において、時間間隔で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程（核酸の融解曲線を表示する過程）、この融解曲線を一次微分する過程、その値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程、を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデーター解析方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１４に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１５に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１６に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１７に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、を有することを特徴とするリアルタイム定量的ＰＣＲの測定および／または解析装置。
【請求項２１】
請求項１３に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１４に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１５に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１６に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程、請求項１９に記載のデータ解析方法によりデータを解析する過程を、コンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体。
【請求項２２】
核酸定量方法において、請求項１３〜１６、１９の何れか１項に記載のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項２３】
核酸定量方法において、請求項２０に記載の装置を利用することを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項２４】
核酸定量方法において、請求項２１に記載のコンピュータ読取可能な記録媒体を用いることを特徴とする核酸の定量方法。
【請求項２５】
標的核酸をその高次構造が十分に破壊されるに適した条件で加熱処理後、核酸プローブと標的核酸をハイブリダイゼーションさせる請求項２に記載の核酸測定方法。
【請求項２６】
ハイブリダイゼーション反応系にヘルパープローブを添加してなる請求項４に記載のキット。
【請求項２７】
標的核酸がＲＮＡである請求項１、２、８、２５の何れか１項に記載の核酸測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の測定方法、それに用いる核酸プローブ及びその方法によって得られるデータを解析する方法に関する。詳しくは蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる各種核酸の各種測定方法に関し、蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定するという原理に基づく各種核酸の各種新規測定方法、それに用いる核酸プローブ及びデバイス（ｄｅｖｉｃｅｓ）、それら測定方法の一つであるＰＣＲ方法によって得られるデータを解析する方法、解析装置、解析方法の各手段をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いて核酸量を測定する各種方法が知られている。該方法には、以下のようなものがある。
（１）ドットブロッテング法
この方法は、標的核酸と当該核酸プローブをメンブラン上でハイブリダイゼーションさせた後、未反応の核酸プローブを洗い流し、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブに標識された蛍光色素分子のみの蛍光強度を測定するものである。
【０００３】
（２）インターカレーター方法（非特許文献１）：
この方法は、インターカレーターと称されるある種の蛍光色素が核酸の二重鎖内にはまりこんだときに、強く発光するのでその発光の増加量を測定する方法である。その蛍光色素として、例えば、エチジウムブロマイド（非特許文献２）、SYBR R グリーン(Green) I(非特許文献３）を挙げることができる。
【０００４】
（３）FRET(fluorescence energy transfer)を利用する方法（非特許文献４）：  この方法は、標的核酸にハイブリダイズする二つの核酸プローブからなる。二つの核酸プローブは、各々異なった蛍光色素で標識されている。二つのプローブの内の一方は、ＦＲＥＴ現象を通して、エネルギーを他方のプローブの蛍光色素に送りこれを発光させることができる蛍光色素で標識されている。二つのプローブは、蛍光色素が向き合うように、かつ１〜９塩基離れてハイブリダイズするように設計されている。それで、二つの核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズすると蛍光色素の発光が起こり、発光の程度が標的核酸の複製量に比例する。
【０００５】
（４）分子ビーコン方法（非特許文献５）
この方法で使用する核酸プローブは、核酸プローブの一端にレポーター色素、他端にクエンチャー色素が標識さている。そしてその両端部は塩基配列において互いに相補性があるので、プローブ全体としてhairpin stemを形成するように塩基配列が設計されている。その構造のために液中に浮遊している状態では、Forster共鳴エネルギーのため、レポーター色素の発光は、クエンチャー色素により抑制されている。しかし、標的核酸にハイブリダイゼーションするとhairpin stem構造が壊れるために、レポーター色素とクエンチャー色素の距離が大きくなるので、Forster共鳴エネルギーの移動が起こらなくなる。そのために、レポーター色素の発光が起こるようになる。
【０００６】
（５）デービスの方法（非特許文献６）
デービスは、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を、炭素原子１８個を有するスペサーを介して結合したプローブを作成した。これをフローサイトメトリーに適用した。３’末端に蛍光色素を直接に結合した場合より、ハイブリダイゼーションした場合、１０倍の蛍光強度が得られることを報告した。
これらの方法は、核酸の各種測定方法、ＨＩＳＨ方法（fluorescent in situ hybridization assays)、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction)、SD方法( strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などに適用されてめざましい発展をとげている。
【０００７】
これらの方法は、現在一般的に使用されいるが、蛍光色素で標識した核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション反応を行った後、ハイブリダイゼーションしなかった当該核酸プローブを反応系から洗い流す必要があるという好ましくない手順を有している。このような手順を除くと測定時間の短縮、測定の簡便性、測定の正確性をもたらすことは明らかである。そこで、このような手順を有さない核酸測定方法の開発が望まれていた。
【０００８】
【非特許文献１】Glazer et al., Nature 359:959,1992
【非特許文献２】実験医学、15巻、7号、46〜51ページ、1997年、羊土社
【非特許文献３】LightCyclerTM System；1999年4月5日、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発行のパンフレット
【非特許文献４】Mergney et al., Nucleic Acid Res., 22: 920-928,1994.
【非特許文献５】Tyagi et al., Nature Biotech.,14:303-308,1996.
【非特許文献６】Davis et al.、Nucleic acids Res.24: 702-706、1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、前記の状況に鑑み、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、より短時間に、より簡便、より正確に目的の核酸量を測定できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決するにあたり、核酸プローブを用いた核酸測定方法について検討を重ねた。その結果、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光が減少するという現象（蛍光消光現象）があり、特定の色素においてはその減少が顕著であり、かつその減少の程度は、蛍光色素が結合した部分の塩基の種類又は塩基配列に依存するということを発見した。本発明はかかる発見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
即ち、本発明は、
１）蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法において、上記核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、上記核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とする核酸の測定方法、また、
２）蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部において、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした末端塩基から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、または、  蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、上記蛍光色素が、その発光を減少させる核酸プローブであり、かつ、当該プローブは、その末端部において蛍光色素で標識されており、当該核酸プローブが、標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、当該末端部分においてハイブリダイゼーションの塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることを特徴とする核酸測定用核酸プローブ、また、それらのプローブを用いる核酸測定方法、また、
【００１２】
３）標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法において、前記２）に記載の核酸プローブを標的核酸若しくは遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、蛍光強度の変化量を測定することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する方法、また、
４）標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定キットにおいて、前記２）に記載の核酸プローブを含有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定キット、また、
【００１３】
５）前記３）に記載の方法により得られるデータを解析する方法において、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正処理する過程を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法、また、
【００１４】
６）標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定装置において、前記５）に記載のデータ解析方法を実施するための手段を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型または／および変異を解析若しくは測定する測定装置、また、
７）前記５）に記載の補正処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、
【００１５】
８）前記１）、２）に記載の核酸プローブを固体表面に結合せしめたプローブを用いる核酸測定方法、及び該方法の核酸測定用デバイス、また、
９）前記１）、２）、８）に記載の核酸測定方法を用いるＨＩＳＨ（fluorescent in situ hybridization assays）方法、また、
【００１６】
１０）前記１）、２）、９）に記載の核酸測定方法によって得られるデータの解析方法、また、
１１）前記１）、２）に記載の核酸測定方法を用いるＰＣＲ方法、また、
１２）前記１１）に記載のＰＣＲ方法によって得られるデータ解析方法、また、
１３）前記１１）に記載のＰＣＲ方法を用いる核酸の融解曲線解析方法、また、
１４）前記１２）と１３）を融合させた解析方法、また、
１５）前記１１）、１２）、１３）又は１４）に記載の解析方法により解析する手段を有するＰＣＲの測定及び／又は解析装置、また、
【００１７】
１６）前記１１）、１２）、１３）又は１４）に記載の解析方法により解析する手順をプログラムとして記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、
１７）前記１２）、又は１４）に記載のデータ解析方法を利用することを特徴とする核酸の定量方法、また、
１８）前記１５）に記載のＰＣＲの測定及び／又は解析装置を用いる核酸の測定方法、また、
１９）前記１６）に記載の記録媒体を用いることを特徴とする核酸の測定方法、を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は次のような効果を有する。
１）前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプローブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型または変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効果を有する。
ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量的ＰＣＲを行うことができる。
ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１オーダー低くなる。
ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によって得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることができる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
本発明において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＸＴＰｓ、ｄＸＴＰｓ、ＮＴＰｓ、ｄＮＴＰｓ、核酸プローブ、ヘルパー核酸プローブ（又は核酸ヘルパープローブ、又は単にヘルパープローブ）、ハイブリダイズ、ハイブリダイゼーション、インターカレーター、プライマー、アニーリング、伸長反応、熱変性反応、核酸融解曲線、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション方法（hybridization assays)、ＨＩＳＨ(fluorescent in situ hybridization assays)方法、ＰＣＲ方法(polymerase chain assays ）、ＬＣＲ方法（ligase chain reaction)、 ＳＤ方法(strand displacement assays)、競合的ハイブリダイゼーション方法( competitive hybridization)、ＤＮＡチップ、核酸検出用（遺伝子検出用）デバイス，ＳＮＰ（スニップ：一塩基置換多型）、複合微生物系等の用語は、現在、分子生物学、遺伝子工学、微生物工学等で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
本発明の第一の特徴は、蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる標的核酸の測定方法において、当該核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに生ずる、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定することにある。
【００２０】
本発明において標的核酸の測定とは、定量若しくは定量的検出、または単なる検出のことを云う。
蛍光色素で標識された核酸プローブを用いる核酸測定方法とは、ハイブリダイゼーション方法(hybridization assays)、ＨＩＳＨ方法(fluorescent in  situ hybridization  assays)、ＰＣＲ方法(polymerase  chain assays）、ＬＣＲ方法(ligase chain reaction)、SD方法(strand displacement assays)、 競合的ハイブリダイゼーション方法(competitive hybridization)などのことをいう。これらの方法では、蛍光色素で標識された核酸プローブを加えた後、標的核酸にハイブリダイゼーションしなかった未反応の当該核酸プローブの蛍光色素を測定系から洗浄等の方法で除去し、標的核酸にハイブリダイゼーションした当該核酸プローブに標識された蛍光色素を当該プローブから直接的に、又は当該プローブに間接的な手段を施して（例えば、酵素を作用させたりして）、発光させて、その発光量を測定する方法である。本発明はこのような複雑な操作をしないで目的核酸を測定することに特徴がある。
【００２１】
本発明において標的核酸とは、定量若しくは定量的検出、または単なる検出を目的とする核酸のことを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数の微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における定量若しくは定量的検出、または単なる検出を目的とする特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。上記の核酸の具体例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、２−Ｏ−メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ、デオキシリボオリゴヌクレオチド（deoxyribo-oligonucleotides)、リボキシオリゴヌクレオチド(riboxy-origonucleotides）等を挙げることができる。
【００２２】
本発明において蛍光色素は、一般に核酸プローブに標識して、核酸の測定・検出に用いられるものが便利に使用できるが、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたときに、プローブに標識した当該蛍光色素が、その発光を減少させるものが好適に用いられる。例えば、フルオレセイン（fluorescein）又はその誘導体類｛例えば、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）（FITC）若しくはその誘導体等、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、EDANS（5-(2'-aminoethyl)amino-1-naphthalene sulfonic acid）｝、ローダミン（rhodamine）6G（R6G）又はその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（teramethylrhodamine）（TMR）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate)(TMRITC)、ｘ−ローダミン（x-rhodamine)、テキサスレッド(Texas red)、ボデピー(BODIPY)FL(商標名;モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes)社製、米国）、ボデピー(BODIPY)FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー(BODIPY)5-FAM（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）TMR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、又はその誘導体（例えば、ボデピー（BODIPY）TR（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）R6G（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY）564（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、デピー（BODIPY）581（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を挙げることができる。これらの中でも、FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、ボデピー（BODIPY） FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY） FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）等を好適なものとして、また、FITC、TMR、6-jeo、ボデピー（BODIPY） FL/C3（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）、ボデピー（BODIPY） FL/C6（商標名；モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社製、米国）をより好適なものとして挙げることができる。
【００２３】
標的核酸にハイブリダイゼーションさせる核酸プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよいし、オリゴリボヌクレオチドで構成されていてもよい。また、それらの双方が介在しているキメリックオリゴヌクレオチド（chemiric oligonucleodite）でもよい。また、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド(2'-o-Methyl oligoribonucleotideｓ）（oligoribonucleotideの５’末端のヌククレオサイド(nucleoside）部がシチジンで、そのシチジンの２’位のＯＨ基がメチル（methyl)基で修飾されているもの）を使用してもよい。又はＲＮＡとの親和性を高めるために、当該２’−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドをオリゴデオキシヌクレオチド（oligodeoxynuclueotide）の中に介在させていてもよい。
【００２４】
尚、２’−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドのような修飾されたＲＮＡをオリゴデオキシヌクレオチドの中に介在させた核酸プローブは主にＲＮＡの測定に用いるものである。当該プローブを使用してＲＮＡを測定する場合、試料であるＲＮＡ溶液を、当該プローブとハイブリダイゼーションさせる前に、８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃、最適には９３〜９７℃で、１〜１５分間、好ましくは２〜１０分間、最適には３〜７分間加熱処理してＲＮＡの高次構造を破壊することが好適である。また、当該核酸プローブの塩基鎖が３５塩基以下の場合、配列領域へのハイブリダイゼーション効率を上げるためにヘルパープローブ、例えば、(5')AGGCCGGCCCTTGACTTTCC T(3')なる塩基配列のオリヌクレオチドを反応溶液に添加することが好適である。この場合、ヘルパープローブはオリゴデオキシヌクレオチド体でも、また、２−ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド体でもよい。ただし、３５塩基鎖を超える核酸プローブを使用する場合は、標的のＲＮＡを熱変性するだけでよい。このような本発明の核酸プローブをＲＮＡにハイブリダイゼーションさせると、反応液中のＲＮＡの量に応じて蛍光強度が減少し、最終ＲＮＡ濃度が約１５０ｐＭまでＲＮＡを測定できる。
【００２５】
核酸プローブを用いる従来のハイブリダイゼーション方法によるＲＮＡの測定において、核酸プローブとしてオリゴデオキシヌクレオチド体又はオリゴリボヌクレオチド体が用いられてきた。ＲＮＡはそれ自体が強固な高次構造をとるため、プローブと標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーション効率が悪く、定量性に乏しかった。そのために、ＲＮＡを変性させた後、メンブランに固定してからハイブリダイゼーション反応を行うという繁雑性を従来方法は有していた。これに対して、前記の本発明方法は、ＲＮＡの特定構造部と高い親和性を有するリボース部修飾核酸プローブを用いているので、従来方法に較べて高い温度でハイブリダイゼーション反応を行うことができる。それで、ＲＮＡの高次構造の前記悪影響は、前処理としての加熱変性処理、ヘルパープローブの併用だけで克服可能である。これにより本発明方法においてハイブリダイゼーション効率は実質的に１００％になり、定量性が向上する。また、従来方法に較べて格段に簡便になる。
【００２６】
本発明のプローブの塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０である。５０を超える場合は、ＨＩＳＨ方法に用いたとき細胞膜の透過性が悪くなり、本発明の適用範囲を狭めることになる。５未満の場合は、非特異的ハイブリダイゼーションが惹起し易くなり、測定誤差が大きくなる。
【００２７】
そのプローブの塩基配列は、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションするものであればよく、特に限定されない。好ましくは、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションしたとき、
（１）当該プローブにハイブリダイゼーションした標的核酸の末端塩基部から１ないし３塩基離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）がすくなとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されいる塩基配列、
（２）プローブの末端部分においてプローブ−核酸ハイブリッド複合体の塩基対がＧ（グアニン）とＣ（シトシン）のペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されている塩基配列、が好ましい。
【００２８】
本発明における核酸プローブのオリゴヌクレオチドは、通常の一般的オリゴヌクレオチドの製造方法で製造できる。例えば、化学合成法、プラスミドベクター、ファージベクター等を使用する微生物法等で製造できる（Tetrahedron letters、 22巻、 1859〜1862頁、 1981年; Nucleic acids Research、 14巻、6227〜6245頁、1986年）。尚、現在、市販されている核酸合成機を使用するのが好適である（例えば、ABI394(Perkin Elmer社製、USA)）。
【００２９】
オリゴヌクレオチドに蛍光色素を標識するには、従来公知の標識法のうちの所望のものを利用することができる（Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143〜 1147頁、 1997年; Nucleic acids Research、 24巻、 4532〜4535頁、 1996年）。例えば、５´末端に蛍光色素分子を結合させる場合は、先ず、常法に従って５´末端のリン酸基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。これらの導入体は市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。この場合、ｎは３〜８、好ましくは６である。このスペーサーにＳＨ基反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。
【００３０】
また、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光色素を結合させることもできる。この場合は、リボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基にスペーサーとして、例えば、-(CH2)n-NH2を導入する。これらの導入体も前記と同様にして市販されているので市販品を購入してもよい（メドランド・サーテイファイフド・レージント・カンパニー（Midland Certified Reagent Company））。また、リン酸基を導入して、リン酸基のＯＨ基にスペサーとして、例えば、-(CH2)n-SHを導入する。これらの場合、ｎは３〜８、好ましくは４〜７である。このスペーサーにアミノ基、ＳＨ基に反応性を有する蛍光色素又はその誘導体を結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。このようにして合成された蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、逆相等のクロマトグラフィー等で精製して本発明で使用する核酸プローブとすることができる。このアミノ基を導入する場合、キット試薬（例えば、Uni-link  aminomodifier（CLONTECH社製、米国）、フルオ・リポターキット（FluoReporter Kits) F-6082、 F-6083、 F-6084、 F-10220（いずれもモレクキュラー・プローベ（Molecular Probes）社製、米国））を用いるのが便利である。そして、常法に従って当該オリゴリボヌクレオチドに蛍光色素分子を結合させることができる。また、プローブ核酸の鎖内に蛍光色素分子を導入することも可能である（ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, 32-38頁（1998年））。
以上のようにして本発明の核酸プローブが調製できるが、好ましいプローブの形態は、３’又は５’末端が蛍光色素が標識されたものであり、その標識されている末端の塩基がＧ又はＣであるものである。５’末端が標識され、３’末端が標識されていない場合、３’末端のリボース又はデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基をリン酸基等、また３’末端のリボースの２’位ＣのＯＨ基をリン酸基等で修飾してもよく何ら制限されない。
【００３１】
本発明の核酸プローブは、単に核酸測定だけでなく、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法に好適に利用できる。特に下記に述べるＤＮＡチップと併用することによりより便利な方法を提供する。すなわち、本発明の核酸プローブと標的核酸若しくは遺伝子とのハイブリダイゼーションにおいて、ＧＣペアーを形成するかどうかにより、蛍光強度が変化する。それで、本発明の核酸プローブを標的核酸若しくは遺伝子にハイブリダイゼーションさせ、発光強度を測定することにより、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定することができる。具体的方法は、実施例に記した。この場合、標的核酸若しくは遺伝子は各種の核酸若しくは遺伝子の増幅方法のうちの一つの方法により増幅された増幅物でもよし、抽出されたものでもよい。また標的核酸はその種類を問わない。本発明を適用しうる標的核酸の例としてＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、人工修飾核酸などを挙げることができる。ただ、鎖中または末端にグアニン塩基が存在しておればよい。鎖中または末端にグアニン塩基が存在しないと蛍光強度が減少しない。よって、本発明方法により、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、  Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの変異、または置換、すなわち、１塩基多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）などの多型（polymorphism analysis）等を解析若しくは測定することができる。なお、現在、多型分析は、マキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert)法、ジデオキシ（dideoxy）法を用いて核酸若しくは遺伝子の塩基配列を決定することにより行われているのが現状である。
【００３２】
それで、本発明の核酸プローブを標的核酸または／および遺伝子の多型（polymorphism）及び変異（mutation）を解析若しくは測定する測定キットに含有させることにより、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する測定キットとして好適に使用することができる。
【００３３】
本発明の標的遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程を設けると、処理されたデータは信頼性の高いものになる。
それで本発明は、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation)を解析若しくは測定する方法のためのデータ解析方法を提供する。
【００３４】
また、本発明の特徴は、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装置において、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理手段を有することを特徴とする標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する測定装置である。
【００３５】
また、本発明の特徴は、標的核酸若しくは遺伝子の多型（polymorphism）または／および変異（mutation）を解析若しくは測定する方法により得られるデータを解析する場合に、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のものがハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【００３６】
本発明のプローブは固体（支持層）表面、例えばスライドガラスの表面に固定されていてもよい。この場合、蛍光色素で標識されていない端が固定されているのが好ましい。この形式は現在ＤＮＡチップと言われる。遺伝子発現（gene  expression）のモニタリング、塩基配列（base  sequence）の決定，変異解析（mutation analysis），１塩基多型（single nucleotide polymorphism (SNP)）などの多型解析（polymorphism analysis）等に使用できる。勿論、核酸測定用デバイス（チップ）として使用することができる。
【００３７】
本発明のプローブを例えばスライドガラスの表面に結合させるには、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミンなどのポリ陽イオンをコートしたスライドガラス、アルデヒド基を導入したスライドガラス、アミノ基を導入したスライドガラスを先ず用意する。そして、i)ポリ陽イオンをコートしたスライドガラスには、プローブのリン酸基を反応させる、ii)アルデヒド基を導入したスライドガラスには、アミノ基を導入したプローブを反応させる、iii)アミノ基を導入したスライドガラスには、ＰＤＣ（pyridinium dichromate）導入、アミノ基又はアルデヒド基導入したプローブを反応させる、などにより達成できる(Fodor,P.A.,et al.,Science,251,767-773(1991); Schena,M.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,10614-10619(1996);McGal,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,93,13555-13560(1996);Blanchad,A.P.,et al.,Biosens.Bioelectron.,11,687-690(1996))。
【００３８】
核酸プローブを固体表面にアレー状に配列、結合させたデバイスは核酸測定用がより便利になる。
この場合、塩基配列の異なる多くの本発明のプローブを、個別に同一固体表面上に結合していデバイスをつくることにより、同時に多種遺伝子を検出定量できる。
このデバイスにおいては、プローブ毎に、前記固体のプローブを結合したと反対側の面に少なくとも一つの温度センサーとヒーターが設け、そのプローブを結合した前記固体の領域が最適温度条件になるように温度調節され得るように設計されているのが好適である。
【００３９】
このデバイスにおいては、本発明のプローブ以外のプローブ、例えば、一つの分子内に二つの異なった蛍光色素を有し、標的核酸にハイブリダイゼーションしていないときは、二つの蛍光色素の相互作用により、消光若しくは発光しているが、標的核酸にハイブリダイゼーションすると蛍光若しくは消光するように設計された構造をもつ核酸プローブ、即ち、前記の分子ビーコン(Tyagi et al., Nature Biotech.,14:303-308,1996)等を結合したものも好適に使用できる。それで、このようなデバイスも本発明の技術的範囲内に含まれる。
【００４０】
本発明のデバイスを用いる測定方法の基本的操作は、核酸プローブを結合した固体表面上にｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ等の標的核酸を含む溶液をのせ、ハイブリダイゼーションさせるだけである。これにより、標的核酸量に応じて蛍光量の変化がおこり、その蛍光変化量から標的核酸の検出定量が可能となる。また、一つの固体表面上に塩基配列の異なる核酸プローブを多数種結合させることにより、一度に多くの核酸を検出定量することができる。それで、ＤＮＡチップと全く同じ用途で使用できるので新規のＤＮＡチップである。最適の反応条件では標的核酸以外の核酸は蛍光の発光量を変化させないために、未反応な核酸を洗浄する操作は必要がない。更に、微小ヒーターにて核酸プローブの種類毎に温度コントロールすることにより、当該プローブ毎に最適反応条件にコントロールできるために正確な定量が可能となる。また、微小ヒーターにて温度を連続的に変化させ、その間、蛍光量を測定することにより、核酸プローブと標的核酸との解離曲線を解析することができる。その解離曲線の違いからハイブリダイゼーションした核酸の性質の判定や、ＳＮＰの検出ができる。
【００４１】
従来の標的核酸測定用デバイスは、蛍光色素で修飾されていない核酸プローブを固体表面に結合（固定：fix）し、それに蛍光色素で標識した標的核酸をハイブリダイゼーションさせた後、ハイブリダイゼーションしていない標的核酸を洗い流して、残存している蛍光色素の蛍光強度を測定していた。
蛍光色素で標的核酸を標識するには、例えば、特定ｍＲＮＡを標的とした場合、次のstepsを取る：（１）細胞から抽出されたｍＲＮＡ全部を抽出する。（２）それから、逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いて、蛍光色素で修飾されヌクレオサイドをとり込ませながらｃＤＮＡを合成する。本発明ではこのような操作は必要がない。
【００４２】
当該デバイスには各種のプローブが多数スポットしてあるが、その各々のプローブにハイブリダイゼーションする核酸の最適ハイブリダイゼーション条件、例えば、温度等は各々異なる。よって本来であれば、プローブ毎（スポット毎）に、ハイブリダイゼーション反応、洗浄操作を最適な条件で行う必要がある。しかし、それは物理的に不可能であるので、すべてのプローブ毎に同一の温度でハイブリダイゼーションを行い、また、洗浄も同一温度で同一洗浄液で行われている。それで、ハイブリダイゼーションが期待されている核酸がハイブリダイゼーションしなかったり、ハイブリダイゼーションしてもハイブリダイゼーションが強固でないので容易に洗い流されてしまう等の欠点を有していた。そのような原因で核酸の定量性が低いものであった。本発明ではこの洗浄操作が必要がないのでこのような欠点を有しない。また、スポットの底に微小ヒータを設け、ハイブリダイゼーション温度をコントロールすることで、プローブ毎に最適温度でハイブリダイゼーション反応を行わせることができる。それで、本発明は定量性が格段に向上したものである。
【００４３】
本発明においては、前記した核酸プローブ又はデバイスを使用することで、標的核酸を短時間で、簡便かつ特異的に測定することができる。
以下に測定法を述べる。
本発明の測定方法において、先ず、測定系に前記の核酸プローブを添加し、標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。その方法は、通常の既知方法で行なうことができる（Analytical Biochemistry、 183巻、 231〜244頁、 1989年; Nature Biotechnology、 14巻、 303〜308頁、 1996年; Applied and Environmental Microbiology、 63巻、 1143-1147頁、 1997年）。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、塩濃度が０〜２モル濃度、好ましくは０．１〜１．０モル濃度、ｐＨは６〜８、好ましくは６．５〜７．５である。
【００４４】
反応温度は、前記核酸プローブが標的核酸の特異的部位にハイブリダイゼーションして得られるハイブリド複合物のＴｍ値±１０℃の範囲内であるのが好ましい。このようにすることにより非特異的なハイブリダイゼーションを防止することができる。Ｔｍ−１０℃未満のときは、非特異的ハイブリダイゼーション起こり、Ｔｍ＋１０℃を越えるときは、ハイブリダイゼーションが起こらない。尚、Ｔｍ値は本発明で用いる核酸プローブを設計するのに必要な実験と同様にして求めることができる。すなわち、当該核酸プローブとハイブリダイゼーションする相補塩基配列のオリゴヌクレオチドを前記の核酸合成機等で化学合成し、当該核酸プローブとのハイブリダイゼーション物のＴｍ値を通常の方法で測定する。
【００４５】
また、その反応時間は１秒間〜１８０分間、好ましくは５秒間〜９０分間である。１秒間未満のときは、ハイブリダイゼーションにおいて未反応の本発明の核酸プローブが多くなる。また、反応時間を余り長くしても特に意味がない。なお、反応時間は核酸種、すなわち、核酸の長さ、あるいは塩基配列によって大きく影響を受ける。
前記のようにして、本発明において核酸プローブを標的核酸にハイブリダイゼーションさせる。そして、ハイブリダイゼーションの前後で、蛍光色素の発光量を蛍光光度計で測定し、発光の減少量を計算する。その減少量の大きさは標的核酸量と比例するので、標的核酸の量を求めることができる。
【００４６】
反応液中の標的核酸の濃度：０．１〜１０．０ｎＭであるのが好ましい。反応液中のプローブの濃度：１．０〜２５．０ｎＭであるが好ましい。検量線を作成する場合は、標的核酸に対して、プローブを１．０〜２．５の比率で用いるのが望ましい。
【００４７】
実際、試料中の未知濃度の標的核酸を測定する場合、上記の条件で先ず、検量線を作成する。そして、複数の濃度のプローブを添加して、蛍光強度値の減少を測定する。そして、測定された蛍光強度の減少値を最大にするプローブ濃度を好ましいプローブ濃度とする。好ましい濃度のプローブで測定された蛍光強度の減少値もって、検量線から標的核酸の定量値を求めることになる。
【００４８】
本発明の核酸測定法の原理は、前記のごとくであるが、各種の核酸測定方法、例えば、ＦＩＳＨ方法、ＰＣＲ方法、ＬＣＲ方法、ＳＤ方法, 競合的ハイブリダイゼーション方法、ＴＡＳ方法、 などに適用できる。
【００４９】
以下にその例を記す。
ａ）ＦＩＳＨ方法に適用した場合
即ち、本発明は色々の種類の微生物若しくは他の動物や植物が混在していて、相互に単離できない微生物系（複合微生物系、共生微生物系）の細胞内若しくは細胞のホモジネート等の核酸測定に好適に適用できる。ここでいう微生物とは一般的にいう微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他、マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。そして、特定配列を有する核酸とは、これらの微生物系において、例えば、どのように活躍しているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩基配列をもつ核酸のことである。例えば、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの特定配列である。
【００５０】
本発明において核酸プローブを複合微生物系又は共生微生物系に添加し、特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの量を測定することにより、当該系における特定菌株の存在量を測定することできる。尚、複合微生物系又は共生微生物系のホモジネートに前記核酸プローブを添加して、ハイブリダイゼーション前後における蛍光色素の発光の減少量を測定して特定菌株の存在量を測定する方法も、本発明の技術的範囲内とする。
【００５１】
前記の測定方法は、例えば、以下の如くである。即ち、核酸プローブを添加する前に、複合微生物系又は共生微生物系の温度、塩濃度、ｐＨを前記の条件に調整する。複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株は、細胞数として１０7〜１０12個／ｍｌ、好ましくは１０9〜１０10個／ｍｌに調整することが好適である。それは希釈、又は遠心分離等による濃縮等で行うことができる。細胞数が１０7個／ｍｌ未満のときは、蛍光強度が弱く、測定誤差が大きくなる。１０12個／ｍｌを超えるときは、複合微生物系又は共生微生物系の蛍光強度が強すぎるため、特定微生物の存在量を定量的に測定することができなくなる。
【００５２】
添加する核酸プローブの濃度は、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の細胞数に依存する。細胞数１×１０8／ｍｌに対して０．１〜１０．０ｎＭ濃度、好ましくは０．５〜５ｎＭ濃度、より好ましくは１．０ｎＭ濃度である。０．１ｎＭ未満のときは、特定微生物の存在量を正確に反映したデータにならない。しかし、最適な核酸プローブの量は、細胞内の標的核酸量に依存するために一概にはいえない。
【００５３】
次に本発明において前記核酸プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はその遺伝子ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせるときの反応温度は、前記した条件と同様である。また、その反応の時間も前記の条件と同様である。
前記のような条件で核酸プローブを特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれの遺伝子ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーション前後の複合微生物系又は共生微生物系の蛍光色素の発光の減少量を測定する。
【００５４】
前記のようにして測定された蛍光色素の発光の減少量は、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の存在量と比例する。それは５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡの量と特定菌株の存在量とが比例するからである。
【００５５】
尚、本発明において、複合微生物系又は共生微生物系における微生物以外の成分は、本発明の核酸プローブと特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを阻害しない限り、また、核酸プローブの蛍光色素の発光を阻害をしない限り、特に限定されない。例えば、KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4、Na2HPO4等のリン酸塩、硫安、硝安、尿素等の無機窒素類、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムイオン等の金属イオンの各種塩類、マンガン、亜鉛、鉄、コバルトイオン等の微量金属イオンの硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩等の各種塩類、更にビタミン類等が適当に含まれていてもよい。もし、上記の阻害が観察される場合は、遠心分離等の操作で複数の微生物が混在する菌体系から菌体を分離し、再び緩衝液系等に懸濁すればよい。
【００５６】
上記の緩衝液としては、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス・塩酸緩衝液、トリス・グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、グット緩衝液等の各種緩衝液をも用いることができる。緩衝液の濃度は、ハイブリダイゼーション、ＦＲＥＴ現象、蛍光色素の発光を阻害しない濃度である。その濃度は緩衝液の種類に依存する。緩衝液のｐＨは４〜１２、好ましくは５〜９である。
【００５７】
ｂ）ＰＣＲ methodsに適用する場合
ＰＣＲ methodsであればどのような方法でも適用できるのであるが、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法に適用する場合を以下に記す。
即ち、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法において、本発明の特定の核酸プローブを用いてＰＣＲを行い、反応前後の蛍光色素の発光の減少をリアルタイムで測定するものである。
本発明のＰＣＲとは各種方法のＰＣＲを意味するものである。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−primed ＰＣＲ、Stretch ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、Ａｌｕ配列を利用したＰＣＲ、多重ＰＣＲ、混合プライマーを用いたＰＣＲ、ＰＮＡを用いたＰＣＲ法等をも含む。また、定量的とは、本来の定量測定の他に、検出程度の定量測定をも意味するものとする。
【００５８】
前記のとおり、標的核酸とは、存在量を定量若しくは定量的検出するまたは単に検出する核酸のことを云う。精製の有無を問わない。また、濃度の大小も問わない。各種の核酸が混在していてもよい。例えば、複合微生物系（複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）又は共生微生物系（複数の動植物及び／又は複数微生物のＲＮＡ若しくは遺伝子ＤＮＡの混在系）における増幅目的の特定核酸である。尚、標的核酸の精製が必要な場合は従来公知の方法で行うことができる。例えば、市販されている精製キット等を使用して行うことができる。
【００５９】
従来公知の定量的ＰＣＲ方法はｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、並びに蛍光色素で標識した核酸プローブ若しくはインターカレーターを用いてＭｇイオンの存在下に、温度を低温、高温を繰り返しつつ標的核酸を増幅し、増幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニタリングするものである（実験医学、１５巻、７号、４６〜５１ページ、１９９７年、羊土社）。
【００６０】
本発明の定量的ＰＣＲ方法は、本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を増幅させ、増幅過程において、蛍光色素の発光の減少量を測定することを特徴とするものである。本発明の定量的ＰＣＲにおいて、好ましい本発明のプローブとしては、その塩基数は５〜５０であり、好ましくは１０〜２５、特に好ましくは１５〜２０で、ＰＣＲサイクル中に標的核酸の増幅産物とハイブリダイゼーションするものであれば、どのようなものでもよい。また、フォワード（forward）型、リバース（reverse）型のどちらに設計してもよい。
【００６１】
例えば、以下のものを挙げることができる。
（１）５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、標的核酸に当該末端部においてハイブリダイゼーションしたとき、当該プローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションした５’末端の塩基部分から１〜３塩基５’側に離れて、標的核酸の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、塩基配列が設計されている。
（２）前記（１）のプローブの内、３’末端が蛍光色素で標識されているプローブ。
【００６２】
（３）前記（１）のプローブの内、３’末端、例えば、３’末端のリボース若しくはデオキシリボースの３’位ＣのＯＨ基がリン酸基等で修飾されているもの、または、３’末端のリボースの２’位ＣのＯＨ基がリン酸基等で修飾されているもの。
（４）３’末端部、好ましくは３’末端が、本発明の蛍光色素で標識され、３’末端の塩基がＧ又はＣであるもの、または３’末端のリボースの２’位のＯＨ基がリン酸基等で修飾されいるもの。
（５）前記（１）のプローブのうち、５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の蛍光色素で標識されているもの。
（６）５’末端部、好ましくは５’末端が、本発明の実施に有用な蛍光色素で標識され、５’末端の塩基がＧ又はＣであるもの。
【００６３】
前記（４）、（６）の場合、標的核酸の塩基配列から、どうしても５’末端がＧ又はＣに設計できない場合は、標的核酸の塩基配列から設計したプライマーであるオリゴヌクレオチドの５’末端に、５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加しても、本発明の目的は好適に達成できる。よって、本発明において、３’、又は５’末端の塩基がＧ又はＣになるように設計した核酸プローブとは、標的核酸の塩基配列から設計したプローブの他に、当該のプローブの３’又は５’末端に５’−グアニル酸又は５’−シチジル酸を付加してなるプローブを含むものと定義する。
【００６４】
特に上記の（１）、（２）、（３）又は（４）のプローブはプライマーとして利用されないように設計したものである。ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ方法において使用する（蛍光色素で標識した）二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを用いてＰＣＲを行うものである。ＰＣＲの反応系に当該プローブを添加し、ＰＣＲを行う。核酸伸長反応時、標的核酸若しくは増幅標的核酸にハイブリダイズしていた当該プローブがポリメラーゼにより分解され、ハイブリダイゼーション物から分解除去される。このときの反応系または核酸変性反応が完了した反応系の蛍光強度値を測定する。また、標的核酸若しくは増幅した増幅標的核酸が当該プローブとハイブリダイズしている反応系（アニーリング反応、若しくはポリメラーゼにより当該プローブがハイブリダイゼーション物から除かれるまでの核酸伸長反応時の反応系）の蛍光強度値を測定する。そして、前者からの蛍光強度値の減少率を算出することにより増幅された核酸を測定する。当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸から、核酸変性反応により完全に解離するか、または核酸伸長時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸とのハイブリダイゼーション物から分解除去されたときは蛍光強度値は大きい。しかし、当該プローブが標的核酸若しくは増幅標的核酸に十分にハイブリダイズしているアニーリング反応が完了している反応系若しくは核酸伸長反応時にポリメラーゼにより当該プローブと標的核酸若しくは増幅標的核酸とのハイブリダイゼーション物から分解除去されるまでの反応系の蛍光強度値は前者より減少している。蛍光強度値の減少は増幅された核酸量に比例する。
この場合、当該プローブが標的核酸とハイブリダイゼーションしたときのそのハイブリダイゼーション物のＴｍが、プライマーのハイブリダイゼーション物のＴｍ値の±１５℃、好ましくは±５℃の範囲になるように、（２）、（３）、（４）のプローブの塩基配列が設計されることが望ましい。プローブのＴｍ値が、プライマーのＴｍ値−５℃、特に−１５℃未満であると、プローブがハイブリダイゼーションしないために、蛍光色素の発光の減少は起こらない。反対にプライマーのＴｍ値＋５℃、特に＋１５℃を超えると、プローブが目的としない標的核酸ともハイブリダイゼーションするので、プローブの特異性が失われる。
【００６５】
上記の（５）、（６）のプローブは、プライマーとしてＰＣＲの反応系に添加するものである。蛍光色素で標識されたプライマーを用いるＰＣＲ方法は本発明以外未だ知られていない。ＰＣＲの反応が進むに従い、増幅された核酸は本発明の蛍光色素で標識される。それで、核酸変性反応が完了している反応系の蛍光強度値は大きいが、アニーリング反応完了しているか若しくは核酸伸長反応時の反応系においては、反応系の蛍光強度は前者の蛍光強度より減少する。
【００６６】
ＰＣＲの反応は通常のＰＣＲ方法と同様の反応条件で行うことができる。それで、Ｍｇイオン濃度が低濃度（１〜２ｍＭ）である反応系で標的核酸の増幅を行うことができる。勿論、従来公知の定量的ＰＣＲにおいて使用されている高濃度（２〜４ｍＭ）のＭｇイオン存在下の反応系でも本発明は実施できる。
【００６７】
尚、本発明のＰＣＲ方法において、本発明のＰＣＲを行い、その増幅産物について核酸の融解曲線を分析を行ってＴｍ値を求めるできる。この方法は新規な核酸の融解曲線の分析方法である。本方法において本発明のＰＣＲ方法に用いた核酸プローブ又はプライマーとして用いた核酸プローブが好適に利用できる。
この場合、本発明のプローブの塩基配列を、ＳＮＰ（スニップ；一塩基置換多型）を含む領域と相補的な配列にすることで、ＰＣＲ終了後、その核酸の本発明のプローブから解離曲線を解析することにより、その解離曲線の違いからＳＮＰの検出ができる。本発明のプローブの配列としては、ＳＮＰを含む配列と相補的な塩基配列を使用すれば、プローブ配列とＳＮＰを含む配列との解離曲線より得られるＴｍ値は、ＳＮＰを含まない配列との解離曲線から得られるＴｍ値より高くなる。
【００６８】
本発明の第二の特徴は、前記のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法ので得られるデータを解析する方法の発明である。
リアルタイム定量的ＰＣＲ方法は、現在、ＰＣＲを行わせる反応装置、蛍光色素の発光を検出装置、ユーザーインターフェース、即ち、データー解析方法の各手順をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（別称：Sequence Detection Software  System）、及びそれらを制御し、データー解析するコンピュータから構成される装置で、リアルタイムで測定されている。それで、本発明の測定もこのような装置で行われる。
【００６９】
以下に、先ず、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置から説明する。本発明において用いる装置は、ＰＣＲをリアルタイムでモニタリングできる装置であればどのような装置でもよいが、例えば、ABI PRISMTM 7700 塩基配列検出システム（Sequence Detection System SDS 7700)(パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステム社(Perkin Elmer Applied Biosytems社、 USA))、ライトサイクラーTM システム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ドイツ）等を特に好適なものとして挙げることができる。
【００７０】
尚、前記の反応装置は、標的核酸の熱変性反応、アニーリング反応、核酸の伸長反応を繰り返し行う装置（例えば、温度を９５℃、６０℃、７２℃に繰り返し行うことができる。）である。また、検出システムは、蛍光励起用アルゴンレーザー、スペクトログラフ並びにＣＣＤカメラからなっている。更に、データー解析方法の各手段をプログラム化して、それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体は、コンピュータにインストールされており、コンピュータを介して上記のシステムを制御し、検出システムから出力されたデーターを解析処理するプログラムを記録したものである。
【００７１】
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析用プログラムは、サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、測定された蛍光強度を、サイクルの関数として、ＰＣＲのamplifcation plotをコンピュータのデスプレー上に表示する過程、蛍光強度が検出され始めるＰＣＲサイクル数（threshold cycle number:Ct）を算出する過程、Ｃｔ値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作成する過程、前記各過程のデーター、プロット値を印字する過程、からなっている。ＰＣＲが指数的に進行している場合、ＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数のＬｏｇ値と、Ｃｔとの間には直線関係が成り立つ。従って標的核酸の既知量のコピー数を用いて検量線を作成し、未知コピー数の標的核酸を含有するサンプルのＣｔを検出することにより、標的核酸のＰＣＲ開始時のコピー数を計算できる。
【００７２】
本発明のＰＣＲ関連発明は、前記のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法である。以下に各特徴について記す。
第一の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する方法において、各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、各サイクルにおける前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値により補正する演算処理過程、即ち、補正演算処理過程である。
【００７３】
「増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系」とは、具体的に例示すると、ＰＣＲの各サイクルにおける４０〜８５℃、好ましくは５０〜８０℃の反応温度を有する核酸伸長反応あるいはアニーリングのときの反応系を挙げることができる。具体的温度は増幅した核酸の長さに依存する。
また、「前記の結合したもの、あるいは前記のハイブリダイズしたものが解離したときの反応系」とは、ＰＣＲの各サイクルにおける核酸の熱変性の反応系、具体的には、例えば、反応温度９０〜１００℃、好ましくは９４〜９６℃のときのものである。
【００７４】
補正演算処理過程の補正演算処理としては本発明の目的に合致するものであればどのようなものでもよいのであるが、具体的には、次の〔数式１〕あるいは〔数式２〕による処理過程を含むものを例示することができる。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
ｆn＝ｆden,n／ｆhyb,n          〔数式２〕
〔式中、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕により算出されたｎサイクルにおける補正演算処理値、
ｆhyb,n：ｎサイクルにおける、増幅した核酸が蛍光色素と結合したとき、あるいは増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プローブとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値、
ｆden,n：ｎサイクルにおける、前記の結合したもの、あるいはハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値〕。
尚、本過程においては、本過程で得られた補正演算処理値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むものである。
【００７５】
第二の特徴は、各サイクルにおける〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値を次の〔数式３〕あるいは〔数式４〕に代入し、各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、それらを比較するデータ解析方法である。
【００７６】
Ｆn＝ｆn／ｆa          〔数式３〕
Ｆn＝ｆa／ｆn          〔数式４〕
〔式中、
Ｆn：ｎサイクルにおける、〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
ｆn：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値
ｆa：〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値で、ｆnの変化が観察される以前の任意のサイクル数のものであるが、通常は、例えば、１０〜４０サイクルのもの、好適には１５〜３０サイクルのもの、より好適には２０〜３０サイクルのものが採用される。〕。
尚、本過程においては、本過程で得られた算出値、比較値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むものであるが、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値については、それらの過程は含むものであっても、含まないものであってもよい。
【００７７】
第三の特徴は、
３１）〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率のデーターを用いて、〔数式５〕、〔数式６〕あるいは〔数式７〕による演算処理する過程、
ｌｏｇb（Ｆn）、ｌｎ（Ｆn）          〔数式５〕
ｌｏｇb｛（１−Ｆn）×Ａ｝、ｌｎ｛（１−Ｆn）×ｂ｝    〔数式６〕
ｌｏｇb｛（Ｆn−１）×Ａ｝、ｌｎ｛（Ｆn−１）×Ａ｝    〔数式７〕
【００７８】
〔式中、
Ａ、ｂ：任意の数値、好ましくは整数値、より好ましくは自然数である。そして、Ａ＝１００、ｂ＝１０のときは、｛（Ｆn−１）×Ａ｝は百分率（％）を表す。
Ｆn：〔数式３〕あるいは〔数式４〕により算出されたｎサイクルにおける蛍光変化割合あるいは蛍光変化率〕、
３２）前記３１）の演算処理値が一定値に達したサイクル数を求める演算処理過程、
３３）既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
３４）未知試料におけるＰＣＲ開始時の標的核酸のコピー数を求める演算処理過程、
を有するデータ解析方法である。そして、３１）→３２）→３３）→３４）の順からなる過程が好適である。
【００７９】
前記３１）〜３３）の各過程においては、各過程で得られた演算処理値若しくは当該値を各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字する過程を含むものであってもよい。前記３４）の過程の演算処理値は、前記と同様であるが、少なくとも印字される必要があるので、その過程を含むものである。
尚、〔数式１〕あるいは〔数式２〕による補正演算処理値、〔数式３〕あるいは〔数式４〕による算出処理値は、各サイクル数に対してグラフ上にプロットし、コンピュータのデスプレー上に表示及び／又は印字されても、されなくてもよいので、それらの過程は必要に応じて追加すればよい。
【００８０】
前記データ解析方法は、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法が蛍光色素の発光の減少量を測定するものである場合に特に有効である。その具体例として、前記の本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。
【００８１】
第４の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置において、前記本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法のためのデータ解析方法を実行する演算及び記憶手段を有するリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置である。
【００８２】
第５の特徴は、リアルタイム定量的ＰＣＲの解析装置を用いてＰＣＲを解析するデータ解析方法の各手段をプログラム化して、そのプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、前記本発明のデータ解析方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【００８３】
第６の特徴は、核酸測定方法において、前記本発明のデータ解析方法、測定及び／又は解析装置、記録媒体を利用する新規な核酸の測定方法である。
【００８４】
また、第７の特徴は、前記の本発明の核酸の融解曲線の分析方法、即ち、本発明のＰＣＲ方法を行って核酸のＴｍ値を求める方法によって得られるデータを解析する方法である。
即ち、本発明のＰＣＲ法により増幅された核酸について、低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げる過程（例えば、５０℃から９５℃まで）、この過程において、短い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃間隔）で蛍光強度を測定する過程、測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、この融解曲線を一次微分する過程、その値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）を微分値としてデスプレー上に表示する過程、その微分値から変曲点を求める過程からなる、解析方法である。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。本発明においては、各サイクルにおける核酸伸長反応時、好ましくはＰＣＲ反応終了時の蛍光強度値を熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理する過程を上記の過程に追加することにより、より好ましい結果が得られる。
【００８５】
本発明においては、前記の本発明の新規なＰＣＲ方法のデータ解析方法に、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法を追加してなる本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲの測定及び／又は解析装置も本発明の技術的範囲内である。
【００８６】
更に、本発明の特徴の一つは、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、また、前記本発明のＰＣＲ方法のデータ解析方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体において、本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手段をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを追加して記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
【００８７】
本発明の前記のデータ解析方法、装置、及び記録媒体は、医学、法医学、人類学、古代生物学、生物学、遺伝子工学、分子生物学、農学、植物育種学等の各種の分野で利用できる。また、複合微生物系、共生微生物系と云われ、色々の種類の微生物若しくは他の動物、植物が混在していて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。ここで云う微生物とは一般的に云う微生物のことで、特に限定されるものではない。例えば、真核微生物、原核微生物、その他マイコプラズマ、ウイルス、リッケチャ等を挙げることができる。
【００８８】
また、本発明の前記データ解析方法、装置及び記録媒体を用いて、複合微生物系又は共生微生物系における特定菌株の５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡ又はそれらの遺伝子ＤＮＡのコピー数を定量することにより、当該系における特定菌株の存在量を測定することができる。それは、５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ若しくは２３ＳｒＲＮＡの遺伝子ＤＮＡのコピー数は菌株よって一定であるからである。尚、本発明においては、複合微生物系又は共生微生物系のホモジネートを用いて、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲを行い、特定菌株の存在量を測定する方法も、本発明の技術的範囲内とする。
【実施例】
【００８９】
次に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
大腸菌（Escherichia coli）の１６ＳｒＲＮＡの核酸塩基配列にハイブリダイゼーションする、即ち、(3')CCGCTCACGCATC(5')の塩基配列を有する核酸プローブの調製を以下の通りに行った。
【００９０】
核酸プローブの調製：(3')CCGCTCACGCATC(5')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドの３’末端のデオキシリボースの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ2）7−ＮＨ2を結合したものを、メドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、 米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits）F-6082（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入のオリゴヌクレオチドに作用させて、本発明で使用するボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成した。
【００９１】
合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率で核酸プローブを得た。
【００９２】
尚、上記の逆相クトマトグラフィーの条件は次の通りである：
溶出ソルベントＡ：０．０５Ｎ  TEAA  ５％CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント(gradient)用）：０．０５Ｎ
TEAA  ４０％CH3CN
カラム：CAPCEL PAK C18；  ６×２５０ｍｍ
溶出速度：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
【００９３】
実施例２
殺菌したニュウトリエントブロス（ＮＢ）（Difco社製）液体培地５０ｍｌ（組成：ＮＢ、０．０８ｇ／１００ｍｌ）を含有する２００ｍｌ容の三角フラスコを用いて、大腸菌ＪＭ１０９株を３７℃で一晩振蘯培養した。次に、本培養液に９９．７％エタノールを当量添加した。このエタノール添加培養液２ｍｌを２．０ｍｌ容量のエッペンドルフ遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。３０ｍＭリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．２）１００μｌで菌体を一回洗浄した。菌体を１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の前記リン酸緩衝液１００μｌに懸濁した。当該懸濁液を氷冷中で４０分間超音波処理し（出力：３３ｗ、発振周波数：２０ｋＨｚ、発振法：０．５秒発振、０．５秒休止）、ホモジネートを作製した。
【００９４】
前記ホモジネートを遠心分離した後、上澄液を採取し蛍光光度計のセルに移した。それを３６℃に温調した。それに３６℃に予め加温した前記核酸プローブの溶液を最終濃度で５ｎＭとなるように添加した。３６℃に温調しながら９０分間大腸菌１６ＳｒＲＮＡと核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせた。そして蛍光光度計で蛍光色素の発光量を測定した。
【００９５】
ハイブリダイゼーション前の蛍光色素の発光量は、上記の上澄液の代りに、１３０ｍＭのＮａＣｌ含有の３０ｍＭのリン酸緩衝液（ソーダ塩）（ｐＨ：７．２）を用いて測定した値を採用した。核酸プローブの量と上澄液の量の比を変えて発光量を測定した（励起光５０３ｎｍ；測定蛍光色５１２ｎｍ）。その結果を図１に示した。図１から分かるように、上澄液の量比が増加することにより蛍光色素の発光が減少することが分かる。即ち、本発明においては、核酸プローブにハイブリダイゼーションする標的核酸量に比例して、蛍光色素の発光の減少量の大きさが大きくなることが分かる。
【００９６】
実施例３
核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の２３ＳｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする(5')CCCACATCGTTTTGTCTGGG(3')の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの３’位炭素のＯＨ基に、−（ＣＨ2)7−ＮＨ2を結合したものを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kit) F-6082 (ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーＦＬで標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２５％の収率でボデピーＦＬで標識した核酸プローブを得た。
【００９７】
実施例４
実施例２で得られた大腸菌ＪＭ１０９株の菌体に実施例２と同一の培地及び培養条件で調製したシュウドモナス・プウシモビルス  ４２１Ｙ株（Pseudomonas paucimobilis）（現在名：スフィンゴモナス・プウシモビルス）（FERM P-5122）の菌体をＯＤ６６０値で大腸菌ＪＭ１０９株と同濃度混合し、複合微生物系を調製した。得られた混合液（大腸菌ＪＭ１０９株の菌体濃度は実施例２と同一）について実施例２と同じ方法によりホモジネートを調製した。実施例３で調製した核酸プローブを用いて、励起光を５４３ｎｍ、また、測定蛍光色を５６９ｎｍにする以外は、実施例２と同様な実験を行った結果、実施例２と同様な結果を得た。
【００９８】
実施例５
蛍光消光現象における標的核酸の塩基選択性、即ち、本発明の塩基特異性を検討した。下記に示す標的合成デオキシリボオリゴヌクレオチド（３０mer）のpoly a〜jの１０種類をＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４（Perkin Elmer社製、米国)で調製した。
【００９９】
更に、上記の合成ＤＮＡに対応するデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端にボデピーＦＬで標識した下記に示す本発明のプローブを調製した。
上記の合成ＤＮＡに対応するプライマーＤＮＡの５’末端のリン酸基に、−（ＣＨ2)6−ＮＨ2を結合したものをメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits）Ｆ−６０８２（ボデピーＦＬのプロピオン酸サクシニジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinidyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記購入のプライマーＤＮＡに作用させて下記のボデピーＦＬで標識した本発明のプローブｐｒｏｂｅ  ａ〜ｄ、及びｆ〜ｈのを合成した。そして対応する合成デオキシリボオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしたときに、蛍光色素の発光がどの程度減少するかを下記の条件下に調べ、本発明のプローブの特異性を検討した。
【０１００】
2004305219.tif 000002
【０１０１】
2004305219.tif 000003
【０１０２】
2004305219.tif 000004
【０１０３】
2004305219.tif 000005
【０１０４】
（１）ハイブリダイゼーション溶液のコンポーネント
合成ＤＮＡ                                ３２０ｎＭ（終濃度）
核酸プローブ                                ８０ｎＭ（終濃度）
ＮａＣｌ                                    ５０ｍＭ（終濃度）
ＭｇＣｌ2                                      １ｍＭ（終濃度）
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）        １００ｍＭ（終濃度）
ミリＱ純水                                    １．６９９２ｍｌ
終全量                                  ２．００００ｍｌ
（２）ハイブリダイゼーションの温度：５１℃
（３）測定条件：
励起光          ：５４３ｎｍ
測定蛍光色      ：５６９ｎｍ
【０１０５】
【表１】
2004305219.tif 000006
【０１０６】
その結果を表１に示した。表１から分かるように、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡ（デオキシリボオリゴヌクレオチド）にハイブリダイゼーションしたときに、当該末端部において、当該プローブと標的ＤＮＡとがハイブリダイゼーションした末端塩基部から１〜３塩基離れて、標的ＤＮＡの塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１塩基以上存在するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることを示している。また、蛍光色素で標識された核酸プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションしたときに、当該末端部においてハイブリダイゼーション物の塩基対がＧとＣのペアーを少なくとも一対以上形成するように、当該プローブの塩基配列が設計されていることが好適であることが表１から分かる。
【０１０７】
実施例６
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内のＧ及び本発明の核酸プローブ内のＧの数の影響について、前記実施例と同様にして調べた。
【０１０８】
2004305219.tif 000007
【０１０９】
2004305219.tif 000008
【０１１０】
2004305219.tif 000009
【０１１１】
2004305219.tif 000010
【０１１２】
【表２】
2004305219.tif 000011
【０１１３】
表２から分かるように、標的核酸内のＧの数、本発明のプローブ内のＧの数はそれほど蛍光強度の減少に影響しないことが認識される。
【０１１４】
実施例７
下記のような塩基配列の標的核酸と本発明の核酸プローブを調製した。標的核酸内の塩基種及び本発明の核酸プローブ内の塩基種の影響について、前記実施例と同様にして調べた。
【０１１５】
2004305219.tif 000012
【０１１６】
2004305219.tif 000013
【０１１７】
【表３】
2004305219.tif 000014
【０１１８】
表３及び前記の実施例から分かるように、(i)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣで構成され、標的核酸がハイブリダイゼーションしたとき、ＧＣ  ペアーを形成するとき、(ii)蛍光色素で標識される本発明のプローブの末端がＣ以外の塩基で構成された場合、蛍光色素で標識されている個所の塩基と、標的核酸の塩基との塩基ペアーより、標的核酸の３’末端側にＧが少なくとも１個以上存在する場合に、蛍光強度の減少率が大きいことが分かる。
【０１１９】
実施例８
本発明の核酸プローブに標識する色素の種類について、前記実施例と同様にして調べた。なお、本発明のプローブは、前記実施例７のプローブｚを、また、標的核酸は前記実施例７のオリゴヌクレオチドｚを用いた。
その結果を、表４に示した。表から分かるように、本発明に用いる蛍光色素として好適なものは、FITC、 BODIPY FL、 BODIPY FL/C3、 6-joe、TMRなどを挙げることができる。
【０１２０】
【表４】
2004305219.tif 000015
【０１２１】
実施例９
核酸プローブの調製：大腸菌ＪＭ１０９株の１６ＳｒＲＮＡの１１５６塩基目から１１９０塩基の塩基配列に相当するＫＹＭ−７株の１６ＳｒＲＮＡ塩基配列に特異的にハイブリダイゼーションする(5')CAT CCC CAC CTT CCT CCC AGT TGA CCC CGG CAG TC(3')（３５塩基対）の塩基配列をもち、１〜１６及び２５〜３５塩基目がデオキシリボヌクレオチド、１７〜２４塩基目が２’位炭素のＯＨ基をアミノ基で修飾したリボオリゴヌクレオチドからなり、５’末端のリン酸基のＯＨ基を-(CH2)7-NN2で修飾しを結合したものを、実施例１と同様にメドランド・サーテイファイド・レージント・カンパニー社（Midland Certified Reagent Company、米国）から購入した。更に実施例１と同様にモレキュラープローブ（Molecular Probes）社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits) F-6082  （ボデピーＦＬ／Ｃ６のプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL/ C6 propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合する試薬を含有するキット）を購入した。当該キットを前記オリゴヌクレオチドに作用させて、ボデピーFL/C6で標識した核酸プローブを合成した。得られた合成物を実施例１と同様に精製して、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより２３％の収率でボデピーFL/C6で標識した核酸プローブを得た。このプローブを３５塩基鎖2-O-Meプローブと名づけた。
【０１２２】
（５’）AGG CCG GCC CTT GAC TTT CCT（３’）の塩基配列を有するリボキシオリゴヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、ホワード（ｆｏｒｗａｒｄ）型のヘルパープローブとした。一方、（５’）AUG GGA GUU CAG UAG UAC CCG CAA UGC UGG UCC(3')の塩基配列を有するリボキシオリゴヌクレオチドを前記同様にしてＤＮＡ合成機を用いて合成して、バックワード(back ward) 型のヘルパープローブとした。
【０１２３】
前記の１６ＳｒＲＮＡを９５℃で５分加熱処理した後、下記に示す反応条件においたプローブ溶液に添加した後、蛍光測定機器パーキンエルマー（Perkin  Elmer) LS-50Bで蛍光強度を測定した。その結果を図２に示した。尚、上記の加熱処理しない１６ＳｒＲＮＡを用いたものをコントロールとした。加熱処理した実験区においては、蛍光強度の減少が大きいことが図２から分かる。この結果は、１６ＳｒＲＮＡを９５℃で加熱処理することで本発明のプローブとより強いハイブリダイゼーションをしていることを示している。
反応条件：
16SrRNA:      10.0 nM
プローブ:        25nM
緩衝液：      100mM コハク酸、125mM  水酸化リチウム、８．５％
リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度: 70℃
【０１２４】
実施例１０（ヘルパープローブのハイブリダイゼーション効率への影響）
前記の１６ＳｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする下記の本発明のプローブ及びヘルパープローブを前記と同様にして調製した。そして下記の条件にて、本発明の2'-O-Meプローブの効果、当該プローブの塩基鎖の長さの影響、及びヘルパープローブの効果について検討した。その結果を図３のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄに示した。図から、本発明の2'-O-Meプローブがハイブリダイゼーション効率に寄与していることが分かる。また、2'-O-Meプローブの塩基鎖が短い場合にヘルパープローブがハイブリダイゼーション効率を高めるのに役立っている。
【０１２５】
１）前記と同じ３５塩基鎖2'-O-Meプローブ、
２）前記１）と同じ３５塩基鎖2'-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドで構成されているプローブ（３５塩基鎖DNA  プローブ）、
３）前記１）の３５塩基鎖2-O-Meプローブと同じ塩基配列であるが、５’末端から８塩基分、３’末端から１０塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ（１７塩基鎖2-O-Me プローブ）、
４）前記２）の３３塩基鎖DNAプローブと同じ塩基配列であるが、３’末端から１６塩基分のヌクレオチドを削除したプローブ（１７塩基鎖DNAプローブ）、
【０１２６】
５）前記ホワード型ヘルパープローブの中央８塩基分のＯＨ基をメチル基で修飾したヘルパープローブ(ファード型 2-O-Meヘルパープローブ)
６）前記リバース型ヘルパープローブの中央８塩基分のＯＨ基をメチル基で修飾したヘルパープローブ(リバース型 2-O-Meヘルパープローブ）
７）前記フォワード型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、オリゴヌクレオチドがデオキヌクレオチドで構成されているヘルパープローブ(ファワード型  DNA ヘルパープローブ）
８）前記リバース型ヘルパープローブの塩基配列と同じ塩基配列であるが、デオキリボヌクレオチドがで構成されているヘルパープローブ(リバース型 DNA ヘルパープローブ）
９）(5')GUGACGGUCACUAUUUGACCUCCUUCCACCCC(3')なる塩基配列を有するリボオリゴヌクレオチド（３５塩基リボオリゴヌクレオチド）、
１０）(5')GUGACGGUCACUAUUUG(3')なる塩基配列を有するリボオリゴヌクレオチド（１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチド）、
【０１２７】
反応条件：
１６ＳｒＲＮＡ：      10nM
プローブ：            25nM
ヘルパープローブ：    1μM
緩衝液：          100mM  コハク酸、125mM  水酸化リチウム、
８．５％  リチウムドデシルサルファイト、pH 5.1
温度：
・３５塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ使用の場合：
７０℃
・１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブまたは
３３塩基鎖リボオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ：６５℃
・１７塩基鎖リボオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブ：５０℃
【０１２８】
実施例１１（ｒＲＮＡ測定のための検量線の作成）
０．１〜１０ｎＭの範囲の前記ｒＲＮＡを９５℃で５分間加熱後、予め下記反応条件においた反応液に添加し、１０００秒後、蛍光強度の減少をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図４に示した。図から検量線は０．１〜１０ｎＭにおいて直線性を示すことが分かる。
反応条件：
３３塩基鎖リボオリゴヌクレオチド2-O-Meプローブ：  1.0〜25nM
緩衝液：  100mM  コハク酸、125mM  水酸化リチウム、
８．５％  リチウムドデシルサルファイト、
ｐＨ  ５．１
温度：    ７０℃
【０１２９】
実施例１２(FISH方法)
セルロモナス（Cellulomonas）sp.KYM-7（FERM P-16806）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium) sp. KYM-8(FERM P-11358)の各々のｒＲＮＡにハイブリダイゼーションする本発明のプローブ35〜36塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド 2-O-Meプローブを前記と同様にして調製した。各プローブの塩基配列は下記の通りである。
【０１３０】
セルロモナス sp.KYM-7のｒＲＮＡ測定のための３５塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ：
（5')CAT CCC CAC CTT CCT CCG AGT TGA CCC CGG CAG TC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。）。
アグロバクテリウム sp. KYM-8(FERM P-11358)のｒＲＮＡ測定のための３６塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ：
(5')CAT CCC CAC CTT CCT CTC GGC TTA TCA CCG GCA GTC(3')（アンダーライン部分がメチル基で修飾されている。）。
【０１３１】
セルロモナス  sp. KYM-7及びアグロバクテリウムsp. KYM-8を下記の培地組成で下記の培養条件で混合培養し、培養時間毎に培養物を採取した。それらから、ｒＲＮＡをRNeasy Maxikit（QIAGENE社）を用いて調製した。当該ｒＲＮＡを９５℃で５分加熱後、予め反応条件においた反応液に添加し、７０℃、１０００秒間反応させた後、蛍光強度をパーキンエルマーLS-50Bを使用して測定した。その結果を図５に示した。尚、全rＲＮＡはリボグリーン（RiboGreen) RNA Kit （会社名：モレキュラープローブ（molecular probes)、所在地名：Eugene,Oregon, USA）を用いて測定した。
図から分かるように、各菌株のｒＲＮＡの動態は全 rＲＮＡの動態と一致した。また、各菌株のｒＲＮＡの合計量は全ｒＲＮＡと一致した。このことは、本発明方法はFISH方法において有効な方法になることを示している。
【０１３２】
培地組成（g/l）：デンプン，10.0；アスパラギン酸，0.1；  K2HPO4，5.0;
KH2PO4,2.0;MgSO4・7H2O ,0.2;NaCl，0.1; (NH4)2SO4;0.1.
培地１００ｍｌを５００ｍｌ容のコニカルフラスコに分注し、該フラスコを１２０℃で１０分間、オートクレーブ釜を用いて殺菌した。
【０１３３】
培養条件：前記の菌株を斜面培地で予め培養した。該斜面培地より１白金耳の菌体をとり、前記の殺菌したコニカルフラスコに接種した。３０℃、１５０ｒｐｍで撹拌培養した。
【０１３４】
反応条件：
３３塩基鎖デオキシオリゴヌクレオチド２−Ｏ−Ｍｅプローブ:    1.0〜10nM
緩衝液:      100mM コハク酸、125mM  水酸化リチウム、
8.5%  リチウムドデシルサルファイト、ｐＨ  ５．１
温度：        70℃
【０１３５】
以下実施例１３に、標的核酸若しくは遺伝子の多型及び変異を解析若しくは測定する方法を記す。
実施例１３
下記に示した塩基配列をもつ４種類のオリゴヌクレオチドを前記実施例５のＤＮＡ合成機を用いて合成した。また、前記実施例５と同様にして、下記の塩基配列の本発明の核酸プローブを合成した。該プローブと各々のオリゴヌクレオチドを溶液中でハイブリダイゼーションさせた後、蛍光強度の変化から１塩基置換の評価ができるかどうか検討した。本発明の核酸プローブの塩基配列は、標的オリゴヌクレオチドの３’末端にＧが存在する場合に、１００％マッチするように設計されている。ハイブリダイゼーション温度は、プローブと標的オリゴヌクレオチドの全塩基対（base-pairs）が１００％ハイブリダイゼーションできる４０℃に設定した。プローブ及び標的オリゴヌクレオチドの濃度、緩衝液の濃度，蛍光測定装置、蛍光測定条件、実験操作などは、前記実施例５と同様である。
【０１３６】
2004305219.tif 000016
【０１３７】
その結果を表５に示した。表から、標的オリゴヌクレオチドＮｏ．１〜３においては、蛍光強度に変化は観察されなかったが、標的オリゴヌクレオチドＮｏ．４においては８４％の減少が観察された。
【０１３８】
【表５】
2004305219.tif 000017
【０１３９】
本発明において、標的核酸若しくは遺伝子（Ｎｏ．１〜４）の多型及び変異を解析若しくは測定若しくは測定する方法により得られるデータ（表５のカラムＡ及びＢのデータ）を解析する方法において、標的核酸若しくは遺伝子が蛍光色素で標識された核酸プローブ（上記の核酸プローブ）とハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値を、前記のハイブリダイズしていないときの反応系の蛍光強度値により補正するとは、表３の（Ａ−Ｂ）／Ｂの計算をいう。
以上の結果より、標的核酸が２本鎖の場合、Ｇ→Ａ、Ｇ←Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ←Ｔ、Ｇ→Ｃ、Ｇ←Ｃの置換を検出できることが明らかになった。
【０１４０】
実施例１４
図６に本発明のＤＮＡチップのモデルを図示した。先ず、実施例１３で調製した本発明のプローブ、3'TTTTTTTTGGGGGGGGC5'BODIPY FL/C6の３’末端の３’位のＯＨにアミノ基を導入したもの、また、スライドガラスを反応基としてエポキシ基を有するシランカップリン剤でスライドガラスの表面を処理したものを用意する。上記の本発明のプローブを含む溶液をＤＮＡチップ作成装置GMSTM417ARRAYER(TAKARA)で該スライドガラス上にスポットする。そうすると、３’末端で発明のプローブがガラス面に結合する。該スライドガラスを密閉容器内に４時間位おき反応を完結させる。そして該スライドガラスを０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬ける。更にホウ素溶液（水３００ｍｌにNaBH4１．０ｇを溶かしたもの。）に５分位つける。９５℃の水に２分つけてから、素早く０．２％ＳＤＳ溶液、水に１分程度交互に２回づつ漬けて試薬を洗い流す。室温で乾燥する。このようにして本発明のＤＮＡチップが調製される。
更に、各スポットのガラスの下面に図のような微小な温度センサーとヒータを設けることにより、高性能な本発明のＤＮＡチップを作成することができる。
このＤＮＡチップを用いて標的核酸若しくは遺伝子を測定する場合を説明する。該プローブに標的核酸若しくは遺伝子がハイブリダイゼーションしていないときは、又はハイブリダイゼーションしても本発明の蛍光色素標識末端でＧＣペアーを形成しないとき、若しくは当該プローブと標的核酸しくは遺伝子とがハイブリダイゼーションした末端塩基部分から１ないし３塩基離れて、標的核酸若しくは遺伝子の塩基配列にＧ（グアニン）が少なくとも１ないし３塩基存在しないときは、蛍光強度に変化ない。しかし、ハイブリダイゼーションすると蛍光強度が減少する。この蛍光強度はＤＮＡチップ解析装置ＧＭＳTM４１８アレースキャナー（Array Scanner）（TAKARA）を使用して測定できる。
【０１４１】
以下、実施例１５〜１９に本発明のＰＣＲ方法を記す。
実施例１５
大腸菌のゲノムＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を標的核酸として、当該核酸の増幅のための（BODIPY FL/C6で標識した）プライマーを調製した。
【０１４２】
プライマー１（Eu800R：リバース型）の調製：(5')CATCGTTTACGGCGTGGAC(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシンの５’位の炭素OH基に、-(CH2)9-NH2を結合したものを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カンパニー社（米国）から購入した。更に、モレキュラープローブ社からフロオ・リポーターキット（FluoReporter Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル（BODIPY FL propionic acid succinimidyl ester）の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマー１を合成した。
【０１４３】
合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaHCO3緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。当該溶解物をＮＡＰ−２５カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC（B gradient：１５〜６５％、２５分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマー１を、最初のオリゴヌクレオチド原料２ｍＭより５０％の収率で得た。
【０１４４】
尚、上記の逆相クロマトグラフィーの条件は次の通りである：
溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント(gradient)用）：0.05N TEAA
40%CH3CN
カラム：CAPCEL PAK C18  ；6×250mm
溶出速度：１．０ml/min
温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
【０１４５】
実施例１６
プライマー２（Eu500R/forward：フォワード型）の調製：(5')CCAGCAGCCGCGGTAATAC(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光色素（BODIPY FL/C6）で標識したプライマー２を実施例１３と同様にして収率５０％で調製した。
【０１４６】
実施例１７
殺菌したニュトリエントブロス(NB)（Difco社製）液体培地５ml（組成：NB、0.08g/100ml）を含有する試験管を用いて、大腸菌JM109株を３７℃で一晩振蘯培養した。培養液１．５mlを１．５ml容量の遠心チューブで遠心分離し、菌体を得た。この菌体から、DNeasy Tissue Kit（キアゲン社、ドイツ国）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。その方法は本キットのプロトコルに従った。その結果、17ng/μlのＤＮＡ溶液を得た。
【０１４７】
実施例１８
上記の大腸菌のゲノムＤＮＡ、プライマー１及び／又はプライマー２を使用して、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のライトサイクラーTMシステム（LightCyclerTM System）を用いて常法通りにＰＣＲ反応を行った。操作は当該システム機器の手順書に従った。
また、上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記されている核酸プローブ（FRET現象を利用する二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライマー１及び／又は２を用いる以外は当該手順書通りに行った。
【０１４８】
ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。
大腸菌ゲノムＤＮＡ溶液    ３．５μｌ（終濃度０〜６ｎｇ／２０μｌ）
（終コピー数０〜２．４・１０6個）
プライマー溶液              ０．８μｌ（終濃度０．０８μＭ）
Ｔａｑ溶液                １０．０μｌ
ミリＱ純水                  ５．７μｌ
全容量                ２０．０μｌ
尚、標的核酸である大腸菌１６ＳｒＤＮＡは、図７の説明欄に示される実験区の濃度で、また、プライマーは、同様に図７の注に示される実験区のプライマー１及び／又は２の組合せで実験を行った。
【０１４９】
また、上記のTaq溶液は次の試薬の混合液である。
Taq 溶液                    ９６．０μｌ
ミリＱ純水                  ６８．２μｌ
Taq DNA ポリメラーゼ溶液    ２４．０μｌ
Taq  スタート(start)          ３．８μｌ
【０１５０】
尚、Taq 溶液、 Taq DNAポリメラーゼ溶液はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Master Hybridization Probes)キットのものである。特にTaq DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）を１０倍に希釈して用いた。また、Taq スタートは、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNAポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加することで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えることができる。即ち、ホット・スタート(hot start)を行うことができるものである。
【０１５１】
反応条件は次の如くである。
変性（denaturation）                初期：９５℃、１２０秒
再：９５℃、    ０秒
アニーリング（annealing）条件        ５７℃、５秒
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強度は７５に固定した。
【０１５２】
その結果を図７及び８に示した。図７及び８から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例していることが分かる。尚、図においては、蛍光色素の発光の減少量を蛍光強度の減少値として表現した。
図９は、サイクル数を関数として、大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数を表現した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線である。相関係数は０．９９７３で、極めてよい相関を示した。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。
【０１５３】
実施例１９
実施例１８においては、本発明のプローブをプライマーとしてＰＣＲを行ったが、本実施例では従来法に用いるＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブの代わりに本発明のプローブを用いて下記の条件で本発明のＰＣＲを行った。
ａ）標的核酸:大腸菌の16S-rDNA
ｂ）使用プライマー：
・フォワードプライマー E8F: (3')AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(5')
・リバースプライマー E1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT(5')
ｃ）使用プローブ: BODIPY FL-(3')CCTTCCCACATCGTTT(5')
ｄ）使用PCR測定機器:ライトサイクラーTMシステム
ｅ）ＰＣＲの条件:
変性反応:95℃ for 0秒 (60秒間、95℃)
アニーリング反応: 50℃ for 5秒
核酸伸長反応: 72℃ for 70秒
全サイクル数: 70サイクル
【０１５４】
ｆ）蛍光測定（アニーリング反応と変性反応後各サイクル後一回づつ測定された。
ｇ）反応液の組成:
反応液の全量:20 μl
DNA  ポリメラーゼの量 (TaKaRa Ex taq): 0.5U
Taq スタート(抗体): 0.3μl
プライマーの濃度: 0.2μM (双方とも)
プローブの濃度: 0.05 μM
MgCl2 濃度: 2 mM
BSA(bovine serum albumin)濃度:0.25 mg/ml
dNTPs濃度: 2.5 mM (各ヌクレオチドについて).
【０１５５】
その結果を図１０に示した。図から、蛍光色素の発光の減少が観察される時点のサイクル数と標的核酸の大腸菌１６ＳｒＤＮＡのコピー数が比例していることが分かる。
以上の結果から分かるように、本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いると標的核酸の当初のコピー数を測定できるようになる。即ち、標的核酸の測定ができる。
【０１５６】
次に以下の実施例に、上記の本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて得られるデータを解析する本発明のデータ解析方法について記す。
実施例２０
ヒトゲノムＤＮＡ（ヒトβ−グロビン（globin）（TaKaRaカタログ商品番号  ９０６０）（TaKaRa株式会社製）（以下、ヒトゲノムＤＮＡという。）を標的核酸として、当該核酸の増幅のためのボデピー FL/C6で標識したプライマーを調製した。
【０１５７】
プライマーKM38+C（リバース型）の調製：（5')CTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ABI394(Perkin Elmer社製、米国）を用いて合成し、更に当該オリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端のリン酸基をホスファターゼ処理してシトシンとし、そのシトシンの５’位の炭素ＯＨ基に、-(CH2)9-NH2を結合したものを、ミドランド・サーテイファイド・レージンド・カンパニー社から購入した。更に、モレキュラープローブ社からリポーターキット（FluoReporter Kits)F-6082（ボデピーFL/C6のプロピオン酸サクシニミジルエステル(BODIPY FL propionic acid succinimidyl esters)の他に、当該化合物をオリゴヌクレオチドのアミン誘導体に結合させる試薬を含有するキット）を購入した。前記購入したオリゴヌクレオチドに当該キットを作用させて、本発明のボデピーFL/C6で標識したプライマーKM38+Cを合成した。
【０１５８】
合成物の精製：得られた合成物を乾固し乾固物を得た。それを0.5M Na2CO3/NaH2CO3緩衝液(pH9.0)に溶解した。当該溶解物をNAP-25カラム（ファルマシア社製）でゲルろ過を行い、未反応物を除去した。更に逆相HPLC(B gradient:15〜65%、25分間）を以下の条件で行った。そして、溶出するメインピークを分取した。分取した画分を凍結乾燥して本発明のプライマーKM38+Cを、最初のオリゴヌクレオチド原料2mMより５０％の収率で得た。
【０１５９】
尚、上記の逆相クロマトグラフィーの条件は次の通りである：
溶出ソルベントＡ：0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベントＢ（グラジエント（gradient）用）：0.05N
TEAA 40%CH3CN
カラム：CAPCEL PAK C18;6×250mm
溶出速度：1.0ml/min
温度：40℃
検出：254nm
【０１６０】
実施例２１
プライマーKM29（フォワード型）の調製：(5')GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG(3')の塩基配列をもつデオキシリボオリゴヌクレオチドを実施例１８と同様に合成した。
【０１６１】
比較実験例１（本発明の、核酸伸長反応時の蛍光強度値を、熱変性反応時の蛍光強度値を用いて割る演算処理過程を有ないデーター解析用ソフトウエアを用いた実験例）。
上記のヒトゲノムＤＮＡ、プライマーKM38+C及びプライマーKM29を使用して、ライトサイクラー TMシステムを用いてＰＣＲ反応を行い、各サイクル毎の蛍光強度を測定した。
尚、本比較実施例のＰＣＲは、前記に説明した蛍光色素色素で標識したプライマーを用いるものであり、蛍光発光の増加でなく、減少を測定する新規なリアルタイム定量的ＰＣＲ方法である。データー解析用ソフトウエアは当該システムのものを用いて行った。上記システムにおいてＰＣＲは、当該手順書に記されている核酸プローブ（ＦＲＥＴ現象を利用する二個のプローブ）と通常のプライマー（蛍光色素で標識されていない通常のプライマー）の代りに本発明プライマーKM38+C及びKM29を用いる以外は当該装置の手順書通りに行った。
【０１６２】
ＰＣＲは次のコンポーネントで行った。
ヒトゲノムＤＮＡ    1.0μl（最終濃度1〜10000コピー）
プライマー溶液      4.0μl（最終濃度0.1μM）
Taq溶液             10.0μｌ
ミリＱ純水          5.0μl
全容量              20.0μl
尚、ヒトゲノムＤＮＡは、図１１の説明欄に示される実験区の濃度で実験を行った。MgCl2の最終濃度は2mMであった。
【０１６３】
また、上記のTaq溶液は次に試薬の混合液である。
Taq 溶液                              96.0μl
ミリＱ純水                            68.2μl
Taq DNA ポリメラーゼ                  24.0μl
Taq スタート                           3.8μl
【０１６４】
尚、Taq溶液、 Taq DNA ポリメラーゼ溶液はロシュ・ダイアグノスティックス株式会社発売のＤＮＡマスターハイブリダイゼーションプローブ（DNA Master Hybridization Probes）キットのものである。特にＴaq DNA ポリメラーゼ溶液は10×conc.（赤いキャップ）を１０倍に希釈して用いた。また、Ｔaqスタートは、クローンテック社（ＵＳＡ）より販売されているTaq DNA ポリメラーゼ用の抗体で、これを反応液に添加することで７０℃までTaq DNAポリメラーゼの活性を抑えることができる。即ち、ホット・スタートを行うことができるものである。
【０１６５】
反応条件は次の如くである。
変性反応初期  ：95℃、60秒
再変性反応    ：95℃、10秒
アニーリング反応  ：60℃、5秒
ＤＮＡ伸長反応    ：72℃、17秒
測定は、ライトサイクラーTMシステムを用いて行った。その際、該システムにあるＦ１〜３の検出器にうち、Ｆ１の検出器を用い、その検出器のゲインは１０、励起強度は７５に固定した。
【０１６６】
前記の如くにＰＣＲを行って、各サイクルの蛍光強度を実測した結果を図１１に示した。即ち、各コピー数のヒトゲノムＤＮＡについて、各サイクルの変性反応時及び核酸伸長反応時の蛍光強度を測定し、印字したものである。どのサイクルにおいても変性反応時には蛍光強度値は一定であるが、核酸伸長反応時には、２５サイクル目当たりから蛍光強度が減少しているのが観察される。そうして、減少はヒトゲノムＤＮＡのコピー数がおおい順に起こることが分かる。
【０１６７】
図１１においてヒトゲノムＤＮＡの各コピー数について初期のサイクル数の蛍光強度値が一様でない。それで、本実験例で使用するデーター解析方法に以下の過程を追加した。
（ｂ）１０サイクル目の蛍光強度値を１として各サイクルの蛍光強度値を換算する過程、即ち、下記の〔数式８〕による計算をする過程、
Ｃn＝Ｆn（７２）／Ｆ10（７２）          〔数式８〕
ただし、Ｃn＝各サイクル値の換算値、Ｆn（７２）＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、Ｆ10（７２）＝１０サイクル目の７２℃の蛍光強度値。
（ｃ）前記（ｂ）の過程で得られた換算値を、各サイクル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
【０１６８】
（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの換算値から下記の〔数式９〕による蛍光強度の変化率（減少率、消光率）を計算をする過程、
〔数式９〕
Ｆdn  ＝ｌｏｇ10｛１００−Ｃn×１００）｝
Ｆdn  ＝２ｌｏｇ10｛１−Ｃn｝
ただし、Ｆdn＝蛍光強度変化率（減少率、消光率）、Ｃn＝〔数式８〕で得られた値。
（ｅ）前記（ｄ）の過程で得られた換算値を、各サイクル数に対してプロットし、デスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
【０１６９】
（ｆ）前記（ｄ）の過程で処理されたデーターの内、０．５をスレッシュホールド（ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ）し、その値に達したサイクル数を計算する過程、
（ｇ）前記（ｆ）の過程で計算した値をＸ軸に、反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフを作成する過程、
（ｈ）前記（ｇ）の過程で作成したグラフをデスプレー上に表示及び／又は印字する過程、
（ｊ）前記（ｈ）の過程で描かれた直線の相関係数又は関係式を計算する過程、（ｉ）前記（ｊ）の過程で計算された計算値又は関係式をデスプレー上に表示及び／又は印字する過程。
【０１７０】
上記のデーター解析用ソフトウエアを用いて、前記図１１で得られたデーターを前記に引き続いて以下のようにデーターを処理した。
図１２は、上記（ｂ）の過程で処理されたデーターを印字した（前記（ｃ）過程）したものである。即ち、１０サイクル目の蛍光強度値を１として換算
し、その換算値をサイクル数に対してプロットしたものである。
図１３は、前記（ｄ）の過程で処理したデーターを印字した（前記（ｅ）過程）ものである。即ち、図１２の各プロット値から蛍光強度の減少率（消光率）を計算して、各計算値を各サイクル数に対してプロットしたものである。
【０１７１】
図１４は、前記（ｆ）の過程で処理したデーターについて、前記（ｇ）の過程で作成したグラフを印字した（前記（ｈ）の過程）ものである。即ち、蛍光強度減少率＝０．５をスレッシュホールド（threshhold）し、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットしたグラフである。このグラフの直線の相関係数（Ｒ２）を前記（ｊ）の過程で計算し、印字した（前記（ｉ）の過程）もので、０．９５１４であった。このように、この相関係数では正確なコピー数を求めるは無理であった。
【０１７２】
実施例２２（本発明のデーター解析方法を用いてデーター処理がなされた実験例）
ＰＣＲは比較実験例１と同様に行った。
データー処理は、比較実験例１の（ｂ）の過程の前に下記の（ａ）の過程をおき、（ｂ）、（ｄ）の過程を以下のように変更する以外は比較実験例１と同様な過程で行った。
（ａ）各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素で標識された核酸プライマーとハイブリダイズしたときの反応系の蛍光強度値（即ち、核酸伸長反応時（７２℃）の蛍光強度値）を、増幅した核酸が核酸プライマーとハイブリダイズしたものが解離したときの反応系の蛍光強度値（即ち、核酸熱変性反応時（９５℃）の蛍光強度値）で割る補正演算処理過程、即ち、実測の蛍光強度値を〔数式１〕で補正した。
ｆn＝ｆhyb,n／ｆden,n          〔数式１〕
［式中、ｆn＝サイクルの蛍光強度の補正値、ｆhyb,n＝各サイクルの７２℃の蛍光強度値、ｆden,n＝各サイクルの９５℃の蛍光強度値］
得られた値を各サイクル数にプロットしたのが図１５である。
【０１７３】
（ｂ）各サイクルにおける〔数式１〕における補正演算処理値を〔数式３〕に代入し、各サイクルにおける各サンプル間の蛍光変化率（減少率又は消光率）を算出する演算処理過程、即ち、下記の〔数式１０〕で演算処理する過程、
Ｆn＝ｆn／ｆ25          〔数式１０〕
［式中、Ｆn＝各サイクルの演算処理値、ｆn＝〔数式１〕で得られた各サイクルの値、ｆ25＝〔数式１〕で得られた値で、サイクル数が２５回目のもの］。
〔数式１０〕は〔数式３〕において、ａ＝２５とした場合におけるものである。
【０１７４】
（ｄ）前記（ｂ）の過程で得られた各サイクルの演算処理値を〔数式６〕による蛍光強度の変化率（減少率又は消光率）の対数値を演算処理をする過程、即ち、下記の〔数式１１〕で演算処理する過程、
ｌｏｇ10｛（１−Ｆn）×１００｝          〔数式１１〕
［式中、Ｆn＝［数式１０］で得られた値］。
〔数式１１〕は〔数式６〕において、ｂ＝１０、Ａ＝１００とした場合におけるものである。
【０１７５】
上記の結果を図１６及び１７に示した。
図１６は、前記（ａ）及び（ｂ）の過程で処理された値をサイクル数に対してプロットし、印字したものである。
図１７は、図１６で得られた値について前記（ｄ）の過程で計算された値を、サイクル数に対してプロットし、印字したものである。
【０１７６】
次に、図１７のグラフを基に、前記（ｆ）、（ｇ）、及び（ｈ）の過程で処理した。即ち、図１７のグラフを基に比較実験例１と同様に、ｌｏｇ10（蛍光強度変化率）のスレッシュホールド値として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を選び、その値に達したサイクル数をＸ軸に、ヒトゲノムＤＮＡの反応開始前のコピー数をＹ軸にプロットし、検量線を描かせた。その結果を図１８に示した。これらの検量線について前記（ｊ）及び（ｉ）の過程で処理して求めた相関係数（Ｒ2）は、前記各スレッシュホールド値に対して、各々０．９９８、０．９９９、０．９９９３、０．９９８５、０．９９８９、０．９９８８であった。これらの相関係数から、スレッシュホールド値として０．５（相関係数０．９９９３）を採用することが望ましいことが認識できた。この相関係数をもつ検量線であれば、未知コピー数の核酸試料について反応開始前のコピー数を精度よく求めることができることが分かる。
【０１７７】
実施例２３（核酸の融解曲線分析及びＴｍ値分析の例）
本発明の新規なＰＣＲ法により増幅された核酸について、５１）低い温度から核酸が完全に変性するまで、温度を徐々に上げるあるいは下げる過程（例えば、５０℃から９５℃まで）、５２）前記５１）過程において、短い時間間隔（例えば、０．２℃〜０．５℃間隔）で蛍光強度を測定する過程、５３）前記５２）過程の測定結果を時間毎にデスプレー上に表示する過程、即ち、核酸の融解曲線を表示する過程、５４）前記５３）過程の融解曲線を一次微分する過程、５５）前記５４）過程の微分値（−ｄＦ／ｄＴ、Ｆ：蛍光強度、Ｔ：時間）をデスプレー上に表示する過程、５６）前記５５）から得られる微分値から変曲点を求める過程からなるソフトウエアを作成し、前記本発明のデーター解析用ソフトウエアに合体した。当該データー解析用ソフトウエアを記録したコンピューター読み取り可能な記録媒体をインストールした前記ライトサイクラーTMシステムを用いて本発明の新規リアルタイム定量的ＰＣＲ反応を行い、核酸融解曲線の分析を行った。本発明においては、蛍光強度は温度が上がるごとに増加する。
【０１７８】
実施例２２と同じヒトゲノムＤＮＡの１コピーと１０コピーについて、実施例２０と同様のＰＣＲを行い、前記５１）、５２）、５３）、５４）及び５５）の過程で処理されたデーターを印字したものが図１９である。１コピーと１０コピーの７５回目の増幅産物について、本実施例の５１）、５２）及び５３）の過程で処理した核酸融解曲線の図が図２０である。５４）の過程でこの曲線を微分し、５５）及び５６）の過程で変曲点（Ｔｍ値）を求めたものが図２１である。図２１から、１コピーと１０コピーの増幅産物のＴｍ値が異なる故に、各増幅産物は異なる産物であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明は次のような効果を有する。
１）前記のように本発明の核酸測定方法、本発明のプローブ及びデバイスを用いると、測定系から未反応の核酸プローブを除く等の操作をすることがないので、標的核酸を短時間でかつ簡便に測定できる。また、複合微生物系又は共生微生物系に適用すると、当該系における特定菌株の存在量を特異的かつ短時間に測定できる。また、本発明は標的核酸若しくは遺伝子のＳＮＰなどの多型または変異などの解析若しくは測定する簡便な方法を提供している。
２）また、本発明の定量的ＰＣＲ方法は、次のような効果を有する。
ａ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる標的核酸の増幅に阻害的に作用する因子が添加されていないことから、従来公知の特異性のある通常のＰＣＲと同様の条件で定量的ＰＣＲを行うことができる。
ｂ．また、ＰＣＲの特異性を高く保つことができるので、プライマーダイマーの増幅が遅くなることから、従来公知の定量的ＰＣＲと比較すると定量限界が約１オーダー低くなる。
ｃ．複雑な核酸プローブを用意する必要がないので、それに要する時間と費用が節約できる。
ｄ．標的核酸の増幅効果も大きく、増幅過程をリアルタイムでモニタリングすることができる。
３）また、リアルタイム定量的ＰＣＲ方法で得られたデーターを解析する際、本発明のデーター解析方法を用いて、未知核酸コピー数の核酸試料について核酸のコピー数を求める検量直線を作成すると、検量線の相関係数は従来の方法により得られたものに較べて格段に高い。それで、本発明のデーター解析方法を用いると核酸の正確なコピー数を求めることができる。
４）また、本発明のリアルタイム定量的ＰＣＲ方法によって得られたデーターの解析方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その解析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、相関係数の高い検量直線を自動的に作成することができる。
５）また、本発明の新規な核酸の融解曲線の分析方法を用いると、精度の高い、核酸のＴｍ値を求めることができる。更に、当該方法に係るデーター解析用ソフトウエア、また、その分析方法の手順をプログラムとして記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体、また、それを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲの測定若しくは解析装置を用いると、正確なＴｍ値を求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】実施例１で得た核酸プローブを用いて大腸菌の１６ＳｒＲＮＡの５´末端から数えて３３５から３５８番目の核酸塩基配列を測定した場合の蛍光強度測定データを示す図。
【図２】３５塩基鎖2-o-Meプローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションに対する熱処理の効果を示す図。
【図３】プローブと標的核酸１６ＳｒＲＮＡのハイブリダイゼーションに対するプローブの塩基鎖の塩基数、ヘルパープローブ及びプローブの５’末端のリボースの２’位ＯＨ基のメチル基修飾の効果を示す図。
【図４】本発明方法によるｒＲＮＡ測定のための検量線。
【図５】ＫＹＭ７株及びＫＹＭ８株の複合培養系のｒＲＮＡ量の時間経過についての本発明のＦＩＳＨ方法による分析。
【図６】本発明のＤＮＡチップを説明する図。
【図７】ボデピーＦＬで標識したプライマー１及び２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光の減少量の関係を示す図。
【図８】ボデピーＦＬで標識したプライマー１及び２を用いた定量的ＰＣＲ方法：サイクル数と蛍光色素の発光の減少量の対数値の関係を示す図。
【図９】本発明の定量的ＰＣＲ方法を用いて作成した大腸菌１６ＳｒＤＮＡの検量線を示す図。ｎ：１０n
【図１０】上図は、ＦＲＥＴ現象を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ方法において使用する蛍光色素で標識した二つのプローブの代わりに、本発明の一つのプローブを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光強度の現象率の変化を示す図である。下図は蛍光強度の現象が有為に観察され始めるサイクル数（threshold number：Ct値）を算出し、検量線を作成した図である。
【図１１】本発明の補正演算処理しない場合の、本発明のボデピーＦＬで標識したプライマーを用いたリアルタイム定量的ＰＣＲによって得られた蛍光減少曲線を示す図。
【図１２】各曲線の１０サイクル目の値を１として補正する以外は、図１１の曲線の場合と同様にして得られたリアルタイム定量的ＰＣＲの蛍光減少曲線を示す図。
【図１３】図１２の各曲線の各プロット値について、［数式９］の蛍光強度減少率（変化率）を計算し、計算値をプロットした曲線を示す図。
【図１４】図１３のデーターから求めたヒトゲノムＤＮＡの検量直線を示す図。
【図１５】図１１の各サイクルの測定値を〔数式１〕で補正演算処理した値を各サイクル 数に対してプロットした曲線を示す図。
【図１６】図１５の各サイクルの演算処理値を〔数式３〕で演算処理した値をサイクル数に対してプロットした曲線を示す図。
【図１７】図１６の各サイクルの演算処理値を〔数式６〕の式で演算処理した値をサイクル数に対してプロットした曲線を示す図。
【図１８】図１６の各log（蛍光変化率）値からＣｔ値の候補として、０．１、０．３、０．５、０．７、０．９、１．２を適当に選んで、それに対応する検量直線を描かせた場合の図。尚、各検量線における相関係数を下記に示した。
【図１９】１コピー及び１０コピーのヒトゲノムＤＮＡについて、本発明のボデピーＦＬで標識したプライマーを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲを行った場合の蛍光減少曲線を示す図。ただし、〔数式１〕の補正演算処理を施した。
【図２０】図１９に示されるＰＣＲの増幅産物についての核酸の融解曲線分析を行った場合の核酸の融解曲線を示す図。
【図２１】図２０の曲線を微分して得られた、Ｔｍ値を示す曲線を示す図（谷がＴｍ値）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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