(57)【要約】【課題】本発明は、膜抵抗による検出方法で、高感度を実現する測定方法および測定装置の提供を目的とする。【解決手段】高い抵抗（抵抗の逆数は電気伝導度で同概念）を有する絶縁性薄膜表面に吸着した被測定物質（電子伝達物質で標識されている）を、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱することで、絶縁性薄膜の内部に取り込ませ、被測定物質の電子伝達物質による抵抗の低下（電気伝導度の上昇）を検出し、被測定物質を測定する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子伝達物質で標識した被測定物質を、電極表面に形成した絶縁性薄膜に吸着させ、前記絶縁性薄膜の電気伝導度または抵抗値の変化量を、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱して検出する被測定物質の測定方法。
【請求項２】
被測定物質を電子伝達物質で標識する手段と、一対の電極と、一方の電極表面に形成した絶縁性薄膜と、前記絶縁性薄膜を加熱する加熱手段を有し、前記絶縁性薄膜の電気伝導度または抵抗値の変化量を、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱して検出する被測定物質の測定装置。
【請求項３】
絶縁性薄膜が、単分子膜あるいは重層膜である請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】
絶縁性薄膜が、単分子膜あるいは重層膜である請求項２に記載の測定装置。
【請求項５】
絶縁性薄膜を構成する材料がアルキルチオールで、イオウ原子を介して電極の金属材料と結合する請求項３に記載の測定方法。
【請求項６】
絶縁性薄膜を構成する材料がアルキルチオールで、イオウ原子を介して電極の金属材料と結合する請求項４に記載の測定装置。
【請求項７】
電子伝達物質が少なくとも陽イオン性または陰イオン性の解離基を有する請求項１、３、５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
電子伝達物質が少なくとも陽イオン性または陰イオン性の解離基を有する請求項２，４、６のいずれかに記載の測定装置。
【請求項９】
電気伝導度または抵抗値の変化量の測定が交流印加あるいは直流バイアスを加えた交流印加である請求項１、３、５、７のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１０】
電気伝導度または抵抗値の変化量の測定が交流印加あるいは直流バイアスを加えた交流印加である請求項２、４、６、８のいずれかに記載の測定装置。
【請求項１１】
被測定物質を電子伝達物質で標識する手段が、電子伝達物質で標識され、不溶化抗体に抗原抗体反応により結合した標識抗原と、被測定物質中の抗原との接触により起こる抗原と標識抗原の置換反応である請求項１、３、５、７、９のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１２】
被測定物質を電子伝達物質で標識する手段が、不溶化抗体と、この不溶化抗体に抗原抗体反応により結合した電子伝達物質で標識した標識抗原とからなる請求項２、４、６、８、１０のいずれかに記載の測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質の電気化学的分析・測定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
測定対象物質を膜表面に吸着させ、膜抵抗の増加分により測定対象物質の量を測定する方法が知られている。特願平８−５２９１８０号公報の発明である分子膜を用いた味覚センサによる味測定方法もその一例であり、被測定溶液中に所定時間浸漬した際に分子膜に吸着した吸着物質（イオン性のもの）を、分子膜の膜電位または膜抵抗の変化により検出するものである。
【０００３】
また、測定対象物中の特定物質を選択的に検出する方法には抗原抗体反応を利用した方法が多く用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
膜抵抗による検出方法で、測定対象物を広い濃度範囲で測定するためには、少量のイオン性吸着物質の吸着によっても膜電位または膜抵抗が検出できるように、分子膜が絶縁性であること、緻密であることが必用である。そのような分子膜であっても、分子膜の表面に吸着したイオン性物質による膜抵抗（逆数の電気伝導度も同概念）の変化分では、十分な感度が得られないことが課題であった。
【０００５】
また、分子膜に吸着する物質はすべて膜電位または膜抵抗の変化により検出してしまうことも課題であった。
【０００６】
一方、抗原抗体反応を利用する方法では、特定の物質を選択的に測定することが可能となるが、電気化学反応による測定で検出するためには、電気化学的に不活性な抗体または抗原を、電気応答性を持つ標識（マーカー）で修飾する等の手段が必要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このために、本発明の測定方法および測定装置は、高い抵抗（抵抗の逆数は電気伝導度で同概念）を有する絶縁性薄膜表面に吸着した被測定物質（電子伝達物質で標識されている）を、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱することで、絶縁性薄膜の内部に取り込ませ、被測定物質の電子伝達物質による抵抗の低下（電気伝導度の上昇）を検出し、被測定物質を測定する。
【０００８】
このような標識と吸着物質を膜内部にとりこませた膜抵抗の検出方法により、被測定物質を選択的に検出し、感度の高い測定方法が可能となる。また、その装置の提供が可能となるのである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載の本発明は、電子伝達物質で標識した被測定物質を、電極表面に形成した絶縁性薄膜に吸着させ、前記絶縁性薄膜の電気伝導度または抵抗値の変化量を、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱して検出する被測定物質の測定方法であり、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱することで、膜の流動性を高め、絶縁性薄膜の内部に被測定物質取り込ませることにより、電子伝達物質による導通を起こりやすくし、検出感度を高めることができる。
【００１０】
また、請求項２に記載の本発明によれば、上記のような検出感度の高い測定装置を提供することができる。
【００１１】
請求項３または４に記載の本発明は、絶縁性薄膜が、単分子膜あるいは重層膜である測定方法および測定装置であり、膜厚は分子鎖により決定されるため、非常に薄く（膜厚がｎｍのオーダー）かつ均一な膜となり、高感度を安定して保持することができる。
【００１２】
請求項５または６に記載の本発明は、絶縁性薄膜を構成する材料がアルキルチオールで、イオウ原子を介して電極の金属材料と結合する測定装置および測定装置であり、チオール基と電極の金属との反応（吸着結合）により、緻密な単分子膜を容易に作成することができる。またアルキル鎖により絶縁性を発現することができ、アルキル鎖の長さを変化させることにより、絶縁性や流動性を制御することも可能となる。
【００１３】
請求項７または８に記載の本発明は、電子伝達物質が少なくとも陽イオン性または陰イオン性の解離基を有する測定装置および測定装置であり、絶縁性薄膜の内部に取り込まれて導通を起こし、電気応答性を発現できる。
【００１４】
請求項９または１０に記載の本発明は、電気伝導度または抵抗値の変化量の測定が交流印加あるいは直流バイアスを加えた交流印加である測定装置および測定装置であり、交流を印加した際の電流値または抵抗値（または逆数の電気伝導度）として電気応答を外部に取り出すことができる。また直流バイアスを加えることにより、電子伝達物質で標識された被測定物質を、電極側へ押し込むような静電気力が作用するため、より絶縁膜の内部へと被測定物質を取り込ませることができ、検出感度を高めることができる。
【００１５】
請求項１１に記載の本発明は、被測定物質を電子伝達物質で標識する手段が、電子伝達物質で標識され、不溶化抗体に抗原抗体反応により結合した標識抗原と、被測定物質中の抗原とが接触し、抗原と標識抗原の置換反応である請求項１、３、５、７、９のいずれかに記載の測定方法であり、被測定物質中の抗原と標識抗原との置換反応により遊離する標識抗原を、絶縁性薄膜に吸着させ、絶縁性薄膜の電気伝導度または抵抗値の変化量を検出することができる。抗原抗体反応は特異的、選択的であるために、被測定物質中の抗原のみが標識抗原と置換反応を起こすことができる。よって、遊離した標識抗原を検出することにより、被測定物質中の抗原のみを検出することができる。
【００１６】
請求項１２に記載の本発明は、被測定物質を電子伝達物質で標識する手段が、不溶化抗体と、この不溶化抗体に抗原抗体反応により結合した電子伝達物質で標識した標識抗原とからなる請求項２、４、６、８、１０のいずれかに記載の測定装置であり、被測定液中の抗原は標識抗原と置換反応を引き起こして、不溶化抗体に結合し、一方、標識抗原は不溶化抗体から遊離し、絶縁性薄膜に吸着する。遊離した標識抗原を検出することにより、被測定物質中の抗原のみを検出する測定装置とすることができる。
【００１７】
【実施例】
（実施例１）
本発明第１の実施例を、図１をもとに説明する。１は、作用極である金電極で、表面に絶縁性薄膜３を有している。絶縁性薄膜３は、アルキルチオール２を作用極１の金電極に吸着結合させた単分子膜で、イオウ原子１１を介して結合している。電子伝達物質で標識した被測定物質６は７の被測定物質と、８の電子伝達物質を有している。絶縁性薄膜３である単分子膜は、アルキル鎖部分の分子間力によって配向し、均一な膜であるため、電子伝達物質で標識した被測定物質６が絶縁性薄膜３の表面に吸着したとしても、内部まで入り込み、導通を起こすまでには至らない。しかし、絶縁性薄膜３を、形成する材料であるアルキルチオール２の融点以上の温度に加熱することにより、アルキル鎖部分の流動性が増し、８の電子伝達物質は絶縁性薄膜３内に取り込まれて、導電性が付与され、膜抵抗が下がり、（電気伝導度が上がり）、この変化を検出し、被測定液中の抗原濃度の測定を行うのである。９は、１の作用極および図示されていない対極の両電極間を満たす被測定液である電解質水溶液で本測定系から見れば外来物である。電解質濃度は、体液あるいは尿程度の塩濃度を想定している。
【００１８】
本例の絶縁性薄膜３であるアルキルチオール２を用いた単分子膜は、面積１平方センチメートルのもとで１０の８乗オーム程度の高い抵抗を有する。これは電解質のイオン伝導の抵抗（通常は導電率で表される）や、電極表面の抵抗に比べて著しく高く、測定系全体の抵抗は近似的に絶縁性薄膜３の抵抗となっている。電解質水溶液９中の電子伝達物質で標識した被測定物質６は電解質溶液９中を拡散して絶縁性薄膜３に至る。この時、電子伝達物質で標識した被測定物質６の電子伝達物質８は絶縁性薄膜３に吸着し取り込まれて、絶縁性薄膜３に導電性を付与し膜抵抗が下がる（電気伝導度が上がる）。前述のように測定系全体の抵抗は膜抵抗であるので、抵抗の増加分、あるいは電気伝導度の上昇分が吸着による寄与分である。
【００１９】
ところで、絶縁性薄膜３に取り込まれた複数の電子伝達物質８、および電子伝達物質８とベースの絶縁性薄膜３の関係は、抵抗の並列接続回路となる。この場合の計算処理は、電気伝導度を用いると、各部分の電気伝導度の総和が、全膜の電気伝導度となるので計算処理が容易である。すなわち、電子伝達物質で標識した被測定物質６の取り込まれていない絶縁性薄膜３を近似的に電気伝導度ゼロとして、取り込まれた脂溶性イオン伝導性物質の数と電気伝導度が比例関係を持つ。
【００２０】
以上述べたように、本発明の測定法および測定装置は本質的に抵抗（電気伝導度）変化を観測して被測定物質濃度を求めるものである。しかしながら、外部電源（図示せず）に対する応答と考えるならば、一定電圧印加状態での電流値は、電気伝導度と同義であるので、電流を観測しても良いことになる。従って、本発明で言う電気伝導度あるいは抵抗は、膜の抵抗変化を観測するものであればその測定手法あるいは表示の単位系は何であっても良い。
【００２１】
（実施例２）
本発明第２の実施例を図２および図３をもとに説明する。図２は本発明のセンサーの全体構成例を示す図で、本体２４の内部に、筒状の対極４、対極４内に先端を挿入した作用極１を有している。２２は筒状の対極４の内部に粒状の不溶化抗体を充填した不溶化抗体層である。２１は被測定液入り口であって、抗原を含む電解質水溶液である被測定液は、ここより不溶化抗体層２２を毛細管現象により通過し、作用極１の先端に達し、作用極１と接触する。２５は本体２４内部を加熱する加熱手段であるヒータであり、本体内部が作用極１の絶縁性を構成する材料の融点より高い温度になるように加熱する。図示されていないサーミスターを作用極１付近に設けて、温度が所定の温度になるようヒータ２５への入力を制御して温度調節しても良い。
【００２２】
図３は、図２の内部構成を被測定液の移動とともに説明した図で、３１は被測定液９中の抗原で本例の被測定物にあたる。９の被測定液は電解質水溶液であり、本構成例の中では、電解質濃度は、体液あるいは尿程度の塩濃度を想定している。被測定液は毛細管現象により不溶化抗体層２２に入る。ここには、不溶化抗体基材３３の表面に、抗原３１に対応する抗体３２が結合して合わせて不溶化抗体３４を形成しており、さらに、被測定物である抗原と同一の抗原を電子伝達物質で修飾した標識抗原６が抗原抗体反応によりあらかじめ不溶化抗体３４に結合している。
【００２３】
電子伝達物質で標識した被測定物質である標識抗原６の被測定物質である抗原７と、抗原３１は同一物質であり、不溶化抗体３４に対しては同等の結合力を持つ。そのため、不溶化抗体層２２に流入した抗原３１は、不溶化抗体３４と結合した標識抗原６と置換反応を行い、標識抗原６が遊離する。遊離した標識抗原６は、被測定液の移動にともない作用極１に達し、作用極１の絶縁性薄膜３に吸着する。加熱手段であるヒータにより、本体内部が絶縁性を構成する材料の融点より高い温度になるように加熱されているため、絶縁性薄膜のアルキル鎖部分の流動性が増し、標識抗原の電子伝達物質８が絶縁性薄膜３内に取り込まれて、導電性が付与され、膜抵抗が下がる。（電気伝導度が上がる。）この変化を検出し、被測定液中の抗原濃度の測定を行うのである。
【００２４】
（実施例３）
本発明の第三の実施例である、アルキルチオールについて示す。アルキルチオールのチオール基は銀、銅、鉄、タングステンなどの多くの金属に作用して容易に結合し、電極上に容易に単分子膜を形成することができる。そのようにしてできた単分子膜は自己組織化単分子膜と呼ばれる。本発明は、これを応用したものであって、容易に非常に薄い（ｎｍのオーダー）かつ均一な薄膜を電極上に形成することができる。またアルキル鎖部分は、疎水性であるために、形成された薄膜は高抵抗の絶縁性薄膜となる。アルキル鎖長の影響は、鎖長が長くなるほど、絶縁性が上がる。市販されている直鎖アルキルチオールとしては、１−ブタンチオール（炭素数４）、１−ヘキサンチオール（炭素数６）、１−オクタンチオール（炭素数８）、１−デカンチオール（炭素数１０）、１−ドデカンチオール（炭素数１２）、１−ヘプタデカンチオール（炭素数１５）、１−ヘキサデカンチオール（炭素数１６）、１−オクタデカンチオール等がある。
【００２５】
また、末端にアミノ基やカルボン酸基が導入されたタイプのものを用いても同様の効果が得られるものである。市販されている末端がアミノ基タイプの直鎖アルキルチオールは、６−アミノ−１−ヘプタンチオール、８−アミノ−１−オクタンチオール、１１−アミノ−１−ウンデカンチオール等がある。市販されている末端がカルボキシル基タイプの直鎖アルキルチオールは、５−カルボキシ−１−ペンタンチオール、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、１０−カルボキシ−１−デカンチオール等がある。
【００２６】
また、カルボン酸基やアミノ基を末端に持つタイプのものは、それぞれ化学結合するような置換基をもつアルキルを反応させて、２重の脂質膜としても良い。この２分子膜の絶縁性薄膜は、単分子膜と同様に均一であり、単分子膜に次いで感度が高く、単分子膜以上に絶縁耐性が高いものである。
【００２７】
また、末端修飾基がメチル基である単分子膜であっても、長鎖のハイドロカーボンをもつカルボン酸（これは高級脂肪酸とよばれる）あるいは長鎖のハイドロカーボンを持つ１から４級アミンを水中で作用させると、長鎖のハイドロカーボンが単分子層に向けて配向し、カルボキシル基あるいはアミン基が水に向けて配向し、容易に２重層の脂質膜が得られる。
【００２８】
また、２分子膜などの重層膜はＬＢ膜（ラングミュア・ブロジェット膜）を電極上に作成することによってもできる。
【００２９】
（実施例４）
本発明の第四の実施例である電子伝達物質の例を示す。アミノベンゾ−１５−クラウン−５は、クラウン化合物の１種であり、電気陰性度の高い酸素を分子を内側に向け、その内部に大きさの定まった空間を持つ。このため、この空間には、空間の大きさに適合し電気的に陽性の化学種を取り込み易い。本例の１５−クラウン−５構造では、ナトリウムイオンを主に包接する。一方では、クラウン化合物は外側を囲うようにハイドロカーボンを向けており、この部分は疎水性であって油に溶解しやすい。このような性質のためにクラウン化合物は、水溶液から移動して絶縁性薄膜に溶解（吸着）して取り込まれ、絶縁性薄膜内にイオンを持ち込む。このイオン伝導でのイオンの移動は、絶縁性薄膜が薄く、クラウン化合物の分子サイズ程度である場合には、クラウン化合物内部の空間が、絶縁性薄膜の貫通孔となって、イオンの直接通過により行われる。アミノベンゾ−１５−クラウン−５のアミノ基部分は、被測定物質を標識する際に、被測定物質と結合する置換基であれば同様の効果を示すものであり、アミノ基の他に、こはく酸アミド、アセトアミドのようなアミドでも良い。
【００３０】
また、ポルフィリン化合物も、同様に、その内部に金属陽イオンを取り込みアミンとの間に配位結合を形成した金属キレートを形成する。この金属キレートは絶縁性薄膜に取り込まれ、前述抱接化合物と同様に絶縁性薄膜にイオン導電性を与える。
【００３１】
ポルフィリンと類似の構造を持ち、ポルフィリンと同様のイオン伝導性を与える物質であるフタリシアニンでも同様の効果が得られるものである。
【００３２】
また、テトラブチルアミンやトリブチルアミン等、アルキル基を有するアミン類を用いても同様の効果が得られるものである。
【００３３】
（実施例５）
本発明の実施例５を、図４を用いて説明する。図４は、図２に示した本発明の測定装置を用いた測定の、測定温度と応答性の関係を示した図である。被測定溶液として、アミノベンゾ−１５−クラウン−５で標識した１７β−エストラジオールの生理リン酸バッファー溶液を用いて、交流０．０５Ｖを印加し、作用極の電気伝導を測定した。作用極には、１−オクタデカンチオールを用いて絶縁性薄膜を設けた金電極を、対極には白金電極を用いた。加熱手段のヒータを作動させて、測定温度を、２０℃、３０℃、３３℃、３８℃に設定し、それぞれ被測定溶液の濃度を変えて測定を行った。被測定溶液の濃度と電気伝導度の変化分（ΔＧ）の関係を図４に示す。電気伝導度の変化分（ΔＧ）は、被測定物質であるアミノベンゾ−１５−クラウン−５で標識した１７β−エストラジオールを含まない、生理リン酸バッファーのみの測定結果を基準として差し引いたものである。
【００３４】
２０℃、３０℃では、どの濃度においてもΔＧが一定で、被測定物質を検出できていない。３３℃、３８℃になると、ΔＧは濃度に比例して大きくなり、３３℃に比べ３８℃の方が傾きも大きくなり、感度が向上し、また測定できる濃度範囲も広くなっていることが解る。これらの結果は、膜の流動性により説明できる。作用極の絶縁性薄膜を形成している１−オクタデカンチオールの融点は３１〜３５℃であるため、２０℃、３０℃ではアルキル鎖部分が配向して密な状態であり、被測定物質であるアミノベンゾ−１５−クラウン−５で標識した１７β−エストラジオールが内部まで進入できないが、３３℃では部分的に、また３８℃では全体的に流動性が向上することから、被測定物質が内部まで進入することができ、アミノベンゾ−１５−クラウン−５に起因する電気伝導性が付与されたものと考えられる。
【００３５】
（実施例６）
本発明の実施例６を、図５を用いて説明する。図５は、図２に示した本発明の測定装置を用いた測定の、直流バイアスと応答性の関係を示した図である。測定に用いた被測定溶液、測定装置、測定条件等は、前記実施例５と同様である。測定温度は３８℃に固定して行った。作用局側がマイナスになるように直流バイアスを印加し、電位が０〜１．４Ｖの範囲で測定を行った。被測定溶液の濃度と電気伝導度の変化分（ΔＧ）の関係を図５に示す。印加する直流バイアスを大きくするほど、感度が向上し、また測定できる濃度範囲も広くなっていることが解る。被測定物質のアミノベンゾ−１５−クラウン−５部分に抱接されているナトリウムイオンが作用極に引きつける静電気力がバイアスを大きくするほど効果的に作用しているためと考えられる。
【００３６】
【発明の効果】
以上のように、本発明の測定方法および測定装置は、高い抵抗（抵抗の逆数は電気伝導度で同概念）を有する絶縁性薄膜表面に吸着した被測定物質（電子伝達物質で標識されている）を、絶縁性薄膜を構成する材料の融点より高い温度に加熱することで、絶縁性薄膜の内部に取り込ませ、被測定物質の電子伝達物質による抵抗の低下（電気伝導度の上昇）を検出することで、感度の高い測定方法が可能となる。また、その装置の提供が可能となるのである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１の構成図
【図２】本発明の実施例２の全体構成図
【図３】本発明の実施例２の内部構成を被測定液の移動とともに説明した図
【図４】本発明の測定装置を用いた測定の、測定温度と応答性の関係を示した図
【図５】本発明の測定装置を用いた測定の、直流バイアスと応答性の関係を示した図
【符号の説明】
１　作用極
２　アルキルチオール
３　絶縁性薄膜（単分子膜）
４　対極
６　電子伝達物質で標識した被測定物質
７　被測定物質
８　電子伝達物質
９　電解質溶液
１１　イオウ原子
２２　不溶化抗体層
２５　加熱手段（ヒータ）
３１　抗原（被測定液中）
３２　抗体
３３　不溶化基材
３４　不溶化抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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