(57)【要約】【課題】ステロイド感受性を判定する臨床検査法として，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβに対する選択性の高いモノクローナル抗体を作成して，酵素抗体法による測定系を提供すること。【解決手段】ヒトグルココルチコイドリセプターを免疫学的にアッセイする方法であって，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体と、ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体とを用いることを特徴とする方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトグルココルチコイドリセプターを免疫学的にアッセイする方法であって，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体と，ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体とを用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体が，ヒトグルココルチコイドリセプターβのＣ末端領域を認識することを特徴とする，請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体が，ヒトグルココルチコイドリセプターのＮ端側１−３６７のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を認識する，請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体が，ヒトグルココルチコイドリセプターβのアミノ酸配列７２７−７４２を含むＣ末端領域を認識する，請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
測定をサンドイッチ法により，酵素免疫学的に行うものであることを特徴とする請求項１−４のいずれか一記載の方法。
【請求項６】
ヒトグルココルチコイドリセプターのＮ端側１−３６７のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を認識し，ヒトグルココルチコイドリセプタープロと免疫反応するモノクローナル抗体。
【請求項７】
ヒトグルココルチコイドリセプターαのアミノ酸配列７２７−７７７を含むＣ末端領域を認識し，ヒトグルココルチコイドリセプターβと免疫反応しないモノクローナル抗体。
【請求項８】
ヒトグルココルチコイドリセプターβのアミノ酸配列７２７−７４２を含むＣ末端領域を認識し，ヒトグルココルチコイドリセプターαと免疫反応しないモノクローナル抗体。
【請求項９】
ヒトグルココルチコイドリセプターの検出限界値が０．１ｎｇ／ｍｌである，請求項６−８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
ヒトグルココルチコイドリセプターの検出限界値が０．０１ｎｇ／ｍｌである，請求項６−８のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ヒトグルココルチコイドリセプターを免疫学的にアッセイするキットであって，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体と，ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体とを含むキット。
【請求項１２】
ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体が，ヒトグルココルチコイドリセプターβのＣ末端領域を認識することを特徴とする，請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体が，ヒトグルココルチコイドリセプターのＮ端側１−３６７のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を認識する，請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体が，ヒトグルココルチコイドリセプターβのアミノ酸配列７２７−７４２を含むＣ末端領域を認識する，請求項１１−１３のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，ステロイド耐性を判定する方法に関する。より詳細には，本発明は，抗ヒトグルココルチコイドリセプターを認識するモノクローナル抗体，及びそのモノクローナル抗体を用いて，検体中に存在するヒトグルココルチコイドリセプターβを定量する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ステロイド剤は気管支喘息，膠原病，ネフローゼ，炎症性腸疾患，アレルギー疾患など非常に広い範囲の疾患に効果を示す抗炎症剤であり，難病といわれる特定疾患にも著効を示す場合がある。しかし，ステロイド剤は使用が長期にわたることが多く，長期使用により薬剤感受性が低下し，全く効果を示さないステロイド耐性に陥る事が少なからずある。このような場合，ステロイド剤は副作用が強いことから，投与したステロイド自体がかえって病態を悪化させる。また，特にリンパ性白血病などの血液腫瘍では，ステロイド自体が細胞殺作用を有する化学療法剤としても使われるが，投与を繰り返すうちに腫瘍細胞がステロイドに対して耐性となることもしばしば経験されている。そこで医療現場ではステロイド感受性の診断法の確立が求められている。
【０００３】
ステロイドの感受性を事前に診断する臨床検査薬は現時点で販売されていない。現在医療現場ではステロイドの耐性を，ステロイド剤投与後にその効果で判断せざるを得ない状況にある。ステロイドには耐性という問題以外に，全身性の副作用が問題となる。ステロイド耐性患者ではその薬理効果が損なわれるにも係わらず，全身性の副作用は残存するという不都合な点がある。ステロイド耐性の事前診断には，不用な薬剤の投与という医療経済的な側面に加えて，無意味な副作用を抑制するという有用性もある。
【０００４】
ステロイドの薬効メカニズムはステロイドが古い薬物であるにも関わらず，現在でも不明な点が多い。しかし近年の分子生物学の進歩により，図１に示すようなメカニズムが考えられている。すなわち，脂溶性の性質を有するステロイド（グルココルチコイドＧＣ）は，細胞膜を通過して細胞質に入ると，その受容体タンパク質であるグルココルチコイドレセプターαアイソフォーム（ＧＲα）に結合する。このＧＣ−ＧＲαは，ホモダイマーを形成し，（１）核に移行，サイトカイン遺伝子などの転写制御領域にあるＤＮＡ上の結合部位ＧＲＥ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）と結合し，対象遺伝子の転写を制御する，（２）種々の遺伝子の転写を活性化する転写因子ＮＦ−κＢを，その阻害因子であるＩ−κＢの合成を亢進させて抑制し，ＮＦ−κＢで活性化される遺伝子発現を抑制する，（３）同様の転写因子ＡＰ−１と結合して不活化し，ＡＰ−１によって活性化される遺伝子発現を抑制する，などの機序で，主に免疫反応を亢進させる遺伝子の発現を抑制すると考えられている。
【０００５】
この機能的受容体であるＧＲαときわめて構造の類似したグルココルチコイドレセプターβアイソフォーム（ＧＲβ）が存在することが知られている。このＧＲβはＧＣと結合するドメインを欠く構造をもっており，ＧＲαと結合してヘテロダイマーを形成し，ＧＲαホモダイマー形成を阻害する優性阻害型の拮抗作用を発揮してＧＣの生物活性を抑制すると考えられている（図１）。
【０００６】
この２つのアイソフォームは，同一のＧＲ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ  ｍＲＮＡ）から選択的スプライシングといわれる選択的ＲＮＡプロセシングによってＧＲα，ＧＲβをコードする特異的ｍＲＮＡが生成され，タンパク質合成が起こることが知られてきた（図２）。この選択的ＲＮＡプロセシングを行う酵素は未だ同定されていない。またステロイドの作用メカニズムの内，その耐性に最も関係しているものは，上述のＡＰ−１を介したメカニズムであるとの報告もある。
【０００７】
本発明者らは，ステロイド剤が治療の第一選択薬である炎症性腸疾患の一つである潰瘍性大腸炎患者において，ステロイドに反応しない症例では末梢血単核球のＧＲα特異的ｍＲＮＡ，ＧＲβ特異的ｍＲＮＡの発現及び，ＧＲαタンパク質，ＧＲβタンパク質の発現が容易に検出されること，一方ステロイドで症状が改善する感受性症例ではＧＲα特異的ｍＲＮＡ，ＧＲαタンパク質のみが検出されてＧＲβ特異的ｍＲＮＡ，ＧＲβタンパク質は検出されないこと，すなわちＧＲβ特異的ｍＲＮＡ，ＧＲβタンパク質の出現がステロイド耐性のマーカーであることを報告した（Ｈｏｎｄａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０００；  １１８：８５９−８６６）。また，その後ＧＲ  ｍＲＮＡについてキャピラリー  ＰＣＲを用いて定量解析したところ，ステロイド耐性患者末梢血単核球では，ＧＲα特異的ｍＲＮＡの発現量は不変で，ＧＲβ特異的ｍＲＮＡの発現量の増大が認められることが明らかとなった。従ってＧＲβタンパク質もステロイド抵抗性症例では増加していることが考えられる。しかし，タンパク質レベルでＧＲα，ＧＲβの定量を行うためには，ＧＲα，ＧＲβをそれぞれ選択的，特異的に認識する強い力価の抗体が必要である。ＧＲα，ＧＲβをそれぞれ選択的，特異的に認識する抗体は市販され，またその使用の報告もある（Ｈｅｃｈｔ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７；  ２７２：  ２６６５９−２６６６４；  Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；  １０６：  ４７９−４８４；  Ｇｏｕｇａｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２００２；  ８０：  ３０９−３１８）。しかし、それらの抗体は力価が弱いためにウェスタンブロッティングでの使用に制限されており，実質的に酵素抗体法による定量が行えないため，これまでタンパク質レベルでの定量を行うことができなかった。
【０００８】
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【特許文献１】
ＵＳＰ  ５７７０１７６
【非特許文献１】
Ｈｏｎｄａ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２０００；  １１８：８５９−８６６
【非特許文献２】
Ｈｅｃｈｔ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７；  ２７２：  ２６６５９−２６６６４
【非特許文献３】
Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００；  １０６：  ４７９−４８４
【非特許文献４】
Ｇｏｕｇａｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．  ２００２；  ８０：  ３０９−３１８
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は，ステロイド感受性を判定する臨床検査法として，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβに対する選択性の高いモノクローナル抗体を作成して，酵素抗体法による測定系を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は，ヒトグルココルチコイドリセプターを免疫学的にアッセイする方法を提供する。該方法は，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体と，ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体とを用いることを特徴とする。好ましくは，ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体は，ヒトグルココルチコイドリセプターβのＣ末端領域を認識する。
【００１１】
本発明の好ましい態様においては，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識する上述のモノクローナル抗体は，ヒトグルココルチコイドリセプターのＮ端側１−３６７のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を認識する。また好ましくは，ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しない上述のモノクローナル抗体は，ヒトグルココルチコイドリセプターβのアミノ酸配列７２７−７４２を含むＣ末端領域を認識する。
【００１２】
特に好ましくは，本発明の方法は，測定をサンドイッチ法により，酵素免疫学的に行う。
【００１３】
別の観点においては，本発明は，ヒトグルココルチコイドリセプターのＮ端側１−３６７のアミノ酸配列を含むＮ末端領域を認識し，ヒトグルココルチコイドリセプタープロと免疫反応するモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた，ヒトグルココルチコイドリセプターαのアミノ酸配列７２７−７７７を含むＣ末端領域を認識し，ヒトグルココルチコイドリセプターβと免疫反応しないモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた，ヒトグルココルチコイドリセプターβのアミノ酸配列７２７−７４２を含むＣ末端領域を認識し，ヒトグルココルチコイドリセプターαと免疫反応しないモノクローナル抗体を提供する。
【００１４】
好ましくは，本発明のモノクローナル抗体は，ヒトグルココルチコイドリセプターの検出限界値が０．１ｎｇ／ｍｌであり，より好ましくは０．０１ｎｇ／ｍｌである。
【００１５】
また別の観点においては，本発明は，ヒトグルココルチコイドリセプターを免疫学的にアッセイするキットであって，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを認識するモノクローナル抗体と，ヒトグルココルチコイドリセプターβを認識するがヒトグルココルチコイドリセプターαを認識しないモノクローナル抗体とを含むキットを提供する。
【００１６】
本発明の方法を用いることにより，末梢血試料を用いてヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβを定量し，臨床の現場でステロイド耐性・感受性を簡便に判定することができる。本発明のモノクローナル抗体はさらに，組織や細胞の免疫学的染色のための研究用試薬としても有用である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は，グルココルチコイドリセプターαとβとを区別して認識することができる。ＧＲβｍＲＮＡ，ＧＲβタンパク質の出現がステロイド耐性のマーカーであることから，本発明のモノクローナル抗体を用いて，ステロイドに対する耐性・感受性を判定することができる。
【００１８】
グルココルチコイドリセプターαおよびβの構造は，Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３１８，  ６３５−６４１，  １９８５）およびＥｎｃｉｏら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｈｍ．  ２６６，  ７１８２−７１８８，  １９９１）に記載されている。αおよびβは，共通のＮ末端領域を有し，Ｃ末端領域においてのみ異なる。したがって，αおよびβのそれぞれのＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体を用いることにより，αおよびβの存在を特異的に検出することができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は，ヒトグルココルチコイドリセプターで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞（脾臓細胞，リンパ節等）と，ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し，所望の反応特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択し，このハイブリドーマから常法により調製することができる。本発明のモノクローナル抗体を得るためには，ｈＧＲαβ共通領域，ｈＧＲαＣ端固有領域またはｈＧＲβＣ端固有領域のそれぞれに対応するヒトグルココルチコイドリセプターフラグメントを調製し，これを免疫原として用いる。
【００２０】
免疫原として用いられるヒトグルココルチコイドリセプターは，ヒトグルココルチコイドリセプターをコードする遺伝子を用いて組み換え的に製造することができる。ヒトグルココルチコイドリセプターをコードする遺伝子の既知の塩基配列にしたがい，適当なヒトｃＤＮＡをテンプレートとして用いて，ＰＣＲによりヒトグルココルチコイドリセプターの所望の領域をコードする遺伝子をクローニングすることができる。これを発現ベクターに挿入して適当な宿主に導入し，組換えヒトグルココルチコイドリセプターを発現させることができる。
【００２１】
組換えタンパク質の製造および精製は，当該技術分野において知られる任意の方法を用いることができる。精製を容易にするために，適当なタグを付加した融合タンパク質として発現させてもよい。例えば，ヒトグルココルチコイドリセプターをＨｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質として発現させれば，アフィニティークロマトグラフィーを用いて容易に精製することができ，次にエンテロキナーゼ処理によりＨｉｓ−Ｔａｇ部分を容易に除去することができる。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るためには，上述のようにして製造した組換えヒトグルココルチコイドリセプターまたはそのフラグメントを免疫原として哺乳動物の皮下または腹腔内に注射する。免疫する動物としては，マウス，ラット，ヤギ，ヒツジ，ウサギ等の哺乳動物を用いることができる。免疫応答性を高めるために，必要に応じて完全フロインドアジュバント，ＲＩＢＩアジュバントなどのアジュバントを用いてもよい。免疫した動物の抗体価をモニターし，抗体価の上昇した動物から脾臓細胞を採取し，マウスミエローマ細胞と融合させる。マウスミエローマ細胞としては，ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損等の選択マーカーを有するものを用いる。融合は，当該技術分野において知られる方法を用いて行なうことができ，融合促進剤としてポリエチレングリコール，センダイウイルス等を用いてもよい。
【００２３】
細胞融合の後，ハイブリドーマのみが生育できるＨＡＴ培地等の選択培地で培養することによりハイブリドーマを選択し，ＥＬＩＳＡ法を用いて所望の抗体を産生するか否かを測定する。ＥＬＩＳＡ法は当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって行うことができる。免疫原として用いたヒトグルココルチコイドリセプターまたはそのフラグメントをプレート上に結合させ，ハイブリドーマの培養上清を反応させる。次に酵素等で標識した抗マウス抗体を用いて抗体を検出することにより，所望の抗体を産生するコロニーを選択する。次に得られたハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングして，本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００２４】
ヒトグルココルチコイドリセプターβ特異的モノクローナル抗体を得るためには，ｈＧＲα組換えタンパク質およびｈＧＲβ組換えタンパク質をそれぞれプレートに固定化して各ハイブリドーマの上清を反応させ，ｈＧＲβに結合するがｈＧＲαには結合しないハイブリドーマを選択する。同様にして，ヒトグルココルチコイドリセプターα特異的モノクローナル抗体，およびｈＧＲαとｈＧＲβとの両方を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ選択することができる。
【００２５】
得られたハイブリドーマはＲＰＭＩ１６４０培地などの適当な培養液で培養して増殖させ，その培養上清から１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。また，大量に抗体を得るためには，あらかじめプリスタンを投与したマウスの腹腔にハイブリドーマを移植することにより，モノクローナル抗体を含む腹水を得ることができる。このようにして得られるモノクローナル抗体は，さらにアフィニティー精製，イオン交換クロマトグラフィー，限外濾過などにより精製してもよい。また，本発明のモノクローナル抗体から，Ｆ（ａｂ′）２，Ｆａｂ′，Ｆａｂ等のフラグメントを調製して用いてもよく，あるいはキメラ抗体を作製してもよい。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体は，ヒトグルココルチコイドリセプターαおよびβの検出に有用である。検出は例えば，当該技術分野においてよく知られるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により行うことができる。サンドイッチ法においては，本発明のモノクローナル抗体をプレート等の表面に固定化し，これに検体中のグルココルチコイドリセプターを結合させ，次に酵素等で標識した本発明のモノクローナル抗体を用いてグルココルチコイドリセプターをサンドイッチした後に，結合した酵素の量を測定することにより検体中のグルココルチコイドリセプターを検出する。
【００２７】
サンドイッチ法においては，バックグラウンドを低下させるために，固定化抗体と標識抗体とは異なるものを用いることが好ましい。すなわち，本発明の方法の好ましい態様においては，固定化抗体としてヒトグルココルチコイドリセプターのＮ末端領域を認識するモノクローナル抗体を用い，標識抗体としてヒトグルココルチコイドリセプターβのＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体を用いる。あるいは，逆に，固定化抗体としてヒトグルココルチコイドリセプターβのＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体を用い，標識抗体としてヒトグルココルチコイドリセプターのＮ末端領域を認識するモノクローナル抗体を用いてもよい。
【００２８】
サンドイッチ法において用いるための標識としては，酵素標識（ペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ等），放射性標識，蛍光標識，化学発光標識，着色コロイド標識等を利用することができる。本発明のモノクローナル抗体に標識を結合させる方法，ならびに発色試薬等を用いてこれらの標識を定量する方法は，当該技術分野においてよく知られている。
【００２９】
また，本発明の方法においては，サンドイッチ法の代わりに競合法を用いてもよい。また，本発明のモノクローナル抗体をラテックス等の担体に結合させ，ラテックス凝集免疫測定法を用いてヒトグルココルチコイドリセプターを検出してもよい。あるいは，本発明のモノクローナル抗体は，カートリッジ式の簡易検出装置において用いてもよい。
【００３０】
【実施例】
以下に実施例を掲げ，本発明を具体的に説明するが，本発明はこれら実施例に限定されず，様々な実施形態が可能であり，本発明は本明細書及び図面に開示の思想に従ったものであるかぎり，すべての実施形態を包含することは理解されるべきである。
【００３１】
実施例１ 組換え体抗原の作製
組換え体抗原の作製のために用いた種々のプラスミドを図３−７に示す。グルココルチコイドリセプターのＤＮＡ配列は，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０３２２５（配列番号７）およびＸ０３３４８（配列番号８）に基づく。
ｈＧＲ遺伝子のクローニング
ヒトリンパ球由来ｃＤＮＡを鋳型に用いて，ＧＲα遺伝子を３ブロックに分け，ＰＣＲを行い遺伝子を増幅した。すなわち，３ブロックについて各ブロック特異的なプライマーの組み合わせでＰＣＲを実施した。なお，ＰＣＲ増幅にはＫＯＤ’  ＤＮＡ  ポリメラーゼを使用した。得られた，増幅ＤＮＡはアガロース電気泳動で精製し，断片を制限酵素マッピング，配列確認後，断片をベクターｐＣＲ２．１に挿入し，クローニングした。得られた，クローンＴ１（ｐＧＲ００３），Ｋ２（ｐＧＲ００４），Ｋ３（ｐＧＲ００５）は制限酵素マッピングにより挿入断片を確認後，ＤＮＡ  シークエンシングにより全配列の確認を行った。遺伝子組換えを行ない，３ブロックに分けたグルココルチコイドリセプター遺伝子を繋ぎ合せ，Ｔ７系プローモーターを有するｐＥＴ３系ベクターに挿入した。ＧＲＮｄｅＳ，ＢＣＸＰＡＳ  プライマーを用いＰＣＲによりｐＧＲ００３（Ｔ１）遺伝子を増幅した。目的断片４６８ｂｐは増幅され，ＸｂａＩ，ＮｄｅＩ消化した。消化断片は１．５％アガロースゲル電気泳動上で分離され，Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットで精製した。ｐＵＣ１８をＮｄｅＩ，ＸｂａＩで消化し，約２．５ｋｂｐのバンドをアガロースＧｅｌから精製した。この切断ベクターと上記精製断片を，ＴＡＫＡＲＡ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎキットでライゲーションした。このライゲーション溶液を直接大腸菌に形質転換した。ｐＧＲ００７をメチラーゼ産生が無い大腸菌株Ｅｐｉｃｕｌｉａｎ  ｃｏｌｉ  ＳＣＳ−１０１に形質転換し，ＸｂａＩで消化した。その結果，目的通り切断された。非メチル化ｐＧＲ００７をＢａｎＩＩＩ，ＸｂａＩで消化した。ｐＧＲ００５（Ｋ３）をＢａｎＩＩＩ，ＸｂａＩで消化した。ｐＧＲ００７消化物はフェノール処理後ＭｉｃｒｏｓｐｉｎＧ２５により精製した。ｐＧＲ００５消化物はアガロースゲルから切り出し，Ｇｅｎｅｃｌｅａｎにより精製した。精製した両ＤＮＡをライゲーション後，大腸菌ＤＨ５ａに形質転換して，プラスミドｐＧＲ００８を得た。ｐＧＲ００８及びｐＧＲ００４（Ｋ２）をＢａｎＩＩＩ，ＸｂａＩ消化し，精製，ライゲーション，形質転換を行い，ＨｉｎｄＩＩＩで消化したときに目的サイズ（４１３４，５５４，３６８ｂｐ）のバンドを与えるプラスミドｐＧＲ００９を得た。ｐＧＲ００９および発現用ベクターｐＥＴ３ａをＮｄｅＩ，ＢａｍＨＩでそれぞれ消化し，ｐＧＲ００９由来２．３ｋｂｐ断片を精製，ｐＥＴ３ａにライゲーションし，形質転換を行い，プラスミドｐＧＲ０１１を得た。順方向，逆方向から各３種のプライマーによりジデオキシ法でシークエンシングして，目的配列と一致することを確認した。
【００３２】
ｈＧＲβ完全長発現遺伝子の構築
次に示すプライマーＧＲＢＳ，ＧＲＢＡＳでｈＧＲβ固有領域の遺伝子をＰＣＲ法で増幅した。
ＧＲＢＳ：ＣＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣ
ＧＲＢＡＳ：ＣＣＡＣＧＴＡＴＣＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣ
鋳型にはヒトリンパ球由来ｃＤＮＡを用いた。得られた増幅産物３５０ｂｐをｐＣＲ２．１ベクターにクローニングし，これをｐＧＲ００６とした。ＰＧＲ００６およびｐＧＲ０１１を制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＢａｍＨＩで消化し，ＰＣＲ由来断片２５６ｂｐを精製し，ｐＧＲ０１１ベクター部分にライゲーションし，形質転換を行い，プラスミドｐＧＲ０１２を得た。このプラスミドをジデオキシ法によりシークエンシングして，目的配列と一致することを確認した。
【００３３】
ｈＧＲα，β共通領域（Ｎ端領域）発現遺伝子の構築
ｈＧＲα発現遺伝子ｐＧＲ０１１のＤＮＡ結合領域より上流に５１８９ｂｐ目のＣをＴに置換し，Ｓｔｏｐコドンを新設し，また同様に５１９７ｂｐ目のＴをＣに換え，ＢａｍＨＩ認識配列を新設する目的で部位特異的突然変異を行った。
以下のプライマーを用いた。
ＳＴＰ５１９１Ｓ：  ＧＧＴＧＣＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＣＴＴＧＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＧ
ＳＴＰ５１９１Ａ：  ＧＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＡＴＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴ  ＴＣＧＧ
このプラスミドをｐＧＲ０１５とした。このｐＧＲ０１５をＢａｍＨＩ消化し，アガロースゲル電気泳動による精製で５．５ｋｂｐのバンドを精製した。このバンドをセルフライゲーションさせて，プラスミドｐＧＲ０１８を得た。
【００３４】
ｈＧＲαＣ端固有領域発現遺伝子の構築
ｈＧＲα発現遺伝子ｐＧＲ０１１のＤＮＡ結合領域より下流５６７６ｂｐ目のＣをＡに，５６７９ｂｐ目のＣをＴに，５６８０ｂｐ目のＣをＧに置換し，ＮｄｅＩ認識配列を新設する目的で部位特異的突然変異を行った。
以下のプライマーを用いた。
ＮＤＥ５６７８Ｓ：ＣＧＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＧＧＡＧＧ
ＮＤＥ５６７８Ａ：ＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＡＧＴＴＧＴＧＧＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＧ
このプラスミドをｐＧＲ０１６とした。このｐＧＲ０１６をＮｄｅＩ消化し，アガロースゲル電気泳動による精製で５．５ｋｂｐのバンドを精製した。このバンドをセルフライゲーションして，プラスミドｐＧＲ０１９を得た。
【００３５】
ｈＧＲβＣ端固有領域発現遺伝子の構築
ｐＧＲ０１９制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ，ＢａｍＨＩで消化し，上記ｐＧＲ００６由来３５０ｂｐ断片を精製し，ｐＧＲ０１９ベクター部分にライゲーションして，プラスミドｐＧＲ０２０を得た。
【００３６】
Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質発現遺伝子の作製
Ｈｉｓ−Ｔａｇ合成遺伝子は２本鎖を作るためにアニーリングし，この後ＮｄｅＩ消化した。このＮｄｅＩ消化断片を精製し，それぞれ制限酵素ＮｄｅＩで完全消化したｐＧＲ０１８，ｐＧＲ０１９およびｐＧＲ０２０とライゲーションして，Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質をコードするプラスミドｐＧＲ０２４，ｐＧＲ０２５およびｐＧＲ０２６を得た。
【００３７】
Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ｈＧＲαβ共通領域融合タンパク質の精製
ｐＧＲ０２４のＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＩＬ形質転換体を１０ｍｌのＭ９ＺＢ培地で３７℃振盪培養した。約５時間後濁度を測定しそれぞれの５５０ｎｍの吸光度が０．６〜０．８である事を確認し，ＩＰＴＧを添加した。添加後同条件で３時間培養し，６ｍｌ分菌体を遠心分離により回収した。菌体を１ｍｌの８Ｍ  尿素，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．８（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）で懸濁した。懸濁液をＴＯＭＹ精工社製超音波発生装置により超音波破砕し，１５０００ｒｐｍ，５分間４℃で遠心分離し，上清を回収した。
【００３８】
この上清をアフィニティークロマトグラフィーにアプライした。アフィニティークロマトグラフィーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎを使用した。予め１ｍｌのゲルをカラムに充填し，１０ｍｌのＢｕｆｆｅｒ  Ａで平衡化しておき，ここに上記菌体抽出液をアプライした。８ｍｌの同バッファーで洗浄し，次いで２ｍｌの８Ｍ  尿素，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ６．５（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）で洗浄後，８Ｍ  尿素，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ４．０（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ）で溶出した。溶出液は１ｍｌずつ分画した。溶出液の２８０ｎｍ吸光度を測定した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。溶出液はシングルバンドであった。Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ｈＧＲαβ融合タンパク質は抽出液から１工程で精製されることが確認された。
【００３９】
Ｈｉｓ−Ｔａｇ部分の切り出し
Ｈｉｓ−Ｔａｇ融合タンパク質をエンテロキナーゼ処理したところ，処理物はＰｒｏＢｏｎｄカラムを素通りし，Ｈｉｓ−Ｔａｇ部分が除去されたことが確認された。
【００４０】
Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ｈＧＲα，およびＨｉｓ−Ｔａｇ−ｈＧＲβ融合タンパク質の精製
ｐＧＲ０２５あるいはｐＧＲ０２６のＨＭＳ１７４（ＤＥ３）形質転換体を５ｍｌ×１０本のＭ９ＺＢ培地で３７℃振盪培養した。約５時間後濁度を測定しそれぞれの５５０ｎｍの吸光度が０．６〜０．８である事を確認し，ＩＰＴＧを添加した。添加後同条件で３時間培養し，５０ｍｌ分菌体を遠心分離により回収した。菌体を５ｍｌの６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．８で懸濁した。懸濁液をＴＯＭＹ精工社製超音波発生装置により超音波破砕し，１５０００ｒｐｍ，５分間４℃で遠心分離し，上清を回収した。この上清をアフィニティークロマトグラフィーにアプライした。アフィニティークロマトグラフィーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＰｒｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｒｅｓｉｎを使用した。予め１ｍｌのゲルをカラムに充填し，１０ｍｌの８Ｍ  尿素，  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ，  ２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ７．８で平衡化しておき，ここに上記菌体抽出液をアプライした。８ｍｌの同バッファーで洗浄し，次いで２ｍｌの８Ｍ  尿素，２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ６．５（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）で洗浄後，さらに８Ｍ  尿素，２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ５．０（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄ）で洗浄した。この後８Ｍ  尿素，２０ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ５．０（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ）溶出した。溶出液は１ｍｌずつ分画した。溶出液の２８０ｎｍ吸光度を測定した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【００４１】
実施例２ヒトグルココルチコイドリセプターαβ共通領域モノクローナル抗体の作製
ｐＧＲ０２４組換え体の免疫
免疫には，マウス３匹（Ｂａｌｂ／ｃ×３）を用いた。ｈＧＲ組換え体を１匹あたり５０μｇを腹腔内に免疫した。アジュバントとしては，ＲＩＢＩ杜のＭＰＬ＋ＴＤＭ  ＥＭＵＬＳＩＯＮを使用し，抗原とアジュバントを容量１：１で混合し，免疫した。免疫スケジュールとして５回免疫後にチェック採血を行い抗体価の上昇をＥＬＩＳＡにて確認した。
【００４２】
力価測定
５回免疫後チェック採血についてｈＧＲ組換え体抗原固相化プレートを作製し，力価測定に供した。プレートについては，抗原１μｇ／ｍ１の濃度で使用した。またアッセイは室温で，血清（一次）反応１ｈｒ，標識抗体（二次）反応１ｈｒ，ＴＭＢによる発色２分で行った。各個体において力価の上昇が確認された。このうち，最も高い力価を示した個体についてアジュバントを含まない抗原（５０μｇ）で追加免疫を行い，以下に記載するようにフュージョンを行った。
【００４３】
フュージョン
マウスから脾臓を摘出し，ＤＭＥＭ培養液下で，ホモジネイトを行った。細胞懸濁液を遠心分離（１０００回転，１０分）し，上清除去後，ペレットをＤＭＥＭ培養液に再懸濁した。細胞懸濁液をあらかじめ用意したマウスハイブリドーマ（Ｐ３Ｕ１）細胞懸濁液と混合し，遠心を行った（１０００回転，１０分間）。上清除去後，フュージョン溶液（ＰＥＧ４０００  １ｍ１，ＤＭＳＯ  ０．３ｍ１，ＤＭＥＭ  １ｍ１）下で，ピペットの撹絆操作を行い，更にＤＭＥＭを添加した。遠心分離（８００回転，１０分間）により得られた細胞を上清除去後，ＨＡＴ培養液に懸濁した。ついで９６ウエルプレート５枚に滴下し（１０ｍ１ピペット，各２滴），ＨＡＴ培地下で２週間培養を行った。培養２週間後，コロニーを確認し，事前に作製したＥＬＩＳＡプレート（ｐＧＲ０２４組換え体抗原１μｇ／ｍ１固相化）にてアッセイを行った。結果として，９６ウエル×５枚のうち，５個のウエルにＩｇＧとしての発色が確認された。
【００４４】
限界希釈
発色が確認された５クローンのうち，２クローンについて限界希釈により上述のＥＬＩＳＡでモノクローン化を行った。発色が確認されたウエルについて細胞をパスツールピペットで懸濁し，ＰＲＭＩ／ＨＴ培地に希釈した。希釈したハイブリドーマを９６ウエルプレートに滴下し，約２週間培養を行った。コロニー確認後，上述のＥＬＩＳＡにて発色を確認した。ウエルにおいて単一のクローンと確認されるまで，作業を繰り返し行った。ただし二回目以降の培地はＲＰＭＩ／１５％ＦＣＳを用い，最終的にはＰＲＭＩ／１０％ＦＣＳとした。最終的にクローンが単一であることが確認されたので，上述のＥＬＩＳＡの系にて２クローンの発色を確認した。各クローンともに，高い発色が確認された。これらのクローンについて細胞ストックを行った。細胞ストックは以下の手順に従った。十分に増殖が確認された細胞を１５ｍ１チューブに移し遠心（１０００回転，５分）した。上清除去後，細胞凍結保存液セルバンカー（ダイアヤトロン）中に懸濁し，５本のセラムチューブに分注を行った後，直ちに一８０℃フリーザーにストックした。３日後，ストックした５本のうち，１本をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳに起こし，細胞の増殖，上清中の活性を確認した。ストック後の細胞にも活性が確認された。
【００４５】
実施例３ ヒトグルココルチコイドリセプターα特異的モノクローナル抗体の作製
ヒトグルココルチコイドリセプターα特異的モノクローナル抗体作成のための免疫原としてはｐＧＲ０２５組換え体を使用した。免疫方法，力価測定，フュージョン，限界希釈は実施例２と同じ方法で実施した。ヒトグルココルチコイドリセプターα特異的クローンの選択には以下の方法を用いた。ｐＧＲ０２５由来ヒトグルココルチコイドリセプターα組換え体を１μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートと，ｐＧＲ０２６由来ヒトグルココルチコイドリセプターβ組換え体を１μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートをそれぞれ用意し，各々のプレートに選択するクローンの培養上清を反応させた。抗体の検出はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体で実施した。ＨＲＰの発色はＴＭＢ基質により行った。ｈＧＲα特異的抗体の選択は，ｈＧＲα組換え体プレートに陽性を示し，ｈＧＲβ組換え体プレートには陰性を示す事を指標に，クローンを限界希釈することで実施した。
【００４６】
実施例４ ヒトグルココルチコイドリセプターβ特異的モノクローナル抗体の作製
ヒトグルココルチコイドリセプターβ特異的モノクローナル抗体作成のための免疫原としてはｐＧＲ０２６組換え体を使用した。免疫方法，力価測定，フュージョン，限界希釈は実施例２と同じ方法で実施した。ヒトグルココルチコイドリセプターβ特異的クローンの選択には以下の方法を用いた。ｐＧＲ０２５由来ヒトグルココルチコイドリセプターα組換え体を１μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートと，ｐＧＲ０２６由来ヒトグルココルチコイドリセプターβ組換え体を１μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートをそれぞれ用意し，各々のプレートに選択するクローンの培養上清を反応させた。抗体の検出はＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体で実施した。ＨＲＰの発色はＴＭＢ基質により行った。ｈＧＲβ特異的抗体の選択は，ｈＧＲβ組換え体プレートに陽性を示し，ｈＧＲα組換え体プレートには陰性を示す事を指標に，クローンを限界希釈することで実施した。
【００４７】
実施例５ モノクローナル抗体の精製
得られた各ハイブリドーマをＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に１匹当たり０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤プリスタン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍ．製）を腹腔内投与した。１〜３週間後に，各ハイブリドーマ１×１０７  個を同じく腹腔内投与し，さらに，その１〜２週間後に４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む腹水が得られた。抗体含有各腹水を，アフィゲル  プロテインＡ  ＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて精製した。
【００４８】
実施例６ ヒトグルココルチコイドリセプターα及びβの定量
酵素標識抗体（ヒトグルココルチコイドリセプターα及びβ−ＨＲＰ）の調製上記精製抗ｈＧＲα，及びｈＧＲβモノクローナル抗体を１．８％食塩を含む０．１Ｍ  炭酸水素ナトリウムバッファーｐＨ９．５溶液でそれぞれ溶解し，３００μｇ／５０μｌとした。このＩｇＧ溶液に１ｍｇを５０μｌ蒸留水に溶解したＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  （ＰＩＥＲＣＥ社製）を混合した。この混合物を４℃終夜反応した後，２００ｍＭ  Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ  ３０μｌを添加した。室温で３時間反応した。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いてゲルろ過し，Ｆａｂ’−ＨＲＰ複合体画分を分取後，等量のグリセロールを添加し，−２０℃で保存した。
【００４９】
Ｆａｂ’画分の調製
精製モノクローナル抗体（ＩｇＧ）を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し，その溶液を以下述べるようにして固定化ペプシンで消化した。すなわち，上記ＩｇＧ  ４ｍｇに対して固定化ペプシン（ＰＩＥＲＣＥ社製  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｅｐｓｉｎ）２００μｌを加え，３７℃，６時間消化した。遠心分離（３３００回転，５分間）により固定化ペプシンを除き，蒸留水に透析し，凍結乾燥した。凍結乾燥品を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いたゲルろ過により，Ｆ（ａｂ’）２  画分を分取した。次に，このＦ（ａｂ’）２  画分を蒸留水中で透析し，凍結乾燥した。凍結乾燥品を２２５μｌのＰＢＳで溶解し，２５μｌ  ２００ｍＭ  ２−メルカプトエチルアミンを加え３７℃で９０分間還元した後，５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化したＰＤ−１０カラムを用いて単純ゲルろ過し，Ｆａｂ’画分を分取した。
【００５０】
抗ヒトグルココルチコイドリセプターαβＦａｂ’−ＨＲＰ複合体画分の調製
Ｆａｂ’に対して，マレイミド標識ＨＲＰとしてＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  ＡｃｔｉｖａｔｅｄＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を等モルになるように両者を混合し，室温で２時間反応後これを膜濃縮した。これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いてゲルろ過し，Ｆａｂ’−ＨＲＰ複合体画分を分取後，等量のグリセロールを添加し，−２０℃で保存した。
【００５１】
サンドイッチＥＩＡ法１（ｈＧＲα，及びｈＧＲβの定量）
ＰＢＳで，抗ｈＧＲαβ共通領域認識抗体を５μｇ／ｍｌになるよう調製し，９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｌ加えた。４℃で終夜反応した後，液を除去し，ウェルにブロッキング液（ＢｌｏｃｋＡ大日本製薬社製）３００μｌを添加し，３７℃１時間反応した。次に洗浄緩衝液で３回プレートを洗浄した。次に，各濃度の標準ｈＧＲαもしくはｈＧＲβ組換え体，あるいは測定検体溶液をプレートに１００μｌ添加した。組換え体，検体の希釈は希釈バッファーを用いた。プレートを３７℃２時間反応させ，この後洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に，上記ＨＲＰ抗ｈＧＲαあるいは抗ｈＧＲβ抗体を２００倍に反応バッファーで希釈し，１００μｌ添加し，３７℃で２時間反応した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。プレートにＨＲＰ発色基質ＴＭＢ（ＭＯＳＳ社製）を１００μｌ加え，２０分間３７℃で反応した。２Ｎ硫酸１００μｌ添加し反応を停止させた。この反応混液のＡ４５０  をマイクロプレートリーダーを用いて測定し検量線より，検体中のヒトグルココルチコイドリセプターα，及びβの濃度を求めた。本ＥＩＡにより測定したヒトグルココルチコイドリセプターα測定の結果を図８に，ヒトグルココルチコイドリセプターβ測定の結果を図９に示す。
【００５２】
サンドイッチＥＩＡ法２（ｈＧＲα，及びｈＧＲβの定量）
ＰＢＳで，抗ｈＧＲα，あるいはｈＧＲβ抗体を５μｇ／ｍｌになるよう調製し，９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）に各々１００μｌ加えた。４℃で終夜反応した後，液を除去し，ウェルにブロッキング液（ＢｌｏｃｋＡ大日本製薬社製）３００μｌを添加し，３７℃１時間反応した。次に洗浄緩衝液で３回プレートを洗浄した。次に，抗ｈＧＲα抗体固相化プレートには各濃度の標準ｈＧＲα，抗ｈＧＲβ抗体固相化プレートにはｈＧＲβ組換え体，あるいは測定検体溶液をプレートに１００μｌ添加した。組換え体，検体の希釈は希釈バッファーを用いた。プレートを３７℃２時間反応させ，この後洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に，上記Ｆａｂ’−ＨＲＰ抗ｈＧＲαβ抗体を２００倍に反応バッファーで希釈し，１００μｌ添加し，３７℃で２時間反応した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。プレートにＨＲＰ発色基質ＴＭＢ（ＭＯＳＳ社製）を１００μｌ加え，２０分間３７℃で反応した。２Ｎ硫酸１００μｌ添加し反応を停止させた。この反応混液のＡ４５０  をマイクロプレートリーダーを用いて測定し検量線より，検体中のヒトグルココルチコイドリセプターα，及びβの濃度を求めた。本ＥＩＡにより測定したヒトグルココルチコイドリセプターα測定の結果を図１０に，ヒトグルココルチコイドリセプターβ測定の結果を図１１に示す。
【００５３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，グルココルチコイドの推定作用メカニズムを示す。
【図２】図２は，グルココルチコイドリセプターαおよびβの発現メカニズムを示す。
【図３】図３は，本発明において作製した組換えグルココルチコイドリセプターαおよびβならびに融合タンパク質の構造を示す。
【図４】図４は，本発明の実施例において作製した各種のプラスミドの構造を示す。
【図５】図５は，本発明の実施例において作製した各種のプラスミドの構造を示す。
【図６】図６は，本発明の実施例において作製した各種のプラスミドの構造を示す。
【図７】図７は，本発明の実施例において作製した各種のプラスミドの構造を示す。
【図８】図８は，本発明のモノクローナル抗体を用いるヒトグルココルチコイドリセプターαの定量を示す。
【図９】図９は，本発明のモノクローナル抗体を用いるヒトグルココルチコイドリセプターβの定量を示す。
【図１０】図１０は，本発明のモノクローナル抗体を用いるヒトグルココルチコイドリセプターαの定量を示す。
【図１１】図１１は，本発明のモノクローナル抗体を用いるヒトグルココルチコイドリセプターβの定量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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