(57)【要約】【課題】核酸プローブの標的核酸とのハイブリッド形成用配列を５’末端を介して担体表面からの所定の距離を持って固定化し、また、プローブ担体製造時における反応によるハイブリッド形成用配列への影響を排除したプローブ担体及びその製造方法を提供すること。【解決手段】プローブを、担体の表面との結合のためのアミノ基を有する５’末端と、チミン塩基の連続配列からなる部分と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とを、５’側から３’側にこの順に有する一本鎖核酸として形成し、担体表面に設けたエポキシキ基と５’末端のアミノ基とを共通結合させて担体に固定化し、その際、ハイブリッド形成用部分を保護用一本鎖核酸で保護し、固定化反応によるハイブリッド形成用部分への影響を排除する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸プローブを担体の表面に固定化したプローブ担体であって、
前記核酸プローブが、前記担体の表面と結合している５’末端と、チミン塩基の連続配列からなる部分と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とを、前記担体側からこの順に有する一本鎖核酸である
ことを特徴とするプローブ担体。
【請求項２】
前記核酸プローブと前記担体表面が前記リンカーの５’末端の有するアミノ基と該担体の表面が有するエポキシ基との反応により形成された共有結合により結合している請求項１に記載のプローブ担体。
【請求項３】
前記エポキシ基が前記担体の表面に存在するポリグリシジルメタクリレートの有するものである請求項２記載のプローブ担体。
【請求項４】
前記チミン塩基の連続配列の長さが３〜１０塩基である請求項１〜３のいずれかに記載のプローブ担体。
【請求項５】
前記チミン塩基の連続配列の長さが３塩基である請求項４記載のプローブ担体。
【請求項６】
前記担体が不溶性固体微粒子である請求項１〜５のいずれかに記載のプローブ担体。
【請求項７】
前記不溶性固体微粒子の平均径が０．８μｍである請求項６に記載のプローブ担体。
【請求項８】
前記担体が、核酸プローブ固定用の平面を有する請求項１〜５のいずれかに記載のプローブ担体。
【請求項９】
担体と、該担体の表面に結合した核酸プローブとを有し、該核酸プローブが、前記担体の表面と結合している５’末端と、チミン塩基の連続配列からなる部分と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とを、前記担体側からこの順に有する一本鎖核酸であるプローブ担体の製造方法であって、
（１）結合用の官能基を有する５’末端と、チミン塩基の連続配列と、核酸プローブとハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とがこの順に配列された一本鎖核酸プローブを調製する工程と、
（２）前記一本鎖核酸プローブに、該一本鎖核酸プローブのハイブリッド形成用配列と相補的な部分を有する配列を有する保護用一本鎖核酸をハイブリダイズさせて、二本鎖部分を有する核酸を形成し、前記ハイブリッド形成用部分にある結合用官能基を保護する工程と、
（３）表面に前記５’末端と結合する官能基を有する担体を用意する工程と、
（４）前記二本鎖部分を有する核酸の一本鎖核酸プローブ側の５’末端の官能基と前記担体表面にある官能基とを反応させることでこれらを結合させる工程と、（５）前記二本鎖部分を有する核酸が結合している担体の表面にある未反応の官能基の反応性を消失させる工程と、
（６）前記担体に結合した二本鎖部分を有する核酸から、保護用一本鎖核酸を除去してプローブ担体を得る工程と
を有することを特徴とするプローブ結合用担体の製造方法。
【請求項１０】
前記核酸プローブ側の結合用官能基がアミノ基であり、前記担体側の官能基がエポキシキ基である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記エポキシ基が、ポリグリシジルメタクリレートの有するエポキシ基である請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記チミン塩基の連続配列の長さが３〜１０塩基である請求項９〜１１のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１３】
前記チミン塩基の連続配列の長さが３塩基である請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記担体が不溶性固体微粒子である請求項９〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
前記不溶性固体微粒子の平均径が０．８μｍである請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１６】
該担体が、核酸プローブ固定用の平面を有する請求項９〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】
前記エポキシ基の反応性の消失処理が、該エポキシ基の加水分解による請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記エポキシ基の加水分解が０．１Ｍエタノールアミンにより行われる請求項１７記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸プローブ結合微粒子担体、その製造方法に関する。更に詳しくは、ハイブリダイゼーション法を基本とする遺伝子検出法等において、そのプローブを固定化する場合に、プローブの配列に含まれる反応性に富む官能基の保護に有効な方法に関する。また、リンカー部分の官能基の保護が不要であり、操作が簡便な核酸プローブ結合用担体の製造方法に関する。また、非特異的な吸着が少ないハイブリッド形成用塩基配列を結合した核酸プローブ結合用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
検査試料中の目的とする特定塩基配列を有する核酸を抽出、分離或いは検出する手段として、核酸のハイブリッド形成が利用されている。このハイブリダイゼーション法における反応では、標識化された、或いは固体担体表面上に固定化されたオリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド（すなわちプローブ）が、標的核酸と塩基対を形成する。
【０００３】
このハイブリダイゼーション法は一本鎖に変性されたＤＮＡまたはＲＮＡの核酸が適当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖核酸と塩基間の水素結合を介してハイブリッドを形成する事を利用するものである。
【０００４】
従来はこれらのハイブリダイゼーション反応では、ニトロセルロース製やナイロン性のメンブランフィルターを支持体としてプローブを結合させ、ハイブリッド形成反応を行う事が一般的であったが、最近、プローブである一本鎖核酸をラテックス等不溶性固体微粒子表面に結合させ、ハイブリッド形成反応後プローブに結合した標識剤等の蛍光で検出する方法が行われるようになった。
【０００５】
このような一本鎖核酸を固体表面に結合する方法として示されている特開昭６３−２７０００号公報では、一本鎖核酸の粒子表面への固定はあらかじめコントロールする事はできず、固定部位を選択する事ができないという問題がある。そのためにハイブリッド形成効率が極めて低く、実用に適さないという問題があった。
【０００６】
上記核酸固定化法の欠点を解消するために種々の核酸固定化支持体及びその製造方法が提案されている。例えば、核酸を構成するヌクレオチドの配列部分と固定化支持体との間に、炭素原子数４〜２０の炭素鎖を介在させ間接的に核酸を固定化する方法が知られている。
【０００７】
また、支持体への固定化の際、固定化に伴う化学反応によりプローブとして重要なヌクレオチド部分の反応性に富む第１級アミノ基が変化してしまう事を避けるため、これらのアミノ基を保護する事が必要となる。
【０００８】
これらの問題点を解決すべく特開平６−３３５３８０号公報では、反応性に富む第１級アミノ基をもつヌクレオチド部分を相補鎖により二本鎖を形成させる事により保護する事が開示されている。そしてハイブリッド形成性塩基配列と固定化支持体との結合には、第１級アミノ基をもつデオキシアデニル酸、或いはデオキシシチジル酸の連続配列を配置し、該塩基が有する第１級アミノ基の反応性を利用して固定化担体に結合させる方法が示されている。つまり、この方法では固体表面上のカルボキシル基とデオキシアデニル酸、或いはデオキシシチジル酸のアミノ基がアミド結合する事により固定される。
【０００９】
しかしこの方法では、連続したデオキシアデニル酸、或いはデオキシシチジル酸のどの部分が固定化担体に結合したのか特定できないために、ハイブリッド形成性塩基配列と固定化支持体との距離が一定にはならず、ハイブリッド形成反応において反応効率に差が生じる場合があるという問題がある。更に、固体表面上のカルボキシル基はハイブリッド形成反応時にターゲットＤＮＡ中の第１級アミノ基と反応したり、あるいはまたターゲットＤＮＡの非特異的な吸着を誘導する場合があるという問題点を有する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
このように定量的にハイブリッド形成反応を評価しようとすると、固定化支持体とハイブリッド形成性塩基配列の距離を一定に制御する事が必要になる。さらに、これらの反応を行う際にハイブリッド形成性塩基配列中の反応性に富む第１級アミノ基などの結合用の官能基を保護する必要がある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、固定化担体とハイブリッド形成性塩基配列との間にチミジン塩基からなるオリゴヌクレオチド（オリゴＴ）をリンカーとして用いる事により、簡便なプローブ結合固定化担体を得る方法を提供することができる。また、本発明の好ましい態様によれば、固体担体の表面をポリグリシジルメタアクリレートで覆う事により非特異吸着を避け、更にポリグリシジルメタアクリレート中のエポキシ基とプローブ核酸末端にあるアミノ基とを反応させる事により安定なプローブ結合固定化担体を得ることができる。
【００１２】
すなわち、本発明にかかるプローブ担体は、核酸プローブを担体の表面に固定化したプローブ担体であって、前記核酸プローブが、前記担体の表面と結合している５’末端と、チミン塩基の連続配列からなる部分と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とを、前記担体側からこの順に有する一本鎖核酸であることを特徴とするプローブ担体である。
【００１３】
また、本発明にかかるプローブ担体の製造方法は、担体と、該担体の表面に結合した核酸プローブとを有し、該核酸プローブが、前記担体の表面と結合している５’末端と、チミン塩基の連続配列からなる部分と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とを、前記担体側からこの順に有する一本鎖核酸であるプローブ担体の製造方法であって、
（１）結合用の官能基を有する５’末端と、チミン塩基の連続配列と、核酸プローブとハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とがこの順に配列された一本鎖核酸プローブを調製する工程と、
（２）前記一本鎖核酸プローブに、該一本鎖核酸プローブのハイブリッド形成用配列と相補的な部分を有する配列を有する保護用一本鎖核酸をハイブリダイズさせて、二本鎖部分を有する核酸を形成し、前記ハイブリッド形成用部分にある結合用官能基を保護する工程と、
（３）表面に前記５’末端と結合する官能基を有する担体を用意する工程と、
（４）前記二本鎖部分を有する核酸の一本鎖核酸プローブ側の５’末端の官能基と前記担体表面にある官能基とを反応させることでこれらを結合させる工程と、
（５）前記二本鎖部分を有する核酸が結合している担体の表面にある未反応の官能基の反応性を消失させる工程と、
（６）前記担体に結合した二本鎖部分を有する核酸から、保護用一本鎖核酸を除去してプローブ担体を得る工程と
を有することを特徴とするプローブ結合用担体の製造方法である。
【００１４】
本発明によれば、核酸プローブの標的核酸とのハイブリッド形成用配列を５’末端を介して担体表面からの所定の距離を持って固定化し、また、プローブ担体製造時における反応によるハイブリッド形成用配列への影響を排除したプローブ担体及びその製造方法を提供することが可能となる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本明細書において、担体上に固定されたプローブは、特定の標的物質に対して特異的に結合可能なものである。本発明ではこのプローブとして核酸、すなわちオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドから構成される。用語「プローブ」は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有する分子、および分散した位置に表面固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有する分子の集団の両方をいい、しばしばリガンドと呼ばれる分子も含まれる。また、プローブ及び標的は、しばしば交換可能に使用され、プローブは、リガンド−抗リガンド（レセプターと呼ぶこともある）対の一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得るものである。本発明におけるプローブ及び標的は、天然において見出されるような塩基、またはその類似物を含み得る。
【００１６】
本発明で用いられるプローブは、その使用目的に応じて、適宜選択されるものであるが、本発明の方法を好適に実施する上では、プローブとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（コンプリメンタリーＤＮＡ）、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、その他の核酸の少なくとも１種であることが好ましい。
【００１７】
本発明においては、これらのプローブの複数種を、それぞれ独立した領域、例えばドット状スポットとして担体表面に固定したものをプローブ担体といい、所定の間隔で配列されたものをプローブ・アレイという。また、高密度にスポットを配列したものにマイクロアレイがある。
【００１８】
本発明におけるプローブは、一本鎖核酸からなり、５’末端から３’末端方向に、担体との結合に利用される官能基を有する５’末端、チミンの連続配列からなるリンカー部分と、標的核酸とハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分と、を有する。
【００１９】
これらの各部分は、本発明の効果が得られる範囲内で複数個、例えば数個の塩基を介して接続していることができるが、これらの各部分が直接結合している構成がより好ましい。プローブ全体の長さとしては、１０〜７０塩基長の範囲とすることが好ましい。
【００２０】
チミンの連続配列からなる部分は、担体表面とハイブリッド形成用部分の距離を一定化させるリンカーとしての機能を有し、チミン塩基数は３〜１０が好ましく、３がより好ましい。
【００２１】
５’末端の結合用の官能基は担体表面に設けた結合用の官能基と結合することで５’末端から正確に核酸プローブを担体に結合させる機能を有する。このような結合用の官能基の組合せとしては、固定のための結合、好ましくは共有結合を形成する固定化用の官能基の各種組合せが利用でき、例えば、プローブ側にアミノ基（第１級）を、担体側にエポキシ基を用いた組合せが特に好ましい。このようなアミノ基を５’末端に有する構造は、アミノ基を有するヌクレオチドを利用して形成することができる。
【００２２】
担体表面へのエポキシ基の導入は、担体全体あるいは担体の所定部分をポリグリシジルメタアクリレートで形成する方法が好適である。
【００２３】
また、例えば、プレート状の担体の表面に、ハイブリッド形成用部分の配列が異なる複数の核酸プローブのそれぞれの固定化領域を互いに隔離して配置して、複数の標的核酸を分析するためのプローブ担体を得ることができ、また、多数の固定化領域を所定の配列で配置してプローブアレイを作製することができる。更に、固定化領域を高密度で配置することでマイクロアレイを作製することができる。
【００２４】
本発明にかかるプローブ担体の好ましい一態様は、以下の工程：
（１）アミノ基を有する５’末端と、チミン塩基の連続配列と、核酸プローブとハイブリッドを形成し得る塩基配列からなるハイブリッド形成用部分とがこの順に配列された一本鎖核酸プローブを調製する工程と、
（２）前記一本鎖核酸プローブに、該一本鎖核酸プローブのハイブリッド形成用配列と補的な部分を有する配列を有する保護用一本鎖核酸をハイブリダイズさせて、二本鎖部分を有する核酸を形成し、前記ハイブリッド形成用部分にあるアミノ基を保護する工程と、
（３）表面に前記５’末端と結合するエポキシ基を有する担体を用意する工程と、
（４）前記二本鎖部分を有する核酸の一本鎖核酸プローブ側の５’末端のアミノ基と前記担体表面にあるエポキシ基とを反応させることでこれらを共有結合させる工程と、
（５）前記二本鎖部分を有する核酸が結合している担体の表面にある未反応のエポキシ基の反応性を消失させる工程と、
（６）前記担体に結合した二本鎖部分を有する核酸から、保護用一本鎖核酸を除去してプローブ担体を得る工程と
を有する製造方法により製造することができる。
【００２５】
各工程を行う際の具体的な操作については公知の方法ができようできる。例えば、二本鎖部分の一本鎖化には、加熱や反応媒体のイオン強度の変化による処理などが利用できる。
【００２６】
上記保護用一本鎖核酸は、核酸プローブの標的核酸とのハイブリッド形成用部分と二本鎖を形成してこれを保護するものであればよい。核酸プローブのハイブリッド形成用部分が保護されることで、ハイブリッド形成用部分中にあるアミノ基（第１級）が担体側のエポキシ基と反応することが防止され、アミノ基とエポキシ基との強固かつ選択的な結合を利用しつつ、プローブ核酸のハイブリッド形成用部分の標的核酸との反応において必要なかつ良好な状態を保ちつつプローブ核酸の担体への固定が可能となる。
【００２７】
担体としては、固体平板状のものや固体粒子状のものなど各種の形状のものが利用できる。粒子状のものを利用する場合は、その平均粒径が０．８μｍであるものが好ましい。
【００２８】
なお、固体粒子状の担体を用いた場合は、粒子状に特有な簡便な取扱い性や用途においてプローブ担体を利用することができる。固体微粒子状の担体にプローブ分子を密に配置した場合、プローブと相補的な配列の有無が検査される検体遺伝子などの検体が、プローブ分子間に入り込めない場合があるという問題があり、本発明では、このような問題の発生を、チミン塩基の連続配列によるリンカーによってプローブ側のハイブリッド形成部分を担体表面から良好な間隔で離した位置に配置することで防止し、より効率よいハイブリダイゼーションを可能とするという効果を得ることができる。更に、本発明では、あらかじめ保護用の一本鎖核酸を用いて核酸プローブとの二本鎖を形成させて（二本鎖形成はアミノ基などの官能基のブロック機能を有する）、検体との有効なプローブ結合が行なわれるように核酸プローブの担体上の配置や密度などのコントロールして、過密なプローブ結合による検体反応の阻害の可能性を排除あるいは低減させるという効果を得ることもできる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
１．エポキシ基導入固定化担体の作製
極低カルボン酸変性ポリスチレン粒子Ｉｍｍｕｔｅｘ　Ｇ−１７０１（粒子系０．７８９μｍ）１０ｇにエマルジット４９（第一工業製薬）を２ｇ（重量比２０％）加えた。次に、グリシジルメタアクリレートをスチレン樹脂の９倍量（重量比）加え、重合開始剤としてＰｏｔａｓｓｉｕｍ　Ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ２％水溶液を加えた。７２℃で１時間加熱後、３０分毎に再度グリシジルメタアクリレートを０．１ｇずつ６回加えた。その後７５℃で２時間加熱し、冷却し洗浄を行った。洗浄は２００メッシュでろ過後、純粋を用いた遠心洗浄を２回行った。得られたスチレン樹脂はフローサイトメーターの解析により１．０９６μｍの径であることが確認された。
２．アミノ基リンクＤＮＡの合成
１８量体オリゴヌクレオチドの５‘末端にチミジンのオリゴヌクレオチドがｎ個結合し、さらにその５’末端に５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６　（　Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）が結合した下図のような構成のプローブをＡＢＩ社製３８１Ａ　ＤＮＡ自動合成機を用いてホスホロアミダイド法にて固相合成した。５’ジメトキシトリチル基は自動合成機上で除去した（配列１）。
【００３０】
配列１（配列番号：１）：
５’−Ｘ―（Ｔ）ｎ−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ−３’
（ｎ　＝　０，　３，　７または２０）
【００３１】
【化１】
2004069489.tif 000002
【００３２】
３．ＦＩＴＣが結合した配列１の相補鎖（配列２）の合成
以下の配列の標識オリゴヌクレオチドを常法により合成した。
配列２（配列番号：２）：
５’−Ｆ−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
（Ｆ＝ＦＩＴＣ）
４．配列１の相補鎖（配列番号：３）の合成
以下の配列の標識オリゴヌクレオチドを常法により合成した。
配列３（配列番号：３）：
５’−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’
５．ハイブリッド形成によるプローブ配列の保護
配列１からなるアミノリンクオリゴヌクレオチド２００μＭ、配列２からなるＦＩＴＣ標識相補鎖２０μＭを含む５０ｍＭＮａＣｌ／５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）溶液を用意し、６５℃にて１０分加温する。その後３５℃まで徐冷する。次に配列３からなるＦＩＴＣの結合していない相補鎖を１８０μＭになるように加え、ＮａＣｌ、及びりん酸ナトリウム緩衝液をそれぞれ最終濃度５０ｍＭになるように調製し、そのまま室温以下になるまで冷却しアニールする（一晩）。この反応により、二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。このとき、その後の反応のモニターのために、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドを混入させている。
６．プローブの粒子への結合反応
上記１項で合成したエポキシ基導入粒子溶液１μｌ（約１０８個）に上記５項で作製したＤＮＡ溶液を４０μＭになるように加え、回転攪拌装置を用いて室温で４時間反応させた。それに５倍量の１０ｍＭりん酸緩衝液を加え、遠心により粒子を回収した。上清の蛍光を日立蛍光分光光度計で測定し（励起波長４９８ｎｍ、蛍光５２２ｎｍ），反応前に比べ、蛍光強度が十分減少していることを確認した。再度りん酸緩衝液で、次に蒸留水にて洗浄を行った後、１Ｍエタノールアミンを加え室温にて一晩反応させることにより未反応のエポキシ基のブロッキングを行った。
【００３３】
反応後の粒子を１００μｌのシース液に懸濁し、そのうちの２０μｌを１ｍｌのシース液で希釈して、フローサイトメーターにより評価した。８５％以上の粒子に蛍光が導入されており、二本鎖オリゴヌクレオチドが粒子表面に結合したことが確認できた。
７．プローブ保護用相補鎖の除去（熱変性による方法）
ハイブリダイゼーション反応を行うためには、直接粒子に結合しているオリゴヌクレオチド以外の相補鎖の部分をはずす作業が必要である。
【００３４】
反応させた粒子を１００μｌの純水に懸濁し、８０℃で２分間加熱した。その後遠心操作を行って粒子を回収し、相補鎖が外れ一本鎖のプローブのみが結合したプローブ結合担体を得た。
８．プローブ保護用相補鎖の除去（アルカリ変性による方法）
熱変性以外の方法として、上記反応溶液２０μｌに１Ｍエタノールアミン５０μｌ加え、室温で５時間攪拌した。遠心により粒子を回収し、純水で数回遠心洗浄して、相補鎖を外した。フローサイトメーターで測定した結果、熱変性の場合も、アルカリ変性の場合も蛍光は完全に消失し、相補鎖が外れていることが確認された。
９．ハイブリダイゼーション反応
配列２のＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド０．２ナノモルを０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．５Ｍ　リン酸バッファーに溶解し、その中に７或いは８で作製したプローブ結合粒子を懸濁して３７℃一晩反応させた。反応後の懸濁液を遠心処理し、粒子を回収してその蛍光量をフローサイトメーターにより測定した。結果を以下の表１に示す。
【００３５】
【表１】
2004069489.tif 000003
【００３６】
表１に示すとおり、Ｔの長さによりハイブリダイゼーションの効率が異なり、Ｔの長さが３の時に最大のハイブリッド効率を示した。
【００３７】
【発明の効果】
ビーズ等、粒子表面にオリゴヌクレオチドを固定する方法を提案した。通常のＤＮＡ合成の際に導入されるリンカー長に加えて、Ｔの三量体程度の長さのリンカーを連結し、リンカー長を長くすることが、ハイブリダイゼーション反応の効率をあげる上で重要であることを示した。
【００３８】
【配列表】
2004069489.tif 000004