(57)【要約】      （修正有）【課題】腫瘍中に蓄積するより大きな抗体濃度を可能にすると共に、血液プールからの相対的に迅速な浄化時間を有し、腫瘍抗原に対するより大きな特異的活性を示す修飾抗体断片を提供する。【解決手段】ＳＰＤＰのようなヘテロ２官能価試薬による化学的接合によって修飾された修飾抗体。ガンおよび他の哺乳動物疾患の診断および治療のための組成物の調製におけるこれらの修飾抗体の使用。これらの診断的使用には免疫シントグラフィが含まれる。修飾抗体を標識または生物学的に活性な分子と更に接合させてこの種の診断および治療に使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の付着部位に付着した所定の種類のヘテロ２官能価試薬を有するＴＮＴ−１抗体であって、第２の付着部位に付着した生物学的に活性な分子をも有する前記ＴＮＴ−１抗体（前記第２の付着部位は、前記ＴＮＴ−１抗体上で前記第１の付着部位とは異なる部位であり、前記第２の付着部位は、前記所定の種類のヘテロ２官能価試薬たる付着したヘテロ２官能価試薬を有しない）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾抗体に関する。詳しくは、本発明は、ヘテロ２官能価試薬による化学的接合によって修飾された抗体、並びにガンおよび他の哺乳動物疾患の診断および治療におけるこれら修飾ＭＡｂの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、特にモノクローナル抗体（「ＭＡｂ」）の使用は、ガンの診断および処置における非常に価値のあるアプローチへの可能性を有している。ＭＡｂの重要な性質は、単一の抗原に対するその特異性である。
【０００３】
これまでに、腫瘍細胞抗原に特異的なＭＡｂが製造されてきている。またＭＡｂは、放射性核種のような補助剤と効率的に結合し得ることも示されている。この種の放射性標識ＭＡｂは、γカメラ画像形成または放射性免疫画像形成としても知られる免疫シントグラフィ（immunoscintography）による腫瘍画像形成のような臨床データを提供するのに有用である。免疫シントグラフィでは、ＭＡｂにより認識される抗原を有する特異的組織または腫瘍の種類に対してＭＡｂを結合させる。その後適切な技術の使用により、例えばゲルマニウムカメラの使用によって放射性核種を視覚化する。腫瘍および他の種類の組織の免疫シントグラフィにおけるその応用を可能とするのは、ＭＡｂの独特の特異性である。
【０００４】
しかしながら、免疫シントグラフィにおけるＭＡｂの使用は、高いバックグラウンドレベルやその抗原に対するＭＡｂの低い結合能力のために制限されていた。実験的検討は、放射性標識ＭＡｂの生物分布は、抗体の特異性および浄化時間を含む多くの因子に依存することを示唆している。免疫シントグラフィによる腫瘍の有効な診断のためには、腫瘍細胞表面上で濃密かつ均一な抗原に結合する抗体を選択することが必要である。また、免疫シントグラフィによる有効な診断には、選択した抗体が腫瘍抗原に有効に結合すべきことも必要である。しかしながら、多くの場合適切な抗原に結合するＭＡｂは、要求される高い結合親和力を持たない。更に、他のＭＡｂと比較して高い親和力で結合するようなＭＡｂを使用したとしても、高いレベルの非特異的結合がなお生成し得て、この結果免疫シントグラフィで使用した場合に高いバックグラウンドレベルとなる。したがって、診断の道具としての免疫シントグラフィを改良するためには、ＭＡｂの結合の有効性を改良する方法が必要となる。
【０００５】
更に、ＭＡｂの細胞毒性効果は、放射性核種、薬物または毒素との結合によって顕著に増加させることができる。ＭＡｂの独特の特異性は、免疫治療の発展に希望を与えるものである。免疫治療では、ＭＡｂを使用して生物学的に活性な薬品を腫瘍細胞のような特定の望ましくない種類の細胞に配送し、これにより対象の他の細胞に効果を与えることなく、望ましくない種類の細胞に効果を与える。しかしながら、健全な組織に効果を与えることを回避するため、免疫治療では極めて高い特異性の抗体が必要である。よって、ＭＡｂの特異性を増加させる方法は、安全で有効な免疫治療の目標に到達するために非常に有益である。
【０００６】
多くのＭＡｂは、対象への導入の後数日間、循環系に残存する。これは少なくとも２つの理由から望ましくない。１つの理由は、循環するＭＡｂにより免疫シントグラフィにおいて高いバックグラウンドレベルが生成するというものである。第２の理由は、放射性核種または他の潜在的に細胞毒性の薬品に結合した循環するＭＡｂにより、長い路程の後には対象中に望ましくない副作用が生成し得るというものである。そこで、ＭＡｂの浄化時間を減少させる方法が必要となる。勿論、減少があまりに大きければ、結果的にＭＡｂが
なし得るあるゆる有効な使用の前に、ＭＡｂが除去されることとなる。よって、腫瘍または他の標的組織によるＭＡｂの取込みに実質的に影響を与えることなく、ＭＡｂの浄化時間を減少させる方法が必要となる。
【０００７】
抗体の特異性および浄化時間の両者を決定するのに重要な１つの因子は抗体の形態である。ここで使用するように、「無傷（intact）」の抗体分子は、２つの重鎖および２つの軽鎖から構成される未修飾抗体分子を指すものとする。無傷の全体の抗体分子は、図１の化学式の反応物側に認められる。図１から分るように、無傷の分子はＦcおよびＦabドメインに分割される。Ｆab断片の２価形態であるＦ（ａｂ′）2は、プロテアーゼによるＦcドメインの消化により製造することができる。
【０００８】
２つの重鎖（図１では「Ｈ」として示す）は、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに保持される。無傷の分子では、これらのジスルフィド架橋は通常は還元剤から保護されている。しかしながら、Ｆcドメインを除去することにより、ジスルフィド架橋の容易な還元が可能であることが突き止められた。よって、１価形態であるＦ（ａｂ′）は、穏やかな還元剤の作用によりＦ（ａｂ′）2から製造することができる。パルハム・ピー、「ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のモノクローナルＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの断片化に当って」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５（１９８３）（この開示を参考によりここに取入れる）には、Ｆ（ａｂ′）およびＦ（ａｂ′）2の製造方法が記載されている。この方法で生起すると考えられる変化を表示すると、図１に示す化学式のようになる。
【０００９】
Ｆcは、抗体分子の非特異的結合の多くに関与することが認められている。また、断片の分子量は糸球体によるろ過の閾値より小さく、このため断片の迅速な除去が可能であるとも考えられている。したがって、放射性画像形成における使用のために抗体の浄化時間を増加させる１つのアプローチは、無傷の抗体を種々の断片、例えばＦａｂおよびその２価形態、Ｆ（ａｂ′）2に分解することであった。予期されるように、これらの断片は体から非常に迅速に浄化されるため、その有用性は低減される。更に、これらの断片は、結果的に、無傷の抗体と比較して、腫瘍または他の標的組織による低減された取込みをすると考えられる。よって、免疫シントグラフィにおけるこれらの断片の使用は、無傷のＭＡｂを用いる場合と比較し、より良好な浄化およびバックグラウンド比率に関してより高い標的組織を与え得るにも拘らず、ＭＡｂが結合し得る抗原を含む標的組織中のＭＡｂの絶対濃度が、いずれの断片を用いた場合も無傷のＭＡｂを用いるより、多くともせいぜい３倍以上までであることが認められた。
【００１０】
更に、両者の種類の断片は血液流から非常に迅速に除去される。よって、これらの断片を使用する診断または治療技術については、有効性の時間は非常に短い。
【００１１】
ヘテロ２官能価試薬は、異なる反応に参与することのできる２つの基を有する試薬である。例えば、スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、そのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基がアミノ基と反応し、２−ピリジルジスルフィド構造が脂肪族チオールと反応するという点でヘテロ２官能性である。
【００１２】
オルランディら、「２−ピリジルジスルフィド基の導入後の抗腫瘍モノクローナル抗体の結合反応性の変化」、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５：１−８（１９８６）には、ヒト卵巣カルシノーマに対して高められたＭＡｂの試験管内結合の増加を、ヘテロ２官能価試薬、ＳＰＤＰとの化学的接合の後に得ることができたことが報告されている。
【００１３】
オルランディらにより使用された接合されたＭＡｂは、平均して１分子当り１１のＰＤＰ基を有していた。オルランディらは、修飾されたＭＡｂは、未修飾ＭＡｂによっては検
出されない分子を検出できる程度に、その試験管内結合活性を増加させることを認めた。これらの研究者は、生体内での接合したＭＡｂの使用の検討は報告していない。更に、これらの研究者は、非常に少数の抗原性部位を有する分子が、接合されたＭＡｂによって検出されると考えていた。よって、ＰＤＰ修飾ＭＡｂは、未修飾対応物と比較し、大きく低減された標的細胞特異性を有するものであった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、前記の進展にも拘らず、腫瘍中に蓄積する抗体のより大きい絶対濃度を可能とすると共に、血液プールからの相対的に迅速な浄化時間を有し（ただし治療または診断の有効性を低減する程は迅速ではない）、腫瘍抗原に対するより大きい特異的活性を示す修飾抗体断片がなお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、Ｆ（ａｂ′）2断片の浄化速度と同じ種類の無傷の抗体との間の生体内浄化速度を有する、ヘテロ２官能価試薬により化学的に修飾された抗体を提供するものである。好適な態様では、ヘテロ２官能価試薬をＳＰＤＰとし、モノクローナル抗体、ヒト抗体、遺伝子操作による抗体、キメラ抗体、合成抗体およびポリクローナル抗体よりなる群から抗体を選択する。
【００１６】
また本発明は、哺乳動物中の特異的組織の画像を形成する方法も提供するものであり、これは特異的組織に対する抗体を取得し、ヘテロ２官能価試薬との接合によりこの抗体を修飾し、さらにこの抗体に標識を導入し、それを哺乳動物に導入して、前記抗体上の標識を明らかにする画像を生成することからなる。好適な態様では、抗体は、平均して抗体１分子当り約１つのＰＤＰ基を用いる接合によって修飾され、γ線を放射する放射性核種を用いて標識する。
【００１７】
更に本発明は、哺乳動物中の疾患状態を処置する方法を提供するものであり、これは哺乳動物の疾患組織に対して特異的な抗体を取得し、ヘテロ２官能価試薬および生物学的に活性な分子との化学的接合によりその抗体を修飾し、それを哺乳動物に投与することからなる。好適な態様では、平均して抗体分子当り１つのＰＤＰ基を用いる化学的接合によって抗体を修飾し、植物毒素、薬物、放射性核種およびキレートよりなる群から生物学的に活性な分子を選択する。
【００１８】
また本発明は、本発明の方法と共に使用する薬学的組成物も提供するものである。この組成物は、薬学的に許容し得るキャリヤ（担体）、賦形剤または基剤中に修飾抗体を含む。
【００１９】
本発明者は、ＳＰＤＰのようなヘテロ２官能価試薬を用いる接合によるＭＡｂ、ヒト抗体、遺伝子操作による抗体、キメラ抗体、合成抗体およびポリクローナル抗体を含む抗体の修飾が、抗体が結合し得る抗原を含む標的細胞中で、修飾抗体の驚くべき増強された蓄積をもたらすことを見い出した。スルホスクシニミジル２−（ｐ−アジドサリチルアミド）エチル−１，３′−ジチオプロピオネート（ＳＡＳＤ）、スルホスクシニミジル２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロベンズアミド）−エチル−１，３′−ジチオプロピオネート（ＳＡＮＤ）、スルホスクシニミジル（４−アジドフェニル−ジチオ）プロピオネート（スルホＳＡＤＰ）および２−アミノチオランＨＣｌ（トラウトの試薬）（Traut's reagent）等を含む他のヘテロ２官能価試薬も、本発明によって抗体と接合した場合、ＳＰＤＰを用いる抗体の接合によりここに示すのと同様の結果を与えると考えられる。
【００２０】
修飾抗体の増強された蓄積は、増幅された特異的結合能力によると考えられる。
本発明者は、平均して抗体１分子当り唯１つのＰＤＰ基を接合することにより、未修飾抗体と比較し、その標的細胞に対する分子の特異性の劇的な増加が起こることを見い出した。
【００２１】
本発明者はまた、１つ以上のＰＤＰ基の接合によるＩｇＧの修飾は、正常組織からの浄化も有利に増強することも見い出した。この効果の如何なる特定の説明にも拘束されることを意図するものではないが、これはＳＰＤＰを用いる修飾が糸球体ろ過の閾値より小さい分子量を有する形態への抗体の断片化を導き、これにより断片の迅速な除去が可能となるためと考えられる。抗体の１価形態への抗体の断片化が起こることは可能である。結果的に得られる断片の正確な形態が如何なるものであれ、これらの断片の除去は、有利なことに修飾抗体の診断または治療的有効性を低減する程には迅速ではない。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の修飾抗体は、Ｆ（ａｂ′）またはＦ（ａｂ′）2のような抗体の断片と比較し、有利なことに驚くべき増強された診断および治療有効性を有する。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は、平均して１つのＰＤＰ基をモノクローナル抗体へ導入する例示的な方法を示すものである。
（実施例１）
【００２４】
ＳＰＤＰによるＬｙｍ−１の修飾
エプステイン・エー・エルら、「ヒトＢ−リンパ球および誘導された腫瘍と反応性で免疫診断および免疫反応性の潜在能力を有する２つの新しいモノクローナル抗体、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：８３０−８４０（１９８７）（その開示を参考によりここに取入れる）における方法で、Ｌｙｍ−１（ＩｇＧ2a）、Ｂ細胞リンパ腫に対するモノクローナル抗体を取得した。カールソン・ジェイら、「蛋白質チオール化および可逆的蛋白質−蛋白質接合：Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、新しいヘテロ２官能価試薬」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７３）（その開示を参考によりここに取入れる）における方法で、ＳＰＤＰ、抗体上の遊離のアミノ基と反応するヘテロ２官能価試薬を使用してＬｙｍ−１ＭＡｂを官能化した。Ｌｙｍ−１を１０ｍｇ／ｍＬ含むＰＢＳ（ｐＨ７．３）１ｍＬを入れた５ｍＬの試験管に、１ｍＬエタノールおよび４０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に３ｍｇのＳＰＤＰを含む溶液２０μＬを添加した。通常の速度に設定した軌道振盪機装置を使用する連続混合により、この混合物を室温で１５分間インキュベートした。インキュベートの後、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０カラムを通過させることにより、官能化したＬｙｍ−１溶液を精製した。
【００２５】
グラセッチ・ディ・アールとムライ・ジェイ・エフ、「２，２′−または４，４′−ジチオジピリジンを用いるスルホヒドリル基の決定」、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１１９：４１−４９（１９６７）（その開示を参考によりここに取入れる）における方法で、ｐＨ７．２のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中でモル過剰の７ｍｇジチオエリスリトールを用いてＬｙｍ−１溶液の画分を還元した後、３４３ｎｍでピリジン−２−チオンの放出を測定することにより、ＳＰＤＰによるＬｙｍ−１の官能化の程度を、平均して１分子当り１つのＰＤＰ基であると決定した。
【００２６】
抗体が実質的に無傷で残留することを示すため、実施例１で得られた修飾抗体を高速蛋白質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって分析した。この分析を実施例２に示す。（実施例２）
【００２７】
高速蛋白質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）による修飾Ｌｙｍ−１の分析
２８０ｎｍに設定した固定波長ＵＶ分光光度計を備えた高速蛋白質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）を用いて実施例１で得られた修飾抗体の分析を行った。溶媒系としてＰＢＳ，ｐＨ７．２を用い、１ｍＬ／分の流速で溶出させ、スーパロース（superose）−１２カラム（ファルマシア）による寸法排除（size exclusion）クロマトグラフィを行った。修飾Ｌｙｍ−１は６９０秒の保持時間に現れ、未標識の無傷Ｌｙｍ−１の保持時間と同一であった。
【００２８】
つまり実施例２では、ＳＰＤＰ修飾抗体はＦＰＬＣにおいて未修飾抗体と実質的に同一の挙動であったことが示されている。このデータは、修飾によっては無傷の分子の試験管内での分解は起こり得ないことを示す。
【００２９】
生体内試験について修飾ＭＡｂを更に検討するため、修飾ＭＡｂの放射性標識化を行った。放射性標識化を実施例３に示す。
（実施例３）
【００３０】
修飾Ｌｙｍ−１の直接的放射性ヨウ素化
ミルス・エス・エルら、「試験管内手順のためのモノクローナル抗体の123Ｉ放射性標識化」、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ５：２６５−２７５（１９８６）（その開示を参考によりここに取入れる）の改変クロラミンＴ法を使用し、１バッチのＰＤＰ修飾Ｌｙｍ−１および無傷のＬｙｍ−１を125Ｉによりヨウ素化し、もう一方のバッチを131Ｉにより標識した。簡単に説明すれば、先ず１００μＬのＰＢＳ中に１００μｇのモノクローナル抗体を含む溶液を５ｍＬの試験管に入れ、バッチに応じて適切なヨウ素アイソトープ、125Ｉまたは131Ｉ、および１０μｌのクロラミンＴの４３ｍＭ水溶液を添加し、さらに３分後に、２０μＬのメタ重亜硫酸ナトリウムの１２０ｍＭ溶液を加え、反応を静めた。その後セファデックスＧ−２５カラムを使用し、放射性標識した抗体を精製した。このカラムは、端部に綿を詰めた血清学用プラスチックピペット（８ｍｍ×２００ｍｍ）（Ｖ0＝４．５ｍＬ、Ｖt＝１２ｍＬ）よりなるものとし、それぞれの反応混合物をそのカラムにかけ、ＰＢＳ、ｐＨ７．２を用いて溶出させた。１ｍＬ画分を含む個々のチューブをカウントし、チューブ６に、放射性標識した抗体を８５〜９０％の収率で回収した。これらの放射性標識抗体を冷蔵庫に保存し、標識化の４時間以内にマウスに投与した。
【００３１】
標識したＭＡｂの純度を決定するため、実施例３からの放射性標識ＭＡｂを瞬間薄層クロマトグラフィ（ＩＴＬＣ）に供した。この分析を実施例４に示す。
（実施例４）
【００３２】
瞬間薄層クロマトグラフィ（ＩＴＬＣ）による放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１の分析
シリカゲルを含浸したガラス繊維よりなる分析用ＩＴＬＣ装置を使用し、実施例３のクロラミンＴ法により131Ｉで放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１および125Ｉで放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１を分析した。使用の前に１１０−１／２℃で１５分間加熱することにより供試片（２×２０ｃｍ）を活性化し、１μｌのサンプルをスポットし、風乾し、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ（８０：２０）を用いて約１２ｃｍ溶出させ、再度風乾し、半分に切断してカウントし、蛋白質結合および非蛋白質結合放射性活性を決定した。放射性標識Ｌｙｍ−１抗体は、両者とも０のＲf値を有し、≧９９％の放射性化学純度を示した。実施例３と同様に標識した無傷のＬｙｍ−１の分析により、同じ純度であることが確認された。
【００３３】
つまり実施例４では、高い純度の放射性標識抗体が得られたことを示している。ラージ（Raji）細胞に結合するその能力により、これらの放射性標識ＭＡｂの免疫反応性を試験した。その分析を実施例５に示す。
（実施例５）
【００３４】
免疫反応性評価による放射性標識修飾Ｌｙｍ−１の分析
エプステイン・エー・エルらの前記の方法による従来の１０6ラージ細胞／チューブ生体検定により、放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１および無傷Ｌｙｍ−１の試験管内免疫反応性を評価した。簡単に説明すると、１００μＬの１％ウシ血清アルブミンＰＢＳ溶液中に再懸濁させたラージ細胞を、三連の試験管にピペットで注入した。１００μＬの標識したＬｙｍ−１を各試験管に添加し（１００，１００ｃｐｍ／チューブ）、軌道振盪機を使用する連続混合により室温で３０分間インキュベートした。インキュベートの後、チューブを１０００ｒｐｍで５分間回転させ、上澄をデカントし、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁することにより、１％ウシ血清ＰＢＳ溶液を用いて細胞を３回洗浄した。洗浄の完了後、ガンマカウンタを使用して細胞に結合した放射性活性を測定することにより、結合したＬｙｍ−１を検出した。結果は、修飾Ｌｙｍ−１の結合活性が８７％であったのに対し、標準対照である無傷Ｌｙｍ−１は８０％の結合活性を有していたことを示した。
【００３５】
よって実施例５により、修飾Ｌｙｍ−１は、試験管内で未修飾Ｌｙｍ−１より免疫反応性であったことが示される。生体内における修飾抗体の活性の安定性の予備的確認を得るため、実施例６に示すように、血清中でのその安定性について修飾ＭＡｂを分析した。
（実施例６）
【００３６】
血清安定性による放射性標識修飾Ｌｙｍ−１の分析
修飾Ｌｙｍ−１およびＩ−１２５で直接標識した無傷Ｌｙｍ−１のモノクローナル抗体を、新鮮なマウス血清が入った幾つかの三連の試験管の各々に添加し、１００μｇ／ｍＬの最終濃度とした。空気を５％ＣＯ2に維持した湿潤したインキュベータ内で試験管を３７−１／２℃でインキュベートした。０〜８日の間に、１００μｌの画分に対して９００μＬの１００％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加することにより蛋白質結合活性を決定した。室温での５分間のインキュベートの後、蛋白質沈殿物を遠心分離により沈降させ、各試験管から５００μＬの上澄を抜取り、ガンマカウンタ内で放射性活性についてカウントした。データを、沈殿物の平均パーセントカウントから対照試験管のそれを引いたものとして示した。結果は、インキュベート後のそれぞれの時点で、修飾125Ｉ−Ｌｙｍ−１は、標準対照である125Ｉ標識無傷Ｌｙｍ−１と同程度安定であったことを示した。更に、結果は、３７−１／２℃での８日間インキュベート後に修飾Ｌｙｍ−１中に存在する≧９２％の放射性活性物がＴＣＡ沈殿性であったことを示した。
【００３７】
このように実施例６により、修飾抗体の活性の安定性は、血清中で少なくとも８日間維持されたことが示された。修飾ＭＡｂは血清中でのインキュベート後に無傷のまま止まるか否かを評価するため、実施例７に示すように、インキュベート後の修飾Ｌｙｍ−１のＨＰＬＣ分析を行った。
（実施例７）
【００３８】
ＨＰＬＣによる修飾Ｌｙｍ−１の分析
溶出溶媒として０．１Ｍの中性リン酸緩衝液を用い、流速を１ｍｌ／分とし、寸法排除カラム（ＳＷ３００）を備えたウォーターズの装置によりＨＰＬＣ分析を行った。放射性アイソトープ検出器を用いて溶出物を検出した。実施例６で標識した修飾Ｌｙｍ−１生成混合物では、７５０秒の溶出時間の低分子量化学種の１つの主要なピーク、加えて６９０秒の少量のものが明らかとなった。無傷のＬｙｍ−１では、６９０秒の保持時間の単一ピークが現れた。
【００３９】
つまり、実施例７では、血清インキュベートした修飾Ｌｙｍ−１サンプルは、ＨＰＬＣ分析において、無傷のＬｙｍ−１のものより低い見かけの分子量を有することが示された。これに対して、実施例２では、インキュベートしていない修飾Ｌｙｍ−１は無傷のＬｙ
ｍ−１と同一の保持時間を有することが示されている。つまり、修飾Ｌｙｍ−１は、血清中でのインキュベートに際してＦＰＬＣ分析において、見かけ上分子量の喪失を示したことになる。
【００４０】
血清中でのインキュベートの際の修飾Ｌｙｍ−１の分子量の見かけ上の喪失を更に確認するため、実施例８に示すように、サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
（実施例８）
【００４１】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による放射性標識した修飾Ｌｙｍ−１の分析
実施例６の各インキュベート血清混合物と同じ画分を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって連続的に調べた。この検討のため、ラエミリ・ユー・ケー、「バクテリオファージＴ４の頭部の会合の際の構造蛋白質の開裂」、Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５（１９７９）（その開示を参考によりここに取入れる）におけるように、１０％アクリルアミドゲル上でサンプルを流し、注意深く乾燥させ、通常の方法で写真フィルムに露呈した。この分析により、無傷の125Ｉ−Ｌｙｍ−１はＭｒ２００，０００で明白であったのに対し、修飾した125Ｉ−Ｌｙｍ−１は約Ｍｒ１１６，０００で、より小さい分子量に対応する別個のバンドに認められたことが明らかとなった。よって、本実施例により、血清中での修飾抗体のインキュベートは、結果的にアクリルアミドゲル上で修飾されたみかけの分子量を与えることが示され、ＨＰＬＣ分析の結果が確認された。
（実施例９）
【００４２】
血清中における標識したＬｙｍ−１の脱ヨウ素化についての試験
また実施例６と同じサンプルを８日間にわたって調べ、放射性標識したＬｙｍ−１からの放射性活性の何らかの喪失があったか否かを見た（この種の喪失は血清中における脱ヨウ素化の証拠であると解釈することができる）。データは、この期間に渡って放射性活性の喪失は実質的にないことを示し、これらの免疫接合体では非常に安定なヨウ素の付着が得られていることが確認された。
【００４３】
よって実施例７〜９により、修飾抗体は、血清中でのインキュベート後も実質的に完全な活性を保持しつつ、見かけ分子量１１６，０００の分子に分解されると認められた。前述したように、分子量のこの喪失は、抗体がその１価値形態へと分解するとこによって起こっているという可能性がある。いずれにしろ、見かけの分子量の喪失は、修飾抗体がその断片へと分解することによるものと考えられる。
【００４４】
前述したような、血清中でインキュベートした場合の修飾抗体の見かけの分子量の前記した予期しない変化を突き止めた後、修飾ＭＡｂの生体内での安定性を試験した。全体浄化時間を決定するためにこれらの生体内試験を行った。これらの試験の例を実施例１０に示す。
（実施例１０）
【００４５】
全体浄化
３群の胸腺欠損ヌードマウス（ｎ＝５）に対し、クロラミンＴ法を使用してＩ−１３１により標識したＬｙｍ−１の（ａ）無傷抗体、（ｂ）Ｆ（ａｂ′）2断片及び（ｃ）修飾抗体を、各々腹腔内注射する実験を行った。注射の時点及びその後経時的に、全体活性を線量計を用いて測定した。この検討により、放射性活性の全体浄化は、抗体調製物により変動することが示された。結果を図２に示す。
【００４６】
図２に示す通り、修飾Ｌｙｍ−１は、２０時間の生物学的半減期（ｔ1/2）で無傷のＬ
ｙｍ−１（ｔ1/2＝５日）より速く全体から浄化された。しかしながら、Ｆ（ａｂ′）2断片の浄化は１０時間の生物学的半減期で、修飾Ｌｙｍ−１より２倍速かった。データは、迅速に浄化されるＦ（ａｂ′）2断片と遅く浄化される無傷抗体との間の中間の速度で修飾Ｌｙｍ−１が浄化されることを示している。
【００４７】
よって、実施例１０のデータから、修飾抗体は比較的高度に持続性の無傷抗体より迅速に体から浄化されるが、Ｆ（ａｂ′）2断片程は迅速ではないことが理解できる。
【００４８】
免疫治療のための理想的な薬品は、所望する毒性効果を与えるのに十分長い期間は血液流中で持続するが、意図しない毒性副作用を生起する程までは長くないものであろう。実施例１０のデータは、修飾抗体は、免疫治療で使用した場合に潜在的に理想的な持続時間を示すことを示唆している。
【００４９】
前述したように、免疫治療のための薬品は、その標的細胞に対して高度に特異的であるものでもあろう。よって、以下の実施例では、無傷ＭＡｂおよびＦ（ａｂ′）2断片の両者と相対して修飾ＭＡｂの特異性を試験した。実施例１１は、後述する生体内分布の検討全てに使用した方法を示すものである。
（実施例１１）
【００５０】
生体内分布の検討
２つの群の６週齢ヌードマウスに対し、ラージ細胞（１０7）を腿領域に皮下注射した。直径１ｃｍより大きくなるまで腫瘍を３週間生育させた。各群のマウスを使用し、以下に記載するように対標識による検討を行った。第１の群（ｎ＝６）では、各マウスに対し、１２μＣｉ／μｇ（１２０μＣｉ／マウス）のＩ−１３１により標識した１０μｇの修飾Ｌｙｍ−１、及び２．５μＣｉ／μｇ（２５μＣｉ／マウス）のＩ−１２５により標識した１０μｇの無傷Ｌｙｍ−１を含む０．２ｍＬの接種物を腹腔内（i.p.）に注射した。第２の群（ｎ＝４）では、マウスは、１２μＣｉ／μｇ（１２０μＣｉ／マウス）のＩ−１３１により標識した１０μｇの修飾Ｌｙｍ−１、および２．５μＣｉ／μｇ（２５μＣｉ／マウス）のＩ−１２５により標識した１０μｇのＦ（ａｂ′）2断片を含む０．２ｍＬの接種物を受容するものとした。全ての実験において、注射後予備選択した時間に頸部脱臼によりマウスを犠牲にし、種々の器官、血液および腫瘍を除去し、分析用天秤で秤量した。その後ガンマカウンタ内でサンプルをカウントし、131Ｉおよび125Ｉ活性を測定した。125Ｉカウントは、１７％の131Ｉチャンネルカウントを差引くことにより、131Ｉチャンネルからの重複について調整した（１２８２コンピュガンマ・ガンマカウンタ（ＬＫＢ）を使用して実験的に決定された式）。動物を犠牲にした日にしたがって131Ｉアイソトープの放射性崩壊についてもデータを補正した。それぞれのマウスについて、グラム腫瘍当りのｃｐｍ／グラム器官当りのｃｐｍ、％投与量／グラムおよび％投与量／器官としてデータを示した。これらのデータから、それぞれの群について平均および標準偏差を計算した。
【００５１】
実施例１２は、実施例１１の方法を使用し、修飾ＭＡｂの生体内分布を無傷ＭＡｂと比較するものである。
（実施例１２）
【００５２】
修飾Ｌｙｍ−１対無傷Ｌｙｍ−１の生体内分布の検討
ここでは、実施例１１の方法で無傷Ｌｙｍ−１抗体を修飾Ｌｙｍ−１抗体と比較した。表Ｉに示すように、無傷Ｌｙｍ−１では、注射後７日目には、血液活性は０．６４％ＩＤ／ｇであった。同じく注射後７日目には、腫瘍は３．９２％ＩＤ／ｇの活性を有していた。
【００５３】
表Ｉに示すように、無傷Ｌｙｍ−１と比較し、修飾Ｌｙｍ−１は血液からより速く浄化され、７日目には、血液活性は０．１４％ＩＤ／ｇであった。同じく注射後７日目には、腫瘍は７．７％の活性を有していたが、これは無傷Ｌｙｍ−１の対応する活性より有意に高い傾向であった。
【００５４】
幾つかの器官における実施例１２で得られた抗体反応性の結果を表Ｉに示し、図３（％投与量／グラム）および図４（腫瘍／器官比率）にグラフにより示す。
【００５５】
【表１】
2004210793.tif 000002
【００５６】
図３から、修飾抗体は、腫瘍中で無傷抗体より高いシグナルを生成したことがわかる。更に、腎臓を除く試験したあらゆる器官で、修飾抗体は無傷ＭＡｂより弱く反応した。より高いシグナルが腎臓に認められることは予期できないことではない。というのは、抗体はこの器官を介して浄化されると予期されるからである。実施例１０で無傷ＭＡｂと比較して修飾ＭＡｂはより迅速な浄化速度を有することが認められているので、腎臓中により高い量の修飾ＭＡｂが存在することを予期し得る。
【００５７】
図３と同じデータを異なる形式で示した図４を参照すると、修飾ＭＡｂは、腎臓を除く試験したあらゆる器官で、無傷ＭＡｂより有意に高い腫瘍／器官比率を与えることが理解できる。よって、修飾抗体は、免疫シントグラフィで使用する場合、有意に低いバックグラウンドを与えることを予期し得る。更に、修飾抗体は、免疫治療で使用する場合、腫瘍に対するその高い親和力および非標的組織に対する低い親和力の両者により、より有効であることを予期し得る。よって免疫治療で使用する場合、修飾抗体は腫瘍に対してより毒性が高く、非標的組織に対してより毒性が低いことを予期し得る。本発明の修飾抗体の免疫治療への使用は、後に更に詳細に説明する。
【００５８】
次に、修飾ＭＡｂの生体内分布を他の未修飾抗体のＦ（ａｂ′）2断片と比較した。実施例１３はこれらの実験を示すものである。
（実施例１３）
【００５９】
修飾Ｌｙｍ−１対Ｌｙｍ−１のＦ（ａｂ′）2断片の生体内分布の検討
ここでは、Ｆ（ａｂ′）2断片を修飾Ｌｙｍ−１ＭＡｂと比較した。実験は、実施例１１と同様に行った。結果を表ＩＩに示し、図４および図５にグラフにより示す。
【００６０】
【表２】
2004210793.tif 000003
【００６１】
表ＩＩから、修飾Ｌｙｍ−１は、Ｆ（ａｂ′）2断片より遅く血液から浄化されたことがわかる。修飾Ｌｙｍ−１では、注射後５日目には、断片（０．０５％）より高い０．０９％ＩＤ／ｇの血液活性を有した。図５は、修飾Ｌｙｍ−１の腫瘍活性が、Ｆ（ａｂ′）2断片の対応する活性より約２．５倍高いことを示している。修飾Ｌｙｍ−１の活性は、腎臓を含む試験した全ての種々の器官についてＦ（ａｂ′）2断片より高かった。これはより迅速に浄化される抗体は腎臓中に蓄積するという理論と一貫するものである。
【００６２】
更に、図６は、修飾Ｌｙｍ−１についての腫瘍対組織比率は、試験した全ての器官に関してＦ（ａｂ′）2断片のものより高いことを示している。すなわち、実施例１２および１３の実験結果により、本発明の修飾抗体は、無傷ＭＡｂまたはＦ（ａｂ′）2断片のいずれよりもその標的腫瘍に対して高い活性を有することが確認される。更に、これらの実験の腫瘍対組織のデータは、修飾抗体は無傷ＭＡｂまたはＦ（ａｂ′）2断片のいずれよりも腫瘍に対する高い特異性を有することを示している。
【００６３】
そこで、本発明の修飾ＭＡｂが有する免疫シントグラフィによい結果を与える能力を試験した。これらの試験の例を実施例１４に示す。
（実施例１４）
【００６４】
Ｌｙｍ−１の画像形成の検討
ピンホールコリメータおよびスペクトル９１ガンマカメラ（ライセオン）を使用し、腫瘍担持ヌードマウスの画像形成を行った。これらの動物の画像分析により、注射後の腫瘍／全体の抗体分布の評価が与えられた。注射後７日目に、２ｍｇケタミンＨＣｌおよび０．４ｍｇキシラジンを０．２ｍＬ皮下（s.c.）接種により投与してマウスを麻酔した。その後、記録１０，０００カウントに予備設定したカメラを用い、固定したマウスを背部位置で画像形成に供した。バックグラウンドの差引きは行わなかった。ポラロイドのタイプ３３０パックフィルムを使用して写真画像を得た。それぞれの画像で２つの領域（（ａ）領域１：全体、（ｂ）領域２：腫瘍）を特定した。図６〜８は、これらの実験により得られたシントグラフ（シントグラムとしても知られる）の例を示すものである。無傷Ｌｙｍ−１を用いる免疫シントグラフィ画像形成を注射後７日に試みたが、図６に認められるように満足し得るものではなかった。図６は、腫瘍は視覚化されたものの、動物の残部も視覚化されたことを示している。図７および図８は、注射後の同じ時間における、標識した修飾Ｌｙｍ−１を用いて注射した２つの異なるラージ腫瘍担持動物の画像を示す。図７および図８の両者は、図６に認められる無傷Ｌｙｍ−１により生成された腫瘍の位置のものと比較し、遥かに高いレベルで腫瘍の位置の標識した修飾Ｌｙｍ−１の濃度を示している。更に重要なことに、修飾Ｌｙｍ−１により生成されたマウス全体のバックグラウンドに対する腫瘍の位置の標識の比率は、無傷Ｌｙｍ−１の場合より数倍高かった。よって図７および図８により腫瘍の明確な画定が示され、バックグラウンド放射性活性は殆どまたは全くない。
【００６５】
更に、修飾Ｌｙｍ−１を使用した場合、注射後５日目に腫瘍の満足し得る視覚化ができた。図１０は、図９（７日目の画像）に示すのと同じ動物を５日目にとった画像を示す。理解し得るように、図１０に示す５日目の画像は、７日目に無傷Ｌｙｍ−１により生成した画像（図７）より有意に優れていた。試験した全ての動物について結果は同様であった。
【００６６】
この検討は、修飾抗体断片の使用は腫瘍抗原に対してより大きい比活性を示し、より高い絶対濃度の抗体の腫瘍中での蓄積を可能とすることを示唆するものである。このことは、修飾Ｌｙｍ−１断片の絶対濃度は、注射後７日目で無傷Ｌｙｍ−１濃度の約２倍、５日目でＦ（ａｂ′）2断片の約２．５倍であることを示す今回の結果によって確認されている。
【００６７】
修飾Ｌｙｍ−１断片の遥かに速い浄化により、高い腫瘍対バックグラウンド比率に到達するのに必要な時間も有意に減少し、よってこの結果、無傷抗体より少ない時間でより良好な画像が得られる。
【００６８】
抗体の特異性および活性の改良における本発明の修飾の一般的有用性を示すために、更に別のＭＡｂを修飾した。これらの種々の修飾ＭＡｂの試験を実施例１５〜１８に示す。
（実施例１５）
【００６９】
モノクローナル抗体Ｂ７２．３の浄化速度
コルチェル・ディら、「ヒト乳腫瘍細胞と反応性のモノクローナル抗体のスペクトル」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：３１９９−３２０３（１９８１）（その開示を参考によりここに取入れる）における方法で、結腸カルシノーマに対するモノクローナル抗体であるＢ７２．３（ＩｇＧ1）を取得した。実施例１の方法に従い、平均して１分子当り１つのＰＤＰ基を用いてＢ７２．３ＭＡｂを官能化した。
【００７０】
実施例３の方法によって修飾Ｂ７２．３ＭＡｂを放射性標識した。実施例１０と同様に全体浄化時間を測定した。図１１は、これらの全体浄化実験の結果を示すものである。修飾抗体の全体浄化半減期は減少を示し、無傷ＭＡｂで約６日のものが修飾抗体については約２．５日となった。Ｆ（ａｂ′）2断片の浄化半減期は、Ｌｙｍ−１断片についてと同様に修飾抗体より速く、約１２時間の半減期を有していた。よって結果は、修飾Ｂ７２．３は、Ｆ（ａｂ′）2断片と無傷抗体の間の中間の浄化半減期を有する点で、修飾Ｌｙｍ−１と同様の挙動であったことを示した。
（実施例１６）
【００７１】
Ｂ７２．３の生物分布
ヒトＬＳ１７４Ｔ結腸カルシノーマを担持する胸腺欠損ヌードマウス、各々５匹づつの２群を用いて、対標識生体内分布の検討を行った。一方の群には無傷Ｉ−１２５標識Ｂ７２．３を注射し、また他方には修飾Ｉ−１３１標識Ｂ７２．３を注射した。実験では、同様に腫瘍、血液および種々の器官における生体内分布を比較した。用いた方法は実施例１１〜１３と同様とした。データを表ＩＩＩに示し、図１１および１２にグラフを示す。
【００７２】
【表３】
2004210793.tif 000004
【００７３】
表ＩＩＩに示したように、無傷Ｂ７２．３抗体では注射後４日目で１．３４％ＩＤ／ｇの血液活性、および表ＩＩＩに示すように腫瘍において４．０４％の活性を有していた。無傷Ｂ７２．３と比較し、修飾Ｂ７２．３では４日目で低い血液活性（１．１％ＩＤ／ｇ）および高い腫瘍活性（６．０２％ＩＤ／ｇ）を有していた。
【００７４】
図１３からわかるように、より迅速に浄化される抗体について予期される通り、全ての種々の器官の活性は、腎臓を除いて修飾Ｂ７２．３に関して高かった。よって、図１４に
示すように、修飾Ｂ７２．３についての腫瘍対器官比率は、無傷Ｂ７２．３についての対応する比率より有意に高かった。腫瘍部位での修飾抗体のより高い活性のため、腫瘍対器官比率は腎臓に関してさえも改良されていた。
（実施例１７）
【００７５】
腫瘍担持マウスにおけるＢ７２．３の画像形成
修飾Ｂ７２．３を注射したＬＳ１７４Ｔ腫瘍担持マウスの画像分析により、注射後の腫瘍／全体抗体分布の評価が与えられた。図１４は、注射後１日目の免疫シントグラフを示すものである。画像は明確な腫瘍の画定を示し、バックグラウンド放射活性を殆ど有していない。図１５は、注射後４日目の免疫シントグラフを示すものである。４日目で腫瘍は明確に認められ、動物の血液プールに残留する放射性活性は殆どなかった。全ての動物について結果は同様であった。
【００７６】
よって、修飾Ｂ７２．３は、Ｂ７２．３と反応性の腫瘍に注射後短時間以内に高品質の免疫シントグラフを得るのに非常に有用であると認められた。
【００７７】
ＴＮＴ−１は、ヒトガンに対するその選択的結合のための標的として壊死性腫瘍を利用するＩｇＧ2aモノクローナル抗体である。実施例１と同様に平均して１分子当り１つのＰＤＰ基を用いてこの抗体を修飾し、実施例１８に示すように全体保持時間を分析した。
（実施例１８）
【００７８】
モノクローナル抗体ＴＮＴ−１の使用
エプステインら、「ヒトガンにおける壊死性病巣の検出のための新しい方法」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：５８４２−５８４８（１９８８）（その開示を参考によりここに取入れる）における方法で、ＴＮＴ−１を取得した。実施例３の方法によってＴＮＴ−１ＭＡｂを放射性標識した。実施例１０と同様にして全体浄化時間を測定した。図１６は、これらの全体浄化実験の結果を示すものである。修飾ＴＮＴ−１ＭＡｂは、無傷ＴＮＴ−１と比較して全体浄化半減期の減少、およびＴＮＴ−１のＦ（ａｂ′）2断片と比較して全体浄化半減期の増加を示した。
【００７９】
よって、修飾ＴＮＴ−１は他の修飾抗体と同様の挙動であった。したがって、修飾ＴＮＴ−１ＭＡｂの有用性は、試験した他の修飾抗体と同等であると期待される。
【００８０】
よって、本発明の方法を使用するあらゆる抗体の修飾は、腫瘍の画像形成を改良できると考えられる。本発明の方法を使用してあらゆる所望の種類の組織の画像を生成するためには、その種類の組織に対する抗体を最初に取得しなければならない。ポリクローナル抗体は、当業者に公知たり得る従来の技術で得ることができる。また、モノクローナル抗体は、同様に当業者に公知たり得るものとして、これらの抗体により与えられる増加した特異性を得るために調製することができる。その後抗体をヘテロ２官能価試薬と化学的に接合させる。接合の後、適切な標識を修飾抗体に適用する。
【００８１】
前記の実施例は、γ線放射の放射性核種からなる標識の画像形成を活用するものであるが、多くの他の種類の標識および画像形成装置を、本発明の範囲内に企図する。例えば、従来のＸ線を使用し、バリウム、セシウムまたはヨウ素のような放射性不透明の材料を画像形成することができる。ＭＲＩ画像形成技術を使用し、常磁性または超磁性粒子を標識として使用して抗体の位置の画像を生成することができる。更に、テクニシウム（technicium）を標識として使用することができる。これらの代替的な標識は、従来の方法を用いて修飾抗体に接合させることができる。
【００８２】
標識した抗体は、薬学的に許容し得る賦形剤、キャリヤまたは基剤とともに、対象に標
識を投与するための薬学的組成物に含有させることができる。適切な賦形剤、キャリヤまたは基剤には、塩類溶液、リン酸緩衝塩類溶液、グリセリン、炭酸カルシウム等が包含される。その後これらの組成物を、局所注射、静脈注射、または低減したシグナル強度が要求される場合や、口腔内での組織の画像形成が望まれる場合は、経口投与のようなあらゆる種類の手段を用いて導入する。しかしながら、好ましくは、抗体に対する標的組織の露呈を最大にするために投与は全身性注射によるものとする。
【００８３】
本発明により１つ以上のＰＤＰ基の付加によって抗体を修飾し、これらの修飾抗体を免疫治療薬品に組込んだ場合、有意に改良された結果が与えられると考えられる。この種の治療薬品は、一般に１以上の生物学的に活性な分子と組合わさった腫瘍または他の疾患組織に対して特異的な抗体を含む。この種の薬品中で機能する適切な生物学的に活性な分子には、毒素、例えばジフテリア毒素（リシン）Ａ鎖、または当業者により公知のあらゆる種類の植物毒素、放射性核種、例えばイットリウムの放射活性アイソトープ、ヨウ素、リン、および他の一般に使用される放射性治療薬品、薬物、例えばメトトレキセート、５−フルオロウラシルまたはアドリアマイシン、キレート（ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを含む）、ｃｉｓ−プラチナおよび他の毒性有機金属薬品、及びあらゆる他の治療薬品が挙げられる。
【００８４】
従来、有効な免疫治療は未だ十分に実現されていなかった。本発明の修飾抗体の増加した活性および特異性により、その標的組織に対する十分な活性および特異性を有する免疫治療薬品が提供され、従来の免疫治療薬品の欠陥を克服できると考えられる。よって、対象に対して適切な免疫治療薬品を注射した場合、対象の健全な組織に有意に影響を与えることなく、標的疾患組織を殺傷することができる。
【００８５】
これらの免疫治療薬品の使用では、特定の望ましくない種類の組織に特異的な抗体を最初に取得しなければならない。所望の抗体が利用可能でない場合、当業者に公知たり得るように、抗原を生物に注射し、哺乳動物から血清を取得することにより、適切な生物中で抗体を生成することができる。あるいは、また好ましくは、当業者に公知の方法でモノクローナル抗体を生成することができる。その後抗体をヘテロ２官能価試薬と化学的に接合する。接合の後、前記した治療薬品のような生物学的に活性な薬品との接合により、得られた修飾抗体を更に修飾する。次に、抗体と、薬学的に許容し得るキャリヤ、賦形剤または基剤を含有する薬学的組成物とを組合せる。この種の薬学的に許容し得るキャリヤ、賦形剤または基剤としては、全身性注射のための通常の塩類溶液、グリセリン、炭酸カルシウムが包含される。こうして組成物は、哺乳動物のような患者へ導入できるものとなる。
【００８６】
その後あらゆる公知の投与経路を介して抗体を対象に導入する。例えば、組成物を、全身性注射、患部組織への局所注射により導入することができ、外部の患部組織に局所塗布することができ、また低減したシグナル強度が要求される場合、や口腔内の組織の治療が所望される場合は経口的に摂取することができる。
【００８７】
抗体を含む生物学的に活性な薬品の投与量は、毒素に対する標的組織の感受性、患部組織の量、投与の経路、抗体の親和力、浄化速度及びその他の因子に依存している。しかしながら、代表的な投与量は、一般に体重１ｋｇ当たり１μｇ〜１ｍｇの範囲とすることができ、大半の用途で、投与量は好ましくは５〜２００μｇ／ｋｇとし得る。
【００８８】
以下の実施例は、マウス中のラージ腫瘍に対して有効な免疫治療を示すものである。
（実施例１９）
【００８９】
マウス中のラージ腫瘍の処置
ＰＤＰ修飾Ｌｙｍ−１を実施例１のように取得する。その後、修飾した抗体を処理して
平均して抗体１分子当り１つのリシンＡ鎖に導入する。無傷Ｌｙｍ−１およびＦ（ａｂ′）2断片を同様に毒素と組合せる。
【００９０】
２５匹のマウスを５つの群に分割する。群Ｉは、８週間の間、週に１回リシン−ＰＤＰ−修飾Ｌｙｍ−１のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）溶液の腹腔内注射（１０μｇ／ｋｇ全体重）を受けるものとする。群ＩＩは、等量のリシン−無傷Ｌｙｍ−１の注射を受けるものとする。群ＩＶは、等量のリシン−Ｌｙｍ−１のＦ（ａｂ′）2断片の注射を受けるものとする。群ＩＩＩは、等量の未接合リシンの注射を受容けるものとする。群Ｖは、ＰＢＳ単独の注射を受けるものとする。
【００９１】
８週間後、実施例１４の方法を使用して全ての生存マウスの免疫シントグラフィを行う。群Ｉのマウスでは、他の群のいずれと比較しても低減した腫瘍の様子が視覚化されて示される。生存する群ＩＩおよび群ＩＩＩのマウスは幾分かの改良を示すが、群Ｉのマウス程劇的ではない。群ＩＶのマウスは病気が重くなるか死亡する。
【００９２】
すなわち、実施例１９は、本発明の修飾抗体を使用した腫瘍の１つの特定の処置を示している。実施例１９は、本発明のＰＤＰ修飾抗体を使用する場合に達成される優れた結果を示す。また、マウスあるいは他の哺乳動物（例えばヒト）の他の腫瘍または疾患組織に特異的な他の抗体の使用に置き換えた場合も、これらの特異的腫瘍または疾患組織を処置する際に、同様に有効な結果が得られると考えられる。更に、他の公知の毒素に置き換えても同様の有効な結果が与えられると考えられる。実施例２０は、ヒトの膵臓ガンに対して有効な類似する治療を使用した例を示すものである。
（実施例２０）
【００９３】
ヒト膵臓ガンの処置
ヒト膵臓腫瘍に認められる抗原に特異的なモノクローナル抗体を取得する。実施例１と同様に、平均して抗体１分子当り１つのＰＤＰ基の接合によりこの抗体を修飾する。実施例１９でリシンについて記載したように、その後メトトレキセートをこれらの修飾抗体に接合させる。
【００９４】
２つの群の１０人の膵臓ガン患者を治療する。第１の群は、従来の治療と組合せて週間基準で２０μｇ／ｋｇ全体重の薬物−ＰＤＰ−ＭＡｂの静脈注射を受けるものとする。第２の群は、対照として従来の治療と組合せてＰＢＳの注射を受けるものとする。１０週間後、生存する患者の免疫シントグラフィを行う。
【００９５】
免疫シントグラフィによると、第１の群で画像化された腫瘍の平均的大きさは、対照群と比較して低減していた。
【００９６】
よって前記した実施例は、ヒトにおける免疫治療での修飾抗体の有用性を示すものである。
【００９７】
前記したように、本発明の１つの好適な形態では、修飾抗体を薬学的組成物に処方する。よって、免疫治療のための薬物と接合したＰＤＰ−修飾抗体を、細胞毒性的に有効な量の本発明の修飾抗体−毒素接合体を有する注射組成物に混和することができる。以下は、ヒトのＢ細胞リンパ腫に対して有効な、細胞毒性的に有効な組成物の例である。
（実施例２１）
【００９８】
ヒトのＢ細胞リンパ腫に対して有効な薬学的組成物
実施例１８の修飾放射性標識Ｌｙｍ−１ ： １０ｍｇ／ｍｌ
リン酸緩衝塩類溶液（０．９％）       ： 残部
【００９９】
更に、放射性標識修飾ＭＡｂを、免疫シントグラフィにおけるその特異的抗原を視覚化するのに有効な組成物に処方することができる。以下はこの種の組成物の１つの例である。
（実施例２２）
【０１００】
結腸カルシノーマの免疫シントグラフィで有効な薬学的組成物
実施例１５の修飾放射性標識Ｂ７２．３ ： １０ｍｇ／ｍｌ
リン酸緩衝塩類溶液（０．９％）       ： 残部
【０１０１】
ある種の機械的または化学的変形は、当業者に対してそれを示唆し得ることが理解されよう。前記した実施例および詳細な説明は例示として与えたものとして明確に理解すべきであり、この発明の精神および範囲は添付する請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、Ｆ（ａｂ′）およびＦ（ａｂ′）2断片を製造する方法で起こると考えられる変化の図による表示を示す。
【図２】図２は、胸腺欠損ヌードマウスにおける放射性標識ＭＡｂＬｙｍ−１の異なる調製物の全体保持量を示す。
【図３】図３は、注射後７日目のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＬｙｍ−１および修飾Ｌｙｍ−１の注射投与量／グラムを％として、その生体内分布を示す。
【図４】図４は、注射後７日目のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＬｙｍ−１および修飾Ｌｙｍ−１の腫瘍／器官比率の生体内分布を示す。
【図５】図５は、注射後５日目のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＬｙｍ−１Ｆ（ａｂ′）2および修飾Ｌｙｍ−１の注射投与量／グラムを％として、その生体内分布を示す。
【図６】図６は、注射後５日のヒトリンパ腫担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＬｙｍ−１Ｆ（ａｂ′）2および修飾Ｌｙｍ−１の腫瘍／器官比率として、生体内分布を示す。
【図７】図７は、Ｉ−１３１標識無傷Ｌｙｍ−１の注射後７日目に得られた画像を示す。
【図８】図８は、Ｉ−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後７日目に得られた画像を示す。
【図９】図９は、Ｉ−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後７日目に得られた画像を示す。
【図１０】図１０は、Ｉ−１３１標識修飾Ｌｙｍ−１の注射後５日目に得られた画像を示す。
【図１１】図１１は、胸腺欠損ヌードマウスにおける放射性標識モノクローナル抗体Ｂ７２．３の異なる調製物の全体保持量を示す。
【図１２】図１２は、注射後４日目のＬＳ１７４Ｔ結腸カルシノーマ担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＢ７２．３および修飾Ｂ７２．３の注射投与量／グラムを％として、その生体内分布を示す。
【図１３】図１３は、注射後４日のＬＳ１７４Ｔ結腸カルシノーマ担持ヌードマウスにおけるＭＡｂＢ７２．３および修飾Ｂ７２．３の腫瘍／器官比率として生体内分布を示す。
【図１４】図１４は、Ｉ−１３１標識修飾Ｂ７２．３の注射後１日目に得られた画像を示す。
【図１５】図１５は、Ｉ−１３１標識修飾Ｂ７２．３の注射後４日目に得られた画像を示す。
【図１６】図１６は、胸腺欠損ヌードマウスにおける放射性標識ＭＡｂＴＮＴ−１の異なる調製物の全体保持量を示す。
【図１】
2004210793.tif 000005
【図２】
2004210793.tif 000006
【図３】
2004210793.tif 000007
【図４】
2004210793.tif 000008
【図５】
2004210793.tif 000009
【図６】
2004210793.tif 000010
【図７】
2004210793.tif 000011
【図８】
2004210793.tif 000012
【図９】
2004210793.tif 000013
【図１０】
2004210793.tif 000014
【図１１】
2004210793.tif 000015
【図１２】
2004210793.tif 000016
【図１３】
2004210793.tif 000017
【図１４】
2004210793.tif 000018
【図１５】
2004210793.tif 000019
【図１６】
2004210793.tif 000020