(57)【要約】【課題】本発明は、特にＤＮＡチップによるＤＮＡ解析に必要な修飾ＤＮＡ類の酵素合成可能な５位置換シチジン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法を提供することにある。【解決手段】本発明の５位置換デオキシウリジン誘導体は、一般式、【化１】2004238353.tif 000024（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式、
【化１】
2004238353.tif 000017
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される５位置換デオキシウリジン誘導体。
【請求項２】
一般式、
【化２】
2004238353.tif 000018
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される５位置換デオキシシチジン誘導体。
【請求項３】
一般式、
【化３】
2004238353.tif 000019
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される５位置換デオキシウリジン誘導体。
【請求項４】
一般式、
【化４】
2004238353.tif 000020
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される５位置換デオキシシチジン誘導体。
【請求項５】
前記各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたものが、グリシル基、アラニル基、バリル基、ロイシル基、イソロイシル基、メチオニル基、プロリル基、フェニルアラニル基、トリプトファニル基、セリル基、スレオニル基、アスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、システイニル基、チロシル基、ヒスチジル基、リシル基、アルギニル基からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１〜５項に記載の誘導体。
【請求項６】
基質、ＤＮＡ合成酵素、鋳型ＤＮＡおよびプライマーを用いて核酸を合成する方法であって、請求項１〜５項に記載の誘導体を、基質として用いる核酸の合成方法。
【請求項７】
さらに、デオキシウリジン誘導体を請求項２、４及び５項に記載のデオキシシチジン誘導体と共に基質として用いる請求項６記載の核酸の合成方法。
【請求項８】
前記デオキシウリジン誘導体が、式、
【化５】
2004238353.tif 000021
【化６】
2004238353.tif 000022
【化７】
2004238353.tif 000023
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種である請求項６又は７記載の核酸の合成方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ合成酵素が、Ｆａｍｉｌｙ  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼである請求項１から８項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
鋳型ＤＮＡが天然のＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ又は天然のＲＮＡを逆転写して形成されたｃＤＮＡである請求項６から９項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規な５位置換デオキシシチジン誘導体と新規な５位置換デオキシウリジン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法に関し、特に、有用な標識を導入することが可能な新規な５位置換デオキシシチジン誘導体と新規な５位置換デオキシウリジン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
標識機能物質が結合したオリゴヌクレオチド類は特定の配列を持った核酸の検出を行なう上で必要不可欠なものであり、それ故、このようなオリゴヌクレオチド類に関して、多くの研究がなされ、またその応用が検討されてきた。標識機能物質が結合したオリゴヌクレオチド類として、当初は、放射性物質である３２Ｐ−リン酸を酵素的に結合させたオリゴヌクレオチド類が用いられたが、この場合、放射性物質を扱うための施設の確保及び維持、放射性物質を扱う上での安全性、３２Ｐの半減期が２週間と短いため保存が困難である等、種々の問題点があった。このため非放射性物質である蛍光物質、発光物質、ビオチン等の標識化物質をオリゴヌクレオチドに結合させた核酸類の化学合成の開発及びその応用研究がなされている。特に自動合成機械による核酸の化学合成法が確立して長いオリゴヌクレオチドの化学合成が容易になって以来、標識化物質を結合させたオリゴヌクレオチド類の化学合成の開発がなされ、ＤＮＡプローブとして利用されてきた。しかし、ＤＮＡチップを用いたマイクロアレイＤＮＡ解析では、天然から得られた特定のＤＮＡ又はＲＮＡを基に酵素的に標識化物質を導入した修飾ＤＮＡをＤＮＡプローブとして用いる必要がある。
【０００３】
核酸塩基部に標識化合物を導入したオリゴヌクレオチドは検出の対象となる核酸と安定な相補的塩基対結合を造らなければならない。このためには立体的な障害が少なく且つ相補的塩基対結合に関係の無いピリミジン環の５位にリンカーを介して標識化合物を結合する方法が最も優れている。このようなピリミジン環の５位の部分に標識化合物を導入したオリゴヌクレオチドの化学合成には、基質として５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体が必要である。このため、従来は天然から得られるウリジンを出発原料にして、標識化合物を結合させることが可能な５位置換２’−デオキシウリジン誘導体を合成する方法が行われている。この合成法では、出発原料である５−クロロ水銀化−２’−デオキシウリジン又は触媒のパラジウム錯体が高価であり、有害な水銀化合物を扱うという難点がある。
【０００４】
前記５位置換２’−デオキシウリジン誘導体を基質に用いてオリゴヌクレオチドを化学合成し、更に標識物質をこのオリゴヌクレオチドに導入する方法が文献に報告され、また特許出願されている［Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｐ２５５−２８２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，  米国特許Ｎｏ４９４８８８２；特開平３−８６８９７号公報参照］。また、これらの５−位置換２’−デオキシウリジン誘導体のある種のものは５’−三リン酸化体に導くと、大腸菌のＤＮＡ合成酵素であるクレノー断片又はある種の好熱菌のＤＮＡ合成酵素であるＴａｑ又はＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの基質となるので、これらから修飾ＤＮＡを酵素的に合成する方法が知られている［Ｒ．Ｐ．Ｌａｎｇｅｒ，Ａ．Ａ．Ｗａｌｄｒｏｐ，Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，６６３３（１９８１）；Ｃ．Ｒ．Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ．ａｌ，．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２，４４１，（１９９１）；Ｊ．Ａ．Ｌａｔａｈｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２８１７（１９９４）；Ｋ．Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆ．Ｂａｒａｂａｓ  ＩＩＩ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ，３７，２８７２（１９９８）参照］。
【０００５】
このようにして酵素的に合成され且つ蛍光物質を導入した修飾ＤＮＡは、ＤＮＡプローブとして、特定のＤＮＡの検出に用いられている［Ｇ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ，”ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ”，ｐ１０５−１４８，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｓ．Ｆ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｄｅｎｎｙ，”ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，ｐ４３−５９，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，”Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｐ９３−１４４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）  参照］。また、アミノ基又はイミダゾール基を導入した修飾ＤＮＡの酵素を用いる合成、増幅法（ＰＣＲ法）と試験管内選択法を併用することで、特定の反応を触媒する触媒ＤＮＡ、又は特定の分子に結合するＤＮＡアプタマーとして応用されている［Ｔ．Ｒ．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａ１．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，９７８１（１９９９）；  Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ．ａ１．，１２２，２４３３（２０００）参照］。しかし、  従来の修飾ＤＮＡの酵素合成法、ＰＣＲ法による大量合成法では酵素の基質特異性が高いため、用いることのできるＤＮＡ合成酵素の種類や基質となる５位置換ピリミジン２’−デオキシヌクレオチド誘導体に大きな制約があった。
【０００６】
前記以外の従来技術としては、例えば、アラビノースとシアンアミドから容易に得られるアラビノアミノオキサゾリンとα−ブロモメチルフマル酸誘導体とを反応させることにより、標識物質などの機能性物質を結合することが可能な新規な５位置換ピリミジン２’−デオキシヌクレオチド類を得る合成法が挙げられる。更にこの５位置換ピリミジン２’−デオキシヌクレオチドを基質に用いてオリゴヌクレオチドを化学合成し、このオリゴヌクレオチドに蛍光物質を導入した修飾ＤＮＡを化学合成する方法が特許出願された［沢井ら、特開平７−１６５７８６号公報参照］。また、この修飾ＤＮＡにポリアミン類を導入した化合物は、特定のＲＮＡを切断するＲＮＡ制限酵素として特許出願された［篠塚ら、特開平８−２４２８６２号公報参照］。
【０００７】
【（非）特許文献１】
［Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｐ２５５−２８２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ｊ．Ｌ．Ｒｕｔｈ，
【（非）特許文献２】
米国特許Ｎｏ４９４８８８２号
【（非）特許文献３】
；  特開平３−８６８９７号公報
【（非）特許文献４】
Ｒ．Ｐ．Ｌａｎｇｅｒ，Ａ．Ａ．Ｗａｌｄｒｏｐ，Ｄ．Ｃ．Ｗａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，６６３３（１９８１）；Ｃ．Ｒ．Ｐｅｔｒｉｅ  ｅｔ．ａｌ，．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２，４４１，（１９９１）；Ｊ．Ａ．Ｌａｔａｈｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２，２８１７（１９９４）；  Ｋ．Ｓａｋｔｈｉｖｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｆ．Ｂａｒａｂａｓ  ＩＩＩ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ，３７，２８７２（１９９８）］
【（非）特許文献５】
［Ｇ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ，”ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ”，ｐ１０５−１４８，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｓ．Ｆ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．Ｄｅｎｎｙ，”ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，ｐ４３−５９，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｃ．Ｋｅｓｓｌｅｒ，”Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １”，Ｅｄ．ｂｙ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｐ９３−１４４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）］。
【（非）特許文献６】
［Ｔ．Ｒ．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ  ｅｔ  ａ１．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，９７８１（１９９９）；Ｓ．Ｗ．Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ．ａ１．，１２２，２４３３  （２０００）］
【（非）特許文献７】
特開平７−１６５７８６号公報
【（非）特許文献８】
特開平８−２４２８６２号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来技術の方法では、５位置換２’−デオキシウリジン誘導体を導入した修飾ＤＮＡ類の合成は化学合成法に限られており、  前記修飾ＤＮＡ類の酵素合成は不可能である。多くの研究分野において、特にＤＮＡチップによるＤＮＡ解析などでは、特定の天然の核酸を鋳型としたＤＮＡプローブの酵素合成、とりわけＰＣＲ法による合成が必要となるので、修飾ＤＮＡ類の酵素合成に関する大きな要求がある。
【０００９】
本発明は前記従来技術の問題点を解決するためのものである。本発明者らは前記実情に鑑み、有用な５位置換デオキシシチジン誘導体と５位置換デオキシウリジン誘導体、及びそれらを用いた核酸の合成方法を確立した。
【００１０】
すなわち、本発明は、特にＤＮＡチップによるＤＮＡ解析に必要な修飾ＤＮＡ類の酵素合成可能な５位置換シチジン誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、基質、ＤＮＡ合成酵素について種々のスクリーニングを行なった結果、本発明の誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法を見出すに至った。
【００１２】
すなわち、本願発明の５位置換デオキシウリジン誘導体は、一般式、
【００１３】
【化８】
2004238353.tif 000002
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。
【００１４】
また、本願発明の５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、
【００１５】
【化９】
2004238353.tif 000003
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。
【００１６】
また、本願発明の５位置換デオキシウリジン誘導体は、一般式、
【００１７】
【化１０】
2004238353.tif 000004
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。
【００１８】
また、本願発明の５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、
【００１９】
【化１１】
2004238353.tif 000005
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表されることを特徴とする。
【００２０】
また、本願発明の５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体の好ましい実施態様において、前記各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたものが、グリシル基、アラニル基、バリル基、ロイシル基、イソロイシル基、メチオニル基、プロリル基、フェニルアラニル基、トリプトファニル基、セリル基、スレオニル基、アスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、システイニル基、チロシル基、ヒスチジル基、リシル基、アルギニル基からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００２１】
また、本願発明の５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体を用いた核酸の合成方法は、前記基質、ＤＮＡ合成酵素、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて核酸を合成する方法であって、請求項１〜５項に記載の誘導体を、基質として用いることを特徴とする。
【００２２】
また、本願発明の５位置換シチジン誘導体を用いた核酸の合成方法は、さらに、デオキシウリジン誘導体と共に基質として用いることが可能であることを特徴とする。
【００２３】
また、本願発明の５位置換デオキシシチジン誘導体を用いた核酸の合成方法は、前記デオキシウリジン誘導体が、式、
【００２４】
【化１２】
2004238353.tif 000006
【００２５】
【化１３】
2004238353.tif 000007
【００２６】
【化１４】
2004238353.tif 000008
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００２７】
また、本願発明の５位置換デオキシシチジン誘導体を用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、前記ＤＮＡ合成酵素が、Ｆａｍｉｌｙ  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
【００２８】
また、本願発明の５位置換シチジン誘導体を用いた核酸の合成方法の好ましい実施態様において、鋳型ＤＮＡが、天然のＤＮＡ，化学合成したＤＮＡ又は天然のＲＮＡを逆転写して形成されたｃＤＮＡであることを特徴とする。
【００２９】
【発明の実施の形態】
本願発明の５位置換デオキシウリジン誘導体は、一般式、
【００３０】
【化１５】
2004238353.tif 000009
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される。
【００３１】
本願発明の５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、
【００３２】
【化１６】
2004238353.tif 000010
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される。
【００３３】
本願発明の５位置換デオキシウリジン誘導体は、一般式、
【００３４】
【化１７】
2004238353.tif 000011
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される。
【００３５】
本願発明の５位置換デオキシシチジン誘導体は、一般式、
【００３６】
【化１８】
2004238353.tif 000012
（但し、式中、Ｒは−ＮＨＸを表し、Ｘは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）で表される。
【００３７】
ここで、ＤＮＡ分子への新しい機能の付与という観点から、Ｘとしては、修飾ＤＮＡアプタマーを創製する際には静電的結合や疎水結合または水素結合を形成するような官能基、また、修飾ＤＮＡ触媒を創製する際にはルイス酸・塩基またはそれらのリガンドとなる分子を用いることが好ましい。
【００３８】
上記本発明の誘導体は、単独又は複数で用いても、容易に修飾ＤＮＡを導入することができる。また、後述するように、これら本発明の誘導体と、従来からある既存の誘導体とを組み合わせても、容易に修飾ＤＮＡを導入することができる。
【００３９】
本願発明の５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体の好ましい実施態様において、前記各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたものが、グリシル基、アラニル基、バリル基、ロイシル基、イソロイシル基、メチオニル基、プロリル基、フェニルアラニル基、トリプトファニル基、セリル基、スレオニル基、アスパラギニル基、グルタミニル基、アスパラチル基、グルタミル基、システイニル基、チロシル基、ヒスチジル基、リシル基、アルギニル基からなる群から選択される少なくとも１種である。これらはタンパク質に含まれる機能性残基という観点から、特に好ましく用いることができる。
【００４０】
次に、核酸の合成方法について説明する。本願発明の５位置換シチジン誘導体を用いた核酸の合成方法は、前記基質、ＤＮＡ合成酵素、鋳型ＤＮＡ及びプライマーを用いて核酸を合成する方法であって、上記本発明の誘導体を、基質として用いる。
【００４１】
これら本発明の誘導体を基質として用いて合成した核酸は、種々の蛍光標識を容易に結合させることが可能であり、蛍光標識を結合させた核酸は、有用なプローブ等となり得る。このような蛍光標識としては、従来のものを挙げることができ特に限定されない。例えば、蛍光標識として、フルオレスセイン，Ｃｙ５，テトラメチルカルボキシローダミン，ピレンなどを挙げることができる。
【００４２】
なお、蛍光標識を予め結合させた本発明の誘導体を用いて核酸を合成することも可能である。
【００４３】
さらに、蛍光標識以外に、種々の機能性物質を結合させた機能性修飾ＤＮＡ，例えば触媒、アプタマーなどを合成することもできる。また、蛍光標識ではなく、阻害剤を結合させることも可能である。
【００４４】
また、本願発明の５位置換シチジン誘導体を用いた核酸の合成方法は、さらに、デオキシウリジン誘導体と共に基質として用いることができる。既存のデオキシウリジン誘導体を用いることにより、より多くの物質（蛍光標識等）を結合させることができる。前記デオキシウリジン誘導体としては、ＤＮＡポリメラーゼによって効率よく修飾ＤＮＡを生成するという観点から、式、
【００４５】
【化１９】
2004238353.tif 000013
【００４６】
【化２０】
2004238353.tif 000014
【００４７】
【化２１】
2004238353.tif 000015
（但し、式中、Ｒは水素原子、アルキニル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基、−ＣＯＣＦ３基、−ＣＯＣＨ３基、カルボニルメチルイミダゾール基、−ＣＨ（＝ＮＨ）ＮＨ２、ビオチニル基、各種アミノ酸をアミド結合を介して結合させたもの、又は−（ＣＨ２）２Ｎ［（ＣＨ２）２ＮＨ２］２基を示す。）からなる群から選択される少なくとも１種を好ましく用いることができる。
【００４８】
本願発明の５位置換シチジン誘導体を用いた核酸の合成方法では、ＤＮＡ合成酵素として、Ｆａｍｉｌｙ  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。これらのポリメラーゼ用いることにより、効率よく修飾ヌクレオチドをＤＮＡに導入できるという利点がある。
【００４９】
鋳型ＤＮＡとしては、天然のＤＮＡ，化学合成したＤＮＡ又は天然のＲＮＡを逆転写して形成されたｃＤＮＡのものを挙げることができる。
【００５０】
【実施例】以下に実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
実施例１
本実施例では、５位に柔軟なアミノ−３，６−オキサへブチルリンカーを持つ修飾２’−デオキシウリジン３リン酸と修飾２’−デオキシシチジン３リン酸（５，８）の合成とそれらのＰＣＲにおける耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対するする基質特性について調べた。
【００５２】
まず、用いた試薬等について説明すれば以下の通りである。
【００５３】
＜用いた試薬と方法＞
１．  試薬
５−プロピニル−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （プロピニル  ｄＵＴＰ  ９），  ５−プロピニル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸  （プロピニル  ｄＣＴＰ  １１）  と５−メチル−２’−デオキシウリジン−  ５’−三リン酸（メチルｄＣＴＰ  １２）  はＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。  ２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸  （ｄＵＴＰ  １０）  はヤマサ株式会社から購入した。天然型の２’−デオキシヌクレオシド−５’−三リン酸  （ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ  及び  ＴＴＰ）  はＲｏｃｈｅ社から購入した。次のＤＮＡ  ポリメラーゼが実験に使われた。Ｔａｑ  （タカラバイオケミカルズ），  Ｔｔｈ  （東洋紡株式会社），  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社），  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）  ａｎｄ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）  （Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社），  Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社），  Ｐｆｕ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）。プライマーオリゴヌクレオチドは北海道システムサイエンスから、  ｐＵＣ１８  鋳型ＤＮＡ  はタカラバイオケミカルズから購入した。他のすべての試薬は特級試薬をそのまま用いた。
【００５４】
２．  分析方法とゲル電気泳動
ＮＭＲはＪＥＯＬ社の  ＪＮＭ−ＡＬ３００で測定した。ＥＳＩ−マススペクトルはアプライドバイオシステム社のＭＤＳ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−１００で測定した。ＵＶスペクトルは島津製作所のＵＶ−１２００分光光度計で測定した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はＯＤＳ−シリカゲルカラム（２０  ｍｍ  Ｉ．Ｄ．  ×  ２５０  ｍｍ  Ｌ）を用い、５０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０）の緩衝溶液中、５〜１５％のアセトニトリルの濃度勾配を用いて、流速８ｍＬ／分で溶出させた。ゲル電気泳動は２％アガロースゲル（１００  Ｖ，  ４０分）でおこなった。ＰＣＲ産物は２％のアガロース電気泳動によって分離し臭化エチジウム着色によって可視化し、ゲルイメージはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオ・ラド社）で記録した。
【００５５】
３．  ２−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル）−２−アミノエトキシ］エタノール（１ａ）の合成
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ２Ｏ，  ４．５７  ｇ，  ２１  ｍｍｏｌ）  と１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１９  ｍＬ）を２−（２−アミノエトキシ）エタノール  （２．００  ｇ，  １９  ｍｍｏｌ）を溶かしたジオキサン−水（２：１）混合液５７  ｍＬに氷冷下で撹拌しながら滴下して加えた。室温で２時間反応させた後、溶媒を減圧留去した。残渣を水に溶かし目的物を酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、オイル状の粗生成物を得た。酢酸エチル−ヘキサン（１：１）混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、無色オイル状の目的物１ａを収率９３％で３．６４ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ５．０９  （ｂ，  １Ｈ），  ３．７４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５９−３．５４  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３３  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６２  （ｂ，  １Ｈ），  １．４５  （ｓ，  ９Ｈ）。
【００５６】
４．  ５−［１−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル）アミノ］−３，６−オキサ−ヘプチル］−２’−デオキシウリジン（３）の合成
乾燥ベンゼン（６７  ｍＬ）に懸濁させた３’，５’−ジ−Ｏ−アセチルチミジン  １  （１．００  ｇ，  ３．１  ｍｍｏｌ），  Ｎ−ブロモスクシミド  （ＮＢＳ，  ０．９８０  ｇ，  ５．５  ｍｍｏｌ）  及びアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ，  ３３  ｍｇ，  ０．２  ｍｍｏｌ）を２時間還流して反応させた。反応終了後、反応液をアルゴン雰囲気下で減圧留去し３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−５−（ブロモメチル）−２’−デオキシウリジンを含む残渣を得た。これを乾燥ＤＭＦ（１５  ｍＬ）に溶かし、続いて  ２−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル）−２−アミノエトキシ］エタノール（１ａ）（１．３９  ｇ，  ６．８  ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（０．３３８  ｇ，  ３．４  ｍｍｏｌ）を加え９０℃で３時間反応させた。  反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣を水に溶かし目的物をクロロホルムで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた後、ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、オイル状の粗生成物を得た。１％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、１ａを不純物として含むヌクレオシド２を１．０２ｇ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ５３０．２  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］，  ５５２．２  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］。粗生成物であるヌクレオシド２（１．０２ｇ）をアンモニア−メタノール（３０  ｍＬ）に溶かし、室温で４時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣を０．５−６％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、目的物３を収率３０％で０．４０６ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ８．０６  （ｓ，  １Ｈ），  ６．３３  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ６），  ４．６２  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．００−３．９３  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．６８−３．３３  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  １．４４  （ｓ，  ９Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ４６８．３  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００５７】
５．  ５−（１−トリフルオロアセタミド−３，６−オキサ−ヘプチル）−２’−デオキシウリジン（４）の合成
ヌクレオシド  ３  （０．２９４  ｇ，  ０．６６  ｍｍｏｌ）  を２０％トリフルオロ酢酸−ジクロロメタン混合液（２０  ｍＬ）に溶かし室温で４時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣をメタノール（６  ｍＬ）に溶かし、これにトリフルオロ酢酸エチル（２．００  ｇ，  ７．０  ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１  ｍＬ，  ７．２  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣を３％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、薄黄色オイル状の目的物４を収率８５％で０．２４７ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ  ８．０６  （ｓ，  １Ｈ），  ６．２７  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ７），  ４．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９２  （ｑ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ３），  ３．８２−３．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６３−３．５８  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．４６  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ  ＝  ５），  ２．３３−２．１７  （ｍ，  ２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］４６４．１  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００５８】
６．  ５−（１−アミノ−３，６−オキサ−ヘプチル）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸（５）の合成
ヌクレオシド４  （０．１１５  ｇ，  ０．２６  ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン  （Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（登録商標），  ０．０８３ｇ，  ０．３９  ｍｍｏｌ）を一晩減圧乾燥させた。これにリン酸トリメチル（１．５  ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で加えて溶かした後、０°Ｃに冷却した。蒸留したオキシ塩化リン（０．０２９  ｍＬ，  ０．３１  ｍｍｏｌ）をマイクロシリンジで滴下し０°Ｃのまま撹拌した。さらに４５分後トリブチルアミン（０．２ｍＬ，  ０．８３  ｍｍｏｌ）と０．５  Ｍピロリン酸トリブチルアンモニウムのＤＭＦ溶液を０°Ｃで加え、反応液を室温に戻し１時間反応させた。１．０  Ｍ  炭酸水素トリブチルアンモニウム水溶液（１５  ｍＬ）を加えて反応を止め反応液を減圧濃縮した。濃縮液を水（５  ｍＬ）で薄めた液をセファデックスＤＥＡＥＡ−２５カラムを用い、炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ  ８．０）の塩濃度勾配（０．０５〜１．０Ｍ）緩衝液により溶出した。精製したＮ−保護ヌクレオシド三リン酸を含むフラクション中の過剰のピロリン酸を取り除くため、さらに、これを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、５−（１−トリフルオロアセタミド−３，６−オキサ−ヘプチル）−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸を収率３１％で７６０  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ６８０．２  ［（Ｍ−Ｈ）−］。このＮ−保護ヌクレオシド三リン酸（５３０  ＯＤ，  ０．０５７ｍｍｏｌ）を２Ｎ  アンモニア水（２．８  ｍＬ）に溶かし室温で２時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し残渣を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、目的物５を収率３１％で５３０  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ５８３．９  ［（Ｍ−Ｈ）−］。
【００５９】
７．  ５−［１−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ］−３，６−オキサ−ヘプチル］−２’−デオキシシチジン（６）の合成
３’，５’−ジ−Ｏ−アセチルチミジン  １  （０．４２５  ｇ，  １．３  ｍｍｏｌ）から得られたヌクレオシド２（０．４２９  ｇ，  １ａを不純物として含む）を溶かした乾燥ピリジン溶液（４  ｍＬ）にオキシ塩化リン（０．１６２  ｍＬ，  １．７  ｍｍｏｌ）を室温で撹拌しながら滴下した。４時間後、反応液に氷水（０．４  ｍＬ）を０℃で加え、さらに０．５時間撹拌した。続いて濃アンモニア水（１．６  ｍＬ）を加え５０℃で２時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し残渣を１−１０％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、黄色オイル状の３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−５−［１−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ］−３，６−オキサ−ヘプチル］−２’−デオキシシチジンを１からの収率２１％で０．１４３  ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）  δ  ７．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ６．２８  （ｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ６，  ８），  ４．３７−４．２９  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．６４（ｓ，  ４Ｈ），  ３．５４  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ  ＝  ５），  ３．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７２  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１０  （ｓ，  ３Ｈ），２．０９  （ｓ，３Ｈ），  ２．０２  （ｍ，  １Ｈ），  １．４５  （ｓ，  ９Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ［帰属］  ５２９．３  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］。このデオキシシチジン誘導体（０．１４３  ｇ，  ０．２７  ｍｍｏｌ）をアンモニア−メタノール（３０  ｍＬ）に溶かし、室温で４時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣を１−１０％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、目的物６を１からの収率１７％で０．０９６ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ  ８．０９  （ｓ，１Ｈ），  ６．２２  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ６），  ４．３８  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６３  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．５１  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ  ＝  ６），  ３．２２  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ  ＝  ６），  ２．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１４  （ｍ，  １Ｈ），  １．４２  （ｓ，  ９Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ４４５．３  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］，  ４６７．２  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］，  ８８９．５  ［（２Ｍ＋Ｈ）＋］，  ９１１．４  ［（２Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００６０】
８．  ５−［（１−トリフルオロアセタミド−３，６−オキサ−ヘプチル）−３，６−オキサ−ヘプチル］−２’−デオキシシチジン（７）の合成
ヌクレオシド６  （０．１１１  ｇ，  ０．２５  ｍｍｏｌ）  を２０％トリフルオロ酢酸−ジクロロメタン混合液（１０  ｍＬ）に溶かし室温で４時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣をメタノール（３  ｍＬ）に溶かし、これにトリフルオロ酢酸エチル（１．００  ｇ，  １４  ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．５  ｍＬ，  ３．６  ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、続いて残渣を３％メタノール−クロロホルム混合液を溶出溶媒に用いて、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、無色オイル状の目的物７を収率９８％で０．１０８  ｇ得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ  ８．１８  （ｓ，  １Ｈ），  ６．２２  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ６），  ４．３７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９４  （ｑ，  １Ｈ，  Ｊ  ＝  ３），  ３．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６１−３．５９  （ｍ，  ６Ｈ），  ３．４７  （ｔ，  ２Ｈ，  Ｊ  ＝  ５），  ２．３７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１７  （ｍ，  １Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ（ポジティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ４４１．２  ［（Ｍ＋Ｈ）＋］，  ４６３．２  ［（Ｍ＋Ｎａ）＋］，  ８８１．４  ［（２Ｍ＋Ｈ）＋］，  ９０３．４  ［（２Ｍ＋Ｎａ）＋］。
【００６１】
９．５−（１−アミノ−３，６−オキサ−ヘプチル）−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸（８）の合成
ヌクレオシド７  （０．０８９  ｇ，  ０．２０  ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン（Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（登録商標），０．０６５ｇ，０．３０  ｍｍｏｌ）を一晩減圧乾燥させた。これにリン酸トリメチル（１．２  ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で加えて溶かした後、０°Ｃに冷却した。蒸留したオキシ塩化リン（０．０２３  ｍＬ，０．２４  ｍｍｏｌ）をマイクロシリンジで滴下し０°Ｃのまま撹拌した。さらに４５分後トリブチルアミン（０．１６  ｍＬ，  ０．６７  ｍｍｏｌ）と０．５  Ｍピロリン酸トリブチルアンモニウムのＤＭＦ溶液（２．１  ｍＬ）を０°Ｃで加え、反応液を室温に戻し１時間反応させた。１．０  Ｍ  炭酸水素トリブチルアンモニウム水溶液（８  ｍＬ）を加えて反応を止め反応液を減圧濃縮した。濃縮液を水（５ｍＬ）で薄めた液をセファデックスＤＥＡＥＡ−２５カラムを用い、炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ｐＨ  ８．０）の塩濃度勾配（０．０５〜１．０Ｍ）緩衝液により溶出した。精製したＮ−保護ヌクレオシド三リン酸を含むフラクション中の過剰のピロリン酸を取り除くため、さらに、これを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、５−（１−トリフルオロアセタミド−３，６−オキサ−ヘプチル）−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸を収率９％で１３５  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ６７９．０  ［（Ｍ−Ｈ）−］。このＮ−保護ヌクレオシド三リン酸（９５  ＯＤ，  ０．０１３  ｍｍｏｌ）を２Ｎ  アンモニア水（３．２ｍＬ）に溶かし室温で２時間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し残渣を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、目的物８を７からの収率３．７％で３７  ＯＤ得た。ＥＳＩ−ＭＳ（ネガティブ・モード）  ｍ／ｚ  ［帰属］  ５８２．９  ［（Ｍ−Ｈ）−］。
【００６２】
上記条件設定によって、具体的に種々の修飾アナログの合成を試みた。
修飾アナログ５と８はスキーム１に従って合成された。図１は、種々の修飾アナログの合成スキームを示す。ＮＢＳとＡＩＢＮを用いた３’、５’ジアセチル２’デオキシチミジンのラジカル炭素化、および続く２−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル）−２−アミノエトキシ］エタンとのアルコキシ置換は２を与えた。
【００６３】
続いて、アンモニア−メタノールでの３’、５’０−脱アシル化は３を与え、１から１段階の収率は、３０％であった。Ｎ−Ｂｏｃ保護基の除去とトリフロオロ酢酸エチルでの遊離のアミノリンカー末端の再保護は、４を収率８５％で与えた。ヌクレオチド４は直接的にオキシ塩化リンとピロリン酸塩で三リン酸化され、続いてアンモニア水でアミノ保護基を除去し収率３１％で５を得た。シチジン誘導体６の合成は、対応するウリジン誘導体２を経由して進めた。オキシ塩化リンと２を反応させ、続いてアンモニア水によってアミノ化させた後、３’、５’０−脱アシル化させると、１からの収率１７％で６を得た。ヌクレオシド６は四段階の反応により総収率３．４％で三リン酸８に変換された。
【００６４】
５位置換修飾ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体を基質とし、特定のＤＮＡ合成酵素（Ｆａｍｉｌｙ  Ｂ  ＤＮＡポリメラーゼ）を用いたＰＣＲ法による修飾ＤＮＡの大量合成。
次に、合成された核酸の増幅を試みた。ｐＵＣｌ８鋳型ＤＮＡと１０８塩基長のＰＣＲ産物を与える適当なプライマーを使って、対応する天然型ヌクレオシド三リン酸（ＴＴＰかｄＣＴＰ）の代わりにアナログ（５や８−１２）のＰＣＲにおける取り込みを検討した（図２及び図３）。図２は、本実施例において使用した５’位置換ピリミジン核酸トリホスフェートを示す。図３は、ＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す図である。電気泳動は、エチジウムブロミド染色した２％アガロースゲルでおこなった。全ての増幅を以下のようにおこなった。すなわち、ホットスタートを使用し（９４℃で１分間）、次いで２０サイクル増幅（９４℃で０．５分間、５２℃で０．５分間、７４℃で１分間）、及び７４℃で５分間最終インキュベーションした。
【００６５】
図３について説明すれば以下のとおりである。（ａ）レーン１：分子量マーカー、レーン２：４つの天然のトリフォスフェートｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含むＰＣＲ（正のコントロール）、レーン３：ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを含むＰＣＲ（負のコントロール）、レーン４−７：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び図２の５を含むＰＣＲ、レーン８−１１：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び図２の９を含むＰＣＲ、レーン１２−１５：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び１０を含むＰＣＲ。使用した熱安定ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔａｑ（レーン２−４、８及び１２）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（レーン５，９及び１３）、Ｐｗｏ（レーン６，１０及び１４）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、（レーン７、１１及び１５  （ｂ）  レーン１：分子量マーカー、レーン２：４つの天然のトリフォスフェートｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含むＰＣＲ（正のコントロール）、レーン３：ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを含むＰＣＲ（負のコントロール）、レーン４−７：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び図２の８を含むＰＣＲ、レーン８−１１：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ及び図２の１１を含むＰＣＲ、レーン１２−１５：ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ及び１２を含むＰＣＲ。使用した熱安定ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔａｑ（レーン２−４、８及び１２）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（レーン５，９及び１３）、Ｐｗｏ（レーン６，１０及び１４）、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、（レーン７、１１及び１５）。
【００６６】
プライマー領域を除いて二本鎖のテンプレートの増幅領域には２５個所の非連続的なＴ配列「Ｔ」、４箇所の二連続Ｔ配列「ＴＴ」、１箇所の三連続Ｔ配列「ＴＴＴ」、１箇所の四連続Ｔ配列「ＴＴＴＴ」、２７箇所の非連続なＣ配列「Ｃ」、７箇所の二連続「ＣＣ」、１箇所の三連続Ｃ配列「ＣＣＣ」、１箇所の四連続Ｃ配列「ＣＣＣＣ」を含んでいる。プライマー１及び２の配列は、それぞれプライマー１：５’−ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣ−３’、プライマー２：３’−ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＣ−５’である。次の購入可能なアナログ、プロビニルｄＵＴＰ９，ｄＵＴＰ１０、プロビニルｄＣＴＰ１１、及びメチルｄＣＴＰ１２、基質特性の比較研究のために用いた。それぞれファミリーＡ（Ｔａｑ、Ｔｔｈ、及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）  とＢ（Ｐｆｕ，Ｐｗｏ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）））に属する７種のポリメラーゼを使用してＰＣＲによる修飾ＤＮＡの直接的合成を行なった。ＰＣＲ産物は２％のアガロース電気泳動によって分離し臭化エチジウム着色によって可視化し、ゲルイメージはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（バイオ・ラド社）で記録した。修飾ＤＮＡの完全長生成物に対応するそれぞれのバンドの強度は、表１に示したようにＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアを使用することで定量化された。表１を以下のように示す。
【００６７】
【表１】
2004238353.tif 000016
記号は、全ての４つの三リン酸塩、ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びＴＴＰでポリメラーゼによって生じた完全長の生成物の量の、対応する天然三リン酸（ＴＴＰ又はｄＣＴＰ）の代わりにＣ−５修飾ピリミジンヌクレオシド三リン酸を使用して生じさせた完全長の生成物の量に対する割合を示す。＋＋＋は、＞７０％、＋＋は、３５〜７０％、＋は、＜３５％を示す。−は、ＰＣＲ産物が検出されなかったことを示す。
【００６８】
それぞれのポジティブコントロール反応によって形成された完全長生成物の量を１００％に設定した。
【００６９】
その結果、１−アミノ３，６−オキサヘプチル基をもつ修飾ｄＵＴＰ５及び修飾ｄＣＴＰ８は、ファミリーＡポリメラーゼの基質にならなかったが、ファミリーＢポリメラーゼの基質になった。対照的にプロピニルｄＵＴＰ９はすべてのポリメラーゼに受容されるにも関わらずプロピニルｄＣＴＰ１１はどのポリメラーゼの基質にもならなかった。メチルｄＣＴＰ１２がすべてのポリメラーゼに対して良い基質となる一方でプロピニルｄＣＴＰ１１が受容されないという事実を考慮すると、ｄＣＴＰのＣ５位における剛直で突き出した置換基での修飾は、酵素中の基質結合部位と置換基の立体障害のため、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに対する適切な基質特性を失わせるかもしれないと推測した。しかし、興味深いことに、Ｃ５位に最も小さな置換基を持つｄＵＴＰ１０はファミリーＢポリメラーゼに受容されなかった。これは、基質、酵素間立体障害だけでなく他の要因もポリメラーゼに対する修飾ヌクレオシド三リン酸の基質特性に影響を与えていることを示唆している。
【００７０】
結論として、ＰｆｕやＰｗｏ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）  などのファミリーＢポリメラーゼのための基質となる新規修飾２’−デオキシウリジン三リン酸及び新規修飾２’−デオキシシチジン三リン酸（５と８）を首尾よく発明した。発明者の知る限り、三リン酸８は天然のｄＣＴＰの代わりにＰＣＲによるＤＮＡの直接的合成に利用できる修飾２’−デオキシシチジンアナログの最初の例である。
【００７１】
このように、これらチミジン誘導体を組み込んだ修飾ＤＮＡが数種のＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の鋳型となるかどうかを調べた結果、本発明者らが既に報告した方法で容易に得られるチミジン誘導体は、Ｃ５位の側鎖の末端にアミノ基等を持っているので、これら５位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体を持つ修飾ＤＮＡには標識化合物又は機能性化合物を結合させることができ、ＤＮＡプローブの合成、又は試験管内選択法を用いた触媒ＤＮＡの合成に有用であることが判明した。
【００７２】
本発明者らはＦａｍｉｌｙＢ  ＤＮＡポリメラーゼが容易に２‘−デオキシシチジンアナログの誘導体を基質として受け入れ、また、２’−デオキシシチジンアナログを持つ修飾ＤＮＡが鋳型として作用することを見出した。
【００７３】
一方、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含め、Ｆａｍｉｌｙ  Ａ  ＤＮＡ合成酵素にはこのような活性は無い。Ｃ５位のα−位置にｓｐ３混成の炭素を持つ２’−デオキシシチジン誘導体がＤＮＡポリメラーゼ反応に対して、基質又は鋳型としての活性を発揮することを、本発明者らが初めて見出した。
【００７４】
【発明の効果】
本発明の誘導体は、ＳＥＬＥＸ法に適用することにより、種々の生体関連物質などに対するアプタマーや特定反応を触媒するリボザイムなど、実用可能性があるさまざまな機能性修飾ＤＮＡを提供し得るという有利な効果を奏する。
【００７５】
また、本発明の誘導体を用いた方法により、標識機能物質が結合した修飾ＤＮＡ類を酵素的に効率良く且つ充分な量得ることができる。この標識機能物質が結合した修飾ＤＮＡ類は特定の核酸を特異的に検出することが可能であり、種々の分野に応用することができる。例えば、前記修飾ＤＮＡ類は診断薬としての利用が可能であり、また特定の核酸の働きを制御する医薬品としての利用が可能である。更に、ポリアミンのような機能性物質を導入した修飾ＤＮＡ類は、酵素合成法（ＰＣＲ法）と試験管内選択法を用いることで、特定の化学反応を触媒する触媒ＤＮＡとしての利用、又は特定の低分子物質を特異的に結合するＤＮＡアプタマーとしての利用が可能である。
【００７６】
また、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いたゲノム研究には、プローブＤＮＡ（蛍光標識ＤＮＡ）が使用されているが、本発明の核酸の合成方法により、異なる２種類の蛍光標識が導入されたプローブＤＮＡを酵素的に合成することが可能であるという有利な効果を奏する。蛍光標識がｎ種類あれば、ｎ（ｎ＋１）／２通りのＤＮＡ標識化が可能となる。
【００７７】
末端のアミノ基に既知の酵素阻害剤を修飾した誘導体を原料として、ＳＥＬＥＸ法により酵素活性を阻害する機能性修飾ＤＮＡを提供し得るという有利な効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、種々の修飾アナログの合成スキームを示す。
【図２】図２は、本発明の一実施態様における、使用した５’位置換ピリミジン核酸トリフォスフェートを示す。
【図３】図３は、１０８塩基長のＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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