(57)【要約】【目的】糖転移酵素を用いて、植物あるいはその部分から直接に可溶性のフラボノイド類を製造することを目的とする。【構成】植物あるいはその部分にアルカリ液と、サイクロデキストリン、シクロアミロース、デキストリンあるいは澱粉を加え、アルカリ域で糖転移酵素を用いて糖転移反応させて、これを分離精製することで、植物あるいはその部分から直接に可溶性のフラボノイド類の配糖体を製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法であって：植物あるいはその部分に、ｐＨ８以上のアルカリ液と、β−サイクロデキストリンあるいはγ−サイクロデキストリンを加え、フラボノイド類を可溶化する工程；および当該アルカリ域にて糖転移酵素で糖転移させる工程；を包含する、製造方法。
【請求項２】
可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法であって：植物あるいはその部分に、ｐＨ８以上のアルカリ液と、α−サイクロデキストリン、デキストリン、可溶性澱粉あるいは澱粉を加え、フラボノイド類を可溶化する工程；および当該アルカリ域にて糖転移酵素で糖転移させる工程；を包含する、製造方法。
【請求項３】
可溶性のフラボノイド配糖体の製造方法であって：植物あるいはその部分に、ｐＨ８以上のアルカリ液と、シクロアミロースあるいはクラスターデキストリンを加え、フラボノイド類を可溶化する工程；および当該アルカリ域にて糖転移酵素で糖転移させる工程；を包含する、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物あるいはその部分にアルカリ液と、サイクロデキストリン、シクロアミロース、デキストリン、可溶性澱粉あるいは澱粉を加え、アルカリ域で糖転移酵素を用いて糖転移反応させて、生成した糖転移化合物を分離精製することで、植物から直接可溶性のフラボノイド類を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術および発明が解決しようとする課題】従来からビタミンＰとして知られているヘスペリジンおよびルチンなどのフラボノイド類は、血管透過性の増大を抑制するという薬理的作用を有することから、抗高血圧剤、出血性疾患予防剤等として利用されている。また、大部分のフラボノイド類は、紫外線の吸収作用を有すること、およびラジカルスカベンジャー作用を有することから、これらフラボノイド類は化粧品および食品等に機能性添加物として利用することが期待される。
【０００３】フラボノイド類は、現在、約３，０００種類が知られており、特に柑橘類中に多量に存在することから、原料を容易に、かつ安価に入手し得るにも係わらず、その利用が非常に限られてくる。それはフラボノイド類の大部分は水に僅かに溶解するかまたは全く溶解しないことによる。
【０００４】これらを解決する方法として、特開昭４８−４４２６０号、特開平３−７５９３号あるいは特開平１１−３４６７９２号に、フラボノイド類から糖転移酵素を用いて可溶性のフラボノイド配糖体を調製する方法が示してある。しかしこれらの方法では、植物からフラボノイド類を精製する必要があり、また精製フラボノイド類も上市されているが、これらは元から高額であるゆえに配糖体の製造コストも当然高くなる。
【０００５】またミカン搾汁粕からフラボノイド類であるヘスペリジンを製造する方法については日食工誌，３７，６３１−６３６（１９９０）および日食工誌，４０，８３３−８４０（１９９３）で報告されている。前者の方法は比較的単純でｐＨ調整、遠心分離、乾燥工程のみであるが、収率が２５％程度と低い。一方、後者では収率こそ７０％と向上しているが、加熱処理、酵素処理、ｐＨ調整、遠心分離、乾燥工程と複雑な処理を必要としている。次に配糖体を得るには、この難溶性のヘスペリジンを再度溶解する必要があり、その後、糖転移反応にて生成することとなり、二段階の複雑な工程で調製しなければならない。
【０００６】このように植物を原料にして直接フラボノイド配糖体を効率的に製造する方法はない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の可溶性フラボノイド配糖体の製造方法は、植物から直接にフラボノイド配糖体を製造する方法であって、植物に含まれるフラボノイド類をｐＨ８以上のアルカリ液と、サイクロデキストリン、デキストリン、可溶性澱粉あるいは澱粉を加えて、可溶化する工程、およびアルカリ域にて糖転移酵素で糖転移させる工程を包含しており、そのことによって上記目的が達成される。
【０００８】フラボノイド類とは、二つのフェニル基がピラン環あるいは、それに近い構造の三つの炭素原子を介して結合している物質群の総称である。
【０００９】本発明で使用し得る植物はどのようなものでもよいが、特に果実類が好ましく、ミカン、オレンジ、レモン、グレープフルーツなどの柑橘類や、リンゴ、ブドウ、モモ、ナシ、パインアップル、バナナ、メロン、イチゴといった果物類などがよい。また、本発明で使用し得る植物、特に果実類においては、果実全体だけでなく、皮、すじ、種子、果汁、果肉、さのう、果汁の絞りカスなどの部分を使用してもよい。さらにこれらの乾燥品を使用してもよい。
【００１０】植物に含まれ、本発明で配糖体となるフラボノイド類には、特に限定されず、公知のフラボノイド類を用いることができる。例えば、フラバノン類、フラボン類、フラボノール類、フラバノノール類、フラバノール類、アントシアン類、イソフラボン類、及びカルコン類等を挙げることができる。
【００１１】フラバノン類としては、レモン等に含まれるエリオジクチオール（Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、エリオジクチン（Ｅｒｉｏｄｉｃｔｉｎ）、カンゾウ等に含まれるリキリチン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ）、リキリチゲニン（Ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）、モモ等に含まれるナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、柑橘類全般等に含まれるナリンギン（Ｎａｒｉｎｇｉｎ）、ネオヘスペリジン（Ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、ヘスペレチン（Ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、ヘスペリジン（Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、及びサクランボ等に含まれるプルニン（Ｐｒｕｎｉｎ）等が挙げられる。
【００１２】フラボン類としては、ダリア等に含まれるアピゲニン（Ａｐｉｇｅｎｉｎ）、パセリ等に含まれるアピイン（ａｐｉｉｎ）、タツナミソウ等に含まれるバイカレイン（Ｂａｉｃａｌｅｉｎ）、スイカズラ等に含まれるシナロシド（Ｃｙｎａｒｏｓｉｄｅ）、レモン等に含まれるジオスメチン（Ｄｉｏｓｍｅｔｉｎ）、ジオスミン（Ｄｉｏｓｍｉｎ）、スギナ等に含まれるガルテオリン（Ｇａｌｕｔｅｏｌｉｎ）、植物種全般に含まれるルテオリン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、及びハッサク等に含まれるノビレチン（Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）等が挙げられる。
【００１３】フラボノール類としては、チャ等に含まれるアストラガリン（Ａｓｔｒａｇａｌｉｎ）、サイカチ等に含まれるフィセチン（Ｆｉｓｅｔｉｎ）、アーモンド等に含まれるイソラムネチン（Ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、カラスウリ等に含まれるケンフェリトリン（Ｋａｅｍｐｆｅｒｉｔｒｉｎ）、柑橘類等に含まれるケンフェロール（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、クワ等に含まれるモリン（Ｍｏｒｉｎ）、ヤマモモ等に含まれるミリセチン（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、ミリシトリン（Ｍｙｒｉｃｉｔｒｉｎ）、タマネギ等に含まれるケルシトリン（Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、ケルシメリトリン（Ｑｕｅｒｃｉｍｅｒｉｔｒｉｎ）、ケルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、キストゥス等に含まれるラムナジン（Ｒｈａｍｎａｚｉｎ）、プロポリス等に含まれるラムネチン（Ｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、及びソバ等に含まれるルチン（Ｒｕｔｉｎ）等が挙げられる。
【００１４】フラバノノール類としては、ブドウ等に含まれるアロマデンドリン（Ａｒｏｍａｄｅｎｄｒｉｎ）、マツ種等に含まれるピノバンクシン（Ｐｉｎｏｂａｎｋｓｉｎ）、及びタキシホリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ）等が挙げられる。
【００１５】フラバノール類としては、チャ等に含まれるエピカテキン（Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、エピカテキンガレート（Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）、エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、エピガロカテキンガレート（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）、カテキン（Ｃａｔｅｃｈｉｎ）、カテキンガレート（Ｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）、ガロカテキン（Ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）、及びガロカテキンガレート（Ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ）等が挙げられる。
【００１６】アントシアン類としては、コーリャン等に含まれるアピゲニニジン（Ａｐｉｇｅｎｉｎｉｄｉｎ）、ブドウ等に含まれるシアニジン（Ｃｙａｎｉｄｉｎ）、ブルーベリー等に含まれるデルフィニジン（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、デルフィニウム等に含まれるデルフィニン（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｎ）、デルフィン（Ｄｅｌｐｈｉｎ）、ソルガム等に含まれるルテオリニジン（Ｌｕｔｅｏｌｉｎｉｄｉｎ）、ウスベニアオイ等に含まれるマルビン（Ｍａｌｖｉｎ）、赤シソ等に含まれるマロニルシソニン（Ｍａｌｏｎｙｌｓｈｉｓｏｎｉｎ）、シソニン（Ｓｈｉｓｏｎｉｎ）、ナス等に含まれるナスニン（Ｎａｓｕｎｉｎ）、紫ジャガイモ等に含まれるペラニン（Ｐｅｌａｎｉｎ）、ペタイン（Ｐｅｔａｎｉｎ）、及びオランダイチゴ等に含まれるペラルゴニジン（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）等が挙げられる。
【００１７】イソフラボン類としては、ダイズ等に含まれるゲニスチン（Ｇｅｎｉｓｔｉｎ）、ゲニステイン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ダイジン（Ｄａｉｄｚｉｎ）、及びダイゼイン（Ｄａｉｄｚｅｉｎ）等が挙げられる。
【００１８】カルコン類としては、ベニバナ等に含まれるカルタミン（Ｃａｒｔｈａｍｉｎ）、及びマメ等に含まれるイソリキリチゲニン（Ｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｇｅｎｉｎ）等が挙げられる。
【００１９】本発明では、フラボノイド類の溶解方法の第１段階として、フラボノイド類がアルカリ域で水に対する溶解性が向上すること、およびサイクロデキストリン（以下「ＣＤ」という）を添加した場合はその包接化合物を形成することによって可溶化し得る。
【００２０】第１段階で、アルカリ液およびＣＤを用いる溶解工程を使用する場合、先に、アルカリ液を、続いてＣＤを添加し得るが、各工程を同時に進行することもできる。
【００２１】植物中に含まれ、本発明で配糖体となるフラボノイド類は、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウムなどを用いた、アルカリ液で溶解され得る。この時のｐＨは８以上であればよい。ｐＨ８未満でもフラボノイド類が溶解されるが、溶解されるフラボノイド類の種類が限定され、フラボノイド類の高濃度溶解液を調製し難いので、ｐＨ８以上がよい。好ましくは、ｐＨ８〜１１の範囲であり、より好ましくはｐＨ９〜１０である。
【００２２】植物中のフラボノイド類の可溶化は、植物またはその部分にアルカリ液を加え、必要に応じて、攪拌機、圧搾機、ホモジナイザー、濾過分離機、遠心分離機などを組み合わせて用いて、抽出液を調製することで得られる。この時、温度は、室温から１００℃までを選択し得るが、好ましくは２０〜８０℃である。なお、調製中にｐＨが８以下に下がることがあるので、適宜アルカリ液を添加しｐＨを８以上に保持するのがよい。
【００２３】ＣＤは、フラボノイド類と包接化合物を形成することにより、フラボノイド類を可溶化することと、フラボノイド配糖体生成における糖の供与体となる。ＣＤは、市販のものを用い得るが、澱粉にサイクロデキストリン合成酵素（１，４−α−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎ：  ４−α−Ｄ−（１，４−ｇｌｕｃａｎｏ）−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｅ．Ｃ．  ２．４．１．１９）  、以下「ＣＧＴａｓｅ」という）を作用させることによっても形成され得る。ここで生成されるＣＤは、グルコースが６〜８個、α−１，４結合で環状に結合した物質で、グルコースが６，７，８個のものをそれぞれα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤという。
【００２４】ＣＤの他に、特開平８−３１１１０３号公報、特開平８−１３４１０４号公報に記載されているシクロアミロース、またはクラスターデキストリンなどでも供与体になるので用いることができる。さらに、多様な種類が市販されているデキストリン、可溶性澱粉、澱粉等も供与体として用いることができる。
【００２５】ＣＤ、シクロアミロース、デキストリン、可溶性澱粉、澱粉は室温のアルカリ液に容易に溶けるものであれば、アルカリ液に粉末を直接加えてもよいが、加熱により糊化溶解する必要があるものは加熱後の溶解液をアルカリ液に添加するのがよい。
【００２６】供与体の濃度は、０．１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％である。
【００２７】第２段階では、糖転移酵素を用いて、糖転移を行い、フラボノイド類を配糖化することによって、中和後も沈澱を生じることがない可溶化フラボノイド類の製造を行う。
【００２８】本発明における、フラボノイド類の配糖体は、糖転移酵素による転移反応を利用して生産される。
【００２９】本発明に用いる酵素は糖転移酵素であればいずれのものでも使用し得る。例えば、ＣＧＴａｓｅ、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）およびα−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）等がある。しかし、本発明はアルカリ域での反応を有するのでアルカリ域で不安定なものを用いるとフラボノイド配糖体の収量が著しく減少する。従って、アルカリ耐性の酵素を用いる方が好ましい。特に好ましいのは特開平７−１０７９７２号公報における好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅである。
【００３０】糖転移酵素による転移反応は、基質と酵素量、ｐＨ、反応温度などにより、適宜選択されるが、フラボノイド類に糖転移するときの条件は、アルカリ域で行うこと以外は常法によるものと変わらない。中性域や酸性域で転移反応を行なうと、可溶化していたフラボノイド類が不溶化する場合があり、効率的な配糖体生成ができなくなるので、アルカリ域で転移反応を行なうのが好ましい。反応温度は、２０〜７５℃であることが好ましい。
【００３１】特開平７−１０７９７２号公報における耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを用いる場合での酵素濃度は、０．１〜１００ユニット／ｍｌとなるようにすることが好ましい。反応時間は酵素活性が持続する限り長いほどよい。反応は１００℃で５分間加熱することにより停止する。
【００３２】生成されたフラボノイド配糖体は、溶解性が著しく向上しているので、中和あるいは／およびＣＤ除去後、または酸性域でも、沈澱を生ずることのない可溶性のフラボノイド類である。
【００３３】植物から糖転移酵素で得られたフラボノイド配糖体は複数のフラボノイド類からなる混成物であるので、必要に応じて、イオン交換、ゲル濾過などを単独または、組み合わせて用いて、単離精製してもよい。
【００３４】
【実施例】
【００３５】（実施例１）オレンジ外皮５０ｇを６０℃で一晩乾燥させ、これを粉砕機で粉末化した。このオレンジ外皮乾燥粉末３ｇに３３ｍＭリン酸一水素カリウム溶液２８５ｍＬを、次に１Ｎ水酸化ナトリウム１５ｍＬを加え、強アルカリ液（ｐＨ１１．８）としてこれを懸濁しながら、粉末をより膨潤化させるために８０℃水中で５分間一時的に加熱した。室温まで冷却後、これにβ−ＣＤ５ｇを加え、次に１Ｎ塩酸の添加によりｐＨ７．０、８．０、９．０、１０．０または１１．０に調整した。これらに特開平７−１０７９７２号公報における好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを１５００ユニット分加えて、ｐＨを微調整し、４０℃に設定しておいた恒温槽に入れ、反応を開始させた。１６時間の反応の後、８０℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。
これらの各溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、図１の通り各ｐＨでの反応前フラボノイド類（ここではヘスペリジン）の溶解量に差は無かった。またオレンジ外皮乾燥粉末から溶解したヘスペリジンの量を求めると、外皮乾燥粉末１ｇ当たりで１７〜１８ｍｇであった。オレンジ乾燥外皮１ｇ中のヘスペリジン量はＪ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，４７，４３９１−４３９７（１９９９）によると１２〜３１ｍｇとされ、本実施例での方法は適正な量が溶解していることが明らかとなった。
さらに酵素反応により生成したヘスペリジン配糖体量は図１の通りｐＨ８のアルカリ域で多く、ｐＨを１１．８から８．０まで下げて酵素反応をさせると効率的に配糖体が生成することが判明した。また、ｐＨ８．０におけるヘスペリジンの溶解量は反応液１００ｍｌ中１８ｍｇ、生成した配糖体量は１５ｍｇで、収率は８０％を超えていた。これらのことは、本実施例によりオレンジ外皮中のヘスペリジンが効率よく配糖化されていることを示している。
【００３６】なお、前記ＨＰＬＣ（ＯＤＳ）の分析条件は、カラム  ：  ＯＤＳ溶出液  ：  ＡｃＣＮ／水  ＝  ２０／８０流速  ：  ０．５  ｍｌ／ｍｉｎカラム温度  ：  ４０℃検出法  ：  ＵＶ２８０によった。
【００３７】（実施例２）オレンジ外皮５０ｇを６０℃で一晩乾燥させ、これを粉砕機で粉末化した。この乾燥粉末２ｇを５ｇのβ−ＣＤを含む次の各緩衝液３００ｍＬに加えた。すなわち、０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、０．５Ｍの炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）、リン酸一水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０）に加えた。これらを懸濁しながら、８０℃水中で５分間加熱した。続いて４０℃に設定しておいた恒温槽に入れ、４０℃に達温後、各緩衝液のｐＨに微調整し、この液に好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを１５００ユニット分加えて反応を開始させた。１６時間の反応の後、８０℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。
これらの各溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、図２の通り各ｐＨでの反応前ヘスペリジンの溶解量はｐＨ８以上のアルカリ域で多かった。また酵素反応により生成したヘスペリジン配糖体量はｐＨ８から９までのアルカリ域で多く、特にｐＨ９が最も多かった。
【００３８】（実施例３）
オレンジ外皮乾燥粉末１ｇに０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１５０ｍＬ、または０．５Ｍのトリス・アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１５０ｍＬを加え、８０℃水中で５分間加熱した。これに懸濁しながらα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、または可溶性澱粉３ｇを加え、溶解後室温まで冷却した。これらに好アルカリ性バチルス属の菌体が生産する耐アルカリ性ＣＧＴａｓｅを８００ユニット分加えて、４０℃に設定しておいた恒温槽に入れ、反応を開始させた。１６時間の反応の後、８０℃、５分間の加熱によって反応を停止させた。
これらの各溶液をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析したところ、図３（ｐＨ８）、図４（ｐＨ９）の通り、β−ＣＤまたはγ−ＣＤの添加によりヘスペリジン配糖体が特に高収率で生成した。
【００３９】
【図面の簡単な説明】
【図１】アルカリ液で溶解し、各ｐＨに調整後の反応前フラボノイド類（ここではヘスペリジン）の溶解量および反応により生成した配糖体量をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析した結果である。（実施例１）
【図２】各ｐＨの緩衝液で溶解後の反応前ヘスペリジンの溶解量および反応により生成した配糖体量をＨＰＬＣ（ＯＤＳ）で分析した結果である。（実施例２）
【図３】ｐＨ８でのα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、または可溶性澱粉を加えたヘスペリジン配糖体の収率分析結果である。（実施例３）
【図４】ｐＨ９でのα−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤ、または可溶性澱粉を加えたヘスペリジン配糖体の収率分析結果である。（実施例３）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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