(57)【要約】【課題】メラノーマ細胞の増殖に対し、優れた抑制効果を示し、なおかつ毒性の弱い抗腫瘍剤を提供すること。【解決手段】ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質又はそれをコードする遺伝子を含有する、メラノーマに対する抗腫瘍剤，  ＰＬＺＦタンパク質、ＢＣＬ−６タンパク質又はこれらをコードする遺伝子を含む当該抗腫瘍剤，これらの抗腫瘍剤を、単独で、又は製剤学的組成物としてメラノーマ患者に投与するメラノーマ細胞の増殖を抑制する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質又はそれをコードする遺伝子を含有することを特徴とする、メラノーマに対する抗腫瘍剤。
【請求項２】
ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質がＰＬＺＦ又はＢＣＬ−６である請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のタンパク質又はそれをコードする遺伝子を用いることを特徴とする、メラノーマ細胞の増殖を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、メラノーマに対する抗腫瘍剤及びメラノーマ細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
メラノーマは、メラニン形成細胞（メラノサイト）が腫瘍性に増殖した状態を指し、表皮のほか、口腔、鼻腔、食道、網膜、肛門、膣などの粘膜にも発生する。
メラノーマ細胞においては、ｐ１６  ＩＮＫ４Ａ／ｐ１５  ＩＮＫ４、ＣＤＫ４／６及びサイクリンＤのような細胞周期の調節に関連する遺伝子のミューテーションや異常発現が認められるが、これらの異常な遺伝子は、メラノーマの病因のひとつであると考えられている。
メラノーマの治療法には、外科的療法、放射線療法、抗腫瘍剤や抗癌剤を投与する化学療法及び免疫療法等がある。現在行われているこれらの治療法には、まだまだ改善の余地があり、多くの癌患者が新しい治療法の開発を待ち望んでいる。
【０００３】
一方、ＢＴＢ（Ｂｒｉｃ  ａ  ｂｒａｃ，  Ｔｒａｍｔｒａｃｋ，  Ｂｒｏａｄ−ｃｏｍｐｌｅｘ）ドメインは、タンパク質とタンパク質との相互作用モジュールとして広く分布している。それは、キイロショウジョウバエのトラムトラクト［Ｔｒａｍｔｒａｃｋ（Ｔｔｋ）］とブロード・コンプレックス（ＢｒＣ）ジンクフィンガータンパク質とにおいて、もともと存在するモチーフとして確認された。当該モチーフは、ポックスウィルスの種々の非ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらの細胞相同物（ショウジョウバエ  ｋｅｌｃｈ）で同様に確認され、アクチン・フィラメントを形成し、卵母細胞の発育に関係している。
【０００４】
ゲノム配列プロジェクトでは、ＢＴＢドメインを含有する数百のタンパク質を明らかにしており、ヒトゲノムにおいてそのドメインは約１００のタンパク質中で見つかっている。そしてこれらのうちおよそ４０のタンパク質は、Ｃ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインを含むことが知られている。
そして、これら多くのＢＴＢドメインを有するタンパク質は、ヒトの悪性腫瘍に何らかの点で関連していることが報告されているが、その詳細は明らかではなく、ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質が、メラノーマに対する抗腫瘍効果を有することについては、全く知られていなかった。
【非特許文献１】ピーター・ストジオス（Ｐｅｔｅｒ  Ｓｔｏｇｉｏｓ），ギルバート・プライブ（Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｐｒｉｖｅ）、“ＢＴＢドメイン・ウェッブ・リソース（ＢＴＢ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｗｅｂ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）”、ラーン・アバウト・ＢＴＢ／ＰＯＺドメイン−オーバービュー（Ｌｅａｒｎ  ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  ＢＴＢ／ＰＯＺ  Ｄｏｍａｉｎ  −  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ）、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成１４年８月２１日アップデート］、インターネット
＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｘｔａｌ．ｏｃｉ．ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ／ｐｒｉｖｅ／ｄａｔａｂａｓｅ＿ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献２】モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），  Ｍａｒ．２００２，  ｐ．１８０４−１８１８
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、メラノーマに対する優れた抗腫瘍活性を有する新規な抗腫瘍剤及びメラノーマ細胞の増殖を抑制する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために種々検討した結果、ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質又はそれをコードする遺伝子がメラノーマに対する抗腫瘍効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、上記の目的は、ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質又はそれをコードする遺伝子、具体的には、例えば、公知の、前骨髄細胞白血病ジンクフィンガー  （ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ：以下「ＰＬＺＦ」と記載する。）タンパク質、ＢＣＬ−６（Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ６）タンパク質又はこれらをコードする遺伝子を単独で、又は製剤学的組成物としてメラノーマ患者に投与することによって達成することができる。
【０００８】
ＰＬＺＦタンパク質及びＢＣＬ−６タンパク質をコードする遺伝子は、公知であり、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔプロテイン・シーケンス・データベースにおいて、夫々Ｚ１５４＿ＨＵＭＡＮ、  ＢＣＬ６＿ＨＵＭＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｔｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｏｒｔ／）というＩＤの遺伝子として知られている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
本発明の抗腫瘍剤に含有される有効成分としては、ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質又はそれをコードする遺伝子、具体的には、例えば、ＰＬＺＦタンパク質、ＢＣＬ−６タンパク質、ミオネウリン（Ｍｙｏｎｅｕｒｉｎ）タンパク質，ＫＩＡＡ０４４１（「かずさＤＮＡ研究所」コード番号）タンパク質，又はこれらをコードする遺伝子等が挙げられ、特に、ＰＬＺＦタンパク質、ＢＣＬ−６タンパク質又はこれらをコードする遺伝子が好ましく、最も好ましいのは、ＰＬＺＦタンパク質又はこれらをコードする遺伝子である。
【００１０】
本発明の抗腫瘍剤は、メラノーマに対して優れた抗腫瘍効果を示し、メラノーマに対する抗腫瘍剤として用いることができる。
【００１１】
本発明の抗腫瘍剤は、好ましくは、静脈内、皮下または筋肉内投与または局所投与するために、注射剤の形態で用いられる。注射剤の調製は、常法によって行うことができる。即ち、注射剤の調製は、ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質の場合、当該タンパク質を生理食塩液に溶解又は懸濁し、当該溶液を無菌的に凍結乾燥することによって行うことができる。また、当該遺伝子の場合には、適当な、ウィルスベクターや発現ベクターに当該遺伝子を組み込んで、例えば、特開２００３−９５９８８に記載の方法に順じてリポソームに懸濁して注射剤を調製することができる。
【００１２】
また、本発明の抗腫瘍剤は、ドラック・デリバリー・システム（ＤＤＳ）を適用した製剤の形態で用いることもできる。特に、抗腫瘍剤が、ＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質をコードする遺伝子を含有する場合のＤＤＳ製剤としては、例えば、上記特開２００３−９５９８８に記載されている、ウイルスとリポソームの特徴を活かした遺伝子治療用の混成ベクターに有効成分を内包させたＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）−リポソーム製剤等が好ましいものとして挙げられる。
【００１３】
本発明の抗腫瘍剤には、必要に応じて、適宜、安定化剤、防腐剤、無痛化剤など通常医薬品に添加される種々の助剤を加えることができる。
【００１４】
本発明の抗腫瘍剤をメラノーマの患者に投与する場合、例えば患部に直接投与することが好ましい。本発明の抗腫瘍剤の投与量は、メラノーマ患者の症状、年齢、体重、有効成分の種類及び投与形態などによっても異なるが、通常、有効成分として、１日、約０．００１ｍｇから約１０ｍｇを１回から２回にわけて投与する。尚、毎日投与しなくとも、数日間隔で投与してもよく、例えば１〜４日毎に投与されても良い。
【００１５】
【発明の効果】
本発明のＢＴＢドメインとＣ２Ｈ２−タイプ・ジンクフィンガードメインとを分子内に併せ持つタンパク質又はそれをコードする遺伝子を有効成分とする薬剤は以下の試験例１の結果から、メラノーマ細胞の増殖に対し、優れた抑制効果を示し、なおかつこれらのタンパク質やそれをコードする遺伝子は、もともと人体にも存在しているものであるため、毒性が弱く、副作用の少ない抗腫瘍剤として期待される。
【００１６】
試験例１
１）ＰＬＺＦ発現メラノーマ細胞の樹立：
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｆｌａｇ−ｈｉｓ６／ＰＬＺＦ（ＰＬＺＦ遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｆｌａｇ−ｈｉｓ６に組み込んだもの、愛媛大学医学部医化学第二教室の東山教授より供与）、もしくはｐＥＣＦＰ−Ｃ１／ＰＬＺＦ（ＰＬＺＦ遺伝子をｐＥＣＦＰ−Ｃ１プラスミドに組み込んだもの、愛媛大学医学部医化学第二教室の東山教授より供与）各々を、メラノーマ細胞にＦｕｇｅｎｅ６ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）を用いてトランスフェクションし、３日後よりｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎもしくはＧ４１８（ｎｅｏｍｙｃｉｎに相当）添加培地に変更してＰＬＺＦ遺伝子導入細胞を選択した。結果として３７５，  ３９７，  ５２６，  ６２４という名称のメラノーマにｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ／ｆｌａｇ−ｈｉｓ６／ＰＬＺＦプラスミドが組み込まれたもの（それぞれ３７５−Ｃ，  ３９７−Ｃ，  ５２６−Ｃ，  ６２４−Ｃと命名）と、３７５，  ３６１，  Ｆｏｒｖｅｓという名称のメラノーマにｐＥＣＦＰ−Ｃ１／ＰＬＺＦプラスミドが組み込まれたもの（それぞれ３７５−Ｅ，  ３６１−Ｅ，  Ｆｏｒｖｅｓ−Ｅと命名）が得られた。
【００１７】
２）ＰＬＺＦのメラノーマの増殖に対する作用効果：
ＰＬＺＦのメラノーマの増殖に対する作用効果を調べる目的で、ＳＣＩＤマウスの背部に、各種のメラノーマ細胞を移植した。１０７  ｃｅｌｌ  ／  ｍｌのメラノーマ細胞含有培地を作製し、０．１  ｍｌ  （１０６ｃｅｌｌ）をＳＣＩＤマウスの皮下に局所注入した（メラノーマ細胞とそれに対応するＰＬＺＦ遺伝子導入メラノーマ細胞を一組とし、四組の各々について５匹ずつ用いた。ただし１ヶ月前後で各組１−２匹死亡している）。それぞれのマウスに対し、左側（図１の左側）にはＰＬＺＦ遺伝子が導入されていないメラノーマ細胞（３７５（二組用意），  ３９７，  ５２６）を注入し、右側（図１の右側）にはＰＬＺＦ遺伝子導入メラノーマ細胞（３７５−Ｃ，  ３７５−Ｅ，    ３９７−Ｃ，  ５２６−Ｃ）を注入した。
尚、図１は、メラノーマ細胞注入後に認められた左右の小腫瘤に関して、腫瘍径に最も差があった、注入後約１ヶ月（３８日）における、代表的な３例を示す図である（３９７，３９７−Ｃを注入した組）。
また、この小腫瘤は、注入の約２週間後より、左右ともに形成が認められたため、各組各々のマウスについて、小腫瘤の形成後１−２週ごとに腫瘤の長径とそれにほぼ直行する短径を測定し、その平均値と標準誤差をグラフに示し、図２〜図４に示した（図２：３７５，３７５−Ｃ，  ３７５−Ｅ／図３：３９７，３９７−Ｃ／図４：５２６，５２６−Ｃ）。
メラノーマ細胞注入後約１ヶ月までは左側のＰＬＺＦ遺伝子が導入されていないメラノーマ細胞（３７５，  ３９７，  ５２６）は、腫瘍径の増大が見られたが、１ヶ月を超えると中央部分に壊死と潰瘍が出現し、腫瘍径の増大速度は徐々に低下している。これは腫瘍径の急速な増大による、中央部分の血流途絶によるものと考えられる。
一方、右側のＰＬＺＦ遺伝子導入メラノーマ細胞（３７５−Ｃ，  ３７５−Ｅ，  ３９７−Ｃ，  ５２６−Ｃ）は、腫瘍の増大速度が遅く、ＰＬＺＦ遺伝子発現によりメラノーマ細胞の増殖が明らかに抑制されていた。
ただし、右側は、メラノーマ細胞注入後約２週間の時点での小腫瘤の腫瘍径が、もともと左側に比べて小さかったために、１ヶ月を超えてもメラノーマ細胞は徐々に増大を続け、注入後２ヶ月目には、成長の止まった左側と、腫瘍径の差は、少なくなっていた。
【００１８】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【００１９】
実施例１
製剤例（注射用製剤）
ＰＬＺＦタンパク質２０ｍｇを生理食塩液１０００ｍｌに溶解又は懸濁し、５ｍｌずつバイアル瓶に分注して、無菌的に凍結乾燥した。
【００２０】
実施例２
製剤例（注射用製剤）
ＢＣＬ−６タンパク質２０ｍｇを生理食塩液１０００ｍｌに溶解又は懸濁し、５ｍｌずつバイアル瓶に分注して、無菌的に凍結乾燥した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＬＺＦ導入メラノーマ細胞（３９７−Ｃ）における、ＰＬＺＦの抗腫瘍効果を示す写真である。
【図２】ＰＬＺＦ導入メラノーマ細胞（３７５−Ｃ，  ３７５−Ｅ）における、ＰＬＺＦの抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図３】ＰＬＺＦ導入メラノーマ細胞（３９７−Ｃ）における、ＰＬＺＦの抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図４】ＰＬＺＦ導入メラノーマ細胞（５２６−Ｃ）における、ＰＬＺＦの抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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