(57)【要約】      （修正有）【課題】ｓｉＲＮＡを利用してＨＣＶの複製を抑制すること。【解決手段】下記の式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド及び下記の式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチド。５’−Ｓ−Ｏ１−３’    （Ｉ）（式中、Ｓは、特定の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１は塩基数１〜１０個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）３’−Ｏ２−Ａ−５’    （ＩＩ）（式中、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１０〜３０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ２は塩基数１〜１０個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）【選択図】  図１
2004305140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド及び下記の式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
５’−Ｓ−Ｏ１−３’    （Ｉ）
（式中、Ｓは、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１は塩基数１〜１０個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
３’−Ｏ２−Ａ−５’    （ＩＩ）
（式中、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１０〜３０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ２は塩基数１〜１０個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
【請求項２】
下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の作用を有する請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ）  Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
（Ｂ）  Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
【請求項３】
Ｓ及びＡが塩基数１９〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である請求項１又は２記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
Ｓ及びＡが塩基数１９〜３０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である請求項３記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
Ｓ及びＡが塩基数１９個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である請求項４記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のＲＮＡ配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のＲＮＡ配列である請求項１〜５のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のＲＮＡ配列である請求項１〜５のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
Ｏ１及びＯ２が下記の塩基配列（ＩＩＩ）を有する請求項１〜７のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
５’−（Ｔ）ｍ−３’    （ＩＩＩ）
（配列（ＩＩＩ）において、ｍは１〜１０のいずれかの整数であり、Ｔはチミンであり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
【請求項９】
下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される請求項１記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（ｉ）式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｃｇｕｃｕａｇｃｃａｕｇｇｃｇｕｕａＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｇｃａｇａｕｃｇｇｕａｃｃｇｃａａｕ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（ｉｉ）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｇａｃｇａｃｃｇｇｇｕｃｃｕｕｕｃｕＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｃｕｇｃｕｇｇｃｃｃａｇｇａａａｇａ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｇｃｃｕｕｇｕｇｇｕａｃｕｇｃｃｕｇＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｃｇｇａａｃａｃｃａｕｇａｃｇｇａｃ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（ｉｖ）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｇｕｃｕｃｇｕａｇａｃｃｇｕｇｃａｃＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｃａｇａｇｃａｕｃｕｇｇｃａｃｇｕｇ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
プロモーターの制御下で、ステムループ型のＲＮＡを発現することができる請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡと式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとをスペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターの制御下に置くように構築した請求項１１記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
スペーサー領域が配列番号１４又は１６の塩基配列を有する請求項１２記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結した請求項１２又は１３記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
ターミネーターが下記の塩基配列（ＩＶ）を有するＤＮＡである請求項１４記載のＤＮＡ。
５’−（Ｔ）ｐ−３’  （ＩＶ）
（配列（ＩＶ）において、ｐは４〜８のいずれかの整数であり、Ｔはチミンであり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
【請求項１６】
プロモーターの制御下で、タンデム型のＲＮＡを発現することができる請求項１０記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結したもの及び式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結したものをそれぞれプロモーターの制御下に置くように構築した請求項１６記載のＤＮＡ。
【請求項１８】
ターミネーターが下記の塩基配列（ＩＶ）を有するＤＮＡである請求項１７記載のＤＮＡ。
５’−（Ｔ）ｐ−３’  （ＩＶ）
（配列（ＩＶ）において、ｐは４〜８のいずれかの整数であり、Ｔはチミンであり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載の発現ベクターを保持する細胞。
【請求項２１】
哺乳動物細胞である請求項２０記載の細胞。
【請求項２２】
請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物であるＲＮＡ。
【請求項２３】
下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の作用を有する請求項２２記載のＲＮＡ。
（Ａ）  Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
（Ｂ）  Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１９記載の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項２５】
Ｃ型肝炎の予防および／または治療のために用いられる請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜９のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、請求項１０〜１８のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項１９記載の発現ベクターを有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制することができる二本鎖オリゴヌクレオチド、それをコードするＤＮＡ、その発現ベクター、並びに該二本鎖オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及び発現ベクターの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は肝臓に関連する罹病率および死亡率の主要な原因である。このウイルスは肝臓に持続感染し、慢性肝炎、肝硬変および肝細胞性癌を発症する（非特許文献１）。ＨＣＶ感染に対する安全・確実な治療はいまだに開発されていない。なぜなら、ＨＣＶに関する研究は安定した細胞培養系が無いこと、および小動物モデルが無いことによって妨げられてきたからである。最近報告されたＨＣＶレプリコンは、ヒト肝癌Ｈｕｈ７細胞中で効率的かつ連続的に複製する選択可能なサブゲノムＨＣＶ−ＲＮＡである（非特許文献２）。このレプリコンシステムの開発はＨＣＶ複製、宿主−細胞相互作用および抗ウイルス療法に関する種々の分子的研究を可能とした。
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、二本鎖ＲＮＡ  （ｄｓＲＮＡ）によって開始される、配列特異的な、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写後に起こる遺伝子抑制プロセスである。ＲＮＡｉは２１−２３個のヌクレオチドからなるＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介した多段階プロセスにより、ｓｉＲＮＡに相補的なＲＮＡの分解をもたらす（非特許文献３）。しかし、哺乳動物細胞において二重鎖ＲＮＡは強い細胞傷害性応答を誘発し、ＲＮＡ転写産物の非特異的分解および宿主細胞タンパク質翻訳の非特異的低下をもたらす（非特許文献４及び５）。この問題は、遺伝子特異的抑制を媒介するに十分長いが、長いｄｓＲＮＡの悪影響を回避するに十分短いｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されたｓｉＲＮＡの使用によって最近克服された（非特許文献６）。ＲＮＡｉは遺伝子機能解析・および遺伝子抑制治療へ応用できる強力な道具となった。最近、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびポリオウイルスの複製をｓｉＲＮＡによって有効に抑制したことが報告されている（非特許文献７及び８）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ａｌｔｅｒ，  Ｍ．Ｊ．  （１９９７）  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２６，  ６２Ｓ−６５Ｓ．
【０００５】
【非特許文献２】
Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｖ．，  Ｋｏｅｒｎｅｒ，  Ｆ．，  Ｋｏｃｈ，  Ｊ．，  −Ｏ．，  Ｈｅｒｉａｎ，  Ｕ．，  Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｒ．  （１９９９）  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ａ  Ｈｅｐａｔｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  １１０−１１３．
【０００６】
【非特許文献３】
Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．Ａ．  （２００１）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ４８５−４９０．
【０００７】
【非特許文献４】
Ｂａｇｌｉｏｎｉ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｎｉｌｓｅｎ，  Ｔ．Ｗ．  （１９８３）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，  ５，  ２３−４２．
【０００８】
【非特許文献５】
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｂ．Ｒ．  （１９９７）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＰＫＲ）  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，  ２５，  ５０９−５１３．
【０００９】
【非特許文献６】
Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  Ｙａｌｃｉｎ，  Ａ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１ａ）
【００１０】
【非特許文献７】
Ｇｉｔｌｉｎ，  Ｌ．，  Ｋａｒｅｌｓｋｙ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ａｎｄｉｎｏ，  Ｒ．  （２００２）  Ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ４３０−４３４．
【００１１】
【非特許文献８】
Ｊａｃｑｕｅ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｔｒｉｑｕｅｓ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，  Ｍ．  （２００２）  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ４３５−４３８．
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ｓｉＲＮＡを利用してＨＣＶの複製を抑制することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
ＨＣＶゲノムは、ウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質をコードする１個の長いオープンリーディングフレームを含むプラス鎖ＲＮＡである。ウイルスゲノムの翻訳は５’末端非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）に位置するリボソーム結合進入部位（ＩＲＥＳ）によって媒介される（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら，  １９９２）。ＨＣＶゲノムは異なるＨＣＶ株の間で相当の変異性がある。しかし、５’−ＵＴＲおよびコア領域の上流は９９．６％の相同性を有し、最も保存されている（Ｃｈｏｏら，  １９９１；  Ｋａｔｏら，  １９９０；  Ｏｋａｍｏｔｏら，  １９９１）。ｓｉＲＮＡと標的の間の配列ミスマッチはＲＮＡｉの効果に重大な影響を及ぼすため、５’−ＵＴＲはｓｉＲＮＡの理想的な標的であると考えられる。本発明者は、ＨＣＶ−ＲＮＡの５’−ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡに基づくベクターを作製し、ルシフェラーゼリポーター遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子のキメラタンパク質を発現するＨＣＶレプリコンを用いてウイルス複製に対する効果を評価した。その結果、ＨＣＶゲノムの保存された５’−ＵＴＲを標的とするｓｉＲＮＡによってウイルス複製が著明に抑制された。本発明は上記の知見により、完成されたものである。
【００１４】
本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  下記の式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド及び下記の式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドからなる二本鎖オリゴヌクレオチド。
５’−Ｓ−Ｏ１−３’    （Ｉ）
（式中、Ｓは、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１は塩基数１〜１０個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
３’−Ｏ２−Ａ−５’    （ＩＩ）
（式中、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１０〜３０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ２は塩基数１〜１０個のＤＮＡ配列であり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
（２）  下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の作用を有する（１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（Ａ）  Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
（Ｂ）  Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
（３）  Ｓ及びＡが塩基数１９〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である（１）又は（２）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（４）  Ｓ及びＡが塩基数１９〜３０個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である（３）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（５）  Ｓ及びＡが塩基数１９個のＲＮＡ配列であり、Ｏ１及びＯ２が塩基数２個のＤＮＡ配列である（４）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（６）  Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のＲＮＡ配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を有する塩基数１９個のＲＮＡ配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（７）  Ｓが配列番号１９、２１、２３又は２５のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のＲＮＡ配列であり、Ａが前記Ｓに相補的な配列番号２０、２２、２４又は２６のいずれかの塩基配列を含む塩基数２０〜５０個のＲＮＡ配列である（１）〜（５）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（８）  Ｏ１及びＯ２が下記の塩基配列（ＩＩＩ）を有する（１）〜（７）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
５’−（Ｔ）ｍ−３’    （ＩＩＩ）
（配列（ＩＩＩ）において、ｍは１〜１０のいずれかの整数であり、Ｔはチミンであり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
（９）  下記の（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選択される（１）記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
（ｉ）式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｃｇｕｃｕａｇｃｃａｕｇｇｃｇｕｕａＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｇｃａｇａｕｃｇｇｕａｃｃｇｃａａｕ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（ｉｉ）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｇａｃｇａｃｃｇｇｇｕｃｃｕｕｕｃｕＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｃｕｇｃｕｇｇｃｃｃａｇｇａａａｇａ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（ｉｉｉ）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｇｃｃｕｕｇｕｇｇｕａｃｕｇｃｃｕｇＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｃｇｇａａｃａｃｃａｕｇａｃｇｇａｃ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（ｉｖ）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドが５’−ｇｇｕｃｕｃｇｕａｇａｃｃｇｕｇｃａｃＴＴ−３’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有し、式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドが３’−ＴＴｃｃａｇａｇｃａｕｃｕｇｇｃａｃｇｕｇ−５’（配列中、ｇはグアニン、ｃはシトシン、ａはアデニン、ｕはウラシル、Ｔはチミンであり、小文字のアルファベットはＲＮＡを表し、大文字のアルファベットはＤＮＡを表し、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
（１０）  （１）〜（９）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ。
（１１）  プロモーターの制御下で、ステムループ型のＲＮＡを発現することができる（１０）記載のＤＮＡ。
（１２）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡと式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとをスペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターの制御下に置くように構築した（１１）記載のＤＮＡ。
（１３）  スペーサー領域が配列番号１４又は１６の塩基配列を有する（１２）記載のＤＮＡ。
（１４）  式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結した（１２）又は（１３）記載のＤＮＡ。
（１５）  ターミネーターが下記の塩基配列（ＩＶ）を有するＤＮＡである（１４）記載のＤＮＡ。
５’−（Ｔ）ｐ−３’  （ＩＶ）
（配列（ＩＶ）において、ｐは４〜８のいずれかの整数であり、Ｔはチミンであり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
（１６）  プロモーターの制御下で、タンデム型のＲＮＡを発現することができる（１０）記載のＤＮＡ。
（１７）  式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結したもの及び式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結したものをそれぞれプロモーターの制御下に置くように構築した（１６）記載のＤＮＡ。
（１８）  ターミネーターが下記の塩基配列（ＩＶ）を有するＤＮＡである（１７）記載のＤＮＡ。
５’−（Ｔ）ｐ−３’  （ＩＶ）
（配列（ＩＶ）において、ｐは４〜８のいずれかの整数であり、Ｔはチミンであり、５’は５’末端を表し、３’は３’末端を表す。）
（１９）  （１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
（２０）  （１９）記載の発現ベクターを保持する細胞。
（２１）  哺乳動物細胞である（２０）記載の細胞。
（２２）  （１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物であるＲＮＡ。
（２３）  下記（Ａ）及び／又は（Ｂ）の作用を有する（２２）記載のＲＮＡ。
（Ａ）  Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する
（Ｂ）  Ｃ型肝炎ウイルスの複製を抑制する
（２４）  （１）〜（９）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、（１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（１９）記載の発現ベクターを有効成分として含む、医薬組成物。
（２５）  Ｃ型肝炎の予防および／または治療のために用いられる（２４）記載の医薬組成物。
（２６）  （１）〜（９）のいずれかに記載の二本鎖オリゴヌクレオチド、（１０）〜（１８）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（１９）記載の発現ベクターを有効成分として含む、Ｃ型肝炎ウイルスのタンパク質合成及び／又はＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制するための薬剤。
【００１５】
式（Ｉ）において、Ｓは、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜５０個、好ましくは１９〜５０個、より好ましくは１９〜３０個、最も好ましくは１９個のＲＮＡ配列である。Ｏ１は塩基数１〜１０個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個のＤＮＡ配列である。
【００１６】
式（ＩＩ）において、Ａは、前記Ｓに相補的な塩基数１０〜５０個、好ましくは１９〜５０個、より好ましくは１９〜３０個、最も好ましくは１９個のＲＮＡ配列である。Ｏ２は塩基数１〜１０個、好ましくは１〜４個、より好ましくは２個のＤＮＡ配列である。
【００１７】
式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド及び式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端は水酸基であるとよいが、それに限定されるわけではなく、所望の効果を有する限り、種々の置換、修飾等がなされていてもよい。置換及び修飾の例としては、５’末端を５’モノリン酸化すること、３’末端の２’水酸基を２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、ビオチン、２’，３’−ダイデオキシシトシン、アミノプロピルホスホエステルに変えることなどを挙げることができる。
【００１８】
また、式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドと式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドとは連結されていてもよい。この連結は、式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドの３’末端側と式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドの５’末端側が、直接あるいは塩基数１〜１００個、好ましくは３〜３０個、より好ましくは５〜２０個のＲＮＡ又はＤＮＡ配列を介して、結合する様式であるとよい。式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチドと式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチドを連結するＲＮＡ又はＤＮＡ配列としては、配列番号１４及び１６の塩基配列を有するＤＮＡがコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００１９】
配列（ＩＩＩ）において、ｍは１〜１０のいずれかの整数であるが、好ましくは１〜４のいずれかの整数であり、より好ましくは２である。
【００２０】
本明細書において、「二本鎖」とは、通常、２本の分子鎖が相補的な塩基対（すなわち、二本鎖ＲＮＡの場合、グアニンとシトシンの組合せ、またはアデニンとウラシルの組合せの塩基対）をつくることによって、１本の軸のまわりにらせん構造を形成している状態をいうが、１本の分子鎖が折り畳まれることにより、同一鎖内に二本鎖が形成されることもあるので、この態様も含まれるものとする。
【００２１】
「スペーサー領域」とは、遺伝子と遺伝子との間に存在する配列を意味する。ここで、「遺伝子」とは、転写されるＲＮＡ分子の全体をコードするＤＮＡ又はＲＮＡの部分をいう。
【００２２】
「対向する」とは、２つの配列が互いに逆方向となるように配置されていることをいう。一般に、核酸の配列について、方向とは５’末端から３’末端に向かう向きを意味する。
【００２３】
「プロモーター」とは、転写開始反応に関与するＤＮＡ領域を含む概念であり、プロモーターは、転写開始反応に関与するＤＮＡ領域のみならず、転写開始反応の効率に影響を与える様々なＤＮＡエレメント（すなわち、調節配列）を含んでもよい。
【００２４】
「プロモーターの制御下に置く」とは、プロモーターからの転写を受けて、所望のＤＮＡの転写産物が生成するように、ＤＮＡとプロモーターが結合していることをいう。従って、ＤＮＡに対するプロモーターの位置は、その下流、上流を問わないが、通常、上流に位置する。また、ＤＮＡとプロモーターとの間には、ＤＮＡの転写が起こりえる限り、任意の他のＤＮＡ配列が存在してもよい。
【００２５】
「ターミネーター」とは、転写を終結させるのに必要なＤＮＡ配列である。
【００２６】
「ステムループ」とは、一本鎖ＲＮＡ上に存在する逆方向反復配列間で水素結合によって生じる二本鎖の部分（ステム；ｓｔｅｍ）とそれに挟まれるループの部分から成る構造をいい、ヘアピンループとも呼ばれる。ステムループ型ＲＮＡ分子は、ステム領域が二本鎖ＲＮＡ構造をしており、細胞質において、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）を含むリボヌクレアーゼＩＩＩ複合体（ＲＩＳＣ）によって処理され、ＲＮＡｉ効果を有するｓｉ（短鎖干渉；ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡが生成されうると考えられる。ｓｉＲＮＡは、通常２０ｂｐ程度の二本鎖ＲＮＡ分子であり、ＲＮＡｉ効果を有することが知られているが、２０ｂｐ程度の大きさのものに限定されるものではない。ダイサーおよびＲＩＳＣは、細胞質に局在しているものと考えられているので、ステムループ型ＲＮＡ分子を細胞質へ移行させることは、ＲＮＡｉ効果を発揮させるために重要である。
【００２７】
「タンデム」とは、一本鎖ＲＮＡ上に存在する逆方向反復配列が直列に結合している構造をいう。
【００２８】
なお、本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉作用を有する（すなわち、標的とするｍＲＮＡを切断する活性を有する）短い二本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。ｓｉＲＮＡの塩基数は、通常５０個以下であり、好ましくは１０〜４０個であり、より好ましくは１０〜３０個である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ分子に限定されるわけではなく、ＲＮＡ分子と他のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡなど）とのキメラ分子であってもよく、また、これらの分子の置換体又は修飾体であってもよい。ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の置換体及び修飾体の例としては、５’末端を５’モノリン酸化したもの、３’末端の２’水酸基を２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、ビオチン、２’，３’−ダイデオキシシトシン、アミノプロピルホスホエステルに変えたものなどを挙げることができる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド及び本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの転写産物であるＲＮＡは、ＲＮＡ干渉作用を有するので、ｓｉＲＮＡとみなすことができる。
【００２９】
なお、本明細書において、「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明するが、これは、本発明の好ましい態様を説明するものであって、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００３１】
１．二本鎖オリゴヌクレオチドの製造
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは化学的合成法で製造することができる。その方法の一例を簡単に説明する。まず、式（Ｉ）で表されるオリゴヌクレオチド（センス鎖）および式（ＩＩ）で表されるオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）のぞれぞれを公知のオリゴヌクレオチド合成法で合成する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，  ４９４−４９８，  ２００１）。その後、センス鎖およびアンチセンス鎖を混合し、９０〜９８℃で１〜４分間アニーリングし、次いで、Ｍｇ２＋を含有する緩衝液中で冷却する。以上の操作により、二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
【００３２】
２．二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡの製造
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列（すなわち、配列番号１３の塩基配列のうち、第８２番目、第１８９番目、第２８６番目又は第３３１番目のいずれかの部位を含む連続した塩基数１０〜３０個のＲＮＡ配列（センス配列）及び前記ＲＮＡ配列に相補的なＲＮＡ配列（アンチセンス配列））をコードするＤＮＡは、随意のプロモーター、センス配列をコードするＤＮＡ、アンチセンス配列をコードするＤＮＡ、随意のターミネーターを含むとよい。
【００３３】
本発明の一実施態様において、センス配列をコードするＤＮＡとアンチセンス配列をコードするＤＮＡとをスペーサー領域を挟んで対向するように連結させ、これをプロモーターの制御下に置くように構築する。このように構築したＤＮＡは、プロモーターの制御下で、ステムループ型のＲＮＡを発現することができる。
【００３４】
本発明の別の一実施態様においては、センス配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結したもの及びアンチセンス配列をコードするＤＮＡの３’末端側にターミネーターを連結したもののそれぞれをプロモーターの制御下に置くように構築する。このように構築したＤＮＡは、プロモーターの制御下で、タンデム型のＲＮＡを発現することができる。
【００３５】
プロモーターは、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列部分をコードするＤＮＡより対応するＲＮＡを産生し得るものであれば、特に限定されるものではないが、ｓｉＲＮＡのような短いＲＮＡの発現に適したｐｏｌ  ＩＩＩ系を用いることが好ましい。
【００３６】
ｐｏｌＩＩＩ系のプロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡｌプロモーター、５Ｓ  ｒＲＮＡプロモーター、７ＳＫ  ＲＮＡプロモーター、７ＳＬ  ＲＮＡプロモーター、Ｈ１  ＲＮＡプロモーターなどを挙げることができる。
【００３７】
Ｕ６プロモーターの塩基配列を以下に記載する。
ｇＡＡ  ＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧ  ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴ  ＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣ  ＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡ  ＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧ  ＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴ  ＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴ  ＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧ  ＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡ  ＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡ  ＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴ  ＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡ  ＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴ  ＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴ  ＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴ  ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴ  ＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧ  ＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴ  ＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡ  ＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ  ＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴ  ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡ  ＴＡＴＡＴＣＴＴ（配列番号１５）
【００３８】
また、プロモーターとして、誘導可能なプロモーターを用いることにより、所望のタイミングでｓｉＲＮＡを発現させることも可能となる。このような誘導可能なプロモーターとしては、テトラサイクリンで誘導可能なＵ６プロモーター（Ｏｈｋａｗａ，  Ｊ．  ＆  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｂｙ  ａ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｕ６  ｓｎＲＮＡ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１，  ５７７−５８５  （２０００））等が挙げられる。また、組織特異性のあるプロモーター、あるいはＣｒｅ−ＬｏｘＰシステムのようなＤＮＡ組み換えのシステムを用いて、組織特異的にｓｉＲＮＡの発現を誘導してもよい。
【００３９】
ターミネーターは、プロモーターの転写を終結し得る配列であれば、特に限定はなく、例えば、Ｔ（チミン）塩基が４つ以上連続した配列、パリンドローム構造を形成し得る配列などを用いることができる。
【００４０】
スペーサー領域を構成するＤＮＡは、それに隣接する逆方向反復配列が水素結合をし得る限り、その長さは特に制限されないが、通常１〜１００塩基、好ましくは、３〜３０塩基であり、より好ましくは５〜２０塩基である。スペーサー領域を構成するＤＮＡの塩基配列は、それに隣接する逆方向反復配列が水素結合をし得る限り、特に規定されず、任意の配列とすることができる。スペーサー領域は、それに隣接する逆方向反復配列が水素結合をした結果、ループ構造をとる。スペーサー領域のＤＮＡの塩基配列としては、以下のものを挙げることができる。
ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ    （配列番号１４）
ＴＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＧＡＧＡＴ    （配列番号１６）
【００４１】
上記の構成要素を含む本発明のＤＮＡは、公知のオリゴヌクレオチド合成法で合成することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，  ４９４−４９８，  ２００１）。
【００４２】
３．発現ベクターの構築
本発明のＤＮＡは、そのまま細胞内の染色体に導入し、細胞内で発現させることもできるが、効率的な細胞導入などを行うために、上記ＤＮＡをベクターに保持させることが好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターもまた、本発明に含まれる。ベクターは、導入したい細胞などに対応して選択することができる。例えば、哺乳動物細胞では、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、バキュロウイルスベクター（ＰＮＡＳ  １９９５；  ９２：  １００９９）などのウイルスベクターやカチオニックリポソーム、リガンドＤＮＡ複合体、ジーンガンなどの非ウイルスベクターなどが挙げられるが（Ｎｉｉｔｓｕ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５：  １３８５−１３９５  （１９９８））、これらに限定されるものではない。
【００４３】
ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカー、あるいは、ＧＦＰなどの蛍光発光などを指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。また、ＥＧＦレセプター、Ｂ７−２などの表面抗原を指標に選択し得る選択マーカーなども用いてもよい。このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入された細胞、すなわち、本発明のベクターが導入された細胞のみを選択することが可能となる。また、ベクターを用いることにより、細胞内での保持時間を高め、またベクターによってはレトロウイルスベクターなどのように染色体へのインテグレーションを誘導するため、本発明のＤＮＡからの細胞内での安定的なＲＮＡ分子の供給を行うことが可能となる。
【００４４】
４．細胞へのＤＮＡ導入
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターを宿主細胞へ導入することにより、宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体に本発明のＤＮＡの転写産物を生産させることができる。宿主となる細胞は、特に限定されず、細菌、動物細胞、植物細胞、菌類（酵母など）等のいかなる細胞を使用してもよいが、哺乳動物細胞が好ましい。
【００４５】
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターの細胞への導入方法は、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、哺乳動物細胞への導入では、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．５２，  ｐ．４５６  （１９７３））、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．１３１１  （１９８７））  、リポフェクション法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｎｕｔｒ．，  Ｖｏｌ．７，  ｐ．１７５  （１９８  ９））、ウィルスにより感染導入方法（Ｓｃｉ．Ａｍ．，  ｐ．３４，  Ｍａｒｃｈ  （１９  ９４））  、ジーンガンなどから選択することができ、植物細胞への導入では、エレクトロポレーション法（Ｎａｔｕｒｅ，  Ｖｏｌ．３１９，  ｐ．７９１  （１９８６））  、ポリエチレングリコール法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，  Ｖｏｌ．３，  ｐ．２７１７  （１９８４））、パーティクルガン法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  Ｖｏ  ｌ．８５，  ｐ．８５０２  （１９８８））、アグロバクテリュウムを介した方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１２，  ｐ．８７１１  （１９８４））  等により行うことができる。
【００４６】
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターが導入された細胞を選択する方法としては、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターに特異的なＤＮＡ配列をプローブあるいはプライマーとして用いるハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法等の公知の手法により選択することもできるが、選択マーカーを備えたベクターに本発明のＤＮＡが保持されている場合には、その選択マーカーによる表現型を指標に選択することができる。
【００４７】
５．細胞培養および生成した転写産物の活性測定
本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡを含むベクターが導入された細胞を培地で培養し、その培養物から転写産物であるＲＮＡを単離することができる。培地の種類、培養の条件は、細胞の種類により、適宜選択することができる。単離したＲＮＡは、公知の方法により、精製することができる。
【００４８】
生成した転写産物ＲＮＡによるＨＣＶの複製を抑制する効果は、後述の実施例に記載のように、ルシフェラーゼアッセイにより測定することができる。
【００４９】
生成した転写産物ＲＮＡによるＨＣＶタンパク質の合成を抑制する効果は、後述の実施例に記載のように、ノーザンおよびウェスタンブロッティングにより測定することができる。
【００５０】
６．二本鎖オリゴヌクレオチド、そのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ及びその発現ベクターの利用
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する効果および／またはＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制する効果を有する。また、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターからの転写により生じたＲＮＡも、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質の合成を抑制する効果および／またはＣ型肝炎ウイルスの複製を抑制する効果を有する。従って、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む発現ベクターは、医薬品として、ヒト、その他の動物に投与したり、実験用の試薬として用いることができる。例えば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む発現ベクターをＣ型肝炎の予防および／または治療のために用いることができる。
【００５１】
ＨＣＶに感染した被験者の組織または細胞（例えば、肝臓）に、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターを導入することによって、細胞中のＨＣＶタンパク質の合成を抑制および／またはＨＣＶの複製を抑制することができる。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡおよび該ＤＮＡを含む発現ベクターの導入は、例えば、それらをリポソームに封入し、細胞内に取り込む方法（”Ｌｉｐｉｄｉｃ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７）  Ｒ．Ｊ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｈｕａｎｇ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ  １４，  １７３−２０６；中西守ら、蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４４，  Ｎｏ．１１，  １５９０−１５９６  （１９９９））、リン酸カルシムム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。ベクターを細胞に導入する場合には、例えば、疾患部位の細胞を一部取り出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入を行った後、該細胞を再び組織に戻すことも可能であるし、あるいは、疾患部の組織に直接ベクターを導入することもできる。ウイルスベクターで感染させる場合のウイルスタイターは通常約１０７ｐｆｕ／ｍｌ以上である。遺伝子治療にウイルスベクターを用いる方法については、例えば、”Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”  （１９９７）  Ａ．Ｅ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４９：８０７−８３８に記載されている。
【００５２】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド、そのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡを含む発現ベクターを有効成分として含む医薬組成物は、必要により、医薬上許容される担体（例えば、生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）を含むことができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
【００５３】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び比較例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５４】
材料および方法
ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡに基づくベクターの調製：ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を合成し、９５℃で１分間アニーリングし、次に２  ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ  ６．８）中でゆっくり冷却した。ｓｉＲＮＡを発現するベクターを構築するため、タンデムな形でヒトＵ６プロモーターを含むインサート、またはセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列に挟まれたステムループ型のループ配列を含むインサートをＰＣＲによって作製した。これらのインサートをｐＵＣ１９のＵ６プロモーターのすぐ下流に挿入した。陰性対照として、無関係な標的であるマチャド−ジョゼフ病遺伝子に対するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターを用いた。
タンデムな形でヒトＵ６プロモーターを含むインサートの塩基配列は以下の通りである。
ｇＡＡ  ＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧ  ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴ  ＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣ  ＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡ  ＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧ  ＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴ  ＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴ  ＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧ  ＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡ  ＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡ  ＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴ  ＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡ  ＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴ  ＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴ  ＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴ  ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴ  ＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧ  ＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴ  ＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡ  ＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ  ＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴ  ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡ  ＴＡＴＡＴＣＴＴｇｔ  ｇｇａａａｇｇａｃｇ  ａａａｃａｃｃＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮｔｔｔｔ  ｔｃＡＡＴＴＣＡＡＧ  ＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧ  ＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴ  ＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧ  ＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴ  ＡＴＴＴＧＣＡＴＡＴ  ＡＣＧＡＴＡＣＡＡＧ  ＧＣＴＧＴＴＡＧＡＧ  ＡＧＡＴＡＡＴＴＡＧ  ＡＡＴＴＡＡＴＴＴＧ  ＡＣＴＧＴＡＡＡＣＡ  ＣＡＡＡＧＡＴＡＴＴ  ＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴ  ＡＣＧＴＧＡＣＧＴＡ  ＧＡＡＡＧＴＡＡＴＡ  ＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧ  ＴＡＧＴＴＴＧＣＡＧ  ＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴ  ＡＴＧＴＴＴＴＡＡＡ  ＡＴＧＧＡＣＴＡＴＣ  ＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣ  ＣＧＴＡＡＣＴＴＧＡ  ＡＡＧＴＡＴＴＴＣＧ  ＡＴＴＴＣＴＴＧＧＣ  ＴＴＴＡＴＡＴＡＴＣ  ＴＴｇｔｇｇａａａｇ  ｇａｃｇａａａｃａｃ  ｃＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ｔｔｔｔｔ（配列番号１７）
なお、配列番号１７の塩基配列において、最初および最後のＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮの配列は、それぞれ、ｓｉＲＮＡ１２、ｓｉＲＮＡ８２、ｓｉＲＮＡ１８９、ｓｉＲＮＡ２８６、ｓｉＲＮＡ３３１または対照ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列である。
センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列に挟まれたステムループ型のループ配列を含むインサートの塩基配列は以下の通りである。
ｇＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＣＧ  ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ  ＧＧＧＣＣＴＡＴＴＴ  ＴＣＣＡＴＧＡＴＴＣ  ＣＴＴＣＡＴＡＴＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＡＣＧＡ  ＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧ  ＴＴＡＧＡＧＡＧＡＴ  ＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴ  ＡＡＴＴＴＧＡＣＴＧ  ＴＡＡＡＣＡＣＡＡＡ  ＧＡＴＡＴＴＡＧＴＡ  ＣＡＡＡＡＴＡＣＧＴ  ＧＡＣＧＴＡＧＡＡＡ  ＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴ  ＣＴＴＧＧＧＴＡＧＴ  ＴＴＧＣＡＧＴＴＴＴ  ＡＡＡＡＴＴＡＴＧＴ  ＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧ  ＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴ  ＧＣＴＴＡＣＣＧＴＡ  ＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴ  ＡＴＴＴＣＧＡＴＴＴ  ＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡ  ＴＡＴＡＴＣＴＴ  ｇｔ  ｇｇａａａｇｇａｃｇ  ａａａｃａｃｃ  ＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮ  ｔｔｃａｇａｇａ  ＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮ  ｔｔｔｔｔ（配列番号１８）
なお、配列番号１８の塩基配列において、最初および最後のＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ  ＮＮＮＮＮＮの配列は、それぞれ、ｓｉＲＮＡ１２、ｓｉＲＮＡ８２、ｓｉＲＮＡ１８９、ｓｉＲＮＡ２８６、ｓｉＲＮＡ３３１または対照ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列である。
キメラリポーター遺伝子を発現するＨＣＶレプリコン：ＨＣＶレプリコンプラスミドｐＨＣＶＩｂｎｅｏ−ｄｅｌＳは感染性ＨＣＶクローンであるＨＣ−Ｎ、遺伝子型Ｉｂに由来するものであった（Ｇｕｏら，  ２００１）。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴ）遺伝子をＦｌｕｃおよびＮＰＴからなる融合遺伝子と置換することによってｐＨＣＶＩｂｎｅｏ−ｄｅｌＳを再構築した（ｐＲｅｐ−Ｆｅｏ、図１Ｃ）。
細胞培養およびトランスフェクション：ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ７（ＡＴＣＣより入手）およびヒト胎児腎細胞系２９３Ｔ（ＡＴＣＣより入手）を、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）中で３７℃で５％  ＣＯ２下で維持した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびプラスミドのトランスフェクションは２４ウエルプレート中で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を製造者のマニュアルに従って用いて実施した。３０  ｎｇのｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃおよび２．５−１２５  ｎＭのｓｉＲＮＡまたは０．５μｇのｓｉＲＮＡ発現ベクターを１０  ｎｇのウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＲＬ−ＲＳＶ；  Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に一過性にトランスフェクトした。Ｈｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏへのトランスフェクションには、２．５−１２５  ｎＭのｓｉＲＮＡまたは０．５μｇのｓｉＲＮＡ発現ベクターを１０  ｎｇのｐＲＬ−ＲＳＶと共にトランスフェクトした。
ルシフェラーゼアッセイ：Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルミノメーター（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０１，  Ｐｒｏｍｅｇａ）によりルシフェラーゼ活性を定量した。アッセイはそれぞれ３回実施し、平均値±ＳＤとして対照の百分率で表わした。
ＭＴＴアッセイ：ｓｉＲＮＡの細胞傷害作用を評価するため、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間目にＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＭＴＴアッセイを実施した。
ノーザンハイブリダイゼーション：ＩＳＯＧＥＮ（和光純薬、大阪）を用いて細胞からＲＮＡを抽出した。このＲＮＡをアガロース−ホルムアルデヒドゲル電気泳動により分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）に転写した。ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含むメンブレンの上部をレプリコン配列に特異的なジゴキシゲニン標識プローブとハイブリダイズさせ、またメンブレンの下部をβ−アクチン特異的プローブとハイブリダイズさせた。Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた化学発光反応によりシグナルを検出し、Ｆｌｕｏｒｏ−Ｉｍａｇｅｒ  （Ｒｏｃｈｅ）により可視化した。
ウエスタンブロッティング：１０μｇの細胞タンパク質溶出液をＮｕＰＡＧＥ  ４．１２％  Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  （Ｒｏｃｈｅ）にブロットした。このメンブレンをモノクローナル抗ＮＳ５Ａ抗体（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，  Ｓａｃｏ，  ＭＥ）と共にインキュベートし、化学発光反応（ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；  ＰＯＤ，  Ｒｏｃｈｅ）により検出した。
統計学的分析：スチューデントのｔ検定を用いて統計学的分析を実施した；ｐ値が０．０５未満で統計学的に有意とみなした。
【００５５】
結果
ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲを標的としたｓｉＲＮＡ：ＨＣＶ−ＲＮＡの５’−ＵＴＲを標的としてｓｉＲＮＡを設計した（表１）。
【００５６】
【表１】
2004305140.tif 000003
ｓｉＲＮＡ１２のセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示す。
ｓｉＲＮＡ１２のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示す。
ｓｉＲＮＡ８２のセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示す。
ｓｉＲＮＡ８２のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示す。
ｓｉＲＮＡ１８９のセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示す。
ｓｉＲＮＡ１８９のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示す。
ｓｉＲＮＡ２８６のセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示す。
ｓｉＲＮＡ２８６のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示す。
ｓｉＲＮＡ３３１のセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示す。
ｓｉＲＮＡ３３１のアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示す。
対照ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１１に示す。
対照ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１２に示す。
ｓｉＲＮＡのターゲッティング配列は、Ｂｒｏｗｎら（Ｂｒｏｗｎら，  １９９２）に基づく５’−ＵＴＲの二次ＲＮＡ構造の１本鎖領域に向けられた（図１Ａ）。この領域からＧＣ含量が７０％未満である（ＡＡ／ＣＡ／ＧＡ）Ｎ１９という形の配列を選択した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  ２００１ｂ）。５’−  ＡＡ／ＣＡ／ＧＡの後のグアニンは、これがＤＮＡに基づくベクターによって発現された場合に、ＲＮＡポリメラーゼによる効率的な重合開始に必要とされる。１９個のヌクレオチドからなる選択されたＲＮＡ分子の最後にＴＴを付けたものを化学的に合成し、ゲル精製した。
ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの効果：まず始めに、ＨＣＶを標的として設計したｓｉＲＮＡのＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介翻訳を抑制する能力を試験した。
ＨＣＶ−ＩＲＥＳ−リポーター遺伝子の発現ベクターであるｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃを標的として用いた。このベクターは、ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲおよびホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）遺伝子と読み枠を合わせて連結されたコア領域の上流部分（ヌクレオチド１−３７７）からなるｍＲＮＡを発現するものであった（図１Ｃ）。ｐＩＲＥＳ−ＦｌｕｃおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。ｓｉＲＮＡ１８９およびｓｉＲＮＡ３３１は２．５から１２５  ｎＭにわたる範囲で用量依存的にルシフェラーゼ活性の発現を有意に抑制した（図２Ａ）。翻訳開始コドンのすぐ上流に向けられたｓｉＲＮＡ３３１は最も効果的で、ルシフェラーゼ活性を対照の７４％分減少させた。対照的に、ｓｉＲＮＡ１２は濃度１２５  ｎＭでルシフェラーゼ活性を増大させた。
Ｆｅｏ−レプリコン細胞に対するｓｉＲＮＡの効果：ＨＣＶの細胞内複製に対するｓｉＲＮＡの効果を評価するため、レプリコンの恒常発現しているＨｕｈ７細胞（Ｈｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏ）を標的として用いた。このレプリコンはネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびホタル・ルシフェラーゼからなるキメラタンパク質を発現する（図１Ｃ）。Ｆｅｏと称するこの融合タンパク質は、レプリコン持続増殖細胞の選択およびルシフェラーゼ活性測定による複製レベルの定量が可能である。ＨＣＶレプリコンを安定に発現するＨｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏ細胞へｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることにより、ｓｉＲＮＡ８２、１８９、２８６および３３１が用量依存的にＨＣＶ−ＲＮＡの複製を有意に抑制することを示した（図２Ｂ）。Ｈｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏ細胞を用いたアッセイによって得られたルシフェラーゼ発現の抑制パターンは、ｓｉＲＮＡおよびｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃのコトランスフェクションによって得られた抑制パターンによく似ていた。最も効果的なｓｉＲＮＡ３３１はルシフェラーゼ活性を９４％抑制した。これらのＨＣＶを標的としたｓｉＲＮＡはＨＣＶ−レプリコンの発現をｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃの発現よりも有効に抑制した。濃度１２５  ｎＭでは、ｓｉＲＮＡ８２はＨＣＶ−レプリコンを８２％抑制したのに対し、ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃを１７％抑制した；ｓｉＲＮＡ１８９はＨＣＶ−レプリコンを７７％抑制したのに対し、ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃを５０％抑制した；また、ｓｉＲＮＡ３３１はＨＣＶ−レプリコンを９４％抑制したのに対し、ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃを７５％抑制した（図２）。
ＨＣＶ−ＲＮＡ配列と無関係な対照ｓｉＲＮＡはＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃリポーター活性にもＨＣＶレプリコンの複製にも何ら影響を及ぼさなかった。ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞のＭＴＴアッセイは細胞増殖および生存率に対する重大な影響を何ら示さなかった（データは掲載していない）。これらのデータは、ルシフェラーゼ活性の低下はＨＣＶ複製に対するｓｉＲＮＡの特異的抑制効果によるものであって、ｓｉＲＮＡによって誘導された細胞死によるものではないことを示していた。
ノーザンおよびウエスタンブロッティング：ノーザンブロッティング分析において、９．６  ｋｂのＦｅｏ−レプリコンＲＮＡは濃度２．５、２５および１２５  ｎＭのｓｉＲＮＡ３３１のトランスフェクションによってそれぞれ減少した（図３Ａ）。このレプリコンＲＮＡのデンシトメトリー分析は、Ｈｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏのルシフェラーゼ活性とよく相関していた。同様にウエスタンブロッティングにおいても、ＨＣＶレプリコンから翻訳されるＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質がｓｉＲＮＡ３３１によって用量依存的に減少していた（図３Ｂ）。
ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡに基づくベクターの、ＨＣＶ  ＲＮＡの発現および複製に対する抑制効果：ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの上記成果に基づいて、タンデム型（ＭｉｙａｇｉｓｈｉおよびＴａｉｒａ，  ２００２）およびステムループ型（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら，  ２００２）を含む２つの異なるベクターを用いて、報告された方法の改変法により、ｓｉＲＮＡ３３１の配列を発現するＤＮＡに基づくベクターを構築した。タンデム型ベクターは、５個のウリジンからなる３’オーバーハングを有する、ｓｉＲＮＡの１９ヌクレオチドからなるセンスおよびアンチセンス配列を含んでいた；各配列はＵ６プロモーターの制御下に置かれていた。ステムループ型ベクターはＵ６プロモーターの制御下でｓｉＲＮＡヘアピンを発現した。これらのｓｉＲＮＡヘアピンは、９個のヌクレオチドからなるループ配列（配列番号１４）によって連結されたセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端を含んでいた（図１Ｂ）。
ｓｉＲＮＡ３３１を発現するベクターをｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃと共に２９３Ｔ細胞にコトランスフェクションした。タンデム型およびステムループ型ｓｉＲＮＡ発現ベクターの両者ともルシフェラーゼ発現を抑制したが、ステムループ型の方がタンデム型よりも効果的であった（図４Ａ）。また、レプリコン細胞においても、タンデム型およびステムループ型の両方のベクターがＨＣＶ−ＲＮＡ複製を有意に抑制した（図４Ｂ）。
【００５７】
考察
ＲＮＡｉはウイルスまたはトランスポゾン等の外来遺伝子の発現を抑制するための、植物や無脊椎動物細胞に古代から備わっている防御機構の１つである（Ｓｈａｒｐ，  ２００１）。ＲＮＡｉが哺乳動物細胞においても抗ウイルス防御に役割を果たすのかどうかは不明である。なぜなら、長いｄｓＲＮＡは一般にインターフェロン応答等の細胞傷害性作用を誘発するからである。しかし、合成ｓｉＲＮＡを用いた分化哺乳動物細胞のトランスフェクションは高度に配列特異的なＲＮＡ干渉をもたらすことが最近見いだされた（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，  ２００１ａ）。そして、ヒトの病原性ウイルス、例えばＨＩＶ  （Ｊａｃｑｕｅら，  ２００２）およびポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎら，  ２００２）は作製されたｓｉＲＮＡの良好な標的であることが示された。
【００５８】
最近、ｓｉＲＮＡと共に流体力学的注入ハイドロダイナミックインジェクションによってマウス肝臓中に一過性にコトランスフェクションされたＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の断片がｓｉＲＮＡによって切断されることが報告された（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら，  ２００２）。しかし、この実験は外部からトランスフェクトされたプラスミドからのタンパク質発現の抑制を示したにすぎず、また該ｓｉＲＮＡがＨＣＶの複製そのものをブロックできたのかどうかも示されていない。今回の研究によって、新たに開発されたＨＣＶレプリコン系を利用して、ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲに向けられたｓｉＲＮＡが効率的かつ特異的にその標的を切断することが証明された。さらに重要なことに、ＨＣＶ−ＲＮＡのこの切断はウイルスタンパク質の合成を抑制するばかりでなく、ウイルスのサブゲノムＲＮＡの複製をブロックすることを示した。
【００５９】
ウイルス、特にＨＣＶ等のＲＮＡウイルスは複製により変異を起こすことが広く知られており、免疫防御機構から逃れるために突然変異したウイルスタンパク質を連続的に産生する（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，  ２００２）。これらの突然変異によりｓｉＲＮＡの攻撃から逃れる可能性がある。なぜなら、ｓｉＲＮＡとその標的の間のたった１つの配列ミスマッチが、触媒作用をし、標的を切断する効果に決定的な影響を与えるからである。ＨＣＶゲノムのタンパク質をコードする領域配列、例えば上記の研究（ＭｃＣａｆｆｒｅｙら，  ２００２）において標的とされたＮＳ５Ｂ領域は、異なるＨＣＶ遺伝子型の間で、また同一遺伝子型の株間においてすら相当の変異性がある（Ｏｋａｍｏｔｏら，  １９９１）。さらに、プルーフリーディング活性を持たないウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの高いエラー率を考えるならば、タンパク質コード配列中にサイレント突然変異を有するｓｉＲＮＡ耐性変異がすぐに出現しうるであろう。それとは対照的に、本研究において選択された標的である５’−ＵＴＲは知られているＨＣＶ遺伝子型の間で、ほとんど同一である（Ｃｈｏｏら，  １９９１；  Ｋａｔｏら，  １９９０；  Ｏｋａｍｏｔｏら，  １９９１）。さらに、リボソーム結合およびウイルスタンパク質の翻訳を開始するという機能からくる５’−ＵＴＲの構造的制限は、その活性を保持するために耐性変異を許さないであろう。よって、ＨＣＶゲノムの５’−ＵＴＲは臨床利用のためのｓｉＲＮＡにとって理想的な標的であると思われる。
【００６０】
ＨＣＶ  ５’−ＵＴＲに向けられた全てのｓｉＲＮＡが等しく効果的というわけではなかった。試験したｓｉＲＮＡの中で、開始コドンの上流に向けられたｓｉＲＮＡ３３１が最も効果的であった。他方、ＵＴＲの５’先端に向けられたｓｉＲＮＡ８２はウイルスゲノム発現に対して殆ど効果を示さなかった。これらの結果は、部分的には、ｓｉＲＮＡが結合・切断しうる１本鎖ギャップを少数しか残さないＩＲＥＳの高度に折りたたまれた構造のためであるかもしれない。本発明者らは以前に、ｓｉＲＮＡ３３１の上記標的領域は触媒性ＲＮＡであるハンマーヘッド型リボザイムがＨＣＶタンパク質発現を抑制するための効果的な標的部位でもあることを報告した（Ｓａｋａｍｏｔｏら，  １９９６）。ＨＣＶ  ＲＮＡゲノムの二次構造がｓｉＲＮＡの効果に影響を及ぼすことが示唆されている。
【００６１】
今回の結果は、ｓｉＲＮＡがＨＣＶ−レプリコンの発現をＩＲＥＳ−リポーターベクターの発現よりも一層有効に抑制することを示した（図２）。ＨＣＶレプリコン系は、ＮＳ３ヘリカーゼおよびＮＳ５Ｂ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む自己によってコードされる非構造タンパク質により触媒されるウイルスゲノムＲＮＡ鎖の自律複製を刺激する（ＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ，  ２０００）。本研究において見いだされた、ＨＣＶレプリコンに対するｓｉＲＮＡのより強い抑制効果は、ウイルスの自律複製機構に対する多重効果によるものであるかもしれない；ウイルスＲＮＡ合成に必須のタンパク質のＩＲＥＳ媒介合成をブロックすること、および相補ＲＮＡ鎖合成の開始に必要な５’−ＵＴＲ中のエレメントの切断は、ウイルス複製のさらなる抑制をもたらすかもしれない。このように、本発明のｓｉＲＮＡはウイルスタンパク質の合成を減少させたばかりでなく、ウイルスゲノムＲＮＡの細胞内複製を抑制し、その結果、ＲＮＡｉは持続感染した宿主細胞からウイルスを排除しうるという可能性を高めた。
【００６２】
ｓｉＲＮＡによるＨＣＶ−ＩＲＥＳの切断は、タンパク質の翻訳に対して複雑な効果をもたらしうる。高用量のｓｉＲＮＡ１２（５’−ＵＴＲのヘリックスＩに向けられている；図１Ａ参照）を用いた処理はＨＣＶタンパク質発現およびウイルス複製の増大をもたらした。ＨＣＶ  ＩＲＥＳの正確な機構は解明されていないが、５’−ＵＴＲの５’端（ヘリックスＩを含む）の欠失は翻訳を増大させた（Ｆｕｋｕｓｈｉら，  １９９４；  Ｒｉｊｎｂｒａｎｄら，  １９９５；  Ｗａｎｇら，  １９９３）。さらに、この領域はＩＲＥＳ依存性翻訳を負に調節することもある（Ｈｏｎｄａら，  １９９６；  Ｋａｍｏｓｈｉｔａら，  １９９７）。それゆえ、ＩＲＥＳのシスまたはトランスに作用する陰性調節エレメントがｓｉＲＮＡによって不活性化される、すなわち切断されるのであろうと推測される。これらの結果は、最大の効果を達成するためばかりでなく治療上の使用に際して副作用を避けるためにも、ウイルスまたは他の標的に対するｓｉＲＮＡのターゲッティング配列の注意深い選択が必要であることを示唆している。
【００６３】
全ての感染細胞におけるＨＣＶ複製を抑制するに十分効果的でかつ安全な、ｓｉＲＮＡの細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏデリバリー方法はまだ確立されていない。ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡベクターもまた細胞中のＨＣＶ複製を抑制するのに有効であった。本発明者らは現在ｓｉＲＮＡ３３１  ＤＮＡ構築物をアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターに挿入し、より有効なデリバリーベクターとして非ウイルス性２本鎖ＤＮＡ構築物を作製しようとしている。最近、カチオン性脂質キャリアを必要とせずにデリバリーすることが可能な血清リボヌクレアーゼ耐性の化学的に改変されたｓｉＲＮＡ  （Ｃａｐｏｄｉｃｉら，  ２００２）、または脳および肝臓におけるｓｉＲＮＡのアデノウイルス媒介デリバリー（Ｘｉａら，  ２００２）が報告された。デリバリーは未だに大きな障害物であるが、細胞中でＨＣＶ複製を抑制する本発明のｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ発現ベクターの効果は、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡを標的とするアプローチがＨＣＶ感染に対する可能性のある効果的な治療オプションを提供することを示唆している。
【００６４】
引用文献
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Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，  Ｔ．Ｒ．，  Ｂｅｒｎａｒｄｓ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ａｇａｍｉ，  Ｒ．  （２００２）  Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６，  ５５０−５５３．
Ｃａｐｏｄｉｃｉ，  Ｊ．，  Ｋａｒｉｋｏ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｄ．  （２００２）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １６９，  ５１９６−５２０１．
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，  Ｇ．Ｇ．  （２００２）  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ３７９−３８０．
Ｃｈｏｏ，  Ｑ．Ｌ．，  Ｒｉｃｈｍａｎ，  Ｋ．Ｈ．，  Ｈａｎ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｋ．，  Ｌｅｅ，  Ｃ．，  Ｄｏｎｇ，  Ｃ．，  Ｇａｌｌｅｇｏｓ，  Ｃ．，  Ｃｏｉｔ，  Ｄ．，  Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｅｌｂｙ，  Ｒ．，  Ｂａｒｒ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ａ．Ｊ．，  Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｋｕｏ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，  Ｍ．  （１９９１）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．，  ８８，  ２４５１−２４５５．
Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  Ｙａｌｃｉｎ，  Ａ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１ａ）  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１，  ４９４−４９８．
Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｊ．，  Ｐａｔｋａｎｉｏｗｓｋａ，  Ａ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  （２００１ｂ）  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ｅｍｂｒｙｏ  ｌｙｓａｔｅ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ，  ２０，  ６８７７−６８８８．
Ｆｕｋｕｓｈｉ，  Ｓ．，  Ｋａｔａｙａｍａ，  Ｋ．，  Ｋｕｒｉｈａｒａ，  Ｃ．，  Ｉｓｈｉｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｆ．Ｂ．，  Ａｎｄｏ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｏｙａ，  Ａ．  （１９９４）  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ５’  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  １９９，  ４２５−４３２．
Ｇｉｔｌｉｎ，  Ｌ．，  Ｋａｒｅｌｓｋｙ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ａｎｄｉｎｏ，  Ｒ．  （２００２）  Ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ４３０−４３４．
Ｇｕｏ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｂｉｃｈｋｏ，  Ｖ．Ｖ．  ａｎｄ  Ｓｅｅｇｅｒ，  Ｃ．  （２００１）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７５，  ８５１６−８５２３．
Ｈｏｎｄａ，  Ｍ．，  Ｐｉｎｇ，  Ｌ．−Ｈ．，  Ｒｉｊｎｂｒａｎｄ，  Ｃ．Ａ．，  Ａｍｐｈｌｅｔｔ，  Ｅ．，  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｂ．，  Ｒｏｗｌａｎｄｓ，  Ｄ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｎ，  Ｓ．Ｍ．  （１９９６）  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  ｒｅｑｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｇｅｎｏｍｅ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２２２，  ３１−４２．
Ｊａｃｑｕｅ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｔｒｉｑｕｅｓ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，  Ｍ．  （２００２）  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ４３５−４３８．
Ｋａｍｏｓｈｉｔａ，  Ｎ．，  Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｋｏｈａｒａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｎｏｍｏｔｏ，  Ａ．  （１９９７）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２３３，  ９−１８．
Ｋａｔｏ，  Ｎ．，  Ｈｉｊｉｋａｔａ，  Ｍ．，  Ｏｏｔｓｕｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｍ．，  Ｏｈｋｏｓｈｉ，  Ｓ．，  Ｓｕｇｉｍｕｒａ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ，  Ｋ．  （１９９０）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｆｒｏｍ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−Ａ，  ｎｏｎ−Ｂ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．，  ８７，  ９５２４−９５２８．
Ｌｏｈｍａｎｎ，  Ｖ．，  Ｋｏｅｒｎｅｒ，  Ｆ．，  Ｋｏｃｈ，  Ｊ．，  −Ｏ．，  Ｈｅｒｉａｎ，  Ｕ．，  Ｔｈｅｉｌｍａｎｎ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｒ．  （１９９９）  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ａ  Ｈｅｐａｔｏｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８５，  １１０−１１３．
ＭｃＣａｆｆｒｅｙ，  Ａ．Ｐ．，  Ｍｅｕｓｅ，  Ｌ．，  Ｐｈａｍ，  Ｔ．Ｔ．，  Ｃｏｎｋｌｉｎ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｋａｙ，  Ｍ．Ａ．  （２００２）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８，  ３８−３９．
Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，  Ｋ．  （２００２）  Ｕ６  ｐｒｏｍｏｔｏｒ−ｄｒｉｖｅｎ  ｓｉＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｆｏｕｒ  ｕｒｉｄｅｉｎｅ  ３’  ｏｖｅｒｈａｎｇｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９，  ４９７−５００．
Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  Ｏｋａｄａ，  Ｓ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｋｕｒａｉ，  Ｋ．，  Ｉｉｚｕｋａ，  Ｈ．，  Ｍａｃｈｉｄａ，  Ａ．，  Ｍｉｙａｋａｗａ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｍａｙｕｍｉ，  Ｍ．  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｒｉｅｒ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｐｏｒｔｅｄ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，  ７２，  ２６９７−２７０４．
Ｒｉｊｎｂｒａｎｄ，  Ｒ．，  Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ，  Ｐ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｒａａｔｅｎ，  Ｔ．，  Ｗｈｅｔｔｅｒ，  Ｌ．，  Ｉｎｃｈａｕｓｐｅ，  Ｇ．，  Ｌｅｍｏｎ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｐａａｎ，  Ｗ．  （１９９５）  Ａｌｍｏｓｔ  ｔｈｅ  ｅｎｔｉｒｅ  ５’  ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，  ３６５，  １１５−１１９．
Ｓａｋａｍｏｔｏ，  Ｎ．，  Ｗｕ，  Ｃ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｇ．Ｙ．  （１９９６）  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ９８，  ２７２０−２７２８．
Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．Ａ．  （２００１）  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １５，  ４８５−４９０．
Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ，  Ｋ．，  Ｉｉｚｕｋａ，  Ｎ．，  Ｋｏｈａｒａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｎｏｍｏｔｏ，  Ａ．  （１９９２）  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ６６，  １４７６−１４８３．
Ｗａｎｇ，  Ｃ．，  Ｓａｒｎｏｗ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，  Ａ．  （１９９３）  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ６７，  ３３３８−３３４４．
Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｂ．Ｒ．  （１９９７）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  （ＰＫＲ）  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，  ２５，  ５０９−５１３．
Ｘｉａ，  Ｈ．，  Ｍａｏ，  Ｑ．，  Ｐａｕｌｓｏｎ，  Ｈ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ｂ．Ｌ．  （２００２）  ｓｉＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ２０，  １００６−１０１０．
【００６５】
【発明の効果】
本発明により、ｓｉＲＮＡを利用して、ＨＣＶの複製及び／又はＨＣＶタンパク質の合成を抑制することが可能となった。
【００６６】
【配列表】
2004305140.tif 000004
2004305140.tif 000005
2004305140.tif 000006
2004305140.tif 000007
2004305140.tif 000008
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2004305140.tif 000013
2004305140.tif 000014
2004305140.tif 000015
【００６７】
【配列表フリーテキスト】
【配列番号１】
配列番号１は、ｓｉＲＮＡ１２のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００６８】
【配列番号２】
配列番号２は、ｓｉＲＮＡ１２のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００６９】
【配列番号３】
配列番号３は、ｓｉＲＮＡ８２のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７０】
【配列番号４】
配列番号４は、ｓｉＲＮＡ８２のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７１】
【配列番号５】
配列番号５は、ｓｉＲＮＡ１８９のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７２】
【配列番号６】
配列番号６は、ｓｉＲＮＡ１８９のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７３】
【配列番号７】
配列番号７は、ｓｉＲＮＡ２８６のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７４】
【配列番号８】
配列番号８は、ｓｉＲＮＡ２８６のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７５】
【配列番号９】
配列番号９は、ｓｉＲＮＡ３３１のセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７６】
【配列番号１０】
配列番号１０は、ｓｉＲＮＡ３３１のアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７７】
【配列番号１１】
配列番号１１は、対照ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７８】
【配列番号１２】
配列番号１２は、対照ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の塩基配列を示す。
【００７９】
【配列番号１３】
配列番号１３は、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの５’末端非翻訳領域の一部の塩基配列を示す。
【００８０】
【配列番号１４】
配列番号１４は、スペーサー領域の塩基配列を示す。
【００８１】
【配列番号１５】
配列番号１５は、Ｕ６プロモーターの塩基配列を示す。
【００８２】
【配列番号１６】
配列番号１６は、スペーサー領域の塩基配列を示す。
【００８３】
【配列番号１７】
配列番号１７は、実施例で用いた、タンデムな形でヒトＵ６プロモーターを含むインサートの塩基配列を示す。
【００８４】
【配列番号１８】
配列番号１８は、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ配列に挟まれたステムループ型のループ配列を含むインサートの塩基配列を示す。
【００８５】
【配列番号１９】
配列番号１９は、ｓｉＲＮＡ８２のセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００８６】
【配列番号２０】
配列番号２０は、ｓｉＲＮＡ８２のアンチセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００８７】
【配列番号２１】
配列番号２１は、ｓｉＲＮＡ１８９のセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００８８】
【配列番号２２】
配列番号２２は、ｓｉＲＮＡ１８９のアンチセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００８９】
【配列番号２３】
配列番号２３は、ｓｉＲＮＡ２８６のセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００９０】
【配列番号２４】
配列番号２４は、ｓｉＲＮＡ２８６のアンチセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００９１】
【配列番号２５】
配列番号２５は、ｓｉＲＮＡ３３１のセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【００９２】
【配列番号２６】
配列番号２６は、ｓｉＲＮＡ３３１のアンチセンス鎖のＲＮＡ部分の塩基配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】パネルＡ：ＨＣＶゲノムの５’−ＵＴＲに存在する５’−ＩＲＥＳの予測される二次構造およびｓｉＲＮＡの標的部位（Ｂｒｏｗｎら，  １９９２）。
パネルＢ：ｓｉＲＮＡ発現ベクターの構造。
パネルＣ：ＨＣＶ−ＩＲＥＳ−リポータープラスミドおよびレプリコンプラスミドの構造。ＣＭＶ−Ｐ／Ｅ、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー；△Ｃ、末端切断型ＨＣＶコア領域（ヌクレオチド３４２−３７７）；  Ｆｌｕｃ、ホタルルシフェラーゼ遺伝子；ＢＧＨ  ｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位；ｐＴ７、Ｔ７プロモーター；５’−ＵＴＲ、５’末端非翻訳領域（ヌクレオチド１−３４１）；ＮＰＴ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ；ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ、ＨＣＶ非構造タンパク質；３’−ＵＴＲ、  ３’末端非翻訳領域；ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルス内部リボソーム進入部位。
【図２】ＩＲＥＳ−リポーターおよびＨＣＶレプリコンに対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの効果。
パネルＡ：ＩＲＥＳ−ホタルルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃ）、ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＲＬ−ＲＳＶ）および記載した濃度のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは対照ｓｉＲＮＡ  （ＮＣ）を用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。
パネルＢ：ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドまたは対照ｓｉＲＮＡ  （ＮＣ）を用いてＨｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。アッセイはそれぞれ３回実施し、測定値を平均値±ＳＤとしてｓｉＲＮＡ陰性対照の百分率で表わした。＊印はｐ＜０．０５を示す。
【図３】レプリコンＲＮＡおよびレプリコン由来ＨＣＶ非構造タンパク質発現の      ｓｉＲＮＡによる抑制。
６０  ｍｍプレートに播いたＨｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いてモック（レーン１）、２．５  ｎＭ（レーン２）、２５  ｎＭ（レーン３）および１２５  ｎＭ（レーン４）のｓｉＲＮＡ３３１オリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。レーン５；未処理のＨｕｈ７細胞。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。
パネルＡ：ノーザンブロッティング。ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含むメンブレンの上部をレプリコンに特異的なジゴキシゲニン標識化プローブとハイブリダイズさせ、またメンブレンの下部をβ−アクチン特異的プローブとハイブリダイズさせた。レプリコンのフルオログラムの下に記載された数字はデンシトメーター分析の結果を示す；数値はｓｉＲＮＡ陰性対照（レーン１）の百分率として表示されている。
パネルＢ：ウエスタンブロッティング。全細胞溶解物をＮｕＰＡＧＥゲル上で分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅにブロットした。このメンブレンをモノクローナル抗ＮＳ５Ａ抗体と共にインキュベートした。
【図４】ＤＮＡに基づくｓｉＲＮＡ３３１発現ベクターのＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介翻訳およびＨＣＶ複製に対する効果。
パネルＡ：モックを用いて、またはｐＩＲＥＳ−Ｆｌｕｃ、ｐＲＬ−ＲＳＶおよびタンデムもしくはステムループ型ｓｉＲＮＡ３３発現ベクターを用いて２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。
パネルＢ：モックを用いて、またはＤＮＡに基づくタンデムもしくはステムループ型ｓｉＲＮＡ３３発現ベクターを用いてＨｕｈ７／Ｒｅｐ−Ｆｅｏ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、内部ルシフェラーゼ活性を測定した。アッセイはそれぞれ３回実施し、測定値を平均値±ＳＤとしてｓｉＲＮＡ陰性対照の百分率で表わした。＊印はｐ＜０．０５を示す。
【図１】
2004305140.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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