(57)【要約】【課題】標的細胞の検査処理を自動的かつ精度良く行うとともに、検査時間を大幅に短くする。【解決手段】光学顕微鏡１は、ＸＹステージ機構を有する電動ステージ１７と対物レンズ制御部５と、ＣＣＤカメラ７とを有している。制御用ＰＣは、ＸＹ方向の移動を行うステージ（ＸＹ）移動部５３ａと、Ｚ方向の自動焦点合わせを行う自動焦点計算部５３ｂと、ＣＣＤカメラ７からの画像を入力する画像入力部５１ａと、画像認識部５１ｂと、画像処理結果を保存する結果保存用データベース部５１ｃと、を有している。ＣＣＤカメラ７により撮影された画像は、画像入力部５１ａに入力され、モニタ５５に表示されるとともに、画像認識部５１ｂと自動焦点計算部５３ｂとに送られる。画像認識部５１ｂで認識された画像は、結果保存用データベース５１ｃに記憶される。画像入力部５１ａに入力された画像は自動焦点計算部５３ｂにも送られ、自動焦点合わせに用いられる。【選択図】  図２
2004248619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象物を検査する対物レンズを備えるとともに、撮像装置と関連付けされた顕微鏡と、
前記顕微鏡における検査可能領域内に配置された試料台であって、ＸＹ移動機構を有し、検査対象試料を載せた試料板を前記光学顕微鏡により観察できる位置に置くことができるように形成された試料台と、
検査対象である標的細胞を探索済みの試料板と探索前の試料板とをそれぞれ複数枚収容できるストッカと、
前記ストッカと試料台との間で前記試料板を搬送する搬送装置と、
前記撮像装置から入力された試料の画像データを解析する解析部と、探索済みの標的細胞に関する画像データ及びその位置を記憶する記憶部と、を有する画像処理ユニットと、
前記対物レンズによる焦点合わせと前記試料板の位置とを制御する制御ユニットと、
観察画像と記憶画像とを表示する表示装置と
を含む標的細胞自動探索システム。
【請求項２】
さらに、探索後に前記試料板を試料台に再ローディングする際に、任意の探索済み標的細胞を過去に探索した際の位置情報と、その場で再度画像処理を行って得た位置情報と、に関する標的細胞の位置情報を比較し、前記試料板又は前記試料台に関する位置ずれ誤差を補正する補正手段を有していることを特徴とする請求項１に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項３】
顕微鏡による検査画像の画像処理を行い、試料板に載せられた標的細胞を自動的に探索する標的細胞自動探索システムであって、
前記標的細胞の形態的特徴を、核領域と細胞膜領域と細胞質領域とに分けて前記検査画像の画像処理を行うことを特徴とする標的画像自動探索システム。
【請求項４】
前記標的細胞とそれ以外の細胞とを、色、形状、位置関係及び面積比のうち少なくともいずれかに基づいて区別することを特徴とする請求項３に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項５】
細胞の核領域の面積と、核の円形度合いと、核の色と、細胞膜の外周値と、細胞質と核の面積比率と、細胞質の赤み度合いと、細胞質の明度と、を含む群中から選択される特性に基づいて、前記標的細胞であるか否かに関する確率値を計算することを特徴とする請求項３又は４に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項６】
さらに、前記確率値を順列化し、該確率値の高い順を表示するように制御する表示制御部を備えることを特徴とする請求項３から５までのいずれか１項に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項７】
前記画像処理による前記標的細胞であるか否かの判別レベルに関するしきい値が、調節可能なパラメータ値として定められていることを特徴とする請求項３から６までのいずれか１項に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項８】
さらに、探索処理時に前記標的細胞と判断された複数の細胞の位置情報を記憶し、検索処理後に指定された前記試料板を再ローディングした際に指定された前記標的細胞を前記顕微鏡の視野中心に自動的に移動される自動位置合わせ機構を有することを特徴とする請求項３から７までのいずれか１項に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項９】
前記自動位置合わせ機構は、探索後に指定したスライドグラスを再ローディングし、指定した前記標的細胞の過去に探索した際の位置情報から前記顕微鏡の視野中心に標的細胞を移動させた後に、その場で再度画像処理を行うことにより、現在と過去との前記標的細胞の位置情報を比較することにより、前記試料板と前記顕微鏡との物理的位置ずれ誤差を補正する補正手段を有していることを特徴とする請求項３から７までのいずれか１項に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項１０】
前記自動位置合わせは、標的細胞を基準として行われることを特徴とする請求項８又は９に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項１１】
前回の検査結果に基づいて、標的画像の判断基準となる形態的特徴のしきい値又は重要度の少なくとも一方を調整する調整手段を有することを特徴とする請求項３から１０までのいずれか１項に記載の標的細胞自動探索システム。
【請求項１２】
対象物を検査する対物レンズを備えるとともに、撮像装置と関連付けされた顕微鏡と、該顕微鏡における検査可能領域内に配置された試料台であって、ＸＹ移動機構を有し、検査対象試料を載せた試料板を前記光学顕微鏡により観察できる位置に置くことができるように形成された試料台と、検査前後の前記試料板を複数枚収容できるストッカと、前記ストッカと試料台との間で前記試料板を搬送する搬送装置と、前記撮像装置から入力された試料の画像データを解析する解析部と、画像データ及びその位置を記憶する記憶部と、を有する画像処理ユニットと、前記対物レンズによる焦点合わせと前記試料板の位置とを制御する制御ユニットと、観察画像と記憶画像とを表示する表示装置とを備えた標的細胞自動探索システムにおける探索方法であって、
標的細胞の実質的な探索を行う前に、低倍率で前記試料板上に細胞が存在する位置と細胞の分布密度が適切な箇所とを画像処理により認識するステップを含む標的細胞自動探索方法。
【請求項１３】
探索エリア内をあるピッチでスライドグラスをステップ送りしながら低倍率で探索を行い、標的細胞と思われる標的細胞候補を検出した時に前記標的細胞候補を高倍率で精密探索するステップを含む
請求項１２に記載の標的細胞自動探索方法。
【請求項１４】
探索エリア内を第１のピッチでスライドグラスをステップ送りしながら低倍率で探索を行い、探索を行ったエリア内において標的細胞候補が検出されなかった場合に、第１のピッチとは異なる第２のピッチであって、前記第１のピッチにおける探索位置と重複しない第２のピッチで探索を行うことを特徴とする請求項１３に記載の標的細胞自動探索方法。
【請求項１５】
さらに、探索した標的細胞を切出し、染色体又は遺伝子の検査の少なくとも一方を行うステップを含む請求項１３又は１４に記載の標的細胞自動探索方法。
【請求項１６】
前記標的細胞が妊婦血液中に含まれる胎児由来の有核赤血球であることを特徴とする請求項３から１５までのいずれか１項に記載の標的細胞自動探索方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的細胞の自動探索システムに関し、特に、胎児由来の有核赤血球の自動探索システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
出生前の診断を行う出生前診断技術としては、従来から、血清マーカーを使用したスクリーニング技術、羊水検査技術や絨毛検査技術などがある。最近、妊婦の血液中に胎児の血球が微量（例えば１０の８乗分の１程度）に含まれることが明らかになってきた。母体血から上記の胎児由来の有核赤血球を回収し、ＤＮＡ診断することにより、信頼性が高く、かつ、母児へのリスクを伴わない無侵襲胎児ＤＮＡ診断が可能になりつつある。
【０００３】
現在、母体血からの胎児由来の有核赤血球を回収するための技術に関して実用化を目指した研究が世界中において盛んに行われている。これらの研究のうち主要なものとして、アメリカの研究グループによるＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）技術、ヨーロッパの研究グループによるＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）技術、金沢医科大学の高林助教授らのチームによるＰｅｒｃｏｌｌ−ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ技術（非特許文献１、以下、この技術を「パーコール技術」と略記する。）の３通りの技術が良く知られている。特に、米国においては、１９９４年頃から国立衛生研究所（ＮＩＨ）の統括のもとでＦＡＣＳ法の研究開発が行われている。
【０００４】
また、画像処理により胎児由来の有核赤血球を検出するための装置としては、カメラと顕微鏡とを用い、コンピュータ制御により試料を検査する装置が開示されている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
【非特許文献１】
高林晴夫、「出生前遺伝子検査の進歩：母体血による胎児ＤＮＡ診断」、遺伝子医学Ｖｏｌ．５、Ｎｏ．３（２００１）ｐ４１０−４１６．
【特許文献１】
特表２００２−５１４７６２号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記技術のうち、血清マーカースクリーニング技術は、胎児由来有核赤血球の回収に関する信頼性に問題がある。羊水検査及び絨毛検査は、母体、胎児への侵襲を伴い、母児へのリスクがあるため広範には普及していない。
【０００７】
また、母体血液中に含まれる胎児由来の有核赤血球の存在率は非常に低いため、効率的に回収することは難しい。
【０００８】
米国の研究グループによるＦＡＣＳ法及び欧州の研究グループによるＭＡＣＳ法は、胎児細胞特異的な抗体などでマーキングし、それらを指標に胎児細胞を選別する技術を用いているが、これらの技術を用いても、母体由来細胞の混入が多く実用化に関する大きな問題点となっている。
【０００９】
これに対して、血液をスライドグラスに塗布し胎児細胞を形態により識別し個々に採取するパーコール技術は、図１２に示すように、画像１００内の胎児由来赤血球（有核）のみを確実に採取でき後工程であるＤＮＡ診断がやりやすいため有効かつ確実な技術である。しかしながら、この技術は、検査担当者が目視で判断を行う工程が入るため、スライドガラス全面を顕微鏡で探索するための処理に膨大な時間を要し、実用化に対して大きな問題となる。例えば、１つの有核赤血球当たりの探索に関して、２０分から１時間程度の時間を要している。また、スライドグラス上における検査対象中には、胎児に由来する有核赤血球に形状が良く似たリンパ球なども多く存在し、熟練した経験者であっても有核赤血球との識別は難しく、実用化に対する大きなネックとなっていた。
【００１０】
また、上記特許文献１の技術は、標的細胞の判定手法、検査技師への提示方法、複数プレパラートの交換、位置決めの画像処理機能が異なり、本装置の方が、効率良く胎児由来有核赤血球の回収が可能である。但し、上記装置においては、高精度なスライドグラス固定機構や高精度位置決めが可能な顕微鏡ステージが必要となり、数μｍ〜数１０μｍ単位での物理的位置ずれ誤差は避けることができず、再現性が乏しいために再度探索が必要になるなど作業性が良くなかった。
【００１１】
本発明の目的は、胎児由来の赤血球などの検査対象を精度良く検出することができるとともに、複数の検査対象を効率良く検査することができる自動検査装置を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の一観点によれば、対象物を検査する対物レンズを備えるとともに、撮像装置と関連付けされた顕微鏡と、前記顕微鏡における検査可能領域内に配置された試料台であって、ＸＹ移動機構を有し、検査対象試料を載せた試料板を前記光学顕微鏡により観察できる位置に置くことができるように形成された試料台と、検査対象である標的細胞を探索済みの試料板と探索前の試料板とをそれぞれ複数枚収容できるストッカと、前記ストッカと試料台との間で前記試料板を搬送する搬送装置と、前記撮像装置から入力された試料の画像データを解析する解析部と、探索済みの標的細胞に関する画像データ及びその位置を記憶する記憶部と、を有する画像処理ユニットと、前記対物レンズによる焦点合わせと前記試料板の位置とを制御する制御ユニットと、観察画像と記憶画像とを表示する表示装置とを含む標的細胞自動探索システムが提供される。
【００１３】
さらに、探索後に前記試料板を試料台に再ローディングする際に、任意の探索済み標的細胞を過去に探索した際の位置情報と、その場で再度画像処理を行って得た位置情報と、に関する標的細胞の位置情報を比較し、前記試料板又は前記試料台に関する位置ずれ誤差を補正する補正手段を有しているのが好ましい。
【００１４】
上記標的細胞自動探索システムによれば、再ローディングした際における前記試料板の位置ずれが生じても、複数の任意の探索済み標的細胞を、直ちに顕微鏡の視野中心に移動でき、作業性が向上する。
【００１５】
本発明の他の観点によれば、対象物を検査する対物レンズを備えるとともに、撮像装置と関連付けされた顕微鏡と、該顕微鏡における検査可能領域内に配置された試料台であって、ＸＹ移動機構を有し、検査対象試料を載せた試料板を前記光学顕微鏡により観察できる位置に置くことができるように形成された試料台と、検査前後の前記試料板を複数枚収容できるストッカと、該ストッカと試料台との間で前記試料板を搬送する搬送装置と、前記撮像装置カメラから入力された試料の画像データを解析する解析部と、画像データ及びその位置を記憶する記憶部と、を有する画像処理ユニットと、前記対物レンズによる焦点合わせと前記試料板の位置とを制御する制御ユニットと、観察画像と記憶画像とを表示する表示装置とを備えた標的細胞自動探索システムにおける探索方法であって、標的細胞の実質的な探索を行う前に、低倍率で前記試料板上に細胞が存在する位置と細胞の分布密度が適切な箇所とを画像処理により認識するステップを含む標的細胞自動探索方法が提供される。上記方法を用いると、探索エリアが限定されるため探索時間を大幅に短縮することができる。
【００１６】
探索エリア内をあるピッチでスライドグラスをステップ送りしながら低倍率で探索を行い、標的細胞と思われる標的細胞候補を検出した時に前記標的細胞候補を高倍率で精密探索するのが好ましい。この方法を用いると、標的細胞をいち早く探索し確定することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明に係る標的細胞自動探索システムは、標的細胞を探索し、探索後に再度顕微鏡上にローディングし、前に探索した標的細胞を自動的に顕微鏡視野中心に移動させることができるシステムである。細胞を比重分離する上記パーコール技術等を用いて分離した血液をスライドグラスに塗布し、胎児細胞を形態により識別し、個々に確実に胎児細胞のみを採取することを目的とする胎児由来有核細胞を探索する本発明に係る標的細胞自動探索システムの構成について、以下に簡単に説明する。
【００１８】
本発明に係るシステムは、顕微鏡と、高精度デジタルカメラと、スライドグラスを載せるステージと、を備え、標的細胞の形態的な特徴を探索することができる。また短時間で標的細胞を探索可能な画像処理を含めた新たな探索アルゴリズムを有している。これらにより、短時間で信頼性の高い標的細胞の探索が可能となる。
【００１９】
また、複数枚のスライドグラスについて処理が可能であり、それぞれのスライドグラスにおいて探索した所定の指定数の標的細胞に関する画像及び顕微鏡ステージ上の位置情報（Ｘ，Ｙ）を記憶することにより、探索停止又は終了後に、所望のスライドグラスをステージ上に再ローディングし、指定した標的細胞を直ちに顕微鏡の視野中心に移動できるように構成した。
【００２０】
再ローディングする際に、任意の探索済み標的細胞を過去に探索して記憶した位置情報と、その場で再度画像処理を行って現在と過去の標的細胞の位置情報を比較し、スライドグラス又は顕微鏡ステージ等の物理的位置ずれ誤差を補正することにより、再ローディング時におけるスライドグラスの位置ずれがあっても複数の任意の探索済み標的細胞を直ちに顕微鏡の視野中心に標的細胞を移動できるようにした。高精度モニタによる画像表示又は顕微鏡像の観察を行うことにより、作業者による細胞の直接判断が可能となり、確実に標的細胞を選別することができる。血液をスライドグラスに塗布し、胎児細胞を形態により識別し、個々に確実に胎児細胞のみを採取することを目的とする有核細胞を探索する自動化装置を考案した。
【００２１】
以下、本実施の形態による標的細胞自動探索システムについて、図面を参照しつつ説明を行う。図１及び図２は、本実施の形態による標的細胞自動探索システムの構成例を示す図である。
【００２２】
図１及び図２に示す装置は、血液をスライドグラスに塗布し、胎児細胞を形態により識別し、個々に確実に胎児細胞のみを採取することを目的とする有核細胞を探索する自動化装置である。
【００２３】
図１に示すように、本実施の形態による標的細胞自動探索システムは、光学搬送系Ａと、画像処理系（画像処理ＰＣ）Ｂと、制御系（制御ＰＣ）Ｃと、出力系（高精度モニタディスプレイ）Ｄとを備えている。
【００２４】
光学搬送系Ａは、光学顕微鏡１であって、上部に形成された凹溝部３内に、その上方の対象物を検査する対物レンズ５を備えるとともに、ＣＣＤカメラ（撮像装置）７を備えた光学顕微鏡１と、光学顕微鏡１の上部に配置された試料台１１であってＸＹステージ機構１７を有する試料台１１と、例えばスライドグラス２３をその上面２１に置くことができるように形成された試料配置部１５と、を有しており、試料配置部１５に配置されるスライドグラス２３上の試料を、対物レンズ５とＣＣＤカメラ７とを有する光学顕微鏡１により検査することができる。
【００２５】
試料台１１上には、検査前又は検査後のスライドグラス２３を多数枚、例えば５０枚程度収容できる収容部４５を備えたストッカ４１が設けられるとともに、スライドグラス２３を試料台１１に設置して検査可能な状態にしたり、ストッカ４１の収容部４５内に収容したりする動作を行うための作動アーム３３を備えた搬送装置３１が設けられている。
【００２６】
画像処理系（画像処理ＰＣ）Ｂは、データ解析、ストレージ（データの記憶）などを行う画像処理ユニット５１を含む。制御ＰＣ系Ｃは、Ｘ−Ｙステージ１７などの位置制御や全体の処理シーケンスを制御する制御ユニット５３を含む。出力系Ｄは、例えば、高精度モニタディスプレイ（表示装置）５５を含む。
【００２７】
複数のスライドグラス２３を収納可能なストッカ４１と自動搬送装置３１とを備えることにより、夜間運転など連続的に大量の探索を行うことができる。光学顕微鏡１に設けられたＸＹステージ１７は、高速、高精度の位置決め動作が可能な電動ステージであり、試料面内における短時間での高速ステップ送りが可能である。光学顕微鏡１に備えられた高精度デジタルカメラ（ＣＣＤカメラ）７と、標的細胞の形態的な特徴に応じた画像処理ソフトウェア（後述する）により、短時間で高精度な標的細胞の探索が可能となる。
【００２８】
試料台１１の中央付近には、内径が２段階に異なる（上の内径が大きい）開口部１５が形成されている。スライドグラス２３のサイズは、開口部１５のうちの小さい方（下方）の開口径よりも大きくなっており、開口部１５のうちの大きい方の開口径よりも小さくなっている。これにより、大きい方の開口部底面２１上にスライドグラス２３の例えば周辺部を載せることができる。
【００２９】
それぞれのスライドグラス２３において探索した指定数の標的細胞の画像、およびステージ上の位置座標（Ｘ，Ｙ）を記憶装置（ストレージ）に記録することにより、探索後に任意のスライドグラスをステージ上に再ローディングし、指定した標的細胞を直ちに顕微鏡の視野中心に移動できる。探索後に、スライドグラス２３を試料台１１に再ローディングする際に、任意の探索済み標的細胞を過去に探索した際の位置情報と、その場で再度画像処理を行って得た位置情報との、現在と過去との標的細胞の位置情報とを比較し、スライドグラス２３又はＸＹステージ機構１７を有する試料台１１等の物理的位置ずれ誤差を補正することにより、再ローディングした際におけるスライドグラス２３の位置ずれが生じても、複数の任意の探索済み標的細胞を、直ちに顕微鏡の視野中心に移動でき、作業性が向上する。上記システムを用いると、高精度かつ高価なスライドグラスや顕微鏡ステージを使用しない場合でも、スライドグラス２３の位置ずれを補正する機構（アルゴリズムを含む）を備えることにより、低コスト、かつ、高精密な検査対象の探索が可能となる。また、高精度モニタ５５による画像表示又は顕微鏡像の観察により、作業者による細胞の直接判別が可能となり、確実に標的細胞を選別することができる。
【００３０】
図２は、図１に示す本実施の形態による標的細胞自動探索システムの概略構成例を示す機能ブロック図であり、特に画像処理系に重点を置いて説明を行う。図２に示すように、光学顕微鏡１は、ＸＹステージ機構１７を有する電動ステージと対物レンズ制御部５と、ＣＣＤカメラ７とを有している。制御用ＰＣは、ＸＹ方向の移動を行うステージ（ＸＹ）移動部５３ａと、Ｚ方向の自動焦点合わせを行う自動焦点計算部５３ｂと、ＣＣＤカメラ７からの画像を入力する画像入力部５１ａと、画像認識部５１ｂと、画像処理結果を保存する結果保存用データベース部５１ｃと、を有している。
【００３１】
ＣＣＤカメラ７により撮影された画像は、画像入力部５１ａに入力され、モニタ５５に表示されるとともに、画像認識部５１ｂと自動焦点計算部５３ｂとに送られる。画像認識部５１ｂで認識された画像は、結果保存用データベース５１ｃに記憶される。自動焦点計算部５３ｂに送られた画像により、自動焦点合わせが行われる。
【００３２】
以下の説明においても、図１及び図２を適宜参照する。
まず、標的細胞探索手順例について図３を参照して説明する。ステップＳ１に示すように、多数のスライドグラス（例えば５０枚）２３をストッカ（カセットホルダ）４１内に収納する。ストッカ４１をエレベータ（図示せず）に取り付ける（ステップＳ２）。高精度モニタディスプレイ５５上においてステップＳ３に示すように標的の探索条件を入力し、搬送装置３１を用いて自動的にスライドグラス２３を、光学顕微鏡１上の試料台（ＸＹステージ）１７上にローディングする（ステップＳ４）。自動焦点機能によりスライドグラス２３上の試料に焦点を合わせる（ステップＳ５）。光学顕微鏡１より得られるデジタル画像を取り込み（ステップＳ６）、画像処理により標的細胞を探索する（ステップＳ７）。標的細胞の特徴となる形状、色、サイズ等により画像処理を行い、標的細胞と他の細胞を選別する。ステップＳ７で、標的細胞検索ができた場合にはステップＳ９に進み、探索した標的細胞の画像と位置座標に関する情報を記憶装置（データベース）５１ｃ（図２）に記録する。
【００３３】
電動ステージを微小ステップ送りし、スライドグラスを他の探索領域が検査できる位置まで移動し、次の探索を開始する。指定数の標的細胞の探索が完了すると（ステップＳ１０）、スライドグラスをステージからアンローディングし（Ｓ１１）、別のスライドグラス２３をストッカ４１よりローディングする（ストッカ４１内の全てのスライドグラス２３又は指定した複数（または単独）のスライドグラス２３の探索が完了するまでこれを繰り返し（ステップＳ１１からステップＳ４に戻るループ））。尚、ステップＳ７において、画像処理により標的細胞の探索ができなかった場合（ＮＧ）にはステップＳ８に進み、ステージ１７を移動し他の探索領域にステージ１７とともにスライドグラス２３を移動させ、ステップＳ６に戻る。ステップＳ１２において、指定したスライドグラスの全量の探索が終了すると、実際の探索は完了し（ステップＳ１３）、探索結果をモニタディスプレイ５５の表示画面上で確認し（ステップＳ１５）、任意のスライドグラス２３およびその上の標的細胞を表示画面上において指定し（ステップＳ１７）、ステップＳ１８において、ステップＳ１７で指定した標的細胞に関連するスライドグラス２３をＸＹステージ１７上にローディングする（ステップＳ１８）。次いで、ステップＳ１９において、指定した標的細胞の位置情報に基づいて、ＸＹステージ１７により標的細胞を光学顕微鏡１の視野の中心又はその近傍まで移動させる。光学顕微鏡１により視野の中心にある細胞が標的細胞であることを確認する（ステップＳ２０）。ステップＳ２０において、標的細胞の最終確認であると判断された場合には、ステップＳ２１に移る。ステップＳ２０において最終確認ではないと判断された場合には、ステップＳ１７に戻り、次の標的細胞を指定する。
【００３４】
ステップＳ２０において最終確認ができた場合には、マイクロマニピュレータ（図示せず）などを用いて、標的細胞をスライドグラス２３から取り出す（ステップＳ２１）。回収した標的細胞の核を用いて、染色体検査、遺伝子検査等へと進む（ステップＳ２２）。
【００３５】
次に説明する処理は、図９（Ａ）から図９（Ｄ）までに示すように、光学顕微鏡に接続したＣＣＤカメラより画像（図９（Ａ）の符号１０３）の取得を行った後、核領域候補を抽出し（図９（Ｂ）の符号１０７、図９（Ｃ）の符号１１５）、細胞膜領域の抽出、細胞質領域の抽出より、標的細胞であるかを判断する（図９（Ｄ）、符号１１８）処理である。
【００３６】
まず、図５を参照して核領域の抽出処理に関する説明を行う。ステップＳ３１において、光学顕微鏡１に接続したＣＣＤカメラ７より画像を取得する。この入力画像は、ＲＧＢ成分を持つデジタル画像である。アナログ入力機器を使用した場合は、デジタル画像（ＲＧＢデジタル信号）に変換してから以後の処理を行う。
【００３７】
ステップＳ３２において、入力画像（ＲＧＢ）から、濃度レベル画像１（Ｌ１＝  １−Ｒ  ＋  １−Ｇ）を作成する。ステップＳ３３において、濃度レベル画像１より、濃度ヒストグラム１を作成する。濃度ヒストグラム１から、濃度基準値１を決定する。濃度レベル画像１のうち、濃度基準値１より高い画素を“１”（核を含む領域）、それ以外を“０”（背景）とする２値化画像を作成し、マスク画像１とする（ステップＳ３４）。    マスク画像１により、入力画像のＲ成分をマスク処理し、Ｒ画像１を作成する（ステップＳ３５）。ステップＳ３６において、Ｒ画像１により、Ｒ値の平均値を算出する。Ｒ画像１のうち、平均値より小さい画素を“１”（核を含む領域）、それ以外を“０”（背景）とする。その画像をマスク画像２とする（ステップＳ３７）。マスク画像２により、入力画像（ＲＧＢ）をマスク処理し、核候補領域画像１（ＲＧＢ）を作成する（ステップＳ３８）。
【００３８】
ステップＳ３９において、作成した核候補領域画像１から濃度レベル画像２（Ｌ２  ＝  （Ｒ  ＋  Ｇ  ＋  Ｂ）／３）を作成する。濃度レベル画像２において、“０”以外の領域の連結成分を探してラベリング処理を行う（ステップＳ４０）。
【００３９】
ステップＳ４１において、各々その連結成分の面積が例えば基準値２より小さいか否かを判断し、連結成分の面積が基準値２より小さいものについては、その領域内に標的細胞は含まれないものと判断し（ステップＳ４３）、領域内のピクセルを０（背景）に設定する。ここで、基準値２は画像内で標的細胞の核が占めると考えられる最低の面積とする。
【００４０】
基準値２より大きい連結成分について、ステップＳ４４において、連結部分を含む濃度レベル画像２を作成する。次いで、各々その連結成分を含む周辺領域を切り抜く（これを部分画像１と称する。図１０（Ａ）に示される。図１０（Ａ）において符号１５１が核候補、符号１５３がその他の構成要素である）。切り抜いた部分画像１内で、“０”（背景）以外の画素において、その値の最小値と最大値とを求め、ここで求めた最小値を、しきい値１とする（ステップＳ５１）。部分画像１について、設定したしきい値により２値化画像を作成する（ステップＳ５２）。２値化した部分画像において、値が“１”の画素を探して部分画像の連結成分をラベリングする（ステップＳ５３）。ここで、「連結成分をラベリングする」とは、連結している画素（連結成分）を識別するため、連結する白（または黒）の画素の塊に対して、同じ値のラベルを割り当て、異なる連結成分同士は異なるラベルを割り当てる処理を指す。
【００４１】
ステップＳ５４において、連結成分の面積が標的細胞の核と考えられる大きさの範囲内であった場合であって、かつ、円形度が例えば０．７以上か否かを判断し、０．７以上であればその領域を標的細胞の核と考える（円形度は、周囲長をＰ、面積をＳとしたとき、４πＳ／Ｐ２により定義される（最大値は１））。ステップＳ５４において、標的細胞の核と考えられる領域が見つからなかった場合、ステップＳ５６において、ステップＳ５１で求めた最小値と最大値との範囲内でしきい値１を変化させて、ステップＳ５２に戻り、ステップＳ５２からステップＳ５４までの処理を繰り返す。最大値まで変化させても標的細胞の核と考えられる領域が見つからなかった場合は（ステップＳ５５のＹＥＳ）、この範囲に標的細胞はないと判断し、他の探索領域を探索する（ステップＳ５７）。
【００４２】
ステップＳ５４において、標的細胞の核と考えられる領域が見つかった場合には、ステップＳ５８に進み、その重心座標を中心に周辺画像を切り出し、細胞周辺画像１を作成する。細胞周辺画像１に対し、核と考えられる領域を“１”、それ以外の領域を“０”としたマスク画像３（核領域マスク、図１０（Ｄ））を作成する（ステップＳ５９）。次に、ステップＳ６０の細胞膜領域の抽出処理（図７）に移る。
【００４３】
図７に示すように、ステップＳ６１において、上記細胞周辺画像１内において、エッジ（境界線）検出フィルタを用いて、エッジ部を“１”、それ以外を“０”とした２値画像を作成する（図１０（Ｂ））。この２値画像内でエッジの結線処理を行い、画像上で膜の欠けている部分を繋げる（図１０（Ｃ）の膜画像）。ステップＳ６２において、上記２値画像内でエッジ部の連結成分を探してラベリング処理を行う。連結成分の外周が、標的細胞の細胞膜と考えられる大きさの範囲内か否かを判断し（ステップＳ６３）、範囲内であった場合には、その領域を穴埋め処理した画像を作成しマスク画像４（細胞膜内領域マスク）とする（ステップＳ６５、図１０（Ｅ））。範囲内でない場合には、ステップＳ６４に進み、標的細胞の細胞膜ではないと判断し、他の探索領域を探索する。
【００４４】
次いで、作成したマスク画像４（図１０（Ｅ）の細胞膜内領域マスク）と、ステップＳ５９（図６）において作成したマスク画像３（図１０（Ｄ）の核抽出画像）と、に関してＡＮＤ処理を行い（図１０（Ｆ））、ステップＳ６７において細胞膜内に核が存在するか否かを判定する。ステップＳ６７において細胞膜内に核（図１０（Ｆ）の符号１５５で示される。）が存在すると判断された場合には、ステップＳ６９の細胞質の抽出処理に進む。ステップＳ６７において細胞膜内に核が存在しないと判断された場合には、ステップＳ６８に進み、標的細胞でないと判断され、他の探索領域に進む。
【００４５】
図８は、細胞質の抽出工程に関するフローである。図８に示すように、ステップＳ６７において細胞膜内に核が含まれていた場合、マスク画像４（細胞膜内マスク画像）からマスク画像３（核マスク画像）を引いた差分画像を作成し、マスク画像５（細胞質マスク画像）とする（ステップＳ７１）。マスク画像５（細胞質マスク画像）と、ステップＳ５９（図６）において作成したマスク画像３（核領域マスク）と、に基づいて、核領域と細胞質領域との面積の比率を計算する（ステップＳ７２）。計算した比率が標的細胞の示す比率の範囲内であるか否かをステップＳ７３において判定し、ステップＳ７３において比率内ではないと判断された場合には、標的細胞でないと判断し（ステップＳ８０）、他の探索領域へ移動する。
【００４６】
ステップＳ７３において比率内であると判断された場合には、マスク画像５（細胞質マスク画像）により入力画像（ＲＧＢ）をマスク処理し、細胞質画像（ＲＧＢ）を作成する（ステップＳ７４）。次いで、ステップＳ７５において、細胞質画像に対してＲ−Ｇのヒストグラムを作成する。Ｒ−Ｇヒストグラムのピークが基準値３よりも大きい否かを判断する（ステップＳ７６）。Ｒ−Ｇヒストグラムのピークが基準値３よりも大きい場合、細胞質に赤みがかっており、この細胞は標的細胞でないと判断し（ステップＳ７６のＮＯ）、他の探索領域へ移動する。Ｒ−Ｇヒストグラムのピークが基準値３よりも小さい場合は、ステップＳ７７に進み、細胞質画像からのグレーレベルヒストグラム（Ｌ３  ＝  （Ｒ  ＋  Ｇ  ＋  Ｂ）／３）を作成する。
【００４７】
ステップＳ７８において、グレーレベルヒストグラムのピークが基準値４より大きいか否かを判断し、グレーレベルヒストグラムのピークが基準値４よりも小さい場合には細胞質の明度が低いため、ステップＳ８０に進み、この細胞は標的細胞でないと判断し他の探索領域へ移動する。グレーレベルヒストグラムのピークが基準値４よりも大きい場合には、ステップＳ７９に進み、最終的に残った細胞を標的細胞であると考え、ステップＳ９（図３）に進み、核領域の面積、核の円形度合い、核の明度、細胞膜の外周値、細胞質と核の面積比率、細胞質の赤み度合い、細胞質の明度などを、標的細胞であるかを示す確率要素として保存する。標的細胞が見つかった場合、入力画像（ＲＧＢ）に対する標的細胞の重心座標を保存する。標的細胞が見つかった場合、入力画像（ＲＧＢ）をデータベース５１ｃ（図２）に保存する。保存された標的細胞に関するデータは、ユーザからの要求に応じて、いつでもデータベース５１ｃから取り出すことができる。Ｓ６からＳ９の処理を、標的細胞が指定数見つかるまで繰り返す。
【００４８】
図１１に、本実施の形態による標的細胞自動探索技術を用いて得られた検査結果に関するモニタ表示画面例を示す。図１１に示すように、標的細胞自動探索結果の表示画面２００は、運転開始ボタン２０１と、探索モードボタン２０３と、探索結果表示ボタン２０５と、メンテナンスボタン２０７と、終了ボタン２０９とを備えている。現在は、探索結果表示ボタン２０５が選択されており、画面にはその探索結果表示２１０が表示されている。探索結果表示２１０は、検体番号０００５に関する表示であって、標的細胞候補１から５まで２１１ａ〜ｅまでが表示されている。現在選択されている標的細胞候補２１１ａが大きく表示されており、この顕微鏡映像表示に関する各種情報も表示されている。
【００４９】
加えて、探索結果一覧２１７には、検体２２１と、標的細胞数２２３と、探索開始日時２２５と、探索終了日時２２７とが、各検体Ｎｏ毎に表示されている。さらに、読み込みボタン２３１と、保存ボタン２３３と、削除ボタン２３５と、Ｅｘｉｔボタン２３７とが設けられ、上記各検体に関して上記、読み込み、保存、削除、Ｅｘｉｔの処理ができる。このような表示画面における各ボタンを選択すると、選択された処理が行われ、簡単なユーザインターフェイスが形成されている。
【００５０】
以上に説明したように、本実施の形態による標的細胞自動探索システムによれば、母体から採取した血液に含まれる標的細胞、例えば、胎児由来の有核細胞を用い、信頼性が高く母児へのリスクが全くない出生前検査と診断とが可能になる。本実施の形態による胎児由来の有核細胞を利用した標的細胞自動探索システムによれば、従来、１有核赤血球あたりの探索時間として２０分から１時間程度を要していた手作業を、１スライドグラス１枚あたり１０分程度で５個の有核赤血球を探索することができた。すなわち、検体処理の自動化と長時間の無人運転とを上記装置と画像処理技術により可能とし、従来、検査技師による長時間の顕微鏡観察による負担を大幅に削減することができた。自動化された高精度な探索装置を用いることにより、終業前に装置をセットしそのまま夜間無人運転を行えば、翌朝には探索結果をディスプレイ上に表示することも可能となる。
【００５１】
また、本実施の形態による標的細胞自動探索装置を用いると、スライドグラスの外形精度、顕微鏡ステージ上のスライドグラス固定機構、或いは、顕微鏡ステージの動作精度が特別に精密で無いものであっても、正常に動作させることができる。画像処理による顕微鏡ステージの位置補正を行えば、同一スライドグラス上の複数の任意の探索済み標的細胞を直ちに顕微鏡の視野中心に標的細胞を移動できるため、短時間での作業が可能になる。また高精度で高価なスライドグラスを使用しなくても良く、検査コストも下げることが可能となった。経験者であっても判断が難しかった無数の血球の中からの有核赤血球の判別に関しても、本実施の形態による装置を用いて探索した数個の細胞からの判断を行えば良く、作業者の負荷を大きく削減することが可能となる。
【００５２】
以上、各実施の形態により本発明を説明したが、その他種々の変形・変更等が可能であることは、当業者は容易に理解できるであろう。例えば、上記探索方法をプログラムとして格納した装置、そのプログラム又はプログラムを記録した記録媒体も本発明の範疇に入ることは言うまでもない。また、標的細胞は、胎児由来の有核赤血球でなくても、他の特徴的な探索対象であれば、検査が可能である。例えば、ガン細胞やリンパ球を含む生体・生理物質を含む種々の対象である。
【００５３】
【発明の効果】
本発明による標的細胞自動探索システムによれば、標的細胞の検査処理を自動的かつ精度良く行うことが可能であり、検査時間を大幅に短くすることができる。
【００５４】
また、スライドグラスの外形精度、顕微鏡ステージ上のスライドグラス固定機構或いは顕微鏡ステージの動作精度などに関しては、画像処理による顕微鏡ステージの位置補正により特別な精度が要求されず、また、同一スライドグラス上の複数の任意の探索済み標的細胞を直ちに顕微鏡の視野中心に標的細胞を移動できるようになるなど、作業の効率化と検査コストの低減が可能となる。また、検査に熟練していない場合でも精度良く検査をすることができ、作業者の負荷を大きく削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態による標的細胞自動検索システムの構成例を示す図である。
【図２】図１に示す標的細胞自動検索システムの構成例を示す機能ブロック図である。
【図３】本発明の一実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理の流れを示すフローチャート図である。
【図４】本発明の一実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理の流れを示すフローチャート図であり、図３に続く図である。
【図５】本発明の一実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理の流れを示すフローチャート図であり、核領域の抽出処理の流れを示す図である。
【図６】本発明の一実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理の流れを示すフローチャート図であり、図５に続く処理の流れを示す図である。
【図７】本発明の一実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理の流れを示すフローチャート図であり、膜領域の抽出処理の流れを示す図である。
【図８】本発明の一実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理の流れを示すフローチャート図であり、細胞質の抽出処理の流れを示す図である。
【図９】図９（Ａ）から図９（Ｄ）までは、本実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理を行った後の各工程における画像例である。
【図１０】図１０（Ａ）から（Ｆ）までは、本実施の形態による標的細胞検索システムにおける処理を行った後の各工程における画像例であり、部分画像の抽出から最終的な核画像の抽出までのそれぞれの工程を行った後の画像である。
【図１１】本実施の形態による標的細胞検索システムにおける表示画面例を示す図である。
【図１２】胎児由来赤血球（有核）の画像である。
【符号の説明】
Ａ…光学搬送系、Ｂ…画像処理系（画像処理ＰＣ）、Ｃ…制御系（制御ＰＣ）、Ｄ…出力系（高精度モニタディスプレイ）、１…光学顕微鏡、３…凹溝部、５…対物レンズ、７…ＣＣＤカメラ（撮像装置）、１１…試料台、１５…試料配置部、１７…ＸＹステージ機構、２１…上面、２３…スライドグラス、３１…搬送装置、３３…作動アーム、４１…ストッカ、４５…収容部、５１…画像処理ユニット、５３…制御ユニット、５５…モニタディスプレイ（表示装置）。
【図１】
2004248619.tif 000003
【図２】
2004248619.tif 000004
【図３】
2004248619.tif 000005
【図４】
2004248619.tif 000006
【図５】
2004248619.tif 000007
【図６】
2004248619.tif 000008
【図７】
2004248619.tif 000009
【図８】
2004248619.tif 000010
【図９】
2004248619.tif 000011
【図１０】
2004248619.tif 000012
【図１１】
2004248619.tif 000013
【図１２】
2004248619.tif 000014