(57)【要約】      （修正有）【課題】「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」を工業的規模で大量かつ安価に脱硫酸化できる触媒を提供する。【解決手段】下記（Ａ）又はこれと同等の機能を有するタンパク質を必須成分とし、グルコサミン骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有する触媒。（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質。「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」は「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましく、「６位が硫酸化されたＮ−アセチルグルコサミン」、「２位と６位の両方が硫酸化されたＮ−アセチルグルコサミン」及び「２位、３位及び６位のいずれもが硫酸化されたグルコサミン」から選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることがより好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、グルコサミン骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」が、「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」であることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」が、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質を必須成分とし、グルコサミン骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有する触媒。
【請求項７】
「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」が、「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」であることを特徴とする、請求項６に記載の触媒。
【請求項８】
「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」が、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることを特徴とする、請求項７に記載の触媒。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の触媒を、「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」に接触させる工程を少なくとも含む、「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化方法。
【請求項１０】
「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」が、「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」であることを特徴とする、請求項９に記載の脱硫酸化方法。
【請求項１１】
「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」が、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることを特徴とする、請求項１０に記載の脱硫酸化方法。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項６〜８のいずれか１項に記載の触媒を、「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」に接触させる工程を少なくとも含む、脱硫酸化された「グルコサミン骨格を有する糖」の生産方法。
【請求項１３】
「グルコサミン骨格を有する硫酸化糖」が、「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」であることを特徴とする、請求項１２に記載の生産方法。
【請求項１４】
「グルコサミン骨格を有する６位硫酸化糖」が、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることを特徴とする、請求項１３に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な糖の脱硫酸化触媒等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
【０００３】
ＡＲＳＧ：アリールスルファターゼＧ
４−ＭＵ：４−メチルウンベリフェロン
４−ＭＵＳ：４−メチルウンベリフェリル硫酸
Ｇａｌ：ガラクトース
Ｇａｌ６Ｓ：６位が硫酸化されたガラクトース
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
ＧａｌＮＡｃ６Ｓ：６位が硫酸化されたＮ−アセチルガラクトサミン
Ｇｌｃ：グルコース
ＧｌｃＮ：グルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ：６位が硫酸化されたグルコサミン
ＧｌｃＮＳ６Ｓ：２位と６位の両方が硫酸化されたグルコサミン
ＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓ：２位、３位及び６位のいずれもが硫酸化されたグルコサミン
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＫＳ：ケラタン硫酸
アリールスルファターゼ（ａｒｙｌｓｕｌｆａｔａｓｅ）は、フェノール類の硫酸モノエステルを加水分解する酵素である。非特許文献１及び２には、アリールスルファターゼの一種であるＡＲＳＧの全アミノ酸配列及び全ヌクレオチド配列が開示されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｖｏｌ．１０  ｐ８１３−８１８  （２００２）
【非特許文献２】
ナガセ，Ｔ．（Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．）ら、“ホモ・サピエンス  ＫＩＡＡ１００１タンパク質のｍＲＮＡ、完全ＣＤＳ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  ＫＩＡＡ１００１  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．）”、ＡＢ０２３２１８、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成１１年６月１６日、ＮＣＢＩ［平成１５年３月１０日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝４５８９６４５＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＞
しかしＡＲＳＧが、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」、特に「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」に特異的に作用して、その６位の硫酸基を脱硫酸化する作用を有すことについては開示も示唆もない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＡＲＧＳやその融合タンパク質、ＡＲＧＳを必須成分とする触媒、ＡＲＧＳを用いる「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化方法等を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＡＲＧＳやその融合タンパク質、ＡＲＧＳを必須成分とする触媒、ＡＲＧＳを用いる「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化方法等を提供するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質（以下「本発明タンパク質」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有するタンパク質。ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」はＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。本発明タンパク質は、特に配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列からなるものが好ましい。
【０００８】
また本発明は、本発明タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（以下「本発明融合タンパク質」という）を提供する。
【０００９】
また本発明は、本発明タンパク質を必須成分とし、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有する触媒（以下「本発明触媒」という）を提供する。ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」はＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。
【００１０】
また本発明は、本発明タンパク質又は本発明触媒を、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」に接触させる工程を少なくとも含む、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化方法（以下「本発明脱硫酸化方法」という）を提供する。ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は、「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。
【００１１】
また本発明は、本発明タンパク質又は本発明触媒を、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」に接触させる工程を少なくとも含む、脱硫酸化された「ＧｌｃＮ骨格を有する糖」の生産方法（以下「本発明生産方法」という）を提供する。ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は、「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、発明の実施の形態によって詳説する。
本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有するタンパク質。
【００１３】
なお、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように（Ａ）のタンパク質に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められないタンパク質も、本発明タンパク質に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４））。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には（Ａ）のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質である。上記の（Ｂ）のタンパク質は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００１４】
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００１５】
（Ｂ）のタンパク質は、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有する必要がある。
【００１６】
このような活性を有するか否かは、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を基質として、その硫酸化糖が脱硫酸化されたか否かを検出することによって判定できる。脱硫酸化されたか否かは、例えば後述の実施例に示すような陰イオンクロマトグラフィーを用い、伝導率を検出すること等によって遊離した硫酸の量を測定したり、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて脱硫酸化によるピークの変動等を検出したり、ＮＭＲ、質量分析等を用いた構造解析等によって調べることができる
このような方法によって、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を容易に選択することができる。
【００１７】
ここで、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また、「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。
【００１８】
本発明タンパク質は、なかでも配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１９】
本発明タンパク質の製造方法は特に限定されず、天然物から上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成等によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよく、遺伝子工学的手法によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよい。遺伝子工学的手法によって本発明タンパク質を製造する具体的方法については、後述する「本発明融合タンパク質」の説明を参照されたい。
＜２＞本発明融合タンパク質
本発明融合タンパク質は、本発明タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質である。
【００２０】
本明細書における「他のペプチド」という用語は、「ポリペプチド」を含む概念として用いる。
【００２１】
本発明融合タンパク質としては、本発明タンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質等が例示される。このような本発明融合タンパク質は、精製又は分析を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばＦＬＡＧペプチド、プロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。プロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２２】
本発明融合タンパク質は、以下の通り製造することができる。
【００２３】
まず、本発明タンパク質のうち、前記（Ａ）のタンパク質（配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ａ）」という）を用意する。このＤＮＡは、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜５２５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌクレオチド配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１におけるヌクレオチド番号４５９〜２０３６で示されるヌクレオチド配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。このＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ０２３２１８  として登録されている。
【００２４】
また、本発明タンパク質のうち、前記（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ｂ）」という）についても、前記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖（好ましくはＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖、より好ましくはＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖）を脱硫酸化する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて使用することができる。このようなＤＮＡとしては、例えば「ＤＮＡ（ａ）」若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００２５】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎＧｌｃａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００２６】
上記ＤＮＡ（ａ）又はＤＮＡ（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
【００２７】
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア  バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア  バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア  バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア  バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア  バイオテック社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）又はｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、ＣＯＳ細胞や３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｐａｕｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｃ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９，  １３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，  Ｓ．  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １８，  ５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，  Ｈ．，  Ｙａｍａｎｕｒａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  Ｊ．  （１９９１）  Ｇｅｎｅ  １０８，  １９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン  コダック（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０，  ２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア  バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせのほか、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に原核細胞（特に大腸菌細胞）とｐＥＴ１５ｂとの組み合わせが好ましい。
【００２８】
ＤＮＡを組込むベクターは、目的とする本発明タンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
【００２９】
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
【００３０】
ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
【００３１】
生育物からの本発明融合タンパク質の採取も、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことができる。
【００３２】
例えば目的とする本発明融合タンパク質が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。また目的とする本発明融合タンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とする本発明融合タンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
【００３３】
これらの培地や抽出物から、本発明融合タンパク質をさらに精製することもできる。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、目的とする本発明融合タンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００３５】
目的とする本発明融合タンパク質が製造されたか否かは、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって確認することができる。
【００３６】
さらに、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質は、リソソーム病の１つであるアリールスルファターゼ欠損症の患者に対する酵素補充療法用の酵素として用いることができる。また、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質をコードするＤＮＡも、このような患者に対する遺伝子治療用の遺伝子として用いることができる。
＜３＞本発明触媒
本発明触媒は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を必須成分とし、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖（好ましくはＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖、より好ましくはＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖）を脱硫酸化する活性を有する触媒である。なお本発明は、脱硫酸化剤としての思想をも包含するものである。すなわち本発明には、「本発明タンパク質を必須成分とし、ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化する活性を有する脱硫酸化剤」という思想も包含されている。この脱硫酸化剤についての他の説明は、本発明触媒における説明と同様である。
【００３７】
本発明触媒は、本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質の少なくとも一方を含有していればよい。すなわち「本発明触媒」としては、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質自体をそのまま本発明触媒としてもよく、両者の混合物を用いてもよく、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質に加えて、これらのタンパク質に悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の成分を含有させてもよい。
【００３８】
本発明触媒の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合した固定化酵素形態のいずれであってもよい。
【００３９】
本発明触媒は「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化や、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」から脱硫酸化された「ＧｌｃＮ骨格を有する糖」を生産する場合等に用いることができる。
＜４＞本発明脱硫酸化方法
本発明脱硫酸化方法は、本発明タンパク質又は本発明触媒を、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」に接触させる工程を少なくとも含む、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化方法である。
【００４０】
ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は、「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また、ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。
【００４１】
本発明脱硫酸化方法においては、本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質の少なくとも一方を、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」に接触させればよい。これらのタンパク質と、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」との「接触」の方法は、これらの分子が相互に接触して酵素反応が生ずる状態となる限りにおいて特に限定されず、例えば前者に後者を添加してもよく、後者に前者を添加してもよく、両者を同時に添加してもよい。
【００４２】
また、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート等）に固定させ、これに「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」を接触させてもよい。
【００４３】
両者を接触させた後の反応の条件は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質が作用する条件である限りにおいて特に限定されない。
【００４４】
例えばこれらのタンパク質の至適ｐＨ付近で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。
【００４５】
またこのときの温度も、これらのタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３５℃〜３７℃程度が例示される。
【００４６】
また本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質の活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。
【００４７】
反応時間は、ｐＨ条件、温度条件、作用させるタンパク質及び基質の量、並びにどの程度の脱硫酸化を所望するか等によって適宜調節することができる。反応時間を長くすれば脱硫酸化の程度を増すことができ、反応時間を短くすれば脱硫酸化の程度を減ずることができる。
【００４８】
また本発明脱硫酸化方法には、このような接触工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
【００４９】
本発明脱硫酸化方法により、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」を脱硫酸化することができる。「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」が脱硫酸化されたか否かは、例えば後述の実施例に示すような陰イオンクロマトグラフィーを用い、伝導率を検出すること等によって遊離した硫酸の量を測定したり、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて脱硫酸化によるピークの変動等を検出したり、ＮＭＲ、質量分析等を用いた構造解析等によって調べることができる。
【００５０】
また本発明脱硫酸化方法には、このような接触工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
＜５＞本発明生産方法
本発明生産方法は、本発明タンパク質又は本発明触媒を、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」に接触させる工程を少なくとも含む、脱硫酸化された「ＧｌｃＮ骨格を有する糖」の生産方法である。
【００５１】
ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」は、「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」であることが好ましい。また、ここにいう「ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖」は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓから選ばれる１又は２以上の硫酸化糖であることが好ましい。
【００５２】
本発明生産方法においては、本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質の少なくとも一方を、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」に接触させればよい。これらのタンパク質と「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」との「接触」の方法、接触後の反応の条件・時間等については、前記の「＜４＞本発明脱硫酸化方法」における説明と同様である。
【００５３】
本発明生産方法には、このような接触工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
【００５４】
本発明生産方法により、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」から、脱硫酸化された「ＧｌｃＮ骨格を有する糖」を生産することができる。これらが生産されたか否かは、例えば後述の実施例に示すような陰イオンクロマトグラフィーを用い、伝導率を検出すること等によって遊離した硫酸の量を測定したり、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて脱硫酸化によるピークの変動等を検出したり、ＮＭＲ、質量分析等を用いた構造解析等によって調べることができる。
【００５５】
また、生成物中から「脱硫酸化された『ＧｌｃＮ骨格を有する糖』」を単離する方法等は、公知の方法によって行うことができる。
【００５６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
（１）ＡＲＳＧ遺伝子の発現
ＣＯＳ−７細胞を、１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で約２０〜４０％コンフルエントになるまで培養した。培養は５％ＣＯ２の下で３７℃で実施した。
【００５７】
配列番号１で示される塩基配列（ＡＲＳＧのｃＤＮＡ）をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターに組み込んだ発現ベクターを、ＴｒａｎｓＦａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地中、３７℃で３日間培養した。培養は５％ＣＯ２の下で３７℃で実施した。
【００５８】
なお、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６への組み込みは、ＡＲＳＧのＮ末端側にＦＬＡＧペプチドが結合した形で発現されるように（以下、これによって発現される融合タンパク質を「Ｎ−」と略記する）、又はＡＲＳＧのＣ末端側にＦＬＡＧペプチドが結合した形で発現されるように（以下、これによって発現される融合タンパク質を「Ｃ−」と略記する）行った。
【００５９】
また、配列番号１で示される塩基配列（ＡＲＳＧのｃＤＮＡ）が組み込まれていないｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターをトランスフェクトした細胞についても、同様に培養した。
（２）酵素液の調製
上記（１）で培養された細胞（ＡＲＳＧのｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをトランスフェクトしたもの、又はＡＲＳＧのｃＤＮＡを組み込んでいない発現ベクターをトランスフェクトしたもの）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４又はｐＨ６．０）、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．２５Ｍ  シュークロースを含有する溶液中、氷冷下でセルスクレーパーを用い破砕した。この破砕後の液をそのまま酵素液として用いた。以下、ＡＲＳＧのｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターをトランスフェクトした細胞の酵素液を「ＡＲＳＧ酵素液」と、ＡＲＳＧのｃＤＮＡを組み込んでいない発現ベクターをトランスフェクトした細胞の酵素液を「ｍｏｃｋ酵素液」という。
（３）脱硫酸化活性の解析
（２）で調製された酵素液を４−ＭＵＳ（ＳＩＧＭＡ社製）に作用させることによって脱硫酸化活性の有無を解析した。反応は、１０ｍＭ  ４−ＭＵＳ（基質）、１０ｍＭ  酢酸鉛、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム液（主としてｐＨ６。場合によってはｐＨ４、ｐＨ５又はｐＨ７）を含有する反応混合液に、（２）で調製された酵素を添加して、３７℃でインキュベートすることによって行った。インキュベート後、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ１１）を反応液の５倍量添加することによって反応を停止させた。蛍光光度計を用いて３６０ｎｍの波長で励起し４６０ｎｍの光の強度を検出することにより、脱硫酸化によって遊離した４−ＭＵを検出した。
【００６０】
１０ｍＭの４−ＭＵＳを用い、ｐＨ６の条件下で、反応時間を３時間として、種々の濃度の酵素液を作用させた場合の結果を図１に示す。図１中、「丸印」は「ＡＲＳＧ酵素液」を用いた結果を、「四角印」は「ｍｏｃｋ酵素液」を用いた結果をそれぞれ示す。図１の横軸の「５」、「１０」、「１５」及び「２０」は、（２）で調製された酵素液を終濃度でそれぞれ「５％」、「１０％」、「１５％」及び「２０％」（いずれもｖｏｌ／ｖｏｌ）含有する溶液を意味する。蛍光強度の「＊２００」は、２００倍希釈液の測定結果であることを意味する。
【００６１】
この結果、「ＡＲＳＧ酵素液」を用いた場合、酵素液濃度の増加に伴って遊離の４−ＭＵが増加したことから、「ＡＲＳＧ酵素液」中に含まれるＡＲＳＧの作用によって脱硫酸化が引き起こされていることが示された。
【００６２】
種々の濃度の４−ＭＵＳを用い、ｐＨ６の条件下で、反応時間を３時間として、終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の酵素液を作用させた場合の結果を図２に示す。図２中の「丸印」、「四角印」及び「＊２００」の意味は、図１と同様である。
【００６３】
この結果、「ＡＲＳＧ酵素液」を用いた場合、５．０ｍＭ程度までは基質（４−ＭＵＳ）濃度の増加に伴って遊離の４−ＭＵが増加したが、さらに１０ｍＭまでは濃度の増加に伴い遊離の４−ＭＵ濃度は漸増した。このことから「ＡＲＳＧ酵素液」中に含まれるＡＲＳＧの、基質濃度依存的な活性の増加が示された。
【００６４】
１０ｍＭの４−ＭＵＳを用い、種々のｐＨ条件下で、反応時間を３時間として、終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の酵素液を作用させた場合の結果を図３に示す。図３中、「太線で結ばれた丸印」は「ＡＲＳＧ酵素液（Ｎ−）」を用いた結果を、「細線で結ばれた丸印」は「ＡＲＳＧ酵素液（Ｃ−）」を用いた結果を、「四角印」は「ｍｏｃｋ酵素液」を用いた結果をそれぞれ示す。蛍光強度の「＊１０００」は、１０００倍希釈液の測定結果であることを意味する。
【００６５】
この結果、「ＡＲＳＧ酵素液（Ｎ−）」、「ＡＲＳＧ酵素液（Ｃ−）」ともに脱硫酸化活性を有すること、およびこれらの至適反応ｐＨは６付近であることが示された。
【００６６】
１０ｍＭの４−ＭＵＳを用い、ｐＨ６の条件下で、種々の反応時間で終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の酵素液を作用させた場合の結果を図４に示す。図４中の「丸印」、「四角印」及び「＊２００」の意味は、図１と同様である。
【００６７】
この結果、「ＡＲＳＧ酵素液」を用いた場合、反応時間が増加するにつれて遊離の４−ＭＵが増加したことから、「ＡＲＳＧ酵素液」中に含まれるＡＲＳＧの、反応時間依存的な活性の増加が示された。
【００６８】
以上の結果から、ＡＲＳＧは脱硫酸化活性を有することが確認された。
（４）基質特異性の解析
（２）で調製された酵素液を種々の基質と反応させることによって、酵素の基質特異性を解析した。反応混合液（１００μｌ）の組成は、１０ｍＭ（Ｇａｌ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓの場合）又は０．２５％（Ｈｅｐ及びＫＳの場合）の基質、１０ｍＭ  （ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｐｂ、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）及び（２）で調製された酵素液（終濃度２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））とした。反応は、３７℃で２日間インキュベートすることによって行った。
【００６９】
この実施例で用いた基質は、Ｇａｌ６Ｓ、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）、Ｈｅｐ（Ｓｉｇｍａ社製）及びＫＳ（生化学工業株式会社製）のものをそれぞれ用いた。
【００７０】
インキュベート後の溶液を、陰イオンクロマトグラフィー（カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＩＣ−Ａｎｉｏｎ−ＰＷ（東ソー株式会社製）、溶出液：ＴＳＫｅｌｕｅｎｔ  ＩＣ−Ａｎｉｏｎ−Ａ（東ソー株式会社製）、流速：１．２ｍＬ／分）に付した。溶出された液の伝導率を  Ｃｈｒｏｍａｔｏｐａｃ（島津製作所製）で検出し、そのピークの出現の有無を確認した。また、ピークの出現が観察されたものについては、そのピークの面積を算出した。このピークは、脱硫酸化によって生じた遊離の硫酸を反映するものである。
【００７１】
結果を表１に示す。表１中の「丸印」は伝導率のピークが観察されたことを、「バツ印」は伝導率のピークが観察されなかったことを示す。表１中の数値は、算出されたピーク面積を示す。
【００７２】
【表１】
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【００７３】
表１より、ＡＲＳＧは、ＧｌｃＮＡｃ６Ｓ、ＧｌｃＮＳ６Ｓ及びＧｌｃＮＡ３Ｓ６Ｓのいずれの硫酸化糖をも脱硫酸化することが示された。これらの硫酸化糖は、いずれもＧｌｃＮ骨格を有し、かつ、６位に硫酸基を保持していることから、ＡＲＳＧはＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖に存在する６位の硫酸基を脱硫酸化することが示唆された。
【００７４】
一方、ＡＲＳＧは、ＧａｌＮＡｃ６Ｓ、Ｇａｌ６Ｓ、Ｈｅｐ及びＫＳのいずれの硫酸化糖をも実質的に脱硫酸化しなかったことから、ＡＲＳＧはＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖を脱硫酸化するが、少なくともガラクトース骨格を有する硫酸化糖は脱硫酸化しないことが示された。
【００７５】
このことから、ＡＲＳＧは、ＧｌｃＮ骨格を有する６位硫酸化糖を脱硫酸化し、脱硫酸化された「ＧｌｃＮ骨格を有する糖」が生産されることが示された。
【００７６】
また上記の結果から、ＡＲＳＧはエキソ型のスルファターゼであることが示唆された。
【００７７】
【発明の効果】
本発明タンパク質、本発明融合タンパク質及び本発明触媒は、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」の脱硫酸化に用いることができ極めて有用である。また本発明脱硫酸化方法も、「ＧｌｃＮ骨格を有する硫酸化糖」を簡便、迅速、大量かつ安価に脱硫酸化することができ、極めて有用である。特に、化学的に脱硫酸化する場合には酸性条件下等でのシビアな条件下で処理する必要があり、糖鎖自体の分解を招くおそれがある。本発明タンパク質等を用いれば、このような心配もない。例えば、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等を、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌを基本骨格とする硫酸化オリゴ糖（特開２０００−２５６３８５号公報等参照）に作用させ、このような硫酸化糖に存在する硫酸基を脱硫酸化することもできる。
【００７８】
また本発明生産方法も、脱硫酸化された「ＧｌｃＮ骨格を有する糖」を簡便、迅速、大量かつ安価に生産することができ極めて有用である。
【００７９】
硫酸化糖における硫酸基の含量は、種々の生理活性の発現において重要な役割を果たしていると考えられている。したがって、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等を用いて脱硫酸化することにより、望ましい生理活性を発現させたり、望ましくない生理活性の発現を抑制することもできる。したがって、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等は、医薬の素材として利用できる可能性も秘めている。
【００８０】
さらに、本発明タンパク質の機能が解明されたことから、生体内において脱硫酸化や硫酸化が疾病等の生理状態と関連している場合には、このような本発明タンパク質に対するモジュレーターを開発することにより、このような生理状態をコントロールすることも可能である。
【００８１】
また、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等は、試薬等としても利用することができる。例えば、脱硫酸化された糖鎖に結合するレクチンを用いて免疫組織染色等を行う前に、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等を用いて組織を前処理することによって、硫酸化糖を脱硫酸化し、レクチンによる染色感度を上昇させることもできる。例えば、組織を本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等で処理することにより、組織中に存在している硫酸化糖の非還元末端に存在するＧｌｃＮＡｃ６Ｓの６位の硫酸基を脱硫酸化し、非還元末端にＧｌｃＮＡｃを発現させることによって、コンカナバリンＡやマンノースバインディング蛋白を結合させることができる。
さらに、本発明タンパク質や本発明融合タンパク質等を用いて非還元末端に存在するＧｌｃＮＡｃ６ＳをＧｌｃＮＡｃに変換し、これをマンノースバインディング蛋白質（マンノースレクチン；ヒトを含む哺乳類細胞に存在する）に結合させることによって、マンノースレクチンを活性化させる免疫系を活性化できる可能性もある。
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【図面の簡単な説明】
【図１】酵素液の濃度を変化させて反応させた場合の結果を示す。
【図２】４−ＭＵＳ（基質）の濃度を変化させて反応させた場合の結果を示す。
【図３】種々のｐＨ条件下で反応させた場合の結果を示す。
【図４】種々の反応時間で反応させた場合の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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