(57)【要約】【課題】食品中の有毒物質を簡易に抽出・濃縮し、高感度かつ高精度に定性・定量分析できる実用的な検査法を提供する。【解決手段】食品中の有毒物質に対する抗体を磁気ビーズに固定化し、抗体固定化磁気ビーズを食品試料と反応させて有毒物質を簡易かつ迅速に抽出・濃縮する。磁気ビーズ上に捕捉された有毒物質は蛍光標識抗体で標識され、その後フローサイトメーターによって正確かつ高感度に定性・定量分析することができる。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有毒物質に対する抗体を固定化した磁気ビーズを用いることを特徴とする食品中の有毒物質定性および／または定量分析方法。
【請求項２】
有毒物質を蛍光ラベル化することを特徴とする請求項１記載の定性および／または定量分析方法。
【請求項３】
定性および／または定量がフローサイトメーターによって行われることを特徴とする請求項１又は２記載の定性および／または定量分析方法。
【請求項４】
有毒物質が菌体外毒素である請求項１〜３のいずれか１項に記載の定性および／または定量分析方法。
【請求項５】
菌体外毒素が黄色ブドウ球菌エンテロトキシンである請求項４に記載の定性および／または定量分析方法。
【請求項６】
食品が乳および／または乳製品である請求項１〜５に記載の定性および／または定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品中の有毒物質の検出方法に関するもので、詳しくは、微生物等による汚染の被害を受けやすい乳等に含まれる有毒な微量成分を簡便かつ迅速に分析する方法を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
食品製造においては、食品の安全を確保することを第一に考えなくてはならない。しかしながら、食品は、原料または製造中に様々な有害物質に汚染される可能性がある。有害物質としては、農薬や内分泌かく乱物質等の化学物質や食中毒をおこす微生物等である。微生物による食中毒には、食品に付着して増えた細菌を、食品と一緒に食べることにより発病する感染型の細菌性食中毒と食品中で大量に増えた細菌が毒素を作り、この毒素を食品と一緒に食べることにより発病する毒素型の細菌性食中毒がある。前者では、サルモネラ属菌や腸炎ビブリオ菌があり、後者では黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）による食中毒の発生件数が多い。
【０００３】
黄色ブドウ球菌は、自然界に広く分布し、ヒトや動物の皮膚、粘膜、腸管等にも定着する微生物である。その一部にエンテロトキシン（腸管毒）を産生するものがある。エンテロトキシンは、分子量２７，０００〜３４，０００の単純たん白質で、抗原特異性により、一般に、Ａ〜Ｅの５種類の毒素型に分類されるが、近年、Ｆ〜Ｋ型が追加された。このエンテロトキシンが高度の下痢や食中毒等の原因となりうるため、黄色ブドウ球菌の検出や感染検査法に、黄色ブドウ球菌が有するエンテロトキシン遺伝子に着目した検出法（特開平０３−４９７００、特開平０５−３１７０９８）や、エンテロトキシン抗体を用いた酵素免疫学的測定法（特開平０６−８８８２４）などがある。
【０００４】
黄色ブドウ球菌による食中毒が発生するためには、まず、食品が汚染され、汚染食品内でエンテロトキシンが産生する菌量までに増殖しなければならない（菌数が少ない時には、エンテロトキシンは産生しない）。たとえ食品が黄色ブドウ球菌に汚染されても、菌自体は、７０℃１〜２分間程度の加熱処理でほぼ完全に死滅するため、食品中の黄色ブドウ球菌を増やさないよう留意し、食品に十分の加熱を施すことで食中毒を予防することが可能である。
【０００５】
これに対し、エンテロトキシンは、１００℃、４０分間の加熱でも失活せず、胃酸や生体のタンパク分解酵素でも破壊されないことなどから、いったんエンテロトキシンが産生されたら、黄色ブドウ球菌を死滅させても食中毒を予防することはできない。そこで、食品の製造工程管理や製品の品質管理には、食品に対する黄色ブドウ球菌の汚染・増殖防止と同時に、産生されうる毒素にも十分配慮する必要がある。
【０００６】
乳および乳製品等は、食品の中でも最も微生物の汚染を受けやすく、微生物の生育に好適な食品のひとつとして知られている。これらの食品から、エンテロトキシンを検出する方法として、厚生労働省から通知された方法（「乳等からのエンテロトキシン検査方法」平成１４年２月１４日、食監発第０２１４００２号）がある。これはトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により抽出・濃縮を行う方法である（以下ＴＣＡ法）。ＴＣＡ法は、検体中のエンテロトキシンを高感度に検出できる一方で、操作が複雑で回収率や精度にばらつきが生じやすいことなどから、多検体を効率的に処理するのが困難である。また、サンドイッチ法のＥＬＩＳＡや逆受身ラテックス凝集反応を利用した定性・定量用の市販キット（ＶＩＤＡＳ　Ｓｔａｐｈ　Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）：Ｔｒａｎｓｉａ　Ｐｌａｔｅ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ　Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ）（ＭＥＲＣＫ社）；ＲＩＤＡＳＣＲＥＥＮ　ＳＥＴ　Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ（Ｂｉｏｐｈａｒｍ社））も知られているが、食品中に微量含まれる低濃度のエンテロトキシンの検出は不可能であることから、食品の総合衛生管理製造工程に組込み可能といえる迅速かつ高感度な毒素検出法は未だなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、乳等の食品中に含まれる有毒な微量成分、特に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンの簡易・迅速な抽出・濃縮法と、その高感度かつ高精度な定性、定量分析方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するのに各方面から検討した結果、本発明者らは、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンの抽出・濃縮に免疫磁気ビーズを採用し、検出にフローサイトメーターを用いることで、既述の問題点を解決し、簡便な操作法で、迅速かつ高感度に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンを定性、定量することができることをはじめて見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）有毒物質に対する抗体を固定化した磁気ビーズを用いることを特徴とする食品中の有毒物質定性および／または定量分析方法、
（２）有毒物質を蛍光ラベル化することを特徴とする（１）の定性および／または定量分析方法、
（３）定性および／または定量がフローサイトメーターによって行われることを特徴とする（１）又は（２）の定性および／または定量分析方法、
（４）有毒物質が菌体外毒素である（１）〜（３）のいずれか１つの定性および／または定量分析方法、
（５）菌体外毒素が黄色ブドウ球菌エンテロトキシンである（４）の定性および／または定量分析方法、
（６）食品が乳および／または乳製品である（１）〜（５）の定性および／または定量分析方法、
からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳述する。
検体中の有毒物質を捕捉するには、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を固定化した磁気ビーズを使用する。本発明に有用な磁気ビーズは、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−２８０　Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（粒径２．８μｍ　±　０．２μｍ，２×１０９　個／　ｍｌ，Ｄｙｎａｌ社，オスロ，ノルウェー）が市販されている。捕捉する有毒物質がエンテロトキシンの場合、ここで用いる抗体としては、エンテロトキシンを認識できるものであれば、いずれも使用することができ、具体的には、羊抗エンテロトキシン抗体（１ｍｇ／ｍｌ　ＰＢＳ，　Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．，　Ｓａｒａｓｏｔａ，　ＦＬ，　ＵＳＡ）、ウサギ抗エンテロトキシン抗体（１ｍｇ／ｍｌ　ＰＢＳ，　Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．，　Ｓａｒａｓｏｔａ，　ＦＬ，　ＵＳＡ）なども使用が可能である
【００１１】
上記磁気ビーズに抗エンテロトキシン抗体を公知の方法により固定化し、次いで、検体と混合する。尚、検体が固体等の場合は、水や緩衝液に検体を混合し、ホモジナイズしたものを検体とすればよい。検体中に標的のエンテロトキシンが存在していれば、エンテロトキシンは磁気ビーズに捕捉される。すなわち、磁気ビーズに抗体が固定化されているため、食品中に含まれるエンテロトキシンが低濃度に微量しか含まれない場合でも、混合容器中で検体と磁気ビーズを攪拌することにより確実に抗体によって捕捉される。攪拌を停止した後、混合容器の外側に磁石を近づけることにより磁気ビーズを容器の壁面に集めることができる。その後、検体を吸引等により廃棄することにより磁気ビーズのみを回収することができる。従って、遠心分離により磁気ビーズを集めることは必ずしも必要ではなく、大容量の検体から、磁気ビーズを容易に回収することができる。回収した磁気ビーズは、洗浄し、次いで、蛍光色素で標識する。蛍光色素には、Ｃｙ３、Ｃｙ５等、フローサイトメーターでの定性・定量分析が可能な物質があげられる。蛍光標識の方法は、最終的にエンテロトキシンを蛍光ラベル化できれば、特に限定されないが、本発明においては、エンテロトキシンに特異的に結合する蛍光標識化した抗体を用いることが好ましい。このようにして標識されたエンテロトキシンは、フローサイトメーターで定性・定量分析される。
【００１２】
本発明は、最終的な定性・定量分析をフローサイトメーターで行うことから、複数の項目の試験にも可能である。具体的には、磁気ビーズ上の抗体を適宜変えることで、菌体外毒素に限らず、食品中の内分泌かく乱物質（いわゆる環境ホルモン）、残留農薬に加え、アレルギー物質のモニタリング、その他加工設備の洗浄度評価などにも使用することができる。
【００１３】
本発明の検体には、特に食品が好ましい。中でも乳、乳製品に最も適しているが、これらに限らず、あらゆる飲食品の適用が可能である。ここでいう乳、乳製品とは、乳等省令で示される乳および乳製品は勿論、これらを主原料とする食品を含めたものである。また、検体が固体の場合には、公知の細菌検査法に従って、検体を水等で適宜ホモジナイズし、定性・定量分析し易い形態に予め調整しておくことが望ましい。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
［実施例１］磁気ビーズへの抗体の固定化
磁気ビーズへの抗体固定化には、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ−２８０　Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（粒径２．８μｍ　±　０．２μｍ、２×１０９個／ｍｌ、Ｄｙｎａｌ社、オスロ、ノルウェー）０．５ｍｌ（１×１０９ｂｅａｄｓ／ｍｌ）を用いた。抗体固定化は、磁気ビーズに添付の方法に沿って行った。即ち、０．１Ｍ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、０．１Ｍ　Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）０．７ｍｌに懸濁し、羊抗エンテロトキシンＢ抗体（１ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ、Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）０．３ｍｌを添加、１夜室温でゆっくり振とうした。磁石により上清を除去し（タンパク量測定：８５μｇ／ｍｌ）、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌで２回洗浄した。次いで０．１％ＢＳＡ含有０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）１ｍｌに懸濁して２０℃、２０時間放置してブロッキングし、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌで１回洗浄した。これを０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌに懸濁し、抗体固定化磁気ビーズを得た（≒５×１０８ｂｅａｄｓ／ｍｌ）。
【００１６】
［実施例２］抗体固定化磁気ビーズを用いた毒素の検出
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ水溶液（１００μｇ／ｍｌ，　Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．，　Ｓａｒａｓｏｔａ，　ＦＬ，　ＵＳＡ）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで希釈し、エンテロトキシン濃度０、０．０１、０．１、１．０、１０ｎｇ／ｍｌの溶液各１０ｍｌを調製した。これに１０μｌの抗体固定化磁気ビーズ（５×１０８個／ｍｌ）を混合し、３７℃でゆっくり１時間振とうして反応させた。磁気ビーズを磁石で集め、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄した。洗浄後のビーズに２００μｌのウサギ抗エンテロトキシンＢ抗体（１ｍｇ／ｍｌ　ＰＢＳ，　Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｉｎｃ．，　Ｓａｒａｓｏｔａ，　ＦＬ，　ＵＳＡ）を添加して３７℃でゆっくり１時間振とうして反応させた。この後、磁気ビーズを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ１ｍｌで２回洗浄し、洗浄後のビーズを２００μｌのＣｙ５標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（１ｍｇ／ｍｌ，　Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｔｅｍｅｃｕｌａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）に懸濁して３７℃で１時間反応させた。この溶液を混合し、５０μｌを９５０μｌのＰＢＳ（孔径０．２μｍのメンブランフィルターでろ過したもの）と混合してフローサイトメーター（ｏｐｔｏｆｌｏｗ社製Ｍｉｃｒｏｃｙｔｅ（オスロ，ノルウェー））による粒子数の測定を行った。
【００１７】
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢのＰＢＳ溶液１０ｍｌから抗エンテロトキシンＢ抗体磁気ビーズを用いて同毒素を回収し、蛍光色素で標識して、フローサイトメーターで検出した結果を図１に示す。ビーズのみをフローサイトメーターで測定した結果、ビーズのピークは、夾雑微粒子とは明らかに区別される位置に検出された。毒素未添加の場合にも、非特異的な蛍光標識２次抗体の結合による蛍光が１３％の磁気ビーズから検出されたが、蛍光強度は非常に弱いものであった。エンテロトキシンＢ濃度０．０１ｎｇ／ｍｌでは、未添加に比べて若干、蛍光性磁気ビーズ数は３９％まで増加した。０．１ｎｇ／ｍｌでは６１％の磁気ビーズが蛍光性となり、その蛍光強度も明らかに強いものが含まれていた。１ｎｇ／ｍｌでは、１００％の磁気ビーズが蛍光性となり、すべての磁気ビーズが強い蛍光を発していた。即ち、本法を用いることにより０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度でもエンテロトキシンを検出することは可能であった（図２）。一般的に黄色ブドウ球菌エンテロトキシンは乳製品中に１．０ｎｇ／ｍｌ含まれていれば、ヒトは嘔吐などの症状を示すとされている。そこで、本法の検出限界は、食品汚染をモニタリングするのに十分な感度といえる。
【００１８】
［実施例３］生乳からのエンテロトキシンＢの検出
生乳からの毒素の検出には、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢを所定の濃度添加・混合したもの各１０ｍｌを試料として用いた。これを、沸騰水中で２分間加熱後、急冷したものに抗体固定化磁気ビーズを上記と同様に添加し、検出を行った。この結果を図３に示す。本法を用いることにより０．０１ｎｇ／ｍｌの濃度でもエンテロトキシンを検出することは可能であり、食品中のエンテロトキシンＢを定量することが可能であることが確認された（図４）。
【００１９】
【発明の効果】
以上、本発明により、食品中の有毒物質の定性・定量分析を、従来の複雑な操作を必要とせず、高感度に迅速かつ簡便に行うことができる。また、検体数にかかわらず短時間でその評価が可能なため、食品の総合衛生管理製造過程における危害分析の評価等のために、食品製造の現場にも導入することが可能である。
【００２０】
【図面の簡単な説明】
【図１】免疫磁気ビーズおよびフローサイトメーター法によるＰＢＳ中における黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢを示すグラフである。
【図２】ＰＢＳ中黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ濃度と総粒子中の蛍光粒子数の割合との関係を示すグラフである。
【図３】免疫磁気ビーズおよびフローサイトメーター法による生乳からの黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢを示すグラフである。
【図４】生乳中黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＢ濃度と総粒子中の蛍光粒子数の割合との関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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