(57)【要約】【解決手段】顕微鏡（１）と、当該顕微鏡で認識される被観察視野のＸＹＺ座標駆動手段（２，３）と、当該駆動手段を制御する手段（５）と、上記被観察視野に対する撮像手段（４）とを有する、複数の微細な任意座標を繰り返して観察するシステムにおいて、上記ＸＹＺ座標駆動手段の機械的駆動系原点から独立して上記被観察視野中に特定された座標系原点と、当該座標系原点を補正する処理手段とを備える。【効果】複数の被観察対象を繰り返し観察しても、駆動機械の繰り返し動作によって発生するメカニカル誤差に起因した被観察視野座標系の狂いを補正することができ、誤差の蓄積を排除でき、被観察対象を繰り返し移動して顕微鏡観察しても、その観察結果の信頼性を損ねることがない。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡と、当該顕微鏡で認識される被観察視野のＸＹＺ座標駆動手段と、当該駆動手段を制御する手段と、上記被観察視野に対する撮像手段とを有する、複数の微細な任意座標を繰り返して観察するシステムにおいて、上記ＸＹＺ座標駆動手段の機械駆動系原点から独立して上記被観察視野中に特定された座標系原点と、当該座標系原点を補正する処理手段とを備えることを特徴とする観察システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡を用いて被観察視野の範囲内に存在する複数の被観察点を順次フォーカスして撮像し、それを或る時間間隔をおいて繰り返すことによって、被観察点の相対移動の様子を観察するシステムに関するものである。上記被観察点は例えば生きた細胞である。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、例えばプラスチック製ペトリ皿に微生物を入れ、これを顕微鏡にセットして、予め任意に設定した複数個の微生物（被観察視野座標）を経時的に撮影することによって、それら微生物の動きを観察することが行われている。
【０００３】
このような観察は、本来、複数個の微生物を順次撮影し、これを長時間にわたって繰り返す必要があるために、各微生物に対してその都度、撮像手段（例えばＣＣＤカメラ）をフォーカスして撮影し、その座標位置をとり、当該ステップをそれぞれの微生物に対して行うべく、ペトリ皿を載置した顕微鏡の電動ステージを動かしている。電動ステージはＸＹＺ座標系で移動可能で、したがって複数の任意座標にある被観察対象の相対移動を立体的に把握することができる。
【０００４】
しかしながら、被観察対象を変更して撮影すべく電動ステージを動かす際、被観察対象の位置精度が駆動機械の機械精度に影響を受けざるを得ない。つまり被観察対象を変更するたびに駆動機械のメカニカル誤差に起因して被観察対象の座標系に微妙な狂いが生じ、観察を繰り返すにしたがって、そのような狂いが積み重なり、観察結果の信頼性が損なわれるという問題があった。要するに、例えば五個の被観察対象の相対位置の経時変化を把握したい状況下で、これら五個の被観察対象に対して順次フォーカスして撮像し座標データをとり、一番目の被観察対象に再び戻って次の座標データをとる場合に、その測定された座標データが機械装置の五回の移動動作で真の座標データに対してどの程度のずれを生じているかを把握し、必要に応じて測定データに補正をかけなければ、観察結果に信頼をおくことができない。
【０００５】
或る研究所の調査によれば、２０倍対物レンズ（視野：横方向約６００μｍ、縦方向約４５０μｍ）で１０ポイント１００サイクル繰り返し撮像操作を行った場合、１５０μｍ以上、本来の座標より変位することが報告されている。このような変位（ずれ）を生じるという事実は、直径が約６０ｍｍ程度のペトリ皿上の観察であっても、微生物の相対移動の観察といった顕微鏡観察としては、繰り返し観察に著しい制約を与えている。現在市販されている各種顕微鏡における電動ステージでは、そのステップ移動分解能が０．１μｍ程度であるのに対して、位置繰り返し再現精度が０．７５（μｍ／移動）程度と大きく、測定機械として極めて大きな欠点を有している。
【０００６】
また機械環境の経時変化によって、上記誤差は繰り返し移動の回数を重ねれば重ねるほど堆積していき、移動頻度の多い場合の顕微鏡観察下での位置繰り返し再現は事実上不可能と考えられていた。機械環境の経時変化によって、焦点も合わなくなっていく。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
以上のことから本発明の根底をなす課題は、被観察視野座標系を新たに定義し、それによって被観察視野座標系原点と機械的駆動系原点との物理的な乖離の蓄積をなくすことができるようにすることにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この課題は本発明に従い、顕微鏡と、当該顕微鏡で認識される被観察視野のＸＹＺ座標駆動手段と、当該駆動手段を制御する手段と、上記被観察視野に対する撮像手段とを有する、複数の微細な任意座標を繰り返して観察するシステムにおいて、上記ＸＹＺ座標駆動手段の機械的駆動系原点から独立して上記被観察視野中に特定された座標系原点と、当該座標系原点を補正する処理手段とを備えることにより解決される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を好適な実施の形態を基に、図面を用いて詳細に説明する。
図１に本システムを実行するための装置器具の関係をブロック図として示す。顕微鏡１は、被観察対象を載置し被観察視野のベース面を構成する電動ステージ２と、被観察視野のＸＹＺ座標駆動手段たる電動フォーカス機構３とを有し、更に撮像手段たるＣＣＤカメラ４を取り付けている。電動フォーカス機構３は電動ステージ２上の被観察対象を焦点合わせするもので、顕微鏡１にもともと内蔵されていてもよいが、モーターを手動フォーカスノブに後付けするように構成される場合もある。
【００１０】
電動ステージ２や電動フォーカス機構３は遠隔駆動系制御装置たるＰＣ５によって制御される。上記電動ステージ２や電動フォーカス機構３のステップ分解能、即ち、駆動制御分解能は０．１μｍである。ＰＣはまた、ＣＣＤカメラ４で撮影された画像を取得し、その画像データを解析して被観察対象の位置を特定する。
【００１１】
以上のような構成のシステムにおいて、本発明においては被観察視野内に不動のアライメントマークが設定されている。不動のアライメントマークは被観察対象を収容するペトリ皿や被観察対象を載置するガラス板の上に設けられる。この不動のアライメントマークを繰り返し観察時の被観察視野座標系の原点とする。したがって、この被観察視野座標系の原点は、電動ステージ２や電動フォーカス機構３の機械的駆動原点（位置座標ゼロ）とは独立して存することになる。
【００１２】
以上のような基本構成のもとで、上記被観察視野座標系の原点たる恒常原点を設定するステップを図２に基づいて説明する。先ず顕微鏡に備えられた蛍光フィルターブロックターレットを空（ブランク）の位置、即ち、蛍光フィルターブロックがセットされていない位置へ移動させる。この蛍光フィルターブロックは、蛍光観察のために被観察対象たる試料に励起光波長と観察光波長をそれぞれ選択するために偏光フィルターを組み合わせたもので、蛍光顕微鏡には通常複数個セットされている。
【００１３】
次いで電動ステージ２の機械的リミット位置を検知して、電動ステージの位置座標初期化を行う。そしてアライメントマーク（恒常原点）へ手動にて視野を移動させる。ＣＣＤカメラ４のライブ画像にてアライメントマークを視野内に目視確認した後、オートフォーカスを実行する。
【００１４】
しかる後に、アライメントマーク、即ち被観察視野座標系の原点の自動補正テストを実行する。つまり、上記オートフォーカス実行直後に画像を取り込み（この時点でＺ位置は補正されている）、この画像にてアライメントマーク重心をＰＣ５での画像処理操作にてＸＹ座標を測定する。画面中央のＸＹ座標からの変位量を算出する。その算出結果より電動ステージ２を制御して、アライメントマーク重心を被観察視野の画面中央へ移動させる。
【００１５】
再度アライメントマークにてオートフォーカスを実行する。以後、アライメントマーク重心座標が画面（視野）中心座標と同一となるまで、又は両者の変位量が一定限度以下となるまで、上記アライメントマークの自動補正テストに関する操作を順に繰り返す。上記一連の操作を終了した直後の電動ステージＸＹ座標及びフォーカス位置座標を原点（０，０，０）と定義する。もっとも電動ステージ初期化直後の座標系及びフォーカス座標系のままでも問題はなく、この場合は上記一連の操作を終了した直後のＸＹＺ座標を記録して、被観察対象の機械的座標系における、オフセットとして活用することと同義である。
【００１６】
以上のように、被観察視野座標系の原点を設定した後、撮像位置及び位置毎の撮像条件を設定する。先ず手動にて第一観察対象（観察ポイント；Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１）へ視野を移動する。そこで採用蛍光ブロック（空を含む）の数を設定する。本例では四つとする。第一蛍光ブロック（Ｂ１）を設定し、第一蛍光ブロック用のカメラの露光時間を設定する。次に第二蛍光ブロック（Ｂ２）を設定し、第二蛍光ブロック用のカメラの露光時間を設定する。第三蛍光ブロック（Ｂ３）を設定して、第三蛍光ブロック用のカメラの露光時間を設定する。更に第四蛍光ブロック（Ｂ４）を設定し、第四蛍光ブロック用のカメラの露光時間を設定する。各情報（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１、採用蛍光ブロック数（Ｂｎ）、各種蛍光（Ｂｉ）ブロックでの露光時間（Ｅｉ））をファイルに保存する。
【００１７】
順次、以下、手動にて第ｎ観察対象（Ｘｎ，Ｙｎ，Ｚｎ）まで設定する。この座標データは被観察視野座標系の原点を基準としている。設定終了ボタンにて、この操作をエスケープする。最後に撮像開始時刻（年月日時分秒）、撮像終了時刻（年月日時分秒）、撮像間隔時間（時分秒）、ムービー名ヘッダーの入力と、それらのファイル保存を行う。
【００１８】
撮像位置と撮像条件の設定を終えた後、自動撮像を実行する。図３に示されるように、先ず被観察視野座標系の原点を検索する。当該原点の設定時と同じく、蛍光フィルターブロックターレットを空（ブランク）の位置へ移動させる。電動ステージの位置座標初期化は省略することができる。次いでアライメントマークの重心座標へ視野を移動させて、オートフォーカスを実行する。
【００１９】
しかる後に、アライメントマークの自動補正を実行する。つまり、上記オートフォーカス実行直後に画像を取り込み、この画像にてアライメントマーク重心をＰＣ５での画像処理操作にてＸＹ座標を測定する。画面中央のＸＹ座標からの変位量を算出する。その算出結果より電動ステージ２を制御して、アライメントマーク重心を被観察視野の画面中央へ移動させる。
【００２０】
再度アライメントマークにてオートフォーカスを実行する。以後、アライメントマーク重心座標が画面（視野）中心座標と同一となるまで、又は両者の変位量が一定限度以下となるまで、上記アライメントマークの自動補正に関する操作を順に繰り返す。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、ＸＹＺ座標駆動手段の機械的駆動系原点から独立して被観察視野座標の原点を特定し、当該座標原点を補正する処理手段を備えるので、複数の被観察対象を繰り返し観察しても、駆動機械の繰り返し動作によって発生するメカニカル誤差に起因した被観察視野座標系の狂いを補正することができ、誤差の蓄積を排除でき、被観察対象を繰り返し移動して顕微鏡観察しても、その観察結果の信頼性を損ねることがない。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るシステムを実行するための装置器具をブロック図として示したものである。
【図２】恒常原点の設定を説明する図である。
【図３】本システムにおける自動撮像の実行を説明する図である。
【符号の説明】
１　顕微鏡
２　電動ステージ
３　電動フォーカス機構
４　ＣＣＤカメラ
５　ＰＣ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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