(57)【要約】【課題】  免疫応答を制御するための組成物を提供する。【解決手段】  リンパ球とB7との相互作用をブロックすることにより免疫応答を制御するために使用するためのIL−４−結合分子及びCTLA−４結合分子を含んで成る組成物。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD28細胞外ドメイン、又は前記細胞外ドメインのCDR3領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列を含んで成り、ここで前記突然変異が、アミノ酸配列AYPPPY, MAPPPY, MYAPPY, MYPAPY, MYPPAY, PYPPPA又はAAPPPYへのMYPPPYアミノ酸配列の変更である可溶性変異体B7−結合分子。
【請求項２】
前記B７−結合分子が、CD28分子である請求項１記載の可溶性変異体B7−結合分子。
【請求項３】
前記B7−結合分子が、CTLA4分子である請求項１記載の可溶性変異体B7−結合分子。
【請求項４】
そのCTLA4細胞外ドメインのCDR3−様領域又はCDR3−様拡張領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部の対応するアミノ酸配列を含んで成るB7抗原を結合する可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項５】
そのCTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項４記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項６】
そのCTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項４記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項７】
ｉ．そのCTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
ii. そのCTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域に突然変異を有するCTLA4細胞外ドメインの少なくとも一部をさらに含んで成る請求項４記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項８】
前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項４記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項９】
前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR1−様領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項５記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１０】
前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR2−様領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項６記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１１】
前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様拡張領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR3−様拡張領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR1−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR1−様領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換であり、そして前記CTLA4細胞外ドメインのCDR2−様領域における突然変異が、CD28分子の対応するアミノ酸残基による、前記CDR2−様領域における１又は複数のアミノ酸残基の置換である請求項５記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１２】
（ｂ）ヒト免疫グロブリンのヒンジ、CH2及びCH3領域のアミノ酸残基を含んで成る第２アミノ酸配列をさらに含んで成る請求項４〜11のいずれか１項記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１３】
前記ヒト免疫グロブリンがCγ1である請求項12記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１４】
前記CTLA４のCDR1−様領域が、位置１でのイソロイシンで開始し、そして位置49でのバリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置58でのロイシンで開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項９記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１５】
前記CTLA４のCDR2−様領域が、位置１でのイソロイシンで開始し、そして位置24でのチロシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置33でのフェニルアラニンで開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項10記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１６】
前記CTLA４のCDR2−様領域が、位置１でのイソロイシンで開始し、そして位置24でのチロシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置31でのフェニルアラニンで開始し、そして位置115でのイソロイシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項10記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１７】
前記CTLA４のCDR1−様領域が、位置１でのイソロイシンで開始し、そして位置115でのイソロイシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項11記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１８】
前記CTLA４のCDR1−様領域が、位置１でのイソロイシンで開始し、そして位置24でのチロシンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換され、そして前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置97でのグルタミン酸で開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項７記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項１９】
前記CTLA4のCDR3−様拡張領域が、位置97でのグルタミン酸で開始し、そして位置125でのセリンで終結する、CD28分子の対応するアミノ酸残基により置換される請求項７記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項２０】
前記CTLA4細胞外ドメインのCDR3−様領域における突然変異が、前記MYPPPYアミノ酸配列における突然変異である請求項１記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項２１】
前記突然変異が、MYPPPY配列におけるアミノ酸残基のいずれかのアニリンによる置換である請求項20記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項２２】
前記突然変異が、アミノ酸配列AYPPPY, MAPPPY, MYAPPY, MYPAPY, MYPPAY, PYPPPA又はAAPPPYへの前記MYPPPYアミノ酸配列の変更である請求項20記載の可溶性CTLA4変異体分子。
【請求項２３】
請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子及びIL4結合分子を含んで成る組成物。
【請求項２４】
前記IL4結合分子が、IL4を特異的に認識し、そしてそれに結合するモノクローナル抗体である請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
前記IL4結合分子が、可溶性IL4受容体である請求項23記載の組成物。
【請求項２６】
リンパ球とのB7相互作用を阻止することによる免疫応答の調節への使用のための、請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項２７】
前記リンパ球がB7陽性リンパ球である請求項26記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記免疫応答が、抗体生成の阻害をもたらすB細胞応答又は細胞介在性免疫性の阻害をもたらすT細胞応答であり、又は前記免疫応答がリンパ球増殖の阻害である請求項26記載の医薬組成物。
【請求項２９】
自己免疫疾患の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３０】
同種移植片拒絶の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３１】
アレルギー反応の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３２】
対象における移植片拒絶の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３３】
対象における対宿主性移植片病の阻害のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３４】
対象におけるリウマチ様関節炎の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３５】
癌の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３６】
ウィルス感染の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項３７】
前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項36記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項36記載の医薬組成物。
【請求項３９】
免疫系疾患の処理のための請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項４０】
細胞介在性免疫応答の調節に使用のためへの請求項23〜25のいずれか１項記載の組成物を含んで成る医薬組成物。
【請求項４１】
リンパ球とのB7相互作用を阻止することにより免疫応答を調節するためへの使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項４２】
前記リンパ球がB7陽性リンパ球である請求項41記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記免疫応答が、抗体生成の阻害をもたらすB細胞応答又は細胞介在性免疫性の阻害をもたらすT細胞応答であり、又は前記免疫応答がリンパ球増殖の阻害である請求項41記載の医薬組成物。
【請求項４４】
移植された組織の受容体である対象における移植片拒絶を阻止することにへの使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項４５】
対宿主性移植片病の阻害への使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項４６】
免疫系疾患の処理への使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項４７】
癌の処理への使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項４８】
T細胞増殖の調節への使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項４９】
サイトカインレベルの調節への使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項５０】
前記サイトカインが、インターロイキンである請求項49記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記サイトカインが、増殖因子である請求項49記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記増殖因子が、腫瘍増殖因子である請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記増殖因子が、コロニー刺激因子である請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記増殖因子が、インターフェロンである請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記増殖因子が、腫瘍懐死因子である請求項51記載の医薬組成物。
【請求項５６】
ウィルス感染の処理のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項５７】
前記ウィルス感染が、HIV感染である請求項56記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記ウィルス感染が、HTLV1感染である請求項56記載の医薬組成物。
【請求項５９】
細胞−介在性免疫応答の調節への使用のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項６０】
自己免疫疾患の処理のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項６１】
同種移植片拒絶の処理のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項６２】
慢性アレルギー反応の処理のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項６３】
対象におけるリウマチ様関節炎の処理のための請求項１〜22のいずれか１項記載の可溶性変異体B7−結合分子を含んで成る医薬組成物。
【請求項６４】
B7抗原へのB7−結合分子の結合を調節するための方法であって、B7抗原と、請求項１〜22のいずれか１項記載の組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項６５】
B7陽性細胞との機能的CTLA4陽性T細胞相互作用を調節するための方法であって、前記B７陽性細胞と、請求項１〜22のいずれか１項記載の組成物とを、CTLA4との内因性B7抗原の反応を妨げるのに効果的な量で接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項６６】
前記B7陽性細胞がB細胞である請求項65記載の方法。
【請求項６７】
前記CTLA4−陽性T細胞と前記B7陽性細胞との相互作用が阻害される請求項65記載の方法。
【請求項６８】
B7陽性細胞とのT細胞相互作用により介在される免疫系疾患の処理方法であって、前記B7陽性細胞とのT細胞相互作用を調節するために効果的な量、請求項１〜22のいずれか１項記載の組成物を、対象に投与することを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、CTLA４ハイブリッド融合タンパク質の発現、CTLA４レセプター遺伝子、前記CTLA４レセプターとB7抗原を発現する細胞との間の相互作用の同定、およびCTLA４レセプターを含む細胞の相互作用を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の免疫系の特徴は、「自己」と「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要とする系の進化に導いた（Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54 : 1-14 (1989))。Ｔ細胞−Ｂ細胞の相互作用は免疫応答に対して必須である。Ｔ細胞およびＢ細胞上に見いだされる多数の付着分子のレベルは、免疫応答の間に上昇する（Springerら、（1987）、前掲；およびShimizu, Current Opinion in Immunology, Kindt およびLong編、１：92-97 (1988)) ；およびHemler, Immunology Today  ９：109-113 (1988)) 。
【０００３】
これらの分子のレベルの上昇は、活性化されたＢ細胞が、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激するとき、休止のＢ細胞よりもいっそう有効である理由の説明を助けるであろう（Kaiuchi ら、J. Immunol. 131 : 109-114 (1983) ; Krcigerら、J. Immunol. 135 : 2937-2945 (1985) ; McKenzie, J. Immunol. 141 : 2907-2911 (1988) ; およびHawrylowicz およびUnanue, J. Immunol. 141 : 4083-4088 (1988)) 。
【０００４】
Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）の免疫応答の発生は、細胞−細胞の相互作用（Springerら、A. Rev. Immunol.５：223-252 (1987)) 、とくにＴ細胞とアクセサリー細胞、例えば、Ｂ細胞との間の相互作用、および可溶性仲介因子（サイトカインまたはリンホカイン）の生産を含む複雑なプロセスである（Dinarello およびMier, New Engl. Jour. Med. 317 : 940-945 (1987))。
【０００５】
この応答は、Ｔ細胞レセプター複合体（Weiss ら、Ann. Rev. Innunol.４：593-619 (1986)) および他の「アクセサリー」表面分子（Springerら、（1987）前掲）を含む、いくつかのＴ細胞表面レセプターにより調節される。これらのアクセサリー分子の多数は、細胞の表面上のモノクローナル抗体の反応性により定められる、天然に見いだされる細胞表面の分化（CD）抗原である（McMichacl 編、Leukocyte Typing III，Oxford Univ. Press、オックスフォード、ニューヨーク（1987))。
【０００６】
リンパ球のアクセサリー分子を含む抗原独立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である（Springerら、（1987）前掲）。例えば、Ｔ細胞関連タンパク質CD２のそのリガンドLFA ３（広く発現される糖タンパク質（ShawおよびShimuz、前掲の中に概観されている））への結合は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するために重要である（Moigcon ら、Nature 339 : 314（1988))。
【０００７】
重要な付着系は、リンパ球、マクロファージ収量顆粒球上に見いだされるLFA-１糖タンパク質（Springerら、（1987）前掲；ShawおよびShimuz (1988) 前掲）のそのリガンドICAM-1（Makgoba ら、Nature311 : 86-88 (1988)) およびICAM−２(Staunton ら、Nature 339 :61-64 (1989)) への結合を含む。
Ｔ細胞のアクセサリー分子CD８およびCD４は、それぞれ、MHC クラスＩ（Norment ら、Nature 336：79-81 (1988)) およびクラスII（Doyle およびStrominger, Nature 330 : 256-259 (1987))分子との相互作用により、Ｔ細胞の付着を強化する。「ホーミング・レセプター（homing receptor)」はリンパ球の移動のコントロールのために重要である（Stoolman, Cell 56 : 907-910 (1989)) 。
【０００８】
VLA 糖タンパク質は、細胞外マトリックス成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介するように思われるインテグリン（integrin) である（Hemler、前掲）。CD２／LFA-３，LFA-１／ICAM-1、およびVLA 付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する（Springerら、（1987）、前掲；ShawおよびShimuz、(1989)、前掲およびHemler、（1988))、前掲）。
【０００９】
さまざまなインビトロ研究により、サイトカインが同種異系反応性エフェクター細胞の生成に関与していることが実証された。例えば、膜結合IL−４及び可溶性IL−４レセプターは、マウスに対し別々に投与されリンパ増殖性応答を増大させるものであることが示された（William C, Fanslow et al. 「IL−４及び可溶性IL−４レセプターによるインビボでの同種異系反応性の調節」J. Immunol. 147 ：535-540 (1991)) 。特異的に言うと、BALB／ｃマウスに対するIL−４の投与は、リンパ増殖性応答のわずかな増大という結果をもたらした。これとは対照的に、可溶性IL−４レセプターはこの同種異系細胞に対する応答を用量に依存した形で抑制した。その上、IL−４に対する中性化抗体及び可溶性IL−４レセプターに対するもう１つの抗体は、リンパ増殖性応答の効果的な阻害物質であった。
【００１０】
Ｂ−リンパ球の活性化は２つのシグナルを必要とすることがかなり以前に提案され（Bretscher およびCohn, Science 169 : 1042−1049 (1970))そして現在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための２つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられている（Janeway 、前掲）。
【００１１】
Freeman ら（J. Immunol. 143 (8) ：2714-2722 (1989)) は、mAB B7により認識されるＢ細胞活性化抗原をエンコードするcDNAクローンを単離しそして配列決定した（Freeman ら、J. Immunol. 138 ：3260 (1987))。このcDNAでトランスフェクションしたCOS 細胞は、標識化mAB B7およびmAB BB−１の両者により染色されることが示された（Clark ら、Human Immunol. 16 : 100-113 (1986)；Yokochi ら、J. Immunol. 128 : 823 (1981)) ; Freeman ら、（1989）前掲；およびFreeman ら、（1987）、前掲))。さらに、この抗原の発現は他の系統の細胞、例えば、単球上に検出された（Freeman ら、前掲）。
【００１２】
Ｔヘルパー細胞（Ｔh ) 抗原の応答のために要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞（APC)により提供される。Ｔ細胞レセプター複合体（Weiss, J. Clin, Invest. 86 : 1015 (1990)) を、APC 上のクラスIIの主要な組織適合性複合体（ＭIIＣ）分子に関係して提示された抗原と相互作用させることによって、第１シグナルは開始される（Allen, Immunol. Today 8 : 270 (1987)) 。この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生するために不十分であり、そして第２シグナルの存在下に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導くことがある (Schwartz, Science 248 : 1349 (1990))。
【００１３】
MHC により提供される第２「共同刺激（costimulatory)」シグナルについての要件は、ある数の実験の系において証明された（Schwartz, 前掲；WeaverおよびUnanue, Immunol. Today 11 : 49 (1990))。これらの１または２以上のシグナルの分子の性質は完全には理解されないが、ある場合において、可溶性分子、例えば、インターロイキン（IL）−１（WeaverおよびUnanuc, 前掲）および細胞間付着に関係する膜レセプターの両者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかである。
【００１４】
CD28抗原、すなわち、免疫グロブリン上科のホモ２量体の糖タンパク質（AruffoおよびSeed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 8573-8577 (1987)) は、ほとんどの成熟ヒトＴ細胞上に見いだされるアクセサリー分子である（Damle ら、J. Immunol. 131 : 2296-2300 (1983)) 。現在の証拠が示唆するように、Ｔ細胞反応複合体により開始されるものと区別される別のＴ細胞活性化の経路において、この分子は機能する（Juneら、Mol. Cell. Bicl. 7 : 4472-4481 (1987))。
【００１５】
CD28抗原と反応性のモノクローナル抗体（mAb)は、種々のポリクローナルの刺激により開始されるＴ細胞の応答を増強することができる（Juneら、前掲、の中に概観されている）。これらの刺激作用はmAb 誘発サイトカインの生産（Thompsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 86 : 1333-1337 (1989) ;  およびLindstenら、Scicnce  244：339-343 (1989)から、mRNA安定化の増加 (Lindstenら、(1989)、前掲）の結果としてを生ずることができる。
【００１６】
抗CD28mAb は、また、阻止作用を有することができ、すなわち、それらはオートロガス混合リンパ球反応（Damle ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096-6001 (1981)) および抗原特異的Ｔ細胞クローンの活性化（Lesslauer ら、Eur. J. Immunol. 16 : 1289-1296 (1986)) をブロックすることができる。
CD28はＢ細胞活性化抗原であるB7／BB−１のための対レセプターであることが研究において示された（Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 5031-5035 (1990)) 。便宜上、B7／BB−１抗原を以後「B7抗原」と呼ぶ。
B7リガンドはまた免疫グロブリンスーパーファミリーの構成員であるが、しかしそれらの細胞外領域中の２つのIgドメイン、CD28及びCTLA４とは異り、Ｎ−末端可変（Ｖ）−様ドメインであって、これに定常（Ｃ）−様ドメインが続く。
【００１７】
CD28又はCTLA４を介してＴ細胞に同時刺激シグナルを供給することがいずれも可能であるAPC, B7-1(B7又はCD80とも称される）及びB7-2中に見出される少なくとも２つの相同なB7ファミリー構成員が存在する場合、重要な非特異的同時刺激シグナルがＴ細胞に供給される。CD28又はCTLA４を通しての同時刺激は、Ｔ細胞の活性化のために必須である。なぜなら、CTLA４の可溶性Ig融合タンパク質（CTLAT-Ig）は、インビボ及びインビトロでＴ細胞活性化現象をブロックするために好結果をもって使用されていない。この第２シグナルの供給の失敗はクローン性不活性化又はＴ細胞アネルギー(anergy)を導くであろう。
【００１８】
CD28とB7抗原との間の相互作用は、B7抗原およびCD28レセプターの細胞外部分、および免疫グロブリン（Ig）Ｃγ１（一定領域の重鎖）の遺伝学的融合を使用して特徴づけられた（Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991))。同定化B7Ig融合タンパク質ならびにB7陽性CHO 細胞は、Ｔ細胞の増殖を共同刺激（costimulate)することが示された。
B7陽性CHO 細胞によるＴ細胞の刺激は、また、IL−２のための転写レベルの増加を特異的に刺激する。追加の研究において、抗CD28mAb は、ある種のＴ細胞白血病細胞系においてＢ細胞系白血病系統との細胞の相互作用により誘発されたIL−２の生産を阻止することが示された（Kohno ら、Cell Immunol. 131-1-10 (1990))。
【００１９】
CD28は単一の細胞外の可変領域（Ｖ）様ドメインを有する（AruffoおよびSeed、前掲) 。相同性分子のCTLA４は、ネズミ細胞溶解性Ｔ細胞のcDNAライブラリーの分別スクリーニングにより同定された（Brunetら、Nature 328 : 267-270 (1987))。このCTLA４分子の転写は細胞障害活性を有するＴ細胞の集団の中に見いだされ、CTLA４が細胞溶解性応答において機能するであろうことを示唆した (Brunetら、前掲；およびBrunetら、Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)) 。
【００２０】
研究者らの報告によると、CTLA４のヒトの対 (Dariavach ら、Eur. J. Immunol. 18 : 1901-1905 (1988)) の遺伝子はクローニングされそしてCD28と同一の染色体領域（２ｇ 33-34) にマッピングされた (Lafage-Pochitalodd) ら、Immunogenetics 31 : 198-201 (1990)) 。CTLA４のIg融合体は、CD28の対応するIg融合体に比べて約20倍高い要求(avidity) をもってB7-1に結合する。
このヒトCTLA４のDNA とCD28タンパク質をエンコードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞質領域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相同性を明らかにする（Brunetら、1988、前掲；Dariavach ら、1988、前掲）。
【００２１】
CD28とCTLA４との間の高度の相同性は、それらの遺伝子の共同局在化と一緒に、これらの分子がまた機能的に関係するかどうかという問題を発生する。しかしながら、CTLA４のタンパク質生産物はまだ首尾よく発現されてきていないので、これらの問題は未解決のままである。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーにおける細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、CD4, HIV-1のレセプター、およびCD28およびB7のレセプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合されたCD4 レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするDNA 配列から成る（免疫グロブリンγ１（Capon ら、Nature 337 : 525-531 (1989)(CD4)およびLinsley ら、J. Exp. Med.、前掲）(CD28 およびB7) 。
【００２２】
白血球のタイプ分け及びFAC 分別のための、B7陽性Ｂ細胞、すなわち活性化されたＢ細胞を同定することができる分子の必要性が存在する。さらに、器官の移植の拒絶を予防し、そして紅斑性狼瘡及び他の自己免疫疾患に関連する症状を阻止するために使用することができる分子の必要性が存在する。過去においては、多くの療法が汎免疫性抑制性(pani mmuhosuppre ssive)薬物、例えばサイクロスポリンＡ又はCD３に対するモノクローナル抗体に頼って、器官移植の拒絶を予防し、又は紅斑の症状を阻止していた。不都合なことに、これらの薬物はどうしても個体に高頻度で投与しなければならず、全免疫系を抑制し、そしてしばしば二次健康不快、例えば感染及び癌の頻度の上昇をもたらす。
【発明の開示】
【００２３】
したがって、本発明はCTLA４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードする完全なかつ正しいDNA 配列を提供し、そしてCTLA４レセプターのために天然のリガンドとしてB7抗原（例えば、B7-1及びB7-2抗原）を同定する。本発明は、また、CTLA４免疫グロブリン（Ig）融合タンパク質生産としてDNA を発現する方法を提供する。
【００２４】
本発明の態様は、CTLA４Ig融合タンパク質（本明細書において、CTLA４／CD28Ig融合タンパク質とも称する）、およびCD28Ig／CTLA４ Ig 融合タンパク質を包含するハイブリッドの融合タンパク質を包含する。また、CTLA４融合タンパク質、B7Ig融合タンパク質、およびそれらの断片および／または誘導体、例えば、CTLA４およびB7抗原と反応性のモノクローナル抗体を使用して細胞の相互作用および免疫応答を調節する方法が提供される。
本発明のヒトCTLA４レセプタータンパク質は187 アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定されたＮ連鎖グリコシル化部位を包含する。
【００２５】
本発明のCTLA４Ig融合タンパク質は、活性化Ｂ細胞、および他の系統上に発現されたB7抗原、Ｔ細胞上のCD28レセプターのためのリガンドと結合する。CTLA４Igは、CD28レセプターに結合するB7よりも有意により高い親和性でB7抗原と結合する。CTLA４Ig構成体は、ヒトIgＣγ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列に融合したCTLA４レセプターの細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列を有する。
【００２６】
第１アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位置１から約位置125 のアミノ酸残基を含有し、これらのアミノ酸残基はヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当する。融合タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。可溶性CTLA４IgはＴおよびＢリンパ球の応答の効力のあるin vivo インヒビターである。
【００２７】
また、本発明には、可溶性CTLA４及びそのハイブリッド融合タンパク質、例えば可溶性ハイブリッド融合タンパク質、例えば、第１アミノ酸配列を有するCD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質が包含される。CTLA４の細胞外ドメインは可溶性CTLA４分子の例である。あるいは、ペプチドタッグに付加されたCTLA４の細胞外ドメインを有する分子は、可溶性CTLA４分子の他の例である。
可溶性ハイブリッド融合タンパク質の例として、本発明は、CD28の細胞外ドメインの断片に相当する第１アミノ酸配列、該第１アミノ酸配列に連結された、CTLA４Igの細胞外ドメインの断片に相当する第２アミノ酸配列、並びにヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸配列、を有するCD28／CTLA４Igを提供する。
【００２８】
ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様は、CD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１から約94のアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸配列を有するCD28／CTLA４Ig融合タンパク質であり、この第１アミノ酸配列は、CTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94から約位置125 のアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合しており、この第２アミノ酸配列は、ヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸残基を含有する第３アミノ酸配列に接合している。本発明のハイブリッド融合タンパク質の他の例は表１及び表２並びに例７に記載する。
【００２９】
また、本発明において、Ｔ細胞をCTLA４レセプターのリガンドと反応させることによって、CTLA４陽性Ｔ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することによる、他の細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法が包含される。リガンドはB7Ig融合タンパク質、CTLA４レセプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断片を包含する。
本発明は、また、B7抗原のためのリガーゼを使用する、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のCTLA４Ig融合タンパク質、例えば、CTLA４Ig融合タンパク質、その断片または誘導体、可溶性CD28／CTLA４ハイブリッド融合タンパク質、例えばCD28／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
【００３０】
本発明は、さらに、B7抗原と反応性のリガンドを投与してB7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節することによって、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含する。このリガンドは、CTLA４Ig融合タンパク質、CD28／CTLA４Ig融合タンパク質のハイブリッド、またはB7抗原と反応性のモノクローナル抗体である。
CTLA４融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびCD28／CTLA４Ig融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の調節における使用について記載する。
【００３１】
CTLA４Ig融合タンパク質を安定に発現する新規なチャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示する。
さらに、本発明は、免疫応答を調節するためB7相互作用を遮断するための方法を提供する。この方法には、B7−結合分子及びIL４結合分子とリンパ球を接触させる段階が含まれている。
さらに、本発明は、B7−結合分子及びIL４−結合分子とB7陽性リンパ球を接触させる段階を含む免疫応答を調節するための方法を提供する。
【００３２】
同様に、本発明は、移植組織の被移植者である患者による組織移植片の拒絶を阻害するための方法をも提供している。この方法には、患者に対しB7−結合分子及びIL４−結合分子を投与する段階が含まれている。
本発明はさらに、患者に対しB7−結合分子及びIL４−結合分子を投与する段階を含む、患者体内の移植片対宿主病を阻害するための方法をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
ここに記載する本発明を完全に理解することができるように、次の説明を記載する。
定義
本出願中で使用する以下の語い又は熟語は規定通りの意味を有する。
ここで用いる「B7相互作用を遮断する」というのは、CD28及び／又はCTLA４といったそのリガンドに対するB7抗原の結合に干渉しかくしてＴ細胞とＢ細胞の相互作用を妨害することを意味する。
本明細書で使用する場合、「B7−結合分子」はB7抗原を結合するあらゆる分子のことを意味する。
本明細書で使用する場合、「IL４結合分子」は、IL４を認識しこれに結合することになるあらゆる分子のことを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「CTLA４変異体」は、CTLA４の細胞外ドメインのアミノ酸配列に類似するアミノ酸を有する分子であって、B7抗原を認識しそしてそれに結合する分子を意味する。
本明細書において使用する場合、「CD28変異体」はCD28の細胞外ドメインのアミノ酸配列に類似するアミノ酸を有する分子であって、B7抗原を認識しそしてそれに結合する分子を意味する。
本明細書において使用する場合「CTLA４／CD28ハイブリッド融合タンパク質」は、CTLA４及びCD28の両者の細胞外ドメインの少なくとも部分を有する分子であって、B7抗原を認識しそしてそれに結合する分子である。
本書で記述する発明をより良く理解することができるように、以下の説明を提供する。
【００３５】
本発明は、Ｔ細胞表面上に見いだされ、活性化Ｂ細胞および他の系統の細胞上に発現されたB7抗原に結合する、ヒトCTLA４レセプターの単離およびクローニング、およびCTLA４レセプター遺伝子の可溶性融合タンパク質生産物の発現に関する。本発明は、また、発現されたCTLA４レセプターを使用して、B7陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方法を提供する。
【００３６】
好ましい態様において、本発明のヒトCTLA４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をコードする完全なかつ正しいDNA 配列をPCR によりクローニングする。CTLA４の完全な予測されたコーディング配列を含有するcDNAを、下の実施例の中に詳細に記載されているように、H38RNAから増幅されたPCR 断片からアセンブリングし、そして発現ベクターCDM8の中に挿入した。単離物をCOS 細胞の中にトランスフェクションし、そしてB7Ig、すなわち、Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991) 記載されているように、B7の細胞外ドメインおよびヒト免疫グロブリン（Ig）Ｃγ１領域に相当するアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合について試験した。
【００３７】
次いで、OMCTLA４と表示する１つの単離物のDNA 配列を決定し、そしてＮ末端においてオンコスタチインＭからのシグナルペプチドに融合した、予測されたヒトCTLA４配列に正確に相当することが発見された。CTLA４レセプターは187 アミノ酸（シグナルペプチドおよび停止コドンを除外する）によりコードされ、そしてアミノ酸位置109-111 に新しく同定されたＮ連鎖グリコシル化部位を含む（下の図３を参照）。オンコスタチインＭのシグナルペプチドを使用して、CTLA４レセプターを発現させる。
【００３８】
他の好ましい態様において、CTLA４の細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列およびヒトIgＣγ１ドメインに相当する第２アミノ酸配列を有する融合タンパク質を使用して、CTLA４レセプター遺伝子（CTLA４Ig）のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。
【００３９】
ここに記載するcDNA配列に基づくヒトCTLA４レセプターに相当するアミノ酸配列の部分をエンコードするcDNAを含有するクローニングおよび発現のプラスミド（CDM8およびπLN）を構成し、ここでCTLA４レセプター遺伝子の細胞外ドメインの断片に相当する第１アミノ酸配列をエンコードするcDNAを、発現されたCTLA４タンパク質の可溶性の変更によりCTLA４レセプター遺伝子の発現を可能とするIgＣ領域に相当する第２アミノ酸配列をコードするDNA に接合する。
【００４０】
こうして、可溶性CTLA４Ig融合タンパク質は第１アミノ酸配列によりコードされ、この第１アミノ酸配列はヒトIgのＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合したCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約125 のアミノ酸残基を含有する。融合タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。次いでこの構成体をCOS またはCHO 細胞の中にトランスフェクションし、そしてCTLA４Igを精製しそして２量体として同定した。
【００４１】
本発明の態様に従うと、CTLA４Ig及びCTLA４／CD28融合タンパク質は、CTLA４の機能的特性を保持する分子を生成するべくCTLA４の外部ドメインに対応するアミノ酸配列におけるアミノ酸置換を有していてよい。すなわち、このような置換を有する分子は、なおもB7抗原に結合することになる。これらのアミノ酸置換には、当該技術分野において「保存的」として知られるアミノ酸置換が含まれるがこれらに必ずしも制限されるわけではない。
【００４２】
例えば、１つのタンパク質の中でタンパク質のコンホーメーションや機能を変えることなく「保存的アミノ酸置換」と呼ばれるいくつかのアミノ酸置換を頻繁に行なうことができるというのは、タンパク質化学の確立した原理である。このような変化には、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいずれかをこれらの疎水性アミノ酸のうちの他のいずれかに置換すること；グルタミン酸（Ｅ）のかわりにアスパラギン酸を又はその逆に置換すること、アスパラギン（Ｎ）に代わってグルタミン（Ａ）を又はその逆に置換すること、及びトレオニン（Ｔ）の代わりにセリン（Ｓ）を又はその逆に置換することが含まれる。特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の３次元構造におけるその役割に応じて、その他の置換も又保存的とみなすことができる。例えば、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、アラニンとバリン（Ｖ）がそうでありうるように、互換性があると考えられることが多い。
【００４３】
比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はロイシン及びイソロイシンと、又時としてバリンと頻繁に互換されうる。リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の有意な特徴がその負荷にありこれら２つのアミノ酸残基のpKの違いが著しいものではないような場所において頻繁に互換可能である。特定の環境の中では、さらにその他の変化も「保存的」とみなすことができる。
【００４４】
実際、本書で開示する方法を用いて、B7−結合分子の突然変異体が産生された。１つの突然変異体は、（１）CD28受容タンパク質の位置１のアミノ酸で始まり位置95のアミノ酸で終わる配列；（２）CTLA４の細胞外ドメインの位置95のアミノ酸で始まり位置125 のアミノ酸で終わる配列；及び（３）ヒトIgＣγ１ドメインに対応する配列、を含んでいる。
【００４５】
第２の突然変異体は、（１）CD28受容タンパク質の位置１のアミノ酸で始まり位置95のアミノ酸で終わる配列；（２）CTLA４の細胞外ドメインの位置95のアミノ酸で始まり位置120 のアミノ酸で終わる配列；及び（３）ヒトIgＣγ１ドメインに対応する配列、を含んでいる。
本発明は、B7−結合分子及びIL４結合分子とリンパ球を接触させることを含む、免疫応答を調節するべくB7相互作用を遮断するための方法を提供する。リンパ球は、B7陽性リンパ球であってよい。
【００４６】
さらに、本発明は、B7−結合分子及びIL４−結合分子とB7陽性リンパ球を接触させることを含む、免疫応答を調節するための方法を提供する。
免疫応答は、抗体産生の阻害という結果をもたらすＢ細胞応答でありうる。付加的には、免疫応答は、細胞性免疫の阻害を結果としてもたらすＴ細胞応答であってもよい。さらに免疫応答は、リンパ球増殖の阻害であってもよい。
同様に、本発明は、移植組織の被移植者である患者による組織移植片の拒絶を阻害するための方法をも提供する。この方法は、患者に対してB7−結合分子及びIL４−結合分子を投与することを含むことができる。
【００４７】
本発明はさらに、患者に対してB7結合分子及びIL４結合分子を投与することを含む、患者体内の移植片対宿主病を阻害するための方法をも提供する。
本発明の態様に従うと、CTLA４結合分子はCTLA４Ig融合タンパク質であってよい。例えば、CTLA４Ig融合タンパク質は、CTLA４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列のほぼ位置１から位置125 までのアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸配列と、ヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応するアミノ酸残基を含む第２のアミノ酸配列を有する融合タンパク質でありうる。
【００４８】
あるいは、B7結合分子は、CD28／CTLA４融合タンパク質ハイブリッドであってよい。例えば、CD28Ig／CTLA４Ig融合タンパク質ハイブリッドは、CTLA４レセプターの細胞外ドメインの一部分に対応する第２のアミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応する第３のアミノ酸配列に融合されたCD28レセプターの細胞外ドメインの一部分に対応する第１のアミノ酸配列を有する融合タンパク質ハイブリッドであってよい。
【００４９】
さらに、IL４結合分子は、IL４を特異的に認識しこれに結合するモノクローナル抗体でありうる。代替的には、IL４結合分子は、IL４を認識しこれに結合する可溶性IL４レセプターである (Fanslow et al. 1991)。
CTLA４Ig融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA は、ブダベスト条約の規定に従いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collcction)(ATCC) （米国マリイランド州ロックビレ）に1991年５月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号68629 を与えられた。
【００５０】
本発明は、可溶性融合タンパク質の形態でCTLA４転写体の第１タンパク質生産物を提供する。CTLA４タンパク質はほぼ50,000サブユニットのＭr のジサルファイド連鎖の２量体を形成し、天然のCTLA４がＴ細胞表面上にジサルファイド連鎖ホモ２量体として多分存在することを示す。
B7抗原はＴ細胞上のCD28レセプターのためのリガンドであることが示された（Linsley ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、前掲）。CTLA４レセプター分子はCD28レセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思われる；両者はＢ細胞活性化抗原のためのレセプターであるが、CTLA４は、リンパ系付着系についてこれまで報告された最高のもの中で、B7に対するより高い親和性を有するように思われる。
【００５１】
しかしながら、CTLA４IgはCD28IgよりB7陽性（B7+ ) 細胞系にいっそう強く結合することが示された。他の実験において、CTLA４はB7抗原に対してCD28レセプターより高い親和性のレセプターであることが証明された。さらに、CTLA４IgはB7抗原に大きさが類似するリンパ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結合することが示された。CTLA４IgはＴ細胞増殖を阻止し、そしてＴh 誘発IgM 生産を阻止した。
【００５２】
他の好ましい態様において、異なるレセプタータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有するハイブリッド融合タンパク質を構成した。例えば、CD28およびCTLA４の細胞外ドメインの選択した断片に相当するアミノ酸配列を連鎖して、CD28／CTLA４ハイブリッド融合タンパク質、例えばCD28／CTLA４Ig融合タンパク質を形成した。
こうして、このタンパク質が得られ、このタンパク質は、CD28の細胞外ドメインの断片に相当するアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸配列、この第１アミノ酸配列に連結された、CTLA４Igの細胞外ドメインの断片に相当する第２アミノ酸配列、並びにヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸配列を有する。
【００５３】
ハイブリッド融合タンパク質の１つの態様は第１アミノ酸配列を有するCD28／CTLA４融合構成体であり、この第１アミノ酸配列はCD28の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置94のアミノ酸残基を含有し、CD28はCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合し、CTLA４はヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合している。
【００５４】
CTLA４レセプタータンパク質、可溶性融合タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をコードするDNA 配列をクローニングしそして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、PCR 、細胞の形質転換、ベクターの構成、発現系などはこの分野においてよく確立されており、そしてほとんどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源材料をよく知っている。しかしながら、必要に応じて便利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこれらの節はカイドラインの役目をするであろう。
【００５５】
レセプターおよび融合タンパク質のためのコーディング配列のクローニングおよび発現
本発明のCTLA４Igを特性決定しかつCD28／CTLA４ハイブリッド融合タンパク質を調製するためのCD28IgＣγ１およびB7IgＣγ１に相当する融合タンパク質の構成体を、Linsley ら、J. Exp. Med. 173 : 721-730 (1991)(これを引用によって加える）に記載されているように調製した。あるいは、B7抗原およびCD28レセプターを発現する細胞から、これらのタンパク質について発表された知識（AruffoおよびSccd、およびFreeman 、前掲）に基づいて標準的手順を使用して、cDNAクローンを調製することができる。
【００５６】
CTLA４の細胞外ドメインおよびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に対応するアミノ酸配列をコードするDNA から成るCTLA４Ig融合体を、PCR 断片の結合により構成した。アミノ酸をコードするcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR 」）技術に従い増幅する（米国特許第4,683,195 号および米国特許第4,683,202 号（Mullisら）、およびMullisおよび Faloona, Methods Enzymol. 154 : 335-350 (1987) を参照のこと）。
【００５７】
CTLA４Ig融合ポリペプチドを構成し、これらのポリペプチドはCTLA４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置125 のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列をコードするDNA 、およびIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA を有した。
【００５８】
ヒトリンパ系細胞の中のCTLA４レセプタータンパク質の発現は従来報告されてきていないので、CTLA４のmRNA源を探すことが必要であった。いくつかのヒト白血病細胞系の全体の細胞のRNA から作ったPCR のcDNAを、プライマーとして、CTLA４遺伝子の発表された配列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした（Dariavach ら、前掲）。試験したcDNAのうちで、H38 細胞（HTLV II 関連白血病系統）は期待したサイズを有するPCR 生産物の最良の収量を提供した。
【００５９】
CTLA４の単一のペプチドはCTLA４遺伝子の中で同定されなかったので、CTLA４の予測された配列のＮ末端をオンコスタチインＭのシグナルペプチド（Malik ら、Molec. and Cell. Biol. 9： 2847 (1989)) に、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融合した。PCR 反応の生産物を、IgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をコードするcDNAを使用して、発現ベクター、例えば、CDM8またはπLNの中に結合した。
【００６０】
全長のヒトCTLA４をコードするDNA を得るために、CTLA４のトランスメンブレンおよび細胞質ドメインをコードするcDNAをH38 細胞からPCR により構成し、そしてCTLA４のＮ末端に融合したオンコスタチインＭシグナルペプチドをコードする、前述したように構成した、CTLA４Igからの断片と、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。PCR 断片をプラスミドCDM8の中に結合して、全長のCTLA４をコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをOMCTLA４と表示した。
【００６１】
ハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードするDNA を構成するために、１つのレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA を、他のレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をコードするDNA 、およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に、B7Ig，CD28IgおよびCTLA４Ig構成体について前述した手順を使用して接合する。
【００６２】
こうして、例えば、CD28レセプターの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約１位置〜約94位置のアミノ酸残基をコードするDNA を、CTLA４レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置94〜約位置125 のアミノ酸残基をコードするDNA 、およびヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に相当するアミノ酸配列をコードするDNA に接合する。
【００６３】
大量のクローニングしたDNA を生産するために、本発明の融合構成体をコードするDNA を含有するベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大腸菌（Ｅ．coli）MC1061／p3株（Invitrogen Corp.、カリフォルニア州サンディエゴ）の中に標準的手順を使用して形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドについてスクリーニングする。
【００６４】
次いで、前述したようにして得られた融合構成体をコードするDNA を含有するクローンを、発現のために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションする。使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクションは、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、CaPO4 共沈、リポフェクション（lipofection)、エレクトロポレイションまたは原形質体の融合、および他のこの分野において知られている方法により達成し、ここで後者の方法は次のものを包含する：
【００６５】
リゾチームの融合または赤血球の融合、スクレイピング、直接的吸収、浸透圧またはスクロースのショック、直接的マイクロインジェクション、間接的マイクロインジェクション、例えば、赤血球仲介技術を介するマイクロインジェクション、および／または宿主細胞を電流に暴露する。
遺伝的情報を細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術は網羅的であると考えられない。
【００６６】
多細胞の生物から誘導化された真核生物の宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい（Tissure Cultures, Academic Press, CruzおよびPatterson 編、（1973）を参照のこと）。これらの系はイントロンをスプライスする能力をもつという追加の利点を有し、こうしてゲノム断片の発現に直接使用することができる。有用な宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO)細胞、サル腎臓（COS)細胞、VERO細胞およびHeLa細胞を包含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する細胞系は好ましい。
【００６７】
このような細胞のための発現ベクターは、通常、哺乳動物細胞と適合性のプロモーターおよびコントロール配列、例えば、CMV プロモーター（CDM8ベクター）および鳥類の肉腫ウイルス（ASV)（πLNベクター）を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプロモーターは、サルのウイルス40（SV40）(Fiersら、Nature 273 : 113 (1973))、または他のウイルスのプロモーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、アデノウイルス２、およびウシ乳頭腫ウイルスを包含する。
【００６８】
コントロール可能なプロモーター、hMTII (Karinら、Nature 299：797-802 (1982)) をまた使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換についての一般的面は、Axel（米国特許第4,399,216 号、1983年８月16日発行）により記載された。現在明らかなように、「エンハンサー」領域は発現を最適化するとき重要である；これらは、一般に、非コーディング領域の中のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる配列である。必要に応じて、複製の由来をウイルス源から得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込みは真核生物におけるDNA の複製のための普通のメカニズムである。
【００６９】
融合構成体の発現のために好ましい真核生物の細胞、例えば、COS またはCHO 細胞を包含するが、他の真核生物の微生物を使用できる。サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces ccrevisiae）、イーストの実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例えば、シゾサッカロミセス・ポンペ（Schizosaccharomyces pombe)を使用できる。
【００７０】
例えば、Broach, Mcthods Enzymol. 101 : 307 (1983) の２μの複製由来、または他の酵母適合性の複製由来（例えば、Stinchcombら、Nature 282 : 39 (1979)) ; Tschempeら、Gene 10 ：157 (1980)；およびClarkeら、Methods Enzymol. 101 : 300 (1983) を参照のこと）を用いるベクターを使用することができる。酵母のベクターのためのコントロール配列は、グリコール分解酵母の合成のためのプロモーターを包含する（Hessら、J. Adv. Enzyme Reg. ７: 149 (1968) ; Hollandら、Biochcmistry. 17 : 4900 (1978)) 。
【００７１】
この分野において知られている追加のプロモーターは、CDM8ベクターの中に提供されたCMV プロモーター（Toyamaおよび Okayama, FEBS 268：217-221 (1990) ;３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Hitzemanら、J. Biol. Chem. 255 : 2073)) 、および他のグリコール分解酵素のためのプロモーターを包含する。
【００７２】
増殖条件によりコントロールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコーディング配列の３′末端において望ましいと信じられる。このようなターミネーターは、酵母誘導化遺伝子の次の３′−非翻訳領域の中に見いだされる。
【００７３】
あるいは、原核生物の細胞を発現のための宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、大腸菌（Ｅ．coli）の種々の株により最も頻繁に発現される；しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に使用される原核生物のコントロール配列は、リボソーム結合部位の配列と一緒に、ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac)プロモーター系（Chang ら、Nature 198 : 1056 (1977)) 、トリプトファン（trp)プロモーター系（Goeddel ら、核酸の研究（Nucleic Acids Res. 8 : 4057 (1980)) およびラムダ誘導化Ｐl プロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Shimatake ら、Nature 292 : 128 (1981))のような普通に使用されているプロモーターを包含する。
【００７４】
CD28IgおよびCTLA４Igタンパク質、および融合ハイゾリッドタンパク質、例えば、CD28／CTLA４Igを後述するように種々の系の中で発現することができる。cDNAを適当な制限酵素で切り出し、そしてこのような発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベクターの中に結合することができる。CD28およびCTLA４レセプターのタンパク質は天然に２量体として存在するので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタンパク質を２量体として形成することを可能とする発現系を必要とすると信じられる。
【００７５】
これらのタンパク質の切頭バージョン（すなわち、タンパク質のトランスメンブレン領域より上流の位置において配列の中に停止コドンを導入することによって形成される）は発現されると思われない。CD28およびCTLA４レセプターの融合タンパク質としての発現は、これらのタンパク質の２量体の形成を可能とする。こうして、CTLA４タンパク質の融合生産物としての発現は、本発明において好ましい。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４Ig−24と表示する本発明の安定なCHO 系はCTLA４Igの発現のために好ましく、そしてブダベスト条約の規定に従いATCCに1991年５月31日に受託され、そしてATCC受け入れ番号10762 を与えられた。
【００７６】
本発明のCTLA４レセプターの発現は、細胞系、例えば、COS 細胞をトランスフェクションし、そしてCTLA４トランスフェクションした細胞をCTLA４レセプターに結合することによって、例えば、細胞のB7Ig融合タンパク質への結合について経験することによって、発現を検出して達成される。
生ずる構成体の配列は、既知の手順、例えば、Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463 (1977) に記載されている、さらにMcssing ら、Nucleic Acids Res. 9 : 309 (1981) に記載されている手順を使用するDNA の配列決定によるか、あるいはMaxam ら、Mcthods Enzymol. 65 : 499 (1980)の方法により確証される。
【００７７】
タンパク質生産物の回収
前述したように、CD28およびCTLA４レセプターの遺伝子は、切頭タンパク質をエンコードするDNA の直接の発現を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ２量体の形成を可能とするために、CD28およびCTLA４の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオンコスタチインＭの配列のためのコドンを含むアミノ酸配列をエンコードするDNA を、天然に２量体のタンパク質のFcドメインに相当するアミノ酸配列をエンコードするDNA と融合する。
【００７８】
こうして、細胞から分泌された後のこれらの融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の抗免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進される。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌されると、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロテインＡカラムへの適用により回収される。
【００７９】
使  用
CTLA４Ig融合タンパク質および／またはその融合タンパク質の断片を使用してB7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、B7抗原陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により仲介される免疫応答を調節することができ、あるいは、インビトロで、白血球のタイプ分けのために使用してＢ細胞成熟段階及び／又はＢ細胞関連疾患を定義することができる(Yokochiら、J. Immunol. 128 (2) : 823)。白血球の表面免疫染色は、免疫蛍光法又は免疫酵素法により行われるが、他の検出手段も可能である。
【００８０】
可溶性CTLA４タンパク質およびCTLA４／CD28ハイブリッド融合タンパク質、および／またはこれらのタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、B7陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の応答により仲介される免疫応答を調節することができる。用語「断片」は、ここにおいて使用するとき、「CTLA４」と呼ぶタンパク質をエンコードするアミノ酸配列の部分を意味する。使用できるCTLA４融合のタンパク質の断片は、ここに記載するCTLA４Ig融合タンパク質を得るために使用するCTLA４レセプターに相当するアミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００８１】
活性化されたＢ細胞および他の系統の細胞上で発現されたB7抗原、およびＴ細胞上で発現されたCD28レセプターを互いに直接結合することができ、そしてこの相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することができる。このような相互作用は、Ｔ細胞の増殖、および免疫グロブリン生産細胞へのＢ細胞の分化に導く、Ｔ細胞の中のCD28活性化経路を直接トリガーする。
【００８２】
起こるＢ細胞の活性化は、B7抗原の発現を増加し、さらにCD28を刺激して、慢性の炎症の状態、例えば、自己免疫疾病、異種移植の拒絶、移植片対宿主の疾患または慢性のアレルギー反応に導くことがある。この反応をブロックまたは阻止することは、Ｔ細胞のサイトカインの調製を防止し、こうして炎症反応を防止または逆転するとき有効であることがある。
【００８３】
可溶性CTLA４、例えばCTLA４Igは、ここにおいて、Ｔ細胞およびＢ細胞の相互作用を必要とするin vitroリンパ球機能の効力のあるインヒビターであることが示された。これはB7抗原およびその対レセプター、CTLA４および／またはCD28の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒトのCTLA４の細胞質ドメインは類似し（Dariavach ら、前掲、1988）、この領域が重要な機能的性質を有することを示唆する。また、CD28およびCTLA４の細胞質ドメインは相同性を共有する。
【００８４】
CTLA４は、抗BB１または抗CD28モノクローナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答のin vitroインヒビターである。CTLA４Igは、その阻止作用と反作用するＴ細胞の増殖に対する直接の刺激作用をもたない。したがって、CTLA４Ig融合タンパク質は抗CD28モノクローナル抗体よりもすぐれたin vivo インヒビターとして働くことができる。CTLA４Igのin vitro免疫抑制作用は、異常なＴ細胞の活性化またはIgの生産を包含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示唆する。
【００８５】
CTLA４Ig融合タンパク質は、in vivo 阻止性質を示すことが期待された。こうして、CTLA４Igは、同様なin vivo 条件下に抗CD28抗体について観察される作用に類似する方法で、Ｔ細胞を阻止する作用をすることが期待される。Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用がＴ細胞とＢ細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、B7抗原陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させために導入されたCTLA４Igの結合は、Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用を妨害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることができる。この独占的な阻止作用のために、CTLA４Igは生体内でＴ細胞の活性のインヒビターとして、非特異的インヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステロイドよりも有用であることが期待される。
【００８６】
１つの態様において、CTLA４Ig融合タンパク質またはCTLA４／CD28Igハイブリッドタンパク質は、適当な製剤学的担体と組み合わせてin vivo 導入する、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患または癌の処置のためにヒトの投与することができる。
融合タンパク質のin vivo 導入は、Ｔ細胞と他の細胞、例えば、Ｂ細胞との相互作用を、B7陽性細胞へのリガンドの結合の結果として、妨害することが期待される。正常のＴ細胞の相互作用の防止は、Ｔ細胞の活性を減少し、例えば、Ｔ細胞の増殖を減少することができる。
【００８７】
さらに、融合タンパク質のin vivo 投与はサイトカインのin vivo レベルの調節して被検体において所望の作用を促進することが期待され、ここでサイトカインは次のものを包含するが、これらに限定されない：インターロイキン、例えば、インターロイキン（「IL」）−２，IL−３，IL−４，IL−６，IL−８，成長因子、例えば、腫瘍成長因子（「TFG 」）、コロニー刺激因子（「CSF 」）、インターフェロン（「IFN 」）および腫瘍壊死因子（「TNF 」）。
【００８８】
例えば、融合タンパク質をin vivo 導入するとき、それは悪性の増殖、例えば、腫瘍細胞の増殖に寄与するサイトカインの生産をブロックすることができる。融合タンパク質は、また、Ｔ細胞の活性化に依存するウイルス、例えば、エイズを引き起こすウイルス、HTLV１の増殖をブロックすることができる。
【００８９】
ある環境下に、前述したように、CTLA４Ig融合タンパク質またはその断片のin vivo 投与の作用は阻止であり、Ｔ細胞／Ｂ細胞の接触から生ずるCTLA４およびCD28のトリガーの融合タンパク質によるブロッキングから生ずる。例えば、CTLA４Igタンパク質はＴ細胞の増殖をブロックすることができる。こうして、CTLA４Ig融合タンパク質のin vivo 導入は、Ｔ細胞およびＢ細胞の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであろう。また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与することができる。
【００９０】
本発明の追加の態様において、CTLA４Ig融合タンパク質またはCTLA４レセプターと反応性の誘導体を包含する他の試薬を使用してＴ細胞の相互作用を調節する。例えば、CTLA４レセプターと反応性の抗体および／または抗体断片をスクリーニングして、B7抗原へのCTLA４Ig融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止することができるものを同定することができる。次いで、抗体または抗体断片、例えば、Fab またはＦ（ab′）2 断片を使用して、例えば、Ｔ細胞と反応させてＴ細胞の増殖を阻止することができる。
【００９１】
CTLA４レセプターと反応性のモノクローナル抗体は、既知の手順、例えば、KohlerおよびMilstein (KohlerおよびMilstein, Nature, 256 : 495-97 (1975))により導入された手順、およびその変更により生成して、細胞の相互作用を調節することができる。
これらの技術は、特定の抗体を生産するようにプライミングした動物の使用を包含する。動物は免疫原（例えば、B7Ig融合タンパク質、CTLA４Ig融合タンパク質またはCD28Ig／CTLA４Igハイブリッド融合タンパク質）の注入によりプライミングして、所望の免疫応答、すなわち、プライミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことができる。また、プライミングされた動物は疾患を発現する動物である。
【００９２】
プライミングされた病気の動物のリンパ節、脾臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免疫グロブリンをエンコードするリンパ球の染色体を、一般に融合剤、例えば、ポリエチレングリコール（PEG)の存在下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例えば、P3−NS１／１−Ag４−１，P3−ｘ63−Ag８，653, Sp2／０−Ag14、またはHLI-653 骨髄腫系統の任意のものを、標準的技術に従い、融合相手として使用することができる。これらの骨髄腫系統はATCC（米国マリイランド州ロックビレ）から入手可能である。
【００９３】
次いで、所望のハイブリドーマを包含する生ずる細胞を選択培地、例えば、HAT 培地の中で成長させ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクローンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液を、例えば、免疫化に使用したCTLA４Igタンパク質を使用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在についてスクリーニングする。次いで、陽性のクローンを制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成したモノクローナル抗体を単離することができる。
【００９４】
モノクローナル抗体の単離および精製の種々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染物質を含有しない抗体を得ることがてきる。モノクローナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを包含する（Zolaら、Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications, Hurell 編、p. 51-52 (CRC Press, 1982 を参照のこと）。
【００９５】
これらの方法に従い生産されたハイブリドーマは、この分野において知られている技術を使用してin vitroまたはin vivo （腹水の中で）増殖することができる（一般に、Finkら、Prog. Clin. Pathol., 9：121-33 (1984), Fig. 6-1, p. 123 を参照のこと）。
一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でin vivo 増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテーション、濾過または遠心により収穫することができる。
【００９６】
さらに、CTLA４レセプターの細胞外ドメインと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断片、例えば、Fab ，Ｆ（ab′）2 およびFv断片を生成することができる。このような断片は、この分野においてよく確立された技術を使用して生成することができる（例えば、Rousseaux ら、Methods Enzymol. 121 : 663-69, Academic Press (1986)を参照のこと）。
【００９７】
前述したようにして調製した抗B7モノクローナル抗体を使用してB7抗原に結合させて、CD28陽性またはCTLA４陽性のＴ細胞とB7陽性細胞との相互作用を阻止することができる。抗CTLA４モノクローナル抗体を使用してCTLA４レセプターと結合させて、CTLA４陽性Ｔ細胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。
他の態様において、CTLA４Ig融合タンパク質を使用して、CTLA４とB7抗原との間の相互作用を調節できる追加の化合物を同定することができる。このような化合物は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞と反応させるために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含することができる。
【００９８】
例えば、発酵ブロスをCTLA４／B7の相互作用を阻止する能力について試験することができる。さらに、前述のCTLA４Ig融合タンパク質の誘導体を使用してＴ細胞の増殖を調節することができる。例えば、断片または誘導体を使用して、異種移植の骨髄の移植に伴う移植片対宿主（GVH)の疾患におけるＴ細胞の増殖をブロックすることができる。
【００９９】
CD28仲介Ｔ細胞増殖経路は、CD３／Ｔ細胞のレセプター複合体により与えれる増殖（Juneら、1987、前掲）と対照的に、シクロスポリン耐性である。シクロスポリンはGVH 疾患のための処置として比較的無効である（Storb, Blood 68 : 119-125 (1986)) 。GVH 疾患は、CD28抗原を発現するＴリンパ球により仲介されると考えられる（Storb およびThomas, Immunol. Rev. 88：215-238 (1985)) 。こうして、CTLA４Ig融合タンパク質は、単独で、あるいは免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンと組み合わせて、GVH 疾患におけるＴ細胞の増殖のブロッキングに有用であることができる。
【０１００】
こうして、Ｂ細胞を包含するB7陽性細胞とのCTLA４陽性Ｔ細胞の相互作用の本発明の方法による調節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移植、感染症および新形成を処置することができる。
ここで記述されているB7結合分子及びIL４結合分子は、溶液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、座薬、重合体マイクロカプセル又は微小嚢、リポソーム及び注射液又は輸液を含むもののこれらに限定されるわけではないさまざまな用量決定形態をしていてよい。好ましい形態は、投与様式及び治療的利用分野によって異なる。
【０１０１】
本発明に基づく分子のための最も効果的な投与様式及び用量決定方法は、疾病の重症度及び経過、患者の健康状態及び治療に対する応答性ならびに担当医の判断によって左右される。従って、分子の服用量は、個々の患者に対し滴定されなくてはならない。
表面積１ｍ2 あたりのmg数に基づくさまざまなサイズ及び種の動物及び人間に対する服用量の相互関係は、Freireich, E. J et al.によって記述されている（マウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル及びヒトにおける抗ガン剤の毒性の定量比較、Cancer Chemother, Rep., 50, No.4, 219-244, 1966 年５月）。
【０１０２】
成長阻害応答を最適化するため、用量決定方法を調製することが可能である。用量は、分割して毎日投与することもできるし、又状況に比例して用量を減少することもできる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することもできるし、或いは又特定の治療状況によって指示される通りに比例して減少させることもできる。
【０１０３】
本発明の実施例に従うと、患者を治療するための有効量は、患者の体重１kgあたり約0.1 〜約10mgでありうる。同様に、有効量は、患者の体重１kgにつき約１mg〜約10mgの量でもありうる。
発明の利点：本発明は、組織又は器官の移植片の拒絶を防止することに向けられた現行の療法に付随する問題を克服する。現行の療法とは対照的に、本発明はB7相互作用により媒介される免疫応答のみに影響を及ぼす。
【０１０４】
例えば、本発明は、移植片抗原特異Ｔ細胞に影響を及ぼし、かくしてドナー特異的及び抗原特異的寛容を誘導する。Ｔ細胞レセプター嵌入中のCD28のそのリガンドB7／BB1 (B7)による結合は、いくつかの系内での適切なＴ細胞シグナル付与にとって重大なことである (M. K. Jenkins, P. S. Taylor, S. D. Norton, K. B. Urdahl, J. Immunol. 147 : 2461 (1991)； C. H. June, J. A. Ledbetter, P. S. Linsley, C. B. Thompson, Immunol. Today 11：211 (1990)；H. Reiser, G. J. Freeman, Z. Razi-Wolf, C. D. Gimmi, B. Benacerraf, L. M. Nadler, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89：271 (1992)；N. K. Damie, K. Klussman, P. S. Linsley, A. Aruffo, J. Immunol. 148 ：1985 (1992))。
【０１０５】
CD28とそのリガンドの相互作用が遮断されると、抗原特異Ｔ細胞は、不適切に抗原特異Ｔ細胞アネルギー状態に誘導される (M. K. Jenkins, P. S. Taylor, S. D. Norton, K. B. Urdahl, J. Immunol. 147：2461 (1991) ；F. A. Harding, J. G. McArthur, J. A. Gross, D. H. Raulet, J. P. Allison, Nature 356 ：607 (1992)) 。
【０１０６】
CTLA４Ig融合タンパク質は、（CD28に比べ20倍大きい親和力をもつ）ヒト及びマウスB7の両方に結合し、B7に対するCD28の結合を遮断し、Ｔ細胞活性化を阻害し、インビトロでのＴ細胞不応答を誘導する（F. A. Harding, J. G. McArthur, J. A. Gross, D. H. Raulet, J. P. Allison, Nature 356 ：607 (1992)；P. S. Linsley et al., J. Exp. Med. 174：561 (1991)。
【０１０７】
その上、本発明は、それまで発現されなかったCTLA遺伝子の可溶性タンパク質産物の発現を得るため、又Ｔ細胞の機能的応答に関与するCTLA４のための天然リガンドを同定するために役立つ。このとき、可溶性タンパク質産物は、病理状態を治療するべくインビボでＴ細胞応答を調節するのに使用することができる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は本発明を限定しない。
【０１０８】
例  １．B7Ig及びCD28Ig融合タンパク質の調製
レセプター−免疫グロブリンＣγ（IgＣγ）融合タンパク質B7Ig及びCD28Igを、本発明において引用により組込まれる、Linsley など., J. Exp. Med. 173 : 721 〜730 (1991)により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質（たとえばB7）に対応するアミノ酸配列をコードするDNA を、ヒトIgＣγ１のヒンジ、CH２及びCH３領域に対応するアミノ酸配列をコードするDNA に連結した。これは次のようにして達成される。
【０１０９】
ポリメラーゼ鎖反応（PCR)
PCR のために、DNA フラグメントを、個々の融合タンパク質について下記のようにしてプライマー対を用いて増幅した。PCR 反応（０．１mlの最終体積）を、Tag ポリメラーゼ緩衝液（Stratagene, La Jolla, CA）において行ない、ここで前記緩衝液は、個々のdNTP20μモル；前記に示されたプライマー50〜100 ｐモル；鋳型（引用により本明細書において組込まれる、Kauasaki, PCR Protocols, Academic Press, 21 〜27ページ（1990）により記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計≦１μｇのRNA から合成されたプラスミド又はcDNA１ng）；及びTag ポリメラーゼ（Stratagene) を含んだ。反応は、16〜30回のサイクル（典型的なサイクルは、94℃で１分、50℃で１〜２分及び72℃で１〜３分の段階から成る）のためにサーモサイクラー（Perkin Elmer Corp. Norwalk, CT) 上で行なわれた。
【０１１０】
プラスミドの構成
Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 8573 (1987)により記載されるような、CD28をコードするcDNAを含む発現プラスミドが、Drs. Aruffo and Seed (Mass General Hospital Boston, MA) により供給された。Aruffo, Cell 61 : 1303 (1990)により記載されるような、CD５をコードするcDNAを含むプラスミドがDr. Aruffoにより供給された。Freeman など.,J. Immunol. 143 : 2714(1989)により記載されるような、B7をコードするcDNAを含むプラスミドは、Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA)により供給された。
【０１１１】
CD28及びB7の可溶性形の発現での初期試みのために、構成体をLinsley など., J. Exp. Med.,前記により記載されているようにして製造し（OMCD28及びOMB7) 、ここで停止コドンがトランスメンブランドメインの上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオンコスタチインＭ（oncostatin M）（Malik など., Mol. Cell Biol. 9 : 2847 (1989)) からのシグナルペプチドにより置換された。それらは、再構成のための合成オリゴヌクレオチド（OMCD28）を用いて又はPCR のためのプライマー（OMB7）として製造された。
【０１１２】
OMCD28は、シグナルペプチドをオンコスタチインＭからの類似領域により置換することによってより効果的な発現のために変性されたCD28 cDNA である。CD28Ig及びB7Ig融合構成体を２つに分けて製造した。５′部分を、鋳型としてOMCD28及びOMB7及び前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド、CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC （配列番号１）（オンコスタチインＭシグナルペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする）及び逆方向プライマーとしてTGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA （配列番号２）又は、TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT （配列番号３）のいづれかをそれぞれ用いて製造した。
【０１１３】
PCR 反応の生成物を、PCR プライマーに導入される部位として制限エンドヌクレアーゼ（HindIII 及びBcl Ｉ）により切断し、そしてゲル精製した。
ヒトIgＣγ１配列に対応する融合構成体の３′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラmAB L6を生成する骨髄細胞系（Dr. P. Fell and M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Conyany, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WAにより供給される）からのRNA を用いて、連結された逆転写酵素（トリ骨髄芽症ウィルスからの；Life Sciences Associates, Bayport, NY)-PCR反応により製造した。
【０１１４】
オリゴペプチド、すなわち
AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG（配列番号４）を前方プライマー及びCTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC （配列番号５）を逆方向プライマーとして使用した。反応生成物をBal Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そしてゲル精製した。
【０１１５】
最終生成物を、IgＣγ１配列を含む、Bcl Ｉ／Xba Ｉ切断されたフラグメントと共に、CD28又はB7配列を含む、HindIII ／Bcl Ｉ切断されたフラグメントを、HindIII ／Xba Ｉ切断されたCD28中に連結することによってアセンブリーした。連結生成物を用いてMC1061／p3  Ｅ．コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドのためにスクーンした。得られた構成体の配列を、DNA 配列決定により確認した。
【０１１６】
B7をコードする構成体は、B7の細胞外ドメインの約１位〜約215 位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNを含んだ。CD28をコードする構成体は、CD28の細胞外ドメインの約１位〜約134 位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするDNA を含んだ。
CD５Igを、前方プライマーとして
CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG （配列番号６）及び逆方向プライマーとしてATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC （配列番号７）を用いて、同じ態様で構成した。PCR 生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして上記のようにしてIgＣγ１フラグメントにより連結した。
【０１１７】
得られた構成体（CD５Ig）は、CD５に対応する配列の１位〜347 位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する成熟タンパク質、前記構成工程により導入された２つのアミノ酸（アミノ酸DQ）、次にIgＣγ１領域に対応するアミノ酸をコードするDNA をコードした。
【０１１８】
細胞培養及びトランスフェクション
COS(モンキー腎細胞）を、引用により本発明に組込まれる、Seed and Aruffo  (Proc. Natl. Acad. Sci. 84 : 3365 (1987))の方法の変法を用いて、CD28及びB7を発現する発現プラスミドによりトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクトする18〜24時間前、10cmの直径の培養皿当たり106 個で接種した。
【０１１９】
プラスミドDNA を、0.1 mMのクロロキン（cloroquine) 及び600 μｇ／mlのDEAE Dextranを含む血清フリーDMEM５mlに添加し（約15μｇ／皿）、そして細胞を37℃で３〜3.5 時間インキュベートした。次に、トランスフェクトされた細胞をすぐに、PBS 中、10％ジメチルスルホキシドにより処理し（約２分）、そして10％FCS を含むDMEMにおいて37℃で16〜24時間インキュベートした。トランスフェクションの24時間後、培養培地を除去し、そして血清フリーDMEMにより変換した（６ml／皿）。インキュベーションを37℃で３時間続け、この時点で、古い培地を集め、そして新鮮な血清フリー培地を添加した。37℃でさらに３日後、古い培地を再び集め、そして細胞を捨てた。
【０１２０】
CD28，CD５又はB7を発現するCHO 細胞を、次の通りに、Linsley など., (1991) 前記により記載されるようにして単離した：簡単に言及すれば、CD28，CD５又はB7を発現する安定したトランスフェクタントを、適切な発現プラスミド及び選択マーカー、pSV2dhfr (Linsley など., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 87 : 5031 (1990))の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣（dhfr- CHO)細胞の同時トランスフェクションの後、次に、形質転換体を、１μＭの最終レベルまでメトトレキヤートの徐々に高まる濃度で増殖させ、そして10％ウシ胎児血清（FBS)、0.2 mMのプロリン及び１μＭのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持した。
【０１２１】
高レベルのCD28（CD28+ CHO)又はB7（B7+ CHO)を発現するCHO 系を、mAbs9.3 又はBB−１による間接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソーチング（FACS（Ｒ))により単離した。CD28又はB7の表面発現のために陰性の増幅されたCHO 細胞をまた、CD28−トランスフェクトされた集団からFACS（Ｒ）により単離した。
【０１２２】
免疫染色及びFACS（Ｒ）分析
トランスフェクトされたCHO 又はCOS 細胞又は活性化されたＴ細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、CHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS におけるインキュベーションによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、ネズミmAbs9.3 （Hansenなど., Immunogenetics 10 : 247 (1980))又はBB−１（Yokochi など., J. Immunol. 128 : 823 (1981))と共に、又はIg融合タンパク質（10％のFCS を含むDMEMにおいて10μｇ／mlで）と共に４℃で１〜２時間インキュベートした。
【０１２３】
次に細胞を洗浄し、そしてさらに0.5 〜２時間、４℃で、FITC−接合の第２段階試薬（ネズミmAbsのためにヤギ抗−マウスIg血清又は融合タンパク質のためにヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（Tago, Inc., Burlingama, CA))と共にインキュベートした。螢光を、40対数増幅器（four decade logarithmic amplifier)を備えたFACS IV(Ｒ）細胞ソーター（Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA ）上で分析した。
【０１２４】
Ig融合タンパク質の精製
トランスフェクトされたCOS 細胞からの古い血清フリー培養培地の第１，第２及び第３回収集物を、Ig融合タンパク質の精製のための源として使用した。高速遠心分離により細胞残髄物を除去した後、培地を、0.05Ｍのクエン酸ナトリウム溶液（pH8.0)により平衡化された、固定されたプロテインＡ（Repligen Corp., Cambridge, MA)のカラム（約200 〜400 mlの培地／ml充填層体積）に適用した。
【０１２５】
その培地の適用の後、カラムを１μのリン酸カリウム溶液（pH８）により洗浄し、そして結合されたタンパク質を0.05Ｍのクエン酸ナトリウム溶液（pH３）により溶出した。画分を集め、そしてすぐに、２Ｍのトリス（pH８）１／10体積の添加により中和した。Ａ280 吸収材料のピークを含む画分をプールし、そして使用の前、PBS に対して透析した。それぞれCD28Ig及びB7Igのための吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により2.4 及び2.8 nl／mgであった。精製されたCD28Ig及びB7Ig結合活性の回収率は、B7+ 及びCD28+ CHO 細胞の間接的な螢光染色の後、FACS（Ｒ）分析により判断される場合、ほぼ定量的であった。
【０１２６】
例  ２．CTLA４Ig融合タンパク質の調製
CTLA４の細胞外ドメインとIgＣγ１ドメインとの間にCTLA４Igをコードする可溶性遺伝子融合体を、CD28Ig構成体についての上記方法に類似する方法で構成した。CTLA４遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列（Dariarach など., Eur. Jour. Immunol. 18 : 1901〜1905 (1988))に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR によりクローン化した。
CTLA４のためのシグナルペプチドはCTLA４遺伝子において同定されていないので、CTLA４の示された配列のＮ−末端を、オーバーラップオリゴヌクレオチドを用いて２段階で、オンコスタチインＭ（Melik など., Mol. and Cell. Biol. 9 : 2847 (1989))のシグナルペプチドに融合せしめた。
【０１２７】
第１段階に関しては、オリゴヌクレオチド、CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC （配列番号８）（CTLA４のＮ末端側の７個のアミノ酸に融合されるコンスタチンＭシグナルペプチドからのＣ末端側の15個のアミノ酸をコードする）を、前方プライマーとして、及びTTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG （配列番号９）（Bcl Ｉ制限酵素部位を含み、そしてCTLA４レセプターをコードするアミノ酸配列のアミノ酸残基119 〜125 をコードする）を逆方向プライマーとして使用した。
【０１２８】
この段階のための鋳型は、H38 細胞（Drs. Salahudin and Gallo, NCI, Bethesda, MD により供給されるHTLVII感染性Ｔ細胞白血球細胞系）からの合計１μｇのRNA から合成されたcDNAであった。第１段階からのPCR 生成物の一部を、オンコスタチインＭシグナルペプチドのＮ末端部分をコードし、そしてHindIII 制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラップ前方プライマー、CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC（配列番号10）及び同じ逆方向プライマーを用いて再増幅した。
【０１２９】
PCR 反応の生成物をHindIII 及びBcl Ｉにより消化し、そしてBcl Ｉ／Xha Ｉにより切断された、IgＣγ１のヒンジ、CH２およびCH３領域に対応するアミノ酸配列をコードするcDNAフラグメントと共に、HindIII ／Xha Ｉ切断された発現ベクター、CDM8又はHindIII ／Xba Ｉ切断された発現ベクター、πLN（Dr. Aruffoにより供給される）中に連結した。
【０１３０】
得られたCTLA４Ig融合構成体の地図は図１に示される。その図に示される配列は、CTLA４（上方の文字、黒くない部分）とコンスタチンＭのシグナルペプチドSP（黒い部分）及びIgＣγ１のヒンジＨ（点描模様の部分）との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構成の間に導入された。星印（★）は、IgＣγヒンジ領域に導入されたシステイン〜セリン変異を示す。CTLA４に存在する免疫グロブリンスーパーファミリーＶ−株ドメインは、IgＣγ１のCH２及びCH３ドメインであるように示される。
【０１３１】
次に、CTLA４Igを含む発現プラスミド、CDM8を、Seed and Aruffo, 1987,前記により記載される方法の変法（Linsley など., 1991,前記）により、DEAE／テキストラントランスフェクションを用いてCOS 細胞中にトランスフェクトした。
CTLA４Igのアミノ酸配列をコードするcDNAを含む発現プラスミド構成体（πLN又はCDM8）を、標準方法を用いてのリポフェクションによりdhfr- CHO 系中にトランスフェクトし、CTLA４Igを安定して発現する新規細胞系を得た。
【０１３２】
CTLA４Igに対応するアミノ酸配列をコードするDNA は、1991年５月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号68629 を得た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞系CTLA４Ig−24と称する、CTLA４Igを発現する好ましい安定性のトランスフェクタントを、免疫染色法を用いて、培地におけるB7結合活性についてB7陽性CHO 細胞系をスクリーンすることによって製造した。トランスフェクタントは、10％ウシ胎児血清（FBS)、0.2 mMのプロリン及び１μＭのメトトレキヤートにより補充されたDMEMに維持された。
【０１３３】
CTLA４Ig−24CHO 細胞系は、1991年５月31日、ブタペスト条約に基づいてATCCに寄託され、そしてATCC受託番号10762 を得た。
CTLA４Igを、血清フリーに条件付けられた上清液からプロテインＡクロマトグラフィー処理により精製した（図２）。CTLA４Igの濃度を、280 nmで1.6 の吸光係数（既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実験的に決定された）を仮定して、決定した。CTLA４Igのサンプル（１μｇ）（レーン２及び４）及び分子量標準（レーン１及び３、図２）を、非還元条件（−βME、レーン１及び２）又は還元条件（＋βME、レーン３及び４）下でSDS-PAGE（４〜12％のアクリルアミドグラジエント）にゆだねた。タンパク質は、クーマシーブリリアンドブルーによる染色により可視化された。
【０１３４】
非還元条件下で、CTLA４IgはMrが約100,000 である種として移動し、そして還元条件下でそれは、Mrが約50,000である種として移動した（図２）。IgＣγヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、CD28IgのようなCTLA４Igは、生来のジスルフィド結合を通してたぶん連結されたダイマーである。
【０１３５】
例  ３．CTLA４レセプター
十分な長さのヒトCTLA４遺伝子に対応するアミノ酸をコードするDNA を再構成するために、CTLA４のトランスメンブラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAを、PCR によりクローン化し、そして次に、CTLA４のＮ−末端に融合されるオンコスタチンＭシグナルペプチドに対応する、CTLA４Igからのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするcDNAにより連結した。PCR のための方法、及び細胞培養及びトランスフェクションは、COS 細胞及びDEAE−デキストラン  トランスフェクションを用いて、例１に記載されている通りであった。
【０１３６】
ヒトリンパ球細胞におけるCTLA４レセプタータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、CTLA４mRNAの源を示す必要はなかった。上記に示されるような、H38 細胞の全体の細胞RNA から逆転写されるPCR cDNAを、PCR によるクローニングのために使用した。
この目的のためには、オリゴヌクレオチド、GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG （配列番号11）（推定されるコード配列に初めの11個のアミノ酸をコードする）を、前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG （配列番号12）CTLA４における最後の８個のアミノ酸に相同であり、且つXba Ｉ部位を含む）を使用した。
【０１３７】
鋳型は再び、H38 細胞からの１μｇのRNA から合成されたcDNAであった。PCR 反応の生成物を制限エンドヌクレアーゼNco Ｉ及びXba Ｉにより切断し、そして得られた316 bpの生成物をゲル精製した。上記CTLAIg融合からの340 bpのHindIII ／Nco Ｉフラグメントをまたゲル精製し、そして両制限フラグメントを、HindIII ／Xba Ｉ切断されたCDM8中に連結し、OMCTLAを形成した。
【０１３８】
得られる構成体は、完全な長さのCTLA４（配列番号13及び14）及びオンコスタチンＭシグナルペプチドに対応した。その構成体は図３に示され、そしてOMCTLA４と称した。図３に示されるCTLA４のための配列は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置111 でのこれまで達告されたアラニンがトレオニンをコードするような塩基変化により、推定されるヒトCTLA４DNA 配列（Dariavach など.,前記）とは異なる。このトレオニンは、融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要である、新しく同定されたＮ−連結グリコシル化部位の一部である。
【０１３９】
連結生成物を用いて、MC1061／p3  Ｅ．コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、DNA 配列分析により確かめた。
【０１４０】
例  ４．CTLA４Igの特徴化
CTLA４Ig構成体を特徴づけるために、いくつかの単離体、CD28Ig，B7Ig及びCD５Igを上記のようにして調製し、そして例２及び３に記載されるようにしてCOS 細胞をトランスフェクトし、そしてB7Igの結合のためにFACS（Ｒ）分析により試験した。上記構成体の他に、Aruffo and Seed (EMBO Jour. 6 : 3313〜3316 (198)) により記載されるようなCD７をコードするcDNAを含むCDM8プラスミドをまた使用した。
【０１４１】
mAbs. ネズミモノクローナル抗体（mAba）9.3 （抗−CD28）及びG19-４（抗−CD３）、G3−７（抗−CD７），BB−１（抗−B7抗原）及びラットmAb 187.1(抗−マウスＫ鎖）はこれまで記載されており（Ledbetter など., Pruc. Natl. Acad. Sci. 84：1384〜1388（1987) ; Ledbetter など., Bloud 75 : 1531 (1990) ; Yokochi など.,前記）、そして使用の前、腹水から精製した。
【０１４２】
mAb OKT8を生成するハイブリドーマをATCC, Rockville, MD から得、そしてmAb をまた、使用の前、腹水から精製した。mAb 4G9(抗−CD19）は、Dr. E. Engleman (Stanfurd Uninersity, Palo Altu, (A)により提供された。精製されたヒト−マウスキメラmAb L6（ヒトＣγ１Fc部分を有する）は、Dr. P. Fell and M. Gayle (Bristal-Myers Squibb Pharmacentical Research Institute, Seattle, WA)の贈与である。
【０１４３】
免疫染色及びFACS（Ｒ）分析
染色の前、COS 又はCHO 細胞を、10mMのEDTAを含むPBS においてインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。細胞をまず、mAbs又はIg融合タンパク質と共に、10％FBS を含むDMEMにおいて10μｇ／mlで４℃で１〜２時間インキュベートした。
【０１４４】
次に、細胞を洗浄し、そしてFITC−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン又はFITC−接合ヤギ抗−ヒトIgＣγ血清（両者とも、Tago, Burlingam, CA からである）と共に、４℃でさらに0.5 〜２時間インキュベートした。両mAbs及びIg融合タンパク質の結合が同じ実験において測定される場合、FITC−接合抗−マウス及び抗−ヒト第２段階試薬を、使用の前、一緒に混合した。合計10,000個の細胞に基づく螢光を次に、FACS（Ｒ）により分析した。
【０１４５】
末梢血液リンパ球分離及び刺激
末梢血液リンパ球（PBLs）を、リンパ球分離媒体（Litton Bionetics, Kensington, MD) を通しての遠心分離により単離した。アロ反応性Ｔ細胞を、一次混合リンパ球反応（MLR)におけるPBL の刺激により単離した。PBL を、106 ／mlの照射された（5000ラド）T51 LCL で培養した。EBV-形質転換リンパ球芽細胞系（LCL)，PM（Bristol-Myers Squibb Co.) 及びT51 (Bristol-Myers Squibb Co.)を、10％FBS により補充されたRPMIに維持した。
【０１４６】
６日後、アロ反応性“幼芽”細胞を凍結保存した。二次MLR を、mAbs及びIg融合タンパク質の存在及び不在下で、新鮮な照射T51 LCL と共に融解されたアロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細胞を、10％FBS を含むRPMIを有する96ウェル平底プレート（0.2 mlの体積、４×104 個のアロ反応性幼芽及び１×104 個の照射T51 LCL 細胞／ウェル）において培養した。四重培養物の細胞増殖を、２〜３日の培養の最後の６時間、〔 3Ｈ〕−チミジンの摂取により測定した。
【０１４７】
PHA-活性化されたＴ細胞を、１μｇ／mlのPHA (Wellcome, Charlotte, NC) と共にPBL を５日間、培養することによって、及びPHA を欠く培地において１日間、培養することによって調製した。生存細胞を、使用の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集めた。細胞をmAbsにより刺激し、又はCHO 細胞により37℃で４〜６時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により集め、そしてRNA を調製するために使用した。
【０１４８】
CD４+ Ｔ細胞を、健康なドナーからのPBL を、羊赤血球ロゼット技法を用いてＴ及び非−Ｔ細胞に分離し、そしてさらに、Damle など., J. Immunol. 139 : 1501 (1987)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにCD４+ 細胞をパンニングすることによりＴ細胞を分離することによってPBLsから単離した。Ｂ細胞をまた、抗−CD19mAb 4G9 を用いて、Wysocki and Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75 : 2844 (1978)(引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにパンニングすることにより末梢血液から精製した。
【０１４９】
Ｔh −誘発されたIg生成を測定するために、106 個のCD４+ Ｔ細胞を、10％のFBS を含むRPMI１mlにおいて106 個のCD19+ Ｂ細胞と共に混合した。37℃での６日間の培養に続いて、ヒトIgM の生成を、Volkman など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 2528 (1981)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにして固相ELISA を用いて培養上清液において測定した。
【０１５０】
簡単に言及すれば、96−ウェル平底マイクロタイターELISA プレート（Corning, Corning, NY) を、10μｇ／mlのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG 又はIgM 抗体（Tago, Burlingame, CA) を含む200 μｌ／ウェルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6)により被覆し、４℃で一晩インキュベートし、そして次に、PBS により洗浄し、そしてウェルをさらに、PBS 中、２％BSA (BSA-PBS) によりブロックした。
【０１５１】
アッセイされるべきサンプルを、それらのウェルに適切な希釈度で添加し、そして200 μｌ／ウェルの１：1000希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトIgG 又はIgM 抗体（Tago）のホスラディシュ  ペルオキシダーゼ（HRP)−接合Ｆ（ab′）2 画分と共にインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして100 μｌ／ウェルのｏ−フェニレンジアミン（Signa Chemical Co., St. Louis, MO)溶液（pH５のクエン酸−リン酸緩衝液１ml当たり0.6 ng及び0.045 ％の過酸化水素）を添加した。色の進行を、２Ｎの硫酸により止めた。
【０１５２】
490 nmでの吸光度を、自動ELISA プレートリーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは３通り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液におけるIgの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上清液サンプルにより同時に行なわれた既知のIgG 又はIgM 標準により得られた値と比較した。データを、三重反復又は四重反復培養物のIg±SEM のng／mlとして表わされる。
【０１５３】
免疫沈殿分析及びSDS PAGE
細胞を、125Iにより表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだねた。簡単に言及すれば、PHA-活性化されたＴ細胞を、Vitetta など., J. Exp. Med. 134 : 242 (1971)（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるように、ラクトペルオキシターゼ及びH2O2を用いて125Iにより表面ラベル化した。
SDS-PAGEクロマトグラフィー処理を、５％のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリルアミドグラジエントゲル上で行なった。ゲルをクーマシーブルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてＸ線フィルム（Kodak XAR-5)に露光せしめた。
【０１５４】
結合アッセイ
B7Igを、約２×106 cpm/ｐモルの比活性に125Iによりラベルした。96のウェルのプラスチック皿を、CTLA４Ig（10mMのトリス（pH８）0.05mlの体積において0.5 μｇ）を含む溶液により16〜24時間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、125I B7Ig （約５×105 cpm)を含む溶液（0.09ml）の添加の前、結合緩衝液（50mMのBES (Sigma Chemical Co),  pH6.8, 0.1％BAS 及び10％FCS を含むDMEM) によりブロックした。23℃で２〜３時間のインキュベーションに続いて、ウェルを結合緩衝液により１度洗浄し、そしてPBS により４度洗浄した。次に、結合された放射能を0.5 ＮのNaOHの添加により溶解し、そしてｒ計数により定量化した。
【０１５５】
B7Igへの結合
完全なヒトCTLA４DNA 遺伝子をコードするOMCTLA４構成体の官能多活性が、図４に示される実験に示される。COS 細胞を、上記のようにして発現プラスミドCD７，OMCD28及びOMCTLA４によりトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を集め、そして培地のみ（添加なし）と共に又はmAbs 9.3，B7Ig，CD５Ig又はG3−７と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、FITC−接合ヤギ抗−マウスIg及びFITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第２段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のようにしてFACS（Ｒ）分析を用いて測定した。
【０１５６】
図４に示されるように、mAb 9.3 は、CD28−トランスフェクトされたCOS 細胞に結合したが、しかしCTLA４−トランスフェクトされる細胞には結合しなかった。対照的に、B7Ig融合タンパク質（但し、対照のCD５Ig融合タンパク質ではない）は、CD28−及びCTLA４−トランスフェクトされた細胞の両者に結合した。CD７−トランスフェクトされたCOS 細胞は、mAb 9.3 にも融合タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、CD28及びCTLA４の両者がＢ細胞活性化抗原、B7を結合することを示唆する。さらに、mAb 9.3 は検出できるほどは、CTLA４を結合しなかった。
【０１５７】
B7陽性CHO 細胞上へのCTLA４Igの結合
CTLA４Ig及びB7の結合をさらに特徴づけるために、B7+ CHO 細胞及びリンパ芽球細胞系（PM LCL) 上への精製されたCTLA４Igの結合活性を、図５に示される実験において測定した。増幅された、トランスフェクトされたCHO 細胞系及びPM LCLを、培地のみ（添加なし）又はCD５Ig，CD28Ig又はCTLA４Igの同濃度のヒトIgＣγ１−含有タンパク質（10μｇ／ml）と共にインキュベートした。結合性を、FITC−接合ヤギ抗−ヒトIg第二段階試薬の添加に続いて、FACS（Ｒ）により検出した。合計10,000個の染色された細胞を、FACS（Ｒ）により分析した。
【０１５８】
図５に示されるように、CD28IgはB7+ CHO 細胞に結合するが、しかしPM LCLには結合せず、すなわち細胞系は比較的低レベルのB7抗原を発現する（Linsley など.,前記，1990）。CTLA４IgはCD28Igよりも両細胞系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴って結合することを示唆する。CD28IgもCTLA４Igも、CD28+ CHO 細胞に結合しなかった。
【０１５９】
CTLA４Ig及びB7Igの結合の親和性
次に、CTLA４IgとB7Igとの間の相互作用の見掛け親和性を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。96−ウェルプラスチック皿を、上記のようにしてCTLA４Igにより被覆した。B7Igを125I（５×105 cpm,  ２×106 cpm/ｐモル）により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度（図６を参照のこと）のラベルされていないキメラmAb L6,  mAb 9.3, mAb BB−１又はB7Igの存在下で、４nMの濃度にした。
【０１６０】
プレート−結合放射能を測定し、そして競争体なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分率として表わされた（28,300cpm)。個々の点は二重反復測定の平均を示し；反復試験は一般的に平均から20％以下変化した。濃度を、mAb に関して結合部位当たり75,000のMrに基づいて及びB7Igに関して結合部位当たり51,000のMrに基づいて計算した。
【０１６１】
図６に示されるように、mAb BB−１及びラベルされていないB7Igが125I−B7Ig結合のために有意に競争した（それぞれ約22nM及び約175 nMで最大の半分の効果）。キメラmAb L6もmAb 9.3 も、試験された濃度で効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用されるmAb の濃度は、固定されたCD28Ig又は90％以上、CD28を発現する細胞表面への125I−B7Igの結合を阻害するのに十分であった。
【０１６２】
図６からの競争データがスキャッチャート  プロットでプロットされる場合、約12nMの解離定数Kdが、固定されたCTLA４Igへの125I−B7の結合性について計算した（図７）。この値は、125I−B7IgとCD28との間で前で測定されたKdよりも約20倍低く（約200 nM）（Linsley など, (1991), 前記）、これは、CTLA４がCD28レセプターよりもB7抗原のためにより高い親和性レセプターであることを示唆する。
【０１６３】
CTLA４Igを結合したリンパ芽球細胞上の分子を同定するために（図７）、125I−表面ラベルされた細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた（図８）。B7+ CHO 及びPM LCL細胞を125Iにより表面ラベルし、そして上記のようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。約1.5 ×107 cpm を有する、0.1 mlの体積での抽出物のアリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ２μｇのCD28Ig，CTLA４Ig又はCD５Igを伴って、上記のようにして免疫沈殿分析にゆだねた。
【０１６４】
次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件下でSDS-PAGE (10〜20％のアクリルアミドグラジエント）により分析した。次に、ゲルを乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィーにゆだねた。図８の左側のパネルは、１日間の暴露の後に得られたオートラジオグラムを示す。図８の右側のパネルは、10日間の暴露の後の同じゲルのオートラジオグラムを示す。図８の中央のパネルにおけるオートラジオグラムはまた、10日間、暴露された。分子量標準の位置はまた、この図に示される。
【０１６５】
図８により示されるように、分散的に移動する（約50,000〜75,000；約60,000での中央）、放射性ラベルされたタンパク質を、CTLA４Igにより（但し、CD28Ig又はCD５Igによってではない）免疫沈殿せしめた。この分子は、CTLA４Igにより、B7+ CHO 細胞から免疫沈殿されたB7と共に同時移動し、そしてCD28Igより免疫沈殿されたB7と共には、より一層弱く同時移動した。これらの発見は、CTLA４Igが、B7抗原に大きさが類似する、リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示唆する。
【０１６６】
CTLA４Igによるインビトロでの免疫応答の阻害
増殖の阻害
これまでの研究は、抗−CD28 mAb, 9.3 及び抗−B7mAb,  BB−１が、アロ抗原を表わすＢ細胞により、アロ抗原特異的Ｔn の増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害することを示している（Damle,など., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 : 5096 (1981)；Lesslauer など., Eur. J. Immunol. 16 : 1289 (1986)) 。CTLA４は本明細書に示されるようにB7抗原のために高い親和性レセプターであるので、可溶性CTLA４Igは、それらの応答を阻害するその能力について試験された。Ｔ細胞増殖に対するCTLA４Igの効果は、図９に示される実験で試験された。
【０１６７】
一次混合リンパ球反応（MLR)幼若を、ネズミ mAb 9.3 Fabフラグメント、又はB7Ig，CD28IgもしくはCTLA４Ig免疫グロブリンＣγ融合タンパク質の濃縮物の不在又は存在下で、照射されたT51 リンパ芽球細胞（IC）により刺激した。細胞増殖を、４日後、〔 3Ｈ〕−チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物による組込みの百分率として表わす、（21,000cpm)。図９は、４重反復測定の平均を表わす（SEM ≦10％）。
【０１６８】
図９に示されるように、CTLA４Igは、約30ng／ml（約0.8 nM）で、１／２最大応答を伴って最大90％以上、投与量−依存性態様でMLR 反応を阻害した。完全なmAb 9.3 よりもより可能性あるMLR のインヒビターであることがこれまで示されている、mAb 9.3 のFab フラグメント（Damle など., J. Immunol. 140 : 1753 〜1761 (1988))はまた、MLR を阻害したが、しかしその濃度は、より高い濃度（約800 ng／ml又は１／２最大応答のためには約30nM）であった。
B7Ig及びCD28Igは、高濃度でさえ、MLR を有意に阻害しなかった。他の実験においては、CTLA４Igと共にB7Igの添加は、CTLA４IgによるMLR の阻害を一部克服し、この事は、その阻害がB7抗原との特異的な相互作用によることを示唆する。
【０１６９】
免疫グロブリン分泌の阻害
ヘルパーＴ細胞（Ｔn ）−誘発性免疫グロブリン分泌に対するCTLA４Igの効果をまた試験した（図10）。CD４+ Ｔ細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在又は不在下で、同種CD19+ Ｂ細胞と共に混合した。ネズミmAbs OKT8, 9.3及びBB−１を20μｇ／mlで添加し、そしてIg融合タンパク質を10μｇ／mlで添加した。６日間の培養の後、培養上清液におけるヒトIgM の濃度（SEM ＜５％）を、上記のようにして酵素イムノアッセイ（ELISA)により測定した。CD４+ Ｔ細胞の不在下で培養されたＢ細胞によるIgM 生成は11ng／mlであった。
【０１７０】
図10に示されるように、CD４+ Ｔ細胞は同種CD19+ Ｂ細胞によるIgM 生成を刺激した（CD４+ Ｔ細胞の不在下で、IgM レベルは93％減じられた）。mAbs 9.3及びBB−１は、Ｔh −誘発されたIgM 生成を有意に阻害した（それぞれ63％及び65％の阻害率）。CTLA４Igは、それらのmAbsよりもインヒビターとしてより効果的であった（89％の阻害率）。
【０１７１】
対照分子、mAb OKT8及びCD５Igによる阻害は、より低かった（30％以下の阻害率）。それらの分子は、スタフィロコーカル・アウレウス（Staphylococcal aureus)エンテロトキシンＢの存在下で測定されるIg生成を有意に阻害しなかった。類似する結果が、他のドナーに由来するＢ細胞及びCD４+ Ｔ細胞により得られた。それらの結果は、CTLA４Igによる阻害が特異的であることを示す。
【０１７２】
上記データはまた、CTLA４及びCD28レセプターが機能的及び構造的に関連していることを示す。CD28のように、CTLA４はまた、Ｂ細胞活性化抗原、B7のためのレセプターでもある。CTLA４Igは、約12nMの親和性定数Kdを伴って125I−B7を結合し、その値は、CD28とB7Igとの間の親和性よりも20倍高い（約200 nM）。従って、CTLA４及びCD28は、同じリガンド、すなわちB7抗原のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとして考えられる。
【０１７３】
CD28とB7との間の見掛け親和性は、ネズミＴ細胞ハイブリドーマのＴ細胞レセプターへの可溶性アロ抗原の結合について報告される親和性に類似し（約100 nM；Schnekなど.,Cell 56 : 47 (1989))、そしてCD２とLFA3との間（Recny など., J. Biol. Chem. 265 : 8542 (1990))又はCD４とMHC クラスII分子との間（Clayton など.,Nature 339 : 548 (1989))の相互作用よりも高い親和性である。
【０１７４】
CTLA４とB7との間の見掛け親和性定数Kdはさらに大きく、そして好都合には、より高い親和性のmAbsに匹適する（Ｋ2 ２−10,000nM；Alzariなど.,Ann. Rev. Immuno. 6 : 555 (1988)) CTLA４とB7との間のKdは、インテグリンレセプター及びそれらのリガンドのKdに類似するか又はそれの値よりも大きい（10〜2000nM：Hautanenなど.,J. Biol. Chem. 264 : 1437 〜1442 (1989) ; Di Minnoなど.,Blood 61 : 140〜148 (1983) ; Thiagarajan and Kelley, J. Biol. Chem. 263 : 3035〜3038 (1988))。
【０１７５】
従って、CTLA４とB7との間の相互作用の親和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される中で最高である。
それらの結果は、CTLA４転写体の官能的タンパク質生成物の最初の発現を示す。CTLA４Ig、すなわちIgＣγ１ドメインに融合されるCTLA４の細胞外ドメインを含む融合構成体は、約50,000サブユニットのMrのジスルフィド結合ダイマーを形成する（図１）。鎖間ジスルフィドはこの融合のIg部分において形成することが予期されないので、CTLA４からのシステインはジスルフィト結合形成に包含される。同種CD28Ig融合タンパク質（Linsley など, 前記，1991）はまた鎖間ジスルフィド結合を含む。
【０１７６】
それらの結果は、CD28のようにCTLA４レセプター（Hansenなど., Immunogenetics 10 : 247〜260 (1980)) がジスルフィド結合ホモダイマーとしてＴ細胞表面上に存在することを示唆する。CD28及びCTLA４は高い相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異なっている。なぜならば抗−CD28mAb, 9.3はCTLA４を認識しないからである（図４及び５）。
【０１７７】
CTLA４が、CD28に類似するシグナル化路によりＴ細胞を活性化できるかどうかについては知られていない。ネズミ及びヒトCTLA４の細胞質ドメインは同一であり（Dariavach., 前記 1988)、これは、この領域が重要な官能性質を有することを示唆する。CD28及びCTLA４の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す。但し、これが２つの分子に類似するシグナル性質を付与するために十分であるかいづれかについては不明である。
【０１７８】
CTLA４IgはＴ細胞及びＢ細胞協力を必要とするインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビターである（図９及び10）。前記研究と共に、これらの発現は、Ｔ及びＢリンパ球応答を調節することにおいて、B7抗原とそのカウンターレセプター、CD28及び／又はCTLA４との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。CTLA４Igは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来の調査のために有用な試薬であるべきである。
【０１７９】
CTLA４Igは、mAb BB−１又はmAb 9.3 のいづれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるインヒビターである（図９及び10）。mAb BB−１よりもよりCTLA４Igの高い能力は、ほとんどそれらの分子間でのB7のための親和性の差異によると思われる（図６）。CTLA４Igはまた、mAb 9.3 よりも可能性がある。なぜならば、たぶん、mAb とは異なって、それはその阻害効果を妨害するために、Ｔ細胞増殖に対して直接的な刺激効果を有さないからである（Juneなど.,Immunology Today 11 : 211 (1989)) 。インビトロでのCTLA４Igの免疫抑制効果は、未来の研究が、異常なＴ細胞活性化又はIg生成を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可能な治療効果を保証されることを示唆する。
【０１８０】
例  ５．
生後６〜８週間の雌のBALB／c (H-2d ) 及び C57BL／6 (H-2d ) マウスを、The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) から得た。
記述されたとおり、コラゲナーゼ消化の後ヒト膵島細胞を精製した（C. Ricordi et al. 移植  52：519 (1991)；A. G. Tzakis et al. Lancet 336：402 (1990)；C. Ricordi, P. E. Lacy, E. H. Finke, B. J. Olack, D. W. Scharp, 糖尿病  37：413 (1988)) 。
【０１８１】
移植の３〜５日前にストレプトゾシン（体重１kgにつき175 mg) での処置を受け280 mg／dl以上 (大部分が300 mg／ml以上) の非絶食血漿グルコースレベルを示すB6又はＢ10マウスを被移植動物として用いた。
各々のマウスは、左副腎の下に直径150 μｍの約800 個の新鮮なヒト膵島を受けた (D. Faustman and C. Coe, Science 252 ：1700 (1991) ；Y. J. Zeng et al. 移植  53：277 (1992)) 。処置は、移植直後に開始された。
【０１８２】
対照動物を、移植直後14日間にわたり隔日に50μｇの割合で PBS (実線) 又はL6 (点線) で処置した（図11) 。３日連続してグルコースレベルが250 mg／dl以上であった時点で、膵島移植片は拒絶されたとみなされた。PBS(ｎ＝14) 及びL6 (ｎ＝８）での処置を受けた動物は、それぞれ5.6 日及び6.4 日の平均移植片生残期間を有していた。
移植直後連続14日間、動物を10μｇのCTLA４Igで処置した（ｎ＝７)(図12) 。７匹のうち３匹の動物がその移植片を80日以上維持した。残りの４匹の動物は12.75 日という平均移植片生残期間を有していた。
【０１８３】
ヒト膵島移植直後14日間隔日に50μｇのCTLA４Igで動物を処置した（図13) 。この用量での処置を受けた全ての動物（ｎ＝12) が、分析中全体を通して移植片を維持した (図13) 。移植片の機能を評価するため、移植後21日目及び29日目に、選択されたマウスを腎摘出した (図13) 。
ヒト膵島細胞の移植を受けた腎臓に対して組織検査を行なった（図14) 。スライドを無差別に分析した。
移植後29日目のヒト膵島移植を受けた対照マウスのヘマトキシリン及びエオシン染色は、大きいリンパ球浸潤を示した (図14のＡ）。インシュリンについて染色された同じ組織は、検出可能なインシュリン産生を全く示さなかった（図14のＢ）。
【０１８４】
移植後21日目のCTLA４Igでの処置を受けたマウスからの組織の組織学的検査は、きわめてわずかなリンパ球しか移植された組織に浸潤していない状態の副腎下の無傷の膵島を示した (図14のＣ）。組織を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。インシュリンについて染色されたCTLA４Ig−処理されたマウスからの同じ組織は、移植された膵島によるインシュリンの産生を示した（図14のＤ）。後の時点で検査された移植片組織内でも類似の結果が観察された。上部、中央及び下部の矢印の頭は、副腎、膵島移植片及び腎臓実質をそれぞれ同定している。
【０１８５】
組織病理学検定においては、全ての組織は10％の緩衝ホルマリン内で固定され処理され、５μｍの切片をヘマトキシリン及びエオシンのいずれかで、又はアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法を用いてインシュリンについて、染色した (S. M. Hsu, L. Raine, H. Fanger, J. Histochem, Cytochem, 29：577 (1981)) 。倍率は×122 であった。
【０１８６】
図15では、図11について上述したように、ストレプトゾトシン処理を受けた動物に移植を施した。14日間隔日に50μｇの用量でヒトB7に対する MAb (実線) 又は PBS (点線) のいずれかでマウスを処置した (図15) 。(PBSで処置された) 対照動物（ｎ＝３）は3.5 日という平均移植片生残期間を有し、一方、抗B7処置を受けた動物（ｎ＝５）は、９日乃至50日以上移植片を維持した (図15) 。
【０１８７】
図16において、血糖正常で、CTLA４Ig処理され移植を受けたマウス (点線) を、移植後44日目に腎摘出し、直ちに1000個の第１の当事者であるドナーの膵島 (点線、黒丸) 又は1000個の第２の当事者の膵島 (点線、白丸) を用いて残存する副腎の下に再移植した。
最初の移植の時点で凍結されていたこれらの膵島を解凍し、膵島の機能を確認するため移植より前３日間にわたり培養した。ストレプトゾトシンで処置され280 mg／dlという非絶食グルコースレベルを示したＢ10マウスを対照として用いた( 実線)(図16) 。移植後はいかなる処置も施さなかった。
【０１８８】
対照動物は、移植後４日目までに第１の当事者（実線、黒丸）及び第２の当事者（実線、白丸）の膵島移植片の両方を拒絶した（図14) 。第２の当事者の膵島で再移植を受けたCTLA４Ig処理されたマウスは、4.5 日の平均移植片生残期間を有していたのに対し、第１の当事者であるドナーの膵島で再移植された動物は、、分析中ずっと (80日以上) 移植片を維持した (図16) 。
【０１８９】
CTLA４Igは、マウス体内でのヒト膵島移植片の生残期間をドナー特異的な形で著しく延長し、かくして免疫抑制に対する１つのアプローチを提供している。
マウスの膵島のＢ dell 機能を除去するため、 C57BL／6 (B6)又は C57BL／10 (B10)マウスをストレプトゾトシンで処置した。副腎下で糖尿病の動物に対して移植を施し、外科手術後直ちに処置を開始した。血中グルコース濃度の分析により膵島移植片の生残を監視した。
【０１９０】
リン酸緩衝溶液 (PBS)（ｎ＝14) 又はL6 (ヒトIgG1キメラMAb ；ｎ＝８）のいずれかで処理された移植を受けた対照動物は、それぞれ5.6 日及び6.4 日の平均移植片生残期間を有していた (図11) 。
これとは対照的に、CTLA４Igでの処置を受けた動物 (14日間１日14μｇ) における膵島拒絶は遅らされ、７匹の動物のうち５匹は平均移植片生残期間の穏やかな延長を示し (12.75 日) 、一方残りの３匹の動物は80日以上の間正常なグルコースレベルを維持した (図12) 。活発な細胞拒絶の証拠は全く観察されなかったため、グルコース濃度におけるこの増大は膵島消耗の結果でありうる。
【０１９１】
長期の膵島移植片を維持した３匹のマウスにおいて、移植から21日目前後でのグルコース濃度の過度的な増大は、療法後のCTLA４Igの浄化値の薬物速度論と一貫した自己制限的拒絶の発現を表わしていた可能性がある（P. S. Linsley et al., Science 257 ：792 (1992)) 。
その後の実験においては、約14日間隔日で動物一匹あたりのCTLA４Ig用量は50μｇまで増大された。この処置の結果、100 ％の動物は拒絶発症の兆候を全く示さず実験全体を通して正常な膵島機能を維持することになった (図13) 。
【０１９２】
インシュリン産生が未変性マウス膵臓ではなく移植された膵島に源を発していたことを確認するため、我々は、膵島移植片を除去するべく21日目及び29日目に、選択された動物を腎摘出した (図13) 。これらの動物において、グルコース濃度は、24時間以内で350 mg／dl以上まで増大し、このことは、膵島異種移植片が正常なグルコースレベルを維持する原因であることを示していた。CD28−B7相互作用の遮断は、異種間膵島移植片拒絶を阻害すると思われる。
【０１９３】
可溶性レセプターすなわちCTLA４Ig融合タンパク質を用いた処理の効果は、Fc結合 (L6は移植片拒絶をひき起こさなかった) 又はインビボでのＴ細胞又はＢ細胞機能に対する全体的効果の結果ではなかった。
対照 (PBS 処置された）マウス及びCTLA４Ig処置されたマウスからの膵島異種移植片の経時的分析を行なった（図14) 。対照動物からの膵島組織は、移植片内への著しいリンパ球浸潤物を伴い、膵島をほとんど残さない状態で、免疫拒絶の証拠を示した (図14のＡ）。
【０１９４】
免疫組織学的染色は、インシュリン陽性細胞が稀にしか存在せず、ソマトスタチン陽性細胞が全く存在しないことを示した（図14のＢ）。これとは対照的に、CTLA４Ig処置されたマウスからの移植片組織には、リンパ球浸潤物が全く無かった（図14のＣ）。
移植片は、数多くの膵島が見える状態で無傷であった。さらに、ヒト膵島組織内に見られるＢ細胞はヒトインシュリン（図14のＤ）及びソマトスタチンを産生した。
【０１９５】
本研究において用いられたヒトCTLA４Igは、マウス及びヒトの両方のB7と反応する。異種間移植モデルの１つの利点は、マウスB7と反応しないヒトB7に対するMAb の利用可能性である（T. Yokochi, R. D. Holly, E. A. Clark, J. Immunol. 128 ：823 (1982)) 。かくしてヒトB7を支持する抗原提供細胞（APCs) の役目を直接検討することができる。
記述通りマウスを移植し、次に移植後14日間隔日にヒトB7に対するMAb 50μｇを用いて処置した。この処置は、対照マウスに対するものに比べて処置を受けたマウスにおける移植片生残期間を延長した (９日から50日以上にまで)(図15) 。抗B7MAb はCTLA４Igと同じように有効に拒絶を遮断することができない。
【０１９６】
CTLA４Ig治療は、大部分のマウスにおける移植片の受容という結果をもたらした。しかしながら、動物は寛容でない可能性がある。過度的な免疫抑制は、移植片適合のため常時膵島移植片受容を導く可能性がある (APC 機能の喪失の結果としての免疫原性の喪失) (L. Hao, Y. Wang, R. G. Gill, K. J. Lafferty, J. Immunol. 139 ：4022 (1987) ；K. J. Lafferty, S. J. Prowse, M. Simeonovic, Annu. Rev. Immunol.１：143 (1983)) 。
【０１９７】
これらの可能性の区別を行なうため、我々は、選択された異種移植を受けたCTLA４Ig処置済みマウスを（40日目に) 腎摘出し、当初のドナー膵島 (第１の当事者) 又は無関係の第２の当事者のヒト膵島のいずれかを用いて残りの副腎の下でそれらに再移植した (図16) 。
【０１９８】
ストレプトゾトシンの処置を受けた、膵島移植片を一度も受けたことのない対照動物にも、第１の当事者又は第２の当事者のいずれかの膵島で移植を施した。移植後は、いかなる処置もとらなかった。対照動物は、４日目までに第１及び第２の当事者の膵島を拒絶した。第２の当事者の膵島を受けたCTLA４Ig処置済みの動物は、これらの膵島を５日目までに拒絶し、一方第１の当事者であるドナーの膵島を受けた動物は80日以上移植片を維持した (図16) 。
【０１９９】
これらの結果は、CTLA４Ig処置が結果として異種膵島に対するドナー特異的不応答の延長をもたらしたということを示唆している。ヒト膵島ドナー間の差異を識別するマウス免疫応答の能力は、ヒト膵島細胞上で発現された多形性MHC 産物の直接的認識を支援する。
【０２００】
例  ６．
生後６〜８週目の雌のBALB／c (H-2d ) 及び C57BL／6 (H-2d ) マウスを、Jackson Laboratory (BarHarbor, ME)から入手した。
モノクローナル抗体11B11 は、ラットIgG1抗マウスIL−４である（Ohara, J.,及びW. E. Paul, 1985, Ｂ細胞刺激因子−１に対するモノクローナル抗体の産生とその分子特徴づけ。Nature 315：333) (Verax (Lebanon, NH))。
【０２０１】
BALB／c マウス（１グループにつき５匹）を108 のSRBC単独で又は、200 μｇのキメリックL6 mAb又はヒトCTLA４Ig融合タンパク質と合わせて、静脈内にて免疫化させた。指示されたグループに、５mg／mlの割合でラット抗マウスIL−４mAb11B11又はラット免疫グロブリンのいずれかを２mls 腹腔内注射することによってSRBCの注入に先立ち２時間処置を施した。キメリックL6 mAb又はCTLA４Igでの処置は、さらに４日間毎日繰返した。
【０２０２】
46日目に全ての動物にSRBC (図17) 又は KLH (図18) の静脈内注射を施した。特定的に言うと、図15では、黒丸は、０日目と46日目にSRBCのみを投与したマウスを表わしている。白丸は46日目にSRBCのみ投与したマウスを表わしている。図17中に表わされた残りのマウスは、さらに46日目にSRBCの投与を受けた。これとは対照的に、図18では、マウスは、46日目のみに異なる免疫原KLH の投与を受けた。
【０２０３】
SRBC又はKLH に向けられた抗体をもつものとして測定されるマウスの血清濃度は、記述どおり (Linsley et al., Science 1992) ELISA により決定された。
バックグラウンドの５倍のＡ450 を与える希釈液として、血清抗体力価を計算した。図15からの血清抗体力価値は、１グループにつき５匹のマウスからのプールした血清から決定されており、一方図16からの血清抗体力価値は５つの個々の血清の平均力価を表わしている。矢印は、46日目におけるSRBC又はKLH 注射を表わす。
【０２０４】
図17及び図18は、CTLA４Igと抗−IL４の両方を同時に注射したマウスにおける免疫応答（白い三角形）が抗原特異的な形で抑制されることを示している。
図17は、CTLA４Ig及び抗−IL４の同時注射を受け０日目及び46日目にSRBCの注射を受けたマウスにおいて血清抗体力価の上昇が全く存在しない (すなわち、一次的又は二次的免疫応答が全くない) ことを示している。CTLA４Ig及び抗−IL4 の組合せは、一次及び二次免疫応答を抑制し、SRBCに対する長く持続する免疫学的不応答を誘導する。
【０２０５】
さらに、図17は、CTLA４Ig及び対照ラットIgを同時に注射されたマウスにおいて一次免疫応答が全く存在しないことを示している (Cappel, Organontecknika, Palo Alto, CA) 。しかしながら、これらのマウスは、46日目にSRBCの注射後に二次免疫応答を示している (黒丸、図17) 。
【０２０６】
図18は、マウスにおける46日目のCTLA４Ig及び抗−IL４とそれに続く異なる免疫原KLH の投与がマウス体内のKLH に対する一次免疫応答を抑制しないことを示している。その代り、これらのマウスはKLH に対する一次免疫応答を示した (白い三角形、図18) 。かくしてCTLA４Ig及び抗−IL4 で処置されたマウスは、体内に投与された抗原に応じてきわめて特異的な免疫応答を示した。
【０２０７】
例  ７．
部位特異的な相同性突然変異誘発により、我々は、B7−１に対するその活性度の高い結合にとって必要であるCTLA４Ig内の領域を同定した。以下に記すのは、B7を結合する可溶性CTLA４／CD28ハイブリッド融合タンパク質の作り方の説明である。
【０２０８】
材料と方法
モノクローナル抗体（mAbs）。前述のとおり、CTLA４に特異的なマウスのmAb を調製し特徴づけした（Linsley et al.，J. Ex. Med., (1992) 176 ：1595-1604)。抗体9.3 （抗−CD28）については以前に記述されてきた(Hansen et al., Immunogenetics 10 ：247-260 (1980)) 。
【０２０９】
細胞培養
安定した形でトランスフェクションを受けたB7−１陽性 CHO細胞の調製については、以前に記述されてきた（Linsley et al.，J. Exp. Med.  中、173 ：721 〜730(1991) ；P, S, Linsley et al.，J. Exp. Med. 174：561 (1991)) 。
10％のウシ胎児血清（FBS)、0.2 mMのブロリン及び１μＭのメトトレキセートで補足されたDMEM中に細胞を維持した。 COS細胞を、10％のFBS で補足されたDMEM内で成長させた。CTLA４Igを前述のとおり CHO細胞内で調製した（例２）。
【０２１０】
CTLA４Ig及びCD28Ig部位特異的突然変異体発現プラスミド
部位特異的突然変異誘発は、CTLA４の細胞外ドメインがヒト IgG重鎖のヒンジ部及び定常部に遺伝子的に融合されている（例２）CTLA４の可溶性キメラ形（CTLA４Ig）をコードするベクターに対して行なわれた。CTLA４Ig部位と部位特異的突然変異体は、重複するオリゴヌクレオチドプライマ内の望まれる突然変異をコードし、鋳型としてCTLA４Igプラスミド構成体を用いてPCR (Ho et al.，1989, 前出）により突然変異体を生成することによって調製された。
推定上の CDR３様ドメイン（図19〜21及び26）の一部を成すきわめて保存度の高いヘキサペプチド98MYPPPY103 の中のアラニンに対する置換をコードする６つの突然変異体を調製した(Ho. et al. ，1989, 前出）。これらの突然変異体については、表IIに記述されている。
【０２１１】
さらに、鋳型としてCD28Igを用いるCD28Ig 99MYPPPY104ヘキサペプチドからの残基P103A 及びY104A をコードする２つの突然変異体（それぞれMYPPAY及びMYPPPA) も又同じ方法で調製した。これらの突然変異体についても表IIに記述されている。
PCR反応のために必要とされるものの、突然変異を導入するためには必要とされないプライマ−には、（１)  CDM８スタッファ（中火部断片）領域の５′未満でHind III制限部位の上流の相補的配列をコードする CDM８順方向（ CDM８FP) プライマ−及び（２） CDM８スタッファ領域の３′未満で XbaＩ部位の下流の相補的配列をコードする逆方向プライマ(CDM８RP）が含まれていた。
【０２１２】
これらのプライマ−は、以下の配列をコードした：
CDM８FP：５′−AATACGACTCACTATAGG
CDM８RP：５′−CACCACACTGTATTAACC
PCR条件は、94℃で６分とそれに続く94℃で１分、55℃で２分及び72℃で３分の25サイクルから成っていた。売り主（Perkin Elmer Cetus, Emeryville，CA) により提案されている通りに、Taq ポリメラーゼ及び反応条件を使用した。 PCR産物をHind III及び XbaＩで消化し、Hind III／ XbaＩ−切断された CDM８発現ベクターに連結させた。
【０２１３】
望まれる突然変異が挿入されたことを確認し、二次的突然変異の不在を確認するため、製造業者の推奨事項に従ってSequenase 試薬を用いて(United States Biochemical Corp., Cleveland, OH)ジデオキシ鎖終結／拡張反応により、各々のCTLA４Ig突然変異体融合タンパク質（可溶性CTLA４突然変異体融合タンパク質の一例）を配列決定した。
COS細胞の中にプラスミドをトランスフェクションし（Aruffo et al.,Cell 61 ：1303 (1990))、結果として得られるIg突然変異体融合タンパク質のための供給源として、順化培地を使用した。
【０２１４】
CTLA４／CD28Igハイブリッド発現プラスミド。構成体HS２，HS４，HS４−Ａ，HS４−Ｂ及びHS５をコードするCTLA４／CD28Igハイブリッド・スキャン・プラスミド（図23及び表Ｉ）を、CD28から等価領域を同時に欠失させながらCD28Ig内にCTLA４配列を導入するように設計された重複するオリゴヌクレオチドプライマ−を用いて PCRにより調製した。上述ものと同じ CDM８順方向及び逆方向 PCRプライマを同様に使用した。
以下に示すのは、作製されたCTLA４／CD28ハイブリッド融合タンパク質のリストである。
【０２１５】
呼称          クレーム枠        修正
────────────────────────────
HS１          CTLA４            CD28の１〜24
CD28の93〜125 
HS２          CD28              CTLA４の１〜22
CTLA４の96〜125 
HS３          CTLA４            CD28の96〜125 
HS４          CD28              CTLA４の96〜123 
HS４Ａ        CD28              CTLA４の96〜113 
HS４Ｂ        CD28              CTLA４の114 〜123 
HS５          CD28              CTLA４の25〜32
HS６          CTLA４            CD28の25〜32
HS７          CD28              CTLA４の96〜123 
CTLA４の25〜32
HS８          CD28              CTLA４の25〜32
CTLA４の96〜113 
HS９          CD28              CTLA４の25〜32
CTLA４の114 〜123 
HS10          CD28              CTLA４の96〜123 
CTLA４の51〜58
HS11          CD28              CTLA４の25〜32
CTLA４の51〜58
CTLA４の96〜123 
HS12          CD28              CTLA４の51〜58
CTLA４の96〜113 
HS13          CD28              CTLA４の25〜32
CTLA４の51〜58
CTLA４の96〜113 
HS14          CD28              CTLA４の51〜58
【０２１６】
可溶性キメラを作るため、ヒト IgG１のヒンジ部及び定常部をコードするcDNAに対して各々のcDNA構成体を遺伝子的に結合させた。
CTLA４Ig内の CDR−１様の領域がCD28Igからの等価領域を置換された点を除いて、上述のものと類似した要領でHS６ハイブリッドを調製した。
それぞれHS４，HS４−Ａ及びHS４−Ｂの約350 塩基対のHind III／ HpaＩ５′フラグメントをHS５から同様に消化された等価cDNAと置換しかくしてCTLA４の CDR１様のループをすでにCTLA４ CDR３様領域を含むハイブリッド内に導入することによって、HS７，HS８及びHS９構成体をそれぞれ調製した。
【０２１７】
HS10−HS13構成体は、以前に構築された相同体突然変異体の中にCTLA４Igの CDR２様ループを導入することにより調製されたドメイン相同体突然変異体である。これは、分子から等価のCD28 CDR２様の領域を同時に欠失させながら相同体鋳型の中にCTLA４ CDR２−様の配列を導入するようにプライマを設計することになる PCR突然変異誘発の重複によって行なわれた。
従って、HS４はHS10を作るための鋳型として役立った。HS７はHS11を作るための鋳型として役立った。HS４−ＡはHS12を作るための鋳型として役立った。そしてHS８はHS13を作るための鋳型として役立った（図23及び表Ｉ）。上述の CDM８プライマ−をこれらの構築においても使用した。
【０２１８】
HS14ハイブリッド構成体は、CTLA４Igからの等価ループでCD28の CDR２様ループを置換することによって調製された（図23及び表Ｉ）。
これらの変化を導入するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマ−を、その他の突然変異体について記述されたものと同じ PCR突然変異誘発を重複する上で利用した。
PCR反応及び CDM８へのサブクローニングは、上述の通りに行なった。ここでも全ての突然変異体は、ジデオキシ鎖終結／拡張反応によって配列決定された。
【０２１９】
突然変異体の各々をコードするプラスミドを COS細胞内にトランスフェクションし、結果として得られた可溶性Ig融合タンパク質を培地内で定量し、以下の項で記述する通りウエスタンブロットにより視覚化した。
培地内の結果として得られたIg融合タンパク質の定量
血清を含まない COS細胞培地の中に存在するIgの量を決定することにより、酵素免疫検定において可溶性突然変異融合タンパク質を定量した。
【０２２０】
マイクロタイター平板（Immulon ２；Dynatech Labs., Chantilly, VA)に、0.5 μｇ／mlのヤギ抗ヒトIgG (Jackson Immunoresearch Labs., West Chester, PA)を16〜24時間４℃でコーティングした。標本希釈剤（Genetic Systems, Seattle, WA) を用いて１時間ウエルを遮断し、次に0.05％のTween20 を含むPBS (PBS-Tw)で洗浄した。
融合タンパク質を含む COS細胞培地をさまざまな希釈度で付加し、22℃で１時間インキュベートした。標準曲線のため、各平板上の分離したウエルに対して既知の濃度のCTLA４Igも付加した。
【０２２１】
洗浄の後、１：12,000に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP)でコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG (Tago, Burlingame,（Ａ）を付加し、22℃で１時間インキュベートした。その後ウエルを洗浄し、３，３′，５，５′テトラメチルベンチジン（TMB)基板(Genetic Systems) で15分間インキュベートしてから、1NのH2SO4 を付加することによって反応を止めた。マイクロタイター平板読取り装置(Genetic Systems) 上で450 及び630nm の２重波長で光学密度を測定した。
既知の濃度のCTLA４Igの標準曲線との比較により、突然変異体Ig融合タンパク質の濃度を決定した。
【０２２２】
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
培地中に存在するCTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質を、４℃で一晩インキュベートすることによりプロテインＡ−セファロースに吸着させた。溶球を0.1 ％のNonidet-P40 (NP40)を含むPBS で洗浄し、次にSDSPAGE 試料緩衝液を付加し、溶出したタンパク質をSDS ポリアクリルアミドゲル上に投入した。
ニトロセルロース上へのタンパク質のウエスタンブロットトランスファを、標準的手順により実施した。その後ニトロセルロース膜を、0.1 ％のNP40及び１％の脱脂粉乳を含むPBS を用いて遮断した。
PBS-Tw内での洗浄の後、膜を１：1,000 の割合で希釈されたアルカリホスファターゼでコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) を用いて１時間22℃でインキュベートした。次にブロットを標準的手順を用いて洗浄し展開させた。
【０２２３】
B7陽性 CHO細胞の酵素免疫検定
CTLA４Ig突然変異体融合タンパク質及びCTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質が有する、 CHO細胞上で安定した形で発現されたB7−１を結合する能力は、酵素免疫検定によって決定された。
丸底の組織培養処理された96ウエルのマイクロタイター平板（Corning, Corning-NY)に１ウエルにつき103 の細胞の割合でB7−１陽性 CHO細胞を播種した。２日後に、集密的細胞を、15分間95％のエタノール中で定着させた。
PBS-Twでの洗浄の後、さまざまな濃度で突然変異体Ig融合タンパク質を付加し、これを４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１：10,000で希釈したHRP コンジュゲートされたヤギ−抗ヒトIgG （Tago) を付加し、１時間22℃でインキュベートした。
次にウエルを洗浄し、上述のとおりTMB 基質を付加し、30分間反応させてから、1NのH2SO4 を用いて反応を停止させた。ウエルの吸光度を450nm で測定した。
【０２２４】
CD28Ig部位特異的突然変異体融合タンパク質結合検定
間接的酵素免疫検定により、B7−１に結合するその能力について、CD28Igの部位特異的突然変異体融合タンパク質を検定した。
ELISA 平板のウエルを、４℃で16時間５μｇ／mlの割合でマウス IgG１ Fc 領域に融合されたヒトB7−１の細胞外ドメインを含むキメラ融合タンパク質でコーティングした。ウエルを１時間標本希釈剤(Genetic Systems) で遮断し、次にPBS-Twで洗浄した。突然変異体融合タンパク質を既知の濃度で含む COS細胞培地をさまざまな濃度で付加し、22℃で１時間インキュベートした。
既知の濃度のCD28Igも同様に各平板上の分離したウエルに付加した。洗浄の後、１：10,000で希釈した HRPコンジュゲートされたヤギ抗ヒトIgG を付加し、22℃で１時間インキュベートした。 TMB基質を付加し、培地中のIg融合タンパク質の定置について記述された通りに光学密度を読み取った。
【０２２５】
Ig融合タンパク質に対する mAb結合
CTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質とCTLA４Ig突然変異体融合タンパク質を結合する抗−CTLA４mAb 及び抗−CD28mAb9.3の能力を、酵素免疫検定によって評価した。
マイクロタイター平板のウエル（Immulon ２) を、４℃で16〜24時間0.5 μｇ／mlのヤギ抗ヒトIgG (Jackson) でコーティングした。平板を標本希釈剤( (Genetic Systems) で１時間遮断し、PBS-Twで洗浄し、次に22℃で１時間Ig融合タンパク質を用いてインキュベートした。洗浄後、ウエルを22℃で１時間１μｇ／mlでmAb を用いてインキュベートした。
【０２２６】
さらに洗浄した後、１：10,000で希釈された HRPコンジュゲートされたヤギ抗マウスIg（Tago) を付加し、22℃で１時間インキュベートした。 TMB基質を付加し、上述のとおりに光学密度を測定した。
CTLA４分子モデル。IGSF変量様ドメインのコンセンサス残基の保存基づいて、CTLA４細胞外ドメインの近似の三次元モデルを生成した。
かかるIGSFコンセンサス残基を配列アライメントのための「アンカーポイント」として用いて、CTLA４残基を、Ig可変折畳みのＡ，Ｂ，Ｃ，Ｃ′，Ｃ″，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇストランド（Williams／Barclay, 1988,前出）及び連結用ループ領域（図26）に割り当てた。
【０２２７】
鋳型構造として HyHEL−５の可変重鎖を用いて（Sheriff et al., 1987 PNAS 84：8075-8079)、CTLA４モデルを構築した。（Insight II、分子モデリング及び力学発見プログラム、Biosym Technologies, Inc. San Diego)。コンホメーション操査（Bruccoleri et al., 1988. 335：564-568)を用いての側鎖置換及びループコンホメーションを近似した。
IGSF可変折畳みとのCTLA４細胞外領域配列の初期アライメントを改善するため3Dプロファイル分析（Luethy et al., 1992, Nature 336 ：83-85)を用いてβストランド又はループに対するいくつかの残基を修正済みアライメントを伴うモデルのいくつかのバージョンを試験した。
【０２２８】
結果
CTLA４Ig及びCD28Ig突然変異体融合タンパク質の構築及び結合活性。
CD28及びCTLA４のさまざまな相同体の配列アライメントが図19〜21に示されている。図19〜21では、ヒト（Ｈ）、マウス（Ｍ）、ラット（Ｒ）及びニワトリ（Ch) のCD28の配列がヒト及びマウスのCTLA４と整列させられている。残基は、シグナルペプチドをもつ成熟タンパク質Ｎ未満から番号づけされ、膜内外ドメインに下線が付加され、 CDR類似領域が記されている。暗影のついた部域は、残基の完全な保存を強調しており、一方明影のついた部域は、全てのグループ構成員における保存的アミノ酸置換を強調している。
【０２２９】
配列保存の領域は、CTLA４及びCD28の両方の CDR３様ループ内にあるヘキサペプチド MYPPYモチーフ内に最も厳密な保存が見られる状態で、これらのタンパク質の細胞外ドメイン全体にわたり散乱している（図19〜21）。このことはすなわち、例えばB7−１及びB7−２といったB7抗原との相互作用においてこの領域が役割を果たしている確率が高いことを示唆している。
この可能性を試験するため、部位特異的アラニン走査突然変異を、 PCRオリゴヌクレオチドプライマ特異的突然変異誘発を用いてCTLA４Igのこの領域の中に導入し、かくして結果としてCTLA４Ig突然変異体融合タンパク質を得た。同様にして、CD28Ig  MYPPPYモチーフ内に２つのアラニン突然変異を導入し、かくしてCD28Ig突然変異体融合タンパク質という結果を得た。
【０２３０】
cDNA構成体を全て、配列決定して、 COS細胞内へのトランスフェクションの前に望まれる突然変異を確認した。血清を含まない COS細胞培地内の突然変異体Ig融合タンパク質の濃度を、Ig定量検定によって決定した。
安定した形でトランスフェクションを受けた CHO細胞上で発現されたB7−１に結合する各CTLA４Ig突然変異体融合タンパク質の能力を、次に間接的細胞結合免疫検定によって決定した。B7−１に対するCD28Ig突然変異体融合タンパク質の結合は、間接的酵素免疫検定によって評価された。これらの検定の各々については材料と方法の項で記述されている。
【０２３１】
Ala に対するCTLA４Ig MYPPYモチーフの各残基の突然変異誘発は、図22に示されている通りB7−１に対する結合に対して絶大なる効果を有していた。図22は、CTLA４Ig及びCD28Igの MYPPYモチーフ内の突然変異がB7−１に対する結合を分断するということを示している。部位特異的突然変異体Ig融合タンパク質を過渡時にトランスフェクションを受けた COS細胞内で産生させ、定量し、B7−１に対するその結合能力について試験した。
【０２３２】
図22では、反復的測定を伴って少なくとも２回、融合タンパク質の定量をくり返した。特定的に言うと、図22は、CTLA４Ig突然変異体が、 ELISA組織培養平板内で集密性に至るまで成長させられた、安定した形でトランスフェクションを受けエタノールで定着されたB7−１＋ CHO細胞に対して結合するということを示している。結合データは、重複するウエルの平均として表現され、少なくとも２つの実験を表わすものである。
【０２３３】
Y99A及びP101A 突然変異体はB7−１に結合したが、野生型CTLA４Igに比べその能力は著しく低いものであった。これとは対照的に、突然変異体M98A，P100A ，P112A,及びY103A は、ほぼ完全な結合喪失を示した。さらにCD28Ig MYPPPY 突然変異体P103A 及びY104A は、 ELISA平板のウエル上に固定化されたB7−１に対する検出可能な結合を全く示していなかった（図22ｂ）。
【０２３４】
CTLA４Ig突然変異体融合タンパク質を用いてインキュベートされ、抗ヒトFITCで標識付けされ、FACSCAN を用いて検定されたB7−１のトランスフェクションを受けた CHO細胞が、同等の結果を示した。これらの結果は、B7−１に対するCTLA４Ig及びCD28Igの両方の結合において MYPPPY モチーフがもつ非常に重要な役割を明確に立証している。
【０２３５】
CTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質の特徴づけ
MYPPYモチーフはCTLA４Ig及びCD28Igの両方に共通であることから、それだけではCTLA４Ig及びCD28Igについて見られるB7−１に対する結合に関して観察された差異を説明することはできない。活性度の高い結合B7−１に対する比較的低い保存度の残基の貢献を、一連の相同体突然変異体を用いて評価した。
CD28の３つの CDR様領域を、さまざまな組合せで、CTLA４細胞外ドメイン（図23及び表Ｉ）からの等価領域と置換した。図23は、CTLA４-Ig との関係におけるB7−１＋ CHO細胞に対する結合活性％を示すCTLA４／CD28Ig突然変異体融合タンパク質の地図である。保存されたシステイン残基（Ｃ）はそれぞれ位置22，93及び121 に示されている（CTLA４番号付け）。同様に示されているのは、MYPPPYモチーフの位置である。白色部域はCD28配列を表わしている。
【０２３６】
黒色部域はCTLA４配列を表わす。交差平行線の入った部域はIgGFc の始まりを表わす（表Ｉも参照のこと）。結合活性百分率は、CTLA４-Ig との関係における結合曲線（図24及び図25）を比較し、CTLA４-Ig について発見されたものと同じＯ．Ｄ（光学密度）を与えるのに必要な突然変異体の濃度を発見することによって決定した。このとき、特定のＯ．ＤにおけるCTLA４-Ig の濃度に対する突然変異体タンパク質の比率を結合活性％として表わした。CTLA４-Ig 結合曲線の直線部分から少なくとも２つのＡ450 読取り値をとり、平均結合活性％を決定した。
合計14のハイブリッドcDNA構成体を調製し、配列決定し COS細胞内にトランスフェクションした。血清を含まない培地内のIg融合タンパク質の濃度を決定し、ウエスタンブロット分析を含むSDS-PAGEによりその電気泳動移動度を比較した。
【０２３７】
還元条件下では、各々のキメラタンパク質は、交換された領域のサイズに応じてCTLA４Ig（Mr-50KDa) 及びCD28Ig（Mr-70KDa) のものの間で相対的分子質量が変わる状態で移動した。
非還元条件下では、タンパク質は、基本的に100 〜140KDaの間で移動し、このことはすなわちこれらの融合タンパク質がFcのヒンジ部内のシステイン残基の突然変異誘発にもかかわらずジスルフィド結合した２量体として存在したということを表わしている。
【０２３８】
CTLA４及びCD28内の５つの保存されたシステイン残基のうちの４つは、鎖内ジスルフィド結合に関与するものと考えられることから、かくして融合タンパク質の二量体化は、CTLA４内の位置121 (CD28 内の位置123)にある第５の保存されたシステイン残基のせいである可能性が最も高かった。
B7−１に対するCTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質の結合。部位特異的CTLA４Ig及びCD28Ig突然変異体融合タンパク質を検定するのに用いられたものと同じ間接的細胞結合免疫検定により、B7−１に対するその結合能力について、ハイブリッド融合タンパク質を試験した。
【０２３９】
これらの条件下で、CD28IgとB7−１の間の結合はほとんど検出できなかった（図24及び図25）。しかしながら、CD28の残基97〜125 (CDR３様の拡張領域）をCTLA４の対応残基で置換することにより、B7−１に対するCD28Ig類似体の結合のおよそ2.5 桁分の増大が結果として得られた（図24及び図25）。図24及び図25は、CTLA４／CD28Ig突然変異体融合タンパク質が、B7−１ CHO細胞に対する高い活性度の結合における CDR類似領域の関与を立証する、ということを示している。突然変異体は、図２で記されている通りに検定された。データは、重複ウエルの平均として表現され、少なくとも３つの実験を代表している。これら３つの曲線から、図23において説明され図示されているとおり、CTLA４-Ig との関係における結合活性％を決定した。
【０２４０】
HS４と呼ばれる（図23）この構成体によるB7−１に対する結合は、野生型CTLA４Igに比べ約５分の１低いものである。CTLA４の付加的なＮ末端残基（アミノ酸１〜22）を含むHS２ハイブリッドは、HS４との関係においてB7−１に対するハイブリッド分子の結合能力を改善しなかった。
CD28の CDR１様領域（残基25〜32) を含んでいる点を除いてCTLA４Ig配列を表わすHS６構成体は、同様に結合した。しかしながらHS４構成体（HS７と呼ぶ）の中へCTLA４ CDR１−様領域（残基25〜32) の付加的な内容は、さらに改善された結合を示し、結合親和力はCTLA４Igの約44％となる（図23）。
【０２４１】
これとは対照的に、CTLA４の CDR２様領域（残基51〜58）をHS４に内含しても（構成体HS10）、さらに結合が増大することはなかった（図23）。CD28Ig内に内含されたCTLA４の３つの CDR様領域配列の全てを有していた構成体HS11についても類似の結果が発見された。CTLA４の CDR１様ドメインのみを含んでいたHS５ハイブリッドは、非常に低いレベルで結合した。
CTLA４／CD28IgハイブリッドHS４−Ａは、Ｃ末端で拡張された CDR３様領域内でCTLA４Ig残基96〜113 、すなわちHS４よりも９つのCTLA４由来残基だけ少ない残基、をコードした（図23及び表Ｉ）。HS４Ａは、HS４ほどB7−１ CHO細胞を結合しなかった（図23及び25）。ただし、CTLA４ CDR１様のループ（HS８ハイブリッド）を付加することにより、野生型結合の約２％から60％近くまでB7−１結合が増大した。
【０２４２】
一方、HS４−Ａ内へのCTLA４ CDR２様ループの付加（HS12）は、HS４−Ａとの関係における結合を増大しなかった：又、CTLA４ CDR様領域全てを付加しても増大はなかった（HS13、図23）。
もう１つのHS４−Ｂと呼ばれるハイブリッドは、MYPPPYモチーフとそれに続くCTLA４残基 114〜122 を含むCD28 CDR３様領域をコードした（表Ｉ及び図23）。
HS４−Ｂ及びHS４−Ａは、B7−１に対する類似の結合を示した。しかしながらHS４−Ａとは異なり、HS４−Ｂ（HS９）内へのCTLA４ CDR１−様ループの内含は結合を改善せず（図23）、CTLA４Ig MYPPPY モチーフの直ぐ隣りの残基が、高活性度の結合において重要な決定要因であることを示唆していた。
CTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質に対するモノクローナル抗体結合。
【０２４３】
各ハイブリッド融合タンパク質の構造的無欠性を、酵素免疫検定におけるCTLA４又はCD28に特異的なmAb を結合するその能力の評価によって決定した。CTLA４特異的mAb 、7F8 、11D4及び10A8はリガンド結合を遮断する（Linsley et al., (1992)前出) 。
これらの抗体はP100A 及びP102A に結合できなかった。11D4を除いて（表II）。CTLA４Ig突然変異体融合タンパク質の各々に結合した。7F8 及び10A8はこれらの突然変異体に結合したことから、11D4による結合の欠如はおそらく、11D4により認識されるエピトープを混乱させる突然変異誘発のせいであると考えることができる。
【０２４４】
逆に言うと、各々の抗体は、HS６に結合した7F8 及びHS８に対し弱く結合した11D4を除いて、相同体走査ハイブリッド融合タンパク質のいずれにも結合できなかった。これらの相同体ハイブリッド融合タンパク質の多くが或る程度までB7−１に結合できたことから、抗体による結合の欠如が、空間的に隣接しているものの直線でない配列により形成されたコンフォーメーショナルエピトープの分断に起因するものであった可能性が高い。
CD28に特異的なmAb9.3（Linsley et al.，(1992)前出）は、CD28部位特異的突然変異体融合タンパク質のいずれにも結合できないかったが、ハイブリッド融合タンパク質HS４，HS４−Ａ，HS７及びHS８に結合した。HS２については、より弱い結合が見られた。HS５及びHS６構成体についてはいかなる結合も見られなかった。
【０２４５】
CTLA４モデル
図26は、CTLA４モデルの図表示を表わしている。図19〜21には、 CDR様領域に対するCTLA４残基の割当てが示されている。CTLA４モデルは、CTLA４とIg可変折畳みの類似性を裏付づける残基Cys49 とCys67 の間の付加的な（非Ig）ジスルフィド結合の存在を示唆している。
CTLA４内の２つの考えられるＮ結合したグリコシル化部位は、Igβ−ストランドフレーム枠領域の溶剤露呈位置に認められる。3D−プロフィール分析は、CTLA４配列が、より遠い関係をもつものの IgV−折畳みと全体的に相容性をもつことを示した。
【０２４６】
残基Val115は、CTLA４Ig様ドメインの最後の残基を表わす、CTLA４ホモダイマーを形成すると思われている膜近位Cys121とVal115の間の領域のコンホメーションはCD28グループの中できわめて可変的である。そこから現われる概念は、CD28のグループ構成員が主として、B7−１に対する結合のために３つの CDR様領域のうちの１つの中の残基を利用するということである。
MYPPPYモチーフは、そのＣ末端拡張により増大させられると思われかつ非常に可変的な CDR１様領域により特異的に変調される結合のための保存された骨格を表わす。 CDR３及び CDR１様領域は、Ig可変折畳みの中で空間的に隣接している。 CDR２様領域は空間的に遠く隔たり、CD28グループの場合、B7−１への結合に対し大きな貢献を果していない。
【０２４７】
【表１】
2004248677.tif 000002
【０２４８】
【表２】
2004248677.tif 000003
【０２４９】
抗体結合は、野生型タンパク質について見られるもの（+++)からバックグラウンド以上（＋）まで、そして検出可能な結合無し（−）と格付けされた。
本発明が関与する当業者に明らかなように、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの以外の形で具体化され得る。従って、上記本発明の特定の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】図１は、下の実施例２に記載するCTLA４Ig融合構成体の線図である。
【図２】図２は、下の実施例２に記載するCTLA４IgのSDS-PAGEクロマトグラフィーの精製から得られたゲルの写真であり、電気泳動の結果を表わす図面に代る写真である。
【図３】図３は、実施例３に記載する、オンコスタチイン（oncostatin) Ｍシグナルプライマー伸長（位置−25〜−１）に融合したヒトCTLA４レセプター（配列識別番号：13および14）をエンコードし、そして新しく同定されたＮ連鎖グリコシル化部位（位置109 〜111)を含む、完全なアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、実施例４に記載する、CD28およびCTLA４でトランスフェクションしたCOS 細胞へのB7Ig融合タンパク質の結合のFACSR 分析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例４に記載する、B7抗原陽性（B7+ ) CHO 細胞およびリンパ芽球様細胞系（PM-LCL) 上の精製したCTLA４Igの結合のFACSR 分析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例４に記載する、同定化CTLA４Igへの125I標識化B7Igの競争結合の分析を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例４に記載する、同定化CTLA４Igへの125I標識化B7Igのスキャッチャード分析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例４に記載する、125Iで表面標識化したB7陽性CHO 細胞およびPM-LCL細胞の免疫沈澱分析のSDS-PAGEクロマトグラフィーからのゲルの電気泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図９】図９は、実施例４に記載する、〔 3Ｈ〕−チミジンの組み込みにより測定した、CTLA４IgのＴ細胞の増殖への作用を示すグラフである。
【図１０】図10は、実施例４に記載する、酵素のイムノアッセイ（ELISA)により決定した、ヒトＴ細胞によるヘルパーＴ細胞（Ｔh ）誘発免疫グロブリンの分泌へのCTLA４Igの作用を示す棒グラフである。
【図１１】図11は、ヒト膵島異種移植片の生残を示す線グラフである。
【図１２】図12は、ヒト膵島異種移植片の生残を示す線グラフである。
【図１３】図13は、ヒト膵島異種移植片の生残を示す線グラフである。
【図１４】図14は、Ｂ10マウスの副腎の下に移植されたヒト膵島の組織病理学スライドの写真である。
【図１５】図15は、ヒトB7に対するMAb を用いた膵島移植片の生残期間の延長を示す線グラフである。
【図１６】図16は、CTLA４Igによる膵島移植片抗原に対するドナー特異的不応答の誘導を示す線グラフである。
【図１７】図17は、ヒツジ赤血球 (SRBC) 、mAbL6 及びラットIg，mAbL6 及び抗−IL４, CTLA４Ig及びラットIg, CTLA４Ig及び抗−IL４の注射を受けたマウスの抗体血清力価レベルを示す線グラフである。Ｘ軸は抗体−血清力価を測定する。Ｙ軸は、日数単位の時間を測定する。黒の正方形は、０日目と46日目にSRBCの注射を受けたマウスを表わす。白の正方形は、46日目にSRBCの注入を受けたマウスを表わす。黒丸は、mAbL6 及びラット免疫グロブリンの注射を受けたマウスを表わす。白丸は、mAbL6 及び抗IL4 抗体の注射を受けたマウスを表わす。黒の三角形は、CTLA４Ig及びラット免疫グロブリンの注射を受けたマウスを表わす。白の三角形は、CTLA４Ig及び抗−IL４抗体の注射を受けたマウスを表わす。
【図１８】図18は、KLH, mAbL6及びラットIg，mAbL6 及び抗−IL４, CTLA４Ig及びラットIg, CTLA４Ig及び抗−IL４の注射を受けたマウスの抗体血清力価レベルを示す線グラフである。Ｘ軸は、抗体血清力価を測定する。Ｙ軸は、日数で表わした時間を測定する。黒の正方形は、46日目にキーホールリンペットヘモシアニン (KLH)の注射を受けたマウスを表わす。黒丸はmAbL6 及びラット免疫グロブリンの注射を受けたマウスを表わす。白丸はmAbL6 及び抗−IL4 抗体の注射を受けたマウスを表わす。黒の三角形は、CTLA４Ig及びラット免疫グロブリンの注射を受けたマウスを表わす。白の三角形は、CTLA４Ig及び抗−IL４抗体の注射を受けたマウスを表わす。
【図１９】図19はCD28及びCTLA４ファミリーの構成員の配列を並べて示すグラフである。ヒト（Ｈ）、マウス（Ｍ）、ラット（Ｒ）及びニワトリ（Ch）のCD28の配列がヒト及びマウスのCTLA４と並べてある。残基の番号は成熟タンパク質のＮ−末端から付されており、シグナルペプチド及び膜貫通ドメインにはアンダーラインが付されており、CDR-類似領域が示されている。暗い影の領域は残基の完全な保存を示しており、他方淡い影の領域はすべてのファミリー構成員における保存的なアミノ酸置換を示している。
【図２０】図20は図19の続きである。
【図２１】図21は図20の続きである。
【図２２】図22は、CTLA４Ig及びCD28Ig変異体がB7-1と結合することを示す線グラフである。
【図２３】図23は、CTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質の模式図である。白い部分はCD28配列を示し、ぬりつぶした部分はCTLA４配列を示し、交差平行線の部分はIgG Fcの開始を示す（さらに表Ｉを参照のこと）。
【図２４】図24は、CTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質が高い親和性をもってB7-1 CHO細胞に結合することを示す線グラフである。
【図２５】図25は、CTLA４／CD28Igハイブリッド融合タンパク質が高い親和性をもってB7-1 CHO細胞に結合することを示す線グラフである。
【図２６】図26はモノマーCTLA４Ig  ｖ−様細胞外ドメインの分子モデルである。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２】
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【図８】
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【図１４】
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【配列表】
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