(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物の侵入に対する防御反応として低分子抗菌性物質ファイトアレキシンがあり，この物質の合成を誘導する所謂エリシター活性を有するタンパク質の提供。【解決手段】フィトフトラ・インフェスタンスに由来する特定のアミノ酸配列を含み、エリシター活性を有する３８ｋＤａ  のタンパク質。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、かつエリシター活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされており、エリシター活性を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を含み、３８ｋＤの分子量を有し、そしてエリシター活性を有する、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）由来の糖タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質を生産する事が出来るフィトフトラ・インフェスタンスを培養し、培養物から、３８ｋＤの分子量を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、培養物からエリシター活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の防御に関与する物質である、エリシター活性を有する新規なタンパク質及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の侵入に対する高等植物の防御反応には、低分子抗菌性物質フィトアレキシンの合成、感染組織における物理的防御壁としてのリグニンやパピラの主成分であるカロースの蓄積、リグニンの蓄積の土台となるヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質の細胞壁での蓄積、侵入菌の細胞壁を分解し、侵入菌又は自己細胞壁からエリシター分子させる機能を有するキチナーゼやグルカナーゼの合成、侵入菌の栄養摂取を阻害するプロテイナーゼ阻害物質の合成などが挙げられる。
【０００３】
上記の防御反応の１つであるフィトアレキシンの合成を誘導する物質をエリシター（ｅｌｉｃｉｔｅｒ）と称する。エリシターには、植物病原菌に由来するものと植物内在的エリシターが存在し、植物病原体由来のエリシターとしてはβ−１，３−Ｄ−  グルカン、ガラクトースやマンノースに富む糖タンパク質、キトサン、アラキドン酸等多くの成分が同定されており、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属由来のエリシターとしては１，３−β−Ｄ−  グルカン（Ａｙｅｒｓ，  Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．５７，  ｐ．７６０−７６５  （１９７６））、糖タンパク質（Ｋｅｅｎ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｖｏｌ．２６，  ｐ．３４３−３５５  （１９８５））、キトサン（Ｓｈｉｂｕｙａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．２，  ｐ．１０９−１１３  （１９９９））、及びアラキドン酸（Ｂａｓｔｏｃｋ，  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２１２，  ｐ．６７−６９  （１９８１））が知られている。
【０００４】
フィトフトラの多くの種により生産され、エリシチン（ｅｌｉｃｉｔｉｎ）と称する小形の細胞外タンパク質が宿主細胞において防御応答を示すものとして同定されており（Ｒｉｃｃｉ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８３，  ｐ．５５５−５６３  （１９８９））、これは高度に保存された１０ｋＤａ  のタンパク質である（Ｒｉｃｃｉ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌ．３，  Ｇ．Ｓｔａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  ｐ．５３−７５  （１９９７））。
【０００５】
【非特許文献１】
Ａｙｅｒｓ，  Ａ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．５７，  ｐ．７６０−７６５  （１９７６）
【非特許文献２】
Ｋｅｅｎ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｖｏｌ．２６，  ｐ．３４３−３５５  （１９８５）
【非特許文献３】
Ｓｈｉｂｕｙａ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．          ２，  ｐ．１０９−１１３  （１９９９）
【非特許文献４】
Ｂａｓｔｏｃｋ，  Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２１２，  ｐ．６７−６９  （１９８１）
【非特許文献５】
Ｒｉｃｃｉ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１８３，  ｐ．５５５−５６３  （１９８９）
【非特許文献６】
Ｒｉｃｃｉ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌ．３，  Ｇ．Ｓｔａｃｅｙ            ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  ｐ．５３−７５  （１９９７）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フィトフトラ属微生物由来の新規なエリシタータンパク質及びその製造方法を提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記の課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、分子量の大きい、エリシター活性を有する新規なタンパク質を単離することに成功し、本発明を完成した。
従って本発明は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質を提供する。
【０００８】
一般に生理活性物質は、生来のタンパク質のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の置換／欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、生来のタンパク質と同等の生物活性を維持していることが当業界においてよく知られている。従って、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を含有し、且つエリシター活性を維持しているタンパク質をも包含する。
【０００９】
また、実施例５に示すごとく、配列番号：１に示す塩基配列にハイブリダイズし、且つエリシタータンパク質をコードする遺伝子は他の微生物株にも存在する。従って本発明は、配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸と、高ストリンジェン条件下でハイブリダイズする、ＤＮＡによりコードされており、且つエリシター活性を有するタンパク質を包含する。このＤＮＡは、好ましくは、フィトフトラ属微生物由来のＤＮＡである。
【００１０】
本発明は更に、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含み、３８ｋＤの分子量を有し、そしてエリシター活性を有する、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）由来の糖タンパク質を提供する。
本発明は更に、上記のタンパク質を生産する事が出来るフィトフトラ・インフェスタンスを培養し、培養物から、３８ｋＤの分子量を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、当該タンパク質の製造方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、上記のタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、培養物からエリシター活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、当該タンパク質の製造方法を提供する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のエリシター活性を有するタンパク質のフィトフトラ・インソレンスからの単離・精製方法、及び該タンパク質をコードする遺伝子のクローニング方法は実施例において具体的に記載する。
【００１３】
本発明のエリシター活性を有するタンパク質は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する。しかしながら、一般に生理活性物質は、生来のタンパク質のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の置換／欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、生来のタンパク質と同等の生物活性を維持していることが当業界においてよく知られている。従って、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加により修飾されたアミノ酸配列を含有し、且つエリシター活性を維持しているタンパク質をも包含する。
【００１４】
また、実施例５に示すごとく、配列番号：１に示す塩基配列にハイブリダイズし、且つエリシタータンパク質をコードする遺伝子は他の微生物株にも存在する。従って本発明は、配列番号：１に示す塩基配列を有するＤＮＡ  と、高ストリンジェン条件下でハイブリダイズする、ＤＮＡによりコードされており、且つエリシター活性を有するタンパク質を包含する。このＤＮＡの由来としては、例えば、フィトフトラ属由来のＤＮＡが挙げられる。
【００１５】
本発明はまた、上記種々のタンパク質をコードする遺伝子をも提供する。本発明はまた、上記遺伝子を含んで成るベクター、例えば発現ベクターを提供する。本発明はまた、このベクターにより形質転換された宿主、例えば微生物宿主をも提供する。
【００１６】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１．エリシター活性を有するタンパク質の単離
フィトフトラ・インフェスタンス（Ｍｏｎｔ）ｄｅＢａｒｙ単離株ＤＨ１０１（レース０）を、２％シュークロース及び０．２  ％バクト酵母エキスを補充したライ麦寒天培地に１８℃にて暗中に保存した。液体培養のためには、Ｆｕｒｕｉｃｈ，  Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．  Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．  Ｖｏｌ．５６，  ．４５７−４６７）に記載されている合成培地中で１８℃にて暗中で２〜３週間培養した。菌糸を濾過により回収し、洗浄し、そして−２０  ℃にて凍結した。
【００１７】
タンパク質の抽出は、泳溶上で又は冷室中で、０℃〜４℃にて行った。前記の凍結した菌糸を液体窒素中で粉砕し、得られた粉末を、１Ｍ  ＮａＣｌ  を含有する０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）５倍量中でホモジナイズし、これにフェニルメチルスルホニルフルオクド（ＰＭＳＦ）を最終濃度２５ｍＭまで加えた。このホモジネートを３分間超音波処理し、そして４℃にて２０分間２０，０００ｘｇで遠心分離した。上清を冷２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．１）に対して、カットオフ分子量１，０００  の多孔性膜を介して透析した。
【００１８】
こうして得られた粗抽出物中に含まれるタンパク質を、上記の緩衝液により平衡化したカラム（４．６ｍｍ  ×１００ｍｍ  、１．７ｍＬ  、ＰｏＲｏｓ  ＱＥ／Ｍ  ；  ＰｅｒＳｅｐｔｉｎｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上ＦＰＬＣ−  アニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。流速を５ｍｌ／分とし、溶出は２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．１）中０Ｍ〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ  のリニアーグラジエントにより行った。溶出は２８０ｎｍ  の吸光度により行い、１ｍｌづつの画分を回収した。結果を図１に示す。
【００１９】
上記の画分を、ＥＬＩＳＡ  により分析し、目的タンパク質の存在を推定した。抗体として菌糸壁成分（ｈｙｐｈａｌ  ｗａｌｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ＨＷＣ）に対するモノクローナル抗体（抗−ＨＷＣモノクローナル抗体）（Ａｂｓ−２Ａ１１）（Ｉｋｅｄａ，  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．３，  ｐ．１８−２０（１９９３））を用いた。このモノクローナル抗体は、Ｇａｒａｓ，  Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ．，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．１１７−１２６（１９７９）に記載の方法により抽出したＨＷＣエリシター中に存在するタンパク質性エピトープを認識する。
【００２０】
ＥＬＩＳＡは、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｆｏｐａｔｈｏｌ，  Ｖｏｌ．７９，  ｐ．６１０−６１３（１９８９）に記載の方法により行った。マイクロプレートのウエルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸緩衝液（ＰＢＳ）により１／１０００に希釈したＡｂｓ−２Ａ１１抗体をコートし、上記のＦＰＬＣ画分のＡｂｓ−２Ａ１１結合活性を測定した。二次抗体として抗−マウス免疫グロブリン−アルカリホスフェターゼ結合体を１〜２０００倍希釈して用いた。吸光度はＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｐｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５９５  ｎｍにて測定した。結果を、図２に示す。図２において、Ｃ１はＬＰＬＣにより分離する前の粗抽出液、Ｃ２はＦＬＬＣの溶離緩衝液、Ｃ３は一次抗体Ａｂｓ−２Ａ１１のみにより処理されたＣ１画分、そしてＣ４は二次抗体のみで処理されたＣ１の結果を示す。最大のＡｂｓ−２Ａ１１結合活性は、０．３５Ｍ  ＮａＣｌにおいて溶出した画分（Ｆ）１７〜２０において検出された。これは４回の反復実験の結果である。
【００２１】
生物活性の測定
上記の方法により得られた、Ａｂｓ−２Ａ１１結合活性を有するＦＰＬＣ画分Ｆ１５  〜Ｆ２１  のエリシター活性を、過敏性応答（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＨＲ）によるポテトの塊茎組織の細胞列を指標として、試験した。各画分（Ｆ１５  〜  Ｆ２１）をプールし、セントリコン−３０  マイクロコンセントレーターにより最終タンパク質濃度６００  μｇ／ｍｌに濃縮し、濃縮したサンプルを、１８℃にて１６時間エージングした栽培種ポテトＥｎｉｗａ（Ｒ１  遺伝子）及びＩｒｉｓｈ  ｃｏｂｂｌｅｒ（ｒ遺伝子）の塊茎組織に、３０μｌの量で適用した。
【００２２】
過敏応答（ＨＲ）の誘導を、９８時間後の塊茎組織の褐色化及び細胞死によりモニターした。結果を図３に示す。エリシター活性画分により高強度のＨＲが誘導されるのに対して、水はＨＲを誘導しなかった。ＨＲの強度は画分Ｆ１９  及びＦ２０  において、他の画分に比べて非常に高かった。これらの結果から、エリシタータンパク質は画分Ｆ１９  及びＦ２０  に含まれることが明らかになった。
【００２３】
ＦＰＬＣ画分のウエスタンイムノブロット分析
高いエリシター活性を示すＦＰＬＣ画分Ｆ１７  〜Ｆ２０  について、Ｌｅａｍｍｌｉ，  Ｕ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．２２７，  ｐ．６８０−６８１（１９７０）に記載の方法に従って、分離用ゲルのために１２．５％アクリルアミドを使用し、スタックゲルのために４．５  ％アクリルアミドを用いて、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。
【００２４】
電気泳動の後、ゲルを、Ｓｗｉｔｚｅｒ，  Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．９８，  ｐ．２３１−２３７（１９７９）の方法に従って銀染色し、あるいは、Ｔｏｗｂｉｎ，  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＰ，  Ｖｏｌ．７６，  ｐ．４３５０−４３５４（１９７９）の方法に従って、ＭｉｌｌｉＢｌｏｔ（商標）−ＳＤＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、２ｍＡ／ｃｍ２  にて３０分間、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｂｉｌｏｎ−Ｐ、孔サイズ０．４５μＭ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）に移送した。次に、この膜をブロック緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び５％スキムミルク（ｐＨ  ７．５））中で室温にて１時間インキュベートした。
【００２５】
これをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  中で５分間づつ２回洗浄し、ＴＢＳ  で希釈したＡｂｓ−２Ａ１１抗体中で室温にて１時間インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  中で２０分間づつ３回洗浄し、ＴＢＳにより１／２０００に希釈した。アルカリホスフェタージ接合ラビット抗−マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で室温にて１時間インキュベートし、そしてＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０  中１０分間つづ３回洗浄した。抗原−抗体複合体の検出はアルカリホスファターゼ発色剤（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により行った。
【００２６】
結果を図４に示す。図４ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色の結果を示し、図４Ｂはウエスタンイムノブロットの結果を示す。これらの結果、画分Ｆ１７  及びＦ１８  は４７ｋＤａ  のシャープなバンドを示し、画分Ｆ１９  及びＦ２０  は４７ｋＤａ  、３８ｋＤａ  及び３４ｋＤａ  の３本のバンドを示した。この結果、エリシター活性は見かけ分子量３８ｋＤａ  の主要ペプチドバンドに関連していると考えられる。分子量４７ｋＤａ  、３８ｋＤａ  及び３４ｋＤａ  の３種類のペプチドは同一のエピトープを有すると予想される。
【００２７】
アフィニティー精製したタンパク質のエリシター活性
画分Ｆ１９  及びＦ２０  からのアフィニティー精製したタンパク質がエリシター活性を有するか否かを知るため、Ａｂｓ−２Ａ１１抗体を用いてアフィニティー精製を行った。結果を図５に示す。図５ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色の結果であり、図５Ｂはウエスタンイムノブロットの結果を示す。分子量４７ｋＤａ  、３８ｋＤａ  及び３４ｋＤａ  の３種類のタンパク質はいずれもＡｂｓ−２Ａ１１抗体結合活性を有していた。
【００２８】
次に、精製したサンプルをプールし、セントリコン−３０  マイクロコンセントレーターにより濃縮した。濃縮したサンプル（３０μＬ）を、１８℃にて１６時間エージングしたポテト栽培種Ｅｎｉｗａ  及び栽培種Ｉｒｉｓｈ  Ｃｏｂｂｌｅｒ  の塊茎組織に適用した。９８時間後に、塊茎組織の褐色化及び細胞死によりＨＲの誘導を観察した。結果を図６のＡに示す。蒸留水及び流過画分はＨＲを誘導しなかった。
【００２９】
活性酵素の発生の測定
活性酵素はＨＲの誘導のために重要であることが知られている。エリシターはポテト組織において活性酵素の生成を増強することが知られている。ポテト栽培種Ｅｎｉｗａ（Ｒ１  遺伝子）及びＩｒｉｓｈ  Ｃｏｂｂｌｅｒ（ｒ遺伝子）の懸濁培養細胞（３〜４日培養したもの）５ｍｌに、５００  μＬ（５００μｇ／ｍｌ）のアフィニティー精製したサンプルを加え、細胞懸濁液を経時的に集め、室温にて遠心分離して上清を集めた。
【００３０】
この上清を、４２６  μＬの３９ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．０）、５μＬの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又は１０ｍＭ  ＣａＣｌ２  、５μＬの１０ｍＭ  ＥＧＴＡ  、１．５  μＬの１０ｍＭグアノシン５′−トリホスフェート（ＧＴＰ）−γ−Ｓ  、１５μＬのホタルルシフェラーゼを含む１５ｍｌのサンプル管に加えた。ホタルルシエラーゼは最後に加えた。サンプル管を３７℃にて３分間インキュベートし、２３μＬの３．３ｍＭ  ＮＡＤＰＨ  の添加の直後から１５分間の間隔で、放射される光のカウントをルミネセンスリーダーで測定した。
結果を図６のＢに示す。活性酵素の生成は３０分後に最大となり、その後除々に低下し、１５０分後には対照と同レベルとなった。
【００３１】
実施例２． 抗−ＨＷＥ抗体を用いての発芽濾液の免疫科学的分析
フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の遊走子からの発芽濾液（Ｄｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．９０，  ｐ．２３６−２４２  （１９７７））が抗−ＨＷＥ抗体のより認識される糖タンパク質エリシターを含有するか否かを決定するため、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の遊走子からの発芽濾液のイムノブロットを行なった。４７ｋＤａ及び３８ｋＤａの２本のバンドが前記の抗体と反応する事が示された（図９）。糖タンパク質であるエリシター（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｌｉｃｉｔｏｒ：ＧＥ）は卵菌類の種の発芽濾液から液中に分泌されるようである。
【００３２】
図４のＢに示すように、４７ｋＤａタンパク質は画分１７及び１８に検出されたが、これらの画分は、ポテトの塊茎上で試験した場合、エリシター活性を示さなかった（図３）。更に、画分１９および２０（図４のＢ）をアフィニティー精製した場合、４７、３８及び３４ｋＤａの３本のバンド（図５）が観察され、これらのタンパク質は過敏性応答（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＨＲ）を誘導し（図６のＡ）、そしてＡＯＳの生成を増強した（図６のＡ）。他方、発芽濾液のイムノブロッティングは、４７及び３８ｋＤａの２本のバンドを示した（図９）。
【００３３】
これらの結果は、画分１９及び２０のエリシター活性が３８ｋＤａの糖タンパク質エリシター（ＧＥ）に基づくことを明確に示している。Ｆ１７及びＦ１８の４７ｋＤａタンパク質のみは、エリシター活性を示さず（図３）、そして３４ｋＤａ断片は、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）からの発芽濾液のイムノブロッチングにより観察されなかった（図９）。これらの結果は、抗体により認識される３８ｋＤａタンパク質が、初期感染過程におけるＰ１のエリシターである事を示唆した。
【００３４】
実施例３．３８ｋＤａ  のエリシタータンパク質をコードする遺伝子のクローニング  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）により染色したＳＤＳ  ゲルからのタンパク質バンドを、ゲルから溶出することなく、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼにより消化した。これは、注目のバンドを含有するゲルスライスを第二ＳＤＳ  ゲルのサンプルウエルに入れ、次に各フライスをスタフィロコッカス・アウレウスＶ８プロテアーゼにより覆うことにより行った。消化は次の電気泳動の間スタックゲル中で直接に進行した。消化により、幾つかのバンドが生じたが、２個の主バンドが生じた。
【００３５】
Ｎ−末端アミノ酸配列の決定のため、タンパク質をセントリコン−３０マイクロコンセントレーターにより１００  ｐｍｏｌまで濃縮し、そしてＰＶＤＦ膜に移した（Ｓｏｕｔｈｅｒｔｏｎ，  Ｓ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ，  Ｖｏｌ．４２，  ｐ．９７−１０７（１９９３））。タンパク質の自動化Ｅｄｍａｎ  分解をＳｈｉｍａｚｕ  ＰＰＳＱ−２１  シーケンサーを用いて行った。生来のタンパク質、及びＶ８プロテアーゼによる消化により生成した短い方のペプチド断片のＮ−末端配列を決定した結果を図７に示す。
【００３６】
この配列に基いて、縮重オリゴヌクレオチドを設計し、合成した。フィトフトラ、インフェスタンスの新鮮な菌糸からＬｏｇｅｍａｎｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｖａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  Ｖｏｌ．１６３，  ｐ．１６−２０（１９８７）に記載のグアニジン塩酸抽出方法に従って全ＲＮＡ  を単離し、これを鋳型とし、前記縮重オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）ビーズ（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡの増幅を行った。すなわち、ＤＥＰＣ処理された水中溶解したビーズに２０ｎｇ〜２μｇの全ＲＮＡ及び最終量１ｐＭのオリゴｄ（Ｔ）１８プライマーを加え、３０分間  ７２℃、５分間  ９５℃の条件で逆転写を行った。次に、前記縮重プライマーを加えてＰＣＲを行った。インキュベーション条件は、９４℃にて４分間、（９４℃にて４０分間、５０℃にて１分間、２７℃にて１．５  分間）の３５サイクル、及び７２℃にて７分間、であった。
【００３７】
この結果、３８ｋＤａ  エリシタータンパク質のタンパク質部分をコードする６５９ｂｐ  のｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡの塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を配列番号：１に示す。この配列は、エリシチン、及びフィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）からの４２ｋＤａ  糖タンパク質エリシターと全く相同性を有しなかった。このことは、本発明のエリシタータンパク質及びそれをコードする遺伝子が全く新規なものであることを示している。
【００３８】
実施例４． エリシター活性タンパク質の発現及び精製
タンパク質の発現
実施例３においてクローニングした、エリシタータンパク質をコードするｃＤＮＡを挿入したプラスミドベクターｐＣＲ  Ｔ７ＣＴ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により形質転換した大腸菌ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ株の細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地１０ｍＬに加え、その細胞を振とうしながら３７℃にて一晩、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５になるまで培養した。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地５０ｍＬに、上に培養した大腸菌の培養液２ｍＬを接種し、振とうしながら３７℃にて４時間、ＯＤ（６００ｎｍ）０．５になるまで培養した。
【００３９】
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．６ｍＭまで加え、そして２５℃にて２４時間培養した。タンパク質の回収のため、４℃にえ１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた細胞ペレットをグアニジニウム細胞溶解緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム，  ｐＨ７．８）に再懸濁した。サンプルを、室温にて７分間、緩く揺り動かしながら、グアニジニウム細胞溶解緩衝液と共にインキュベートし、そして氷上で超音波処理した。４℃にて１５分間６５００ｒｐｍで遠心分離する事により不溶物を除去した。上清を集め、そして更なる精製のために４℃で貯蔵した。
【００４０】
Ｈｉｓ−標識したタンパク質の精製
Ｈｉｓ−標識タンパク質の精製のため、Ｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｓｙｓｔｅｍタンパク質精製プロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従った。ポリヒスチジジン−標識融合タンパク質を、細胞溶解緩衝液により平衡化したＰｒｏＢｏｎｄヒスチジン結合樹脂カラムに付加した。カラムを８ｍＬの変性結合緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．８）により洗浄した。次に、カラムを、ｐＨ６．０及び５．３に亘って、８ｍＭの変性洗浄緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム）により洗浄した。最後に、タンパク質を、５ｍＬの変性溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ４．０８）により溶出した。溶出液を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して、４℃にて一晩透析して尿素を除去した。この間に、透析液を４回交換した。
【００４１】
上記の方法により得られた精製されたタンパク質を確認した結果を図１０に示す。図１０のＡは、上記の方法により得られたタンパク質（レーン２）と、ｃＤＮＡを挿入しないベクターを使用して同様の実験を行って得た試料（レーン１）とを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ染色した結果を示す。２７．５ｋＤａのバンドが、得られた発現生成物を示す。なお、３８ｋＤａのタンパク質は糖タンパク質であるのに対し、実施例４においては、宿主として大腸菌を使用したので、生成したタンパク質はグリコシル化されておらず、２２６個のアミノ酸から成るタンパク質が約２７．５ｋＤａの見かけ分子量を有する。図１０のＡにおいて、ｃＤＮＡに由来する２７．５ｋＤａのタンパク質の存在が確認できた。
【００４２】
図１０のＢは、挿入したｃＤＮＡに由来するタンパク質のイムノブロット図であり、レーンａは抗−ヒスチジン抗体により検出した結果を示し、レーンｂは抗−ＨＷＥタンパク質抗体により検出した結果を示す。この実施例においてはエリシタータンパク質がヒスチジン標識された状態で発現されたので、上記両方の抗体により検出された。
【００４３】
図１０のＣは、ポテト（栽培種「Ｅｎｉｗａ」及び「Ｉｒｉｓｈ  Ｃｏｂｂｌｅｒ」を使用）の塊茎組織に対する褐色化効果を示す写真であり、「Ｃｏｎｔ．１」は、水対照の結果であり、「Ｃｏｎｔ．１」は、ｃＤＮＡを挿入しないベクターに由来する生成物の結果であり、そして「Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」は、挿入したｃＤＮＡの発現に由来する生成されたタンパク質の結果である。「Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」において、活性が認められた。
図１０のＤは、図１０のＣと同じ３種類の試料につき、２種類のポテト（［Ｒｉｓｈｉｒｉ」及び「Ｉｒｉｓｈ  Ｃｏｂｂｌｅｒ」）の細胞の懸濁培養における、活性酸素種の指標であるＣＬＡ指数を示す。ｃＤＮＡを挿入したベクターに由来するタンパク質のみが活性を示した。
実施例５．３８ｋＤａ  エリシター遺伝子の分布
フィトフトラ属の種々の種における３８ｋＤａ  エリシター遺伝子の分布を調べるため、フィトフトラ・インフェスタンス単離株ＤＮ１０１（レース０）、Ｅ００３株（レース０）、Ｐｉ８３１  株（レース１）及びＳＥ４０１株（レース１）、並びにフィトフトラ・メガスペルマ、フィトフトラ・ニコチアナ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、フィトフトラ・クリプトゲア（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃｒｙｐｔｏｇｅａ）、及びフィトフトラ・カプシシ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｃａｐｓｉｃｉ）の新鮮な菌糸からの全ＲＮＡ  を鋳型として、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡを合成した。さらに、得られた６５９ｂｐ  のｃＤＮＡバンドを、ＰＣＲ  により増幅した。この結果を図８のＡに示す。
さらに、ＰＣＲ  生成物（６５９ｂｐ）をナイロン膜に移し、そしてサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。実施例２においてクローニングした６５９ｂｐ  ｃＤＮＡは、上記の種々の由来のｃＤＮＡをハイブリダイズした。結果を図８のＢに示す。従って、本発明のエリシタータンパク質に相同なタンパク質をコードする遺伝子は、フィトフトラ属微生物間に広く分布していることが明らかである。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のエリシタータンパク質は、植物の防御機構の増幅のために有用であると機待される。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はフィトフトラ・インフェスタンスＤＨ１０１  株の菌体からの粗抽出物のＦＰＬＣにおける溶出プロファイルを示す図である。
【図２】図２は、図１における溶出画物と、抗−ＨＷＣモノクローナル抗体との反応性を示すグラフである。
【図３】図３は、図１における画分の、ポテト塊茎組織に対する褐色化効果を示す写真であり、生物の形態を示す図面代用写真である。
【図４】図４において、Ａは図１における画分Ｆ１７  〜Ｆ２０  をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色した結果を示し、Ｂは抗−ＨＷＣモノクローナル抗体により検出した結果を示し、いずれも電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図５】図５において、Ａは、図１における画分Ｆ１９  及びＦ２０  を、抗−ＨＷＣモノクローナル抗体Ａｂｓ−２Ａ１１によりアフィニティー精製して銀染色した結果を示し、Ｂはウエスタンブロットにより検出した結果を示し、いずれも電気泳動の結果を示す図面代用写真である。
【図６】図６のＡは、アフィニティー精製した本発明のタンパク質がポテト塊茎組織に対して褐色化作用（ＨＲの誘導）を有することを示す写真であり、生物の形態を示す図面代用写真であり、Ｂはアフィニティー精製した本発明のタンパク質がポテト塊茎組織において活性酵素の発生を誘導することを示すグラフである。
【図７】図７は、３８ｋＤａ  の生来のエリシタータンパク質と、そのプロテアーゼ分解物のＮ−末端のアミノ酸配列、及びそれに基いて設計されたプライマー又はプローブ用オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図である。
【図８】図８は、フィトフトラ属の種々の微生物に、３８ｋＤａ  エリシタータンパク質をコードする遺伝子が分布していることを示す電気泳動図であり、図面代用写真である。
【図９】図９は、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の遊走子からの発芽濾液中のタンパク質の、抗−ＨＷＥ抗体による検出を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。図中、レーンＡは、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）からの可溶性サンプルの結果を示し、そしてレーンＢは、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）の遊走子からの発芽濾液の結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の精製した組換えタンパク質の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）、イムノブロット（パネルＢ）、ポテト塊茎アッセイ（パネルＣ）及び懸濁培養におけるＣＬＡ指数を示す。パネルＡ及びＢは電気泳動の結果を示す図面代用写真であり、パネルＣは生物の形態を表す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月1日(2003.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、かつエリシター活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされており、エリシター活性を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を含み、38kDの分子量を有し、そしてエリシター活性を有する、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）由来の糖タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質を生産する事が出来るフィトフトラ・インフェスタンスを培養し、培養物から、38kDの分子量を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養し、培養物からエリシター活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項７】
配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、そしてエリシター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、かつエリシター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
配列番号：１に示す塩基配列を有する核酸に、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、そしてエリシター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１０】
配列番号：１に示す塩基配列を有する遺伝子。