(57)【要約】【課題】血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去する方法、及び血清タンパク質成分を可溶化するバッファーを提供する。【解決手段】前処理すべき血清試料を５５〜６５％飽和硫安によって硫安分画し、得られた沈殿画分を、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体を用いて精製する、血清の前処理法。好ましくは、血清アルブミンに対する親和性吸着体がチバクロンブルーＦ３ＧＡ、免疫グロブリンに対する親和性吸着体がプロテインＡ、リシスバッファーの組成が５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００、０．２〜０．６重量％の両性担体、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトールである。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
前処理すべき血清試料を５５〜６５％飽和硫安によって硫安分画し、得られた沈殿画分を、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体を用いて精製する、血清の前処理法。
【請求項２】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、クロロトリアジン色素である、請求項１に記載の血清の前処理法。
【請求項３】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、チバクロンブルーＦ３ＧＡ及びプロシオンレッドＨＥ３Ｂから選ばれる、請求項１又は２に記載の血清の前処理法。
【請求項４】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が抗原物質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血清の前処理法。
【請求項５】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が、プロテインＡ及びプロテインＧから選ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血清の前処理法。
【請求項６】
前記精製の後、リシスバッファーに溶解する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の血清の前処理法。
【請求項７】
前記リシスバッファーが、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００、０．２〜０．６重量％の両性担体、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトールを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の血清の前処理法。
【請求項８】
電気泳動のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の血清の前処理法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基礎研究レベル、臨床診断レベルの全てにおける血清の電気泳動的解析分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血清のアルブミンを除去する方法、免疫グロブリンを除去する方法はそれぞれ個別の方法として知られている。しかし、これらの方法は血清中の微量なタンパク質成分の電気泳動的解析には不十分である。また、２次元電気泳動を行う際に効率よく血清タンパク質成分を可溶化するための組成を有するリシスバッファーは知られていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去する方法、及び血清タンパク質成分を可溶化するバッファーを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、前処理すべき血清試料を５５〜６５％飽和硫安によって硫安分画し、得られた沈殿画分を、後述する血清アルブミン用担体及び後述する免疫グロブリン用担体を用いて精製することによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、前処理すべき血清試料を５５〜６５％飽和硫安によって硫安分画し、得られた沈殿画分を、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体を用いて精製する、血清の前処理法である。
【０００６】
本発明は、前記硫安分画を６０％飽和硫安によって行う、前記の血清の前処理法である。
【０００７】
本発明は、前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、クロロトリアジン色素である、前記の血清の前処理法である。
本発明は、前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、チバクロンブルーＦ３ＧＡ及びプロシオンレッドＨＥ３Ｂから選ばれる、前記の血清の前処理法である。
【０００８】
本発明は、前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が抗原物質である、前記の血清の前処理法である。
本発明は、前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が、プロテインＡ及びプロテインＧから選ばれる、前記の血清の前処理法である。
【０００９】
本発明は、前記精製の後、リシスバッファーに溶解する、前記の血清の前処理法である。
本発明は、前記リシスバッファーが、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、０．２〜０．６重量％の両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む、前記の血清の前処理法である。
【００１０】
本発明は、電気泳動のための、前記の血清の前処理法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、血清タンパク質から、血清アルブミン、免疫グロブリンを高効率で除去する。本明細書では、血清タンパク質から血清アルブミン及び免疫グロブリンを除外したものをその他の血清タンパク質と表記する。
【００１２】
本発明においては、まず前処理すべき血清試料を硫安分画することによって、通常血清タンパク質全体に対して５０〜６０重量％程度含まれている血清アルブミンの大部分を除去する。用いられる硫安（硫酸アンモニウム）の濃度は、５５〜６５％飽和、例えば６０％飽和である。ここで、％飽和で表される濃度は、２５℃における硫酸アンモニウムの溶解度に対する１００分率を表す。上記特定の範囲の濃度によって、血清タンパク質のうち、主にその他の血清タンパク質及び免疫グロブリンを沈殿させ、血清アルブミンの大部分を上澄みへ分画することができる。この範囲において沈殿する画分は、主として前記その他の血清タンパク質及び免疫グロブリンであり、少量の血清アルブミンも含まれている。この沈殿画分に含まれている血清アルブミンの量は、沈殿画分全体の量を基準として１５〜２５重量％程度である。
【００１３】
上記硫安分画による沈殿画分は、限外濾過によって脱塩・濃縮することができる。限外濾過は、常法により行うことができる。
【００１４】
本発明においては、前記硫安分画に加えて、さらにアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行う。アフィニティークロマトグラフィーは、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体（血清アルブミン用担体）、及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体（免疫グロブリン用担体）を用いて行う。
【００１５】
血清アルブミンに対する親和性吸着体としては、イオン相互作用、疎水相互作用、立体構造的相互作用等による結合部位が存在し、これらの作用が重なり合うことによって血清アルブミンを特異的に結合させるものを用いる。このような親和性吸着体としては、クロロトリアジン色素が挙げられる。クロロトリアジン色素の例としては、チバクロンブルーＦ３ＧＡ、プロシオンレッドＨＥ３Ｂなどが挙げられる。これら親和性吸着体は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。本発明においては、チバクロンブルーＦ３ＧＡを用いることが好ましい。
【００１６】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体を結合させる支持体としては特に限定されないが、架橋アガロースゲルを用いることが好ましい。支持体の形状としては特に限定されないが、ゲル等をビーズ状にしたものが好ましい。
本発明における血清アルブミン用担体としては、架橋アガロースビーズにチバクロンブルーＦ３ＧＡを結合させた担体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ（バイオラッド社製）を用いることが特に好ましい。
このような血清アルブミン用担体を用いることによって、前記沈殿画分に残留する血清アルブミンをさらに除去することができる。
【００１７】
免疫グロブリンに対する親和性吸着体としては、免疫グロブリンを特異的に吸着させる抗原物質を用いることが好ましい。このような親和性吸着体としては、プロテインＡ、プロテインＧなどが挙げられる。これら親和性吸着体は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。本発明においては、プロテインＡを用いることが好ましい。
【００１８】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体を結合させる支持体としては特に限定されないが、架橋アガロースゲルを用いることができる。支持体の形状としては特に限定されないが、ゲル等をビーズ状にしたものを用いることができる。
本発明における免疫グロブリン用担体としては、架橋アガロースビーズにプロテインＡを結合させた担体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（バイオラッド社製）を用いることが特に好ましい。
このような免疫グロブリン用担体を用いることによって、前記沈殿画分に含まれる免疫グロブリンを除去することができる。
【００１９】
上述したように、本発明においては、硫安分画と、上記血清アルブミン用担体及び上記免疫グロブリン担体を用いた精製とを組み合わせて行う。これによって得られる精製試料は、主としてその他の血清タンパク質を含み、血清アルブミン及び免疫グロブリンは少量含むのみである。特にこの精製試料に含まれる血清アルブミンはほとんど除去されており、その量は、精製試料全体の量を基準として０．３〜０．８重量％程度である。一方、この精製試料に含まれる免疫グロブリンの量は、精製試料全体の量を基準として５〜１５重量％程度である。
【００２０】
本発明においては、上記血清アルブミン用担体及び上記免疫グロブリン用担体を組み合わせて用いることによって、血清タンパク質から血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率よく取り除くことができる。このようにして得られた精製試料は、様々な血清プロテオーム解析に用いることができる。
【００２１】
２次元電気泳動によってプロテオーム解析を行う場合は、上述の硫安分画及び精製によって得られた精製試料を、リシスバッファーに溶解させる。前記リシスバッファーは、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、０．２〜０．６重量％の両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むことが好ましい。本発明においては、例えば、リシスバッファー全体を基準として５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、３重量％のＣＨＡＰＳ、１重量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４重量％のｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、及び５０ｍＭのＤＴＴの組成を有するリシスバッファーを用いることができる。
【００２２】
上記特定の範囲の組成を有するリシスバッファーを用いることによって、効率よく血清タンパク質成分を可溶化することができる。また、２次元電気泳動パターンにおいて多くのタンパク質スポットの数を検出することができ、各タンパク質スポットのフォーカスのされ方も優れている。
【００２３】
本発明の方法においては、検出できるタンパク質のスポットの数が従来の方法に比べて多く、各タンパク質のフォーカスのされ方も従来の方法に比べて優れている。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。また、「％」は特に断りのない限り、すべて重量基準である。
【００２５】
［実施例］
ラット血清１０μｌ（１０００μｇ）に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を９０μｌ加え、１００μｌとした。これに終濃度６０％硫安になるように１００％硫安溶液を加えた。攪拌後、氷上に３０分放置した。（このとき、１０分毎に攪拌した。）その後、２０，０００×ｇ、１時間、４℃で遠心操作を行った。得られた沈殿物に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４００μｌ加え、溶解した。溶解されたサンプルをマイクロコンＹＭ−３（ミリポア社製）に移し、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。マイクロコンＹＭ−３のリザーバーに１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を４００μｌ加え、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。濃縮された液をＡｕｒｕｍ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（バイオラッド製、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ及びＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎのキット）により精製した。精製試料をリシスバッファー（５Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、３重量％  ＣＨＡＰＳ、１重量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４重量％  ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００２６】
［比較例１］
ラット血清１００μｌ（１００μｇ）を６種類用意し、終濃度がそれぞれ３０、４０、５０、６０、７０、８０％飽和硫安になるように、それぞれに１００％硫安溶液を加えた。攪拌後、氷上に３０分放置した。（このとき、１０分毎に攪拌した。）その後、２０，０００×ｇ、１時間、４℃で遠心操作を行った。上清（ｓｕｐ）は、マイクロコンＹＭ−３（ミリポア社製）に移し、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。一方、沈殿物（ｐｐｔ）は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４００μｌに溶解し、マイクロコンＹＭ−３に移し、１４，０００×ｇ、４℃、１００分で遠心操作を行った。遠心操作を行った上清試料及び沈殿物試料それぞれに、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／４％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）／３０％グリセロール／０．０２５％ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー））を加え、１００℃で３分間加熱し、電気泳動用サンプルを調製した。それぞれの電気泳動用サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）に供し、ＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色を行った。
その結果を図１に示す。図１が示すように、６０％飽和硫安による沈殿画分におけるアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）の量が少なく、且つ他のタンパク質のロスも少ないという結果になった。
【００２７】
［比較例２］
ラット血清５０μｌ（５００μｇ）を、Ａｕｒｕｍ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔによって精製した。精製試料をリシスバッファー（５Ｍ  尿素、２Ｍ  チオ尿素、３重量％  ＣＨＡＰＳ、１重量％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４重量％  ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００２８】
［血清アルブミンの精製度の比較評価］
比較例２で精製に用いられた後のカラムゲル、及び実施例で精製に用いられた後のカラムゲルそれぞれに、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）／４％ＳＤＳ／３０％グリセロール／０．０２５％ＢＰＢ）を加え、１００℃で３分間加熱し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００２９】
試料に用いたラット血清、実施例の精製試料、比較例１の６０％飽和硫安による硫安分画後の沈殿物試料、比較例２の精製試料、比較例２の精製後のカラムゲルからの試料、及び実施例の精製後のカラムゲルからの試料のそれぞれの電気泳動用サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ゲル）にかけ、ＣＢＢ染色を行った。その結果を図２に示す。図２中、Ｍはマーカー、Ｃはラット血清、１は比較例１の硫安分画後の沈殿物試料、２は比較例２の精製試料、３は実施例の精製試料、４は比較例２の精製後のカラムゲルからの試料、５は実施例の精製後のカラムゲルからの試料である。Ｃ、１、２、及び３のレーンのゲルから血清アルブミンに相当するバンド部分を切り出し、その染色強度から血清アルブミンの量を概算した。
その結果、各レーンの全バンドに対する血清アルブミンの割合は以下のようになった。
Ｃ：４１．２％    １：１８．４％    ２：３．６％    ３：０．５％
【００３０】
以上の結果から、６０％飽和硫安による硫安分画と、Ａｕｒｕｍ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔとを組み合わせると、血清アルブミンをほとんど取り除くことができた。また、Ａｕｒｕｍ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔによる処理のみと比較しても、他のタンパク質の損失に大きな差はなかった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去する方法、及び血清タンパク質成分を可溶化するバッファーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】比較例１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図２】実施例及び比較例による血清アルブミンの精製度を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図１】
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【図２】
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