(57)【要約】【課題】液性因子による機能向上に加え、繊維芽細胞と肝実質細胞の直接接触による機能向上を加え、かつ長期培養を可能にする肝実質細胞の培養方法を提供する。【解決手段】プレート１０上の培養液に繊維芽細胞１１を播種し、培養する工程と、プレート１０が繊維芽細胞１１に覆われた後、洗浄して前記培養液を除去する工程と、肝実質細胞１３を、所要温度に保たれてゾル状をなす培地中１２に懸濁し、該培地１２と共に繊維芽細胞１１上に播種し、静置して肝実質細胞１３を培地１２中に沈降させて繊維芽細胞１１に接触させる工程と、冷却して培地１２をゲル化させる工程と、培地１２をゲル化した状態のまま肝実質細胞１３を培養する工程を含むことを特徴とする。【選択図】                図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレート上の培養液に繊維芽細胞を播種し、培養する工程と、
前記プレートが繊維芽細胞に覆われた後、洗浄して前記培養液を除去する工程と、
肝実質細胞を、所要温度に保たれてゾル状をなす培地中に懸濁し、該培地と共に前記繊維芽細胞上に播種し、静置して肝実質細胞を培地中に沈降させて前記繊維芽細胞に接触させる工程と、
冷却して前記培地をゲル化させる工程と、
培地をゲル化した状態のまま肝実質細胞を培養する工程を含むことを特徴とする肝実質細胞の培養方法。
【請求項２】
前記繊維芽細胞にマウス由来のＳＴＯ細胞を用いることを特徴とする請求項１記載の肝実質細胞の培養方法。
【請求項３】
前記培地のゲル化物質にアガロースを用いることを特徴とする請求項１または２記載の肝実質細胞の培養方法。
【請求項４】
前記アガロースがほぼ３７℃の温度でゾル状をなす低融点アガロースゲルであることを特徴とする請求項３記載の肝実質細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培地におけるアガロースの含有量がほぼ０．３ｗｔ％であることを特徴とする請求項３または４記載の肝実質細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は肝実質細胞の培養方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
現在の毒性評価は主に動物実験によって行われているが、費用の面、動物愛護的な面から問題が多く、代替法が強く求められている。
近年、代替法として、培養皮膚細胞など、一部の培養細胞を動物実験代替物として利用する動きがでてきているが、体内において薬物を代謝する役目を持っている細胞でテストすることが重要であることから、完全な代替物としての能力を有するには至っていない。
【０００３】
上記の現状を踏まえ、生体内で薬物の代謝を担う肝臓の細胞を体外で培養し、生体内に存在したときと同等の能力を発現させることができれば、動物実験の犠牲となる実験動物の数を大幅に減らし得る動物実験代替物となりうる。
上記実現のためには、肝臓の細胞、特に薬物代謝の機能を直接的に担う肝実質細胞を良好な状態で体外培養することが重要である。従来の研究には、体外で培養する肝実質細胞の機能向上のためには繊維芽細胞と肝実質細胞も共培養が有効とされている（例えば特開２００１−１４９０７０）。
【０００４】
【特許文献】
特開２００１−１４９０７０
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、繊維芽細胞と肝実質細胞の細胞間直接接触を持たせた共培養を試みると、接触の影響から培養初期には機能向上が見られるが、多くの場合増殖力旺盛な繊維芽細胞に押されて肝実質細胞が淘汰されてしまい、最終的には培養系から消滅してしまうことが知られている。
一方、繊維目細胞と肝実質の直接接触をとらず、細胞から培養液中に放出される液性因子のみを介した共培養においては、若干の機能向上を伴って、良好に培養を維持できることが報告されている。
そこで、本発明は、液性因子による機能向上に加え、繊維芽細胞と肝実質細胞の直接接触による機能向上を加え、かつ長期培養を可能にする肝実質細胞の培養方法を提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る肝実質細胞の培養方法は、プレート上の培養液に繊維芽細胞を播種し、培養する工程と、前記プレートが繊維芽細胞に覆われた後、洗浄して前記培養液を除去する工程と、肝実質細胞を、所要温度に保たれてゾル状をなす培地中に懸濁し、該培地と共に前記繊維芽細胞上に播種し、静置して肝実質細胞を培地中に沈降させて前記繊維芽細胞に接触させる工程と、冷却して前記培地をゲル化させる工程と、培地をゲル化した状態のまま肝実質細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
【０００７】
前記繊維芽細胞にマウス由来のＳＴＯ細胞を用いることができる。
また、前記培地のゲル化物質にアガロースを用いると好適である。
前記アガロースがほぼ３７℃の温度でゾル状をなす低融点アガロースが好適である。このアガロースの含有量をほぼ０．３ｗｔ％にすると好適である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下本発明の好適な実施の形態を詳細に説明する。
前記のように、本実施の形態では、図１に示すように、まず、プレート（培養皿）１０上の培養液に繊維芽細胞１１を播種し、培養する。
繊維芽細胞１１はマウス由来のＳＴＯ細胞を用いることができる。
プレート１０が繊維芽細胞１１に覆われるまで（コンフルエント状態）培養を行う。
培養液は公知のものを用いることができる。
培養後、繊維芽細胞１１を洗浄して培養液を除去する。
【０００９】
次に、通常の手段で単離した肝実質細胞を、恒温槽中で所要温度に保たれてゾル状（コロイド溶液）をなす培地中に懸濁し、該培地１２と共に繊維芽細胞１１上に播種する（図２）。
しばらく静置することによって、肝実質細胞１３の比重が培地１２よりも大きいことから、肝実質細胞１３が培地１２中を沈降し、図３に示すように繊維芽細胞１１に接触する状態となる。
【００１０】
この状態に至ったら、プレート１０を恒温槽から取りだし、氷浴中等で急冷して培地１２をゲル化させる。これにより肝実質細胞１３は、繊維芽細胞１１に接触してはいるが、回りをゲル化した培地１２で囲まれ、培地１２中に固定される状態となる。
次いで、インキュベーター中で肝実質細胞１３を培養するのである。
この状態のまま培養を継続すると、少なくとも１週間以上は良好に培養を維持できた。
因みに、回りをゲル化した培地で覆わない通常の状態で共培養すると、１週間以内で肝実質細胞は淘汰され、顕微鏡観察でも、機能評価的観点からも、肝実質細胞が培養系から消滅することが確認されている。
【００１１】
上記のように肝実質細胞１３をゲル化した培地１２で囲むことによって、肝実質細胞１３の運動が制限され、伸展が非常に遅くなる。繊維芽細胞１１は肝実質細胞１３の機能を引き出すのに有効に作用する。この作用は両細胞が接触していることによって機能する。一方、肝実質細胞１３は、回りを培地１２に囲まれていて伸展が遅く、したがって、狭い面積で繊維芽細胞１１と接触する。このように肝実質細胞１３が狭い面積で接触していることが、繊維芽細胞１１によって駆逐されない要因と考えられ、長い培養期間を維持することができ、長期にわたって肝実質細胞１３を実験に使用することができるのである。
【００１２】
すなわち、ゲル化した培地１２によって肝実質細胞１３を囲むことによって、両細胞の接触を保ちつつ、相手を排斥しないようにする、バランスのとれた培養系が構築されるのである。
培養液や、培地条件、生育条件は特に特別なものを必要とせず、通常の条件を用いることができる。他の液性因子等の添加も容易である。
【００１３】
上記培地１２のゲル化物質にアガロースを用いると好適である。
このアガロースには、ほぼ３７℃の温度でゾル状をなす低融点アガロースが存在し、この低融点アガロースを好適に用いることができる。この低融点アガロースの培地１２における含有量はほぼ０．３ｗｔ％であることが好ましい。
アガロースの含有量が０．３ｗｔ％前後の場合に、ゲル化した際の硬度が最適であり、肝実質細胞１３の必要以上の伸展を防止でき、長期間の培養を可能とする。
なお、アガロースの含有量が０．５ｗｔ％を越すと、ゲル化した培地からの制限が強すぎて肝実質細胞１３が伸展しないので好ましくない。
【００１４】
【実施例】
繊維芽細胞として、マウス由来のＳＴＯ細胞を用いた。ＳＴＯ細胞を播種したＴＣ１２Ｗｅｌｌプレートを、３７℃インキュベータにて培養し、コンフルエントなＳＴＯ細胞を得た。培養液は、ＰＳＮ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｎｅｏｍｙｃｉｎ：いずれも抗生物質）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ    ｍｏｄｉｆｉｅｄ    ｅａｇｌｅ´ｓ    ｍｅｄｉｕｍ）９０ｖｏｌ％に１０ｖｏｌ％のＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ    ｂｏｖｉｎｅ    ｓｅｒｕｍ：牛胎児血清）を加えたものを使用した。
コンフルエントになったＳＴＯ層の培養液を除去し、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。肝実質細胞は、３７℃に保った培地（ＰＳＮが含有されたＷＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍｓ´ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ）９０ｖｏｌ％に１０ｖｏｌ％のＦＢＳを添加し、０．３ｗｔ％の低融点アガロースを融解したもの）に懸濁し、１ｗｅｌｌあたり５００μｌ、２０万個を播種した。すぐさま３７℃にて２時間インキュベーションし、細胞を十分沈降させ、次いで氷冷して培地をゲル化した。
上記のように肝実質細胞と繊維芽細胞とを共培養した培地を定期的にサンプリングし、アルブミン産生能試験を行ったところ、図４に示すように、共培養しないものに比して有意に長期間、産生能が保持された。他の肝実質細胞のもつ機能についても向上が期待できる。
【００１５】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、液性因子による機能向上に加え、繊維芽細胞と肝実質細胞の直接接触による機能向上を加え、かつ長期培養を可能にする肝実質細胞の培養方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】プレートに繊維芽細胞を播種した状態の説明図である。
【図２】繊維芽細胞上に、肝実質細胞を懸濁した培地を播種した状態の説明図である。
【図３】肝実質細胞が沈降した状態を示す説明図である。
【図４】アルブミン産生能を示すグラフである。
【符号の説明】
１０  プレート
１１  繊維芽細胞
１２  培地
１３  肝実質細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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