(57)【要約】【課題】マウスの尿などの少量の試料しか得られない場合であっても、少量の試料中の微量のコラーゲンを測定することを可能にするコラーゲンの新規な測定方法を提供すること。【解決手段】抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法において被験試料を還元剤で処理することを特徴とする、コラーゲンの測定方法。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法において被験試料を還元剤で処理することを特徴とする、コラーゲンの測定方法。
【請求項２】
免疫分析が抗コラーゲン抗体を用いる蛍光イムノアッセイである、請求項１に記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項３】
免疫分析が、サンドイッチ式時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）である、請求項１又は２に記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項４】
コラーゲンがＩＶ型コラーゲンである、請求項１から３の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項５】
還元剤がジチオトレイトールである、請求項１から４の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項６】
被験試料が尿である、請求項１から５の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項７】
被験試料が実験動物の尿である、請求項１から６の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項８】
被験試料中の還元剤の濃度が０．１ｍＭから１０ｍＭである、請求項１から７の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項９】
被験試料中の還元剤の濃度が０．１ｍＭから５ｍＭである、請求項８に記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項１０】
被験試料中の還元剤の濃度が０．５ｍＭから５ｍＭである、請求項８に記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項１１】
下記の工程；
（１）被験試料を還元剤で処理する工程；
（２）抗コラーゲン固相化抗体を固定化した固相担体に、上記（１）で処理した被験試料を接触させる工程；
（３）上記固相担体に、標識物質を有する抗コラーゲン標識抗体を接触させる工程；及び、
（４）上記標識物質を利用して、抗コラーゲン固相化抗体に結合したコラーゲンを検出又は測定する工程；
を含む、請求項１から１０の何れかに記載のコラーゲンの測定方法。
【請求項１２】
少なくとも還元剤と抗コラーゲン抗体とを含む、請求項１から１１の何れかに記載のコラーゲンの測定方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲンの測定方法、より詳細には、少量の試料において高感度でコラーゲンを測定する方法、並びにコラーゲンの測定を行うためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩＶ型コラーゲンは、腎組織の腎糸球体及び尿細管から放出される腎細胞外基質の主要成分の一つである（Ｔ．　Ｉｉｊｉｍａ，　他、Ｊ．　Ｃｌｉｎｉ．　Ｌａｂ．　Ａｎａｌ．，　１９９８，　１２，３７８−３８２）。ＩＶ型コラーゲンの尿への排出は、病的腎臓におけるＩＶ型コラーゲンの産生亢進の結果として各種腎疾患の進行に伴って増加する。
【０００３】
糖尿病性腎症の良好な指標を探索することを目的とした最近の臨床試験によれば、尿中のＩＶ型コラーゲン量は亢進している細胞外基質の代謝の速さを正確に反映していると考えられている（Ｈ．　Ｏｋｏｎｏｇｉ，　他、Ｃｌｉｎ．　Ｎｅｐｈｒｏｌ．，　２００１，　５５，　３５７−３６４；Ｈ．　Ｍａｋｉｎｏ，　他、Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｍｕｎ．　Ｍｏｌ．　Ｐａｔｈｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　１９９５，　８８，２１５−２２３；及び、Ｍ．　Ｐ．　Ｃｏｈｅｎ，　他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，　２００１，　２４，　９１４−９１８）。また、ＩＶ型コラーゲンは糖尿病性腎症などの腎疾患において尿アルブミンよりも優れた指標である（Ｔ．　Ｉｉｊｉｍａ，　他、Ｊ．　Ｃｌｉｎｉ．　Ｌａｂ．　Ａｎａｌ．，　１９９８，　１２，　３７８−３８２；Ｍ．　Ｐ．　Ｃｏｈｅｎ，　他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ，　２００１，　２４，　９１４−９１８；Ｎ．　Ｂａｎｕ，　他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅｓ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐｒａｃｔ．，　１９９５，　２９，　５７−６７；及びＮ．　Ｋｏｔａｊｉｍａ，　他、Ｊ．　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　２０００，　１４，　１３−１７）。ヒトＩＶ型コラーゲンを測定するための各種のＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が臨床検査で使用されているが（Ｊ．　Ｒｉｓｔｅｌｉ，　他、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８１，　１１３，　３７２−　３７８；及びＫ．　Ｏｂａｔａ，他、Ｃｌｉｎ．　Ｃｌｉｍ．　Ａｃｔａ．，　１９８９，　１８１，　２９３−３０４）、極少量の検体量で尿中の微量なコラーゲンを測定することを可能にする実用的なマウスＩＶ型コラーゲンの測定方法は存在しない。
【０００４】
ＩＶ型コラーゲンは、自己凝集性を含む独特な構造的特徴を有する巨大なポリマーである（Ｒ．　Ｔｉｍｐｌ，　他、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８１，　１２０，　２０３−２１１；Ｐ．　Ｄ．　Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，　他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８４，　２３，　１８３９−　１８５０；Ｐ．　Ｄ．　Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，　他、Ｊ．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，　１９８６，　３４，　９３−１０２；Ｃ．　Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，　他、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　１９９２，　２６７，　２４５３３−２４５３７；Ｂ．　Ｓｉｅｂｏｌｄ，　他、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８７，　１６８，　５６９−５７５；Ｐ．　Ｄ．　Ｙｕｒｃｈｅｎｃｏ，　他、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１９８７，　１０５，　２５５９−２５６８；及びＲ．　Ｄｏｌｚ，　他、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８８，　１７８，　３５７−３６６）。ＩＶ型コラーゲン分子は各々、３つのドメイン（即ち、Ｎ末端領域の小さなコラーゲン性ドメインである７Ｓ、中間領域の大きなコラーゲン性ドメイン、及びＣ末端領域の非コラーゲン性球状ドメインであるＮＣ１）に分けることができる３本のα鎖から構成される。α鎖の３量体は７Ｓ及び大きなコラーゲン性ドメインでは３重らせんに組織化されているが、ＮＣ１ドメインでは各鎖は球構造に折り畳まれ、鎖内のジスルフィド結合により安定化されている。架橋ドメインとして７Ｓ及びＮＣ１ドメインを使用することにより、４つのＩＶ型コラーゲン分子が７Ｓドメイン中で結合し、２個の分子がＮＣ１ドメイン中で結合し、ＩＶ型コラーゲン分子の巨大な多角形ネットワークが生成する（Ｒ．　Ｔｉｍｐｌ，　他、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８１，　１２０，　２０３−２１１）。我々が特に注目した重要な構造的特徴は、ジスルフィド架橋が主要な結合として働き、分子内架橋の８８％で使用され、各ユニットを結合することにより多角形の巨大ネットワークを形成していることである（Ｂ．　Ｓｉｅｂｏｌｅｄ，　他、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９８８，　１７６，　６１７−６２４）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、マウスの尿などの少量の試料しか得られない場合であっても、少量の試料中の微量のコラーゲンを測定することを可能にするコラーゲンの新規な測定方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、実験モデルマウスにおける早期腎障害を正確に反映させることを目的として、非常に少量の検体量で微量にしか存在しないマウス尿中ＩＶ型コラーゲン量を測定するための高感度時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）を確立することを試みた。本発明者らは先ず、上記したようなＩＶ型コラーゲンの構造上の特徴に基づいて、試料をジチオトレイトールで前処理し、分子間ジスルフィド架橋の数を減少させた。ジチオトレイトールによる前処理により、多量の尿を必要とすることなく、マウス尿中のＩＶ型コラーゲンをより正確に測定することが可能になった。本発明の方法とＤＴＴを使用しない通常の競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＫＫ／Ｔａマウス（自然発症ＩＩ型糖尿病モデルマウス、Ｈ．Ｉｋｅｄａ，　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｒｅｓ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐｒａｃｔ．，　１９９４，　２４　（Ｓｕｐｐｌ．），　３１３−３１６）及び糖尿病を呈しないコントロールマウスとしてＢＡＬＢ／ｃマウスの両方を用いて尿中のＩＶ型コラーゲンの量を比較した結果、本発明の方法の有用性が確認された。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法において被験試料を還元剤で処理することを特徴とする、コラーゲンの測定方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、免疫分析は抗コラーゲン抗体を用いる蛍光イムノアッセイであり、さらに好ましくは、サンドイッチ式時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）である。
好ましくは、コラーゲンはＩＶ型コラーゲンである。
好ましくは、還元剤はジチオトレイトールである。
好ましくは、被験試料が尿であり、さらに好ましくは、実験動物の尿である。
【０００９】
好ましくは、被験試料中の還元剤の濃度は０．１ｍＭから１０ｍＭであり、より好ましくは０．１ｍＭから５ｍＭであり、さらに好ましくは０．５ｍＭから５ｍＭである。
【００１０】
本発明のコラーゲンの測定方法は、好ましくは、下記の工程；
（１）被験試料を還元剤で処理する工程；
（２）抗コラーゲン固相化抗体を固定化した固相担体に、上記（１）で処理した被験試料を接触させる工程；
（３）上記固相担体に、標識物質を有する抗コラーゲン標識抗体を接触させる工程；及び、
（４）上記標識物質を利用して、抗コラーゲン固相化抗体に結合したコラーゲンを検出又は測定する工程；
を含む。
【００１１】
本発明の別の側面によれば、少なくとも還元剤と抗コラーゲン抗体とを含む、コラーゲンの測定方法を行うためのキットが提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明によれば、マウス尿中ＩＶ型コラーゲンなどの微量のコラーゲンを測定するための高感度のイムノアッセイ法が提供される。本発明では、ＩＶ型コラーゲン分子の構造上の特徴に基づいて、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて被験試料の前処理を行う。ＤＴＴ処理を行わない従来の競合的ＥＬＩＳＡにおける検出限界は２．４ｎｇ／ｍｌであるのに対し、本発明の方法によれば、５μｌの尿試料中の２７ｐｇ／ｍｌのＩＶ型コラーゲンを測定することが可能である。
【００１３】
本発明の方法により、２種類のマウス系統（ＫＫ／Ｔａ及びＢＡＬＢ／ｃ）の１２試料に由来する尿中ＩＶ型コラーゲン量を測定した結果、糖尿病マウスと糖尿病でないマウスでは尿中のＩＶ型コラーゲン量が明らかに異なることが判明した。ＤＴＴによる前処理を行わない場合と比較して、本発明の方法は　極少量の試料でも測定可能であることから、検体量に限りのある特にマウスの尿中ＩＶ型コラーゲンの測定に適している。
【００１４】
本発明の抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析によるコラーゲンの測定方法においては、被験試料を還元剤で処理することを特徴とする。
本発明で用いる被験試料としては、コラーゲン量を測定する必要のあるものであれば特に限定されず、例えば、ヒト又はラットやマウスなどの哺乳動物の尿、血液、血清、血漿、組織液、唾液、汗等の任意の体液が挙げられる。本発明のコラーゲンの測定方法は、微量の試料中の少量のコラーゲンでも高感度に測定することができることから、通常は少量しか採取されず、多量の試料を集めることが困難であるマウスなどの実験動物の尿などを被験試料として用いることができる。
【００１５】
本発明で測定するコラーゲンの種類は特に限定されない。脊椎動物のコラーゲンはＩ型からＸＸＶ型に分類することができ、本発明ではこのうちの何れの型のコラーゲンを測定してもよい。本発明では、これらの中でも特に好ましくは、ＩＶ型コラーゲンを測定することができる。
【００１６】
本発明で用いる還元剤は、コラーゲン中のジスルフィド結合を還元することができる還元剤であれば特に限定されず、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノールなどを使用できる。特に好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を使用することができる。
【００１７】
本発明の方法では、被験試料を上記した還元剤で予め処理する。還元剤による処理の際における被験試料中の還元剤の濃度は、好ましくは０．１ｍＭから１０ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭから５ｍＭ、さらに好ましくは０．５ｍＭから５ｍＭであり、例えば、約２ｍＭとすることができる。還元剤の濃度が０．１ｍＭ未満であると、還元剤によるジスルフィド結合の還元作用が十分に発揮されず、また還元剤の濃度を１０ｍＭより高いと、コラーゲン分子のエピトープの立体構造に悪影響を与える可能性があるため、好ましくない。
【００１８】
本発明の免疫分析は、抗コラーゲン抗体を用いる免疫分析である。
本発明で用いる抗コラーゲン抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、これらの抗体は、通常の抗体の作成方法により取得することができる。また、抗体としては、ＩｇＧだけでなく、抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等）を使用してもよい。
【００１９】
例えば、ポリクローナル抗コラーゲン抗体は、コラーゲンを抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。抗原投与の方法は当業者に公知であり、投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができる。また、必要に応じてアジュバントを使用することもできる。免疫感作した哺乳動物を適当な期間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定する。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原を投与して追加免疫を行なってもよい。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗コラーゲン抗体を得ることができる。
【００２０】
また、モノクローナル抗体は、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマを作製することにより取得することができる。抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用することができる。例えば、免疫動物から抗体産生細胞として脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞と公知の方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６　４９５（１９７５））により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングする。更に、コラーゲンを用いた酵素免疫測定法によりスクリーニングを行なうことにより、所望のコラーゲンを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。ハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
【００２１】
本発明によるコラーゲンの測定方法としては、例えば蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、発光免疫測定法等を例示することができる。例えば、抗コラーゲン抗体を不溶性担体に結合させて抗体結合不溶性担体を調製し、この担体を用いてサンドイッチ式免疫測定法を行なうことができる。本発明の方法を、例えば、サンドイッチ式免疫分析を行う場合には、
（１）被験試料を還元剤で処理する工程；
（２）抗コラーゲン固相化抗体を固定化した固相担体に、（１）で処理した被験試料を接触させる工程；
（３）上記固相担体に、標識物質を有する抗コラーゲン標識抗体を接触させる工程；及び、
（４）上記標識物質を利用して、抗コラーゲン固相化抗体に結合したコラーゲンを検出又は測定する工程；
を含む工程により行うことができる。
【００２２】
標識抗体として使用する抗コラーゲン抗体には、標識物質、好ましくは非放射性標識物質により標識する。非放射性標識としては、酵素標識、蛍光標識、発光標識等の標識を用いることができる。酵素標識としては、例えば標識用酵素としてアルカリ性フォスファターゼ（ＡＬＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ等を用いることができる。これらの酵素の検出には、それぞれの酵素基質であるそれぞれ、４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）、過酸化水素と３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンの組合せ、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等を用いることができる。これらの酵素基質は、酵素の作用を受けて変化（例えば開裂）することにより発色し、検出することができる。
【００２３】
免疫分析の測定方法をその機器の測定原理により分類すると下記を挙げることができるが、本発明ではこれらの何れの方法を使用してもよい。
【００２４】
（Ａ）化学発光免疫測定装置
１．ＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ）（酵素を用いて化学発光を起こす）
２．ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ）（触媒を用いて化学発光を起こす）
３．ＥＣＬＩＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ）（電気的変化によって化学発光を起こす）
【００２５】
（Ｂ）ラジオイムノアッセイ測定装置
１．ラジオイムノアッセイ（Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ；　ＲＩＡ）　競合法
２．イムノラジオメトリック法（Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒａｄｉｏ　Ｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ；　ＩＲＭＡ）
【００２６】
（Ｃ）酵素免疫測定装置
１．エンザイムイムノアッサイ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ；　ＥＩＡ）
２．ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）
【００２７】
（Ｄ）蛍光、蛍光偏向免疫測定装置
１．蛍光エンザイムイムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ；　ＦＥＩＡ）
２．蛍光偏向イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ａｓｓａｙ；　ＦＰＩＡ）
３．時間分解蛍光測定装置（ＴＲ−Ｆ）
【００２８】
（Ｅ）ラッテクス凝集免疫測定装置
（Ｆ）ネフェロメトリック免疫測定装置
（Ｇ）イムノセンサー
１．電気化学免疫センサー
２．オプティカル免疫センサー
３．サーマル免疫センサー
４．ピエゾアコースティック免疫センサー
【００２９】
本発明の免疫分析は好ましくは蛍光イムノアッセイであり、特に好ましくは、サンドイッチ式時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）である。
三価希土類イオンの中で，サマリウム（Ｓｍ）、ユウロピウム（Ｅｕ），テルビウム（Ｔｂ）およびジスプロシウム（Ｄｙ）イオンは特定の配位子と錯生成をすると，金属イオン特有の蛍光を強く発することが知られている。これらの錯体の蛍光は以下のような特徴を有する：（１）蛍光寿命が非常に長く、希土類蛍光錯体、特にユウロピウムとテルビウムの錯体は数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を持つ；（２）ストークスシフトが非常に大きい。ほとんどの場合，これらの錯体は紫外光を吸収して励起され，５００　ｎｍ以上の可視光を発する；（３）蛍光発光ピークの半値幅が約１０から２０　ｎｍであり，非常にシャープである。このような蛍光特性を利用することにより、希土類蛍光錯体を標識物質として利用する時間分解蛍光イムノアッセイが開発されている。時間分解蛍光イムノアッセイでは、様々な短寿命のバックグラウンド蛍光をなくすことができ、高感度な測定が可能である。
【００３０】
本発明はまた、コラーゲンの測定用キットを提供する。本発明のキットには、少なくとも還元剤と抗コラーゲン抗体とが含まれている。抗コラーゲン抗体は、固相化抗体及び標識抗体の２種類を含めてもよい。本発明のキットには、さらに、上記した標識物質を検出するための試薬を含めることもできる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００３１】
【実施例】
（Ａ）材料と方法
（１）実験動物
動物実験は、順天堂大学の動物施設のガイドラインに従って行った。本実験のために、２種類の近交系のマウス（ＫＫ／ＴａおよびＢＡＬＢ／ｃ）を日本クレア（東京、日本）から４週齢で購入した。６週齢以降から、マウスは、実験の全期間を通じて、食物（げっ歯動物ペレット食（ＣＥ−２；３４２．２ｋｃａｌ／１００ｇ、４．４％粗脂肪を含有）および水を自由に摂取させながらプラスチックケージ中に個別に飼育した。雄マウスのみを本実験では使用した。マウスは全て、１２時間の明期／１２時間の暗期の規則的な光周期を伴う通常の条件下で同じ部屋で飼育し、温度は２４±１℃に調節した。２０週齢で評価した糖負荷試験により、ＫＫ／Ｔａが完全に糖尿病であることを示した。大量の尿が比較用に必要であったので、尿試料を１０日間繰り返し採取した。耐糖能は、マウス用の腹腔内糖負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を使用して評価した。ＩＰＧＴＴは、一晩絶食したマウスにグルコース（２０％溶液で２ｇ／ｋｇ）を腹腔内注入することにより行った。後眼窩から採取された血液中グルコース量を、腹腔内へのグルコース注入後０分（空腹時血糖値）および１２０分に、Ｇｌｕｔｅｓｔ　Ｅ（京都第一化学、京都（日本））を使用して測定した。体重も同週令に測定した。
【００３２】
（２）抗体及び抗原
ウサギポリクローナル抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体は、ＮＯＶＯＴＥＣ（Ｓｔ　Ｍａｒｔｉｎ　Ｌａ　Ｇａｒｅｎｎｅ、フランス）から購入した。マウスＩＶ型コラーゲンと交差反応するビオチン化ヤギポリクローナル抗ヒトＩＶ型コラーゲン抗体はＡｂｃａｍ社（ケンブリッジ、英国）から得た。Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ移植マウス腫瘍由来のＩＶ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を標準抗原として使用した。
【００３３】
（３）ＢＨＨＣＴによるストレプトアビジンの標識
ストレプトアビジンは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）から得た。ストレプトアビジ−ＢＳＡ結合体（ＳＡ−ＢＳＡ）は既報の通り調製した（Ｊ．　Ｙｕａｎ，　Ｇ．　Ｗａｎｇ，　他、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９９７，　２５４，　２８３−２８７）。ＳＡ−ＢＳＡ結合体を、キレート化合物ＢＨＨＣＴで既報の通り標識した（Ｊ．　Ｙｕａｎ，　Ｇ．　Ｗａｎｇ，　他、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９９７，　２５４，　２８３−２８７）。溶液は、１．０×１０−７　Ｍ　ＥｕＣｌ３，　０．２％　ＢＳＡ，　０．１％　ＮａＮ３　及び０．９％　ＮａＣｌを含む０．０５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　緩衝液　（ｐＨ　７．８）　（希釈緩衝液）を添加することによって希釈し、イムノアッセイに使用する前の２時間５６℃で反応させた。
【００３４】
（４）時間分解蛍光イムノアッセイ（ＴＲ−ＦＩＡ）を用いたマウス尿ＩＶ型コラーゲンの測定
尿試料を等量の２ｍＭジチオトレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　社、ＣＡ、米国）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。標準ＩＶ型コラーゲン溶液（２０００ｎｇ／ｍｌ）も同様に２ｍＭのＤＴＴ　とインキュベートした。試料を希釈緩衝液で希釈後、５０μｌの尿又は標準溶液を、ウサギ抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体（１：２００希釈抗体５０μｌ／ウェル）を予め被覆した蛍光測定用マイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｎ．Ｙ．，　米国）のウェルに添加した。５℃で一晩インキュベーションした後、ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液で３回洗浄し、５０μｌのビオチン化抗ＩＶ型コラーゲン抗体（１：３００に希釈）を添加した。５℃で一晩インキュベーションした後、５０μｌのＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋標識ＳＡ−ＢＳＡ結合体（ＳＡ−ＢＳＡ−ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋）溶液を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。最後に、ウェルを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．１）で３回洗浄し、プレートを固相蛍光測定に供した。時間分解蛍光測定を、Ａｒｖｏ　ＳＸマルチラベルカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｂｏｓｔｏｎ，　ＭＡ，米国）を用いて、３４０ｎｍで励起、０．２ｍｓのディレイタイム、及び０．４ｍｓのウィンドウタイムで行った。蛍光強度は６１５ｎｍで測定した。
【００３５】
（５）競合的ＥＬＩＳＡを用いたマウス尿ＩＶ型コラーゲンの測定
競合的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（コラーゲンＩＶ　Ｍキット、Ｅｘｏｃｅｌｌ社、フィラデルフィア、ＰＡ、米国）を用いて尿ＩＶ型コラーゲンを測定した。アッセイはキットの指示に従って行い、２４０μｌの尿試料を使用した。
【００３６】
（６）クレアチニンアッセイ
尿中クレアチニンは、尿試料用の市販キット（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ，　Ｅｘｏｃｅｌｌ社、フィラデルフィア、ＰＡ、米国）を使用して測定した。
【００３７】
（７）ＩＶ型コラーゲンのｍＲＮＡのノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析に使用するプローブは既報の通り調製した（Ｅ．　Ｐ．　Ｐｅｔｅｎ，他、Ａｍ．　Ｊ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１９９２，　２６３，　９５１−９５７）。２０週齢のＫＫ／ＴａおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの全腎臓からの全ＲＮＡの単離は、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ，　ＣＡ，米国）を用いて行った。ＲＮＡ（１０μｇ）を１．５％アガロース上で電気泳動し、ナイロン膜に転写した。膜は４時間プレハイブリダイゼーションを行い、次いで、マウスＩＶ型コラーゲンのα１鎖及び及びＧＡＰＤＨに対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブで一晩ハイブリダイズさせた。洗浄後、膜をイメージ・プレート（富士写真フィルム会社、東京、日本）に露出した。イメージ・プレート上のバンドの強度は、ＢＡＳｔａｔｉｏｎ　２５００（富士写真フイルム会社、東京、日本）の濃度計走査モデルによって定量した。　　　最後に、α１鎖のバンドの強度の補正は、ＧＡＰＤＨのバンド強度で行った。
【００３８】
（８）統計分析
データは平均±ＳＤとして表現した。２種の異なるマウス系統間の統計的有意差は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ検定によって測定した。ＥＬＩＳＡ及びＴＲ−ＦＩＡ間の回帰相関分析は、Ｓｐｅａｒｍａｎの検定を用いて行った。０．０５未満のＰ値を有意差ありとみなした。
【００３９】
（Ｂ）結果
（１）競合的ＥＬＩＳＡおよびＴＲ−ＦＩＡシステム間の検出限界の比較
競合的ＥＬＩＳＡ及びＴＲ−ＦＩＡによるマウスＩＶ型コラーゲンの標準曲線は図１に示す。３×ＳＤのバックグラウンドを用いて特定したＴＲ−ＦＩＡの検出限界は、既報の方法を用いると、２７ｐｇ／ｍｌである（Ｊ．　Ｙｕａｎ，　Ｇ．　Ｗａｎｇ，　他、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１９９７，　２５４，　２８３−２８７）。同時に測定した際の、平均変動係数は４．２％であった（８種の異なる濃度で０．４〜７．４％）。ＴＲ−ＦＩＡの検出限界（２７ｐｇ／ｍｌ）は、競合的ＥＬＩＳＡの検出限界より約１／１００小さかった。尿試料への標準抗原の回収率を得るために、１：５に希釈したヒト尿を希釈剤として使用した。希釈したヒト尿中の５種の異なる濃度の標準マウスＩＶ型コラーゲン（２．５、１０、４０、１６０、及び３２０ｎｇ／ｍｌ）をアッセイした。ヒト尿試料に添加したマウスＩＶ型コラーゲンの回収率は、各濃度で９５％以上であった。
【００４０】
（２）希釈したマウス尿試料の分析
２０週齢の糖尿病ＫＫ／Ｔａおよび糖尿病を呈していないＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した尿試料を使用して、尿のマウスＩＶ型コラーゲンの濃度と蛍光強度の相関関係を調べた（図２）。各系統（ｎ＝３）の尿試料を稀釈緩衝液で希釈した。試料を前処理なしでアッセイした場合、蛍光強度は希釈１：２０から１：２まで減少した（白四角で示す）。この傾向は、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりＫＫ／Ｔａマウスにおいてより顕著であった。ＫＫ／Ｔａマウス尿中の抗原の低い回収率は、ＩＶ型コラーゲンが多数のジスルフィド結合により巨大分子を呈していることによって引き起こされる可能性がある。これは、巨大分子のウェルへの非特異的付着を介した免疫反応の妨害が示唆している。そこで、マウス尿試料は、分析前にＤＴＴで処理した。
【００４１】
（３）ＤＴＴ前処理による尿中ＩＶ型コラーゲン測定のための至適条件の検討
測定用の至適条件を確立するために、尿試料の前処理におけるＤＴＴ濃度の効果を検討した（図３Ａ）。ＤＴＴ濃度を変化させた（１、２および５ｍＭ）。結果は図３に示す。標準抗原も同様に処理した（図３Ｂ）。両方の分析で、標準溶液は、２ｍＭのＤＴＴ濃度でほとんど影響を受けず、尿試料中のＩＶ型コラーゲンの最良の分析は２ｍＭで達成された。希釈前に２ｍＭの濃度のＤＴＴで前処理することにより、尿のＩＶ型コラーゲン濃度と蛍光強度との間で正の相関関係がＫＫ／Ｔａマウスで観察された（図３Ｂ中で黒四角で示す）。
【００４２】
マウスＩ型及びＩＩ型コラーゲンなどの他の型のコラーゲンとの交差反応性を確認するために、両方の型のコラーゲンも２ｍＭのＤＴＴで処理した。これらの型のコラーゲンとの交差反応は観察されず、ＤＴＴによる前処理がＩ型及びＩＩ型等の他のコラーゲン分子に対して交差性を与えずに、ＩＶ型コラーゲンへの特異性が保たれることが確認された。
【００４３】
（４）ＫＫ／ＴａおよびＢＡＬＢ／ｃマウスの耐糖能および体重
表１に示す通り、２０週齢の正常コントロールＢＡＬＢ／ｃマウスでの知見と比較して、２０週齢のＫＫ／Ｔａマウスは、空腹時血糖の上昇および耐糖能の低下並びに肥満を呈した　（ｐ＜０．０１）。
【００４４】
【表１】
2004108914.tif 000002
【００４５】
（５）ＴＲ−ＦＩＡおよび通常の競合イムノアッセイを用いた、２種のマウス系統の尿中ＩＶ型コラーゲンの濃度の測定
ＴＲ−ＦＩＡの有用性を検討するために、マウスＩＶ型コラーゲンを、市販のキットを使用して競合的ＥＬＩＳＡによって同時に測定した。図４に示す通り、２０週齢の糖尿病のＫＫ／Ｔａおよび糖尿病でないＢＡＬＢ／ｃマウスにおける尿のＩＶ型コラーゲンの濃度を、ＴＲ−ＦＩＡおよび競合的ＥＬＩＳＡの両方で測定した。各々の免疫測定において、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりＫＫ／Ｔａマウスの方が濃度は高かった（ｐ＜０．０１）。しかし、ＴＲ−ＦＩＡでの濃度範囲は、競合的ＥＬＩＳＡでの濃度範囲より高かった。さらに、ＴＲ−ＦＩＡでは、ＫＫ／ＴａとＢＡＬＢ／ｃマウス間の値の相違が、競合的ＥＬＩＳＡの場合よりも大きかった。正の相関関係がこれらの分析間で見られた（相関係数＝０．６０７、ｐ値＝０．０３４）。
【００４６】
（６）ノーザンブロット分析
図５に示す通り、ＩＶ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現は、ＢＡＬＢ／ｃマウスと比較してＫＫ／Ｔａマウスでより顕著に増加した。濃度測定スキャニングにより、α１鎖のｍＲＮＡの発現がＢＡＬＢ／ｃマウスよりＫＫ／Ｔａマウスにおいて１１．１倍高いことが示された。
【００４７】
（Ｃ）考察
病的腎臓ではＩＶ型コラーゲンの産生が亢進することが報告されている（Ｍ．　Ｓ．　Ｒａｚｚａｑｕｅ，　他、Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌ．，　１９９４，　１７４，　１３１−１３８；及びＴ．　Ａ．　Ｊａｃｏｔ，　他、Ｌａｂ．　Ｉｎｖｅｓｔ．，　１９９６，　　　７５，　７８１−７９９）。これらの報告に加えて尿中ＩＶ型コラーゲン値について検討した様々なクリニカルスタディーの結果は、尿中ＩＶ型コラーゲンの増加が早期腎障害の良好な指標であることを示唆しているが、げっ歯動物から尿試料などの極少量の尿試料で使用できる高感度のアッセイ法は存在しなかった。現在使用されている通常のＥＬＩＳＡは多量（２４０μｌ）の試料が必要であるが、マウス尿は、１回の排泄で極少量しか得られず、多量の検体採取が困難である。しかし、標識としてユウロピウムキレート化合物（ＢＨＨＣＴ−Ｅｕ３＋）を使用するＴＲ−ＦＩＡを利用して、極少量の試料中の尿ＩＶ型コラーゲンを測定できることが判明した。
【００４８】
ＩＶ型コラーゲンは複数の構造上の特徴を有する巨大分子である。ゲルクロマトグラフィー分析によれば、尿試料中でＩＶ型コラーゲンは３４０　ｋＤａに最大ピークを有する（Ｈ．　Ｍａｋｉｎｏ，　他、Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｍｕｎ．　Ｍｏｌ．　Ｐａｔｈｏｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，　１９９５，　８８，　２１５−２２３）。上記の通り、この巨大分子は、主な結合として多数のジスルフィド結合を各々有するポリマー単位から構成されている。一般にイムノアッセイは、測定すべき分子の大きさに伴いその複雑度が増すと言われている。ＤＴＴによる前処理をしないアッセイでは、多量のコラーゲンがＫＫ／Ｔａマウスの尿に排泄されるにも拘わらず、高濃度の尿試料での蛍光強度はＩＶ型コラーゲンの量に比例しなかった。この正の相関関係の喪失は、抗原抗体反応の妨害が原因であり、自己凝集性の巨大分子ネットワークにより立体的に遮蔽されるものと考えられた。
【００４９】
抗原抗体反応では、抗体は、抗原の表面上のペプチドのみを認識すると一般に考えられている（Ｇ．　Ｓ．　Ｐａｇｅ，　他、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．，　１９８８，　６２，　１７８１−１７９４）。２ｍＭのＤＴＴと２ｍＭのグアニジンを使用してＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍマウス腫瘍からＩＶ型コラーゲンを効率的に抽出したことが報告されている（Ｈ．　Ｋ．　Ｋｌｅｉｎｍａｎ，　他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１９８２，　２１，　６１８８−６１９３）。本発明では、ＤＴＴで多数のジスルフィド架橋を還元することによって、尿中のＩＶ型コラーゲンの分子の大きさを小さくして、抗体がコラーゲン分子の表面エピトープを十分に認識できるようにすることを試みた。その結果、尿試料をＤＴＴで前処理することによって、尿のＩＶ型コラーゲンの濃度とＴＲ−ＦＩＡのシグナル強度の間の正の相関関係を回復させた。ジスルフィド結合は、ＩＶ型コラーゲン分子の立体構造に関与する分子間及び分子内結合の一部を担っていると考えられる。２ｍＭ以上のＤＴＴを標準溶液に添加しても良好な結果が得られなかったことから、過剰な前処理は分子内ジスルフィド結合にも影響を与える結果、抗原のエピトープの立体構造に変化をもたらす可能性がある。
【００５０】
ＤＴＴによる前処理を行ったＴＲ−ＦＩＡと市販のキットを用いる競合的ＥＬＩＳＡは、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりもＫＫ／Ｔａマウスの方が尿ＩＶ型コラーゲンの濃度が高いという同様の傾向を示したが、これらのイムノアッセイでは以下のような明白な相違が見られた。
【００５１】
ＴＲ−ＦＩＡの濃度範囲は競合的ＥＬＩＳＡの場合よりほぼ１００倍近く高かった。これは、アッセイ法、使用した抗体、ＤＴＴの添加などの相違に起因するものである。ＤＴＴによる添加は、競合的ＥＬＩＳＡの場合よりＴＲ−ＦＩＡの場合におけるＫＫ／ＴａとＢＡＬＢ／ｃマウスのさらなる相違の増加に寄与している可能性がある。ＴＲ−ＦＩＡの結果と同様に、ノーザンブロット分析でも、ＩＶ型コラーゲンのｍＲＮＡはＢＡＬＢ／ｃマウスの場合よりもＫＫ／Ｔａマウスの場合の方が著明に発現が亢進していることが示された。この発現量の相違はＴＲ−ＦＩＡ分析の結果を支持するものである。ＴＲ−ＦＩＡでは５μｌだけの尿試料が必要であったが競合的ＥＬＩＳＡでは２４０μｌが必要であった。ＴＲ−ＦＩＡではＤＴＴによる前処理を行ったために少量の試料でも十分であった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、極少量の試料中の微量のコラーゲンを測定することが可能になる。また、本発明の方法によれば、他の型のコラーゲンと交差反応することなくマウス系統間のコラーゲン量の相違を明確化することができる。本発明の方法を利用することにより、アルブミン等のタンパク質を指標とする従来のアッセイ法を使用する場合よりも、実験用モデルマウスにおけるより早期の腎障害をより感度よく評価することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＴＲ−ＦＩＡ（Ａ）及び競合的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）によるマウスＩＶ型コラーゲンの標準曲線を示す。各点は、４回の実験の平均±ＳＤを示す。
【図２】
図２は、ＩＶ型コラーゲンを含むマウス尿の濃度とＴＲ−ＦＩＡの蛍光強度との相関関係を示す。ＤＴＴの添加の前（白の四角と丸で示す）と後（黒の四角と丸で示す）の濃度は、ＫＫ／Ｔａ及びＢＡＬＢ／ｃの尿試料を用いて測定した。各点は、３回の実験の平均±ＳＤを示す。
【図３】
図３は、尿及び標準試料に対するＤＴＴ濃度の影響を示す。ＫＫ／Ｔａマウスからの尿試料及び標準溶液を０、２及び５ｍＭの等量のＤＴＴと一緒にインキュベートした。
【図４】
図４は、２０週齢のＫＫ／Ｔａ（ｎ＝６）及びＢＡＬＢ／ｃ（ｎ＝６）マウスにおけるマウス尿ＩＶ型コラーゲン量の比較を示す。測定は、ＴＲ−ＦＩＡ（Ａ）及び市販の競合的ＥＬＩＳＡ（Ｂ）を用いて行った。
＊　ＫＫ／ＴａはＢＡＬＢ／ｃよりも有意に高い（ｐ＜０．０１）
【図５】
図５は、ＫＫ／Ｔａ及びＢＡＬＢ／ｃの全腎臓から単離したＩＶ型コラーゲン（α１鎖）のｍＲＮＡ発現を示す。
【図１】
2004108914.tif 000003
【図２】
2004108914.tif 000004
【図３】
2004108914.tif 000005
【図４】
2004108914.tif 000006
【図５】
2004108914.tif 000007