(57)【要約】【課題】安定性に優れたベシクルであって、しかもレシチンを使用しなくとも生体適合性にも優れたベシクルを提供すること。また、とくに難しい操作を要することなく、比較的簡単な操作でベシクルを提供すること。【解決する手段】少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを含有する組成物から、少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを膜成分とするベシクルを調製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを含有することを特徴とするベシクル調製用組成物。
【請求項２】
少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを膜成分とすることを特徴とするベシクル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを構成成分とすることを特徴とするベシクル調製用組成物に関する。また少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとをベシクルの膜成分とする安定性に優れたベシクルに関する。
【０００２】
【従来技術と発明が解決すべき課題】
例えば経口投与された医薬、体内に投与されたＸ線造影剤などを望まれる部位まで輸送させ、有効な治療を行うための手段としてベシクルを利用する方法が研究され、数多くの報告がなされている。また、美白剤、防腐剤、顔料など各種化合物をベシクルに予め内包させておき、該化合物を徐々にベシクル外に放出させる方法が研究されており、化粧品、食品などに応用されている。
それらベシクル関連技術では、生体内に投与されることなどの点から生体内に存在する膜成分であるレシチンに注目し、ベシクルを製造する研究がなされている。これらレシチンから調製されるベシクルは、それ自体の不安定性が指摘されており、レシチンにコレステロールを共存させてベシクルの安定性を向上させる技術が知られている。さらに、ベシクル膜の安定性を高めるためにレシチンにコレステロール誘導体を共存させ（特許文献１を参照）、イソプレノイド骨格を有する酸あるいはアルコールを共存させておく技術が開示されている（特許文献２を参照）。しかし、それらの技術により一応の安定性は改善されたものの、さらに安定性が高められることが求められている。
【０００３】
一方、安定性の高いベシクルを得るために、レシチンを使用せずにベシクルを開発する技術が報告されている。すなわち、ショ糖脂肪酸ジエステルを用いて安定なベシクルを製造でき（特許文献３を参照）、マルチトールジ脂肪酸エステルを用いて安定なベシクルを製造できた（特許文献４を参照）との報告がある。しかし、これら化合物は極めて水に分散しがたく、単独ではベシクルを形成できないのであり、それら化合物に例えばイオン性界面活性剤を加えて初めてベシクルを形成するという不都合さが残っていた。
【０００４】
【特許文献１】
特開平２−２２５４９５号公報
【特許文献２】
特開平４−２７９５２１号公報
【特許文献３】
特開平５−１５５７６７号公報
【特許文献４】
特開平６−１５７２９６号公報
【０００５】
そこで本発明の課題は安定性の優れたベシクルであって、しかもレシチンを使用しなくとも生体適合性にも優れたベシクルを提供することにある。また、とくに難しい操作を要することなく、比較的簡単な操作でベシクルを提供することにある。
なお、本発明では、ベシクルはリポソームと異なるものではないとする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定のリン含有化合物を選択しベシクルを調製することができること、そして該リン含有化合物に特定の化合物を共存させると、安定性に優れたベシクルを得ることができるという知見を得、さらにこの知見に基づいて研究を重ね、遂に本発明の到達した。
【０００７】
すなわち、本発明により
少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを構成成分とするベシクル調製用組成物、および
少なくともポリプレニルリン酸あるいはその塩とポリプレニルアルコールとを膜成分として調製されるベシクル
が提供された。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
まずベシクルを構成する成分であるポリプレニルリン酸あるいはその塩について説明する。
ここでいうポリプレニルリン酸あるいはその塩とは、二つあるいは二つ以上のイソプレン単位を有する炭化水素基とリン酸あるいはその塩とからなる化合物、それらの部分水素化物あるいは完全水素化物である。また、その炭化水素の一部が環化され一つの炭素環を有する化合物も含まれる。
【０００９】
好ましい炭化水素基は、イソプレン単位を２〜８有する炭化水素基であり、さらにはイソプレン単位を３〜６有する炭化水素基が好ましく、イソプレン単位を４有する鎖状の炭化水素基がとくに好ましい。
上記炭化水素基がリン酸あるいはその塩と結合する上記炭化水素基の数は一つでよいが、二つあるいは三つでもよい。
【００１０】
本発明では、ポリプレニルリン酸としては、ポリプレニルモノリン酸あるいはポリプレニルジリン酸が使用可能である。
ポリプレニルリン酸あるいはその塩としては、具体的には、ゲラニルゲラニルリン酸、フィチルリン酸、フィタニルリン酸、ゲラニルファルネシルリン酸、ファルネシルファルネシルリン酸、それらのモノナトリウム塩、ジナトリウム塩、モノアンモニウム塩、ジアンモニウム塩、モノシクロヘキシルアンモニウム塩、ジシクロヘキシルアンモニウム塩を例示できる。
その中でも好ましいポリプレニルリン酸あるいはその塩としては、ゲラニルゲラニルリン酸、フィチルリン酸、フィタニルリン酸、それらのモノナトリウム塩、ジナトリウム塩を挙げることができる。
これらリン酸あるいはその塩は単独で使用することが好ましいが、所期の目的を達成できる限り、複数の化合物を用いてもよいし、その他のリン脂質を共存させてもよい。
【００１１】
次にベシクルを構成する成分であるポリプレニルアルコールについて説明する。ここでいうポリプレニルアルコールとは二つあるいは二つ以上のイソプレン単位からなる炭化水素基を有するアルコール、それらの部分水素化物あるいは完全水素化物である。また、炭化水素の一部が環化され一つの炭素環を有するアルコールも含まれる。
【００１２】
好ましい炭化水素基は、イソプレン単位を２〜８有する炭化水素基であり、さらにはイソプレン単位を３〜６有する炭化水素基が好ましく、イソプレン単位を４有する鎖状炭化水素基がとくに好ましい。
【００１３】
ポリプレニルアルコールとしては、具体的には、ゲラニルゲラニオール、ゲラニルファルネソール、ファルネシルファルネソール、フィトール、フィタノールを例示できる。また、上記アルコールから導かれる、末端に６員脂環基が１つ形成された炭化水素のアルコールも例示できる。
【００１４】
上記化合物は市販品を購入することにより入手できる。また、ユーカリ、ペパーミント、クスノキ、バラ、ラベンダーなどの植物からイソプレノイドを抽出し、ついでそれらイソプレノイドから常法により上記化合物を調製することも可能である。
【００１５】
上記ポリプレニルリン酸とポリプレニルアルコールとの組合せはとくに限定されないが、とくに、ゲラニルゲラニルリン酸ジナトリウム塩とファルネシルファルネソールあるいはその脂環基置換体との組合せ、ゲラニルゲラニルリン酸ジナトリウム塩とゲラニルゲラニオールあるいはその脂環基置換体との組合せ、ゲラニルゲラニルリン酸ジナトリウム塩とフィトールあるいはその脂環基置換体との組合せ、ゲラニルゲラニルリン酸ジナトリウム塩とフィタノールから選ばれるアルコールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィチルリン酸ジナトリウム塩とゲラニルファルネソールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィチルリン酸ジナトリウム塩とゲラニルゲラニオールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィチルリン酸ジナトリウム塩とフィトールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィタニルリン酸ジナトリウム塩とゲラニルファルネソールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィタニルリン酸ジナトリウム塩とゲラニルゲラニノールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィタニルリン酸ジナトリウム塩とフィトールあるいはその脂環基置換体との組合せ、フィタニルリン酸ジナトリウム塩とフィタノールあるいはその脂環基置換体との組合せが好ましく、その中でもとくにゲラニルゲラニルリン酸ジナトリウム塩とフィトールとの組合せ、フィチルリン酸ジナトリウム塩とフィトールとの組合せ、フィタニルリン酸ジナトリウム塩とフィトールとの組合せがとくに好ましい。
【００１６】
上記ポリプレニルリン酸とアルコールとの量割合は、使用するポリプレニルリン酸やアルコールにより変動するので一概に規定することができないが、代表的な例としてはポリプレニルリン酸に対してアルコールを１〜２０モル％、好ましくは１〜１０モル％共存させると好ましい結果をもたらすことができる。
本発明では上記化合物以外に所期の目的を達成できる限り他の化合物を共存させてもよい。その量はとくに限定されない。
【００１７】
上記化合物を用い、公知の方法を利用してベシクルを調製することができる。その調製法としては、超音波処理法、アニーリング法、凍結融解法、高圧噴射乳化法、押し出し法、薄膜法、プレベシクル法、逆相蒸発法、トリトンＸ−１００バッチ法、エタノール注入法、エーテル注入法などを例示できる。さらにはそれらの製法を組み合わせてベシクルを調製することもできる。
【００１８】
ベシクル調製法の一例を説明する。
ベシクル調製用物質をエタノールなどの溶媒に溶かす。ベシクルに内包される化合物を含む液体を添加し、高速度高剪断均質化ミキサーなどの装置を用いて激しく混合すると、ベシクル含有分散液を得ることができる。
さらにこの分散液を超音波処理してもよい。
【００１９】
ベシクル調製法の異なる一例を説明する。
ベシクル調製用物質を溶媒に溶かす。次に、溶媒を蒸発させて、薄膜を得る。この薄膜に水、または水性緩衝液を加え、出発物質の結晶融解温度以上の温度条件下でベシクル調製用物質を水和させ、攪拌することによりベシクル含有分散液を得る。この際、ベシクル調製用物質が複数種類共存するときには、最も高いベシクル調製用物質の結晶融解温度以上の温度でベシクル調製用物質を水和させる。この後、ベシクル径がより小さいベシクル含有分散液、あるいはより均一なベシクル径分布を有するベシクル含有分散液を得ることもできる。
【００２０】
上記溶媒はベシクル調製用物質を溶解できるのであれば特に限定されないが、容易に蒸発除去できる溶媒が好ましい。具体的には、例えばメタノール、エタノール、ブタノールなどの低級アルコール、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサンなどの炭化水素、クロロホルムなどのハロゲン化炭素、それらの混合溶媒などが挙げられる。
溶媒を蒸発させる際には減圧下加熱することが好ましい。
溶媒の添加量は特に限定されるないのであり、ベシクル調製用物質を溶解でき、しかもその後の操作がし易い程度の濃度であるような量だけ加えればよい。
【００２１】
上記水性緩衝液は、公知の緩衝液を使用することができる。具体的にはリン酸ナトリウム系緩衝液などが挙げられる。
上記水あるいは水性緩衝液を薄膜に加え、攪拌することによりベシクル含有分散液が得られる。水あるいは水性緩衝液の添加量は後の操作がし易い量である限り特に限定されず、上記攪拌する条件はベシクルが調製できる条件であるかぎりとくに限定されない。この際、水あるいは緩衝液に、ベシクルに内包させる化合物を共存させてもよい。内包させる化合物の添加量は用いる化合物により異なるので一概に規定することができないが、ベシクル調製用組成物に対して、約１〜約３０重量％とすると好ましい結果をもたらすことができる。
【００２２】
調製されたベシクル分散液内のベシクル径を調整する方法は公知である。代表的な方法として、ベシクル径調整用のフィルターを通過させて、ベシクルの径分布を揃えることができる。上記フィルターの代表例として一定の範囲のポアサイズを有するポリカーボネート膜が用いられる。すなわち、ポリカーボネート膜にベシクル含有分散液を接触させ、ベシクル含有分散液を通過させ、ベシクル径を揃えることができる。例えば、ポアーサイズ２００ｎｍのポリカーボネート膜を用いると１８０−２１０ｎｍ程度の直径を有するベシクル含有分散液を得ることができる。
なお、ベシクル含有分散液に超音波処理して、より小さな径を持つベシクルを含有する分散液を調製することも可能である。
ベシクル径の調整処理する工程に入る前に、凍結融解処理を数回繰り返すと、さらに好ましい結果が得られる。
【００２３】
上記各種方法によって得られるベシクルは、通常多層構造あるいは単層構造を有する球状あるいは球状に近い形状であり、５０ｎｍ〜５０μｍ程度の径を有する。径が大きければそれだけ内包する化合物の量を増すことができるので有利である。一方、生体内での輸送のしやすさから言えば小さい方が有利である。
【００２４】
このベシクルに種々の化合物を内包させることができる。
化合物を内接させる方法は公知の方法を使用すればよい。例えば、ベシクル調製用出発物質に当該化合物を添加し、ベシクルを調製する方法、すでに調製されたベシクル含有分散液に当該化合物を添加し、加熱、攪拌し、化合物を内包するベシクル含有分散物を調製する方法などが例示される。
内包させる化合物としてはとくに医薬が適している。具体的には、抗がん剤、抗炎症剤、狭心症治療剤、血管拡張剤、脳代謝賦活剤、抗アレルギー・抗喘息薬、各種ビタミン類などが挙げられる。その他の化合物としては、美白剤、保湿剤、防腐剤、色素、香料、芳香剤、安定剤などを挙げることができる。
【００２５】
このベシクルに種々の化合物を内包したベシクルは医薬組成物、化粧品製造用材料、皮膚外用剤用組成物、口腔用組成物などの構成成分として利用される。
これら組成物あるいは材料は、医薬品、診断用製品、化粧品、食品、記録材料などに配合され、経口投与、生体内投与、粘膜への適用、体表面への適用などにより利用される。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例、比較例に基づき本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
実施例１
フィチルリン酸ジナトリウム塩５．００ｍｇとフィトール０．３５ｍｇとをクロロホルム−メタノール混合溶液（１：１）（ｖ／ｖ）１ｍＬに添加し、ベシクル調製用組成物を得た。
【００２８】
実施例２
実施例１の組成物を減圧下、溶媒を留去し、薄膜を得た。該薄膜を一昼夜真空ポンプ（１３．３Ｐａ）で乾燥した後、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を含むクエン酸−Ｎａ２ＨＰＯ４系緩衝液（ＰＨ：５．８１）（以下、Ａ液という）１．５ｍＬを加え、ボルテックスミキシングを５分間行い、粗分散液を得た。次にこの分散液を−７８℃に冷却した。この冷凍物を３５℃で融解した後、ボルテックスミキシングを行った。これら一連の操作、すなわち、ボルテックスミキシング処理−凍結処理−融解処理を１サイクルとして、５サイクル行い、最後にボルテックスミキシング処理した。このサイクル処理した液体にＡ液を加えて２５ｍＬに調整する。次いで、この液体を、所定のポアーサイズを有するポリカーボネート膜を備えたＥｘｔｒｕｄｅｒ（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｅｍｅｍｂｒａｎｅｓ社製）を用いて窒素雰囲気下２２℃で押し出し処理した。この押し出し処理操作を１０回繰返して行い、表１記載のベシクル径を有する単層ベシクル含有分散液を得た。
【００２９】
実施例３〜７
表１記載のポリプレニルリン酸ジナトリウム塩と、ポリプレニルアルコールを使用する以外は、実施例２と同様な操作を行い、ベシクル含有分散液を得た。
【００３０】
試験例１      ベシクル径の測定
電子顕微鏡（ＣＭ１２  Ｐｈｉｌｉｐｓ社製）を用いて、調製されたベシクル含有分散液のベシクル径を測定した。
測定結果を表１に示した。
【００３１】
試験例２      ａ）ベシクル径の分布の測定
動的散乱法  （Ｎ４ＭＤ  装置；Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ社製）を用いて、実施例２で得られたベシクル含有分散液のベシクル径の分布を測定した。その結果、ベシクル径の分布は単一分散分布であることを確認した。
【００３２】
試験例３      ベシクル膜の水透過速度の測定
この試験では、２つのシリンジ、それぞれのシリンジに設けられたチューブが途中で１つに合一したチューブとつながる１つのキュベット、キュベットにレーザー光を照射するレーザー光照射部、照射されたレーザー光の散乱光を測定する光散乱強度測定部などを備えたストップドフロー装置（Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ＤＸ−１７ＭＶ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ社製）を使用した。
【００３３】
調製されたベシクル分散液１００μＬを上記ストップドフロー装置内に備えられたシリンジに注入し、ＮａＣｌ（７５ｍＭ）を含むクエン酸−Ｎａ２ＨＰＯ４系緩衝液（ＰＨ：５．８１）（以下、Ｂ液という）１００μＬを異なるシリンジに注入し、表１記載の温度に３０分間保った。次に、各シリンジ内の液体を押し出し、混合し、キュベット内に移送した。本操作は０．３秒で行われた。押し出し操作と同時に同キュベットにレーザー光（Ｈｅ−Ｎｅ：λ＝６３２．８ｎｍ）を照射し、散乱された光をフォトマルで集め、光散乱強度を測定した。この測定を約２分間行った。光散乱強度が時間に対して一定の値をとるようになったときに反応が終了したとした。この測定は、同じサンプルに対して１５−２０回行った。
【００３４】
一次反応速度定数ｋは式（１）から算出し、半減期ｔ１／２は式（２）から算出した。
Ｉ（ｔ）＝Ｉ∞  ＋（Ｉｏ−Ｉ∞）ｅ−ｋｔ          （１）
ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ                                  （２）
（式中、Ｉ（ｔ）はｔ時間経過後の光散乱強度、Ｉｏは混合直後の光散乱強度、Ｉ∞はベシクルの膨潤が終了した時間における光散乱強度、ｋは一次反応速度定数、ｔは経過時間、ｔ１／２は半減期を示す）
測定結果を表１に示した。なお、測定結果は平均値である。
【００３５】
表１
2004323382.tif 000002
＊  １３−（２，６，６−トリメチル−２−シクロヘキセニル−１−イル）−３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−トリデセノール
【００３６】
比較例１〜６
表２記載のポリプレニルリン酸ジナトリウム塩と、ポリプレニルアルコールを使用する以外は、実施例２と同様な操作を行い、ベシクル含有分散液を得た。
【００３７】
試験例４
比較例１〜６で得られたベシクル含有分散液に、試験例１、３と同様な操作を行い、ベシクル径を求め、一次反応速度定数ｋと半減期ｔ１／２を算出した。
その結果を表２に示した。
【００３８】
表２
2004323382.tif 000003
表１と表２とから、本発明のベシクル調製用組成物から調製されたベシクルは膨潤され破壊されにくく、水透過が低い。このことは浸透圧がかかる環境でも内包された化合物の漏れが低いことを示している。一方、本発明で使用するポリプレニルリン酸だけ、あるいはジミリストイルホスファチジルコリンから調製されるベシクル、本発明で使用するポリプレニルリン酸とビタミンＡあるいはコレステロールから調製されたベシクルは膨潤されやすく、水透過が高いことが判明した。このことは浸透圧がかかる環境ではベシクルは膨潤され、破壊されやすく、内包された化合物の漏れが高いことを示している。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、安定性の高いベシクルを得ることができ、また、とくに難しい操作を必要とすることなくベシクルを調製することができる。このベシクルは多用されているレシチンから調製されるベシクルよりも安定である。さらに、レシチンから調製されるベシクルは広く存在するホスホリパーゼで加水分解を受け破壊されやすい。ところが、本発明で調製されたベシクルはホスホリパーゼで加水分解されないのであり、ターゲットへの内包された化合物の輸送に適している。
このベシクルを使用するとベシクルに内包された化合物を長く保持することができ、しかも生体への適合性も優れているので、極めて実用的である。