(57)【要約】【課題】化学物質の生体における吸収・代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用を効率的に測定する方法およびこの方法に使用可能な形質転換細胞を提供する。【解決手段】本発明は、少なくとも１種のシトクロームＰ４５０発現遺伝子と、少なくとも１種のホルモンレセプター発現遺伝子と、少なくとも１種の発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子とが哺乳動物由来細胞に導入されている、シトクロームＰ４５０とレポーターとを発現する形質転換細胞を提供する。この細胞により同一細胞内での化学物質の代謝および代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用の連続的な測定が可能になる。さらに得られた細胞の培養系と化学物質の吸収機能を有する細胞との複合培養系により、化学物質の吸収・代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用の連続的かつ効率的な測定が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のシトクロームＰ４５０発現遺伝子と、
少なくとも１種のホルモンレセプター発現遺伝子と、
少なくとも１種の、発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子と、
が哺乳動物由来細胞に導入されている、シトクロームＰ４５０とレポーターとを発現する形質転換細胞。
【請求項２】
前記少なくとも１種のホルモンレセプター発現遺伝子がエストロジェンレセプター発現遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の形質転換細胞。
【請求項３】
前記哺乳動物由来細胞がヒト肝臓由来のＨｅｐＧ２細胞であることを特徴とする、請求項１または２に記載の形質転換細胞。
【請求項４】
前記少なくとも１種のシトクロームＰ４５０発現遺伝子がヒトシトクロームＣＹＰ３Ａ４発現遺伝子およびヒトシトクロームＣＹＰ３Ａ７発現遺伝子の少なくともいずれかを含むことを特徴とする、請求項３に記載の形質転換細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換細胞の培養系を形成し、
被験化学物質を含む試料を前記培養系上に導入して前記形質転換細胞内に吸収させ、
吸収された化学物質をシトクロームＰ４５０により代謝させ、
発生した代謝物質をホルモンレセプターに結合させ、
ホルモンレセプターによる転写活性化を通してレポーターを発現させ、
レポーターの発現量を測定する、
ことにより被験化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換細胞の培養系上に化学物質吸収機能を有する細胞の膜組織を重ねた複合培養系
【請求項７】
前記膜組織がＣａｃｏ−２細胞の膜組織であることを特徴とする、請求項６に記載の複合培養系。
【請求項８】
請求項６または７に記載の複合培養系における膜組織上に被験化学物質を含む試料を導入し、
被検化学物質を前記膜組織に吸収させて該膜組織を通過させ、
通過した化学物質を形質転換細胞の培養系に吸収させ、
吸収された化学物質をシトクロームＰ４５０により代謝させ、
発生した代謝物質をホルモンレセプターに結合させ、
ホルモンレセプターによる転写活性化を通してレポーターを発現させ、
レポーターの発現量を測定する、
ことにより被検化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質の内分泌撹乱作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定のために好適に使用されるシトクロームＰ４５０とレポーターとを同時に発現する形質転換細胞に関する。本発明はまた、上記形質転換細胞を含む複合培養系、および上記細胞または複合培養系を利用した内分泌撹乱作用の測定方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
近年、環境中に放出された後に生体内に吸収された化学物質が、少量であっても生体の生殖系、免疫系、神経系などに大きな影響を及ぼし、さらに生殖障害や胎児障害を通じて次世代にも影響を与える、という現象が多数報告されている。これらのいわゆる内分泌撹乱化学物質は、ホルモンレセプターとの結合により生体の内分泌系に影響を及ぼすと考えられている。例えば、化学物質がホルモンレセプターに結合し、以後ホルモンがレセプターに結合した場合と同様に結合後のレセプターがＤＮＡ上の特定の位置（ホルモン応答配列）に結合し、その結果特定のｍＲＮＡが転写される。ｍＲＮＡは核外に出てメッセージの翻訳が行われ、特定のたんぱく質が必要以上に合成される。逆に化学物質がレセプターと結合し、ホルモン自体がレセプターに結合することを阻害する場合もある。その結果、特定のたんぱく質の合成が阻害される。内分泌撹乱化学物質は、その作用の違いにより、エストロジェン様作用、抗エストロジェン様作用、アンドロジェン作用、抗アンドロジェン様作用、甲状腺ホルモン撹乱作用、副腎皮質ホルモン撹乱作用を示す物質に分けられ、中でもエストロジェン様作用物質は最も深刻な影響が懸念される物質である。
【０００３】
内分泌撹乱作用が疑われる化学物質には、ビスフェノールＡ、ノニルフェノール、フタル酸エステル等の産業化学物質、エンドサルファン、メトキシクロル等の農薬類、ダイオキシンを始めとする有機ハロゲン化合物、医薬品（合成ホルモン）、および天然物質（植物性エストロジェンおよび天然ホルモン）が含まれており、環境省では現在までに６７種類の化学物質を内分泌撹乱作用が疑われる化学物質として指定している。しかし、世界中で生産されている何万種類もの化学物質のうちどれが内分泌撹乱作用を有するかは一部を除いてほとんど明らかになっていないのが現状である。また、ダイオキシン類のように非意図的に生産される化学物質、環境中で生物学的あるいは化学的な反応によって生産される化学物質についても内分泌撹乱作用は明らかになっていない。さらに、化学物質はヒト体内に吸収されたのち主として肝臓で代謝を受け、その結果化学物質の内分泌撹乱作用が変化する。例えば農薬の１種であるメトキシクロルはそれ自身では内分泌撹乱作用を示さないが、肝臓細胞により代謝を受けてエストロジェン様作用を示すようになる。従って、これらの多種に及ぶ化学物質の内分泌撹乱作用を調査して化学物質の適正管理を実施していくためには、効果的かつ高感度な内分泌撹乱作用の測定方法を開発する必要があり、さらに開発される測定方法は、生体に吸収される化学物質だけでなく吸収された化学物質の代謝物質に関しても測定可能な方法であるのが好ましい。
【０００４】
化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法として、現在までに幾つかの方法が提案され、実行されている。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ測定法としては、卵巣摘出成熟ラットあるいは幼若ラットに化学物質を投与して子宮重量の増加を測定することによりエストロジェン様作用を測定する方法、魚類を使用したヒドロジェニンアッセイ法があり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定法としては、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７を使用した細胞増殖アッセイ法がある。また、上述のホルモンレセプターと内分泌撹乱化学物質との結合を利用した測定法も提案され、実施されている。例えば、被験化学物質のレセプターに対する結合の強さを検出するレセプター結合アッセイ法、レセプターに結合した物質が標的遺伝子を活性化する能力を検出する遺伝子組換えヒト細胞あるいは遺伝子組換え酵母を使用したレポータージーンアッセイ法がある。特に、レポータージーンアッセイ法は測定感度が高くかつ高速スクリーニングが可能である点で優れているため盛んに研究が行われており、例えば、特表平９−５０２３４５号公報には抗エストロジェン様活性の測定方法が、特表平１１−５０３３１２号公報にはエストロジェン様活性の測定方法が開示されており、特開２０００−２０１６８８公報、特開２０００−３００２５８公報、および特開２００１−１９７８９０公報には好適なエストロジェンレセプター発現遺伝子および測定用細胞が開示されている。
【０００５】
しかし、このような従来の測定方法は様々な問題を抱えている。例えば、ラットによるエストロジェン様作用の測定方法および魚類を使用したヒドロジェニンアッセイ法はあくまで動物実験であるため、化学物質の人体への影響を考慮した場合、すなわち「人体モデル」として考慮した場合には、測定結果を人体に対して外挿する方法が問題となる。また、ＭＣＦ−７を使用した細胞増殖アッセイ法、レセプター結合アッセイ法およびレポータージーンアッセイ法の場合には、測定すべき化学物質の標的が分子あるいは細胞レベルに止まっており、化学物質が生体内に吸収された後に代謝されるというプロセスの一部が測定に反映されているに過ぎない。
【０００６】
これに対し、化学物質が生体内に吸収された後に代謝されるというプロセスを考慮に入れて生体への影響をより厳密に調査する方法も提案されている。
【０００７】
まず、化学物質をラット肝臓由来のＳ９画分あるいはヒト肝臓由来のミクロソーム画分により代謝させた後、代謝物質の内分泌撹乱作用を測定する方法が検討されており、例えば、鈴木  典子らは、ラット肝臓由来のＳ９画分を培養し、これに化学物質を加えて一定時間代謝反応を行わせた後、代謝物をレポータージーンアッセイ法により測定する方法を開示している（環境ホルモン学会第３回研究発表会要旨集１７７頁参照）。
【０００８】
また、Ｐ．ＡｒｔｕｒｓｓｏｎとＪ．Ｋａｒｌｓｓｏｎは、ヒト小腸上皮細胞であるＣａｃｏ−２細胞を培養した膜組織の化学物質の吸収移送挙動が人体における化学物質の吸収挙動とよい相関を示すことを発見し、Ｃａｃｏ−２細胞の膜組織が人体における化学物質の吸収モデルとして適していることを開示しており（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍ．  １７５  （１９９１）  ８８０−８８５  参照）、鈴木  基之らは、上述のＣａｃｏ−２細胞と人体における化学物質の代謝モデルとして適するヒト肝臓由来のＨｅｐＧ２細胞との複合培養系を「人体モデル」として形成し、ベンゾピレンの吸収・代謝プロセスを経た細胞毒性発現の測定を行っている（第１４回日本動物実験代替法学会要旨集１３４ページ参照）。この文献では、生体内での代謝において最も重要な役割を果たしている代謝酵素シトクロームＰ４５０（以後、代謝酵素シトクロームＰ４５０を単に“Ｐ４５０”と言う。）の誘導剤である３−メチルコラントンまたは７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリンを使用してＨｅｐＧ２細胞を処理することによりＰ４５０の誘導を行い、ＨｅｐＧ２細胞の化学物質の代謝能を向上させた場合の細胞毒性発現の検討も行っている。
【０００９】
さらに、Ｍ．ＳａｗａｄａとＴ．Ｋａｍａｔａｋｉは、Ｐ４５０発現遺伝子を細胞内に導入して得たＰ４５０を一過的にまたは安定に発現する形質転換細胞およびこの形質転換細胞を使用した化学物質の細胞毒性評価に関する研究をまとめて紹介している（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１１  （１９９８）１９−４３参照）。また、特開２００１−８６８１号公報は、同様のヒト型Ｐ４５０を安定に発現するヒト肝臓癌細胞由来の安定形質転換株およびこの形質転換株に所定の化学物質を作用させた際の細胞形態の変化、生細胞数の変動、細胞内酵素の漏出、細胞表層構造の変化あるいは細胞内酵素の変動などを観察することによる化学物質の毒性評価方法を開示している。
【００１０】
【特許文献１】
特表平９−５０２３４５号公報
【特許文献２】
特表平１１−５０３３１２号公報
【特許文献３】
特開２０００−２０１６８８公報
【特許文献４】
特開２０００−３００２５８公報
【特許文献５】
特開２００１−１９７８９０公報
【特許文献６】
特開２００１−８６８１号公報
【非特許文献１】
鈴木典子、他３名、“環境ホルモン学会第３回研究発表会要旨集”，ｐ．１７７
【非特許文献２】
Ｐ．Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍ．”，１９９１年，１７５巻，３号，ｐ．８８０−８８５
【非特許文献３】
鈴木基之、他３名、“第１４回日本動物実験代替法学会要旨集”，ｐ．１３４−１３５
【非特許文献４】
Ｍ．Ｓａｗａｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｋａｍａｔａｋｉ，“Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，１９９８年，４１１巻，ｐ．１９−４３
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述の鈴木  典子らによるラット肝臓由来のＳ９画分による代謝を利用した内分泌撹乱作用の測定方法は、代謝反応後内分泌撹乱作用の測定前に代謝物質の抽出操作の必要があるなどステップ数が多く、試験器材も多く、高価で非効率的である上に、代謝反応と代謝物質の内分泌撹乱作用の測定との間に不連続性が生ずるため将来の自動化が困難であると考えられる。また、この方法も生体における吸収のプロセスを経ていない化学物質を測定することになるため、体内現象の一部が測定に反映されているに過ぎない。
【００１２】
また、鈴木  基之らによるＣａｃｏ−２細胞とＨｅｐＧ２細胞との複合培養系を開示する文献には化学物質の吸収・代謝プロセスを経た後の細胞毒性について開示されているものの、内分泌撹乱作用の測定方法および代謝物質の内分泌系への影響については何ら開示されていない。発明者らはＨｅｐＧ２細胞が内分泌撹乱作用の測定に使用するのに十分な化学物質の代謝能を有しているか否かを確認した。その結果、ＨｅｐＧ２それ自体の代謝能は非常に低く、３−メチルコラントンまたは７−ベンジルオキシ−４−（トリフルオロメチル）−クマリンによりＰ４５０の誘導を行った場合でも、従来化学物質の代謝反応を行わせるために使用されているラット肝臓由来のＳ９画分あるいはヒト肝ミクロソームと比較すると代謝能が不十分であった。また、誘導剤を使用して細胞の代謝活性を増加させる方法によると、被検化学物質の種類によっては、被検化学物質と細胞内に残存する誘導剤との相互作用による内分泌撹乱作用の測定結果への影響が懸念される。
【００１３】
さらに、Ｐ４５０発現遺伝子を直接細胞内に導入することにより化学物質の代謝能を向上させる方法を開示しているＭ．Ｓａｗａｄａらによる文献および特開２００１−８６８１号公報にはＰ４５０の高度の発現が開示されているものの、細胞毒性の評価結果、細胞形態の変化、生細胞数の変動等が開示されているのみであり、内分泌撹乱作用の測定方法および代謝物質の内分泌系への影響については全く開示されていない。また、この方法も生体内における吸収のプロセスを経ていない化学物質の細胞毒性を調査することになるため、やはり体内現象の一部が調査に反映されているに過ぎない。
【００１４】
従って、本発明の目的はまず、優れた化学物質の代謝能を有しておりかつ測定感度が高い点で有利なレポータージーンアッセイをも同時に行うことができる細胞を提供することである。また本発明の別の目的は、同一細胞により化学物質の代謝と内分泌撹乱作用の測定を連続的に行う方法、さらには化学物質の吸収・代謝のプロセスを経た内分泌撹乱作用を簡便かつ連続的に測定する方法、すなわち「生体モデル」として取り扱うことができる方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、同一細胞内にＰ４５０発現遺伝子とホルモンレセプター発現遺伝子と発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子とを導入しても各遺伝子の機能および各遺伝子から発現する各タンパク質の機能が相互作用により悪影響を受けることがないことを確認し、また、得られた形質転換細胞における化学物質の代謝能は内分泌撹乱作用の測定のために十分であり、従って代謝物質の内分泌撹乱作用を同一細胞により簡便かつ連続的に測定することができることを発見し、本発明の完成に至った。
【００１６】
すなわち、本発明はまず、少なくとも１種のＰ４５０発現遺伝子と、少なくとも１種のホルモンレセプター発現遺伝子と、少なくとも１種の発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子と、が哺乳動物由来細胞に導入されている、Ｐ４５０とレポーターとを発現する形質転換細胞を提供する。
【００１７】
この細胞における化学物質の代謝能は導入されたＰ４５０発現遺伝子によるＰ４５０の発現のため著しく高い。さらに、ホルモンレセプター発現遺伝子と発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子とが同一細胞内に導入されているため、この形質転換細胞自体により化学物質の代謝反応と代謝物質についてのレポータージーンアッセイを連続的に行うことが可能である。
【００１８】
導入されるホルモンレセプター発現遺伝子は、上述のように特にエストロジェン様作用物質が生体に深刻な影響を及ぼすため、エストロジェンレセプター発現遺伝子であるのが好ましい。上記哺乳動物由来細胞は、特に興味のある人体に対する内分泌撹乱化学物質の影響を調査する目的のためにはヒト由来細胞が好ましく、ヒト肝臓由来細胞がより好ましく、ＨｅｐＧ２細胞が特に好ましい。この場合、ヒト由来細胞内に導入されるＰ４５０発現遺伝子にはヒトシトクロームＣＹＰ３Ａ４発現遺伝子および／またはヒトシトクロームＣＹＰ３Ａ７発現遺伝子が含まれているのが好ましい。
【００１９】
本発明ではさらに、上記形質転換細胞の培養系を形成し、被験化学物質を含む試料を上記培養系上に導入して上記形質転換細胞内に吸収させ、吸収された化学物質をＰ４５０により代謝させ、発生した代謝物質をホルモンレセプターに結合させ、ホルモンレセプターによる転写活性化を通してレポーターを発現させ、レポーターの発現量を測定することにより被験化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法を提供する。この方法により、被験化学物質の生体における代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定を同一細胞により連続的かつ簡便に行うことが可能になる。
【００２０】
さらに、本発明は、上記形質転換細胞の培養系上に化学物質吸収機能を有する細胞の膜組織を重ねた複合培養系を提供する。この複合培養系は化学物質の生体における吸収・代謝プロセスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現するために好適であり、従ってこの複合培養系は「生体モデル」として取り扱うことができる。形質転換細胞の培養系上に形成される膜組織としては、ヒト小腸上皮細胞であるＣａｃｏ−２細胞の膜組織が好ましい。
【００２１】
さらに、本発明は、上述の複合培養系における膜組織上に被験化学物質を含む試料を導入し、被検化学物質を上記膜組織に吸収させてこの膜組織を通過させ、通過した化学物質を形質転換細胞の培養系に吸収させ、吸収された化学物質をＰ４５０により代謝させ、発生した代謝物質をホルモンレセプターに結合させ、ホルモンレセプターによる転写活性化を通してレポーターを発現させ、レポーターの発現量を測定することにより被検化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法を提供する。この方法により、被験化学物質の生体における吸収・代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定を同一培養容器内で連続的に行うことができ、従って簡易で迅速かつ高感度な自動測定が可能になる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の形質転換細胞は、少なくとも１種のＰ４５０発現遺伝子と、少なくとも１種のホルモンレセプター発現遺伝子と、少なくとも１種の発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子と、が哺乳動物由来細胞に導入されている、Ｐ４５０とレポーターとを発現する形質転換細胞である。
【００２３】
本発明において、Ｐ４５０発現遺伝子およびホルモンレセプター発現遺伝子が導入されるべき哺乳動物由来細胞は、導入されるＰ４５０発現遺伝子およびホルモンレセプター発現遺伝子の機能および発現したＰ４５０およびホルモンレセプターの機能が十分に発揮されるような細胞であればよい。しかし、特定の種に関する内分泌撹乱作用の調査を目的とする場合には宿主細胞としてその種の細胞を使用するのが好ましく、例えば特に興味のある人体に関する内分泌撹乱作用の調査を目的とする場合には、ヒト由来細胞、好ましくはＰ４５０の補酵素の発現量が十分であり化学物質の代謝活性が高いＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ３、ＷＲＬ６８、ＰＬＣ／ＲＲＦ／５等のヒト肝臓由来細胞、特に好ましくはＨｅｐＧ２細胞を宿主細胞として使用する。
【００２４】
宿主細胞は公知の方法により培養することができる。例えばヒト肝臓由来細胞はヒト肝臓癌より分離して得ることができ、１０（ｖ／ｖ）％となるようにウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地中で培養したヒト肝臓由来細胞、特に好ましくはＨｅｐＧ２細胞、をトリプシン溶液で分散させた後、プレートのウエルに播くことにより培養することができる。播種濃度が低すぎると培養に時間がかかり、細胞の死滅につながり、逆に播種濃度が高すぎると細胞が弱体化する。播種濃度は１×１０４個／ｍＬ以上であり、特に２×１０４個／ｍＬ以上であるのが好ましく、１×１０６個／ｍＬ以下であり、特に５×１０５個／ｍＬ以下であるのが好ましい。
【００２５】
特定の種に関する内分泌撹乱作用の調査を目的として選択された宿主細胞には、好ましくはその種のＰ４５０発現遺伝子が導入される。例えば人体に関する内分泌撹乱作用の調査を目的として選択されたヒト肝臓由来細胞、特に好ましくはＨｅｐＧ２細胞には、ヒトＰ４５０発現遺伝子であるヒトＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７等の発現遺伝子のうちの少なくとも１種が導入される。この場合には、ヒトＣＹＰ３Ａ４発現遺伝子および／またはＣＹＰ３Ａ７発現遺伝子が含まれているのが好ましい。ＣＹＰ３Ａ４はヒトＰ４５０の半数以上を占める重要な役割を果たしている代謝酵素であるため化学物質の代謝反応の結果物に関する内分泌撹乱作用を調査する目的のために好ましく、ＣＹＰ３Ａ７は胎児および１歳以下の幼児においてのみ認められる酵素であるため胎児や幼児への化学物質の内分泌撹乱作用を調査する目的のために好ましい。
【００２６】
宿主細胞に導入されるＰ４５０発現遺伝子は、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーションスクリーニング法などの公知の方法により得ることができる。例えば、導入すべきＰ４５０のｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーを作成し、さらに公知のデータバンクに公開されている導入すべきＰ４５０発現遺伝子の塩基配列に基づきフォワードプライマーとリバースプライマーを設計して合成し、合成したプライマーを使用して得られたｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により特定塩基配列を増幅し、目的のＤＮＡ断片を得ることができる。得られたＤＮＡ断片は一般的に、宿主細胞への導入のために、宿主細胞で機能可能なプロモーター、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウィルス（ＳＶ４０）プロモーター、を有しており該プロモーターの下流に遺伝子挿入部位を有している市販の動物細胞発現用ベクター、例えばｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔベクター等に、制限酵素のサイトを利用してプロモーターの機能する方向に合わせて挿入される。
【００２７】
本発明の形質転換細胞において導入されるホルモンレセプター発現遺伝子としては、エストロジェンレセプター発現遺伝子、アンドロジェンレセプター発現遺伝子、甲状腺ホルモンレセプター発現遺伝子等の少なくとも１種が挙げられる。上述のようにエストロジェン様作用物質は最も深刻な影響が懸念される物質であるため、エストロゲンレセプター発現遺伝子が導入されるのが好ましい。特定の種に関する内分泌撹乱作用の調査を目的とする場合には、好ましくはその種の細胞にその種のホルモンレセプターが導入される。例えば人体に関する内分泌撹乱作用の調査を目的として選択されたヒト肝臓由来細胞、特に好ましくはＨｅｐＧ２細胞にはヒトのホルモンレセプター発現遺伝子が導入され、例えはヒトエストロジェンレセプターα発現遺伝子および／またはヒトエストロジェンレセプターβ発現遺伝子が導入される。
【００２８】
宿主細胞に導入されるホルモンレセプター発現遺伝子も、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーションスクリーニング法などの公知の方法により得ることができる。例えば、導入すべきホルモンレセプターのｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーを作成し、さらに公知のデータバンクに公開されている導入すべきホルモンレセプター発現遺伝子の塩基配列に基づきフォワードプライマーとリバースプライマーを設計して合成し、合成したプライマーを使用して得られたｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により特定塩基配列を増幅し、目的のＤＮＡ断片を得ることができる。得られたＤＮＡ断片は一般的に、宿主細胞への導入のために、宿主細胞で機能可能なプロモーター、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウィルス（ＳＶ４０）プロモーター、を有しており該プロモーターの下流に遺伝子挿入部位を有している市販の動物細胞発現用ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１、ＰＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等に、制限酵素のサイトを利用してプロモーターの機能する方向に合わせて挿入される。
【００２９】
本発明では、Ｐ４５０発現遺伝子およびホルモンレセプター発現遺伝子とともに、発現したホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子の少なくとも１種が哺乳動物由来細胞に導入される。ホルモン応答配列は導入されるホルモンレセプター発現遺伝子に応じて選択され、例えばエストロジェンレセプター発現遺伝子が導入される場合にはエストロジェン応答配列（ＥＲＥ）が選択され、アンドロジェンレセプター発現遺伝子が導入される場合にはアンドロジェン応答配列（ＡＲＥ）が選択され、甲状腺ホルモンレセプター発現遺伝子が導入される場合には甲状腺ホルモン応答配列（ＴＲＥ）が導入される。レポーター発現遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、βガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカルホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）、成長ホルモン遺伝子等を使用することができる。
【００３０】
ホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター発現遺伝子は一般的に、宿主細胞への導入のために、上述のレポーター発現遺伝子のいずれかを含む市販のレポーター発現用プラスミドに目的のホルモン応答配列を制限サイトを利用して組み込んだ形態に調製される。ホルモン応答配列は公知のホルモン応答配列を使用することができるが、ホルモン応答配列としてＥＲＥを採用する場合には、ＥＲＥのコンセンサス配列ＡＧＧＴＣＡＸＸＸＴＧＡＣＣＴ（ＸはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを意味する。）（配列番号１）を３〜５回直列に結合させたものをオリゴヌクレオチド合成により作成し、市販のレポーター発現用プラスミド、例えばｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  Ｎｏ．６０５３−１）、ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  Ｎｏ．６２５２−１）、ｐＴＡＬ−ＳＥＡＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  Ｎｏ．６２５２−２）に制限酵素のサイトを利用して組み込むことにより、形質転換用レポーター発現プラスミドを得ることができる。同様に、ホルモン応答配列としてＡＲＥを採用する場合する場合にはＡＲＥのコンセンサス配列ＧＧＴＡＣＡＸＸＸＴＧＴＴＣＴ（ＸはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを意味する。）（配列番号２）を、ＴＲＥを使用する場合にはＴＲＥのコンセンサス配列ＡＧＧＴＣＡＸＸＸＸＡＧＧＴＣＡ（ＸはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを意味する。）（配列番号３）を３〜５回直列に結合させたものをオリゴヌクレオチド合成により作成し、やはり市販のレポーター発現遺伝子プラスミド、例えばｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  Ｎｏ．６０５３−１）、ｐＴＡＬ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  Ｎｏ．６２５２−１）、ｐＴＡＬ−ＳＥＡＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社  Ｎｏ．６２５２−２）に制限酵素のサイトを利用して組み込むことにより、形質転換用レポーター発現プラスミドを得ることができる。
【００３１】
上述のようにして培養した宿主細胞に、上述のようにして作成したＰ４５０発現ベクター、エストロジェンレセプター発現ベクターおよびレポーター発現プラスミドをトランスフェクションして本発明の形質転換細胞を得る。ヒト肝臓由来細胞、特にＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションする場合には、宿主細胞の播種の翌日〜４日後に行うのが好ましい。トランスフェクションは、リン酸カルシウム法を始めとして、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）、スーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ社）、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いる方法等の公知の方法により行うことができる。宿主細胞にＰ４５０発現ベクター、エストロジェンレセプター発現ベクターおよびレポーター発現プラスミドをトランスフェクションする順番は、本発明においては特に問題とならず、同時にトランスフェクションしてもよい。
【００３２】
得られた形質転換細胞のＰ４５０の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＰ４５０のｍＲＮＡを確認する方法またはＰ４５０タンパク質を確認する方法により確認することができ、発現したＰ４５０の正常な機能は、酵素活性を測定することにより確認することができる。ホルモンレセプターおよびレポーターの発現および機能は、一般的なレポータージーンアッセイ法を実行することにより確認することができる。また、上述の確認を行うことにより、本発明の優れた機能を有する形質転換細胞を選択することができる。
【００３３】
上述の本発明のＰ４５０とレポーターとを発現する形質転換細胞ではＰ４５０が高度に発現しており、この形質転換細胞の化学物質に対する代謝能は上述したラット肝臓由来のＳ９画分やヒト肝ミクロソームにほぼ匹敵することがわかっている。
【００３４】
本発明の形質転換細胞を培養した培養系により、従来行われていたラットＳ９画分により化学物質を代謝させた後にレポータージーンアッセイを行う場合のような不連続性を伴うことなく、同一細胞により化学物質の代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用を連続的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定することができる。従って本発明は、本発明の形質転換細胞の培養系を形成し、被験化学物質を含む試料を上記培養系上に導入して上記形質転換細胞内に吸収させ、吸収された化学物質をＰ４５０により代謝させ、発生した代謝物質をホルモンレセプターに結合させ、ホルモンレセプターによる転写活性化を通してレポーターを発現させ、レポーターの発現量を測定することにより被験化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法をも提供する。図１により本発明の測定方法を説明する。図１のａ）は、本発明の形質転換細胞の培養系を使用した測定系の略図を、ｂ）は本発明の形質転換細胞内の反応の模式図を、それぞれ示している。
【００３５】
まず、図１のａ）に示すように、被験化学物質２を含む試料１を本発明の形質転換細胞の培養系３上に導入する。本発明の測定方法はいかなる種類の試料にも適用し得るが、工業化学物質、農薬、ダイオキシン類、土壌、河川水等の環境中試料、血液、尿、母乳等の生態試料の内分泌撹乱作用を特に有効に測定することができる。これらの試料は本発明の形質転換細胞を変質させない濃度に希釈して使用することができ、希釈のために使用される溶媒は本発明の形質転換細胞を変質させずかつ内分泌撹乱作用を有していない溶媒であればよく、例えば水、エタノール、ＤＭＳＯ等が使用される。被験化学物質２は、ｂ）に示すように、本発明の形質転換細胞１１に含まれるＰ４５０によって化学物質の種類に応じた代謝物質１２に変換される。さらに、この代謝物質１２は本発明の形質転換細胞１１中のホルモンレセプター１３、例えばエストロジェンレセプター、に結合し、レセプター１３が活性化される。活性化されたレセプター１３はホルモン応答配列１４に結合する。この結合に応じてレポーター遺伝子１５のｍＲＮＡ１６への転写が活性化され、レポーター１７が本発明の形質転換細胞１１中に発現する。例えば、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼの遺伝子が含まれている場合にはホタルルシフェラーゼが発現する。発現したレポーター１７の量を測定することにより、化学物質の生体における代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定をすることができる。例えば、レポーターがホタルルシフェラーゼの場合には、ホタルルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを添加して発光強度をルミノメーターで測定することにより発光量を測定する。発光量が多いほどエストロジェン様活性が強いと判断される。
【００３６】
さらに、本発明により得られる本発明の形質転換細胞は、化学物質吸収機能を有する細胞の膜組織と組み合わせることにより、従来行われていたラットＳ９画分により化学物質を代謝させた後にレポータージーンアッセイを行う場合のような不連続性を伴うことなく、さらに生体における吸収・代謝プロセスを経た化学物質の内分泌撹乱作用の測定を効率的に行うことが可能になる。従って、本発明はまた、上述の本発明の形質転換細胞の培養系上に化学物質吸収機能を有する細胞の膜組織を重ねた複合培養系をも提供する。
【００３７】
本発明のこの方法に使用する化学物質吸収機能を有する細胞は、細胞分化により膜組織を形成することができかつ形成された膜組織が生体における化学物質の吸収と類似した吸収機能を有する細胞であればよいが、人体における内分泌撹乱作用の測定のためにはヒト小腸上皮細胞であるＣａｃｏ−２細胞が特に好ましい。
【００３８】
Ｃａｃｏ−２細胞の培養は、例えば１０（ｖ／ｖ）％となるようにＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地中で培養したものをトリプシン溶液で分散させて行うことができる。この培養は、Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン社製など）でコートした透過性メンブレン上で行うことができる。この際のプレートは、本発明の形質転換細胞を播種したプレートに対応するものを使用する。具体的には、トランズウエル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）培養容器を使用することができる。この際、播種密度が低すぎると培養に時間がかかり、細胞の死滅につながり、逆に播種密度が高すぎると細胞が弱体化する。播種密度は、１×１０４個／ｃｍ２以上であり、特に５×１０４個／ｃｍ２以上あるのが好ましく、１×１０６個／ｃｍ２以下であり、特に３×１０５個／ｃｍ２以下であるのが好ましい。上記透過性メンブレンのメンブレン孔サイズは、細胞を安定に保持しかつ吸収物質の透過性に影響を及ぼさないサイズであれば良く、一般的には孔サイズは０．１μｍ〜１μｍであり、特に０．４μｍが好ましい。２〜３日おきに培地を交換しながら細胞分化を行わせ、膜組織を均一に形成させる。Ａｐｉｃａｌ側およびＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ側間の抵抗値が２００ｏｈｍｓ・ｃｍ２以上になるまで培養するとよい。膜組織の形成までは、通常２週間から３週間程度を要する。
【００３９】
次に、上述のようにして形成した本発明の形質転換細胞、例えばＨｅｐＧ２細胞、の培養系上にＣａｃｏ−２細胞の培養膜組織を載せ、複合培養系を形成する。一過性発現の場合には、トランスフェクション後１〜７日後に複合培養系とするのが好ましい。
【００４０】
上記複合培養系によると、従来行われていたラットＳ９画分により化学物質を代謝させた後にレポータージーンアッセイを行う場合のような不連続性を伴うことなく、化学物質の生体における吸収・代謝プロセスを経た内分泌撹乱作用を連続的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定することができる。従って本発明はまた、上述の本発明の複合培養系における膜組織上に被験化学物質を含む試料を導入し、被検化学物質を上記膜組織に吸収させて該膜組織を通過させ、通過した化学物質を形質転換細胞の培養系に吸収させ、吸収された化学物質をＰ４５０により代謝させ、発生した代謝物質をホルモンレセプターに結合させ、ホルモンレセプターによる転写活性化を通してレポーターを発現させ、レポーターの発現量を測定することにより被検化学物質の内分泌撹乱作用を測定する方法をも提供する。図２により本発明の測定方法を説明する。  図２ａ）は、上述のようにして得られた複合培養系を使用した測定系の略図を、ｂ）は複合培養系における本発明の形質転換細胞内の反応の模式図を、それぞれ示している。
【００４１】
まず、図２のａ）に示すように、必要に応じて上述した溶媒により希釈した被験化学物質２を含む試料１を、Ｃａｃｏ−２細胞の膜組織４の上、すなわちＡｐｉｃａｌ側に導入する。導入された試料中の化学物質２のうち、Ｃａｃｏ−２細胞によって吸収される化学物質２´のみがＣａｃｏ−２細胞中を移送され、本発明の形質転換細胞の培養系に到達する。到達した化学物質２´は、ｂ）に示すように、本発明の本発明の形質転換細胞１１に含まれるＰ４５０によって化学物質の種類に応じた代謝物質１２に変換される。さらに、この代謝物質１２は本発明の形質転換細胞１１中のホルモンレセプター１３、例えばエストロジェンレセプター、に結合してレセプター１３が活性化される。活性化されたレセプター１３はホルモン応答配列１４に結合する。この結合に応じてレポーター遺伝子１５のｍＲＮＡ１６への転写が活性化され、レポーター１７が本発明の形質転換細胞１１中に発現する。適当な時期にメンブレンを取り除き、発現したレポーターの量を測定する。従って、Ｃａｃｏ−２細胞と本発明の形質転換細胞を使用することにより、生体における吸収・代謝プロセスを経た化学物質の内分泌撹乱作用の連続的かつ効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定、すなわち「人体モデル」としての測定を実現することができる。
【００４２】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４３】
Ａ：Ｐ４５０遺伝子のクローニング
例１：ＣＹＰ３Ａ４発現遺伝子のクローニング
ヒト肝ｃＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｎｏ．７１１３−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を鋳型に用い、フォワードプライマーとして５’−ＡＴＧＧＣＴＣＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号４）を、リバースプライマーとして５’−ＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＡＣＧＧＴ−３’（配列番号５）をそれぞれ使用してＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＥｘ．ｔａｑ（宝酒造社）を使用した。ＰＣＲは、９４℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃２分を１サイクルとして４５サイクル行った。次いで反応産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル精製した。続いて、ＰＣＲで増幅された目的ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にＴＡクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２０個のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。得られたクローンの塩基配列を公知のデータベースの塩基配列と比較したところ、極めて高い相同性を示した。
【００４４】
例２：ＣＹＰ３Ａ７発現遺伝子のクローニング
ヒト脳ＲＮＡｐｏｌｙＡ＋（Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ，  Ｗｈｏｌｅ  Ｎｏ．６５１６−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を、逆転写酵素としてＲｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ−αＴＭ（Ｔｏｙｏｂｏ社）をそれぞれ使用し、ＲＴ−ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを作成した。ＲＴ−ＰＣＲは、Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ−αＴＭの添付説明書に従って行った。
【００４５】
次に、得られたｃＤＮＡについて、フォワードプライマーとして５’−ＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＴＧＧＣＣＧ−３’（配列番号６）を、リバースプライマーとして５’−ＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＡＣＧＧＴＣＴＣＡＴ−３’（配列番号７）をそれぞれ使用し、ポリメラーゼとしてＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社）を使用してＰＣＲを行ない、目的ＤＮＡ断片を選択的に増幅した。ＰＣＲは、９４℃１分→５８℃１分→７２℃１．５分を１サイクルとして４０サイクル行った。次いで反応産物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲル精製した。続いて、ＰＣＲで増幅された目的ＤＮＡ断片をｐＢＳ  ＫＳ（＋）ベクター（Ｔｏｙｏｂｏ社）にＴＡクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーのうちの２０個からプラスミドＤＮＡを調整した。電気泳動により確認した結果、図３に示すように２種のＣＹＰ３Ａ７発現遺伝子のクローンが形成されていた。また得られたクローンの塩基配列を公知のデータベースの塩基配列と比較したところ、極めて高い相同性を示した。
【００４６】
Ｂ：Ｐ４５０発現ベクターの作成
例３：ＣＹＰ３Ａ４発現ベクターの作成
上記例１において変異の認められなかったクローンについて、制限酵素ＡｐａＩおよびＳａｌＩを用いて切断し、電気泳動によりＣＹＰ３Ａ４のＤＮＡ断片をゲル回収した。次にｐＢＫ−ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を同じ制限酵素で切断し、ゲル回収した上記ＤＮＡ断片とのライゲーションを行った。大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーのうちの２０個からプラスミドＤＮＡを調整した。上記制限酵素でプラスミドＤＮＡを切断し、ＤＮＡの挿入を確認した。ＤＮＡの挿入が確認された１クローンについて、その菌体を２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地で培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを精製した。
【００４７】
例４：ＣＹＰ３Ａ７発現ベクターの作成
上記例２において変異の認められなかったクローンについて、例３の手順を繰り返した。
【００４８】
Ｃ：Ｐ４５０発現ベクターのトランスフェクション
例５：ＣＹＰ３Ａ４発現ベクターのトランスフェクション
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン溶液で分散させ、１０（ｖ／ｖ）％となるようにウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社）に懸濁し、３．５ｃｍのプレートのウェルに播種した。播種濃度は、１×１０５個／ｍＬとし、１ウェルあたりの培地量は２ｍＬとした。５％ＣＯ２を含む３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養後、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて、例３で得られたＣＹＰ３Ａ４発現ベクター（ｐＢＫ−ＣＭＶ−ｈＣＹＰ３Ａ４）１μｇのトランスフェクションを行った。トランスフェクションの方法は、ＦｕＧＥＮＥ６の添付説明書に従った。
【００４９】
例６：ＣＹＰ３Ａ７発現ベクターのトランスフェクション
例４で得られたＣＹＰ３Ａ７発現ベクター（ｐＢＫ−ＣＭＶ−ｈＣＹＰ３Ａ７）１μｇを使用した以外は、例５と同様の手法を繰り返した。
【００５０】
Ｄ：Ｐ４５０発現および機能の確認
例７：ＣＹＰ３Ａ４のＲＮＡ発現確認
例５で得られたトランスフェクション後の細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃のＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養後、ＴＲＩｚｏｌＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）によりＲＮＡを抽出した。抽出はＴＲＩｚｏｌＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従っておこなった。抽出したＲＮＡについて、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）２０を、逆転写酵素としてＲｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ−αＴＭ（Ｔｏｙｏｂｏ社）を使用し、ＲＴ−ＰＣＲを行なってｃＤＮＡに変換した。ＲＴ−ＰＣＲはＲｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ−αＴＭの添付説明書に従って行った。さらに、得られたｃＤＮＡについてＰＣＲを行った。ＣＹＰ３Ａ４の全長について増幅するためには配列番号４および配列番号５のプライマーを使用し、特異配列について増幅するためには、フォワードプライマーとして５’−ＡＧＴＧＴＧＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号８）を、リバースプライマーとして５’−ＡＴＡＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＴＡＧＧＧＡ−３’（配列番号９）をそれぞれ使用した。ポリメラーゼはＡｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用した。ＰＣＲは、９４℃１分→５８℃１．５分→７２℃１．５分を１サイクルとして３０サイクル行った。図４に示すように、ＣＹＰ３Ａ４のＲＮＡの発現がその全長および特異配列において確認された。
【００５１】
例８：ＣＹＰ３Ａ７のＲＮＡ発現確認
例６で得られたトランスフェクション後の細胞を使用し、ＣＹＰ３Ａ７の全長について増幅するために配列番号６および配列番号７のプライマーを使用し、特異配列について増幅するために、フォワードプライマーとして５’−ＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＴＡＣＧＧＴＣＴ−３’（配列番号１０）を、リバースプライマーとして５’−ＣＣＡＣＣＴＡＴＧＡＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＣＡＧＴＴ−３’（配列番号１１）をそれぞれをそれぞれ使用した以外は、例７と同様の手法を繰り返した。図５に示すように、ＣＹＰ３Ａ７のＲＮＡ発現がその全長および特異配列において確認された。
【００５２】
例９：ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性確認
発現したＣＹＰ３Ａ４の酵素活性は、テストステロンの６β位水酸化能により確認した。例５で得られたトランスフェクション後の細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃のＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養後、上清を除去し、２（ｖ／ｖ）％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにテストステロンを２×１０−４Ｍ加えた培地に交換し、さらに６時間培養した。上清を回収し、１／２量のＭｅＯＨを加え、フィルターによる粒子除去を行った後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて６β−テストステロン量を測定した。ＨＰＬＣの測定にあたってはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ５μｍ  ４．６×２５０ｍｍのカラムを使用し、展開液としてＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを使用した傾斜溶離法により溶離を行った。
【００５３】
比較のために、ＣＹＰ３Ａ４発現ベクターのトランスフェクションを行わなかった細胞についても上記と同様の実験を行った。図６に比活性の結果を示す。ＣＹＰ３Ａ４発現ベクター１μｇをトランスフェクションした細胞は、無処理の細胞に比較して、約７倍の６β−テストステロン生成能を有していた。
【００５４】
Ｅ：培養系によるエストロジェン様作用の測定
例１０
ＨｅｐＧ２細胞をトリプシン溶液で分散させ、１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社）に懸濁し、３．５ｃｍのプレートに播種した。播種濃度は、１．１×１０５個／ｍＬとした。５％ＣＯ２を含む３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養後、１μｇの例３で得られたＣＹＰ３Ａ４発現ベクター、０．１μｇのエストロジェンレセプター発現ベクターおよび０．４μｇのレポーター発現プラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションはＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて行った。トランスフェクションの方法はＦｕＧＥＮＥ６の添付説明書に従った。エストロジェンレセプター発現ベクターは、（株）東レリサーチセンターより供与されたエストロジェンレセプターα発現遺伝子を動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に制限酵素ＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１サイトを利用して挿入して作製した。上述のエストロジェンレセプターα発現遺伝子は、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７から調整されたｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡライブラリーを作成し、さらにＰＣＲ法により特定塩基配列を増幅させて目的のＤＮＡ断片をクローニングすることにより得られたものである（谷口  佳隆らによる第１８回バイオテクノロジーシンポジウム（２０００年）要旨集参照）。レポーター発現プラスミドは、ＥＲＥの下流に転写開始部位とレポーター遺伝子を結合させたプラスミドとした。ＥＲＥとして塩基配列ＡＧＧＴＣＡＸＸＸＴＧＡＣＣＴ（ＸはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを意味する。）（配列番号１）を３回直列に結合させたものをオリゴヌクレオチド合成により作成し、これを市販のホタルルシフェラーゼ遺伝子プラスミドｐＮＦｋＢ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に制限酵素ＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩのサイトを利用して挿入し、レポーター発現プラスミドを得た。
【００５５】
トランスフェクション後の細胞を５％ＣＯ２を含む３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養後、被験化学物質として１０−８Ｍの１７β−エストラジオール（ナカライテスク社）を添加した。１７β−エストラジオールを溶解するための溶媒はＤＭＳＯを使用した。５％ＣＯ２を含む３７℃のＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養後、メンブレンおよび培地を除去し、ＰＢＳ（−）で１回洗浄後、Ｄｕｅｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＡｓｓｅｙＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の細胞溶解液１００μｌを加えて室温で１５分間振とうさせて細胞を溶解した。２０μｌを白色９６ウエルのオプティプレート（白色）に移し、Ｄｕｅｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍの添付説明書に従って基質を添加した。ホタルルシフェラーゼの基質を添加して発光強度を測定した。測定装置としては、トップカウントマイクロプレートシンチレーション／ルミネッセンスカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いた。
【００５６】
比較のために、溶媒のみを培養系に添加した場合についてもルシフェラーゼ量を確認した。さらにＣＹＰ３Ａ４発現ベクター１μｇのみをトランスフェクションした細胞、０．１μｇのエストロジェンレセプター発現ベクターおよび０．４μｇのレポーター発現プラスミドのみをトランスフェクションした細胞に関しても上述の実験を行った。図７に測定結果をまとめて示す。１７β−エストラジオールの内分泌撹乱作用を得られた形質転換細胞を使用することにより測定することができたことがわかる。
【００５７】
Ｆ：複合培養系によるエストロジェン様作用の測定
例１１
２４ウエルトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の透過性メンブレン（メンブレン孔サイズ：０．４μｍ、培養面積：０．３３ｃｍ２）をＩ型コラーゲン（新田ゼラチン社）でコートした。Ａｐｉｃａｌ側にＣａｃｏ−２細胞を懸濁した培地を、Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側に培地を添加し、細胞をメンブレンに接着させた。尚、Ｃａｃｏ−２細胞はトリプシン溶液で懸濁させた。培地は、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地とした。細胞の播種密度は２×１０４個／ウエル（６×１０４個／ｃｍ２）とした。Ａｐｉｃａｌ側の培地量は１ウエルあたり０．３ｍＬ、Ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ側の培地量は１ウエルあたり０．５ｍＬとした。２〜３日おきに培地を交換しながら１７日間培養した。１７日後、Ａｐｉｃａｌ側およびＢａｓｏｌａｔｅｒａｌ側間の抵抗値は平均３００ｏｈｍｓ・ｃｍ２となった。
【００５８】
Ｃａｃｏ−２の培養を開始してから１７日目に、ＨｅｐＧ２細胞を１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁し、２４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播いた。播種濃度は１０５個／ウエル（２×１０５／ｍＬ）とした。培地量は、１ウエルあたり０．５ｍＬとした。播種翌日（Ｃａｃｏ−２培養から１８日目）に培地を１０％の活性炭デキストラン処理済ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に交換し、１μｇの例３で得られたＣＹＰ３Ａ４発現ベクター、０．１０μｇのエストロジェンレセプター発現ベクター、および０．４μｇのレポータープラスミドを例１０と同様の条件でＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションした。
【００５９】
一方、Ｃａｃｏ−２培養から１９日目にＣａｃｏ−２を培養している培地を１０％の活性炭デキストラン処理済ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に交換した。さらに翌日（Ｃａｃｏ−２培養から２０日目）、ＨｅｐＧ２を培養している２４ウエルプレートにＣａｃｏ−２が接着したトランズウエルのメンブレンを載せ、Ａｐｉｃａｌ側に被験化学物質として１０−８Ｍの１７β−エストラジオール（ナカライテスク社）を添加した。２４時間培養した後にメンブレンおよび培地を除去し、ＰＢＳ（−）で１回洗浄後、Ｄｕｅｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓｅｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の細胞溶解液１００μｌを加えて室温で１５分間振とうさせて細胞を溶解した。上清を回収し、例１０と同様にしてルシフェラーゼ量を測定し、同様の結果を得た。
【００６０】
【発明の効果】
以上説明したように、同一細胞内にＰ４５０をコードする遺伝子とホルモンレセプター遺伝子とホルモンレセプターが結合するホルモン応答配列を含む転写制御領域の下流に連結されたレポーター遺伝子とが導入されている本発明の形質転換細胞では、各遺伝子の機能および各遺伝子から発現する各タンパク質の機能が相互作用により消滅することがなく、得られた形質転換細胞の化学物質に対する代謝能は内分泌撹乱作用の測定のために十分であり、代謝物質の内分泌撹乱作用を同一細胞により簡易かつ連続的に測定することができる。また、得られた細胞と化学物質の吸収機能を有する細胞との複合培養系により、吸収・代謝プロセスを経た化学物質の内分泌撹乱作用の自動測定が可能になり、「生体モデル」を構築することができる。
【００６１】
【配列表】
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2004305081.tif 000003
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【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）は本発明の形質転換細胞の培養系を使用した測定系の略図を、ｂ）は細胞内の反応の模式図を、それぞれ示している。
【図２】ａ）は複合培養系を使用した測定系の略図を、ｂ）は本発明の形質転換細胞内の反応の模式図を、それぞれ示している。
【図３】脳から得られたＣＹＰ３Ａ７クローンの電気泳動図を示す図である。
【図４】ＨｅｐＧ２細胞にＣＹＰ３Ａ４発現ベクターをトランスフェクションした細胞に関する、ＣＹＰ３Ａ４のＲＮＡ発現を確認した電気泳動図である。
【図５】ＨｅｐＧ２細胞にＣＹＰ３Ａ７発現ベクターをトランスフェクションした細胞に関する、ＣＹＰ３Ａ７のＲＮＡ発現を確認した電気泳動図である。
【図６】ＨｅｐＧ２細胞にＣＹＰ３Ａ４発現ベクターをトランスフェクションした細胞に関する、発現したＣＹＰ３Ａ４の酵素活性の確認結果を示す図である。
【図７】本発明の形質転換細胞を使用してエストロジェン様作用を測定した結果を示す図である。
【符号の説明】
１      試料
２      被験化学物質
２´    吸収された被験化学物質
３      本発明の形質転換細胞の培養系
４      吸収機能を有する細胞の膜組織
１１    本発明の形質転換細胞
１２    代謝物質
１３    ホルモンレセプター
１４    ホルモン応答配列
１５    レポーター遺伝子
１６    ｍＲＮＡ
１７    レポーター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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