(57)【要約】【課題】モデルマウスの系統及び週齢の統一を図り、血清中に多量に存在するアルブミン及びグロブリンを効率的に除去し、血清タンパク質成分を可溶化するバッファーを提供することによって、再現性良く、且つハイスループットに糖尿病関連タンパク質を解析する方法、及びそれによって見出されたタンパク質を用いて医薬品を開発する方法を提供する。【解決手段】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ及び／又はＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌ系統のマウスの血清を用いて、糖尿病関連タンパク質を解析する方法。好ましくは、１０週齢のマウスを用いる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ及び／又はＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌ系統のマウスの血清を用いて、糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項２】
前記マウスが１０週齢である、請求項１に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項３】
前記Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ及びＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌの２系統のマウスの血清をそれぞれリシスバッファーに溶解して二次元電気泳動し、得られた二次元電気泳動画像において前記２系統の間で発現量の差異のあるタンパク質を見出し、前記見出されたタンパク質を質量分析する、請求項１又は２に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項４】
前記二次元電気泳動を行う前に、血清試料を血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体を用いて精製を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項５】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、クロロトリアジン色素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項６】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、チバクロンブルーＦ３ＧＡ及びプロシオンレッドＨＥ３Ｂから選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項７】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が抗原物質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項８】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が、プロテインＡ及びプロテインＧから選ばれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項９】
前記精製の前に、血清試料を５５〜６５％飽和で硫安分画する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項１０】
前記リシスバッファーが、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００、０．２〜０．６重量％の両性担体、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトールを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法によって見出された、配列表の配列番号１、２、３及び４に記載の糖尿病関連タンパク質を用いる医薬品の開発方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ライフサイエンス基礎研究分野、診断薬開発分野、医薬品開発分野など幅広い分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病モデルマウスを使用した解析例は多数存在すると考えられるが、血清の二次元電気泳動画像はその系統及び週齢による差が大きく、直接疾患に関与するものかどうかを判断する基準が無かった。また、血清に多量に含まれる血清アルブミン及び免疫グロブリンが起因して血清の二次元電気泳動の再現性が悪く、血清タンパク質の有意な解析ができていなかった。
一方、血清アルブミンを除去する方法、免疫グロブリンを除去する方法はそれぞれ単独の方法として知られているが、これらの方法では血清中の微量なタンパク質成分の電気泳動的解析には不十分であった。また、二次元電気泳動を行う際に効率よく血清タンパク質成分を可溶化するための組成を有するリシスバッファーは知られていなかった。このこともまた、二次元電気泳動の再現性欠如の原因となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、モデルマウスの系統及び週齢の統一を図り、血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去し、血清タンパク質成分を可溶化するバッファーを提供することによって、再現性良く、且つハイスループットに糖尿病関連タンパク質を解析する方法、及びそれによって見出されたタンパク質を用いて医薬品を開発する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、１０週齢、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ及びＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌ系統のマウスの血清を用い、後述する血清アルブミン用担体及び後述する免疫グロブリン用担体を用いて精製し、後述する特定の組成を有するバッファーを用いることによって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち本発明は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ及び／又はＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌ系統のマウスの血清を用いて、糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
本発明は、前記マウスが１０週齢である、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
【０００６】
本発明は、前記Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ及びＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌの２系統のマウスの血清をそれぞれリシスバッファーに溶解して二次元電気泳動し、得られた二次元電気泳動画像において前記２系統の間で発現量の差異のあるタンパク質を見出し、前記見出されたタンパク質を質量分析する、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
【０００７】
本発明は、前記二次元電気泳動を行う前に、血清試料を血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体を用いて精製を行う、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
本発明は、前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、クロロトリアジン色素である、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
本発明は、前記血清アルブミンに対する親和性吸着体が、チバクロンブルーＦ３ＧＡ及びプロシオンレッドＨＥ３Ｂから選ばれる、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
本発明は、前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が抗原物質である、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
本発明は、前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体が、プロテインＡ及びプロテインＧから選ばれる、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
【０００８】
本発明は、前記精製の前に、血清試料を５５〜６５％飽和で硫安分画する、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
【０００９】
本発明は、前記リシスバッファーが、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００、０．２〜０．６重量％の両性担体、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトールを含む、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法である。
【００１０】
本発明は、前記の糖尿病関連タンパク質を解析する方法請求項１〜１１のいずれか１項に記載の糖尿病関連タンパク質を解析する方法によって見出された、配列表の配列番号１、２、３及び４に記載の糖尿病関連タンパク質を用いる医薬品の開発方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、糖尿病関連タンパク質を以下に述べる方法で解析する。サンプルとしては、マウスの血清を用いる。前記マウスとしてはＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ系統及びＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌ系統を用いる。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌは正常マウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌは糖尿病マウスの系統である。これらマウスは１０週齢のものを用いることが好ましい。上記系統及び週齢のものを用いることによって、後述する二次元電気泳動解析を行った際の画像を再現性良く得ることができる。
【００１２】
上記２系統のマウス血清は、それぞれ二次元電気泳動に供する。このときにタンパク質を溶解するバッファーとしては、以下の組成を有するリシスバッファーを用いることが好ましい。すなわち、リシスバッファー全体を基準として５〜８Ｍの尿素、１．５〜２．５Ｍのチオ尿素、２〜４重量％の３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、０．５〜２重量％のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、０．２〜０．６重量％の両性担体（ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）、及び２０〜７０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むことが好ましい。本発明においては、例えば、リシスバッファー全体を基準として５Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、３重量％のＣＨＡＰＳ、１重量％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４重量％のｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、及び５０ｍＭのＤＴＴの組成を有するリシスバッファーを用いることができる。
【００１３】
電気泳動は、通常の方法を用いて行うことができる。電気泳動を行った後の二次元電気泳動ゲルは、ＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色剤でそれぞれ染色することが好ましい。得られた電気泳動画像は、市販のソフトウェアによってディファレンシャル画像解析を行い、２系統の血清間で発現量に差異のあるタンパク質、すなわち、糖尿発症前後で差異のあるタンパク質を見出す。見出されたタンパク質は糖尿病発症に関連するタンパク質であると考えることができる。上記見出されたタンパク質は、ペプチドマスフィンガープリンティングなどの質量分析を行うことによって糖尿病関連タンパク質を同定することができる。
【００１４】
本発明においては、上記特定の範囲の組成を有するリシスバッファーを用いることによって、効率よく血清タンパク質成分を可溶化することができる。それとともに、二次元電気泳動画像において多くのタンパク質スポットを検出することができ、また、各タンパク質スポットのフォーカスのされ方も優れたものが得られる。
【００１５】
本発明においては、前述の電気泳動を行う前に、それぞれのマウス血清の血清タンパク質に多量に含まれる血清アルブミン及び免疫グロブリンを除去することが好ましい。なお、本明細書においては、血清タンパク質から血清アルブミン及び免疫グロブリンを除いたものをその他の血清タンパク質と表記する。
【００１６】
血清アルブミン及び免疫グロブリンの除去方法としては、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行うことができる。さらに、アフィニティークロマトグラフィーを行う前に硫安分画を行うと、血清アルブミン及び免疫グロブリンをより効率良く除去することができる。以下、硫安分画及びアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせて血清アルブミン及び免疫グロブリンの除去を行う場合を挙げて説明する。
【００１７】
まず血清試料を硫安分画することによって、通常血清タンパク質全体対して５０〜６０％程度含まれている血清アルブミンの大部分を除去することができる。硫安分画は、５５〜６５％飽和、例えば６０％飽和で行うと良い。ここで、％飽和で表される数値は、２５℃における硫酸アンモニウムの溶解度に対する重量１００分率を表す。上記特定の範囲の濃度によって、血清タンパク質のうち、主にその他の血清タンパク質及び免疫グロブリンを沈殿させ、血清アルブミンの大部分を上澄みへ分画することができる。この濃度範囲において沈殿する画分は、主として前記その他の血清タンパク質及び免疫グロブリンであり、少量の血清アルブミンも含まれている。この沈殿画分に含まれている血清アルブミンの量は、沈殿画分全体の量を基準として１５〜２５重量％程度である。
【００１８】
上記硫安分画による沈殿画分は、限外濾過によって脱塩・濃縮することができる。限外濾過は、常法により行うことができる。
【００１９】
本発明においては、アフィニティークロマトグラフィーによる精製を行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーは、血清アルブミンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体（血清アルブミン用担体）、及び免疫グロブリンに対する親和性吸着体が支持体に結合した担体（免疫グロブリン用担体）を用いると良い。
【００２０】
血清アルブミンに対する親和性吸着体としては、イオン相互作用、疎水相互作用、立体構造的相互作用等による結合部位が存在し、これらの作用が重なり合うことによって血清アルブミンを特異的に結合させるものを用いると良い。このような親和性吸着体としては、クロロトリアジン色素が挙げられる。クロロトリアジン色素の例としては、チバクロンブルーＦ３ＧＡ、プロシオンレッドＨＥ３Ｂなどが挙げられる。これら親和性吸着体は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。本発明においては、チバクロンブルーＦ３ＧＡを用いることが好ましい。
【００２１】
前記血清アルブミンに対する親和性吸着体を結合させる支持体としては特に限定されないが、架橋アガロースゲルを用いることが好ましい。支持体の形状としては特に限定されないが、ゲル等をビーズ状にしたものが好ましい。
本発明における血清アルブミン用担体としては、架橋アガロースビーズにチバクロンブルーＦ３ＧＡを結合させた担体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ（バイオラッド社製）を用いることが特に好ましい。
このような血清アルブミン用担体を用いることによって、前記沈殿画分に残量する血清アルブミンをさらに除去することができる。
【００２２】
免疫グロブリンに対する親和性吸着体としては、免疫グロブリンを特異的に吸着させる抗原物質を用いることが好ましい。このような親和性吸着体としては、プロテインＡ、プロテインＧなどが挙げられる。これら親和性吸着体は、単独で、又は組み合わせて用いることができる。本発明においては、プロテインＡを用いることが好ましい。
【００２３】
前記免疫グロブリンに対する親和性吸着体を結合させる支持体としては特に限定されないが、架橋アガロースゲルを用いることができる。支持体の形状としては特に限定されないが、ゲル等をビーズ状にしたものを用いることができる。
本発明における免疫グロブリン用担体としては、架橋アガロースビーズにプロテインＡを結合させた担体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（バイオラッド社製）を用いることが特に好ましい。
このような免疫グロブリン用担体を用いることによって、前記沈殿画分に含まれる免疫グロブリンを除去することができる。
【００２４】
上述したように、本発明においては、硫安分画と、上記血清アルブミン用担体及び上記免疫グロブリン用担体を用いた精製とを組み合わせることができる。これによって得られる精製試料は主としてその他の血清タンパク質を含み、血清アルブミン及び免疫グロブリンは少量含むのみである。特にこの精製試料に含まれる血清アルブミンはほとんど除去されており、その量は、精製試料全体の量を基準として０．３〜０．８重量％である。一方、この精製試料に含まれる免疫グロブリンの量は、精製試料全体の量を基準として５〜１５重量％である。
【００２５】
本発明においては、血清アルブミン及び免疫グロブリンの除去方法として、硫安分画を行わずにアフィニティークロマトグラフィーのみによって行うこともできる。この場合に得られる精製試料は主としてその他の血清タンパク質を含み、血清アルブミン及び免疫グロブリンは少量含むのみである。この精製試料に含まれる血清アルブミンの量は、精製試料全体の量を基準として２〜５重量％であり、免疫グロブリンの量は、精製試料全体の量を基準として５〜１５重量％である。
【００２６】
上記方法によって血清アルブミン及び免疫グロブリンを除去された正常マウス血清及び糖尿病マウス血清は、前記特定の組成を有するリシスバッファーに溶解し、二次元電気泳動に供することが好ましい。このときの二次元電気泳動画像においては、より多くのタンパク質スポットが検出され、また、各タンパク質スポットのフォーカスのされ方もより優れている。さらに、このような画像をより再現性良く得ることができる。
【００２７】
上述したように、本発明の糖尿病関連タンパク質の解析方法によると、二次元電気泳動画像において検出できるタンパク質のスポットの数が従来の方法に比べて多く、各タンパク質のフォーカスのされ方も従来の方法に比べて優れている。また、このような優れた画像を従来の方法に比べて再現性良く得ることができる。さらに、本発明の方法は、解析にかかる時間が従来の方法に比べてはるかに短い。
従って、本発明の方法によると、よりハイスループットな解析をより再現性良く行うことが可能である。
【００２８】
また、優れた二次元電気泳動画像が得られることから、例えば、糖尿病の発症において単一のタンパク質が変動しているのか、又は複数のタンパク質が変動しているのかを知ることができる。このことは、糖尿病の診断において１つの指標を示すこととなる。
また、本発明によって見出された糖尿病関連タンパク質を用いると、医薬品を開発することができる。例えば、糖尿病関連タンパク質を標的として特異的に作用し、その機能を効果的に制御する化合物をコンピュータで理論的にデザインし、医薬品候補化合物を創出することによって医薬品を開発することができる。また、糖尿病関連タンパク質をコードする遺伝子の情報を見出し、該遺伝子の発現を特異的に制御する物質を医薬品候補化合物として創出することによって医薬品を開発することもできる。本発明の方法は、これら医薬品の開発をより効率的なものにすることができる。
【００２９】
【実施例】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。また、「％」は特に断りのない限り、すべて重量基準である。
【００３０】
コントロール（Ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＣ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｊｃｌ系統、１０週齢のマウス、及び糖尿病モデル（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｏｄｅｌ；血糖値３００ｍｇ／ｄｌ以上）としてＣ５７ＢＬ／ＫＳＪ−ｄｂ／ｂｄ  Ｊｃｌ系統、１０週齢のマウスを用いた。これらのマウス血清１２０μｌ（血清タンパク質濃度  ５０ｍｇ／ｍｌ）をＡｕｒｕｍ  Ｓｅｒｕｍ  Ｋｉｔ（バイオラッド社製、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ及びＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  ＰｒｏｔｅｉｎＡのキット）各３本ずつにかけ、溶出フラクションを回収した。
得られた溶出フラクションは常法により凍結乾燥させた。
【００３１】
これらを２００μｌのリシスバッファー（５Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３重量％ＣＨＡＰＳ、１重量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４重量％ｃａｒｒｉｅｒ  ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解した。このとき、攪拌及び超音波処理により十分溶解した。可溶化したサンプルは、３０分、室温で還元された。得られたサンプルを、市販の固定化ｐＨグラジェントゲル（ｐＨ５−８、１１ｃｍ、バイオラッド社製）に１２時間膨潤させた。
【００３２】
サンプルを膨潤させたゲルを、ステップワイズ・ボルテージ・ランピング（ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｒａｍｐｉｎｇ）法によってそれぞれ等電点電気泳動した。すなわち、最初の３０分で電圧を２５０Ｖまで上げ、次の２．５時間で５，０００Ｖまでｓｌｏｗ  ｒａｍｐｉｎｇモードで上昇させ、その後、５，０００Ｖで５０，０００ＶＨとなるように電圧をかけ続けた。
二次元目ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける前にタンパク質の変性を行った。ストリップゲル用変性バッファー（６Ｍ  尿素、２％  ＳＤＳ、２％  ＤＴＴ、２０％  グリセロール、３７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８）中で４５分間振盪した。これを、１５ｍＡ定電流、５〜１５％グラジェントゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００３３】
二次元電気泳動を行ったゲルをＣＢＢ染色剤で染色し、ゲル用デンシトメーター（ＧＳ８００、バイオラッド社製）を用いてゲル画像を取得した。画像解析は、二次元電気泳動用画像解析ソフトウェア（ＰＤＱｕｅｓｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．１、バイオラッド社製）を用いて行った。このとき得られた画像を図１及び図２に示す。図１は、正常マウス血清の画像、図２は、糖尿病マウス血清の画像である。図１と図２との間において、発現量に有意な変動があった２つのスポットとその周辺部分を拡大し、比較したのが図３である。図３において、１及び２のスポットが、発現量に有意な変動があったスポットである。スポット１は、血糖値の上昇に伴って発現量が下がる傾向、スポット２は血糖値の上昇に伴って発現量が上がる傾向が見られた。
これら２つのスポットを切り出し、以下のようにしてインゲル消化を行った。
【００３４】
切り出したスポットをマイクロチューブに移し、アセトニトリル１００μｌを加え、室温で１０分間時々攪拌した。溶媒を取り除いた後、ゲルを遠心乾燥した。
次に、１０ｍＭ  ＤＴＴを１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３１００μｌに溶解したものを加え、５６℃で１時間反応させた。室温に冷却後、溶媒を除去し、５５ｍＭ  ＩＣＨ２ＣＯＮＨ２を１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３１００μｌに溶解したものを加え、室温で４５分反応させた。溶媒を除去した後、１００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３１００μｌの添加及び溶媒の除去と、アセトニトリル１００μｌの添加及び溶媒の除去とを繰り返し、ゲルを遠心乾燥させた。
【００３５】
遠心乾燥させたゲルを４℃に冷却し、酵素溶液（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１２．５ｎｇ／μｌトリプシン）１００μｌを加え、４℃で４５分間インキュベートした。溶媒を除去した後、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、５ｍＭ  ＣａＣｌ２１０μｌを加え、３７℃で１６時間インキュベートした。
【００３６】
消化されたサンプルに２０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３１００μｌを加え、室温で２０分間時々攪拌し、溶液を回収した。次に、５％蟻酸及び５０％アセトニトリル１００μｌを加え、室温で２０分間時々攪拌し、溶液を回収する操作を２回繰り返した。（２回目は超音波処理を行った。）回収した溶液をまとめて遠心乾燥させた。
【００３７】
以上のようにしてインゲル消化を行ったサンプルは、ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８（ミリポア社製）で脱塩を行った後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（島津／クラトス社製、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ）によって質量分析を行った。このときのマススペクトルチャートを図４及び図５に示す。図４及び図５において、横軸は（質量／電荷）（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ）を表し、縦軸はイオンピークの相対強度（％Ｉｎｔ．）を示す。図４は、スポット１の質量分析結果、図５は、スポット２の質量分析結果である。
【００３８】
質量分析の結果をもとに、ＭａｓｃｏｔＴＭ検索を行い、この２つのタンパク質を同定した。スポット１のタンパク質は、アセッション番号ｇｉ１７０４６４７１（配列表の配列番号１）、又はｇｉ２０３３０８０２（配列表の配列番号２）の配列を有するタンパク質であることが分かった。一方、スポット２のタンパク質は、アセッション番号ｇｉ２０３９５６０４４（配列表の配列番号３）、又はｇｉ１３５２１０２（配列表の配列番号４）の配列を有するタンパク質であることが分かった。このことは、糖尿病の発症において、単一のタンパク質が変動するのではなく、複数のタンパク質が変動していることを示唆している。
【００３９】
【発明の効果】
本発明によれば、モデルマウスの系統及び週齢の統一を図り、血清中に多量に存在する血清アルブミン及び免疫グロブリンを効率的に除去し、血清タンパク質成分を可溶化するバッファーを提供することによって、再現性良く、且つハイスループットに糖尿病関連タンパク質を解析する方法、及びそれによって見出されたタンパク質を用いて医薬品を開発する方法が提供される。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】正常マウス血清の二次元電気泳動の画像である。
【図２】糖尿病マウス血清の二次元電気泳動の画像である。
【図３】図１の一部及び図２の一部を拡大し、比較した図である。
【図４】図３のスポット１の質量分析結果である。
【図５】図２のスポット１の質量分析結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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