(57)【要約】【課題】イヌジステンパーウイルスに対応する抗体を担体または反応膜に固相化せしめ、有色粒子や酵素で標識した抗ジステンパーウイルス抗体を用いて、検体中のＣＤＶ抗原を簡便かつ迅速に検出する。【解決手段】イヌジステンパーウイルスの糖蛋白質に対応する抗体を調製し、反応膜の中央部分に塗布し、判定部位とする。反応膜の下端にサンプル口をおき、サンプル口と判定部の間に有色粒子または酵素で標識した同抗体を含有する濾紙を置く。さらに、反応膜の他端に吸水性の高い濾紙を配置する。この検出法は、従来法に比べて、感度及び特異性に遜色なく、操作が簡便でかつ約２０分で終了する。従って、この検出法は診察時間内に判定可能で、特別な器具が不要で、判定も目視可能で、ＣＤＶの早期診断と感染拡大の予防にきわめて有用である。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌジステンパーウイルスに対応する抗体を反応膜または担体に固定する工程と、この反応膜または担体に検体を滴下し、有色粒子や酵素で標識した抗ジステンパーウイルス抗体を用いて、検体と抗体とを反応させる工程とを含むイヌジステンパーウイルス抗原の検出法。
【請求項２】
上記イヌジステンパーウイルスに対応する抗体が、イヌジステンパーウイルスの糖蛋白質であるＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体である請求項１に記載のイヌジステンパーウイルス抗原の検出法。
【請求項３】
上記イヌジステンパーウイルスのＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体のクラスがＩｇＧである請求項２に記載のイヌジステンパーウイルス抗原の検出法。
【請求項４】
上記イヌジステンパーウイルスのＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体がペプシン消化物である請求項２または請求項３に記載のイヌジステンパーウイルス抗原の検出法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明はイヌジステンパーウイルス（以下、ＣＤＶと略す）抗原の検出法、詳しくはＣＤＶ抗原を特異的に、迅速にかつ簡便に検出することができるＣＤＶ抗原の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、人と愛玩動物との係わりがより親密になっている。犬などの愛玩動物に対する日々の健康管理や疾病診断が重要視されている。
ＣＤＶ感染症は、パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属するＣＤＶにより引き起こされるイヌのウイルス性伝染病の一種であり、伝染性が強く、死亡率も高い。このＣＤＶ感染症のため、多くのイヌが犠牲になっている。ＣＤＶ感染症は発熱、鼻炎、結膜炎、呼吸器および消化器障害を主徴とする。本感染症では神経症状もみられるが、リンパ肉腫や骨髄に増殖性の腫瘍を起こすことも知られており、多様な臨床症状を呈することが特徴である。
【０００３】
非特許文献１に示すように、わが国ではこのＣＤＶ感染症に対するワクチンが市販されているものの、現在もなお全国的に多くの発生例が認められている。これは、ワクチン接種率がまだ低いこと、およびＣＤＶ感染症が多様な臨床症状を呈するためその診断が難しいことがその一因である。臨床現場では、ＣＤＶ感染症の確定診断の一助とするため、迅速かつ簡便なＣＤＶ抗原の検出法が強く望まれていた。
【非特許文献１】Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５８，５４７，（１９９６）
【０００４】
従来より、ＣＤＶ抗原の検出法としては、非特許文献２に記載のウイルス分離法や、非特許文献３に記載の蛍光抗体法（ＩＦＡ法）、および非特許文献４に記載の遺伝子増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が一般的に用いられている。
【非特許文献２】Ｊ．Ｔ．Ｖａｎｔｓｉｓ，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．７１，９９−１００，（１９５９）
【非特許文献３】ＩＦＡ法；Ｇ．Ａ．Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ  ｅｔ．ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２８，７６１−７６８，（１９６７）
【非特許文献４】ＲＴ−ＰＣＲ法；Ｍ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７，２９３６−２９４２，（１９９９）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＣＤＶ抗原の検出法のうち、ウイルス分離法は細胞培養を伴い、判定までに長時間を必要とする。
また、ＩＦＡ法やＲＴ−ＰＣＲ法は検出のために蛍光顕微鏡やサーマルサーキュラー等の高価な機器が必要である。
いずれも専門的な技術が要求されるため、迅速性や簡便性の点で臨床現場で使用することは不可能であった。
この発明は、ＣＤＶ抗原を、臨床現場で、特異的に、迅速かつ簡便に検出できる方法の開発を目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、発明者は上記問題点を解決すべく鋭意検討した結果、ＣＤＶに対する抗体、好ましくはＣＤＶの糖蛋白質であるＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体を担体や反応膜に固定することにより、検体中のＣＤＶを選択的に捕捉することができ、加えてこの抗体を金コロイド、有色ラテックス、または、酵素標識することにより定性的または定量的にＣＤＶの有無を判定できることを見出し、この発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、請求項１に記載の発明は、イヌジステンパーウイルスに対応する抗体を反応膜または担体に固定する工程と、この反応膜または担体に検体を滴下し、有色粒子や酵素で標識した抗ジステンパーウイルス抗体を用いて、検体と抗体とを反応させる工程とを含むイヌジステンパーウイルス抗原の検出法である。
反応膜または担体としては、ニトロセルロース膜やポリスチレン性の担体がある。検体は液体に限られず、固形物でも生理食塩水などにより懸濁することにより使用できる。
【０００８】
また、請求項２に記載の発明は、上記イヌジステンパーウイルスに対応する抗体が、イヌジステンパーウイルスの糖蛋白質であるＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体である請求項１に記載のイヌジステンパーウイルス抗原の検出法である。
【０００９】
また、請求項３に記載の発明は、上記イヌジステンパーウイルスのＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体のクラスがＩｇＧである請求項２に記載のイヌジステンパーウイルス抗原の検出法である。
【００１０】
さらに、請求項４に記載の発明は、上記イヌジステンパーウイルスのＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体がペプシン消化物である請求項２または請求項３に記載のイヌジステンパーウイルス抗原の検出法である。
【００１１】
【発明の実施の態様】
以下、この発明に係るイヌジステンパーウイルス抗原の検出法の実施態様について詳細に説明する。
まず、ＣＤＶに対応する抗体の作製には、ＣＤＶをＶｅｒｏ細胞中で培養し、蔗糖密度勾配等で精製し使用する。また、精製したＣＤＶを１％トリトンＸ−１００で可溶化後、レンチルレクチン処理し、０．２Ｍ−α−メチルマンノピラノシドを含むリン酸食塩緩衝液で溶離したＣＤＶのＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質を含む糖蛋白質を免疫源として使用することも可能である。
【００１２】
本法に使用するＣＤＶに対応する抗体、または、ＣＤＶの糖蛋白質であるＨ蛋白質および／またはＦ蛋白質に対応する抗体の作製には一般的にウサギが使用されるが、緬羊など高い抗体価を産生する宿主であればその種類は問わない。抗体の作製は非特許文献５に示す常法にしたがって行うと良い。
【非特許文献５】微生物学実習提要、東京大学医科学研究所学友会編、１９９８年
【００１３】
例えば、精製したＣＤＶ０．５ｍｇ／ｍＬとフロイント完全アジュバントの当量混合液でウサギを免疫し、２週間後に再度ＣＤＶ０．５ｍｇ／ｍＬとフロイント不完全アジュバントの当量混合液で追加免疫をした。さらに、２週間後にＣＤＶ０．５ｍｇ／ｍＬとフロイント不完全アジュバントの当量混合液で追加免疫をし、最終免疫後３〜４日目に採血を行った。血清分離後、上清をＣＤＶの抗血清として使用した。
また、糖蛋白質を使用する場合には、レンチルレクチンで精製した糖蛋白質画分の蛋白質濃度を合わせて同様に行うと良い。
【００１４】
得られた抗血清中の抗体を４５％硫安沈澱により２回精製し、遠心分離後、得られた沈殿を生理食塩水に溶解し、リン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）に透析後、抗体液とした。この抗体液をプロテインＡに吸着せしめ、クエン酸液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ２．５）により溶出した液を精製抗体液とし、キットの作成に使用した。
【００１５】
なお、使用する抗体はポリクローナル抗体に限定するものではなく、抗ＣＤＶモノクローナル抗体を同様に精製し使用しても良い。また、必要に応じて精製抗体を酢酸ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．５）中で、ペプシン処理した抗ＣＤＶ抗体のｆ（ａｂ’）２画分を回収し、濃縮後の抗体液をキットの作製に使用しても良い。
【００１６】
抗ＣＤＶ抗体を固相化する反応膜としては、ニトロセルロースが好適に用いられるが、蛋白質を吸着する能力を有する担体であれば、膜の種類や材質は問わない。さらに、そのままでは吸着能を有さない反応膜については、アミノ基やカルボキシル基等を導入し、化学的に抗ＣＤＶ抗体を結合せしめることにより反応膜として使用することも可能である。
【００１７】
抗ＣＤＶ抗体は１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で反応膜上に線状に固相化した。固相化後、牛血清アルブミンを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に浸してブロッキングし、乾燥した。
【００１８】
また、標識物質としては金コロイド粒子が一般的に使用されるが、有色のラテックス粒子や酵素でも良い。金コロイド粒子の場合、その粒子径は２０〜１００ｎｍのサイズが好ましく、有色のラテックス粒子では０．０５〜０．５μｍの粒径が好適に用いられる。酵素標識の場合はアルカリ性フォスファターゼやペルオキシダーゼが一般的に用いられる。それらの粒子に抗ＣＤＶ抗体を１０〜１０００μｇ／ｍＬ濃度で炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で吸着させ使用した。
【００１９】
金コロイド粒子を用いたＣＤＶ抗原の検出法では、図１、図２に示す検査用キットを使用した。この検査用キットは、台紙１０の上面に短冊状の反応膜１１が貼り付けられ、この短冊状の反応膜１１は透明プラスチック製カバー１２で覆われている。
この反応膜１１の長形方向の一端には、サンプル滴下部１３が構成されている。また、このサンプル滴下部１３に隣接して標識抗体含有濾紙部１４が設けられている。さらに、この標識抗体含有濾紙部１４に隣接して判定部（ＣＤＶ抗原検出部）１５がこの反応膜１１の中央部に設けられている。さらには、反応膜１１の判定部１５の他端に吸水濾紙部１６が配置されている。
反応膜１１は検体中のＣＤＶ、抗ＣＤＶ標識抗体、および抗ＣＤＶ抗体との反応の場となり、加えて判定の場を提供するものである。
上記標識抗体含有濾紙部１４には抗ＣＤＶ標識抗体を含有した濾紙が設けられ、判定部１５には抗ＣＤＶ抗体が塗布されている。
サンプル滴下部１３に滴下された検体は、標識抗体含有濾紙部１４、判定部１５を通って吸水濾紙部１６に流れる。そして、この判定部１５に生じるラインの有無で判定が行われる。
【００２０】
感染が疑われる犬からのＣＤＶ抗原の検出を行うには、例えば、眼脂、口腔スワブ、鼻汁や糞便をそれぞれ生理食塩水に懸濁して検体とし、サンプル滴下部位に滴下し反応させる。検体は反応膜上を展開し、まず標識抗体と反応する。さらに、反応膜中央部にある判定部（ＣＤＶ抗原検出部）で反応し、吸収濾紙部に移動し、反応は終了する。
【００２１】
検体中にＣＤＶが存在すれば、まず、ＣＤＶは標識抗体と複合体を形成し、中央部で捕捉される。捕捉された複合体は捕捉部分に蓄積し、標識物質の色を呈するようになり、目視でＣＤＶの存在を確認できる。例えば、金コロイド標識の場合には赤紫色の線が出現する。
【００２２】
検体中にＣＤＶが存在しなければ、標識抗体と複合体を形成することがなく、反応膜上の抗体とも反応しないので、反応後の判定部の膜面に変化はない。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例を説明する。
実施例１（親和性テスト）
硫安分画により精製した抗ＣＤＶウサギポリクローナル抗体１ｍｇ／ｍＬを炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で２００倍に希釈し、９６穴マイクロプレートに０．１ｍＬずつ分注した。４℃、２時間以上放置後、１％スキムミルク溶液を加えてブロッキングした。水洗後、真空乾燥し測定に使用した。
本プレートを用いて、ＣＤＶウイルスの構成成分に対する親和性を調べた。
ＣＤＶの１％トリトンＸ−１００により可溶化したウイルス液、レンチルレクチン吸着画分、及び非吸着画分をそれぞれ蛋白質濃度１０μｇ／ｍＬに調製し、０．１ｍＬづつマイクロプレートに入れた。４℃、一夜放置後、水洗し、ペルオキシダーゼ標識抗ＣＤＶ抗体と反応させ、発色させた。その結果、表１に示したようにレンチルレクチン吸着画分に強い反応性を有し、この抗ＣＤＶ抗体はＣＤＶを構成する糖蛋白質と強い親和性があることが示された。
【表１】
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【００２４】
実施例２（特異性テスト）
プロテインＡ精製した抗ＣＤＶウサギポリクローナル抗体１ｍｇ／ｍＬを用いて、ニトロセルロース膜の中央部にラインを引き、乾燥後、１％スキムミルク溶液に浸漬してブロッキングした。乾燥後、抗体塗布面を上にして台紙に貼付した。粒径４０ｎｍの金コロイド液１００ｍＬを炭酸緩衝液で最終０．４５ｍＭ（ｐＨ９．０）に調製し、抗ＣＤＶウサギポリクローナル抗体（０．１ｍｇ／ｍＬ）、６ｍＬを穏やかに撹拌しながら滴下した。室温で３０分間反応し、牛血清アルブミンを０．１％濃度になるように添加した。更に、室温で２０分間撹拌し、６０００×ｇ、３０分間遠心分離し、沈殿を回収した。
【００２５】
２％牛血清アルブミン加５％蔗糖液に懸濁し、５０ｍＬとした。この液をガラス繊維濾紙に浸潤させ、乾燥させた。乾燥後、１ｃｍ幅にカットし、ニトロセルロース膜の下端に重なるように貼付した。ニトロセルロース膜の上端に重なるように吸水濾紙（一般的な厚手の濾紙であればよい）を貼付した。これらを適当な幅で裁断し検査用スティックとした。このスティックをサンプル滴下口と判定部分に開口部を有するケースに入れ検査用キットとし、検査に使用した。
【００２６】
本キットを用いてＣＤＶの遺伝子型の異なるワクチン株および国内分離株について、本発明のＣＤＶ検出法の特異性を調べた。各ウイルス液０．１ｍＬをサンプル口に滴下し、２０分後に判定した。その結果、表２に示したように本法はいずれの遺伝子型のＣＤＶとも反応した。（以後、このＣＤＶ抗原の検査法をＩＣ法と略す。）
【表２】
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【００２７】
実施例３（交差性テスト）
プロテインＡ処理により精製した抗ＣＤＶウサギポリクローナル抗体を０．１Ｍ食塩加酢酸ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．５）で透析後、ペプシンを加え、３７℃、１０時間処理した。ｐＨ調整後、リン酸緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックスＧ−７５でゲル濾過し、抗ＣＤＶ抗体のｆ（ａｂ’）２画分を回収した。本抗体液を用いて、実施例２と同様に検査用キットを作成した。
【００２８】
本検査用キットを用いて、イヌパルボウイルスなどの、イヌに感染性があるウイルスおよび腸内細菌群について、本発明のＣＤＶ検出法の交差性を調べた。各ウイルス液もしくは、細菌液０．１ｍＬをサンプル口に滴下し、２０分後に判定した。その結果、表３に示したように本法はＣＤＶ以外のウイルスや腸内細菌には反応しなかった。
【表３】
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【００２９】
実施例４（相関性テスト）
実施例３で作成した検査用キットを用いて、小動物病院でＣＤＶ感染症の疑いありと診断された検体５５例を対象とし、相関性テストを実施した。検査材料は糞便を使用した。表４に示したように、一致率９４．５％と良好な一致を見た。なお、不一致の３検体は検出感度の違いによるものと考えられた。
【表４】
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【００３０】
実施例５（検査時間テスト）
本発明のＣＤＶ検出法とＲＴ−ＰＣＲ法とを用いて、検査時間を比較した。
検査材料にはＣＤＶ培養液を用いた。表５に示したように、ＩＣ法が操作時間、操作性ともに有利であった。
【表５】
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【００３１】
【発明の効果】
この発明におけるＣＤＶ抗原検出法は、従来法より操作性が良く、簡便で短時間に結果が得られるため、臨床現場で使用可能であり、ＣＤＶの早期診断と感染拡大の予防にきわめて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施例に係るＣＤＶ抗原の検出法を説明するための検査用キットを示す平面図である。
【図２】この発明に係るＣＤＶ抗原の検出法を説明するための検査用キットを示す正面図である。
【符号の説明】
１０  台紙
１１  反応膜
１２  透明プラスチック製カバー
１３  サンプル滴下部
１４  標識抗体含有濾紙部
１５  判定部（ＣＤＶ抗原検出部）
１６  吸水濾紙部
【図１】
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【図２】
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