(57)【要約】【課題】ＤＮＡを化学的結合で強固にかつ高密度で固定化でき、しかも、ＤＮＡを担持した層が基材と強固に固定されており、また、容易に微細なパターニングが可能であるマイクロアレイ用基板とその作製方法を提案する。【解決手段】板状の基材と、この基材表面に一部が食い込んだアンカー部を介して形成された金属酸化物層と、この金属酸化物層の表面にはカルボキシル基が共有結合もしくは配位結合により固定されていると共に、自由末端にもカルボキシル基を有するように前記金属酸化物表面が修飾されているマイクロアレイ用基板。【選択図】　図１
2004069355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
板状の基材と、この基材表面に製膜された金属酸化物層と、前記金属酸化物層の表面にカルボキシル基が共有結合により固定されていると共に、自由末端にもカルボキシル基を有する化合物と、から構成されているマイクロアレイ用基板。
【請求項２】
板状の基材と、この基材表面に一部が食い込んだアンカー部を有して形成された金属酸化物層と、この金属酸化物層の表面にカルボキシル基が共有結合により固定されていると共に、自由末端にもカルボキシル基を有する化合物と、から構成されているマイクロアレイ用基板。
【請求項３】
請求項２に記載のマイクロアレイ用基板において、前記金属酸化物層の表面は、粗面化されていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載のマイクロアレイ用基板において、前記金属酸化物層は、前記基材上に複数の点状にパターニングされていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。
【請求項５】
板状の基材表面へ金属酸化物の微粒子を高速で衝突させて、前記基材に前記金属酸化物の微粒子が食い込むアンカー部を形成させるとともに前記金属酸化物層を形成させる工程と、形成された前記金属酸化物層の表面に共有結合によりカルボキシル基を固定し、かつ、自由末端にもカルボキシル基を有するよう前記金属酸化物表面を修飾する工程と、からなるマイクロアレイ用基板の作製方法。
【請求項６】
請求項５に記載のマイクロアレイ用基板の作製方法において、前記金属酸化物層を形成させる工程が常温環境下で行われることを特徴とするマイクロアレイ用基板の作製方法。
【請求項７】
請求項５に記載のマイクロアレイ用基板の作製方法において、前記金属酸化物の微粒子を高速で衝突させる手段は、前記金属酸化物の微粒子をガス中に分散させたエアロゾルを、高速で前記基材に向けて噴射することとしたマイクロアレイ用基板の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医療、農業分野や生化学、分子生物学、遺伝子工学等において使用されるＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）等のマイクロアレイの作製に必要なマイクロアレイ用基板とその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡマイクロアレイは、表面処理したスライドガラスやシリコンなどの基板にＤＮＡ分子を高密度に配列固定化させたデバイスであり、遺伝子発現や遺伝子多型などを効率的に解析可能である。ＤＮＡマイクロアレイの基板に用いられるスライドガラス等の表面はＤＮＡ等の生体高分子を固定化するのに適切な官能基を有さないため、表面処理を行う必要がある。スライドガラスの表面処理としては、従来、ポリリシンを用いて処理する方法［Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，４６７−４７０（１９９５）］が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ＤＮＡマイクロアレイの基板として、ポリリシンで表面処理したスライドガラスを用いた場合、基板とＤＮＡの固定が静電気的な結合であるため、ＤＮＡの固定化が不安定で、スポッティング工程、ハイブリダイゼーション工程、後処理工程、洗浄工程において、ＤＮＡが剥離しやすく、また、ＤＮＡが非特異的な吸着を起こすといった問題がある。
【０００４】
これを解決するために、特開２０００−６３１５４号公報に開示されるように、カルボキシル基を官能基として有するポリマーで表面をコーティングしたガラスプレートがある。この方法は、表面に効率的にＤＮＡ等の核酸を安定に固定化することができるガラスプレートである。しかし、この基板材料は、コーティング剤溶液中にガラスプレートを浸して乾燥させたものであり、ＤＮＡマイクロアレイ基板を繰り返し使用した場合にはコーティング層がガラスプレートから剥離することにより結局ＤＮＡも剥離するといった恐れがあり、また、微細加工のしやすさに問題がある。
【０００５】
そこで、本発明は、ＤＮＡを化学的結合で強固にかつ高密度で固定化でき、しかも、ＤＮＡを担持した層が基材と強固に固定されており、また、容易に微細なパターニングが可能であるマイクロアレイ用基板とその作製方法を提案するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を達成すべく、本発明は、板状の基材と、この基材表面に製膜された金属酸化物層と、前記金属酸化物層の表面にカルボキシル基が共有結合により固定されていると共に、自由末端にもカルボキシル基を有する化合物と、から構成されているマイクロアレイ用基板を提供する。
【０００７】
ここで、金属酸化物層はＰＶＤ等の手段によって基材に対して強固に固定されているものである。そして、この金属酸化物層は基材表面よりも起伏に富む等により、単位領域当たりのＯＨ基数はガラス基材表面に比べて多く、また、化合物のカルボキシル基と共有結合（通常ではエステル結合であるが、特定の化合物については配位結合である）していることにより、自由末端にカルボキシル基を有する多くの化合物を金属酸化物層に対して強固に固定することができる。
【０００８】
また、別の形態に係る本発明においては、板状の基材と、この基材表面に一部が食い込んだアンカー部を介して形成された金属酸化物層と、この金属酸化物層の表面にはカルボキシル基が共有結合により固定されていると共に、自由末端にもカルボキシル基を有する化合物と、から構成されているマイクロアレイ用基板を提供する。
【０００９】
本発明においては、自由末端にカルボキシル基を有する化合物が、後述するエアロゾルディポジション法によって形成された基材表面に一部が食い込むアンカー部を有する金属酸化物層を介して基材と固定されている。このように、基材と金属酸化物層とはアンカー部によって強固に固定されており剥離する可能性が低く、また、金属酸化物層のＯＨ基が化合物のカルボキシル基と共有結合（通常ではエステル結合であるが、特定の化合物については配位結合である）していることにより、自由末端にカルボキシル基を有する化合物が金属酸化物層に対して強固に固定される。その結果として、基材から自由末端にカルボキシル基を有する化合物が剥離する可能性も低くなる。
【００１０】
以上の２つの発明の形態において、基材材料は金、銀、銅、鉄、シリコン等の金属、ガラス、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化インジウム等のセラミックス、ポリカーボネイト、フッ素樹脂等のプラスティック等が挙げられる。
また、金属酸化物層は、その主成分として酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化亜鉛、酸化スズ、酸化インジウム等が挙げられる。また、これら金属酸化物を主成分とする金属との複合体、これら金属酸化物を主成分とする樹脂との複合体が挙げられる。
また、前記金属酸化物層と共有結合もしくは配位結合により固定されるカルボキシル基を有し、かつ、自由末端にカルボキシル基を有する化合物は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、テレフタル酸等のジカルボン酸、クエン酸、１，２，３−プロパントリカルボン酸、エチレンジアミン四酢酸、１，２，４−ベンゼントリカルボン酸等の多価カルボン酸、およびそれらの酸無水物等が有用である。
なお、前記ジカルボン酸よりも前記多価カルボン酸の方が、基板とＤＮＡ等の生体高分子の固定化が強固になると考えられる。
そして、前記自由末端のカルボキシル基とＤＮＡ、たんぱく質等の生体高分子のアミノ基とを反応させて固定化すれば、ＤＮＡマイクロアレイ等として利用することができるが、このとき、金属酸化物層が基材から剥離することが殆ど無く、ＤＮＡマイクロアレイは耐久性に優れたものとなる。
【００１１】
また、本発明において、前記金属酸化物層は、その表面がＪＩＳ　Ｂ　０６０１に規定された算術平均粗さ０．０５μｍ以上に粗面化されていることが望ましい。前記金属酸化物層の表面が粗面化され表面積が大きくなると、多量のＤＮＡ等の生体高分子を高密度に固定化することができ、精度、再現性、定量性が向上すると考えられる。
【００１２】
また、本発明において、前記金属酸化物層は、複数の点状にパターニングされていることが望ましい。あらかじめ基板側が複数の点状にパターニングされていると、基板にＤＮＡ等の生体高分子をスポッティングする工程やハイブリダイゼーション工程、後処理工程、洗浄工程において、ＤＮＡの非特異的な吸着が起こりにくいと考えられる。
【００１３】
なお、基板材料は凹型にパターニングされており、かつ、その凹部の表面に金属酸化物層が形成されていることが望ましい。これは、スポッティング工程、ハイブリダイゼーション工程、後処理工程、洗浄工程において、ＤＮＡ等の生体高分子の剥離や、非特異的な吸着が起こりにくいと考えられる。
【００１４】
本発明に係るマイクロアレイ用基板の作製方法は、板状の基材表面へ金属酸化物の微粒子を高速で衝突させて、前記基材に前記金属酸化物の微粒子が食い込むアンカー部を形成させるとともに前記金属酸化物層を形成させる工程と、形成された前記金属酸化物層の表面に共有結合によりカルボキシル基を固定し、かつ、自由末端にもカルボキシル基を有するよう前記金属酸化物表面を修飾する工程と、からなることを特徴とする。
【００１５】
この金属酸化物層を形成させる工程は、エアロゾルデポジション法（特許第３２６５４８１号、国際出願特許ＷＯ　０１／２７３４８　Ａ１）で作製される構造物の特徴である。エアロゾルデポジション法は、前述する金属酸化物層等のセラミックスの膜を各種基材上に形成させる方法であり、昇温させる工程を要さず、焼結体と同等の強度を保有するセラミックス膜を形成できる。このセラミックス膜と基材の界面には上述のようなアンカー部が形成される特徴を有する。
【００１６】
アンカー部を保有することは、ＤＮＡ等の生体高分子の固定化に最適なカルボキシル基を導入できる前記金属酸化物と、前記基材との密着性を良好にできるため好適である。
また、エアロゾルデポジション法は、前記基材に所望とする微細形状のマスクを配置することにより、所望とする金属酸化物層の微細なパターニングが容易に形成できるため好適な手法である。
なお、金属酸化物表面を修飾する工程は、前記基材上に前記金属酸化物を形成したものを、前記ジカルボン酸や前記多価カルボン酸の溶液に浸漬することにより、自由末端にカルボキシル基を有するマイクロアレイ用基板が簡便に作製できる。
【００１７】
また、本発明の特徴の１つは、前記基材上に前記金属酸化物層の形成を常温環境下で行うことである。ここで常温とは、室温以上２００℃以下を指し、即ち、セラミックスの焼成温度より十分に低い値である。従って、プラスティック基材や金属基材に金属酸化物を形成させることが容易である。
【００１８】
ここで、本発明を理解する上で重要となる語句の解釈を以下に行う。
（アンカー部）
本件の場合には、スライドガラス等の基材と金属酸化物層の界面に形成された凹凸を指し、特に、予めスライドガラス等の基材に凹凸を形成させるのではなく、金属酸化物層の形成時に、元のスライドガラス等の基材の表面精度を変化させて形成される凹凸のことを指す。
（界面）
本件の場合には、結晶子同士の境界を構成する領域を指す。
【００１９】
【発明の実施の態様】
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明する。
図１に、基材であるスライドガラス１０１上に金属酸化物層１０２と、この金属酸化物層１０２の表面に化合物としてのジカルボン酸１０３が修飾されたマイクロアレイ用基板１０の構成模式図を示す。
この図１に示すように、ジカルボン酸１０３のカルボキシル基が共有結合又は配位結合により金属酸化物層１０２に固定され、かつ、自由末端にもカルボキシル基を有する。
このように、金属酸化物層１０３とジカルボン酸１０３とが化学的結合により固定されており、その結合は強固である。
【００２０】
なお、スライドガラス１０１上に金属酸化物層１０２を形成するには、真空蒸着、スパッタリング、イオンプレーティングといったＰＶＤ法によって形成することも可能であるが、エアロゾルディポジション法によって、アンカー層を介して形成した方が強固に固定できる為好ましい。
【００２１】
また、図２には、基材であるスライドガラス１０１に表面が粗面化された金属酸化物層１０２が形成され、この金属酸化物層１０２をジカルボン酸１０３で修飾したマイクロアレイ用基板１１の構成模式図を示す。
この図２では金属酸化物層１０２の表面が粗面化されていることを強調すべく、金属酸化物層１０２の断面が△状が連なる形状として表現しているが、実際には触針式表面形状測定器（Ｖｅｅｃｏ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製　Ｄｅｋｔａｋ３０３０）により測定したＪＩＳ　Ｂ　０６０１に規定された算術平均粗さが０．０５μｍ以上となるようにエアロゾルデポジション法により製膜されているものを用いれば良く、この図２に示すように断面が△状が連なる形状となっているものに限定されるものではない。
【００２２】
また、図３には、基板であるスライドガラス１０１の表面が凹型にパターニングされており、かつ、その凹部の表面に粗面化された金属酸化物層１０２が形成され、この金属酸化物層１０２をジカルボン酸１０３で修飾したマイクロアレイ用基板１２の構成模式図を示す。
【００２３】
図４はアンカー部を説明するものであり、エアロゾルデポジション法を用いて、基材に該当する単結晶シリコン基材上に金属酸化物層に該当する酸化アルミニウム層を形成した構造物について、断面方向から透過型電子顕微鏡（日立製作所製　Ｈ−９０００ＵＨＲ）により観察したイメージを示す。シリコン基材と酸化アルミニウム層との界面には約１００ｎｍ程度の凹凸からなるアンカー層が形成されていることが確認できる。
【００２４】
図５に、エアロゾルデポジション法を利用した、スライドガラス上に複数の点状にパターニングされた金属酸化物層の形成に使用する構造物作製装置３０の模式図を示す。
作製装置３０は、窒素等のガスボンベ３０１がガス搬送管３０２を介して、金属酸化物の微粒子を内蔵するエアロゾル発生器３０３に接続し、エアロゾル搬送管３０４を介して形成室３０５内に設置された、縦０．４ｍｍ横１０ｍｍの開口を持つノズル３０６に接続されている。ノズル３０６の先にはＸＹステージ３０７に設置されたスライドガラス３０８が配置され、スライドガラス３０８には複数の点状にパターニングされたマスク３０９が配置されている。形成室３０５は真空ポンプ３１０に接続されている。
【００２５】
以上の構成の作製装置３０による、マイクロアレイ用基板における複数の点状にパターニングされた金属酸化物層の作製手順を次に述べる。窒素ガスボンベ３０１を開栓し、窒素ガスを搬送管３０２を通じてエアロゾル発生器３０３に導入させ、金属酸化物の微粒子を含むエアロゾルを発生させる。エアロゾルは搬送管３０４を通じてノズル３０６へと送られ、ノズル３０６の開口より高速で噴出される。このとき真空ポンプ３１０の作動により、形成室３０５内は数ｋＰａの減圧環境下に置かれている。
【００２６】
ノズル３０６の開口の先に配置されたスライドガラス３０８に金属酸化物の微粒子が高速（５０ｍ／ｓｅｃ〜４５０ｍ／ｓｅｃ程度）で衝突し、粒子はその運動エネルギーにより変形、破砕を起こして、一部はスライドガラス３０８に食い込みアンカー部を形成し、一部はアンカー部の上に破砕して形成された微細断片粒子同士がその新生面を介して接合し、これを繰り返してスライドガラス３０８上に金属酸化物層を形成していく。この金属酸化物の形成過程により、金属酸化物の表面は粗面化される。
【００２７】
スライドガラス３０８は複数の穴が点状にパターニングされたマスク３０９によりマスキングされているため、アンカー部および金属酸化物層はマスキングされていない箇所のみに形成される。スライドガラス３０８はＸＹステージ３０７により揺動されており、所望の面積に金属酸化物層は形成され、また、これらのプロセスはすべて室温下で行われた。
【００２８】
こうして金属酸化物層の形成されたスライドガラス３０８を取り出し、ジカルボン酸の溶解した溶液に浸漬することによりジカルボン酸を固定し、カルボジイミドによりこのジカルボン酸の自由末端にあるカルボキシル基を活性化し、ＤＮＡのアミノ基をアミド結合させて、ＤＮＡマイクロアレイを形成することができる。
【００２９】
【発明の効果】
以上に説明したように本発明によれば、ＤＮＡ等の生体高分子を化学的結合で強固にかつ高密度で固定化でき、また、容易に微細なパターニングが可能であるマイクロアレイ用基板を提供することができる。このため、精度、再現性、定量性に優れた遺伝子解析を行うことができ、医療、農業分野や生化学、分子生物学、遺伝子工学等の分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るマイクロアレイ用基板の構成模式図。
【図２】本発明に係るマイクロアレイ用基板の構成模式図。
【図３】本発明に係るマイクロアレイ用基板の構成模式図。
【図４】本発明に係るマイクロアレイ用基板における基材と金属酸化物層との界面付近の様子を断面方向から透過型電子顕微鏡にて観察したイメージ。
【図５】本発明に係るマイクロアレイ用基板における金属酸化物層の作製装置の模式図。
【符号の説明】
１０，１１，１２…マイクロアレイ用基板、１０１…スライドガラス、１０２…金属酸化物層、１０３…ジカルボン酸、３０…金属酸化物層の作製装置、３０１…ガスボンベ、３０２…ガス搬送管、３０３…エアロゾル発生器、３０４…エアロゾル搬送管、３０５…形成室、３０６…ノズル、３０７…ＸＹステージ、３０８…スライドガラス、３０９…マスク、３１０…真空ポンプ
【図１】
2004069355.tif 000003
【図２】
2004069355.tif 000004
【図３】
2004069355.tif 000005
【図４】
2004069355.tif 000006
【図５】
2004069355.tif 000007