(57)【要約】      （修正有）【課題】検出方法として蛍光エネルギー移動を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特定の適用を見出すクエンチャー化合物を提供する。【解決手段】式（１）（その置換形態を含む）を有する非対称シアニン色素化合物を提供し、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも１個は連結基であり、ＸはＯ、ＳまたはＳｅであり、そしてｎは０〜２の範囲である。さらに、非対称シアニン色素を含むレポーター−クエンチャー色素対、非対称シアニン色素を取込む色素−標識化ポリヌクレオチドおよび色素−標識化ポリヌクレオチドを利用するハイブリダイゼーション検出方法を提供する。2004323839.tif 000025【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造を有し、そして任意の付随する対イオンを含む非対称シアニン色素化合物であって：
【化１】
2004323839.tif 000024
ここで：
ｎは、０〜２の範囲内であり；
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＳｅであり；
Ｒ１は、メチルおよび連結基からなる群から選択されるか、またはメチン架橋の隣接炭素と一緒になる場合、５〜７員を有する環構造を形成し；
Ｒ２は、連結基であり；
Ｒ３は、水素であるか、またはＲ４と一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；
Ｒ４は、水素であるか、またはＲ３もしくはＲ５のどちらかと一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；
Ｒ５は、ニトロであるか、またはＲ４もしくはＲ６のどちらかと一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；
Ｒ６は、水素であるか、またはＲ５と一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成する、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、レポーター−クエンチャーエネルギー−移動色素対でクエンチャーとして有用な色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、シアニンクエンチャー化合物、このような化合物を取込む試薬、このような化合物および／または試薬を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、現代生物学において重要な分類の技術に含まれる。このようなアッセイは、多様な適用を有し、遺伝病の診断、ヒトの同定、微生物の同定、親子鑑定、ウイルス学、およびＤＮＡ塩基配列決定（すなわちハイブリダイゼーションによる塩基配列決定）が挙げられる。
【０００３】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの重要な局面は、ハイブリダイゼーションの検出を容易とするために使用される方法である。核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される特に重要な分類の方法は、「レポーター」色素および「クエンチャー」色素を含むレポーター−クエンチャーエネルギー−移動色素対を利用する。これらの色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）過程を通じて相互作用する。これらの方法において、レポーターは、発光化合物であって、これは、化学反応（化学ルミネセンスを生ずる）によるか、または光の吸収（蛍光を生ずる）によるかどちらかで励起され得る。このクエンチャーは、レポーターと相互作用することにより光の放射を変え、その結果、通常、レポーターの発光効率を減少し得る。この現象を、クエンチングと呼ぶ。このクエンチング効率は、レポーター分子とクエンチャー分子との間の距離の強い関数である。従って、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ハイブリダイゼーションの検出は、エネルギー移動系を設計することによって達成され、この移動系においてレポーターとクエンチャーとの間の間隔が、ハイブリダイゼーションの結果として調節される。
【０００４】
現在、ＦＲＥＴベースの核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用されるクエンチャーは、それ自体が、蛍光性である。すなわちレポーターの蛍光をクエンチングすることに加えて、このクエンチャーは、蛍光発光を生じる。このことは、複数のスペクトル分析レポーターを使用するアッセイにおいて特に問題である。クエンチャーの蛍光が、１種またはそれ以上のレポーターによって生じられる蛍光シグナルと相互作用し得るからである。
【０００５】
従って、実質的にそれ自体、非蛍光性であるクエンチャー色素が引き続き必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（要旨）
本発明は、レポーター−クエンチャーエネルギー−移動色素対のコンテクストにおいて有用である非蛍光性シアニンクエンチャー化合物の１分類における本発明者らの発見に関する。これらのクエンチャー化合物は、検出方法として蛍光エネルギー移動を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特定の適用を見出す。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下を提供する：
項目（１）  次の構造を有し、そして任意の付随する対イオンを含む非対称シアニン色素化合物であって：
【０００８】
【化２】
2004323839.tif 000002
ここで：
ｎは、０〜２の範囲内であり；
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＳｅであり；
Ｒ１は、メチルおよび連結基からなる群から選択されるか、またはメチン架橋の隣接炭素と一緒になる場合、５〜７員を有する環構造を形成し；
Ｒ２は、連結基であり；
Ｒ３は、水素であるか、またはＲ４と一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；
Ｒ４は、水素であるか、またはＲ３もしくはＲ５のどちらかと一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；
Ｒ５は、ニトロであるか、またはＲ４もしくはＲ６のどちらかと一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；
Ｒ６は、水素であるか、またはＲ５と一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成する、化合物。
【０００９】
項目（２）  項目１に記載の化合物であって、Ｒ５がニトロであり、そしてＲ３、Ｒ４およびＲ６が、それぞれ水素である、化合物。
【００１０】
項目（３）  項目１に記載の化合物であって、前記連結基が、低級アルキルアミンまたは低級アルキルカルボキシである、化合物。
【００１１】
項目（４）  項目１に記載の化合物であって、Ｒ１またはＲ２の一方が−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ＋（ＣＨ３）３であり、ここでｑは、２〜１２の範囲であり、そしてもう一方は、連結基である、化合物。
【００１２】
項目（５）  項目３に記載の化合物であって、ここで、前記低級アルキルカルボキシが−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ＋（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ２Ｈであり、ここでｑは、２〜１２の範囲である、化合物。
【００１３】
項目（６）  項目１に記載の化合物であって、ここでＸが、硫黄である、化合物。
【００１４】
項目（７）  項目１に記載の化合物であって、ここでｎが、０または１である、化合物。
【００１５】
項目（８）  項目１に記載の化合物であって、ここでＲ３およびＲ４がそれぞれ水素であり、そしてＲ５およびＲ６が一緒になって、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族環となる、化合物。
【００１６】
項目（９）  以下の式の化合物
【００１７】
【化３】
2004323839.tif 000003
項目（１０）  以下の式の化合物
【００１８】
【化４】
2004323839.tif 000004
項目（１１）  以下の式の化合物
【００１９】
【化５】
2004323839.tif 000005
項目（１２）  以下の式の化合物
【００２０】
【化６】
2004323839.tif 000006
項目（１３）  以下の式の化合物
【００２１】
【化７】
2004323839.tif 000007
項目（１４）  以下の式の化合物
【００２２】
【化８】
2004323839.tif 000008
項目（１５）  レポーター色素およびクエンチャー色素を含むレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対であって、該クエンチャー色素が、項目１に記載の非対称シアニン色素化合物である、レポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対。
【００２３】
項目（１６）  前記レポーター色素が、キサンテン、クマリン、ナフチルアミン、シアニンおよびボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）色素からなる群から選択される、項目１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対。
【００２４】
項目（１７）  前記レポーター色素がキサンテン色素である、項目１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対。
【００２５】
項目（１８）  前記キサンテン色素が、フルオレセイン色素またはローダミン色素である、項目１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対。
【００２６】
項目（１９）  前記レポーター色素が、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）であり、前記クエンチャー色素が、以下の式である、項目１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対
【００２７】
【化９】
2004323839.tif 000009
項目（２０）  前記レポーター色素が、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、および２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）からなる群から選択され、そして前記クエンチャー色素が、以下の式である、項目１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対
【００２８】
【化１０】
2004323839.tif 000010
項目（２１）  前記クエンチャー色素が、以下の式である、項目１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対
【００２９】
【化１１】
2004323839.tif 000011
項目（２２）  標識化オリゴヌクレオチドであって、
オリゴヌクレオチド；および
該オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合した項目１に記載の非蛍光シアニン色素クエンチャーを含む、標識化オリゴヌクレオチド。
【００３０】
項目（２３）  前記オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合したレポーター色素をさらに含む、項目２２に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【００３１】
項目（２４）  項目２３に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、ここで、前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の前記位置において、該標識化オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされる場合、該レポーター色素が該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされず、そして該標識化オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされない場合、該レポーター色素が該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされるような、標識化オリゴヌクレオチド。
【００３２】
項目（２５）  項目２４に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、前記レポーター色素が、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にクエンチされない場合の蛍光に比べて、２分の１以下に減少する、標識化オリゴヌクレオチド。
【００３３】
項目（２６）  項目２５に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、前記レポーター色素が、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にクエンチされない場合の蛍光に比べて、６分の１以下に減少する、標識化オリゴヌクレオチド。
【００３４】
項目（２７）  項目２３に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の一方が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端で結合し、そしてもう一方が、該オリゴヌクレオチドの５’−末端で結合する、標識化オリゴヌクレオチド。
【００３５】
項目（２８）  標的核酸配列を検出する方法であって、少なくとも１つの標的核酸配列を含む核酸サンプルを提供する工程；および標識化オリゴヌクレオチドプローブを、該標的核酸配列にハイブリダイズする工程を包含し、該標識化オリゴヌクレオチドプローブは、項目１に記載の非対称シアニン色素化合物で標識化される、方法。
【００３６】
項目（２９）  項目２８に記載の方法であって、前記標識化オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合したレポーター色素を含む、方法。
【００３７】
項目（３０）  項目２９に記載の方法であって、ここで、前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の前記位置において、前記標識化オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされる場合、該レポーター色素が、該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされず、そして該標識化オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされない場合、該レポーター色素が該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされるような、方法。
【００３８】
項目（３１）  項目３０に記載の方法であって、前記レポーター色素が、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にクエンチされない場合の蛍光に比べて、２分の１以下に減少する、方法。
【００３９】
項目（３２）  項目３１に記載の方法であって、前記レポーター色素が、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にクエンチされない場合の蛍光に比べて、６分の１以下に減少する、方法。
【００４０】
項目（３３）  項目２９に記載の方法であって、前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の一方が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端で結合し、そしてもう一方が、該オリゴヌクレオチドの５’−末端で結合する、方法。
【００４１】
項目（３４）  項目２９に記載の方法であって、前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の一方または両方が、前記オリゴヌクレオチドプローブから除去されるように該オリゴヌクレオチドプローブを消化する工程をさらに含む、方法。
【００４２】
項目（３５）  項目３４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する工程が、ポリメラーゼ酵素の５’→３’ヌクレアーゼ活性によって行われる、方法。
【００４３】
項目（３６）  次の構造を有する非対称シアニン色素化合物であって：
【００４４】
【化１２】
2004323839.tif 000012
その置換された形態を含み、ここで：
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、連結基であり；そして
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり；
ここでｎは０〜２の範囲である、非対称シアニン色素化合物。
【００４５】
項目（３７）  Ｃ−３置換基がニトロである、項目（３６）に記載の化合物。
【００４６】
項目（３８）  項目３６に記載の化合物であって、前記連結基が、低級アルキルアミンまたは低級アルキルカルボキシである、化合物。
【００４７】
項目（３９）  項目３６に記載の化合物であって、Ｒ１またはＲ２の一方が−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ＋（ＣＨ３）３であり、ここでｑは、２〜１２の範囲であり、そしてもう一方は、連結基である、化合物。
【００４８】
項目（４０）  項目３８に記載の化合物であって、ここで、前記低級アルキルカルボキシが−（ＣＨ２）ｑ−Ｎ＋（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ２Ｈであり、ここでｑは、２〜１２の範囲である、化合物。
【００４９】
項目（４１）  項目３６に記載の化合物であって、ここでＸが、硫黄である、化合物。
【００５０】
項目（４２）  １位および２位；２位および３位；ならびに／または３位および４位で結合した、縮合芳香族置換基または置換芳香族置換基を有する、項目（３６）に記載の化合物。
【００５１】
項目（４３）  前記置換芳香族が、ニトロ置換基を含む、項目（４２）に記載の化合物。
【００５２】
項目（４４）  Ｒ２およびメチン架橋の最も近い炭素と一緒になる場合に５員〜７員の環構造を形成する架橋基を含む、項目３６に記載の化合物。
【００５３】
第１の局面において、本発明は、以下の構造を有する非対称性のシアニン色素化合物（その置換形態を含む）を含み、
【００５４】
【化１３】
2004323839.tif 000013
ここで、すくなくとも１個のＲ１およびＲ２は連結基であり、ＸはＯ、Ｓ、またはＳｅであり、そしてｎは０〜２の範囲である。
【００５５】
第２の局面において、本発明は、レポーター色素およびクエンチャー色素を含むレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対を含み、ここで、クエンチャー色素は、第１の局面の非対称シアニン色素化合物である。
【００５６】
ＥＰ−Ａ−０  ７１０  ６６８は、非ニトロ置換シアン色素およびオリゴヌクレオチドの結合体を開示する。これらの結合体が、標的にハイブリダイズまたは結合する場合、蛍光強度の検出可能な増加または蛍光偏光の変化が観測される。従って、ＥＰ−Ａ−０  ７１０  ６６８の結合体色素は、蛍光共鳴エネルギー移動によって予想外のクエンチングおよびニトロ置換シアニン色素の非蛍光特性によって本発明と区別される。
【００５７】
第３の局面において、本発明は、第１の局面に従って、そこに共有結合的に結合したシアニン色素クエンチャーを有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００５８】
第４の局面において、本発明は、標的の核酸配列を検出するための方法を提供し、これは、少なくとも１個の標的核酸配列を含む核酸サンプルを提供し、そして標識化オリゴヌクレオチドプローブを標的の核酸配列にハイブリダイズする工程を含み、この標識化オリゴヌクレオチドプローブが、第１の局面の非対称シアニン色素化合物で標識化される。この第４の局面の特定の好ましい実施態様において、さらなる方法は、レポーター色素およびクエンチャー色素の１個または両方がオリゴヌクレオチドプローブから取除かれるようなオリゴオリゴヌクレオチドを消化する工程を含む。
【００５９】
上記発明の様々な局面および実施態様は、公知のクエンチャー色素化合物を越える次の重要な有用性の１またはそれ以上を達成する。本発明の非対称シアニンクエンチャーは、試薬（例えば、ポリヌクレオチド）と容易に共有結合をし得る。さらに、オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の非対称シアニンクエンチャーで標識化され、従来の標識化プローブに比べて高いハイブリダイゼーション安定性を示し、これによりハイブリダイゼーションの不一致に対してより敏感である、より短いプローブの使用を可能にする。さらに、本発明の非対称シアニンクエンチャーは、本質的に非蛍光性であり、これにより１個またはそれ以上のさらなるレポーターにより占有され得るさらなるスペクトルを提供する。
【００６０】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および有用性は、以下の明細書、図面、および特許請求の範囲を参照することでより良く理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
参考は、本発明の好ましい実施態様、添付する図面で説明される例に詳細に示される。本発明は、好ましい実施態様を組合せて記載されるが、これらの実施態様によって本発明を限定しようと意図するものではないことを理解されるべきである。逆に、本発明は、代替の、改変のおよび等価のものを含むことを意図するものであり、これらは、添付される特許請求の範囲によって定義される発明の範囲内に含まれ得る。
【００６２】
（Ｉ．定義）
他に記述しなければ、次の本明細書において使用する用語および語法は、次の意味を有することを意図する。
【００６３】
「エネルギー移動」および「蛍光クエンチング」とは、エネルギーが、電子的に励起したルミネセンス「レポーター」分子から、「クエンチャー」分子によって取除かれ、これによりレポーター分子からの光発光なしで、レポーター分子がその基底状態に戻るプロセスをいう。このレポーター分子は、光吸収および化学反応を含む多数のプロセスの任意により、より高いエネルギーレベルの１つに励起され得る。
【００６４】
一連の色素に関して「スペクトル分解能」とは、色素の蛍光発光バンドが十分に明瞭（すなわち、十分に重複しないこと）であることを意味し、各色素が結合する試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、各色素により発生する蛍光シグナルに基づいて、標準光検出系（例えば、通過帯域フィルター、光電子増倍管、電荷結合素子、および分光器などの系を使用すること）を使用して識別され得、米国特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１〜７６頁、ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５）に記載される系に例示される。
【００６５】
「連結基」とは、試薬に付属した「補相的官能基」と反応し得る部分を意味し、これらの反応により、試薬に色素を結合する「連結」を形成する。この補相的官能基がアミンである場合、好ましい、連結基は、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、４，６−ジクロロトリアジニル、カルボキシレートスクシンイミミジルエステル、または他の活性なカルボキシレートである。あるいは、連結基は、アミンであり得る。この補相的官能基がスルフヒドリルである場合、好ましくは、この連結基は、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照のこと。特定の好ましい実施態様において、この連結基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして補相的官能基がアミンである。ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート連結基を含む本発明の色素を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。
【００６６】
「低級アルキル」とは、１〜８個の炭素原子を含む直鎖および分岐炭化水素の部分（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、など）を意味する。
【００６７】
「ヌクレオシド」とは、ペントースの１’位に連結したプリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシドベース（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン、など）からなる化合物をいう。ヌクレオシドベースがプリンまたは７−デアザプリンである場合、この糖部分がプリンまたはデアザプリンの９位に結合され、そしてヌクレオシドベースがピリミジンである場合、糖部分がピリミジンの１位に結合される（例えば、ＫｏｒｎｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２））。本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）のことをいう。ここで、最も一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位に結合される水酸基である。本明細書中で使用される用語「ヌクレオシド／ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方を含む一連の化合物をいう。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「アナログ」は、改変されたベース部分、改変された糖部分および／または改変されたホスフェート部分を有する合成アナログを含む（例えば、ＳｃｈｅｉｔによるＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０）に一般的に記載される）。ホスフェートアナログは、リン原子が、＋５酸化状態であり、そして１個またはそれ以上の酸素原子が、非酸素部分で置換されるホスフェートアナログを含む。典型的なホスフェートアナログは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホアミデート、ホウ素ホスフェート（付随する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）を、このような対イオンが存在する場合に含む）が挙げられるが、これらにより限定されるものではない。典型的なベースアナログは、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、偽ウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジンおよび他の同様なアナログが挙げられるが、これらに限定されない。典型的な糖アナログは、２’−または３’位が水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アミノ、またはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモである２’−または３’−改変体が挙げられるが、これらにより限定されるものではない。用語「標識化ヌクレオシド／標識化ヌクレオチド」は、標識に共有結合するヌクレオシド／ヌクレオチドのことをいう。
【００６８】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、天然のヌクレオチドモノマーまたはそのアナログ（二本鎖または一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー形状、などを含む）のポリマーのことを意味する。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結によって結合されるが、本明細書において使用される場合、用語「ホスホジエステル連結」は、ホスホジエステル結合またはそのホスフェートアナログを含む結合（付随する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋）を、このような対イオンが存在する場合に含む）のことをいう。典型的に、ポリヌクレオチドは、少しのモノマー単位（例えば５〜４０）から幾千のモノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドが文字の配列によって表される場合（例えば、ＡＴＧＣＣＴＧ）は、ヌクレオチドは、左から右へ５’から３’の順序であり、そして他に記述がなければ、「Ａ」は、デオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを意味し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」は、デオキシチミジンを意味することが理解される。
【００６９】
本明細書中で使用される「置換」とは、１またはそれ以上の水素原子が、１またはそれ以上の非水素原子、官能基または官能部分で置換される分子のことをいう。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ２であり、一方置換窒素は、−ＮＨＣＨ３である。典型的な置換基は、ハロ（フッ素および塩素）、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、電子リッチな複素環、および連結基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
「メチン架橋」または「ポリメチン架橋」とは、２個のベース部分を接続するシアニン色素化合物の部分、すなわち次の構造を有する架橋のことをいい、
−（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＨ−
ここで、ｎは、典型的に０〜２の範囲にある。
【００７１】
「キサンテン系色素」とは、次の縮合３環構造を含む色素であり、
【００７２】
【化１４】
2004323839.tif 000014
ここで、Ｒは、酸素（フルオレセイン）または−ＮＨ（ローダミン）（その置換形状を含む）である。典型的な置換フルオレセイン化合物は、次の構造を有する「ＮＥＤ」色素、
【００７３】
【化１５】
2004323839.tif 000015
次の構造を有する「ＴＥＴ」色素、
【００７４】
【化１６】
2004323839.tif 000016
および、次の構造を有する「ＦＡＭ」色素、
【００７５】
【化１７】
2004323839.tif 000017
を含む。典型的なローダミン色素は、以下の構造を有する「ＴＡＭＲＡ」または「ＴＭＲ」色素である。
【００７６】
【化１８】
2004323839.tif 000018
「クマリン色素」は、次の縮合２環構造を含む色素であり、
【００７７】
【化１９】
2004323839.tif 000019
ここで、Ｒは、酸素（ヒドロキシクマリン）または−ＮＨ（アミノクマリン）（それらの置換形状を含む）である。
【００７８】
「ＢＯＤＩＰＹＴＭ色素」は、次の縮合環構造を含む色素（その置換形状を含む）である。
【００７９】
【化２０】
2004323839.tif 000020
ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｉｘｔｈ  Ａｄｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）を参照のこと。
【００８０】
「シアニン色素」は、メチン、またはポリメチン、架橋によって結合される２個の窒素複素環式環を含む色素である。このような色素の網羅的な総説は、Ｆｉｃｋｅｎ（Ｆｉｃｋｅｎ、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｙｅｓ、第ＩＶ巻、Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ（１９７１））によって提供される。
【００８１】
（Ｉ．非対称シアニン色素化合物）
（Ａ．構造）
第一の局面において、本発明は、非蛍光クエンチャーとして有用な新規な分類のシアニン色素化合物を含む。これらの化合物は、すぐ下の式１に示される一般式（その置換形状を含む）を有し、ここでＲ１およびＲ２の少なくとも１個は、連結基であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、そしてｎは、０〜２の範囲である。（本明細書において提供される全分子構造は、示される正確な電子構造だけではなく、全ての共鳴構造、プロトン化状態、およびそれらに付随する対イオンをも含むことを意図していることに注意すべきである。）
【００８２】
【化２１】
2004323839.tif 000021
好ましくは、この化合物が、非蛍光クエンチャーとして使用される場合、この化合物は、ニトロＣ−３置換を含む。例えば、化合物５、９、２０、２１および２３。
【００８３】
代わりの好ましい実施態様において、式１の化合物の連結基は、低級アルキルアミン、または低級アルキルカルボキシ部分であり、ここで、特に好ましい低級アルキルカルボキシは、−（ＣＨ２）ｑＮ＋（ＣＨ３）２（ＣＨ２）ｑＣＯ２Ｈ（ここで、ｑは２〜１２の範囲である）である。例えば、化合物２３。
【００８４】
別の好ましい実施態様において、Ｒ1またはＲ2のうちの１つは、−（ＣＨ2）qＮ+（ＣＨ3）3であり、ここでｑは、２〜１２の範囲であり、Ｒ1またはＲ2のもう一方は、連結基である。
【００８５】
さらに別の好ましい実施態様において、本発明のシアニン化合物のＸ基は、硫黄である。例えば、化合物５、９、２０、２１、２２および２３。
【００８６】
別の好ましい実施態様において、式１の化合物は、縮合芳香族、または置換芳香族、１位および２位、２位および３位；ならびに／または３位および４位で結合した置換基が挙げられる。さらに好ましくは、この置換芳香族は、１個またはそれ以上のニトロ置換基を含む。例えば、化合物２１および２２。
【００８７】
本発明のさらに好ましい実施態様において、式１の化合物は、Ｒ1およびメチン架橋の隣接炭素が一緒になって、５〜７員（より好ましくは６員）を有する環構造を形成する、架橋基を含む。例えば、化合物２０および２１。
【００８８】
（Ｂ．合成）
一般に、非蛍光シアニン色素クエンチャーは、以下のように調製され得る。図２Ａおよび２Ｂを参照のこと。四級化ベンザゾール誘導体（例えば、ベンゾチアゾリウム塩１０または１３）をレピジニウム塩、１１と混合し、そして塩基性条件下で（メタノール中のジイソプロピルエチルアミン、またはピリジン）還流した。溶媒をエバポレートし、そして粗製固体を希塩酸（例えば、水中５％）で洗浄し、そして乾燥した。
【００８９】
この色素は、カルボン酸基をスクシンイミジルエステルに変換することによってアミノ反応性が与えられ得る。例えば、色素１２または１４を、スクシンイミジルテトラメチルウロニウム塩およびＤＩＰＥＡと共に、ＤＭＦ中に溶解させる。この生成物を、希塩酸を添加することで沈殿させ、洗浄し、そして乾燥する。
【００９０】
（ＩＩ．非蛍光シアニン色素を含有する色素対）
レポーター−クエンチャー色素対は、任意の分子対から構成され得、これらの分子は、エネルギー転移プロセスに関与し得る。典型的なレポーターは、キサンテン色素（フルオレセイン、およびローダミン色素を含む）から選択され得る。これらの化合物の多くの適切な形態は市販されており、様々な置換基をそれぞれのキサンテン環に有し、これらの置換基が、オリゴヌクレオチドに対する結合部位として、または、付着のための結合官能性として使用され得る。蛍光化合物の別のグループは、ナフチルアミン類であり、これらは、α位またはβ位にアミノ基を有する。このようなナフチルアミノ化合物には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の色素には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：３−フェニル−７−イソシアナートクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチオシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ）、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなど。
【００９１】
好ましくは、レポーター分子は、フルオレセイン色素およびローダミン色素から選択される。オリゴヌクレオチドに対する付着に関する、これらの色素および適切な連結方法論は、ほかの場合にも記載されている（Ｋｈａｎｎａら（上記）；Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，７：２９９−３０３（１９７５）；Ｍｅｃｈｎｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号；Ｍｅｎｃｈｅｎら、欧州特許出願第８７３１０２５６．０号；およびＢｅｒｇｏｔら、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５）。特に好ましいレポーター分子には、フルオレセイン色素、ＮＥＤ、ＴＥＴおよびＦＡＭが挙げられる：
典型的なレポーター−クエンチャー対には、以下のものが挙げられる。
【００９２】
【表１】
2004323839.tif 000022
（ＩＩＩ．色素標識されたポリヌクレオチド）
別の局面において、本発明は、本発明の非蛍光シアニン色素を用いて標識されたポリヌクレオチドを包含する。このような標識されたポリヌクレオチドは、多数の重要なコンテクストにおいて有用であり、これらのコンテクストは、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブとして、およびオリゴヌクレオチドライゲーションプローブとして含む。
【００９３】
一重に、または二重に標識されたポリヌクレオチドは、任意の多数の周知の方法を使用して調製され得る。３’末端でオリゴヌクレオチドを適切に標識する方法は、以下の方法が挙げられるが、これらに限定されない：（１）３’末端のリボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化、続く、アミン含有標識との反応（ＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｄ．Ｔ．ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＳ．Ｆａｌｋｏｗ、編）、頁２４５−２５６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に記載）；（２）デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いる、３’−脂肪族アミン含有ヌクレオチドの酵素的付加、続く、アミン反応性標識との反応（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、欧州特許出願第２３２９６７号）；および（３）３’−リボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化、続く、１，６−ヘキサンジアミンとの反応による、３’末端脂肪族アミンの提供、続く、アミン反応性標識との反応（Ｃａｒｄｕｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４（１９９８））。
【００９４】
オリゴヌクレオチドの５’末端の標識化方法には、以下のものが挙げられる：（１）５’〜５’カップリングリボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化、続く、アミン反応性標識との反応（ＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５）；（２）エチレンジアミンと５’ホスホリル化ポリヌクレオチドとの縮合、続く、アミン反応性標識との反応（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８７）；および（３）固相ＤＮＡ合成において、アミノヘキシルホスファイト剤を用いる脂肪族アミン置換基の導入、続く、アミン反応性標識との反応（Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８）。
【００９５】
これらの末端標識化方法に加え、標識は、アミン含有ヌクレオチドホスホルアミダイト剤（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、５’−ジメトキシトリチル−５−［Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシ）−３−アクリルイミド］−２−デオキシウリジン）、３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）（例えば、アミノモディファイヤー  Ｃ６  ｄＴ  ホスホルアミダイト（Ｌｉｎｋｅｒ  Ａｒｍ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，Ｇｌｅｎ  Ｒｅａｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．））を使用して、合成ポリヌクレオチドの特定の位置に配置され得る（Ｍａｔｈｉｅｓら、米国特許第５，６８８，６４８号）。
【００９６】
オリゴヌクレオチドの標識化手順の全体的な総説に関しては、以下を参照のこと：Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄの、Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｓｔｅｉｎｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）、Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９６）、およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）における記載。
【００９７】
一般に、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの設計は、本発明の非蛍光シアニン色素クエンチャーを含み、従来技術に従う。従って、標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを設計する場合、以下の一般のガイドラインに従うべきである：（１）標的核酸の配列がＰＣＲ単位複製配列内に配置される場合、プローブ配列は、プローブが、ＰＣＲプライマー間の配列上の位置でハイブリダイゼーションするようにあるべきである；（２）プローブは、約２０〜３０個のヌクレオチド長を有するべきであり、その結果、良好なハイブリダイゼーション動態および結合特異性を保証する；（３）プローブおよび標的の核酸配列における２次構造の阻止；（４）このプローブが１対のＰＣＲプライマーと組み合わせて使用される場合、このプローブは、正方向プライマーおよび逆方向プライマーのいずれともハイブリダイゼーションすべきではない；そして（５）単一ヌクレオチドの長伸縮（すなわち、４より大きい）を有するプローブを阻止する；および（６）プローブ配列とその相補体との間で選択する場合、ＧヌクレオチドよりもＣヌクレオチドを多く有するストランドを取り出す。
【００９８】
（ＩＶ．非蛍光シアニン色素を利用するハイブリダイゼーション方法）
ハイブリダイゼーションの検出方法としてエネルギー転移を利用する、幾つかのハイブリダイゼーションアッセイフォーマットが記載されており、これらのうち５つを以下に記載し、そして、概略的に図５Ａ〜Ｅに示す。
【００９９】
第１アッセイフォーマットにおいて、図５Ａに示されるように、２つのオリゴヌクレオチドプローブの配列を、それらが標的の核酸５の近接した領域とハイブリダイゼーションするように選択される。第１プローブ１０（標的核酸の５’末端方向へハイブリダイゼーションする）は、その５’末端付近で、レポーター標識で標識され、ここで、第２プローブ１５がその３’末端付近で、クエンチャーラベルで標識される。従って、３方向ハイブリッド２０が、標的核酸５および第１プローブ１０および第２プローブ１５との間で形成され、レポーターおよびクエンチャーを、かなり接近させ、そして、エネルギー転移が進行し得る。従って、このフォーマットにおいて、２つのプローブの標的のハイブリダイゼーションの際、レポーターの発光がクエンチされる（Ｈｅｌｌｅｒら、欧州特許出願第０７０６８５号（１９８３））。
【０１００】
第２のアッセイフォーマットにおいて、図５Ｂに示されるように、２つのオリゴヌクレオチドプローブ２５および３０は、互いに相補的であり、そして、これらの各々は、レポーター標識またはクエンチャー標識を備え、使用される。プローブが互いとハイブリダイゼーションし、プローブ−プローブハイブリッド３５を形成する場合、クエンチング相互作用が好まれるようにラベルの位置が選択され、ここでプローブが分離される場合、わずかな量のクエンチングが起こる。標的核酸の検出は、標的核酸５およびプローブ２５および３０の両方の変性によって達成され、次いで、ストランドの再アニールが可能となる。従って、プローブ−プローブハイブリダイゼーションとプローブ−標的ハイブリダイゼーションの間に競合が存在する。標的核酸が多く存在すればするほど、より多くのプローブが標的とハイブリダイゼーションし、プローブ−標的ハイブリッド４０を形成する。標的ＤＮＡが存在は、レセプターＲからの発光の増加によって示され、これは、プローブ−プローブハイブリッド数の減少によって引き起こされる、クエンチャーＱによるクエンチングの減少による（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、欧州特許出願第２３２９６７号（１９８７））。
【０１０１】
第３のアッセイフォーマット（図５Ｃに記載する）は、唯一の標識プローブ４５および二重鎖核酸５０と優先的に結合する色素を使用する。この色素５０は、二重鎖種の塩基対間でインターカレートし得るか、または、ヘリックスの外部と結合し得、そしてクエンチャーとして作用する。従って、ハイブリダイゼーションが存在しない場合、クエンチャーＱは、一重鎖プローブ４５と結合せず、そしてレポーターＲは、Ｑによる影響を受けない。しかし、標的の核酸５が存在する場合、プローブ４５は標的の核酸とハイブリダイゼーションし、そしてＱは、得られた二重鎖領域と結合し、標的−プローブ−色素複合体５５を形成する。この複合体において、ＱおよびＲはかなり接近して配置され、そして、エネルギー転移または蛍光のクエンチングが起こり得る。従って、このフォーマットにおいて、レポーターの発光は、プローブが標的とハイブリダイゼーションする際にクエンチされる（ＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ（Ｄ．Ｔ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｓ．Ｆａｌｋｏｗ、編）、２４５−２５６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）））。
【０１０２】
第４のアッセイフォーマット（図５Ｄに示す）において、レポーターおよびクエンチャーの両方を用いて標識される単一プローブ６０が使用される。プローブが一本鎖状態である場合、すなわち、標的の核酸とハイブリダイゼーションしていない場合、一本鎖構造のプローブは、レポーター標識およびクエンチャー標識が非常に接近し、それによってエネルギー転移が進行し得るような状態となるように、レポーター標識およびクエンチャー標識の位置が選択される。この一本鎖構造を達成する１つの代替方法において、レポーターおよびクエンチャーは、プローブ配列を設計することによってかなりの近接化がもたらされ、その結果、プローブの末端でヘアピン形状を形成し、それによってレポーターおよびクエンチャーを一緒にねじ伏せる（Ｂａｇｗｅｌｌ、欧州特許出願第６０１８８９号（１９９４）；ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：３０３−３０８（１９９６））。この一本鎖構造を達成する別の代替方法において、クエンチャーおよびレポーターを十分かなり接近してさせるために、一本鎖プローブのランダムコイル形状が役立つように、レポーターおよびクエンチャーがプローブ上で十分に間隔を開けて配置される（Ｍａｙｒａｎｄ、米国特許第５，６９１，１４６号）。しかし、二重標識されたプローブ６０が、標的の核酸５とハイブリダイゼーションし、プローブ−標的ハイブリッド６５を形成する場合、レポーターおよびクエンチャーは互いに分離され、そしてクエンチング相互作用が妨げられる。従って、このフォーマットでは、プローブの標的へのハイブリダイゼーションの際、レポーターの発光はクエンチされなくなる。
【０１０３】
第５アッセイフォーマット、本明細書中では、「Ｔａｑｍａｎ」アッセイとして言及され、図５Ｅに示され、レポーター標識およびクエンチャー標識の両方を備える二重標識されたプローブは、標的の核酸とのハイブリダイゼーションの際に消化され、それによって、プローブからの一方または両方の標識を遊離する（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７２７６−７２８０（１９９１）；Ｌｉｖａｋ、米国特許第５，５３８，８４８号）。この方法において、二重に標識されたプローブ７５は、標的の核酸５とハイブリダイゼーションされる。さらに、オリゴヌクレオチドプライマー７０は、プローブの上流の位置で標的の核酸とハイブリダイゼーションされる（すなわち、標的の核酸の３’末端と接近する）。次いで、プライマー７０は、ポリメラーゼ酵素を用いて伸長され、それによって伸長されたプライマー８０を形成する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用して）。プライマー伸長反応の間、ポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、プローブ７５を切断するのに役立ち、その結果、レポーター標識を備える第１プローブフラグメント８５およびクエンチャー標識を備える第２プローブフラグメント９０を形成する。従って、レポーター標識およびクエンチャー標識は分離され、それによって、これら２つの間のエネルギー転移を阻止する。従って、このフォーマットにおいて、レポーターの発光は、プローブの標的へのハイブリダイゼーションおよび次のプローブの分解の際に、クエンチされなくなる。
【０１０４】
上記および図５Ａ〜Ｅの各５つのアッセイフォーマットにおいて、別に説明しない限り、レポーターおよびクエンチャーの位置は任意であることに注目されたい。従って、レポーターが一方のプローブ上に、そしてクエンチャーが他方のプローブ上に示されるが、それらの位置は逆転され得る。
【０１０５】
上記のアッセイフォーマットは、単一のレポーター標識のみを使用するシステムに関して示されるが、マルチレポーターシステムがまた、実施され得る。このようなマルチレポーターシステムは、単一反応用量におけるマ複数のハイブリダイゼーションの分析を必要とする用途に有益である。このようなシステムにおいて、各レポーター分子は発光を生じ、この発光は、任意の他のレポーターからの発光によるスペクトル解析が可能である。各レポーターと共に使用される特定のクエンチャーは、同一であるか、または異なり得、これは、クエンチャーおよびレポーターのスペクトル特性に依存する。
【０１０６】
上記のアッセイの各々は、核酸増幅工程（例えば、ＰＣＲ）と組み合わせて実施され得る。従って、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する前に、全部または一部の核酸サンプルが増幅され得る。増幅工程と組み合わせて実施する場合、このハイブリダイゼーションアッセイは、エンドポイントモードまたはリアルタイムモードで実施され得る。エンドポイントモードにおいて、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応が完了した後（例えば、全部、または実質的に全部のＰＣＲ反応の増幅サイクルが完了した後）に実施される。リアルタイムモードにおいて、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応の間の複数の時点（例えば、ＰＣＲプロセスの各熱サイクル後）で実施される（Ｈｉｇｕｃｈｉ、欧州特許出願第５１２３３４号）。リアルタイムモードが好ましいのは、標的の核酸の初期量の定量測定が必要である場合である（例えば、血液サンプル中に存在する病原核酸の複製数）。
【０１０７】
（Ｖ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することによってさらに明らかにされ、これらの実施例は、本発明の単なる例示を意図し、いかなる点においても本発明の範囲を制限することは意図されない。
【０１０８】
（実施例１）
ニトロチアゾールブルー５およびニトロチアゾールオレンジ９の合成
ニトロチアゾールブルー５およびニトロチアゾールオレンジ９の合成を、図３および４に概説する。
【０１０９】
（６−ニトロベンゾチアゾール１の調製）
図３Ａを参照のこと。２−メチルベンゾチアゾールのニトロ化を以下の方法に従って実施した：Ｍｉｚｕｎｏ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ、７２、７４５（１９５２）。発煙硝酸（１．６ｍＬ）および濃硫酸（１．２ｍＬ）の混合物を、２−メチルベンゾチアゾール（２ｇ）の氷冷硫酸（８ｍＬ）溶液に添加した。この溶液を１時間室温に加温し、次いで、１００ｍＬの氷に注いだ。固体を濾過し、水で洗浄し、そしてエタノール（８０ｍＬ）から再結晶し、２．５ｇの黄みを帯びた針状物を得た。
【０１１０】
（３−メチル−６−ニトロベンゾチアゾリウム  ｐ−トルエンスルホネート２の調製）
図３Ａを参照のこと。６−ニトロベンゾチアゾール（１ｇ）およびメチル−ｐ−トルエンスルホネート（１．２ｇ）の混合物を１４０℃で２０分間加熱した。この固体をアセトンで洗浄し、濾過して、青みを帯びた固体を得た（１．１ｇ）。
【０１１１】
（２−（２’−アセトアニリドビニル）−３−メチルベンゾチアゾリウム  ｐ−トルエンスルホネート３の調製）
図３Ａを参照のこと。３−メチル−６−ニトロベンゾチアゾリウム  ｐ−トルエンスルホネート２（２００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、ジフェニルホルムアミジン（１６０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）および無水酢酸（２ｍＬ）の混合物を２０分間還流した。溶液を冷却し、エーテルで粉砕し、茶褐色の固体を得た（２００ｍｇ）。
【０１１２】
（１−（５’−カルボキシフェニル）−レピジニウムブロミド４の調製）
図３Ｂを参照のこと。レピジン（５ｇ）および６−ブロモヘキサン酸（１０ｇ）の混合物を１３０℃で６時間加熱した。この固体をアセトンで洗浄し、濾過し、オフホワイトの固体を得た（１０．５ｇ）。
【０１１３】
（ニトロチアゾールブルー５の調製）
図３Ｃを参照のこと。上記のアセトアニリド３（６５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）および上記のレピジニウムブロミド４（６６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびピリジン（１ｍＬ）の混合物を併せ、そして３０分間還流した。この青色溶液を乾固するまで濃縮し、そして１ｍＬの５％  ＨＣｌで洗浄した（５×）。残渣を乾燥し、青色固体を得た（６７ｍｇ）。
【０１１４】
（ニトロチアゾールブルースクシンイミジルエステルの調製）
ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０５ｍＬ）中のニトロチアゾールブルー５（３１ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１０分間、７０℃に加温した。反応の進行を、シリカゲルのＴＬＣ（溶出液として、６００：６０：１６  ジクロロメタン：メタノール：酢酸を使用する）によってモニターした。この均一溶液に５％のＨＣＬ（２ｍＬ）を添加した。沈殿物を、さらにＨＣｌで洗浄し、そして乾燥させ、暗色の固体を得た（３０ｍｇ）。
【０１１５】
（２−（メチルチオ）−６−ニトロベンゾチアゾール７の調製）
図４Ａを参照のこと。発煙硝酸（１．９３ｇ）を、２−（メチルチオ）ベンゾチアゾール（５ｇ）の氷浴で冷却した濃硫酸（１６．８ｇ）溶液に滴下した。５℃で３時間攪拌後、この溶液を氷に注ぎ、そして濾過し、黄色固体を得た（５．７ｇ、２５ｍｍｏｌ、９１％）。
【０１１６】
（３−メチル−２−（メチルチオ）−ベンゾチアゾリウム  ｐ−トルエンスルホネート８の調製）
６−ニトロ−２−（メチルチオ）ベンゾチアゾール７（０．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）およびメチル−ｐ−トルエンスルホネート（３．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）の混合物を、１時間にわたって１２０℃〜１４５℃に加熱した。この溶液を冷却し、３０ｍＬのエーテルを添加した。得られた非結晶固体をアセトンで粉砕し、淡紫色の固体を得た（０．５７ｇ、１．４ｍｍｏｌ、６３％）。
【０１１７】
（ニトロチアゾールオレンジ９の調製）
図４Ｂを参照のこと。３−メチル−２−（メチルチオ）−ベンゾチアゾリウム  ｐ−トルエンスルホネート８（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および１−（５’−カルボキシペンチル）−レピジニウムブロミド４（４１ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を添加した。この溶液を１５分間還流した。この溶媒をエバポレートし、そして反応残渣を５％のＨＣｌ（２ｍＬ）で粉砕した。この固体を、さらなる５％のＨＣｌで洗浄し、そして乾燥させ、オレンジ色の固体（８ｍｇ）を得た。
【０１１８】
（ニトロチアゾールオレンジスクシンイミジルエステルの調製）
ジメチルホルムアミド（０．１ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０１ｍＬ）中のニトロチアゾールオレンジ９（８ｍｇ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（１０ｍｇ）を添加した。この混合物を１０分間、７０℃に加温した。反応の進行をシリカゲルのＴＬＣ（溶出液として、６００：６０：１６  ジクロロメタン：メタノール：酢酸を使用する）によってモニターした。この均一溶液に５％のＨＣｌ（１ｍＬ）を添加した。沈殿物をさらなるＨＣｌで洗浄し、そして乾燥させ、オレンジ色の固体を得た（８ｍｇ）。
【０１１９】
（実施例２）
Ｔａｑｍａｎアッセイのための二重標識プローブの調製
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（Ｔｈｅ  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＢＤ））を使用し、操作手引きに記載の一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチドプローブの自動合成を実施した。色素標識ＣＰＧ固体支持体（ＭｕｌｌａｈおよびＡｎｄｒｕｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３８（３３）：５７５１−５７５４（１９９７））、ＤＮＡ  ＦａｓｔＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ番号８５、１９９４、ＡＢＤ）ならびに、色素標識ホスホルアミダイト、ＦＡＭおよびＴＥＴ（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ番号７５、１９９４、ＡＢＤ）を使用し、オリゴヌクレオチドを０．２μｍｏｌスケールで合成した。標準的な０．２μｍｏｌの合成サイクルを、ＦＡＭアミダイトのカップリング時間をさらに１２０秒延長することで若干変更した（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ番号７８、１９９４、ＡＢＤ）。各プローブは、このプローブの５’末端に付着したレポーター色素および３’末端に配置されたクエンチャー色素を備える。
【０１２０】
合成の完了後、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ２：Ｈ２Ｏ（１：１：２）（Ｗｏｏら、米国特許第５，２３１，１９１号）の混合物での処理によって、ＤＮＡ合成機の支持体からオリゴヌクレオチドを自動切断し、ここで、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機に関する操作手引きに記載される、１時間自動切断手順（「ＥＮＤ  ＣＥ」手順）を使用した。この混合物を８５℃で１時間または６５℃で３時間加熱することで、塩基の保護基を除去した。
【０１２１】
粗製オリゴヌクレオチドを、純度および完全性に関し、以下の装備および条件を使用する逆相ＨＰＬＣによって分析した：ＡＢＩ  ７８３Ａプログラム可能検出器を装備したＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  シリーズ２００溶媒送達システム；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＩＳＳ２００オートサンプラー；およびＰＥ  Ｎｅｌｓｏｎ  ９００シリーズ  データシステム；ＲＰ−１８逆相クロマトグラフィーカラム（２２０×４．６ｍｍ、ＡＢＤ）；溶媒Ａ：０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート；溶媒Ｂ：ＣＨ３ＣＮ；勾配４〜２８％Ｂ（３５分において）；流速：１ｍＬ／分；および検出器：２６０ｎｍ。
【０１２２】
（実施例３）
ヒトβアクチン遺伝子のためのＴａｑｍａｎアッセイ
ヒト遺伝子ＤＮＡを従来の方法を使用して調製した。アッセイ試薬の組成は以下である（全体の用量、５０μｌ）：
【０１２３】
【表２】
2004323839.tif 000023
試薬を９６−ウェルマイクロタイタートレイ中で混合し、以下のプロトコルを使用して熱的に循環させた：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５秒間、続いて６０℃で１分間を４０サイクル。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＤ）を使用し、増幅プロセス間の蛍光をモニターした。
【０１２４】
Ｔａｑｍａｎ実験の結果は、２つのパラメータ；Ｒｎ値およびＣｔ値を使用して分析され得る。Ｒｎ値は、ＰＣＲ実験の終了時のレポーター色素の蛍光および受動的参照の蛍光との比率である。Ｃｔ値、または閾値サイクル数は、蛍光比がバックグラウンドとの識別が可能な時点における、ＰＣＲサイクル数である。所定のレポーター色素および固定の標的濃度に対し、Ｒｎ値およびＣｔ値の両方は、クエンチャーの効率を反映する。
【０１２５】
ＮＢＴ５の効率を、レポーターＦＡＭおよびＴＥＴをクエンチングする際のＴＭＲの効率と比較した。ＮＴＢおよびＴＭＲに対するＲｎ値およびＣｔ値は、両方のレポーター色素に対して識別不可能であった。クエンチャーＮＴＯ９をＦＡＭと共に使用し、そしてＮＴＢおよびＴＭＲの両方と等しいことが見出された。ＮＴＢをレポーターＮＥＤと対にすることで他のレポーターと同様の結果を得た。ＴＭＲは、レポーター色素ＮＥＤと共にクエンチャーとして使用され得なかった。なぜなら、ＴＭＲおよびＮＥＤの蛍光発光は、同一の波長であったためである。
【０１２６】
各個々の出願または特許出願を、特異的、かつ、個々に示し、参考として援用する場合、全ての出願および特許出願は、本明細書中で参考として同程度に援用される。
【０１２７】
極少数の実施態様を以上で詳細に説明したが、これらを含む分子生物学の当業者は、多くの改変が好ましい実施態様において本発明の技術から逸脱することなく可能であることを明らかに理解する。全てのこのような改変は、添付の特許請求の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の様々な好ましいシアニン色素化合物を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の様々な好ましいシアニン色素化合物を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のシアニン色素クエンチャーの合成のための一般的な合成スキームを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のシアニン色素クエンチャーの合成のための一般的な合成スキームを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第１番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のための合成スキームを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の第１番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のための合成スキームを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の第１番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のための合成スキームを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の第２番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のための合成スキームを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の第２番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のための合成スキームを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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