(57)【要約】【課題】ＰＣＲ法により増幅される二本鎖ＤＮＡの内、所望の配列を持つもののみを基板上に固定することで上記の課題を達成し得るｃＤＮＡアレイを作製することのできる方法を提供すること【解決手段】担体上にｃＤＮＡアレイを作成する際に、（１）既知の配列を有し、一方の端部に前記担体への固定用の官能基が導入された一本鎖ｃＤＮＡの２種以上を調製する工程と、（２）前記２種以上の一本鎖ｃＤＮＡの各々を、各一本鎖ｃＤＮＡごとの固定化領域が互いに隔離されて配置されるように、各一本鎖ｃＤＮＡを結合用の官能基を介して担体に結合させて、該固定化領域が所定の配列で配置されたｃＤＮＡアレイを作製する工程と、によってｃＤＮＡアレイを作製する。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上にｃＤＮＡアレイを作成するための方法であって、
（１）既知の配列を有し、一方の端部に前記担体への固定用の官能基が導入された一本鎖ｃＤＮＡの２種以上を調製する工程と、
（２）前記２種以上の一本鎖ｃＤＮＡの各々を、各一本鎖ｃＤＮＡごとの固定化領域が互いに隔離されて配置されるように、各一本鎖ｃＤＮＡを結合用の官能基を介して担体に結合させて、該固定化領域が所定の配列で配置されたｃＤＮＡアレイを作製する工程と、
を有することを特徴とするｃＤＮＡアレイの作製方法。
【請求項２】
前記一本鎖ｃＤＮＡが、前記官能基を末端に結合したプライマーと官能基を持たないプライマーのセットを用いたＰＣＲ反応により調製されることで、一方の端部のみに該官能基を有するものである請求項１に記載の作製方法。
【請求項３】
前記官能基と前記担体表面とが化学反応して前記一本鎖ｃＤＮＡが前記担体上に固定化される請求項１〜３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項４】
担体上にｃＤＮＡアレイを作成するための方法であって、
（１）既知の配列を有し、前記担体への固定用の官能基が導入されたプライマーと官能基を持たないプライマーのセットを用いたＰＣＲ反応により増幅された二本鎖ｃＤＮＡを２種以上を調製する工程と、
（２）前記２種以上の二本鎖ｃＤＮＡの各々の溶液を、各ｃＤＮＡごとの固定化領域が互いに隔離されて配置されるように、担体上に供給する工程と、
（３）二本鎖ｃＤＮＡのうち、官能基の導入された一本鎖ｃＤＮＡのみが結合用の官能基を介して担体に化学結合により固定される工程と、
（４）温水中に上記担体を浸し熱変性を行い、担体に結合していない相補鎖を除去して、一本鎖のプローブＤＮＡとする工程と、
を有することを特徴とする該固定化領域が所定の配列で配置されたｃＤＮＡアレイを作製方法。
【請求項５】
前記官能基がチオール基である請求項４記載の作製方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ反応用の溶液に前記チオール基の保護剤を含む請求項５に記載の作製方法。
【請求項７】
前記チオール基の保護剤がＤＴＴ（ジチオトレイトール）である請求項６に記載の作製方法。
【請求項８】
前記ＤＴＴの濃度が１０μＭ〜１０ｍＭである請求項７記載の作製方法。
【請求項９】
前記保護剤がβ−メルカプトエタノールである請求項６に記載の作製方法。
【請求項１０】
前記β−メルカプトエタノールの濃度が１００μＭ〜５０ｍＭである請求項９記載の作製方法。
【請求項１１】
前記担体が、マレイミド基を有する表面を有し、前記一本鎖ｃＤＮＡがその５’末端がチオール基により修飾されており、該マレイミド基と該チオール基との反応により該一本鎖ｃＤＮＡが該担体に共有結合により固定される請求項５〜１０のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１２】
前記担体がガラス基板であることを特徴とする請求項１１記載の作製方法。
【請求項１３】
前記ガラス表面が、シランカップリング剤との反応後、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）試薬によりマレイミド基が導入されたものである請求項１１に記載の作製方法。
【請求項１４】
前記担体が金属であることを特徴とする請求項１記載の作製方法。
【請求項１５】
前記担体が金であり、前記官能基がチオール基であることを特徴とする請求項１記載の作製方法。
【請求項１６】
前記官能基がアミノ基である請求項１〜３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項１７】
前記担体が、エポキシ基を有する表面を有し、前記一本鎖ｃＤＮＡがその５’末端がアミノ基により修飾されており、該エポキシ基と該アミノ基との反応により該一本鎖ｃＤＮＡが該担体に共有結合により固定される請求項１６に記載の作製方法。
【請求項１８】
前記担体が、アルデヒド基を有する表面を有し、前記一本鎖ｃＤＮＡがその５’末端がアミノ基により修飾されており、該アルデヒド基と該アミノ基との反応により該一本鎖ｃＤＮＡが該担体に共有結合により固定される請求項１６に記載の作製方法。
【請求項１９】
前記担体が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基を有する表面を有し、前記一本鎖ｃＤＮＡがその５’末端がアミノ基により修飾されており、該Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基と該アミノ基との反応により該一本鎖ｃＤＮＡが該担体に共有結合により固定される請求項１６に記載の作製方法。
【請求項２０】
前記一本鎖ｃＤＮＡの前記担体への供給が、該一本鎖ｃＤＮＡを含む吐出用液体をインクジェット法により前記担体の所定位置に付与することにより行われる請求項１〜１９のいずれかに記載の作製方法。
【請求項２１】
前記インクジェット法がバブルジェット方式によるものである請求項２０記載の作製方法。
【請求項２２】
前記吐出用液体中の一本鎖ｃＤＮＡの濃度が３００μＭ以下である請求項２０または２１に記載の作製方法。
【請求項２３】
前記吐出用液体中の一本鎖ｃＤＮＡの濃度が５〜１０μＭである請求項２２記載の作製方法。
【請求項２４】
前記一本鎖ｃＤＮＡの長さが５０００塩基長以下である請求項１〜２３のいずれかに記載の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス、微生物、動植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の所望の塩基配列の検出、同定に有用なｃＤＮＡアレイの作製方法に関する。特に、各ステージでの発現量の比較、或いは組織間の発現量比較のために用いられるｃＤＮＡアレイ作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ｃＤＮＡをアレイ状に並べたｃＤＮＡアレイは１９９５年にスタンフォード大学で開発されて以来、多くの研究用途で利用されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０巻、ｐ４６７、（１９９５））。この方法は、抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲで増幅後、マイクロピペッティングの手法により基板に供給し固定させてｃＤＮＡアレイを作製するものである。基板に固定化されるｃＤＮＡは、各種ｃＤＮＡが網羅されたｃＤＮＡライブラリーと称するストックＤＮＡ溶液から選ばれ基板上に供給される。このライブラリーの作成は、組織等から抽出されたｍＲＮＡをベースにＰＣＲ法により増幅を行い、その一部を使用することになる。
【０００３】
ＰＣＲ法では、通常２種のプライマーが設計され、それらが鋳型ＤＮＡに結合して、その部位を開始点として酵素的にＤＮＡ配列の合成が繰り返し行なわれる。従って、合成されるＤＮＡはこれらのプライマー配列を末端に持つ二本鎖ＤＮＡであり、それらを基板上に供給し、イオン結合、或いはＵＶリンク等で基板表面に結合させたＤＮＡアレイでは、二本鎖の両方のＤＮＡが同じ場所に結合することになる。また、これらの結合は基板上で二本鎖の変性を行い一本鎖にするために、ハイブリダイゼーション反応に関わる塩基部分が結合に利用される。
【０００４】
このような従来の方法では、これらのｃＤＮＡは、マイクロピペットによって基板上に供給されるか、或いは、ピン法と呼ばれ、針の先にＤＮＡ溶液を付着させて、スタンピングによりガラス基板上に供給される。このときのマイクロピペットの滴下量はナノリットルが限界である。
【０００５】
一方、インクジェット法によるインクの吐出量は、ピコリットルオーダーである。インクジェットプリンターではこのような吐出量のインクを正確な位置決めにより重ね打ちにより混合する事も可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
これまでのｃＤＮＡアレイでは、二本鎖ＤＮＡを同一スポット上に固定するため、ハイブリダイゼーション反応には両方のストランドが寄与することになる。その結果、評価したい配列のみならず、その相補鎖と形成されたハイブリッドも蛍光量を持つため、正確な評価ができない場合があるという問題があった。また、ｃＤＮＡの場合には、ハイブリッドを形成する領域が長いため、他の遺伝子との部分的な結合によるハイブリッド体も存在し、これらの完全マッチではないミスマッチを含むハイブリッドがノイズになる。しかも、その相補鎖も同じ場所に存在することによって、そのノイズも倍増される。従って、このようなノイズが問題となるような場合への適用が制限されていた。そのため、定量的に発現量を評価するために、評価したい片方のｃＤＮＡのみを選択的に固定する方法が望まれていた。
【０００７】
また、更に厳密な定量性を確保するためには、ハイブリッド形成に影響を与えるような核酸塩基部分を固定に用いる方法は好ましくないと考えられる。そのためには、ハイブリッド形成に関与しない核酸塩基の末端でのｃＤＮＡの固定が望まれる。
【０００８】
さらに、マイクロピペッティングの方法では、基板に反応液として滴下できるＤＮＡプローブのサンプル量は５ｎｌが限界である。そのスポット径は１００〜２００μｍで、ピペッティングの精度等を勘案すると、１インチ角に１００００種以上のプローブを並べることは困難であり、大量のプローブを同時に評価することが重要な発現解析チップには、さらに高密度でプローブを固定する方法が望まれていた。
【０００９】
本発明の目的は、上記問題点に鑑み、ＰＣＲ法により増幅される二本鎖ＤＮＡの内、所望の配列を持つもののみを基板上に固定することで上記の課題を達成し得るｃＤＮＡアレイを作製することのできる方法を提供することにある。本発明の他の目的は、高密度のｃＤＮＡアレイを作製するために、インクジェット法によりｃＤＮＡ溶液を基板上に供給し、固定することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を達成し得る本発明のｃＤＮＡアレイの作製方法は、担体上にｃＤＮＡアレイを作成するための方法であって、
（１）既知の配列を有し、一方の端部に前記担体への固定用の官能基が導入された一本鎖ｃＤＮＡの２種以上を調製する工程と、
（２）前記２種以上の一本鎖ｃＤＮＡの各々を、各一本鎖ｃＤＮＡごとの固定化領域が互いに隔離されて配置されるように、各一本鎖ｃＤＮＡを結合用の官能基を介して担体に結合させて、該固定化領域が所定の配列で配置されたｃＤＮＡアレイを作製する工程と、
を有することを特徴とするｃＤＮＡアレイの作製方法である。
【００１１】
また、本発明は、担体上にｃＤＮＡアレイを作成するための方法であって、
（１）既知の配列を有し、前記担体への固定用の官能基が導入されたプライマーと官能基を持たないプライマーのセットを用いたＰＣＲ反応により増幅された二本鎖ｃＤＮＡを２種以上を調製する工程と、
（２）前記２種以上の二本鎖ｃＤＮＡの各々の溶液を、各ｃＤＮＡごとの固定化領域が互いに隔離されて配置されるように、担体上に供給する工程と、
（３）二本鎖ｃＤＮＡのうち、官能基の導入された一本鎖ｃＤＮＡのみが結合用の官能基を介して担体に化学結合により固定される工程と、
（４）温水中に上記担体を浸し熱変性を行い、担体に結合していない相補鎖を除去して、一本鎖のプローブＤＮＡとする工程と、
を有することを特徴とする該固定化領域が所定の配列で配置されたｃＤＮＡアレイを作製方法を提示する。
【００１２】
本発明の作製方法に得られるｃＤＮＡアレイでは、各固定化領域中に固定化されているｃＤＮＡは一本鎖の状態にあり、しかも、配列の末端に導入された担体への結合用の官能基を介して担体と結合している。この結合形態によって、先に挙げた二本鎖の状態で担体に結合している場合における問題や、配列の一部を担体への結合に利用する場合における問題を解決することが可能となる。
【００１３】
本発明では、ＰＣＲ反応により得られる二本鎖ＤＮＡをあらかじめ一本鎖に分離することは必要としない。プライマーの一方に担体に結合可能な官能基を結合しておくことで、二本鎖の状態で担体上に供給されたｃＤＮＡ溶液の中から、官能基を持つもののみが基板上に固定されるからである。このような方法は、例えば、末端にアミノ基のような官能基を導入する場合にも好適に利用できる。塩基部分に含まれるアミノ基は、この場合、相補鎖との二本鎖形成によりブロックされ、担体との結合には供されない。従って、末端部分のアミノ基のみが担体との結合に選択的に利用され、その後の熱変性により相補鎖を分離し、一本鎖することで容易に一本鎖ｃＤＮＡが末端で結合したｃＤＮＡアレイを形成可能である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において担体の固定化領域に固定化されるｃＤＮＡとしては、例えば、検出対象となる特定の配列を有する標的ＤＮＡを認識し得るプローブとしての機能を有する一本鎖のポリヌクレオチドが好適に利用できる。
【００１５】
プローブは、特定のターゲット（標的）によって特異的に認識され得るもので、しばしばリガンドと呼ばれるものである。更に、このプローブには、特定の標的によって認識され得るオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチド、あるいはその他のポリマーなどが含まれる。用語「プローブ」は、個々のポリヌクレオチド分子などのプローブ機能を有する分子そのものを意味する場合と、分散した状態等で担体表面に固定された同じ配列のポリヌクレオチドなどの同じプローブ機能を有する分子の集団を意味する場合がある。また、プローブは、リガンド−抗リガンドの一部として標的と結合し得るか、または結合するようになり得るものである。プローブ及び標的は、天然において見出されるような塩基、またはその類似物を含み得る。
【００１６】
これらのプローブの複数種を、それぞれ独立した固定化領域、例えばドット状スポットとして担体表面に固定したものをプローブ担体といい、所定の間隔で配列されたものをプローブ・アレイという。本発明においては、プローブとしてｃＤＮＡが用いられ、高密度に配列したものはマイクロアレイに相当する。
【００１７】
本発明においては一本鎖ｃＤＮＡの担体への結合用として用い得る官能基は、化学反応によって担体表面と結合し得るものであることが好ましい。そのような官能基としては、例えば、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート基、スルフォニルクロリド基（−ＳＯ２Ｃｌ）、アルデヒド基（ホルミル基；−ＣＨＯ）、ヒドラジン、ヨウ化アセトアミドなどの有機官能基の少なくとも１種を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。これらの官能基は適当な長さのスペーサー分子、例えばアルキレン鎖などを介してｃＤＮＡの末端と結合していてもよい。
【００１８】
また、プローブ側の担体への結合に必要な構造に応じて、担体の表面に必要とされる処理を施してもよい。
【００１９】
一方、プローブは担体表面に結合可能な構造を有しており、担体上へのプローブの固定がこの結合可能な構造を介して行われていることが望ましい。その際、プローブが有する担体表面に結合可能な構造は、アミノ基、メルカプト基、カルボキシル基、水酸基、酸ハライド化物（ハロホルミル基；−ＣＯＸ）、ハライド化物（−Ｘ）、アジリジン、マレイミド基、スクシイミド基、イソチオシアネート、スルフォニルクロリド（−ＳＯ２Ｃｌ）基、アルデヒド（ホルミル基；−ＣＨＯ）基、ヒドラジン、ヨウ化アセトアミドなどの有機官能基を導入する処理により形成されたものであることが好ましい。また、プローブ側の担体への結合用としての官能基の種類に応じて、担体の表面に必要とされる処理を施してもよい。
【００２０】
そのような一本鎖ｃＤＮＡ側の官能基と担体表面の処理の好ましい組合せとしては、
（１）一本鎖ｃＤＮＡ側にチオール基（−ＳＨ）を導入し、これを担体の表面に導入したマレイミド基と反応させて共有結合により固定化を行う組合せ、
（２）一本鎖ｃＤＮＡ側にアミノ基を導入し、これを担体の表面に導入したエポキシ基と反応させて共有結合により固定化を行う組合せ、及び
（３）一本鎖ｃＤＮＡ側にアミノ基を導入し、これを担体の表面に導入したアルデヒド基と反応させて共有結合により固定化を行う組合せ、及び
（４）一本鎖ｃＤＮＡ側にアミノ基を導入し、これを担体の表面に導入したＮ−ヒドロキシスクシンイミド基と反応させて共有結合により固定化を行う組合せ、などを挙げることができる。これらの（１）〜（４）の各態様における担体としては、入手性の確保や表面処理の容易性などの点からはガラス基板を好適に利用することができる。また、担体としてガラスなどのシランカップリング剤による表面処理が可能な材料からなる表面を有するものを用いた場合は、担体表面をシランカップリング剤と反応させてから、ＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）試薬によりマレイミド基を導入する方法が好適に利用できる。
【００２１】
担体としては、ｃＤＮＡの末端に修飾した担体との結合用の官能基と結合可能な表面を有するものが利用でき、ガラス、プラスチック、金属などから固定化用の表面が形成され、板状や各種形状のものを好適に利用できる。また、担体は、固定化用の表面を形成する材料から全体が構成されるものであってもよい。金属として金を利用する場合には、ｃＤＮＡの官能基としてチオール基を結合させることで、直接金への結合が可能になる。
【００２２】
一本鎖ｃＤＮＡの担体への供給には、各種のスポッティングやドット形成方法が利用でき、中でも、一本鎖ｃＤＮＡを含む吐出用の液体をインクジェット法を用いて担体の所定位置に吐出させる方法が好ましい。この場合に好適に適用し得る一本鎖ｃＤＮＡの長さは、所望とする分析に必要な長さを有し、かつ５０００塩基以下のものが好ましい。その下限は、ＰＣＲ法により合成可能な最低限の長さを有していることが好ましい。
【００２３】
また、吐出用液体中での一本鎖ｃＤＮＡの濃度としては、５００μＭ以下が好ましく、５〜１０μＭの範囲にあることがより好ましい。この濃度範囲、塩基長のものはインクジェット法によりアレイを形成するのに良好な配列を与えるもので、より高密度なアレイを作製可能である。
【００２４】
なお、５０００塩基長を超える長さの一本鎖ｃＤＮＡを用いる場合は、インクジェット法以外のピン法、マイクロピペット法を用いることにより、ｃＤＮＡアレイを作製できる。
【００２５】
しかし、現状ではガラス板の表面処理が比較的容易であることから、ガラス板を例に説明する。そのひとつが、ガラス表面のマレイミド基とＤＮＡ末端のＳＨ基との結合反応である。
【００２６】
一本鎖ｃＤＮＡをインクジェット法により担体へ適用する場合に用いる吐出用液体を構成する液媒体としては、一本鎖ｃＤＮＡと混合したとき、及び吐出させたときに一本鎖ｃＤＮＡに対して影響を実質的に与えないものであって、且つ正常に吐出可能である吐出用液体を提供できるものであれば良い。このような液媒体としては水を好適なものとして挙げることができ、必要に応じて、グリセリン、尿素、チオジグリコール又はエチレングリコール、イソプロピルアルコール及びアセチレンアルコールなどの添加剤の少なくとも１種を添加して用いることができる。これらの添加剤の濃度は、例えば０．０１重量（ｗｔ）％〜４０ｗｔ％の範囲とすることが好ましい。好ましい吐出用液体の調製用の液体組成物としては、液媒体としての水中に、尿素を５〜１０質量％、グリセリンを５〜１０質量％、チオジグリコールを５〜１０質量％、アセチレンアルコールを０．０２〜５質量％、より好ましくは０．５〜１質量％を含む液体組成物が好適に用いられる。
【００２７】
吐出液体は、インクジェット法による吐出適性を考慮して、例えばその粘度が１〜１５ｃｐｓ、表面張力が３０ｄｙｎ／ｃｍ以上でインクジェット適性を満たす値となるような物性を有するものが好ましい。また、粘度を１〜５ｃｐｓ、表面張力を３０〜５０ｄｙｎ／ｃｍとした場合、固相上での着弾位置が適正なものとなり、特に好適に用いることが出来る。
【００２８】
更に、一本鎖ｃＤＮＡがその一方の端部にチオール基を有する場合には、吐出用液体には、チオール基の保護剤が含有されていることが好ましい。その場合、チオール基保護剤の濃度は、プローブを溶解して得られる溶液がインクジェット法により吐出されることから、得られる溶液がインクジェット法により吐出可能な液体特性の範囲内であればよい。例えば、プローブ溶液をバブルジェットヘッドから吐出する場合には、液体の特性としては、上記の粘度範囲及び表面張力の値を満たすようにチオール基保護剤を加えることが望ましい。
【００２９】
チオール基保護剤を用いる場合におけるチオール基保護剤以外の成分は、特に限定されるものではないが、バブルジェット用吐出溶液としての特性を満たす液体組成の例として、先に挙げたグリセリン、尿素、チオジグリコール、エチレングリコール及びアセチレンアルコールの少なくとも１種を添加剤として用いることができる。
【００３０】
チオール基保護剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリトール及び２−メルカプトエタノール（β−メルカプトエタノール）が好ましい。ＤＴＴの濃度としては１０μＭ〜１０ｍＭを挙げることができ、β−メルカプトエタノールの濃度としては１００μＭ〜５０ｍＭを挙げることができる。
【００３１】
更に、具体的には、吐出用の液体に含まれる一本鎖ｃＤＮＡ濃度の観点からは、チオール基保護剤の濃度は、プローブ濃度が１００μｍｏｌ／Ｌ以下のプローブ溶液の場合、チオール基保護剤としてジチオトレイトールを用いるときは保護剤の濃度は０．１ｍｍｏｌ／Ｌから１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが望ましく、更には０．１ｍｍｏｌ／Ｌから２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが望ましい。また、同じ吐出用液体における一本鎖ｃＤＮＡの濃度において保護剤として２−メルカプトエタノールを用いる場合には、チオール基保護剤の濃度は１ｍｍｏｌ／Ｌから５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが望ましく、更には１ｍｍｏｌ／Ｌから２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが望ましい。
【００３２】
一方、一本鎖ｃＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてプライマーを合成し、未修飾のプライマーとのセットを用いてＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡを得る。
【００３３】
担体表面の方にアルデヒド基、エポキシ基、スクシイミド基を導入した場合には、アミノ基が末端にあるｃＤＮＡが結合に関与し、そのためのプライマーとしては、上記ＳＨ基の場合と同様、５’−Ａｍｉｎｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて自動合成が可能である。
【００３４】
【実施例】
以下実施例を用いて詳細に説明する。
実施例１　ｐ５３遺伝子ｃＤＮＡアレイ
１）ｃＤＮＡアレイの作製
（ガラス基板処理）
ｃＤＮＡ作製用のガラス基板は、特開平１１−１８７９００号公報の方法に従い、マレイミド基を表面に有する基板を作製した。
（末端にチオール基を有するｃＤＮＡの調製）
ヒトゲノムＤＮＡ（コスモバイオ株式会社）のｐ５３遺伝子の各エクソンをＰＣＲ法により増幅し、エクソン　５、６、７及び８についてそれぞれ２６９、１８１、１７１及び２２９ｂｐのＰＣＲ産物を得た。
【００３５】
ＰＣＲ反応に用いた各エクソンに対するプライマーの塩基配列は以下の通りである。各アンチセンス側の５’末端には基板への結合用官能基であるチオール基を結合しておく。
Ｅ５Ｓ：５’−ＴＧＴＴＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴ−３’（エクソン５―センス）（配列番号：１）；
Ｅ５Ａ：５’−ＳＨ−ＴＧＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧ−３’（エクソン５−アンチセンス）（配列番号：２）；
Ｅ６Ｓ：５’−ＧＣＣＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴ−３’（エクソン６―センス）（配列番号：３）；
Ｅ６Ａ：５’−ＳＨ−ＴＴＡＡＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＡ−３’（エクソン６−アンチセンス）（配列番号：４）；
Ｅ７Ｓ：５’−ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴ−３’（エクソン７―センス）（配列番号：５）；
Ｅ７Ａ：５’−ＳＨ−ＴＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＣ−３’（エクソン７−アンチセンス）（配列番号：６）；
Ｅ８Ｓ：５’−ＴＡＡＡＴＧＧＧＡＣＡＧＧＴＡＧＧＡＣＣ−３’（エクソン８―センス）（配列番号：７）；
Ｅ８Ａ：５’−ＳＨ−ＴＣＣＡＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣ−３’（エクソン８−アンチセンス）（配列番号：８）。
【００３６】
反応は１０〜２５ｎｇのゲノムＤＮＡと０．４μＭの各プライマーを含むＰＣＲ反応溶液（５０μｌ）を用い、９４℃（３０秒）―６０℃（４５秒）のサイクルを４０回行った。
【００３７】
ＰＣＲ反応増幅物をゲル電気泳動で調べた結果、予想される長さのＤＮＡバンドの他に、その二量体の位置にもわずかにバンドがみられた。
（インクジェット法によるｃＤＮＡのプリント）
特開平１１−１８７９００号公報に記載の方法に従い、４種類の各エクソンのｃＤＮＡ溶液をインクの代わりに充填して印字した。その後、室温に１時間放置してチオールとマレイミド基の反応を完結させ、さらに基板を８０℃の温水に浸して未反応のｃＤＮＡを除去した。この工程により、チオール基のついていないセンス側のｃＤＮＡは基板への結合ができずに洗い流され、アンチセンス側のｃＤＮＡのみが５’末端で基板上に結合した。
２）ｃＤＮＡアレイ評価
（ｃＤＮＡ検体の調整）
上記反応によって得られたエクソン７遺伝子を基にＰＣＲ法により、ローダミン標識一本鎖ＤＮＡを得た。つまり、エクソン７のセンス側のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、反応時にｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅでラベルされたｄｅｏｘｙ　ＵＴＰ（ＦｌｕｏｒｏＲｅｄ：Ａｍｅｒｃｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を導入した。ＰＣＲ反応は９６℃、３０秒―５０℃、３０秒―６０℃、４分のサイクルを２５回行った。その後ゲル濾過により未反応色素を除去し、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅで標識されたエクソン７の一本鎖ＤＮＡを得た。
（ブロッキング反応）
２％牛血清アルブミンによりｃＤＮＡアレイをブロッキング処理後、以下のようにハイブリダイゼーション反応を行った。
（ハイブリダイゼーション反応）
上記ＰＣＲ反応により得られた標識一本鎖ＤＮＡ溶液（最終濃度１００ｍＭのＮａＣｌを含む）にｃＤＮＡアレイを浸し、６５℃２時間放置した。その後、基板を軽く洗浄し顕微鏡で観察した。蛍光はエクソン７のｃＤＮＡの部分にのみ検出された。
【００３８】
実施例２
（ＰＣＲ反応時にＤＴＴ添加）
実施例１における末端にチオール基を有するｃＤＮＡの調整の際に、ＰＣＲ反応溶液にＤＴＴ（ジチオスレイトール）を１ｍＭ濃度になるように添加し、反応を行った。反応終了後、ＰＣＲ反応物をゲル電気泳動で確認したところ、実施例１で見られた二量体のバンドは完全に消失していた。また、この試料を用いたハイブリダイゼーション反応の結果は、実施例１に比べてエクソン７の部分の蛍光強度が２割以上上昇していた。
実施例３
（ミスマッチの検出）
実施例１と同様にｃＤＮＡアレイを作製した。ＣＤＮＡアレイを実施例１と同様にブロッキング反応を行い、その後以下の試料とハイブリダイゼーション反応を行った。
１）標識ターゲットＤＮＡの作製
ｐ５３遺伝子の正常な配列を持ち、１８塩基長の標識ＤＮＡを作製した。配列は下に示す通りで、５’末端にはローダミンを結合してある。
【００３９】
Ｎｏ．１　５’Ｃｙ３−ＡＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ３’（配列番号：９）
また、上記配列と１塩基異なる配列の標識ＤＮＡを合成した。
【００４０】
Ｎｏ．２　５’Ｃｙ５−ＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣ３’（配列番号：１０）
これらの２種の標識オリゴヌクレオチドを混合してハイブリダイゼーション反応に用いた。
２）ハイブリダイゼーション反応
ＤＮＡアレイ基板の入った袋に上記標識オリゴヌクレオチド溶液（１００ｍＭＮａＣｌを含む）を入れ、最初に７０℃３０分加熱後、インキュベーターの温度を４０℃に下げ、そのまま一晩反応させた。
３）検出
蛍光顕微鏡を用いて各スポットの蛍光を観察した。エクソン７の部分にＣｙ３の蛍光が観察され、Ｎｏ．１の配列のみがハイブリッドを形成していることが明らかになった。１塩基ミスマッチが判別されていると考えられる。他のエクソンｃＤＮＡスポットでは、蛍光が全く観察されなかった。
実施例４及び比較例
１）ｃＤＮＡアレイの作製
市販のポリリジンコート処理されたスライドガラスに、実施例１と同様なプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｃＤＮＡ溶液を得た。但し、このプライマーは通常用いられるプライマーであって、末端にチオール基を持つものではない。
【００４１】
実施例１と同様インクジェット法により４種のエクソンに対応する各スポットを得、７０〜８０℃で１時間処理した。その後、ＵＶを１２０ｋＪ照射しｃＤＮＡを固定化した。スライドガラスをコハク酸溶液（７０ｍＭ無水コハク酸、０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）、１−メチル−２−ピロリジノン）に、ときどき振とうしながら１０〜２０分間浸す。沸騰した純水中に２分間浸し、エタノールで脱水した後、室温で乾燥させた。
２）ハイブリダイゼーション反応
実施例３と同様２種類の標識オリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーション反応を行った。条件は実施例３と同様である。
３）検出
蛍光顕微鏡を用いて各スポットの蛍光を観察した。エクソン７の部分で最も強いＣｙ３の蛍光が観察されたが、その強度は実施例３で得られた蛍光量の約半分であった。エクソン７では、Ｃｙ３の蛍光の他にＣｙ５の蛍光も同程度観察され、ミスマッチが区別されていないことが示された。また、他のエクソンのスポットにもＣｙ３及びＣｙ５の蛍光が観察され、全体的にスポット間のコントラストが悪く、Ｓ／Ｎ比が悪かった。
【００４２】
【発明の効果】
ｃＤＮＡを構成する二本鎖ＤＮＡのうち所望のストランドのみを固定した一本鎖ｃＤＮＡアレイが作製されることにより、従来の二本鎖を固定したものに比べて高い蛍光量を得ることができた。また、他のスポットへの吸着によるバックグランドが軽減され、Ｓ／Ｎ比の高いハイブリダイゼーションの結果を得ることができた。さらに、末端のみが固定されていることにより、従来の方法では困難であった１塩基ミスマッチの検出も可能になった。
【００４３】
【配列表】
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