(57)【要約】【課題】ゴキブリについて客観的な判別および分類方法を確立すること。【解決手段】ゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の種類別塩基配列とそれらの比較による分類方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表のＩＤ  Ｎｏ：１で示されるキョウトゴキブリ（Ａｓｉａｂｌａｔｔａ
ｋｙｏｔｅｎｓｉｓ）のミトコンドリアリＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列。
【請求項２】
配列表のＩＤ  Ｎｏ：２で示されるトビイロゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａｂｒｕｎｎｅａ）のミトコンドリアリＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列。
【請求項３】
配列表のＩＤ  Ｎｏ：３で示されるヤマトゴキブリ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ
ｊａｐｏｎｉｃａ）のミトコンドリアリＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列。
【請求項４】
配列表のＩＤ  Ｎｏ：４で示されるトウヨウゴキブリ（Ｂｌａｔｔａ
ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）のミトコンドリアリＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列。
【請求項５】
配列表のＩＤ  Ｎｏ：１からＮｏ：４で示される塩基配列において、１もしくは複数の塩基配列が付加、欠失もしくは置換されていることを特徴とする塩基配列。
【請求項６】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる、ゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の領域の全部または一部を含む塩基配列を、上記請求項１から請求項４に記載の塩基配列と比較し、その異同により分類することを特徴とする、ゴキブリの分類方法。
【請求項７】
上記分類方法において、上記比較が上記領域の塩基配列を決定し、その相同性の割合を測定して比較するものであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列とそれを利用した分類方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年消費者の食品の品質に対する目は非常に厳しいものになってきている。加工食品にわずか１、２匹の昆虫や昆虫の破片が混入しているだけでも、消費者に不快感を与え、異物クレームがつけられ、食品メーカーには商品価値の喪失と、メーカー・製品に対するイメージダウンという経済被害がもたらされる。最近では、昆虫等の混入により製品の回収という事態もたびたび見られ、その損害額は計り知れないものがある。
当然そのような異物の混入防止に全力を挙げることが第一であるが、万が一混入が起こったときには、消費者や流通関係者への迅速な説明が必要であり、そのためには異物の同定能力を高めることが必要となる。
【０００３】
従来からの異物昆虫の検査は形態観察により行われてきた。しかし、脚や翅など昆虫の体の一部のみが混入した場合には、専門家でない限り形態観察での同定は困難であると考えられる。
【０００４】
一方近年の分子生物学の進歩は、生物の分類系統学における方法に大きな影響を与えてきた。すなわちこれまでの形態的な分類だけではなく、特定の遺伝子に注目して、目的の生物の塩基配列を比較すると、その遺伝子の相同性より進化過程を推定し、系統分類することが可能となったのである。
【０００５】
生物種による遺伝子はタンパク質をコードする遺伝子で驚くほど保存されている。一方、他の多くの遺伝子では生物の進化に従って変化し、もはや起源が同じであるかさえ不明になる場合がある。したがって、対象とする生物に応じて適切な遺伝子領域を選ぶことによって、かなりかけ離れた生物間の分類・同定から、非常に近縁の生物間の分類・同定まで可能となると考えられる。このような分類・同定に最も一般的に利用される遺伝子として、ゲノムＤＮＡのリボソームＲＮＡ遺伝子やミトコンドリアＤＮＡ内の遺伝子等が数多く報告されている。
【０００６】
ミトコンドリアＤＮＡは、ミトコンドリアのマトリックス中に存在する環状二本鎖のＤＮＡである。高等動物ではほぼ１６，６００塩基対であり、昆虫のミトコンドリアＤＮＡには、２種類のリボソームＲＮＡ遺伝子と２２種類のトランスファーＲＮＡ遺伝子、１３種類のタンパク質をコードした遺伝子が存在している。
【０００７】
これまで、ゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列はいくつか報告されてきた。しかし、国内で異物混入する可能性のあるゴキブリであるキョウトゴキブリ、トビイロゴキブリ、ヤマトゴキブリ、トウヨウゴキブリについては未報告である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、国内で異物混入する可能性のあるゴキブリの内、ミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列が未報告のゴキブリに関して、それらの塩基配列を提供し、ゴキブリの客観的鑑別方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
以上のような課題を解決すべく、本願発明者は、ゴキブリを専門に研究している複数の研究機関より、キョウトゴキブリ、トビイロゴキブリ、ヤマトゴキブリ、トウヨウゴキブリを貰い受け、それぞれのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全部、すなわちショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる、ゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の領域約６９０ｂｐの塩基配列を決定した。その結果、当該配列において相互鑑別に用いることができる程度の相違を見出し、これに基づいて本発明を完成させたものである。
【００１０】
すなわち、本発明の塩基配列の第１の態様は、配列表のＩＤ  Ｎｏ：１で示されるミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列である。上述したミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列の全部は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる。
【００１１】
本発明の塩基配列の第２の態様は、配列表のＩＤ  Ｎｏ：２で示されるミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列である。上述したミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列の全部は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる。
【００１２】
本発明の塩基配列の第３の態様は、配列表のＩＤ  Ｎｏ：３で示されるミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の一部である塩基配列である。上述したミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列の全部は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる。
【００１３】
本発明の塩基配列の第４の態様は、配列表のＩＤ  Ｎｏ：４で示されるミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全塩基配列である。上述したミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子塩基配列の全部は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる。
【００１４】
本発明の塩基配列の第５の態様は、配列表のＩＤＮｏ：１からＮｏ：４で示される塩基配列において、１もしくは複数の塩基配列が付加、欠失もしくは置換されていることを特徴とする、上記ミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全部である塩基配列である。
【００１５】
本発明の方法の第一の態様は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｙａｋｕｂａ）のミトコンドリアＤＮＡにおいて３０３９番目の塩基から３７８３番目の塩基の領域に含まれる、ゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の全部または一部を含む塩基配列を、上記請求項１から請求項４に記載の塩基配列と比較し、その異同により、ゴキブリを分類する方法である。
【００１６】
本発明の方法の第二の態様は、上記比較が、上記領域の塩基配列を決定し、その相同性の割合を測定して比較するものであることを特徴とする、ゴキブリを分類する方法である。
【００１７】
【発明実施の形態】
本発明に用いたキョウトゴキブリ、トビイロゴキブリ、ヤマトゴキブリ、トウヨウゴキブリ、および本実施例に用いたチャバネゴキブリ、ワモンゴキブリ、コワモンゴキブリ、クロゴキブリは、ゴキブリを専門に研究している複数の研究機関より貰い受けた。
【００１８】
検体からのＤＮＡ抽出はＳｕらの方法（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  Ｖｏｌ．４２，１２４−１２９（１９９６））を参考にした。各々のゴキブリの脚の付け根の筋肉から数ｍｇの組織を採取した。これに０．２ｍｇ／ｍＬｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ、０．６％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５００μＬを加えて、５０℃で４時間加熱した。加熱後、ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）飽和フェノール５００μＬを加え、遠心し、上清を回収した。回収した上清に等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール溶媒  （２５／２４／１）を加え、遠心し、上清を回収した。回収した上清に等量のクロロホルム−イソアミルアルコール溶媒（２４／１）を加え、遠心し、上清を回収した。上清に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム  （ｐＨ５．２）  、２．５倍量の  ９５％エタノール（特級エタノールを滅菌超純水で調製したもの）を加え、遠心後、上清を除去した。あらかじめ冷却しておいた７０％エタノール（特級エタノールを滅菌超純水で調製したもの）２５０μＬを加え、遠心後、上清を除去し、真空乾燥後、滅菌超純水５０μＬを加えた。
【００１９】
ＰＣＲ法によるミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの選定および合成については、広範囲の昆虫に関してミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子を含む領域を増幅するプライマーが報告されており（Ｈｏｎｇ，Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，Ｍａｒｃｈ，４１−４５（１９９２））、そのプライマーを委託合成した。調製したＤＮＡ溶液０．１μｇを０．２ｍＬチューブに取り、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（パーキンエルマー）中のＧｅｎｅａＡｍｐ  １０×ＰＣＲバッファー１０μＬ、１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を１６μＬ、５Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．５μＬ、濃度２０ｍＭに調製したプライマーを各々５μＬ、これに滅菌蒸留水を加えて１００μＬの溶液にした。ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間、４０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを１０回繰り返した後、９５℃で３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した。ＰＣＲ反応後、そのＰＣＲ産物１０μＬを３％アガロースゲル（宝酒造）で電気泳動を行った（図１参照）。泳動条件は１００Ｖ、３０分間で、泳動バッファーはエチジウムブロマイド入りＴＡＥ（４０ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）（ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓ）を用いた。
【００２０】
ＰＣＲ産物はＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００  （ミリポア）  を用いて精製し、２０μＬの滅菌超純水を加えＤＮＡの鋳型とした。またシークエンスに用いたプライマーはＰＣＲ反応で用いたプライマーを用いた。ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９６℃で３０秒間、５０℃で１５秒間、６０℃で４分間の反応を２５サイクル行った。シークエンス産物２０μＬに９５％エタノール５０μＬ、３．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）２μＬを加え、１５分間静置した。遠心後、上清を除去し、あらかじめ冷却した７０％エタノール２５０μＬ加え、遠心後上清を除去し、真空乾燥後、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２５μＬを加えた。塩基配列の決定はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行った。各種のゴキブリの塩基配列を本願段落番号００２３以下に示す。
【００２１】
上記の方法により決定した各種のゴキブリの相互間の相同性を遺伝子解析ソフトＧｅｎｅｔｙｘ（ＳｏｆｔｗａｒｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．，ＬＴＤ．）により計算したところ、７９．９％か  ら９３．４％であることが判明した（図２参照）。
以上の結果、当該配列において相互鑑別に用いることができる程度の相違を見出し、これに基づいて本発明を完成させたものである。
【００２２】
【発明の効果】
上述したように、この発明によると、国内で異物として加工食品に混入する可能性のあるキョウトゴキブリ、トビイロゴキブリ、ヤマトゴキブリ、トウヨウゴキブリのミトコンドリアＤＮＡチトクロムオキシダーゼＩＩ遺伝子配列の一部を提供することができ、更に、ゴキブリの種の特定について、客観的鑑別方法を提供することができる。
【００２３】
【配列表】
2004305127.tif 000002
【００２４】
2004305127.tif 000003
【００２５】
2004305127.tif 000004
【００２６】
2004305127.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に示す各種ゴキブリの電気泳動図である。
レーン１：１００ｂｐ  Ｌａｄｄｅｒ（宝酒造）
レーン２：チャバネゴキブリ
レーン３：ワモンゴキブリ
レーン４：コワモンゴキブリ
レーン５：クロゴキブリ
レーン６：トビイロゴキブリ
レーン７：ヤマトゴキブリ
レーン８：トウヨウゴキブリ
レーン９：キョウトゴキブリ
【図２】実施例の各種ゴキブリ相互間の相同性割合
【図１】
2004305127.tif 000006
【図２】
2004305127.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月24日(2004.2.24)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本明細書において学名と和名についての相関は以下の通り。すなわちBlattella germanica（チャバネゴキブリ）,Blatta orientalis（トウヨウゴキブリ）,Periplaneta americana（ワモンゴキブリ）,Periplaneta fuliginosa（クロゴキブリ）,Periplaneta australasiae（コワモンゴキブリ）,Periplaneta japonica（ヤマトゴキブリ）,Periplaneta brunnera（トビイロゴキブリ）,Asiablatta kyotensis（キョウトゴキブリ）である。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】削除
【補正の内容】