(57)【要約】　　　（修正有）【課題】抗酸菌検出でのアクリジンオレンジ蛍光染色法における、検出感度の向上した染色法、および該方法に使用する染色液および後染色液を提供する。【解決手段】抗酸菌のアクリジンオレンジ蛍光染色法であって、以下の工程、被試験料の塗抹標本を作製する工程、該標本をアクリジンオレンジ染色液にて染色する工程、更に該標本を後染色液にて脱色および後染色する工程、該染色後の標本を鏡検し、判定する工程、を含み、ここで該アクリジンオレンジ染色液のアクリジンオレンジ濃度が０．３〜０．５％である、該染色法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸菌のアクリジンオレンジ蛍光染色法であって、以下の工程、
被検試料の塗抹標本を作製する工程、
該標本をアクリジンオレンジ染色液にて染色する工程、
更に該標本を後染色液にて脱色および後染色する工程、
該染色後の標本を鏡検し、判定する工程、
を含み、ここで該アクリジンオレンジ染色液のアクリジンオレンジ濃度が０．３〜０．５％である、該染色法。
【請求項２】
前記アクリジンオレンジ染色液のフェノール濃度が５〜８％である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記後染色液のＨＣｌ濃度が１．０〜２．０％である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
後染色液による脱色および後染色する工程の時間が１分以内である、請求項１乃至３に記載の方法。
【請求項５】
アクリジンオレンジ濃度が０．３〜０．５％である、抗酸菌アクリジンオレンジ蛍光染色用染色液。
【請求項６】
フェノール濃度が５〜８％である、請求項５記載の抗酸菌アクリジンオレンジ蛍光染色用染色液。
【請求項７】
ＨＣｌ濃度が０．５〜２．０％である、抗酸菌アクリジンオレンジ蛍光染色用後染色液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗酸菌のアクリジンオレンジ蛍光染色法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
「再興感染症」としての結核症が最近大きな話題となっている。減少すべき患者数が逆に増加し、小中学校や医療施設での集団感染が報道され、また初回治療を開始するにあたって既に結核菌が薬剤に耐性を示すといったことが話題性の主因となっている。抗酸菌、特に結核菌に対する対応には、素早く診断して素早く治療を開始することが特に重要であり、その意味から臨床検査は重要である。
【０００３】
いくつかの検査法がわが国でも独自に考案、実用化されている。検査法は大きく以下の３つに分けられる。
１）塗抹検査：ガラスに喀痰を塗りつけ、染色して顕微鏡で観察する。もし菌がいれば赤く染まって見える。
【０００４】
２）培養検査：培地に喀痰等検体液を広げて、３７℃で培養し菌の発育を観察していくため、結果が判明するのに４週以上を要する。
３）遺伝子による検査
近年、遺伝子を用いた抗酸菌同定検査の迅速法が開発され、より感度の高い検出、同定が可能となり、早期診断・治療に有用な検査となってきている。
【０００５】
しかし、１８８２年にロベルトコッホがアルカリ性メチレンブルーにて一昼夜かけて結核菌を染色して以来、現在でも塗抹検査は抗酸菌迅速検査の要であり、遺伝子診断が進んだ今も普遍である。ＷＨＯは塗抹検査を結核対策のうえで最も重要な柱として位置付けている。わが国においても公衆衛生学的に周囲のヒトへの感染性、あるいはその危険性の指標として塗抹検査の結果が用いられており、このことからも塗抹検査の重要性が理解できる。
【０００６】
塗抹検査における抗酸菌の染色は、抗酸菌属の抗酸性を利用したものである。抗酸性とは、媒染剤として石炭酸を加えたフクシンやオーラミンで染色すると酸やアルコールによって脱色されにくいという染色上の特徴である。
【０００７】
抗酸菌の染色には、チール・ネルゼン染色法と蛍光法が一般に用いられている。材料中に菌が少ない場合にチール・ネルゼン染色法では見落しする場合がある。これに対し蛍光法では，暗い視野の中に結核菌がオレンジ色に光って見えるので見落としは少ない。またチール・ネルゼン染色法では１，０００倍拡大で観察するのに対し，蛍光法での観察は２００倍拡大で行うので観察に要する時間も短縮できる。このような理由からわが国の「結核菌検査指針」において、染色法として蛍光法の使用が勧められている。
【０００８】
蛍光染色は加温操作をしないため、チールネルゼン染色に比べ、染色性にバラツキ少ない。また、蛍光染色はチールネルゼン染色に比べ短時間で正確に抗酸菌を検出可能である。蛍光染色ではオーラミン染色が代表的である。
【０００９】
オーラミン染色とは、蛍光色素であるオーラミンで塗抹標本を染め、塩酸アルコールで脱色し、メチレン青液で後染色したものに３６０ｎｍ前後の紫外線を照射することにより、オーラミンから二次蛍光を発生させる。これにより抗酸菌を検出するもので、抗酸菌染色の一種である。しかし、オーラミンはＷＨＯより発癌性物質に指摘されているため、安全性にかける。また、特定化学物質等中毒予防規則において特殊健康診断の対象物質とされており、事業者はオーラミンを製造し、又は取り扱う業務に常時従事する労働者に対し、医師による健康診断を行わなければならないと定められている。
【００１０】
その他の蛍光染色法として、アクリジンオレンジ染色法が検討されている。抗酸菌のアクリジンオレンジ染色法は、アクリジンオレンジを含有する染色液による染色工程と、メチレンブルー、マラカイトグリーン、過マンガン酸カリウムなどによる後染色工程を含む。アクリジンオレンジ染色は脱色操作が省かれており、操作が簡便である。Ｋａｔｉｌａ，　Ｍ．　Ｌ．，らが最初に、抗酸菌の蛍光染色の染料としてアクリジンオレンジを用い、有効性を評価している（Ｋａｔｉｌａ，　Ｍ．　Ｌ．，　ａｎｄ　Ｒ．Ａ．Ｍａｎｔｙｊａｒｖｉ．　１９８２　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１：３５１−３５３）。しかし、該方法は染色工程前に酸性化工程が必要であり、また染色液の保存性にも問題がある。Ｒｏｎａｌｄ　Ｗ．　Ｓｍｉｔｈｗｉｃｋらは、アクリジンオレンジのミコバクテリアへの浸透性を向上させるためにフェノールを含有する染色液を用いて、有効性を評価している（Ｒｏｎａｌｄ　Ｗ．　Ｓｍｉｔｈｗｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈｅｎｏｌｉｃ　Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｓｔａｉｎ　ｆｏｒ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｃｔ．　１９９５，　ｐ２７６３−２７６４）。しかし、その結果によれば、オーラミン陽性検体がアクリジン陰性に判定されるケースがあり、感度の面で満足いく評価結果は得られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、現在報告されている抗酸菌検出でのアクリジンオレンジ染色方法では、菌体の発光がオーラミン染色法よりも低く、そのため臨床材料を塗抹した際の検出感度が低い。さらに、喀痰を塗抹した際に背景の非特異的発光（黄緑〜緑色）が問題となり、検出感度の点で改善が求められている。
【００１２】
本発明は、抗酸菌検出でのアクリジンオレンジ蛍光染色法における、検出感度の向上した染色法、および該方法に使用する染色液および後染色液を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、アクリジンオレンジ蛍光染色法を詳細に検討した結果、特定組成の染色液および後染色液を用いることにより顕著に検出感度が向上することが見いだされ、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、抗酸菌のアクリジンオレンジ蛍光染色法であって、以下の工程、
被検試料の塗抹標本を作製する工程、
該標本をアクリジンオレンジ染色液にて染色する工程、
更に該標本を後染色液にて脱色および後染色する工程、
該染色後の標本を鏡検し、判定する工程、
を含み、ここで該アクリジンオレンジ染色液のアクリジンオレンジ濃度が０．３〜０．５％である、該染色法を提供する。更に本発明は、該方法に用いる染色液および後染色液を提供する。
【００１５】
本発明の抗酸菌染色は、抗酸菌属の抗酸性を利用したものである。抗酸性とは、媒染剤として石炭酸を加えたフクシンやオーラミンで染色すると酸やアルコールによって脱色されにくいという染色上の特徴である。本発明のアクリジンオレンジ染色法により抗酸菌が染色される。
【００１６】
アクリジンオレンジ染色の原理は蛍光色素であるアクリジンオレンジの核酸（ＤＮＡ）に対する親和性を利用したものであり、原核生物である細菌ＤＮＡとアクリジンオレンジの複合体を蛍光顕微鏡によって観察するものである。
【００１７】
披検試料は、喀痰等の採取した検体および結核菌、らい菌等の菌液であってもよい。
塗抹標本の作製工程は、上記検体または菌液をスライドグラス上に滴下または線引きし、次に該スライドグラスを火炎上を通過させるにより菌を熱固定することにより、またはアルコール固定すること等により行なう。
【００１８】
染色液での染色工程は、上記菌を固定したスライドグラス上にアクリジンオレンジ染色液を滴下し、約１５分間室温で放置することにより行なう。次に、脱イオン水等で洗浄後、水分を切る。
【００１９】
アクリジンオレンジ染色液には、アクリジンオレンジ、フェノール、エタノール／グリセリンおよび蒸留水が含まれる。その組成は、例えば、アクリジンオレンジ０．３〜０．５ｇ、フェノール５〜８ｇ、エタノール／グリセリン（１：１）５０ｍｌ、蒸留水５０ｍｌである。
【００２０】
アクリジンオレンジ染色液は、例えば以下の手順により調製することができる。蒸留水５０ｍｌおよびエタノール／グリセリン（１：１）５０ｍｌからなる溶液にフェノール５〜８ｇを溶解させる。次に、０．３〜０．５ｇのアクリジンオレンジを添加し、撹拌して溶解させる。完全に溶解後、使用時まで遮光にて保存する。保存は、室温または冷蔵保存することができるが、室温保存が好ましい。
【００２１】
アクリジンオレンジは、アクリジン色素の一種で塩基性染料であり、構造式Ｃ１７Ｈ２０ＣｌＮ３／ＺｎＳＯ４であり、強い蛍光を発する物質である。アクリジンオレンジは市販されており、例えば和光純薬工業株式会社から入手可能である。
【００２２】
アクリジンオレンジ濃度を０．３〜０．５％とすることで菌体の色調が橙色もしくは濃い橙色となり、非特異蛍光（黄緑）とのコントラストが悪いという問題が解消され、鏡検が容易になる。
【００２３】
フェノールは、アクリジンオレンジのマイコバクテリア細胞壁への浸透を促進するため、アクリジンオレンジ染色液に添加するのが好ましい（Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｗ．　Ｔｈｅ　ｄｕａｌ　ｎａｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｃｉｄ−ｆａｓｔｎｅｓｓ．　１９９５　Ｙａｌｅ　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．　２６：２１５−２２３）。フェノール濃度は鏡検時の蛍光輝度を上げるため５％以上が好ましく、抗酸菌の輝度の上昇とともに輪郭もはっきりする。但し、９％以上であるとハレーション現象が見られ、菌体の形態が確認し難くなる。従って、染色液中のフェノール濃度は５〜８％が好ましい。
【００２４】
染色液に粘性を与え、染色液を染色の間塗抹標本上に留めるために、染色液にはグリセリン等の粘性物質を添加するのが好ましい。エタノールは、９０％以上の純度のものが好ましい。
【００２５】
後染色液での脱色および後染色工程は、該スライドグラス上に後染色液を滴下し、約２分間室温で静置後、脱イオン水等で洗浄、水切りを行なう。
後染色液には、メチレンブルー、塩酸、エタノールおよび蒸留水が含まれる。メチレンブルーの代わりにマラカイトグリーンまたは過マンガン酸カリウムを用いることもできる。その組成は、例えば、メチレンブルー０．２ｇ、塩酸０．５〜２．０ｍｌ、エタノール７４ｍｌおよび蒸留水２６ｍｌである。
【００２６】
後染色液は、例えば以下の手順により調製することができる。メチレンブルー０．２ｇ、塩酸０．５〜２．０ｍｌ、エタノール７４ｍｌおよび蒸留水２６ｍｌを撹拌して調製する。完全に均一溶解後、使用時まで遮光にて保存する。保存は、結晶の析出を避けるために室温保存が好ましい。
【００２７】
後染色液中のメチレンブルーは、染色された標本の背景の蛍光を低下させるために添加する。メチレンブルーは塩基性染料であり、構造式Ｃ１６Ｈ１８ＣｌＮ３Ｓ・３Ｈ２Ｏであり、市販されており、例えば和光純薬株式会社から入手可能である。
【００２８】
背景の非特異的蛍光はＨＣｌ濃度を高くするに従い抑えられるが、抗酸菌自身の蛍光はＨＣｌ濃度１．５％を境に低下していき、形態の確認も困難になる。したがって、両者のバランスから、後染色液のＨＣｌ濃度は１．０〜２．０％が好ましい。より好ましくは１．５〜２．０％である。後染色時間は２分以下が好ましく、より好ましくは１分以下である。喀痰を塗抹した際に背景の非特異的発光（黄緑〜緑色）が最少限に抑えられ、かつ抗酸菌自身の蛍光を落とさない。
【００２９】
エタノールは、９０％以上の純度のものが好ましい。
鏡検は、蛍光顕微鏡で通常２００〜６００倍拡大にて行なう。抗酸菌は、黄橙〜赤橙色に染色されて観察される。また、形態観察を行う場合は、６００〜１０００倍拡大にて観察する。
【００３０】
本発明の方法の特に好ましい態様は、アクリジンオレンジ濃度が０．３〜０．５％であり、フェノール濃度が５〜８％のアクリジンオレンジ染色液を用い、ＨＣｌ濃度が１．０〜２．０％の後染色液を用い、後染色時間を１分とした場合である。
【００３１】
本発明の方法では、抗酸菌の検出限界が菌液濃度１０４ＣＦＵ／ｍｌであり、従来の抗酸菌のアクリジンオレンジ蛍光染色法と比較して優れている。
更に、本発明の染色液及び後染色液は保存安定性に優れている。上記のように保存は、遮光にて室温保存が好ましい。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明に関して、実施例を示して説明する。
実施例１
被検体として喀痰（ガフキー２号、７号）を用い、表１の染色液および表２の後染色液を用い、条件Ａ〜条件Ｈにて処理し鏡検した結果を表３に示す。アクリジンオレンジ染色液による染色は、全条件とも１５分間行なった。尚、アクリジンオレンジおよびメチレンブルーは、和光純薬工業株式会社から購入したものを使用した。他の薬品は市販の試薬グレード品を用いた。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
【表２】
2004069341.tif 000003
【００３５】
条件Ａ：アクリジンオレンジ０．４ｇ、フェノール７ｇ、ＨＣｌ濃度１．５ｍｌ、後染色時間１分
条件Ｂ：アクリジンオレンジ０．２ｇ、フェノール７ｇ、ＨＣｌ濃度１．５ｍｌ、後染色時間１分
条件Ｃ：アクリジンオレンジ０．４ｇ、フェノール３ｇ、ＨＣｌ濃度１．５ｍｌ、後染色時間１分
条件Ｄ：アクリジンオレンジ０．４ｇ、フェノール８ｇ、ＨＣｌ濃度１．５ｍｌ、後染色時間１分
条件Ｅ：アクリジンオレンジ０．４ｇ、フェノール７ｇ、ＨＣｌ濃度０．５ｍｌ、後染色時間１分
条件Ｆ：アクリジンオレンジ０．４ｇ、フェノール７ｇ、ＨＣｌ濃度３ｍｌ、後染色時間１分
条件Ｇ：アクリジンオレンジ０．４ｇ、フェノール７ｇ、ＨＣｌ濃度１．５ｍｌ、後染色時間２分
条件Ｈ（コントロール）：アクリジンオレンジ０．１ｇ、フェノール５ｇ、ＨＣｌ濃度０．５ｍｌ、後染色時間２分
【００３６】
【表３】
2004069341.tif 000004
【００３７】
条件Ａにおいて抗酸菌の検出、観察が最も容易であった。
実施例２
本発明の方法（実施例１の条件Ａにて実施）での検出感度と前述の文献（Ｒｏｎａｌｄ　Ｗ．　Ｓｍｉｔｈｗｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈｅｎｏｌｉｃ　Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｓｔａｉｎ　ｆｏｒ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｃｔ．　１９９５，　ｐ２７６３−２７６４）の方法での検出感度の比較を行った。
【００３８】
純培養菌株を規定濃度に調製し、一定量塗抹したときの検出菌数を表４に示す。菌種はＭＴＢ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＮＴＭ（Ｍ．ａｖｉｕｍ）を使用。表４中には、本発明の方法を改良処方と記載している。
【００３９】
【表４】
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【００４０】
本願方法では、抗酸菌の検出限界が菌液濃度１０４ＣＦＵ／ｍｌであったのに対し、前述の文献の方法では同濃度では検出できなかった。
実施例３
本発明の方法（実施例１の条件Ａにて実施）と前述の文献（Ｒｏｎａｌｄ　Ｗ．　Ｓｍｉｔｈｗｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｈｅｎｏｌｉｃ　Ａｃｒｉｄｉｎｅ　Ｏｒａｎｇｅ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｓｔａｉｎ　ｆｏｒ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｃｔ．　１９９５，　ｐ２７６３−２７６４）の方法にて試料の蛍光顕微鏡観察を行った。倍率は４００倍にて観察した。
【００４１】
図１は喀痰を直接塗抹しており、前述の文献の方法にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。図２は喀痰を直接塗抹しており、本発明の方法（実施例１の条件Ａにて実施）にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。
【００４２】
図１では、緑色に観察される細胞や扁平上皮などが多く観察されており、これら非特異蛍光の影響で抗酸菌とのコントラストが弱い。一方、図２では緑色に観察される細胞や扁平上皮などがあまり観察されず、抗酸菌の観察が容易であった。
図３は喀痰を前処理（セミアルカリプロテアーゼでタンパク融解）後集菌した沈渣を前述の文献の方法にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。図４は喀痰を前処理（セミアルカリプロテアーゼでタンパク融解）後集菌した沈渣を本発明の方法（実施例１の条件Ａにて実施）にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。
【００４３】
図４では図３に比較して抗酸菌が濃く染色されており、検出が容易であった。
実施例４
実施例１の条件Ａで用いた染色液の保存安定性を、室温および冷蔵２ヶ月保存後のｐＨ及び４９０ｎｍにおける吸光度の変化により評価した。
【００４４】
試験開始時のｐＨは２．６６であり、室温２ヶ月保存後は２．６３であり、冷蔵２ヶ月保存後は２．６２であった。
試験開始時の吸光度は０．３７７であり、室温２ヶ月保存後は０．３７２であり、冷蔵２ヶ月保存後は０．３７２であった。
【００４５】
実施例５
実施例１の条件Ａで用いた後染色液の保存安定性を、室温および冷蔵２ヶ月保存後のｐＨ及び４９０ｎｍにおける吸光度の変化により評価した。
【００４６】
試験開始時のｐＨは１．１１であり、室温２ヶ月保存後は０．９０であり、冷蔵２ヶ月保存後は０．９２であった。
試験開始時の吸光度は０．５０８であり、室温２ヶ月保存後は０．５００であり、冷蔵２ヶ月保存後は０．４９６であった。
【００４７】
実施例４および５で使用した室温および冷蔵２ヶ月保存後の染色液および後染色液を使用して、実施例１に示す条件にて試験したところ、表３に示す結果と同一の結果が得られた。
【００４８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明により染色性にバラツキが少なく、短時間で正確に抗酸菌の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、喀痰を直接塗抹し、前述の文献の方法にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍。
【図２】図２は、喀痰を直接塗抹し、本発明の方法にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍。
【図３】図３は、喀痰を前処理（セミアルカリプロテアーゼでタンパク融解）後集菌した沈渣を前述の文献の方法にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍。
【図４】図４は喀痰を前処理（セミアルカリプロテアーゼでタンパク融解）後集菌した沈渣を本発明の方法にて染色したサンプルの蛍光顕微鏡写真である。倍率は４００倍。
【図１】
2004069341.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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