(57)【要約】【課題】選択する励起波長を容易に切り換えることのできる蛍光試料分析装置を提供する。【解決手段】超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光器１５で分光し、波長選択手段１７ａにより、分光された各波長中の目的波長光のみを選択する。そして、各光路に設けられたシャッタ２１により、選択された目的波長光の中でも、現時点で試料１８に照射したい波長のみを選択的に通過させる。シャッタ２１を通過した目的波長光を逆分光器（分光器１５をそのまま使用）で合成し、合成光パルスを生成する。これを試料１８に照射することにより、所望の波長の励起光のみを任意に試料１８に照射することができる。【選択図】　図１
2004069574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
ｂ）分光された各波長中の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
ｃ）選択された目的波長光の各々を任意に通過させ又は遮断し得るシャッタと、
ｄ）シャッタを通過した目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
を備えることを特徴とする蛍光試料分析装置。
【請求項２】
ａ）超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
ｂ）分光された各波長中の目的波長光のみを選択する１つ又は複数の波長選択手段と、
ｃ）各波長選択手段の有効／無効を切り換える選択波長ＯＮ／ＯＦＦ手段と、
ｄ）有効とされた波長選択手段により選択された目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
を備えることを特徴とする蛍光試料分析装置。
【請求項３】
ａ）超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
ｂ）分光された各波長中の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
ｃ）複数の波長選択手段を切り換える選択切換手段と、
ｄ）選択切換手段により選択された波長選択手段により選択された目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
を備えることを特徴とする蛍光試料分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に存在する複数の蛍光物質を略同時に励起する方法に関する。細胞等の生体試料中のタンパク質等に蛍光物質で標識を付け、この方法を用いることによって、生体に含まれる複数のタンパク質等の動き、作用等を同時に且つ独立に追跡することができるようになる。
【０００２】
【従来の技術】
フェムト秒（１０−１５秒）オーダーの超短光パルスを空間的にも収束して物質に照射すると、その点におけるエネルギ密度は非常に高いものとなり、超短光パルスとその物質との間で線形及び非線形相互作用が生じる。その結果、各種の現象が生じるが、その一つに白色連続スペクトル光の発生がある。この白色連続スペクトル光は、原パルスと同様の超短パルスでありながら白色連続スペクトルを有するため、様々な用途が考えられている。
【０００３】
上記超短光パルスを用いて試料中に存在する複数の蛍光物質を略同時に励起する方法に関しては、特願２００１−３７２５７０号に記載がある。この方法では超短パルス光により生成される白色連続スペクトルパルス光を分光し、目的とする複数の蛍光物質の励起に必要な波長光を選択した後、逆分光器でそれらを合成し、試料に照射している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記方法では、目的とする波長を任意に選択することができるものの、その目的波長の変更は必ずしも容易ではなかった。例えば、新規の蛍光物質を開発する際に、その蛍光物質に最適な励起波長を探す場合、予想される励起波長を順次切り換えてゆけばいずれは最適な励起波長が発見されるが、その励起波長の切り替えが容易でないと、探索に長時間を要することになる。また、蛍光物質により標識された物質が試料中に複雑に重複して位置する場合、各蛍光物質の励起波長を同時に試料に照射すると、特定の物質の位置を詳細に調査することが困難である。
本発明はこのような課題を解決するために成されたものであり、選択する励起波長を容易に切り換えることのできる蛍光試料分析装置を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために成された本発明に係る蛍光試料分析装置の第１の態様のものは、
ａ）超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
ｂ）分光された各波長中の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
ｃ）選択された目的波長光の各々を任意に通過させ又は遮断し得るシャッタと、ｄ）シャッタを通過した目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
を備えることを特徴とする。
【０００６】
本発明に係る蛍光試料分析装置の第２の態様のものは、
ａ）超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
ｂ）分光された各波長中の目的波長光のみを選択する１つ又は複数の波長選択手段と、
ｃ）各波長選択手段の有効／無効を切り換える選択波長ＯＮ／ＯＦＦ手段と、
ｄ）有効とされた波長選択手段により選択された目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
を備えることを特徴とする。
【０００７】
本発明に係る蛍光試料分析装置の第３の態様のものは、
ａ）超短光パルスより生成される白色連続スペクトル光パルスを分光する分光器と、
ｂ）分光された各波長中の目的波長光のみを選択する波長選択手段と、
ｃ）複数の波長選択手段を切り換える選択切換手段と、
ｄ）選択切換手段により選択された波長選択手段により選択された目的波長光を合成して合成光パルスを生成する逆分光器と、
を備えることを特徴とする。
【発明の実施の形態】
【０００８】
第１の態様の蛍光試料分析装置は次のように使用する。予め、励起したい１つ又は複数の蛍光物質を定めておき、それら蛍光物質を励起させるための波長を調べておく。本発明では、励起光は超短光パルスより生成されるため、２光子励起や３光子励起等の多光子励起が生じる。従って、励起波長はそれらを考慮した値としておく。
【０００９】
白色連続スペクトル光パルスを分光した後のスペクトルから、波長選択手段により、これら１又は複数の励起波長（目的波長）のみを選択する。波長選択手段の具体的な態様としては、各目的波長の箇所のみにそれぞれ反射鏡を配置した反射鏡列（アレイ）、各目的波長箇所以外の箇所に吸収マスクをカバーした反射鏡等、種々考えることができる。
【００１０】
こうして選択された目的波長光のうち、更に、実際に試料に照射する目的波長光のみを、上記シャッタにより通過させる。選択された目的波長光のうち、現時点では試料に照射しないものは、シャッタにより遮断する。
【００１１】
シャッタには、切欠を設けた回転円盤式シャッタやカメラのプレーンシャッタ等の機械シャッタの他、液晶シャッタを用いることができる。
【００１２】
シャッタを通過した目的波長光のみが逆分光器に送られ、そこで合成光パルスが生成される。なお、ここにおける逆分光器は、上記スペクトルを生成するための分光器とは別に設けてもよいし、その分光器をそのまま逆分光器として用いてもよい。
【００１３】
こうして生成された合成光パルスには、最初の波長選択手段による選択時に、目的とする蛍光物質に対応する励起光パルスのみが選択されているため、試料中に多種存在する蛍光物質のうち目的とする複数の蛍光物質のみを励起することができる。本発明では更に、各シャッタの通過／遮断状態を適宜切り換えることにより、その目的蛍光物質の中でも、現時点で必要な蛍光物質のみを励起することができる。シャッタを用いているため、その切り替えは極めて容易且つ短時間に行うことができ、これにより新規蛍光物質の最適励起波長を探索するとか、複雑に混在する多数の蛍光物質を区別して分布・行動調査を行う等の調査が容易となる。
【００１４】
第２の態様の蛍光物質分析装置では、波長選択ＯＮ／ＯＦＦ手段により、波長選択手段の有効／無効を切り換えることが可能となっている。波長選択手段を有効としたときはその波長光が選択され、逆分光器に送られて合成光パルス内に含まれる。一方、波長選択手段を無効としたときは、その波長光は選択されず、合成光パルス内にはその波長の光は含まれない。このように、波長選択ＯＮ／ＯＦＦ手段で波長選択手段を制御することにより、合成光パルスに含まれる光の波長の組み合わせを任意に切り換えることができる。
【００１５】
第３の態様の蛍光物質分析装置では波長選択手段が複数備えられており、それらが選択切換手段により切り換え可能となっている。従って、合成光パルスに含まれる選択波長光の組み合わせを、任意に且つ簡易に切り換えることができる。
【００１６】
なお、本発明に係る装置では、生成される合成光パルスが原超短光パルスと同じく超短光パルスであるため、試料中の蛍光物質を２光子励起、３光子励起等の多光子励起モードで励起する。通常の線形の吸収による励起（線形の励起）では光の通る全ての部分で吸収が起こるが、本発明のように多光子励起とすることにより、焦点の部分のみで非線形吸収を起こすことができ、焦点付近のみの情報を得ることができる。この焦点位置を２次元・３次元的に走査すれば、２次元・３次元の分析映像が得られる。また、時間的に追跡することにより、その動き等を観察することもできる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明に係る蛍光物質分析装置では、試料に照射される合成光パルスに含まれる波長光の組み合わせを簡単且つ容易に切り換えることが可能である。このような切り換えは、次のような場合に有効である。
まず、前記のように新規の蛍光物質を開発する場合、本発明に係る装置で、予想される励起波長を順次切り換えてゆくことにより、短時間で最適な励起波長を探索することが可能となる。また、蛍光物質により標識された物質が試料中に複雑に混在する場合、各蛍光物質の励起波長を順次切り換えてゆくことにより、それらを個別に発光させることができ、各蛍光物質の位置を正確に知ることが可能となる。
【００１８】
次に、複数の励起波長光を同時に試料に照射した場合、それらが干渉し、非線形効果により差周波数成分光が発生する可能性がある。このような差周波数成分光は、目的とするもの以外の蛍光物質を励起して分析のノイズとなる可能性がある。そこで、本発明に係る装置により、試料中の蛍光物質を１つずつ励起させ、個別に励起及び蛍光の観察を行った後、最後に全ての観察結果を合成することにより、このような干渉による差周波数成分光を除去した、ノイズの少ない目的蛍光物質のみの観察を行うことが可能である。
【００１９】
【実施例】
本発明の第１の態様の一実施例である蛍光試料分析装置を図１に示す。Ｅｒドープ・ファイバレーザ、モードロックＴｉ：サファイアレーザあるいはモードロックＣｒ：フォルステライトレーザ（特開平１１−２８４２６０号公報参照）等の光源１１で生成された超短光パルスは、第１光学系１２により水、水晶等の適宜の透明物質１３中の１点に集光される。この集光点において物質１３と超短光パルスとの非線形相互作用により白色連続スペクトル光パルスが生成される。生成された白色連続スペクトル光パルスは第２光学系１４（レンズ、反射鏡等を含む）により分光器１５に照射され、そこで分光される。分光された光はコリメート光学系１６により波長選択手段１７に送られる。
【００２０】
図１において、１７ａは目的波長の箇所に小反射鏡を配置した波長選択手段を示し、１７ｂは目的波長光以外の箇所に光吸収部を設けた反射鏡による波長選択手段を示す。
【００２１】
コリメート光学系１６と波長選択手段１７との間にはシャッタ２１が設けられている。図２に示すように、シャッタ２１は波長選択手段１７ａの各小反射鏡（又は波長選択手段１７ｂの反射部分）の前にそれぞれ設けられた回転シャッタユニット２２で構成される。各回転シャッタユニットは、操作者の近くに設けられた操作部２３におけるキー等の操作により任意に回転し、その光路における光の通過／遮断を行えるようになっている。なお、操作部２３としては、簡単なスイッチで実現することができることはもちろん、本蛍光試料分析装置全体の動作を制御する制御装置（多くの場合、パソコンが使用されている）にそのような機能を組み込むことにより実現することもできる。
【００２２】
波長選択手段１７により選択され、且つ、シャッタ２１により通過を許された波長光のみがコリメート光学系１６により分光器１５に戻り、そこで１つの超短光パルスに合成される。これを試料１８に照射することにより、目的物質のみが励起され、検出器１９によりその蛍光が検出される。
このように、本実施例の蛍光試料分析装置では、操作者の手元にある操作部２３で操作することにより、試料１８に照射する合成光パルスに含まれる波長を簡単に切り換えることができる。
【００２３】
なお、シャッタ２１で複数の選択光を通過させ、試料に照射する合成光パルスに複数の波長光が含まれるようにした場合、合成光パルス内で各成分光が互いに干渉し、非線形効果により差周波数成分光が発生する場合がある。このような差周波数成分光は、試料１８内において目的とするもの以外の蛍光物質を励起して分析のノイズとなる可能性がある。そこで、上記実施例の分析装置において、各目的波長光の光路長を互いに異なるようにしておいてもよい。これにより、シャッタ２１により選択された各成分光パルスが合成光パルスにおいて時間的に分離して含まれるようになるため、差周波数成分光の生成が防止され、上記ノイズの発生が抑制される（詳細は前記特願２００１−３７２５７０号を参照されたい）。
【００２４】
そのような構成の例を図５及び図６に示す。図５は小反射鏡１７ｃの光路上での位置を前後させることにより、光路差を設けたものである。図６は、選択反射鏡型の波長選択手段１７ｂを用いた光路内に、厚さ（光路方向の寸法）の異なる透明光学媒体（屈折率の大きい物質が望ましい）１７ｄを配置することにより、光路長を光学的に変化させたものである。いずれの場合も、各光路上に回転シャッタユニット２２を置いてシャッタ２１を構成する。
【００２５】
本発明の第２の態様の蛍光試料分析装置の一実施例を次に説明する。本実施例の全体の構成は図１に示す通りであるが、コリメート光学系１６以降が図３に示すような構成となっている。すなわち、波長選択手段３１には、各波長の光路に対応して設けられた小鏡３２が多数収納されており、操作部３３からの指令信号により、各波長の光路に小鏡３２を進出させる。小鏡３２が進出した箇所では、その波長の光がコリメート光学系１６に戻り、分光器１５により超短光パルスに合成される。そうでない波長の箇所では、分光された光は分光器１５には戻らないため、合成光パルスには含まれない。従って、この実施例の装置でも、上記同様に、操作部３３から指示を与えることにより、試料１８に照射される合成光パルスに含まれる波長を任意に選択することができる。
【００２６】
本発明の第３の態様の蛍光試料分析装置の一実施例を次に説明する。本実施例の全体の構成は図１に示す通りであるが、コリメート光学系１６以降が図４に示すような構成となっている。すなわち、図１で１７ｂとして示した、光吸収部と反射部とを選択的に設けた波長選択手段４２を複数用意し、それらを選択するための選択切換手段４１を設けた。図４では波長選択手段４２は回転式に切り換えるようになっているが、これは平行移動式としてもよい。この切り換えの指示は、操作部４３から行う。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の態様の一実施例である蛍光物質分析装置の全体構成図。
【図２】前記実施例のコリメート光学系以降の部分の構成図。
【図３】本発明の第２の態様の一実施例である蛍光物質分析装置のコリメート光学系以降の部分の構成図。
【図４】本発明の第３の態様の一実施例である蛍光物質分析装置のコリメート光学系以降の部分の構成図。
【図５】第１の態様の実施例の第１変形例の構成図。
【図６】第１の態様の実施例の第２変形例の構成図。
【符号の説明】
１１…光源
１２…第１光学系
１３…透明物質
１４…第２光学系
１５…分光器（逆分光器）
１６…コリメート光学系
１７…波長選択手段
１８…試料
１９…検出器
２３、３３、４３…操作部
【図１】
2004069574.tif 000003
【図２】
2004069574.tif 000004
【図３】
2004069574.tif 000005
【図４】
2004069574.tif 000006
【図５】
2004069574.tif 000007
【図６】
2004069574.tif 000008