(57)【要約】【課題】検体中における対象となる抗体または抗原に対応する抗原または抗体を有する担体を、検体と混合したのち、前記混合工程により免疫学的凝集反応の発生状態を測定方法において、抗原または抗体を効率的に担体表面に固定する方法を提供する。【解決手段】担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して、抗原または抗体を前記担体に固定する。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中における対象となる抗体または抗原の存在または量を測定する方法であって、
前記検体中の抗体または抗原に対応する抗原または抗体が固定された担体を用意する工程と、
前記担体と前記検体とを混合する工程と、
前記混合工程により免疫学的凝集反応の発生状態を測定する工程とを有し、
前記担体に固定された前記抗原または抗体は、前記担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して前記担体に結合していることを特徴とする、測定方法。
【請求項２】
前記担体が、顔料であることを特徴とする請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
前記顔料が銅フタロシアニンである請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
前記顔料が銅フタロシアニンであり、前記顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列が、
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１）、
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２）、
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号：３）、
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号：４）、
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号：５）、
Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ（配列番号：６）、
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号：７）、
Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：８）、
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（配列番号：９）、
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）、
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号：１１）、
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号：１２）、
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：１３）、
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１４）、
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号：１５）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの配列を含む請求項３記載の測定方法。
【請求項５】
前記顔料がカーボンブラックである請求項２記載の測定方法。
【請求項６】
前記顔料がカーボンブラックであり、前記顔料に対して結合能を有するアミノ酸配列が、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１６）、
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１７）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：１８）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：１９）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（配列番号：２０）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：２１）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号：２２）、
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：２３）、
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号：２４）、
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：２５）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号：２６）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：２７）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（配列番号：２８）、
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号：２９）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号：３０）、
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：３１）、
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号：３２）、
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：３３）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）、
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：３５）、
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号：３６）、
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：３７）、
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：３８）、
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）、
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番号：４０）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの配列を含む請求項５記載の測定方法。
【請求項７】
検体中における対象となる抗体または抗原の存在または量を測定するための測定用試薬であって、
前記抗体または抗原に対応する抗原または抗体が、担体に固定され、
前記担体に固定した前記抗原または抗体は、前記担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して前記担体に結合していることを特徴とする、測定用試薬。
【請求項８】
検体中における対象となる抗体または抗原の存在または量を測定するための測定用試薬の製造方法であって、
前記抗体または抗原に対応する抗原または抗体を、担体に固定する工程を有し、
前記担体に固定された抗原または抗体は、前記担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して前記担体に結合していることを特徴とする測定用試薬の製造方法。
【請求項９】
前記対応する抗原または抗体を、前記抗原または抗体の生産能を有する生物、または前記生産能に関与する遺伝子を導入した形質転換体に生産させる工程を更に有することを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
前記形質転換体の宿主微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、
Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１）
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２）
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号：３）
Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号：４）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号：５）
Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ（配列番号：６）
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ（配列番号：７）
Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：８）
Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（配列番号：９）
Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号：１１）
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（配列番号：１２）
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：１３）
Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（配列番号：１４）
Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ（配列番号：１５）
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１６）
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１７）
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：１８）
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：１９）
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（配列番号：２０）
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：２１）
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号：２２）
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：２３）
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号：２４）
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：２５）
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号：２６）
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：２７）
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（配列番号：２８）
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号：２９）
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号：３０）
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：３１）
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号：３２）
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：３３）
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号：３４）
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：３５）
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号：３６）
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：３７）
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：３８）
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３９）
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番号：４０）
からなる群より選ばれた少なくとも１つの配列を含むペプチド。
【請求項１２】
請求項１１記載のアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むことを特徴とする、抗原タンパク質または抗体タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、測定対象物である抗体または抗原に対応する抗原または抗体を、検体と混合して免疫学的凝集反応をさせたのち、凝集状態を検出または判定することによる検体中の測定対象物の測定方法及びそれに用いる測定用試薬及びその製造方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
臨床検査の分野では、血液、尿等の生体試料中に含まれる各種成分を測定することにより、種々の疾患の診断を行っている。これらを測定する方法として、各種の測定方法が開発され、利用されており、例えば、酵素反応を利用する酵素的測定法、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法等が広く利用されている。特に近年、特異性の高い抗原抗体反応を利用した免疫測定法が、その測定精度の高さ等から盛んに用いられている。
【０００３】
一方、環境分析や食品分析の分野では、従来、試料から測定対象物質を抽出・濃縮したのち、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等の分析機器を用いて測定する方法が一般的であった。しかし近年、ダイオキシンや内分泌撹乱物質（いわゆる環境ホルモン）等の問題に見られるように、極めて低濃度の測定対象物の測定、多種多様の測定対象物の測定、多検体の迅速測定等のニーズが増大し、従来法での対応が困難になりつつある。そこで近年、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が、環境分析や食品分析の分野でも利用され始めている。
【０００４】
免疫測定法としては、免疫凝集法（免疫比濁法、ラテックス凝集法）、酵素免疫測定法、放射免疫測定法等が挙げられ、目的に応じて使い分けられている。特に、水に不溶性の担体に抗原または抗体を固定し、検体と混合して免疫学的凝集反応をさせたのち、その凝集度を検出または判定する免疫凝集法は、必ずしも大型で高価な測定装置を必要とせず、目視により簡易に判定することも可能であることから、オンサイトにおける簡易測定法等として広く用いられている。しかしながら、免疫凝集法においては、一般に、その不溶性担体微粒子としてポリスチレンラテックスやゼラチン粒子等が用いられており（特開平１１−２９５３１３号公報、特開２０００−３３８１０８号公報）、色調が白色あるいは透明であるため、目視による判定をしようとする場合には、専門技術と訓練を必要とする等の課題があった。
【０００５】
上記の課題を解決する方法として、顔料や染料等の、目視判定が容易な色調を備えた水に不溶性の担体を用いる試みがなされている。特開平４−２７４７６２号公報では、不溶性担体としてフタロシアニン色素を用い、該微粒子に物理的吸着法によって抗体を固定した固定化抗体を使用することにより、免疫学的凝集反応後の凝集物が青色の色調を呈する、目視判定が容易な免疫凝集測定方法が開示されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、顔料等の不溶性担体上に抗原や抗体を、物理的吸着によって固定しようとする場合、十分な吸着力を得られない場合があり、測定用試薬の製造効率や保存安定性等において課題があった。また一般に、物理的吸着によって抗原や抗体を固定しようとする場合、それら抗原や抗体の疎水性度が問題となり、常に一定量を固定することが困難である場合も多かった。このことは、測定系の性能を左右する大きな要因であり、さらには製造ロット差を生み出す原因にもなっていた。
【０００７】
このため、抗体を一部変性させて疎水性度を高めたのち、不溶性担体に吸着させる方法が試みられている（生化学実験法１１エンザイムイムノアッセイ、東京化学同人、ｐ２７０、１９８９年）。しかしながら、この方法には、変性によって抗体が活性を失う場合があり、すべての種類の抗体には応用できないという課題があった。
【０００８】
本発明の目的は、免疫測定法、即ち、測定対象物である抗体または抗原に対応する抗原または抗体を有する担体を、検体と混合して免疫学的凝集反応をさせたのち、前記担体の凝集状態により測定対象物である抗体または抗原の存在または量を測定する、検体中の測定対象物の測定方法及びそれに用いる測定用試薬及びその製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、担体、例えば顔料に対して、結合能を有するアミノ酸配列を、ペプチドライブラリーからスクリーニングし、このアミノ酸配列のペプチドを、遺伝子工学的手法を用いて抗原または抗体に融合させて提示させたところ、該抗原または該抗体を効率的に顔料表面に固定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、検体中における対象となる抗体または抗原の存在または量を測定する方法であって、検体中の抗体または抗原に対応する抗原または抗体が固定された担体を用意する工程と、前記担体と前記検体とを混合する工程と、前記混合工程により免疫学的凝集反応の発生状態を測定する工程とを有し、前記担体に固定された前記抗原または抗体は、前記担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して前記担体に結合している、測定方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、検体中における対象となる抗体または抗原の存在または量を測定するための測定用試薬であって、前記抗体または抗原に対応する抗原または抗体が、担体に固定され、前記担体に固定した前記抗原または抗体は、前記担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して前記担体に結合していることを特徴とする、測定用試薬に関する。
【００１２】
また、本発明は、検体中における対象となる抗体または抗原の存在または量を測定するための測定用試薬の製造方法であって、前記抗体または抗原に対応する抗原または抗体を、担体に固定する工程を有し、前記担体に固定された抗原または抗体は、前記担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を介して前記担体に結合している。測定用試薬の製造方法に関する。
【００１３】
ここで、本発明における抗体または抗原の存在又は量の測定とは、凝集状態の測定であり、凝集の有無を測定する場合と、凝集の程度を測定する場合の双方を含む。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明における担体としては、従来抗原抗体反応に使用される抗原や抗体の担体として公知のものは特に制限なくいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体等の乳化重合により得られる有機高分子ラテックスのような有機高分子物質；シリカ、シリカ−アルミナ、アルミナ等の無機酸化物等を挙げることができる。更に、担体として顔料を使用することができる。顔料は、特に制限はなく、例えば、カーボンブラック，酸化銅，二酸化マンガン，アニリンブラック，活性炭，非磁性フェライト，マグネタイト等の黒色顔料、黄鉛，亜鉛黄，黄色酸化鉄，カドミウムイエロー，ミネラルファストイエロー，ニッケルチタンイエロー，ネーブルスイエロー，ナフトールイエローＳ，ハンザーイエローＧ，ハンザーイエロー１０Ｇ，ベンジジンイエローＧ，ベンジジンイエローＧＲ，キノリンイエローレーキ，パーマネントイエローＮＣＧ，タートラジンレーキ等の黄色顔料、赤色黄鉛，モリブデンオレンジ，パーマネントオレンジＧＴＲ，ピラゾロンオレンジ，バルカンオレンジ，ベンジジンオレンジＧ，インダスレンブリリアントオレンジＲＫ，インダスレンブリリアントオレンジＧＫ等の橙色顔料、ベンカラ，カドミウムレッド鉛丹，硫化水銀，カドミウム，パーマネントレッド４Ｒ，リソールレッド，ピラゾロンレッド，ウォッチングレッド，カルシウム塩，レーキレッドＣ，レーキレッドＤ，ブリリアントカーミン６Ｂ，ブリリアントカーミン３Ｂ，エオキシンレーキ，ローダミンレーキＢ，アリザリンレーキ等の赤色顔料、紺青，コバルトブルー，アルカリブルーレーキ，ビクトリアブルーレーキ，フタロシアニンブルー，無金属フタロシアニンブルー，フタロシアニンブルー一部分塩素化合物，ファーストスカイブルー，インダスレンブルーＢＣ等の青色顔料、マンガン紫，ファストバイオレットＢ，メチルバイオレットレーキ等の紫色顔料、酸化クロム，クロムグリーン，ピグメントグリーンＢ，マラカイトグリーンレーキ，ファイナルイエローグリーンＧ等の緑色顔料、亜鉛華，酸化チタン，アンチモン白，硫化亜鉛等の白色顔料、バライト粉，炭酸バリウム，クレー，シリカ，ホワイトカーボン，タルク，アルミナホワイト等の体質顔料等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
また、担体として、前記の有機高分子物質等を顔料や染料で着色して使用することもできる。但し、染料で着色したときに、担体から染料成分が溶出してしまわないように、ポリマー中に染料を封入することが望ましい。
【００１６】
担体の形状は、その用途に応じて適宜選択可能であるが、例えば、測定対象物が抗原であり、担体表面に対応する抗体を固定する場合には、１ｎｍから１０μｍの範囲内の粒径を有する粒子を用いるとよく、さらに好ましくは５０ｎｍから１μｍの範囲内の粒径を有する粒子を用いるとよい。
【００１７】
本発明において、測定対象物に対する抗原または抗体としては、特に制限はなく、測定対象物との間に抗原抗体反応を起こす、生物由来のタンパク質またはペプチド、またはこれを一部改変したタンパク質またはペプチド、人工的に設計されたタンパク質またはペプチド、またはこれらの断片を用いることができる。例えば、測定対象物が抗原であり、顔料表面に対応する抗体を固定する場合には、前記抗体としては、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれをも用いることができる。また、測定対象物が抗体であり、顔料表面に対応する抗原を固定する場合には、前記抗原としては、タンパク質あるいはペプチドのいずれであってもよい。
【００１８】
例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染症の診断を目的として、血液中のＣ型肝炎ウイルス抗体を測定対象物とする場合は、Ｃ型肝炎ウイルス抗体と抗原抗体反応を起こす公知のＣ型肝炎ウイルスの抗原タンパク質、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質やエンベロープタンパク質のような構造タンパク質、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４タンパク質、ＮＳ５タンパク質のような非構造タンパク質やその断片からなる群（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１００１１−１００１５，１９９２）より選択される少なくとも一つを、前記の測定対象物に対する抗原または抗体として用いることができる。また、前記抗原タンパク質のアミノ酸配列の一部がアミノ酸の付加、欠損、置換、脱落、挿入等によって修飾を受けたものであっても、抗原性が本発明の方法の実施に十分な程度備えられていれば使用することができる。
【００１９】
本発明の担体に対する結合能を有するアミノ酸配列を得るためには、例えば、以下に述べるファージディスプレイペプチドライブラリー法を用いることができる。ファージランダムペプチドライブラリーを構築する方法としては、例えばＭ１３系ファージの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結し作製すれば良い。その方法としてはＳｃｏｔｔ　ＪＫ．ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ　ＧＰ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６，１９９０やＣｗｉｒｌａ　ＳＥ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６３７８，１９９０等の報告がある。挿入する遺伝子の大きさはペプチドが安定に発現できれば特に制限はないが、作製したライブラリーがすべてのランダム配列を網羅し、しかも結合能を有するためには６アミノ酸から４０アミノ酸に相当する長さ（分子量約６００から４，０００に相当）が適当で、中でも７アミノ酸から１８アミノ酸が好ましい。
【００２０】
目的の担体に結合するファージを選択するためには、担体をカラムやプレート上等に固定化し、上記のライブラリーを担体に接触させ、結合ファージを残して非結合ファージは洗浄で洗い流す。洗浄後残ったファージを酸等により溶出し、緩衝液で中和したのち、大腸菌に感染させファージを増幅する。この選別を複数回繰り返すと、目的の担体に結合能のある複数のクローンが濃縮される。ここで、単一なクローンを得るため、再度大腸菌に感染させた状態で、培地プレート上にコロニーを作らせる。それぞれの単一コロニーを液体培地で培養したのち、培地上清中に存在するファージをポリエチレングリコール等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。ランダムなアミノ酸配列を有するペプチドライブラリーの作製方法としては、上記のようなファージを用いる方法のほか、化学合成したペプチドを用いることも可能である。その方法として、例えば、ビーズを用いる方法（Ｌａｍ　ＫＳ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８２，１９９１）、液相フォーカシング法（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　ＲＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８４，１９９１）、マイクロプレート法（Ｆｏｄｏｒ　ＳＰＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，７６７，１９９１）等が報告されており、いずれも本発明に供し得る。
【００２１】
ファージディスプレイペプチドライブラリのスクリーニングによって、担体に対して結合能を有するアミノ酸配列が二種類以上得られた場合には、これらのアミノ酸配列の全部または一部を適当な組合わせで直列に繋いだ配列を、担体に対して結合能を有するアミノ酸配列として用いても良い。この際、二種類のアミノ酸配列の間には適当なスペーサー配列を設けることが望ましい。スペーサー配列としては、３アミノ酸から約４００アミノ酸が好ましく、また、スペーサー配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列は、抗原または抗体と測定対象物との間の作用を阻害せず、また、該抗原または該抗体が担体に結合するのを妨害しないものである。
【００２２】
本発明の担体に対する結合能を有するアミノ酸配列は、ランダムペプチドライブラリのスクリーニングによって決定されたアミノ酸配列の他、担体の化学的性質により合理的に設計されたアミノ酸配列とすることもできる。
【００２３】
上記方法により得られた、担体に対する結合能を有するアミノ酸配列は、通常の遺伝子工学的手法を用いて、測定対象物に対する抗原または抗体に融合して利用される。担体に対する結合能を有するアミノ酸配列は、前記の抗原または抗体であるタンパク質またはペプチドのＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現させることができる。また、適当なスペーサー配列を挿入して発現させることもできる。
【００２４】
スペーサー配列としては、３アミノ酸から約４００アミノ酸からなる配列が好ましく、また、スペーサー配列は、いかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペーサー配列が、抗原または抗体と測定対象物との間の作用を妨害せず、また、該抗原または該抗体が担体に結合するのを妨害しないものである。
【００２５】
担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を含む抗原または抗体の分離・精製方法は、上述したように、該抗原または該抗体の活性が保持される方法であれば、いかなる方法をも用いることができる。
【００２６】
測定対象物に対する抗原または抗体を担体に固定する工程は、担体に対して結合能を有するアミノ酸配列を含む前記抗原または前記抗体を、水性媒体中で担体と接触させることにより達成される。
【００２７】
本工程の水性媒体の組成は、特に制限されないが、例えば、各種の緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファー、リン酸カリウムバッファー、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファー、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファー、トリス塩酸バッファー、グリシンバッファー、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファー等が好適に用いられる。緩衝液の濃度は、一般的な濃度、すなわち、５ｍＭから１．０Ｍの範囲で使用することができるが、望ましくは１０〜２００ｍＭで行うことが好ましい。また、ｐＨは５．５から９．０、好ましくは７．０から８．５となるように調製するが、使用する条件によっては、上記範囲以外に条件を設定することも除外されない。
【００２８】
また、水性媒体中での担体の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度であれば、適当な界面活性剤を添加してもよい。このような界面活性剤の例として、オレイン酸ナトリウム，ドデシルスルホン酸ナトリウム，ドデシル硫酸ナトリウム，ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム，コール酸ナトリウム，デオキシコール酸ナトリウム，タウロデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド，ドデシルピリジニウムクロライド等の陽イオン界面活性剤、３−〔（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ），３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ），パルミトイルリゾレシチン，ドデシル−β−アラニン等の両性イオン界面活性剤、オクチルグルコシド，オクチルチオグルコシド，ヘプチルチオグルコシド，デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０），ポリオキシエチレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊ、Ｌｕｂｒｏｌ），ポリオキシエチレン−ｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ），ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｎ），ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（Ｓｐａｎ），ポリオキシエチレンソリビトールエステル（Ｔｗｅｅｎ）等の非イオン界面活性剤等を挙げることが出来る。
【００２９】
また、水性媒体中での粉体状担体の分散状態を保つために、後の工程を妨げない種類及び濃度であれば、適当な補助溶媒を添加してもよい。補助溶媒としては、例えばヘキサン等、直鎖脂肪族炭化水素、またメタノール，エタノール等の１価アルコール類やグリセロール等の多価アルコール類及び脂肪酸エーテル類、カルボン酸エステル類等の誘導体から選ばれる一種または二種以上のものを選択し使用することができる。
【００３０】
前記の抗原または抗体の担体への固定化は、該担体と該抗原または該抗体とを所定の水性媒体中で所定の濃度となるように混合することによって達成される。このとき、抗原または抗体が担体の表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【００３１】
固定化量の測定は、例えば、担体に濃度既知の抗原または抗体溶液を添加し、固定化処理を行った後、溶液中のタンパク質濃度を測定し、差し引き法により固定化量を求める等の方法を用いればよい。
【００３２】
上記方法により作製された固定化抗原または固定化抗体は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。抗原または抗体の固定化処理を行う時間は１分間から２４時間が望ましく、より望ましくは１０分間から１時間である。過剰な静置あるいは放置は抗原または抗体の活性の低下を招くので好ましくない。
【００３３】
本発明において、前記の構成要素と共に、必要に応じて、有機溶剤、顔料、染料、指示薬、界面活性剤、防腐剤、保護剤、無機塩等の添加剤を用いてもよい。
【００３４】
本発明によれば、抗原または抗体を効率的に担体表面に固定することができるので、製造工程が極めて効率的である。
【００３５】
また、担体に顔料などの色材を用いた場合、臨床検査や環境分析、食品分析等に用いたときに、定量性が高いと同時に、目視判定が容易で信頼性が高い測定用試薬となり得る。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は本発明の実施形態の一例であり、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３７】
また、以下の実施例は、担体として顔料を用いているが、顔料に限定されるわけではなく、従来抗原抗体反応に使用される抗原や抗体の担体として公知のものは特に制限なくいずれも使用することができる。
【００３８】
（参考例１）
Ｃ型肝炎ウイルス抗体に対する抗原タンパク質の取得
Ｂ型肝炎ウイルス陰性でＧＰＴ値１００単位以上のヒト血清０．５ｍｌにグアニジウムチオシアネート溶液（４Ｍ　グアニジウムチオシアネート、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　２−メルカプトメタノール、２％ザルコシル、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．６）２．５ｍｌを加え、フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲンをキャリアーとしてエタノール沈澱により血清中の全ＲＮＡを精製した。次に、岡本らの方法（Ｊａｐａｎ　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，６０（３），１６７−１７７，１９９０）に従って、ランダムヘキサマーをプライマーとして得られたＲＮＡのｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ合成システム（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて作製した。このｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ法を行いて、目的のＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１８プラスミド（アマシャムファルマシアバイオテク社製）と連結してクローニングした。プラスミドにクローニングされたＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡの塩基配列を、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅシーケンスキット（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）により決定し得られた塩基配列から、目的とする抗原タンパク質ＮＳ４をコードする遺伝子を含む塩基配列を、常法に従ってプラスミドｐＵＣ１８のＳｍａＩ切断部位に挿入し、プラスミドｐＵＣ１８−ＮＳを構築した。
【００３９】
（実施例１）
銅フタロシアニンに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼銅フタロシアニン（α型、東京化成工業社製）を０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に５ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ　ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の４×１０１０ｐｆｕ相当をチューブに添加し、２５℃で１０分間静置した。
▲３▼チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て沈殿として顔料を回収した。回収した顔料を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し遠心分離を繰返すことによって、顔料をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲４▼１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ　ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて１分間静置した後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、１５μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと３回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
【００４０】
２回目からは、エッペンドルフチューブに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2004069677.tif 000002
【００４２】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読し、ディスプレイしているペプチドのアミノ酸配列を決定することによって、銅フタロシアニンに対して結合能を有するアミノ酸配列を取得した。結果のアミノ酸配列と頻度を表２に示す。
【００４３】
【表２】
2004069677.tif 000003
【００４４】
（実施例２）
カーボンブラックに対する結合能を有するアミノ酸配列の取得
▲１▼カーボンブラック（シグマアルドリッチジャパン社製）を０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に５ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ　ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー＋０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）の４×１０１０ｐｆｕ相当をチューブに添加し、２５℃で１０分間静置した。
▲３▼チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て沈殿として顔料を回収した。回収した顔料を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し遠心分離を繰返すことによって、顔料をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲４▼１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ　ｐＨ２．２、１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加えて１分間静置した後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、１５μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと３回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
【００４５】
２回目からは、エッペンドルフチューブに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表３に示す。
【００４６】
【表３】
2004069677.tif 000004
【００４７】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読することによって、カーボンブラックに対して結合能を有するアミノ酸配列を取得した。結果のアミノ酸配列と頻度を表４に示す。
【００４８】
【表４】
2004069677.tif 000005
【００４９】
（実施例３）
銅フタロシアニンに対する結合能を有する抗原タンパク質の製造
プラスミド参考例１のｐＵＣ１８−ＮＳ中の抗原タンパク質ＮＳ４をコードする塩基配列に対して、上流側プライマー（５’−ＴＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣ−３’）及び下流側プライマー（５’−ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣＧＣＴ−３’）を用いて、プラスミドｐＵＣ１８−ＮＳをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限部位、下流にＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を有する、抗原タンパク質ＮＳ４遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
【００５０】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）の対応する部位に挿入し、ベクターｐＧＥＸ−ＮＳとした。
【００５１】
一方、実施例１の各アミノ酸配列（配列番号：１から配列番号１５）に対して、スペーサー配列ＧＳを介して、抗原タンパク質ＮＳ４のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖合成ＤＮＡとして作製するために、次の表５に挙げる合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【００５２】
【表５】
2004069677.tif 000006
【００５３】
表５に挙げた、それぞれのアミノ酸配列に対する２種の合成ＤＮＡを製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて二種の合成ＤＮＡを等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片を形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【００５４】
プラスミドｐＧＥＸ−ＮＳをＢａｍＨＩ及びＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片のいずれかを挿入した。このベクターを用いて宿主微生物である大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、形質転換体として発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ　５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０　ｍｌで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０　ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加（終濃度　１ｍＭ）し、３７℃で４〜１２時間培養を続けた。
【００５５】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８，０００×ｇ、２分、４℃）し、１／１０量の４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解及びソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製した。
【００５６】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８，０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％　ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース　４０μｌを、無細胞抽出液１ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【００５７】
吸着後、遠心（８，０００×ｇ、１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０ｍＭグルタチオン４０μｌを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着したＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。遠心（８，０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収したのち、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【００５８】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテク社製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオンセファロースに通してＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示すことを確認した。
【００５９】
（実施例４）
カーボンブラックに対する結合能を有する抗原タンパク質の製造
プラスミドｐＵＣ１８−ＮＳ中の抗原タンパク質ＮＳ４をコードする塩基配列に対して、上流側プライマー（５’−ＴＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣ−３’）及び下流側プライマー（５’−ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣＧＣＴ−３’）を用いて、プラスミドｐＵＣ１８−ＮＳをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限部位、下流にＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を有する、抗原タンパク質ＮＳ４遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
【００６０】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）の対応する部位に挿入し、ベクターｐＧＥＸ−ＮＳとした。
【００６１】
一方、実施例２の各アミノ酸配列（配列番号：１６から配列番号４０）に対して、スペーサー配列ＧＳを介して、抗原タンパク質ＮＳ４のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖合成ＤＮＡとして作製するために、次の表６に挙げる合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【００６２】
【表６】
2004069677.tif 000007
【００６３】
表６に挙げた、それぞれのアミノ酸配列に対する２種の合成ＤＮＡを製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。続いて二種の合成ＤＮＡを等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片を形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【００６４】
プラスミドｐＧＥＸ−ＮＳをＢａｍＨＩ及びＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ　５’　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍｌで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加（終濃度
１ｍＭ）し、３７℃で４〜１２時間培養を続けた。
【００６５】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８，０００×ｇ、２分、４度）し、１／１０量の４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解及びソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製した。
【００６６】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８，０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％　ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース４０μｌを、無細胞抽出液１ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【００６７】
吸着後、遠心（８，０００×ｇ、１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０ｍＭグルタチオン４０μｌを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着したＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。遠心（８，０００×ｇ、２分、４度）して上清を回収したのち、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【００６８】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテク社製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオンセファロースに通してＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示すことを確認した。
【００６９】
（実施例５）
銅フタロシアニンに対する結合能を有する抗原タンパク質の製造
銅フタロシアニンに対する結合能を有する二種類のアミノ酸配列、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（配列番号：１）及びＰｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：２）の全部を、スペーサー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してこの順番に直列に繋いだ配列、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ（配列番号：４１）を、さらにスペーサー配列ＧＳを介して、抗原タンパク質ＮＳ４のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド、５’−ＧＡＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＡＴＡＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＣＧＡＡＣＣＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＧＴＧＣＧＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴ−３’及び５’−ＣＴＴＣＣＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＧＧＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＧＧＣＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＧ−３’をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した後、等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例３と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ−ＮＳのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し発現用菌株を得た。実施例３と同様にして、配列番号４１のアミノ酸配列をＮ末端に融合した発現タンパク質を精製した。
【００７０】
（実施例６）
カーボンブラックに対する結合能を有する抗原タンパク質の製造
カーボンブラックに対する結合能を有する二種類のアミノ酸配列、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１６）及びＡｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１７）の全部を、スペーサー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してこの順番に直列に繋いだ配列、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：４２）を、さらにスペーサー配列ＧＳを介して、抗原タンパク質ＮＳ４のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド、５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴ−３’及び５’−ＣＣＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧ−３’をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した後、等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例４と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ−ＮＳのＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し発現用菌株を得た。実施例４と同様にして、配列番号４２のアミノ酸配列をＮ末端に融合した発現タンパク質を精製した。
【００７１】
（比較例１）
抗原タンパク質の製造
プラスミドｐＵＣ１８−ＮＳ中の抗原タンパク質ＮＳ４をコードする塩基配列に対して、上流側プライマー（５’−ＴＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＣＡＣ−３’）及び下流側プライマー（５’−ＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＡＣＴＡＧＴＡＧＴＣＧＣＴ−３’）を用いて、プラスミドｐＵＣ１８−ＮＳをテンプレートとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ及びＳａｃＩ制限部位、下流にＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位を有する、抗原タンパク質ＮＳ４遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。
【００７２】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）の対応する部位に挿入した。このベクターｐＧＥＸ−ＮＳを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。
【００７３】
得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍｌで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加（終濃度　１ｍＭ）し、３７℃で４〜１２時間培養を続けた。
【００７４】
ＩＰＴＧ誘導した大腸菌を集菌（８，０００×ｇ、２分、４度）し、１／１０量の４℃　ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解及びソニケーションにより菌体を破砕し、遠心（８，０００×ｇ、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ　ｂｅａｄｓ：アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製した。
【００７５】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８，０００×ｇ、１分、４℃）した後、４％　ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース４０μｌを、無細胞抽出液１ｍｌに添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロースに吸着させた。
【００７６】
吸着後、遠心（８，０００×ｇ、１分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０　ｍＭグルタチオン４０μｌを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着したＧＳＴ融合タンパク質を溶出した。遠心（８，０００×ｇ、２分、４度）して上清を回収したのち、ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【００７７】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシアバイオテク社製、５Ｕ）で消化した後、グルタチオンセファロースに通してＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりシングルバンドを示すことを確認した。
【００７８】
（実施例７）
抗原タンパク質の銅フタロシアニン粒子への固定化
銅フタロシアニン粒子を、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン（Ｒ）製遠沈管にとり、ここに、実施例３で調製した融合タンパク質、または比較例１で調整したタンパク質５０μｇを加え、室温で３０分間振盪した。遠心分離操作（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によって銅フタロシアニン粒子を沈殿として回収し、該銅フタロシアニン粒子に結合しなかった酵素を含む上清と分離した。該銅フタロシアニン粒子を再び０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、銅フタロシアニン粒子を洗浄した。洗浄した銅フタロシアニン粒子の懸濁液のタンパク質濃度をマイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。測定結果を表７に示す。
【００７９】
【表７】
2004069677.tif 000008
【００８０】
比較例１のタンパク質を用いた場合に比べて、銅フタロシアニン結合配列を融合した実施例３及び実施例５の融合タンパク質を用いた場合の方が、タンパク質濃度が高く、抗原タンパク質を有効に顔料表面に固定できることが確かめられた。
【００８１】
（実施例８）
抗原タンパク質のカーボンブラック粒子への固定化
カーボンブラック粒子を、０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン（Ｒ）製遠沈管にとり、ここに、実施例６で調製した融合タンパク質、または比較例１で調整したタンパク質５０μｇを加え、室温で３０分間振盪した。遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によってカーボンブラック粒子を沈殿として回収し、該カーボンブラック粒子に結合しなかった酵素を含む上清と分離した。該カーボンブラック粒子を再び０．１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、カーボンブラック粒子を洗浄した。洗浄したカーボンブラック粒子の懸濁液のタンパク質濃度をマイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。測定結果を表８に示す。
【００８２】
【表８】
2004069677.tif 000009
【００８３】
比較例１のタンパク質を用いた場合に比べて、カーボンブラック結合配列を融合した実施例４及び実施例６の融合タンパク質を用いた場合の方が、タンパク質濃度が高く、抗原タンパク質を有効に顔料表面に固定できることが確かめられた。
【００８４】
（実施例９）
免疫凝集法によるＣ型肝炎ウイルス抗体の測定
０．１　Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１．０％　ウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチジャパン社製）、０．０５％　ＮａＮ３からなるブロッキング用バッファー１０ｍｌに、実施例８から実施例１１で製造した、融合タンパク質を固定した顔料粒子を懸濁し、遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）によって該顔料粒子を回収する操作を３回繰返して洗浄し、これを４ｍｌのブロッキング用バッファーに懸濁した。
【００８５】
上記のように調製した測定用試薬と、市販の免疫凝集法を用いた診断薬（オーソ　ＨＣＶ　Ａｂ　ＰＡＩＩ、オーソ・ダイアグノスティック・システムズ社製、以下「市販品」という）との比較を、Ｃ型肝炎ウイルス抗体陽性患者の血清を用いて行った。試験方法は前記市販品のマニュアルに従った。その結果を表９及び表１０に示す。
【００８６】
【表９】
2004069677.tif 000010
【００８７】
【表１０】
2004069677.tif 000011
【００８８】
表９及び表１０の結果から、本発明の測定用試薬は、市販品と同等以上の感度を有していることがわかった。さらに、本発明の測定用試薬は、不溶性担体が顔料のため色調を帯びており、目視判定が極めて容易であった。
【００８９】
なお、上記の実施例では、目視にて測定を行っているが、ＣＣＤなどの視覚的画像認識手段を用いて凝集状態を測定してもよい。この場合は、担体に色材を用いなくとも、凝集状態の測定を行うことができる。
【００９０】
【発明の効果】
本発明によれば、抗原または抗体を効率的に担体の表面に固定することができるので、製造工程が極めて効率的である。
【００９１】
2004069677.tif 000012
2004069677.tif 000013
2004069677.tif 000014
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