(57)【要約】【課題】  新規の間葉性骨格前駆細胞マーカーを提供すること。【解決手段】  本発明は、間葉性骨格前駆細胞についての新規なマーカーとしての線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）に関する。この新規なマーカーを利用することにより、組織内において間葉性骨格前駆細胞を同定しそして位置付けすること、ならびにこのような細胞の実質的に純粋な培養物を得ることが可能になった。間葉性骨格前駆細胞の純粋な培養物は、必要に応じて、エキソビボでの様々な操作の後、骨および／または軟骨の修復の目的のための薬学的組成物中または移植物中の活性成分として使用され得る。ＦＧＦＲ３はまた、軟骨および骨由来の腫瘍の同定および位置付けのためのマーカーとして使用され得る。ＦＧＦＲ３に結合し得る因子もまた、軟骨および骨由来の腫瘍に対して細胞傷害性因子を標的化するために使用され得る。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織またはサンプル内の軟骨−骨腫瘍を検出する方法であって、
（ｉ）アッセイされた組織またはサンプルをＦＧＦＲ３結合因子と接触させる工程；
（ｉｉ）該ＦＧＦＲ３結合因子が結合する細胞の存在を検出する工程を包含し、陽性の検出が、該アッセイされた組織またはサンプル内の軟骨−骨腫瘍の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記軟骨−骨腫瘍が、外骨症および骨増殖体からなる群より選択される、良性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
軟骨−骨腫瘍の処置のための薬学的組成物
（ｉ）薬学的に受容可能なキャリア、および
（ｉｉ）活性成分として、細胞傷害性部分に結合したＦＧＦＲ３結合因子、
を含む、組成物。
【請求項４】
前記ＦＧＦＲ３結合因子がＦＧＦ９である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ＦＧＦＲ３結合因子がＦＧＦＲ３に対する抗体である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
軟骨−骨腫瘍細胞を特異的に破壊するための方法であって、治療有効量の細胞傷害性部分に結合したＦＧＦＲ３結合因子を、そのような処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記ＦＧＦＲ３結合因子がＦＧＦ９である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＦＧＦＲ３結合因子がＦＧＦＲ３に対する抗体である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面上に線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）を特徴として有する細胞の同定により間葉性骨格前駆細胞を同定するための方法に関する。
【０００２】
本発明はさらに、ＦＧＦＲ３結合因子を利用することにより、間葉性骨格前駆細胞を得るための方法に関する。本発明はなおさらに、間葉性骨格前駆細胞の実質的に純粋な培養物、並びにこの間葉性骨格前駆細胞を含む薬学的組成物および移植物に関する。
【０００３】
別の局面によると、本発明は、軟骨−骨腫瘍の同定方法および軟骨−骨腫瘍の処置のための薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
骨格の成長は、組織細胞エレメント（軟骨細胞）、および長骨の軟骨成長中心におけるその細胞膜レセプターの適切な機能、並びに循環しているホルモンおよび局所のホルモンおよび増殖因子の、正常性およびレベルの両方に依存する。そのため、発育不全は２つの異なるカテゴリー、（ａ）循環因子における不全、および（ｂ）標的軟骨組織における不全に分類される。
【０００５】
正常な分化過程は、間葉性幹細胞から始まり、間葉性幹細胞は、骨前駆細胞に分化し、これは前軟骨幹細胞に分化して最終的に軟骨を形成し得るか、または前骨形成性幹細胞に分化して最終的に骨を形成し得る。
【０００６】
成長を支持する間葉性幹細胞、並びに正常および発育不全のファミリーにおける移動経路を追跡しようとする試みにおいて、これらの特定の間葉性幹細胞用の適切なマーカーの欠如を含む困難が存在する。例えば、長手方向および横方向の成長を支持する増殖板幹細胞の本来の位置および移動の経路に関して、部分的で不完全な情報は入手可能である。「Ｒａｎｖｉｅｒ対Ｌａ  Ｃｒｏ２ｉｘ」と呼ばれ得る、１００年以上もの間に亘って長く続いている議論は今も続いている。１８８９年に、Ｒａｎｖｉｅｒは、「骨膜骨を形成する細胞は、増殖板の細胞から派生する。」と述べ、１９５１年にＬａ  Ｃｒｏｉｘは、「並列的成長は、軟骨膜周縁の細胞から起こる。」と述べた。Ｒａｎｖｉｅｒの理論は、７０年代初頭にＲｉｇａｌ、Ｈｅｒｔ，Ｊ．（Ａｃｔａ  Ａｎａｔ（Ｂａｚｅｌ）８２：４２０−４３６（１９７２））らによって支持を得、そして９０年代には、Ｌａｎｇｅｎｓｋｉｏｌｄら（Ａｃｔａ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．，６４：６８３−６８７（１９９３））によって支持を得た。このことは、胚層からの細胞が骨溝の境界線に移動して、長手方向と横方向の両方の骨成長の両方の供給源として作用することを示唆している。
【０００７】
しかし、軟骨細胞および間葉の分化をもたらす因子の様々なタイプの完全な理解は、これらの細胞の主要な貯蔵部の本来の位置を位置付けることができないこと、およびそのことによるインビトロでの細胞培養の限界によって妨害されてきた。１つの困難なことは、連続する分化現象に続く特定の表現型マーカーの欠如である。ＩＩ型コラーゲン分泌は、軟骨細胞分化の主要な初期のマーカーであると考えられる一方で、アルカリ性ホスファターゼの合成は、骨芽細胞分化の初期のマーカーである。成熟した骨芽細胞はまた、オステオポンチン、オステオネクチン、およびオステオカルシンを産生し、これら３つの細胞外基質タンパク質はＩ型コラーゲンと共に沈着して無機化した骨基質になる。不運にも、わずかの分化マーカーしか同定されておらず、そしてこれらのうちのいくつか（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、オステオポンチン、およびオステオネクチン）は、骨形成性分化に対して特異的ではない。他方、オステオカルシンのような他のものは、インビトロでは稀にしか発現しない。さらに、間葉細胞株、並びに分化している軟骨細胞および骨芽細胞の初代培養物は、可変表現型を示し、そしてしばしば異なる分化段階での細胞型の混合物である（Ｅｒｉｅｂａｃｈｅｒ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ８０：３７１−３７８（１９９５）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｐ．およびＲｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ５：４８５−４９１（１９９５））。
【０００８】
従って、長手方向および横方向の両方の成長を支持しそしてこれに貢献する幹細胞の部位および供給源を正確に位置付け得るマーカーであって、正常な状態および病的状態における間葉発達のメカニズムをよりよく理解するため、および治療目的のために間葉性骨格前駆細胞の実質的に純粋な培養物を得る目的の両方のための、骨修復に対するマーカーを開発することが非常に望まれてきた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）が間葉性骨格前駆細胞についてのマーカーとして作用するという驚くべき発見に基づく。本発明はさらに、間葉性骨格前駆細胞の解剖学的位置がＬａ  Ｃｒｏｉｘ溝内の軟骨膜内にあるという驚くべき発見に基づく。
【００１０】
用語「間葉性骨格前駆細胞」は、以下の型の細胞を示すために以下に用いられる。（ａ）骨格前駆細胞に分化し得る間葉性幹細胞、（ｂ）骨格前駆細胞、（ｃ）前軟骨幹細胞、および（ｄ）前骨形成性幹細胞、または上記の細胞型の２つ以上の組み合わせ。間葉性骨格前駆細胞はすべて、骨および／または軟骨の成長に寄与するという特性を共有し、他のタイプの軟骨および骨由来の細胞に比べて向上した増殖性、並びに線維芽増殖因子９のような適切な走化性因子の存在下で移動する傾向も示す。
【００１１】
これらの間葉性骨格前駆細胞は、胚および新生個体の生命の初期段階において、関節および骨端軟骨成長（板軟骨）の両方の成長を支持する。しかし、生命の非常に初期の段階（生後２〜３ヶ月）で、関節領域へのこれらの幹細胞の連結は破壊され、このことが関節軟骨の貧弱な自己創傷治癒につながる。このような間葉性骨格前駆細胞は、骨端軟骨の閉塞まで（１８〜２２歳での）、長骨の長手方向および横断方向（横方向）の成長のための細胞供給源を維持し続け、そして一生を通じて骨折の仮骨に関連する骨膜の幹細胞貯蔵部を供給し続ける。成体の生命において、特に老年の場合、増殖する軟骨細胞を確立する可能性を有する未分化の細胞供給源を追跡する技術は、このような細胞供給源の不足のため、およびこのような未分化細胞についてのマーカーが不適切であるために、これまで失敗している。
【００１２】
本発明が基づく発見、すなわち、ＦＧＦＲ３は間葉性骨格前駆細胞についてのマーカーであることを用いることにより、表面上にＦＧＦＲ３を特徴として有するこれらの細胞を同定することにより間葉性骨格前駆細胞を同定する方法を開発することが可能であった。このような方法は、例えばＦＧＦＲ３レセプターが関連する成長の停止の病的状態をよりよく理解するために、間葉性骨格前駆細胞を追跡するために重要であり得る。これらは、例えば、遺伝的軟骨無形成性小人症、または複数の遺伝性外骨症における持続的発現、および主要な変形性関節炎の骨増殖体における再発現を導く。
【００１３】
従って、本発明は、間葉性骨格前駆細胞を同定するための方法であって、
（ａ）リガンド−レセプター結合を可能にする条件下で、線維芽細胞増殖因子レセプター３（ＦＧＦＲ３）結合因子を、アッセイされる細胞または組織に適用する工程；
（ｂ）どの細胞がこのＦＧＦＲ３結合因子に結合しているかを決定する工程を包含し、ここで、この細胞は、間葉性骨格前駆細胞である、方法を提供する。
【００１４】
抗体または線維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ９）であり得るＦＧＦＲ３結合因子は、標識されて、そしてアッセイされる組織（例えば関節の組織）に適用されるべきである。標識されたこれらの領域は、間葉性骨格前駆細胞の供給源として作用する。
【００１５】
好ましくは、間葉性骨格前駆細胞の供給源は、Ｌａ  Ｃｒｏｉｘの領域での軟骨膜であり、そして滑膜および骨膜に接する領域である。
【００１６】
様々な目的のため（例えば、間葉性骨格前駆細胞の培養物を得、これらをインビトロで増殖させ、次いで軟骨および骨の成長を促進するためにこれらを体内に再導入するという目的のために）、本発明の方法を使用して関節のような様々な組織内の間葉性骨格前駆細胞を同定しそして位置付け得る。あるいは、これらの細胞を同定することにより、未分化の間葉性骨格前駆細胞の過度の活性を特徴とする様々な疾患および異常におけるこのような幹細胞の過剰な活性を排除するために、組織部位からこれらの細胞を除去することが可能になる。さらに、ＦＧＦＲ３を有する細胞の領域を位置づけることにより、様々な調節因子をこれらの細胞の正確な位置に投与することによって、インサイチュでこのような細胞を操作することが可能である。このような因子は、ＦＧＦＲ３を安定化し、それにより、これらの細胞の未分化に増殖する状態をより長期間維持する能力を有する因子であり得る。その一例がＦＧＦ９である。あるいは、因子は、ＦＧＦＲ３を有する細胞の未熟な分化を引き起こし得、その一例がＦＧＦ９アンタゴニストである。
【００１７】
ＦＧＦＲ３が間葉性骨格前駆細胞のマーカーであるという事実を用いることにより、胚でない供給源からのこのような細胞の実質的に純粋な培養物を得ることが初めて可能になった。本発明の方法によると、ＦＧＦＲ３をマーカーとして用いることにより、間葉性骨格前駆細胞が、成長板の周縁に存在する軟骨膜リング（Ｌａ  Ｃｒｏｉｘ領域）内に位置付けられた。老年期における関節軟骨の自己創傷治癒が貧弱であることは、軟骨膜Ｌａ  Ｃｒｏｉｘ領域での潜在的幹細胞の供給源から関節領域が切断されることに基づいて説明され得る。このことは、成長の休止で起こる。
【００１８】
従って、本発明は、間葉性骨格前駆細胞の局在化のみならず、大量のこのような細胞の実質的に純粋な培養物を初めて得ることも可能にする。用語「実質的に純粋な培養物」は、本質的に、上記で定義した用語「間葉性骨格前駆細胞」にカバーされる４つの細胞型のうちの１つ以上を含む培養物を意味する。
【００１９】
従って、本発明は、以下に説明するように、様々な供給源から大量の間葉性骨格前駆細胞を得るための方法に関する。間葉性骨格前駆細胞は、ＦＧＦＲ３に対する特異的な抗体か、またはＦＧＦ９リガンドのようなこのレセプターに対する特異的リガンドのいずれかを用いることにより、同定され、そして供給源中の他の細胞から分離され得る。
【００２０】
間葉性骨格前駆細胞の実質的に純粋な培養物を得る方法は、
（ｃ）ＦＧＦＲ３結合因子を、間葉性骨格前駆細胞を含む細胞供給源に適用する工程、
（ｄ）ＦＧＦＲ３を結合する細胞のみを、この供給源から分離する工程を包含し、ここで、この細胞は間葉性骨格前駆細胞の実質的に純粋な培養物を提供する。
【００２１】
分離は、外科的に、例えば、ＦＧＦＲ３標識した結合因子に結合された領域のみをメスで取り上げることにより行われ得るか、または、特定の標識（ＦＧＦＲ３結合因子）を有する個々の細胞を、供給源内の標識されていない細胞の集団から分離し得る様々な細胞分離システムを利用することにより行われ得る。
【００２２】
このような間葉性骨格前駆細胞を得るための適切な供給源は、関節鏡検査または骨髄バイオプシーから入手可能な自己供給源である。バイオプシー供給源は、増殖していない軟骨細胞または脱分化した線維芽細胞様の細胞であり得る。細胞供給源はまた、軟骨膜、滑膜、もしくは骨膜の領域、またはこれらの領域が接する位置から得られ得る。これらの細胞は組織内においてまれであるので、特定のマーカーを利用するだけで、間葉性骨格前駆細胞をこれらの供給源から単離することが可能である。あるいは、細胞供給源はまた、胚性であり得る。
【００２３】
これらの供給源から得られた間葉性骨格前駆細胞は、適切な増殖因子およびヘパリンの存在下でエキソビボで増殖するように誘導され得る。次いで、軟骨細胞の生存能力を維持するに適した培地中の薬学的組成物という形態で体内に再導入され得るか、あるいは、移植物の形態で所望の部位に導入され得る。後者の場合、間葉性骨格前駆細胞は増殖を許容する接着性の環境（ｇｒｏｗｔｈ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｇｌｕｅｙ  ｍｉｌｉｅｕ）内に存在する。薬学的組成物および移植物の両方がまた、これらの間葉性骨格前駆細胞上に存在するＦＧＦＲ３の活性を刺激するために、適切な線維芽細胞増殖因子、好ましくは線維芽細胞増殖因子９を含むことが好ましい。
【００２４】
本発明の薬学的組成物または移植物は、欠陥関節軟骨の修復および再生の目的のため、軟骨形成不全患者の処置のため、他の発育不全に罹患している患者の処置のため、および軟骨および骨の成長速度が貧弱であると予測される物理的障害の処置のために用いられ得る。本発明の薬学的組成物または移植物は、成長速度を向上させるため、および／または未熟な分化を防止するために成長板内の成長の速度を操作するための介入として用いられ得るか、あるいは、脊柱障害の治癒を促進するために微細な（ｆｉｎｅ）椎骨の髄核に直接注入するために用いられ得る。所望であれば、自己の間葉性骨格前駆細胞は、分子工学により、所望の部位に導入する前に所望の形質を発現するようにエキソビボで改変され得る。遺伝子操作の例は、変異欠損レセプターを置換するための野生型ＦＧＦＲ３の過剰発現、または、例えば様々なタイプの腫瘍などの場合に野生型レセプターの活性を抑制するためのドミナントネガティブ変異ＦＧＦＲ３の発現を指向する遺伝子操作である。
【００２５】
実際、本発明の方法は、通常、ヒアルロン酸ベースの粘性の増殖を許容する環境内に間葉性骨格前駆細胞を包埋する工程、混成の半固体移植物を形成する工程を包含する。移植物は、開放性の関節手術下かまたは関節鏡検査デバイスによるかのいずれかによって、成長の標的部位、例えば関節病変部位に移され、関節表面までの損傷の管腔を充填する。スプレーデバイスにより薄い浸透膜が形成されて、欠損を閉鎖しそして移植物の本来の位置における定着および維持を保証する。
【００２６】
別の局面によると、本発明は、ＦＧＦＲ３がまた例えば、良性腫瘍（例えば、外骨症および骨増殖体など）軟骨−骨腫瘍上に存在し、従って、このような腫瘍の存在のインジケーターならびにこのような腫瘍の正確な位置付けのためのマーカーの両方として作用し得るという発見に基づく。そのため、本発明はさらに、組織またはサンプル中の軟骨−骨腫瘍を検出するための方法であって、
（ｉ）アッセイされる組織またはサンプルをＦＧＦＲ３結合因子と接触させる工程；
（ｉｉ）ＦＧＦＲ３結合因子が結合する細胞の存在を検出する工程であって、陽性の検出が、そのアッセイされた組織またはサンプル中の軟骨−骨腫瘍の存在を示す工程を包含する、方法を包含する。
【００２７】
検出は、ＦＧＦＲ３に対する適切な標識抗体を用いることにより、またはＦＧＦ９のようなのＦＧＦＲ３に対する特異的な標識リガンドの使用により、行われ得る。この標識したＦＧＦＲ３結合因子をインビボで組織に適用することにより、腫瘍が組織内に存在するか否かを決定するだけでなく、腫瘍を正確に位置付けすることが可能になる。このことは、腫瘍の外科的除去を補助し得る。
【００２８】
ＦＧＦＲ３が軟骨−骨腫瘍細胞上に存在するという事実はまた、適切な細胞傷害性部分を、ＦＧＦ９のようなＦＧＦＲ３に特異的なリガンド、またはＦＧＦ９に対して特異的な抗体に結合させることにより、特に腫瘍部位に特異的に細胞傷害性の因子を標的化するために作用し得る。従って、本発明はさらに、細胞傷害性部分に結合したＦＧＦＲ３結合因子を含む軟骨−骨腫瘍の処置のための薬学的組成物、および、細胞傷害性部分に結合した治療有効量のＦＧＦＲ３を被験体に投与することによりこのような腫瘍を処置する方法に関する。
【００２９】
細胞傷害性因子は、当該分野で周知であり、この用語は、本発明の文脈において、軟骨および骨由来腫瘍細胞を破壊し得る全ての因子を示す。上記因子の例は、例えば、メトトレキセート、ドキソムビシン（ｄｏｘｏｍｂｉｃｉｎ）、シクロホスファミドなどである。
【００３０】
癌の処置はまた、ＦＧＦＲ３を有する細胞の分化を誘導することによっても行われ得る。これは、例えば、ＦＧＦＲ３分化誘導性因子を、ＦＧＦＲ３結合因子によって標識された領域に導入することによって行われ得る。分化誘導性因子の例は、ＦＧＦ９アンタゴニストまたはＦＧＦ９に対する抗体である。
【００３１】
処置はまた、野生型ＦＧＦＲ３の活性を減弱するドミナントネガティブの検出用の（ｄｅｔｅｔｉｖｅ）ＦＧＦＲ３の腫瘍への導入（例えば、遺伝子工学により）により行われ得る。
【００３２】
以下に、いくつかの限定しない図面および実施例に照らして本発明を説明する。
【実施例】
【００３３】
（材料および方法）
（ａ）初代軟骨細胞培養：
長骨（大腿骨および脛骨）の骨端を、１１日齢のひな胚から得た。切除後、組織セグメントを、Ｔｙｒｏｄ溶液中のトリプシンで処理し、遊離細胞の懸濁液が得られるまで機械的に粉砕した。次いで細胞を高濃度（５×１０６）でプレーティングした。
（ｂ）初代軟骨細胞培養物のＰＣＲスクリーニング：
コンフルエントに達すると、細胞を収集してＲＮＡ精製キット（３試薬）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，  Ｏｈｉｏ）により溶解した。細胞由来のＲＮＡをフェノール抽出し、イソプロパノール沈殿させ、水中で再懸濁し、そしてその光学密度を測定することによりアッセイした。クリーンなＲＮＡ（Ｏ．Ｄ．２６０／２８０  ｎｍ＞１．５）を得た後、逆転写酵素反応を用いてｃＤＮＡを生成し、そして線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）についてスクリーニングした。ＦＧＦＲ３とＦＧＦ９との両方についてオリゴヌクレオチドペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いた。変性を９４℃で行い、５２−６５℃でアニーリングし、７２℃で伸長させ、これを３５サイクル繰り返した。
（ｃ）ＦＧＦ９の放射標識：
組換えマウスＦＧＦ９を、上述したように（Ｈｅｃｈｔ，Ｄら、Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  １２、２２３−２３３（１９９５））調製し、クロラミン−Ｔ法を用いてＮａ１２５Ｉ（０．５ｍＣｉ）で標識し、ヘパリン−セファロースカラム上の遊離ヨウ素から分離した。比活性の範囲は、０．５〜２×１０５  ｃｐｍ／ｎｇであった。
（ｄ）免疫組織化学：
脱灰した骨を、ホルマリンおよびピクリン酸により固定した後、液体パラフィン中に包埋した。パラフィンブロックを切断し、標準的なプロトコルを用いて免疫組織化学のために調製した。抗ＦＧＦＲ３抗体の力価を上昇させながらスライドを染色した。
（ｅ）インサイチュハイブリダイゼーション：
Ｔ７（アンチセンスプローブ）およびＴ３（センスプローブ）を、Ｓ−３５標識したウリジン残基を用いて、プラスミド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）を含む組換えＦＧＦ９およびＦＧＦＲ３から作製した。受胎後１０．５〜１８．５日齢のマウス胚をパラホルムアルデヒド中で固定し、エタノールの濃度を上昇させながら脱水し、液体パラフィン中に包埋した。切片を切断し、そして標準的な方法を用いて調製し、そして適切なＲＮＡプローブとハイブリダイズした。
【００３４】
（実施例１：ＦＧＦＲ３に対する抗体による組織化学的染色）
図１に見られるように、ＦＧＦＲ３に対する抗体で染色された領域は、受け入れた軟骨染色であるマッソンの三色染色で染色された領域に一致しなかった。これらの発見は、ＦＧＦＲ３を有する細胞は軟骨内自体には位置しないが、むしろＬａ  Ｃｒｏｉｘ溝として知られている領域内の軟骨膜内に位置することを示している。
【００３５】
（実施例２：青年期ラットのＬａ  Ｃｒｏｉｘのリングのストリッピング）
３つのグループの各グループには１０匹のラットが含まれていた。グループ１は、対照群（ＣＮＴＬ）として供した。ラットには麻酔をかけたが、手術は行わなかった。グループ２（ＳＨＡＭ）は、見かけの手術グループとして供し、麻酔をかけて軟組織を切除して軟骨膜を曝露した。グループ３（ＳＴＲＩＰ）は、ループ拡大下で骨端軟骨を取り囲む軟骨膜リングをストリップした。ループ拡大は、骨端軟骨自体にいかなる損傷も与えることなく軟組織のみを切除することを可能にした。４週間後、ラットの平均の大腿骨の長さを測定した。結果を図３に示す。反対側の足（ｃｏｎｔｒａ−ｌａｔｅｒａｌ）は、手術における長さにおいて、対照の足と同様であった（データは示さない）。見かけの手術を行った足は、統計学的に有意なレベルに達しない程度に足の長さが増加する傾向を示した。これらのストリップされた足は、足の成長の停止を示した。これらの結果は、ＦＧＦＲ３抗体で染色された領域を除去することにより足の長さが停止することを示し、このことは、このような領域が正常な成長に関与することを示す。
【００３６】
（実施例３：Ｌａ  Ｃｒｏｉｘのリングから得られた細胞のインビトロでの増殖）
上記のラットから取り出した、Ｌａ  Ｃｒｏｉｘ領域由来の軟骨膜組織を、培養ディッシュ内の適切な成長培地中に置き、そしてコロニー形成までの期間を決定した。比較として、遠位大腿骨（関節軟骨、骨端（骨）、骨端軟骨（軟骨））の様々な位置から得た組織を同一条件下で培養し、そしてまたコロニー形成までの期間を決定した。
【００３７】
図４に見られるように、軟骨膜から取り出した組織は、培養約３日後に細胞コロニーを急速に形成する能力を示したが、一方、他の領域から取り出した組織は、移植から１０日以上後になって初めて培養物を生成した。これらの結果は再び、ＦＧＦＲ３抗体で染色した領域から得られた細胞は、ＦＧＦＲ３を特徴として有しない、骨の他の領域から得られた細胞よりもより急速に成長するということを示す。
【００３８】
（実施例４：外骨症におけるＦＧＦＲ３の存在）
ＦＧＦＲ３に対する抗体を、外骨症良性腫瘍から得た組織に適用した。抗体は線維性の組織中の細胞を染色し、そして本質的に軟骨の細胞を染色しなかった（データは示さない）。これらの発見は、ＦＧＦＲ３が、軟骨−骨由来の良性腫瘍（外骨症）内に存在し、その結果、ＦＧＦＲ３結合因子（抗体のような）をこのような腫瘍を同定しかつそれに結合した細胞傷害性因子を標的化するために使用し得ることを示す。この発見はまた、ＦＧＦＲ３の消滅を引き起こし、従って分化を導く因子（例えばＦＧＦ９のアンタゴニスト）による、このような腫瘍の処置を導く。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】ＦＧＦＲ３に対する抗体によるモルモットの骨端部の組織学的染色。顕微鏡写真１〜５は、若齢の成体モルモットの骨端断面を示す。
【００４０】
１．コラーゲンおよびプロトグリカン（ｐｒｏｔｏｇｌｙｃａｎ）などの結合組織エレメントについて特異的な染色である、マッソン三色染色（倍率：×６）の組織学的色素で染色された矢状断面。
【００４１】
２．ＦＧＦＲ３に対する抗体での免疫組織化学的染色により染色された矢状断面（×４００）。３、４および５。軸方向断面。
【００４２】
３．ＦＧＦＲ３抗体因子についての免疫組織化学的染色（×１００）。
【００４３】
４．マッソン三色染色（×２５）、および
５．ＦＧＦＲ３抗体因子についての免疫組織化学的染色（×４００）。
【図１−２】ＦＧＦＲ３に対する抗体によるモルモットの骨端部の組織学的染色。顕微鏡写真１〜５は、若齢の成体モルモットの骨端断面を示す。
【００４４】
１．コラーゲンおよびプロトグリカン（ｐｒｏｔｏｇｌｙｃａｎ）などの結合組織エレメントについて特異的な染色である、マッソン三色染色（倍率：×６）の組織学的色素で染色された矢状断面。
【００４５】
２．ＦＧＦＲ３に対する抗体での免疫組織化学的染色により染色された矢状断面（×４００）。３、４および５。軸方向断面。
【００４６】
３．ＦＧＦＲ３抗体因子についての免疫組織化学的染色（×１００）。
【００４７】
４．マッソン三色染色（×２５）、および
５．ＦＧＦＲ３抗体因子についての免疫組織化学的染色（×４００）。
【図１−３】ＦＧＦＲ３に対する抗体によるモルモットの骨端部の組織学的染色。顕微鏡写真１〜５は、若齢の成体モルモットの骨端断面を示す。
【００４８】
１．コラーゲンおよびプロトグリカン（ｐｒｏｔｏｇｌｙｃａｎ）などの結合組織エレメントについて特異的な染色である、マッソン三色染色（倍率：×６）の組織学的色素で染色された矢状断面。
【００４９】
２．ＦＧＦＲ３に対する抗体での免疫組織化学的染色により染色された矢状断面（×４００）。３、４および５。軸方向断面。
【００５０】
３．ＦＧＦＲ３抗体因子についての免疫組織化学的染色（×１００）。
【００５１】
４．マッソン三色染色（×２５）、および
５．ＦＧＦＲ３抗体因子についての免疫組織化学的染色（×４００）。
【図２−１】図２−１は、１７日齢のひな胚の長骨の骨端の矢状断面を示す顕微鏡写真６〜１１からなる。
【００５２】
顕微鏡写真６、１０および１１は、ＦＧＦＲ３に対する抗体での免疫組織化学的染色により染色されており、そして８は、プロトグリカンに特異的なアルシアンブルー（ｐＨ２．５）により染色されている。（特定の領域で染色が欠如していることに留意されたい。）
顕微鏡写真の倍率は以下の通りである：６（×２５）；７（×４０）；９（×１００）；１０（×４００）；および１１（×１００）。
【００５３】
７および９は、マッソン三色染色により染色されている。
【図２−２】図２−２は、１７日齢のひな胚の長骨の骨端の矢状断面を示す顕微鏡写真６〜１１からなる。
【００５４】
顕微鏡写真６、１０および１１は、ＦＧＦＲ３に対する抗体での免疫組織化学的染色により染色されており、そして８は、プロトグリカンに特異的なアルシアンブルー（ｐＨ２．５）により染色されている。（特定の領域で染色が欠如していることに留意されたい。）
顕微鏡写真の倍率は以下の通りである：６（×２５）；７（×４０）；９（×１００）；１０（×４００）；および１１（×１００）。
【００５５】
７および９は、マッソン三色染色により染色されている。
【図２−３】図２−３は、１７日齢のひな胚の長骨の骨端の矢状断面を示す顕微鏡写真６〜１１からなる。
【００５６】
顕微鏡写真６、１０および１１は、ＦＧＦＲ３に対する抗体での免疫組織化学的染色により染色されており、そして８は、プロトグリカンに特異的なアルシアンブルー（ｐＨ２．５）により染色されている。（特定の領域で染色が欠如していることに留意されたい。）
顕微鏡写真の倍率は以下の通りである：６（×２５）；７（×４０）；９（×１００）；１０（×４００）；および１１（×１００）。
【００５７】
７および９は、マッソン三色染色により染色されている。
【図３】図３は、骨端軟骨を取り囲む前軟骨リングが除去された青年期ラット（ＳＴＲＩＰ）；上記の除去なしに軟骨膜を曝露したラット（ＳＨＡＭ）；およびいずれの操作にも供されなかったラット（ＣＮＴＬ）体内の大腿骨成長を示す。
【図４】図４は、インビトロで増殖させ、関節軟骨、骨端、骨端軟骨、および軟骨膜から得られた細胞のコロニー形成までの日数を示す。
【図１−１】
2004305221.tif 000002
【図１−２】
2004305221.tif 000003
【図１−３】
2004305221.tif 000004
【図２−１】
2004305221.tif 000005
【図２−２】
2004305221.tif 000006
【図２−３】
2004305221.tif 000007
【図３】
2004305221.tif 000008
【図４】
2004305221.tif 000009