(57)【要約】【課題】  新規化合物およびそれを含む薬学的組成物を提供する。【解決手段】  以下の式Ｉ〜ＩＶのいずれかで表される、フォルミル置換したフェニルまたはピロール化合物：【化１６】2004210768.tif 000018  ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＲ３、ＯＲ４、ＮＨＲ３、ＮＨＲ４、ＳＲ３、ＳＲ４、ＳＯ３Ｒ３、ＳＯ３Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＲ３、（ＣＨ２）ｎＲ４、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ３、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、ＰｈＲ３、ＰｈＲ４、および（ＣＨ２）ｎＣＨＲ３Ｒ４からなる群から選択される基であり、  Ｒ２は、該Ｒ１で定義した基と同意義の基およびＣ（ＮＨＲ３）Ｒ３からなる群から選択される基であり、  Ｒ３は、置換または非置換の直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、  Ｒ４は、カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、  ｎは、０〜６の整数である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式Ｉ〜ＩＶのいずれかで表される、フォルミル置換したフェニルまたはピロール化合物：
【化１】
2004210768.tif 000013
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＲ３、ＯＲ４、ＮＨＲ３、ＮＨＲ４、ＳＲ３、ＳＲ４、ＳＯ３Ｒ３、ＳＯ３Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＲ３、（ＣＨ２）ｎＲ４、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ３、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、ＰｈＲ３、ＰｈＲ４、および（ＣＨ２）ｎＣＨＲ３Ｒ４からなる群から選択される基であり、
Ｒ２は、該Ｒ１で定義した基と同意義の基およびＣ（ＮＨＲ３）Ｒ３からなる群から選択される基であり、
Ｒ３は、置換または非置換の直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４は、カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｎは、０〜６の整数である。
【請求項２】
前記式ＩＩで表される４−フォルミルフェニル型構造をもつ、請求項１に記載の化合物：
ここで、前記Ｒ１は、末端カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または末端ヒドラジノ基もしくは末端アミノ基で置換されたアミノ酸である。
【請求項３】
前記式ＩＩにおいて、Ｒ１はＮＨ−ＮＨ−ＲａまたはＮＨ−Ｒａを表し、ここで、Ｒａは、α−もしくはβ−アスパルチル、またはα−、β−もしくはγ−グルタミルである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式Ｖで表される、請求項３に記載の化合物：
【化２】
2004210768.tif 000014
【請求項５】
請求項１に記載の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項６】
免疫賦活活性を有する、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記免疫賦活活性が樹状細胞誘導活性誘導能である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）様活性を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記式ＩＶで表される２−フォルミルピロール型構造をもつ、請求項１に記載の化合物：
ここで、前記Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＯＲ４、ＮＨＲ４、ＳＲ４、ＳＯ３Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＲ３、（ＣＨ２）ｎＲ４、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、ＰｈＲ４および（ＣＨ２）ｎＣＨＲ３Ｒ４からなる群から選択される基であり、
Ｒ３は、置換または非置換の直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４は、カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｎは、０〜６の整数である。
【請求項１０】
前記Ｒ２は、ヒドロキシル基で置換された直鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
以下の式ＶＩで表される、請求項１０に記載の化合物：
【化３】
2004210768.tif 000015
【請求項１２】
請求項９に記載の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
免疫賦活活性を有する、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記免疫賦活活性が樹状細胞誘導活性誘導能である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
以下の式ＩＸで表される、請求項１に記載の化合物。
【化４】
2004210768.tif 000016
【請求項１６】
以下の式Ｘで表される、請求項１に記載の化合物。
【化５】
2004210768.tif 000017
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物に関する。より詳細には、本発明は、新規フォルミルフェニル型構造をもつ化合物またはフォルミルピロール型構造をもつ化合物、およびこの化合物を有効成分として含有する薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康を維持する願望が増加するとともに、多くの人々が、健康食品および健康補助剤を摂取するようになっている。健康食品および健康補助剤として、副作用がほとんどなく、そして免疫賦活作用、抗癌作用などの生理活性を有する成分を含む天然素材およびそれに含まれる成分が注目され、免疫賦活効果、発癌予防効果をもつとされる健康食品が多数市販されている。これらの健康食品は、一般に、天然素材の熱水抽出エキスの形態で提供されることが多い。このような、生理活性を有する成分を含む天然素材の例として、マッシュルーム、アガリクス茸などが挙げられる。
【０００３】
一般にアガリクス茸と呼ばれるものは、学名を「アガリクス・ブラゼイ・ムリル  Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｌｌ」和名を「カワリハラタケ」という担子菌類ハラタケ科に属するきのこである。アガリクス茸（以後、本明細書では、一般に、カワリハラタケまたはＡＢＭと称する）は、ブラジルのサンパウロ州に位置するＰｉｅｄａｄｅ地方で伝統的に医薬として用いられている。カワリハラタケは、種々の免疫賦活活性、発癌予防効果、腫瘍増殖抑制効果をもつといわれ、現在、健康食品として幅広く内服されている。
【０００４】
マッシュルームから、抗腫瘍活性をもつ多くの多糖類が単離されている（Ｈａｍｕｒｏ  Ｊら（１９７８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３８：３０８０−３０８５、非特許文献１；Ｍｉｚｕｎｏ  Ｔら（１９９２）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：３４７−３４８、非特許文献２）。
【０００５】
カワリハラタケに含まれる多糖類は、ザルコーマ１８０に対して抗腫瘍活性を有し、そしてβ−１，６−グルコピラノシル残基を含む（Ｅｂｉｎａ  Ｔら（１９８６）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７７：１０３４−１０４２、非特許文献３）。カワリハラタケ抽出物は、（１→６）−β分岐をもつ（１→４）−α−Ｄ−グルカンを含み、ナチュラルキラー細胞活性化およびアポトーシスを経由して媒介される選択的抗腫瘍活性を有している（Ｆｕｊｉｍｉｙａ  Ｙら（１９９８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４６：１４７−１５９、非特許文献４）。二重移植腫瘍系において、カワリハラタケに含まれるペプチドグリカンは、Ｍｅｔｈ  Ａ腫瘍細胞に対して直接的な細胞傷害性作用を有し、そして腫瘍をもつマウスに対して間接的な免疫増強作用を有していた（Ｅｂｉｎａ  Ｔら（１９９８）、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  １１：２５９−２６５、非特許文献５）。カワリハラタケに含まれる多糖類は、マウスにおけるＴ細胞サブセットにおける脾臓Ｔｈｙ１，２−、Ｌ３Ｔ４陽性細胞の割合を変えた（Ｍｉｚｕｎｏ  Ｍら（１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４３４−４３７、非特許文献６）。これらの報告は、カワリハラタケに含まれる多糖類が、免疫調節活性を通じて腫瘍細胞に対する細胞傷害性作用を有することを示唆している。
【０００６】
多糖類を除くと、生理活性を示すカワワリハラタケの成分についての報告はほとんどない。そして、一般に、天然素材由来の健康食品および健康補助剤は、素材の産地、収穫時期、抽出方法の違いなどに起因して、あるいは含有される成分が多種多様であることに起因して品質が一定の製品を提供するのは困難である。
【非特許文献１】Ｈａｍｕｒｏ  Ｊら（１９７８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３８：３０８０−３０８５
【非特許文献２】Ｍｉｚｕｎｏ  Ｔら（１９９２）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：３４７−３４８
【非特許文献３】Ｅｂｉｎａ  Ｔら（１９８６）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７７：１０３４−１０４２
【非特許文献４】Ｆｕｊｉｍｉｙａ  Ｙら（１９９８）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４６：１４７−１５９
【非特許文献５】Ｅｂｉｎａ  Ｔら（１９９８）、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  １１：２５９−２６５
【非特許文献６】Ｍｉｚｕｎｏ  Ｍら（１９９８）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：４３４−４３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性を含む生理活性を有する新規化合物を提供し、それによって、天然の素材を原料とし、品質が変動する傾向のある従来の製品に代え、一定品質の生理活性を有する組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ハラタケ属担子菌Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｌａｚｅｉ  Ｍｕｒｉｌｌ（カワリハラタケ）由来の低分子成分を精製分離し、その化学構造を決定し、フォルミルフェニル型構造をもつ化合物が存在することを見出した。本発明者らは、その後、その化学構造に基づき、種々の誘導体を合成して検討を重ねた結果、式（Ｉ）〜（Ｘ）で表わされる、フォルミルフェニル型構造をもつ化合物またはフォルミルピロール型構造を有する化合物が、免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性を含む種々の生理活性、特に、ヒト末梢血単球由来樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）誘導能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、以下を提供する。
【００１０】
（１）以下の式Ｉ〜ＩＶのいずれかで表される、フォルミル置換したフェニルまたはピロール化合物であって、
【００１１】
【化６】
2004210768.tif 000002
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＲ３、ＯＲ４、ＮＨＲ３、ＮＨＲ４、ＳＲ３、ＳＲ４、ＳＯ３Ｒ３、ＳＯ３Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＲ３、（ＣＨ２）ｎＲ４、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ３、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ３、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、ＰｈＲ３、ＰｈＲ４、および（ＣＨ２）ｎＣＨＲ３Ｒ４からなる群から選択される基であり、
Ｒ２は、上記Ｒ１で定義した基と同意義の基およびＣ（ＮＨＲ３）Ｒ３からなる群から選択される基であり、
Ｒ３は、置換または非置換の直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４は、カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｎは、０〜６の整数である、化合物。
【００１２】
（２）上記式ＩＩで表される４−フォルミルフェニル型構造をもつ、項（１）に記載の化合物であって、
ここで、上記Ｒ１は、末端カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または末端ヒドラジノ基もしくは末端アミノ基で置換されたアミノ酸である、化合物。
【００１３】
（３）上記式ＩＩにおいて、Ｒ１はＮＨ−ＮＨ−ＲａまたはＮＨ−Ｒａを表し、ここで、Ｒａは、α−もしくはβ−アスパルチル、またはα−、β−もしくはγ−グルタミルである、項（２）に記載の化合物。
【００１４】
（４）以下の式Ｖで表される、項（３）に記載の化合物：
【００１５】
【化７】
2004210768.tif 000003
（５）項（１）に記載の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【００１６】
（６）免疫賦活活性を有する、項（５）に記載の薬学的組成物。
【００１７】
（７）上記免疫賦活活性が樹状細胞誘導活性誘導能である、項（６）に記載の組成物。
【００１８】
（８）スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）様活性を有する、項（５）に記載の組成物。
【００１９】
（９）上記式ＩＶで表される２−フォルミルピロール型構造をもつ、項（１）に記載の化合物であって、
ここで、上記Ｒ１およびＲ２は、独立して、ＯＲ４、ＮＨＲ４、ＳＲ４、ＳＯ３Ｒ４、（ＣＨ２）ｎＲ３、（ＣＨ２）ｎＲ４、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎＲ４、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４、ＰｈＲ４および（ＣＨ２）ｎＣＨＲ３Ｒ４からなる群から選択される基であり、
Ｒ３は、置換または非置換の直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ４は、カルボキシル基で置換された直鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｎは、０〜６の整数である、化合物。
【００２０】
（１０）上記Ｒ２は、ヒドロキシル基で置換された直鎖のＣ１〜Ｃ６アルキルである、（９）に記載の化合物。
【００２１】
（１１）以下の式ＶＩで表される、項（１０）に記載の化合物：
【００２２】
【化８】
2004210768.tif 000004
（１２）項（９）に記載の化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【００２３】
（１３）免疫賦活活性を有する、項（１２）に記載の薬学的組成物。
【００２４】
（１４）上記免疫賦活活性が樹状細胞誘導活性誘導能である、項（１３）に記載の組成物。
【００２５】
（１５）以下の式ＩＸで表される、項（１）に記載の化合物。
【００２６】
【化９】
2004210768.tif 000005
（１６）以下の式Ｘで表される、項（１）に記載の化合物。
【００２７】
【化１０】
2004210768.tif 000006
【発明の効果】
【００２８】
免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性を含む生理活性を有する新規化合物が提供され、それによって、天然の素材を原料とし、品質が変動する傾向のある従来の製品に代え、一定品質の生理活性を有する薬学的組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる定義で用いられることが理解されるべきである。
【００３０】
「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素から水素原子が１個失われて生ずる１価の基をいい、一般に、ＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。
【００３１】
「置換のアルキル」とは、アルキルの１個または複数個の水素原子が、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、フォルミル、およびヒドラジノからなる群から選択される基で置換されたアルキルを意味する。「非置換のアルキル」とは、いずれの水素原子も他の基で置換されていないアルキルを意味する。
【００３２】
「フォルミル」とは、−ＣＨＯで表される基をいう。
【００３３】
「カルボキシル」とは、−ＣＯＯＨで表される基をいう。
【００３４】
「ヒドラジノ」とは、−ＨＮ−ＮＨ２で表される基をいう。
【００３５】
「アミノ」とは、−ＮＨ２で表される基をいう。
【００３６】
「ヒドロキシル」とは、−ＯＨで表される基をいう。
【００３７】
「フォルミル置換したフェニル」とは、フェニルの水素原子がＣＨＯ基で置換されたフェニルをいう。
【００３８】
「フォルミル置換したピロール」とは、ピロールの水素原子がＣＨＯ基で置換されたピロールをいう。
【００３９】
「４−フォルミルフェニル型構造」とは、フェニルの１個の水素原子がＣＨＯ基で置換され、さらにこのＣＨＯ基に対してｐ位に別の置換基をもつフェニルの構造をいう。
【００４０】
「２−フォルミルピロール型構造」とは、ピロールの２位に位置する１個の水素原子がＣＨＯ基で置換されたピロールの構造をいう。
【００４１】
「末端カルボキシル基」とは、ある分子の末端（もしくは先端）官能基内の水素原子と置換するためのカルボキシル基を意味する。
【００４２】
「末端ヒドラジノ基」とは、ある分子の末端（もしくは先端）官能基内の水素原子と置換するためのヒドラジノ基を意味する。
【００４３】
「末端アミノ基」とは、ある分子の末端（もしくは先端）官能基内の水素原子と置換するためのアミノ基を意味する。
【００４４】
「アミノ酸」とは、分子内にカルボキシル基とアミノ基とを有する化合物を意味し、アミノ基とカルボキシル基が同一炭素原子に結合するものをα−アミノ酸と称し、相対距離が遠ざかるに従い順次β−、γ−、δ−、・・・アミノ酸と称する。
【００４５】
「アスパルチル」とは、モノアミノジカルボン酸であるアスパラギン酸の２個のカルボキシル基のうちの１個からヒドロキシル基を除いてできる基を意味する。
【００４６】
「グルタミル」とは、モノアミノジカルボン酸であるグルタミン酸の２個のカルボキシル基のうちの１個からヒドロキシル基を除いてできる基を意味する。
【００４７】
上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物が、例えば、免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性を含む生理活性を有することは知られていない。従って、本発明は、一般式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される新規な化合物を提供するものである。特定の理論に拘束されるわけではないが、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物は、フォルミル基とＲ１基との組み合わせおよびそれらの間の距離が免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性に関連していると考えられる。本発明はさらに、一般式（Ｉ）〜（Ｘ）で表わされる化合物を含有する新規な免疫賦活剤などの薬学的組成物を提供する。
【００４８】
上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＩＸ）または（Ｘ）で表される化合物は、代表的には、例えば、フェニルヒドラジンまたはアニリンを出発原料として合成され得る。フェニルヒドラジンは、アニリンを亜硝酸ナトリウム、塩酸でジアゾ化したのち亜硫酸ナトリウムと反応させて得られる、単斜結晶または微黄色の透明液体である（Ｇ．Ｈ．Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｏｒｇ．Ｓｙｎ．、Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．、１、４４２（１９５１））。フェニルヒドラジンは、染料中間物、アンチピリン（解熱剤）用原料、糖、アルデヒド、ケトンの検出用試薬として用いられている。本発明の新規化合物は、フェニルヒドラジンまたはアニリンを出発物質として製造し得る。フェニルヒドラジンまたはアニリンは、当業者に公知の縮合反応によって種々の誘導体を生成する。本発明の新規化合物は、このような縮合反応を利用して合成され得る。
【００４９】
フォルミルフェニル型化学構造を特徴とする新規化合物は、フェニルヒドラジンとモノアミノジカルボン酸（例えば、グルタミン酸）とを公知の方法を用いて縮合させ、加圧されたＣＯ下にて、ＨＣｌ／ＡｌＣｌ３の存在下でフォルミル化を行うことにより、得ることができる。
【００５０】
また、上記式（ＩＶ）または（ＶＩ）で表される２−フォルミルピロール型化学構造を特徴とする化合物は、代表的には、市販のピロールまたはピロール型化合物を用い、通常化学反応で用いられるアルキル化反応、アリール化反応およびアシル化反応を行うことにより得ることができる。
【００５１】
式（ＩＶ）の式中、Ｒ２で表わされる置換基は、種々の置換基をもつか、またはもたない飽和または不飽和のアルキルであり得る。これらの化合物は、ピロール型化合物を出発物質として、これに、通常化学反応で用いられるアルキル化剤、例えば該当するアルキルを有するハロゲン化アルキルなどを添加し、適当なアルカリ、例えば、炭酸カリウム、ｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液などを加え、必要に応じて、反応中に生じる酸の吸収剤（例えば、ジメチルホルムアミド）の存在下、所定の温度条件下で撹拌することによって得ることができる。
【００５２】
あるいは、式（ＩＶ）の式中、Ｒ２で表わされる置換基は、種々の置換基を有しまたは有しない脂肪族または芳香族のアシルであり得る。これらの化合物は、ピロール型化合物を出発物質として、これを、適切な溶媒、例えば、ピリジン、塩化メチレン、テトラヒドロフランなどに溶解し、アシル化剤、例えば、酸塩化物、または酸無水物などを加え、適切な溶媒、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、ｎ−ブチルリチウムのヘキサン溶液等の存在下、所定の温度条件下で撹拌することによって得られ得る。また、上記の反応を適宜組合せることにより、式（ＩＶ）または（ＶＩ）で表わされる化合物が得られ得る。
【００５３】
あるいは、上記式（ＩＶ）または（ＶＩ）で表される化合物は、前述の有機合成による手法のほか、担子菌の子実体または培養菌糸体から分離・精製し、単離してもよい。例えば、担子菌の子実体または培養菌糸体を加熱抽出してエキスを得、得られたエキスを、ゲル濾過、疎水性ゲルカラム、イオン交換樹脂などを用いて分離・精製することにより、１−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチル−ピロールを得てもよい。さらに、この分離・精製過程にある分画エキスもまた、式（ＩＶ）または（ＶＩ）で表される化合物を含有している。
【００５４】
上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物は、本発明に係る免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性を含む種々の生理活性を有する薬学的組成物の有効成分としてそのまま用いられ得るか、または適切なキャリアとともに本発明の組成物中に含有され得る。
【００５５】
本明細書で用いる用語「免疫賦活活性」は、一般に、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ａ細胞（付随細胞（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｃｅｌｌ））、プラズマ細胞などの免疫担当細胞を介して、正常または低下している個体の免疫応答能を賦活または増強することを意味する。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、キラーＴ細胞、遅延型過敏症をひき起こすＴ細胞（ＤＴＨＴ細胞）などが含まれる。Ｂ細胞には、一般に、抗体産生細胞の前駆細胞が含まれる。Ａ細胞には、Ｉａ陽性マクロファージ、リンパ組織の樹状細胞、表皮のランゲルハンス細胞などが含まれる。そしてプラズマ細胞には、脾臓やリンパ節などの二次リンパ系組織、骨髄、全身の結合組織に分布する抗体産生細胞などが含まれる。
【００５６】
本明細書で用いる用語「スーパーオキシドジスムターゼ様活性（またはＳＯＤ様活性）」は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と同様の酵素反応を行う能力をいい、ＳＯＤの存在下で、ＳＯＤが、活性酸素、例えば、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）を基質として触媒する２Ｏ２−＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２の反応（スーパーオキシドの不均化反応）を阻害することで評価され得る。
【００５７】
一般に、生体臓器は、好気的生命活動を営むとき、活性酸素分子種、生体臓器中のとりわけ酸素フリーラジカルや過酸化水素への暴露を避けることはできない。生体臓器の細胞が、好気的生命活動によって、活性酸素分子種を生成するからである。従って、化学物質、環境汚染物質などの外界からの有害物質だけでなく、生体臓器のすべての細胞もまた同様に生体攻撃種の１つであると考えられている。生体において酸化促進物質が優勢になり、抗酸化物質とのバランスが崩れたとき、生体に障害が生じる可能性がある。
【００５８】
活性酸素には、ヒドロキシラジカル、ペルオキシラジカル、一酸化窒素などの種類がある。ＳＯＤは、代表的には、Ｏ２−を基質として、２Ｏ２−＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２＋Ｏ２の反応を触媒する酵素であり、Ｏ２−を消去することにより生体を酸素傷害から防御している。ＳＯＤは、その分子中に含まれる金属によって，Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤ、Ｆｅ−ＳＯＤ、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ（ＥＣ）−ＳＯＤ、およびＦｅ、Ｚｎ−ＳＯＤの５種類に分けられている。ヒト組織および赤血球は、Ｃｕ、Ｚｎ−ＳＯＤ、Ｍｎ−ＳＯＤ、およびＦｅ−ＳＯＤ活性が高いことが知られている。
【００５９】
ＳＯＤ活性の分布を生体臓器別比較してみると、代謝を盛んに行う肝臓で最も高く、次いで、副腎および腎臓で高い活性が認められている。副腎では、生理的条件下でＯ２−および過酸化脂質が生成されている。これは、種々の副腎ホルモンの生成に関与するＰ−４５０がＯ２−を生成し、その影響を防ぐためにＳＯＤ活性が上昇していると考えられている。
【００６０】
ＳＯＤ活性を疾患別に見てみると、急性腎不全では腎臓細胞が壊されるため、その値は上昇し、糖尿病ではその値は低下する。これは、糖尿病によって増加したグルコースにより、ＳＯＤがｇｌｕｃａｔｉｏｎされてその活性が低下しているものと考えられている。同様の現象は、老化によっても起こっている。このように、ＳＯＤ様活性は、様々な疾患の１つの指標であり、そしてＳＯＤ様活性を有する組成物は、活性酸素の不均化反応を触媒することによって、三大成人病の引き金となる様々な疾患を含む疾患、例えば、肝障害、副腎障害、腎臓障害、各種の癌、高血圧、老化防止などを処置するために用いることが可能である。
【００６１】
本発明はまた、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物を単独で、または安定化化合物、希釈剤などのキャリア、あるいは他の成分または薬剤と組み合わせて含む組成物を提供する。本発明の組成物は、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物が、投与された生体において、免疫賦活活性およびスーパーオキシドディスムターゼ様活性を含む生理活性を生じるか、または増大するような形態で用いられる。
【００６２】
上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物は、一般に、無菌であって生体適合性のキャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むがそれらに限定されるわけではない）を用いて被験体に投与され得る。あるいは、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物は、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアと混合された組成物の形態で、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて被験体に投与され得る。
【００６３】
本発明の化合物または組成物の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、皮膚塗布、動脈内（例えば、腫瘍、動脈瘤に直接）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。
【００６４】
本発明の組成物は、薬学的に使用できる製剤を調製するために、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物に加え、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。処方および投与のための技術のさらなる詳細は、例えば、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」  （Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）の最終版に記載されている。
【００６５】
以下、本発明の組成物を含む免疫賦活化製剤を、投与形態別に、用いる薬学的に受容可能なキャリアを詳細に例示して説明する。なお、以下に示す本発明の組成物は、本発明の例示であって本発明を制限するものではない。
【００６６】
経口投与のための製剤は、投与に適した投与形態として当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、本発明の組成物が、患者による摂取に適した錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、軟膏、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。
【００６７】
経口使用のための製剤は、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物をキャリアとしての固体賦形剤と組合せ、所望により得られた混合物を粉砕し、所望であれば、錠剤または糖衣剤のコアを得るために、適切なさらなる化合物を添加した後、顆粒の混合物を処理することによって得られ得る。代表的な賦形剤として、以下に例示される炭水化物、タンパク質充填剤などが用いられ得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ゼラチン；およびコラーゲンのようなタンパク質。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）のような崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
【００６８】
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液のような適切なコーティングとともに提供される。これはまた、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラツカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液をも含有し得る。製品同定のため、または活性化合物の量（すなわち用量）を特徴付けるために、染料または色素を錠剤または糖衣剤に添加してもよい。
【００６９】
経口で使用され得る製剤は、例えば、ゼラチンカプセル、ゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）よりなるソフト封着カプセルであり得る。ゼラチンカプセルは、ラクトースまたは澱粉のような充填剤またはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した活性な成分を含有し得る。ソフトカプセルでは、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物は、脂肪油、流動パラフィンまたは液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解または懸濁されて用いられ得る。
【００７０】
非経口投与用の製剤は、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物の水溶液を包含する。注射のために、本発明の組成物は、水溶液、好ましくはハンクスの溶液、リンゲル溶液、または緩衝化生理食塩水のような生理学的に適合する緩衝液中で処方され得る。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストラン）を含有し得る。このような懸濁物は適切な油状注射懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油のような脂肪酸、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含し得る。必要に応じて、懸濁物は、高濃度溶液の製剤を可能にする安定化剤または化合物の溶解度を増加させる適切な薬剤または試薬を含有し得る。
【００７１】
局所または鼻孔投与のために、浸透されるべき特定のバリアに対して適切な浸透剤を製剤中に含有し得る。このような浸透剤は一般に当該分野で公知である。
【００７２】
本発明の製剤は、当該分野で公知の様式と同様の様式（例えば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣剤作製、水簸、乳化、カプセル化、包括、または凍結乾燥の手段によって）で製造され得る。
【００７３】
本発明の組成物は、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物を、意図される目的を達成するに有効な量で含有する。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であって、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量（例えば、治療的有効量）を確認する１つの有用なアッセイは、標的疾患の免疫活性を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
【００７４】
上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表されるいずれの化合物についても、治療的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイまたは任意の適切な動物モデルのいずれかにおいて、見積もられ得る。動物モデルはまた、所望の濃度範囲および投与経路を達成するために用いられる。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量および経路を決定することができる。
【００７５】
治療的有効量とは、疾患の徴候または状態を軽減する上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物の量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０、集団の５０％において治療的に有効な用量；およびＬＤ５０、集団の５０％に対して致死的である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、それは比率ＥＤ５０／ＬＤ５０として表され得る。大きな治療係数を呈する薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータが、ヒトでの使用のための量の範囲を公式化するのに使用される。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物の投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類等により適宜選択されるが、例えば、血液内投与、筋肉内投与、関節内投与、一般に、１回あたり、１μｇ〜１００ｍｇを１日１回から数回投与することができる。
【００７６】
正確な用量は、治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度（例えば、腫瘍のサイズおよび位置；患者の年齢、体重、および性別；投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性／応答）が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、３〜４日毎に、毎週、または２週間に１回、投与され得る。特定の用量および送達の方法に関するガイダンスは当該分野で公知の文献に提供されている。
【００７７】
この様にして得られた上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物を主成分として含有する医薬品は、対照となる疾患の種類などにより各種の方法で投与することができる。
【００７８】
本発明の上記式（Ｉ）〜（Ｘ）で表される化合物またはそれを含む組成物は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品素材として種類を限定せずに利用できる。例えば、清涼飲料水、ジュース、茶、ゼリー、プリン、パン、クッキー、キャラメル、おかきなどに添加したり、必要に応じて、でんぷん、デキストリン、乳糖などの賦型剤、その他の食用組成物のエキス剤、色素、香料などとともに粉末、顆粒、錠剤に加工したり、ゼラチンなどの被覆剤を用いてカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品などとして利用できる。なお、本発明の組成物はこれらの例に限定されないことはいうまでもない。
【００７９】
また、本発明の組成物は、最終製品の種類や状態などに依存して、ほぼ０．１〜１００重量％の範囲で添加され得る。添加量の目安は、約０．００５〜１％、好ましくは０．０１〜０．５％である。
【００８０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限するものではない。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００８２】
（実施例１）化合物の合成
１．１．β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（式ＶＩＩ）の合成
フェニルヒドラジン９４０ｍｇに大過剰量のグルタミン酸を加え、公知の方法を用いて縮合させ、β−Ｎ−（γ−グルタミル）−フェニルヒドラジンを形成し、この縮合反応をフェニルヒドラジンが完全に消失するまで行った。次いで、加圧ＣＯ雰囲気下にて、ＨＣｌ／ＡｌＣｌ３の存在下でフォルミル化を行い、最終生成物１（１５０ｍｇ）を得た。
【００８３】
１．２．Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（式ＶＩＩＩ）の合成
２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール６２５ｍｇに４−クロロ−酪酸６７４ｍｇ及び炭酸カリウム６００ｍｇを加え、１８時間加熱還流した。冷却後、反応液を濾過した後、濾液を減圧下濃縮乾固し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル：３０ｇ，溶離液：クロロホルム−メタノール２：１）にて精製し、最終生成物２（無色油状、６０ｍｇ）を得た。
【００８４】
上記２つの最終生成物１および２について、以下の条件の質量分析およびＮＭＲ分析に供し、その構造を解析した結果、これら２つの成分は、それぞれ、以下の構造をもつβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（以下の式ＶＩＩで表される構造をもつ）、およびＮ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（以下の式ＶＩＩＩで表される構造をもつ）であることが確認された。
【００８５】
【化１１】
2004210768.tif 000007
［質量分析］
得られた最終生成物１および２をそれぞれ、１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、ｍｉｌｉ−Ｑ水を加えて水溶液とした後に測定に供した。測定装置として、ＪＥＯＬ  ＨＸ１１０／１１０Ａタンデム型質量分析計を用い、以下のＦＡＢ、ＥＩ、ＣＩおよびＨＲＦＡＢの質量分析において、それぞれ、ポジティブ（ＦＡＢ、ＥＩ、ＣＩ）、ネガティブ（ＦＡＢ、ＣＩ）およびネガティブ（ＨＲＦＡＢ）の測定モードで測定した。なお、各質量分析における分解能は、ＦＡＢ、ＥＩおよびＣＩについて１０００、そしてＨＲＦＡＢについて５０００で行った。
【００８６】
１．ＦＡＢ−ＭＳ
マトリックスとしてグリセロールを用いた。試料搭載台でグリセロールと試料とを１：１（ｖ／ｖ）で混合した直後に測定を行った。質量較正には、ポジティブモードではアルカリイオンの混合物を、ネガティブモードではヨウ化セシウム（ＣｓＩ）のグリセロール溶液を使用した。
【００８７】
２．ＥＩ−ＭＳおよびＣＩ−ＭＳ
試料そのものをイオン源に導入した。ＣＩではイオンガスとしてイソブタンを使用した。
【００８８】
３．ＨＲＦＡＢ−ＭＳ
質量較正試料としてＰＥＧ−５００を使用した。試料搭載台でグリセロールと試料とを１：１（ｖ／ｖ）で混合した後に適量のＰＥＧ−５００を添加し、直後にネガティブモードで測定を行った。質量較正は、目的ピーク（［Ｍ−Ｈ］−＝２１０）を挟む２本のＰＥＧ−５００のピークを選択して行った。
【００８９】
［ＮＭＲ分析］
Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ５００核磁気共鳴装置（１Ｈ５００ＭＨｚ）およびＪＥＯＬ  ＪＮＭ−Ａ４００核磁気共鳴装置（１Ｈ４００ＭＨｚ）を用いて行った。
【００９０】
質量分析後の試料を凍結乾燥後、重水（０．３ｍｌ）に溶解して測定に供した。また、溶媒を重クロロホルムに再置換した試料を用いた測定も行った。
【００９１】
［結果の解析］
最終生成物１：
ＦＡＢ−ＭＳにおいて、ｍ／ｚ  ２６６で偽分子イオンＭＨ＋を観察し、ＥＩ−ＭＳにおいて、トリフロオロ酢酸および酢酸誘導体については、それぞれ、ｍ／ｚ  ６４９（Ｃ２０Ｈ１１Ｆ１２Ｎ３Ｏ３）でＭ＋イオンを、ｍ／ｚ  ３３１で［Ｍ−Ｈ２Ｏ］＋イオンを観察した。Ｈ１ＮＭＲにより、アルデヒドプロトン、ｐ−置換芳香環およびグルタミン酸残基−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＯＨが特徴付けられた。２個の芳香族プロトン（ｄ７．９１ｐｐｍ）の脱シールド、中性溶液（３１３ｎｍ）およびアルカリ性溶液（３８５ｎｍ）でのＵＶ吸収、ｍ／ｚ  １３６（Ｃ７Ｈ８Ｎ２Ｏ）における重要なイオンの発生は、ｐ−フォルミルフェニルヒドラジンユニットと一致した。下記１Ｈ−ＮＭＲは、重水中、テトラメチルシランを内部標準として測定した。δ値はｐｐｍで、結合定数（Ｊ）はＨｚで表記した。データ中、ｄは一重線、ｄは二重線、ｔは三重線、ｍは多重線を意味する。
【００９２】
ＵＶλ１２０ｍａｘｎｍ（ｌｏｇε）；２３１（３．７９）、３１３（４．１９）；＋ＮａＯＨ  ２４８（３．７６）、３８５（４．３０）；＋ＨＣｌ  ２３１（３．７９）、３１３（４．１９）：ＦＡＢ＋ＭＳ  ｍ／ｚ（相対強度）：２６６（ＭＨ＋、１００）、２０１（６２）、１６６（１６）、１３７（２０）、１３６（１５）、１３２（３９）、１２１（１６）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）９．７３（１Ｈ、ｓ、−ＣＨＯ）、７．９１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、７．０３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ）、３．９１（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、Ｈα）、２．６７（２Ｈ、ｍ、Ｈγ）、２３１（２Ｈ、ｍ、Ｈβ）。
【００９３】
最終生成物２：
上記各種質量分析モードにおけるいずれのスペクトルにおいても分子量２１１に相当するピークが観測され、この化合物の分子量は２１１と決定された。次いで、ピーク感度がより良好なネガティブモードでＨＲＦＡＢ−ＭＳ測定を行ったところ、観測された精密質量（ｍ／ｚ＝２１０．０７５７）がＣ１０Ｈ１２Ｏ４Ｎ（−１．０ｍｍｕ）とよい一致を示したことから、最終生成物２の分子式は、Ｃ１０Ｈ１８Ｏ４Ｎと決定された。
【００９４】
次に、構造情報を得る目的で各種ＮＭＲ測定を行い、ＨＭＢＣスペクトルのクロスピーク情報を基に解析した結果、上記式ＶＩで示される構造をもつと決定された。
【００９５】
１．３．β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルアニリン（または４−（４−グルタミル）アミノベンズアルデヒド）（式Ｖ：以下、本明細書ではＡＴＯ−１と称する）の合成
ＡＴＯ−１の合成スキームおよび合成方法を以下に示す。
【００９６】
【化１２】
2004210768.tif 000008
Ｎ−Ｂｏｃ−１−ベンジルグルタミン酸（９６４ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ、２）をＴＨＦ３０ｍｌに溶解させて０℃に冷却し、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（６１９ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて３０分攪拌した。次に、パラアミノベンズアルデヒド塩酸塩（６３０ｍｇ、４ｍｍｏｌ、１）、ピリジン０．４ｍｌおよびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（３４９ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を加え、水浴を外して室温で1時間攪拌した。反応液にトリエチルアミン０．３ｍｌを加えてさらに１６時間攪拌した。その後、反応液を減圧濾過し、酢酸エチル３０ｍｌを加えて１Ｍ  ＨＣｌ、５％ＮａＨＣＯ３および水で洗浄した後、乾燥し減圧濃縮した。残渣（１．３ｇ）をシリカゲルクロマトグラフィーで精製することによりアミド３（１１５．２ｍｇ）を得た。次に、アミド３（５６．２ｍｇ）をＭｅＯＨ（０．１４ｍｌ）に溶解し、４Ｍ  ＮａＯＨ（０．０４ｍｌ）を加えて室温で３０分攪拌した。反応混合物に水４ｍｌを加え、酢酸エチルで洗浄後水層にＤｏｗｅｘ５０ＷＸ８（１ｍｌ）を加えて５分間攪拌した後、Ｄｏｗｅｘ５０ＷＸ８を濾別、水層を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチルを留去した残渣を９８％ギ酸（１．５ｍｌ）で処理することにより（ＡＴＯ−１、１８．６ｍｇ、２からの収率６．７％）を得た。
４−（４−グルタミル）アミノベンズアルデヒド（ＡＴＯ−１）
ＭＳ  ｍ／ｚ  ２５１（Ｍ＋＋１）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４００，１６７０，１５９０，１５４０ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）δ２．２０（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝６．８），２．６０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８，７．３），３．７９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８），７．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３），７．８８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３），９．７９（１Ｈ，ｓ）。
【００９７】
１．４．Ｎ−（４−カルボキシブチル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（式ＶＩ）の合成
出発物質である４−クロロ−酪酸の代わりに５−クロロ−吉草酸を用いることを除いて、上記と同様の方法でアルキル化および精製を行い、最終生成物４（無色油状、５０ｍｇ）を得た。
【００９８】
上記２つの最終生成物３および４について、上記と同様の条件下で質量分析およびＮＭＲ分析に供し、その構造を解析した結果、これら２つの物質は、それぞれ、以下の構造をもつβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルアニリン（以下の式Ｖで表される構造をもつ）、およびＮ−（４−カルボキシブチル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（以下の式ＶＩで表される構造をもつ）であることが確認された。
【００９９】
【化１３】
2004210768.tif 000009
１．５．４−（４−フォルミルフェニルカルバモイル）ブタン酸（以下の式ＩＸで表される構造をもつ：以下、本明細書ではＡＴＯ−３と称する）の合成
ｐ−ニトロベンズアルデヒド１．５１ｇを無水エタノール２０ｍｌ中に懸濁し、塩化スズ（ＩＩ）１１．２８ｇを添加して還元反応を行った。得られた反応液を水５０ｍｌに添加し、水酸化ナトリウムを用いて中和した後、反応産物を酢酸エチルで抽出した。得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後濾別した。得られた濾液に１Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨ  １１ｍｌを添加して造塩し、析出した結晶を濾別、洗浄および乾燥してｐ−アミノベンズアルデヒド塩酸塩０．８８ｇを得た。
【０１００】
得られたｐ−アミノベンズアルデヒド塩酸塩０．８ｇを塩化メチレン１０ｍｌ中に懸濁し、トリエチルアミン０．５３ｇを添加してｐ−アミノベンズアルデヒド溶液を得た。この溶液を、グルタル酸無水物２．９ｇを懸濁した塩化メチレン１０ｍｌに添加してペプチド合成を行った。合成終了後、析出した結晶を濾別し、濾液中に水を添加して晶析させた。これを濾別し、洗浄および乾燥することにより微黄結晶０．８１ｇを得た。この微黄結晶を、ＮＭＲ、ＩＲ、ＬＣ、ＴＬＣを用いて分析した結果、以下の構造式で表される４−（４−フォルミルフェニルカルバモイル）ブタン酸であることが確認された。
【０１０１】
ＩＲ分析において、吸収ピークが帰属した結果を以下に示す。
３３５０ｃｍ−１（−ＮＨ）、３１０２〜２９８１ｃｍ−１（−ＣＯＯＨ）、２８４２ｃｍ−１付近（−ＣＨ２−）、１７１６ｃｍ−１（−ＣＨＯ）、１６６４〜１５２５ｃｍ−１付近（−ＮＨ）、１５８１ｃｍ−１（−ＣＯＯＨ）、１３１７ｃｍ−１付近（−ＣＨ２）、１１６４ｃｍ−１（Ｐｈ・Ｎ）。
【０１０２】
【化１４】
2004210768.tif 000010
ＭＳ  ｍ／ｚ  ２３４（Ｍ＋−１）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３２００、１７１０、１６８０、１５７５、１５２５ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、５００ＭＨｚ）δ１．９８（２Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝７．４）、２．３９（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．４）、２．４８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．４）、７．７８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８）、７．８５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８）、９．８６（１Ｈ、ｓ）。
【０１０３】
１．６．４−（４−フォルミルフェニルカルバモイル）プロピルアミン（以下の式Ｘで表される構造をもつ：以下、本明細書ではＡＴＯ−４と称する）の合成
Ｎ−Ｂｏｃ  γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）３．６６ｇをＴＨＦ  １０ｍｌに溶解し、冷却した後、ＤＣＣ４．１ｇ／ＴＨＦ  ５ｍｌ溶液を添加して一昼夜反応させた。析出した結晶（ＤＣＵ）を濾別し、得られた濾液を塩化メチレンに溶媒置換することによりＮ−Ｂｏｃ  ＧＡＢＡ無水溶液を得た。このＮ−Ｂｏｃ  ＧＡＢＡ無水物溶液に、ｐ−アミノベンズアルデヒド塩酸塩０．６３ｇ、およびトリエチレンアミン０．４２ｇを添加してペプチドを形成させた。得られた反応液を濃縮し、残渣を酢酸エチルに溶解し、５％重炭酸ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した後、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した。これを、濾過した後濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、濃縮することにより赤褐色のｏｉｌを得た。これを塩化メチレンに溶解し、氷冷下、ＴＦＡ／塩化メチレン溶液を滴下して反応させ、Ｂｏｃ基を除去した。得られた反応液を濃縮し、赤褐色のｏｉｌを得た。これを、ＮＭＲ、ＩＲ、ＬＣ、ＴＬＣを用いて分析した結果、以下の構造式で表される４−（４−フォルミルフェニルカルバモイル）プロピルアミンであることが確認された。
【０１０４】
【化１５】
2004210768.tif 000011
ＭＳ  ｍ／ｚ２０７（Ｍ＋＋１）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν３４００、１６７２、１５８７、１５２６ｃｍ−１；１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、５００ＭＨｚ）δ２．０２（２Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝７．３）、２．５８（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３）、３．０５（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３）、７．６６（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．３）、７．９１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．３）、９．８０（１Ｈ、ｓ）。
【０１０５】
（実施例２）免疫賦活活性の測定
上記実施例１で合成したＮ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（最終生成物２）、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（最終生成物１）について、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を用いて免疫賦活活性を測定した。
【０１０６】
樹状細胞は、免疫の成立に関与する細胞である。樹枝状細胞、樹状白血球、Ｄ細胞とも呼ばれる。脳を除く生体内各種組織器官に分布する骨髄細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群の総称である。この細胞群には、リンパ系樹状細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）、ランゲルハンス細胞、ベール細胞、相互連結細胞、間質細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｅｌｌ）などが含まれる。生体内で異物の侵入により開始される炎症応答に伴い、異物を取り込んで（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）局所から輸入リンパ管を経て所属リンパ節または血流に乗って脾臓へと移動する。Ｔ細胞依存性領域に達した後、抗原をクラスＩＩ抗原と結合した形で提示し特異的Ｔ細胞を活性化することにより免疫応答を開始させることが知られている。いわば免疫の根幹をつかさどる細胞である。本願では、本発明の化合物の免疫賦活活性を、単球の樹状細胞への誘導能をアッセイすることにより確認した。
【０１０７】
Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンは、フォルミル基とＲ１基として末端カルボキシルを有しており、これらの基の組み合わせ、およびそれらの間の間隔が、免疫賦活活性に関連していると考えられる。
【０１０８】
２．材料および方法
２．１．材料
同意を得ることのできた２人の健常人の末梢血を材料として用いた。
【０１０９】
２．２．末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）の分離
ヘパリン加採血された全血検体からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ比重遠心法によりＰＢＭＣを分離した。
【０１１０】
２．３．被験試料
上記実施例１で合成されたＮ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（最終生成物２）、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（最終生成物１）を被験試料とした。
【０１１１】
各実験に使用する細胞の培養液（１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０、５％ヒトＡＢ血清加ＲＰＭＩ−１６４０）に、これらの化合物をそれぞれ２００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、孔径０．２２μｍのフィルターを通して濾過滅菌したものを被験試料とした。
【０１１２】
２．４．免疫賦活活性の測定
上記化合物の免疫賦活活性効果を、インビトロにおけるヒト末梢血単球由来樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）誘導能から検討した。
【０１１３】
ＰＢＭＣを炭酸ガスインキュベーターで１時間ディシュ処理し、単球に富む付着細胞分画を得た。得られた細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ（ＤＩＡＣＬＯＮＥ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）およびＩＬ−４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）の各々５００Ｕ／ｍｌ存在下で、５％ヒトＡＢ血清加ＲＰＭＩ−１６４０（日研生物医学研究所製）中で培養した。
【０１１４】
培養には、径３．５ｃｍのディッシュ（ＮＵＮＣ社製）を用いた。培養６日目にピシバニールおよび上記２つの化合物を、それぞれ最終濃度がピシバニールについては０．１ＫＥ／ｍｌ、そして上記２つの化合物については２００μｇ／ｍｌとなるように加えた。なお、ピシバニール（中外製薬製）は、ＤＣ誘導能をもつポジティブコントロールとして用いた。ネガティブコントロールは、５％ヒトＡＢ血清加ＲＰＭＩ−１６４０を用いて同様に培養した細胞である。
【０１１５】
ディシュ内のすべてのＤＣを培養開始７日目に回収し、その表面抗原をモノクローナル抗体（抗−ＣＤ８０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いたフローサイトメトリーで解析した。なお、有意差検定はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて行った。
【０１１６】
３．結果
検討を行った被験体で、ＤＣ培養開始６日目に上記化合物を添加することによって、ＣＤ８０分子の著しく強い発現誘導が認められた。その代表的パターンを示した一例を図１および図２に示す。
【０１１７】
図１は、β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（最終生成物１）についての試験結果を示す。図１の上に示すチャートは、被験化合物非添加の細胞のフローサイトメトリー解析結果を、図１の下に示すチャートは、β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンを添加した後の培養細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。図においてチャートの横軸は、蛍光強度（１０ｇ）を、縦軸は、細胞数を、そしてＭ１はコントロール抗体（ＩｇＧ１ＦＩＴＣ）測定値より設定した領域をそれぞれ示す。
【０１１８】
図１に示されるように、β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンの添加により、約９２％（測定数値は示さず）のＤＣ上にＣＤ８０の発現の増加が認められ、新規化合物の添加によって樹状細胞の活性化が誘導されることが示された。
【０１１９】
同様に、図２は、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（最終生成物２）についての試験結果を示す。図２の上に示すチャートは、被験化合物非添加の細胞のフローサイトメトリー解析結果を、図２の下に示すチャートは、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロールを添加した後の培養細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。示されるチャートの横軸および縦軸は図１と同じである。
【０１２０】
図２に示されるように、新規化合物Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロールにより、約２０％（測定数値は示さず）のＤＣ上にＣＤ８０の発現の増加が認められ、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロールの添加によって樹状細胞の活性化が誘導されることが示された。
【０１２１】
その一方、図３は、同じＰＢＭＣについて、ＤＣ培養開始６日目にピシバニール（中外製薬製）を添加することによって得られた結果を示す。ピシバニールはＤＣ誘導能をもつことが知られる物質である。図３の上はピシバニール非添加、そして図３の下はピシバニール添加により、約２６％（測定数値は示さず）のＤＣ上にＣＤ８０の発現増加が認められ、ピシバニールの添加によって樹状細胞の活性化が誘導されたことを示す。
【０１２２】
図１、図２および図３の結果により、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンがＤＣ誘導能をもち、特に、β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（最終生成物１）は、ピシバニールよりも強いＤＣ誘導能を有することが示された。
【０１２３】
（実施例３）白血病細胞株の増殖抑制作用
上記実施例１で合成したＮ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（最終生成物２）、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（最終生成物１）について、白血病細胞株の増殖抑制作用を測定した。白血病細胞株の増殖抑制作用は、ＴＵＮＥＬ法（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄＵＴＰ）−ｂｉｏｔｉｎ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定した。
【０１２４】
ＴＵＮＥＬ法は、１９９２年、Ｇａｖｒｉｅｌｉら（Ｙａｅｌ  Ｇａｖｒｉｅｌｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１１９巻、Ｎｏ．３、１９９２年１１月、４９３−５０１頁）によって報告された、組織切片上アポトーシスを指摘する方法である。種々の病態における個々の細胞レベルでのアポトーシスの観察、形態変化との対比を可能にする方法として知られている。ＴＵＮＥＬ法は、Ｇａｖｒｉｅｌｉら（前述）の方法に準じ、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗａｋｏ（和光純薬工業株式会社）を用い、白血病細胞株ＨＬ−６０に対して行った。
【０１２５】
Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロールは、２．０７×１０−６Ｍ〜２．０７×１０−４Ｍ濃度範囲で、そしておよびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンは、２．７×１０−６Ｍ〜２．７×１０−４Ｍ濃度範囲で試験した。結果を、図４および図５に示す。
【０１２６】
図４は、種々の濃度のＮ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（最終生成物２：図４の左上ではＦ−Ｐｙと略して記載している）、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（最終生成物１：図４の左上ではＦ−φと略して記載している）存在下におけるＨＬ−６０細胞株の増殖曲線である。図４中の各シンボルは、図４の左上に示した各シンボルに対応して記載された濃度の成分の存在下における細胞数測定結果を示す（個／ｍｌ）。白丸は、アポトーシス誘導能についてポジティブコントロールのアクチノマイシンＤ（ＡＣＤ）、そして黒丸は、薬剤なしの対照試験区である。
【０１２７】
図４に示されるように、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンのいずれもが、ほぼ濃度依存的にＨＬ−６０細胞の増殖を抑制し、特に、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（Ｆ−Ｐｙ）の２．０７×１０−４Ｍ存在下、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（Ｆ−φ）の２．７×１０−４Ｍ存在下では、ＨＬ−６０細胞の増殖が著しく抑制されることが示された。
【０１２８】
図５は、培養２日後の、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（Ｆ−Ｐｙ）の２．０７×１０−４Ｍ存在下およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（Ｆ−φ）の２．７×１０−４Ｍ存在下における、アポトーシス陽性細胞の比率を示した図である。図５の横軸は各試験区を、そして縦軸はアポトーシスを起こした細胞の割合を示す。図５に示されるように、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（Ｆ−Ｐｙ）の２．０７×１０−４Ｍ存在下では、約３５％の細胞において、そしてβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン（Ｆ−φ）の２．７×１０−４Ｍ存在下では、約７０％の細胞においてそれぞれアポトーシスが誘導され、Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール、およびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジンがアポトーシス誘導能を有していることが確認された。
【０１２９】
（実施例４）
実施例１で合成したβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルアニリン（最終生成物３）およびＮ−（４−カルボキシブチル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール（最終生成物４）についても、実施例２と同様に、免疫賦活活性を測定する。β−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルアニリンおよびＮ−（４−カルボキシブチル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロール存在下で培養した樹状細胞上の表面抗原を、モノクローナル抗体（抗−ＣＤ８０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いたフローサイトメトリーで解析することによって、ＤＣ細胞誘導能をアッセイし免疫賦活活性を確認する。
【０１３０】
（実施例５）
上記実施例１．３、１．６および１．７で合成したＡＴＯ−１、ＡＴＯ−３、およびＡＴＯ−４のそれぞれ６ｍｇをエッペンドルフチューブに入れ、最終濃度が１００μｌ／ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解して各被験試料の溶液を作製した。得られた被験試料の溶液の各々を、さらにＤＭＳＯで希釈して各被験試料について異なる濃度の一連の希釈系列を作製した。得られた各被験試料の一連の希釈系列を、新しく採取した精製水（ｍｉｌｉＱ）で１０倍希釈して被験液としてＳＯＤ活性を測定した。
【０１３１】
ＳＯＤ活性は、市販のキット（ＤＯＪＩＮＤＯ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ，ＩＮＣ．社製）を用い、製造業者の指示書に準じて測定を行った。要約すれば、被験液をマイクロプレートに入れ、反応試薬を添加した。最後に酵素（ＳＯＤ）溶液を添加し、３７℃に２０分間インキュベートした。反応後のマイクロプレートの吸光度を測定し、ＳＯＤ様活性（酵素阻害活性）を次式により求めた。
ＳＯＤ活性値（阻害率％）＝［（Ａｂｌａｎｋ１−Ａｂｌａｎｋ３）−(Ａｓａｍｐｌｅ−Ａｂｌａｎｋ２)］／（Ａｂｌａｎｋ１−Ａｂｌａｎｋ３）×１００
ここで、Ａｂｌａｎｋ１は阻害無しの全発色量を、Ａｂｌａｎｋ２は被験液自体のブランクを、Ａｂｌａｎｋ３はＳＯＤ酵素液のブランクをそれぞれ示す。
【０１３２】
表１に結果を示す。
【０１３３】
【表１】
2004210768.tif 000012
表１に示されるように、ＡＴＯ−１、ＡＴＯ−３、およびＡＴＯ−４のいずれも、その濃度が増加するにつれて、ＳＯＤの活性を阻害する割合が増加し、８３．３μｇ／ｍｌの濃度で、ＳＯＤ活性を、それぞれ約３０％、４０％および２１％阻害することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
免疫賦活活性およびスーパーオキシドジスムターゼ様活性を有する新規化合物が提供される。従来の天然素材から調製され、品質が変動する傾向にある従来の製品に代え、一定品質の生理活性を有する製剤が提供される。これらの新規化合物は、単球細胞から樹状細胞への誘導を促進する作用、そして活性酸素分解する作用を有するので、生体内への異物の侵入により開始される炎症応答を効率的に促進し、そして活性酸素と関連する老化および発癌を防止し得る薬学的組成物を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】本発明の化合物の免疫賦活活性を示す図である。
【図２】本発明の化合物の免疫賦活活性を示す図である。
【図３】免疫賦活剤ピシバニールの免疫賦活活性を示す図である。
【図４】Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロールおよびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン存在下の白血病細胞株ＨＬ−６０の増殖曲線を示す図である。
【図５】Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−２−フォルミル−５−ヒドロキシメチルピロールおよびβ−Ｎ−（γ−グルタミル）−４−フォルミルフェニルヒドラジン存在下の白血病細胞株ＨＬ−６０のアポトーシスを示す図である。
【図１】
2004210768.tif 000019
【図２】
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【図３】
2004210768.tif 000021
【図４】
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【図５】
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