(57)【要約】【課題】所望する量の幹細胞を効率良く培養できる生体組織補填体の製造方法を提供すること。【解決手段】患者或いは患者以外の第３者の腸骨から骨髄液（生体組織）１０を抽出する。この骨髄液１０には、多量の脂肪細胞１１等と少量の骨髄間葉系幹細胞（幹細胞）１２とを備える骨髄細胞１３が含まれる。この骨髄液１０を−２０℃に設定した冷凍庫１４内に挿入して所定の期間保管する。このとき、骨髄間葉系幹細胞１２と脂肪細胞１１等とでは凍結に対する耐性が異なるため、脂肪細胞１１は体積が膨張し、又は氷塊が生成することによって細胞膜等が損傷して死滅する。一方、骨髄間葉系幹細胞１２は脂肪細胞１１よりも生存率が高いため、多くの骨髄間葉系幹細胞１２の生存状態が維持される。所定の時間経過後、冷凍庫１４内から骨髄液１０を取り出して、室温にて徐々に解凍する。こうして、脂肪細胞１１等が死滅した骨髄液１０ａが得られる方法とした。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織から採取した、細胞を含む体液を凍結する工程と、前記体液を解凍する工程と、解凍して得られた前記体液内の細胞を培地とともに容器内に投入して培養する工程とを備えることを特徴とする培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織から採取した細胞を培養する培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨等の生体組織の欠損部に、骨補填材等の生体組織補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄液から骨髄間葉系幹細胞を培養し、その後さらに骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨等の生体組織補填体を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系幹細胞を含む骨補填体を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
【非特許文献１】
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、骨髄間葉系幹細胞を培養する従来の培養方法では、患者から採取した骨髄液が骨髄間葉系幹細胞以外に脂肪細胞等を含むので、骨髄間葉系幹細胞のみならず脂肪細胞等もあわせて培養していた。そのため、骨髄間葉系幹細胞を所望の量に培養するために多大な時間を必要とした。また、得られた培養細胞から骨髄間葉系幹細胞のみを取り出す操作が必要となり、効率的な培養が困難であった。
本発明は上記事情に鑑みて成されたものであり、所望する量の幹細胞を効率良く培養できる培養方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を採用する。
本発明に係る培養方法は、生体組織から採取した、細胞を含む体液を凍結する工程と、前記体液を解凍する工程と、解凍して得られた前記体液内の細胞を培地とともに容器内に投入して培養する工程とを備えることを特徴とする。
この培養方法によれば、生体組織から採取した体液を凍結するので、凍結耐性の高い所望の細胞は生存させながら凍結耐性の低い細胞を死滅させることができる。
そして、死滅した細胞は培地に接着することができないので、培地交換の際に古い培地とともに洗浄して除去することができ、その結果、コンフルエント状態における全細胞に占める所望の細胞の比率が極めて高い培養細胞を得ることができる。また、培養後に幹細胞のみを分離して取り出す工程を省略することができ、培養作業を効率よく行うことができる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の一実施形態に係る培養方法について、図１から図３を参照して説明する。
この培養方法は、図１に示すように、生体組織から採取した、細胞を含む体液を凍結する工程（Ｓ０１）と、前記体液を解凍する工程（Ｓ０２）と、解凍して得られた前記体液内の細胞を培地とともに容器内に投入して培養する工程（Ｓ０３）とを備える。以下、それぞれの工程について説明する。
【０００８】
まず、凍結する工程（Ｓ０１）について説明する。
本工程を実施する前に、図２に示すように、患者或いは患者以外の第３者の腸骨から骨髄液（体液）１０を抽出する。この骨髄液１０には、多量の脂肪細胞１１等と、少量の骨髄間葉系幹細胞（細胞）１２とを備える骨髄細胞１３が含まれている。
続いて、この骨髄液１０を−２０℃に設定された冷凍庫１４内に挿入して所定の期間（例えば１ヶ月）保管する。このとき、骨髄間葉系幹細胞１２と脂肪細胞１１等とでは凍結に対する耐性が異なり、脂肪細胞１１は、細胞内の水分が凍結することによって体積が膨張し、又は氷塊が生成することによって細胞膜等が損傷して死滅する。
一方、骨髄間葉系幹細胞１２は、脂肪細胞１１よりも凍結耐性を有しており、冷凍しても生存率が高いため多くの骨髄間葉系幹細胞１２の生存状態が維持される。
以上で、凍結する工程（Ｓ０１）を終了する。
なお、凍結する工程として、上述のように新鮮に採取した骨髄液をそのまま冷凍する方法以外に、初期培養した後にトリプシン処理し、細胞浮遊液の状態にしてこれを凝縮し（遠心分離後に上澄み液を捨てる）、これを冷凍するという方法をとってもよい。細胞密度を高くすることで、冷凍によって全ての細胞が死滅するリスクを減らすことが可能となる。
【０００９】
次に、解凍する工程（Ｓ０２）について説明する。
所定の時間経過後に、凍結する工程によって得られた骨髄液１０を冷凍庫１４内から取り出して、室温にて徐々に自然解凍する。このとき、脂肪細胞１１内の凍結した水分、又は氷塊が解凍するが、細胞膜等が損傷しているので、再び活性化することはない。一方、骨髄間葉系幹細胞１２は、凍結状態下でも生存しているので、再び活性化する。
こうして、生存している骨髄間葉系幹細胞１２と、死滅した脂肪細胞１１等が混合した骨髄細胞１３を含む骨髄液１０ａが得られる。
【００１０】
続いて、解凍して得られた骨髄液１０内の骨髄間葉系幹細胞１２を培地とともに容器内に投入して培養する工程（Ｓ０３）について説明する。
得られた骨髄液１０ａを、図３に示すように遠心分離等による濃縮処理を行って、比重の重い骨髄細胞１３を抽出して分離する。こうして得られた骨髄細胞１３と、骨髄間葉系幹細胞１２を培養するための培地とを培養容器１４に投入する。そして、所定の温度（例えば、３７±０．５℃）及びＣＯ２濃度（例えば、５％）等の培養条件下にて培養する。
【００１１】
このとき、骨髄間葉系幹細胞１２以外の細胞は死滅しているので培地には接着しない。そのため、所定の培養期間経過後毎に培地を交換する際、死滅した脂肪細胞１１等は、古い培地とともに流されてしまう。そこで、培地交換を繰り返す度に培養細胞中の骨髄間葉系幹細胞１２の比率が増大する。
こうして、所定の期間終了後、培養する工程（Ｓ０３）を終了する。
【００１２】
この培養方法によれば、骨髄液１０を凍結させるので、凍結耐性の高い骨髄間葉系幹細胞１２を生存させながら凍結耐性の低い脂肪細胞１１等を死滅させることができる。また、この死滅した脂肪細胞１１等は培地に接着することができないので、培地交換の際に古い培地とともに洗浄して除去され、その結果、骨髄間葉系幹細胞１２の比率の極めて高い培養細胞を得ることができる。
さらに、必要に応じて骨髄液１０を解凍すればよいので、骨髄液１０を凍結させた状態で保管しておくことができる。
【００１３】
なお、本発明の技術範囲は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
例えば、骨髄液を凍結する際に設定温度に対して所定の降温速度で徐々に凍結させてもよい。また、解凍の際に電子レンジを用いてもよい。弱いながらも電子線の効果で殺菌効果を高めることができる。
さらに、凍結と解凍を複数回繰り返してもよい。脂肪細胞等を死滅させる作用は凍結過程に発生するので、より確実に死滅させることができる。
【００１４】
【発明の効果】
以上説明した本発明においては以下の効果を奏する。
本発明の培養方法によれば、体液から培養を所望する細胞を分離して培養するので、所望の量の細胞を短時間で効率良く得ることができ、培養工程の短縮化を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る一実施形態における培養方法のフローを示すブロック図である。
【図２】本発明に係る一実施形態における工程を説明する図である。
【図３】本発明に係る実施形態における工程を説明する図である。
【符号の説明】
１０、１０ａ  骨髄液（体液）
１２  骨髄間葉系幹細胞（細胞）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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