(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該方法を実施のキットを提供する。【解決手段】（ａ）試料を、該インヒビターに特異的なレセプター、ならびに該インヒビターのリガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲートと合わせる工程、（ｂ）該コンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工程、ならびに（ｃ）該インヒビターの存在または量と相関させる工程、を含む、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するための免疫測定法、ならびに（ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、（ｂ）該インヒビターのリガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲートをパッケージした組み合せで含有する、テストキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該インヒビターに特異的なレセプター、ならびに該インヒビターのリガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲートと合わせる工程、
（ｂ）該シグナル生成部分により生じるシグナル生成をモニターすることにより、該コンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工程、ならびに
（ｃ）該シグナル生成を試料中の該インヒビターの存在または量と相関させる工程、
を含む、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するための免疫測定法。
【請求項２】
該プロテアーゼインヒビターが、サキナビル、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびリトナビルからなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項３】
（ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、および
（ｂ）該インヒビターのリガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲート
をパッケージした組み合せで含有してなり、
（ｉ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該プロテアーゼインヒビターのリガンドおよびミコフェノール酸を含有するコンジュゲート、該プロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、ＩＭＰ、ＮＡＤならびにＩＭＰＤＨと合わせる工程、
（ii）ＮＡＤＨの生成をモニターする工程、ならびに
（iii）ＮＡＤＨの生成を試料中の該プロテアーゼインヒビターの存在または量と相関させる工程、
を含む非アイソトープ性免疫測定法に使用され得る、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するためのテストキット。
【請求項４】
該プロテアーゼインヒビターが、サキナビル、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびリトナビルからなる群より選ばれてなる請求項３記載のテストキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、液体媒体中の解析物を測定する技術分野に関する。より詳細には、生物学的試料中の治療薬を測定するための免疫測定法に関する。特に、本発明は、生物学的試料中のプロテアーゼインヒビター、特にＨＩＶプロテアーゼインヒビターを検出するための非アイソトープ性免疫測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶプロテアーゼインヒビターは、１９９５年に第１号のサキナビルが市場に導入されて以来、ＡＩＤＳ患者の健康管理に対して意義のある効果を与えてきた重要な新薬である。他のプロテアーゼインヒビターの例には、アンプレナビル（amprenavir）、インジナビル（indinavir ）、ネルフィナビル（nelfinavir）およびリトナビル（ritonavir ）がある。これらは、逆転写酵素インヒビターなどの他の抗ＨＩＶ薬や、他のＨＩＶプロテアーゼインヒビターと併用すると特に有効である。これらの新しい治療法が顕著な成功を収めているにもかかわらず、プロテアーゼインヒビターをモニターするための治療薬試験法があれば、治療成績はもっと改善されるであろうという強い示唆がある。すべての患者がプロテアーゼインヒビター併用療法に最適に応答するわけではない。最初は応答を示した患者でさえ、ＨＩＶウイルスの変異率が非常に高いことから薬剤耐性を発現しうる。しかしながら、プロテアーゼインヒビターの血漿レベルと、ウイルス量の低下およびＣＤ４細胞数の増加に基づく治療有効性との間に明白な関係があることが示されている。薬剤には、広範に代謝され、複雑な薬剤間相互作用を行うという問題がある。その結果、極めて複雑な薬剤動態が生じ、用量と、任意の特定患者における任意の特定時間での残留薬剤レベルとの間に予測不可能な強い要因がもたらされる。治療薬のモニタリングにより、薬剤の用量は、個々の患者毎に決定することができ、ウイルスが抑制される可能性がずっと高くなる。しかしながら、プロテアーゼインヒビターの常套的治療薬モニタリングには、高処理臨床解析装置に適合しうる簡単な自動化試験法が利用できることが必要である。現在、プロテアーゼインヒビターの治療薬モニタリングに関する報告のほとんどは、ＨＰＬＣ法を使用したものであるが、これは、時間、労力および費用がかかる。最近、サキナビルに関する放射免疫測定（ＲＩＡ）法が報告された。しかしながら、この方法は、高処理治療薬モニタリングに適合しえないことがあり、すべてのＲＩＡ法と同様に、アッセイで使用したラジオアイソトープ標識に関する安全性や廃棄物処理の管理の問題がある。したがって、治療薬モニタリングの最も望ましいアッセイの形態は、非アイソトープ性免疫測定法であり、このような形態の方法は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターのモニタリングに関して、これまでに知られていない。
【０００３】
ＨＰＬＣは、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターのモニタリング方法の１つとして使用されてきた。最近の文献において、非特許文献１および非特許文献２の２件の報告には、ヒト血漿中において数種類のプロテアーゼインヒビターを同時測定するためのＨＰＬＣアッセイが記載されている。あらゆる免疫測定法の中でＨＩＶプロテアーゼインヒビター関する公知文献はたった１件しかない。今年より前では、サキナビルのためのＲＩＡ、その患者サンプルでの使用およびＨＰＬＣ法との比較が、非特許文献３に記載されている。しかしながら、非アイソトープ性代替法の教示も示唆もなかった。
【０００４】
化学的アッセイおよび生物学的アッセイは、通常、目的の解析物を、所定の非限定的な量の１種以上のアッセイ試薬と接触させる工程、得られた生成物（検出産物）の１種以上の物性を測定する工程、および典型的には被検試料に期待される範囲の既知量の目的解析物を含有する標品試料または較正試料から求められる関係を用い、測定値を元の試料中に存在する解析物の量と相関させる工程を含む。典型的には、検出産物は、１種以上のアッセイ試薬により供給される１種以上の検出可能な標識を含有する。一般的に使用される標識の例としては、125 Ｉおよび32Ｐなどのラジオアイソトープ標識、ペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼなどの酵素ならびに酵素基質標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ニトロキシド遊離ラジカルなどの電子スピン共鳴標識、抗体および抗原などの免疫反応性標識、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンなどの結合ペアの一方の構成物である標識、ならびにルテニウムビピリジル部を含有するものなどの電子化学発光標識が挙げられる。サンドイッチアッセイは、典型的には、最終的に分離に使用する第一アッセイ試薬、例えば、抗体、抗原または結合ペアの一方の構成物と、検出可能な標識を供給する第二アッセイ試薬との間に目的解析物がサンドイッチされた複合体を形成する工程を含む。競合アッセイは、典型的には、目的解析物とこの解析物の類似体の両方が別の試薬、例えば抗体の結合部位に関して競合する系を含み、このとき、解析物、類似物または結合試薬のうち１つは、検出可能な標識を有する。
【非特許文献１】Poirier ら、Therapeutic Drug Monitoring 22, 465-473, 2000
【非特許文献２】Remmelら、Clinical Chemistry 46, 73-81, 2000
【非特許文献３】Wiltshire ら、Analytical Biochemistry 281, 105-114,2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高処理量の治療薬モニタリングに適合し、安全であり、廃棄物処理の管理を必要としない、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該方法を実施するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明の要旨は、
（１）  （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該インヒビターに特異的なレセプター、ならびに該インヒビターのリガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲートと合わせる工程、
（ｂ）該シグナル生成部分により生じるシグナル生成をモニターすることにより、該コンジュゲートに結合した該レセプターの量を測定する工程、ならびに
（ｃ）該シグナル生成を試料中の該インヒビターの存在または量と相関させる工程、
を含む、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するための免疫測定法、
（２）  該レセプターが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体からなる群より選ばれる前記（１）記載の方法、
（３）  該プロテアーゼインヒビターが、サキナビル、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびリトナビルからなる群より選ばれる前記（１）記載の方法、
（４）  該レセプターが、直接または間接的に固相に結合している前記（１）記載の方法、
（５）  該シグナル生成部分が、酵素、蛍光発生化合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、粒子、レポーター基、酵素インヒビターおよびポリペプチドキャリアからなる群より選ばれる前記（１）記載の方法、
（６）  （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該プロテアーゼインヒビターのリガンドおよびミコフェノール酸を含有するコンジュゲート、該プロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、ＩＭＰ、ＮＡＤならびにＩＭＰＤＨと合わせる工程、
（ｂ）ＮＡＤＨの生成をモニターする工程、ならびに
（ｃ）ＮＡＤＨの生成を試料中の該プロテアーゼインヒビターの存在または量と相関させる工程、
を含む、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するための非アイソトープ性免疫測定法、
（７）  （ａ）ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、および
（ｂ）該インヒビターのリガンドおよび非アイソトープ性シグナル生成部分を含有してなるコンジュゲート
をパッケージした組み合せで含有する、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを測定するためのテストキット、
（８）  該レセプターが、抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体からなる群より選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、
（９）  該プロテアーゼインヒビターが、サキナビル、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビルおよびリトナビルからなる群より選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、
（１０）  該レセプターが、直接または間接的に固相に結合している前記（７）記載のテストキット、
（１１）  該シグナル生成部分が、酵素、蛍光発生化合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、粒子、レポーター基、酵素インヒビターおよびポリペプチドキャリアからなる群より選ばれてなる前記（７）記載のテストキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、高処理量の治療薬モニタリングに適合し、安全であり、廃棄物処理の管理を必要としない、新規なＨＩＶプロテアーゼインヒビターの検出のための非アイソトープ性免疫測定法および該方法を実施するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの免疫測定法を包含し、該方法は、該プロテアーゼインヒビターを含有すると思われる試料を、該インヒビターに特異的なレセプター、および該インヒビターのリガンドまたは類似体と非アイソトープ性標識とからなる非アイソトープ性コンジュゲートとともにインキュベートする工程、該コンジュゲートに結合するレセプターの量を測定する工程、ならびに結合したパートナーの量を試料中のプロテアーゼインヒビターの量と相関させる工程を含む。レセプターおよびコンジュゲートとの試料のインキュベーションは逐次的または同時に行いうる。試料は、好ましくは全血、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液または涙などの体液である。レセプターまたは結合パートナーは、他のプロテアーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター代謝物または同時投与された非プロテアーゼインヒビター薬剤から特定のプロテアーゼインヒビターを選択しうる（selective ）抗体でありうる。あるいはまた、本発明の別の局面では、レセプターは、構造的に関連するプロテアーゼインヒビターおよび／またはプロテアーゼインヒビター代謝物の一群と反応しうる抗体である。非アイソトープ性コンジュゲートは、非アイソトープ性標識とリガンドとの共有結合複合体または非共有結合複合体であり、リガンドは、プロテアーゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター誘導体およびプロテアーゼインヒビター類似体からなる群より選ばれる。非アイソトープ性標識の例としては、酵素、蛍光発生化合物、化学発光物質、電気化学的メディエーター、粒子、ビオチンなどのレポーター群、ミコフェノール酸などの酵素インヒビター、およびタンパク質、糖タンパク質、多糖と核酸との複合体などの巨大分子担体が挙げられる。本発明の免疫測定法は、固相を用いた不均一形態で行ってもよく、溶液または懸濁液を用いた均一形態で行ってもよく、どちらのアッセイ形態も当該技術分野において周知である。好ましい不均一系形態の１つにマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法）がある。好ましい均一系形態には、微粒子凝集、および非競合阻害免疫測定法、例えば２０００年６月２６日に出願された、Dornらの米国特許出願第０９／６０３，６４６号明細書に記載されたミコフェノール酸／イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ法が挙げられる。
【０００９】
ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの非アイソトープ性免疫測定法は、不均一形態でも均一形態でも構築しうる。不均一系免疫測定法は、結合した解析物を遊離の解析物から、または結合した標識を遊離の標識から固相分離することが特徴である。固相は、チューブ、プレート、ビーズまたは細片などの当該技術分野において周知の種々の形態をとりうるが、これらには限定されない。特に好ましい形態の１つにマイクロタイタープレートがある。固相材料は、様々なガラス、ポリマー、プラスチック、紙または膜から構成されうる。特に好ましくは、ポリスチレンなどのプラスチックである。不均一系免疫測定法は、競合形態であってもよく、非競合形態、すなわちサンドイッチ形態であってもよい。
【００１０】
ＨＩＶプロテアーゼインヒビターなどの低分子量解析物には、競合形態が好ましい。ＨＩＶプロテアーゼインヒビター用の競合不均一系免疫測定は様々な方法で行いうる。例えば、一形態では、プロテアーゼインヒビターに対する抗体を固相に固定した後、ある一定数のレセプター結合部位に関して競合する試料およびコンジュゲートとともにインキュベートする。次いで、結合しなかった解析物およびコンジュゲートを除き、結合したコンジュゲートの量を測定する。結合したコンジュゲートの量は、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター量に反比例する。当該技術分野において周知の方法により、既知量のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを用いて用量応答較正曲線を作成する。
【００１１】
本発明の別の好ましい形態は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター誘導体とタンパク質などの巨大分子担体物質とのコンジュゲートを最初に調製する工程を含む。このようなコンジュゲートの調製は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）輸送タンパク質とサキナビル誘導体とのコンジュゲートに関して本明細書の実施例１〜３に記載している。このタイプのコンジュゲートは、共有結合固定化または受動固定化（passive immobilization）を用いて任意の固相に固定しうる。実施例４には、マイクロタイタープレート上への受動固定化について記載している。コンジュゲートでコートしたプレートの調製後、レセプターを所定の至適希釈度で、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター含有試料とともに添加する。その結果、固相に結合したコンジュゲートと溶液中のＨＩＶプロテアーゼインヒビターとが、ある限られた数のレセプター結合部位に関して競合する。インキュベーション後、固相を洗浄して未結合レセプターを除去する。最後に、標識を加え、結合した抗体の存在を検出するのに使用する。実施例６に記載したようなＥＬＩＳＡアッセイの場合、標識として特定の結合レセプター種に対する二次抗体または二次レセプター、例えばウサギ抗ヒツジ抗体が挙げられ、これは酵素標識、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートする。他の酵素標識および二次結合物質は、マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡの技術分野の当業者とって自明である。最初に記載したアッセイ形態と同様、結合した酵素コンジュゲートの量は、試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター量に反比例する。標準的な方法を用い、既知量のＨＩＶプロテアーゼインヒビターを用いて用量応答較正曲線を作成し、次いで、未知試料中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター量を該較正曲線と相関させる。
【００１２】
本発明の好ましい均一系微粒子免疫測定法およびテストキットは、血清、血漿、全血、尿および唾液中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既製の（ready-to-use）液体試薬を含有する二試薬系を含む。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、自動解析装置を用いて簡便に測定される。この特定のアッセイ形態では、特定のプロテアーゼインヒビターに対する抗体を、共有結合固定化または受動固定化を用いて微粒子上に負荷し、このプロテアーゼインヒビターの誘導体をアミノデキストランなどの任意の巨大分子に結合させる。以下、これを薬剤コンジュゲートという。薬剤コンジュゲートと血清試料中の任意の薬剤との間には、微粒子上のある限られた量の特異的抗体結合部位への結合に関して競合反応が起こる。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、薬剤コンジュゲートの微粒子上の抗体への結合により誘導され、試料中の薬剤の存在により阻害される。微粒子の相互作用は、溶液の吸光度により測定され、それは溶液の濁度と関連している。粒子と薬剤コンジュゲートが架橋すると濁度が高くなる（吸光度が高くなる）。遊離の薬剤が粒子上の抗体に結合すると、濁度は低くなる（吸光度が低くなる）。
【００１３】
均一系微粒子免疫測定法およびテストキットの別の形態は、血清、血漿、全血、尿および唾液中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既製液体試薬を含む。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、自動解析装置を用いて簡便に測定される。このアッセイ形態では、ウシ血清アルブミンなどの任意の巨大分子に結合した薬剤誘導体を、共有結合固定化または受動固定化を用いて微粒子上に負荷する。この特定のプロテアーゼインヒビターに対する抗体をバッファー系に配合する。微粒子上の薬剤コンジュゲートと血清試料中に存在する任意の薬剤との間には、反応溶液中のある一定量の特異的抗体への結合に関して競合反応が起こる。溶液中の微粒子の動力学的相互作用は、薬剤コンジュゲートの抗体への結合により誘導され、試料中の薬剤の存在により阻害される。微粒子の相互作用は、溶液の吸光度により測定され、それは溶液の濁度と関連している。粒子と薬剤コンジュゲートが架橋すると濁度が高くなる（吸光度が高くなる）。遊離の薬剤が粒子上の抗体に結合すると、濁度は低くなる（吸光度が低くなる）。
【００１４】
本発明の別の免疫測定形態では、蛍光偏光免疫測定法およびテストキットは、蛍光偏光の原理を用いる血清、血漿、全血、尿および唾液中のＨＩＶプロテアーゼインヒビター検出のための既製液体試薬を含む。このアッセイ形態では、薬剤誘導体を発蛍光団でタグ化または標識し、この特定のプロテアーゼインヒビターに対する抗体をバッファー系に配合する。蛍光トレーサーを有する薬剤と血清試料中の任意の薬剤との間には、反応溶液中のある一定量の特異的抗体への結合に関して競合反応が起こる。
【００１５】
蛍光分子または発蛍光団に適切な波長（励起波長）の光を照射すると、長波長（発光波長）でいくらかの発光が見られる。発光が偏光しているか否かは、溶液中での発蛍光団の回転自由度に依存する。フルオレセインなどの小さな分子は、発光前に迅速に回転し得、これにより発光の偏光解消が生じる。これに対し、フルオレセイン標識タンパク質などの蛍光巨大分子の回転はずっと遅い。したがって、巨大分子は、励起と発光の間にごくわずかしか回転せず、発光は偏光する。蛍光偏光は、薬剤濃度の再現可能な相関的要素であり、試料中の薬剤濃度の定量に好適である。
【００１６】
本発明により意図される別の免疫測定形態は、抗体または別の結合レセプターに結合すると阻害される電気的活性な標識の使用に基づく均一系電気化学的免疫測定法である。好ましい電気的活性標識は、ビピリジルオスミウム複合体などの可逆的酸化還元標識である。シグナルの増幅は、酸化還元酵素やインターデジタル・アレイ（interdigitated array）（ＩＤＡ）電極を用い、これらのメディエーターを生体電気触媒的に（bioelectrocatalytically ）に酸化還元サイクルを行うことにより達成しうる。均一系アッセイに使用する形態は、逐次的結合阻害である。アッセイ対象の試料は、抗体または他の結合レセプターと混合される。抗原が存在する場合、結合が生じる。未結合の抗体／結合レセプターが残っていれば、それを電気的活性標識で標識した抗原と混合する。次いで、電気的活性化合物で標識された未結合の抗原を電極表面で測定する。
【００１７】
試料中に解析物が存在しない場合、より多量の抗体または結合レセプターが、抗原標識電気的活性化合物と結合する。これにより、電気的活性化合物の阻害が最大となる。試料中の解析物濃度が高いと、電気的活性化合物の阻害はほとんどないか、あるいは全くない。したがって、電気化学的応答と解析物濃度との間には明確な関連性がある。
【００１８】
本発明のさらにまた別の免疫測定形態において、試料中に存在する解析物は、キャピラリー表面上に固定された抗体の結合部位に関して、解析物−酵素コンジュゲートと競合する。未結合解析物−酵素コンジュゲートは検出ゾーンに向かって流れ、そこで該酵素は基質を電気的活性産物に変換する。次いで、該産物を電極で電気化学的に検出する。試料中の解析物濃度が高いと、未結合のまま検出ゾーンに向かって流れる解析物−酵素コンジュゲートが多くなる。これにより、酵素コンジュゲートにより生成される電気的活性産物の濃度は高くなり、電極で検知される電流は高くなる。したがって、検知される電流と解析物濃度との間には明確な関連性がある。
【００１９】
本発明の別の局面は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの測定のために本発明のアッセイ法を簡便に行うのに有用なキットに関する。本発明の多様性を高めるため、本発明の方法に有用な試薬は、同じ容器または別個の容器内にパッケージした組み合せで、液体または凍結乾燥の形態で提供され、それにより該方法およびアッセイを実質的に最適化することができる。該試薬は、その架橋反応性および安定性に応じて、それぞれ別個の容器に入れてもよく、種々の試薬を１個以上の容器内に合わせて入れることもできる。
【００２０】
本発明の試薬キットは、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに特異的なレセプター、およびこのインヒビターのリガンドと非アイソトープ性シグナル生成部分とを含有してなるコンジュゲートを含む。試薬は液体のままであってもよく、凍結乾燥してもよい。このキットは、本発明のアッセイを行うのに有用な較正物質および対照物質をさらに含みうる。レセプターまたはコンジュゲートは、固体支持体に固定されていてもよい。
【００２１】
解析物、すなわちＨＩＶプロテアーゼインヒビターまたは代謝物を適当量含有すると思われる試料はいずれも本発明の方法により解析することができる。試料は、典型的には、例えば尿、全血、血漿、血清、唾液、精液、糞便、喀痰、脳脊髄液、涙、粘液などの、宿主由来の体液などの水性溶液であるが、好ましくは血漿または血清である。試料は、所望により前処理することができ、該アッセイを妨げない簡便な任意の媒体中で調製することができる。水性媒体が好ましい。
【００２２】
抗体（または好ましくはレセプター）とは、解析物の特異的結合パートナーを意味し、リガンドに対し、他の物質を除外する程度の特異的結合親和性を有する任意の物質または物質群である。
【００２３】
リガンドとは、解析物に対する抗体の結合親和性に関して、解析物と本質的に同じ挙動を示す任意の物質または物質群を意味し、任意のＨＩＶプロテアーゼインヒビターもしくはその誘導体および異性体を含むものとする。
【００２４】
較正物質とは、既知量の測定対象解析物を含有する任意の標準物質または参照物質を意味する。解析物を含むと思われる試料および較正物質を同様の条件下でアッセイする。次いで、未知試料について得られた結果を標品について得られた結果と比較することにより解析物濃度を算出する。これは、較正曲線や図２に示すような用量応答曲線を作成することによってよく用いられる手段である。
【００２５】
本発明のアッセイでは、種々の補助物質を使用することが多い。例えば、通常、アッセイ媒体にはバッファーとともにアッセイ媒体の安定化剤およびアッセイ成分が存在する。これらの添加剤に加えて、アルブミンなどの追加のタンパク質や界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤等が含まれる場合も多い。
【００２６】
ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに関する明細書および特許請求の範囲における記載はいずれも、該インヒビターに加え、生物学的な意味において該インヒビターとしての挙動を示すその生物学的活性代謝物および治療上活性な代謝物ならびに生物学的活性誘導体および治療上活性な誘導体を含むことが意図されることを理解されたい。
【００２７】
誘導体という用語は、１つ以上の化学反応により親化合物または親分子から作製される化合物または分子をいう。
【００２８】
本明細書に記載のように、検出用分子、標識またはトレーサーは、非放射活性の同定タグであり、担体物質または担体分子と結合させて解析物を検出するのに使用しうる。標識は、連結部または架橋部により担体分子に直接または間接的に結合しうる。標識の例としては、β−ガラクトシダーゼおよびペルオキシダーゼなどの酵素、ローダミンおよびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光化合物、ならびにジオキセタンおよびルシフェリンなどの発光化合物が挙げられる。
【実施例】
【００２９】
実施例１
２−［３（Ｓ）−［（Ｌ−アスパラギニル）アミノ］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−４−フェニルブチル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−３（Ｓ）−カルボキサミド（ＩＩ）の調製
５４８ｍｇのシス−２−［３（Ｓ）−［［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−アスパラギニル］アミノ］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−４−フェニルブチル］−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−３（Ｓ）−カルボキサミド（Ｉ、米国特許第５，１９６，４３８号明細書）を含有する５０ｍｌのメタノール溶液を含むフラスコに、５８ｍｇの１０％パラジウム／カーボンを加えた。フラスコおよび内容物を水素雰囲気下に置き（パージ／排気サイクル５回）、次いで、内容物を攪拌下、水素圧１〜２気圧、室温で一晩放置した。薄層クロマトグラフィー解析（シリカゲルプレート、１０％メタノール／クロロホルムで溶出）の後、ヨウ素チャンバにてプレートの染色を行うと、出発物質の消失が示され、より極性の高い新たなスポットが現れた。反応物をセライトパッドで濾過し、メタノールで洗浄した。濾液を回収し、減圧下で液体を蒸発させた。残渣を少量のメタノールに再度溶解し、濾過（０．２μ、Gelman Acrodisc ）し、蒸発乾固した。残渣を蒸留塩化メチレンに再度溶解させ、再度液体を蒸発させ（反復５回）、残渣を高真空下で２日間乾燥させ、白色／オフホワイト固体の生成物（ＩＩ）４５１ｍｇを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ：一致。ＦＡＢ（＋）ＭＳ：５１６（Ｍ＋Ｈ）。
【００３０】
実施例２
シス−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベンジル−３−［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−カルバモイル−エチルカルバモイル｝−酪酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（ＩＶ）の調製
アルゴン雰囲気下、氷水浴中で冷却した、５０ｍｇの生成物（ＩＩ）を含有する１０ｍｌの乾燥塩化メチレン（アルゴン雰囲気下、水素化カルシウムで蒸留）の攪拌溶液に、２４ｍｇ（１モル当量）の５−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−５−オキソ−ペンタノイルクロリド（ＩＩＩ、欧州特許出願第ＥＰ  ５０３４５４号および米国特許第５，２４８，６１１号明細書の記載と同様にして調製）を固体で一度に添加した。冷却しながら反応物を２時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー解析（シリカゲルプレート、１０％メタノール／塩化メチレンで溶出）により、反応の完結が示された。反応物を塩化メチレンで希釈し、０．１Ｎ塩酸水溶液中に注入し、１０％炭酸ナトリウムでｐＨを約５に調整した。混合液を充分に振盪し、相分離させた。水相をさらに１０％炭酸ナトリウムでｐＨ約７まで塩基性化し、塩化メチレンで再度抽出した。有機性抽出物を合わせ、水（１回）、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（３回）、飽和塩化ナトリウム水溶液（１回）で洗浄し、硫酸ナトリウムでの乾燥、濾過および液体の蒸発を行った。ゲル様残渣を高真空下、室温で数時間乾燥し、白色固体および一部塩化メチレンとの溶媒和物として生成物（ＩＶ）５７ｍｇを得た。1 Ｈ−ＮＭＲ：一致。ＦＡＢ（＋）ＭＳ：７２７（Ｍ＋Ｈ）。ＨＲ（＋）ＦＡＢ  ＭＳ：計算（Ｍ＋Ｈ）値７２７．４０３１、測定値７２７．４０１３。
【００３１】
実施例３
［シス−１−オキソ−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベンジル−３−［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−カルバモイル−エチルカルバモイル｝−ブチル］−ＢＳＡ（Ｖ）の調製
氷水浴中で冷却した、３８０ｍｇのウシ血清アルブミン（Miles-Pentex, Fraction V）を含有する７．６ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）、ｐＨ７．５の攪拌溶液に、１．９ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を５〜１０分かけて滴下した。得られた透明な溶液のうち１ｍｌを取り出し、ＢＳＡを対照とした。約３４０ｍｇのＢＳＡを含有する２０％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ７．５）からなる残りの溶液に、全量約１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した７．８ｍｇ（約２．１モル当量）の生成物（ＩＶ）を添加し、生成物（ＩＶ）と、ＢＳＡを含有する３２％ＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ７．５とを反応させた。反応物を一晩攪拌し、温度を室温にした。得られた溶液を３〜１５ｍｌ容透析カセット（Pierce Chemical Co., Slide-A-Lyzer（登録商標）、分子量１０Ｋカットオフ）に移し、順に３０％、２０％、１０％のＤＭＳＯ／５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ７．５（各１Ｌ）に対して室温でそれぞれ約２時間、次いで５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ７．５に対して室温で一晩、さらに５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ７．５（５回交換）に対して３日間かけて逐次的に透析した。保持物質をカセットから取り出し、実質的に無色透明の溶液のコンジュゲート（Ｖ）１９ｍｌを得た。ＢＳＡ対照を標準として使用し、タンパク質濃度を測定すると（クーマシーブルー、Bradford変法）、１８．６ｍｇ／ｍｌであった。
【００３２】
実施例４
抗血清およびサキナビル−ＢＳＡコンジュゲート濃度範囲
本実験ではCorning マイクロＥＬＩＳＡプレート（９６穴）を使用した。サキナビル−ＢＳＡコンジュゲートを０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ９．５中で２μｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌのバッファーを、プレートの第１列以外の各列のウェルに入れた。第１列には、２００μｌの２μｇ／ｍｌサキナビル／ＢＳＡ溶液を入れ、１２チップマイクロピペッターを用いて第１列から１００μｌを全てのカラムの第２列に同時に移した。ピペッティングを３回繰り返すことにより第２列の内容物を混合した。第２列から１００μｌを第３列に移し、混合した。この操作をプレートの最終列まで繰り返した。混合後、最終列から１００μｌを取り出し、廃棄した。プレートを加湿したＺｉｐ−Ｌｏｃ袋に入れ、１時間３７℃でインキュベートした。
【００３３】
インキュベーション後、インキュベーターと袋からプレートを取り出し、空にして廃棄用容器に入れた。２００μｌのＰｏｓｔＣｏａｔ溶液を各ウェルに加えた。この溶液は、１％ゼラチン水解物、２％スクロース、０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．１７％Ｔｗｅｅｎ  ２０および０．０２％チメロサール保存料から構成され、すべての試薬はSigma Chemicals 社製である。プレートを加湿した袋に戻し、インキュベーター内に１時間放置した。
【００３４】
インキュベーションの間、サキナビル抗血清希釈液（H.R. Wiltshire、Anal. Biochem. 281, 105-114, 2000 参照のこと）を以下のようにして調製した。血清バイアルを温水中で解凍し、２μｌの１０％チメロサールを保存料として添加した。これを気泡が生じないように静かに混合した。Falconフレキシブルマイクロタイタープレートを用い、１１０μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．２％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有リン酸緩衝生理食塩水）を第１列のウェル以外の各ウェルに添加することにより血清希釈物を調製した。第１列のウェルには１１０μｌの希釈度１：１００の血清含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを添加した。第２列には、８口マイクロピペッター（8 place micropipettor ）を用いて１００μｌの希釈度１：１００の血清含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを添加し、ピペッティングを３回繰り返すことにより混合した。次いで、第２列から１１０μｌを第３列に移し、混合を繰り返した。この操作をプレートの各列について繰り返した。
【００３５】
コートしたプレートのインキュベーション終了後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、最後に吸引することによりコートしたプレートを空にした。８口マイクロピペッターを用い、希釈プレートの第１２カラムから１００μｌをコートしたプレートの第１２カラムに移した。次いで、第１１カラムから１００μｌを移した（以下同様）。希釈抗体を移し終えた後、コートしたプレートを再度袋に入れて３７℃で１時間インキュベートした。
【００３６】
インキュベーション完了の５分前に、Zymed ウサギ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中で１：２０００に希釈し、静かに攪拌して充分に混合した。インキュベーション時間終了時、Bio Tek Instruments, Inc. 社製 EL 404 プレート洗浄器を用い３００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎでプレートを４回洗浄した。次いで、１００μｌの希釈ウサギ抗ヒツジＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを各ウェルにピペッティングし、プレートを再度袋に入れて１時間インキュベートした。
【００３７】
１時間後、プレートをインキュベーターと袋から取り出し、プレート洗浄器で６回洗浄した。次いで、１００μｌのＫ−ＢＬＵＥ酵素基質（Neogen, Inc.）を各ウェルに添加し、暗所で５分間、発色させた。１００μｌの１Ｎ塩酸を各ウェルに添加することにより発色を止めた。Molecular Devices, Inc, 社製 ThermoMaxプレートリーダーを用い、各ウェルの光学密度を２つの波長、４０５ｎｍおよび４５０ｎｍで測定した。４５０ｎｍでの目盛りにより、このリーダーの測定能は、高濃度のコンジュゲートおよび抗血清では目盛りが振り切れた（exceed）。したがって、ＯＤ405 測定値を用い、両波長での目盛りの線形最小二乗法回帰を用いる周知の方法により外挿ＯＤ450 を算出した。
【００３８】
各希釈度の抗血清について、光学密度を各サキナビル／ＢＳＡ濃度に対して、それぞれＹ軸、Ｘ軸にプロットすることにより得られたデータを解析した。これにより、１２個の曲線が得られた。次に、光学密度対血清希釈度を各サキナビル／ＢＳＡ濃度に対してプロットし、８つの曲線を含むグラフを得た。後者のグラフにより、サキナビル／ＢＳＡは、１：１０００以下の抗サキナビル血清希釈物と併用した場合、０．１２５μｇ／ｍｌ以下の濃度で顕著なプロゾーン効果を示すことがわかった。これらの２つのグラフから、６２．５ｎｇ／ｍｌのコンジュゲートおよび１：１２，８００希釈度の抗血清を併用することにした。
【００３９】
実施例５
アッセイ特異性の測定
上記と同じ条件下で、ＥＬＩＳＡプレートを上記濃度のサキナビル−ＢＳＡでコートした。プレートをポストコート（ＰｏｓｔＣｏａｔ）溶液でコートしている間に、１ｍｌ容９６穴プレート中でサキナビル、リトナビル、インジナビルおよびネルフィナビルの段階３倍希釈物を調製した。すべての薬剤は、絶対メタノールで１ｍｇ／ｍｌとし、使用時まで４℃で保存した。簡単には、まず各薬剤１μｌをプレートの第１列のウェルに移した。なお、第１列の各ウェルは５００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを含み、他の列のウェルはすべて２００μｌの同バッファーを含んだ。混合後、４つのカラムのそれぞれの第１列から１００μｌを第２列に移し、混合した。この操作を、各列について第７列が完了するまで繰り返した。第８列はバッファーのみを含み、各薬剤のゼロ濃度とした。
【００４０】
ポストコートインキュベーションの終了時、コートしたプレートを洗浄し、５０μｌの溶液を希釈プレートのＨ列からコートしたプレートのＨ列に移し、この操作を４チップマイクロピペッターを用いてＧ列からＡ列まで繰り返した。この操作の終了後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１：１２，８００に希釈した５０μｌのサキナビル抗血清を、コートしたプレートの各ウェルに添加した。プレートを上述のようにしてインキュベートした。１時間後、プレートを４回洗浄し、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで１：２，０００に希釈した１００μｌのZymed ウサギ抗ヒツジＩｇＧ／ＨＲＰを添加し、上述のようにしてインキュベートした。さらにプレートを上述のようにして処理した。４５０ｎｍでの光学密度の読み取りにより、サキナビルでは用量応答曲線が得られ、ネルフィナビルでは応答が少なく、その他の薬剤では用量応答曲線は観察されなかった。これらのデータから、ネルフィナビルと交差反応した抗血清は０．４％程度と算出された。
【００４１】
実施例６
血清環境でのアッセイ性能
本実施例は、いくつかの変更を行った以外は実施例５と同様にして行う。評価した薬剤はサキナビルであり、薬剤の希釈剤は、１００％正常ヒト血清とした。したがって、最後のアッセイは、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで希釈した抗血清を半量（容積比）を加えた５０％ヒト血清において行った。さらに、先の実施例で７段階の希釈を行ったようにして、本実施例では１５段階の希釈を行った。実施例５においてゼロ濃度でない最低濃度の薬剤ではゼロ濃度の約５０％の阻害を示したため、完全な阻害曲線を得るために希釈工程を増やす必要があった。すべての薬剤濃度について３連の実験を行った。各薬剤濃度での３つのウェルの平均およびエラーバーを用いてデータを図式化し、図２に示す用量応答曲線を得た。グラフに示すように、アッセイは、１ｍｌあたり１ｎｇ未満から１μｇの範囲で行った。最低検出可能レベルは０．５ｎｇ／ｍｌと推定される。
【００４２】
本実施例は、酵素結合免疫測定法によるヒト血清中の薬剤量の測定における、サキナビル−ＫＬＨに対する抗血清の使用法を示すものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、実施例１〜３に記載の［シス−１−オキソ−４−｛１（Ｓ）−［１（Ｓ）−ベンジル−３−［３（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル−デカヒドロ−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−２−イル］−２（Ｒ）−ヒドロキシ−プロピルカルバモイル］−２−カルバモイル−エチルカルバモイル｝−ブチル］−ＢＳＡの合成を示す概略図である。
【図２】図２は、種々の濃度のサキナビルを含む試料を本発明に従ってアッセイした実施例６において得られた結果をプロットすることにより得られたグラフを示す図である。Ｘ軸はサキナビルの濃度であり、Ｙ軸は４５０ｎｍでの吸光度である。
【図１】
2004294443.tif 000002
【図２】
2004294443.tif 000003