(57)【要約】【課題】黒糖焼酎の製造時に生じる蒸留残渣を有効に利用することができると共に，チロシナーゼに対する優れた阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤及びその製造方法を提供すること。【解決手段】チロシナーゼ阻害剤の製造方法であって，該製造方法は，黒糖焼酎の製造工程において得られる蒸留残渣を吸着樹脂又は／及び活性炭よりなる吸着材に接触させて，上記蒸留残渣に含まれるチロシナーゼ阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤を，選択的に上記吸着材に吸着させる吸着工程と，上記吸着工程後の吸着材に極性有機溶媒と水とを含有する溶離液を反応させて，上記吸着材から上記チロシナーゼ阻害剤を溶出する溶出工程とを有すること。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒糖焼酎の製造工程において得られる蒸留残渣を吸着樹脂又は／及び活性炭よりなる吸着材に接触させて，上記蒸留残渣に含まれるチロシナーゼ阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤を，選択的に上記吸着材に吸着させる吸着工程と，
上記吸着工程後の吸着材に極性有機溶媒を含有する溶離液を反応させて，上記吸着材から上記チロシナーゼ阻害剤を溶出する溶出工程とを有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項２】
請求項１において，上記吸着工程と上記溶出工程との間に，上記吸着材を洗浄液にて洗浄して不純物を除去する洗浄工程を有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２において，上記溶離液は，１０重量部以上の上記極性有機溶媒と，９０重量部以下の水（但し，極性有機溶媒と水との合計を１００重量部とする）とを含有してなることを特徴とするチロシナーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項において，上記溶出工程時に，上記吸着材から溶出されるチロシナーゼ阻害剤をクロマトグラフィー法により分取することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法により得られたチロシナーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は，チロシナーゼの活性を阻害するチロシナーゼ阻害剤及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
従来より，例えば奄美大島では特産物の一つとして黒糖焼酎が製造されている。黒糖焼酎の製造工程は，例えば図３に示すごとく，複数の工程により行われる。
図３に示すごとく，まず，原料となる米を洗米し，蒸した後，麹菌を加えて米麹を得る。さらに，酵母菌と水とを加えて一次モロミを得る。続いてこの一次モロミと，原料としての黒糖を溶解して冷却したものとを混合して二次モロミを得る。
次に，二次モロミを蒸留し，原酒を作製し，熟成後，ブレンドして，度数調整を行い，最終的な黒糖焼酎を得る。
【０００３】
上記の黒糖焼酎の製造工程においては，上記二次モロミの蒸留時に，大量の蒸留残渣を生じる。この蒸留残渣は，利用価値がないため，そのほとんどは廃棄物として大量に処分されていた。
【０００４】
一方，近年，美白ブームという言葉で表現されるように，化粧品業界等では，主として紫外線やストレスなどが原因でできるシミ・ソバカス等の予防や改善をねらった美白化粧品が注目されている。
【０００５】
一般に，シミやソバカス等は，メラニン色素が過剰に生産されることによって引き起こされると考えられている。このメラニン色素は，例えば下記のようにして生成することが知られている。
即ち，まず紫外線やストレス等にさらされることにより，肌の中で活性酸素が発生し，該活性酸素の刺激によりメラノサイトが活性化される。
【０００６】
活性化したメラノサイト中では，酵素チロシナーゼが活性化し，このチロシナーゼがアミノ酸の一種であるチロシンからメラニン色素を合成する。そしてこのメラニン色素が過剰に蓄積することによって，シミやソバカスの原因となると考えられている。
【０００７】
そこで，チロシナーゼの活性を阻害するチロシナーゼ阻害剤を美白成分とする化粧品等によって，メラニン色素の産生を抑制し，シミ・ソバカスの予防や改善を図ることが行われてきた。
このようなチロシナーゼ阻害剤としては，例えばコウジ酸が知られている（非特許文献１参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
「コウジ酸のメラニン生成抑制作用について」，「フレグランスジャーナル」，フレグランスジャーナル社，１９８３年，通巻第６３号，ｐ．４０−４４
【０００９】
【解決しようとする課題】
しかしながら，上記のコウジ酸は，チロシナーゼの活性を阻害する効果を有するものの，その阻害効果は充分ではなかった。そのため，チロシナーゼに対する阻害活性が，より優れたチロシナーゼ阻害剤の開発が望まれている。
また，上述のように，上記黒糖焼酎の製造時には，大量の蒸留残渣が生じ，この蒸留残渣は，利用価値がほとんどなかったため，そのほとんどは廃棄処分されていた。そのため，上記黒糖焼酎の蒸留残渣を有効に利用できる方法が求められていた。
【００１０】
本発明は，かかる従来の問題点に鑑みてなされたもので，黒糖焼酎の製造時に生じる蒸留残渣を有効に利用することができると共に，チロシナーゼに対する優れた阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤及びその製造方法を提供しようとするものである。
【００１１】
【課題の解決手段】
第１の発明は，黒糖焼酎の製造工程において得られる蒸留残渣を吸着樹脂又は／及び活性炭よりなる吸着材に接触させて，上記蒸留残渣に含まれるチロシナーゼ阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤を，選択的に上記吸着材に吸着させる吸着工程と，
上記吸着工程後の吸着材に極性有機溶媒を含有する溶離液を反応させて，上記吸着材から上記チロシナーゼ阻害剤を溶出する溶出工程とを有することを特徴とするチロシナーゼ阻害剤の製造方法にある（請求項１）。
【００１２】
次に，本発明の作用効果につき説明する。
本発明の製造方法においては，上記のように，上記吸着工程と上記溶出工程を有している。そして，上記吸着工程においては，上記黒糖焼酎の蒸留残渣に含まれるチロシナーゼ阻害剤を，選択的に上記吸着材に吸着させることができる。
また，上記溶出工程においては，上記溶離液により上記吸着材から上記チロシナーゼ阻害剤を溶出することができる。
【００１３】
このように，本発明においては，上記吸着工程と上記溶出工程によって，上記黒糖焼酎の蒸留残渣から，チロシナーゼに対する阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤を得ることができる。そして，上記チロシナーゼ阻害剤は，チロシナーゼに対する優れた阻害活性を有している。そのため，優れた美白成分として，例えば化粧品や食品等の原料に利用することができる。
【００１４】
また，本発明の製造方法においては，上記黒糖焼酎の製造時に大量に生じる上記蒸留残渣を原料にしている。そのため，本発明においては，従来利用価値がないために，そのほとんどが廃棄物として大量に処分されていた上記残留残渣を有効に利用することができる。
【００１５】
以上のように，上記第１の発明によれば，黒糖焼酎の製造時に生じる蒸留残渣を有効に利用することができると共に，チロシナーゼに対する優れた阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤の製造方法を提供することができる。
【００１６】
第２の発明は，上記第１の発明の製造方法により得られたチロシナーゼ阻害剤にある（請求項５）。
【００１７】
上記第２の発明のチロシナーゼ阻害剤は，上記第１の発明の製造方法によって，上記黒糖焼酎の蒸留残渣より得られる。このようなチロシナーゼ阻害剤は，例えばコウジ酸などよりも，優れたチロシナーゼ阻害活性を有している。そのため，優れた美白成分として，例えば化粧品や食料品等の原料に利用することができる。
また，上述のように，上記チロシナーゼ阻害剤は，上記黒糖焼酎の蒸留残渣より作製されたものである。そのため，黒糖焼酎の製造時に生じる蒸留残渣を有効に利用することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において，上記黒糖焼酎の蒸留残渣は，上述したように，例えば米を洗米し，麹菌を加えて蒸し，酵母菌を加えて発酵させて得られる一次モロミに，黒糖を溶解し冷却したものを加えて蒸留することによって，黒糖焼酎の原酒の残渣として得ることができる。
【００１９】
また，上記吸着工程において，上記吸着材としては，吸着樹脂又は／及び活性炭を用いることができる。
上記吸着樹脂としては，例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学株式会社製），及びアンバーライトＸＡＤ−２（ローム  アンド  ハース社製）等がある。上記吸着樹脂としては，これらのうちの１種を，又は２種以上を混合して用いることができる。
【００２０】
上記吸着材は，例えば上記吸着樹脂又は／及び活性炭をカラムに充填したものやバッチとしたもの等を用いることができる。
この場合には，上記吸着工程において，上記蒸留残渣中のチロシナーゼ阻害剤を簡単に吸着させることができると共に，上記溶出工程において，上記吸着材から上記チロシナーゼ阻害剤を簡単かつ収率よく得ることができる。
【００２１】
また，上記溶出工程において，上記溶離液は極性有機溶媒を含有している。
上記極性有機溶媒としては，例えばエタノール，メタノール，及びアセトン等がある。上記極性有機溶媒としては，これらのうちの１種を，又は２種以上を混合して用いることができる。
また，上記溶離液としては，上記極性有機溶媒に水等を含有させたものを用いることができる。また，上記溶離液としては，水等を含有させずに上記極性有機溶媒をそのまま用いることもできる。
【００２２】
また，上記溶出工程後のチロシナーゼ阻害剤は，溶離液に溶解された溶液状態になっているが，本発明において，上記チロシナーゼ阻害剤は，溶液状態のもの，または溶液状態から溶離液等の水分を蒸発させた状態のもの等を含む概念である。
【００２３】
次に，上記吸着工程と上記溶出工程との間に，上記吸着材を洗浄液にて洗浄して不純物を除去する洗浄工程を有することが好ましい（請求項２）。
この場合には，上記溶出工程において，上記溶離液に溶解されて溶出される上記チロシナーゼ阻害剤の純度を高めることができる。
また，上記洗浄工程は，複数回繰り返して行うことができる。
この場合には，上記チロシナーゼ阻害剤の純度をさらに一層高めることができる。
【００２４】
上記洗浄液としては，例えば，水，もしくは上記極性有機溶媒と水との混合液等を用いることができる。
上記洗浄液として，上記極性有機溶媒と水との混合液を用いる場合には，上記洗浄液は，上記極性有機溶媒と水との混合液１００重量部中に，上記極性有機溶媒を１０重量部未満含有していることが好ましい。上記極性有機溶媒が１０重量部を越える場合には，上記洗浄工程において，上記吸着材からチロシナーゼ阻害剤が溶出されてしまい，最終的なチロシナーゼ阻害剤の収率が低下するおそれがある。
【００２５】
次に，上記溶離液は，１０重量部以上の上記極性有機溶媒と，９０重量部以下の水（但し，極性有機溶媒と水との合計を１００重量部とする）とを含有してなることが好ましい（請求項３）。
この場合には，上記溶出工程において，高収率で上記チロシナーゼ阻害剤を溶出させることができる。
上記溶離液中の上記極性有機溶媒の割合が１０重量部未満の場合，又は水が９０重量部を越える場合には，上記溶出工程において，目的物であるチロシナーゼ阻害剤が充分に溶出されないおそれがある。なお，上述のように，上記溶離液は，水を含有せず，上記極性有機溶媒だけからなるものでもよい。
【００２６】
次に，上記溶出工程時に，上記吸着材から溶出されるチロシナーゼ阻害剤をクロマトグラフィー法により分取することが好ましい（請求項４）。
この場合には，上記チロシナーゼ阻害剤の純度をさらに一層高めることができる。そのため，チロシナーゼに対する阻害活性に一層優れたチロシナーゼ阻害剤を得ることができる。
上記クロマトグラフィー法としては，特に高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。
【００２７】
【実施例】
（実施例１）
次に，本発明のチロシナーゼ阻害剤の製造方法につき，説明する。
本発明の製造方法は，上記吸着工程と，上記溶出工程とを有する。
上記吸着工程においては，黒糖焼酎の製造工程において得られる蒸留残渣を吸着樹脂又は／及び活性炭よりなる吸着材に接触させて，上記蒸留残渣に含まれるチロシナーゼ阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤を，選択的に上記吸着材に吸着させる。
また，上記溶出工程においては，上記吸着工程後の吸着材に極性有機溶媒を含有する溶離液を反応させて，上記吸着材から上記チロシナーゼ阻害剤を溶出する。
【００２８】
また，本例の製造方法においては，上記吸着工程と上記溶出工程との間に上記洗浄工程を有する。この洗浄工程においては，上記吸着材を洗浄液にて洗浄して不純物を除去する。
【００２９】
以下，本例の製造方法につき，詳細に説明する。
まず，上記黒糖焼酎の蒸留残渣を準備した。この黒糖焼酎の蒸留残渣は，ＪＡ奄美より入手した。
【００３０】
また，上記吸着材として三菱化学株式会社製のＨＰ−２０（ダイヤイオン）をカラムに充填したものを準備した。
次に，ＨＰ−２０のカラム内の吸着樹脂に，該吸着樹脂の容積の３倍量の蒸留残渣を重層し，自然落下により蒸留残渣を吸着樹脂に通した。このとき，蒸留残渣に含まれるチロシナーゼ阻害剤が吸着樹脂に吸着される。
続いて，上記蒸留残渣が完全に通過したら，吸着樹脂の容積の１．５〜２倍量の水（洗浄液）を上記カラム内に通し，ＨＰ−２０のカラム内を洗浄した。
【００３１】
次に，水２０重量部と，極性有機溶媒としてのメタノール８０重量部とよりなる溶離液，即ち８０％メタノール水溶液をカラム内に通して，チロシナーゼ阻害剤を溶出させた。溶離液の量は，吸着樹脂の容積の１．５〜２倍量とした。
溶出後，溶媒を蒸発させ，チロシナーゼ阻害剤を得た。
【００３２】
本例においては，上記のように，溶出後に得られる溶出液を蒸発させて，チロシナーゼ阻害剤としたが，この溶出液自体も，チロシンナーゼの活性を阻害する活性を有しており，チロシナーゼ阻害剤として利用することができる。
【００３３】
また，本例においては，上記溶離液のメタノールの濃度を変更して，他は上記と同様にしてチロシナーゼ阻害剤を作製した。
その結果，上記溶離液は，上記極性有機溶媒としてのメタノールを１０重量部以上含有するとき，充分にチロシナーゼ阻害剤を溶出することができ，溶出後に得られる溶出液は，チロシナーゼに対する優れた阻害活性を有していた。
【００３４】
（実施例２）
本例は，上記溶出工程時に上記吸着材より溶出されるチロシナーゼ阻害剤を分取し，そのチロシナーゼに対する阻害活性を測定した例である。
具体的には，まず，実施例１と同様にして，黒糖焼酎の蒸留残渣をＨＰ−２０のカラムに吸着させた。
次に，実施例１と同様に，溶離液を上記カラム内に通して，チロシナーゼ阻害剤を溶出させた。このとき，高速液体クロマトグラフィーにより溶出される溶出液を４つのフラクションに分取した。これらを試料Ｆ１〜Ｆ４とする。
【００３５】
高速液体クロマトグラフィーは，カラムとしてのφ６×５００ｍｍのＳＰ−１２０−４０／６０−ＯＤＳ−Ｂ（ダイソー株式会社製）に，溶離液としてのメタノール水溶液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで流通させて行った。
メタノール水溶液の濃度は，後述する図１に示すごとく，２０％の濃度で開始して，試料Ｆ３の分取中に８０％の濃度に変更した。また，検出にはＵＶ検出機（ＳＰＤ−１０ＡＶＰ，株式会社島津製作所製）を用い，２２０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果を図１に示す。
【００３６】
これら４つのフラクション（試料Ｆ１〜Ｆ４）を乾燥させて，実施例１と同様にメタノール水溶液を蒸発させて，チロシナーゼに対する阻害活性を調べたところ，試料Ｆ１及び試料Ｆ２はチロシナーゼに対して優れた阻害活性を有していた。
【００３７】
次に，以下のようにして，試料Ｆ１のチロシナーゼ阻害活性を測定し，コウジ酸のものと比較した。
具体的には，まず，乾燥後の試料Ｆ１を水にて溶解し，試料Ｆ１の濃度を６００μｇ／ｍｌに調整した。
【００３８】
また，５００〜６００ＩＵ／ｍｌのチロシナーゼ（マッシュルーム由来，和光純薬工業株式会社製），及び１０ｍｍｏｌ／ｍｌのチロシン（和光純薬工業株式会社製）を準備した。さらに，反応停止液として，６２．５ｍｍｏｌ／ｍｌのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．７）を準備した。
また，試料Ｆ１のチロシナーゼに対する優れた阻害活性を明らかにするため，チロシナーゼに対する阻害活性を有することが知られているコウジ酸（東京化成工業株式会社製）を準備し，これを上記試料Ｆ１と同様に水にて濃度を６００μｇ／ｍｌに調整し，これを試料Ｃ１とした。
【００３９】
続いて，試料Ｆ１及び試料Ｃ１を，それぞれ１ｍｌのチロシナーゼに混合して，３７℃で１０分間インキュベートした。このとき，試料Ｆ１及び試料Ｃ１は，チロシナーゼに混合した後の濃度が，４５０，１３５０，１９８０，及び４２６０μｇ／ｍｌとなるように変化させて，混合した。
さらに，１ｍｌのチロシンをそれぞれ添加し，３７℃で１５分間インキュベートした。
その後，直ちに反応停止液を１ｍｌ加え，酵素反応によって生成されたオルソキノン骨格の生成量を調べるために，４７５ｎｍの吸光度を測定した。
このときの吸光度を吸光度Ｂとした。
【００４０】
また，１ｍｌのチロシナーゼと１ｍｌのチロシンとを混合し，３７℃で１５分間インキュベートし，１ｍｌの反応停止液を加えて，４７５ｎｍの吸光度を測定し，この場合の吸光度を吸光度Ａとした。
【００４１】
次に，上記のようにして得られた吸光度Ａ及び吸光度Ｂを用いて，下記の式（１）より，チロシナーゼに対する阻害活性（％）算出した。
チロシナーゼに対する阻害活性（％）＝（Ｂ−Ａ）×１００／Ａ    （１）
その結果を図２に示す。
【００４２】
図２において，横軸は試料Ｆ１及び試料Ｃ１の濃度を示し，縦軸はチロシナーゼに対する阻害活性（％）を示す。
図２より知られるごとく，本例の試料Ｆ１は，その添加量が１９８０μｇ／ｍｌのとき，チロシナーゼに対する阻害活性が１００％となり，優れた阻害活性を有していることがわかった。これは，同じ添加量の試料Ｃ１と比較すると約３倍であった。
また，添加量１３５０μｇ／ｍｌにおける試料Ｆ１と試料Ｃ１との結果を比較すると，試料Ｆ１は，チロシナーゼの阻害活性において試料Ｃ１よりも約５倍も優れていた。
試料Ｃ１は，添加量を増加させても，チロシナーゼに対する阻害活性はあまり増加せず，添加量４２６０μｇ／ｍｌでも約５０％程度であった。
【００４３】
このように，本例によれば，黒糖焼酎の製造時に生じる蒸留残渣を有効に利用することができると共に，チロシナーゼに対する優れた阻害活性を有するチロシナーゼ阻害剤及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２にかかる，高速液体クロマトグラフィーの結果を示す説明図。
【図２】実施例２にかかる，試料Ｆ１及び試料Ｃ１のチロシナーゼに対する阻害活性を示す説明図。
【図３】黒糖焼酎の製造工程の概略を示す説明図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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