(57)【要約】【課題】試料に光照射を行なって反応させるときの光照射反応効率を高めるとともに、反応修了後の操作性を向上させる。【解決手段】試料導入装置６では、流路切替えバルブ２０が実線の流路にされることにより、インジェクタ１８から注入された試料溶液が送液ポンプ２２からのキャリアにより光反応器１０のチューブ１２に導入され、送液ポンプ２２の駆動を停止させると導入された試料溶液は光反応器１０のチューブ１２に留まる。その状態でランプ１４を点灯することにより試料溶液が光照射される。その後、流路切替えバルブ２０が破線の流路に切り替えられると、光反応器１０で光照射された試料溶液が送液ポンプ４から供給される移動相によりカラム２に導入され、分離されてカラム２から溶出し検出器８で検出される。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相とともに導入された試料を成分に分離するカラム、前記移動相を前記カラムに供給する移動相供給機構、前記移動相供給機構とカラムの間の流路に設けられ試料を導入する試料導入装置、及び前記カラムから溶出する試料成分を検出する検出器を備えた液体クロマトグラフ装置において、
前記試料導入装置は試料溶液を流すことのできる光透過性チューブと、前記チューブ内の試料溶液に光照射を行なう光源とを備えた光反応器を備えていることを特徴とするオンライン光反応測定用液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
前記光反応器は、前記チューブがコイル状に巻かれ、そのコイルの中心軸上に前記光源のランプが配置されたものである請求項１に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
前記試料導入装置は試料溶液を注入するインジェクタと、前記チューブを前記インジェクタに接続するか前記カラムにつながる流路に接続するかを切り替える流路切替えバルブをさらに備えた請求項１又は２のいずれかに記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項４】
前記チューブはフッ素系樹脂製である請求項１から３のいずれかに記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項５】
前記フッ素系樹脂はポリ四フッ化エチレンである請求項４に記載の液体クロマトグラフ装置。
【請求項６】
前記光源は可視域よりも短波長の光を発生しうるランプである請求項１から５のいずれかに記載の液体クロマトグラフ装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は試料溶液中の試料成分を分離分析する液体クロマトグラフ装置に関し、特に光照射により生成した化学物質をオンラインで測定することのできる液体クロマトグラフ装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品、農薬、食品、香料などの物質は製造、流通、保存等の様々な過程において外界から影響を受けるが、それらの物質に影響を与える大きな環境因子の１つとして光がある。そこで、評価対象となる物質に光を照射し、その反応生成物を分析することによりその物質の光安定性を評価することが行なわれている。
【０００３】
光安定性評価のために、通常は、図２に示されるように、目的物質を含む試料溶液を光透過性の容器３２、例えば石英セルに入れ、ランプ３４によって光照射を行なう。ランプ３４としては、可視領域よりも短波長の近紫外ないし紫外領域の光を照射するランプが使用される。このように光照射を行なって目的物質を反応させた後、その試料溶液を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）などの液体クロマトグラフ装置に導入し、分析を行なう。
【０００４】
食品、医薬品、食品添加物などに含まれるビタミンＢ２（ＶＢ２）の分析を例に挙げると、ＶＢ２の測定法として高速液体クロマトグラフによる定量法が衛生試験法（２０００）に定めされており、その方法ではＶＢ２３型を加水分解して全てをリボフラビンとして測定を行なう。
【０００５】
リボフラビン（分子量３７６）の光照射により、図３に示されるように、酸性又は中性条件下では発蛍光物質ルミクローム（分子量２４２）が生成し、アルカリ性条件下では発蛍光物質ルミフラビン（分子量２５６）が生成することが知られている。
【０００６】
そこで、光安定性評価の一例として、リボフラビンを取りあげ、リボフラビンに酸性又は中性条件下で図２の光照射法で光を照射してルミクロームを生成させる反応を行わせ結果の時間経過を図４に示す。容器３２としては石英セルを使用して酸性又は中性にしたリボフラビン水溶液を入れ、光源３４としては近紫外線を発生するケミカルランプ（ＦＬ６ＢＬ：東芝社製）を用いて４５０分まで光照射を行なった。図４は、光照射後の試料溶液を高速液体クロマトグラフに注入して蛍光検出器により励起波長３５５ｎｍ、検出蛍光波長４８０ｎｍで検出して得たクロマトグラムのピーク面積を示したものである。ａは出発物質のリボフラビンを表し、時間の経過に伴って減少していく。それに対し、リボフラビンが変化して生じる生成物としてルミクロームｂが増加をしていく。他に、光分解生成物としてｃ１，ｃ２で示される化合物が僅かに生成する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
図４の結果からわかるように、図２のような光照射法は、反応速度が遅い、すなわち光照射反応効率が悪い。この例で取り上げたリボフラビンからルミクロームへの光反応に対しては、光分解がほぼ完了するまでに２００分以上という長時間を要する。
【０００８】
また、光照射により反応を行なわせた試料溶液を採取して液体クロマトグラフに導入するオフライン式であるため、反応修了後に光照射反応装置から液体クロマトグラフへ試料を移し変える操作が必要になり、操作が煩わしい。
本発明は、試料に光照射を行なって反応させるときの光照射反応効率を高めるとともに、反応修了後の操作性を向上させることを目的とするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、移動相とともに導入された試料を成分に分離するカラム、前記移動相を前記カラムに供給する移動相供給機構、その移動相供給機構とカラムの間の流路に設けられ試料を導入する試料導入装置、及び前記カラムから溶出する試料成分を検出する検出器を備えた液体クロマトグラフ装置において、前記試料導入装置は試料溶液を流すことのできる光透過性チューブと、そのチューブ内の試料溶液に光照射を行なう光源とを備えた光反応器を備えていることを特徴とするオンライン光反応測定用液体クロマトグラフ装置である。
【００１０】
光反応器の好ましい一形態は、チューブがコイル状に巻かれ、そのコイルの中心軸上に光源としてランプが配置されたものである。このような反応器は、チューブ内の試料溶液に光を効率よく照射することができる。また、チューブをコイル状に巻くだけであるので、製作が容易である。
【００１１】
チューブとしては、樹脂やガラスなどを使用することができ、反応を起こさせるために照射する波長領域の光に対して光透過性があれば特に限定はされない。
樹脂製チューブで可撓性をもつものはコイル状に巻くような操作が容易で製作の上では好ましい。樹脂の中でもフッ素系樹脂、例えばポリ四フッ化エチレンは耐薬品性の点でも優れており、反応器に用いるチューブの材質としては好ましいものである。
【００１２】
光反応器と液体クロマトグラフとを一体化し、操作性を向上させる上で、試料導入装置が試料溶液を注入するインジェクタと、反応器のチューブをそのインジェクタに接続するかカラムにつながる流路に接続するかを切り替える流路切替えバルブをさらに備えていることが好ましい。
光反応器で使用する光源としては、反応効率を高める上で、可視域よりも短波長の光を発生しうるランプが好ましい。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１に一実施例を示す。（Ａ）で符号１により示される枠内の構成は、分析部としての高速液体クロマトグラフを表わしている。その高速液体クロマトグラフ１は、移動相とともに導入された試料を成分に分離するカラム２、その移動相をカラム２に供給する移動相供給機構としての送液ポンプ４、送液ポンプ４とカラム２の間の流路に設けられ試料を導入する試料導入装置６、及びカラム２から溶出する試料成分を検出する検出器８を備えている。
【００１４】
検出器８としては、検出器のセルに光を照射しその透過光をフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）８ａで受光して吸光度を測定する吸光度光度計、検出器のセルに励起光を照射し試料成分から発生する蛍光を検出する蛍光検出器８ｂ、及び溶出液をインターフェイスを介してイオン化室に導いてイオン化した後に質量分析を行なう質量分析計（ＭＳ）８ｃを備え、それらを同時に使用することも、いずれかを選択して使用することもできるようにした。
【００１５】
試料導入装置６は、図１（Ｂ）に示されるように、試料溶液を流すことのできる光透過性チューブ１２と、チューブ２内の試料溶液に光照射を行なう光源のランプ１４を備えた光反応器１０を備えている。光反応器１０では、ランプ１４が透明石英パイプ１６の中心軸上に配置されており、石英パイプ１６の周囲にはチューブ１２がコイル状に巻き付けられている。
【００１６】
ランプ１４としては３５２ｎｍにピーク波長をもつ近紫外領域の光を発生するケミカルランプＦＬ６ＢＬ（東芝社製）を使用した。チューブ１２はポリ四フッ化エチレン製のチューブで、内径が０．５ｍｍ、外径が約１．６ｍｍのものを使用した。チューブ１４は長さが２．５ｍで、その内の１．５ｍの範囲が石英パイプ１６に巻き付けられてランプ１４により光照射が行われる。
【００１７】
試料導入装置６では、流路切替えバルブ２０として六方バルブが設けられており、光反応器１０はその流路切替えバルブ２０の２つのポート間に接続されている。流路切替えバルブ２０の１つのポートには送液ポンプ４が接続され、他のポートには試料を光反応器１０に導入するキャリアを供給する送液ポンプ２２が試料注入用インジェクタ１８を介して接続されている。流路切替えバルブ２０のさらに他のポートにはカラム２につながる流路が接続されており、１つのポートが廃液用ドレインに接続されている。
【００１８】
流路切替えバルブ２０が実線の流路にされることにより、インジェクタ１８から注入された試料溶液が送液ポンプ２２からのキャリアにより光反応器１０のチューブ１２に導入され、送液ポンプ２２の駆動を停止させると導入された試料溶液は光反応器１０のチューブ１２に留まる。その状態でランプ１４を点灯することにより試料溶液が光照射される。その後、流路切替えバルブ２０が破線の流路に切り替えられると、光反応器１０で光照射された試料溶液が送液ポンプ４から供給される移動相によりカラム２に導入され、分離されてカラム２から溶出し検出器８で検出される。
【００１９】
この実施例の高速液体クロマトグラフを用いた測定の一例として、従来の光照射法による測定結果と比較するために、リボフラビンを試料として光照射により分解させる反応を測定した例について説明する。
【００２０】
試料はリボフラビン水溶液であり、インジェクタ１８から注入する。送液ポンプ２２はキャリアとして水を１．０ｍＬ／分の流速で供給するように設定した。
試料を光反応器１０に導入する際には、バルブ２０を実線の流路にした状態で、インジェクタ１８から試料溶液を注入し、送液ポンプ２２を作動させてキャリアを供給する。試料溶液が光反応器１０に到達したところで送液ポンプ２２の作動を停止させ、試料溶液を光反応器１０のチューブ１２内に留める。その状態でランプ１４を所定の時間点灯して試料溶液中のリボフラビンの光分解反応を行なった。
【００２１】
高速液体クロマトグラフ１の分析条件は次のように設定した。送液ポンプ４から供給する移動相として水：アセトニトリル＝８０：２０の溶液を使用し、流速０．２ｍＬ／分で供給する。カラム２はＳｈｉｍ−ｐａｃｋ　ＶＰ−ＯＤＳ（内径２．０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ：島津製作所製）であり、カラム温度を４０℃とした。
【００２２】
この高速液体クロマトグラフで、試料のリボフラビン水溶液を光反応器１０に収容し、照射時間を異ならせて反応させた各試料溶液を、流路切替えバルブ２０を切り替えてカラム２に導き、分離分析した結果を図５に示す。図５の測定データは、図４の測定データと同じく、検出器８として蛍光検出器８ｂを用い、３５５ｎｍで励起し、４８０ｎｍでの蛍光を検出して得たクロマトグラムのピーク面積を光反応器１０での光照射時間に対して表示している。ａはリボフラビン、ｂはルミクローム、ｃ１，ｃ２はそれぞれ他の分解生成物である。
【００２３】
図５の結果によれば、照射時間２０分で既に反応が完了しており、図４の結果に示した従来の光照射法による反応に比べて光照射反応効率が格段に向上していることがわかる。
【００２４】
図６には、図２に示した従来の光照射法により２１０分間光照射をした試料溶液（Ａ）と、本実施例の装置により２０分間光照射した試料溶液（Ｂ）のそれぞれを励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４８０ｎｍで蛍光検出したクロマトグラムを示す。両者はほぼ同じクロマトグラムであるところから、本実施例による２０分間の光照射により従来の光照射法による２１０分間の光照射時と同等の分解生成物が生じていることを意味しており、本発明による方が光照射反応効率の高いことを示している。
【００２５】
次に、本実施例の装置により２０分間の光照射で得られた反応生成物を吸収スペクトルと質量スペクトルにより同定した。その結果を図７に示す。（Ａ）は図６（Ｂ）と同じ蛍光検出によるクロマトグラムである。その内の保持時間８分付近の大きなピークの成分の吸収スペクトルを示したものが図７（Ｂ）、質量スペクトルを示したものが図７（Ｃ）である。
【００２６】
図７（Ｂ）の吸収スペクトルの測定において、検出波長範囲は２００〜５００ｎｍであり、縦軸は吸光度（ｍＡｂｓ）である。
【００２７】
図７（Ｃ）の質量スペクトルは、目的とするピーク部分の溶出液を高速液体クロマトグラフからインターフェイスを経て質量分析計に８ｃに導き、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）のポジティブモードでイオン化して得たものである。
【００２８】
図７の吸収スペクトルと質量スペクトルから、リボフラビンの光照射による分解生成物がルミクロームであることが同定される。
本発明は実施例に示したリボフラビンの分解反応の測定に限らず、他の物質の光照射による反応過程の測定に適用することができる。
【００２９】
試料導入装置は図１に示したものに限らず、例えば図１の流路において、光反応器１０をインジェクタ１８と流路切替えバルブ２０の間に配置し、流路切替えバルブ２０を省略してもよい。
【００３０】
また、光反応器１０をインジェクタ１８と流路切替えバルブ２０の間に配置するとともに、流路切替えバルブ２０はそのまま設け、光反応器１０の位置に長さが１〜３ｃｍ程度と短いカラムを試料濃縮用カラムとして配置してもよい。
【００３１】
【発明の効果】
本発明の光反応測定用液体クロマトグラフ装置では、その試料導入装置が試料溶液を流すことのできる光透過性チューブと、そのチューブ内の試料溶液に光照射を行なう光源とを備えた光反応器を備えているので、光源による光照射反応効率が高くなる。
また、試料導入装置に光反応器を備えて液体クロマトグラフと一体化したので、反応修了後の操作性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は一実施例の高速液体クロマトグラフを示す概略構成図、（Ｂ）は同実施例で用いられる光反応器を示す概略斜視図である。
【図２】従来の光照射法を示す概略斜視図である。
【図３】リボフラビンの光分解反応を示す化学反応式である。
【図４】従来の光照射法によるリボフラビンの光分解反応を時間の経過とともに示すグラフである。
【図５】一実施例の装置を用いたリボフラビンの光分解反応を時間の経過とともに示すグラフである。
【図６】従来の光照射法によるリボフラビンの光分解反応生成物（Ａ）と一実施例の装置を用いたリボフラビンの光分解反応生成物（Ｂ）を示すクロマトグラムである。
【図７】一実施例の装置を用いたリボフラビンの光分解反応生成物の定性結果を示す図で、（Ａ）はクロマトグラム、（Ｂ）は吸収スペクトル、（Ｃ）は質量スペクトルである。
【符号の説明】
１　　　高速液体クロマトグラフ
２　　　カラム
４　　　移動相用の送液ポンプ
６　　　試料導入装置
８　　　検出器
８ａ　　　吸光度光度計のフォトダイオードアレイ
８ｂ　　　蛍光検出器
８ｃ　　　質量分析計
１０　　　光反応器
１２　　　光透過性チューブ
１４　　　光源のランプ
１８　　　インジェクタ
２０　　　流路切替えバルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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