(57)【要約】【課題】安全で有用なＣＤ４４の切断誘導剤及び細胞の移動促進剤を提供する。【解決手段】低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ＣＤ４４切断誘導剤及び細胞の移動促進剤。ここでいう「低分子量ＨＡ」は、ＨＡ２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のＨＡであるものが好ましく、２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤ以下のＨＡであるものがより好ましく、ＨＡ４糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡであるものが特に好ましく、ＨＡ６糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡであるものが極めて好ましい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項２】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のヒアルロン酸である、請求項１に記載の誘導剤。
【請求項３】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤ以下のヒアルロン酸である、請求項２に記載の誘導剤。
【請求項４】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸４糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のヒアルロン酸である、請求項３に記載の誘導剤。
【請求項５】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸６糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のヒアルロン酸である、請求項４に記載の誘導剤。
【請求項６】
低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、細胞の移動促進剤。
【請求項７】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のヒアルロン酸である、請求項６に記載の促進剤。
【請求項８】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤ以下のヒアルロン酸である、請求項７に記載の促進剤。
【請求項９】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸４糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のヒアルロン酸である、請求項８に記載の促進剤。
【請求項１０】
「低分子量ヒアルロン酸」が、ヒアルロン酸６糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のヒアルロン酸である、請求項９に記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤に関する。また本発明は、低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする細胞の移動促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本明細書において用いる略号を説明する。
【０００３】
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
Ｆａｂフラグメント：抗原結合性フラグメント
ＦＣＳ：ウシ胎仔血清
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）
ＦＬ−ＨＡ：フルオレセインが結合したＨＡ
ＧｌｃＡ：グルクロン酸
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＡｆｒ：ＨＡフラグメント
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＰ：ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ｐＡｂ：ポリクローナル抗体
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩液
ＰＭＡ：ホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＣＤ４４は、ＨＡをはじめとする種々の細胞外マトリクスに対する細胞表面受容体として広く存在している細胞接着タンパク質であり（非特許文献１）、リンパ球のローリング、腫瘍細胞の移動、細胞の浸潤などの種々の生物活性を有することが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，  ６１，  ｐ１３０３−１３１３，  （１９９０）
【非特許文献２】Ａｄｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ７１，  ｐ２４１−３１９，  （１９９７）
そして細胞表面のＣＤ４４は、ＭＴ１−ＭＭＰのような膜結合メタロプロテイナーゼによって細胞外ドメイン部分で切断されることが知られており（非特許文献３）、このＣＤ４４の切断は、細胞の移動等の生物活性の発現に重要な役割を果たしていることが示唆されている（非特許文献４及び５）。
【０００５】
【非特許文献３】Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １５３，  ｐ８９３−９０４，  （２００１）
【非特許文献４】Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １８，  ｐ１４３５−１４４６，  （１９９９）
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ｐ２９６２８−２９６３５，  （２０００）
一方、低分子量ＨＡも、ケモカイン遺伝子の発現（非特許文献６、７及び８）、ＮＦ−κＢのような転写因子の活性化（非特許文献９）、細胞増殖（非特許文献１０及び１１）、血管形成の誘導（非特許文献１２、１３、１４及び１５）等の種々の生物活性を有することが明らかにされてきている。
【０００６】
【非特許文献６】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９８，  ｐ２４０３−２４１３，  （１９９６）
【非特許文献７】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３，  ｐ３５０８８−３５０９４，  （１９９８）
【非特許文献８】Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６０，  ｐ３０２３−３０３０，  （１９９８）
【非特許文献９】Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８３，  ｐ２３７３−２３７８，  （１９９６）
【非特許文献１０】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５７，  ｐ７７３−７７７，  （１９９７）
【非特許文献１１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７，  ｐ４１０４６−４１０５９，  （２００２）
【非特許文献１２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２８，  ｐ１３２４−１３２６，  （１９８５）
【非特許文献１３】Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １０５，  ｐ２１３−２１８，  （１９９３）
【非特許文献１４】Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  １０３，  ｐ５７６−５７９，  （１９９４）
【非特許文献１５】Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ７５，  ｐ２４９−２６２，  （１９９６）
しかし、低分子量ＨＡがＣＤ４４の切断を誘導すること、及び細胞の移動を促進することについては開示も示唆もない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤、及び細胞の移動促進剤を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、低分子量ＨＡが、ＣＤ４４の切断を誘導することを見出すとともに、細胞の移動を促進することを見出し、これにより上記課題を解決しうるＣＤ４４切断誘導剤及び細胞の移動促進剤を提供できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
すなわち本発明は、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ＣＤ４４切断誘導剤（以下、本発明誘導剤という）を提供する。ここでいう「低分子量ＨＡ」は、ＨＡ２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のＨＡであるものが好ましく、２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤ以下のＨＡであるものがより好ましく、ＨＡ４糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡであるものが特に好ましく、ＨＡ６糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡであるものが極めて好ましい。
【００１０】
また本発明は、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、細胞の移動促進剤（以下、本発明促進剤という）を提供する。ここでいう「低分子量ＨＡ」は、ＨＡ２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のＨＡであるものが好ましく、２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤ以下のＨＡであるものがより好ましく、ＨＡ４糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡであるものが特に好ましく、ＨＡ６糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡであるものが極めて好ましい。
【００１１】
また、本発明誘導剤と本発明促進剤とを併せて、単に「本発明薬剤」という。
【００１２】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明薬剤の有効成分
（１）低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩
本明細書において「低分子量ＨＡ」とは、ＨＡの構成二糖組成と同様の組成からなる低分子量の糖鎖である。具体的は、ＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃとが交互にグリコシド結合している低分子量の糖鎖を意味する。
【００１３】
すなわち、このような糖鎖であって、糖鎖の非還元末端がＧｌｃＡであるものの他、非還元末端がＧｌｃＮＡｃであるものも、ここでいう「低分子量ＨＡ」に包含される。なかでも、非還元末端に位置する糖がＧｌｃＡであるものが好ましい。また、その還元末端に位置する糖はＧｌｃＮＡｃであるものが好ましい。
【００１４】
非還元末端に位置する糖は、飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含まないもの）でも不飽和糖（単糖中の炭素・炭素間の結合に二重結合を含むもの）でもよい。なかでも非還元末端に位置する糖が飽和糖であるものが好ましい。
【００１５】
ＧｌｃＡとＧｌｃＮＡｃとの間におけるグリコシド結合はβ１→３結合であることが好ましく、ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＡとの間におけるグリコシド結合はβ１→４結合であることが好ましい。
【００１６】
また、ここで「低分子量」とは、当技術分野における当業者において、低分子量であると認識される程度の分子量を意味する。少なくとも、重量平均分子量３０ｋＤ以下のものについては当技術分野において「低分子量」であると認識されることに疑いはない。一方で、重量平均分子量が１００ｋＤａを超えるものについては、当技術分野においては「低分子量」であると認識されるものではない。
【００１７】
「低分子量ＨＡ」としては、ＨＡ２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のＨＡが好ましく、２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤ以下のＨＡがより好ましく、ＨＡ４糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡがさらに好ましく、ＨＡ６糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡが特に好ましい。
【００１８】
なかでも本発明薬剤は、ＨＡ８糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡが好ましく、ＨＡ１０糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡがより好ましく、ＨＡ１２糖以上で、かつ重量平均分子量１０ｋＤａ以下のＨＡがさらに好ましく、重量平均分子量５ｋＤａ以上で、かつ１０ｋＤａ以下のＨＡが特に好ましく、重量平均分子量７ｋＤａ程度のＨＡが極めて好ましい。
【００１９】
本発明薬剤において用いることができる「低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩」の由来は特に限定されない。例えば、鶏冠、臍帯、ＨＡを産生する微生物等から分離、精製されたＨＡを分解する方法（例えば酵素分解法、化学分解法、加熱処理法、超音波処理法等）や、合成（例えば化学合成法や酵素合成法）によって製造できる。
【００２０】
酵素分解法としては、ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来）、ヒアルロニダーゼＳＤ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣなどの、ＨＡを分解する酵素をＨＡに作用させる方法が挙げられる（新生化学実験講座「糖質ＩＩ―プロテオグリカンとグリコサミノグリカン―」ｐ２４４−２４８、１９９１年発行、東京化学同人  参照）。低分子量ＨＡを得るためには、ＨＡを分解する酵素として加水分解酵素を用いることが好ましい。
【００２１】
化学分解法としては、アルカリ分解法やＤＭＳＯ法等が挙げられる。アルカリ分解法は、例えばＨＡの溶液に１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和することにより行うことができる。ＤＭＳＯ法としてはＮａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．  Ｒｅｓ．，  １４１，  ｐ９９−１１０，  １９８５）が挙げられる。超音波処理法としては  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３３，  ｐ６５０３−６５０７  （１９９４）等に記載された方法が挙げられる。
【００２２】
合成による製造方法としては  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，  ｐ４５３−４３９  （１９９３）、国際公開ＷＯ９３／２０８２７等に記載された方法が挙げられる。
【００２３】
以上のような方法によって低分子量ＨＡを含む画分が得られるが、この画分は通常の糖鎖の分離、精製の手法によってさらに精製することができる。例えば、吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、有機溶媒による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作によって行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
このような方法によって画分中の低分子量ＨＡの含有率を高めることができ、また医薬として混入が許されない物質を排除することもできる。
【００２５】
このようにして得られる低分子量ＨＡは、高純度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものが好ましい。
【００２６】
低分子量ＨＡの薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。なかでもナトリウム塩であることが好ましい。
【００２７】
上記のような低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を用いることにより、極めて優れた薬理作用を有するＣＤ４４切断誘導剤、及び細胞の移動促進剤とすることができる。
【００２８】
なお、本発明薬剤に使用される低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩中のエンドトキシン濃度は、本発明薬剤とした場合において０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。本発明薬剤中のエンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシンの測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なおＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ  Ｋ８００８）に従って測定・算出できる。また、鉄含量は２０ｐｐｍ以下であることが好ましい。
（２）本発明薬剤の剤型等
本発明薬剤の投与方法は、本発明誘導剤によるＣＤ４４の切断誘導作用、又は本発明促進剤による細胞の移動促進作用が発揮される限りにおいて特に限定されないが、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の投与経路が挙げられる。その投与方法は、注射による特定部位への直接投与や、点滴による投与など、適用される疾患や部位等によって適宜選択される。
【００２９】
このような投与経路や投与方法に応じて、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を適宜製剤化して、本発明薬剤とすることができる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられるが、注射剤等の液剤の形態とすることが好ましい。
【００３０】
液剤は、例えば適当な水性溶媒あるいは医薬品に慣用される溶媒に、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水等が例示される。
【００３１】
本発明薬剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。
【００３２】
本発明薬剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩に悪影響を与えず、かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子など）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用できる。
【００３３】
本発明薬剤は、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を有効成分とすることから、少なくとも低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩が含有されていればよく、他の分子サイズのＨＡを含んでいても差し支えない。
【００３４】
また本発明薬剤は、細胞生物学分野における試験試薬等として利用することもできる。例えば、本発明誘導剤は、細胞生物学分野における実験において、ＣＤ４４の切断を誘導するための試薬として利用することができる。また、例えば本発明促進剤は、細胞生物学分野における実験において、細胞の移動を促進するための試薬として利用することができる。この場合、試薬的に許容される賦形剤等を用いて、試薬として製剤化してもよい。
（３）本発明薬剤の投与対象等
本発明誘導剤は、ＣＤ４４の切断の誘導に資せんとするものであるから、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる細胞やこれを含む組織や臓器に対して適用することができる。ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる細胞としては、例えばＣＤ４４が切断されるべきであるにもかかわらず切断されないような状態にある細胞や、細胞生物学分野における実験において、ＣＤ４４の切断を誘導する必要がある細胞等が例示される。
【００３５】
また本発明促進剤は、細胞の移動の促進に資せんとするものであるから、細胞の移動の促進が望まれる細胞やこれを含む組織や臓器に対して適用することができる。細胞の移動の促進が望まれる細胞としては、例えば細胞の移動が引き起こされるべきであるにもかかわらず、引き起こされないような状態にある細胞や、細胞生物学分野における実験において、細胞の移動を促進する必要がある細胞等が例示される。
【００３６】
本発明薬剤を動物に投与する場合、これが投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。本発明薬剤は、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる疾患、ＣＤ４４の切断の抑制もしくは阻害に起因する疾患、細胞の移動の促進が望まれる疾患、細胞の移動の抑制もしくは阻害に起因する疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、症状の改善または治療等を目的として投与することができる。
【００３７】
本発明薬剤における低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明薬剤の投与方法、投与形態、使用目的等、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されないが、低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩の臨床量として成人１人１回当り１〜１００ｍｇが例示される。
【００３８】
また本発明薬剤の投与間隔は、１日１回程度でもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。
【００３９】
なお本発明は、上記の本発明誘導剤及び本発明促進剤だけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて細胞または生体組織等の適用対象に低分子量ＨＡを作用させ、該適用対象においてＣＤ４４の切断を誘導し、あるいは細胞の移動を促進する方法も包含する。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
＜材料等＞
まず、本実施例において用いた物質等を説明する。
（１）試薬等
ヒトＣＤ４４の細胞質ドメインに対するウサギのｐＡｂ（抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂ）は、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １８，  ｐ１４３５−１４４６，  （１９９９）に記載の方法で作製した。抗ヒトＣＤ４４  ｍＡｂ（Ｈｅｒｍｅｓ−３）は、Ｔｕｒｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｔｕｒｋｅｙ，  ＦｉｎｌａｎｄのＳｉｒｐａ  Ｊａｌｋａｎｅｎ博士より恵与された。抗ヒトＣＤ４４ｍＡｂ（ＢＲＩＣ２３５）は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，  ＵＫ）から購入した。抗β−チューブリンｍＡｂは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）から購入した。ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ、及びＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ（Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，  ＣＡ）から購入した。ＨＡの結合をブロックすることができる抗ＲＨＡＭＭ  ｐＡｂは、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，
ＣａｎａｄａのＥ．  Ｔｕｒｌｅｙ博士より恵与された。
【００４１】
ＨＡオリゴ糖及びＦＬ−ＨＡは、生化学工業株式会社から提供されたものを用いた。このＨＡオリゴ糖は、以下の構造を有し、以下の性質を有するものであった（カッコ内は、本実施例において用いる略号を示す。下記式中、「−」はグリコシド結合を表す。）
・ＨＡ飽和２糖（ＨＡ２）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和４糖（ＨＡ４）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和６糖（ＨＡ６）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和８糖（ＨＡ８）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和１０糖（ＨＡ１０）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
・ＨＡ飽和１２糖（ＨＡ１２）
ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ
ＨＡ（重量平均分子量  ６．９  ｋＤａ；ＨＡ６．９ｋＤａ）
ＨＡ飽和オリゴ糖は、Ｎａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．  Ｒｅｓ．，  １４１，  ｐ９９−１１０，  １９８５）に準じて、ＨＣｌを含有するＤＭＳＯでＨＡを処理して得られた分解産物を、陰イオン交換クロマトグラフィーでサイズごとに分画することによって得た。
【００４２】
ＨＡ６．９ｋＤａは、特開２０００−１３６１３８号公報に記載された方法で調製し、同公報に記載された方法で重量平均分子量を算出した。
【００４３】
被験物質は、以下の薬効薬理試験に応じて所定の濃度となるようにＰＢＳに溶解して用いた。ＰＢＳに溶解した後のエンドトキシン濃度はいずれも０．３ＥＵ／ｍＬ以下であり、また鉄含量はいずれも２０ｐｐｍ以下であった。
【００４４】
ヒト臍帯の由来の重量平均分子量  ２００ｋＤａのＨＡ（ＨＡ  ２００ｋＤａ）及び重量平均分子量  １０００ｋＤａのＨＡ（ＨＡ  １０００ｋＤａ）は、それぞれＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，  ＣＡ）及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から購入した。ヒツジ睾丸のヒアルロニダーゼ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来のヒアルロニダーゼ（ヒアルロニダーゼＳＤ）は、それぞれＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）及び生化学工業株式会社から購入した。カルボベンゾキシル−ロイシニル−ロイシニル−ロイシナル（ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｉｎａｌ）（ＭＧ１３２）はペプチド研究所から、ＰＭＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）からそれぞれ入手した。
（２）細胞培養
ヒト膵癌細胞株であるＭＩＡ  ＰａＣａ−２は、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  から入手した。細胞を、１０％  ＦＣＳ、１％  （ｖ／ｖ）  １００  ｘ  非必須アミノ酸，  １  ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、２  ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ５０  ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００  Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、及び１００  ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有する  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）中で、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で増殖させた。
（３）ＢＲＩＣ２３５抗体へのＦＩＴＣの結合
ＢＲＩＣ２３５抗体の溶液を、まず炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ９．２）に対して透析した。１．４  ｍｇ／ｍｌのＢＲＩＣ２３５抗体を４００  ｍｌ分取し、２８  ｍｇのＦＩＴＣ  （ＤＯＪＩＮＤＯ，  Ｋｕｍａｍｏｔｏ，  Ｊａｐａｎ）と共に室温で４時間インキュベートした。この溶液を、０．０５％  アジ化ナトリウムを含有する  ＰＢＳ  で平衡化した  ＰＤ−１０  ｃｏｌｕｍｎ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｕｐｐｓａｌａ，  Ｓｗｅｄｅｎ）  にアプライした。溶出されてきた液を２８０ｎｍの吸収でモニターした。
（４）ＢＲＩＣ２３５抗体のＦａｂフラグメントの調製と精製
ＢＲＩＣ２３５抗体のＦａｂフラグメントは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （ＰＩＥＲＣＥ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）  を用い、その説明書に従って調製し、精製した。すなわち、ＢＲＩＣ２３５抗体の溶液を  ２０  ｍＭ  リン酸ナトリウム／１０  ｍＭ  ＥＤＴＡ  緩衝液（ｐＨ  ７．０）に対して十分に透析した。その後、この抗体を約  ２０  ｍｇ／ｍｌに濃縮して、固定化したパパインと共に３７℃で５時間インキュベートすることによって消化した。ＦａｂフラグメントをＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラムを用いて分離し、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。
（５）ＨＡフラグメントの調製
ヒト臍帯のＨＡ  （２００  ｍｇ）を３，６００単位（Ｕ）のヒツジ睾丸由来のヒアルロニダーゼを用いて３７℃で１９時間消化し、ＨＡフラグメントの混合物を１０％  エタノールを含有する１Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−１０  カラム（１．５  ｃｍ  ｘ  １００  ｃｍ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）  で分離した。そのカラム画分を蒸留水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ｃｏｌｕｍｎ  （１  ｃｍ  ｘ  ５０  ｃｍ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にアプライして脱塩し、その溶出液をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＰＡ−０３  ｃｏｌｕｍｎ  （ＹＭＣ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＮＣ；  ４．６  ｍｍｘ  ２５０  ｍｍ）を用いたＮａＨ２ＰＯ４  の直線濃度勾配（１６  ｍＭ  〜１  Ｍ  ；７０分間）で行った。流速は１．０  ｍｌ／分とした。
【００４５】
溶出液は２１０  ｎｍの吸収でモニターした。フラグメント化された  ＨＡ  （１０  ｍｇ；ＨＡ６〜ＨＡ１４）を０．１単位（Ｕ）のヒアルロニダーゼ  ＳＤを用いて３７℃で３時間消化し、蒸留水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  カラムにアプライして脱塩した。溶出液を前記と同様にＨＰＬＣで分析した。実験によっては、ボイルして熱失活させたヒアルロニダーゼ  ＳＤ  を用いた。
（６）ＣＤ４４切断アッセイ
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を２４ウエルのプレートに５  ｘ  １０４  細胞／ウエルとなるように播種し、３７℃で一晩培養した。その後、細胞を１０  ｍＭ  ＭＧ１３２中、３７℃で３０分間インキュベートすることによってＣＤ４４の細胞内ドメインの二次分解を防ぐことができる（Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １５５（５），  ｐ７５５−７６２，  （２００１））。細胞を、３７℃、  １０  ｍＭ  ＭＧ１３２の存在下でＨＡと共に１時間、又は１００  ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとともに３０分間インキュベートし、細胞上清を採取して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に付した。細胞をＳＤＳサンプルバッファー（２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、０．１  Ｍ  ジチオトレイトール、１２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）、０．０２％  ブロモフェノールブルー）で溶解し、５分間ボイルした。同数の細胞から抽出した細胞溶解液を含有する等量のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中でブロッキングし、抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂ又は抗ｂ−チューブリンｍＡｂと共にインキュベートした。抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂでインキュベートした膜についてはＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧと共に、抗チューブリン  ｍＡｂでインキュベートした膜についてはＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧと共にそれぞれインキュベートした。二次抗体は、ＥＣＬ  ウエスタンブロッティング検出試薬（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡで分析する前に、刺激を与えた細胞の上清を０．２２−ｍｍ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｆｉｌｔｅｒ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）で濾過した。培養上清中に存在する可溶性のヒトＣＤ４４Ｈ  を、可溶性ＣＤ４４Ｈ  ＥＬＩＳＡ  キット（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ，  Ｖｉｅｎｎａ，  Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、その説明書に従って定量した。
（７）フローサイトメトリー
ＦＬ−ＨＡの細胞表面への結合は、ＥＰＩＣＳ  ＸＬ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｈｉａｌｅａｈ，  ＦＬ）を用いて公知の方法で決定した（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６３，  ｐ１２５８−１２６４，  （１９９９））。ＣＤ４４への結合は、抗ＣＤ４４  ｍＡｂ  ＢＲＩＣ２３５  の結合阻害によって確認した。ＨＡ  ６．９  ｋＤａの細胞表面への結合は、以下の通りＨＡ  ６．９  ｋＤａを添加した場合のＦＬ−ＨＡ結合の阻害によって解析した。１００万個の細胞を、種々の濃度のＨＡ  ６．９  ｋＤａ又は１０  ｍｇ／ｍｌ  ＢＲＩＣ２３５と共に４℃で２０分間インキュベートし、１．０  ｍｇ／ｍｌのＦＬ−ＨＡを添加して、４℃で３０分間インキュベートした。  細胞を、０．１％  ＢＳＡを含有する冷ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
（８）免疫蛍光顕微鏡観察
６ウエルのプレート中で、ヒト臍帯のＨＡ（ＨＡ  １０００  ｋＤａ）でコートされたカバーグラスにＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を２．８  ｘ  １０５  細胞／ウエルの濃度で播種し、  ３７℃で一晩インキュベートした。前記と同様の成分を含有する無血清ＲＰＭＩ培地に交換した後、この細胞を１．０  ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡの存在下又は非存在下で３０分間、又はＨＡ  ６．９  ｋＤａの存在下又は非存在下で１時間インキュベートした。
【００４６】
次いで、この細胞を４％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定し、次いで０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳで５分間処理し、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、室温下で３０分間ブロッキングした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂと共に室温で１時間インキュベートし、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ  （Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）  とローダミン結合ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  ＯＲ）  と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＰｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でマウントし、共焦点顕微鏡  ＬＳＭ  ４１０  （Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
（９）細胞移動の解析
細胞移動は、２４ウエルの  Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒｓ  （Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）と孔径８ｍｍのポリカーボネートフィルターを用いて解析した。フィルターの上側を１００  ｍｇ／ｍｌのＨＡ  ６．９  ｋＤａ、ＨＡ  １０００  ｋＤａ又はＰＢＳのみでコーティングした。チャンバーの下側のコンパートメントを０．１％  ＢＳＡを含有する６００  ｍｌのＲＰＭＩ培地で満たし、ＨＡでコーティングしたフィルターのコートしていない側がチャンバーの下側のコンパートメントに面するように設置した。増殖が対数期にあるＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで短時間処理することによって剥がし、０．１％  ＢＳＡを含有するＲＰＭＩに４  ｘ  １０５  細胞／ｍｌで再懸濁させた。
【００４７】
細胞懸濁液１００  ｍｌを上部のコンパートメントに添加した。抗体を用いた実験においては、細胞移動の解析の１時間前及び細胞移動の解析の間、細胞を１０  ｍｇ／ｍｌのＢＲＩＣ２３５又はＨｅｒｍｅｓ−３（いずれも０．１％  ＢＳＡを含有するＲＰＭＩ培地で希釈）と共にインキュベートした。
【００４８】
次いで、チャンバーを３７℃、５％  ＣＯ２  条件下で２４時間インキュベートした。フィルターをはずし、フィルターの上側に存在する細胞を穏やかにふき取った。フィルターをメタノール中で固定し、ヘマトキシリンとエオシンで染色して、スライドガラスにマウントした。
【００４９】
フィルターの下側に移動した細胞数を光学顕微鏡下でカウントした。細胞が多く存在する５箇所の異なる領域で細胞数をカウントし、平均値を算出した。それぞれの実験は５回行った。
＜結果＞
本発明者らはＣＤ４４の高レベルの切断が報告されているヒト膵癌細胞株ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５３，  ｐ８９３−９０４，  （２００１））を用いて、ＨＡフラグメントによるＣＤ４４分解の誘導能を評価した。図１に示されるように、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞はＣＤ４４を豊富に発現しており（図１Ａ）、ＦＬ−ＨＡに結合し、この結合は抗ＣＤ４４  ｍＡｂ（ＢＲＩＣ２３５）によって完全にブロックされた。この結果は、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞が、ＨＡの唯一のレセプターとして活性型のＣＤ４４を発現していることを示している。
【００５０】
抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂを用いたウエスタンブロッティングによって、既報（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １８，  ｐ１４３５−１４４６，  （１９９９）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １６０，  ｐ４４１−４４７，  （２００２）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７４，  ｐ２５５２５−２５５３４，  （１９９９））の通り、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞はＣＤ４４Ｈ（９０  ｋＤａを示すＣＤ４４の通常のフォーム）を発現していることが示された（図１Ｂ）。また、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をＰＭＡで処理することによって膜に結合した２５  ｋＤａの切断産物が増加したことから（図１Ｂ）、ＣＤ４４の細胞内ドメインの切断がＰＭＡによって有意に増強されることが示された。ＰＭＡ刺激によるＣＤ４４の切断の増強は、ＥＬＩＳＡによっても確認された（図１Ｃ）。
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、主にＨＡ６〜ＨＡ１４で構成される小さいサイズのＨＡフラグメントで処理すると（図２Ａ）、ＨＡフラグメントの濃度依存的にＣＤ４４の切断が増強された（図２Ｂ）。これに対して、主に１，０００糖又はそれ以上のポリマーで構成されるピーク分子量がＨＡ  ２００  ｋＤａで処理した場合には、ＣＤ４４の切断の増強は観察されなかった（図２Ｃ）。同様の結果は、ヒトのグリオブラストーマ細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ）株  Ｕ２５１ＭＧ  及びヒトの膵癌細胞株  Ｐａｎｃ−１においても示された（データは示さない）。これらの結果から、小さいサイズのＨＡフラグメントには種々の癌細胞におけるＣＤ４４の切断を増強する作用があり、大きいサイズのＨＡはこのような作用を示さないことが明らかとなった。
【００５１】
ＨＡフラグメント依存性の現象として報告されている炎症性サイトカイン遺伝子の発現や（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９８，  ｐ２４０３−２４１３，  （１９９６））、ｉＮＯＳ遺伝子の誘導（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２，  ｐ８０１３−８０１８，  （１９９７）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６２，  ｐ２５８３−２５９１，  （２００２））等の現象は、ＨＡを２糖に分解すると観察されなくなる。このことは、ＨＡフラグメントによって誘導されるＣＤ４４の切断においても同様であった（図３）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ  由来のＨＡ特異的ヒアルロニダーゼによって完全に２糖に分解すると、ＣＤ４４の切断は誘導されなかった（図３Ａ）。熱失活させたヒアルロニダーゼでＨＡを処理した場合（図３Ｂ）には、分解されないＨＡフラグメントが含有されていることから、未処理のＨＡフラグメント（図３Ｃ）と同レベルのＣＤ４４切断誘導活性を示した。
【００５２】
これらの結果から、ＨＡフラグメントによってＣＤ４４の切断が誘導されるが、ＨＡ２によっては誘導されないことが示された。またＨＡ  ２００  ｋＤａ画分中に、ＣＤ４４の切断を増強させるＨＡ以外の物質が存在する可能性が排除された。
【００５３】
ＨＡのサイズがＣＤ４４の切断に対して与える影響を調べるために、２糖〜１２糖の単一のサイズのＨＡフラグメント及びＨＡ  ６．９  ｋＤａ画分（主として３６糖を含有する）を用いて実験した。図４Ａに示す通り、２糖以上のＨＡフラグメントにＣＤ４４の切断誘導活性が認められた。６糖以上のＨＡフラグメントにおいては、２糖及び４糖のＨＡフラグメントにおけるＣＤ４４切断誘導活性よりもさらに強い活性がみられ、見かけ上、サイズ依存的にＣＤ４４の切断を誘導した。しかし、ＨＡ画分の分子量を更に高くすると（例えば、３６  ｋＤａ、２００  ｋＤａ及び１，０００  ｋＤａ）ＣＤ４４の切断活性を有しなくなった（図４Ｂ）。これらの結果から、特定の範囲にあるサイズのＨＡのみが、ＣＤ４４の切断活性を示すことが明らかとなった。
【００５４】
２糖や４糖以上のＨＡフラグメントにＣＤ４４の切断誘導活性がみられ、特に６糖以上のＨＡフラグメントだけがＣＤ４４の切断を強く誘導するという以上の結果から、ＣＤ４４にＨＡが結合するために必要な最小のサイズは６糖であるという報告が想起される（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ｐ２６９６７−２６９７５，  （２０００））。そこで、ＨＡフラグメントがＣＤ４４に結合することによってＣＤ４４の切断が誘導される可能性について検討した。まず、ＦＬ−ＨＡのＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対する結合におけるＨＡ  ６．９  ｋＤａによるブロッキング効果を検討した。小さいサイズのＨＡフラグメントのＣＤ４４への結合は、フローサイトメトリーでは一見、検出できないからである（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５，  ｐ２６９６７−２６９７５，  （２０００））。図５に示す通り、ＦＬ−ＨＡのＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対する結合（中和抗体である抗ＣＤ４４  ｍＡｂ  ＢＲＩＣ２３５によって完全にブロックされる）は、ＨＡ  ６．９
ｋＤａ  によって濃度依存的に有意にブロックされた。
【００５５】
図２においてＣＤ４４の切断の誘導に用いたＨＡフラグメントは、ＦＬ−ＨＡの結合も阻害した（データは示さない）。これらの結果は、ＣＤ４４の切断を誘導できるＨＡフラグメントは、ＣＤ４４への結合能を有していることを示している。そこで、ＣＤ４４のＨＡへの結合能をブロックすることによって、ＣＤ４４の切断の誘導が阻害されるか否かを検討した。ＣＤ４４自体が架橋することによってもＣＤ４４の切断が誘導されてしまうことから（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６７，  ｐ１２３−１３１，  （２００１））、これを防ぐために抗ＣＤ４４  ｍＡｂ  ＢＲＩＣ２３５のＦａｂフラグメントを使用した。図６に示すように、ＨＡフラグメントによって誘導されたＣＤ４４の切断は、ＢＲＩＣ２３５抗体のＦａｂフラグメントによってほぼ完全に阻害された。このことは、ＨＡによって誘導される切断は、ＣＤ４４とＨＡとの相互作用によって引き起こされることを示している。これに対し、ＨＡ結合分子に対するｐＡｂであるＲＨＡＭＭ（ＨＡの結合をブロックできる）は、ＨＡフラグメントによって誘導されるＣＤ４４の切断をブロックできなかった（データは示さない）。このことは、ほとんど全てのＨＡが、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞のＣＤ４４に結合するとの観察と一致する（図１Ａ）。
【００５６】
これらの結果は、ＨＡフラグメントが、ＣＤ４４と相互作用することによってＣＤ４４の切断を誘導することを強く示唆するものである。
【００５７】
ＣＤ４４の切断は、ＣＤ４４と細胞外マトリクスとの相互作用のダイナミックな制御を通して、ＣＤ４４を介した癌細胞の転移に重要な役割を果たしていることが報告されている。そこで、ＣＤ４４の切断活性が非常に高いＨＡ  ６．９  ｋＤａ  画分が、  細胞の運動能に影響するか否かを検討した。
【００５８】
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をＨＡ  ６．９  ｋＤａで刺激すると、細胞は多くのｆｉｌｏｐｏｄｉａを形成し（図７Ｄ）、  アクチンフィラメントの再構成を示した（図７Ｅ，  Ｆ）。この現象は、ＰＭＡで刺激した場合と同様であった  （図７Ｊ，  Ｋ，  Ｌ）。これに対して、ＨＡ  １，０００  ｋＤａ画分でＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を刺激した場合には、ｆｉｌｏｐｏｄｉａの形成及びアクチンの再構成もわずかであり、ほとんど変化が見られなかった（Ｆｉｇ．  ７Ｇ，  Ｈ，  Ｉ）。このことは、小さいサイズのＨＡフラグメントのみが癌細胞の形態に影響を与えることを示している。
【００５９】
次に、異なる分子サイズのＨＡ画分が、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の運動性に対して異なる影響を与えるかどうかを、Ｂｏｙｄｅｎ−ｔｙｐｅ  チャンバー（上下のウエルが、小さい分子サイズ又は大きい分子サイズのＨＡ画分でコーティングされたフィルターで分離されているもの）を用いて評価した。図８に示す通り、ＨＡ  ６．９  ｋＤａでコーティングされたフィルターにＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をのせた場合、その運動性は高かったが、これは中和抗体である抗ＣＤ４４  ｍＡｂ  ＢＲＩＣ２３５によって完全にブロックされた。しかし、ブロックしないｍＡｂである  Ｈｅｒｍｅｓ−３によってはブロックされなかった。
【００６０】
このことは、運動性の上昇がＣＤ４４とＨＡとの相互作用に基づくものであることを示している。これに対して、ＨＡ  １，０００  ｋＤａでコーティングされたフィルターにＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をのせた場合には、  コーティングされていないフィルターに比してもその運動性は非常に低かった。これらの結果は、低分子量サイズのＨＡはＣＤ４４の切断のみならず、ＣＤ４４依存性の細胞の移動をも誘導することを示すものである。
【００６１】
【発明の効果】
低分子量ＨＡ又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする本発明誘導剤及び促進剤は、前記実施例の結果からも明らかな通り、顕著なＣＤ４４切断誘導作用、及び細胞の移動促進効果を発揮することから極めて有用である。
【００６２】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞が活性型のＣＤ４４を発現し、ホルボールエステル処理によってＣＤ４４の切断が増加することを示す図である。
Ａ：ＣＤ４４の発現を調べるために、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を１０  ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ＢＲＩＣ２３５の存在下（左側のパネル；黒色の部分）又は非存在下（左側のパネル；白色の部分；ドットの部分）  でインキュベートし、フローサイトメーターで解析した。
次に、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞におけるＣＤ４４のリガンド結合活性を、ＦＬ−ＨＡ結合によって解析した。細胞をまず１０  ｍｇ／ｍｌのＢＲＩＣ２３５  （右側のパネル；黒色の部分）又はアイソタイプコントロール（マウス  ＩｇＧ  ）（右側のパネル；白色の部分、細い実線）と共にインキュベートし、あるいは何ともインキュベートせず（右側のパネル；白色の部分（太い実線））、次いで１０  ｍｇ／ｍｌのＦＬ−ＨＡと共にインキュベートした。細胞をフローサイトメーターで解析した。染色されていない細胞の蛍光のプロファイルは、ＢＲＩＣ２３５で前処理した細胞と、また、アイソタイプコントロールで前処理した細胞の蛍光のプロファイルは、前処理をしなかった細胞と、それぞれ完全にオーバーラップしているので、図面上では現れていない。
Ｂ：ＣＤ４４の切断をイムノブロッティングによって調べた。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、２４ウェルのプレートに５  ｘ  １０４  細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩培養した。次いで細胞を１０  ｍＭ  ＭＧ１３２と共に３０分間培養し、１００  ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡの存在下又は非存在下で３０分間培養した。この細胞をＳＤＳサンプルバッファーで溶解し、等量の細胞溶解液を含有するサンプルを、抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂ  （上のパネル）又は抗β−チューブリン  ｍＡｂ  （下のパネル）を用いたイムノブロッティングによって分析した。
Ｃ：前記の細胞培養液から採取した細胞を含有しない上清液中の可溶性ＣＤ４４を、ＥＬＩＳＡ系を用いて分析した。カラム及びバーは、独立した３回の実験に基づく平均値及びＳ．Ｄ．を示す。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）によって行った。図中の「＊」は、ｐ  ＜  ０．００５で有意差があることを示す。
【図２】ＣＤ４４の切断はＨＡフラグメントによって増強されるが、ＨＡ  ２００  ｋＤａによっては増強されないことを示す図である。
Ａ：ＨＡフラグメントのＨＰＬＣプロファイル。ＨＡ  ２００  ｋＤａをヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼで消化した。分解されたＨＡフラグメントを、前記の＜材料等＞に記載の方法で、ＨＰＬＣ解析した。それぞれのオリゴ糖ピークにおける単糖単位の数は、それぞれのピークの上部に示した。
Ｂ：ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を図１で述べたのと同様に一晩培養し、ＭＧ１３２で処理した後、１００  ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡの存在下（レーン１）若しくは非存在下（レーン２）で３０分間、又は表示した濃度のｆｒＨＡの存在下（レーン３〜７）で１時間培養した。細胞を溶解し、そのサンプルを図１で述べたのと同様にイムノブロッティングに付した。
Ｃ：ｆｒＨＡの代わりにＨＡ  ２００  ｋＤａを用いた点を除き、細胞を前記と同様に処理した。
【図３】ＨＡフラグメントが、インタクトなヒアルロニダーゼによる消化によってＣＤ４４切断誘導活性を失うが、ボイルしたヒアルロニダーゼによっては失わないことを示す図である。
ＡとＢ：ヒアルロニダーゼ処理したＨＡ画分の、ＨＰＬＣプロファイル。ＦｒＨＡをインタクトなヒアルロニダーゼＳＤ（Ａ）又はボイルしたヒアルロニダーゼＳＤ（Ｂ）で処理した。その処理産物であるＨＡフラグメント（ｆｒＨＡ−ＨＡａｓｅ及びｆｒＨＡ−ＨＡａｓｅ／ｂｏｉｌｅｄ）をＨＰＬＣで分析した。ｆｒＨＡはインタクトなヒアルロニダーゼによって二糖に分解されたが
、熱失活させたヒアルロニダーゼによっては分解されなかった。
Ｃ：ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、図１で述べたのと同様に一晩培養し、ＭＧ１３２で処理して、１００  ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ  の存在下（レーン２）又は非存在下（レーン１）で３０分間、又は２５  ｍｇ／ｍｌ  ｆｒＨＡ−ＨＡａｓｅ（レーン３）、ｆｒＨＡ−ＨＡａｓｅ／ｂｏｉｌｅｄ（レーン４）又はｆｒＨＡ（レーン５）の存在下で１時間培養した。ＣＤ４４の切断は、図２で述べたのと同様に解析した。
【図４】サイズ的に単一な小さいＨＡによってＣＤ４４の切断が誘導されるが、大きなポリマーによっては誘導されないことを示す図である。
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、図２及び図３で述べたのと同様に一晩培養し、１０  ｍＭ  ＭＧ１３２で３０分間処理した。パネルＡは、細胞を、培地のみで（レーン１）若しくは１００  ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡと共に（レーン２）３０分間培養したもの、又は２５  ｍｇ／ｍｌの種々のＨＡフラグメントで１時間培養したもの（ｆｒＨＡ；レーン３、ＨＡ２；レーン４、ＨＡ４；レーン５、ＨＡ６；レーン６、ＨＡ８；レーン７、ＨＡ１０；レーン８、ＨＡ１２；レーン９、ＨＡ６．９  ｋＤａ；レーン１０）の結果を示す。
パネルＢは、細胞を種々の濃度の大きなＨＡ画分で処理した結果を示す。細胞を、薬剤の非存在下（レーン１）若しくは１００  ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下（レーン２）で３０分間インキュベートしたもの、又は２５  ｍｇ／ｍｌ  （レーン４、７及び１０）、５０  ｍｇ／ｍｌ  （レーン５、８及び１１）若しくは１００  ｍｇ／ｍｌ  （レーン６、９及び１２）のＨＡで１時間インキュベートしたもの（ｆｒＨＡ；レーン３、ＨＡ  ３６  ｋＤａ；レーン４、５及び６、ＨＡ２００  ｋＤａ；レーン７、８及び９、ＨＡ  １０００  ｋＤａ；レーン１０、１１及び１２）の結果を示す。サンプルは前記と同様に解析した。
【図５】ＨＡ  ６．９  ｋＤａ  は細胞表面のＣＤ４４に結合することを示す図である。
標識されていないＨＡ  ６．９  ｋＤａのＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対する結合は、ＦＬ−ＨＡの結合の阻害によって測定した。一番上のパネルは、細胞を１０  ｍｇ／ｍｌ  ＢＲＩＣ２３５の存在下（実線）又は非存在下（黒）で２０分間培養し、１．０  ｍｇ／ｍｌ  ＦＬ−ＨＡと共にさらに４℃で３０分間培養してフローサイトメトリーで解析した結果である。点線は培地のみで培養した細胞の蛍光を示し、実線と完全にオーバーラップしていた。他のパネルは、まず細胞を段階的に希釈したＨＡ  ６．９  ｋＤａと共に２０分間インキュベートし、次いで１．０  ｍｇ／ｍｌ  ＦＬ−ＨＡと共に４℃で３０分間インキュベートした（黒の部分）。ＦＬ−ＨＡの結合が、標識していないＨＡ  ６．９  ｋＤａの用量依存的な添加に置換されていることに注意されたい。
【図６】ＨＡフラグメントによって誘導されるＣＤ４４の切断が、抗ＣＤ４４ブロッキングｍＡｂ  ＢＲＩＣ２３５によってブロッキングされることを示す図である。
２４ウェルのプレートに５  ｘ  １０４  細胞／ウェルの密度で播種されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を一晩培養し、１０  ｍＭ  ＭＧ１３２と共に３０分間インキュベートした。この細胞を、１０  ｍｇ／ｍｌのＢＲＩＣ２３５  Ｆａｂ  フラグメントの存在下（レーン４）又は非存在下（レーン１〜３）で３０分間プレインキュベートし、ＢＲＩＣ２３５  Ｆａｂ  の存在下で１００  ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ  と共に３０分間（レーン２）  又は２５  ｍｇ／ｍｌのｆｒＨＡとともに１時間（レーン３及び４）インキュベートした。
細胞をＳＤＳサンプルバッファーで溶解させ、サンプルを抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂ  （上段と中段のパネル）又は抗β−チューブリン  ｍＡｂ  （下段のパネル）を用いたイムノブロッティングによって解析した。
【図７】ＨＡ  ６．９  ｋＤａ  が、細胞の移動を促進する作用を有することを示す図である。
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、６ウェルプレートに設置された、ＨＡ  １０００  ｋＤａがコートされたカバーカラスに２．８  ｘ  １０５  細胞／ウェルの濃度で播種し、３７℃で一晩インキュベートした。細胞は、処理しないか（Ａ、Ｂ、Ｃ）、又はＨＡ  ６．９  ｋＤａ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）、ＨＡ  １０００  ｋＤａ（Ｇ、Ｈ、Ｉ）若しくはＰＭＡ  （Ｊ、Ｋ、Ｌ）で処理した。刺激した後、細胞を、抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ  ｐＡｂ  （Ａ、Ｄ、Ｇ及びＪ）、及びローダミン結合ファロイジン（Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＫ）で二重染色した。．
サンプルは共焦顕微鏡で解析した。２つの蛍光を併せたイメージも示した（Ｃ、Ｆ、Ｉ及びＬ）。  実験結果は、少なくとも３回の独立した実験によって求めた値である。
【図８】ＨＡ  ６．９  ｋＤａによる細胞の移動の誘導は、ブロッキング  抗ＣＤ４４抗体によって阻害されるが、非ブロッキング抗ＣＤ４４抗体によっては阻害されないことを示す図である。
ＨＡ  ６．９  ｋＤａの、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の移動に対する効果は、Ｂｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｔｙｐｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙを用いて評価した。上下のチャンバーを画するフィルターをＨＡ  ６．９  ｋＤａ（カラム  ４、５及び６）若しくはＨＡ  １０００  ｋＤａ  （カラム７、８及び９）でコーティングし、又はＨＡでは何らコーティングしなかった（カラム１、２及び３）。細胞（４．０  ｘ  １０４  細胞／ウェル）を、抗体不存在の条件下（カラム１、４及び７）、ＢＲＩＣ２３５の存在下  （カラム２、５及び８）  又はＨｅｒｍｅｓ−３  の存在下（カラム３、６及び９）で上部のチャンバーに入れ、１時間インキュベートした。
細胞を、これらの抗体の存在下でさらに２４時間インキュベートした。カラム及びバーは、独立した５回の実験に基づく平均値及びＳ．Ｄ．を示す。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）によって行った。図中の「＊」は、ｐ  ＜  ０．００５で有意差があることを示す。
【図１】
2004238294.tif 000002
【図２】
2004238294.tif 000003
【図３】
2004238294.tif 000004
【図４】
2004238294.tif 000005
【図５】
2004238294.tif 000006
【図６】
2004238294.tif 000007
【図７】
2004238294.tif 000008
【図８】
2004238294.tif 000009