(57)【要約】【課題】心筋梗塞、脳梗塞などの発生を予防するのに有効な血清コレステロール低下剤の提供。【解決手段】シクロデキストリン水溶液からなる血管内細胞膜中のコレステロールの量を低下させる抗血栓薬。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリン水溶液からなる血管内細胞膜中のコレステロールの量を低下させる抗血栓薬。
【請求項２】
水溶液中のシクロデキストリン濃度が１〜５０重量％である請求項１に記載の抗血栓薬。
【請求項３】
血管内細胞膜中のコレステロールの量を低下させるためのシクロデキストリン水溶液の注射薬としての使用。
【請求項４】
水溶液中のシクロデキストリン濃度が１〜５０重量％である請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管内に存在する細胞成分、特に血球細胞である血小板膜中に存在するコレステロール量を低下させることにより、血小板膜表面上でＧＰＩｂ，ＧＰＶＩなどの膜糖蛋白がコレステロールリッチのマイクロドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔ）に集積して血小板を活性化させるシグナルを出すのを抑制して抗血小板効果、抗血栓効果を発揮させ、心筋梗塞、脳梗塞などの動脈血栓性疾患（ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）の発症を予防する抗血栓薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、コレステロール低下療法は、動脈壁のコレステロールを減少させることにより動脈硬化巣の進展及び不安定化の予防に役立つと理解されて来た。実際、公知のスタチン系薬物による強力なコレステロール低下療法により心筋梗塞などの動脈硬化、動脈血栓性疾患の発症率が減少することが大規模臨床試験により確認されている。動脈血栓性疾患の発症には血液成分である血小板が重要な役割を果たすため、コレステロール低下療法の心筋梗塞発症予防効果には抗血小板効果、抗血栓効果も関与すると想定されていながら、そのメカニズムは知られていなかった。例えば血小板機能検査法として従来から広く使用されている血小板凝集検査では、血管内細胞膜中のコレステロール低下作用に基づく抗血栓効果を確認することができなかった。血清コレステロールを低下させる作用を有するスタチン系薬物により、動脈血栓症でもある心筋梗塞症の発症抑制効果があることは大規模臨床試験により明らかにされていたが、その理由は全く知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、心筋梗塞、脳梗塞などの原因である血小板血栓の発生を予防するのに有効な血管内細胞膜（特に、血小板、赤血球、白血球などの血球細胞膜）中のコレステロールの量を低下させる抗血栓薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、シクロデキストリン水溶液からなる血管内細胞膜中のコレステロールの量を低下させる抗血栓薬が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】
スタチン系薬物は心筋梗塞などの動脈血栓性疾患発症予防効果があることが知られている。これらの発症予防効果は血清中のコレステロール量の低下による動脈硬化巣の安定化に基づくと理解されて来た。動脈血栓性疾患の発症には血管側の因子である動脈硬化巣を構成する白血球、細胞外マトリックスのみならず、動脈血流条件下の血栓形成において中心的役割を演じる血小板も重要な役割を果たすが、コレステロール量の低下と血小板機能との関連に関しては理解されていなかった。本発明者は、血管内細胞膜中のコレステロールの量を低下させることにより、特に血小板膜中のコレステロールの量を低下させることによって、動脈硬化巣が破綻してコラーゲンなどの内皮下組織が血流に曝露された時に形成される血小板血栓を構成する血小板を活性化させる膜蛋白（例えばＧＰＩＤ，ＧＰＶＩ）からの情報伝達が障害されることを明らかにし、血漿中のＬＤＬコレステロールを低下させることによる間接的抗血栓療法がコレステロール低下療法の用途の拡大に役立つことを見出した。
【０００６】
本発明によれば、シクロデキストリンからなる細胞膜中のコレステロールの量を低下させる抗血栓薬を用いて血管内細胞膜中のコレステロール濃度を低下させることができるため、前記血小板血栓を構成する血小板の表面上でＧＰＩｂ，ＧＰＶＩなどの膜蛋白がコレステロールの豊富なマイクロドメインに集積して、血小板を活性化させるシグナルが抑制されるため、抗血栓治療法として極めて有用である。
【０００７】
本発明者らは前記知見に基づき、実験的にシクロデキストリンにより細胞膜中のコレステロール量を低下させることによって抗血栓効果が得られることを明らかにし、臨床応用に当たっては、シクロデキストリン及びその誘導体による血小板膜コレステロール低下療法に加えて、スタチン系薬物その他の、すでにコレステロール低下作用があることが知られている薬物を一緒に使用する療法を研究した。後の実施例に示したように、蛍光標識した血小板による血栓の定量的評価、同じく標識化した血小板表面蛋白に対する抗体を用いることによる膜蛋白の再構築評価法を用いて、シクロデキストリンの、抗血栓薬としての評価をすることができ、またフィブリン形成の指標となる蛍光物質を用いて血小板由来凝固活性化（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）のイメージング方法として抗血栓薬の評価をすることができる。
【０００８】
次に血液中の細胞膜内のコレステロール量を低下させる方法としてシクロデキストリンを使用することについて説明する。
シクロデキストリンは、式（Ｉ）：
【０００９】
【化１】
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【００１０】
に示すような構造をした化合物（注：式（Ｉ）はβ−シクロデキストリンで、その他α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン及びこれらの例えばメチル置換体であるメチルβ−シクロデキストリン、プロピル置換体である２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンなどの誘導体を含む総称）で、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ属の菌が生産する環状デキストリン生成酵素とデンプンとの反応によって得られる水に易溶性のドーナツ状の分子で、シクロデキストリンの分子はその内側が疎水性で、外側が親水性である性質を利用して、本発明では血管内細胞膜中のコレステロールなどの脂質を分子の内側に取り込んで包接物を形成せしめて細胞膜中のコレステロールを吸着する。即ち、本発明によれば、血液中にこのシクロデキストリンの水溶液を導入することにより、血液中の細胞膜内、特に血小板細胞膜内のコレステロールを吸着して、抗血栓作用を呈する。シクロデキストリンを用いることにより、以下の実施例に示すように、細胞膜内のコレステロールの大半を取り除いた状態での抗血栓性効果が評価され、シクロデキストリンは容量依存的に血小板血栓の形成を抑制した（図２参照）。また市販のスタチン薬物と併用すれば、シクロデキストリンによる細胞膜内のコレステロール量の低下とスタチン薬物による血清中のコレステロールの量の低下とを組み合せたコレステロール低下療法ができ、結果として優れた抗血小板集積効果及び抗血栓効果が得られる。
【００１１】
本発明に用いるシクロデキストリンは、前述の如く、α−、β−及びγ−シクロデキストリン並びにこれらの誘導体（例えばメチル−α、β又はγ−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンなど）を含む化合物をいい、これらは単独又は任意の混合状態で用いることができる。
【００１２】
本発明に係る抗血栓薬は上記シクロデキストリン化合物を水に溶解した水溶液である。この水溶液中のシクロデキストリンの濃度には特に制限はないが、取扱その他を考慮すると１重量％以上、１〜５０重量％程度であるのが好ましく、１０〜５０重量％であるのが更に好ましい。かかるシクロデキストリン水溶液は、例えば注射剤として血管、特に静脈中に注入することができるが、その他消化管で吸収されるカプセルなどの形態で経口的に患者に投与することもできる。
【００１３】
本発明に係るシクロデキストリン水溶液は、例えば注射薬中に一般に配合される浸透圧調節物質であるブドウ糖、食塩などの汎用の添加剤を通常の一般的な量で含むことができる。本発明の抗血栓薬の投与量には特に限定はないが、成人につき１日当りシクロデキストリンとして１００〜１０００ｍＭ、好ましくは５００〜１０００ｍＭ投与するのが好ましい。
【００１４】
【実施例】
本発明に従って、シクロデキストリンが血液中、特に血小板細胞膜内のコレステロールの量を低下させる実施例を以下に説明するが、本発明の範囲をこれらの実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
以下の例では、前述の如く、内側が疎水性、外側が親水性となるように設計された分子であるメチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を用いた。以下の実施例の結果から明らかなように、シクロデキストリンにより、血小板膜内のコレステロールがシクロデキストリン分子内に移動するため、コラーゲン上にシクロデキストリンを含まない血液を灌流すると血小板血栓が形成されるのに対し、メチルβ−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を含む血液では、容量依存的に血栓形成を抑制した。
【００１５】
動脈血栓モデルを用いたシクロデキストリンの抗血栓作用の評価
従来血小板機能の評価法として広く使用されていた血小板の凝集による方法では動脈血栓の形成で同じ条件で抗血栓薬の薬効を評価することができない。動脈血栓症は、動脈硬化巣の破綻した部位で曝露されたコラーゲンなどのマトリックス表面上に血流条件下で形成されるものであり、本例では、同様の条件下で血小板血栓の形成過程を評価するために、コラーゲンを固相化した表面上に、血液を灌流して、コラーゲン層２上に形成される血小板血栓の生成状態を指標としてシクロデキストリンの抗血栓効果を評価した（図１参照）。
【００１６】
この評価法によれば、心筋梗塞など、実際に生体内での動脈血栓症の発症にかかわる血栓形成と同じ条件下での血小板血栓形成の有無を評価することができる。
具体的には、図１に示すように、コラーゲン層２を、例えばガラス板１の表面上に固相化し、蛍光標識した血小板５を含む全血をフローチャンバー８に血流９として灌流し、そのコラーゲン層２上に形成される血小板血栓３を蛍光顕微鏡４で観察して記録することにより血小板血栓３の形成を評価することができる。血小板血栓３の定量化のためには、血小板血栓３に覆われたコラーゲン層２の面積を計測すればよい。
【００１７】
血管壁近傍を流れる血小板は、血管壁が損傷し内皮下マトリックスが暴露されると、マトリックス上に血流条件下での集積血栓形成に関与する。そこで、コラーゲン表面上に蛍光標識した血小板を含む全血を灌流した時にコラーゲン上に形成される血小板血栓を動脈血栓の指標とした。蛍光標識した血小板を用いることにより、赤血球の存在下でも血栓形成の有無などを評価をすることができるとした。
【００１８】
血流条件下において、図１に示すように、厚さ２ｍｍのガラス板１上に設けた平均厚さ０．１ｍｍのコラーゲン層２上の血小板血栓３の形成におよぼすシクロデキストリンの抗血栓効果を試験した。なお、図１において、５は血小板、６は血小板かコラーゲン上へ粘着していく状態を示し、７は光源、８はフローチャンバーを示す。
健常成人より血液を採取し、選択的抗トロンビン薬アルガトロバンにて抗凝固処理を行った。血液中の血小板をメパクリンにて蛍光標識した。蛍光標識した血小板を濃度２０万／μｌで含む全血にメチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を終濃度１０ｍＭとなる量で添加して血小板細胞膜中のコレステロールを吸着させた。さまざまな濃度のＭＢＣＤを含む全血を、固相化したコラーゲン表面上に１，５００  Ｓ−１，１００  Ｓ−１のずり速度の条件で９分間灌流させ、コラーゲン層２上の血小板血栓３の形成状態を蛍光顕微鏡４で観察し、結果をデジタルビデオテープに記録した。血小板がコラーゲン層２を覆っている面積を計算し、血栓形成の定量的指標としたその結果１００Ｓ−１及び１５００Ｓ−１での９分間の灌流後、シクロデキストリンを含まない対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）ではそれぞれ２４±５％及び４８＋６％が血小板で覆われた。これに対し、１０ｍＭのメチルβ−シクロデキストリンを含む血流の灌流後には１００Ｓ−１及び１５００Ｓ−１のいずれの場合にも血小板血栓は殆んど形成されなかった。スタチン服用後（１０ｍｇ／日）はそれぞれ１８±４％及び３３＋６％が血小板で覆われた。
【００１９】
図２は図１に示すフローチャンバーに設けたガラス板上に固相化したコラーゲン上に、シクロデキストリンを含まない対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、メチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）を５ｍＭ及び１０ｍＭ含む血液を９分間ずり速度１５００Ｓ−１及び１００Ｓ−１で灌流させた際のコラーゲン上の血小板血栓（図の白い部分が血栓を示す）の形成状態を示す蛍光顕微鏡写真（４０倍）を示す。図２の結果から明らかなようにＭＢＣＤの添加によって、特にＭＢＣＤ１０ｍＭで血栓の形成状態が明らかに減少していることは明らかである。
【００２０】
図３及び図４はそれぞれ対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）（薬剤無添加）、スタチン（ＳＴＡＴＩＮ）添加（１０ｍｇ／日服用）及びＭＢＣＤ１０ｍＭ添加の３種類の血液試料を上と同様にして図１のフローチャンバーを灌流させて（図３はずり速度１００Ｓ−１、図４はずり速度１５００Ｓ−１）、それぞれ１分、３分、６分及び９分後の血栓の形成状態を蛍光顕微鏡写真（４０倍）に示した。図３及び図４からＭＢＣＤによる抗血栓効果が顕著であった。
【００２１】
図２〜４に示すように、ＭＢＣＤは、薬剤無添加の対照試料及び従来の市販抗血栓薬であるスタチン系薬物（ファイザー薬品製アトルバスタチン）を含む試料に比較して、容量依存的にコラーゲン上の血小板血栓の形成を抑制した。
【００２２】
血小板膜表面上にはコレステロールとスフィンゴ脂質に富む（コレステロールリッチマイクロドメイン）（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔ）が存在し、刺激を受けるとＧＰ  Ｉｂ／ＩＸ複合体、ＧＰ  ＶＩ／ＦｃＲｇａｍｍａ複合体がコレステロールリッチマイクロドメイン上集積して活性化シグナルを惹起する。血清コレステロールが低下し、血小板膜内のコレステロールが減少するとｒａｆｔが減少する結果、コラーゲン、ヴォンビルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）上の血小板血栓の形成が抑制されると考えられる。
【００２３】
【発明の効果】
従来、広く使用されていた血小板機能評価法である血小板凝集は、ＡＤＰ（アデノシン２リン酸），トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）などの活性化物質を添加することにより惹起される。この方法は血小板無力症などの出血性疾患の評価には有効であったが、血栓性疾患の評価、抗血小板薬の評価には適さなかった。本発明で評価された血流条件下の血小板集積抑制機能は、動脈硬化巣の破綻部位での動脈血栓の形成の評価、抗血栓薬の評価に適する。本発明で用いた評価法は、実際の動脈血栓の形成される条件と近い条件における血小板形成を評価しており、単純な糖質であるシクロデキストリンは脂質を取り囲む以外の作用は乏しく、コレステロール低下作用以外の作用を考える必要性が少ない。
【図面の簡単な説明】
【図１】血流条件下にコラーゲン表面上の血小板血栓の生成を評価する方法を示す図面である。
【図２】シクロデキストリンによる、血流条件下コラーゲン上での血栓形成の抑制状態を示す図面に代る写真である。
【図３】シクロデキストリンによる、血流条件下コラーゲン上での血栓形成の抑制状態を示す図面に代る写真である。
【図４】シクロデキストリンによる、血流条件下コラーゲン上での血栓形成の抑制状態を示す図面に代る写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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