(57)【要約】【課題】本発明の目的は高分離能を有し且つ自動的に高精度の分析が可能な高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置を提供することにある。【解決手段】２００μｌ／ｍｉｎ以下の定量でグラジエント溶離液を送液する前段送液手段１２と、試料及びグラジエント溶離液を送液流路へ導入するオートサンプラ１４と、前段分離カラム１６と、を備えた前段分離部と、トラップカラム２０で脱塩処理を行う脱塩部と；１００μｌ／ｍｉｎ以下の定量でグラジエント溶離液を送液する後段送液手段２２と、後段分離カラム２４を備えた後段分離部と；前記後段分離部と接続された質量分析部２６と；前記オートサンプラによる流路への導入操作、前記送液手段の操作、及び送液流路の切り換え操作を制御する制御部２８を備えたことを特徴とする２次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラジエント溶離により分離カラムで分離された試料中の各成分を検出する高速液体クロマトグラフ装置において、
２００μｌ／ｍｉｎ以下の定量でグラジエント溶離液を送液する前段送液手段と、
試料及びグラジエント溶離液を送液流路へ導入するオートサンプラと、
該試料を各成分へ分離する前段分離カラムと、
を備えた前段分離部と、
前記前段分離部で分離された各分離成分をトラップするカラムを備え、ポンプにより該カラムに洗浄液を流して該各分離成分について脱塩処理を行う脱塩部と、
１００μｌ／ｍｉｎ以下の定量でグラジエント溶離液を送液する後段送液手段と、
前記各分離成分ごとにさらに分離を行う後段分離カラムと、
を備えた後段分離部と、
前記後段分離部と接続された質量分析部と、
前記オートサンプラによる流路への導入操作、前記送液手段の操作、及び送液流路の切り換え操作を制御する制御部を備えたことを特徴とする２次元高速液体クロマトグラフ装置。
【請求項２】
請求項１記載の装置において、
前記前段分離カラムはイオン交換カラムであり、
前記後段分離カラムは逆相カラムであり、
前記オートサンプラから一のグラジエント溶離液を前記イオン交換カラムに導入して分離成分を脱塩部のカラムにトラップし、該分離成分について脱塩部での脱塩処理、後段分離部での逆相分離、及び質量分析部での試料検出を行い、
続いて前記オートサンプラに準備した他の各グラジエント溶離液についても同様に各部における操作を行うことを特徴とする２次元高速液体クロマトグラフ装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載の装置を用い、
あらかじめ分析対象の蛋白質をペプチドに分解する前処理を行った、該ペプチドを含む混合物を試料として用い、
前記各分離部での分離により前記混合物から各ペプチドを分離し、
前記質量分析部で該分離されたペプチドについて質量分析を行い、該ペプチドのアミノ酸配列を同定することを特徴とする蛋白質分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は２次元高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置、特に蛋白質の分離分析における自動化、及び分析精度の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のゲノムプロジェクトのような遺伝子情報の解析プロジェクトの進展に伴い明らかにされた膨大な遺伝子情報と、細胞内で複雑に相互作用している多様なタンパク質との関連を明らかにすることにより、遺伝子の機能解析を進めていくことが求められている。プロテオーム解析は、細胞の機能を支える多様なタンパク質の関係を総合的にとらえようとする試みである。しかし現在の分析技術では、タンパク質の解析には多大な時間と労力が必要とされており、このように多様性に富むタンパク質の集合であるプロテオームの変化を、総合的に、しかも迅速に把握することが求められている。従来、プロテオーム解析に一般的に用いられている手法としては、２次元電気泳動法等がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
このプロテオーム解析に高速液体クロマトグラフを適用し、様々な成分からなる混合物を分離する場合、従来の高速液体クロマトグラフ装置では、用いるカラムの特性と各成分の特性との関係等から分離能に限界があった。すなわち、例えば成分として多数の成分が混在しているときには、各成分の極性等の性質やカラム特性により、よく分離される成分もある一方でカラムを通しても十分に分離されない一群の成分も同時に存在する場合がある。
【０００４】
また、従来蛋白質の分離分析として一般的に行われている電気泳動法では、高い分離能で分離できる一方で、自動化が困難で再現性や定量性の確保が難しいという問題があった。
本発明は前記従来技術の課題に鑑み為されたものであり、その目的は高分離能を有し且つ自動的に高精度の分析が可能な高速液体クロマトグラフ装置及びそれを用いた蛋白質分析装置を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の２次元高速液体クロマトグラフ装置は、グラジエント溶離により分離カラムで分離された試料中の各成分を検出する高速液体クロマトグラフ装置において、
２００μｌ／ｍｉｎ以下の定量でグラジエント溶離液を送液する前段送液手段と、
試料及びグラジエント溶離液を送液流路へ導入するオートサンプラと、
該試料を各成分へ分離する前段分離カラムと、
を備えた前段分離部と、
前記前段分離部で分離された各分離成分をトラップするカラムを備え、ポンプにより該カラムに洗浄液を流して該各分離成分について脱塩処理を行う脱塩部と、
１００μｌ／ｍｉｎ以下の定量でグラジエント溶離液を送液する後段送液手段と、
前記各分離成分ごとにさらに分離を行う後段分離カラムと、
を備えた後段分離部と、
前記後段分離部と接続された質量分析部と、
前記オートサンプラによる流路への導入操作、前記送液手段の操作、及び送液流路の切り換え操作を制御する制御部を備えたことを特徴とする。
【０００６】
また、前記装置において、
前記前段分離カラムはイオン交換カラムであり、
前記後段分離カラムは逆相カラムであり、
前記オートサンプラから一のグラジエント溶離液を前記イオン交換カラムに導入して分離成分を脱塩部のカラムにトラップし、該分離成分について脱塩部での脱塩処理、後段分離部での逆相分離、及び質量分析部での試料検出を行い、
続いて前記オートサンプラに準備した他の各グラジエント溶離液についても同様に各部における操作を行うことが好適である。
【０００７】
本発明の蛋白質分析装置は、前記装置を用い、
あらかじめ分析対象の蛋白質をペプチドに分解する前処理を行った、該ペプチドを含む混合物を試料として用い、
前記各分離部での分離により前記混合物から各ペプチドを分離し、
前記質量分析部で該分離されたペプチドについて質量分析を行い、該ペプチドのアミノ酸配列を同定することを特徴とする。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、図面に基づき本発明の実施形態について説明する。
図１には、本発明の一実施形態に係る２次元高速液体クロマトグラフ装置の概略図が示されている。同図の該装置１０は、送液手段１２、オートサンプラ１４、及びイオン交換カラム１６を含む前段分離部と、ポンプ１８及びトラップカラム２０を含む脱塩部と、グラジエント送液手段２２及び逆相カラム２４を含む後段分離部と、後段分離部に接続された質量分析部２６を備えている。
そして、これらの各部における分析操作をコンピュータ２８からなる制御部で制御している。
【０００９】
以下、測定手順に従い本装置について説明する。
前段分離部
本実施形態では、前段分離部の送液手段１２として最初のグラジエント溶離液を満たしたシリンジポンプを備え、コンピュータ２８からの駆動制御により、該溶離液を定量でイオン交換カラム１６へ送液する。前段分離部の溶離液流量としては、極微量試料に対する高分離能での分離を可能とするために２００μｌ／ｍｉｎ以下が好適である。前段分離部の溶離液流量は、多数成分からなる試料をよく分離できるように試料負荷を考慮して決定される。
また、イオン交換カラム１６の固定相としては、イオン交換クロマトグラフの固定相として用いられる各種イオン交換体が、試料の性質等に応じて適宜用いられる。
【００１０】
分析対象の試料を含む試料溶液は、オートサンプラ１４から導入される。さらに、イオン強度が異なる各グラジエント溶離液もオートサンプラ１４から導入される。ここで使用するオートサンプラは従来ＨＰＬＣで用いられているものであり、複数の試料を自動的に連続分析するための装置として市販されているものを含むが、これと同一の機能を有するもの、及び目的に応じて測定性能を改善するために市販のオートサンプラを改良したものも含む。
【００１１】
このようなオートサンプラとして、図２に示した構成のものが例示される。図２において、バイアルＡには試料溶液が、そしてバイアルＢ、Ｃ、Ｄにはイオン強度が異なる各グラジエント溶離液が封入されており（従来の使用方法ではバイアルＢ、Ｃ、Ｄに他の試料溶液が封入される）、ラック上に配列されている。
バイアルから試料溶液又は各グラジエント溶離液を採取するニードル３２は、ループ３４を介してインジェクタバルブ３６に連結されている。また、該ニードルは図示しない駆動機構に保持されて、バイアル、洗浄ポート３８、インジェクションポート４０の間を移動することができる。バルブ４２は、回転式の六方バルブで、機械力によって往復運動するように構成されたプランジャ４４により吸入吐出される液体の流路を切り換えるものである。４６は洗浄液ボトルである。インジェクタバルブ３６は、液体クロマトグラフ装置１０の送液流路へ連結されており、シリンジポンプに満たした最初の溶離液の流れの中に試料溶液又は後続のグラジエント溶離液を導入するものである。
【００１２】
このように構成されたオートサンプラにより試料又はグラジエント溶離液を導入する操作の一例は次の通りである。バルブ４２は、図に示すようにポート０−ａが連通する位置において、ニードル３２をバイアルＡに挿入し、プランジャ４４を引いて所定量の試料溶液を吸い上げる。吸い上げた試料溶液はループ３４内に留まり、バルブ４２やプランジャ４４までは至らない。次に、ニードル３２をバイアルＡから抜き、インジェクションポート４０に移動させる。インジェクタバルブ３６を動作させ、ループ３４内の試料溶液をイオン交換カラムへ続く送液流路中に導入することでシリンジポンプからの最初の溶離液による分離が開始される。そして、次にバイアルＢに封入された溶離液で試料の分離をする際には、ニードル３２をバイアルＢまで移動させた後、上記の各操作を繰り返す。続いてバイアルＣ、Ｄに封入された溶離液で試料の分離をする際にも同様の操作を繰り返す。
【００１３】
このように、オートサンプラを試料の導入のみに使用するのではなく、各グラジエント溶離液の導入、送液にも適用することで、従来からある装置を用いて試料を導入すると共にグラジエント送液のシステムを構築できる利点がある。
【００１４】
オートサンプラから導入された試料の一部は、図１のイオン交換カラム１６で最初の溶離液により分離されて該カラムから流出し、六方バルブ３０を経由して接続されたトラップカラム２０に分離された状態でトラップされる。トラップカラム２０中の該分離試料は、後述の脱塩、逆相グラジエント分離、質量分析の一連の操作を経て分析される。続いて、イオン交換カラム１６に残留している試料は、図２のバイアルＢからの溶離液でその一部が分離されてイオン交換カラム１６から流出し、トラップカラム２０にトラップされ、同じく脱塩、逆相グラジエント分離、質量分析の一連の操作を経て分析される。さらにバイアルＣ、続いてバイアルＤからの溶離液でイオン交換カラム１６に残留している試料は分離されてトラップカラム２０にトラップされ、同様に後続の過程を経て分析される。
【００１５】
脱塩部
前段分離部では、試料中の各成分のイオン性等に基づいてある程度までの分離は可能であるが、必ずしも十分な分離が行えない場合がある。特に蛋白質分析における試料のように様々なペプチドを含む混合成分を用いた場合には、イオン交換分離による各分離成分は単一のペプチドまでには分離されず、複数のペプチド成分を含んだ状態である場合がある。そして、後続の検出器として質量分析器を用いて分析を行うためには、単一成分まで分離する必要がある。
そこで、本装置では、さらに後段分離部で逆相分離を行い２段階目の分離を行う。
【００１６】
しかし、前記各分離成分をそのまま逆相分離系へ導入した場合、該成分中に含まれる塩が後続の質量分析器に混入してしまい、その性能に影響してしまうという問題がある。
そこで、本発明では、イオン交換カラム１６からの分離成分の脱塩処理を行うための脱塩部を備えている。
イオン交換カラム１６からの分離成分が、六方バルブ３０を介して前段分離部に後続するトラップカラム４４にトラップされた後、ポンプ１８からトラップカラム２０へ、例えば有機酸の水溶液等の洗浄液を送液し、各分離成分はトラップカラム２０中で脱塩処理される。さらに場合によってはその他の不純物も同時に該分離成分から洗い流され、濃縮された分離成分が得られる。
【００１７】
後段分離部
トラップカラム２０で前記各分離成分を脱塩処理した後、六方バルブ３０を回転して流路を切り替える。そして各分離成分は逆相カラム２４へ送られ、逆相分離用の溶離液によりグラジエント分離される。
【００１８】
後段分離部の送液手段２２では、図３に示すように２種類の各溶離液成分が２つの各シリンジポンプ５０ａ、５０ｂからそれぞれ定量で圧送され、ミキサ５２で各成分を混合することにより、各溶離液成分が任意の組成比率で混合された溶離液が調整され、逆相カラム２４へ導入される。
溶離液の組成比率はコンピュータ２８の制御により段階的に変えられ、溶出強度勾配を有する一連の溶離液として逆相カラム２４へ導入され、グラジエント分離が行われる。前記各分離成分は、溶離液の溶出強度に基づいてさらに各成分に分離される。
後段分離部の溶離液流量としては、極微量試料に対する高分離能での分離を可能とするために１００μｌ／ｍｉｎ以下が好適である。
【００１９】
また、ｎｌ／ｍｉｎオーダーの溶離液流量で送液する場合、特に５００ｎｌ／ｍｉｎ以下の溶離液流量で送液する場合には、図４に示す送液手段を用いることが好適である。同図の送液手段では、逆相カラムへ導入する溶離液として、それぞれ前記各分離成分に対する溶出強度が異なる複数の各溶離液が調整され、それぞれ所定の容量を有する分岐流路６０、６０・・・にあらかじめ格納されている。各溶離液は、定量ポンプ６２により圧送され、バルブ６４のポートを通過した後、１０ポートの多岐管６６（例えばＶＩＣＩ社製のＺ１０Ｍ１）に接続された１０本の分岐流路６０、６０・・・にそれぞれ格納される。
【００２０】
分岐流路６０、６０・・・の数及び形状等は特に限定されず、分析目的に応じて適宜選択されるが、本実施形態では１０本の分岐流路がそれぞれ内径０．２５ｍｍ、長さ２００ｍｍ、容量１０μｌのＰＥＥＫ管で形成されており、所定量の各溶離液を格納する。
バルブ６４のポート６８の開閉切り換えによって、各分岐流路６０、６０・・・に対して、シリンジ７０から直接溶離液を充填できるようにすることもできる。これにより、配管をその都度調整して溶離液の交換又は補充を行う手間が解消される。
また、分岐流路６０、６０・・・への各溶離液の充填は、コンピュータ２８による自動制御で行うようにしてもよい。具体的には、各分岐流路６０、６０・・・に対して、所定組成の各溶離液を自動調合作成し、順次自動で各分岐流路６０、６０・・・に送液及び格納するようにする。この手段を採用すると、溶離液の充填精度を高めることができるので、分析精度を向上させることが可能となる。
【００２１】
また、ロータリー型のバルブ７２は各分岐流路６０、６０・・・に一時格納された各溶離液を選択するための手段として機能し、所定のポート７４を開放することによって所望の溶離液を後続のカラムへ流すことができる。なお、バルブ７２の出口部分には、図示しないコントローラが接続されており、図１のコンピュータ２８からの電気信号により、バルブ位置の選択を制御している。
【００２２】
分岐流路６０、６０・・・中に所定量格納された各溶離液は、その所定量ごとに順次逆相カラム２４へ連続的に導入される。すなわち、１０本の分岐流路に格納された１０種類の溶出強度が異なる各溶離液によって、１０段階の溶出強度勾配を有する一連の溶離液として逆相カラム２４へ導入され、グラジエント分離が行われる。そして、イオン交換分離による前記各分離成分ごとに、さらに各成分に分離される。
【００２３】
逆相分離用の溶離液としては揮発性の酸を含む逆相系の溶媒が好適に用いられ、試料や逆相カラムの性質等により適宜調整される。
また、逆相カラムの固定相としては、逆相クロマトグラフの固定相として用いられる各種固定相が、溶離液や試料の性質等に応じて適宜用いられる。
【００２４】
質量分析部
このようにして２段階の分離により単一成分へ分離された後、後段分離部に直結する質量分析器２６により各成分の定性、定量分析が行われる。高速液体クロマトグラフと質量分析計のインターフェースとしては、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）等が用いられる。また、質量分析計としては飛行時間型やイオントラップ型などの構成も適用され得る。
【００２５】
制御部
なお、本実施形態ではオートサンプラによる試料及び溶離液の流路への注入、各送液手段の操作、及び六方バルブ３０による流路の切り換え等一連の測定操作は図１のコンピュータ２８により制御されており、高分離能での分析が連続的、自動的に行うことができる。
【００２６】
蛋白質分析装置
以下、上記の実施形態にかかる２次元高速液体クロマトグラフ装置を用いた蛋白質分析について説明する。
蛋白質分析を行う場合には、分析対象である蛋白質を含む混合物について、あらかじめ酵素による消化処理で該蛋白質を多数のペプチドに分解したものを試料として用いる。
【００２７】
図１において、前段分離部のイオン交換カラム１６に導入された試料は、主にイオン性に基づきある程度の分離が行われる。しかし、試料は様々なペプチドを含んでおり、各分離成分は単一のペプチドまでには分離されず、複数のペプチド成分を含んでいる。
そこで、脱塩部を通して後段分離部で逆相分離を行い、更に各分離成分ごとに２段階目の分離を行う。
【００２８】
このようにして、２段階の分離により試料中の測定対象である各ペプチド成分ごとにまで分離された後、直結された質量分析計２６において各ペプチド成分のアミノ酸配列の同定が行われる。
質量分析により同定されたペプチド断片のアミノ酸配列は、各アミノ酸と遺伝子コードとの相関から遺伝子コード配列へ翻訳される。さらに、すでに配列がわかっている染色体の全遺伝子コード配列中の、前記配列に該当する部分が同定され、当該配列部分の周囲の配列から前記ペプチド断片を構成成分とする、試料中の特定蛋白質の存在及びそのアミノ酸配列が明らかになる。
【００２９】
【実施例】
図１に示した本発明の装置を用いて人体中の血清アルブミン（ＨＳＡ）のトリプシン分解物、又は大腸菌タンパク質トリプシン分解物の２次元ナノ液体クロマトグラムを測定した。前段分離部の分離カラムにアニオン交換カラム（ＱＡ　１０μｍ　０．８ｍｍＩＤ×３ｍｍＬ　１０μｌ／ｍｉｎ）を、後段分離部の分離手段として逆相カラム（Ｃ１８　３μｍ　０．１５ｍｍＩＤ×４５ｍｍＬ　１００ｎｌ／ｍｉｎ）を使用した。また、脱塩部に小型のトラップカラム（Ｃ１８　３μｍ　０．５ｍｍＩＤ×１ｍｍＬ）を設け、イオン交換分離後の分離成分をぎ酸水溶液で洗浄後に逆相カラムで分離し、質量分析計（ＥＳＩ−ＴＯＦ　ＭＳ：Ｑ−ｔｏｆ　ｍｉｃｒｏ　キャピラリ電圧１５００Ｖ）に導入した。
【００３０】
前段分離部の送液手段にシリンジポンプを使用し、最初のグラジエント溶離液であるＡ液（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０）をシリンジに満たした。オートサンプラの１番目のバイアルには試料（ＨＳＡ　１００ｆｍｏｌ／μｌ　１０μｌ、或いは大腸菌タンパク質　１μｇ／１０μｌ）を、２〜４番目のバイアルにはグラジエント溶離液（２番目：Ａ＋２０ｍＭ　ＮａＣｌ　１５μｌ　３番目：Ａ＋４０ｍＭ　ＮａＣｌ　１５μｌ　４番目：Ａ＋４００ｍＭ　ＮａＣｌ　４０μｌ）をあらかじめ封入し、この順に送液流路へ導入してグラジエント分離を行った。
【００３１】
また、逆相カラムに導入する溶離液としては、Ｃ液（０．１％ギ酸水溶液）及びＤ液（０．１％ギ酸アセトニトリル水溶液）の混合液を用い、１００％Ｃ液に対して２％／ｍｉｎの割合でＤ液を混合してグラジエント溶離を行った。
【００３２】
図５にＨＳＡを試料とした測定結果を、図６に大腸菌タンパク質を試料とした測定結果を示した。また、図７には質量分析計としてＴＯＦ型を用い、衝突誘起解離分析測定の結果（試料：大腸菌タンパク質）を示した。測定操作は再現的に作動し、大腸菌タンパク質フラグメントのアミノ酸配列を自動的に分離同定できた。
【００３３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の２次元高速液体クロマトグラフ装置によれば、前段と後段で試料に対する分離特性がそれぞれ異なる分離部を設けたことにより、高分離能での分析が可能になる。
また、各分離部の間に脱塩部を設けることとしたので、各分離部を連結して測定することが可能であり、質量分析部との連結も可能となり高精度の測定が可能となる。
また、オートサンプラによる試料及び溶離液の流路への注入、各送液手段の操作、及び送液流路の切り換え等一連の測定操作を制御する制御部を設けることとしたので、高分離能での分析を連続的、自動的に行うことが可能となる。
また、本発明の２次元高速液体クロマトグラフ装置を用いて蛋白質分析を行うことにより、複雑なペプチド混合物についてペプチドのアミノ酸配列同定が自動的かつ高精度で可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る２次元高速液体クロマトグラフ装置の概略構成図である。
【図２】本発明の装置が備えるオートサンプラの一例を示す概略構成図である。
【図３】後段送液部の一例を示す概略構成図である。
【図４】後段送液部の一例を示す概略構成図である。
【図５】実施例の測定結果である。
【図６】実施例の測定結果である。
【図７】実施例の測定結果である。
【符号の説明】
１０：２次元高速クロマトグラフ装置　１２：送液手段　１４：オートサンプラ
１６：イオン交換カラム　１８：ポンプ　２０：トラップカラム　２２：グラジエント送液手段　２４：逆相カラム　２６：質量分析部　２８：コンピュータ
３０：六方バルブ　３２：ニードル　３４：ループ　３６：インジェクタバルブ　３８：洗浄ポート　４０：インジェクションポート　４２：バルブ　４４：プランジャ　４６：洗浄液ボトル　５０ａ、５０ｂ：シリンジポンプ　５２：ミキサ　６０：分岐流路　６２：定量ポンプ　６４：バルブ　６６：多岐管　６８：ポート　７０：シリンジ　７２：バルブ　７４：ポート
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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