(57)【要約】【課題】高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供する。【解決手段】抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬であって、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を含有する抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬であって、
梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を含有する
ことを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項２】
抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬であって、
担体と、前記担体に固定化された梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原とからなる
ことを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬。
【請求項３】
抗原抗体反応を利用して検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法であって、
抗原として、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を用いる
ことを特徴とする抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法。
【請求項４】
免疫凝集法により抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法であって、
担体に固定化された梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を用いる
ことを特徴とする請求項３記載の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒は、梅毒トレポネーマ菌（トレポネーマ・パリダム、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ）の感染により引き起こされる疾患である。梅毒に罹患しているか否かは血液中に抗梅毒トレポネーマ抗体が存在するか否かを免疫分析により検査することにより診断されている。梅毒トレポネーマの表面には多数の表面抗原が存在しており、この表面抗原と検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応を利用する方法により免疫分析が行われている。かかる梅毒トレポネーマ菌の細胞表面に存在する表面抗原のうち主なものとしては、分子量４７ｋＤａ、４２ｋＤａ、３７ｋＤａ、１７ｋＤａ及び１５ｋＤａのものが知られている（Ｊｏｕｍａ１　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１２９，ｐｐ．１２８７−１２９１，１９９２）。
【０００３】
現在、この免疫分析に用いられている梅毒トレポネーマの表面抗原としては、梅毒トレポネーマ菌を家兔睾丸で培養し、界面活性剤等で可溶化・抽出し、更に種々の方法を用いて不要物の除去・必要成分の精製を行ったものが用いられている。しかし、このような家兔を用いた製造方法は、動物を宿主とすることから収量が限られているうえ、動物により梅毒トレポネーマ菌の増殖状態がばらつくことから、大量の安定した収量を確保するのが困難であるという問題があった。一方、現時点では、梅毒トレポネーマ菌を直接人工培養することには成功していない。
【０００４】
これに対して、梅毒トレポネーマの表面抗原をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に表面抗原を大量生産して免疫分析に用いる方法が提案されている。例えば、特表平２−５００４０号公報には、梅毒トレポネーマの分子量４７ｋＤａの抗原を遺伝子工学的に調製し、これを用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫測定する方法が記載されている。また、特開平７−６３３６５号公報には、１５ｋＤａ及び１７ｋＤａの表面抗原のＮ末端にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合したタンパク質を用いる方法が開示されている。更に、この他にも特定の方法で調製した特定の分子量の抗原を用いた抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法等が報告されている。
しかしながら、このような方法で調製された梅毒トレポネーマの表面抗原を用いても、抗梅毒トレポネーマ抗体の測定を行うことは可能であるものの、感度及び精度の点では必ずしも満足できるものではなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、梅毒トレポネーマの表面抗原のうち、分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を抗原として用いることにより、従来の方法よりも有意に高い感度で、しかも極めて高い精度で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、抗原抗体反応を利用した抗梅毒トレポネーマ抗体の測定に用いる試薬であって、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を含有する抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬は、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を含有するものである。
これらの抗原のうち、いずれか一方が含まれていてもよいし、両方が含まれていてもよい。特に両方が含まれる場合には、検出感度が更に高まるので好ましい。
【０００９】
上記梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原及び分子量１７ｋＤａの表面抗原については、既にコードする遺伝子がクローニングされており、また、これらのアミノ酸配列も決定されている（ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＩＭＭＵＮＩＴＹ，ｖｏｌ．５７，ＮＯ．１２，ｐｐ．３７０８−３７１４，１９８９；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏ．４，ＮＯ．８，ｐｐ１３７１−１３７９，１９９０；ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ　ＡＮＤ　ＩＭＭＵＮＩＴＹ，ｖｏｌ．６１，ＮＯ．４，ｐｐ．１２０２−１２１０，１９９３）。したがって、これらを常法により遺伝子工学的に生産して用いることができる。
【００１０】
上記梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原及び分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合させる方法としては特に限定されず常法を用いることができる。
β−ガラクトシダーゼはラクトースの分解及び合成を行う酵素であり、大腸菌では古くからラクトースによって誘導される誘導酵素の典型として研究されている。
β−ガラクトシダーゼは分子量約１１６ｋＤａであり４量体を形成する。その構造遺伝子はｌａｃＺと呼ばれ、その遺伝子配列は既知であり（ＥＭＢＯ　Ｊ　１９６３；２（４）：５９３−５９７）、各種のプラスミドに含まれる形で市販されている。市販されているもののうち代表的なものとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（いずれも東洋紡社製）等が挙げられるが、外来タンパク質とβ−ガラクトシダーゼとの融合タンパク質が発現し得るものであれば特に限定されない。また、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原及び分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼを融合させる際には、Ｃ末端或いはＮ末端のいずれからでも良く、特には限定されない。
上記梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原及び分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼを融合させる方法しては、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原又は分子量１７ｋＤａの表面抗原の構造遺伝子をｌａｃＺ遺伝子に導入すればよく、その方法は当業者にとっては既知の遺伝子組み換え技術で可能であり、特に限定されない。
梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原又は分子量１７ｋＤａの表面抗原とβ−ガラクトシダーゼとが融合した融合タンパク質を精製する方法としては特に限定されず、例えば、ｐ−アミノベンジル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが結合したアガロースカラム（例えば、シグマ社製）、又は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体（例えば、プロメガ社製）等を用いて精製する方法等が挙げられる。
なお、上記梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原及び分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質は、一般に販売されているので、これらの市販品を用いることもできる。
【００１１】
これらの梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原は、ラテックス粒子等の適当な担体に固定化してもよい。かかる担体に固定化することにより本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を免疫凝集法等に供することができる。
上記固定化の方法としては特に限定されず、例えば、物理的吸着法、担体表面に設けた官能基と化学結合する方法等が挙げられる。
【００１２】
上記梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原と梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原とはいずれも公知のものであったが、驚くべきことに、これらを用いて抗梅毒トレポネーマ抗体を免疫測定すると、その感度はβ−ガラクトシダ−ゼと融合していない表面抗原を用いた場合よりも飛躍的に向上し、かつ、非特異的反応による検出精度の低下を抑制することができる。
抗原抗体反応を利用して検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体を測定する方法であって、抗原として、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を用いる抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法もまた、本発明の１つである。
【００１３】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法としては、本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いるのであれば特に限定されず、通常の方法により行うことができる。
すなわち、反応形式で分類すればサンドイッチ法、凝集法等を利用することができ、また標識で分類すれば、酵素免疫測定法、蛍光分析測定法、放射免疫分析等を採用することができる。なかでも、操作が簡便で感度も良好であり、かつ多数の検体の処理に適しているラテックス免疫凝集法がより好ましい。
【００１４】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法の具体例としては、例えば、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原をラテックス粒子に固定化し、所定の操作を得てラテックス試薬として調製した後、これに検体を加えて反応させ、所定の時間間隔での濁度変化を視覚的、光学的又は電気化学的に検出する方法が挙げられる。
【００１５】
また、別の具体例としては、例えば、マイクロタイタープレート等のウェルに梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を固定化し、非特異的吸着部位をブロッキング後、洗浄し、これに検体を加えて反応させ、洗浄後、ペルオキシダ−ゼ等の酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、洗浄後、標識抗体の基質を加えて酵素反応を行い発色させ、反応停止後の発色の程度を吸光度測定により測定する方法が挙げられる。
【００１６】
更に、別の具体例としては、例えば、フェライト磁性粒子等の粒子に梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１５Ｋ抗原及び／又は梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダーゼが融合したタンパク質からなる１７Ｋ抗原を固定化し、これに検体を加えて反応させ、ペルオキシダ−ゼ等の酵素で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体と化学発光基質とを反応させる化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）が挙げられる。
【００１７】
この他にも、上記ラテックス粒子、プラスチックプレート、フェライト磁性粒子以外の不溶化担体、例えば、特公昭６３−２９２２３号公報に開示されているゼラチン等からなる人工担体；ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物赤血球等の粒子担体に固定化し、この担体の懸濁液に検体を加えて粒子が凝集するか否かを測定する凝集免疫分析法も挙げられる。
【００１８】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法に供される検体としては特に限定されず、梅毒の診断を行うべきヒトや動物の血清等の体液及びその希釈物を挙げることができる。
【００１９】
本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法は、本発明の抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いることにより、極めて高い感度・精度で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができ、より正確な梅毒の診断を行うことができる。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）
ラテックス液（積水化学工業社製：平均粒径０．３μｍ、固形分１０％）０．０５ｍＬを試験管内で攪拌しながら、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液（Ｂｉｏｓ　Ｐａｃｉｆｉｃ社製、１００μｇ／ｍＬ）１ｍＬを添加し、ラテックス粒子の表面に融合タンパク質を固定化した。
【００２２】
得られた融合タンパク質固定化ラテックス粒子の抗原未吸着部分を１％ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ：以下、ＢＳＡともいう）を含むＰＢＳバッファーにてブロッキングし、未吸着抗原を遠心洗浄にて除去し、充分攪拌した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーにて０．１％に希釈して、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬とした。
【００２３】
（実施例２）
梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液の代わりに、梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液（Ｂｉｏｓ　Ｐａｃｉｆｉｃ社製、１００μｇ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。
【００２４】
（比較例１）
梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液の代わりに、梅毒トレポネーマの分子量１５ｋＤａの表面抗原溶液（ＧＳＴ１５抗原、Ｂｉｏｋｉｔ社製、１００μｇ／ｍＬ）を用いた以外は実施例１と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。
【００２５】
（比較例２）
梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原にβ−ガラクトシダ−ゼを融合したタンパク質溶液の代わりに、梅毒トレポネーマの分子量１７ｋＤａの表面抗原溶液（ＧＳＴ１７抗原、Ｂｉｏｋｉｔ社製、１００μｇ／ｍＬ）を用いた以外は実施例２と同様にして、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を調製した。
【００２６】
実施例１、２及び比較例１、２で調製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いて全自動分析装置（日立社製、７１７０形）により、梅毒陽性血清として臨床症状から梅毒と診断された患者血清２０例を、梅毒陰性血清として各種血清検査等から非梅毒である正常ヒト血清２０例を検体として試験を行った。
すなわち、検体希釈用緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳバッファー）１２０μＬ、抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬６０μＬ及び検体１５μＬを加え、２０〜３４分間の溶液の濁度の変化を７００ｎｍの吸光度の変化量として測定し、これを反応量とした。
結果を表１に示した。
【００２７】
【表１】
2004101511.tif 000002
【００２８】
更に、表１のデータより縦軸を反応量として梅毒陽性血清の場合を図１に、梅毒陰性血清の場合を図２に示した。
【００２９】
表１より、β−ガラクトシダーゼが融合した融合タンパク質を用いた実施例１、２で作製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いた場合には、β−ガラクトシダーゼを融合しない抗原を用いた比較例１、２作製した抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬を用いた場合に比べ、高感度で梅毒患者血清を検出することができ、かつ、梅毒陰性血清群における非特異反応も低いことがわかった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によれば、高い感度・特異性で抗梅毒トレポネーマ抗体を測定することができる抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及びこれを用いた測定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例において梅毒陽性血清について行った抗梅毒トレポネーマ抗体測定試験の結果を示す図である。
【図２】実施例において梅毒陰性血清について行った抗梅毒トレポネーマ抗体測定試験の結果を示す図である。
【図１】
2004101511.tif 000003
【図２】
2004101511.tif 000004