(57)【要約】【課題】精子へのダメージを低減しつつ、Ｘ精子とＹ精子の選別を良好に実施できること。【解決手段】シャーレ２１上の緩衝液３中に存在する精子１を一個捕捉するピペット２３と、捕捉された上記精子へ光源１４からの赤外線２を照射するカセグレン鏡１５と、上記精子を透過した光を検出する検出分光器１９と、この検出分光器にて検出され分光された赤外線のスペクトルを分析して上記精子の種別を判定する種別判定部２０とを有するものである。【選択図】　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
精子に光を照射し、当該精子を透過した、または当該精子から反射された光のスペクトルを分析することにより、上記精子の種別を判定することを特徴とするＸ・Ｙ精子の選別方法。
【請求項２】
上記光が赤外線、近赤外線または可視光であることを特徴とする請求項１に記載のＸ・Ｙ精子の選別方法。
【請求項３】
試料台上の液体中に存在する精子を１個捕捉する捕捉手段と、捕捉された上記精子へ光源からの光を照射する照射手段と、上記精子を透過した、または上記精子から反射された光を検出する検出手段と、この検出手段にて検出された光のスペクトルを分析して上記精子の種別を判定する判定手段と、を有することを特徴とするＸ・Ｙ精子の選別装置。
【請求項４】
上記照射手段は、捕捉手段により捕捉された精子へ光を集光して照射するカセグレン鏡であることを特徴とする請求項３に記載のＸ・Ｙ精子の選別装置。
【請求項５】
上記照射手段は、捕捉手段により捕捉された精子へ近接場光を照射するプリズムであることを特徴する請求項３に記載のＸ・Ｙ精子の選別装置。
【請求項６】
上記照射手段は、捕捉手段により捕捉された精子へ光を導いて照射する光ファイバーであることを特徴とする請求項３に記載のＸ・Ｙ精子の選別装置。
【請求項７】
上記試料台の表面に、液体中の精子を透過した光を反射する反射材が設けられたことを特徴する請求項４に記載のＸ・Ｙ精子の選別装置。
【請求項８】
上記捕捉手段の一部に、液体中の精子を透過した光を反射する反射材が設けられたこと特許する請求項４に記載のＸ・Ｙ精子の選別装置。
【請求項９】
上記光が赤外線、近赤外線または可視光であることを特徴する請求項３乃至８のいずれかに記載のＸ・Ｙ精子の選別装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｘ精子、Ｙ精子を選別するＸ・Ｙ精子の選別方法及びＸ・Ｙ精子の選別装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｘ精子とＹ精子の選別・分離は、畜産分野における家畜の有効活用の為の産みわけ技術や、ヒトの医療においても重要な意義を持つ。医療においては、伴性劣性遺伝性疾患（進行性筋ジストロフィー、血友病、色盲など）の回避や、性染色体異常の発生（染色体不分離、片親性ダイソミーなど）を解明する上で要求されてくる雄性生殖細胞の発生および性の分化の機序の検討に、Ｘ精子とＹ精子の分離技術が必要である。
従来のＸ・Ｙ精子の選別方法としては、Ｘ精子とＹ精子における進行スピード及び生存期間の差による方法、膣内ｐＨの差による方法、比重の差による方法、無担体電気泳動法、モノクローナルＹ抗体を用いた方法などが報告されているが、その有用性が認められた方法はない。
【０００３】
従来のＸ・Ｙ精子の選別・分離方法において、その有効性が認められた唯一の方法は、フローサイトメトリー法である。この方法は、まず、精子のＤＮＡに蛍光色素を結合し、次に、この精子にレーザー光を照射し、蛍光染色の違いからＤＮＡの量の相違を判定してＸ精子とＹ精子を判別し、その後、この精子の種別判別結果に基づいて、Ｘ精子を例えばマイナスに、Ｙ精子を例えばプラスにそれぞれ帯電させ、静電気力の作用でＸ精子とＹ精子を分離するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上述のフローサイトメトリー法では、使用されるレーザー光の安全性やＤＮＡ結合色素による染色体異常、ＤＮＡ合成能の低下、細胞周期の遅延など精子にダメージを与えて、副作用が生ずる恐れがある。
本発明の目的は、上述の事情を考慮してなされたものであり、精子へのダメージを低減しつつ、Ｘ精子とＹ精子の選別を良好に実施できるＸ・Ｙ精子の選別方法及び装置を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項１に記載の発明は、精子に光を照射し、当該精子を透過した、または当該精子から反射された光のスペクトルを分析することにより、上記精子の種別を判定することを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、上記光が赤外線、近赤外線または可視光であることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３に記載の発明は、試料台上の液体中に存在する精子を１個捕捉する捕捉手段と、捕捉された上記精子へ光源からの光を照射する照射手段と、上記精子を透過した、または上記精子から反射された光を検出する検出手段と、この検出手段にて検出された光のスペクトルを分析して上記精子の種別を判定する判定手段と、を有することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４に記載の発明は、請求項３に記載の発明において、上記照射手段が、捕捉手段により捕捉された精子へ光を集光して照射するカセグレン鏡であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５に記載の発明は、請求項３に記載の発明において、上記照射手段が、捕捉手段により捕捉された精子へ近接場光を照射するプリズムであることを特徴するものである。
【００１０】
請求項６に記載の発明は、請求項３に記載の発明において、上記照射手段が、捕捉手段により捕捉された精子へ光を導いて照射する光ファイバーであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７に記載の発明は、請求項４に記載の発明において、上記試料台の表面に、液体中の精子を透過した光を反射する反射材が設けられたことを特徴するものである。
【００１２】
請求項８に記載の発明は、請求項４に記載の発明において、上記捕捉手段の一部に、液体中の精子を透過した光を反射する反射材が設けられたこと特許するものである。
【００１３】
請求項９に記載の発明は、請求項３乃至８のいずれかに記載の発明において、上記光が赤外線、近赤外線または可視光であることを特徴するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を、図面に基づき説明する。
［Ａ］第１の実施の形態（図１）
図１は、本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第１の実施の形態を概念的に示す構成図である。
【００１５】
このＸ・Ｙ精子の選別装置１０は、精子１に赤外線２を照射し、この精子１を透過した赤外線２の吸収スペクトルを分析することにより、上記精子１がＸ精子であるかＹ精子であるかを判定して選別するものであり、フーリエ変換赤外分光光度計１１、顕微観察部１２、及び図示しないにマニュピュレータを有して構成される。
ここで、Ｘ精子は、２３対の染色体における最後の一対がＸＸ（Ｘ染色体どうしの組合せ）であるものであり、Ｙ精子は、上記染色体の最後の一対がＸＹ（Ｘ染色体とＹ染色体の組合せ）であるものである。これらのＸ精子とＹ精子は、重量、密度、形状、ＤＮＡ含有量などにおいて差がある。また、赤外線２は、波長２〜６０μｍの電磁波をいう。
【００１６】
上記フーリエ変換赤外分光光度計１１は、光源１４、主鏡１５Ａ（凹面鏡）及び副鏡１５Ｂ（凸面鏡）からなる照射手段としてのカセグレン鏡１５、シャーレ載置部１７、ハーフミラー１８、検出手段としての検出分光器１９、及び判定手段としての種別判定部２５を備えてなる。
【００１７】
上記シャーレ載置部１７に、試料台としてのシャーレ２１が載置され、このシャーレ２１の所定位置に、精子１が混在された緩衝液３が滴下されている。この緩衝液３は、精子１の移動速度を低下させるものである。そして、シャーレ２１の表面で、緩衝液３が滴下される上記所定位置に、赤外線２を反射する反射材２２（例えば金）が蒸着またはスパッタリングされている。
【００１８】
前記マニュピュレータは、捕捉手段としてのピペット２３を着脱自在に固着して、このピペット２３により、上記シャーレ２１の緩衝液３中に存在する精子１を一個捕捉させ、この捕捉された精子１を、顕微観察部１２にて観察され得る所定位置まで移動させるものである。
【００１９】
また、前記顕微観察部１２はカメラ（不図示）を備え、シャーレ載置部１７の下方に配置されて、ピペット２３の先端部および緩衝液３中の精子１を観察する。この顕微観察部１２により観察された画像は、図示しないにモニタに表示され、このモニタ画像に基づいて上記マニュピュレータによりピペット２３が操作される。
【００２０】
前記フーリエ変換赤外分光光度計１１の光源１４から照射された赤外線２はハーフミラー１８にて反射され、カセリング鏡１５における主鏡１５Ａの細孔２４またはスリットを通過して副鏡１５Ｂに至り、この副鏡１５Ｂ、主鏡１５Ａにより順次反射されて集光され、ピペット２３に捕捉された１個の精子１へ照射される。この精子１へ照射された赤外線２は精子１を透過した後、シャーレ２１の反射材２２にて反射され、再度精子１を透過して、カセリング鏡１５の主鏡１５Ａ、副鏡１５Ｂにて順次反射され、ハーフミラー１８を透過して検出分光器１９にて検出される。
【００２１】
この検出分光器１９にて検出された赤外線２は、検出分光器１９に内蔵された回析格子によりスペクトルに分光される。種別判定部２０は、検出分光器１９からのスペクトル、つまり精子１にて吸収されたスペクトル（吸光スペクトル）を観察することにより、そのスペクトルの相違から、ピペット２３にて捕捉された１個の精子１がＸ精子であるか、Ｙ精子であるかの種別を判定する。
ここで、Ｘ精子、Ｙ精子の吸光スペクトルの相違は、これらの精子の前述した特徴（重量、ＤＮＡ含有量など）の差に基づく。尚、種別判定部２０に代えて、検出分光器１９からのスペクトルを表示する表示部を備え、この表示部に表示された表示結果（例えばスペクトル波形）を観察者が観察して、この観察者が上記表示部による表示結果の相違から精子１の種別を判定してもよい。
【００２２】
上述のように構成されたことから、上記実施の形態によれば、次の効果▲１▼及び▲２▼を奏する。
▲１▼シャーレ２１内の緩衝液３中に存在する精子１がピペット２３によって１個捕捉され、この捕捉された精子１へカセグレン鏡１５を介して光源１４から赤外線２が照射され、この精子１を透過した赤外線２を検出分光器１９が検出してスペクトルに分光し、このスペクトルを種別判定部２０が分析して精子１の種別を判定することから、Ｘ精子とＹ精子の選別を良好に実施でき、その選別率を向上させることができる。
【００２３】
▲２▼精子１を透過した赤外線２のスペクトルを分析することにより精子１の種別を判定することから、精子１がレーザー光線や蛍光色素の影響で染色体異常を起こしたり、ＤＮＡの合成能力が低下したり、細胞周期が遅延するなどの悪影響を蒙ることがないので、精子１へのダメージを極力低減できる。
【００２４】
［Ｂ］第２の実施の形態（図２）
図２は、本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第２の実施の形態を概念的に示す構成図である。この第２の実施の形態において、前記第１の実施の形態と同様な部分は、同一の符号を付すことにより説明を省略する。
【００２５】
この第２の実施の形態におけるＸ・Ｙ精子の選別装置３０では、精子１を透過した赤外線２を反射する反射材２２がシャーレ２１の表面ではなく、ピペット３１に蒸着またはスパッタリングされている。つまり、このピペット３１は、その先端部の略上半部が切除されて略下半部３２のみが残り、その略上半部が切り欠かれることにより端面３３が形成された構造であり、上記略下半部３２の内面３４に反射材２２が付着されている。
【００２６】
ピペット３１における端面３３は、略下半部３２を臨む位置に形成され、緩衝液３中の精子１を略下半部３２の内面３４における反射材２２の上方に位置付けた状態で、当該精子１を吸引して捕捉する。従って、光源１４から放射された赤外線２は、精子１を透過した後、ピペット３１における略下半部３２の内面３４に付着された反射材２２により反射され、再び精子１を透過して検出分光器１９へ至る。
【００２７】
従って、この第２の実施の形態におけるＸ・Ｙ精子の選別装置３０によれば、上記第１の実施の形態の効果▲１▼及び▲２▼と同様な効果を奏する他、次の効果▲３▼を奏する。
▲３▼反射材２２が、シャーレ２１の表面に付着されず、ピペット３１の略下半部３２における内面３４に付着されたことから、顕微観察部１２が、シャーレ載置部１７の下方からシャーレ２１を通してピペット３１と精子１を観察するに際し、反射材２２が邪魔にならず、従って、マニュピュレータによるピペット３１の操作性を向上させることができる。
【００２８】
［Ｃ］第３の実施の形態（図３）
図３は、本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第３の実施の形態を概念的に示す構成図である。この第３の実施の形態において、前記第１の実施の形態と同様な部分は、同一の符号を付すことにより説明を省略する。
【００２９】
このＸ・Ｙ精子選別装置４０では、シャーレ２１内の緩衝液３中に存在してピペット２３に捕捉された１個の精子１へ、光源１４から赤外線を照射する照射手段がプリズム４１であり、このプリズム４１の一表面４２に上記精子１が接触して位置づけられている。光源１４からの赤外線２は、プリズム４１の上記一表面４２にて全反射するように、当該プリズム４１に臨界角以上の入射角で入射される。
【００３０】
この赤外線２は、プリズム４１の上記一表面４２と、この一表面４２に接触した精子１との境界で全反射されるが、この一表面４２から近接場光４３が放射される。この近接場光４３は、当該一表面４２に接触した精子１へ照射され、この精子１のプリズム４１側の表面内側を透過してプリズム４１の一表面４２に戻るので、このプリズム４１の一表面４２にて反射された赤外線２の強度が変化する。
【００３１】
このようにプリズム４１にて反射された赤外線２は検出分光器１９にて検出されて、スペクトルに分光される。この赤外線２のスペクトルが種別判定部２０にて分析されて、ピペット２３により捕捉された一個の精子１の種別（Ｘ精子またはＹ精子）が判定される。上述のような全反射光を用いた分光法をＡＴＲ法と称する。なお、この実施の形態では、シャーレ２１の表面またはピペット２３、３１の一部に反射材２２の付着がなされていない。
【００３２】
従って、この第３の実施の形態によれば、前記第１の実施の形態の効果▲１▼及び▲２▼と同様な効果を奏する他、次の効果▲４▼を奏する。
▲４▼プリズム４１から放射された赤外線２の近接場光４３を精子１に照射することにより、この精子１の種別を判定することから、測定環境（または測定雰囲気）の影響を極力低減でき、高精度な精子の種別の選別を実現できる。
【００３３】
［Ｄ］第４の実施の形態（図４）
図４は、（Ａ）が、本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第４の実施の形態を概念的に示す構成図であり、（Ｂ）が、図４（Ａ）のＸ・Ｙ精子の選別装置における変形例を概念的に示す構成図である。この第４の実施の形態において、前記第１の実施の形態と同様な部分は、同一の符号を付すことにより説明を省略する。
【００３４】
図４（Ａ）、（Ｂ）にそれぞれ示すＸ・Ｙ精子の選別装置５０（図４（Ａ））、５１（図４（Ｂ））では、シャーレ２１内の緩衝液３中に存在してピペット２３に捕捉された１個の精子１へ、光源１４から赤外線２を照射する照射手段が光ファイバー５２である。この光ファイバー５２と光源１４との間に、この光源１４からの赤外線２を集光して光ファイバー５２へ導く凸レンズ５３が配置されている。
【００３５】
更に、Ｘ・Ｙ精子の選別装置５０では、精子１を透過した赤外線２が光ファイバー５４内を通り、検出分光器１９にて検出され、スペクトルに分光されて、そのスペクトルが種別判定部２０により分析され、精子１の種別が判定される。
【００３６】
また、Ｘ・Ｙ精子の選別装置５１では、精子１を透過した赤外線２がミラー５５にて反射され、検出分光器１９にて検出され、スペクトルに分光されて、そのスペクトルが種別判定部２０により分析され、精子１の種別が判定される。
【００３７】
従って、この第４の実施の形態においても、前記第１の実施の形態の効果▲１▼及び▲２▼と同様な効果を奏する他、次の効果▲５▼を奏する。
▲５▼光源１４から放射された光が光ファイバー５２を経て、ピペット２３にて捕捉された精子１へ導かれるので、光源１４とピペット２３とが遠隔位置にあっても、または、光源１４とピペット２３とのいずれか一方が遮蔽されていても、ピペット２３にて捕捉された精子１へ赤外線２を確実に照射することができる。
【００３８】
以上、本発明を上記実施の形態に基づいて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
例えば、上記各実施の形態では、ピペット２３、３１にて捕捉された精子１へ赤外線２を照射するものを述べたが、近赤外線（波長０．７５〜２μｍ）または可視光を照射するものであってもよい。可視光を精子１へ照射する場合には、可視光の一部であるラマン反射光を用いてラマン分光分析により精子の種別を判定する。
【００３９】
【発明の効果】
請求項１及び２に記載の発明に係るＸ・Ｙ精子の選別方法によれば、精子へのダメージを低減しつつ、Ｘ精子とＹ精子の選別を良好に実施できる。
請求項３乃至９に記載の発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置によれば、精子へのダメージを低減しつつ、Ｘ精子とＹ精子の選別を良好に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第１の実施の形態を概念的に示す構成図である。
【図２】本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第２の実施の形態を概念的に示す構成図である。
【図３】本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第３の実施の形態を概念的に示す構成図である。
【図４】（Ａ）が、本発明に係るＸ・Ｙ精子の選別装置における第４の実施の形態を概念的に示す構成図であり、（Ｂ）が、図４（Ａ）のＸ・Ｙ精子の選別装置における変形例を概念的に示す構成図である。
【符号の説明】
１　精子
２　赤外線
１０　Ｘ・Ｙ精子の選別装置
１１フーリエ変換赤外分光光度計
１２　顕微観察部
１４　光源
１５　カセグレン鏡（照射手段）
１９　検出分光器（検出器）
２０　種別判定部（判定手段）
２１　シャーレ（試料台）
２２　反射材
２３　ピペット（捕捉手段）
３０　Ｘ・Ｙ精子の選別装置
３１　ピペット（捕捉手段）
３２　略下半部
４０　Ｘ・Ｙ精子の選別装置
４１　プリズム（照射手段）
４３　近接場光
５０、５１　Ｘ・Ｙ精子の選別装置
５２　光ファイバー
【図１】
2004101323.tif 000003
【図２】
2004101323.tif 000004
【図３】
2004101323.tif 000005
【図４】
2004101323.tif 000006