(57)【要約】【課題】アラビナナーゼ活性を有する新規タンパク質の提供を目的とする。【解決手段】前記目的を解決するために、本発明のタンパク質は、アラビナンに対するエンド型のアラビナナーゼ活性を有するタンパク質であって、その活性の至適温度が２０〜４０℃であり、０℃での活性が最大活性の３０％以上であるタンパク質である。本発明のタンパク質を果汁加工液に用いれば、果汁加工液中で形成されるおりを低温で除去することが可能である。また、本発明のタンパク質を植物由来廃棄物のコンポスト化に用いれば、コンポスト菌の増殖初期における低温での増殖促進が可能となる。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビナンに対するエンド型のアラビナナーゼ活性を有するタンパク質であって、前記活性の至適温度が２０〜４０℃であり、０℃おける前記活性が最大活性の３０％以上であるタンパク質。
【請求項２】
活性至適ｐＨが６〜７であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が３５ｋＤａまたは７５ｋＤａであり、単量体で機能する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌体に由来する請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１または配列番号１の２０番目から３２０番目に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｃ）請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質であって、（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入若しくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項６】
下記（ｄ）から（ｈ）のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｄ）請求項４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３または配列番号３の５８番目から９６３番目に記載の塩基配列。
（ｆ）配列番号４に記載の塩基配列。
（ｇ）請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列であって、（ｅ）から（ｆ）のいずれかに記載の塩基配列において、１個以上の塩基が、置換、付加、挿入若しくは欠失した塩基配列。
（ｈ）（ｄ）から（ｇ）のいずれかに記載の塩基配列の相補配列。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
果汁加工液のおりを除去する方法であって、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質を加えておりを分解して除去する方法。
【請求項１１】
果汁加工液の製造方法であって、請求項１０に記載の方法によるおりの除去工程を含む果汁加工液の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の製造方法により製造された果汁加工液。
【請求項１３】
アラビノオリゴ糖の製造方法であって、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質のアラビナナーゼ活性により、アラビナンをアラビノオリゴ糖に分解する方法。
【請求項１４】
農産廃棄物から堆肥を製造する方法であって、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質のアラビナナーゼ活性により、前記農産廃棄物のアラビノース含有多糖を分解する前処理工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アラビナナーゼ活性を有する新規タンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｌ−アラビノースは、多くの高等植物の細胞壁内に存在し、アラビナン、アラビノガラクタン、アラビノキシランなどの多糖の構成糖として存在している。アラビナンは、フラノース環をもつＬ−アラビノースからなる重合度４０〜５０の低分子多糖であり、植物体において、ホモポリマーとしてではなく、ペクチン質成分の一成分として、テンサイ、果物、野菜、種、樹皮、木材、落花生等のペクチン質として存在している。
【０００３】
数種類のカビや細菌は、前記アラビナン、あるいは他のアラビノースを含む多糖を分解するアラビナン分解酵素を産生することができる。これらのアラビナン分解酵素は、アラビナンの分解様式から以下の６つのタイプに分類される（非特許文献１参照）。
（ｉ）ｐ−ニトロフェニル−α−アラビノフラノシドあるいはアラビノオリゴ糖を加水分解し、多糖に対して活性のないα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ。
（ｉｉ）アラビノ多糖に対して活性のあるα−アラビノフラノシダーゼ。
（ｉｉｉ）アラビノキシランに特異的なα−アラビノフラノヒドラーゼ。
（ｉｖ）ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドに対しては不活性であるエキソ型のα−Ｌ−アラビナナーゼ。
（ｖ）β−Ｌ−アラビノピラノシダーゼ。
（ｖｉ）直鎖状のα−１，５−Ｌ−アラビナンと枝分かれしたテンサイのアラビナンに対して活性のある、エンド型のα−１，５−Ｌ−アラビナナーゼ。
【０００４】
前記エンド型のアラビナン分解酵素活性を有するタンパク質において、その活性が最大となる温度（至適温度）は、５０〜６０℃である。
【０００５】
【非特許文献１】
ベルドマンら（Ｂｅｌｄｍａｎ，  Ｇ．，  Ｈ．  Ａ．  Ｓｃｈｏｌｓ，  Ｓ．  Ｍ．  Ｐｉｔｓｏｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｆ．  Ｓｅａｒｌｅ−ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｇ．  Ｊ．  Ｖｏｒａｇｅｎ．  １９９７．）、アラビナンとアラビナン分解酵素（Ａｒａｂｉｎａｎｓ  ａｎｄ  ａｒａｂｉｎａｎ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ．）、「Ａｄｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．」、１９９７年、第１巻、ｐ．１−６４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、エンド型のアラビナン分解酵素活性を有するタンパク質であって、前記至適温度よりも低温の至適温度を有するタンパク質は存在していなかった。そこで、本発明は、エンド型のアラビナン分解酵素活性を有し、その活性至適温度が前記従来の至適温度よりも低温である新規タンパク質の提供を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質は、アラビナンに対するエンド型のアラビナナーゼ活性を有し、その活性の至適温度が２０℃から４０℃であり、０℃での活性が最大活性の３０％以上であるタンパク質である。
【０００８】
本発明者等は、腐敗したシュガービートから単離したペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌体；ペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  ３１Ｂ）（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）が、培養液中に分泌する複数のアラビナン分解酵素について鋭意研究を重ね、それらの酵素の一つが、アラビナナーゼ活性を有し、活性至適温度が、通常のアラビナン分解酵素活性を有するタンパク質の活性至適温度よりも低温であることを見出し本発明に到達した。なお、本発明のタンパク質は、前記菌株由来のものに限定されず、例えば、遺伝子工学的に、大腸菌等の他の宿主により組換えタンパク質として大量発現させてもよい。
【０００９】
本発明のタンパク質は、０℃でも最大活性の３０％以上の活性を有するから、本発明のタンパク質を用いれば、低温において、アラビナナーゼ活性を利用することができる。なお、本発明のおいて、エンド型のアラビナナーゼ活性とは、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）活性のことであり、α−１，５−Ｌ−アラビナン鎖をランダムに加水分解する活性のことである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明のタンパク質について、さらに説明をする。
【００１１】
（本発明のタンパク質の精製方法）
本発明のタンパク質の精製方法を説明する。本発明のタンパク質の精製方法としては、例えば、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌体であって、本発明のタンパク質を培養液中に分泌するペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭＰ−１９１６３）を利用して、本発明の天然型タンパク質を精製する方法があげられる。具体的には、例えば、菌体培養、硫安沈殿、１ｓｔＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィー、ＰｈｅｎｙｌＳｕｐｅｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー、２ｎｄＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィー、および、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムクロマトグラフィーの各ステップをこの順に行えば、本発明の天然型タンパク質を精製することができる。前記各カラムクロマトグラフィーのステップでは、アラビナナーゼ活性を指標に分画を選択することができるが、このアラビナナーゼ活性の測定は、例えば、基質との反応後に遊離してくる還元糖を測定することで行うことができる。前記還元糖の測定方法としては、特に限定されないが、例えば、ソモギー・ネルソン法によって測定できる。以下に、本発明の天然型タンパク質の精製方法の形態の一例を示す。
【００１２】
ペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）の培養は、前培養と本培養に分けて行うことが好ましい。前記前培養は、例えば、胞子懸濁液１００μｌを、３ｍｌのＧＹＰ培地３本にそれぞれ植菌し、３０℃で一晩振盪培養する等して行う。前記胞子懸濁液は、例えば、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０を含む０．８５％ＮａＣｌ溶液（２０ｍｌ）をオートクレーブし、そこに前記菌のフレッシュな胞子を加え、十分にスティアラーで懸濁した後、４℃で保存する等して調製できる。また、前記ＧＹＰ培地は、通常、グルコース２％、イーストエキストラクト０．５％、ペプトン０．５％、ｐＨ５．０という組成である。前記本培養は、例えば、前記前培養（９ｍｌ）を１リットルの培地に加えて、３０℃で２０日間静置培養する等して行う。前記培地としては、例えば、下記表１の組成の培地を使用できる。
【００１３】
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【００１４】
本発明の天然型タンパク質の精製における前記硫安沈殿のステップは、例えば、以下のようにして行う。まず、前記本培養後の培養液をガーゼでろ過して菌体を取り除き、ろ液を４℃、１３７，２００ｍ／ｓ２（１４，０００  ｇ）で１０分間遠心分離し、その上清を粗酵素溶液とする。次に、前記粗酵素溶液に、硫酸アンモニウムを、氷中でスティアラーをゆっくり回転させながら、８０％飽和まで加え、さらに、４℃で一晩スティアラー攪拌を継続し、タンパク質を沈殿させる。そして、前記沈殿を、４℃、１４，０００  ｇ、２０分間の遠心分離により回収し、その沈殿を５０ｍｌの２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）に溶解し、その溶解液を、例えば、ポアサイズ０．８μｍの酢酸セルロース膜（イワキ社製）等を使用してフィルターろ過し、硫安沈殿後の粗酵素溶液を得る。
【００１５】
本発明の天然型タンパク質の精製における前記１ｓｔＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーのステップは、例えば、前記硫安沈殿後の粗酵素溶液を、セルラーゼ活性を抑えるため、予め冷却した５リットルの２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に対して、４℃、２日間の透析を行い、透析後の溶液を、ＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラム（容量１ｍｌ）を用いたＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により分離して行う。その分離条件は、例えば、流速  １ｍｌ／ｍｉｎ、分画  サイズ１ｍｌ／分画、平衡化バッファー  ２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、濃度勾配  ０−０．４Ｍ  ＮａＣｌ、検出  ＯＤ２８０である。本発明の天然型タンパク質は、前記ＭｏｎｏＱカラムに吸着した分画であって、かつ、アラビナナーゼ活性を示す分画に存在するので、その分画をまとめて回収する。前記アラビナナーゼ活性は、例えば、各分画中の１０μｌを使用し、基質にＡＺＣＬ−脱分枝アラビナン（ＭｅｇａＺｙｍｅ社製）を用いて、２０℃、１０分間の反応して測定する。本発明の天然型タンパク質の精製における他のカラムステップにおけるアラビナナーゼ活性も、同様にして測定できる。
【００１６】
本発明の天然型タンパク質の精製における前記ＰｈｅｎｙｌＳｕｐｅｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーのステップは、例えば、前記１ｓｔＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーから回収した溶液に、３０％飽和まで硫酸アンモニウムを加え、その溶液を、ＰｈｅｎｙｌＳｕｐｅｒｏｓｅＨＲ５／５カラム（容量１ｍ）を用いたＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により分離して行う。その分離条件は、例えば、流速  ０．５ｍｌ／ｍｉｎ、分画  サイズ１ｍｌ／分画、平衡化バッファー  ３０％硫酸アンモニウム−２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、濃度勾配  ３０−０％硫酸アンモニウム、検出  ＯＤ２８０である。前記カラムに吸着した分画であって、アラビナナーゼ活性を示す分画をまとめて回収し、回収した溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）に対して４℃で透析し、透析後の溶液を次の精製ステップに使用する。
【００１７】
本発明の天然型タンパク質の精製における前記２ｎｄＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーのステップは、例えば、前記透析後の溶液を、前記１ｓｔＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーと同様に行い、アラビナナーゼ活性を示す分画をまとめて回収する。
【００１８】
本発明の天然型タンパク質の精製における前記Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムクロマトグラフィーのステップは、例えば、前記２ｎｄＭｏｎｏＱカラムクロマトグラフィーにより回収された分画を、商品名ＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣ１０，０００ＮＭＷＬフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた限外ろ過により３５０μｌまで濃縮し、濃縮後の溶液を、ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いたＦＰＬＣシステム（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）により分離して行う。その分離条件は、例えば、流速  １ｍｌ／ｍｉｎ、分画  サイズ１ｍｌ／分画、平衡化および溶出バッファー  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ−２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、検出  ＯＤ２８０である。ゲルろ過後の分画から、アラビナナーゼ活性を示す分画をまとめて回収する。本発明の天然型タンパク質は、例えば、以上のようにして精製することができる。
【００１９】
前述のようにして精製される本発明の天然型タンパク質の分子量は、前記Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを用いたゲルろ過カラムによる定量では、３２ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動）による測定では、３５ｋＤａである。したがって、本発明のタンパク質は、単量体で機能するタンパク質である。また、本発明の天然型タンパク質のアラビナナーゼ活性は、１ｍＭのＢａ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋もしくはＭｎ２＋塩化物塩またはＡｇＮＯ３金属塩の添加では影響を受けないが、１ｍＭ  Ｈｇ２＋の添加により約６０％のアラビナナーゼ活性が阻害される。
【００２０】
（本発明のタンパク質の部分アミノ酸配列）
本発明の天然型タンパク質のＮ末端の部分アミノ酸配列は、例えば、エドマン分解による気相ペプチドシーケンサー等によって決定できる。また、内部の部分アミノ酸配列は、例えば、リジルエンドペプチターゼ等により切断された断片を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、前述のようなペプチドシーケンサー等によって、その断片のＮ末端からアミノ酸配列を決定できる。
【００２１】
（本発明の天然型タンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列）
前述のようにして本発明の天然型タンパク質のＮ末端および内部の部分アミノ酸配列が決定できると、その情報に基づいて、本発明の菌であるペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のゲノムから、本発明の天然型タンパク質をコードする遺伝子配列を決定できる。その方法としては、特に限定されず、様々なキット等を使用する方法があげられる。例えば、前記Ｎ末端および内部の部分アミノ酸配列から設計した縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを使用するｄｅｇｅｎｅｒａｔｅＰＣＲ法等により本発明の天然型タンパク質の部分ゲノム塩基配列を決定し、前記部分塩基配列から設計されるプライマーと、例えば、商品名ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）とを用いれば、本発明の天然型タンパク質をコードするゲノム塩基配列を決定できる。このようにして得られるペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）のゲノム塩基配列の一例を、配列番号５に示す。
【００２２】
前記ゲノム塩基配列から、本発明の天然型タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を決定できる。そのｃＤＮＡの塩基配列決定方法としては、特に限定されないが、例えば、３’−ＲＡＣＥ法や５’−ＲＡＣＥ法等が使用できる。前記ｃＤＮＡの塩基配列から、本発明の天然型タンパク質のコード領域配列（ＣＤＳ）およびアミノ酸配列を決定でき、それらの一例を、それぞれ、配列番号３および１に記載する。
【００２３】
前記配列番号１に記載の本発明の天然型タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端１９アミノ酸残基のシグナルペプチドを含む３２０アミノ酸残基（予測分子量３４．３ｋＤａ）からなる前駆体である。一方、ペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）の培養液から精製される本発明の天然型タンパク質は、Ｎ末端が前記配列番号１に記載のアミノ酸配列の第２０残基目のチロシンから始まる３０１アミノ残基（予測分子量３２．３ｋＤａ）からなる成熟型のタンパク質である。前記配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＦＡＳＴＡプログラムによる相同性検索によれば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒが産生するエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼと、６５．５％の相同性（同一性）を示し、また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓが産生するエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼとも、６３．４％の相同性（同一性）を示す。なお、本発明のタンパク質は、このように、前記既知のアラビナナーゼと比較的高い相同性を示すが、本発明のタンパク質は、前述のように、至適温度が低温側であるという顕著な特徴を有するタンパク質である。したがって、これらの既知のアラビナナーゼから本発明のタンパク質に想到することは困難である。
【００２４】
得られる前記ゲノム塩基配列と前記ｃＤＮＡ塩基配列をアライメントすると、本発明の天然型タンパク質をコードする遺伝子配列には、３つのイントロンが存在することが確認できる。その様子を図１に示す。図１に示すとおり、前記イントロンの長さは、５’側から、９８ｂｐ、６１ｂｐおよび４９ｂｐであり、これらにはさまれる２つのエキソンの長さは、４７７ｂｐおよび８７ｂｐである。前記３つのイントロンの５’側と３’側にはスプライシングシグナルであるＧ−Ｔ−Ｐｕ−Ｎ−Ｇ−Ｐｙ  および  Ｐｙ−Ａ−Ｇ  が一部のイントロンに存在するが、存在しないイントロンもある。また、カビにおけるイントロンのスプライシングシグナルのコンセンサス配列は、前記３つのイントロンでは確認できない。
【００２５】
（本発明の組換え型タンパク質の作製と精製）
本発明の天然型タンパク質に由来する組換え型タンパク質は、例えば、大腸菌等で発現させることができる。前記組換え型タンパク質を発現するベクターとしては、特に制限されず、適宜選択したベクターに、例えば、本発明の天然型タンパク質の成熟型をコードする領域等の塩基配列をクローニングすればよい。本発明の組換え型タンパク質は、例えば、前記成熟体のアミノ配列のみからなるものでもよいし、種々のタンパク質やペプチド等との融合タンパク質でもよい。前記融合させるタンパク質またはペプチドとしては、特に限定されないが、例えば、精製の手順の簡略化・低廉化や、安定性の向上・可溶化等を目的としたものがあげられ、具体的には、例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタンパク質等があげられる。
【００２６】
本発明の組換え型タンパク質をコードするベクターおよびその宿主は、本発明のタンパク質の大量発現系として使用できる。例えば、大腸菌等の微生物を使用した大量発現およびその精製は、簡便に、また、安価で行えるため好ましい。本発明の組換えタンパク質の一例としては、例えば、配列番号４の塩基配列がコードするＭＢＰ融合タンパク質（配列番号２）があげられる。
【００２７】
（至適温度）
本発明のタンパク質は、天然型、組換え型ともに、２０〜４０℃で、最大のアラビナナーゼ活性を示す。また、本発明のタンパク質は、０℃においても前記最大活性の３０％以上、好ましくは、４０％以上の活性を示す。またさらに、本発明のタンパク質は、１０℃において前記最大活性の６０％以上を示すことが好ましく、より好ましくは、７０％以上である。図２に、本発明の天然型および組換え型タンパク質におけるアラビナナーゼ活性の温度による変化の一例を示す。図２が示すとおり、天然型と組換え型は、温度に対してほぼ同じ活性変化の様式を示す。また、図６に、本発明の天然型タンパク質とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒが産生するエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼの温度による活性変化の一例を示す。図６が示すように、本発明のタンパク質のアラビナナーゼ活性の至適温度は、従来のアラビナナーゼ活性を有するタンパク質の至適温度よりも低温である。
【００２８】
（至適ｐＨ）
本発明のタンパク質は、天然型、組換え型ともに、ｐＨ６〜７で、最大のアラビナナーゼ活性を示す。図４に、本発明の天然型および組換え型タンパク質におけるアラビナナーゼ活性のｐＨによる変化の一例を示す。図４が示すとおり、天然型と組換え型は、ｐＨに対してほぼ同じ活性変化の様式を示す。
【００２９】
（基質特異性）
本発明のタンパク質は、アラビノース側鎖のついていない直鎖状アラビナンに特異的に高い分解活性を示す。前記分解活性の分解様式は、エキソ型とエンド型に分類でき、さらにその反応様式は、マルチプルアタックモード（プロセッシブ酵素）と、シングルアタックモードとに分類できる。これらの分類は、例えば、分解反応による生成物を経時的にモニターし、その結果に基づき行うことが可能である。例えば、前記エキソ型の場合、分解反応初期段階では、単糖または二糖等の１種類の反応生成物が蓄積し、一方、前記エンド型の場合、反応初期段階からさまざまなオリゴ糖の生成が検出できる。また、例えば、エンド型のマルチプルアタックモードの場合、酵素は一分子の基質に結合すると同分子を連続的に分解するから、反応初期において最終生成物が他のオリゴ糖よりも著しく生成される。一方、エンド型のシングルアタックモードの場合、酵素は基質を一回切断するごとに基質から解離するから、反応初期においては低重合度オリゴマーの生成は高重合度オリゴマーの生成よりも少なく、反応時間の経過と共に徐々に反応最終物が蓄積していく。前記モニターは、例えば、高性能陰イオン交換クロマトグラフィー等を利用できる。本発明の組換え型タンパク質をアラビナンと反応させて、所定時間後に生成物を検出した一例を図７に示す。図７に示すとおり、本発明のタンパク質は、主にアラビノトリオースを生成するエンド型のアラビナナーゼであって、その反応様式はマルチプルアタックモードである。
【００３０】
従って、本発明のタンパク質としては、例えば、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質であり、本発明の遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子である。さらに、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば、下記（ｄ）から（ｈ）のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１または配列番号１の２０番目から３２０番目に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸残基が、置換、付加、挿入若しくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ｉ）        アラビナンに対するエンド型のアラビナナーゼ活性を有するタンパク質であって、前記活性の至適温度が２０〜４０℃であり、０℃おける前記活性が最大活性の３０％以上であるタンパク質。
（ｉｉ）      活性至適ｐＨが６〜７であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定による分子量が３５ｋＤａまたは７５ｋＤａであり、単量体で機能する（ｉ）に記載のタンパク質。
（ｉｉｉ）    ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の菌体に由来する（ｉ）または（ｉｉ）に記載のタンパク質。
（ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３または配列番号３の５８番目から９６３番目に記載の塩基配列。
（ｆ）配列番号４に記載の塩基配列。
（ｇ）（ｅ）から（ｆ）のいずれかに記載の塩基配列において、１個以上の塩基が、置換、付加、挿入若しくは欠失した塩基配列であって、上記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列。
（ｈ）（ｄ）から（ｇ）のいずれかに記載の塩基配列の相補配列。
【００３１】
（果汁加工液のおり防止）
果汁加工液中に形成されるおり（沈殿物）の原因としては、果汁圧搾時に使用されるペクチナーゼ製剤の作用であると考えられている。すなわち、ペクチナーゼ製剤中には、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質が存在しており、このタンパク質がアラビナンに結合している側鎖アラビノースを切断し、その結果、直鎖状のアラビナンが生成する。側鎖結合型アラビナンは可溶性であるが、直鎖状アラビナンは不溶性であるため、前記アラビノフラノシダーゼ反応が進行するにつれておりが形成されるのである。本発明のタンパク質は、直鎖状アラビナンを可溶性のアラビノオリゴ糖に加水分解できるから、前記果汁加工液中のおりの分解および防止が可能である。前記果汁加工液は、製造および製造後において、品質保持の点から、低温で保存、加工、搬送等されるが、本発明のタンパク質は、低温でも作用するから、製造後も効果的におりの発生を防止できる。また、果汁加工液製造における果汁圧搾の前処理として、アラビナナーゼ活性を有するタンパク質を用いれば、ろ過性が向上するから果汁回収率が向上が可能である。そこで、低温でも作用する本発明のタンパク質を前記前処理に用いれば、低温で品質を保持したまま、前記果汁回収率の向上と、前述のおりの発生防止とを併せて実現できる。
【００３２】
本発明のタンパク質が添加された果汁加工液中では、直鎖状アラビナンが本発明のタンパク質によりアラビノオリゴ糖に分解され、前記アラビノオリゴ糖はアラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質によりアラビノースまで分解されうる。アラビノースは、小腸上皮スクラーゼの活性を阻害し、砂糖の吸収を抑制できることが知られている。本発明のタンパク質を用いれば、前記アラビノースがより多く含まれた果汁加工液を提供できる。
【００３３】
（農産廃棄物からのアラビノオリゴ糖の製造）
本発明のタンパク質を用いれば、例えば、農産廃棄物等に含まれるアラビノース含有多糖から、アラビノオリゴ糖を製造することができる。前記農産廃棄物としては、例えば、オレンジファイバー、みかんジュース粕、アップルファイバー、りんごジュース粕、ビートファイバー、ビートパルプ、シュガービートパルプ、落花生粕、米ぬか、とうもろこし粕、大豆粕、あずき粕等があげられる。これらの中で、アラビノオリゴ糖の製造の材料として好ましいのは、シュガービートパルプ、りんごジュース粕、大豆粕であって、より好ましくは、シュガービートパルプである。農産廃棄物からのアラビノオリゴ糖の製造方法は、例えば、農産廃棄物からアラビノース含有多糖を抽出する工程、前記多糖を酵素処理する工程、前記酵素反応溶液からアラビノオリゴ糖を分離する工程等を含む。
【００３４】
前記農産廃棄物からのアラビノース含有多糖の抽出は、例えば、前記廃棄物をアルカリ条件下で加熱処理することで行うことができる。また、アラビノース含有多糖の酵素処理は、例えば、大豆のアラビナン等のように、アラビナンに側鎖がついていない場合は、直接本発明のタンパク質を作用させて、アラビノオリゴ糖を遊離させることができる。一方、例えば、シュガービート（甜菜）のアラビナン等のように、アラビナンに側鎖がついている場合には、本発明のタンパク質を作用させる前に、例えば、アラビノフラノシダーゼ活性を有するタンパク質（枝切酵素）等で処理して脱分枝し、さらに、遊離したアラビノースを除くため、例えば、限外ろ過等をする必要がある。こうして得られた脱分枝アラビナンに本発明のタンパク質を作用させてると、アラビノオリゴ糖を遊離させることができる。そして、このような酵素反応溶液からアラビノオリゴ糖を分離する工程としては、例えば、限外ろ過法によって、アラビノオリゴ糖と未反応物を分離する方法等があげられ、前記アラビノオリゴ糖を含む画分を、さらに、例えば、脱塩処理等することにより、精製アラビノオリゴ糖を得ることができる。
【００３５】
（コンポスト化における使用）
日本において、年間約２０００万ｔ発生すると推定される植物由来の廃棄物の利用方法の一つがコンポスト（堆肥）化である。本発明のタンパク質は、前記コンポスト化に使用するコンポスト菌の増殖を促進するための前処理に使用できる。すなわち、本発明のタンパク質の作用により、前記の植物由来廃棄物の植物細胞壁をある程度分解することで、前記コンポスト菌の増殖開始時における増殖を促進できる。寒冷地におけるコンポスト化では、秋から冬にかけて、コンポスト菌が増殖して熱を発生しはじめるまでの工程が問題となる場合、低温で活性を有する本発明のタンパク質を使用した前処理をすることが好ましい。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３７】
（本発明の天然型タンパク質の精製）
前述した本発明の天然型タンパク質の精製方法に従って、ペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）から、本発明の天然型タンパク質を精製した。各精製ステップの結果を下記表２にまとめる。
【００３８】
2004248630.tif 000004
【００３９】
（Ｎ末端および内部アミノ酸配列）
前述のとおり精製した本発明の天然型タンパク質および前記タンパク質をリジルエンドペプチダーゼ処理した断片を用いて、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲル内のタンパク質および断片をＰＶＤＦ膜にブロッティングし、前記タンパク質および断片のスポットをそれぞれ切り出し、プロテインシークエンサー（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．製商品名ＰＳＱ−１）により、前記スポットのアミノ酸配列を決定した。決定されたＮ末端および内部アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１に記載のアミノ酸配列の２０〜４３残基目および９５〜１０５残基目に一致することが確認できた。
【００４０】
前記決定された２ヵ所のアミノ酸配列から、本発明のタンパク質をコードする部分ゲノム塩基配列を、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅＰＣＲ法により決定した。１ｓｔＰＣＲは、前記Ｎ末端アミノ酸配列の配列番号１の２０〜２６残基目に記載の配列に基づき設計した配列番号６に記載の縮退フォワードプライマーｃｏｌｄＡｒａＡと、前記内部アミノ酸配列の配列番号１の１０３〜９７残基目に記載の配列に基づき設計した配列番号７に記載の縮退リバースプライマーｃｏｌｄＡｒａ４とをプライマーとして使用し、鋳型としてペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）ゲノムを使用し、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、９５℃１分間熱変性の後、熱変性９４℃１分間、アニーリング５２℃１分間、伸長反応７２℃１分間からなるサイクルを３０サイクル行った。その他の反応条件は、製造業者の取扱説明書にしたがった。２ｎｄＰＣＲは、鋳型として前記１ｓｔＰＣＲ産物の１／１０００希釈物を使用し、プライマーとして前記Ｎ末端アミノ酸配列の配列番号１の２９〜３５残基目に記載の配列にも基づき設計した配列番号８に記載の縮退ｎｅｓｔｅｄフォワードプライマーｃｏｌｄＡｒａＢと前記ｃｏｌｄＡｒａ４プライマーとを使用して、同様の条件で行い、約３００ｂｐの増幅産物を得た。前記ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。決定された塩基配列は、３２３ｂｐであり、配列番号５に記載のペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）ゲノム塩基配列の８５〜４０７塩基目と一致することが確認できた。塩基配列決定は、商品名ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅシーケンスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）と、ＤＮＡシーケンサー商品名モデル３７３ストレッチ（Ａｐｐｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて行った。以下、塩基配列決定は、同様に行った。
【００４１】
（ゲノムおよびｃＤＮＡ塩基配列）
前記部分ゲノム塩基配列から設計したプライマーと、商品名ＴａＫａＲａ  ＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）とを用いて、ペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）ゲノムにおける本発明のタンパク質をコードする遺伝子領域をクローニングした。３’領域のクローニングの１ｓｔＰＣＲは、鋳型として前記菌ゲノムをＳａｌＩ制限酵素処理して前記キットのＳａｌＩカセットをライゲーションしたものを使用し、プライマーとして配列番号９に記載のフォワードプライマーＣｏｌｄＣ１Ｆおよび前記キットのＣ１プライマーを使用し、９５℃１分間熱変性の後、熱変性９４℃１分間、アニーリング５５℃２分間、伸長反応７２℃５分間からなるサイクルを３０サイクル行った。２ｎｄＰＣＲは、鋳型として前記１ｓｔＰＣＲ産物の１／１０００希釈物を使用し、プライマーとして配列番号１０に記載のＣｏｌｄＣ２Ｆおよび前記キットのＣ２プライマーを使用し、９５℃１分間熱変性の後、熱変性９４℃１分間、アニーリング５５℃２分間、伸長反応７２℃５分間からなるサイクルを２０サイクル行った。また、５’領域のクローニングの１ｓｔＰＣＲは、鋳型として３’領域のクローニングに使用したものと同じ鋳型を使用し、プライマーとして配列番号１１に記載のリバースプライマーＣｏｌｄＣ１Ｒおよび前記キットのＣ１プライマーを使用し、９５℃１分間熱変性の後、熱変性９４℃１分間、アニーリング５５℃２分間、伸長反応７２℃５分間からなるサイクルを３０サイクル行った。２ｎｄＰＣＲは、鋳型として前記１ｓｔＰＣＲ産物の１／１０００希釈物を使用し、プライマーとして配列番号１２に記載のＣｏｌｄＣ２Ｒおよび前記キットのＣ２プライマーを使用し、９５℃１分間熱変性の後、熱変性９４℃１分間、アニーリング５５℃２分間、伸長反応７２℃５分間からなるサイクルを１５サイクル行った。その他の反応条件は、製造業者の取扱説明書にしたがった。得られたＰＣＲ産物は、前述と同様にＴＯＰＯ  ＴＡクローニングし、塩基配列を決定し、その結果、配列番号５に記載する１１７１ｂｐを含む約３ｋｂｐのゲノム領域の塩基配列が得られた。
【００４２】
本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥ法によってクローニングした。トータルＲＮＡは、前培養したペニシリウム  クリソジェナム  ３１Ｂ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６３）を、２％シュガービートパルプを１％シュガービートエキストラクト（シュガービートパルプアルカリ抽出物）に変更した以外は上記表１に記載の組成と同様の液体培地１００ｍｌに接種し、２００ｍｌ三角フラスコ中、３０℃で１３日、静置培養し、その培養後、菌糸体を遠心分離法により回収し、液体窒素で処理し、乳鉢で粉状化し、その菌糸体１５０ｍｇから、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して回収した。
【００４３】
３’−ＲＡＣＥの１ｓｔＰＣＲは、鋳型として配列番号１３に記載のアダプター配列が付加されたオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）と前記トータルＲＮＡとから作製されたｃＤＮＡを使用し、プライマーとして前記ＣｏｌｄＣ１Ｆプライマーおよび配列番号１４に記載のＡＰ１プライマーを使用し、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、９５℃３分間熱変性の後、熱変性９４℃１分間、アニーリング６５℃１分間、伸長反応７２℃２分間からなるサイクルを３０サイクル行った。２ｎｄＰＣＲは、鋳型として前記１ｓｔＰＣＲ産物の１／１０００希釈物を使用し、プライマーとして前記ＣｏｌｄＣ１Ｆプライマーおよび配列番号１５に記載のＡＰ２プライマーを使用した他は、前記１ｓｔＰＣＲと同様に行った。また、５’−ＲＡＣＥによりｃＤＮＡの５’側領域の決定するため、ＰＣＲを、鋳型として前記トータルＲＮＡからランダムヘキサマープライマーと逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）とを用いて作製したｃＤＮＡを使用し、プライマーとして前記ゲノム配列から予測されるスタートコドンの上流部分にあたる配列番号１６に記載のプライマーＣｏｌｄＡと前記ＣｏｌｄＣ２Ｒプライマーを使用し、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、９５℃３分間熱変性後、熱変性９４℃１分間、アニーリング５６℃１分間、伸長反応７２℃１分間からなるサイクルを３０サイクル行った。その他の反応条件は、製造業者の取扱説明書にしたがった。得られたＰＣＲ産物は、前述と同様にＴＯＰＯ  ＴＡクローニングし、塩基配列を決定し、その結果、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡ塩基配列（配列番号３）が得られた。
【００４４】
（組換え型タンパク質の発現）
本発明の組換えタンパク質を得るために、ｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位に、本発明の天然型タンパク質の成熟型をコードする領域を挿入した。前記挿入断片は、ＰＣＲにより増幅し、前記ＰＣＲは、鋳型として前記ｃＤＮＡを使用し、プライマーとして配列番号１７および１８にそれぞれ記載のプライマーＣｏｌｄ−Ｎ／ＥｃｏおよびＣｏｌｄ−ｓｔｏｐ／Ｘｂａを使用し、ＫＯＤ−Ｐｕｌｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、９４℃１分間の熱変性の後、熱変性９４℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、伸長反応６８℃２分間からなるサイクルを２０サイクル行った。その結果、ｍａｌＥ遺伝子の下流に本発明の成熟型タンパク質をコードする領域が挿入されたベクターｐＭＡＬ−ＡＣを得た。前記ｐＭＡＬ−ＡＣは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合組換え型タンパク質をコードする。このタンパク質のアミノ酸配列および塩基配列は、それぞれ、配列番号２および４に記載した。
【００４５】
本発明の組換え型タンパク質を発現するために、前記ベクターで、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリンを含む２００ｍｌのＬＢ培地で培養し、１ｍＭＩＰＴＧにより発現誘導した。発現誘導は、本発明の天然型タンパク質に対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。この培養細胞の無細胞抽出物から、アミロース樹脂カラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を使用して、本発明の組換えタンパク質を精製した。まず、前記カラムを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡからなるバッファーで平衡化し、次に、前記抽出物を前記バッファーに溶解し、そして、その溶液中のタンパク質を前記カラムに結合させ、その結合したタンパク質を、１０ｍＭのマルトースを含む前記バッファーで溶出した。その結果、前記２００ｍｌの培養液から、８．０５ｍｇの組換え型タンパク質を回収した。
【００４６】
（アラビナナーゼ活性の測定）
精製された本発明の天然型および組換え型タンパク質の温度によるアラビナナーゼ活性の変化を示すため、前記タンパク質を、所定の温度下で、２００μｌの０．１％脱分枝アラビナンを基質として反応させ、その反応により遊離した還元糖量をソモギー・ネルソン法により測定した。使用したタンパク質量は、天然型タンパク質は３μｌ（０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０）であり、組換え型タンパク質は３μｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）であった。反応は、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０℃でそれぞれ１時間行った。その結果を図２に示す。図２に示すとおり、本発明の天然型および組換え型タンパク質のアラビナナーゼ活性の至適温度が２０〜４０℃であることが確認できた。また、本発明のタンパク質のアラビアナーゼ活性が、１０℃において最大活性の約６０〜７０％、０℃において最大活性の約４０％の活性であることが確認できた。
【００４７】
また、精製された本発明の天然型および組換え型タンパク質の温度安定性を示すため、前記タンパク質を所定の温度で１時間インキュベーションした後の残存活性を測定した。本発明の天然型タンパク質１６０μｌ（０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０）、および、組換え型タンパク質１６０μｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）を、それぞれ、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０℃で１時間インキュベートし、そのうち４０μｌを用いて、前記基質と、２０℃で１時間反応させた。その結果を図３に示す。図３に示すとおり、前記天然型タンパク質は、０〜４０℃の範囲で、１時間処理後においても９０％の活性を示したが、前記組換え型タンパク質は、９０％以上の残存活性を示したのは０〜３０℃であり、４０℃では残存活性は３０％となった。
【００４８】
さらにまた、精製された本発明の天然型および組換え型タンパク質のｐＨによるアラビナナーゼ活性の変化を示すため、前記タンパク質を、所定のｐＨで基質と反応させ、遊離した還元糖量をソモギー・ネルソン法により測定した。前記基質は、１９６μｌの０．１％脱分枝アラビナン水溶液に、所定のｐＨの１Ｍバッファーを４μｌ加えて調製した。使用した本発明のタンパク質は、天然型タンパク質が３μｌ（０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０）であり、組換え型タンパク質が３μｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）であった。反応は、２０℃で１０分間行った。前記所定のｐＨに調整するバッファーとして、ｐＨ１〜２のバッファーには、ＨＣｌ−ＫＣｌバッファーを、ｐＨ３〜５のバッファーには、酢酸バッファーを、ｐＨ６〜８のバッファーには、リン酸バッファーを、ｐＨ９〜１１のバッファーには、Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３バッファーを、それぞれ使用した。その結果を図４に示す。図４に示すとおり、本発明の天然型および組換え型タンパク質は、ともに、至適ｐＨが６〜７であった。
【００４９】
さらにまた、精製された本発明の天然型および組換え型タンパク質のｐＨ安定性を示すため、前記ｐＨ調整バッファーを、本発明の天然型タンパク質（０．４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭ酢酸バッファーｐＨ５．０）、および、組換え型タンパク質（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）に、それぞれ、最終濃度が２００ｍＭとなるように加え、２０℃で１６時間インキュベートし、インキュベート後の前記天然型タンパク質１０μｌおよび前記組換え型タンパク質３μｌを、２００μｌの０．１％脱分枝アラビナン（１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．０）に加え、それぞれ、２０℃で２時間、および、２０℃で１０分間反応させて、その後、残存活性を測定した。その結果を図５に示す。図５に示すとおり、本発明の天然型タンパク質は、ｐＨ５〜９で、残存活性が８０％以上であったのに対し、本発明の組換え型タンパク質は、ｐＨ７〜８で８０％以上の残存活性を示した。
【００５０】
対照例として、Ｎｏｖｏ社製のＡｐｓｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来組換えエンドアラビナナーゼのアラビナナーゼ活性を所定の温度下で測定した。前記酵素を０．１μｇ使用した他は、前述の本発明の天然型タンパク質の場合と同様にして測定した。その結果を、本発明の天然型タンパク質の結果と併せて、図６に示す。図６に示すとおり、前記Ａｐｓｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来組換えエンドアラビナナーゼの活性至適温度は、５０℃付近であった。
【００５１】
（分解反応様式）
本発明のタンパク質が基質であるアラビナンの分解反応様式を確認するため、所定時間分解反応をさせた後、反応生成物をｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＡＥＣ、Ｄｉｏｎｅｘ社製）で検出した。２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）に対して透析を行い、アラビノースを除去した１％脱分枝アラビナン１ｍｌに、本発明の組換え型タンパク質５０μｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）を混合し、１６０μｌずつ４本に分注した後、それぞれ、２０℃で、１、１０、３０、６０分間反応した。反応後、５分間のボイルで酵素活性を失活させ、等量の純水を加え、ポアサイズ０．４５μｍのナイロン膜フィルター（Ｉｗａｋｉ社製）を用いてフィルターろ過したものを、前記ＨＰＡＥＣを用いて分離した。前記分離条件は、カラム  Ｃａｒｂｏｐａｃ  ＰＡ−１カラム、カラムサイズ  ２×２５０  ｍｍ、流速  ０．２５  ｍｌ／ｍｉｎ、平衡化バッファー  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ、濃度勾配  ０−０．４５Ｍ  酢酸ナトリウム（３０ｍｉｎ）、検出  パルス電流滴定方式で行った。その結果を図７に示す。図７に示すとおり、反応初期において、さまざまなアラビノオリゴマーが生成されるが、それらの中でもアラビノトリオースの生成が顕著に認められた。さらに、反応時間が長くなる場合でも、アラビノトリオースの生成量が最も大きかった。この結果から、本発明のタンパク質は、エンド型マルチプルアタックモードの酵素であり、主としてアラビノトリオースを生成する酵素であることが確認された。
【００５２】
（基質特異性）
本発明のタンパク質の基質特異性を示すため、以下の９種類の基質と本発明のタンパク質を反応させた。まず、本発明のタンパク質のアラビノフラノシダーゼ活性を調べるために、本発明の組換え型タンパク質１０μｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）と、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド２００μｌ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製、０．０２％、２０ｍＭの酢酸バッファーｐＨ５．０）とを混合し、２０℃で１６時間インキュベートした。０．２ＭのＮａ２ＣＯ３を反応溶液に加えた後に、遊離したｐ−ニトロフェノールを、分光光度法（４２０ｎｍ）でモニターした。次に、脱分枝アラビナン（シュガービート由来）、アラビノキシラン、ガラクタン、ソイビーンアラビノガラクタン、Ｌ−アラビナン（以上Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）、可溶性スターチ、カルボキシメチルセルロース（以上Ｗａｋｏ社製）およびポリガラクツロン酸（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製）の８種類の基質を、それぞれ、０．１％溶液（２０ｍＭの酢酸バッファーｐＨ５．０）に調製し、そこへ本発明の組換え型タンパク質１０μｌ（１．３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４）を混合し、２０℃で１６時間反応させた後、ソモギー・ネルソン法によって活性を測定した。その結果を下記表３に示す。下記表３に示すとおり、本発明のタンパク質は、アラビノース側鎖が付加されていない直鎖状アラビナンにのみ高い活性を有することが確認できた。
【００５３】
2004248630.tif 000005
【００５４】
【発明の効果】
以上のように、本発明のタンパク質は、アラビナンに対するエンド型のアラビナナーゼ活性を有するタンパク質であって、その活性の至適温度が２０〜４０℃であり、０℃での活性が最大活性の３０％以上であり、低温側においても優れた活性を示す。したがって、本発明のタンパク質を用いれば、例えば、低温での加工、貯蔵、搬送等が必要な果汁加工液のおり防止に使用できる。この他にも、本発明のタンパク質は、例えば、寒冷地での植物由来廃棄物のコンポスト化に使用できる。
【００５５】
【配列表】
2004248630.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のタンパク質をコードする遺伝子のエキソンとイントロンの一例を示す模式図である。
【図２】本発明のタンパク質のアラビナナーゼ活性と温度との関係の一例を示すグラフである。
【図３】本発明のタンパク質の温度安定性の一例を示すグラフである。
【図４】本発明のタンパク質のアラビナナーゼ活性とｐＨとの関係の一例を示すグラフである。
【図５】本発明のタンパク質のｐＨ安定性の一例を示すグラフである。
【図６】Ａｐｓｅｒｇｉｌｌｕｓ． ｎｉｇｅｒ由来タンパク質のアラビナナーゼ活性と温度との関係の一例を示すグラフである。
【図７】本発明のタンパク質のアラビナナーゼ活性の分解反応様式の一例を示す図である。
【図１】
2004248630.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004248630.tif 000024
【図６】
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【図７】
2004248630.tif 000026