(57)【要約】【課題】ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液を用いてカルボン酸アンモニウムを製造するにあたり、非常に不安定なそれらのニトリラーゼ活性を長期安定的に保持する方法を提供する。【解決手段】本発明は、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の中から選ばれた少なくとも１種の化合物を存在させることを特徴とするニトリラーゼ活性の保持方法である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリラーゼ活性の保持方法であって、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又は該グラム陰性菌のニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の中から選ばれた少なくとも１種の化合物を存在させることを特徴とするニトリラーゼ活性の保持方法。
【請求項２】
上記固定化物溶液又は懸濁液中にカルボン酸アンモニウムが含まれ、かつ、ニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の濃度が全体で０．１〜５００ｍＭである請求項１記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【請求項３】
上記固定化物溶液又は懸濁液のｐＨが６．５〜１１．５である請求項１又は２記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【請求項４】
保持温度が氷点〜２０℃であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【請求項５】
上記ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター属又はアルカリゲネス属である請求項１〜４のいずれか一項に記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【請求項６】
上記ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター属である請求項５記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【請求項７】
上記ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌が、アシネトバクター  エスピー  ＡＫ２２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４５１）、アシネトバクター  エスピー  ＡＫ２２７（微工研菌寄８２７２号）である請求項６記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の微生物の産生するニトリラーゼに基づくニトリラーゼ活性の経時的な低下を防止し、この活性を安定的に保持する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
酵素活性を持つ微生物あるいはその酵素、若しくはそれらの固定化物を利用して目的の化合物を合成する方法は、反応条件が穏和であるため反応プロセスが簡略化できること、あるいは副生成物が少ないため高純度の反応生成物を取得できる等の利点があるため、近年、様々な化合物の製造に用いられている。
【０００３】
そのような酵素のうち、ニトリラーゼは、ニトリル化合物を水和して対応するカルボン酸アンモニウムを生成せしめる酵素として知られている。この酵素に関する従来技術としては、例えば特許文献１〜４が挙げられる。また、それら酵素ニトリラーゼを産生する微生物の内、グラム陰性菌のものとしてアシネトバクター属やアルカリゲネス属等が知られている。
【０００４】
ところで、実際に、これらのニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物を用いてカルボン酸アンモニウムを製造する場合には、酵素のニトリラーゼ活性を使用時まで安定に保存しておく必要がある。すなわち、酵素の触媒活性の失活、あるいは低下を防がなければならない。
【０００５】
しかしながら、本発明者らが検討したところ、上記ニトリラーゼの活性は非常に不安定で、集菌直後であっても大きな活性低下が引き起こされることが判明した。その上、この大きな活性低下は、一般的な冷蔵等の手法でもっても防止することができないことも判明した。
【０００６】
この問題に対する別の解決法として、特許文献５には、１００ｍＭ〜飽和濃度の無機塩類水溶液の懸濁液での長期保存が記載されている。しかしながらこの従来技術は、高濃度の塩類を用いることによりと高コストとなる、また反応系での使用前に水洗等の煩雑な操作が必要となる、あるいは反応系内に不純物としてその無機塩類が混入し、その精製のためイオン交換等の精製系への負荷が増える等の欠点を有していた。
【０００７】
【特許文献１】
特公昭６３−２５９６号公報
【特許文献２】
特開昭６３−１２９９８８号公報
【特許文献３】
特開昭６３−２０９５９２号公報
【特許文献４】
特表２０００−５０１６１０号公報
【特許文献５】
特開平８−１１２０８９号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又は該グラム陰性菌のニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液を用いてカルボン酸アンモニウムを製造するにあたり、非常に不安定なそれらのニトリラーゼ活性を長期安定的に保持する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者はこのような問題を解決するため、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物を水性媒体に懸濁した状態で、酵素活性を長期間安定に保存する方法について鋭意検討した。その結果、驚くべき事に特定の物質、即ち、ニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の使用が該目的に極めて有効であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち本発明は、以下の１〜７のニトリラーゼ活性の保持方法である。
１  ニトリラーゼ活性の保持方法であって、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又は該グラム陰性菌のニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の中から選ばれた少なくとも１種の化合物を存在させることを特徴とするニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１１】
２  上記固定化物溶液又は懸濁液中にカルボン酸アンモニウムが含まれ、かつ、ニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の濃度が全体で０．１〜５００ｍＭである１記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１２】
３  上記固定化物溶液又は懸濁液のｐＨが６．５〜１１．５である１又は２記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１３】
４  保持温度が氷点〜２０℃であることを特徴とする１〜３のいずれか一項に記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１４】
５  上記ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター属又はアルカリゲネス属である１〜４のいずれか一項に記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１５】
６  上記ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌がアシネトバクター属である５記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１６】
７  上記ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌が、アシネトバクター  エスピー  ＡＫ２２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４５１）、アシネトバクター  エスピー  ＡＫ２２７（微工研菌寄８２７２号）である６記載のニトリラーゼ活性の保持方法。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明について、以下具体的に説明する。
本発明でいうニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌は数多くのものが知られている。代表的な高活性を有するものとして、アシネトバクター属、アルカリゲネス属等が挙げられるが、本発明においてはこれらに限定するものではない。具体的には、アシネトバクター  エスピー  ＡＫ２２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４５１）、アシネトバクター  エスピー  ＡＫ２２７（微工研菌寄  ８２７２号）である。これらの菌株は、特公昭６３−２５９６号公報に記載されている。また、天然のあるいは人為的に改良したニトリラーゼ遺伝子を遺伝子工学的手法により組み込んだ微生物あるいはそこから取り出した酵素であっても構わない。
【００１８】
ニトリラーゼ活性を保持するときの形態としては、微生物をそのまま用いても構わないが、そのもの、あるいは破砕等の処理をしたもの、あるいは微生物等からニトリラーゼ酵素を取り出したもの、さらに取り出した酵素を一般的な包括法、架橋法、担体結合法等で固定化したものを用いてもよい。それらニトリラーゼ活性を有するものを固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明における安定化剤とは、ニトリル類、アミド類、カルボン酸類及びそれらの塩から選ばれた化合物であり、これらは単独に又は混合して使用することができる。具体的には、例えば次の化合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
１）  アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリルのような脂肪族ニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。（ここでいう対応するとは、ニトリル基の替わりにアミド基又はカルボキシル基が結合していることを指す。）
２）  グリシンニトリル、α−アミノプロピオニトリルのようなアミノニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
３）  ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリルのようなヒドロキシニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
４）  アクリロニトリル、メタクリロニトリルのような不飽和ニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
５）  マロンニトリル、スクシノニトリルのようなジニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
６）  シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモノシアノアミド及びモノシアノ酸又はその塩類。
７）  ベンゾニトリル、フェニルアセトニトリルのような芳香族ニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
８）  ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルのような複素環式ニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
９）  クロロアセトニトリル、β−クロロプロピオニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と対応するアミド及びカルボン酸又はその塩類。
１０）グリオキサールのようなアルデヒド基を有するカルボン酸又はその塩類。
【００２０】
本発明においてニトリラーゼ活性を保持するには、安定化剤である前記した化合物と、同じく前記したニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液とを、共に各種バッファー溶液、生理食塩水、水等に溶解又は分散させることで達成できる。具体的には、まず菌体培養液を遠心分離機にかけ、菌体ペレットと培養液に分離した後、該培養液を取り除く。次いで、菌体ペレットに安定剤の入った液を添加、混合、懸濁させ、再び遠心分離して菌体ペレットを得、最後に安定化剤入り液を添加、混合、懸濁させることができる。後述する実施例ではこの一連の操作を行ったが、これを菌体液の洗浄と記した。このような方法によってニトリラーゼ活性は８時間を越える保持時間を実現することができ、さらには、後述する実施例では２日後も安定な活性を示した。
【００２１】
安定化剤の添加量は、ニトリル類、アミド類、カルボン酸及びそれらの塩類の全体の濃度が０．１〜５００ｍＭの範囲となるように加えれば良く、経済性を考慮すると、好ましくは１〜１００ｍＭである。溶液又は懸濁液のｐＨは６．５〜１１．５の範囲であるが、好ましくは７〜９が良い。温度は短期間保存の場合は室温でもよいが、長期保存する場合には氷点〜２０℃の低温、特に氷点近くで氷点に達しない温度が良い。
【００２２】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは無く、その要旨を変えない限り、様々な変更、修飾などが可能である。
【００２３】
固定化してない微生物菌体液中の乾燥菌体重量の測定法は、以下のごとく実施した。まず、適当な濃度の微生物菌体懸濁液を適量取り、−８０℃まで冷却した後、凍結乾燥機を用いて完全に乾燥し、菌体懸濁液濃度を算出した。既知濃度となった菌体懸濁液を適当な複数の濃度に希釈し、濁度計にて濁度を測定し、濁度計の検量線を作成し、ファクターを算出した。該濁度計の濁度指示値から任意の微生物菌体懸濁液の乾燥菌体濃度を算出した。
【００２４】
菌体を固定化したものを生体触媒とする場合は、固定化する前の菌体懸濁液の乾燥菌体濃度を測定し、固定化担体と菌体の混合比で固定化触媒中の固定化担体を差し引いた生体由来成分の乾燥重量を算出した。
【００２５】
ニトリラーゼ活性評価は以下のごとく実施した。基質としてアクリロニトリルを用い、生成物であるアクリル酸アンモニウム量を測定することで活性を評価した。具体的には、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物を、３０ｍＭのアクリル酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝７）に懸濁した液５ｍＬを予め３０℃に保持したものに、アクリロニトリル１００μＬを素早く添加した時点を反応スタートとし、振盪培養器中、３０℃で２０分間反応させた。反応後の反応液あるいは上澄み液中のアクリル酸アンモニウム濃度は、ホルマリン処理でアンモニウムイオンをヘキサメチレンテトラミンとしてトラップした後、中和滴定にて定量した。この時同時にアクリロニトリルを添加しないサンプルも作製し、添加したサンプルと同様に処理し、その滴定値をブランク値（反応前のアクリル酸アンモニウム濃度）として、前記滴定値から差し引いた値を生成アクリル酸アンモニウム濃度とした。反応活性は１時間当たり、１ｇ微生物菌体当たりの生成アクリル酸アンモニウム重量で表示した。
【００２６】
［微生物菌体液の調製例］
ニトリラーゼ活性を有するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＡＫ２２６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４５１）を、塩化ナトリウム０．１％、リン酸２水素カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、硫酸鉄７水和物０．００５％、硫酸マンガン５水和物０．００５％、硫酸アンモニウム０．１％、硝酸カリウム０．１％（いずれも重量％）を含む水溶液をｐＨ＝７に調整した培地で、栄養源としてアセトニトリル０．５重量％を添加し、３０℃で好気的に培養した。この時、培養終了直後の反応活性評価を前記の方法で実施したところ、８９．５［ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間］であった。
【００２７】
【実施例１】
［活性保持確認実験］
上記調製例で調製した微生物菌体液を、３０ｍＭアクリル酸アンモニウム（ｐＨ＝７．０）で洗浄し、菌体懸濁液（乾燥菌体１０重量％）を得て、５℃で冷蔵保存した。それから２時間後の反応活性評価を前記の方法で実施したところ、８９．０［ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間］であった。また、更に５℃で２日冷蔵保存後の反応活性評価を前記の方法で実施したところ、８９．２［ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間］であった。
【００２８】
【比較例１】
［リン酸バッファーでの効果］
上記調製例で調製した微生物菌体液を、３０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）で洗浄し、菌体懸濁液（乾燥菌体１０重量％）を得て、５℃で冷蔵保存した。それから２時間後の反応活性評価を前記の方法で実施したところ７１．２［ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間］であった。また、更に５℃で２日冷蔵保存後の反応活性評価を前記の方法で実施したところ４２．５［ｇ−アクリル酸アンモニウム／ｇ−乾燥菌体／時間］であった。
【００２９】
【実施例２〜６】
［カルボン酸類添加効果］
上記調製例で調製した微生物菌体液を３０ｍＭリン酸バッファーと下記表１に示す３０ｍＭカルボン酸類の混合液（ｐＨ＝７．０）で洗浄し、菌体懸濁液（乾燥菌体１０重量％）を得て、実施例１と同様に２時間後及び２日後の反応活性評価を実施した。結果を下記表１に示す。
【００３０】
【表１】
2004305066.tif 000002
【００３１】
【実施例７〜１１】
［アミド類添加効果］
上記調製例で調製した微生物菌体液を、３０ｍＭリン酸バッファーと表２に示す３０ｍＭアミド類の混合液（ｐＨ＝７．０）で洗浄し、菌体懸濁液（乾燥菌体１０重量％）を得て、実施例１と同様に２時間後及び２日後の反応活性評価を実施した。結果を表２に示す。
【００３２】
【表２】
2004305066.tif 000003
【００３３】
【実施例１２〜１６】
［ニトリル類添加効果］
上記調製例で調製した微生物菌体液を、３０ｍＭリン酸バッファーと下記表３に示す３０ｍＭニトリル類の混合液（ｐＨ＝７．０）で洗浄し、菌体懸濁液（乾燥菌体１０重量％）を得て、実施例１と同様に２時間後及び２日後の反応活性評価を実施した。結果を下記表３に示す。
【００３４】
【表３】
2004305066.tif 000004
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、ニトリラーゼ活性を有するグラム陰性菌又はそのニトリラーゼ酵素の固定化物溶液又は懸濁液を用いてカルボン酸アンモニウムを製造するにあたり、非常に不安定なそれらのニトリラーゼ活性を長期安定的に保持する方法を提供することができる。本発明の方法によれば、８時間を越えるニトリラーゼ活性の保持時間が実現される。