(57)【要約】      （修正有）【解決手段】ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質を結合できる抗体及び断片、かかるタンパク質をコードする核酸を提供する。活性化合物を同定するためのかかるタンパク質の使用、並びに該活性化合物のワクチンとしての使用に関する情報を提供する。【効果】ＨＩＶ−１感染症の研究及び／又は治療に有用な検定法及び化合物をもたらす。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ鎖及び／又はＨ鎖からなる抗体又はその断片であって、Ｌ鎖又はＨ鎖が配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するものであるＨＩＶ由来のｇｐ１２０タンパク質を結合できる抗体又はその断片。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体の断片であって、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質を結合できる断片（但し、配列番号４、配列番号６又は配列番号８の一部分が存在する場合には、それぞれの配列のアミノ酸番号１１９由来の少なくとも１個のアミノ酸が前記抗体断片中に存在することを条件とする）。
【請求項３】
ＨＣＤＲ３ドメインのＡｒｇ９５を含有してなる請求項１又は２に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
Ｌ鎖及びＨ鎖からなる抗体又はその断片であって、Ｌ鎖が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものであり且つＨ鎖が配列番号４、配列番号６及び配列番号８の中から選択されるアミノ酸配列を有してなるものであるＨＩＶ由来のｇｐ１２０タンパク質を結合できる抗体又はその断片。
【請求項５】
Ｆ（ａｂ´）２又はＦａｂ  断片である請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項６】
核酸分子であって、
（ａ）  前記の請求項のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードする核酸分子；
（ｂ）  配列番号１に示されるヌクレオチド配列と、場合によっては配列番号３、配列番号５又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列とを有してなる核酸分子；
（ｃ）  分子の相補鎖が前記（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸分子にハイブリダイズするものである核酸分子であって、抗体をコードするか又は抗体Ｌ鎖の断片をコードし且つＨＩＶ由来のｇｐ１２０タンパク質を結合できる核酸分子；
及び
（ｄ）遺伝暗号の縮重により前記（ｃ）の配列と異なる核酸分子
の中から選択される核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片の使用であって、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質又はその断片に対する前記抗体又はその断片の結合について競合できる化合物を同定するための使用。
【請求項１０】
請求項１０に記載の方法によって同定できる化合物。
【請求項１１】
ペプチドである請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
ＨＩＶ−１のｇｐ１２０タンパク質の領域Ｉｌｅ４２０−Ｇｌｎ４２２  及び／又は領域Ｐｒｏ４３７−Ｐｒｏ４３８  の一方又は両方に対するコンフォメーショナルエピトープである請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号９    ＧＩＱＬＡＮＰＰＲＬＹＧ
配列番号１０    ＦＬＱＰＰＤＦＳＨＬＰＰ
配列番号１１    ＳＡＭＥＡＰＰ
配列番号１２    ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ
配列番号１３    ＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩ
又は配列番号１４〜４３のいずれか一つに記載の配列
の中から選択されるアミノ酸配列を有してなる請求項１１又は請求項１２に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号９及び配列番号１０に記載の配列を有してなる請求項１３に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の化合物を含有してなるワクチン。
【請求項１６】
ＨＴＶ感染症を治療するために使用する請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片あるいは請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片、あるいは請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の化合物を含有してなる生体内又は生体外でＨＴＶ感染症を研究するためのキット。
【請求項１８】
ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質の領域Ｉｌｅ４２０−Ｇｌｎ４２２  及び／又は領域Ｐｒｏ４３７−Ｐｒｏ４３８  の一方又は両方をコードするアミノ酸配列を有してなる単離ペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片、あるいは請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の化合物を使用することからなるＨＴＶのウイルス補助受容体に対する結合を阻害する方法。
【請求項２０】
予後標識としてのＡＩＤＳの進行及び／又は感染の状態を評価するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はその断片あるいは請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質を結合できる抗体及び断片、かかるタンパク質をコードする核酸、かかるタンパク質の使用であって活性化合物を同定するための使用、及び該化合物のワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ−１は、宿主においてＣＤ４＋Ｔリンパ球の減少を誘発し、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳと略記する）を引き起こす。宿主細胞内へのウイルスの侵入は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質  ｅｘｔｅｒｉｏｒ  １２０（ｇｐ１２０）及び貫膜エンベロープ糖タンパク質４１（ｇｐ４１）によって仲介される。ｇｐ１２０は、最も外側に露出したタンパク質であり、ビリオン上に三量体エンベロープタンパク質のスパイクを形成する。ＨＩＶ−１は、ウイルスＥｎｖタンパク質と、２種類の区別し得る細胞表面受容体分子であるＣＤ４及び特異的ケモカイン受容体とを必要とするプロセスにおいて、ビリオン表面Ｅｎｖタンパク質と標的細胞の間の直接融合によって侵入する〔Ｂｅｒｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９），  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｓ  ＨＴＶ−１  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｅｎｔｒｙ，  ｔｒｏｐｉｓｍ，  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７，  ６５７−７００〕。ケモカイン補助受容体に対するＨＴＶ−１株の特異性は複雑であるが、ＣＣＲ５は大部分の一次分離株によって優先的に使用され且つＴ細胞適合実験株（ＴＣＬＡと略記する）によって使用されない；ＣＸＣＲ４は実験株や幾つかの一次単離株により優先的に使用される。また、ＣＣＲ３及びＣＣＲ２ｂもＨＴＶ−１補助受容体として報告されている。
【０００３】
数種のケモカインリガンドがＨＴＶ−１感染を阻害することが報告されている。Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１株によって補助受容体として使用されるＣＸＣＲ４は、ＳＤＦ−１によってブロックされ得る。ＳＤＦ−１β遺伝子（ＳＤＦ１  ３´−Ａ対立遺伝子）変異体を有するＨＴＶ−１感染患者は、ＡＩＤＳへの進展がより遅いことに関係がある。別のＣＣＲ５ケモカインリガンド、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＭＴＰ−１α及びＭＩＰ−１βが、ＣＤ４＋細胞のマクロファージ指向性ＨＴＶ−１の感染を阻害することが明らかにされた。生体内補助受容体としてＣＣＲ５の役割は、３２ｂｐのＣＣＲ５遺伝子欠損（３２−ＣＣＲ５）についてホモ接合性（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）の個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）におけるＲ５  ＨＴＶ−１ウイルス感染に対する抵抗性によって裏付けられる。また、ＣＣＲ５プロモーター及びＣＣＲ２（ＣＣＲ２−６４Ｉ）遺伝子における対立遺伝子多形性もＡＩＤＳへの進展に影響を及ぼすことが報告されている。
【０００４】
証拠のある幾つかの系（ｌｉｎｅｓ）は、標的細胞受容体とのｇｐ１２０相互作用がＣＤ４に対する初期結合を伴うことを示唆している；これはｇｐ１２０におけるコンフォメーション変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ）を誘発し、補助受容体結合を増強する。補助受容体結合のためのｇｐ１２０領域は、抗体阻害、突然変異誘発及びＸ線結晶学によって研究されている。補助受容体結合に重要な高保存Ｅｎｖ残基は、ｇｐ１２０架橋シート（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ｓｈｅｅｔ）ミニドメインにおける２つのβ鎖上に局在化された。Ｅｎｖにおける配座変化に関連するｇｐ１２０−受容体相互作用の性質は、Ｅｎｖ機能を妨害する抗体について重要な意味合いをもつ。
【０００５】
本発明者らは、ＡＩＤＳの進行の遅延に関連したＨＩＶ−１ケモカイン遺伝子、ＬＴＮＰ  ＨＩＶ−１ウイルスの特定及びＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質に応答する一次抗体及び二次抗体の分子分析を含め、ＨＩＶ−１感染ＬＴＮＰ（１５年以上）個人について徹底的な分析を行った。ＣＣＲ５、ＣＣＲ５プロモーター、ＣＣＲ２ｂ及び３ＵＴＲ−ＳＤＦ−１βの遺伝子型割り出しは、ＡＩＤＳの進行の遅延に関連することが知られている対立遺伝子の突然変異を示さなかった。ＬＴＮＰ分離株は、ＭＴ−２細胞の感染によりＮＳＩウイルスとして分類された。ＬＴＮＰウイルスｇｐ１２０及びＮｅｆ遺伝子が分析された。ドナーから得られたｇｐ１２０  Ｃ２−Ｖ３−Ｃ３領域の多重ウイルスクローン、数種のスペインＨＩＶ−１単離株、及び対照ウイルス株の比較分析は、ドナー分離株がＢクレードに属することを示す。ウイルス表現型によれば、ｇｐ１２０  Ｖ３領域はＮＳＩ／マクロファージ指向性マーカーを表示する。未成熟停止コドン又は欠失は、ＴＮＰウイルス由来のＮｅｆ遺伝子配列には認められなかった。ｇｐ１２０に対する体液性応答は、よりいっそう大きな受容能をもつ二次ＩｇＧ応答に至るまで成熟する低親和性の多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｅ）抗体からなるＩｇＭ応答を示す。ドナーから構築したファージディスプレイライブラリーから得られたｇｐ１２０に対する高親和性の特異ＩｇＧ  Ｆａｂは、数種の参考ウイルス株、例えばＸ４  ＨＩＶ−１ウイルス及びＲ５  ＨＩＶ−１ウイルスを生体外で中和することができた。試験したＩｇＧ  Ｆａｂの一つ（Ｓ８）は、ウイルス感染モデルとしてヒトＰＢＬ−再形成ＳＣＩＤマウスを使用して、マクロファージ指向性の（Ｂａｌ）  ＨＴＶ−１ウイルスに対して生体内中和活性を示した。Ｆａｂ−ｇｐ１２０結合に競争できるペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）がランダムペプチドファージディスプレイライブラリーから選択された。ミモペプチド（ｍｉｍｏｐｅｐｔｉｄｅ）情報及びｇｐ１２０構造の分子モデル化を使用してＳ８  Ｆａｂエピトープを同定した。このモデルは、Ｆａｂエピトープが高次構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であり且つケモカイン補助受容体結合部位に関与する重要なｇｐ１２０残基を含むことを示唆している。このエピトープは大部分のＨＩＶ−１ウイルス中に保存されていることが認められた。Ｆａｂ  Ｓ８活性は、このＦａｂ中の帯電したＨＣＤＲ３残基（Ａｒｇ９５）とｇｐ１２０中のＧｌｕ３８１との相互作用に関与し、ｇｐ１２０の内外ドメイン間に著しいコンフォメーション変化を生じ得る。
【０００６】
本発明者らが提供した情報は、ＨＩＶ−１感染症の研究及び／又は治療に有用な検定法及び化合物をもたらした。
【考案の開示】
【０００７】
本発明の第一の要旨によれば、Ｌ鎖及び／又はＨ鎖からなる抗体又はその断片であって、Ｌ鎖又はＨ鎖が配列番号２、配列番号４、配列番号６又は配列番号８及び／又は図８〜１１に示されるアミノ酸配列を有するものである抗体又はその断片が提供される。
【０００８】
前記の抗体の断片は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶと略記する）のｇｐ１２０タンパク質を結合できるものであることが好ましい（但し、配列番号４、配列番号６又は配列番号８の一部分が存在する場合には、それぞれの配列の前方のアミノ酸番号１１９由来の少なくとも１個のアミノ酸が前記抗体断片中に存在することを条件とする）。
【０００９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、本発明者らによって同定された３種類の抗体、Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０のそれぞれのＬ鎖をコードする。配列番号４に示されるアミノ酸配列は抗体Ｓ８のＨ鎖をコードし、配列番号６に示されるアミノ酸配列は抗体Ｓ１９のＨ鎖をコードし且つ配列番号８に示されるアミノ酸配列は抗体Ｓ２０のＨ鎖をコードする。これらの配列もまた図８〜１１に示される。
【００１０】
本発明の抗体又は断片は、ＨＣＤＲ３ループ、すなわちＡｒｇ９５を含有するループを有するものであることが好ましい。この残基は、前記の複数の抗体とｇｐ１２０との相互作用に特に重要であることが確認されている。この残基はｇｐ１２０のＧｌｕ３８１と静電気相互作用を形成するものと思われる。ＨＣＤＲ３ループはＦａｂ  Ｓ８由来のものであることが最も好ましい。
【００１１】
従って、本発明の抗体又は断片は、ＨＣＤＲ３ループ、すなわちｇｐ１２０に結合する際にｇｐ１２０と静電気的に相互作用するＡｒｇ残基を含有するループを有していていもよい。
【００１２】
本発明の第一の要旨の抗体又はその断片は、少なくとも、配列番号６に示される配列よってコードされるＨ鎖（Ｓ１９  Ｈ鎖）の断片を含有し且つそのペプチドの残基３２を少なくとも含有するものであることが好ましい。これは、本発明者らによってｇｐ１２０結合中に含まれるとか確認されている。
【００１３】
また、本発明の抗体又はその断片は、Ｓ２０のＨ鎖（配列番号８）を含有していてもよく且つＡｒｇ３０及びＡｓｐ３１（これらはＨＣＤＲ１領域の残基であり、本発明者らによって抗原結合に含まれることが明らかにされている）を含有していてもよい。残基３０又は３１はｇｐ１２０結合を向上させるために種々のアミノ酸によって置換されたものであることが好ましい。これは体細胞突然変異によって行い得る。この変換はＳｅｒ３０及びＳｅｒ３１からＡｓｐ３０及びＡｒｇ３１への変化であることが最も好ましい。
【００１４】
前記の抗体Ｓ１９及びＳ２０の断片について好ましい置換は、Ｔｏｒａｎ  Ｊ．Ｌ．らにより文献：
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．３１  （２００１），  ｐａｇｅｓ  １２８−１３１  に詳細に示されている。
【００１５】
本発明の第二の要旨によれば、Ｌ鎖及びＨ鎖からなる抗体又はその断片であって、Ｌ鎖が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものであり且つＨ鎖が配列番号４、配列番号６及び  配列番号８の中から選択されるアミノ酸配列を有してなるものであるＨＩＶ由来のｇｐ１２０タンパク質を結合できる抗体又はその断片が提供される。
【００１６】
本発明の第一の要旨又は第二の要旨の抗体断片は、Ｆ（ａｂ´）２  、Ｆａｂ又は一本鎖（ＳｃｈＦｖ）断片であることが好ましい。
【００１７】
使用される前記の抗体断片は、Ｆａｂ  Ｓ８抗体であることがさらに好ましい。
【００１８】
抗体それ自体は当該技術では周知である。これらの抗体は、通常、いわゆる複数個のＨ鎖と複数個のＬ鎖からなる。一つのＬ鎖は、通常はジスルフィ結合によってＨ鎖に結合されている。通常は、２個のＨ鎖が、互いに１個又はそれ以上のジスルフィド結合によって結合されている。抗体は、幾つかの異なるクラスの抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＭのうちのひとつであり得る。
【００１９】
前記の抗体はヒト抗体又は断片であることが好ましい。また、前記の抗体は、ヒト以外の起源のものであってもよく、好ましくは当該技術で知られている方法を使用してヒト化されていてもよい。
【００２０】
前記の抗体又はその断片はヒトＩｇＧ抗体又はその断片であることがさらに好ましい。
【００２１】
Ｆ（ａｂ´）２抗体は、２個のＬ鎖と２個のＨ鎖からなる抗体をペプシンで消化することによって形成される。Ｆａｂ断片は、２個のＬ鎖と２個のＨ鎖からなる抗体をパパインで消化して少なくとも１個の共有結合、例えばジスルフィド結合によってＬ鎖に結合されたＨ鎖の断片からなるＦａｂ断片を２個形成することによって形成される。Ｆ（ａｂ´）２断片及びＦａｂ断片を形成する方法は、当該技術では周知である。
【００２２】
ｇｐ１２０タンパク質が誘導されるＨＩＶウイルスはＨＩＶ−１であることが好ましい。
【００２３】
ｇｐ１２０の配列は若干変化し得ることが知られている。例えば、種々の配列がＭｙｅｒｓら（１９９２年）；Ｇｕｒｇｏら（１９９８年）；及びＭｃＣｕｔｃｈａｎら（１９９２年）によって報告された文献に示されている。
【００２４】
本発明で使用するｇｐ１２０の配列は、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＢｘ２）完全ゲノム；ＨＩＶ−ｌ／ＬＡＶ（ＩＩＩＢ）〔Ｒａｔｎｅｒ，  Ｌ．らの文献（１９８５年）〕である。
【００２５】
本発明の抗体又はその断片は、少なくとも１×１０−１０ＭのＫｄ、特に９．０×１０−１０Ｍよりも大きいＫｄをもつｇｐ１２０を結合できるものであることが好ましい。この結合特異性は表面プラズモン共鳴で測定することが好ましい。
【００２６】
本発明の第三の要旨によれば、核酸分子であって、
（ａ）  本発明の抗体又は抗体断片をコードする核酸分子；
（ｂ）  配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有してなる核酸分子（該核酸分子は配列番号１に示される配列と、さらに配列番号３、配列番号５又は配列番号７に示される配列の一つ又はそれ以上とを有してなるものであることが好ましい）；
（ｃ）  分子の相補鎖が上記の（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子であって、ＨＩＶ、特にＨＩＶ−１由来のｇｐ１２０タンパク質を結合できる抗体又は抗体断片をコードする、好ましくはＨ鎖とＬ鎖の両方を有する抗体又は抗体断片をコードする核酸分子；及び
（ｄ）遺伝暗号の縮重により上記の（ｃ）の配列と異なる核酸分子
の中から選択される核酸分子が提供される。
【００２７】
アミノ酸は、ある一定の配列のヌクレオチド３個のトリプレット、いわゆるコドンによってコードされる。大部分のアミノ酸については、２個以上のコドンが存在する。これは“縮重”と呼ばれる。従って、１個又はそれ以上のトリプレットがその他のトリプレットに置き換えられていてもよいが、前記の核酸分子は同じペプチドをまだコードしていてもよい。
【００２８】
配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号７の配列に対して９０％を越える相同性をもつヌクレオチド配列、好ましくは９２％、９４％、９５％、９６％、９８％又は９９％の相同性をもつヌクレオチド配列を有する核酸分子もまた、本発明によって提供される。また、かかる核酸分子によってコードされる抗体の断片も本発明によって提供される。前記の抗体及び断片は、ＨＩＶ、最も好ましくはＨＩＶ−１由来のｇｐ１２０タンパク質を結合できるものであることが好ましい。
【００２９】
また、Ｌ鎖、Ｓ８  Ｈ鎖、Ｓ１９  Ｈ鎖及びＳ２０  Ｈ鎖の核酸配列を図８〜１１に示す。
【００３０】
前記の核酸配列はワクチンに使用してもよい。
【００３１】
また、本発明の核酸分子を含有するベクター及び宿主細胞も提供される。適当なベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、１個又はそれ以上の調節配列、例えばプロモーター、本発明の核酸分子をタンパク質として発現できる終結及び分泌シグナル配列を含有することが好ましい。ベクターはレトロウイルスベクターであることが好ましく、該ベクターは核酸を細胞又は患者に感染させるのに使用し得る。かかるレトロウイルスベクターは、遺伝子治療用途に使用してもよい。アデノウイルスベクターが特に好ましい。
【００３２】
適当な宿主細胞としては、当該技術において知られている細胞、例えば真核細胞、例えば哺乳動物細胞、酵母細胞及び原核細胞例えば大腸菌が挙げられる。
【００３３】
前記の核酸分子はＤＮＡ又はＲＮＡであることが好ましく、天然産ヌクレオチド、例えば塩基としてアデニン、グアニン、チミン、シトシン又はウラシルを含有する天然産ヌクレオチドを含有するものであることが好ましい。また、非天然産ヌクレオチド、例えば当該技術において知られている種類の非天然産ヌクレオチドも使用し得る。
【００３４】
本発明の抗体又は抗体断片は、抗体又はその断片のＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質又はその断片に対する結合について競争できる化合物を同定するのに使用し得る。ｇｐ１２０タンパク質はＨＩＶ−１由来のものであることが好ましい。ｇｐ１２０タンパク質の断片は、Ｉｌｅ４２０−Ｇｌｎ４２２及び／又はＰｒｏ４３７−Ｐｒｏ４３８．の一方又は両方を含有するタンパク質の一部分を含有していてもよい。前記の化合物は、ペプチド又はペプトイドであることが好ましい。特に、該化合物はミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）であってもよい。
【００３５】
ミモトープは、エピトープをミミックするペプチドであることが好ましい。ミモトープは、その元のエピトープのアミノ酸配列との類似性をもたないアミノ酸配列を有していてもよい。特に、ミモトープは、ランダムペプチドアレイを選別することによって同定し得る。
【００３６】
本明細書では、ペプチドとは、アミノ酸４０個又は３５未満、好ましくは３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、特に１３個未満の長さをもつアミノ酸（これは天然産又は非天然産のアミノ酸であり得る）の配列を意味する。
【００３７】
アミノ酸はペプチド及びタンパク質を構成する基本成分である。アミノ酸は、アミノ基（−ＮＨ２）とカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）の両方を持つ。必ずしも全部ではないが、多数のアミノ酸は、構造式  ＮＨ２−ＣＨＲ−ＣＯＯＨ（式中、Ｒは水素原子であるか又は種々の官能基である）を有する。２０種類のアミノ酸は天然に遺伝学的にコードされるが、非天然産アミノ酸、例えば当該技術において知られているアミノ酸を使用してもよい。
【００３８】
ペプチドはペプチジル（−ＮＨＣＯ−）結合によって一緒に結合された複数個のアミノ酸残基からなる。
【００３９】
これらのアミノ酸残基は、本発明の核酸分子の発現によって製造してもよいし又は化学合成によって人工的に製造してもよい。
【００４０】
ペプトイドは、ペプチド結合の１個又はそれ以上がプソイドペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）結合、例えば：
カルバ  Ψ（ＣＨ２−ＣＨ２）
デプシ  Ψ（ＣＯ−Ｏ）
ヒドロキシメチレン  Ψ（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）
ケトメチレン  Ψ（ＣＨ−ＣＨ２）
メチレン−オキシ  ＣＨ２−Ｏ−
還元ＣＨ２−ＮＨ
チオメチレン  ＣＨ２−Ｓ−
チオペプチド  ＣＳ−ＮＨ
Ｎ−修飾  −ＮＲＣＯ−
で置換されているペプチド類縁体である。
【００４１】
エピトープとは、本明細書では前記の抗体又はその断片を結合することができる免疫学的に活性な領域又は免疫原を意味する。免疫原は、ＨＩＶ、特にＨＩＶ−１由来のｇｐ１２０であるか又はかかるタンパク質の断片であることが好ましい。
【００４２】
好ましくは、ランダムファージディスプレイライブラリー又はその他のかかる組み合わせライブラリーとは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質又は該タンパク質の断片に対する抗体又はその断片の結合について競争できる化合物を同定するのに使用してもよい。
【００４３】
本発明者らは、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質に対する抗体又はその断片の結合について競争できる多数のペプチド配列を見出した。
【００４４】
本発明はまた、前記の方法によって同定できる化合物も包含する。前記の化合物は、ペプチド又はペプトイドであることが好ましい。前記ペプチドは、特に、ｇｐ１２０タンパク質のＩｌｅ４２０−Ｇｌｎ４２２及び／又はＰｒｏ４３７−Ｐｒｏ４３８の一方又は両方の領域に対してコンフォメーショナル（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）なエピトープであってもよい。該ペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３の中から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１４〜４３のいずれか一つに示される配列、又は表１に示される配列を含有し得る。
【００４５】
前記ペプチドは、配列番号９と配列番号１０の両方に示されるようなアミノ酸配列を含有し得るものであることがさらに好ましい。
【００４６】
前記ペプチドをコードする核酸分子もまた本発明によって提供される。
【００４７】
前記の化合物、例えば  ペプチド又はペプトイドは、ワクチンを製造するのに使用し得る。また、前記ペプチドをコードする核酸、例えばＤＮＡもワクチンとして使用し得る。これらの後者のワクチンは、“ＤＮＡワクチン”という一般用語で通常的に知られている。また、前記の核酸はベクター、例えばレトロウイルスベクターの中に存在していてもよい。
【００４８】
前記の化合物は、１種又はそれ以上の補助剤、例えばウシ血清アルブミン、硫酸アルミニウムカリウム、フロイント不完全アジュバント又はフロイント完全アジュバントと混合されることが好ましい。
【００４９】
前記のワクチンは、典型的には０．０１〜５０  ｍｇ／ｋｇ、特に０．１〜５  ｍｇ／ｋｇの用量で投与し得る。前記ワクチンは当該技術において知られている方法で、例えば静脈内に、皮内に、皮下に、筋肉内に又は腹腔内に投与し得る。
【００５０】
本発明はまた、その範囲内に、本発明の抗体又は断片あるいは本発明の化合物の使用であってＨＩＶ感染症、特にＨＩＶ−１感染症を予防又は治療するための使用を包含する。また、本発明は、ＨＩＶ感染症、特にＨＩＶ−１感染症の治療用の本発明の抗体又はその断片あるいは本発明の化合物も包含する。
【００５１】
本発明の抗体又は断片あるいは本発明の化合物は、例えば蛍光化合物、放射性ヌクレオチド、コロイド状金属、生物発光化合物及び／又は酵素で標識されていてもよい。かかる標識は、当該技術において周知である。この場合に、本発明の抗体又は断片あるいは化合物は、これらのｇｐ１２０に対する結合能によって又はｇｐ１２０タンパク質に対する抗体の結合を阻害する能力により、生体内又は生体外でＨＩＶ感染症を研究するために使用し得る。
【００５２】
本発明の抗体、断片又は化合物はまた、ウイルス補助受容体に対するＨＩＶの結合を阻害するのにも使用し得る。本発明者らは、本発明の抗体がＨＴＶのｇｐ１２０タンパク質のＩｌｅ４２０−Ｇｌｎ４２２及び／又はＰｒｏ４３７−Ｐｒｏ４３８と相互作用することを認めた。これは、Ｃ．  ＲｉｚｚｕｔｏとＪ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ（２０００年）によって、結合に重要である領域内に存在するものとして認められている。
【００５３】
本発明の別の態様において、本発明の抗体、断片又は化合物は、予後診断マーカーとしてＡＩＤＳの進行及び／又は感染の状態を評価するのに使用し得る。
【００５４】
本発明のさらに別の要旨によれば、本発明の抗体又は断片、あるいは化合物を含有してなるＨＩＶ感染症、特にＨＩＶ−１感染症の生体内及び／又は生体外研究用のキットが提供される。
【００５５】
前記の抗体、断片又は化合物は、前記のようにして標識されていてもよい。
【００５６】
本発明のさらに別の要旨によれば、本発明の抗体、断片又は化合物を使用することからなる補助受容体に対するＨＩＶの結合の阻害を研究するためのキットが提供される。ＨＩＶはＨＩＶ−１であることが好ましい。阻害される相互作用は、ｇｐ１２０とＣＣＲ５との間の相互作用であることが好ましい。
【００５７】
本発明を、下記の図面を参照して実施例により説明する。
【００５８】
図１は、ＬＴＮＰドナーから単離されたＨＩＶ−１ウイルスのｇｐ１２０、Ｎｅｆ及び系統発生的分類の推定アミノ酸配列を表す。
図のＡは、ＬＴＮＰドナーから単離されたＨＩＶ−１ウイルスの推定されるアミノ酸配列のアラインメントを表す。
図のＢは、ＨＢＸ２ウイルス参考株に従って番号を付したｇｐ１２０アミノ酸配列を表す。ＮＳＩマクロファージ指向性表現型についてのＶ３アミノ酸は矢印で示した。
図のＣは、ＬＴＮＰドナーＨＩＶ−１ウイルス由来の推定Ｎｅｆアミノ酸配列を表す。図のＣのＮｅｆ配列は、１９９８年及び２０００年に採取したドナー試料からのプロウイルス（ＪＭＭ９８及びＪＭＭ００）から得た。その配置は、ミリストイル化シグナル用の予測されるモチーフ、可変領域多形性配列、酸性帯電領域、（ＰｘｘＰ）反復配列、推定リン酸化部位（ＰＫＣ）、ポリプリントラック（ＰＰＴ）、３´ＵＴＲの５´境界、βターン（ＧＰＧ）、及びＥｘｘｘＬＬ（ＣＤ４−Ｎｅｆ−介在エンドサイトーシス用）について示す。ＬＴＮＰドナーからのウイルス単離株の系統発生分類。ＬＴＮＰウイルス配列のＣ２−Ｖ３−Ｃ３領域を、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｇ法を使用して、７３個のスペイン単離株と、数個のＨＩＶ−１サブタイプ由来の参考配列と比較した。複数の参考Ｂ株（ＬＡＩ、ＭＮ、ＳＦ−２、ＳＦ−１６２及びＲＦ）は標識した。
【００５９】
図２は、ＬＴＮＰドナー血清及び抗ｇｐ１２０  Ｆａｂの結合特性を示すグラフを表す。
図のＡは、ＥＬＩＳＡ法で試験した組換え体ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ、ｐ２４、ＢＳＡ及びｄｓＤＮＡに対するＬＴＮＰドナー血清ＩｇＧ（図のＡの左側のグラフ）及びＩｇＭ（図のＡの右側のグラフ）の結合特性を表すグラフである。図のＢは、ドナーから誘導された多反応性のＩｇＭ  Ｆａｂ（Ｍ０２５）並びに高親和性のＩｇＧ  Ｆａｂｓ  Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０のｇｐ１２０及びＢＳＡ結合を表すグラフである。図のＣは、多反応性及び特異性の複数の抗ｇｐ１２０  Ｆａｂ同士の間のＬ鎖シャフリングを表す；ＩｇＭ  Ｍ０２５、ＩｇＭ  Ｓ８又はＳ２０由来のＨ鎖及びＬ鎖、並びに破傷風トキソイド（毒性を失い免疫原性をもつ毒素）（Ｔｅｔ）に対する無関係Ｆａｂを一緒にして、得られたＦａｂ  ＨＣ／ＬＣ  対をｇｐ１２０及びＢＳＡに対する結合についてＥＬＩＳＡ法で試験した。図のＤは、ドナー血清とＦａｂ  Ｓ８との間の抗原に対する結合競争を表すグラフである；ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ（２μｇ／ｍｌ）に対するＦａｂ  Ｓ８  （０．０５μｇ／ｍｌ）の結合を、対照としてドナー血清全部又はヒトＨＩＶ−１−血清陰性血清の希釈液の存在下にＥＬＩＳＡ法で試験した；  Ｆａｂ  Ｓ８結合はＰＯ−複合抗ヒスチジン抗体を使用して進展させた。図のＥは、ドナー血清（１／２００）を、Ｆａｂ  Ｓ８  （０．０１〜３０μｇ／ｍｌ）又は無関係Ｆａｂ  Ｐ１の存在下でｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ  結合について試験したグラフである。ＩｇＧ血清結合はＰＯ−複合抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを使用して進展させた。
【００６０】
図３はヒトＦａｂによるＨＩＶ−１の中和を表す。
図のＡは、ＭＴ−４細胞においてプラーク検定法（ＮＰＡ）によって決定されたＩｇＭ  Ｆａｂ  Ｍ０２及びＭ０２５  並びにＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０によるＨＩＶ−１  ＭＮ株の中和を表す。図のＢは、ＭＴ−２細胞における感染力低下検定法（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＥＲＡと略記する）を使用したＦａｂ  Ｓ８によるＴ細胞適合株、ＬＡＩ、ＭＮ、ＲＦ及びＳＦ−２の中和を表すグラフである。図のＣ及びＤは、Ｘ４  （ＮＬ４−３）（グラフＣ）及びＲ５  ＨＩＶ−１株（Ｂａｌ）（グラフＤ）によるＰＢＭＣ感染後にｐ２４の定量によって測定されたＦａｂ  Ｓ８の中和能を表すグラフである。図のＥは、ヒトＰＢＭＣ再構成ＳＣＩＤマウスにおけるＲ５  （Ｂａｌ）  ＨＩＶ−１感染のＦａｂ  Ｓ８  生体内中和活性を表す。ＨＩＶ−１感染に感受性のヒト成人のＰＢＭＣを移植したＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ−ＰＢＭＣ）を、１００  ＴＣＩＤ５０を含有する細胞フリーのＨＩＶ−１  Ｂａｌストックをもちいて再構成した２週間後に感染させた。マウスに、精製Ｆａｂ  Ｓ８（３００μｇ／マウス；処理群）又は  ＰＢＳ単独（未処理群）をｉ．ｐ．注射した。腹膜細胞を１５日後に回収し、ＨＩＶ−１血清陰性の個体から得られたＰＨＡ活性化ＰＢＭＣと一緒に培養した。同時培養物をＥＬＩＳＡ法で７日目（左図）及び１４日目（右図）に上清中のＨＩＶ−１コア抗原について追跡し、ｐ２４が＞３０ｎｇ／ｍｌである場合に陽性であるとみなした。
【００６１】
図４はｓＣＤ４の存在下でのＳ８  Ｆａｂのｇｐ１２０結合を表す。
精製Ｆａｂ  Ｓ８の数種の希釈物を、ｇｐ１２０  ＩＩＩｌ−Ｂ  （２μｇ／ｍｌ）単独に対する結合について又は４倍モル過剰量のｓＣＤ４を用いてプレインキュベートしてあるｇｐ１２０  ＩＩＩｌ−Ｂ  に対する結合についてＥＬＩＳＡ法で試験した。Ｆａｂ  Ｓ２０を使用して同様の結果が得られた。
【００６２】
図５はｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８結合のミモペプチドによる阻害を表す。
ｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８の結合を、ペプチドライブラリーパニング由来のペプチド、１２Ｒ１（Ａ）、１２Ｒ４（Ｂ）、１２Ｒ９（Ｄ）、無関係ペプチド（Ｃ）、及びｇｐ１２０のアミノ酸配列４２８−４３９に相当するＨＩＶ−１ペプチド（Ｅ）の存在下にＥＬＩＳＡ法で試験した。
【００６３】
図６はＦａｂ  Ｓ８及びＳ２０  ＨＣＤＲ３変異体によるｇｐ１２０の結合を表す。
Ｆａｂ  Ｓ８（グラフＡ）及びＳ２０（グラフＢ）ＨＣＤＲ３由来のＡｒｇ９５を、１文字コードで示されるアミノ酸で置換した。次いで、これらのＦａｂ変異体、未変異体  及び関連する多重反応性Ｆａｂ  Ｍ０２５によるｇｐ１２０及びＢＳＡに対する結合をＥＬＩＳＡ法で試験した。
【００６４】
図７はＦａｂ  Ｓ８  ｇｐ１２０エピトープの分子モデルを表す。
図７Ａにおいて、上の図はＫｗｏｎｇらによって提案されたｇｐ１２０三量体モデル再生の再構築を表す；結合されたＣＤ４は金色で示される。ｇｐ１２０表面はドメインによって着色される；内側ドメインは黄色（アミノ酸９０−１１７、２０８−２５５、４７４−４９２）、架橋シートドメインは紫色（アミノ酸１１８−２０７、４２２−４３９）及び外側ドメインは赤色（アミノ酸２５６−３９６、４１０−４２１、４４０−４７３）で着色される。白い球は、ｇｐ１２０の残基２９９のＣ−αに対応し且つｇｐ１２０コア構造においてみつからないＶ３ループの可視化を促進する。下の図は、提案されたＦａｂ  Ｓ８  コンフォメーショナルエピトープを球及び棒（Ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋ）で示したものである。この領域は、ファージディスプレイライブラリーから誘導される線状ペプチドミモトープの配列を模したものである；この領域は、大部分のｇｐ１２０  配列によく保存されている。この図はまた、Ｇｌｕ３８１とＬｙｓ２０７の間の塩類（ｓａｌｉｎｅ）架橋を表し、ドメイン間の関係において重要な役割が示唆されている。また、Ｆａｂ  １７ｂと強い結合を形成するＡｒｇ４１９もまた示される。Ｆａｂ  Ｓ８コンフォメーショナルエピトープの位置は、ＣＤ４ｉエピトープの一部分を形成する少なくとも２個の残基（Ａｒｇ４１９とＧｌｎ４２２）と重なる；それはｇｐ１２０  ＣＤ４結合部位とは明らかに異なり、しかもまた十分に特定されたＶ３領域とも異なる。
【００６５】
図８はＳ８、Ｓ１９及びＳ２０のＬ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【００６６】
図９はＳ８のＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【００６７】
図１０はＳ１９のＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【００６８】
図１１はＳ２０のＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【実施例】
【００６９】
材料及び方法
長期無症候性ＨＩＶ−１血清陽性ドナー
患者ＪＭＭからＨＩＶ−１血清陽性を１９８５年に検出した。この患者は、これまでに抗レトロウイルス剤を用いて治療を受けておらず、最近の２年間にわたってＣＤ４＋絶対数  ＞８００〜９５０／ｍｍ３と、ＰＢＭＣにおいて定期的に測定される低ウイルス量〔ウイルス量（ｂＤＮＡ  ３．０  Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ）ＲＮＡウイルスコピー／ｍｌ〕：１９９９年５月に４３６７  ｃ／ｍｌ；  １９９９年１０月に６９３６  ｃ／ｍｌ；２０００年３月に５３２６  ｃ／ｍｌ及び２００１年３月に７２０５  ｃ／ｍｌとを有して無症候状態を維持していた（１５年以上）。
【００７０】
ＬＴＮＰ  ＨＩＶ−１ドナーの対立遺伝子の遺伝子型分析
ＪＭＭドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣと略記する）からＥａｓｙ  ＤＮＡ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。上流及び下流オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、第二の細胞外領域に対応するＣＣＲ５遺伝子を増幅した；前記のオリゴヌクレオチドプライマーの配列は次の通りであった：
５´−プライマー：  ＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＴＧ；
３´−プライマー：  ＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣ
このプライマーの組み合わせを用いると、野生型ＣＣＲ５の対立遺伝子は２４５ｂｐのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片を生じ、これに対して欠失対立遺伝子は２１３ｂｐの断片を生じる。それぞれのＰＣＲ反応（１００ｍｌ）について、ゲノムＤＮＡ（１μｇ）を９５℃で５分間変性し、ＰＣＲ（９４℃で４５秒；５５℃で４５秒；７２℃で４５秒）を５サイクル行い、次いでさらにＰＣＲ（９４℃で４５秒；  ６３℃で４５秒；７２℃で３０秒）を３５サイクル行うことにより増幅した。反応生成物（２５μｌ）を、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ  ＧＴＧ  アガロースゲルを用いて分離し、ＤＮＡバンドを臭化エチジウムで染色した。ＣＣＲ５  ＰＣＲ断片をｐＣＲ  ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）中でクローン化し、幾つかのクローンを自動配列決定した。
【００７１】
ＣＣＲ５プロモーター領域（ヌクレオチド  ５９０１３〜５９７３２；  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｅ．  Ｎｏ．  Ｕ９５２６）を、ゲノムＤＮＡドナーから、プライマーＬＫ８４及びＬＫ８７を使用して後記の参考文献（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）に記載のようにしてＰＣＲにより増幅した。１〜３２７ｂｐの領域に対応するＣＣＲ２ｂ遺伝子を、後記の参考文献（Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）に記載のようにしてプライマー  ＣＣＲ２  Ｆ３（５´−ＡＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＴＣ−３´）及び
ＣＣＲ２  Ｒ３（５´−ＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＡＴＴＴＧ−３´）
を使用してＰＣＲにより増幅した。ＳＤＦ−ｌｐ  遺伝子由来の３´ＵＴＲ断片（ヌクレオチド３５７〜１０８０）を、プライマー：
５−Ｓｄｆ  ＴＧＡＧＡＧＧＧＴＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＡＧＧ  及び
３−Ｓｄｆ  ＡＧＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＣ
を使用してＰＣＲにより増幅した。二つの遺伝子から得られたＰＣＲ断片生成物をｐＣＲ  ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にサブクローン化し、自動配列決定し、次いでＧｅｎＢａｎｋで比較した。
【００７２】
シンシチウム誘導性（ＳＩ）表現型及びＮＳＩ表現型を決定するためのＭＴ−２検定
シンシチウム誘導性（ＳＩと略記する）表現型又はＮＳＩ表現型は、既に後記の参考文献（Ｋｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）に記載されているようにＭＴ−２細胞を感染させルことによって定義された。シンシチウムは、正常細胞３個の直径よりも大きい直径をもつ生き残っている大きい多核細として定義される。ＪＭＭ由来のウイルスを血清陰性ドナー由来のＰＢＭＣ及びｔｉｔｕｌａｔｅ上で増殖させた。ＪＭＭ単離株  １．３×１０３  ＴＣＩＤ５０  （５０％組織培養感染用量）を、ＭＴ−２細胞（１０×ｌＯ６個／ｍｌ）と混合し且つＭＴ−２培地（ＩＬ２なしのＲＰＭＩ）中で、３７℃で２時間混合した。細胞を円心分離（１５０００ｒｐｍで１０分）後に回収し、ＭＴ−２培地を１０ｍｌになるまで加えた。毎週、細胞を取り出し、ＭＴ−２細胞５×ｌ０６個と交換した。培養物をシンシチウムの有無について調べ、７日目、１４日目及び３０日目に上清からｐ２４を評価した。ＪＭＭ培養物はｐ２４及びＳＩ表現型について陰性であることが認められた。
【００７３】
ＬＴＮＰドナーウイルスからのＨＩＶ−１  ｇｐ１２０  ｅｎｖ及びＮｅｆ配列の分析
ドナーＪＭＭ由来のｇｐ１２０  ｅｎｖ遺伝子を、フィコール円心分離により分離したＰＢＭＣのプロウイルスＤＮＡから誘導した。得られた試料をネステッドＰＣＲにより増幅した。最初のＰＣＲ反応ではプライマー  １２８ＥＵ（５´−ＴＴＡＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧ−３´）及び
１２９ＥＤ（５´−ＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡ−３´）を使用し、次のＰＣＲではプライマー  ９９ＥＵ（５´−ＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣ−３´）及び
９６ＥＤ（５´−ＣＧＣＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴ−３´）を使用した。これらのＰＣＲは、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％ゼラチン、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各プライマー１００ｎｇ及び２．５ＵのＡｍｐｌｉ−Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ製、米国コネティカット州ノーウォーク所在）を有するｐＨ８．３の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で、最終容量５０ｍｌで行った。増幅条件は、９４℃、５分を１サイクル、９４℃、１分を３５サイクル、５５℃（最初のＰＣＲ）又は５８℃  （ネステッドＰＣＲ）、１分、及び第二の反応では７２℃、２分、次いで最終インキュベートが７２℃で１０分間であった。ＰＣＲ生成物をＴＡクローニングベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）でクローン化し、８個のクローンを自動配列決定した。ＪＭＭ  Ｃ２−Ｖ３−Ｃ３領域を、後記の参考文献（Ｃａｓａｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００ａ）に記載のようにして、ネステッドＰＣＲで増幅した数個のスペイン試料から得られたｅｎｖ遺伝子のＣ２−Ｖ３−Ｃ３断片の配列と比較した。
【００７４】
ヌクレオチドデータ分析に関して、サブタイプＡ〜Ｈからの参考株は、ロスアラモスデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎ．ｇｏｖ）からダウンロードした。ヌクレオチド配列は、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）を使用してスペイン試料（Ｃａｓａｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００ａ）及びＪＭＭ試料とアラインメントし、手動で編集した。ＤＮＡ距離マトリックスを、木村の二要素モデルを用いて計算し、それを使用してＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｇ法（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  １９９３）により系統発生樹を組み立てた。系統樹のロバスト性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を、１０００個のレプリカに関するブートストラップ（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ）分析により評価した（Ｋｕｍａｒ，  １９９３）；Ｔｒｅｅ  Ｖｉｅｗ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．５  （Ｐａｇｅ，  １９９６）  を使用して系統発生樹を編集した。ＪＭＭ  Ｎｅｆ遺伝子を、１９９８年及び２０００年に採取したドナー試料から得られたプロウイルス  ＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの最初のラウンドは、プライマー：
ｐ２１１  ５´−ＴＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＴＡＧＣＴｒＧＣＴＣ−３´  及び
ｐｌ６３  ５´−ＣＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＧ  ＴＴＡＣＣＡＧＡＧ−３´
を使用して行い、次いで第二の反応はプライマー：
ｎｅｆ−２０５  ５´−ＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧ  ＧＧＧＡＣＡＧＡＴＡＧ−３´  及び
ｎｅｆ−２１６  ５´−ＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴ−３´
を使用して行った。増幅条件は、１サイクル（９４℃、５分；  ５５℃、３０秒；  ７２℃、１分）  及び３５サイクル（９４℃、３０秒；  ５５℃、１分；  ７２℃、１分）、次いで最終インキュベーション（７２℃、１０分）であった。ＰＣＲ生成物は自動配列決定した。
【００７５】
ＨＩＶ−１ドナー血清及びモノクロナール抗体
ＬＴＮＰドナーＪＭＭから得られた血清をＰＢＳ中に希釈し、ＥＬＩＳＡ法でｇｐ１２０、ｐ２４、及びその他の抗原に対する特異性について試験した。ウエルを  ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ（２μｇ／ｍｌ）、ｇｐ４１（２μｇ／ｍｌ）、ｐ２４（２  μｇ／ｍｌ）、３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ製）、ｓｓＤＮＡ（４μｇ／ｍｌ）、ＯＶＡ（２μｇ／ｍｌ）又はｈＧＨ（ヒト成長ホルモン、２μｇ／ｍｌ）で被覆し、洗浄し、ブロックした。ドナー血清希釈物を抗原と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ（ＰＯ）複合化マウス抗ヒトＩｇＭ及びＩｇＧ１  ｍＡｂ〔Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ製（米国カリフォルニア州サン＝ディエゴ所在）〕を使用して展開した（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）。抗ｇｐ１２０  ヒトＦａｂ  Ｓ１９、Ｓ８及びＳ２０  並びにＩｇＭ  Ｆａｂ  Ｍ０２及びＭ０２５を、既に報告されている（Ｔｏｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）ようにして、ドナーＪＭＭ  ＰＢＭＣから組み立てたイソタイプＩｇＧ１Ｇｌ，  ｋ  及びＶＨ３ＩｇＭ，  ｋ抗体ファージディスプレイライブラリーから得た。大部分の実験については、ＦａｂはＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー〔Ｑｕｉａｇｅｎ製（ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ所在）〕で精製した。
【００７６】
ドナー血清によるｇｐ１２０に対するＳ８の結合阻害については、ウエルをｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ（２μｇ／ｍｌ）で被覆し、精製Ｓ８  Ｆａｂ  （０．０５  ｐｇ／ｍｌ）  をドナー血清の数種の希釈物の存在下で加えた。ウエルを洗浄し、ｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８結合をＰＯ複合化抗ヒスチジン抗体及びＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ製）を使用して発展させ、次いでＯＤ４９２  ｎｍで読み取った。Ｆａｂ  Ｓ８によるｇｐ１２０に対するドナー血清結合の阻害については、ウエルを上記のｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂで被覆した。ドナー血清（１／２００）を、Ｆａｂ  Ｓ８  （０．０１〜３０μｇ／ｍｌ）又は無関係Ｆａｂ  Ｐ１の存在下で加え、次いでＩｇＭ結合をＰＯ−複合化抗ヒトＩｇＭ  Ｆｃ及びＯＰＤ  （Ｓｉｇｍａ製）を用いて発展させた。
【００７７】
表面プラズモン共鳴による抗ｇｐ１２０  Ｆａｂの動力学的パラメーターの測定
ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂに対するＦａｂの動力学的結合定数を、バイオセンサー〔ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ製（スウェーデン国Ｕｐｐｓａｌａ所在）〕を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。リガンド固定化及び結合分析を前記のようにして行った。簡単に言えば、ｇｐ１２０（１０〜３０μｇ／ｍｌ  １０ｍＭ酢酸ナトリウム）をＣＭ５センサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）上に、製造業者が推奨するようにしてアミノ基を介して固定化した。固定化及び相互作用の実験は全て、操作緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＢＩＡｃｏｒｅ界面活性剤  Ｐ２０、ｐＨ７．４）としてＨＢＳを一定流量５μｌ／ｍｉｎ（解離相については２０μｌ／ｍｉｎ）で使用して行った。次いで、１００ｍＭリン酸を使用して結合表面を再生させた。動力学的分析は、精製ＦａｂをＨＢＳ中１〜１３５ｎＭの濃度で、２５℃で行った。動力学的速度定数（Ｋｏｎ及びＫｏｆｆ）及び見かけ平衡親和性定数（Ｋａ＝Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆ及びＫｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）を、ソフトウエアＢＩＡｌｏｇｕｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ製）を使用して測定した。陰性対照として、抗破傷風トキソイドＦａｂを使用した。
【００７８】
Ｆａｂ及びＦａｂのＨ鎖  ＣＤＲ３変異体のＬ鎖シャフリング
ＩｇＭ  Ｆａｂ  Ｍ０２５、ＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８又はＳ２０、あるいは無関係の（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）Ｆａｂ  （Ｔｅｔ）由来のＭ０２５、Ｓ２０及びＳ８Ｈ鎖及びＬ鎖から得られるＬＣ及びＨＣ断片をＰＣＲ増幅し、次いでＨ  Ｐｃｏｍｂ３ベクター中にクローン化した。得られたＨＣ／ＬＣの対それぞれからの可溶性Ｆａｂを、前記のようにしてＥＬＩＳＡ法でｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ及びＢＳＡに対する結合について試験した。残基９５を、Ｆａｂ  Ｓ８及びＳ２０並びにＭ０２５のＨ鎖  ＨＣＤＲ３変異体において直接ＰＣＲ突然変異誘発によって置換した。それぞれの変異体由来の可溶性Ｆａｂを、ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ及びＢＳＡに対する結合について前記のようにしてＥＬＩＳＡ法で試験した。
【００７９】
ＨＩＶ−１  Ｆａｂの中和
中和プラーク検定法（ＮＰＡと略記する）を、ＭＴ−４細胞（Ｈａｒａｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）において若干の部分改変した方法（Ｓａｎｃｈｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）を用いて確立した。６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，  ＣＡ）をポリ−Ｌ−リシン（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ製）１ｍｌを用いて室温で６０分間インキュベートし、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳと略記する、ｐＨ７）中で３回洗浄した。ＭＴ−４細胞（４×１Ｏ６個／ウエル）を加え、２時間インキュベートし、その後に未結合細胞を除去した。１００プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルス及び種々の濃度の５種類の精製Ｆａｂ（Ｓ２０、Ｓ１９、Ｓ８、Ｍ０２及びＭ０２５）を用いて中和を行った。得られたウイルス−抗体の混合物をインキュベートし（３７℃、３時間）、前記プレートに徐々に加え、吸着させ（３７℃、９０分）、その後にウイルスを除去し、次いで２ｍｌのアガロース培地（完全ＲＰＭＩ３培地中０．２％のＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース）を加えた。プレートをインキュベートし（３７℃、５％ＣＯ２雰囲気）、３日目に２ｍｌのアガロース培地を加えた。プラークの生成を７日目に裸眼で数えた。中和力価は、次の式：
中和（％）＝（１−ｐ／ｎ）×１００
（式中、ｐは対応するＦａｂの存在下で産生されたウイルスの量であり、ｎはＦａｂなしで産生されたウイルスの平均量であり、培養物中のプラーク数によって測定される）
に従って算出した。
【００８０】
中和実験には、下記のウイルス：ＨＩＶ１  ＭＮ、ＨＩＶ−１  ＲＦ、ＨＩＶ−１  ＳＦ−２、ＨＩＶ−１  Ｎ１４−３  及びＨＩＶ−１  Ｂａ−Ｌを使用した。
【００８１】
感染力低下検定（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＩＲＡと略記する）をＭＴ−２細胞を使用して行った。ＬＡＩ、ＳＦ−２、ＭＮ及びＲＦ株のウイルス力価は、ＭＴ−２細胞において測定し、Ｓｐｅａｍｉａｎ−Ｋａｒｂｅｒ式により算出されるＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染用量）として表した。１０倍ウイルス希釈物５種類を種々の濃度のＦａｂ  Ｓ２０、Ｓ１９、Ｓ８、Ｍ０２  及び  Ｍ０２５と混合し、インキュベートし（３７℃、１時間５％ＣＯ２）、次いでＭＴ−２細胞１０５個／ウエルを入れた９６ウエルマイクロタイタープレートに加えた。４日後に新しい培地（１００μｌ）を加えた。７日目に巨大多核細胞の出現を特徴とする細胞変性効果（ＣＰＥと略記する）を定量した。各希釈物についてそれぞれの６個の複製ウエルを調製した。中和は、次の式：
中和（％）＝（１−ｐ／ｎ）×１００
（式中、ｐは対応する混合物を用いてインキュベートした培養物中で産生されたウイルスのＴＣＩＤ５０／ｍｌの平均力価であり且つｎはＦａｂなしでインキュベートした培養物中で産生されたウイルスの平均力価である）
により算出した。それぞれの力価得点は２つの個々の実験の平均である。
【００８２】
１９９６年に患者から得たＰＢＭＣを、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡと略記する）を用いて３日間刺激してあるＨＩＶ−１血清陰性のＰＢＭＣと同時培養した。同時培養物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２と略記する）を用いた培地中で少なくとも４０日間（３７℃、５ＣＯ２）保持した。毎週毎に新しいＰＢＭＣを加え、ｐ２４抗原産生物を７日間連日監視した。上清を収集し、刺激されたＰＢＭＣについてＴＣＩＤ５０％  により特定した。同時培養物（１．３×１０３  ＴＣｌＤ５０％）から得た上清（１ｍｌ）を１０×１０６個のＰＢＭＣに摂取した。細胞をインキュベーション（１時間、３７℃）後に円心分離し、ＥＬ−２を有するＲＰＭＩ  １０ｍｌを加えた。ウイルスを培養し、収集した。この一次継代ウイルス株を使用してＰＢＭＣにおいてＩＲＡを行った。４種類の４倍ウイルス保存希釈物を数種類の濃度のＦａｂ  Ｓ８と共にインキュベートし（１時間、３７℃）、２×１０５個のＰＢＭＣに加えた。ＩＬ−２を有する培地を１週間に２回交換した。１４時間後に、ｐ２４検定を行い、ＴＣｌＤ５０％を算出した。中和力価を前記の式に従って算出した。
【００８３】
ＨＩＶ−１ウイルスＢａｌ及びＮＬ４−３のＦａｂ  Ｓ８中和については、未感染ドナーから得られたＰＢＭＣをＰＨＡを用いて活性化し（１０ｎｇ／ｍｌ、４８時間、３７℃、５％Ｃ０２）；洗浄後に、細胞を、Ｂａｌ又はＮＬ４−３ウイルス保存株（１検定当たり２ｎｇ／１０６、３０分、３７℃）単独又はこれと精製Ｆａｂ（１０  μｇ／ｍｌにおいて０．０５）と共にｒｈＩＬ−２  （１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートした。過剰のウイルス及びＦａｂを洗浄することによって除去し、ＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩ  １６４０中で３７℃でインキュベートした。感染後２日毎に、培養上清の半分を（５００μｌ）を取り除き、前記の濃度のｒｈＩＬ−２及びＦａｂを含有する新しい培地に交換した。細胞を含有していない上清を、７日目にＨＩＶ−１  ｐ２４抗原について市販のＥＬＩＳＡ試験（Ｃｏｕｌｔｅｒ製、米国フロリダ州マイアミ所在）を使用して試験した。中和のパーセントを、供試試料単独又はＦａｂ含有供試試料についてｐ２４濃度同士の間の比率として算出した。無関係ＨｍＦａｂ  ＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を陰性対照として使用した。
【００８４】
ＳＣＩＤマウスの再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及びＨＩＶ−１ウイルス感染
ＣＢ．１７  ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤマウスを飼育し、動物施設ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｃｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ  で特定病原なしの条件下に保持した。８〜１０週齢の非漏出表現型マウスを、新しく単離した正常ヒトＰＢＭＣ２０×１０６個をｉ．ｐ．注射することによって再構成した。ウイルス感染の４時間前及びその次の２日間、マウスに、ＰＢＳに溶解した精製Ｆａｂ  Ｓ８（１００μｇ／マウス）を用いるか又はＰＢＳだけを用いてｉ．ｐ．注射した。マウスを、ＰＢＭＣ再形成の２週間後に、１００  ＴＣＩＤ５０を含有する希釈した細胞無含有ＨＴＶ−ｌ  Ｂａｌ株０．５ｍｌをｉ．ｐ．注射することによって感染させた。ウイルス感染の２週間後に、マウスを頸部脱臼によって殺し、氷冷ＰＢＳで洗浄することによって腹膜細胞を得た。細胞（１×１０６個）を、ＨＴＶ−１−血清陰性のドナーから得られたフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）活性化ＰＢＭＣ（１×１０６個）と共に、１０％加熱不活性化ＰＣＳ及び組換え体ＥＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を有するＲＰＭＩ  １６４０中でインキュベートした。同時培養物を、７日目及び１４日目に、ＥＬＩＳＡにより上清中のＨＩＶ−１  コア抗原について監視し、ｐ２４が＞３０ｎｇ／ｍｌであった場合に、陽性とみなした。
【００８５】
ペプチドファージディスプレイライブラリーからのＦａｂ  ＳＢ結合ペプチドの選択
ペプチドファージディスプレイライブラリー  Ｐｈ．Ｄ．−７、Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ及びＰｈ．Ｄ．−１２を、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから購入した。ペプチド結合ファージのパニング選択については、マイクロタイターウエルを５０μｌの精製Ｆａｂ  Ｓ８（１μｇ／ｍｌＰＢＳ）を用いて被覆し（４℃、一夜）、水で３回洗浄し、ＰＢＳ溶解３％ＢＳＡでブロックした（３７℃、１時間）。非特異的ファージペプチド結合を減らすために、ペプチドファージディスプレイライブラリーを０．５％ＢＳＡを有するヒトＦ（ａｂ）２と先にインキュベートした（３７℃、１時間）。それぞれの選択回数について、ウエルを対応するライブラリー５０μｌ（２×１０１１ｐｆｕ）で満たし、インキュベートし（３７℃、２時間）、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いて数回激しく洗浄し、結合ファージをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）及びＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて溶出し、次いで１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いて迅速に中和した。溶出したファージの試料を、製造業者の指示書に従って力価測定した。溶出したファージを大腸菌ＥＲ２５３７中で増幅し、ＰＥＧ濃縮し、次の選択に使用した。ファージペプチド結合クローンの同定については、複数の選択操作から得られた独立ブルーファージプラークを無作為に選定し、増幅し、そのＤＮＡを調製し次いで自動配列決定した。さらにパニングを同様の条件下で行った。対照として、ファージミド結合バックグラウンドを、Ｆａｂ  Ｓ８を除いた以外は前記の最後の選択回で力価測定した。
【００８６】
ｇｐ１２０−Ｆａｂ結合のペプチド阻害
選択されたファージクローンから得られたペプチドをＩｓｏｇｅｎ（Ｍａａｒｓｓｅｎ製、オランダ）により合成した。結合競合実験については、精製Ｓ８  Ｆａｂ  （１μｇ／ｍｌ）  を対応ペプチドの数個の希釈物と共にインキュベートし（４℃、４時間）、その後にｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ（２μｇ／ｍｌ）被覆マイクロタイターウエルに加えた。ウエルをインキュベートし（３７℃、１時間）、ＰＢＳＴで洗浄し、次いでｇｐ１２０に結合するＦａｂ  Ｓ８を、ＰＯ複合化ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）´２  （Ｐｉｅｒｃｅ製）  及びＯＰＤを用いて進展させた。
【００８７】
分子モデル化
構造及び溶媒アクセシビリティー（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を、ＷｈａｔＩｆ（Ｖｒｉｅｎｄ，  １９９０）及びＧｒａｓｐ（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）を用いて分析した。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ  （ｖ．  ９８．０，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ）を用いて図を作成した。分析に使用した構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢと略記する）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から得た。分析に使用した構造  １ＧＣ１、１Ｇ９Ｎ  及び１Ｇ９Ｍ  （Ｋｗｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｋｗｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から得た。三量体モデルは、Ｋｗｏｎｇら（Ｋｗｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）によって提案されたモデルに基づいて手動設定によって作成した。可変性ｇｐ１２０表面マッピングについては、ｇｐ１２０配列アラインメントをｔｈｅ  Ｐｆａｍ  データベース（Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）から得た。アラインメント及び使用したｇｐ１２０  ＨＩＶ−１配列の設定に関するさらなる詳細については、ｗｅｂページ情報（下記）を参照のこと。図はＩｎｓｉｇｈｔ  Ｈ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９８．０  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて描いた。追加の図及び情報は、
“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｂ．ｕａｍ．ｅｓ／￣ｃｎｂｐｒｏｔ／Ｓ２０／”で入手できる。
【００８８】
結果
ＬＴＮＰドナー及びＨＩＶ−１ウイルスの対立遺伝子遺伝子型及び系統発生分析
この研究で分析されたドナー（ＪＭＭ）は、未治療のＨＩＶ−１血清陽性のＬＴＮＰ（この研究時点では１５年以上のＨＩＶ−１感染）である；彼はこれまで正常なＣＤ４数及び低いウイルス量を維持していた（方法の欄参照）。ＡＩＤＳの発症遅延に関連したケモカイン受容体又はケモカインリガンド遺伝子対立遺伝子が存在するかどうかを調べるために、  ＣＣＲ５及びＣＣＲ２ｂケモカイン受容体、ＣＣＲ５プロモーター、並びに３´ＵＴＲ  ＳＤＦ−１βケモカインを含めて、広範なＤＮＡ遺伝子型分析を行った。分析により、ＣＣＲ５ケモカインレセプター、ＣＣＲ２ケモカインレセプター、ＣＣＲ５遺伝子プロモーター、及びＳＤＦ−１βの３´ＵＴＲについて非突然変異対立遺伝子が明らかにされ、ＬＴＮＰドナー表現型がＡＩＤＳ進行の遅延に関連した公知の遺伝子因子によるものではないことが示される。
【００８９】
次に、本発明者らはこの個体のＨＩＶ−１ウイルス株を同定した。ドナーのＰＢＭＣを得、これを使用してプロウイルスＤＮＡをＰＣＲにより単離した。ｅｎｖ遺伝子をプロウイルスＤＮＡから増幅し、クローン化した。数個の独立クローンからｇｐ１２０を完全に配列決定した；誘導されたアミノ酸配列を示す（図１Ａ）。分析した複数のクローンの中で３．０２％のｇｐ１２０配列変化が認められた。この遺伝子変化のレベルは患者で認められたレベル（Ｍｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）と同様であった。準種（ｓｐｅｃｉｅｓ）メンバー同士の間の最大距離は、６．０７％（クロン５０−１０とクローン５０−９の間）であり、最小距離は０．２％（クローン５０−３とクローン５０−１の間）であった。Ｖ１ループにおいて欠失を示したクローンのうちの２つのクローンもまた、前記ＬＡＩクローンＨＸＢ２の位置２８９で認められたように、位置２９９にグリコシル化部位を有していた。ＨＸＢ２には存在していない新規なグリコシル化部位が、３種類の準種の位置４０９で認められた（図１のＡ）。ＬＴＮＰドナーから得られた一次単離ウイルスは、健常な血清陰性個体から得られたＰＢＭＣの継代によって得られた。このウイルスは生育することができず、しかもＭＴ−２細胞中でシンシチウムを形成することができなかった。さらに、単離された数種のドナーウイルスクローン由来のｇｐ１２０  Ｖ３領域の分析により、ＮＳＩ／マクロファージ指向性アミノ酸（Ｓ３０６及びＥ３２０）マーカーが明らかにされ、観察されたＮＳＩウイルス表現型と一致した（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。
【００９０】
前記のＬＴＮＰ  ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ遺伝子を２つの研究ポイントでドナープロウイルスＤＮＡから増幅し、完全に配列決定した；誘導されたアミノ酸配列を示す（図１Ｂ）。試料同士の間で小さい変化（１％未満）が認められ、しかもＮｅｆの未成熟終止コドンをもたらす欠失又はフレームシフトが認められなかった。さらにまた、予測された機能的Ｎｅｆモチーフは全てＬＴＮＰウイルスに保存されていた。本発明者らは、ＬＴＮＰ分離株の系統発生分類を研究するために、そのｇｐ１２０配列を７３個のスペイン分離株の配列（Ｃａｓａｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）及び数個のＨＩＶ−１サブタイプ参考配列（Ｍｙｅｒｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）と比較した。この分析は、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｇ法（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，  １９９３）によりｇｐ１２０  Ｃ２−Ｖ３−Ｃ３領域において行った；得られたツリーを図１Ｃに示す。ＬＴＮＰ分離株は、高いブートストラップ値をもつスペイン株及び参考Ｂ株（ＬＡＩ、ＭＮ、ＳＦ−２、ＳＦ−１６２及びＲＦ）と一緒に、Ｂクレードに含まれた。
【００９１】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対する抗体応答
ｇｐ１２０及びｐ２４に対するドナーＪＭＭ血清ＩｇＭ及びＩｇＧ結合をＥＬＩＳＡ法で分析した；上記二つの抗原に対する高いＩｇＭ及びＩｇＧ力価が認められた（図２Ａ）。本発明者らは、このドナーから構築された２つの抗体イソタイプファージディスプレイライブラリー（ＩｇＭ及びＩｇＧレパートリーに対応する）からｇｐ１２０バイオパニングによるＩｇＭ及びＩｇＧ１抗ｇｐ１２０  Ｆａｂの一群の単離を先に報告した（Ｔｏｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。これらの実験において、本発明者らは、複数のＩｇＭ  Ｆａｂは低親和性をもってｇｐ１２０に結合し、数個の抗原に反応し、これに対して回収された複数のＩｇＧ  Ｆａｂは特異的であり、ｇｐ１２０に高親和性（Ｋｄ、２．２×１０−９  〜  ９．５×１０−１０  Ｍ）を有することを見出した（図２Ｂ）。ＩｇＭ  Ｆａｂ  ＶＨ遺伝子の分析により、種々様々な生殖細胞系遺伝子（大部分は未突然変異）の使用が示された。これに対して、単離されたＩｇＧ  Ｆａｂは全て、単一のＶＨ３生殖細胞系遺伝子（ＤＰ５０）から誘導され、広範囲に及ぶ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）体細胞突然変異の形跡を示し、しかもＨＣＤＲ３分析は共通クローン起源（ｏｒｉｇｉｎ）を示した。それにもかかわらず、ＩｇＧ  Ｆａｂは、ＢＩＡｃｏｒｅで測定されたように、ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂに関して異なる親和性定数を有していた。これらの親和性の相違は、これらのＦＲ１及びＨＣＤＲ１領域におけるアミノ酸の変化によるものであり、体細胞突然変異によってもたらされるものであり、ｇｐ１２０について親和性で１０倍の増大をもたらした（Ｔｏｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。このドナーから得られたこれらの２つのイソタイプの間の相関関係は、ＶＨ  ＤＰ５０遺伝子によってコードされるＩｇＭ及びＩｇＧ  ＦａｂのＶＨ及びＨＣＤＲ３分析によって明らかにされ、一つのＩｇＧ  Ｆａｂ，  Ｓ８がＩｇＭ  Ｆａｂ  Ｍ０２５から生じたことを示唆している。
【００９２】
これら２つのＦａｂから得られらるＶＨは共通の体細胞突然変異を有し且つ主としてＨＣＤＲ３  領域に違いがあるが、Ｆａｂ  Ｓ８及びＭ０２５のＬ鎖（ＬＣと略記する）分子の分析は種々のＨＣ／ＬＣ対形成を示した。もとのＢ細胞のＨＣ／ＬＣの対の形成は、ドナー  ｋ  ＬＣ  レパートリーと種々のＨＣ（ＩｇＭ及びＩｇＧ）レパートリーとの組み合わせ手法を使用して喪失され得る；それにもかかわらず、特定のＨＣが異なるＬＣと対を形成する場合には大部分の抗体はその特異性を保持することが知られている（Ｃｏｌｌｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。  本発明者らは、Ｆａｂ  Ｓ８及びＭ０２５から得られるＬＣを交換することによって二つのＦａｂのそれぞれのＨＣ／ＬＣ対の結合特性を、このようにして分析し、ＥＬＩＳＡ法でこれらの組み合わせによｇｐ１２０結合を試験した。得られた結果は、Ｆａｂ  Ｓ８  ｇｐ１２０特異性が、そのＨＣをＭ０２５由来の又は無関係Ｆａｂ  （Ｔｅｔ）由来のＬＣとの対形成によって影響されなかったことを示す（図２Ｃ）。また、Ｆａｂ  Ｍ０２５  ＨＣとＦａｂ  Ｓ８  ＬＣとの組み合わせは、Ｍ０２５に関して認められた多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を部分的に変化させなかった。このように全てのデータは、抗原認識において比較的重要でない役割を果たすこと及び抗原結合特異性の相違はこれらのＦａｂのＨ鎖によって左右されることを示している  ドナー抗体レパートリーにおけるＦａｂ  Ｓ８  特異性の発現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を、ＥＬＩＳＡ法で組み合わせライブラリーを構築するのに使用したＰＢＬと同時に採取した全ドナー血清によるｇｐ１２０−Ｆａｂ結合阻害によって例証した（図２Ｄ）。また、血清ＩｇＧのｇｐ１２０結合は、Ｓ８  Ｆａｂによって阻害された（図２Ｅ）。このことは、抗体ファージディスプレイアプローチを使用して選択されるｇｐ１２０抗体特異性がＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対するナーの体液応答において表されることを示している。
【００９３】
総合すれば、データは、別の体液応答に関して、ＨＩＶ−１はこのＬＴＮＰにおいてｇｐ１２０に対して多反応性一次ＩｇＭ応答と高親和性ＩｇＧ応答とを誘導することを示している。一次抗体応答の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）は、ＶＨ及びＣＤＲ３体細胞突然変異の蓄積及びイソタイプスィッチング（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を含み、ＩｇＧ  Ｆａｂによって例証されるような、ｇｐ１２０について親和性の増大（１００倍）に関連した特異性の変化（多反応性から特異抗体まで）を招く。
【００９４】
表面プラズモン共鳴により測定された抗ｇｐ１２０  Ｆａｂの反応速度パラメーター
各Ｆａｂについて得られた結果を以下に示す：
2004248664.tif 000002
【００９５】
ヒト抗ｇｐ１２０  ＦａｂによるＨＩＶ−１の中和
精製ＦａｂのＨＩＶ−１（ＭＮ株）中和能を、ＭＴ−４細胞においてＮＰＡにより測定した（図３Ａ）。この検定においては、１００％中和に必要なＦａｂ濃度に応じて、異なる複数のパターンが観察された。Ｆａｂ  Ｓ２０は最も低い濃度（１μｇ／ｍｌ）で１００％中和に至った。Ｆａｂ  Ｓ８は、濃度１０μｇ／ｍｌで１００％中和を示した；Ｆａｂ  Ｓ１９については、２０μｇ／ｍｌの濃度で９２％の中和が観察された。  Ｆａｂ  Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０と同じＤＰ５０生殖細胞系遺伝子から誘導されるＩｇＭ  Ｆａｂ  （Ｍ０２及びＭ０２５）は、ｈａｄ  ｓ同様の中和パターンを有しており、１０μｇ／ｍｌで９０％中和であった。２０μｇ／ｍｌでは、全てのＦａｂが９０％中和を示す。
【００９６】
Ｆａｂ  Ｓ８を選択し、ＭＴ−２細胞においてＩＲＡを使用して、種々のＴ細胞適応（ＴＣＡと略記する）株（ＬＡＩ、ＭＮ、ＲＦ及びＳＦ−２）に対する中和を研究した（図３Ｂ）。数種のＦａｂ  Ｓ８濃度を使用して各ウイルスの１０倍稀釈物を中和した。Ｆａｂ  Ｓ８は、中和濃度を種々の供試ＴＣＡ株の間で変化させたが、全ての供試ＴＣＡ株を中和した。１μｇ／ｍｌのＦａｂ  Ｓ８では、ＳＦ−２、ＭＮ及びＲＦのみが５０％中和された。１０μｇ／ｍｌでは、ＭＮ、ＳＦ−２及びＲＦの中和値は９０％を越えるが、ＨＩＶ−１  ＬＡＩ株は上記と同じＦａｂ濃度では十分に中和されなかった。ドナーウイルス分離株はＰＢＭＣにおける検定法を使用して中和された；２５μｇ／ｍｌのＦａｂでは、３２％の中和が認められた。また、Ｆａｂ  Ｓ８中和能を、ＨＩＶ−１  Ｘ４（ＮＬ４−３）及びＲ５（Ｂａｌ）株を用いてＰＢＭＣを感染させた後に、ｐ２４の定量により測定した（図３Ｃ、Ｄ）。この検定において、０．１ｐ．ｇ／ｍ１よりも少ないＦａｂ  Ｓ８を用いて、ＮＬ４−３及びＢａｌの５０％中和が認められた。
【００９７】
Ｆａｂ  Ｓ８の生体外中和結果を、ヒトＰＢＭＣを用いて再構成したＳＣＩＤマウスにおける生体内Ｒ５（Ｂａｌ）株感染に適用した。ヒトＰＢＬ移植ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ−ＰＢＭＣと略記する）はＨＩＶ−１感染症に感受性である；従ってこのマウスはヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球の喪失を受け、ＨＩＶ−１発病のメカニズム及び可能な治療処置を研究するのに適する（Ｍｏｓｉｅｒ，  １９９６）。ＳＣＩＤ−ｈｕ−ＰＢＭ  マウスに１００μｇの精製Ｆａｂ  Ｓ８又はＰＢＳを注射し、その後に１００  ＴＣＩＤ５０のＨＩＶ−１  Ｂａｌを感染させた。ウイルス感染後に、さらに２種類の用量のＦａｂ  Ｓ８を投与した。１５日後にマウスを犠牲にし、腹膜細胞を回収し、ＰＨＡ活性化ヒトＰＢＭＣと共に同時培養した。７日目及び１４日目に、同時培養上清から得たＨＩＶ−１  ｐ２４を市販のキットを使用して測定した。ｐ２４は、７日目にＦａｂ処理したマウスの１００％において及び１４日目については８匹のうちの７匹において検出できなかったが、対照マウスの４１％は高いｐ２４濃度を示した（図３Ｅ）。このデータは、Ｆａｂ  Ｓ８もまたＳＣＩＤ−ｈｕ−ＰＢＭＣマウスにおいてマクロファージ指向性Ｒ５  ＨＩＶ−１  Ｂａｌ株について生体内中和活性を有していたことを示している。
【００９８】
ＩｇＧ  Ｆａｂを中和することによって認識されるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０エピトープの特定
ファージディスプレイを使用して、他のグループは、ｇｐ１２０−ＣＤ４結合部位に向けられた組換え体Ｆａｂの単離を報告している。可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４と略記する）によるＦａｂ  Ｓ８−ｇｐ１２０結合に対する競争は、抗原（図示されていない）に対するＦａｂ結合を減少しない。それにもかかわらず、ＣＤ４を用いたｇｐ１２０のプレインキュベーションはＥＬＩＳＡ法で測定されるようにｇｐ１２０に対してＦａｂ結合の３０％の増加を示す（図４）。これらの結果は、Ｆａｂによって認識されるｇｐ１２０エピトープがＣＤ４と次の相互作用をおそらくはよりよく受けるであろうということを示している。それにもかかわらず、このＦａｂ−ｇｐ１２０結合の増加は、ＣＤ４ｉ抗体（１７ｂ及び４８ｄ）（これらの抗体はｓＣＤ４の存在下ではｇｐ１２０に結合するだけである）について報告された増加よりも少なく述べられる（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｔｈａｌｉ，  ｅｔａｌ．，  １９９３）。
【００９９】
幾つかの研究方法を使用してＪＭＭから単離したＩｇＧ  Ｆａｂを認識するｇｐ１２０  エピトープを特定した。ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ  （ＬＡＩ）アミノ酸配列に対応する重複２０量体ペプチドの収集物を、セルロース上で調製し、エピトープマッピングを精製Ｆａｂ  Ｓ８及びヤギ抗ヒト抗体を使用して行った。一次配列に対応する非特異（ｎｏｎ−ｕｎｉｑｕｅ）ペプチドモチーフが同定され、コンフォメーショナルｇｐ１２０エピトープが示唆された（図示されていない）。次いで、本発明者らは一組のペプチドファージディスプレイライブラリーを使用してＦａｂ−ｇｐ１２０エピトープを地図作成した（ｍａｐ）。Ｆａｂ  Ｓ８に結合ファージクローンを、３種類のペプチドファージライブラリー、Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ１２  （１２個のアミノ酸）、Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７  （７個のアミノ酸）  及びＰｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  （７個の環状化アミノ酸）  をＦａｂと反応させることによって同定した。パンニング選択を４回行った後に、ライブラリー  Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ１２  及び  Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  において顕著なファージの富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が認められた。溶出された個々のファージクローンから得られたＤＮＡ（それぞれの選択回数に対応する）を配列決定してペプチド  アミノ酸配列を推定した（表１）。
【０１００】
Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ１２ライブラリーを使用すると、８個の独立したペプチド配列が最後の選択操作から同定された。分析された１１個のファージクローンは特異的であり、クローン  ｃｌ２４Ｒ４（ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ）によって示される同じヌクレオチド及びペプチド配列を有していた。ペプチドファージクローン  ｃ１２４Ｒ９  （ＧＩＱＬＡＮＰＰＲＬＹＧ）  及び  ｃ１２４Ｒ１  （ＦＬＱＰＰＤＦＳＨＬＰＰ）  はそれぞれ４回及び２回認められ、これに対してその他のファージクローンはそれぞれ１回認められた。また、ペプチドファージクローン  ｃ１２４Ｒ４  及び  ｃ１２４Ｒ９  もまた、２回目の選択実験及び３回目の選択実験から分析されたファージクローンの中に認められた。
【０１０１】
Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７Ｃ  ライブラリーの最後の選択実験から回収された全ての独立したクローンは、識別できるペプチド配列を有しており、また非共通モチーフが同定された。Ｆａｂ  Ｓ８選択を４回行った後に、ライブラリー  Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７  は種々のペプチド配列を示すファージを提供した。しかし、クローン  ｃ７２Ｒ４  （ＳＡＭＥＡＰＰ）  はライブラリー  Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ１２由来のクローン  ｃ１２４Ｒ９に類似した配列モチーフを示した。
【０１０２】
明白な共通アミノ酸モチーフはペプチドファージクローン全てにおいて認められなかったが、大部分のペプチドは２個の連続したプロリン残基を有していた。１２４Ｒ９ペプチド及びｃ７２Ｒ４とアラインできるｇｐ１２０から得られたアミノ酸残基  ４２８−４３９に対応するクローン  ｃ１２４Ｒ９  （ＧＩＱＬＡＮＰＰＲＬＹＧ）、ｃ１２４Ｒ４  （ＬＬＡＤＴＴＨＨＲＰＷＴ）、ｃ１２４Ｒ１  （ＦＬＱＰＰＤＦＳＨＬＰＰ）  及び  ＥＮＶ−９  （ＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩ）  由来のペプチドを分析し、ＥＬＩＳＡ法でｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８結合の阻害について試験した。ペプチド１２４Ｒ４及び１２４Ｒ９は５０μｇ／ｍｌでＦａｂ  Ｓ  ８−ｇｐ１２０結合について阻止率５０％を示し、これに対してペプチド１２４Ｒ１は、同様の濃度で僅か１５％の阻止率しか示さなかった（図５）。さらにまた、ペプチドＥＮＶ−９は、Ｆａｂ  Ｓ  ８−ｇｐ１２０結合について阻止率５０％を示した。関連しない陰性対照ペプチドはＦａｂ  Ｓ８−ｇｐ１２０結合阻害活性を示さなかった。
【０１０３】
コンフォメーショナルＦａｂ−ｇｐ１２０エピトープ相互作用の構造分析
Ａｂ−Ａｇ結合におけるＨＣＤＲ３領域の重要性が報告されている（Ｍｏｒｅａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）；この領域由来のアミノ酸残基はＡｂ−Ａｇ相互作用を頻繁に招く。ＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８、Ｓ１９  及びＳ２０を中和するＨＩＶ−１について、これらのＨ鎖に関する分子モデルは、接触抗原におけるＨＣＤＲ３ループについて重要な役割を示唆している（Ｔｏｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。Ｆａｂ  Ｓ８、Ｓ１９  及びＳ２０を中和する高親和性由来のＩｇＧはＨＣＤＲ３ループの位置９５に帯電したしたアミノ酸残基（Ａｒｇ）を有し、これに対して多反応性ＩｇＭ  Ｆａｂ  Ｍ０２５はこの位置にＴｈｒを有し、ＨＣＤＲ３におけるＡｒｇ９５の存在が抗原特異性及び結合において必須の役割を果たすことを示唆している。ＩｇＧ  Ｆａｂ中のこの残基の重要な役割を、ＥＬＩＳＡ法でＡｒｇ９５  Ｆａｂ変異体の作成及びそのｇｐ１２０結合特性の測定することにより分析した。結果は、Ａｓｐ、Ｐｒｏ又はＧｌｙによるＡｒｇ９５の置換がｇｐ１２０に対するＦａｂ結合を廃することを示している；変異体  Ｆａｂ  Ｓ８９５Ｋ  又は  Ｓ２０９５Ｋにおける同様の帯電アミノ酸（Ｌｙｓ）  による置換は、ｇｐ１２０特異性の変化を示さなかった（図６）。これに対して、Ａｒｇ９５がＴｒｐ、Ｍｅｔ  又は  Ｔｈｒ  （最後のＴｈｒはＦａｂ  Ｍ０２５中の均等の残基である）で置換されたＦａｂは結合Ｇの減少とｇｐ１２０特異性の変化とを示した。
【０１０４】
2004248664.tif 000003
【０１０５】
Ｆａｂ  Ｓ８によって認識されるｇｐ１２０エピトープの構造を分析するために、本発明者らは、ペプチドファージ由来のペプチド配列を数種のＨＩＶ−１エンベロープ、例えばドナー  ＪＭＭ  由来のｇｐ１２０のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  （Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）を使用し比較した。幾つかのペプチド及びｇｐ１２０において２個の連続したプロリンの周囲に部分類似性が認められ、おそらくはファージペプチドディスプレーのランダム性を反映し、そこでは特定のアミノ酸残基が真の抗原エピトープを模擬できると思われる。ｇｐ１２０のコア構造に基づいて、本発明者らは、Ｆａｂ  ＳＳ−結合ペプチドに対応するコンフォメーショナルな表面配列について手動で調べた。ペプチド  １２４Ｒ９  （ＧＩＱＬＡＮＰＰＲＬＹＧ）  及び  １２４Ｒ１  （ＰＬＱＰＰＤＦＳＨＬＰＰ）  のみがコンフォメーショナルエピトープを生じ、残基４２０−４２２及び４３７−４３９で２つのｇｐ１２０領域と並び（図７Ａ）、このようにｇｐ１２０−ＣＣＲ５結合領域（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ａｎｄ  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，  ２０００）をもつアミノ酸を共有する。Ｆａｂ  Ｓ８エピトープのアミノ酸可変性は、Ｐｆａｍ（タンパク質ファミリーデータベース；Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）由来の多数のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０  配列（例えば、マクロファージ指向性及びＴ細胞指向性ウイルス由来の配列）のアラインメントによって分析した。可変性は、ＭｃＬａｃｈｌａｎ行列（ＭｃＬａｃｈｌａｎ，  １９７１）を使用して９９％非重複ｇｐ１２０アラインメント（ｇｐ１２０断片なしで）から算出し、ｇｐ１２０コア構造表面（Ｋｗｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）にわたってマッピングした。Ｓ８  Ｆａｂ  エピトープを構成するアミノ酸Ｈｅ４２０、Ｇｌｎ４２２、Ｐｒｏ４３７  及びＰｒｏ４３８は、大部分のＨＩＶ−１ウイルスみおいて高い保存度を示す低い可変性を示した  （図７Ｂ）。
【０１０６】
これらのデータ及びＦａｂ  Ｓ８  Ａｒｇ９５に関する突然変異誘発実験結果を考慮に入れて、本発明者らは、推定されるｇｐ１２０  Ｆａｂエピトープの近くの帯電アミノ酸残基（Ａｓｐ又はＧｌｕ）について調べ、ＦａｂのＨＣＤＲ３  ループ中のＡｒｇ９５との静電相互作用を確証する候補としてＧｌｕ３８１のみを見出した。また、本発明者らは、Ｇｌｕ３８１がＨＴＶ−１ウイルス中に保存されたことを見出した（ｗｅｂページ参照）。従来の観察は、ＣＤ４結合ｇｐ１２０  の内側ドメインと外側ドメインの間で塩架橋を形成することを示している（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ａｎｄ  Ｓ  ｏｄｒｏｓｋｉ，  ２０００）。また、Ｇｌｕ３８１又はＬｙｓ２０７の変化は、ＣＣＲ５結合を廃棄し、ｇｐ１２０ドメイン間相互関係及び補助受容体結合におけるこれらの残基の重要性を例証している。Ｆａｂ  Ｓ８  ＨＣＤＲ３ループ由来のＡｒｇ９５と、ｇｐ１２０のＧｌｕ３８１との間の仮想相互作用は、このように隔絶された高エネルギーの塩結合を切断し得（Ｈｅｎｄｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔｉｄｏｒ，  １９９４；  Ｓｉｎｄｅｌａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）、ｇｐ１２０  内部−外部ドメイン間相関関係の変化をもたらす。
【０１０７】
検討
ＨＩＶ−１感染患者の間で、長期未発症患者（ＬＴＮＰと略記する）は、抗レトロウイルス療法の不存在下で１０年以上も免疫を抑制することなく感染に耐える感染患者の減少群（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｕｐ）を有してなる。これらの患者は、数種のＨＩＶ−１分離株を生体外で中和できる可能な体液応答を証明し、自然ＨＩＶ−１感染の結果として発現される体液応答の役割を研究する機会を提供している。ＨＩＶ−１に対する保護免疫における前記抗体の役割は知られていないが、データは線状エピトープよりもむしろ不連続エンベロープエピトープが有効な中和性抗体の標的であり得ることを示している。コンフォメーショナルエピトープ指向性抗体は、ＨＩＶ−１感染患者の抗ＨＩＶ−１糖タンパク質抗体の大部分である。このタイプの抗体はワクチン接種ボランティアでは検出されておらず、ボランティアにおいては免疫原は多種多様な特異性をもつ線状エピトープに対する抗体を誘発し、それはＴＣＬＡウイルス（Ｍａｓｃｏｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）を中和するが、一次分離株（Ｂｅｄｄｏｗｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｌｏｏｍｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）を中和しない。コンフォメーショナルエピトープに対する特異的高親和性ヒト抗体は、抗体ファージディスプレイ法を使用して得ることができ、自然感染の結果として発現されたヒト抗体レパートリーの分析を可能にする。本発明者らは先に、ＨＩＶ−１−感染ＬＴＮＰ（１５年以上）ドナーから２種類の抗体ファージディスプレイイソタイプ（ＩｇＭ  及び  ＩｇＧ）ライブラリーを構築した（Ｔｏｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。これらのライブラリーからｇｐ１２０抗原パニングによって数個のＦａｂを選択した；回収されたＩｇＧ  Ｆａｂは親和性であり且つｇｐ１２０特異性であり、これに対してＩｇＭ  Ｆａｂは低親和性であり且つ多反応性であった。
【０１０８】
ここで、本発明者らはこれらの結果を拡大適用し、ＡＩＤＳ遅延に関連したケモカイン遺伝子の徹底的な分析を行い、ＬＴＮＰ  ＨＩＶ−１ウイルスを特定した。ドナーのＤＮＡ遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）  は、ＡＩＤＳ発生の遅延を生じるために報告された主なヒト遺伝子に関連した対立遺伝子を示さず（Ｏ´Ｂｒｉｅｎ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  ２０００）、このＬＴＮＰドナーの表現型はかかる遺伝因子によるものではないことを示している。このドナーウイルス分離株は、ＭＴ−２細胞における表現型に基づいてＮＳＩとして分類された。ｇｐ１２０の分析は、重要な配列変化を示さず、同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＨＩＶ−１ウイルス分離株を示し且つｇｐ１２０由来のＶ３領域が認められたＮＳＩ表現型と相互に関連があるマクロファージ指向性アミノ酸マーカーを有していたことを示している。ＬＴＮＰウイルス由来の欠陥Ｎｅｆ遺伝子対立遺伝子は認められなかった。系統発生分類は、このＬＴＮＰ  ＨＩＶ−１分離株がクレードＢ、すなわち、スペインの主サブタイプに属することを示した（Ｃａｓａｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００ａ，  ｂ）。
【０１０９】
ドナーから得られた一次抗体（ＩｇＭ）及び二次抗体（ＩｇＧ）の分析を広げるために、高親和性抗ｇｐ１２０  ＩｇＧ  Ｆａｂを広く特定した。ＩｇＧ  Ｆａｂ結合特性は主としてＨ鎖に帰することができる。本発明者らの結果は、ＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８及びＳ２０  結合特性及び特異的性質におけるＬ鎖について役割が小さいことを示している；Ｓ８  Ｈ鎖と、クロン関連多反応性ＩｇＭ  Ｆａｂ  （Ｍ０２５）  又は非関連非特異的Ｆａｂ由来のＬ鎖との組み合わせは、Ｆａｂ  Ｓ８  ｇｐ１２０結合及び特異性に大して効果を及ぼさなかった。元のＨ鎖とＬ鎖との対合は、コンビナトリアル手法を使用して抗体ライブラリーを作成中に消失し得るが、本発明者らは、ＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８とＬＴＮＰドナー由来の血清がｇｐ１２０結合について競合できることを認めた。これらのデータは、前記抗体ライブラリーから回収されたＦａｂ  Ｓ８抗ｇｐ１２０特異性がドナー血清中で十分に示され且つ上記手法の無作為性によって生じた新規な抗体特異性ではないことを示している（Ｐｅｒｓｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。これはまた、体液性免疫応答レパートリーを研究するための抗体ディスプレー法の利用を確認している（Ｂａｒｂａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｄｉｔｚｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。
【０１１０】
ＩｇＧ  Ｆａｂと比較すると、ドナーから選択されたＩｇＭ  Ｆａｂは全て多反応性であり、ｇｐ１２０については低親和性であった。ＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８をコードする生殖系列遺伝子と同じ生殖系列  遺伝子から誘導された一つの多反応性ＩｇＭ  Ｆａｂ  （Ｍ０２５）  は普通のＶＨヌクレオチド配列を共有し、同一の体細胞突然変異によって生じたアミノ酸変化を有していた。ＨＣＤＲ３類似性もまたこれらの２種類のＦａｂ同士の間の相関関係を示唆した。ここで、本発明者らは、これら２種類のＦａｂ同士の間のＨＣＤＲ３アミノ酸残基の相違がＦａｂ  ｇｐ１２０特異性及び親和性において顕著な役割を果たすことを示す。結果は、ＨＣＤＲ３  Ａｒｇ９５の  Ａｓｐ、Ｐｒｏ  又はＧｌｙによる置換はｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８結合を廃止したこと；また、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ又はＴｈｒ（この最後の残基はＦａｂ  Ｍ０２５の固有の残基である）によるＡｒｇ９５  置換によりｇｐ１２０結合及び特異性に変化が生じること示している。これらの知見は、限定されたＶ領域を有するが十分なＣＤＲ３多様性をもつトランスジェニックマウスモデルを使用する最近の実験と一致する。これらの研究から得られた結果は、ＨＣＤＲ３多様性は大部分の抗体特異性については十分であったこと及び体細胞の突然変異は予想外に高い抗体親和性の達成を可能にすることを示した。
【０１１１】
このドナーから単離されたＤＰ５０誘導Ｆａｂの全て（ＩｇＭ及びＩｇＧ）は、実験ＨＩＶ−１株ＭＮを中和することができた。Ｆａｂ  Ｓ８  中和能もまた数種の方法及びＨＩＶ−１株を使用して試験された；このＦａｂはＸ４  ＨＩＶ−１株ＭＮ、ＲＦ、ＳＦ−２、ＤＩ−Ｂ  及びＮＬ４−３、並びにＲ５  Ｂａｌ  株を中和した。また、Ｆａｂ  Ｓ８は、ヒトＰＢＭＣ−再構成ＳＣＩＤマウスにおいて、生体内でマイクロファージ指向性Ｂａｌ感染を中和した。これらのデータは、ＬＴＮＰドナーから単離した抗ｇｐ１２０  Ｆａｂ  Ｓ８  はＨＩＶ−１感染の有力な生体外及び生体内阻害剤であることを示している。
【０１１２】
Ｆａｂ  Ｓ８をさらに特定するために、本発明者らは，  幾つかの方法を使用してｇｐ１２０エピトープをマッピングした。ｇｐ１２０重複ペプチドエピトープを使用する従来の実験は、ｓｕｇｇｅｓｔｓ  ｔｈａｔ  Ｆａｂ  Ｓ８が非線状エピトープを認識することを示唆している。この場合、本発明者らは、別のツールとして一組のランダムペプチドファージライブラリーを使用してＳ８  エピトープ  をマッピングした（Ｂｏｏｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｆｅｒｒｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，  １９９９；  Ｆｅｒｒｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ．  １９９０；  Ｙｉｐ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，  １９９９）。Ｓ８  Ｆａｂを用いてパニング後に回収された大部分のファージは、２個の連続したプロリンからなるモチーフもつペプチドを有していた。最も頻繁に選択されるファージ由来のペプチドを選択し、合成し且つＳ８−ｇｐ１２０結合競争について試験した。本発明者らの結果は、ペプチド  １２４Ｒ１、１２４Ｒ９及び１２４Ｒ４がＳ８−ｇｐ１２０結合について顕著な阻害を示したことを示している。また、ｇｐ１２０  アミノ酸残基  ４２８−４３９に対応し且つ１２４Ｒ９及び７２Ｒ４  （ペプチド  ライブラリー  Ｐｈ．Ｄ．−Ｃ７のパニングによってファージクローンｃ７２Ｒ４から誘導されたペプチド）  に対する類似性に関して選択されたペプチド  ＥＮＶ−９もまたＦａｂ  Ｓ８−ｇｐ１２０結合を阻害した。数種のＨＴＶ−１エンベロープ、例えばドナーｇｐ１２０、並びにペプチド１２４Ｒ９及び１２４Ｒ１のアミノ酸配列と候補ペプチドとのアラインメントは、２個の連続したｇｐ１２０プロリン（Ｐｒｏ４３７及びＰｒｏ４３８）の周囲にごく部分的な類似性を示した。これらの２個のプロリンは、最近、ｇｐ１２０補助受容体結合部位に含まれる重要な残基として報告された（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ａｎｄ
Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，  ２０００）。
【０１１３】
Ｆａｂ  Ｓ８エピトープを詳細に研究するために、本発明者らは分子モデル化を使用してＦａｂ  Ｓ８結合ペプチドに対応するコンフォメーショナルなｇｐ１２０コア構造型表面配列について調べた。本発明者らのモデルは、ペプチド１２４Ｒ９及び１２４Ｒ１が残基４２０−４２２及び４３７−４３９で２個のｇｐ１２０領域とアラインするコンフォメーショナルエピトープを生じることができることを予測している。これらの由来のアミノ酸  （Ｉｌｅ４２０、Ｌｙｓ４２１、Ｇｌｎ４２２、Ｐｒｏ４３８）  は、ｇｐ１２０−ＣＣＲ５結合領域の要素として記載されている。突然変異誘発実験は、これらの残基及びＧｌｙ４４１の修飾は、Ｃ  ＣＲ５結合に特異的結果を有し、ＣＤ４に対する結合に関してほとんど効果を有していないことを示している（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ａｎｄ  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，  ２０００）；モノクロナール抗体１７ｂ  及び４８ｄもまたこの領域でアミノ酸を結合することが報告されている（Ｔｈａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。これらのＡｂはｇｐ１２０を結合し且つＣＤ４の存在下でのみＨＩＶ−１を効率的に中和し（Ｓａｌｚｗｅｄｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、ｇｐ１２０  上に誘導し得るＣＤ４（ＣＤ４ｉ）エピトープを規定している（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｔｈａｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。
【０１１４】
前記の結果は、Ｆａｂ  Ｓ８  によって認識されるある種のｇｐ１２０  アミノ酸類がｍＡｂ  １７ｂによって認識されるアミノ酸と共に共有されることを示唆しているが、１７ｂと比べると、本発明者らは、ｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８結合にほとんどＣＤ４依存しないことを認めた（ｇｐ１２０に既に結合されている可溶性ＣＤ４はＦａｂ−ｇｐ１２０結合を僅か３０％まで増加した）、Ｆａｂ  Ｓ８エピトープは、このようにＣＤ４ｉ−様（ＣＤ４ｉｌ）として定義される。エピトープ１７ｂ−ＣＤ４ｉ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）とＳ８−ＣＤ４１１との間の相違は、ａ）  １７ｂ−ＣＤ４ｉエピトープは、Ｓ８−ＣＤ４Ｕとは違って、ｇｐ１２０に対するＣＤ４結合後に劇的なコンフォメーショナル変化の結果として存在し得ること、ｂ）  ＣＤ４結合の不存在下で、ｇｐ１２０  Ｖ３領域はＳ８−ＣＤ４１１エピトープよりも一層よく１７ｂ−ＣＤ４ｉエピトープを覆い得ること、又は  ｃ）これらのプロセスの組み合わせによるのかもしれない。
【０１１５】
本発明者らのモデルは、架橋シートミニドメインを形成するｇｐ１２０構造の種々の鎖に配置された２つのｇｐ１２０領域、Ｉｌｅ４２０−Ｇｌｎ４２２  及び  Ｐｒｏ４３７−Ｐｒｏ４３８にＳ８  Ｆａｂが結合し得ることを示唆している。Ａｂ−Ａｇ相互作用におけるＨＣＤＲ３の重要性は既に報告されている（Ｍｏｒｅａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＨＣＤＲ３におけるＡｒｇ９５の突然変異誘発による結果は、このＨＣＤＲ３残基が、ｇｐ１２０のＦａｂ  Ｓ８結合に必須であることを示す本発明者らの前記のモデルを支持している（Ｔｏｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。これらの結果に照らして、本発明者らは、Ｆａｂ  Ｓ８  ＨＣＤＲ３  ループと相互作用できるアミノ酸残基について推定ｇｐ１２０エピトープを調べ且つＡｒｇ９５との静電相互作用を確立するための唯一の候補としてＧｌｕ３８１を見出した。Ｌｙｓ２０７とのＧｌｕ３８１相互作用は、内側ｇｐ１２０ドメインと外側ｇｐ１２０ドメインとの間で塩架橋を形成する（Ｒｉｚｚｕｔｏ  ａｎｄ  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，  ２０００）；Ｇｌｕ３８１又はＬｙｓ２０７の変化はＣＣＲ５結合を廃止し、  補助受容体との相互作用についてこのドメイン間関係の重要性を示す（Ｒｉｚｚｕｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。Ｆａｂ  Ｓ８  ＨＣＤＲ３  ループのＡｒｇ９５とｇｐ１２０のＧｌｕ３８１との間の仮定の相互作用は、このようにしてｇｐ１２０の内側−外側ドメイン間の相関関係の適切な変化を生じ得る。
【０１１６】
最後に、本発明者らは、ｇｐ１２０アミノ酸の大きな非重複アラインメントからＦａｂ  Ｓ８エピトープ可変性を分析した。これらの結果は、アミノ酸  Ｇｌｕ３８１、Ｉｌｅ４２０、Ｇｌｎ４２２、Ｐｒｏ４３７及びＰｒｏ４３８について示し、低い可変性ＨＩＶ−１ウイルス類の間でＳ８エピトープについて高度の保存を示している。ケモカイン補助受容体についてのＨＩＶ−１株特異性は複雑であるが、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４特異性は、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のＶ３可変性ループ中に残ることが提案される。その理由は、このループにおける単一のアミノ酸の置換がウイルスの屈性を変えるからである（Ｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。本発明者らの結果は、Ｆａｂ  Ｓ８によって認識されるエピトープはＶ３領域依存性でないことを示唆している。このＦａｂは、Ｘ４及びＲ５  ＨＩＶ−１株の両方を中和し、ケモカイン補助受容体相互作用における共通のｇｐ１２０領域のかかわりを裏付けた。最近の構造データは  ｓｈｏｗ  ｔｈａｔ  ｇｐ１２０上の中和面が分子の上の縮小した領域を占めることを示している（Ｗｙａｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。報告された可能な交差クレード中和性ｍＡｂの大部分（ｂ１２、２Ｇ１２及び２Ｆ５）（Ｂｕｒｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｍｕｓｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｔｒｋｏｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）は、コンフォメーショナルなエピトープに対して指向されるが、これらの特異性はまれにしか誘発されない。Ｆａｂ  Ｓ８エピトープは分子表面に近づくことができることが認められ且つ大部分のＨＩＶ−１ウイルスに保存される。興味深いことには、Ｆａｂ  Ｓ８  Ｈ鎖はＶＨ３ファミリーによってコードされ、ＶＨ  Ｉｇファミリーは、  ＡＩＤＳに進展する大部分のＨＩＶ−１感染者において低下することが認められる（Ｊｕｏｍｐａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。これらの抗体特異性は、健常状態に寄与する重要な因子であり得、更なる実験はＨＴＶ−１感染者におけるＳ８  エピトープ特異性の程度を分析することを必要とされる。また、ヒトＦａｂ  Ｓ８は、ＨＩＶ−１感染症の治療に有効である抗体法に含まれる。このヒトＦａｂのマッピングから誘導されるここで説明されたペプチドは、ｇｐ１２０−助受容体相互作用の理解と、ＡＩＤＳの治療に有効である新規な方法の開発に寄与し得る。
【０１１７】
略号
ＣＤ４ｉ      ＣＤ４誘導
ＣＤ４ｉｌ      ＣＤ４誘導様
ＣＤＲ        相補性決定領域
ＣＰＥ        細胞変性効果
ＦＲ        フレームワーク領域
ＨＣ        Ｈ鎖
ＨＣＤＲ３      Ｈ鎖相補性決定領域３
ＩＲＡ        感染力低下検定
ＬＣ        Ｌ鎖
ＬＴＮＰ      長期未発症感染者
ＮＰＡ        中和プラーク検定
ＮＳＩ        非シンシチウム誘導
ＰＢＭＣ      末梢血単核細胞
ＰＨＡ        フィトヘマグルチニン
ＳＩ        シンシチウム誘導
ＴＣＡ        Ｔ細胞適合
ＴＣＩＤ      ５０％組織感染量
ＴＣＬＡ      Ｔ細胞適合実験株
【０１１８】
参考文献
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Ｃａｓａｄｏ，  Ｃ．，  Ｉ．  Ｕｒｔａｓｕｎ，  Ｓ．  Ｓａｒａｇｏｓｔｉ，  Ｍ．Ｌ．  Ｃｈａｉｘ，  Ａ．  Ｄｅ  Ｒｏｓｉ，  Ａ．Ｍ．  Ｃａｔｔｅｌａｎ，  Ｕ．  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．  Ｌｏｐｅｚ．  （２０００ｂ）．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  １  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｉｓｋ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ．  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，  １６，  ２９９−３０４．
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Ｋｗｏｎｇ，  Ｐ．Ｄ．，  Ｒ．  Ｗｙａｔｔ，  Ｑ．Ｊ．  Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  Ｊ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ  ａｎｄ  Ｗ．Ａ．  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ．  ２０００．  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｐ１２０  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４，  １９６１−１９７２．
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Ｍａｓｃｏｌａ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｓ．Ｗ．  Ｓｎｙｄｅｒ，  Ｏ．Ｓ．  Ｗｅｉｓｌｏｗ，  Ｓ．Ｍ．  Ｂｅｌａｙ，  Ｒ．Ｂ．  Ｂｅｌｓｈｅ，  Ｄ．Ｈ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｍ．Ｌ．  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  Ｒ．  Ｄｏｌｉｎ，  Ｂ．Ｓ．  Ｇｒａｈａｍ，  Ｇ．Ｊ．  Ｇｏｒｓｅ，  Ｍ．Ｃ．  Ｋｅｅｆｅｒ，  Ｍ．Ｊ．  ＭｃＥｌｒａｔｈ，  Ｍ．Ｃ．  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｋ．Ｆ．  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｊ．Ｇ．  ＭｃＮｅｉｌ，  Ｍ．Ｅ．  ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｓ．  Ｂｕｒｋｅ．  １９９６．  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ａｄａｐｔｅｄ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ＡＩＤＳ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １７３，  ３４０−３４８．
ＭｃＣｕｔｃｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，  ８  （１９９２），  １８８７−１８９５．  ＭｃＤｅｎｎｏｔｔ，  Ｄ．Ｈ．，  Ｐ．Ａ．  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｆ．  Ｇｕｉｇｎａｒｄ，  Ｃ．Ａ．  Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒ，  Ｓ．Ｆ．  Ｌｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ．  １９９８．  ＣＣＲ５  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  （ＭＡＣＳ）．  Ｌａｎｃｅｔ，  ３５２，  ８６６−８７０．
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Ｍｏｒｅａ，  Ｖ．，  Ａ．  Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，  Ｍ．  Ｒｕｓｔｉｃｉ，  Ｃ．  Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．  Ｌｅｓｋ．  １９９７．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．，  ６８，  ９−１６．
Ｍｏｓｉｅｒ，  Ｄ．Ｅ．  １９９６．  Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６３，  ７９−１２５．Ｍｕｓｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｆ．  Ｓｔｅｉｎｄｌ，  Ｍ．  Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒ，  Ａ．  Ｔｒｋｏｌａ，  Ａ．  Ｋｌｉｍａ，  Ｇ．  Ｈｉｍｍｌｅｒ，  Ｆ．  Ｒｕｋｅｒ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｋａｔｉｎｇｅｒ．  １  ９９３．  Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｇｐ４１  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７，  ６６４２−６６４７．
Ｍｙｅｒｓ，  Ｇ．，  Ｂ．  Ｋｏｒｂｅｒ，  Ｊ．Ａ．  Ｂｅｒｚｏｆｋｓｙ，  Ｒ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｐａｖｌａｋｉｓ．  １９９２．  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  １９９２：  Ａ  Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｎ．  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ．  Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，  ｅｄ．Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，  Ａ．，  Ｋ．Ａ．  Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｈｏｎｉｇ．  １９９１．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  １１，  ２８１−２９６．
Ｏ´Ｂｒｉｅｎ，  Ｓ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｐ．  Ｍｏｏｒｅ．  ２０００．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ＨＴＶ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ＡＩＤＳ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １７７，  ９９−１１１．
Ｐａｇｅ，  Ｒ．Ｄ．  １９９６．  ＴｒｅｅＶｉｅｗ：  ａｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ  ｏｎ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  １２，  ３５７−３５８．
Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｒ．Ｈ．  Ｃａｏｔｈｉｅｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｂｕｒｔｏｎ．  １９９１．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｒｉｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８，  ２４３２−２４３６．
Ｒａｔｎｅｒ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１３  （１９８５），  ２７７−２８４．
Ｒｉｚｚｕｔｏ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ．  ２０００．  Ｆｉｎｅ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＣＣＲ５−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １２０．  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ，  １６，  ７４１−７４９．
Ｒｉｚｚｕｔｏ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｒ．  Ｗｙａｔｔ，  Ｒ．Ｎ．  Ｈｅｍａｎｄｅｚ，  Ｙ．  Ｓｕｎ，  Ｐ．Ｄ．  Ｋｗｏｎｇ，  Ｗ．Ａ．  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ．  １９９８．  Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＨＴＶ  ｇｐ１２０  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｈｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８０，  １９４９−１９５３．
Ｓａｌｚｗｅｄｅｌ，  Ｋ．，  Ｅ．Ｄ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．  Ｄｅｙ  ａｎｄ  Ｅ．Ａ．  Ｂｅｒｇｅｒ．  ２０００．  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ＣＤ４−ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｅｎｖ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＣＤ４  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｅｎｖ  ｆｏｒ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｇｐ１２０．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４，  ３２６−３３．
Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｐ．Ｓ．，  Ｊ．Ｍ．  Ｒｏｊａｓ，  Ｍ．Ａ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｅ．Ｍ．  Ｆｅｎｙｏ，  Ｒ．  Ｎａｊｅｒａ，  Ｅ．  Ｄｏｍｉｎｇｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．  Ｌｏｐｅｚ．  １９９３．  Ｄｉｌｕｔｅ  ｐａｓｓａｇｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７，  ２９３８−２９３４３．
Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ，  Ｇ．Ａ．，  Ｅ．  Ｌａｓｏｎｄｅｒ，  Ｍ．  Ｆｅｉｊｉｂｒｉｅｆ，  Ｄ．Ｇ．  Ｋｏｅｄｉｊｋ，  Ｊ．Ｗ．  Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ，  Ａ．Ｊ．  Ｓｃｈｅｆｆｅｒ，  Ｗ．Ｓ．  Ｗｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｗ．  Ｗｅｌｌｉｎｇ．  １９９４．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒａｉｓｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｂｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４，  ３１８８−３１９３．
Ｓｃｏｔｔ，  Ｊ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．  Ｓｍｉｔｈ．  １９９０．  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄａ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｌｉｂｒａｒｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ３８６−３９０．
Ｓｈａｎｋａｒａｐｐａ，  Ｒ．，  Ｊ．Ｂ．  Ｍａｒｇｏｌｉｃｋ，  Ｓ．Ｊ．  Ｇａｎｇｅ，  Ａ．Ｇ．  Ｒｏｄｒｉｇｏ，  Ｄ．  Ｕｐｃｈｕｒｃｈ，  Ｈ．  Ｆａｒｚａｄｅｇａｎ，  Ｐ．  Ｇｕｐｔａ，  Ｃ．Ｒ．  Ｒｉｎａｌｄｏ，  Ｇ．Ｈ．  Ｌｅａｍ，  Ｘ．  Ｈｅ，  Ｘ．Ｌ．  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｊ．Ｉ．  Ｍｕｌｌｉｎｓ．  １９９９．  Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｖｉｒａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅｓ  ａ  ｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｍｎａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７３，  １０４８９−１０５０２．
Ｓｉｎｄｅｌａｒ，  Ｃ．Ｖ．，  Ｚ．Ｓ．  Ｈｅｎｄｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｔｉｄｏｒ．  １９９８．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓａｌｔ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  ７，  １８９８−１９１４．
Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｍ．  Ｄｅａｎ，  Ｍ．  Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｃ．  Ｗｉｎｋｌｅｒ，  Ｇ．Ａ．  Ｈｕｔｔｌｅｙ，  Ｄ．Ａ．  Ｌｏｍｂ，  Ｊ．Ｊ．  Ｇｏｅｄｅｒｔ，  Ｔ．Ｒ．  Ｏ´Ｂｒｉｅｎ，  Ｌ．Ｐ．  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｒ．  Ｋａｓｌｏｗ，  Ｓ．  Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，  Ｅ．  Ｖｉｔｔｉｎｇｈｏｆｆ，  Ｄ．  Ｖｌａｈｏｖ，  Ｋ．  Ｈｏｏｔｓ，  Ｍ．Ｗ．  Ｈｉｌｇａｒｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．  Ｏ´Ｂｒｉｅｎ．  １９９７．
Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＣＲ２  ａｎｄ  ＣＣＲ５  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｎ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  （ＨＧＤＳ），  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  （ＭＡＣＳ），  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  （ＭＨＣＳ），  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｃｉｔｙ  Ｃｏｈｏｒｔ  （ＳＦＣＣ），  ＡＬＩＶＥ  Ｓｔｕｄｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７，  ９５９−９６５．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｎ．，  Ｙ．  Ｓｕｎ，  Ｑ．  Ｓａｔｔｅｎｔａｕ，  Ｍ．  Ｔｈａｌｉ，  Ｄ．  Ｗｕ，  Ｇ．  Ｄｅｎｉｓｏｖａ，  Ｊ．  Ｇｅｒｓｈｏｎｉ，  Ｊ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ．  １９９８．  ＣＤ４−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｆｏｎｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ１２０  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｓ：  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７２，  ４６９４−４７０３．
Ｔｈａｌｉ，  Ｍ．，  Ｊ．Ｐ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｃ．  Ｆｕｒｍａｎ，  Ｍ．  Ｃｈａｒｌｅｓ，  Ｄ．Ｄ．  Ｈｏ，  Ｊ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ．  １９９３．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ヒト  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｇｐ１２０  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ｇｐ１２０−ＣＤ４  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６７，  ３９７８−３９８８．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｄ．Ｇ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．  Ｇｉｂｓｏｎ．  １９９４．  ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，  ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２，  ４６７３−４６８０．
Ｔｏｒａｎ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｌ．  Ｋｒｅｍｅｒ，  Ｐ．Ｌ．  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｉ．  Ｍｏｒｅｎｏ  ｄｅ  Ａｌｂｏｒａｎ，  Ｇ．  ｄｅｌ  Ｒｅａｌ，  Ｍ．  Ｌｌｏｒｅｎｔｅ，  Ａ．  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  Ｍ．  Ａｌｖａｒｅｚ  ｄｅ  Ｍｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａ．  １９９９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＨＴＶ−ｌ  ｇｐ１２０  ａｎｔｉｂｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ＩｇＭ  ａｎｄ  ＩｇＧ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｎｏｎ−ｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２９，  ２６６６−２６７５．
Ｔｏｒａｎ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｐ．Ｌ．  Ｓａｎｃｈｅｚ，  Ｌ．  Ｋｒｅｍｅｒ，  Ｇ．  ｄｅｌ  Ｒｅａｌ，  Ａ．  Ｖａｌｅｎｃｉａ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ａ．  ２００１．  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｆｉｒｓｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３１，  １２８−１３７．
Ｔｒｋｏｌａ，  Ａ．，  Ｍ．  Ｐｕｒｔｓｃｈｅｒ，  Ｔ．  Ｍｕｓｔｅｒ，  Ｃ．  Ｂａｌｌａｕｎ，  Ａ．  Ｂｕｃｈａｃｈｅｒ，  Ｎ．  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｋ．  Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，  Ｊ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ，  Ｊ．Ｐ．  Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｋａｔｉｎｇｅｒ．  １９９６．  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ２Ｇ１２  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｐ１２０  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７０，  １１００−１１０８．  Ｖｒｉｅｎｄ，  Ｇ．  （１９９０）．  ＷＨＡＴ  ＩＦ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ｐｒｏｇｒａｍ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．，  ８，  ５２−５６．
Ｗｙａｔｔ，  Ｒ．，  Ｐ．Ｄ．  Ｋｗｏｎｇ，  Ｅ．  Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ，  Ｒ．Ｗ．  Ｓｗｅｅｔ，  Ｊ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｗ．Ａ．  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｇ．  Ｓｏｄｒｏｓｋｉ．  １９９８．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＴＶ  ｇｐ１２０  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９３，  ７０５−７１１．
Ｙｉｐ，  Ｙ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．  Ｗａｒｄ．  １９９９．  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｈａｇｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．，  ２，  １２５−１３８．
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ＬＴＮＰドナーから単離されたＨＩＶ−１ウイルスのｇｐ１２０、Ｎｅｆ及び系統発生的分類の推定されるアミノ酸配列を表す。
【図２】ＬＴＮＰドナー血清及び抗−ｇｐ１２０  Ｆａｂの結合特性を示すグラフを表す。
【図３】ヒトＦａｂによるＨＩＶ−１の中和を表すグラフである。
【図４】ｓＣＤ４の存在下のＳ８  Ｆａｂのｇｐ１２０結合を表す。
【図５】ｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８結合のミモペプチドによる阻害を表す。
【図６】Ｆａｂ  Ｓ８及びＳ２０  ＨＣＤＲ３変異体によるｇｐ１２０の結合を表す。
【図７】Ｆａｂ  Ｓ８  ｇｐ１２０エピトープの分子モデルを表す。
【図８】Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０のＬ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【図９】Ｓ８のＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【図１０】Ｓ１９のＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【図１１】Ｓ２０のＨ鎖の核酸及びアミノ酸配列を表す。
【０１２０】
■配列表■
2004248664.tif 000004
2004248664.tif 000005
2004248664.tif 000006
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2004248664.tif 000015
2004248664.tif 000016
【図１（１）】
2004248664.tif 000017
【図１（２）】
2004248664.tif 000018
【図２】
2004248664.tif 000019
【図３】
2004248664.tif 000020
【図４】
2004248664.tif 000021
【図５】
2004248664.tif 000022
【図６】
2004248664.tif 000023
【図７．Ａ】
2004248664.tif 000024
【図７．Ｂ】
2004248664.tif 000025
【図８】
2004248664.tif 000026
【図９（１）】
2004248664.tif 000027
【図９（２）】
2004248664.tif 000028
【図１０（１）】
2004248664.tif 000029
【図１０（２）】
2004248664.tif 000030
【図１１（１）】
2004248664.tif 000031
【図１１（２）】
2004248664.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月2日(2003.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１−Ａ】ＬＴＮＰドナーから単離されたＨＩＶ−１ウイルスのｇｐ１２０タンパク質の推定アミノ酸配列のアライメントを表す。
【図１−Ｂ】ＨＢＸ２ウイルス参考株に従って番号を付したｇｐ１２０タンパク質の一部分のアミノ酸配列を表す。
【図１−Ｃ】ＬＴＮＰドナーのＨＩＶ−１ウイルス由来のプロバイアルＤＮＡのＮｅｆの推定アミノ酸配列を表す。
【図２−Ａ】ＥＬＩＳＡ法で試験した組換え体ｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ、ｐ２４、ＢＳＡ及びｄｓＤＮＡに対するＬＴＮＰドナーの血清ＩｇＧ（図２−Ａの左側のグラフ）及びＩｇＭ（図２−Ａの右側のグラフ）の結合特性を表すグラフである。
【図２−Ｂ】ドナーから誘導された多反応性のＩｇＭ  Ｆａｂ（ＭＯ２５）並びに高親和性のＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０のｇｐ１２０及びＢＳＡへの結合を表すグラフである。
【図２−Ｃ】多反応性及び特異性の複数の抗ｇｐ１２０  Ｆａｂ同士の間のＬ鎖シャフリングを表すグラフである。
【図２−Ｄ】ドナー血清とＦａｂ  Ｓ８との間の抗原に対する結合競争を表すグラフである。
【図２−Ｅ】ドナー血清（１／２００）を、Ｆａｂ  Ｓ８（０．０１〜３０μｇ／ｍｌ）又は無関係なＦａｂ  ＰＩの存在下でｇｐ１２０  ＩＩＩ−Ｂ結合について試験したグラフである。
【図３−Ａ】ＭＴ−４細胞においてプラーク検定法（ＮＰＡ）によって決定されたＩｇＭ  Ｆａｂ  ＭＯ２及びＭＯ２５並びにＩｇＧ  Ｆａｂ  Ｓ８、Ｓ９及びＳ２０によるＨＩＶ−１  ＭＮ株の中和を表すグラフである。
【図３−Ｂ】ＭＴ細胞における感染力低下検定法（ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＥＲＡと略記する）を使用したＦａｂ  Ｓ８によるＴ細胞適合株、ＬＡＩ、ＭＮ、ＲＦ及びＳＦ−２の中和を表すグラフである。
【図３−Ｃ】Ｘ４（ＮＬ４−３）によるＰＢＭＣ感染後にｐ２４の定量によって測定されたＦａｂ  Ｓ８の中和能を表すグラフである。
【図３−Ｄ】ＨＩＶ−１株（Ｂａｌ）によるＰＢＭＣ感染後にｐ２４の定量によって測定されたＦａｂ  Ｓ８の中和能を表すグラフである。
【図３−Ｅ】ヒトＰＢＭＣ再構成ＳＣＩＤマウスにおけるＲ５（Ｂａｌ）ＨＩＶ−１感染のＦａｂ  Ｓ８生体内中和活性を表す。
【図４】ｓＣＤ４の存在下でのＳ８  Ｆａｂのｇｐ１２０への結合を表すグラフである。
【図５】ｇｐ１２０に対するＦａｂ  Ｓ８の結合がミモペプチドにより阻害されることを表すグラフである。
【図６−Ａ】Ｆａｂ  Ｓ８変異体によるｇｐ１２０の結合を表すグラフである。
【図６−Ｂ】Ｓ２Ｏ  ＨＣＤＲ３変異体によるｇｐ１２０の結合を表すグラフである。
【図７−Ａ】Ｆａｂ  Ｓ８とｇｐ１２０とのエピトープの分子モデルを表す模式図である。
【図７−Ｂ】図７−Ａの分子モデルの一部拡大説明図である。
【図８】Ｓ８、Ｓ１９及びＳ２０のそれぞれのＬ鎖の核酸配列及びアミノ酸配列を表す。
【図９】Ｓ８のＨ鎖の核酸配列及びアミノ酸配列を表す。
【図１０】Ｓ１９のＨ鎖の核酸配列及びアミノ酸配列を表す。
【図１１】Ｓ２０のＨ鎖の核酸配列及びアミノ酸配列を表す。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図１−Ｃ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図２−Ｄ】
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【図２−Ｅ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図３−Ｃ】
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【図３−Ｄ】
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【図３−Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７−Ａ】
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【図７−Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【外国語明細書】
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