(57)【要約】      （修正有）【課題】線維症又は硬化症の治療に有効な化合物を提供し、さらには皮膚再建又は創傷治療の方法並びに人工結合組織を開示。さらに、ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物の同定及び単離のためのセルベース方法、ならびに創傷治療を支援する抗癌薬及び抗癌剤の製造方法へのその使用を開示。【解決手段】有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいはこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸を投与することを含む、線維芽細胞中でマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を誘導する方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいはこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸を投与することを含む、線維芽細胞中のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）発現の誘導方法。
【請求項２】
前記ＭＭＰがＭＭＰ−１又は膜型ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティックが、α２β１インテグリン受容体との結合に関してネイティブのハララギンと競合可能である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合が前記α２β１インテグリンの可溶性外部ドメインで生ずる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰがＢｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａに由来する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰがＣｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘに由来する、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記同族体が、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭｓ）に含まれる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰがそのメタロプロテイナーゼ活性を失っている、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの前記フラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティックが、少なくとも一つのディスインテグリン様／システインリッチドメインを有する、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に十分な量含む、線維症又は硬化症の治療又は予防用組成物。
【請求項１２】
前記核酸が、普遍的及び／又は組織特異的プロモーターによって制御される、目的のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する組換えベクターである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記線維症又は硬化症が、肝臓繊維症、肺繊維症、腎臓繊維症、及び心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所性及び全身性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、並びに増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される疾患である、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記線維症が皮膚線維症である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を、生理学的有効量含む、皮膚再建又は創傷治療用組成物。
【請求項１６】
請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸の存在下で、候補化合物又は化合物の混合物の、ＭＭＰ活性又は発現を促進又は抑制する能力を調べるステップを含む、ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物を同定及び単離するためのセルベース方法。
【請求項１７】
前記ＭＭＰがＭＭＰ−１又はＭＭＰ−１４である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が規定サイズのコラーゲン様マトリックス中に懸濁され、前記化合物が存在する場合のコラーゲン様マトリックスの大きさを、該化合物が存在しない場合のものと比較するステップを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が細胞株由来のものである、請求項１６から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が形質転換細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が形質転換線維芽細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
同定された化合物を単離するステップを含む、請求項１６から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物の混合物が約１０５の多様な化合物コレクションであり、一つ又は複数のサブコレクションを単離するステップを必要に応じて含む、請求項１６から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１６から２３のいずれかに記載のステップを含み、ＭＭＰ活性量又は活性ＭＭＰ量の減少が、抗癌薬であることの指標とされる、抗癌薬の製造方法。
【請求項２５】
請求項１６から２３のいずれかに記載のステップを含み、ＭＭＰ活性量又は活性ＭＭＰ量の減少が、目的の薬剤であることの指標とされる、創傷治療を支援する薬剤の製造方法。
【請求項２６】
毒性の原因であると疑われる部分の変更、削除、及び／又は誘導体化、バイオアベイラビリティ、溶解性及び／又は半減期の増加のために前記化合物を修飾するステップをさらに含む、請求項１６から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
単離又は修飾された前記化合物を医薬上許容される担体と混合するステップをさらに含む、請求項１６から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を含み、必要に応じて、細胞、アガロースゲル、コラーゲン、細胞増殖培地、抗体、及び核酸プローブから選択される一つ以上を含む、請求項１６から２７のいずれかに記載の方法の実施に有用なキット。
【請求項２９】
請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティックを含む、人工結合組織。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）あるいはそれらのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいはこれらの化合物の任意の１種類をコードする核酸を投与することを含む、線維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）発現を誘導する方法に関する。特に、本発明は、線維症又は硬化症の治療又は予防が必要な患者の治療又は予防のために上記化合物を使用することに関する。さらに、本発明は、生理学的有効量のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、好ましくはハララギン（ｊａｒａｒｈａｇｉｎ）、あるいは機能的に同等のそれらの誘導体を治療を必要とする患者に投与することを含む、患者の皮膚再建又は創傷治療方法に関する。さらに、本発明は、ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物のセルベースの同定及び単離方法、ならびに創傷治療を補助する抗癌薬及び抗癌剤の製造方法におけるその使用を含む。本発明は、以上のような方法の実施に有用なキット、及びＰＩＩＩＳＶＭＰ又は機能的に同等のそれらの誘導体を含む人工結合組織にも関する。
【０００２】
本明細書においていくつかの文献が引用される。ここで引用される各文献（製造元の仕様書、使用説明書を含む）を本明細書に援用するが、本発明に関してすべての引用文献が従来技術であるわけではない。
【０００３】
【従来の技術】
線維症、即ち線維組織又は瘢痕組織の過剰な形成は医学における大きな問題である。瘢痕組織は、動脈を遮断し、関節を動かなくし、内臓を損傷し、生体機能を維持する生体の能力を大きく混乱させる。
線維化は、手術後に癒着、ケロイド腫瘍、又は肥大性（非常に重篤な）瘢痕化の形態で発生しうる。線維化は、激しい衝突、創傷、又は整形外科的外傷の後で拘縮及び関節脱臼を引き起こし、あらゆる器官で発生する可能性があり、肝炎（肝硬変）、高血圧（心不全）、結核（肺線維症）、強皮症（線維性皮膚及び内臓）、糖尿病（腎症）、及びアテローム性動脈硬化症（線維状血管）などの多くの疾病状態を伴う。
皮肉なことに、身体を修復するために計画された過程自体が非常に危険な問題の原因となりうる。エポキシ樹脂のように、瘢痕組織は単に構造的な役割を果たしているだけである。これは間隙を充填するが、この組織が出現する器官の機能に寄与することはできない。例えば、高血圧で損傷した心筋が線維状の瘢痕組織で置き換えられると、心臓の弾性が低下し始め、そのため機能が低下する。同様に、肺線維症は肺を硬化させ、萎縮させ、生命を脅かしうる症状となる。また、線維の成長は広がり、元の外傷が治癒した後でさえも、それを取り囲む健康な組織に侵入する。このように瘢痕組織が多すぎるとこれらが生理学的な障害物となり、変形、肢体不自由、又は死亡の原因となる。
ほとんどの場合、線維化は反応性プロセスであり、いくつかの異なる要因が、組織を線維化へと導く経路を調節できることが明らかとなっている。このような要因としては、早期炎症反応、線維芽細胞集団の局所的増加、線維芽細胞の合成機能の変化、ならびにコラーゲンの生合成及び分解の制御の変化が挙げられる。
したがって、治療方法の一つは、早期炎症反応を対象としている。外用副腎皮質ホルモン剤を使用する治療は、早期の線維化に使用する場合に限って成功していた。しかしながら、ステロイド治療は、瘢痕組織がすでに形成されてからではほとんど又は全く効果がなかった。さらに、肺線維症などにおいてヒドロコルチゾンの投与が長期間に及ぶと、症状が悪化する場合がある。
第２の方法は、コラーゲン合成の増加に関与する細胞の増殖を鈍化させることである。一般にこれは、平滑筋細胞がコラーゲンの沈着を行う脈管構造を除けば線維芽細胞が関与する。
多数の治療法が、線維芽細胞又は平滑筋細胞の合成機能の調節に基づいて考案されてきた。ほとんどの細胞と同様に、線維芽細胞及び平滑筋細胞はサイトカイン（標的細胞の機能を修飾する影響に反応して分泌される因子）によって調節される。γインターフェロンは、線維芽細胞増殖及びコラーゲン合成を抑制することが知られているリンホカイン（リンパ球が産生するサイトカイン）である。同様に、モノカイン（マクロファージが産生するサイトカイン）のβ−インターフェロンも同じ機能を果たす。例えば、米国特許第５，３１２，６２１号は、これらのサイトカインの線維化の治療への使用を教示している。有望ではあるのだが、これらの物質及び組成物の多くは重大な副作用があることが知られており、そのため有効性が制限される。
さらに別の治療方針は、コラーゲン及び線維組織の他の成分の代謝に直接影響を与えることを含んでいる。例えば、コラーゲンの生合成、蓄積、及び異化を妨害する薬物が、線維化の治療に使用されてきた。多くの薬物がコラーゲン合成の阻害に使用されており、例えば、ピリドン、アルカジエン、ベンゾキノン、ピリジン、オキサリルアミノ酸、及びプロリン類似体の誘導体が挙げられる。しかしながら、これらの薬物のすべては、線維化中に生じる有害な合成を阻害するとともに、正常時の必要なコラーゲン合成も阻害するという欠点がある。別の方法として考えられるのは、線維組織及び／又は線維芽細胞に、ヒトメタロプロテアーゼ又はコラゲナーゼ、ヒトＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２などの治療遺伝子を送達することであって、これらは、沈着した過剰のコラーゲンタンパク質を分解し、及び／又はコラーゲンタンパク質の過剰な合成を抑制する。
【０００４】
線維芽細胞の天然Ｉ型コラーゲンへの付着は、α１β１及びα２β１インテグリン受容体によって調節される（１，２）。近年、Ｋｎｉｇｈｔら（３）は、三重らせんコラーゲンＩ型及びＩＶ型の配列ＧＦＯＧＥＲ（Ｏ，ヒドロキシプロリン）がα１β１及びα２β１の両方のインテグリンに認識されることを示した。いくつかの研究で、α鎖インテグリンサブユニットのＩ−ドメインのコラーゲン結合部位が特定されている。Ｉ−ドメインは約２００個のアミノ酸で構成され、フォンビルブラント因子Ａドメインと相同性を有する（４〜６）。
ヒト皮膚線維芽細胞が線維コラーゲンＩ型と接触するようになると、一連の事象が引き起こる。線維芽細胞に表現型組織様特性を獲得し、これはプラスチック上又はモノマーコラーゲンＩ型状上の単層培養で成長した線維芽細胞には見られない（７，８）。これらのコラーゲンフィブリルのゆるい網目構造に線維芽細胞が播種された場合、Ｉ型コラーゲンの発現が抑制され（９）、ＭＭＰ−１合成が誘導され（１０）、プロＭＭＰ−２が活性化される（１１）。さらに、α２β１インテグリンに結合したコラーゲンは、コラーゲンマトリックスの再構成及び収縮に寄与し（１２，１３）、ＭＭＰ−１合成を誘導する原因となる（１４，１５）ことが線維芽細胞に観察された。この系におけるＩ型コラーゲン合成の抑制は、コラーゲンがα１β１インテグリンと結合することが原因であった（１４）。最近、本発明者らは、ＭＭＰ−１以外に、ＭＴ１−ＭＭＰも、α２β１インテグリン受容体が線維コラーゲンと連結することによってｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で誘導されることを発見した（１６）。コラーゲン格子構造において、α２β１インテグリンの合成が増加される一方で、α１β１やα３β１などの別のコラーゲンインテグリン受容体の発現は影響を受けないことが分かった（１３）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、線維症の治療に極めて有用と考えられる、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現を調節する有効物質が望まれており、また線維症ならびに癌、特にメラノーマなどの異常なコラーゲンの代謝回転を伴う他の疾患の治療に使用される物質の同定方法も望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
実施態様の一つでは、本発明は、有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック（ｍｉｍｅｔｉｃ）、あるいはこららの化合物のいずれか一つをコードする核酸を投与することを含む、線維芽細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を誘導するための方法及び組成物を提供する。好ましい実施態様では、前記ＭＭＰは、ＭＭＰ−１又は膜型ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４）である。ＭＭＰの発現を誘導する好ましい化合物は、ヘビ毒メタロプロテイナーゼハララギン、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック化合物である。これらの物質は、医薬用担体又は賦形剤とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで投与することができる。本発明の物質の好ましい実施態様は、治療の必要な患者に局所的に投与することができ、例えば、皮膚、特に肥厚性瘢痕及びケロイド（局所的皮内注射によって）、肺（例えば薬剤の吸入によって）、又は肝臓（肝灌流によって）に投与することができる。
【０００７】
好ましい実施態様では、本発明は、肝臓、肺、腎臓、及び心臓の線維化、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所的及び系統的強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、並びに増殖性硝子体網膜症などの線維症又は硬化症の治療方法又は予防方法を提供する。また、これらの方法に使用される組成物を提供する。好ましくは本発明の方法は、ＭＭＰの発現の誘導に十分な量のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいはこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸を、治療又は予防を必要とする患者に投与することを含む。従って、本発明の組成物では、ＭＭＰの発現の誘導に十分な量の前記化合物又は核酸を含むことが好ましい。さらに別の実施態様では、本発明は、患者の皮膚再建方法又は創傷治療方法のためのこれらの化合物の使用に関する。
【０００８】
別の局面では、本発明は、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは前述の規定の核酸の存在下で、候補となる化合物又は化合物の混合物の、ＭＭＰ活性又は発現を促進又は抑制する能力を調べる（評価する）ことを含む、ＭＭＰの活性及び発現を調節する化合物のセルベースの同定及び単離方法に関する。
さらに本発明は、線維症の進行を防止する化合物を同定するためのゲル収縮アッセイを提供する。概して、このアッセイは、試験化合物及びゲルの収縮を刺激する既知物質と細胞とを接触させ、試験化合物が存在しない場合と比べて、試験化合物が存在することでゲルの収縮が阻害されるかどうかを調べることを含む。この方法で単離される化合物は、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの媒介するＭＭＰ発現の誘導を増強又は抑制する化合物であり得、したがってそれらはそれぞれアゴニスト又はアンタゴニスト／阻害剤とされる。本発明のセルベースアッセイは線維芽細胞で行われることが好ましく、最も好ましくは皮膚線維芽細胞で行われる。
化合物がＭＭＰ活性を低下させるか、あるいは活性ＭＭＰ量を減少させることが分かれば、前記化合物は抗癌薬（好ましくはメラノーマの治療用）の製造に有利に使用される。別の実施態様では、この化合物は創傷治療を補助する薬剤の製造に使用することができる。
さらに本発明は、上述の方法及びアッセイの実施に有用なキットを提供する。さらに、本発明は、上記ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ及び関連化合物の少なくとも１種類を含む人工組織を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、血小板において観察さる現象とは対象的に、ハララギン（ｊａｒａｒｈａｇｉｎ）、ＰＩＩＩヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）の一つの要素、及びいわゆるＡＤＡＭ（哺乳類タンパク質のディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼファミリー）に含まれる分子の同族体が、線維芽細胞のインテグリン受容体α２β１と結合して、ＭＭＰ１及びＭＴ１−ＭＭＰのアップレギュレーションなどのコラーゲン様細胞シグナル伝達を行うという知見に少なくとも一部が基づいている。したがって、このような毒メタロプロテイナーゼならびにそれらの活性フラグメント及び誘導体を、線維芽細胞におけるＭＭＰ発現の誘導に使用することができ、したがって線維症（一例として肥厚性瘢痕）などの異常なコラーゲン沈着と関連する疾患の治療に使用することができる。本発明は、線維芽細胞が線維状Ｉ型コラーゲンを主成分とする３次元マトリックスに組み込まれる細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの使用、並びにハララギンが他の種類の細胞と比較する場合のヒト皮膚線維芽細胞のコラーゲンに誘導される細胞活性の分子機序を研究するための有用なツールとなるという知見にも基づく。
したがって本発明の実施態様の一つは、有効量のＰＩＩＩヘビ毒Ｚｎ−メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいはこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸を含む、線維芽細胞でマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を誘導する方法に関する。好ましくは前記線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。
【００１０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、亜鉛依存性細胞外エンドプロテイナーゼのファミリーである。これらは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基底膜のすべての成分を分解させることができる。新しいタンパク質分解機能は、ミエリン塩基性タンパク質などの非マトリックス高分子の分解、α抗トリプシンの不活性化、ＥＣＭからの増殖因子の放出、及び細胞表面からの生体活性分子の開裂などで規定される。これらは、腫瘍浸潤及び転移、リウマチ及び変形性関節症、脈管形成、ならびに創傷治癒などの多数の病原過程と関与しており、例えばＳｋｉｌｅｓら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８（２００１），４２５−４７４、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２（２００２），３３−４９、Ｏｖｅｒａｌｌ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２（２００２），６５７−６７２を参照することができる。
【００１１】
ＭＭＰは、正常な発生、形態形成、ホメオスタシス、及び組織再形成において主要な役割を果たしている。したがって、ＭＭＰの発現又は活性を調節する化合物は、上記病原過程の治療に使用され得るし、及び／又は組織再形成を補助する物質として使用され得る。
【００１２】
ヘビ毒メタロプロテイナーゼ（ＳＶＭＰ）は、メタロプロテイナーゼのＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎファミリー（Ｍ１３）に含まれる。タンパク質のＡＤＡＭ（ディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼ）／ＭＤＣ（メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、システインリッチ）グループもＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎファミリーに含まれる（１７）。ＳＶＭＰのＰＩＩＩクラス及びＡＤＡＭは、相同メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン、及びシステインリッチドメインを共有している（１８）。これらの類似性のため、ＳＶＭＰは、ＡＤＡＭ機能の早期モデルとして機能してきた。ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰは、細胞外マトリックスのタンパク分解、及び血小板のα２β１へのコラーゲンの結合を遮断することによる血小板凝集の阻害が可能であることが示されている（１７）。
Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａの出血性メタロプロテイナーゼであるハララギンは、毒を受けた人に観察される局所性及び全身性出血の原因となる主要毒成分の一つである（１９）。ハララギンは、微小血管系の基底膜の成分及び止血に重要な一部の血漿タンパク質を分解することが示されている（２０，２１）。さらに、コラーゲンに誘導される血小板凝集を阻害することによって出血を促進する（２２）。この毒に関して、ハララギンのメタロプロテイナーゼドメインは、タンパク分解過程によって、ハララギンのディスインテグリン及びシステインリッチドメインのフラグメントであるハララギン−Ｃを生成する。α２β１インテグリンは、ハララギン−Ｃとも相互作用可能であるが、この相互作用はハララギンとの相互作用より弱いと思われ（２３）、これはさらなるＮ−末端構造のハララギン−α２β１結合との関与を示唆している。興味深いことに、ハララギンのメタロプロテイナーゼドメインの配列に基づいた合成ペプチドは、組換えα２インテグリン鎖のＩ−ドメインと結合し、それによってα２−ＩドメインのコラーゲンＩ及びＩＶへの結合、ならびにラミニン−１への結合が防止されることが示されている（２４）。
本発明によると、線維コラーゲンの線維芽細胞との相互作用を模倣して、インテグリンα２β１、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの発現を調節するハララギンの能力を詳細に調べた。血小板に対して行われた従来の研究とは対照的に、線維芽細胞と結合するハララギンによって、α２β１インテグリンを介して結合した線維状Ｉ型コラーゲンによって誘導される細胞活性と同様の細胞活性が得られた。これらの結果によると、他のディスインテグリン様／システインリッチドメインを含有するするタンパク質（例えばＡＤＡＭ）は、従来示されているようにインテグリンと結合できるだけではなく、遺伝子及びタンパク質の発現などの細胞の活動を変化させる信号をインテグリンを介して発生し、ハララギンと同一ではないかもしれないが同様の生物活性を示すと予想される。
【００１３】
前述したように、ハララギンは、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰ発現を調節することが示された。したがって、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はそれから誘導される化合物は、ＭＭＰ−１及び／又は膜型ＭＴ１−ＭＭＰ（ＭＭＰ−１４とも呼ばれる）の発現を調節可能であることが好ましい。本発明は、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ（好ましくはハララギン）から誘導されるフラグメント、ペプチド、又は誘導体、同族体、類似体、若しくはミメティックの使用にも関する。ハララギンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は当業者には公知であり、前述の文献及び参考文献の項を参照されたい。これらの配列はＧｅｎＢａｎｋよりＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｘ６８２５１  Ｓ４９３８５（Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｘ６８２５１．１  ＧＩ：６２４６７）で入手可能であり、Ｐａｉｎｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１９９２），２２８６９−２２８７６）によって公開されている。同様に、血小板のコラーゲンへの付着を阻害するＣｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘ（ニシダイヤガラガラヘビ）のヘビ毒タンパク質であるカトロコラスタチン（ｃａｔｒｏｃｏｌｌａｓｔａｔｉｎ）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列も、ＧｅｎＢａｎｋよりＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｕ２１００３（Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｕ２１００３．１  ＧＩ：７１０３５３）で入手可能であり、Ｚｈｏｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７（１９９５），４１１−４１７）によって公開されている。
【００１４】
好ましくは、これらの誘導体の任意の一つは、ハララギンのアミノ酸配列と少なくとも４０％類似、より好ましくは６０％、さらにより好ましくは８０％類似した、あるいは同一のアミノ酸配列を有し、その誘導体は実施例に記載されるようにＭＭＰ発現を調節することができる。前記ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ及びフラグメントに加えて、又は代替的に、そのペプチド、誘導体、同族体、又はミメティックも、α２β１インテグリン受容体の結合に関して未変性ハララギンと競合可能である。ハララギンに関する発見によると、前記結合がα２β１インテグリンの可溶性外部ドメインで行われることが好ましい。ハララギンと十分に結合することができる化合物を検出するための競合アッセイを実施例に従って設計することができる。比較ウィンドウをアライメントするための最適な配列のアライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２（１９８１），４８２の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（１９７０），４４３の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．ＳＡ．）８５（１９８８），２４４４の同様の方法の研究、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０によるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、あるいは選択した種々の方法で得られる検定及び最適なアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって相同性の比率が最大となる）によって実施することができる。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基と交換可能であることを意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。好ましくは、前記フラグメント、誘導体、同族体、類似体、又はミメティックは、それら自体がペプチド化合物である。
【００１５】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は本明細書では互いに交換可能に使用される。しかしながら好ましくはペプチドは、約２アミノ酸残基〜約５０アミノ酸残基を含むタンパク質性分子を含む。ハララギンのインテグリン結合モチーフはこれまでのところ知られていない。しかしながら、α２β１と結合可能な約８アミノ酸のペプチドが報告されている。このペプチドは、Ｉｖａｓｋａらにより記載されているようにハララギンのメタロプロテイナーゼドメイン中に存在する配列モチーフＲＫＫＨを有する（２４）。
好ましくは、本発明におけるペプチドは約３アミノ酸残基〜約４０アミノ酸残基を有する。さらにより好ましくは、本発明におけるペプチドは約４アミノ酸残基〜約３０アミノ酸残基を有する。特に好ましい本発明の実施態様は、約４アミノ酸残基〜約２０アミノ酸残基（例えば４〜１５アミノ酸残基及び６〜８アミノ酸残基）を有するペプチドを含む。前記ペプチドのアミノ酸配列はヘビ毒から誘導されるかこれに基づくものであるが、ヘビ毒の全長に必ずしも対応するわけではなく、むしろその一部分である。
前記ペプチドは、グリコシル化又は非グリコシル化される場合があるし、及び／又は縮合、架橋、結合、又はペプチドと関連するその他の方法である範囲の他の分子を含むこともあり、例えば、アミノ酸、脂質、炭水化物、又は他のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含みうる。本明細書において「ペプチド」を使用する場合は、あるアミノ酸配列を有するペプチド、ならびにアミノ酸、脂質、炭化水素、又は他のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質などの他の分子と関連するペプチドを含む。本発明の説明では、少なくとも約５０個のアミノ酸配列を有する分子をペプチドと見なす。
本発明のペプチドについては、化学合成技術によって生成することができ、あるいは後に詳述する組換えＤＮＡ技術によって生成することもできる。本発明のペプチドは、ヘビ毒由来のより大きな分子のフラグメントであってもよい。フラグメントは天然のフラグメントの場合もあるし、あるいはプロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミダーゼ、溶解素、又は他の酵素の作用、ならびに超音波破壊、熱、化学的破壊、及び／又は剪断によって得られる場合もある。
ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰのペプチドのアミノ酸配列は、ヘビ毒トキシン、より具体的にはハララギンから誘導されるかこれに基づくものと考えられている。しかしながら、これは、好ましいペプチドが天然のヘビ毒トキシの誘導体であることを必ずしも意味するわけではなく、本発明によると特に有用なペプチドは、より大きなヘビ毒トキシンのアミノ酸配列に基づいて化学合成される。好ましいヘビとしては、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ属及びＣｒｏｔａｌｕｓ属などのＶｉｐｅｒｉｄａｅ科及びＣｒｏｔａｌｉｄａｅ科のヘビが挙げられる。特に好ましいヘビは、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ及びＣｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘである。
【００１６】
前述したように、血小板でみられるのとは対照的に、線維芽細胞中でインテグリン受容体α２β１と結合したハララギンが、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰのアップレグレーションなどのコラーゲン様細胞のシグナル伝達を引き起こすことが示されている。メタロプロテイナーゼドメインを不活性化しても、ハララギンのこのような性質には影響しなかった。したがって線維芽細胞では、ヘビ毒メタロプロテイナーゼハララギンは、インテグリンと結合しこれを活性化させるコラーゲン−模倣的（ミメティック）基質として機能する。メタロプロテイナーゼ、ハララギンディスインテグリン様及びシステインリッチドメイン、及びＡＤＡＭ（ディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼ）タンパク質ファミリー内の分子間に相同性があると仮定すると、本発明は、これらのタンパク質の生物学的機能と関連する応答を誘導する細胞シグナル伝達物質としてのＡＤＡＭ中のディスインテグリン様／システインリッチドメインの能力を示す。毒タンパク質のＰ−ＩＩＩクラスに関して記載したドメイン構造以外に、ＡＤＡＭは上皮増殖因子様ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを有する。これらのドメインは本発明による使用に必ずしも必要であるわけではなく、そのため使用されなくてもよいし、他の機能ドメインで置き換えられてもよい。毒メタロプロテイナーゼ構造、ならびに毒タンパク質、及びタンパク質のＡＤＡＭファミリーの間の類似性及び相違に関する説明は、例えば、Ｊｉａら，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３４（１９９６），１２６９−１２７６に記載されている。ＡＤＡＭタンパク質とそれらのＰＩＩＩ  ＳＶＭＰとの関係は当業者には周知であり、例えば、Ｃａｌｖｅｔｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９（２０００），１３６５−１３７３に記載されている。ＡＤＡＭのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はｗｗｗ（ｗｏｒｌｄ  ｗｉｄｅ  ｗｅｂ）及びＧｅｎＢａｎｋから容易に入手可能である。例えば、公知のＡＤＡＭのＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．及び配列のアラインメントにアクセスでき、頻繁に更新される３つのウェブサイトが、Ｈｏｗａｒｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４８（２０００），２１−２７の導入部分に記載されており、この記載内容を本明細書に援用する。この発見は、最近発表されたＢｒｉｄｇｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２００２），３７８４−３７９２によってさらに支持されており、この文献はＡＤＡＭファミリーの一員とインテグリンα４β１の相互作用を報告している。したがって、本発明において使用可能なＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの前記同族体は、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）に属するものであってもよい。ＡＤＡＭタンパク質の同族体、誘導体、突然変異タンパク質、又は同等物の調製方法も当業者には公知であり、例えば、ＷＯ９７／４００７２号（この記載内容を本明細書に援用する）を参照されたい。ＷＯ９７／４００７２号に記載のベクター及び宿主細胞も、前述のタンパク質の発現に使用することができる。
【００１７】
実施例で示すように、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰハララギンは、メタロプロテイナーゼ活性非存在下に観察される生物学的活性に影響を与える。したがって、あるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰのこの特定の活性は停止され得る。あるいは、プロテイナーゼドメインの一部又は全体を削除又は置換することができる。ここにおいて、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰのディスインテグリン様／システインリッチドメインは、α２β１インテグリンとの結合に関与し、そのため、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現の誘導及びコラーゲン格子の収縮の遅延に最も影響するであろうということが示されている。したがって本発明の方法では、少なくともＰＩＩＩ  ＳＶＭＰのディスインテグリン様／システインリッチドメインを使用すれば十分であると考えられる。したがって、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの前記のフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、類似体、又はミメティックは、これらのドメインを有するか、これらのドメインの少なくとも一部を有するか、これらのドメインから誘導されるか、あるいはこれらの構造に基づいて設計されることが好ましい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「誘導体」は、対象となるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ（特にハララギン）の一部、フラグメント、及び部分を含む。また、誘導体は、一つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を含んでいてもよい。同族体（ホモローグ）は、同じ種のヘビ又は同じ属又は科のヘビの毒と、機能的、構造的、又は立体化学的に類似の（ポリ）ペプチドを含む。あるいは、元のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰポリペプチドの一部のアミノ酸は、類似の電荷、空間配置、コンフォメーション、又はペプチドコンフォメーションへの影響性、を有するアミノ酸で置換されていてもよい。これらのすべての同族体が本発明で考慮されるものである。類似体及びミメティックとしては、非天然アミノ酸を含有する分子、又はアミノ酸を含有しないが実施例に記載のアッセイでＰＩＩＩ  ＳＶＭＰと同じ機能を示す分子を有する分子が挙げられる。天然物スクリーニングは類似体及びミメティックを同定するための有用な方法の一つである。しかし、本発明で考慮の対象となるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの類似体では、側鎖の修飾、（ポリ）ペプチド合成中の非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の導入、及び架橋剤の使用、（ポリ）ペプチド分子又はそれらの類似体の立体配座を制約する他の方法の使用も考慮される。
本発明で考慮される側鎖修飾の例としては、アミノ基の修飾が挙げられ、例えば、アルデヒドと反応させた後でＮａＢＨＬ４と反応させることによる還元的アルキル化、メチルアセトイミデートによるアミジン基転移、無水酢酸によるアシル化、シアネートによるアミノ基のカルバミル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリクロロベンジル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ酸のアシル化、及びピリドキサル−５−リン酸と反応させた後ＮａＢＨ４と反応させるリジンのピリドキシル化が挙げられる。可能なさらに別の修飾、ならびにペプチド及びペプチド類似体の好適な生成方法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４７（１９９８），１２７−１４２、ＷＯ９９／２４０５５号、及びＷＯ９９／５０２８１号に記載されており、これらの記載内容は本明細書に援用される。
さらに本発明では、ＭＭＰのアンタゴニスト又はアゴニストとして作用しうる、対象ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの化学的類似体を用いることもできる。化学的類似体は必ずしも前記ペプチド自体から誘導される必要はないが、コンフォメーション的にある程度の類似性を有する場合がある。例えば、本発明における類似体は、ハララギンの結合部位のエピトープの内部構造を表す抗体又は抗イディオタイプ抗体によって表される。このような抗体又はこれらに対応する結合部位は特に重要である。なぜなら、実施例１及び２に示されるように、公知のα２及びβ１抗体はハララギンの受容体との結合を完全には阻害せず、ハララギンの結合が２価の陽イオンの存在に依存しないように思われる観察と合わせて考えると、ハララギン、及び受容体分子上のコラーゲンに対する結合部位が異なる可能性を示唆しているからである。したがって、ハララギンのα２β１インテグリンへの結合を模倣する抗体又は対応する結合分子は、本発明の方法に特に有用であると予想される。抗体及び抗イディオタイプ抗体の調製方法は当業者には公知であり、例えばＶｏｇｅｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９（２００２），７２９−７３５を参照されたい。あるいは、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの特定の生理学的性質を模倣するように化学的類似体を特異的に設計することもできる。化学的類似体は、化学合成することもできるし、あるいは天然物スクリーニングなどで検出することもできる。
【００１９】
本明細書では実施態様のほとんどは、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、特にハララギン、及びそれらの誘導体を例として説明される。しかしながら、これらの説明は、前述のフラグメント、ペプチド、同族体、類似体、及びミメティック化合物、ならびにこれらの化合物のいずれか一つをコードする核酸にも適用される。
【００２０】
さらに別の局面では、本発明は、患者の線維症又は硬化症を治療又は予防する方法に関し、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは前述の核酸の、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に有効な量を、患者に投与することを含む。また、本発明は、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に使用される組成物に関し、当該組成物はＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは前述の核酸を、患者の線維症又は硬化症の治療又は予防に有効な量だけ含有する。
【００２１】
実施態様の一つでは、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体が最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、次に細胞又は必要とする患者に投与される。別の実施態様では、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰをコードする核酸、又は前記核酸を発現する細胞、又は誘導体が、細胞又は必要とする患者に投与される。
典型的には、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ  タンパク質の発現に使用される発現ベクターは少なくとも一つの転写制御配列の制御下に結合させたＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体をコードする核酸を含む。制御配列は、その技術分野では公知であり、所望の方式（時間及び場所）で対象のタンパク質を直接発現するように選択される。転写制御配列は例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。外来タンパク質の発現に好適なベクターとしては、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、及びｐＵＣ由来プラスミドなどを例示でき、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞での発現に使用される。
好ましい哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するために原核細胞の配列を有し、真核細胞で発現する一つ以上の真核生物の転写ユニットも有する。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、及びｐＨｙｇに由来するベクターが、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、原核細胞と真核細胞の両方において複製と薬剤耐性選択を促進するために、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドの配列によって修飾される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、又はエプスタイイン・バール  ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来、及びｐ２０５）などのウイルスの誘導体も、真核細胞のタンパク質の一過性の発現に使用することができる。プラスミドの調製及び宿主生物の形質転換に使用される種々の方法が当技術分野では公知である。原核細胞と真核細胞の両方に対して好適な他の発現系、ならびに一般的な組換え方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ、及びＭａｎｉａｔｉｓ編著（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １６及び１７を参照されたい。
好ましい実施態様では、プロモーターは構成性プロモーターであり、例えば強いウイルス性プロモーターであり、例えばＣＭＶプロモーターである。プロモーターは、所定の細胞（例えば、専門的には抗原提示細胞）のみでＤＮＡの実質的な転写が起こる細胞特異的又は組織特異的であってもよく、例えば、線維芽細胞又は平滑筋細胞、網膜細胞又はＲＰＥ細胞に特異的なプロモーターであってもよい。線維芽細胞に対して比較的特異的なプロモーターはα２（Ｉ）コラーゲンプロモーター（骨細胞中にも存在する）であると考えられる（Ｚｈｅｎｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０（２００２），１６０９−１６１７、Ａｎｔｏｎｉｖ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１），２１７５４−２１７６４を参照されたい）。平滑筋に特異的なプロモーターは、例えば、平滑筋細胞マーカーのＳＭ２２ａｌｐｈａのプロモーターである（Ａｋｙｕｒａら，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６（２０００），９８３）。網膜色素上皮細胞に特異的なプロモーターは、例えば、Ｒｐｅ６５遺伝子のプロモーターである（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２０００），３１２７４）。プロモーターは誘導性プロモーターであってもよく、例えばメタロチオネインプロモーターであってもよい。他の誘導性プロモーターとしては、転写因子の誘導性結合又は活性化によって制御されるプロモーターが挙げられ、例えば、Ｃｒａｂｔｒｅｅらの米国特許第５，８６９，３３７号及び第５，８３０，４６２号（小分子誘導性遺伝子発現（遺伝子スイッチ）が記載されている）、国際特許出願ＷＯ９４／１８３１７号、ＷＯ９６／０６１１１号、ＷＯ９６／４１８６５号などに記載されており、またＢｕｊａｒｄらによる報告のテトラサイクリン系制御などの他の異種転写系も挙げられ、これはアロステリック「オフスイッチ」と一般に呼ばれており、Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１９９２），５５４７）及びＢｕｊａｒｄらの米国特許第５，４６４，７５８号、第５，６５０，２９８号、及び第５，５８９，３６２号に記載されている。その他の誘導性転写系としては、ステロイド又は他のホルモン系の制御が挙げられる。
核酸を、別の物質をコードする別のＤＮＡ配列（前記核酸と同一又は異なるＤＮＡ分子であってよい）とともに発現するように細胞中に導入することもできる。具体的な物質は後に詳述する。実施態様の一つでは、ＤＮＡは、そのＤＮＡの転写のポリメラーゼをコードし、ポリメラーゼの認識部位を含むことができ、注射製剤は初期量のポリメラーゼを含むことができる。
場合によっては、ポリペプチドの送達が一過的となるように制限された時間で核酸が翻訳されることが好ましい。これは、例えば、誘導性プロモーターを使用することで実現可能である。
本発明で使用される核酸は、化学合成によってその一部又は全体を作製することもでき、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（１９８１），１８５９−１８６２に記載のホスホラミダイト法、又はＭａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ，Ｓｏｃ．１０３（１９８１），３１８５に記載の方法によるトリエステル法によって生成することができ、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で実施することもできる。二本鎖フラグメントは、化学合成による１本鎖生成物から得ることができ、相補鎖を合成し適切な条件下で互いの鎖をアニールするか、あるいは適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって得ることができる。
すべての必要な転写及び翻訳制御要素と作動可能なように結合した核酸は、裸のＤＮＡとして患者に注射することができる。好ましい実施態様では、核酸及び必要な制御要素は、プラスミド又はベクター中に存在した状態で使用される。したがって、本発明の核酸は、非複製性のＤＮＡであってもよいが、レプリケーターをさらに含みうるプラスミドに挿入される。ＤＮＡは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないように設計された配列であってもよい。
本発明により使用される好ましいベクターは、発現ベクターであり、すなわち、細胞中での核酸の発現を可能にするベクターである。好ましい発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核細胞中で発現する真核生物の一つ以上の転写ユニットとの両方を含む発現ベクターであり、前述を参照されたい。哺乳動物（ヒト又は非ヒト）に核酸を導入のための任意の手段を、本発明の実施において、種々のベクターを目的のレシピエント内に運搬することに利用できる。本発明の実施態様の一つでは、トランスフェクションによって、すなわち「裸の」ＤＮＡ又はコロイド分散系との複合体のデリバリによってベクターが細胞に導入される。コロイド系としては、高分子錯体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームなどの脂質系が挙げられる。このような送達システムは、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰタンパク質、そのペプチド、及び誘導体に使用することもできる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合ＤＮＡ又はリポソームが配合されたＤＮＡである。前者の方法では、ＤＮＡの形成の前に、例えば、所望のＤＮＡコンストラクトを有する導入遺伝子を含有するプラスミドに脂質を加えたものを、まず発現に対して実験的に最適化させる（例えば、５’非翻訳領域にイントロンを導入し、不要な配列を除去する（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９５）１２６−１３９））。次にＤＮＡの構築（例えば種々の脂質又はリポソーム材料との配合）を公知の方法及び材料によって実施し、宿主哺乳動物に導入することができ、例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０（１９９４）２４−２９、Ｔｓａｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８、Ａｌｔｏｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５（１９９３），１３５−１４２、及びＣａｒｓｏｎらのコロイド分散系（米国特許第５，６７９，６４７号）を参照されたい。
本発明の好ましい方法では、ウイルスベクターが使用される。導入遺伝子は、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び単純ヘルペスウイルス−１、あるいは組換え細菌又は真核生物プラスミドなどの遺伝子治療に有用な種々のウイルスベクターに組込まれて使用される。種々のウイルスベクターを本発明の実施に使用できるが、ＡＡＶ及びアデノウイルスを利用した方法が特に重要である。このようなベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、特にヒトへの外因性遺伝子の移入に好適な組換え遺伝子導入（送達）システムであると一般に理解されている。ウイルスベクターの選択及び使用に関する以下のさらなる手引きは本発明の実施に有用である。後に詳述するように、対象となる発現コンストラクトのこのような実施態様は、種々のｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療プロトコルで特に使用され得る。
例えば肝硬変、及び全身性線維化（例えば腎線維症、肺線維症、肥厚性瘢痕、及び皮膚のケロイド）、及び／又はそれに罹患する可能性のある他の目標臓器の治療に有用な治療タンパク質をコードする外因性遺伝子の発現に使用することができるベクターが、例えばＷＯ０１／２１７６１号に記載されている。
【００２２】
組換えベクターの好ましい使用方法は、静脈内投与による方法であり、これは治療的有効量が線維症の患者に好都合な単位投与計画で投与される。この投与計画は、疾患の程度によって調節され得る。一般にウイルスベクターの場合、患者当たり約１０１０個のウイルス粒子が単位用量で使用される。組換えベクターを含む医薬化合物の調製は、従来の医薬上許容される担体と組み合わせて当業者には周知の標準的な技術を使用して行うことができ、従来の医薬上許容される担体としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゲル、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセリルモノステアレート粉末、ＮａＣｌ、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、及びこれらに類似したものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物は、溶液、懸濁液、丸剤、錠剤、カプセル、散剤、徐放性処方などの薬剤形態を取りうる。
【００２３】
患者の線維症又は硬化症の治療又は予防のための本発明による別の方法は細胞治療プロトコルを含む。例えば、これらの化合物を長期持続的に全身に送達するために、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体を発現するように遺伝子操作された皮膚線維芽細胞を使用することができる。治療抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ産生及び全身への送達のための対応する方法は、例えば、Ｎｏｅｌら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５（２０００）７４０−７４５に記載されている。同様に、この方法は、後にさらに詳述する本発明の方法により同定及び単離されたＭＭＰ拮抗化合物の送達に使用することができる。
【００２４】
タンパク質又はペプチド材料を使用する場合、好適なプロモーター及び他の適切な転写制御要素を有する発現ベクターへの分子クローニングを行うことで、本明細書に記載のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体をコードするクローン化核酸をリコンビナント発現させ、原核生物又は真核生物宿主細胞に移行させ、これによって組換えタンパク質を産生させることができる。このような操作方法は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋらの文献に詳述されており、当技術分野では公知である。発現ベクターは本明細書に記載されており、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌、ラン藻類、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真菌細胞、及び動物細胞などの種々の宿主での真核生物遺伝子の発現に使用することができる。発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、及びエレクトロポレーションから任意に選択される方法で宿主細胞に導入可能であるが、これらの方法に限定されるものではない。発現ベクターを含有する細胞は、クローニングで増殖させることができ、それぞれについてＰＩＩＩ  ＳＶＭＰタンパク質又はその誘導体を産生するかどうかを分析することができる。これらの宿主細胞クローンの同定は、抗ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ抗体に対する免疫学的活性、及び／又は宿主細胞関連ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ活性の存在など、いくつかの手段によって行うことができるが、これらの手段に限定されるものではない。
ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰのＤＮＡの発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される合成ｍＲＮＡを使用して行うこともできる。合成ｍＲＮＡ、又はＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ産生細胞から単離されたｍＲＮＡは、限定するものではないが小麦胚芽抽出物及び赤血球抽出物などの種々の細胞非使用の系で効率的に翻訳することができ、また限定するものではないがカエル卵母細胞へのマイクロインジェクションなどのセルベース系で効率的に翻訳することもでき、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが一般には好ましい。したがって、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体は、本発明の宿主を核酸が発現する条件で培養するか、核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行い、産生されるタンパク質を回収することによって得ることができる。
形質転換した宿主は、発酵槽で成長させ、当技術分野で公知の技術により培養して、細胞増殖を最適にすることができる。次に、タンパク質を、増殖培地、細胞溶解物、又は細胞膜画分から単離することができる。発現されたタンパク質は、硫安分画、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などの当技術分野の標準的方法によって精製することができ、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照されたい。医薬用途では、少なくとも約９０〜９５％の均質性の実質的に純粋なタンパク質が好ましく、９８〜９９％又はそれを超える均質性が最も好ましい。必要に応じて部分的又は全体的に精製した後、タンパク質は治療に使用したり（体外を含む）、あるいは分析方法の開発及び実施に使用したりすることができる。
【００２５】
本発明を構成する化合物のサイズは、細胞の親油性細胞膜を通過できるように「バイオアベイラビリティの壁」である５００〜６００Ｄａを下回ることが好ましい。一方、タンパク質治療の場合、ＨＩＶウイルスのタンパク質の一部と融合する酵素は、細胞膜を通過することができ、マウスによるｉｎ  ｖｉｖｏの酵素活性が維持されることが最近示された（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（１９９９），１５６９−１５７２）。ＨＩＶウイルスのトランス転写活性促進タンパク質（ＴＡＴタンパク質）は、受容体又はトランスポーターを使用したりＡＴＰを必要としたりせずに細胞膜を通過するという特異な能力を有することがほぼ１０年前から知られている（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｃｅｌｌ  ５５（１９８８），１１７９−１１８８）。その正確な機構は未知であるが、ＴＡＴのタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）が細胞膜の脂質二重層に「穴」を開け、共有結合的に結合してその穴から中に入り込み、再び穴を閉じることが知られている。これは特殊な方法であり、他の方法では細胞を損傷しない。したがって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体又はその他の化合物は、リンカーによってＰＴＤと結合させて、細胞膜を通過させることができ、ＤＤＴ  ４（１９９９），５３７も参照されたい。
【００２６】
一般に、本発明は、ＭＭＰ発現、細胞移動、細胞増殖、収縮、及び／又は  細胞外マトリックス合成又は分泌などの線維芽細胞におけるα２β１インテグリン介在性細胞応答を正常化する方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、線維症又は疾患の治療又は予防方法を提供する。このような疾病又は疾患は一般に、創傷治療部位などの特定の部位で新しい細胞及び細胞外マトリックスが過剰になったりし無秩序に沈着したりするために起こる。この余分な物質は、正常組織の機能を妨害することによって疾患又は障害の原因となりうる。余分な物質は障害となることもある。新しく沈着した細胞及び細胞外マトリックスは一般に瘢痕組織と呼ばれる。大部分の線維症では、瘢痕組織の収縮が起こり、そのためさらに別の望ましくないことが起こりうる。代表的な線維症としては、肺線維症（肺の線維症）、糸球体腎炎（腎臓の線維症）、肝硬変（肝臓の線維症）、上皮又は皮膚の創傷治療、アテローム性動脈硬化症、及び増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）が挙げられる。線維症としては、腱の障害の修復、衝突傷害の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）の外傷の治癒、ＣＮＳに瘢痕組織が形成される症状、脳卒中による瘢痕組織の形成、外傷又は手術などによる組織の接着も挙げられる。したがって、本発明の方法は、瘢痕を減少させて創傷又は線維症を治療することを可能とする。
組織損傷後の創傷治癒は、炎症、増殖、及び瘢痕の調節の３つのフェーズに分割可能な過程である。第１フェーズは、外傷直後の血液眼球関門の破壊、及び初期炎症反応によって引き起こされる。この段階で血小板が損傷部位に移動し、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、及びＥＧＦなどの増殖因子を放出すると考えられている。次にこれらの因子は創傷後数時間で多核白血球を引き寄せ、この多角白血球は循環する血中単球を引き寄せる別の因子を放出し、血中単球はマクロファージになる場合があり、この細胞は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などのさらに別の増殖因子を放出する。創傷治癒過程の第２段階では、マクロファージが結合性組織細胞の増殖及び蓄積を刺激し、組織の肉芽化が起こる。創傷治癒過程の第３フェーズは、細胞及び細胞外マトリックスの再編成からなり、即ち先に形成された組織の変調からなる。次に線維芽細胞は収縮し、肉芽化によって成熟瘢痕となる（Ｐａｓｔｏｒ  Ｊ．Ｃ．Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ４３（１９９８），３）。
実施態様の一つでは、本発明の方法は、コラーゲンとの望ましくない収縮が起こる線維芽細胞に導入遺伝子が送達されるように、前述の核酸を有するベクターを創傷治癒又は線維化の部位と接触させることを含む。導入遺伝子の発現によって、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体が発現され、それによって、実施例に示されるようにコラーゲン格子の収縮の減少又は阻害が起こる。実施例に示されるように、コラーゲンが組織中に存在する場合でも多量のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰを使用する必要がある訳ではない。当然ながら、導入遺伝子を含有するベクターを外傷部位に接触させる代わりに、タンパク質又はペプチドが細胞に取り込まれるような方法で、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又は誘導体タンパク質を直接細胞に送達することも可能であり、例えば、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体をＴＡＴトランスダクションドメインと融合した融合タンパク質を使用する方法によって可能となる（上記参照）。所望の細胞へ到達させるために、所望の細胞を特異的に目標とするベクター又は運搬体を使用することができる。あるいは、又はベクターが外傷部位に送達される場合にはこのようなベクター又は運搬体と併用して、組織又は細胞特異的プロモーターを使用して、所望の細胞で特異的に導入遺伝子を直接発現させることができる。
本発明の方法により治療可能な線維症は、好ましくは肝臓、肺、腎臓、及び心臓の線維症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所性及び全身性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、及び増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される線維症又は硬化症である。好ましくは、前記線維症は皮膚線維症である。
【００２７】
さらに他の局面では、本発明は、生理学的有効量のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、あるいはそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいは前述の定義の若しくは後に更に特定される核酸を、それを必要とする患者に投与することを含む患者の皮膚再建又は創傷治療方法に関する。
前述したように、本発明によると、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ化合物は、望ましくない組織の増殖（例えば、  線維症）を特徴とする症状を治療するために患者に投与され得る。あるいは、任意にＰＩＩＩ  ＳＶＭＰが媒介するＭＭＰ発現又は活性を阻害する化合物を同定して、望ましくない組織の破壊（例えば、治癒しない創傷、慢性潰瘍、化学線（日光）性弾力線維症、及び加齢関連の皮膚の萎縮、腫瘍細胞の浸潤）を特徴とする症状を治療するために患者に投与することができる。ＭＭＰ活性の阻害は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の破壊を防止することによって腫瘍細胞の他の部位への移動（すなわち転移）を防止できるため、腫瘍を有する患者の治療にも有用となりうる。プロテアーゼがタンパク質の性質をいかに変化させることができるかに関する顕著な例はＢｌｏｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２（２０００），６０６−６１２に記載されており、これはマトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）又は膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）で処理されるラミニン５の場合である。無傷のラミニン５は細胞接着を支援するが、ＭＭＰ−２及びＭＴ１−ＭＭＰによって切断されたラミニン５は細胞移動を促進する。興味深いことに、切断されたラミニン５フラグメントは、ｉｎ  ｖｉｖｏで再構成される組織で検出され、例えば皮膚癌、及び妊娠中のラットの乳腺組織で検出されるが、正常組織や未成熟のメスの乳腺組織からは検出されない。ＭＴ１−ＭＭＰは骨及び細胞外結合組織の発育にも重要である。ＭＴ１−ＭＭＰ欠損マウスは、頭蓋異形成症、関節炎、オステオペニア、小人症、及び軟組織線維症などの重篤な骨格性及び骨外性異常を有する。ＭＴ１−ＭＭＰは、別の酵素ＭＭＰ２／ゼラチナーゼＡの活性化に必要であると提言されている。実際、ＭＭＰ２の活性化は、ＭＴ１−ＭＭＰを欠失したマウスの組織抽出物中では低下した。ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰはマトリックスメタロプロテイナーゼの発現、特にＭＴ１−ＭＭＰの発現を促進可能なことを本発明により示されるため、上記のことは本発明のさらに重要な用途を提供する。したがって、前述のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ及びその誘導体、ならびにそれらの化合物をコードする核酸は、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現又は活性、特にＭＴ１−ＭＭＰの以上と関連する障害の治療に使用することができる。一方、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現又は活性、特にＭＴ１−ＭＭＰの発現又は活性に対して拮抗する化合物は、ＭＭＰの望ましくない切断活性と関連する皮膚癌などの疾患の治療に使用することができる。したがって、ＭＭＰ、特にＭＭＰ−１及び／又はＭＴ１−ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物の同定及び単離のための化合物及び方法を提供することも本発明の目的の一つであり、これは前述及び後述のような治療用途に有用となりうる。
【００２８】
したがって、本発明は、ＭＭＰの活性又は発現を調節する化合物の同定及び単離のためのセルベースの方法を含み、これは好ましくは前述の定義のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、あるいはそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいは核酸の存在下で、候補化合物又は化合物の混合物のＭＭＰ活性又は発現を促進又は抑制する能力を調べることを含む。
本発明は、線維症の治療に使用することができる化合物、好ましくは小さな分子の化合物を同定するためのアッセイをさらに提供する。このアッセイは一般に、細胞培養皿中に実質的に単層で存在する線維芽細胞集団の収縮に関して、試験化合物の影響を調べることを含む。さらにより好ましい実施態様では、前記細胞はコラーゲンゲルなどのゲル中で培養される。好ましいコラーゲンゲルはコラーゲンＩ型ゲルである。前記細胞はゲル上で培養されても、あるいはゲル内部で培養されてもよい。好ましい収縮アッセイは実施例に記載される。簡潔に言えば、細胞はゲル（例えばコラーゲンゲル）中に分散され、培養皿に播種され、そして培地が培養皿に加えられる。続いてゲルの直径を測定する（コントロールの直径）。試験物質を加えて細胞を適当な時間インキュベートし、再び直径を測定して収縮が生じたかどうかを調べる。コラーゲンなどのある物質による収縮の刺激に対する試験物質の影響を調べようとする場合には、試験物質とコラーゲンＩ型などの物質を加えて細胞をインキュベートし、コラーゲンに誘導される収縮に対する物質の影響を調べる。線維化の治療ための治療薬の同定をしようとする実施態様では、例えば、コラーゲンと試験物質を細胞に加えてインキュベートして、コラーゲンと試験物質を加えてインキュベートした細胞の収縮と、試験物質を加えなかった場合の細胞の収縮とを比較する。したがって、試験物質の存在下でコラーゲンに誘導される収縮が、試験物質を使用しない場合と比べて減少すると、その試験物質は細胞の収縮を防止していることを示しており、そのため試験物質は、過剰な瘢痕化などの細胞収縮が少なくとも原因の一部である疾患又は障害の治療に有効である。好ましい実施態様では、コラーゲンはＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体で部分的又は完全に置き換えられる。
したがって、一般的には、本発明は、患者の線維症の治療に有効な物質の同定方法を提供し、その方法は、刺激物質の存在下では細胞が収縮する条件下で、前記物質を線維芽細胞及び刺激物質と接触させることを含み、前記物質の存在下での細胞の収縮が、前記物質の非存在下での収縮よりも軽減されると、前記物質が患者の線維症の治療に有効であることが示される。線維芽細胞は、規定サイズのコラーゲンマトリックス中に分散させてもよく、本発明の方法は、前記物質の存在下におけるコラーゲンマトリックスのサイズを前記物質の非存在下でのサイズと比較することを含む。
このアッセイに使用される細胞は初代培養のものであってもよいが、確立された細胞株のものが好ましい。実際、新しい細胞を単離し、新しい細胞培養を確立するよりも細胞株を使用する方がより便利である。ＳＶ４０の感染などの当技術分野で公知の方法によって、細胞株を初代培養から確立することもできる。さらにより好ましい細胞は線維芽細胞である。これらの細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ヒツジ、ウシ、又はニワトリの細胞などの哺乳動物の細胞であってもよい。好ましい実施態様では、細胞は（不死化）皮膚線維芽細胞である。
ある種のゲル収縮アッセイは当技術分野で公知であり、例えばＢｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．７６（１９７９），１２７４−１２７８を参照することができるが、血小板細胞培養とは異なり、線維化と関連する疾患の治療における物質の効果を予測するゲル収縮アッセイに線維芽細胞を使用できることが発見された（実施例で説明する）。新しい細胞を単離する必要がなくいつでもアッセイを実施できるので、細胞株を使用することがはるかに有利である。異なる患者又は動物から得られた新しい細胞を使用するのではなく、アッセイが同じ細胞に基づくため再現性もより優れている。
本発明の好ましいアッセイは、細胞が３次元ゲル内部にあるという点で記載のコラーゲン収縮アッセイとはさらに異なる。ゲル収縮アッセイは数百万の化合物を同時に試験する高処理能力アッセイの形態で容易に実施可能である。
本発明の収縮アッセイは、細胞及び／又はマトリックスの収縮を伴う線維症などの種々の疾患を治療するための化合物を同定するために使用することができる。いずれの線維症であるかを同定するための化合物を同定する場合、アッセイに使用される細胞は、特定の線維症及び細胞収縮を引き起こす疾患における特定の刺激で収縮する細胞と類似するように選択され得る。したがって、例えば、皮膚創傷治療における過剰な瘢痕を防止する化合物を同定する場合は、皮膚線維芽細胞をアッセイに使用することができ、刺激物質はコラーゲンであってよく、より好ましくはＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体である。好ましい実施態様では、細胞は規定サイズのコラーゲン様マトリックス中に分散され、本発明の方法はコラーゲン様マトリックスのサイズを化合物の存在下と非存在下で比較することを含む。本発明の方法は好ましくは、同定した化合物の単離も含む。
【００２９】
出発材料として、通常は多様な約１０５もの様々な分子を含む化合物コレクション等の化合物の混合物が使用され、本発明の方法は一つ以上のサブコレクションを単離するステップを含むことができる。本発明の方法（すなわち「スクリーニングアッセイ」）を実施することによって、当業者であれば、モジュレーター、すなわちα２β１インテグリンと結合する、及び／又はＭＭＰ発現又はＭＭＰ活性などに対して刺激又は抑制作用を有する候補又は試験化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティック、小分子、又はその他の薬物）を同定可能である。好ましくは、前記ＭＭＰはＭＭＰ−１及び／又はＭＭＰ−１４である。例えば、ＭＭＰ活性又は発現を調節する候補化合物又は試験化合物のスクリーニングが可能である。試験化合物は、コンビナトリアルライブラリ法の分野で公知の種々のライブラリの任意のものを使用して得ることができ、例えば、生物学的ライブラリ、空間的にアドレス可能な並列固相又は溶液相ライブラリ、デコンボリューションの必要な合成ライブラリ法、「１ビーズ１化合物」ライブラリ法、及びアフィニティークロマトグラフィーによる選別を使用する合成ライブラリ法を使用することができる。生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに制限されるが、他の４つの方法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は小分子の化合物ライブラリに適用できる（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２（１９９７），１４５）。分子ライブラリの合成方法の例は当技術分野で公知であって、例えばＤｅＷｉｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１９９３），６９０９、Ｅｒｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４），１１４２２、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１９９４），２６７８；Ｃｈｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１（１９９３），１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３（１９９４），２０５９、Ｃａｒｅｌｌら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３  ８（１９９４），２０６１、及びＧａｌｌｏｐら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７（１９９４），１２３３を参照できる。化合物のライブラリは、溶液（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３（１９９２），４１２−４２１）、又はビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４（１９９１），８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４（１９９３），５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、及び第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９２），１８６５−１８６９）、又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０），３８６−３９０、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０），４０４−４０６、Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（１９９０），６３７８−６３８２、及びＦｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１），３０１−３１０）で存在��うる。
【００３０】
好ましい実施態様では、本発明は、前述のステップのいずれか一つを含む抗癌薬の製造方法に関し、ＭＭＰ活性量の減少又は活性ＭＭＰ量の減少が抗癌薬に対する指標となる。最近、Ｋｕｒｓｃｈａｔら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９７（２００２），１７９−１８７で、マトリックスメタロプロテイナーゼによるタンパク分解の増加は、腫瘍細胞と近接する間質に主に局在化されることが示された。特に、腫瘍−間質相互作用部位でＭＰ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−２の強い発現を示すことができる。したがって、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性を阻害又はこれと拮抗するとして本発明により同定され単離された化合物は、悪性メラノーマの治療に特に有用である。
【００３１】
別の好ましい実施態様では、本発明は、創傷治療を支援する薬剤の製造方法に関し、この方法は前述の本発明のスクリーニング及び単離方法のステップのいずれか一つを含み、ＭＭＰ活性量の減少又は活性ＭＭＰ量の減少が前記薬剤に対する指標となる。
【００３２】
したがって、さらに本発明は、医薬組成物の製造方法に関し、特に癌、好ましくはメラノーマ、又は前述のような線維症、創傷治療、さらにはある美容上の価値を有しうる組織再構成などの一般的な用途のための医薬組成物の製造方法に関する。本発明の方法は、前述のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体のいずれか一つの使用、又は前述のＭＭＰのモジュレーターを同定して得るための本発明の方法のステップのいずれか一つを実施することを含み、さらに（ａ）（ｉ）カルボキシル基のエステル化、又は（ｉｉ）ヒドロキシル基とカルボン酸のエステル化、又は（ｉｉｉ）ヒドロキシル基と、例えばホスフェート、ピロホスフェート、又はサルフェート又はヘミサルフェートとのエステル化、又は（ｉｖ）医薬上許容される塩の形成、又は（ｖ）医薬上許容される錯体の形成、又は（ｖｉ）薬理学的に活性のポリマーの合成、又は（ｖｉｉ）親水性部分の導入、又は（ｖｉｉｉ）芳香族部分又は側鎖の置換基の導入又は交換、置換パターンの変更、又は（ｉｘ）等配電子部分又は生物学的等価部分の導入による改質、又は（ｘ）同族化合物の合成、又は（ｘｉ）分岐側鎖の導入、又は（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への転化、又は（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、又は（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化、又は（ｘｖ）Ｍａｎｎｉｃｈ塩基、イミンの合成、又は（ｘｖｉ）ケトン又はアルデヒドの、Ｓｃｈｉｆｆ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チオゾリジン、又はそれらの組合せへの変換によって、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体、あるいはリード化合物として単離された化合物を修飾して、（ｉ）作用、活性スペクトル、又は器官特異性の修飾部位、及び／又は（ｉｉ）効力の向上、及び／又は（ｉｉｉ）毒性の減少（治療指数の増加）、及び／又は（ｉｖ）副作用の減少、及び／又は（ｖ）治療効果の開始、効果持続時間の変更、及び／又は（ｖｉ）薬物動力的パラメータ（吸収、分布、代謝、及び排泄）の修正、及び／又は（ｖｉｉ）物理化学的パラメータ（溶解性、吸湿性、色、食味、におい、安定性、状態）の修正、及び／又は（ｖｉｉｉ）全体的な特異性、器官／組織特異性の向上、及び／又は（ｉｘ）使用形態及び経路の最適化を行うステップ、ならびに（ｂ）前記修飾した化合物と医薬上許容される担体から生成物を得るステップとを含む。
上記の種々の工程は一般に当技術分野で公知である。例えば、これらの技術を実施するためのコンピュータプログラムが利用可能であり、例えば、Ｒｅｉｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）が利用可能である。化学的誘導体及び類似体の調製方法は当業者には公知であり、例えば、Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｅｄｉｔｉｏｎＮｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｉｎｃ．，１７５  Ｆｉｆｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００１０  Ｕ．Ｓ．Ａ．、及びＯｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡに記載されている。さらに、前述の方法などによって、ペプチドミメティック及び／又は適切な誘導体及び類似体のコンピュータ支援デザインを使用することができる。薬物発見のリード化合物創出法も、タンパク質と質量分析の使用（Ｃｈｅｎｇら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（１９９５），８８５９−８８６０）、及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）法（Ｆｅｊｚｏら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（１９９９），７５５−７６９、Ｌｉｎら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２（１９９７），８９３０−８９３１）の使用を含む。これらは、定量的な構造−作用関係（ＱＳＡＲ）分析（Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（１９９３），２５５３−２５６４，Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｐｈａｒｍ．Ｕｎｓｅｒｅｒ  Ｚｅｉｔ  ２３（１９９４），２８１−２９０）コンビナトリアル生化学、古典的化学、及びその他を含んだりそれらを基礎としている場合もある（例えば、Ｈｏｌｚｇｒａｂｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ  Ｈｅｌｖ．７４（２０００），１４９−１５５参照）。さらに、担体及び製剤方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照することができる。上述した本発明の方法のいずれか一つにより薬剤を選択すると、その薬剤又はそのプロドラッグを治療的有効量となるように合成することができる。本明細書で使用される場合、「治療的有効量」とは、患者に有意義な利益をもたらす、すなわちアポトーシスと関連する症状の治療、治癒、予防、又は回復、あるいはそのような症状の治療、治癒、予防、又は回復の速度の増加を示すために十分な薬剤又はプロドラッグの全量を意味する。加えて又は代替的に、特に薬物の前臨床試験に関する場合、「治療的有効量」とは、非ヒト動物試験で生理学的反応を誘発するのに十分な薬物又はプロドラッグの全量を意味する。
【００３３】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後の薬物又はプロドラッグは、排泄あるいは１種類以上の活性又は不活性代謝物質に代謝することによって除去するために代謝される（Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２４（１９９６），４４９−４５９）。したがって、本発明の方法による同定され得られた実際の化合物又は薬物を使用するよりも、患者体内で活性形態に変化するプロドラッグとして作用する製剤を使用することができる。プロドラッグ及び薬物の使用に対して行うことができる予備的測定は文献に記載されており、レビューのＯｚａｍａ，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１（１９９６），３２３−３２９を参照することができる。
さらに、本発明は、前述のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又は前述の関連化合物、又はそれらの化学的誘導体、あるいは核酸、あるいはそのいずれかを含むベクター又は細胞を含む組成物の使用に関する。本発明の組成物は、医薬上許容される担体をさらに含むことができる。用語「化学的誘導体」は、通常は基本分子の一部としては存在しない別の化学的部分を含有する分子を意味する。このような部分は、基本分子の溶解性、半減期、吸収などを向上させ得る。あるいは、これらの部分は、基本分子の望ましくない副作用を軽減したり、基本分子の毒性を低下させたりすることもある。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどの種々の文献に記載されている。好適な医薬用担体の例は当業者には公知であり、リン酸緩衝液、水、油／水エマルションなどのエマルション、種々の湿潤剤、無菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、公知の従来方法によって製剤することができる。これらの医薬組成物は、適当な投与量で患者に投与することができる。好適な組成物の投与は、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉投与、局所投与、又は皮内投与などの種々の方法で行うことができる。鼻内噴霧製剤などのエアロゾル製剤においては、活性物質に保存剤及び等張剤が加えられた精製水溶液又は他の溶液を含む。このような製剤は、ｐＨ及び等張状態が鼻粘膜と適合するように調整されることが好ましい。直腸投与又は経膣投与用の製剤は、適当な担体を使用した座剤として提供することができる。
投与計画は、主治医及び臨床的要因によって決定される。医療分野では公知であるが、患者の投与量は、患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与時間及び経路、身体全体の健康状態、及び同時に投与される他の薬剤などの多くの要因に依存する。典型的な投与量は、例えば０．００１μｇ〜１０ｍｇの範囲内（発現又は発現の阻害のための核酸もこの範囲内）とすることができ、特に上記要因を考慮して、この範囲より少ない、又は多い投与量を設定してもよい。一般に、医薬組成物の規則的投与としての投与計画では、１日当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲とされる。投与計画が連続的輸液である場合は、体重１ｋｇ、１分間当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲とされる。定期的な診断によって経過を観察することができる。場合によって異なるが、静脈内投与によるＤＮＡの好ましい投与量は約１０６〜１０１２コピーのＤＮＡ分子である。
【００３４】
本発明の組成物は、局所的又は全身的に投与することができる。一般に投与は非経口的に行われ、例えば静脈内投与であり、ＤＮＡを使用する場合には、目標部位に直接投与することもでき、例えば、内部又は外部目標部位への微粒子銃送達（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、又は動脈内の部位へカテーテルなどによって投与することができる。非経口投与用の製剤としては、滅菌した水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性／水性溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられ、例えば食塩水及び緩衝媒体が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、又は不揮発性油が挙げられる。静脈用媒体としては、流動性栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースを主成分とするものなど）などが挙げられる。保存剤及び他の添加剤も使用することができ、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなどを使用できる。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の用途に応じて、インターロイキンやインターフェロンなどの薬剤も含むことができる。
【００３５】
本発明の治療又は診断用組成物は、ＭＭＰ活性の調節が見られる異常を治療又は診断するのに十分な有効投与量で患者に投与される。有効量は、患者の状態、体重、性別、及び年齢などの要因によって変動しうる。他の要因としては投与形態が挙げられる。本発明の医薬組成物は、冠内、腹腔内、皮下、静脈内、経皮、滑膜内、筋肉内、又は経口経路などの種々の経路で患者に投与される。さらに、他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合もある。
治療的有効投与量は、症状及び状態を改善する、前述の本発明ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ及び関連化合物、ポリヌクレオチド、及びベクターの投与量を意味する。このような化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物を利用した標準的な医薬的手順によって決定することができ、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な投与量）及びＬＤ５０（集団の５０％が死亡する投与量）によって決定される。治療効果と毒性作用との投与量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表現することができる。
【００３６】
本発明は、上述の方法を実施するためのキットも提供し、当該キットは、前述の定義のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、あるいはそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティック、あるいは核酸を含み、さらに細胞、アガロースゲル、コラーゲン、抗体、細胞増殖培地、核酸プローブの中の一つ又は複数を含んでいてもよい。一態様では、所定量の上記成分を収容する容器を含む。本発明のキットは、他の組成物や、及びそれを含有する化合物を細胞又は組織に投与するために有用な装置（例えば、シリンジ）を含んでいてもよい。また、使用説明書を含んでいてもよい。本発明のキットは、箱、ブリスターパック、又は液体の収容に使用される同様の包装材料などの包装材料に封入することができる。包装材料は、輸送及び貯蔵中の内容物の無菌性を維持しやすくするために不浸透性カバーでコーティングすることができる。容器はガラスびんが好ましいが、液体のロス又は内容物の汚染のない状態で液体の輸送及び貯蔵が可能な、びん又は袋の形態の剛性又は可撓性プラスチックなどの任意の不活性材料で作製することができる。本発明のキットの他の形態としては、本明細書に記載のゲル収縮アッセイの構成成分を含む。例えば、本発明のキットは、アッセイに使用される細胞（例えば、細胞株、好ましくは線維芽細胞）、ゲル（例えば、コラーゲンＩ型）、細胞増殖培地、刺激物質（例えば、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ）、及び標準試薬を含んでもよい。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、前述のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、又はミメティックを含む人工結合組織等に関する。
【００３８】
有効な創傷修復を促進するために、人工移植材料への医療的な要求は大きい。
慢性的又は欠損の大きな創傷の例としては、床ずれ（褥瘡性潰瘍）、糖尿病性皮膚潰瘍、静脈鬱血性潰瘍、火傷、及び腫瘍切除後に現れる異常が挙げられる。大規模の全層性熱創傷の治療は、中間層皮膚移植及び自家網状植皮などの外科的皮膚移植法の発達によってかなり向上している。しかしながら再生した皮膚の品質は正常な無傷の組織と比較すると不十分である。そのため、創傷収縮及び瘢痕形成が起こって、関節が外傷と近接している場合には大きな機能障害となりうる。実験及び臨床データに基づく予備的な結果は、代用真皮を使用することによって、創傷収縮を抑制し皮膚構築を改善することが可能なことを示している。より有効な治療計画では、機能障害及び不快感が少なくなり、瘢痕修正の形成外科手術の必要性及びコストが押さえられる。このような治療によって、重要な社会経済的影響が生じ、すなわち入院が少なくなり、生活の質が向上し、医療費が軽減される。
【００３９】
したがって、本発明は代用真皮を提供し、それは通常は、線維芽細胞（場合によってはさらに内皮細胞）の浸透、接着、増殖、及び新しいマトリックスの形成産生を補助可能な支持構造と、真皮成分及び表皮成分の両方を支持可能な代用真皮及び代用表皮の組合せの代用皮膚とからなる。この人工組織で使用される材料の潜在的有効性は、内部に成長する細胞を支持する能力、接着に好適な基材の提供、細胞増殖及び細胞外マトリックス産生の促進、及び制御された方法による創傷部位の再吸収などのいくつかの要因に依存する。
最小限の毒性、低免疫原性、及び無傷の組織と同様の引張特性等もさらに要求される。多数の材料が修復の実験モデルとして評価されてきており、そのような材料としては、コラーゲン（多くはウシ又はブタ由来）、フィブリン、フィブロネクチン、キチン／キトサン、コンドロイチン−６−硫酸、基底膜タンパク質、ヒアルロン酸、ポリ乳酸、及びポリグリコール酸が挙げられる。任意の組織工学製品の細胞成分は、自己細胞、同種細胞、異種組織、又は線維芽細胞を組込んだコラーゲンスポンジであってよい。
【００４０】
本発明では、培養組織又は代用真皮／表皮、及び代表皮膚はそれぞれ、前述のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体のいずれか１種類を、追加成分又はコラーゲンＩの代用として含む。さらに、前述のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ又はその誘導体、あるいは本発明の方法により得られた化合物を含む人工結合組織は、骨新生を促進する歯周治療などで代用骨移植材料として使用することができる。この実施態様では、無機質ウシ骨基質への細胞の付着を促進し、骨の再生を促進するためにＰＩＩＩ  ＳＶＭＰは、コラーゲンＩ型の代替物として使用される。この点に関しては例えば、Ｌａｌｌｉｅｒら，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８０（２００１），１７４８−１７５２を参照されたい。
【００４１】
これら及びその他の実施態様は、本発明の説明及び実施例によって開示され、また説明される。本発明により使用されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、方法、使用法、及び化合物のいずれかに関するさらに詳細な文献は、電子機器などを使用して公共図書館及びデータベースから入手することができる。例えば、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  及び／又は  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが提供する公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を利用することができる。ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （ＥＭＢＬ）の一部であるｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）などのさらに別のデータベース及びウェブアドレスは当業者には公知であり、インターネットの検索エンジンを使用して調べることができる。バイオテクノロジーの特許情報の概要、及び遡及調査及び現状把握調査に有用な特許情報の関連情報の概説が、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４に記載されている。
【００４２】
上記開示は本発明を概略的に説明している。以下の具体的実施例を参照することによってより十分に理解することができ、これらの実施例は単に説明の目的で提供さるものであり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。すべての引用文献（本出願全体に記載の参考文献、発行特許、公開特許出願など）の記載内容を特に本明細書に援用する。
他に明記しない限り、本発明の実施には、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組み換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術が使用され、これらは当業者には公知である。これらの技術は公知文献で十分説明されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、論文のＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）を参照されたい。
【００４３】
【実施例】
［材料及び方法］
（抗体及び試薬）
以下の抗体を使用した。β１（４Ｂ４；コールター・コーポレーション（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、α２（Ｐ１Ｅ６；バイオモル（Ｂｉｏｍｏｌ））、及びα３（バイオモル）インテグリン鎖に対する機能阻止マウスｍＡｂ。ＭＴ１−ＭＭＰに対する単一特異性マウス抗体は、ヒトＭＴ１−ＭＭＰの残基１６０〜１７３に対応するペプチドに対して作製された（１１４−１Ｆ２；フジ・ケミカルズ（Ｆｕｊｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））。ヒトＭＭＰ−１に対するウサギポリクローナル抗体はＤｒ．Ｐ  Ａｎｇｅｌ（ＤＫＦＺ，ハイデルベルグ）の好意により提供された。ヒトＭＭＰ−１に対する市販のモノクローナル抗体は、フジ・ケミカル（Ｆｕｊｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）（富山、日本）より販売されている。イムノブロッティングに使用したヒトα１インテグリン鎖に対する機能阻止マウス抗体、ヒトＨＬＡ−ＡＢＣに対するマウス抗体、及びβ１インテグリンサブユニット抗体に対する抗体はケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）製である。ハララギンに対するウサギポリクローナル抗体はＤｒ．Ａ．Ｓ．Ｋａｍｉｇｕｔｉより提供され、参考文献１９に記載されている。
【００４４】
既報の方法（１９）ようにＢ．ｊａｒａｒａｃａの毒液よりハララギンを精製した。５ｍＭの１，１０−フェナントロリンで３７℃において５分間処理することによってタンパク分解活性を不活性化した（２５）。
【００４５】
（細胞培養及び免疫染色）
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、及びそれぞれ１００Ｕ／ｍｌのペニシリンとストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）で外植片の増殖より得たヒト真皮線維芽細胞を培養した。継代数１〜９の線維芽細胞を使用した。３次元コラーゲンゲルを既報の方法で調製した（９）。簡潔に述べると、Ｉ型コラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ、ビトロゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ））と１０×ＤＭＥＭを１０：１の比で混合し、０．１ＭのＮａＯＨを加えて中和した。線維芽細胞を１×１０５細胞／ｍｌの密度でコラーゲンゲル中に播種し、３７℃でインキュベートした。あるいは、線維芽細胞の浮遊液にハララギン１００ｎＭを加えて３７℃で２０分間プレインキュベートしてから、コラーゲンゲルに播種した。残りの表面積を測定することでゲル収縮の比率をモニタした。
【００４６】
インテグリン結合試験の場合、トリプシン処理によってコンフルエントの単層培養物から細胞を剥がし、遠心分離で回収し、増殖培地に再懸濁させた。組織培養プラスチックプレートに播種する前に、異なる濃度の抗体の存在下３７℃で２０分間細胞をプレインキュベートした。細胞の生存度を、トリパンブルー排除法で測定した。
α２インテグリンを検出するために、線維芽細胞をチャンバースライド上で培養した。４８時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、次に冷アセトンで固定した。タンパク質の細胞質ドメインに対するウサギ抗α２抗体（ケミコン）を使用して４％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中４℃で終夜染色を行い、続いてヤギ抗ウサギ−Ｃｙ３抗体（１：４００、ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中、ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ））を加えて加湿チャンバー中室温で１時間インキュベートした。１次抗体を使用しないものをネガティブコントロールとした。
【００４７】
（接着アッセイ）
セミコンフルエントな線維芽細胞の単層培養物をトリプシン処理し、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％のＢＳＡ、及びインスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウムを製造元（シグマ（Ｓｉｇｍａ））推奨の濃度で含有するＤＭＥＭ中に再懸濁させた。競合アッセイの場合、抗体を細胞懸濁液に加えてプレートに播いた。既報の方法と同様に接着アッセイを実施した（２６）。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートに、１００μｌの活性又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギン（４μｇ／ｍｌ）、モノマーコラーゲンＩ型（４０μｇ／ｍｌ）、又は５０％ＦＣＳをコーティングして４℃で終夜静置した。熱変性ＢＳＡ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ中１％のＢＳＡ）を加えて室温で１時間インキュベートすることによって、ＢＳＡコーティングと非特異的結合部位のブロッキングを行った。ウェルを２回洗浄した後、細胞（２×１０４細胞／ウェル）を播種し、３７℃で２時間インキュベートした。接着しなかった細胞をＰＢＳで２回洗浄することで除去し、接着した細胞は３％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で固定し、０．５％のクリスタルバイオレットを含む２０％（ｖ／ｖ）メタノールで染色した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウムの５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を加えることによって発色させた。発色した溶液の光学濃度を５９５ｎｍで測定した。コントロールアッセイ（ＦＣＳ又はハララギンをあらかじめコーティングしたプレート）で得られた値を１００％に設定して、これに対する値を計算した。統計分析をＡＮＯＶＡ  Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定で行った。
【００４８】
（可溶性α２β１の固定化ハララギンへの結合）
既述の方法（２７）で細胞質ドメインと膜貫通ドメインをＦｏｓ及びＪｕｎ二量化モチーフで置き換えた発現プラスミドを使用して昆虫細胞中で、組換え可溶性ヒトインテグリンα２β１外部ドメインヘテロ二量体を調製した。
３ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１Ｍの酢酸を含有するトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中４μｇ／ｍｌと４０μｇ／ｍｌの濃度のハララギン及びウシＩ型コラーゲンでマイクロタイタープレートをコーティングした。終夜インキュベートした後、ウェルを熱変性ＢＳＡでブロックし、１０ｍＭのＥＤＴＡの非存在下又は存在下で６μｇ／ｍｌの可溶性α２β１インテグリンを加え室温で２時間インキュベートした。続いて、ウェルを２回洗浄し、ウサギ抗ヒトβ１インテグリン抗血清及びアルカリホスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体をそれぞれ１次抗体及び２次抗体として使用して、基質結合インテグリンをＥＬＩＳＡで検出した。ｐ−ニトロフェニルホスフェートをＥＬＩＳＡの基質として使用し、４０５ｎｍで生成物を測定した。各値は２回ずつ測定し、標準偏差を計算した。
【００４９】
（細胞膜の調製及びウエスタンブロット分析）
粗原形質膜を調製するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼインヒビターのアプロチニン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｐｅｆａｂｌｏｃ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）、及びロイペプチン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳでプレートをこすり取った。ドライアイス・エタノール／３７℃浴中で細胞懸濁液の凍結溶解を３サイクル実施し、細胞の溶解を顕微鏡で確認した。５００×ｇで遠心分離して溶解物を細胞核から分離した。次に、上清を７０００×ｇで４℃において１５分間遠心分離した。粗原形質膜をＰＢＳ／インヒビターで１回洗浄し、遠心分離後、ＰＢＳに再懸濁させた。全溶解物の調製のため、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５％のＮＰ４０を含有するＰＢＳ中に溶解させた。溶解物を１５０００×ｇで４℃において２０分間遠心分離した。タンパク質濃度は市販のアッセイ（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））を使用して測定した。
ウエスタンブロッティングのために、膜調製物、溶解物、又は調整培地から等量のタンパク質を、還元条件下で１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させて、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｓｕｐｅｒ（登録商標）（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））上に転写した。非特異的結合部位を、５％の脱脂粉乳を含有し０．５％のＴｗｅｅｎ（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳでブロックした後、ブロットに１次抗体を加えて４℃で終夜インキュベートした。結合した１次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼの結合した２次抗体（１：２０００；ダコ（Ｄａｋｏ））を使用して検出し、ＥＣＬシステム（ＥＣＬ（商標）、ファルマシア・バイオテック）で可視化した。
【００５０】
（線維芽細胞に結合するハララギンの分析）
精製ハララギンにビオチン−ＸＸスルホスクシンイミジルエステルを使用してビオチンと結合させた。ビオチン標識ハララギンの標識及び精製を、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ（登録商標）  Ｍｉｎｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ  ＰｒｏｔｅｉｎＬａｂｅｌｉｎｇキット（モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、ライデン、オランダ）で行った。結合から離れるハララギンの能力、ビオチン化ハララギンが線維芽細胞から離れる能力を分析するため、ビオチン化ハララギンの存在下で線維芽細胞を２４時間インキュベートした後、濃度の異なる未標識ハララギンを加えてさらに２４時間インキュベートした。処理から４８時間後、細胞表面と結合する全ハララギン（ハララギン及びビオチン化ハララギン）及びビオチン化ハララギンを測定するために、冷ＰＢＳで２回洗浄し、還元性試料緩衝液で直接溶解して調製した細胞溶解物のウエスタンブロットを行った。ブロッティング後、膜に抗ハララギン抗体（結合する全ハララギンの可視化のため）、又はエクストラアビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）（登録商標）−ペルオキシダーゼ（ビオチン化ハララギンのみの可視化のため）（１：１０００、シグマ）を加えて１時間インキュベートして、前述のように検出を行った。
【００５１】
（ザイモグラフ分析）
ハララギン刺激を使用又は使用せずに細胞を単層培養した。種々の時点で、培地を回収し、ウシゼラチン（シグマ）を含有する１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離させた（２０μｌ／レーン）。次に、ゲルを２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で３０分間洗浄した後、メタロプロテイナーゼ基質緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＣａＣｌ２）中で終夜インキュベートした（２８）。クマシーブルーＲ２５０でゲルを染色し、水中で脱染色した。
【００５２】
（ノーザンブロット分析）
チオシアン酸グアニジンで細胞を直接溶解し、続いてフェノール−クロロホルム抽出を行って全ＲＮＡを単離した（２９）。全ＲＮＡ（５μｇ）をホルムアルデヒド／アガロースゲルに展開し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ファルマシア・バイオテック）上にブロットし、ＭＴ１−ＭＭＰ（３０）、ＭＭＰ−１（３１）、及びα２インテグリン鎖用のランダムプライム３２Ｐ−標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた（３２）。
【００５３】
［実施例１］
ハララギンは線維芽細胞の接着を支援し、コラーゲン格子収縮を阻害する［この実施例は、ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰハララギンがコラーゲン格子収縮を阻害し、またインテグリンα２β１への結合が伴うことを示す。収縮及びその結果得られる収縮力は、肥厚性瘢痕などの線維症の重要な要素である］
【００５４】
ハララギンをコーティングした皿と、Ｉ型コラーゲンをコーティングした皿で線維芽細胞の接着量は同程度であることが分かった（図１Ａ）。線維芽細胞のハララギン又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギンへの接着の間に有意差は見られなかった。図１Ｂに見られるように、α２又はβ１インテグリンサブユニットに対する阻止抗体の存在下ではハララギンへの細胞接着が約３０％減少したが、どちらもコラーゲン受容体として作用しうるα１又はα３インテグリンに対する他の機能阻止抗体では阻害は起こらなかった（２）。α２及びβ１抗体の両方を組合せて使用すると、ハララギンへの細胞接着は使用量に依存して最大約６０％阻害された。
線維芽細胞ハララギンで予備処理した後、コラーゲン格子中で細胞をインキュベートすると、格子の収縮の遅れが顕著となった（図２）。２４時間では、未処理の線維芽細胞は、初期表面積の約３０％までゲルを収縮させた。しかしながら、１００ｎＭのハララギンの存在下では、同程度の収縮は４８時間経過しても観察されなかった。細胞生存率は、処理及び未処理線維芽細胞培養で同等であった。線維コラーゲンＩ型格子の収縮はインテグリンα２β１によって調節されることが示されているので（１２−１４）、これらの結果から、ハララギンがα２β１−コラーゲンの相互作用を妨害することによって収縮を遅らせると考えられる。
【００５５】
［実施例２］
ハララギンとインテグリン受容体α２β１の相互作用［この実施例は、ハララギンがインテグリンα２β１の可溶性外部ドメインと結合し、この結合は２価の陽イオンの存在に依存しないと思われることを示す。さらに、この実験は、ディスインテグリン様／システインリッチドメインを含むハララギンのフラグメントによって観察される生物学的活性が得られることを示す。このことは、ディスインテグリン様／システインリッチドメインを有する他のＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ及びＡＤＡＭも、ハララギンと同様に使用できるか、あるいは少なくとも修飾することができるという仮定を裏付ける重要な観察である。］
【００５６】
先行する研究では、ＰＩＩＩ  ヘビ毒メタロプロテイナーゼによるα２β１インテグリンの血小板への結合の結果、通常は有効な血小板凝集が連動してコラーゲン刺激血小板で誘導されるシグナル伝達が阻害されることが示されている（２２，２３）。ハララギンが細胞表面タンパク質と結合するかどうかを調べるために、上清と粗線維芽細胞膜の両方をハララギンで２４時間及び４８時間インキュベートした後にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した（図３）。ハララギン特異的抗体を使用したイムノブロットにより５５ｋＤａのバンドが検出され、細胞培養上清にハララギンが存在することが示された。約３３ｋＤａの別のバンドは、ディスインテグリン様／システインリッチドメイン（ハララギン−Ｃ）で構成されるハララギンのタンパク分解フラグメントを示していると思われる（図３Ａ）。２４時間で単離した膜の場合、無傷のハララギンに対応する弱く染色された５５ｋＤａのバンドが検出された。このバンドの強度は４８時間で顕著に増大した（図３Ｂ）。５２ｋＤａのもう一つのバンドは、回復していないハララギン又はタンパク分解した形態を表していると思われる（１３）。さらに、これらのデータから、線維芽細胞の細胞表面タンパク質と結合するハララギンは、ハララギン−Ｃを形成する部位でタンパク分解から保護すると思われる。
ハララギンの細胞表面への結合の特異性を示すための分析を行った。これらの実験では、線維芽細胞の細胞表面からビオチン化ハララギンを置換するために未標識ハララギンを使用した。図４Ａに示されるように、未標識ハララギンは、細胞表面と結合するビオチン化ハララギンを濃度依存的に置換することができる。
図４Ｂでは、インテグリンα２β１の可溶性外部ドメインが固定化ハララギンと結合している。しかしながら、コラーゲンＩ型とは対照的に、可溶性α２β１受容体のハララギンへの結合は、２価の陽イオンの存在に依存しないように思われた。これは、ハララギンとコラーゲンの場合では、受容体分子上の結合部位が異なる可能性を示唆している。
【００５７】
［実施例３］
コラーゲンゲル培養で増殖させた線維芽細胞をハララギン処理しても、ＭＭＰのコラーゲン誘導合成に影響しなかった［この実験は、実施例４と合わせて、ハララギン様コラーゲンがＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１の転写を誘導することを示す。］
【００５８】
コラーゲン格子中で２４時間及び４８時間増殖させた後、１００ｎＭのハララギンで前処理した線維芽細胞から全ＲＮＡを単離し、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの転写量をノーザンブロット分析で調べた（図５）。コラーゲンゲル中で増殖したコントロールの線維芽細胞では、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１の転写量が２４時間の増殖で増加し、４８時間の培養ではさらに増加した。どちらの時点でも、ハララギンによる前処理の有無によって観察される転写量に有意差は認められなかった。さらに、未処理及びハララギン処理の両方の線維芽細胞でインテグリンα２のｍＲＮＡ量が同様な増加を示した。したがって、ハララギンによる前処理による、コラーゲン格子中の線維芽細胞の増殖への明らかな影響は認められなかった。
【００５９】
［実施例４］
線維芽細胞単層培養物のハララギン処理を行うと、コラーゲン格子中で増殖した線維芽細胞で観察されるのと同様の変化が見られた。［この実験は、ハララギンなどのＰＩＩＩ  ＳＶＭＰは、α２β１インテグリンと結合してマトリックスメタロプロテイナーゼを活性化させることによって、コラーゲン格子ミメティックとして作用できることを示している。この観察から、ハララギン及び同様の結合特性を示すその誘導体は、線維症及び創傷治癒に重要な要素である、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現を誘導するために使用することができると結論できる。さらに、ＭＭＰ発現又は活性に拮抗又はこれらを阻害する化合物を同定するアッセイ系を確立可能となる。このような化合物は癌、特にメラノーマの治療に非常に有用であると期待される。］
形態：濃度の増加するハララギンで処理した線維芽細胞細胞の形態分析によると、コラーゲンゲル中で増殖した線維芽細胞で報告されるものと同じ細胞の伸張による突起を有する特徴的な細長い形状を示した（９）。未処理の線維芽細胞は、平坦な細胞形状で紡錘状形態の特徴を維持した（図６）。
ＭＭＰのｍＲＮＡ発現：有意な変化が検出されないコラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞とは対照的に、ハララギンで処理した単層培養では図５に示すように有意な差が生じた。単層培養では、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１の転写は非常に少なかった。しかしながら、ハララギンで前処理した線維芽細胞では、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１のｍＲＮＡ発現が強く誘導されるとともにα２−インテグリンの転写量も増加した。これらの増加は２４時間で明らかであり、４８時間でこの増加はコラーゲン格子中で培養した線維芽細胞で得られるものに匹敵した。さらに、ＭＭＰのｍＲＮＡ量の誘導は濃度に依存することが分かり、細胞を２００ｎＭのハララギンで前処理した場合に刺激が最大となった（図７）。
ハララギンのメタロプロテイナーゼ活性がＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの発現の誘導に必要かどうかを調べるために、線維芽細胞の単層培養物を活性ハララギン又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギンで処理した（２２）。図８に見られるように、タンパク分解で不活性となったハララギンで線維芽細胞を処理すると、活性ハララギンで処理した線維芽細胞と比較してＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰのｍＲＮＡ量に有意差は見られなかった。不活性化ハララギンによる処理後に観察されるｍＲＮＡ量にわずかな減少が見られるのは、１，１０−フェナントロリンによるコントロール線維芽細胞処理で示されるように、一般メタロプロテイナーゼインヒビター１，１０−フェナントロリンが存在することによるものであった。
ＭＭＰタンパク質発現：ハララギンで処理した細胞の粗膜調製物のＭＴ１−ＭＭＰのウエスタンブロット分析では、未処理線維芽細胞と比較して、産生される活性６０ｋＤａＭＴ１−ＭＭＰタンパク質量が２４時間及び４８時間の両時点において増加することが示された（図９Ａ）。不活性状態のチモーゲンに対応する、６３ｋＤａの別の免疫反応性タンパク質も少量検出された（３３，３４）。処理した単層培養におけるＭＴ１−ＭＭＰ産生の増加と並行して、活性酵素に対応する６２／５９ｋＤａの形態で示されるｐｒｏＭＭＰ−２の活性化が向上された（図９Ｂ）。ハララギンで処理した細胞の上清中のＭＭＰ−１タンパク質を分析すると、２４時間及び４８時間処理の両方で、不活性ＭＭＰ−１形態の５２／５７ｋＤａが増加し、活性ＭＭＰ−１の４２／４７ｋＤａも見られた（図９Ｃ）。
ハララギンのタンパク分解活性が、ＭＴ１−ＭＭＰ及びｐｒｏＭＭＰ−２の活性化と直接関連があるという可能性について評価した。ｐｒｏ形態のＭＴ１−ＭＭＰのみを含有するＭＴ１−ＭＭＰを安定に発現する細胞株（３４）から調製した細胞膜をハララギンで処理すると、ｐｒｏＭＴ１−ＭＭＰの活性化は生じなかった。さらに、ｐｒｏＭＭＰ−２を含有する培地をハララギンで処理してもチモーゲンの活性化は見られなかった。これらの観察から、ｐｒｏＭＴ１−ＭＭＰの活性化もｐｒｏＭＭＰ−２の活性化もハララギンのタンパク分解活性と関係がないと示唆された。
α２β１タンパク質発現：前述したように、コラーゲン格子中で増殖した線維芽細胞において、α２β１に誘導されるＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの増強をハララギンは阻害しなかった。驚くべきことに、単層培養では、ハララギンを加えることによって、α２−インテグリンサブユニットならびにＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの転写量が増加し、このことは、このインテグリン受容体を阻害するのではなくむしろ活性化することを示している。コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞はα２β１インテグリン発現の増加に反応し、一方、線維芽細胞が単層で増殖する場合には変化は見られない（１６）ことが分かった。線維芽細胞をハララギンで処理した後に単層で増殖させると、α２β１−インテグリン免疫染色が有意に増加し、一方未処理の単層培養では特異的な染色は見られなかった（図１０Ａ）。ハララギンで処理した細胞中のα２インテグリンサブユニットのウエスタンブロット分析によると、２４時間でタンパク質量のわずかな増加が見られ、４８時間処理では有意な増加となった（図１０Ｂ）。細胞表面におけるα２インテグリン量の増加は、図３に示されるハララギンの結合の増加を説明できる。
これらのデータは、線維芽細胞をハララギンで処理することによって、コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞において観察されるのと同様に、遺伝子発現が変化し、また細胞の表現型が変化することを示している。したがって、この系では、ハララギンは、α２β１インテグリンと結合してシグナル伝達を活性化させることによってコラーゲン格子ミメティックとして作用することができる。
【００６０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでは皮膚線維芽細胞は、線維コラーゲンを含む細胞外マトリックスに囲まれている。ｉｎ  ｖｉｖｏ環境を再現するアプローチとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが数年前に確立され、このモデルはｉｎ  ｖｉｖｏ環境をある程度模倣していると考えられている（９、３５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでは、線維芽細胞は主に線維状Ｉ型コラーゲンからなる３次元マトリックスに埋め込まれる。コラーゲン環境では、ＭＭＰ−１、ＭＴ１−ＭＭＰ、及びα２β１インテグリンなどの多様なタンパク質の発現を変化させるα２β１媒介性細胞内シグナル伝達が生ずる（１０、１６、１３）。最近、単層で接着する場合と比べると、３次元マトリックス中で接着する場合の線維芽細胞は、局所的な接着複合体、形態、及び生物学的活性が非常に異なることが示された（３６）。これらの結果は、それが接着する細胞外マトリックスの構造が異なると細胞の反応が異なるという概念を強く肯定するものである。
ヘビ毒メタロプロテイナーゼハララギンは、α２β１インテグリンと結合することによってコラーゲン誘導性血小板凝集を阻害し、それによってコラーゲンの結合を遮断し、引き続く細胞表面受容体媒介性シグナル伝達も阻害する（１８、１９）。本発明の目的は、ハララギンなどのＰＩＩＩ  ＳＶＭＰが、線維コラーゲンと接触する場合に観察される、α２β１が媒介する線維芽細胞の変化を阻害しうるかどうかを調べることであった。
本発明によると、ハララギンは線維芽細胞の細胞表面と結合し、興味深いことに経時によって結合量が増加することが示された。これは、線維芽細胞にハララギンを加えて初期にインキュベートすると観察される、細胞表面で発現されるα２β１受容体の増加によって説明できる。ハララギンと線維芽細胞の相互作用は、結合した標識ハララギンがハララギンと特異的に置換され得ることから（図４Ａ）、ハララギンと細胞表面との間の一つ又は複数の特異的な相互作用を介して生ずると考えられる。
固定化ハララギンへの線維芽細胞の結合はＳＶＭＰのタンパク分解活性に依存しなかった（図８）。コラーゲン結合性インテグリンのサブユニット（α２、α１、α３、及びβ１）に対する抗体、あるいはα２及びβ１のインテグリン鎖に対する抗体の混合物で線維芽細胞をプレインキュベートすると、コントロールの約４０％まで結合量が阻害された（図１Ｂ）。この不完全な阻害に対する説明の一つとして考えられるのは、α２β１インテグリン以外に、他のインテグリン又はマトリックス結合受容体が線維芽細胞のハララギンへの接着に関与しているということである。このことは、タンパク質の複数のドメイン（メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリン様、及びシステインリッチ）のそれぞれが細胞表面相互作用と関与しうると仮定すれば必ずしも驚くべきことではない（３７）。さらに、組換えα２β１の外部ドメインとハララギンの直接の結合は陽イオンに依存しないことも示された（図４Ｂ）。コラーゲンを含むほとんどのマトリックス成分は、陽イオンに依存してα２β１インテグリンと結合する（３８）。しかしながら、最近の報告では、ｐｒｏＭＭＰ−１との結合を補助するα２サブユニットのＩ−ドメインに非陽イオン依存性部位が存在することが示された（３９）。したがって、ハララギンは、陽イオン依存性部位とは異なる部位でα２β１インテグリンと相互作用することによって線維芽細胞と結合し、抗α２抗体が使用されても、それはＩ−ドメインの非陽イオン依存性部位における結合を効率的に阻害するように作用するとは限らない。これは、ハララギンの可溶性α２β１に対する不完全な阻害に対する可能性のある説明である。いくつかの報告では、α２β１インテグリンはハララギンと結合することが示されており（１８、１９、２３）、本発明の結果はこれを裏付けているが、他の受容体もハララギンの細胞表面への結合に関与しているという可能性を排除するものではない。
単層での線維芽細胞の増殖とは対照的に、線維状Ｉ型コラーゲンを含むコラーゲン格子中（１６）で線維芽細胞を増殖させると遺伝子発現の顕著な変化が観察された。したがって、本発明者らは、線維芽細胞をハララギンで処理してからコラーゲン格子中で増殖させると、コラーゲンフィブリルとα２β１結合に関して競合し、コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞に観察される、典型的なα２β１媒介性シグナル伝達反応が阻害されると予想した。しかしながら、コラーゲン格子中で増殖する線維芽細胞をハララギン処理によって、コラーゲンで誘導されるＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１転写量の増強が全く阻害されなかった。ハララギン処理によってコラーゲン格子収縮が遅延したが、この現象はインテグリンα２β１が媒介するものであることが示されている（１１、１３、１４）。本発明のデータでは、試験した濃度においてハララギンのα２β１インテグリン受容体に対する結合は、未変性基質コラーゲンとわずかしか競合しなかった。他の研究者らは、ハララギン又はハララギン−Ｃの存在量が増加すると、血小板のモノマーコラーゲンへの接着が濃度依存的に阻害されることを示している（２３）。
コラーゲン結合に対して線維芽細胞のハララギン処理が部分的に競合したが（コラーゲンゲル収縮が遅れることで示される）、コラーゲン誘導性のＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１のｍＲＮＡ発現については変化がなかった。このことから、ハララギンが結合したα２β１インテグリン集団では、インテグリンの線維コラーゲンへの結合が繰り返されるという、同様のシグナル伝達現象が生じていたと考えられる。これはコラーゲン格子中（１６）で増殖する細胞で観察される反応と類似の反応を、単層培養によってハララギンが誘導したという結果でさらに実証された。これらは、ＭＭＰ−１及びＭＴ１−ＭＭＰの発現、ならびにｐｒｏＭＭＰ−２活性化の誘導を伴った。ＭＴ１−ＭＭＰの外見上の増加は緩やかなものであったが、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＴＩＭＰ−２、及びｐｒｏＭＭＰ−２の機能的な化学量論を得るためには十分であり、このため、ザイモグラフィーで観察されるようにｐｒｏＭＭＰ−２の全体的な活性化が見られる。
ハララギン処理した単層培養で観察される効果は、α２β１インテグリンが媒介しているコラーゲンゲル中で起こる効果と類似しているため、ハララギンは、生理学的なリガンドの効果を実質的に模倣していると推測される。このことは、ハララギンがα２β１インテグリンの可溶性外部ドメインと結合するという発見によって裏付けられている。
ハララギンはα２β１外部ドメインの結合をサポートすることができるが、ＥＤＴＡがこの過程を阻害しないこと、即ちこの結合は２価の陽イオンに依存しないことは驚くべきことであった。リガンド−インテグリン相互作用の大部分は２価イオンに依存しているが（３８）、コラーゲンとα２Ｉ−ドメインの結合は金属イオンが無くても起こりうることが最近になって報告されている（４０）。これらの著者は、コラーゲンの結合はＩ−ドメインのコンフォメーションが「開いた状態」では金属依存性となり、「閉じた状態」では金属非依存性となる可能性があることを示唆している。
線維芽細胞の処理によって観察される活性が、ハララギンのどの領域によるものなのかは分かっていない。ＰＩＩＩ  ＳＶＭＰの異なる領域がα２β１インテグリンと結合することが示されている。これらの領域の一つは、ディスインテグリン様ドメイン中にあるＥＣＤモチーフである（４１）。ハララギンの第２の領域であるＲＫＫＨモチーフは、メタロプロテイナーゼドメイン内にある（２４）。可能性のある第３の部位はシステインリッチドメインである。Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｔｒｏｘの毒液から単離されたＰＩＩＩ  ＳＶＭＰであるａｔｒｏｌｙｓｉｎ  Ａの組換えシステインリッチドメインは、コラーゲン刺激性血小板凝集を阻害することが示されており、したがって血小板α２β１インテグリンと結合可能であることを示している（３７）。ディスインテグリン様／システインリッチドメインのみを含有する毒タンパク質を使用した本発明による予備的研究によると、これらのドメインは、線維芽細胞の処理に使用する場合にハララギンに見られる活性と同様の活性を誘導できることが分かった。したがって、プロテイナーゼドメインは、これらの活性に関して重要な役割を果たしていないと思われる。
Ｋａｍｉｇｕｔｉ及び共同研究者によるデータ（２５）は、コラーゲン誘導性の血小板凝集の阻害は、血小板上のα２インテグリンサブユニットのＩ−ドメインとハララギンが結合することにより起こることを示している。対照的に、線維芽細胞がハララギンで処理されると、ＭＭＰ合成が増強されることにより、α２β１インテグリン受容体の活性化が観察された。Ｋａｍｉｇｕｔｉ及び共同研究者（２２）は、コラーゲン誘導性の血小板凝集の阻害によって、チロシンキナーゼｐｐ７２ｓｙｋのコラーゲン刺激性リン酸化の現象が引き起こされることも示している。
血小板において、コラーゲンによって誘導される活性化及び凝集はα２β１、ＧＰＶＩ、及びαＩＩｂβ３の協同作用に依存し（４２）、そのためハララギンのα２β１への結合は、効率的なシグナル伝達には十分とならない可能性がある。さらに、ハララギンと血小板α２β１の結合によって、コラーゲンとα２β１及び／又はＧＰＶＩの十分な結合は、これら２つの受容体と近接している場合には阻害される可能性がある。これらの事象は、全体的な効果として血小板凝集を阻害しうる。しかしながら、線維芽細胞についての状況はかなり異なる。ハララギンとα２β１インテグリンの結合は、線維コラーゲンの場合に観察されるものと実質的に同一の細胞のシグナル伝達を誘導するために十分である。したがって、異なる細胞が信号の伝達に同じインテグリンを使用することができるが、他の受容体又は細胞のシグナル経路が存在することで異なる活性が得られると考えられる。本発明により実施される実験で示されるように、血小板中でハララギンはα２β１受容体に結合して血小板凝集を阻害することができるが、線維芽細胞中ではハララギンはα２β１受容体の媒介するシグナル伝達を促進して、ＭＭＰ−１、ＭＴ１−ＭＭＰ、及びα２β１インテグリンの発現を促進する。したがって、意外ではないが、リガンドがシグナル伝達受容体と結合して得られる活性を考慮する場合、受容体と他の細胞表面受容体との関係、ならびに信号伝達に利用されるパスウェイの理解に注意を払う必要がある。
ＲｅｐｒｏｌｙｓｉｎのＡＤＡＭファミリー内の分子は、種々のインテグリンと結合することが示されている（４３）。例えば、ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１５は、それらのディスインテグリン様／システインリッチドメインを介してα９β１インテグリンと結合し、それによって細胞間の接触を調節することが示されている（４４）。その他の例として、ＡＤＡＭ２３はαｖβ３インテグリンと結合し、天然由来の細胞の細胞相互作用を調節することが示されている（４５）。これは精子−卵子の融合を促進するが、ＡＤＡＭ／インテグリン相互作用につながるシグナル伝達に関するデータは非常にわずかである。これらに提示されるデータに基づくと、ＡＤＡＭによるα２β１インテグリンの結合後の細胞シグナル伝達によって、ハララギン結合の場合と同一又は類似の生物学的活性が誘導されると推測するのが合理的である。
当業者であれば、日常的な実験によって、本明細書に記載される特定の実施態様に限らず、これらと等価な多くの実施態様を認識し、また確認することができる。このような等価物は請求項に含まれるものである。
【００６１】
以下、本明細書における参考文献を記載する。
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４．  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ａ．Ｌ．  （１９９２）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ９，  ２１６−２３４
５．  Ｅｂｌｅ，  Ｊ．Ａ．，  Ｇｏｌｂｉｋ，  Ｒ．，  Ｍａｎｎ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｋｕｈｎ，  Ｋ．  （１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２，  ４７９５−４８０２
６．  Ｔｕｃｋｗｅｌｌ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ，  Ｄ．Ａ．，  Ｇｒｅｅｎ，  Ｌ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，  Ｍ．Ｊ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １０８，  １６２９−１６３７
７．  Ｇｒｉｎｎｅｌ，  Ｆ．  （１９９４）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２４，  ４０１−４０４
８．  Ｇｒｉｎｎｅｌ，  Ｆ．，  Ｈｏ，  Ｃ．−Ｈ．，  Ｌｉｎ，  Ｙ．−Ｃ．，  ａｎｄ  Ｓｋｕｔａ，  Ｇ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ９１８−９２３
９．  Ｍａｕｃｈ，  Ｃ．，  Ｈａｔａｍｏｃｈｉ，  Ａ．，  Ｓｃｈａｒｆｆｅｔｔｅｒ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｋｒｉｅｇ，  Ｔ．  （１９８８）  Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １７８，  ４９３−５０３
１０．  Ｍａｕｃｈ，  Ｃ．，  Ａｄｅｌｍａｎｎ−Ｇｒｉｌｌ，  Ｃ．Ｂ．，  Ｈａｔａｍｏｃｈｉ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｋｒｉｅｇ，  Ｔ．  （１９８９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ２５０，  ３０１−３０５
１１．  Ｓｅｌｔｚｅｒ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｌｅｅ，  Ａ．−Ｙ．，  Ａｋｅｒｓ，  Ｋ．Ｔ．，  Ｓｕｄｂｅｃｋ，  Ｂ．，  Ｓｏｕｔｈｏｎ，  Ｅ．Ａ．，  Ｗａｙｎｅｒ，  Ｅ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎ，  Ａ．Ｚ．．  （１９９４）  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２１３，  ３６５−３７４
１２．  Ｃｈａｎ，  Ｂ．Ｍ．，  Ｍａｔｓｕｕｒａ，  Ｎ．，  Ｔａｋａｄａ，  Ｙ．，  Ｚｅｔｔｅｒ，  Ｂ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈｅｍｌｅｒ，  Ｍ．Ｅ．（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，  １６００−１６０２
１３．  Ｋｌｅｉｎ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｄｒｅｓｓｅｌ，  Ｄ．，  Ｓｔｅｉｎｍａｙｅｒ，  Ｔ．，  Ｍａｕｃｈ，  Ｃ．，  Ｅｃｋｅｓ，  Ｂ．，  Ｋｒｉｅｇ，  Ｔ．，  Ｂａｎｋｅｒｔ，  Ｒ．Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ，  Ｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１５，  １４２７−１４３６
１４．  Ｌａｎｇｈｏｌｚ，  Ｏ．，  Ｒｏｅｃｋｅｌ，  Ｄ．，  Ｍａｕｃｈ，  Ｃ．，  Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ，  Ｅ．，  Ｂａｎｋ，  Ｉ．，  Ｋｒｉｅｇ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｅｃｋｅｓ，  Ｂ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３１，  １９０３−１９１５
１５．  Ｒｉｉｋｏｎｅｎ，  Ｔ．，  Ｗｅｓｔｅｒｍａｒｃｋ，  Ｊ．，  Ｋｏｉｖｉｓｔｏ，  Ｌ．，  Ｂｒｏｂｅｒｇ，  Ａ．，  Ｋａｈａｒｉ，  Ｖ．−Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｏ，  Ｊ．  （１９９５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０，  １３５４８−１３５５２
１６．  Ｚｉｇｒｉｎｏ，  Ｐ．，  Ｄｒｅｓｃｈｅｒ，  Ｃ．，  Ｍａｕｃｈ，  Ｃ．  （２００１）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８０，  ６８−７７
１７．  Ｆｏｘ，  Ｊ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，  Ｃ．  （１９９８）  Ｓｎａｋｅ  Ｖｅｎｏｍ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （Ｂａｉｌｅｙ，  Ｇ．，  ｅｄ．），  ｐ．１５１−１７８．  Ａｌａｋｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｆｔ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  ＣＯ．
１８．  Ｊｉａ  Ｌ．−Ｇ．，  Ｓｈｉｍｏｋａｗａ  Ｋ．−Ｉ．，  Ｂｊａｒｎａｓｏｎ  Ｊ．Ｂ．，  Ｊ．  Ｆｏｘ．  （１９９６）  Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３４，  １２６９−１２７６．
１９．  Ｐａｉｎｅ，  Ｍ．Ｊ．Ｉ．，  Ｄｅｓｍｏｎｄ，  Ｈ．Ｐ．，  Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｄ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｃｒａｍｐｔｏｎ，  Ｊ．Ｍ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６７，  ２２８６９−２２８７６
２０．  Ｋａｍｉｇｕｔｉ，  Ａ．Ｓ．，  Ｈａｙ，  Ｃ．Ｒ．Ｍ．，  Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｄ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｚｕｚｅｌ，  Ｍ．  （１９９６）Ｔｏｘｉｃｏｎ  ３４，  ６２７−６４２
２１．  Ｈａｔｉ，  Ｒ．，  Ｍｉｔｒａ，  Ｐ．，  Ｓａｒｋｅｒ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，  Ｋ．Ｋ．  （１９９９）  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２９，  １−１９
２２．  Ｋａｍｉｇｕｔｉ，  Ａ．Ｓ．，  Ｍａｒｋｌａｎｄ，  Ｆ．Ｓ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｑ．，  Ｌａｉｎｇ，  Ｇ．Ｄ．，  Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｄ．Ｇ．，  ａｎｄ  Ｚｕｚｅｌ，  Ｍ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ３２５９９−３２６０５
２３．  Ｄｅ  Ｌｕｃａ，  Ｍ．，  Ｗａｒｄ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｏｈｍｏｒｉ，  Ｋ．，  Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｒ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｄｔ，  Ｍ．Ｃ．（１９９５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０６，  ５７０−５７６
２４．  Ｉｖａｓｋａ，  Ｊ．，  Ｋａｐｙｌａ，  Ｊ．，  Ｐｅｎｔｉｋａｉｎｅｎ，  Ｏ．，  Ｈｏｆｆｒｅｎ，  Ａ．−Ｍ．，  Ｈｅｒｍｏｎｅｎ，  Ｊ．，  Ｈｕｔｔｕｎｅｎ，  Ｐ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍ．Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｏ，  Ｊ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，３５１３−３５２１
２５．  Ｋａｍｉｇｕｔｉ，  Ａ．Ｓ．，  Ｈａｙ，  Ｃ．Ｒ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｚｕｚｅｌ，  Ｍ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２０，  ６３５−６４１
２６．  Ｚｉｇｒｉｎｏ，  Ｐ．，  Ｇａｉｅｔｔａ，  Ｇ．，  Ｚａｍｂｏｎｉｎ  Ｚａｌｌｏｎｅ，  Ａ．，  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，  Ａ．Ｊ．，  ａｎｄＱｕａｒａｎｔａ，  Ｖ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２２１，  ５１−５８
２７．  Ｅｂｌｅ，  Ｊ．Ａ．，  Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，  Ｋ．Ｗ．，  Ｇａｕｔｈｉｅｒ，  Ｌ．，  Ｄｅｒｓｃｈ，  Ｐ．，  Ｋｒｕｋｏｎｉｓ，Ｅ．，  Ｉｓｂｅｒｇ，  Ｒ．Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈｅｍｌｅｒ，  Ｍ．Ｅ．  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，  １０９４５−１０９５５
２８．  Ｈｏｗａｒｄ，  Ｅ．Ｗ．，  Ｂｕｌｌｅｎ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｂａｎｄａ，  Ｍ．Ｊ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６６，１３０６４−１３０６９
２９．  Ｃｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，  Ｎ．  （１９８７）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６２，  １５６−１５９
３０．  Ｓａｔｏ，  Ｈ．，  Ｔａｋｉｎｏ，  Ｔ．，  Ｏｋａｄａ，  Ｙ．，  Ｃａｏ，  Ｊ．，  Ｓｈｉｎａｇａｗａ，  Ａ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｓｅｉｋｉ，  Ｍ．  （１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，  ６１−６５
３１．  Ａｎｇｅｌ，  Ｐ．，  Ｂａｕｍａｎｎ，  Ｉ．，  Ｓｔｅｉｎ，  Ｂ．，  Ｄｅｌｌｕｓ，  Ｈ．，  Ｒａｈｍｓｄｏｒｆ，  Ｈ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｌｉｃｈ，  Ｐ．  （１９８７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７，  ２２５６−２２６６
３２．  Ｈｅｍｌｅｒ，  Ｍ．Ｅ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０，  １５２４−１５２６
３３．  Ｌｅｈｔｉ，  Ｋ．，  Ｌｏｈｉ，  Ｊ．，  Ｖａｌｔａｎｅｎ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａ，  Ｊ．  （１９９８）．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３３４，  ３４５−３５３
３４．  Ｋｕｒｓｃｈａｔ，  Ｐ．，  Ｚｉｇｒｉｎｏ，  Ｐ．，  Ｎｉｓｃｈｔ，  Ｒ．，  Ｂｒｅｉｔｋｏｐｆ，  Ｋ．，  Ｓｔｅｕｒｅｒ，  Ｐ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｅ．Ｃ．，  Ｋｒｉｅｇ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｍａｕｃｈ，  Ｃ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４，  ２１０５６−２１０６２
３５．  Ｂｅｌｌ，  Ｅ．，  Ｉｖａｒｓｓｏｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｌ，  Ｃ．  （１９７９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，  １２７４−１２７８
３６．  Ｃｕｋｉｅｒｍａｎ  Ｅ，  Ｐａｎｋｏｖ  Ｒ，  Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＤＲ，  Ｙａｍａｄａ  ＫＭ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，１７０８−１２
３７．  Ｊｉａ  ＬＧ，  Ｗａｎｇ  ＸＭ，  Ｓｈａｎｎｏｎ  ＪＤ，  Ｂｊａｒｎａｓｏｎ  ＪＢ，  Ｆｏｘ  ＪＷ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １３０９４−１０２
３８．  Ｅｍｓｌｅｙ，  Ｊ．，  Ｋｎｉｇｈｔ，  Ｃ．Ｇ．，  Ｆａｒｎｄａｌｅ，  Ｒ．Ｗ．，  Ｂａｒｎｅｓ，  Ｍ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｒ．Ｃ．  （２０００）  Ｃｅｌｌ  １００，  ４７−５６
３９．  Ｓｔｒｉｃｋｅｒ  ＴＰ，  Ｄｕｍｉｎ  ＪＡ，  Ｄｉｃｋｅｓｏｎ  ＳＫ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｌ，  Ｎａｇａｓｅ  Ｈ，  Ｐａｒｋｓ  ＷＣ，  Ｓａｎｔｏｒｏ  ＳＡ．  （２００１）    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９３７５−８１
４０．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．，  Ｅｓｔａｖｉｌｌｏ，  Ｄ．，  Ｅｍｓｌｅｙ，  Ｊ．，  Ｂａｎｋｓｔｏｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ｌｉｄｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｒ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｃｒｕｚ，  Ｍ．Ａ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５，  ４２０５−４２０９
４１．  Ｋａｍｉｇｕｔｉ，  Ａ．Ｓ．，  Ｚｕｚｅｌ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｄ．Ｇ．  （１９９８）  Ｂｒａｚ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓ．  ３１，  ８５３−８６２
４２．  Ｋａｍｉｇｕｔｉ，  Ａ．Ｓ．，  Ｔｈｅａｋｓｔｏｎ，  Ｒ．Ｄ．Ｇ．，  Ｗａｔｓｏｎ，  Ｓ．Ｐ．，  Ｂｏｎ，  Ｃ．，  Ｌａｉｎｇ，  Ｇ．Ｄ．，  Ｚｕｚｅｌ，  Ｍ．  （２０００）  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３７４，  ３５６−３６２
４３．  Ｅｖａｎｓ  ＪＰ．  （２００１）  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３，  ６２８−３９
４４．  Ｅｔｏ  Ｋ，  Ｐｕｚｏｎ−ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｗ，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｄ，  Ｓｅｈａｒａ−Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ａ，  Ｚｈａｎｇ  Ｘ−Ｐ，Ｔａｋａｄａ  Ｙ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５，  ３４９２２−３４９３０
４５．  Ｃａｌ  Ｓ，  Ｆｒｅｉｊｅ  ＪＭＰ，  Ｌｏｐｅｚ  ＪＭ，  Ｔａｋａｄａ  Ｙ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎ  Ｃ．  （２０００）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １１，  １４５７−１４６９
【００６２】
以下、次の事項を開示する。
１１．  患者の線維症または硬化症の治療または予防に十分な量の、請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を患者に投与するステップを含む、線維症又は硬化症の治療又は予防方法。
１２．  前記核酸が、普遍的及び／又は組織特異的プロモーターによって制御される、目的のタンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する組換えベクターである、１１．に記載の方法。
１３．  前記線維症又は硬化症が、肝臓繊維症、肺繊維症、腎臓繊維症、及び心臓線維症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、局所性及び全身性強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕、並びに増殖性硝子体網膜症からなる群より選択される疾患である、１１．又は１２．に記載の方法。
１４．  前記線維症が皮膚線維症である、１１．に記載の方法。
１５．  生理学的有効量の、請求項１から９のいずれかにおいて規定されるＰＩＩＩ  ＳＶＭＰ、又はそのフラグメント、ペプチド、誘導体、同族体、若しくはミメティック、あるいは核酸を、治療を必要とする患者に投与するステップを含む、皮膚再建又は創傷治療方法。
【図面の簡単な説明】
【図１】「ハララギンは細胞接着基質である」  Ａ：実施例における「材料及び方法」に記載されるように、４μｇ／ｍｌのハララギン又は１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギン、４０μｇ／ｍｌのコラーゲンＩ型、あるいは５０％ＦＣＳのいずれかをコーティングしたマイクロタイタープレート（２×１０４細胞／ウェル）に線維芽細胞を播種した。ネガティブコントロールとしてＢＳＡをコーティングしたウェルも使用した。２時間後、非接着性の細胞を取り除き、接着性の細胞を固定後にクリスタルバイオレットで染色した。棒グラフは、それぞれ２回ずつ繰り返した３つの独立した実験で発色した後に測定した光学濃度の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表している。ＦＣＳをコーティングした皿（ＯＤ５９５ｎｍ＝０．６６±０．０８）で得られた平均値を１００％と設定した。Ｂ：線維芽細胞に、α２、α１、α３、又はβ１インテグリン鎖に対するモノクローナル抗体（２．５μｇ／ｍｌ）、又はα２及びβ１インテグリン鎖に対する抗体の混合物（各２．５μｇ／ｍｌ又は５μｇ／ｍｌ）を加えてインキュベートした。次にこれらの細胞を、ハララギン（４μｇ／ｍｌ）をあらかじめコーティングしたプレートに播種し、２時間培養した。ＨＬＡ抗体（５μｇ／ｍｌ）をコントロールとして使用した。棒グラフは、それぞれ２回ずつ実施した３つの独立した実験で発色した後に測定した光学濃度の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表している。処理をしないハララギンをコーティングしたウェルへの付着で得られた平均光学濃度（ＯＤ５９５ｎｍ＝０．５±０，０９）を１００％と設定した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図２】「ハララギンはコラーゲンゲル収縮を阻害する」  ハララギン非存在下（白いバー）又は１００ｎＭ存在下（黒いバー）のコラーゲンゲル中でヒト線維芽細胞を増殖させた。図示される各時点でゲル表面積を測定した。初期ゲル表面積を１００％としたときのパーセント値として収縮度合が示される。結果はそれぞれ３回繰り返した２つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表される。
【図３】「ハララギンと結合する線維芽細胞からの膜の調製」  線維芽細胞を、ハララギン非存在、又は１００ｎＭのハララギンの存在下で（＋Ｊ）２４時間及び４８時間単層培養（ｍ）した。２４時間後、培地を取り替え、新しいハララギンを加えた。各時点で培地を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。これと並行して、「材料及び方法」に記載のように細胞を膜調製に使用した。２０μｌの調整培地（Ａ）と４０μｇの未精製膜画分（Ｂ）を、還元条件下で１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上に展開した。ブロッティング後、ハララギンに対するポリクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）を使用して免疫検出することによって特定のタンパク質バンドを可視化した。ハララギンに特異的な５５及び３３ｋＤａのバンドを矢印で示している（後者は分解生成物であると思われる）。分子量標準が示される（ｋＤａ）。
【図４】「組換え可溶性α２β１インテグリンはハララギンと結合する」  Ａ：細胞に１００ｎＭのビオチン化ハララギン（Ｊ＊）を加えて２４時間インキュベートした後、所定濃度（５０〜１００ｎＭ）の未標識ハララギン（Ｊ）を加えてさらに２４時間インキュベートした。４８時間処理した後にハララギン及びビオチン化ハララギンと結合した細部表面をウエスタンブロットで測定した。ブロッティング後、膜を抗ハララギン抗体、又はエクストラビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ、登録商標）−ペルオキシダーゼで調べた。Ｂ：精製ハララギン（Ｊ）又はＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌ  Ｉ）を等モル濃度でコーティングした（４μｇ／ｍｌのハララギン及び４０μｇ／ｍｌのコラーゲン）。可溶性α２β１インテグリンを、２ｍＭのＭｇＣｌ２（白いバー）又は１０ｍＭのＥＤＴＡ（黒いバー）のいずれかの存在下で固定化リガンドに結合させた。洗浄及び固定の後、α２β１インテグリンと結合した量を、「材料及び方法」に記載のようにして定量化した。これらのバーは、それぞれ２回繰り返した３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを表している。
【図５】「単層で増殖させた線維芽細胞のハララギン処理によって、コラーゲンゲル中で増殖された場合と同様の変化の誘導が観察される」  同数の線維芽細胞を、細胞培養プラスチック上の単層（ｍ）、又は３次元コラーゲンゲル中（ｇ）で、ハララギン非存在下又は１００ｎＭのハララギン存在下（＋Ｊ）で増殖させた。培養の２４時間後及び４８時間後に全ＲＮＡを抽出し、ノーザンブロット分析に供した（５μｇ／レーン）。ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＭＰ−１、及びα２インテグリンサブユニットに対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを使用して転写物量を検出した。ＲＮＡ量は、１８  ＳｒＲＮＡオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって評価した。転写物長はＭＴ１−ＭＭＰで４．５ｋｂ、ＭＭＰ−１で２．２ｋｂ、そしてα２インテグリン鎖で８ｋｂであった。
【図６】「ハララギンは線維芽細胞の形態を変化させる」  ハララギン非存在下（−）又は所定量のハララギン存在下（５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭ）で単層培養により４８時間増殖させた線維芽細胞を光学顕微鏡で分析した。バーは２５μｍを表す。
【図７】「ララギンによって誘導される変化は添加量に依存する」  ハララギン非存在下（−）又は所定量のハララギン存在下（５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭ）で単層培養により４８時間増殖させた線維芽細胞を、ノーザンブロット分析、及びゼラチンザイモグラフィーで分析した。５μｇの全ＲＮＡをホルムアルデヒド／アガロースゲル上で展開し、ナイロン膜に転写し、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１に対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡ量は、１８ＳｒＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって評価した。
【図８】「ハララギンのメタロプロテイナーゼドメインを不活性化させてもｍＲＮＡ量には影響しない」  ハララギン非存在下、あるいは１００ｎＭのハララギン（＋Ｊ）、１００ｎＭの１，１０−フェナントロリン−不活性化ハララギン（＋ｉＪ）、又は１００ｎＭの１，１０−フェナントロリン（＋Ｐｈ）の存在下で、線維芽細胞を単層培養（ｍ）により４８時間増殖させた。４８時間後、全ＲＮＡを単離し、ホルムアルデヒド／アガロースゲル上で分離した（５μｇ／レーン）。ＲＮＡを転写した後、ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１に対する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとそのナイロン膜をハイブリダイズさせた。１８  ＳｒＲＮＡのハイブリダイゼーションからＲＮＡ量は等しいことが分かる。
【図９】「ハララギン処理によって、処理された線維芽細胞内の活性ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＭＰ−１量が増加する」  ハララギン非存在下又は１００ｎＭのハララギン存在下（＋Ｊ）で、単層（ｍ）で２４時間又は４８時間増殖させた線維芽細胞から、未精製膜調製物（Ａ）又は調整培地（Ｂ，Ｃ）を調製した。ウエスタンブロット分析から、４０μｇの膜調製物又は２０μｌの調整培地を、還元条件下で１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＭＴ１−ＭＭＰタンパク質（Ａ）をヒトＭＴ１−ＭＭＰ（１１４−１Ｆ２、１μｇ／ｍｌ）に対する単一特異性抗体を使用して検出し、一方ＭＭＰ−１タンパク質はヒトＭＭＰ−１に対するウサギポリクローナル抗体を使用して検出した（Ｃ）。結合した抗体はＥＣＬを使用して可視化した。プロＭＴ１−ＭＭＰ（６３ｋＤａ）、活性ＭＴ１−ＭＭＰ（６０ｋＤａ）、プロＭＭＰ−１（５２／５７ｋＤａ）、及び活性ＭＭＰ−１（４２／４６ｋＤａ）の分子量は右に示している。ゼラチンザイモグラフィー（Ｂ）のために、非還元条件下で１５μｌの調整培地を１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上で分離した。プロＭＭＰ−２（７２ｋＤａ）及び活性化ＭＭＰ−２形態（６２／５９ｋＤａ）の分子サイズを右に示している。
【図１０】「ハララギンで処理した後には、線維芽細胞中でα２インテグリンが増加する」線維芽細胞を、ハララギン非存在下（ａ）又はハララギン存在下（ｂ）で４８時間単層増殖させた。Ａ：固定後、これらの細胞をウサギ抗α２インテグリン抗体（１：４００）で染色した。結合した抗体を、ヤギ抗ウサギＣｙ３−結合抗体を使用して検出した。バーは２０μｍを表す。Ｂ：一方、２０μｇの全溶解産物を還元条件下で、１０％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上に展開した。α２インテグリンサブユニットは、ポリクローナル抗α２インテグリン抗体（１：２００）を使用して検出した。結合した抗体はＥＣＬで可視化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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