(57)【要約】【課題】ラットのリンパ管の効率よく内皮細胞系を樹立する。【解決手段】ラットの胸管のリンパ管の内皮細胞をトリプシン消化で酵素により分離し、低酸素空気中（５％Ｏ２−５％ＣＯ２−９０Ｎ２）、内皮成長培地（ＥＧＭ）−２内で培養する。【選択図】  図１
2004248577.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットのリンパ管の内皮細胞を分離し、低酸素空気中雰囲気で内皮成長培地ＥＧＭ−２内で培養することを特徴とするラットのリンパ管内皮細胞の培養方法。
【請求項２】
ラットの胸管のリンパ管の内皮細胞をトリプシン消化酵素により分離することを特徴とするラットのリンパ管内皮細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラットのリンパ管内皮細胞株を樹立するための内皮細胞培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に癌はリンパ行性に転移しやすく、肉腫は血行性転移を起こしやすいという性質が判明しており、また、癌組織の組織液は低酸素、低ｐＨであり、この物理化学的特性が低酸素環境で生理機能を営んでいるリンパ管、リンパ節の働きを修飾し癌細胞の転移に影響を及ぼす可能性をも報告されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、癌のリンパ管への転移の研究に関してリンパ管内皮細胞の効率のよい培養方法が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明はラットのリンパ管の内皮細胞を分離し、低酸素空気中雰囲気で内皮成長培地ＥＧＭ−２内で培養するようにした。
【０００５】
なお、前記内皮細胞はトリプシン消化酵素により分離することが好ましい。
【０００６】
【実施の態様】
以下、本発明の実施態様について説明する。
【０００７】
一般に、リンパ管内皮細胞は、窒素酸化物（ＮＯ）及びミオゲンの調整及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  （１，  ９−１２，  １５，  １７，  ２０）のリンパ管滑性筋肉のポンプ作用に中心的な役割をもつプロスタグラジンの両方を生成することができる。内皮の組成分であるＮＯシンターゼ（ｅｃＮＯＳ）は犬の培養リンパ管内皮細胞中にも密にあることがわかっている。犬及び牛の培養リンパ管内皮細胞はリンパ管内皮細胞（１，  ５−８，  １４，  １９）の生態学的、形態学的性質を研究するのに用いられてきた。しかし、ラットやネズミのような小実験動物から分離したリンパ管内皮細胞系の樹立に関する報告はない。ラットやネズミのリンパ管内皮細胞系の樹立は、血管の内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、またはｅｃＮＯＳ撃退動物におけるリンパ管の発生の細胞的、分子的メカニズムを数値化するための重要な研究を促進させることができるであろう。
【０００８】
そこで、本発明においては、環境制御下の動物飼育場で飼育した生後５から７週の雄のウィスターラット（体重２００ｇまで、ＳＬＣ，  ＪＡＰＡＮ）を用いて、リンパ管内皮細胞系を樹立した。
【０００９】
１）ラットのリンパ管内皮細胞の分離及び培養
ラットをペントバルビタールナトリウム（５０  ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）で麻酔させ、瀉血させた。解剖用顕微鏡を使い、ラットの胸管（長さ３０−４０ｍｍ）を分離し、周囲の連結組織を速やかに取り除いた。胸管の周端に殺菌したポリエチレンチューブをカニューレ挿入した。カニューレ挿入後、胸管は冷温のＣａ２＋−ｆｒｅｅ  Ｈａｎｋｓ’ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ，ＵＳＡ）で洗浄した後、３７℃のトリプシン（内皮細胞培養用ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液  ５００Ｕ／ｍｌ，  Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）を１０分間充満させた。酵素による消化の後、内皮細胞を含んだ腔内液を内皮成長培地（ＥＧＭ）−２  （ｃｌｏｎｔｅｃｓ，  ＵＳＡ）（製造元：ＢＩＯ−ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ，輸入販売元：三光純薬株式会社（東京都千代田区岩本町１丁目１０番６号））と共に静かに遠心分離用チューブに排出させた。５００ｍｌのＥＧＭ−２にはｍｌ中、胎児牛の血清１０，副腎皮質ホルモン０．２、人の組織芽成長因子２，人の遺伝子組換え型血管内細胞成長因子０．５，インシュリン用成長因子０．５，人の遺伝子組換え型上皮成長因子０．５、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）  ｓｕｌｆａｔｅ−ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ及びヘパリン０．５を含ませた。混合溶液は１５００  ｒｐｍで３分間遠心分離させた。分離した細胞を０．６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン４型（細胞マトリックス４型、ニッタ、ゲラティン、日本）を塗工した３５ｍｍ皿に播種した。これら細胞を１２％溶解性ＦＢＳを補添したＥＧＭ−２中で培養し、３７℃の５％Ｏ２−５％ＣＯ２−９０％Ｎ２低酸素空気中で保温培養した。本研究で使用した培養細胞は第三から第四継代のものであった。
【００１０】
２）培養細胞中のＦアクチン、血液凝固関連抗原因子、細胞表面炭水化物、及びアセチル化低密度リポタンパク質（Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）についての免疫蛍光検査
培養細胞中のＦアクチンの配列を目で見えるようにするために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、（３．７％ホルムアルデヒド，  ２０分）で固定させ、（０．１％  トリトンＸ−１００，５分）浸透させ、及びＦアクチン検査フルオレセイン−ファロイジン（８×１０−７Ｍ，  １２０分；  Ｓｉｇｍａ）で変色させた。蛍光顕微鏡、チルドＣＣＤカメラ及びアーガス５０システムによってＦアクチン配列の画像を得た。
【００１１】
これにより、リンパ管培養細胞上に血液凝固関連抗原因子及び細胞表面炭水化物（Ｄ−ガラクトーゼα、Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトーザミンα）が発見された。また、培養細胞にはまた１，１−ｄｉｏｃａｄｅｃｙ  １    １−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏ−ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ  ｌａｂｅｌｅｄ  アセチル化低密度リポタンパク質  （Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）の食菌作用が認められた。細胞骨格タンパク質Ｆアクチンが培養細胞のプラズマ膜上に周辺の薄い束として部位し、繊維状の束としてチトプラズマとなっていた。
【００１２】
血液凝固関連抗原因子の局部制限を調べるために、培養細胞を燐酸バッファ溶液で洗浄（ＰＢＳ，１５分３回）し、−２０℃のアセトンで１０分、固定させ、室温で乾燥させた後、２０分間にわたってＰＢＳ中で２回すすいだ。ヒトの血液凝固関連抗原因子（Ｎｅｏ  Ｍａｒｋｅｒｓ，  ＵＳＡ）に対するウサギの血清を培養皿に添加し、４℃，１／１００希釈液で一晩培養した。培養細胞をＰＢＳ中で３０分間（３回変えて）洗浄した後、室温で２時間、（ＰＢＳ中１／１００希釈）のフルオレセインーラベルのヤギ、アンチラビットＩｇＧを受容した。培養皿を３回、３０分間にわたってＰＢＳ中で洗浄し、ＪＢ−４包理溶液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてスライドグラス上に載せた。
【００１３】
細胞表面の炭水化物（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  α  ａｎｄ  Ｄ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅα）はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  ｌｅｃｔｉｎ  Ｉ（ＧＳＬ−Ｉ；  Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＵＳＡ）を用いて検査した。培養細胞を燐酸バッファ溶液で洗浄（ＰＢＳ，１５分３回）し、−２０゜Ｃのアセトンで１０分、固定させ、室温で乾燥させた後、２０分間にわたってＰＢＳ中で２回すすいだ。上記ＧＳＬ−Ｉを培養皿に添加し、４℃，１／２００希釈液で一晩培養した。培養皿を３回、３０分間にわたってＰＢＳ中で洗浄し、ＪＢ−４包理溶液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いてスライドグラスに載せた。
【００１４】
１，１−ｄｉｏｃａｄｅｃｙ  １１−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏ−ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ  ｌａｂｅｌｅｄ  ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  （Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ；  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈ．  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ）のファゴサイトーシス（食菌作用）を上記培養細胞において検査した。ＨＢＳＳ中で２回培養細胞を洗浄した後、培養皿にＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃，  ４時間保温培養した。培養皿を３回、１０分間にわたってＰＢＳ中で洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで  ２０分、固定させ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ−ＰＢＳを用いてスライドグラスに載せた。
【００１５】
蛍光顕微鏡により、上記培養細胞中で変色した血液凝固関連抗原因子、ＧＳＬ−Ｉ  及びＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの免疫蛍光画像を得、撮影した。
【００１６】
図１は上記培養細胞の位相比較画像を示すマイクロ写真である。細胞が融合へと成長するにつれ、均質な玉石状を呈する単層を顕した（図１Ａ）。細胞の形状は通常多角形でそれぞれの細胞は相接していた。図１Ｂは上記培養細胞中のＦアクチンの配列が顕われている画像である。融合した培養では、Ｆアクチンの糸状構造は、大体において周辺の薄い束として細胞のプラズマ膜上に分布し、糸状の束としてサイトプラズマとなっていた。
【００１７】
免疫蛍光検査により、血液凝固関連抗原因子は培養細胞の核周囲領域に見られることが示された（図２Ａ）。図２Ｂは培養細胞中の細胞表面の炭水化物（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  α  ａｎｄ  Ｄ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅα）の分布を示している。上記培養細胞はすべてＧＳＬ−Ｉに対して陽性であった。上記培養細胞はまた核周囲領域きわだったＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（アセチル化低密度リポタンパク質）の食菌作用を示した（図２Ｃ）。
【００１８】
【発明の効果】
本発明は以上のように構成したので、ラットのリンパ管の内皮細胞を容易に樹立できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは培養細胞の位相比較画像のマイクロ写真であり、図１Ｂは培養細胞中のＦアクチン配列画像である。
【図２】図２Ａは血液凝固関連抗原因子の免疫蛍光検査によって得られる状態図であり、図２Ｂは培養細胞中の細胞表面の炭水化物の分布状態図、図２Ｃは培養細胞の食菌作用を示す状態図である。
【図１】
2004248577.tif 000003
【図２】
2004248577.tif 000004