(57)【要約】【課題】ＴＢＴの精度の安定した定量分析法の提供【解決手段】トリブチルスズ化合物を特異的に分解する酵素を産生する識別のための表示  Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＢ−Ｎ  またはＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＡ−Ｔの菌株を前記菌株の培養可能な条件に調整した被測定試料に加え、単離生成した無機化合物ＳｎＣｌ２をＩＣＰ発光分析計で測定し、被測定試料中のトリブチルスズ化合物定量するトリブチルスズ化合物の定量分析法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリブチルスズ化合物を特異的に分解する酵素を産生する識別のための表示  Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＢ−Ｎ  またはＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＡ−Ｔの菌株を前記菌株の培養可能な条件に調整した被測定試料に加え、単離生成した無機化合物ＳｎＣｌ２をＩＣＰ発光分析計で測定し、被測定試料中のトリブチルスズ化合物を定量するトリブチルスズ化合物の定量分析法。
【請求項２】
菌株の培養可能な条件がＹＮＢ培地組成の条件である請求項１に記載のトリブチルスズ化合物の定量分析法。
【請求項３】
培地のＮａＣｌ濃度を１０％〜２２％とした請求項１または２に記載のトリブチルスズ化合物の定量分析法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、内分泌攪乱作用を有するトリブチルスズ化合物を、前記化合物を基質特異的に分解するＨａｌｏｍｏｎａｓ属の微生物、特に本発明者らが海底沈殿物（北緯３５゜２１．０分、東経１３９゜４７．０分、水深１２ｍの東京湾の堆積物）中から採取し、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＢ−Ｎ（独立行政法人産業技術総合研究所  特許寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７２として受託された。平成１５年３月２６日）およびＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＡ−Ｔと命名した菌（東京水産大学応用微生物学講座、保管者から分譲し得る。）から産生される酵素を利用して、無機スズ、例えばＳｎＣｌ２に分解し、該無機スズを、原子吸光光度計もしくはＩＣＰ発光分析計により定量分析する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トリブチルスズ化合物の魚類などに与える内分泌攪乱作用は、「内分泌攪乱化学物質問題検討会」などにおいて検討されるなかで、その有害性が認められた。トリブチルスズ化合物には、ｂｉｓ−トリブチルスズ、塩化トリブチルスズ、酢酸トリブチルスズなどを含めて１３種の同族体があるが、水中最低作用濃度が塩化トリブチルスズであったことから、環境実態調査においては遊離したトリブチルスズとして測定され、塩化トリブチルスズに換算されて比較されている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｎａｏｋｏ  Ｈａｍａｄａ−Ｓａｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉ．，  ｓｕｐｐｌ．，  ６３４−６３５  （２００２）
【０００４】
平成１３年８月の「トリブチルスズ（ＴＢＴ）が魚類に与える内分泌攪乱作用の試験結果に関する報告（案）」ではトリブチルスズ化合物の種々の生物に対する影響、環境中の分布、分解などについて言及している。
また、環境省ではトリブチルスズ化合物についての環境汚染に関する調査を実施し、測定方法としてＧＤ−ＦＰＤやＧＣ／ＭＳにより、試料の性状、利用可能な分析値を考慮して、トリブチルスズ化合物の統一検出限界値として０．０５μｇ／ｇ−ｗｅｔを定めている（平成１１年度有機スズ化合物に関する環境調査結果の概要）。
【０００５】
これまではトリブチルスズ化合物の測定方法としてＧＤ−ＦＰＤ（ガスクロマトグラフィー−炎光光度検出法）やＧＣ／ＭＳ−ＳＩＭ（ガスクロマトグラフィー−質量分析法）などが用いられていた。また、「ｆｉｌｅ：／／Ｅ：￥Ｙ２００２−Ｐ４６１、東京水産大学￥標準分析法Ｃ１０−ｔｉｎ．ｈｔｍｌ」においてトリブチルスズ化合物の分析法のマニュアルが報告されている。しかしながら、前記測定方法は、抽出−濃縮などの前処理が必要であり、操作性に問題があった。また、前記前処理などには経験的技術が必要であり、精度においても安定性の観点から充分とは言えなかった。
本発明者らは、使用は禁止されているものの、それ以前に大量に使用されたトリブチルスズ化合物などが依然として海中などに残存し続けたり、それらが生物中に取り込まれるなどして循環し、環境に存在し、依然として環境汚染の問題を引き起こしているトリブチルスズ化合物を特異的に分解する酵素を産生する微生物を見出している（前記非特許文献１）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前記従来のトリブチルスズ化合物類の測定に用いられていた、前記の問題点を取り除いた新規なトリブチルスズ化合物の定量的分析測定方法を提供することである。本発明者らは、前記本発明者らが見出した菌株から産生されるトリブチルスズ化合物を分解する酵素が、前記トリブチルスズ化合物を適当な分析手段により分析可能な生成物に分解するならば、該測定方法と前記酵素を産生する菌株の組み合わせにより、菌株により産生される酵素を利用したトリブチルスズ化合物類の定量的分析測定方法を提供することができるのではないかと考えた。そこで、トリブチルスズ化合物類が存在する被測定試料（１００ｍＬ）を、前記菌株が生育可能な条件とすると共に、前記菌株（１００μｇ／Ｌ）を加え、ＹＮＢ培地条件（ｐＨ７．０）（表１）に調整し、更にＮａＣｌ濃度を３％に調整し３週間、２７℃で完全分解し、得られた試料をＩＣＰ発光分析計（（株）島津製作所社製、ＩＣＰＳ−８０００）により波長１９０．０ｎｍの発光を測定した。その発光強度から、前記既知のトリブチルスズ化合物中のＳｎを計算より求めた数値と比較し、９４％の精度でトリブチルスズ化合物を定量できることが確認できた。
これにより、本発明者らが発見した菌株と前記ＩＣＰ発光分析計とを組み合わせることにより前記課題を解決することができた。
ＩＣＰは、高周波誘導プラズマ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ）の略称。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）トリブチルスズ化合物を特異的に分解する酵素を産生する識別のための表示  Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＢ−Ｎ  またはＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＡ−Ｔの菌株を前記菌株の培養可能な条件に調整した被測定試料に加え、単離生成した無機化合物ＳｎＣｌ２をＩＣＰ発光分析計で波長１９０．０ｎｍの測定をし、被測定試料中のトリブチルスズ化合物を定量するトリブチルスズ化合物の定量分析法である。好ましくは、（２）前記菌株の培養可能な条件がＹＮＢ（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）培地組成の条件である前記（１）のトリブチルスズ化合物の定量分析法であり、より好ましくは、培地のＮａＣｌ濃度を１０％〜２２％とした前記（１）または（２）のトリブチルスズ化合物の定量分析法である。
【０００８】
【本発明の実施の態様】
本発明をより詳細に説明する。
Ａ．本発明で利用される菌株は、北緯３５゜２１．０分、東経１３９゜４７．０分、水深１２ｍの東京湾の堆積物中から採取し堆積物を、終濃度１００μｇ／ＬのＴＢＴを含むＹＮＢ培地中で２７℃において、２１日間、暗条件下で集積培養し（１６０回転／分で撹拌）、培養物から平板法により、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＢ−Ｎ菌株（以下、ＨＢ−Ｎ菌という）およびＨａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＨＡ−Ｔ菌株（以下、ＨＡ−Ｔ菌という）を分離した。
分離した前記菌株、特にＨＢ−Ｎ菌の生理・生化学的性質を以下の表１に示す。
【０００９】
【表１】
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【００１０】
前記ＨＢ−Ｎ菌およびＨＡ−Ｔ菌から産生される酵素はＴＢＴを特異的に分解すること、特にＨＢ−Ｎ菌から産生されるものはより活性が高いことが確認された。
前記菌株は１６ｓＤＮＡによる解析から、ＨＢ−Ｎ菌はＨａｌｏｍｏｎａｓ
ａｌｉｍｅｎｔａｒｉａと９８％の相同性、またＨＡ−Ｔ菌はＨａｌｏｍｏｎａｓ  ａｑｕａｍａｒｉｎａと９７％の相同性が見られた。
【００１１】
Ｂ．前記ＨＢ−Ｎ菌を用いてのＴＢＴ分解活性のＮａＣｌ濃度依存性を測定した。
図１に培地におけるＮａＣｌ濃度（％）を０〜２０％まで変えた場合のＴＢＴの分解活性を、ＴＢＴの全部が分解する培養時間（日）との関連で表した。塩濃度１０％以上だとほぼ１週間で完全に分解されることが分かる。
他の培養条件は前記菌株を採取するに際して採用したと同様の条件とした。
Ｃ．図２にＳｎ濃度（ｐｐｍ）とＩＣＰ発光分析計での発光強度（任意単位）との相関から成る検量線を示す。
標準液の調製には塩化スズ、ＳｎＣｌ２を用い、ＮａＣｌ  ３％を含む同様の培地（ＹＮＢ培地、菌株未接種）を行ったもので、測定を３回行い、平均より検量線、Ｓｎ濃度（ｐｐｍ）とＩＣＰ発光分析計による発光強度との相関を作成した。
【００１２】
【実施例】
ＹＮＢ培地（培地組成を以下の表２に示す。）に被測定試料中のＴＢＴを分解する酵素を産生するＨＢ−Ｎ菌を加えた被測定試料を加え、前記ＴＢＴを完全に分解して、ＩＣＰ発光分析で測定できる無機の塩化スズ、ＳｎＣｌ２とし、培養液をそのままＩＣＰ発光分析計にかけた。
ＩＣＰ発光分析計；（株）島津製作所製  ＩＣＰＳ−８０００
【００１３】
【表２】
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【００１４】
実施例１
ＹＮＢ培地６．７ｇ、ＮａＣｌ  ３０ｇ、ＴＢＴ１００μｇ／１Ｌ、  ｐＨ７．０；温度２７℃で、２１日間培養（図１）した。
培養液をそのまま前記ＩＣＰ発光分析計にかけた。その発光強度と、図２の検量線から無機のＳｎ濃度は９４μｇ／１Ｌ（０．０９４ｐｐｍ）であった。
このことから、本測定方法では９４％の精度でＴＢＴを定量測定できることが確認できた。
【００１５】
ＨＡ−Ｔ菌を用いても、ＨＢ−Ｎ菌ほどの活性はないので、ＴＢＴの分解には長時間を要するが、前記ＨＢ−Ｎ菌を用いたと同様の結果が得られる。
【００１６】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の方法によれば、使用する菌から産生される酵素のＴＢＴに対する基質特異的分解特性と、ＮａＣｌの濃度調整による分解活性の向上、およびＩＣＰ発光分析法の特性との組み合わせにより、安定な、精度の高いＴＢＴ定量分析を可能にしたという、顕著な効果がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＢ−Ｎ菌のＴＢＴ分解活性のＮａＣｌ濃度依存性
【図２】ＩＣＰ発光分析法における発光強度とＳｎ濃度との相関
【図１】
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【図２】
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