(57)【要約】【課題】  冷水病ワクチンの提供。【解決手段】  フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類冷水病ワクチン。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類冷水病ワクチン。
【請求項２】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類冷水病ワクチン組成物。
【請求項３】
フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類冷水病の予防法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類冷水病ワクチン及びこれを用いた魚類冷水病の予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
冷水病は、サケ、マス、アユ、フナ等に低水温期に発病する病気である。もともとは北米のマス類の病気で、低水温期の稚魚に発生し死亡率が高い病気である。死亡率は２０〜５０％であるが、死亡しない魚でも体表に潰瘍などの後遺症が残るという問題がある。
【０００３】
冷水病の治療手段としては、水温を上昇させる、スルフィソゾールナトリウムの経口投与等が行なわれているが、水温を２５℃以上に上昇させるのは経済的に負担が大きすぎ、薬物投与は食用魚としては好ましくない。
【０００４】
冷水病の原因菌はフラボバクテリウム  サイクロフィラム（Flavobacterium psychrophilum）であることが判明している。しかし現在までこれに対するワクチンは開発されていない。なお、フラボバクテリウム  サイクロフィラムは、フレキシバクター  サイクロフィルス、又はサイトファーガー  サイクロフィルスと呼ばれることもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は魚類冷水病ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は冷水病の原因菌であるフラボバクテリウム  サイクロフィラムの各種培養条件による病原性及びワクチン活性について検討してきたところ、全く意外にも定常期の菌体よりも対数増殖期の菌体を用いた場合に特にワクチン活性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類冷水病ワクチンを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類冷水病ワクチン組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに本発明は、フラボバクテリウム  サイクロフィラムの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類冷水病の予防法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のワクチンを用いれば、サケ、マス、アユ等の冷水病が効率的に防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のワクチンは、フラボバクテリウム  サイクロフィラム（以下、本菌ということがある）の対数増殖期の不活化菌体又はその成分を用いる。通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられる。本発明者が本菌が魚類生体に侵入している様子を観察したところ、侵入している菌体表面に多くの小胞が観察された。一方、本菌の誘導期、対数増殖期及び定常期の菌体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる産生物の差異及び形態を観察したところ、対数増殖期の菌体表面に小胞及び分泌物が存在することが明らかになった。
【００１２】
本発明のワクチンに用いる菌体は、本菌を常法により培養し、対数増殖期に採取することにより得られる。本菌の培養は、本菌を適当な培地に接種し常法に従って培養すればよい。培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有させておくのが好ましい。
【００１３】
この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてトリプトン、各種動物血清、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては、資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、蔗糖、麦芽糖、可溶性デンプン、乳糖、廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Na+、K+などの無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。またＴＹ培地、サイトファーガー（ＣＹＴ）培地等の市販の培地、改変サイトファーガー（ＭＣＹＴ）培地、及びこれらに牛胎児血清を添加した培地を用いることもできる。
【００１４】
培養条件は、pH６．８〜７．８、４〜２０℃とするのが好ましい。
【００１５】
本菌が対数増殖期にあるか否かの確認は、６００nmでの光学密度を測定することにより行なわれる。すなわち６００nmでの光学密度が急激に上昇する時期が対数増殖期である。例えばpH７．３、１５℃で培養した場合、培養２０〜３０時間が対数増殖期である。
【００１６】
対数増殖期にある本菌を遠心分離、濾過等により分離するか、培養物をそのまま不活化する。不活化処理としては加熱処理、ホルマリン処理等が挙げられる。
【００１７】
本菌の成分には、菌体の膜成分、小胞及び分泌物が含まれる。これらの成分を採取するには、不活化菌体の超音波破砕等により行なうのが好ましい。
【００１８】
得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、エバポレーション、濃縮、凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。
【００１９】
本菌の不活化菌体又はその成分は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状又は固体状の担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。当該ワクチン組成物の形態としては、経口投与用組成物、注射用組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられる。液状の担体としては水、生理食塩水等が挙げられる固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。また、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。
【００２０】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の投与は、成魚でもよいが、冷水病に羅患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。その投与量は、体重１kgあたり不活化菌体又はその成分として約１mg〜５ｇが好ましい。投与回数は１回でもよいが、複数回、例えば２〜１０回が好ましく、また毎日投与でもよいが１〜２日間隔をあけて投与してもよい。
【００２１】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚類としては、本菌による冷水病になる魚類であれば制限されず、例えばアユ、フナ、ヤマメ、ニジマス、ギンザケ等のサケマス類等が挙げられる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
（１）フラボバクテリウム  サイクロフィラムＧ３７２４（以下の実験でもこの株を使用した。）の一白金耳を４mLのＭＣＹＴ培地（トリプトン２．０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、肉エキス０．２ｇ、酢酸ナトリウム０．２ｇ、塩化カルシウム０．２ｇ、蒸留水１０００mL、pH７．２）に接種し、１５℃で２日間培養後、そのうちの０．５mLを２００mL ＭＣＹＴ培地に接種し、１５℃で振盪培養した。培養時間と菌体数及び６００nmにおける光学密度との関係を図１に示す。図１から明らかなように、本菌は０〜２４時間までが誘導期であり、２４〜４８時間までが対数増殖期であり、４８時間以降が定常期であることがわかる。
【００２４】
（２）本菌の各種培養条件による病原性の差異について検討した。すなわち、対数増殖期及び定常期の本菌を１０8〜１０10ＣＦＵ／mLとなるようにアユの水槽に添加し、病原性を検討した。なお、対照としたアユは０．５〜５ｇであり、水槽の温度は１５℃とした。その結果、図２に示すように対照群（非感染群）に比べて定常期の本菌感染群は１０日目までの死亡率が２０〜６０％だったのに対し、対数増殖期の本菌感染群は１０日目の死亡率が１００％であり、定常期の菌に比べて対数増殖期の菌の病原性が高いことが判明した。
【００２５】
（３）段階の異なる本菌の菌体を超音波破砕した。その画分についてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ，銀染色）を行なった。結果を図３に示す。その結果、対数増殖期に特異的に産生される物質（図中の矢印）があることが判明した。
【００２６】
（４）対数増殖期及び定常期の本菌についての走査型顕微鏡観察（図４）及び透過型電子顕微鏡観察（図５）を行なった。その結果、対数増殖期には菌体表面に小胞が存在することが判明した。
【００２７】
（５）対数増殖期の本菌をアユに感染させ、本菌がアユの下あごに侵入している様子を走査型顕微鏡で観察した（図６）。その結果、小胞を有する対数増殖期にある本菌がアユ生体に侵入していることが判明した。
【００２８】
実施例２
フラボバクテリウム  サイクロフィラムＧ３７２４を２０００mL容坂口フラスコ中で１０００mL ＭＣＹＴ培地中１５℃で培養した。ＯＤ６００nmが０．２〜０．７のものを対数増殖期菌体として用いた。すなわち、培養２４〜３６時間の間のＯＤ６００nmが０．２〜０．７の時期の培養物を、０．３％ホルマリン中で１５℃、２日間インキュベーションして不活化菌体とし、次いで４℃で８，０００〜１０，０００×gで遠心分離して不活化菌体とした。また、対照として培養３６時間経過後（ＯＤ６００nm＝１．０）の培養物を同様に不活化して定常期不活化菌体を得た。
【００２９】
実施例３
フラボバクテリウム  サイクロフィラムＧ３７２４の一白金耳を５０mLのＭＣＹＴ培地に接種し、１５℃で４８時間予備培養した。このうち２．５mLを１０００mLのＭＣＹＴ培地に接種し、１５℃で３６時間培養した。このときＯＤ６００nmは０．２〜０．７であった。培養物を０．３％ホルマリン中で１５℃、２日間インキュベーションした。次いで、４℃で８，０００〜１０，０００×gで遠心分離して菌体を採取した。得られた菌体をさらに０．３％ホルマリン生理食塩水に再懸濁し、本菌の不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。
【００３０】
実施例４
平均体重５．０ｇのアユに、実施例２で得た対数増殖期及び定常期の菌体から得た不活化菌体を、０．１FKCg／kg／dayで経口投与した。
このように経口投与したアユに対して浸漬攻撃実験を行なった。その結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
表１より定常期群及び対数増殖期群ともに対照群に対して生残率に有意差があった。しかし、対数増殖期群の生存率は、定常期群のそれよりも有意に高く、対数増殖期群がワクチンとして特に有用であることが判明した。
【００３３】
実施例５
実施例３で得たワクチン組成物を用いてワクチン効果を検討した。すなわち、攻撃試験開始５週間前からワクチンを２週間経口投与（０．１ｇ／kg）を行ない、その後、３週間免疫活性を上昇させる為に通常飼料で飼育を行なった。その後、３週間後に攻撃試験を実施する区と、ワクチン投与終了から、７週後に攻撃試験を実施する２区を設定し、攻撃試験を実施した。
０．５ｇのアユの２０００尾に対して、ワクチンを毎日経口投与した区と、２週間で５回投与した（中２日で経口投与）区の２区を設けた。結果を表２、図７及び図８に示す。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
その結果、ワクチン投与３週間後に攻撃試験を実施した結果では、ワクチン投与区と対照区では有意差が認められた。また、５回だけ投与した区は、毎日投与した区よりもワクチン効果が非常に高いことが明らかとなった。
さらに、ワクチン投与後、７週間で攻撃試験を実施した場合、ワクチンを投与した両区において対照区よりも有意にワクチン効果が高かった。
【００３６】
本試験期間中に死亡した供試魚について、本菌による死亡か否かを確認した結果、図９及び図１０に示すように、死亡魚全てについて冷水病の典型的な症状が認められ、さらに、蛍光抗体法により死亡魚を診断した結果、検査した全ての個体で陽性に染色されたことから、本試験期間中に死亡した試験魚は、本菌の感染を原因とするものであることが明らかになった。
【００３７】
実施例６
フラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＮＣＭＢ１９４７をＭＣＹＴ培地中１５℃の振盪培養し、培養２４〜４８時間の間のＯＤ６００nmが０．２〜０．７の対数増殖期の培養液を人工感染に用いた。すなわち、対数増殖期の本菌を１０6〜１０8ＣＦＵ／mLになるようにニジマスの水槽に添加し、浸漬方法による人工感染を試みた。なお、供試したニジマスは１〜４ｇであり、水温は１５℃とした。その結果、図１１に示すように対照群（非感染群）の死亡率が０％であったのに対して、対数増殖期の本菌感染群は死亡率が５５．８％であり、本菌の浸漬方法によるニジマスに対する人工感染に初めて成功した。図１２に健康なニジマス（Ａ）、１日目に死亡したニジマスの症状（Ｂ、Ｃ、Ｄ）、５日目に死亡したニジマスの症状（Ｅ、Ｆ）及び死亡したニジマスの尾鰭から発見されたフラボバクテリウム  サイクロフィラムを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本菌の培養時間と６００nmにおける光学密度（ＯＤ）及び菌数（ＣＦＵ／mL）との関係を示す図である。
【図２】本菌の培養条件によるアユに対する病原性（累積死亡率）を示す図である。
【図３】本菌の菌体成分のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【図４】本菌の対数増殖期（３６ｈ，Ａ及びＢ）と定常期（４８ｈ，Ｃ及びＤ；７２ｈ，Ｅ及びＦ）の菌体の走査型顕微鏡像（Ａ、Ｃ、Ｅ＝２０，０００倍，Ｂ、Ｄ、Ｆ＝１００，０００倍）を示す図である。
【図５】本菌の対数増殖期における菌体の超薄切片の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図６】本菌がアユの下あごに感染した様子を走査型顕微鏡像で示す図である。
【図７】攻撃１（ワクチン投与３週後攻撃）における生残率を示す図である。
【図８】攻撃２（ワクチン投与７週後攻撃）における生残率を示す図である。
【図９】死亡したアユの症状を示す図である（矢印部は、冷水病特有の症状を示す）。
【図１０】死亡したアユの蛍光抗体法による本菌の感染の有無についての診断結果を示す図である（矢印部が本菌の感染部）。
【図１１】フラボバクテリウム  サイクロフィラム  ＮＣＭＢ１９４７の培養条件によるニジマスに対する病原性（累積死亡率）を示す図である。
【図１２】Ａ：対照群の健康なニジマスを示す図である。Ｂ、Ｃ、Ｄ：浸漬攻撃後１日目に死亡したニジマスの症状を示す図である（矢印部は冷水病特有の症状を示す）。Ｅ、Ｆ：浸漬攻撃後５日目に死亡したニジマスの症状を示す図である（矢印部は冷水病特有の症状を示す）。Ｇ、Ｈ：死亡したニジマスの尾鰭から発見されたフラボバクテリウム  サイクロフィラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004210769.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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