(57)【要約】【課題】増幅効率の高い核酸増幅装置を提供する。【解決手段】核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体の流れる流路と、前記流路が複数の分岐流路に分岐される流路分岐部、分岐した前記複数の分岐流路が合流する合流部、合流した前記反応流体が導かれる合流流路と、を備え、前記分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む試料と試薬とを含む反応流体の流れる流路と、
前記流路が複数の分岐流路に分岐される流路分岐部、分岐した前記複数の分岐流路が合流する合流部、合流した前記反応流体が導かれる合流流路と、を備え、
前記分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有する核酸増幅装置。
【請求項２】
請求項１において、前記加熱機構は、第一の温度の第一加熱機構と第一の温度より低い第二の温度の第二加熱機構を備え、前記分岐流路は前記第一加熱機構で加熱された領域を通過した後前記第二加熱機構で加熱された領域を通過することを繰返すよう配置されている核酸増幅装置。
【請求項３】
核酸を含む試料と試薬とを含む反応流体の流れる流路と、
前記流路を分岐する第一の分岐部と、
前記第一の分岐部から分岐した第一の分岐流路と、
前記第一分岐流路が合流する第一合流部と、
前記第一の合流部で合流した流路を再び分岐する第二の分岐部と、
前記第二の分岐部から分岐した第二の分岐流路と、
前記第二の分岐流路が合流する第二合流部と、を備え、
前記、第一の分岐流路と第二分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有する核酸増幅装置。
【請求項４】
請求項３において、前記第一の分岐流路より前記第二の分岐流路の方が長く形成される核酸増幅装置。
【請求項５】
請求項３において、前記第一の分岐流路及び第二の分岐流路を流れる前記反応流体は前記加熱機構により前記複数の設定温度に繰返し保持され、前記第一の分岐流路を流下中の前記反応流体の前記加熱機構による温度変化繰返し回数より、前記第二の分岐流路を流下中の前記反応流体の前記加熱機構による温度変化繰返し回数の方が多くなるよう形成される核酸増幅装置。
【請求項６】
請求項３において、前記第一の分岐流路と第二の分岐流路との間に試薬を供給する流路を有する核酸増幅装置。
【請求項７】
請求項１において、前記合流部に連絡する第一の分岐流路と第二の分岐流路を有し、前記第一の分岐流路に第一の加熱温度とする第一の加熱機構と、第二分岐流路に第二の加熱温度とする第二の加熱機構を備える核酸増幅装置。
【請求項８】
核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体の流れる流路と、
前記流路が複数の分岐流路に分岐される流路分岐部、分岐した前記複数の分岐流路が合流する合流部、合流した反応流体が導かれる合流流路と、
前記合流流路に導かれた前記反応流体の核酸を検出する検出部と、を有し、
前記分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有し、
前記加熱機構は前記分岐流路が前記複数の温度域を繰返通過するよう形成される化学分析装置。
【請求項９】
核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体を分岐する分岐工程と、
前記分岐された反応流体に複数の設定温度間での加熱冷却を繰り返す繰返加熱冷却工程と、
前記繰返し加熱冷却された複数の前記分岐された反応流体を合流する合流工程と、を有する核酸増幅方法。
【請求項１０】
核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体を分岐する第一の分岐工程と、
前記分岐された反応流体に複数の設定温度間での加熱冷却を繰り返す第一の繰返加熱冷却工程と、
前記繰返し加熱冷却された複数に分岐された反応流体を合流する第一の合流工程と、
前記合流された反応流体を再度分岐する第二の分岐工程と、
第二の分岐工程で分岐された反応流体に複数の設定温度間での加熱冷却を繰り返す第二の繰返加熱冷却工程と、
前記第二の繰返し加熱冷却工程を経た複数に分岐された反応流体を合流する第二の合流工程と、を有する核酸増幅方法。
【請求項１１】
請求項１０において、前記第一の繰返加熱工程における繰返加熱回数より前記第二の繰返加熱工程における繰返加熱回数の方が多くなるよう形成された核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体中の核酸を増幅する機構を備えた核酸増幅装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】微量の核酸を増幅する方法として、一般的に良く知られている方法として、ＰＣＲ法がある。この方法は、２本鎖のＤＮＡを鋳型とし、特定領域を挟むように短いプライマーＤＮＡを各相補鎖にハイブリッド結合させ、基質である４種類のデオキシヌクレオチド三りん酸の存在下、ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、このプライマーの３´末端に、鋳型の塩基配列に従ってヌクレオチドが添加され、鎖が伸長する。ＰＣＲ法の原理は、この反応でできた新たな２本鎖ＤＮＡを加熱して相補鎖に分離し、過剰に存在するプライマーを再び該当位置にハイブリッド結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ反応で新たなＤＮＡ鎖を合成させることである。この反応が繰り返されることで、目的領域を含むＤＮＡ断片を大量に増やすことが可能になる。
【０００３】
ＰＣＲ法を自動的に行う装置としては、サンプルを入れるホルダーを直接加熱・冷却することで温度調節を行うヒートブロック方式のサーマルサイクラーが一般的である。
【０００４】
一方、複数の温度域を通過する流路にＰＣＲ反応混合物を流動させることで、ＰＣＲ反応混合物にＰＣＲ増幅反応に必要な温度変化を与え、核酸を増幅する方法（以下フロースルー増幅法）とそれを実現する装置が報告されている。
【０００５】
フロースルー増幅法とそれを実現する装置として、特開平６−３０７７６に、ＤＮＡ増幅方法及びＤＮＡ増幅装置が示されている。この方法は、外部に加熱部を設けた一本のキャピラリー（内径０．５ｍｍ、外形１．５ｍｍ、長さ１０ｍ以上）の中にＰＣＲ反応混合物を流動させることで、ＰＣＲ反応混合物に必要な温度変化を与え、ＰＣＲ反応を行う。
【０００６】
また、１９９８年のサイエンス誌の２８２巻４８４頁から４８７頁に、ナノリッターＤＮＡ分析装置が示されている。この装置は、マイクロファブリケーション技術により製作されたマイクロ流路（加熱部の流路（幅５００μｍ、深さ５０μｍ、長さ１ｃｍ以上）、ヒーター、温度センサー、蛍光検出器を備え、ＰＣＲ反応混合物が異なる温度域を通過する一本のマイクロ流路を流れることで、ＰＣＲ反応混合物を加熱・冷却し、ＰＣＲ反応による核酸増幅を行い、増幅した核酸を蛍光検出する。
【特許文献１】
特開平６−３０７７６号公報
【非特許文献１】
１９９８年サイエンス誌、２８２巻、４８４頁から４８７頁
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ヒートブロック式のサーマルサイクラーは、ブロックを目的温度に加熱、冷却するための時間が存在するため、増幅反応終了まで必要とする時間が長くなる。また、増幅反応が終了するまでの時間が長くなることは、酵素の失活につながり、増幅量の減少の原因と一つとなっている。
【０００８】
一方、フロースルー増幅法はＰＣＲ反応混合物が加熱部を通過する間に、反応混合物の温度を目的の温度に変化する必要がある。ＰＣＲ反応混合物の量あたりの表面積を増やすため、ＰＣＲ反応混合物が通過する流路は、断面積に対して長さが必要になる。そのため一本の流路にＰＣＲ反応混合物を流動させる場合、使用できるＰＣＲ反応混合物の量は小さくなる。ヒートブロック式のサーマルサイクラーで使用するＰＣＲ反応混合物の量は一般的に１０μｌ〜１００μｌであるのに対して、特開平６−３０７７６号公報に示されるＤＮＡ増幅装置で使用しているＰＣＲ反応混合物は５μｌ、１９９８年のサイエンス誌の２８２巻４８４頁から４８７頁のナノリッターＤＮＡ分析装置で使用しているＰＣＲ反応混合物は１２０ｎｌである。しかし、ＰＣＲ反応混合物の量を増やすと、ＰＣＲ反応混合物は流路の長さ方向に長く広がる。そのため、反応混合物が複数の温度領域にまたがって流動するため、反応混合物の温度分布が不均一になり、増幅反応がうまく行われない。
【０００９】
また、直径の大きい流路を用いた場合は、ＰＣＲ反応混合物あたりの表面積が減少し、熱効率が減少するので増幅反応に必要な時間が長くなる。
【００１０】
さらに、前記従来技術では、一本の流路が複数の温度域を通過しているため、適したＰＣＲサイクルが不明の鋳型核酸を増幅するには、ＰＣＲの温度サイクルをあらかじめ調べておく必要がある。
【００１１】
そこで、本発明の目的は、上記従来技術の課題の少なくとも一つを解決する酸増幅装置を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
（１）上記課題を解決するために、本発明は、目的の核酸を増幅する試薬を複数の温度域を通過する流路が分岐している構造を持つ核酸増幅装置を有する。
【００１３】
例えば、核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体の流れる流路と、前記流路が複数の分岐流路に分岐される流路分岐部、分岐した前記複数の分岐流路が合流する合流部、合流した反応液が導かれる合流流路と、を備え、前記分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有する核酸増幅装置である。
【００１４】
これにより、高速で温度変化させることができ、表面積を増大させて受熱量を増大できるので、なだらかな温度分布となることを抑制して、短時間で増幅の温度繰返ができるので、増幅効率を向上させることができる。
（２）より好ましくは、反応流体の流れる流路は分岐したのち合流する構造を複数回繰り返すことを特徴とする。
【００１５】
例えば、核酸を含む試料と試薬とを含む反応流体の流れる流路と、前記流路の前記反応流体を分岐する第一の分岐部と、前記第一の分岐部から分岐した複数の第一の分岐流路と、前記複数の第一分岐流路が合流する第一合流部と、前記第一の合流部の下流側に前記合流した前記反応流体を分岐する第二の分岐部と、前記第二の分岐部から分岐した複数の第二の分岐流路と、前記複数の第二の分岐流路が合流する第二合流部と、を備え、前記、第一の分岐流路と第二分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有する核酸増幅装置である。
【００１６】
なお、例えば、前記試薬は酵素を含む増幅液であり、前記合流流路に連絡する核酸を検出する検出部を有する。
【００１７】
これにより、低濃度の核酸を含む反応流体が供給された場合、分岐流路のレーンごとの核酸量のばらつきが増幅量のばらつきになる。しかし、いったん合流して再度分岐加熱することにより、レーンごとのバラツキ量の緩和でき、増幅効率の増加させることができる。
【００１８】
また、例えば、前記第一の分岐流路より前記第二の分岐流路の方が長く形成される。これにより、第一の分岐流路内に核酸のばらつきがあってもある程度増幅して、一旦合流後分岐して再度第二の分岐流路で分岐して十分増幅すると、ばらつきを効果的に緩和でき、十分な増幅を行うことができるので増幅効果が増大できる
（３）また、分析装置としては、核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体の流れる流路と、前記流路が複数の分岐流路に分岐される流路分岐部、分岐した前記複数の分岐流路が合流する合流部、合流した反応液が導かれる合流流路と、前記合流流路に導かれた前記反応流体の核酸を検出する検出部と、を有し、前記分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有し、前記加熱機構は前記分岐流路が複数の温度域を繰返通過するよう配置されることを特徴とする。
（４）核酸増幅方法としては、核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体を分岐する分岐工程と、前記分岐された反応流体に複数の設定温度間での加熱冷却を繰り返す繰返加熱工程と、前記繰返し加熱冷却された複数に分岐された反応流体を合流する合流工程と、を有する。
【００１９】
又は、核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体を分岐する第一の分岐工程と、前記分岐された反応流体に複数の設定温度間での加熱冷却を繰り返す第一の繰返加熱工程と、前記繰返し加熱冷却された複数に分岐された反応流体を合流する第一の合流工程と、前記合流された反応流体を再度分岐する第二の分岐工程と、第二の分岐工程で分岐された反応流体に複数の設定温度間での加熱冷却を繰り返す第二の繰返加熱工程と、前記第二の繰返し加熱冷却工程を経た複数に分岐された反応流体を合流する第二の合流工程と、を有する。
【００２０】
また、上記流路を試薬が流動しているときの核酸の増幅の様子を調べるための検出機構を備え、検出後の流路が通過する複数の温度域の温度を設定することができることが好ましい。
【００２１】
【発明の実施の形態】
図１〜図２９を参照して、本発明による遺伝子分析装置の実施例を説明する。なお、本発明は、当該明細書に開示の形態に限定されるものではなく、周知技術及び今後周知技術となる技術に基く変更を許容するものである。
（実施例１）
適当なＰＣＲのサイクルが不明の核酸を増幅するときの実施例を以下で示す。図１は、本遺伝子分析装置１の全体構成図である。遺伝子分析装置１は、核酸増幅チップ１０を備え付ける設置台４０と、作業内容を出力するモニタ４１と、作業内容を入力するためのパネル４２と、増幅した核酸を検出するための光学機器（図示せず）を備える。パネル４２により入力された作業内容に従い、遺伝子分析装置１は核酸増幅チップ１０を介して遺伝子を増幅、検出する。光学装置により検出した遺伝子の量や種類はモニタ４１に出力される。
【００２２】
図２から図７を用いて、核酸増幅チップ１０の構造を説明する。
図２は、核酸増幅チップ１０の外観図である。核酸増幅チップ１０は、使用する試薬を流動させるための溝を刻んだ流路部２０（図３）と、流路部２０の流路の温度を制御するための温度制御部３０（図４）を接合して構成する。
流路部２０は、試薬注入流路部２００、第一分岐流路部２０３、第一増幅流路部２０４、第一合流流路部２０５、第二分岐流路部２０６、第二増幅流路部２０７、第二合流流路部２０８、検出流路部２０９を構成する溝を温度制御部３０との接触面側に持つ。
温度制御部３０は流路部２０の第一増幅流路部２０４を加温するための第一熱変性ヒーター３００および、第一アニーリングヒーター３０１と、流路部２０の第二増幅流路部２０４を加温するための第二熱変性ヒーター３０２、第二アニーリングヒーター３０３を流路部２０との接触面側に備え、それぞれのヒーターは温度センサー（図示せず）を備えている。ヒーターと温度センサーは電極端子３０６を介して図１の遺伝子増幅装置１とつながり、ヒーターの温度は遺伝子増幅装置１のパネル４２により、自由に設定することができる。また、温度制御部３０は反応液注入口３０７、洗浄液注入口３０８、廃液口３０９となる貫通孔も備える。
【００２３】
このように、図３の形態は、目的の核酸を増幅する試薬を複数の温度域を通過する流路が分岐している構造を持つ核酸増幅装置を構成する特徴を有する。具体的には、核酸を含む試料と前記試料に混合する試薬とを含む反応流体の流れる流路と、前記流路が複数の分岐流路に分岐される流路分岐部である第一分岐流路部２０３、分岐した前記複数の分岐流路が合流する合流部である第一合流流路部２０３、合流した反応液が導かれる合流流路と、を備え、前記分岐流路に複数の設定温度域を備えた加熱機構を有する点を特徴とする。
【００２４】
これにより、高速温度変化を得ることができ、流路表面積を増大させて受熱量を増大できるので、効果的に昇温降下を繰り返して核酸の増幅をすることができる。
【００２５】
また、上記の流路は分岐したのち合流する構造を複数回繰り返すことを特徴とする。
【００２６】
低濃度の核酸を含む反応流体が供給された場合、分岐流路のレーンごとの核酸量のばらつきが増幅量のばらつきになる。単に増幅したのでは、全体としての増幅効率低下する。このため、いったん合流して再度分岐して増幅することにより、レーンごとのバラツキ量の緩和でき、増幅効率を増加させることができる。
【００２７】
例えば、第一の増幅工程より第二の増幅工程の方を長くする点を特徴とする。
【００２８】
具体的構造としては、前記第一の分岐流路より前記第二の分岐流路の方が長く形成される。或いは、例えば、第一の分岐流路及び第二の分岐流路を流れる反応液は加熱機構であるヒータにより前記複数の設定温度に繰返し保持され、第一の分岐流路を流下中の前記反応液の温度変化繰返し回数より、前記第二の分岐流路を流下中の前記反応液の温度変化繰返し回数の方が多くなるよう形成される。
【００２９】
これにより、初めの増幅工程において増幅ばらつきがあっても、ある程度増幅して合流後に分岐して各々の分岐流路で再度十分増幅すると、ばらつきをより緩和でき、十分な増幅を行うことができるので増幅効果が増大できる。
【００３０】
図５は、流路部２０の第二分岐部２０６、第二増幅流路部２０７、第二合流部２０８における、流路部２０と温度制御部３０の対応図である。第二増幅流路部２０７を構成する流路は、温度制御部３０の第二熱変性ヒーター３０２上および、第二アニーリングヒーター３０３上を交互に通過する。同様に、第一増幅流路部２０４を構成する流路も第一熱変性ヒーター３００上と第一アニーリングヒーター３０１上を交互に通過する。図５の範囲Ａの拡大図を図６に示す。図７は、図６の断面線Ｂにおける核酸増幅チップ１０の組図の断面図である。温度制御部３０の流路部２０と接する面は、絶縁膜３０５で覆われている。核酸増幅チップ１０の流路は、流路部２０上の溝と温度制御部の表面が接合することで構成されている。
【００３１】
このように、加熱機構は、  第一の温度の第一加熱機構であるヒータ３００と第一の温度より低い第二の温度の第二加熱機構であるヒータ３０１を備え、前記第一加熱機構と前記加熱機構とで加熱された領域を通過するよう前記分岐流路が形成されている点が特徴である。そして、分岐流路は前記第一加熱機構で加熱された領域を通過した後前記加熱機構とで加熱された領域を通過することを複数回繰り返すよう配置されている。
【００３２】
以下、核酸増幅チップ１０内の流路を試薬が流動することで、目的の遺伝子を増幅し、検出する実施例を、図８から図２３を用いて示す。増幅および検出動作の流れを図８に示す。
【００３３】
はじめに、核酸増幅チップ１０の温度制御部３０の反応液注入口３０７から、鋳型となるＤＮＡを含む反応液２１１を注入する（図９）。反応液は、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２種類のプライマー、ｄＮＴＰ、金属イオン、緩衝液、増幅したＤＮＡを検出するための蛍光色素を含んでいる。蛍光色素は例えばＣｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を使用する。反応液を注入した核酸増幅チップ１０を遺伝子分析装置１の設置台４０に設置する。設置後、核酸増幅チップ１０の温度制御部３０のヒーターの温度を設定する。たとえば、第一熱変性ヒーター３００は熱変性のため９５℃に設定し、第一アニーリングヒーター３０１の設定温度はそれぞれ異なる設定にする。  例えば、図１０に示すように、第一増幅流路部２０４を構成する微小流路に対応する第一アニーリングヒーター３０１を、それぞれ第一アニーリング小ヒーター３０１１、３０１２、３０１３、３０１４、３０１５、３０１６、３０１７、３０１８とし、温度を５５℃から６２℃まで１℃刻みに設定する。
【００３４】
設置後の核酸増幅チップ１０と設置台４０の関係を図１１に示す。核酸増幅チップの電極端子３０６を設置台４０の設置台電極端子５０に取り付け、反応液注入口３０７に反応液注入口バルブ４６を、洗浄液注入口３０８に洗浄液注入用バルブ４７を、廃液口３０９に廃液口バルブ４８を取り付ける。また、タンク４３に洗浄液４９を入れる。反応液や洗浄液の流動はポンプ４３による圧力と各バルブ４６、４７、４８の開閉により制御され、核酸増幅チップ１０の流路を通過し、目的遺伝子を増幅・検出した後、廃液口２０２を通過し、廃液容器５１に廃棄される。洗浄液にはＴＥバッファーなどを用いる。
【００３５】
反応液を遺伝子増幅チップ１０に注入し、設置台４０に設置した後、反応液２１１が第一分岐部２０３まで流動するまでの反応液２１１の流動の様子を図１２、図１３に示す。廃液口バルブ４８を開け、洗浄液注入バルブ４７を閉じた状態で、ポンプ４３を用いて反応液２１１を反応液合流部２１０まで押し出す  （図１２）。次に、廃液口バルブ４８を閉じ、洗浄液注入バルブ４７を開け、ポンプ４３を用いて、洗浄液２１２を反応液合流部２１０の手前まで押し出す。次に廃液口バルブを開け、反応液注入バルブ４６を閉じ、ポンプ４３を用いて、洗浄液２１２を押し出す。このとき反応液２１１と洗浄液２１２の間には空気の層２１３ができるため（図１３）、反応液２１１と洗浄液２１２は混合することはない。引き続き、ポンプ４３により、反応液２１１は流路の下流方向に流動する。分岐した流路の断面積は同じであるため、反応液２１１は第一分岐部２０３を通過し、第一増幅流路部２０４に等量に分かれる。
【００３６】
図１４は、第一増幅流路２０４における温度制御部３０との対応を示すものである。第一増幅流路部２０４の流路は、９５℃に設定した第一熱変性ヒーター３００上と５５℃に設定した第一アニーリングヒーター３０１上を交互に通過する。等量に分かれた反応液２１１は、第一分岐部２０３を通過し、第一増幅流路部２０４に分離した後、第一増幅流路部２０４を流れることで、９５℃の温度域と５５℃の温度域を交互に通過する。図１５から図１８は、反応液２１１が第一増幅流路部２０４を通過し、ＤＮＡの増幅反応が起こる過程を図示したものである。反応液２１１が９５℃に設定した第一熱変性ヒーター３００上を通過するとき（図１５）に熱変性による２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへのかい離反応が起こり、次に５５℃に設定した第一アニーリングヒーター３０１上を通過するとき（図１６）に、１本鎖ＤＮＡは反応液２１１中のプライマーとアニーリング反応をする。さらに、反応液２１１が第一アニーリングヒーター３０１上から第一熱変性ヒーター上へ流動する過程（図１７）において、ＤＮＡ増幅反応がおこり、ＤＮＡは増幅する。反応液２１１は再び第一熱変性ヒーター上を通過（図１８）し、２本鎖ＤＮＡは１本鎖ＤＮＡにかい離する。第一増幅流路部２０４を通過する過程で、反応液２１１には９５℃―５５℃の温度変化を繰り返すことによるＰＣＲ反応がおこり、ＤＮＡは増幅する。
【００３７】
第一アニーリングヒーターの温度を設定温度がヒーターごとに異なるため、設定した温度の違いにより、分かれた反応液の増幅効率は異なる。第一増幅流路部２０４の最後２１５（図１９）、まで、各反応液が流れてきたときに、光学機器（図示せず）により、微小流路２０４１、２０４２、２０４３、２０４４、２０４５、２０４６，２０４７、２０４８ごとの核酸の増幅量を検出する。検出結果より、もっとも増幅量の多い流路に用いたアニーリング温度を選択し、第二増幅流路２０７を加熱する第二アニーリングヒーター３０３の温度を決定する。例えば、アニーリング温度５６℃が適当であるならば、第二アニーリングヒーター３０３を５６℃に設定する。第二熱変性ヒーター３０２は核酸の熱変性のため９５℃に設定する。
【００３８】
第一増幅流路部２０４を通過した反応液２１１は、図２０に示すように、第一増幅流路２０４を第一合流部２０５で合流し、分けた反応液２１１を混合する。混合することで、第一増幅流路部２０４における設定温度の違いにより生じた核酸の増幅量の違いを解消する。第一増幅流路部２０４においての増幅反応で、流路ごとの違いが大きくなりすぎないようにするため、第一増幅流路部２０４における９５℃―５５℃の温度変化の回数が１０回程度になるように流路を設計する。
【００３９】
また、図２１に示すように、第一合流部２０５に対応する温度制御部３０の箇所に混合用ヒーター２１４、２１５、２１６、２１７、２１８，２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、を設け、ヒーター２１４とヒーター２１５、ヒーター２１６とヒーター２１７、ヒーター２１８とヒーター２１９、ヒーター２２０とヒーター２２１、ヒーター２２２とヒーター２２３、ヒーター２２４とヒーター２２５、ヒーター２２６とヒーター２２７を異なる温度に設定することで、第一合流部２０５の流路の合流部分に温度変化をつけ、熱拡散の違いを利用することで混合の効果をさらに強めてもよい。第一合流部２０５を通過した反応液２１１の成分の組成は、混合することで均一になる。
【００４０】
このように、加熱機構の下流側で前記合流部の上流側の分岐流路に異なる設定温度の加熱機構を備えることを特徴とする。また、分岐したのち複数の温度域を通過し合流する構造をもつ流路を流動する試薬が、合流時に温度が異なるように合流部分に温度制御機能を持つことを特徴とする。
【００４１】
具体的に例えば、合流部２０５に連絡する第一の分岐流路と第二の分岐流路を有し、前記第一の分岐流路に第一の加熱温度とする第一の加熱機構として第一のヒータと、第二分岐流路に第二の加熱温度とする第二の加熱機構として第二のヒータを備えることを特徴とする。
【００４２】
引き続き、反応液２１１は図２２に示す流路部２０の第二分岐部２０６を通過し、第二増幅流路２０７へ、等量に分かれる。
【００４３】
図２２は、流路部２０の第二分岐部２０６、第二増幅流路２０７、第二合流部２０８と、温度制御部３０の第二熱変性ヒーター３０２、第二アニーリングヒーター３０３との対応を示す。第二増幅流路２０７は、９５℃に設定した第二熱変性ヒーター３０２上と５５℃に設定した第二アニーリングヒーター３０３上を交互に通過する。第一増幅流路部２０４の通過時と同様に、反応液中の核酸は第二増幅流路部２０７を流れることで、９５℃−５５℃の温度変化を繰り返し受けるため、ＰＣＲ反応により再び増幅する。第二増幅流路２０７を経た反応液は第二合流部２０８を通過することで再び混合され、図３の検出部２０９まで流れる（図２３）。検出窓２１３にて反応液中の増幅した核酸を光学機器（図示せず）により、検出する。検出部２０９を備えた化学分析装置としても増幅した核酸を分析することができ精度の高い分析ができる。
【００４４】
また、本実施例によれば、温度設定の可能な核酸増幅流路を複数の流路に分岐させることで、反応液が、流路方向に広がり、複数の温度域にまたがって流動することを防ぐ。このため、反応液が複数の温度域に存在する時間を短縮させることができ、反応液に生じる温度の不均一性を軽減する。さらに、反応液の接触面積を上げるため、反応液の熱伝達の効率が向上し、反応液の加熱および冷却に必要な時間を短縮することができるため、反応時間の短縮につながる。また、分岐した流路を再び合流することで、反応液を混合するため、増幅過程において各増幅流路ごとの反応液に生じる成分の不均一を解消することにより、増幅量を増大させる効果がある。
【００４５】
また、温度変化の異なる複数のＰＣＲサイクルを行い、適当なＰＣＲサイクルを調べる第一段階ＰＣＲ反応と、反応液を再び混合、均一化したのち、適当なＰＣＲサイクルにて、ＰＣＲ反応を行う第二段階ＰＣＲ反応を一貫して行うことが可能であるため、適したＰＣＲサイクルがわからない鋳型核酸においても、増幅することが可能である。
【００４６】
このように、本発明の実施例によれば、温度設定が可能な微小流路を複数の流路に分岐させることで、反応液が流路方向に広がりすぎることをふせぐことができる。このため、反応液が複数の温度域にまたがって流動することを防ぎ、反応液に生じる温度の不均一性を軽減する。さらに、反応液の接触面積を増えるため、反応液の熱伝達の効率が向上し、反応液の加熱および冷却に必要な時間を短縮することができるため、反応時間の短縮につながる。また、分岐した流路を再び合流することで、反応液を混合するため、増幅過程において各増幅流路ごとの反応液に生じる成分の不均一を解消することにより、増幅量を増大させる効果がある。
【００４７】
また、適当なＰＣＲサイクルを調べる工程と、適当なＰＣＲサイクルでＰＣＲ反応を行う工程を一貫して行うことが可能であるため、適したＰＣＲサイクルがわからない鋳型核酸においても、増幅することが可能である。
【００４８】
（実施例２）
次に、ＰＣＲ増幅反応の過程で、ＰＣＲ反応液に鋳型核酸を含まないＰＣＲ増幅液を追加するときの実施例を示す。
【００４９】
本実施例においても、実施例１で使用した遺伝子分析装置１（図１）を使用する。
図２４から図２５を用いて、核酸増幅チップ１０の構造を説明する。
核酸増幅チップ１０５も実施例１と同様に、使用する試薬を流動させるための溝を刻んだ流路部２０００（図２４）と、流路部２０の流路の温度を制御するための温度制御部３０００（図２５）を接合して構成する。
【００５０】
流路部２０００は、試薬注入部２００５、第一分岐部２０３５、第一増幅流路部２０４５、第一合流部２０５５、第二分岐部２０６５、第二増幅流路部２０７５、第二合流部２０８５、第三分岐部２０９５、第三増幅流路部２１０５、第三合流部２１１５、第一増幅液注入流路２１２５、第二増幅液注入流路２１３５、検出部２１４５を構成する溝を温度制御部３０００との接触面側に持つ。検出を行うための光学窓２１５５を温度制御部３０００との接触面と反対側に備える。
【００５１】
温度制御部３０００は、第一増幅流路部２０４５を加熱するための第一熱変性ヒーター３００５および第一アニーリングヒーター３０１５、第二増幅流路部２０７５を加熱するための第二熱変性ヒーター３０２５および第二アニーリングヒーター３０３５、第三増幅流路部２１０５を加熱するための第三熱変性ヒーター３０４５および第三アニーリングヒーター３０５５、を流路部２０との接触面側に備え、それぞれのヒーターは温度センサー（図示せず）を備えている。それぞれの増幅流路とヒーターと温度センサーは電極端子３０６５を介して図１の遺伝子増幅装置１とつながり、ヒーターの温度は遺伝子増幅装置１のパネル４２により、自由に設定することができる。また、温度制御部３０００は反応液注入口３０７５、洗浄液注入口３０８５、廃液口３０９５、第一増幅液注入口３１０５、第二増幅液注入口３１１５となる貫通孔も備える。
【００５２】
以下、核酸増幅チップ１０内の流路を試薬が流動することで、目的の遺伝子を増幅し、検出する実施例を、図２６から図２９を用いて示す。増幅および検出動作の流れを図２６に示す。
【００５３】
はじめに、核酸増幅チップ１０５の温度制御部３０００の反応液注入口３０７５から、鋳型となるＤＮＡを含む反応液２１１５を注入する。さらに、第一増幅液注入口３１０５、第二増幅液注入口３１１５から鋳型となるＤＮＡを含まない反応液２１１を注入する。反応液は、ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２種類のプライマー、ｄＮＴＰ、金属イオン、緩衝液、増幅したＤＮＡを検出するための蛍光色素を含んでいる。蛍光色素は例えばＣｙｂｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を使用する。反応液を注入した核酸増幅チップ１０５を遺伝子分析装置１の設置台４０５に設置する。設置後、核酸増幅チップ１０の温度制御部３０００のヒーターの温度を設定する。例えば、第一熱変性ヒーター３００、第二熱変性ヒーター３０２５、第三熱変性ヒーター３０３５は熱変性のために９５℃、第一アニーリングヒーター３０１５と第二アニーリングヒーター３０３５と第三アニーリングヒーター３０５５はアニーリングのために５５℃に設定する。
【００５４】
設置後の核酸増幅チップ１０５と設置台４０５の関係を図２７に示す。核酸増幅チップの電極端子３０６５を設置台４０５の設置台電極端子４５５に取り付け、反応液注入口３０７５に反応液注入口バルブ４６５を、洗浄液注入口３０８５に洗浄液注入用バルブ４７５を、廃液口３０９５に廃液口バルブ４８５を、第一増幅液注入口３１０５に第一増幅液注入口バルブ４９５を、第二増幅液注入口３１１５に第二増幅液注入口バルブ５０５を取り付ける。また、タンク４３５に洗浄液を入れる。反応液や洗浄液の流動はポンプ４３５による圧力と各バルブ４６５、４７５、４８５、４９５の開閉により制御され、核酸増幅チップ１０の流路を通過し、目的遺伝子を増幅・検出した後、廃液口２０２を通過し、廃液容器５１に廃棄される。洗浄液にはＴＥバッファーなどを用いる。
以下、鋳型となる核酸を含む反応液を核酸増幅チップ１０５内の流路に流動させることで、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅する過程を説明する。
【００５５】
核酸増幅チップ１０５に注入した反応液は、実施例１および２と同様にポンプ４３５と、反応液注入口バルブ４６５、洗浄液注入用バルブ４７５、廃液口バルブ４８５の開閉により、図２４の流路部２０００における試薬注入部２００５、第一分岐部２０１５、第一増幅流路部２０２５、第一合流部２０３５を流動する。このとき第一増幅液注入口バルブ４９５と第二増幅液注入口バルブ５０５は閉じている。
【００５６】
図２８は、第一増幅流路部２０２５における温度制御部３０００の第一熱変性ヒーター３００５と第一アニーリングヒーター３０１５との対応を示すものである。実施例１で用いた核酸増幅チップ１０と同様に、第一増幅流路部２０２５の各流路は、９５℃に設定した第一熱変性ヒーター３００５上と５５℃に設定した第一アニーリングヒーター３０１５上を交互に通過する。等量に分かれた反応液は、第一分岐部２０１５を通過し、第一増幅流路部２０２５に分離した後、第一増幅流路部２０２５を流れることで、９５℃の温度域と５５℃の温度域を交互に通過するため、反応液はＰＣＲ反応に必要な温度変化を受け、増幅する。また、図２４における第二増幅流路部２０７５と第二熱変性ヒーター３０２５および第二アニーリングヒーター３０３５の位置関係、第三増幅流路部２１０５と第三熱変性ヒーター３０４５および第三アニーリングヒーター３０５５の位置関係も第一増幅流路部２０２５と第一熱変性ヒーター３００５および第一アニーリングヒーター３０１５との位置関係と同じため、反応液が第二増幅流路部、第三増幅流路部を通過したときには、反応液は同様の温度変化を請けるため反応液中の核酸は増幅する。
【００５７】
第一合流部２０５５を通過した反応液が第二合流部２０６５に流動するとき、図２９に示すように、反応液２２０５に増幅液を追加し、混合する。追加の動作は、図２７に示す第一増幅液注入口バルブを４９５開き、ポンプ４３５による圧力により行う。
【００５８】
新たに増幅液が追加された反応液は、図２４の第二分岐部２０６５、第二増幅流路２０７５、第二合流部２０８５を通過する。反応液は第二増幅流路２０７５を通過するときに、第一増幅流路２０４５を通過する時と同様に、９５℃−５５℃の温度変化を受けるためＰＣＲ反応により鋳型核酸は増幅する。さらに反応液は流動し、第三合流部２０９５に流動するときに、図２７に示す第二増幅液注入口バルブ５０５を開き、新たに増幅液を追加する。新たに増幅液が追加された反応液は、第三分岐部２０９５、第三増幅流路２１０５、第三合流部２１１５を通過する。第三増幅流路２１０５を通過するときに、第一増幅流路２０４５を通過するときと同様に９５℃−５５℃の温度変化を受けるためＰＣＲ反応により鋳型核酸は増幅する。
反応液は検出部２１４５に流動し、増幅した核酸を検出窓２１５５より光学機器を用いて検出する。
【００５９】
このように、増幅する工程の間に増幅液等の試薬を追加する流路を備えることを特徴とする。
【００６０】
また、試薬が複数の温度域を通過する流路を流動しているときに、流動している新たに試薬を追加できる構造を持つ。また、目的の核酸を増幅する試薬を複数の温度域を通過する流路に流動させる過程で、上記試薬を混合することを特徴とする核酸増幅方法を提供することで解決できる。
【００６１】
本実施例によれば、ＰＣＲ反応の過程で不足した基質や失活したＤＮＡポリメラーゼを補うために新たに増幅液を追加しているため、基質の不足やＤＮＡポリメラーゼの失活による鋳型核酸の増幅量の低下を抑えることができる。
【００６２】
【発明の効果】
本発明により、増幅効率の高い核酸増幅装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例による遺伝子分析装置の全体構成図である。
【図２】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの外観図である。
【図３】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の構成図である。
【図４】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの温度制御部の構成図である
【図５】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部と温度制御部の対応図である。
【図６】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の拡大図である。
【図７】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの組図の断面図である。
【図８】本発明の実施例による動作手順を示す説明図である。
【図９】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１０】本発明の実施例による遺伝子分析装置の流路対応図である。
【図１１】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１２】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１３】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１４】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１５】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１６】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１７】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図１８】本発明の実施例による遺伝子増幅チップにおける流路部の合流部と温度制御部の対応図である。
【図１９】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部と温度制御部の対応図である。
【図２０】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図２１】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部と温度制御部の対応図である。
【図２２】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図２３】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【図２４】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の構成図である。
【図２５】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの温度制御部の構成図である
【図２６】本発明の実施例による動作手順を示す説明図である。
【図２７】本発明の実施例による遺伝子分析装置の流路対応図である。
【図２８】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部と温度制御部の対応図である。
【図２９】本発明の実施例による遺伝子増幅チップの流路部の流動状態を示したものである。
【符号の説明】
１・・・遺伝子分析装置、１０・・・核酸増幅チップ、２０・・・流路部、４０・・・設置台、４１・・・モニタ、４２・・・パネル、２００・・・試薬注入流路部、２０３・・・第一分岐流路部、２０４・・・第一増幅流路部、２０５・・・第一合流流路部、２０６・・・第二分岐流路部、２０７・・・第二増幅流路部、２０８・・・第二合流流路部２０８、２０９・・・検出流路部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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