(57)【要約】【課題】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌は、炭化水素、原油、安息香酸、塩素化ベンゼンなどの分解菌として知られている。そして、この細菌を生産する培地として、ＭＳＢ培地またはＭ９培地とピルビン酸ナトリウムとの組み合わせ提案されているが、このような培地ではロドコッカス属細菌以外の微生物も多量に培養されるという問題点がある。本発明はの目的は、ロドコッカス属細菌を主として培養することができる培地を提供することである。【解決手段】土壌等に尿素−アルデヒド縮合物を含有させることによって、ロドコッカス属細菌用の培地とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿素−アルデヒド縮合物を含有することを特徴とするロドコッカス属細菌用培地。
【請求項２】
尿素−アルデヒド縮合物が尿素−アセトアルデヒド縮合物である、請求項１に記載のロドコッカス属細菌用培地。
【請求項３】
尿素−アセトアルデヒド縮合物が２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンである、請求項１に記載のロドコッカス属細菌用培地。
【請求項４】
尿素−アルデヒド縮合物の含有量が、培地の全重量を基準として０．００００１〜１０重量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌用培地。
【請求項５】
培地が土壌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、尿素−アルデヒド縮合物を含有することを特徴とする、ロドコッカス属細菌用培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌は、代表的な放線菌であり、陸地、河川、湖沼、海洋など様々な場所に存在する。そしてこの細菌は、炭化水素（ヘキサン、トルエン、ナフタレンなど）、原油、安息香酸などの分解菌として知られている。この細菌はまた、塩素化ベンゼン（三塩化ベンゼン、四塩化ベンゼン、ＰＣＢなど）から塩素を脱離して、これらを分解する菌としても知られている。
【０００３】
そして、ロドコッカス属細菌を生産できる培地の例が、特許文献１に開示されている。この文献には、炭素源として「ピルビン酸ナトリウム」が記載されており、無機培地として「ＭＳＢ培地」および「Ｍ９培地」が記載されている。そしてＭ９培地の成分は、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化アンモニウムなどである。しかしながらこのような培地には、ロドコッカス属細菌以外の微生物も多量に培養されるという問題点がある。ロドコッカス属細菌以外の微生物の増殖によって、培地中の栄養成分が多量に消費されると、ロドコッカス属細菌を効率良く培養できなくなる。そのため、ロドコッカス属細菌を選択的に培養するための培地の提供が求められている。
【特許文献１】特開２００２−０００２８６公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ロドコッカス属細菌を主として培養することができる培地を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために、本発明は次の構成を有する。
［１］尿素−アルデヒド縮合物を含有することを特徴とするロドコッカス属細菌用培地。
［２］尿素−アルデヒド縮合物が尿素−アセトアルデヒド縮合物である、［１］項に記載のロドコッカス属細菌用培地。
［３］尿素−アセトアルデヒド縮合物が２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンである、［１］項に記載のロドコッカス属細菌用培地。
［４］尿素−アルデヒド縮合物の含有量が、培地の全重量を基準として０．００００１〜１０重量％である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌用培地。
［５］培地が土壌である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のロドコッカス属細菌用培地。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のロドコッカス属細菌用培地は、尿素−アルデヒド縮合物を含有することを特徴とする。この尿素−アルデヒド縮合物は、微生物によって分解されやすい特性を有することが好ましい。本発明に用いる尿素−アルデヒド縮合物は、直鎖状、分岐鎖状、または環状のアルデヒドと尿素との縮合物である。この具体例は、尿素−ホルムアルデヒド縮合物、尿素−アセトアルデヒド縮合物、尿素−イソブチルアルデヒド縮合物などである。尿素−アセトアルデヒド縮合物の例は、２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンである。これらの縮合物の１種以上を混合して用いてもよい。
【０００７】
ロドコッカス属細菌を選択的に培養することを目的とするとき、上記の例のうち尿素−アセトアルデヒド縮合物がより好ましい。そして、下記の２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンが更に好ましい。
2004248530.tif 000002
【０００８】
この２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンの製造法の例を次に示す。まず、尿素６０ｇを水６０ｍｌに溶解し、濃塩酸８．５ｍｌを加え、氷冷下にアセトアルデヒド３０ｇを滴下する。次いで、５０℃で４時間攪拌しながら反応させると結晶が析出してくる。この結晶を濾過し、水で洗浄し、減圧乾燥して目的物を得ることができる。
【０００９】
本発明に用いる尿素−アルデヒド縮合物は、どのような形状であってもよい。粒状、粉状、圧片状などの固形状の他、溶液、研濁液、ペーストなどでもよい。本発明では、尿素−アルデヒド縮合物に加えて栄養成分を用いることができる。栄養成分の例は、含窒素化合物、リン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、キレート化合物、金属、糖類、アミノ酸類、蛋白質、脂質などである。これらは、尿素−アルデヒド縮合物とは別に加えてもよいが、尿素−アルデヒド縮合物を上記のいずれかの形状にするときに配合してもよい。これらは、尿素−アルデヒド縮合物の効果が失われない程度の範囲で添加することが好ましい。含窒素化合物の例はアンモニウム塩、硝酸塩などであり、キレート化合物の例は、カリウムキレート、マグネシウムキレート、ナトリウムキレート、カルシウムキレートなどである。金属の例は、鉄、亜鉛、銅、マンガン、コバルト、モリブデンなどである。糖類の例は、グルコース、スクロース、デンプン、フルクトース、フラクトース、マンノース、ラクトース、アガロース、セルロース、デキストロースなどである。アミノ酸の例は、システイン、カゼイン、アラニンなどである。蛋白質の例は、ペプトン、トリプトン、ポリペプトンなどである。上記の他、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、肉エキスなども用いることができる。
【００１０】
本発明では、細菌が生息または増殖できる環境を形作るものをすべて培地と表現する。このような培地には、固形の培地、培養液、土壌などがある。固形の培地や培養液の具体例は、Ｅ−培地、Ｂ−９最小培地、Ｂ−１０グアニン補添培地、Ｂ−１５培地、Ｍ９培地、Ｂ−１９培地、Ｂ−２２培地、コロイド状キチン培地（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｃｈｉｔｉｎ  ｍｅｄｉｕｍ）、スターチ−カゼイン培地、Ｍ３培地、土壌抽出物（ｓｏｉｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）−寒天培地などである。
【００１１】
本発明は土壌を培地とする場合において特に有効である。未滅菌または未殺菌の土壌においては、ロドコッカス属細菌が存在している可能性が高い。そして土壌を培地とするとき、ロドコッカス属細菌の選択的培養が顕著に発現する。このような土壌の例は、黒ボク土、赤色土、黄色土、赤黄色土、灰色低地土、森林土、グライ土、褐色低地土、砂質土などである。農地土壌、非農地土壌、森林土壌、海岸土壌などに分類してもよい。農地土壌の例は、水田土壌、畑土壌などである。非農地土壌の例は、緑地土壌、芝栽培土壌、牧草栽培土壌、非栽培土壌、荒地土壌、埋立て用土壌、土木工事用土壌、砂丘土壌、球技場土壌、遊技場土壌、競馬用土壌、工業用地内土壌等などである。なお、上記の如何なる土壌であっても本発明を適用できるが、非農地土壌、森林土壌、海岸土壌など栄養分が比較的少ない土壌が好ましい。これらの土壌では、尿素−アルデヒド縮合物の高い効果が期待できる。
【００１２】
本発明のロドコッカス属細菌用培地において、尿素−アルデヒド縮合物の好ましい含有量は、培地全重量を基準とする割合で０．００００１〜１０重量％である。この割合のより好ましい範囲は０．０００１〜５重量％である。更に好ましい範囲は０．００１〜３重量％である。ロドコッカス属細菌の増殖量を多くするためには、この割合が０．００００１重量％以上であることが好ましい。ロドコッカス属細菌の効率的増殖効果を高くするためには、この割合が１０重量％以下であることが好ましい。
【００１３】
選択した培地に栄養成分の含有量が少ない場合は、栄養成分を添加することが好ましい。栄養成分の例は前記の通りである。その他、本発明の目的を損なわない範囲で、アガロース、水、無機鉱物、肥料、農薬、水溶性樹脂、合成樹脂、木炭、泥炭などを培地に添加することができる。本発明のロドコッカス属細菌用培地を製造するには、尿素−アルデヒド縮合物を培地に添加し、混合すればよい。添加の方法や混合の方法には、特別な手段を要しない。通常知られている方法を採用することが推奨される。
【００１４】
本発明の培地を用いてロドコッカス属細菌を培養するには、ロドコッカス属細菌が含まれている培地を放置するだけでよい。場合によっては更にロドコッカス属細菌を接種してから放置してもよい。放置に際しては、ロドコッカス属細菌を酸素と接触させることが好ましい。通常の大気の下であれば特に問題はないが、ロドコッカス属細菌を多く増殖させるためには、培地が土壌の場合は耕起を行うことが好ましく、培地が培養液の場合は曝気、振とう攪拌などを行うことが好ましい。そして、ロドコッカス属細菌が多く増殖するためには、ロドコッカス属細菌用培地の温度が０〜８０℃であることが好ましい。より好ましい培地温度の範囲は５〜６０℃であり、更に好ましい培地温度の範囲は１５〜４０℃である。
【００１５】
培地が土壌である場合には、土壌の自由水量を調整する必要がある。自由水量は、土壌中の固相表面に吸着されていない水量の指標であり、ｐＦ値とも呼ばれている。その値は、「土壌標準分析・測定法」（株式会社博友社、昭和６１年１１月１５日発行）の３６頁１行目〜５４頁３行目に記載の方法により求めることができる。そして、ロドコッカス属細菌を多く増殖させるためには、土壌の自由水量がｐＦ０〜４．２であることが好ましい。ｐＦ値のより好ましい範囲は０．１〜３．５であり、更に好ましい範囲は０．５〜３．０以下である。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
実施例１
（１）ロドコッカス属細菌の培養
高知県幡多郡大方町の海岸にある乾土（砂質土）を、網目２ｍｍの篩いを通して粒度を調整した後、ｐＦ１．８になるように水分を調整して培地とした。これに、培地１０００ｇに対して２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンを３ｇ添加し、混合してロドコッカス属細菌用培地を作成した。このとき、２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンは、直径約３ｍｍの粒状物を用いた。このロドコッカス属細菌用培地を容積２リットルの容器に入れ、容器の上縁をポリエチレンフィルムで覆って、２５℃の恒温室に静置した。そして、２０日毎に容器内の培地を攪拌してロドコッカス属細菌の培養を行った。２０日毎に約１０ｇの培地を採取し分析した。
【００１７】
２）ＤＮＡ抽出
採取した培地より、「Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ」（ＭＯ  ＢＩＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、土壌中に存在する全てのＤＮＡ抽出を下記のように行った。
２ｍｌ−ネジ付チューブに、約０．８ｇの培地を量りとり、更に「Ｕｌｔｒａ  Ｃｌｅａｎ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ」（以下、キットと略称する。）中の２ｍｌ−Ｂｅａｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｕｂｅｓの内容液を添加して穏やかに攪拌した。キット中のＳｏｌｕｔｉｏｎ−Ｓ１を６０μｌ添加し、一度転倒混和した。更に、キット中のＳｏｌｕｔｉｏｎ−ＩＲＳを２００μｌ添加し、「ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤ−ＢＥＡＤＥＲ」（ＢＩＯＳＰＥＣ社製）で、回転数５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。遠心分離後に上清を新しいキット中のチューブ（Ｐｒｏｖｉｄｅｄ）に移し、キット中のＳｏｌｕｔｉｏｎ−Ｓ２を２５０μｌ添加した。そして５秒間攪拌後、４℃の条件下で５分間培養し、その後回転数１１，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離後に上清４５０μｌをキット中の新しいチューブ（Ｐｒｏｖｉｄｅｄ）に移し、キット中のＳｏｌｕｔｉｏｎ−Ｓ３を９００μｌ添加した。これを５分間攪拌した後に、７００μｌをキット中のスピンフィルターに添加し、回転数１１，０００ｒｐｍで、１分間遠心分離した。それから、通過液（Ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を除いた後に、チューブ中の残りの液をスピンフィルターに添加し、回転数１１，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。通過液（Ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を除いた後に、スピンフィルターにＳｏｌｕｔｉｏｎ−Ｓ４を３００μｌ流し、回転数１１，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離する。更に通過液（Ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を除いた後に、回転数１１，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。スピンフィルターを新しいチューブ（Ｐｒｏｖｉｄｅｄ）に移し、スピンフィルターの中央部にキット中のＳｏｌｕｔｉｏｎ−Ｓ５を５０μｌ添加した。そして、回転数１１，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、ＤＮＡ溶液を得た。
【００１８】
３）ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
次に、得られたＤＮＡ容液を用いて、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ法（以下ＰＣＲと略称する）によるＤＮＡ増幅を行った。このとき、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）を用い、ｃｏｏｌ  ｓｔａｒｔ法を利用した。条件は下記の通りであった。
＜対象＞  １６ＳｒＤＮＡ（細菌）
＜プライマー＞
３４１ＦＧＣ４０、５１５Ｒ（細菌の１６ＳｒＤＮＡ  Ｖ３ｒｅｇｉｏｎを含む領域を増幅）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．（１９９３）５９  Ｐ６９５〜７００に記載のプライマー）
＜増幅条件＞
２μｌのテンプレートＤＮＡおよび２５０ｎＭプライマー
＜温度―反応条件＞
温度９４℃−反応時間５分を１回行う。次ぎに温度５２℃−反応時間１分、その後温度７２℃−反応時間１分、その後温度９４℃−反応時間１分を１回行い、これを２９回繰り返す。更に温度７２℃−反応時間１０分を１回行う。
【００１９】
４）ＤＧＧＥ
得られたＰＣＲによる産物を用いて、以下の条件で変性濃度勾配ゲル電気泳動法（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（以下ＤＧＧＥと略称する。））を行った。条件は下記の通りであった。
＜対象＞  １６ＳｒＤＮＡ（細菌）
＜ＰＣＲ産物のアプライ量＞  ２０μｌ
＜変性剤濃度勾配＞  ４５〜６０重量％
（７Ｍ尿素、４０重量％ホルムアミドを１００重量％とする）
＜泳動条件＞  ２００Ｖ、５時間、６０℃
結果を図１に示す。図１中のバンド１が他のバンドより顕著に濃くなっていることより、バンド１のＤＮＡを有する菌が多いと判定された。
【００２０】
５）塩基配列の決定
図１に示すバンド１を切り出し、滅菌水１００μｌにて洗浄後、滅菌水２０μｌに４℃で一晩浸漬してＤＮＡを溶出させ、ＤＮＡ溶液を得た。このＤＮＡ溶液について、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。そして、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の決定を以下の方法で行った。
ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを用い、塩基配列の決定はＤＮＡ末端の両方向から行なった。プライマーは上流３４１ＦＧＣ４０、下流５１５Ｒを用いて、これらの結果を基にアライメントを行い、塩基配列を決定した。アライメントは、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ  ＣＬＵＳＴＡＬＷ  Ｓｅｒｖｅｒ（京都大学  化学研究所  バイオインフォマティックセンター）にて、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  １．８１を用いて行った。得られた塩基配列を下記に示す。
【００２１】
2004248530.tif 000003
【００２２】
６）ホモロジーサーチ
上記の塩基配列を基に、ホモロジーサーチを行い、相同性の高い菌の調査を行い、相同性の高い順に４位までを下記に示す。このサーチは、ＧｅｎｏｍｅＮｅｔ  ＢＬＡＳＴ２  ｓｅｒｖｅｒｒ（京都大学  化学研究所  バイオインフォマティックセンター）にて、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ  １．８１を用いて行った。
【００２３】
＜表１＞
2004248530.tif 000004
この結果によって、バンド１中の菌がロドコッカス属細菌であると同定された。このことは、実施例１に用いた培地において、ロドコッカス属細菌が選択的に培養されたことを意味する。
【００２４】
比較例１
２−オキソ−４−メチル−６−ウレイドヘキサヒドロピリミジンを添加しないことと、恒温室の温度を３０℃とした以外は実施例１と全く同様にして培養し、実施例１と同様にＤＮＡ抽出からＤＧＧＥまで行った。その結果を図１に示す。図１では、実施例１と同じ位置にバンドが認められない。即ち、ロドコッカス属細菌が顕著に増殖されていないことが分かる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の培地は、主にロドコッカス属細菌を選択的に培養するという効果を発揮する。即ち、炭化水素（ヘキサン、トルエン、ナフタレン、原油等）の分解能を有するロドコッカス属細菌を主に生産するので、バイオレメディエーション（Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）に効果的に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１および比較例１における培養で、培養後の培地中に存在する細菌の１６ＳｒＤＮＡ解析結果
【図１】
2004248530.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月26日(2003.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
５）塩基配列の決定
図１に示すバンド１を切り出し、滅菌水１００μｌにて洗浄後、滅菌水２０μｌに４℃で一晩浸漬してＤＮＡを溶出させ、ＤＮＡ溶液を得た。このＤＮＡ溶液について、上記と同様の条件でＰＣＲを行った。そして、得られたＰＣＲ産物の塩基配列の決定を以下の方法で行った。
ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７ＸＬ（Applied Biosystems社製）およびBig Dye Terminator Cycle Sequencingを用い、塩基配列の決定はＤＮＡ末端の両方向から行なった。プライマーは上流３４１ＦＧＣ４０、下流５１５Ｒを用いて、これらの結果を基にアライメントを行い、塩基配列を決定した。結果を配列１に示す。アライメントは、GenomeNet CLUSTALW Server（京都大学  化学研究所  バイオインフォマティックセンター）にて、CLUSTAL Ｗ １．８１を用いて行った。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【配列表】
2004248530.tif 000006