(57)【要約】【課題】  炎症疾患の処置【解決手段】  本発明は、第ＶＩＩ因子、第Ｘａ因子、および組織因子の発現の活性化を含む、急性炎症または慢性炎症に関連する症候群（敗血症および敗血症性ショックなど）を予防的におよび治療的に処置するために使用でき組成物を提供する。この組成物は、有効量のリポタンパク質関連凝固因子（ＬＡＣＩ）を含有する。本発明に従って、ＬＡＣＩを投与することで、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、または他のサイトカインが組織因子を上方制御する病状を治療することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症疾患を処置するための組成物であって、ヘパリンの非存在下で、ＴＦＰＩ−１−２７６、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１−１６０、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１３−１６１、ａｌａ−ＴＦＰＩ−２２−１５０、およびａｌａ−ＴＦＰＩ−１−２７６からなる群より選択される治療有効量のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、非グリコシル化形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１−１６０である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１３−１６１である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−２２−１５０である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１−２７６である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
敗血症および敗血症性ショックを含む炎症の危険および重篤度を低減するための予防用組成物であって、ＴＦＰＩ−１−２７６、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１−１６０、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１３−１６１、ａｌａ−ＴＦＰＩ−２２−１５０、およびａｌａ−ＴＦＰＩ−１−２７６からなる群より選択される予防有効量のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、非グリコシル化形態である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１−１６０である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１３−１６１である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−２２−１５０である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ａｌａ−ＴＦＰＩ−１−２７６である、請求項８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性炎症および慢性炎症、敗血症および敗血症性ショックを、予防的および治療的に処置する方法である。さらに詳細には、治療的に有効量の特定のタンパク質を投与して、敗血症性ショックと関連する生理学的経路を弱める工程を包含する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症およびそれに続く敗血症性ショックが、手術後の最も案じられる合併症の中におよび危篤患者において残っている。Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌは、敗血症を米国における１３番目の死因（ＭＭＷＲ，１９８７，３９：３１およびＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，３７：７，１９８９を参照）として、そして高齢のアメリカ人の間の１０番目の死因（ＭＭＷＲ，１９８７，３９：７７７参照）としてランク付けている。これらの病気の発生率は増加し、死亡率は高いままである。敗血症患者へのケアの全コストの概算は、毎年５０億ドルから１００億ドルの範囲である（ＭＭＷＲ，１９８７，３９：３１を参照のこと）。この患者の４０％から６０％が死に至り得る。この割合は、過去２０年間に亘って全く改善されていない。
【０００３】
敗血症性ショックを導き得るグラム陽性およびグラム陰性感染を生じた血液の発生率はほとんど等しい。敗血症性ショックは、不十分な組織潅流、組織への不十分な酸素供給の誘発、低血圧、および乏尿を特徴とする。敗血症性ショックは、細菌生成物（主にＬＰＳ）が、細胞膜ならびに凝集成分、補体、フィブリン溶解物、ブラジキニン、および免疫系と反応して凝集を活性化し、細胞を傷害し、そして血流（特に微小血管において）を変化させて起こる。微生物は、頻繁に古典的補体経路を活性化し、エンドトキシンは第二経路を活性化する。補体活性化、ロイコトリエンの生成、および好中球上でのエンドトキシンの直接効果は、肺でのこれらの炎症細胞の蓄積、酵素の放出、および、肺内皮を傷害して急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を開始する毒性の酸素ラジカルの生成を導く。ＡＲＤＳは、敗血症性ショックの患者の主な死因であり、肺うっ血、顆粒球凝集、出血、および毛細血管の血栓を特徴とする。
【０００４】
凝集システムの活性化の結果、血栓発生および多くの器官の微小循環における血小板血栓形成を生じる。この症候群の病因は、第ＸＩＩ因子による内因性の凝集システムの活性化、および組織因子の上方制御を介する外因性経路の活性化を含む。活性化第ＸＩＩ因子は内因性凝集カスケードを開始し、やがてフィブリノーゲンがフィブリンに変換されて凝血が生じる。制御されない凝集が活性化（通常ショックを伴う）された結果、血栓症ならびに凝固因子ＩＩ、Ｖ、およびＶＩＩＩの消費を生じる。拡散した血管内凝集のいくつかの共通の合併症は、重篤な臨床上の出血、血栓症、組織の虚血および壊死、溶血および器官不全である。
【０００５】
同時に、凝集はエンドトキシンにより明らかに開始されるので、カウンターベニング（ｃｏｕｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ）メカニズムもまた凝血（すなわちフィブリン溶解システムの活性化）により活性化されることが判明した。活性化した第ＸＩＩ因子がプラスミノーゲンプロ活性化因子をプラスミノーゲン活性化因子に変換し、次いでプラスミノーゲン活性化因子により凝固物の溶解を介してプラスミノーゲンをプラスミンに変換する。従って、血漿フィブリン溶解システムの活性化はまた出血傾向に寄与する。
【０００６】
外毒素症は、組織プラスミノーゲン活性化因子インヒビター（ＰＡＩ）の循環レベルを増加することに関連する。このインヒビターは組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）を迅速に不活性化し、プラスミノーゲンのプラスミンへの活性化を通してフィブリン溶解を促進する能力を妨害する。フィブリン溶解の減損は血管でのフィブリンの堆積を引き起こし得、従って敗血症性ショックに関連のある拡散した血管内凝集に寄与する。
【０００７】
拡散した血管内凝集（ＤＩＣ）は、小管中のフィブリンの広範囲の堆積を特徴とする微生物を侵すことに応答して生じる凝固障害である。ＤＩＣの開始原因は循環系へのトロンボプラスチン（組織因子）の放出であるようである。このプロセスの間、フィブリノーゲンおよび血小板が減少してフィブリン分解生成物が増加した結果、血管でのフィブリン堆積を生じる。ＤＩＣの間に起こる連続した事象を図１に記載する。患者は疾患プロセスの間、凝集プロテアーゼインヒビターの枯渇の程度に依存して、血栓症または出血のいずれかを患う。凝集カスケードの制御の一部分は、血流の速度に依存する。ＤＩＣおよび敗血症のように流れが減少した場合、問題は大きくなる。臨床的に軽症から重症のＤＩＣは、敗血症性ショックの患者、ならびに頭部外傷および火傷、産科の合併症、輸血反応、ならびに癌のようないくつかの他の症候群において高頻度で起こると考えられる。Ｘｏｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる最近の抄録で、ＤＩＣが敗血症患者の２４％で記載があったことが示される（Ｍａｒｔｉｎら，１９８９，Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  １９８０ｓ，抄録番号３１７，ＩＣＡＡＣ会合，Ｄａｌｌａｓ）。さらに、この抄録には、ＤＩＣおよび急性呼吸窮迫症候群が７日目までに最も死亡の前兆が変わりやすい（危険率４および２．３）ことが記載されている。循環および敗血症への組織因子の遊離を導く事象のカスケードは大変複雑である。種々のサイトカインが、活性化した単球、内皮細胞などから遊離される：これらのサイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）（組織因子発現を上方制御することが知られている）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン８（ＩＬ−８）などを含む。補体カスケードはまた、敗血症患者の血漿中のＣ３ａおよびＣ５ａのレベルを上昇させることにより証明されるように活性化される。従って、組織因子の発現またはその活性に影響しないで凝集を治療する薬剤は、必ずしも敗血症の治療に有効ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、敗血症またはＤＩＣの予防または治療のための満足のいく発明はない。ヘパリンがＤＩＣでの最も普通に用いられる抗凝固剤である。しかし、出血を誘発し、患者の健康状態を悪化するので論議をかもす。抗凝固剤を用いて敗血症を治療するの他の試みもまた困難である。Ｔａｙｌｏｒら，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７８：３６４−３６８に示すように、ワルファリンおよびヘパリンは敗血症におけるＤＩＣの治療に用いられる２つの抗凝固剤として記載されているが、いずれも理想的な薬物ではない。さらに、Ｔａｙｌｏｒらは、新規の薬物のＤＥＧＲ−Ｘａ（Ｘａ因子のアンタゴニスト）がＤＩＣを阻害し得るが、この薬物は敗血症の致死効果をブロックしないことを示す。従って、凝集経路を妨害し得る薬剤が必ずしも敗血症性ショックのインヒビターとして有効ではないことが明らかである。従って、敗血症の致死効果を阻害する組成物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、第ＶＩＩ因子、第Ｘａ因子、および組織因子の発現の活性化を含む、急性炎症または慢性炎症に関連する症候群（敗血症および敗血症性ショックなど）を予防的におよび治療的に処置する方法であって、有効量のリポタンパク質関連凝固因子（ＬＡＣＩ）を投与する工程を包含する方法である。さらに本発明は、ＬＡＣＩを投与して、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、または他のサイトカインが組織因子を上方制御する病状を治療する工程を包含する方法である。詳細には、これらの病状には急性炎症または慢性炎症を含む。好ましくは、ＬＡＣＩは、１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間、さらに好ましくは２０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの間、最も好ましくは１から７ｍｇ／ｋｇの間の用量で静脈内に投与される。ＬＡＣＩは、好ましくは敗血症および敗血症性ショックを治療する添加剤（例えば、抗生物質）とともに投与される。
【００１０】
他の物の間で、その抗凝集特性について知られている化合物がまた免疫応答を弱め、敗血症および敗血症性ショックの治療として用い得ることが、驚くべく発見された。このことは、Ｗａｒｒら，  １９９０，  Ｂｌｏｏｄ，  ７５：１４８１−１４８９、およびＴａｙｌｏｒら，  １９９１，  Ｂｌｏｏｄ，  ７８：３６４−３６８の所見を考慮すると、驚くべきことである。
【００１１】
（表の説明）
表１は、＋３０分でのコントロールのヒヒおよびＬＡＣＩ処置したヒヒの体重、性別、Ｅ．ｃｏｌｉ用量、および生存期間を示す。
【００１２】
表２は、＋３０分でのＬＡＣＩ処置したヒヒおよびコントロールのヒヒの臨床化学値のまとめを示す。
【００１３】
表３は、＋３０分でのＬＡＣＩ投与後のＩＬ−６レベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【００１４】
表４は、＋２４０分でのコントロールのヒヒおよびＬＡＣＩ処置したヒヒの体重、性別、Ｅ．ｃｏｌｉ用量、および生存期間を示す。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
（ＬＡＣＩ）
上記のように、本発明は、ＬＡＣＩが敗血症性ショックの有害な効果を阻害し得ることの発見である。詳細には、ＬＡＣＩは、凝固障害ならびに急性炎症および敗血症性ショックに関連する炎症プロセスを阻害／減弱する。ＬＡＣＩは分子量３８，０００Ｋｄの血清の糖タンパク質である。なぜなら、これは組織因子インヒビターとしても知られている。これは凝固を誘導する天然のトロンボプラスチン（組織因子）インヒビターである（米国特許第５，１１０，７３０号および第５，１０６，８３３号は組織因子を記載し、そして本明細書に参考として全体が援用されている）。ＬＡＣＩはプロテアーゼインヒビターであり、３つのクーニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを有する。それぞれの内２つは、それぞれ第ＶＩＩ因子および第Ｘａ因子をを相互作用することが公知であるが、第３のドメインの機能は、知られていない。ＬＡＣＩの構造特性の多くは、他の良く研究されたプロテアーゼとの相同性のため推察し得る。ＬＡＣＩは酵素ではないので、おそらく化学量論的にプロテアーゼの標的を阻害する；すなわち、ＬＡＣＩのドメインの１つが１つのプロテアーゼ分子を阻害する。ＬＡＣＩは、抗敗血症活性を維持するフラグメント、およびＬＡＣＩを含むハイブリッド分子を含むと定義される。ＬＡＣＩフラグメントおよびその変異体に関しては米国特許第５，１０６，８３３号を参照のこと。
【００１６】
ＬＡＣＩは、Ｂｒｏｚｅら，  １９８７，  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：１８８６−１８９０により発見され、第Ｘａ因子を直接阻害すること、ならびに不活性化第ＶＩＩａ因子／組織因子（ＴＦ）／第Ｘａ因子／Ｃａ＋＋インヒビター複合体の形成により組織因子活性を阻害することが見出された。それは、米国特許第４，９６６，８５２号（本明細書に参考として全体が援用されている）に示されたＤＮＡ配列を有する。ＬＡＣＩによる第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子／ＴＦ複合体の阻害に関するの提案されたメカニズムの模式図を図１に示す。
【００１７】
凝集は、内因性経路および外因性経路の２つの経路を介して起こる。凝集の内因性経路および外因性経路は、一連の活性化されたいくつかのプロテアーゼからなり、それは阻害されない限りフィブリン凝固の形成を生じる。ＬＡＣＩは上記の第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子／ＴＦレベルの両方で、凝集カスケード経路中の２つのステップで作用する。ＬＡＣＩが阻害する組織因子の活性化は、外因性経路の比較的初期の事象である。（ＬＡＣＩはまた、外因性経路インヒビター（ＥＰＩ）および組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）と呼ばれてきた）。ＬＡＣＩは内因性経路および外因性経路に関する共通のプロテアーゼである第Ｘａ因子を不活性化し、組織因子の活性化の下流にある。
【００１８】
正常な血漿中のＬＡＣＩ濃度は、１００ｎｇ／ｍｌである。Ｂａｊａｊら，１９８７，Ｊ．Ｃｉｒｃ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７９：１８７４−１８７８による報告は、ＬＡＣＩが肝臓および上皮細胞で合成され、患者においてＤＩＣの間中、消費されることを示唆する。具体的には、１５人の健常ボランティアの血漿中のＬＡＣＩ値は７２Ｕ／ｍｌから１４２Ｕ／ｍｌの範囲であり、平均１０１Ｕ／ｍｌであった。興味のあることに、１０人のＤＩＣ患者のＬＡＣＩレベルは５７±３０Ｕ／ｍｌ（ｐ＜０．００１）であった。それに比べて、１２人の血液細胞疾患患者のＬＡＣＩレベルは平均１０７±３３であり、すなわち健常値に似ていた。Ｓａｎｄｓｅｔら，１９８９，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．，２２５：３１１−３１６は、肺炎患者（ｎ＝１３）から、ならびに梗塞発作（ｎ＝９）および出血発作（ｎ＝９）の患者における７日の観察期間の間のＬＡＣＩ血漿レベルをモニターした。肺炎患者では、ＬＡＣＩは回復期において、弱いが有意ではない増加を示した（ｐ＝０．０６８）。脳出血患者では、ＬＡＣＩレベルは一貫した変化を示さなかったが、脳梗塞患者ではＬＡＣＩレベルの増加が１日目から２日目に観察された（ｐ＜０．０５）。この後者の効果は、十中八九ヘパリンによる組織結合性ＬＡＣＩの放出によるものである。従って、ヘパリン治療患者でのみ観察された。
【００１９】
Ｓａｎｄｓｅｔら，１９８９，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１９：１８９−１９５はまた、手術後／外傷後の敗血症の１３人の患者におけるＬＡＣＩレベルを継続的に測定した。生存者（ｎ＝８）では、初期の低ＬＡＣＩ活性は回復の間に正常化した。致死症例（ｎ＝５）では、ＬＡＣＩ活性の累進的な増加（最高３０±１５％）が死に至るまでに観察された。この増加は、循環血中へ組織結合性ＬＡＣＩを放出するひどく傷害された上皮細胞により説明され得る。
【００２０】
（ＬＡＣＩの製造）
ＬＡＣＩは、いくつかの方法により作製および単離され得る。例えば、ＬＡＣＩ分泌細胞には、約３日から４日間ＴＮＦで処置した加齢上皮細胞または若齢上皮細胞、また血液細胞または肝癌細胞も含まれる。ＬＡＣＩは従来の方法によりこの細胞培養物から精製し得る。例えば、これらの方法にはクロマトグラフ法を含み、それはＰｅｄｅｒｓｅｎら，１９９０，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：１６７８６−１６７９３，Ｎｏｖｏｔｎｙら，１９８９，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４；１８８３２−１８８３７，Ｎｏｖｏｔｎｙら，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７８：３９４−４００，Ｗｕｎら，１９９０，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５；１６０９６−１６１０１、およびＢｒｏｚｅら，１９８７，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：１８８６−１８９０に示される。さらに、ＬＡＣＩは血流中に現れて、血液から精製し得た。前出のＰｅｄｅｒｓｅｎらを参照のこと。しかし、この方法は十分な量のＬＡＣＩを得るのに大量の血液を必要とするので、提案しないかあるいは好ましくない。
【００２１】
ＬＡＣＩは米国特許第４，９６６，８５２号に示されるように、組換え法により生成され得る。例えば、このタンパク質のｃＤＮＡは原核細胞または真核細胞中での発現のためにプラスミドへ組み込まれ得る。米国特許第４，８４７，２０１号（本明細書中に参考としてその全体が援用されている）は、特異的なＤＮＡ配列を有する微生物の形質転換、およびそれらの発現の詳細を提供する。微生物を用いるタンパク質の発現について詳細を提供する当業者に公知の多くの他の文献がある。それらの多くは米国特許第４，８４７，２０１号に引用されている。例えば、Ｍａｎｉａｔａｓ，Ｔ．ら，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓである。
【００２２】
次は、微生物中でＬＡＣＩを形質転換することおよび発現することについての概要である。ＬＡＣＩ  ＤＮＡ配列は単離され、そして適切なコントロール配列に連結されなければならない。ＬＡＣＩ  ＤＮＡ配列は米国特許第４，９６６，８５２号に示されており、ｐＵＮＣ１３またはｐＢＲ３８２２のようなプラスミドに組み込まれ得る。これらはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍのような会社から市販されている。ＬＡＣＩ  ＤＮＡがベクターに挿入されると、適切な宿主にクローニングされ得る。ＤＮＡは、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，２０２号およびＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号のような技術により増幅し得る（ＬＡＣＩ  ｃＤＮＡは、肝癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２およびＳＫ  Ｈｅｐ）のような細胞を誘導することにより得られ得、ＬＡＣＩ  ｍＲＮＡを作製し、次いでｍＲＮＡを同定し、単離し、そしてそれを逆転写してＬＡＣＩのｃＤＮＡを得る）。発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉのような宿主に形質転換した後、細菌を発酵し、タンパク質を発現し得る。細菌は好ましい原核微生物であり、Ｅ．ｃｏｌｉが特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２、ＭＭ２９４株であり、ブダペスト条約の条文に基づいて１９８４年２月１４日にＡＴＣＣに寄託されている。受託番号は３９６０７である。あるいは、ＬＡＣＩは哺乳動物細胞に導入され得る。これらの哺乳動物細胞には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ  Ｈｅｐ、バキュロウイルス、および感染させた昆虫細胞（上記の米国特許第４，８４７，２０１号も参照のこと）を含み得る。また、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，１９９０，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：１６７８６−１６７９３を参照のこと。組換えタンパク質の生成についてのいくつかの特定の詳細には、典型的には以下含む：
（適切な、宿主、コントロール系、および方法）
最初に、成熟タンパク質（本明細書では全ての変異体を含む）をコードするＤＮＡ；前駆体タンパク質；あるいは、ＬＡＣＩタンパク質の活性を損なわない追加の配列または制御された条件下で切断されて（例えばペプチダーゼ処理）活性なタンパク質を生じる追加の配列への融合物、が得られる。この配列がイントロンにより妨害されない場合、任意の宿主中での発現に適切である。イントロンがある場合、発現は哺乳動物またはそれらをプロセシングし得る他の真核生物系において得られ得る。従って、この配列は切断可能なおよび回復可能な形である。次いで、切断可能なおよび回復可能なコーディング配列は、複製可能な発現ベクター中に適切なコントロール配列と共に作動可能に連結される。このベクターは適切な宿主に形質転換され、この形質転換された宿主を組換えＬＡＣＩの生成に効果のある好ましい条件下で培養した。
【００２３】
ゲノムフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントを得て適切な宿主に直接用いた。種々の宿主中で作動可能な発現ベクターの構築を、下記のように適切な複製およびコントロール配列を用いて作製する。適切な切断部位は、通常入手不可能な場合、切断可能な遺伝子をこれらのベクターに挿入するために提供するように、コーディング配列の末端に付加し得る。
【００２４】
コントロール配列、発現ベクター、および形質転換法は、遺伝子を発現するのに用いた宿主細胞のタイプに依存する。一般的に、原核生物、酵母、または哺乳動物細胞は、宿主として現在も有用である。適切な翻訳後プロセシングが可能な宿主株が好ましい。従って、一般的に原核生物の宿主が組換えタンパク質の生成に最も効果的であり、そして便利であるが、真核細胞および特に哺乳動物細胞がこれらのプロセシング能力、例えば適切なグリコシル化パターンを形成する能力、について好ましい。さらに、この本来のシグナル配列が哺乳動物宿主細胞により認識され、従って分泌を可能にし、それによって生成が容易になることがより保証される。
【００２５】
（コントロール配列および関連する宿主）
原核生物は、種々のＥ．ｃｏｌｉ株により最もたびたび代表される。しかし、桿菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、または他の細菌株のような他の微生物株も用いられる。このような原核生物系において、宿主と適合する種由来である複製部位およびコントロール配列を含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｂｏｌｉｖａｒら，１９７７，Ｇｅｎｅ，２：９５によりＥ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて典型的に形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含み、従って、所望のベクターの構築において維持されるかまたは破壊されるかのいずれかであり得る追加のマーカーを提供する。通常用いられる原核生物のコントロール配列は、本明細書において転写開始プロモーター（必要であればリボソーム結合部位配列を伴うオペレーター）を含むと定義される。転写開始プロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６）、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，１９８０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７）、およびλ由来ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８）のような通常用いられるプロモーターを含む。これらは、ポータブルコントロールカセットとして有用であり、１９８７年１２月８日に発行された米国特許第４，７１１，８４５号に記載されている。しかし、原核生物に適合し得るどんなプロモーター系も用いられ得る。
【００２６】
細菌に加えて、酵母のような真核微生物もまた宿主として用いられ得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの研究室株のＢａｋｅｒ酵母は、多くの他の株が通常入手可能であるが、最もよく用いられる。酵母発現に適切なプラスミドベクターの例は、Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｒ．，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１０１：３０７；Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９；ならびに、Ｔｓｃｈｅｍｐｅら，１９８０，Ｇｅｎｅ，１０：１５７およびＣｌａｒｋｅ，Ｌ．ら，１９８３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１０１：３００に示される。酵母ベクターのコントロール配列は、解糖酵素の合成のプロモーターを含む（Ｈｅｓｓら，１９６８，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄら，１９７８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００）。当該分野で公知の他のプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，１９８０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３）、および他の解糖酵素のプロモーターを含む。例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターである。さらに増殖条件により制御された転写の他の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関する酵素のプロモーター部位である（Ｈｏｌｌａｎｄ、前出）。また、ターミネーター配列はコーディング配列の３’末端であることが望ましいと考えられる。このようなターミネーターは、酵母由来の遺伝子においてコーディング配列に続く３’非転写領域で見出される。例示した多くのベクターは、プラスミドｐｅｎｏ４６（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．ら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：１３８５）、またはＹＥｐ１３から得られたＬＵＥ２遺伝子（Ｂｒｏａｃｈ，Ｊ．ら，１９７８，Ｇｅｎｅ，８：１２１）を含むエノラーゼ遺伝子由来のコントロール配列を含む。しかし、酵母に適合するプロモーター、複製元、および他のコントロール配列を含むいかなるベクターでも適切である。
【００２７】
もちろん、多細胞生物由来の真核宿主細胞培養におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現も可能である。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９７３，ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。有用な宿主細胞株は、ネズミミエローマＮ５１、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、Ｃ１２７、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ  Ｈｅｐ、バキュロウイルス、および感染した昆虫細胞を含む。このような細胞の発現ベクターは通常、哺乳動物細胞に適合するプロモーターおよびコントロール配列を含む。例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の共通に用いられる初期プロモーターおよび後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３）、またはポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、または鳥類のサルコーマウイルス由来のような他のウイルスプロモーター、またはイムノグロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモーターである。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な局面は、Ａｘｅｌにより記載されている（１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４，３９９，２１６号）。現在、「エンハンサー」領域が発現を最適にするのに重要であることも明らかになっている：これらは一般的に、プロモーター領域の上流に見出される配列である。複製元は、必要な場合、ウイルス材料から得られ得る。しかし、染色体中への蓄積が真核生物におけるＤＮＡ複製の共通のメカニズムである。現在、植物細胞もまた宿主として有用であり、そしてノパリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞に適合し得るコントロール配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａ．ら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．，１：５６１）が有用である。植物細胞の形質転換の方法およびベクターは、１９８５年１１月７日に公表されたＰＣＴ公開番号ＷＯ８５／０４８９９に開示されている。
【００２８】
本明細書でクローニングおよび発現に有用な宿主株は以下のものである：
クローニングおよび配列決定のためには、ならびにほとんどの細菌のプロモーターの制御下での構築物の発現のためには、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４株がＥ．ｃｏｌｉから得られた（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＧＣＳＣ  ＃６１３５）。ＰＬＮＲＢＳプロモーターの制御下での発現については、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＭＣ１０００株のλリソゲン、Ｎ７Ｎ５３ｃＩ８５７  ＳｕｓＰ８０、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託した株（ＡＴＣＣ  ３９５３１）を用い得る。１９８７年４月７日にＡＴＣＣに寄託したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＧ１１６（受託番号５３６０６）もまた用い得る。
【００２９】
Ｍ１３ファージ組換え体については、ファージ感染に感受性のあるＥ．ｃｏｌｉ株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２のＤＧ９８株）が用いられ得る。ＤＧ９８株は、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託されている（ＡＴＣＣ  ３９７６８）。
【００３０】
哺乳動物発現は、ＣＯＳ−Ａ２細胞、ＣＯＳ−７、ＣＶ−１、ネズミミエローマＮ５１、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、Ｃ１２７、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ  Ｈｅｐ、バキュロウイルス、および感染した昆虫細胞で達成し得る。昆虫細胞ベースの発現は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおいてであり得る。
【００３１】
（形質転換）
用いた宿主細胞によって、このような細胞に適切な標準の技術を用いて形質転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，１９７２，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），６９：２１１０に記載されるような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、原核細胞または実質的な細胞壁関門を含む他の細胞に用いられる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの感染（Ｓｈａｗ，Ｃ．Ｈ．ら，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：３１５）が、特定の植物細胞に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞については、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，１９８７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。酵母中への形質転換は、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ，Ｐ．ら，１９７７，Ｊ．  Ｂａｃｔ．，１３０：９４６、およびＨｓｉａｏ，Ｃ．Ｌ．ら，１９７９，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），７６：３８２９の方法に従って行われる。
【００３２】
（ノーザンブロットによるｍＲＮＡのプローブ反応；ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのプローブ）
ＲＮＡを、変性剤としてホルムアルデヒド（Ｍａｎｉａｔａｓ，Ｔ．ら，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２０２−２０３頁）、または１０ｍＭ  メチル水銀（ＣＨ３ＨｇＯＨ）（Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら，１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０：７５−８５；Ｓｈｅｇａｌ，Ｐ．Ｂ．ら，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８８：９５−９７）を用いて十分に変性させる条件下で、アガローススラブゲル電気泳動によるノーザンブロットで分画した。メチル水銀ゲルについては、１．５％ゲルを、泳動用緩衝液（１００ｍＭ  ホウ酸、６ｍＭホウ酸ナトリウム、１０ｍＭ  硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２）中にアガロースを溶解して調製し、６０℃に冷却し、そして１／１００容量の１Ｍ  ＣＨ３ＨｇＯＨを加えた。ＲＮＡを０．５×泳動用緩衝液に溶解して、室温で１０分間１０ｍＭ  メチル水銀中でインキュベートすることにより変性させた。グリセロール（２０％）およびブロモフェノールブルー（０．０５％）をサンプルを載せるために加えた。緩衝液を再循環させてサンプルを５００−６００ボルト／時間で電気泳動する。電気泳動後、ゲルを１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール中で４０分間洗浄して、メチル水銀を脱毒化する。そして、ゲルからメンブレンフィルターにＲＮＡを転写することによりノーザンブロットを調製した。
【００３３】
ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーをコロニーハイブリダイゼーション法またはプラークハイブリダイゼーション法を用いてスクリーニングする。細菌のコロニーまたはファージのプラークを、２枚のニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ  ＢＡ−８５タイプ）上に載せる。プラークまたはコロニーを溶解し、そしてＤＮＡを５００ｍＭ  ＮａＯＨ、１．５Ｍ  ＮａＣｌで５分間の連続的な処置をして濾紙に固定する。濾紙を毎回５分間５×標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）で２回洗浄し、そして風乾し、８０℃で２時間ベーキングした。
【００３４】
ノーザンブロット用ゲルまたはｃＤＮＡまたはゲノムのスクリーニング用の２枚の濾紙は、２５℃から４２℃で６から８時間、濾紙１枚当たり１０ｍｌのプローブの入っていないＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液（０〜５０％ホルムアミド、５〜６×ＳＳＣ、ｐＨ７．０、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液（ポリビニルピロリドンに加えてフィコールおよびウシ血清アルブミン；１×＝それぞれの０．０２％）、２０〜５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０μｇ／ｍｌのポリＵ（ｃＤＮＡをプロービングする場合）、および５０μｇ／ｍｌの変性させたサケ精子ＤＮＡ）でプレハイブリダイズさせておく。次いで、サンプルをキナーゼ処理したプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いて約２４〜３６時間適当な温度でインキュベートしてハイブリダイズした（オリゴマー用）。長いｃＤＮＡプローブまたはゲノムフラグメントプローブをニックトランスレーションまたはプライマー伸長により標識した。
【００３５】
プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの両方の条件は、所望のストリンジェンシーに依存し、そして例えばプローブ長で変化する。比較的長い（例えば３０〜５０ヌクレオチドより長い）プローブのための典型的な条件では、４２℃〜５５℃の温度および２０％〜５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液を用いる。約１５ヌクレオチドのオリゴマープローブに必要な低いストリンジェンシーについては、約２５℃〜４２℃の低温、および低いホルムアミド濃度（０％〜２０％）を用いる。長いプローブについては、フィルターを洗浄し得る。例えば３０分間４回、毎回４０℃〜５５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ、および５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、次いで０．２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで２回洗浄し、風乾し、そして−７０℃で２〜３日オートラジオグラフィーを行う。洗浄条件は、短いプローブについては多少荒くないようにする。
【００３６】
８ベクター構築）
所望のコーディングおよびコントロール配列を含む適切なベクターの構築は、当該分野で周知の標準のライゲーションおよび制限処理方法を用いる。単離したプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを切断し、適合するように仕立てて、そして所望の型に再ライゲーションする。
【００３７】
部位特異的ＤＮＡ切断を、当該分野で周知の条件下でおよびこれらの市販の制限酵素によって明示された特定の条件下で適切な制限酵素（または酵素）で処理して行う。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  製品カタログを参照のこと。一般的には、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２０μｌの緩衝溶液中で１ユニットの酵素により切断する：本明細書中の実施例においては、典型的には、過剰の制限酵素を用いてＤＮＡ基質の完全な切断を確実にする。約３７℃での約１時間から２時間のインキュベート時間で実行し得るが、変更は容認され得る。各インキュベーション後、タンパク質をフェノール／クロロホルムで抽出して除去し、次いでエーテル抽出をし得、そして核酸をエタノールで沈殿させることにより水性画分から回収し得る。所望の場合、切断したフラグメントのサイズ分離を、標準の技術を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロースゲル電気泳動により行い得る。サイズ分離の一般的な記述は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８０，６５：４９９−５６０に見出される。
【００３８】
制限切断フラグメントを、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下２０〜２５℃で約１５〜２５分間のインキュベートを用いて、５０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および５〜１０μＭ  ｄＮＴＰ中でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ）の大フラグメントで処理して平滑末端を作製し得る。クレノウフラグメントは５’の付着末端を埋めるが、たとえ４種のｄＮＴＰが存在しても、突出した３’の一本鎖を埋めない。所望の場合、付着末端の性質により規定された制限内で、唯一のまたは選択したｄＮＴＰを供給することにより、選択的な修復を行い得る。クレノウでの処理後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿する。Ｓ１ヌクレアーゼでの適切な条件下での処理の結果、任意の一本鎖部分の加水分解を生じた。
【００３９】
合成オリゴヌクレオチドを、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１のトリエステル法により、または自動化合成法を用いて調製し得る。アニールの前または標識ための一本鎖のキナーゼ処理を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、１〜２ｍＭ  ＡＴＰの存在下で、過剰の、例えば１ｎｍｏｌの基質に対して約１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを用いて行う。キナーゼ処理がプローブの標識のためである場合、ＡＴＰは高比活性の３２ＹＰを含む。
【００４０】
ライゲーションを、１５〜３０μｌ容量で、次の標準の条件および温度下で行う：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０ｍＭ〜５０ｍＭ  ＮａＣｌ、そして、０℃で４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（ワイス（Ｗｅｉｓｓ））ユニット  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」ライゲーション用）、または１４℃で１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３〜０．６（ワイス）ユニット  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」ライゲーション用）のいずれか。分子間「付着末端」ライゲーションは通常、３３〜１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの全末端濃度）で行う。分子間平滑末端ライゲーション（通常１０〜３０倍モル過剰のリンカーを用いる）は１μＭの全末端濃度で行う。
【００４１】
「ベクターフラグメント」を用いるベクター構築において、ベクターフラグメントは５’リン酸を除去し、そしてベクターの再ライゲーションを避けるために、細菌のアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で通常に処理される。ＢＡＰ切断は、ｐＨ８で、約１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中、Ｎａ２＋およびＭｇ２＋の存在下で１μｇのベクターあたり約１ユニットのＢＡＰを用いて、６０℃で約１時間行われる。核酸フラグメントを回収するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿する。または、再ライゲーションを、不要のフラグメントの他の制限酵素切断により、２重に切断したベクターにおいて避け得る。
【００４２】
（ＤＮＡ配列の改変）
配列の改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクターの部分について、変異を意図した部位特異的プライマーを用いる。この技術は現在当該分野で標準的であり、一本鎖ファージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、限られたミス対合を除いて所望の変異を示すように変異する。簡単に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ファージに相補的な鎖を直接合成し、得られた二本鎖ＤＮＡをファージ支持宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養物をトップアガーにのせ、ファージを潜伏させた単細胞からプラーク形成し得る。
【００４３】
理論的には、５０％の新規のプラークが一本鎖として変異型を有するファージを含む：５０％は元の配列を有する。プラークを、キナーゼ処理した合成プライマーを用いて、正しい対合のハイブリダイゼーションをし得る温度で、しかし、元の鎖とのミス対合をハイブリダイゼーションするのを避けるのに十分である温度で、ハイブリダイズした。次いで、プローブとハイブリダイズするプラークを釣り上げ、培養し、そしてＤＮＡを回収した。
【００４４】
（構築の確認）
プラスミド構築の正しいライゲーションは、まず、ライゲーション混合物と、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＭ２９４株または他の適切な宿主を形質転換することにより確認した。成功した組換え体をアンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質の耐性により、あるいはプラスミド構築の態様に依存する他のマーカーを用いて、当該分野で理解されるように選択した。次いで、組換え体由来のプラスミドは、Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．ら，１９６９，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），６２：１１５９の方法に従って、必要に応じて続いてクロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｄ．Ｂ．，１９７２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１１０：６６７）を行って調製する。単離されたＤＮＡを、制限処理により分析、および／またはＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ら，１９７７，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），７４：５４６３のジデオキシ法（さらにＭｅｓｓｉｎｇら，１９８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，９：３０９により記載されたように）により、またはＭａｘａｍら，１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の方法により、配列決定する。
【００４５】
（ＬＡＣＩの精製）
ＬＡＣＩを発現する哺乳動物細胞の精製について、次の方法を用い得る：ヘパリン−セファロース、ＭｏｎｏＱ、ＭｏｎｏＳ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの一連の適用。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，  前出、Ｎｏｖｏｔｎｙら，１９８９，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４：１８８３２−１８８３７、Ｎｏｖｏｔｎｙら，１９９１，Ｂｌｏｏｄ，７８：３９４−４００、Ｗｕｎら，１９９０，Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６５：１６０９６−１６１０１、およびＢｒｏｚｅら，１９８７，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），８４：１８８６−１８９０を参照のこと。これらの参考文献は、哺乳動物の産生したＬＡＣＩを精製する種々の方法を記載している。
【００４６】
さらに、ＬＡＣＩはＥ．ｃｏｌｉのような細菌中で生成され、ついで精製され得る。一般的に、米国特許第４，５１１，５０２号；第４，６２０，９４８号；第４，９２９，７００号；第４，５３０，７８７号；第４，５６９，７９０号；第４，５７２，７９８号；および第４，７４８，２３４号に示された手法を用い得る。これらの特許は、本明細書中に参考として全体が援用されている。典型的には、異種タンパク質（すなわちＬＡＣＩ）は、細菌内で屈折物（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ  ｂｏｄｙ）中で生成される。タンパク質を回収および精製するために細胞を溶解し、そして屈折物を遠心操作して細胞片から分離する（培地のイオン強度を低下させて精製を簡単にすることに関する米国特許第４，７４８，２３４号を参照のこと）。次いで、ＬＡＣＩを含む屈折物を少なくとも１回変性させ（典型的には還元環境中）、そしてタンパク質を酸化して、適当な時間、適切な緩衝液中で再生させる。ＬＡＣＩはかなりの数のシステイン残基を有し、ＣＳＦ−１もまたかなりの数のシステイン残基を含むので、米国特許第４，９２９，７００号に示された手法が関連すべきである。ＬＡＣＩは、ＬＡＣＩ由来の哺乳動物細胞に関する上記の方法のように種々のクロマトグラフ法により緩衝液から精製され得る。さらに、米国特許第４，９２９，７００号に示される方法が用いられ得る。
【００４７】
（形態および投与）
ＬＡＣＩは、敗血症、急性炎症、または慢性炎症、およびサイトカインが組織因子を上方制御する他の疾患を治療および予防するために治療学的に有効な濃度で投与される。この目的を達成するために、ＬＡＣＩは好ましくは静脈内に投与される。この投与を達成するための方法は当業者に公知である。
【００４８】
患者に投与する前に、処方物をＬＡＣＩに添加し得る。液体の処方が好ましい。下記の実施例において、ＬＡＣＩは、ｐＨ７．２で１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  ＮａＰＯ４に処方された。しかし、ＬＡＣＩは異なる濃度でまたは異なる処方を用いて処方され得る。例えば、これらの処方物には、油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、塩類、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、または賦形剤を含み得る。好ましい炭化水素は、単糖、二糖、または多糖のような糖または糖アルコール、あるいは水溶性グルカンを含む。糖またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、水溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物を含み得る。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは−ＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素として定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを含む。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖または糖アルコールは別個にまたは組み合わせて用いられ得る。糖または糖アルコールが水性の調製物中に溶解する限り、量に決まった限界はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は１．０ｗ／ｖ％と７．０ｗ／ｖ％との間であり、さらに好ましくは２．０ｗ／ｖ％と６．０ｗ／ｖ％との間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む；しかし他のアミノ酸が追加され得る。好ましいポリマーは２，０００と３，０００との間の平均分子量を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または３，０００と５，０００との間の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。凍結乾燥前または再構成後に溶液中のｐＨ変化を最小にするための組成物に緩衝液を用いることもまた好ましい。ほとんどの任意の生理学的な緩衝液を用い得るが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液、またはそれらの混合物が好ましい。好ましくは、濃度は０．０１モル濃度から０．３モル濃度である。処方に加え得る界面活性剤は、ヨーロッパ特許第２７０，７９９号および第２６８，１１０号に示されている。
【００４９】
さらに、ＬＡＣＩは、ポリマーに共有結合により化学的に改変されて、例えば循環半減期を増加し得る。好ましいポリマーおよびそれらをペプチドに結合する方法は米国特許第４，７６６，１０６号、第４，１７９，３３７号、第４，４９５，２８５号、および第４，６０９，５４６号に示されており、本明細書中に参考として全体が援用されている。好ましいポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水溶性であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここでＲは、酸素、あるいはアルキル基またはアルカノール基のような保護基であり得る。好ましくは、保護基は１から８個の炭素を有し、さらに好ましくは保護基はメチルである。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１から１，０００であり、さらに好ましくは２から５００である。ＰＥＧは１，０００と４０，０００との間の好ましい平均分子量を有し、さらに好ましくは２，０００と２０，０００との間であり、最も好ましくは３，０００と１２，０００との間である。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つの水酸基を有し、さらに好ましくは末端の水酸基を有する。好ましくはこの水酸基が活性化され、インヒビター上の遊離のアミノ基と反応する。しかし、反応基のタイプおよび量が変化して本発明の共有結合したＰＥＧ／ＩＬ−２を生じ得ることが理解される。
【００５０】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などを含む。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が例えば動物およびヒト中で、モノ、ジ、トリグリセリドで天然に存在するのと同じ骨格であるからである。従って、この分枝は必ずしも生体内の外来因子としては見られない。ＰＯＧはＰＥＧと同じ範囲で好ましい分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら，  １９８８，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６３：１５０６４−１５０７０に示され、ＰＯＧ／ＩＬ−２コンジュゲートの議論は米国特許第４，７６６，１０６号に見出され、両方とも本明細書中に参考として全体が援用されている。
【００５１】
液体の薬学的組成物を調製した後、好ましくは、凍結乾燥して分解を避け、そして滅菌を保持する。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に公知である。使用直前に、組成物を、追加の成分を含み得る滅菌希釈液（例えば、リンゲル液、蒸留水、または滅菌生理食塩水）で再構成し得る。再構成に基づいて、組成物は好ましくは当業者に公知の方法を用いて被験体に投与される。
【００５２】
（罹患した個体への投与）
上記のように、ＬＡＣＩは敗血症または敗血症性ショックのヒトの患者を治療的にまたは予防的に処置するのに有用である。一般的に、敗血症を有するヒトは、高熱（３８．５℃より高い）または低体温症（３５．５℃より低い）、低血圧、頻呼吸（２０呼吸／分より多い）、頻脈（１００拍動／分より多い）、白血球増加症（１５，０００細胞／ｍｍ３より多い）、および菌血症に関連する血小板減少症（１００，０００血小板／ｍｍ３より少ない）を特徴とする。ＬＡＣＩは患者が敗血症であると疑われると同時に投与される；フィブリノーゲンの２０％より多いかまたは等しい低下、あるいはフィブリン分解生成物の出現、患者体温の上昇、ならびに敗血症と関連する白血球減少、血小板減少、および低血圧の診断でそれら自体が示される。また上記のように好ましい経路は静脈内投与による。一般的に、ＬＡＣＩは１μｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で、さらに好ましくは２０μｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で、最も好ましくは１ｍｇ／ｋｇと７ｍｇ／ｋｇとの間の用量で与えられる。好ましくは、持続用量として与えられ、持続用量後４〜６時間は、循環レベルを１０〜２０倍増加する。点滴注入もまた持続用量後に用いられ得る。その場合、ＬＡＣＩは５μｇ／ｋｇ／分と２０μｇ／ｋｇ／分との間の用量で、さらに好ましくは７μｇ／ｋｇ／分と１５μｇ／ｋｇ／分との間の用量で注入され得る。
【００５３】
ＬＡＣＩは敗血症を治療するのに有効な他の薬剤と組合せて与えられ得る。例えば、次の薬剤はＬＡＣＩと組合せて投与され得る：潜在している細菌感染を治療し得る抗生物質；細菌の細胞壁成分に対するモノクローナル抗体；敗血症経路中に含まれるサイトカインと複合し得るレセプター；および一般的には敗血症経路でサイトカインまたは補体タンパク質と相互作用してそれらの効果を減少し、敗血症または敗血症性ショックを弱める任意の薬剤またはタンパク質。
【００５４】
本発明で有用な抗生物質は、以下の一般的なカテゴリー中のものを含む：β−ラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合したアミノ糖（アミノグリコシド）、大環ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサミドの多環誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系を有する大環（ポリエン）、スルファニルアミド由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５−ニトロ−２−フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、およびその他多数。他の抗生物質および上記の特定の抗生物質のさらに多くの変型が、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第３版，Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｙｍｅｒ（編），２巻，７８２−１０３６頁（１９７８）および３巻，１−７８頁、Ｚｉｎｓｓｅｒ，ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙ，第１７版，Ｗ．Ｊｏｋｌｉｋら（編），２３５−２７７頁（１９８０）、またはＤｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，  第２７版，  Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８８）に見出され得る。
【００５５】
ＬＡＣＩとともに投与され得るモノクローナル抗体は、Ｌａｒｒｉｃｋらの「グラム陰性細菌の内毒素をブロックするモノクローナル抗体」と題するＰＣＴ  ＷＯ／８８／０３２１１に見出されるものを含む。この出願は、敗血症を治療するのに有用であり、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌細胞壁上の種々の抗原に結合する特異的なモノクローナル抗体を開示している。特に好ましいモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４３１のハイブリドーマにより産生される抗体である。
【００５６】
ＬＡＣＩと組合せ得る他の薬剤は、ＩＬ−６またはＭ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体（Ｃｒｅａｓｅｙらの１９９１年６月２７日に公表されたＰＣＴ  ＷＯ９１／０８７７４を参照）、およびＴＮＦに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｒａｍｉら，  米国特許第４，６０３，１０６号を参照）のような敗血症経路に含まれるサイトカインに対するモノクローナル抗体を含む。生成された細胞由来の成熟したＴＮＦプロホルモンを切断するタンパク質のインヒビターは、１９９１年３月７日に公表されたＫｒｉｅｇｌｅｒらのＰＣＴ  ＷＯ９１／０２５４０を参照のこと。１９９１年１１月１４日に公表されたＨａｓｋｉｌｌらのＰＣＴ  ＷＯ９１／１７２４９に示されるようなＩＬ−１のアンタゴニスト。１９９１年８月２２日に公表されたＷａｒｒｅｎらのＰＣＴ  ＷＯ９１／１２３３４に示されるようなＩＬ−６サイトカイン発現のインヒビター（例えばインヒビン）、およびレセプターに基づく種々のサイトカイン（例えばＩＬ−１）のインヒビター。補体、またはＣＲ１、ＤＡＦ、およびＭＣＰのような補体のタンパク質インヒビターに対する抗体もまた用い得る。
【００５７】
一般的にＬＡＣＩは、ＴＮＦ、ＩＬ−１、または他のサイトカインによりもたらされた組織因子の上方制御によって引き起こされるそれらの疾患に有用であり得る。例えば、下記の実施例中で、ＬＡＣＩ投与がＩＬ−６濃度を低下することを示す。ＩＬ−６は急性炎症または慢性炎症に含まれる１つの因子であるので、ＬＡＣＩ投与は炎症を治療するのに有用である。ＬＡＣＩにより治療し得る典型的な炎症状態は、関節炎、敗血症性ショック、再潅流障害、炎症性腸疾患、急性呼吸疾患、外傷、および火傷を含む。
【００５８】
慢性炎症および急性炎症の治療において、ＬＡＣＩは抗敗血症の方法と同じ様式および同じ用量で投与され得る。
【００５９】
本発明は、現在、特に有利な実施態様を示す次の実施例を参考として例示される。しかし、これらの実施態様は例であり、そしていかなる様にも発明を制限するように解釈されるべきではないことに留意すべきである。
【実施例】
【００６０】
（実施例１）
（ＬＡＣＩの生成）
（Ａ．加齢細胞）
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨｕＶｅｃ）をプレートにまき、標準の組織培養液中で維持した。それらを３２〜３６日間加齢し、新鮮な培地で一週間に２度培地交換して、３２日後に培養上清を取り出した（いわゆる調整培地またはＣＭ）。ＣＭはＬＡＣＩを含んでいた。
【００６１】
（Ｂ．誘導した細胞）
同様のＨｕＶｅｃ細胞をプレートにまき、２４〜４８時間組織培養液中で維持し、次いで３〜４日間種々の濃度の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と接触させた。ＬＡＣＩを含む培地を取り出した。これをＴＮＦ  ＣＭと呼ぶ。
【００６２】
（実施例２）
（ＬＡＣＩの敗血症阻害）
次のアッセイを考案し、ＬＡＣＩによる敗血症の阻害を測定した。ＨｕＶｅｃ細胞をプレートにまき、４８時間インキュベートした。細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）を敗血症の誘導剤として加えた。ＬＰＳの添加が、単純な凝固よりも広い敗血症様応答を刺激するための最良の方法であった。誘導剤を加えた場合、試験サンプルを加えて内皮細胞上のＬＰＳ効果への影響を試験した。試験したサンプルはＬＡＣＩを含んでいた。細胞を４時間と５時間との間インキュベートし、次いでクロモザイム（ｃｈｒｏｍｏｚｙｍｅ）を加えた。クロモザイムは、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を含む。この最初の方法では組織因子の誘導阻害および活性阻害を測定した。組織因子活性の阻害を測定する本アッセイの２つの内の１つでは、サンプルをクロモザイムと共に加え、次いで４５分間インキュベートした。ＬＡＣＩ阻害活性をＡ４０５で分光光度計で吸光度（色調変化を生じる）を読むことにより測定した。
【００６３】
加齢に用いたＴＮＦ誘導調整培地を実施例１のように調製した。図２に、図示されたそれぞれの培地中に含まれた物質による組織因子活性の用量依存的な阻害を示す。物質の性質を、次のように測定した組織因子活性の阻害を含む次の実験により同定した：ＨｕＶｅｃ細胞をアッセイのために調製した。１つの細胞サンプルを、コントロールとして未処置のまま放置した。他の細胞サンプルを、いかなる可能性のあるインヒビターも添加せずにＬＰＳを用いて誘導した。続いて６クラスのサンプルを、０、１０、および１００ｍｇのＬＡＣＩ抗体とともに、ＬＡＣＩを含む加齢に用いた調整培地およびＴＮＦ調整培地を用いて行った。図３は、この実験の結果を示す。例えば、左から始まるレーン１はコントロールであり、非常に小さい組織因子活性を検出した。レーン２は１００％の組織因子活性およびＬＰＳの添加による誘導を示す。レーン３、４、および５は、抗ＬＡＣＩ抗体の量に依存して活性量（およびこのような誘導）を直線的に増加することを示す。例えば、０濃度（レーン３）は、非常に小さい組織因子活性が検出可能であることを示し、組織因子誘導の欠損を示唆した。これは、ＬＡＣＩがＬＰＳにより誘導した組織因子の活性を阻害することを示した。レーン４および５は類似の結果を示すが、より大量のＬＡＣＩが抗ＬＡＣＩ抗体により中和されるにつれて、組織因子活性／誘導の量が増加した。レーン６、７、および８（ＴＮＦ調整培地とともに）はまた、レーン３、４、および５に示されたように、ほとんど同じ程度の組織因子活性阻害を示す。調整培地中の物質の同等性を確認するために、本発明者らは中和抗体の存在または不在において、種々の濃度の高度に精製したＬＡＣＩを用いた。結果は加齢に用いたＴＮＦ誘導調整培地を用いた結果と合う。図４を参照のこと。
【００６４】
これらのデータは、ＬＡＣＩが濃度依存的にＨｕＶｅｃ細胞におけるＬＰＳの効果を阻害すること、およびこの効果がＬＡＣＩへの種々の濃度の中和抗体の添加において逆転し得ることを示す。さらに、このモデルは、ＬＡＣＩが敗血症の治療に用いられ得、そしてその効果がその抗凝固特性に単純に限定されなかったことを証明する。
【００６５】
（実施例３）
（ＬＡＣＩを用いるヒト患者の治療）
敗血症に罹患したヒト患者は、ＬＡＣＩを用いて治療的に処置され得る。患者は、上昇した熱、血圧の低下、白血球数の減少、およびフィブリノーゲンの２０％以上の低下が現れる場合、ＬＡＣＩを、３〜１０ｍｇ／ｋｇの持続用量として、および１０〜２０μｇ／ｋｇ／分の３〜４時間の注入として静脈内に投与する。あるいは、ＬＡＣＩを約１０ｍｇ／ｋｇ／分の連続した速さで３日間または３〜４日間毎日４時間投与し得る。抗菌治療または広いスペクトルの抗菌剤をＬＡＣＩと共に患者に投与する。
【００６６】
ＬＡＣＩは同様に予防的に与えられる。
【００６７】
（実施例４）
本実験において、高度に精製した組換えＬＡＣＩ（６ｍｇ／ｋｇ）を致死量のＥ．ｃｏｌｉ静脈内注入の開始後３０分または４時間のいずれかでヒヒに投与した。発病後初期のＬＡＣＩ処置の結果、ａ）永続的な７日の生存動物（５／５）が生存の質において有意な改善を示したが、コントロールの平均生存時間（５／５）は３９．９時間であった（生存動物なし）；ｂ）腎臓、副腎、および肺を含むＥ．ｃｏｌｉ敗血症の標的細胞で観察される病理における有意な減少を伴う、有意な凝固応答および種々の程度の細胞障害の減少を生じる。ＬＡＣＩ投与は、平均の全身性動脈圧の減少、細菌感染に関連する呼吸速度および心拍数の増加、または体温変化に影響しなかった。ＬＡＣＩ処置のＥ．ｃｏｌｉ感染ヒヒは、リン酸緩衝化生理食塩水処置コントロールより２０倍低いＩＬ−６レベルを有していた。初期の３０分治療に比較して、細菌感染の開始後４時間、すなわち２４０分でのＬＡＣＩの投与の結果、生存率（２匹の生存動物）で４０％改善した生存時間の延長を生じ、特にフィブリノーゲンレベルがＬＡＣＩ投与時に正常の１０％を超える動物における凝固応答のいくらかの減少を生じた。
【００６８】
（組換え組織因子経路インヒビター）
ＬＡＣＩを、Ｗｕｎら，  １９９２，  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，  ６８：５４−５９，  Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶菌試験での細菌内毒素の検出、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ．に記載されているようにヒト肝癌細胞ＳＫ  Ｈｅｐ株中で発現した。物質は標準法により精製して９５％を超える純粋な調製物を得た。ＬＡＣＩを、賦形剤コントロールとして用いられる１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ７．２）中に処方した。ＬＡＣＩサンプル中の最終タンパク質濃度は、２．３ｍｇ／ｍｌ〜３．７ｍｇ／ｍｌの範囲であり、アミノ酸組成により決定した；内毒素レベルはタンパク質１５ミリグラム当たり８から２７内毒素ユニットの範囲であった。ＬＡＣＩのロットは、組織因子阻害アッセイを用いて生物学的活性をモニターした（Ｂｏｚｅら，  Ｂｌｏｏｄ（１９８８）７１：３３５−３４３）。
【００６９】
（ヒヒ）
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）から購入した雄および雌のＰａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓヒヒ（７．６±２．４ｋｇ）を最低で３０日間、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙ，  ＯＫ）に隔離した。動物は、３６％以上のヘマトクリットを有する感染または寄生生物のないものであった。
【００７０】
（細菌）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０８６：Ｋ６１Ｈ生物（ＡＴＣＣ  ３３９８５；  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｃｉｔｙで便試料から単離した。それらを、トリプシンソイビーンアガー中で増殖した後、４℃で凍結乾燥状態で保存し、Ｈｉｎｓｈａｗら，  Ｊ．  Ｔｒａｕｍａ（１９８２）２３：３６１−３６５に記載のように再構成して特徴付けした。
【００７１】
（アッセイ）
（内毒素測定）
ＬＡＣＩ調製物および賦形剤緩衝液中の内毒素レベルをｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶菌試験（Ｗｕｎら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．，  （１９９２）  ６８：５４−５９）によりモニターした。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＬＰＳ（Ｂ５５０５；Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を標準として含んだ。このアッセイの検出限界は、１０内毒素ユニット（Ｅ．Ｕ．）／ｍｌであった。
【００７２】
（ＴＮＦ  ＥＬＩＳＡ）
ヒヒの血漿中のＴＮＦレベルを、ヒトＴＮＦを検出するために開発されたＥＬＩＳＡを用いて測定した（Ｃｒｅａｓｅｙら，  Ｃｉｒｃ．  Ｓｈｏｃｋ（１９９１）３３：８４−９１）。精製したモノクローナル抗ＴＮＦ抗体（２４５１０Ｅ１１）を、マイクロタイタープレートのウエル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ  Ｉ，  Ｆｉｓｈｅｒ）に結合させた。次いで、プラスチック上の占領されていない結合部位をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。標準の濃度の精製組換えヒトＴＮＦまたはヒヒ血漿試料のアリコートを２重測定でインキュベートした。ＥＬＩＳＡウエルを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲートした組換えヒトＴＮＦに対する親和性を有するポリクローナルウサギ抗体に曝し、続いてＯ−フェニレンジアミン基質を色素原として曝した。ウエルを、連続したインキュベーションの間に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ，  ｐＨ７．５）で繰り返してすすいだ。吸光度（ＯＤ）を自動化２波長プレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で４９０ｎｍで測定した。本アッセイのヒヒのＴＮＦの検出限界は、０．５ｎｇ／ｍｌであった。
【００７３】
（ＩＬ−６バイオアッセイ）
ＩＬ−６生物活性を、ＩＬ−６依存性マウスハイブリドーマ細胞株Ｂ９を用いて、そしてアッセイ標準として、Ａｍｇｅｎ，  Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）から市販で入手し得るＩＬ−６を用いて、ヒヒ血漿中で定量した（Ｃｒｅａｓｅｙら，  前出）。本アッセイの検出限界は、１０ｐｇ／ｍｌであった。
【００７４】
（ＬＡＣＩレベル）
Ｎｏｖｏｔｎｙら，  Ｂｌｏｏｄ（１９９１）７８：３９４−４００に以前に記載されたように、ＬＡＣＩの競合蛍光免疫アッセイを用いた。ウサギ抗ＬＡＣＩ  ＩｇＧを用いて、試験すべきサンプル中のＬＡＣＩを捕捉し、ＦＩＴＣ−ＬＡＣＩ（Ｈｅｐ  Ｇ２）を加えて、抗ＬＡＣＩ結合部位の残存数を定量した。標準曲線を、集めたヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｖｅｒｌａｎｄ  Ｐａｒｋ，ＫＳ）の希釈物または純粋なＨｅｐ  Ｇ２  ＬＡＣＩの希釈物を用いて描いた。
【００７５】
ＬＡＣＩ機能アッセイ（組織因子阻害アッセイ）は３段階の凝血アッセイである。簡単にいうと、第１段階では試験するサンプルを、粗脳組織因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、およびカルシウムとともにインキュベートする。インキュベーションの３０分後に、追加の第Ｘ因子を添加し、１分後、第Ｘ因子不足血漿を添加し、凝血時間をフィブロメーターで測定する。アッセイの第２段階では、残存第ＶＩＩ（ａ）因子／組織因子活性が試験サンプル中のＬＡＣＩ濃度に反比例する。従って、凝血時間の延長は、より高いＬＡＣＩ活性を反映する。標準曲線は純粋なＨｅｐ  Ｇ２  ＬＡＣＩの希釈物を用いて描いた。
【００７６】
（薬動力学分析）
各々のヒヒのデータ（種々のサンプル時間における、μｇ  ＬＡＣＩ／ｍｌ血漿）は２コンパートメントモデルに適合した。モデルパラメータをＰＫＤＡＡＳデータ分析システム（Ｃｈｉｒｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎでＶＡＸコンピュータ用に開発され、登録番号ＴＸＵ  ４１６−９７７として米国著作権庁に寄託された）を用いて非直線最小二乗曲線適合法により測定した。各時間での正しい濃度のＣ（ｔ）は、各々の二乗された濃度の逆数として考量した。次いで、考量した値を次の２指数方程式を用いて個々の被験体の曲線に適合させた：
Ｃ（ｔ）＝（ＤＯＳＥ／ＶＣ）＊［（１−Ｂ）＊２−να＋Ｂ２＊−νβ］
ここで、ｔは時間、そしてＶＣ、Ｂ、α、およびβはモデルパラメータである。係数の合計は１．０に標準化した。次いで、全身クリアランス（ＣＬ）を以下の式から計算した：
ＣＬ＝ＶＣ／ＭＲＴ、ここで、
ＭＲＴ＝［（１−Ｂ）＊α＋Ｂ＊β］ｌｎ（２）。
【００７７】
（統計学的分析）
データをｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて分析し、所定の時間における群間の平均の有意差（ｐ＜０．０５）を測定した。変動の分析（ＡＮＯＶＡ）および多重比較Ｄｕｎｃａｎの検定を用いて、群内での０時およびこれに続く時間での平均の間の有意差を測定した。Ｆｉｓｈｅｒの精密（ｅｘａｃｔ）検定を用いて、生存率の観点で群間の有意差を測定した。
【００７８】
（薬動力学的研究）
Ｅ．ｃｏｌｉ敗血症性ショックモデルの適切なＬＡＣＩ用量を決定するために、本発明者らは３匹の健康なヒヒで薬動力学的研究を行った。図５は０．５ｍｇ／ｋｇで持続用量として投与したものを示し、ＬＡＣＩは２相の半減期を示した；約２分のα相および約２時間のβ相。次いで、上記のようにこれらのデータをモデル化し、必要なＬＡＣＩ用量を同定して、２μｇ／ｍｌの循環ＬＡＣＩ血清濃度を達成した。これは、霊長類でのＬＡＣＩの内在性レベルが約０．１μｇ／ｍｌであることが報告されていたので（Ｎｏｖｏｔｎｙら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４：１８８３２−１８８３７）、所望のＬＡＣＩ血液濃度として便宜上定義した。従って、ヒヒにおけるＬＡＣＩ血清濃度の２０倍増加を達成するために、本発明者らは、ＬＡＣＩを７００μｇ／ｋｇの負荷用量およびＥ．ｃｏｌｉ感染の開始３０分後続けて開始した１０μｇ／ｋｇ／分の持続用量（すなわち６，０００μｇ／ｋｇの全用量）を投与した。
【００７９】
（実験および感染方法）
各ヒヒを、研究当日の朝、筋肉内に塩酸ケタミン（１４ｍｇ／ｋｇ）固定し、Ｈｉｎｓｈａｗら，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．（１９８９）２８：１５１−１７０に記載のように橈側皮静脈に配置した経皮カテーテルを介してペントバルビタールナトリウム（約９ｍｇ／ｋｇ）でゆっくりと麻酔した。わずかな体液損失を補うために、動物を、細菌投与後それぞれ３０分または２４０分に、上腕静脈を介して１２時間、３．３ｍｌ／ｋｇ／時で等張の生理食塩水を注入した。ＬＡＣＩを７００μｇ／ｋｇの負荷用量で１５分間投与し、そして１０μｇ／ｋｇ／分でＬＡＣＩの連続注入をさらに５２５分間与えた（０時間と定義した細菌注入の開始から数えて）。ヒヒ１匹当りに同じ全ＬＡＣＩ用量を送達するために、＋２４０分で処置した動物は２．８μｇ／ｋｇの負荷用量を１５分間、および同時に１０μｇ／ｋｇ／分でのＬＡＣＩの連続注入を４８０分間受けた。
【００８０】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ０８６：Ｋ６１Ｈを、トリプシン消化ソイブロスアガーに接種するのに用い、そして接種物の生菌数を標準希釈技法で測定した。０時間で、ヒヒは、４．５  ｘ  １０１０生細菌／ｋｇ体重（４ｍｌ／ｋｇ）以上の注入を受け、２時間の連続注入により右橈側皮静脈中に経皮カテーテルを通して投与された。
【００８１】
大腿動脈および１つの大腿静脈に無菌的にカニューレ挿入し、平均の全身性動脈圧を測定し、血液サンプルを得、そして抗生物質の投与した。ゲンタマイシンをＥ．ｃｏｌｉ注入の最後（すなわちＴ＋１２０で３０分間）に与え、次いでＴ＋３６０で４．５ｍｇ／ｋｇ、そしてＴ＋５４０分で３０分間与えた（９ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）。次いで、ゲンタマイシン（４．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）を実験の最後および３日間毎日１度与えた。
【００８２】
動物を麻酔下で維持し、１２時間継続的にモニターした。血液サンプルを、血液学的測定、臨床化学的測定、サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６）の測定、およびＬＡＣＩの測定のために１時間に１度採取した。同様に、呼吸速度、心臓の拍動、平均の全身の動脈圧、および温度を１時間に１度モニターした。動物を、実験の最初の３０時間継続して観察した。７日間生存する動物は、永続的に生存する動物と考えられ、続いて８日目に剖検のためにペントバルビタールナトリウムで安楽死させた。
【００８３】
１０匹のヒヒ（ＬＡＣＩ治療した５匹および賦形剤コントロールの５匹）にＥ．ｃｏｌｉの致死量の注入物を静脈内に２時間投与した。表１は、ＬＡＣＩは、５匹のＥ．ｃｏｌｉ処置したヒヒの５匹を救い、永続的な生存動物となったことを示している。ＬＡＣＩ治療された動物の平均Ｅ．ｃｏｌｉ用量は、５．７  ｘ  １０１０ＣＦＵ／ｋｇであり、そして全動物は７日間以上生存した。賦形剤コントロール群の平均Ｅ．ｃｏｌｉ用量は、５．５  ｘ  １０１０ＣＦＵ／ｋｇであり、平均生存時間は３９．９時間であった（表１）。賦形剤コントロール群の平均重量は、８．４ｋｇ（５．９ｋｇから１２．１ｋｇの範囲）であった。そしてＬＡＣＩ治療群の平均重量は６．８ｋｇ（５．２ｋｇから８．０ｋｇの範囲）であった。２匹の雌および３匹の雄で賦形剤コントロール群を構成したが、ＬＡＣＩ治療群は５匹の雄からなる。各群に投与したＥ．ｃｏｌｉの平均の用量間にも（ｐ＞０．０５）、動物の体重にも（ｐ＞０．０５）、差異はなかった。
【００８４】
ＬＡＣＩ治療したヒヒはケージ内を精力的に動き回り、致死量のＥ．ｃｏｌｉ（ＬＤ１００）を受けて２４時間以内に普通に餌を食べ、水を飲んだ。しかし、賦形剤コントロールのヒヒは昏睡状態で、呼吸困難のようであり、皮膚の微小血管系におけるＤＩＣの発生を示すヒヒの全身にわたり複数の点状出血を示した。
【００８５】
（＋３０分でのＬＡＣＩ投与に対する凝集および血液学的応答）
ＬＡＣＩが細菌感染したヒヒを防御するメカニズムを測定するために、凝集、臨床化学、および炎症応答に関連する選択された生理学的パラメータを測定した。図６は細菌感染に関連する凝固障害の多くが、ＬＡＣＩ治療したヒヒで阻害されたおよび／または弱まったことを示す。賦形剤コントロール動物におけるフィブリノーゲンレベルは３時間で約８０％減少したが、ＬＡＣＩ治療したヒヒは２０％（ｐ＜０．０００１）のみの減少であった。同様に、コントロールに比較して、フィブリノーゲン消費のマーカーとしての２４０分および７２０分でのフィブリン分解生成物の増加は、ＬＡＣＩ治療動物において明白ではなかった（ｐ＜０．０５）。
【００８６】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）は、賦形剤コントロールにおいて４時間を超える時間で非常に延長された（図６）。ＡＰＴＴは３７秒から２０８秒に、次いで２６６秒に増加し、ＰＴはそれぞれ４時間および１２時間で、１４秒から５８秒、次いで１３７秒に増加した。対照的に、ＬＡＣＩ治療したヒヒにおいて、ＡＰＴＴはそれぞれ４時間および１２時間で、３２秒から４５秒、次いで６０秒に増加し、そしてＰＴはそれぞれ４時間および１２時間で、１５秒から１８秒、次いで２２秒に増加した（ｐ＜０．０５）。
【００８７】
血小板細胞濃度の緩やかな減少が、１２時間の観察期間にわたって、賦形剤コントロール中およびＬＡＣＩ治療したヒヒ中で認められた（図６）。しかし、ＬＡＣＩ治療は上記の減少を遅らせ、４時間以上で最も明らかであった。４、６、および１２時間でコントロール群の平均血小板濃度は、それぞれ１０２．８±２６、６９±２０、および４３±５．０であった。これに対して、ＬＡＣＩ治療群の平均血小板濃度は、同一時間で、それぞれ、２４９±４４、２３６±３５、および１５３±３１であった。
【００８８】
ＬＡＣＩ治療した血漿サンプルでは可視的な溶血がないのにもかかわらず、ヘマトクリットが時間と共に減少し、コントロール群（４４±２％）に比較して、実験（治療）群（３６±２％）では１２時間でより低かった（ｐ＜０．０５）。さらに、生存動物の７日間の平均のヘマトクリット値もまた、ベースラインに比較して低かった：２８±１％対４２±０％。
【００８９】
ヘマトクリットの結果に一致して、赤血球濃度が、両群において初期の１２時間にわたって若干低下し、コントロール（４．９４±０．２１から４．４±０．１１）およびＬＡＣＩ治療群（５．２０±０．１０から４．８８±０．１７）であり、そして低い（３．４２±０．２  ｘ  １０６）赤血球濃度が生存動物で観察された。
【００９０】
白血球減少がＬＡＣＩ治療群およびコントロール群で同程度まで起こり、最低値は（約１．４８  ｘ  １０３／μｌ）、２時間で記録された：しかし、白血球濃度はベースラインの９．０±１．５  ｘ  １０３／μｌに比較して生存動物において７日間で上昇し、平均１９．２±３．５であった。
【００９１】
（＋３０分間でのＬＡＣＩ投与に対する臨床応答）
呼吸速度および心拍が両群で増加した。呼吸速度は細菌注入の開始後すぐに上昇し、１２時間上昇したままであった。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ注入の最初の２時間以内に心拍が１２０回／分から２００回／分まで劇的に増加し、１２時間上昇したままであった。
【００９２】
平均収縮期動脈圧（ＭＳＡＰ）および体温は、ＬＡＣＩ治療群およびコントロール群において等しく減退した。ＭＳＡＰにおける劇的な減少が細菌注入の終わりで観察された。ＭＳＡＰは、コントロール群では、２時間で１０７±５ｍｍＨｇから６９±５ｍｍＨｇに減退し、次いで１０時間から１２時間で徐々に９３±１１ｍｍＨｇに戻った。同様に、ＭＳＡＰは２時間で１１５±９から７４±３に減退し、６時間から１２時間までに８５±７に上昇した。１０匹のヒヒはＥ．ｃｏｌｉ注入に対して減少した体温応答を示した。実験開始時の賦形剤コントロール群の平均体温は３７．３±０．１℃であり、１２時間で３４．７±２．２℃までゆっくりと減退した。ＬＡＣＩ治療群の平均体温は最初３７．０±０．３℃であり、１２時間にわたって最小限で変化し、３６．９±０．２℃であった。
【００９３】
（血液化学値）
表２はＥ．ｃｏｌｉ感染し、治療した１０匹のヒヒの臨床化学値をまとめた。血清クレアチニン、総ビリルビン、尿酸、乳酸、トリグリセリド、アニオンギャップ、塩素、およびナトリウムにおける増加を１２時間で測定した。しかし、増加の程度は、賦形剤コントロール動物よりＬＡＣＩ治療動物においてより低かった（ｐ＜０．０５）。次のパラメーターの濃度変化を観察した：アルブミン、アルカリホスファターゼ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、カルシウム、コレステロール、ＣＫ、二酸化炭素、コルチゾール、カリウム、乳酸デヒドロゲナーゼ、リン、ＳＧＰＴ、および総タンパク質。それらの濃度の増加または減少は、ＬＡＣＩ治療により影響されなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、アルブミン、尿素窒素（ＢＵＮ）、および乳酸の平均濃度は、７日目で、ＬＡＣＩ治療した動物（すなわち、生存動物）におけるベースラインに戻らなかった。特に、アルブミン濃度は、実験開始時の３．７±０．１に比較して７日目で２．７±０．２であった。従って、アルブミンは約２５％減少した。同様に、７日目で、血清尿素窒素値（ＢＵＮ）は、実験開始時の２９．６±３．９に対して１３．８±２．１であった。最終的に、乳酸濃度は生存動物で約３倍に増加した。これらの動物の平均のベースラインの乳酸濃度は手法の開始時で１．７±０．５ｍｅｑ／Ｌであり、７日目で５．７±１．２ｍｅｑ／Ｌに増加した。
【００９４】
グルコース濃度の増加が、両群で２時間以内に観察された（ｐ＜０．０５）。平均値は徐々に初期の増加を超えて低下したが、１２時間まではＬＡＣＩ治療動物において一貫してより高いままであった（ｐ＜０．０５）。動脈ｐＨの増加が、両群で生じた。
【００９５】
（ＴＮＦレベルおよびＩＬ−６レベル）
血漿ＴＮＦ濃度は、賦形剤群およびＬＡＣＩ治療したヒヒの両方で上昇した。本発明者らの以前の研究（Ｃｒｅａｓｅｙら，  Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ（１９９１）３３：８４−９１）と一致して、ピークのＴＮＦレベルは１２０分（Ｅ．ｃｏｌｉ注入の終わり）にあった。ＬＡＣＩ治療は、血清ＴＮＦ濃度の上昇またはその放出のキネティクスに影響しないようであった（表３）。血漿ＩＬ−６濃度はまた、賦形剤コントロール群で時間と共に増加した。ここで、ＩＬ−６レベルは、２６〜３９ピコグラムで始まり、４時間を過ぎて１００〜２００ナノグラムに上昇した（表４）。興味深いことに、ＬＡＣＩ治療動物の血漿ＩＬ−６濃度は、コントロール群の濃度より、特に４時間でおよび４時間を過ぎて、低かった。ＩＬ−６濃度は、１２時間で、賦形剤コントロール群よりＬＡＣＩ治療群で約２０倍低かった（ｐ＞０．０５）。
【００９６】
（＋２４０分でのＬＡＣＩの投与）
ＬＡＣＩが、Ｅ．ｃｏｌｉショックを弱めることにもはや有効ではない時間を測定するために、細菌注入の終了後２時間までＬＡＣＩの投与を遅らせた。フィブリノーゲンの消耗およびフィブリン分解生成物の生成は、４時間ではっきりと明らかになった。表５は、この一連の実験において、賦形剤コントロール群の平均Ｅ．ｃｏｌｉ用量が５．６８（±２．６）  ｘ  １０１０ＣＦＵ／ｋｇそして２８．２±９．６時間の平均生存時間であったことを示す。ＬＡＣＩ群の平均Ｅ．ｃｏｌｉ用量は５．４３（±０．１９）  ｘ  １０１０ＣＦＵ／ｋｇであり、平均生存時間は９９±２９時間であった。５匹のＬＡＣＩ治療動物のうち２匹は７日間生存動物であった（ｐ＜０．０５）。平均体重または上記群の各々に投与したＥ．ｃｏｌｉ用量に差異は無かった（ｐ＞０．０５）。
【００９７】
（＋２４０分でのＬＡＣＩの投与の生物学的影響および生化学的影響）
２時間の細菌注入の終了後２時間のＬＡＣＩの投与は、１２時間以上で、ＦＤＰレベル、およびプロトロンビン時間の減少により明らかなように、凝固障害応答を若干弱めるのに有効であった。＋３０分に一致して、ＩＬ−６レベルは、１２時間で、賦形剤対照よりＬＡＣＩ治療ヒヒで２倍、より低かった。フィブリノーゲン濃度、ＡＰＴＴ、および血小板細胞濃度は、１２時間で、賦形剤コントロールおよびＬＡＣＩ治療ヒヒの間に有意な差異はなかった。しかし、生存した２匹の動物における７日目のフィブリノーゲンレベルは若干上昇した；ＦＤＰ、ＡＰＴＴ、およびＰＴ値は正常近くに回復したが、血小板細胞濃度は一匹（４３５）は正常そしてもう１匹（９７）では低かった。
【００９８】
血液細胞数およびヘマトクリットは、最初の１２時間の間、両群において常時変動したが、２匹の生存動物は、７日目で手法の開始時（４３％および４１％）に比較してより低いヘマトクリット（３５％および１９％）を有した。同様に、血液細胞濃度は、０日目の４．７  ｘ  １０６／ｍｍ３および４．５  ｘ  １０６／ｍｍ３に対して、７日目においては４．０  ｘ  １０６／ｍｍ３および２．７  ｘ  １０６／ｍｍ３であった。
【００９９】
臨床化学値を、＋３０分での研究で行ったように、＋４時間での研究を行った１０匹のヒヒについて測定した。１２時間で賦形剤コントロールおよびＬＡＣＩ治療ヒヒの間で最小の差異を観察した。しかし、＋３０分の研究に矛盾することなく、乳酸レベルは、１２時間で、コントロールよりＬＡＣＩ治療群のほうが高く（ｐ＜０．０５）、７日間生存した２匹において上昇したままであった（０時間での０．５ｍｇ／ｄｌおよび０．６ｍｇ／ｄｌに対して１３．２ｍｇ／ｄｌおよび４．０ｍｇ／ｄｌ）。対照的に、尿酸レベルは、１２時間で、コントロール群よりＬＡＣＩ治療群で若干低く、２匹のＬＡＣＩ治療生存動物において正常レベルに戻った。
【０１００】
＋３０分の研究と同様に、２４０分で治療した全ての動物は、白血球減少、および１２時間にわたってＷＢＣ数の緩やかだが少しの増加を経験した。さらに、２匹の７日間生存したＬＡＣＩ治療ヒヒは、ＷＢＣ数が、７日目で、０時間での５．１  ｘ  １０３細胞／ｍｍ３および８．０  ｘ  １０３細胞／ｍｍ３に比較して上昇した（１２．５  ｘ  １０３細胞／ｍｍ３および２１．８  ｘ  １０３細胞／ｍｍ３）。この傾向は、＋３０分でＬＡＣＩを用いて治療したヒヒの生存動物で観察された傾向に似ている。
【０１０１】
（病理学的結果）
死後検査を全てのヒヒについて行った。動物のサーベイランスを最初の３６時間継続した；そのため、死後数分以内に分析のために取り出し、それによって死後の自己消化変化を避けた。肺、肝臓、副腎、腎臓、脾臓、および胆嚢が、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌注入の標的器官であった。特に、賦形剤＋Ｅ．ｃｏｌｉを受けた動物は、重篤なうっ血、出血、フィブリン沈着、肺および肝臓での浮腫および大量の白血球蓄積、脾臓での髄質洞様毛細血管（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｓｉｎｕｓｏｉｄ）の重篤なうっ血、ならびに腎臓内の尿細管壊死および血栓症の顕著な証拠、ならびに副腎の皮質の重篤なうっ血を患った。Ｅ．ｃｏｌｉに冒されなかった器官は、胃、心臓、膵臓、小腸、および大腸であった。ＬＡＣＩは、肝臓、副腎、腎臓、脾臓、および胆嚢を保護した。そこでは、ほんの軽症か病理変化のないことが観察された。保護の程度は、肺では若干減少され、穏やかな血管うっ血、および軽症の白血球の蓄積が観察された。
【０１０２】
本研究の結果は、１ｘ  １０１０微生物／ｋｇがヒヒの血液中にすでに導入された場合に、細菌注入開始後３０分で投与した場合に、ＬＡＣＩがＬＤ１００用量のＥ．ｃｏｌｉを与えられたヒヒの１００パーセントを救ったことを示した。さらに、ＬＡＣＩが細菌注入終了後２時間で与えられた場合（すなわち、５  ｘ  １０１０微生物／ｋｇを超える量が注入され、そして多くのヒヒの宿主防御メカニズムが２時間で引き起こされた場合）に、ヒヒの４０パーセントを救った。
【０１０３】
ＴＮＦレベルは、Ｅ．ｃｏｌｉ注入の終了時（すなわち２時間で）にピークとなったが、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６レベルが見え始めた（Ｃｒｅａｓｅｙら，  Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ（１９９１）３３：８４−９１）；フィブリノーゲンの低減および消耗、ならびにフィブリン分解生成物の生成が、３時間および４時間の間でさらに容易に検出可能になる（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら，  Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ（１９９２印刷中））。この研究は、ＬＡＣＩが、致死的な細菌注入の開始後４時間程度遅く投与された場合に、フィブリノーゲンの消耗を回避、遅延、および反転さえし得ることを示している。
【０１０４】
凝固を弱めることに加えて、ＬＡＣＩは、コントロール群においてはっきりと明らかなように、細胞障害（クレアチニン、尿酸、乳酸）および代謝アシドーシス（アニオンギャップ、塩素、およびナトリウム）の程度を弱める。多くのこれらの低酸素血症、アシドーシス、および細胞障害のマーカーの減少した血清レベルと一致して、ＬＡＣＩは、腎臓、副腎、肝臓、脾臓、および肺を病理学的変化から著明に形態学的に保護した。致死的なＥ．ｃｏｌｉで感染させたヒヒにおけるＬＡＣＩの効果は、グラム陰性ショックが血管上皮の急性炎症性疾患であることを示し、しかもグラム陰性細菌に伴う感染から上皮を一時的に保護することにより有意な効果が達成されることを示している。
【０１０５】
本発明者らの以前の研究は、細菌感染の最初の３０分以内に、循環血中のＰＭＮ白血球濃度が急激に低下したことを示し（Ｔａｙｌｏｒら，  Ｃｏｌｌｏｑｕｉｕｍ  Ｍｏｓｂａｃｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（１９９１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  ｐｐ．２７７−２８８）、トロンビン−抗トロンビン（ＴＡＴ）複合体、組織プラスミノーゲンアクチベーター／プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ｔ−ＰＡ／ＰＡＩ）、およびプラスミン−抗プラスミン（ＰＡＰ）複合体が出現し始め（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら，  Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ（１９９２）印刷中）、そして致死的なＥ．ｃｏｌｉ感染において補体カスケードの活性化がはっきりと明らかであった（Ｄｅ  Ｂｏｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら，  提案）。ＬＡＣＩ治療の結果、腎臓における尿細管壊死および糸球体血栓症の回避；副腎における皮質性うっ血、出血、壊死、および白血球蓄積；肝臓における、血管のうっ血および白血球の蓄積の回避；脾臓における、髄質のうっ血、出血、および壊死の回避；ならびに、肺における、フィブリントロンビン沈着および水腫形成を生じた。ＬＡＣＩは、顕著に肺における白血球流入および血管のうっ血を減退した。４時間でＬＡＣＩを受けて７日間生存した２匹のヒヒは、上記の病理学的変化と非常に似た病理学的変化の回避を示した。しかし、緩和な白血球蓄積および血管のうっ血を伴う、ある種の軽症の水腫および肺胞嚢におけるフィブリンの存在があった。７日間生存したＬＡＣＩ治療ヒヒのいずれにおいても複数の器官の損傷の証拠は無かった。この保護の程度は、ＬＡＣＩの遅延した投与およびヒヒに大量の細菌投与を与えられたとすると、顕著であり、そして予期できない。
【０１０６】
ＬＡＣＩ治療し、Ｅ．ｃｏｌｉを投与した７日間生存動物は、より低い赤血球細胞濃度および白血球濃度の増加を示した。組織学的な検査では、いずれの組織においても出血の発生は見いだされなかった。従って、より低いヘマトクリットは、骨髄における赤血球希釈または赤血球の遅い発生に寄与し得る。非感染のヒヒでのＬＡＣＩの毒性学研究はこの問題を解決するために必要である。
【０１０７】
本研究のＥ．ｃｏｌｉ投与し、ＬＡＣＩ治療したヒヒにおけるＩＬ−６レベルの減少は予測不能であり、そして直接または間接のいずれでも、ＬＡＣＩは炎症応答に影響を示すことを示唆する。従って、その抗凝固活性に加えて、ＬＡＣＩの生理学的役割は免疫系の種々の関与物質とともに凝固経路の相互作用の調節に有用である。
【０１０８】
【表１】
2004210801.tif 000002
【０１０９】
【表２−１】
2004210801.tif 000003
【０１１０】
【表２−２】
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【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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本発明は、特定の実施態様を参考にして記載された。しかし、本出願は、以下に添付の請求の範囲の趣旨および範囲から離れない限り、当業者により行われ得るこれらの変更および置換を包含することを意図するものである
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は敗血症および敗血症性ショックに含まれる複合経路を示す。内因性経路および外因性経路が含まれる。微小血管の血栓症の徴候は以下のものを含む：（１）神経系：多病巣性、譫妄（ｄｅｌｅｒｉｕｍ）、昏睡；（２）皮膚：局所的な虚血、表面の壊疸；（３）腎臓：乏尿症、高窒素血症、皮質性壊死；（４）肺：急性呼吸窮迫症候群；および（５）胃腸管：急性潰瘍。出血性素質の徴候は以下を含む：（１）神経系：脳内出血；（２）皮膚：点状出血、斑状出血、静脈穿刺浸出；（３）腎臓：血尿；（４）粘膜：鼻出血、歯肉浸出；および（５）胃腸管：塊状の出血。
【図２】図２は、３６日の調整培地（ＣＭ）およびＴＮＦに誘発されたＣＭによる、組織因子活性の阻害を示す。
【図３】図３は、内皮細胞由来のＣＭのＬＡＣＩ中和を示す。
【図４】図４は、ＬＡＣＩタンパク質の抗体中和を示す。
【図５】図５ａおよび５ｂは、ヒヒでのＬＡＣＩの薬動力学的プロフィールを示す。白丸はイムノアッセイの結果を示し、黒丸はバイオアッセイの結果を示す。例えば、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＡＣＩは、２匹の健康なヒヒに３０秒にわたって持続性Ｉ．Ｖ．として与えられた。血液を、動物から＋１、３、６、１０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０、２４０、および４２０分で採取した。血漿中のＬＡＣＩレベルは、イムノアッセイおよびバイオアッセイ（テキストに記載）の両方を用いて測定した。図５ｂでは、ラインは、０．７ｕｇ／ｋｇ＋１０ｕｇ／ｋｇ／分注入、１２時間を示す。
【図６】図６ａから図６ｈは、２時間の致死的な細菌の静脈内注入の開始後３０分の、ＬＡＣＩ投与に対する凝集および血液学的応答を示す。黒丸を伴う線は処置した動物から得られた結果を示し、「Ｘ」を伴う線はコントロールの動物から得られた結果を示す。＊（スター）はコントロール群と実験群との間の統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示し、白丸は時間の間の統計学的に有意な差（ｐ＜０．０５）を示す。図６ａはフィブリノーゲンのレベルを示し、図６ｂはＦＤＰのレベルを示す。図６ｃは血小板のレベルを示し、図６ｄはＷＢＣのレベルを示す。図６ｅはＰＴのレベルを示し、図６ｆはＡＰＴＴのレベルを示し、図６ｇはヘマトクリットのレベルを示し、そして図６ｈはＲＢＣのレベルを示す。例えば、致死量のＥ．ｃｏｌｉ（約５ｘ１０１０微生物／ｋｇ）を２時間にわたる静脈内注入で麻酔したヒヒに投与した。細菌注入の開始後３０分後、５匹のヒヒにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；媒体コントロール；＊）を注入し、他の５匹にＰＢＳ中のＬＡＣＩ（●）を注入した。細菌注入前ならびに注入開始後２、４、６、および１２時間で血液サンプルを１０匹のヒヒから得た。血液サンプルを、フィブリノーゲン、フィブリン分解生成物、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、ならびにヘマトクリット、血小板、赤血球、および白血球数について常法でアッセイした。各測定値の平均±標準誤差を時間（時間）に対してプロットした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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