(57)【要約】【課題】本発明は、免疫法の汎用性と、生体のレセプターのセンシングに見られる、感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持ち、免疫反応を電気応答として取り出す免疫電極センサーを提供することを目的とする。【解決手段】本発明では、イオンチャネルマーカーを標識にし、抵抗検出を標識検出の検出法として併用し、これに、抗原抗体反応の結果イオンチャネルを遊離する手段を組み合わせ、被測定物である抗体を測定する。【選択図】　図１
2004108814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物である抗体とは同一抗原に対応する認識部位の異なる脂溶性イオン伝導性物質で標識した可溶性の標識抗体と、前記標識抗体とは同一抗原に対応する認識部位の異なる不溶化抗体と、作用極と対極の一対の電極と、前記作用極表面に形成した脂質薄膜とを有し、前記標識抗原と被測定液中の抗体との接触により抗体と標識抗原との複合体を生成させ、未反応の前記標識抗原を不溶化抗体に結合させて除去し、抗体と標識抗原との複合体を脂質薄膜に吸着させ、脂質薄膜の電気伝導度の変化量をもって脂溶性イオン伝導性標識を検出し、被測定液中の抗体を検出する免疫電極センサー。
【請求項２】
水溶性イオンと抱接化合物を生成する脂溶性物質、その抱接化合物、脂溶性キレート剤、そのキレート化合物、脂溶性イオン、内向けに極性基が配向し外向けに疎水基が配向する構造をもつポリマーまたはオリゴマー、の内の少なくとも１つを脂溶性イオン伝導性物質である請求項１記載の免疫電極センサー。
【請求項３】
脂質薄膜が、単分子膜または重層膜である請求項１記載の免疫電極センサー。
【請求項４】
脂質薄膜がイオウ原子を介して電極の金属材料と結合する請求項１記載の免疫電極センサー。
【請求項５】
脂質薄膜表面が、疎水基、非イオン性親水基、陽イオン性解離基、陰イオン性解離基、両性イオン性解離基の内の少なくとも１つで覆われた請求項１記載の免疫電極センサー。
【請求項６】
脂溶性イオン伝導性物質で標識した可溶性の標識抗体がモノクーロナル抗体である請求項１記載の免疫電極センサー。
【請求項７】
電気伝導度の変化量測定が交流加印あるいは直流バイアスを加えた交流加印である請求項１記載の免疫電極センサー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、化学物質の電気化学的分析・測定に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
特定物質を選択的に検出する方法には抗体を利用した方法が多く用いられる。
【０００３】
抗体は特異的認識・結合を行う生体物質である。実験動物に抗原を感作させることにより多数の物質に対応する抗体を得ることが可能であり、汎用的に多種類の物質に対しセンシング法を構築することが可能である。抗体が特異的に抗原を認識して結合し複合体を形成する反応は、抗原抗体反応あるいは免疫反応と呼ばれる。この抗原抗体反応を利用して多くのセンシング法が開発されてきた。
【０００４】
その内の一つは、特に標識物質を用いず、抗原抗体反応の結果生じる複合体を検出するもので、目視で検出を行うＡＢＯ血液型判定は古くから知られる例である。他にも、複合体をゲル濾過法で分子量分画して分析する液体クロマトグラフィーなどの検出法がある。
【０００５】
しかしながら、この分野の多くのセンシング法は、抗体あるいは抗原に標識（マーカー）を結合させて用い、標識の検出手段との併用で利用され発展してきた。
【０００６】
ラジオイムノアッセイは、ラジオアイソトープを標識とし、放射線をシンチレーションカウンターあるいはラジオオートグラフィーなどで検出する。
【０００７】
蛍光抗体法は、蛍光物質を標識とし、蛍光光度法、蛍光顕微鏡観察などの光学的検出を行う。
【０００８】
酵素免疫法は、カラシ大根のパーオキシダーゼを標識とし、パーオキシダーゼ反応を利用した発光分析で検出するのが一般的である。また、この方法のバリエーションとして、酸化還元酵素を標識とし、酵素反応の結果である酸化性物質あるいは還元性物質の濃度変化を、電極電位あるいは電流滴定（電気分解）の電流として検出することは可能である。
【０００９】
色素・顔料などの有色物質を標識とするものは、光度法または目視判定などで検出される。金コロイドやブルーラテックス粒子などが標識として用いられることが多い。これらは、濾紙などの基板上に標識抗体などを内蔵し、その上での検の移動を伴って抗原抗体反応の結果生ずる複合体を分離し、同じくその上で比色検出を行う簡易法である免疫クロマト法に利用されることが多い。
【００１０】
他にも、マグネタイト粒子を標識とし、磁性を検出するなど、標識と標識の検出法の併用にはその組み合わせが多い。
【００１１】
しかしながら、これらの免疫法には、課題も多い。
【００１２】
ラジオイムノアッセイは、放射性物質の管理が大きな負担で、簡便な測定法にはなり得ない。
【００１３】
各種の光学的検出法を用いる方法は、感度が悪い。あるいは、感度を上げるために増感を行うと、ノイズを拾い精度が悪くなる。
【００１４】
また、免疫クロマト法などの簡易法は、測定に際し煩雑な操作は必要としないが、精度と感度の問題から、しきい値を設けた２値あるいは３値判定にならざるを得ない。
【００１５】
一方、生体内において、選択的な特定物質の検出方法の典型的な例として、神経シナプスにおける、アセチルコリンレセプターによる、神経伝達物質アセチルコリンの認識・応答が知られるている。
【００１６】
アセチルコリンレセプターは、脂質二重層を貫通し、アセチルコリン認識部位を外側に向けて存在する。アセチルコリンレセプターのアセチルコリンの認識・結合は特異的で精度・感度が高い。アセチルコリンを認識・結合したアセチルコリンレセプターは、コンフォメーション変化により脂質二重層を貫通した、イオンチャネルを形成する。通常、脂質二重層の内外は、イオンの偏りによって電気的に分極した状態にあるが、イオンチャネルを介してのイオンの移動・混合により脱分極がおこる。この脱分極状態がパルスとして神経細胞中を移動して、生体内の離れた部位に情報を伝達する（神経伝達）。
【００１７】
この例のように、生体の検出は、精度・感度が高く、かつ、１ステップの簡便迅速なプロセスで認識情報が電気信号に変換されて以降の情報処理がなされるという点で、極めて合理性の高い検出法であると言い得る。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この生体検出の生体外での検出技術は、生体からレセプターを抽出し、これを脂質二重層上に再構築するに止まり、生体がもつレセプターの種類に制約されて汎用的に多種類の物質に対して同等のセンシングを行うことができない。
【００１９】
本発明は、免疫法の汎用性と、生体のレセプターのセンシングに見られる、感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持ち、免疫反応を電気応答として取り出す免疫電極センサーを提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明では、イオンチャネルマーカーを標識にし、抵抗検出を標識検出の検出法として併用し、これに、抗原抗体反応の結果イオンチャネルを遊離する手段を組み合わせ、被測定物である抗体を測定する。
【００２１】
すなわち、本発明の免疫電極センサーは、被検物である抗体とは同一抗原に対応する認識部位の異なる脂溶性イオン伝導性物質で標識した可溶性の標識抗体と、前記標識抗体とは同一抗原に対応する認識部位の異なる不溶化抗体と、作用極と対極の一対の電極と、前記作用極表面に形成した脂質薄膜とを有し、前記標識抗原と被測定液中の抗体との接触により抗体と標識抗原との複合体を生成させ、未反応の前記標識抗原を不溶化抗体に結合させて除去し、抗体と標識抗原との複合体を脂質薄膜に吸着させ、脂質薄膜の電気伝導度の変化量をもって脂溶性イオン伝導性標識を検出する。
【００２２】
このような標識と標識検出を併用することにより、免疫法の汎用性と、生体のレセプターのセンシングに見られる、感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持ち、免疫反応を電気応答として取り出す免疫電極センサーが可能となる。
【００２３】
【発明の実施の形態】
請求項１に記載の本発明は、被検物である抗体とは同一抗原に対応する認識部位の異なる脂溶性イオン伝導性物質で標識した可溶性の標識抗体と、前記標識抗体とは同一抗原に対応する認識部位の異なる不溶化抗体と、作用極と対極の一対の電極と、前記作用極表面に形成した脂質薄膜とを有し、前記標識抗原と被測定液中の抗体との接触により抗体と標識抗原との複合体を生成させ、未反応の前記標識抗原を不溶化抗体に結合させて除去し、抗体と標識抗原との複合体を脂質薄膜に吸着させ、脂質薄膜の電気伝導度の変化量をもって脂溶性イオン伝導性標識を検出し、免疫反応を電気応答として取り出す。
【００２４】
免疫法の汎用性と、生体のレセプターのセンシングに見られる、感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持ち、免疫反応を電気応答として取り出す免疫電極センサーを与える。
【００２５】
請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の発明の、脂溶性イオン伝導性物質が、水溶性イオンと抱接化合物を生成する脂溶性物質、その抱接化合物、脂溶性キレート剤、そのキレート化合物、脂溶性イオン、内向けに極性基が配向し外向けに疎水基が配向する構造をもつポリマーまたはオリゴマー、の内の少なくとも１つである免疫電極センサーであり、標識の種類が増える。
【００２６】
請求項３に記載の本発明は、請求項１に記載の発明の脂質薄膜が、単分子膜あるいは重層膜である測定法であり、高感度を安定して保持できる。
【００２７】
請求項４に記載の本発明は、請求項１に記載の発明の脂質薄膜がイオウ原子を介して電極の金属材料と結合する免疫電極センサーであり、脂質薄膜を容易に作成することができる。
【００２８】
請求項５に記載の本発明は、請求項１に記載の発明の脂質薄膜表面が疎水基、非イオン性親水基、陽イオン性解離基、陰イオン性解離基、両性イオン性解離基の内の少なくとも１つで覆われた免疫電極センサーであり、測定の感度、測定範囲、応答速度を制御することができ、さらに、絶縁耐性を高めることができる。
【００２９】
請求項６に記載の本発明は、請求項１に記載の発明の脂溶性イオン伝導性物質で標識した可溶性の標識抗体にモノクーロナル抗体を使用する免疫電極センサーであり、一般のポリクーロナル抗体使用時の抵抗測定の応答性の低下を回避することができる。
【００３０】
請求項７に記載の本発明は、請求項１に記載の発明の電気伝導度測定が交流加印あるいは直流バイアスを加えた交流加印である免疫電極センサーであり、電気応答を外部に取り出すことができる。
【００３１】
【実施例】
（実施例１）
本発明第１の実施例を図１図２をもとに説明する。図１は本発明のセンサーの全体構成例を示す図で、図中１は筒状の対極、２は対極１内に先端を挿入した作用極である。６は標識抗体層でありセルロースパウダーに標識抗体を塗布して充填したものである。３は筒状の対極１の内部に粒状の不溶化抗体を充填した不溶化抗体層である。４は被測定液入り口であって、抗体を含む電解質水溶液である被測定液は、ここより標識抗体層に入り、不溶化抗体層３を毛細管現象により通過して作用極２の先端に達し、作用極と接触する。
【００３２】
図２は、図１の内部構成を被測定液の移動とともに説明した図で、１１は被測定液１２中の抗体で本例の被測定物にあたる。被測定液１２は毛細管現象により標識抗体層６に入る。ここには、被測定物である抗体１２とは異なる抗原の認識部位を持った抗体１３、にマーカー１５を結合させた標識抗体１６に、さらに被測定物である抗体１１に対応する抗原１４を抗原抗体反応により結合させた１次複合体が塗布されている。このマーカー１５は脂溶性イオン伝導性物質である。この１次複合体１６は被測定液１２に溶けて遊離状態となる。被測定液に含まれる抗体１１は、１次複合体１６と抗原抗体反応で結合して２次複合体１８となる。
【００３３】
このようにしてできた、２次複合体１８と未反応の遊離の１次複合体１７は、次の不溶化抗体層に入る。ここには、不溶化基材２０の表面に、抗体１１と同じ抗体１９があらかじめ結合して、合わせて不溶化抗体２４を形成している。この不溶化抗体２４に対して未反応の１次複合体１７が抗原抗体反応により結合する。一方の２次複合体１８の抗原部は、既に抗体と結合しており、不溶化抗体２４と結合することができない。このために、被測定液から１次複合体１７だけが選択的に除去される。
【００３４】
このようにして残った２次複合体１８が、被測定液の移動にともない作用極１に達し、作用極１と対極２が被測定液を介して接続されることとなる。
【００３５】
ここで２１は１の作用極上に形成された脂質分子２２からなる脂質単分子膜であり脂質薄膜である。１２は、１、２の両電極の間を満たす電解質水溶液で、本構成例の中では、不溶化抗体層を通過した被測定液である。その電解質濃度は、体液あるいは尿程度の塩濃度を想定している。
【００３６】
本例の脂質薄膜である脂質単分子膜は、面積１平方センチメートルのもとで１０の８乗オーム程度の高い抵抗を有する。これは電解質のイオン伝導の抵抗（通常は導電率で表される）や、電極表面の抵抗に比べて著しく高く、測定系全体の抵抗は近似的に脂質単分子膜の抵抗となっている。電解質水溶液中の２次複合体１８は電解質溶液中を拡散して脂質単分子膜に至る。この時、図２中の２３のようにマーカー部は脂質単分子膜に吸着し取り込まれて、脂質単分子膜に導電性を付与し膜抵抗が下がる（電気伝導度が上がる）。前述のように測定系全体の抵抗は膜抵抗であるので、抵抗の減少分、あるいは電気伝導度の上昇分が吸着による寄与分である。
【００３７】
ところで、脂質単分子膜を作用極と対極との間に置かれた電気回路と見た場合、脂質単分子膜に取り込まれたマーカーとマーカー、マーカーとベースの脂質単分子膜の関係は、抵抗の並列接続回路となる。この場合の計算処理は、電気伝導度を用いると、各部分の電気伝導度の総和が、全膜の電気伝導度となるので計算処理が容易である。すなわち、マーカーの取り込まれていない脂質単分子膜部分を近似的に電気伝導度ゼロとして、取り込まれたマーカー数と電気伝導度が比例関係を持つ。
【００３８】
一方、マーカーの取り込み現象は、一般的吸着現象であり、時間に対するマーカーの吸着量の関係は、飽和曲線を描く。このとき、平衡吸着量と吸着の初速度が電解質溶液中のマーカー濃度（これは、複合体濃度でもある）に比例する。従って、測定の平衡時の電気伝導度、または、電気伝導度の接液初期の立ち上がり傾きがマーカー濃度に比例するのでこの関係から標識抗原と抗原の複合体濃度を算出することができる。
【００３９】
また、作用極に至る２次複合体１８の濃度は、そのまま初期に被測定液にあった抗体濃度であるので、前述の通り、測定の平衡時の電気伝導度、または、電気伝導度の接液初期の立ち上がり傾きがそのまま被測定液中の抗原濃度に比例するのでこの関係から被測定物である抗原の濃度を算出することができる。
【００４０】
以上は、比例領域を用いた測定であり、比例領域を用いるのが簡単である。しかし、比例領域でなくとも、抗体濃度と応答の間に１対１の関係が成り立てば抗体濃度の測定は可能である。比例領域以外は、別途検量線を作成し、検量線上の応答と抗体濃度の対応として求めることができる。
【００４１】
また、脂質単分子層に対する、マーカー１個の吸着による電気伝導度の上昇は、１０のマイナス８乗ジーメンス程度あり、これは、高精度の抵抗測定で一分子の被測定物の検出が可能であり、マーカーの検出感度は極めて高いものであり、測定の感度は極めて高い。
【００４２】
以上述べたように、本発明の測定法は本質的に抵抗（電気伝導度）変化を観測して被測定物質濃度を求めるものであり、電気分解の電流を測定する他の測定法や電極電位を測定する他の測定法との区別は明確である。しかしながら、外部電源（図１に図示せず）に対する応答と考えるならば、一定電圧印加状態での電流値は、電気伝導度と同義であるので、電流を観測しても良いことになる。従って、本発明で言う電気伝導度あるいは抵抗は、膜の抵抗変化を観測するものであればその測定手法あるいは表示の単位系は何であっても良い。
【００４３】
（実施例２）
本発明第２のマーカーの実施例を、標識抗体の構造例を示す図３の化学構造式を用いて説明する。
【００４４】
図３中３１は抗体であり、３２はそのチオール残基である。３５は抗体タンパク鎖のカルボキシル末端である。３３はアミノベンゾー１５−クラウン−５残基であり脂溶性イオン伝導性の標識（マーカー）の一例である。３４は抗体とマーカーとをつなぐ二価架橋試薬であるＮ−（４−マレイミドブチロキシ）スクシニミドの残基である。３３のマーカー部は、クラウン化合物の１種であり、電気陰性度の高い酸素を分子を内側に向け、その内部に大きさの定まった空間を持つ。このため、この空間には、空間の大きさに適合し電気的に陽性の化学種を取り込み易い。本例の１５−クラウン−５構造では、ナトリウムイオン、カリウムイオンを主に包接する。一方では、クラウン化合物は外側を囲うようにハイドロカーボンを向けており、この部分は疎水性であって油に溶解しやすい。このような性質のためにクラウン化合物は、水溶液から移動して脂質薄膜に溶解（吸着）して取り込まれ、脂質薄膜内にイオンを持ち込む。このイオン伝導でのイオンの移動は、脂質薄膜が薄く、クラウン化合物の分子サイズ程度である場合には、クラウン化合物内部の空間が、脂質薄膜の貫通孔となって、イオンの直接通過により行われる。脂質薄膜が厚くなれば、イオンを抱接した抱接化合物イオンが脂質薄膜内を電気泳動することにより行われる。これは、脂溶性イオンによるイオン伝導である。従って、吸着マーカー当たりの導電性の増加は、脂質薄膜が薄い方が大きく、感度が高い。
【００４５】
クラウン化合物と同様にイオンを抱接する、脂溶性イオン伝導性物質に、天然物で抗生物質であるバリノマイシンなど多種類の化合物が知られている。これらはニュートラルイオンキャリアーあるいはイオノフォアなどと呼ばれ、実用上はイオン電極などに応用されている。これらの化合物は、アミノベンゾイル−１５−クラウン−５のアミノ基のように架橋に利用できる修飾基を導入するならば、すべて脂溶性イオン伝導性のマーカーとして利用できる。
【００４６】
親水基の修飾を受けていないポルフィリン化合物は脂溶性物質である。クラウン化合物と同様に内部に空間を有する化合物であるが、内向けにアミンが並ぶ点がクラウンと大きく異なる。ポルフィリン化合物はその内部に金属陽イオンを取り込みアミンとの間に配位結合を形成した金属キレートを形成する。この金属キレートは脂質薄膜に取り込まれ、前述抱接化合物と同様に脂質薄膜にイオン導電性を与える。また、ポルフィリン化合物の内部に向かって並ぶアミンは、陽イオン性の解離基であって、ポルフィリン化合物自身は脂溶性のイオン性物質である。このため、前述の抱接イオンと同様に、脂溶性イオンによるイオン伝導性を脂質薄膜にあたえる。ポルフィリン化合物は架橋に利用できる修飾基を導入するならば、脂溶性イオン伝導性のマーカーとして利用できる。
【００４７】
ポルフィリンと類似の構造を持ち、ポルフィリンと同様のイオン伝導性を与える物質にフタロシアニンがある。また、脂溶性イオンとして脂質薄膜にイオン伝導性を与える物質として、長鎖のアルキル基を有するアミン類がある。また、金属キレートを作り、これが脂質薄膜に吸着してイオン伝導性を示す物質には、多くの疎水性のキレート剤が市販されている。これらはいずれも架橋に利用できる修飾基を導入するならば、すべて脂溶性イオン伝導性のマーカーとして利用できる。
【００４８】
また、アミノ酸であるＬ−アラニンがペプチド結合（アマイド結合）したポリマーあるいはオリゴマーはペプチド主鎖の極性基間の水素結合のために、ヘリックス構造をとり、螺旋状の主鎖の極性基を内に配向し、これを疎水基であるハイドロカーボン側鎖が取り囲む立体構造をとる。結果、親水部を中心に周囲を疎水基が取り囲んだ筒状構造ができる。この筒状物質は外側を覆う疎水基のために脂溶性で、脂質薄膜に取り込まれ、親水部がイオンの貫通孔として働き、脂質薄膜にイオン伝導性を与える。この時、イオン伝導に関与するイオン種はサイズが小さく移動の容易な水素イオンが中心である。このポリマーまたはオリゴマーを用いて標識抗原を作るための架橋反応は、Ｎ末端のアミノ基に対して行うことができる。
【００４９】
（実施例３）
本発明第３の脂質薄膜の実施例を、脂質薄膜の構造を示す図４をもとに説明する。図４中の５１は金属銅の電極である。５２は脂質分子であって、これが銅表面を覆って単分子膜をなしており、５１の金属銅の電極と合わせて作用極をなしている。本例の脂質分子原料は６−アミノ−メルカプトヘキサンである。脂質分子と銅とは、イオウ原子５３を介して結合する。５５は末端の修飾基であるアミノ基である。５４はハイドロカーボン鎖であって、この層は疎水性で脂質薄膜の高抵抗の主体である。本例の単分子膜は、脂質薄膜としては究極の薄さを持ち、かつ均一な厚みをもつ。前述したごとく、脂質薄膜は薄い方が高感度である。しかも、均一であってどの部位でも等しい感度を出し得るので、安定した高感度が得られる。ハイドロカーボン鎖長の影響は、鎖長が長くなるほど、感度が下がるが、Ｃ１８程度までは影響は小さい。一方、測定時に電圧を印加した場合、過剰な印加にたいしマーカーがないハイドロカーボン層をイオンが貫通して絶縁破壊が起こるが、絶縁耐性はハイドロカーボン鎖長が長い方が高く有利である。
【００５０】
末端修飾基は修飾基の種類により、特徴ある挙動を示す。これについては後述する。
【００５１】
また、末端修飾基がメチル基である単分子膜に、長鎖のハイドロカーボンをもつカルボン酸（これは高級脂肪酸とよばれる）あるいは長鎖のハイドロカーボンを持つ１から４級アミンを水中で作用させると、長鎖のハイドロカーボンが単分子層に向けて配向し、カルボキシル基あるいはアミン基が水に向けて配向し、容易に２重層の脂質膜が得られる。この２分子膜の脂質薄膜は、単分子膜と同様に均一であり、単分子膜に次いで感度が高く、単分子膜以上に絶縁耐性が高い、好ましいものである。
【００５２】
また、２分子膜などの重層膜はＬＢ膜（ラングミュア・ブロジェット膜）を電極上に作成することによってもできる。
【００５３】
以上のように、本実施例によれば、脂質薄膜を、単分子膜あるいは重層膜にすることにより、高感度を安定して保持することができる。
【００５４】
（実施例４）
本発明第４の脂質薄膜の実施例を、前出図４をもとに説明する。図４中の５３はイオウ原子であり、その原料であった６−アミノ−メルカプトヘキサンではチオハイドリル基として存在していたものである。チオハイドリル基は銀、銅、鉄、タングステンなどの多くの金属に作用して容易に結合する。その結合が、図４中の５３に示すイオウ原子を介しての電極金属との結合である。このように、チオハイドリル基を有するハイドロカーボンは金属電極上に容易に脂質単分子膜を形成することができる。そのようにしてできた単分子膜は自己組織化単分子膜と呼ばれる。本発明は、これを応用したものであって、容易に均質高感度な作用極を作成することができる。
【００５５】
同様の自己組織化単分子膜を生成するものに、トリアジン環に２つのチオハイドリル基を導入したトリアジチオール基を有する長鎖のハイドロカーボンが知られる。この場合も、トリアジチオールのチオハイドリル基が金属との結合を行い、単純なチオハイドリル基のみの結合と同様な、均一で高感度の脂質薄膜を有する作用極ができる。
【００５６】
（実施例５）
本発明第５の脂質薄膜の実施例を、前出図４と図３を用いて説明する。図４中の５５は、脂質単分子膜の末端修飾基であるアミノ基である。アミノ基は陽イオン性の解離基であり、電解質溶液（被測定液）中の陰イオンを吸着してイオン対を作る。一方、既に図３に示した標識抗体は、さらに、抗原と抗体とを結合した２次複合体となって、作用極の脂質単分子膜に到達する。抗体は図３の３５のカルボキシル基を持つ。このカルボキシル基は陰イオン性の解離基である。そのために、２次複合体は、図４の脂質薄膜表面のアミノ基との間にイオン対を作って吸着し、脂質薄膜表面に複合体が濃縮されることとなる。この濃縮状態から脂溶性イオン導電性物質であるマーカー部３３が、さらに５４のハイドロカーボン層に取り込まれる。このためにマーカー部の平衡吸着量が大きく、かつ吸着速度が大きくなる。平衡吸着量の増大に伴い、測定できるマーカーの測定範囲が大きくなる。また、吸着速度の増加にともない、測定の応答速度が大きくなる。
【００５７】
同じことが、標識抗体に１から４級アミンなどの陽イオン性の解離基を導入し、脂質薄膜の表面をカルボキシル基などの陰イオン性の解離基で覆った時にも起こる。すなわち、標識抗原と脂質薄膜表面の解離基が逆符号である場合は、平衡吸着量の増大と吸着速度の増大が起こる。
【００５８】
また、標識抗原と脂質薄膜表面の解離基が同符号である場合には、標識抗原は脂質薄膜表面に近づきにくくなり、そのためにマーカー部の平衡吸着量は小さくなり、吸着速度も小さくなる。
【００５９】
また、脂質薄膜表面が、水酸基、フォルムアマイド基などの非イオン性の極性の大きな親水基で覆われた場合と、疎水基のメチル基であった場合とでは、平衡吸着量に大きな差は無いが、吸着速度は親水基を用いた方が速い。脂質表面が親水基で覆われた場合、被測定液中の水分子との間に水素結合ができ、その分脂質薄膜界面での水分子間の水素結合が減少する。このため水分子との間に水素結合を作らない疎水基の場合に比べ、界面張力が小さくなり、小さな力で界面を破ってマーカーが脂質薄膜のハイドロカーボンの疎水層に侵入できるからである。
【００６０】
また、脂質薄膜表面が前述のホスファチジルコリンやホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質のように、アミンの陽イオン性解離基とリン酸エステルなどの陰イオン性解離基の両者をもつ両性イオン性電解質で覆われた場合、脂質薄膜表面にリン酸エステルなどの陰イオン層とアミンの陽イオン層が重層された脂質薄膜の表面構造ができる。この陽イオン層は陽イオンを排斥し、陰イオン層は陰イオンを排斥する。このため、この重層構造を通して陽イオンが通過することも、陰イオンが通過することも阻止するので、脂質薄膜の抵抗が上昇し、さらにイオンが脂質薄膜を貫通して移動するために起こる、絶縁破壊に対しても強くなる。
【００６１】
以上のように、脂質薄膜の表面基は、平衡吸着量、吸着速度をに関係し、抗体の測定範囲、応答速度を制御でき、また脂質薄膜の抵抗に関与し、絶縁耐性を高めることができる。
【００６２】
（実施例６）
本発明第６の抗体の実施例を図５の不溶化抗体の構成例および図６の１価抗体の作成例をもとに説明する。
【００６３】
図５中の５３は被測定物である抗体と同じ抗体である。５１は本例で不溶化基材として選んだポリスチレンビーズである。ポリスチレンはハイドロカーボンの主鎖にフェニル基の側鎖が結合した分子構造を有する。このポリスチレンに臭素分子を作用させると、フェニル基の水素が臭素原子と置換した臭素化ポリスチレンが得られる。この臭素化ポリスチレンは活性であって、抗体などのタンパクと反応してフェニル基を介した架橋結合ができる。図１の３に示す不溶化抗体層はこのようにして得た不溶化抗体を筒状の対極に充填したものである。また、例示の方法以外にも、不溶化の方法は多種類あり、また、その形状もビーズ以外に多種類のものが知られる。本発明は、これらを限定しない。
【００６４】
モノクロナール抗体の実施例を説明する。ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウシなどの実験動物に抗原を感作させることにより、抗原に対応する多種類の抗体が血漿中に生産される。実験動物の体内では、抗体を生産する免疫細胞は、１細胞１抗体であって、多数の免疫細胞が同一の抗原に対する、別の抗体を生産することにより抗体の多様性ができる。このような抗体はポリクロナール抗体と呼ばれる。これに対し、一つの免疫細胞のみを取り出し、骨髄腫細胞との細胞融合などで不死化（あるいは幼若化）した細胞は、ただ１種の抗体を作る。この抗体は、モノクロナール抗体と呼ばれる。
【００６５】
ポリクロナール抗体は、同一抗原内の、別個の認識位置を認識して結合する多数の抗体の混合物である。多数の抗体の中には、すでに抗原抗体反応で結合した２次複合体の抗原部に別の認識部をもち結合能力を有するものが存在する。そのため、２次複合体がポリクーロナル抗体でできた不溶化抗体で除去され作用極に達することができない。
【００６６】
これに対し、モノクロナール抗体では、同一の認識位置をもつ抗体は除去されないので、必ず作用極に到達し、電気伝導度測にかかる。
【００６７】
（実施例７）
本発明第７の電気伝導度測定の実施例について図２をもとに説明する。図２中の１、２は脂質薄膜を挟むように設置された一対の電極である。　抵抗を測定するには、脂質薄膜の両側に電位差を付ける。これは、外部電源（図示せず）より一対の電極を介して行う。
【００６８】
外部電源を用いる場合には、電圧にたいする電流の応答から抵抗を求める。また、ホイストンブリッジ回路の抵抗の一つに替えて、電極・電解質水溶液・脂質薄膜からなる図２の構成の回路を用い、ブリッジ回路の平衡条件から既知抵抗との比として求めることもできる。
【００６９】
しかしながら、外部電源が直流電圧の印加である場合には、イオンの移動に従って、化学ポテンシャルが変化して逆電位が発生し、外部電源の電位が短時間の内に経時的に相殺されて、脂質薄膜の抵抗変化を計りにくい。
【００７０】
その対策として、外部電源から、脂質薄膜を挟む１対の電極に対し、交流電圧を加印して抵抗を求める。なぜなら、交流では、化学ポテンシャルの変化を伴わずに抵抗測定を行うことができるからである。この場合の用語は、交流によるものであるから、抵抗は、インピーダンスであり、電気伝導度はアドミッタンスと読み替える。
【００７１】
一方、このようなインピーダンス測定では、外部電源の交流に、電気分解が起こらない程度の直流バイアス電圧を加えると、２次複合体の解離基に対し一定方向への電気泳動の駆動力がかかる。その結果、等電点が電解質のｐＨより酸性側にある２次複合体は陽極側へ移動する。陽極が作用極である場合は、マーカーが脂質薄膜に取り込まれるため、マーカーの脂質薄膜にたいする吸着が加速されて応答が速くなり、また、マーカーの脂質薄膜に対する平衡吸着量が増して、感度が上がる。なお、電気分解が起こらない程度の直流バイアス電圧は、特に酸化性物質や還元性物質が存在しない場合、交流の最大電圧を加えた合計で、水の水酸イオン、水素イオンへの解離の理論電位である０．８３ボルト未満である。また、電気分解を起こさない限り、このバイアス電圧では、持続的電気泳動はできず、そのため、微量の標識抗原に対してのみ感度を増す方法となる。
【００７２】
また、等電点が電解質のｐＨよりアルカリ側にある２次複合体は、作用極が陰極である場合に、マーカーが脂質薄膜に取り込まれるため、マーカーの脂質薄膜にたいする吸着が加速されて応答が速くなり、また、マーカーの脂質薄膜に対する平衡吸着量が増して、感度が上がり同様の効果が得られる
【００７３】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、高い抵抗を有する脂質に可溶性で、かつ脂質にイオン伝導性を付与する物質を標識として抗体に結合させ、さらに被測定物である抗体との間に抗原を介して２次複合体を生成させ、この標識が脂質薄膜に吸着（薄膜に対する溶解）して、脂質薄膜にイオン伝導性を付与するために生じる抵抗の低下（電気伝導度の上昇）を検出し、被測定物質である抗体を測定するものであり、このような標識と標識検出のを併用することにより、免疫法の汎用性と、生体のレセプターのセンシングに見られる、感度、精度、簡便性、迅速性を併せ持ち、免疫反応を電気応答として取り出す免疫電極センサーが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１における全体構成を示す図
【図２】本発明の実施例１における内部構成を示す図
【図３】本発明の実施例２における標識抗原の構造を示す図
【図４】本発明の実施例３、４、５における脂質薄膜の構成を示す図
【図５】本発明の実施例６に不溶化抗体の構成図
【図６】本発明の実施例６における一価抗体の作成行程を示す図
【符号の説明】
１　作用極
１１　抗体
１３　抗体
１４　抗原
１５　マーカー
１６　標識抗体
１７　１次複合体
１８　２次複合体
１９　抗体
２１　脂質薄膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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