(57)【要約】      （修正有）【課題】レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体、及び該抗体を用いてレストンエボラウイルスを鑑別診断する方法を提供することを目的する。【解決手段】レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体、就中、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体、更には、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で特定の領域の配列ＤＰＤＩＧＱＳＫの４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体を提供する。また本発明は、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原補足ＥＬＩＳＡ法によりレストンエボラウイルスを鑑別診断する方法を提供する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レストンエボラウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するものである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するものである、請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（６３６ＤＰＤＩ６３９）からなるエピトープを認識するものである、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）からなるエピトープを認識するものである、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体の抗原結合部位を含む断片。
【請求項７】
レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープ。
【請求項８】
請求項７に記載のエピトープを用いて精製されたポリクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１から５のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１１】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９１である請求項１０に記載のハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１３】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９２である請求項１２に記載のハイブリドーマ。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含む断片を用いて、レストンエボラウイルスを検出する方法。
【請求項１５】
抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法により測定を行う、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
エボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉性のあるモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と組み合わせて測定を行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含む断片、及び抗原抗体反応を検出する試薬からなるレストンエボラウイルスを検出するキット。
【請求項１８】
次の工程を含むことを特徴とするレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体の作製方法：
（イ）レストンエボラウイルスの核蛋白質を免疫した動物より脾臓細胞又はリンパ球をとりだし、ミエローマ細胞と融合さてせハイブリドーマを作製する
（ロ）レストンエボラウイルスの核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを用いて、（イ）のハイブリドーマのうちレストンエボラウイルスに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選別する
（ハ）選別されたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を精製する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レストンエボラウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を用いたレストンエボラウイルスの検出方法、該モノクローナル抗体を作製する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エボラウイルスによる感染症は、出血を伴う重篤なウイルス感染症であり、最も危険な感染症の一つである。
エボラウイルスには４つの種、ザイールエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｚ）、スーダンエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｓ）、コートジボアールエボラウイルス（ＥＢＯ−ＣＩ）、レストンエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｒ）がある。エボラウイルスは一本鎖の（−）鎖ＲＮＡゲノムを有し、そのウイルス遺伝子は、核蛋白（ＮＰ）、Ｐ蛋白質（ＶＰ３５）、マトリックス蛋白質（ＶＰ４０）、糖蛋白質（ＧＰ）、ウイルスｍＲＮＡの合成に作用する核蛋白（ＶＰ３０）、膜に結合する蛋白質（ＶＰ２４）、そしてＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）をコードする。
レストンエボラウイルス（ＥＢＯ−Ｒ）はフィリピンに固有のウイルスであると考えられているが、このレストンエボラウイルスに感染したカニクイザルが米国及びイタリアに輸出されたことが報告されている。レストンエボラウイルスはヒト以外の霊長類に致死的な疾患を引き起こすが、ヒトには感染症状を引き起こさない。
【０００３】
エボラウイルスの自然宿主は特定されていないが、患者との接触によりヒトは感染する。また、エボラウイルスは輸入サルを介して国内に持ち込まれる可能性があり、全輸入サルに対する検疫も行われている。エボラ出血熱の早期の実験室診断がエボラウイルス感染の拡大を防ぐために重要であるが、前述したようにレストンエボラウイルスはヒトには感染症状を引き起こさないため、エボラウイルスの種の迅速な区別が必要である。特に、検疫などでヒト以外の霊長類由来のサンプルを試験する場合には、レストンエボラウイルスであるか否かの鑑別が重要となる。
【０００４】
エボラウイルス感染の実験室診断としては、ウイルス分離、透過型電子顕微鏡による観察、免疫組織化学的手法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、蛍光５´ヌクレアーゼアッセイ（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ５´  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）、そして抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法が用いられている。エボラウイルス感染においては血中のウイルス量が高くなるため、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法によるエボラウイルス抗原の検出が十分可能である。一方、ウイルス分離には高度安全実験施設を使用することが必要であり、逆転写ＰＣＲ法では増幅された断片の配列確認が必要である。このため、実験室診断としては抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法が適している。
本発明者らは以前に、ザイールエボラウイルス核蛋白に対するモノクローナル抗体３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を報告した。しかしながら、このモノクローナル抗体３−３Ｄは、ザイールエボラウイルスの核蛋白のみならず、スーダンエボラウイルス核蛋白とレストンエボラウイルス核蛋白にも反応する特異性のない抗体であった（特許文献１及び非特許文献１参照）。
従って、検疫などにおいてエボラウイルスの種を迅速に鑑別するために、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を開発する必要があった。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１４−３０６１６４号公報
【非特許文献１】
新倉その他著、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ）、２００１年、第３９巻、第９号、ｐ．３２６７−３２７１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。本発明はまた、該モノクローナル抗体を用いてレストンエボラウイルスを鑑別診断する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体、就中、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体、更には、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体を見出し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者らは、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含む断片を用いてレストンエボラウイルスを検出する方法を開発するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明者らは、ヒスチジンタグがＮ末端に付加されたレストンエボラウイルス核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ）をマウスに免疫し、該マウスの脾臓細胞を用いたハイブリドーマによりモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製したところ、レストンエボラウイルスに特異的な二つのモノクローナル抗体、Ｒｅｓ２−６Ｃ８とＲｅｓ２−１Ｄ８が得られた。間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を行うことにより、モノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８のエボラウイルスの種に対する特異性を試験したところ、これらの二つのモノクローナル抗体はレストンエボラウイルス核蛋白に反応したが、ザイールエボラウイルスの核蛋白やスーダンエボラウイルスの核蛋白には反応しないものであり（図１）、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体であった。
【０００９】
次に、レストンエボラウイルスの短縮型核蛋白に対するＩｇＧ−ＥＬＩＳＡを行うことにより、Ｒｅｓ２−６Ｃ８又はＲｅｓ２−１Ｄ８が認識する最小エピトープを決定した。この結果、Ｒｅｓ２−６Ｃ８により認識されるエピトープはレストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（４アミノ酸残基：６３６ＤＰＤＩ６３９）であり、Ｒｅｓ２−１Ｄ８が認識するエピトープは６３６番目から６４３番目までの領域（８アミノ酸残基：６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）であった（図２）。これにより以下の事実が明らかとなった。すなわち、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体を作製すれば、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を作製できる。また、８アミノ酸残基ＤＰＤＩＧＱＳＫのうち４アミノ酸残基以上を含むエピトープが、レストンエボラウイルスに特異的な抗体の選別又は精製に利用できる。
【００１０】
本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法の感度を試験したところ、感度が高くかつレストンエボラウイルスを特異的に検出できる方法であることが明らかとなった（図３）。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と、エボラウイルスサブタイプの交叉生モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法とを併用することによって、迅速にレストンエボラウイルス感染症をザイールエボラウイルス感染症及びスーダンエボラウイルス感染症から区別して鑑別診断することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体としては、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体が好ましく、より好ましくはレストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体が好ましい。
本発明のモノクローナル抗体は、例えばレストンエボラウイルスの核蛋白に対するモノクローナル抗体を作製することにより得ることができる。すなわち、レストンエボラウイルスの核蛋白を動物に免疫し、該動物の脾臓細胞又はリンパ球を用いてハイブリドーマを作製し、次に、得られたハイブリドーマの中からレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を産生するものを選抜する。そのスクリーニングにあたっては、例えばレストンエボラウイルスの核蛋白を用いることができ、より好ましくはレストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列からなるエピトープを用いることができ、さらに好ましくは、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを用いることができる。
この選抜されたハイブリドーマの産生する上清を精製することにより、本発明のモノクローナル抗体を多量に作製することができる。
【００１２】
以下、本発明のモノクローナル抗体を作製する方法をより詳細に説明する。
まず、レストンエボラウイルスの核蛋白を動物に免疫し、免疫感化させて抗原に対する抗体を産生する細胞を生じさせる。ここで用いる哺乳動物としてはマウス、ラット、ハムスター、ニワトリなどが挙げられるが、取り扱いが簡便なマウスにより行うことが可能である。抗原として用いるレストンエボラウイルスの核蛋白（ＮＰ）としては、天然のレストンエボラウイルス核蛋白でも、組み換え体の核蛋白でもよいが、組み換え体の核蛋白を用いれば、感染の心配が無く好ましい。組み換え体の核蛋白としては、レストンエボラウイルスの有する核蛋白の全長タンパク質でもよく、また、レストンエボラウイルスの有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列を含む部分長のタンパク質でも良い。
【００１３】
レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白を作製する方法としては、例えば、遺伝子工学的手法を用いて、レストンエボラウイルスの核蛋白の全長あるいは部分長をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得し、次に該遺伝子を適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組み換え体ベクターを構築し、それを宿主細胞に導入することにより遺伝子を発現させて目的のタンパク質を得る方法が挙げられる。
組み換え核蛋白の作製に用いる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればよいが、取り扱いが簡単な昆虫細胞又は大腸菌を用いることが可能である。これらの細胞を用いた組み換え蛋白の作製は、公知の方法により行うことができる。例えば、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞での蛋白質発現系により目的の蛋白を得ることができる。
【００１４】
レストンエボラウイルスの核蛋白をコードする遺伝子（ＤＮＡ）としては、次の方法により得ることができる。例えば、レストンエボラウイルスに感染したカニクイザルの肝臓組織からＲＮＡを抽出してｃＤＡＮライブラリーを作製し、レストンエボラウイルス核蛋白に特異的な配列をもつプライマーをを用いたＰＣＲによるスクリーニングで目的のＤＮＡを得ることができる。２つ目の例として、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０５０９３６に記載の配列を基に合成遺伝子を作製する方法が挙げられる。すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０５０９３６に記載のアミノ酸配列を基に塩基配列を設計し、この遺伝子をいくつかの約４００ｂｐのセグメントに分け、セグメントの末端には制限酵素部位を設ける。各セグメントを３対ほどの長いプライマーでカバーできるようにプライマーを設計する。各プライマーは１０〜１２ｂｐ程度のオーバーラップを持つように設定する。これらのプライマーを用いた段階的ＰＣＲを行って各セグメントを作製する。各セグメントを制限酵素部位で連結することにより目的のＤＮＡを得ることができる。
組み換え蛋白を作製するにあたっては、蛋白の回収のためにアフィニティータグを付することができる。アフィニティータグとしてはＧＳＴタグ及びヒスチジンタグが挙げられる。
その他、レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白を作製する方法としては、例えば、［池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ａｎｄ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８］に記載の方法に従って行うことができる。
【００１５】
レストンエボラウイルスの核蛋白を動物に免疫する方法、及び該動物の脾臓細胞又はリンパ球からハイブリドーマを作製する方法は、公知のモノクローナル抗体作製法に従って行うことができる。
例えば、動物に免疫する際に、抗原性の高いキャリアタンパク質と抗原を結合させて投与したり、適当なアジュバントと共に抗原を投与することにより抗原性を高めることができる。キャリアタンパク質としてＩＭＪＥＣＴ−ＡＬＵＭ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いることができ、アジュバントとしてはフロインドの完全アジュバンド（Ｂｅｃｔｏｎ社製）を用いることができる。抗原の投与は、１回目の投与の後、５日〜２週間の間隔で３〜１０回行うのが好ましい。
免疫した動物の脾臓細胞又はリンパ球からハイブリドーマを作製する方法としては、脾臓細胞又はリンパ球を無限に増殖可能なミエローマ細胞と融合させることにより可能である。すなわち、脾臓細胞又はリンパ球、ミエローマ細胞に、ポリエチレングリコールなどの細胞凝集性媒体を加えて培地中で懸濁することにより、細胞を融合させる。目的の融合細胞のみを選択的に得るためにはＨＡＴ選択培地を用いることができる。核酸合成系のｄｅ  ｎｏｖｏ回路しかもたないミエローマ細胞を用いることにより、ｄｅ  ｎｏｖｏ回路を阻害するＨＡＴ選択培地ではハイブリドーマのみが分別される。
【００１６】
ハイブリドーマの中から、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法としては、次の方法が挙げられる。例えば、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法により、ハイブリドーマ上清のレストンエボラウイルス核蛋白に対する反応性を検定することによってハイブリドーマを選抜する方法が挙げられる。ここで用いるレストンエボラウイルス核蛋白としては、全長のレストンエボラウイルス核蛋白でもよいが、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなる部分長核蛋白を用いれば、レストンエボラウイルスの核蛋白に特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマを高い確度でスクリーニングできる。好ましくは、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域を含む核蛋白を用いてＩｇＧ−ＥＬＩＳＡによりスクリーニングする方法がよい。
このようなＩｇＧ−ＥＬＩＳＡに用いるレストンエボラウイルス核蛋白は、上記の組み換え核蛋白を作製する方法に従って得ることができる。若しくは、後記実施例４に記載の方法に従って行うこともできる。
【００１７】
ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法は、公知の方法に従って行うなうことができる。例えば、抗原とするレストンエボラウイルス組み換え核蛋白をプレートにコートし、ハイブリドーマ上清を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質等で標識した第一抗体の動物種に対するイムノグロブリン抗体を反応させた後に、標識物質に応じた反応を行い、抗原に特異的に反応するハイブリドーマ上清を特定する。このようにして本発明のハイブリドーマを得ることができ、本発明のモノクローナル抗体は、該ハイブリドーマの培養上清を精製することにより得ることができる。
【００１８】
上記の方法により得られたモノクローナル抗体については、例えば、後記実施例５に記載の抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法により、レストンエボラウイルス核蛋白への反応性を試験してさらに選抜することもできる。
また、後記実施例２に記載の方法に従って間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を行うことにより、得られたモノクローナル抗体のエボラウイルスの種に対する特異性、すなわちレストンエボラウイルスの核蛋白、ザイールエボラウイルスの核蛋白、スーダンエボラウイルスの核蛋白のそれぞれに対する反応性を確認することができる。
本発明のモノクローナル抗体の認識するエピトープのマッピングは、例えば後記実施例４に記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】
上記の記載により、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を作製する方法は明らかである。
すなわち、本発明は、次の工程（イ）〜（ハ）を含むことを特徴とするレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体の作製方法を提供する：
（イ）レストンエボラウイルスの核蛋白質を免疫した動物より脾臓細胞又はリンパ球をとりだし、ミエローマ細胞と融合さてせハイブリドーマを作製する
（ロ）レストンエボラウイルスの核蛋白のうち該ウイルスに特異的なアミノ酸配列の領域からなるエピトープを用いて、（イ）のハイブリドーマのうちレストンエボラウイルスに特異的な抗体を産生するハイブリドーマを選別する
（ハ）選別されたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を精製する。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体を作製する方法のさらに具体的な方法としては、例えば後記実施例１に記載された方法に従って行うことができる。
また、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９１及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９２として、平成１５年４月８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番１号）に寄託されている。
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９１にて寄託されているハイブリドーマは、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（６３６ＤＰＤＩ６３９）からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８を産生するハイブリドーマである。
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２９２にて寄託されているハイブリドーマは、レストンエボラウイルスの有する核蛋白のうち、アミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）からなるエピトープを認識するモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−１Ｄ８を産生するハイブリドーマである。
【００２１】
本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体の抗原結合部位を含む断片は、例えば、レストンエボラウイルスに特異的なモノクロール抗体をパパイン又はペプシンなどの蛋白分解酵素で処理することにより得ることができる。
例えば、モノクローナル抗体のアイソタイプがＩｇＧであったとき、パパインでモノクローナル抗体を切断すると、抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントを二つと、抗原結合部位を含まないＦｃフラグメント一つとに分解される。また、ペプシンでＩｇＧ型の抗体を切断した場合には、抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントが２つ結合した大きな断片と、それ以外の断片とに分解される。
【００２２】
本発明は、レストンエボラウイルスが有する核蛋白のうちアミノ酸配列で６３６番目から６４３番目までの領域（６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）の４アミノ酸残基以上の領域からなるエピトープを提供する。本発明のエピトープは、上記のモノクローナル抗体の作製に用いることができ、また、レストンエボラウイルスに特異性のあるポリクローナル抗体を作製する場合に用いることができる。
例えば、抗原として精製したレストンエボラウイルスの核蛋白を、動物（ウサギ、ニワトリ、ラット、マウスなど）に繰り返し注射し、免疫反応によりレストンエボラウイルス核蛋白に対する抗体を産生させる。次に、血液を採取して、これをレストンエボラウイルス核蛋白を固定化したカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけ、レストンエボラウイルス核蛋白に対するポリクローナル抗体を精製する。この精製されたポリクローナル抗体に対して、さらに、本発明のエピトープを固定化したカラムによりアフィニティークロマトグラフィーで精製することにより、レストンエボラウイルスに対して特異性を有するポリクローナル抗体を作製することができる。
このように作製されたレストンエボラウイルスに特異性のあるポリクローナル抗体は、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体に代用することができる。例えば、レストンエボラウイルスに対して特異性のあるポリクローナル抗体を使用して、レストンエボラウイルスを検出することができる。
【００２３】
本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いてレストンエボラウイルスを検出する方法としては、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法（ＩＦＡ法など）、放射線物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法など）、ウエスタンブロッティング法、免役沈降法等を挙げることができる。
これらの方法は、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を使用し、公知の方法に従って行うことができる。
【００２４】
本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、例えば次のような方法により行うことができる。簡潔にその方法を述べると、まず、精製した本発明のモノクローナル抗体をマイクロタイタープレートのウェルに１晩ほど吸着させ、各穴をバッファーでブロッキングする。次に、バッファーで洗浄後、サンプルをウェルにロードして１時間ほどおき、本発明のモノクローナル抗体とサンプル中のレストンエボラウイルス核蛋白を反応させる。各穴をバッファーで洗浄し、エボラウイルス核蛋白に対するポリクローナル抗体を加えて１時間ほどおき、モノクローナル抗体に捕捉されたレストンエボラウイルス核蛋白とポリクローナル抗体とを反応させる。バッファーで洗浄後、酵素で標識された抗ＩｇＧ抗体を加えて、抗原抗体複合体に抗ＩｇＧ抗体を反応させる。最後に、酵素の基質を加えて酵素反応を測定することにより、レストンエボラウイルス核蛋白を検出する。
この方法で用いるレストンエボラウイルス核蛋白に対するポリクローナル抗体は、公知の方法に従って調製できる。また、抗ＩｇＧ抗体を標識する酵素としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（西洋わさび過酸化酵素）や、アルカリフォスファターゼなどが挙げられる。ホースラディッシュペルオキシダーゼの発色試薬としては２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（略名ＡＢＴＳ）や、ジアミノベンジジン（略名ＤＡＢ）を用いることができる。また、標識酵素としてアルカリフォスファターゼを用いるときには、Ｘ−リン酸（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸）を基質とし、発色試薬ニトロブルーテトラゾリウムを用いることができる。
また、本発明のレストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、例えば、後記実施例５に記載の方法に従って行うことができる。ここで使用されている抗ＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰウサギ血清は、後記実施例３に記載の方法に従って調整することができる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、後記実施例５及び図３に示されるように、レストンエボラウイルスの核蛋白を抗原希釈比１：６４０００〜１：１２８０００まで検出できる非常に感度の高い方法である。また、後記実施例５及び図３に示されるように、ザイールエボラウイルスの核蛋白を全く検出せず、レストンエボラウイルスの核蛋白のみを特異的に検出できる極めて優れた方法である。
【００２５】
レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と、エボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉性のあるモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と組み合わせて測定を行えば、より高い精度でレストンエボラウイルスの鑑別診断が可能である。この方法も例えば後記実施例５に記載の方法に従って行うことができる。ここで使用するエボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉生のあるモノクローナル抗体（３−３Ｄ）は、前記特許文献１及び非特許文献１に記載の方法に従って作製することができる。
【００２６】
本発明のレストンエボラウイルスを検出するキットは、レストンエボラウイルスに特異的なモノクローナル抗体又はその抗原結合部位を含む断片、及び抗原抗体反応を検出する試薬からなるものである。ここで言うモノクローナル抗体またはその断片としては、プレートに固定化された抗体や、酵素、蛍光色素などで標識された抗体であってもよい。また、抗原抗体反応を検出する試薬としては、レストンエボラウイルスを特異的に認識する抗体を一次抗体として使用した場合に抗原抗体結合反応により形成された複合体を検出するための二次抗体や、抗体の標識物質として酵素を使用する場合に酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤などが挙げられる。その他、各種溶解剤、バッファー、洗浄剤など、免疫学的測定試薬のキットに通常使用されているものが挙げられる。
【００２７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：  モノクローナル抗体の作製
（１）エボラウイルスの組み換え核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ）の作製
レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ）及びザイールエボラウイルスの組み換え核蛋白（Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ）を作製した。Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを発現する組み換えバキュロウイルス（Ａｃ−Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ）及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰを発現する組み換えバキュロウイルス（Ａｃ−Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ）を発明者らが先に報告した方法（池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ａｎｄ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８）により作製した。Ａｃ−Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰを感染させたＴｎ５細胞を２６℃で３日間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄した。そして、１％のＮＰ−４０を含むＰＢＳで１５分インキュベートした。一分間超音波処理をし、細胞溶解物を試験に用いた。
【００２９】
（２）  マウスへの免疫
フロインドの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ）（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｃｏ．，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）とともにＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰをＢａｌｂ／ｃマウスに免疫した。そして、ＩＭＪＥＣＴ−ＡＬＵＭ（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）と共にＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰをマウスの皮下に抗原接種することを２週間の間隔で３回行った。
（３）ハイブリドーマの作製
最後の免疫処置から３日後に脾臓を取り出し、その脾臓細胞をポリエチレングリコール４０００（カタログＮｏ．４０３０−０３５、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いてＰ３／Ａｇ５６８と融合させた。１０％ウシ胎児血清と抗生物質（ストレプトマイシンとペニシリン；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）中で、細胞培養を行った。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）添加剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を培地中に加え、使用説明書に従ってハイブリドーマの選抜を行った。培地の組成をＨＡＴからＲＰＭＩ１６４０へ換えたときには、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）添加剤（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を培地に加えた。
【００３０】
（４）ハイブリドーマのスクリーニング
Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを抗原とする免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡ法（非特許文献１参照）により、ハイブリドーマの上清のスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡ法で陽性であったものとして大まかにスクリーニングされたハイブリドーマが得られ、これを限界希釈にてクローン化し株化した。３２種の株化されたハイブリドーマが得られ、これらの産生するモノクローナル抗体のレストンエボラウイルス核蛋白に対する反応性を、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法に従って検定した。この結果により、二つのモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８が選ばれ、その後の試験に用いられた。ＭＡｂ  Ｔｒａｐ  ＧＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｕ．Ｋ．）を用い、使用説明書に従って培養上清からモノクローナル抗体を精製した。モノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて決定した。Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８のアイソタイプはそれぞれＩｇＧ２ｂとＩｇＧ１であった。
【００３１】
実施例２：  間接蛍光抗体法（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓａｙ：ＩＦＡ）による本発明のモノクローナル抗体の抗原特異性の検定
レストンエボラウイルス又はザイールエボラウイルスの全ての核蛋白を発現するＨｅＬａ細胞を用いた間接蛍光抗体法（ＩＦＡ）を、発明者らが先に報告した方法（池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ａｎｄ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８）により行った。ザイールエボラウイルスに感染したＶｅｒｏ  Ｅ６細胞をガンマ線照射したものを塗布したＩＦＡスライドは、米疾患管理・予防センター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ）の好意により提供された。それぞれのモノクローナル抗体を１００ｎｇ／μｌの濃度で２０μｌスライド上のウェルにスポットし、湿潤下３７℃で１時間インキュベートした。
スライドをＰＢＳで洗浄したのち、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）血清（カタログＮｏ．６２−６５１１、Ｚｙｍｙｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  ＣＡ）と１：１００の比率で混ぜ、反応させた。スライドをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で染色パターンを観察した。
その結果を図１に示す。レストンエボラウイルスの組み換え核蛋白を発現するＨｅＬａ細胞（Ａ〜Ｃ）、ザイールエボラウイルスの組み換え核蛋白を発現するＨｅＬａ細胞（Ｄ〜Ｆ）、スーダンエボラウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞（Ｇ〜Ｉ）に対するモノクローナル抗体の反応性、すなわちＲｅｓ２−６Ｃ８の反応性（Ａ，Ｄ，Ｇ）、同じくＲｅｓ２−１Ｄ８反応性（Ｂ，Ｅ，Ｈ）、そして３−３Ｄの反応性（Ｃ，Ｆ，Ｉ）を間接蛍光抗体法により測定した結果を示す。二つのモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８はレストンエボラウイルス核蛋白に反応したが（図１Ａ，Ｂ）、ザイールエボラウイルスの核蛋白やスーダンエボラウイルスの核蛋白には反応しなかった（図１Ｄ，Ｅ，Ｇ，Ｈ）。３−３Ｄは３種のエボラウイルスの核蛋白全てに反応した。
【００３２】
実施例３：  ポリクローナル抗体の調製
文献記載の方法に従って次のウサギ抗血清を調製した。すなわち、レストンエボラウイルス核蛋白のＣ末端側半分（アミノ酸配列で３６０番目から７３９番目まで）にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを付加したもの（ＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰ）に対するウサギ抗血清（池上その他著、マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ａｎｄ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、２００２年、第４６巻、第９号、ｐ．６３３−６３８参照）、及びＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰに対するウサギ抗血清（西條その他著、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００１年、第３９巻、第２号、ｐ．７７６−７７８参照）を作製した。簡潔に作製方法を述べると、まず、ウサギの皮下にＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰ又はＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰをＩＭＪＥＣＴ−ＡＬＵＭ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に４回免疫し、最後の免疫処理から７日後の血清を採取した。
【００３３】
実施例４：  モノクローナル抗体が認識するエピトープのマッピング
（１）レストンエボラウイルスの短縮型核蛋白の作製
Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８により認識されるエピトープを決定するするために、レストンエボラウイルスの短縮型組み換え核蛋白のセットを用意した。次の表１にこれらのペプチドを構築するために用いたプライマーを示す。
【００３４】
【表１】
2004315394.tif 000002
【００３５】
レストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３１番目から７３９番目に相当する短縮型核蛋白は次のように作製した。プライマーＲＥＳ−Ｎ８Ｆ及びＲＥＳ−Ｎ８Ｒ（非特許文献１参照）を用いたＰＣＲを行い、レストンエボラウイルスのｃＤＮＡの対応する領域を増幅した。ＰＣＲ断片をｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）にサブクローニングし、ｐＧＥＸ−ΔＮＰ６３１−７３９を構築した。この構築ベクターの挿入配列が正しいかどうかを確認した。ＧＳＴタグの付加されたレストンエボラウイルスの短縮型核蛋白を大腸菌（ＢＬ−２１）で発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。精製は使用説明書に従って行った（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。フォワードプライマーＲ６３５ｆ，Ｒ６３６ｆ，Ｒ６３７ｆ及びＲ６３８ｆ、そしてリバースプライマーＲＥＳ−Ｎ８Ｒを用いてＰＣＲを行った。レストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３５番目から７３９番目、６３６番目から７３９番目、６３７番目から７３９番目、６３８番目から７３９番目に対応する短縮型核蛋白をそれぞれ発現させ、それを精製した。レストンエボラウイルス核蛋白の６３１番目から６３８番目まで、６３１番目から６３９番目まで、６３１番目から６４０番目まで、６３１番目から６４１番目まで、６３１番目から６４２番目まで、６３１番目から６４３番目までに対応する長さの各短縮型核蛋白を発現するベクターは、部位特異変異導入法によりｐＧＥＸ−ΔＮＰ６３１−７３９の対応するコドンを終始コドンに換えることにより構築した。この部位特異変異導入には、次のプライマー、Ｍｕ６３９ｆ／Ｍｕ６３９ｒ、Ｍｕ６４０ｆ／Ｍｕ６４０ｒ、Ｍｕ６４１ｆ／Ｍｕ６４１ｒ、Ｍｕ６４２ｆ／Ｍｕ６４２ｒ、Ｍｕ６４３ｆ／Ｍｕ６４３ｒ、Ｍｕ６４４ｆ／Ｍｕ６４４ｒを用い、使用説明書（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；  ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）に従って行った。前述したように、それぞれのレストンエボラウイルス短縮型核蛋白を発現させ、それを精製した。
【００３６】
（２）エピトープの決定
レストンエボラウイルスの短縮型核蛋白に対するＩｇＧ−ＥＬＩＳＡを行うことにより、Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８が認識するエピトープを決定した（図２）。
ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡは次のようにして行った。まず、精製されたＧＳＴ融合蛋白を１００ｎｇ／ウェルでＭｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．）に吸着させ、Ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ（５％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及びＰＢＳ）でブロッキング後、各モノクローナル抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＨＲＰＯ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ）及びＡＢＴＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、特異反応を検出した。
Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８はレストンエボラウイルス核蛋白の６３１番目から７３９番目までのアミノ酸残基を認識することがわかった。そして、最小のエピトープを決定するためにさらに試験が行われた。
Ｒｅｓ２−６Ｃ８はレストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から７３９番目までに対応する短縮型核蛋白、そして６３１番目から６３９番目までに相当する短縮型核蛋白には反応したが、６３７番目から７３９番目までに相当する短縮型核蛋白と６３１番目から６３８番目までに相当する短縮型核蛋白には反応しなかった。一方、Ｒｅｓ２−１Ｄ８はレストエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から７３９番目までに相当する短縮型核蛋白及び６３１番目から６４３番目までに相当する短縮型核蛋白には反応したが、６３７番目から７３９番目までに相当する短縮型核蛋白と６３１番目から６４２番目までに相当する短縮型核蛋白には反応しなかった。これらの結果から、Ｒｅｓ２−６Ｃ８により認識されるエピトープはレストンエボラウイルス核蛋白のアミノ酸配列で６３６番目から６３９番目までの領域（４アミノ酸残基：６３６ＤＰＤＩ６３９）であり、Ｒｅｓ２−１Ｄ８が認識するエピトープは６３６番目から６４３番目までの領域（８アミノ酸残基：６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３）であることが示された。前記エピトープのアミノ酸配列と、１９８９年と１９９０年に単離・同定されたレストンエボラウイルス・ペンシルヴェニアが有する蛋白のアミノ酸配列、ザイールエボラウイルスが有する蛋白のアミノ酸配列、スーダンエボラウイルスが有する蛋白のアミノ酸配列とをアラインメントして比較した。アラインメントの結果を次の表２に示す。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
エピトープの８アミノ酸残基は１９８９年及び１９９０年に単離・同定されたレストンエボラウイルス・ペンシルヴェニアの有するアミノ酸配列の対応するアミノ酸残基と全く同一であった。レストンエボラウイルスのアミノ酸残基６３６ＤＰＤＩＧＱＳＫ６４３に対応するザイールエボラウイルス及びスーダンエボラウイルスの核蛋白のアミノ酸残基はそれぞれ、ＮＱＤＳＤＮＴＱ、ＥＡＬＰＩＮＳＫであった（表２）。
【００３９】
実施例５：  抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法
（１）臨床検体
１９９６年にフイリピンで起こったレストンエボラウイルスの流行の際、レストンエボラウイルスに感染したカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）から採集され凍結保存されている、肝臓の検体（番号２８８２，２８７７）、脾臓の検体（番号２８７７，２８８２，２８８５）、血清の検体（番号２８６６，２６１２）を本研究に用いた。これらの検体から、抗体３−３Ｄ（非特許文献１参照）を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法、免疫組織化学法、プライマーＲＥＳ−Ｎｆ２（５´−ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＧＡ  ＣＧＧ  ＴＧＴ−３´）及びＲＥＳ−Ｎｒ２（５´−ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＴＧＴ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＴＧＣ−３´）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、エボラウイルス核蛋白抗原あるいはエボラウイルスゲノムＲＮＡが検出された。レストンエボラウイルス非感染のカニクイザル由来の肝臓５検体及び血清７９検体をネガティブコントロールとして用いた。肝臓及び脾臓の組織を、ほぼ１０％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び５％のスキムミルクを加えた溶液（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴ）中で、ホモジェナイズした。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心したのち、上澄みを試験に用いた。血清の検体は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｍｉｌｋ−ＰＢＳＴで希釈して試験に用いた。
【００４０】
（２）測定方法
抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を以前に報告した方法（非特許文献１参照）に従って行った。簡潔に方法を述べると、まず、精製したモノクローナル抗体を、マイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｃｏ．）のウェルあたりに１００ｎｇずつ１００μｌのＰＢＳに溶かして塗布し、４℃で一晩おいた。３つのモノクローナル抗体、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、及び３−３Ｄをこの方法の捕捉抗体として用いた。尚、モノクローナル抗体３−３Ｄはザイールエボラウイルスの核蛋白に対する抗体として作製されたものであり、これを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を行うことによってザイールエボラウイルス、レストンエボラウイルス、（そしておそらくスーダンエボラウイルスも）検出できることが報告されている。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回プレートを洗浄し、５％のスキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔ（Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔ）を加えてウェルをブロックし、３７℃で保温した。Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔを除去し、１００μｌのサンプルをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ここで、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−Ｔをサンプルの希釈バッファーとして用いた。ＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄した後、プレートの各ウェルに塗布されたモノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、３−３Ｄそれぞれに対して、抗ＧＳＴ−ＥＢＯ−Ｒ−ΔＮＰウサギ血清を１：１０００の希釈比で添加し、さらに抗Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ｒＮＰウサギ血清を１：１０００の希釈比で添加した。プレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。それからＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）が結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗血清（カタログＮｏ．６２−６１２０、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を１：１０００の希釈比でウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄したのち、ＡＢＴＳ基質（ＡＢＴＳ錠剤とＡＢＴＳバッファー；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）をウェルに添加した。その後、プレートを室温で３０分間インキュベートし、４０５ｎｍの波長のＯＤ（光学密度）を測定し記録した。
レストンエボラウイルスに非感染のカニクイザル由来の血清７９検体について、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡを行ったところ、ＯＤの平均値＋標準偏差×３の値はそれぞれ０．１１，０．０７，０．１１であった。また、レストンエボラウイルスに非感染のカニクイザル由来の肝臓５検体について、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８、３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡを行ったところ、ＯＤの平均値＋標準偏差×３の値はそれぞれ０．１５，０．０８，０．１５であった。従って、このＯＤ測定のカットオフ値を０．２とした。
【００４１】
（３）ＥＬＩＳＡ法の感度の試験
本発明の抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法の感度を試験した。すなわち、図３に示されるように、レストンエボラウイルスとザイールエボラウイルスの組み換え核蛋白に対する、３つのモノクローナル抗体の反応性を抗原捕捉ＥＬＩＳＡにより測定した。図中、□はＲｅｓ２−６Ｃ８を用いた結果、△はＲｅｓ２−１Ｄ８を用いた結果、◆は３−３Ｄを用いた結果を示す。Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰ（Ａ）とＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰ（Ｂ）を抗原として用いた。４回の検定の平均値±標準偏差を示す。図３Ａに示されるように、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法を行った場合、Ｒｅｓ２−６Ｃ８はＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを希釈比１：１２８０００の濃度まで検出でき、Ｒｅｓ２−１Ｄ８はＨｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを希釈比１：６４０００の濃度まで検出できた。３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法では、Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｒ−ＮＰを希釈比１：３２０００の濃度まで検出できた。予想されたように、Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法では、Ｈｉｓ−ＥＢＯ−Ｚ−ＮＰを検出できなかった（図３Ｂ）。
【００４２】
（４）レストンエボラウイルスに感染したサル由来の検体におけるレストンエボラウイルス核蛋白の検出
レストンエボラウイルスに感染したカニクイザル由来の血清、肝臓、脾臓の検体に対し、Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８及び３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法によりレストンエボラウイルス核蛋白の検出を行った。この結果を次の表３に示す。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８は、血清、肝臓及び脾臓から、抗原であるレストンエボラウイルス核蛋白を検出した。Ｒｅｓ２−６Ｃ８はすべての検体から核蛋白を検出したが、Ｒｅｓ２−１Ｄ８は７検体のうち６検体から核蛋白を検出し、３−３Ｄは７検体のうち５検体から核蛋白を検出した。３−３Ｄを用いたＥＬＩＳＡ法よりも、Ｒｅｓ２−６Ｃ８又はＲｅｓ２−１Ｄ８を用いたＥＬＩＳＡ法の方が、核蛋白を検出できる適定終点が高かった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、レストンエボラウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、レストンエボラウイルスの核蛋白にのみ反応し、ザイールエボラウイルスの核蛋白やスーダンエボラウイルスの核蛋白には反応しないため、エボラウイルスの種の鑑別診断に用いることができる。また、本発明のモノクローナル抗体を作製する方法は、非感染性の組み換え蛋白質などを抗原とすることができるため、高度安全実験施設等を使用せずに作製することができる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、レストンエボラウイルスを特異的に検出することができ、かつ抗原希釈比１：６４０００〜１：１２８０００まで検出できる非常に感度の高い検出方法を提供する。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法と、エボラウイルスの各種サブタイプの核蛋白に交叉性のあるモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法とを併用することにより、レストンエボラウイルス感染症をザイールエボラウイルス感染症及びスーダンエボラウイルス感染症と区別して、迅速かつ簡便に鑑別診断することが可能となる。本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、ウイルス分離法のように高度安全実験施設を使用する必要がなく、また、ＲＴ−ＰＣＲ法などのように増幅産物の配列決定を行うといった面倒な操作が不要である。このように本発明のモノクローナル抗体を用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法は、迅速、簡便かつ高感度で、レストンエボラウイルスの鑑別診断が可能であるため、輸入動物の検疫などに極めて有用である。
【００４６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、レストンエボラウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルスの核蛋白を発現する培養細胞に対する、各種モノクローナル抗体（Ｒｅｓ２−６Ｃ８，Ｒｅｓ２−１Ｄ８，３−３Ｄ）の反応性を間接蛍光抗体法により測定した結果を示す。
【図２】図２は、モノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８及びＲｅｓ２−１Ｄ８の、レストンエボラウイルス短縮型組み換え核蛋白に対する反応性を、ＩｇＧ−ＥＬＩＳＡ法により検討した結果を示す。
【図３】図３は、モノクローナル抗体Ｒｅｓ２−６Ｃ８、Ｒｅｓ２−１Ｄ８及び３−３Ｄを用いた抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法により、エボラウイルスの組み換え核蛋白を検出した結果示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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