(57)【要約】【課題】移植による免疫拒絶反応の発生を抑制することができ、また、長期間の保管や大量生産に好適な生体組織補填体とその製造方法を提供すること。【解決手段】骨補填材１１を、培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。そして、−２０℃に設定された冷凍庫１４内に挿入して保管すると、骨芽細胞内の水分が凍結する。このため、細胞体積が膨張し、又は氷塊が生成することによって細胞膜等が損傷して、細胞が死滅する。一方、骨基質は低温状態に晒されても変質することなくその状態が維持される。所定の時間経過後、冷凍庫１４内から骨補填材１１を取り出して、室温にて徐々に解凍する。こうして、骨補填材１１内の骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる方法とした。【選択図】      図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織補填材に幹細胞を付着させる付着工程と、付着させた前記幹細胞を分化させることにより前記生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせる形成工程と、形成された組織細胞を死滅させる処理工程とを備えることを特徴とする生体組織補填体の製造方法。
【請求項２】
前記処理工程が、前記生体組織補填材を凍結させることを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項３】
前記処理工程が、前記生体組織補填材に超音波を発振することを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項４】
前記処理工程が、前記生体組織補填材に放射線を照射することを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項５】
前記処理工程が、前記生体組織補填材を界面活性剤に浸漬することを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項６】
前記処理工程が、前記生体組織補填材を減圧することを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項７】
前記処理工程が、前記生体組織補填材を酸溶液に浸漬することを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項８】
前記処理工程が、前記生体組織補填材を加熱することを特徴とする請求項１記載の生体組織補填体の製造方法。
【請求項９】
生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着させた前記幹細胞を分化させることにより前記生体組織補填材を足場として生体組織補填作用を生じさせた後に、形成された組織細胞を死滅させて製造されることを特徴とする生体組織補填体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織補填材から生体組織の欠損部を補填する生体組織補填体とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨等の生体組織の欠損部に、骨補填材等の生体組織補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨等の生体組織補填体を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系幹細胞を含む骨補填体を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
【非特許文献１】
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第三０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、患者以外の第三者から採取した幹細胞を使用して製造した生体組織補填体を移植すると、免疫拒絶反応を引き起こす不都合が考えられる。
免疫拒絶反応を抑えるには、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）の一致する細胞を使用する必要がある。しかし、ＨＬＡが合致する第三者の数が限られるため一致させるのが極めて困難である。
【０００６】
そのため、ＨＬＡが一致しない細胞を使用した場合、免疫拒絶反応を低減するために患者に免疫抑制剤を投与し続ける必要がある。しかしながら、継続的な投与は患者に身体的、経済的に大きな負担を強いることになる。
さらに、細胞が生きているので長期間保管することができず、そのため培養骨を大量に製造することができないことから、培養骨の供給をスムーズに行うことが困難であった。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みて成されたものであり、移植による免疫拒絶反応の発生を抑制することができ、また、長期間の保管や大量生産に好適な生体組織補填体とその製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を採用する。
本発明に係る生体組織補填体の製造方法は、生体組織補填材に幹細胞を付着させる付着工程と、付着させた前記幹細胞を分化させることにより前記生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせる形成工程と、形成された組織細胞を死滅させる処理工程とを備えることを特徴とする。
【０００９】
この生体組織補填体の製造方法によれば、ＨＬＡが一致しない幹細胞を用いて生体組織補填体を製造することが可能となる。このようにして製造された生体組織補填体は生きた組織細胞を有しないので、生体内に移植されても、組織細胞を起因とする免疫拒絶反応を引き起こすことがない。また、細胞基質による生体再生機能は保持されるので、移植された患部の周囲を活性化して再生することができる。
【００１０】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材を凍結する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材を凍結させることにより組織細胞内の水分が凍結して細胞の体積が膨張し、又は氷塊が生成されることによって細胞膜等を損傷させ、細胞を死滅させることができる。
【００１１】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材に超音波を発振する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材に超音波を発振することにより、組織細胞内の水分等に振動を発生して細胞内組織を破壊し、細胞を死滅させることができる。
【００１２】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材に放射線を照射する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材に放射線を照射することにより、放射線の有するエネルギーによって組織細胞の核等の細胞内組織を破壊して、免疫反応やアレルギー反応等の活性を有する細胞を死滅させることができる。
【００１３】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材を界面活性剤に浸漬する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材を界面活性剤に浸漬することにより、組織細胞の細胞膜等を破壊して細胞を死滅させることができる。
【００１４】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材を減圧する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材を減圧することにより、細胞内部への浸透圧が高まり細胞膜が破損するので、細胞を破壊して死滅させることができる。
【００１５】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材を酸溶液に浸漬する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材を酸溶液に浸漬することにより、酸溶液内が含有する非解離型分子が細胞内に取り込まれ、細胞内での代謝によって水素イオンが増加して細胞自身が変性するため、細胞を死滅させることができる。
【００１６】
本発明は、前記処理工程が、前記生体組織補填材を加熱する工程であることを特徴とする。
この生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材を加熱することにより、組織細胞を構成する生体成分を熱によって変性させて、細胞を死滅させることができる。
【００１７】
本発明の生体組織補填体は、生体組織補填材に幹細胞を付着させ、付着させた前記幹細胞を分化させることにより前記生体組織補填材を足場として生体組織補填作用を生じさせた後に、形成された組織細胞を死滅させて製造されることを特徴とする。
この生体組織補填体によれば、生体組織補填作用を有していても生きた組織細胞を有しないことにより、欠損部に移植しても免疫拒絶反応を起こさずに欠損部周囲の組織を活性化して組織を再生することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法について、図１から図３を参照して説明する。
本実施形態に係る生体組織補填体の製造方法は、図１に示すように、生体組織補填材に幹細胞を付着させる付着工程（Ｓ０１）と、付着させた幹細胞を分化させることにより生体組織補填材を足場として生体組織形成作用を生じさせる形成工程（Ｓ０２）と、形成された組織細胞を死滅させる処理工程（Ｓ０３）とを備えている。
ここでは、生体組織として骨を対象とする。
【００１９】
付着工程（Ｓ０１）は、骨補填体（生体組織補填体）１０の製造で使用する骨補填材（生体組織補填材）１１に幹細胞を付着させる工程である。
本工程では、図２に示すように、β−ＴＣＰの多孔体により構成されているブロック状の骨補填材１１を骨髄間葉系幹細胞（幹細胞）が培養された培養容器内に投入して、表面に幹細胞を付着させる。
【００２０】
形成工程（Ｓ０２）は、図２に示すように、付着させた幹細胞を分化させることにより、骨補填材１１を足場として骨形成作用（生体組織形成作用）を生じさせる工程である。
本工程では、まず、上記の培養容器内に新しい培地を供給・混合する。供給する培地には、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ：最小必須培地）、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）の他にデキサメタゾンやβグリセロフォスフェートのような分化誘導因子やビタミンＣのような栄養剤が混合されている。
この培養容器を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）及びＣＯ２濃度（例えば、０．５％）等の培養条件に維持し、所定の培養期間（例えば、６週間）内で培地を交換しながら培養する。
この培養によって、幹細胞から分化した骨芽細胞（組織細胞）と産生された骨基質（細胞基質）とを有し、骨形成作用が備えられた骨補填材１１が得られる。
【００２１】
処理工程（Ｓ０３）は、骨芽細胞を凍結して死滅させる工程である。
図３に示すように、本工程では、骨補填材１１を培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。そして、−２０℃に設定した冷凍庫１４内に挿入して所定の期間（例えば、１ヶ月間）保管して骨芽細胞内の水分を凍結させる。これにより、細胞の体積が膨張し、又は氷塊が生成することによって細胞膜等が損傷して細胞が死滅する。一方、骨芽細胞によって産生された骨基質は、低温状態に晒されても変質することなくその状態が維持される。
【００２２】
所定の時間経過後、冷凍庫１４内から骨補填材１１を取り出して、室温にて徐々に解凍する。こうして、骨補填材１１内の細胞成分が死滅した骨補填体１０が得られる。
この骨補填体１０は、骨補填材１１の気孔内に侵入した骨芽細胞の作用によって、骨補填材１１を構成するβ−ＴＣＰから置換されて産生した骨基質が、骨補填材１１の表面に付着している。この骨補填体１０を患者の欠損部に移植することによって、やがて新しい自家骨が形成される。
【００２３】
この骨補填体の製造方法によれば、患者以外の第三者から採取した骨髄間葉系幹細胞を使用して製造した骨補填体１０であっても、骨芽細胞が産生した骨基質を変性させずに骨補填材１１内の骨芽細胞のみを死滅させることができる。また、ＨＬＡの一致する細胞を使用しなくても、移植した場合に免疫拒絶反応や、癌化、感染症等の発生を抑制することができる。
さらに、必要に応じて解凍すればよいので、予め骨補填材１１を作りおきしておくことができる。
【００２４】
なお、上記実施形態において、解凍の際に電子レンジを用いてもよい。弱いながらも電子線の効果で殺菌効果を高めることができる。
また、凍結と解凍を複数回繰り返してもよい。細胞を死滅させる作用は凍結過程に発生するので、より確実に死滅させることができる。
骨基質は冷凍しても変性に対する耐性を有するので、冷凍温度は−７０℃程度まで低温にすることも可能である。さらに、凍結乾燥機を用いてもよい。乾燥した骨補填体を供給することができるので、より長期保存することが可能となる。
【００２５】
次に、本発明に係る第２の実施形態について、図４を参照して説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態において説明した構成要素には同一符号を付し、その説明は省略する。
第２の実施形態と上記第１の実施形態との異なる点は、第１の実施形態における処理工程（Ｓ０３）では、骨補填材１１を凍結処理するのに対して、第２の実施形態における処理工程（Ｓ１３）では、骨補填材１１を超音波処理するとした点である。以下、本実施形態に係る処理工程（Ｓ１３）について説明する。
【００２６】
まず、上記第１の実施形態と同様の付着工程（０１）及び形成工程（０２）によって、骨芽細胞と産生された骨基質とによって骨形成作用が備えられた骨補填材１１を製造する。
この骨補填材１１を、培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。このシャーレ１３内にランジュバン振動子１５を挿入して、超音波（例えば、４７ｋＨｚ）を間欠的に発振する（例えば、３０秒間あてて、３０秒間停止を５回行う）。このとき、超音波をあてたことによる発熱でタンパク質等が変性することを防ぐため、シャーレ１３を水冷してやることが望ましい。
【００２７】
これによって、骨芽細胞内の水分等に高周波の振動が発生して、細胞内組織が破壊されて細胞が死滅する。一方、骨補填材１１内の骨芽細胞によって産生された骨基質は、超音波に晒されても変質することなくその状態が維持される。
こうして骨補填材１１内の骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる。
この生体組織補填体の製造方法によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００２８】
次に、本発明に係る第３の実施形態について、図５を参照して説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態において説明した構成要素には同一符号を付し、その説明は省略する。
第３の実施形態と上記第２の実施形態との異なる点は、第２の実施形態における処理工程（Ｓ１３）では骨補填材１１を超音波処理するのに対して、第３の実施形態における処理工程（Ｓ２３）では骨補填材１１を放射線処理するとした点である。以下、本実施形態に係る処理工程（Ｓ２３）について説明する。
【００２９】
まず、上記第１の実施形態と同様の付着工程（Ｓ０１）及び形成工程（Ｓ０２）によって、骨芽細胞と産生された骨基質とによって骨形成作用が備えられた骨補填材１１を製造する。
この骨補填材１１を、培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。このシャーレ１３を電子線を照射する電子線照射装置１６内に挿入して、１５〜５０Ｇｙのγ線若しくは電子線である放射線１６ａを骨補填材１１に照射する。
すると、放射線が有するエネルギーによって骨芽細胞内の核等の細胞内組織が破壊される。一方、放射線がγ線若しくは電子線なので骨基質の変性は抑制される。こうして骨補填材１１内の骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる。
【００３０】
この生体組織補填体の製造方法によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
また、放射線の照射によって、殺菌効果を得ることができるので、本実施形態に係る方法によって製造された骨補填体１０を患者に移植しても、感染やＧＶＨ（Ｇｒａｆｔ  ｖｓ  ｈｏｓｔ）の問題等を低減することができる。
【００３１】
次に、本発明に係る第４の実施形態について、図６を参照して説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態において説明した構成要素には同一符号を付し、その説明は省略する。
第４の実施形態と上記第３の実施形態との異なる点は、第３の実施形態における処理工程（Ｓ２３）では骨補填材１１を放射線処理するのに対して、第４の実施形態における処理工程（Ｓ３３）では骨補填材１１を界面活性剤処理するとした点である。以下、本実施形態に係る処理工程について説明する。
【００３２】
まず、上記第１の実施形態と同様の付着工程（Ｓ０１）及び形成工程（Ｓ０２）によって、骨芽細胞と産生された骨基質とによって骨形成作用が備えられた骨補填材１１を製造する。
この骨補填材１１を、非イオン界面活性剤を含有する培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。このときの界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリエチレンアルキルエーテルのうち少なくとも１つ或いはこれらの混合物が好適である。具体的には、０．５％濃度のＴｗｅｅｎ８０（和光純薬工業製）含有ＰＢＳ（リン酸緩衝液）に１０分間浸漬する。すると、界面活性剤によって骨芽細胞の細胞膜等が破壊されて細胞が死滅する。一方、界面活性剤が非イオン系界面活性剤なので、骨基質の変性は抑制される。
【００３３】
浸漬した後、ＰＢＳ１２ａでリンスして界面活性成分を洗い流す。
こうして、骨補填材１１内の骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる。
なお、上記界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ８０の代わりにトリトンＸ−１００（和光純薬工業製）、又は、Ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬工業製）であってもよい。
この生体組織補填体の製造方法によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００３４】
次に、本発明に係る第５の実施形態について、図７を参照して説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態において説明した構成要素には同一符号を付し、その説明は省略する。
第５の実施形態と上記第４の実施形態との異なる点は、第４の実施形態における処理工程（Ｓ３３）では骨補填材１１を放射線処理するのに対して、第５の実施形態における処理工程（Ｓ４３）では骨補填材１１を減圧処理するとした点である。以下、本実施形態に係る処理工程（Ｓ４３）について説明する。
【００３５】
まず、上記第１の実施形態と同様の付着工程及び形成工程によって、骨芽細胞と産生された骨基質とによって骨形成作用が備えられた骨補填材１１を製造する。
この骨補填材１１を、培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。このシャーレ１３を真空乾燥装置１７内に挿入して、約１２０Ｐａ（１Ｔｏｒｒ）程度の圧力に減圧する。
このとき、減圧すると水の沸点が下がって沸騰及び蒸発が起きるので、骨基質に対しても変性等の影響が発生する可能性がある。そこで、上記圧力に対する飽和蒸気圧を考慮して、溶液１２内に沸騰等が発生しない低い温度条件下で減圧する。
【００３６】
すると、骨芽細胞内部への浸透圧が高まるので、細胞膜が破損してしまうことにより細胞が破壊される。一方、溶液１２の沸騰及び蒸発が発生しないので、骨基質の破損は発生しない。こうして、骨補填材１１内の骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる。
なお、予め溶液１２を純水等の低張状態のものとすることによって、より骨芽細胞内への浸透圧を高めることも可能である。
この生体組織補填体の製造方法によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００３７】
次に、本発明に係る第６の実施形態について、図８を参照して説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態において説明した構成要素には同一符号を付し、その説明は省略する。
第６の実施形態と上記第５の実施形態との異なる点は、第５の実施形態における処理工程（Ｓ４３）では骨補填材１１を減圧処理するのに対して、第６の実施形態における処理工程（Ｓ５３）では骨補填材１１を酸処理するとした点である。以下、本実施形態に係る処理工程（Ｓ５３）について説明する。
【００３８】
まず、上記第１の実施形態と同様の付着工程（０１）及び形成工程（Ｓ０２）によって、骨芽細胞と産生された骨基質とによって骨形成作用が備えられた骨補填材１１を製造する。
この骨補填材１１を、酸溶液、好ましくは有機酸水溶液が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。具体的には、ｐＨ４から６程度に調整された酢酸溶液１８に１０分間程度浸漬する。このとき、酢酸溶液１８内の非解離型分子が骨芽細胞の細胞膜を通過して細胞内に侵入するため、細胞の代謝によって水素イオンが増加して細胞自らが変性して死滅する。一方、骨気質には水素イオンによる変性作用が発生しない。
その後、炭酸カルシウム水溶液等のアルカリ溶液１９に浸漬して中和する。
こうして、骨補填材１１内の骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる。
この生体組織補填体の製造方法によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００３９】
次に、本発明に係る第７の実施形態について、図９を参照して説明する。なお、以下の説明において、上記実施形態において説明した構成要素には同一符号を付し、その説明は省略する。
第７の実施形態と上記第６の実施形態との異なる点は、第６の実施形態における処理工程（Ｓ５３）では骨補填材１１を酸溶液処理するのに対して、第７の実施形態における処理工程（Ｓ６３）では骨補填材１１を加熱処理するとした点である。以下、本実施形態に係る処理工程（Ｓ６３）について説明する。
【００４０】
まず、上記第１の実施形態と同様の付着工程（０１）及び形成工程（Ｓ０２）によって、骨芽細胞と産生された骨基質とによって骨形成作用が備えられた骨補填材１１を製造する。
この骨補填材１１を、培養液或いは緩衝液若しくは生理食塩水からなる溶液１２が充填されたシャーレ１３内に浸漬する。このシャーレ１３を恒温槽２０内に挿入して加熱することによってパスチャリゼーション（加熱）処理を行う。具体的には、１℃１分程度の緩やかな温度上昇で６３℃まで昇温した後、３０分間の保持を行う低温長時間殺菌法（ＬＴＬＴ）処理を実施する。温度が保持されている間に骨芽細胞が死滅する。一方、この温度では骨基質の変性は発生しない。
【００４１】
なお、７２℃まで昇温した後、１５秒間保持する高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ）でもよい。
また、温度制御可能な加熱機であれば、恒温槽２０でなくてもよい。
こうして、骨芽細胞のみが死滅した骨補填体１０が得られる。
この生体組織補填体の製造方法によっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００４２】
なお、骨補填体１０として、例えば、骨２１に挿入して使用する図１０に示すゲージ２２や図１１に示すスクリュー２３がある。これらを製造する際に、表面に窪みを付けて、その内部に幹細胞を播種して骨芽細胞を分化して骨基質を産生させた後のものに対して、上記各実施形態に係る処理を施すことも可能である。
同様に、図１２に示す後方経路腰椎椎体２４間の固定術等に用いる内固定具２５や、図１３に示す骨欠損部の骨２６間の架橋材或いは緩衝材であるコラーゲングラフト２７上に幹細胞を播種して骨芽細胞を分化して骨基質を産生後、上記各実施形態に係る処理を施すことも可能である。
【００４３】
また、本発明の技術範囲は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。
例えば、生体組織としては、骨以外の組織である皮膚、筋肉、及び血管等であってもよい。そして、幹細胞をこれらの組織に分化して形成した生体組織補填材に上記実施形態に係る各処理工程を施すことによって、組織細胞を死滅させた生体組織補填体を製造することも可能である。例えば、図１４に示すように、心室中隔欠損症の患者の心臓２８に対する人工弁（パッチ）２９として使用することも可能である。
【００４４】
【実施例】
上記第１の実施形態に係る生体組織補填体の製造方法によって、骨補填体としてｒａｔの培養骨を作製した。
まず、ＡＣＩｒａｔから骨髄液を抽出し、２週間培養を行うことによって不要成分を除去した骨髄間葉系幹細胞を含む培養細胞を生成した。
【００４５】
上記培養細胞をトリプシン処理後、β−ＴＣＰの多孔体から構成される骨補填材に播種する。培地にＭＥＭ、ＦＢＳの他にデキサメタゾンを混合して幹細胞の分化を開始しさらに６週間培養した。
こうして、骨髄間葉系幹細胞から分化した骨芽細胞を備える骨補填材を得た後、この骨補填材を−２０℃の冷凍庫内にて１ヶ月間保持して凍結処理した。
その後、これを冷凍庫から取り出して自然解凍することによって培養骨を得た。
【００４６】
この培養骨をＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔの背中に移植し、４週間後に骨形成機能をＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）で確認したところ、有為なＡＬＰ活性の上昇を検出したことから、骨形成を確認することができた。
このとき、移植されたＦｉｓｈｅｒ  ｒａｔには、免疫拒絶反応と見られるような症状は認められなかったことから、免疫抑制剤を要せず同種間移植を可能とすることが確認できた。
なお、有為なＡＬＰ活性の上昇を得るためには、培養期間は分化開始から６週間以上が望ましい。
【００４７】
【発明の効果】
以上説明した本発明においては以下の効果を奏する。
本発明の生体組織補填体の製造方法によれば、生体組織補填材の組織細胞のみを死滅させるので、第三者の幹細胞を移植しても免疫拒絶反応や、癌化、感染症等の発生を抑制するとともに、長期間の保管や大量生産が可能な生体組織補填体を提供することができる。
また、本発明の生体組織補填体によれば、必要なときに必要な量の生体組織補填体をタイムリーに提供することができ、移植した欠損部周囲の組織を活性化して、組織を再生することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る各実施形態における骨補填体の製造フローを示す図である。
【図２】本発明に係る各実施形態における付着工程と形成工程とを説明する図である。
【図３】本発明に係る第１の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図４】本発明に係る第２の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図５】本発明に係る第三の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図６】本発明に係る第４の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図７】本発明に係る第５の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図８】本発明に係る第６の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図９】本発明に係る第７の実施形態における骨補填体の処理工程を示す図である。
【図１０】本発明の第１の実施形態に係る実施例を示す図である。
【図１１】本発明の第１の実施形態に係る実施例を示す図である。
【図１２】本発明の第１の実施形態に係る実施例を示す図である。
【図１３】本発明の第１の実施形態に係る実施例を示す図である。
【図１４】本発明の第１の実施形態に係る実施例を示す図である。
【符号の説明】
１０  骨補填体（生体組織補填体）
１１  骨補填材（生体組織補填材）
１８  酢酸溶液（酸溶液）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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