(57)【要約】【課題】単一の操作で、単一の検量線用スタンダードコントロールを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法により代表的な各種血清型のヒトアデノウイルスを定量することができる、ヒトアデノウイルスの定量方法を提供すること。【解決手段】本発明の試料中のヒトアデノウイルスの定量方法では、特定の塩基配列を有する１４塩基ないし２０塩基の長さの核酸から成るフォワード側プライマーと、特定の塩基配列得を有する１４塩基ないし２２塩基の長さの核酸から成るリバース側プライマーとを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法によりヒトアデノウイルス遺伝子中の領域を増幅する。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも第７番目から第２０番目の連続する塩基配列を含む、１４塩基ないし２０塩基の長さの核酸から成るフォワード側プライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、少なくとも第６番目から第１９番目の連続する塩基配列を含む、１４塩基ないし２２塩基の長さの核酸から成るリバース側プライマーとを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法によりヒトアデノウイルス遺伝子中の領域を増幅することを含む、試料中のヒトアデノウイルスの定量方法。
【請求項２】
前記フォワード側プライマーが、配列表の配列番号２に示される１７塩基の長さの核酸から成る請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リバース側プライマーが、配列表の配列番号４に示される２０塩基の長さの核酸から成る請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
配列表の配列番号５、６及び７に示される各塩基配列のうち、それぞれ少なくとも第４番目から第２２番目の連続する塩基配列を含む、それぞれ１９塩基ないし２５塩基の長さの核酸を標識したプローブ混合物を用いて増幅産物の測定を行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブ混合物を構成する核酸が、配列表の配列番号５、６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するそれぞれ２５塩基の長さの核酸である請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載された、請求項１又は２記載の方法に用いられるヒトアデノウイルス定量用フォワード側プライマー。
【請求項７】
請求項１又は３に記載された、請求項１又は３記載の方法に用いられるヒトアデノウイルス定量用リバース側プライマー。
【請求項８】
請求項４又は５に記載された、請求項４又は５記載の方法に用いられるヒトアデノウイルス定量用混合プローブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトアデノウイルスの定量方法並びにそのためのプライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトアデノウイルスは、５１の血清型が知られており（文献：Ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９；  ３７：  ３９４０−３９４５，    Ｎｏｄａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００２；  ４０：  １４０−１４５）、上気道、下気道の呼吸器疾患、胃腸炎などの消化器疾患、流行性角結膜炎などの眼疾患、出血性膀胱炎などの泌尿器疾患から、さまざまな臨床症状を引き起こす。特に移植医療の進歩による易感染者の増加に伴い、移植後の出血性膀胱炎は移植後感染症の一つとして重要な感染症となっている。従来ヒトアデノウイルスの検出には、ウイルス分離培養、抗原検出、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が用いられている。しかし、これらの検出法は定性法でありウイルス量、ウイルス抗原量あるいはウイルスゲノム量を定量することはできない。ウイルスゲノムの定量法は、治療効果のモニター、予後の予測、疾患との関連などをもたらすことが期待される。
【０００３】
現在、従来の定量ＰＣＲには無かった、高再現性、高感度、５桁以上のダイナミックレンジが可能である、リアルタイム検出ＰＣＲ法が開発され、ウイルスを含めたさまざまな病原体のゲノムや、遺伝子発現の量的な詳細な解析が可能となり臨床応用され始めている。しかし、多くの血清型のウイルスゲノムをリアルタイム検出ＰＣＲ法で定量するには、個々の血清型の塩基配列が微妙に異なるため、ＰＣＲ増幅曲線が異なることが考えられる。ＰＣＲ増幅曲線が異なる場合、血清型別それぞれに検量線用スタンダードコントロールを準備する必要とともに、リアルタイム検出ＰＣＲ実施まえに血清型が判明している必要があり、煩雑となってしまう。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−９５５８３号公報
【特許文献２】特開２００１−１６１３７１号公報
【特許文献３】特開平７−３２７７００号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、単一の操作で、単一の検量線用スタンダードコントロールを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法により代表的な各種血清型のヒトアデノウイルスを定量することができる、ヒトアデノウイルスの定量方法並びにそのためのプライマー及びプローブを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、特定の塩基配列を有するフォワード側プライマーと、特定の塩基配列を有するリバース側プライマーの組合せを用いることにより、ＰＣＲにおける増幅曲線の傾きが、ウイルスの血清型に関係なく一定にすることができることを見出し、従って、これらのプライマーの組合せを用いてリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、単一の操作で、単一の検量線用スタンダードコントロールを用いてヒトアデノウイルスの定量が可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも第７番目から第２０番目の連続する塩基配列を含む、１４塩基ないし２０塩基の長さの核酸から成るフォワード側プライマーと、配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、少なくとも第６番目から第１９番目の連続する塩基配列を含む、１４塩基ないし２２塩基の長さの核酸から成るリバース側プライマーとを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法によりヒトアデノウイルス遺伝子中の領域を増幅することを含む、試料中のヒトアデノウイルスの定量方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法において、プローブとして、配列表の配列番号５、６及び７に示される各塩基配列のうち、それぞれ少なくとも第４番目から第２２番目の連続する塩基配列を含む、それぞれ１９塩基ないし２５塩基の長さの核酸を標識したプローブ混合物を用いる方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の方法に用いられるヒトアデノウイルス定量用フォワード側プライマー、ヒトアデノウイルス定量用リバース側プライマー及びヒトアデノウイルス定量用プローブを提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記の通り、ヒトアデノウイルスには５１の血清型が知られているが、これらのうち、ヒトに疾患を引き起こすアデノウイルスとして重要なものは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１９、２１及び３７型であり、これらを単一操作で定量することが望まれる。本願発明者は、これまでにヒトアデノウイルスのＰＣＲによる検出方法とし報告の多いヘキソン遺伝子の下流域に着目した。上記重要な血清型のうち、血清型２、３、４、５、６、７及び２１型については、ヘキソン遺伝子下流域の塩基配列が決定されており、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている。これらのＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は次の通りである。血清型２はＪ０１９１７、血清型３はＸ７６５４９、血清型４はＸ８４６４６、血清型５はＪ０１９６６、血清型６はＹ１７２４５、血清型７はＡＦ０６５０６５、血清型２１はＡＹ００８２７９。しかしながら、血清型１、８、１１、１９及び３７型については、少なくとも目的の領域の塩基配列は未知であるので、先ず、これらの血清型のヘキソン遺伝子下流域の塩基配列を決定する必要があった。これは、下記参考例に具体的に記載する方法により決定に成功した。決定した各血清型の上記領域の塩基配列を図１に並べて示す。なお、図１中、「ＡＤ」の後の数字が血清型、その後ろの括弧内の文字は亜群、塩基の位置（２１５９１等）は、ヒトアデノウイルス２型（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｊ０１９１７）における塩基の位置を示す。
【０００９】
本願発明者は、これらの塩基配列を基に鋭意研究の結果、上記の通り、特定の塩基配列を有する核酸をフォワード側プライマー及びリバース側プライマーとして用いることにより、単一のＰＣＲ操作で、増幅曲線の傾きを同じにすることができることを見出した。フォワード側プライマーとしては、配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、少なくとも第７番目から第２０番目の連続する塩基配列を含む、１４塩基ないし２０塩基の長さの核酸が用いられる。これらのうち、特に好ましいものは配列番号２で示される塩基配列を有する１７塩基の長さの核酸である。配列番号２で示される塩基配列を有する１７塩基の長さの核酸がハイブリダイズする領域は、図１中、塩基が太字で示されている２つの領域のうちの上流側の領域であり、すなわち、２１６１３ｎｔ〜２１６２９ｎｔの領域である。なお、配列番号１及び２には、「ｙ」、すなわちｔ又はｃが含まれる。本発明では、ｙがｔであるもの及びｃであるものの両者が同時に用いられ、従って、本発明で用いられるフォワード側プライマーは２種類のプライマーの混合プライマーである。
【００１０】
リバース側プライマーとしては、配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、少なくとも第６番目から第１９番目の連続する塩基配列を含む、１４塩基ないし２２塩基の長さの核酸が用いられる。これらのうち、特に好ましいものは配列番号４で示される塩基配列を有する２０塩基の長さの核酸である。配列番号４で示される塩基配列を有する２０塩基の長さの核酸がハイブリダイズする領域は、図１中、塩基が太字で示されている２つの領域のうちの下流側の領域であり、すなわち、２１６８９ｎｔ〜２１７０８ｎｔの領域である。なお、配列番号３及び４には、「ｙ」、すなわちｔ又はｃが含まれる。本発明では、ｙがｔであるもの及びｃであるものの両者が同時に用いられ、従って、本発明で用いられるリバース側プライマーは２種類のプライマーの混合プライマーである。
【００１１】
周知のとおり、リアルタイム検出ＰＣＲには、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素とで標識されたプローブ（商品名ＴａｑＭａｎプローブ）が用いられる。レポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましく用いられている。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は、通常、プローブ核酸の５’末端にレポーター蛍光色素が、３’末端にクエンチャー蛍光色素が結合される。本発明の方法では、好ましくは、プローブとして、配列表の配列番号５、６及び７に示される各塩基配列のうち、それぞれ少なくとも第４番目から第２２番目の連続する塩基配列を含む、それぞれ１９塩基ないし２５塩基の長さの核酸を標識したプローブ混合物が用いられる。好ましくは、プローブ混合物を構成する核酸は、配列表の配列番号５、６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するそれぞれ２５塩基の長さの核酸を標識したプローブ混合物が用いられる。なお、配列表の配列番号５、６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するそれぞれ２５塩基の長さの核酸を標識した各プローブがハイブリダイズする領域は、図１中、下線を引いた領域である。
【００１２】
本発明の最も好ましい態様では、フォワード側プライマーとして、配列番号２に示される配列を有する１７塩基の長さの核酸を用い、リバース側プライマーとして、配列番号４に示される２０塩基の長さの核酸を用い、プローブとして、配列表の配列番号５、６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するそれぞれ２５塩基の長さの核酸の５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合した混合プローブを用いる。
【００１３】
リアルタイム検出ＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、市販のキットを用いて容易に行うことができる。キットには、必要な酵素類、緩衝液等も含まれている。また、上記蛍光色素も市販されている。反応条件も、キットの添付文書に従って適宜設定することができ、下記実施例にも具体的な反応条件の好ましい１例が記載されている。
【００１４】
ヒトアデノウイルスを含むかもしれない試料としては、何ら限定されるものではなく、全血、血清、血漿、髄液、尿、唾液等の体液や、咽頭、結膜、鼻腔内粘膜等の各種粘膜の拭い液並びにこれらの希釈物等を例示することができる。
【００１５】
これらの試料からのヒトアデノウイルスＤＮＡの抽出も、市販のキットを用いた常法により容易に行うことができる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１７】
１．  血清型１、８、１１、１９及び３７型のヘキソン遺伝子下流域の塩基配列の決定
血清型１、８、１１、１９及び３７型のヘキソン遺伝子下流域の塩基配列は、具体的に次のようにして決定した。血清型１、８、１１、１９、及び３７型のプロトタイプウイルスからＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いＤＮＡ抽出を行い、プライマーとして  ５’−ｔａｃｇｃｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃａ−３’  （フォワードプライマー）、５’−ｇｃｇｔｔｇｃｃｇｇｃｃｇａｇａａｇ  （リバースプライマー）を用い、定法に従いＰＣＲを行い、それぞれのプロトタイプのＤＮＡを増幅した。増幅産物の精製とバッファー交換は、増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、特異バンドをアガロースゲルより切り出し、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い回収し行なった。塩基配列決定プライマーとしては、上記のフォワードプライマーとリバースプライマーを用いた。精製増幅産物の一部を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、プロトコールに従い反応を行なった。反応物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ａｐｐｌｉｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により分析した。
その結果、上記した通り図１に示す塩基配列が決定された。
【００１８】
２．  ＤＮＡの抽出
（１）  全血、血清、髄液
ＤＮＡ抽出は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いた。検体２００μＬとプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）  ２０μＬを良く混ぜ、そこへ２００μＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＬを添加し、１５秒間良くミキシングした。５６℃、１時間インキュベーションし、エタノール２００μＬ添加後、１５秒間ミキシング後全量をＱＩＡｍｐ  スピンカラムに移し、６０００×ｇで１分間遠心した。Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＷ１、５００μＬにて洗浄し、さらにＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２、５００μＬにて洗浄を繰り返した。洗浄後のＱＩＡｍｐ  スピンカラムに１００μＬの滅菌精製水を加え、室温、１０分間インキュベーションし、ＤＮＡを溶出後、６０００×ｇで１分間遠心しＤＮＡ液を回収した。
【００１９】
（２）  尿
ＤＮＡ抽出は、尿検体からのＤＮＡ抽出用として推奨されているＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いた。Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＶＬ  ５６０μＬに検体１４０μＬを加え良くミキシングし、１０分間インキュベートする。エタノール５６０μＬ添加後、１５秒間ミキシングし、６３０μＬ全量をＱＩＡｍｐ  スピンカラムに移し、６０００×ｇで１分間遠心した。さらに同様の操作を繰り返した。つぎにＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１、５００μＬにて洗浄し、さらにＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２、５００μＬにて洗浄を繰り返した。洗浄後のＱＩＡｍｐ  スピンカラムに６０μＬの滅菌精製水を加え、室温、１０分間インキュベーションし、ＤＮＡを溶出後、６０００×ｇで１分間遠心しＤＮＡ液を回収した。
【００２０】
（３）  プライマー及びプローブ
フォワード側プライマーとして、配列番号２に示される配列を有する１７塩基の長さの核酸（ＡＤ１５）を用い、リバース側プライマーとして、配列番号４に示される２０塩基の長さの核酸（ＡＤ８）を用い、プローブとして、配列表の配列番号５、６及び７に示される塩基配列をそれぞれ有するそれぞれ２５塩基の長さの核酸の５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合した混合プローブを用いた。
【００２１】
（４）  リアルタイムＰＣＲ
反応試薬組成のうち１０×ＴａｑＭａｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄとアニーリング、伸長反応温度以外の反応条件、サイクル数はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＴａｎａｋａらの方法（文献：Ｔａｎａｋａ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．  ２０００；  ６０：  ４５５−４６２）に従った。１反応あたり以下の試薬を混合し反応に用いた。１０×ＴａｑＭａｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ；５μＬ（終濃度×１）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１０μＬ（終濃度５ｍＭ）、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ；  ４μＬ（終濃度０．２ｍＭ）、５Ｕ／μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＴａｑＭａｎ  １０００  ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ  Ｐａｃｋ；  Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；０．２５μＬ（終濃度１．２５Ｕ）、各５０μＭ  プライマー（ＡＤ１５、ＡＤ８）；０．２μＬ（終濃度２００ｎＭ）、１０μＭ  ＴａｑＭａｎ  プローブ；０．２５μＬ（終濃度５０ｎＭ）、を滅菌精製水にて４０μＬとした。検体ＤＮＡ  １０μＬを反応液に加え、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを活性化するため、９５℃、１０分間プレヒーティングを行った後、９５℃、１５秒、５８℃、１分の温度サイクルを５０サイクル繰り返した。この時、定量換算用スタンダードの１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５コピー／μＬを同時に測定を行った。
【００２２】
（５）  データ解析
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアプリケーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、既知量のスタンダードコントロールより検量線を作成し、検体ＤＮＡのコピー数を算出した。
【００２３】
（６）  各血清型での定量性
複数の血清型を同一方法で定量を行なうには、増幅曲線が同一である必要がある。血清型１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１９、２１、３７型のＤＮＡを用い同様な増幅曲線を描くか検討を行なった。
【００２４】
検討の結果、図２に示すようにほぼ同一の増幅曲線が認められ、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１９、２１、３７型の定量が可能であった。なお、図２において、横軸はＰＣＲのサイクル数、縦軸は、蛍光強度の変化の対数である。また、ヒトアデノウイルス３型（Ｂ群）、４型（Ｅ群）、５型（Ｃ群）、８型（Ｄ群）、１１型（Ｂ群）それぞれの既知プラスミドＤＮＡを用い測定を行った結果、既知量と測定値は一致していた。なお、図２において、増幅曲線が急に立ち上がるサイクル数は異なっているが、これは試料中に含まれるヒトアデノウイルス量の違いを反映しているものであり、各増幅曲線の傾きが同じであるから増幅曲線は同じである。
【００２５】
【発明の効果】
単一の操作で、単一の検量線用スタンダードコントロールを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法により代表的な各種血清型のヒトアデノウイルスを定量することができる、ヒトアデノウイルスの定量方法が提供された。本発明の方法によれば、単一の操作で、単一の検量線用スタンダードコントロールを用いてリアルタイム検出ＰＣＲ法により、臨床的に重要な血清型１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１９、２１、３７型のヒトアデノウイルスを定量することができ、簡便にアデノウイルスの臨床検査を行うことができる。
【００２６】
【配列表】
2004305092.tif 000003
【００２７】
2004305092.tif 000004
【００２８】
2004305092.tif 000005
【００２９】
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【００３０】
2004305092.tif 000007
【００３１】
2004305092.tif 000008
【００３２】
2004305092.tif 000009
【００３３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】血清型１、２、３、４、５、６、７、８、１１、１９、２１、３７型のヒトアデノウイルスのヘキソン遺伝子下流の領域の塩基配列を並べて示す図である。
【図２】実施例で行った本発明の方法により増幅されたヒトアデノウイルスの増幅曲線を示す図である。
【図１】
2004305092.tif 000011
【図２】
2004305092.tif 000012