(57)【要約】【課題】高温での熱処理の後にも高い活性を保持できるＤＮＡリガーゼを提供する。【解決手段】本発明者は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株から１００℃で１時間の熱処理によっても実質的に活性が低下しない耐熱性ＤＮＡリガーゼを単離し、そのアミノ酸配列とＤＮＡ配列を決定した。このＤＮＡリガーゼは１１０℃で１０分間の熱処理によっても８５％以上の活性が残存する。この酵素は、コファクターとしてＡＴＰ及びＡＤＰの双方を利用することができる。また、２価カチオンを要求するが、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋及びＣｏ２＋のいずれも利用することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００℃で１時間の熱処理により実質的に活性が低下しない耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質を備える請求項１に記載の耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
（ａ）    至適温度が７０℃以上である。
（ｂ）    コファクターとしてＡＴＰ又はＡＤＰを利用することができる。
（ｃ）    コファクターとしてＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋又はＣｏ２＋を利用できる。
【請求項３】
Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ由来の酵素である請求項１又は２に記載の耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【請求項４】
以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）    配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）    配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で１時間の熱処理により実質的にＤＮＡリガーゼ活性が低下しないポリペプチド。
【請求項５】
以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で１時間の熱処理により実質的に活性が低下しない耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするポリヌクレオチド。
（５）    請求項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体から耐熱性ＤＮＡリガーゼを回収する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡの組み換えやＤＮＡ増幅等の遺伝子工学の分野で使用される耐熱性ＤＮＡリガーゼなどに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ  リガーゼはＤＮＡの３’−ＯＨ基と５’−リン酸基との間にホスホジエステル結合を形成することにより、ＤＮＡ鎖同士を連結する活性を有する酵素である。この酵素は遺伝子組換え技術において不可欠な酵素である。遺伝子組み替えには、通常、細菌やファージ由来の易熱性のＤＮＡリガーゼが使用されている。
【０００３】
また、ＤＮＡリガーゼはリガーゼ連結反応（ＬＣＲ）という特異的ヌクレオチド増幅反応にも使用されている（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  Ｕ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７−１０８０；  Ｂａｒａｎｙ，Ｆ．（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １：５−１６；  Ｍａｒｓｈ  Ｅ．，（１９９２）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ５：７３−７６）。ＬＣＲは、耐熱性のＤＮＡリガーゼを用いて温度サイクリング反応を行うことにより既知のヌクレオチド配列を増幅及び検出する方法である。詳述すれば、ＬＣＲは、目的とするヌクレオチド配列に相補的な二つの隣接するオリゴヌクレオチド、その各々に相補的なオリゴヌクレオチド及び耐熱性ＤＮＡリガーゼを混合し、高温における変性及び低温におけるアニーリング及び連結反応からなる温度サイクルを繰り返すことにより実施される。ＬＣＲでは、耐熱性ＤＮＡリガーゼとしてＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのＰｆｕ  ＤＮＡリガーゼ等が用いられてる。
【０００４】
耐熱性ＤＮＡリガーゼとしては、その他、超好熱性始原菌のＫＯＤ−１株から単離されたＤＮＡリガーゼであって、至適温度が８０℃であり、１００℃の温度下でも活性を示す耐熱性ＤＮＡリガーゼが知られている（特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、試料の加熱及び冷却を繰り返すＬＣＲに用いるＤＮＡリガーゼは、高温下で活性を有するのみならず、高温で長時間熱処理した後にも当初と同様の活性を保持することが望ましい。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１２−３０８４９４号（段落０００７、００５６など）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高温で熱処理した後にも高い活性を保持するＤＮＡリガーゼを提供することを主目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者は研究を重ね、超好熱性始原菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ    ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株からＤＮＡリガーゼ遺伝子をクローニングし、そのＤＮＡリガーゼが１００℃で１時間の熱処理によっても実質的に活性が低下しない、極めて優れた耐熱性を有するＤＮＡリガーゼであることを見出した。
【０００９】
本発明は前記知見に基づき完成されたものであり、以下の耐熱性ＤＮＡリガーゼ等を提供する。
【００１０】
項１．  １００℃で１時間の熱処理により実質的に活性が低下しない耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【００１１】
項２．  以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の性質を備える項１に記載の耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
（ａ）    至適温度が７０℃以上である。
（ｂ）    コファクターとしてＡＴＰ又はＡＤＰを利用することができる。
（ｃ）    コファクターとしてＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋又はＣｏ２＋を利用できる。
【００１２】
項３．  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ由来の酵素である項１又は２に記載の耐熱性ＤＮＡリガーゼ。
【００１３】
項４．  以下の（１）又は（２）のポリペプチド。
（１）    配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）    配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で１時間の熱処理により実質的にＤＮＡリガーゼ活性が低下しないポリペプチド。
【００１４】
項５．  以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチド。
（３）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で１時間の熱処理により実質的に活性が低下しない耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするポリヌクレオチド。
（５）    項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
項６．  項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００１６】
項７．  項６に記載のベクターを保持する形質転換体。
【００１７】
項８．  項７に記載の形質転換体を培養し、その形質転換体から耐熱性ＤＮＡリガーゼを回収する方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ＤＮＡリガーゼ
耐熱性
本発明のＤＮＡリガーゼは非常に耐熱性に優れる酵素であり、１００℃で１時間の熱処理によっても実質的にＤＮＡリガーゼ活性が低下しない酵素である。本発明において、「実質的に活性が低下しないこと」には、例えば、熱処理前の活性の９０％以上の活性が残存する場合が含まれる。
【００１９】
本発明のＤＮＡリガーゼは、１００℃で２時間熱処理した後にも実質的に活性が低下しない酵素であることが好ましく、１００℃で１２時間熱処理した後にも実質的に活性が低下しない酵素であることがより好ましい。また、１１０℃で１０分間の熱処理の後にも８０％以上の活性が残存する酵素であることがさらにより好ましい。
【００２０】
また、酵素反応を行う緩衝液の種類によっても異なるが、本発明のＤＮＡリガーゼは、酵素反応の初速度を測定した場合の至適温度が７０℃以上の酵素であることが好ましい。
【００２１】
本発明において、ＤＮＡリガーゼ活性は、実施例の項目に記載のニックトランスレーションアッセイ又はコヘジティブエンドライゲーションアッセイにより測定した値である。
常温での安定性
本発明のＤＮＡリガーゼは、常温下での安定性にも勿論優れる。本発明のＤＮＡリガーゼは、常温（２５℃）で１０日間以上放置しても実質的に活性が低下しないことが好ましい。
有機溶媒耐性
本発明のＤＮＡリガーゼは、有機溶媒に耐性である。例えば、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、酢酸エチル等の有機溶媒を２０容量％以上含む緩衝液中で活性を示す酵素であることが好ましい。本発明のＤＮＡリガーゼが酵素活性を示し得る、緩衝液中の有機溶媒の容量比率の上限は、酵素蛋白が沈殿しない範囲である。
コファクター
本発明の耐熱性ＤＮＡリガーゼは、通常コファクターとしてＡＴＰまたはＮＡＤを要求する。本発明のＤＮＡリガーゼは、コファクターとしてＡＴＰ及びＡＤＰのいずれも用いることができるものであることが好ましい。
【００２２】
また本発明のＤＮＡリガーゼは、２価カチオンを要求するが、２価カチオンとしてＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋又はＣｏ２＋のいずれも利用できることが好ましい。
生産細菌
本発明の耐熱性ＤＮＡリガーゼの由来は特に限定されないが、好熱性細菌、例えばＡｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属又はＴｈｅｒｍｕｓ属等の細菌により生産されたものが挙げられる。特に、超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘにより生産されたものが好ましい。
アミノ酸配列
また、本発明の耐熱性ＤＮＡリガーゼとしては、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
（１）    配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（２）    配列番号２において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１００℃で１時間の熱処理により実質的にＤＮＡリガーゼ活性が低下しないポリペプチド。
【００２３】
（２）のポリペプチドは、  配列番号２のアミノ酸配列において、１￣２００個程度、特に１￣１００個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましいが、ＤＮＡリガーゼ間で保存されていない領域であれば、配列番号２のアミノ酸配列を、全アミノ酸数の３０％以下の範囲で改変したものであってよい。
【００２４】
具体的には、例えばアミノ酸の置換の場合には、タンパク質の構造保持の観点から、極性、電荷、可溶性、親水性／疎水性等の点で、置換前のアミノ酸と類似した性質を有するアミノ酸に置換することができる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンは非極性アミノ酸に分類され；セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンは極性アミノ酸に分類され；フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンは芳香族側鎖を有するアミノ酸に分類され；リジン、アルギニン、ヒスチジンは塩基性アミノ酸に分類され；アスパラギン酸、グルタミン酸は酸性アミノ酸に分類される。従って、同じ群のアミノ酸から選択して置換することができる。
【００２５】
また、アミノ酸の置換により側鎖が小さくなる場合は、ポリペプチドの３次元構造が変化し難く、それにより活性が変化し難いため、配列番号２のアミノ酸配列についてこのような置換を行うことにより  （２）のポリペプチドを得ることができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡリガーゼは、例えば、この酵素を生産する細菌を培養し、菌体破砕液から回収又はさらに精製することにより得られる。また、配列番号２のアミノ酸配列を基に化学的に合成することによっても得ることができる。また、後述する本発明方法によっても得られる。
（２）ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、以下の（３）、（４）又は（５）のポリヌクレオチドである。
（３）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（４）    配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、１００℃で１時間の熱処理により実質的に活性が低下しない耐熱性ＤＮＡリガーゼをコードするポリヌクレオチド。
（５）上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドには、特に言及しない限り、その塩基配列を有するポリヌクレオチドの他、それに相補的なポリヌクレオチドが含まれる。また、本発明のポリヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮＡの双方が含まれる。また、本発明の目的を達成できる範囲であれば修飾されたＤＮＡ（例えばホスホロチオエートＤＮＡ、Ｈ−ホスホネートＤＮＡなど）及び修飾されたＲＮＡも含まれる。さらに、１本鎖ポリヌクレオチド、２本鎖ポリヌクレオチドの双方が含まれ、２本鎖ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドも含まれる。
【００２８】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のハイブリダイゼーション溶液中であれば６８℃で行う条件が挙げられ、５０％フォルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液中であれば４２℃で行う条件が挙げられる。詳しくは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版第２巻に記載のサザンハイブリダイゼーションに用いられる条件が挙げられる。
【００２９】
（４）のＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列において１〜２００個程度、特に１〜１００個程度のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。しかし、ＤＮＡリガーゼ間で保存されていない領域であれば、配列番号２のアミノ酸配列を全アミノ酸数の３０％以下の範囲で改変したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってよい。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばアエロパイラム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、スフォロバス（Ｓｕｆｏｌｏｂｕｓ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属、サーモプロテウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、マスティゴクラダス（Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属等の好熱性細菌の染色体ＤＮＡのライブラリーから、配列番号１に基づき設計したプローブを用いてハイブリダイゼーションにより単離することができる。また、配列番号１の塩基配列を基に設計したプライマーを用いて、例えば上記好熱性細菌の染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲ法により増幅することもできる。また、化学合成によっても取得できる。
【００３１】
また、（４）の変異したポリヌクレオチドは、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発法などの公知の方法で作成することができる。遺伝子工学的手法としては、（３）のＤＮＡリガーゼ遺伝子に対して、エキソヌクレアーゼを用いたヌクレオチド欠失導入、リンカー導入、位置指定突然変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法による塩基配列の改変などを行う方法が挙げられる。
（３）ベクター
本発明のベクターは、上記説明した本発明のポリヌクレオチド（ここではＤＮＡ）を含有する組換えベクターである。本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターは公知のものを広く利用でき、細菌用ベクターの他、酵母用ベクター、動物細胞用ベクター等も利用できる。酵素の生産効率の点から、通常は細菌用ベクターを用いればよい。公知のベクターとしては、大腸菌ベクターのｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２３３−２等、バチルス属細菌ベクターのｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＨＴ１５、ｐＢＤ１６等、酵母用ベクターＹｉｐ５、Ｙｒｐ１７、Ｙｅｐ２４等、動物細胞用ベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｍ１３ｍｐ１８等を例示できる。
（４）形質転換体
また、本発明の形質転換体は、上記説明した本発明の組換えベクターを保持する形質転換体である。宿主としては、ベクターに応じて細菌、酵母、動物細胞等を利用できる。宿主としては、バチルスズブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ）、酵母、カビ等が、大量に目的タンパク質を生産できる点で好ましい。形質転換は、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等の公知の方法で行うことができる。これらの公知の方法の中から、宿主の種類に応じて選択すればよい。
（５）ＤＮＡリガーゼの製造方法
本発明のＤＮＡリガーゼの製造方法は、本発明の形質転換体を培養し、この形質転換体からＤＮＡリガーゼを回収する方法である。
【００３２】
培養条件は、特に限定されず、宿主の生育が可能な培地、温度等の条件下で培養すればよい。培養時間は、その他の培養条件により異なるが、通常１２〜２４時間程度とすればよい。温度シフト型やＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）誘導型等の誘導型の発現ベクターを用いる場合は、誘導時間は２〜８時間程度とすればよい。
【００３３】
目的とするＤＮＡリガーゼが宿主細胞内又はペリプラズム内に生産される場合は、超音波処理や界面活性剤処理などの公知の細胞破壊方法により細胞を破壊してＤＮＡリガーゼを回収すればよい。宿主がＤＮＡリガーゼを分泌する場合は、培地中に分泌されたＤＮＡリガーゼを回収すればよい。
【００３４】
回収されたＤＮＡリガーゼをさらに精製する場合は、遠心分離、塩析、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、逆相高速液体クロマトグラフィー法等の公知の蛋白精製方法を組み合わせて精製することができる。
【００３５】
本発明の耐熱性ＤＮＡリガーゼを精製する場合、精製ステップの一つとして、熱処理を行うことが好ましい。熱処理は、宿主の生育限界温度より通常１０℃以上、特に１５℃以上高い温度で、かつ、当該熱処理により本発明のＤＮＡリガーゼの活性が６０〜８０％程度残存する温度である８０〜９５℃程度の温度で、１０〜６０分間程度行うことが効率的である。これにより、目的とするＤＮＡリガーゼを殆ど失活させることなく、宿主が生産する夾雑タンパク質を変性により失活させることができる。この加熱処理後に、被精製酵素溶液を、特に限定されないが、例えば１５０００ｒｐｍ程度で２０分間程度遠心することにより変性した夾雑タンパク質を沈殿させることができる。この加熱処理工程は、精製のいずれの段階で行ってもよい。これにより耐熱性ＤＮＡリガーゼの精製度を飛躍的に向上させることができる。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
実施例１（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株のＤＮＡリガーゼ遺伝子のクローニング）
ｉ）染色体ＤＮＡの調製
バクトマリン培地（Ｄｉｆｃｏ）３７．４ｇ  とＮａ２Ｓ２Ｏ３−５Ｈ２Ｏ  １．０ｇ  を水１リットルに溶かした後、ｐＨを７．０〜７．２に調整することにより培地を調製し、加圧加熱滅菌した。超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株（理化学研究所においてＪＣＭ９８２０として登録）をこの培地に接種し、９０℃で３日間振盪培養した。培養液を５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより集菌した。
【００３７】
菌体を１０ｍＭ  トリス（ｐＨ  ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ  溶液で２回洗浄後インサートアガロース（ＩｎＣｅｒｔ  Ａｇａｒｏｓｅ、ＦＭＣ社製）ブロック中に封入した。このブロックを１％Ｎ−ラウロイルザルコシン−１ｍｇ／ｍｌ  プロテアーゼＫ溶液中で処理することにより、染色体ＤＮＡがアガロースブロック中に分離調製された。インサートアガロースブロックを用いた染色体ＤＮＡの分離条件は、アガロースブロックの添付マニュアルに従った。
ｉｉ）ＤＮＡリガーゼ遺伝子の増幅
配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ条件は、ＰＣＲキットの添付マニュアルに従った。５’末端側に対応するプライマーとしては、配列表の配列番号１に示すＤＮＡ配列において、塩基番号１から始まる（すなわち開始コドンから始まる）オリゴヌクレオチドプライマーを合成した（５’−ＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴ−３’；配列番号３）。また、３’末端側に対応するプライマーとしては、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株の染色体ＤＮＡにおいて配列番号１の塩基配列の３’末端より下流域に対応するプライマーであって、増幅されたＤＮＡ中に制限酵素のＢａｍＨＩサイトが生じるようなプライマーを合成した（５’−ＧＴＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＧＣ−３’；配列番号４）。ＰＣＲ反応後、ＤＮＡを制限酵素のＢａｍＨＩで３７℃で３時間処理することにより完全分解した。次いで、ＤＮＡリガーゼ遺伝子を精製カラムキットを用いて精製した。
ｉｉｉ）ＤＮＡリガーゼ遺伝子を含有するベクターの構築
ベクターのｐＥＴ−３ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩで切断し、精製した後、Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用いて平滑末端化した。精製したプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、精製した。次いで、ＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＥＴ−８ｃと  ＢａｍＨＩで切断された上記のＤＮＡリガーゼ遺伝子とをＴ４リガーゼを用いて１６℃で、１６時間反応させることにより連結した。連結したＤＮＡを用いて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）  ＪＭ１０９  株（ＴＡＫＡＲＡ  社製）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は、０．０５  ｍｇ／ｍｌの  アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体からＤＮＡリガーゼ遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
実施例２（組み換えＤＮＡリガーゼの発現）
ｉ）ＤＮＡリガーゼ遺伝子を含有する形質転換体の作製
１．５ｍｌ容チューブ内に、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ）Ｒｏｓｅｔｔａ  （ＤＥ３）株（  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のコンピテントセル０．１ｍｌ（２００００００ｃｆｕ）と、上記調製したＤＮＡリガーゼ遺伝子含有プラスミドＤＮＡ溶液０．００２ｍｌ（プラスミドＤＮＡ１０ｎｇ）を加え氷中に３０分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを与えた。次いで、チューブ内にＳＯＣｍｅｄｉｕｍ  を１ｍｌ加え、３７℃で１時間振とう培養した。次いで、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、３７℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
ｉｉ）ＤＮＡリガーゼの精製
得られた形質転換体をアンピシリンを含むＮＺＣＹＭ培地に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達するまで、３７℃で培養した後、プラスミドの発現量を高めるためにＩＰＴＧを加えさらに４時間培養した。培養液を８，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離することにより集菌した。
【００３８】
集菌した菌体２．８ｇに、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌを加え、菌体を９０Ｗの出力で３分間超音波破砕した。破砕した菌液を  １５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を採取した。
【００３９】
夾雑蛋白を沈殿させて除去する目的で、この上清を８５℃で３０分間加熱した後、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を採取した。上清を、１５  ｍＭ    ＭｇＣｌ２、０．１  ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０  ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）中で透析し、同緩衝液で平衡化した陰イオン交換樹脂のＨｉｔｒａｐＱ（ファルマシア社製）カラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。
【００４０】
さらに、活性画分を、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、１５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２  を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．２）中で透析し、同緩衝液で平衡化したゲル濾過材のＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ２６／６０（ファルマシア社製）カラムを用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行った。活性画分には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含まれていた。
【００４１】
また、ゲルろ過クロマトグラフィーの結果、本酵素の分子量は約６９ｋＤａであった。
実施例３（超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株のＤＮＡリガーゼ遺伝子の同定）
実施例１で得られた超好熱性古細菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株の染色体ＤＮＡ中のＤＮＡリガーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を配列番号１に示す。また、実施例２で得られたＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株のＤＮＡリガーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
実施例４（耐熱性ＤＮＡリガーゼの性質）
前記の方法で得られたＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株由来のＤＮＡリガーゼの諸特性を評価した。ＤＮＡリガーゼ活性は以下に示すニッククロージングアッセイ又はコヘジティブエンドライゲーションアッセイにより測定した。
＜ニッククロージングアッセイ＞
ニッククロージングアッセイ（ｎｉｃｋ−ｃｌｏｓｉｎｇ  ａｓｓａｙ；Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．  １８２、ｐ６４２４−６４３３、２０００年）によりＤＮＡリガーゼ活性を測定する。詳述すれば、以下の３種類のＤＮＡプライマー
ＡＬ１：５’−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ５’−ＴＡＡＧＣＴＣＣＧＧＡＴＴＧＴＣＣＧＧＧＡＧＧＴＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号５）
ＡＬ  ２：５’−  ＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧ−３’（配列番号６）
ＡＬ３：５’−ＴＧＧＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＡＡＴＣＣＧＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号７）
を各０．００１ｍｇと、最終的に（ｆｉｎａｌ）２０ｎＭのＤＮＡリガーゼと、２０μｌの反応液  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（  ｐＨ  ７．５）、  ５０ｍＭ  ＫＣｌ、  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  ５ｍＭ  ＤＴＴ、  ０．１  ｍＭ  ＡＴＰ）とを混合し、７０  （Ｃで１０  分間反応させた後、反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド（１ｍｇ／ｍｌ）溶液で染色する。次いで、デンシトメーターを用いて、上記３つのオリゴヌクレオチドが連結して生じるオリゴヌクレオチドに相当するバンドの濃度を測定することにより、反応産物量を相対的に評価する。反応産物量の相対値は、ＤＮＡリガーゼ活性の相対値を示す。
＜コヘジティブエンドライゲーションアッセイ＞
コヘジティブエンドライゲーションアッセイ（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａａｓａｙ；  Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、ｖｏｌ．  ５、ｐ１６１−１６８、２００１年）によりＤＮＡリガーゼ活性を測定する。詳述すれば、０．５μｇのＨｉｎｄ−ＩＩＩ  で切断したλＤＮＡと、最終的に（ｆｉｎａｌ）１００ｎＭのＤＮＡリガーゼと、２０μｌの反応液  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（  ｐＨ  ７．５）、  ５０  ｍＭ  ＫＣｌ、  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  １０  ｍＭ  ＤＴＴ、  １  ｍＭ  ＡＴＰ）とを混合し、３７  （Ｃで２時間反応させる。次いで、反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジウムブロマイド（１ｍｇ／ｍｌ）溶液で染色する。次いで、連結されて生じるλＤＮＡに相当するバンドの濃度をデンシトメーターで測定することにより反応産物量の相対値を評価する。反応産物量の相対値は、ＤＮＡリガーゼ活性の相対値を示す。
ｉ）至適温度
ニッククロージングアッセイ及びコヘジティブエンドライゲーションアッセイにより、３０〜９０℃の温度下で、ＤＮＡリガーゼ活性を測定した。酵素活性の相対値を図１に示す。図１から分かるように、ｐＨ  ７．５のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中での本酵素の至適温度は７０℃である。
ｉｉ）耐熱性
反応液  （５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（  ｐＨ  ７．５）、  １０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、５ｍＭ  ＤＴＴ）中にＤＮＡリガーゼを濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ及び１０  ｍｇ／ｍｌになるように添加した各３つの酵素溶液サンプル（計９サンプル）を用意した。各酵素濃度の３つのサンプルを、それぞれ１００℃、１０５℃、及び１１０℃で１時間インキュベートして経時的に残存活性を測定した。１００℃及び１１０℃の場合は、加圧することにより当該温度に設定した。
【００４２】
各インキュベーション温度での残存活性は、ＤＮＡリガーゼ濃度にかかわらず、略同じであった。各インキュベーション温度につき、ＤＮＡリガーゼ濃度が異なる３サンプルの残存活性を平均した。結果を図２に示す。
【００４３】
本酵素は、１００℃でインキュベートした場合に１時間後に９７％程度の活性が残った。なお、ここには示さないが、１００℃で１２時間インキュベートした後にも９０％程度の活性が残った。また、１０５℃でインキュベートした場合に１０分間後に１００％程度の活性が残り、２０分後に８５％程度の活性が残った。１１０℃でインキュベートした場合は、１０分後に８０％程度の活性が残り、２０分後に６５％程度の活性が残った。
ｉｉｉ）コファクター
ＡＴＰ／ＡＤＰ
上記説明したコヘジティブエンドライゲーションアッセイ及びニッククロージングアッセイにおいて、ＡＴＰに代えてそれぞれＡＤＰを用いて、同様にＤＮＡリガーゼ活性を測定した。その結果、ＡＴＰの場合と略同様のＤＮＡリガーゼ活性が測定された。本酵素は、ＡＴＰに代えてＡＤＰを利用して同様に酵素反応を行えることが分かる。
カチオン
また上記説明したコヘジティブエンドライゲーションアッセイ及びニッククロージングアッセイにおいて、１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２に代えて、１０ｍＭ    ＭｎＣｌ２、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ  ＣｏＣｌ２をそれぞれ用いてＤＮＡリガーゼ活性を測定した。また、これらのカチオンを添加せずにＤＮＡリガーゼ活性を同様に測定した。この結果、２価カチオンを添加しない場合は、本酵素の活性は極めて低かったが、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２及びＣｏＣｌ２のいずれを添加した場合も、ＭｇＣｌ２を添加した場合と同様のＤＮＡリガーゼ活性が測定された。
【００４４】
このことから、本酵素は、コファクターとして２価カチオンを要求し、２価カチオンとしてＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋又はＣｏ２＋のいずれも利用できることが分かる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、高温での熱処理の後にも高い活性を保持できる耐熱性ＤＮＡリガーゼが提供された。
【００４６】
さらにいえば、超好熱性始原菌Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ１株から単離されたＤＮＡリガーゼは、１００℃で１時間熱処理しても実質的に活性が低下せず、１１０℃で１０分間の熱処理によっても８０％以上の活性が残存する極めて耐熱性の高い酵素である。ＬＣＲにおいては、通常９０〜１００℃程度の加熱／５０〜６５℃程度の冷却の熱サイクルを繰り返すことから、このような熱処理によっても高い活性を保持するＤＮＡリガーゼが必要であるところ、本酵素は、ＤＮＡリガーゼ活性が１００℃で１時間の熱処理によっても維持されるため、ＬＣＲに供するＤＮＡリガーゼとして好適に使用できる。
【００４７】
また一般に、ＤＮＡライゲーションは、酵素の失活等を回避するために、反応液を氷冷しながら迅速に操作する必要がある。本酵素は、常温下での安定性にも優れるため反応液をそれほど厳密に冷却しなくてもよく、またそれほど迅速に操作しなくてもよくなるというメリットがある。また、ＤＮＡライゲーションを比較的高い温度下で行えるため、夾雑タンパク質の影響を低減することができ、酵素反応効率がよくなる。
【００４８】
また本酵素は常温下でも安定であるため、長期保存が可能である。
【００４９】
また、本酵素は分子構造が安定であることから有機溶媒にも耐性であり、一般に酵素が失活しやすい有機溶媒中あるいは有機溶媒水溶液中においてＤＮＡリガーゼ反応を行える。このことから、新たなＤＮＡ関連反応の開発を期待できる。
【００５０】
本酵素は、コファクターとしてＡＴＰを利用でき、またＡＴＰに代えてＡＤＰを利用することもできる。ＡＤＰはＡＴＰより安定な化合物であり、ＡＴＰより安価である。また本酵素は、２価カチオンを要求するが、２価カチオンとしてＭｇ２＋、Ｍｎ２  ＋、Ｃａ２＋及びＣｏ２＋のいずれも利用できる。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ−１株由来のＤＮＡリガーゼの至適温度を示すグラフである。
【図２】Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ  Ｋ−１株由来のＤＮＡリガーゼを熱処理した場合の残存活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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