(57)【要約】【課題】微生物のニトリル合成経路で作用するアルドキシム脱水酵素またはその遺伝子を単離し、これを利用してニトリルの生物学的合成を可能にする。【解決手段】シュードモナス属に属する微生物由来の新規アルドキシム脱水酵素遺伝子の単離と、該遺伝子を用いたアルドキシム脱水酵素タンパク質の遺伝子工学的生産。さらに、前記アルドキシム脱水酵素タンパク質またはその遺伝子を導入した形質転換体を利用した、ニトリル化合物の生物学的合成。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および／または（ｂ）のタンパク質のダイマーから構成されるアルドキシム脱水酵素タンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードするシュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡ
【請求項４】
請求項２または３記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載のベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からアルドキシム脱水酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、アルドキシム脱水酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項１記載の酵素タンパク質、または請求項５記載の形質転換体をアルドキシム化合物に作用させてニトリル化合物を得ることを特徴とする、ニトリル化合物の製造方法。
【請求項８】
酵素タンパク質または形質転換体をｐＨ５〜１０、温度２０〜５０℃、および嫌気的還元条件下でアルドキシム化合物に作用させることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
アルドキシム化合物が脂肪族アルドキシム化合物である、請求項７または８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、シュードモナス属に属する微生物由来の新規アルドキシム脱水酵素タンパク質およびその遺伝子、ならびにこれらの利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物のニトリル代謝経路にはニトリルから直接カルボン酸を生成するニトリラーゼ系と、ニトリルからアミドを経てカルボン酸を生成するニトリルヒドラターゼ系が存在する。このニトリル代謝経路ではたらく各酵素は、学術研究上重要であると同時に、工業的にも高い利用価値を有する。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼは、温和な条件下でニトリルをアミド化合物に変換できるため、従来からアミド化合物の工業的生産に利用されてきた。例えば、ロドコッカス・ロドクロスＪ−１株（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ−１）由来のニトリルヒドラターゼを利用した、アクリルアミドやニコチンアミドの工業的生産（例えば、非特許文献１および２参照）；シュードモナス・クロロラフィスＢ２３株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３）由来のニトリルヒドラターゼを利用した、５−シアノ吉草酸アミド（ヘルビシド（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ）の中間体）の工業的生産（例えば、前記非特許文献２および非特許文献３参照）等が公知である。
【０００４】
ニトリル代謝経路ではたらく一連の酵素：例えば、ニトリルをアミドに変換するニトリルヒドラターゼとアミドをカルボン酸に変換するアミダーゼやこれらのアクセサリータンパク等は、ゲノム上クラスターを形成する（例えば、非特許文献４参照）。このようにニトリルの分解経路については、タンパクや遺伝子レベルでその詳細が明らかになってきたが、ニトリルの合成経路については、未だ不明な点が多い。
【０００５】
アルドキシムは、ニトリル生合成の中間体候補物質の１つとして知られている（例えば、非特許文献５参照）。例えば、ある種の高等植物においては、トリプトファン由来のインドールアセトアルドキシムが脱水されてインドールアセトニトリルになることが報告されている（例えば、前記非特許文献５および非特許文献６−８参照）。また、アルドキシムを青酸グリコシドやグルコシノレートに変換する微生物も知られている（例えば、フェニルプロピオンアルドキシムをフェニルエチルグルコシノレートに変換するＮａｓｔｕｒｔｉｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ等：非特許文献９参照）。さらに、これらのアルドキシム以外にも、いくつかの天然のアルドキシム化合物が微生物中から見出されている（例えば、真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｌｓｏｎｉｉにおける２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｏｘｏａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｏｘｉｍｅ等：非特許文献１０参照）。
【０００６】
しかしながら、アルドキシムに作用する酵素については、アルドキシムからニトリル合成を行う２つの酵素しか精製されてはいない。これらの遺伝子は異なるスーパーファミリーに属し、１つは、ＣＹＰ７１Ｅ１：ソルガムのｄｈｕｒｒｉｎ生合成に関与するチトクロームＰ４５０であり（例えば、非特許文献１１参照）、ｐ−フェニルアセトアルドキシムからｐ−ヒドロキシフェニツアセトニトリルへの変換を触媒する。もう１つは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＯｘＢ−１株のニトリル代謝で機能するフェニルアセトアルドキシム脱水酵素（例えば、非特許文献１２参照）であり、フェニルアセトアルドキシムからフェニルアセトニトリルへの脱水を触媒する。バシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素はヘムとの結合が弱く、酵素活性にはＦＭＮを必要とすることがわかっているが、共因子の機能等、詳細な性質はまだわかっていない。このように、ニトリル合成経路で作用する酵素の生化学的、遺伝子情報はまだ限られたものである。
【０００７】
アルドキシムからニトリルへの化学的変換には厳しい条件を必要とすることが知られている（例えば、非特許文献１３参照）。したがって、生物学的に温和な条件でニトリルを合成することができれば、ニトリル化合物の工業的生産、ひいてはアミド化合物の工業的生産にとって、重要な意味を持つ。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｓ．  （１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １  ６  ，  ｐ７３３−７３６
【非特許文献２】
Ｙａｍａｄａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．  （１９９６）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６  ０  ，  ｐ１３９１−１４００
【非特許文献３】
Ｙａｍａｄａ，  Ｈ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．  （２００１）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄｓ  １  ，  ｐ１５２−１６１
【非特許文献４】
Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，  Ｍ．，  Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，  Ｓ  ．  ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｎａｇａｓａｗａ，  Ｔ．，  Ｙａｍａｄａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｂｅｐｐｕ，  Ｔ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３  ，  ｐ２４６５−２４７２
【非特許文献５】
Ｓｉｂｂｅｓｅｎ，  Ｏ．，  Ｋｏｃｈ，  Ｂ．，  Ｒｏｕｚｅ，  Ｐ．，  Ｍｏｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｈａｌｋｉｅｒ，  Ｂ．  Ａ．  （１９９５）  ｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ  （Ｗａｌｌｓｇｒｏｖｅ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．），  ｐｐ．  ２２７−２４１，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
【非特許文献６】
Ｍａｈａｄｅｖａｎ，  Ｓ．  （１９７３）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２４  ，  ｐ６９−８８
【非特許文献７】
Ｈａｎｓｅｎ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｄｕ，  Ｌ．，  Ｎａｕｒ，  Ｐ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ａｘｅｌｓｅｎ，  Ｋ．  Ｂ．，  Ｈｉｃｋ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｐｉｃｋｅｔｔ，  Ｊ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈａｌｋｉｅｒ，  Ｂ．  Ａ．  （２００１）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６  ，  ｐ２４７９０−２４７９６
【非特許文献８】
Ｂａｋ，  Ｓ  ．  ，  Ｔａｘ，  Ｆ．  Ｅ．，  Ｆｅｌｄｍａｎｎ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｇａｌｂｒａｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｆｅｙｅｒｅｉｓｅｎ，  Ｒ．  （２００１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３  ，  ｐ１０１−１１１
【非特許文献９】
Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，  Ｅ．  Ｗ．  （１９６７）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２  ，  ｐ６１−６３
【非特許文献１０】
Ａｍａｄｅ，  Ｐ．，  Ｍａｌｌｅａ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｂｏｕａｉｃｈａ，  Ｎ．  （１９９４）  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ４７  ，  ｐ２０１−２０７
【非特許文献１１】
Ｂａｋ，  Ｓ．，  Ｋａｈｎ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｈ．  Ｌ．，  Ｍｏｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｈａｌｋｉｅｒ，  Ｂ．  Ａ．  （１９９８）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３６  ，  ｐ３９３−４０５
【非特許文献１２】
Ｋａｔｏ，  Ｙ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｓａｋｉｙａｍａ，  Ｈ．，  Ｍａｙｈｅｗ，  Ｓ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ａｓａｎｏ，  Ｙ．  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９  ，  ｐ８００−８０９
【非特許文献１３】
Ｘｉｅ，  Ｓ．  Ｘ．，  Ｋａｔｏ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ａｓａｎｏ，  Ｙ．  （２００１）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６５  ，  ｐ２６６６−２６７２
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、微生物のニトリル合成経路で作用するアルドキシム脱水酵素を単離し、これを利用することにより、アミド化合物の出発物質であるニトリル化合物の生物学的合成を可能にすることを目的とする。
【００１０】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３株のニトリルヒドラターゼ遺伝子近傍の配列からアルドキシム脱水酵素をコードする新規遺伝子の単離に成功した。さらに、該遺伝子を用いて、アルドキシム脱水酵素の遺伝子工学的生産に成功した。このアルドキシム脱水酵素を利用すれば、アミド化合物の出発物質であるニトリル化合物をアルドキシムから温和な条件で製造することが可能になる。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供するものである。
（１）  以下の（ａ）および／または（ｂ）のタンパク質のホモダイマーから構成されるアルドキシム脱水酵素タンパク質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）  以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質
（３）  以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードするシュードモナス属に属する微生物由来のＤＮＡ
（４）  上記（２）または（３）記載の遺伝子を含有する、組換えベクター。
（５）  上記（４）記載のベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
（６）  上記（５）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からあるアルドキシム脱水酵素活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする、アルドキシム脱水酵素の製造方法。
（７）  上記（１）記載の酵素タンパク質、または請求項５記載の形質転換体をアルドキシム化合物に作用させてニトリル化合物を得ることを特徴とする、ニトリル化合物の製造方法。
（８）  酵素タンパク質または形質転換体をｐＨ５〜１０、温度２０〜５０℃、および嫌気的還元条件下でアルドキシム化合物に作用させることを特徴とする、上記（７）記載の方法。
（９）  アルドキシム化合物が脂肪族アルドキシム化合物である、上記（７）または（８）記載の方法。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．アルドキシム脱水酵素
本発明にかかるタンパク質は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３株から単離されたアルドキシム脱水酵素（Ａｌｄｏｘｉｍ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）活性を有する新規タンパク質である。該タンパク質は、アルドキシム化合物を脱水して、対応するニトリル化合物に変換する「アルドキシム脱水酵素活性」を有する。
【００１３】
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパクは、以下のような性質を有する。
構造について：
▲１▼分子量は約７６．２ｋＤａ、３５２アミノ酸残基からなる２つの同一サブユニットから構成されるホモダイマーである。
▲２▼酵素中にヘムを含むヘムタンパクである。
▲３▼還元条件下でのラマンスペクトルから予測される構造は、還元状態のデオキシミオグロビンや還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼに類似している。
▲３▼酵素中には、鉄以外の金属として、カルシウムが含まれる。
酵素活性について：
▲１▼酵素はヘムがフェロフェム（２価鉄）状態にあるとき触媒作用を示す。すなわち、酵素は還元状態で活性である。
▲２▼酵素活性にはＦＭＮを必要としない（この点で、公知のＢａｃｉｌｌｕｓ属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素と異なる）。
▲３▼酵素活性は、ヒドロキシルアミン、硝酸銀により強い阻害を受ける。
基質特異性について：
基質としては、脂肪族アルドキシム、特にＣ１〜Ｃ６の脂肪族アルドキシムが好ましく、ブチルアルドキシムが最も好適である。芳香族アルドキシムに対してはほとんど酵素活性を示さない。
【００１４】
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質を構成するサブユニットは配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。しかしながらこの配列に限定されず、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された他のアミノ酸配列からなるタンパク質も、それがアルドキシム脱水酵素のホモダイマーを構成するサブユニットの１つとして機能する限り、本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質のサブユニットに含まれる。なお、前記欠失、置換、付加等の変異の数は、全アミノ酸数に対して好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００１５】
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質は、２つの同一サブユニットから構成されるホモダイマーである。しかしながら、ホモダイマーは厳密に完全同一のアミノ酸配列を有するサブユニットからなる二量体に限定されず、１または数個程度の微細なアミノ酸の違いを有する実質的に等価なサブユニット間のダイマーであってもよい。
【００１６】
２．アルドキシム脱水酵素遺伝子
本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子は、前記アルドキシム脱水酵素タンパク質をコードする遺伝子である。より詳細には、アルドキシム脱水酵素タンパク質ホモダイマーの各サブユニットをコードする遺伝子である。
【００１７】
該遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３株のゲノム中において、アミダーゼ遺伝子の上流域に存在し、該微生物のニトリル代謝経路で働く一連の遺伝子（ニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子、約４７ｋＤａのニトリルヒドラターゼアクセリータンパク（Ｐ４７Ｋ）等）と、クラスターを形成する。
【００１８】
本発明の遺伝子は、配列番号１に示される１６６２ヌクレオチドからなる塩基配列を有し、３５２アミノ酸残基のタンパクをコードする。
【００１９】
しかしながら、本発明にかかるアルドキシム脱水酵素タンパク質をコードする遺伝子は、上記配列に限定されず、この遺伝子（配列番号１）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる他の遺伝子も、該遺伝子がアルドキシム脱水酵素のサブユニットとして機能しうるタンパク質をコードする限り、本発明の遺伝子に含まれる。なお、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が３００−２０００ｍＭで温度が４０−７５℃、好ましくはナトリウム濃度が６００−９００ｍＭで温度が６５℃の条件をいう。
【００２０】
３．組換えベクター
本発明の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
【００２１】
前記プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば  ｐＢＲ３２２，  ｐＢＲ３２５，  ｐＵＣ１８，  ｐＵＣ１１９，  ｐＴｒｃＨｉｓ，  ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ  等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば  ｐＵＢ１１０，  ｐＴＰ５  等）、酵母由来のプラスミド（例えば  ＹＥｐ１３，  ＹＥｐ２４，  ＹＣｐ５０，  ｐＹＥ５２  等）などが、ファージ  ＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。
【００２２】
前記ベクターへの本発明の遺伝子の挿入は、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法が採用される。
【００２３】
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、構造遺伝子の前に、適当なプロモーターを配置させる必要がある。前記プロモーターは特に限定されず、宿主内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。なおプロモーターについては、後述する形質転換体において、宿主ごとに詳述する。また、必要であればエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ターミネーター配列等を配置させてもよい。
【００２４】
前記ベクターは、ニトリル代謝系で機能する他の酵素の遺伝子を含んでいてもよい。そのような遺伝子としては、例えば、各種生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子若しくはアミダーゼ遺伝子（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３のニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子（Ｄ９０２１６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ１のＨ型ニトリルヒドラターゼ遺伝子（Ｘ６４３５９）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ１のＬ型ニトリルヒドラターゼ遺伝子（Ｘ６４３６０）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｎ７７４のニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子（Ｘ５４０７４）等）、またはニトリラーゼ遺伝子（例えば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｊ１のニトリラーゼ遺伝子（Ｄ６７０２６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  Ｋ２２のニトリラーゼ遺伝子（Ｄ１２５８３）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ（シロイヌナズナ）のニトリラーゼ遺伝子（ＢＴ００００４０）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓのニトリラーゼ遺伝子（Ｄ１３４１９）等）等を挙げることができる。なお、カッコ内の番号は各遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒを示す。
【００２５】
４．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを目的遺伝子が発現しうるように宿主中に導入することによって得ることができる。ここで宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるのもであれば特に限定されず、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロテイ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、またサッカロミセス・セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、その他ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ１９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を挙げることができる。
【００２６】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが各細菌中で自律複製可能であるとともにプロモーター、リボゾーム結合配列、本発明遺伝子、転写終結配列により構成されていることが望ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていても良い。大腸菌としてはエッシェリヒア・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１、ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）、ＴＯＰ１０Ｆ等が挙げられ、枯草菌としてはバチルス・ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４、２０７−２１  等が挙げられる。
【００２７】
大腸菌等の宿主で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌由来のプロモータや、Ｔ７プロモーター等のファージ由来のプロモーターを用いることができる。
【００２８】
細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入できる方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，  ＳＮ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９  ：  ２１１０  （１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２９】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セルビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、チゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母で発現しうるもの、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＡＯＸプロモーター等を挙げることができる。
【００３０】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４  ：  １８０  （１９９０））、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ：  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５  ：  １９２９  （１９７８））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，  Ｈ．  ：  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５３  ：  １６３  （１９８３））等を挙げることができる。
【００３１】
本発明の形質転換体は、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子とともに、ニトリル代謝系で機能する他の酵素の遺伝子を同時に導入されてもよい。そのような遺伝子としては、前述したような、各種生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子、アミダーゼ遺伝子、またはニトリラーゼ遺伝子等を挙げることができる。
【００３２】
これらの遺伝子は１つのベクターにより本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子と同時に導入されても、あるいは異なるベクターにより別個に導入されてもよいが、協調して機能するために同じプロモーターの支配下に配置されることが必要である。これらの遺伝子は形質転換体内で協調して発現することにより、アルドキシム脱水酵素によって生成したニトリル化合物を、さらにアミド化合物やカルボン酸化合物に変換することができる。
【００３３】
５．本発明のアルドキシム脱水酵素の製造
本発明の酵素は、本発明の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて、決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
【００３４】
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加しても良い。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加しても良い。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加しても良い。なお、大腸菌を宿主する形質転換体の培養においては、１５℃で７日間培養することにより最大量の酵素タンパク質が得られることが確認されている。
【００３５】
培養後、本発明の酵素タンパク質が菌体内または細胞内に生産される場合は、菌体内または細胞を破砕する。一方、本発明のタンパク質が菌体外または細胞外に分泌される場合は、培養液をそのまま用いるか、遠心分離等によって回収する。
【００３６】
タンパク質の単離・精製には、例えば硫安沈澱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独であるいは適宜組み合わせて用いればよい。
【００３７】
また本発明のアルドキシム脱水酵素活性は、基質となりうる適当なアルドキシム化合物を含む反応液に該酵素を添加し、生成するニトリルを検出することにより確認することができる。ニトリル化合物の確認は、例えば、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いることができる。あるいは、本発明のアルドキシム脱水酵素に特異的に結合する抗体を作製し、該抗体を用いたウェスタンブロッティングによって発現を確認することもできる。
【００３８】
６．ニトリル化合物、およびアミド化合物の生物学的生産
本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質を利用すれば、温和な条件下でアルドキシム化合物を対応するニトリル化合物に変換することができる。すなわち、本発明は、本発明のアルドキシム脱水酵素タンパク質または、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子を含む形質転換体を利用した、ニトリル化合物の製造方法を提供する。
【００３９】
例えば、前述の形質転換体（例えば、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子を含む大腸菌）によって大量生産された組換えアルドキシム脱水酵素タンパク質を該酵素が機能しうる条件下で基質であるアルドキシム化合物に作用させる。あるいは、前記形質転換体を含む培地に基質であるアルドキシム化合物を添加し、本発明の酵素が機能しうる条件下で培養する。これにより、アルドキシム化合物は対応するニトリル化合物に変換される。
【００４０】
なお、「酵素が機能しうる条件下」とは、本発明のアルドキシム脱水酵素がその酵素活性を適切に発揮しうる条件を意味する。具体的にいえば、本発明の酵素は還元条件下（嫌気的条件）で酵素活性を示すため、前記条件は少なくともそのような還元的条件であることが必要である。還元条件は、例えば、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４等の還元剤を、酵素反応液中あるいは培地中に添加することによって達成される。この他、例えば温度は０〜７０℃、好ましくは２０〜５０℃、さらに好ましくは１５℃付近、またｐＨは３〜１２、好ましくは５〜１０、さらに好ましくは、ｐＨ６〜９程度である。
【００４１】
基質としては、脂肪族アルドキシム、特にＣ１〜Ｃ６程度の脂肪族アルドキシムが好ましく、ブチルアルドキシムが最も好ましい。
【００４２】
こうして製造されるニトリルは、ニトリルヒドラターゼによるアミド化合物製造の出発物質となる。したがって、本発明の方法はニトリル化合物のみならず、アミド化合物の工業的生産にも利用できる。
【００４３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００４４】
〔実施例１〕アルドキシム脱水酵素コーディング領域の探索
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３由来のニトリルヒドラターゼ系に関連する遺伝子のコーディング領域はクラスター化しており、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を中心として、その上流域にアミダーゼ遺伝子が、また下流域に約４７ｋＤａのニトリルヒドラターゼアクセリータンパク（Ｐ４７Ｋ）、機能未知のＯｒｆＥが存在する（図９）。一方、大腸菌においてニトリルヒドラターゼを最大限に発現させるためには推定３８ｋＤａのタンパクが必要であることがわかっている（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９１）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７３，  ｐ２４６５−２４７２）。そこで、アミダーゼ遺伝子の上流域より、前述のニトリルヒドラターゼ系遺伝子とクラスター化する分子量約３８ｋＤａのタンパクをコードするＯＲＦを探索した。
【００４５】
その結果、図１に示す、１０５６ヌクレオチド、３５２アミノ酸残基からなり、推定約４０１２７Ｄａの分子量を有するＯＲＦ（配列番号１）が見つかった。以下、このＯＲＦをｏｘｄＡと呼ぶ。このｏｘｄＡの開始コドンから８ヌクレオチド上流にはリボゾーム結合サイト（ＧＡＧＧＡ）が存在することが確認された。またＢＬＡＳＴを用いた検索により、ｏｘｄＡはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＯｘＢ−１株由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素遺伝子：ＯｘＢ−１（Ｋａｔｏ  Ｙ．，  ｅｔｒ  ａｌ，  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，  ｐ８００−８０９）と約３２％の相同性を有することが確認された（図２）。
【００４６】
〔実施例２〕ｏｘｄＡ（アルドキシム脱水酵素遺伝子）の大腸菌における発現
Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．  らの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）に従い、ｏｘｄＡの大腸菌における発現を試みた。
【００４７】
（１）ｐＰＣＮ４の調製
ニトリルヒドラターゼ遺伝子近傍の配列を含むプラスミドｐＰＣＮ４を、これを含む大腸菌ＪＭ１０５／ｐＰＣＮ４株（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２７７９；特開平３−２５１１８４号）より、常法に従って調製した。
【００４８】
（２）ｏｘｄＡの増幅
実施例１で選択されたｏｘｄＡの塩基配列を基に、以下のプライマーを合成し、ｐＰＣＮ４を鋳型としてＰＣＲを行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＣＴＧＣＧＡＴＣＧＡＣＡＣＧＣ−３’（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ条件：９４℃  ３０ｓｅｃ、５５℃  ３０ｓｅｃ、６８℃  ３０ｓｅｃ  を３０サイクル
Ｆｏｒｗａｒｄ  ＰｒｉｍｅｒはＮｄｅＩ認識配列（下線部）を含み、ｏｘｄＡの開始コドンから２２塩基に対応する。Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒは、ＳａｌＩ認識配列（下線部）を含み、ｏｘｄＡ  の３’末端の配列に相補的な２１塩基に対応する。
【００４９】
（３）発現ベクターの構築
得られた増幅断片はｐＵＣ１８ベクターにサブクローニングし、ＤＮＡ配列をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて確認した。次いで、このベクターをＮｄｅＩとＳａｌＩで切断し、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ製）のＮｄｅＩ‐ＳａｌＩ領域に挿入し、得られたプラスミドをｐＥＴ−ｏｘｄＡと命名した。ｐＥＴ−ｏｘｄＡ中において、ｏｘｄＡはＴ７プロモーターの支配下にある。
【００５０】
（４）形質転換体による発現実験
次いで、ｐＥＴ−ｏｘｄＡを大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）に導入し、得られた形質転換体を用いて発現実験を行った。形質転換体は５０μｇ／ｍｌカナマイシンと３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ  培地２４０ｍｌ中３７℃で振とう培養した。オーバーナイトで培養後、全培養物を同じ培地４８Ｌに接種し、３７℃で２時間振とう培養した。ここにＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭとなるように添加して、Ｔ７プロモーターを誘導し、さらに１５℃で７日間培養した。
【００５１】
３７℃の培養条件下では、ｏｘｄＡ遺伝子産物は完全な封入体として発現した。可溶性酵素の収量を増やすために培養条件を検討した結果、１５℃で７日間培養することにより、可溶性タンパク中、約１０％の遺伝子産物を発現させることに成功した。
【００５２】
〔実施例３〕  ｏｘｄＡ（アルドキシム脱水酵素遺伝子）産物の精製
実施例２で得られたｏｘｄＡ遺伝子産物の精製は、０−４℃で、５ｍＭ  ２ＭＥを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて行った。まず、遠心（１５，０００×ｇ、３０分）により菌体を集め、１ｍＭのジチオスレイトールを含む１００ｍＭ緩衝液で２回洗浄し、ソニケーション（Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  ２０１Ｍ：ＫＵＢＯＴＡ製）により菌体を破壊し、菌体を含まない抽出物を集めた。さらに遠心して残った菌体を取り除き、上清を硫酸アンモニウム（４０〜６０％）で分画し、１０ｍＭ緩衝液に透析した。透析後の液は１０ｍＭ緩衝液で等張化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム（５×２５ｃｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）に供し、ＫＣｌ  ０．１−０．４Ｍの直線グラジエントをかけた１０ｍＭ緩衝液１．２Ｌでタンパクを溶出させた。
【００５３】
活性が認められたフラクションを集め、硫酸アンモニウムを７０％飽和まで加え、遠心した。得られた沈殿は０．１Ｍ緩衝液に溶かし、硫酸アンモニウム（２０％飽和）溶液に移した。酵素溶液は硫酸アンモニウム（２０％飽和）を含む１０ｍＭ緩衝液で等張化したＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｌ  ６５０Ｍカラム（５×２２ｃｍ：東ソー製）にかけ、硫酸アンモニウムの濃度を２０％〜５％に下げた同様のバッファー１．２Ｌで溶出させた。活性画分を集め、７０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた。生じた沈澱を遠心して集め、０．１Ｍ緩衝液に溶かし、０．５％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ緩衝液に透析した。これを同様の緩衝液で等張化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（５×２２ｃｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）にかけ、０．５％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ緩衝液で完全にウォッシュした後、１０ｍＭ緩衝液で溶出させた。活性画分を集め、固形の硫酸アンモニウムを７０％飽和まで加えて遠心した。得られた沈殿は０．１Ｍ緩衝液に溶かし、１ｍＭ緩衝液（ｐＨ６．８）２Ｌで３回透析した。
【００５４】
透析後の酵素溶液は、遠心後、１ｍＭ緩衝液で等張化したＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ  ＨＡｐカラム（５×２２ｃｍ：生化学工業製）にかけた。カラムは１−１００ｍＭの直線グラジエントをかけた緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出し、さらに硫酸アンモニウム（５０−６０％飽和）で再分画した。沈殿を遠心して集め、０．１Ｍ緩衝液に溶かして１０ｍＭ緩衝液に再度透析し、遠心した。
【００５５】
〔実施例４〕  ｏｘｄＡ（アルドキシム脱水酵素遺伝子）産物の分子量の測定
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製された酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図３）。分子量マーカーとしては、フォスフォリラ−ゼｂ（９４ｋＤａ）、ＢＳＡ（６７ｋＤａ）、卵白アルブミン（４３ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３０ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２０．１ｋＤａ）、αラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を用いた。図３に示すように、ｏｘｄＡ遺伝子産物は約３８ｋＤａの分子量を示した。
【００５６】
（２）ゲルろ過
次に、未変性の酵素の分子量をゲルろ過により確認した。精製された酵素は、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）に接続させたＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）にかけ、０．１５Ｍ  ＫＣｌを含む１００ｍＭ緩衝液を用いて０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。溶出液の吸収は２８０〜４２２ｎｍで記録し、スタンダード：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（２９０ｋＤａ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（１４２ｋＤａ）、エノラーゼ（６７ｋＤａ）、アデニレートキナーゼ（３２ｋＤａ）、およびチトクロームｃ（１２．４ｋＤａ）の動きから酵素の分子量を測定した。その結果、未変性の酵素は７６．４ｋＤａの分子量を有することが確認された。この結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる結果から、ｏｘｄＡ遺伝子産物は２つの同一サブユニットから構成されることが示唆された。
【００５７】
〔実施例５〕  アルドキシム脱水酵素活性の確認
反応用混合物として、全量２００μｌ中に２０μｍｏｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１μｍｏｌのブチルアルドキシム（東京化成製）、および適当量の酵素を含むものを用いた。反応はブチルアルドキシムを加えて開始させ、３０℃、好気的条件下で５分間行った。１００μｌのＩＭ  ＫＯＨを加えて反応を止め、上清を遠心（１０，０００×ｇ、５分）により集めた。反応生成物は、水素炎イオン化検出器とガスクロパック５６（８０／１００％１メッシュ；ＧＬ−Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を充填したガラスカラム（３．２ｍｍ  ｂｙ  ２．１ｍ）を装備したガスクロマトグラフィー（ＧＣ−１４ＢＰＦ；ＳＨＩＭＡＺＵ製）で解析した。
【００５８】
アルドキシムデヒドラターゼ活性１ユニットは、ブチルアルドキシムからブチロニトリル  １μｍｏｌ／ｍｉｎの生成を触媒する酵素量として定義し、特異的活性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）はタンパク１ｍｇあたりのユニット数で評価した。
【００５９】
表１に各精製工程におけるｏｘｄＡ遺伝子産物（アルドキシム脱水酵素）の酵素活性を示す。最終的に精製された酵素の活性は、好気的条件下で０．７５８  ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。
【００６０】
【表１】
2004248572.tif 000003
【００６１】
〔実施例６〕  アルドキシム脱水酵素の補欠分子の解析
（１）ヘム染色
精製されたアルドキシム脱水酵素は溶液中で赤茶色をしており、酵素中にヘムの存在が予測されたため、未変性でのポリアクリルアミドゲル電気泳動後の酵素について、Ｋｌａｔｔらの方法（Ｋｌａｔｔ  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ｐ７３３６−７３４２）にしたがってヘム染色を実施した。すなわち、泳動後のゲルを３，３’−ジメトキシベンチジン／Ｈ２Ｏ２およびクーマシーブリリアントブルーで染色した。いずれの染色においても、単一バンドが同じ位置に確認された。さらに、この酵素の吸収スペクトルをＳｈｉｍａｚｕ  ＵＶ−１７００  ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ  （ＳＨＩＭＡＺＵ製）を用いて測定したところ、４１５ｎｍにヘムタンパクに特異的なピークが確認された（図４Ａ）。
【００６２】
（２）ピリジンヘモクロムのスペクトル
ヘムをピリジンヘモクロムに変換することにより、補欠分子の同定とヘムの定量を行った（Ｆａｌｋ，  Ｊ．Ｅ．，  （１９６４）  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ，  ｐ．２４０，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。すなわち、酵素にピリジン（最終濃度２０％）と少量のＮａ２Ｓ２Ｏ４を加え、１５分後に生成するピリジンヘモクロムのスペクトルを測定した。図５に示すよう、４１８．５ｎｍ（Ｓｏｒｅｔ）、５２４ｎｍ（β−ｂａｎｄ）、５５６ｎｍ（α−ｂａｎｄ）の位置にピークが確認された。さらに、ＨＣｌ−Ａｃｅｔｏｎ処理により補欠分子を抽出し、抽出物中のピリジンヘモクロムのスペクトルを測定したところ、得られたスペクトルは酵素中のピリジンヘモクロムのスペクトルと同じであった。
【００６３】
酸−アセトン抽出によりピリジンヘモクロムが抽出できることと、ピリジンヘモクロムのスペクトルの形から、このアルドキシム脱水酵素は補欠分子としてプロトヘムＩＸを含むことが確認された。そこで、酵素中のヘム含有量を、プロトヘムＩＸのヘモクロムのモル吸収係数（ε：３４．４ｍＭ−１ｃｍ−１  ａｔ  ５５７ｎｍ）から計算したところ、１モルのサブユニットに０．６９モルのヘムが含まれることが確認された。
【００６４】
（３）鉄イオンの定量
以下の方法により金属分析を行った。全てのガラス器具は２Ｍ  ＨＣｌで一晩洗浄し、使用前に蒸留水でよくすすいだ。分析に先立って、酵素は１ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に透析した。０．９４ｍｇタンパク／ｍｌを含む酵素試料を高周波プラズマ発光分析装置ＩＣＰＳ−８０００（２７．１２０ＭＨｚ：ＳＨＩＭＡＺＵ製）を用いて分析した。酵素の金属含量は標準溶液から検量線を描くことによって求めた。その結果、ホモダイマーを形成している酵素は１モルあたり１．６２モルの鉄を含むことが確認された。この結果から、本発明のアルドキシム脱水酵素は鉄とヘムを１：１の比率で含み、すべての鉄イオンはヘム分子中に存在すると考えられた。なお、測定されたヘム含量はタンパクより少ないが、これは精製工程中で一部のヘムが失われたことを示すものであった。同様の結果はバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素の精製工程についても報告されている。ちなみに、該酵素の精製工程では、最終的に酵素１モルあたり０．３５モルのヘムしか検出されなかったことが報告されている（Ｋａｔｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，  ｐ８００−８０９）。
【００６５】
金属分析の結果、この酵素は鉄イオンのほかには１モルあたり１．５８モルのカルシウムイオンを含むことが確認されたが、それ以外の金属は検出されなかった。
【００６６】
〔実施例７〕  酸化還元による酵素活性の変化
表２に示すように、好気的条件下におけるアルドキシム脱水酵素は不活性な状態にあり、酵素の特異的活性は非常に弱いもの（０．７５８  ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）である。この精製された酵素にＮａ２Ｓ２Ｏ４をに添加すると、４１５ｎｍのピークが４２８ｎｍにシフトし（図４Ａ）、同時に酵素の特異的活性は２５０倍増加する。
【００６７】
【表２】
2004248572.tif 000004
【００６８】
Ｎａ２Ｓ２Ｏ４で還元した酵素にさらにＣＯを加えると４２８ｎｍのピークは４１９ｎｍにシフトし（図４Ａ）、酵素の特異的活性は４９％を阻害されるが、基質はＣＯ存在下でも脱水される。これらの知見は、酵素中のフェロフェム（２価鉄）状態のヘムに結合したＣＯは、酵素反応中にブチルアルドキシムによって置換されることを示すものである。他方、好気的条件下では、精製酵素の吸収スペクトルはＣＯによって変化しないが、酵素に酸化剤であるＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］を加えると、４１５ｎｍから４１９ｎｍに吸収のピークがシフトし（図４Ｂ）、酵素の活性は全くなくなってしまう。これらのスペクトル特性は、精製された酵素のヘム鉄はフェリフェム（３価鉄）状態にあるが、酵素は還元状態：フェロフェム（２価鉄）状態でなければ活性を示さないことを示すものである。
【００６９】
〔実施例８〕  還元状態における酵素の特性
以下の実験は、全てＮａ２Ｓ２Ｏ４による還元状態下で実施した。
（１）分子量の測定
０．１５Ｍ  ＫＣｌと１０ｍＭのＮａ２Ｓ２Ｏ４を含む１００ｍＭ緩衝液を用いる以外は実施例４と同様にして、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４還元後の酵素について、その分子量をゲルろ過により求めた。その結果、酵素の分子量は７６．２ｋＤａと測定された。このことから、活性状態（すなわち、還元状態）にある酵素もまたホモダイマーであることが確認された。
【００７０】
（２）ラマンスペクトル
Ｎａ２Ｓ２Ｏ４で還元後の酵素について室温でＴＲＳ−６００／Ｓ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｒ（日本分光製）を用いてラマンスペクトルを測定した。励起にはＨｅ−Ｃｄレーザーからの４４１．６ｎｍ  ｌｉｎｅを用い、ラマン散乱をレーザー光に対して垂直方向に集めた。分散するラマン散乱はＣＣＤ検出機：ＬＮ／ＣＣＤ−１１００ＰＢＵＶＡＲ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて測定した。
【００７１】
還元状態のアルドキシム脱水酵素の高周波数領域（１２５０−１７００ｃｍ−１）におけるラマンスペクトル（図６）を既知のヘムタンパクと比較することにより解析した。
【００７２】
アルドキシム脱水酵素では１３５７ｃｍ−１にポルフィリンバンドが認められた。この位置はデオキシミオグロビン（１３５５ｃｍ−１）、還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼ（１３５８ｃｍ−１）のポルフィリンバンドと似ている。さらに、他のライン（例えば、１４７０、１５６５、１６１８ｃｍ−１）についても、還元状態のデオキシミオグロビン（１４７２、１５６３、１６１８ｃｍ−１）、および還元状態のホースラディッシュパーオキシダーゼ（１４７３、１５６５、１６２７ｃｍ−１）と近似していた。
【００７３】
（３）化学量論
酵素反応におけるアルドキシム消費量とニトリル生成量の関係を測定した。反応は、４０μｍｏｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２μｍｏｌのブチルアルドキシム、２μｍｏｌのＮａ２Ｓ２Ｏ４、１μｇ（１２．５ｐｍｏｌ）の酵素を含む反応混合物中、３０℃、嫌気的条件下で行った。その結果、アルドキシム消費量とニトリル生成量は化学量論的関係にあることが確認された。
【００７４】
（４）基質特異性と反応速度
種々のアルドキシムを基質として酵素の脱水活性を調べた。なお、酵素活性の確認は、実施例５に記載した方法を基に、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４（最終濃度５ｍＭ）を緩衝液に加え、還元条件下で嫌気的に実施した（標準アッセイ  Ｂ）。結果を表３に示す。
【００７５】
【表３】
2004248572.tif 000005
【００７６】
実験に供したアルドキシムのうち、３種の酵素が本酵素の基質となった。また、本実験で用いた芳香族アルドキシムは基質とはならなかった。基質となった３種のアルドキシムのうち、ブチルアルドキシムに対する酵素活性は特に高いものであった。また、Ｅ−ブチルアルドキシムとＺ−ブチルアルドキシムの各光学活性体に対する基質特異性を調べたところ、本酵素はいずれのアルドキシムについても同様に活性を示すことが確認された。
【００７７】
バシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素は本酵素に比べてブチルアルドキシムに対して非常に弱い酵素活性しか示さない（表２）。
【００７８】
（５）温度とｐＨによる影響
ｐＨ４．０〜１１．０の領域における酵素活性を調べた（図７）。その結果、最大の活性はｐＨ５．５で得られ（図７Ａ）、それ以外にはｐＨ９．４で高い酵素活性が得られることが確認された（図７Ｂ）。これはバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム脱水酵素ではみられない特性である。さらに、酵素の最適温度は４５℃であると確認された。
【００７９】
さらに、種々の温度およびｐＨにおける酵素の安定性を調べた。温度については、２０℃、１００％；２５℃、９４％；３０℃、９１％；３５℃、７８％；４０℃、５１％；４５℃、１４％；５０℃、３．２％の結果が得られた。一方、ｐＨについては、クエン酸／クエン酸ナトリウム（ｐＨ４．４−６．５）、リン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ６．７−７．９）、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９−８．８）およびＮＨ４Ｃｌ／ＮＨ４ＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９−１０．４）を用いて試験を行ったところ、酵素は６．０−８．０の領域で最も安定であり、ｐＨ１０においても、最初の酵素活性の４０％の活性を維持していた。
【００８０】
（６）酵素活性の阻害物質
表４に挙げる種々の化合物について、酵素活性阻害効果を調べた。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
その結果、酵素は硝酸銀に非常に感受性が高いことが確認された。一方、ヨード酢酸のようなチオール試薬、Ｎ−エチルマレイミド、ｐ−クロロ安息香酸水銀、および５，５’−ジチオビス２−ニトロ安息香酸にはほとんど阻害効果を示さなかった。酵素活性はヒドロキシルアミンによって完全に阻害された。また、酵素はＥＤＴＡ等のキレート剤には感受性を示さず、フッ化フェニルメタンスルフォニルのようなセリン修飾剤にもほとんど影響を受けなかった。
【００８３】
（７）アルドキシムによるスペクトル変化
ブチルアルドキシムの添加（最終濃度５０ｍＭ）により、還元状態にある酵素（最終濃度ｍｇ／ｍｌ）のスペクトルがどのように変化するかを観察した。
【００８４】
図８に示すように、ブチルアルドキシムを添加するとすぐに、４１６ｎｍにピークが現れるが、ブチロニトリルを添加しても４１６ｎｍにピークは現れなかった。このことは、基質であるアルドキシムは酵素中のフェロフェム（２価鉄）状態のヘムに作用することを示す。酵素反応が進むにつれ、４１６ｎｍのピークは消失し、１０分後には開始時と同じスペクトルが現れる。この状態では、反応液中のブチルアルドキシムは完全に消費されていることから、４１６ｎｍのピークはブチロニトリル合成反応における中間体に由来するものであることが示唆される。よく似た結果が、アセトアルドキシムを基質として添加したときにも観察された。
【００８５】
これらの結果より、本酵素のヘム分子はフェロフェム（２価鉄）状態において、触媒作用の必須部分として機能することが確認された。
【００８６】
【発明の効果】
本発明は、シュードモナス属に属する微生物由来の新規アルドキシム脱水酵素およびその遺伝子を提供する。該酵素やその遺伝子を利用すれば、アミド合成の出発物質であるニトリル化合物を温和な条件で製造することができる。
【００８７】
【配列表】
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【００８８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のアルドキシム脱水酵素遺伝子とその近傍の配列を示す。
【図２】図２は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３  の  ニトリルヒドラターゼ遺伝子とバシラス属由来のフェニルアセトアルドキシム遺伝子（ＯｘＢ−１）の塩基配列を比較したものである。
【図３】図３は、アルドキシム脱水酵素タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図４】図４は、アルドキシム脱水酵素（最終濃度０．５６ｍｇ／ｍｌ）の吸収スペクトルを示す。
４Ａ：実線は精製酵素、破線はＮａ２Ｓ２Ｏ４還元後の酵素、細線はＮａ２Ｓ２Ｏ４還元後にＣＯを添加した酵素の結果を示す。
４Ｂ：実線は精製酵素、破線はＫ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］酸化後の酵素、細線はＫＣＮを添加した酵素の結果を示す。
右上の挿入図は、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４還元後にＣＯを添加した酵素の結果からＮａ２Ｓ２Ｏ４還元後の酵素の結果を差し引いたものである。
【図５】図５は、アルドキシム脱水酵素のピリジンヘモクロムの吸収スペクトルを示す。
【図６】図６は、高周波数領域におけるアルドキシム脱水酵素（還元状態：最終濃度０．５０ｍｇ／ｍｌ）のラマンスペクトルを示す。
【図７】図７は、アルドキシム脱水酵素活性に対する、ｐＨと温度の影響をみたグラフである。
７Ａ：３０℃で５分間反応を行った結果を示す。図中、●：クエン酸／クエン酸ナトリウム、◆：リン酸カルシウム、■：Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、▲：ＮＨ４Ｃｌ／ＮＨ４ＯＨ。
７Ｂ：種々の温度で５分間反応を行った結果を示す。
【図８】図８は、基質の添加によるアルドキシム脱水酵素の吸収スペクトルの変化をみた結果である。実線はＮａ２Ｓ２Ｏ４還元後の酵素、破線は添加直後、細線は添加１０分後の結果を示す。
【図９】図９は、アルドキシム代謝に作用する遺伝子クラスターと、対応する代謝経路を示す図である。Ｂ２３はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ  Ｂ２３株を、ＯｘＢ−１はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＯｘＢ−１株を、Ｐｓｙｒは、Ｐ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｓｙｒｉｎｇａｅ  Ｂ７２８ａ株を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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