(57)【要約】【解決手段】フラクトシルトランスフェラーゼ生産菌（例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＨＵ  １７５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６））を、イヌリンを０．１〜１０％（好ましくは０．５〜５％）含有し、所望に応じて更に酵母エキスを０．０２〜２．０％（好ましくは０．１〜１．５％）含有する培地中において、０．５ｖｖｍ以上の通気量にて培養し、同酵素を大量に製造する方法が提供される。【効果】本発明は、上記例示菌のみでなく、フラクトシルトランスフェラーゼを生産する微生物であればすべての微生物に広く適用できるだけでなく、２００リットル容以上の大容量タンクを用いても酵素活性値を実験室レベルに維持できるどころか上昇させることをはじめて可能にしたものである。その結果、イヌリン由来のオリゴ糖の低コスト化が図られる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラクトシルトランスフェラーゼ生産菌をイヌリン含有培地で培養すること、を特徴とするフラクトシルトランスフェラーゼの生産方法。
【請求項２】
イヌリンを０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％含有する培地を使用すること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、酵母エキスを含有する培地を使用すること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵母エキスを０．０２〜２．０％、好ましくは０．１〜１．５％含有する培地を使用すること、を特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養時の通気量を０．５ｖｖｍ以上、好ましくは１〜２ｖｖｍとすること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
フラクトシルトランスフェラーゼが、（１）フルクトース単位を基質とし、これを加水・転移してオリゴ糖又は多糖を合成する酵素、あるいは、（２）フラクタンを基質とし、これを加水・転移してオリゴ糖を合成する酵素であること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
フラクトシルトランスフェラーゼが、イヌラーゼ、イヌリンフラクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）、イヌリンフラクトシル−β−１，２−フルクトフラノシルトランスフェラーゼ（サイクライジング）、サイクロイヌロオリゴサッカライドフルクタノトランスフェラーゼから選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
フラクトシルトランスフェラーゼとしてアースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＨＵ  １７５３株（ＦＥＲＭＢＰ−８２９６）由来のイヌリンフラクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（ｉｎｕｌｉｎ  ｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ））を使用すること、を特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
フラクトシルトランスフェラーゼ生産菌が、アースロバクター属、クルイベロマイセス属、ストレプトマイセス属、エンテロバクター属、バチルス属、ミクロバクテリウム属のいずれかに属する微生物であること、を特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
フラクトシルトランスフェラーゼ生産菌、アースロバクター  エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）  ＡＨＵ  １７５３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６）。
【請求項１１】
容量が５０リットル以上、好ましくは１００リットル以上の大型発酵タンクを用いる大型微生物培養装置を使用して大量に酵素を生産すること、を特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素の大量生産法に係り、更に詳細には、フルクトース単位を転移触媒してオリゴ糖を合成する酵素（フラクトシルトランスフェラーゼ）を効率的に大量生産する方法、つまり、高活性に生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
イヌリン、つまりフルクトースがβ−２，１結合を有し連結した多糖を、微生物酵素反応法により迅速かつ特異的に分解し、新たな化合物、特に生理機能の高い有用オリゴ糖を合成することは、とても重要な技術である。
【０００３】
イヌリンから特徴のあるオリゴ糖をつくり出す微生物としては、アースロバクター属、クルイベロマイセス属、ストレプトマイセス属、エンテロバクター属、バチルス属、ミクロバクテリウム属などに属する微生物が例示される。
【０００４】
合成されるオリゴ糖として、イヌロオリゴ糖やフルクトオリゴ糖（環状構造を有するものも含む）、ジフルクトースアンヒドライド（ＤＦＡ）など、ユニークな物質が数多く見いだされており、食品および医薬品など、様々な産業分野で、今後、広く利用されることが予測され、今後の動向に注目すべきであろう。
【０００５】
イヌリン由来のオリゴ糖としては、上記のようにＤＦＡが例示されるが、その内、ジフルクトース・ジアンヒドリドＩＩＩ（ｄｉｆｒｕｃｔｏｓｅ  ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ  ＩＩＩ：ＤＦＡ  ＩＩＩ）は、フラクトース２分子が１，２’；２，３’で結合している難消化性二糖類であって（ｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｅ−１，２’；２，３’ｄｉａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、水への溶解性が高く、蔗糖の９０〜９５％程度を示すが、その甘味度は蔗糖の５２％程度である。
【０００６】
ＤＦＡ  ＩＩＩは、最近の本発明者らの研究により、Ｃａ等ミネラルの吸収促進作用を有することが明らかにされ（例えば、特許文献１参照）、今後、特に高齢者や乳幼児等にとって、医薬上、健康食品、特定保健用食品、その他飲食品上、有益な物質として期待されている。したがって、高純度のＤＦＡ  ＩＩＩ、特に取扱いのうえからもまた加工のし易さからも、結晶化したＤＦＡ  ＩＩＩの製造、しかも研究試薬用のように小規模高コスト生産ではなく、大規模低コスト生産法の開発が待望されている。
【０００７】
ＤＦＡ  ＩＩＩは、従来、イヌリン又はイヌリン含有物（例えば、キクイモ、ゴボウ、チコリ等の抽出液）にアースロバクター属等の細菌又はそれが生産する酵素フラクトシルトランスフェラーゼであるイヌリンフラクトトランスフェラーゼを作用させてＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を製造した後、これを更に処理して高濃度ＤＦＡ  ＩＩＩ液を得ている（例えば、特許文献２、３、４参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平１１−４３４３８号公報
【０００９】
【特許文献２】
特公昭５６−２６４００号公報
【００１０】
【特許文献３】
特開平３−２５９０９０号公報
【００１１】
【特許文献４】
特開平１−２８５１９５号公報
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、近年、ＤＦＡ  ＩＩＩその他イヌリン由来の各種オリゴ糖について有用な用途が開発されるに伴い、ＤＦＡ  ＩＩＩ等オリゴ糖の需要が高まってきている。そして医薬用途に使用する場合はもちろんのこと飲食品用途に使用する場合においても、ＤＦＡ  ＩＩＩ等オリゴ糖の大量生産が強く要望されるようになってきた。
【００１３】
しかしながら、これまでの研究・技術では、先の様な有望な可能性を秘めるオリゴ糖が見い出せても、工業的に生産することは困難である。その原因は、オリゴ糖の生産を触媒する酵素が十分量確保できないことによる。つまり、大量に酵素を生産できないことに起因する。微生物を大量にかつ簡便に培養し、効率的にフラクトシルトランスフェラーゼを調製する手法がこれまでには確立されていなかったからである。
【００１４】
このような技術の現状に鑑み、本発明は、これらのオリゴ糖の合成に関与する酵素を効率的に大量生産する方法を開発する目的でなされたものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、フルクトース単位を転移触媒して、ＤＦＡ  ＩＩＩの様なオリゴ糖を合成する酵素を大量生産する方法を開発するためになされたものであり、このように本発明に係る酵素は、広義で「フラクトシルトランスフェラーゼ」である。フラクトシルトランスフェラーゼは、大きく２種類に大別される。（１）フルクトース単位（スクロースなどの２糖類を含む）を基質とし、これを加水・転移して、オリゴ糖を合成する酵素（場合として、多糖も合成する）。（２）イヌリンやレバンなどのフラクタンを基質とし、これを加水・転移して、オリゴ糖を合成する酵素である。例えば、イヌリンからのＤＦＡ  ＩＩＩ製造に使用したのは、フラクトシルトランスフェラーゼの中でも、学名がイヌリンフルクトトランスフェラーゼであり、（２）の種類に属する。本発明は、イヌリンフルクトトランスフェラーゼ（以後、単にＩＦＴとする）をはじめとするフラクトシルトランスフェラーゼの効率的大量生産方法の新規提供を目的としてなされたものである。
【００１６】
上記目的を達成するため、本発明者らは、広範な検討の結果、オリゴ糖を合成する酵素（フラクトシルトランスフェラーゼ）が微生物を培養することによって生産されている点に鑑み、その培養条件に着目した。そして、培養条件について各方面から鋭意研究した結果、該酵素生産菌の培養時に酵素誘導物質を添加するという新規着想を得た。
【００１７】
そして、この新規着想に基づき、誘導物質について広範にスクリーニングを行った結果、イヌリンの添加によって活性を低下させることなく、本酵素の生産量が飛躍的に増大することをはじめて見出しただけでなく、２００リットル以上もの大容量タンクにおける大量培養でもこの点を確認した。本発明は、これらの有用な新知見に基づき更に研究を重ね、遂に完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【００１８】
本発明を実施するには、本酵素を生成する微生物（菌体外に本酵素を分泌するもの、及び／又は、菌体内に本酵素を蓄積するものを問わない）を培養して、培養物から本酵素を取得するに際して、イヌリンを添加した培地を用いて培養を行う必要がある。イヌリンの添加量は、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％であって、例えば、イヌリンを約１％添加した培地を使用することができる。
【００１９】
また、更に、培地には酵母エキスを微量栄養源として添加すると好適である。その際、酵母エキスを０．０２〜２．０％、好ましくは０．１〜１．５％添加すればよく、例えば、酵母エキスを約０．５％添加した培地を使用することができる。
【００２０】
本発明を実施するには、上記のようにイヌリンを添加した培地（好適には、更に酵母エキスを添加した培地）で本酵素生産菌を培養すればよい。その際、その他の培地組成及び培養条件等に格別の限定はなく、使用菌に応じて適宜行えばよいが、培養時の通気量については、０．５ｖｖｍ以上、好ましくは１〜２ｖｖｍとするのがよい。
【００２１】
上記した本発明に係る培養方法によれば、本酵素を大量に生産することができ、従来法では、酵素調製量が１〜多くても数十ユニット（酵素単位）／ｍｌ（培養液）であったのが、本法では、高活性（数百ユニット（酵素単位）／ｍｌ（培養液）以上）とすることがはじめて可能になったという著効が奏される。
【００２２】
しかも、上記著効は、実験室や小規模生産レベルで奏されることはもちろんのこと、容量が５０リットル以上、例えば１００リットル以上の大型発酵タンクを用いる大型微生物培養装置を使用した場合にも奏されるという特徴を有し、２００リットル容のジャーファーメンターの使用も確認されており、それ以上の大容量発酵タンク、例えば３００〜５００リットル容の発酵タンクの使用も可能である。
【００２３】
このように本発明は、酵素の大量生産をはじめて可能にしたものであり、しかも酵素活性をいささかも低下させることがないものであって、そのポイントを例示すれば次のとおりである。
【００２４】
（培養装置に関して）
（１）大型微生物培養装置を導入したこと。
フルクトシルトランスフェラーゼの調製は、実験室レベルでは成功されているので、容易に考えられる発展項目でもあるが、これらの誘導酵素は、培養装置を大型にすることで、活性値が実験室レベルより顕著に低下することが多くある。２００リットル容以上タンクの導入で、事実活性値が上昇したことは、新たな重大発見である。
【００２５】
（培養方法に関して）
（２）酵素の誘導物質であるイヌリンの最適添加量を、大型微生物培養装置に合わせ、決定したこと。
（３）酵素の生産量増加、および安定性上昇の要素として、酵母エキスを見出し、その最適添加量を大型微生物培養装置に合わせ、決定したこと。
（４）酵素の生産量増加の要素として、培養中の空気の通気量を見出し、その最適量を大型微生物培養装置に合わせ、決定したこと。
【００２６】
上記したように、本発明では、フルクトシルトランスフェラーゼを高活性（数百ユニット（酵素単位）／ミリリットル（培養液）以上）に、つまり大量に生産することを目的に、新たな酵素生産技術を見い出したものである。この技術は、イヌリンから特徴のあるオリゴ糖をつくり出す微生物すべてに応用できる技術であって、この点も本発明の特徴のひとつである。
【００２７】
これらの微生物としては、アースロバクター属、クルイベロマイセス属、ストレプトマイセス属、エンテロバクター属、バチルス属、ミクロバクテリウム属に属する微生物のほか、各種細菌、酵母、糸状菌、放線菌等が適宜使用可能である。
【００２８】
本発明において使用できる微生物の非限定例を以下に示す：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、同（ＩＦＯ  １２１４０）、同（ＡＴＣＣ２１１２４）、Ａ．ｐａｓｃｅｎｓ（ＩＦＯ  １２１３９）、同Ｔ１３−２、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ（ＩＦＯ  １２１３７）、同Ｃ１１−１、Ａ．ｎｉｃｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９、Ａ．ｉｌｉｃｉｓ  ＯＫＵ  １７Ｂ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、同Ｈ６５−７、同ＡＨＵ  １７５３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６）、同ＭＣＩ−２４９３；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ（ＡＴＣＣ  １２４２４）、同ＣＢＳ  ６５５６、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、同（ＩＦＯ  １７３５）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｓ．ｒｏｃｈｅｉ、同Ｅ８７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、同ＭＣＩ−２５２４；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、同Ｎｏ．９４９；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、同ＯＫＵＭＺ．３１Ｂ、同ＭＣＩ−２５５４、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、同Ｓｎｕ−７；Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、同ＭＣＩ−２４９４；Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、同ＡＬ−２１０；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、同Ｓ４５；  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ。
【００２９】
本酵素を生産するに当っては、例えば上記したような本酵素生産菌を用い、既述した特定の培養条件のほかは常法にしたがって培養を行い、培養物中から酵素製造の常法にしたがって本酵素を抽出精製すればよい。例えば、得られた培養物を遠心分離して除菌し、得られた濾液に硫安（６５％飽和）を加えて、塩析し、析出した沈殿物を遠心分離により取得し、少量の水に懸濁させた後、透析して粗酵素液を得ることができる。そして所望するのであれば、常法にしたがい、例えば粗製酵素をクロマトグラフィー処理等既知の精製方法を１種又は２種以上組み合わせて、精製酵素とすることができる。
【００３０】
なお、本酵素生産菌が上記のように本酵素を菌体外へ分泌するタイプではなく、菌体内に蓄積するタイプの場合には、培養物から菌体を分離し、得られた菌体を超音波処理等常用される菌体破壊処理に対して菌体を破壊し、しかる後に上記したようにして酵素を分離、精製すればよい。
【００３１】
しかも、本発明では、小規模に本酵素を生産できることはもちろんのこと、特に上記した培養条件によれば、２００リットル以上、更には５００リットル以上もの大容量発酵タンクを用いても、何らの弊害も生じることなく、酵素力価を低下させることなく、高活性の酵素を大量に生産できるという工業上特にすぐれた効果が奏される。
【００３２】
本発明においては、酵素としては、分離精製した酵素のほか、粗精製酵素、微生物培養物、同処理物（培養上清、分離菌体、菌体破砕物等）も使用可能である。なお、ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶を食品用途に使用する場合には、酵素としてフラクトシルトランスフェラーゼ、特にＩＦＴを使用するのが好適であって、上記微生物由来の酵素のほか、今回、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６として寄託されたＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＨＵ  １７５３株は、ＩＦＴ生産能にすぐれているので、本酵素生産菌として好適に使用可能である。
【００３３】
このようにして大量生産した酵素は、酵素自体として試薬や研究用に利用されるほか、多数の応用が可能であって、そのひとつとして、本酵素をイヌリンに作用させることにより、各種のオリゴ糖を合成することができる。例えばフラクトースの重合度が１０以上、好ましくは１０〜６０のイヌリンにフラクトシルトランスフェラーゼを作用させることによってＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を製造することができるが、その際、イヌリンフラクトトランスフェラーゼ（デポリメライジング）（ｉｎｕｌｉｎ  ｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｄｅｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ））として、アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ・）ＡＨＵ  １７５３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６）由来の精製酵素、粗製酵素、酵素含有物、菌体、菌培養物、同処理物の少くともひとつを使用することができる。
【００３４】
このようにして、効率的に且つ低コストでＤＦＡ  ＩＩＩ含有液を製造することが可能となったので、例えばこれに粉末活性炭を例えば固形分に対し５％以下添加して清浄化した後、固液分離し、分離した液状部を濃縮した後、直ちに結晶化し、必要あれば、これらの操作をくり返したり、クロマトグラフィー処理を組み合わせたりして、更に精製して、臭いも除去されてきわめて高純度の結晶ＤＦＡ  ＩＩＩを得ることができる。
【００３５】
以下、本発明の実施例及び応用例について述べる。
【００３６】
【実施例１】
フラクトシルトランスフェラーゼの製造
（１）  アースロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＡＨＵ  １７５３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２９６）を下記の培養条件で培養し、酵素液を作成した。
【００３７】
（２）培地１：１％グルコース、１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．０。５００ｍｌ容の振とう坂口フラスコに、１００ｍｌを調製し、高圧蒸気殺歯をした。
培地２：１％イヌリン、０．２％硝酸ナトリウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％リン酸二水素カリウム、０．０１ｇ／Ｌ硫酸第二鉄、０．５％酵母エキス、ｐＨ７．０。２００Ｌ容のジャーファーメンター（日立製作所製、モデルＦＦ−０２）に、１００Ｌを調製し、高圧蒸気殺菌をした。
【００３８】
（３）培養（酵素生産）
前培養：保存スラント培地より、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＡＨＵ１７５３株の一白金耳量菌体を、無菌的に（培地１）に接種した。そして、２７℃、２４時間、振とう培養をした。振とう条件は、１５センチ幅、１２０ｒｐｍ。
本培養：  前培養で調製した培養液（フラスコ１０本分、１Ｌ分）を、無菌的に（培地２）に接種した。そして、ジャーファーメンターを２７℃で、１７時間、運転した。通気量は、１ｖｖｍ（１５０Ｌ／分）、攪拌数は、３００ｒｐｍ。
【００３９】
（４）菌体回収、およびその他（３）で調製した培養液を、遠心分離器で菌体と上清とに分離し、上清をＤＦＡ  ＩＩＩ酵素液とした。酵素液をリン酸にて、ｐＨ５．５に調整後、マイナス２０℃で保存した。
（結果）
この操作により、ＩＦＴを、
濃度：  ３００ユニット／ミリリットル（培養液）、（実験室レベルの３倍）
全量：  ４．５×１０の７乗、ユニット量、（工業生産に対応できる十分量）
時間：  １７時間、（実験室レベルより短時間）
に製造できた。
【００４０】
（培養条件）
・前培養：２７℃、２４時間、振とう培養
・本培養：前培養液を本培養液に接種（本培養液量に対して１％の前培養液量）し、２７℃、２４時間振とう培養する。
【００４１】
（酵素液の調整）
本培養液を遠心分離（２０００Ｇ、４℃、２０分）し、上澄みを酵素液として使用する。
【００４２】
【応用例１】
ＩＦＴによるＤＦＡ  ＩＩＩの製造
上記によって製造したＩＦＴを用い、イヌリンを原料として、製造フロー（図１）にしたがい、ＤＦＡ  ＩＩＩを結晶化した。
【００４３】
（１）市販イヌリン製品（Ｄ社品：化学構造ＧＦｎ、フラクトース重合範囲１０〜６０、平均重合度２０〜２５、ポリサッカライド含量１００％、液体クロマトグラム  図３）を２００ｋｇ使用し、これを８０℃のお湯１０００ｋｇで溶解し、６０℃まで冷却する。その溶液に上記酵素生産で得られたＩＦＴ  ５０００ｕｎｉｔｓ／ｋｇイヌリンを添加し、６０℃で２４時間攪拌しＤＦＡ  ＩＩＩの含有液を生成させる。この反応完了液を８０℃に上げ酵素を失活させる。この失活液に固形分当たり１％の割合で太閤活性炭Ｓ（二村化学工業製：平均粒径約３５ミクロン、１４７ミクロン以下）を添加し６０℃、１０分間攪拌する。この完了液を珪藻土（昭和化学工業製ラジオライト７００）濾過を行った。すなわちセラミック製の筒（日本ポール（株）製ＰＲ−１２型セラミックチューブ）の内面に上記珪藻土をプレコートしておき、筒内に活性炭含有反応液を加圧通過させて、加圧濾過し、筒外から濾液を回収した。
【００４４】
（２）  この濾液を濃縮缶で濃縮（６０〜７０℃  １２０ｍｍＨｇ以下）する。最終濃度Ｒ−Ｂｘ７７まで濃縮した後、その母液を結晶化工程に移した。結晶は冷却結晶化法を行った。６０℃の濃縮液を冷却缶外部に冷却外套及び攪拌機が設けられた缶で、２３時間かけて１５〜２０℃に冷却する。結晶の析出した母液を分離機（３０００ｒｐｍ、１２００Ｇ）で粗結晶とシラップに分離する。その粗結晶（ＤＦＡ  ＩＩＩ純度９７％）を再溶解し、得られた再溶解液（ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液）を、上記条件と同様に活性炭処理、珪藻土濾過を行い濃縮、結晶化・分離し、製品結晶（ＤＦＡ  ＩＩＩ純度９９％）を得る。得られた結晶を５０℃で通風乾燥し、ＤＦＡ  ＩＩＩ７．２ｋｇ（水分０．１％）が得られた。この結晶は、着色もなく臭いも認められなかった。
【００４５】
（３）  上記（１）において、珪藻土濾過にかえてメンブランフィルター（ＭＦ）濾過を行った。
すなわち、酵素反応完了液（約Ｒ−Ｂｘ２０）を失活させて、それに太閤活性炭Ｓを固形分当たり１％添加し、６０℃、１０分間攪拌する。それを、０．１４μｍのメンブランフィルター（月島機械株式会社製：セラミック膜  ＴＳＫ−ＴＡＭＩダリア）を使用し、濾過を行った。濃縮率は１０倍とした。結果を図４に示す。その結果から明らかなように、透過液量の低下もみられず順調に濾過できることを確認した。透過液は透明であった。
【００４６】
（４）  上記（１）、（２）において、ＤＦＡ  ＩＩＩ含有液（酵素反応完了液：濃度Ｒ−Ｂｘ６０、ＤＦＡ  ＩＩＩ純度７８．６％、その他２４．１％（主に４糖類および５糖類））について、以下によってクロマト処理を行い、下記する画分を得た（表１）。このようにして、通液量０．６００〜０．７００Ｌ／Ｌ−Ｒ画分を回収して、ＤＦＡ  ＩＩＩ画分（純度９７．３％）を得た。このようにしてクロマト分画して得たＤＦＡ  ＩＩＩ画分は、ＤＦＡ  ＩＩＩリッチ画分として、清浄濾過した後に濃縮して製品結晶母液として使用できるほか、粗結晶再溶解液（ＤＦＡ  ＩＩＩ精製液）としてあるいはそれに添加して使用できることも確認された。また、ＤＦＡ  ＩＩＩ純度７６．８％画分は、例えばＤＦＡ  ＩＩＩ非リッチ画分としてルートＣに利用できることも確認された（図２）。
【００４７】
（表１）
───────────────────────────────
画分（Ｌ／Ｌ−Ｒ）        純度（％）        回収率（％）
───────────────────────────────
０．５００〜０．５９９      ７６．８          ６１．４
０．６００〜０．７００      ９７．３          ３２．９
───────────────────────────────
【００４８】
2004305125.tif 000002
【００４９】
【発明の効果】
微生物を用いる酵素の生産において、そのスケールアップは簡単ではなく、単にスケールアップしても活性値が大幅に低下することもしばしばである。誘導酵素の場合も同様であって、培養装置を大型化すると、活性値が実験室レベルよりも顕著に低下することがある。
【００５０】
本発明は、この点を解決して大型化に成功したものである。つまり、２００リットル容以上の大型タンクの導入にもかかわらず、事実活性値が実験室レベルと同等ではなく、それよりも大幅に上昇したことは、きわめて重大にして有用な新知見である。しかも、そのために導入した培養条件は、イヌリンの添加、酵母エキスの添加、通気量の特定というシンプルなものである点も、本発明の顕著な効果である。
【００５１】
このように本発明は、シンプルな操作で高活性酵素の大量生産にはじめて成功したものである。したがって本発明の効果は、特に工業的な面から顕著である。このようにして本発明によりフラクトシルトランスフェラーゼを低コストで大量生産することがはじめて可能となったということは単なる酵素の大量生産にとどまらず、各種のイヌリン由来の高価なオリゴ糖（例えばＤＦＡ  ＩＩＩ）について、大量生産及び低コスト化を可能とするものである。
【００５２】
このように、本発明に係る酵素を用いて製造したＤＦＡ  ＩＩＩ結晶は、単に純度が高いだけでなく、臭いがないというきわめて顕著な効果が奏されるので、医薬用途や飲食品用途に使用するのに特に適しており、例えばカルシウム吸収剤として自由に使用できる特徴も奏される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＦＡ  ＩＩＩ結晶の製造フローの一例を示す。
【図２】クロマト処理による精製フローの例を示す。
【図３】各種イヌリン商品の液体クロマトグラムである。
【図４】ＭＦ（メンブランフィルター）濾過試験の結果を示す。
【図１】
2004305125.tif 000003
【図２】
2004305125.tif 000004
【図３】
2004305125.tif 000005
【図４】
2004305125.tif 000006