(57)【要約】【課題】ＧＰＣＲ内在化を変化させる化合物の識別方法に関することを提供する。【解決手段】本発明は、ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物をスクリーニングするための、アゴニスト非依存的な方法に関する。本発明には、アゴニストの非存在下でＧＰＣＲが脱感作されるＧＲＫを含み、前記ＧＲＫを改変することができる細胞株が含まれる。本発明は、ＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうか、およびＧＰＣＲはアレスチンに親和性を有するかどうかを識別する方法に関する。アレスチン親和性が増加した改変ＧＰＣＲが本発明に含まれる。これらの改変ＧＰＣＲは、本明細書中に記載されたアゴニスト非依存的な方法およびアゴニスト依存的な方法を含む、脱感作を変化させる化合物のスクリーニング法で有用である。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＣＲの内在化を変化させる化合物の識別方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、および改変ＧＲＫを含む細胞であって、前記ＧＰＣＲが前記ＧＲＫの発現の際にアゴニストに非依存的な様式で少なくとも一部が内在化することを特徴とする細胞を得る工程と、
（ｂ）前記細胞を前記化合物に曝露する工程と、
（ｃ）前記ＧＰＣＲ、アレスチン、または改変ＧＲＫの細胞分布を決定する工程と、
（ｄ）（１）前記化合物の存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲ、アレスチン、または改変ＧＲＫの細胞分布と、（２）前記化合物の非存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲ、アレスチン、または改変ＧＲＫの細胞分布との相違をモニターする工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記工程（ａ）の前記ＧＲＫが過剰発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）の前記ＧＲＫの発現が誘導性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＧＲＫがＣＡＡＸモチーフを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＧＰＣＲがＧＲＫによって、リン酸化が増強されるように改変された、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＰＣＲがβ２ＡＲ（Ｙ３２６Ａ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＰＣＲが図１に列挙されたＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲ、味覚受容体、クラスＡ  ＧＰＣＲ、クラスＢ  ＧＰＣＲ、変異ＧＰＣＲ、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＧＲＫが、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、およびアレスチンが検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
脱感作に関連する分子が検出可能に標識されているか、脱感作に関連する分子に相互作用する分子が検出可能に標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アレスチンが、視覚アレスチン、網膜錐体アレスチン、βアレスチン１、βアレスチン２、またはその生物学的に活性なフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アゴニストが得られない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｄ）の（１）と（２）との相違は、ＧＰＣＲ内在化が調節されていることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＰＣＲのリン酸化を変化させる化合物の識別方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む細胞を得る工程と、
（ｂ）前記細胞を前記化合物に曝露する工程と、
（ｃ）前記化合物の存在下でＧＰＣＲのＧＲＫによるリン酸化が変化するかどうかを識別する工程と
を含む方法。
【請求項１５】
前記ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布を決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（１）前記化合物の存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布と、（２）前記化合物の非存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布との相違をモニターする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記（１）と（２）との相違を、前記ＧＰＣＲのリン酸化と相関させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＲＫが原形質膜中に存在せず、このことが、前記ＧＰＣＲのＧＲＫによるリン酸化が変化したことを示す、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＧＰＣＲのリン酸化状態を決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＧＲＫの活性を決定する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＰＣＲの内在化能力を決定する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを同定する方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記アレスチンが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、
（ｂ）前記アレスチンの細胞分布を決定する工程と、
（ｃ）前記アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲの原形質膜で発現する能力に相関させる工程と
を含む方法。
【請求項２３】
前記アレスチンが、小胞、ピット、エンドソーム、または脱感作経路中のいたる場所に局在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記ＧＲＫが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、
（ｂ）前記ＧＲＫの細胞分布を決定する工程と、
（ｃ）前記ＧＲＫの細胞分布をＧＰＣＲの原形質膜で発現する能力に相関させる工程と
を含む方法。
【請求項２５】
前記ＧＲＫが、原形質膜に局在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＰＣＲのアレスチン結合能力を分析する方法であって、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記アレスチンが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、
（ｂ）前記アレスチンの細胞分布を決定する工程と、
（ｃ）前記アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲのアレスチン結合能力に相関させる工程と
を含む方法。
【請求項２７】
前記アレスチンまたはＣＰＧＲが、小胞、ピット、またはエンドソームに局在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１によって識別される化合物。
【請求項２９】
宿主細胞中におけるＧＰＣＲの脱感作の調節によって疾患を治療する方法であって、
（ａ）請求項１で識別された化合物を得る工程と、
（ｂ）前記化合物を宿主に投与する工程と
を含む方法。
【請求項３０】
ＧＰＣＲおよび改変ＧＲＫを含む宿主細胞。
【請求項３１】
前記ＧＲＫが誘導的であるか、または過剰発現する、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記宿主細胞が、アレスチンをさらに含み、前記アレスチンが検出可能に標識されうる、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
少なくとも１つのＧＰＣＲ、ＧＲＫ、脱感作に関連する別の分子、または脱感作に関連する分子に相互作用する分子を検出可能に標識する、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
ＧＰＣＲが構成的に内在化されるＧＲＫをコードする核酸を改変する方法であって、
（ａ）ＧＲＫをコードする核酸を得る工程と、
（ｂ）前記コードされたＧＲＫがＣＡＡＸモチーフを含むように、前記ＧＲＫをコードする核酸を改変する工程であって、前記改変ＧＲＫがアゴニストの存在下でＧＰＣＲをリン酸化し、
（ｃ）細胞中で改変ＧＲＫを発現させる工程と
を含む方法。
【請求項３５】
前記ＧＲＫをコードする核酸が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３０に記載の宿主細胞を含む、前記ＧＰＣＲの内在化を調整する化合物を識別するためのキット。
【請求項３７】
ＮＰＸＸＹモチーフおよびカルボキシル末端テールを含む改変ＧＰＣＲであって、
前記カルボキシル末端テールが推定パルミトイル化部位および１つまたは複数のリン酸化クラスターを含み、
前記カルボキシル末端テールが、第２のＧＰＣＲ由来のカルボキシル末端の一部に融合した第１のＧＰＣＲ部分のカルボキシル末端領域の保持部分を含み、
前記第２のＧＰＣＲが、１つまたは複数のリン酸化クラスターを含み、第２のＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５アミノ酸残基下流に第２の推定パルミトイル化部位をさらに含むことを特徴とする改変ＧＰＣＲ。
【請求項３８】
前記第１のＧＰＣＲがクラスＡ受容体である請求項３７に記載の改変ＧＰＣＲ。
【請求項３９】
前記第１のＧＰＣＲが、ｈＧＰＲ３、ｈＧＰＲ６、ｈＧＰＲ１２、ｈＳＲＥＢ２、ｈＳＲＥＢ３、ｈＧＰＲ８、またはｈＧＰＲ２２である、請求項３７に記載の改変ＧＰＣＲ。
【請求項４０】
前記第２のＧＰＣＲがクラスＢ受容体である請求項３７に記載の改変ＧＰＣＲ。
【請求項４１】
前記クラスＢ受容体が、バソプレシンＶ２受容体、ニューロテンシン１受容体、基質Ｐ受容体、およびオキシトシン受容体からなる群から選択される請求項３７に記載の改変ＧＰＣＲ。
【請求項４２】
請求項３７に記載の改変ＧＰＣＲをコードする核酸。
【請求項４３】
配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４，５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０からなる群から選択される核酸。
【請求項４４】
請求項４２に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４７】
ＧＰＣＲ活性について化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項３７に記載の少なくとも１つの改変ＧＰＣＲを発現する細胞を得る工程であって、前記細胞は検出可能な分子と接合したアレスチンをさらに含み、
（ｂ）前記化合物に前記細胞を曝露する工程と、
（ｃ）前記細胞内のアレスチンの位置を検出する工程と、
（ｄ）前記化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と前記化合物の非存在下での細胞内のアレスチンの位置とを比較する工程と、
（ｅ）（１）前記化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と（２）前記化合物の非存在下での細胞内のアレスチンの位置との相違を相関させる工程とを含む方法。
【請求項４８】
前記アレスチンが、エンドソーム、エンドサイトーシス小胞、またはピット中で検出される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの請求項３７に記載の改変ＧＰＣＲを発現する細胞を含み、前記細胞が検出可能な分子と接合した脱感作に関連する分子をさらに含む、ＧＰＣＲの活性を調節する分子を識別するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アゴニストに非依存的な様式でのＧＰＣＲ脱感作のアッセイ法、このような方法に有用な宿主細胞、ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物の識別方法、識別された化合物、および疾患治療でのこれらの化合物の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンまたはリガンド結合を細胞内シグナルに翻訳する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは、全ての動物、昆虫、および植物に見出される。ＧＰＣＲシグナル伝達は、光情報伝達、嗅覚、神経伝達、血管の調子、心拍出量、消化、痛み、流動体と電解質とのバランスを含む種々の生理学的機能の調節において中心的役割を果たす。これらは多数の生理学的機能に関連するにもかかわらず、ＧＰＣＲは、多数の共通の特徴を共有する。これらは、細胞内および細胞外ループならびに種々の長さの細胞内カルボキシル末端テールが交互に並ぶことによって架橋している７つの膜ドメインを含む。
【０００３】
ＧＰＣＲは、多数の疾患状態（狭心症、本態性高血圧症、心筋梗塞、上室性および心室性不整脈、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、腎不全、糖尿病、呼吸器適応症（喘息など）、慢性気管支炎、気管支痙攣、気腫、気道閉塞症、上気道適応症（鼻炎など）、季節性アレルギー、炎症疾患、損傷反応における炎症、慢性関節リウマチ、慢性炎症性腸疾患、緑内障、抗ガストリン血症、胃腸適応症（酸／消化性疾患など）、びらん性食道炎、消化管過分泌、肥満細胞症、胃腸逆流、消化性潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群、痛み、肥満、神経性大食症、うつ病、脅迫性障害、器官奇形（例えば、心臓奇形）、神経変性疾患（パーキンソン病およびアルツハイマー病など）、多発性硬化症、エプスタイン−バー感染、および癌などが含まれるが、これらに限定されない）に関連している。
【０００４】
ＧＰＣＲで調節される生理学的反応の規模は、ＧＰＣＲシグナル伝達とシグナル終結との間のバランスに関連する。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、アレスチンと呼ばれる細胞内タンパク質ファミリーによって調節される。アレスチンは、活性化されたＧＰＣＲ（アゴニスト活性化されているものおよび特にＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化されたものを含む）に結合する。
【０００５】
ＧＰＣＲを含む受容体は、リガンド、ホルモン、および薬物と高い特異性で結合するので、歴史的に薬物発見および治療薬の標的とされてきた。今日使用されている治療薬の約１５％が、直接ＧＰＣＲで標的化されるか相互作用する。例えば、Ｊｕｒｇｅｎ  Ｄｒｅｗｓ、２０００、「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｒｙ：Ａ  Ｈｉｓｔｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７、１９６０〜１９６４を参照のこと。
【０００６】
Ｇタンパク質共役型受容体活性の正確且つ解釈の容易な方法およびＧＰＣＲ活性のアッセイ法が必要である。Ｂａｒａｋらに付与された米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている１つの方法は、ＧＰＣＲを発現する細胞と、アレスチンと検出可能な分子との接合体を使用する。
【０００７】
たった数百のヒトＧＰＣＲしか公知でないにもかかわらず、数千のＧＰＣＲがヒトゲノム中に存在すると見積もられている。これらの公知のＧＰＣＲのうち、多数は今もなおリガンドと関連付けられていないオーファン受容体である。
【０００８】
既存のＧＰＣＲアンタゴニストの識別方法のほとんどは、アゴニストの存在に依存する。ＧＰＣＲの作用を防止する化合物の識別アッセイは、典型的には、妨害化合物を同定するためにＧＰＣＲを最初に活性化することが必要である。公知のアゴニストを有するレセプターについては、現在、これらのアゴニストはこれらの受容体の活性化に使用されている。しかし、多数のＧＰＣＲは公知のリガンドまたはアゴニストを持たないオーファン受容体である。
【０００９】
オーファン受容体のアンタゴニスト発見は、典型的にはアゴニストまたはリガンドの事前の発見に依存しているので、ＧＰＣＲアッセイのアゴニスト依存性は問題でありつづけている。ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物のアゴニストに非依存的なスクリーニング法は、（１）スクリーニング法におけるアゴニスト添加工程を無くし、（２）オーファン受容体の脱感作を変化させる化合物の同定が可能となる。アゴニストに非依存的な方法は、オーファン受容体の脱感作を変化させる化合物のスクリーニング前のオーファン受容体のアゴニストの同定工程をなくす。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧＰＣＲ内在化を変化させる化合物の識別方法に関する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の態様は、ＧＰＣＲの内在化を変化させる化合物の識別方法であって、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、および改変ＧＲＫを含む細胞であって、前記ＧＰＣＲが前記ＧＲＫの発現の際にアゴニストに非依存的な様式で少なくとも一部が内在化することを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記細胞を前記化合物に曝露する工程と、（ｃ）前記ＧＰＣＲ、アレスチン、または改変ＧＲＫの細胞分布を決定する工程と、（ｄ）（１）前記化合物の存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲ、アレスチン、または改変ＧＲＫの細胞分布と（２）前記化合物の非存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲ、アレスチン、または改変ＧＲＫの細胞分布との相違をモニターする工程とを含む方法である。上記方法ではアゴニストを得ることはできない。この方法では、工程（ｄ）の（１）と（２）との相違は、ＧＰＣＲ内在化の調整を示し得る。
【００１２】
ＧＲＫは、過剰発現することができ、その発現は誘導可能であり、ＣＡＡＸモチーフを含み得る。ＧＲＫは、ＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、またはその生物学的に活性なフラグメントであり得る。
【００１３】
ＧＰＣＲは、ＧＲＫによってリン酸化が増強されるように改変することができる。ＧＰＣＲは、β２ＡＲ（Ｙ３２６Ａ）、図１に列挙したＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲ、味覚受容体、クラスＡ  ＧＰＣＲ、クラスＢ  ＧＰＣＲ、変異ＧＰＣＲ、またはその生物学的に活性なフラグメントであり得る。
【００１４】
アレスチンは、視覚アレスチン、網膜錐体アレスチン、βアレスチン１、βアレスチン２、またはその生物学的に活性なフラグメントであり得る。
【００１５】
ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、およびアレスチンを検出可能に標識されうる。脱感作に関連する分子は検出可能に標識することができるか、脱感作に関連する分子と相互作用する分子は検出可能に標識することができる。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、ＧＰＣＲのリン酸化を変化させる化合物の識別方法であって、（ａ）ＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む細胞を得る工程と、（ｂ）前記細胞を前記化合物に曝露する工程と、（ｃ）前記化合物の存在下でＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化が変化するかどうかを同定する工程とを含む方法に関する。
【００１７】
ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布を決定することができる。（１）化合物の存在下での細胞中のＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布と（２）化合物の非存在下での細胞中の前記ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布との相違をモニターすることができる。（１）と（２）との相違を、ＧＰＣＲのリン酸化と相関させることができる。
【００１８】
ＧＲＫが原形質膜中に存在せず、これは、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化が変化したことを示し得る。ＧＰＣＲのリン酸化状態を同定することができる。ＧＲＫの活性を同定することができる。ＧＰＣＲの内在化能力を識別することができる。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する方法であって、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記アレスチンが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記アレスチンの細胞分布を決定する工程と、（ｃ）前記アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲの原形質膜で発現する能力に相関させる工程とを含む方法に関する。アレスチンは、小胞、ピット、エンドソーム、または脱感作経路中のいたる場所に局在し得る。
【００２０】
さらに、本発明は、ＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する方法であって、（ａ）ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記ＧＲＫが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記ＧＲＫの細胞分布を決定する工程と、（ｃ）前記ＧＲＫの細胞分布をＧＰＣＲの原形質膜で発現する能力に相関させる工程とを含むさらなる方法に関する。ＧＲＫは、原形質膜に局在し得る。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ＧＰＣＲのアレスチン結合能力を分析する方法であって、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記アレスチンが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記アレスチンの細胞分布を決定する工程と、（ｃ）前記アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲのアレスチン結合能力に相関させる工程とを含む方法に関する。アレスチンまたはＧＰＣＲは、小胞、ピット、またはエンドソームに局在し得る。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物に関する。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、宿主細胞中のＧＰＣＲの脱感作の調節によって疾患を治療する方法であって、（ａ）本発明の方法で同定された化合物を得る工程と、（ｂ）前記化合物を宿主に投与する工程とを含む方法に関する。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＧＰＣＲおよび改変ＧＲＫを含む宿主細胞に関する。ＧＲＫは誘導性を示すか過剰発現し得る。宿主細胞はアレスチンをさらに含み、前記アレスチンを検出可能に標識することができる。ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、脱感作に関連する別の分子、または脱感作に関連する分子と相互作用する分子を検出可能に標識することができる。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、ＧＰＣＲが構成的に内在化するＧＲＫをコードする核酸を改変する方法であって、（ａ）ＧＲＫをコードする核酸を得る工程と、（ｂ）前記ＧＲＫをコードする核酸を、前記コードされたＧＲＫがＣＡＡＸモチーフを含むように改変する工程であって、前記改変ＧＲＫがアゴニストの存在下でＧＰＣＲをリン酸化し、（ｃ）細胞中で改変ＧＲＫを発現する工程とを含む方法に関する。ＧＲＫをコードする核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４を含み得る。
【００２６】
本発明はまた、ＧＰＣＲおよび改変ＧＲＫを含む宿主細胞を含む、ＧＰＣＲの内在化を調整する化合物を識別するためのキットに関する。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、ＮＰＸＸＹモチーフおよびカルボキシル末端テールを含み、前記カルボキシル末端テールが推定パルミトイル化部位および１つまたは複数のリン酸化クラスターを含み、前記カルボキシル末端テールが、第２のＧＰＣＲ由来のカルボキシル末端の一部に融合した第１のＧＰＣＲ部分のカルボキシル末端領域の保持部分を含み、前記第２のＧＰＣＲが、１つまたは複数のリン酸化クラスターを含み、第２のＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５アミノ酸残基下流に第２の推定パルミトイル化部位をさらに含む改変ＧＰＣＲに関する。第１のＧＰＣＲがクラスＡ受容体であり得る。第１のＧＰＣＲは、ｈＧＰＲ３、ｈＧＰＲ６、ｈＧＰＲ１２、ｈＳＲＥＢ２、ｈＳＲＥＢ３、ｈＧＰＲ８、またはｈＧＰＲ２２であり得る。第２のＧＰＣＲはクラスＢ受容体であり得る。クラスＢ受容体は、バソプレシンＶ２受容体、ニューロテンシン１受容体、基質Ｐ受容体（ａ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびオキシトシン受容体からなる群から選択することができる。
【００２８】
本発明は、改変ＧＰＣＲをコードする核酸に関する。本発明は、配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４，５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０からなる群から選択される核酸を含む。本発明はまた、核酸を含む発現ベクターを含む。ベクターまたは核酸を含む宿主細胞も含まれる。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、ＧＰＣＲ活性について化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）少なくとも１つの改変ＧＰＣＲを発現する細胞を得る工程であって、前記細胞は検出可能な分子と接合した（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｏ）アレスチンをさらに含み、（ｂ）前記化合物に前記細胞を曝露する工程と、（ｃ）前記細胞内のアレスチンの位置を検出する工程と、（ｄ）前記化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と前記化合物の非存在下での細胞内のアレスチンの位置とを比較する工程と、（ｅ）（１）前記化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と（２）前記化合物の非存在下での細胞内のアレスチンの位置との相違を相関させる工程とを含む方法に関する。アレスチンを、エンドソーム、エンドサイトーシス小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、またはピット中で検出することができる。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの改変ＧＰＣＲを発現する細胞を含み、前記細胞が検出可能な分子と接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ）した脱感作に関連する分子をさらに含む、ＧＰＣＲの活性を調整する分子を同定するためのキットである。
【００３１】
【発明の実施の形態】
本発明の目的および利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読むことによって理解される。
【００３２】
本発明によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、第３版、２００１；「現代の分子生物学プロトコール」、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編、２００２（隔月毎に改訂）；「細胞生物学：実験ハンドブック」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９４；「現代の免疫学プロトコール」、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編、２００２（隔月毎に改訂）；「オリゴヌクレオチド合成」、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４；「核酸ハイブリッド形成」、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５；「転写と翻訳」、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４；「動物細胞培養、第４版」、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、２０００；「固定細胞と酵素」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニング実践ガイド」、１９８８；「抗体の使用：実験マニュアル：ポータブルプロトコール」、第１巻、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅｄ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８；「抗体の使用：実験マニュアル」、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅｄ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；「Ｇタンパク質共役型受容体」、Ｔ．Ｈａｇａら編、１９９９を参照のこと。
【００３３】
特記しない限り、明細書および特許請求の範囲で使用した以下の用語は、以下の意味を有する。
【００３４】
「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自立性単位として機能する（すなわち、それ自体の調節下で複製することができる）任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００３５】
「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントを連結して連結セグメントが複製することができるプラスミド、ファージ、コスミドなどのレプリコンである。
【００３６】
「ＤＮＡ分子」は、一本鎖形態または二本鎖らせんのいずれかの重合体のデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）をいう。この用語は、分子の一次構造および二次構造のみをいい、いかなる特定の三次構造にも制限されない。したがって、この用語には、特に線状ＤＮＡ（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体で見出される二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の考察では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿った５’→３’方向の配列のみを示す通常の慣習に従って、本明細書中に配列を記載することができる。
【００３７】
「複製起点」は、ＤＮＡ合成の開始に関連するＤＮＡ配列をいう。
【００３８】
ＤＮＡの「コード配列」は、適切な調節配列の調節下に置かれた場合に転写されてインビボでポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終結コドンによって決定される。コード配列は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえも含み得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’に存在する。
【００３９】
転写および翻訳調節配列は、宿主細胞中のコード配列を発現するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどのＤＮＡ調節配列である。
【００４０】
宿主細胞中のコード配列の発現は、誘導性を示し得る。「誘導性」は、発現を調節することができることを意味する。例えば、核酸は細胞中に存在し得るが、必要なシグナルが得られるまで発現しない。典型的には、タンパク質の誘導性発現を、タンパク質の誘導性転写へ必要なシグナルを必要とされるプロモーターによって調節される。しかし、細胞中の目的のＤＮＡ配列数を増加させるプロセスまたは配列によって発現を誘導することもできる。このようなプロセスまたは配列には、複製起点および細胞へのＤＮＡの物理的付加が含まれる。
【００４１】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、転写開始部位によって３’末端に結合し、バックグラウンドを越える検出レベルでの転写開始に必要な最小数の塩基またはエレメントを誘導するように上流（５’方向）に伸長する。プロモーター配列には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって都合よく定義される）およびＲＮＡポリメラーゼ結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が認められる。真核生物プロモーターは、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、常に含むわけではない。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加えて、シャイン・ダルカルノ配列を含む。
【００４２】
「発現調節配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、その後コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、転写および翻訳調節配列の「調節下」にある。
【００４３】
コード配列の前に「シグナル配列」を含むことができる。この配列は、宿主細胞にポリペプチドを細胞表面に導くか培地中にポリペプチドを分泌するように伝達するシグナルペプチド（ポリペプチドのＮ末端）をコードし、このシグナルペプチドは細胞からタンパク質が放出される前に宿主細胞によって切り取られる。原核生物および真核生物本来の種々のタンパク質に関連するシグナル配列を見出すことができる。
【００４４】
本明細書中で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプローブをいい、２つまたはそれ以上、好ましくは３つを超えるリボヌクレオチドを含む分子と定義する。その正確なサイズは多数の因子に依存し、言い換えれば、オリゴヌクレオチドの最終的機能および使用に依存する。
【００４５】
本明細書中で使用される、用語「プライマー」は、精製制限消化物として天然に存在するか合成され、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導因子の存在下ならびに適切な温度およびｐＨ）に置かれた場合に合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよく、誘導因子の存在下で所望の伸長産物の合成を開始するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの供給源、および方法の用途を含む多数の因子に依存する。例えば、標的配列の複雑さに依存する診断用には、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５〜２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少数のヌクレオチドを含むことができる。
【００４６】
本明細書中のプライマーを、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的になるように選択する。これは、プライマーはその各鎖とのハイブリッド形成に十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、テンプレート配列を正確に反映する必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチドフラグメントを、プライマーの５’末端に結合し、プライマーの残りの配列を鎖に相補的にすることができる。あるいは、プライマー配列がハイブリッド形成する鎖の配列と十分な相補性を有するので伸長産物の合成用のテンプレートが形成される場合、非相補性塩基またはより長い配列をプライマーに散在させることができる。
【００４７】
本明細書中で使用される、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は細菌酵素をいい、それぞれ特異的ヌクレオチド配列またはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する。
【００４８】
このようなＤＮＡが細胞内に移入される場合、細胞は外因性または内因性ＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを作製する染色体ＤＮＡに組み込まれていても（共有結合）いなくても良い。原核生物、酵母、および哺乳動物細胞では、例えば、形質転換ＤＮＡを、プラスミドなどのエピソームエレメントで維持することができる。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体の複製を介して娘細胞に受け継がれるように染色体に組み込まれた細胞である。この安定性は、真核細胞の形質転換ＤＮＡを含む娘細胞集団から構成される細胞株またはクローンを確立する能力によって証明される。「クローン」は、１つの細胞または有糸分裂による共通の先祖由来の細胞集団である。「細胞株」は、インビトロで何世代も安定に増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００４９】
少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）のヌクレオチドが規定の長さのＤＮＡ配列に適合する場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」である。実質的に相同的な配列を、配列データバンクで利用可能な標準的ソフトウェアを使用した配列比較または例えば特定の系で定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリッド形成実験によって同定することができる。適切なハイブリッド形成条件の定義は、当業者の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出、「ＤＮＡクローニング」、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出、「核酸ハイブリッド形成」、前出を参照のこと。
【００５０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１，３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および８９と同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列だけでなく、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６，１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０に縮重する配列もまた本発明の範囲内であると認識すべきである。「〜に縮重する」は、異なる三文字コドンを使用して特定のアミノ酸を特定することを意味する。
【００５１】
「アレスチン」は、全ての型の天然に存在するアレスチンか、または遺伝子操作により作出されたアレスチン変異体を意味し、視覚アレスチン（アレスチン１と呼ばれる場合もある）、網膜錐体アレスチン（アレスチン４と呼ばれる場合もある）、βアレスチン１（アレスチン２と呼ばれる場合もある）、およびβアレスチン２（アレスチン３と呼ばれる場合もある）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
「βＡＲＫ１」は、βアドレナリン作動性受容体キナーゼ１をいうＧＲＫ（ＧＲＫ２とも呼ばれる）である。
【００５３】
「βＡＲ」は、βアドレナリン作動性受容体をいうＧＰＣＲである。
【００５４】
ＧＰＣＲの「内在化」は、細胞表面膜から細胞外に残存する物質がアクセスし難い細胞内小胞膜へのトランスロケーションである。
【００５５】
「カルボキシ末端テール」は、膜スパン７の後のＧＰＣＲのカルボキシ末端テールを意味する。多数のＧＰＣＲのカルボキシ末端テールは、７回膜貫通ドメインの末端を記す保存されたＮＰＸＸＹモチーフの直後から始まる（すなわち、ＮＰＸＸＹモチーフに続く配列がＧＰＣＲのカルボキシ末端テールである）。カルボキシ末端テールは、比較的長くても（約数千のアミノ酸）、比較的短くても（約数十のアミノ酸）、事実上に存在しなくても（約１０アミノ酸未満）よい。本明細書中で使用される、「カルボキシル末端テール」は、３つ全ての変異型（比較的長いか、比較的短いか、実質的に現存しない）を意味し、パルミトイル化システイン残基を含んでいてもよく、含んでいなくても良い。
【００５６】
「クラスＡ受容体」は、ＨＥＫ−２９３細胞においてアレスチンタンパク質と共にアレスチン−ＧＦＰに関連する細胞内小胞またはエンドソームにトランスロケーションされないことが好ましい。
【００５７】
「クラスＢ受容体」は、ＨＥＫ−２９３細胞においてアレスチンタンパク質と共にアレスチン−ＧＦＰに関連する細胞内小胞またはエンドソームにトランスロケーションすることが好ましい。
【００５８】
「ＤＡＣ」は、任意の脱感作活性化合物を意味する。脱感作活性化合物は、プロセスの刺激または阻害によってＧＰＣＲ脱感作機構に影響を与える任意の化合物である。ＤＡＣは、プロセスの任意の細胞成分およびプロセスに関連する任意の細胞構造（アレスチン、ＧＲＫ，ＧＰＣＲ、ホスホイノシチド３−キナーゼ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなどが含まれるが、これらに限定されない）への作用によってＧＰＣＲ脱感作経路に影響を与え得る。ＤＡＣは、アレスチンのＧＰＣＲへのトランスロケーションを阻害する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの結合を阻害する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへのトランスロケーションを刺激する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの結合を刺激する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を阻害する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を刺激する化合物、ＧＲＫのＧＰＣＲへの結合を刺激または阻害する化合物、ＧＰＣＲのプロテインホスファターゼ脱感作を阻害する化合物、ＧＰＣＲのプロテインホスファターゼ脱感作を刺激ＧＰＣＲ内在化または細胞表面への再循環を防止する化合物、ＧＰＣＲからのアレスチンの放出、ＧＰＣＲのアンタゴニスト、逆アゴニストなどの放出を調節する化合物を含み得るが、これらに限定されない。ＤＡＣは、ＧＰＣＲ脱感作プロセスを阻害または刺激することができ、ＧＰＣＲの一過性アゴニストおよびアンタゴニストと同一のＧＰＣＲリガンド結合部位に結合しなくてもよい。ＤＡＣは、ＧＰＣＲと独立して作用することができる（すなわち、ＤＡＣは１つの特定のＧＰＣＲまたはＧＰＣＲの１つの特定の型に高い親和性を示さない）。ＤＡＣは、アゴニストまたはアンタゴニストと同一の部位に結合することができるが、受容体を脱感作しない（おそらく、受容体を全くリン酸化しないかアレスチンまたは任意の他のタンパク質に結合しないことによる）。ＤＡＣは、受容体のアロステリック部位に結合して脱感作を阻害または増強することができる。
【００５９】
「検出可能な分子」は、分光光学、光化学、生化学、免疫化学、電気的、放射性、および光学的手段（蛍光、リン光、および生体発光、放射性崩壊が含まれるが、これらに限定されない）で検出することができる任意の分子を意味する。検出可能な分子には、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ローダミン結合抗体などが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、放射性同位元素、エピトープタグ、親和性標識、酵素、蛍光発光団、化学発光団などが含まれる。検出可能な分子には、他の分子との相互作用の関数として間接的に、または直接に検出される分子が含まれる。
【００６０】
「ＧＦＰ」は、緑色蛍光タンパク質を意味し、天然の供給源から単離するか遺伝子操作することができるＧＦＰの種々の天然に存在する形態ならびに人為的に改変されたＧＦＰをいう。ＧＦＰは当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，６２５，０４８号、同第５，７７７，０７９号、および同第６，０６６，４７６号を参照のこと。ＧＦＰが天然の供給源から単離されるか遺伝子操作された他の蛍光タンパク質（黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェリン、ＵＶ励起性蛍光タンパク質、または両者の間の波長のタンパク質が含まれるが、これらに限定されない）と容易に交換可能であることが当該分野で十分に理解されている。本明細書中で使用される、「ＧＦＰ」は、当該分野で既知の全ての蛍光タンパク質を意味する。
【００６１】
「未知のまたはオーファン受容体」は、そのリガンドが未知のＧＰＣＲを意味する。
【００６２】
「下流（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」は、アミノ末端に関して、アミノ酸配列のカルボキシル末端側を意味する。
【００６３】
「上流（Ｕｐｓｔｒｅａｍ）」は、カルボキシル末端に関して、アミノ酸配列のアミノ末端側を意味する。
【００６４】
特に好ましい性質を有するアミノ酸に置換するためのアミノ酸置換を導入することができる。例えば、Ｃｙｓを、別のＣｙｓとジスルフィド結合を形成する潜在的部位に導入することができる。Ｈｉｓを、特定の「触媒」残基として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、生体触媒において最も一般的なアミノ酸である）。タンパク質構造中にβターンを含む特定の平面構造のために、Ｐｒｏを導入することができる。
【００６５】
少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）のアミノ酸残基が同一であるか、保存的置換を示す場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」である。
【００６６】
ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、本来より大きな分子との会合で見出されないより大きなＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントである。したがって、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、遺伝子は、通常、元の生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接する。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が本来見出されない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡまたは天然の遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または天然に存在する変異事象によって、本明細書中に定義のＤＮＡの異種領域は得られない。
【００６７】
用語「薬学的に許容可能な」は、生理学的に耐性を示すか典型的にはヒトに投与した場合にアレルギー反応または類似の不適切な反応（胃の不調など）を起こさない分子構成要素および組成物をいう。
【００６８】
本明細書中で使用される、用語「治療有効量」は、いくつかの病理学的特徴（例えば、血圧の上昇、呼吸排出量など）を予防し、好ましくは緩和するのに十分な量を意味する。
【００６９】
発現調節配列がＤＮＡ配列の転写および翻訳を調節および制御する場合、ＤＮＡ配列は発現調節配列に「作動可能に連結」している。用語「作動可能に連結された」には、発現すべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有することならびに発現調節配列の調節下でＤＮＡ配列を発現させてＤＮＡ配列によってコードされた所望の産物を産生する正確なリーディングフレームを維持することが含まれる。組換えＤＮＡ分子への挿入を所望する遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルを、この遺伝子の前に挿入することができる。
【００７０】
「ハイブリッド形成」は、相補性ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間のワトソン−クリック、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）または逆フーグスティーン水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は、水素結合を介して対合する相補性ヌクレオチド塩基である。
【００７１】
用語「標準ハイブリッド形成条件」は、ハイブリッド形成および洗浄の両方について実質的に５×ＳＳＣおよび６５℃に等しい塩および温度条件をいう。しかし、当業者は、このような「標準ハイブリッド形成条件」は、緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチ率、ホルムアミドの割合などを含む特定の条件に依存することを認識する。ハイブリッド形成する２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡであるかどうかもまた「標準ハイブリッド形成条件」の決定に重要である。当業者は、このような標準ハイブリッド形成条件を、予想または決定されたＴｍより典型的には１０〜２０℃低い温度で、所望ならばより高ストリンジェンシーの洗浄を使用してハイブリッド形成させる周知の形式にしたがって容易に決定する。
【００７２】
「動物」は、脊椎動物（例えば、カエル、サンショウウオ、ニワトリ、またはウマ）および無脊椎動物（例えば、蠕虫など）を含む動物界の任意の構成要素を意味する。「動物」はまた、「哺乳動物」を含むことを意味する。好ましい哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、バッファロー、ウマ、ヒツジ、ブタ、およびヤギなどの有蹄類）、げっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラット、およびモルモット）、イヌ、ネコ、霊長類、オオカミ、ラクダ、シカ、げっ歯類、鳥類、魚類が含まれる。
【００７３】
「アンタゴニスト」には、アゴニストへの野生型および／または改変ＧＰＣＲ結合、野生型および／または改変ＧＰＣＲ脱感作、野生型および／または改変ＧＰＣＲ結合アレスチン、野生型および／または改変ＧＰＣＲエンドソーム局在化、内在化などを阻害する全ての因子が含まれ、これには、野生型および／または改変ＧＰＣＲに影響を与える因子ならびに野生型および／または改変ＧＰＣＲシグナル伝達、脱感作、エンドソーム局在化、再感作などに関連する他のタンパク質に影響を与える因子が含まれる。
【００７４】
「改変ＧＰＣＲ」は、そのカルボキシル末端テールのアミノ酸配列中に１つまたは複数の改変を有するＧＰＣＲを意味する。したがって、カルボキシ末端テールの全体または一部を改変することができる。アミノ酸配列におけるこれらの改変には、１つまたは複数のアミノ酸の変異、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、および１つまたは複数のアミノ酸が欠失され且つ欠失アミノ酸の代わりに１つまたは複数のアミノ酸が付加される１つまたは複数のアミノ酸の置換が含まれる。このような改変ＧＰＣＲは、本明細書中および米国特許出願番号０９／９９３，８４４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【００７５】
「ＧＰＣＲ」はＧタンパク質共役型受容体を意味し、これには天然に存在するＧＰＣＲおよび改変されたＧＰＣＲが含まれる。
【００７６】
「推定パルミトイル化部位」は、予想されるパルミチン酸付加部位（好ましくはシステイン残基）を意味する。本発明の使用されるＧＰＣＲでは、推定パルミトイル化部位は、ＮＰＸＸＹモチーフから好ましくは１０〜２５アミノ酸残基、好ましくは１５〜２０アミノ酸残基下流に存在する。
【００７７】
「リン酸化部位のクラスター」は、有効なリン酸化によりリン酸化部位として容易に機能することができるアミノ酸残基のクラスターを意味する。アミノ酸クラスターは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端テール中で２つのうち２つ、３つのうち２つ、３つのうち３つ、４つのうち３つ、４つのうち４つ、５つのうち４つ、５つのうち５つなどの連続アミノ酸位置を占める。これらのリン酸化部位のクラスターは、好ましくは、セリン（Ｓ）および／またはトレオニン（Ｔ）残基のクラスターである。得られる改変ＧＰＣＲがエンドソーム中でのアレスチンを利用に十分な親和性でアレスチンに結合するように、リン酸化部位のクラスターをＧＰＣＲ配列に置換、挿入、または付加することができる。
【００７８】
「ＮＰＸＸＹモチーフ」は、７回膜貫通ドメインの末端を記す保存アミノ酸モチーフを意味する。保存アミノ酸モチーフは、最も頻繁には、アスパラギンおよびプロリンから始まり、その後２つの不特定のアミノ酸をはさみ、チロシンへと続く。２つの不特定のアミノ酸は、ＧＰＣＲ間で非常に変化し得るが、ＮＰＸＸＹモチーフ全体は保存されている。
【００７９】
「異常なＧＰＣＲ脱感作」および「異常な脱感作」は、活性受容体と脱感作受容体との間のバランスが野生型条件で変化するようにＧＰＣＲ脱感作経路が破壊されていることを意味する。通常よりも活性の高い受容体が存在するか、野生型条件よりも脱感作された受容体が存在する。異常なＧＰＣＲ脱感作は、構成性に活性であるか構成性に脱感作されて、この受容体のシグナル伝達が通常のものより増大するかこの受容体のシグナル伝達が通常のものより減少するＧＰＣＲの結果であり得る。
【００８０】
「生体サンプル」は、被験体から単離した組織、細胞、および生体流動体ならびに被験体内に存在する組織、細胞、および生体流動体を含むことを意図し、前記サンプルは、血液、血清、尿サンプル、糞便サンプル、腫瘍サンプル、細胞洗浄物、口腔サンプル、唾液、生体流動体、組織抽出物、新たに採取した細胞、または組織培養でインキュベートした細胞であり得る。
【００８１】
「即時投与」、「組み合わせ投与」、「同時投与」、または「同時に投与する」は、化合物を、同時または本質的に２つまたはそれ以上の化合物があたかも同時に投与されたかのような結果が得られるほど十分に短い時間で投与することを意味する。
【００８２】
「保存的な異常」は、ＧＰＣＲ経路の異常（異常なＣＰＧＲシグナル伝達によって引き起こされ得るＧＰＣＲ、ＧＲＫ、アレスチン、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなどの異常が含まれるが、これらに限定されない）を意味する。この異常なＧＰＣＲシグナル伝達は、ＧＰＣＲ関連疾患に寄与し得る。
【００８３】
「脱感作ＧＰＣＲ」は、アゴニストに反応する能力および従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力をもはや持たないＧＰＣＲを意味する。
【００８４】
「脱感作経路」は、脱感作プロセスの任意の細胞成分ならびに脱感作プロセスおよびその後のプロセスに関連する細胞構造を意味し、これには、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、プロテインホスファターゼなどが含まれるが、これらに限定されない。本発明のアッセイ法では、例えば細胞質中、細胞膜中、クラスリンコートピット中、細胞内処方中、エンドソーム中など、それらの間の任意の段階においてポリペプチドを検出することができる。
【００８５】
「ＧＰＣＲシグナル伝達」は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ誘導活性化を意味する。これにより、例えば、ｃＡＭＰを産生することができる。
【００８６】
「Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ」（ＧＲＫ）には、ＧＰＣＲをリン酸化する能力を有する任意のキナーゼが含まれる。本発明で使用することができる一定のＧＲＫを、図２に列挙する。スプライス変異体、生物学的に活性なフラグメント、改変ＧＲＫ、ならびに動物および他の生物由来のＧＲＫが含まれる。
【００８７】
「ホモサピエンスＧＰＣＲ」は、ホモサピエンスにおいて天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
【００８８】
「逆アゴニスト」は、ＧＰＣＲへの結合の際、ＧＰＣＲの基本的な固有の活性を阻害する化合物を意味する。逆アゴニストはある種のアンタゴニストである。
【００８９】
「改変ＧＲＫ」は、脱感作が変化するように改変されたＧＲＫを意味する。
【００９０】
「天然に存在するＧＰＣＲ」は、自然界で存在するＧＰＣＲを意味する。
【００９１】
「臭気物質リガンド」は、受容体への結合の際にアゴニストおよびアンタゴニスト分子を含む合成化合物および／または組換えによって産性した化合物を含む臭気を知覚するリガンド化合物を意味する。
【００９２】
「臭気物質受容体」は、通常、活性化された場合（通常、臭気物質リガンドの結合による）に臭気を感知する臭覚ニューロン表面に見出される受容体を意味する。
【００９３】
本明細書中で使用される、用語「薬学的に許容可能なキャリア」は、薬学的に許容可能な物質、組成物、または賦形剤（化学物質の送達または運搬に関連する液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化材料など）を意味する。
【００９４】
「感作ＧＰＣＲ」は、目下のところアゴニストに反応して従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化させる能力を有するＧＰＣＲを意味する。
【００９５】
「調整（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」には、発現の少なくともアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションまたはタンパク質活性の増加もしくは減少が含まれる。タンパク質の調整には、タンパク質またはタンパク質を制御（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）する化合物の活性のアップレギュレーション、ダウンレギュレーション、増加、または減少が含まれる。調整には、遺伝子、ｍＲＮＡ、または目的のタンパク質の合成における任意の他の工程の制御も含まれる。
【００９６】
「過剰発現」タンパク質は、野生型発現レベルよりも高いレベルで発現するタンパク質をいう。
【００９７】
「改変ＧＲＫ」は、ＧＲＫのＣ末端のアミノ酸配列における１つまたは複数の改変を有するＧＲＫを意味する。改変ＧＲＫは、原形質膜に構成的に局在化する。好ましくは、ＧＲＫは、ＣＡＡＸモチーフの付加によって改変される。
【００９８】
「ＣＡＡＸ」モチーフは、Ｃがシステインであり、Ａが脂肪族アミノ酸であり、Ｘがタンパク質のＣ末端アミノ酸である、４つのアミノ酸配列を意味する。
【００９９】
「構成性」活性は、アゴニストの非存在下で得られる活性を意味する。例えば、改変ＧＲＫが原形質膜に構成的に局在化するとは、改変ＧＲＫがアゴニストの非存在下で原形質膜に局在することを意味する。
【０１００】
「ＧＲＫ−Ｃ２０」は、ＧＲＫに付加されたゲラニルゲラニル基を有する能力を有する改変ＧＲＫをいう。ＧＲＫ２−Ｃ２０は、この様式で改変されたＧＲＫ２である。好ましくは、ＧＲＫ−Ｃ２０は、ＣＡＡＸモチーフを含む。
【０１０１】
本発明者らは、ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物の独立スクリーニング法を開発した。これＧＰＣＲがアゴニストの非存在下で脱感作される細胞株を開発した。これらの細胞株には、改変することができるＧＲＫが含まれる。これらの細胞株を使用して、アゴニストの非存在下でのＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物のスクリーニング法を開発した。これらの方法は、スクリーニング法からアゴニスト添加工程を省く。この工程の省略により、（１）公知のアゴニストを用いてＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物のより有効なスクリーニング法が得られ、（２）公知のアゴニストを持たないオーファンＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物のスクリーニング法が得られる。ＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを同定し、ＧＰＣＲがアレスチンに対する親和性を有するかを同定する方法が開発され、好ましくは、これらの方法は、オーファンＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む宿主細胞を使用し、前記ＧＰＣＲはＧＲＫの発現の際にアゴニストに非依存的な様式で少なくとも部分的に内在化されるので、アゴニスト添加の必要性がなくなる。アレスチンに対する親和性を増加させるためにＧＰＣＲを改変した。これらの改変ＧＰＣＲは、脱感作を変化させる化合物のアゴニスト独立スクリーニング法に有用である。
【０１０２】
［ＧＰＣＲおよび脱感作］
アゴニストへのＧＰＣＲの曝露により、同族ヘテロ三量体Ｇタンパク質由来の受容体の非共役を含むシグナル伝達能力が急速に弱まる。アゴニスト特異的または同種の脱感作を調節する細胞機構は、アゴニスト共役型受容体をＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）でリン酸化して、アレスチンタンパク質に結合する２工程である。
【０１０３】
アゴニストがＧＰＣＲに結合した後、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）は、ＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化することが知られている。リン酸化後、アレスチンタンパク質は、ＧＲＫリン酸化状態に会合し、同族Ｇタンパク質から受容体を分離する。アレスチンのリン酸化ＧＰＣＲとの相互作用により、ＧＰＣＲシグナル伝達が終結し、シグナル伝達を行わない脱感作受容体が得られる。
【０１０４】
脱感作ＧＰＣＲに結合したアレスチンは、ＧＰＣＲをアダプタータンパク質２（ＡＰ−２）およびクラスリンなどエンドサイトーシス機構の成分に結合するアダプタータンパク質としての機能化によって、ＧＰＣＲをクラスリンコートピットまたは他のエンドサイトーシス（すなわち、内面化）のための細胞機構に標的する。内在化ＧＰＣＲは、脱リン酸化され、再感作された細胞表面で再利用され、細胞内に保持されるか分解される。アレスチンのＧＰＣＲとの相互作用能力は、ＧＰＣＲ脱リン酸化、再利用、および再感作速度を予想する１つの要因である。ＧＰＣＲリン酸化および脱感作プロセスにおける脱リン酸化は、２００１年１１月５日に提出された米国特許出願番号０９／９３３，８４４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に例示されている。
【０１０５】
本明細書中に記載の方法を使用して、本発明者らは、アレスチンに親和性を示さない一定のＧＰＣＲを同定した。カルボキシル末端テールに適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化、好ましくはリン酸化部位のクラスターを含むようにこれらのＧＰＣＲを改変した。この改変により、改変ＧＰＣＲがアレスチンと安定な複合体を形成し、１つの単位としてエンドソームに内在化する。これらの改変ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ活性アッセイ法に有用であり得る。これらの改変ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲのアゴニストの同定に有用であり得る。これらの改変ＧＰＣＲは、本明細書中に記載のアゴニスト非依存的スクリーニング法で有用であり得る。
【０１０６】
ＤＲＹモチーフを含むように変化させたＧＰＣＲを使用したアゴニストに非依存的なスクリーニング法は、米国特許出願番号１０／０５４，６１６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。ＧＰＣＲの変更は、このスクリーニング法に含まれており、利用される各ＧＰＣＲはこのような様式で変更されなければならない。
【０１０７】
本発明者らは、改変することができるＧＲＫを使用したアゴニストに非依存的なスクリーニング法を開発した。これらのＧＲＫは、アゴニストの非存在下でＧＰＣＲをリン酸化する。これらのリン酸化されたＧＰＣＲは、アゴニストの非存在下で内在化される。本発明者らは、これらの改変ＧＲＫを使用したＧＰＣＲ内在化のアゴニストをスクリーニングするための、アゴニストに非依存的な方法を開発した。これらの方法は、米国特許出願番号１０／０５４，６１６に記載されたＧＰＣＲ改変を必要としない。
【０１０８】
以前に、一定のＧＲＫが、原形質膜に構成的に局在することが示された。Ｉｎｇｌｅｓｅらは、構成的にイソプレニル化され、膜に局在するＧＲＫ２−Ｃ２０を構築した。
【０１０９】
本発明者らは、原形質膜に構成的に局在するＧＲＫの細胞発現により、ＧＰＣＲが旺盛的に脱感作されると同定した。これらのＧＲＫは、過剰発現することができ、発現を誘導することができ、これをコードする核酸をベクターに局在させるかゲノムに組み込むことができる。本発明者らは、原形質膜に構成的に局在するＧＲＫを発現する宿主細胞を構築した。これらの宿主細胞もまた、アレスチンを発現することができる。これらの宿主細胞に、目的のＧＰＣＲを移入した。ＧＲＫ含有細胞を使用して、目的のＧＰＣＲの原形質膜での発現を同定し、ＧＰＣＲのアレスチン結合能力を分析し、構成的に脱感作したＧＰＣＲを検出する方法を開発した。これらの脱感作法を構築し、アゴニストに非依存的な、ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物の識別方法を開発した。これらの方法は、ＧＰＣＲアゴニストの既知であるか、または未知である、ＧＰＣＲの内在化を変化させる化合物の同定に有用である。
【０１１０】
本発明者らはまた、ＧＲＫが原形質膜中に構成的に局在するかどうかにかかわらず、野生型または改変ＧＲＫの増加により脱感作が増加するかを同定した。
【０１１１】
本発明は、改変ＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲのポリペプチド、改変ＧＰＣＲをコードする核酸分子、改変ＧＰＣＲをコードする核酸分子を含むベクター、改変ＧＰＣＲの核酸を構築することができるベクター、および改変ＧＰＣＲを含む細胞に関する。本発明は、さらに、改変ＧＰＣＲを使用するアッセイ系、改変ＧＰＣＲを含む細胞を使用するアッセイ系、アッセイ系を使用して同定した化合物、同定した化合物を使用した治療法、アッセイ系を使用した疾患の診断法、および本発明のアッセイ試薬および本発明の細胞を含むキットに関する。
【０１１２】
特定のコドンを異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するようにＧＰＣＲまたは改変ＧＰＣＲ変異させることができる。このような変異は、一般に、可能な最も少数のヌクレオチドの変化によって行う。得られたタンパク質が非保存的な様式（すなわち、ある粒子サイズまたは特徴を有するアミノ酸グループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸へのコドンの変化による）または保存的な様式（すなわち、ある粒子サイズまたは特徴を有するアミノ酸グループに属するアミノ酸から同一のグループに属するアミノ酸へのコドンの変化による）でアミノ酸が変化すように、この種の置換変異を行うことができる。一般に、このような保存的変化により、得られたタンパク質の構造および機能はあまり変化しない。非保存的変化は、おそらく得られたタンパク質の構造、活性、または機能が変化する。本発明は、得られたタンパク質の活性および結合特性が有意に変化していない保存的に変化した配列を含めることを考慮すべきである。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明の改変ＧＰＣＲには、カルボキシ末端テールに適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを有するように改変したＧＰＣＲが含まれる。これらの改変ＧＰＣＲは、アゴニスト刺激から約３０分以内にエンドソームに漸増する。これらの改変ＧＰＣＲは、本明細書中に記載の細胞中のエンドソームに漸増し、ＧＰＣＲはアゴニストに依存的な様式でリン酸化される。
【０１１４】
本発明の改変ＧＰＣＲは、カルボキシル末端テールに適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを含む。本発明者らは、カルボキシル末端テールに適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターは、本明細書中に記載のアゴニストでの刺激後またはアゴニストに非依存的な様式のいずれかで、アレスチンに対する親和性が増加し、ＧＰＣＲリン酸化の際にエンドソーム中にアレスチンと同時局在化することを発見した。本発明者らはまた、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターは、ＧＰＣＲのアレスチンに対する親和性が増加するようにＧＰＣＲテール内に最適に存在しなければならないことを発見した。したがって、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターがカルボキシ末端テール内に最適に存在するように改変ＧＰＣＲを構築することができる。互いに融合して改変ＧＰＣＲを形成するポリペプチドの一部を、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターがカルボキシ末端テール内に適切に確かに存在するように選択する。あるいは、改変ＧＰＣＲを作成するための個別の点変異の位置を、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターがカルボキシ末端テール内に適切に位置付けられるように選択することができる。
【０１１５】
本発明者らは、本発明の改変ＧＰＣＲがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性を変化させることができる化合物のスクリーニングアッセイに有用であることを発見した。本発明を使用することができるアッセイの例には、米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のアッセイが含まれるが、これらに限定されない。本発明を使用することができるアッセイのさらなる例には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を使用するアッセイおよびＡｎｇｅｒｓ，Ｓ．、Ｓａｌａｈｐｏｕｒ，Ａ．、Ｊｏｌｙ，Ｅ．、Ｈｉｌａｉｒｅｔ，Ｓ．、Ｃｈｅｌｓｋｙ、「生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を使用した生細胞中のβ２アドレナリン作動性受容体の二量体化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、７、３６８４〜３６８９に記載の生物発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）技術を使用するアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明者らは、これらの改変ＧＰＣＲがＧＰＣＲ内在化を変化させることができる化合物をスクリーニングするための、アゴニストに非依存的な方法に有用であると同定した。本発明を使用することができるアッセイのさらなる例には、本明細書中に記載のアッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
ＧＰＣＲ脱感作の増強
本発明は、ＧＰＣＲ脱感作の増強法を提供する。１つの実施形態は、改変することができるＧＲＫの発現に関する。ＧＲＫを過剰発現することができるか、その発現を誘導することができる。これらの方法を使用して、ＧＰＣＲ（改変ＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、味覚受容体、変異ＧＰＣＲ、β２ＡＲ  Ｙ３２６ＡＧＰＣＲ変異体、または別のＧＰＣＲを含む）の脱感作を分析することができる。本発明に有用な一定のＧＰＣＲを、図１に列挙する。
【０１１８】
好ましい実施形態では、発現系およびＧＲＫをコードする核酸を含む細胞を得る。ＧＲＫの発現によりＧＰＣＲが構成的に脱感作されるようにＧＲＫを改変することができる。ＧＲＫを過剰発現し、その発現を誘導することができる。
【０１１９】
好ましくは、改変することができるＧＲＫおよびアレスチンを含む宿主細胞を得る。次いで、これらの細胞にＧＰＣＲを添加する。アゴニストに非依存的なＧＰＣＲの脱感作を検出する。図４、５、６、および７は、この方法の例である。検出法を以下に記載する。
【０１２０】
本発明は、目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する方法を提供する。原形質膜で発現したＧＰＣＲは、先に記載した化合物の識別方法に有用である。
【０１２１】
目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する好ましい方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記アレスチンが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記アレスチンの細胞分布を決定する工程と、（ｃ）前記アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲの原形質膜で発現する能力に相関させる工程とを含む。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態を、実施例２、３、４、５、６、および７に記載し、図４、５、６、および７に例示する。
【０１２３】
目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する別の方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記ＧＲＫが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記ＧＲＫの細胞分布を決定する工程と、（ｃ）前記ＧＲＫの細胞分布をＧＰＣＲの原形質膜で発現する能力に相関させる工程とを含む。
【０１２４】
本発明は、ＧＰＣＲがアレスチンに結合する能力の分析法を提供する。アレスチンに結合するＧＰＣＲは、上記の化合物の識別方法に有用である。
【０１２５】
ＧＰＣＲのアレスチン結合能力を分析する好ましい方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞であって、前記アレスチンが検出可能に標識されていることを特徴とする細胞を得る工程と、（ｂ）前記アレスチンの細胞分布を決定する工程と、（ｃ）前記アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲのアレスチン結合能力に相関させる工程とを含む。
【０１２６】
本発明の好ましい実施形態を、実施例２、３、４、５、６、および７に記載し、図４、５、６、および７に例示する。
【０１２７】
本発明の方法を使用して、一定のＧＰＣＲはアレスチンに結合して脱感作する。しかし、一定のＧＰＣＲは、米国特許出願番号０９／９９３，８４４に記載のようにＧＰＣＲを改変せずに脱感作しない。本発明者らは、図３に列挙した公知およびオーファンＧＰＣＲを含むいくつかのＧＰＣＲを可変した。改変の際、これらの改変ＧＰＣＲは、上記系で構成的に脱感作した。
【０１２８】
［改変ＧＰＣＲ］
本発明は、改変ＧＰＣＲに関する。本発明の改変ＧＰＣＲは、そのカルボキシ末端テールに１つまたは複数の可変を含み得る。これらの改変は、カルボキシル末端テールの一定の領域内に１つまたは複数のリン酸化、好ましくはリン酸化部位のクラスターを含み得る。したがって、カルボキシ末端テールの全体または一部を改変することができる。多数のＧＰＣＲのカルボキシ末端テールは、７回膜貫通ドメインの末端を記す保存されたＮＰＸＸＹモチーフの直後から始まる（すなわち、ＮＰＸＸＹモチーフに続く配列がＧＰＣＲのカルボキシ末端テールである）。多数のＧＰＣＲのカルボキシ末端テールは、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５アミノ酸残基、好ましくは１５〜２０アミノ酸残基下流に推定パルミトイル化部位を含む。この部位は、典型的には、１つまたは複数のシステイン残基である。ＧＰＣＲのカルボキシ末端、比較的に長くても、比較的短くても、事実上存在しなくてもよい。本発明者らは、ＧＰＣＲのカルボキシ末端テールによりアレスチン結合の親和性が決定されると同定した。
【０１２９】
本発明者らは、カルボキシ末端テール中の特異的アミノ酸モチーフが安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進し、それにより最終的にアレスチンのエンドソームへの漸増を促進することができることを発見した。これらのアミノ酸モチーフは、有効にリン酸化されることによりリン酸化部位として容易に機能する１つまたは複数のアミノ酸、好ましくはアミノ酸残基のクラスターを含む。アミノ酸クラスターは、２つのうち２つ、３つのうち２つ、３つのうち３つ、４つのうち３つ、４つのうち４つ、５つのうち４つ、５つのうち５つなどの連続アミノ酸位置を占め得る。したがって、安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体形成を促進するアミノ酸クラスターは、「リン酸化部位クラスター」である。リン酸化部位のこれらのクラスターは、好ましくは、セリンおよびトレオニン残基のクラスターである。
【０１３０】
アレスチンと安定な複合体を形成するＧＰＣＲは、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを含む。１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターに加えて、この部位は、安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体形成を促進するためにカルボキシ末端テール内に適切に存在しなければならないことを発見した。安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するために、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターは、ＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位の約１５〜３５（好ましくは１５〜２５）アミノ酸残基下流に存在し得る。さらに、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターは、ＧＰＣＲのＮＲＸＸＹモチーフの約２０〜５５（好ましくは３０〜４５）アミノ酸残基下流に存在し得る。適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを含むＧＰＣＲは、典型的にはクラスＢ受容体である。
【０１３１】
例として、Ｖ２Ｒ受容体は、推定パルミトイル化部位の１９アミノ酸残基下流およびＮＲＸＸＹモチーフの３６アミノ酸残基下流に安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するリン酸化部位のクラスター（ＳＳＳ）を含むことが発見された。ＮＴＲ−２受容体は、推定パルミトイル化部位の２６アミノ酸残基下流およびＮＲＸＸＹモチーフの４５アミノ酸残基下流に安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するリン酸化部位のクラスター（ＳＴＳ）を含む。オキシトシン受容体（ＯＴＲ）授与体は、一方は推定パルミトイル化部位の２０アミノ酸残基下流および他方はＮＲＸＸＹモチーフの２９アミノ酸残基下流に、そして一方はＮＲＸＸＹモチーフの３８アミノ酸残基下流および他方はＮＲＸＸＹモチーフの４７アミノ酸残基下流に安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進する２つのリン酸化部位のクラスター（ＳＳＬＳＴおよびＳＴＬＳ）を含む。基質Ｐ受容体（ＳＰＲ、ニューロキニン１受容体としても公知）は、推定パルミトイル化部位の３２アミノ酸残基下流およびＮＲＸＸＹモチーフの５０アミノ酸残基下流に安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するリン酸化部位のクラスター（ＴＴＩＳＴ）を含む。
【０１３２】
本発明者らは、カルボキシル末端テール内に存在する１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを欠くＧＰＣＲは、あまり安定でなく、原形質膜またはその近傍で解離しているＧＰＣＲ／アレスチン複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成すると同定した。これらのＧＰＣＲは、典型的にはクラスＡ受容体、オーファン受容体、味覚受容体などである。しかし、本発明者らは、本来１つまたは複数のリン酸化部位を欠き、これらの受容体のカルボキシル末端テールの改変によってアレスチンに対する親和性が低い安定なＧＰＣＲ／アレスチン複合体を得ることができることを発見した。好ましくは、カルボキシル末端テールを、カルボキシル末端テール内に適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを含むように改変する。
【０１３３】
本発明は、これらの改変ＧＰＣＲのポリペプチド配列を含む。本発明の改変ＧＰＣＲは、そのカルボキシ末端テール中に適切に位置付けられた１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを有するように改変されたＧＰＣＲを含む。本発明の改変ＧＰＣＲのポリペプチド配列はまた、１つまたは複数の付加、欠失、置換、または変異を有する配列を含む。これらの変異は、好ましくは、保存様式（すなわち、粒子サイズまたは特徴を有するアミノ酸グループに属するアミノ酸から同一のグループへのコドンの変化）で作製された置換変異である。このような保存的変化により、一般に、得られたタンパク質の構造および機能はあまり変化しない。本発明は、得られたタンパク質の活性または結合特性が有意に変化していない保存的に変化した配列を含めることを考慮すべきである。
【０１３４】
本発明の改変ＧＰＣＲは、ＮＰＸＸＹモチーフを含むＧＰＣＲ、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５アミノ酸残基（好ましくは１５〜２０アミノ酸）下流の推定パルミトイル部位、および改変カルボキシ末端テールを含む。改変カルボキシ末端テールは、リン酸化部位が改変ＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位の約１５〜３５、好ましくは１５〜２５アミノ酸残基下流であるように１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを有する。改変カルボキシル末端テールは、リン酸化部位が改変ＧＰＣＲのＮＰＸＸＹの約２０〜５５、好ましくは３０〜４５アミノ酸残基下流であるように１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを有する。
【０１３５】
本発明は、さらに、改変ＧＰＣＲをコードする単離核酸分子を含む。改変ＧＰＣＲと同一のアミノ酸配列を有するが縮重している改変ＧＰＣＲをコードする改変ＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内であることも認識すべきである。「〜に縮重する」は、異なる３文字コドンを使用して特定のアミノ酸を特定することを意味する。
【０１３６】
当業者が容易に理解するように、多数のＧＰＣＲのカルボキシルテールを、７回膜貫通ドメインの末端を記すＮＰＸＸＹモチーフによって識別することができる。
【０１３７】
本発明の改変カルボキシル末端領域を含む改変ＧＰＣＲを作製するために、リン酸部位またはリン酸部位のクラスターを欠くか、アレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲは、そのカルボキシル末端テール中のアミノ酸残基に１つまたは複数の付加、置換、欠失、または変異を含み得る。カルボキシル末端テールが、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを含むように改変されるようにこれらの付加、置換、欠失、または変異を行う。例として、改変ＧＰＣＲが得られるように、アミノ酸残基を個別に点変異することができる。例として、３つの連続するアミノ酸を、改変ＧＰＣＲが得られるようにセリン残基に変異することができる。１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターがカルボキシル末端テール内に適切に位置付けられるように、これらの変異を行う。
【０１３８】
さらに、改変カルボキシル末端領域を含む改変ＧＰＣＲを作製するために、リン酸部位またはリン酸部位のクラスターを欠くか、アレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲの核酸配列を、特定のコドンを異なるアミノ酸、好ましくはセリンまたはトレオニンをコードするコドンに変更するように変異することができる。一般に、可能な限り最も少数のヌクレオチドの変化によってこのような変異を行う。１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスターを作製するために、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるこの種の置換変異を行うことができる。例として、核酸配列の個別の点変異を行うことができる。改変ＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位の約１５〜３５アミノ酸残基下流に局在するようにリン酸化部位を位置付ける。
【０１３９】
さらに、本発明の改変ＧＰＣＲを得るために、適切に位置付けられたリン酸化部位を欠くかアレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲは、そのカルボキシル末端テールの全てまたは一部を適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲのそれと交換することができる。交換部位は、保存ＮＰＸＸＹモチーフの後に存在するかこのモチーフを含み得る。代わりとして、保存ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流にＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位を同定することができ、交換部位は、パルミトイル化システインの後に存在するかこれを含む。好ましくは、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスターを欠くかアレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを、推定パルミトイル化部位に極めて接近したアミノ酸残基で交換する。より好ましくは、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスターを欠くかアレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを、パルミトイル化システイン残基が維持されるようにＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位で交換する。好ましい交換様式により、リン酸化部位のクラスターが改変ＧＰＣＲのカルボキシル末端テール内の適切な位置に容易に位置付けられる。テールを交換することができるので、改変ＧＰＣＲを核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作によって構築することができる。
【０１４０】
さらにその代わりとして、ＧＰＣＲ（例えば、ＮＰＸＸＹモチーフを含まないＧＰＣＲ）のカルボキシルテールを、疎水性プロットから推測することができるので、交換部位を選択することができる。疎水性プロットに基づいて、当業者は、ＧＰＣＲを膜中に固定することができる部位を予想し、推定パルミトイル化部位がどこに導入されたかを予想することができる。この技術を使用して、ＮＰＸＸＹモチーフも推定パルミトイル化部位も含まないＧＰＣＲを、基準点（例えば、推定パルミトイル部位）が作製されるように改変することができる。導入された推定パルミトイル部位を使用して、テール交換を位置付けることができる。
【０１４１】
交換に使用したカルボキシル末端テールは、１つまたは複数の適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスターおよびＮＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位を有する第２のＧＰＣＲ由来であり得る。同定されたテールを、保存ＮＰＸＸＹモチーフの後で交換するかこれを含むことができる。代わりとして、ＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位を、保存ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流で同定することができ、テールは、パルミトイル化システインの後で交換するかこれを含むことができる。好ましくは、リン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを、推定パルミトイル化部位に極めて接近したアミノ酸残基で交換する。より好ましくは、リン酸化部位のクラスターを含むカルボキシル末端テールの一部がパルミトイル化システイン残基のすぐ下流のアミノ酸残基から始まるようにリン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲのカルボキシル末端テールをＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位で交換する。好ましい様式での交換により、リン酸化部位のクラスターが改変ＧＰＣＲのカルボキシル末端テール内の適切な位置に容易に位置付けられる。交換に使用したリン酸化部位のクラスターを有するカルボキシル末端テールは、カルボキシル末端に結合した検出可能な分子を有し得る。テールを交換することができるので、核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作により改変ＧＰＣＲを構築することができる。
【０１４２】
さらに、交換に使用したカルボキシル末端テール部分は、１つまたは複数のリン酸化部位、好ましくは１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲ由来のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するように合成されたポリペプチドを起源とし得る。合成ポリペプチドは、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位を有し得る。合成ポリペプチドは、ポリペプチドの構造および機能に影響を与えないか変化させない１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、欠失を有し得る。
【０１４３】
さらに、交換に使用したカルボキシル末端テール部分は、１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲ由来のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有することを認識する天然に存在するポリペプチドを起源とし得る。ポリペプチドは、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位を有し得る。ポリペプチドは、ポリペプチドの構造および機能に影響を与えないか変化させない１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、欠失を有し得る。
【０１４４】
改変カルボキシル末端領域を含む改変ＧＰＣＲを、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスターを欠くかアレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲの第１のカルボキシル末端テール部分と１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲまたはポリペプチドの第２のカルボキシル末端テール部分との融合によって作製することができる。第２のＧＰＣＲまたはポリペプチドは、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位を有し得る。したがって、改変ＧＰＣＲの改変カルボキシル末端領域は、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスターを欠くかリン酸化部位のクラスターを有するＧＰＣＲまたはポリペプチドのカルボキシ末端テールの一部に融合したアレスチンに対する親和性が低いか未知であるＧＰＣＲ由来のカルボキシル末端テールの一部を含む。適切に位置付けたリン酸化部位のクラスターを欠くＧＰＣＲのテールを、保存ＮＰＸＸＹモチーフの後で交換するかこれを含むことができ、保存ＮＰＸＸＹモチーフの後でリン酸化部位のクラスターを含むカルボキシル末端テールに融合するかこれを含むことができる。代わりとして、適切に位置付けたリン酸化部位のクラスターを欠くＧＰＣＲのテールを、パルミトイル化システインの後で交換するかこれを含むことができ、パルミトイル化モチーフの後でリン酸化部位のクラスターを含むテールに融合するかこれを含むことができる。テールを交換することができるので、核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作により改変ＧＰＣＲを構築することができる。
【０１４５】
さらにその代わりとして、ＧＰＣＲ（例えば、ＮＰＸＸＹモチーフを含まないＧＰＣＲ）のカルボキシルテールを、疎水性プロットから推測および交換することができる。疎水性プロットにしたがって、交換部位を選択することができる。疎水性プロットに基づいて、当業者は、ＧＰＣＲを膜中に固定することができる部位を予想し、推定パルミトイル化部位がどこに導入されたかを予想することができる。この技術を使用して、ＮＰＸＸＹモチーフも推定パルミトイル化部位も含まないＧＰＣＲを、基準点（例えば、推定パルミトイル部位）が作製されるように改変することができる。導入された推定パルミトイル部位を使用して、テール交換を位置付けることができる。推定パルミトイル化部位の導入後、得られたテールを、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流に１つまたは複数のリン酸化部位のクラスターおよび推定パルミトイル化部位を有するＧＰＣＲまたはポリペプチドの第２のカルボキシルテール部分と融合することができる。
【０１４６】
好ましくは、改変ＧＰＣＲの改変カルボキシル末端領域を、推定パルミトイル化部位に極めて接近したアミノ酸残基で交換する。より好ましくは、アレスチンに対する親和性が低い第１のＧＰＣＲ由来の部分がＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流の推定パルミトイル化部位によるＮＰＸＸＹモチーフ由来のアミノ酸残基を含み、ＮＰＸＸＹモチーフの約１０〜２５（好ましくは１５〜２０）アミノ酸残基下流にリン酸化部位のクラスターおよび推定パルミトイル化部位を有する第のＧＰＣＲ由来の部分がカルボキシル末端の最後まで伸長している第２のＧＰＣＲの推定パルミトイル化部位のすぐ下流のアミノ酸残基から始まるアミノ酸残基を含むように、改変ＧＰＣＲの改変カルボキシル末端領域を融合する。リン酸化部位のクラスターがカルボキシル末端テール内の適切な位置に容易に位置付けられ、改変ＧＰＣＲは、その構造および機能する能力を維持している。
【０１４７】
例として、クラスＡ受容体またはオーファン受容体は、公知のクラスＢ受容体由来のカルボキシ末端テールの一部に交換されたカルボキシ末端テールの一部を有し得る。さらに、事実上カルボキシル末端テールが存在しない受容体（例えば、オーファン受容体および味覚受容体）は、公知のクラスＢ受容体由来のカルボキシ末端テールの一部に交換されたカルボキシ末端テールの一部を有し得る。これらの交換に使用したクラスＢ受容体テールは、カルボキシル末端に融合した検出可能な分子を有し得る。
【０１４８】
改変ＧＰＣＲを、遺伝子操作分野で標準的な分子生物学技術（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素、発現ベクター、プラスミドなどが含まれるが、これらに限定されない）によって作製することができる。例として、ｐＥＡｒｒＢなどのベクター（アレスチン結合が増強されている）を、アレスチンに対するリン酸化部位のクラスターを欠くＧＰＣＲの親和性を増強するようにデザインすることができる。ｐＥＡｒｒＢなどのベクターを形成するために、アレスチンと安定な複合体を形成するＰＣＲ増幅したＧＰＣＲカルボキシル末端のＤＮＡフラグメントを、適切な制限酵素で消化し、プラスミドにクローン化することができる。１つのこのようなプラスミドの略図を、図４Ａに示す。図４Ｂに示すように、改変されるＧＰＣＲのＤＮＡもまたＰＣＲ増幅し、制限酵素によって適切な位置で消化し、ｐＥＡｒｒＢなどのベクターにサブクローン化することができる。発現する場合、改変ＧＰＣＲは、カルボキシル末端に融合したポリペプチドを含む。ポリペプチドは、リン酸化部位のクラスターを含む。好ましくは、ポリペプチドは、アレスチンと安定な複合体を形成する受容体のＧＰＣＲカルボキシル末端を起源とする。
【０１４９】
このような改変ＧＰＣＲはまた、異常な遺伝子スプライシングまたは一塩基多型の結果として天然に存在し得る。このような天然に存在する改変ＧＰＣＲは、改変エンドサイトーシス標的化を有すると予想される。これらの天然に存在する改変ＧＰＣＲは、多数のＧＰＣＲ関連疾患に関連し得る。
【０１５０】
図３に示すように、本発明者らは、いくつかのＧＰＣＲを改変した。本明細書中に記載のように、β２アドレナリン作動性受容体、ドーパミンＤ１Ａ受容体、ｍｕオピオイド受容体、オーファンＧＰＲ３、オーファンＧＰＲ６、オーファンＧＰＲ１２、オーファンＧＰＲ７、オーファンＧＰＲ８、オーファンＧＰＲ５５、オーファンＳＲＥＢ２、およびオーファンＳＲＥＢ３を改変した。これらの改変ＧＰＣＲは、改変ＧＰＣＲテール内に適切に位置付けたリン酸化部位のＶ２Ｒクラスター（ＳＳＳ）を含む。
【０１５１】
標準的な受容体結合アッセイによって示し得るように、改変受容体は、アレスチンに対する高い親和性によるアレスチンとの複合体の安定性の増加、アレスチンに作用する能力、および再利用および再感作能力以外は野生型の対応物と本質的に区別不可能である。例えば、改変受容体は膜で適切に発現し、アゴニストまたはリガンドに対して類似の親和性を有する。しかし、改変ＧＰＣＲは、アレスチンに対する親和性が増加しているので、野生型対象物よりも安定なアレスチンとの複合体を形成し、エンドソームに輸送された場合にアレスチンに結合したままであり得る。
【０１５２】
これらの改変ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲのアゴニストのスクリーニングアッセイおよびＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物についてのアゴニストに非依存的なアッセイに有用である。
【０１５３】
［改変ＧＰＣＲを使用したＧＰＣＲ活性のアッセイ法］
本発明の改変ＧＰＣＲは、ＧＰＣＲ活性のアッセイ法で有用である。本発明の改変ＧＰＣＲを、アレスチンとの所望の相互作用および会合よりも弱いＧＰＣＲおよびアレスチンとの未知の相互作用または会合を有するＧＰＣＲの研究アッセイに使用することができる。改変ＧＰＣＲを使用する本発明の方法により感度の高いアッセイが得られ、例えば、エンドソーム中のアレスチン／ＧＰＣＲの検出を向上させることができる。本発明の改変ＧＰＣＲを使用するアッセイは、リガンド、アゴニスト、逆アゴニスト、脱感作活性化合物などについての化合物およびサンプル溶液のスクリーニングに有用であり得る。一旦同定されると、これらの化合物は、ＧＰＣＲ活性を調整することができ、ＧＰＣＲに関連する１つまたは複数の疾患の治療に有用な薬物として有用であり得る。
【０１５４】
本発明の好ましいアッセイでは、本発明の改変ＧＰＣＲを発現する細胞が得られ、これらの細胞は、アレスチンと検出可能な分子との接合体をさらに含み得る。
【０１５５】
検出可能な分子に結合したアレスチンを検出し、ＧＰＣＲ経路での機能をモニターすることができる。アレスチンの位置（例えば、細胞質に均一に分散している、細胞膜に密集している、クラスリンコートピットに密集している、エンドソームに局在しているなど）を検出することができる。アゴニスト刺激に対する反応では、ＧＰＣＲへのアレスチンの接近および任意の他の細胞構造への接近をモニターすることができる。例えば、アゴニスト刺激に対する反応では、アレスチンを、細胞膜でのＧＰＣＲへの接近、クラスリンコートピット中でのＧＰＣＲとの密集、エンドソーム上でのＧＰＣＲとの同時局在などで検出することができる。
【０１５６】
本発明の改変ＧＰＣＲは、アレスチンに対する親和性が増加しており、ＧＰＣＲのアレスチンとの安定な複合体が得られるので、エンドソームへのＧＰＣＲとアレスチンとが同時局在する。本発明のアッセイ法では、アレスチンを、例えば、細胞質中、細胞膜でのＧＰＣＲ付近での密集、クラスリンコートピット中でのＧＰＣＲ付近での密集、エンドソーム上でのＧＰＣＲとの同時局在として検出することができる。好ましくは、アレスチンを、エンドソーム上でのＧＰＣＲとの同時局在として検出することができる。
【０１５７】
細胞膜でのアレスチンのＧＰＣＲとの会合を、アゴニスト添加後（例えば、約１秒〜２分）に迅速に検出することができる。エンドソーム上でのアレスチンのＧＰＣＲとの同時局在を、アゴニスト添加から数分以内（例えば、約３〜１５分）に検出し、長時間（例えば、１時間後）保持することができる。エンドソーム上でのアレスチンのＧＰＣＲとの会合により、強力且つ容易に認識可能なシグナルを得ることができる。４０倍の対物レンズで、シグナルは、ドーナッツ様の外観を示し得る。エンドソーム小胞中に同時局在化されたアレスチンおよびＧＰＣＲの区画化から得られたシグナルは、典型的には、検出が容易で、長時間保持することができる。
【０１５８】
本発明のＧＰＣＲ経路の好ましいアッセイ法は、（ａ）少なくとも１つの本発明の改変ＧＰＣＲを発現し、アレスチンと検出可能な分子との接合体をさらに含む細胞を得る工程と、（ｂ）前記アレスチンのトランスロケーションを誘導する工程と、（ｃ）トランスロケーション経路に沿ってアレスチンの改変ＧＰＣＲとの相互作用を検出する工程とを含む。
【０１５９】
アレスチンの改変ＧＰＣＲとの相互作用を、例えば、エンドソーム中、クラスリンコートピット中、細胞膜付近での濃縮として検出することができる。好ましくは、アレスチンの改変ＧＰＣＲとの相互作用は、エンドソーム中で検出される。エンドソーム中でのアレスチンのＧＰＣＲとの相互作用を、アゴニスト添加から数分以内（例えば、約３〜１５分）に検出し、長時間（例えば、１時間後）保持することができる。エンドソーム上でのアレスチンのＧＰＣＲとの相互作用により、長時間維持される強力且つ容易に認識可能なシグナルを得ることができる。
【０１６０】
本発明のＧＰＣＲ活性についての化合物のスクリーニング法では、少なくとも１つの改変ＧＰＣＲを発現する細胞が得られる。細胞は、検出可能な分子に結合するアレスチンを含む。細胞を、試験化合物に曝露する。細胞内のアレスチンの位置を検出する。化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置を、化合物の非存在下での細胞内のアレスチンの位置と比較し、（１）化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と（２）化合物の非存在下での細胞内のアレスチンの位置の相違を相関させる。
【０１６１】
例として、本発明の改変ＧＰＣＲを使用して、ＧＰＣＲアゴニスト活性について化合物およびサンプル溶液をスクリーニングすることができる。この方法では、少なくとも１つの本発明の改変ＧＰＣＲを発現し、アレスチンと検出可能な分子との接合対をさらに含む細胞が得られる。細胞を、試験すべき化合物またはサンプル溶液に曝露する。アレスチンの改変ＧＰＣＲとの相互作用が試験化合物および溶液への曝露後に増加するかどうかが検出され、この相互作用の増加は化合物または溶液がＧＰＣＲアゴニスト活性を有することの指標となる。アレスチンのＧＰＣＲとの相互作用を、エンドソーム中、クラスリンコートピット中、細胞膜付近などで検出することができる。改変ＧＰＣＲを、好ましくはカルボキシル末端で検出可能な分子に結合することもできる。上記で説明するように、本発明でのＧＰＣＲに対する改変は、ＧＰＣＲのアゴニストまたはリガンドに対する天然の親和性に影響を与えないはずである。
【０１６２】
例として、本発明の改変ＧＰＣＲを使用して、化合物およびサンプル溶液をＧＰＣＲアンタゴニストまたは逆アゴニスト活性についてスクリーニングすることができる。少なくとも１つの本発明の改変ＧＰＣＲを発現し、アレスチンと検出可能な分子との接合体をさらに含む細胞が得られる。細胞を、試験すべき化合物またはサンプル溶液およびＧＰＣＲの公知のアゴニストに曝露する。アレスチンの改変ＧＰＣＲとの相互作用が試験化合物および溶液への曝露後に減少するかどうかが検出され、この相互作用の減少は化合物または溶液がＧＰＣＲアンタゴニストまたは逆アゴニスト活性を有することの指標となる。アレスチンのＧＰＣＲとの相互作用を、エンドソーム中、クラスリンコートピット中、細胞膜付近などで検出することができる。改変ＧＰＣＲを、好ましくはカルボキシル末端で検出可能な分子に結合することもできる。上記で説明するように、本発明でのＧＰＣＲに対する改変は、ＧＰＣＲのアゴニストまたはリガンドに対する天然の親和性に影響を与えないはずである。
【０１６３】
さらなる例として、本発明の改変ＧＰＣＲを使用して、化合物およびサンプル溶液をＧＰＣＲ脱感作活性についてスクリーニングすることができる。少なくとも１つの本発明の第１の改変ＧＰＣＲを発現し、アレスチンと検出可能な分子との接合体をさらに含む細胞が得られる。第１の細胞を、試験すべき化合物またはサンプル溶液および第１のＧＰＣＲの公知のアゴニストに曝露する。アレスチンの第１の改変ＧＰＣＲとの相互作用が試験化合物および溶液への曝露後に減少するかまたは増加しないどうかが検出され、この相互作用の減少または欠失は化合物または溶液が脱感作活性を有することの指標となる。アレスチンのＧＰＣＲとの相互作用を、エンドソーム中、クラスリンコートピット中、細胞膜付近などで検出することができる。少なくとも１つの本発明の第２の改変ＧＰＣＲを発現し、アレスチンと検出可能な分子との接合体をさらに含む細胞が得られる。第２の改変ＧＰＣＲは、第１の改変ＧＰＣＲに関連しない。第２の細胞を、試験すべき化合物またはサンプル溶液および第２のＧＰＣＲの公知のアゴニストに曝露する。アレスチンの第２の改変ＧＰＣＲとの相互作用が試験化合物および溶液への曝露後に減少するかまたは増加しないどうかが検出され、この相互作用の減少または欠失は化合物または溶液が発現されたＧＰＣＲと独立したＧＰＣＲ脱感作活性を有することの指標となる。アレスチンのＧＰＣＲとの相互作用を、エンドソーム中、クラスリンコートピット中、細胞膜付近などで検出することができる。
【０１６４】
本発明のＧＰＣＲ経路活性の評価法もまた、無細胞アッセイを含む。本発明の無細胞アッセイでは、沈殿した基質（本発明の改変ＧＰＣＲ）が得られる。アレスチンと検出可能な分子との接合体を含む流動体も得られる。アレスチンのトランスロケーションを誘導し、アレスチンのＧＰＣＲとの相互作用を検出する。ホールセルからＧＰＣＲおよびアレスチンが得られ、これを精製後に無細胞アッセイに使用することができる。改変ＧＰＣＲは、アレスチン結合部位およびアゴニスト結合部位を有し、多層または二重層脂質小胞中で支持することができる。改変ＧＰＣＲを支持する小胞は基質上に沈殿し、アレスチン結合部位がアレスチンに曝露され、レセプター結合部位がアゴニストに接近可能となるように、改変ＧＰＣＲを脂質小胞中で支持して基質上に沈殿させることができる。基質は、ＧＰＣＲが沈殿することができる任意の人工基質（ガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマー、生体適合性ポリマー、ポリマービーズ（有機および無機ポリマー）などが含まれるが、これらに限定されない）であり得る。
【０１６５】
本発明は、本発明のアッセイ方法によって、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、またはＤＡＣと同定される化合物に関する。これらの化合物を使用して、ＧＰＣＲに関与する任意の疾患の１つを治療することができる。同定された化合物を、ＧＰＣＲに関与する病態、障害、または疾患の治療または改善のための治療有効量をヒトまたは非ヒトに投与することができる。治療有効量は、このような病態、障害、または疾患の症状の改善に十分な化合物の量をいう。
【０１６６】
［ＧＰＣＲ脱感作を調整する化合物の識別方法］
本発明は、ＧＰＣＲ脱感作を調整する化合物のスクリーニング法に関する。本方法は、ＧＰＣＲを構成的にリン酸化して構成的に脱感作された改変ＧＲＫを使用する。ＧＰＣＲアゴニストが未知であっても、これらを使用してＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物を同定することができる。一旦同定されると、これらの化合物は、ＧＰＣＲ活性を調整することができ、ＧＰＣＲに関連する１つまたは複数の疾患の治療に有用な薬物として有用であり得る。
【０１６７】
本発明の好ましい方法では、発現系および改変ＧＰＣＲをコードする核酸を含み、細胞中で発現するＧＰＣＲが構成的に脱感作される細胞が得られる。これらの細胞は、ＧＦＰに結合するアレスチンをさらに含み得る。
【０１６８】
ＧＰＣＲ内在化を阻害する化合物の好ましい識別方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、および改変ＧＲＫを含む細胞を得る工程と、（ｂ）前記化合物に前記細胞を曝露する工程と、（ｃ）前記ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を決定する工程と、（ｄ）（１）前記化合物の存在下での細胞内の標識分子の位置と（２）前記化合物の非存在下での細胞内の標識分子の位置との相違をＧＰＣＲ内在化の調整に相関させる工程とを含む。この方法の非限定的な例を、図４、５、６、および７ならびに実施例２、３、４、５、６、および７に記載する。
【０１６９】
上記の工程（ａ）のＧＲＫは、ＧＲＫ１、２、３、４、５、６、または任意の他のＧＲＫ（スプライス変異体、生物活性フラグメント、または改変ＧＲＫを含む）であり得る。ＧＲＫを過剰発現させることができ、そして／または発現は誘導性を示し得る。ＧＲＫは、ＣＡＡＸモチーフを含み得る。
【０１７０】
上記方法では、アゴニストが得られても得られなくても良い。
【０１７１】
標識した分子の検出およびＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布の識別方法を、以下に記載する。
【０１７２】
本発明で有用なＧＰＣＲには、公知のアゴニストを有するＧＰＣＲ、アゴニストが知られていないＧＰＣＲ、図１に列挙したＧＰＣＲ、図３、４、５、６、および７に示すＧＰＣＲ、クラスＡ  ＧＰＣＲ、クラスＢ  ＧＰＣＲ、味覚受容体、臭気物質受容体、オーファンＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲ、米国特許出願番号１０／０５４，６１６、０９／９９３，８４４、１０／０９５，６２０、１０／１０１，２３５、０９／６３１，４６８、１０／１４１，７２５、１０／１６１，９１６、０９／４６９，５５４、０９／７７２，６４４、６０／３９３，７８９、および６０／３７９，９８６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載のＧＰＣＲ、または上記ＧＰＣＲの生物学的に活性なフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
［タンパク質発現用のベクター、核酸、宿主細胞］
本発明は、過剰発現し、その発現が誘導性であるＧＲＫを含む改変ＧＲＫに関する。
【０１７４】
改変ＧＲＫをコードする核酸が得られる。本発明は、これらのタンパク質の発現、過剰発現、および誘導性発現に関する。下記のように、ベクターに含まれる適切な発現系によって発現させることができる。
【０１７５】
本発明の１つの態様は、（１）改変ＧＲＫをコードする核酸と（２）ＧＰＣＲが構成的に脱感作される、改変ＧＲＫの発現系との組み合わせに関する。改変ＧＲＫの発現系には、プロモーターまたは複製起点を含み得る。
【０１７６】
本発明の別の態様は、改変ＧＰＣＲ、改変ＧＰＣＲをコードする核酸、および改変ＧＰＣＲ発現用の宿主細胞に関する。
【０１７７】
改変ＧＰＣＲをコードする核酸が得られる。本発明は、これらのタンパク質の発現、過剰発現、および誘導性発現に関する。下記のように、ベクター中に含まれる適切な発現系によって、発現することができる。
【０１７８】
本発明の特徴は、本明細書中に開示のＤＮＡ配列の発現である。当該分野で周知のように、ＤＮＡ配列を、適切な発現ベクター中、発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）への作動可能な連結および適切な単細胞宿主を形質転換するための発現ベクターの使用によって発現することができる。形質転換ＤＮＡを、細胞ゲノムを作製する染色体ＤＮＡに組み込んでも（共有結合）組み込まなくても良い。
【０１７９】
本発明のＤＮＡ配列の発現調節配列へのこのような作動可能な連結には、勿論、既にＤＮＡ配列の一部ではない場合、ＤＮＡ配列上流の正確な読み取り枠中の開始コドン（ＡＴＧ）が含まれる。
【０１８０】
本発明のＤＮＡ配列の発現には、広範な種々の宿主／発現ベクターの組み合わせを使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体配列、非染色体配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなることができる。適切なベクターには、ＳＶ４０の誘導体、公知の細菌プラスミド（Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、およびこれらの誘導体など）、ＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡＳ（例えば、λファージの多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９）、および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ））、酵母プラスミド（２μプラスミドまたはその誘導体）、真核細胞で有用なベクター（昆虫または哺乳動物細胞で有用なベクターなど）、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせ由来のベクター（ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を使用するように改変されたプラスミドなど）などが含まれる。
【０１８１】
任意の広範な種々の発現調節配列（作動可能に連結したＤＮＡ配列の発現を調節する配列）は、本発明のＤＮＡ配列を発現するためのこれらのベクターで使用することができる。このような有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ、またはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、λファージの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、被覆タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α交配因子のプロモーター、および原核細胞または真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、ならびにその組み合わせが含まれる。
【０１８２】
広範な種々の単細胞宿主細胞もまた、本発明のＤＮＡ配列の発現に有用である。これらの宿主には、周知の真核生物および原核生物宿主Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの株、酵母などの菌類、植物細胞、線虫細胞、およびＨＥＫ−２９３、Ｕ２ＯＳ、ＣＨＯ，ＲＩ．１、Ｂ−Ｗ、およびＬ−Ｍ細胞アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）などの動物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、ならびに組織培養におけるヒト細胞および植物細胞を含み得る。本発明の１つの態様では、宿主細胞には、ＧＲＫ−Ｃ２０およびアレスチンが含まれる。本発明のさらなる態様では、宿主細胞には、ＧＲＫ−Ｃ２０、アレスチン、およびＧＰＣＲが含まれる。
【０１８３】
全てのベクターではないが発現調節配列および宿主は本発明のＤＮＡ配列を発現するように等しく機能すると理解される。全ての宿主が、同一の発現系を用いて等しく十分に機能するわけではない。しかし、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく所望の発現を達成するために過度の実験を行うことなく、適切なベクター、発現調節配列、および宿主を選択することができる。例えば、ベクターの選択では、ベクターは宿主中で機能しなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現もまた考慮する。
【０１８４】
発現調節配列の選択では、通常、種々の因子を考慮する。これらには、例えば、系の相対的強度、その調節性、および特に潜在的な二次構造を発現する得意呈のＤＮＡ配列との適合性が含まれる。適切な単細胞宿主を、例えば、選択したベクターとの適合性、分泌特性、タンパク質を性格に折りたたむ能力および発酵要件ならびに発現するＤＮＡ配列によってコードされるサンプルの宿主に対する毒性および発現産物の精製の容易さを考慮することによって選択する。
【０１８５】
これらおよび他の要因の考慮において、当業者は、発酵または大量動物培養において本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現調節配列／宿主組み合わせを構築することができる。
【０１８６】
改変ＧＲＫアナログを、本発明の範囲内で誘導したタンパク質複合体／サブユニットのヌクレオチド配列から調整することができることがさらに意図される。フラグメントなどのアナログを、例えば、ＧＲＫ物質のペプシン消化によって産生することができる。ムテインなどの他のアナログを、ＧＲＫコード配列の標準的な部位特異的変異誘発によって産生することができる。プロモーターまたはインヒビターのいずれかとして機能する小分子などの「ＧＲＫ活性」を示すアナログを、公知のインビボおよび／またはインビトロアッセイによって同定することができる。
【０１８７】
上記のように、改変ＧＲＫをコードするＤＮＡ配列を、クローン化よりも合成によって調製することができる。ＧＲＫアミノ酸配列の適切なコドンを使用して、ＤＮＡ配列をデザインすることができる。一般に、配列を発現に使用する場合、意図する宿主に好ましいコドンを選択する。完全な配列を、標準的な方法によって調製されたオリゴヌクレオチドの重複から構築し、完全なコード配列に構築する。例えば、Ｅｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９２、７５６、１９８１；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３、１２９９、１９８４；Ｊａｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９、６３１１、１９８４を参照のこと。
【０１８８】
合成ＤＮＡ配列により、ＧＲＫアナログまたは「変異体」を発現する遺伝子を都合よく構築可能である。あるいは、ムテインをコードするＤＮＡを、天然または改変ＧＲＫ遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作製し、ムテインを従来のポリペプチド合成を使用して直接作製することができる。
【０１８９】
非天然アミノ酸のタンパク質への一般的な部位特異的組み込み法は、ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＪ．Ｎｏｒｅｎ、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈｅａｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２〜１８８，１９８４年４月に記載されている。この方法を使用して、非天然アミノ酸でアナログを作製することができる。
【０１９０】
精製での一助とするためのエピトープタグまたは配列などのさらなるモチーフを、改変ＧＲＫまたは改変ＧＰＣＲをコードする核酸に組み込むことができる。好ましくは、モチーフをコードする核酸は、タンパク質のＮまたはＣ末端にモチーフを存在させる、核酸の５’または３’末端に存在し得る。
【０１９１】
［接合体（Ｔｈｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）］
本発明のアッセイ法で使用される細胞は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との接合体を含み得る。本発明の細胞および方法では、細胞はまた、本発明の改変ＧＰＣＲと検出可能な分子との接合体を含み得る。
【０１９２】
全ての型のアレスチン（視覚アレスチン、網膜錐体アレスチン、βアレスチン１、およびβアレスチン２を含む天然に存在するアレスチンおよび操作変異体）を、本発明で使用することができる。本発明の改変ＧＰＣＲは、全ての型のアレスチンと検出可能なレベルで相互作用することができる。
【０１９３】
アレスチンとの結合に使用することができる検出可能な分子には、分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気的、放射性、および光学的手段（生物発光、リン光、および蛍光が含まれるが、これらに限定されない）によって検出可能な分子が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ローダミン結合抗体などが含まれるが、これらに限定されない。検出可能な分子には、放射性同位元素、エピトープタグ、親和性標識、酵素、蛍光発光団、化学発光団などが含まれる。検出可能な分子には、他の分子との相互作用の関数として間接的または直接検出される分子が含まれる。これらの検出可能な分子は、生体適合分子であるはずであり、アレスチンのＧＰＣＲ系と相互作用する能力を妨害すべきでなく、アレスチンのＧＰＣ系との相互作用は、検出可能な分子の検出能力妨害してはならない。好ましい検出可能な分子は、蛍光、リン光、または生物発光を放射するために化学的、機械的、電気的、または放射性に励起することができるような光学的に検出可能なタンパク質を含む光学的に検出可能な分子である。より好ましい検出可能な分子は、本質的に蛍光性の分子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光タンパク質など）である。検出可能な分子を、Ｂａｒａｋらが記載の方法（米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号）によってアレスチンタンパク質と接合することができる。検出可能な分子を、アレスチンのフロントエンド、バックエンド、またはその中央で、接合させることができる。
【０１９４】
ＧＰＣＲおよびその生物活性フラグメントを、検出可能な分子に接合することもできる。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端を、検出可能な分子に接合する。検出可能な分子に接合または連結したカルボキシル末端テールを、検出可能に標識したＧＰＣＲを得るためにカルボキシル末端テール交換で使用することができる。
【０１９５】
ＧＰＣＲが検出可能な分子と結合する場合、ＧＰＣＲのアレスチンとの近さを容易に検出することができる。さらに、ＧＰＣＲを検出可能な分子と接合体である場合、ＧＰＣＲのアレスチンとの区画化を容易に確認することができる。ＧＰＣＲとの結合に使用される検出可能な分子には、例えば、蛍光、リン光、または生物発光を放射するために化学的、機械的、電気的、または放射性に励起することができるような光学的に検出可能な分子を含む、上記の分子を含み得る。好ましい光学的に検出可能な分子を、免疫蛍光、発光、蛍光、およびリン光で検出することができる。
【０１９６】
例えば、ＧＰＣＲは、免疫蛍光分子と結合した抗体で標識された抗体であるか、ＧＰＣＲは、蛍光ドナーと結合することができる。特に、ＧＰＣＲを、例えば、ルシフェラーゼ（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）またはローダミン結合抗体（例えば、ローダミン結合抗ＨＡマウスモノクローナル抗体）と結合することができる。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシ末端テールを、蛍光ドナー（例えば、ルシフェラーゼ）と結合することができる。Ｌ．Ｓ．Ｂａｒａｋら、「機能的にインタクトなβ２アドレナリン作動性受容体−緑色蛍光タンパク質接合体の内部輸送および表面移動性」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．、１９９７、５１、１７７〜１８４に記載のように、ＧＰＣＲ、好ましくはカルボキシ末端テールを、ＧＦＰに結合することもできる。
【０１９７】
［細胞型および基質］
本発明の細胞は、少なくとも１つの本発明の改変ＧＰＣＲを発現することができる。細胞は、アレスチンタンパク質と検出可能な分子との接合体をさらに含み得る。有用な細胞には、原核細胞および真核細胞（細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および動物細胞が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。適切な動物細胞には、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、および種々の初代哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。組織のいたるところまたは特定の型の器官または組織中でアレスチンと検出可能な分子との接合体を発現する動物モデルも使用することができる。
【０１９８】
本発明の細胞は、エンドサイトーシス小胞またはエンドソームにＧＰＣＲがアゴニストに非依存的に局在化する１つの改変タンパク質を発現することができる。
【０１９９】
基質は、本発明の複数の細胞上に蓄積することができた。基質は、任意の生体基質（ガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマー、または生体適合性ポリマー材料が含まれるが、これらに限定されない）であり得る。
【０２００】
［検出方法］
検出可能に標識したアレスチンの細胞内の位置、検出可能に標識したＧＰＣＲの細胞内の位置、検出可能に標識したアレスチンの相互作用、ＧＰＣＲまたは他の任意の細胞構造（例えば、細胞膜でのアレスチンまたはＧＰＣＲの密集、エンドソーム中でのアレスチンとＧＰＣＲの同時局在化、およいｂクラスリンコートピット中のアレスチンまたはＧＰＣＲの密集などを含む）を有するＧＰＣＲ／アレスチン複合体の他のメンバーを検出する方法は、使用した検出可能な分子に依存して変化する。
【０２０１】
当業者は、使用した検出可能な分子に適切な検出方法を案出することができる。光学的に検出可能な分子については、蛍光、生物発光、またはリン光の変化を放射光の再配分または再方向付けによって測定することができる任意の光学的方法を使用することができる。このような方法には、例えば、偏光顕微鏡、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡、ならびに標準的な顕微鏡または鏡焦点顕微鏡が含まれる。
【０２０２】
好ましい実施形態では、アレスチンを、ＧＦＰに接合することができ、アレスチン−ＧＦＰ接合体を、鏡焦点顕微鏡で検出することができる。別の好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰに接合し、ＧＰＣＲを免疫蛍光分子に接合し、接合体を鏡焦点顕微鏡で検出することができる。さらに好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰに結合し、ＧＰＣＲのカルボキシ末端をルシフェラーゼに結合し、接合体を生物発光共鳴放射技術によって検出することができる。さらに好ましい実施形態では、アレスチンをルシフェラーゼに接合し、ＧＰＣＲをＧＦＰに結合し、接合体を生体は抗共鳴放出技術によって検出することができる。本発明の方法は、ＧＰＣＲ活性の検出を指示する。本発明の方法により、ＧＰＣＲ経路の同時モニタリングを向上させる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、検出可能な分子の局在パターンを同定する。好ましい実施形態では、検出可能な分子の局在パターンの変化を同定することができる。局在パターンは、検出可能な分子の細胞分布を示し得る。一定の検出法は、２００１年３月１３日に提出された米国特許仮出願番号６０／２７５，３３９の優先権を主張する２００２年３月１２日提出の米国と仮出願番号１０／０９５，６２０（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【０２０４】
分子を、抗体などの別の検出可能に標識された分子との相互作用によって検出することもできる。
【０２０５】
［試験キット］
本発明のさらなる実施形態では、ＧＰＣＲ活性の調整に有効な潜在的薬物のスクリーニングアッセイ系を含む市販の試験キットを準備することができる。試験キットには、本明細書中に記載の細胞、核酸、またはタンパク質を含み得る。試験キットを使用して、本明細書中に記載の任意の方法を行うことができる。目的のＧＰＣＲを、試験キットの宿主細胞に導入することができる。試験キットは、ＧＰＣＲが原形質膜で発現するか、リン酸化もしくは非リン酸化ＧＰＣＲがアレスチンに結合するか、またはリン酸化もしくは非リン酸化ＧＰＣＲが内在化しているかの識別に有用であり得る。試験キットは、目的のＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物の識別に有用であり得る。
【０２０６】
ＧＰＣＲを試験系に導入することができ、予想される薬物を得られた細胞培養株に導入することができ、その後培養株を細胞中のＧＰＣＲ活性（例えば、シグナル伝達、再利用、アレスチンに対する親和性など）の任意の変化を観察するために試験した。
【０２０７】
本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために、以下の実施例を示す。しかし、実施例は、本発明の範囲を制限するものであると解釈すべきでない。
【０２０８】
（実施例）
［実施例１］
［実験手順］
本発明者らは、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ＋（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）にウシＧＲＫ−Ｃ２０ｃＤＮＡ（Ｉｎｇｌｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２）をサブスクリーニングした。このｃＤＮＡの発現により、カルボキシル末端に結合したＣＡＡＸモチーフ（Ｃはシステインであり、Ａは小さな脂肪族残基であり、Ｘは荷電していないアミノ酸）を有するＧＲＫ２が産生される。ＧＲＫ２、ＣＶＬＬの末端に結合した特異的ＣＡＡＸモチーフは、このタンパク質のゲラニルゲラニル化（Ｃ２０イソプレニル化）を指示する。ＧＲＫ２のカルボキシル末端への２０炭素のゲラニルゲラニル脂質基の酵素指向性共有結合により、原形質膜に局在する（Ｉｎｇｌｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９２）。
【０２０９】
［細胞培養］
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清およびゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補足したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で増殖させた。アレスチン−ＧＦＰを安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞（ＨＥＫ２９３−ＡｒｒＧＦＰ）を、Ｇ４１８選択（０．４ｍｇ／ｍｌ）を使用した標準的な手順によって作製した。ＨＥＫ−２９３細胞を、アレスチン−ＧＦＰ、目的のＧＰＣＲ、およびＧＲＫ２−２０で一過性にトランスフェクトした。平衡して行うコントロール実験のために、ＨＥＫ−２９３細胞を、アレスチン−ＧＦＰを使用し、目的のＧＰＣＲを使用し、ＧＲＫ２−２０を使用しないで一過性にトランスフェクトした。ＨＥＫ−２９３細胞を、アレスチン−ＧＦＰを使用し、目的のＧＰＣＲおよびＧＲＫ２−２０を使用して一過性にトランスフェクトした。並行して行うコントロール実験のために、アレスチン−ＧＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、目的のＧＰＣＲを使用し、ＧＲＫ２−Ｃ２０を使用しないでトランスフェクションした。全てのトランスフェクションを、前述のリン酸カルシウム沈殿法によって行った（Ｏａｋｌｅｙら、１９９９）。トランスフェクション後、細胞を、培養培地（１０％のＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足したＥＭＥＭ）中で約２４時間維持した。次いで、細胞を３５ｍｍのガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）にプレートし、さらに１６〜２４時間インキュベートした。形質転換ＧＰＣＲを、公知のＧＰＣＲ（天然のリガンドが既知の受容体）およびオーファンＧＰＣＲ（天然のリガンドが未だ同定されていない受容体）とインキュベートした。
【０２１０】
［鏡焦点顕微鏡］
トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞を、３５ｍｍのガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）にプレートし、一晩インキュベートした。翌日、培地を除去し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳを補足した無血清培地と置換し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、アレスチン−ＧＦＰの分布を、Ｚｅｉｓｓレーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）を使用して評価した。単線（ｓｉｎｇｌｅｌｉｎｅ）励起（４８８ｎｍ）およびＬＰ５０５放射フィルターを使用して、生細胞から６３倍のオイル対象物（ｏｉｌ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を含む画像が得られた。
【０２１１】
［実施例２］
［改変ＧＲＫの発現の際の公知のＧＰＣＲのアゴニスト非依存的脱感作］
本発明は、アレスチン−ＧＦＰを発現する細胞中の原形質膜で発現するＧＲＫ２−Ｃ２０（Ｉｎｇｌｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９２）の過剰発現がリガンドの非存在下でアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合を促進することを同定した。
【０２１２】
アレスチン−ＧＦＰでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＧＲＫ２−Ｃ２０を用いるか用いないで目的のＧＰＣＲで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を使用して、アレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコートピット、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路の他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの脱感作は、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰ結合を示した。したがって、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰの結合によって視覚化されたＧＰＣＲの脱感作を分析した。
【０２１３】
アゴニストの非存在下では、アレスチン−ＧＦＰは、ＧＲＫ２−２０Ｃおよびカンナビノイド２型受容体（ＣＢ２Ｒ）のいずれかを発現する細胞中の原形質膜で小さなくぼみ（おそらく、クラスチンコートピット）に局在化した（図４）。さらに、アゴニストの非存在下では、アレスチン−ＧＦＰは、ＧＲＫ２−Ｃ２０およびアンギオテンシンＩＩ  ＩＡ型受容体（ＡＴ１ＡＲ）、バソプレシンＶ２受容体（Ｖ２Ｒ）（図４）、またはニューロキニン１／基質Ｐ受容体（ＮＫ−１またはＳＰＲ）のいずれかを発現する細胞中のエンドサイトーシス小胞中に局在した。各受容体（ＣＢ２Ｒ、ＡＴ１ＡＲ、Ｖ２Ｒ、またはＳＰＲ）を発現するが、ＧＲＫ２−Ｃ２０を欠くコントロール細胞では、アレスチン−ＧＦＰは、細胞質中で散らばって発現し、原形質膜でのピットまたは細胞内小胞中で任意の有意な範囲に局在しなかった（図４）。
【０２１４】
［実施例３］
［改変ＧＲＫ発現の際のオーファンＧＰＣＲのアゴニスト非依存的脱感作］
本発明は、アレスチン−ＧＦＰを発現する細胞中の原形質膜で発現するＧＲＫ２−Ｃ２０（Ｉｎｇｌｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９２）の過剰発現がリガンドの非存在下でアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合を促進することを同定した。
【０２１５】
上記のように、アレスチン−ＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、目的のＧＰＣＲを使用し、かつＧＲＫ２−Ｃ２０を使用するか使用しないで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を使用して、アレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコートピット、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路の他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの脱感作は、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰ結合を示した。したがって、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰの結合によって視覚化されたＧＰＣＲの脱感作を分析した。
【０２１６】
アゴニストの非存在下では、アレスチン−ＧＦＰは、オーファン受容体ＧＰＲ５５を発現する細胞中の原形質膜で小さなくぼみ（おそらく、クラスチンコートピット）に局在化した（図７）。ＧＰＲ５５を発現するがＧＲＫ２−Ｃ２０を欠くコントロール細胞では、アレスチン−ＧＦＰは、細胞質中で散らばって発現し、原形質膜でのピットまたは細胞内小胞中で任意の有意な範囲に局在しなかった（図７）。他のオーファンＧＰＣＲを、以下に記載する。
【０２１７】
［実施例４］
［ＧＰＣＲのアレスチン結合能力を分析する方法］
本発明者らは、目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する方法を開発した。好ましくは、オーファンＧＰＣＲの発現を、本明細書中に記載のアゴニストに非依存的な様式でＧＰＣＲが脱感作する宿主細胞において分析することができる。
【０２１８】
上記のように、アレスチンＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、目的のＧＰＣＲを使用し、且つＧＲＫ２−Ｃ２０を使用するか使用しないで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を使用して、アレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコートピット、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路の他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの脱感作は、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰ結合を示した。したがって、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰの結合によって視覚化されたＧＰＣＲの脱感作を分析した。
【０２１９】
一定のＧＰＣＲは、上記のように、クラスリンコートピット、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路の他の段階で局在化した。アレスチン結合は脱感作経路でその後局在化されることが必要であるので、この局在化はＧＰＣＲがアレスチンに結合する能力を有することを示す。アレスチンに結合しないＧＰＣＲは、脱感作経路に入ることも局在化もされない。アレスチンに結合しないＧＰＣＲを、アレスチンに結合するように変化させることができる。本発明者らは、下記のように、一定のＧＰＣＲを、アレスチン親和性が増強するように改変した。
【０２２０】
［実施例５］
［ＧＰＣＲのアレスチン結合能力を増加する方法］
本発明者らは、そのアレスチンへの結合を増強するためにＧＰＣＲを改変した。これらの改変は、米国特許出願０９／９３，８４４に記載されている。ＧＰＣＲを、そのＣ末端テールでＧＲＫによってより良好にリン酸化されるように改変した。これらの改変およびリン酸化ＧＰＣＲにより、アレスチンへの結合が増強された。内在化の増加を証明した。文字Ｅ（増強リン酸化）を、この様式で改変したＧＰＣＲの名前の末端に添加する。
【０２２１】
改変ＧＰＣＲ構築物を、標準的なプロトコールに従ったポリメラーゼ連鎖反応によって作製し、これはＨＡエピトープを含んでいる。推定パルミトイル化部位の後でＧＰＣＲおよびＶ２Ｒのカルボキシ末端テールが他の配列（ｏｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｔｈｅｒ）交換された（図３）キメラ受容体を構築した。ＤＮＡ構築物の配列を、ＤＮＡ配列決定で確認した。
【０２２２】
目的のＧＰＣＲの核酸を、Ｖ２Ｒカルボキシル末端に融合されたＮＲＸＹの１０〜２５アミノ酸（好ましくは１５〜２０）下流のシステイン残基（推定パルミトイル部位）のコドンの直後にＮｏｔＩ制限酵素部位（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）を移入したプライマーでＰＣＲ増幅した。次いで、増幅レセプターＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩ制限酵素部位および受容体ａｔｇ開始コドンの上流にさらなる制限酵素部位を使用してｐＥＡｒｒＢ−１ベクター（米国特許出願第０９／９９３，８４４）にサブクローン化した。発現した場合、改変ＧＰＣＲは、受容体カルボキシル末端に融合した３１アミノ酸ペプチドを含む。第１の２つのアミノ酸は、ＮｏｔＩ部位によるＡｌａ残基であり、最後の２９アミノ酸は、Ｖ２Ｒカルボキシル末端に由来する。
【０２２３】
本発明者らは、上記および米国特許出願第０９／９９３，８４４に記載の以下の受容体のカルボキシル末端テールを改変した。β２アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲＥ）、ドーパミンＤ１Ａ受容体（Ｄ１ＡＲＥ）、ｍｕオピオイド受容体（ＭＯＲＥ）、オーファンＧＲＫ３（ＧＰＲ３Ｅ）、オーファンＧＲＫ６（ＧＰＲ６Ｅ）、オーファンＧＲＫ１２（ＧＰＲ１２Ｅ）、オーファンＧＲＫ７（ＧＰＲ７Ｅ）、オーファンＧＲＫ８（ＧＰＲ８Ｅ）、オーファンＧＲＫ５５（ＧＰＲ５５Ｅ）、オーファンＧＲＫＢ２（ＧＰＲＢ２Ｅ）、およびオーファンＧＲＫＢ３（ＧＰＲＢ３Ｅ）。「Ｅ」は、「アレスチン結合の増強」を示す。アゴニストの非存在下では、アレスチンＧＦＰは、ＧＲＫ２−Ｃ２０と同時発現した場合、上記の各改変ＧＰＣＲについてエンドサイトーシス商法に局在した（図４、５、６、および７）。これらのいくつかの改変レセプターについて（オーファンＧＰＲ６Ｅ）、ＧＲＫ２−Ｃ２０を欠く調節細胞中の細胞内小胞中に少量であるが有意な量のアレスチン−ＧＦＰの局在が認められた（図５）。しかし、これらの受容体でのＧＲＫ２−Ｃ２０の過剰発現により、この反応の顕著な増加を促進した（図５）。これらの改変ＧＰＣＲ、野生型配列、およびＨＡタグ化改変ＧＰＣＲのアミノ酸および核酸配列を、図３および配列番号３５〜９０に示す。
【０２２４】
［実施例６］
［目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを識別する方法］
本発明者らは、目的のＧＰＣＲが原形質膜で発現するかどうかを同定する方法を開発した。
【０２２５】
アレスチン−ＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、目的のＧＰＣＲを使用し、且つＧＲＫ２−Ｃ２０を使用するか使用しないで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を使用して、アレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコートピット、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路の他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの脱感作は、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰ結合を示した。したがって、ＧＰＣＲへのアレスチン−ＧＦＰの結合によって視覚化されたＧＰＣＲの脱感作を分析した。
【０２２６】
一定のＧＰＣＲは、上記のように、クラスリンコートピット、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路の他の段階で局在化した。原形質膜発現は脱感作経路でその後局在化されることが必要であるので、この局在化はＧＰＣＲが原形質膜で発現することを示す。原形質膜で発現しないＧＰＣＲは、脱感作経路に局在化しない。原形質膜で発現しないＧＰＣＲを、原形質膜で発現するように変化させることができる。例えば、ＧＰＣＲの発現を変化させるか、ＧＰＣＲのアミノ酸配列を変化させるか、ＧＰＣＲを別の宿主細胞に移入することができる。
【０２２７】
［実施例７］
［ＧＰＣＲ変異体の脱感作のモニタリング］
ＧＰＣＲ変異体を含む細胞中の脱感作をモニターすることができる。ＧＰＣＲ変異体の脱感作は、ＧＲＫ過剰発現に依存し得る。
【０２２８】
点変異を含むヒトβ２ＡＲ−Ｅ−Ｙ３２６Ａを含むベクター（チロシン残基３２６がアラニンに変換されている）を、改変することができるアレスチン−ＧＦＰおよびＧＲＫを発現する細胞にトランスフェクトする。「Ｅ」は、上記のようにＧＰＣＲが改変されていることを示す。Ｙ３２６変異体は、ＧＰＣＲをリン酸化およびその後の脱感作のための過剰発現ＧＲＫ依存性にする。β２ＡＲ−Ｙ３２６Ａアゴニストの非存在下でＧＲＫ−Ｃ２０の発現の際に脱感作する。ＧＲＫの発現を変化させることができ、これには、誘導プロモーター、複製起点などの複製調節機構を使用して細胞中のＧＲＫ核酸量を変化させる方法、細胞中のベクターの量を手動で変化させる方法を含む。
【０２２９】
細胞を、９６ウェルまたはそれ以上の密度のプレートに播種し、一晩インキュベートする。翌朝、誘導系のアクチベーターまたは賦形剤のみをウェルに添加して、ＧＲＫまたは改変ＧＲＫの過剰発現を誘導する。ＧＲＫを発現する細胞にアゴニストを添加する。
【０２３０】
次いで、アレスチン−ＧＦＰの内在化を変化させるかを調査するために、目的の化合物をウェルに添加する。次いで、細胞を、２％のパラホルムアミドで固定し、アレスチン−ＧＦＰのトランスロケーション量を、画像分析システムを使用して測定する。
【０２３１】
本発明を、種々の特定の材料、手順、および実施例を参考にして本明細書中に例示しているが、本発明は特定の材料の組み合わせおよびこの目的のために選択した手順に限定されないことが理解される。当業者に認識されるように、このような項目の多数の変形形態を意図し得る。
【０２３２】
以下は、上記の開示ならびに特に実験手順および考察に関する書類のリストである。以下の書類および上記明細書中で参照された任意の書類を、引用することにより本明細書の一部をなすものとみなすべきである。
【表１】
2004248506.tif 000002
【表１（つづき）】
2004248506.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明で使用することができるＧＰＣＲのリストである。
【図１Ｂ】本発明で使用することができるＧＰＣＲのリストである。
【図１Ｃ】本発明で使用することができるＧＰＣＲのリストである。
【図２】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図４】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図５】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図６】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図７】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図１Ａ】
2004248506.tif 000004
【図１Ｂ】
2004248506.tif 000005
【図１Ｃ】
2004248506.tif 000006
【図２】
2004248506.tif 000007
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004248506.tif 000053
【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月14日(2003.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明で使用することができるＧＰＣＲのリストである。
【図１Ｂ】本発明で使用することができるＧＰＣＲのリストである。
【図１Ｃ】本発明で使用することができるＧＰＣＲのリストである。
【図２Ａ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｂ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｃ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｄ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｅ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｆ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｇ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｈ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｉ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｊ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｋ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図２Ｌ】本発明で使用することができるＧＲＫのリストである。一定のＧＲＫのアミノ酸配列および核酸配列を示す。ＧＲＫ２−Ｃ２０（改変ＧＲＫ）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ａ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｂ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｃ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｄ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｅ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｆ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｇ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｈ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｉ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｊ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｋ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｌ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｍ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｎ】アレスチンに対する親和性が増強されたＧＰＣＲのリストである。アミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図４】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図５】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図６】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。
【図７】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチンＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的トランスロケーションを示す図である。


【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2004248506.tif 000056
【図１Ｂ】
2004248506.tif 000057
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2004248506.tif 000059
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2004248506.tif 000062
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
2004248506.tif 000064
【図２Ｇ】
2004248506.tif 000065
【図２Ｈ】
2004248506.tif 000066
【図２Ｉ】
2004248506.tif 000067
【図２Ｊ】
2004248506.tif 000068
【図２Ｋ】
2004248506.tif 000069
【図２Ｌ】
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【図３Ａ】
2004248506.tif 000071
【図３Ｂ】
2004248506.tif 000072
【図３Ｃ】
2004248506.tif 000073
【図３Ｄ】
2004248506.tif 000074
【図３Ｅ】
2004248506.tif 000075
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
2004248506.tif 000077
【図３Ｈ】
2004248506.tif 000078
【図３Ｉ】
2004248506.tif 000079
【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004248506.tif 000088
【外国語明細書】
2004248506.tif 000089
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