(57)【要約】【課題】一定品質のアンモニア酸化細菌固定化膜を効率よく製造するために、より正確にアンモニア酸化細菌の培養状態を判定できる指標を提供すると共に、この指標に基づくアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法を提供する。【解決手段】アンモニア酸化細菌を培養する工程と、前記工程で得られたアンモニア酸化細菌の培養液を用いてアンモニア酸化細菌固定化膜を製膜する工程とからなるアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法において、アンモニア酸化細菌を培養する際に、培養液中のアンモニア酸化細菌の活性度及び平均亜硝酸生成能力の２つのパラメータを包含する指標である「培養液亜硝酸生成能」を求めてアンモニア酸化細菌の培養状態を判定し、前記「培養液亜硝酸生成能」の値に基づいて、アンモニア酸化細菌固定化膜の活性の指標である「亜硝酸生成能」が所定の範囲内になるようにアンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量を調整する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水道原水や下・排水処理プロセスの流入水中の化学物質を計測するバイオセンサを利用した水質計測器に使用されるアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法であって、（Ａ）アンモニア酸化細菌を培養する工程と、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたアンモニア酸化細菌の培養液を用いてアンモニア酸化細菌固定化膜を製膜する工程とからなり、
前記工程（Ａ）において、アンモニア酸化細菌を培養する際に、下記（１）〜（３）で定義される「培養液活性度」、「ホルマザン吸光度」及び「平均亜硝酸生成進行度」を測定して、下記（４）で定義される「培養液亜硝酸生成能」を求めることにより、アンモニア酸化細菌の培養状態を判定し、
前記工程（Ｂ）において、前記「培養液亜硝酸生成能」の値に基づいて、下記（５）で定義される「亜硝酸生成能」が所定の範囲内になるようにアンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量を調整することを特徴とするアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法。
（１）「培養液活性度」：下記式（Ｉ）で定義される培養終了日のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの活性度を表す指標
【数１】
2004248516.tif 000010
（２）「ホルマザン吸光度」：アンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ中に含まれるアンモニア酸化細菌をテトラゾリウム塩で染色した際に、該アンモニア酸化細菌中に生成するホルマザンの吸光度値
（３）「平均亜硝酸生成進行度」：下記式（ＩＩ）で定義される培養期間中のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの平均的亜硝酸生成能力を表す指標
【数２】
2004248516.tif 000011
（４）「培養液亜硝酸生成能」：下記式（ＩＩＩ）で定義される培養終了日のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの活性度及び平均亜硝酸生成能力の２つのパラメータを包含する指標
【数３】
2004248516.tif 000012
（５）「亜硝酸生成能」：下記式（ＩＶ）で定義されるアンモニア酸化細菌固定化膜の活性を表す指標
【数４】
2004248516.tif 000013
【請求項２】
前記（２）で定義される「ホルマザン吸光度」を測定する際に、テトラゾリウム塩として２−（４−ｉｎｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）を用いてアンモニア酸化細菌を染色し、該アンモニア酸化細菌中に生成するホルマザンを波長５００ｎｍで測定して、前記（１）で定義される「培養液活性度」及び前記（４）で定義される「培養液亜硝酸生成能」を求め、前記（５）で定義される「亜硝酸生成能」が２ｍｇ以上になるように前記菌体固定化量を調整する、請求項１に記載のアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、上下水道の各処理プロセスの水や河川水、湖沼水などの環境水を対象として、水中の化学成分をモニタリングすることを目的としたバイオセンサ応用水質計測器に用いられるアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、溶液中の測定対象物質を認識する分子識別素子として、酵素や抗体などの生体機能高分子や、微生物や細胞など生体そのものを利用し、これらの生体材料を多孔性高分子膜に包括又は共有結合させることにより固定化した膜と、電気化学的検出器などのトランスデューサとを組み合わせて試料液中の化学成分の測定を行うセンサであり、試料液を上記生体材料を固定化した膜に接触させ、これによって生じる生化学反応により生成又は消費される物質の濃度変化を、検出器の出力（電流、電圧など）変化に変換して測定し、試料液に対するセンサ出力から、既知の濃度の被測定物質の標準液によって得られた検量線を用いて、試料液中の目的物質の濃度を算出するものである。
【０００３】
例えば、特許文献１には、生体材料として有害物質に極めて弱い微生物である硝化細菌（アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌の総称）をアルギン酸ゲルによってセルロース膜上に包括固定化した硝化細菌固定化膜を用い、トランスデューサとして溶存酸素電極を用いた水中の毒物検出用バイオセンサが開示されている。このバイオセンサでは、硝化細菌の呼吸速度を連続モニタリングして、検水中に毒物が混入した時の硝化細菌の呼吸速度低下率を基に毒物検出を行うことができる。
【０００４】
上記のような硝化細菌固定化膜の品質や保存性は、▲１▼硝化細菌の活性、▲２▼硝化細菌固定化膜の菌体固定化量、▲３▼硝化細菌固定化膜の保存液組成、という３つのパラメータに左右される。例えば、一般に微生物の培養状態は、図４に示す増殖曲線のように培養時間の推移に伴って、培養令が誘導期・加速期・対数増殖期・定常期・死滅期の順に変化し、微生物の活性は対数増殖期において最も高く、生菌個数濃度は定常期において最も高くなるが、亜硝酸態窒素（ＮＯ２−−Ｎ）濃度、濁度、ＭＰＮ法などの従来の硝化細菌の培養状態の判定指標・方法では、培養状態を正確かつ迅速に把握することができないため、生産日時、すなわちロットの異なる硝化細菌固定化膜間で品質が一定せず、保存性に大きなバラツキが生じてしまっていた。
【０００５】
本出願人は、上記のような問題を解決する一つの方法として、硝化細菌固定化膜の保存液及びアンモニア酸化細菌固定化膜の保存方法（特願２００２−１４０４８４号）において、アンモニア酸化細菌をテトラゾリウム塩により染色し、該アンモニア酸化細菌中に生成するホルマザンの吸光度を測定し、ホルマザン吸光度による増殖曲線を用いてアンモニア酸化細菌の培養令の判定及び生菌個数濃度の測定を行い、その結果に基づいてアンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量を特定の範囲に調整すると共に該アンモニア酸化細菌固定化膜の保存液のオキサル酢酸濃度を０．５〜２ｍＭに調整することを提案している。
【０００６】
【特許文献１】
特公平７−８５０７２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のようなホルマザン吸光度による増殖曲線のみによる培養状態の判定では、バイオセンサのセンサ出力に反映されるアンモニア酸化細菌の酸素消費速度、すなわち亜硝酸生成速度に関する正確な情報を得ることができないため、品質管理基準としては不充分であった。
【０００８】
また、上記の方法では、アンモニア酸化細菌の培養状態に応じて菌体固定化量と保存液のオキサル酢酸濃度の両方を調整しなければならないので手間がかかるため、より簡便に品質管理ができる方法が望まれていた。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、一定品質のアンモニア酸化細菌固定化膜を効率よく製造するために、より正確にアンモニア酸化細菌の培養状態を判定できる指標を提供すると共に、この指標に基づくアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明のアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法は、水道原水や下・排水処理プロセスの流入水中の化学物質を計測するバイオセンサを利用した水質計測器に使用されるアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法であって、（Ａ）アンモニア酸化細菌を培養する工程と、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたアンモニア酸化細菌の培養液を用いてアンモニア酸化細菌固定化膜を製膜する工程とからなり、
前記工程（Ａ）において、アンモニア酸化細菌を培養する際に、下記（１）〜（３）で定義される「培養液活性度」、「ホルマザン吸光度」及び「平均亜硝酸生成進行度」を測定して、下記（４）で定義される「培養液亜硝酸生成能」を求めることにより、アンモニア酸化細菌の培養状態を判定し、
前記工程（Ｂ）において、前記「培養液亜硝酸生成能」の値に基づいて、下記（５）で定義される「亜硝酸生成能」が所定の範囲内になるようにアンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量を調整することを特徴とする。
【００１１】
（１）「培養液活性度」：下記式（Ｉ）で定義される培養終了日のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの活性度を表す指標
【００１２】
【数５】
2004248516.tif 000002
【００１３】
（２）「ホルマザン吸光度」：アンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ中に含まれるアンモニア酸化細菌をテトラゾリウム塩で染色した際に、該アンモニア酸化細菌中に生成するホルマザンの吸光度値
【００１４】
（３）「平均亜硝酸生成進行度」：下記式（ＩＩ）で定義される培養期間中のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの平均的亜硝酸生成能力を表す指標
【００１５】
【数６】
2004248516.tif 000003
【００１６】
（４）「培養液亜硝酸生成能」：下記式（ＩＩＩ）で定義される培養終了日のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの活性度及び平均亜硝酸生成能力の２つのパラメータを包含する指標
【００１７】
【数７】
2004248516.tif 000004
【００１８】
（５）「亜硝酸生成能」：下記式（ＩＶ）で定義されるアンモニア酸化細菌固定化膜の活性を表す指標
【００１９】
【数８】
2004248516.tif 000005
【００２０】
上記発明においては、前記（２）で定義される「ホルマザン吸光度」を測定する際に、テトラゾリウム塩として２−（４−ｉｎｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）を用いてアンモニア酸化細菌を染色し、該アンモニア酸化細菌中に生成するホルマザンを波長５００ｎｍで測定して、前記（１）で定義される「培養液活性度」及び前記（４）で定義される「培養液亜硝酸生成能」を求め、前記（５）で定義される「亜硝酸生成能」が２ｍｇ以上になるように前記菌体固定化量を調整することが好ましい。
【００２１】
本発明の製造方法によれば、培養液中のアンモニア酸化細菌の活性度（菌体個数濃度及び菌体活性）及び平均亜硝酸生成能力の２つのパラメータを包含する指標である「培養液亜硝酸生成能」を求め、この「培養液亜硝酸生成能」に基づいてアンモニア酸化細菌の培養状態を判定することにより、アンモニア酸化細菌の培養状態をより正確に判定することができる。そして、該「培養液亜硝酸生成能」に基づいて、アンモニア酸化細菌固定化膜の活性の指標である「亜硝酸生成能」が所定の範囲内になるようにアンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量を調整することにより、一定品質のアンモニア酸化細菌固定化膜を効率よく製造することができる。また、前記「亜硝酸生成能」は、アンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量、すなわち、製膜に用いるアンモニア酸化細菌の培養液量を調整するだけで簡単に調整できるので、製造工程の合理化・簡素化、及び適切な品質管理が可能となる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
まず、本発明において定義する各指標について説明する。
【００２３】
（１）「培養液活性度」
「培養液活性度」は、培養終了日のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの活性度（菌体個数濃度×菌体活性）を表す指標であり、上記式（Ｉ）に示されるように、培養終了日のホルマザン吸光度と、培養期間中の日平均ホルマザン吸光度との商で定義される。
【００２４】
（２）「ホルマザン吸光度」
「ホルマザン吸光度」は、アンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ中に含まれるアンモニア酸化細菌をテトラゾリウム塩で染色した際に、生菌中のミトコンドリアの脱水素酵素によって還元されて該菌体中に生成したホルマザンの吸光度値であり、培養液中のアンモニア酸化細菌の増殖活性と比例関係にある。
【００２５】
ホルマザン吸光度は、特願２００２−１４０４８４号に記載された方法にしたがって測定することができる。すなわち、サンプリングしたアンモニア酸化細菌の培養液１ｍＬ当たり、０．２５％（ｗ／ｖ）テトラゾリウム塩水溶液を０．１２５ｍＬ、及びアンモニア態窒素含有水溶液（例えば、アンモニア態窒素を５ｇ／Ｌ含有するように調製されたＮＨ４Ｃｌ水溶液等）を０．１２５ｍＬ添加して、３０℃で２４時間静置した後、遠心分離して上澄みを除去し、菌体に１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）／０．１Ｎ−ＨＣｌを１ｍＬ添加してよく混合し、菌体中に生成したホルマザンを抽出・溶解して分光光度計でその吸光度を測定すればよい。
【００２６】
テトラゾリウム塩としては、２−（４−ｉｎｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）、２，３−ｂｉｓ（２−Ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏ−５−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ−５−ｃａｒｂｏｘｙａｎｉｌｉｄｅ  ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ（ＸＴＴ）、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｙａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）等を用いることができる。なお、使用するテトラゾリウム塩の種類によって生成するホルマザンの吸光波長も変わるため、生成したホルマザンに最適な波長の吸光度を測定すればよい。例えば、テトラゾリウム塩としてＩＮＴを用いた場合は赤紫色のホルマザンが生成するので、波長５００ｎｍにおける吸光度を測定すればよい。
【００２７】
（３）「平均亜硝酸生成進行度（μｇ／ｍＬ）」
「平均亜硝酸生成進行度」は、培養期間中のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの平均的亜硝酸生成能力を表す指標であり、上記式（ＩＩ）に示されるように、培養期間中の各日における全亜硝酸生成量の総和を培養日数で平均化した値で定義される。
【００２８】
なお、培養液中の亜硝酸態窒素濃度（以下、ＮＯ２−−Ｎ濃度と表す）は、ＪＩＳ  Ｋ  ０１０１（工業用水試験方法  ３７．１．１  ナフチルエチレンジアミン吸光光度法）にしたがって測定すればよい。すなわち、適宜希釈したアンモニア酸化細菌の培養液に、スルファニルアミド溶液を添加して５分間反応させた後、ナフチルエチレンジアミン溶液を添加して１０分以上静置し、５４０ｎｍ吸光度を測定する。そして、亜硝酸イオン標準溶液を用いて同様にして５４０ｎｍ吸光度を測定して作成した検量線により、試料液中のＮＯ２−−Ｎ濃度を求めることができる。
【００２９】
（４）「培養液亜硝酸生成能（μｇ／ｍＬ）」
「培養液亜硝酸生成能」は、培養終了日のアンモニア酸化細菌培養液１ｍＬ当たりの活性度及び平均亜硝酸生成能力という２つのパラメータを包含する指標であり、上記式（ＩＩＩ）に示されるように、上記「培養液活性度」と上記「平均亜硝酸生成進行度」との積で定義される。
【００３０】
（５）「亜硝酸生成能（ｍｇ）」
「亜硝酸生成能」は、アンモニア酸化細菌固定化膜の活性の指標であり、上記式（ＩＶ）に示されるように、上記「培養液亜硝酸生成能」と菌体固定化量との積で定義される。したがって、この指標を所定の範囲内に調整することにより、一定品質のアンモニア酸化細菌固定化膜を効率よく製造することができる。また、菌体固定化量、すなわち、製膜に用いるアンモニア酸化細菌の培養液量を調整するだけで簡単に調整できるので、製造工程の合理化・簡素化、及び適切な品質管理が可能となる。
【００３１】
なお、本発明において、上記式（Ｉ）〜（ＩＶ）中において、全培養日数（ｎ）は、特に制限されないが、通常、４≦ｎ≦６であることが好ましい。
【００３２】
以下、本発明の製造方法について更に詳細に説明する。
本発明において、アンモニア酸化細菌固定化膜に用いられるアンモニア酸化細菌としては、ニトロモナス・ユーロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ：ＡＴＣＣ２５９７８、ＡＴＣＣ１９７１８）等が例示できる。また、アンモニア酸化細菌の培養は、公知の液体培地を用いた継代培養法にしたがって行うことができる。例えば、５〜１０℃で適当な期間保存された前培養液を新しいＰｒａｍｅｒ培地（Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｐｒａｍｅｒ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｉｎ  Ｐｕｒｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．；  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ７６，  ５２４−５２８  （１９５８））に、通常、５〜２０％（ｖ／ｖ）接種して、温度３０℃で４〜６日間振とう培養（振とう機回転数１５０〜１８０ｒｐｍ）すればよい。なお、培地としては、Ｐｒａｍｅｒ培地に類似した組成の培地（例えば、Ｐｒａｍｅｒ培地における各種塩の代替塩を用いた培地等）を用いることもできる。
【００３３】
アンモニア酸化細菌の培養期間中、菌体を含む培養液をサンプリングして５〜１０℃で冷蔵保存し、採取した各サンプルについて、上述した方法によりホルマザン吸光度及びＮＯ２−−Ｎ濃度を測定する。
【００３４】
そして、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）により、「培養液活性度」、「平均亜硝酸生成進行度」、「培養液亜硝酸生成能」を順次求め、上記の式（ＩＶ）により、「亜硝酸生成能」の値が所定の範囲内になるように、「菌体固定化量」、すなわち製膜に用いるアンモニア酸化細菌の培養液の液量を決定し、常法にしたがってアンモニア酸化細菌固定化膜を作成すればよい。
【００３５】
なお、「ホルマザン吸光度」の値は、上述したように使用するテトラゾリウム塩の種類によって変わるため、前記「培養液活性度」の値、及び該「培養液活性度」の値に基づいて決定される「亜硝酸生成能」の値も変わる。したがって、菌体固定化量を決定する際の前記「亜硝酸生成能」の値の範囲は、使用するテトラゾリウム塩の種類によって適宜設定する必要がある。
【００３６】
例えば、テトラゾリウム塩としてＩＮＴを用いてアンモニア酸化細菌を染色して該アンモニア酸化細菌中に生成するホルマザンを波長５００ｎｍで測定し、この「ホルマザン吸光度」の値に基づいて「培養液活性度」を求めた場合は、「亜硝酸生成能」が２ｍｇ以上となるように菌体固定化量を調整することが好ましく、２〜２．５ｍｇとすることがより好ましく、２．２５〜２．５ｍｇとすることが特に好ましい。前記「亜硝酸生成能」が２ｍｇ未満であると、品質のバラツキが大きくなり、２．５ｍｇを超えると、膜の酸素透過能低下が原因と考えられる、センサ装着時の校正エラーが発生する場合がある。そして、前記「亜硝酸生成能」を２．２５ｍｇ以上とすることにより、品質のバラツキをよりなくすことができる。
【００３７】
図１には、アンモニア酸化細菌固定化膜の一例が示されており、以下、図１に基づいてアンモニア酸化細菌固定化膜の製膜方法について説明する。
【００３８】
このアンモニア酸化細菌固定化膜２０は、円形の多孔質のセルロース膜２１、２２が、菌体固定化部２４と重ならないように中心部が所定の大きさにくりぬかれたドーナツ状をなした両面テープ２３によって貼り合わされたものであり、その中心部には、アンモニア酸化細菌が固定化された所定の大きさの円形の菌体固定化部２４を有している。なお、上記セルロース膜の大きさや形状は、使用するフローセルの形状に合わせて適宜決定すればよい。また、菌体固定化部の大きさ（Ｌ１）も特に制限されないが、通常、５ｍｍ程度が好ましい。
【００３９】
まず、上記の指標に基づいて決定した所定量のアンモニア酸化細菌の培養液を遠心分離して上澄みを除去した後、１％アルギン酸ナトリウム水溶液を適量加えて菌体を懸濁し、菌体濃縮液を得る。
【００４０】
そして、セルロース膜２２の中心部に、上記菌体濃縮液を滴下して、余剰のアルギン酸ナトリウム水溶液を吸引除去した後、更に塩化カルシウム水溶液（３０ｇ／Ｌ）を適量滴下して、余剰の塩化カルシウム水溶液を吸引除去し、菌体を固定化した側を内側にして、ドーナツ状の両面テープ２３を介してセルロース膜２１と貼り合わせる。次いで、最後に塩化カルシウム水溶液（３０ｇ／Ｌ）に１５分間浸漬し、アルギン酸ナトリウムを完全にゲル化させて菌体を固定化する。
【００４１】
このようにして製造されたアンモニア酸化細菌固定化膜は、例えば０．５〜２ｍＭのオキサル酢酸（特に好ましくは１〜２ｍＭ）を含有するアンモニア酸化細菌用培地（例えばＰｒａｍｅｒ培地）とともにビニールパックの中に封入して５〜１０℃で保存することが好ましい。これにより、膜の保存性を高めることができる。
【００４２】
図２には、アンモニア酸化細菌固定化膜を用いたバイオセンサの一例が示されている。このバイオセンサ１０は、検水の流路１２ａが設けられたフローセル１２と、アンモニア酸化細菌固定化膜２０と、溶存酸素電極１１とから構成されている。アンモニア酸化細菌固定化膜２０の一方の面は、流路１２ａ中の検水と接するように配置されている。また、もう一方の面は溶存酸素電極１１と接するように配置されており、アンモニア酸化細菌固定化膜２０に固定化されたアンモニア酸化細菌の酸素消費速度を連続的にモニタリングできるようになっている。
【００４３】
そして、流路１２ａを矢印の方向に流れる検水中に毒物が混入していると、アンモニア酸化細菌の酸素消費速度が低下するので、この酸素消費速度の低下率を基に毒物検出を行うことができるようになっている。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。なお、ホルマザン吸光度は、テトラゾリウム塩としてＩＮＴを用いて、上述した方法にしたがって５００ｎｍにおける吸光度を測定し、ＮＯ２−−Ｎ濃度の測定は、ＪＩＳ  Ｋ  ０１０１（工業用水試験方法  ３７．１．１  ナフチルエチレンジアミン吸光光度法）にしたがって行った。
【００４５】
実施例
（Ｉ）アンモニア酸化細菌（ニトロモナス・ユーロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）：ＡＴＣＣ２５９７８）の前培養液を、新しいＰｒａｍｅｒ培地に１０（ｖ／ｖ）％接種し、温度３０℃、振とう機回転数１５０ｒｐｍで６日間培養した。なお、アンモニア酸化細菌の培養は、５つのロット（Ｌｏｔ．１〜５）で行い、各ロットの培養条件は同一とした。
【００４６】
そして、各ロットについて、ホルマザン吸光度（０〜６日目）及びＮＯ２−−Ｎ濃度（０、３、６日目）を測定して、「培養液活性度」、「平均亜硝酸生成進行度」及び「培養液亜硝酸生成能」を求めた。その結果を表１に示す。
【００４７】
なお、「平均亜硝酸生成進行度」は、通常、上記式（ＩＩ）に基づいて計算するが、培養０、３、６日目のＮＯ２−−Ｎ濃度の測定結果しかないので、図３に示すように、ＮＯ２−−Ｎ濃度の増加曲線の面積（▲１▼＋▲２▼＋▲３▼）を求めて、下記式により計算した。
【００４８】
【数９】
2004248516.tif 000006
【００４９】
そして、菌体固定化量を５ｍＬとし、常法にしたがってアンモニア酸化細菌固定化膜を製造した。なお、Ｌｏｔ．５は、Ｌｏｔ．２と同等の亜硝酸生成能になるように菌体固定化量を８ｍＬとした。
【００５０】
得られた各アンモニア酸化細菌固定化膜を、保存液（オキサル酢酸を１ｍＭ含むＰｒａｍｅｒ培地）に入れ、５〜１０℃で所定期間保存した後、バイオセンサに装着してセンサ出力規格値（０．３５ｍＶ）到達時間を測定し、従来の品質管理基準である、センサ出力規格値到達時間が２４時間以内である場合を「保存可能」、２４時間以上である場合を「保存不可」であると判断し、保存寿命を測定した。それらの結果を表１に合わせて示す。
【００５１】
【表１】
2004248516.tif 000007
【００５２】
表１から、Ｌｏｔ．１〜４においては、アンモニア酸化細菌培養液の生菌個数濃度はロット間で大きな差はないにもかかわらず、全ＮＯ２―−Ｎ生成量は大きく変動しており、概して、全ＮＯ２−−Ｎ生成量が低下すると、製膜時良品率及び保存寿命が低下する傾向にあることが分かる。しかし、例えばＬｏｔ．２とＬｏｔ．３を比較すると、全ＮＯ２―−Ｎ生成量にほとんど差が無いのにもかかわらず、保存寿命はＬｏｔ．３の方が１ヶ月も短い結果となっており、両者の培養終了日（６日目）のホルマザン吸光度を比較すると、Ｌｏｔ．３はＬｏｔ．２の約半分であることから、Ｌｏｔ．３ではアンモニア酸化細菌の増殖活性が大幅に低いために保存寿命が短いことが分かる。以上の結果から、各分析項目単独ではアンモニア酸化細菌の培養状態を正確に把握することができず、一定品質のアンモニア酸化細菌固定化膜を製造することが困難であることが分かる。
【００５３】
また、培養液亜硝酸生成能がＬｏｔ．４と同等であったＬｏｔ．５において、亜硝酸生成能がＬｏｔ．２と同等となるように菌体固定化量を８ｍＬに調整して製膜したが、保存寿命は短く、Ｌｏｔ．２と同等の品質にはならなかった。これは、菌体固定化量を増量すると、菌体増量による酸素消費量増加の効果と、固定化用ゲルの増量による膜の酸素透過性低下の効果が相克しており、菌体固定化量増量とアンモニア酸化細菌固定化膜の酸素消費速度上昇は直線的な比例関係にはないためであると考えられる。
【００５４】
（ＩＩ）上記（Ｉ）の結果を踏まえて、更に以下の試験を行った。すなわち、上記と同様の条件で、５つのロット（Ｌｏｔ．６〜１０）でアンモニア酸化細菌（ニトロモナス・ユーロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ）：ＡＴＣＣ２５９７８）を培養した。
【００５５】
そして、上記と同様に各ロットについて、ホルマザン吸光度（０〜６日目）及びＮＯ２−−Ｎ濃度（０、３、６日目）を測定して、「培養液活性度」、「平均亜硝酸生成進行度」及び「培養液亜硝酸生成能」を求めた。その結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2004248516.tif 000008
【００５７】
そして、Ｌｏｔ．６〜１０の各培養液を用いて、それぞれアンモニア酸化細菌固定化膜を製造した。なお、各ロットにおける亜硝酸生成能は、上記（Ｉ）において、培養状態が最も良く、アンモニア酸化細菌固定化膜の保存寿命が長かったＬｏｔ．１の亜硝酸生成能の値（１．９８ｍｇ）を超えるように設定した。
【００５８】
得られた各ロットのアンモニア酸化細菌固定化膜（Ｌｏｔ．６〜１０）を用いて、保存試験を行った。なお、対照として、Ｌｏｔ．６〜１０の各培養液を用い、菌体固定化量を５ｍＬ（亜硝酸生成能２ｍｇ未満）として同様にして製膜した各アンモニア酸化細菌固定化膜を作成して用いた。
【００５９】
保存試験は、アンモニア酸化細菌固定化膜を保存液（オキサル酢酸を１ｍＭ含むＰｒａｍｅｒ培地）に入れ、５〜１０℃で所定期間保存した後、バイオセンサに装着してセンサ出力規格値（０．３５ｍＶ）到達時間を測定し、出荷時の品質管理基準である、センサ出力規格値到達時間が３時間以内である場合を「保存可能」、３時間以上である場合を「保存不可」であると判断し、保存率を求めた。その結果を表３に示す。
【００６０】
【表３】
2004248516.tif 000009
【００６１】
表３から、「亜硝酸生成能」が２ｍｇ以上となるように菌体固定化量を調整したＬｏｔ．６〜１０のアンモニア酸化細菌固定化膜は、長期間保存しても、「亜硝酸生成能」が２ｍｇ未満の対照に比べて、出荷時の品質管理基準を高確率で満たしており、品質が一定していることが分かる。なお、この保存試験において、「亜硝酸生成能」が２〜２．２５ｍｇであるアンモニア酸化細菌固定化膜（Ｌｏｔ．６、１０）は、他のロットの膜（Ｌｏｔ．７〜９）に比べて保存期間が多少短い傾向にあることが分かった。一方、亜硝酸生成能が２．５ｍｇを超えるアンモニア酸化細菌固定化膜（Ｌｏｔ．９）は、固定化量が多過ぎることによる膜の酸素透過能低下が原因と考えられる、センサ装着時の校正エラーが発生することがあった。以上のことから、アンモニア酸化細菌固定化膜の「亜硝酸生成能」を好ましくは２ｍｇ以上、より好ましくは２〜２．５ｍｇ、特に好ましくは２．２５〜２．５ｍｇとすることにより、品質管理基準達成率向上及び校正エラー回避できると考えられた。
【００６２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のアンモニア酸化細菌固定化膜の製造方法によれば、培養液中のアンモニア酸化細菌の活性度及び平均亜硝酸生成能力の２つのパラメータを包含する指標である「培養液亜硝酸生成能」を求め、この「培養液亜硝酸生成能」に基づいてアンモニア酸化細菌の培養状態を判定することにより、アンモニア酸化細菌の培養状態をより正確に判定することができる。そして、該「培養液亜硝酸生成能」に基づいて、アンモニア酸化細菌固定化膜の活性の指標である「亜硝酸生成能」が所定の範囲内になるようにアンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量を調整することにより、一定品質のアンモニア酸化細菌固定化膜を効率よく製造することができる。また、前記「亜硝酸生成能」は、アンモニア酸化細菌固定化膜の菌体固定化量、すなわち、製膜に用いるアンモニア酸化細菌の培養液量を調整するだけで簡単に調整できるので、製造工程の合理化・簡素化、及び適切な品質管理が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アンモニア酸化細菌固定化膜の構成の一例を示す模式図である。
【図２】バイオセンサ（微生物センサ）の構成例を示す模式図である。
【図３】実施例におけるＮＯ２−−Ｎ濃度の増加曲線を示す図である。
【図４】一般的な微生物の増殖曲線を示す図である。
【符号の説明】
２０  アンモニア酸化細菌固定化膜
２１、２２  セルロース膜
２３  両面テープ
２４  菌体固定化部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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