(57)【要約】【課題】  遺伝子ターゲッティングによりゲノムＤＮＡの大フラグメントを欠失するための置換型標的化構築物の使用方法を提供すること。【解決手段】  本発明の方法は、遺伝子ターゲッティングによりゲノムＤＮＡの大フラグメントを欠失するための置換型標的化構築物の使用を提供する。選択マーカーを含み得る置換標的化構築物は、標的遺伝子座の５’および３’フランキング配列に相同である配列の２つの領域を含むように構築される。標的化構築物の所望の細胞株へのトランスフェクション後、遺伝子標的化媒介性欠失は、選択によって同定され、そしてさらに特徴づけられる。適切な遺伝子座の例は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ抗原ならびに免疫グロブリン遺伝子（例えば、κ、λ、またはＨ鎖の可変領域および定常領域を含む）を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５０ｋｂ〜３０００ｋｂの範囲のゲノム欠失を含む哺乳動物細胞を得る方法であって、ここで該方法は、
ａ）野生型標的遺伝子座の５’および３’フランキング配列に相同である配列の２つの領域を含む構築物を導入することによって、該野生型標的遺伝子座を含む哺乳動物細胞のゲノムを改変する工程；
ｂ）該構築物中に存在する選択マーカーを含む細胞を選択することによって、該欠失を含む細胞を同定する工程；ならびに
ｃ）該欠失を含む細胞を回収する工程、
からなる、方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子座がヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子座が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的遺伝子座が主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞が、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ニューロン、膠細胞、神経節細胞、網膜細胞、ケラチノサイト、胚幹（ＥＳ）細胞、肝細胞、骨髄細胞、および筋細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、置換型標的化構築物を用いる遺伝ターゲッティングを用いる大きなゲノムＤＮＡ欠失を生成することによる哺乳動物遺伝子のゲノムの改変である。
【背景技術】
【０００２】
（背景および関連文献）
外因性ＤＮＡと内因性相同染色体配列との間の相同組換えによる遺伝子ターゲッティングは、マウス中の培養哺乳動物細胞（マウス胚幹細胞を含む）において設計された変異を作製するためまたは遺伝子変異を訂正するための、そして「標的化Ｅ細胞の注入」の際にマウス生殖系列中にこれらの変異を伝達するための卓越した道具であることが判明している（Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１７：３２０−２３４，１９８５；Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９２７−８９３１，１９８９；Ｋｕｈｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：７０７−７１０，１９９１；Ｔｈｏｍａｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８４７−８５０，１９９０；Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：７９９−８０３，１９８９；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７；Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１，１９８９；Ｓｈｅｓｅｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：４２９４−４２９８，１９９１）。遺伝子ターゲッティングによって大きな欠失を作製する能力は、特に遺伝子クラスターおよび／または多コピーを含む大きな遺伝子または複合遺伝子座に関して非常に有用であることが当該分野において十分理解されている。これらの遺伝子において、完全なターゲッティングは、通常、ＥＳ細胞のより長い継代を必要とするディファレンシャルマーカーを用いる連続的ターゲッティングを必要とする。この間に、生殖系列への伝達能力は減少され得る。初代哺乳動物細胞についても、より長い継代はそれらの分化する性質に影響し得る。良好なサイズの１５ｋｂの欠失が、Ｔ細胞抗原レセプターβサブユニット遺伝子座中で達成されたが（Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３０８４−３０８７，１９９１）、それによってより長いゲノム欠失が達成し得る方法のために顕著な必要性が残っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
遺伝子ターゲッティングによりゲノムＤＮＡの大フラグメントを欠失するための置換型標的化構築物の使用方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、１５ｋｂより大きいゲノム欠失を含む哺乳動物細胞を得る方法に関する。この方法は、野生型遺伝子座において欠失されるべき領域の５’および３’フランキング配列に相同である配列の２つの領域を含む構築物を導入することによって、その野生型遺伝子座を含むその細胞のゲノムを改変する工程を包含する。
【０００５】
１つの実施形態において、上記方法は、上記標的遺伝子座がＨＰＲＴ遺伝子座である。
【０００６】
別の実施形態において、上記方法は、上記標的遺伝子座がＭＨＣクラスＩ遺伝子座である。
【０００７】
別の実施形態において、上記方法は、上記標的遺伝子座がＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座である。
【０００８】
別の実施形態において、上記方法は、上記標的遺伝子座が免疫グロブリン遺伝子座である。
【０００９】
別の実施形態において、上記方法は、上記哺乳動物細胞が、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ニューロン、膠細胞、神経節細胞、網膜細胞、ケラチノサイト胚幹（ＥＳ）細胞、肝細胞、骨髄細胞、および筋細胞からなる群より選択される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、標的遺伝子座において１５から約３０００ｋｂより大きい範囲内での欠失を有する哺乳動物細胞を得る方法に関する。この方法は、野生型遺伝子座の５’および３’フランキング配列に相同である配列の２つの領域を含む構築物を導入することによって、その野生型遺伝子座を含むその細胞のゲノムを改変する工程を包含する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＨＰＲＴが欠失した哺乳動物細胞を調製する方法に関する。この方法は、改変ＤＮＡフラグメントを含む構築物を野生型ＨＰＲＴ遺伝子座を含む標的細胞に導入する工程を包含し、ここでこのフラグメントは、この野生型ＨＰＲＴ遺伝子座が位置するゲノム部位に対応し、
ここで、このＤＮＡフラグメントは、この野生型ＨＰＲＴ遺伝子座を含むネイティブＤＮＡ中の第一の配列の５５ｋｂ上流の野生型配列に一致するｈｐｒｔ遺伝子座の第２エクソンのすぐ下流に第一の配列を含む。
【００１２】
１つの実施形態において、上記方法は、以下の工程：
ａ）上記構築物中に存在する選択マーカーを含む細胞を選択することによって、上記欠失を含む細胞を同定する工程；および
ｂ）上記欠失を含む細胞を回収する工程、
をさらに包含する。
【００１３】
別の局面において、本発明は、上記のいずれかの方法によって調製される、哺乳動物細胞に関する。
【００１４】
本発明は、野生型遺伝子座において欠失されるべき領域の５’および３’フランキング配列に相同である配列の２つの領域を含む標的化構築物を誘導することによって、野生型遺伝子座を含む細胞のゲノムを改変する工程を包含する、標的遺伝子座において１５ｋｂよりも大きい欠失を有する哺乳動物細胞を得る方法を提供する。この方法は、選択薬剤を含む培地中で改変細胞を培養する工程、および上記の欠失を含む細胞を回収する工程をさらに含む。本発明の方法における標的遺伝子座は、任意の遺伝子座（例えば、ＨＰＲＴ、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩまたは免疫グロブリン遺伝子座）であり得るが、これらに限定されない。本発明の哺乳動物細胞は、初代細胞または形質転換細胞株のいずれかであり得、そして例えば、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ニューロン、膠細胞、神経節細胞、網膜細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、肝細胞、骨髄細胞、ケラチノサイト、および筋芽（筋）細胞を含む任意の細胞型を含み得る。
【００１５】
より詳細には、本発明はまた、ｈｐｒｔが欠失した哺乳動物細胞（ＥＳ細胞を含む）を調製する方法を提供する。この方法は、野生型ｈｐｒｔ遺伝子座を含む標的細胞へ、野生型ｈｐｒｔ遺伝子座が位置するゲノムに相当する、改変ＤＮＡフラグメントを含む標的化構築物を導入する工程を包含する。ここで、改変ＤＮＡフラグメントは、野生型ｈｐｒｔ遺伝子座を含むネイティブＤＮＡ中の第一の配列の５５ｋｂ上流の野生型配列に一致するｈｐｒｔ遺伝子座の第２エクソンのすぐ下流の第一の配列を含む。
【発明の効果】
【００１６】
遺伝子ターゲッティングによりゲノムＤＮＡの大フラグメントを欠失するための置換型標的化構築物の使用方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（特定の実施態様の詳細な説明）
本発明の方法は、遺伝子ターゲッティングによるゲノムＤＮＡの大きなフラグメントを欠失するための置換型標的化構築物の使用を提供する。選択マーカーを含み得るこの置換標的構築物は、標的化遺伝子座の５’および３’フランキング配列に相同である配列の２つの領域を含むように構築される。標的構築物の所望の細胞株へのトランスフェクションの後、遺伝子標的化媒介性欠失を、選択によって同定し、そしてサザンブロット分析およびパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）によってさらに特徴づけ得る。
【００１８】
本発明が、任意の目的（例えば、研究、治療、および細胞株またはトランスジェニック哺乳動物の産生を含む）のために大きなゲノム欠失を作製しようとする任意の遺伝子座における欠失の生成のために使用され得ることを強調すべきである。適切な遺伝子座の例としては、Ｔ細胞レセプター、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ抗原、ならびに免疫グロブリン遺伝子座（例えば、κ、λ、またはＨ鎖遺伝子座の可変領域および定常領域をコードする遺伝子を含む）が挙げられる。遺伝子座のさらなる例としては、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｂ，第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＳ膜貫通調節タンパク質（ＣＳ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）、ジストロフィン遺伝子が挙げられる。大きなゲノム欠失を含む細胞およびトランスジェニック哺乳動物は、遺伝子構造および機能または生化学的プロセス（例えば、タンパク質産生または阻害）を研究するために使用され得る。さらに、トランスジェニック哺乳動物は、細胞、器官、または組織の供給源として使用され得るか、またはヒトの疾患（例えば、筋ジストロフィー、免疫系異常、高コレステロール血症、血友病、および嚢胞性線維症）のモデル系を提供するために使用され得る。
【００１９】
トランスジェニック哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、特に、非霊長類哺乳動物（例えば、実験動物（特に、マウス、ラット、モルモットなどの小実験動物）、家畜、ペットなど）であり得る。トランスジェニック哺乳動物は、薬物のスクリーニングのためまたは生化学的経路を研究するために実験的に使用され得る。トランスジェニック哺乳動物（好ましくは、マウス）はまた、ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９１／００２４５およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６、これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載のように、異種の（好ましくは、ヒトの）抗体または改変抗体を産生するために使用され得る。大きなゲノム欠失が、マウス胚幹細胞中の内因性免疫グロブリン遺伝子座中に作製され、そして、別々の工程において、ヒトＨ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス生殖系列に導入される。これは、適切な真核微生物または原核微生物中にヒトＨ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン遺伝子を再構築し、そして得られたＤＮＡフラグメントを、受精卵母細胞または胚幹細胞（好ましくは、マウス由来の）の前核に挿入することによって達成される。改変された胚幹細胞に部分的に由来し、そして生殖系列を介して遺伝的改変を伝達し得るキメラマウスが生成される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むマウス株と、マウス免疫グロブリン遺伝子座が欠失している株を有する株との交配は、純粋にヒトの抗体を産生するマウスを生成させる。
【００２０】
遺伝子ターゲッティングに供され得る細胞は、任意の目的の哺乳動物細胞であり得、そして初代細胞および形質転換細胞株の両方を含み、それらは、細胞治療、研究、インビトロでの他の細胞との相互作用などにおける使用が見出され得る。特に目的とする細胞としては、ランゲルハンス島、副腎髄質細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、ニューロン、膠細胞、神経節細胞、網膜細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、肝細胞、骨髄細胞、ケラチノサイトおよび筋芽（筋）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、哺乳動物宿主（好ましくはヒトであり、そしてマウスおよび他の齧歯類、ウサギ、ブタ、ネコ、ウシ、イヌなどもまた含む）から得られ得る。
【００２１】
置換標的化構築物は、その発現を防止するために、内因性遺伝子（単数または複数）の少なくとも１つ（好ましくは、両方）のコピーに欠失を導入する目的のための、選択された遺伝子座の内因性遺伝子（単数または複数）の少なくとも一部を含む。欠失が、不活化される遺伝子の１つのコピーのみに導入される場合、標的遺伝子の１つの変異されていないコピーを有する細胞は拡大され、そして第二の標的化工程に供され得る。ここでこの欠失は、第一の欠失と同一であるかまたは異なり得、そして元に導入された欠失の少なくとも一部と重複し得る。この第二の標的化工程において、相同性の同一のアームを有するが、異なる哺乳動物選択マーカー（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ１））を含む標的化構築物が使用され得、ホモ接合型欠失を含むクローンが生成され得る。得られた形質転換体は、ネガティブまたはポジティブ選択マーカーの使用のような標準的な手順によりスクリーニングされ、そして細胞のＤＮＡは、野生型標的遺伝子の非存在を確証するために、サザンブロッティングのような標準的な手順によりさらにスクリーニングされる。あるいは、ＥＳ細胞が標的化され、そして欠失についてのヘテロ接合型であるマウスを生成させるために使用される場合、欠失についてのホモ接合型は、ヘテロ接合型マウスを交雑することにより、達成され得る。
【００２２】
それによってホモ接合型欠失が、第二の標的化工程の使用なしに哺乳動物細胞中に作製され得る別の手段は、ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＵＳ９３／００９２９、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載の、遺伝子標的化事象のホモ部分二倍体化（ｈｏｍｏｇｅｎｏｔｉｚａｔｉｏｎ）を包含する。この方法において、標的化構築物は、第一の標的工程において細胞に導入され、所望のゲノム欠失を作製する。次いで、この細胞を、遺伝子標的化組換え体についてスクリーニングし、そしてこの組換え体を、増幅以外によって複数のコピーの選択因子を有する細胞について選択するために、マーカー遺伝子について上昇したレベルの選択薬剤に曝露する。次いで、この細胞を、標的遺伝子座でのホモ接合性について分析する。
【００２３】
標的化構築物の細胞内への所望の導入を提供するＤＮＡベクターを、使用し得る。この構築物は、構築物の調製、増幅、宿主細胞のトランスフェクション、および構築物の宿主細胞への組み込みについての使用が見出され得る欠失標的化構築物以外の機能的物質を含むように改変され得る。
【００２４】
置換標的化構築物は、１つの部位での欠失および選択マーカーの遺伝子を含む別の部位での挿入を含み得る。特に目的とするのは、マーカー（例えば、ネオマイシン耐性のような抗生物質耐性）を提供する遺伝子である。標的遺伝子中に挿入された選択マーカー遺伝子の存在は、標的ベクターの宿主ゲノムへの組み込みを確立する。しかし、ＤＮＡ分析が、相同組換えまたは非相同組換えが生じたかどうかを確立するために必要とされる。このような欠失が導入される場合、これは、インサートにするプローブを使用し、次いで、構築物のフランキング領域を越えて広がるＤＮＡの存在についてインサートに隣接する５’および３’領域を配列決定するか、または欠失の存在を同定することによって決定され得る。
【００２５】
置換標的化構築物を哺乳動物細胞に導入するために使用され得る技術としては、リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈、ＤＮＡの核へのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、トランスフェクション、リポフェクションなどが挙げられる。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状、弛緩ＤＮＡまたは超らせんＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （１９９０）、第１８５巻、５２７〜５３７頁を参照のこと（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００２６】
ゲノム欠失は、１５  ｋｂより大きく、そして好ましくは、５０  ｋｂ〜３０００  ｋｂの範囲内である。この欠失は、通常、１つ以上のエクソンの一部、１つ以上のイントロンの一部を含むコード領域の少なくとも一部を含み、そしてフランキング非コード領域（特に５’非コード領域（転写調節領域））の一部を含んでもよくまたは含まなくてもよい。従って、相同領域は、コード領域を越えて５’非コード領域へあるいは３’非コード領域へ広がり得る。相同配列は、少なくとも約５００  ｂｐを含むべきである。
【００２７】
標的遺伝子構築物の上流および／または下流には、二重交差が生じたかどうかの同定を提供する遺伝子が存在し得る。この目的のために、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を使用し得る。なぜなら、チミジンキナーゼ遺伝子の存在は、機能的なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含む細胞に対するそれらの細胞傷害性効果について、ヌクレオチドアナログ（例えば、アシクロビルまたはガンシクロビル）の使用により検出され得るからである。それらのヌクレオチドアナログに対する感受性の非存在は、チミジンキナーゼ遺伝子の非存在を示し、従って、この場合相同的組換えが生じ、二重交差事象もまた生じたことを示す。
【００２８】
標的化構築物は、哺乳動物宿主細胞中で機能的である複製系をさらに含み得る。大部分の場合、これらの複製系は、ウイルス複製系（例えば、シミアンウイルス４０、エプスタイン−バーウイルス、乳頭腫ウイルス、アデノウイルスなど）を含む。
【００２９】
遺伝子の性質に依存して、インサート、および／またはフランキング遺伝子として選択マーカー遺伝子が含まれる場合、これは、野生型転写調節領域（特に、転写開始調節領域（例えば、プロモーターまたはエンハンサー））、あるいは異なる転写開始領域を有し得る。遺伝子が、転写開始領域（プロモーター）が、哺乳動物宿主細胞の転写機構によって認識さない宿主由来である場合はいつでも、異なる転写開始領域（プロモーター）が必要とされる。この領域は、構成性または誘導性であり得る。広範な種々の転写開始領域が単離されており、そして異なる遺伝子で使用されている。特に目的とするのは、哺乳動物宿主由来のメタロチオネインＩおよびＩＩのプロモーター、チミジンキナーゼ、βアクチン、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、およびポリオーマウイルスプロモーターである。プロモーターに加えて、野生型エンハンサーが存在し得るか、または異なる遺伝子由来のエンハンサーが、プロモーター領域に連結され得る。
【００３０】
標的化構築物は、原核生物（特にＥ．ｃｏｌｉ）のための複製系をさらに含み得る。この系は、ベクターの調製、各操作後のクローニング、分析（例えば、制限マッピングまたは配列決定）、クローンの拡大およびさらなる操作のためのプラスミドの単離に使用され得る。必要な場合、異なるマーカーを、細菌形質転換体を検出するために使用し得る。
【００３１】
一旦標的化構築物が調製されると、これは細菌配列の直鎖化の欠失によってさらに操作され得る。ここで、小さな欠失（例えば、６０  ｂｐ）が、相同配列中に提供され得る。小さな欠失は、一般に、標的化構造遺伝子の一方または他方の末端付近に存在する。このような調製の後、構築物は、今や標的化細胞中に導入される用意ができている。既に示したように、ＤＮＡを標的細胞中に導入するための便利な任意の技術を使用し得る。標的化構築物の導入後、標的化細胞を、既に示したように、ポジティブおよび／またはネガティブマーカー（例えば、ネオマイシン耐性およびアシクロビルまたはガンシクロビル耐性）によって選択し得る。次いで、所望の表現型を示すこれらの細胞を、制限分析、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）などによりさらに分析し得る。標的遺伝子部位での欠失（単数または複数）の存在を示すフラグメントを同定することによって、相同組換えが生じて、標的遺伝子の２つのコピーのうち１つが不活化された細胞を同定し得る。特に、ＰＣＲを、遺伝子ターゲッティング生じた細胞を検出することにおいて有利に使用し得る。構築物内の配列に相補的なおよび構築物の外側かつ標的遺伝子座における配列に相補的なプライマーが使用され得る。この方法において、相同組換えが生じた場合にのみ、相同鎖に存在するプライマーの両方を有するＤＮＡ二重鎖を得ることができる。プライマー配列または予想されたサイズのＰＣＲ産物配列の存在を実証することにより、相同組換えの発生が確認される。
【００３２】
第二の構築物は、選択マーカーを必ずしも必要としないことにおいて、第一の構築物とは異なる。なぜなら、標的遺伝子産物（例えば、ｈｐｒｔ）の非存在が、マーカーとして使用され得るからである。従って、標的遺伝子を改変および不活化するために、挿入、欠失、または置換を再び使用し得る。
【００３３】
標的遺伝子が欠失している細胞およびＭＨＣクラスＩまたはＩＩ抗原、あるいは免疫グロブリン領域をコードする遺伝子を標的化するときに特に有用である細胞を検出するための別の方法は、標的化構築物およびＥＬＩＳＡを基本とする検出系の使用を包含し、これは独立に標的化された多くのクローンの迅速な検出を可能にする。この方法において、相同的組換えのための部位を、エピトープ（例えば、ＣＤ４）を含むタンパク質のドメインに融合された、強力なエンハンサー／プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶエンハンサー）によって駆動される組換え融合タンパク質を作製するために設計する。エピトープは、それが結合するリガンド（例えば、抗体）によって、検出され得る。ここで、組換え融合タンパク質は、正確に標的化された細胞によって分泌され、次いで、分泌された融合タンパク質を認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡを基本とする系を用いて検出される。この方法において、組換え遺伝子座の５’末端は、標的化構築物に由来し、一方、遺伝子座の３’末端は、標的遺伝子に由来する。全体の５’末端を実験的に制御するので、組換え融合タンパク質の発現レベルおよび最終的な輸送の結果（ｆａｔｅ）の両方を指向し得る。β２−ミクログロブリンエピトープを含むタンパク質をトラップし、そしてＣＤ４エピトープを含むタンパク質を検出するＥＬＩＳＡにおいて、融合タンパク質を検出するために培地をスクリーニングする。この方法は、ＥＳ細胞を含む他の哺乳動物細胞型のために使用され得る。ＣＤ４エピトープに加えて、リガンド（例えば、エピトープに結合する抗体）によって認識されるエピトープを含む他のペプチドを、融合タンパク質において使用し得る。
【００３４】
胚幹細胞（特に、マウス宿主由来のＥＳ細胞）が標的されている場合、トランスジェニック動物を生成させるためにこのような細胞を使用することが所望され得る。このような手順のために、標的化構築物のＥＳ細胞への導入後、細胞を適切な培地（例えば、ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地）中の支持細胞層上にプレーティングし得る。ＥＳ細胞は、標的化された単一の遺伝子座（ヘテロ接合型）または標的化された両方の遺伝子座（ホモ接合型）を有し得る。構築物を含有する細胞を、選択培地を使用することによって検出し得、そしてコロニーが成長するための十分な期間後、コロニーを拾い、そして遺伝子ターゲッティングの発生について分析し得る。前記のように、構築物の配列内および配列外のプライマーを用いるＰＣＲ、あるいはサザンブロット分析またはＰＦＧＥを、しかし標的遺伝子座で使用し得る。次いで、遺伝子ターゲッティングを示すこれらのコロニーを、マウス胚盤胞中への注射に使用し得る。胚盤胞は、排卵後３．５日に子宮をフラッシュすることにより、４〜６週齢の過剰排卵された雌から得られ得る。次いで、ＥＳ細胞をトリプシン処理し、そして改変細胞を胚盤胞を含む小滴に添加し得る。少なくとも１個、通常少なくとも約１０個かつ約３０個までの改変胚幹細胞を、胚盤胞の分割腔に注射し得る。注射後、少なくとも１個かつ１５個以下の胚盤胞を、偽妊娠した雌の各子宮角に戻す。次いで、雌を予定日に進行させ、そして得られた同産児を遺伝子標的化された欠失を含む変異体細胞についてスクリーニングする。
【００３５】
ヘテロ接合型の子孫は、異なる被覆の色（キメラ子孫）を生じる胚盤胞およびＥＳ細胞の異なる遺伝子型を提供することにより容易に検出され得る。特に有用な表現型は、毛の色であるが、任意の表現型を使用し得るか、または所望される場合、改変されたゲノムＤＮＡの存在についてプローブして遺伝子型を調査し得る。子は、通常、胚盤胞の養母への導入後１６〜１８日で生まれる。ヘテロ接合型の動物を、標的化されたゲノム欠失の存在についてスクリーニングし、そして欠失を含む雄と雌とを、欠失についてホモ接合型である動物を生成するために交配する。
【００３６】
ここで、一般に本発明を記載して、以下の実施例は、例示として提供するが、これが本発明を制限することを意図しない。上記および以下で引用された全ての刊行物は、本明細書に参考としてそれらの全体が援用される。
【実施例】
【００３７】
（実験）
（実施例１：置換型遺伝子標的化構築物によるＥＳ細胞中のマウスｈｐｒｔ遺伝子中の５５ｋｂの欠失）
（材料および方法）
（細胞培養およびトランスフェクション）
ＥＳ細胞株Ｅ１４．１およびＥ１４ＴＧ２ａは、それぞれ、Ｒａｊｅｗｓｋｙ博士（Ｕｎｉｖ．Ｋｏｌｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＨｏｏｐｅｒ博士（Ｕｎｉｖ．Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から贈与された。ＥＳ細胞を、１５％の熱不活化ウシ胎児血清（ＨＹＣＬＯＮＥ）、８μｌのβ−メルカプトエタノールおよび１，０００Ｕ／ｍｌの組換えＬＩＦ（Ｅｓｇｒｏ）を含有する抗生物質を補充したダルベッコ改変培地中で増殖させた。細胞を、マイトマイシンＣ処理したマウス胚線維芽細胞の支持細胞層上で培養した。Ｅ１４．１  ＥＳ細胞（２×１０７／０．８ｍｌ）を、それぞれＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化によりプラスミド（ｐＭｐ４またはｐＭｐ５Ｘ）から切り出した１５μｇの標的化構築物の存在下で、Ｇｅｎｅ−ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）によって、２５０Ｖでかつ９６０μＦでエレクトロポーレーションした。ヒトｈｐｒｔミニ遺伝子（Ｒｅｉｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：４２９９−４３０３，１９９０）を、エレクトロポーレーション（２５０Ｖ、５００Ｉ１Ｆまたは９６０μＦ）あるいはリポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７，１９８７）によってＥＳ細胞にトランスフェクトした。
【００３８】
（Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞中の欠失連結部を含むゲノムフラグメントのクローニングおよびマッピングならびに遺伝子ターゲッティング構築物の構築）
ＢａｍＨＩで消化したＥ１４ＴＧ２ａおよび野生型ＥＳ細胞株由来のゲノムＤＮＡの分析により、正常マウスＤＮＡ中に存在する７．０ｋｂのフラグメントのかわりの、Ｅ１４ＴＧ２ａ  ＤＮＡ中のエクソン２および３を含む新規の９．２ｋｂ  ＢａｍＨＩが同定された。新規の９．２ｋｂのフラグメントをクローン化するために、ＢａｍＨＩ消化したＥ１４．１．ＴＧ２ａ  ＤＮＡ由来のゲノムライブラリーを構築し、そして必要な配列を含むクローンをｈｐｒｔ  ｃＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションによって同定した。エクソン３配列を含む９．２ｋｂのフラグメントをクローン化し、そしてエキソン３のＸｈｏＩ部位までの欠失連結部を含む７．０  ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）構築物中にサブクローン化してｐＭＰ４プラスミドを生成させた。
【００３９】
ｐＭＰ４上に存在する相同性の長さを増大させるために、エクソン３の３’末端およびいくらかのイントロン３配列を含む１．１５ｋｂのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、正常なＥＳ細胞からクローン化し、そしてｐＭＰ４中のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩフラグメントのその正常な位置に挿入し、ｐＭＰ５を生成させた。ｐＭＰ５Ｘを、ＥｃｏＲＩでｐＭＰ５を消化し、クレノウを用いて平滑末端を生成させ、そしてＤＮＡを再連結してエクソン３の上流に唯一のＸｍｎＩ部位を作製することにより構築した。２つの構築物ｐＭＰ４およびｐＭＰ５Ｘを、Ｅ１４．１  ＥＳ細胞中にＥ１４Ｔ６２ａ欠失を再現するための遺伝子ターゲッティング実験における標的構築物として使用した。
【００４０】
（ＨＰＲＴ標的化ＥＳクローンの選択）
エレクトロポーレーション後、２×１０６のＥ１４．１  ＥＳ細胞を、支持細胞をコートした９０ｍｍのプレート上に播種した。５〜６日後、細胞をトリプシン処理し、そしてゼラチンをコートした９０ｍｍのディッシュに０．５×１０６ＥＳ細胞／プレートの濃度で再播種した。６−チオグアニン（６−ＴＧ、５μｇ／ｍｌ）を添加し、そして培地を２日毎に交換した。選択開始の７〜１０日後、６−ＴＧ耐性ＥＳコロニーを拾い、そして分析のために処理した。
【００４１】
（６−ＴＧ耐性ＥＳクローンの分析）
６−ＴＧ  ＥＳクローンから抽出したゲノムＤＮＡを、種々の制限酵素で消化し、そして以下のプローブを用いたサザンブロット分析によって分析した：ＡＴＣＣから得たマウスｈｐｒｔ  ｃＤＮＡ；５’プローブ−ｐＭＰ４由来の４００  ｂｐのＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩフラグメント（図３参照）；および３’プローブ−Ｅ２（マウスｈｐｒｔ遺伝子のイントロン３由来の２５０ｂｐのＲｓａＩフラグメント）。Ｅ１４ＴＧ２ａおよび遺伝指標的化ＥＳクローン中のＨＰＲＴ欠失のサイズを、ＣＨＥＦ  ＤＲＩＩ（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＰＦＧＥによって決定した。電気泳動の条件は以下のとおりであった：１５秒の一定のパルス間隔；０．５×ＴＢＥ中、２００Ｖ、２０〜２２℃、２２時間。
【００４２】
（ＥＳ細胞のマイクロインジェクションおよびマウス生成）
ＥＳ細胞のマウス胚盤胞へのマイクロインジェクション、キメラマウスの生成および飼育を、記載のように実施した（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編、（ＩＲＬ  Ｏｘｆｏｒｄ、１３〜１５１頁、１９８７））。
【００４３】
（結果および考察）
第一のＨＰＲＴ欠失ＥＳ細胞株Ｅ１４ＴＧ２ａを、Ｅ１４（１２９胚盤胞から単離されたＥＳ細胞株）の６−ＴＧ自発性変異体として選択した。Ｅ１４ＴＧ２ａ中の獲得された変異の以前の特徴づけにより、これがｈｐｒｔ遺伝子の最初の２つのエクソン、そのプロモーター、および未決定的な長さの上流配列を除去した欠失として同定された。欠失のサイズは、２０ｋｂと評価されたが、その正確なサイズは決定されなかった。Ｅ１４．１細胞において遺伝子ターゲッティングによってＥ１４ＴＧ２ａ変異を再現するために、変異体細胞株由来の欠失連結部を含むゲノムフラグメントをクローン化し、そして欠失の正確なサイズを決定した。
【００４４】
Ｅ１４ＴＧ２ａのマッピング分析により、変異が、２および３にわたる７．０  ｋｂの野生型フラグメントのかわりに９．２ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを生成したことが示された（図１を参照のこと）。エクソン３配列を含む９．２ｋｂのフラグメントを、Ｅ１４ＴＧ２ａ  ＢａｍＨＩゲノムライブラリーからクローン化し、そして欠失連結部領域をさらにマッピングおよびサイズ決定するために使用した（図１を参照のこと）。欠失サイズを、稀な制限酵素および３’および５’プローブを用いたハイブリダイゼーションを使用して（ＰＦＧＥ）決定した（図１を参照のこと）。Ｅ１４．１およびＥ１４ＴＧ２ａから単離したＳｃａＩＩ消化ゲノムＤＮＡの５’プローブを用いるサザンブロットのハイブリダイゼーションにより、それぞれ、１７０  ｋｂおよび１１５  ｋｂのフラグメントが示された（図２Ａを参照のこと）。３’プローブを用いるこのブロットのハイブリダイゼーションにより、同じ１７０  ｋｂおよび１１５  ｋｂのフラグメントが検出され、このことは、ＳｃａＩＩフラグメントが欠失領域全体にわたり、そしてＥ１４ＴＧ２ａにおける５５  ｋｂの欠失サイズを示すことを示唆する。欠失サイズを、両方の細胞株由来のＢｓＨＩＩ消化ＤＮＡの分析によってさらに確認した。単一の１２５  ｋｂのフラグメントが、５’および３’プローブによってＥ１４ＴＧ２ａ中に検出され、一方Ｅ１４．１は、以下の二つのフラグメントを生じた：それぞれ５’および３’プローブによって検出された１００  ｋｂおよび８０  ｋｂ。この分析により、欠失領域内のＢｓｓＨＩＩ部位の存在が示され、そして欠失サイズが５５  ｋｂであることがさらに確認された。
【００４５】
（Ｅ１４．１細胞中のマウスＨＰＲＴ遺伝子の５５  ｋｂの遺伝子標的化欠失）
９．２  ｋｂの欠失連結部クローンの７．０  ｋｂのＢａｍＨ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ構築物中にサブクローン化し、Ｅ１４．１−ｈｐｒｔ遺伝子座に対する６．６  ｋｂの相同性を含むｐＭＰ４標的化構築物を生成した。さらに、第二の標的化構築物ｐＭＰ５を、さらなる１．１  ｋｂの３’側の相同性を付加することにより構築した（図１を参照のこと）。エクソン３の０．２５  ｋｂ上流に位置するＥｃｏＲＩのかわりにＸｍｎＩ部位を含みかつ選択マーカーを欠く二つの構築物（ｐＭＰ４および改変したｐＭＰ５）を、置換型標的化構築物として使用し、遺伝子ターゲッティングによるＥ１４．１細胞中の５５．０  ｋｂの欠失を生成させた。この構築物を、Ｅ１４．１細胞中にエレクトロプレートし（ｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｔｅ）、そして細胞を７〜１０日間６−ＴＧ選択に供し、それぞれ２４および１６の６−ＴＧ耐性クローンを生成させた。全てのクローンを拡大し、そしてそれらのゲノムＤＮＡを３’プローブを用いたサザンブロット分析に供した。遺伝子標的化事象により、ネイティブなＥ１４．１細胞中の７．０のフラグメントに比較して、９．２  ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントが生じるはずである。それぞれｐＭＰ４およびｐＭＰ５．２Ｘのエレクトロポーレーションから生成した２つのクローンｐｍ４．２およびｐｍ５ｘ．１は、予想されたＢａｍＨＩパターンを示した（図３を参照のこと）。これらの９．２ｋｂのフラグメントはまた、親株Ｅ１４．１中の１２ｋｂのフラグメントを検出した５’プローブにハイブリダイズした。
【００４６】
上記２つのクローン（ｐｍ４．２およびｐｍ５ｘ．１）のさらなる分析を、ＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ消化によって行った。３’プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、Ｅ１４ＴＧ２ａについて検出されたものと同一であるが、Ｅ１４．１中に存在しない、ｐｍ４．２およびｐｍ５ｘ．１クローン中の５．２  ｋｂが示された。残りの９．２  ｋｂのフラグメントは、おそらくメチル化の結果としての不完全なＣｌａＩ消化から生じた。対照的に、５’プローブを用いたハイブリダイゼーションにより、予想されたように、４個全ての細胞株中の４．０  ｋｂのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントの存在が示された（図３を参照のこと）。これらの結果は、ｐｍ４．２およびｐｍ５ｘ．１が、遺伝子ターゲッティング事象から得られた事を示す。
【００４７】
遺伝子標的化された５５  ｋｂ欠失のさらなる確認は、ＰＦＧＥ分析から得られた（図２を参照のこと）。ＳｃａＩＩおよびＢｓｓＨＩＩを用いた消化の際、クローン（ｐｍ４．２およびｐｍ５ｘ．１）は、Ｅ１４ＴＧ２ａについて検出されたフラグメントとサイズが同一であるフラグメントを生じた。このことは、ＥＳ細胞における遺伝子ターゲッティングによるＥ１４ＴＧ２ａ欠失の再現を示す。
【００４８】
本発明者らは、前記実施例中で、１５  ｋｂより大きな欠失が、比較的簡単な置換型構築物を用いることによって作製され得ることを実証した。この実施例において、ｈｐｒｔ遺伝子を、ｈｐｒｔ欠失Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞由来の置換構築物を用いて標的化した（Ｈｏｏｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３２６：２９２−２９５  １９８７）。この分野の他者がｈｐｒｔ遺伝子を標的化したが、達成された欠失は、１〜２ｋｂおよび１９ｋｂのオーダーであり、これらは、本発明者らが実証した欠失よりも顕著に小さい（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，  ５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８５：８５８３−８５８７，１９８８；Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．  １４：２４０２−２４１０，１９９４）。置換構築物を用いて、本発明者らは、ｈｐｒｔ遺伝子座中の５５  ｋｂの欠失を作製した。これらの結果は、置換型構築物を使用し、大きなＤＮＡフラグメントを欠失し得ること実証する。
【００４９】
上記発明を、理解を明瞭にする目的のために例示および実施例によっていくらか詳細に記載したが、本発明の教示を考慮すれば、特定の改変および変形が、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなくそれに対してなされ得ることは当業者に容易に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、以下の実施例１に記載の、正常マウスおよび変異体Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞中のｈｐｒｔ遺伝子座ならびに５５ｋｂを欠失するために使用された標的化構築物を示す（制限酵素部位：Ｂ；ＢａｍＨＩ、Ｃ；ＣｌａＩ、Ｅ；ＥｃｏＲＩ、Ｘ；ＸｈｏＩ、ＳＳ；ＳａｌＩおよびＸｍｎＩ）。
【図２】図２（ａおよびｂ）は、以下の実施例１に記載の、Ｅ１４．１、Ｅ１４ＴＧ２ａ、ｐｍ４．２、およびｐｍ５ｘ．１細胞中のｈｐｒｔ遺伝子座のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を示す。（図２ａ。ＤＮＡを、ＳａｃＩＩ（Ａ，Ｂ）またはＢｓｓＨＩＩ（Ｅ，Ｆ）で消化し、そして５’プローブ（Ａ，Ｅ）または３’プローブ（Ｂ，Ｆ）でプローブした）；図２ｂ。Ｅ１４．１およびｐｍ４．２  ＥＳ細胞中のｈｐｒｔ遺伝子座中のＳａｃＩＩおよびＢｓｓＨＩＩ制限部位の略図。）
【図３】図３（ａおよびｂ）は、以下の実施例１に記載の、標的化構築物（ｐＭｐ４）を用いる、遺伝子標的化した５５ｋｂ欠失によるマウスｈｐｒｔ遺伝子座の不活化を示す。（図３ａ。分析のために使用したプローブ（５’および３’プローブ）ならびにＥ１４．１細胞、Ｅ１４ＴＧ２ａ細胞および得たれた標的化クローン中の標的化領域の周囲のｈｐｒｔ遺伝子の構造：Ｂ；ＢａｍＨＩ、Ｃ；ＣｌａＩ、Ｘ；ＸｈｏＩ、Ｒ；ＲｓａＩ、ｊｘ；連結部およびＥｘ；エクソン；図３ｂ。Ｅ１４．１、Ｅ１４ＴＧ２ａ、ならびに標的化ＥＳクローンｐｍ４．２およびｐｍ５ｘ．１中のｈｐｒｔ遺伝子座のサザンブロット分析。ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ（Ａ，Ｂ）またはＢａｍＨＩ／ＣｌａＩ（Ｃ，Ｄ）で消化し、そして５’プローブ（Ａ，Ｃ）または３’プローブ（Ｂ，Ｄ）でプローブした。）
【図１】
2004305220.tif 000002
【図２】
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【図３】
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