(57)【要約】【課題】乳頭腫ウィルス抗原蛋白質及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドを含む、乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を予防又は治療するための薬剤学的組成物を提供すること。【解決手段】乳頭腫ウィルスＥ７抗原蛋白質として、ヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７蛋白質を使用する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的有効量の乳頭腫ウィルスＥ７抗原蛋白質及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドを含み、ここで、上記オリゴデオキシヌクレオチドが、１以上のヌクレオチドがそのオリゴデオキシヌクレオチド内の連続したＣｐＧモチーフを分離しているところの１以上のＣｐＧモチーフを有する、８〜４０個のヌクレオチドを含む、乳頭腫ウィルスにより誘発される細胞増殖性疾患を予防又は治療するための薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記乳頭腫ウィルス抗原蛋白質がヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７蛋白質である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記ヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７蛋白質が組換え蛋白質である、請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドが５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患が子宮頸部癌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乳頭腫ウィルス抗原蛋白質及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（以下、ＣｐＧ−ＯＤＮという）を含む、乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を予防又は治療するための薬剤学的組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳頭腫ウィルス（ＰＶ）は漫然してある深刻な疾患であって、皮膚及び粘膜表皮の陽性、異形性及び悪性過増殖を誘導するものと知られている［参照：Ｍａｎｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，  １１５５：  ３２３−３４５，  １９９３；  Ｐｆｉｓｔｅｒ，  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ９９：１１１−１８１，  １９８４；  Ｂｒｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，  ４  ：  １７−３６，  １９８６］。
【０００３】
ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）はヒトの扁平上皮の過増殖、悪性病変（癌腫）等に関連しているＤＮＡ腫瘍ウィルスである。数多くの女性の生殖系がヒト乳頭腫ウィルスに感染しているが、乳頭腫ウィルス感染は相当数の女性において頸部癌に進行する。よって、女性の癌死亡率の２０％がＨＰＶと関連がある。
ＨＰＶは癌に進行する病変に対する相対的傾向及び関連した臨床的病変に基づき、ハイリスクＨＰＶ（例：ＨＰＶ１６型、ＨＰＶ１８型）及びローリスクＨＰＶ（例：ＨＰＶ６型、ＨＰＶ１１型）に分類される。ＨＰＶ１６型の感染が子宮頸部癌発生の主要原因であり［参照：ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ，  Ｈ．，  Ｖｉｒｏｌ．，  １８４：  ９−１３，  １９９１］、ＨＰＶ蛋白質の中でもＥ６及びＥ７蛋白質が子宮頸部癌の形成及び維持に重要な役割をするものと公知になっている［参照：Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８；  ５５２３−５５２７，  １９９１；  Ｗｅｒｎｅｓｓ，  Ｂ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４８：  ７６−７９，  １９９０；  Ｄｙｓｏｎ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４３：  ９３４−９３７，  １９８９］。ＨＰＶ１６型のＥ７蛋白質のアミノ酸序列がこの核酸序列から類推され、文献［参照：Ｎ．  Ｓａｌｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｈａｗｌｅｙ，  “Ｔｈｅ  Ｐａｐｏｖｉｒｉｄａｅ”，  Ｖｏｌ．  ２，  ｐ．３７９，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８７）］に記述されている。
【０００４】
子宮頸部癌患者からＥ７特異免疫反応が検出されるが［参照：ｄｅ  Ｇｒｕｉｊｌ，  Ｔ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７７：  ２１８３−２１９１，  １９９６］、これはＥ７蛋白質が子宮頸部癌免疫治療の目的物になれることを意味する。従って、いろいろの動物モデルにおいてＥ７蛋白質を用いた予防及び治療用ワクチンの使用可能性が研究されている。その例としては、Ｅ７組換え蛋白質［参照：Ｆｅｒｎａｎｄｏ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１５，  １９９９］、Ｅ７発現遺伝子ワクチン［参照：Ｈｕｎｇ，  Ｃ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１：  ３６９８−３７０３，  ２００１］、Ｅ７又はＥ７の細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを発現する微生物及びウィルスベクター［参照：Ｌａｍｉｋａｎｒａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７５：  ９６５４−９６６４，  ２００１；  Ｃｈｅｎｇ，  Ｗ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １３：  ５５３−５６８，  ２００２；  Ｌｉｕ，  Ｄ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４：  ２８８８−２８９４，  ２０００；  Ｌｏｎｄｏｎｏ，  Ｌ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １４：  ５４５−５５２，  １９９６］及びＥ７  ＣＴＬエピトープ［参照：Ｆｅｌｔｋａｍｐ，  Ｍ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２３：  ２２４２−２２４９，  １９９３］などの利用が挙げられる。これらの研究において、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び特にＣＴＬが腫瘍生成の抑制に関与する免疫細胞群として明らかになった。
【０００５】
一方、免疫システムは、病原体と宿主ＤＮＡ間の構造的及び序列上の差によって、細菌を含んだ下等有機体のＤＮＡを認識する。特に、非脊椎動物から由来した短ストレッチのＤＮＡ又は特定塩基脈絡でメチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含む短いオリゴデオキシヌクレオチド型の短ストレッチのＤＮＡが標的になった。
最近、細菌性ＤＮＡ自体が哺乳動物の免役反応を刺激するものと明らかになった。細菌性ＤＮＡと哺乳動物ＤＮＡとの主な差は、細菌性ＤＮＡが哺乳動物ＤＮＡには含まれないメチル化されていないＣｐＧ（シトシン−ホスホロチオエート−グアニン）ジヌクレオチドを多数含むことにある。これに基づき、メチル化されていないＣｐＧモチーフを含む合成ＣｐＧ−ＯＤＮが免役刺激剤として用いられている。
【０００６】
メチル化されていない形のＣｐＧモチーフを有するＯＤＮは、Ｂリンパ球、大食球及びＮＫ細胞を活性化させ、Ｔｈ１型の免役反応を誘導するものと公知になっている［参照：Ｂｏｈｌｅ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２９：  ２３４４−２３５３，  １９９９；  Ｋｌｉｎｍａｎ，  Ｄ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３：  ２８７９−２８８３，  １９９６；  Ｋｒｉｅｇ，  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７４：  ５４６−５４９，  １９９５；  Ｂａｌｌａｓ，  Ｚ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５７：  １８４０−１８４５，  １９９６；  Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３０：  ３５９１−３５９７，  ２０００；  Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２８：  ２０４５−２０５４，  １９９８；  Ｃｈｕ，  Ｒ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８６；  １６２３−１６３１，  １９９７；  Ｌｅｃｌｅｃｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７９：  ９７−１０６，  １９９７；  Ｋｌｉｎｍａｎ，  Ｄ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８：  ３６３５−３６３９，  １９９７；  Ｊａｋｏｂ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６１：  ３０４２−３０４９，  １９９８．］。ＣｐＧ−ＯＤＮは大食球からＩＬ−１２の生成を誘導してＮＫ細胞からＩＦＮ−γの生成を誘導し、Ｔｈ１型の免役反応を選択的に誘導するものと公知になっている［参照：Ｃｈｕ，  Ｒ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８６：  １６２３−１６３１，  １９９７；  Ｒｏｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ３：  ８４９−８５４，  １９９７］。また、ＣｐＧ−ＯＤＮは抗体の中でもＩｇＧ２ａ型抗体（Ｔｈ１型の抗体）の生成を選択的に誘導し［参照：Ｃｈｕ，  Ｒ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８６：  １６２３−１６３１，  １９９７；  Ｄａｖｉｓ，  Ｈ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６０：  ８７０−８７６，  １９９８］、ＣＴＬ反応も増加させるものと公知になっている［参照：Ｋｒｉｅｇ，  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７４：  ５４６−５４９，  １９９５；  Ｗａｒｒｅｎ，  Ｔ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６５：  ６２４４−６２５１，  ２０００］。これらＣｐＧ−ＯＤＮは現在免役活性剤として広範囲に研究されている［参照：Ｄａｖｉｓ，  Ｈ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６０：  ８７０−８７６，  １９９８；  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｇ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４：  １０８３３−１０８３７，  １９９７；  Ｄａｉｖｓ，  Ｈ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３；  ７２１３−７２１８，  １９９６；  Ｋｌｉｎｅ，  Ｊ．  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６０：  ２５５５−２５５９，  １９９８；  Ｓｃｏｔｔ  Ｇａｌｌｉｃｈ���ｎ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６６：  ３４５１−３４５７，  ２００１］。ところが、ＣｐＧ−ＯＤＮの子宮頸部癌を含んだ乳頭腫ウィルス誘発疾患における抗免役効果については記述されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
現在まで乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を治療するための多数の利用可能な方法があったが、いずれの治療法も持続的なＨＰＶ誘発疾患の除去に対し一定に効果を示す方法ではなかった。
【０００８】
本発明は、乳頭腫ウィルス抗原蛋白質をＣｐＧ−ＯＤＮと共に使用する場合、これらの単独使用に比べてＥ７特異抗体反応及びＴｈ細胞増殖反応を増加させ、またこれらを同時に使用した場合にのみ、腫瘍の予防及び治療に関する抗腫瘍活性を有し、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）Ｔリンパ球反応を示し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞からＩＦＮ−γが生成されるという優れた効果を有することを明らかにした。
【０００９】
これに基づき、本発明はＴｈ１型のＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＴＬ反応を選択的に増加させ、乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を効果的に処理することが可能な強力な免疫誘導方法を提供することができる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、免疫学的有効量の乳頭腫ウィルスＥ７抗原蛋白質及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドを含む、乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を予防又は治療するための薬剤学的組成物に関するものである。本発明の組成物はＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドであって、一つ以上のメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含み、一つ以上のヌクレオチドが連続したＣｐＧを分離させ、約８〜４０個のヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチドを含む。
好ましくは、本発明の組成物は乳頭腫ウィルス抗原蛋白質であって、ヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７蛋白質を含む。
特に好ましくは、本発明の組成物は乳頭腫ウィルス抗原蛋白質であって、ヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７組換え蛋白質を含む。
【００１１】
特に好ましくは、本発明の組成物はＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドであって、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’を含む。
好ましくは、本発明の組成物は子宮頸部癌を予防又は治療するための薬剤学的組成物に関するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、免疫学的有効量の乳頭腫ウィルスＥ７抗原蛋白質及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドを含む、乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を予防又は治療するための薬剤学的組成物を提供する。
前記において、用語「免疫学的有効量」とは、投与対象の動物内で乳頭腫ウィルス誘発疾患の予防又は治療に効果的な免役反応を誘導することが可能な活性成分の量を意味する。
【００１３】
用語「乳頭腫ウィルス誘発疾患」とは、乳頭腫ウィルスにより誘発され、周辺組織と形態上異なる悪性及び非悪性細胞群の細胞−増殖性疾患を意味する。
用語「予防又は治療」において、予防は乳頭腫ウィルスに露出される前に薬物が投与されること、治療は感染後又は疾患の発病後に薬物が投与されることを意味する。
【００１４】
用語「抗原」とは、免役反応を起こすことが可能な分子を意味する。本発明の目的上、「乳頭腫ウィルス抗原」は天然から分離したものか、或いは組換え方法によって製造したものを使用する。
好ましい様態として、本発明は、乳頭腫ウィルスＥ７抗原蛋白質としてヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７蛋白質を使用する。
【００１５】
本発明の薬剤学的組成物内に乳頭腫ウィルス抗原蛋白質として含まれることが可能な、天然から分離されたか或いは組換え方法によって製造された乳頭腫ウィルス抗原蛋白質は、天然蛋白質序列を有する蛋白質は勿論、天然の蛋白質序列と８５％以上、好ましくは９０％以上同一の序列を有しており、天然の乳頭腫ウィルス抗原蛋白質と実質的に同一の免役反応を起こすことが可能な蛋白質を意味する。天然から分離された蛋白質は、乳頭腫ウィルスの大量培養から当分野の通常の方法を用いて分離、精製することができる。
【００１６】
本発明の乳頭腫ウィルス抗原蛋白質として特に好ましいものは、遺伝子組換え方法によって生産されたヒト乳頭腫ウィルス１６型のＥ７組換え蛋白質である。本発明で使用するＥ７組換え蛋白質は、公知の様々な組換え発現ベクターを用いて製造することができる。
【００１７】
用語「ベクター」とは、適合な宿主内でＤＮＡを発現させ得る適合な調節序列に作動可能に連結されたＤＮＡ序列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。本発明の目的上、組換え発現ベクターとしては、乳頭腫ウィルス抗原蛋白質を発現させることが可能なものであれば、いずれも制限なく使用することができる。例えば、プラスミド、ファージ、他のウィルスなどを使用することができる。一般に、適合した宿主が組換えベクターで形質転換されると、このベクターは宿主ゲノムと関係なく複製及び機能することができ、一部の場合にはゲノム自体に統合されることもできる。
【００１８】
本発明の乳頭腫ウィルス抗原蛋白質の発現に適した真核宿主で使用可能な発現ベクターには、例えばＳＶ４０、レトロウィルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウィルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ）、ポックスウィルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、レンチウィルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウィルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウィルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）などがあり、細菌宿主で使用可能な発現ベクターには、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体などのようにＥ．ｃｏｌｉ由来の細菌性プラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０、λｇｔ１１などの非常に様々なファージλ誘導体で例示されるファージＤＮＡ、Ｍ１３とフィラメント性単一本のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージなどが含まれる。酵母細胞で有用な発現ベクターには２μプラスミド及びそれの誘導体などが含まれ、昆虫細胞に有用なベクターにはｐＶＬ９４１などが含まれる。
【００１９】
一般に、組換え発現ベクターは、特定の宿主生物から作動可能に連結された暗号化序列の発現に必須的な発現調節序列を含む。本発明に係るＤＮＡ序列を発現させるために、非常に様々な発現調節序列を使用することができる。例えば転写を行うためのプロモータ、このような転写を調節するための任意のオペレーター序列、適合なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする序列、及び転写と解読の終結を調節する序列を含む。例えば、原核生物に適した調節序列はプロモータ、オペレーター、リボソーム結合部位などを含む。真核細胞の発現に適した調節序列はプロモータ、ポリアデニル化シグナル、エンハンサなどを含む。プラスミド遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子はプロモータであり、高発現用のプロモータとしてＳＲαプロモータやサイトメガロウィルス由来プロモータなどが好ましく使用される。
【００２０】
また、一つの核酸序列が他の核酸序列と機能的な関係で配置されるとき、作動可能に連結されることができる。例えば、遺伝子発現ができるように転写活性化蛋白質を暗号化する序列が調節序列（等）に連結されるか、或いはプリシーケンス（ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダーを暗号化する序列が目的蛋白質またはペプチド暗号化核酸序列に連結されるか、或いは転写に影響を与えるリボソーム結合部位が目的蛋白質又はペプチド暗号化序列に連結されるか、或いは解読を容易にするリボソーム結合部位が目的蛋白質又はペプチド暗号化序列に連結される。
【００２１】
本発明に係る組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム、エレクトロポレーションなどの方法を用いて細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換させるための技術及びこれらの内でクローニングンされた外来ＤＮＡ序列を発現させる方法は当分野で既によく知られている［参照：Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）；  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ＆  Ｆｉｎｋ（ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  １９９１；  Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５５，  １２０７３−１２０８０，  １９８０］。
【００２２】
発現される蛋白質は、目的蛋白質が他の蛋白質と融合された融合蛋白質として発現されることができ、例えばＥ７蛋白質とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質がＥ．ｃｏｌｉで発現されることができる［参照：Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ｇ．  Ｊ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １１５（３）：  ３９７−４０３，  １９９９  Ｍａｒ］。また、熱ショック蛋白質遺伝子と融合されたＥ７蛋白質を暗号化する遺伝子を有するアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）で宿主細胞を形質感染させ、それから融合蛋白質を製造することができる［参照：Ｌｉｕ  Ｄ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４（６）２８８８−９４，  ２０００，  Ｍａｒ］。
【００２３】
また、乳頭腫ウィルス抗原蛋白質は、グリコシル化或いはリピド化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）されることができ、抗原提示を増進させ且つ抗原の抗原提示細胞への標的を向上させる分子を含むように誘導体化されることができる。
乳頭腫ウィルス抗原蛋白質は、分離精製して使用することが好ましい。このため、蛋白質を分離精製する通常の技術を使用することができる。また、乳頭腫ウィルス組換え蛋白質の分離精製を容易にするため、例えばＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇなどとの融合蛋白質に製造することができる。
【００２４】
本発明で製造されたＥ７組換え蛋白質はＥ７蛋白質の９８個のアミノ酸を含む蛋白質であって、プラスミドベクターｐＥＴ−Ｅ７をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、Ｅ７蛋白質とｐＥＴベクターのＨｉｓ−ｔａｇペプチドが融合された蛋白質として分泌されたものであり、Ｈｉｓ−ｔａｇペプチド残基は蛋白質の精製を容易にする。このように分離精製されたＥ７組換え蛋白質は内毒素を除去した後使用することが好ましい。
【００２５】
また、本発明の組成物に使用される天然又は組換え乳頭腫ウィルス抗原蛋白質は、免役反応を増強させることが可能な通常の技術で変形することができる。
用語「ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）」とは、メチル化されていない一つ以上のＣｐＧ（シトシン−ホスホロチオエート−グアニン）ジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２６】
好ましくは、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドは一つ以上のヌクレオチドが連続したＣｐＧを分離させ、約８〜４０個のヌクレオチドを含むＯＤＮである。
特に好ましくは、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号１）を含む。
ＣｐＧ−ＯＤＮは化学的に合成されるか、或いは組換え的に生成されるか、或いは天然供給源から誘導されることができる。勿論、他のＣｐＧ−ＯＤＮの混合物も使用されることができる。
【００２７】
化学的に合成されたＣｐＧ−ＯＤＮは当分野の多数の公知方法を用いてデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成をすることができる。例えば、β−シアノエチルホスホルアミデート方法［参照：Ｓ．  Ｌ．  Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．，  ２２：  １８５９，  １９８１］、ヌクレトシドＨ−ホスホネート方法［参照：Ｇａｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．，  ２７：  ４０５１−４０５４，  １９８６；  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  １４：  ５３９９−５４０７；  Ｇａｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔ．  Ｌｅｔ．  ２９：  ２６１９−２６２２，  １９８８］を利用することができる。このような化学的合成方法は市販される様々な自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して行うことができる。この他にも、オリゴヌクレオチドを、公知の方法、例えば制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いて、存在する核酸序列（例えば：ゲノム又はｃＤＮＡ）から製造することができる。
【００２８】
また、ＣｐＧ−ＯＤＮは、生体内における分解に耐性を持たせるために、適した変形を加えることができる。好ましくは、ホスホロチオエート変形を含む。ホスホロチオエート変形は末端から起こることができる。例えば、最後の２つまたは３つの５’又は３’ヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって結合されることができる。また、ＣｐＧ−ＯＤＮは分解に耐性を持たせる２次構造（例：ステムループ構造）を含むように変形されることができる。好適な安定化された核酸は、一つ以上の部分的ホスホロチオエート変形された骨格を有するものである。ホスホロチオエートはホスホルアミデート又はＨ−ホスホネート化学によって自動化された技術を用いて合成することができる。アリール−及びアルキル−ホスホネートは例えば米国特許第４，４６９，８６３号の記述通りに製造することができ、アルキルホスホトリエステル（荷電された酸素残基が米国特許第５，０２３，２４３号及びヨーロッパ特許第０９２，５７４号の記述通りにアルキル化される）は市販試薬を用いて、自動化された固相合成によって製造することができる。他のＤＮＡ骨格変形を作る方法及び置換方法が文献［参照：Ｕｈｌｍａｎｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９０：  ５４４，  １９９０；  Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  Ｊ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  １：  １６５，  １９９０］に記述されている。分解に少し鈍くする別の変形はアデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウリジンのアセチル−、チオ−及び類似の変形形態だけでなく、イノシン及びクェシン（ｑｕｅｓｉｎ）のような非定型塩基を含むものである。
【００２９】
ジオール、例えばテトラエチレングリコール又はヘキサエチレングリコールを末端に含むＣｐＧ−ＯＤＮも分解にさらに耐性的であるものと明らかになった。
生体内投与の場合には、ＣｐＧ−ＯＤＮは、標的細胞の表面への高親和性結合又は増加された細胞摂取のための分子との結合により、「核酸伝達コンプレックス」を形成することができる。核酸は、当分野に広く知られている技術を用いて、イオン結合的又は共有結合的に適した分子と結合されることができる。適したカップリング剤又は架橋剤として、例えば蛋白質Ａ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ビリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）などを使用することができる。また、ＣｐＧ−ＯＤＮは公知技術を用いてリポソーム又はウィロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）にカプセル化することができる。
【００３０】
本発明では、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを共同注射して動物モデルから抗腫瘍効果を観測し、またＥ７特異抗体反応、Ｔｈ細胞増殖反応、ＣＴＬ反応、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γの生成を観測した。
具体的に、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射して乳頭腫ウィルス１６型のＥ７発現腫瘍細胞株の注射に対する抗腫瘍予防効果を観測した（図１及び表２）。その結果、Ｅ７蛋白質又はＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ注射した場合には、図１及び表２に示すように、前記のような抗腫瘍予防効果が全く観測されず、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射した場合にのみ抗腫瘍予防効果が観測された。これは抗腫瘍治療効果の面においても類似であって、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射した場合にのみ抗腫瘍治療効果が観測された（図２）。これは乳頭腫ウィルスにより誘発される腫瘍の予防及び治療に乳頭腫ウィルス抗原蛋白質及びＣｐＧ−ＯＤＮが必須的であることを示す。
【００３１】
このように本発明の場合には乳頭腫ウィルス抗原蛋白質及びＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ使用した場合にはいずれの抗腫瘍効果も観測することができず、これらの両者を全て使用した場合にのみ抗腫瘍効果が観測された。これからみても、ＣｐＧ−ＯＤＮをそれ自体で或いは公知の免役効果を増強させるための補助剤として使用する従来の技術からは、本発明におけるような抗腫瘍効果を全く予測することができない。
【００３２】
また、Ｅ７蛋白質とＣｐｇ−ＯＤＮの同時注射によるＥ７特異抗体反応を観測した結果、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射した場合、より高いＥＬＩＳＡ力価を示し、Ｅ７蛋白質の単独注射に比べて一層増強した抗体反応を示し（図３Ａ）、またＩｇＧイソ型、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３抗体の生成が一層増強した（図３Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。
【００３３】
Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射によるＴｈ細胞増殖反応を観測した場合にも、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ注射した場合に比べてＴｈ細胞増殖反応が相当増加した（図４Ａ）。一方、ＣＤ４＋Ｔリンパ球を除去した場合、Ｔｈ細胞増殖反応は全く探知されなかった。これは抗体反応とＣＤ４＋Ｔリンパ球に連関したＴｈ細胞増殖反応とが直接的相関関係にあることを意味する。
【００３４】
また、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射によるＣＴＬ反応を観測した結果、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射した場合にのみＣＴＬ反応が観測され、Ｅ７又はＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ注射した場合にはＣＴＬ反応が観測されなかった（図４Ｂ）。このような結果からＥ７蛋白質による抗原特異的ＣＴＬ反応の誘導にＣｐＧ−ＯＤＮが必須的であることが分る。
【００３５】
また、Ｅ７蛋白質とＯＤＮの同時注射によるＩＦＮ−γの生成を観測した。ＩＦＮ−γの生成におけるＣｐＧ−ＯＤＮの効果について報告されたことがあり［参照：Ｃｈｕ，  Ｒ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８６：  １６２３−１６３１，  １９９７］、本発明では抗原で刺激した場合、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮが同時に注射された動物群でのみＣＤ４＋Ｔリンパ球からＩＦＮ−γの生成が誘導された（図５Ｂ）。これは抗原刺激の際にＣＤ８＋Ｔリンパ球でないＣＤ４＋Ｔリンパ球がＩＦＮ−γを生産することを意味する。同様に、ＴＣ−１細胞株で刺激した場合には、Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮが同時に注射された動物群でのみＣＤ８＋Ｔリンパ球からＩＦＮ−γが生成される反面、Ｅ７又はＣｐＧ−ＯＤＮがそれぞれ注射された動物ではＩＦＮ−γの生成を観測することができなかった（図５Ｄ）。これはＴＣ−１細胞株の刺激の際、ＣＤ４＋Ｔリンパ球でないＣＤ８＋Ｔリンパ球がＩＦＮ−γを分泌することを意味する。
【００３６】
このような結果はＥ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射して誘導されたＣＴＬ反応誘導結果とも一致する。これは結局Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮの同時利用がＭＨＣ  Ｉ及びＩＩに相応してＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球からＩＦＮ−γの生成を誘導するのに必要であることを意味する。これと関連し、ウィルス感染又は抗腫瘍効果に対するＩＦＮ−γの保護免役性が明らかになったことがある［参照：Ｓａｍｕｅｌ，  Ｃ．  Ｅ．，  Ｖｉｒｏｌ．，  １８３：  １−１１，  １９９１；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｐ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌ．，  ２０２：  ７６−８８，  １９９４；  Ｂｏｅｈｍ，  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５：  ７４９−７９５，  １９９７；  Ｙａｎｇ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：  ４９２８−４９３２，  １９９２］。
【００３７】
また、ＴＣ−１細胞株に対する抗腫瘍免役効果に関与するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の役割を究明した（図６）。Ｅ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮが同時に注射された動物からＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球群を全て除去した場合、非処理対照群と類似の腫瘍形成を示した。一方、ＣＤ８＋Ｔリンパ球のみ除去した場合、対照群に比べてやや遅いが、全ての動物で腫瘍が生成された。これはＣＤ８＋Ｔリンパ球が最も重要な免役細胞群であることを立証するものである。ＣＤ４＋Ｔリンパ球群が除去された場合、５匹中の１匹で腫瘍が形成された。これはＣＤ４＋Ｔリンパ球群も保護免役性の形成に関与する免役細胞群であることを意味する。これはＣＤ４＋及び特にＣＤ８＋Ｔリンパ球群が抗腫瘍効果を有することを意味する。ＴＣ−１に対する抗腫瘍免役効果の面において、抗体はあまり寄与しなかった。
【００３８】
このような結果はＣＤ４＋又はＣＤ８＋効果器Ｔリンパ球群の全てがＴＣ−１腫瘍細胞株に対し抗腫瘍機能を有するという他の研究結果と一致する［参照：Ｈｕｎｇ，  Ｃ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１：  ３６９８−３７０３，  ２００１；  Ｌａｍｉｋａｎｒａ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７５：  ９６５４−９６６４，  ２００１；  Ｃｈｅｎｇ，  Ｗ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １３：  ５５３−５６８，  ２００２；  Ｌｉｕ，  Ｄ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４：２８８８−２８９４，  ２０００；  Ｌｉｎ，  Ｋ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６：  ２１−２６，  １９９６］。
【００３９】
【表１】
2004315433.tif 000003
【００４０】
前記結果から明らかなように、ＣｐＧ−ＯＤＮがＥ７抗原特異反応、Ｔｈ増殖反応、ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ４＋Ｔリンパ球（Ｔｈ１）及びＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性を増加させる補助剤の役割をし、これによりＥ７蛋白質とＣｐＧ−ＯＤＮの同時利用によってのみ抗原特異Ｔｈ１型ＣＤ４＋及び特にＣＤ８＋Ｔ細胞免役反応から優れた乳頭腫ウィルス誘発疾患抑制免役効果、特に子宮頸部癌抑制免役効果を誘導するのに有用であることが立証される。
【００４１】
本発明の薬剤学的組成物は、乳頭腫ウィルスに感染されるか或いは感染されたと疑われる対象に対し予防的又は治療学的に投与することができる。このような投与対象は乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患にかかったか或いは発病する可能性のある対象を含む。乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患は例えばボーエン様丘疹症、肛門異形成、呼吸又は結膜乳頭腫、子宮頸部異形成、子宮頸部癌、陰部癌、前立腺癌などを含む。
【００４２】
特に、本発明の薬剤学的組成物は、乳頭腫ウィルスにより誘発される子宮頸部癌の予防及び治療に有用である。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物は、単独で投与するか、或いは当分野の他の公知処理、例えば化学療法治療、放射線治療、手術などと共に投与することができる。また、当分野によく知られている他の補助剤又はサイトカインと共同投与することができる。共同投与可能な、免役反応を刺激し得るサイトカインは、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、Ｆｌｔ３リガンドなどを含む。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物は、当分野で広く知られている方法［参照：Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １７６：  １４５，  １９９４；  Ｖｉｔｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ，  ９５：３４１，  １９９５］によって投与することができる。投与形態は錠剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、液剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤、座剤、エアロゾル剤などを含む。前記投与形態は移殖される（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）徐放出考案物などをさらに含む。また、当分野の公知方法、例えば経口又は非経口、例えば筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または皮下投与するか、胃腸管、粘膜又は呼吸器を介して投与することができる。
【００４５】
本発明の薬剤学的組成物は、局所投与或いは全身系投与を行うことができる。局所投与の場合には全身的吸収を最小化しながら投与部位に薬物を集中させることができて有利である。このような局所投与の際、他の経路による投与の場合に比べて一層少ない量を投与することができる。局所投与時の剤形は経皮考案物、エアロゾル、クリーム剤及び軟膏剤、ローション剤、散剤などを含む。
【００４６】
本発明の薬剤学的組成物は賦形剤を含んだ一つ以上の薬剤学的に許容される担体または製剤化を容易にする任意の補助剤を使用して剤形化することができる。剤形は投与経路によって異なる。注射するための場合、活性成分は水性溶液、好ましくは生理的食塩水中に剤形化することができる。粘膜伝達のための場合、透過される障害物に適した透過剤を剤形化に使用することができる。このような透過剤は当分野で一般的に広く知られている。経口投与の場合には、活性成分を錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに含むのに適した担体と配合することができる。吸入投与のためには、活性成分を適切な推進剤を用いて、加圧されたパックからエアロゾル噴霧形態で伝達されるか、カートリッジに剤形化することが可能な粉末の形態で伝達されることができる。また、注射により投与する場合、懸濁剤、液剤、乳化剤などで形成することができる。
【００４７】
投与用量は１回に約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約３μｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．５μｇ／ｋｇ／日〜乃至１μｇ／ｋｇ／日で最小限１週日間隔にて投与することができ、体重、年齢、性別、投与経路、剤形及び時間、一般的健康状態などいろいろの要因によって異なる。
【００４８】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げて説明する。記述された実施例は説明のためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【００４９】
【実施例】
略語説明
ＯＤＮ：オリゴデオキシヌクレオチド、ＨＰＶ：ヒト乳頭腫ウィルス、ＰＢＳ：リン酸緩衝性生理食塩水、ＨＲＰ：ワサビ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ、ＨＳＶ：単純ヘルペスウィルス、ＯＤ：吸光度、ＩＰＴＧ：イソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド、ＲＴ−ＰＣＲ：逆転写酵素連鎖反応、ｉ．ｐ．：腹腔内、ｓ．ｃ．：皮下、ＳＩ：刺激指数。
統計分析は対応のあるＳｔｕｄｅｎｔ’ｓＴ検定（Ｔｈｅ  ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ  Ｔｅｓｔ）を利用し、ｐ数値＜０．０５の際に統計的有意性を置いた。
【００５０】
実施例１：組換えＥ７蛋白質の製造
乳頭腫ウィルス１６型のＥ７組換え蛋白質を公知の方法［参照：Ｎｏｖａｇｅｎ会社のプロトコル及び  Ｓｉｎ．  Ｊ．  Ｉ．  Ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：  １８２７−１８３３，  １９９７］を用いて製造分離した。
子宮頸部癌細胞株（Ｃａｓｋｉ細胞株）から２つのプライマー、すなわち５’−Ｔ  ＴＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’を  （配列番号２）（ＢａｍＨＩ切断部位を含む）５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧ  −３’  （配列番号３）（ＥｃｏＲＩ切断部位を含む）を用いて逆転写酵素連鎖反応により乳頭腫ウィルス１６型のＥ７遺伝子を得た。得られたＥ７遺伝子を制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ）を用いて切断した後、ＤＮＡゲルからＥ７遺伝子を分離した。その後、分離されたＥ７遺伝子を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで酵素処理されたｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＴ）にクローニングさせた。クローニングされたＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５を形質転換させ、カナマイシンの下で成長するＥ．ｃｏｌｉを選別してｐＥＴ−Ｅ７  ＤＮＡを分離した後、これを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。収得されたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＥＴ−Ｅ７）をカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）含有のＬＢ溶液で培養して６００ｎｍ波長でＯＤ値が約０．６〜０．８に到達したとき、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した後、３時間培養した。Ｅ．ｃｏｌｉを４ｋｒｐｍで２０分間遠心分離した後、−２０℃で冷凍−解凍過程を１回行った。細胞沈澱物を５ｍｌの８Ｍ尿素緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かした後、常温で６０分間撹拌しながら細胞を破壊した。その後、１．５ｋｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を得た後、８Ｍ尿素緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂カラム（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）に通過させた。次に、樹脂カラムに５倍容積の緩衝液Ｂ（８Ｍ尿素緩衝液、ｐＨ８．０）を通過させた後、５〜１０倍容積の緩衝液Ｃ（８Ｍ尿素緩衝液、ｐＨ６．３）を通過させた。最後に、Ｈｉｓ−ｔａｇＥ７蛋白質を１０ｍｌの緩衝液Ｃ（２００ｍＭのイミダゾールが添加された緩衝液Ｂ）を用いて溶出させた。２時間間隔で蛋白質溶液を６Ｍ尿素緩衝液で透析した後、４Ｍ尿素緩衝液で再び透析した。最後に、生理食塩水で透析した。その後、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ内毒素除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）に透過させて内毒素を除去した。蛋白質濃度は公知のＢｒａｄｆｏｒｄ方法で定量した［参照：Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７２：  ２４８−２５４，  １９７６］。最終的にＥ７蛋白質を−７０℃で保管した。
【００５１】
前記製造された蛋白質サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥから分離した後、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）に付着させた。次いで、ニトロセルロース膜を２％ＢＳＡ含有のＴＢＳＴ溶液［１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０］に１時間浸漬させた後、Ｅ７特異抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）と１時間反応させた。それぞれの反応後、ＴＢＳＴ溶液で数回洗浄し、最終的に抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）と１時間反応させた後、ＥＣＬ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で発色させた。
【００５２】
９８個のアミノ酸を含む組換えＥ７蛋白質がＥ．ｃｏｌｉで発現された。組換え蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで２３ｋＤの蛋白質と確認され、免役ブロット検定（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）でＥ７特異抗体と反応した。蛋白質の実際の大きさは予測より大きかった（１１ｋＤのＥ７蛋白質及びｐＥＴベクターのＨｉｓ−ｔａｇ４ｋＤ蛋白質）。ゲルにおける非正常的なＥ７蛋白質の移動特性は以前にも発表されたことがある［参照：Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，  Ｄ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １９２：  １３８０−１３８７，  １９９３；  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １１５：  ３９７−４０３，  １９９９］。
【００５３】
Ｅ７蛋白質内の内毒素水準は内毒素検出キット（Ｓｉｇｍａ，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を用いて定量した。蛋白質内の内毒素水準は１００ＥＵ／ｍｇ以下と測定された。
【００５４】
実施例２：ＣｐＧ−ＯＤＮの製造
本実施例ではＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’）（配列番号１）を利用し、各塩基当たりホスホロチオエートで変化させたＯＤＮをＢｉｏｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｃａｎａｄａ）に製造依頼して購入した。ＣｐＧ−ＯＤＮを内毒素の除去された水に溶解させて使用した。
【００５５】
実施例３：抗腫瘍活性
生後４〜６週齢のＣ５６ＢＬ／６マウス（Ｄａｅｈａｎ  Ｂｉｏｌｉｎｋ  ｃｏ．，  Ｌｔｄ）を動物モデルとし、２０μｇの組換えＥ７蛋白質、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ又はこれらの全てを最終生理食塩水１００μｌに希釈して２８−ゲージ注射針（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）で皮下注射した。
【００５６】
腫瘍誘導に使用された細胞株はＴＣ−１細胞であるが、ジョンホプキンス大学のＷｕ博士から提供を受け、ｃＲＰＭＩ（４００μｇ／ｍｌのＧ４１８）で培養された。ＴＣ−１はＥ７発現細胞株であって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺上皮細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｌｕｎｇ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）に乳頭腫ウィルス１６型のＥ６とＥ７、及びｒａｓ遺伝子を用いて作った細胞株である［参照：Ｗｕ，  Ｔ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２：  １１６７１−１１６７５，  １９９５］。それぞれの予防及び治療効果を検定するために２×１０５及び５×１０４個のＴＣ−１細胞株をＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に注射した。様々な注射容量が既に発表されたことがある［参照：Ｌｉｎ，  Ｋ．  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６：  ２１−２６，  １９９６］。ＴＣ−１細胞株は生理食塩水で２回洗浄した後、注射に使用した。
【００５７】
実施例３．１：腫瘍予防活性
前記マウス動物モデルから、Ｅ７、ＣｐＧ−ＯＤＮ又はこれらの両者ともを使用した予防注射により誘導される抗腫瘍効果を観測した。各群の動物（ｎ＝１１〜１６）に対し、２０μｇのＥ７、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ又はこれら両者ともを０週及び２週に皮下注射した。最終注射後の３週目に各動物当たり２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞株を皮下注射した。
【００５８】
図１及び表２はＥ７（動物当たり２０μｇ）、ＣｐＧ−ＯＤＮ（動物当たり２０μｇ）又はこれら両者ともを２回予防注射し、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞株を注射した後の抗腫瘍活性を示す。
【００５９】
【表２】
2004315433.tif 000004
【００６０】
前記表２より分るように、Ｅ７又はＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ単独で注射した場合には、非処理対照群でのように、ＴＣ−１腫瘍細胞株でチャレンジされた後腫瘍が現れたが、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射した群では時間が経過しても腫瘍が全く現われなかった。すなわち、Ｅ７又はＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ単独で処理した場合には、いずれの腫瘍予防効果も示さなかったが、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に処理した場合には全てのマウス動物モデルで完全な腫瘍予防効果を示した。
【００６１】
また、腫瘍チャレンジ後の腫瘍の大きさを観測して示した図１の結果は、Ｅ７又はＣｐＧ−ＯＤＮをそれぞれ単独で注射する場合には時間経過に伴って腫瘍が段々大きくなるが、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に注射した場合には全く腫瘍が成長しないことを示す。この際、腫瘍が形成された動物はいずれも３０〜４０日の経過後に死んでしまった。Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射した動物は４ヶ月以上生存した。死んだ動物を剖検した結果、死因が悪液質ショック（ｃａｃｈｅｃｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ）であり、他の器官には全く転移されなかった。
【００６２】
前記表２及び図１から分るように、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時に予防注射した場合にのみＥ７発現腫瘍細胞株の成長を抑制することが可能な予防効果がある。
【００６３】
実施例３．２：腫瘍治療活性
前記マウス動物モデルから、既に形成された腫瘍に対するＥ７、ＣｐＧ−ＯＤＮ又はこれらの両者の注射により誘導される抗腫瘍効果を観測した。それぞれの群（グループ）の動物に５×１０４個のＴＣ−１腫瘍細胞株を皮下注射し、腫瘍の大きさが１〜２ｍｍとなったとき、腫瘍注射部位から離れた箇所に２０μｇのＥ７、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ又は２０μｇのＥ７と２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを皮下注射し、さらに１週後に皮下注射した。注射後１ヶ月間１週に２回ずつ測定器を用いて腫瘍の大きさを測定した。腫瘍の大きさは腫瘍の平均値［（ａ＋ｂ）／２、ａ：腫瘍の長軸長、ｂ：腫瘍の短縮長］で計算された。
【００６４】
腫瘍チャレンジ後、腫瘍を有するマウスの減少率を観測した結果を示す図２は、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時に注射された動物群では２０％の動物でのみ腫瘍が探知され、残りの動物では腫瘍が無くなった反面、Ｅ７が単独注射された動物群及びＣｐＧ−ＯＤＮが単独注射された動物群では非処理対照群でのように全ての動物で腫瘍が抑制されなかったことを示す。一方、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時注射された動物のうち１匹から観測された腫瘍の大きさは他の処理群に比べて相対的に小さかった。また、Ｅ７又はＣｐＧ−ＯＤＮがそれぞれ単独注射された動物群では腫瘍注射後４０日が経過してから全て死んだが、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時に注射された処理群では２ヶ月以上長く生存した。
【００６５】
これはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射する場合にのみ、既に形成されたＥ７発現腫瘍細胞株の成長を抑制することができて抗腫瘍治療効果があることを示す。
【００６６】
実施例３．３：選択的免役細胞除去活性
ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋リンパ球の数をＦＡＣＳ分析で測定した。Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時注射された前記のマウス動物モデルから採取した脾臓細胞（１×１０５個）をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ＋０．１％のアジ化ナトリウム）を用いて３回洗浄し、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）に結合された抗マウスＣＤ４及びＣＤ８抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）と３０分間４℃で反応させた。その後、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ：  Ｃｏｕｌｔｅｒ−Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ，  Ｍｉａｍｉ，  ＦＬ）を用いてＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の数を測定した。
【００６７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を試験管内及び生体内で除去するために公知の方法を利用した［参照：Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．  Ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １２：  １０９１−１１０２，  ２００１；  Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６２：  ２９１２−２９２１，  １９９９］。
具体的に、試験管内リンパ球の除去は次のように処理した。Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが共同注射された動物からの脾臓細胞を抗−ＣＤ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又は抗−ＣＤ８抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ）と４℃で１時間反応させた。その後、ウサギの補体（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１時間培養させた。細胞の生存率をトリパンブルー染料除去方法によって測定し、２回の分離除去過程後９８％以上のＴリンパ球が除去されたことをＦＡＣＳで確認した。
【００６８】
生体内リンパ球の除去は次のように処理した。予めプリスタンで処理されたヌードマウスにそれぞれのハイブリドーマ細胞株（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を注射して抗−ＣＤ４抗体（クローンＧＫ１．５）及び抗−ＣＤ８抗体（クローン２．４３）腹水液を採取した。得られた１００μｌの腹水液（抗−ＣＤ４抗体及び抗−ＣＤ８抗体）を腫瘍注射する前後３、０及び３日に腹腔内注射した。ＦＡＣＳを用いて、９８％以上のＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球が除去されることを確認し、０日に腫瘍を注射した。
【００６９】
抗腫瘍活性に関与する細胞群を動物モデルから確認した結果が図６に示されている。図６はＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞それぞれ又はＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を全て除去した後、これらの細胞群の抗腫瘍効果に対する重要性を確認することができる結果である。具体的に、各群（グループ）の動物（ｎ＝５）に対し２０μｇのＥ７と２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを０週及び２週に皮下注射し、最終注射後の３週目に動物からＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔまたは２つの細胞群を全て除去した後、２×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞株を皮下注射した後、腫瘍を有しないマウスの数を測定した。
【００７０】
これによれば、前記表１及び図１から立証されたように、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋細胞を除去していない場合には完全な腫瘍抑制効果が観測された。一方、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の全てを除去した場合には非処理対照群と類似に腫瘍が形成された。特に、ＣＤ８＋Ｔリンパ球が除去された動物では、非処理対照群に比べてはやや遅いが、結局いずれも腫瘍が形成された。一方、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が除去された動物では、５匹のうち４匹から腫瘍が観測されなかった。また、１匹に形成された腫瘍の大きさも相対的に小さかった。
【００７１】
これらの免役細胞群除去実験より、ＣｐＧ−ＯＤＮの存在下でＥ７がＣＤ４＋Ｔリンパ球及び特にＣＤ８＋Ｔリンパ球を活性化させて抗腫瘍効果を示すことが分る。従って、動物モデルにおける抗腫瘍効果がＣＤ４＋Ｔリンパ球及び特にＣＤ８＋Ｔリンパ球群により媒介されるという事実を確認することができる。
【００７２】
実施例４：免役反応誘導
実施例４．１：抗体反応誘導
公知の方法を用いてＥＬＩＳＡを行った［参照：Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １５：  １８２７−１８３３，  １９９７；  Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７４：  １１１７３−１１１８０，  ２０００］。
【００７３】
プレートをコートするために組換えＥ７蛋白質を生理食塩水に１μｇ／ｍｌの濃度で希釈させ、５０μｌずつ各ウェルに添加した後、次の日に利用した。ＥＬＩＳＡ緩衝液（２％のＢＳＡ）で遮断した後、抗−ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）ＩｇＧ−ＨＲＰを１：１０００の濃度で希釈して５０μｌずつ各ウェルに加えて反応させた。また、Ｅ７特異ＩｇＧサブクラスを検出するために、ＨＲＰの結合された抗−ネズミＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）を抗−ネズミＩｇＧ−ＨＲＰに代えて使用した。
【００７４】
各群の動物に２０μｇのＥ７、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ、或いは２０μｇのＥ７及び２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを０週及び２週に皮下注射した。初注射後２、４及び８週に各動物群（ｎ＝１０）から血清を採取して同一の容量で混合した各群別血清を２倍率ずつ希釈してＥＬＩＳＡ力価を測定した。また、４週及び８週の血清は１：１００で希釈してＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡ力価は対照群のＯＤ数値の２倍となる最も高い血清希釈倍率の逆数値とした。ＯＤ数値は４０５ｎｍで測定した。Ｅ７注射に比べてｐ＜０．０５で統計的有意性をもつ。
【００７５】
Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、或いはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射によるＥ７特異抗体生成程度を測定した結果を図３に示した。図３ＡはＥ７が単独注射された動物の４週後の血清ＥＬＩＳＡ力価は１，６００であったが、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時注射された動物の４週後の血清ＥＬＩＳＡ力価は６，４００であったことを示す。これはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時使用により抗体生成が抗体力価において２倍以上増加したものである。また、注射後８週のＥＬＩＳＡ力価は、Ｅ７の場合には８００、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時使用した場合には３，２００であって、類似の増加を示す。ところが、ＣｐＧ−ＯＤＮが単独注射された動物では非処理対照群でのように抗体反応が観測されなかった。
【００７６】
また、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ及び図３ＥはＥ７特異抗体のＩｇＧイソ型に対する生成を示す。一番目の注射後４週及び８週の血清において、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮ同時注射の場合、Ｅ７単独注射に比べてＩｇＧイソ型の生成がさらに多く誘導された。
【００７７】
実際に、ＩｇＧ１及びＩｇＥはＴｈ２に連関した抗体であり、ＩｇＧ２ａはＴｈ１に連関した抗体である［参照：Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ，  Ｆ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ８：  ３０３−３３３，  １９９０］。特に、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射する場合には、Ｅ７単独注射に比べてＩｇＧ２ａの生成がさらに増加した。また、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の数値は０．２（Ｅ７）及び０．２６（Ｅ７＋ＣｐＧ−ＯＤＮ）で計算された。
【００７８】
このような結果から確認されるように、ＣｐＧ−ＯＤＮが全般的な抗体免役反応を増加させるため、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射の場合、Ｅ７単独注射に比べてＩｇＧ及びＩｇＧサブクラスの生成が増加する。
【００７９】
実施例４．２：Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞増殖反応の誘導
Ｔｈ細胞増殖反応は細胞免役反応に重要な役割を果たす。Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、或いはＥ７及びＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射が行われた各動物群から脾臓免役細胞を採取してＴｈ細胞増殖反応を測定した。
【００８０】
Ｔｈ細胞増殖反応を公知の方法で行った［参照：Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １２：  １０９１−１１０２，  ２００１；  Ｓｉｎ，  Ｊ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６２：  ２９１２−２９２１，  １９９９］。
【００８１】
各群の動物に対し２０μｇのＥ７、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ、或いは２０μｇのＥ７及び２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを０週及び２週に皮下注射し、最終注射後の３週目に動物群から脾臓免役細胞を採取した。採取した脾臓細胞を様々な濃度（０．５、１及び５μｇ／ｍｌ）のＥ７で３日間刺激した後、標識３［Ｈ］の付いたチミジン（各ウェル当たり１μＣｉ）を添加した後、次の日に細胞を回収してβ計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）によって各免役群のｃｐｍを測定した。ＳＩは［実験群ｃｐｍ−対照群ｃｐｍ］／［対照群ｃｐｍ］で計算した。
【００８２】
図４ＡはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射がＥ７単独注射に比べてＴｈ細胞増殖反応を増加させることを示す。その結果は同じ結果を示す重複実験の一つである。＊は対照群に比較してｐ＜０．０５で統計的有意性を有し、＊＊はＥ７注射グループに比較してｐ＜０．０５で統計的有意性を有する。Ｅ７単独注射の際、Ｅ７特異Ｔｈ細胞増殖反応が現われたが、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射した場合にはさらに増加したＴｈ細胞増殖反応を示した。反面、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射の際には非処理対照群でのようにＴｈ細胞増殖反応が観測されなかった。
【００８３】
実施例４．３：細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応の誘導
５時間５１Ｃｒ探知方法を用いてＣＴＬ検定を行った。
各群の動物に対し２０μｇのＥ７、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ、或いは２０μｇのＥ７及び２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを０週及び２週に皮下注射し、最終注射後の３週目に動物群から脾臓免役細胞を採取した。採取した脾臓細胞を、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）と予めマイトマイシンＣ（３０μｇ／ｍｌ）で３時間処理されたＴＣ−１細胞株と共に５日間培養して活性化させた。その後、１００μＣｉ／ｍｌＮａ２５１ＣｒＯ４と共に２時間培養されたＴＣ−１細胞を前記活性化された免役細胞とは異なる比率で５時間培養して細胞溶解（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ）活性をＴＣ−１細胞主に対する５１Ｃｒ分泌程度で測定したものである。その後、１００μｌの細胞培養液を採取してγ−計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いてｃｐｍを測定した。ＣＴＬ活性（％）は１００×［（実験群ｃｐｍ−自然積分比ｃｐｍ）／（最大分泌ｃｐｍ−自然積分比ｃｐｍ）］である。最大分泌ｃｐｍは１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した標的ＴＣ−１細胞のｃｐｍとした。
【００８４】
図４ＢはＥ７単独注射の場合及びＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射の場合にはＣＴＬ反応が観測されない反面、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射の場合にはＣＴＬ反応が観測されることを示す。その結果は同じ結果を示す重複実験の一つである。
前記図４Ｂから立証されるように、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮを同時注射した場合にのみＣＴＬ反応が誘導された。
これはＥ７がＣｐＧ−ＯＤＮの存在下でＥ７特異ＣＴＬ反応を誘導することができることを示す。
【００８５】
実施例４．４：ＩＦＮ−γの生成
ＩＦＮ−γはＴｈ１型免役反応及びＣＴＬ反応の誘導に重要な役割をする。ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの生成程度を測定した。
【００８６】
各群の動物に対し２０μｇのＥ７、２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮ、或いは２０μｇのＥ７及び２０μｇのＣｐＧ−ＯＤＮを０週及び２週に皮下注射し、最終注射後の３週目に動物群から脾臓免役細胞を採取した。採取した脾臓細胞を６×１０６個／ｍｌで２４ウェルフラスコに加え、組換えＥ７蛋白質を１μｇ／ｍｌ添加し或いは予めマイトマイシンＣ（３０μｇ／ｍｌ）で３時間処理されたＴＣ−１細胞株（５×１０５個の細胞／ｍｌ）を添加した後、３７℃の５％ＣＯ２培養条件で３日間培養した。細胞培養液を取ってＩＦＮ−γ検出キット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，  Ｉｎｔｌ．，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）を用いて、分泌されたＩＦＮ−γの量を測定した。
【００８７】
具体的に、ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの生成程度を測定するために、動物から採取した脾臓免役細胞をＥ７蛋白質で刺激した。
【００８８】
図５ＡはＥ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、或いはＥ７及びＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射で免役誘導された脾臓免役細胞を１μｇのＥ７蛋白質／ｍｌに添加した後、３日間培養した場合のＩＦＮ−γの分泌を示す。ＩＦＮ−γの生成は、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時注射された動物群のみから観測され、Ｅ７単独注射又はＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射の行われた群からは観測されなかった。
【００８９】
図５ＢはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射が行われた脾臓免役細胞からＣＤ４＋Ｔ又はＣＤ８＋Ｔリンパ球をそれぞれ除去した後、１μｇのＥ７蛋白質／ｍｌに添加した後、３日間培養した場合のＩＦＮ−γの分泌を示す。脾臓免役細胞からＣＤ４＋Ｔリンパ球を除去した場合にはＩＦＮ−γの生成が観測されなかったが、ＣＤ＋８Ｔリンパ球を除去した場合にはＩＦＮ−γの生成が観測された。数値及びバー（ｂａｒ）はＩＦＮ−γの平均値と誤差を意味する。前記の結果は２回繰り返した結果であり、類似の結果が測定された。
【００９０】
このような結果はＴｈ１型のＣＤ４＋Ｔリンパ球がＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射によってのみ活性化され、ＣｐＧ−ＯＤＮがＥ７特異Ｔｈ１型の免役反応を誘導することを意味する。
【００９１】
また、ＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの生成程度を測定するために、Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、或いはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射を行って処理した動物から採取した脾臓免役細胞を、不活性化されたＴＣ−１細胞株（ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ＋，  ｃｌａｓｓ  ＩＩ−）と共に３日間培養した。
図５ＣはＥ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、或いはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射で免役誘導された脾臓免役細胞を予めマイトマイシンＣで処理されたＴＣ−１と３日間培養した場合のＩＦＮ−γの分泌を示す。ＩＦＮ−γの生成は、Ｅ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射が行われた動物群からのみ観測され、Ｅ７単独注射又はＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射の行われた群からは観測されなかった。このような結果はＣＴＬ（ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞）結果とも同一である（図４Ｂ）。
【００９２】
また、図５ＤはＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時注射された脾臓免役細胞からＣＤ４＋Ｔ又はＣＤ８＋Ｔリンパ球をそれぞれ除去した後、予めマイトマイシンＣで処理されたＴＣ−１と３日間培養した場合のＩＦＮ−γの分泌を示す。脾臓免役細胞からＣＤ８＋Ｔリンパ球を除去した場合にはＩＦＮ−γの生成が観測されなかったが、ＣＤ＋４Ｔリンパ球を除去した場合にはＩＦＮ−γの生成が観測された。数値及びバーはＩＦＮ−γの平均値と誤差を意味する。前記の結果は２回繰り返した結果であり、類似の結果が測定された。
【００９３】
このような結果はＣＤ８＋Ｔリンパ球がＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの同時注射によってのみＭＨＣｃｌａｓｓＩに連繋されてＩＦＮ−γを生成することを意味する。以上、本発明を具体的様態によって説明したが、本発明の趣旨及び範囲内で様々な変形が可能であることを当業者なら理解するであろう。従って、本発明は本明細書に例示された具体的様態に制限されない。
【００９４】
【発明の効果】
乳頭腫ウィルス抗原蛋白質及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドを含む本発明の薬剤学的組成物は、これらを同時に投与する場合にのみ動物モデルで抗腫瘍活性を有し、ＣＴＬ反応を示し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γの生成を誘導する強力な免役反応を誘導することができるため、乳頭腫ウィルスにより誘発される疾患を効果的に予防又は治療することができる。
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）単独注射、及びＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射による抗腫瘍予防効果を示す。
【図２】Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、及びＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射による抗腫瘍治療効果を示す。
【図３】Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、及びＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射によるＥ７特異抗体反応（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ及びＩｇＧ３）を示す。
【図４】Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、及びＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射により誘導されるＥ７特異Ｔｈ細胞増殖反応及びＣＴＬ反応を示す。
【図５】Ｅ７単独注射、ＣｐＧ−ＯＤＮ単独注射、及びＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮの共同注射により誘導される免疫細胞におけるＩＦＮ−γの分泌程度、及びＥ７とＣｐＧ−ＯＤＮが同時注射された脾臓免疫細胞からＣＤ４＋Ｔ又はＣＤ８＋Ｔリンパ球をそれぞれ除去した後のＩＦＮ−γの分泌程度を示す。
【図６】抗腫瘍効果に対する免疫細胞群の役割を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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