(57)【要約】【課題】標本の温度制御を安定して行うことができる、構成が簡単で、価格的にも安価な液浸媒質供給装置、蛍光分光検査装置及び培養顕微鏡を提供すること。【解決手段】観察標本と液浸対物レンズ１２との間に充填される液浸媒質１３と、前記液浸媒質１３を所定の温度に制御する温度制御器２６と、前記温度制御器２６により温度制御された前記液浸媒質１３を前記液浸対物レンズ１２に供給する液浸媒質供給部（２２〜２５）とを備えた。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察標本と液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、
前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、
前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸対物レンズに供給する液浸媒質供給部とを具備することを特徴とする液浸媒質供給装置。
【請求項２】
液中に浮遊する蛍光標識された生物分子の標本からの光を集光する液浸対物レンズと、
前記標本と前記液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、
少なくとも液浸対物レンズの拡大像を検出する光検出器と蛍光照明とを備えた光学システムと、
前記光検出器の出力から前記標本の運動を演算する演算部と、
前記演算部による演算結果を表示するモニターと、
前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、
前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸媒質レンズに供給する液浸媒質供給部と、を具備することを特徴とする蛍光分光検査装置。
【請求項３】
観察標本を載置するステージと、前記ステージを支持する顕微鏡と、前記顕微鏡に支持された液浸対物レンズと、前記顕微鏡に収納された観察標本の拡大像を取込む撮像装置及び光学系と、を収納する培養器と、
前記観察標本と前記液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、
前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、
前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸媒質レンズに供給する液浸媒質供給部と、
前記培養器に温風を送り込む温風機と、を具備することを特徴とする培養顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液浸対物レンズに液浸媒質を供給する液浸媒質供給装置、蛍光分光検査装置及び培養顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、タンパク質などの生物標本の反応は、その温度変化に大きく影響されることが知られている。そこで、このような標本を顕微鏡観察する場合には、標本温度を所定温度に保持するための種々の工夫がなされている。
【０００３】
特許文献１は、このような考えを実現した技術を開示しており、ステージに発熱部や電熱板を設け、これら発熱部や電熱板により、ステージ上に載置されたガラスシャーレ内の試料に熱を与えることにより、試料の温度を一定に保つようにしている。
【０００４】
また、特許文献２に開示されるように標本の周囲から対物レンズの周囲にかけて、適温に制御された水を供給するためのパイプを配置し、このパイプに所定温度の水を流すことにより、標本の温度を一定に制御するようにした技術や、特許文献３に開示されるように一部が発熱部で構成された載物台に載置される溶媒観察容器の保温箱に加熱手段を設け、溶媒観察容器内部の溶媒標本を適正な保温状態に制御するようにした技術も知られている。
【０００５】
一方、最近になって、特許文献４に開示されるように、蛍光顕微測光により、液体中の微小領域に浮遊する蛍光標識した生物分子の運動を捉えて、生物分子の反応を特定するような検査方法が考えられている。
【０００６】
この方法には、検査用ウェルを多数配列したマイクロプレートと呼ばれる樹脂製の又は底面がカバーガラスでできた標本容器が用いられている。そして、このマイクロプレートのウェルに蛍光標識された標本を収容し、マイクロプレートリーダーにより蛍光標識された標本の蛍光を検出しながら、標本から放射される揺らぎ強度をモニターすることによって標本分析が行われる。この場合、マイクロプレートのウェル中の標本は、液中に、大小の分子が浮遊している状態になっている。そして、この浮遊分子にマイクロプレート底面のカバーガラスを介して液浸対物レンズにより励起光を集光させ、励起された蛍光を分子分解能で検出し、演算により分子の性質が判定されている。
【０００７】
【特許文献１】実開昭６０−１５６５２１号公報
【０００８】
【特許文献２】実開平７−３６１１８号公報
【０００９】
【特許文献３】実公平３−２５５９８号公報
【００１０】
【特許文献４】特表２００１−５０２０６２号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、標本の温度制御を安定して行うことができる、構成が簡単で、価格的にも安価な液浸媒質供給装置、蛍光分光検査装置及び培養顕微鏡を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の局面に係る液浸媒質供給装置は、観察標本と液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸対物レンズに供給する液浸媒質供給部とを具備することを特徴とする。
【００１３】
本発明の第２の局面に係る蛍光分光検査装置は、液中に浮遊する蛍光標識された生物分子の標本からの光を集光する液浸対物レンズと、前記標本と前記液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、少なくとも液浸対物レンズの拡大像を検出する光検出器と蛍光照明とを備えた光学システムと、前記光検出器の出力から前記標本の運動を演算する演算部と、前記演算部による演算結果を表示するモニターと、前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸媒質レンズに供給する液浸媒質供給部と、を具備することを特徴とする。
【００１４】
本発明の第３の局面に係る培養顕微鏡は、観察標本を載置するステージと、前記ステージを支持する顕微鏡と、前記顕微鏡に支持された液浸対物レンズと、前記顕微鏡に収納された観察標本の拡大像を取込む撮像装置及び光学系と、を収納する培養器と、前記観察標本と前記液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸媒質レンズに供給する液浸媒質供給部と、前記培養器に温風を送り込む温風機と、を具備することを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００１６】
（第１の実施の形態）
図１は、本発明の液浸媒質供給装置が適用される検査装置の概略構成を示している。図１において、装置本体１内部には、倒立顕微鏡２が設けられている。
【００１７】
倒立顕微鏡２には、ＸＹステージ３が設けられている。このＸＹステージ３上には標本４を入れる多数のウェル５ａを有するマイクロプレート５が載置されている。
【００１８】
マイクロプレート５は、樹脂製の標本容器であって、図３に示すように、標本４を入れるウェル５ａが整然と多数個配列されている。また、マイクロプレート５の底面には、透明部材として、例えば厚さ０．１７ｍｍ前後のカバーガラス５ｂが配置されている。これにより、マイクロプレート５の各ウェル５ａは、図４に示すように、下面からの倒立観察に適するように底面にカバーガラス５ｂが接着されている構造をしている。なお、ウェル５ａに入れられる標本４は、蛍光標識された生物分子がコロイド状になって液中を浮遊したものである。
【００１９】
装置本体１の正面には、図２に示すようにマイクロプレート挿入窓１ａが設けられている。マイクロプレート挿入窓１ａは、装置本体１へのマイクロプレート５の出し入れを行うための窓である。マイクロプレート５をマイクロプレート挿入窓１ａより装置本体１内部に挿入すると、ＸＹステージ３上に載置され、この状態で自動的に標本検査を行うことができる。
【００２０】
波長の異なる励起用レーザ光源６、７からのレーザ光は、ハーフミラー８およびミラー９を介して、選択的に、または同時に、倒立顕微鏡２に導入される。そして、レーザ光は、コリメートレンズ１０で平行光となってダイクロイックミラー１１で反射され、対物レンズ１２に導入される。
【００２１】
この場合、対物レンズ１２には、標本４の液中の数マイクロメートルの微小領域に集光できるように集光能力を高めた液浸対物レンズ（図示例では水浸対物レンズ）が使用されている（以下、水浸対物レンズ１２として説明する。）。また、水浸対物レンズ１２は、図４に示すように、マイクロプレート５底面のカバーガラス５ｂに近接して配置されている。水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間には、液浸媒質（純水）１３が充填されている。
【００２２】
水浸対物レンズ１２を透過された励起光は、液浸媒質１３を通り、カバーガラス５ｂを通ってマイクロプレート５のウェル５ａ中に進み、標本４の液中の微小領域に集光される。ここで、標本４の液中に浮遊する蛍光標識された生物分子が、励起光の集光された微小領域内に存在すると、その瞬間、蛍光を発する。
【００２３】
この蛍光は、水浸対物レンズ１２を通り、ダイクロイックミラー１１を透過して、励起光バリアフィルタ１４を通り、結像レンズ１５により水浸対物レンズ１２による蛍光の拡大像が形成され、反射ミラー１６で折り返して、ピンホール１７を通り光検出器１８に到達する。
【００２４】
この場合、標本４の液中に浮遊する蛍光標識された生物分子は、コロイド状の浮遊体であるから、ブラウン運動により振動し、微小領域を出たり入ったりしている。これにより、光検出器１８は、微小領域を出たり入ったりする生物分子の蛍光を検出することとなる。
【００２５】
光検出器１８には、演算装置１９が接続されている。この演算装置１９は、光検出器１８の検出信号の揺らぎを演算する。
【００２６】
演算装置１９には、装置本体１に設けられた中央処理手段としてのパソコン２０が接続されている。このパソコン２０は、演算装置１９で演算された揺らぎから生物分子の性質を分析し、この結果を表示部２１に表示する。
【００２７】
一方、水浸対物レンズ１２には、本発明の以下述べるような液浸媒質供給装置が設けられている。
【００２８】
この場合において、水浸対物レンズ１２とマイクロプレート５底面のカバーガラス５ｂとの隙間には、液浸媒質（純水）１３が充填されている。この液浸媒質１３は、液浸媒質供給源としての給水ボトル２２中に用意されている。この給水ボトル２２には、液浸媒質供給手段を構成する給水パイプ２３ａ、給水ポンプ２４、給水パイプ２３ｂ、２３ｃおよび給液ノズル（ここでは給水ノズル２５）が設けられている。給水ボトル２２中の液浸媒質１３が給水パイプ２３ａを介して給水ポンプ２４に送出される。液浸媒質１３は、給水パイプ２３ｂ、２３ｃを経由して給水ノズル２５より水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給される。この場合、図４に示すように、カバーガラス５ｂと水浸対物レンズ１２先端との距離ｌは、例えば１ｍｍ以下と極めて小さい。このため、この間に供給された液浸媒質１３は、表面張力によってその場に保持される。給水パイプ２３ｂと２３ｃとの間には、温度制御手段としての温度制御装置２６が設けられている。この温度制御装置２６は、液浸媒質１３の温度を加熱または冷却して所定温度に調節する。温度制御装置２６で温度調整された液浸媒質１３が給水ノズル２５側に供給される。
【００２９】
水浸対物レンズ１２の先端部には、液受け部２７が設けられている。液受け部２７は、図４に示すように水浸対物レンズ１２の周囲に沿って設けられ、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に保持しきれない液浸媒質１３を受け止めるようになっている。液受け部２７には、排水口２７ａが設けられている。排水口２７ａには、液浸媒質排出手段を構成する排水パイプ２８、排水ポンプ２９および排水ボトル３０が設けられ、液受け部２７で受け止められた液浸媒質１３を排水パイプ２８を介して排水ポンプ２９に送出し、排水ポンプ２９により排水ボトル３０に回収できるようになっている。
【００３０】
給水ポンプ２４、温度制御装置２６、排水ポンプ２９には、制御装置３２が接続されている。制御装置３２は、パソコン２０からの指示により、給水ポンプ２４、温度制御装置２６、排水ポンプ２９の動作を制御する。
【００３１】
なお、給水ボトル２２と排水ボトル３０は、装置本体１内部に配置されるが、これらは装置本体１外部から簡単に交換したり、給水ボトル２２への液浸媒質１３の補給ができるような配置構成となっている。勿論、給水ボトル２２と排水ボトル３０を装置本体１の外部に配置すれば、さらに給水ボトル２２および排水ボトル３０の交換を始め、給水ボトル２２への液浸媒質１３の補給を簡単にできる。
【００３２】
このような構成において、まず、多数のウェル５ａに蛍光標識された標本４を収容したマイクロプレート５を用意する。そして、このマイクロプレート５をマイクロプレート挿入窓１ａより装置本体１内部に挿入して、ＸＹステージ３上に載置する。
【００３３】
この状態で、ＸＹステージ３が移動され、最初のウェル５ａが水浸対物レンズ１２の光軸上に位置されると、給水ボトル２２中に用意された液浸媒質１３が、給水パイプ２３ａを介して給水ポンプ２４に送られ、給水パイプ２３ｂ、２３ｃを経由して給水ノズル２５より水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給される。この場合、液浸媒質１３は、表面張力によって、その場に保持される。
【００３４】
この時、液浸媒質１３は、温度制御装置２６により所定の温度に制御されている。これにより、液浸媒質１３がカバーガラス５ｂに接触すると、液浸媒質１３とカバーガラス５ｂの間での熱交換と、さらにカバーガラス５ｂと標本４の間での熱交換により、標本４は、所定温度に制御される。この場合、カバーガラス５ｂには、厚さが０．１７ｍｍ前後のものが用いられ、熱容量を回りの物質に比べ小さくしているので、標本４との熱交換に障害にはならず、逆に熱伝導性が良好であるので熱交換を有利にできる。
【００３５】
この状態で、上述した蛍光検出の実行により、標本４の液中に浮遊する生物分子の蛍光が光検出器１８で検出され、演算装置１９で演算した揺らぎに基づいてパソコン２０により生物分子の性質が分析されて、表示部２１に表示される。
【００３６】
最初の標本４の検査が終了すると、ＸＹステージ３が動いて、次のウェル５ａが水浸対物レンズ１２の光軸上に位置され、同様な蛍光検出が実行される。
【００３７】
この場合、ＸＹステージ３の移動とともに、水浸対物レンズ１２に対してカバーガラス５ｂが移動すると、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間で保持しきれなくなった液浸媒質１３が落下し、その液浸媒質１３が水浸対物レンズ１２の周囲に設けられた液受け部２７で受け止められる。そして、液浸媒質１３は排水口２７ａより排水パイプ２８に送られて、排水ポンプ２９によって排水ボトル３０に回収される。これと同時に、給水ノズル２５より一定量の液浸媒質１３が水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に補給される。
【００３８】
なお、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間への液浸媒質１３の補給は、一定時間ごとに所定量ずつ行うようにしてもよい。
【００３９】
以下、同様にして、マイクロプレート５の全てのウェル５ａについて、蛍光検出が実行され、その分析結果がパソコン２０により表示部２１に表示される。
【００４０】
従って、上記の実施の形態によれば、水浸対物レンズ１２に用いられる液浸媒質１３に着目し、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に充填される液浸媒質１３を予め所定の温度に調整して供給するようにしたので、マイクロプレート５のウェル５ａに入れられた全ての標本４の温度を、液浸媒質１３の予め調整された所定温度に制御することができる。これにより、標本４の液体中での浮遊分子運動、つまり温度変化により、その運動量が変化するブラウン運動を常に一定に維持することができるので、マイクロプレート５の全てのウェル５ａ内の標本４に対して安定した蛍光検出を行うことができる。つまり、生物標本の観察の場合には、適切な形態を観察できるようになり、分子運動を捉える蛍光測光において、安定したデータが得られ、正しい判定が可能となる。
【００４１】
検査方法の例としては、蛍光相関分析法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）があり、蛍光強度の揺らぎを解析することで拡散強度に関する情報と分子の数に関する情報を得ることができる。この装置は、蛍光相関分光法などの蛍光分子検査装置に用いられる。
【００４２】
温度制御範囲は、純粋を使っているので、０〜１００℃が最大範囲となり、温度の例を挙げると、海水を用いた海水生物では約２５℃、動物たんぱく質などの生物細胞がそのまま生きたままの状態では３７℃、ＤＮＡの場合は８０℃の場合もある。生物細胞が生きたままの状態の温度範囲は３７℃±１℃以下が望ましい。温度の精度は、検査目的と対象物の温度感度によって適宜選択する。
【００４３】
また、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間へ供給される液浸媒質１３の量を多く設定することにより、標本４の温度制御を安定して行うことができ、また、液浸媒質１３の供給、排出を頻繁に繰り返すことにより、標本４の温度制御を簡単に変更することもできるので、精度のよい温度制御を行うこともできる。
【００４４】
また、水浸対物レンズ１２に用いられる液浸媒質１３を利用して、この液浸媒質１３の温度を制御する構成としているので、装置全体の構成を簡単にでき、価格的にも安価にできる。
【００４５】
なお、上述した実施の形態では、給水パイプ２３ｂと２３ｃとの間に温度制御装置２６を配置したが、これに代えて、または同時に、給水ボトル２２に近接させて、給水ボトル２２全体を温度制御するボトル温度制御器３１を設けるようにしてもよい。
【００４６】
また、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に保持される液浸媒質１３の温度を常時検出するセンサＳＴを設け、このセンサＳＴの出力により温度制御装置２６を制御して水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間の液浸媒質１３が常に一定温度になるように制御するようにしてもよい。
【００４７】
さらに、上述した実施の形態では、給水ボトル２２の液浸媒質１３を水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給し、余分となった液浸媒質１３を排水ボトル３０に回収するようにしたが、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間に供給される液浸媒質１３を循環させる構成としてもよい。この場合、液浸媒質１３の循環により、異物などが液浸媒質１３に混入する可能性があるので、フィルタなどを用いて、異物等を確実に除去する必要がある。
【００４８】
さらに、装置本体１内部の温度が外部温度より数度高いことに注目して、温度制御装置２６に代えて熱交換器を設け、この熱交換器により液浸媒質１３を装置内の温度と同じになるように制御して、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給するようにしてもよい。
【００４９】
さらに、上述した実施の形態では、液浸媒質１３に純水を使用した水浸方式の例を述べたが、オイルを使用した油浸方式についても同様に適用できる。
【００５０】
なお、給水ノズル２５は、液浸媒質１３を水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給するが、この給水ノズル２５は、水浸対物レンズ１２の外側に着脱可能に保持されている。給水ノズル２５は、水浸対物レンズ１２外枠に埋設しても良い。給水ノズル２５は倒立顕微鏡２で保持しても良く、又は水浸対物レンズ１２１２の先端周辺部に設置された液受け部２７に保持しても良い。また、給水ノズル２５は、図では１つになっているが、例えば、３つ、５つなど複数にしても良い。
【００５１】
（第１の実施の形態の変形例）
次に、本発明の第１の実施の形態の変形例を説明する。
【００５２】
この変形例は、倒立型顕微鏡に本発明の第１の実施の形態に係る液浸媒質供給装置を適用した例を示している。
【００５３】
図５は、第１の実施の形態の変形例の概略構成を示すものである。
【００５４】
図５において、顕微鏡本体４１の前側固定部４１ａと後側固定部４１ｂ上には、ステージ４２が配置されている。
【００５５】
ステージ４２上にはシャーレ標本４３が載置されている。このシャーレ標本４３は、底面にカバーガラスを有するもので、シャーレ内には生物標本が入れられている。
【００５６】
そして、図示しない落射照明光源からの光束が、水浸対物レンズ４４を介してシャーレ標本４３の底面（カバーガラス）側から生物標本に照射される。また、シャーレ標本４３からの光は、水浸対物レンズ４４を介して図示しないリレー光学系によってリレーされた後に観察鏡筒４５に取り付けられた接眼レンズ４６に入射して、目視観察される。
【００５７】
この場合も、水浸対物レンズ４４とシャーレ標本４３底面のカバーガラスとの隙間には、液浸媒質（純水）４７が充填されている。この液浸媒質４７は、図１で述べたものと同様に、図示しない温度制御装置により所定の温度に制御されていて、給水パイプ４８を介して給水ノズル４９より水浸対物レンズ４４とカバーガラスとの隙間に供給され、表面張力によってその場に保持される。また、水浸対物レンズ４４とカバーガラスとの間に保持しきれない液浸媒質４７は、液受け部５０を介して排水パイプ５１より排出される。
【００５８】
この場合、液浸媒質４７の供給は、電動式であっても、手動ポンプを用いた手動式であってもよい。
【００５９】
なお、図５において、透過照明光源５２と、コンデンサレンズ５３も示されている。
【００６０】
本変形例に拠れば、水浸対物レンズ４４とシャーレ標本４３底面のカバーガラスとの隙間に充填される液浸媒質４７を予め所定の温度に調整して供給することができるので、シャーレ標本４３、つまりシャーレに入れた生物標本の温度を液浸媒質４７の予め調整された一定温度に制御することができ、質の高い生物標本の観察を行うことができる。
【００６１】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００６２】
図６は、本発明の液浸媒質供給装置が適用される培養顕微鏡の概略構成を示している。図６において、第１の実施形態と同じ構成には、同じ符号を付している。
【００６３】
図６において、装置本体１内部には、倒立顕微鏡２が設けられている。倒立顕微鏡２には、ステージ受け２′を介してＸＹステージ３が設けられている。このＸＹステージ３にはラックＲＸＹ、ピニオンＰＸＹ及び駆動用のモータＭＸＹが設けられている。このＸＹステージ３上には標本４を入れる多数のウェル５ａを有するマイクロプレート５が載置されている。
【００６４】
マイクロプレート５は、樹脂製の標本容器であって、図３に示すように、標本４を入れるウェル５ａが整然と多数個配列されている。また、マイクロプレート５の底面には、透明部材として、例えば厚さ０．１７ｍｍ前後のカバーガラス５ｂが配置されている。これにより、マイクロプレート５の各ウェル５ａは、図４に示すように、下面からの倒立観察に適するように底面にカバーガラス５ｂが接着されている構造をしている。なお、これらウェル５ａに入れられる標本４は、蛍光標識された生物細胞が培養液中で生きたままの状態にしてある。
【００６５】
装置本体１の正面には、図２に示すようにマイクロプレート挿入窓１ａが設けられている。マイクロプレート挿入窓１ａは、装置本体１へのマイクロプレート５の出し入れを行うための窓である。マイクロプレート５をマイクロプレート挿入窓１ａより装置本体１内部に挿入すると、ＸＹステージ３上に載置され、この状態で自動的に標本検査を行うことができる。
【００６６】
光源６′からの照明光は、倒立顕微鏡２に導入される。照明光は、励起光エキサイタフィルタ１４′、及びレンズ１０′を通ってダイクロイックミラー１１で反射され、対物レンズ１２に導入される。
【００６７】
この場合、対物レンズ１２には、標本４の液中の生物細胞に集光できるように集光能力を高めた液浸対物レンズ（図示例では水浸対物レンズ）が使用されている（以下、水浸対物レンズ１２として説明する。）。また、水浸対物レンズ１２は、図４に示すように、マイクロプレート５底面のカバーガラス５ｂに近接して配置されている。水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間には、液浸媒質（純水）１３が充填されている。
【００６８】
水浸対物レンズ１２を透過された励起光は、液浸媒質１３を通り、カバーガラス５ｂを通ってマイクロプレート５のウェル５ａ中に進み、標本４の液中の生物細胞に集光される。ここで、標本４の液中の蛍光標識された生物細胞が、励起光の領域内に存在すると、蛍光を発する。
【００６９】
この蛍光は、水浸対物レンズ１２を通り、ダイクロイックミラー１１を透過して、励起光バリアフィルタ１４を通り、結像レンズ１５により水浸対物レンズ１２による蛍光の拡大像が形成され、反射ミラー１６で折り返して、固体撮像素子（ＣＣＤ）などの撮像素子１８′に到達する。水浸対物レンズ１２が倒立顕微鏡２との間で上下動するために、水浸対物レンズ１２側にラックＲＺが設けられており、倒立顕微鏡にピニオンＰＺ及びモータＭＺが設けられている。
【００７０】
この場合、標本４の液中の蛍光標識された生物細胞は、水浸対物レンズ１２で拡大され、撮像素子１８′で、生物細胞の蛍光像を撮像することとなる。
【００７１】
撮像素子１８′には、装置本体１に設けられた中央処理手段としてのパソコン２０が接続されている。このパソコン２０には、モニター等の表示部２１とキーボードなどの入力装置３３が接続されている。
【００７２】
一方、水浸対物レンズ１２には、本発明の以下述べるような液浸媒質供給装置が設けられている。
【００７３】
この場合において、水浸対物レンズ１２とマイクロプレート５底面のカバーガラス５ｂとの隙間には、液浸媒質（純水）１３が充填されている。この液浸媒質１３は、液浸媒質供給源としての給水ボトル２２中に用意されている。この給水ボトル２２には、液浸媒質供給手段を構成する給水パイプ２３ａ、給水ポンプ２４、給水パイプ２３ｂ、２３ｃおよび給液ノズル（ここでは給水ノズル２５）が設けられている。給水ボトル２２中の液浸媒質１３が給水パイプ２３ａを介して給水ポンプ２４に送出される。液浸媒質１３は、給水パイプ２３ｂ、２３ｃを経由して給水ノズル２５より水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給される。この場合、図４に示すように、カバーガラス５ｂと水浸対物レンズ１２先端との距離ｌは、例えば１ｍｍ以下と極めて小さい。このため、この間に供給された液浸媒質１３は、表面張力によってその場に保持される。給水パイプ２３ｂと２３ｃとの間には、温度制御手段としての温度制御装置２６が設けられている。この温度制御装置２６は、液浸媒質１３の温度を加熱または冷却して所定温度に調節する。温度制御装置２６で温度調整された液浸媒質１３が給水ノズル２５側に供給される。
【００７４】
水浸対物レンズ１２の先端部には、液受け部２７が設けられている。液受け部２７は、図４に示すように水浸対物レンズ１２の周囲に沿って設けられ、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に保持しきれない液浸媒質１３を受け止めるようになっている。液受け部２７には、排水口２７ａが設けられている。排水口２７ａには、液浸媒質排出手段を構成する排水パイプ２８、排水ポンプ２９および排水ボトル３０が設けられ、液受け部２７で受け止められた液浸媒質１３を排水パイプ２８を介して排水ポンプ２９に送出し、排水ポンプ２９により排水ボトル３０に回収できるようになっている。
【００７５】
給水ポンプ２４、温度制御装置２６、排水ポンプ２９には、制御装置３２が接続されている。制御装置３２は、パソコン２０からの指示により、給水ポンプ２４、温度制御装置２６、排水ポンプ２９の動作を制御する。更に、液浸媒質１３に設けられ、水浸対物レンズ１２に固定された熱電対型の媒質温度センサＳＴが、制御装置３２が接続されている。この媒質温度センサＳＴの温度を制御装置３２にフィードバックすることにより、温度制御装置２６の温度が制御される。
【００７６】
なお、給水ボトル２２と排水ボトル３０は、装置本体１内部に配置されるが、これらは装置本体１外部から簡単に交換したり、給水ボトル２２への液浸媒質１３の補給ができるような配置構成となっている。勿論、給水ボトル２２と排水ボトル３０を装置本体１の外部に配置すれば、さらに給水ボトル２２および排水ボトル３０の交換を始め、給水ボトル２２への液浸媒質１３の補給を簡単にできる。
【００７７】
更に、装置本体１の外部に温風機３４及び炭酸ガス（ＣＯ２）供給装置、装置本体１の外部に加湿水３７及びこれを加熱するヒータ３６が設けられている。この温風機３４とヒータ３６には制御装置３２が接続されている。装置本体１内部に設けられた熱電対型の温湿度センサＳＴＨが、制御装置３２に接続されている。
【００７８】
このような構成において、まず、多数のウェル５ａに蛍光標識された標本４を収容したマイクロプレート５を用意する。そして、このマイクロプレート５をマイクロプレート挿入窓１ａより装置本体１内部に挿入して、ＸＹステージ３上に載置する。
【００７９】
この状態で、ＸＹステージ３が移動され、最初のウェル５ａが水浸対物レンズ１２の光軸上に位置されると、給水ボトル２２中に用意された液浸媒質１３が、給水パイプ２３ａを介して給水ポンプ２４に送られ、給水パイプ２３ｂ、２３ｃを経由して給水ノズル２５より水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給される。この場合、液浸媒質１３は、表面張力によって、その場に保持される。
【００８０】
この時、液浸媒質１３は、温度制御装置２６により所定の温度に制御されている。これにより、液浸媒質１３がカバーガラス５ｂに接触すると、液浸媒質１３とカバーガラス５ｂの間での熱交換と、さらにカバーガラス５ｂと標本４の間での熱交換により、標本４は、所定温度に制御される。この場合、カバーガラス５ｂには、厚さが０．１７ｍｍ前後のものが用いられ、熱容量を回りの物質に比べ小さくしているので、標本４との熱交換に障害にはならず、逆に熱伝導性が良好であるので熱交換を有利にできる。
【００８１】
炭酸ガス（ＣＯ２）供給装置によって、標本４の液中のＰＨ濃度が調整されている。これは、ＣＯ２を本体１の内部に供給すると、結果的に標本のＰＨを調整できるためである。ヒータ３６によって加熱された加湿水３７が湿度の飽和（１００％）前で温湿度センサＳＴＨの値をフィードバックして制御され、標本４の乾燥を防いでいる。
【００８２】
温風機３４によって温湿度センサＳＴＨの値をフィードバックして制御され、倒立顕微鏡２、ステージ受け２′及びＸＹステージ３が液浸媒質１３の温度と略同じに制御されている。なお、生物細胞の一例では、温度は３７℃を中心に±１℃の間で保たれる。
【００８３】
この状態で、上述した蛍光観察の実行により、標本４の液中の生物細胞の蛍光が撮像素子１８′で撮像され、パソコン２０を介して生物細胞が表示部２１に表示される。
【００８４】
最初の標本４の検査が終了すると、ＸＹステージ３が動いて、次のウェル５ａが水浸対物レンズ１２の光軸上に位置され、同様な蛍光観察が実行される。
【００８５】
この場合、ＸＹステージ３の移動とともに、水浸対物レンズ１２に対してカバーガラス５ｂが移動すると、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間で保持しきれなくなった液浸媒質１３が落下し、その液浸媒質１３が水浸対物レンズ１２の周囲に設けられた液受け部２７で受け止められる。そして、液浸媒質１３は排水口２７ａより排水パイプ２８に送られて、排水ポンプ２９によって排水ボトル３０に回収される。これと同時に、給水ノズル２５より一定量の液浸媒質１３が水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に補給される。
【００８６】
以下、同様にして、マイクロプレート５の全てのウェル５ａについて、蛍光観察が実行され、生物細胞がパソコン２０により表示部２１に表示される。
【００８７】
なお、マイクロプレート５のＸＹ移動及び焦点合わせは、入力装置３３からの指示によって、パソコン２０を介して制御装置３２からＸＹ移動の駆動用モータＭＸＹや焦点合わせ用のモータＭＺによって行われる。入力装置３３からの指示を制御装置３２に直接送っても良い。
【００８８】
従って、上記の実施の形態によれば、水浸対物レンズ１２に用いられる液浸媒質１３に着目し、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に充填される液浸媒質１３を予め所定の温度に調整して供給するようにしたので、マイクロプレート５のウェル５ａに入れられた全ての標本４の温度を、液浸媒質１３の予め調整された所定温度に制御することができる。また、液浸媒質１３によって水浸対物レンズ１２も所定の温度と略同じになるため、水浸対物レンズ１２の影響が非常に少なくなる。温風機３４によっても倒立顕微鏡２及び標本４の温度が所定の温度に保たれ、水浸対物レンズ１２も所定の温度と略同じになる。
【００８９】
これにより、標本４の液体中の生物細胞を常に一定の温度に維持することができるので、マイクロプレート５の全てのウェル５ａ内の標本４に対して安定した蛍光観察を行うことができる。
【００９０】
また、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間へ供給される液浸媒質１３の量を多く設定することにより、標本４の温度制御を安定して行うことができ、また、液浸媒質１３の供給、排出を頻繁に繰り返すことにより、標本４の温度制御を簡単に変更することもできるので、精度のよい温度制御を行うこともできる。
【００９１】
なお、上述した実施の形態では、給水パイプ２３ｂと２３ｃとの間に温度制御装置２６を配置したが、これに代えて、または同時に、給水ボトル２２全体を温度制御するボトル温度制御器３１を設けるようにしてもよい。
【００９２】
さらに、上述した実施の形態では、給水ボトル２２の液浸媒質１３を水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給し、余分となった液浸媒質１３を排水ボトル３０に回収するようにしたが、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの間に供給される液浸媒質１３を循環させる構成としてもよい。この場合、液浸媒質１３の循環により、異物などが液浸媒質１３に混入する可能性があるので、フィルタなどを用いて、異物等を確実に除去する必要がある。
【００９３】
さらに、装置本体１内部の温度が外部温度より数度高いことに注目して、温度制御装置２６に代えて熱交換器を設け、この熱交換器により液浸媒質１３を装置内の温度と同じになるように制御して、水浸対物レンズ１２とカバーガラス５ｂとの隙間に供給するようにしてもよい。
【００９４】
さらに、上述した実施の形態では、液浸媒質１３に純水を使用した水浸方式の例を述べたが、オイルを使用した油浸方式についても同様に適用できる。
【００９５】
なお、上述した実施の形態では、倒立型顕微鏡の場合を述べたが、正立型顕微鏡についても同様に適用できる。また、液浸媒質４７に純水を使用した水浸方式の例を述べたが、オイルを使用した油浸方式についても同様に適用できる。
【００９６】
上記のように、本発明の実施の形態によれば、液浸対物レンズに供給される液浸媒質を利用することで、標本の温度制御を安定して行うことができる、構成が簡単で、価格的にも安価な液浸媒質供給装置、蛍光分光検査装置及び培養顕微鏡を提供できる。
【００９７】
本発明は、上記各実施の形態に限ることなく、その他、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で種々の変形を実施し得ることが可能である。さらに、上記各実施形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示される複数の構成要件における適宜な組合せにより種々の発明が抽出され得る。
【００９８】
また、例えば各実施形態に示される全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出され得る。
【００９９】
上記の各実施の形態より、例えば、下記の発明が抽出できる。なお、下記の発明は、それぞれ単独で適用しても良いし、適宜組み合わせて適用することもできる。
【０１００】
本発明の第１の局面に係る液浸媒質供給装置は、観察標本と液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸対物レンズに供給する液浸媒質供給部とを具備することを特徴とする。液浸対物レンズと観察標本との間に充填される液浸媒質を予め所定の温度に調整して供給することにより、標本を所定の温度に制御することができる。これにより、例えば、生物標本の観察の場合に、適切な形態を観察でき、分子運動を捉える蛍光測光において、安定したデータが得られ、正しい判定が可能となる。
また、液浸対物レンズに用いられる液浸媒質を利用し、この液浸媒質の温度を制御する構成としているので、装置全体の構成を簡単にでき、価格的にも安価にできる。
【０１０１】
第１の局面において、好ましい実施態様は以下の通りである。
（１）　前記液浸媒質供給部は、液浸媒質供給源と前記液浸対物レンズに液浸媒質を供給する給液ノズルを有するとともに、前記温度制御器は液浸媒質供給源と給液ノズルの間に設けられること。
（２）　前記液浸媒質供給部の前記給水ノズルは少なくとも１つ以上であり、前記液浸対物レンズに着脱可能に保持されていること。
（３）　前記給水ノズルは、前記液浸対物レンズの外枠に埋設されていること。
（４）　前記給水ノズルは、前記液浸対物レンズの先端周辺部に設置された液受け部に埋設されている。
【０１０２】
本発明の第２の局面に係る蛍光分光検査装置は、液中に浮遊する蛍光標識された生物分子の標本からの光を集光する液浸対物レンズと、前記標本と前記液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、少なくとも液浸対物レンズの拡大像を検出する光検出器と蛍光照明とを備えた光学システムと、前記光検出器の出力から前記標本の運動を演算する演算部と、前記演算部による演算結果を表示するモニターと、前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸媒質レンズに供給する液浸媒質供給部とを具備することを特徴とする。ここで、前記演算部は蛍光相関分光法による演算を行うことが好ましい。蛍光強度のゆらぎを解析することで、拡散速度に関する情報と分子の数に関する情報を得る際に、標本の温度を一定にしているため、標本の液体中での浮遊分子運動を一定に維持することができ、マイクロプレートの全てのウェル内の標本に対して安定した蛍光検出を行うことができる。分子運動を捉える蛍光測定において、安定したデータが得られ、正しい判定が可能となる。
【０１０３】
第１及び第２の局面において、前記液浸媒質の温度を測定するセンサを更に具備することが好ましい。ここで、前記センサは液浸対物レンズの近傍に配置されることが好ましい。
【０１０４】
本発明の第３の局面に係る培養顕微鏡は、観察標本を載置するステージと、前記ステージを支持する顕微鏡と、前記顕微鏡に支持された液浸対物レンズと、前記顕微鏡に収納された観察標本の拡大像を取込む撮像装置及び光学系と、を収納する培養器と、前記観察標本と前記液浸対物レンズとの間に充填される液浸媒質と、前記液浸媒質を所定の温度に制御する温度制御器と、前記温度制御器により温度制御された前記液浸媒質を前記液浸媒質レンズに供給する液浸媒質供給部と、前記培養器に温風を送り込む温風機と、を具備することを特徴とする。ここで、前記液浸媒質の温度及び培養器内の湿度を測定するセンサを更に具備すること、更には、前記センサは液浸対物レンズの近傍に配置されることが好ましい。液浸媒質で観察標本と液浸対物レンズとの間を所定の温度に保つことができ、温風機で培養装置内を所定の温度に保つことにより、顕微鏡及び液浸対物レンズが所定の温度になる。液浸対物レンズが所定の温度になることで、液浸媒質を介した観察標本がより安定する。
【０１０５】
第１から第３の局面において、前記液浸媒質供給部より前記液浸対物レンズに供給される液浸媒質を排出する液浸媒質排出部をさらに具備することが好ましい。
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。例えば、実施の形態中に特に明示しなかったが、第２の実施の形態に記載したように、顕微鏡全体を箱状のもので覆うことによって内部の環境を調整する方法は、第１の実施の形態の蛍光測定装置にも適用可能である。
【０１０６】
【発明の効果】
本発明によれば、標本の温度制御を安定して行うことができる、構成が簡単で、価格的にも安価な液浸媒質供給装置、蛍光分光検査装置及び培養顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の装置本体の外観を示す図。
【図３】第１の実施の形態に用いられるマイクロプレートの概略構成を示す図。
【図４】第１の実施の形態の水浸対物レンズとマイクロプレートのカバーガラスの間の構成を拡大して示す図。
【図５】本発明の第１の実施の形態の変形例の概略構成を示す図。
【図６】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
ＲＸＹ…ラック
ＰＸＹ…ピニオン
ＭＸＹ…駆動用モータ
ＲＺ…ラック
ＰＺ…ピニオン
ＭＺ…モータ
ＳＴ…温度センサ
ＳＴＨ…温湿度センサ
１…装置本体
１ａ…マイクロプレート挿入窓
２…倒立顕微鏡
３…ＸＹステージ
４…標本
５ａ…ウェル
５…マイクロプレート
５ｂ…カバーガラス
６．７…励起用レーザ光源
６…光源
８…ハーフミラー
９…ミラー
１０…コリメートレンズ
１１…ダイクロイックミラー
１２…対物レンズ
１３…液浸媒質
１４…励起光バリアフィルタ
１５…結像レンズ
１６…反射ミラー
１７…ピンホール
１８…光検出器（撮像素子）
１９…演算装置
２０…パソコン
２１…表示部
２２…給水ボトル
２３ａ、２３ｂ、２３ｃ…給水パイプ
２４…給水ポンプ
２５…給水ノズル
２６…温度制御装置
２７ａ…排水口
２８…排水パイプ
２９…排水ポンプ
３０…排水ボトル
３１…ボトル温度制御器
３２…制御装置
３３…入力装置
３４…温風機
３６…ヒータ
３７…加湿水
４１…顕微鏡本体
４１ａ…前側固定部
４１ｂ…後側固定部
４２…ステージ
４３…シャーレ標本
４４…水浸対物レンズ
４５…観察鏡筒
４６…接眼レンズ
４７…液浸媒質
４８…給水パイプ
４９…給水ノズル
５１…排水パイプ
５２…透過照明光源
５３…コンデンサレンズ
【図１】
2004070307.tif 000003
【図２】
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【図３】
2004070307.tif 000005
【図４】
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【図５】
2004070307.tif 000007
【図６】
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