(57)【要約】【解決手段】ＰＡＣＡＰペプチドまたはＶＩＰペプチドより誘導したペプチドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、ＣＯＰＤ  等慢性肺疾患改善および進行抑制作用を有する医薬組成物。【効果】本発明によれば、ＣＯＰＤ  等の肺疾患を長時間に渡って抑制する  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  誘導体を提供できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａ−Ｂ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−
Ｅ−Ａｒｇ−Ｆ−Ａｒｇ−Ｇ−Ｇｌｎ−Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉ−            （Ｉ）
Ｊ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｋ−Ｌ−Ｍ−Ｎ                                                                （配列番号１）
（式中、Ａ  は、Ａｌａ  または  Ｇｌｙ；Ｂ  はＶａｌ  または  Ｉｌｅ；Ｃ  は、Ａｓｐ、  Ｇｌｕ  または  Ａｌａ；Ｄ  は、Ａｓｎ  または  Ｓｅｒ；Ｅ  は、Ｔｈｒ  または  Ｓｅｒ；Ｆ  は、Ｌｅｕ  または  Ｔｙｒ；Ｇ，Ｉ，Ｊ  は  Ｌｙｓ  または  Ａｒｇ；Ｈ  は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ  または  ｎＬｅｕ；Ｋ  は、Ａｓｎ、Ａｌａ  または化学結合；Ｌ  は  Ｓｅｒ、Ａｌａ  または化学結合；Ｍ  は、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたは化学結合；Ｎ  は、化学結合、Ｌｅｕ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、またはＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを表す。）
で示されるアミノ酸配列のＮ末端より少なくとも２３残基からなるアミノ酸配列で示され、Ｃ  末端アミノ酸のα位カルボキシル基がＮＨ２で修飾されているかまたはされていないペプチド、または薬学的に許容されるその塩を含有する慢性肺疾患治療剤。
【請求項２】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ｌｙｓ、Ｈ  が  Ｍｅｔ、Ｋ  が  Ａｓｎ、Ｌ  が  Ｓｅｒ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ａｓｎであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項３】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｓｎ、Ｌ  が  Ｓｅｒ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ａｓｎであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項４】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｓｎ、Ｌ  が  Ｓｅｒ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項５】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ  が化学結合であるアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項６】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項７】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ｇｌｕ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項８】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｌａ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項９】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ｌｙｓ、Ｈ  が  Ｍｅｔ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１０】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ｌｙｓ、Ｈ  が  Ｍｅｔ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１１】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１２】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１３】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１４】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１５】
前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ  が化学結合であるアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。
【請求項１６】
慢性肺疾患が慢性閉塞性肺疾患または肺気腫である、請求項１〜１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
経口製剤、粉末吸入製剤、粉末点鼻製剤、眼局所投与剤、または塗布剤である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、慢性肺疾患に対して強力に炎症抑制、細胞死抑制をもたらし、生体内において長時間に渡ってその効果を示すことが可能である  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  誘導体及びこれを含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢者の慢性肺疾患、特に慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：  ＣＯＰＤ）の罹患率は急上昇し、１９９９  年の死因順位表（厚生労働省発表）では第  １０  位に位置している（非特許文献１）。国内での患者数は約  ２２  万人と報告されているが、米国では約  １６００  万人とその数は非常に多く、我が国では診断されていない潜在的な高齢の  ＣＯＰＤ  患者は非常に多いものと推測される。ＣＯＰＤ  は「傷害性物質に対する異常な炎症反応によってもたらされた非可逆性の気流閉塞が進行性にみられる」として病態生理学的に定義づけられており、これらの病態形成に関与する病変としては、気道の過分泌をもたらす中枢気道病変、固定性気道閉塞をもたらす末梢気道病変、そして肺胞系の気腫病変がある（非特許文献２）。特に、末梢気道や肺実質では、重度な症状になると細胞死による組織断裂あるいは繊維化がみられ、気管支喘息の症状とは大きく異なっている。この組織破壊に寄与しているのはアポトーシスであり、特に好中球浸潤とそれに伴うエラスターゼの過剰化が大きな役割を担っているものと考えられている。この  ＣＯＰＤ  について、その発症要因として最も重要な因子として喫煙があげられており、実効のある予防方法としての禁煙指導が日常臨床上重視されつつある。また、その他の因子としては遺伝的素因、気道の反応性亢進、肺の成長、職場での傷害物質暴露、室内外での汚染物質吸入、感染などが挙げられる（非特許文献３）。ＣＯＰＤ  に対する薬剤投与療法として、ベータ作動薬、抗コリン剤、キサンチン製剤、そしてステロイド剤と、一般的な喘息治療薬がそのまま適用されているのが現状であるが、これらは  ＣＯＰＤ  等によって誘起される症状の緩和であって、病変進行抑制あるいは病変改善にはなりえない（非特許文献４）。それ故、ＣＯＰＤ  罹患に伴う肺組織の異常化を抑制しうる薬剤の開発が強く望まれているところである。
【０００３】
一方、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド；Ｖｏｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）は、脳−腸管ペプチドと呼ばれ、血流促進、血圧低下作用をもつ生理活性ペプチドの一種である。このＶＩＰは、ブタ腸管から抽出されており、２８個のアミノ酸残基からなる（非特許文献５）。また、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド；  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ａｄｅｎｙｌａｔｅ  Ｃｙｃｌａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）  は、羊の視床下部から下垂体培養細胞のアデニル酸シクラーゼを活性化させるバイオアッセイ系を指標にして単離され構造決定された３８個のアミノ酸残基よりなるペプチドであり、ＰＡＣＡＰ３８と、ＰＡＣＡＰ２７の２種類がある（非特許文献６）。このＰＡＣＡＰのＮ末端側から２７個のアミノ酸配列はＶＩＰと極めて類似した構造を有している。また、ＶＩＰとＰＡＣＡＰのアミノ酸配列は、セクレチン、グルカゴン等に類似していることから、グルカゴン−セクレチンスーパーファミリーに属するペプチドとされている。これら  ＰＡＣＡＰ  および  ＶＩＰ  は  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  レセプターを介してその生理作用を示すが、この  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  レセプターは生体内において広い分布を示し、それ故  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  は多くの生理活性を有することが報告されている。
【０００４】
これらの薬理活性を高める目的で、本発明者らは先に、酵素耐性を新規機能として保持させた  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  誘導体を創製し（特許文献１）、実際にこれらがトリプシン等生体内ペプチダーゼによる代謝に対して優れていること（非特許文献７）、さらには気管支拡張作用を指標としてこれらの誘導体が著しい薬効持続作用を有することを明らかにした（非特許文献８）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平８−３３３２７６号公報
【非特許文献１】
石井  健男ら、「日本老年医学会雑誌」２００２  年  ３９  巻  ｐ．  ３０８
【非特許文献２】
青柴  和徹ら、「日本臨床」１９９９  年  ５７  巻  ｐ．  ４２
【非特許文献３】
永井  厚志ら、「日本内科学会雑誌」２００２  年  ９１  巻  ｐ．  １３７
【非特許文献４】
木田  厚瑞ら、「呼吸ケアのデザイン」（日本医事新報社発行）２００１  年
【非特許文献５】
サイド  （Ｓａｉｄ，  Ｓ．Ｉ）  ら、「サイエンス  （Ｓｃｉｅｎｃｅ）」（米国）１９７０  年  １６９  巻  ｐ．１２１７
【非特許文献６】
宮田  篤郎ら、「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ  （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」（米国）１９８９  年  １６４  巻  ｐ．５６７
【非特許文献７】
樫本  和久ら、「ペプチド  ケミストリー（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」  １９９６年  ｐ．２４９
【非特許文献８】
吉原  重美ら、「ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」  （米国）  １９９８年  １９巻  ｐ．５９３；吉原  重美ら、「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」  １９９７年  １２１巻  ｐ．１７３０
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、慢性肺疾患、特に  ＣＯＰＤ  に対して肺組織保護・進行防止等治療を目的として臨床使用できる  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  誘導体を含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＣＯＰＤ  の原因物質とされるタバコの煙毒性に着目し、この毒性を評価するための実験系の構築を行った。その結果、タバコ煙抽出液をラット肺胞由来細胞に添加することにより、著しい炎症反応と、それに伴うアポトーシスの発現およびアポトーシス時の  ＤＮＡ  断片化を実行する  Ｃａｓｐａｓｅ−３  の活性化を確認し、この実験系が  ＣＯＰＤ  の病態と高い関連性を有することを明らかにした。
【０００８】
さらに、タバコ煙抽出液と共に種々のペプチド性ならびに非ペプチド性薬剤を共存させ、その効果を観察し、ついにはタバコ煙毒性に対して  ＶＩＰ  および  ＰＡＣＡＰ  が有効であることを確認するに至った。
【０００９】
この薬理効果については、特に  ＶＩＰ  が有効であり、このことは肺胞上皮細胞に、ＶＩＰ  に特異的な受容体が発現している事実に起因するものと考えられる。さらに本研究者らは、鋭意研究の結果、ＶＩＰ  および  ＰＡＣＡＰ  誘導体が天然型両ペプチドよりも有意に  ＣＯＰＤ  様症状改善効果が強く、継続的に薬効を発揮しうる事実を見出すに至った。本発明者らは、先に溶液中での安定性を飛躍的に向上させたＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ誘導体を開発し、薬理効果の延長を可能とすることに成功した（特願２００２−３４４５２３）。従って、この長時間作動型  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  誘導体は医薬応用において極めて有用なものであり、特にＣＯＰＤに対する薬理作用を目的とした薬剤として特に有効である。また、ＰＡＣＡＰ  と  ＶＩＰ  の最小活性単位は共に  Ｎ  末端より  ２３  残基であることが公知の事実となっており（Ｋｉｔａｄａ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，  １９９１，  ２３９−２４４，  Ｏｎｏｕｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００２，  ２００３，  ２２５−２２８）、上記  ＰＡＣＡＰ  および  ＶＩＰ  誘導体群についても  Ｎ  末端より  ２３  残基以上あれば  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  の生理・薬理効果が期待できる。
【００１０】
さらに本発明者らは上記ペプチドが、天然型ＶＩＰ及びＰＡＣＡＰと同様、またはそれ以上の高い生理活性を有すると共に、高い安定性を有することを見出すに到った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１７）の発明を提供する。
（１）    下記式（Ｉ）：
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａ−Ｂ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−
Ｅ−Ａｒｇ−Ｆ−Ａｒｇ−Ｇ−Ｇｌｎ−Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｉ−            （Ｉ）
Ｊ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｋ−Ｌ−Ｍ−Ｎ                                                                （配列番号１）
（式中、Ａ  は、Ａｌａ  または  Ｇｌｙ；Ｂ  はＶａｌ  または  Ｉｌｅ；Ｃ  は、Ａｓｐ、  Ｇｌｕ  または  Ａｌａ；Ｄ  は、Ａｓｎ  または  Ｓｅｒ；Ｅ  は、Ｔｈｒ  または  Ｓｅｒ；Ｆ  は、Ｌｅｕ  または  Ｔｙｒ；Ｇ，Ｉ，Ｊ  は  Ｌｙｓ  または  Ａｒｇ；Ｈ  は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ  または  ｎＬｅｕ；Ｋ  は、Ａｓｎ、Ａｌａ  または化学結合；Ｌ  は  Ｓｅｒ、Ａｌａ  または化学結合；Ｍ  は、Ｉｌｅ、Ｖａｌまたは化学結合；Ｎ  は、化学結合、Ｌｅｕ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ，Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ，Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ、またはＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒを表す。）
で示されるアミノ酸配列のＮ末端より少なくとも２３残基からなるアミノ酸配列で示され、Ｃ  末端アミノ酸のα位カルボキシル基がＮＨ２で修飾されているかまたはされていないペプチド、または薬学的に許容されるその塩を含有する慢性肺疾患治療剤。
（２）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ｌｙｓ、Ｈ  が  Ｍｅｔ、Ｋ  が  Ａｓｎ、Ｌ  が  Ｓｅｒ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ａｓｎであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  １等が相当）
（３）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｓｎ、Ｌ  が  Ｓｅｒ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ａｓｎであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ２等）
（４）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｓｎ、Ｌ  が  Ｓｅｒ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ４等）
（５）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ  が化学結合であるアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ６等）
（６）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ８等）
（７）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ｇｌｕ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  １７等）
（８）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｖａｌ、Ｃ  が  Ａｌａ、Ｄ  が  Ａｓｎ、Ｅ  が  Ｔｈｒ、Ｆ  がＬｅｕ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｉｌｅ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇであるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  １９等）
（９）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ｌｙｓ、Ｈ  が  Ｍｅｔ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ２２等）
（１０）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ｌｙｓ、Ｈ  が  Ｍｅｔ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ２３等）
（１１）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ２４等）
（１２）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ｇｌｙ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ２５等）
（１３）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ２７等）
（１４）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ  が  Ａｌａ、Ｌ  が  Ａｌａ、Ｍ  が  Ｖａｌ、Ｎ  が  Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ  であるアミノ酸配列のＮ  末端より少なくとも  ２３  残基のアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ３１等）
（１５）    前記ペプチドが、一般式  （Ｉ）  においてＡ  が  Ａｌａ、Ｂ  が  Ｉｌｅ、Ｃ  が  Ａｓｐ、Ｄ  が  Ｓｅｒ、Ｅ  が  Ｓｅｒ、Ｆ  がＴｙｒ、Ｇ，  Ｉ，  Ｊ  が  Ａｒｇ、Ｈ  が  Ｌｅｕ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ  が化学結合であるアミノ酸配列で示され、Ｃ末端が−ＮＨ２で修飾されたペプチドである、請求項１に記載の慢性肺疾患治療剤。（ペプチド  ３５等）
（１６）    慢性肺疾患が慢性閉塞性肺疾患または肺気腫である、（１）〜（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）    経口製剤、粉末吸入製剤、粉末点鼻製剤、眼局所投与剤、または塗布剤である、（１６）に記載の医薬組成物。
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１２】
【発明を実施するための形態】
本発明の高安定性ペプチド誘導体は、具体的には一般式（Ｉ）に記載のアミノ酸配列のＮ末端より少なくとも２３残基からなるアミノ酸配列で示され、Ｃ  末端アミノ酸のα位カルボキシル基がＮＨ２で修飾されているかまたはされていないペプチドであり、Ｎ末端のアミノ基はアセチル基、ステアリル基等の各種アシル基、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸等の高分子、さらにはデンドリマー等が結合していても良い。Ｃ  末端については、−ＯＨ、−ＮＨ２、あるいは  Ｎ−メチルアミドや  Ｎ−エチルアミド等で修飾されていても良いが望ましくは−ＮＨ２  である。
【００１３】
本発明に用いられるペプチドの代表例を表１に示した。ここに示したペプチド  １〜３６  は、後記配列表の配列番号２〜３７に対応するペプチドである。ただし、ペプチド  ５，６，１８，２０，３４，３５，３６は  ２３  残基のアミノ酸配列からなるペプチドであり、ペプチド  ９，  ２９，  ３６  は  Ｎ  末端アミノ基にアセチル基が、そしてペプチド  １０  の  Ｎ  末端アミノ基にはステアリル基が結合している。尚、表中の空欄は化学結合であることを示す。
【００１４】
【表１】
2004315436.tif 000002
2004315436.tif 000003
【００１５】
上記ペプチドは、使用の際にはその  Ｎ  末端に極性物質または非極性物質（脂肪酸、アシル基等）を結合させて分子の極性を変化させたり、ポリエチレングリコール、グルコサミノグリカン（ヒアルロン酸等）の高分子を結合させて酵素耐性を増強したり、リポソーム基質に結合させてリポソームに封入したり、あるいは脂質膜表面に固定することもできる。アシル基の導入は、その活性の向上のみならず、自己凝集を抑制することが当業者間で知られている。
【００１６】
本発明に使用するペプチドは、特に限定するものではないが、公知のペプチド合成の常法に従って合成できる。例えば「ザ．ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻（１９６６年）  ［Ｓｃｈｒｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｌｕｈｋｅ  著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．］  、あるいは「ペプチド合成」［泉屋ら著、丸善株式会社（１９７５年）］の記載に従い、具体的には、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法（Ｐ−ニトロフエニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法、シアノメチルエステル法など）、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ−アディティブ（ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＳｕ）法など、各種の方法により合成することができる。これらの方法は、固相合成及び液相合成のいずれにも適用できる。
【００１７】
本発明においてペプチド合成は、上記のような一般的なポリペプチドの合成法に従って、例えば末端アミノ酸に順次１個ずつアミノ酸を縮合させるいわゆるステップワイズ法によって、または数個のフラグメントに分けてカップリングさせていく方法により行われる。
【００１８】
例えばステップワイズ法による固相合成は、具体的には、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ．Ｒ．Ｂ．）の方法  ［Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，  ８５，  ２１４９−２１５９  （１９６３）］に従い、以下のようにして行うことができる。まず、Ｃ末端アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキシル基によって不溶性樹脂に結合させ、その後、該Ｃ末端アミノ酸のアミノ基の保護基を除去する。次いで、得られたこの遊離の反応性アミノ基に、目的とするペプチドのアミノ酸配列に従って、アミノ基を保護したアミノ酸の反応性カルボキシル基を縮合反応により順次結合させる。このようにして一段階ずつ全配列を合成した後、ペプチドを不溶性樹脂からはずす。
【００１９】
上記の固相合成において用いられる不溶性樹脂は、反応性カルボキシル基との結合性を有するものであればいずれをも使用でき、例えばベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、メチルベンズヒドリル樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、４−アミノメチルフェノキシメチル樹脂、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂などが挙げられる。
【００２０】
また、α−アミノ基の保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）を使用する場合は４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル樹脂など、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって樹脂から脱離できるものがよく、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）を使用する場合は４−オキシメチルフェニルアセタミドメチル樹脂（ＰＡＭ樹脂）など、フッ化水素などによって樹脂から脱離できるものがよい。樹脂１ｇ当りペプチド濃度は０．５ｍｍｏｌｅ以下とすることが好ましい。
【００２１】
上記の方法においては、アミノ酸のペプチド結合に関与するアミノ基への保護基の結合及び該保護基の脱離、ならびにアミノ酸のペプチド結合に関与するカルボキシル基の活性化が必要である。
【００２２】
アミノ基の保護基として、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミノオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボニルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−クロル−ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフイノチオイルなどの基が挙げられる。
【００２３】
また、アミノ酸の中で、側鎖に官能基を有するもの、例えばＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｒｇ及びＳｅｒは、その側鎖の官能基を保護しておくのが好ましい。官能基の保護は、通常用いられている方法で、下記のような通常の保護基を結合させることにより行われ、反応終了後、該保護基は脱離される。
【００２４】
Ｈｉｓのイミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トリチル基などが挙げられる。
【００２５】
Ｓｅｒ及びＴｈｒの水酸基は、例えばエステル化またはエーテル化によって保護することができるが、この保護は必須ではない。エステル化に適する基としては、アセチルなどの低級アルカノイル基、ベンゾイルなどのアロイル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニルなどの炭酸から誘導される基などが挙げられる。またエーテル化に適する基としては、ベンジル（Ｂｚｌ）、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル基などが挙げられる。
【００２６】
Ｔｙｒの水酸基の保護基としては、例えばベンジル（Ｂｚｌ）、ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）  、ジクロロベンジル（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）  、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、アセチル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
【００２７】
Ｌｙｓのアミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）  、ジクロロベンジル（Ｃｌ２−Ｂｚｌ）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）基などが挙げられる。
【００２８】
Ａｒｇのグアニジノ基の保護基としては、例えばｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ニトロ、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）基などが挙げられる。
【００２９】
Ａｓｐのカルボキシル基の保護は、例えばベンジルアルコール、メタノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、シクロヘキシル（ｃＨｅｘ）などによるエステル化により行われる。
【００３０】
その他のアミノ酸の保護基として、Ｔｒｐのインドリル基の保護基としては、例えばホルミル、カルボベンゾキシル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニルなどが挙げられるが、この保護は必須ではない。
【００３１】
Ｍｅｔのチオメチル基の保護基としては予めメチルスルホキシドにしておき、後に還元する方法があるが、この保護は必須ではない。
【００３２】
一方、カルボキシル基の活性化は、従来公知の方法にて行うことができ、用いられる試薬なども公知のものから適宜選択しえる。例えば、カルボキル基の活性化は、該カルボキシル基と種々の試薬とを反応させ、対応する酸クロライド、酸無水物または混合酸無水物、アジド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド等とのエステル）などを形成させることにより行う。
【００３３】
上記の固相における反応性アミノ基と反応性カルボキシル基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）に用いる溶媒としては、ペプチド結合形成に使用できるものであればいずれでもよい。例えば無水または含水のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）などを単独で、あるいは２種以上の混合溶媒として使用することができる。
【００３４】
また、上記縮合反応は、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボキシイミド（ＤＣＣ）、カルボジイミダゾールなどのカルボジイミド試薬やテトラエチルピロホスフェイト、ベンゾトリアゾール−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（Ｂｏｐ試薬）などの存在下に行うこともできる。
【００３５】
合成されたペプチドは、通常の方法に従い脱塩、精製することができる。例えば、ＤＥＡＥ−セルロースなどのイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ−２０  、セファデックスＧ−２５  などの分配クロマトグラフィー、シリカゲルなどの順相クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルなどの逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３６】
上記のようにして精製したペプチドは、各種の酸を用いて、所望により薬学的に許容される塩、例えば、酢酸塩、塩酸塩、リン酸塩等にすることができる。
【００３７】
上記ペプチドまたはその塩は、医薬的に許容できる溶剤、賦形剤、担体、補助剤などを使用し、製剤製造の常法に従って液剤、錠剤、散剤、顆粒剤、坐剤、腸溶剤およびカプセル剤などの医薬組成物として調製し、経口製剤、粉末吸入製剤、粉末点鼻製剤、眼局所投与剤、注射剤、または塗布剤として用いることができるが、特に限定するものではない。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して非経口的にまたは経口的に、さらにはドラッグデリバリーシステムを必要に応じて用いて、安全に投与することができる。当該医薬組成物の投与量は、剤形、投与ルート、症状等により適宜変更しうるが、例えばヒトを含む哺乳動物に投与する場合、ペプチド量として１人１日当たり約１ｐｇ  〜１  ｍｇ／ｋｇ  程度を適用することが例示される。
【００３９】
【実施例】
以下に本発明を参考例、実施例を挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１〕  ペプチドの合成
配列番号２０に示すアミノ酸配列を有するペプチド  １９  をペプチド固相合成の常法に従い製造した。
ＭＢＨＡ  樹脂  ＨＣｌ  塩  （ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−１％  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  共重合体、１００〜２００  ｍｅｓｈ）  をマニュアル合成用反応槽（ガラス製、φ６．０  ｘ  ２９．５  ｃｍ）に加え、樹脂容量の  ２〜３  倍量のメタノールで攪拌洗浄し、次いでジクロロメタン（樹脂容量の  ２〜３  倍量）で攪拌洗浄して樹脂を膨潤させた。１０％  トリエチルアミン／ジクロロメタンにて中和反応を行い、Ｃ  末端アミノ酸に相当する  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ  を樹脂の約  ２  倍当量用い、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび  Ｎ−ハイドロキシベンゾトリアゾールを加えて縮合反応を行った。約  ２  時間の反応（攪拌下）後、メタノールおよびジクロロメタンにて洗浄し、カイザー試験にてα−アミノ基の消失を確認後、５０％  トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンにて  ３０  分間処理して脱保護を行った。次いで、１０％  トリエチルアミン／ジクロロメタンにて中和し、メタノールおよびジクロロメタンにて再洗浄後、再びカイザー試験を実施して脱保護反応の確認を行った。確認後は  Ｃ  末より  ２  番目の  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ  のカップリングを行うため、同様の工程を繰り返した。その後、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｔｙｒ  （Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｇｌｎ  （Ｘａｎ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｔｈｒ  （Ｂｚｌ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｔｙｒ  （Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｓｎ  （Ｘａｎ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｔｈｒ  （Ｂｚｌ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ａｓｐ  （ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｓｅｒ  （Ｂｚｌ）−ＯＨ，  Ｂｏｃ−Ｈｉｓ  （Ｂｏｍ）−ＯＨ  の順に順次カップリング／脱保護を行い、ペプチド  １９  に相当する保護ペプチド；  Ｈｉｓ  （Ｂｏｍ）−Ｓｅｒ  （Ｂｚｌ）−Ａｓｐ  （ＯｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ  （Ｂｚｌ）−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ  （Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｔｈｒ  （Ｂｚｌ）−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−  Ａｒｇ  （Ｔｏｓ）−Ｔｙｒ  （Ｃｌ２−Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＢＨＡ  を得た。ここで得られた保護ペプチド−ＭＢＨＡ  樹脂にエタンジチオールおよびアニソール存在下無水フッ化水素を加えて反応させた。反応後、無水フッ化水素を減圧下留去後、残渣をエーテルで洗浄し、これに  １０％酢酸を加えてペプチドを抽出した。抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーにより精製し、凍結乾燥を行いペプチド  １９  を得た。
【００４１】
上記方法と同様にして、下記のペプチド１〜３６  を化学合成した。
2004315436.tif 000004
2004315436.tif 000005
2004315436.tif 000006
2004315436.tif 000007
2004315436.tif 000008
2004315436.tif 000009
【００４２】
〔実施例２〕  （肺胞由来  Ｌ２  細胞における  ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  レセプターの所在）
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  からラット胚胞由来  Ｌ２  細胞を入手し、１０％  ウシ血清添加ダルベッコ改変イーグル培地中にて培養した（３７℃，５％  ＣＯ２／９５％  Ａｉｒ）。約  １０５  個の  Ｌ２  細胞から、塩酸・フェノール法によって  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  を抽出し、逆転写酵素処理を行い  ｃＤＮＡ  を調製した。これらの  ｃＤＮＡ  を鋳型として、下記の３種のプライマー対を用い、ポリメラーゼチェインリアクション  （ＰＣＲ）  を行った。反応液は鋳型  ＤＮＡ  （１  μｌ）、１×Ｔａｑ  緩衝液（５０  ｍＭ  ＫＣｌ，  １．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２  含有  １０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  緩衝液，  ｐＨ  ９．０）、２００  μＭ  ｄＮＴＰｓ、２００  μＭ  ＢＳＡ、０．４  μＭ  プライマー、１．５  ｕｎｉｔｓ  Ｔａｑ  ポリメラーゼの混合液で、反応容量は  ２５  μｌ  とした。反応条件は最初に  ９４℃で  ３  分間熱変性を行い、４０  サイクルの  ＰＣＲ  反応を検討した。各サイクルは、９４℃、３０  秒間の熱変性、各指定温度下、３０  秒間のアニーリング、７２℃、１  分間の伸長反応からなり、アニーリング温度はプライマーによって変化させた。すなわち、ＰＡＣ１  レセプター、ＶＰＡＣ１  レセプターの場合は  ６６℃、ＶＰＡＣ２  レセプターは  ６３℃  とした。ＰＣＲ  終了後、２％  アガロースゲル（ＬＯ３「ＴＡＫＡＲＡ」，宝酒造）、Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ  緩衝液中にて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド水溶液（０．５  μｇ／ｍｌ）に約  ３０  分間浸して染色を行った。ＰＣＲ  に使用したプライマーは下記の通りである。
【００４３】
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【００４４】
その結果、ＶＩＰ  特異的なレセプターである  ＶＰＡＣ２  レセプター  ｍＲＮＡ  由来の  ＰＣＲ  産物（３２６  ｂｐ）を認め、Ｌ２  細胞には  ＶＰＡＣ２  レセプターが主に発現していることを確認した（図１）。この結果は、肺組織に  ＶＩＰ  レセプターが多く存在することを示唆する既報の事実と矛盾せず、本細胞を用いたアッセイが肺における薬剤の挙動を模擬することが可能であることを強く示唆している。
【００４５】
〔実施例３〕  （タバコ煙抽出液の肺胞細胞に対する毒性）
タバコ煙による  ＣＯＰＤ  病変を  Ｌ２  細胞を用いて評価した。まず、タバコ煙を吸引用ポンプにて捕集し、その煙を  ＤＭＥＭ  ２０  ｍＬ  にトラップした、メンブランフィルター（０．２２  μｍ）にて滅菌濾過後、２５  ｍＬ  にメスアップし、タバコ煙抽出液とした。この抽出液を  ＤＭＥＭ  にて目的とする濃度に希釈し、Ｌ２  細胞に添加して毒性実験を行った。すなわち、Ｌ２  細胞をトリプシン  （０．２５％）  処理にて遊離させ、６  ｗｅｌｌ  カルチャープレート、９６  ｗｅｌｌ  コラーゲンコート済みプレートに  １０５  ，  ２．０  ｘ  １０３  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  にそれぞれなるよう細胞を定着させた。６  ｗｅｌｌ  カルチャープレートに終濃度  ５％  になるようタバコ煙抽出液を添加し、２４  時間後に  １０％  中性緩衝ホルマリンにて固定後、Ｔｕｎｎｅｌ  法によって  ＤＮＡ  断片化の有無を検証した。その結果、図  ２  に示すように、タバコ煙抽出液を添加していないコントロール群は陰性であるのに対して、タバコ煙抽出液存在下培養した細胞群は著しい  ＤＮＡ  断片化を起こしていることが明らかとなった。
【００４６】
また、様々な濃度のタバコ煙抽出液を添加して培養した後に、生細胞数を  ＬＤＨ放出  およびＷＳＴ−８  を用いて検討した結果を図  ３  に示す。その結果、タバコ煙抽出液の濃度依存的および経時的に  Ｌ２  細胞の生存率は低下し、タバコ煙抽出液  １％  未満存在下でほぼ定常状態となった。このことは、タバコ煙が著しい肺組織障害機能を有していることと、このアッセイ系が  ＣＯＰＤ  を模擬しうることを強く示唆するものである。
【００４７】
〔実施例４〕  （タバコ煙抽出液誘発細胞死に対する神経ペプチド類の効果）
タバコ煙抽出液  ０．２５％  添加  Ｌ２  細胞培養系に、ＲＴ−ＰＣＲ  によって存在が明らかとなった  ＶＰＡＣ２  レセプターのアゴニストである  ＶＩＰ  を添加し、細胞死抑制効果の有無を検討した。また、ＶＰＡＣ２  レセプターに対して  ＶＩＰ  とほぼ同程度の結合活性を有する  ＰＡＣＡＰ  についても同様にその薬理効果を検証した。４８  時間後の生細胞数を  ＷＳＴ−８  法によって算出した結果を図  ４  に示す。この結果が示すとおり、ＶＩＰ  および  ＰＡＣＡＰ  は極めて低い濃度において有効な細胞保護作用を有することが明らかとなった。また、同様に  ＶＩＰ  および  ＰＡＣＡＰ  の誘導体であるペプチド  ４，８，１７，そして  １９（１０−７  Ｍ）を対象に、その  Ｌ２  細胞保護作用を検討したところ、図  ５  に示すように、ＶＩＰ  よりも有意に強力な神経保護活性を示した。また、これらのペプチドを含むペプチド  １〜３６  すべての  ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ  関連ペプチドに同様の薬理効果（タバコ煙抽出液  ０．２５％  による細胞死を  ２０〜８０％  の範囲で阻害）を確認した。
【００４８】
〔実施例５〕  （タバコ煙抽出液による肺胞細胞のアポトーシス誘導酵素活性化とそれに対する神経ペプチド類の効果）
タバコ煙抽出液を用いたアッセイ系が  ＣＯＰＤ  モデル実験となりうるか否かさらなる検討を行うために、タバコ煙によるアポトーシス誘導について精査した。本実験ではアポトーシス誘導を  ｃａｓｐａｓｅ−３  の活性化を指標に検討を行った。すなわち、Ｌ２  細胞をトリプシン  （０．２５％）  処理にて遊離させ、９６  ｗｅｌｌ  コラーゲンコート済みプレートに  １．０  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  になるよう細胞を定着させた。次に終濃度  ０．２５％  になるようタバコ煙抽出液を添加し、経時的に細胞を  Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製）にて溶解させて、細胞溶解液中の酵素活性を蛍光基質を用いて評価した。Ｃａｓｐａｓｅ−３  活性評価には  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ  を利用した。基質添加後、１２〜１４  時間経過してから蛍光測定し、タバコ煙抽出液非添加群との比較をおこなった。Ｃａｓｐａｓｅ−３  活性測定の結果を図  ６  に示す。この結果から、タバコ煙抽出液によって著しいアポトーシス関連酵素が誘導されることが明らかとなった。また、タバコ煙抽出液存在下、ｃａｓｐａｓｅ  阻害剤  Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ  （ｃａｓｐａｓｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  阻害剤）、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ  （ｃａｓｐａｓｅ−３）  阻害剤を添加した場合には、図  ７  に示すように細胞死が有意に抑制された。この結果は、ＣＯＰＤ  による肺組織傷害がアポトーシス誘導に起因していることの更なる証明と考えられる。
【００４９】
〔実施例６〕  （タバコ煙抽出液誘発  ｃａｓｐａｓｅ  活性化に対する神経ペプチド類の効果）
神経ペプチド類のアポトーシス抑制効果に対して更なる検証を行うため、神経ペプチドによる  ｃａｓｐａｓｅ−３  活性への影響について検討した。すなわち、Ｌ２  細胞をトリプシン  （０．２５％）  処理にて遊離させ、９６  ｗｅｌｌ  コラーゲンコート済みプレートに  １．０  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  になるよう細胞を定着させた。次に終濃度  ０２５％  になるようタバコ煙抽出液および各濃度の  ＶＩＰ  を添加し、１２  時間培養後に細胞を  Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  にて溶解させて、細胞溶解液中の酵素活性を蛍光基質（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣ）を用いて評価した。基質添加後、１２〜１４  時間経過してから蛍光測定し、種々比較検討を行った。その結果を図  ８  に示す。ＶＩＰ  は濃度依存的に  ｃａｓｐａｓｅ  活性を抑制することが明らかとなり、本知見は  ＶＩＰ  の  ＣＯＰＤ  改善作用メカニズムの一つに抗アポトーシス機能があることを強く示唆している。
【００５０】
〔実施例７〕  （タバコ煙抽出液による肺胞細胞の炎症関連酵素活性化とそれに対する神経ペプチド類の効果）
タバコ煙による炎症誘起について精査した。本実験では炎症誘起を  ＭＭＰ  活性を指標として検討を行った。すなわち、Ｌ２  細胞をトリプシン  （０．２５％）  処理にて遊離させ、９６  ｗｅｌｌ  コラーゲンコート済みプレートに  １．０  ｘ  １０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  になるよう細胞を定着させた。次に終濃度  ０．２５％  になるようタバコ煙抽出液を添加し、経時的に細胞を  Ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  にて溶解させて、細胞溶解液中の酵素活性を蛍光基質を用いて評価した。ＭＭＰ  活性評価には  ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｄｐａ（ＤＮＰ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２  を用いた。基質添加後、１２〜１４  時間経過してから蛍光測定し、タバコ煙非添加群との比較をおこなった。ＭＭＰ  活性測定の結果を図  ９に示す。これらの結果から、タバコ煙抽出液によって著しい炎症反応とアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。また、タバコ煙抽出液存在下、ＭＭＰ  阻害剤  ＧＭ６００４（シグマ社製）を添加した場合には、図  １０  に示すように細胞死が有意に抑制された。この結果は、ＣＯＰＤ  によるアポトーシス誘導およびそれに伴う細胞死に  ＭＭＰ  の活性化が起因していることの更なる証明と考えられる。また、ＶＩＰ（１０−７  Ｍ）を本実験系に添加したところ、有意に  ＭＭＰ  活性を抑制することが明らかとなり、本知見は  ＶＩＰ  の  ＣＯＰＤ  改善作用メカニズムの一つに  ＭＭＰ  活性低下作用があることを強く示唆している。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、慢性肺疾患特に  ＣＯＰＤ  に対してその進行阻害ならびに改善機能を有するＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  誘導体を提供することが出来る。
【００５２】
【配列表】
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【００５３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１〜３７：合成ペプチド
配列番号３８：ＰＡＣ１センスプライマー
配列番号３９：ＰＡＣ１アンチセンスプライマー
配列番号４０：ＶＰＡＣ１センスプライマー
配列番号４１：ＶＰＡＣ１アンチセンスプライマー
配列番号４２：ＶＰＡＣ２センスプライマー
配列番号４３：ＶＰＡＣ２アンチセンスプライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】ラット肺胞上皮由来  Ｌ２  細胞から抽出した  ｍＲＮＡ  をもとに、ＰＡＣＡＰ／ＶＩＰ  レセプターである  ＰＡＣ１，  ＶＰＡＣ１  そして  ＶＰＡＣ２  レセプター特異的プライマーを利用して行った  ＲＴ−ＰＣＲ  実験の結果を示す。これらのレセプターのうち  ＶＰＡＣ２  レセプターに相当する  ＰＣＲ  産物のみが検出されており、Ｌ２  細胞には  ＶＰＡＣ２  レセプターが主に発現していることが分かる。
【図２】タバコ煙抽出液による  Ｌ２  細胞のアポトーシス誘導を示す。Ｔｕｎｎｅｌ  法によって、タバコ煙抽出液  ０．５％  存在下  ２４  時間培養した  Ｌ２  細胞中の  ＤＮＡ  断片化を検討した。タバコ煙非添加群  （Ａ）  と比して、添加群（Ｂ）は明瞭なアポトーシス誘導を起こしていることが分かる。
【図３】タバコ煙抽出液による細胞毒性評価の結果を示す。
タバコ煙抽出液による  Ｌ２  細胞からの乳酸脱水素酵素放出。
●，非添加群；◆，０．１％  タバコ煙抽出液；▲，０．２５％  タバコ煙抽出液；■，０．５％  タバコ煙抽出液；１．０％  タバコ煙抽出液
タバコ煙抽出液による細胞死。ＷＳＴ−８  法による。コントロール群に対する生細胞数を検出。
【図４】タバコ煙抽出液  ０．２５％  に対する神経ペプチドの保護効果を示す。
●，ＶＩＰ；▲，ＰＡＣＡＰ２７
【図５】タバコ煙抽出液  ０．２５％  に対する  本発明のＶＩＰ誘導体ペプチドの保護効果を示す。
【図６】タバコ煙抽出液  ０．２５％  による  Ｌ２  細胞中  ｃａｓｐａｓｅ−３  活性化作用を示す。
【図７】タバコ煙抽出液  ０．２５％  による  ４８  時間培養後の  Ｌ２  細胞死と、ｃａｓｐａｓｅ  阻害剤による細胞死抑制効果を示す。
●，Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ；▲，Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ
【図８】タバコ煙抽出液  ０．２５％  による  １２  時間培養後の  Ｌ２  細胞中  ｃａｓｐａｓｅ−３  活性化作用と  ＶＩＰ  によるその抑制効果を示す。
【図９】タバコ煙抽出液  ０．２５％  による  Ｌ２  細胞中  ＭＭＰ  活性化と  ＶＩＰ  による抑制効果を示す。
■，タバコ煙抽出液  ０．２５％；●，タバコ煙抽出液  ０．２５％  存在下  ＶＩＰ  添加群
【図１０】タバコ煙抽出液  ０．２５％  存在下  ４８  時間培養による  Ｌ２  細胞死の  ＭＭＰ  阻害剤  ＧＭ６００１  による抑制を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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