(57)【要約】【課題】一般的に普及可能であり、体液中から、直接、ＴＧＦβ、免疫抑制酸性蛋白、ＰＧＥ２などの免疫抑制物質を高い効率で選択的に吸着し、かつ、健康上、安全上の問題がなく体外循環できる免疫抑制物質吸着材を提供し、ひいては癌の治療に役立てる。【解決手段】水不溶性担体にアミン残基を結合し、蒸気滅菌してなる免疫抑制物質の吸着材およびこれを充填した体外循環用カラム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体にアミン残基を固定化した免疫抑制物質吸着材であって、蒸気滅菌しても活性を失わないことを特徴とする免疫抑制物質吸着材。
【請求項２】
アミン残基が窒素原子１個当たり炭素数３以上１８以下である第４級アンモニウム基である請求項１記載の免疫抑制物質吸着材。
【請求項３】
免疫抑制物質がトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータである請求項１または２記載の免疫抑制物質吸着材。
【請求項４】
水不溶性担体がポリスルホン系重合体である請求項１〜３のいずれか記載の免疫抑制物質吸着材。
【請求項５】
水不溶性重合体がポリ（芳香族ビニル化合物）である請求項１〜３のいずれか記載の免疫抑制物質吸着材。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の免疫抑制物質吸着材を膜、繊維、粒状物またはこれらの組み立て品に成型したことを特徴とする免疫抑制物質吸着材。
【請求項７】
請求欧１〜５のいずれかに記載の免疫抑制物質吸着材を、膜、繊維、粒状物のいずれかの表面に被覆せしめたことを特徴とする免疫抑制物質吸着材。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか記載の免疫抑制物質吸着材を充填した体外循環カラム。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか記載の免疫抑制物質吸着材を充填した癌治療用体外循環カラム。
【請求項１０】
水不溶性担体にアミン残基を固定化した後、蒸気滅菌することを特徴とする免疫抑制物質吸着材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中に過剰に存在すれば免疫の大幅な低下を招き、癌の形成が促進されるＴＧＦβ、免疫抑制酸性蛋白、ＰＧＥ２などの免疫抑制物質を除去するための吸着材および体外循環カラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
医学の発達した今日でも、依然として日本人の主な死亡原因の一つが癌である。その原因は患者には手術で取りきれない癌細胞が存在するためであり、その除去のため抗癌剤治療や放射線治療が行われてきた。しかし、これらは正常細胞をも傷害するため患者の生命を維持しつつ癌細胞を完全に除去することができない。一方、最近、患者の免疫力を高めて、患者自身の白血球で癌を排除しようとする細胞療法が盛んに試みられる様になった。最も有望なものとして、患者の樹状細胞を体外で癌抗原刺激した後、患者に戻し、癌特異的キラー細胞（ＣＴＬ）を誘導して治療しようとする樹状細胞輸注療法がある。しかし、健康な動物の血液からはＣＴＬを誘導できても癌末期の担癌動物からは誘導できないことが多い。また、動物実験では好成績を得ても臨床では目に見えた効果が出ないことが殆どである。この理由として患者の血中には免疫を抑制する物質が存在するためと考えられる。
【０００３】
その免疫抑制物質の代表的なものがトランスフォーミング・グロウス・ファクター・ベータ（ＴＧＦβ）、免疫抑制酸性蛋白、プロスタグランジン−Ｅ２（ＰＧＥ２）である。この物質がＣＴＬの誘導や機能発現を阻害していると考えられる。ＴＧＦβは、健康な人の血液中にも存在する蛋白質で免疫作用を調整する重要な物質であるが、癌の進行に伴って異常に増え、癌細胞の増殖を助けていると考えられる。ＴＧＦβは単独では分子量２５０００程度の蛋白質であるが、血中では他の蛋白質と結合して１０万前後の分子量で存在するため、従来の吸着材では吸着除去が困難な物質である。従って、癌患者の血液中から異常に増えたＴＧＦβを効率よく除去できる吸着材は知られていない。また、免疫抑制酸性蛋白は分子量５万程度の蛋白質で、癌の悪性度のマーカーとして臨床で利用されているが、免疫を抑制すると言われている。活性炭カラムでの除去も試みられたが、吸着能力が不十分だったためか治療効果が明確でなかった。また、活性炭は粉が出やすいので、直接、血液と接触する用途には向かない。これら免疫抑制物質の除去には、理論上、血漿交換も有効であるが、感染の危険が避けがたいという本質的な欠点がある。
【０００４】
また、免疫抑制物質吸着材を臨床に使う時には、その表面から細菌を完全に除いておくために滅菌が必要である。滅菌としては特許文献１（特開平８ー１９６６０４号公報）に開示されているエチレンオキサイド（ＥＯＧ）滅菌および放射線滅菌が知られているが、ＥＧＯ滅菌では、残留エチレンオキサイドが有害物質として体液中に吸収される危険性があり、また、放射線滅菌も放射線の取扱い上の危険性があり、好ましくない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平８−１９６６０４号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑み、一般的に普及可能であり、体液中から、直接、ＴＧＦβ、免疫抑制酸性蛋白、ＰＧＥ２などの免疫抑制物質を高い効率で選択的に吸着し、かつ、健康上、安全上の問題がなく体外循環できる免疫抑制物質吸着材を提供し、ひいては癌の治療に役立てることを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、不溶性担体にアミン残基を固定化した免疫抑制物質吸着材であって、蒸気滅菌しても活性を失わない免疫抑制物質吸着材である。
【０００８】
また本発明は、上記の吸着材を充填した体外循環カラムである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
続いて、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１０】
本発明で用いる水不溶性担体としては、水に不溶で、アミンを固定化できるものであれば良く、特に制限はされないが、水不溶性重合体であることが好ましい。
【００１１】
水不溶性重合体の具体例としてはポリスチレンで代表されるポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリ（ｐ−フェニレンエーテルスルホン）や−｛（ｐ−Ｃ６  Ｈ４  ）−Ｃ（ＣＨ３）２−（ｐ−Ｃ６  Ｈ４  ）−Ｏ−（ｐ−Ｃ６  Ｈ４  ）−ＳＯ２  −（ｐ−Ｃ６  Ｈ４  ）−Ｏ−｝ｎ−（以下ユーデルポリスルホンと略記する）などで代表されるポリスルホン系重合体、ポリエーテルイミド、ポリイミド、ポリアミド、ポリエーテル、ポリフェニレンサルファイドなどで、かつ、アミンを固定化できるものがあげられる。アミンを固定化するための反応性官能基としては、ハロメチル基、ハロアセチル基、ハロアセトアミドメチル基、ハロゲン化アルキル基などの活性ハロゲン基、エポキサイド基、カルボキシル基、イソシアン酸基、チオイソシアン酸基、酸無水物基などをあげることができるが、とりわけ、活性ハロゲン基、中でも、ハロアセチル基は、製造が容易な上に、反応性が適度に高く、アミンの固定化反応が温和な条件で遂行できると共に、この際生じる共有結合が化学的に安定なので好ましい。さらに具体的な例としては、クロルアセトアミドメチルポリスチレン、クロルアセトアミドメチル化したユーデル・ポリスルホン、クロルアセトアミドメチル化したポリエーテルイミドなどがあげられる。さらに、これらのポリマーは有機溶媒に対し可溶であると、成型しやすい利点がある。
【００１２】
本発明で言うアミン残基とは、アンモニア、第１〜３級アミンがポリマーに化学的に結合した状態のものを意味する。本発明においては、アミン残基のもととなるアミンとしては、炭素数で言うと、窒素原子１個当たり炭素数１８以下であるものが好ましい。
【００１３】
さらに、アミンの中でも、窒素原子１個当たり炭素数３以上１８以下、とりわけ、４以上１４以下のアルキル基を持つ第３級アミンが好ましく、これらの第３級アミンから得られる第４アンモニウム基を結合した吸着材が優れている。そのような第３級アミンの具体例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルヘキシルアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチルオクチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ−エチル−ヘキシルアミンなどがあげられる。
【００１４】
本発明におけるアミン残基の結合の密度は、水不溶性重合体の化学構造および用途により異なるが、少なすぎるとその機能が発現しない傾向にあり、一方、多すぎると、固定化後の重合体の物理的強度が悪くなり、吸着材としての機能も下がる傾向にあるので、該密度は水不溶性重合体の繰り返し単位あたり０．０１〜２．０モル、より好ましくは０．１〜１．０モルが良い。密度はアニオン交換容量もしくは収量などを測定することによって算出することができる。
【００１５】
本発明の吸着材の表面積は吸着材１グラム当たり０．０１平方メートル以上であることが重要であり、より好ましくは、０．１平方メートル以上である。ただし無限に大きくはできないので、実際上、限界があり、１００平方メートル以下が好ましい。この表面積は窒素ガス吸着法（ＢＥＴ法）で求めることができる。
【００１６】
本発明の吸着材は、アミン残基を結合した水不溶性重合体を膜、繊維、粒状物またはこれらの組み立て品に成型するか、あるいはアミン残基を結合した水不溶性重合体を、膜、繊維、粒状物のいずれかの基材に被覆せしめるか、あるいは水不溶性重合体の膜、繊維等の成型品にアミンを結合させるか等により得ることができる。
【００１７】
アミン残基を結合した水不溶性担体の成型品の製造には、水不溶性重合体の成型品にアミンの溶液を接触させる不均一系反応の方法と、水不溶性重合体の溶液とアミンの溶液を混合して反応させた後、成型する均一系反応の方法とがある。
【００１８】
不均一系反応の方法の一例としては、クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンの繊維または中空糸などの成型品をジメチルヘキシルアミンやポリアルキレンイミン等のイソプロパノール溶液中に浸し、０〜１００℃の温度で反応させることにより、容易に達成される。均一系反応による方法の一例を述べると、クロルアセトアミドメチル化ポリスルホンの溶液中に対応したポリアミンを加えて、０〜１００℃の温度で反応させることにより、達成される。その量には特に制限はないが、可溶性のポリマーを得るためにはハロアセトアミドメチル基に対し１倍モル以上用いるのが望ましい。とりわけ、ポリアミンの場合は、可溶性の重合体を得るためにはアミンを大過剰用いるのが好ましい。
【００１９】
また、上記両方法における反応溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの極性の高い溶媒の方が反応が速く進む利点がある。不均一系反応では、アミンが溶ける溶媒であれば良く、特に制限はない。均一系で反応させる場合には、水不溶性担体とアミンの両方が溶解する溶媒、具体的にはテトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどが好ましく用いらる。また、成型品を表面処理する方法も可能で、そのためには水、メタノール、エタノールなどの、ポリスルホンを溶かさずに親水性アミンを溶かす溶媒が好ましく用いられる。
【００２０】
上記均一系反応により製造したアミノ残基が結合した水不溶性担体を、それ自体を成型するのではなく、ポリエステル繊維、ポリアミド繊維、ポリフェニレンサルファイド繊維などの成型品の表面に被覆すると、簡単且つ安価に表面積の大きな高次の成型品が得られる利点がある。被覆は、例えば、アミノ残基が結合した水不溶性担体を塩化メチレンやテトラヒドロフランなどの低沸点溶媒に溶かしたものにポリアミド等の編み地や織物を浸した後、溶媒を蒸発させることにより容易に達成できる。また、アミノ残基が結合した水不溶性担体をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどの溶媒に溶かしたものを水などのポリマーの貧溶媒に入れる湿式コーティング法も利用できる。被覆される成型品のポリマーはポリアミド、ポリウレタン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリフェニレンサルファイドなど、本発明吸着材ポリマーとの接着性の良いものであれば何でも良く、その種類には特に制限はないが、ポリアミド、ポリエーテルイミドなどのアミド系のポリマーが接着性が特に良いので、好ましく用いられる。また被覆する成型品、すなわち基材も、繊維や、織物、編物等の繊維の高次加工品に限らず、膜、粒状物なども好ましい。
【００２１】
上記の成型や基材への被覆において、成型品や基材の形態に採用する繊維として、中空糸を用いることも好ましい。この場合、濾過の機能を具備した吸着材が作れるので、人工透析器として、あるいは、血漿分離器として使用しながら免疫抑制物質を除去できる利点がある。
【００２２】
本発明でいう蒸気滅菌とは、水または生理食塩水を、本発明の吸着材を入れたケースに充填した状態、あるいは充填した後、吸着材を取り出し、滅菌袋に入れた状態で、オートクレーブなどの加圧密封し得る装置内で加熱滅菌する滅菌方法をいう。本発明の吸着材は蒸気滅菌してもその活性、すなわち吸着能を失うことがなく、したがって滅菌方法として蒸気滅菌を採用することが可能となった。本発明でいう「活性を失わない」とは、吸着率の低下が１０％以内であることをいう。
【００２３】
本発明の吸着材は血液中のＴＧＦβ、免疫抑制酸性蛋白、ＰＧＥ２などの免疫抑制物質の除去の目的で、カラムに詰めた状態で、癌等の病気の体外循環治療に用いられる。本発明のカラムの作製は、綿状、筒編み状もしくはフェルト状の本発明の吸着材を、空隙容積が２００ｍＬ程度以下になるようにして、適度の大きさの円筒形のカラム容器に詰めることで達成できる。また、本発明の吸着材は輸血用血液、血清、血漿からの免疫抑制物質の除去の目的にも用いることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実験例により本発明をさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞
（水不溶性担体）
３６島の海島複合繊維であって、島が更に芯鞘複合によりなるものを次の成分を用いて、紡糸速度８００ｍ／分、延伸倍率３倍の製糸条件で得た。
島の芯成分；ポリプロピレン
島の鞘成分；ポリスチレン９０％、ポリプロピレン１０％
海成分；５−ナトリウムスルホイソフタル酸を３％共重合したポリエチレンテレフタレート
複合比率；芯：鞘：海＝２７：５３：２０。
この海成分を熱苛性ソーダ水溶液で溶解し、芯鞘型のポリプロピレン補強ポリスチレン繊維として、直径４μｍの原糸１を得た。
【００２５】
（中間体）
ニトロベンゼン１５０ｍＬと硫酸９８ｍＬの混合溶液にパラホルムアルデヒド０．３９ｇを２０℃で溶解した後、０℃に冷却し、２７．２ｇのＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて、５℃以下で溶解した。これに１０ｇの上記で調製した原糸１を浸し、室温で２時間静置した。その後、繊維を取りだし、大過剰の冷メタノール中に入れ、洗浄した。繊維をメタノールで良く洗った後、乾燥して、１５．９ｇのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスチレン繊維（中間体１）を得た。
【００２６】
（アミンの固定）
Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキシルアミン５ｇとヨウ化カリウム１ｇを１００ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液に５ｇの上記中間体１を浸し、８５℃のバス中で３時間加熱した。繊維を１モル／Ｌ濃度の食塩水に浸漬した後、水洗し、メタノール洗浄し、真空乾燥して、７．７ｇのジメチルヘキシルアンモニウム化ポリスチレン繊維（吸着材ａ）を得た。この繊維の半分を生理食塩水に浸し、オートクレーブを用いて１２０℃で２０分間、蒸気滅菌することにより本発明の吸着材（吸着材Ａ）を得た。
＜実施例２＞
（アミン結合ポリマーの合成とコーティング）
ニトロベンゼン１６ｍＬと硫酸３２ｍＬの混合溶液を０℃に冷却後、４．２ｇのＮ−メチロール−α−クロルアセトアミドを加えて、溶解し、これを、１０℃のユーデルポリスルホンＰ３５００の３Ｌのニトロベンゼン溶液（３００ｇ／３Ｌ）に、良く撹拌しながら加えた。さらに、室温で３時間撹拌した。その後、反応混合物を大過剰の冷メタノール中に入れ、ポリマーを沈殿させた。沈殿をメタノールで良く洗った後、乾燥し、さらに、ジメチルホルムアミド／メタノールから再沈殿して、３０３ｇのα−クロルアセトアミドメチル化ポリスルホン（置換率：０．０５；重合体Ｃ）を得た。
【００２７】
ポリエチレンイミン（平均分子量１００００：和光純薬）６０ｇを３００ｍＬのＤＭＦに溶かした溶液と３０ｇの重合体Ｃを含む３００ｍＬのＤＭＦ溶液と混合し、室温で４８時間撹拌した。反応混合物を大過剰の飽和食塩水に加え、沈殿したポリマーをろ取した。ポリマーを水洗後、乾燥し、さらに、ジメチルホルムアミド／メタノールから再沈殿して、２６ｇのＮ−アルキル化ポリアルキレンイミン固定化ポリスルホン（重合体Ｄ）を調製した。
【００２８】
上記重合体Ｄを５ｇ含む塩化メチレン２５０ｍＬの溶液に、単糸の直径が３．５μｍのポリエチレンテレフタレート繊維の綿２０ｇを浸し、２０時間後に綿を取り出し、液を切って風乾し、２１ｇのコーティング綿（吸着材ｂ）を得た。この綿の半分を生理食塩水に浸し、オートクレーブを用いて１２０℃で２０分間、蒸気滅菌することにより本発明の吸着材（吸着材Ｂ）を得た。
【００２９】
（吸着能の評価）
１０週令のＷＫＡＨ／Ｈｋｍラット（雄）の背部皮下にＫＤＨ８細胞（北海道大学提供）２×１０６個接種して調製した担癌ラットから血液を採取し、血清６ｍＬ（ＴＧＦβの濃度：２５ｎｇ／ｍＬ）を調製した。その血清１ｍＬに吸着材５０ｍｇを入れ、３７℃で４時間振とうした。上清中のＴＧＦβ濃度を測定して、吸着率を求めたところ、吸着材Ａが８２％、吸着材ａが８３％、吸着材Ｂが２１％および吸着材ｂが２０％であった。なお、ＴＧＦβ濃度はゼンザイム・テクネ社のヒトＴＧＦβ免疫分析キットを使用して求めた。吸着率の計算は、１００×｛（吸着前の血清中のＴＧＦβ濃度）−（吸着後の血清中のＴＧＦβ濃度）｝／（吸着前の血清中のＴＧＦβ濃度）、を計算することより行った。
【００３０】
実施例１および実施例２から蒸気滅菌してもＴＧＦβ吸着率に変化がないことが分かる。実施例１と２との比較から第４級アンモニウム基が高いＴＧＦβ吸着率を示すことが分かる。また、実施例１および２は蒸気滅菌されており、健康上、安全上の問題がなく体外循環できる。
【００３１】
【表１】
2004248950.tif 000002
【００３２】
【発明の効果】
本発明により、免疫抑制物質を安全に、効率よく吸着除去することが可能となり、癌の患者の治療に有用である。