(57)【要約】【課題】ハロパーオキシダーゼ及びＨ２Ｏ２を産生する新規微生物である【解決手段】２種の菌株を提供する。これらの菌株は、ハロパーオキシダーゼを産生し、中性付近でも高い活性を有する。即ち、ハロパーオキシダーゼを産生するコプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＷＫ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７４）及びコプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＫ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７３）から成る群から選択される微生物である。ＰＡＫ−１はＨ２Ｏ２を培養液中に蓄積する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハロパーオキシダーゼを産生するコプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＷＫ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７４）及びコプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＫ−１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７３）から成る群から選択される微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物の培養液。
【請求項３】
請求項２に記載の培養液から抽出されたハロパーオキシダーゼ及び／又はＨ２Ｏ２。
【請求項４】
請求項２に記載の培養液、又は請求項３に記載のハロパーオキシダーゼにより有機基質にハロゲン元素を導入する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ハロパーオキシダーゼを産生する新規微生物、コプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＷＫ−１及びＰＡＫ−１に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界にはハロゲン元素を含む有機化合物が多数存在し、抗生物質のようにわれわれの健康にとって大変重要な物質が含まれる。これらの物質へのハロゲン元素の導入は直接的、間接的にハロパーオキシダーゼが関与していると考えられる。
ハロパーオキシダーゼはパーオキシダーゼの１種と考えられるが、Ｈ２Ｏ２とＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＩの存在下で有機基質にハロゲン元素を導入できる酵素を示す。利用可能なハライドイオンにより、ハロパーオキシダーゼはクロロパーオキシダーゼ、ブロモパーオキシダーゼ、ヨードパーオキシダーゼに分けられる。クロロパーオキシダーゼはＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＩの全てに反応し、真菌に広く見出されている。
とりわけ、Ｃａｌｄａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ  の酵素１は工業的に実用化され、詳しく調べられている（非特許文献１）。しかし、Ｃａｌｄａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏの酵素１はｐＨ３〜４の酸性で活性を示すので、反応容器の耐酸性や廃水の中和処理などを要する。また、海藻由来の酵素２は酵素１に比べてハライドイオンが限定され、菌体内酵素であるので、破砕・抽出操作を要し、精製もより複雑であり、耐熱性についても報告されていない（非特許文献２）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｍ．  Ａ．  Ｐｉｃｋａｒｄ，  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２７，  １２９８−１３０５  （１９８１）
【非特許文献２】
Ａ．  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ａｎｄ  Ｍ．  Ａ．  Ｐｉｃｋａｒｄ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３０，  ２０５１−２０５８  （１９５８）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで発明者らは、当初、カビ及びキノコに関してはＣｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．  に活性が認められたので、本坦子菌について耐熱性（生育温度１５〜４５℃）で、かつ、酵素を菌体外に生産するものを検索した。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者はタイの各地から多くの耐熱性Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．を採取し、培地中に分泌される酵素１を測定した。その中で高い活性を示す菌株ＰＡＷＫ−１及びＰＡＫ−１を得た。
これらの菌は幅広いｐＨ域で反応し、中性付近でも高い活性を有する。反応容器の腐食や廃水処理で問題が生じる酸やアルカリ使用を避けることができるため、中性付のｐＨ近で反応ができることは望ましい。一般に酵素反応は温度が高いほど速いが、使用に当たっては酵素の熱安定性が問題になるが、本発明の菌株は耐熱性酵素であるのでこれらの問題点をクリアーできる。また本菌は菌体外に酵素１を分泌するので精製が容易であり、場合によっては培養上清の利用も可能であるので、コスト削減が可能である。従って、これらの酵素は合成反応、医薬品としての利用、汚染処理、分析診断用酵素の開発等へ利用することができる。
【０００６】
即ち、本発明は、ハロパーオキシダーゼを産生するコプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＷＫ−１及びコプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＫ−１から成る群から選択される微生物である。
また、本発明は、この微生物の培養液、又はこの培養液から抽出されたハロパーオキシダーゼ及び／又はＨ２Ｏ２である。
更に、本発明は、この培養液、又はこのハロパーオキシダーゼにより有機基質にハロゲン元素を導入する方法である。この有機基質として、オレフィン、芳香族化合物、アミノ酸、不飽和結合を有する化合物等が挙げられる。
コプリナス属坦子菌（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．）ＰＡＷＫ−１とＰＡＫ−１は、平成１５年３月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７４及び受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９２７３が付与された。
【０００７】
【発明の実施の形態】
コプリナス属坦子菌ＰＡＷＫ−１及びＰＡＫ−１は形態だけで同定される。
分離源：腐朽木材や植物質およびこれらを含む土壌
形態学的特徴（子実体）：
やや淡黄色がかった白色。かさ周辺は次第にグレー味を帯びる。
かさは釣り鐘型で、幅２０〜５０ｍｍ、高さ３０〜６０ｍｍである。
枝は幅１０ｍｍ以下、高さ４０〜１２０ｍｍである。
ヒダは平行状で、白色から着色して黒色になる。
胞子紋は黒色である。
１日以内に自己消化で融ける。
【０００８】
【発明の効果】
本発明の微生物が産生するハロパーオキシダーゼは化学合成、医用酵素、汚染処理、分析診断用酵素、歯みがき、水歯みがき（マウスウォッシュ）、防腐剤などへの応用が考えられる。その際、上に記したように、耐熱性、精製の容易さ、精製コスト低減、反応ｐＨ域の広さから、従来のものに比べて優れている。また培養液中に著量の過酸化水素の生産が認められるので、それを漂白や殺菌に用いることが可能である。
ハロパーオキシダーゼは酸化反応、特に立体特異性の高いエポキサイドの合成反応その他に利用されていて、最も有名な例がＣｅｔｕｓ  社のＣａｌｄａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｆｕｍａｇｏ由来のクロロパーオキシダーゼ（ＣＰＯ）によるエチレンオキシドの生産である。ハロパーオキシダーゼはハロゲン元素が存在しない条件ではパーオキシダーゼ活性を示し、両者は本質的には同様の酵素である。しかし、パーオキシダーゼはハロパーオキシダーゼ活性を必ずしも有していない。
【０００９】
従って、想定される用途としてはハロゲン化反応及び酸化能の高い化学反応触媒としての使用が考えられる。至適ｐＨは低いが、ｐＨ安定性と温度安定性に優れているので、取り扱いが容易である。一方、パーオキシダーゼ（ＰＯ）は医療用定量試薬キット、ｅｌｉｓａ  測定キットなどへの幅広い応用が考えられる。最もよく使われるｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  由来のＰＯはｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  の資源としての限界や酵素の耐熱性限界、測定感度などから、より安定で反応性の高い、検出感度の高いＰＯの開発が試みられている。Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｓｐ．  由来のＰＯは既に知られているが、ＰＡＷＫ−１株の酵素はハロパーオキシダーゼ活性と同時に室温での長期保存性に優れているのが特徴である。酵素が一般的に熱安定性に欠けるため、酵素を用いる測定キットは冷蔵庫で保存することが求められる。しかし、冷蔵庫使用が不可能だったり、省エネルギーの観点から室温で放置しても酵素活性が安定な酵素の開発が求められる。ＰＡＷＫ−１株の生産する酵素は室温保存が可能なので、工業的利用や汎用キットの組成としての利用が考えられる。また、ｐＨ安定性が高いので幅広い応用が期待できる。
【００１０】
Ｈ２Ｏ２は上記の酵素やカタラーゼ等の基質であり、これらの酵素反応を利用した酵素漂白はよく知られている。しかし、Ｈ２Ｏ２の取り扱いや酵素の保存性とコストを考えると、必ずしもベストの方法ではない。ＰＡＫ−１株はＨ２Ｏ２を蓄積すると同時にパーオキシダーゼ活性を有するので培養液そのものが利用できる。Ｈ２Ｏ２自体にも酸化漂白能が期待できるが、このような生物システムは化学漂白剤に比べて、原材料の損傷を防ぎ風合いのよい仕上がりが期待できるので、高級繊維素材の漂白や、脱色効果を利用した模様づけや表面処理などが考えられる。本菌株の培養は静置培養が適し、一旦生成された酵素や過酸化水素は安定なので、培養液毎静かに容器に入れてそれに素材を潜らせる方法を採用すれば一定期間の繰り返し使用が可能と考えられる。
一方、過酸化水素単独あるいはＦｅ２＋やＣｕ＋と組み合わせたフェントン反応で色素類の脱色処理や分解処理が可能であるので、繊維工場の製造工程等で培養液を使用した後、これを用いて廃水処理をすることも可能である。
【００１１】
【実施例】
本発明のコプリナス属坦子菌ＰＡＷＫ−１及びＰＡＫ−１は、タイの腐朽木材、木の葉、稲わらやそれらを含む土壌から分離されたが、同属の菌によるパーオキシダーゼの生産は知られているが（Ａ．Ｔｕｙｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７５，３０２５−３０３０，２０００；Ｙ．Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０３，６９３−６９９（１９８８））、ＰＡＷＫ−１株のようなハロパーオキシダーゼの生産に関する報告はなかった。また、ＰＡＫ−１は培養液中にＨ２Ｏ２を蓄積するが、これに関する報告はなかった。
【００１２】
本発明の微生物は、タイ国内腐朽木質素材又はこれらを含む土壌から下記の方法により単離した。
１）１次スクリーニング：
ポテト−デキストロース−寒天培地に各地から採取したキノコ類の子実体を滅菌ナイフで裁断した切片を無菌的に接種する。雑菌に汚染されていないことを確認して、生育が１５〜４５℃で可能な耐熱菌かどうかを確認した。これを液体培地（ポテト−デキストロース液体培地）に接種して液体培地で３０〜３５℃でロータリシェーカー上で生育させた上澄み液を適宜とり、これを酵素源として酵素活性を測定した。
指標として下記に記す方法でクロロパーオキシダーゼ、パーオキシダーゼ活性を測定した。キノコの同定は子実体の形態などに基づいて行った。
２）２次スクリーニング：
培養条件は１次スクリーニングに準ずる。１次スクリーニングでハロパーオキシダーゼ活性＋と思われるものを選んで、その中から選択した。
【００１３】
ポテト−デキストロース−寒天培地：市販品のＮｉｓｓｕｉ  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．０５７０９を使用した。純水１Ｌあたりの組成はほぼ以下のようである。
Ｐｏｔａｔｏ  ｅｘｔｒａｃｔ            ４ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ                        ２０ｇ
Ａｇａｒ                              １５ｇ      ｐＨ  ６．０
ポテト−デキストロース液体培地：市販品のＤｉｆｃｏ  ２５４９２０  を使用した。純水１Ｌ当たりの組成はほぼ以下のようである。
Ｐｏｔａｔｏ  ｅｘｔｒａｃｔ            ４ｇ
Ｇｌｕｃｏｓｅ                        ２０ｇ
ｐＨ  ５．１
グルコース−麦芽エキス培地
Ｍａｌｔ  ｅｘｔｒａｃｔ                １％
Ｇｌｕｃｏｓｅ                          ３％
Ａｒｇｉｎｉｎｅ                      ０．４％
ＮａＮＯ３                            ０．２％
ＫＣｌ                                ０．２％
ＫＨ２ＰＯ４                          ０．２％
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ                  ０．１％
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ                  ０．００２％
【００１４】
ハロパーオキシダーゼ活性の測定：
ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ５．０）      １００μｍｏｌｅｓ
ＫＣｌ                                                            ２０μｍｏｌｅｓ
Ｈ２Ｏ２                                                            ２０μｍｏｌｅｓ
Ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｄｉｍｅｄｏｎｅ                            ０．１μｍｏｌｅｓ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ                            ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ    ｉｎ  ３ｍｌ
酵素活性はＨ２Ｏ２の添加で開始し２７８ｎｍの吸光度変化で測定し、３０℃で１分間に１μｍｏｌｅのｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｄｉｍｅｄｏｎｅ  を変化させる酵素量とした（ε＝１．２２ｘ１０４ｍ−１ｃｍ−１）（Ｈｅｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｇｅｒ，  １９８０）．
Ｒｅｆ．：  Ｈｅｗｓｏｎ，Ｗ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈａｇｅｒ，Ｌ．Ｐ．（１９８０）Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．  １６，３４０−３４５
【００１５】
パーオキシダーゼ活性の測定：
ｐｈｅｎｏｌ                                                      １５μｍｏｌｅｓ
４−ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ                                ２．５μｍｏｌｅｓ
Ｈ２Ｏ２                                                              ５μｍｏｌｅｓ
Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ７．０）  １００μｍｏｌｅｓ
Ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ                              ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ    ｉｎ  ３ｍｌ
上記組成の反応液で３０℃で反応させた時、１分間に１μｍｏｌｅのフェノールを酸化する酵素量を１  ｕｎｉｔとした。この単位は国際単位でもある。反応は酵素添加でスタートさせ、発生する色素を５００ｎｍの吸光度変化で測定した。
【００１６】
Ｈ２Ｏ２の測定：
上記反応組成にｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  の代わりに市販のｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  由来のｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ３  ｕｎｉｔｓ  を加えて、培養ろ液を加えた時に生じる５００ｎｍの吸光度の変化を測定した。これをＨ２Ｏ２の添加量を変えて求めた標準直線からＨ２Ｏ２量に換算した発生量を求めた。
【００１７】
タンパク質測定：
市販のバイオラッド測定試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）を用いて、牛血清アルブミンで測定した標準値から求めた。
【００１８】
以上の結果を以下に示す。
１）ハロパーオキシダーゼ活性を有する菌株の選定
合計約７属１０種にわたる約５０株のキノコを採集した。これらを３０〜３２℃で、ロータリーシェーカー上で震盪培養した時に培養液中に生産される酵素活性を測定した。特にＣｏｐｒｉｎｕｓ  属に属する分離菌株で酵素生産が認められたので、２次スクリーニングとして本坦子菌を主に採集し約２０株を採集して、各株の酵素生産能を比較した。殆どの菌株はパーオキシダーゼを生産する。また、クロロパーオキシダーゼの生産はパーオキシダーゼに比べると、限定される（２０％以下）。特に３菌株で活性が認められたので、これらを比較して最も生産性が高いと思われるＰＡＷＫ−１株を選択した。
さらに、これらの酵素活性の測定過程で、Ｈ２Ｏ２の有無に関係なく、活性が出現した菌株ＰＡＫ−１を見出し、培養液中に著量のＨ２Ｏ２を蓄積していることを確認した。本菌もハロパーオキシダーゼを生産するが、ＰＡＷＫ−１株に比べると１０分の１以下である。
【００１９】
２）ハロパーオキシダーゼの特徴とパーオキシダーゼ活性
酵素の生産は上記グルコース−麦芽エキストラクト培地で１３〜１６日で、最大活性約２００ｍＵ／ｍｌに達し、約１週間活性は持続した。アルギニン濃度を０．４％にした時、１６日で最大活性約４００ｍＵ／ｍｌが得られた。
至適ｐＨは約４．０であるが、ｐＨ３．０〜５．０で５０％以上の活性が認められた（図１）。
また、酵素活性は３０℃、３０分処理で、ｐＨ４．０〜１１．０にわたる広い領域で安定であった（図２）。
さらに、温度安定性に関しては、５分処理では６０℃でも６０％の残存活性が得られた（図３）。このように本酵素は広範囲のｐＨに安定で、耐熱性も高い。
さらに培養ろ液を０〜２５℃で保存した時よりも、３０〜３５℃で３０分保存した方が酵素活性は常に高い価が得られた（図４）。
【００２０】
震盪培養条件で約１週間にわたってほぼ最大活性が保持されたことから、培養液中に分泌される酵素は酸素及び室温保存に安定であると考えられる。
ハロパーオキシダーゼはパーオキシダーゼとして用いることが可能である。培養ろ液のパーオキシダーゼ活性はハロパーオキシダーゼとほぼ同じ至適ｐＨ及び安定性（ｐＨ、温度）を示し、３５℃保存で活性は長期間（〜３ヶ月）安定であった。
ＫＣｌの他、ＫＢｒ、ＫＩの存在下でも活性があり、ハロゲン元素に対する選択性は広い。
【００２１】
３）Ｈ２Ｏ２蓄積量
ＰＡＫ−１株のポテト−デキストロース液体培地に蓄積される過酸化水素を測定した結果、１０μｍｏｌｅｓ／ｍｌ以上の過酸化水素の蓄積が認められた（図５）。
【図面の簡単な説明】
【図１】コプリナス属坦子菌ＰＡＷＫ−１の粗酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図２】コプリナス属坦子菌ＰＡＷＫ−１の粗酵素標品中のクロロパーオキシダーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３】コプリナス属坦子菌ＰＡＷＫ−１の粗酵素標品中のクロロパーオキシダーゼの熱安定性を示す図である。
【図４】コプリナス属坦子菌ＰＡＷＫ−１の粗酵素標品中のクロロパーオキシダーゼの温度安定性と活性化を示す図である。
【図５】コプリナス属坦子菌ＰＡＫ−１の過酸化水素の蓄積量と培養時間の関係を示す図である。
【図１】
2004305013.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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