(57)【要約】【課題】高感度核酸固定化担体作製のための新規な核酸固定化用担体、核酸を固定化した担体、核酸を固定化した該担体の製造方法、核酸を固定化した該担体を用いる核酸の検出方法、および核酸の検出のための核酸を固定化した担体の洗浄方法を提供すること。【解決手段】高感度核酸固定化担体作製のための新規な核酸固定化用担体、核酸を固定化した担体、核酸を固定化した該担体の製造方法、核酸を固定化した該担体を用いる核酸の検出方法、および核酸の検出のための核酸を固定化した担体の洗浄方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を固定化するための担体であって、担体の表面にポリアニオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎ）を有しており、ポリアニオンによるコーティングの後にアルカリ処理を行って作成されることを特徴とする核酸固定化用担体。
【請求項２】
ポリアニオンが、ポリアクリル酸である請求項１記載の核酸固定化用担体。
【請求項３】
担体が、非多孔性担体である請求項１または２記載の核酸固定化用担体。
【請求項４】
非多孔性担体が、ガラスである請求項３記載の核酸固定化用担体。
【請求項５】
アルカリ処理が、水酸化ナトリウムを含有するアルカリ溶液によって実施されている請求項１〜４いずれか記載の核酸固定化用担体。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか記載の核酸固定化用担体の表面のポリアニオンが活性エステル誘導体に活性化されてなる核酸固定化用担体。
【請求項７】
核酸が固定化された担体であって、請求項１〜６いずれか記載の核酸固定化用担体上のあらかじめ定められた位置に核酸が固定化されてなる担体。
【請求項８】
核酸が共有結合を介して担体に結合されている請求項７記載の核酸が固定化された担体。
【請求項９】
核酸の担体への固定化方法であって、ポリアニオンで表面処理し、次いでアルカリ処理を施した後にポリアニオンを活性エステル誘導体とした担体を、核酸溶液と接触させる工程を有することを特徴とする核酸の担体への固定化方法。
【請求項１０】
ポリアニオンが、ポリアクリル酸である請求項９記載の核酸の担体への固定化方法。
【請求項１１】
担体が、非多孔性担体である請求項９または１０記載の核酸の担体への固定化方法。
【請求項１２】
非多孔性担体が、ガラスである請求項１１記載の核酸の担体への固定化方法。
【請求項１３】
核酸が、活性化エステル誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸である請求項９〜１２いずれか記載の核酸の担体への固定化工程。
【請求項１４】
官能基がアミノ基である請求項１３記載の核酸の担体への固定化方法
【請求項１５】
必要に応じてブロッキング工程を行う請求項９〜１４いずれか記載の核酸の担体への固定化方法。
【請求項１６】
アルカリ処理が、水酸化ナトリウムを含有するアルカリ溶液によって実施される請求項９〜１５いずれか記載の核酸の担体への固定化方法。
【請求項１７】
下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法。
（ａ）請求項１〜５いずれか記載の核酸固定化用担体のポリアニオンを活性エステル誘導体とする工程、
（ｂ）上記活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｃ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【請求項１８】
工程（ｂ）の後に、必要に応じてブロッキング工程を行う請求項１７記載の核酸の検出方法。
【請求項１９】
下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法。
（ａ）請求項６記載の核酸固定化用担体の活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｂ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【請求項２０】
工程（ａ）の後に、必要に応じてブロッキング工程を行う請求項１９記載の核酸の検出方法。
【請求項２１】
下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法。
（ａ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた担体をテトラメチルアンモニウムクロライドを含有する洗浄液で洗浄する工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡチップ等の核酸が固定化された担体の作製に有用な、核酸固定化用担体に関する。また、本発明は、該担体への核酸の固定化方法、核酸が固定化された担体、及び当該担体を使用する被検体中の核酸の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム解析技術の進展により、各種生物ゲノムの構造が解明されつつある。これと並行して、ゲノムの機能解析のための技術開発がすすめられており、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）はその中で最も注目されている技術である。ＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体表面に多数の異なる遺伝子あるいはその断片（ＤＮＡ断片）を整列させて固定化したマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の解析を飛躍的に加速させる技術として、非常に有用である。
【０００３】
ＤＮＡの担体への固定化は、ＤＮＡチップを作製するための基本技術であり、大きく分けて２通りの方法が知られている。一つは、担体上に共有結合したリンカーの先端でＤＮＡを化学合成する方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５１巻、７６７―７７３頁（１９９１）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、１６７９―１６８４（１９９２）に記載されている。この方法で固定化できるＤＮＡはオリゴヌクレオチドに限られており、また、反応を制御するための特殊な装置を必要とし、必ずしも一般的ではない。
【０００４】
もう一つの方法は、予め合成されたＤＮＡやＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で調製されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を担体に共有結合あるいは非共有結合させる方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、４６７―４７０頁（１９９５）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２２巻、５４５６―５４６５（１９９４）に記載されている。
非共有結合による固定化方法としては、例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）等の塩溶液に溶解したＤＮＡをそのままあるいは変性処理した後、ポリリジンやポリエチレンイミン等の塩基性ポリ陽イオン、あるいはアミノ基を有する塩基性シランカップリング剤等でコートしたスライドガラス（担体）にスポットし、ＵＶ照射により固定化する方法が知られている。この方法によれば、どのようなＤＮＡも固定化することができるはずである。
しかしながら、この方法では、オリゴヌクレオチドや０．３ｋｂ以下の短鎖ＤＮＡは固定化されにくい。また、長鎖ＤＮＡを非共有結合で担体に固定化する場合においても、洗浄や標的核酸とのハイブリダイゼーションの工程で固定化したＤＮＡが剥離し易く、標的核酸の検出感度を低下させる要因となる。
さらには、担体表面に残存する塩基性官能基（陽イオン）と標的核酸との非特異的な結合により、バックグラウンドが高くなり易いという欠点がある。
【０００５】
一方、共有結合による固定化方法では、オリゴヌクレオチドを含むいずれのＤＮＡも固定化することができるが、一般的には、官能基としてアミノ基等の陽イオン基を有する担体を使用するので、前述の如くバックグラウンドが高くなり、検出感度が低下するという欠点があった。
残存するアミノ基をアセチル化等によりブロッキングする方法が知られているが、必ずしも十分な効果を発揮していない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
核酸としては短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の種々の形態があり、各々の形状の核酸の固定化に適し、高感度で目的の核酸の検出に使用することができる核酸固定化担体の開発が求められている。
本発明の主な目的は、（１）高感度核酸固定化担体作製のための新規な核酸固定化用担体、（２）核酸を固定化した担体、（３）核酸を固定化した該担体の製造方法、（４）核酸を固定化した該担体を用いる核酸の検出方法、および（５）核酸の検出のための核酸を固定化した担体の洗浄方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、オリゴヌクレオチドを含む全ての核酸に適用でき、目的の核酸の高感度検出を可能にする核酸の固定化方法について研究した結果、ポリアニオン（ｐｏｌｙａｎｉｏｎ）で表面処理し、さらにアルカリ処理を施した担体に核酸を固定化することで、その目的を達成できることを見出し、本発明に到達した。
また、目的の核酸の検出において、より高感度な検出を可能とする核酸固定化担体の洗浄方法を開発し、本発明を完成させた。
【０００８】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は核酸を固定化するための担体であって、担体の表面にポリアニオンを有し、ポリアニオンによるコーティングの後にアルカリ処理を行って作成されることを特徴とする核酸固定化用担体に関する。
本発明の第１の発明の好ましい態様においてポリアニオンはポリアクリル酸である。また、担体としては非多孔性担体が好適であり、当該非多孔性担体としては特にガラスが好適である。
【０００９】
本発明の第２の発明は核酸を固定化するための担体であって、第一の発明の担体の表面に存在するポリアニオンが活性エステル誘導体に活性化されてなる核酸固定化用担体に関する。
【００１０】
本発明の第３の発明は核酸が固定化された担体であって、核酸が第１または第２の発明の核酸固定化用担体上のあらかじめ定められた位置に固定化されてなる担体に関する。
本発明の第３の発明の好ましい態様において、ポリアニオンはポリアクリル酸である。また、担体としては非多孔性担体が好適であり、当該非多孔性担体としては特にガラスが好適である。
【００１１】
本発明の第４の発明は核酸の担体への固定化方法であって、ポリアニオンで表面処理し、次いでアルカリ処理を施した後に当該ポリアニオンを活性エステル誘導体とした担体を、核酸溶液と接触させる工程を有することを特徴とする核酸の担体への固定化方法に関する。
本発明の第４の発明の好ましい態様において、ポリアニオンはポリアクリル酸であり、担体は非多孔性担体であり、当該非多孔性担体としてはガラスが好適である。
本発明の第４の発明の好ましい態様において、核酸は活性化エステル誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸であり、当該官能基としてはアミノ基が好適である。
本発明の第４の発明において、ブロッキング工程は必要に応じて行えばよい。
【００１２】
本発明の第５の発明は下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する。
（ａ）本発明の第１の発明の核酸固定化用担体のポリアニオンを活性エステル誘導体とする工程、
（ｂ）上記活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｃ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
本発明の第５の発明において、ブロッキング工程は必要に応じてを行えばよい。
【００１３】
本発明の第６の発明は下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する。
（ａ）本発明の第２の発明の核酸固定化用担体の活性エステル誘導体と、当該誘導体と反応性を有する官能基で修飾された核酸とを反応させる工程、
（ｂ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
本発明において、ブロッキング工程は必要に応じて行えばよい。
【００１４】
本発明の第７の発明は下記工程を包含することを特徴とする被検体中の核酸の検出方法に関する。
（ａ）担体に固定化された核酸と、当該核酸に相補的な被検体中の核酸をハイブリダイズさせる工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた担体をテトラメチルアンモニウムクロライドを含有する洗浄液で洗浄する工程、及び
（ｄ）ハイブリダイズした核酸を検出する工程。
【００１５】
本発明においてポリアニオンとは酸性官能基を２以上有する化合物であり、核酸を結合させるために使用できるものであれば限定はない。
本発明において核酸とは核酸の検出に使用できるものであれば限定はなく、短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が例示される。
なお短鎖核酸とは核酸数２〜１００の核酸、長鎖核酸とは核酸数１００超の核酸と定義する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明における核酸を固定化する担体は、ＤＮＡチップやバイオセンサー等の担体として使用出来るものであれば特に限定はないが、好ましくは、非多孔性で、表面がなめらかな構造を有する材質、例えば、スライドガラス等のガラスが好適に使用出来る。
【００１７】
また、担体は、予め後述の陰イオン官能基を有する化合物を保持するような表面処理を行うが、これらの官能基は担体自体の表面特性として存在していても良い。また、シランカップリング剤等で処理した担体であっても、該表面処理に不都合が無い限り使用することが出来る。
【００１８】
担体の表面処理に使用するポリアニオンとしては、核酸との非特異的結合を妨げる効果のある、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基等の酸性官能基を有するポリマー、例えば、ポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリン酸等が好適に用いられる。
担体を表面処理するには、一般的なコーティング方法を用いることが出来、例えば担体をこれらのポリアニオンの溶液に浸せきした後、洗浄、乾燥すればよい。
【００１９】
上記の、ポリアニオンでコーティングされた担体は、次いでアルカリ処理に付される。該工程により、検出感度および／または核酸の判別能力に優れた核酸固定化物を作成するための核酸固定化用担体が得られる。
上記アルカリ処理に使用されるアルカリ溶液としては、特に限定するものではないが、アルカリ性水溶液が使用され、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液が例示される。上記のアルカリ水溶液は０．０５〜１Ｍの範囲の濃度で使用することができ、好適には０．１〜０．５Ｍの範囲で使用される。処理の方法にも特に限定はなく、例えば、ポリアニオンでコートされた担体を上記の溶液に浸せきした後、洗浄、乾燥することにより実施される。
これらの表面処理した担体にＤＮＡを固定化するためには、好ましくは、酸性官能基を常法により予め活性化しておく必要がある。例えば、カルボキシル基であればＮ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＮＨＳエステル）、リン酸基であればイミダゾールエステル等の活性化エステル誘導体として使用することができる。表面処理した担体は、さらに官能基を介してスぺーサーや架橋剤を付加してもよい。この場合、それらの核酸に結合する末端は活性化された酸性官能基を有するものとする。
【００２０】
固定化する核酸としては、特に限定はなく、合成オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらの誘導体のいずれも使用することができる。これらの核酸は一本鎖、二本鎖のいずれであってもよい。該誘導体としては、担体表面への固定化を可能にする修飾であれば特に制限はないが、例えば、ＤＮＡの５’末端がアミノ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基等で修飾された誘導体を例示することができる。また、修飾した５’末端に架橋剤や、スぺーサーとしてのリンカー、例えばアルキルアミン等を付加した誘導体も使用することが出来る。本発明においては、５’末端の修飾はオリゴヌクレオチドのような短鎖ＤＮＡの固定化に特に有効である。
【００２１】
例えば前記ＤＮＡを、０．０１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、固定化に好適な溶液、例えば、アミノ基で修飾されたＤＮＡであれば、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３―モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）、あるいは５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、そのままあるいは変性処理した後、表面処理して酸性官能基を活性化した前記担体と接触させることにより、所望のＤＮＡを担体に固定化することができる。すなわち、前記ＤＮＡ溶液をマイクロピペットやＤＮＡチップ作製装置（アレイヤー）等を用いて、前記表面処理して活性化された酸性官能基を有する担体上のあらかじめ定められた位置に一定量ずつスポットする。ついで、保湿器中に３０〜６０分保持した後、０．１〜０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、蒸留水の順で洗浄する。さらに、必要とあればＤＮＡを固定化した担体を室温で０．３Ｎ  ＮａＯＨに５分間、あるいは沸騰水中に２分間浸せきしてＤＮＡを変性させ、蒸留水、無水エタノールの順で洗浄、乾燥させる。この段階で担体表面の固定化反応（共有結合）に関与しなかった未反応の活性化された酸性官能基は、遊離の酸性基に加水分解される。これらの酸性基は、標的核酸と担体との非特異的な結合を妨げるので、一般的にはブロッキング操作が不要で、しかもハイブリダイゼーションにおけるバックグラウンドを低下させる効果がある。しかしながらバックグラウンドを更に低下させるためのブロッキング処理を行っても良い。
【００２２】
このようにして担体に固定化された核酸量、例えばＤＮＡ量は、蛍光標識したＤＮＡを用いて固定化操作を行い、残存する蛍光シグナルを蛍光スキャナー等で測定することにより求めることができる。本発明の固定化方法は、固定化効率が高く、固定化された核酸、例えばＤＮＡはハイブリダイゼーションの条件下で剥離することはないので、高性能ＤＮＡチップとして、遺伝子の発現、変異、多型性等の高感度測定に利用することが出来る。
【００２３】
本発明の核酸を固定化した担体（例えばＤＮＡチップ）による標的核酸の検出には、一般的なハイブリダイゼーション方法が用いられる。例えば、担体がスライドガラスであれば、蛍光標識した標的核酸を、アルカリ、または熱変性した後、ハイブリダイゼーション溶液に加え、その５〜２０μｌをアレイ表面に滴下し、その上に空気がはいらないようにカバーガラスをのせ、周囲をシールする。これを恒温恒湿器に入れ、適当な温度で適当な時間保持した後カバーガラスをはずし、スライドをストリンジェントな条件で洗浄し、水滴を除いてアレイ用蛍光スキャナー等で蛍光シグナルを検出する。
【００２４】
本発明により提供される核酸を固定化するための担体はポリアニオンの３次構造により、核酸の固定化量が多く、当該核酸はハイブリダイズ可能な形で担体に固定化されており、効率よく核酸を固定化した担体を製造することができる。また核酸が結合していない未反応のポリアニオンの活性エステル誘導体は加水分解によりポリアニオンになり、負荷電の核酸の非特異的吸着を阻止するため、本発明の核酸が固定化された担体は、極めてバックグランドの低い高感度核酸検出用担体として使用することができる。
【００２５】
さらに、本発明は担体に固定化された核酸より、これに非特異的にハイブリダイズした核酸を効果的に除去する方法を提供する。
本発明の洗浄方法は、テトラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）を含有する洗浄液を使用することを特徴とする。洗浄液の組成には限定はなく、非特異的な核酸のハイブリダイゼーションを妨げうる濃度のＴＭＡＣが含有されていればよい。使用される核酸の鎖長やＧＣ含量にもよるが、通常、０．５〜４ＭのＴＭＡＣを含有するものが使用される。この他、ｐＨを適正な範囲に保つ緩衝成分やＥＤＴＡ等を含むものであってもよい。洗浄の条件にも特に限定はなく、通常、ハイブリダイゼーションに使用される条件が使用できる。例えば、室温〜６５℃で５分〜２４時間の処理が行われる。使用される核酸やその目的に応じて、所望の結果が得られるように洗浄液の組成、洗浄条件が設定されるのは当然のことである。
【００２６】
本発明の洗浄方法は、非多孔性の担体に固定化された核酸のハイブリダイゼーションやオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにおいて特に有効である。本発明の洗浄方法により、非特異的なハイブリダイゼーションに起因するバックグラウンドが低減された、ＳＮ比の高い解析結果を得ることができる。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
（１）顕微鏡用スライドガラスを、２Ｍ硝酸、２Ｍ水酸化ナトリウム、純水、およびアセトン中で、それぞれ１０分間ずつ超音波処理することにより洗浄した。終濃度４％となるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノールに溶解し、先に洗浄したスライドガラスをこの溶液に２分間浸した後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。次に、５ｍｇ／ｍｌとなるようにポリアクリル酸をジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、４．０ｇ／１００ｍｌとなるように１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］―３―エチルカルボジイミド塩酸塩｛１−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ｝（以下ＥＤＣと略す）を加えた。上記スライドガラスをこの溶液に一晩浸し、ジメチルホルムアミド、メタノール、純水、およびアセトンでリンス後、減圧下で乾燥した。このスライドグラスをアルカリ（−）グラスとして以下の実験に使用した。
【００２９】
（２）上記（１）と同様にＥＤＣ溶液に浸せきまでの処理を行ったスライドグラスをジメチルホルムアミド、メタノールでリンスした。このスライドグラスを０．３Ｍ水酸化ナトリウムに２分間浸し、純水、およびアセトンでリンス後、減圧下で乾燥した。このスライドグラスをアルカリ（＋）グラスとして以下の実験に使用した。
【００３０】
（３）１．８ｇのペンタフルオロフェノール、２．０ｇのＥＤＣ、および１３ｍｇのジメチルアミノピリジンを５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。上記（１）、（２）で作製された２種のスライドグラスを、この溶液に浸し室温で５時間処理した後、ジメチルホルムアミドおよび塩化メチレンでリンス後、減圧下で乾燥し、デシケーター中で保存した。
【００３１】
実施例２
（１）５’末端にアルキレン鎖が６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）を結合させた２４塩基もしくは２５塩基長の２０種のオリゴヌクレオチドプローブ、ＮＨ２−１１〜ＮＨ２−１５、ＮＨ２−２１〜ＮＨ２−２５、ＮＨ２−３１〜ＮＨ２−３５、ＮＨ２−４１〜ＮＨ２−４５をそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。これらのプローブの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号１〜２０に示す。
【００３２】
上記のプローブを２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に、１００μＭの濃度となるようにそれぞれ溶解し、実施例１記載のアルカリ（−）グラス、アルカリ（＋）グラスのそれぞれにスポット後、３７℃、湿度９０％の恒温恒湿器（アイラＫＣＬ１０００型）中に３０分間保持した。次いで室温の０．２％ＳＤＳに５分間浸潤させて余分な塩等を洗浄し、次いで蒸留水で十分洗浄した。
固定化処理後のスライドグラスは以下に示す操作でブロッキング処理に付した。すなわち、１．５ｇの無水コハク酸を８９．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解後、９ｍｌの１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ８．０）を混和し、ブロッキング溶液を調製した。すぐさま、上記のスライドガラスをブロッキング溶液に浸し、室温で２０分間ブロッキング処理した。このように処理したスライドガラスを、蒸留水で十分洗浄した後、沸騰水浴中で３分間煮沸し、次いで氷浴上の冷エタノールにさらした。このスライドグラスを低速遠心分離に付してエタノールを除去後、風乾し、デシケーター中に保存した。
【００３３】
（２）標識オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
配列番号２１に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３を結合させたオリゴヌクレオチドであるＣｙ３−Ｐ１オリゴ、ならびに配列番号２２に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３を結合させたオリゴヌクレオチドであるＣｙ３−Ｐ２オリゴをＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００３４】
実施例２−（１）で作製した２種のプローブ固定化スライドグラスに、Ｃｙ３−Ｐ１オリゴとＣｙ３−Ｐ２オリゴの混合液を添加してハイブリダイゼーションを行い、そのシグナルを観察した。すなわち、１μＭのＣｙ３−Ｐ１オリゴおよびＣｙ３−Ｐ２オリゴ、０．２％ＳＤＳ、および４×ＳＳＣからなるハイブリダイゼーション溶液約１０μｌを上記のプローブ固定化スライドグラスのプローブが固定されている領域にそれぞれ滴下し、泡が入らないようにカバーグラスで覆った後、保湿箱に入れて３７℃で２時間保温した。室温の５×ＳＳＣ中でカバーグラスを外し、４℃の５×ＳＳＣ中で３０分間の洗浄を２回行い、３Ｍ  テトラメチルアンモニウムクロライド、５０ｍＭ  トリス塩酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＳＤＳ（ｐＨ８．０）からなる洗浄液に５５℃で１６時間保温した。室温の２×ＳＳＣ中で５分間洗浄し、室温の０．２×ＳＳＣ中で５分間洗浄し、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。ハイブリダイゼーション後のプローブ固定化スライドグラスをアフィメトリックス４１８アレイスキャナー（アフィメトリックス社製）を用いて、励起波長：５３２ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍで測定し、得られたシグナルの強度を画像解析ソフトＩｍａＧｅｎｅを用いて解析した。その結果を表１にまとめて示した。
【００３５】
表１中、ＮＨ２−１１〜ＮＨ２−１５、ＮＨ２−２１〜ＮＨ２−２５、ＮＨ２−３１〜ＮＨ２−３５、ＮＨ２−４１〜ＮＨ２−４５の中でＣｙ３−Ｐ１オリゴと完全に相補性があるのは、それぞれＮＨ２−１１、ＮＨ２―２１、およびＮＨ２−３４で、またＣｙ３−Ｐ２オリゴと完全に相補性があるのは、ＮＨ２−４２であり、他のプローブはそれぞれ１塩基のミスマッチを持っている。また、表中のシグナル強度は上記の解析ソフトでのシグナル読み取り値を、シグナル比は上記ミスマッチを有するプローブでのシグナル読み取り値の平均値に対する、完全な相補性を有するプローブでのシグナル読み取り値の比をそれぞれ表している。
【００３６】
【表１】
2004248503.tif 000002
【００３７】
表１から明らかなように、アルカリ（＋）グラスを用いた場合には、アルカリ（−）グラスに比べて全般的に高いシグナルを示した。また、完全に相補性があるプローブのシグナルと、他のプローブのシグナルとの差は、アルカリ（＋）グラスの方が大きい。このことから、１塩基置換の検出において、アルカリ処理を行ったポリアクリル酸コートスライドグラスの使用が有効であることが示された。
【００３８】
実施例３
（１）５’末端にアルキレン鎖が６のアルキルアミノリンカー（ＰＥバイオシステムズ社製）を結合させた２４塩基もしくは２５塩基長の４０種のオリゴヌクレオチドプローブ、ＮＨ−Ａ−１〜ＮＨ−Ａ−５、ＮＨ−Ｂ−１〜ＮＨ−Ｂ−５、ＮＨ−Ｃ−１〜ＮＨ−Ｃ−５、ＮＨ−Ｄ−１〜ＮＨ−Ｄ−５、ＮＨ−Ｅ−１〜ＮＨ−Ｅ−５、ＮＨ−Ｆ−１〜ＮＨ−Ｆ−５、ＮＨ−Ｇ−１〜ＮＨ−Ｇ−５、ＮＨ−Ｈ−１〜ＮＨ−Ｈ−５（以下、ＮＨ−ＦＸオリゴと称す）をそれぞれＤＮＡ合成機を用いて合成した。これらのプローブの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号２３〜６２に示す。これらのプローブをそれぞれ１ｍＭの濃度となるように５０ｍＭ  炭酸緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ナカライテスク社製）および５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク社製）の溶液を混合してｐＨ９．５に調製）に溶解した。さらに、配列番号６３に示した配列を有し、５’末端にＣｙ３を結合させたオリゴヌクレオチド（以下、Ｃｙ３−ＲＸオリゴと称す）をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
【００３９】
（２）アミノアルキルシラン処理した市販スライドガラス（Ｓｉｌａｎｅ−Ｐｒｅｐ  Ｓｌｉｄｅｓ、シグマ社製）を２．５％  グルタルアルデヒド水溶液に１時間浸積した後、蒸留水で３回洗浄し、風乾させた。ＮＨ−ＦＸオリゴをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤー（アフィメトリックス社製）を用いて、このグルタルアルデヒド処理スライドにスポットした。スポット後のスライドガラスは、室温の０．２％ＳＤＳで２分間洗浄後、蒸留水で十分洗浄した。担体のアルデヒド基とＤＮＡのアミノ基との共有結合によるシッフ塩基を安定なアミンに還元するために、洗浄後のスライドをさらに０．２５％の水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬社製）を含んだＰＢＳ―１００％エタノール混合（体積比３：１）溶液に５分間浸積する工程を行なった後、上記同様に洗浄乾燥した。
【００４０】
（３）作製したＤＮＡプローブ固定化スライドグラス２枚を、先に合成したＣｙ３−ＲＸオリゴをプローブとしてハイブリダイゼーションさせ、そのシグナルを観察した。すなわち、１μＭのＣｙ３−ＲＸオリゴ、４×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳからなるハイブリダイゼーション溶液約５μｌをスライドグラス上のＤＮＡが固定されている領域にそれぞれ滴下し、泡が入らないようにカバーガラスで覆った後、保湿箱に入れ３７℃で２時間保温した。一方のＤＮＡプローブ固定化スライドグラスは室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスを外し、室温の２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＡ中で５分間の洗浄を行った後、室温の０．２×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を行い、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した（以下、ＴＭＡＣ処理（−）と称す。）。もう一方のスライドグラスは室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスを外し、氷温の５×ＳＳＣ中で３０分間の洗浄を２回行った後、５５℃のＴＭＡＣ洗浄液（３Ｍ  テトラメチルアンモニウムクロライド（和光純薬株式会社製）、５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．０、ナカライテスク社製）、０．１％ＳＤＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１４時間の洗浄を行い、室温の２×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中で５分間の洗浄を行った後、室温の０．２×ＳＳＣ中で５分間の洗浄を行い、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した（以下、ＴＭＡＣ処理（＋）と称す）。
【００４１】
（４）ハイブリダイゼーション後のＤＮＡプローブ固定化スライドグラス上のシグナルをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１８アレイスキャナーを使用し、励起波長：５３２ｎｍ、測定波長：５７０ｎｍで測定した。得られたシグナルの強度を画像解析ソフトＩｍａＧｅｎｅを用いて解析した。その結果を表２及び表３に示した。
【００４２】
表２及び表３中、ＮＨ−Ａ群、ＮＨ−Ｂ群、ＮＨ−Ｃ群、ＮＨ−Ｄ群、ＮＨ−Ｅ群、ＮＨ−Ｆ群、ＮＨ−Ｇ群、ＮＨ−Ｈ群の中でＣｙ３−ＲＸオリゴと完全に相補性があるのは、それぞれＮＨ−Ａ−３、ＮＨ−Ｂ−４、ＮＨ−Ｃ−２、ＮＨ−Ｄ−４、ＮＨ−Ｅ−２、ＮＨ−Ｆ−３、ＮＨ−Ｇ−４およびＮＨ−Ｈ−２で、他のプローブはそれぞれ１塩基のミスマッチを持っている。また、表中、シグナル強度は上記の解析ソフトでのシグナル読み取り値を、シグナル比は上記ミスマッチを有するプローブでのシグナル読み取り値の平均値に対する、完全な相補性を有するプローブでのシグナル読み取り値の比をそれぞれ表している。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
【表３】
2004248503.tif 000004
【００４５】
表２及び表３から明らかなように、ＴＭＡＣ洗浄液で洗浄を行った場合には、行わない場合に比べて全般的にシグナルが低くなるが、完全に相補性があるプローブのシグナルと、他のプローブのシグナルとの差は大きくなる。このことから、１塩基置換の検出において、ＴＭＡＣ洗浄液で洗浄を行った場合が有効であることが示された。
【００４６】
【発明の効果】
本発明によれば、ハイブリダイゼーションにおけるシグナル強度に優れたＤＮＡ固定化担体が提供される。当該ＤＮＡ固定化担体は、一塩基の差に基づくハイブリダイゼーションシグナルの差が明確となり、例えば、一塩基置換（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）の検出に有効である。
【００４７】
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【００４８】
【配列表】
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