(57)【要約】      （修正有）【課題】帯状ヘルペスを発症する危険がある人の発症を防止する手段の提供。【解決手段】水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）抗原を用いて免疫することにより、抗ＶＺＶ免疫応答の高揚を誘発する。この免疫によりＶＺＶ再活性化に伴なうヘルペス後神経痛が低減されると共に、再活性自体も低減または予防される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＺＶに対して血清反応陽性を示す５０歳以上の人における帯状ヘルペスの再活性化を予防したりもしくはその重症度を帯状ヘルペスの発症後１カ月未満に低減するためのワクチンであって、免疫有効量のＶＺＶウイルスまたはgpI、gpIIもしくはgpIII抗原よりなる前記ワクチン。
【請求項２】
前記ＶＺＶ抗原またはウイルスが、弱毒化生体ＶＺＶ、死滅全ＶＺＶ、または、全ＶＺＶもしくは組換え産物由来のgpI、gpII及びgpIIIから選択されるＶＺＶサブユニットもしくは前記ＶＺＶサブユニットの組合せである請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記弱毒化生体ＶＺＶが水痘帯状ヘルペスウイルスのＯｋａ株である請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
少なくとも１０００ＰＦＵのＶＺＶ弱毒化生ワクチン、１０単位以上の死滅ＶＺＶワクチン、または、全ＶＺＶもしくは組換え産物由来の１単位以上のＶＺＶ gpI、gpIIもしくはgpIIIサブユニットもしくは各々が１単位のＶＺＶサブユニットの混合物よりなる請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヘルペス後神経痛は、帯状疱疹としても公知の帯状ヘルペスの発症に伴う主たる罹患状態である。神経痛は一般に１〜６カ月間続き、耐え難い痛みを伴うことが多い。
【０００２】
帯状ヘルペスは潜伏水痘ウイルスの再活性化によって惹起されることが最近証明されている〔Strausら，Ann.Int.Med.(1988);108，221-237；Hymanら,Lancet(1983) 2,814-816；Gildenら,Nature(1983) 306,478-80；Croenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1988);85,9773-9777；Mahalinghamら,New Eng.J.Med.(1990) 323，627-631〕。初回水痘感染は、乳児水痘の結果、または水痘を予防すべく水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）弱毒化生ワクチンで免疫した結果生じ得る。いずれの場合もウイルスは感染個体系中に水痘または予防接種後しばらくの間存続すると見られる。ＶＺＶ潜伏場所は、背根神経節内の神経細胞であると見られている。
【０００３】
ＶＺＶが潜伏状態となった数年後、ウイルスは再度活性化するが、その機構はまだよく判っていない。しかしながら、ＶＺＶの再活性化及びそれに続く複製によって帯状ヘルペスが生じる。重症のヘルペス後神経痛が発症するのはこの再活性化の過程及びその後である。
【０００４】
免疫適応の低下と帯状ヘルペスの潜伏状態からの再活性化とに相関関係があり得ると多数の文献で報告されている。再活性化が起こる機構として提案されたものには、ＶＺＶの食作用に続いて起こる、ＭＨＣタイプII分子によって提示される非自己抗原を認識する作用を有する血液中のＣＤ４＋レセプター担持Ｔリンパ球数が減少するなど、細胞性免疫の低下が含まれる。また、ＭＨＣタイプＩ分子が非自己抗原を認識及び提示した細胞を殺す作用を有するＣＤ８＋Ｔリンパ球レベルの低下も、ＶＺＶ再活性化を可能にし得る機構として示唆されている。Neumeyerら〔N.E.J.Med．p.1456,1986年5月29日〕は、帯状ヘルペスの前にＣＤ４＋／ＣＤ８＋比が低下し、臨床症候が一段落するとその比がまた増加すると記載している。
【０００５】
１つの実験で、ＶＺＶに対するＣＭＩ応答を増強（boost）する目的で水痘ワクチンを高齢被験者に投与した。ＶＺＶ特異的ＣＭＩの年齢相関的減退が既に文献に記載されていること〔Miller AE.，Neurology (1980);30,582-587；Berger R.ら，Infect.Immun.(1981);32，24-27；Burke BLら，Arch.Intern.Med.(1982) 142，291-293〕、及び（帯状ヘルペスのように）ＶＺＶの年齢相関再活性化がこの減退の結果である可能性があることから、かかる血清反応陽性個体のＶＺＶ免疫を試みたのであった。この弱毒化生ワクチンは十分に寛容され、深刻な局所的または全身性の反応は起こらず、中程度の反応もそれほど見られなかった。微小皮疹に現れるワクチンウイルスの全身拡散が起こった場合もあった（恐らくは６／２４５注射）。これは、文献記載の高齢患者における特異的細胞性免疫の低下と理論的に関わるものであるが、生じた病変部及び症候に臨床的有意性はないことが明らかとなった。このことは、血清反応陽性祖父母は、水痘の孫に暴露されても感染しないという逸話的知見と一致する。
【０００６】
高齢者におけるＶＺＶ特異的免疫の不全はＣＭＩ応答の一般的低下に関わって起こる。これらは、遅延型過敏皮膚応答アッセイ〔Goodwin JSら，Clin.Exp.Immunol.(1982);48，403-410〕及びマイトジェンに刺激されたTリンパ球のin vitro増殖応答アッセイ〔Hayward ARら，J.Clin.Immunol.(1987);7，174-178；Tice RRら，J.Exp.Med.(1979);149，1029-1041；Murasko DMら，Am.J.Med.(1986);81，612-618〕において検出されている。ほとんどの研究が、Ｔ細胞数は正常であるがＣＤ４＋細胞は低下すると記載している〔Nagel Jeら，J.Immunol.(1981);127，2086-2088；Thompson JSら，J.Am.Geriate Soc.(1984);32，274-281〕。天然キラー細胞の数と機能はかかる患者において正常である〔Hayward AR，Herberger M.，J.Clin.Immunol.(1987);7，174-178；Nagel Jeら，J.Immunol.(1981);127，2086-2088〕。Ticeらの研究で示されたような細胞周期の時間増加は、老化に伴うＣＭＩの損失を説明し得るものである〔Tice RRら，J.Exp.Med.(1979);149，1029-1041〕。しかしながら、その後の研究では、抗原刺激後の細胞周期の変化即ちクローン膨脹度の低下に好都合ではない〔Staiano-Coico Lら，J.Immunol.(1984);132,1788-1792；Sohnie PGら，Clin.Exp.Immunol.(1982);47,138-146〕。代わりに、ＤＮＡ分析により、高齢者由来のマイトジェン刺激細胞におけるＤＮＡ損傷、姉妹染色分体間の組換え及び細胞損失の頻度増加が示されている〔Dutkowski RTら，Mutat.Res.(1985);149，505-512〕。マイトジェンに対する増殖応答の低下には必ずしもＩＬ２またはＩＬ２Ｒ合成の低下が伴なうわけではない〔Dutkowski RTら，Mutat.Res.(1985);149，505-512〕。Chopraらによって見い出された最も一致した欠損は、γ−インターフェロン産生の増加と、追加免疫の使用を支援する刺激細胞の生存性の低下であった〔Chopra RKら，Clin.Immunol.Immunopathol.(1989);53，297-308〕。
【０００７】
老齢化集団における別の実験からは、高齢者におけるＨＺの発生増加を伴なうＶＺＶ特異的免疫性の低下は、血液中のＶＺＶ特異的ＣＤ４＋細胞数の低下によって少なくとも一部は説明されることが判っている。しかしながら、かかる患者はＴ細胞数は正常であり、十分なＩＬ２が存在するという条件でＶＺＶ抗原に応答しＮＫ細胞活性は保存されている〔Hayward ARら，J.Clin.Immunol.(1987);7，174-178〕。記憶細胞表現型（ＣＤ４５ＲＯ）を発現するＴ細胞の数は年齢と共に増加し、２８歳で平均４３＋１７％であったものが７０歳で平均６５＋１４％となり、老化に伴うＶＺＶ特異的免疫性の減退は、この分画の選択的減損によるものではない。ＣＤ４５ＲＯ＋細胞はＣＤ４５ＲＡ−細胞よりもγ−インターフェロンを多く作り出し、これはChoplaらの結果と相関する。
【０００８】
帯状疱疹の制御または再活性化の機構がどのようであるにしろ、帯状ヘルペスの再活性化（帯状疱疹）の予防によりヘルペス後神経痛が明らかに軽減したとすべき医学的証明はない。１つのクラスとしての化学療法剤はこの痛みのひどい病状に適用することにおいて絶望的である〔Watson,C.P.N.，Neurol.Clin.，7，231-248(1989)；Strausら，Ann.Int.Med.108,221-237(1988)〕。
【０００９】
本発明は、ヘルペス後神経痛を低減すると共に帯状ヘルペス再活性化を緩和または阻害する方法を提供する。本発明方法の有用性は、ＶＺＶ特異的リンパ球レベルが増加するというin vivoで得られる陽性結果によって示される。本発明方法に従う免疫によって誘発される応答細胞数ＲＣＦ（responder cell frequency）の増加は、ＶＺＶ再活性化及びヘルペス後神経痛を含む疾患状態に対して抵抗力のあるin vivo免疫状態を与える。広域にまたがる複数の実験場所において、発症の危険がある個体に弱毒化生抗原、死滅抗原、またはＶＺＶもしくは組換え産物から精製したサブユニット抗原を投与した長期間臨床調査から、本発明の免疫はＶＺＶ再活性化に対して有意な保護をもたらし、再活性化が起きてもヘルペス後神経痛の期間または重症度を著しく軽減することが判った。
【００１０】
（発明の要約）
ヘルペス後神経痛を軽減すると共に、発症の危険がある人において帯状ヘルペス再活性化を緩和または予防する方法であって、ＶＺＶ抗原刺激を使用する方法を記載する。ＶＺＶ抗原は、弱毒化生ＶＺＶウイルス、死滅全ＶＺＶウイルス、または全ＶＺＶもしくは組換え発現由来の精製ＶＺＶサブユニット抗原である。
【００１１】
発症の危険がある個体は、非顕性であったとしても水痘（varicella,chickenpox）にかかったことがあるか、水痘生ワクチンを受けたことがある者である。特に発症の危険があるのは高齢または免疫弱体化個体である。発症危険状態は、陽性血清抗ＶＺＶ抗体またはＶＺＶ抗原皮膚テストに対する陽性応答によって確認され得る。特に発症危険状態の指標となるものは、６８,０００に約１以下のＶＺＶ応答細胞数であり、一方ＲＣＦが４０,０００に１の応答細胞に近ければ保護状態に近づいている。
【００１２】
発症の危険がある個体に免疫有効量のＶＺＶ抗原を投与し、発症危険状態への戻りを監視して、その時にはもう一度免疫を試みる。
【００１３】
本発明方法の効能は、広域にまたがる複数の実験場所における長期間臨床調査において得られた陽性結果によって示される。
【００１４】
（発明の詳細）
本発明の方法においては、帯状ヘルペスを発症する危険がある個体をＶＺＶ抗原を用いて免疫し、抗ＶＺＶ免疫応答の高揚を誘発する。この免疫により、ＶＺＶ再活性化に伴なうヘルペス後神経痛の重症度が低減されると共に、再活性化自体も低減または予防される。
【００１５】
発症の危険がある個体には、非顕性であったとしても水痘を経験した者、水痘帯状ヘルペスウイルス生ワクチンを受容したことのある者が含まれる。なかでも特に発症の危険がある者は、いかなる理由にせよ免疫弱体化している者である。これは、後天性免疫不全症（例えばＡＩＤＳ，ＡＲＣ）の発症や化学療法その他の免疫抑制療法（例えば移植片拒絶反応免疫抑制）によるものであり得る。更に、帯状疱疹の発生率は年齢と共に増加する。５０歳以上の発症の危険がある人では発生率は２.５〜５.０症例／１,０００人／年であるが、８０歳までに発生率は５〜１０症例／１,０００人／年に増加する。この危険性の増加は、ＶＺＶに対する細胞性免疫の減退に相関する。
【００１６】
個人記録または記憶に頼らずに発症の危険がある個体であることを確定するため、後述の実施例セクションに記載のごとき単純な皮膚テストを実施し得る。発症の危険がある状態を判定する別の方法としては、例えば抗ＶＺＶ抗体ＥＬＩＳＡアッセイによる血清学的評価が挙げられる。更に別の方法はＶＺＶ特異的応答細胞数ＲＣＦを測定することであり、６８,０００に約１であれば個体は恐らく発症の危険があると推定される。しかしながら本発明においては、本発明の一律免疫に伴なう副作用はいかなる時点においても知られていないので、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染したり後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が完全に発症したような重症の免疫弱体化個体は生体ＶＺＶ抗原で免疫しないということとすれば、集団中の全個体を発症の危険があると見なしても差支えない。
【００１７】
ＶＺＶ抗原は、米国特許第３,９８５,６１５号明細書（Takahashi）または後述の実施例に記載の方法に従って調製した弱毒化生ＶＺＶであり得る。弱毒化生水痘の生存性は、多くの既知の安定化剤調製物のいずれかにおいて維持し得る。弱毒化Ｏｋａ ＶＺＶはＡＴＣＣに寄託されており（受託番号ＶＲ−７９５）、本出願人によってＶＡＲＩＶＡＸ（登録商標）として市販されている。初めて予防接種を受ける未感染（naive）個体でも自然疾患を惹起しないように、または死滅もしくはサブユニットＶＺＶ抗原生産に差支えないほどに、十分に弱毒化してさえあれば、他のＶＺＶの株を使用してもよい。
【００１８】
ＶＺＶ抗原は不活化ウイルスであってもよい。この材料は、生体ＶＺＶのアリコートを加熱し、適当なアッセイによって残留プラーク形成単位（ＰＦＵ）の数をモニターするといった簡単な方法で調製することもできるし、既知量の時間及び強度でγ線照射するなどのより高度の技術によって不活化することもできる。死滅全ウイルスは本発明においては生体ＶＺＶと同様に有効であることが明らかであり、ＶＺＶ抗原の完全性が保持される限りは任意の慣用手段によって製造し得る。抗ＶＺＶ応答細胞数の上昇は、熱死滅ＶＺＶを約１０μg以上の用量で使用しても、１０００ＰＦＵの生体ウイルスを投与しても同じである。受容者が重度に免疫弱体化している場合には特に、死滅全ＶＺＶを使用することが好ましい。
【００１９】
抗原は、ＶＺＶから精製または組換え手段によって生産し得るＶＺＶサブユニット抗原または抗原混合物とし得る。純粋なＶＺＶ糖タンパク質はKellerら〔J.Virol.Methods，14，177-188(1986)〕に従って製造し得る。１つの組合せにおいては、新命名法（new nomenclature system）〔Davisonら，J.Virol．57，1195-1197(1986)〕に記載の３つのクラスgpＩ、gpII、gpIIIの各々から精製された１〜３種のＶＺＶ糖タンパク質が含まれる。
【００２０】
本発明の方法においてはどの抗原を選択した場合でも、下記の本発明方法の免疫学的有効量及び効能の指標が有用である：
１．ＶＺＶ特異的応答細胞数を約３０％増加する（ＲＣＦ,後述の実施例参照）。
２．ＶＺＶ特異的ＣＤ８＋細胞（キラー細胞,後述の実施例参照）の高揚によって測定されるように抗ＶＺＶ細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を高揚する。
３．ＶＺＶ特異的ＣＤ４＋細胞（後述の実施例参照）の高揚によって測定されるように抗ＶＺＶヘルパーＴ細胞を高揚する。
４．抗ＶＺＶ特異的抗体のレベルを増加する。
５．インターフェロンのごときリンフォカインまたはインターロイキンのレベルを増加する。
６．個体におけるヘルペス後神経痛の期間または重症度を、帯状疱疹の発症後１カ月未満に軽減する。
７．統計学的検定による帯状疱疹発生率を、同様に発症の危険がある個体の一般集団に認められる発生率以下に低下させる。
【００２１】
ヒトにおける細胞性免疫を定量するための一般的に容認されたin vitro方法はない。本発明者らは、この実験においてＲＣＦ分析を含む限界希釈培養を選択した。何故ならば、この方法はＳＩの測定より正確であろうと期待したからである。両分析方法とも免疫後にＶＺＶ特異的免疫の著しい増幅を示したが、本発明者らがＲＣＦの結果を選択したのは、ＳＩ結果と比較してＲＣＦの結果は平均からの標準偏差がより小さいことを見い出したことによる。これは、ＳＩを計算するには一般に６〜８培養ウェルが使用されるのに対して、１９６の組織培養ウェルを分析してＲＣＦ推定に至ることにもよる。しかしながら、本発明者らが使用した限界希釈培養は応答数の間接的推定値しか与え得ない。この試験に使用した分母はフィコール濃度勾配から回収された細胞数であり、ＶＺＶ特異的応答Ｔ細胞が引き出される記憶表現型であるＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋集団に属するのはこれらの４分の１だけである〔Beverly PCL.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1990);159，111-112；Hayward Aら，Viral Lmmunol.(1989);2,175〕。従って本発明者らのＲＣＦ推定は、予防接種に対する応答を過小評価し易い。しかしながら、予防接種後に得られる平均ＲＣＦ（１／４０,０００）はＨＺ後に達するものと同じ大きさであり〔Hayward Aら，J.Infect.Dis.(1991);163，873-875〕、ここでは、外来的に産生されたＶＺＶ抗原の負荷は大きいと見られる。予防接種後に得られる免疫レベルは３５〜４５歳の無症候個体に匹敵し得る。現状では免疫応答の増強は２４カ月維持され、推定半減期は５６カ月であり、これは年齢に依存しなかった。この後者の特性は、最高齢の個体が最もＨＺを発症し易く、予防ワクチン法の主なターゲットであることから重要である。
【００２２】
予防接種後のＲＣＦ応答は、１,０００〜１２,０００ＰＦＵの範囲で与えられるワクチン用量と相関しなかった。更に、応答被験者の度数は、より高いワクチン用量を与えても増加しなかった。これは、最低の投与量でもＲＣＦに対する最大効果を与えるに十分なＶＺＶ抗原をもたらすほどの、受容者内でのワクチンウイルス複製が生ずる旨を証明するものであり得る。或いは、比較的少ない用量でも比較的高いＶＺＶ含有量（例えば１,０００ＰＦＵは約２単位のＶＺＶ抗原を含む）が得られ、最高免疫に十分となり得る。培養細胞のγ−インターフェロン応答だけが用量の多さまたは年齢の若さと相関した。
【００２３】
ＶＺＶ抗体に及ぼすＶＺＶワクチンの作用は、ＣＭＩに及ぼす作用よりも小さく且つ短期間であった。これは恐らく、力価はＨＺ後１〜２年間でベースラインレベルにまで低下する〔Hayward Aら，J.Infect.Dis.(1991);163,873-875〕が、ＶＺＶ抗体レベルは老化に伴って著しく減退することはない〔Miller AE.，Neurology.(1980);30，582-587；Gershon AA,Steinberg SP.,Am.J.Med.Sci.(1981);282(1),12-17〕ことから、ＨＺを予防するという長期目標に重要ではない。本発明者らの被験者におけるワクチン前平均ＶＺＶ抗体レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定したところでは、ずっと若年の成人対照に匹敵した。
【００２４】
ワクチン後の免疫応答評価は、ＶＺＶ抗原に暴露されたＭＮＣによるγ−インターフェロン放出の測定を含んだ。γ−インターフェロンが天然キラー細胞及び抗原特異的Ｔ細胞によって製造されるというin vitro証拠の故に〔Hayward ARら，Pediatr.Res.(1986);20,398-401〕、インターフェロン放出は独立の変数となり得るものとして評価した。天然キラー細胞及びγ−インターフェロンはいずれもin vitroでのヘルペスウイルス複製の制限に貢献する〔Leibson PJら，J.Virol.(1986);57,976-982〕。in vitroでのγ−インターフェロンの統計的に有意な増加が免疫の３カ月後に認められたが、標準誤差は極めて大きかった。従ってγ−インターフェロン測定値はＶＺＶ免疫の結果の強力な指標ではない。
【００２５】
本発明を更に説明するために以下の実施例を与えるが、本発明はこれら実施例の詳細に制限されることはない。
【実施例１】
【００２６】
ＶＺＶ弱毒化生ワクチンの調製
Ａ．ＶＺＶ生産
弱毒化生水痘帯状ヘルペスウイルスは、米国特許第３,９８５,６１５号明細書または当分野において公知の任意の他の方法に従って生産し得る。
【００２７】
Ｂ．ＶＺＶ収率測定アッセイ
水痘帯状ヘルペスウイルス（ＶＺＶ）調製物の感染力価を、Krahら〔J.Virol.Methods,1990,27:319-326〕またはTakahashiら〔Postgrad Med.J.61(別冊4)736-741(1985)〕によって記載されているアガロースオーバーレイ法または液体オーバーレイ法を使用して評価した。アッセイは以下のように実施した。
【００２８】
ＭＲＣ−５細胞を、６０mm組織培養プレートにおいて、１００mg／Ｌガラクトース、５０μg／mlネオマイシン及び２mＭ Ｌ−グルタミンを含む５mlのＢＭＥ（ハンクス平衡塩溶液を含むイーグルの基礎培地）中に６×１０５細胞で播種し、５％ＣＯ２雰囲気下に３５℃でインキュベートした。２４〜４８時間インキュベートすると細胞は５０〜８０％集密に達した。吸引によって増殖培地を除去し、適当なウイルス希釈液例えばＳＰＧＡ緩衝液または液体維持培地（ＬＭＭ）で希釈したＶＺＶ溶液１００μlを用いて細胞を感染させた。ＳＰＧＡ緩衝液は７.５％（ｗ／ｖ）スクロース、１１mＭリン酸カリウム、０.１％（ｗ／ｖ）グルタミン酸ナトリウム及び１％ヒト血清アルブミンを含む。５％ＣＯ２雰囲気下に３５℃で１時間以上ウイルスと接触させた。次いでＶＺＶ感染細胞培養物の上に５mlのアガロースオーバーレイ培地（ＡＯＭ）または液体維持培地（ＬＭＭ）を重層した。アガロースオーバーレイ培地は２種類の液体、即ち液体オーバーレイ培地（ＬＯＭ）とアガロース溶液の混合物であった。ＬＯＭは、イーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）、２％熱不活化ウシ胎児血清、５０μg／ml硫酸ネオマイシン及び２mＭ Ｌ−グルタミンを含んでいた。アガロース溶液は、４.５ｇの低ゲル化温度アガロースを１００mlのＭＥＭ中で１２１℃で１５分間加熱し、次いで溶液を４５℃まで冷却することにより調製した。ＡＯＭは、１倍容のアガロース溶液を４倍容の１.２５倍に濃縮したＬＯＭと４５℃で混合することにより調製した。プレートを２３〜２５℃に冷却してＡＯＭを固化させた。培養物をインキュベートしてプラークを発生させた。６〜７日後、ＬＯＭが入ったプレートに５mlのリン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）を重層し、ガラス製のパスツールピペットを用いて周縁を離し、アガロースを取り出した。ＬＭＭを入れたプレートから培地を吸引し、エタノール−１％酢酸中に０.２％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーＲ−２５０を含む溶液を用いて細胞を染色することによりプラークを可視化した。プラーク数は４〜５反復プレートの平均であり、１ml当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ／ml）で表わす。
【実施例２】
【００２９】
不活化ＶＺＶワクチンの調製
実施例１の方法または任意の他の方法に従って調製した生体ＶＺＶは、ウイルスのアリコートを約５０℃で約５〜１５日間インキュベートすることにより不活化し得る。或いは、ウイルスの抗原完全性が犠牲にならない限りは、γ線への暴露または任意の他のウイルス不活化手段によって生体ＶＺＶを不活化し得る。
【００３０】
１つの実験においては、弱毒化生体ＣＲ４５３ＶＡＲＩＶＡＸ（登録商標）を以下のように不活化した。
【００３１】
熱不活化方法：ロットＣＲ４５３ワクチンの５００個のバイアルを、再構成しないバイアルのまま、５０℃のインキュベーター内で１２日間加熱した。熱処理に続き、５００個全ての加熱バイアルの各バイアルラベルの中央に目立つ安全赤色インクで三角形の印を付け、−２０℃の保管庫に入れた。
【００３２】
分析：
加熱ワクチン中に残留する感染性水痘ウイルス含量：Takahashiら,Postgrad Med.J.61(別冊4)736-741(1985)に記載のごとく、プラーク形成単位数を測定した。１０個の加熱ワクチンバイアルから得た全部で５mlの再構成材料を分析した。２.４プラーク形成単位／mlという値が得られた。未加熱ワクチンの基準アッセイは、３８３０プラーク形成単位／mlという値を与えた。
【００３３】
ドットブロットアッセイによる水痘ウイルス抗原：ドットブロットアッセイによりまたは後述の実施例９に記載のごとく、ウイルス抗原質量を測定した。加熱産物は、ドットブロット分析によると１ml当たり９.８単位の抗原を含むと推定された。同時にアッセイした基準たる未加熱ワクチンは、１ml当たり９.４単位の抗原を含むと推定された。  イムノブロットによる抗原分析：他の物質に対して使用した方法に準じて設計した実験ウェスターンブロット法を使用し、加熱ワクチン及び正常ワクチン中の抗原を比較した。２種類の産物は、ウイルス糖タンパク質Ｉに対するヒトポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体のいずれかと反応させたイムノブロットの目視観察範囲内では相互に極めて同等であると見られた。
【００３４】
上述のごとく不活化した全ＶＺＶ試料を、帯状ヘルペスに対する細胞性免疫応答を活性化するための免疫原として使用した。約１０,０００ＰＦＵの生体または死滅ＶＺＶに相当する量を、帯状ヘルペスを発症する危険性のある人に投与した。免疫前及び免疫３カ月後の抗体応答（Ａb）及びＶＺＶ応答細胞数（ＲＣＦ）を以下にまとめて示す：
【００３５】
【表１】
2004323531.tif 000002
上記データは、生体ＶＺＶまたは死滅ＶＺＶのいずれを用いて免疫する場合も、抗ＶＺＶ免疫応答が実質的に増強されたことを示している。
【実施例３】
【００３６】
精製ＶＺＶサブユニット抗原の調製
ＶＺＶは、血清学的に別個の３種の糖タンパク質遺伝子産物ＧＡ、ＧＢ及びＧＣをコードし〔Kellerら，J.Virol.52,293-297(1984)〕、これらは最近になってそれぞれＧＰIII、ＧＰII及びＧＰＩと改称されている〔Davisonら,J.Virol 57,1195-1197(1986)〕。実質的に均一のＶＺＶ糖タンパク質はKellerら〔J.Virol.Methods 14,177-188(1986)〕に記載のごとく調製し得る。簡単に述べると、完全フロイントアジュバント中の１７μgの全ＶＺＶを使用してbalb／cマウスを免疫し、次いでアジュバントなしで２５mgの腹腔内追加免疫を与え、あとで更に２５μgのＶＺＶを静脈内に導入した。３日後、脾臓を取り出し、脾細胞をＳＰ ２/０マウスミエローマ細胞と融合した。ハイブリドーマ上清を抗ＶＺＶモノクローナル抗体についてスクリーニングし、限界希釈によってクローニングし、更に膨張させて腹水を生成した。モノクローナル抗体を精製し、ＶＺＶ糖タンパク質特異性を免疫沈降によって分析した。
【００３７】
２０μg／gの臭化シアノゲンと活性化セファロース４Ｂ（Pharmacia）とをカップリングすることにより、特異性が与えられたモノクローナル抗体親和性樹脂を生成した。ＶＺＶに感染させたＭＲＣ−５細胞を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７.５、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４mＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド中に抽出した。細胞抽出物を、リン酸緩衝塩水溶液と０.０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に対して透析した。次いで２０mlの細胞抽出物を１ｇのモノクローナル抗体をカップリングした樹脂と結合することにより特異的糖タンパク質を単離した。スラリーを遠心し、洗浄し、結合した特異的糖タンパク質を３Ｍ ＫＳＣＮを用いて溶離した。溶出液を、０.０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むリン酸緩衝塩水溶液に対して透析した。このようにして精製gpＩ、gpII及びgpIII糖タンパク質を得た。
【００３８】
実質的に均一なＶＺＶ糖タンパク質を生成する別の方法は特異的ＶＺＶ遺伝子産物の組換え生産を含む。即ち、Ellisら〔J.Virol.53，81-88(1985)〕またはKellerら〔Virology 152，181-191(1986)〕の方法を使用し得る。
【実施例４】
【００３９】
抗ＶＺＶ皮膚テスト
水痘皮膚テストは、ＶＺＶ抗原または対照抗原を皮下導入し、次いで抗原導入の約４８時間後の紅斑変化を測定することにより実施する。従って、Kamigaら〔J.Inf.Dis.136,784-788(1977)〕、Babuら〔J.Clin.Microbiol.25,2193-496(1987)〕またはLafussaら〔J.Inf.Dis.152,869-875(1985)〕の方法を使用して皮膚テストを実施し得る。或いは、実施例２に記載のごとく調製した不活化抗原または実施例３の精製抗原を使用してＶＺＶ抗原を与えることもできる。いずれの場合も、Takahashi〔Adv.Virus.Res.28,285-356(1987)〕による陰性皮膚試験抗原アッセイは、水痘感染に対する感受性と密接に相関することを示した。この点に関して、細胞性免疫に密接に関与する分子量１５,０００〜４５,０００のＶＺＶ糖タンパク質は、帯状疱疹再活性化に対する感受性の指標として好ましい。
【実施例５】
【００４０】
ＶＺＶ応答細胞数アッセイ
ＶＺＶ応答細胞数は当分野において公知の方法に従って測定することができ、例えば制限希釈分析がM.Zauderer〔Handbook of Experimental Immunology,第2巻−Cellular Immunology,Blackwell Scientific Publications,D.M.Weirら編(1986)−第65章〕によって記載されている。更に後述の実施例７のセクション５：「ＶＺＶ抗原に応答して増殖する血液単核細胞（ＭＮＣ）数測定」の記述も参照されたい。
【００４１】
本発明の方法によれば、４０,０００に約１つの応答細胞に近い応答細胞レベルが得られ、これは帯状疱疹後の個体に認められるＲＣＦと同じレベルである。
【実施例６】
【００４２】
抗ＶＺＶ細胞障害性Ｔ細胞レベルアッセイ
ＶＺＶ細胞障害性アッセイ：末梢血単球（ＰＢＭＮ）を分離し、マイクロウェルにおいて生体ＶＺＶと一緒に１０４細胞／ウェルで培養した。７日後、１単位のＩＬ２を各ウェルに加え、プレートを目視検査したとき増殖したウェルが観察されるまで、１０日間培養を続けた。かかるウェルから幼若な細胞（blast cells）を回収し、１週間のクローン膨張のため、相同抗原及び自原性ＥＢＶ細胞（５０００ｒの放射線を照射したもの）並びに１０ｕ／ml ＩＬ２を用いて再刺激した。ここで生体ＶＺＶを使用して刺激することは、クラスＩ制限応答を誘発するためには生体ウイルス刺激が必要であるいうBracialeらの証言〔Immunol.Rev.,98,95(1987)〕、単球はＶＺＶにより感染可能であるというデータ〔Arbeitら,Intervirology 18,56(1982)〕、並びにクラスＩ及びII抗原提示型の両方を有する自原性細胞が必要なことから行った。
【００４３】
応答ウェル由来の細胞の、主に細胞障害性の阻害によるＭＨＣ制限〔Gastonら,Immunogenetics 19,475-486(1984)〕を試験した。Ｔ細胞を１０６／mlに懸濁させ、１０５個の細胞を、ＶＺＶと一緒にプレインキュベートした５×１０３個の自原性ターゲットまたは未関連ターゲットに加えた。（１）エフェクター細胞のアリコートをＣＤ４及びＣＤ８の表現型について分類し、（２）１μg／mlのＷ６／３２（ＡＴＣＣハイブリドーマバンクＨＢ９５，抗クラスＩ）またはＨＢ５５（ＡＴＣＣ，抗クラスII）を細胞障害性アッセイに加えることにより、ＭＨＣ制限を判定した。かかる抗体は、混合リンパ球培養物中のクラスＩ及びクラスII制限細胞障害性細胞の発生をそれぞれ抑制するが故に適当である。６時間インキュベートした後にターゲット細胞からの５１Ｃr放出を測定した。
【００４４】
クラスＩＭＨＣ制限細胞障害性細胞は、Ｗ６／３２及びＣＤ８表現型によって阻害可能なものとして同定された。クラスII制限細胞障害性細胞はＨＢ５５によって阻害され、エフェクターはＣＤ４であった。若年成人において急性ＶＺＶ後の種々の時点並びにＯＫＡ追加免疫の前及び後で得たＰＢＭＮの結果を比較した。
【実施例７】
【００４５】
帯状ヘルペス発症の危険がある成人の免疫
１．集団
水痘歴はあるがＨＺにはまだかかっていない５５〜８７歳の個体に接種した。衰弱性または免疫抑制性の疾患をもつ者及び免疫抑制療法を受けている者は除外した。また、過去１カ月以内に別のワクチンを受けた者またはＶＺＶ予防接種後１カ月以内に別のワクチンを受ける予定の者、更にＶＺＶ予防接種から過去３カ月以内にγ−グロブリン療法を受けた者も除外した。
【００４６】
２．ワクチン
弱毒化生ワクチン（Oka/Merck Strain）は−２０℃の凍結乾燥状態で保存されており、それを蒸留水を用いて感染力価１,１４０pfu／０.５ml（ロットＣＲ４５２）または３,０１０pfu／０.５ml（ロットＣＲ３２０）に再構成した。他の弱毒化生体水痘帯状ヘルペスウイルスを使用することもできる。好ましいＯｋａウイルスは、米国特許第３,９８５,６１５号明細書の開示に従って調製することができ、該明細書は参照により本明細書の一部を構成するものとする。
【００４７】
３．態様
ワクチン受容候補者を年齢によって分類した（５５〜５９；６０〜６４；６５〜６９；７０〜７９；８０歳以上）。各年齢群の個体をランダムに割り当て、４種のワクチン用量：３,０１０pfu；６,０２０pfu；１２,０４０pfuのいずれかを皮下注射するか、或いは３,０１０pfuの初回接種の３カ月後に３,０１０pfuの追加接種を行った。５５〜５９歳の別の個体をランダムに選択して１,１４０pfuを受けさせた。
【００４８】
免疫直前と免疫の１、１２及び２４カ月後に、血清学的評価のためにワクチン受容者から採血した。更に追加免疫の３カ月後にも採血した。
【００４９】
２週間ごとに電話し、ワクチン受容者のワクチン反応を４２日間追跡した。また、ワクチン受容者は予防接種記録カードに徴候及び症候を記録した。彼らは予防接種後の５日間は毎日検温し、その後は熱があると感じたときのみ検温した。異常反応があった者は別個に評価し、ＶＺＶを想定して皮膚の病変部を培養した。患者には、ＨＺを発症したと思われたときは電話連絡するよう指示しておいた。更に、１年目はＨＺについて問診するため毎月電話し、２年目の終わりにも同様に問診した。ＨＺを表わすと思われる皮膚病変または疼痛症候を、身体検査、ＶＺＶを想定しての病変部培養、並びに急性及び回復期（ＨＺの疑いが生じてから４〜６週間後）のＶＺＶ特異的免疫学的評価によって調査した。
【００５０】
４．酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によるＶＺＶ抗原に対するＩgＧ抗体の検出
【００５１】
リン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ；０.１５Ｍ，ｐＨ７）で１：２０に希釈したＶＺＶ抗原及び対照抗原（M.A.Bioproducts,Walkerville,MD;カタログ番号30-149J(ＶＺＶ抗原);30-150J(対照抗原)）をそれぞれ０.１ml用い、ＩＭＭＵＬＯＮ１１プレート（Dynatech,Alexandria,VA;カタログ番号011-010-3450）のＡ〜Ｄ列及びＥ〜Ｈ列を４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳ中で濯ぎ、ＰＢＳ中の１mg／mlゼラチンを用いて一晩かけてブロックした。患者及び対照の陽性血清を４倍希釈系列（出発時１：５０）の抗原及び対照ウェルに加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳで１：２０００に希釈したペルオキシダーゼ接合アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩgＧ（Tago,Burlingame,CA;カタログ番号2390）及びＡＢＴＳ基質（Sigma,St.Louis,MO）と一緒にインキュベートした。３０〜６０分間で発色し、ＥＬＩＳＡＣＡＬＣソフトウェアを備えたＤＹＮＡＴＥＣＨプレート読取り装置においてＯＤを読み取った。対照ウェルの光学密度をＶＺＶウェルのそれから減算した。単一の陽性基準血清のアリコートを全てのプレートにおいて試験し、対数（希釈度）対対数（ＯＤ）の回帰直線を計算した。被検試料中のＶＺＶ抗体を基準血清のパーセントで表わした。
【００５２】
５．ＶＺＶ抗原に応答して増殖する血液単核細胞（ＭＮＣ）数測定
Ficoll−Hypaque遠心によってヘパリン化血液からＭＮＣを分離し、ハンクス平衡塩溶液中で洗浄し、抗体及び１０％自原性血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。応答細胞数（ＲＣＦ）を決定するのに使用した限界希釈培養の詳細は公開されている〔Feldman Sら,Am.J.Dis.Child.126,178-184(1973)〕。簡単に述べると、１ウェル当たり１００,０００、５０,０００、２５,０００及び１２,５００ＭＮＣを含む培養物をそれぞれ２４個ずつ無細胞ＶＺＶ抗原の１：２００希釈物と一緒に１０日間培養し、次いで１ウェル当たり０.２５μＣi[３Ｈ]チミジン（TRK 61,Radiochemical Centre,Amersham；5Ｃi／mmol）と一緒に８時間パルス処理した。非感染細胞から調製した希釈対照抗原を用いて刺激したことを除き、対照培養物を同様に並行して調製した。応答ウェルとは、並行対照培養物の２４個の平均＋３ＳＤ cpmより大きいものと定義した。ウェル当たりの細胞数に対する非応答ウェルの割合の対数プロットにおいて、ＶＺＶ抗原刺激ウェルの３７％が非応答である点としてＲＣＦは補間された〔Henry Cら,In Mishell BB,Shiigi SM編，Selected Methods in Cellular Immunology．San Francisco:Freeman Press (1980)〕。ＲＣＦは、１つのＶＺＶ特異的増殖細胞を検出するのに必要な平均ＭＮＣ数であると表現される。
【００５３】
被験者の２％において、１０５個の細胞を含む未刺激ウェル中の平均cpmが非応答ウェルの割合を人為的に増加した。本発明者らは、従ってこの被験者サブセットの１２,５００；２５,０００；及び５０,０００細胞／ウェルのデータポイントからＲＣＦを計算した。データポイントの直線性が相当大きいため、かかる被験者の比較的低い細胞数におけるデータポイントの信頼性は高いことが裏付けられる。
【００５４】
かかる培養物から刺激指数を得るため、刺激ウェル及び未刺激ウェルの数値平均を計算し、（刺激cpm／未刺激cpm）として表わした。
【００５５】
６．ＶＺＶ刺激ＭＮＣ培養物におけるγ−インターフェロン産生
０.５ｍｌ中の５×１０５ＭＮＣの培養物を対照またはＶＺＶ抗原の１：２０希釈物と一緒にインキュベートした。５日後、上清のγ−インターフェロンをＥＬＩＳＡ（Amgen,ABC 3,000；Thousand Oaks,CA）によって評価した。結果は国際単位（ＩＵ）／ｍｌで表わした。
【００５６】
７．ＶＺＶ単離
丘疹または小疱疹を掻き取り、基材に強くこすり付けた後にヒト胚肺線維芽細胞（局所から取得；１０〜２０継代）中で培養することにより、皮膚病変部からＶＺＶを単離した。特異的免疫蛍光法によってＶＺＶを同定した。
【００５７】
８．統計
適宜Bonferroni補正を加えた０.０５有意率のStudentのｔ検定を用いて単純な比較を行った。性別、年齢、ワクチン用量及び免疫後の月数の影響を反復測定分析〔Laird NM,Ware JH.,Diometrics(1982);38,963-974；Jennrich R,Schluchter MD.,Biometrics (1986);42,805-820〕によって評価した。免疫持続期間を調査するために、Laird及びWareモデルの非線形類似形式を使用し、逆多項式モデルを適合させた〔Nelder JA.,Biometrics(1966):22,128-141;Hirst Kら,Commun.Stat.(1991):B20〕。
【００５８】
結果
全部で２０２の個体を免疫した。１３８人の女性ワクチン受容者の平均年齢は６５.８±７.３歳であり、６４人の男性ワクチン受容者の平均年齢は６７.７±６.５歳であった。全ての用量範疇において８〜１５人の被験者が８０歳以上であった。
【００５９】
ワクチンは概して十分に寛容であった。２５％未満のワクチン受容者が局所反応を有した。
【００６０】
【表２】
2004323531.tif 000003
局所反応は紅斑、腫脹及び／または圧痛からなった。局所反応の平均継続時間は、紅斑が２.９日間、腫脹が２.９日間、及び圧痛が３.６日間であった。かかる反応は、追加免疫を受けたワクチン受容者においても、度数がより高いこともないし、より重症であることもなかった。１００°Ｆ以上の体温が認められたワクチン受容者は１％未満である。
【００６１】
【表３】
2004323531.tif 000004
ワクチン受容者の４％以下に種々の他の穏やかな症候が起こった。
【００６２】
１１人の患者が予防接種の４０日以内に発疹を訴えた。
【００６３】
【表４】
2004323531.tif 000005
かかる個体のうち２人は、ワクチンに対して局所的紅斑反応しか示さなかったことが判った。６人は、免疫の３〜１５日後に出現した１〜１０病変部を含む筋肉丘疹状発疹を有した。ＶＺＶは、病変部を試験した５人の患者のうち１人からしか単離されなかった。このＶＺＶは、制限酵素分析によって野生型であることが判明した。
【００６４】
高齢患者における抗体レベルは、免疫前は対照標準基準血清の８５％であった。水痘ワクチンを投与した後、抗体レベルは１２カ月間にわたり著しく高くなった（ｐ＜.００１）が、予防接種の２４カ月後は高くなかった（ｐ＝.００１）。用量、性別及び年齢はこの応答に影響しなかった。ＶＺＶ刺激Ｔ細胞によるγ−インターフェロンのin vitro産生は免疫の３及び６カ月は著しく高かった（ｐ＜.００１）が（図２）、この作用は１２カ月までに失われた。ワクチン用量が高いか（ｐ＝．０３７）、年齢がより若いと（ｐ＝.０２３）、γ−インターフェロン応答はより高かった。
【００６５】
細胞性免疫
追加免疫後のＶＺＶ抗原に対する細胞性免疫を測定するため、１ウェル当たり種々の数の細胞を使用して患者のＭＮＣを培養した。かかる培養物を限界希釈培養によって分析し、血液中のＶＺＶ特異的Ｔ細胞数（ＲＣＦ）の近似値を得た。数年にもわたる実験においてデータポイントを定量化及び比較することがより容易であろうと予想して本発明者らはこの方法を使用した。ワクチンを受容する前の被験者は平均ＲＣＦ１：６８,０００（即ち６８,０００の末梢血ＭＮＣ当たり１つのＶＺＶ特異的増殖細胞）を有した。これは予防接種の６カ月後までに１：４０,０００に増加し、２４カ月間は免疫前のレベルよりかなり高く維持された（図３）（ｐ＝＜．００１）。予防接種前に１００,０００ＭＮＣに１つ以下の応答細胞を有したワクチン受容者の３３％が１つの応答細胞を有するとして本発明者らの分析に含まれていることから、このＲＣＦの平均向上は恐らく過小評価されている。予防接種の１２または２４カ月後のＲＣＦの絶対値は、性別、投与量またはワクチン受容者の年齢の関数ではなかった。しかしながら、ＲＣＦが一時的増加に止まる場合（即ち予防接種前より１２または２４カ月後のほうがＲＣＦが小さい）はより高齢の個体においてより大きく（ｐ＜.０５）、これは、より高齢の個体においては免疫前のＣＭＩが比較的乏しいこと、並びに年齢に関係なく全ての応答性ワクチン受容者が同様のワクチン後レベルを有したという事実を反映している。データの逆多項式モデル化から、６.３４カ月に最高ＲＣＦに達し、この作用が半分になるのに５５.９カ月を要することが推定される。ワクチン後免疫は３０９±３６４細胞／応答細胞／月の速度で失われる（９５％信頼限界＝０〜１,０４７細胞）。ＲＣＦは抗体またはγ−インターフェロン応答とあまり相関しなかった。
【００６６】
一群のワクチン受容者は予防接種後のいずれの時点でも１ＲＣＦ／１０５ＭＮＣ以上を有することはできなかったことが特記される。この非応答群は、８０歳以上のワクチン受容者において５〜８人が非応答者であったことを除き、全ての年齢群において同様（８〜２０％）であった。年齢と非応答とには統計的に有意な相関はなく、また非応答は投与したワクチンの量とも相関しなかった。
【００６７】
データを刺激指数として表わすと、ＶＺＶ免疫の増強も検出された。かかる結果は対数分布であるので、分析のために対数変換した。当初、平均刺激指数は３.４４（１ＳＤ範囲１.２〜９.９）であり；３カ月後は４.５７（１.６〜１２.８）であり；１年後は４.８５（１.８１〜１３.５）であり；２年後は４.５８（１.７〜１７.１）であった。
【００６８】
ＨＺに対する保護
７人の患者の帯状ヘルペスの可能性を２年間（４００患者年（patient−year）の観察に相当）にわたり評価した。この分析結果を下記の表４に示す。
【００６９】
【表５】
2004323531.tif 000006
１人が皮膚病変部由来の培養物中にＶＺＶを与えた。他に３人が類似の臨床的症候を示し、そのうちの２人は、近年のＶＺＶ感染を示す回復期ＲＣＦの向上を示した。１人の患者は完璧な免疫学的評価を得たが、他の３人は、病変部がＶＺＶによるものではなかったので、免疫学的評価は得られなかった。たった２人の疑似症例が急性疼痛を示し（各々４日間持続）、病変部治癒後に疼痛（ヘルペス後神経痛）を訴えたものはなかった。
【実施例８】
【００７０】
ＶＺＶサブユニットワクチン調製
実施例３のサブユニット抗原を水酸化アルミニウムゲルを用いて製剤化し、約０.１μg／kg〜１mg／kgの用量で投与した。
【実施例９】
【００７１】
ＶＺＶ抗原の定量化のための競合ＥＬＩＳＡ
ＶＺＶプラークアッセイは時間を要するが故に、製造工程での使用には適さない。迅速なＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡによって抗原量を測定し、水痘生ワクチンの製造の間のウイルス増殖をモニターし得る。更にこの試験を使用し、清澄化及び超音波処理したワクチンバルク中のＶＺＶ抗原の量を推定し得、更に凍結乾燥ワクチン充填バイアル中の抗原を測定し得る。簡単に述べると、このアッセイは、検査試料から採ったＶＺＶ抗原を抗ＶＺＶ血清溶液と一緒にインキュベートすることにより実施される。残存する遊離抗体を、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上に固定したＶＺＶ抗原に結合させる。プレートに結合し得る抗体の量は、検査試料中の抗原の量に逆相関する。プレートに結合している抗体を、酵素付着抗ヒト抗体及び着色生成物を与える適当な基質と反応させ、着色産物を分光光度計によって定量する。
【００７２】
ＶＺＶ抗原ＥＬＩＳＡ及びＶＺＶプラークアッセイのデータは、一般に相関するデータを与えるべきであるが、ＶＺＶ抗原アッセイは生存不可能なＶＺＶ及び生存可能なＶＺＶの両方を検出することに留意されたい。抗原アッセイは更に、ＶＺＶワクチン受容者に投与される全抗原負荷の測定値を与えることにおいても貴重である。
【００７３】
試験方法
１．ＥＬＩＳＡプレートをＶＺＶ感染または未感染のＭＲＣ−５細胞由来の糖タンパク質（gps）で被覆し、抗体のプレートへの非特異的吸着を低減するよう更に１％ウシ血清アルブミン（フラクションV,＃Ａ−９６４７，Sigma）でオーバーコートする。一列おきにＶＺＶまたは対照抗原で被覆する（即ちＡ、Ｃ、Ｅ及びＧ列はＶＺＶgpを受容し、Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ列は非感染ＭＲＣ−５gp抗原を受容する）。
２．清澄化（最低３２５０ｇ）した試験抗原を１２×７５mm試験管またはマイクロ試験管において安定化剤で希釈する。標準ウイルス抗原調製物（ドットブロットアッセイによれば２６単位／ml ＶＺＶ抗原）を１：１０に希釈し、更に１：１.２５倍に順次希釈し、２.６、２.１、１.７、１.３、１.１、０.９単位／mlの抗原濃度を得る。０.７及び０.５単位／mlの抗原を与える別の希釈物を含んでもよい。この希釈系列を使用し、検査試料中の抗原量の測定値の標準曲線を生成する。
３．ヒト抗ＶＺＶ血清を安定化剤で、所望の最終希釈度の２倍に希釈する。
４．３００μlの希釈抗原をマイクロ試験管中に分注し、３００μlの希釈抗ＶＺＶ血清と混合し、３５℃で１５〜２２分間インキュベートする。対照はヒト抗ＶＺＶ及び希釈物（抗原なし）を含む。
５．各血清−抗原混合物の１００μlアリコートを、２つの同じＶＺＶ糖タンパク質（ＶＺＶgp）被覆ウェルと２つのＭＲＣ−５gp被覆ウェル（１試料当たり４つのウェル）に添加する（例えば：試料１はカラム１のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ列に；試料２はカラム２のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ列に；など）。
６．プレートを３５℃で１５±１分間インキュベートし、プレート上に固定したウイルス抗原に（溶液中の抗原と複合体形成していない）遊離抗体を結合させる。
７．未結合の抗体を洗浄によって除去し、結合ヒト抗体を検出すべくウェルにアルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩgＧを加える。
８．３５℃で１５±１分間インキュベートした後、未結合の接合体を洗浄によって除去する。ジエタノールアミン緩衝液中に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート基質と一緒に３５℃で１５分間インキュベートすることにより、結合した接合体を検出する。
９．５０μl／ウェルの３Ｍ ＮaＯＨを加えることにより基質反応を停止させた後、マイクロプレート分光光度計を使用して発色（４０５nmにおけるＯＤ）を定量する。
【００７４】
試算及び判定
１．重複するＶＺＶ及びＭＲＣ−５被覆ウェルのＯＤ値をそれぞれ平均する。経験から、ＭＲＣ−５のＯＤは異なる試料及び希釈物間で一貫していることが判っている。従って、プレート全体のＭＲＣ−５値を平均し、これを使用して一次抗体または接合体の未感染細胞抽出物への非特異的結合を補正する。ＭＲＣ−５の平均ＯＤをＶＺＶの平均ＯＤからそれぞれ減算し、ＶＺＶ特異的ＯＤ（ΔＯＤ値）を得る。
２．抗原量測定用標準曲線の生成：
標準曲線ΔＯＤ値を既知の抗原濃度（単位ＶＺＶ／ml）に対してプロットする。データを適当なグラフ作成プログラム（例えばCricket Graphバージョン1.3,Cricket Software,Malvern,PA）に入力し、曲線の直線形部分を同定し（少なくとも４つの点を含む必要がある）、「線形適合式」（ｙ＝ａ＋ｂｘ）を得る。
３．検査試料の抗原量の計算：
ａ及びｂの値は線形適合式によって与えられ、ｙ（ΔＯＤ）は既知である。単位／ｍｌ抗原を表わす残りの未知数ｘを計算し、試料希釈度によって補正し、未希釈試料の抗原濃度を得ることができる。一般計算法の一例は以下の通りである：
【００７５】
【表６】
2004323531.tif 000007
記録される抗原濃度は、標準曲線の線形部分内でΔＯＤ値を与える最少希釈試料を用いて得られるものである。
【実施例１０】
【００７６】
臨床試験：
抗帯状疱疹ワクチンの効能を試験する方法は下記の通りである。
ａ．帯状疱疹感受性成人集団の予防接種前のＶＺＶ応答細胞数、抗ＶＺＶ抗体及びＶＺＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞レベルを得る；
ｂ．十分に大きな第１のＶＺＶ感受性成人集団を、生、不活化またはサブユニットＶＺＶワクチンで接種し、十分に大きな第２の同様の成人集団（対照）を、生、不活化またはサブユニットＶＺＶを除いたＶＺＶワクチン希釈物で接種する；
ｃ．接種後の応答細胞数、抗ＶＺＶ抗体及びＶＺＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞の値を得る；
ｄ．（ｃ）で得られた値を（ａ）で得られた値と比較し、接種後３カ月以内にＶＺＶ応答細胞数の３０％増加、ＶＺＶ特異的抗体の増加、及びＶＺＶ特異的Ｔ細胞の増加をもって抗ＶＺＶワクチン効能の指標とする。