(57)【要約】【課題】ＩｇＡ腎症の発症機構の解明や根本的な治療薬の開発に有効なＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物を提供する。【解決手段】ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損し、ヒトＩｇＡ腎症に特有の症状を発症し、また、ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損するという遺伝的に明確な特徴を有するので、ＩｇＡ腎症のモデル動物として極めて有用である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損し、ＩｇＡ腎症の症状を呈することを特徴とするＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物。
【請求項２】
上記β−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子が、配列番号１記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１記載のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物。
【請求項３】
上記非ヒト動物が、げっ歯目動物であることを特徴とする請求項１又は２記載のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物。
【請求項４】
上記げっ歯目動物が、マウスであることを特徴とする請求項３記載のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物に被験物質を投与し、ＩｇＡ腎症の症状を改善するか否かを判別することを特徴とするＩｇＡ腎症の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＩｇＡ腎症の発症機構の解明や治療薬の開発に用いられる、ＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＩｇＡ腎症は、糸球体メサンギウム細胞及び基質の増殖性変化と、メサンギウム領域へのＩｇＡを主体とする沈着物とを認めるものをいい、我が国の慢性糸球体腎炎のうち約半数を占める代表的な腎炎である。１０代から４０代までの幅広い年齢層で発症し、一般に腎機能が徐々に低下するといった緩慢な経過をたどるが、発症後約２０年で３割から４割の患者が末期腎不全に移行し、人工透析治療や腎移植を余儀なくされるといわれる。ＩｇＡ腎症発症の原因は不明であり、血中のＩｇＡを主体とする免疫複合体の糸球体への沈着によって引き起こされるという説が有力であるが、免疫複合体を構成する原因抗原や、免疫複合体の形成の機構等も不明である。自己抗原、食物抗原、ウイルス抗原、細菌抗原等が原因抗原の候補として例示されているが、確定的な証拠は得られていない。ＩｇＡ腎症患者の血清及び糸球体沈着性ＩｇＡにおいて多量体ＩｇＡが形成される原因としては、高ＩｇＡ血症やＩｇＡ１ヒンジ部の糖鎖不全等が考えられている。
【０００３】
ＩｇＡ腎症は、患者に対する精神的・経済的負担が極めて大きく、日本では特定疾患の指定を受ける重要な腎疾患であるが、発症機構が不明であることから根本的な治療方法や治療薬が得られていないのが現状である。したがって、ＩｇＡ腎症の治療薬の研究者らから、発症機構を解明するための適切なモデル動物の開発が渇望されている。
【０００４】
ＩｇＡ腎症のモデル動物としては、例えばクローズド・コロニーの動物として市販されているＤＤＹ系マウスを素材として、ＩｇＡ腎症の早期発症と高率発症を目標に掲げ血清ＩｇＡ値を指標とした選抜育種を実施し、早期かつ高率に当該病態を発現するヒトＩｇＡ腎症様病態発現マウスが、ＩｇＡ腎症の病態研究のためのモデル動物として提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、血清中のＩｇＡ値が高値であることがＩｇＡ腎症の発症原因であるとはいえないため、単に高ＩｇＡ血症のマウスを選抜育種し、さらに近交系化して作製された上述のモデルマウスでは、ＩｇＡ腎症の根本的な発症原因を突き止めるには不十分である。また、このモデルマウスのＩｇＡ腎症の発症原因は全くわかっていない。
【０００６】
ところで、β−１，４−ガラクトース転移酵素（以下、β−１，４−ＧａｌＴ又はＧａｌＴと称することがある。）（ＥＣ  ２．４．１．３８）は、２型基幹構造（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ）の生合成に必須な糖転移酵素であり、この構造は糖タンパク質のＮ型糖鎖やＯ型糖鎖並びに糖脂質に広く見られる。特に、２型基幹構造は、免疫系で重要な役割を担っているシアリルルイスｘや初期発生に重要なＳＳＥＡ−１に必須である。β−１，４−ＧａｌＴ遺伝子は最近までひとつと思われてきたが、１９９７年から１９９８年に次々と新しい遺伝子が単離され、現在、７つからなる遺伝子ファミリーを形成していることが明らかとなった。
【０００７】
これらの遺伝子ファミリーのうち、最初に単離されたβ−１，４ＧａｌＴ−Ｉについて、本発明者や他のグループがノックアウトマウスを作製している（非特許文献１，２参照。）。特に非特許文献１においては、β−１，４ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスに関して、若干のβ−１，４−ＧａｌＴ残存活性や２型基幹構造に対応する薄いバンドが検出されたが、これらは他のβ−１，４−ＧａｌＴ遺伝子によるものと考えられること等が記載されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開２００２−３６０１１８号公報
【非特許文献１】
Ａｓａｎｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  β−１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １６：  １８５０−１８５７  （１９９７）．
【非特許文献２】
Ｌｕ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  β−１，４−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  １８１：  ２５７−２６７  （１９９７）．
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、特許文献１に記載のモデル動物だけではＩｇＡ腎症の解明に不十分であるため、より適切なモデル動物の開発が望まれている。また、非特許文献１，２には、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子ノックアウトマウスの作製方法等が記載されているが、当該マウスが腎臓に病変を示すことについては全く記載されていない。
【００１０】
そこで本発明は、ＩｇＡ腎症の発症機構の解明や根本的な治療薬の開発に有効なＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、β−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子ノックアウトマウスについて鋭意研究を進めたところ、当該マウスが典型的なＩｇＡ腎症を発症しており、係るノックアウトマウスをＩｇＡ腎症の発症機構の解明に必要不可欠なＩｇＡ腎症のモデル動物として利用可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明に係るＩｇＡ腎症発症モデルノックアウト非ヒト動物は、ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損し、ＩｇＡ腎症の症状を呈することを特徴とする。
【００１３】
以上のようなＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物は、メサンギウム増殖性変化（光顕所見）、メサンギウム領域を主体とするＩｇＡの沈着（免疫組織所見）、及びメサンギウム基質内、特にパラメサンギウム領域を主体とする高電子密度の物質沈着（電顕所見）の他、血尿、タンパク尿、血中ＩｇＡ濃度の上昇、血中におけるＩｇＡ多量体の優位性といったヒトＩｇＡ腎症に特有の症状を発症し、また、ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損するという遺伝的に明確な特徴を有するので、ＩｇＡ腎症のモデル動物として極めて有用である。
【００１４】
β−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉは糖タンパク質の２型基幹構造（Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ）の生合成で重要な役割を担うことから、ＩｇＡ腎症を発症する一因として、β−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損した非ヒト動物ではＩｇＡ分子を構成する糖鎖構造に異常を生じ、ＩｇＡ分子が多量体を形成しやすい性質に変化したことが挙げられる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物について、詳細に説明する。
【００１６】
本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物は、ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ（以下、単にＧａｌＴ−Ｉと称することがある。）遺伝子が欠損し、ＩｇＡ腎症の症状を呈することを特徴とし、ヒトＩｇＡ腎症のモデルとして利用される動物のことである。ここで非ヒト動物とは、例えばマウス、ラット等のげっ歯目動物等のヒト以外の動物を指し、中でも繁殖が容易である等の利点を有することからマウスを用いることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
ヒトのＩｇＡ腎症とは、臨床症状として糸球体メサンギウム細胞と基質の増殖性変化と、メサンギウム領域へのＩｇＡを主体とする沈着物とを認める症状を呈する疾患をいう。ＩｇＡ腎症の診断基準は統一されていないが、下記表１に示す症状のうち、腎生検による３項目の症状、すなわち、巣状分節性からびまん性全節性までのメサンギウム増殖性変化（光顕所見）、びまん性にメサンギウム領域を主体とするＩｇＡの沈着（免疫組織所見）、及びメサンギウム基質内、特にパラメサンギウム領域を主体とする高電子密度物質沈着（電顕所見）を呈する状態を基準として確定診断がなされることが一般的であり、その他に血液検査や尿検査によって下記表１のような症状が現れることがある。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本明細書中で、非ヒト動物がＩｇＡ腎症の症状を呈するとは、非ヒト動物が、上述したヒトのＩｇＡ腎症の診断基準のうち、確定診断となる３項目の症状、すなわち、巣状分節性からびまん性全節性までのメサンギウム増殖性変化（光顕所見）、びまん性にメサンギウム領域を主体とするＩｇＡの沈着（免疫組織所見）、及びメサンギウム基質内、特にパラメサンギウム領域を主体とする高電子密度物質沈着（電顕所見）を呈する状態のことと定義する。
【００２０】
なお、非ヒト動物がＩｇＡ腎症の症状を呈するか否かの判断は、非ヒト動物がマウスである場合、１６週齢の時点とする。
【００２１】
ゲノム中のＧａｌＴ−Ｉ遺伝子が欠損した状態とは、ゲノム中でＧａｌＴ−Ｉ遺伝子に人為的に置換、欠失、付加、挿入等の変異を加えることにより、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子の発現能が抑制又は喪失した状態等を含む。ゲノム中のＧａｌＴ−Ｉ遺伝子が欠損した状態か否かは、動物の組織等から抽出したＤＮＡについてサザンブロット分析を行うこと等によって容易に判別できる。
【００２２】
β−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ（ＧａｌＴ−Ｉ）遺伝子とは、ＧａｌＴ（ＥＣ  ２．４．１．３８）をコードするヒト以外の動物の遺伝子であり、例えばマウスＧａｌＴをコードする遺伝子等が挙げられる。具体的には、配列番号１で示されるマウスＧａｌＴ−Ｉ遺伝子等が挙げられる。コドンの縮重に鑑みれば、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有する遺伝子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる。
【００２３】
つぎに、ＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物の作製方法の一例として、ＩｇＡ腎症の症状を呈するＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスの作製方法を例に挙げて説明する。ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（以下ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）と称することがある。）は、例えば以下のように作製することができる。
【００２４】
ＧａｌＴ−Ｉ染色体遺伝子は、その塩基配列情報に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる。具体的には、ＥＳ細胞がマウス１２９系統由来であるので、１２９／ＳｖＪマウスの染色体ＤＮＡライブラリー（例えば、ＳｔｒａｔａＧｅｎｅ社製）からＧａｌＴ−Ｉ遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選択することにより実施できる。染色体ＤＮＡの起源としては、１２９／ＳｖＪマウスの組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。ＧａｌＴ−Ｉ染色体遺伝子を染色体ＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も特に制限されず、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、これらの組合せ等、通常の方法に従うことができる。
【００２５】
上述の方法等により得たＧａｌＴ−Ｉ遺伝子の配列のうち、エキソン部分、特に本発明ではエキソン１に、例えばネオマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子等を挿入してエキソンの機能を破壊してターゲティングベクターを作製する。また、エキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって結果的にＧａｌＴ−Ｉ遺伝子を破壊するようにターゲティングベクターを作製することもできる。さらに、ポジティブ−ネガティブ選択が可能となるように、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子の端部に例えばＭＣ１プロモーター支配のジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を付加することが好ましく、これによってランダム組換え体を除去して相同組換え体を効率よく取得できる。
【００２６】
このターゲティングベクターをマウス等のＥＳ細胞に導入し、細胞ゲノムＤＮＡの同遺伝子がターゲティングベクター中の変異配列に相同組換えされた細胞を選択する。このような相同組換えを生じた細胞の選択は、例えばＧ４１８を細胞培地に添加してマーカー遺伝子を持たない非組換え細胞を除去することにより実現できる。ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子を付加した場合、ランダムな組換え細胞はジフテリア毒素Ａフラグメントが発現することによって除去される。選択された相同組換えを生じた細胞の遺伝子は、例えばそのコード配列中にマーカー遺伝子が挿入された変異配列を有し、ＧａｌＴ−Ｉを発現することはできない。
【００２７】
ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入は、常法に従って行うことができ、具体的にはエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。ＥＳ細胞としては、例えば胚盤胞の内部細胞塊由来のものを用いることができる。
【００２８】
次いで、相同組換えの生じた細胞を選択する。選択は、例えば、選択マーカーの表現型や、サザンブロット法による標的配列とのハイブリダイゼーションの検出、またはＰＣＲによる増幅断片長の解析などにより行うことができる。選択マーカーの使用は、この選択を容易にする点で好ましい。
【００２９】
次いで、選択された細胞をマウスの初期胚に注入し、この初期胚を偽妊娠雌マウスの胎内に移植し、個体へと発生させ、キメラマウスを産出させる。キメラマウスの生殖細胞が相同組換え体に由来すれば、このキメラマウスを野生型マウスと交雑することによって、対立遺伝子の一方でＧａｌＴ−Ｉ遺伝子を欠損したヘテロ接合体のマウスを得ることができる。そして、ヘテロ接合体のマウス同士を交雑することによって、対立遺伝子の両方でＧａｌＴ−Ｉ遺伝子が欠損したホモ接合体のノックアウトマウスを得ることができる。
【００３０】
本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物は、ゲノム中のＧａｌＴ−Ｉ遺伝子の欠損という遺伝的に明確な特長を有するため、従来のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物と比較して、発症要因の遺伝的解析をより効率的に進めることができ、ＩｇＡ腎症の発症機構解明の研究開発への貢献が極めて大きい。また、本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物は、ヒトＩｇＡ腎症の症状と酷似した症状を呈するため、ＩｇＡ腎症治療薬のスクリーニングや、ＩｇＡ腎症治療薬の候補化合物等の効果を評価する用途においても極めて有用である。
【００３１】
また、本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物に新薬候補化合物等の被検物質を投与し、ＩｇＡ腎症の症状を改善しうるか否かを判別することによって、ＩｇＡ腎症の治療薬をスクリーニングすることができる。また、ＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物由来の細胞を培養し、当該細胞に被検物質を投与することによっても、上述の動物個体と同様にＩｇＡ腎症の治療薬のスクリーニングが可能である。特にこの方法は、多数の動物を飼育する必要がないので、一度に大量の被検物質を扱う場合や、一次スクリーニングを行う場合等に有効である。
【００３２】
【実施例】
次に、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００３３】
１．ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスの作製
ＩｇＡ腎症発症を発症するＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスは、具体的には以下に述べるような方法（非特許文献１参照）で作製することができる。
【００３４】
〈実験１  ターゲティングベクターの構築〉
ターゲティングベクターの構築には、１２９／ＳｖＪゲノムライブラリー（ＳｔｒａｔａＧｅｎｅ社製）から単離したＧａｌＴ−Ｉ遺伝子を用いた。先ず、ホスホグリセリン酸キナーゼＩプロモーター支配で発現するようにネオマイシン耐性遺伝子が結合され、ネオマイシン耐性遺伝子の下流にウシ成長ホルモン由来のポリＡ化付加部位が結合されたＰＧＫｎｅｏｂｐＡカセット（Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）を、ポジティブ選択用にＧａｌＴ−Ｉのエキソン１のＳａｃＩＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入した。ＭＣ１プロモーター支配で発現するようにジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子が結合されたＤＴ−Ａカセット（Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）を、ネガティブ選択用にターゲティングベクターの５’末端に結合した。その結果、得られたターゲティングベクターにおいてはエキソン１のほとんど（ＳａｃＩＩからＮｏｔＩまでの４２０ｂｐ）が欠失され、５’及び３’末端でそれぞれ５．７ｋｂ及び１．７ｋｂの相同領域を有していた。
【００３５】
〈実験２  ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスの作製〉
先ず、線状化したターゲティングベクター（２０μｇ）をエレクトロポレーション法（２５０Ｖ、５００μＦ）によって１０７個のＲ１  ＥＳ細胞（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）に導入し、導入後のＥＳ細胞を１８０μｇ（活性型）／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）添加培地で７〜１０日間培養し、Ｇ４１８抵抗性のコロニーを選択した。Ｒ１  ＥＳ細胞は、カナダトロントのＭｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｓａｍｕｅｌ  Ｌｕｎｅｎｆｅｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  のＡｎｄｒａｓ  Ｎａｇｙ博士より分与された。培地としては、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）に１５％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、１０００ｕ／ｍｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ
Ｆａｃｔｏｒ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）を加えたものを用いた。
【００３６】
次に、選択したコロニーからＰＣＲによって相同組換え体をスクリーニングし、サザンブロットハイブリダイゼーションによって相同組換えを起こしたことを確認した。ＰＣＲのＰＧＫｎｅｏｂｐＡカセットのフォワードプライマー（Ｐ１）としては、ＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧ（配列番号２）を用い、ターゲティングベクターの外側のリバースプライマー（Ｐ２）としては、ＣＡＣＡＧＴＣＣＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＧ（配列番号３）を用いた。ＰＣＲ条件は、５０μｌ溶液〔１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭ  Ｐ１及びＰ２プライマー、２．５Ｕ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ〕について、（９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で３分間）×４０サイクルとした。
【００３７】
次に、改変した凝集法  （Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）によりキメラマウスを作製した。キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌と交配し、得られたヘテロ接合体同士の交雑によりホモ接合体の変異体マウスを作製した。マウスの尾部からＤＮＡを抽出し、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子のエキソン１を野生型対立遺伝子−特異的プローブとして、及びｎｅｏ遺伝子を変異型対立遺伝子−特異的プローブとして用い、ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションによって遺伝子型を決定した。作製されたマウスは、金沢大学大学院医学系研究科の動物実験施設内のクリーンルームで、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）環境で維持されている。
【００３８】
〈実験３  サザンブロット分析及びノーザンブロット分析〉
サザンブロット分析は、ＥＳ細胞から調製したゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、０．７％アガロースゲルにて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写することにより行った。ノーザンブロット分析は、ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法によって全ＲＮＡを肝臓から調製し、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製し、０．８％変性アガロースゲルにてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写することにより行った。Ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅｄ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）による３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを用いた一般的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）によってハイブリダイゼーションを行った。
【００３９】
〈結果〉
ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子の長鎖型及び短鎖型両者の発現を阻害するよう、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子のエキソン１をＰＧＫｎｅｏｂｐＡカセットで置換したターゲティングベクターを構築した。このコンストラクトでは、両型の翻訳開始部位と、エキソン１のゴルジ体貯留シグナルが欠失している（図１Ａ）。なお、図１Ａ中、スクリーニングのために用いたＰＣＲプライマー（Ｐ１及びＰ２）を矢頭で表しＨｉｎｄＩＩＩ断片を矢印で示す。また、ＢＨはＢａｍＨＩを、ＨｄはＨｉｎｄＩＩＩを、ＲＩはＥｃｏＲＩを、ＳａはＳａｃＩＩを、ＮｏはＮｏｔＩの制限サイトをそれぞれ表す。
【００４０】
次に、構築されたターゲティングベクターをエレクトロポレーション法によってＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８抵抗性のコロニーを選択した。１８０のＮｅｏｒクローンからＰＣＲによって１２のポジティブクローンを得、外側３’−プローブ及び５’−プローブを用いたサザンブロット分析によって相同組換えを確認した（図１Ｂ）。
【００４１】
３つのターゲティングされたＥＳ細胞クローンを用いてキメラマウスが作製され、２つの独立したＥＳ細胞クローンでターゲティングされた対立遺伝子座が生殖系列を通して伝達された。そして、ＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウス間で交配を行いＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）を作製した。その結果、２つのマウスの系列で同じ表現型を示した。ノーザンブロット分析を行った結果、ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）からＧａｌＴ−ＩのｍＲＮＡは検出されず、ＧａｌＴ−Ｉ遺伝子が欠損したことがわかった（図１Ｃ）。
【００４２】
２．ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）がＩｇＡ腎症を発症するか否かの確認
【００４３】
〈実験４〉
つぎに、以上のように作製したＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスについて、ヒトＩｇＡ腎症の確定診断である以下の３つの所見が見出されるか否かを確認すべく、実証実験を行った。
（１）巣状分節性からびまん性全節性までのメサンギウム増殖性変化（光顕所見）
（２）びまん性にメサンギウム領域を主体とするＩｇＡの沈着（免疫組織所見）
（３）メサンギウム基質内、特にパラメサンギウム領域を主体とする高電子密度物質沈着（電顕所見）
【００４４】
なお、ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスの作製過程で生じるヘテロ接合体（ＧａｌＴ−Ｉ＋／−）マウス（＋／−）は、対立遺伝子の両方でＧａｌＴ−Ｉ遺伝子が維持されている野生型（ＧａｌＴ−Ｉ＋／＋）マウス（＋／＋）に比べてＧａｌＴ−Ｉの発現強度が半分であるが、これらＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスとＧａｌＴ−Ｉ＋／＋マウスとで合成される糖鎖の構造及び量に変化がないことを確認したため、以下の実験ではＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスをＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）（ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウス）のコントロールとして用いることとした。
【００４５】
先ず、メサンギウム細胞の増殖性の変化を確認するために、常法に従って糸球体をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）で染色し、光学顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。ＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスにおいては、赤色に染色された赤血球が観察されたが、一方、Ｇａｌ−Ｉ−／−においては、赤血球がほとんど観察されず、メサンギウム細胞の異常増殖、メサンギウム基質の増加、及び係蹄の消失が観察され、ヒトＩｇＡ腎症と同様の病変を表していた。したがって、実験４の結果から、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスは、ＩｇＡ腎症の確定診断の１つである、（１）巣状分節性からびまん性全節性までのメサンギウム増殖性変化（光顕所見）を示すことが明らかとなった。
【００４６】
〈実験５〉
次に、メサンギウムの増生及び免疫複合体の沈着を確認するために、様々な染色を行った。ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスの腎組織を採取し、常法に従ってＰＡＳ（ｐ−ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）染色、ＰＡＭ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ  ｓｉｌｖｅｒ）染色、及びマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行い、光学顕微鏡で糸球体を観察した。結果を図３に示す。メサンギウムの増生は、ＰＡＳ染色した場合には濃いピンク色、ＰＡＭ染色した場合には黒褐色、マッソントリクローム染色した場合には青色として観察され、免疫複合体の沈着物は、マッソントリクローム染色した場合には赤色として観察される。特にマッソントリクローム染色した場合において、ＧａｌＴ−／−マウスの糸球体に免疫複合体が沈着しているのが容易に判別された。
【００４７】
〈実験６〉
次に、実験５で確認された免疫複合体がＩｇＡを含むものであるかどうかを判別するために、抗ＩｇＡ抗体による免疫組織化学染色を行った。具体的には、腎臓を還流固定した後、凍結ブロックを作製し、クリオスタットを用いて３μｍの薄さの切片を作製した。次に、一次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）をその切片上のＩｇＡと反応させた後、さらに二次抗体としてＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：蛍光色素）結合ラビット抗ＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を一次抗体に結合させた。その切片を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。その結果、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスの糸球体にＩｇＡの特異的な沈着が観察された。このことから、実験５で確認された免疫複合体はＩｇＡを含むことが確認された。
【００４８】
〈実験７〉
ヒトＩｇＡ腎症では、ＩｇＡ以外の他の免疫グロブリンも糸球体へ沈着することが知られている。そこで、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスにおいても、ヒトＩｇＡ腎症と同様に他の免疫グロブリンが糸球体に沈着するか否かを調べた。具体的には、実験６の手法と同様であるが、一次抗体としてＩｇＧを検出する際にはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）、ＩｇＭを検出する際にはヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を使用し、二次抗体として実験６と同じものを使用して、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図５に示す。ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスは、ＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスと比べてＩｇＧ及びＩｇＭともに良好に染色され、特にＩｇＭの沈着が顕著であった。
【００４９】
以上の実験５〜７の結果から、ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）は、ＩｇＡ腎症の確定診断の１つである、（２）びまん性にメサンギウム領域を主体とするＩｇＡの沈着（免疫組織所見）を示すことが明らかとなった。
【００５０】
〈実験８〉
次にＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスの糸球体を電子顕微鏡で観察し、ヒトＩｇＡ腎症の診断根拠となるメサンギウム基質内、特にパラメサンギウム領域を主体とする高電子密度物質の沈着が認められるかどうかの確認を行った。結果を図６に示す。写真中、ＭＥＳ又はＭはメサンギウム細胞、ＥＰは上皮細胞、ＲＢＣ又はＲは赤血球、ＥＮＤ又はＮは内皮細胞をそれぞれ表す。その結果、写真より、パラメサンギウム領域に電子密度の高い部位（図中、点線内）が観察された。したがって、実験８の結果から、ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）は、ＩｇＡ腎症の確定診断の１つである、（３）メサンギウム基質内、特にパラメサンギウム領域を主体とする高電子密度物質沈着（電顕所見）を示すことが明らかとなった。
【００５１】
以上の実験４〜８の結果から、ヒトＩｇＡ腎症の診断を確定する３つの所見がいずれもＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウスにおいて観察されることが明らかとなった。したがって、ＧａｌＴ−ＩノックアウトマウスはヒトＩｇＡ腎症と類似の症状を発症しており、ＩｇＡ腎症の発症機構の解明や、ＩｇＡ腎症の治療薬の開発に用いられるためのＩｇＡ腎症発症モデル動物として利用可能であることが確認された。
【００５２】
つぎに、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスのＩｇＡ腎症のモデル動物としての有用性を明らかとするために、さらに以下の実験９及び１０の実験を行った。
【００５３】
〈実験９〉
ヒトＩｇＡ腎症では、確定診断の根拠ではないが、持続的な顕微鏡的血尿が必見所見として、また、持続的又は間欠的タンパク尿が頻発所見としてみられる。そこで、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスもこれらの症状を呈するか確認した。
【００５４】
先ず、血尿について検討した。具体的にはマウスから採尿後、尿試験紙（ウロペーパーＩＩ、栄研化学社製）を用いて潜血を検出した。結果を表２に示す。ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスにおいては２６匹中７匹（２７％）に血尿が観察されたが、ＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスにおいては血尿は全く観察されなかった。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
次に、タンパク尿について検討した。具体的には、上記の尿試験紙を用いて尿中のタンパク質量を４段階で判定した。結果を図７に示す。ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスでは４段階評価で２．１程度、ＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスでは１．６程度と、統計学的に有意差が認められた。
【００５７】
以上の実験９の結果からＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）においても、一部の個体ではあるが、ヒトＩｇＡ腎症と同様に血尿及びタンパク尿が見られることが明らかとなった。
【００５８】
〈実験１０〉
ヒトＩｇＡ腎症では、確定診断の根拠ではないが、血清ＩｇＡ値が高値であることが頻発所見として見られ、また、「血中にＩｇＡを含む免疫複合体の存在」及び「血清及び糸球体沈着性ＩｇＡにおける多量体ＩｇＡの優位性」といった特徴が見られる。そこで、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスもこれらの特徴を示すかどうか確認した。
【００５９】
先ず、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウス及びＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスから血液を採取し、ＥＬＩＳＡによって、血清中ＩｇＡ値の測定を行った。具体的には、抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ｍ＋Ａ）抗体（Ｃｏｐｐｅｌ社製）を９６ウェルプレートに固層化させた後、バックグラウンドを抑えるためにＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（雪印乳業社製）でブロッキングしたプレートに、５０倍希釈から順次３倍ずつ希釈したサンプル血清を加えて抗体と反応させた。５回の洗浄の後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を結合させた抗マウスＩｇＡ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を反応させ、５回の洗浄の後、ＨＲＰの基質であるＡＢＴＳ（２，２’−ＡＺＩＮＯ−ｂｉｓ（３−ＥＴＨＹＬＢＥＮＺ−ＴＨＩＡＺＯＬＩＮＥ−６−ＳＵＬＦＯＮＩＣ−ＡＣＩＤ）を加えて発色させた。吸光度はＯＤ４０５ｎｍで測定した。結果を図８に示す。図８より、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスはＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスに比べて血清中のＩｇＡ濃度が高い値を示すことが明らかとなった。また、血清の希釈率を下げるとＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスの吸光度がＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスの約２倍となることから、１つの分子に２つの抗ＩｇＡ抗体認識部位があること、すなわち、ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）においては、血清中でＩｇＡが２量体の状態で存在することが示唆された。
【００６０】
次に、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスの血清中でＩｇＡが２量体の状態で存在するかどうかを確認するために、血清中ＩｇＡについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析を行った。具体的には、非還元条件下に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでサンプルを電気泳動した後、メンブレンにゲル上のタンパク質を転写した。ヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）をメンブレンと反応させ、次にビオチン化抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ社製）、アビジン−ＨＲＰ複合体（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ社製）を順次反応させ、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で化学発光させてＸ線フィルムに感光し、ＩｇＡを検出した。ところでＩｇＡ分子を熱変性させると凝集を起こすことが知られていることから、ＩｇＡ分子の標品を６５℃、３０分間の条件で熱変性させ、これをＩｇＡ分子の２量体のマーカーとして用いた。結果を図９に示す。
【００６１】
図９から明らかなように、ＧａｌＴ−Ｉ＋／−マウスでは、通常のマウスＩｇＡ単量体の理論上の分子量である約１７０ｋＤにバンドが検出され、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスでは、ＩｇＡの２量体（熱変性ＩｇＡ）に対応した約３００ｋＤにバンドが検出された。このことから、ＧａｌＴ−Ｉ−／−マウスの血清中においては、２量体ＩｇＡが単量体ＩｇＡに比べて優位に存在することが確認された。この傾向は、ＩｇＡを４０ｎｇとした場合においても同様であった。ＩｇＡ分子が血清中で２量体等の多量体として存在する理由としては、ＧａｌＴ−Ｉの欠損によってＩｇＡ分子の糖鎖構造に異常が生じ、ＩｇＡ分子自体が多量体を形成しやすい性質に変化したことが挙げられる。
【００６２】
以上の実験９及び実験１０の結果から、ＩｇＡ腎症の確定診断の症状以外の点でもＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）は、ヒトＩｇＡ腎症と酷似した症状を示すことが明らかとなった。このことから、本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物は、既存のＩｇＡ腎症発症モデル動物に比べてＩｇＡ腎症の発症機構の解明に非常に有利であり、有効な治療方法及び治療薬の研究開発に大いに貢献することができるといえる。
【００６３】
【発明の効果】
本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物は、ヒトＩｇＡ腎症に特有の症状を発症し、また、ゲノム中のβ−１，４−ガラクトース転移酵素−Ｉ遺伝子を欠損するという遺伝的に明確な特徴を有するので、ＩｇＡ腎症のモデル動物として極めて有用である。したがって、本発明のＩｇＡ腎症発症モデル非ヒト動物をヒトＩｇＡ腎症のモデルとして利用することで、ＩｇＡ腎症の発症機構の解明、根本的な治療法及び新規な治療薬の開発に大きく貢献することができる。
【００６４】
【配列表】
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【００６５】
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）は、Ｇａｌ−Ｔノックアウトマウス及び野生型マウスの遺伝子地図である。（Ｂ）は、親ＥＳ細胞（Ｒ１）由来のゲノムＤＮＡ（１０μｇ）及びターゲティングされたＥＳ細胞クローンを、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化し、３’プローブでハイブリダイズしたＥＳ細胞クローンのサザンブロット分析の結果を示す図であり、レーン１−Ｄ２、レーン５−Ａ３及びレーン１−Ａ２は相同組換えを生じたＥＳ細胞、レーンＲ１は相同組換えを生じなかった細胞である。突然変異対立遺伝子座（Ｍｔ）及び野生型対立遺伝子座（Ｗｔ）で、予期されたＤＮＡ断片のバンドが示された。（Ｃ）は、肝臓から調製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（１μｇ）をＧａｌＴのエキソン１及びエキソン２プローブとハイブリダイズし、β−アクチンプローブでリハイブリダイズした、野生型（＋／＋）、コントロール（＋／−）及びＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）のノーザンブロット分析の結果を示す図である。
【図２】ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）及びコントロール（＋／−）の糸球体をヘマトキシリンエオジン（ＨＥ）染色した写真である。
【図３】ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）及びコントロール（＋／−）の糸球体をその他の染色法で染色した写真である。
【図４】ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）及びコントロール（＋／−）の糸球体を抗ＩｇＡ抗体で免疫組織化学染色した写真である。
【図５】ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）及びコントロール（＋／−）の糸球体を抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＭ抗体で免疫組織化学染色した写真である。
【図６】ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）の糸球体を電子顕微鏡により観察した写真であり、左が低倍率、右が高倍率である。
【図７】ＧａｌＴ−Ｉノックアウトマウス（−／−）及びコントロール（＋／−）の尿中タンパク質の量を分析した結果を示すグラフである。
【図８】ＥＬＩＳＡにより血清中のＩｇＡ分子の量を測定したグラフである。
【図９】血清中ＩｇＡをウェスタンブロット法により分析した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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