(57)【要約】【解決課題】両性担体を用いず、安定なｐＨ勾配を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子とそれを用いたフリーフロー等電点電気泳動法を提供することにある。【解決手段】２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動素子において、電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を、酸基と塩基とが結合した両性高分子により構成する。【選択図】        図４
2004294334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動素子において、電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面が、酸基と塩基とが結合した両性高分子により構成されていることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項２】
請求項１記載のフリーフロー電気泳動素子において、前記両性高分子が膜形状とされ、２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を構成していることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項３】
請求項１または２記載のフリーフロー電気泳動素子において、前記両性高分子はカルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子であることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動素子において、前記両性高分子はカルボキシル基とアミノ基を結合したポリアクリルアミドであることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動素子において、両性高分子の該酸基と塩基の割合を変化させ、電気泳動槽の両端に配置される１対の電極との間で、一方電極から他方電極に向けて、ｐＨが増加または減少していることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動素子において、両性高分子に酸基と塩基が結合しており、電気泳動槽が液の流れに沿って複数の隔壁で区切られており、隔壁で区切られた電気泳動槽の各部分を形成する２枚の平板電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を、酸基と塩基の結合の割合が異なる両性高分子によって構成し、電気泳動槽の両端に配置される１対の電極との間で、一方電極から他方電極に向けて、ｐＨが増加または減少していることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載のフリーフロー電気泳動素子において、電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも１つの面に、酸基と塩基を結合した両性高分子を含む板が該両性高分子が電気泳動槽側に向けて取外し可能に配置されて、前記少なくとも一方の面を構成していることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項８】
請求項１乃至７記載のフリーフロー電気泳動素子において、電気泳動槽の間隔が１５０μｍ以下であることを特徴とするフリーフロー電気泳動素子。
【請求項９】
請求項１乃至８記載のフリーフロー電気泳動素子を用い、等電点電気泳動を行うことを特徴とするフリーフロー等電点電気泳動法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に流しながら試料溶液中に含まれる溶質の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動素子とそれを用いたフリーフロー電気泳動法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
フリーフロー電気泳動とは、２枚の板に挟まれて構成された液体流路としての電気泳動槽に試料と緩衝液を連続的に注入しながら電気泳動により分離及び分取を行う電気泳動法である。分離操作は予め緩衝液注入口から一定流速で支持液を流して複数の流出口への液の流れを作り、試料注入口から試料を注入する。泳動槽内部は狭い空間特有の物理的現象によって強い層流が実現されているため、異なる液体を連続的に流すと液体が拡散しにくく、ほぼ直線的に流出口に向かって流れ出る。泳動槽の両端に形成した１対の電極間に電圧を印加すると、試料に含まれる物質は電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動しながら流出口に流出する。物質によって泳動の方向及び速度が異なるため、試料に含まれる物質は分離しながら流出口に流出する。従って、複数の流出口の中から特定の分取口より液を取り出すことにより試料の分取が行える。
【０００３】
フリーフロー電気泳動法の一手法に、フリーフロー等電点電気泳動があるが（例えば、非特許文献１参照）、フリーフロー等電点電気泳動法は両性担体の混合液を含んだ緩衝液を用い、電圧印加により電極間の溶液にｐＨ勾配を作って、等電点を有する試料を等電点分離する方法であり、主にタンパク質の分離に用いられる。非特許文献１は、電気泳動槽に両性担体の混合液を含んだ緩衝液と陽極側部液と陰極側部液と陽極電極液と陰極電極液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の等電点分離と分取を行うフリーフロー等電点電気泳動法が報告している。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９９６，１７，１９０６−１９１０（例えば、図３Ｂ，１９０８〜１９０９頁“３．３Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｄｅｔａｉｌｓ”参照）
【０００５】
より詳しく述べると、非特許文献１では、電気泳動槽としては長さ５００ｍｍ、幅１００ｍｍ、深さ０．４ｍｍのフリーフロー電気泳動装置を用い、電気泳動槽の中央部に０．５％の両性担体の混合液と０．２％のヒドロキシプロピルメチルセルロースを含んだ緩衝液を、電気泳動槽の陽極側の側部に０．２％のヒドロキシプロピルメチルセルロースを含んだ０．１ｍ  ｍｏｌ／ｌリン酸水溶液を、電気泳動槽の陰極側の側部に０．２％のヒドロキシプロピルメチルセルロースを含んだ０．１ｍ  ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液を、陽極電極液として０．１ｍ  ｍｏｌ／ｌリン酸水溶液を、陰極電極液として０．１ｍ  ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて、フリーフロー等電点電気泳動を行う手法が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
非特許文献１に報告されている手法は、両性担体の混合液を含んだ緩衝液を用い、電場による両性担体の泳動によって電極間にｐＨ勾配を形成する方法である。両性担体には複数種のものが市販されているが、等電点電気泳動を行うに当たり、狭い範囲のｐＨ勾配が作りにくい、再現性が良くない等の問題点を有する。特にフリーフロー等電点電気泳動では分離後に分取して２次分析を行うに当たり、両性担体がペプチドと似た性質を持っており分離精度に影響を与える可能性もあり、市販のものの成分が公開されておらず未知の部分が多い等の問題を有する。
また、両性担体はペプチドと似た性質を持っているため、試料として蛋白質を断片化してペプチドにしたものを用いた場合、両性担体がペプチドと似た振る舞いをする。したがって、分取液を用いた２次分析を行うに当たり、分取液には分離した試料と一緒に両性担体が含まれるため、分析結果が試料のデーターか両性担体のデータかを判別するのが難しい。また、両性担体は市販のものの成分が公開されておらず未知の部分が多い等の問題を有する。
【０００７】
等電点電気泳動においては、両性担体の問題点を解決する一手段として固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動法が広く利用されている。この方法は支持体となるゲルを作成する際に同時にｐＨ勾配をゲルに固定する方法である。このため、分離中にｐＨ勾配の変化が起こらず、再現性に優れた等電点電気泳動が可能となる特徴があり、二次元電気泳動の一次元目の等電点電気泳動には主にこの手法が用いられている。しかしながら、固定化ｐＨ勾配等電点電気泳動法はゲルを支持体としたゲル電気泳動法であり、無担体で分離と分取を連続的に行うフリーフロー電気泳動法には応用できない。
【０００８】
したがって本発明は、上記問題を解決すべくなされたもので、両性担体を用いず、安定なｐＨ勾配を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子とそれを用いたフリーフロー等電点電気泳動法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のフリーフロー電気泳動素子は、２枚の平板を組み合わせて構成された電気泳動槽に緩衝液と試料溶液とを連続的に注入しながら試料の分離と分取を行うフリーフロー電気泳動素子であって、電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面が、酸基と塩基とが結合した両性高分子により構成されていることを特徴とする。
【００１０】
両性高分子とは、酸基と塩基が結合し酸性およびアルカリ性の両方の性質を有する高分子をいう。電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面が、酸基と塩基とが結合した両性高分子により構成されているので、電気泳動槽内のｐＨの制御が可能となる。均一な両性高分子によって２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を構成する場合には、電気泳動層内が均一なｐＨ値に制御される。また、両性高分子に結合してい酸基の量を多くすると電気泳動槽内を酸性とし、塩基の量を多くするとアルカリ性となる。このようにすることによって、両性高分子に結合する酸基とアルカリ性の量によって決定されるｐＨ値に電気泳動槽を保持することが可能となる。
【００１１】
通常、泳動槽内のｐＨ制御は、用いる緩衝液のｐＨ、もしくは緩衝液に含まれる複数種の両性担体によって制御されるが、本構成では電気泳動槽壁面を構成する両性高分子によってｐＨを制御するため、安定したｐＨ制御を行うことができ、安定した分離が実現可能なフリーフロー電気泳動素子を提供することができる。
【００１２】
また、本発明は、上記フリーフロー電気泳動素子あるいは下記の好ましい実施の態様のフリーフロー電気泳動素子を用い、等電点電気泳動を行うフリーフロー等電点電気泳動法に関する。本方法により、両性担体を用いず、安定なｐＨ勾配を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子法を提供することができる。
【００１３】
【発明の実施の態様】
以下に本発明を詳細に説明する。
上述のとおり、両性高分子とは、酸基と塩基が結合し酸性およびアルカリ性の両方の性質を有する高分子をいう。酸基としてはカルボキシル基、スルホン酸基、燐酸基等が挙げられ、また塩基としては第１，第２，第３アミノ基等が挙げられる。また、高分子としては、ポリアクリルアミド等の親水性高分子が挙げられる。
【００１４】
両性高分子は、電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を構成すればよいが、電気泳動槽のｐＨ雰囲気を制御する観点からは、両性高分子によって電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の対向面を形成することが好ましい。
【００１５】
平板の電気泳動槽側の面を構成する両性高分子は、当該平板の面に板状、膜状等の形状で固定あるいは貼り付けることができるが、これらの形状に限定されない。例えば、電気泳動槽側の面を構成するようにするのであれば、点状、ストライブ状等の不連続形状に形成することも可能である。ただし、両性高分子を収容する凹部を平板の当該面に設ける必要がある。また、当該技術分野においては、酸基および塩基の任意の比率の両性高分子を製造することが可能である。例えば、ポリアクリルアミドの場合、アクリル酸とアクリル酸アミドを所望の比率で共重合させることによって酸基および塩基の所望の比率のポリアクリル酸アミドが得られる。
酸と塩基の比率を連続的に変えて連続的なｐＨ勾配を高分子に固定する方法としては、例えば、市販の固定化ｐＨ勾配ゲル作成用アクリルアミド誘導体を用い、既知の方法で作成することができる。市販の固定化ｐＨ勾配ゲル作成用アクリルアミド誘導体としては、例えば、アマシャムバイオサイエンス社製のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅが挙げられる。また、市販されているシート状またはストリップ状の固定化ｐＨ勾配プレキャストゲルを用い、電気泳動槽側の面に固定あるいは貼り付けることで構成することもできる。シート状またはストリップ状の固定化ｐＨ勾配プレキャストゲルは、アマシャムバイオサイエンス社、バイオラッド社、インビトロジェン社等から複数のものが市販されている。
【００１６】
以下に、本発明の好ましい態様について記載する。それらの任意の組み合わせも、特に矛盾がない限り本発明の好ましい態様である。
（１）  前記両性高分子が膜形状とされ、２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を構成している。膜形状とすることによって、当該面を広く連続的に形成することができ、また膜状であるので両性高分子の量を減らすことができる。
（２）  前記両性高分子はカルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子である。カルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子が最も一般的であり、またたんぱく質等の生体物質との相溶性が良い。カルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子としては、カルボキシル基とアミノ基を結合したポリアクリルアミドが挙げられる。
【００１７】
（３）  両性高分子の該酸基と塩基の割合が、電気泳動槽の両端に配置される１対の電極との間で、一方電極から他方電極に向けて、ｐＨが増加または減少している。従って、電気泳動槽には一方電極から他方電極に向けて特定の範囲のｐＨ勾配が形成されている。電気泳動槽内のｐＨ勾配は、平板の電気泳動槽側の面を構成する両性ポリマーによって形成されているので、ｐＨ勾配が安定して形成でき、再現性の良いフリーフロー等速電気泳動が可能となる。また、両性高分子に結合する酸基と塩基の割合を変えることでｐＨ勾配を自在に設計可能となる。また、ｐＨ勾配の形成に両性担体を用いていないため、２次分析を阻害する夾雑物は含まれない。したがって、本構成により、両性担体を用いず、安定なｐＨ勾配を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子が提供でき、該フリーフロー電気泳動素子を用いることによって良好なフリーフロー等電点電気泳動法が実現できる。
【００１８】
（４）  電気泳動槽が液の流れに沿って複数の隔壁で区切られており、隔壁で区切られた電気泳動槽の各部分を形成する２枚の平板電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を、酸基と塩基の結合の割合が異なる両性高分子によって構成し、電気泳動槽の両端に配置される１対の電極との間で、一方電極から他方電極に向けて、ｐＨが増加または減少させる。
【００１９】
本フリーフロー電気泳動素子は、緩衝液注入口と流出口との間に複数の隔壁が構成されているため、注入口から流出口に向かう流れの拡散を抑えることが可能となる。隔壁で区切られた電気泳動槽は、その内壁に構成された両性高分子によってそれぞれ異なるｐＨとなっているので、隔壁で区切られた電気泳動槽毎にｐＨを制御でき、電極間におけるｐＨ勾配をより安定に維持することが可能となる。したがって、本構成とすることで、より安定した分離を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子を提供することができる。
【００２０】
なお、両性高分子は平板の電気泳動槽側の面を固定的に構成する必要はなく、隔壁で区切られた電気泳動槽毎に帯形状の膜状あるいは板状の高分子固定基板を設置することも可能である。隔壁は対向する注入口構成基板との間に空隙を空けて設けるが、該空隙は緩衝液注入口から流出口までの間、必ずしも一定間隔である必要はなく、部分的に突起を有した構造とすることもできる。この突起を注入口構成基板に接触させるよう構成することで、注入口構成基板と泳動槽構成基板２１との間隔を規制することも可能である。
【００２１】
（５）  電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも１つの面に、酸基と塩基を結合した両性高分子を含む板が電気泳動槽側に向けて取外し可能に配置されて、前記少なくとも一方の面を構成している。
両性高分子により構成した平板面は、両性高分子の性能が劣化するため、劣化に応じて交換する必要が生ずる場合がある。本構成とすることで、両性高分子を含む板と電気泳動槽を構成する平板とが分離可能となり、劣化した両性高分子を含む板のみを交換することができる。このため、ランニングコストを下げることが可能となる。なお、「両性高分子を含む板」とは、段落００１４の電気泳動槽側の面を構成する「板状、膜状等の連続形状、点状、ストライブ状等の不連続形状」を包含する意味で用いている。
【００２２】
また、電気泳動槽を構成する２枚の平板は繰り返し使うことが可能であるため、コストのかかる複雑な形状を構成することも問題ではなくなる。例えば、泳動槽両端の電極近傍に電極室と隔壁を構成し、電気泳動槽と電極室との流れを独立することによって、電極で発生するガスを電気泳動槽に浸入させることなく泳動できる構成となる。また、両性高分子を含む板を設置する部分の溝深さを制御することにより、微小な間隔の電気泳動槽を構成することが可能となる。泳動槽の間隔を狭くすると、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。また、泳動槽の容積に対する泳動槽壁面の表面積の割合が大きくなるため、両性高分子を含む板に固定されたる酸基と塩基に依存するｐＨの勾配を電気泳動槽内でより安定に維持することが可能となる。したがって、本構成とすることで、ランニングコストを下げることができ、より安定した分離を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子を提供することができる。
【００２３】
（６）電気泳動槽の間隔が１５０μｍ以下である。
電気泳動槽を１５０μｍ以下とすると、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、電気泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。また、電気泳動槽の容積に対する電気泳動槽壁面の表面積の割合が大きくなるため、アクリルアミド膜に固定されたるカルボキシル基と３級のアミノ基に依存するｐＨの勾配を電気泳動槽内でより安定に維持することが可能となる。したがって、安定した分離を高速で実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子を提供することができる。
【００２４】
【実施例】
（第１の実施の形態）
図１及び図２は，本発明のフリーフロー電気泳動素子の第１の実施形態を示す。図１は該フリーフロー電気泳動素子１の上面図であり、図２は図１の線ＩＩ−ＩＩでの断面図を示す。
フリーフロー電気泳動素子１は、泳動槽構成基板２及び３をスペーサ９を介して組み合わせて構成される。電気泳動槽構成基板３には複数の緩衝液注入口４ａ〜４ｇと複数の試料注入口５ａ〜５ｃと複数の流出口６ａ〜６ｕとが形成されている。このフリーフロー電気泳動素子１では、泳動槽構成基板２及び３とスペーサ９とにより電気泳動槽８が構成され、電気泳動槽８の両端部には１対の電極７ａ，７ｂが配置されている。
【００２５】
電気泳動槽構成基板２及び３の電気泳動槽８を構成する側の面には、カルボキシル基と第３級のアミノ基を結合したポリアクリルアミドの膜（図示せず）が形成されている。該ポリアクリルアミドの膜は、該膜に結合しているカルボキシル基と３級のアミノ基の割合が電極７ａから電極７ｂに向けてｐＨ勾配を形成するよう、製膜されており、その結果、電気泳動槽８には電極７ａから電極７ｂに向けて、例えば、ｐＨ１０〜ｐＨ３のｐＨ勾配がリニアに形成されている。
【００２６】
次に、フリーフロー電気泳動素子１を用いたフリーフロー電気泳動法を説明する。
フリーフロー電気泳動とは、電気泳動槽８に試料と支持液を連続的に注入しながら電気泳動による分離及び分取を行う電気泳動法であるが、電気泳動槽８にたいして、予め複数の緩衝液注入口４から一定流速で支持液を流して複数の流出口６への液の流れを作り、複数ある試料注入口５の少なくとも一つから試料を注入することによって分離操作を行なう。電気泳動槽内部は狭い空間特有の物理的現象によって強い層流が実現されているため、異なる液体を連続的に流すと液体が拡散しにくく、ほぼ直線的に流出口に向かって流れ出る。１対の電極７間に電圧を印加すると試料に含まれる物質は、電気泳動の原理によって正負いずれかの電極側に泳動しながら流出口６に流出する。物質によって泳動の方向及び速度が異なるため、試料に含まれる物質は分離しながら流出口６に流出する。従って、複数の流出口６の中から特定の分取口より液を取り出すことにより試料の分取が行える。なお、フリーフロー等速電気泳動とはタンパク質の分離を行う際に用いられる手法であり、電気泳動槽８内にｐＨ勾配を生じさせてタンパク質の等電点の違いで分離・分取する手法である。
【００２７】
（実施例１）
図１及び図２に示す本発明に係るフリーフロー電気泳動素子１を用いて、フリーフロー電気泳動法を行なった。
泳動槽の中央に流す緩衝液として１ｖ／ｖ％のグリセリンと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、陰極側に流す陰極電極液として１０ｍ  ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムと１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、陽極側に流す陽極電極液として１０ｍ  ｍｏｌ／ｌのリン酸と１０ｖ／ｖ％のエチルアルコールを含んだ水溶液を、試料溶液として１０ｍｇ／ｍｌのチトクロムＣと１０ｍｇ／ｍｌのミオグロビンを含んだ水溶液を用い、フリーフロー電気泳動素子１にてフリーフロー等電点電気泳動を行った。電極７ａを図示しない電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続し、中央の緩衝液注入口４ｂ〜ｆに緩衝液を、４ａに陰極電極液を、４ｇに陽極電極液を、ポンプで流した。試料溶液は試料注入口５ｂからポンプで注入した。フリーフロー等電点電気泳動は、緩衝液と陰極電極液と陽極電極液と試料溶液を注入しながら電極７に電界を印加して行った。
【００２８】
分取液は流出口６ｂ〜ｔからの流出液を回収して得た。流出口６ａ及び６ｕからの流出液は回収せずドレインに排出した。電界の印加方法は定電流設定とし、値を０．７ｍＡとした。泳動槽内の流速は試料溶液の線流速が３ｍｍ／ｓｅｃ以下になるようにポンプ調整した。アクリルアミド膜により緩衝液の流れるエリアにはｐＨ勾配が生じ、分取液にはｐＨ勾配が生じた。試料溶液中に含まれるチトクロムＣとミオグロビンは、有色タンパク質であるため泳動槽上面を観察することで両タンパクの分離状態を確認した。両タンパクは泳動槽に入ると同時に分離し、後に収束しながら流出口に排出した。チトクロムＣの等電点９．６であり、チトクロムＣを含む分取液のｐＨは９．４、ミオグロビンの等電点７．０であり、ミオグロビンを含む分取液のｐＨは６．４であり、それぞれの等電点の値とほぼ一致した。試料溶液の注入口を試料注入口５ａまたは試料注入口５ｃとした場合においても両タンパクは同じ流出口に収束し流出したことから、この泳動が等電点電気泳動であることが確認できた。
【００２９】
（作用・効果）
次に、この発明の実施形態の作用及び効果を説明する。
本実施形態では、泳動槽構成基板２及び３の泳動槽８を構成する側の面には、カルボキシル基と第３級のアミノ基を結合したポリアクリルアミドの膜が配置されている。該ポリアクリルアミドの膜に結合しているカルボキシル基と３級のアミノ基の割合は、電極７ａから電極７ｂに向けて系統的に異ならせて、その結果、電気泳動槽８には電極７ａから電極７ｂに向けてｐＨ３〜ｐＨ１０のｐＨ勾配が形成している。電気泳動槽８内のｐＨ勾配は、その側面に固定されたアクリルアミド膜によって形成されているものであるため、ｐＨ勾配が安定して形成でき、再現性の良いフリーフロー等速電気泳動が可能となる。また、アクリルアミド膜に結合するカルボキシル基と第３級のアミノ基の割合を変えることでｐＨ勾配を自在に設計可能となる。また、ｐＨ勾配の形成に両性担体を用いていないため、２次分析を阻害する夾雑物は含まれない。
したがって、本実施形態により、両性担体を用いず、安定なｐＨ勾配を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子とそれを用いたフリーフロー等電点電気泳動法を提供することができる。
【００３０】
なお、この発明の実施形態は、当然、各種変更が可能である。
例えば、ｐＨ勾配の範囲は３〜１０に限定されず、アクリルアミド膜に結合するカルボキシル基と第３級のアミノ基の割合を変えることでｐＨ勾配を自在に設計できる。本実施形態では、泳動槽の間隔はスペーサ９よって規制されているが、その構成は限定されず、泳動槽構成基板２及び３に溝を形成して泳動槽とすることもできる。
緩衝液や電極液の種類は限定されず通常電気泳動に用いられる緩衝液に変更できる。グリセリンの有無、エチルアルコールの有無、及びそれらの添加量は限定されない。なお、試料注入口の場所は限定されない。
【００３１】
（第２の実施の形態）
図３及び図４に本発明のフリーフロー電気泳動素子の第２の実施形態を示す。図３は本フリーフロー電気泳動素子１０の上面図であり、図４は図３の線ＩＶ−ＩＶでの断面図を示す。
【００３２】
フリーフロー電気泳動素子１０は、泳動槽構成基板１１と注入口構成基板１２との組み合わせで構成される。電気泳動槽構成基板１１には、アクリルアミド膜を構成した板をはめ込むための幅広溝１５と細長い溝からなる２つの電極室１３と、幅広溝１５と電極室１３とを区切る隔壁１４とが構成されている。注入口構成基板１２には、アクリルアミド膜を構成した板をはめ込むための幅広溝１６と複数の緩衝液注入口４ａ〜４ｇと複数の試料注入口５ａ〜５ｃと複数の流出口６ａ〜６ｕとが構成されている。幅広溝１５，１６には、カルボキシル基と第３級のアミノ基を結合したポリアクリルアミドの膜が構成された膜構成基板１７がそれぞれ取り外し可能に設置されている。電極室１３ａ，１３ｂには電極７ａ，７ｂがをそれぞれ設置されている。電気泳動槽８は、２枚の膜構成基板１７に挟まれた空間によって構成される。幅広溝１５，１６は膜構成基板１７を設置した状態で電気泳動槽８の間隔が３０μｍとなるように構成した。
【００３３】
膜構成基板１７に構成したポリアクリルアミドの膜に結合しているカルボキシル基と３級のアミノ基の割合を変えることによって、電極７ａから電極７ｂに向けて電気泳動槽８には電極７ａから電極７ｂに向けてｐＨ１０〜ｐＨ３のｐＨ勾配が形成されるようにしてある。泳動槽構成基板１１及び注入口構成基板１２の素材はホウケイ酸ガラス、電極７は白金からなる。幅広溝１５，１６と電極室１３は公知のウェットエッチング法にて加工した。隔壁１４は対向する注入口構成基板１２との間に微小の空隙ができるように加工した。泳動槽構成基板１１及び注入口構成基板１２の接合は、公知の接着技術にてよって接合した。
【００３４】
（実施例２）
フリーフロー電気泳動素子１０を用い、電極７ａを図示しない電圧印加電源の陰極に、電極７ｂを電圧印加電源の陽極に接続して、実施形態１記載の実施例と同様の分離を実施したところ、試料の等電点に応じた分離が実現できた。
【００３５】
（作用・効果）
次に、この発明の実施例の作用及び効果を説明する。
本実施形態は、電気泳動槽８を構成する泳動槽構成基板１１と注入口構成基板１２の電気泳動槽側の面に、カルボキシル基と第３級のアミノ基を結合したポリアクリルアミドの膜を構成した２枚の膜構成基板１７が、ポリアクリルアミドの膜を電気泳動槽側に向けて配置されている。ポリアクリルアミドの膜を構成した２枚の膜構成基板１７は、膜の性能が劣化する。したがって、膜が劣化するのに応じて交換する必要が生ずる場合がある。本構成とすることで、膜構成基板１７と電気泳動槽８を構成する２枚の平板とが分離可能となり、劣化する膜構成基板１７のみを交換することができる。このため、ランニングコストを下げることが可能となる。
【００３６】
また、電気泳動槽８を構成する２枚の平板は繰り返し使うことが可能であるため、コストのかかる複雑な形状を構成することも問題ではなくなる。例えば、本実施例では電極室１３と隔壁１４を構成した。この構成によって、電気泳動槽８と電極室１３との流れを独立でき、電極７で発生するガスを電気泳動槽８に浸入させることなく泳動できる構成となる。また、アクリルアミド膜を構成した板をはめ込むための幅広溝１５，１６の深さを制御することにより、微小な間隔の電気泳動槽８を構成することが可能となる。泳動槽の間隔を狭くすると、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。また、電気泳動槽の容積に対する電気泳動槽壁面の表面積の割合が大きくなるため、アクリルアミド膜に固定されたるカルボキシル基と３級のアミノ基に依存するｐＨの勾配を電気泳動槽８内でより安定に維持することが可能となる。したがって、本実施形態とすることで、ランニングコストを下げることができ、より安定した分離を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子を提供することができる。
【００３７】
なお、この発明の実施形態は、第１実施形態と同様に、当然、各種変更が可能である。
電気泳動槽の間隔は３０μｍに限定されなず、安定層流が実現できる間隔であれば任意の間隔とすることができる。１５０μｍ以下であれば、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、電気泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる等の効果が得られる。なお、電気泳動槽の間隔を狭くすることによってその効果は大きくなり、電気泳動槽の容積も小さくなるために緩衝液や試料の微量化ができる。電気泳動槽の最適な間隔は１０μｍ〜５０μｍの範囲である。この範囲を下回ると電気泳動槽の抵抗が高くなる、電気泳動槽への水圧の負荷が大きくなる等の問題が生じる。また、この範囲を超えると、高電圧印加時に流れる電流が大きくなり気泡発生や熱の発生等の問題も大きくなる。
【００３８】
（第３の実施の形態）
以下に、図５及び図６に本発明のフリーフロー電気泳動素子の第３の実施形態を示す。図５は本フリーフロー電気泳動素子１０の上面図であり、図６は図５の線ＶＩ−ＶＩでの断面図であり、図７は電気泳動槽構成基板の上面図であり、図８は注入口構成基板の上面図である。
【００３９】
フリーフロー電気泳動素子２０は、泳動槽構成基板２１と注入口構成基板２２との組み合わせで構成され、電気泳動槽構成基板２１には細長い溝からなる複数の泳動槽部２３と細長い溝からなる２つの電極室１３と、各電気泳動槽部２３と電極室１３とを区切る隔壁２４とが設けられている。注入口構成基板２２には、複数の緩衝液注入口４と複数の試料注入口５と複数の流出口６と１対の電極７とが設けられている。電極７は注入口構成基板２２の泳動槽構成基板２１と対向する面上に薄膜で構成される。複数の緩衝液注入口４と複数の流出口６は同数且つ同間隔で構成される。隔壁２３は、複数の緩衝液注入口４の間に流出口６に向かって同間隔で設けられ、対向する注入口構成基板３との間に空隙を有して構成される。泳動槽構成基板２１の素材はホウケイ酸ガラスからなる。泳動槽２３と電極室１３は公知のウェットエッチング法にて深さ５０マイクロメートルに加工した。
電気泳動槽構成基板２１及び注入口構成基板２２の接合は、公知の接合技術を用いて接合した。
【００４０】
各泳動槽２３には、それぞれカルボキシル基と第３級のアミノ基を結合したポリアクリルアミドの膜が構成されている。なお、ポリアクリルアミドの膜は図示していない。該ポリアクリルアミドの膜に結合しているカルボキシル基と３級のアミノ基の割合は、各電気泳動槽２３で異なり、電極７ａから電極７ｂに向けて系統的に異なるよう製膜されている。その結果、各電気泳動槽２３内はそれぞれ異なるｐＨとなり、電極７ａから電極７ｂに向けてｐＨ１０〜ｐＨ３のｐＨ勾配が形成されている。
【００４１】
（作用・効果）
次に、この発明の実施の形態の作用及び効果を説明する。
本発明のフリーフロー電気泳動素子２０は、緩衝液注入口４と流出口６とが同数且つ同間隔に構成され、その間に同間隔で隔壁２４が構成されている。このため、各緩衝液注入口から対向する流出口に向かう流れの拡散を抑えることが可能となる。各電気泳動槽２３はその内壁に構成されたアクリルアミド膜によってそれぞれ異なるｐＨとなっている。本構成とすることで、ｐＨの勾配を電気泳動槽２３内でより安定に維持することが可能となる。したがって、本実施形態とすることで、より安定した分離を実現することが可能なフリーフロー電気泳動素子を提供することができる。
【００４２】
なお、この発明の実施の形態の各構成は、当然、各種変形、変更が可能である。アクリルアミド膜は電気泳動槽２３の内壁に直接構成される必要はなく、第２実施形態のように、各泳動槽の壁面に帯状のアクリルアミド膜固定基板を設置することでも実現可能である。隔壁２４は対向する注入口構成基板２２との間に空隙を有して構成されているが、該空隙は緩衝液注入口から流出口までの間、必ずしも一定間隔である必要はなく、部分的に突起を有した構造とすることもできる。この突起を注入口構成基板２２に接触させるよう構成することで、注入口構成基板２２と泳動槽構成基板２１との間隔を規制する効果を付加することも可能である。泳動槽２３の深さは限定されないが、流れを強い層流に保つには１５０マイクロメートル以下が望ましい。
【００４３】
【発明の効果】
（１）請求項１に係るフリーフロー電気泳動素子は、電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面が、酸基と塩基とが結合した両性高分子により構成されているので、電気泳動槽壁面を構成する両性高分子によって電気泳動槽内のｐＨを制御するため、安定したｐＨ制御を実現することができ、両性担体を用いていないため、２次分析を阻害する夾雑物は含まれない。
【００４４】
（２）  請求項２に係るフリーフロー電気泳動素子においては、前記両性高分子が膜形状とされ、２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を構成しているので、当該面を広く連続的に形成することができ、また膜状であるので両性高分子の量を減らすことができる。
（３）  請求項３に係るフリーフロー電気泳動素子においては、前記両性高分子をカルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子としたので、一般的によく用いられるカルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子を使用することができ、またたんぱく質等の生体物質との相性が良い。
【００４５】
（４）  請求項４に係るフリーフロー電気泳動素子においては、カルボキシル基とアミノ基を結合した両性高分子をカルボキシル基とアミノ基を結合したポリアクリルアミドとするので、市販の固定化ｐＨ勾配ゲル作成用アクリルアミド誘導体を利用でき、安定したｐＨ制御を実現し安定した分離が実現可能なフリーフロー電気泳動素子を安価に提供することができる。
【００４６】
（４）  請求項５に係るフリーフロー電気泳動素子においては、両性高分子の該酸基と塩基の割合を、電気泳動槽の両端に配置される１対の電極との間で変更し、一方電極から他方電極に向けて、ｐＨを増加または減少させ電気泳動槽に一方電極から他方電極に向けて特定の範囲のｐＨ勾配が形成されているが、電気泳動槽内のｐＨ勾配は、平板の電気泳動槽側の面を構成する両性ポリマーによって形成されているので、ｐＨ勾配が安定して形成でき、再現性の良いフリーフロー等速電気泳動が可能となる。また、両性高分子に結合する酸基と塩基の割合を変えることでｐＨ勾配を自在に設計可能となり、またｐＨ勾配の形成に両性担体を用いていないため、２次分析を阻害する夾雑物は含まれない。
【００４７】
（６）  請求項６に係るフリーフロー電気泳動素子においては、電気泳動槽が液の流れに沿って複数の隔壁で区切られており、隔壁で区切られた電気泳動槽の部分を形成する２枚の平板電気泳動槽側の面の少なくとも一方の面を、酸基と塩基の結合の割合が異なる両性高分子によって構成し、電気泳動槽の両端に配置される１対の電極との間で、一方電極から他方電極に向けて、ｐＨが増加または減少させているので、注入口から流出口に向かう流れの拡散を抑えることが可能となり、隔壁で区切られた電気泳動槽は、その内壁に構成された両性高分子によってそれぞれ異なるｐＨとなり、隔壁で区切られた電気泳動槽毎にｐＨを制御でき、電極間におけるｐＨ勾配をより安定に維持することが可能となる。
【００４８】
（７）  電気泳動槽を構成する２枚の平板の電気泳動槽側の面の少なくとも１つの面に、酸基と塩基を結合した両性高分子を含む板が電気泳動槽側に向けて取外し可能に配置されて、前記少なくとも一方の面を構成しているので、両性高分子を含む板板と電気泳動槽を構成する平板とが分離可能となり、劣化した両性高分子を含む板のみを交換することができ、ランニングコストを下げることが可能となる。また、電気泳動槽を構成する２枚の平板は繰り返し使うことが可能であるため、コストのかかる複雑な形状を構成することもできる。
【００４９】
（８）  請求項８に係るフリーフロー電気泳動素子においては、電気泳動槽の間隔が１５０μｍ以下としたので、レイノルズ数が小さくなるために安定な層流が実現できることや、電気泳動槽の断面積が小さくなるために高電圧の印加可能となり高速な分離が実現できる。また、また、電気泳動槽の容積に対する電気泳動槽壁面の表面積の割合が大きくなるため、アクリルアミド膜に固定されたるカルボキシル基と３級のアミノ基に依存するｐＨの勾配を電気泳動槽内でより安定に維持することが可能となる。
【００５０】
（９）  請求項９に係るフリーフロー等電点電気泳動方法においては、  上記フリーフロー電気泳動素子を用い、等電点電気泳動を行うフリーフロー等電点電気泳動法を行なうもので、本方法により、両性担体を用いず、安定なｐＨ勾配を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のフリーフロー電気泳動素子の第１の実施形態の上面図である。
【図２】図１の線ＩＩ−ＩＩでの断面図を示す。
【図３】本発明のフリーフロー電気泳動素子の第２の実施形態の上面図である。
【図４】図３の線ＩＶ−ＩＶでの断面図を示す。
【図５】本発明のフリーフロー電気泳動素子の第３の実施形態の上面図である。
【図６】図５の線ＶＩ−ＶＩでの断面図を示す。
【図７】本発明のフリーフロー電気泳動素子の第３の実施形態の泳動槽構成基板２１の上面図である。
【図８】注入口構成基板の上面図である。
【符号の説明】
１、１０，２０・・・フリーフロー電気泳動素子、２，３・・・電気泳動槽構成基板、４、４ａ〜４ｇ・・・緩衝液注入口、５、５ａ〜５ｃ・・・資料注入口、６、６ａ〜６ｕ・・・流出口、７、７ａ，７ｂ・・・電極、８・・・電気泳動室、９・・・スペーサ、１０・・・フリーフロー電気泳動素子、１１・・・電気泳動槽構成基板、１２・・・注入口構成基板、１３・・・電極室、１４・・・隔壁、１５、１６・・・幅広溝、１７・・・膜構成基板、２０・・・フリーフロー電気泳動素子、２１・・・電気泳動槽構成基板、２２・・・注入口構成基板、２３・・・電気泳動槽、２４・・・隔壁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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