(57)【要約】【課題】カルコン２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｃｈ  ２’ＧＴ）遺伝子とその利用方法、特に植物の花色を改変する方法を提供することを課題とする。【解決手段】黄花をつけるカーネーション「Ａ６６」および橙色花をつけるカーネーション「８３５８−０１」の花蕾中の花弁より全ＲＮＡを抽出した後、ｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。Ｃｈ  ２’ＧＴ候補となるｃＤＮＡは、縮重プライマーによる  ＰＣＲスクリーニングによって単離した。次いで、該ｃＤＮＡからコードされるタンパク質の活性測定を行った。その結果、カルコノナリンゲニンを基質とし、カルコンナリンゲニン配糖体を生成するｃＤＮＡは二種類存在することがわかった。これらＣｈ  ２’ＧＴをコードするＤＮＡを利用することで、植物の花色を改変できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
グルコシルトランスフェラーゼが、カルコン  ２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
カーネーション由来である、請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
植物においてカルコン２’−Ｏ−グルコシドを生産させるために用いる、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】
植物の花色を改変するために用いる、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項６】
植物の花色を黄色〜橙色に改変するために用いる、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ、または請求項８に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１１】
花色が改変した、請求項１０に記載の形質転換植物体。
【請求項１２】
花色が黄色〜橙色に改変した、請求項１０に記載の形質転換植物体。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換植物体の切り花。
【請求項１６】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項８に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１７】
形質転換植物体が、花色が改変した形質転換植物体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
形質転換植物体が、花色が黄色〜橙色に改変した形質転換植物体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の花色を改変する方法。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の花色を黄色〜橙色に改変する方法。
【請求項２１】
植物がカーネーションである、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子およびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
花の色や果実の色などに見られるように、自然界には多くの植物性色素が存在するが、これらは化学構造によってカロチノイド、ベタシアニン及びフラボノイドに分類できる。その中でも多種多様な花の色のうち、赤色、赤紫色、紫色、青色のほとんどはフラボノイドの一種であるアントシアニンにより発色していることが古くより知られている。アントシアニンは花や紅葉に存在する赤色色素で植物界に最も広く分布し、現在では食品添加物としても広く用いられており、最近、抗酸化効果等の生理的機能を有することも報告されている（非特許文献１および２）。
【０００３】
アントシアニンの生合成は、主にペチュニアやキンギョソウ等を用いて研究されてきた（非特許文献３〜５）。アントシアニンは一次代謝系におけるフェニルアラニンをその原料とし、フェニルプロパノイド合成系とそれに続くフラボノイド（アントシアニン）合成系を通じて生成される。このアントシアニン生合成経路の解明により、従来の交配育種の手法や新規遺伝子導入などの分子生物学的な手法を用いて、新しい花色を有する新規花品種の育成がなされている（非特許文献６）。
【０００４】
黄色や橙色の花色を呈する色素は、カロチノイド、ベタキサンチン、そしてカルコン類やオーロン類を中心とする黄色フラボノイド色素、の三つのグループに分類される。しかし黄色フラボノイド色素を除き、その生合成経路には未だ不明な点が多く、遺伝学的知見はもちろん、化学合成的知見も未だ得られていない。一方、黄色フラボノイド色素は、アントシアニンの生合成経路における中間代謝産物として知られ、特にカルコン類については強い黄色を呈すこと及びアントシアニンと共存することで橙色を示すことから（非特許文献７）、新規な黄色または橙色花品種の育成への利用が有望視されている（非特許文献８）。またペチュニアにおいては、カルコン還元酵素を用いてカルコンから６’−デゾキシカルコンへのフラボノイド生合成を変化させることで黄色の花が作出されている（非特許文献９）。しかし、これまでカルコン類を利用した分子生物学的手法による黄色品種または橙色品種の作出に成功した例は知られていない。
【０００５】
カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）は植物学的分類上、中心子目ナデシコ科ナデシコ属に属する。カーネーションにおいては黄色の花を持つ品種は限られているが、黄色の花を持つカーネーションの花弁細胞の液胞には、主要黄色フラボノイド色素としてカルコノナリンゲニン２’−Ｏ−グルコシド（Ｃｈａｌｃｏｎｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ  ２’−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；以下Ｃｈ  ２’Ｇと称する）が含まれている（非特許文献１０）。アントシアニン生合成経路の中間産物であるｐ−クマロイル−ＣｏＡと、マロニル−ＣｏＡを基質としてＣＨＳ（ｃｈａｌｃｏｎ  ｓｙｎｔａｓｅ）によりカルコン（４，２’，４’，６’−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｃｈａｌｃｏｎ；以下カルコンと称する）が合成され、その後、配糖体化酵素（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下ＧＴと称する）であるカルコン２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼ（Ｃｈａｌｃｏｎ  ２’−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（以下、Ｃｈ  ２’ＧＴと称する）によってカルコンの２’位が配糖化されてＣｈ  ２’Ｇとなり、液胞に運搬され蓄積されると考えられている（非特許文献１１および１２）。しかし、Ｃｈ  ２’ＧＴの存在は未だ確認されていない。
【０００６】
黄色カーネーションの種類が少ないのは、カーネーションではそのアントシアニン生合成経路において、カルコンがＣＨＩ  （ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）遺伝子やＤＦＲ  （ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ  ４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の作用を受け、最終的にアントシアニンが生成される経路が主経路であるためと考えられる。従ってカーネーションの花が黄色を呈するためには、ＣＨＩ遺伝子並びにＤＦＲ遺伝子にトランスポゾン  （ｄＴｄｉｃ１）  が挿入されるといった理由により遺伝子破壊が生じなければならず、さらにこれによって過剰に余った中間産物であるカルコンがＣｈ  ２’ＧＴによって配糖体化されることが必要だと想定される（非特許文献８）。配糖体化が必要である理由のひとつとして”解毒”ということがあげられる。カルコンは元々油溶性物質であり、さらにこれが配糖体化されないままでは植物の生育、花の形成にとっては有害であるためである。つまり、このカルコンに配糖体化する酵素が存在しない花においては、黄色を呈しない、もしくは花が形成されないと考えられている。このことからＣｈ  ２’ＧＴを利用することができれば、黄色花を持つ新品種の作出に有効であると考えられているがこれまでのところ実現には至っていない。
【０００７】
一般に、ＧＴはフラボノイド生合成経路において大きな役割を果たす。ＧＴは基質分子の水酸基がＵＤＰ−グルコース（ｕｒｉｄｉｎｅ−５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｓｅ）へと転移する反応を触媒する働きを持つ。３−デオキシ型を除くすべてのアントシアニジンは、３−水酸基の位置で配糖体化され、さらに多くの場合５−水酸基の位置で配糖体化された後、アントシアニンとなる。アントシアニジンを配糖体化するアントシアニングルコシルトランスフェラーゼ（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、多くの植物種に存在することがわかっている（例えば、非特許文献１３〜１５）。
【０００８】
ＧＴをコードする遺伝子に関しては、３−水酸基を配糖体化する酵素、３ＧＴをコードする３ＧＴ遺伝子が、Ａｃと呼ばれるトランスポゾンタギングによってトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）から初めて単離され（非特許文献１６）、続いてその他の植物種からも単離が行なわれている（例えば、非特許文献１７および１８）。一方、アントシアニン５ＧＴ遺伝子がディファレンシャルスクリーニング法によって、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）から最初に単離された（非特許文献１９）。またフラボノイド生合成経路の中間産物であるケンフェロール、クェルセチンに配糖化するフラボノイドグルコシルトランスフェラーゼ（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子も単離されている（非特許文献２０）。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のゲノム内には、約１１０の個別のＧＴ配列を含むことが示されており、機能的に特徴付けされたのはごくわずかである（非特許文献２１および２２）ことからも配糖化酵素の機能が多岐にわたっていることが示唆される。そしてこれまでに、アントシアニン生合成経路の中間産物であるカルコンの２’位を配糖体化するＣｈ  ２’ＧＴをコードする遺伝子は単離されていない。
【０００９】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓｈｏｋｕｈｉｎ  Ｋｏｇｙｏ  Ｇａｋｋａｉｓｈｉ，  ３６（１０）：８５２，  １９８９
【非特許文献２】Ｔａｍｕｒａら、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４２：１６１２，  １９９４
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ，  １：３７−４９，  １９９１
【非特許文献４】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２：２９１−２９９，  １９９０
【非特許文献５】Ｈｏｌｔｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ，  ４：１００３−１０１０，  １９９３
【非特許文献６】Ｆｏｒｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｅｎｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １２（２）：１５５−６０，  ２００１
【非特許文献７】北川ら、園学雑，７０  別２：２０５，２００１
【非特許文献８】Ｉｔｏｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ４３：５７８−５８５，  ２００２
【非特許文献９】Ｄａｖｉｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３（２）：２５９−２６６  Ｊａｎ．，  １９９８
【非特許文献１０】Ｆｏｒｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄａｎｇｅｌｍａｙｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｔ，  １８（５−６）：５１９−２７，  １９８０
【非特許文献１１】Ｇｏｎｇ  Ｚら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ３５（６）：９１５−２７，  １９９７
【非特許文献１２】Ｎａｋａｙａｍａ  Ｍら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ５５（８）：９３７−９，  ２０００
【非特許文献１３】Ｄｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １１２：４３−５１，  １９９５
【非特許文献１４】Ｏｇａｔａら、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｓ，  １１１：２１３−２１６，  １９９８
【非特許文献１５】Ｏｇａｔａら、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １５８：７０９−７１４，  ２００１
【非特許文献１６】Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ，  ４９：３３９−４５，  １９８４
【非特許文献１７】Ｔａｎａｋａら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ３７：７１１−７１６，  １９９６
【非特許文献１８】Ｆｏｒｄら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７３：９２２４−９２３３，  １９９８
【非特許文献１９】Ｙａｍａｚａｋｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  ２７４：７４０５−７４１１，  １９９９
【非特許文献２０】Ｍａｔｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  ３９（１１）：１１４５−５５，  １９９８
【非特許文献２１】Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７６：４３５０−４３５６，  ２００１
【非特許文献２２】Ｌｉｍら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７６：４３４４−４３４９，  ２００１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｃｈ  ２’ＧＴをコードする遺伝子とその利用方法、特に植物の花色を改変する方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、黄花をつけるカーネーション「Ａ６６」および橙色花をつけるカーネーション「８３５８−０１」の花蕾中の花弁より全ＲＮＡを抽出した後、ｍＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。Ｃｈ  ２’ＧＴ遺伝子の候補となるｃＤＮＡは、縮重プライマーによる  ＰＣＲスクリーニングによって単離した。得られたＰＣＲ産物をベクターに導入した後、シークエンス解析を行なった。その結果、遺伝子の相同性からＧＴをコードすると思われるｃＤＮＡを２６種類単離した。次いで、この全長を５’および３’ＲＡＣＥによって単離した。これらをベクターにクローニングした後、大腸菌に導入し、培養した後、ホモジナイザーで破砕した。これを遠心し、上澄み液を酵素液として活性の測定に用いた。その際反応基質としてはアントシアニンの生合成経路の中間代謝産物などを用いた。この酵素液について、ＴＬＣ分析、ＨＰＬＣおよび１４ＣＵＤＰ−グルコースを用いた液体シンチレーターによる分析を行った。その結果、カルコノナリンゲニンを基質とし、Ｃｈ  ２’Ｇを生成するＣｈ  ２’ＧＴ  は二種類存在することがわかった。よって、これらのＣｈ  ２’ＧＴをコードするＤＮＡを利用することで、植物の花を改変できる。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔２１〕を提供するものである。
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１または３に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕  グルコシルトランスフェラーゼが、カルコン  ２’−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼである、〔１〕に記載のＤＮＡ。
〔３〕  カーネーション由来である、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ。
〔４〕  植物においてカルコン２’−Ｏ−グルコシドを生産させるために用いる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔５〕  植物の花色を改変するために用いる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔６〕  植物の花色を黄色〜橙色に改変するために用いる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔７〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡからコードされるタンパク質。〔８〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
〔９〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ、または〔８〕に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
〔１０〕  〔９〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
〔１１〕  花色が改変した、〔１０〕に記載の形質転換植物体。
〔１２〕  花色が黄色〜橙色に改変した、〔１０〕に記載の形質転換植物体。
〔１３〕  〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔１４〕  〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔１５〕  〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換植物体の切り花。
〔１６〕  〔１０〕〜〔１２〕のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡまたは〔８〕に記載のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
〔１７〕  形質転換植物体が、花色が改変した形質転換植物体である、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕  形質転換植物体が、花色が黄色〜橙色に改変した形質転換植物体である、〔１６〕に記載の方法。
〔１９〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の花色を改変する方法。
〔２０〕  〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の花色を黄色〜橙色に改変する方法。
〔２１〕  植物がカーネーションである、〔１６〕〜〔２０〕のいずれかに記載の方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、新規な２つのグルコシルトランスフェラーゼ（ＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）と命名）を単離した。本発明で単離されたＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）のｃＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号：１および３に、これらのＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２および４に示す。
【００１４】
本発明者らが単離したＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）は、カルコンからＣｈ  ２’Ｇへの変換反応を触媒する（図１）。さらに、ＤｃＧＴ２（Ｄ）は、シアニジンからシアニジン３−Ｏ−グルコシドへの変換反応およびシアニジン５−Ｏ−グルコシドへの変換反応、シアニジン３−Ｏ−グルコシドからシアニジン３，５−Ｏ−グルコシドへの変換反応を触媒する。
【００１５】
すなわち、本発明者らが単離したＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）は、Ｃｈ  ２’ＧＴとしての活性を有し、ＤｃＧＴ２（Ｄ）は、シアニジン３−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼおよびシアニジン５−Ｏ−グルコシルトランスフェラーゼとしての活性も有する。
【００１６】
本発明は、以上の知見に基づき、これら２つのグルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子およびその利用法を提供するものである。
【００１７】
本発明において、グルコシルトランスフェラーゼとは、カルコン、アントシアニジン骨格あるいはアントシアニン骨格を持つ化合物を配糖体化する酵素を意味する。
【００１８】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼを利用することで、Ｃｈ  ２’Ｇ、またはアントシアニジン骨格を有する化合物の、３−Ｏ−グルコシド化合物および５−Ｏ−グルコシド化合物が合成できる。本発明のグルコシルトランスフェラーゼを利用して合成された化合物は、着色剤として利用できる。
【００１９】
また、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを使用することによって、植物においてＣｈ  ２’Ｇを生産できる。Ｃｈ  ２’Ｇは、植物の花色を黄色に発色させる色素であるから、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを使用することで、植物の花色を黄色に改変できる。またＣｈ  ２’Ｇは、その他の色素の共存下において、植物の花色を様々な色に発色させる。例えばＣｈ  ２’Ｇは、アントシアニンの共存下において、植物の花色を橙色に発色させる。よって、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを利用することで、植物の花色を改変することができる。改変後の色の色相としては、好ましくは黄色〜橙色の範囲の色相、より好ましくは黄色または橙色が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、改変後の色の明度および彩度は特に制限されるものではない。
【００２０】
本発明におけるグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：１または３に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡや配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２１】
また、本発明は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。このようなＤＮＡの配列は、配列番号：１または３に記載の塩基配列と、配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を示す。
また、このようなＤＮＡからコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列と、配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を示す。
【００２２】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡが由来する生物種としては、特に制限はないが、好ましくは植物である。該植物としては、例えばカーネーション、ボタン、ダリア、アスター、アサガオ、ムギワラギク、シクラメンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と構造的に類似したタンパク質（被検タンパク質）が、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質であるか否かは、例えば、被検タンパク質がカルコンからＣｈ  ２’Ｇへの変換反応を触媒するか否か、または、被検タンパク質をコードするＤＮＡが導入された植物の花色が改変する（好ましくは黄色〜橙色、より好ましくは黄色または橙色に改変する）か否か、を検討することで確認できる。また、被検タンパク質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質であるか否かは、例えば、被検タンパク質がアントシアニジンからアントシアニン３−Ｏ−グルコシドおよびアントシアニン５−Ｏ−グルコシドへの変換反応を触媒するか否かを検討することで確認できる。
【００２４】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アリル、バリアントおよびホモログが含まれる。このようなアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。変異するアミノ酸数は、アミノ酸が付加、欠失もしくは置換されるアミノ酸残基の部位などによって異なるが、好ましくは１２０個以内、より好ましくは３〜５０個、さらに好ましくは３〜３０個程度である。
【００２５】
また、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２６】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸の置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，  Ｄ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８４）  ８１，  ５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９８２）  １０，  ６４８７−６５００  、Ｗａｎｇ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，  １４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８２）  ７９，  ６４０９−６４１３、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９０）  ２４７，  １３０６−１３１０）。
【００２７】
また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  １５２，  ２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，  ＭＪ，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．（１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００，  ４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２，  ９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，  ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４，  ３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２，  ４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ  （１９８８）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ８５，  ２７６３−２７６６）などを使用できる。
【００２８】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製するには、例えば、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。
【００２９】
本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、特に制限はない。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，  Ｔ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９８８）  ６，  １２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ  抗原の断片、ｌｃｋ  ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
【００３０】
配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ：  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８：  ５０３，  １９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：  １３５０，  １９８５、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：  ４８７，  １９８８）を利用する方法が挙げられる。すなわち、本発明のグルコシルトランスフェラーゼのｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１または３）、または、その一部をプローブとして、また、配列番号：１または３に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、カーネーションや他の植物からグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは、当業者にとって通常行い得ることである。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得るグルコシルトランスフェラーゼと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００３１】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明のハイブリダイゼーション反応においては、さまざまな程度のストリンジェントな条件を用いることができる。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。好ましくは、標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第三版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（２００１））において説明されているような当技術分野において周知の技術によって、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイゼーションを行う。
【００３２】
本発明の目的に適した「低ストリンジェントな条件」は、例えば５ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、４２℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、４２℃での洗浄である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば２ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く１ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５５℃での洗浄である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば１ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く０．１ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃での洗浄である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られると期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ここで、「高い相同性」とは、ＤＮＡ配列全体で少なくとも５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の配列の同一性を指す。
【００３３】
また、配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のＤＮＡを有する植物や植物細胞に変異処理を行い、該植物や細胞から、例えば配列番号：２または４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを選択することによっても得ることができる。
【００３４】
また、たとえ塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わないこと（縮重変異）があるが、このような縮重変異ＤＮＡも本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００３５】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：  ５８７３，  １９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３，  １９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３６】
本発明のＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段により行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、カーネーションからゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで調製できる。また、本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１または３）に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行って調製することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば、カーネーションから抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰなどのベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことで、またＰＣＲを行うことにより調製できる。
【００３７】
本発明のグルコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを使用することによって、植物の花色を改変する（好ましくは黄色〜橙色、より好ましくは黄色または橙色に改変する）ことが可能である。例えば、該ＤＮＡを発現または発現誘導可能なベクターに連結して、後述する方法で、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることによって、植物の花色を改変できる。
【００３８】
本発明のＤＮＡを導入することにより、花色を改変することが可能な植物としては、特に制限はなく、例えばカーネーション、ペチュニア、バラ、アサガオなどアントシアニン色素を発色する花を持つ植物全てが挙げられる。
【００３９】
本発明は、本発明のＤＮＡを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む形質転換植物体の製造方法を提供する。
【００４０】
本発明において、植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はないが、挿入遺伝子を過剰発現させることが可能なベクターであることが好ましい。例えば、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。例えば、バイナリーベクターｐＢＩ  １０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら１９８７）などこれらの改変ベクターを使用することができる。
【００４１】
また、上記「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００４２】
植物細胞へのベクターの導入には、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法など、当業者に公知の種々の方法を用いることができる。
【００４３】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、高等植物において形質転換植物体を作出する手法については、組織からプロトプラストを単離し、最適培養密度に調整した後に、植物ホルモンを添加したＭＳ培地でカルスを誘導し、これを脱分化させることによって植物体を再生させる方法など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００４４】
ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体がいったん得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができる。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなど）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００４５】
また、本発明の形質転換植物体やその子孫あるいはクローンから切り花を生産することも可能である。本発明は、このような切り花もまた提供するものである。切り花とは、一般的には枝や茎のついたまま切りとった花を指すが、本発明における切り花には、枝や茎のついていない花も含む。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔１〕植物材料
カーネーションのうち、濃桃色花をつける「シンフォニーローズ（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  Ｒｏｓｅ）」、色素分析によりＣｈ  ２’Ｇを含有していることが確認された、黄色花をつける「Ａ６６」並びに橙色花をつける「８３５８−０１」を、長野県の農場で栽培し、４つの発育段階で葉、茎、根および花弁に分離した。組織を秤量し、液体窒素中で凍結して、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４７】
〔２〕ＧＴのクローニング
全ＲＮＡは、改良グアニジニウムチオシアネート−ＣｓＣｌ超遠心法を用いて、上記品種の第二段階の閉じた蕾の赤色花弁（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏらの図５Ａ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  １７：３２５−３２９，  ２０００）より調製した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、日本）を用いて、供給者によるマニュアルに記載されているように全ＲＮＡから調製した。第一鎖ｃＤＮＡは、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、上記品種の花弁から調製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡにより合成し、ＰＣＲのテンプレートとして使用した。全長ｃＤＮＡは、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ）を用いて調製した。カーネーションｃＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲ増幅には、以前に報告された種々のＧＴによる保存アミノ酸配列に基づいて設計した縮重プライマーを使用した。その配列は以下に示す。リバースプライマー、５’‐ＧＴＢＲＴＷＮＴＳＡＡＹＷＳＹＴＴＹＫＡＫＧＡＲＹＴＫＧＡ‐３’（配列番号：５）および５’‐ＡＡＲＳＭＭＲＲＷＴＣＭＧＴＫＧＴＫＴＡＹＶＴＮＷＧＴＴＴＹＧＧＭＡ‐３’（配列番号：６）、フォワードプライマー、５’‐ＴＮＧＡＲＴＴＣＣＡＮＣＣＲＣＡＲＴＧＨＧＴＮＡＣＲＡＡ‐３’（配列番号：７）および５’‐ＲＴＧＭＫＣＭＡＲＲＡＴＹＷＳＨＡＮＹＴＧＧＧＧＷＧＣＣＣＡ‐３’（配列番号：８）。
【００４８】
ｃＤＮＡ混合物１μｌとプライマー４ｐｍｏｌを含むＬＡ−ＰＣＲ混合物（１０μｌ）を、供給者の推奨に従って調製した。混合物は９２℃にて１分間インキュベートし、その後０．５ｕｎｉｔのＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加えた。ＰＣＲは４０回の増幅サイクルを実施した（９２℃にて３０秒；５５℃にて４５秒；７２℃にて１分）。増幅した断片をｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ中にクローニングして、Ａｌｏｋａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ４０００ＬとともにＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｕｓｂ）を使用して配列決定を行った。配列データに基づいて、特異性ＧＴフォワードおよびリバースプライマーを作成した。ＧＴ５’上流および３’下流領域は、カーネーションｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマーおよび特異性ＧＴリバースプライマー、並びにＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’プライマーおよび特異性ＧＴリバースプライマーを用いて単離した。ＤｃＧＴ２（Ｄ）に関し５’上流および３’下流領域はプライマー、５’‐ＡＴＣＣＴＴＧＡＧＧＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＴ‐３’（配列番号：９）およびプライマー、５’‐ＴＣＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＴＧＣＡＣＣＣＧＣＴ‐３’（配列番号：１０）、ＤｃＧＴ３（Ｈ）に関し５’上流および３’下流領域はプライマー、５’‐ＡＴＴＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＣＡ‐３’（配列番号：１１）およびプライマー、５’‐ＡＧＣＡＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡ‐３’（配列番号：１２）をそれぞれ用いた。増幅された断片を、上述と同様の方法でクローニングした。全長カーネーションＧＴ  ｃＤＮＡは、配列データを基に構築したプライマーを使用し、カーネーションｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、増幅された断片を上述と同様の方法でクローニングした。
【００４９】
〔３〕ノーザンブロット解析
第１、２、３および４段階の花弁、根、茎、葉からの全ＲＮＡ（１０μｇ）は、Ｎｙｔｒａｎ  ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ  ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）上にブロットし、α３２Ｐ  ｄＣＴＰ−ラベルＧＴ断片を用いて探索した。ブロットは、ストリンジェントな条件下で洗浄し、−８０℃でＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）を使用して感光させた。
【００５０】
〔４〕ｒＧＴの発現および酵素アッセイ
ｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクターを使用して、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＨ５α内でＧＴ全長ｃＤＮＡを発現させた。ｃＤＮＡインサートは、プラスミド内の誘導性Ｔ７プロモーターのもとで調節される。ｒＧＴタンパク質を発現する形質転換体を、２ＹＴ＋Ａｍｐ  ５ｍｌの培地中で培養した。収集した細胞を５０ｍＭ  Ｋ−Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、遠心分離（１０，０００ｘｇ、３０秒）にかけた。ペレットに５０ｍＭ  Ｋ−Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．０）および１４ｍＭ  ２−ＭＥを加えて、超音波処理した（ＴＯＭＹ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ＵＤ−２０１）。遠心分離（１２，０００ｘｇ、２０分、４℃）の後、粗酵素抽出物が得られた。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）の方法により、ウシ血清アルブミンを基準タンパク質として用いて決定した。形質転換されたインサートなしのｐＢｒｕｓｃｒｉｐｔ  ＳＫを対照酵素として使用した。
【００５１】
〔５〕フラボノイドＧＴ活性の決定
ｒＧＴのアッセイ用の標準反応混合物（総体積５０μｌ）は、酵素溶液２０μｌ、ｐＨ７．５の５０ｍＭ  Ｋ−ｐｉ中のフラボノイドまたはベタニジン２５ｎｍｏｌおよび２５ｎｍｏｌ  ＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ）（９２５Ｂｑ  ＵＤＰ−Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］ｇｌｕｃｏｓｅ）より構成された。混合物を３０℃にて１５分間インキュベートした。ＣＨ３Ｃｌ／ＣＨ３ＯＨ、２：１（Ｖ／Ｖ；プラス５％  ＨＣＯＯＨ）からなる停止溶液５０μｌを加えて、反応を終了させ、次に混合物を３，０００ｘｇにて３分間遠心分離にかけた。上清２０μｌを薄層クロマトグラフィープレートに付し、次いで同じ場所に標品のアントシアニンを加えて、ＡＡＨ−ＩＩ（ＨＯＡｃ：ＨＣｌ：Ｈ２Ｏ、１５：３：８２）中で展開した。クロマトグラムの放射能は、バイオイメージアナライザー（ｂｉｏｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＡＳ  １５００、Ｆｕｊｉ  Ｐｈｏｔｏｆｉｌｍ））によって走査した。基質としてのアントシアニンとベタレインを除くフラボノイド化合物の反応混合物は、１０％ＨＣＯＯＨ  ２０μｌを加えて停止させ、反応生成物は酢酸エチル２００μｌで抽出した。有機相のアリコート１００μｌをシンチレーションバイアルに移し、トルエンベースのシンチレーション液中で放射能を測定した。カルコンは、Ｍｏｕｓｔａｆａ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ（１９６７）の方法に従って、ナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）より合成した（Ｍｏｕｓｔａｆａ  ａｎｄ  Ｗｏｎｇ、ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ，  ６：６２５−６３２，  １９６７）。
【００５２】
〔６〕カーネーションｒＧＴの反応生成物の同定
停止溶液によって終了させた反応混合物の上清中の反応生成物は、ＡＡＨ−ＩＩおよびｎ−ＢｕＯＨ−ＨＯＡｃ−Ｈ２Ｏ（４：１：２、ｖ／ｖ）の溶媒系を用いて、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（Ａｖｉｃｅｌ  ＳＦ．  Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ、日本）中の標品のフラボノイドのＲｆ値との比較によって同定した。さらに、逆相カラム（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ、５Ｃ１８  ＡＲ）を備えたＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）によって、標品のフラボノイドの保持時間と比較して同定した。［分析条件  移動相Ａ液：１．５％  Ｈ３ＰＯ４，移動相Ｂ液  ：８０％  ＭｅＯＨ、移動流量（１ｍｌ／ｍｉｎ）２０分間  のＢ液２０→８０のグラジエント溶出、検出波長  ：５２０、３６０または２８０ｎｍ  ］。
【００５３】
［実施例１］
本発明者らは、数種の全長カーネーションＧＴ  ｃＤＮＡをクローニングした（表１）。
【００５４】
【表１】
2004305049.tif 000002
【００５５】
これらのカーネーションＧＴを大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で発現させ生成した組換えタンパク質に対し、その酵素活性および基質特異性を決定するため、種々のフラボノイドを使用し、ＴＬＣ分析、ＨＰＬＣおよび１４ＣＵＤＰ−グルコースを用いた液体シンチレーターによる分析を行った。
【００５６】
図２および図３に示すように、生成した組換えタンパク質であるＤｃＧＴ３（Ｈ）及びＤｃＧＴ２（Ｄ）について、ＴＬＣ分析を行なった。その結果、ＤｃＧＴ３（Ｈ）では１４Ｃでラベルされたカルコンおよびナリンゲニンが検出された（図２Ａ）。一方ＤｃＧＴ２（Ｄ）では１４Ｃでラベルされたカルコン配糖体が検出された（図２Ｂ）。またＤｃＧＴ２（Ｄ）では、クェルセチンを基質としたとき、いくつかのスポットが確認され、そのうち一つはクェルセチン３−Ｏ−グルコシドであることが判明した。またナリンゲニンを基質としたとき、ＤｃＧＴ３（Ｈ）と同様に配糖化していることがわかった。
【００５７】
また、カルコンを基質としてＤｃＧＴ３（Ｈ）、ＤｃＧＴ２（Ｄ）と反応させ、ＨＰＬＣにて分析を行なった。その結果、ＤｃＧＴ２（Ｄ）により生成された生成物については、いくつかのスペクトルが確認され、これらの吸収波長がカルコンと同一もしくは類似していることから、カルコン配糖体であることがわかった。またこのカルコン配糖体とＣｈ  ２’Ｇの標準色素のリテンションタイムが完全一致した。このことから、このカルコン配糖体は２’の位置に配糖体化されていることが明らかになった。一方  ＤｃＧＴ３（Ｈ）においても同様なスペクトルが見られ、標準色素と同じリテンションタイムに微量ではあるがＣｈ  ２’Ｇのスペクトルが見られた。
【００５８】
これらの結果から、ＤｃＧＴ２（Ｄ）とＤｃＧＴ３（Ｈ）は、カルコノナリンゲニンを基質とし、Ｃｈ  ２’Ｇを生成する酵素Ｃｈ  ２’ＧＴであることが判明した。これよりＣｈ  ２’ＧＴをコードするｃＤＮＡは二種類存在することがわかった。ＤｃＧＴ２（Ｄ）のアミノ酸配列は、ドロテアンサス属のベタニジン５ＧＴに対して６０％の同一性を示した（Ｖｏｇｔら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ，  １９：５０９−５１９，  １９９９）。
【００５９】
アントシアニン配糖化酵素は一般的にその基質特異性が広いと言われているが、ＤｃＧＴ２（Ｄ）に対してシアニジンを基質として反応させたときにはシアニジン  ３−Ｏ−グルコシドとシアニジン５−Ｏ−グルコシドの両方が生成した。これに対し、ＤｃＧＴ３（Ｈ）はシアニジンを配糖化しなかった。この結果、ＤｃＧＴ２（Ｄ）はシアニジン、シアニジン  ３−Ｏ−グルコシド、クェルセチンなどのフラボノールなど様々なアントシアニンの生合成経路の中間代謝産物を配糖体化するのに対し、ＤｃＧＴ３（Ｈ）はカルコンナリンゲニンを特異的に配糖体化することが判明した。またこれら二種類のｃＤＮＡの間には顕著な相同性はみられず、また酵素の至適ｐＨや至適温度も異なることが判明した（データは示さず）。
【００６０】
ＤｃＧＴ２（Ｄ）およびＤｃＧＴ３（Ｈ）のｃＤＮＡが単離できたことから、植物においてこれらが発現していることは明らかであるが、ノーザンレベルでは確認できなかった。このことは、これらの酵素活性が非常に高いこと、また、ごく微量の発現で植物の花色を改変できることを示唆する。
【００６１】
以上の結果は、遺伝子技術によりＤｃＧＴ２（Ｄ）またはＤｃＧＴ３（Ｈ）の遺伝子を導入することにより、花色が、例えば黄色〜橙色に改変された花を作成することが可能であることを示している。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によって、Ｃｈ  ２’Ｇ、アントシアニジン３−Ｏ−グルコシド、およびアントシアニジン５−Ｏ−グルコシド等が製造できるようになった。また、本発明のＤＮＡを利用することで、植物の花色を改変できる。花に対する消費者ニーズが年々拡大、多様化しており、最近のガーデニングブームなどの影響もあって、家庭用の手軽で安価な切り花に人気が移りつつある。本発明のＤＮＡを利用して新規な花色を有する植物体を作出することで、このニーズに応えることができる。
【００６３】
【配列表】
2004305049.tif 000003
2004305049.tif 000004
2004305049.tif 000005
2004305049.tif 000006
2004305049.tif 000007
2004305049.tif 000008
2004305049.tif 000009
2004305049.tif 000010
2004305049.tif 000011
2004305049.tif 000012
2004305049.tif 000013
2004305049.tif 000014
2004305049.tif 000015
2004305049.tif 000016
2004305049.tif 000017
2004305049.tif 000018
2004305049.tif 000019
2004305049.tif 000020
2004305049.tif 000021
2004305049.tif 000022
2004305049.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【図１】カーネーションによるナデシコ属Ｃｈ  ２’ＧＴによって触媒されたグルコシル転移を示す図である。
【図２】反応混合物中のナデシコ属Ｃｈ  ２’ＧＴによる反応生成物としてのカルコングルコシド、ナリンゲニングルコシドのＴＬＣ上での放射能の走査パターンを示す写真である。
【図３】反応混合物中のナデシコ属Ｃｈ  ２’ＧＴによる反応生成物としてのＣｈ  ２’ＧのＴＬＣ上での放射能の走査パターンを示す写真である。
【図１】
2004305049.tif 000024
【図２】
2004305049.tif 000025
【図３】
2004305049.tif 000026