(57)【要約】【課題】血管平滑筋増殖に起因する疾患、例えば、心臓の冠動脈閉塞をバルーンで拡大する治療後に起こる再閉塞等に対する、新規な予防治療剤を提供すること。【解決手段】１４員環マクロライド化合物、具体的には、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体を有効成分とする、血管平滑筋増殖の抑制剤、サイクリン依存性キナーゼ複合体発現増強剤、及び血管平滑筋の増殖に起因する疾患の予防治療剤、並びに、該疾患の治療方法等を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋増殖抑制剤。
【請求項２】
血管平滑筋がヒト冠血管平滑筋であることを特徴とする、請求項１に記載の血管平滑筋増殖抑制剤。
【請求項３】
前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、請求項１又は２に記載の血管平滑筋増殖抑制剤。
【請求項４】
前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、請求項３記載の血管平滑筋増殖抑制剤。
【請求項５】
１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤。
【請求項６】
前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、請求項５に記載のサイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤。
【請求項７】
前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、請求項６記載のサイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤。
【請求項８】
１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の予防治療剤。
【請求項９】
前記血管平滑筋の増殖に起因する疾患は、血管平滑筋の増殖に伴う動脈硬化症または慢性血管硬化症である、請求項８記載の予防治療剤。
【請求項１０】
前記血管平滑筋の増殖に起因する疾患は、脳血管狭窄症、腎血管狭窄症、又は心筋梗塞症である、請求項８記載の予防治療剤。
【請求項１１】
前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の予防治療剤。
【請求項１２】
前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、請求項１１記載の予防治療剤。
【請求項１３】
治療に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、血管平滑筋増殖の抑制方法。
【請求項１４】
細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階を有意に抑制することを特徴とする、請求項１３記載の血管平滑筋増殖の抑制方法。
【請求項１５】
細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階の抑制が、リン酸化網膜芽腫遺伝子産物の生成の抑制によってもたらされるものであることを特徴とする、請求項１４記載の血管平滑筋増殖の抑制方法。
【請求項１６】
細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階の抑制が、サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）の発現を増強することによってもたらされるものであることを特徴とする、請求項１４又は１５記載の血管平滑筋増殖の抑制方法。
【請求項１７】
治療に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の治療方法。
【請求項１８】
予防に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、心臓の冠動脈閉塞手術後の再閉塞を防止する方法。
【請求項１９】
前記投与工程は経口投与によって行われる、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の予防治療剤及びその治療方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
エリスロマイシン及びロキシスロマイシン等に代表される１４員環マクロライド系化合物は、メチル側鎖等を有する１４員環ラクトンにジメチルアミノ糖又は中性糖などが結合した放線菌により生産される抗生物質であり、従来から種々の感染症、たとえば、グラム陽性菌、ある種のグラム陰性菌、マイコプラズマやクラミジア等において、その強力な抗菌活性によって臨床上幅広く利用されている。その作用機序は、細菌の７０Ｓリボゾームの５０Ｓサブユニットに作用し、ペプチド転移酵素反応を阻害して蛋白質合成を抑制するものである。
【０００３】
近年に至り、虚血性心疾患の患者は、健常人に比べ、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）に対するＩｇＧ抗体価が有意に高値であるとの報告がなされている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
さらに、肺炎クラミジアの感染が、虚血性心疾患の発生頻度を２〜４倍増加させているとの、疫学的な研究報告もなされている（例えば、非特許文献２参照）。かかる疫学結果を支持するような研究として、剖検患者の心冠動脈におけるアテローム病変部位に、当該病原体を高率に検出させるとの報告もなされている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００５】
一方、マクロライド系化合物に属するラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）等は、血管平滑筋の増殖抑制活性を示すことが知られており、本活性が種々のサイトカイン等による増殖刺激を阻害することでもたらされていることが明らかとなっている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｓａｉｋｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  Ｎｏ．２，  ｐｐ９８３−９８６，  １９８８
【非特許文献２】
Ｄａｎｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  Ｎｏ．３５０，  ｐｐ４３０−４３６，  １９９７
【非特許文献３】
Ｓｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｆｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌｓ，  Ｎｏ．８２，  ｐ１５８，  １９９２
【非特許文献４】
Ｍａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｚ  Ｋａｒｄｉｏｌ，  Ｓｕｐｐｌｅ  ３，  ｐｐＩＩＩ／４９−ＩＩＩ／５７，  ２００２
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
最近では、心臓の冠動脈閉塞をバルーンで拡大する治療が行われているが、手術後に再度閉塞が起き、臨床上の問題となっている。これは血管の平滑筋が血管内膜のキズを刺激に増殖し、キズの部分の平滑筋が肥大することが原因とされている。
【０００８】
しかしながら、前述のラパマイシンは細胞毒性が強く、これを投与すると動物の免疫力が低下するために、種々の副作用が生じるという問題点がある。従って、特に、上記のような平滑筋の肥大を防ぐ臨床上有効な手段として使用することが出来るような、血管平滑筋への直接的な増殖阻害活性に基づく有効でかつ実用的な疾患の治療剤は未だに提供されていないのが実情である。
【０００９】
そこで、本発明では、上記課題を解決し、血管平滑筋増殖に起因する疾患に対する、新規な予防又は治療の為の薬剤（予防治療剤）を提供することを目的とする。
本発明者は、かかる事情に鑑み、鋭意研究した結果、ラパマイシン等の巨大な分子量を有するものではなく、１４員環マクロライド系化合物が直接的に血管平滑筋増殖抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、以下の各態様に係る発明を提供するものである。
１．１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋増殖抑制剤。
２．血管平滑筋がヒト冠血管平滑筋であることを特徴とする、態様１に記載の血管平滑筋増殖抑制剤。
３．前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、態様１又は２に記載の血管平滑筋増殖抑制剤。
４．前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、態様３記載の血管平滑筋増殖抑制剤。
５．１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤。
６．前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、態様５に記載のサイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤。
７．前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、態様６記載のサイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤。
８．１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の予防治療剤。
９．前記血管平滑筋の増殖に起因する疾患は、血管平滑筋の増殖に伴う動脈硬化症または慢性血管硬化症である、態様８記載の予防治療剤。
１０．前記血管平滑筋の増殖に起因する疾患は、脳血管狭窄症、腎血管狭窄症、又は心筋梗塞症である、態様８記載の予防治療剤。
１１．前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、態様８〜１０のいずれか一項に記載の予防治療剤。
１２．前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、態様１１記載の予防治療剤。
１３．治療に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、血管平滑筋増殖の抑制方法。
１４．細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階を有意に抑制することを特徴とする、態様１３記載の血管平滑筋増殖の抑制方法。
１５．細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階の抑制が、リン酸化網膜芽腫遺伝子産物の生成の抑制によってもたらされるものであることを特徴とする、態様１４記載の血管平滑筋増殖の抑制方法。
１６．細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階の抑制が、サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）の発現を増強することによってもたらされるものであることを特徴とする、態様１４又は１５記載の血管平滑筋増殖の抑制方法。
１７．治療に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の治療方法。
１８．予防に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、心臓の冠動脈閉塞手術後の再閉塞を防止する方法。
１９．投与工程は経口投与によって行われる、態様１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記１４員環マクロライド化合物は、エリスロマイシン又はエリスロマイシン誘導体、ロキシスロマイシン又はロキシスロマイシン誘導体から選ばれる、態様１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記１４員環マクロライド化合物がロキシスロマイシンである、態様２０に記載の方法。
【００１１】
本発明の１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋増殖抑制剤の好ましい態様によれば、該血管平滑筋増殖抑制剤は、血管平滑筋の細胞周期におけるＧ１期（ＤＮＡ合成準備期）からＳ期（ＤＮＡ合成期）に向かう段階を有意に抑制することを特徴とする。
【００１２】
本発明の増殖抑制剤の対象となる血管平滑筋は血管壁に見られ、緊張の保存と収縮にあずかる不随意筋である。その由来動物種、その部位等に関して特に制限はなく、代表的な例として、例えば、冠血管平滑筋及び大動脈血管平滑筋等を挙げることができる。本発明の増殖抑制剤は特に、ヒト冠血管平滑筋の増殖抑制に有効であり、従って、心臓の冠動脈閉塞のバルーンでの拡大治療手術後の再閉塞防止に有効である。
【００１３】
本明細書中の実施例で示されているように、血管平滑筋の細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階の抑制は、真核生物の細胞周期の進行に中心的な役割を果たすサイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ）の中心的な分子であるＣＤＫＩｓ−ｐ２７の発現が増強されることによってもたらされるものである。従って、本発明はまた、１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）発現増強剤に係るものである。
【００１４】
更に本発明は、１４員環マクロライド化合物を有効成分とする、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の予防治療剤に係るものである。かかる疾患の代表的な例としては、血管平滑筋の増殖に伴う動脈硬化症及び慢性血管硬化症、並びに、脳血管狭窄症、腎血管狭窄症、及び心筋梗塞症等を挙げることができる。
【００１５】
本発明は、治療に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、血管平滑筋増殖の抑制方法に係る。本明細書中の実施例で示されているように、かかる血管平滑筋増殖の抑制は、リン酸化網膜芽腫遺伝子産物の生成の抑制によってもたらされるものであり、更にこれは、サイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ−ｐ２７）の発現を増強することによってもたらされるものである。本発明は、又、治療に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、血管平滑筋の増殖に起因する疾患の治療方法に係る。更に、予防に有効な量の１４員環マクロライド化合物を投与することを含む、心臓の冠動脈閉塞手術後の再閉塞を防止する方法にも係る。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明において有効成分として使用される１４員環マクロライド化合物の種類に特に制限はなく、当業者に公知の任意の１４員環マクロライド化合物を使用することができる。
【００１７】
１４員環マクロライド化合物は、本発明では、下記式  （Ｉ）  で表されるエリスロマイシン若しくは、下記式  （ＩＩ）  で表されるロキシスロマイシン、又はそれらの誘導体であることが好ましい。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
【化２】
2004323414.tif 000004
【００２０】
かかる１４員環マクロライド化合物は公知の化合物であり、試薬、工業原料として容易に入手可能である。因みに、エリスロマイシン塩酸塩の急性毒性（マウスＬＤ５０）は、４２５．６＋１５．７ｍｇ／ｋｇ（静脈）及び４９０＋３０．４ｍｇ／ｋｇ（腹腔）である。
【００２１】
本発明に用いられる１４員環マクロライド化合物は、当業者に公知の任意の塩又はエステルを形成してもよい。かかる塩における好ましい例としては、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、酸性又は塩基性アミノ酸との塩などが挙げられる。酸、塩基は、当該化合物１分子に対し、０．１〜５分子の適宜な比で塩を形成する。
【００２２】
無機酸との塩の好ましい例としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などとの塩が挙げられ、有機酸との塩の好ましい例としては、たとえば、酢酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、ステアリン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
【００２３】
無機塩基との塩の好ましい例としては、たとえば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。また、有機塩基との塩の好ましい例としては、たとえば、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、メグルミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
【００２４】
酸性アミノ酸との塩の好ましい例としては、たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられ、塩基性アミノ酸との塩の好ましい例としては、たとえば、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられる。
【００２５】
エステル体の例としては、２’−アセチルエステル体、及び油脂（各種脂肪酸とのエステル体）等を挙げることが出来る。
【００２６】
又、１４員環マクロライド化合物の「誘導体」とは、当業者に公知の任意の誘導体、例えば、各種エリスロマイシン誘導体を意味する。
【００２７】
本発明に用いられる化合物を予防治療剤として使用する場合の投与経路は特に限定されず、経口投与若しくは非経口投与（たとえば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）のいずれでもよい。
【００２８】
本発明方法における活性成分の有効な投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤などを総合的に勘案して適宜選択することができる。投与量は、特に限定されないが、通常成人１日あたり約０．１〜２０００ｍｇ、好ましくは約１〜１０００ｍｇであり、より好ましくは１０〜５００ｍｇであり、これを、通例、１日１〜４回にわけて投与する。１日１回投与の場合の投与量合計が０．１ｍｇ以下では予防治療効果が得られず、１日４回投与での投与量合計が２０００ｍｇ以上では、薬剤の血中濃度が上昇し、発疹等を引き起こすおそれがある。
【００２９】
本発明の各薬剤は、当業者に公知の任意の方法に従って製造することが出来る。その形態は投与経路等に応じて適宜選択することが出来、例えば、経口投与のための製剤としては、たとえば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、口腔内崩壊錠、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては、たとえば、注射剤、点滴剤、坐薬、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。尚、これら薬剤にはその形態等に応じて、製薬業界において通常使用されるような、当業者に公知の任意の各種補助物質を適宜含むことが出来る。又、これら薬剤中の活性成分の含有量は、その形態等にもよるが、通常、１〜１０重量％程度である。
【００３０】
【実施例】
以下の実施例では、ヒト冠血管平滑筋細胞であるＣＡＳＭＣｓ細胞の培養実験、ＣＡＳＭＣｓ細胞増殖阻害試験、細胞周期解析法、ウエスタンブロット法等を利用して、本発明で使用される１４員環マクロライド化合物が血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有することを示して、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されない。
【００３１】
【実施例１】
ＣＡＳＭＣｓ細胞培養法：ヒト冠血管平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣｓ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ社より購入し、付属の培養キット（ＳｍＧＭ−２）を用いて３７℃の５％ＣＯ２条件下で培養し、細胞培養液中には５％牛胎児血清、２ｎｇ／ｍｌ  ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）、５μｇ／ｍｌ  牛インシュリン、０．５ｎｇ／ｍｌ  ヒト上皮増殖因子（ＦＧＦ）等を添加して培養を行った。
【００３２】
【実施例２】
ＣＡＳＭＣｓ細胞増殖阻害試験：ＣＡＳＭＣｓ細胞を前記の方法によって９６穴プレートに培養し、一定時間経過後細胞が７０〜８０％近く各穴の培養面を埋めてきた時点において、２４時間の血清非存在条件下による細胞の栄養枯渇状態を設定させて後、被検物質であるロキシスロマイシン（ＲＸＭ）を種々の濃度（０．１，  １．０，  １０，  １００  μｇ／ｍｌ）で添加し、被検物質の添加後２４時間から７２時間の培養後、各経過時点での細胞の増殖程度を、タカラＰｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔを用いて、ＷＳＴ−１試薬によるフォルマザン形成発色試験方法によって比色定量した。具体的には、Ｐｒｅｍｉｘ  ＷＳＴ−１  を１０μｌ  ずつ加え、２−４時間後に４４０ｎｍ  の吸光度をプレートリーダーで測定した。
【００３３】
図１のＦｉｇｕｒｅ１Ａに示されるように、ＲＸＭはＣＡＳＭＣｓ細胞の増殖を、陰性コントロールであるＲＸＭ非添加群と比して、ＲＸＭが１および１０μｇ／ｍｌの両濃度において、経時観察を行った時点のいずれにおいても、統計的に有意なレベルで増殖阻害を示した。
【００３４】
又、図１のＦｉｇｕｒｅ１Ｂに示されるように、ＲＸＭはＣＡＳＭＣｓ細胞の増殖を、陰性コントロールであるＲＸＭ非添加群と比して、ＲＸＭが１〜１００μｇ／ｍｌの濃度に渡って、薬物濃度依存的に統計的有意なレベルで増殖阻害を示した。
【００３５】
【実施例３】
ＣＡＳＭＣｓ細胞増殖阻害試験（その他の抗菌剤）：一方、その他の抗菌剤を被検物質として用いて同様な試験系で行ったところ、図２に示されるように、抗菌剤の代表であるＡｍｐｉｃｉｌｉｎ  （ＡＢＰＣ；  ５０μｇ／ｍｌ）  およびＧｅｎｔａｍｉｃｉｎ  （５０μｇ／ｍｌ）、さらに抗真菌剤の代表的薬剤のＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  （５０  ｎｇ／ｍｌ）  などはＣＡＳＭＣｓ細胞の増殖に対して、２４〜７２時間のいずれの観察時点においても阻害作用を示すことはなかった。
【００３６】
【実施例４】
細胞周期解析法：上記で示されてきた、ＲＸＭのＣＡＳＭＣｓ細胞への直接的増殖阻害作用が、細胞周期におけるいかなる時点で効果を現しているかについて、フローサイトメトリを用いた実験によって、さらなる検討を行った。
具体的には、以下の手順及び条件でフローサイトメトリを用いた測定を行った。７０％エタノールで３０分間固定後、ＲＮａｓｅ  （５μｇ／ｍｌ  ）で３０分間インキュベートした。その後、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（１０μｇ／ｍｌ  ）で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳｃａｎ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  社）で測定した。
尚、細胞周期の移行する程度は、具体的には、ＭｏｄＦｉｔ  ＬＴ  ソフトフェアでＤＮＡヒストグラム解析を行い、全体の細胞に対する％で示した。
【００３７】
図３に示されるように、ＲＸＭの１０μｇ／ｍｌの濃度において、細胞周期におけるＧ１期からＳ期に向かう段階を統計的に有意なレベルで抑制していることが示されたが、一方、細胞周期のＳ期からＧ２／Ｍ期に向かう段階には阻害作用が認められなかった。
【００３８】
【実施例５】
ウエスタンブロット法（１）：上記のＲＸＭによるＣＡＳＭＣｓ細胞おけるＧ１期からＳ期に向かう段階の抑制が、本細胞周期移行に必須の細胞内分子であるとされているリン酸化網膜芽腫遺伝子産物（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ：ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂ）を指標として、本分子のリン酸化の阻害に基づくものであるかを、ウエスタン・ブロッティング法においてｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂを特異的に認識するモノクロナール抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて解析した。
【００３９】
この実験において、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂは通常の条件下ではウエスタン・ブロット法では検出出来ないレベルであるため、５％牛胎児血清（ＦＢＳ），  ２ｎｇ／ｍｌ  ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ），  ５μｇ／ｍｌ  牛インシュリン、及び０．５ｎｇ／ｍｌ  ヒト上皮増殖因子（ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を培養液に添加することによって、ＣＡＳＭＣｓ細胞をマイトージェンにより刺激し、活性化状態を生起させｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂ発現量を増加させた状態において後、解析を行った。
具体的には、以下の手順及び条件で、活性化状態を生起させ、ウエスタン・ブロットを実施した。
ＳＤＳゲルで電気泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、ドライミルクでブロッキング後、一次抗体（抗ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂウサギ抗体）及び標識二次抗体（抗ウサギＩｇＧマウス抗体）で順次インキュベーとした。その後、アルカリフォスファターゼイムノブロットキットを用いて発色させ、デンシトメーターで定量した。
【００４０】
その結果、図４に示されるように、ＲＸＭの１〜１０μｇ／ｍｌの濃度において、ＣＡＳＭＣｓ細胞おけるｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂの生成を明瞭に抑制していることが示された。
【００４１】
【実施例６】
ウエスタン・ブロット法（２）：上記ＲＸＭによるＣＡＳＭＣｓ細胞おけるｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂの生成阻害が、如何なる細胞内分子を修飾することで生起しているかを検討する目的で、当該細胞内分子を制御する分子として知られているサイクリン依存性キナーゼ複合体（ＣＤＫＩｓ）に着目し、その中心的分子であるＣＤＫＩｓ−ｐ２７およびＣＤＫＩｓ−ｐ２１について、実施例５と同様な条件下でウエスタン・ブロッティング法によって解析を行った。
【００４２】
ＣＤＫＩｓ−ｐ２７およびＣＤＫＩｓ−ｐ２１分子はｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂと同様に、通常の細胞では発現は弱くウエスタン・ブロット法によっても検出出来ないレベルであるため、実施例５と同様な条件下でマイトージェンによって細胞を活性化状態にしたものを解析の対象とした。
【００４３】
その結果、図５に示されるように、ＲＸＭの１〜１０μｇ／ｍｌの濃度において、ＣＡＳＭＣｓ細胞おけるマイトージェン刺激存在下におけるＣＤＫＩｓ−ｐ２７の発現は、ＲＸＭの濃度依存的に明瞭に増加していたが、一方、ＣＤＫＩｓ−ｐ２１の発現には明瞭な差異が認められなかった。
【００４４】
こうしたウエスタン・ブロット法を用いた細胞内分子の解析の結果、ＲＸＭによるＣＡＳＭＣｓ細胞への直接的増殖阻害活性は、主として、サイクリン依存性キナーゼ複合体のなかのＣＤＫＩｓ−ｐ２７の発現増強効果によってもたらされた、細胞周期移行におけるＧ１からＳ期への移行阻害に基づくものであることが示された。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、１４員環マクロライド化合物は血管平滑筋細胞の増殖を抑制するため、１４員環マクロライド化合物を有効成分として含有する血管平滑筋の増殖に起因する疾患、例えば、血管平滑筋の増殖に伴う動脈硬化症及び慢性血管硬化症、並びに、脳血管狭窄症、腎血管狭窄症、及び心筋梗塞症等に対する有効な予防治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＲＸＭによるＣＡＳＭＣｓ細胞への直接的増殖阻害効果を示している。図中ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍとは、実施例１に記載した組成の完全栄養培地を示し、ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅとはこの完全栄養培地から必須栄養素であるところの牛由来血清を添加していない培地を示す。
縦軸は細胞密度を表すところの、光波長４５０ｎｍにおける吸収度である。Ｆｉｇｕｒｅ１Ａの横軸は培養時間を示し、Ｆｉｇｕｒｅ１Ｂの横軸はＲＸＭの濃度を示す。
【図２】図２は、一般的抗菌剤および抗真菌剤によるＣＡＳＭＣｓ細胞への直接的増殖阻害効果を示している。図中ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ、ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅとは図１における説明と同様であり、ＡＢＰＣとはａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを指す。
縦軸は細胞密度を表すところの、光波長４５０ｎｍにおける吸収度であり、横軸は培養時間を示す。
【図３】図３は、フローサイトメトリを用いての細胞周期を解析した結果であり、上段の図がＧ１期からＳ期に移行する程度を示したもので、下段の図がＳ期からＧ２／Ｍ期への移行の程度を示したものである。
縦軸は細胞周期の移行する程度を％で表したものであり、横軸はＲＸＭ（１０μｇ／ｍｌ）の有無を表す。
【図４】図４は、ウエスタンブロット法によりｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂ蛋白質を解析した結果を示す電気泳動の写真である。
写真の左に記載された数字はｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒｂの分子量（Ｋ  Ｄａｌｔｏｎ）を表す。写真下のｑｕｉｅｓｃｅｎｔはｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄされていない（非活性化状態の）Ｒｂ分子を入れてあるレーンを示し、その隣からはＲＸＭの濃度を示す。
【図５】図５は、ウエスタンブロット法によりＣＤＫＩｓ蛋白質（ｐ２１およびｐ２７）を解析した結果を示す電気泳動の写真である。
写真の左に記載された数字はＣＤＫＩｓの分子量（Ｋ  Ｄａｌｔｏｎ）を表す。上段の写真はＣＤＫＩｓ−ｐ２１についての解析結果の写真であり、下段の写真はＣＤＫＩｓ−ｐ２７についてのものである。写真下のｑｕｉｅｓｃｅｎｔはマイトージェン非刺激下の活性化されていない細胞から回収した（非活性化状態の）ＣＤＫＩｓ分子を入れてあるレーンを示し、その隣からはＲＸＭの濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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