(57)【要約】【課題】      抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強することのできる因子を食品成分中から見出し、該因子を配合する食品組成物及び医薬組成物を提供すること。【解決手段】ヒトβディフェンシン２のｍＲＮＡに特異的なプライマーを使用することを特徴とする、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトβディフェンシン２ｍＲＮＡの定量的検出方法。【選択図】          図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
qRThBD2fプライマー（5'-cttccaggtgtttttggtggta-3'）、qRThBD2rプライマー（5'-ggagccatatgtcatccagtc-3'）、及び、タックマン（TaqManTM）プローブとしてhBD2
probe（5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3'）を使用することを特徴とする、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトβディフェンシン２ｍＲＮＡの定量的検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の検出方法を用いてヒトβディフェンシン２ｍＲＮＡの発現量を測定することにより、食品素材抽出物の、ヒトβディフェンシン２の発現を誘導及び／又は増強する効果を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品素材中に含まれる、抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強する因子、並びに、ヒトβディフェンシン２の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫機構をもたない生物は、生体防御機構として抗菌性物質を作りだし、細菌等の微生物の感染などから身を守っているが、免疫機構を持つ脊椎動物も抗菌（抗微生物活性）ペプチドといわれる物質を作ることが知られている。これら抗菌ペプチドの大きさ及び構造はかなりの多様性を示すが、一般には、それらは中性ｐＨで正味の正電荷を有する膜活性両親媒性分子である。
これらカチオン性ペプチドには、大まかに区分された２つのファミリー：つまり線状ペプチド（例えば、セクロピン類（cecropins)) 及びシステインに富むペプチドがある。後者には、哺乳動物ディフェンシン、気管抗微生物性ペプチド及びウシバクテネシン類（bovine
bactenecines)等が含まれる。ヒトの抗菌ペプチドとしては、ディフェンシンとよばれる物質が存在し、好中球や小腸粘膜のPaneth細胞の他に体内の様々な組織で、恒常的に又は発達段階に一過性に発現されていることが知られている。
ディフェンシンは好中球のアズール顆粒の主要構成成分であり、これまでにHNP-1 、-2、-3及び-4と呼ばれる４種類のディフェンシンが単離されその構造も明らかにされている。かかるディフェンシンは２９〜３４個のアミノ酸から成る塩基性ペプチドであり、６個のシステインと１個のグリシンが共通して保存されている遺伝子ファミリー(hBD-1)
を構成している。
又、ヒトPaneth細胞で発現しているディフェンシンファミリー遺伝子の存在も証明された。これらの消化器ディフェンシンはヒトディフェンシン５及び６と呼ばれ、その構造も決定された（特表平７−５０７２１３）。
以上のことから、ヒトディフェンシンは正常細胞叢の維持、及び外来細菌からの防御に貢献していることが示唆されている。
【０００３】
最近、新たな抗菌ペプチドがヒトの表皮ケラチノ（角化）細胞から発見された。この抗菌ペプチドは、上記ディフェンシン遺伝子ファミリーに見られる共通配列を有しておりこれらと相同性が高いことから、ヒトβディフェンシン２（hBD-2)と名付けられた。更に、このhBD-2 の転写のレベルが細菌の感染によって変化することが判明した。又、このhBD-2 は肺及び気管等でも発現していることが判った（ジェイ・ハーダー他、ネイチャー（Nature)
、第３８７巻、第８６１ページ、１９９７）。しかしながら、その発現調節機構は未だ明らかとなっていない。
【特許文献１】特表平７−５０７２１３
【非特許文献１】ジェイ・ハーダー他、ネイチャー（Nature) 、第３８７巻、第８６１ページ、１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、このような抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強することのできる因子を、例えば食品成分中から見出すことが出来れば、このような因子を配合することによって生体防御機構の強化が可能な食品、又は、消化器系等の障害の治療に有効な医薬品の開発が可能になる。
【０００５】
本発明者は上記課題を解決する為に、ヒト角化細胞及びヒト鼻粘膜上皮細胞を使い、死菌や食品素材抽出物を添加することによって、抗菌ペプチドの発現レベルの変化をＲＴ−ＰＣＲ法によって測定し、抗菌ペプチド産生を誘導及び／又は増強する因子を検出する実験系を構築することに成功し、抗菌ペプチドの産生を誘導及び／又は増強することのできる成分を見出して、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、ヒト抗菌ペプチドの発現を誘導する因子を含有する食品抽出物、及びヒト抗菌ペプチドの発現を増強する因子を含有する食品抽出物に係わるものである。
ヒト抗菌ペプチドとしては、従来から知られている各種の物質を対象とすることができる。好適な例として、ヒトβディフェンシン２（hBD-2)を挙げることができる。
本発明の食品抽出物は、各種食品素材を、当業者には公知の如何なる抽出操作を施すことによっても調製することができる。例えば、無機酸、有機酸、塩類、糖質等を含む水又は熱水による抽出、アルコール類による抽出、或いは液化炭酸ガスによる抽出等を挙げることができる。又、該食品組成物は、固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、及び顆粒等のあらゆる形態を採ることが可能である。
【０００７】
本明細書中で、「抗菌」又は「抗微生物活性」という用語は、微生物の生育を阻害するか、または不可逆的に阻止する化合物の能力を意味するものである。この種の阻害または阻止は、殺微生物作用または微生物静止阻害を介するものとし得る。ここで「殺微生物作用」という用語は、標的微生物を殺傷するか、または取り返しのつかないように損傷を与えることのできる化合物の能力を示すものである。又、「微生物静止阻害」という用語は、微生物の死滅にまでは至らないが、その増殖及び生育を抑制することを意味するものである。
【０００８】
従って、本発明は、上記因子又は該因子を含有する食品抽出物を配合したことを特徴とする食品組成物にも係わるものである。
本発明の食品組成物を摂取することによって、消化器系統に於いてヒトディフェンシン等の抗菌ペプチドの発現が誘導又は増強されて、潜在的な微生物病原体を予防又は除去することが期待される。該食品組成物は，固形、液体、ゾル、ゲル、粉末、及び顆粒等のあらゆる形態を採ることが可能である。製造方法も当該技術分野で公知の如何なる方法も可能である。
本発明の食品組成物における上記因子又は食品抽出物の含有量は、配合目的及び食品組成物の種類・形態等に応じて当業者が適宜選ぶことができる。
【０００９】
更に、本発明は、上記因子又は該因子を含有する食品抽出物を含む医薬組成物にも係わるものである。本発明の医薬組成物は、微生物感染症又は消化器系炎症等の予防及び治療に使用することができる。
本発明の医薬組成物は、かかる予防及び治療に有効な量の上記因子又は該因子を含有する食品抽出物の他に、当業者に公知の薬学的に許容し得る適当なキャリアを含むことができる。
本発明の医薬組成物は、広範な種類の微生物、例えばカビ及び細菌（グラム陽性及び陰性の両者）等に起因する感染症又は消化器系炎症等に有効である。
該医薬組成物中に配合される上記因子又は食品抽出物の量は、他の成分の性状、使用目的、患者の年齢・体重、及び要求される効果の程度等に応じて当業者が適宜選ぶことができる。
【００１０】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で公知の任意の形態を採ることができ、例えば、様々な塩及び緩衝剤によって緩衝化した、溶液、懸濁液、乳濁液等の液体製剤とすることができる。塩は、大半のものをアルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物、リン酸塩及び硫酸塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムまたは硫酸ナトリウムとし得る。種々の緩衝剤、例えばクエン酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、トリス等を、この種の緩衝剤が処置される対象に生理学的に許容され得る程度で使用することができる。
又、本発明の医薬組成物を錠剤、顆粒、粉末、ゲル、ゾル等の剤型とする場合には、当業者には公知の種々の賦形剤または他の添加物を使用することができる。更に、上記因子又は食品抽出物及び上記の各種添加物を薬学的に許容し得るリポソームで包摂した製剤形態とすることも可能である。
医薬組成物の形態及び投与対象の性状等に応じて、種々の様式で本発明の医薬組成物を投与することができる。例えば、経口、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜内等、鼻咽頭等により施すことができる。
【００１１】
更に本発明は、ヒト抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子の検出法に係わる。かかる検出方法においては、ヒト抗菌ペプチドを発現し得る各種培養細胞、例えば、ヒト表皮角化細胞及びヒト鼻粘膜上皮細胞等を使用する。かかる細胞を、ヒト抗菌ペプチド誘導及び／又は増強因子を含有すると考えられる、各種食品素材からの抽出物等の試料の存在下で培養する。
検出方法としては、当業者には公知の各種方法、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、リポータジーンアッセイ、抗菌試験、免疫測定法等を使用することができる。各検出方法における測定条件等は当業者が適宜、実験的に選択することができる。
【００１２】
即ち、本発明は、hBD-2 f プライマー（5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3')及びhBD-2 r プライマー（5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3') を使用することを特徴とする、ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトβディフェンシン２ｍＲＮＡの検出方法似かかる。
更に、本発明は、qRThBD2fプライマー（5'-cttccaggtgtttttggtggta-3'）及びqRThBD2rプライマー（5'-ggagccatatgtcatccagtc-3'）を使用することを特徴とする、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトβディフェンシン２ｍＲＮＡの定量的検出方法、特に、タックマン（TaqManTM）プローブとしてhBD2
probe（5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3'）を用いる該方法に係る。
又、本発明は、上記の検出方法を用いてヒトβディフェンシン２ｍＲＮＡの発現量を測定することにより、食品素材抽出物の、ヒトβディフェンシン２の発現を誘導及び／又は増強する効果を検出する方法にも係る。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、抗菌ペプチドの誘導及び／又は増強因子、或いは該因子を含む食品素材（食品抽出物）を検出することができ、かかる因子又は食品抽出物を配合した食品組成物又は医薬組成物は生体防御の強化、各種疾患の治療に有効である。
更に、焼酎もろみ等、従来は産業廃棄物として処理され、環境汚染の原因とされていた物質を、本発明によれば有用な素材として再利用することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
実施例１：ヒトβディフェンシン２の最少誘導濃度の決定
１０φのディッシュでコンフルエントにまで培養したヒト表皮角化細胞（日水製薬（株））に、オートクレーブ滅菌した大腸菌のＰＢＳ懸濁液を大腸菌の終濃度が０、０．２、１、５、２５ng／mlとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２ 雰囲気下で培養した。約１６時間後、培地を除きＰＢＳで洗い、スクレパーによって細胞を回収した。回収した細胞からRNeasy(Qiagen 社）を用いて総ＲＮＡを抽出した。各総ＲＮＡ溶液の濃度を、１μｇ／μｌに調整した。抽出した各ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法によって目的のｍＲＮＡを増幅した。
【００１６】
ＲＴ−ＰＣＲの条件は、まずヒトβディフェンシン２のｃＤＮＡの配列（Accession No.Z71389)をもとに、hBD-2 f プライマー（5'-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3')及びhBD-2
r プライマー（5'-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3')を作製した。GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
ｃＤＮＡの配列（Accession No.M33197)を参考にして、GAPDH f プライマー（5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3') とGAPDH
r プライマー（5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3') を作製し、内部標準として用いた。
ＲＴ−ＰＣＲの反応液はOneStep RNA PCR Kit(Takara酒造（株）製）を用いて、まず１チューブあたり以下の表１に示す組成になるようにマスターミックスを作製し、さらに各総ＲＮＡを表２に示す組成になるように混合し、２５μｌの系で反応を行った。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【表２】
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【００１９】
ＲＴ−ＰＣＲは、逆転写反応を５０℃下３０min、９４℃下２min、ＰＣＲ反応を、９４℃下３０sec６８℃下３０secの条件で２５サイクル行った。
反応後、反応液１０μｌを２％アガロースゲル電気泳動により分析した。表３のように、大腸菌溶液の添加によって濃度依存的な傾向でβディフェンシン２ｍＲＮＡの検出が可能であることがわかった。
大腸菌終濃度が１ng／ml以上の添加量では、βディフェンシン２のｍＲＮＡの発現が認められた（表３）。このことからディフェンシン最少誘導濃度を１ng／mlと決定した。限界検出感度として総ＲＮＡの量は１μｇ、増幅サイクル数は２５サイクルとした。
【００２０】
【表３】
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【００２１】
実施例２：食品素材抽出物の調製
各食品素材１ｇを精製水に懸濁し１０mlとした後、オートクレーブ滅菌した。これらを遠心し、上清を食品素材抽出液（食品抽出物）とした。
【００２２】
実施例３：ヒトβディフェンシン２の誘導
実施例１の実験系を使い、大腸菌溶液の代わりに実施例２で調製した各食品素材抽出液を終濃度で０．１％となるように添加した。その結果、糠味噌濃縮液及び焼酎もろみを添加した場合に、大腸菌の場合と同様なβディフェンシン２ｍＲＮＡの誘導効果が認められた。
【００２３】
実施例４：ヒトβディフェンシン２の増強
実施例３で誘導効果が認められなかった食品素材抽出液を実施例１の実験系にさらに加え、大腸菌溶液と共存する状態でβディフェンシン２ｍＲＮＡの発現を調べたところ、ローストアマランス、ロースト小麦胚芽、ハイチュウ用濃縮ヨーグルトエキス、甘酒について大腸菌溶液単独の場合よりも発現の増強が認められた。
以上の実施例３及び４で得られた結果を表４に示す。
【００２４】
【表４】
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【００２５】
以上の結果から明らかなように、抗菌ペプチドの誘導及び／又は増強効果を有する因子が各種食品素材中に存在することが見出された。
これらの誘導因子はそれ自身で抗菌ペプチドの発現を調節する機能を持ち、一方、増強因子は大腸菌の感染によって抗菌ペプチドの発現のスイッチがオンになった後にそのシグナルをより強くする機能を持つと考えられる。
こうして確認された各種食品素材中の因子の抗菌ペプチドの誘導及び／又は増強効果を、以下の実施例で更に定量的に測定した。
【００２６】
実施例5：ヒトβディフェンシン2の発現誘導条件の設定
６ウェルマルチプレート（ファルコン社製）でコンフルエントにまで培養したヒト表皮角化細胞（日水製薬（株）製）に、オートクレーブ滅菌した大腸菌のＰＢＳ懸濁液を大腸菌の終濃度が0, 0.07, 0.7, 7, 70, 700 uｇ/ｍｌとなるように添加し、37℃、5％ＣＯ2雰囲気下で培養した。約16時間後、培地を除きＰＢＳで洗った。ＲＮｅａｓｙ(Ｑｉａｇｅｎ社)を用いて、回収した細胞から総ＲＮＡを抽出した。抽出した各ＲＮＡを鋳型として、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって目的のｍＲＮＡを増幅した。
定量ＲＴ−ＰＣＲの条件は、まずヒトβディフェンシン2のｃＤＮＡの配列 (Accession No.Z71389)をもとに、qRThBD2fプライマー（5'-cttccaggtgtttttggtggta-3'）、qRThBD2rプライマー（5'-ggagccatatgtcatccagtc-3'）、更に、ABI PRISM TaqManTMプローブとしてhBD2
probe（5'-aggcgatcctgttacctgccttaagag-3'）を作製した。
GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)遺伝子のmRNAをTaqManTMGAPDH Control Regents（（株）パーキンエルマージャパン製）を用いて同時に測定し、鋳型のmRNA量の内部標準とした。
ＲＴ−ＰＣＲの反応液はTaqMan EZ RT-PCR Kit（（株）パーキンエルマージャパン製）を用いて、まず1チューブあたり以下の表５に示す組成になるようにマスターミックスを作製した。さらに各総ＲＮＡを表６に示す組成になるように混合して、サンプルあたり25μｌｘ３本の系で増幅反応をおこない、ABI
PRISM 7700 sequence detecter（（株）パーキンエルマージャパン製）によるリアルタイム検出を行った。
RT-PCRは、逆転写反応を60℃
30 min、95℃ 5 min、PCR反応を、94℃ 20 sec、60℃ 1 minの条件で40〜 45サイクル行った。更に付属の解析ソフト（Sequence
Detector v1.6.3）上で閾値を設定し、発現量の計算をおこなった。ＰＢＳのみを加えたサンプルを１００％として、相対発現量を求めた。
図１の様に、大腸菌溶液の添加によって濃度依存的にβディフェンシン2 mRNAの検出が可能であることがわかった。
大腸菌終濃度が7 ug/ml以上の添加量では、ディフェンシンのmRNAの発現の増加が認められた。（図１）このことからディフェンシン誘導濃度を7 ug/mlと設定した。
【００２７】
【表５】
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【００２８】
【表６】
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【００２９】
実施例6：食品によるヒトβディフェンシン2の誘導及び増強
実施例5の実験系を使い、実施例2で調整した各食品素材抽出液を終濃度で0.1％となるように添加した。食材のみを加えた場合と大腸菌溶液と同時に加えた場合で比較した。その結果、焼酎もろみ及び甘酒を添加した場合に大腸菌の場合と同様なβディフェンシン2
mRNAの誘導効果が認められた。また、大腸菌溶液と共存する状態では、焼酎もろみ、ローストアマランス、甘酒について大腸菌溶液のみ、あるいは食品抽出液のみの場合よりも発現の増強効果が認められた。得られた結果を図2に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】大腸菌溶液の添加による、βディフェンシン2 mRNAの濃度依存的な発現を示す。
【図２】各食品素材抽出液の添加による、βディフェンシン2 mRNA発現の誘導効果及び誘導・増強効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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