(57)【要約】【課題】ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）感染後のウシの発症可能性あるいは発症抵抗性を、簡便で且つ正確に判定できる方法を提供すること。【解決手段】ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病発症の可能性あるいは抵抗性を、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）のヘテロあるいはホモであるかによって判定することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病発症の可能性あるいは抵抗性を判定する方法であって、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）がヘテロあるいはホモであるかによって判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）がホモである個体を、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病の発症に対して抵抗性である可能性が高い個体であると判定することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いてウシ血清中の抗ウシ白血病抗体価を測定することによって、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）がヘテロであるかホモであるかを測定する工程を含む請求項１または２に記載の判定方法。
【請求項４】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて作成した標識モノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡによりウシ血清中の抗ウシ白血病抗体価を測定する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）によるウシの白血病発症の抵抗性あるいは発症の可能性を判定するためのキット。
【請求項７】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体を含む請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病の発症可能性、あるいは発症抵抗性を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ：ＨＴＬＶ）と最も近縁のレトロウイルスで、Ｂリンパ腫である地方病性牛白血病（Ｅｎｚｏｏｔｉｃ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｕｅｋｏｓｉｓ：ＥＢＬ）を誘発する。日本においてＢＬＶに感染したウシの割合（感染率）は、平均２０〜３０％であるが、多い地方では９０％にも達している。ＢＬＶに感染したウシは次の三つの病態を示す。ｉ）  ＢＬＶ感染牛の約７０％が臨床的に健康であるが抗体が検出される抗体陽性未発症健康牛であり、  ｉｉ）  約３０％のＢＬＶ感染牛は末梢血リンパ球が著しく増加した状態である持続的リンパ球増多症（ＰｅｒｓｉｓｔｅｎｔＬｙｍｐｈｏｃｙｔｏｓｉｏｓ：ＰＬ）を示し、そして、  ｉｉｉ）  ＢＬＶ感染牛の約２％が感染から５年から１０年を要して極めて悪性のウシ白血病を発症するに至る。日本では年間約５００頭のウシが白血病を発症し被害にあっている。しかしながら、未発症健康、ＰＬ、更に長い潜伏期間を経て白血病を発症するという、３つの病態の発生機序は未だ不明である。
【０００３】
しかも、近年、感染牛の数が増加し、比例して発症牛の数も急増傾向である。このため、近年定期的な抗体検査によって感染牛の摘発を行い、感染牛を繁殖に用いない措置が講じられている。しかし、全国で統一された措置を講ずることはなく、また対策も不十分であることも多く、依然として感染牛の増加が認められ、このまま放置すればいずれはほとんどが感染牛になる恐れもある。感染あるいは発症した牛は有効な治療法がなく、また予防措置としてのワクチンもない。発症牛は市場価値がまったくないため、それまでに要した飼養コストがすべて無駄となり、甚大な損害をもたらす。
【０００４】
そのため、ＢＬＶ感染後のウシの発症可能性を簡単に且つ正確に判定できるようになれば、発症抵抗性のウシを予め選択することができ、安全にウシの飼育を継続することが可能になるので、極めて有用である。
【０００５】
一方、主要組織適合性遺伝子複合体  （Ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）分子は、移植片や細菌、ウイルスなどの外来抗原ペプチドと結合してＴ細胞に提示する膜蛋白質であり、液性免疫および細胞性免疫の主要な機能を担っている。ＭＨＣは、ウシではＢｏＬＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）と呼称され、ＢＬＶとの関連性の解析が進展している。
【０００６】
ＭＨＣ分子はその構造と機能からクラスＩとクラスＩＩに大きく分けられる。
ＭＨＣクラスＩＩ分子は約３０ｋＤａのα鎖とβ鎖が非共有結合した膜結合型糖蛋白質であり、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、皮膚ランゲルハンス細胞などの限られた細胞に発現している。Ｘ線結晶解析の結果、α及びβ鎖の細胞外部分は、それぞれ２個のドメインに分かれており、α１及びβ１ドメインが組合わさって溝状の構造を作ることが明らかとなった。この溝は、２つの相対するαへリックスが側壁を、βシート構造が底を形成することによりできている。この溝に９〜３０数個のアミノ酸からなる抗原ペプチドが伸長された形で結合し、一部のアミノ酸残基は溝の両端からはみ出している。主に飲作用によって取り込まれた細菌や血中可溶性抗原などの外来抗原に由来するペプチドは、クラスＩＩ分子の細胞外ドメインの先端部分に存在するペプチド収容溝に結合して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示される。ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうち、炎症性Ｔ細胞（Ｔｈ１）は活性化されるとマクロファージを刺激して小胞内の物質を速やかに破壊させるように働く（図１）。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）は抗原を結合したＢ細胞にのみに作用し、抗体産生細胞へと分化増殖させ免疫グロブリンの産生、すなわち液性免疫を誘導する（図１）。ＭＨＣクラスＩＩの中でα鎖は多型に乏しいが、β鎖は高度な多型を示している。ＭＨＣの多型はペプチド収容溝を構成するアミノ酸残基に集中しており、それぞれの対立遺伝子産物は、ペプチド収容溝にそれぞれ異なる形と性質（極性や電荷など）を示すポケット（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７およびＰ９）を有している。
【０００７】
ＭＨＣはマウスではＨ−２、ヒトではＨＬＡと呼ばれるのに対応して、ウシではＢｏＬＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）と呼称される。ＢｏＬＡ遺伝子領域は、第２３染色体上に位置し、ヒト、マウスと相同性の高い、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ遺伝子を含んでいる。ＢｏＬＡクラスＩＩ遺伝子がヒトやマウスのそれと大きく異なる点は、少なくとも１５ｃＭの領域をはさんでクラスＩＩａとクラスＩＩｂの２つの亜領域に分断されていることである（図２）。クラスＩＩｂ亜領域にはＤＲとＤＱの各遺伝子亜領域がマップされている。
ＤＲ遺伝子亜領域には、セントロメア側からＤＲＢ１−ＤＲＢ２−ＤＲＢ３−ＤＲＡの順に各遺伝子が位置しており、ＤＲＡによってコードされるα鎖とＤＲＢ３によってコードされるβ鎖から成るヘテロダイマーがＤＲ分子として細胞表面へ発現し、強い抗原提示能を誘導する。ＤＲＢ３  がＢｏＬＡ遺伝子の中で最も機能的で多型性に富んでいて、現在１０４対立遺伝子が確認されている。
【０００８】
ＢｏＬＡと疾患感受性の関連性についての研究は、ウシにおける免疫応答遺伝子の存在を証明する目的で始められた。はじめに、ヒト血清アルブミンに対する抗体産生能に遺伝的差異があることが発見された。ＢｏＬＡ−Ｗ１６を持つ個体は抗体産性能が高く乳房炎に易病性であり、ＢｏＬＡ−Ｗ２を持つ個体はヒト血清アルブミンに対して抗体産性能が低く、相対的に抵抗性であることが示された。このように、乳房炎を始めとして、ウシの疾患は経済形質に直接関わるものであることから、徐々にではあるがＢｏＬＡクラスＩおよびクラスＩＩと関連のある疾患が報告され始めている（非特許文献１参照）。
【０００９】
ＢｏＬＡクラスＩＩとの関連性の解析が進展しているものの一つにＢＬＶがある。ＢＬＶとＢｏＬＡとの相関性は当初、血清学的に決定されるＢｏＬＡ−Ａ座位のクラスＩ抗原とリンパ球増多症に対する抵抗性・感受性との間で論じられていたが、その後、ＢｏＬＡ−Ａ遺伝子座よりもむしろクラスＩＩ遺伝子、ＢｏＬＡ−ＤＱＢ、−ＤＲＢ２との間により強い相関が見いだされ（非特許文献２）、更に検索した結果、ＤＲＢ３との著しい相関性が明らかになった（非特許文献３）。
本発明者らは、これまで、ＰＣＲ法によってＢｏＬＡ−ＤＲＢ３対立遺伝子を増幅して塩基配列の決定を行い、あるいは制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＲＦＬＰ）法により、ＢＬＶによる白血病発症に対する抵抗性や感受性のＢｏＬＡ−ＤＲＢ３対立遺伝子を予測して開示してきた（特許文献１〜５）。しかし、ＰＣＲ法は、目的以外の遺伝子のコンタミネーションが多いために操作を丁寧に行う必要があり、技術的にも熟練が必要である。また、塩基配列を決定するために大型機器も必要であるという問題点もある。
よって、コンタミネーションがなく、習熟をさほど要せず、大型機器も必要としない、ＢＬＶによる白血病発症に対する抵抗性や感受性を判別できる方法が要望されている。
【００１０】
【特許文献１】
国際公開第９８／０３６８０号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第９８／３６０９２号パンフレット
【特許文献３】
特開２０００−８６６９８号公報
【特許文献４】
特開２００１−１７８４９９号公報
【特許文献５】
特開２００１−２３８６７９号公報
【非特許文献１】
間  陽子等  ウシＭＨＣ遺伝子  日本組織適合性学会誌  ３：２１３−２２５（１９９７）
【非特許文献２】
Ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  Ｍ．Ｊ．Ｔ．，  Ｓｔｅｖａｒｔ−Ｈａｙｎｅ  Ｊ．Ａ．，  Ｂｅｅｖｅｒ  Ｊ．Ｅ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｄｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ  ｉｓ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＲＢ２．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃ  ３７：６４．  １９９
【非特許文献３】
Ｘｕ  Ａ．Ｌ．，  ｖａｎ  Ｅｉｊｋ  Ｍ．Ｊ．Ｔ．，  Ｐａｒｋ  Ｃ．，  Ｌｅｖｉｎ  Ｈ．Ａ．  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３  ｅｘｏｎ２  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｖｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｖｉｒｕｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  １５１：６９７７−６９８５．  １９９３．
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来法による上記の問題点を解決することにあり、ＢＬＶ感染後のウシの発症可能性あるいは発症抵抗性をより簡便で且つ正確に判定できる方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題を追求した結果、ＢＬＶに対する液性免疫とＢｏＬＡ−ＤＲＢ３対立遺伝子との関連性を解析して応用することで、ＢＬＶ感染後のウシの発症可能性（抵抗性）を予測できることを見出し、本発明に至ったものである。
より具体的には、免疫的手法により発症可能性が高いことを識別したウシの群が有するＢｏＬＡ−ＤＲＢ３対立遺伝子の特徴を見出し、その特徴によってＢＬＶ感染後のウシの発症可能性を判定できることに着想した結果、本発明に至ったものである。
さらに説明すると、本発明では、ＢＬＶ膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１（ＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１：単にｇｐ５１ということがある。）の特定のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いてウシ個体のＢＬＶ反応性を確認し、ＢＬＶに高反応性のウシ群と低反応性のウシ群とを識別し、ＢｏＬＡ−ＤＲ分子のタイピングを行った。その結果、ＢＬＶに高反応性群では、ＤＲ分子のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）のホモ結合度が有意に高いことが確認された。また、本発明者らは、このようなＢＬＶ高反応性群において、ＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１の特定のエピトープに対する免疫応答性が高いこと、ＢＬＶ感染細胞の割合が低下することを見出した。本発明は、そのような知見によってなされたものである。
【００１３】
すなわち本発明は、
（１）ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病発症の可能性あるいは抵抗性を判定する方法であって、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）がヘテロあるいはホモであるかによってウシ白血病の発症抵抗性を判定する方法、
（２）ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）がホモである個体を、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病の発症抵抗性である可能性が高い個体であると判定することを特徴とする上記（１）の方法、
（３）ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いてウシ血清中の抗ウシ白血病抗体価を測定することによって、ウシ主要組織適合抗原ＤＲ分子（ＢｏＬＡ−ＤＲ）のβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲβ６６）がヘテロあるいはホモであるかを測定する工程を含む上記（１）または（２）の判定方法、
（４）ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて作成した標識モノクローナル抗体を用いた競合ＥＬＩＳＡによりウシ血清中の抗ウシ白血病抗体価を測定する上記（３）の方法、
（５）寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体を用いることを特徴とする上記（３）または（４）の方法、
（６）ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を含むウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病発症の可能性あるいは抵抗性を判定するためのキット、及び
（７）寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体を含む上記（６）のキット、
に関するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜ＢＬＶ感染牛の摘出＞
ウシの血液から、血清及びゲノムを採取し、ＢＬＶ感染の有無を解析した。まず、ゲノムＤＮＡに組み込まれているＢＬＶプロウイルスはＢＬＶのＬＴＲ及びｅｎｖを特異的に増幅可能なＰＣＲ法を用いて検出する。さらに、血清中のＢＬＶ抗体の有無をＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１及びＧａｇ  ｐ２４抗原を用いたゲル内沈降法により検出する。両検出方法によって、ＢＬＶ感染の有無を識別する。
【００１５】
＜ＢＬＶ感染牛におけるＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１に対する免疫応答性の比較＞
ＢＬＶ感染牛の血清を試料として、ＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１に対するモノクローナル抗体を用いて、競合ＥＬＩＳＡを行い、ＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１に対する抗体価を比較する。
この競合ＥＬＩＳＡには、本発明者等が開発して特許出願した方法を用いた（特願２００２−２６８９８７号）。概略は次のとおりである。
【００１６】
モノクローナル抗体の作製
遺伝的に単一なＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原物質を免疫注射し、抗体を産生させる。抗体産生の有無は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）やウエスタンブロット、オクタロニー法、免疫拡散法等種々の方法で確認できる。抗体価の上昇が認められたら、マウスから無菌的に脾臓を摘出する。脾臓には抗体産生細胞が約１〜２×１０８個程度存在しているが、これらの細胞のマウス体内での半減期は数週間から数ヶ月であり、増殖分化しない。また、各細胞はそれぞれ１つのエピトープを認識する抗体のみを産生しており、全体で種々のエピトープを認識するポリクローナルな抗体を産生している。
【００１７】
脾臓から細胞を取り出した後、マウスのミエローマ細胞と融合させる。細胞融合により、得られたハイブリドーマは、培養液中で増殖する。
ハイブリドーマが生成すると７日〜１４日のうちに増殖したハイブリドーマの細胞塊が肉眼で確認できるようになる。このときの培養上清には産生された抗体が放出されている。この時点では数種のハイブリドーマが混在している状態であり、培養上清中の抗体も種々のエピトープを認識する抗体の混合物であったり、あるいは不必要な抗体を含んでいる場合が多い。この段階でまず、培養上清中の抗体の中に、必要とする抗体が含まれているか否かをＥＬＩＳＡ等でスクリーニングする。スクリーニングによって陽性のクローンを選択する。
【００１８】
次にクローニングを繰り返し、陽性クローンをさらに単一なものに仕上げる。
得られたクローンは、２４ウェルプレートへ移して拡大培養し増殖させる。増殖して得られたハイブリドーマは、−８０℃以下、望ましくは液体窒素中で凍結保存することが望ましい。
凍結保存されたハイブリドーマは必要に応じて融解し、増殖させることができる。増殖は、培養液中でも、マウス体内で無ウイルス的にも行うことができる。
得られたモノクローナル抗体はスクリーニングされ、１個〜数個のクローンに絞る。
【００１９】
固相プレートの作製
ウシ白血病ウイルス由来の抗原を固相、例えば９６穴式ポリスチレン製マイクロタイタープレートに固相化する。抗原はウイルスの超遠心ショ糖密度勾配法による分画精製画分、ウイルスを含む培養上清等があげられる。しかし、得られるｇｐ５１の量は極めて少ないため、実用的ではない。ウシ白血病のような持続型感染の経過をとるウイルスは一般的に得られるウイルス粒子量が極めて少なく、ある程度大量に必要な場合は遺伝子組み換えによって発現された必要な抗原エピトープを含んだ画分が有効である。この方法では標的とする牛白血病ウイルスの特定エピトープたとえばｇｐ５１，ｐ２４，ｐ１２，ｇｐ３０などの遺伝子配列が上述のとおり既知である（特許文献１参照）。
既知配列を適当なベクターに組み込み、標的蛋白を発現させる試みもすでになされている。いずれにせよエピトープが保存されており、かつ液状物質となっていれば固相化は達成可能である。組み換え蛋白の末端にヒスチジン６残基が付加されるようにあらかじめ塩基配列の設計を施してあれば、得られた組み換え蛋白はニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製可能である。
精製された抗原を希釈し、希釈した抗原液は５０μＬ〜１００μＬずつマイクロタイタープレートに加えて４℃〜１０℃で１５時間〜２４時間静置する。
０．０５重量％〜０．１重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で該プレートを洗浄する。洗浄回数は５回程度が望ましい。
次にブロッキング操作を行う。該プレートに３００μＬずつブロッキング剤を含む溶液を分注し、該プレートを４℃〜１０℃で１５時間〜１８時間静置する。
該プレートを０．０５重量％〜０．１％重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩水で洗浄する。
洗浄が終了したプレートを水気を良く切った後、室温中で自然乾燥又は減圧乾燥させる。以上のように抗原を固定化して得られたプレートを乾燥剤が同封されたビニール袋に入れれば、４℃にて長期保存が可能である。
【００２０】
酵素標識モノクローナル抗体の作製
酵素標識に先立って、モノクローナル抗体を精製しなければならない。モノクローナル抗体はマウス腹水由来あるいは培養上清由来のいずれでも良い。一般には３３Ｖ／Ｖ％飽和〜５０Ｖ／Ｖ％飽和相当の硫酸アンモニウム粉末を加えて、抗体画分を沈殿させて得た後、プロテインＡあるいはプロテインＧ固定化担体を用いて精製する。精製されたモノクローナル抗体は、各種の酵素、例えばペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、で標識することができる。これらのうち、ペルオキシダーゼによる標識は、バックグラウンドが低く、高感度であることから、近年多く使われている。抗体とペルオキシダーゼの結合モル比は１：１〜１：３程度が望ましい。
【００２１】
競合ＥＬＩＳＡの手法
被検血清を２〜２００倍に希釈する。血清を希釈するための溶液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）および１重量％から１０重量％のブロッキング剤を含む生理食塩水が望ましい。同様に、陰性コントロール血清および陽性コントロール血清も希釈する。希釈した被検血清ならびに陰性コントロール血清および陽性コントロール血清を上記作成したプレートのウェルに５０〜１００μＬずつ加える。測定は２連以上で行うことが望ましい。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを２０℃〜３７℃で一定時間望ましくは３０分以上静置する。
次に、洗浄液でプレートを洗浄する。洗浄回数は３回〜１０回が適当である。
次に、標識モノクローナル抗体を希釈液で５０００〜１００００倍に希釈し、上述のウェルに５０〜１００μＬずつ加える。
標識抗体を加えた後、蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、２０℃〜３７℃で一定時間望ましくは３０分以上静置する。
次に、洗浄液でプレートを洗浄する。洗浄回数は３回〜１０回が適当である。
【００２２】
次に、発色操作を行う。標識抗体の標識酵素がペルオキシダーゼの場合、発色基質は２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン等が適当である。過酸化水素を含むこれらの発色基質溶液を５０〜１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせる。
１５分〜４０分間、２０℃〜３７℃で静置後、反応停止液を５０μＬ〜１００μＬずつウェルに加えて発色反応を停止させる。プレートリーダーで発色反応を停止させたプレートの吸光度を測定する。酵素や用いた発色基質により極大吸収が異なるので、最適波長を選択する。例えば酵素がペルオキシダーゼで発色基質が２，２’−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン）−６−スルホン酸の場合は４０５ｎｍ〜４１５ｎｍ、同じく酵素がペルオキシダーゼで発色基質が３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンの場合は４５０ｎｍが適当である。
【００２３】
（ウシ白血病発症の可能性あるいは抵抗性の判定）
ＢＬＶ感染牛の血清を用いて、上記のような競合ＥＬＩＳＡによる吸光度を測定して、各個体の血清中ＢＬＶ抗体価（競合ＥＬＩＳＡによる競合抑制率）を測定する。
該測定によりＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１抗原に対する反応性が高いと判定されたウシの群と反応性が低いと測定されたウシの群に分けて、それぞれのＢｏＬＡ−ＤＲのβ鎖を構成するアミノ酸のヘテロ接合度あるいはホモ接合度の程度を測定した。
その結果、ＢｏＬＡ−ＤＲのβ鎖を構成するアミノ酸のうち６６番目のアミノ酸残基（ＤＲ  β６６）がヘテロあるいはホモであるかとＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１に対する反応性との間に相関関係があることが分かった。
【００２４】
（ウシ白血病発症の可能性あるいは抵抗性判定用キット）
本発明においては、前記の牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）膜表面糖タンパク質（Ｅｎｖ）ｇｐ５１抗原の特定のエピトープに特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するウシの白血病発症の可能性あるいは抵抗性を判定するためのキットを作製できる。モノクローナル抗体としては、寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０１０の細胞の結合特異性の特徴を持つハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体が好ましい。
抗原固定化プレート、ならびにこれに付随する、陰性コントロール血清、陽性コントロール血清、洗浄液、標識抗体溶液、血清希釈用液、発色基質および反応停止液はあらかじめ調製して安定な条件下、例えば凍結乾燥あるいは安定剤を添加した溶液状態で４℃〜８℃で保存すれば長期保存および即時使用可能となる。測定用キットは上記の条件で調製した抗原固定化プレート及びこれに付随する標識抗体溶液、血清希釈用液、発色基質、反応停止液をセットしたものからなる。キットは上述と同様の方法で使用する。
得られた吸光度は被検血清中の抗牛白血病抗体の量に反比例対数的に増加する。この結果から抗体価の高低を比較する。
また、測定に必要な、抗原固定化済みのプレートやその他必要な試薬をセットにしたキットとして提供することも可能である。
【００２５】
以下には、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
＜ＢＬＶ感染牛の摘出＞
岩手大学農学部附属御明神牧場から分与されたウシ５３頭の血液から、血清及びゲノムを採取し、ＢＬＶ感染の有無を解析した（表１）。まず、ゲノムＤＮＡに組み込まれているＢＬＶプロウイルスはＢＬＶのＬＴＲ及びｅｎｖを特異的に増幅可能なＰＣＲ法を用いて検出した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｆｅｂ．２００３，Ｐ．１８９４−１９０３）。ＰＣＲ法において５３頭中５２頭が陽性であった。
さらに、血清中のＢＬＶ抗体の有無をＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１及びＧａｇｐ２４抗原を用いたゲル内沈降法により検出した。検査した２５頭全てにおいてＢＬＶプロウイルスの検出結果と同様の結果を得ることが出来た。
【００２６】
【表１】
2004301518.tif 000002
【００２７】
＜ＢＬＶ感染牛におけるＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１に対する免疫応答性の評価＞
ＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１に対するモノクローナル抗体を用いて、競合ＥＬＩＳＡを行い、ＢＬＶ感染牛５２頭の血清のＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１に対する抗体価（競合ＥＬＩＳＡの競合抑制率）を比較した（表２）。
【００２８】
【表２】
2004301518.tif 000003
【００２９】
本実施例で用いたＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１に対する４種類のモノクローナル抗体と、競合ＥＬＩＳＡを用いる抗体価の測定方法は、本発明者等の特許出願（特願２００２−２６８９８７号）の実施例に記載される次のとおりのものである。
【００３０】
（モノクローナル抗体評価用抗原固相化プレートの作製）
ウシ白血病ウイルスの構造蛋白のうち、表面糖蛋白のｇｐ５１に相当する全長０．９０２ｋｂのｇｐ５１遺伝子（理化学研究所  分子ウイルス学研究ユニット）をバキュロウイルストランスファーベクター：ｐＹＮＧｓｉｇＨｉｓ（カタクラ工業（株）製）に組み込んだ。該ベクターは発現蛋白のＮ末端側にヒスチジンＴａｇが付加されるよう設計されている。組み換えバキュロウイルスはカイコに感染、増殖させることによりカイコ体液に多量の組み換えｇｐ５１が発現した。組み換え及び組み換えバキュロウイルスによる大量発現はカタクラ工業（株）の特開平０７−３０３４８８に基づくベクター及び製造方法に従って行った。すなわち、バキュロウイルスベクターのＢに相当するＥｃｏＲＩ、ＸＢａＩサイト内にｇｐ５１遺伝子配列を組み込み、タンパク分解酵素遺伝子欠損カイコに感染させた。
カイコ体液１ｍＬを結合バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋１０ｍＭイミダゾール（ｐＨ  ７．４）１Ｌに対して２４時間４℃で透析した。ニッケルキレートセファロース（アマシャム社製））をバイオラッド製エコノカラム（１．０ｃｍφ×５ｃｍ）に充填し、ゲル体積を１ｍＬとし、結合バッファーで平衡化した。カラムはエコノシステム（バイオラッド社製）に接続し、カイコ体液を同カラムに０．１ｍＬ／分の流速で添加した。全量添加後、約１０培ゲル体積分の結合バッファーを流しつづけた。続いて溶出バッファー：結合バッファー＋４９０ｍＭイミダゾールを０．２ｍＬ／分で流し、組み換えｇｐ５１を溶出した。紫外線吸収検出器によって検出されたピーク位置の溶出画分を分取した（ｇｐ５１画分）。ｇｐ５１画分を０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）で２０倍に希釈し、９６穴平底ポリスチレン製マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に５０μＬ加え、４℃で２４時間静置した。内容物を廃棄後、１Ｗ／Ｖ％スキムミルクを含むＰＢＳで全ウェルを満たし、４℃で２４時間静置した。内容物を廃棄後、０．０５Ｗ／Ｖ％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標））を含むＰＢＳで５回洗浄して直ちに使用した。
【００３１】
（ポリクローナル血清の調製）
ウシ白血病ウイルス感染細胞である羊胎児腎臓由来株化細胞（理化学研究所  分子ウイルス学研究ユニット  ＦＬＫ：Ｖａｎ，ｄｅｒ  Ｍａａｔｅｎ  ａｎｄＭｉｌｌｅｒ、  １９７６）を抗原として用いた。ＦＬＫは牛白血病ウイルスに持続的に感染し、細胞の増殖に伴い、細胞内にウイルス粒子を蓄積し、一部は細胞外に放出されている。ＦＬＫを１０Ｖ／Ｖ％牛胎児血清（Ｔｒａｃｅ社製）加イーグルＭＥＭ培地（日水製薬製）中、２２０ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト製）（培地量１０ｍＬ）中で７２時間培養後、培養液を除去し、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−）で２回細胞を洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ混液（ギブコ社製）を０．５ｍＬ加えて細胞をフラスコから剥離し、直ちに培地１０ｍＬを加えて消化を停止した。３００×ｇで遠心して細胞を集めた。培養液を捨て、細胞ペレットに１Ｗ／Ｖ％非イオン性界面活性剤トライトン−Ｘ（登録商標）生理食塩水溶液２０ｍＬ加えてウイルスの不活化ならびに可溶化を行った。ＰＢＳ−に対して２４時間４℃で透析し、１００００×ｇで４℃、１０分間遠心し、上清２５ｍＬを得た。使用時まで−８０℃で保存した。この上清をセルライセートと呼ぶ。セルライセートを不完全フロイントアジュバントとし、これをＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に注射した。２週間ごとに同様に追加免疫を行った。マウスが牛白血病ウイルスに対して免疫状態になったことを確かめるため、ＥＬＩＳＡによって免疫前後の抗体価の変動を調べた。ＥＬＩＳＡは実施例１で作製したプレートを用いた。すなわち、マウスの尾静脈より採血して得られた被検血清を０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）および５重量％のスキムミルク（和光純薬製）を含むＰＢＳで１０００倍に希釈した。希釈した被検血清ならびプレートのウェルに１００μＬずつ加えた。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で１時間静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで６回洗浄した。
次に、西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（和光純薬製）を上記洗浄液で５００倍希釈し、ウェルに１００μＬずつ加えた。蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、３７℃で３０分静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで６回洗浄した。
ジメチルホルムアミド（和光純薬製）に５５ｍＭ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジ（同仁化学製）相当の粉末を溶解し、０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）に１／１００容溶解し、さらに３０Ｖ／Ｖ％過酸化水素水（和光純薬製）を蒸留水で１００倍希釈したものを１／１００容加えたものを発色基質１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせた。
１５分間、室温で静置後、１Ｍ  硫酸水溶液を５０μＬずつウェルに加えて発色反応を停止し、直ちにプレートリーダー（バイオラッド社製  モデル３５５０）で発色反応を停止させたプレートの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
これにより、抗ウシ白血病抗体だけがウシ白血病ウイルスの最初の注射に先立ってマウスから得られた対照血清よりもそれらに結合するようになる。３度目の免疫注射により、免疫前より１００倍に抗体力価が上昇した。十分な抗体価があると判断した。最終免疫として実施例１で調製した組み換え精製ｇｐ５１画分を希釈せずにマウスの尾静脈に５０μＬ注射した。最終免疫から３日後、マウスは全採血を行うと同時に直ちに次のハイブリドーマの作製に供した。
【００３２】
（ハイブリドーマの作製）
ポリクローナル血清の調製のために全採血されて死亡したマウスからその脾臓を摘出した。骨髄腫細胞ＳＰ−０／Ａｇ１４（理化学研究所    分子ウイルス学研究ユニット  Ｓｃｈｕｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２７６、２６９（１９７８））を１５Ｖ／Ｖ％牛胎児血清と１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールとペニシリン１００Ｕ／ｍＬとストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬとアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬを含むイスコフ培地（ＧＩＢＣＯ社）中で増殖した。脾臓を１ｍＭグルタミンと５ｍＭＨＥＰＥＳを含むＭＥＭ培地（日水製薬）で２回洗浄し、先曲がりピンセットで脾細胞を押し出した。２００メッシュのステンレスメッシュ上で夾雑物を除去し、脾細胞を集めた。脾細胞（１×１０８個）は次に２×１０７の骨髄腫細胞と共に５０ｍＬの円錐チューブに入れ１０分間１０００ｒｐｍの回転速度で遠心した。上清を吸引し、その細胞に５０重量％のポリエチレングリコール１ｍＬを１分間以上かけて滴下し、骨髄腫細胞と脾細胞を融合した。次の５分間にわたって１０ｍＬの無血清イスコフ培地を滴下した。混合物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を吸引除去した。細胞ペレットを軽くほぐし、ＨＡＴ培地すなわち０．０８８ｍｇ／ｍＬアミノプテリンと１．９４ｍｇ／ｍＬチミジンと６．８ｍｇ／ｍＬのヒポキサンチンと１５Ｖ／Ｖ％牛胎児血清と１０−５Ｍβ−メルカプトエタノールとペニシリン１００Ｕ／ｍＬとストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬとアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍＬを含むイスコフ培地を１００ｍＬに再懸濁した。再懸濁した細胞液は５枚の９６ウェル培養プレートに１００μ／ウェルとなるようにまき込みを行った。炭酸ガスインキュベーター内で、湿度９９％、３７℃、炭酸ガス濃度７．０Ｖ／Ｖ％の条件で培養した。培養後１日目にＨＡＴ培地を各ウェルに１５０μＬずつ滴下した。４日目に各ウェルの培地を半量吸引除去し、新たにＨＡＴ培地を１５０μＬずつ各ウェルに加えた。クローンは７日〜１０日目に現れた。各ウェルの上清のＥＬＩＳＡ測定によって牛白血病抗体陽性のクローン数は１６であることを確認した。確認培養のため、各陽性クローンを２４ウェルプレートに移し、ＨＴ培地すなわちＨＡＴ培地からアミノプテリンのみをのぞいた培地を０．５ｍＬ各ウェルに加え、２日〜３日間培養した。クローンが目視できるようになるまで増殖したら、再びＥＬＩＳＡで陽性クローンを確認した。この時点で１４クローンが陽性で、残るクローンは抗体生産能が消失していた。陽性クローンをさらにクローニングし、モノクローナルなハイブリドーマに仕上げた。すなわち各陽性ウェル中のハイブリドーマを５個／ｍＬとなるまでＨＴ培地で希釈し、９６ウェルプレート１枚に各ウェル２００μＬずつまき込んだ。７日〜１０日後に出現したクローンのうち、高い抗体価を示し、コロニーが単一であるクローンを選択した。選択したクローンをさらに２４ウェルプレートにまき込んで増殖させ、上述と同じクローニング操作をもう一度繰り返し、完全な単一クローンを得た。クローニングの過程で４個のクローンが増殖能を失い、最終的に１０個の単一なクローンが得られた。各クローンは２４ウェルプレートへ増殖培養後、１０ｍＬ培養フラスコへ増殖させ、最終的に１００ｍＬのスケールまで増殖させた。３００×ｇの遠心分離により培養上清と細胞と分け、各クローンは２×１０７個／ｍＬずつ１０％ジメチルスホルムアミド（和光純薬社製）を含む牛胎児血清に懸濁し、プラスチックバイアル（住友ベークラト）に０．５ｍＬずつ分注後、液体窒素内で保存した。保存した各クローンの細胞は１０Ｖ／Ｖ％牛胎児血清、０．１８Ｗ／Ｖ％炭酸水素ナトリウムおよび２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）で培養可能であった。必要に応じて凍結細胞を同培地で復帰させ、１０００ｍＬスケールまで培養した。培養上清はモノクローナル抗体を含むため、実施例３〜６に供した。なお、１０種の各クローンはそれぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の番号を付した。このうちクローン７を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０１０として寄託した。
【００３３】
（モノクローナル抗体の抗原との反応部位）
ウエスタンブロットにより、組み換えｇｐ５１との反応位置をウシ白血病抗体陽性牛血清（北里研究所製）と比較した。
前記のモノクローナル抗体評価用抗原固相化プレートを作製するために得た組み換えｇｐ５１  １００μＬに対して０．６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２．５μＬ、β−メルカプトエタノール５μＬ、２ｍｇＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて１００℃で３分間加熱処理した。これをスラブ電気泳動の濃縮ゲル上に各１００μＬチャージした。同時に分子量マーカー（第一化学薬品製）を専用レーンに５μＬチャージした。
スラブ電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは濃縮ゲル５．０Ｖ／Ｖ％、分離ゲル１０Ｖ／Ｖ％とし、３０ｍＡで１．５時間通電した。
泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブランに電気通電によって転写し、１重量％スキムミルクを含む生理食塩液に浸して３７℃で１時間振盪しながらブロッキングを行った。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で洗浄した。分子量マーカーが泳動されたレーンのみを切り取ってクマジーブリリアントブルー染色液（ＣＢＢ）で染色した。残りのメンブランは、幅約４ｍｍに切り、短冊状にした。前記で得たおのおののモノクローナル抗体の培養上清は０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２倍希釈し、ウシ白血病陽性牛血清および陰性血清は同液で２０倍希釈した。それぞれに短冊状のメンブランを浸し、振盪しながら３７℃で１時間反応させた。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。モノクローナル抗体についてはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（和光純薬製）を、牛陽性血清についてはペルオキシダーゼ標識抗ウシＩｇＧ（カペル社製）をそれぞれ０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２００倍に希釈してメンブランを浸し、振盪しながら３７℃で３０分間反応させた。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。次に５０ｍＭ４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社製）および０．００３容量％過酸化水素水を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にメンブランを浸して室温で発色させた。結果を図３に示す。
ＣＢＢで染色された分子量マーカーの位置と比較して、上記ウエスタンブロットにより、糖鎖修飾が数段になされておりウシ白血病抗体陽性血清で複数のバンドが認められた。ウシ白血病抗体陽性血清がｇｐ５１と特異的に結合した抗原の分子量は３０ｋＤａ〜６６ｋＤａを有しており、これと共通のバンドが現れたモノクローナル抗体は１、２、７、８であった。これら以外のクローンは３５ｋＤａ付近に単一バンドが認められるが、牛陽性血清にはこの分子量位置にバンドは存在しなかった。
【００３４】
（競合ＥＬＩＳＡによるクローンの絞込み）
前記で作製したプレートにウシ白血病抗体陽性血清（北里研究所製）、ならびにウシ白血病抗体陰性血清（ハイクローン社製）をそれぞれ０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２倍希釈したものをウェルに５０μＬずつ加えてプレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で１時間静置した。３７℃で１時間静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した。
次に、
【００３２】で得た各クローンの培養上清を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で１０倍希釈したものをウシ白血病抗体陽性血清ならびにウシ白血病抗体陰性血清を加えていたウェルにそれぞれ５０μＬずつ加えてプレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で３０分間静置した。次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を上記洗浄液で１０００倍希釈し、ウェルに１００μＬずつ加えた。蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、３７℃で３０分静置した。
次に、プレートを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した。
ジメチルホルムアミド（和光純薬製）に５５ｍＭ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジ（同仁化学製）相当の粉末を溶解し、０．０５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）に１／１００容溶解し、さらに３０Ｖ／Ｖ％過酸化水素水（和光純薬製）を蒸留水で１００倍希釈したものを１／１００容加えたものを発色基質１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせた。
１２分間、室温で静置後、１Ｍ  硫酸水溶液を５０μＬずつウェルに加えて発色反応を停止した。直ちにプレートリーダー（バイオラッド社製  モデル３５５０）で発色反応を停止させたプレートの４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ウシ白血病陰性血清の吸光度に対する牛陽性血清の吸光度の割合を次式から求め、抑制率としたとき、１、２、７、８、は５０％以上の抑制率だったが、これら以外はすべて０％であった（表３）。
この結果は前記のモノクローナル抗体と抗原との反応部位の確認において牛陽性血清と共通のバンドが認められたクローン番号と一致していた。
このことから、以降は、１、２、７、８のクローンについて絞り込んだ検討を行った。
抑制率（％）＝１００（１−牛陽性血清吸光度／牛陰性血清吸光度）
【００３５】
【表３】
2004301518.tif 000004
【００３６】
（培養上清からのモノクローナル抗体の精製）
前記で絞り込んだ各クローン（１，２，７，８）の培養上清（約１０００ｍＬ）に硫酸アンモニウムを３００ｇ加えて溶解し、４℃で一晩静置して沈殿を生じさせた。沈殿を１００００×ｇで５分間遠心して沈殿部を得る。沈殿部にＰＢＳを１０ｍＬ加えて溶解する（粗抗体液）。あらかじめプロテインＧセファロースＦＦ（アマシャム社製）を１．５ｃｍφ×５ｃｍのエコノカラム（バイオラッド社製）にゲル体積５ｍＬとなるように充填し、ＰＢＳで平衡化した。これに粗抗体液を０．２ｍＬ／分の流速で加え、全量加えた後にＰＢＳを２０ｍＬ流しつづけて洗浄した。次に０．１Ｍグリシン塩酸酸バッファー（ｐＨ２．５）を０．４ｍＬ／分で流し、紫外線吸収検出器で２８０ｎｍの吸収をモニターし、現れたピークを分取した。得られた画分を精製水４Ｌに対して２４時間透析し、凍結乾燥した。それぞれ約５０ｍｇの精製モノクローナル抗体が得られた。
【００３７】
（モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識）
０．３Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）１ｍＬに西洋わさびペルオキシダーゼ（和光純薬社製）を１０ｍｇ溶解し、１ｍＬの２０ｍＭ−ＮａＩＯ４水溶液を加えた。２５℃で３０分静置し、精製モノクローナル抗体粉末４０ｍｇを０．１Ｍ炭酸ナトリウム１ｍＬに溶かし、先の溶液に加えた。グリセロールを２０μＬ加え、４℃℃で１８時間反応させた。５０％飽和となるように飽和硫安を加え、１００００×ｇで１０分遠心し、沈殿を得た。
沈殿にＰＢＳを１ｍＬ加えて溶解した。１ｍＬのグリセロールを加えて、使用時まで−２０℃で保存した。
得られた酵素標識モノクローナル抗体は後述のように適宜希釈してＥＬＩＳＡに供した。
【００３８】
（エピトープ解析）
前記で標識した４種のモノクローナル抗体をそれぞれ１−ＨＲＰ、２−ＨＲＰ、７−ＨＲＰ、８−ＨＲＰとする。前記（ハイブリドーマの作製の項）で得た各非標識モノクローナル抗体（培養上清）と標識モノクローナル抗体を用いて精製組み換えｇｐ５１に対する競合ＥＬＩＳＡを行った。競合ＥＬＩＳＡにあたっては前記のクローンの絞込みのためのＥＬＩＳＡで示した試薬を使用した。
前記のモノクローナル抗体評価用に作製したプレートにそれぞれのモノクローナル抗体培養上清およびモノクローナル抗体産生細胞用の培養液を５０μＬ加え、３７℃で１時間静置した。４回洗浄後、１−ＨＲＰ、２−ＨＲＰ、７−ＨＲＰ、８−ＨＲＰをそれぞれ洗浄液で１０００倍希釈したものを５０μＬずつ各ウェルに加え、３７℃で３０分間静置した。洗浄後、発色基質で発色させて吸光度を測定した。モノクローナル抗体産生細胞用の培養液の発色強度を１００とした場合の各発色強度を下表に示す（表４）。
【００３９】
【表４】
2004301518.tif 000005
数値が低いほど競合していることを示す。たとえば同一クローンの非標識、標識モノクローナル抗体は競合して数値が低くなるのが普通である。１と２のクローンおよび７と８のクローンの競合性は高く、数値が低い。したがってモノクローナル抗体１と２が似通ったエピトープ、７と８が似通ったエピトープを認識していると考えられた。逆に１や２は明らかに７や８とは異なるエピトープを認識していると考えられた。
【００４０】
（ウエスタンブロットによる抗原検出）
ＢＬＶ感染ＦＬＫ細胞ならびに非感染ＦＬＫ細胞（理化学研究所    分子ウイルス学研究ユニット）を１０％ウシ胎児血清を含むイーグルＭＥＭ培地中、２４穴細胞培養プレート（コースター社製）で５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃４日間培養した。培養液を廃棄し、１Ｗ／Ｖ％ノニデットＰ−４０（商標）を含む生理食塩水を０．５ｍＬ加えて細胞膜を溶解した。このセルライセートの上清を遠心分離１００００ｒｐｍの遠心分離により得て、ＳＤＳ電気泳動に供した。すなわち、上清１００μＬに対して０．６２５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２．５μＬ、β−メルカプトエタノール５μＬ、２ｍｇＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）０．０５Ｗ／Ｖ％を加えて５６℃で３０分間処理した。これをスラブ電気泳動のウェルに各１０μＬずつチャージした。同時に分子量マーカー（第一化学薬品製）を５μＬチャージした。
スラブ電気泳動用のポリアクリルアミドゲルは濃縮ゲル３．５Ｖ／Ｖ％、分離ゲル１０Ｖ／Ｖ％とし、２０ｍＡで通電し、ＢＰＢのラインがゲルの下端から５ｍｍ程度まで泳動したら通電をとめた。
泳動後、ゲルをニトロセルロースメンブラン（ワットマン製）に電気通電によって転写し、１重量％スキムミルクを含む生理食塩液に浸して４℃で１８〜２４時間あるいは３７℃で１時間ブロッキングを行った。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で洗浄し、分子量マーカーが泳動されたレーンのみを切り取ってクマジーブリリアントブルー染色液（ＣＢＢ）で染色した。実施例５のごとく、感染細胞及び非感染細胞を泳動して得たメンブランは４ｍｍ幅の短冊状に切り分けた。
４種（Ｎｏ．１，２，７，８）の精製モノクローナル抗体溶液ならびに市販の抗ｇｐ５１モノクローナル抗体２種（ＶＭＲＤ社製  ＢＬＶ１とＢＬＶ２）を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液でそれぞれ希釈し、ＩｇＧ濃度として１μｇ／ｍＬとなるように調製した。ＩｇＧ濃度は希釈前の溶液の２８０ｎｍの紫外吸収値から求めた。それぞれに上記短冊状のメンブランを浸し、振盪しながら２５℃で１時間反応させた。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ザイメッド社製）を０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で２００倍に希釈してメンブランを浸し、振盪しながら２５℃で３０分間反応させる。次にメンブランを０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液で充分洗浄した。次に５０ｍＭ４−クロロ−１−ナフトール（シグマ社製）および０．００３容量％過酸化水素水を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）にメンブランを浸して室温で発色させた。結果を図４に示す。
ＣＢＢで染色された分子量マーカーの位置と比較して、上記ウエスタンブロットにより、ウイルス感染細胞にはモノクローナル抗体Ｎｏ．１と２  はきわめて薄いバンドが認められたが明瞭とは言いがたかった。Ｎｏ．８は全くバンドが認められなかった。本発明のＮｏ．７は最も強く５１ｋＤａの位置に明瞭な抗原のバンドが認められ、一方、非感染細胞には全くバンドが認められなかった。市販の２種のモノクローナル抗体はいずれもｇｐ５１相当の位置に特異バンドはほとんど認められなかった。
【００４１】
（牛血清中の抗ウシ白血病抗体価の評価）
前記（
【００３０】）のモノクローナル抗体評価用に作製したプレートおよび
前記（
【００３４】）で得たモノクローナル抗体７−ＨＲＰを用いた。
ゲル内沈降反応（北里研究所製）により判別されたウシ白血病抗体陽性群の牛５頭及びウシ白血病抗体陰性牛１０頭の血清を被検血清とし、２倍に希釈した。血清を希釈するための溶液は０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含むＰＢＳを用いた。同様に、陰性コントロール血清（ハイクローン社製）および陽性コントロール血清（北里研究所製）も２倍希釈した。希釈した被検血清ならびに陰性コントロール血清および陽性コントロール血清を上記作成したプレートのウェルに５０μＬずつ４連で加えた。プレート上に蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムを張り、該プレートを３７℃で１時間静置した。０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液からなる洗浄液でプレートを５回洗浄した。
次に、モノクローナル抗体７を西洋わさびペルオキシダーゼ（和光純薬社製）で標識した標識モノクローナル抗体を希釈液で１００００倍に希釈したものを各ウェルに５０μＬずつ加えた。希釈用の液は上記血清希釈用の液を用いた。蒸発を防ぐためにビニール製のフィルムをプレート上に張り、３７℃で３０分静置した。次に、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含む生理食塩液からなる洗浄液でプレートを５回洗浄した。
５５ｍＭ  ３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン−ジメチルホルムアミド溶液（同仁化学社製）および０．３容量％過酸化水素水を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に１／１００容加え、発色基質溶液とした。発色基質溶液を１００μＬずつウェルに加えて発色をスタートさせた。
室温で３０分間静置後、反応停止液１Ｍ硫酸水溶液を５０μＬずつウェルに加えて発色反応を停止させた。
直ちにプレートリーダー（バイオラッド社製  モデル３５５０）で発色反応を停止させたプレートの吸収波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、次式から抑制率を求めた（表５）。
抑制率（％）＝１００×［１−（検体の吸光度−ブランクの吸光度）／（陰性血清の吸光度−ブランクの吸光度）］
ゲル内沈降反応で陽性となった検体は４つの標識モノクローナルのいずれでも５０％以上の抑制率を示し、ゲル内沈降反応で陰性となった検体は４つの標識モノクローナルのいずれでも５０％未満の抑制率を示した。このことから、抑制率５０％以上を陽性、５０％未満を陰性とすれば陽性と陰性の区分が容易に可能であることが示された。
なお、ブランク吸光度とは、抗原を固相化していないウエルで同一反応を行ったときの吸光度で、通常はゼロであるが、ブランク吸光度の値が高いときには、抑制率の値が１００％を超えることがある。
【００４２】
【表５】
2004301518.tif 000006
【００４３】
（ＢＬＶ感染牛のウシ白血病抗体価の測定）
前項の牛血清中の抗ウシ白血病抗体価の測定法の評価に則って、ゲル内沈降反応（北里研究所製）とＢＬＶプロウイルスの検出によりウシ白血病抗体陽性と判別されたウシ５２頭の血清を被検血清とし、抗体価（競合ＥＬＩＳＡによる抑制率）を測定した。その結果が表２に示した反応性の値である。
【００４４】
＜ＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１に対して高・低反応性を示すウシ群におけるＢｏＬＡ−ＤＲＢβ鎖の各アミノ酸残基におけるヘテロ接合度の解析＞
次に単クローン性抗体の反応性の相関性を探るため、各対立遺伝子がコードするアミノ酸配列に着目した。ＢｏＬＡ−ＤＲＢβ鎖の中でも抗原ペプチドを噛み込む溝を作り、直接抗原ペプチドに相互作用するため最も多型に富む、β１ドメインを構成するアミノ酸のうち、抗原認識部位を含む９〜８６番までのアミノ酸を比較した。その結果、ＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１モノクローナル抗体の反応性の違いによって分類された高反応性群と低反応性群の間で、アミノ酸残基６６、６７，７１，７４及び７７番目において、著しくヘテロ接合度に差が見られた（表６）。ここで、各個体のＢｏＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子をＰＣＲ−ＳＢＴ法によって決定し、１頭のウシから得られた２つの対立遺伝子由来の特定のアミノ酸残基が両方とも同じであればホモ、異なればヘテロとする。ヘテロ接合度は、集団中のヘテロ接合であるウシの数を数え、ヘテロ個体数／集団の個体数により算出したものである。
【００４５】
【表６】
2004301518.tif 000007
【００４６】
６６番目アミノ酸のヘテロ接合度は高反応性群で０．１３６３６であるのに対し、低反応性群では０．５４５４５、６７番目アミノ酸は高反応性群で０．４５４５５であるのに対し低反応性群では０．７２７２７、７１番目アミノ酸は高反応性群で０．８６３６４であるのに対し、低反応性群では０．６８１６２、７４番目アミノ酸は高反応性群で０．７２７２７であるのに対し、低反応性群では０．５９０９１，７７番目は高反応性群で０．３６３６４であるのに対し、低反応性群では０．１８１８２であった。そこで、これらのアミノ酸のヘテロ接合体に有意差があるかどうかをＦｉｓｈｅｒの直接確率検定を用いて計算したところ、６６番目のアミノ酸のヘテロ接合度は高反応性群と低反応性群で有意に異なっており、高反応性群ではヘテロ接合体が明らかに低くなっていることが示された。危険率は、両側検定で１％未満を有意差ありとし、ｐ＝０．００９７２５であった。
そこで、高反応性群と低反応性群でヘテロ接合度の異なるアミノ酸残基について、アミノ酸の種類に差が有るかどうかを比較した（表７）。６６番目のアミノ酸残基のアミノ酸の種類は、高反応性群と低反応性群で特に違いは見られなかった。この結果は、表７に示すように６７、７１、７４及び７７位のアミノ酸残基でも同様であった。
【００４７】
【表７】
2004301518.tif 000008
【００４８】
＜ＢＬＶプロウイルスのゲノタイプ解析＞
モノクローナル抗体２及び８に対する反応性の違いがＢＬＶの抗原性の違いによって誘導されるか否かを解析した。ＢＬＶｅｎｖ遺伝子のゲノタイプをＬｉｃｕｒｓｉらの論文（Ｍａｒｉａ  Ｌｉｃｕｒｓｉ，  ＹａｓｕｏＩｎｏｓｈｉｍａ，  Ｄｏｎｇｌａｉ  Ｗｕ，  Ｔａｋａｓｈｉ  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｅｓｔｅｒ  Ｔｅｒｅｓａ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｓｅｎｔｓｕｉ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｍｏｎｇ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｕｍｏｒａｌｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｈｏｓｔｓ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ８６：１０１−１１０．  ２００２）に従い、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を用いて解析した。初めにＰＣＲを用いて、ｅｎｖ遺伝子を増幅したところ、５３頭中４６頭のウシより増幅産物が得られた（表１及び８）。次に、増幅されたＰＣＲ産物をＢｃｌＩ、ＨａｅＩＩＩ及びＰｖｕＩＩにより消化した。ＢｃｌＩより２２０ｂｐ、１２０ｂｐ、１０５ｂｐの切断断片が、ＨａｅＩＩＩより２８５ｂｐ、９５ｂｐの切断断片が得られた。ＰｖｕＩＩでは切断されず４４４ｂｐの未消化断片が得られた。４６頭全て切断パターンは同じだった（表８）。
【００４９】
【表８】
2004301518.tif 000009
【００５０】
表９に、日本のＢＬＶ感染牛においてこれまでに報告のあったＢＬＶプロウイルス中のｅｎｖ  ６種類のゲノタイプの各酵素における切断パターンを示してある。本発明で使用したＢＬＶ感染牛全てが表９に示してあるゲノタイプ１に相当していることが明らかになった。以上の結果から、この実験においてＢＬＶｅｎｖ遺伝子のゲノタイプがＢＬＶ感染牛に対するモノクローナル抗体の反応性に影響を及ぼしていないことが確認された。
【００５１】
【表９】
2004301518.tif 000010
【００５２】
＜ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３のタイピング＞
次にモノクローナル抗体２及び８に対する反応性の違いの要因の一つとして免疫応答に重要なＭＨＣ遺伝子に着目した。ウシＭＨＣ（ＢｏＬＡ）クラスＩＩの中で最も機能的で最も多型に富むＢｏＬＡ−ＤＲＢ３対立遺伝子のタイピングをＰＣＲ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｙｐｉｎｇ（ＳＢＴ）法を用いて行った。５３頭のウシより１８種類の対立遺伝子が得られた（表１０）。
【００５３】
【表１０】
2004301518.tif 000011
【００５４】
表１０において、４桁の数字は、塩基配列を表わすものである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｒｏｓｌｉｎ．ａｃ．ｕｋ／ｂｏｌａ／ｂｏｌａｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。次にモノクローナル抗体２に対して高反応性及び低反応性を示した牛群における各対立遺伝子頻度を算出し、Ｒａｙｍｏｎｄらの方法（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｍ．，  Ｆ．Ｒｏｕｓｓｅｔ．  Ａｎｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  ４９：１２８０−１２８３．  １９９５．）に従いＰ検定を行った。その結果、Ｐ値は０．５８７６０±０．０１２３となり、有意差は認められなかった。
【００５５】
以上のとおり、本発明において、ＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１抗原に対するモノクローナル抗体に高い反応性を示したウシ群は、低反応性のウシ群に比較して、ＢｏＬＡ−ＤＲβ鎖の６６番目のアミノ酸のヘテロ接合度が有意に低くなるという結果を得た。ＨＬＡ−ＤＲ分子のＸ線回折像、Ｈ２−Ｅ分子及びＨ２−Ａ分子モデルの構造解析によると、６６番目のアミノ酸残基はポケット４の近傍に位置している。また、６６番目のアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）であるＨＬＡ−ＤＲ分子とグルタミン酸（Ｅ）であるＨ２−Ｅ及びＨ２−Ａで共に、６６番目のアミノ酸残基はαへリックス上に存在し、アミノ酸残基の方向はＴ細胞レセプター側を向いている。一方、Ｔ細胞レセプターはα鎖とβ鎖の２つのサブユニットからなり、超可変部位であるＣＤＲ１とＣＤＲ２はＭＨＣ抗原のαへリックスを、ＣＤＲ３はβシート上の抗原ペプチドを認識することが知られている。６６番目のアミノ酸残基はＣＤＲ１とＣＤＲ２のα鎖により認識される分子である。ウシとヒト、マウスのＤＲ分子はお互いに構造的に類似している可能性が高いことから、この６６番目の残基はウシでも同様な機能を有する可能性がある（図５  Ａ、Ｂ）。図５において、ＡはＭＨＣクラスＩＩ分子と抗原ペプチドの立体構造を示している。２本のαへリックスの側壁とβシートの底とが非共有結合して溝（ｇｒｏｖｅ）を形成している。その溝に抗原ペプチドが組み込まれる。図５Ｂは、６６番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるモデル（Ｄβ６６）と６６番目のアミノ酸がグルタミン酸であるモデル（Ｅβ６６）を示した。
【００５６】
ＭＨＣの抗原認識部位はホモ接合体に比べてヘテロ接合体の方が生存に有利であり、その結果として、抗原認識部位のアミノ酸残基は超優性淘汰を受け、ヘテロ接合体になりやすいことがＨｕｇｈｅｓらによって報告されている（ＨｕｇｈｅｓＡ．Ｌ．，  Ｎｅｉ  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｔ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  ＩＩｌｏｃｉ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ８６：９５８−６２．１９８９）。このことは、エイズの発症にＨＬＡクラスＩがヘテロ接合体である方が有利である事などからも想像できる（ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎＭ．，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｇ．Ｗ．，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍ．Ｐ．，  Ｋｉｓｓｎｅｒ  Ｔ．，  Ｖｌａｈｏｖ  Ｄ．，  Ｇｏｅｄｅｒｔ  Ｊ．Ｊ．，  Ｋａｓｌｏｗ  Ｒ．，  ＢｕｃｂｂｉｎｄｅｒＳ．，  Ｈｏｏｔｓ  Ａ．Ｌ．，  Ｏｂｒｉｅｎ  Ｓ．Ｊ．  ＨＬＡ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１：ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅｓ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ａｎｄ  Ｂ＊３５−Ｃｗ＊０４ｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２８３：１７４８−５２．  １９９９）。一方、抗原認識を行わないアミノ酸残基については未だどのような選択圧が働いているか明らかではない。
上記の結果、抗原認識を行わない残基の一つである６６番目のアミノ酸残基がホモ接合体であることとＢＬＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ５１の特定のエピトープに対する反応性が高いことの間に相関性があることが示された。ＤＲβ鎖の６６番目の残基がホモ接合体であることによってＢＬＶＥｎｖ  ｇｐ５１に対する免疫応答が強く活性化される可能性が示唆される。
ＢＬＶによる白血病発症とＭＨＣの多型性との相関性は本発明者らの研究グループが以前から報告している。本発明者らは既に、７１番目のアミノ酸がリジン（Ｋ）、７４番目のアミノ酸がアラニン（Ａ）、７７番目のアミノ酸がスレオニン（Ｔ）、そして７８番目のアミノ酸がチロシン（Ｙ）であるＢｏＬＡ−ＤＲβ鎖をコードする対立遺伝子をホモ接合体で持つ個体が発症しやすいという結果を得ている。本発明においては、ＢｏＬＡ−ＤＲβ鎖の６６番目のアミノ酸残基とＢＬＶに対する抗体価上昇との間の相関性を証明した。このことによって、ＭＨＣクラスＩＩの多型性が白血病発症を規定していることに加えて、液性免疫の程度と相関関係があるという結果を示すことができた。
【００５７】
＜ＢＬＶ感染細胞の割合の測定＞
ＢＬＶ感染細胞の割合は、次のように測定した。
▲１▼  ゲノムＤＮＡ濃度測定
ｉ  ＯＤ２６０を測定し、濃度決定用ＤＮＡの濃度を測定する。
ｉｉ  ５０ｎｇ／ｔｕｂｅ以下になるように希釈濃度を設定する。
ｉｉｉ  サンプルＤＮＡを希釈し、５０ｎｇ／ｔｕｂｅ以下になるようにする。
ｉｖ  β−ｇｌｏｂｉｎのプライマーＰＣ０３及びＰＣ０４を使用してサンプル濃度をＬｙｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＲｅａｌ  ｔｉｍｅＰＣＲで測定する（Ｓａｉｋｉ，  Ｒ．Ｋ．，  Ｓｃｈａｒｆ，  Ｓ．，  Ｆａｌｏｏｎａ，  Ｆ．，  Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．Ｂ．，  Ｈｏｒｎ，  Ｇ．  Ｔ．，Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  Ａ．，  Ａｒｎｈｅｉｍ  Ｎ．  （１９８５）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂ−ｇｌｏｂｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒＤｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：  １３５０−１３５１）。
▲２▼  コントロールＤＮＡの調整
ｉ  ＦＬＫ／ＢＬＶ細胞（一細胞あたり６コピーのＢＬＶプロウイルスがインテグレートしていることが確認されている）及びＦＬＫ細胞を培養する。
ｉｉ  Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を用いて各々よりゲノムＤＮＡを抽出する。
ｉｉｉ  ＦＬＫ／ＢＬＶ由来のゲノムＤＮＡをＦＬＫ由来のゲノムＤＮＡで６倍希釈し、１細胞あたり１コピーのコントロールＤＮＡを調整する。
ｉｖ  全ての希釈倍率で一定の濃度にあわせる。
ｖ  ＬｙｇｈｔＣｙｃｌｅｒＴＭ  （Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いたＲｅａｌ  ｔｉｍｅＰＣＲで定量性を確認する。
▲３▼      ＢＬＶ感染細胞の割合の算出
ｉ  サンプル濃度をコントロールＤＮＡの濃度とあわせる。
ｉｉ  ＢＬＶ−ＬＴＲを増幅するプライマー２５６及び４５３を用いて、コントロールＤＮＡのＢＬＶ−ＬＴＲ濃度とサンプルＤＮＡのＬＴＲ濃度を測定する（ＴａｊｉｍａＳ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ，  Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  ＳＮ，  Ｋｏｎｎａｉ  Ｓ，  Ｙｉｎ  ＳＡ，  Ｗａｔａｒａｉ  Ｓ，  Ｔａｎａｋａ  Ｙ，  Ｏｎｕｍａ  Ｍ，Ｏｋａｄａ  Ｋ，  Ａｉｄａ  Ｙ．  （２００３）  Ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  （ＢＬＶ），ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆＢＬＶ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：  １８９４−１９０３）。
ｉｉｉ  コントロールＤＮＡと比較することにより、サンプルＤＮＡのＢＬＶ−ＬＴＲ濃度を算出する。
【００５８】
（測定結果）
この方法を用いて、御明神牧場より分与された５３頭のウシについてＢＬＶ感染細胞の割合を測定した。
その結果、ＢＬＶ  ＥＮＶ  ｇｐ５１抗体に対して高い反応性を示すＢＬＶ感染牛群、及びＢｏＬＡ−ＤＲβ鎖の６６番目のアミノ酸残基がホモである個体は、ＢＬＶ感染細胞の割合が低反応性群及びヘテロの牛群よりも低いことが明らかとなった（表１１）。
以上の結果からＴ細胞受容体とＭＨＣクラスＩＩの相互作用に重要な残基であるＢｏＬＡ−ＤＲβ鎖の６６番目のアミノ酸がホモであると、ＢＬＶ−ｇｐ５１の特定の領域を認識するモノクローナル抗体の反応性が高くなる結果として、ＢＬＶ感染細胞の割合が低下することが示唆された。
このことを、これまでに本発明者らが見出した、ＢＬＶの白血病発症に対して抵抗性を示すヒツジＭＨＣ（ＯＬＡ）クラスＩＩ  ＤＲＢ１対立遺伝子を保有するヒツジは中和抗体価が高い結果としてウイルス量が低下して白血病発症には至らないという知見（Ｎａｇａｏｋａ  Ｙ，  Ｋａｂｅｙａ  Ｈ，  Ｏｎｕｍａ  Ｍ，Ｋａｓａｉ  Ｎ，  Ｏｋａｄａ  Ｋ，  Ａｉｄａ  Ｙ．  （１９９９）  Ｏｖｉｎｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ＤＲＢ１  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｖｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５９：９７５−９８１）と考え合わせると、ＢＬＶ感染ウシで認められたＢＬＶ感染細胞の割合が低下する結果としてＢＬＶ発症抵抗性が現れることが推定できる。
【００５９】
【表１１】
2004301518.tif 000012
【００６０】
【発明の効果】
以上に詳述したとおり、本発明によると、ＢＬＶ感染後のウシの発症可能性あるいは発症抵抗性をより簡便で且つ正確に判定できる方法、およびそのためのキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＨＣクラスＩとクラスＩＩ分子の機能を説明する概念図である。
【図２】ＢｏＬＡ遺伝子領域の推定される構成（Ａ）及びクラスＩＩ遺伝子産物の模式図（Ｂ）を示す。
【図３】牛陽性血清、各クローンについて、組み換えｇｐ５１に対するウエスタンブロット像を示す。
【図４】ＢＬＶ感染ＦＬＫ細胞（ＦＬＫ＋）とＢＬＶ非感染細胞（ＦＬＫ−）に対する牛陽性血清、各クローン、市販抗ｇｐ５１モノクローナル抗体のウエスタンブロットにおける反応性を示す。
【図５】ＭＨＣクラスＩＩ分子と抗原ペプチドの立体構造を示す。
【図１】
2004301518.tif 000013
【図２】
2004301518.tif 000014
【図３】
2004301518.tif 000015
【図４】
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【図５】
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