(57)【要約】【課題】男性型脱毛症の分子生物学的メカニズムに基づいた男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法、および、男性型脱毛症治療薬の提供を目的とする。【解決手段】前記目的を解決するために、本発明の男性型脱毛治療薬のスクリーニング方法は、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性阻害を指標として、治療薬候補化合物から男性型脱毛症治療薬を選択する工程を含むスクリーニング方法である。また、本発明の男性型脱毛治療薬は、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性化阻害物質を含む。【選択図】  図６
2004248632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法であって、活性型ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング増殖因子β１）およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性阻害を指標として、治療薬候補化合物から男性型脱毛症治療薬を選択する工程を含むスクリーニング方法。
【請求項２】
スクリーニングが、毛乳頭細胞および上皮細胞を共に培養する共培養系で行われるインビトロスクリーニングであり、前記共培養系には治療薬候補化合物および男性ホルモンが添加され、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性阻害が、前記上皮細胞の増殖阻害抑制として検出される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記毛乳頭細胞が、男性型脱毛症男性の前頭脱毛部由来のヒト毛乳頭細胞であり、前記ヒト毛乳頭細胞が、男性型ホルモン受容体を発現している請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記男性ホルモン受容体の発現が、遺伝子工学的な操作による強制発現である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記上皮細胞が、ヒト上皮細胞である請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト上皮細胞が、ヒト毛包上皮細胞またはヒトケラチノサイトである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
スクリーニングが、器官培養された毛包を用いたインビトロスクリーニングであり、前記毛包には治療薬候補化合物および男性ホルモンが添加され、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性阻害が、前記毛包の退行期移行の抑制として検出される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
スクリーニングが、無細胞系のインビトロスクリーニングである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＴＧＦ−β１活性化因子が、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、エラスターゼ、メタロプロテアーゼ、カテプシン、キマーゼ、トロンボスポンジンおよび活性酸素からなる群から選択される少なくとも１つの物質である、請求項１から８のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法を含む男性型脱毛症治療薬の製造方法。
【請求項１１】
活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性化阻害物質を含む男性型脱毛症治療薬。
【請求項１２】
前記活性化阻害物質が、ネキシン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、アプロチニン、フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）、ＳＰＩＮＫ１、アンチキモトリプシン、トリプシンインヒビター、フェニルメチルスルフォニルフロリド、Ｓｅｒｐｉｎｅ、Ｓｐｉ、Ｍａｓｐｉｎ（マスピン）、アンチトロンビン、ニューロセルピン、α１−プロテースインヒビター、メグシンおよびＳｅｐｉｎファミリーからなる群から選択される少なくとも１種類である請求項１１に記載の男性型脱毛症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法、男性型脱毛症治療薬の製造方法および男性型脱毛症治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
男性ホルモンは、毛髪発育に関して部位特異的に作用する。例えば、ヒゲやワキ等の部位では、男性ホルモンは毛髪発育を促進する一方、例えば、男性型脱毛症の前頭部では、男性ホルモンは毛髪発育を抑制する。
【０００３】
男性型脱毛症（ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｏｐｅｃｉａ）では、前頭部や頭頂部の毛包の退行が促進され脱毛に至る。このような毛包の退行は、思春期以後のテストステロン（男性ホルモン）の上昇により引き起こされることが知られている。前記毛包は、主に、上皮由来の毛包上皮細胞と真皮由来の毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ；ＤＰＣｓ）から構成され、前記毛乳頭細胞は男性ホルモンに反応しするが、前記毛包上皮細胞は男性ホルモンに反応しない。従って、男性型脱毛症における毛包の退行は、まず、前記毛乳頭細胞が男性ホルモンからの刺激を受け、そして、この毛乳頭細胞から前記毛包上皮細胞へ何らかの信号が伝達されて起こると考えられている。しかしながら、前記毛乳頭細胞から前記毛包上皮細胞への毛包退行に関わる信号伝達が何によって行われているか等の分子生物学的メカニズムは、明らかにされていなかった。
【０００４】
男性型脱毛のモデルとなるインビトロのシステムとしては、ベニガオザル（Ｓｔａｍｐｔａｉｌｅｄ  Ｍａｃａｑｕｅｓ）の毛乳頭細胞とベニガオザルの外毛根鞘細胞とをトランスウェル内で共に培養する共培養系が知られている。この共培養系では、テストステロン（男性ホルモン）を添加した場合、男性ホルモンを加えない場合に比べ前記ベニガオザル外毛根鞘細胞の増殖抑制が有意に観察される（非特許文献１参照）。つまり、前記共培養系は、ベニガオザル由来の細胞を利用した、男性ホルモンによる毛包の退行を外毛根鞘細胞の増殖阻害という指標で観察できるインビトロシステムである。しかしながら、男性型脱毛のモデルとなるヒト毛乳頭細胞を用いた共培養系は知られていなかった。
【０００５】
一方、男性型脱毛の治療薬の開発には、主に、マウスを用いた成分外用による成長期誘導による評価、または、毛包の器官培養による評価（例えば、特許文献１参照。）が用いられている。また、ミノキシジルのように薬剤の副作用として発毛効果が偶然発見されることもある。しかしながら、これら従来のスクリーニング方法は、男性型脱毛症の分子生物学的メカニズムに基づいたものではなく、有効な成分の発見には偶然が大きく作用し、有効とはいえない。
【０００６】
【非特許文献１】
オバナ、チャン、およびウノ（Ｏｂａｎａ，  Ｎ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｕｎｏ．  Ｎ．）  思春期後のベニガオザルの前頭脱毛部から採取した毛乳頭細胞の存在下における、テストステロンによる毛髪生育阻害。（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｉｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｆｒｏｎｔａｌ  ｂａｌｄ  ｓｃａｌｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｐｕｂｅｒｔａｌ  ｓｔｕｍｐｔａｉｌｅｄ  ｍａｃａｑｕｅ．）「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」  １９９７年、第１３８巻、ｐ．３５６−３６１
【特許文献１】
特開２００２−８７９３８号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、男性型脱毛症の分子生物学的メカニズムに基づいた男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明の男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法は、活性化ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング増殖因子β１）およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方の活性阻害を指標として、治療薬候補化合物から男性型脱毛症治療薬を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
【０００９】
本発明者等は、男性型脱毛症における男性ホルモンによる毛髪成長抑制の機序解明のため、ヒト毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌｓ；ＤＰＣｓ）を用いた共培養系を構築するという着想を得て、単離培養されたヒトＤＰＣｓを用いた共培養系を試みたところ、ベニガオザルＤＰＣｓを用いた場合のような毛包上皮細胞の生育阻害を観察することができず、ヒト毛乳頭細胞を用いた男性型脱毛のモデル系が構築できないという問題に直面した。本発明者等は、その問題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、男性型脱毛の前頭部から単離培養されたヒトＤＰＣｓでは、男性ホルモン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＡＲ）の発現が、継代培養中に減少していくことを見出した。そこで、本発明者等は、ＡＲ遺伝子を前記ＤＰＣｓ内で強制発現させ、ヒトＤＰＣｓを用いた男性型脱毛症のモデル系となる共培養系を確立した。さらに、本発明者等は、前記共培養系を用いて、鋭意研究を重ねた結果、前記共培養系に男性ホルモンを添加すると、その培養液中に活性型ＴＧＦ−β１が多量に産生されることを見出した。そして、さらに研究を進め、前記活性型ＴＧＦ−β１が、ヒト男性型脱毛前頭部において、ＤＰＣｓから毛包上皮細胞への脱毛に関する情報伝達を担っており、前記活性型ＴＧＦ−β１が男性型脱毛治療薬の標的となることが可能であることを見出し、本発明の男性型脱毛治療薬のスクリーニング方法に到達した。このように、本発明のスクリーニング方法は、男性型脱毛症の分子生物学的メカニズムに基づいたものであり、この方法によって有望な治療薬をスクリーニングできる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法、男性型脱毛症治療薬の製造方法および男性型脱毛症治療薬について、さらに説明をする。
【００１１】
（標的となるＴＧＦ−β１）
本発明の男性型脱毛症治療薬のスクリーニングにおける標的は、活性型ＴＧＦ−β１である。前記活性型ＴＧＦ−β１は、毛乳頭細胞から毛包上皮細胞に発せられる毛包退行の信号となる。ＴＧＦ−β１は、いったん活性をもたない潜在型（ｌａｔｅｎｔ  ｆｏｒｍ）として作られ、例えば、プラスミン等のＴＧＦ−β１活性化因子によって活性化される。したがって、本発明の男性型脱毛症治療薬のスクリーニングにおける標的には、ＴＧＦ−β１活性化因子も含まれる。
【００１２】
前記ＴＧＦ−β１活性化因子としては、例えば、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、エラスターゼ、ＭＭＰ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、カテプシン、キマーゼ、トロンボスポンジン、活性酸素等があげられる。
【００１３】
（共培養系におけるスクリーニング）
本発明のスクリーニング方法の実施の一例としては、毛乳頭細胞（ＤＰＣｓ）と上皮細胞とを共に培養する共培養系で行われるインビトロスクリーニングがあげられる。前記共培養系に、治療薬候補化合物および男性ホルモンを添加し、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性阻害を、前記上皮細胞の増殖阻害抑制として検出する。
【００１４】
前記共培養系で使用するＤＰＣｓは、男性型脱毛症の男性、または、例えば、ベニガオザル等のように思春期後に前頭部が脱毛する哺乳動物の前頭部の皮膚から分離培養したＤＰＣｓを使用することが好ましく、より正確で有効なスクリーニングという点から、ヒト由来ＤＰＣｓを使用することがより好ましい。ＤＰＣｓの分離培養方法としては、特に制限されないが、例えば、所定の体部位から、形成外科術により皮膚試料を得て、その皮膚試料からＤＰＣｓを分離し、培養する方法があげられる。前記培養に使用する培地は、特に制限されず、例えば、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、抗生物質等を補ったダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）等が使用できる。前記培養の条件としては、例えば、３７℃、酸素９５％二酸化炭素５％の加湿大気下があげられる。共培養系に使用する場合、継代培養後のＤＰＣｓを使用することが好ましく、例えば、第３代〜第１１代の継代培養ＤＰＣｓが好ましく、より好ましくは、第３代〜第５代の継代培養ＤＰＣｓである。ＤＰＣｓは、生体から少量しか得られず、継代を行って必要量を得る必要があるからである。
【００１５】
前記男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓにおける男性ホルモン受容体（ＡＲ）の発現は、単離した細胞では検出できるが、さらに継代培養した後では減少し、検出できない場合もある。したがって、前記ヒトＤＰＣｓを共培養系で使用する場合、使用するヒトＤＰＣｓの継代数によっては、ＡＲの発現を促進し、男性ホルモンに対する応答を確実にすることが好ましい。ＡＲの発現促進の方法は、特に制限されないが、例えば、ＡＲ発現ベクターをトランスフェクションする方法等があげられる。使用するベクターとしては、ヒトＤＰＣｓ内で転写活性を有するプロモーターを含むベクターであれば特に制限されない。また、ＡＲ遺伝子としては、例えば、公開塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣ  Ｎｏ．  Ｍ２０１３２、配列番号９）があげられる。
【００１６】
前記トランスフェクションとしては、トランジェント・トランスフェクションが利用でき、その方法としては、特に制限されず、例えば、ＤＮＡ−リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロウイルス法、電気穿孔法等があげられる。これらの中でも、作業性がよく、ＤＮＡの導入効率がよい等の点より、リポフェクション法が好ましく、例えば、種々の市販遺伝子導入用リポソーム等を使用できる。
【００１７】
前記共培養系に使用できる上皮細胞としては、哺乳動物の上皮細胞であれば特に限定されず、例えば、ヒトまたはベニガオザルの毛包上皮細胞、ケラチノサイト等があげられ、前記毛包上皮細胞としては、例えば、外毛根鞘細胞等があげられる。これらの中でも、例えば、入手の容易性等の点より、正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＫＣｓ）が好ましい。正常ヒトＫＣｓの単離培養方法は、特に限定されず、ヒトの皮膚から単離し、培養する。培養に使用する培地としては、特に制限されず、例えば、インシュリン、ヒドロコルチソン、エタノールアミン、ホスホエタノールアミン、カルシウムおよびウシ下垂体エキスを補ったＭＣＤＢ１５３（ケラチノサイト生育培地；ＫＧＭ）等があげられる。共培養系に使用する場合、継代培養後のＫＣｓを使用することが好ましく、例えば、第３代〜第１０代の継代培養ＫＣｓが好ましく、より好ましくは、第３代〜第５代の継代培養ＫＣｓである。
【００１８】
前記共培養系において、前記ＤＰＣｓおよび上皮細胞は、例えば、トランスウェルを使用して培養してもよく、または、両者を混ぜて培養してもよいが、上皮細胞の増殖阻害の検出および取扱いが容易である等の点から、前記トランスウェルを使用することが好ましい。前記トランスウェルの隔壁のポアサイズとしては、特に限定されないが、０．１μｍ〜１μｍが好ましく、より好ましくは、０．４μｍである。図７に、トランスウェルを用いた共培養系の一例を示す。図示のように、隔壁２を備えたトランスウェル１を用いて、例えば、下段にヒトＤＰＣｓ４、上段に上皮細胞３を配置し、培地５を満たして培養する。
【００１９】
前記共培養系に使用する細胞数としては特に制限されないが、例えば、前記トランスウェルを使用する場合、接種に使用する前記上皮細胞は、１ウェルあたり、例えば、４×１０４〜１０×１０４セルであって、好ましくは、４×１０４〜５×１０４セルであり、この上皮細胞数に対応して接種に使用する前記ヒトＤＰＣｓの細胞数としては、例えば、前述したトランスフェクション効率が３０〜５０％の場合、５×１０４〜１×１０５セルであって、好ましくは５×１０４セルである。なお、前記トランスフェクション効率の測定方法としては、特に制限されないが、例えば、種々の蛍光タンパク発現ベクターを使用して、同様のトランスフェクションをすることで推定する方法等があげられる。
【００２０】
前記共培養に使用する培地としては、例えば、成長因子やウシ下垂体エキスを含まないＭＣＤＢ１５３等があげられる。前記培地に添加する男性ホルモンとして使用できる物質としては、例えば、テストステロン、メチルトリエノロン、５−αディハイドロテストステロン等があげられ、これらの中でも、メチルトリエノロンが好ましい。また、その濃度としては、特に制限されず、例えば、１×１０−５〜１×１０−１２Ｍであって、好ましくは１×１０−８〜１×１０−９Ｍである。前記男性ホルモン添加の模擬処理物質としては、例えば、前記男性ホルモンの溶媒等を使用できる。また、前記模擬処理にかえて、抗男性ホルモン剤を使用してもよい。前記抗男性ホルモン剤としては、例えば、酢酸シプロテン（ＣＰＡ）、ＲＵ５８８４１、カソデックス、フルタマイド、ビカルタマイド等があげられる。
【００２１】
前記共培養系において、男性ホルモンを加えて培養後、前記上皮細胞の増殖阻害を検出するまでの培養期間は、例えば、１日〜７日間である。前記上皮細胞増殖阻害の検出の方法は、特に制限されず、例えば、培養後に前記男性ホルモンを加えた場合と加えない場合の上皮細胞の細胞数をカウントし比較する方法等があげられる。前記共培養系に治療薬候補化合物を加え、前記上皮細胞増殖阻害が抑制されることを指標にすれば、男性型脱毛症治療薬のスクリーニングをすることができる。
【００２２】
（器官培養系におけるスクリーニング）
本発明のスクリーニング方法の実施のその他の例としては、器官培養された毛包を用いたインビトロスクリーニングがあげられる。前記培養毛包に、治療薬候補化合物および男性ホルモンを添加し、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性阻害を、前記毛包の退行期移行の抑制として検出する。前述の共培養の変わりに、退行期の毛包を単離して使用し、毛包退行抑制を指標にする他は、前述の共培養系におけるスクリーニング方法と同様にして行うことができる。
【００２３】
（無細胞系におけるスクリーニング）
本発明のスクリーニング方法の実施のさらなるその他の例としては、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β１活性化因子の活性をタンパク質レベルでアッセイするインビトロクリーニング方法であり、例えば、活性型ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β１活性化因子との結合力等をアッセイしたり、潜在型ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β１活性化因子との反応におけるＴＧＦ−β１活性化阻害をアッセイする方法があげられる。
【００２４】
（その他の系におけるスクリーニング）
本発明の男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法は、さらに、インシリコ、および、インビボのスクリーニングに適用できる。
【００２５】
前記インシリコスクリーニングとしては、特に制限されないが、例えば、ＴＧＦ‐β１やＴＧＦ‐β１活性化因子の立体構造データに基づいて、コンピューター上で治療薬候補化合物のライブラリーの作製、バーチャルスクリーニング等をして治療薬化合物の分子設計をする方法等があげられる。また、前記インビボスクリーニングとしては、特に制限されず、例えば、ＴＧＦ‐β１を過剰発現させて脱毛させたマウスや、前頭部が脱毛したベニガオザル等を使用して、脱毛治療効果を指標に薬剤物質を選択するインビボスクリーニング等があげられる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法の実施のさらなるその他の例としては、以上のインシリコ、インビトロ、インビボスクリーニング方法を少なくとも２種類以上組み合わせることでより効率よく、より有効に行う方法があげられる。
【００２７】
（男性型脱毛症治療薬の製造方法）
本発明の男性型脱毛治療薬の製造方法は、本発明のスクリーニング方法を含み、その他の製造工程については特に制限されない。本発明の男性型脱毛治療薬の剤型も特に制限されず、例えば、注射剤、軟膏剤、貼付剤、ローション剤、エアゾール等の剤型で、例えば、局所外用剤等として使用でき、これらの剤型の治療薬は、この分野で通常知られた慣用的な方法により製造することができる。
【００２８】
（男性型脱毛症治療薬）
本発明の男性型脱毛治療薬は、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子の少なくとも一方に対する活性化阻害物質を含む。前記ＴＧＦ−β１活性化因子としては、例えば、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベーター、エラスターゼ、ＭＭＰ（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、カテプシン、キマーゼ、トロンボスポンジン、活性酸素等があげられる。また、前記活性阻害物質として、例えば、ネキシン、プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター、アプロチニン、フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ）、ＳＰＩＮＫＩ、アンチキモトリプシン、トリプシンインヒビター、フェニルメチルスルフォニルフロリド、Ｓｅｒｐｉｎｅ、Ｓｐｉ、Ｍａｓｐｉｎ（マスピン）、アンチトロンビン、ニューロセルピン、α１−プロテースインヒビター、メグシン、ｓｅｒｐｉｎファミリー等があげられる。本発明の男性型脱毛症治療薬は、前記活性阻害物質に加え、他の成分を含んでいてもよい。例えば、ミノキシジル等の治療薬や、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。
【００２９】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。実施例において使用した手法は、以下のとおりである。
【００３０】
（ヒトＤＰＣｓおよびＫＣｓの分離と培養）
ヒトＤＰＣｓは、１６歳から４３歳までの７人の男性の体の所定部分から皮膚試料を得てＤＰＣｓを分離し、培養した。男性型脱毛のＤＰＣｓは、２９歳から４３歳までの４人の男性型脱毛症の男性の前頭部の皮膚試料から分離した。前記皮膚試料は、形成外科術により得たものであって、それらからＤＰＣｓを分離し、１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０Ｕ／ｍｌ）を補ったＤＭＥＭ（Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈｅｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社製）中、３７℃、酸素９５％二酸化炭素５％の大気下で培養した。初代培養細胞は、０．０２５％トリプシン処理した後に継代した。初代培養開始から最初の継代までの期間は、通常、約４週間であった。共培養には、第３代から第１１代の継代培養ＤＰＣｓを使用した。また、ヒト正常ＫＣｓは、ヒトの皮膚から分離し、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（０．１ｍＭ）、ホスホエタノールアミン（０．１ｍＭ）、Ｃａ２＋およびウシ下垂体ホルモン（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社製）を補ったＭＣＤＢ１５３培地（ケラチノサイト育成培地；ＫＧＭ）で培養した。共培養には、第３代から第５代の継代培養ＫＣｓを使用した。
【００３１】
（ＤＰＣｓへのＡＲ発現ベクターのトランスフェクション）
共培養に使用するヒトＤＰＣｓにＡＲを発現させるため、ＡＲ発現ベクターのトランジェント・トランスフェクションを行った。前述のように培養したＤＰＣｓを、組織培養マルチプレート（６ウェル、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に、２×１０５セル／ウェルの濃度で接種し、１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で培養した。５０％〜７０％コンフルエンシーに達したら、培地をＦＣＳフリーのＤＭＥＭに交換し、２μｇのＡＲ発現ベクター；ｐＳＧ５−ＡＲを、６μｌのトランスフェクション試薬（商品名Ｆｕｇｅｎ−６、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を使用してトランスフェクトした。そのトランスフェクションから３時間後に、培地をチャコール処理した１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭに交換し、２４時間後に、ＤＰＣｓを回収するか、または、培養ＫＣｓとの共培養を開始した。このトランスフェクションの効率は、蛍光タンパク質発現ベクター；ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用した測定からの推定によると、〜５０％であった。トランスフェクションに使用した前記ｐＳＧ５−ＡＲは、プラスミドｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に、ヒトＡＲ遺伝子がクローニングされたものである。前記ヒトＡＲ遺伝子は、ＡＲタンパク質のＮ末端のポリＣＡＧ領域以外は、プラスミドｈＡＲａ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ８０００５）に由来する。前記Ｎ末端のポリＣＡＧ領域は、公開塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣ  Ｎｏ．  Ｍ２０１３２）に基づき、配列番号１に記載のフォワードプライマー  ＭＡＲ−Ｆ１  と配列番号２に記載のリバースプライマー  ＭＡＲ−Ｒ８  を作製し、鋳型に  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌａｃｅｎｔａ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、ｃａｔ．Ｎｏ．  ６５５０−１）を用いて、ＰＣＲにより増幅して得た。前記ＰＣＲは、反応酵素として  ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を使用し、反応溶液５０μｌで、初期変性を９８℃で４分間行った後、変性９８℃２０秒、アニール６０℃５秒、伸長７２℃３０秒からなる増幅サイクルを２５サイクル行った。得られた増幅産物の塩基配列を決定したところ、前記公開塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣ  Ｎｏ．  Ｍ２０１３２）のポリＣＡＧ数は２１であったのに対し、前記増幅産物にコードされているポリＣＡＧ数は２３であった。ポリＣＡＧ数に関してはバリアントが報告されており、ポリＣＡＧ数の平均が２１±２（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，  ｐ７７，  １９９１）であることから、前記増幅産物のポリＣＡＧ数２３は、平均的なポリＣＡＧ数であり問題が無く、Ｎ末端のコード領域として使用した。
【００３２】
（ヒトＤＰＣｓとヒトＫＣｓとの共培養）
共培養に使用するヒトＤＰＣｓは、前述のように、６穴ポリスチレンディッシュ上で５０％〜７０％コンフルエンシーまで培養した後、ｐＳＧ５−ＡＲまたはｐＳＧ５をトランスフェクションした。それと同時に、ヒトＫＣｓを、トランスウェル培養ディッシュ（商品名、直径２４ｍｍ、孔径０．４μｍ、Ｃｏｓｔａｒ社製）の上部コンパートメントに接種し（５×１０４セル／ウェル）、ＫＧＭで一晩インキュベートした。その次の日、培地を成長因子やウシ下垂体エキスを含まないＭＣＤＢ１５３に交換した培養ＫＣｓと、トランスフェクションされたヒトＤＰＣｓとを、４ｍｌのＭＣＤＢ１５３中に共存させた。共培養を開始する時点で、男性ホルモンを添加する場合は、１０−９Ｍのメチルトリエノロン（合成男性ホルモンＲ１８８１、Ｓｉｇｍａ社製）を加え、その模擬処理をする場合には、エタノールを加えた。また、前記Ｒ１８８１を中和する場合は、１０−６Ｍの酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）を、抗男性ホルモン剤として使用した。さらにまた、ＴＧＦ−β１の中和をするためには、抗ＴＧＦ−β１モノクローナルＩｇＧ（クローン６０１６．２；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、その模擬処理としては、免疫前マウスＩｇＧを使用した。共培養は、４日間行い、その後に、培養後の細胞数を数えた。それぞれのデータは、異なる試料で３通り、少なくとも３回は繰り返し、平均値の差異の有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定を使用して評価した。
【００３３】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
細胞内のｍＲＮＡの発現量を調べるためのＲＴ−ＰＣＲは、以下のように行った。まず、細胞を回収し、トータルＲＮＡを、酸性グアニジウムチオシアネート‐フェノール‐クロロホルム法で分離した。そのＲＮＡの収率と純度は、２６０および２８０ｎｍでの光学濃度から算出した。トータルＲＮＡ１μｇにつき、２．５μＭランダムヘキサマー、５μＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  ＫＣｌ、１０μＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１μＭ  各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１．０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｔａｋａｒａ社製）、および、２．５Ｕ／μｌ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を使用して、逆転写反応を行った。その反応は、混合液を、２５℃で１０分間インキュベートした後、さらに４２℃で４５分間、９９℃で５分間、そして、４℃で５分間インキュベートしておこなった。その結果として得られたｃＤＮＡを、サーマルサイクラー（Ａｓｔｅｃ社製）を使用して、２μＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  ＫＣｌ、１０μＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１μＭ  ｄＮＴＰ、０．０２５Ｕ／μｌ  組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）、および、それぞれ０．５μＭの順および逆方向のプライマーを含む、最終容量２５μｌで、増幅した。上記ＲＴ−ＰＣＲにおいてＡＲｍＲＮＡの検出を行う場合には、センスプライマーとして、配列番号３に記載のプライマーを使用し、アンチセンスプライマーとして、配列番号４に記載のプライマーを使用し、初期変性を９５℃で９分間行った後、変性９４℃１分、アニール６０℃４５秒、伸長７２℃１分からなる増幅サイクルを３５サイクル行い、最終伸長を７２℃で１分間行った。また、内部対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）のｍＲＮＡを検出する場合には、センスプライマーとして、配列番号５に記載のプライマーを使用し、アンチセンスプライマーとして、配列番号６に記載のプライマーを使用し、９４℃１分、６０℃４５秒、７２℃４５秒からなる増幅サイクルを２２サイクル行った。またさらに、ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡを検出する場合には、センスプライマーとして、配列番号７に記載のプライマーを、アンチセンスプライマーとして、配列番号８に記載のプライマーを使用し、９４℃１分、５４℃１分、７２℃１分からなる増幅サイクルを３５サイクル行った。これらのＰＣＲのサイクル数は、それぞれのプライマーを使用した場合について、デンシトメトリー解析を行い、対数直線増幅する範囲から選択した。生成物は、２％アガロースゲル電気泳動で解析し、それらのサイズを、１００−ｂｐ分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）と比較した。
【００３４】
（ウェスタンブロット）
ＡＲの発現を、タンパク質レベルで確認するため、ウェスタンブロットを以下のようにして行った。脱毛または非脱毛前頭部頭皮由来のヒトＤＰＣｓを６穴ポリスチレンディッシュで５０〜７０％コンフルエンシーまで培養し、前述のように、ｐＳＧ５−ＡＲでトランジェント・トランスフェクションをした。そのトランスフェクションから４８時間後、細胞を、氷冷リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、抽出バッファー（１％  ＮＰ−４０、１μｇ／ｍｌ  アプロチニン、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）を使用して抽出物を得た。タンパク質量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を使用して測定した。前記細胞由来の細胞溶解タンパク質を１レーンにつき４０μｇ使用して、８％ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース膜に転写した。その膜を、５％スキムミルクを含むＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中に、４℃で一晩浸し、次に、５％スキムミルクを含むＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で１／１２，０００希釈した抗ＡＲポリクローナル抗体（ＮＨ２７，金沢医科大のＤｒ．Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｍｉｚｏｋａｍｉの好意によりいただいたもの）と室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を使用して、１０分間隔で３回洗浄した後、その膜を１／２０００希釈したアルカリホスファターゼ結合ゴート抗ラビットＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）と、室温で１時間インキュベートし、ＡＲを検出した。
【００３５】
（レポーター遺伝子アッセイ）
脱毛または非脱毛前頭部頭皮由来のヒトＤＰＣｓ内で、ｐＳＧ５−ＡＲからのＡＲの転写レベルが同じであることを確認するための、レポーター遺伝子アッセイは、以下のようにして行った。１２穴プレートで５０〜７０％コンフルエンシーまで培養された脱毛または非脱毛前頭部頭皮由来のＤＰＣｓを、０．１μｇのｐＳＧ５‐ＡＲ、０．３μｇのレポータープラスミドであるマウス乳腺癌ウイルスＬＴＲ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＭＭＴＶ−Ｌｕｃ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、および、０．１ｇの内部対照として使用するｐＲＬ−ＣＭＶベクター（ＣＭＶの即時−初期エンハンサー／プロモーターによってウミシイタケのルシフェラーゼが発現するコントロールレポーターベクター）で、トランジェント・トランスフェクションをした。トランスフェクションから２４時間後、メチルトリエノロン（Ｒ１８８１、合成男性ホルモン）、または、模擬処理としてのエタノールを加えた。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性は、商品名Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で測定した。
【００３６】
（ＥＬＩＳＡによる活性型ＴＧＦ−β１の測定）
共培養した培地中のＴＧＦ−β１の濃度を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイを、以下のようにして行った。ヒトＫＣｓとヒトＤＰＣｓとを共培養ディッシュで４日間インキュベートしたのち、その順化培地を回収し、ＴＧＦ−β１の濃度をＥＬＩＳＡアッセイキット（商品名ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＴＧＦ−β１免疫アッセイ、Ｒ＆Ｄ    Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、製造者の使用説明書に従い行った。潜在型と活性型とをあわせた全ＴＧＦ−β１を測定する場合は、ＨＣｌによって、試料中の潜在型ＴＧＦ−β１を酸により活性化してから測定した。
【００３７】
（実施例）
最初に、ヒトＤＰＣｓとヒトＫＣｓを使用する共培養系において、ヒトＤＰＣｓ内でＡＲ遺伝子発現を促進する必要があることを確認した。図１に、ヒトＫＣｓを単独で（図１レーン１および２）、または、男性型脱毛のヒトＤＰＣｓとの共培養で（図１レーン３および４）、１０−９Ｍの男性ホルモン（Ｒ１８８１）存在下（図１レーン２および４）または非存在下（図１レーン１および３）で４日間培養した結果を示す。図１の縦軸には、培養後のＫＣｓの細胞数を、第５代から第７代の継代培養ヒトＤＰＣｓを使用した３回の独立試行の平均値±標準偏差で示す。図１が示すように、ヒトＫＣｓは、ヒトＤＰＣｓとの共培養により、その増殖が促進されるが（図１レーン１ｖｓレーン３）、男性ホルモンの添加に対しては、単独培養の場合でも（図１レーン１ｖｓレーン２）、共培養の場合でも（図１レーン３ｖｓレーン４）、有意な差を示さなかった。この結果は、異なる個体から採取した、男性型脱毛ＤＰＣｓの第３、７および１１代培養ヒトＤＰＣｓについても同様であった。つまり、継代培養された男性型脱毛前頭部由来のＤＰＣｓは、そのままでは男性型脱毛症のモデル系として使用できないことが確認された。
【００３８】
その原因は、前記継代培養男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓにおけるＡＲの発現が減少しているからであるが、そのことを半定量ＲＴ−ＰＣＲで測定し確認した。図２Ａに、第３代（Ｓ３）、第６代（Ｓ６）および第９代（Ｓ９）の継代培養男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓを使用して、ＡＲｍＲＮＡの発現量を測定した結果を示す。ＲＴ−ＰＣＲの方法は、前述のとおりである。図２Ａに示すように、継代培養の間に、男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓ内のＡＲｍＲＮＡが、明らかに減少することが確認できた。この問題は、前述したＡＲ発現ベクターｐＳＧ５−ＡＲを男性型脱毛ヒトＤＰＣｓにトランジェント・トランスフェクションすることで解決できる。このトランスフェクションの方法は、前述のとおりである。図２Ｂに、ＡＲ発現ベクターであるｐＳＧ５−ＡＲ（図２レーン２および４）とその親ベクターであるｐＳＧ５（図２レーン１およびレーン３）を男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓにトランスフェクションし、内部コントロールとしてＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡの発現量（図２レーン１および２）と、ＡＲのｍＲＮＡの発現量（図２レーン３および４）を測定した結果を示す。前記ｐＳＧ５−ＡＲのトランジェント・トランスフェクションによって、ヒトＤＰＣｓ内でＡＲが発現することが確認できた。
【００３９】
次に、このようにしてＡＲを強制発現させたヒトＤＰＣｓを用いれば、共培養系が男性型脱毛のモデル系となりえることを確認した。図３Ａに、前述のようにしてＡＲを強制発現させた各種ＤＰＣｓとヒトＫＣｓとの共培養を、１０−９Ｍの男性ホルモン（Ｒ１８８１）存在下（図３Ａレーン２、４、６および８）または非存在下（図３Ａレーン１、３、５および７）で４日間行った結果を示す。図３Ａに示すように、ヒゲ由来ヒトＤＰＣｓの場合、前記男性ホルモンは、ヒトＫＣｓの生育を４１％促進したが（図３Ａレーン１および２）、脱毛前頭部由来ＤＰＣｓの場合、対照的に、前記男性ホルモンは、ヒトＫＣｓの生育を５０％抑制した（図３Ａレーン３および４）。また、非脱毛前頭部（図３Ａレーン５および６）ならびに後頭部（図３Ａレーン７および８）由来ＤＰＣｓの場合、前記男性ホルモンは、ヒトＫＣｓの生育に対して有意な影響を与えなかった。また、これらの共培養系において、前記男性ホルモンが前記各種ＤＰＣｓの生育に与える影響は観察されなかった。したがって、ＡＲを強制発現させたヒトＤＰＣｓを用いた共培養系が、男性型脱毛を含め、男性ホルモンがインビボにおいて毛包生育に与える部位特異的な影響のモデル系となることが確認できた。図３Ａにおいて、値は、第５代〜第７代のＤＰＣｓを用いた３回の独立試行の平均値±標準偏差で示され、＊は、コントロールに対してＰ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であることを示す。確認のため、前記脱毛前頭部由来ＤＰＣｓおよび前記非脱毛前頭部由来ＤＰＣｓ内におけるトランスフェクトされたＡＲ遺伝子の発現を、ウェスタンブロットおよびレポーター遺伝子アッセイにより検出した。その結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示すように、ＡＲは前記２種類のＤＰＣｓ内でともに発現し、受容体として機能することが確認できた。
【００４０】
さらに、活性型ＴＧＦ−β１が、男性脱毛症治療薬のスクリーニングにおける標的となり得ることを、下記のようにヒトＤＰＣｓとヒトＫＣｓとの共培養系を利用して確認した。
【００４１】
まず、男性型脱毛前頭部由来のヒトＤＰＣｓ内では、ＴＧＦ−β１の転写は正の調節を受けているが、そのことをＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＲＴ−ＰＣＲの方法は、前述のとおりである。配列番号７および８に記載のプライマーを使用したＰＣＲにおいて、サイクル数３５が、ＰＣＲの対数直線増幅期にあたり、十分なシグナル強度を得えることを確認するため、男性型脱毛ヒトＤＰＣｓとヒトＫＣｓとの共培養を、１０−９Ｍの男性ホルモン（Ｒ１８８１）存在下４日間行ったヒトＤＰＣｓから調製したトータルＲＮＡのｃＤＮＡを用いて、様々なサイクル数の反応を行った。その結果を、図４Ａに示す。図４Ａでは、横軸にサイクル回数、縦軸にＮＩＨｉｍａｇｅ（Ｍｒ．Ｗ．Ｒａｓｂａｎｄ、ＮＩＨ）を使用したデンシトメトリーの結果を対数（任意の単位）で示す。図４Ａに示すように、反応サイクル数３５とすることが適当でることが確認された。ＲＴ−ＰＣＲ産物のシグナル強度は、ＤＰＣｓから調製したトータルＲＮＡの量に依存し、半定量が可能であることを、図４Ｂに示す。図４Ｂでは、横軸に反応に使用したトータルＲＮＡ量、縦軸に得られたシグナル強度（任意の単位、ＮＩＨｉｍａｇｅによる）を示す。このような半定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｐＳＧ５−ＡＲをトランジェント・トランスフェクトした男性型脱毛前頭部ヒトＤＰＣｓまたは非脱毛前頭部ヒトＤＰＣｓを用いた共培養系において、４日間、男性ホルモン（Ｒ１８８１）存在下（Ｒ＋）または非存在下（Ｒ−）で培養し、ＴＧＦ−β１の発現量を測定した。その結果を図４Ｃに示す。図４Ｃの結果は、第７代の継代培養ヒトＤＰＣｓのものであるが、３回独立に試行し、同様な結果となったものの一つである。内部コントロールとして、Ｇ３ＰＤＨを転写量を測定した。図４Ｃに示すとおり、ｐＳＧ５−ＡＲがトランジェント・トランスフェクションされた男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓでは、男性ホルモンにより部位特異的にＴＧＦ−β１の転写誘導を受けるが（図４Ｃ左パネル）、非脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓでは、ＡＲがトランスフェクションされても、男性ホルモンによりＴＧＦ−β１の転写は誘導されないことが確認された（図４Ｃ右パネル）。
【００４２】
そして、男性ホルモンによるＴＧＦ−β１に対する正の調節が、タンパク質産生レベルおよびその活性化レベルでなされていることを、活性型ＴＧＦ−β１に特異的なＥＬＩＳＡアッセイを行い確認した。その方法は、前述のとおりである。このアッセイでは、ＨＣｌによって潜在型ＴＧＦ−β１を活性化したサンプルと前記活性化をしないサンプルとを調製し、それぞれのサンプルを用いて、前記順化培地中のトータル（活性型および潜在型）ＴＧＦ−β１と活性型ＴＧＦ−β１とを測定した。その結果を図５に示す。図５に示すように、ヒトＫＣｓと、ｐＳＧ５−ＡＲをトランスフェクションした男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓ（図５レーン１〜６）、ｐＳＧ５−ＡＲをトランスフェクションした非脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓ（図５レーン７〜１０）、または、模擬ベクターｐＳＧ５をトランスフェクションした男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓ（図５レーン１１〜１４）とを、１０−９Ｍの男性ホルモン（Ｒ１８８１、図５レーン２，５，８，１０）、１０−９Ｍの男性ホルモンおよび１０−６Ｍの抗男性ホルモン剤ＣＰＡ（図５レーン３および６）、または、模擬処理エタノール（図５レーン１，４，７，９，１１）の存在下で、４日間共培養した後、順化培地中のトータルＴＧＦ−β１濃度（図５レーン１，２，３，７，８，１１，１２）と活性型ＴＧＦ−β１濃度（図５レーン４，５，６，９，１０，１３，１４）をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。図５において、値は、第６代から第８代のＤＰＣｓを使用した３回の独立試行の平均値±標準偏差で示され、＊は、それぞれのコントロールに対してＰ＜０．０３であることを示す。図５に示すように、順化培地中のトータルＴＧＦ−β１は、１０−９Ｍの男性ホルモン処理により、コントロールに対して２．６８倍増加したが（図５レーン１および２）、１０−６Ｍの抗男性ホルモン剤ＣＰＡにより、前記増加が完全に消滅した（図５レーン３）。したがって、男性ホルモン‐ＡＲシステムが関与し、ＴＧＦ−β１タンパク質の産生レベルの増加が起きていることが確認された。さらに、活性型ＴＧＦ−β１の濃度は、１０−９Ｍの男性ホルモン処理の場合、１７４．１ｐｇ／ｍｌであるのに対して、エタノール処理の場合は、１２．９ｐｇ／ｍｌであり（図５レーン４および５）、そして、１０−６Ｍの抗男性ホルモン剤ＣＰＡにより、この活性型ＴＧＦ−β１の誘導が取り消された（図５レーン６）。したがって、男性ホルモンによるＴＧＦ−β１の活性調節は、タンパク質の産生レベルのみならず、活性化レベルで行われることが確認された。非脱毛前頭部のヒトＤＰＣｓを用いた場合では、男性ホルモンによる順化培地中のトータルおよび活性型ＴＧＦ−β１濃度に対する有意な影響は認められなかった（図５レーン７〜１１）。ＡＲ遺伝子をトランスフェクションしない男性型脱毛前頭部ＤＰＣｓを用いた場合も、男性ホルモンによる順化培地中のトータルおよび活性型ＴＧＦ−β１量に対する有意な影響は認められず（図５レーン１２〜１４）、共培養系における外因性ＡＲのトランスフェクションの必要性が確認された。
【００４３】
このように、男性ホルモンにより、ＴＧＦ−β１は、ｍＲＮＡ、タンパク質および活性化のレベルで正の制御を受けることが確認されたが、このＴＧＦ−β１の共培養系におけるＫＣｓ生育阻害への関与を確かめるため、ヒトＴＧＦ−β１中和抗体を用いて、共培養を行った。その結果を図６に示す。図６に示すように、ヒトＫＣｓとｐＳＧ５−ＡＲがトランスフェクションされた男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓとの共培養を、１０−９Ｍの男性ホルモン（Ｒ１８８１、図６レーン３〜６）、または、エタノール（図６レーン１および２）存在下で、０．５μｇ／ｍｌ（図６レーン５）もしくは５．０μｇ／ｍｌ（図６レーン２および６）の抗ＴＧＦ−β１抗体、または、５．０μｇ／ｍｌの免疫前マウスＩｇＧ（図６レーン４）と共に４日間行った。図６に示すように、１０−９Ｍの男性ホルモンにより、ＫＣｓは増殖阻害を受けるが（図６レーン１ｖｓ３）、ＴＧＦ−β１に対する中和抗体は、ほぼ完全に前記ＫＣｓ増殖阻害を無効化した（図６レーン５および６）。従って、ＴＧＦ−β１が、ＤＰＣｓからＫＣｓへの生育阻害シグナルを媒介していることが確認された。男性ホルモンが存在しない場合のＴＧＦ−β１中和抗体および男性ホルモンが存在する場合の免疫前マウスＩｇＧによるＫＣｓの生育への有意な影響は認められなかった（図６レーン２および４）。図６において、値は、第６代〜第８代の培養ＤＰＣｓを用いた３回の独立試行の平均値±標準偏差で示され、＊は、コントロールに対してＰ＜０．０３であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であることを示す。
【００４４】
【発明の効果】
以上のように、男性型脱毛症には、活性型ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β１活性化因子が関与しているため、これらを標的とする本発明のスクリーニング方法によれば、男性型脱毛治療薬を適切にスクリーニングすることができる。
【００４５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓとヒトＫＣｓとの共培養における、前記ＫＣｓの増殖に対する男性ホルモンの影響の一例を示す図である。
【図２Ａ】継代培養された男性型脱毛前頭部由来ヒトＤＰＣｓにおけるＡＲｍＲＮＡ発現の一例を示す図である。
【図２Ｂ】ＡＲ遺伝子がトランスフェクションされたヒトＤＰＣｓにおけるＡＲｍＲＮＡ発現の一例を示す図である。
【図３Ａ】ＡＲ発現ヒトＤＰＣｓとヒトＫＣｓとの共培養における、ＫＣｓの増殖に対する男性ホルモンの影響を示す図である。
【図３Ｂ】ヒトＤＰＣｓにおける、トランスフェクトされたＡＲ遺伝子の発現の一例を示す図である。
【図４】ヒトＤＰＣｓにおける、ＴＧＦ−β１の半定量ＲＴ−ＰＣＲの一例を示す図である。
【図５】共培養系の培地中へ分泌されるＴＧＦ−β１に対しての男性ホルモンによる正の調節の一例を示す図である。
【図６】男性ホルモン誘導ＫＣｓ生育阻害に対してのＴＧＦ−β１の中和による無効化の一例を示す図である。
【図７】ＤＰＣｓとＫＣｓとの共培養の一例の説明図である。
【符号の説明】
１  トランスウェル
２  隔壁
３  上皮細胞
４  ヒトＤＰＣｓ
５  培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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