(57)【要約】【課題】新規なＨｂＡ１ｃの検定法ならびにその試薬を提供する。【解決手段】ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼ、特に、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼをＨｂＡ１ｃに作用させ、生成したペプチドをＨＰＬＣ等を用いて定量することにより、ヘモグロビンＡ１ｃの測定が可能となった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼを用いることを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】
ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼが、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼである請求項１に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項３】
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼがリジン残基のカルボシキシル基側を水解できる酵素またはアルギニン残基のカルボシキシル基側を水解できる酵素である請求項１または２に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の測定方法を用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は試料中のヘモグロビンＡ１ｃ（以下「ＨｂＡ１ｃ」と略称する）を簡便かつ正確に測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヘモグロビン分子のβ鎖のＮ末端のバリン残基にグルコースが結合したものを「ＨｂＡ１ｃ」といい、臨床的には過去１〜２ヶ月の平均の血糖値を反映しており、糖尿病管理の指標として重要である。
このＨｂＡ１ｃを測定する方法としては、通常、ＨＰＬＣを用いた方法が行われている。しかし、この方法はアセトアルデヒドがヘモグロビンに結合したａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　Ｈｂ、腎不全患者では尿素から生成されるシアン酸によるｃａｒｂａｍｙｌａｔｅｄ　Ｈｂ、胎児型ヘモグロビン（ＨｂＦ）などがＨｂＡ１ｃと同じ画分に溶出し見かけ上ＨｂＡ１ｃが高値になる問題がある。
また、ＨｂＡ１ｃを測定する方法としてＨｂＡ１ｃに特異的な抗体を用いて測定する方法がある。しかし、この方法は抗体を用いた方法であり、操作が煩雑でありまた特殊な装置が必要である。
さらに、特開平５−１９２１９３ではＨｂＡ１ｃのようなグリコシル化タンバク質をプロテアーゼで処理し、プロテアーゼ処理液をケトアミンオキシダーゼで処理しその反応生成物を測定する方法が開示されている。しかし、フルクトシルバリン残基を特異的に切り出すことができるプロテアーゼの例示も開示もされておらず特異的に切り出す方法も全く不明である。また、トリプシン、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫあるいはセリンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ　３．４．１６．１）、ロイシンカルボキシペプチダーゼを用いた方法が一般に知られている。これらはいずれも選択性が低く、ＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端のフルクトシルバリンを遊離させようとするとき、試料中に夾雑するタンパク質にも作用するという問題があり、そのためにプロテアーゼを作用させる前に試料中から夾雑するタンパク質を除去する必要があった。
【０００３】
【発明が解決しょうとする課題】
本発明の目的は、ＨｂＡ１ｃを簡便かつ正確に定量できる方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼを用いることにより、上記問題を解決することを見出し、本発明を完成させた。
つまり、本発明は、
１．ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼを用いることを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
２．ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼが、
Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼである前記１に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
３．Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のプロテアーゼがリジン残基のカルボシキシル基側を水解できる酵素またはアルギニン残基のカルボシキシル基側を水解できる酵素である前記１または２に記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
４．前記１〜３のいずれか１に記載の測定方法を用いたヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼとしては、ヘモグロビンに結合できさらに、プロテアーゼ活性を示すものであれば特に限定されないが、一つのタンパク質にプロテアーゼ活性部位およびヘモグロビン結合部位を有するものがあげられ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のリジン残基カルボシキシル基側を水解できる酵素（ＫＧＰ）あるいはアルギニン残基のカルボシキシル基側を水解できる酵素（ＲＧＰ）を例示することができる。また、処理条件としては、これらプロテアーゼの活性量としては、０．０１〜１０００Ｕ／ｍＬ、特に１〜２００Ｕ／ｍＬが好ましい。また、処理温度は１０〜５０℃、処理時間は１分〜１時間を例示することができる。これら処理条件はこれらに限定されるものではなく、適宜調整可能である。
【０００６】
ＨｂＡ１ｃを含む検体に作用させることによりＨｂＡ１ｃのリジン残基あるいはアルギニン残基のカルボシキシル基側で加水分解されフルクトシル化されたペプチドであるｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓまたはｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇが生成する。生成したこれらペプチドはＨＰＬＣ、電気泳動、免疫学的な方法により定量することが可能である。
【０００７】
ＨＰＬＣを用いた分析方法としては、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを挙げることができる。特に好もしいものとしてイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを挙げることが出来る。逆相クロマトグラフィーに用いるカラムとしてはシリカゲルにオクタデシル（ＯＤＳ）基、オクチル基、フェニル基などを結合させたものが例示され、特に好ましいものとしてＯＤＳ基を挙げることができる。また、溶離液としてはアセトニトリル−水の混合溶媒を挙げることができる。これらの条件はこれらに限定されるものではなく、適宜選択可能である。
【０００８】
また、上記処理により生じたｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓまたはｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇにさらにプロテアーゼを作用させ、フルクトシルバリンを生成させた後、当該生成したフルクトシルバリンを定量することにより、ＨｂＡ１ｃの定量が可能である。つまり、ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼをＨｂＡ１ｃに作用させ、生成したｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓまたはｆｒｕｃｔｏｓｙｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ適当なエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼ等を用いて処理することによりフルクトシルバリンを生成することが出来る。これらプロテアーゼとしては、例えばエラスターゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、アルカリプロテアーゼ、トリプシン、プロリン特異エンドプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ等を挙げることができ、これらを一または二以上用いてもよい。また、処理条件としては、これらプロテアーゼの活性量としては、０．０１〜１０００Ｕ／ｍＬ、特に１〜２００Ｕ／ｍＬが好ましい。また、処理温度は１０〜５０℃、処理時間は１分〜１時間などが例示される。条件はこれらに限定されるものではなく、適宜調整可能である。
次ぎにフルクトシルバリンの定量方法について説明する。本発明の定量方法は、上記操作により生成したフルクトシルバリンをケトアミンオキシダーゼで処理し、生成した過酸化水素を測定することにより、フルクトシルバリンを定量することができる。ケトアミンオキシダーゼとしては、フルクトシルバリンを基質として過酸化水素を生成するものであれば特に限定されないが、フルクトシルリジンに対して特異性の低いものが好ましい。かかるケトアミンオキシダーゼとしては、例えばコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来の酵素、または当該菌株由来の遺伝子組換えフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが挙げられる。また、処理条件としては、これらプロテアーゼの活性量としては、０．０１〜１０００Ｕ／ｍＬ、特に１〜２００Ｕ／ｍＬが好ましい。また、処理温度は１０〜５０℃、処理時間は１分〜１時間などが例示される。処理条件はこれらに限定されるものではなく、適宜調整可能である。
【０００９】
フルクトシルバリンをケトアミンオキシダーゼで処理することによって生成する酸化水素の測定方法は、特に限定されないが、反応系に色原体及びぺルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を添加し、当該色原体を酸化して発色物質を生成させ、これを測定する方法が好適である。この色原体としては、４−アミノアンチピリンと、フェノール系化合物、ナフトール化合物又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−ベゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物との組み合わせ、ロイコメチレンブルー等が用いられる。また、過酸化水素を検出する試薬として、高感度に測定可能なＴＰＭ−ＰＳ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルフォプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン）（同仁化学社製）等も利用できる。
【００１０】
また、ヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼおよび／またはエンドプロテアーゼ又はエキソプロテアーゼ等を用いて処理する際に、タンパク質変性剤を用いることが可能である。タンパク質を用いることにより、ＨｂＡ１ｃの三次構造が変化することによりプロテアーゼが作用しやすくなるためである。変性剤の種類としては尿素、ＳＤＳ、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドが挙げられる。また、処理条件としては、これら変性剤の濃度としては、０．１〜２０ｍＭ、特に１〜１０ｍＭが好ましい。また、処理温度は１０〜５０℃、処理時間は０．５分〜１時間などが例示される。処理条件はこれらに限定されるものではなく、適宜調整可能である。
【００１１】
かかるヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼの定量方法を用いれば、Ｎ末端のバリンがフルクトシル化されているペプチド、蛋白質、蛋白質のサブユニット等、例えばＨｂＡ１ｃを極めて高精度で定量することができる。
【００１２】
ＨｂＡ１ｃの定量に使用される被験試料としては、例えば全血、赤血球等が挙げられる。
【００１３】
【実施例】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１４】実施例１
ＫＧＰの取得
ＫＧＰはＫｕｂｏｎｉｗａ　Ｍ，　Ａｍａｎｏ　Ａ，　Ｓｈｉｚｕｋｕｉｓｈｉ　Ｓ．　１９９８，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，　２４９，　３８−４３の方法に従いＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＡＴＣＣ３３２７７株から抽出した。
つまりヒツジ血球寒天培地上にコロニーを形成させた後、０．１％　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ，　１μｇ／ｍｌ　Ｍｅｎａｄｉｏｎｅ，　５μｇ／ｍｌ　ｈｅｍｉｎを含む１００ｍｌのＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ　（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，　ＭＤ）に植菌し、嫌気的に３７℃、３日間培養した。
遠心分離により菌体を回収した後、３％の界面活性剤（ＣＨＡＰＳ；３−［３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ］−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、室温で３時間攪拌した後、遠心分離（２００００ｇ×６０分）して上清を回収した。
この上清に５０％飽和硫安を添加し、沈殿物を４Ｍ尿素を含むリン酸緩衝液で透析した。
これを同緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂゲルろ過により分画した。
この活性化画分をプールしＫＧＰとして以下の試験に供試した。
【００１５】実施例２
ＨｂＡ１ｃの測定
ヒト血液を精製水で５倍に希釈したものに実施例１で抽出精製したＫＧＰを５単位を添加し、３７℃、８時間インキュベートし後、昭和電工　Ａｓａｈｉｐａｋ　ＧＳ−２２０　ＨＱに２０μＬアプライし、溶離液５０ｍＭ　アンモニウムアセテートを用いて生成した糖化ペプチドを分別定量した。なお、検出は２１０ｎｍで行った。その結果、あらかじめ免疫比濁阻害法試薬キット（リキテックＨｂＡ１ｃ−ＩＩ、ロシュ）を用いて定量した試料中のＨｂＡ１ｃ濃度と相関する結果が得られた。（図１）
【００１６】
【発明の効果】
本発明のヘモグロビンに結合部位をもつプロテアーゼを用いることにより、高精度でＨｂＡ１ｃの定量が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来法との相関を示す図である（実施例２）
【図１】
2004069640.tif 000002