(57)【要約】【課題】破骨細胞の分化成熟を抑制することによって、骨吸収作用を抑制する骨吸収抑制剤及び骨吸収抑制用飲食品の提供。【解決手段】ラクトパーオキシダーゼ及び／又はラクトパーオキシダーゼをトリプシンなどのプロテアーゼで分解した分解物を有効成分とする骨吸収抑制剤、及びラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を配合した骨吸収抑制用飲食品。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を有効成分とする骨吸収抑制剤。
【請求項２】
ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を配合した骨吸収抑制用飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を有効成分とする骨吸収抑制剤、及びラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を配合した骨吸収抑制用飲食品に関する。本発明により、破骨細胞の分化成熟を抑制することによって、骨吸収作用が抑制されることから、骨強化効果を有し、また骨粗鬆症などの骨量減少の抑制に有効である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く（アンカップリング）。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防止することができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を予防することができると考えられている。
【０００３】
従来より、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、（１）食餌によるカルシウム補給、（２）軽い運動、（３）日光浴、（４）薬物治療等が行われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されている。しかし、これらは必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。
軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆ど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ３  の補給という点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、１α−ヒドロキシビタミンＤ３  やカルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であるということが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可能なものではない。
【０００４】
一方、本発明者らは、食品素材として使用可能な骨強化作用や骨吸収抑制作用を有する物質を得るために、乳清タンパク質中に存在する骨強化及び骨吸収抑制因子を探索し続けてきた。その結果、逆浸透膜や電気透析等の処理により、乳清タンパク質の水溶性画分から乳清由来の塩を除去したタンパク質及びペプチド混合物に骨強化作用があることを見出した  （例えば、特許文献１参照。）。そして、このタンパク質及びペプチド混合物の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、あるいは限外濾過膜処理して得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及び骨強化作用があることを見出した  （例えば、特許文献２及び特許文献３参照。）。また、乳中に微量にしか存在しない塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収抑制作用があることを見出した  （例えば、特許文献４参照。）。
【０００５】
【特許文献１】
特開平４−１８３３７１号公報
【特許文献２】
特開平５−１７６７１５号公報
【特許文献３】
特開平５−３２００６６号公報
【特許文献４】
特開平８−１５１３３１号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
骨粗鬆症という疾病の性質上、日常の食事の中で、嗜好的にも問題なく、長期的・直接的に経口摂取することができ、また、直接的に骨吸収抑制作用を骨に付与し、骨粗鬆症の予防または改善治療効果が期待できるような、骨吸収抑制剤及び／又は骨吸収抑制用飲食品の提供を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、さらに、骨吸収抑制作用を有する物質を求め、鋭意研究を進めていたところ、ラクトパーオキシダーゼが骨吸収抑制作用を有することを見出した。そして、ラクトパーオキシダーゼの分解物も同様の作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明では、ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を有効成分とする骨吸収抑制剤を提供する。また、本発明では、ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を配合した骨吸収抑制用飲食品を提供する。
本発明では、骨吸収抑制作用を賦与するために、ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を使用する。
ラクトパーオキシダーゼは哺乳動物の乳から調製する。給源としては、ウシ、水牛、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等の乳があげられる。ラクトパーオキシダーゼは、公知の物質であって、それを製造するには、公知の方法、例えばスルホン化担体を用いてラクトパーオキシダーゼを精製する方法（特開平３−１０９４００号公報）が工業的に有利に利用することができる。また、本願発明では、遺伝子工学的手法により生産されたラクトパーオキシダーゼも使用し得る。
ラクトパーオキシダーゼ分解物は、上記のラクトパーオキシダーゼをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が１０，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の骨吸収抑制剤を投与するに際しては、ラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物をそのままの状態で用いることもできるが、必要に応じ、常法に従い、乳糖、澱粉などで賦型して、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤としたり、あるいはドリンク剤などに製剤化して用いることもできる。さらには、このラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品に配合して、骨吸収抑制による骨強化を図ることも可能である。
骨吸収抑制効果を得るためには、本発明の骨吸収抑制剤、及び骨吸収抑制用飲食品の有効量として、成人において、固形物換算でラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を１０ｍｇ／日以上、経口摂取することが望ましい。そして、骨吸収抑制剤には、固形物換算でラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を５ｍｇ〜１００ｇ／１００ｇ、骨吸収抑制用飲食品には、固形物換算でラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を５ｍｇ〜１０ｇ／１００ｇ配合することが望ましい。
なお、本発明の骨吸収抑制剤を飼料に含有させて、家畜や家禽等の骨吸収を抑制させることもできる。
【０００９】
【実施例１】
陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール（富士紡績社製）４００ｇを充填したカラム（直径５ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳４０  ｌ  （ｐＨ  ６．７）を流速２５ｍｌ／ｍｉｎで通液した。通液後、カラムを脱イオン水で十分洗浄し、  １．５Ｍ塩化ナトリウムを含む  ０．０２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）で溶出した。そしてラクトパーオキシダーゼを含有する溶出画分をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に吸着させ、脱イオン水で十分洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した後、０〜１Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエントで吸着した画分を溶出し、ラクトパーオキシダーゼを含む画分を回収した。そしてその画分をＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで処理し、ラクトパーオキシダーゼ１１ｇを得た。なお、このようにして得られたラクトパーオキシダーゼの純度は９１％であり、そのまま骨吸収抑制剤として使用可能である。
【００１０】
【実施例２】
実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼ５ｍｇを水１０ｍｌに懸濁し、最終濃度０．０１重量％となるようタンパク質分解酵素であるパンクレアチン（シグマ社製）を加え、３７℃で５時間酵素処理した。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してラクトパーオキシダーゼ分解物  ４．４ｍｇを得た。なお、このようにして得られたラクトパーオキシダーゼ分解物の分子量は、１０，０００以下であり、そのまま骨吸収抑制剤として使用可能である。
【００１１】
【試験例１】
ＳＴ２細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６−ｗｅｌｌプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で３７℃、５％ＣＯ２の条件で２日間培養した。ｄｄｙマウス（７又は８週齢雄性）の大腿骨から採取した骨髄細胞を、上記ＳＴ２細胞層に播種して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２４時間培養した後、培養液を除去し、１×１０−８  Ｍの１，２５（ＯＨ２）Ｄ３及び１×１０−７  Ｍのデキサメタゾンを含有した１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地を９０μｌ／ｗｅｌｌ添加した。続いて、試料として０．０１〜１００μｇ／ｍｌのラクトパーオキシダーゼ（実施例１）溶液又はラクトパーオキシダーゼ分解物（実施例２）溶液を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件で３日間培養した後、培地を交換してさらに３日間培養した。培養終了後、培養液を除去して、ＰＢＳで洗浄し、アセトン−エタノール（１：１）溶液で１分間処理して固定した後、１．５  ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム−２０  ｍＭ  酒石酸ナトリウム−５０  ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で３０分間反応させた。１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加して反応を停止した後、４０５ｎｍの吸光度を測定し、破骨細胞分化成熟の指標とした。その結果を図１に示す。吸光度が高いほど破骨細胞の分化成熟が多いことを示している。
これによると、実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼ、実施例２で得られたラクトパーオキシダーゼ分解物を添加した群はいずれも、対照である無添加群に比べ破骨細胞の分化成熟が抑制されることが判った。また、ラクトパーオキシダーゼ又はその分解物の添加量が１、１０、１００μｇ／ｍｌと増加すればするほど、４０５ｎｍでの吸光度が減少し、破骨細胞の分化成熟抑制作用が顕著であることが判った。
【００１２】
【実施例３】
（骨吸収抑制剤の製造）
実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼ１００ｍｇに、含水結晶ぶどう糖  ９３．４ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、シュガーエステル１ｇ、香料０．５ｇを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の骨吸収抑制剤を製造した。
【００１３】
【実施例４】
（骨吸収抑制剤の製造）
実施例２で得られたラクトパーオキシダーゼ分解物１００ｍｇに、含水結晶ぶどう糖  ９３．４ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、シュガーエステル１ｇ、香料０．５ｇを加え、混和した後、タブレット状に打錠して、本発明の骨吸収抑制剤を製造した。
【００１４】
【実施例５】
（骨吸収抑制用乳飲料の製造）
実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼを、  １  ｌ当たり１ｇとなるように生乳に添加し、均質圧力１２０ｋｇ／ｃｍ２でホモゲナイズした後、  ７５℃で１５秒間加熱殺菌して、骨吸収抑制用乳飲料を製造した。
【００１５】
【実施例６】
（骨吸収抑制用乳飲料の製造）
実施例２で得られたラクトパーオキシダーゼ分解物を、  １  ｌ当たり１ｇとなるように生乳に添加し、均質圧力１２０ｋｇ／ｃｍ２でホモゲナイズした後、  ７５℃で１５秒間加熱殺菌して、骨吸収抑制用乳飲料を製造した。
【００１６】
【実施例７】
（骨吸収抑制用飲料の製造）
実施例１で得られたラクトパーオキシダーゼ４０ｇを、乳酸でｐＨ３．２に調整した脱イオン水５０  ｌに溶解した後、砂糖１ｋｇ、香料１０ｇを溶解して、９０℃で１５秒間加熱殺菌を行った。これを５０  ｍｌずつ蓋付きガラスビンに密封充填し、骨吸収抑制用飲料を製造した。
【００１７】
【発明の効果】
本発明のラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を有効成分とする骨吸収抑制剤、及びラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を配合した骨吸収抑制用飲食品は、破骨細胞の分化成熟を抑制することによって、骨吸収作用が抑制されることから、骨強化作用を有し、また骨粗鬆症などの骨量減少の抑制に有効である。
また、本発明の骨吸収抑制剤、及び骨吸収抑制用飲食品は、原料の入手が容易であり、常に一定の品質が得られ、複雑な工程を必要としないで安価に製造でき、また大量調製することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１のラクトパーオキシダーゼ、及び実施例２のラクトパーオキシダーゼ分解物の破骨細胞の分化成熟抑制作用を示す。
【図１】
2004238320.tif 000002