(57)【要約】【課題】発酵法による新規なＬ−シスタチオニンの製造方法を提供する。【解決手段】炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を程よく含有する発酵培地に、大腸菌のＬ−シスタチオニン生産性変異株を好気的に培養し発酵液中に著量のＬ−シスタチオニンを蓄積させ、発酵液からＬ−シスタチオニンを単離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養して、培養液中にＬ−シスタチオニンを蓄積させ、得られた培養液からＬ−シスタチオニンを単離するＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項２】
前記大腸菌がシスタチオニンβ−リア−ゼ（ＥＣ  ４．４．１．８）欠失性Ｌ−メチオニン要求性変異株である請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項３】
栄養物としてのＬ−メチオニンを前記培地に所定量添加する請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項４】
前記培地への栄養物としてのＬ−メチオニンの添加濃度が５０〜３００μｇ／ｍｌである請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項５】
得られた培養液を凍結後融解処理してＬ−シスタチオニンを単離する請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項６】
得られた培養液を加熱処理してＬ−シスタチオニンを単離する請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項７】
前記発酵培地の炭素源として、でんぷん加水分解物、ぶどう糖、果糖、糖蜜等を用いる請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項８】
前記発酵培地の窒素源として、アンモニア水、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等を用いる請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【請求項９】
前記発酵培地の硫黄源として、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオ尿素等を用いる請求項１に記載のＬ−シスタチオニンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法によるＬ−シスタチオニンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来からコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属の変異株がＬ−シスタチオニンを分泌することが知られている（特許公報昭和５１−２１０７５）が、蓄積量が低くまだ改善すべき点がある。酵母がシスタチオニンを菌体内に蓄積すること（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１５８巻、８６０頁、１９８４年）、また大腸菌の変異株がシスタチオニンを分泌することが知られている（日本農芸化学会、１９９９年度大会要旨集、２７０頁）が、蓄積量が低くまたその立体構造が考えられる四種の異性体の内どれであるかについては全く証明がなかった。また、酵素法によってＬ−システインとＯ−サクシニル−ＬホモセリンからＬ−シスタチオニンを合成する方法が知られているが、これらは酵素や原料のコストが高価であるという問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明では、安価な炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含む安価な発酵培地に、Ｌ−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を好気的に培養して、培養液中に蓄積するシスタチオニンがＬ−体である事を証明し、これを蓄積せしめる経済的に優れたＬ−シスタチオニンの製造法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｌ−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養して、培養液中にＬ−シスタチオニンを蓄積させ、得られた培養液からＬ−シスタチオニンを単離することでＬ−シスタチオニンを製造するものである。
【０００５】
好適には、上記大腸菌がシスタチオニンβ−リア−ゼ（ＥＣ  ４．４．１．８）欠失性Ｌ−メチオニン要求性変異株である。
【０００６】
また、栄養物としてのＬ−メチオニンを前記培地に所定量、より好ましくは、５０〜３００μｇ／ｍｌの濃度で添加する。
【０００７】
かかる単離は、得られた培養液を凍結後融解処理することで行われるか、又は得られた培養液を加熱処理することで行われる。
【０００８】
発酵培地の炭素源としては、でんぷん加水分解物、ぶどう糖、果糖、糖蜜等、窒素源としては、アンモニア水、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等、そして硫黄源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、チオ硫酸塩、チオ尿素等を用いることが好ましい。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はなんらこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１０】
まず、Ｌ−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌を炭素源、窒素源、硫黄源その他の栄養物を含有する発酵培地に好気的に培養する。このＬ−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌とは、それを培地に培養したときに、培地中に有意な量のＬ−シスタチオニンを蓄積する大腸菌をいう。大腸菌に属しＬ−シスタチオニンを菌体内及び菌体外に蓄積する変異株であれば栄養要求性変異株、代謝調節変異株、各種薬剤耐性変異株、各種薬剤感受性変異株、遺伝子組換え株あるいはそれらを組み合わせて持つ変異株が上げられるが、これに限定されるものではない。
【００１１】
本発明で使用する炭素源としては、各種でんぷん加水分解物、糖蜜、コーン・スチープ・リカー、ぶどう糖、果糖、それらを含む天然試料等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【００１２】
また、本発明で使用する窒素源としては、アンモニア水、尿素、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【００１３】
そしてまた、本発明で使用する硫黄源としては、各種硫酸塩、各種亜硫酸塩、各種チオ硫酸塩、各種硫化物、チオ尿素、Ｄ−、Ｌ−あるいはＤＬ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン等の含硫アミノ酸類、タンパク質、タンパク質分解物等使用菌の利用できるものならばいずれも使用出来る。
【００１４】
特にメチオニン要求性変異株を用いる場合には、発酵液に添加するＬ−メチオニン濃度を所定量に、特に５０〜３００μｇ／ｍｌに制限すると好結果を得る。
【００１５】
その他、本発明で使用する栄養物としては、カリ、リン酸、マンガン、鉄、マグネシウム、ナトリウム、塩素、コバルト、ニッケル等のミネラルの塩類、チアミン、ビオチン、リボフラビン、コバラミン、葉酸等のビタミン等が程良く添加されたものがあげられる。
【００１６】
好気的に培養する方法として、振とう培養、通気撹拌培養等が好ましいがこれに限定されるものではない。
【００１７】
発酵液はｐＨ５〜８の範囲に調製され、２５〜４０℃の範囲で発酵される。この発酵は回分式、連続式のいずれでも良い。
【００１８】
次に，発酵液からのＬ−シスタチオニンを単離する。
【００１９】
発酵液からＬ−シスタチオニンを単離するに際して、まず発酵液を加熱もしくは一旦−２０℃程度で凍結して後融解する操作を行い、菌の細胞膜のＬ−シスタチニン透過性をよくしてから、よく撹拌して十分にＬ−シスタチオニンを細胞外に排出せしめる。
【００２０】
もしくは、一旦ろ過または遠心分離で菌体を集めその細胞懸濁液を加熱もしくは凍結後融解して撹拌して十分に細胞外にＬ−シスタチオニンを排出せしめる。
【００２１】
発酵液の上澄に蓄積したものと菌体から溶出された  Ｌ−シスタチオニンを含む液を合わせて各種のイオン交換樹脂カラムに通塔してＬ−シスタチオニンを吸着させ、これを希アンモニア水、もしくは希塩酸等で溶出させ、溶出液を減圧濃縮し、これを冷却することによって、Ｌ−シスタチオニンの粗結晶を得る事が出来る。
【００２２】
得られた粗結晶は洗浄後乾燥され、必要に応じて再結して純度の高い製品を得る。
【００２３】
次に本発明にかかるＬ−シスタチオニンの製造方法を具体的な実施例に基づいて説明する。
【００２４】
［実施例１］
殺菌した４重量％グルコ−ス、１重量％ポリペプトン、０．５重量％酵母エキス、ｐＨ７の組成の種培地１０ｍｌを、殺菌した１００ｍｌ容の三角フラスコに移し、これに一夜栄養寒天培地で生育させたＬ−シスタチオニン生産能力を有する大腸菌、本例ではシスタチオニンβ−リア−ゼ欠失性メチオニン要求性変異株（名称：ＣＡＧ１８４７５）を接種し、３０℃で１４０ｒｐｍの振とう条件で１６時間振とう培養した。このＣＡＧ１８４７５大腸菌は、ブタペスト条約に基づく微生物の寄託機関である工業技術院微生物工業技術研究所に平成１４年６月１３日付けで寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８９１が付与されている。
【００２５】
得られた種培養液を無菌状態にて８，０００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離し、沈殿した菌体全量を遠心上澄液３．３ｍｌに懸濁し、これを種菌液とした。
【００２６】
殺菌した３重量％果糖、０．１５重量％リン酸一カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、０．０５重量％リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、０．０５重量％硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、０．００７重量％硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ）、０．０１重量％硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）、ｐＨ７の組成の発酵培地７ｍｌずつを二十個の殺菌した３００ｍｌ容の三角フラスコに入れ、それぞれに殺菌した炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）７０ｍｇと殺菌したＬ−メチオニン（３０ｍｇ／ｍｌ）溶液０．０２３ｍｌずつを添加し、これに上記の種菌液０．７ｍｌずつを接種して、１４０ｒｐｍ、３０℃で振とう培養し、培養２４時間目に殺菌した３０〜４０重量％フラクトース０．７ｍｌを添加してさらに２４時間培養を継続した。
【００２７】
上記の四個のフラスコの培養終了液を集めて混合しそのうち７ｍｌずつを三本の試験管に移した。
【００２８】
上記の試験管のうち一本の培養液を撹拌後遠心分離し、上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、０．４ｍｇ／ｍｌであった。沈殿した菌体は−２０℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解し、７ｍｌの水を加えて撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、１．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００２９】
上記の三本のうちもう一本の培養液を−２０℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解し撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、１．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００３０】
上記の三本のうちさらにもう一本の培養液を９０℃で５分間加熱し、撹拌後遠心分離して得た上澄液中のシスタチオニン量を測定したところ、１．１ｍｇ／ｍｌであった。
【００３１】
上記の残りの培養液をすべて集め−２０℃の冷凍庫中で凍結し、翌日融解して撹拌後遠心分離して得た上澄液から以下のようにＬ−シスタチオニンの単離を試みた。
【００３２】
上澄液１００ｍｌを水で二倍に希釈し、希塩酸を用いてｐＨ３にした。
【００３３】
この液を陽イオン交換樹脂ダイアイオンＳＫ＃１ＢのＨ型カラムに通塔してＬ−シスタチオニンを吸着させ、水洗後３２０ｍｌの２ＮＮＨ４ＯＨで溶出した。
【００３４】
この溶出液を減圧下で約５０ｍｌまで濃縮し冷蔵庫で冷却したところ白色の沈殿が生じたのでこれを単離し、洗浄後乾燥して７０ｍｇのＬ−シスタチオニンの粗結晶を得た。
【００３５】
得られた粗結晶の標品をアミノ酸アナライザー分析したところ、標準のシスタチオニンと溶出時間が一致した。
【００３６】
得られた粗結晶の標品を１３Ｃ−及び１Ｈ−ＮＭＲ分析したところ、得られたシグナルが標準のシスタチオニンのそれと一致した。
【００３７】
得られた粗結晶の標品を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、溶出時間が標準のＬ−シスタチオニンのそれと一致し、シスタチオニンの他の異性体のどれとも一致しなかった。
【００３８】
［実施例２］
実施例１の発酵液のＬ−メチオニン濃度を最終濃度として０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００μｇ／ｍｌに変えて同様に実施した結果、Ｌ−メチオニン濃度が５０〜３００μｇ／ｍｌに制限した時にＬ−シスタチオニンが０．５〜１．２ｍｇ／ｍｌ蓄積した。
【００３９】
【発明の効果】
以上の説明により、本発明は安価な原料を含む発酵培地で短時間に著量のＬ−シスタチオニンを蓄積せしめ容易に製品を得ることが可能となる。