(57)【要約】      （修正有）【課題】  活性酸素ストレス負荷時に発現誘導することができるプロモーターを提供する。【解決課題】  以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる活性酸素ストレス応答性プロモーター。(a)特定の塩基配列からなるDNA(b)特定の塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA(c)特定の塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる活性酸素ストレス応答性プロモーター。
(a)配列番号１、２又は３で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１、２又は３で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号１、２又は３で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
【請求項２】
請求項１記載の活性酸素ストレス応答性プロモーターを含む組換えベクター。
【請求項３】
上記活性酸素ストレス応答性プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする請求項２記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項２又は３記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
請求項２又は３記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【請求項６】
請求項３記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体に対して、活性酸素ストレスを負荷する工程と
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む遺伝子発現調節方法。
【請求項７】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなり、葉基部にて発現調節機能を示すプロモーター。
(a)配列番号２１で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号２１で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、葉基部にて発現調節機能を示すプロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号２１で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、葉基部にて発現調節機能を示すプロモーターとして機能するDNA
【請求項８】
請求項７記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項９】
上記プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする請求項８記載の組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８又は９記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項８又は９記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【請求項１２】
請求項１１記載の形質転換植物に対して、
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む葉基部における遺伝子発現調節方法。
【請求項１３】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなり、葉及び茎にて発現調節機能を示すプロモーター。
(a)配列番号２２で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号２２で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、葉及び茎にて発現調節機能を示すプロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号２２で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、葉及び茎にて発現調節機能を示すプロモーターとして機能するDNA
【請求項１４】
請求項１３記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項１５】
上記プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする請求項１４記載の組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１４又は１５記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１７】
請求項１４又は１５記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【請求項１８】
請求項１７記載の形質転換植物に対して、
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む葉及び茎における遺伝子発現調節方法。
【請求項１９】
以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなり、根にて発現調節機能を示すプロモーター。
(a)配列番号２３で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号２３で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、根にて発現調節機能を示すプロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号２３で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性酸素ストレス応答性を示し、根にて発現調節機能を示すプロモーターとして機能するDNA
【請求項２０】
請求項１９記載のプロモーターを含む組換えベクター。
【請求項２１】
上記プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする請求項２０記載の組換えベクター。
【請求項２２】
請求項２０又は２１記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項２３】
請求項２０又は２１記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
【請求項２４】
請求項２３記載の形質転換植物に対して、
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む根における遺伝子発現調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性酸素ストレスによって特異的に発現誘導する活性酸素ストレス応答性プロモーターに関する。また、本発明は、組織特異的に発現誘導するプロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、日ごろより高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌等の様々な活性酸素ストレスにさらされている。そして、これら活性酸素ストレス下でも十分生育できる有用な植物、例えば穀物などが開発できれば、活性酸素ストレスにより穀物が生育できない地域においても食料生産が可能となり、将来予想されている深刻な食糧危機への備えとなる可能性が高い。このため、これら活性酸素ストレスに対する耐性が向上した植物の作出が世界的に繰り広げられている。例えば、低温耐性（Nature，356, 710−703，1992、Plant Physiol．，105，601−605，1994）、乾燥耐性（Plant Physiol．，107，125−130，1995、Nature，379，683-684，1996、 Nature Biotech. , 17，287-291，1999）、塩耐性（Science, 259, 508-510, 1993、Biotechnology, 14, 177-180, 1996、Plant J., 12, 133-142, 1997）、大気汚染物質耐性（Plant Cell Physiol.，34，129-135，1993、 Biotechnology, 12, 165-168, 1994）、病害抵抗性（化学と生物, 37, 295-305, 385-392, 1999）等を遺伝子組換え技術により付与された植物が作出されている。また遺伝子組換え技術により農薬耐性（Nature，317, 741-744，1985、Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 85, 391-395, 1988、EMBO J., 6, 2513-2518, 1987、EMBO J., 7, 1241-1248, 1988）を付与された植物は実用化されているものもある。
【０００３】
これら活性酸素ストレスは、生体内の活性酸素分子種（スーパーオキシドラジカル：O2-、過酸化水素：H2O2、ヒドロキシラジカル：OH-）の発生と密接に関係している。活性酸素分子種は、呼吸、光合成、活性酸素ストレス等により発生し、タンパク質、核酸、膜構造等を過度に酸化することにより細胞に致命的な障害を与える。遺伝子組換え技術により作出された活性酸素耐性植物が、これら活性酸素ストレス耐性の向上につながった報告も見うけられる（Plant Physiol．，111，1177−1181，1996、FEBS Letters, 428, 47-51, 1998）。
【０００４】
活性酸素耐性植物の作出には、主に活性酸素分子種の消去系酵素（スーパーオキシドディスムターゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びグルタチオンレダクターゼ等）の遺伝子を植物に導入する方法がとられており、またパラコート（活性酸素を発生させ殺草効果を示す除草剤）に耐性な植物のパラコート耐性の機構に関する解析もみられる（Pestic. Biochem. Physiol., 26, 22-28, 1986、Theor. Appl. Genet. 75, 850-856, 1988、Plant Physiol., 91, 1174-1178, 1989）。
【０００５】
そのようなパラコート耐性に関与する遺伝子が単離されれば、様々な活性酸素ストレス（高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス、病原菌等）条件下で発生する活性酸素に対して耐性の高い植物の開発に有用であると思われる。
【０００６】
ところで、機能遺伝子の発現は、RNAへの転写、タンパク質への翻訳、RNA の安定性、タンパク質の安定性、タンパク質輸送及びタンパク質修飾など、遺伝子が転写されてから機能性分子が機能するまでの多くの過程で制御されている。プロモーターはその中でもRNAへの転写のタイミング、強度、部位などを制御する主たる発現制御因子として知られ、遺伝子のある一部分を指す調節遺伝子の一種であり、DNA分子上にあって、RNA合成酵素が結合してオペロンの転写を開始する部位と定義される。
【０００７】
従って、所定の機能遺伝子の発現を制御するためには、プロモーターの開発が有効である。特に、活性酸素ストレス負荷によって、下流に配置された機能遺伝子の発現を誘導できるプロモーターを開発することで、活性酸素ストレスに優れた耐久性を示す植物の作出が期待できる。
【０００８】
【非特許文献１】Nature，356, 710−703，1992
【非特許文献２】Plant Physiol．，105，601−605，1994
【非特許文献３】Plant Physiol．，107，125−130，1995
【非特許文献４】Nature，379，683-684，1996
【非特許文献５】Nature Biotech. , 17，287-291，1999
【非特許文献６】Science, 259, 508-510, 1993
【非特許文献７】Biotechnology, 14, 177-180, 1996
【非特許文献８】Plant J., 12, 133-142, 1997
【非特許文献９】Plant Cell Physiol.，34，129-135，1993
【非特許文献１０】Biotechnology, 12, 165-168, 1994
【非特許文献１１】化学と生物, 37, 295-305, 385-392, 1999
【非特許文献１２】Nature，317, 741-744，1985
【非特許文献１３】Proc.Natl.Acad.Sci.USA , 85, 391-395, 1988
【非特許文献１４】EMBO J., 6, 2513-2518, 1987
【非特許文献１５】EMBO J., 7, 1241-1248, 1988
【非特許文献１６】Plant Physiol．，111，1177−1181，1996
【非特許文献１７】FEBS Letters, 428, 47-51, 1998
【非特許文献１８】Pestic. Biochem. Physiol., 26, 22-28, 1986
【非特許文献１９】Theor. Appl. Genet. 75, 850-856, 1988
【非特許文献２０】Plant Physiol., 91, 1174-1178, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、活性酸素ストレス負荷時に発現誘導することができるプロモーターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる活性酸素ストレス応答性プロモーター。
(a)配列番号１、２又は３で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１、２又は３で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号１、２又は３で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
（２）（１）記載の活性酸素ストレス応答性プロモーターを含む組換えベクター。
（３）上記活性酸素ストレス応答性プロモーターに、機能しうるかたちで連結された目的遺伝子を有することを特徴とする（２）記載の組換えベクター。
（４）（２）又は（３）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（５）（２）又は（３）記載の組換えベクターで植物細胞を形質転換し、形質転換された植物細胞から得られた形質転換植物。
（６）（３）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体に対して、活性酸素ストレスを負荷する工程と
上記組換えベクターの目的遺伝子の発現を誘導する工程と
を含む遺伝子発現調節方法。
【００１１】
また、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなり、葉基部、葉及び茎、若しくは根にて遺伝子発現制御機能を示すプロモーターである。
(a)配列番号２１、２２又は２３で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号２１、２２又は２３で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、プロモーターとして機能するDNA
(c)配列番号２１、２２又は２３で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロモーターとして機能するDNA
特に、配列番号２１で表される塩基配列からなるDNAをプロモーターとして使用することによって、葉基部における特異的な遺伝子発現調節を行うことができる。また、配列番号２２で表される塩基配列からなるDNAをプロモーターとして使用することによって、葉及び茎における特異的な遺伝子発現調節を行うことができる。さらに、配列番号２３で表される塩基配列からなるDNAをプロモーターとして使用することによって、根における特異的な遺伝子発現調節を行うことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、活性酸素ストレス負荷時に発現誘導することができる新規な活性酸素ストレス応答性プロモーターを提供することができる。また、本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターを用いることによって、活性酸素ストレス負荷により下流の目的遺伝子の発現誘導を行うことができる組換えベクターを提供することができる。さらに、本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターを用いることによって、活性酸素ストレス負荷により発現誘導される目的遺伝子を有する形質転換体を提供することができる。
【００１３】
さらに本発明により、組織特異的な発現誘導を行うことができるプロモーターを適用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターについて説明する。
本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターは、以下の１〜３のいずれかのDNAからなる。
１．配列番号１、２又は３で表される塩基配列からなるDNA
２．配列番号１、２又は３で表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基
が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、活性酸素ストレス応答性プロモーターとして機能するDNA
３．配列番号１、２又は３で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するDNA
【００１５】
配列番号１、２及び３で表される塩基配列は、それぞれ、活性酸素を発生させ殺草効果を示す除草剤であるパラコートに対し耐性を示すタバコカルス由来のペルオキシダーゼ遺伝子NTPXC3、NTPXC1及びNTPXC2の上流に位置し、各遺伝子の発現を制御している塩基配列である。
【００１６】
タバコにおけるペルオキシダーゼ遺伝子（NTPXC1、NTPXC2及びNTPXC3）は、定法に従って調製することができる。例えば、タバコから抽出したゲノムDNAを鋳型とし、特開2001-95585号公報に開示されているNTPXC1遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてPCRを行うことによって、NTPXC1遺伝子を調製することができる。
【００１７】
また、NTPXC1遺伝子の上流に位置するプロモーター領域は、例えば、NTPXC1遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、いわゆるインバースPCRによって調製することができる。インバースPCRとは、既知の塩基配列の両端に隣接する未知の塩基配列をPCR法を用いて増幅する方法である。具体的には、先ず、既知の塩基配列を含むDNAを適当な制限酵素で切断し、PCR増幅に適した大きさのDNA断片とし、このDNA断片の両端をライゲーションして環状とする。その後、一対のプライマーを、それぞれ環状分子内のコア領域の両端部分には相補的だが、通常のPCRとは逆に、既知の塩基配列から未知の塩基配列に向かって伸長鎖を合成するように設計する。そして、このように設計された一対のプライマーと、環状化されたDNA断片を用いてPCRを行う。これにより、既知の塩基配列に隣接する未知の塩基配列を増幅することができる。
【００１８】
インバースPCRによって増幅されたDNA断片を用いて、既知の塩基配列に隣接する未知の塩基配列を決定することができる。そして、決定した塩基配列に基づいて、さらに一対のプライマーを設計し、決定した塩基配列に隣接する未知の塩基配列を同様にして増幅することができる。
【００１９】
このように、インバースPCRによってNTPXC3遺伝子の上流に位置する未知の塩基配列を順次増幅し、定法に従って塩基配列を決定することによって、配列番号１で表される塩基配列を得ることができる。一旦、配列番号１で表される塩基配列が決定されると、その後は、配列番号１で表される塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、タバコから抽出したゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、配列番号１に表される塩基配列を得ることができる。
【００２０】
配列番号１、２及び３に表される塩基配列は、活性酸素ストレスに対して応答性を示すプロモーターとして機能する。プロモーターとは、機能遺伝子の上流に配置され、RNAポリメラーゼが結合することにより、下流に配置された機能遺伝子の発現を調節する塩基配列である。
【００２１】
ここで、活性酸素ストレスとは、高低温、乾燥、強光、塩、大気汚染ガス及び病原菌等の活性酸素ストレスや呼吸、光合成等に起因して、活性酸素分子種（スーパーオキシドラジカル：O2-、過酸化水素：H2O2、ヒドロキシラジカル：OH-）が植物体内に発生することを意味する。植物体内に活性酸素が発生すると、活性酸素分子種がタンパク質、核酸、膜構造等を過度に酸化することにより細胞に致命的な障害を与える。「活性酸素ストレスに対して応答性を示す」とは、植物体において活性酸素が有意に増加したときに、活性酸素の増加に伴って特異的に応答することを意味する。したがって、「活性酸素ストレスに対して応答性を示すプロモーター」とは、植物体において活性酸素が有意に増加したときに、活性酸素の増加に伴って、下流に配置された機能遺伝子等を特異的に発現させることができるプロモーターを意味する。
【００２２】
活性酸素ストレス応答性プロモーターとしての活性を有するか否かは、以下のような手法により確認することができる。すなわち、活性酸素ストレス応答性プロモーターとしての活性は、例えば、種々のレポーター遺伝子（例えば、β-グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）、ルシフェラーゼ遺伝子（LUC）、グリーンフルオレッセントプロテイン遺伝子（GFP）等）をプロモーターの下流域に連結したベクターを作製し、当該ベクターを用いて宿主のゲノムに導入した後、活性酸素を増加させる条件下で、当該レポーター遺伝子の発現を測定することにより確認することができる。
【００２３】
具体的に、活性酸素ストレスとしては、植物体に10μM〜1mMのパラコート等の除草剤を噴霧したり、葉を0.1μM〜100μMのパラコート等の除草剤溶液に浸漬したり、或いは培地に1μM〜200μMのパラコート等の除草剤を添加した環境及び当該環境に相当する環境を例示することができる。その他にも、活性酸素ストレスとしては、H2O2、SO2及び紫外線などによっても付与することができる。
【００２４】
特に、配列番号２に示す塩基配列からなるプロモーター、すなわちNTPXC1の上流に位置するプロモーターにおける部分領域は、植物における組織特異的な遺伝子発現制御を司る。具体的には、配列番号２における2048〜2264番目の塩基配列（配列番号２１）は、葉基部における遺伝子発現を制御する。配列番号２における1061〜2046番目の塩基配列（配列番号２２）は、葉及び茎における遺伝子発現を制御する。配列番号２における658〜1060番目の塩基配列（配列番号２３）は、根における遺伝子発現を制御する。
【００２５】
一方、本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターは、配列番号１、２又は３に表される塩基配列からなるものに限定されず、上記２．に記載したように、活性酸素ストレスに対して応答性を示すプロモーター活性を示す限り、配列番号１、２又は３に表される塩基配列において、1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であってもよい。
【００２６】
例えば、配列番号１、２又は３に表される塩基配列において、1〜100個の塩基、好ましくは1〜50個の塩基、より好ましくは1〜10個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であっても、活性酸素ストレスに対して応答性を示すプロモーター活性を示す限り本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターに含まれる。
【００２７】
また、本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターは、配列番号１、２又は３に表される塩基配列からなるもの限定されず、上記３．に記載したように、活性酸素ストレスに対して応答性を示すプロモーター活性を示す限り、配列番号１、２又は３で表される塩基配列の全部若しくは一部と相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であってもよい。
【００２８】
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、P32で標識下プローブDNAを用いる場合には、５×SSC（0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト試薬（0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン）及び0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）からなるハイブリダイゼーション溶液中で、温度が45〜68℃、好ましくは60〜68℃である。洗浄ステップにおいては、２×SSC及び0.1％SDSからなる洗浄溶液中で、温度が45〜55℃、より好ましくは、0.1×SSC及び0.1％SDSからなる洗浄溶液中で、温度が45〜55℃である。
【００２９】
また、AlkPhos direct labeling module（アマシャムバイオテク社製）のキットを用いて、酵素標識したプローブDNAを用いる場合には、当該キットのマニュアルに記載されている組成のハイブリダイゼーション溶液（0.5M NaCl及び4％ブロッキング試薬を含む）中で、温度が55〜75℃である。洗浄ステップにおいては、当該キットのマニュアルに記載されている一次洗浄液（2M尿素を含む）中で、55〜75℃であり、更に、二次洗浄液中で室温である。
【００３０】
さらに、他の検出法であってもよく、その場合には当該検出法の標準的な条件を適宜使用することができる。
【００３１】
一旦本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターの塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はゲノムDNAを鋳型としたPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、本発明に係る活性酸素ストレス応答性プロモーターを得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によって、配列番号１、２又は３に表される塩基配列に1若しくは複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を合成することもできる。
【００３２】
なお、配列番号１、２又は３に表される塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製)やMutant-G(TAKARA社製))などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異の導入が行われる。
【００３３】
次に、上述した活性酸素ストレス応答性プロモーターを用いた組換えベクターについて説明する。組換えベクターは、適当なベクターに、上述した活性酸素ストレス応答性プロモーターを連結（挿入）することにより得ることができる。また、上述した活性酸素ストレス応答性プロモーターの下流に目的遺伝子を連結（挿入）したものも、本発明に係る組換えベクターに含まれる。ここで「目的遺伝子」とは、例えば、タンパク質をコードする核酸又はそのアンチセンス核酸、アンチセンスRNAデコイをコードする核酸、リボザイムなどが挙げられる。また、「目的遺伝子」としては、RNA干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）の原理を利用するための遺伝子であっても良い。
【００３４】
タンパク質をコードする核酸としては、酵素をコードする遺伝子の核酸であってもよく、例えば、スーパーオキシディスムターゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ及びグルタチオンレダクターゼ等の活性酸素ストレスに耐性を付与する遺伝子等が挙げられる。また、ナトリウムポンプ遺伝子などの塩ストレスに耐性を付与する遺伝子、TFL遺伝子などの開花時期や形態などを制御する制御遺伝子、α-チオニンなどの抗菌ペプチド遺伝子等も挙げられる。
【００３５】
アンチセンス核酸とは、任意のRNA（ゲノムRNA及びmRNA）と相補的な塩基配列を有し、これらと２本鎖を形成することによって該RNAにコードされる遺伝子情報の発現（転写、翻訳）を抑制するものをいう。アンチセンス配列は、遺伝子の翻訳又は転写をブロックする限り任意の核酸物質を使用することができる。例えば、DNA、RNA、又は任意の核酸擬似物が挙げられる。従って、発現を抑制させようとする遺伝子の一部の配列に相補的となるようにアンチセンス核酸（オリゴヌクレオチド）配列を設計する。
【００３６】
本発明の目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体も使用することができる。分子類似体は、高安定性、分布特異性などを有するものである。分子類似体には、化学的に反応性である基、例えば鉄結合エチレンジアミン四酢酸をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させたものが挙げられる。
【００３７】
RNAデコイをコードする核酸とは、転写因子の結合タンパク質をコードする遺伝子あるいは転写因子の結合部位の配列又は類似の配列を有するRNAを指し、これらを「おとり」として細胞内に導入することによって転写因子の作用を抑制するものをいう。
【００３８】
リボザイムとは、特定のタンパク質のmRNAを切断するものをいい、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。リボザイムは特定のタンパク質をコードする遺伝子配列より設計することができ、例えば、ハンマーヘッド型リボザイムとしては、FEBS Letter, 228; 228-230(1988)に記載の方法を用いることができる。また、ハンマーヘッド型リボザイムだけではなく、ヘアピン型リボザイム、デルタ型リボザイムなどの、特定のタンパク質のmRNAを切断するものであって、これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば本発明において使用しうる。
【００３９】
RNA干渉とは、二本鎖を形成しているRNA（以下、「二本鎖RNA」又は「dsRNA」ともいう）が細胞内に存在する場合に、そのＲＮＡの塩基配列に相同的な内在性のmRNAが分解される結果、当該mRNAからの遺伝子発現が特異的に抑制される現象である。RNA干渉は、RNAインターフェアランス、RNAiとも称される。RNA干渉の原理を利用するための遺伝子としては、ヘアピン型dsRNA等の宿主内で二本鎖RNAを形成するように、発現を抑制したい遺伝子の塩基配列に基づいて設計される。
【００４０】
目的遺伝子を挿入するためのベクターは、プラスミド型ベクター、又は宿主生物中のゲノムに組み込み可能な染色体導入型ベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA（YAC：yeast artificial chromosome）などが挙げられる。
【００４１】
プラスミド DNAとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばpBI101等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18又はM13mp19などが挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４２】
ベクターに本発明の活性酸素ストレス応答性プロモーター及び目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００４３】
組換えベクターにおいて、活性酸素ストレス応答性プロモーターは、目的遺伝子の機能が発揮されるように、目的遺伝子が発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、目的遺伝子が導入される宿主生物において活性酸素ストレス応答性プロモーターの制御下に目的遺伝子が発現されるように、目的遺伝子と活性酸素ストレス応答性プロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。そこで、組換えベクターには、活性酸素ストレス応答性プロモーター、目的遺伝子、ターミネーターのほか、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などの除草剤耐性遺伝子などが挙げられる。
【００４４】
このように作製された組換えベクターを用いて形質転換体を作製することができる。すなわち、形質転換体は、上述した組換えベクターを、目的遺伝子が発現しうるように宿主に導入することによって作製することができる。宿主としては、特に限定されるものではない。例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはSf9等の昆虫細胞が挙げられる。
【００４５】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli) DH5α、Y1090などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)] 、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００４６】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Methods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラスト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J. Bacteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。
【００４７】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４８】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４９】
宿主が植物である場合は、形質転換植物は以下のようにして得ることができる。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子等)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等)又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、例えばナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、バラ科、キク科、ユリ科、ナデシコ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
【００５０】
組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。
【００５１】
例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、組換えベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404株に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著,植物遺伝子操作マニュアル,1990,27-31pp,講談社サイエンティフィック,東京）等に従って宿主（例えばタバコ）の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００５２】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばPDS-1000(BIO-RAD社)等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は450〜2000psi程度の圧力、3〜12cm程度の距離で行う。
【００５３】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００５４】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。PCRは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕活性酸素ストレス応答性プロモーターの単離
(1)NTPXC3遺伝子上流に存在するプロモーター領域の塩基配列決定
先ず、配列番号４に示すタバコにおけるNTPXC3遺伝子cDNA（5'末端領域）の塩基配列に基づいて、インバースPCRに用いるプライマーを設計した。配列番号４に示すNTPXC3遺伝子cDNA（5'末端領域）の塩基配列と設計したプライマーとの関係を図１に示す。設計したプライマーは、図１に示すように、Per11-2（配列番号５）、Per11-3（配列番号６）、Per11 Rev.2（配列番号７）及びPer11 Rev.3（配列番号８）と命名した。
【００５７】
また、配列番号４に示すNTPXC3遺伝子cDNAの塩基配列から、開始コドンから数えて58塩基から始まる配列にNheI認識配列（NheIサイト）を見出したためインバースPCRの際に用いる制限酵素としてNheIを選択した。
【００５８】
タバコ（Nicotiana tabacum L. cv. Samsun）のゲノムDNAは以下のように調製した。すなわち、タバコ植物体の成葉100mgを採取し、Dneasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、タバコゲノムを調製した。
【００５９】
次に、ゲノムDNA2μgを用いて、表１に示す組成となるように反応溶液を調製し、37℃で6時間反応させゲノムDNAをNheIで消化した。NheIで処理した後の反応溶液及びサイズマーカーを電気泳動した結果を図２に示す。
【００６０】
【表１】
2004180678.tif 000002
【００６１】
次に、GENECLEAN SPIN Kits(BIO 101)を用いて、反応溶液200μlから100μlの精製ゲノム断片溶液を得た。そして、得られた精製ゲノム断片溶液のうち90μlについて、表２に示す組成となるようにライゲーション反応溶液を調製し、ライゲーション反応を行った。このライゲーション反応により、精製ゲノム断片溶液に含まれるゲノム断片を環状化することができる。
【００６２】
【表２】
2004180678.tif 000003
【００６３】
次に、GENECLEAN SPIN Kits(BIO 101)を用いて、ライゲーション反応後の精製ゲノム断片溶液500μlから環化ゲノム断片を精製し、蒸留水に溶解して40μlの精製環化ゲノム溶液を得た。そして、得られた精製環化ゲノム溶液及びTakara LA PCR Kit(Takara社製)を用いて１回目のインバースPCRのための反応溶液を、表３に示す組成で調製した。なお、１回目のインバースPCRにおいては、Per11-2プライマーとPer11 Rev.2プライマーとを用い、94℃で1分間の変性工程、55℃で2分間のアニーリング工程及び72℃で3分間の伸長工程からなる1サイクルを30サイクル行った。
【００６４】
【表３】
2004180678.tif 000004
【００６５】
１回目のインバースPCRの結果、増幅産物を確認できなかったため、１回目のインバースPCRの反応後液5μlを鋳型とし、Per11-3プライマーとPer11 Rev.3プライマーとを用いて2回目のインバースPCRを同条件で行った。１回目のインバースPCR及び2回目のインバースPCRの結果並びにサイズマーカーをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図３に示す。図３から判るように、２回目のインバースPCRの結果、2.2kb及び3.2kbの増幅DNA産物を得た。
【００６６】
次に、2回目のインバースPCRで得られた増幅DNA産物を、それぞれTOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。増幅DNA産物をクローニングしたTOPO-pCR2.1ベクターを用いて、増幅DNA産物の塩基配列を決定したところ、2回目のインバースPCRで得られた3.2kbの増幅DNA断片がNTPXC1遺伝子の上流に隣接する領域を含んでいることが明らかとなった。なお、塩基配列の決定の際には、配列解析用のプライマーを設計した。配列解析用のプライマーは、Per11-4（配列番号９）、Per11-5（配列番号１０）、Per11-Rev.4（配列番号１１）及びPer11-Rev.5（配列番号１２）と命名した。
【００６７】
これらプライマーを用いて決定した塩基配列を図４に示す。2回目のインバースPCRで得られた3.2kbの増幅DNA産物から、配列番号１に示す塩基配列を同定することができた。
【００６８】
(2)NTPXC1遺伝子上流に存在するプロモーター領域の塩基配列決定
次に、NTPXC1遺伝子上流に存在するプロモーター領域を、上記(1)と同様にして同定した。具体的に本例では、NheIの代わりにXbaIを用いてゲノムDNAを制限酵素処理し（図５参照）、１回目のインバースPCRにPer11-2プライマー（配列番号５）及びPer11 Rev.2（配列番号７）を用い、2回目のインバースPCRにPer11-3プライマー（配列番号６）及びPer11 Rev.3（配列番号８）を用いた以外は、上記（1）と同様に実験を行った。１回目のインバースPCR及び2回目のインバースPCRの結果並びにサイズマーカーをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図６に示す。図６から判るように、２回目のインバースPCRの結果、1.6kb、2.7kb及び3.1kbの増幅DNA産物を得た。
【００６９】
次に、2回目のインバースPCRで得られた増幅DNA産物を、それぞれTOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。増幅DNA産物をクローニングしたTOPO-pCR2.1ベクターを用いて、増幅DNA産物の塩基配列を決定したところ、2回目のインバースPCRで得られた3.1kbの増幅DNA断片がNTPXC1遺伝子の上流に隣接する領域を含んでいることが明らかとなった。
【００７０】
上記(1)と同様に塩基配列を決定した結果を図７に示す。2回目のインバースPCRで得られた3.1kbの増幅DNA産物から、配列番号２に示す塩基配列を同定することができた。
【００７１】
(3)NTPXC2遺伝子上流に存在するプロモーター領域の塩基配列決定
次に、NTPXC2遺伝子上流に存在するプロモーター領域を、上記(1)と同様にして同定した。具体的に本例では、NheIの代わりにPvuIを用いてゲノムDNAを制限酵素処理し（図８参照）、１回目のインバースPCRにPer51-2プライマー（配列番号１３）及びPer51 Rev.1（配列番号１４）を用い、2回目のインバースPCRにPer51-3プライマー（配列番号１５）及びPer51 Rev.3（配列番号１６）を用いた以外は、上記（1）と同様に実験を行った。１回目のインバースPCR及び2回目のインバースPCRの結果並びにサイズマーカーをアガロースゲル電気泳動に供した結果を図９に示す。図９から判るように、２回目のインバースPCRの結果、1.8kbの増幅DNA産物を得た。
【００７２】
次に、2回目のインバースPCRで得られた増幅DNA産物を、TOPO-pCR2.1ベクター（Invitrogen社製）にクローニングした。増幅DNA産物をクローニングしたTOPO-pCR2.1ベクターを用いて、増幅DNA産物の塩基配列を決定したところ、2回目のインバースPCRで得られた1.8kbの増幅DNA断片がNTPXC2遺伝子の上流に隣接する領域を含んでいることが明らかとなった。
【００７３】
上記(1)と同様に塩基配列を決定した結果を図１０に示す。2回目のインバースPCRで得られた1.8kbの増幅DNA産物から、配列番号３に示す塩基配列を同定することができた。
【００７４】
〔実施例２〕NTPXC1遺伝子の発現解析
実施例１の解析の結果として得られた活性酸素ストレス応答性プロモーターの機能を検証するため、NTPXC1遺伝子の発現解析を行った。
【００７５】
NTPXC1遺伝子の発現量
後述する方法で活性酸素ストレスを負荷したタバコ成葉から、経時的にmRNAを抽出した後RT-PCRによってcDNA量の差異を検出することで、経時的にNTPXC1遺伝子の発現量を検出した。また、活性酸素ストレスを負荷しない条件下でタバコの各種組織からmRNAを抽出した後RT-PCRによってcDNA量の差異を検出することで、NTPXC1遺伝子の発現に関する組織特異性を決定した。
【００７６】
本例では、タバコに対してパラコート処理を施すことによって活性酸素ストレスを負荷した。具体的には、タバコ種子をバーミキュライト入りのトレーに播種し、コイトトロン（小糸工業社製）で生育させ（16時間日長）、播種後2ヶ月後の植物体（大きさ：15cm〜20cm）にパラコート（625μM）を噴霧した。パラコート噴霧後、植物体をコイトトロン内に戻し、500μmol m-2sec-1の光を照射した。パラコート処理後、1、3、6、9及び24時間後に、タバコ３個体の１〜３葉（上葉より大きさが1cm以上の葉）を採取し、直ちに液体窒素で凍結した（保存する場合は、-80℃で保存した）。凍結した葉は、液体窒素下、乳鉢で細かくすりつぶし、RNeasy Plant Mini Kit（キアゲン社製）を用いて全RNAを抽出した。
【００７７】
抽出した全RNAをDNaseI（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で処理し、混入したゲノムDNAを取り除き、再度RNeasy Plant Mini Kitを用いて全RNAを精製した。精製した全RNA（0.4μg）は、GeneAmp RNA PCR Kit（パーキンエルマー社製）を用いてRT-PCR反応を行った。RT-PCR反応後、反応液の一部を電気泳動した[0.8％アガロース、TAE(40mM Tris-acetate, pH7.6; 1mM EDTA)バッファー]。DNAマーカーには、Perfect DNA Markers (Novagen社製)を用いた。結果を図１１に示す。
【００７８】
なお、図１１において、左レーンから右レーンに向かって、サイズマーカー、パラコート添加前、パラコート添加1時間後、パラコート添加3時間後、パラコート添加6時間後、パラコート添加9時間後及びパラコート添加24時間後を示している。図１１から、NTPXC1遺伝子は、パラコート添加1時間後から発現量が増大していることが判る。この結果から、NTPXC1遺伝子の転写は、活性酸素ストレスに応答性を示すプロモーターによって制御されていることが明らかとなった。したがって、実施例１(1)の解析の結果として得られた活性酸素ストレス応答性プロモーターは、活性酸素ストレスの負荷によって下流の遺伝子の転写量を増大させる機能を有することが明らかとなった。
【００７９】
〔実施例３〕NTPXC1遺伝子上流に位置するプロモーターの解析
以下の説明において、NTPXC1遺伝子上流に位置し、且つ活性酸素ストレスに対する応答性を有するプロモーターを、単に「NTPXC1プロモーター」と称する。
【００８０】
１．NTPXC1プロモーター機能解析DNAカセットの作製
NTPXC1プロモーターの遺伝子発現制御機能を解析するために、図１２に示すスキームにて、３つのプロモーター機能解析DNAカセットを作製した。詳細を以下に説明する。
【００８１】
(1)プロモーターDNA断片の調製
先ず、配列番号２に示すNTPXC1遺伝子の5'上流に存在するNTPXC1プロモーターの塩基配列に基づいて、DNAカセット作製に用いるプライマーを設計した（図１３参照）。設計したプライマーは、おのおのNTPXC1-1600（配列番号17）、NTPXC1-1200（配列番号18）、NTPXC1-200（配列番号19）、NTPXC1-ATG（配列番号20）と命名した。なお、NTPXC1-1600、NTPXC1-1200、NTPXC1-200各プライマーは、5'末端にHindIII認識配列を有し、またNTPXC1-ATGプライマーは、3'末端にBamHI認識配列を有する。
【００８２】
次に、NTPXC1プロモーターの翻訳開始点から上流1600bpまでのDNA配列（以下NTPXC1（-1600）とする）、NTPXC1プロモーターの翻訳開始点から上流1200bpまでのDNA配列（以下NTPXC1（-1200）とする）、NTPXC1プロモーターの翻訳開始点から上流200bpまでのDNA配列（以下NTPXC1（-200）とする）の３つNTPXC1プロモーターDNA断片をPCRにより調製した。同PCRは、タバコのゲノムDNAをテンプレートとし、表4に示すプライマー組合せ、表5に示す組成にて実施した。
【００８３】
【表４】
2004180678.tif 000005
【００８４】
【表５】
2004180678.tif 000006
【００８５】
これら各PCRの結果、鎖長の異なる３つのNTPXC1プロモーターDNA断片であるNTPXC1(-1600)、NTPXC1(-1200)、NTPXC1(-200)を得た。これらNTPXC1プロモーターDNA断片は、GENECLEAN SPIN Kits(BIO101)を用いて反応液より精製し、以後の工程に用いた。
【００８６】
(2)NTPXC1プロモーターDNA断片の突出末端化
上記(1)で調製したNTPXC1(-1600)、NTPXC1(-1200)及びNTPXC1(-200)の各NTPXC1プロモーターDNA断片に対して制限酵素処理を実施し、その両端に存在するHindIII、BamHIサイトを突出末端化した。制限酵素処理は、表6に示す組成にて37℃、2時間で実施した。
【００８７】
【表６】
2004180678.tif 000007
【００８８】
制限酵素処理によって突出末端化された各NTPXC1プロモーターDNA断片は、同反応液よりGENECLEAN SPIN Kits(BIO101)を用いて精製し、以後の工程で用いた。
【００８９】
(3)ベクターDNA断片の調製
次に、上記(2)で調製した各NTPXC1プロモーターDNA断片を用いてベクターDNAを調製した。先ず、アグロバクテリウムのバイナリ-ベクターであるCLONTECH社製pBI121のGUS遺伝子コード領域5'上流へ各NTPXC1プロモーターDNA断片を組込むことを目的として、pBI121の制限酵素処理を実施し、GUS上流域に存在するHindIII、BamHIサイトが突出末端化されたpBI121断片を調製した。反応は、表7に示す組成で37度、6時間の制限酵素処理を実施した。
【００９０】
【表７】
2004180678.tif 000008
【００９１】
制限酵素処理の後、同反応液について0.8％アガロースによる電気泳動分離を行い、約12.2kbのDNA断片を確認した。そして、同DNA断片をGENECLEAN SPIN Kits(BIO101)を用いて抽出精製し、pBI121 HindIII-BamHIとして以後の工程で用いた。
【００９２】
(4)プロモーター・ベクターライゲーション
上記(2)で調製した３種類のNTPXC1プロモーターDNA断片と上記(3)で調製したpBI121 HindIII-BamHIとのライゲーションを実施し、３種類のNTPXC1プロモーター機能解析ベクター（pBI-NTPXC1(-1600)、pBI-NTPXC1(-1200)、pBI-NTPXC1(-200)）を作出した。反応は、表8に示す組成にて実施し、GENECLEAN SPIN Kits(BIO101)を用いて抽出精製し、以後の工程で用いた。
【００９３】
【表８】
2004180678.tif 000009
【００９４】
なお、作出した３種類の解析ベクターは、NTPXC1プロモーターDNA断片がGUS遺伝子の上流に位置し、当該NTPXC1プロモーターDNA断片の制御下においてGUS遺伝子を発現する。
【００９５】
２．NTPXC1プロモーター機能解析ベクター組換えアグロバクテリウムの作製
上記「1.」で作出した３種類の解析ベクターを、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58C1に導入し、後述の実験に使用する３種類の組換えアグロバクテリウムを作出した。まず、アグロバクテリウム・チュメファシエンスC58C1を250μg/mlのストレプトマイシンと50μg/mlのリファンピシンを含むL培地中、28℃で培養した。次に、Nagelら(1990)(Microbiol. Lett., 67:325)の方法に従って細胞懸濁液を調製し、上記「1.」で作出した３種類の解析ベクターそれぞれをエレクトロポレーションにより上記菌株に導入した。
【００９６】
３．NTPXC1プロモーター機能解析ベクター組換え植物の作出
上記「2.」で作出した３種類の組換えアグロバクテリウムを用いて、組換え植物体を作出した。
【００９７】
(1)植物材料の調製
NTPXC1プロモーターの機能解析用植物としては、双子葉植物のモデルとされる実験植物シロイヌナズナを用いることとした。シロイヌナズナの栽培法は、既成のプロトコール（モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）p33-40）に従った。
【００９８】
(2)組換え植物の作出
上記「2.」で作出した３種類の組換えアグロバクテリウムを用いて、シロイヌナズナへの遺伝子導入を実施した。組換え植物の作出までの実験法は、既成のプロトコール（モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）p109-113）に従った。
【００９９】
４．NTPXC1プロモーターの遺伝子発現制御機能解析
上記「3.」で作出した組換え植物（組換えシロイヌナズナ）におけるGUS活性を検出することによってNTPXC1プロモーターの機能を解析した。
【０１００】
すなわち、上記「3.」で作出した組換えシロイヌナズナに対して、GUS活性検出による遺伝子発現制御機能評価を実施した。実験法は既成のプロトコール（モデル植物の実験プロトコール（秀潤社）p131-134）に従った。結果を図１４に示す。なお、図１４中（ａ）はpBI-NTPXC1(-200)を導入したシロイヌナズナであり、（ｂ）はpBI-NTPXC1(-1200)を導入したシロイヌナズナであり、（ｃ）はpBI-NTPXC1(-1600)を導入したシロイヌナズナである。
【０１０１】
図１４から分かるように、NTPXC1(-1600)、NTPXC1(-1200)、NTPXC1(-200)プロモーター配列それぞれにおいて、組織特異的な遺伝子発現制御機能を確認できた。具体的には、NTPXC1(-200)は葉基部特異的な遺伝子発現制御機能を有し、NTPXC1(-1200)は葉基部、葉及び茎に特異的な遺伝子発現制御機能を有し、NTPXC1(-1600)は葉基部、葉、茎及び根に特異的な遺伝子発現制御機能を有することが分かった。
【０１０２】
この結果より、NTPXC1プロモーターにおいて、翻訳開始点より上流200bpまでの領域は葉基部に特異的な遺伝子発現制御機能を有することが明らかとなった。また、NTPXC1プロモーターにおいて、翻訳開始点より上流200bp〜1200bpまでの領域は葉及び茎において遺伝子発現を誘導する機能を有することが明らかとなった。更に、NTPXC1プロモーターにおいて、翻訳開始点より上流1200bp〜1600bpまでの領域は根において遺伝子発現を誘導する機能を有することが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】配列番号４に示すNTPXC3遺伝子cDNA（5'末端領域）の塩基配列におけるプライマーの位置を表す図である。
【図２】タバコから抽出したゲノムDNAをNheIで処理した後の反応溶液及びサイズマーカーを電気泳動した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】１回目のインバースPCR及び2回目のインバースPCRの結果並びにサイズマーカーを電気泳動に供した結果を示す電気泳動写真である。
【図４】実施例1(1)で決定した塩基配列を示す図である。
【図５】タバコから抽出したゲノムDNAをXbaIで処理した後の反応溶液及びサイズマーカーを電気泳動した結果を示す電気泳動写真である。
【図６】１回目のインバースPCR及び2回目のインバースPCRの結果並びにサイズマーカーを電気泳動に供した結果を示す電気泳動写真である。
【図７】実施例1(2)で決定した塩基配列を示す図である。
【図８】タバコから抽出したゲノムDNAをPvuIで処理した後の反応溶液及びサイズマーカーを電気泳動した結果を示す電気泳動写真である。
【図９】１回目のインバースPCR及び2回目のインバースPCRの結果並びにサイズマーカーを電気泳動に供した結果を示す電気泳動写真である。
【図１０】実施例1(3)で決定した塩基配列を示す図である。
【図１１】パラコート添加前後におけるNTPXC1遺伝子の発現解析を経時的に行った結果を示す電気泳動写真である。
【図１２】実施例３で作製した三種類のプロモーター機能解析DNAカセットの作製工程を示す模式図である。
【図１３】NTPXC1プロモーターの塩基配列において、DNAカセット作製に用いるプライマーの位置を矢印で示した図である。
【図１４】（ａ）はpBI-NTPXC1(-200)を導入したシロイヌナズナの写真であり、（ｂ）はpBI-NTPXC1(-1200)を導入したシロイヌナズナの写真であり、（ｃ）はpBI-NTPXC1(-1600)を導入したシロイヌナズナの写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号５〜２０は合成DNAである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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