(57)【要約】【課題】特定の細胞を簡単、大量に回収するための材料に使用できる脱離可能なリガンド親和性物質を固定化した基材、および該基材にリガンドを結合させた材料およびそれを用いたカラムを提供すること。【解決手段】リガンド親和性物質を固定化した基材であって、固定化したリガンド親和性物質を外部刺激によって脱離できることを特徴とするリガンド親和性物質固定化基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンド親和性物質を固定化した基材であって、固定化したリガンド親和性物質を外部刺激によって脱離できることを特徴とするリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項２】
リガンド親和性物質が抗体あるいは／またはレセプターに親和性を有する物質であることを特徴とする請求項１に記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項３】
リガンド親和性物質が、プロテインＡ、プロテインＧ、抗抗体、レクチンのうちのいずれか１種である請求項２に記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項４】
基材の形状が繊維状、中空糸状または平膜状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項５】
基材が多孔質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項６】
基材がポリスルホン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレンからなる群より１つ以上選択される高分子化合物を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項７】
基材が親水性高分子を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項８】
親水性高分子がポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項７に記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項９】
外部刺激により化学結合が切断されるものであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリガンド親和性物質を固定化基材。
【請求項１０】
外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１１】
リガンド親和性物質と基材がジスルフィド結合を介して結合されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１２】
リガンド親和性物質がアミノ基を有し、かつ基材がメルカプト基を有するものであり、前記リガンド親和性物質のアミノ基と前記基材のメルカプト基を外部刺激により切断可能な架橋剤を利用してリガンド親和性物質を基材に固定化されたものであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１３】
リガンド親和性物質がメルカプト基を有し、かつ基材がアミノ基を有するものであり、前記リガンド親和性物質の前記メルカプト基と前記基材の前記アミノ基を外部刺激により切断可能な架橋剤を利用してリガンド親和性物質を基材に固定化されたものである請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基あるいは／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基とマレイミド基を有する架橋剤を利用してリガンド親和性物質が基材に固定化されたものであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１５】
架橋剤がＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネートであることを特徴とする請求項１４記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１６】
細胞分離に用いる請求項１〜１５のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載のリガンド親和性物質固定化基材にリガンドを結合させた材料。
【請求項１８】
リガンドが抗体あるいは／またはレセプターである請求項１６あるいは１７記載のリガンドを結合させた材料。
【請求項１９】
請求項１７〜１８のいずれかの材料を用いた体外循環に使用可能な細胞分離カラム。
【請求項２０】
請求項１７〜１８のいずれかの材料を用いた体外循環に使用可能な血液浄化カラム。
【請求項２１】
請求項１７記載のリガンド親和性物質固定化基材にリガンドを結合させた材料を含む疾病治療用カラムであって、該疾病治療用カラムで得られた細胞が癌または自己免疫疾患または脳梗塞またはパーキンソン病またはアルツハイマー病または糖尿病または心筋梗塞または血管再生の治療に用いられる疾病治療用カラム。
【請求項２２】
前記細胞が造血幹細胞である請求項２１に記載の疾病治療用カラム。
【請求項２３】
前記細胞が神経幹細胞である請求項２１に記載の疾病治療用カラム。
【請求項２４】
前記細胞がＴ細胞である請求項２１に記載の疾病治療用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の病因物質や有用物質を効率よく除去回収したり、あるいは幹細胞やリンパ球系の細胞などの特定の細胞を分離回収する材料のために利用でき、さらに該材料を再利用するため、外部刺激により材料に固定化されたリガンド親和性物質が脱離できることを特徴とするリガンド親和性物質を固定化した基材に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、リガンド、特に抗体を用いて抗体と相互作用する細胞を選択的に分離する試みがなされている。特定の細胞を回収する技術としては、フローサイトメトリーによる方法や最近では磁気ビーズ法（例えば、非特許文献１参照）などがあげられるが、いずれも少量の細胞を対象としており、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、特定の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかることが問題であった。
【０００３】
また、抗体を不織布担体に化学的に固定化した材料を用い、ここに血液細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用するある特定の細胞を除去する技術が検討されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、このような技術は、ある特定の細胞が分離除去する場合には問題ないが、抗体と相互作用した特定の細胞を担体表面から回収するには、機械的な処理など様々な処理が必要であることが多く、細胞の回収率が非常に悪くなったり、また、細胞の生存率に影響を与えることもある。
【０００４】
また、化学結合により抗体を担体に固定化する場合には、抗体の方向性が制御できないため、抗体と細胞との相互作用が適切に行われない場合がある。また、化学結合で抗体を基材に固定化する場合は、抗体を１ｍｇ／ｍｌより高濃度で反応させる必要がある。このため、リガンドに方向性を持たせるために、ガラスビーズ担体上に抗抗体を固定した担体を作製し、この担体により細胞分離を試みている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、この場合も細胞を分離除去することは可能だが、抗体と相互作用した特定の細胞を担体表面から回収することは困難であった。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第９７／０２７８７８号パンフレット
【０００６】
【非特許文献１】
ポール・Ｔ・シャープ（Ｐａｕｌ  Ｔ．Ｓｈａｒｐｅ）著，「生化学実験法１３−細胞分離法−」，第１版，東京化学同人，１９９１年，ｐ．１５１−１９０
【０００７】
【非特許文献２】
Ｎｉｅｄｒｅら，「バイオコンジュゲイト・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｙｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，１９９３年，第４巻，ｐ．１６６−１７１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の問題に対し、特定の細胞を簡単、効率よく、大量に回収するため、脱離可能なリガンド親和性物質を固定化した基材、および該基材にリガンドを結合させた材料およびそれを用いたカラムを提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は主として下記の構成を有する。すなわち、
「リガンド親和性物質を固定化した基材であって、固定化したリガンド親和性物質を外部刺激によって脱離できることを特徴とするリガンド親和性物質固定化基材。」、「前記のリガンド親和性物質固定化基材にリガンドを結合させた材料。」、「前記のリガンド親和性物質固定化基材にリガンドを結合させた材料を含む疾病治療用カラムであって、該疾病治療用カラムで得られた細胞が癌または自己免疫疾患または脳梗塞またはパーキンソン病またはアルツハイマー病または糖尿病または心筋梗塞または血管再生の治療に用いられる疾病治療用カラム。」である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するリガンド親和性物質としては、抗体やレセプターなどのリガンドに親和性を持つものであれば特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、レクチン、抗抗体などがあげられる。
【００１１】
親和性をもつとは、Ａ（Ｍ：ｍｏｌ／ｌ）とＢ（Ｍ：ｍｏｌ／ｌ）が結合する際の結合定数＝［Ａ−Ｂ］／（［Ａ］×［Ｂ］）で表される数値が、１０６Ｍ−１以上であることをいう。
【００１２】
レクチンとしては、ヒイロチャワンタケレクチン、マッシュルームレクチン、抗Ｈレクチン、バンデリアマメアグルチニン、コンナカバリンＡ、ドリコスマメレクチン、ダツラレクチン、デイゴマメレクチン、フコースバインディングプロテイン、レンチルレクチン、イヌエンジレクチン、インゲンマメレクチン、ピーナッツレクチン、ヒママメレクチン、セロトニン、ニホンニワトコレクチン、小麦胚芽レクチン、ロータスレクチン、エンドウマメレクチン、アメリカヤマゴボウレクチン、ダイズレクチン、キカラスウリレクチン、カブトガニレクチン、ハリエニシダレクチンなどがあげられるが特に限定はされない。抗抗体としては抗Ｉｇ抗体、抗Ｉｇ（Ｆｃ）抗体、抗Ｉｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体、抗Ｉｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）抗体、抗Ｉｇ（Ｇ１＋Ｇ２＋Ｇ３＋Ｇ４）抗体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体、抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、抗ＩｇＧ（γ）抗体、抗ＩｇＧ１抗体、抗ＩｇＧ２抗体、抗ＩｇＧ３抗体、抗ＩｇＭ抗体などがあげられ、免疫動物、由来としてはヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ロバ、モルモット、ネコ、ニワトリなどがあげられるがこれらに限定されない。
【００１３】
本発明においてリガンド親和性物質を固定化する基材としては、血液などの細胞群を一度に大量に処理できる体外循環に使用可能な基材が好ましく、基材の形状としては平膜状、中空糸状、繊維状、粒子状、ゲル状、スポンジ状、カットファイバーなど何でもよいが、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず体外循環できる利点から平膜状、中空糸状、繊維状が望ましい。また、表面積を確保し、細胞との相互作用を大きくする点から基材は多孔質であることが望ましい。基材が多孔質材料の場合は、製造条件を制御することにより孔の数や径の制御も可能である。
【００１４】
基材に使用される素材は、医療用に用いられている素材が好ましく、医療用に用いられている高分子（ポリマー）がより好ましい。例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。この中でも特にポリスルホンは成形が容易で、成形したときの膜性能に優れているため、好適に用いられる。ポリスルホンとしては、主鎖に芳香環、スルフォニル基およびエーテル基をもつもので、例えば、次式（１）、（２）の化学式で示されるポリスルホンが好適に使用されるが、本発明ではこれらに限定されない。式中のｎは、例えば５０〜８０の如き整数である。
【００１５】
【化１】
2004180703.tif 000002
【００１６】
【化２】
2004180703.tif 000003
【００１７】
ポリスルホンの具体例としては、テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）ポリスルホンＰ−１７００、Ｐ−３５００、ＢＡＳＦ社製”ウルトラソン”（登録商標）Ｓ３０１０、Ｓ６０１０、住友化学製”ビクトレックス”（登録商標）、テイジンアモコ社製”レーデルＡ”（登録商標）、ＢＡＳＦ社製”ウルトラソンＥ”（登録商標）等のポリスルホンが挙げられる。又、本発明で用いられるポリスルホンは上記式（１）及び／又は（２）で表される繰り返し単位のみからなるポリマーが好適ではあるが、本発明の効果を妨げない範囲で他のモノマーと共重合していても良い。特に限定されるものではないが、他の共重合モノマーは１０重量％以下であることが好ましい。
【００１８】
また、ポリスルホンなど疎水性の高分子を使用する場合は、血液や細胞と接触するような用途で使用する際は、その接触面を親水化することが好ましい。親水化の方法としては、ポリビニルピロリドンやポリエチレングリコールなどのポリスルホン系高分子との相溶性に優れる親水性高分子を加工前のポリスルホン溶液に添加したり、血液や細胞との接触面を親水性の化合物でコーティングすることにより達成できる。これらのうちで血液適合性の観点からポリビニルピロリドンが好適に用いられる。使用するポリビニルピロリドンとしては、特に限定されないが、入手の容易さから、市販されている重量平均分子量１１０万、４．５万、２．９万、９０００、２９００のものが好適に用いられるが、もちろんそれ以外の分子量のものを使用してもかまわない。ポリビニルピロリドンの重量平均分子量は特に限定されるものではないが、２０００〜２００００００が好ましく、１００００〜１５０００００がより好ましい。なお、ここで記したポリビニルピロリドンの重量平均分子量は、基材に使用する原料段階での分子量である。作製された基材においては、放射線架橋などの手段によりポリビニルピロリドンの分子量は原料段階での分子量より大きなものとなっている場合もある。これらのポリビニルピロリドンは、ホモポリマーが好適であるが、他のモノマーと共重合されたものであってもかまわない。ここで、他の共重合モノマーの量は特に限定するものではないが、１０重量％以下であることが好ましい。
【００１９】
ポリスルホン系材料に多孔質性を付与するには、あらかじめポリスルホン溶液にポリビニルピロリドンをブレンドさせることにより達成できる。
【００２０】
基材としてポリスルホン系中空糸を用いる場合、ポリスルホン系中空糸は例えば以下のようにして製造できる。
【００２１】
ポリスルホンとポリビニルピロリドン（重量比率２０：１〜１：５が好ましく、５：１〜１：１がより好ましい）を良溶媒（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ジオキサンなどが好ましい）および良溶媒の混合溶液に溶解させた原液（濃度は、１０〜３０重量％が好ましく、１５〜２５重量％がより好ましい）を二重環状口金から吐出する際に内側に注入液を流し、乾式部を走行させた後凝固浴へ導く。この際、乾式部の湿度が影響を与えるために、乾式部走行中に膜外表面からの水分補給によって、外表面近傍での相分離挙動を速め、孔径拡大し、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を減らすことも可能である。ただし、相対湿度が高すぎると外表面での原液凝固が支配的になり、かえって孔径が小さくなり、結果として透析の際の透過・拡散抵抗を増大する傾向がある。そのため、相対湿度としては６０〜９０％が好適である。また、注入液組成としてはプロセス適性から原液に用いた溶媒を基本とする組成からなるものを用いることが好ましい。注入液濃度としては、例えばジメチルアセトアミドを用いたときは、４５〜８０重量％、さらには６０〜７５重量％の水溶液が好適に用いられる。
【００２２】
次にリガンド親和性物質を基材に固定化する方法について説明する。
【００２３】
基材にリガンド親和性物質を固定化するためには基材表面に官能基を含有させる必要がある。官能基としてはアミノ基、カルボキシル基、硫酸基、水酸基、リン酸基、イソシアネート基、ニトロ基、アルデヒド基、ピリジルジスルフィド基などが挙げられるが、リガンド親和性物質の固定化反応の容易さと水溶液で中での安定性からアミノ基が好適である。
【００２４】
基材にアミノ基を含有させる方法としては、ａ）あらかじめ成形のための溶液にアミノ基を有する物質をブレンドしておいてから成形する方法や、ｂ）成形した材料にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法、ｃ）基材に活性基を導入しておき、アミノ基含有物質を固定化する方法などが用いられる。活性基はクロロメチル基、クロロアセトアミドメチル基などが利用される。
【００２５】
以下、それぞれの方法について説明する。
ａ）あらかじめ成形のための溶液にアミノ基を有する物質をブレンドしておいてから成形する方法：
アミノ基を含有させる部位としては、基材全体にアミノ基を含有させてもよいし、血液や細胞の接触させる部分だけにアミノ基を含有させてもよい。中空糸の内表面を用いる場合は、アミノ基含有高分子物質の溶液を中空糸の内側からろ過し、充填することにより中空糸内表面にアミノ基を集積させることができる。
【００２６】
基材にアミノ基を含有させる際に使用するアミノ基を有する物質としては、ポリマーであっても低分子であってもよい。低分子の場合は、アンモニア、テトラエチレンペンタミン、デンドリマー、アグマチンなどが用いられる。ポリマーの場合は、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、ポリエチレンイミン誘導体、キトサン、グリシンエステル化ポリエチレングリコール、ヒドラジド化ポリエチレングリコール、ω−ヒドロキシ−α−アミンポリエチレングリコール、ω−アミノ−α−カルボキシルポリエチレングリコールおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
これらアミノ基を有するポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンが特に好適に用いられる。ポリエチレンイミンは、分子量６００以上１０００万以下の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられる。より好ましくは分子量１０００以上１０万以下のものが用いられる。また、ポリエチレンイミンの誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化、メルカプト化、ピリジルジスルフィド化など、所望の割合で誘導体化したものが挙げられる。
ｂ）成形した材料にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法：
また、上記の成形した基材にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法をとる際の放射線処理としては、湿潤状態でγ線・電子線などを照射すればよい。ここでいう湿潤状態とは、基材を乾燥させない状態のことを言う。その程度は特に限定されるものではないが、通常、基材が１重量％以上の水分を含んでいることが好ましい。例えば、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド基材を十分水洗した後、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して基材にアミノ基を含有させる方法をとる。
【００２８】
放射線の吸収線量は湿潤状態で１０〜５０ｋＧｙ程度が好ましく、２０ｋＧｙを超える線量を照射した場合は、滅菌処理を同時に行うことも可能である。この際、吸収線量は線量測定ラベルをモジュールの表面に貼り付けるなどして測定することができる。得られたアミノ基含有の基材を医療用途に用いる場合は、リガンド親和性物質の固定化操作を無菌下で行うことが望ましい。
ｃ）基材に活性基を導入しておき、アミノ基含有物質を固定化する方法：
基材に活性基を導入しておき、アミノ基含有物質を固定化する方法により基材にアミノ基を含有させるには、ポリスチレン基材をＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、ニトロベンゼン、硫酸、パラホルムアルデヒドの混合液で反応させ、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン基材を得て、さらに、ポリエチレンイミンをトリエチルアミン、ジメチルスルフォキシドの混合溶液に溶解し、この溶液にクロロアセトアミドメチル化架橋基材を加えて攪拌、洗浄して、ポリスチレン基材へアミノ基を導入することもできるが、これらの方法に限定されない。
【００２９】
以上のように、基材表面に活性基を含有させた後、この活性基を介してリガンド親和性物質を固定化するが、本発明においてはこの活性基とリガンド親和性物質の間にある種の結合を導入することにより、基材に固定化したリガンド親和性物質が外部刺激により脱離できる特徴をもつ。このことにより、基材上のリガンド親和性物質に結合したリガンドにより捕捉した物質を容易に回収することが可能となる。
【００３０】
外部刺激としては、光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあげられるが、リガンド親和性物質の安定性などから化学反応により化学結合を切断してリガンド親和性物質が脱離される結合が好ましく、化学的な結合が切断される反応として、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などがあげられる。材料がセルロースである場合には、リガンド親和性物質を固定化して、セルラーゼを用いて、材料そのものを酵素処理したり、リガンド親和性物質をＤＮＡを介して結合し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）で酵素処理したり、リガンド親和性物質そのものをパパイン等で消化することができるが、取り扱い性、コスト、水中での安定性や細胞の生存率維持の必要性から還元反応が好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、リガンド親和性物質を脱離する反応として好適であるため、基材表面の活性基にジスルフィド結合を介してリガンド親和性物質を固定化することが望ましい。ここで使用する還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００３１】
基材表面の活性基にジスルフィド結合を介してリガンド親和性物質を固定化する方法としては、リガンド親和性物質がタンパク質である場合は、タンパク質自身もジスルフィド結合を有することもあるので、リガンド親和性物質を直接基材表面の活性基に固定しても良いが、通常、メルカプト基同士の酸化反応、あるいはジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる方法をとる。ジスルフィド交換反応を利用する方法としては、ピリジルジスルフィド基とメルカプト基の交換反応を用いるのが反応性の点から好ましく、ピリジルジスルフィド基やメルカプト基を基材およびリガンド親和性物質に導入して結合させる。この際、通常架橋剤を利用する。
【００３２】
上記のようなジスルフィド結合を介した固定化に利用できるような架橋剤としては、基材表面の官能基同士あるいはリガンド親和性物質同士の結合を防ぐため二種類の違った官能基と反応する活性化基をもつ架橋剤を使用することが好ましく、活性化基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、イミドエステル基、ニトロアリールハライド基、メルカプト基と反応するマレイミド基、ピリジルジスルフィド基、チオフタルイミド基、活性化ハロゲン基、光化学反応により架橋するフェニルアジド基、ジアゾカルベン基、などを持つような架橋剤を利用することができる。なかでも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤を利用することにより、上記で作製したようなアミノの基を有する基材やプロテインＡなどのアミノ基を有するリガンド親和性物質にピリジルジスルフィド基を導入できる。また、このピリジルジスルフィド基を還元剤により還元することによりメルカプト基に変換できる。このような架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル−６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルフォスクシンイミジル−６−［３’（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどが挙げられる。また、架橋剤として２−イミノチオランを利用すれば、１段階でメルカプト基を導入することができる。
【００３３】
水に不溶性の架橋剤を用いる場合は、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、水系の反応液に添加することにより利用できるが、基材に反応させる際は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤はポリスルホン系の基材に吸着しやすいため、メタノール、エチレンオキシド、グリセリンなどの架橋剤を溶解し、基材を溶解しない有機溶媒で洗浄することが望ましい。
【００３４】
上記のような架橋剤などを利用して、基材にピリジルジスルフィド基が導入される場合には、例えば下記反応式（３）のような反応を用いてリガンド親和性物質を固定化できる。すなわち、リガンド親和性物質に上記のような架橋剤を利用してピリジルジスルフィド基を導入後、還元してメルカプト基を導入する、あるいは、リガンド親和性物質に２−イミノチオランを反応してメルカプト基を導入し、これらリガンド親和性物質のメルカプト基と、架橋剤と活性基を反応させて導入した基材表面のピリジルジスルフィド基とのジスルフィド交換反応によりジスルフィド結合を介してリガンド親和性物質を基材に固定化する。ここで、リガンド親和性物質にピリジルジスルフィド基を導入して還元する際には、リガンド親和性物質が抗体である場合、抗体自体の還元による失活を防ぐために酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。
【００３５】
【化３】
2004180703.tif 000004
【００３６】
また、上記のような架橋剤などを利用して基材にメルカプト基が導入されている場合、例えば下記反応式（４）のような反応を用いて固定化できる。すなわち、リガンド親和性物質に上記のような架橋剤ピリジルジスルフィド基を導入したもの使用し、リガンド親和性物質のピリジルジスルフィド基と基材上のメルカプト基のジスルフィド交換反応によりジスルフィド結合を介してリガンド親和性物質を基材に固定化することができる。
【００３７】
【化４】
2004180703.tif 000005
【００３８】
基材へ導入されるピリジルジスルフィド基あるいはメルカプト基の密度は高い方が望ましいが、反応に用いる架橋剤の濃度や反応時間により制御することができるので、適宜選ぶことができる。
【００３９】
リガンド親和性物質へのピリジルジスルフィド基の導入率はリガンド親和性物質１モル当たり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げるとリガンド親和性物質がタンパク質の場合は失活したり、凝集したりするおそれがある。望ましくは仕込量はリガンド親和性物質１モルあたり１０モル以下が望ましい。
【００４０】
基材にリガンド親和性物質を固定化した際のリガンド親和性物質の濃度は、固定化密度を上げるためには高い方が望ましく、１ｍｇ／ｍｌ以上が望ましい。０．５ｍｇ／ｍｌ以下の場合は固定化されるリガンド親和性物質の量が少なくなり、機能が低下する恐れがある。
【００４１】
以上に示したような反応を利用してリガンド親和性物質を基材にジスルフィド結合を介して固定化させる方法の例を具体的に以下に示すが、固定化の方法はこれらに限定されない。
【００４２】
アミノ基を含有するポリスルホン基材を架橋剤としてＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（以下ＳＰＤＰ）を溶解したジメチルスルホキシド溶液に浸漬し反応させた後、メタノールで洗浄した平膜をジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、メルカプト基を有するポリスルホン平膜を得る。さらに、ＳＰＤＰを溶解したジメチルスルホキシド溶液をプロテインＡ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させて、プロテインＡにピリジルジスルフィド基を導入した後、精製する。メルカプト基を有するポリスルホン平膜にピリジルジスルフィド基を導入したプロテインＡを反応させ、プロテインＡをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化した基材を作製する。この基材に還元剤としてジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬して、ジスルフィド結合を還元することによりプロテインＡを脱離させることができる。
【００４３】
次にリガンド親和性物質を固定化した基材にリガンドを結合させる方法を説明する。
【００４４】
本発明で結合に使用するリガンドは、細胞や病因物質などのターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品でも天然物でもよいが、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャーレセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは単独で使用しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００４５】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができ、血液中の有用物質や病因物質を特異的に除去、回収する場合は細胞、無機物、タンパク質、ＤＮＡ、脂質、糖、ウィルスなどがターゲットとして挙げられる。例えば、抗ＣＤ２抗体を用いればＴ細胞およびＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ３抗体を用いればＴ細胞をを分離でき、抗ＣＤ４抗体を用いればヘルパーＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ８抗体を用いればサイトトキシックＴ細胞を分離でき、抗ＣＤ１１ａを用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ１１ｂを用いれば単球を分離でき、抗ＣＤ１４抗体を用いれば単球やマクロファージを分離でき、抗ＣＤ１５抗体を用いれば顆粒球やミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ１６細胞を用いれば好中球あるいは休止期ＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ１９抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２２抗体を用いればＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ２７抗体を用いればナイーブＢ細胞やメモリーＢ細胞を分離でき、抗ＣＤ３０抗体を用いれば活性化Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を分離でき、抗ＣＤ３３細胞を用いれば単球、顆粒球およびミエロイド細胞を分離でき、抗ＣＤ３４抗体を用いれば造血幹細胞を分離でき、抗ＣＤ４５抗体を用いれば白血球を分離でき、抗ＣＤ５６抗体を用いればＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ６１抗体を用いれば巨核球及びその前駆細胞を分離でき、抗ＣＤ６６抗体を用いれば顆粒球を分離でき、抗ＣＤ６９抗体を用いれば活性化Ｔ細胞や活性化Ｂ細胞やＮＫ細胞を分離でき、抗ＣＤ７１抗体を用いれば赤芽球や活性化されたリンパ芽球を分離でき、抗ＣＤ１０５抗体を用いれば内皮細胞を分離できる。
【００４６】
前述の方法でリガンド親和性物質を固定化した基材にリガンドを結合させる方法としては、例えば基材にリガンドを含む溶液を接触させることにより、リガンド親和性物質にリガンドが結合する方法があげられる。
【００４７】
リガンドとして抗体を使用した場合、プロテインＡやプロテインＧは抗体のＦｃ領域を認識して結合し、レクチンは抗体の糖鎖部分を認識して結合する。このため、抗体の基材表面上での方向性を制御することができる。また、このように基材上での抗体の方向性を制御するために、リガンド親和性物質として抗抗体を利用する場合には、抗体のＦａｂ領域以外を認識する抗抗体を利用することが好ましい。
【００４８】
リガンドを結合させる方法としては、リガンドを含む溶液を入れた容器に基材をいれてエージングする、基材をカラムに詰めてリガンドを含む溶液を通過させる、等の方法をとることが出来るがこれらに限定されない。
【００４９】
また、リガンドを結合させる前に、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、ヒト血清、ウシ胎児血清、スキムミルクなどのブロッキング剤で基材をブロッキングして非特異な吸着を抑えた後、リガンドを結合させても良い。また、リガンドを含む溶液に使用する溶液としては、様々なｐＨ値のリン酸バッファー、酢酸バッファー、トリス−塩酸バッファー、炭酸バッファー、クエン酸バッファー等が使用できるが、リガンドを失活させなければいずれのバッファーを使用しても良い。また、溶液中に塩化ナトリウムや上記のブロッキング剤、カチオン性、アニオン性、親水性、疎水性などのポリマーを含有していても良い。
【００５０】
また、基材にリガンドを結合させる際のリガンド溶液のリガンド濃度を調整することにより、簡単にリガンドの固定化密度を制御できる。リガンド濃度を上げれば固定化密度は高くなり、リガンド濃度を下げれば固定化密度は低くなる。この方法による基材へのリガンドの固定化は、化学的な方法で固定化させるよりも比較的低濃度でも固定化させることが可能である。リガンドの固定化密度の濃度は固定化前後のリガンド溶液中のリガンド濃度を高速液体クロマトグラフィーなどを用いて測定することができる。
【００５１】
本発明の材料をカラムとして利用する場合、特に中空糸を用いる場合、例えば以下のようにしてカラムを製造することができるが特に限定されるものではない。まず、中空糸膜を必要な長さに切断し、必要本数を束ねた後、筒状ケースに入れる。その後、両端に仮のキャップをし、中空糸膜両端部にポッティング剤を入れる。このとき遠心機でモジュールを回転させながらポッティング剤を入れる方法は、ポッティング剤が均一に充填されるために好ましい方法である。ポッティング剤が固化した後、中空糸膜の両端が開口するように両端部を切断し、中空糸膜モジュールを得ることができる。
【００５２】
本発明のリガンド親和性物質を固定化した基材にリガンドを結合させた材料を利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる有用物質や病因物質をリガンドにより捕捉でき、さらに、外部刺激によりリガンドと結合したリガンド親和性物質を基材から離脱させることにより、捕捉した有用物質や病因物質を回収することが可能である。なお、ターゲット物質を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒としては、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液を用いることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性、親水性、疎水性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００５３】
さらに基材として多孔質材料を用いる場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化、細胞分離用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用材料としても用いることができる。
【００５４】
細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００５５】
以上のような方法で、回収した有用物質、病因物質を分析に用いることが可能である。また、回収する細胞が血液幹細胞細胞、神経幹細胞、Ｔ細胞であれば、その細胞を分析だけでなく、培養し、増殖、活性化させることにより癌や自己免疫疾患、アルツハイマー病などの治療に利用できる。例えば、リガンドとして抗ＣＤ４抗体を使用し、プロテインＡをジスルフィド結合を介して基材に固定化した基材に抗ＣＤ４抗体を結合させた本発明の材料に、末梢血から分離した単核球成分を通してＣＤ４陽性のＴ細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でプロテインＡを脱離することにより、捕捉した細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて増殖、活性化させた後、体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとして用いることができる。
【００５６】
また、例えば、リガンドとして抗ＣＤ３４抗体（マウスＩｇＧ２ａ）を使用し、抗マウスＩｇＧ２ａ抗体をジスルフィド結合を介して基材に固定化した基材に抗ＣＤ３４抗体（マウスＩｇＧ２ａ）を結合させた本発明の材料に、臍帯血を通して造血幹細胞を捕捉し、ジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、造血幹細胞を大量に回収し、回収した造血幹細胞を培養して輸血医療に用いたり、様々な組織幹細胞に分化させることにより、肝疾患や神経疾患、血管傷害などの細胞療法に用いることができる。
【００５７】
また、外部刺激によりジスルフィド結合を解離してリガンド親和性物質を脱離した後の材料は、表面にメルカプト基を有するので、再びピリジルジスルフィドを有するリガンド親和性物質を固定化し、再利用することもできる。
【００５８】
【実施例】
［作製例１．ビーズ担体へのメルカプト基の導入］
ＣＮＢｒ活性化セファロース６ＭＢ（アマシャム社製）を０．１ｍＭ  ＨＣｌａｑ．で膨潤、洗浄し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．３：カップリングバッファー）で手早く洗浄後、メルカプトエチルアミンを０．２Ｍ含有するカップリングバッファーを加え室温で２時間反応し、ｐＨ４の酢酸バッファーとカップリングバッファーで交互に３回洗浄し、セファロースビーズ表面にメルカプト基を導入した。
［作製例２．プロテインＡのＳＰＤＰ化］
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１０ｍｇ／ｍｌに溶解したプロテインＡ（シグマ社製）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をプロテインＡ１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。合成したＳＰＤＰ化プロテインＡの一部を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応を行い、反応により生成するピリジン−２−チオンの吸収（３４３ｎｍ）を測定することにより、ＳＰＤＰ基の導入量を測定したところ、プロテインＡ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は５．３モルであった。
【００５９】
＜実施例１＞
作製例１．で得られたメルカプト基導入セファロースビーズ担体１ｍＬに２．で得られたＳＰＤＰ化プロテインＡを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液を１ｍＬ混合し、室温で３時間反応させ、プロテインＡをセファロースビーズ担体にジスルフィド結合を介して固定化した。このジスルフィド基を介してプロテインＡを固定化したビーズ担体をＤＴＴ（ジチオスレイトール、ピアース社製）１ｍＭを含むリン酸緩衝液で室温で３０分処理するとプロテインＡが脱離されることが確認された。そこで、作製したプロテインＡを固定化したセファロースビーズ担体１ｍＬに１ｍｇ／ｍｌの精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製、以下ＩｇＧ）を含むリン酸緩衝液１ｍＬを加え室温で１時間結合させた。ＩｇＧの固定化は、固定化前後のＩｇＧ水溶液濃度の変化を高速液体クロマトグラフィーで測定することにより確認できた。結合後、リン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＴＴ１ｍＭを含むリン酸緩衝液で室温で３０分処理し、脱離したＩｇＧを高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、０．９ｍｇ脱離することが確認できた。
［作製例３．ビーズ担体へのプロテインＡの固定化］
ＣＮＢｒ活性化セファロース６ＭＢ（アマシャム社製）を０．１ｍＭ  ＨＣｌａｑ．で膨潤、洗浄（１５分間）し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．３：カップリングバッファー）で手早く洗浄後、プロテインＡを１ｍｇ／ｍＬ含有するカップリングバッファーを加え室温で２時間反応した。反応後、反応液を除去した後、０．２Ｍグリシンカップリングバッファーを加え室温で２時間反応し、過剰な活性基をブロッキングし、最後にｐＨ４の酢酸バッファーとカップリングバッファーで交互に３回洗浄した。
【００６０】
＜比較例１＞
作製例３．で作製したプロテインＡを固定化したセファロースビーズ担体１ｍＬに１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液１ｍＬを加え室温で１時間結合させた。結合後、リン酸乾燥液で洗浄した後、ＤＴＴ１ｍＭを含むリン酸緩衝液で室温で３０分処理して、脱離するＩｇＧを測定したところ０．０２ｍｇとほとんど脱離しなかった。
［作製例４．メルカプト基をもつ平膜の作製］
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８重量部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９重量部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２重量部、水１重量部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この溶液を０．１ｍｍスペーサー付きのガラス板に塗布し、ドクターブレードにて溶液を引き延ばしたものを水中にいれて、凝固させ、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンドからなる平膜状の材料を作製した。
【００６１】
上記、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド材料を十分水洗した後、１ｗｔ％のポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射した。放射線処理した支持体は、十分水洗した。
【００６２】
上記のアミノ基を含有するポリスルホン平膜をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を最終ＳＰＤＰ濃度が１．２ｍＭとなるように添加した溶液に２．５時間浸漬した（室温）。反応させた平膜をメタノールで洗浄した後、水洗した材料を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、表面にメルカプト基をもつポリスルホン平膜を得た。
【００６３】
＜実施例２＞
作製例４．で作製した平膜１ｃｍ２を作製例２．で得られたＳＰＤＰ化プロテインＡを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４．５時間浸漬した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、プロテインＡをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化したリガンド親和性物質固定化基材（実施例２）を作製した。
【００６４】
ここで得られたプロテインＡ固定化平膜１ｃｍ２に１ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ（シグマ社製）を含むリン酸緩衝液１ｍＬを加え室温で１時間結合、洗浄した後、外部刺激として１ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬して、ジスルフィド結合を還元することにより抗体を２０μｇ脱離させることができた。
【００６５】
また、還元後のポリスルホン平膜１ｃｍ２を再度、ＳＰＤＰ化プロテインＡを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で１２時間浸漬することにより、再度プロテインＡをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化することができた。
［作製例５．抗体へのＳＰＤＰの導入］
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に精製ヒト免疫グロブリンＧ（シグマ社製、以下ＩｇＧ）を５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、さらに、ＳＰＤＰを２０ｍＭとなるように溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画を精製した。合成したＳＰＤＰ化ＩｇＧの一部を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元反応を行い、反応により生成するピリジン−２−チオンの吸収（３４３ｎｍ）を測定することにより、ＳＰＤＰ基の導入量を測定したところ、ＩｇＧ１モルあたりのＳＰＤＰ導入量は４．２モルであった。
【００６６】
＜比較例２＞
作製例４．で作製した平膜１ｃｍ２を作製例５．で得られたＳＰＤＰ化ＩｇＧを０．５ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１ｍｌに室温で４．５時間浸漬した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、平膜を外部刺激として２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬して、ジスルフィド結合を還元したところにより抗体の脱離を確認できなかった。
［作製例６．メルカプト基をもつ中空糸の作製］
ポリスルホン（テイジンアモコ社製”ユーデル”（登録商標）Ｐ−３５００）１８部、ポリビニルピロリドン（ＢＡＳＦ社製”Ｋ３０”（登録商標））９部をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド７２部、水１部に加え、９０℃、１４時間加熱溶解した。この製膜原液を外径０．３ｍｍ、内径０．２ｍｍのオリフィス型二重円筒型口金より吐出し芯液としてジメチルアセトアミド５８部、水４２部からなる溶液を吐出させ、乾式長３５０ｍｍを通過した後、水１００％の凝固浴に導き中空糸膜を得た。
【００６７】
中空糸分離膜を１００００本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、モジュールを作製した後、ポリエチレンイミン（分子量１００万、ＢＡＳＦ社製）０．１重量％を含む水溶液を中空糸内側から外側にかけてろ過をかけることにより、ポリエチレンイミンを中空糸内表面に集積して充填した後、２５ｋＧｙでγ線照射した。中空糸を水洗した後、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＳＰＤＰを２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液を最終ＳＰＤＰ濃度が１．２ｍＭとなるように添加した溶液を中空糸内部に室温で１時間灌流し、中空糸内表面をＳＰＤＰ化した後、膜をメタノールで洗浄し、さらに水洗した膜を２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、内表面にメルカプト基をもつポリスルホン中空糸膜を得た。
【００６８】
＜実施例３＞
作製例６．で得られたモジュールを解体して中空糸を取り出し、中空糸分離膜を３６本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールの直径は約７ｍｍ、長さは約１０ｃｍである。ミニモジュール内部に２．で得られたＳＰＤＰ化プロテインＡを１ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液５ｍｌを室温で２０時間灌流し、洗浄することにより、プロテインＡをポリスルホン中空糸膜内表面にジスルフィド結合を介して固定化し、さらに、”オルソクローンＯＫＴ３”（登録商標、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体、ヤンセンファーマ社）を０．２ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液５ｍｌを室温で２０時間灌流し洗浄することにより、抗ＣＤ３抗体をポリスルホン中空糸膜内表面にジスルフィド結合を介して固定し、リガンドが固定化された材料を用いたカラムを得た。
【００６９】
得られたカラムにヒト末梢血（ヘパリン含有）をＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製”リンフォプレップ”（登録商標）で処理して単核球成分を分離し、単核球成分１．０×１０７個をリン酸緩衝液３ｍｌに懸濁し、該懸濁を実施例３のカラムに室温で１時間灌流させた。灌流前のＣＤ３陽性細胞数は６．３×１０６個であったのに対し、処理後は３．５×１０５個であった。また、処理後のモジュールをリン酸緩衝液を１時間灌流させて洗浄した後、０．２ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液を５ｍｌで１時間灌流させて得た細胞は５．６×１０６個であり、ＣＤ３陽性細胞の割合は９割以上であった。  以上のＣＤ３陽性細胞の分析はフローサイトメーターにより行った。
【００７０】
【発明の効果】
本発明のリガンド親和性物質固定化基材にリガンドを結合させれば、リガンドは方向性を持つことができ、基材からの表面効果を受けることなく、細胞の表面抗原などと適切に相互作用することが可能となる。
【００７１】
またこのような方法によるリガンドの固定化方法は、化学結合によるリガンドの固定化方法より比較的低濃度でリガンドを作用させた場合でも、リガンドを固定化することができる。このため、少量高価なリガンドを使用する場合、少量のリガンドを使用するだけでリガンドを固定した材料を提供できる。
【００７２】
さらに、リガンド親和性物質を外部刺激により基材から脱離できるようにすることにより、リガンド親和性物質と共にリガンドを材料から脱離できることから、この材料を用いたカラムを利用してリガンドとの相互作用により捕捉された細胞を、外部刺激により簡単、効率よく、大量に回収することができる。