(57)【要約】      （修正有）【課題】肺の新生物または頭部及び頚部の新生物を有するかまたは有する危険のある患者の新生物に関する突然変異ヌクレオチド配列の非侵襲的、迅速、および正確な検出方法に関する。【解決手段】唾液検体中に存在する突然変異ヌクレオチド配列を有する核酸の突然変異、制限断片長多型、ヌクレオチド欠失、置換、などの分析を利用した、癌等の細胞増殖性障害の検出方法を開示する。標的変異核酸の存在は、肺又は頭部及び頸部の新生物障害の存在を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における癌の検出方法であって、
該被験者から採取した唾液検体から核酸を単離し、そして
癌に関連する遺伝的変異について核酸をアッセイする、
ことを含み、該変異の存在によって被験者における癌の存在が示されることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
標的核酸を検出前に増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記増幅が、標的核酸の隣接（flanking）領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドによるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
標的核酸が、突然変異、制限的断片長多型、核酸欠失、または核酸置換を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記突然変異が新生物と関連するものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記新生物が肺、又は頭部及び頸部のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記新生物が悪性のものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記新生物に関連する標的核酸が、マイクロサテライト、癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記癌遺伝子がrasファミリーのメンバーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
唾液検体からの標的核酸の検出のために有用なキットであって、該標的核酸にハイブリダイズするハイブリダイゼーションプローブを含有する容器を含む、１以上の容器を収容する区画化されたキャリアー手段を含む、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は一般的には標的核酸配列の検出に関し、具体的には被験体からの唾液検体における標的突然変異核酸配列の分析による被験体の前新生物または癌の早期検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術
ヒトの癌の誘発における原因として重要な肉体的徴候は体細胞突然変異の増加である。これらの体細胞突然変異は、以前には正常であった細胞のゲノム内に蓄積し、その後、そのうちのいくらかは悪性増殖に関連した表現型を示す。そのような腫瘍形成性突然変異は、DNA構造において多くの異なる型の変化を含む。そのような変化としては、欠失、転座、および単一のヌクレオチドの変化が挙げられる。後者は、点突然変異としても知られており、しばしば発癌に関与し、種々の変異原性化学物質がそのような突然変異を誘発する。さらに、そのような突然変異は、DNA複製における誤りの結果として自然に起こることもある。
【０００３】
組換えDNA技術の進歩により、増殖、発生、分化を制御する正常細胞遺伝子(癌原遺伝子および腫瘍抑制遺伝子)が発見されてきた。特定の状況下においては、これらの遺伝子の調節が変化し、正常細胞が新生物的な増殖の特徴を呈する原因となる。現在までに、40を超える癌原遺伝子および抑制遺伝子が知られており、その機能的特徴によって様々なカテゴリーに分けられている。これらのものとしては、(1)増殖因子および増殖因子受容体、(2)細胞質と核との間などの細胞内シグナル伝達経路のメッセンジャー、(3)遺伝子発現およびDNA複製に影響する調節タンパク質、などが挙げられる。
【０００４】
点突然変異は、多くのヒト腫瘍の原因に直接的に関与してきた。いくつかの腫瘍は、ras遺伝子ファミリーの癌遺伝子を担持しており、それらは、これらの遺伝子の限られた数の部位のうちの１つにおける点突然変異の存在により、それらの正常細胞の等価物である癌原遺伝子とは異なる。同様に、p53などの腫瘍抑制遺伝子の重要な領域における点突然変異が、しばしば腫瘍細胞において検出される。これらの突然変異は、腫瘍細胞ゲノムにおいて質的な変化を示し、これらの細胞と正常細胞とを区別することができ、研究下での腫瘍の遺伝的起源の診断のための基礎となる。活性な癌遺伝子を生み出した突然変異の同定は、腫瘍の発生の重要な診断的および予後的糸口を提供することができる。例えば、いくつかの突然変異がras癌遺伝子の12番目のコドンを変化させることがわかってきており、それは正常に存在するグリシンが多くの別のアミノ酸残基のいずれかに置換される原因となる。そのようなアミノ酸置換は、強力なトランスフォーミング対立遺伝子を生み出す。従って、特定のヌクレオチド置換の存在は、腫瘍細胞の振る舞い(例えば、その増殖速度、侵入性など)の有力な決定因子であり得る。結果として、癌遺伝子突然変異のためのDNAプローブは、臨床腫瘍学における診断薬として有望である。
【０００５】
種々の新生物の型の中で、肺において見出されるものの多くは、癌遺伝子の突然変異に関連している。肺癌は西欧諸国における癌に関連する死因の筆頭である。肺癌を有する患者の予後は、臨床診断の時点での腫瘍のステージに主に依存する。現在、全ての肺腫瘍のうちの25〜40％のみが初期の評価時点で切除可能であると考えられている。ステージIの腫瘍を有すると早期に診断された患者の外科的切除後の生存率は、40〜70％である。年３回の唾液細胞診断および年１回の胸部X線診断による肺癌のスクリーニングにおける試みは肺癌の早期検出にとっては不十分であることが証明された。あるいは、腫瘍は癌遺伝子の点突然変異などの一連の明確な遺伝的変化を通して進行するという知見は、肺の新生物をより正確に検出できるさらなる非侵襲的な試験を開発する努力を奨励してきた。例えば、米国特許第5,561,041号および米国特許第5,726,223号は、喀痰サンプルの分析による肺の新生物の検出を記載している。これらの特許は、その全体が参照として本明細書に組み入れられるものとする。
【０００６】
他の深刻な癌は、頭部および頸部の癌である。頭部および頸部の癌は、依然として恐ろしく、しばしば致命的な疾患である。大きな腫瘍容積および腫瘍の拡大は、局所的な再発の前兆であり、克服し難い。手術の許容範囲の周りにある目に見えない新生物細胞の検出は、局所的な再発の有力な前兆であり、総体的な生存率を有意に減少させる。
【０００７】
DNAは、中程度および高度の繰り返しDNA配列が点在したユニークな配列を含む。ミニサテライト(または可変回数直列型繰り返し配列(variable number tandem repeat))DNA配列およびマイクロサテライト(または可変単純繰り返し配列(variable simple sequence repeat))DNA配列などの繰り返し配列エレメントにおける変異は、染色体同定、１次遺伝子マッピング、および連鎖解析に有用であった。マイクロサテライトDNA配列は、特に一般的であり、高度な多型クラスのヒトゲノムの遺伝的エレメントである。繰り返し配列の変異を使用する利点の１つは、ユニークな遺伝子配列の変異と比較して遺伝子集団に存在する対立遺伝子数がより多いことである。別の利点は、多くのDNAサンプルの迅速で安価な分析のためにポリメラーゼ連鎖反応を用いて配列の長さの変異を容易に検出できることである。
【０００８】
腫瘍は、一連の遺伝子突然変異を通して進行する。これらの遺伝子突然変異を、癌の検出のための特異的マーカーとして使用することができる。癌の存在を検出するのに使用できる１組の遺伝子突然変異は、染色体の欠損である。ヒトなどの２倍体生物は、染色体セットの各メンバーにつき１対の染色体を有する。腫瘍細胞は、その特徴として染色体を欠損しており、染色体セットの各メンバーにつき１対の染色体というよりむしろ単一の染色体になっている。染色体の欠失および付加は、新生物の進行の不可欠な部分であり、ほとんどの種の癌において説明されてきた。１つの遺伝子座につき２つの対立遺伝子を有する１対の染色体は、その座に関してヘテロ接合性であり、従って、そのヘテロ接合性は１対の染色体を有する細胞に相関する。長年、これらの染色体の欠損または増幅は、ヘテロ接合性の消失を通して検出された。
【０００９】
癌の存在を検出するために使用される遺伝子突然変異の別のものは、遺伝子の不安定性である。遺伝子組換えは、DNAが相同である(DNAが高度の配列類似性を有する)染色体領域で最も頻繁に起こる傾向がある。DNA配列が繰り返している場合、そのDNAの相同性はより大きくなる。DNAの相同は、他の染色体対上の同じ遺伝子座だけでなく、同じ染色体上の他の遺伝子座または同じ遺伝子座でも起こる。正常(非腫瘍)細胞は、この遺伝子組換えを抑制する傾向がある。しかし、腫瘍細胞が受ける遺伝子組換えは増加するという特徴がある。DNA配列が繰り返している場合、遺伝子組換えは、ある遺伝子座での繰り返しDNA配列の欠損または繰り返しDNA配列の獲得をもたらす可能性がある。
【００１０】
マイクロサテライトDNAの不安定性は、ヒトの癌において説明されてきた。マイクロサテライトDNAの不安定性は、遺伝性の非ポリープ性結腸癌の患者由来の腫瘍の重要な特徴である(Peltomakiら、Science, 260:810(1993); Aaltonenら、Science, 260:812(1993); Thibodeauら、Science, 260:816(1993))。繰り返しエレメントの伸長または欠失によるマイクロサテライトDNAの不安定性もまた、結腸、子宮内膜、乳房、胃、膵臓、および膀胱の新生物組織において報告されてきた(Risingerら、Cancer Res., 53:5100(1993); Hadら、Cancer Res., 53:5087 (1993)；Peltomakiら、Cancer Res., 53:5853(1993)；Gonzalez-Zuluetaら、Cancer Res., 53:5620(1993))。
【００１１】
前新生物または癌の早期検出は、そのような疾患を治療する確率を増大させるのに重要である。非侵襲的で単純なスクリーニング試験は、早期診断または予後スクリーニングを実施するためのツールを医療関係者に提供するであろう。
【非特許文献１】Peltomakiら、Science, 260:810(1993)
【非特許文献２】Aaltonenら、Science, 260:812(1993); Thibodeauら、Science, 260:816(1993)
【非特許文献３】Risingerら、Cancer Res., 53:5100(1993)
【非特許文献４】Hadら、Cancer Res., 53:5087 (1993)
【非特許文献５】Peltomakiら、Cancer Res., 53:5853(1993)
【非特許文献６】Gonzalez-Zuluetaら、Cancer Res., 53:5620(1993)
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、肺の新生物または頭部および頸部の癌に関連する突然変異ヌクレオチド配列を有する核酸が、肺の新生物または頭部および頸部の癌を有するかまたは有する危険のある患者由来の唾液検体において検出可能なレベルで存在するという予期せぬ知見から生まれた。
【００１３】
この発見の結果として、本発明は、肺の新生物または頭部および頸部の新生物に関連する突然変異ヌクレオチド配列の非侵襲的、迅速、および正確な検出方法を提供することにより、組織生検などの技術に著しい進歩をもたらす。本発明のDNA増幅に基づく手法により、大過剰(10,000個を超える)の正常細胞の中で突然変異遺伝子を担持する１個の細胞を同定することが可能になる。この知見に基づき、他の病態に関連する種々の他の標的核酸を検出することが今や可能になった。本発明により提供される方法を用いて、ハイリスク集団をスクリーニングして新生物または癌を検出したり、化学的予防または化学療法を受けているハイリスクの患者をモニターすることができる。
【００１４】
第１の実施形態において、本発明は、被験体における頭部および頸部または肺の新生物疾患を検出する方法を提供する。該方法は、被験体からの唾液検体由来の核酸サンプルを提供すること、および標的突然変異核酸配列の存在を検出することを含む。唾液中の標的核酸配列の存在は、頭部および頸部または肺の新生物疾患を示す。好ましくは、該被験体はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
発明の説明
本発明は、唾液中に存在する突然変異ヌクレオチド配列を有する核酸を分析することにより、被験体における前新生物もしくは新生物疾患または癌を検出する方法に関し、ここで、突然変異した、または変化した核酸配列の存在は、肺または頭部および頸部の新生物または前新生物に関連する。
【００１６】
その最も広い意味において、本発明は、診断的または治療的に妥当な任意の標的核酸配列について任意の器官の任意の新生物疾患の検出を可能にする。ここで、該標的核酸配列は唾液中に存在する。従って、該標的ヌクレオチド配列は、例えば、突然変異ヌクレオチド、制限断片長多型(RFLP)、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換、または任意の他の目的の哺乳動物の核酸配列であってよい。
【００１７】
さらに、本質的には、唾液検体において任意の型の対立遺伝子不均衡を検出することができる。用語「対立遺伝子不均衡」とは、腫瘍細胞に特徴的な染色体の欠損または獲得を指す。ヒトなどの２倍体生物は、染色体セットの各メンバーにつき１対の染色体を有する。腫瘍細胞は染色体を欠損していることを特徴とし、しばしば１つの染色体セットの各メンバーにつき１対の染色体というよりむしろ単一の染色体になる。腫瘍細胞はまた、時には染色体を獲得し、染色体セットの各メンバーにつき１対の染色体というよりむしろ２つ以上の染色体になる。
【００１８】
染色体上の遺伝子座が各染色体上に異なるDNA配列を有する場合、２倍体生物はその遺伝子座に２つの対立遺伝子を有することになる。１つの遺伝子座につき２つの対立遺伝子を有する１対の染色体はヘテロ接合性である。被験体の遺伝子座がヘテロ接合性であるか否かについては、被験体の正常(非腫瘍)細胞由来のDNAサンプルを分析することにより容易に決定することができる。マイクロサテライトDNAは多型性であるので、マイクロサテライトDNAを含有する遺伝子座は、ヘテロ接合性であることが多い。腫瘍細胞が染色体を欠損するかまたは獲得する場合、結果として該細胞は対立遺伝子の１つのさらなるコピーを欠損するかまたは獲得することになり、それにより対立遺伝子不均衡または「ヘテロ接合性の消失」(LOH)が引き起こされる。LOHの検出方法は、同時係属中の米国特許出願第08/968,733号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００１９】
本発明の方法において、標的核酸における突然変異を同定することができ、種々の癌をスクリーニングするのに用いることができる。「突然変異」とは、ある生物の遺伝物質に質的または構造的な変化が起こる過程である。突然変異は、表現型を変化させるような遺伝物質の恒久的変化である。突然変異は、単一の遺伝子のヌクレオチド配列の修飾、遺伝子または全染色体の塊を含んでいてもよい。単一の遺伝子における変化は、DNA配列内の単一のヌクレオチド塩基の欠失、付加、または置換を含む点突然変異の結果であってもよく、または多数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失を含む変化の結果であってもよい。全染色体の修飾は、染色体異常に関与する数的または構造的変化またはその双方を含む。数的な染色体突然変異は、「倍数性」と呼ばれる複数の完全な核型を含んでもよく、または「異数性」と呼ばれる正常な染色体数からの逸脱を含んでもよい。突然変異は、DNA複製の正確性における誤り、またはゲノム内の転位性遺伝因子の移動などの事象の結果として自然に起こり得る。それらは化学的または物理的変異原に曝露した後にも誘発される。そのような突然変異誘発剤としては、イオン化放射線、紫外線、およびアルキル化剤、多環芳香族炭水化物などの様々な範囲の化合物があり、その全てが核酸と直接的にも間接的にも(一般的には何らかの代謝性生体内変換の後に)相互作用することができる。そのような環境作用物質により誘発されたDNA損傷は、影響を受けたDNAが複製されるかまたは修復されるときに塩基配列の修飾を誘導し、従って、突然変異を誘発する。
【００２０】
ヒトの癌の誘発における原因として重要な肉体的徴候は体細胞突然変異の増加である。これらの体細胞突然変異は、以前には正常であった細胞のゲノム内に蓄積し、その後、そのうちのいくらかは悪性増殖に関連した表現型を示す。そのような腫瘍形成性突然変異は、DNA構造において多くの異なる型の変化を含む。そのような変化としては、欠失、転座、および単一のヌクレオチドの変化が挙げられる。後者は、点突然変異としても知られており、しばしば発癌に関与し、種々の変異原性化学物質がそのような突然変異を誘発する。さらに、そのような突然変異は、DNA複製における誤りの結果として自然に起こることもある。本明細書で用いる用語「突然変異または突然変異した」は、標的新生物のヌクレオチド配列に対して適用され、限定されるものではないが突然変異、制限断片長多型、核酸の欠失、または核酸の置換などを含むと理解されるべきである。点突然変異は、例えば、G残基がT残基に変化するといったDNA鎖の単一の塩基の変化からなる。そのような突然変異は、コドンの同一性を変化させ、それによりミスセンス変異またはナンセンス変異を生み出す。トランジション変異は、DNA中の１個のプリンの別のプリンによる置換、または１個のピリミジンの別のピリミジンによる置換、すなわちGによるAの置換およびその逆、またはCによるTの置換およびその逆を含む。トランスバージョンは、ピリミジンによるプリンの置換およびその逆を含む。ミスセンス変異は、あるコドンが特定の位置で正常に見出されるもの以外のアミノ酸をコードするコドンに変化するような点突然変異である。ナンセンス変異は、アミノ酸を特定するコドンを、翻訳終止コドンに変換する任意の突然変異である。スプライシング変異は、正しいRNAスプライシングに変化をもたらすことにより遺伝子発現に変化をもたらす任意の突然変異である。スプライシング変異は、スプライス部位を変化させるイントロン−エキソンの境界での突然変異によることもある。
【００２１】
ポリアデニル化部位突然変異体は、未成熟mRNAの破壊を引き起こす、成熟mRNAの3’末端へのポリAの付加に必須のコンセンサス配列の突然変異である。挿入とは、遺伝子へのヌクレオチドまたはヌクレオチド伸長鎖の挿入により生じる任意の突然変異である。例えば、自然に起こる挿入突然変異は、転位性遺伝因子の転位の結果でありうる。
【００２２】
体細胞で起こる突然変異は、有性生殖によって生まれた子孫に伝承されない。しかし、このような体細胞突然変異は子孫の娘細胞に伝達し、ある特定の遺伝子の突然変異は癌に関与している。癌原遺伝子と呼ばれる、一連の正常遺伝子の1つ以上に突然変異が起きた場合、突然変異により癌が誘導されるということは現在明らかである。癌原遺伝子は、種々の突然変異の変化により改変され、癌を引き起こす癌遺伝子（40種以上が同定されている）を生じうる。癌原遺伝子は、細胞増殖および分化の制御に重要な役割を果たしており、突然変異が起きて該遺伝子の正常活性が中断されることによって、癌細胞で観察される異常増殖特性が導かれる。
【００２３】
突然変異が起きて癌遺伝子に変換しうる、または癌遺伝子を活性化しうる癌原遺伝子の存在は、癌誘発の環境作用因子（放射線および化学物質）に晒す役割を示唆している。他の遺伝子型（腫瘍抑制遺伝子すなわちアンチオンコジーン）もあるが、それらは不活性化または欠失した場合のみ癌発症に寄与する。このような遺伝子の正常形態は、腫瘍の発生を抑制するように思われるが、突然変異形態のみが存在する場合には腫瘍が発生しうる。抑制遺伝子（すなわちp53またはRb）の機能的コピーを欠損する多くの腫瘍は、2つの同じ突然変異（すなわちホモ接合）対立遺伝子を提示するので、このような遺伝子が同定されたが、影響を受けない組織は1つの突然変異腫瘍抑制対立遺伝子および1つの野生型対立遺伝子を有する事が示されうる。従って、腫瘍細胞の特定の染色体領域におけるヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity：LOH）は、（同じ個体からの体細胞と比較して）一般的に、これらの領域に位置する腫瘍抑制遺伝子における突然変異の存在を明らかとする証拠とみなされる。
【００２４】
更に、「サイレント突然変異」と呼ばれる、検出可能な表現型の変化には至らないDNA配列の変化もまた構造遺伝子で起こる。構造遺伝子における突然変異は、挿入されたアミノ酸に変化がない場合、またはタンパク質機能に影響を及ぼさない残基の置換が生じる場合に、サイレントである。サイレント突然変異はまた、タンパク質コード領域の外にも位置しうる。中立突然変異は、生物の適応度に全く影響しない表現型を生じる遺伝子的変化からなる。従って、置換によってポリペプチドに異なるアミノ酸の挿入が起こる場合（ミスセンス突然変異）でも、そのアミノ酸は許容可能な置換体であり、ポリペプチドの活性におけるどんな有意な変化にも至らない可能性がある。しかし、いくつかのミスセンスアミノ酸変化は、ポリペプチド鎖の折りたたみに、または酵素の活性部位の立体構造に強力な影響を及ぼしうる。他の塩基置換は、アミノ酸のトリプレットコードを3種の終止シグナルの1つに変換しポリペプチド合成が早く終止するので、強力な影響を及ぼしうる。通常このようなナンセンス変化は、遺伝子産物の機能の欠損により起こる。
【００２５】
自然または誘発突然変異が、有性生殖を行う生物の生殖細胞に存在する場合、それらは子孫に伝承されうる。このような遺伝性の突然変異は、バックグラウンドに突然変異荷重を与え、それらは疾病および障害の一因となる。遺伝病は、染色体異常および単一遺伝子の突然変異の両方により生じうるが、この2つのカテゴリーの観察される突然変異率への影響は一様ではない。
【００２６】
突然変異によるヌクレオチド配列の変更に加えて、DNA多型の他の主要なタイプは、ゲノム中の特定の位置における縦列反復配列数の変更である。該反復配列は、10〜60のヌクレオチド長であることができ、この場合、縦列配列は「ミニサテライト」と呼ばれる。より短い反復配列（一つあたり2〜5ヌクレオチド）の群は「マイクロサテライト」と呼ばれる。単純配列リピート（SSR）としても知られるマイクロサテライトは、多様な数の、縦列に配列した単純な、ジ−、トリ−またはテトラ−ヌクレオチドリピートからなる、非常に多様な多型DNA配列である。一般にマイクロサテライトは、特定の染色体領域のどこにも局所化しないが、他のゲノムDNAにランダムに散在する。癌におけるマイクロサテライトマーカーの検出法は、米国特許出願第08/854,727号に記載されており、その全文を参照として本明細書に組み入れる。
【００２７】
一つの実施形態において、本発明の方法を、良性新生物および悪性新生物（癌）に関連する変異ヌクレオチド配列の検出に適用できる。好ましい実施形態では、肺または頭部および頸部の新生物を検出するが、該方法を使用して、任意の新生物の変異ヌクレオチド配列を、起源に拘わらず、該配列が唾液中に検出可能に存在している限り検出することができる。例えば、頭部および頸部癌は唾液中に癌細胞を放出し、それを検出することができる。本明細書で使用する「頭部および頸部癌」という用語は、被験体の頭部および頸部領域の組織における任意の癌腫を包含する。このような頭部および頸部癌腫には、例えば、口、食道、咽喉、喉頭、甲状腺、舌、唇、唾液腺、鼻、副鼻腔、鼻咽頭、上鼻咽頭円蓋および上鼻腔（superior nasal vault and sinus）の腫瘍、感覚神経芽腫、扁平上皮癌、悪性黒色腫、副鼻腔(sinonasal)未分化癌腫SNUC）または血液新生物の癌腫が含まれる。また、頸リンパ節、喉頭前リンパ節、肺食道傍リンパ節および顎下リンパ節などの局部リンパ節の癌腫も含まれる（「ハリソンの内科学原理（Harrison’s Principles of Internal Medicine）」Isselbacherら編、McGraw-Hill, Inc.、第13版、p.1850-1853、1994）。
【００２８】
異常遺伝子産物を産生する変異ヌクレオチド配列を有する多数の核酸が種々の新生物に関与していると知られている。最も一般的な変異ヌクレオチド配列の中には、結腸癌（DCC）、腺腫様結腸ポリポーシス（APC）、家族性腺腫様結腸ポリポーシス（FAP）において欠失するK-ras突然変異癌遺伝子p16、およびp53などの、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子がある。本発明では、K-ras突然変異癌遺伝子p16、p53腫瘍抑制遺伝子（Vogelstein、Nature、348:681、1990）、マイクロサテライト遺伝子座およびLOH遺伝子座の検出が特に重要である。
【００２９】
本発明の方法に従って唾液検体を分析するために、該検体中に存在する上皮細胞を豊富にすることが望ましい。これは、該サンプルを、Dakopatts（Gestrop Denmark）より入手可能なEBA−1またはBer−Ep4（Can. Res. 53:3455、1993）などの上皮細胞に特異的なモノクローナル抗体と混合することにより行うことができる。他の上皮細胞に特異的な抗体は当業者に公知であろう。
【００３０】
検出前に変異ヌクレオチド配列を増幅することが望ましい場合、これは、増幅用のプライマーであるオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。この独特なオリゴヌクレオチドプライマーは、変異ヌクレオチド配列に隣接するフランキング領域の同定に基づいていて、フランキング領域と実質的にハイブリダイズして増幅を進めさせる能力がある。例えばK−rasの場合、そのオリゴヌクレオチドプライマーには以下のようなヌクレオチド配列：
5’−AGGAATTCATGACTGAATATAAACTTGT−3’（配列番号１６７）および／または
5’−ATCGAATTCTATGCATATTAAAACAAGATT−3’（配列番号１６８）、並びにこれらの配列に相補的な配列が含まれる。p53の場合、該オリゴヌクレオチドプライマーには、フランキングヌクレオチド配列とハイブリダイズする能力のある配列が含まれ、そのようなプライマーは：
5’−GTAGGAATTCACTTGTGCCCTGACTT−3’（配列番号１６９）および
5’−CATCGAATTCCACTGACAACCACCCTT−3’（配列番号１７０）（エキソン5〜6）および
5’−GTAGGAATTCCAAGGCGCACTGGCCTC−3’（配列番号１７１）および
5’−ACTGAATTCTTCGTCTCCTCCACCGC−3’（配列番号１７２）（エキソン7〜8）、並びにこれらの配列に相補的な配列である。
【００３１】
本発明の方法に従って用いることのできるプライマーは、標的核酸を含む有意な数の核酸分子の重合を特異的に開始させるよう、十分に長く、適切な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。この方法において、目的の核酸を含む特定の標的核酸配列を選択的に増幅することが可能である。特に、本明細書で用いられる「プライマー」という用語は、2つ以上、好ましくは少なくとも8つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む配列であり、プライマー伸長産物の合成を開始する能力があって、標的核酸鎖と実質的に相補的な配列を意味する。典型的に、オリゴヌクレオチドプライマーには15〜22またはそれ以上のヌクレオチドが含まれるが、それより少ないヌクレオチドが含まれるのでもよい。
【００３２】
合成を促す実験的条件には、ヌクレオシド三リン酸、およびDNAポリメラーゼなどの重合用試薬の存在、並びに適切な温度およびpHが含まれる。プライマーは、増幅で最も効率的である一本鎖が好ましいが、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、伸長産物の調製に用いる前に、最初にプライマーを処理して鎖を分離させる。好ましくは、該プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。該プライマーは、重合を誘導する試薬の存在下で、伸長産物の合成を開始させるよう十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、バッファーおよびヌクレオチド組成を含む多くの因子に依存しうる。
【００３３】
本発明の方法に従って用いるプライマーは、増幅すべき標的ヌクレオチド配列のそれぞれの鎖と「実質的に」相補的に設計される。実質的に相補的とは、該プライマーが、重合用試薬を機能させる条件下で、各々の鎖とハイブリダイズするように実質的に相補的でなければならないことを意味する。言い換えれば、該プライマーがフランキング配列とハイブリダイズし、ヌクレオチド配列の増幅が可能となるように、該フランキング配列と十分に相補性を有するべきである。好ましくは、伸長する該プライマーの3’末端が、相補的なフランキング鎖と完全に塩基対合した相補性を有する。
【００３４】
本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを任意の増幅法で用いて、標的核酸を増加量で産生させる。典型的には、一方のプライマーは変異ヌクレオチド配列の陰性(−)鎖に相補的であり、他方のプライマーは陽性(＋)鎖に相補的である。該プライマーを変性させた核酸にアニーリングした後、大きな断片のDNAポリメラーゼI（Klenow）またはTaq DNAポリメラーゼなどの酵素およびヌクレオチドを用いて伸長させ、それにより標的核酸を含む＋および−鎖が新しく合成される。この新しく合成された核酸もまた鋳型となるので、変性、プライマーのアニーリングおよび伸長、のサイクルを繰り返すことにより、該プライマーによって特定される領域（すなわち標的の変異ヌクレオチド配列）が指数関数的に産生される。該増幅反応産物は、使用する特異的プライマーの末端に対応する末端を有する別個の核酸の二重鎖である。他の増幅法を知った当業者であれば、その増幅法を使用して標的核酸のコピー数を増加させうるであろう。
【００３５】
核酸ハイブリダイゼーション反応において、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の特性に応じて変化しうる。例えば、核酸の、長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列組成（例えば、GC含量対AT含量）、およびハイブリダイズする領域の核酸型（例えば、RNA対DNA）を、ハイブリダイゼーション条件を選択する上で考慮することができる。更に考慮すべき問題として、核酸の1つが、例えばフィルター上に固定されるか否かがある。
【００３６】
段階的に高いストリンジェンシー条件の一例は、以下の通りである：ほぼ室温で2×SSC／0.1% SDS（ハイブリダイゼーション条件）、ほぼ室温で0.2×SSC／0.1% SDS（低ストリンジェンシー条件）、約42℃で0.2×SSC／0.1% SDS（中程度ストリンジェンシー条件）、および約68℃で0.1×SSC（高ストリンジェンシー条件）。これらの条件のうちの一つのみ（例えば、高ストリンジェンシー条件）を用いて洗浄を行うことができる。または各条件を用いて、例えば各10〜15分間で、上に挙げた順に、上に挙げた任意のまたは全てのステップを繰り返して、洗浄を行うことができる。しかし上述のように、最適条件は行われる特定のハイブリダイゼーション反応によって変化し、経験に基づいて決定しうる。
【００３７】
本発明で使用するオリゴヌクレオチドプライマーを、従来のリン酸トリエステルおよびリン酸ジエステル法またはそれらの自動化法などの、任意の適当な方法を用いて調製することができる。このような自動化法の一つでは、ジエチルホスホロアミダイトを出発物質として用いて、Beaucageら（Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, 1981）が記載のように合成することができる。改良された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する方法の一つに、米国特許第4,458,066号に記載のものがある。本発明で用いることのできる増幅法の一つに、米国特許第4,683,202号および第4,683,195号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）がある。
【００３８】
任意の唾液検体の核酸を、精製されたまたは未精製の形態で1種以上の出発核酸として使用して、該核酸が標的核酸を含有する特異的核酸配列を含む、または含むと推測されることを示しうる。従って、該方法は、例えばDNAまたはRNA（メッセンジャーRNAなど）で実施され、また該DNAまたはRNAは一本鎖または二本鎖でありうる。RNAを鋳型として用いるべき場合、該鋳型をDNAに逆転写するために最適な酵素および／または条件を使用しうる。更に、それぞれの一つの鎖を含むDNA−RNAハイブリッドを用いてもよい。核酸の混合物もまた使用することができ、または本明細書で上述した増幅反応で、同じまたは異なるプライマーを用いて産生された核酸を使用してもよい。増幅すべき変異ヌクレオチド配列は、より大きな分子の一部分でもよく、または最初は分離した分子として存在することができ、それにより特異的な配列が核酸全体を構成する。増幅すべき配列が最初に純粋な形態で存在する必要はなく、それはヒトDNA全体に含まれるような、小さい部分の複合体混合物であってもよい。
【００３９】
前記サンプルの標的の変異ヌクレオチド配列が2本の鎖を含む場合、該核酸鎖を鋳型として使用しうる前に分離する必要がある。鎖の分離を、分離ステップで、またはプライマー伸長産物の合成と同時に、実施することができる。この鎖の分離を、物理的、化学的または酵素的手段などの、種々の適切な変性条件を用いて行いうる。「変性」という用語にはそのような手段がすべて含まれる。核酸鎖を分離するための物理的方法の一つには、変性するまで核酸を加熱することが含まれる。典型的な熱変性には、約1〜10分間、約80℃〜105℃の温度が含まれうる。また鎖の分離を、DNAを変性すると知られているリボATPの存在下で、ヘリカーゼとして知られる酵素クラスからの酵素で、またはヘリカーゼ活性を有する酵素RecAで誘導しうる。ヘリカーゼを用いる核酸鎖の分離に適切な反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berling（CSH−Quantitative Biology, 43:63, 1978）により記載され、またRecAを用いる方法はC. Radding（Ann. Rev. Genetics, 16:405-437, 1982）により総説として記載されている。
【００４０】
増幅すべき標的核酸を含む核酸が一本鎖である場合、その相補体を1または2種のオリゴヌクレオチドプライマーを添加して合成する。単一プライマーを使用する場合、プライマー、重合用試薬および以下に記載する4種のヌクレオシド三リン酸の存在下で、プライマー伸長産物を合成する。該産物は一本鎖核酸に相補的であり、一本鎖核酸とハイブリダイズして二重鎖の不均等な長さの鎖を形成し、続いてそれは一本鎖に分離して2本の相補的な分離した一本鎖となりうる。あるいは、2種のプライマーを一本鎖核酸に添加し、反応を記載のように実施しうる。
【００４１】
核酸または核酸群の相補鎖が分離すると、該核酸が本来二本鎖または一本鎖であったかにかかわらず、分離した鎖を更なる核酸鎖合成のための鋳型としてすぐに使用できる。この合成はプライマーの鋳型へのハイブリダイゼーションが生じ得るような条件下で実施する。一般に合成は、緩衝水溶液内、好ましくはpH 7〜pH 9、最も好ましくは約pH 8で起こる。好ましくは、モル過剰(ゲノム核酸については、通常プライマー：鋳型が約108:1）の2種のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離した鋳型鎖を含有する緩衝液に添加する。しかし、本発明の方法を診断に応用するために使用する場合は、相補鎖の量が分からない場合があるので、相補鎖の量に対するプライマーの量を確実に決定することができないことは理解されよう。しかし実際のところは、添加するプライマーの量は一般的に、増幅しようとする配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物中に含まれるときは、相補鎖（鋳型）の量に対してモル過剰である。大幅なモル過剰は該方法の効率を改善するのに好ましい。
【００４２】
いくつかの増幅の実施形態においては、基質、例えばデオキシリボヌクレオチド三リン酸dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを、合成のための混合物にプライマーと別々にまたは一緒に適量添加し、得られた溶液を約90℃〜100℃で約１〜10分間、好ましくは1〜４分間加熱する。この加熱期間の後、この溶液を室温まで冷却させる。これはプライマーのハイブリダイゼーションのために好ましい。冷却した混合物にプライマー伸長反応を生じさせるための適切な試薬を加え（本明細書中では、「重合剤」と称する）、当技術分野で公知の条件で反応を生じさせる。耐熱性であれば重合剤もその他の試薬と一緒に添加してもよい。この合成（または増幅）反応は、室温から、その温度を超えると重合剤がもはや機能しなくなる温度まで起こり得る。従って、例えば試薬としてDNAポリメラーゼを使用した場合は、該温度は一般的に約40℃以下である。反応が室温で起こるのが最も都合がよい。
【００４３】
重合剤は、機能してプライマー伸長産物の合成を達成するどんな化合物または系でもよく、酵素も含まれる。この目的に適する酵素としては、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、Taq ポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノー断片、T４DNAポリメラーゼ、その他利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、逆転写酵素、リガーゼ、および耐熱酵素（すなわち、変性を生ずるのに十分な温度上昇下においた後に、プライマーの伸長を行う酵素）を含むその他の酵素が挙げられる。適切な酵素は、各変異ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに適当な方法で、ヌクレオチドの組合わせを促進するであろう。一般的に、合成は各プライマーの３’末端から開始して、合成が終了するまで鋳型鎖にそって5'の方向に進行し、異なる長さの分子を産生する。しかし、上記と同様の方法を使用し、5'末端から合成を開始して反対方向に進行させる重合剤も存在し得る。いずれにしても、本発明の方法は、本明細書に記載した増幅の実施形態に限定されない。
【００４４】
新たに合成した変異ヌクレオチド鎖およびこれに相補的な核酸鎖は、上記のハイブリダイゼーション条件下で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドをこの方法における後の段階で使用する。次の段階では、新たに合成した二本鎖分子を上記のいずれかの方法を用いて変性条件下に置き、一本鎖分子を準備する。
【００４５】
上記の処理を一本鎖分子において繰り返す。必要であれば、追加の重合剤、ヌクレオシドおよびプライマーを上記で定めた条件下で反応を進行させるために加える。再び、合成が各オリゴヌクレオチドプライマーの一方の末端から開始し、鋳型の一本鎖に沿って進行し、更なる核酸を産生する。この段階の後において、伸長産物の半分は2種のプライマーが結合した特定の核酸配列からなるであろう。
【００４６】
変性および伸長産物合成の段階を必要な回数繰り返して、検出のために必要な程度まで標的の変異ヌクレオチド配列を増幅することができる。産生される変異ヌクレオチド配列の量は、指数関数的に増大する。
【００４７】
増幅された産物は、放射性プローブを使用しないサザンブロットによって解析することによって検出し得る。このような方法においては、例えば非常に低レベルの変異ヌクレオチド配列を含むDNAの少量のサンプルを増幅し、サザンブロット技術により解析する。高レベルの増幅されたシグナルによって、非放射性プローブまたは非放射性標識の使用は容易になる。
【００４８】
本発明の方法で検出された変異を有する核酸を、溶液中または固体支持体に結合させたあとで、特定のDNA配列を検出するために通常利用されるいずれかの方法、例えばPCR、オリゴマー制限(Saikiら、Bio/Technology, 3:1008-1012, 1985)、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO）プローブ解析（Connerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278（1983))、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLAs)（Landegrenら、Science, 241：1077, 1988)などによって、さらに評価、検出、クローン化、配列決定などを実施することができる。DNA解析のための分子的技術が概説されている（Landegrenら、Science, 242：229-237, 1988)。従って、検出しようとする変異ヌクレオチド配列がK-rasである場合の好ましい実施形態においては、以下の配列：5'-TTGCCTACGCCAACAGCTCC-3'(Val12)（配列番号 173)、5'-TTGCCTACGCCATCAGCTCC-3'(Asp12)(配列番号174)、5'-TTGCCTACGCCACTAGCTCC-3'(Ser12)(配列番号175)、または5'-TTGCCTACGCCACAAGCTCC -3'(Cys12)(配列番号176)およびこれらに相補的な配列を含む、変異ヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るハイブリダイゼーションプローブを使用する。検出しようとする変異ヌクレオチド配列がp53である場合、次の配列：5'-CACAAACATGCACCTCAA-3'(His273)(配列番号177)または5'-TGCGCCGGCCTCTCCCA-3'(Gly281)(配列番号178)およびこれらに相補的な配列を含む、変異ヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るハイブリダイゼーションプローブを使用する。野生型K-rasおよび野生型p53はそれぞれ、次の配列：5'-TTGCCTACGCCACCAGCTCC-3'（配列番号179)および5'-CCGGTTCATGGCGCCCAT-3'(配列番号180）を含むヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせることによって検出する。
【００４９】
本発明の方法に従って使用できるin vitro増幅方法の１つに、米国特許第4,683,202号および第4,683,195号に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（PCR)がある。用語「ポリメラーゼ連鎖反応」は、DNAの塩基配列を、耐熱性DNAポリメラーゼおよび2種のオリゴヌクレオチドプライマー（一方が増幅しようとする配列の片方の末端において(+)鎖と相補的であり、他方がもう片方の末端において(-)鎖と相補的である）を用いて増幅する方法をいう。新たに合成したDNA鎖は実質的に同じプライマー配列に対する追加の鋳型として機能するので、プライマーアニーリング、鎖の伸長および解離の連続した繰り返しにより、所望の配列が急速にかつ非常に特異的に増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応を用いてマイクロサテライトDNAサンプル内の一定の配列の存在を検出する。多くのポリメラーゼ連鎖反応が当業者に知られており、本発明の方法において使用し得る。例えば、DNAを次のようにサーモサイクラーにおいて、増幅サイクルに30〜35回かけることができる。該サイクルは、95℃で30秒、52℃〜60℃で1分、そして72℃で1分であり、72℃で5分の最後の伸長段階をともなう。別の例として、サーモサイクラーにおいて変性温度95℃で30秒、続いて54℃〜58℃の範囲にわたる異なるアニーリング温度で1分、伸長段階は70℃で1分および70℃の最後の伸長段階からなる35回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにDNAをかけることができる。
【００５０】
相補的なオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする、本発明の典型的は標的ヌクレオチド配列として、以下の配列が挙げられる。
【００５１】
2004159661.tif 000002
その他のプライマーを以下に一覧する。これらがハイブリダイズする標的の配列は当業者であれば容易に決定できる。
【００５２】
本発明の典型的なオリゴヌクレオチドプライマーとして以下のものが挙げられるが、いずれの意味においても限定することを意図しない。当業者であれば、増幅すべきその他の遺伝子座を同定し、唾液から核酸を増幅するための適切なプライマーを同様に設計することができる。
【００５３】
2004159661.tif 000003
2004159661.tif 000004
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当業者であれば、標的核酸のコピー数を増やすためにも使用できる様々な増幅方法論を知っているであろう。本発明の方法で検出されたマイクロサテライトDNA配列を、溶液中または固体支持体に結合させたあとで、特定のDNA配列を検出するために通常利用されるいずれかの方法、例えば別のポリメラーゼ連鎖反応、オリゴマー制限(Saikiら、Bio/Technology,3:1008-1012 (1985))、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO）プローブ解析（Connerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:278（1983))、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLAs)（Landegrenら、Science,241：1077, 1988)などによって、さらに評価、検出、クローン化、配列決定などを実施することができる。DNA解析のための分子的技術が概説されている（Landegrenら、Science, 242：229-237, 1988)。DNA増幅に続いて、反応産物を放射性プローブを使用しないサザンブロット分析によって検出し得る。このような方法においては、例えば非常に低レベルのマイクロサテライトDNAヌクレオチド配列を含むDNAの少量のサンプルを増幅し、サザンブロット技術によって解析する。高レベルの増幅されたシグナルによって、非放射性プローブまたは非放射性標識の使用が容易になる。本発明の好ましい実施形態においては、1種のヌクレオシド三リン酸を放射能標識し、それによってオートラジオグラフィーによる増幅産物の直接的な可視化が可能になる。別の実施形態においては、増幅プライマーを蛍光標識し、電気泳動システムに流す。増幅産物をレーザー検出の後、コンピューターを使ってグラフィック表示することによって可視化する。
【００５４】
本発明の一実施形態においては、10〜50塩基対の介在配列またはオリゴヌクレオチド配列を含む精製した核酸断片を放射能標識する。標識した調製物を用いてサザンハイブリダイゼーション技術によって唾液から核酸を探しだす。増幅後または増幅前における唾液由来のヌクレオチド断片を、ゲル電気泳動によって異なる分子量を有する断片に分離し、核酸を結合するフィルターにトランスファーする。標的の核酸配列を含むヌクレオチド断片にハイブリダイズする標識プローブに暴露したあと、放射性プローブの標的核酸断片への結合をオートラジオグラフィーによって同定する（Genetic Engineering, 1,ed. Robert Williamson, Academic Press,(1981), 72-81参照)。あるいは、唾液由来の核酸を、放射性プローブによって、目的とする特定の配列を有する核酸を選択的に結合するようなフィルターに直接結合させることができ、結合の程度を放射性発光を直接計数することによって定量する。
【００５５】
標的核酸を増幅しないときは、適切なハイブリダイゼーションプローブを用いる検出を、分離した哺乳動物核酸に対して直接実施してもよい。標的核酸を増幅する場合は、適切なハイブリダイゼーションプローブを用いる検出は、増幅後に実施する。
【００５６】
本発明のプローブは、検出された特定の断片の分布、ならびに特定の強く結合する（ハイブリダイズする）配列が生じたかどうかを調べるためのプローブ結合の定量的（相対的）な程度を調査するために使用することもでき、これは個体の肺癌などの腫瘍性疾患に対する危険性が高いか低いかの可能性を示す。さらにクローニングは、突然変異ヌクレオチド（すなわち突然変異細胞）数の明確な評価を可能にし、腫瘍性疾患が発病する危険性を正確に判定することができる。
【００５７】
大部分は、該プローブを原子または無機ラジカルで、もっとも一般的には放射性核種、しかしまたおそらくは重金属を使用して標識する。放射性標識を使用するのが都合がよい。放射性標識には32Ｐ、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃなどがある。十分なシグナルを提供し、十分な半減期を有するのであれば、どんな放射性標識を使用してもよい。その他の標識としては、標識したリガンドに対する特定の結合ペアのメンバーとして機能できるリガンドなどが含まれる。免疫アッセイにおいては広範な標識が使用されており、本発明のアッセイにおいて容易に使用することができる。標識の選択は、その標識がハイブリダイゼーション速度およびプローブの変異ヌクレオチド配列への結合に及ぼす影響によって決定される。標識が、ハイブリダイゼーションに利用できる変異ヌクレオチド配列の量を検出するのに十分な感度を提供することが必要である。他にはプローブの合成が容易であること、既に利用できる装置の存在、自動化能、利便性などが考慮される。
【００５８】
標識のプローブへの結合様式は、標識の性質に依存して異なる。放射性標識に対しては、非常に多様な技術が使用できる。一般的に使用されるのは、32P-dNTPを用いるニックトランスレーションまたはγ32P-ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用する放射性32Ｐでの末端標識である。あるいは、存在する要素を1以上放射性同位体で、例えば水素をトリチウムで置き換えて、ヌクレオチドを合成することができる。所望であれば、相補的に標識した鎖をプローブとして使用して、ハイブリダイズした標識の濃度を増大させることができる。
【００５９】
その他の放射性核種標識が含まれる場合は、様々な結合基を使用できる。末端水酸基は無機酸（例えば32Pリン酸）、または14C有機酸でエステル化することができ、さもなければエステル化して標識に結合する基を提供することができる。あるいは、中間体塩基を活性化し得る連結基と置換して、その後標識に連結させることができる。
【００６０】
レポーター基としての目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にエステラーゼ
およびグリコシダーゼ、または酸化還元酵素、特にぺルオキシダーゼである。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光物としては、ルシフェリン、および2,3-ジヒドロフタルアジンジオン（例えばルミノール）が挙げられる。
【００６１】
該プローブは、水不溶性多孔質支持体に付着したヌクレオチド配列にハイブリダイズさせるために使用することができる。核酸の起源に依存して、核酸が支持体に付着する方法は異なり得る。当業者であれば、本発明の方法において使用できる異なる支持体を知っているかまたは容易に確認できる。
【００６２】
唾液中に存在するどんな哺乳動物細胞も、その核酸を放出させるために処理する。変異ヌクレオチドを含む標的の配列をPCRまたはその他前掲の技術によって増幅する。唾液検体由来の増幅した核酸をフィルターにスポットするかまたは播き、個々の部位を多数提供する。フィルターは、不活性な多孔質性の固体支持体（例えばニトロセルロース）である。細胞溶解および核酸変性ならびにそれに続く洗浄を適切な溶液を用いて十分な時間行って、細胞を溶解させ核酸を変性することができる。細胞溶解のために、唾液溶解緩衝液について上述したように、化学的溶解を便宜に使用する。その他の変性剤としては、温度上昇、有機試薬（例えばアルコール、アミド、アミン、尿素、フェノールおよびスルホキシド）またはある種の無機イオン（例えばチオシアン酸塩および過塩素酸塩）が含まれる。
【００６３】
好ましい実施形態においては、変異ヌクレオチドを含む増幅した核酸を、増幅プライマー内に含まれる5'制限部位を用いてベクター（例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ)中にクローン化する。各クローンは増幅した標的配列のコピーを1つ含む。該クローンを上記のようにフィルターにトランスファーし、その後変性させる。変異ヌクレオチドに特異的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、1塩基対において異なる10,000個の正常なヌクレオチドのなかから１つの変異ヌクレオチドを検出することが可能になる。
【００６４】
変性後、フィルターをTrisなどの水性緩衝溶液、一般的にpHが約6〜8、通常pH７のもので洗浄する。1種以上の洗浄を含んでいてもよく、細胞溶解および変性のために使用したのと同じ方法を使用するのが便利である。細胞溶解、変性および洗浄が終了した後、核酸をスポットしたフィルターを一般的には約50℃〜70℃に温度を上げて乾燥させる。この手順において、該核酸の位置が固定され都合の良い時にプローブでアッセイできる。
【００６５】
フィルターを完全に湿らせるために、フィルターをプローブを含まないハイブリダイゼーション溶液と共に温度を穏やかに上昇させて、十分な時間インキュベーションすることによって、プレハイブリダイゼーションを達成させることができる。容積で約20％〜60％、好ましくは30％の不活性極性有機溶媒を含む、様々なハイブリダイゼーション溶液を使用し得る。一般的なハイブリダイゼーション溶液には約50％のホルムアミド、約0.5〜１Mの塩化ナトリウム、約0.05〜0.1Mのクエン酸ナトリウム、約0.05〜0.2％のドデシル硫酸ナトリウムおよび少量のEDTA、フィコール（約300〜500ｋD)、ポリビニルピロリドン(約250〜500ｋD)および血清アルブミンを使用する。約0.5〜5mg/mlの超音波変性DNA（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子）および任意に約0.5〜２％wt/volのグリシンもまた、一般的にハイブリダイゼーション溶液に含まれる。約100〜1,000kDで、ハイブリダイゼーション溶液に対して8〜15重量％の量の硫酸デキストランなど、その他の添加物が含まれていてもよい。
【００６６】
特定のハイブリダイゼーション技術は本発明には必須ではない。その他のハイブリダイゼーション技術が、GallおよびPardue, Proc. Natl. Acad. Sci. 63:378, 1969; およびJohnら, Nature, 223:582, 1969に記載されている。ハイブリダイゼーション技術における改良がなされるのと平行して、それらは直ちに本発明の方法に適用され得る。
【００６７】
ハイブリダイゼーション溶液中に存在する標識プローブの量は、標識の性質、フィルターにほどよく結合し得る標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して大きく異なる。一般に、化学量論的濃度に対して実質的に過剰量のプローブは、固定化した標的核酸に対する該プローブの結合率を増大させるために用いられる。
【００６８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは様々な程度で用いられ得る。条件が厳しいほど、二重鎖形成のための該プローブと一本鎖標的核酸配列との間のハイブリダイゼーションに必要な相補性もより高い。条件の厳しさは、温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間などによって調節することができる。都合のよいことには、このハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ホルムアミドの濃度を20％〜50％の範囲で操作することによって反応溶液の極性を変化させることで変えることができる。使用する温度は通常約20℃〜80℃の範囲内であり、大抵は30℃〜75℃の範囲内である（一般的には、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel編, Wiley & Sons, 1989を参照のこと）。
【００６９】
フィルターを、ハイブリダイゼーションを引き起こすのに十分な時間にわたって中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させた後、ハイブリダイゼーション溶液に同程度の濃度の塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびドデシル硫酸ナトリウムを添加して含ませた第２の溶液中に該フィルターを入れる。該フィルターを第２の溶液中に保持する時間は、５分間〜３時間あるいはそれ以上までさまざまであり得る。第２の溶液は、交差二重鎖および短い相補配列を分解するようにストリンジェンシーを決定する。該フィルターをクエン酸ナトリウム-塩化ナトリウム希釈溶液を用いて室温で洗い流した後、今度は標識の性質に従い二重鎖の存在について該フィルターをアッセイする。標識が放射性である場合、該フィルターを乾燥し、X線フィルムに露光する。
【００７０】
また標識は蛍光部分を用いても標識することができ、その蛍光部分は後に特異的抗蛍光抗体によってプローブされ得る。この抗体に結合されるのは、例えば化学発光反応を触媒することのできる西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素である。次いで光発生をフィルムに対する急速露光において見ることができる。
【００７１】
本発明のアッセイに用いられる物質は、キットの製造に適していることが理想的である。かかるキットは、バイアル、チューブ等のような１つ以上の容器手段を密閉して収納するために区画化されている運搬手段を含み、該容器手段の各々は本方法にて用いられる個別の構成要素の内の一つを含んでいる。
【００７２】
一般に、該容器手段のうち１つは、検出可能に標識されているかまたは標識されている可能性があるハイブリダイゼーションプローブを含み得る。２つ目の容器は唾液／上皮細胞溶解バッファーを含み得る。また該キットには、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含む容器、および／またはレポーター分子（酵素、蛍光、または放射性核種の標識など）に結合したビオチン結合タンパク質（アビジンまたはストレプトアビジンなど）のようなレポーター手段を含む容器も含めることができる。
【００７３】
本発明の方法は、唾液検体中の標的突然変異核酸配列の検出に有用なキットの基礎となるものを提供する。唾液中の標的突然変異核酸配列の存在は、（例えば頭部および頚部または肺の）新生物性疾患の存在を示す。該キットは、１つ以上の容器をその中に収納するために区画されている運搬手段を含む。例えば第１の容器は、標的核酸にハイブリダイズする核酸ハイブリダイゼーションプローブを含む。例えば、該プローブがハイブリダイズする標的核酸は、以下の配列からなる群より選択される：
5'-TTGCCTACGCCAACAGCTCC-3'（配列番号173）
5'-TTGCCTACGCCATCAGCTCC-3'（配列番号174）
5'-TTGCCTACGCCACTAGCTCC-3'（配列番号175）
5'-TTGCCTACGCCACAAGCTCC-3'（配列番号176）
5'-CACAAACATGCACCTCAA-3'（配列番号177）
5'-TGCGCCGGCCTCTCCCA-3'（配列番号178）
5'-TTGCCCACGCCACCAGCTCC-3'（配列番号179）および
5'-CCGGTTCATGGCGCCCAT-3'（配列番号180）。
【００７４】
その他の標的核酸配列は当業者により決定することができ、また限定するものではないが、癌抑制遺伝子（例えばp53、p16）、癌遺伝子（例えばK-ras）、マイクロサテライトマーカーなどの配列が含まれる。さらに該キットは、標的核酸とのプローブのハイブリダイゼーションを検出するための手段を入れた第２の容器を含み得る。そういったレポーター手段としては、レポーター分子（酵素、蛍光、または放射性核種の標識など）と結合したアビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチン結合タンパク質が挙げられる。その他のレポーター手段および標識も当技術分野では周知である。該キットは増幅ポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチドも含み得る。該キットは更に核酸増幅バッファーを含み得る。好ましくは、非メチル化シトシンを修飾する試薬は重亜硫酸塩である。本発明のキットは、本明細書に記載したように核酸のハイブリダイゼーション分析を行うために必要な試薬を提供することが意図されている。
【００７５】
通常、唾液を得るための方法は、吸引、または口内のどこかに置いたかもしくは噛んだ材料への吸収による回収、あるいは口からの排出となる任意の方法に基づいている。唾液回収は、試験用に液が十分な量で得られるように被験体からサンプルを単離できる任意の手段によって、行うことができる。かかる方法には、例えば滅菌済吸収性綿棒（例えば、体液または細胞の回収に用いるためにデザインされたのこぎり状のエッジを有するもの）を使用することが含まれる。その綿棒頭部はマイクロ遠心分離用チューブ中にうまくはまるように設計することができ、または小型バイアル移送システムと組み合わせることができる。この装置はさらに、プラグ-ガスケット-フィルターからなるアッセンブリの一端に装着したプラスティック性シリンダーからなる。該フィルターは典型的には、微粒子を排除する一方清澄な試験液を容器中に通過させ得る適切な細孔サイズを有する。好ましくは、唾液サンプルは生理食塩水（例えば約0.9％のNaCl溶液）中に回収する。
【００７６】
口腔すすぎおよび唾液を得るその他の方法を、本発明の方法において利用することができる。歯科関係者および他の医療または非医療従事者を含むさまざまな関係者は、本明細書に記載の更なる分析のために唾液サンプルを集めることができる。唾液回収の例は、本明細書の実施例１に記載される。
【００７７】
Omni-SALは、サンプルの完全性を維持するために設計された、苦痛がなく非侵襲性の唾液回収システムである。血液または尿の代わりとなる唾液は、最小限の訓練でどんな場所でも回収することができる。このシステムは、特許を受けている量適切性表示器および安定化バッファーを含む輸送チューブを備えた、無菌回収装置からなる。
【００７８】
上記開示は本発明について一般的に記載した。以下の特定の実施例を参照することにより、より完全な理解が得られるが、これら実施例は例示の目的でのみ本明細書に提示されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００７９】
実施例１
唾液回収プロトコール
唾液は数多くの方法により被験者から得ることができ、口腔すすぎ、綿棒ぬぐい、吸引などを含むそれらの方法は当業者には明らかであろう。以下は被験者からの唾液採収の具体例であるが、限定的なものではないことが意図されている。
【００８０】
１．手術前口腔すすぎ- 患者または対照被験者はうがいをし、そして25ccの滅菌0.9％ NaClで15秒間すすぐ。サンプルを手術中に回収しなければならない場合は、仰向けに寝て麻酔をかけられた患者の口腔内に生理食塩水を注入し、吸引トラップを用いて回収する。
【００８１】
２．手術中の腫瘍ぬぐい- 外科医は滅菌済先端綿アプリケーターまたはパウダーフリーの手袋をはめた指で、上皮病変の表面をぬぐう。剥げ落ちた細胞を25ccの滅菌0.9％ NaCl中に回収する。患者を外科的に処置しない場合は、この検体は診療室で回収する。
【００８２】
３．手術中の非特定口腔ぬぐい- 外科医は滅菌済先端綿アプリケーターまたはパウダーフリーの手袋をはめた指で、口腔および中咽頭（ぬぐうことができるだけの下咽頭も含む）をぬぐう。剥げ落ちた細胞を25ccの滅菌0.9％ NaCl中に回収する。患者を外科的に処置しない場合は、この検体は診療室で回収する。
【００８３】
４．研究者は、該すすぎ検体を50mlのSarstedt円錐型遠心分離用チューブに入れ、2500rpmで15分間回転させる。上清を静かに捨て、沈殿をDNA抽出のために用いる。
【００８４】
実施例２
唾液サンプルから、米国特許第5,561,041号および米国特許第5,726,223号に記載されたような標準法により、DNAを抽出した。それらの方法は本明細書に参照により組み入れられる。
【００８５】
マイクロサテライト分析は当技術分野で公知の標準的PCR技術を用いて行った。例示的な実験は以下のようなものである。
【００８６】
１．プライマーの末端標識
1.5ml チューブ（小）  10μl  ddH20
５μl  プライマー（FまたはR）
２μl  バッファー（T4バッファー）
１μl  T4キナーゼ
２μl  p32γATP
-----
総量          20μl
37℃にて30分間のインキュベーション。
【００８７】
２．PCR室におけるPCR分析のためのチューブ／ウェルの準備
ゲノムDNA（分析する各サンプルに対する正常および腫瘍DNA）を使用濃度10ng/μlに希釈する。
【００８８】
各サンプルに対するNおよびT（を標識し）、2.5μlを対応するチューブ／ウェル中に入れる。
【００８９】
３．反応／ウェルの数に対応した、各PCR反応のための反応混合液を調製する。
【００９０】
使用するストック／希釈物として100ng/μlに希釈したプライマーFおよびR。
【００９１】
４．反応混合物を7.5μl取って工程２で調製した鋳型チューブに加え、反応総量を10μlにする。
【００９２】
５．ミネラルオイル一滴を各チューブの水面に加える。
【００９３】
６．PCRブロックにチューブ／ウェルを配置しPCR反応を行う。
【００９４】
95℃で１分間
最適化温度  50〜58℃で１分間
72℃で１分間        35サイクル
72℃                １サイクル
７．PCR反応を完了させ、4μlの停止バッファーで希釈する。
【００９５】
８．7Mホルムアミド変性ゲル上に反応混合液3μlをロードし、その産物のサイズに応じて2〜5時間にわたり電気泳動する。
【００９６】
９．3mmのワットマンペーパー上にゲルを移し、カセットに入れる。
【００９７】
10．ゲル上にフィルムを載せ、-80℃で8〜10時間経た後に現像する。
【００９８】
結果（N=32）
１．研究番号１：  8個のマイクロサテライトマーカーのパネルを用いて、剥げ落ちた上皮性細胞サンプルの全てに腫瘍特異的なマイクロサテライトの変化が検出されたケース：14/18（77％）。
【００９９】
a. シフトマーカーにより検出されたケース：10/18（55％）
b. LOHマーカーにより検出されたケース：7/18（38％）
c. シフトマーカーおよびLOHマーカーの両方により検出されたケース：3/14（21％）
２．研究番号２：  21個のマイクロサテライトマーカーのパネルを用いて、剥げ落ちた上皮性細胞サンプルの全てに腫瘍特異的なマイクロサテライトの変化が検出されたケース：12/14（86％）。
【０１００】
a. シフトマーカーにより検出されたケース：9/14（64％）
b. LOHマーカーにより検出されたケース：4/14（29％）
c. シフトマーカーおよびLOHマーカーの両方により検出されたケース：2/14（14％）
３．２つの試験的研究を組み合わせた検出率(n=32)：26/32（81％）
マイクロサテライト分析の概要
マイクロサテライトDNAマーカーは、原発腫瘍における遺伝的変化を精密に検出するために一般的に用いられてきた。口腔、咽頭粘膜、喉頭粘膜の公知の新生物性病変を有する22人の患者に由来する唾液を、本明細書に記載の方法を用いたマイクロサテライト分析により分子的に分析した。８個の有益な４ヌクレオチドマイクロサテライトマーカーを使用すると、22人のうち15人(68％)の患者が唾液中にマイクロサテライト変化を示し、その変化は各腫瘍でみられる変化と一致していた。唾液中に遺伝的変化のみられた15人のうち4人(27％)の患者は、唾液および腫瘍DNAにおいてヘテロ接合体消失(LOH)を示した。15人のうち他の8人の患者は唾液および腫瘍DNAにおいてマイクロサテライト不安定性を示し、3人の患者はLOHおよびマイクロサテライト不安定性の両方を示した。15人の正常対照の唾液DNAをこの分子的方法によって分析したが、マイクロサテライト不安定性を有するものは見出されなかった。このデータは、シフト変化に感受性のある選択オリゴヌクレオチドマーカーのパネルを用いたPCRに基づくマイクロサテライト分析が、頭部および頚部（例えば中咽頭）の新生物性病変の検出法および監視法として非常に感度が高いことを示している。
【０１０１】
図１〜３は、患者由来の唾液の分析、および唾液検体から得られる核酸中の突然変異の同定の結果を示している。核酸中の突然変異の同定は、患者の頭部および頚部または肺の腫瘍の同定と相関があった。
【０１０２】
以上は本発明の範囲を例示するものであって限定するものではないと意図される。実際、当業者であれば、本明細書の教示に基づいて、過度の実験を行うことなく、さらなる実施形態を容易に構想し生み出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、いくらかの患者の一連のマイクロサテライト座を示す。
【図２】図２は、シフトまたはLOHを有するマイクロサテライトマーカーのグラフである。
【図３】図３は、シフト対LOHによる唾液中の腫瘍検出のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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