(57)【要約】【課題】本発明は、ＤＮＡの増幅反応の効率を向上させる方法及びオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性を向上させる方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法であって、プライマーの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、ｇｃ含量が５０％以上のオリゴヌクレオチド等を結合したものをプライマーとして用いることを特徴とするＤＮＡ増幅反応の効率向上方法；並びにオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法であって、ＤＮＡにハイブリダイズさせるものとして、オリゴヌクレオチドの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５等を結合したものを使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法であって、プライマーの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、リン酸基、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、及びｇとｃの合計の含有量が５０％以上のオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる化合物を結合したものをプライマーとして用いることを特徴とするＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項２】
前記のオリゴヌクレオチドが、４塩基以上である請求項１に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項３】
前記のオリゴヌクレオチドが、４０塩基以下であり、かつｇとｃの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合、ａとｔの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合である請求項１に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項４】
前記のオリゴヌクレオチド中のｇとｃの合計の含有量が７５％以上である、請求項１に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項５】
前記のオリゴヌクレオチド中のｇとｃの合計の含有量が１００％である、請求項１に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項６】
前記のＤＮＡ増幅反応が、ＰＣＲである請求項１乃至５の何れか一項に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項７】
前記のＰＣＲが、非対称ＰＣＲ又はデジェネレートＰＣＲである請求項６に記載のＤＮＡ増幅反応の効率向上方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法であって、ＤＮＡにハイブリダイズさせるものとして、オリゴヌクレオチドの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、リン酸基、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０及びＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１からなる群より選ばれる化合物を結合したものを使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法及びオリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡの増幅は、遺伝子の検出の際等に極めて重要であり、このうちＰＣＲ法は、ＤＮＡの目的とする一部分の塩基配列のみを大幅に増幅させることができる方法であり、バイオテクノロジーをはじめ、多くの分野で利用されている。
【０００３】
【特許文献１】
特開平８−２５６７９８号公報
【非特許文献１】
イニスら（Ｉｎｎｉｓ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＣＲプロトコール：ア・ガイド・トゥ・メソッド・アンド・アプリケーション（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、（米国）、アカデミック・プレス、１９９０年、ｐ．３９−４５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、特異的な検出プライマーをデザインする場合、プライマーは、標的配列に特異的な塩基ポジションを含むことが必要である。
しかしながら、そのようなポジションを含む配列がプライマーとして適していないことがしばしばある。すなわち、例えばａｔ含量が極端に高かったり、フォワードとリバースの融解温度（Ｔｍ）が合わないような場合には、増幅効率が悪くなるため、プライマーとして実用的でない。特に、微量のＤＮＡを検出しようとする場合には非常に不利である。
【０００５】
また、ＰＣＲ法では、増幅効率を向上させるため、増幅の至適温度条件を見出す必要がある。しかしながら、至適温度条件を見出すには、煩雑な予備実験が必要である。
【０００６】
したがって、本発明は、至適温度条件を見出すための操作を簡略化でき、かつＤＮＡ増幅反応の効率向上方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、驚くべき事実を見出した。すなわち、デジェネレートプライマーの５’末端に、非特異的配列が結合していると、ＰＣＲの増幅効率が上昇し、当該５’末端配列を除去してＰＣＲを行うと、ＰＣＲの増幅効率はかえって低下した。
【０００８】
そこで、本発明者らはさらに研究した結果、全く意外にも、非特異的配列のみならず、ＬＣＲｅｄ７０５等の化合物を５’末端に結合させても、ＰＣＲの増幅効率を向上させることができ、結果としてＤＮＡ増幅反応の効率を向上させることができることを見出し、本発明を完成した。本発明においては、５’末端の配列や化合物により、アニーリングの至適温度範囲が広がるため、アニーリング条件の検討等の予備実験を簡略化でき、操作を大幅に簡素化することができる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明の第一の発明は、ＤＮＡ増幅反応の効率向上方法であって、プライマーの５’末端に、ＬＣＲｅｄ７０５、アミノ基、リン酸基、ビオチン、ＤＩＧ、ＤＮＰ、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ、ＲＯＸ、ＸＲＩＴＣ、ローダミン、ＬＣＲｅｄ６４０、メルカプト基、ソラーレン、コレステロール、ＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＴＥＴ、ｃｙ３、ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１（以下、「特定化合物群」という）、及びｇとｃの合計の含有量が５０％以上のオリゴヌクレオチド（以下、「特定塩基」という）からなる群より選ばれる化合物を結合したものをプライマーとして用いることを特徴とするＤＮＡ増幅反応の効率向上方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明の第二の発明は、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法であって、ＤＮＡにハイブリダイズさせるものとして、オリゴヌクレオチドの５’末端に、特定化合物群より選ばれる化合物を結合したものを使用することを特徴とする、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性向上方法を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の発明及び第二の発明において、特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させるプライマー又は特定化合物群より選ばれる化合物を結合させるオリゴヌクレオチドとしては、通常のＤＮＡの増幅に用いることができるプライマー又はオリゴヌクレオチドであれば、特に制限はない。また、本発明においては、ＤＮＡの増幅効率を向上させることができるのであるから、通常のＤＮＡの増幅には用いることができないプライマーも用いることができる。
【００１２】
本発明の第一の発明及び第二の発明において、特定化合物群は、ＤＮＡ増幅法により増幅させる標的配列に対して非特異的である。ＤＩＧとはジゴキシゲニンであり、ＤＮＰとはジニトロフェニルであり、ＴＡＭＲＡとはカルボキシテトラメチルローダミンであり、Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄとは１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−Ｘａｎｔｈｅｎｏ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ｄｉｑｕｉｎｏｌｉｚｉｎ−１８−ｉｕｍ，９−［２（ｏｒ４）−［［［６−（２，５−ｄｉｏｘｏ−１−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ）ｏｘｙ］−６−ｏｘｏｈｅｘｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］−４（ｏｒ２）ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−，ｉｎｎｅｒｓａｌｔであり、ＲＯＸとはローダミンＸであり、ＸＲＩＴＣとはローダミンＸイソチオシアネートであり、ＦＩＴＣとはフルオレセインイソチオシアネートであり、６−ＦＡＭとは６−カルボキシフルオレセインであり、ＴＥＴとはテトラクロロフルオレセインであり、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−ｓｔｙｒｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５，７−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒであり、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１とは４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−５−（４−ｐｈｅｎｙｌ−１，３−ｂｕｔａｄｉｅｎｙｌ）−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｅｓｔｅｒである。
【００１３】
また、本発明の第一の発明において、特定塩基は、ハイブリダイズさせる塩基配列に対して非特異的な配列でも特異的な配列でもよい。ここで、「特異的である場合」とは、プライマーが鋳型と相補的に結合する領域とは連続しない領域と、当該付加配列とが相補性を有している場合のみならず、プライマ−が鋳型と相補的に結合する領域と連続する領域（特に鋳型の３’末端側（プライマ−の５’末端側に相当する領域））と、当該付加配列とが相補性を有している場合も含まれる。後者の手法は、従来においてもプライマーのＴｍ値を調整するために行われることがあったが、本発明においては、増幅効率を上昇させるために用いられている。
【００１４】
一方、「非特異的である場合」とは、プライマーが鋳型の配列とは無関係である場合、即ち付加配列が、標的核酸との間に連続してＧＣ、ＡＴの塩基対でもって二本鎖を形成しない配列を有していることを意味する。このように非特異的な場合であっても、本発明においてはプライマーのアニールの上限温度上昇に貢献することが可能となっている。
【００１５】
このように本発明の第一の態様において、特定塩基は、ハイブリダイズされる塩基配列（鋳型ＤＮＡ）に対して非特異的な配列でもよく、特異的でもよいが、増幅効率の上昇の点では、非特異的な配列の場合が好ましい。
【００１６】
本発明の第一の発明においては、特定化合物群、特定塩基から選ばれる１種又は２種以上を用いることができる。
本発明の第二の発明においては、特定化合物群から選ばれる１種又は２種以上を用いることができる。
【００１７】
本発明の第一の発明及び第二の発明においては、オリゴヌクレオチド又はプライマーと特定化合物群より選ばれる化合物とをリンカーを介して結合させてもよい。リンカーとしては、例えば炭素数が２〜１６の炭化水素基等が挙げられる。
【００１８】
本発明の第一の発明において、プライマーの５’末端に結合するオリゴヌクレオチド（付加配列）は、ｇｃ含量が高いことが好ましい。具体的には、ｇｃ含量が５０％以上であることが好ましい。ｇｃ含量は高い方が、ＤＮＡ増幅反応の効率が高くなる傾向があり、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、そして１００％とすることが可能である。ｇｃ含量をこれらの何れの割合で選択するかは、付加配列自体の長さ、付加配列自体と増幅する配列やプライマーとの間に相補性が生じないようにすること等を考慮することにより、当業者が適宜選択することができるものである。付加配列が長くなりすぎると、ＤＮＡ増幅反応の効率は低下する場合もあるため、付加配列は４０塩基以下であることが好ましい。また、プライマーダイマーを形成させにくくするため、ｇとｃの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合、ａとｔの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合で含まれることが好ましい。
【００１９】
具体的な好ましい塩基配列として、例えば以下の２−８塩基のものを例示することができる。また、９塩基以上の配列については、以下の２〜８塩基のものを適宜組み合わせればよい。なお、Ｓとはｃ又はｇを表し、Ｗとはａ又はｔを表す。ｇとｃの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合、ａとｔの一方の塩基の含有量が５０％以上の割合であることが好ましい。
ＳＳ、ＳＷ、ＷＳ、ＳＳＳ、ＳＳＷ、ＳＷＳ、ＷＳＳ、ＳＳＳＳ、ＳＳＳＷ、ＳＳＷＳ、ＳＷＳＳ、ＷＳＳＳ、ＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＷＳ、ＳＳＷＳＳ、ＳＷＳＳＳ、ＷＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＳＷＳＳＳＳＳ、ＳＷＳＳＳＳＳＳ、ＷＳＳＳＳＳＳＳ、ＳＳＳＳＳＳＷＷ、ＳＳＳＳＳＷＳＷ、ＳＳＳＳＷＳＳＷ、ＳＳＳＷＳＳＳＷ、ＳＳＷＳＳＳＳＷ、ＳＷＳＳＳＳＳＷ、ＷＳＳＳＳＳＳＷ、ＳＳＳＳＳＷＷＳ、ＳＳＳＳＷＳＷＳ、ＳＳＳＷＳＳＷＳ、ＳＳＷＳＳＳＷＳ、ＳＷＳＳＳＳＷＳ、ＷＳＳＳＳＳＷＳ、ＳＳＳＳＷＷＳＳ、ＳＳＳＷＳＷＳＳ、ＳＳＷＳＳＷＳＳ、ＳＷＳＳＳＷＳＳ、ＷＳＳＳＳＷＳＳ、ＳＳＳＷＷＳＳＳ、ＳＳＷＳＷＳＳＳ、ＳＷＳＳＷＳＳＳ、ＷＳＳＳＷＳＳＳ、ＳＳＷＷＳＳＳＳ、ＳＷＳＷＳＳＳＳ、ＷＳＳＷＳＳＳＳ、ＳＷＷＳＳＳＳＳ、ＷＳＷＳＳＳＳＳ、ＷＷＳＳＳＳＳＳ
また、具体的には、ａｇｔｃ、ａａｇｔ、ｇｇａｃ又はｇｇｇｃの繰り返し単位からなる２０塩基までのオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００２０】
また、付加配列は２次構造を形成して増幅反応を阻害しないような配列を有することが好ましいが、より具体的には配列間で塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形成がないことが特に好ましい。少なくとも、連続して塩基対が形成されないことが好ましい。さらに、配列が付加されたプライマーに対しても、塩基対形成が低いことが好ましく、塩基対形成が無いことが特に好ましい。
【００２１】
本発明の第一の発明においては、上記特定化合物群及び特定塩基より選ばれる化合物を、常法に従ってプライマーの５’末端に結合させることができる。特定化合物群、特定塩基の２種以上を結合させる場合には、まず化合物を結合させてから特定塩基の配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成してもよいし、特定塩基の配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成してから化合物を結合させてもよい。２種以上の化合物群、特定塩基を結合させるものとしては、例えばＦＩＴＣにｇｇｇｃの２回繰り返し配列を結合させたものが挙げられる。
【００２２】
本発明の第二の発明においては、上記特定化合物群より選ばれる化合物を、常法に従ってオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させることができる。特定化合物群、特定塩基の２種以上を結合させる場合には、まず化合物を結合させてから特定塩基の配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成してもよいし、特定塩基の配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成してから化合物を結合させてもよい。
【００２３】
本発明の第一の発明は、プライマーに特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させることにより、プライマーの増幅産物との結合速度や結合安定性が向上するため、通常のＰＣＲに適用することが好ましい。この結合速度や結合安定性の向上は、特定塩基が鋳型ＤＮＡに対して非特異的な場合であっても観察される（例えば表１、表２の結果を参照）。
【００２４】
従って本発明の方法は、非対称ＰＣＲに好適に適用することができる。
非対称ＰＣＲは、標的ＤＮＡ断片を直接シークエンスしたいとき等、一本鎖ＤＮＡを迅速に増幅する目的に適した方法である。すなわち、通常のＰＣＲでは、用いる１組のプライマーの濃度を等しくするが、非対称ＰＣＲでは、一方のプライマーの濃度を他方の濃度の数倍から数十倍にしておく。このようにしておくと、他方のプライマーのみが先に消費されるため、残りのＰＣＲは、過剰な一方のプライマーのみから進行し、一方のＤＮＡ鎖が大量に生産される。また、非対称ＰＣＲの一種であるサーマルアシメトリックＰＣＲ法は、１組のプライマーのＴｍの差が１０℃以上あるものを用い、まずＴｍが低い方のプライマーもアニールする条件でＰＣＲを行い、次にＴｍが高い方のプライマーのみがアニールする条件でＰＣＲを行う。
【００２５】
しかしながら、非対称ＰＣＲには、以下のような問題点がある。すなわち、鋳型になるＤＮＡとプライマーの濃度を最適化しないと、一本鎖の増幅は低いものとなる（非特許文献１）。しかしながら、最適化するためには、煩雑な予備実験が必要である。
また、サーマルアシメトリックＰＣＲでは、１０℃以上の極端なアニール温度差を有する特異プライマーのセットを作成しなければならないが、これは必ずしも容易ではない。
【００２６】
さらに、一本鎖ＤＮＡを迅速に増幅する他の方法として、１組のプライマーの増幅能力の差を利用する方法がある。例えば、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドプライマーを用いる。ＲＮＡプライマーは、伸長反応への寄与がＤＮＡプライマーより弱いので、該ハイブリットプライマーを用いてＰＣＲを行うと、純粋なＤＮＡ側の増幅が大きくなり、ＤＮＡの一本鎖が得られる。
【００２７】
しかしながら、この方法は、ＲＮＡ側の増幅能力が低い結果としてＤＮＡ一本鎖が得られたのであり、所望するＤＮＡの増幅能力が向上したのではないという問題を有する。
【００２８】
しかしながら、本発明の第一の発明においては、１組のプライマーのうちの１本についてのみ特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させておくことにより、両プライマーの増幅効率に大きな差が生じるため、鋳型になるＤＮＡとプライマーの濃度の最適化という煩雑な操作をする必要がない。このため、本発明の第一の発明を非対称ＰＣＲに適用することにより、１本鎖ＤＮＡの増幅効率を大幅に向上させることができる。また、本発明の第一の発明は、プライマーの至適温度範囲を広げることができるため、サーマルアシメトリックＰＣＲにおいて、一方のプライマーのＴｍ値を所望の値に変化させるために本発明を適用することも可能である。
【００２９】
従来の非対称ＰＣＲは、片方のプライマーの合成を阻害することにより、すなわち全体としてのＰＣＲの効率を低下させることにより行われてきた。これに対し、本発明の第一の発明は、片方のプライマーの増幅効率を向上させることによって非対称ＰＣＲを行うものである。すなわち、通常のＰＣＲと比較して、増幅効率が下がることがない。したがって、本発明の第一の発明は、病原体等の微量のＤＮＡを迅速、簡便に検出、型別する場合のように、１本鎖の生成とともに高い増幅効率が必要な場合に特に有効である。
【００３０】
また、本発明の方法は、デジェネレートＰＣＲに適用することが好ましい。デジェネレートＰＣＲにおいては、例えば数１００〜数１０００種類程度のプライマーを混合して用いるため、混在するそれぞれの配列で至適アニール温度が異なる。そのため、増幅温度の設定が比較的難しい。しかしながら、このような問題も、本発明により回避可能である。また、アニール温度を高く設定することが可能であるため、非特異的な増幅を抑えることができ、効率よく増幅することができる。
【００３１】
本発明の第一の発明に用いる特定化合物群より選ばれる化合物が結合したプライマーは、プローブとして用いることもできる。
【００３２】
本発明の第二の発明は、オリゴヌクレオチドの５’末端に、特定化合物群からより選ばれる化合物を結合したものを使用することにより、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性を向上させるものである。すなわち、かかる化合物を結合したオリゴヌクレオチドは、かかる化合物が結合していないオリゴヌクレオチドと比較して、ＤＮＡへの結合速度や結合安定性が向上する。
【００３３】
【実施例】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
増幅可能なアニール上限温度の比較
腸炎ビブリオ検出用プライマーの５’末端に、特定化合物群より選ばれる化合物を結合させたものを用い、ＧｒａｄｉｅｎｔＢｌｏｃｋＭｏｄｕｌｅを装着したＨＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲＥｘｐｒｅｓｓを用い、下記条件でＰＣＲを行うことにより、増幅可能なアニール上限温度を測定した。
腸炎ビブリオ検出用プライマーとして、フォワード側を配列番号１で表される塩基配列、リバース側を配列番号２で表される塩基配列を用いた。該フォワード側プライマー及び該リバース側プライマーの５’末端に、表１に示す各特定化合物群を結合させた。これとは別に、腸炎ビブリオのタイプストレイン（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ｒｐｏＤ遺伝子増幅用ユニバーサルプライマー（特許文献１：配列番号３、４）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物を調製した。次いで、該増幅産物を鋳型とし、上記各特定化合物群結合プライマーを用いて複数アニール温度条件のＰＣＲを行った。
【００３５】
ＰＣＲの条件は、以下の通りである。（１）Ｔａｑポリメレース（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ）の活性化：９５℃で１０分；（２）変性：９４℃で１分；（３）アニール：５５．１℃、５５．５℃、５６．３℃、５７．７℃、５９．４℃、６１．４℃、６３．３℃、６５．３℃、６７．６℃、６９．０℃、６９．７℃及び７０．２℃で３０秒；（４）伸長反応：７２℃で１分
上記（２）−（４）を４０サイクル繰り返す。（５）伸長反応：７２℃で１０分；（６）冷却：４℃まで冷却
次いで、得られた増幅断片をアガロースゲル電気泳動により解析し、アニール上限温度を決定した。なお、プライマーに特定化合物群を結合させないものをコントロールとした。アニール上限温度及びアニール上限温度のコントロールに対する上昇温度を表１、及び表２に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】
特定化合物群を結合させたプライマーは、アニール上限温度が上昇し、増幅効率が向上したことが確認された。
【００３９】
実施例２
増幅可能なアニール上限温度の比較
プライマーとして、フォワード側を配列番号３で表される塩基配列、リバース側を配列番号４で表される塩基配列を用いた。該プライマーの５’末端に、表２に示す塩基配列を繰り返し単位とした４ｍｅｒ−２０ｍｅｒを結合させたものを用い、ＧｒａｄｉｅｎｔＢｌｏｃｋＭｏｄｕｌｅを装着したＨＹＢＡＩＤ社製ＰＣＲＥｘｐｒｅｓｓを用い、腸炎ビブリオのタイプストレイン（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、アニール時間を１分として、実施例１と同様の条件でＰＣＲを行い、増幅可能なアニール上限温度を測定した。なお、プライマーに塩基を結合させないものをコントロールとした。また、ｇｃ含量が０％であるａａａｔを繰り返し単位とした４ｍｅｒ−２０ｍｅｒを結合させたものを比較例とした。アニール上限温度及びアニール上限温度のコントロールに対する上昇温度（かっこ内）を表３に示す。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
ｇｃ含量が２５％以上で４塩基以上のオリゴヌクレオチドを結合させたプライマーは、増幅効率が向上し、特にｇｃ含量が高い塩基を結合させたプライマーにおいてその効果が著しかった。
【００４２】
実施例３
プライマーの５’末端に特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させたことによる増幅効率の検討
プライマーとして、フォワード側を配列番号１で表される塩基配列、リバース側を配列番号２で表される塩基配列を用いた。該フォワード側プライマー及び該リバース側プライマーの５’末端に、ｃｙ３、ｃｙ５、ビオチン、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒ又はａａｇｔを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結合させたものを用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＳｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティック（株）製）を用い、腸炎ビブリオのタイプストレイン（ＩＦＯ１２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、増幅可能なアニール上限温度を測定した。
【００４３】
ＰＣＲの条件は、以下の通りである。（１）変性：９５℃で１．５分；（２）変性：９５℃で０秒；（３）アニール：６０℃で０秒、５秒もしくは１０秒又は６４℃で５秒；（４）伸長反応：７２℃で１５秒
上記（２）−（４）を４０サイクル繰り返す。
次いで、各サイクルで得られた増幅断片の蛍光強度を測定した。なお、プライマーに特定塩基より選ばれる化合物を結合させないものをコントロールとした。結果を図１−４に示す。なお、この蛍光強度は、プライマーに付加した特定化合物群に由来するものではなく、２本鎖に結合したサイバーグリーンに由来するものであり、増幅ＤＮＡ量を示す。
【００４４】
図１は、アニール条件６０℃で０秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。図２は、アニール条件６０℃で５秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。図３は、アニール条件６０℃で１０秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。図４は、アニール条件６４℃で５秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【００４５】
特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させたプライマー（修飾プライマー）は、すべての増幅条件で特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させていないプライマー（非修飾プライマー）よりも増幅反応の立ち上がりが早くなる。すなわち、一定の蛍光強度となるためのサイクルが短くなる（図２、図３）。
【００４６】
同じアニール温度でアニール時間を短くしていくと（１０秒（図３）→５秒（図２）→０秒（図１））、非修飾プライマーでは増幅が始まるサイクルが顕著に遅くなる（すなわち、増幅が弱くなる。）。例えば、蛍光強度が１０を超えるのに、アニール時間１０秒（図３）では１４サイクル目であったが、アニール時間５秒（図２）では２０サイクル目となり、アニール時間０秒では４０サイクルでも蛍光強度が１０を超えない。これに対し、修飾プライマーでは、アニール時間の減少による増幅開始サイクルの遅れは、非修飾プライマーの場合より緩やかである。すなわち、検出系に使用された場合は、感度の向上もたらす。この修飾の効果は、アニール時間が０秒の場合に非常に顕著であり、修飾プライマーの中でも、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結合した場合の効果が特に高い。
【００４７】
非修飾プライマーでは増幅が起こらないアニール温度、アニール時間であっても、修飾プライマーでは実用となり得るレベルの増幅が起こる（図４）。この場合もｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結合した場合の効果が特に高い。
【００４８】
４０サイクル目の最終増幅産物の量は、修飾プライマーの方が非修飾プライマーよりも顕著に多い（図１−４）。通常のＰＣＲでは、４０サイクル以上の増幅反応は行わないため、修飾プライマーは、実用範囲で明らかな優位性を有する。
【００４９】
以上より、温度上昇とアニール時間短縮の両者で修飾の効果が認められたため、かかる効果は、プライマーと鋳型ＤＮＡ間の結合の熱的安定性の向上、すなわち結合力の増大に由来すると考えられる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の第一の発明を用いれば、アニーリング条件の検討等の予備実験を大幅に簡略化することができるとともに、ＰＣＲの増幅効率を向上させることができる。かかる効果は、ＰＣＲが、非対称ＰＣＲ又はデジェネレートＰＣＲである場合に特に著しい。
また、本発明の第二の発明を用いれば、オリゴヌクレオチドのＤＮＡへの特異的結合性を向上させることができる。
【００５１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】アニール条件６０℃で０秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図２】アニール条件６０℃で５秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図３】アニール条件６０℃で１０秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図４】アニール条件６４℃で５秒におけるＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月11日(2003.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
実施例３
プライマーの５’末端に特定化合物群、特定塩基より選ばれる化合物を結合させたことによる増幅効率の検討
プライマーとして、フォワード側を配列番号１で表される塩基配列、リバース側を配列番号２で表される塩基配列を用いた。該フォワード側プライマー及び該リバース側プライマーの５’末端に、ｃｙ３、ｃｙ５、ビオチン、ｇｇａｃを繰り返し単位とする１２ｍｅｒ又はａａｇｔを繰り返し単位とする１２ｍｅｒを結合させたものを用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒＳｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティック（株）製）を用い、腸炎ビブリオのタイプストレイン（ＩＦＯ １２７１１Ｔ）から抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、以下の条件でリアルタイムＰＣＲを行うことにより、ＰＣＲサイクル数と蛍光強度との関係を調べた。