(57)【要約】【課題】ＨＩＶ−１に対する新規多価ＤＮＡワクチンの提供。【解決手段】本願発明に係る多価ＤＮＡワクチンは、以下の１９個のエピトープ：ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３、ＣＤ４結合部位、ｇｐ１２０　ＣＴＬ、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ、ｎｅｆ　ＣＴＬ、Ｒｅｖ　ＣＴＬ、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１、Ｔａｔ　ＣＴＬ−２、Ｖ３　ＣＴＬ、Ｖ４　ＣＴＬ、ｇｐ４１、Ｇａｇ、ＧａｇＣＴＬ−１、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−２を、それぞれヒト型化コドンを用いて、コードする各ＤＮＡを結合して成るヌクレオチドを含む。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１９個のエピトープ：ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３（ペプチドＡ１）、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３（ペプチドＡ２）、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３（ペプチドＡ３）、ｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３（ペプチドＡ４）、ＣＤ４結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ）、ｇｐ１２０　ＣＴＬ、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ，ｎｅｆ　ＣＴＬ（ペプチドＡ５）、Ｒｅｖ　ＣＴＬ、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１、ＴａｔＣＴＬ−２（ペプチドＡ６）、Ｖ３　ＣＴＬ、Ｖ４　ＣＴＬ（ペプチドＡ７）、ｇｐ４１−１（ペプチドＡ８）、ｇｐ４１−２（ペプチドＡ９）、Ｇａｇ　ＣＴＬ−１（ペプチドＡ１０）、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２（ペプチドＡ１１）、ＰｏｌＣＴＬ−１（ペプチドＡ１２）、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−２を、それぞれコードする各ＤＮＡを結合して成るヌクレオチドを含む、ＨＩＶ−１に対する多価ＤＮＡワクチン。
【請求項２】
ＨｅｌｐｅｒエピトープをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項１に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項３】
ＣＭＶプロモーターを含む、請求項１に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項４】
ＣＡＧＧＳプロモーターを含む、請求項１に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項５】
前記各ＤＮＡが、ヒト型化コドンを用いてコードされている、請求項１又は２に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項６】
前記ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３（ペプチドＡ１）をコードするＤＮＡが配列番号１に示す塩基配列をもち、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３（ペプチドＡ２）をコードするＤＮＡが配列番号２に示す塩基配列をもち、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３（ペプチドＡ３）をコードするＤＮＡが配列番号３に示す塩基配列をもち、ｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３（ペプチドＡ４）をコードするＤＮＡが配列番号４に示す塩基配列をもち、ＣＤ４結合部位をコードするＤＮＡが配列番号５に示す塩基配列をもち、ｇｐ１２０　ＣＴＬをコードするＤＮＡが配列番号６に示す塩基配列をもち、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇをコードするＤＮＡが配列番号７に示す塩基配列をもち、ｎｅｆ　ＣＴＬ（ペプチドＡ５）をコードするＤＮＡが配列番号８に示す塩基配列をもち、Ｒｅｖ　ＣＴＬをコードするＤＮＡが配列番号９に示す塩基配列をもち、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１をコードするＤＮＡが配列番号１０に示す塩基配列をもち、Ｔａｔ　ＣＴＬ−２（ペプチドＡ６）をコードするＤＮＡが配列番号１１に示す塩基配列をもち、Ｖ３　ＣＴＬをコードするＤＮＡが配列番号１２に示す塩基配列をもち、Ｖ４　ＣＴＬ（ペプチドＡ７）をコードするＤＮＡが配列番号１３に示す塩基配列をもち、ｇｐ４１−１（ペプチドＡ８）をコードするＤＮＡが配列番号１４に示す塩基配列をもち、ｇｐ４１−２（ペプチドＡ９）をコードするＤＮＡが配列番号１５に示す塩基配列をもち、Ｇａｇ　ＣＴＬ−１（ペプチドＡ１０）をコードするＤＮＡが配列番号１６に示す塩基配列をもち、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２（ペプチドＡ１１）をコードするＤＮＡが配列番号１７に示す塩基配列をもち、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１（ペプチドＡ１２）をコードするＤＮＡが配列番号１８に示す塩基配列をもち、そしてＰｏｌ　ＣＴＬ−２をコードするＤＮＡが配列番号１９示す塩基配列をもつ、請求項１に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項７】
前記１９個の各ＤＮＡが、タンデムに配置され、そしてそのタンデムに配置されたヌクレオチド成分内では前記各ＤＮＡが直接結合されている、請求項１に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項８】
前記１９個の各ＤＮＡが、５′→３′の方向において、ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３、ｃｌａｄｅＥ　Ｖ３、ＣＤ４結合部位、ｇｐ１２０　ＣＴＬ、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ、ｎｅｆ　ＣＴＬ、Ｒｅｖ　ＣＴＬ、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１、Ｔａｔ　ＣＴＬ−２、Ｖ３　ＣＴＬ、Ｖ４　ＣＴＬ、ｇｐ４１−１、ｇｐ４１−２、Ｇａｇ　ＣＴＬ−１、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−２の順序で結合されている、請求項１に記載の多価ＤＮＡワクチン。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の多価ＤＮＡワクチンをＩＬ−２／Ｉｇと混合して得られる、ＨＩＶ−１に対する混合多価ＤＮＡワクチン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＩＶ−１に対する新規多価ＤＮＡワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
感染疾患に対する免疫を生体に付与する各種ＤＮＡワクチンが知られている（非特許文献１〜４参照）。ＨＩＶ−１（ヒト免疫不全ウイルス１型）感染に対する免疫を生体に付与する免疫原（感染予防抗原）としての役割を担うエピトープ（抗原決定基）をコードするＤＮＡワクチンが開発されている（非特許文献１、５〜７参照）。ＨＩＶ−１のＤＮＡ配列は変化するので、ＤＮＡの１つのサブタイプだけでワクチンを作製しても、保護免疫としては実際的ではない。なぜなら、１価ワクチンは、他の多数のＨＩＶ−１と交差反応しないからである。これを回避するために、ＨＩＶ−１の突然変異に対して有効であることが証明されている多価ＨＩＶ−１ワクチンが合成され、そして小動物モデルを用いていくつかの株に対して抗体を産生するに際しての、その合成ワクチンの有効性が討議されてきた（非特許文献８参照）。多数のＨＩＶ−１株に対して保護免疫を誘導することができ、そしてＨＩＶ−１のｃｌａｄｅ　Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＥの保護抗原である１９の抗原性エピトープが報告されている（非特許文献９参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｏｋｕｄａ，　Ｋ．，　Ｈ．　Ｂｕｋａｗａ，　Ｋ．　Ｈａｍａｊｉｍａ，　Ｓ．　Ｋａｗａｍｏｔｏ，　Ｋ．　Ｓｅｋｉｇａｗａ，　Ｙ　　　　　．　Ｙａｍａｄａ，　Ｓ．　Ｔａｎａｋａ，　Ｎ．　Ｉｓｈｉ，　Ｉ．　Ａｏｋｉ，　ａｎｄ　Ｍ．　Ｎａｋａｍｕｒａ．　１９９５．　　　　　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｔｅｎｔ　ｈｕｍｏｒａｌ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　　　　　　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｄｉｒｅｃｔ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ＨＩＶ　ｔｙｐｅ　１　ｅｎｖ　　　　　　ａｎｄ　ｒｅｖ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ．　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　Ｈｕｍ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１１　：　９３３．
【非特許文献２】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，　Ｈ．Ｌ．，　Ｌ．Ａ．　Ｈｕｎｔ，　ａｎｄ　Ｒ．Ｇ．　Ｗｅｂｓｔｅｒ．　１９９３．　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　　　　　ａｇａｉｎｓｔ　ａ　ｌｅｔｈａｌ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｖｉｒｕｓ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔ　　　　　ｈ　ａ　ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ，　Ｖａｃｃｉｎｅ　１１　：　９５７．
【非特許文献３】
Ｕｌｍｅｒ，　Ｊ．，　Ｊ．　Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，　Ｓ．　Ｐａｒｋｅｒ，　Ｇ．　Ｒｈｏｄｅｓ，　Ｐ．　Ｆｅｌｇｎｅｒ，　Ｖ．　Ｄ　　　　　ｗａｒｋｉ，　Ｓ．　Ｇｒｏｍｋｏｗｓｋｉ，　Ｒ．　Ｄｅｃｋ，　Ｃ．　Ｄｅｗｉｔｔ，　Ａ．　Ｆｒｉｅｄｍａｎ，　Ｌ．　Ｈａｗｅ　　　　　，　Ｋ．　Ｌｅａｎｄｅｒ，　Ｄ．　Ｍａｒｔｉｎｅｚ，　Ｈ．　Ｐｅｔｔｙ，　Ｊ．　Ｓｈｉｖｅｒ，　Ｄ．　Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，　　　　　　ａｎｄ　Ｍ．　Ｌｉｕ．　１９９３．　Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　ｂ　　　　　ｙ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９　：　１７４　　　　　５．
【非特許文献４】
Ｗｏｌｆｆ，　Ｊ．Ａ．，　Ｒ．Ｗ．　Ｍａｌｏｎｅ，　Ｐ．　Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｗ．　Ｃｈｏｎｇ，　Ｇ．　Ａｃｓａｄｉ，　Ａ．　　　　　　Ｊａｎｉ，　ａｎｄ　Ｐ．Ｌ．　Ｆｅｌｇｎｅｒ．　１９９０．　Ｄｉｒｅｃｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　ｍｏｕｓｅ　　　　　　ｍｕｓｃｌｅ　ｉｎ　ｖｉｖｏ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７　：　１４６５．
【非特許文献５】
Ｓａｓａｋｉ，　Ｓ．，　Ｋ．　Ｉｎａｍｕｒａ，　ａｎｄ　Ｋ．　Ｏｋｕｄａ．　１９９９．　Ｇｅｎｅｓ　ｔｈａｔ　ｉｎｄｕｃｅ　　　　　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　−ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅｓ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４３　：　１９１．
【非特許文献６】
Ｗａｎｇ，　Ｂ．，　Ｋ．Ｅ．　Ｕｇｅｎ，　Ｖ．　Ｓｒｉｋａｎｔａｎ，　Ｍ．Ｇ．　Ａｇａｄｊａｎｙａｎ，　Ｋ．　Ｄａｎｇ，　Ｙ　　　　　．　Ｒｅｆａｅｌｉ，　Ａ．Ｉ．　Ｓａｔｏ，　Ｊ．　Ｂｏｙｅｒ，　Ｗ．Ｖ．　Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　ａｎｄ　Ｄ．Ｂ．　Ｗｅｉｎｅｒ　　　　　．　１９９３．　Ｇｅｎｅ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅｒａｔｅｓ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｈｕ　　　　　ｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　　　　　　９０　：　４１５６．
【非特許文献７】
Ｌｕ，　Ｓ．，　Ｊ．Ｃ．　Ｓａｎｔｏｒｏ，　Ｄ．Ｈ．　Ｆｕｌｌｅｒ，　Ｊ．Ｒ．　Ｈａｙｎｅｓ，　ａｎｄ　Ｈ．Ｌ．　Ｒｏｂｉｎ　　　　　ｓｏｎ．　１９９５．　Ｕｓｅ　ｏｆ　ＤＮＡｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＨＩＶ−１　Ｅｎｖ　ａｎｄ　ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　　　　　ＨＩＶ−１　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｔｏ　ｒａｉｓｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　　　　２０９　：　１４７．
【非特許文献８】
Ｂｕｋａｗａ，　Ｈ．，　Ｋ．　Ｓｅｋｉｇａｗａ，　Ｋ．　Ｈａｍａｊｉｍａ，　Ｊ．　Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，　Ｙ．　Ｙａｍａｄａ，　　　　　　Ｈ．　Ｋｉｙｏｎｏ，　ａｎｄ　Ｋ．　Ｏｋｕｄａ．　１９９５．　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＶ−１　ｂｙ　ｓｅｃ　　　　　ｒｅｔｏｒｙ　ＩｇＡ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｏｒａｌ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｎｅｗ　ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ．　Ｎａｔ　Ｍｅｄ　１　：　６８１．
【非特許文献９】
Ｋｏｒｂｅｒ，　Ｂ．，　Ｃ．　Ｂｒａｎｄｅｒ，　Ｂ．　Ｈａｙｎｅｓ，　Ｒ．　Ｋｏｕｐ，　Ｃ．　Ｋｕｉｋｅｎ，　Ｊ．　Ｍｏｏｒ　　　　　ｅ，　Ｂ．　Ｗａｌｋｅｒ，　ａｎｄ　Ｄ．　Ｗａｔｋｉｎｓ．　２０００．　ＨＩＶ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．　　　　　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ，　ＮＭ．
【非特許文献１０】
Ｌｉｕ，　Ｗ．Ｊ．，　Ｋ．Ｎ．　Ｚｈａｏ，　Ｆ．Ｇ．　Ｇａｏ，　Ｇ．Ｒ．　Ｌｅｇｇａｔｔ，　Ｇ．　Ｆｅｒｎａｎｄｏ，　ａｎｄ　　　　　　Ｉ．Ｈ．　Ｆｒａｚｅｒ．　２００１．　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｖｉｒａｌ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　：　ｃｏｄｏｎ　ｏｐｔｉ　　　　　ｍｉｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ　ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ　ａｎｄ　ｔ　　　　　ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｅｆｆｉｃａｃｙ．　Ｖａｃｃｉｎｅ　２０　：　８６２．
【非特許文献１１】
Ｎａｒｕｍ，　Ｄ．Ｌ．，　Ｓ．　Ｋｕｍａｒ，　Ｗ．Ｏ．　Ｒｏｇｅｒｓ，　Ｓ．Ｒ．　Ｆｕｈｒｍａｎｎ，　Ｈ．　Ｌｉａｎｇ，　Ｍ　　　　　．　Ｏａｋｌｅｙ，　Ａ．　Ｔａｙｅ，　Ｂ．Ｋ．　Ｓｉｍ，　ａｎｄ　Ｓ．Ｌ．　Ｈｏｆｆｍａｎ．　２００１．　Ｃｏｄｏｎ　ｏｐｔ　　　　　ｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　ｍｅｒ　　　　　ｚｏｉｔｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍ　　　　　ｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ．　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ　６９　：　７２５０．
【非特許文献１２】
Ｄｅｍｌ，　Ｌ．，　Ａ．　Ｂｏｊａｋ，　Ｓ．　Ｓｔｅｃｋ，　Ｍ．　Ｇｒａｆ，　Ｊ．　Ｗｉｌｄ，　Ｒ．　Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ，　　　　　　Ｈ．　Ｗｏｌｆ，　ａｎｄ　Ｒ．　Ｗａｇｎｅｒ．　２００１．　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　　　　　　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｃａｎｄｉｄａｔ　　　　　ｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　Ｇａ　　　　　ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ　７５　：　１０９９１．
【非特許文献１３】
Ｅｇａｎ，　Ｍ．Ａ．，　Ｗ．Ａ．　Ｃｈａｒｉｎｉ，　Ｍ．Ｊ．　Ｋｕｒｏｄａ，　Ｊ．Ｅ．　Ｓｃｈｍｉｔｚ，　Ｐ．　Ｒａｃｚ，　　　　　Ｋ．　Ｔｅｎｎｅｒ−Ｒａｃｚ，　Ｋ．　Ｍａｎｓｏｎ，　Ｍ．　Ｗｙａｎｄ，　Ｍ．Ａ．　Ｌｉｆｔｏｎ，　Ｃ．Ｅ．　Ｎｉｃｋｅｒｓ　　　　　ｏｎ，　Ｔ．　Ｆｕ，　Ｊ．Ｗ．　Ｓｈｉｖｅｒ，　ａｎｄ　Ｎ．Ｌ．　Ｌｅｔｖｉｎ．　２０００．　Ｓｉｍｉａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅ　　　　　ｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　（ＳＩＶ）　ｇａｇ　ＤＮＡ−ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙｓ　ｄｅｖｅｌｏｐ　　　　　　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｖｉｒａｌ　　　　　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｆｔｅｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ＳＩＶ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ　７４　：　７４８５．
【非特許文献１４】
ｚｕｒ　Ｍｅｇｅｄｅ，　Ｊ．，　Ｍ．Ｃ．　Ｃｈｅｎ，　Ｂ．　Ｄｏｅ，　Ｍ．　Ｓｃｈａｅｆｅｒ，　Ｃ．Ｅ．　Ｇｒｅｅｒ，　Ｍ．　　　　　　Ｓｅｌｂｙ，　Ｇ．Ｒ．　Ｏｔｔｅｎ，　ａｎｄ　Ｓ．Ｗ．　Ｂａｒｎｅｔｔ．　２０００．　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ　　　　　ｏｎ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅ　　　　　ｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｇａｇ　ｇｅｎｅ．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　７４　：　２６２８．
【非特許文献１５】
Ｕｃｈｉｊｉｍａ，　Ｍ．，　Ａ．　Ｙｏｓｈｉｄａ，　Ｔ．　Ｎａｇａｔａ，　ａｎｄ　Ｙ．　Ｋｏｉｄｅ．　１９９８．　Ｏｐｔｉｍ　　　　　ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　　　　　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　　　　　ａｎ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６１　：　５５９４．
【非特許文献１６】
Ｂｅｌｙａｋｏｖ，　Ｉ．Ｍ．，　Ｍ．Ａ．　Ｄｅｒｂｙ，　Ｊ．Ｄ．　Ａｈｌｅｒｓ，　Ｂ．Ｌ．　Ｋｅｌｓａｌｌ，　Ｐ．　Ｅａｒｌ　　　　　，　Ｂ．　Ｍｏｓｓ，　Ｗ．　Ｓｔｒｏｂｅｒ，　ａｎｄ　Ｊ．Ａ．　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ．　１９９８．　Ｍｕｃｏｓａｌ　ｉｍｍｕｎ　　　　　ｉｚａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＨＩＶ−１　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｍｕｃｏｓａｌ　ａｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｉ　　　　　ｃ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ａｇａｉ　　　　　ｎｓｔ　ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＨＩＶ−ｖａｃｃｉｎｉａ　ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　　　　　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９５　：　１７０９．
【非特許文献１７】
Ｃｉｅｒｎｉｋ，　Ｉ．Ｆ．，　Ｂ．Ｈ．　Ｋｒａｙｅｎｂｕｈｌ，　ａｎｄ　Ｄ．Ｐ．　Ｃａｒｂｏｎｅ．　１９９６．　Ｐｕｎｃｔｕ　　　　　ｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ．　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ　７　：　８９３．
【非特許文献１８】
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，　Ｊ．Ａ．　１９９５．　Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｔｏ　ｂｒｏａｄｅｎ　ｒｅ　　　　　ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｐｏｔｅｎｃｙ．　Ａｎｎ　Ｎ　Ｙ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　７５４　：　１６１．
【非特許文献１９】
Ｄｅ　Ｇｒｏｏｔ，　Ａ．Ｓ．，　Ｍ．　Ｃｌｅｒｉｃｉ，　Ａ．　Ｈｏｓｍａｌｉｎ，　Ｓ．Ｈ．　Ｈｕｇｈｅｓ，　Ｄ．　Ｂａｒｎｄ　　　　　，　Ｃ．Ｗ．　Ｈｅｎｄｒｉｘ，　Ｒ．　Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，　Ｇ．Ｍ．　Ｓｈｅａｒｅｒ，　ａｎｄ　Ｊ．Ａ．　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ．　　　　　　１９９１．　Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｔ　ｈｅ　　　　　ｌｐｅｒ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎｓ　：　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅ．　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　１６４　：　１０５８．
【非特許文献２０】
Ｋｉｍ，　Ｊ．Ｅ．，　Ｍ．　Ｋｏｊｉｍａ，　Ｒ．　Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，　Ｃ．Ｄ．　Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ，　Ｊ．Ｌ．　Ｃｏｒｎｅｔ　　　　　ｔｅ，　Ｃ．　ＤｅＬｉｓｉ，　ａｎｄ　Ｊ．Ａ．　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ．　１９９０．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　　　　　　ｈｅｌｐｅｒ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　ｂｙ　ｍｉｃｅ　ｏｆ　ａ　ｌｏｗ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ　ｍ　　　　　ａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｙｐｅ．　Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　２７　：　９４１．
【非特許文献２１】
Ｂａｒｏｕｃｈ，　Ｄ．Ｈ．，　Ａ．　Ｃｒａｉｕ，　Ｍ．Ｊ．　Ｋｕｒｏｄａ，　Ｊ．Ｅ．　Ｓｃｈｍｉｔｚ，　Ｘ．Ｘ．　Ｚｈｅｎｇ　　　　　，　Ｓ．　Ｓａｎｔｒａ，　Ｊ．Ｄ．　Ｆｒｏｓｔ，　Ｇ．Ｒ．　Ｋｒｉｖｕｌｋａ，　Ｍ．Ａ．　Ｌｉｆｔｏｎ，　Ｃ．Ｌ．　Ｃｒａｂ　　　　　ｂｓ，　Ｇ．　Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ，　Ｈ．Ｃ．　Ｐｅｒｒｙ，　Ｄａｖｉｅｓ　ＭＥ，　Ｈ．　Ｘｉｅ，　Ｃ．Ｅ．　Ｎｉｃｋｅｒｓｏ　　　　　ｎ，　Ｔ．Ｄ．　Ｓｔｅｅｎｂｅｋｅ，　Ｃ．Ｉ．　Ｌｏｒｄ，　Ｄ．Ｃ．　Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，　Ｔ．Ｂ．　Ｓｔｒｏｍ，　Ｊ．Ｗ　　　　　．　Ｓｈｉｖｅｒ，　Ｍ．Ｇ．　Ｌｅｗｉｓ，　ａｎｄ　Ｎ．Ｌ．　Ｌｅｔｖｉｎ．　２０００．　Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉ　　　　　ｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ＨＩＶ−１　ａｎｄ　ｓｉｍｉａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　　　　　　ｖａｃｃｉｎｅｓ　ｂｙ　ＩＬ−２／Ｉｇ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙｓ．　　　　　　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９７　：　４１９２．
【非特許文献２２】
Ｂａｒｏｕｃｈ，　Ｄ．Ｈ．，　Ｓ．　Ｓａｎｔｒａ，　Ｔ．Ｄ．　Ｓｔｅｅｎｂｅｋｅ，　Ｘ．Ｘ．　Ｚｈｅｎｇ，　Ｈ．Ｃ．　Ｐｅｒ　　　　　ｒｙ，　Ｍ．Ｅ．　Ｄａｖｉｅｓ，　Ｄ．Ｃ．　Ｆｒｅｅｄ，　Ａ．　Ｃｒａｉｕ，　Ｔ．Ｂ．　Ｓｔｒｏｍ，　Ｊ．Ｗ．　Ｓｈｉｖｅｒ　　　　　，　ａｎｄ　Ｎ．Ｌ．　Ｌｅｔｖｉｎ．　１９９８．　Ａｕｇｍａｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎ　　　　　ｅ　ｒｅｐｏｎｓｅｓ　ｔｏ　ａｎ　ＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｂｙ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｉｇ　ａｄｍｉ　　　　　ｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６１　：　１８７５．
【非特許文献２３】
Ｌａｎｄｏｌｆｉ，　Ｎ．Ｆ．　１９９１．　Ａ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ＩＬ−２／Ｉｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ　ｔｈｅ　　　　　　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４６　：　９１５．
【非特許文献２４】
Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，　Ｐ．，　Ｘ．Ｘ．　Ｚｈｅｎｇ，　Ｊ．　Ｓｔｅｉｇｅｒ，　Ａ．Ｗ．　Ｓｔｅｅｌｅ，　Ｗ．　Ｓｔｅｕｒｅｒ　　　　　，　Ｐ．　Ｒｏｙ−Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ，　Ｗ．　Ｍｕｌｌｅｒ，　ａｎｄ　Ｔ．　Ｓｔｒｏｍ．　１９９６．　Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ｉ　　　　　ｓｌｅｔ　ａｌｌｏｇｒａｆｔ　ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　４　ｅｘｐｒ　　　　　ｅｓｓｉｏｎ．　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　４　：　８１．
【非特許文献２５】
Ｏｋｕｄａ，　Ｋ．，　Ｓ．Ｓ．　Ｔｗｉｎｉｎｇ，　Ｃ．Ｓ．　Ｄａｖｉｄ，　ａｎｄ　Ｍ．Ｚ．　Ａｔａｓｓｉ，　１９７９．　Ｇｅ　　　　　ｎｅｔｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｓｐｅｒｍ　ｗｈａｌｅ　ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ　ｉｎ　ｍ　　　　　ｉｃｅ．　ＩＩ．　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　　　　　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｓｉｔｅｓ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１２３　：　１８２．
【非特許文献２６】
Ｔｏｄａ，　Ｓ．，　Ｎ．　Ｉｓｈｉｉ，　Ｅ．　Ｏｋａｄａ，　Ｋ．−Ｉ．　Ｋｕｓａｋａｂｅ，　Ｈ．　Ａｒａｉ，　Ｋ．　Ｈａｍａ　　　　　ｊｉｍａ，　Ｉ．　Ｇｏｒａｉ，　Ｋ．　Ｎｉｓｈｉｏｋａ，　ａｎｄ　Ｋ．　Ｏｋｕｄａ．　１９９７．　ＨＩＶ−１−ｓｐｅｃｉｆｉ　　　　　ｃ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｗｅ　　　　　ｒｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｂｙ　ｍａｎｎａｎ−ｃｏａｔｅｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｂｙ　ａｎｔｉ−ｉ　　　　　ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ　ａｎｔｉｂｏｄｙ．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９２　：　１１１．
【非特許文献２７】
Ｏｋａｄａ，　Ｅ．，　Ｓ．　Ｓａｓａｋｉ，　Ｎ．　Ｉｓｈｉｉ，　Ｉ．　Ａｏｋｉ，　Ｔ．　Ｙａｓｕｄａ，　Ｋ．　Ｎｉｓｈｉｏｋ　　　　　ａ，　Ｊ．　Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，　Ｊ．−Ｉ．　Ｍｉｙａｚａｋｉ，　Ｂ．　Ｗａｈｒｅｎ，　ａｎｄ　Ｋ．　Ｏｋｕｄａ．　１９９７　　　　　．　Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ　ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＤＮＡ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ＩＬ−１２−ａｎｄ　ｇｒａｎ　　　　　ｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　（ＧＭ−ＣＳＦ）−ｅｘｐｒｅｓｓｉ　　　　　ｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄｓ　ｉｎ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ｓｔｒｏｎｇ　ｍｕｃｏｓａｌ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａ　　　　　ｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＩＶ−１　ａｎｔｉｇｅｎｓ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１５９　：　　　　　　３６３８．
【非特許文献２８】
Ｈａｇｉｙａ，　Ｍ．，　Ｄ．Ｄ．　Ｄａｖｉｓ，　Ｔ．　Ｔａｋａｈａｓｈｉ，　Ｋ．　Ｏｋｕｄａ，　Ｗ．Ｃ．　Ｒａｓｃｈｋｅ，　　　　　ａｎｄ　Ｈ．　Ｓａｋａｎｏ．　１９８６．　Ｔｗｏ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ａｂｅｌ　　　　　ｓｏｎ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ−　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｃｅｌｌｓ　：　ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏ　　　　　ｒ　Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３　：　１４　　　　　５．
【非特許文献２９】
Ｈｅｒｒ，　Ｗ．，　Ｂ．　Ｌｉｎｎ，　Ｎ．　Ｌｅｉｓｔｅｒ，　Ｅ．　Ｗａｎｄｅｌ，　Ｋ．Ｈ．　Ｍｅｙｅｒ　ｚｕｍ　Ｂｕｓｃｈ　　　　　ｅｎｆｅｌｄｅ，　ａｎｄ　Ｔ．　Ｗｏｌｆｅｌ．　１９９７．　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｖｉｄ　　　　　ｅｏ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ８＋　Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ　ｓｐｏｔｓ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｐｅｐ　　　　　ｔｉｄｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０３　：　１４１．
【非特許文献３０】
Ｂｅｅｋｍａｎ，　Ｎ．　Ｊ．，　Ｐ．Ａ．　ｖａｎ　Ｖｅｅｌｅｎ，　Ｔ．　ｖａｎ　Ｈａｌｌ，　Ａ．　Ｎｅｉｓｉｇ，　Ａ．　Ｓｉ　　　　　ｊｔｓ，　Ｍ．　Ｃａｍｐｓ，　Ｐ．Ｍ．　Ｋｌｏｅｔｚｅｌ，　Ｊ．Ｊ．　Ｎｅｅｆｊｅｓ，　Ｃ．Ｊ．　Ｍｅｌｉｅｆ，　ａｎｄ　Ｆ　　　　　．　Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ．　２０００．　Ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＴＬ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｂｙ　ｓｉｎ　　　　　ｇｌｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ　　　　　　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｓｉｔｅ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６４　：　１８９８．
【非特許文献３１】
Ｌｕｃｃｈｉａｒｉ−Ｈａｒｔｚ，　Ｍ．，　Ｐ．Ｍ．　ｖａｎ　Ｅｎｄｅｒｔ，　Ｇ．　Ｌａｕｖａｕ，　Ｒ．　Ｍａｉｅｒ，　Ａ．　　　　　Ｍｅｙｅｒｈａｎｓ，　Ｄ．　Ｍａｎｎ，　Ｋ．　Ｅｉｃｈｍａｎｎ，　ａｎｄ　Ｇ．　Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ．　２０００．　Ｃｙｔｏ　　　　　ｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ｏｆ　ＨＩＶ−１　Ｎｅｆ　：　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉ　　　　　ｐｌｅ　ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃｌａｓｓ　Ｉ　ｌｉｇａｎｄ　　　　　ｓ　ｂｙ　ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ．　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１９１　：　２３９．
【非特許文献３２】
Ｒｏｃｋ，　Ｋ．Ｌ．，　ａｎｄ　Ａ．Ｌ．　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ．　１９９９．　Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｐｒｏｔｅ　　　　　ｉｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　Ｉ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ．　Ａｎｎｕ　　　　　　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１７　：　７３９．
【非特許文献３３】
Ｎｕｓｓｂａｕｍ，　Ａ．Ｋ．，　Ｃ．　Ｋｕｔｔｌｅｒ，　Ｋ．−Ｐ．　Ｈａｄｅｌｅｒ，　Ｈ．−Ｇ．　Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ．　ａｎ　　　　　ｄ　Ｈ．　Ｓｃｈｉｌｄ．　２００１．　ＰＡＰｒｏＣ　：　ａ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍｆｏｒ　ｐｒｏｔｅａｓｏ　　　　　ｍａｌ　ｃｌｅａｖａｇｅｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＷＷＷ．　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ　５３　：　８７．
【非特許文献３４】
Ａｈｌｅｒｓ，　Ｊ．Ｄ．，　Ｃ．Ｄ．　Ｐｅｎｄｌｅｔｏｎ，　Ｎ．　Ｄｕｎｌｏｐ，　Ａ　Ｍｉｎａｓｓｉａｎ，　Ｐ．Ｌ．　Ｎａｒ　　　　　ａ，　ａｎｄ　Ｊ．　Ａ．　Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ．　１９９３．　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ＨＩＶ−１　ｐｅｐｔｉｄｅ　　　　　　ｖａｃｃｉｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ａ　ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｔ　　　　　ｏ　ａ　Ｖ３　ｌｏｏｐ　ｐｅｐｔｉｄｅ　１８　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｓｔｒｏｎｇ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｒ　　　　　ｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｉｎ　ｍｉｃｅ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ＭＨＣ　ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｗｏ　ｉｍｍｕｎｉｚａ　　　　　ｔｉｏｎ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５０　：　５６４７．
【非特許文献３５】
Ｄａｉ，　Ｚ．，　Ｂ．Ｔ．　Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ，　ａｎｄ　Ｆ．Ｇ．　Ｌａｋｋｉｓ．　２０００．　Ｔｈｅ　ｄｕａｌ　ｒｏｌｅ　　　　　ｏｆ　ＩＬ−２　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｏｆ　ＣＤ８＋　ｍｅｍｏｒｙ　Ｔ　ｃｅｌ　　　　　ｌｓ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１６５　：　３０３１．
【非特許文献３６】
Ｔｓｕｊｉ，　Ｔ．，　Ｋ．　Ｈａｍａｊｉｍａ，　Ｊ．　Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，　Ｋ．−Ｑ．　Ｘｉｎ，　Ｎ．　Ｉｓｈｉｉ，　Ｉ．　　　　　Ａｏｋｉ，　Ｙ．　Ｉｓｈｉｇａｔｓｕｂｏ，　Ｋ．　Ｔａｎｉ，　Ｓ．　Ｋａｗａｍｏｔｏ，　Ｙ．　Ｎｉｔｔａ，　Ｊ．　Ｍｉｙａｚ　　　　　ａｋｉ，　Ｗ．Ｃ．　Ｋｏｆｆ，　Ｔ．　Ｏｋｕｄｏ，　ａｎｄ　Ｋ．　Ｏｋｕｄａ．　１９９７．　Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃ　　　　　ｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ＨＩＶ−１　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｏｉｎｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ　　　　　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ　ＨＩＶ−１　ａｎｔｉｇｅｎ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＩＬ−１２　　　　　．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５８　：　４００８．
【非特許文献３７】
Ｇｏｒｎｙ，　Ｍ．Ｋ．，　Ｊ．Ｙ．　Ｘｕ，　Ｓ．　Ｋａｒｗｏｗｓｋａ，　Ａ．　Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，　ａｎｄ　Ｓ．　Ｚｏｌｌ　　　　　ａ−Ｐａｚｎｅｒ．　１９９３．　Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｏｆ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎ　　　　　ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｖ３　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ＨＩＶ−１　ｇｐ１２０．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　　　　　１５０　：　６３５．
【非特許文献３８】
Ｊｕｖｉｅｒ−Ｍａｕｒｉｎ，　Ｖ．，　Ｓ．　Ｓａｒａｇｏｓｔｉ，　Ｊ．Ｌ．　Ｐｅｒｒｅｔ，　Ｅ．　Ｍｐｏｕｄｉ，　Ｅ．　Ｅｓ　　　　　ｕ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，　Ｃ．　Ｍｕｌａｎｇａ，　Ｆ．　Ｌｉｅｇｅｏｉｓ，　Ｍ．　Ｅｋｗａｌａｎｇａ，　Ｅ．　Ｄｅｌａｐｏｒｔ　　　　　ｅ，　ａｎｄ　Ｍ．　Ｐｅｅｔｅｒｓ．　１９９９．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｅｆ　ｇ　　　　　ｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｇｒｏｕｐ　Ｍ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｒ　　　　　ｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　Ａ，　Ｂ，　Ｃ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｇ，　ａｎｄ　Ｈ．　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ　　　　　　Ｈｕｍ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．　１５　：　２３．
【非特許文献３９】
Ｒａｎｋｉ，　Ａ．，　Ｊ．　Ｓｕｎｉ，　Ｖ．　Ｂｌａｚｅｖｉｃ，　Ｐ．　Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ，　Ｓ．　Ｍａｔｔｉｎｅｎ，　Ｋ．　　　　　　Ｋｒｏｈｎ，　ａｎｄ　Ｓ．　Ｖａｌｌｅ．　１９９７．　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＨＩＶ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　　　　　　ｉｎ　ＨＩＶ−ｓｅｒｏｒｅｖｅｒｔｅｄ　ｐｅｒｓｏｎｓ．　ＡＩＤＳ．　１１　：　１３２．
【非特許文献４０】
Ｗｏｌｉｎｓｋｙ，　Ｓ．Ｍ．，　Ｂ．Ｔ．　Ｋｏｒｂｅｒ，　Ａ．Ｕ．　Ｎｅｕｍａｎｎ，　Ｍ．　Ｄａｎｉｅｌｓ，　Ｋ．　Ｊ．　Ｋｕｎｓｔｍａｎ，　Ａ．Ｊ．　Ｗｈｅｔｓｅｌｌ，　Ｍ．Ｒ．　Ｆｕｒｔａｄｏ，　Ｙ．　Ｃａｏ，　Ｄ．Ｄ．　Ｈｏ，　ａｎｄ　Ｊ．　　　　　Ｔ．　Ｓａｆｒｉｔ．　１９９６．　Ａｄａｐｔｉｖｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　　　　　ｖｉｒｕｓ−ｔｙｐｅ　１　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａｌ　ｃｏｕｒｓｅ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２　　　　　７２　：　５３７．
【非特許文献４１】
Ｄａｄａｇｌｉｏ，　Ｇ．，　Ａ．　Ｌｅｒｏｕｘ，　Ｐ．　Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ，　Ｅ．Ｍ．　Ｂａｈｒａｏｕｉ，　Ｆ　　　　　．　Ｔｒａｉｎｃａｒｄ，　Ｒ．　Ｆｉｓｈｅｒ，　ａｎｄ　Ｆ．　Ｐｌａｔａ．　１９９１．　Ｅｐｉｔｏｐｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ　　　　　ｎ　ｏｆ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ＨＩＶ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍ　　　　　ｐｈｏｃｙｔｅｓ．　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４７　：　２３０２．
【非特許文献４２】
Ｊａｓｓｏｙ，　Ｃ．，　Ｔ．　Ｈａｒｒｅｒ，　Ｔ．　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，　Ｂ．Ａ．　Ｎａｖｉａ，　Ｊ．　Ｗｏｒｔｈ，　Ｒ．Ｐ　　　　　．　Ｊｏｈｎｓｏｎ，　ａｎｄ　Ｂ．Ｄ．　Ｗａｌｋｅｒ．　１９９３．　Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　　　　　　ｔｙｐｅ　１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｇａｍｍａ　ｉｎｔｅｒｆｅ　　　　　ｒｏｎ，　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ　ａｌｐｈａ　（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ），　ａｎｄ　ＴＮＦ−ｂｅｔａ　ｗｈｅ　　　　　ｎ　ｔｈｅｙ　ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ　ｔｈｅｉｒ　ｔａｒｇｅｔ　ａｎｔｉｇｅｎｓ．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．　６７　：　２８４４．
【非特許文献４３】
Ｂｅｔｔｓ，　Ｍ．Ｒ．，　Ｊ．Ｐ．　Ｃａｓａｚｚａ，　Ｂ．Ａ．　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，　Ｓ．　Ｗａｌｄｒｏｐ，　Ｗ．　Ｔｒｉｇ　　　　　ｏｎａ，　Ｔ．Ｍ．　Ｆｕ，　Ｆ．　Ｋｅｒｎ，　Ｌ．　Ｊ．　Ｐｉｃｋｅｒ，　ａｎｄ　Ｒ．Ａ．　Ｋｏｕｐ．　２０００．　Ｐｕｔａ　　　　　ｔｉｖｅ　ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＣＤ８（　　　　　＋）　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｃａｎｎｏｔ　ｂｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂ　　　　　ｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃｌａｓｓ　Ｉ　ｈａｐｌｏｔｙｐｅ．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．　７４　：　９１４４．
【非特許文献４４】
Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，　Ｐ．，　Ｓ．　Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓ，　Ｓ．　ＭｃＡｄａｍ，　Ｊ．　Ｅｄｗａｒｄｓ，　Ｓ．　Ｄａｅ　　　　　ｎｋｅ，　Ｄ．　Ｌａｌｌｏｏ，　Ｂ．　Ｋｏｐｐｅ，　Ｗ．　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，　Ｄ．　Ｂｏｙｄ，　ａｎｄ　Ａ．　Ｅｄｗａｒｄ　　　　　ｓ，　ｅｔ　ａｌ．　１９９４．　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｄ　ｂｙ　ｎａｔｕｒ　　　　　ａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　ＨＩＶ−１　Ｇａｇ　ｖａｒｉａｎｔｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　３６９　：　４０３．
【非特許文献４５】
Ｈａｙ，　Ｃ．Ｍ．，　Ｄ．Ｊ．　Ｒｕｈｌ，　Ｎ．Ｏ．　Ｂａｓｇｏｚ，　Ｃ．Ｃ．　Ｗｉｌｓｏｎ，　Ｊ．Ｍ．　Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌ　　　　　ｅｙ，　Ｍ．Ｐ．　ＤｅＰａｓｑｕａｌｅ，　Ｒ．Ｔ．　Ｄ’Ａｑｕｉｌａ，　Ｓ．Ｍ．　Ｗｏｌｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｍ．　Ｃｒａｗｆｏｒｄ，　Ｄ．Ｃ．　Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，　ａｎｄ　Ｂ．Ｄ．　Ｗａｌｋｅｒ．　１９９９．　Ｌａｃｋ　ｏｆ　ｖｉｒａｌ　ｅｓｃａ　　　　　ｐｅ　ａｎｄ　ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　　　　　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１−ｓｅｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｔ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｒａｐｉｄｌｙ　ｐｒｏｇ　　　　　ｒｅｓｓｉｖｅ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．　７３　：　５５０９．
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記１９のエピトープの各々を単独でコードするＤＮＡを含む従来技術のＤＮＡワクチンの多数のＨＩＶ−１株に対する感染予防能は満足できるものではなく、さらに高い感染予防能を有するより多数のＨＩＶ−１に対するＤＮＡワクチンを提供する必要が未だ在る。さらに、生体内に投与されるＤＮＡワクチン中に含まれるエピトープＤＮＡがＨＩＶ−１に組み込まれて、生体内で危険な組換えウイルスが出現する危険を回避しなければならない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、ＨＩＶ−１　ｃｌａｄｅ　Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＥの保護抗原として報告された上記１９の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ヒト化コドンを用いて合成した（非特許文献１０〜１５参照）。本発明においては、抗原性エピトープをコードするＤＮＡだけを選択し、かつ、ヒト化コドンを用いて上記ＤＮＡ合成した。ヒト化又は最適化コドンは、強い免疫原性を誘導すると報告されている（非特許文献１０〜１４参照）。上述のように、本発明においては、非免疫原性領域をコードする遺伝子は除かれている。
【０００６】
したがって、本発明に係る多価ＤＮＡワクチンは、多数の抗原性エピトープをコードするＤＮＡを用いて合成された新規ＤＮＡワクチンである。
【０００７】
すなわち、本発明の１の態様においては、以下の１９個のエピトープ：ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３、ＣＤ４結合部位、ｇｐ１２０　ＣＴＬ、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ、ｎｅｆ　ＣＴＬ、Ｒｅｖ　ＣＴＬ、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１、Ｔａｔ
ＣＴＬ−２、Ｖ３　ＣＴＬ、Ｖ４　ＣＴＬ、ｇｐ４１−１、ｇｐ４１−２、Ｇａｇ　ＣＴＬ−１、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−２を、それぞれコードする各ＤＮＡを結合して成るヌクレオチドを含む、ＨＩＶに対する多価ＤＮＡワクチンが提供される。前記多価ＤＮＡワクチンは、ＨｅｌｐｅｒエピトープをコードするＤＮＡを含むことができる。また、前記多価ＤＮＡワクチンは、ＣＭＶプロモーター又はＣＡＧＧＳプロモーターを含むことができる。前記各ＤＮＡは、ヒト型化コドンを用いてコードされることができる。例えば、前記ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３（ペプチドＡ１）をコードするＤＮＡは配列番号１をもち、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３（ペプチドＡ２）をコードするＤＮＡは配列番号２をもち、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３（ペプチドＡ３）をコードするＤＮＡは配列番号３をもち、ｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３（ペプチドＡ４）をコードするＤＮＡは配列番号４をもち、ＣＤ４結合部位をコードするＤＮＡは配列番号５をもち、ｇｐ１２０　ＣＴＬをコードするＤＮＡは配列番号６をもち、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇをコードするＤＮＡは配列番号７をもち、ｎｅｆ　ＣＴＬ（ペプチドＡ５）をコードするＤＮＡは配列番号８をもち、Ｒｅｖ　ＣＴＬをコードするＤＮＡは配列番号９をもち、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１をコードするＤＮＡは配列番号１０をもち、Ｔａｔ　ＣＴＬ−２（ペプチドＡ６）をコードするＤＮＡは配列番号１１をもち、Ｖ３　ＣＴＬをコードするＤＮＡは配列番号１２をもち、Ｖ４　ＣＴＬ（ペプチドＡ７）をコードするＤＮＡは配列番号１３をもち、ｇｐ４１−１（ペプチドＡ８）をコードするＤＮＡは配列番号１４をもち、ｇｐ４１−２（ペプチドＡ９）をコードするＤＮＡは配列番号１５をもち、Ｇａｇ　ＣＴＬ−１（ペプチドＡ１０）をコードするＤＮＡは配列番号１６をもち、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２（ペプチドＡ１１）をコードするＤＮＡは配列番号１７をもち、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１（ペプチドＡ１２）をコードするＤＮＡは配列番号１８をもち、そしてＰｏｌ　ＣＴＬ−２をコードするＤＮＡは配列番号１９をもつことができる。
【０００８】
前記１９個の各ＤＮＡは、タンデムに配置され、そしてそのタンデムに配置されたヌクレオチド成分内では前記各ＤＮＡは直接結合されたものであることができる。例えば、前記１９個の各ＤＮＡは、５′→３′の方向において、ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３、ｃｌａｄｅ　ＥＶ３、ＣＤ４結合部位、ｇｐ１２０　ＣＴＬ、ｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ、ｎｅｆ　ＣＴＬ、Ｒｅｖ　ＣＴＬ、Ｔａｔ　ＣＴＬ−１、Ｔａｔ　ＣＴＬ−２、Ｖ３　ＣＴＬ、Ｖ４　ＣＴＬ、ｇｐ４１、Ｇａｇ、Ｇａｇ　ＣＴＬ−１、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１、Ｐｏｌ　ＣＴＬ−２の順序で結合されたものであることができる。
【０００９】
本発明の他の態様においては、前記多価ＤＮＡワクチンを、ＩＬ−２／Ｉｇと混合して得られる、ＨＩＶ−１に対する混合多価ＤＮＡワクチンが提供される。
【００１０】
マウスの卵巣アッセイ系を用いて、ＨＩＶ−ワクシニア・キメラ・ウイルスに対する保護免疫が報告されている（非特許文献１６参照）。本発明者は、新規タイプのＤＮＡワクチン接種により誘導される保護活性を評価するために上記アッセイ系を使用した。
【００１１】
ヒト化され、かつ、多数のＤＮＡを含むＨＩＶ−１に対する本発明に係る新規タイプの多価ワクチン（ｈＤＮＡワクチン）は、抗原特異性的保護免疫を誘導するために従来作製されたＤＮＡワクチンよりも有効である。なぜなら、本発明に係る多価ＤＮＡワクチンは、抗原性エピトープをコードする多様な遺伝子を含有するからである。以下の実施例中に述べるように、本発明に係るｈＤＮＡワクチンは、従来技術のＨＩＶ−１　ＤＮＡワクチンよりも強い免疫応答を誘導し、そして、組換えＨＩＶ−ワクシニア・ウイルスを用いたとき、より強い保護免疫を誘導した（非特許文献１６参照）。ワクチン内にＨＩＶ−１のｈｅｌｐｅｒエピトープが含まれる場合、そのワクチンの免疫原性を高めることが報告されている（非特許文献１８〜２０参照）。したがって、本発明者は、本発明に係るｈＤＮＡワクチンを担持するプラスミド内にｈｅｌｐｅｒエピトープをコードするＤＮＡを挿入することにより、本発明に係るｈＤＮＡワクチンの免疫原性をさらに高めることができるのではないかと考え、実験を重ねた結果、上記効果が発揮されることを確認した。
【００１２】
ＨＩＶ−１のエピトープｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３のアミノ酸配列を、配列番号２０に示す。ｃｌａｄｅ　Ｃ　Ｖ３を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ１ともいう。
【００１３】
ＨＩＶ−１のエピトープｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３のアミノ酸配列を、配列番号２１に示す。ｃｌａｄｅ　Ａ　Ｖ３を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ２ともいう。
【００１４】
ＨＩＶ−１のエピトープｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３のアミノ酸配列を、配列番号２２に示す。ｃｌａｄｅ　Ｂ　Ｖ３を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ３ともいう。
【００１５】
ＨＩＶ−１のエピトープｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３のアミノ酸配列を、配列番号２３に示す。ｃｌａｄｅ　Ｅ　Ｖ３を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ４ともいう。
【００１６】
ＨＩＶ−１のエピトープＣＤ４結合部位のアミノ酸配列を、配列番号２４に示す。
【００１７】
ＨＩＶ−１のエピトープｇｐ１２０　ＣＴＬのアミノ酸配列を、配列番号２５に示す。
【００１８】
ＨＩＶ−１のエピトープｇｐ４１　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇのアミノ酸配列を、配列番号２６に示す。
【００１９】
ＨＩＶ−１のエピトープｎｅｆ　ＣＴＬのアミノ酸配列を、配列番号２７に示す。ｎｅｆ　ＣＴＬを、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ５ともいう。
【００２０】
ＨＩＶ−１のエピトープＲｅｖ　ＣＴＬのアミノ酸配列を、配列番号２８に示す。
【００２１】
ＨＩＶ−１のエピトープＴａｔ　ＣＴＬ−１のアミノ酸配列を、配列番号２９に示す。
【００２２】
ＨＩＶ−１のエピトープＴａｔ　ＣＴＬ−２のアミノ酸配列を、配列番号３０に示す。Ｔａｔ　ＣＴＬ−２を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ６ともいう。
【００２３】
ＨＩＶ−１のエピトープＶ３　ＣＴＬのアミノ酸配列を、配列番号３１に示す。
【００２４】
ＨＩＶ−１のエピトープＶ４　ＣＴＬのアミノ酸配列を、配列番号３２に示す。Ｖ４　ＣＴＬを、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ７ともいう。
【００２５】
ＨＩＶ−１のエピトープｇｐ４１−１のアミノ酸配列を、配列番号３３に示す。ｇｐ４１−１を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ８ともいう。
【００２６】
ＨＩＶ−１のエピトープｇｐ４１−２のアミノ酸配列を、配列番号３４に示す。ｇｐ４１−２を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ９ともいう。
【００２７】
ＨＩＶ−１のエピトープＧａｇ　ＣＴＬ−１のアミノ酸配列を、配列番号３５に示す。Ｇａｇ　ＣＴＬ−１を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ１０ともいう。
【００２８】
ＨＩＶ−１のエピトープＧａｇ　ＣＴＬ−２のアミノ酸配列を、配列番号３６に示す。Ｇａｇ　ＣＴＬ−２を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ１１ともいう。
【００２９】
ＨＩＶ−１のエピトープＰｏｌ　ＣＴＬ−１のアミノ酸配列を、配列番号３７に示す。Ｐｏｌ　ＣＴＬ−１を、本願明細書中、適宜、ペプチドＡ１２ともいう。
【００３０】
ＨＩＶ−１のエピトープＰｏｌ　ＣＴＬ−２のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。
【００３１】
Ｈｅｌｐｅｒエピトープのアミノ酸配列を、配列番号４０に示す。
【００３２】
上記各エピトープのアミノ酸配列情報に基づき、ヒト型化コドンを用いて、各エピトープに対応するＤＮＡを、それぞれ、合成する。合成された各ＤＮＡを、常法により結合し、図１〜図２に示す塩基配列をもつ８２５ｂｐのＤＮＡを作製した。図３は、かかる８２５ｂｐのＤＮＡを含むＤＮＡワクチンが生体内でどのようなエピトープを提供するか、及び提示される各エピトープの位置関係を表す概略図である。
【００３３】
本発明の目的は、ＨＩＶの抗原性エピトープをコードする１９の遺伝子から構成される新規ＤＮＡのワクチンを製造することである。この新規タイプのＤＮＡワクチンは、有害なウイルスを産生する危険を低下させるであろう。なぜなら、体内に多数のＨＩＶ−１のＤＮＡが注射されるとき、有害なウイルスを誘導する場合があるからである。さらに、１のワクチン内に、保護エピトープをコードする多数の遺伝子を挿入することができた。これは、理想的な多価保護ワクチンの製造のために有用である。
【００３４】
図７に示すように、上記１９の遺伝子を含有するプラスミドが４０ｋＤのポリペプチドを合成したことは明らかである。しかしながら、ウェスタン・ブロット技術によっては感染細胞からの抽出物を用いて上記の強いバンドを観察することはできなかった。この４０ｋＤポリペプチドの抗原プロセッシングが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内のプロテオソーム又はいくつかのプロセッシング段階において理想的に生じるのかどうかは、未だ明らかではない（非特許文献３０〜３３参照）。各ポリペプチドに対する免疫応答がＥＬＩＳＡ及びＤＴＨ応答を用いて観察されたので（表２及び表３参照）、いくつかのポリペプチドが適正にプロセッシングされたことは容易に推定される。本発明者は、現在、２つの抗原決定基の間にリジン−リジンを挿入し、そして抗原決定基の間に１９のスペーサーを含むＤＮＡワクチンを製造している。さらに、本発明者は、本発明に係るｈＤＮＡプラスミドによりトランスフェクトされている細胞溶解産物を用いて上記４０ｋＤバンドを検出することはできなかった。上記点を結論するためにはさらなる試験が必要である。
【００３５】
図９に示すようにヒト化コドンＤＮＡは、慣用のＤＮＡワクチン（ｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ）よりも、ｇｐ１２０に対してより高いレベルの抗体力価を誘導し、そしてこの抗体レベルは、ＩＬ−２／Ｉｇプラスミドを本発明に係るＤＮＡはワクチンと共に投与したとき、さらに上昇した。また、ＥＬＩＳＡのためのコーティング抗原として上記抗原ペプチドを使用したとき、ペプチドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、及びＡ１０に対して、高レベルの抗体産生が観察された（以下、表２参照）。Ａ５、Ａ６、Ａ９、及びＡ１２ペプチドに対する抗体力価は低かった。Ａ１〜Ａ４は抗体に関するペプチドであり、そしてＡ５〜１２のペプチドはＣＴＬエピトープとして主に報告されているので、上記の結果は容易に説明される（非特許文献９参照）。本試験において、全てのエピトープをテストしなかったけれども、本発明者は、本発明に係るｈＤＮＡにより免疫化されたマウスからの抗体がいくつかのＣＴＬエピトープも反応したという証拠を観察しえた。上記抗体がＣＴＬエピトープに対して生じた理由は明らかでないが、本発明者は、合成ポリペプチドのＣＴＬエピトープの３次構造がＨＩＶ感染過程において形成される構造とは異なっているからであると考える。
【００３６】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、及びＡ１１エピトープに対するＤＴＨ応答に関しては、陽性応答が観察された。上記結果は、いくつかの遺伝子が適正に発現し、そして本発明に係るｈＤＮＡワクチンのペプチドＡ８、Ａ１０、及びＡ１１を用いてＤＴＨ応答を誘導していることを示唆している。上記結果は、本発明に係る新規ＤＮＡワクチンが、全ｇｐ１２０タンパク質に対して強い免疫応答を誘導していることをも明らかにした。ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより観察されるとき、本発明に係る新規タイプのＤＮＡワクチンは、ＨＩＶ関連抗原に対して最高レベルのＩＦＮ−γ生産を誘導した（図１１参照）。（Ｄ８＋産生細胞とＩＮＦ−γ＋産生細胞は、ＣＴＬ応答と相関すると報告されている（非特許文献９参照）。本試験において、本発明者は、ＥＬＩｓｐｏｔ（図１１）、及びＩＣＣＳアッセイ（図１２）により、ＨＩＶ−特異的免疫応答の活性化を確認した。さらに、Ａ６、Ａ８、Ａ９、及びＡ１１抗原に対する細胞仲介免疫応答も、上記技術を用いて観察された。上記エピトープの中のいくつかは、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの血清又は脾臓細胞と反応しなかった。本試験において、本発明者は、ＣＴＬのための抗原性エピトープ、及び抗体誘導のためのエピトープであると報告されているものだけを使用した。本発明者は、これらのエピトープがＨ−２ｄハプロタイプのマウスと反応するかどうかについて詳しく試験しなかった。
【００３７】
Ａｈｌｅｒｓら（非特許文献３４参照）は、ヘルパー・エピトープとＨＩＶエピトープの錯合体がＨＩＶ抗原の免疫原性を高めるということを報告している。本発明者は、ヘルパー・エピトープの追加により免疫原性が高められることを確認した。ヘルパー・エピトープを用いることにより、ＣＴＬのための抗原性エピトープであると報告されているＨＩＶワクチンを、そしてペプチド系を用いた抗体誘導をより良いものにすることができる（非特許文献３４参照）。
【００３８】
ＩＬ−２／Ｉｇは、抗体の形成を高めることができるが、細胞免疫応答を高めていなかった。記憶Ｔ細胞の生成及び維持におけるＩＬ−２の２重の役割が報告されている（非特許文献３５参照）。この点について結論するにはさらなる試験が必要である。ＩＬ−１２プラスミドは、本試験における系を用いて、細胞免疫応答と保護免疫の両者を高めた。Ｔｓｕｊｉら（非特許文献３６）は、同様の現象を観察している。本試験の結果は、サイトカイン・アジュバントの添加が、本発明に係るｈＤＮＡワクチンの効果を高め又は変更するのであろうと示唆した。
【００３９】
ｖＰＥ１６又はｖＰ１２０６によりマウスを感染させたとき、本発明に係る新規タイプのＤＮＡワクチンで免疫化されたマウスにおいて、卵巣内のウイルス力価がかなり低下したことは非常に興味深い（図１３、及び図１４参照）。さらに、ＩＬ−１２プラスミドを添加したとき、その保護効果が高められた。上記感染試験においては、本発明者は、２つの組換えワクシニア・ウイルスを使用した。ｖＰＥ１６は、ＨＩＶ−１　Ｅｎｖを取り込んだワクシニア・ウイルスであり、そしてｖＰ１６０２は、Ｇａｇ・Ｐｏｌを取り込んだワクシニア・ウイルスである。本発明者は、上記両ワクシニア・ウイルスにおいて、低下したレベルのワクシニア・ウイルス力価を観察した。特に、高いレベルの、ｖＰ１６０２ウイルス増殖阻害が観察された。ＣＴＬエピトープのための多数の遺伝子が本発明に係るｈＤＮＡワクチンに含まれることが、上記観察結果を説明する。ＨＩＶ　Ｅｎｖ関連ワクシニアにより感染させた場合よりも、ＨＩＶ　Ｇａｇ・Ｐｏｌワクシニア・ウイルスにより感染させた場合、保護効果は強いであろう。
【００４０】
本発明に係る新規タイプのＤＮＡワクチンによりポリペプチドが生産された後のプロセッシング段階に関しては未だ十分に試験していないけれども、本発明者は、抗原性エピトープをコードする多数の遺伝子を一体にした本発明に係るｈＤＮＡワクチンが、ＨＩＶ−１ワクシニア・キメラ・ウイルスの感染試験において高レベルの保護効果を示すことを発見した。さらに検討すべき点が未だ残っているけれども、本発明に係るｈＤＮＡワクチンは、さまざまに微生物感染に対して非常に有効かつ安全なワクチンであるといえる。
【００４１】
以下の実施例において本発明を説明するが、かかる実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【００４２】
【実施例】
実施例１：実験材料及び方法
プラスミドＤＮＡ：
ＨＩＶ−１　ＩＩＩＢのｅｎｖ遺伝子とｒｅｖ遺伝子をそれぞれコードするｐＣＭＶ１６０　ＩＩＩＢとｐｃＲＥＶ、及びこれら２つのプラスミドの混合物（ｐＣＭＶＩＩＩＢ）は、報告されている（非特許文献３参照）。本発明に係る新規タイプのｈＤＮＡワクチンを、ＨＩＶ−１の抗原性エピトープをコードする１９の遺伝子を連結することにより作製した（図３参照）。上記抗原性エピトープをＨＩＶ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｄａｔａｂａｓｅからのデータにより選択した（非特許文献９参照）。上記合成プラスミドを、ｐＣＭＶベクター系又はｐＣＡＧＧＳベクター系内に挿入した（図７参照）。全てのコドンを、ヒト化又は最適化されたコドン用法に従って合成した（非特許文献１０〜１５参照）。図１と２に、上記の連結された１９の遺伝子の塩基配列を示す。本発明に係るｈＤＮＡワクチンのＤＮＡ配列を、ＰＣＲ法により確認した。Ｉｌ−２遺伝子とＩｇ遺伝子のＦｃ領域から成る融合プラスミドであるＩＬ−２／Ｉｇプラスミドは、Ｂｅｔｈ　Ｉｓｒａｅｌ　Ｄｅａｃｏｎｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｈｏｏｌ，　ＢｏｓｔｏｎのＮ．　Ｌｅｔｖｉｎ博士により寄贈されたものであった（非特許文献２１〜２３参照）。ｐＣＡＧＧＳＩＬ−１２（ｐＩＬ−１２）と命名されたマウスＩＬ−１２発現プラスミドを、先に記載されたように構築した（非特許文献２１と２４参照）。
【００４３】
実験動物：
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを、Ｓａｐａｎ　ＳＬＣ，　Ｉｎｃ．（静岡県、日本国）から購入した。上記動物を、水平層流キャビネット内で飼育し、そして無菌の食餌と水を与えた。学内動物ケア及び使用委員会は、上記マウスの使用及びケアに関する手順の全てを許可した。
【００４４】
合成ペプチド：
全抗原性ペプチドを、Ｓａｗａｄｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（東京都、日本国）から購入した。以下の表１：
【００４５】
【表１】
2004002343.tif 000002
【００４６】
に、Ａ１〜Ａ１２抗原性ペプチドのアミノ酸配列等を示す。全ペプチドを、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、そして内毒素を含まないことを確認した。クジラ精子ミログロビンも使用した（非特許文献２５参照）。上記ペプチドを、酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答、及びエフェクター細胞の再刺激に関するサイトカイン・アッセイの抗原として使用した。
【００４７】
ワクシニア・ウイルス・プロモーターを用いたブロッティング分析：
本発明に係るｈＤＮＡワクチンの発現を確認するために、本発明者は、（ＮＩＨのＢ．　Ｍｏｓｓ博士から寄贈された）ワクシニア・ウイルス伝達ベクター、ｐＪ５５のＥｃｏＲＩ部位に、上記ｈＤＮＡ断片をサブクローニングし、そしてＨＩＶ−１　ＩＩＩＢ由来のｇａｇ遺伝子の全長を、同一伝達ベクターのＮｏｔＩ部位にサブクローニングした（ｐＪＳ５／ｈＤＮＡ／ｇａｇ）。
【００４８】
７０〜８０％集密のＣＶ−１細胞を、１時間室温で感染多重度（ＭＯＩ）１０において、ワクシニア・ウイルス（ＮＩＨ　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ，　ＭＤにより寄贈されたＷＲ株）で感染させた。上記細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰＢＳ中０．０５％のトリプシン／０．０２％ＥＤＴＡを用いて収獲した。約１０６個の感染した細胞を、Ｋ−ＰＢＳバッファー（３１ｍＭ　ＮａＣｌ、１２０．７ｍＭ　ＫＣｌ、８．１ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で洗浄し、そしてエレクトロポレーション・キュベット（０．４ｃｍ、ＢｉｏＲａｄ）内に１０又は５０μｇのｐＪＳ５／ｈＤＮＡ／ｇａｇプラスミドを含む８００μｌのＫ−ＰＢＳバッファー中に懸濁させた。５００μＦＤの静電容量及び３３０ＶにおいてＧｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒを用いて、エレクトロポレーションを行った。上記細胞を、３日間５％ＣＯ２を含有する調湿雰囲気中３７℃で、２０％ＦＣＳ，ＤＭＥＭ培地中で培養した。上記の接種された細胞を、３回冷凍・解凍し、そして１回音波処理した。その後、上記細胞溶解産物を、４〜１２％グラジエントのポリアクリルアミド・ゲル上で分析し、そしてその後、Ｈｙｂｏｎｄ　ＥＣＬ　ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，　Ｅｎｇｌａｎｄ）に転写した。上記タンパク質を、抗Ｇａｇ特異的マウス・モノクローナル抗体（ＨＩＶ−１　ｐ２４　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，　ＡＧ３．０，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　４１２１，　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ，　ＭＤ）により検出した。
【００４９】
免疫感作：
マウスを、２週間の間隔で、２０μｇのｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ、空ベクター又は本発明に係るｈＤＮＡ　ＨＩＶワクチンにより３回、筋中免疫感作させた。いくつかの場合、１０μｇの、ｐＩＬ−２／Ｉｇ（非特許文献２０〜２３参照）又はＩＬ−２プラスミドを添加した。これらのワクチンを、カチオン・リポソームと混合することにより（非特許文献２６参照）、そしていくつかの場合には、サイトカイン・プラスミドと混合することにより、調製した。各免疫化されたプラスミドの合計容積は０．１ｍｌであった。ｐＣＭＶ−空ベクター対照を、同じやり方で調製し、そして同じ投与量と同じ間隔で投与した。各群は、５〜９匹のマウスから成っていた。
【００５０】
サンプル採取：
上記ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２週間間隔で３回筋中（ｉ．ｍ．）免疫化した。最後の免疫化から２週間後にジエチル・エーテルによる麻酔下、眼窩後穿刺により、マウス血清を採取し、そして４℃で保存した。糞便押出サンプルを、文献中に記載されるように調製した（例えば、非特許文献２７参照）。
【００５１】
酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：
文献中に記載されたように、抗原特異的ＩｇＧ又はＩｇＡ応答の滴定のために使用した（例えば、非特許文献２７参照）。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｆａｌｃｏｎ（ＮＪ）を、１０μｇ／ｍｌの、ｇｐ１２０タンパク質（Ａｕｓｔｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ　Ｒａｍｏｎｅ，　ＣＡ）、又は上記各合成ペプチドでコートした。
【００５２】
遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答：
遅延型過敏症応答を、先に記載された方法を用いて行った（非特許文献２８参照）。上記マウスを、本発明に係るｈＤＮＡワクチンで２週間毎に３回免疫化した。２週間後、上記マウスの肉趾に、ｇｐ１２０又は上記各合成ペプチドを注射した。５〜８マウスに、１０μｇの各ペプチド又はペプチド・カクテルを注射した。上記マウスの肉趾上の腫れ応答を、２４時間後に観察した。
【００５３】
ＩＦＮ−γ　ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、及びコンピュータ支援ビデオ画像分析（ＣＶＩＡ）：
脾臓細胞を、最後の本願に係るｈＤＮＡ免疫化から２週間後に単離し、そしてＮＦＮ−γ　ＥＬＩｓｐｏｔをアッセイを行った。簡単に言えば、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｅｄｆｏｒｓ，　ＭＡ）を、４℃で一夜ＰＢＳ中、５０μｌの、１０μｇ／ｍｌの精製ラット抗−マウスＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ　１．２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，　ＣＡ）でコートした。その後、上記プレートを、室温で２時間、ＰＢＳ−５％ＢＳＡと０．０２５％　Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックした。１〜１０×１０５の、脾臓から単離されたリンパ球を、３連で各ウェルに添加した。上記脾臓細胞を、３７℃で２４時間、１０μｇ／ｍｌの、ＨＩＶ　Ｖ３ペプチド（ＮＮＴＲＫＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ）で刺激した。対照ウェルは、クジラ精子ミオグロビン・ペプチド（ＡＬＶＥＡＤＶＡ）を含有していた（非特許文献２５参照）。インキュベーション後、細胞を取り出し、そして３７℃で２時間、０．５μｇ／ｍｌの、ビオチン化抗−マウスＩＮＦ−γ抗体（Ｃａｔ．　３３２１−２Ａ−２，　ＭＡＢＴＥＣＨ）とともにインキュベートし、その後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０（商標）と５％　ＢＳＡを含有するＰＢＳ中０．２％アルカリ・ホスファターゼ・ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）１００μｌ／ウェルを添加して、さらに１．５時間インキュベートした。最後に、上記プレートを２０分間室温で５０μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ膜ホスファターゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｅ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　ＭＤ）で処理し、そして上記反応を、蒸留水を流して停止させた。スポット数をＣＶＩＡにより自動測定した（非特許文献２９参照）。
【００５４】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）：
本アッセイを、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ　Ｐｌｕｓキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の製造者の指示書に従って行った。簡単に言えば、脾臓細胞を、２４時間、１０μｇ／ｍｌの上記ＨＩＶペプチドで刺激した。１μｇ／ｍｌのＧｏｌｇｉＰｌｕｇを、最後の２時間の刺激において添加した。細胞を、染色バッファーＰＢＳ中３％ＦＣＳ、０．１％　ＮａＮ３）で洗浄し、４％正常マウス血清でブロックし、そしてＰＥ標識された抗−マウスＣＤ８ａ抗体（Ｌｙ−２、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色した。その後、上記細胞を、２０分間４℃で２５０μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液中に懸濁させ、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で洗浄し、３分間４℃でＦＩＴＣ標識した抗マウスＩＮＦ−γ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）で染色し、その後、フロー・サイトメトリー分析を行った。
【００５５】
組換えワクシニア・ウイルスを用いた感染試験：
ウイルス感染実験を、先に記載されたように、最後の免疫化から２週間後に行った（非特許文献１６参照）。（ＮＩＨ　ＡＩＤＳ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ，　ＭＤ　；　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　３６２と４０９５からの）、ＨＩＶ−１　ｅｎｖ遺伝子とＨＩＶ−１　ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子をそれぞれ発現する組換えＨＩＶ−１ワクシニア・ウイルスｖＰＥ１６とｖＰ１２０６を本試験に使用した。簡単に言えば、最後の免疫化から２週間後に、マウスを、２．５×１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）のｖＰＥ１６又はｖＰ１２０６で直腸内感染させた。上記組換えＨＩＶ−１ワクシニア・ウイルスによる感染から６日後に、マウスを殺し、そして卵巣を取り出し、ホモジェナイズし、音波処理し、そしてＣＶＩ細胞プレート上逐次１０倍希釈法によりｖＰＥ１６力価についてアッセイし、クリスタル・バイオレットで染色し、そして各希釈においてプラークをカウントした。
【００５６】
統計学的分析：
２群の比較に関する統計学的分析を、分布パラメーターについての不対ｔ−検定又はバラツキの１元階乗分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、行った。有意差を、両分析においてｐ＜０．０５として定義した。
【００５７】
実施例２：ＣＭＶプロモーターを含む本願発明に係る多価ＤＮＡワクチンの抗体産生能
ＣＭＶプロモーターを含む本願発明に係る多価ＤＮＡワクチンと上記従来技術のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ　ＩＩＩＢを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの筋中にワクチン接種した。本願発明に係る多価ＤＮＡワクチン（ｈＤＮＡワクチンともいう）にＩＬ−２／Ｉｇを加えたもの、及びベクターにエピトープＤＮＡを含まないもの（空ベクター（対照））も、同様にワクチン接種した。初めに２０μｇをワクチン接種し、初回接種から１週間後と２週間後にブーストした。初回接種から３週間後（最後のブーストから１週間後）と７週間後に上記マウスから採血し、その血中の抗体力価を測定した。図４に示すように、抗体力価は、ｈＤＮＡワクチン＋ＩＬ−２／Ｉｇの場合に最も高く、ｈＤＮＡワクチン、ｐＣＭＶ　ＩＩＩＢと続いた。したがって、本願発明に係るＣＭＶプロモーターを含む多価ＤＮＡワクチンが従来技術のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ　ＩＩＩＢに比較して、かなり高い抗体産生能、すなわち免疫原性を有することが証明された。さらに、本願発明に係るＣＭＶプロモーターを含む多価ＤＮＡワクチンとＩＬ−２／Ｉｇを混合した場合、非常に高い免疫原性を示すことが判った。
【００５８】
実施例３：各種ＨＩＶ−１ペプチド（エピトープ）に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答
実施例２において使用した、ＣＭＶプロモーターを含むｈＤＮＡワクチン、上記ｈＤＮＡワクチン＋ＩＬ−２／Ｉｇ、ｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ、及び空ｐＣＭＶ（対照）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、２回（初回と２週間後）ワクチン接種した後、初回接種から４週間後に、ｇｐ１２０　ｇｐ４１−１、及びＶ３　ＣＴＬ各５μｇを、右足踵蹠に注入し、そして４８時間後に、その左足の腫脹応答を測定した。図５に示すように、ｈＤＮＡワクチン＋ＩＬ−２／Ｉｇが最も高い腫脹応答を示し、ｈＤＮＡワクチンとｐＣＭＶ　ＩＩＩＢがそれに続いた。また、ｈＤＮＡワクチンにより生じた腫脹応答は、従来技術のｐＣＭＶ　ＩＩＩＢにより生じたものに比較してかなり大きいものであることが判明した。従って、本発明に係る多価ＤＮＡワクチンは、従来技術のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ　ＩＩＩＢに比較して、高い免疫応答を誘発することが証明された。さらに、本発明に係る多価ＤＮＡワクチンは、ｎｅｆ　ＣＴＬ、Ｇａｇ　ＣＴＬ−２、及びＰｏｌ　ＣＴＬ−１に対しても有意差をもって、免疫反応を顕出したことが判明した。
【００５９】
実施例４：ＨＩＶ−ｇｐ１６０発現性組換えワクシニア・ウィルスに対する感染予防効果
ＣＭＶプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡワクチン、上記ｈＤＮＡワクチン＋ＩＬ−２／Ｉｇ、ｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ＋ＩＬ−２／Ｉｇ、及びｐＣＭＶｅｍｐｔｙ（対照としてＨＩＶ−１の遺伝子の挿入されていないもの）各２０μｇを、０、２、及び４週目に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの筋中に、ワクチン接種して免疫感作させた。最後のワクチン接種から２週間後（６週目）に、２．５×１０７ＰＦＵで、ＨＩＶ−ｇｐ１６０発現性ワクシニア・ウィルス（ｖＰＥ１６）を感染させた。上記ウィルス感染から１週間後に、上記マウスから卵巣を摘出して、その中のウィルスのウィルス数（ウィルス力価）を測定した。図６に示すように、ｈＤＮＡワクチンとｈＤＮＡワクチン＋ＩＬ−２／Ｉｇは、それぞれ、ｐＣＭＶ　ＩＩＩＢとｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ＋ＩＬ−２／Ｉｇに比較して、ｖＰＥ１６力価を有意に低下させていることが判かる。特に、ｈＤＮＡワクチン＋ＩＬ−２／Ｉｇで免疫感作されたマウスの卵巣中のウィルス力価は最も低く、かかる本願発明に係る多価ＤＮＡワクチンがＩＬ−２／Ｉｇと混合された場合、対照（ｐＣＭＶｅｍｐｔｙ）、及び従来技術のＤＮＡワクチンｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ（及びｐＣＭＶ　ＩＩＩＢ＋ＩＬ−２／Ｉｇ）に比較して、顕著な抗ウィルス効果を有することが分かる。
【００６０】
実施例５：本発明に係るｈＤＮＡプラスミドによりコードされる遺伝子産物の検出
本発明に係る合成ＤＮＡワクチンが所望のポリペプチドを正しく合成しているかどうか確認した。本発明者は、ｈＤＮＡワクチンにより製造されるポリペプチドを検出するためにワクシニア・ウイルス・プロモーターを使用した。上記ポリペプチドを抗−Ｇａｇモノクローナル抗体と反応させたとき、それぞれＧａｇと上記各合成ポリペプチドに対応する６５ｋＤａバンドと４０ｋＤａバンドを、ｐＪＳ５／ｈＤＮＡ／ｇａｇ−トランスフェクト・サンプル中に検出した（図７（Ａ）参照）。しかしながら、ＨＩＶ−１　ｇａｇ遺伝子を含有しない対照サンプル（ｐＣＭＶＩＩＩＢ）を用いたとき、上記２つのバンドは観察されなかった。天然の６．５ｋＤａのＧａｇバンドと比較したとき、上記ポリペプチドのバンドは弱かった。これは、上記モノクローナル抗体に結合するエピトープのが少量であるか又は上記ｈＤＮＡワクチンの免疫原性がより弱いことに因るかもしれない。別の実験において、ｈＤＮＡワクチンにより製造されるポリペプチドをＨＩＶ−１陽性ヒト血清と反応させたとき、上記ｈＤＮＡプラスミドが、上記モノクローナル抗−Ｇａｇ抗体又は抗−Ｅｎｖ抗体と反応するポリペプチドを正しく合成していることが判明した。
【００６１】
実施例６：抗体応答
本発明者は、本発明に係るＣＡＧＧＳプロモーターを含むｈＤＮＡの、３番目の免疫化の後の抗体レベルを調べた。図９に示すように、ｇｐ１２０に対する高レベルの抗体力価が、４週間後に観察され、そしてその抗体レベルは８週間後にあっても未だ高かった。これらの抗体力価は２０週間後に徐々に低下した。ＩＬ−２／Ｉｇと共に注射したとき、その抗体レベルは上昇した。ＩＬ−２発現プラスミドが同時に注射されたとき、その抗体力価は低下した。
【００６２】
次に、本発明者は、上記抗体が各合成ペプチドと反応するかどうかを調べた。以下の表２：
【００６３】
【表２】
2004002343.tif 000003
【００６４】
に結果を示す。各抗原性ペプチドを、ＥＬＩＳＡのためのコーティング抗原として使用した。ペプチドＡ５とペプチドＡ６は実質的に反応した。他のペプチド（Ａ６、Ａ９、及びＡ１２）を使用したとき、抗体は検出されなかった。上記結果から、いくつかのペプチド・エピトープに対する抗体が、本発明に係るｈＤＮＡワクチンの免疫化により誘導されたことが明らかとなった。
【００６５】
本発明者らは、糞ＩｇＡの抗体レベルをも観察した。３番目の追加免疫化から２週間後に、本発明者らは、糞を集め、そしてｇｐ１２０、及びペプチドＡ１〜Ａ４のカクテルに対するＩｇＧ抗体力価とＩｇＡ抗体力価をアッセイした。３番目の免疫化の後、免疫抗血清は、抗原性ペプチドＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、及びＡ１１と反応した。これらの結果は、ｇｐ１２０とペプチドＡ１〜Ａ４カクテルに対する平均ＩｇＡ抗体力価が、それぞれ、６．３±０．７、と７．１±１．１であったことを示した。さらに、ｇｐ１２０とＡ１〜Ａ４カクテルに対する平均ＩｇＧ抗体力価は、それぞれ、２．８±０．３と３．５±１．８であった。これらの実験は、ＣＡＧＧＳプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡワクチンによる免疫化が、糞ＩｇＡの誘導を高めることを示唆している。
【００６６】
実施例７：ｇｐ１２０、及び各合成ペプチドに対するＤＴＨ応答
３番目の免疫化の後に、各抗原を、肉趾中に注射し、そしてはれ応答を調べた（図１０参照）。ｇｐ１２０、又はＡ８、Ａ１０、及びＡ１１のカクテルを注射したとき、ＣＡＧＧＳプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡワクチンを接種されたマウスは高レベルのはれ（腫れ）を示した。さらに、これらの応答は、ＩＬ−２発現プラスミドと同時に注射されたとき、上昇した。次に、本発明者は、ペプチド抗原を使用して、さらに詳しく調べた。結果を以下の表３：
【００６７】
【表３】
2004002343.tif 000004
【００６８】
に示す。肉趾はれ応答が、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、及びＡ１１エピトープに対して観察された。しかしながら、ペプチドＡ５、Ａ６、Ａ９、及びＡ１２に対するはれ応答は検出されなかった。別の実験において、本発明者は、１５週間後に、実質的なレベルの高いＤＴＨ応答を観察した。
【００６９】
実施例８：ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ
次に、本発明者は、ＣＡＧＧＳプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡワクチンを接種されたマウスからの脾臓細胞が、ｇｐ１２０又はペプチド・カクテルと反応し、そしてその後にＩＦＮ−γを産生するかどうかを調べた。ｈＤＮＡ又はｐＣＭＶＩＩＩＢワクチン接種されたマウスの脾臓細胞を用いて、スポットを確認した。図１１に示すように、ｈＤＮＡワクチン接種されたマウスからの脾臓細胞がｇｐ１２０又はペプチドＡ８、Ａ１０、及びＡ１１のカクテルと共に培養されたとき、ＩＮＦ−γ＋細胞数が増加した。他方、ｐＣＭＶＩＩＩＢ免疫化マウスからの脾臓細胞は、ペプチドＡ１〜Ａ４と共に培養されたときに、ＩＦＮ−γ産生細胞の増加数を示した。
【００７０】
実施例９：ＩＣＣＳアッセイ
次に、ｇｐ１２０又はペプチド・カプセルと共に培養されたとき、ＣＡＧＧＳプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡワクチン、ｐＣＭＶＩＩＩＢ、又はｖＰＥ１６＋ｖＰ１２０６免疫化マウスからのＣＤ８＋脾臓細胞が、ＩＮＦ−γを誘導するかどうかを調べた。図１２に示すように、免疫脾臓細胞がＨＩＶ−１関連抗原と共に培養されるとき、ＣＤ８＋細胞とＩＦＮ−γ＋細胞の両者が、増加した。これらの結果は、ＣＡＧＧＳプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡの数回のワクチン接種が、ｇｐ１２０だけではなく、抗原ペプチドのワクチンに対しても、高レベルの活性を誘導することを示している。
【００７１】
実施例１０：ＨＩＶ−１遺伝子組込みワクシニア・ウイルスを用いた感染試験本発明者は、ＣＡＧＧＳプロモーターを含む本発明に係るｈＤＮＡワクチンが接種されたマウスが、ＨＩＶ−１ワクシニア・ウイルス感染に対して、阻害活性を示すかどうかを調べるために一連の試験を実施した。３番目の免疫化の後、ＨＩＶ　ｅｎｖ　遺伝子を含むｖＰＥ１６ワクシニアを、静脈内に注射し、そして卵巣のウイルス力価を６日後にアッセイした。空ベクターだけを注射された群は、５．８±０．９　ＰＦＵのウイルス力価を示したが、本発明に係るｈＤＮＡプラスミドを注射されたマウスは、ウイルス増殖に対する高い阻害効果を示した（図１３参照）。この阻害効果は、ＩＬ−１２発現プラスミドと共に注射されたときに高められたが、ＩＬ−２／Ｉｇプラスミドと共に注射されたときは、高められなかった。ｐＣＭＶＩＩＩＢにより免疫化されたマウスは、ある程度の阻害効果を示した。
【００７２】
同じ試験を、ＨＩＶ−１　ｇａｇ・ｐｏｌ遺伝子を担持するｖＰ１２０６を用いて行った。本発明に係るｈＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、ｖＰ１２０６ウイルス増殖に対する高レベルの阻害効果を示した（図１４参照）。ＨＩＶ−１　ｅｎｖ遺伝子だけを含むｐＣＭＶＩＩＩＢにより免疫化されたマウスは、ｖＰ１２０６増殖に対する阻害を全く示さなかった。本発明に係るｈＤＮＡワクチンは、ｇａｇ・ｐｏｌ遺伝子の多くのＣＴＬエピトープをコードする遺伝子を含む。これらの結果は、本発明に係るｈＤＮＡワクチンの免疫化が、上記組換えＨＩＶ−１ワクチン増殖を強く阻害することを示唆する。
【００７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本願発明に係る多価ＤＮＡワクチンに含まれるヌクレオチド配列であって、１９個のエピトープをコードする各ＤＮＡ合成ＤＮＡを結合して得られたヌクレオチド配列。配列中に、Ａ１〜Ａ１２ペプチドの位置を四角形で示す。
【図２】図１の続きである。
【図３】図１〜２に示す８２５ｂｐの合成結合ＤＮＡを含むＤＮＡワクチンが生体内でどのようなエピトープを提供するか、及び提示されるエピトープの位置関係を示す概略図。
【図４】ｇｐ１２０タンパク質に対する抗体力価を表すグラフである。使用した本発明に係るｈＤＮＡワクチンは、ＣＭＶプロモーターを含む。
【図５】各種ＨＩＶ−１ペプチドに対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を表すグラフである。使用した本発明に係るｈＤＮＡワクチンは、ＣＭＶプロモーターを含む。
【図６】ＨＩＶ−ｇｐ１６０発現組換えワクシニア・ウィルスによる静脈内感染に対するＤＮＡワクチンの保護効果を表すグラフである。使用した本発明に係るｈＤＮＡワクチンは、ＣＭＶプロモーターを含む。
【図７】ワクシニア・ウイルス・プロモーターを用いたｈＤＮＡワクチンの遺伝子産物のブロッティング分析結果を示す図面に代わる電気泳動写真である。ｈＤＮＡ断片、ｇａｇ遺伝子の場合、全長、及びｐＣＭＶＩＩＩＢを、ｐＪ５５内にサブクローニングした。ｈＤＮＡプラスミドとＧａｇプラスミドの両者を、ワクシニア伝達ベクター内にサブクローニングした。ワクシニア・ウイルス・ベクターによりトランスフェクトされた細胞からの精製タンパク質を、電気泳動にかけ、そしてそのゲルを抗Ｇａｇ抗体を用いて染色した。
【図８】ｐＣＡＧＧＳプロモーターを駆動するＨＩＶポリペプチド発現プラスミドを示す。
【図９】ｇｐ１２０タンパク質に対する抗体力価を示すグラフである。別の実験データも同様の結果を示した。
【図１０】本発明に係るｈＤＮＡワクチンで免疫化されたマウスの肉趾腫れ応答を示すグラフである。免疫化されたマウス又は免疫化されていないマウスに１０μｇの、ｇｐ１２０又はペプチドＡ８＋Ａ１０＋Ａ１１のカクテルを注射し、そして腫れ応答を２４時間後に計測した。別の実験データも同様の結果を示した。
【図１１】本発明に係るｈＤＮＡワクチンにより免疫化されたマウスのＥＬＩＳｐｏｔ分析を表すグラフである。細胞内ＩＮＦ−γ産生脾臓細胞の数を、ｈＤＮＡワクチンにより３回免疫化されたマウスからの脾臓細胞のインビトロにおける再刺激後にアッセイした。ペプチド又はｇｐ１２０で２４時間共に培養した後、ＩＦＮ−γ産生細胞をアッセイした。データは４〜６匹のマウス／群の平均を表す。別の実験データも同様の結果を示した。
【図１２】ＩＣＣＳアッセイの結果を示すプロット図である。ペプチド・カクテルと共に又はそれを伴わずに共培養することによるＩＦＮ−γ＋、ＣＤ８＋脾臓細胞をＦＡＣＳにより試験した。免疫脾臓細胞を、ペプチドＡ１、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、とＡ１１各２ｇを含むペプチド・カクテル１０μｇ／ｍｌで共培養した。２４時間後、ＩＦＮ−γ担持ＣＤ８＋脾臓細胞を、ＩＣＣＳアッセイによりカウントした。ｖＰＥ１６とｖＰ１２０６を注射されたマウスからの脾臓細胞を、ペプチド・カクテル有（Ａ′）又はペプチド・カクテル無（Ａ）で、共培養し、ｈＤＮＡプラスミド免疫脾臓細胞をカクテル有（Ｂ′）又はカクテル無（Ｂ）で、共培養し、ｈＤＮＡプラスミド免疫脾臓細胞を、ｇｐ１２０（５μｇ）有（Ｃ′）又はｇｐ１２０無（Ｃ）で、共培養し、ベクター・プラスミド免疫脾臓細胞をカクテル有（Ｄ′）又はカクテル無（Ｄ）で共培養し、ｐＣＭＶＩＩＩＢ免疫脾臓細胞をカクテル有（Ｅ′）又はカクテル無（Ｅ）で、共培養した。別の実験も同様の結果を示した。
【図１３】ＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を発現するｖＰＥ１６ワクシニア・ウイルス感染に対する免疫化されたマウスの耐性を示すグラフである。最後の免疫化の２週間後に、２×１０７ｐｆｕのｖＰＥ１６ウイルスを静脈内感染させた。ワクシニア・ウイルス力価を、ウイルス感染後６日目に計測した。データは、１０匹のマウス／群の平均を表す。別の実験も同様の結果を示した。
【図１４】ＨＩＶ　ｇａｇ・ｐｏｌ遺伝子を発現するｖＰ１２０６ワクシニア・ウイルス感染に対する免疫化されたマウスの耐性を示すグラフである。最後の免疫化の２週間後に、２×１０７ｐｆｕのｖＰ１２０６ウイルスを静脈内感染させた。ワクシニア・ウイルス力価を、ウイルス感染後６日目に計測した。データは、１０匹のマウス／群の平均を示す。別の実験も同様の結果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2004002343.tif 000027
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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