(57)【要約】【課題】哺乳動物の免疫系を強化する能力を有する組成物、その製造方法、及びその使用方法を提供する。【解決手段】複数の酵母菌を含む組成物であって、前記複数の酵母菌が、特定の周波数および特定の場の強さを有する交番電場の存在下で培養された結果、哺乳動物の免疫系を強化する（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、およびナチュラルキラー細胞の活性を増大させる）能力を有することを特徴とする組成物。これらの組成物の製造および使用の方法も含む。【選択図】  図１
2004159644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の酵母菌を含む組成物であって、前記複数の酵母菌が、周波数１７６５０〜１７８５０ＭＨｚ、場の強さ５０〜５００ｍＶ／ｃｍの交番電場の存在下で培養された結果、そのように培養されていない酵母菌に比べて、（１）哺乳動物のＴリンパ球数を増加させ、（２）哺乳動物の分裂促進因子に応答してＢリンパ球の増殖能力を高め、（３）哺乳動物のナチュラルキラー細胞の細胞毒性を強める能力を有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記周波数が１７６９６〜１７８１１ＭＨｚである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記場の強さが７０〜４７０ｍＶ／ｃｍである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵母菌が、サッカロミセス  セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、またはハンセヌラ  サブペリカロサ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）種である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵母菌が、ＡＳ２．５０３、ＡＳ２．４４０、ＡＳ２．５０１、ＡＳ２．５０２、ＡＳ２．５０４、ＡＳ２．３７５、ＡＳ２．４２０、およびＩＦＦＩ１０４８からなる群から選択される受託番号でＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託されている菌株である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が錠剤、粉末、または健康飲料の形である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
組成物が健康飲料の形である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を患者に経口投与することを含む、患者の免疫系を強化する方法。
【請求項９】
周波数１７６５０〜１７８５０ＭＨｚ、場の強さ５０〜５００ｍＶ／ｃｍの交番電場の存在下で、哺乳動物のＴリンパ球、Ｂリンパ球、またはナチュラルキラー細胞の活性を高める複数の酵母菌の能力を実質的に強化するのに十分な時間、前記複数の酵母菌を培養することを含む、酵母菌組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物の有害な免疫状態を軽減でき、栄養補助食品（例えば、健康飲料）として有用な組成物に関する。これらの組成物は、特定の周波数および場の強さを有する電磁場中で増殖させて得られる酵母菌を含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、特定の周波数および場の強さを有する電磁場によって特定の酵母菌を活性化して、免疫系に有益な物質を産生することができるという発見に基づいている。これらの活性な酵母菌を含む組成物を、それを必要とする患者、例えば、癌、ウイルス感染症、または細菌感染症に罹ったヒト患者の免疫を改善するための栄養補助食品（例えば、健康飲料）として使用することができる。
【０００５】
本発明は、周波数が約１７６５０〜１７８５０ＭＨｚ（例えば、１７６９０〜１７８１５または１７６９６〜１７８１１ＭＨｚ）、場の強さが約５０〜５００ｍＶ／ｃｍ（例えば、７０〜４７０または８０〜４６０ｍＶ／ｃｍ）である交番電場中で培養した複数の酵母菌を含む組成物を包含する。この交番電場中で、免疫系に有益な物質を産生する前記複数の酵母菌の能力を実質的に高めるのに十分な時間、酵母菌を培養する。例えば、この培養酵母菌は、経口摂取した時に、Ｔリンパ球の数、Ｂリンパ球が分裂促進因子（例えば、ＬＰＳなどのレクチン）に応答して増殖する能力、および／または哺乳動物のナチュラルキラー細胞の細胞毒性を（例えば、２０％、２００％など、少なくとも１０％）増加させることができる。
【０００６】
一実施形態では、交番電場の周波数および／または場の強さを、前記時間中に前記範囲内で変えることができる。換言すれば、一連の電磁場に酵母菌を曝すことができる。例示的な時間は約３０〜１３０時間（例えば、５０〜１０５時間）である。
【０００７】
この組成物に含めることができる酵母菌はすべて、ブダペスト条約の下に承認された保管所であるＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（「ＣＧＭＣＣ」）、中国科学アカデミー、微生物研究所、中国微生物寄託所、ハイディアン、Ｐ．Ｏ．ＢＯＸ２７１４、北京、１０００８０、中国（Ｃｈｉｎａ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｉｄｉａｎ、Ｐ．Ｏ．ＢＯＸ２７１４、Ｂｅｉｊｉｎｇ、１０００８０、Ｃｈｉｎａ）から入手することができる。有用な酵母種としては、サッカロミセス  セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス  サケ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｋｅ）、サッカロミセス  ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｒａｒｕｍ）、しょう油酵母（Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｘｉｉ）、ハンセヌラ  サブペリカロサ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｕｂｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）、およびロドトルラ  アウランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。例えば、酵母菌を、サッカロミセス  セレビシェ  ハンセン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ）ＡＳ２．３７５、ＩＦＦＩ１０４８、ＡＳ２．５０１、ＡＳ２．５０２、ＡＳ２．５０３、ＡＳ２．５０４、ＡＳ２．５３５、ＡＳ２．５５８、ＡＳ２．５６０、ＡＳ２．５６１、またはＡＳ２．５６２；またはビール酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）ＡＳ２．４４０、またはＡＳ２．４２０菌株とすることもできる。
【０００８】
個体の免疫系を強化するこれらの組成物使用する方法、およびこれらの組成物を製造する方法も本発明に包含される。
【０００９】
特に定義しない限り、本明細書で使用する専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味である。例示的な方法および材料を以下に記述するが、本明細書に記載するそれらと類似または同等の方法および材料も本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書に記載する出版物およびその他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。紛争が生じた場合、定義を含めた本明細書を基準とするものとする。材料、方法、および例は例示的なものにすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の語、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などその変形は、記述した構成要素（ｉｎｔｅｇｅｒ）または構成要素群を包含するが、その他の構成要素または構成要素群を排除しないことを意味すると理解すべきである。
【００１０】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるはずである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、特定の周波数および場の強さを有する電磁場（ＥＭＦ）によって特定の酵母菌株を活性化して、免疫の改善に有用な薬剤を産生することができるという発見に基づいている。活性な酵母菌を含有する酵母菌組成物は、健康飲料または栄養錠剤の形の栄養補助食品として使用することができる。特定の実施形態では、本発明の酵母菌組成物は、免疫的に易感染性の患者（例えば、ヒト患者）のＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞の活性レベルを回復させることによって示されるように、免疫機能を改善することができる。
【００１２】
これらの酵母菌組成物が含有する活性な酵母菌は、酸性条件（ｐＨ２．５〜４．２）に耐えるように培養されているので、この組成物は胃の中で安定であり、腸に送ることができる。腸に入ると、酵母菌は種々の消化酵素で破壊され、老化防止剤が放出されて直ちに吸収される。
【００１３】
いかなる理論または機構にも拘束されるものではないが、酵母菌中の遺伝子または遺伝子セットの発現をＥＭＦが活性化または促進して、酵母菌が特定の代謝活性を示すのに活性またはより効率的になり、免疫系に有益な薬剤の産生をもたらすと本発明者は考えている。
【００１４】
Ｉ．本発明に有用な酵母菌株
本発明に有用な酵母のタイプとしては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属の酵母菌が挙げられるが、これらだけに限定されるものではない。
【００１５】
前記属の例示的な種としては、表１、２、３、４に示す種が挙げられるが、これらだけに限定されるものではない。本発明に有用な酵母菌株は、研究室における培養から、または、ＣＧＭＣＣおよびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９などの利用可能な公共の培養物寄託所から入手することができる。有用な菌株（とＣＧＭＣＣの受託番号）の非限定的な例は、サッカロミセス  セレビシェ  ハンセン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｈａｎｓｅｎ）ＡＳ２．５０１、ＡＳ２．５０２、ＡＳ２．５０３、ＡＳ２．５０４、ＡＳ２．５３５、ＡＳ２．５５８、ＡＳ２．５６０、ＡＳ２．５６１、およびＡＳ２．５６２である。一般に、本発明の好ましい酵母菌株は、食品およびワイン工業の発酵で使用されている菌株である。したがって、これらの酵母菌を含有する組成物は、ヒトが消費しても安全である。
【００１６】
本発明の酵母菌組成物の調製は、純粋な酵母菌株を用いて始めることが好ましいが、それだけに限定されない。本発明の酵母菌組成物は、異なる種または菌株の酵母菌の混合物を培養して生成させることができる。
【００１７】
【表１】
2004159644.tif 000003
【００１８】
【表２】
2004159644.tif 000004
【００１９】
【表３】
2004159644.tif 000005
【００２０】
【表４】
2004159644.tif 000006
【００２１】
ＩＩ．電磁場の適用
本発明に有用な電磁場は、当分野で周知の様々な方法によって発生させ、かけることができる。例えば、ＥＭＦは、交番電場または振動磁場をかけることによって発生させることができる。
【００２２】
交番電場は、培養培地と直接接触させた電極により、または電磁誘導により酵母菌培養物にかけることができる。例えば、図１を参照されたい。電極を培地に接触させる方法を用いることによって、比較的強い電場を培地中に発生させることができる。電極での電気分解によって有害なイオンが培地中に混入しないように、また、接触抵抗、泡、または電気分解の他の特性により電場レベルが所望のレベルより低下しないように注意しなければならない。電極は、その周囲環境に合ったもの、例えば、塩素イオンが豊富な溶液にはＡｇ−ＡｇＣｌを用い、できるだけ低い電圧で運転すべきである。一般的な総説としては、グッドマン等、１９９５、アカデミックプレス、１５８巻、細胞生物学概説、細胞学の国際的レビュー、細胞と分子における電磁場の影響（Ｇｏｏｄｍａｎｅｔ  ａｌ．、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＥＭＦ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５８、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照されたい。
【００２３】
本発明に有用なＥＭＦは、振動磁場をかけることによっても発生させることができる。振動磁場は、ヘルムホルツコイルを流れる振動電流によって発生させることができる。このような磁場はさらに電場を誘導する。
【００２４】
本発明に有用なＥＭＦの周波数は、約１７６５０ＭＨｚ〜１７８５０ＭＨｚの範囲である。例示的な周波数は、１７６９６、１７７０２、１７７０９、１７８０６、および１７８１１ＭＨｚである。本発明に有用な電場の場の強さは、約５０〜５００ｍＶ／ｃｍ（例えば、７０〜９０、１６０〜１９０、１５０〜１８０、３５０〜３８０、４４０〜４７０、３２０〜３５０、３５０〜４００、および３４０〜３８０ｍＶ／ｃｍ）の範囲である。例示的な場の強さは、８２、１７５、１６８、３６７、４５２、３３２、３５２、３６２、１７７、２０６、および１１５ｍＶ／ｃｍである。
【００２５】
酵母培養物にＥＭＦを連続してかけるときには、酵母培養物を同一容器中に保持したまま、同じＥＭＦ発生装置とエミッタのセットを用いて周波数および／または場の強さを変化させることができる。この連続したＥＭＦはそれぞれ、異なる周波数または異なる場の強さ、あるいは異なる周波数と異なる場の強さをそれぞれ有することができる。このような周波数および場の強さは、前記範囲内にあることが好ましい。一連におけるＥＭＦのどんな実際の数は、どんなものでも使用することができるが、総数が２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の一連のＥＭＦに酵母培養物を曝すことが好ましいこともある。
【００２６】
酵母菌は、ＥＭＦの存在下で数時間培養しただけでも活性化させることができるが、活性化した酵母菌を、合計３０〜１３０時間、例えば３０〜１００、３０〜７５、または５０〜１０５時間、ＥＭＦの存在下で繁殖および増殖させることが好ましいこともある。
【００２７】
図１は、交番電場を発生させるための例示的な装置である。所望の周波数および強度の電場は、好ましくは正弦波の形をした、周波数範囲が５〜２０，０００ＭＨｚの交番電場を発生できるＡＣ電源（３）で発生させることができる。狭い周波数範囲の信号を発生できる信号発生器も使用することができる。必要ならば、信号増幅器も使用して出力を上げることができる。培養容器（２）は、非導電材料、例えばガラス、プラスチック、またはセラミックス製とすることができる。培養容器（２）と信号発生器（３）とを結合するケーブルは、伝送周波数が少なくとも３０ＧＨｚの高周波同軸ケーブルであることが好ましい。
【００２８】
ＥＭＦを伝達可能な金属ワイヤまたはチューブなどの信号エミッタの極めて近傍に酵母培養物（１）を置くことを含めて様々な手段によって、培養物に交番電場をかけることができる。金属ワイヤまたはチューブは、赤銅でできていてもよく、容器（２）の内部に置くことができ、３〜３０ｃｍの深さまで達することができる。例えば、容器（２）の中の流体の深さが１５〜２０ｃｍ、２０〜３０ｃｍ、３０〜５０ｃｍ、５０〜７０ｃｍ、７０〜１００ｃｍ、１００〜１５０ｃｍ、または１５０〜２００ｃｍである場合、金属ワイヤをそれぞれ、容器（２）の底部から３〜５ｃｍ、５〜７ｃｍ、７〜１０ｃｍ、１０〜１５ｃｍ、１５〜２０ｃｍ、２０〜３０ｃｍ、および２５〜３０ｃｍとすることができる。使用する金属ワイヤ／チューブの数は、１〜１０（例えば、２〜３）本とすることができる。体積が１０Ｌまでの培養には、直径０．５〜２ｍｍの金属ワイヤ／チューブを使用することを推奨するが、必ずしも使用しなくともよい。体積が１０〜１００Ｌの培養には、直径３〜５ｍｍの金属ワイヤ／チューブを使用することができる。体積が１００〜１０００Ｌの培養には、直径６〜１５ｍｍの金属ワイヤ／チューブを使用することができる。体積が１０００Ｌを超える培養には、直径２０〜２５ｍｍの金属ワイヤ／チューブを使用することができる。
【００２９】
一実施形態では、培養物（１）中に沈めた電極で電場をかける。この実施形態では、一方の電極を容器（２）底部上に置いた金属板とすることができ、もう一方の電極を培養物（１）中に均一に分散させた複数の電極で構成して、電場のエネルギー分布を均一にすることができる。使用する電極線の数は、培養物の体積ならびに電極線の直径によって決まる。
【００３０】
ＩＩＩ．培養培地
本発明に有用な培養培地は、酵母菌が同化できる栄養源を含んでいる。適切な形（例えば、スクロース、グルコース、ブドウ糖、マルトース、およびキシロースなどの炭水化物）の複雑な炭素含有物質は、酵母菌の炭素源となり得る。炭素源の正確な量は、培地の他の成分に応じて調節することができる。一般に、炭水化物の量は、培地の約１重量％〜１０重量％の間で変わり、好ましくは約１％〜５％、最も好ましくは約２％である。これらの炭素源は、個別にまたは組み合わせて使用することができる。牛肉エキスおよびペプトンなどのアミノ酸を含有する物質も添加することができる。一般に、アミノ酸含有物質の量は、培地の約０．１重量％〜１重量％、好ましくは約０．１〜０．５％の間で変わる。培養培地に添加できる無機塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リン酸、硫酸、炭酸などのイオンを生成できる通常の塩がある。栄養素の無機塩の非限定的な例は、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、ＣａＣＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、およびＣａＳＯ４である。
【００３１】
ＩＶ．電磁気による酵母菌の活性化
胃腸管系に有益な薬剤を産生する酵母菌の能力を活性化または高めるために、適切な培地中無菌状態下２０〜３５℃（例えば、２８〜３２℃）で十分な時間（例えば、１０〜１５０時間）、前記交番電場または連続した交番電場中でこの菌を培養することができる。
【００３２】
培養プロセスの例示的な構成を図１に示す（前記を参照のこと）。例示的な培養培地は、１０００ｍｌの無菌水当たり以下の成分を含有する：２０ｇのスクロース、４０μｇの（溶液に添加する前に滅菌して４５℃に冷却した）ビタミンＢ１２、５０μｇの（溶液に添加する前に滅菌して４５℃に冷却した）ビタミンＣ、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２５ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、３ｇのＣａＣＯ３・５Ｈ２Ｏ、および２．５ｇのペプトン。次いで、所望の菌株の酵母菌を培養培地に添加して、培養培地１０００ｍｌ当たり１×１０８個の酵母菌を含有する混合物を形成させる。酵母菌は表１、２、３、４に列記した菌株のうち任意のものとすることができる。次いで、この混合物を図１に示す装置に入れる。
【００３３】
酵母菌の活性化プロセスは以下のステップを含む：（１）活性化装置の温度を２４〜３３℃（例えば、２８〜３２℃）に維持して、酵母菌を２５〜４２時間（例えば、３２時間）培養するステップ；（２）周波数が１７６９６ＭＨｚ、場の強さが１６０〜１９０ｍＶ／ｃｍ（例えば、１７５ｍＶ／ｃｍ）の交番電場を１４〜１８時間（例えば、１５時間）かけるステップ；（３）次いで、周波数が１７７０２ＭＨｚ、場の強さが１５０〜１８０ｍＶ／ｃｍ（例えば、１６８ｍＶ／ｃｍ）の交番電場を３０〜３５時間（例えば、３２時間）かけるステップ；（４）次いで、周波数が１７７０９ＭＨｚ、場の強さが３５０〜３８０ｍＶ／ｃｍ（例えば、３６７ｍＶ／ｃｍ）の交番電場を２５〜３０時間（例えば、２８時間）かけるステップ；（５）次いで、周波数が１７８０６ＭＨｚ、場の強さが４４０〜４７０ｍＶ／ｃｍ（例えば、４５２ｍＶ／ｃｍ）の交番電場を１６〜２０時間（例えば、１８時間）かけるステップ；および（６）次いで、周波数が１７８１１ＭＨｚ、場の強さが３２０〜３５０ｍＶ／ｃｍ（例えば、３３２ｍＶ／ｃｍ）の交番電場を１０〜１４時間（例えば、１２時間）かけるステップ。次いで、活性化した酵母菌を、当分野で知られている様々な方法により培地から回収し、（例えば、凍結乾燥により）乾燥し、４℃で貯蔵する。乾燥した酵母菌の濃度は１０１０酵母菌／ｇ以上であることが好ましい。
【００３４】
Ｖ．胃の環境への酵母菌の順化
本発明の酵母菌組成物は、胃を通過してから小腸に達し、そこでその有効成分を酵母菌から放出するので、これらの酵母菌を胃液に順化させるために酸性条件下で培養することが好ましい。この順化プロセスにより、酵母菌の酸性胃環境中での生存能力が高まることになる。
【００３５】
これを達成するために、酸性の強い順化用培養培地１０００ｍｌ当たり、活性酵母菌を含有する酵母菌粉体１０ｇ（グラム当たり１０１０個の活性酵母菌を含む）を混合することができる。それから、はじめに周波数が１７８０６ＭＨｚで場の強さが３５０〜４００ｍＶ／ｃｍ（例えば、３６７ｍＶ／ｃｍ）の交番電場の存在下、約２８〜３２℃で３８〜４２時間（例えば、４０時間）、この酵母菌混合物を培養する。得られた酵母菌を、周波数が１７８１１ＭＨｚで場の強さが３４０〜３８０ｍＶ／ｃｍ（例えば、３５２ｍＶ／ｃｍ）の交番電場の存在下、約２８〜３２℃で２０〜２５時間（例えば、２２時間）さらにインキュベートする。次いで、得られる順化した酵母菌を、乾燥し、粉体の形で（１０１０酵母菌／ｇ以上）室温または減圧下０〜４℃で貯蔵する。
【００３６】
例示的な培養培地の順化は、７００ｍｌの新鮮なブタの胃液および３００ｍｌの野生のカナメモチ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｗｔｈｏｒｎ）のエキスを混合して行なわれる。培養培地を順化するｐＨを、０．１Ｍ塩酸および０．２Ｍフタル酸水素カリウムで２．５に調整する。新鮮なブタの胃液を以下のように調製する。約４カ月齢で、新生のオランダ白ブタ（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｗｈｉｔｅ  ｐｉｇｓ）を屠殺し、その胃の全内容物を回収して、２０００ｍｌの水と無菌条件下で混合する。次いで、この混合物を４℃で６時間無菌条件下で静置して、食物の残骸を沈殿させる。野生のカナメモチのエキスを調製するため、５００ｇの新鮮な野生カナメモチを無菌条件下で乾燥して含水量を（８％以下に）減らす。次いで、その乾燥した果実を粉砕し（２０メッシュ以上）、１５００ｍｌの無菌水に添加する。この混合物を４℃で６時間無菌条件下で静置する。その上清を回収して、順化用培養培地に使用する。
【００３７】
ＶＩ．酵母菌組成物の製造
本発明の酵母菌組成物を製造するために、図２に示す装置またはその等価物を使用することができる。この装置は、それぞれ１対の電極（４）を装着した第１の容器（１）、第２の容器（２）、および第３の容器（３）を備える。一方の電極は容器底部上に配置した金属板であり、もう一方の電極は容器内の空間に均一に分散させた複数の電極で構成して、電場のエネルギーを均一に分布させる。３対の電極すべてを共通の信号発生器に接続する。
【００３８】
この目的に使用する培養培地は、１０００Ｌ当たり次の成分を含有する混合果実エキス溶液である：３００Ｌの野生カナメモチエキス、３００Ｌのナツメエキス、３００Ｌの朝鮮五味子（チョウセンゴミシの種子）エキス、および１００Ｌの大豆エキス。カナメモチエキス、ナツメエキス、朝鮮五味子エキスを調製するため、新鮮な果実を無菌条件下で洗浄し、乾燥して、含水量を８％以下に減少させる。次いで、１００キログラムの乾燥果実を粉砕し（２０メッシュ以上）、４００Ｌの無菌水に添加する。この混合物を無菌条件下室温で１２時間撹拌し、次いで１０００ｒｐｍで遠心分離して不溶の残渣を除去する。大豆エキスを生成するため、新鮮な大豆を無菌条件下で洗浄し、乾燥して、含水量を８％以下に減少させる。次いで、３０キログラムの乾燥大豆を粉砕して２０メッシュ以上の粒子とし、１３０Ｌの無菌水に添加する。この混合物を無菌条件下室温で１２時間撹拌し、１０００ｒｐｍで遠心分離して不溶の残渣を除去する。培養培地を作製するため、これらの成分を前記レシピに従って混合し、この混合物を１２１℃で３０分間加圧滅菌し、４０℃に冷却してから使用する。
【００３９】
前記（前記Ｖ項）の通りに調製した１０００グラムの活性酵母菌粉体を１０００Ｌの混合果実エキス溶液に添加し、この酵母菌溶液を図２に示す第１の容器（１）に移送する。次いで、周波数が１７８０６ＭＨｚで場の強さが約３３０〜３８０ｍＶ／ｃｍ（例えば、３６２ｍＶ／ｃｍ）の交番電場の存在下、２８〜３２℃、無菌条件下で１４時間この酵母菌を培養する。この酵母菌を、周波数が１７８１１ＭＨｚで場の強さが約３３０〜３８０ｍＶ／ｃｍ（例えば、３５２ｍＶ／ｃｍ）の交番電場の存在下でさらにインキュベートする。培養をさらに１２時間続ける。
【００４０】
次いで、酵母菌培養物を第１の容器（１）から第２の容器（２）へ移送し（必要であれば、酵母菌培養の新たなバッチを現在使用可能になった第１の容器（１）で開始することができる）、周波数が１７８０６ＭＨｚで場の強さが１３０〜１８０ｍＶ／ｃｍ（例えば、１７７ｍＶ／ｃｍ）の交番電場に８時間かける。続いて、電場の周波数および場の強さをそれぞれ１７８１１ＭＨｚおよび２００〜２１０ｍＶ／ｃｍ（例えば、２０６ｍＶ／ｃｍ）に変える。培養をさらに１０時間続ける。
【００４１】
次いで、酵母菌培養物を第２の容器（２）から第３の容器（３）へ移送し、周波数が１７８０６ＭＨｚで場の強さが９０〜１２０ｍＶ／ｃｍ（例えば、１１５ｍＶ／ｃｍ）の交番電場に８時間かける。続いて、電場の周波数および場の強さをそれぞれ１７８１１ＭＨｚおよび７０〜９０ｍＶ／ｃｍ（例えば、８２ｍＶ／ｃｍ）に変える。培養をさらに１０時間続ける。
【００４２】
次いで、第３の容器（３）の酵母菌培養物を減圧密封ボトルに詰め、栄養補助食品、例えば強壮飲料として使用する。必要に応じて、最後の酵母菌培養物を２４時間以内に乾燥し、粉体の形で貯蔵することもできる。この栄養補助食品は、３０〜６０ｍｌの用量を毎日３〜４回で３ヶ月間、好ましくは食事および就寝の１０〜３０分前に摂取することができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を無菌の注射用製剤の形で静脈内または腹膜に投与することもできる。このような無菌製剤を、次のように調製することができる。無菌健康飲料組成物をまず超音波（１０００Ｈｚ）で１０分間処理し、次いで、さらに１０分間遠心分離する。得られる上清を１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．２〜７．４に調整し、その後無菌条件下でメンブレン（静脈内用は０．２２μｍ、腹膜用は０．４５μｍ）を通してろ過する。得られる無菌製剤を３５〜３８℃の水浴に３０分間浸してから使用する。
【００４４】
本発明の酵母菌組成物は、食品または製薬産業で使用される酵母菌から誘導される。したがって、この酵母菌組成物は、多くの医薬品化合物に付随する副作用がない。
【００４５】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の方法および材料を説明するためのものである。当業者に自明である適切な変形および記載条件もしくはパラメータの調節は、本発明の精神および範囲に含まれる。
【００４６】
前記ＩＶ項に列記した推奨範囲に従って括弧内に例示した電場周波数および場の強さを有する交番電場の存在下で培養したサッカロミセス  セレビシェ  ハンセン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ  Ｈａｎｓｅｎ）ＡＳ２．５０３酵母菌を用いて、以下の実験に使用する活性酵母菌組成物を調製した。対照の酵母菌組成物は、酵母菌をＥＭＦなしで培養した以外は同様にして調製した酵母菌組成物である。
【００４７】
（実施例１）エステラーゼ染色
成熟Ｔリンパ球は、その細胞表面にアルファ‐ナフチルアセテートエステラーゼ（ＡＮＡＥ）を発現する。ＡＮＡＥの発現レベルは、Ｔリンパ球の機能と正の相関がある。
【００４８】
この実験では、３０匹のＮＩＨマウス（６〜８週齢）を各１０匹のグループＡ、Ｂ、およびＣに分けた。これら各グループのマウスに、それぞれ２．５ｍｌの活性酵母菌組成物、対照酵母菌組成物、および生理食塩水を１０日間連続して与えた。１０日目に、組成物投与から４時間後、これらマウスの眼窩静脈から０．５ｍｌの血液を採取し、ガラススライドに塗り、室温の空気を流して乾燥させた。次いで、このスライドを３７℃のインキュベーション緩衝液に３時間浸漬し、水ですすいでごみを取り除き、ろ紙で注意深く乾燥した。
【００４９】
インキュベーション緩衝液を次のように調製した。２グラムのαナフチルアセテートを１００ｍｌのメチルグリコールに溶解し、４℃で貯蔵した。次いで、４ｇのパラローザニリンを１００ｍｌの２Ｍ  ＨＣｌに溶解した。次いで、この溶液を６０〜８０℃に加温し、ろ過し、４℃で貯蔵した。使用直前に、３ｍｌの新鮮な４％亜硝酸ナトリウムを３ｍｌのパラローザニリン溶液に、その色が褐色から淡黄色に変化するまで振とうしながら滴下した。この溶液がインキュベーション緩衝液として使用可能なヘキサゾニウムパラローザニリン溶液であった。
【００５０】
次いで、８９ｍｌのＰＢ緩衝液（１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４と１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４とを１：１で混合して調製した；ｐＨ７．６）中にこのスライドを置き、６ｍｌのヘキサゾニウムパラローザニリン溶液を徐々に添加し、穏やかに混合した。次いで、２．５ｍｌのαナフチルアセテート溶液を、溶液を穏やかに混合しながら徐々に添加した。次いで、この溶液のｐＨを酢酸で６．４に調整した。次いで、このスライドに１％マラカイトグリーン液を添加し、さらに５〜１０秒間インキュベートした。次いで、このスライドを水ですすぎ、ろ紙で軽く叩いて乾燥させ、加熱ドライヤーで乾燥した。
【００５１】
次いで、このスライドをオイルを用いた顕微鏡で検査した。各スライドで、細胞質中に赤い顆粒があるかどうかを２００個のリンパ球について調べた。細胞質中に分布する赤い細粒を含むリンパ球を（＋）と記録した。単一またはより大きな赤い顆粒を含むリンパ球を（＋＋）と記録した。これらの細胞を、ＡＮＡＥ陽性とみなした。赤い顆粒を含まないリンパ球を（−）と記録した。（＋）細胞と（＋＋）細胞の数を２００で割ってＡＮＡＥ陽性な細胞の割合を計算した。結果を下記表５に示す。
【００５２】
【表５】
2004159644.tif 000007
【００５３】
このように、活性酵母菌組成物が対照酵母菌組成物および生理食塩水よりもＡＮＡＥ陽性細胞によって示されるＴリンパ球のレベルを有意に増加させることがデータから実証される。
【００５４】
（実施例２）Ｂリンパ球増殖の制御
４０匹のＮＩＨマウス（１８〜２２ｇ）をＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの等グループに分けた。グループＡのマウスには、動物１匹当たり３ｍｌの活性酵母菌組成物を毎日連続して４２日間経口投与した。１４日目から残りの２８日間、このマウスを０．９４ｐｐｍのオゾンを含む雰囲気中に置いた。グループＢおよびＣのマウスは、それぞれ対照の酵母菌組成物および防腐剤のエチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸を与えた以外は同様に処理した。グループＤのマウスは、オゾン処理をしなかった以外はグループＣと同様に処理した。
【００５５】
４２日目に、眼球から瀉血してマウスを屠殺した。この血液細胞をＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁させて濃度１×１０８細胞／ｍｌとした。次いで、この細胞懸濁液にＴｈｙ−１．２のモノクローナル抗体を１：１０００の比率で添加した。この試料を４℃で３０秒間インキュベートし、２回蒸留した水（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）で１回洗浄した。次いで、抗体：細胞懸濁液比１：１０で補体を添加した。次いで、この試料を３７℃で４５分間インキュベートし、３回洗浄した。残った無傷の細胞を数え、ＲＰＭＩ−１６４０に２．５×１０６細胞／ｍｌで懸濁させた。次いで、この細胞を９６ウェルプレートに各ウェル０．２ｍｌで蒔いた。各マウスから単離した細胞をウェルに蒔いて同じものを３組用意した。各ウェルに１０μｇのリポ多糖（ＬＰＳ）を添加し、このプレートを５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーション終了の１６時間前に、３Ｈ−ＴｄＲを０．５μＣｉ／ウェルで添加した。各ウェルからの放射能を標準の方法で測定した。データを下記表６に示す。
【００５６】
【表６】
2004159644.tif 000008
【００５７】
オゾンはＢ細胞の増殖を著しく阻害するが、本発明の活性酵母菌組成物は、この阻害を有意に阻止することが、このデータから示される。
【００５８】
（実施例３）ＮＫ細胞の活性
Ｌ９２９細胞は、ニュートラルレッドを摂取できる接着性のマウス線維芽細胞である。したがって、ＮＫ細胞をＬ９２９細胞と接触状態に置いた後のニュートラルレッド摂取量は、ＮＫ細胞の細胞毒性活性を示す。
【００５９】
この実験では、３０匹のＮＩＨマウスを３つの等グループに分けた。グループＡのマウスには、それぞれ３ｍｌの活性酵母菌組成物を毎日１４日間経口投与した。グループＢおよびＣのマウスは、それぞれ対照酵母菌組成物および防腐剤のエチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸を与えた以外は同様に処理した。１４日目に、これらの動物の脾細胞を標準の手法で調製した。収集した脾細胞を０．４ｍｌの２回蒸留した水（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）に懸濁し、この細胞試料を３０秒間穏やかに撹拌（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）して赤血球を溶解した。０．４ｍｌの１．７％生理食塩水を添加して細胞試料の浸透圧バランスを回復させた。この細胞を遠心沈殿し、血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁して濃度を１×１０７細胞／ｍｌとした。この調製物はＮＫ細胞の濃縮集団を含んでいた。
【００６０】
標的Ｌ９２９細胞を調製するため、細胞毒性実験の１日前にこの細胞をほぼコンフルエントになるまで増殖させ、細胞培養培地を新鮮な培地と交換した。翌日、この細胞を１〜２ｍｌの０．２５％トリプシンでトリプシン処理した。この細胞を培養容器からＲＰＭＩ−１６４０で洗い流し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この沈殿物を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。次いで、平底の９６ウェルプレート上にＬ９２９細胞を０．１ｍｌ／ウェルで蒔き、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中３７℃で少なくとも１時間（例えば、６時間）インキュベートした。次いで、０．１ｍｌのＮＫ細胞溶液を各ウェルに添加して、ＮＫ細胞とＬ９２９細胞との比を５０：１とした。各試料に対して４組の同じウェルを使用した。１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０を、対照のウェルに添加した。このプレートを３７℃のインキュベータ中で少なくとも２０時間（例えば、３６時間）置換した。次いで、培養培地を取り出し、ウェルを生理食塩水で３回洗浄した。次いで、０．１ｍｌの０．１％ニュートラルレッドを各ウェルに添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、色素溶液を取り除き、ウェルを生理食塩水で３回洗浄した。次に、０．１ｍｌの細胞溶解溶液（５０％ＨＣｌと５０％エタノール）を各ウェルに添加してＬ９２９細胞からニュートラルレッドを遊離させた。各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を、基準波長として４５０ｎｍを用いて４２９ｎｍで測定した。ＮＫ細胞の細胞毒性活性を、［（対照試料のＯＤ−試験試料のＯＤ）／対照試料のＯＤ］×１００％（式中、対照試料のＯＤはＬ９２９細胞のみを含むウェルのＯＤであり、試験試料のＯＤはＬ９２９細胞とＮＫ細胞を含むウェルのＯＤであった）で示した。データを下記表７に示す。
【００６１】
【表７】
2004159644.tif 000009
【００６２】
本発明の活性酵母菌組成物が、ＮＫ細胞の細胞毒性活性を有意に増大できることがこれらのデータから示される。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態を示したが、その基本的な構成を変更して、本発明の組成物および方法を利用する他の実施形態を提供できることも明らかである。
【００６４】
【発明の効果】
本発明は、特定の周波数および場の強さを有する電磁場によって特定の酵母菌を活性化して、免疫系に有益な物質を産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】電磁場を用いて酵母菌を活性化するための例示的な装置を示す概略図である。
【図２】本発明の酵母菌組成物を製造するための例示的な装置を示す概略図である。この装置は、信号発生器および相互に連結された容器１、２、および３を備える。
【符号の説明】
１酵母培養物
２容器
３電源
【図１】
2004159644.tif 000010
【図２】
2004159644.tif 000011
【外国語明細書】
2004159644.tif 000012
2004159644.tif 000013
2004159644.tif 000014
2004159644.tif 000015
2004159644.tif 000016
2004159644.tif 000017
2004159644.tif 000018
2004159644.tif 000019
2004159644.tif 000020
2004159644.tif 000021
2004159644.tif 000022
2004159644.tif 000023
2004159644.tif 000024
2004159644.tif 000025
2004159644.tif 000026
2004159644.tif 000027
2004159644.tif 000028
2004159644.tif 000029
2004159644.tif 000030
2004159644.tif 000031
2004159644.tif 000032
2004159644.tif 000033
2004159644.tif 000034
2004159644.tif 000035
2004159644.tif 000036
2004159644.tif 000037
2004159644.tif 000038
2004159644.tif 000039
2004159644.tif 000040