(57)【要約】【課題】尋常性白斑の治療、老化性白毛の改善などに有効なメラニン産生促進剤を提供する。【解決手段】フラボン骨格、フラボノール骨格、フラバノン骨格、フラバノノール骨格及びイソフラボン骨格の少なくとも一つの骨格を有するフラボノイドからなるメラニン産生促進剤。【選択図】　　　図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボン骨格、フラボノール骨格、フラバノン骨格、フラバノノール骨格及びイソフラボン骨格の少なくとも一つの骨格を有するフラボノイドからなるメラニン産生促進剤。
【請求項２】
前記フラボノイドがケルセチン、ダイゼン、ゲニステイン、フィスティン、キリスティン、アピゲニン、ルテオリン、ラムネチン及びケンフェロールから選ばれた少なくとも一種のフラボノイドである請求項１に記載のメラニン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のメラニン産生促進剤と皮膚外用剤用基剤とを含んでなる皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
前記フラボノイドの含量が組成物全重量当り０．１ｐｐｍ（重量）〜１０重量％である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
白髪改善用頭髪化粧料である請求項３又は４に記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
後天性色素脱失症の治療薬である請求項３又は４に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はメラニン産生促進剤に関し、更に詳しくはフラボノイドからなるメラニン産生促進剤及びそれを含む皮膚外用剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚、毛根の色を決定する最も重要な因子はメラニンと呼ばれる色素性物質である。メラニンは、皮膚では表皮基底層と毛根に存在するメラノサイトといわれる色素産生細胞により産生される。このメラニンの産生が異常に抑制されたり、メラノサイトが消失したりすると、後天性色素脱失症である尋常性白斑が発症する。尋常性白斑症は我が国において１００〜２００万人が罹患していると推計される進行性の色素脱失症である。従来、本症の治療は困難を極めてきた。メラニン細胞とその異常についての病態生化学的、細胞生物学的研究の発展により、本症が一つの原因因子による単一疾患ではなく、その発症原因から分節型、汎発型などいくつかの病型に分けることのできる疾患であることが判ってきている。現在、本症の治療法は、ステロイド療法並びに光化学療法により行われており、ある程度の成果が得られているが、予後不良であることが多く、難治性疾患とされている。本症は色素細胞の選択的なｐｒｅｍｅｌａｎｏｓｏｍｅ生成機能喪失とそれに続く色素細胞の消失をきたすもので、これまで、皮膚のみの疾患と考えられてきたが、現在は、目、脳軟膜にも病変を来すことが判ってきている。また、毛髪の色もメラニンの沈着によるものであることから、加齢に伴って起こる白髪は毛根のメラニン産生の減退によるものと考えられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は後天性脱失症である尋常性白斑の治療、老化性白毛の改善、その他に有効で、かつ日焼け効果も有するメラニン産生促進剤及びそれを含む皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、フラボン骨格、フラボノール骨格、フラバノン骨格、フラバノノール骨格及びイソフラボン骨格の少なくとも一つの骨格を有するフラボノイドからなるメラニン産生促進剤が提供される。
【０００５】
本発明に従えば、また上記フラボノイドからなるメラニン産生促進剤と皮膚外用剤用基剤とを含んでなる皮膚外用剤組成物が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ヒト皮膚由来のメラノサイト細胞（ＨＭＶＩＩ）及びヒト３次元皮膚モデルにおいて、フラボノイドがメラニン産生を増大させることを見出し、かかる知見に基づいて本発明をするに至ったものである。
【０００７】
フラボノイドは、野菜や果物などの植物に広く存在し、２つのフェニル基が炭素原子３つを介して結合した化学構造を形成している一群の色素化合物を総称する用語である。フラボノイドは狭義には、３環性で４位にオキソ構造を持つ場合を指し、図１に示したように、フラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノノール及びイソフラボンの５種である。このようなフラボノイドは、抗アレルギー、抗ウイルス、抗酸化といった有用な生理作用を持つことは知られているが、フラボノイドがフラボン骨格、フラボノール骨格、フラバノン骨格、フラバノノール骨格及び／又はイソフラボン骨格を有するフラボノイドがメラニン産生促進作用を有することは全く知られていない。
【０００８】
フラボノイドは自然界に広く分布する天然化合物であることから強い副作用をもたらすことなく効能を示すと考えられ、様々なｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（化学予防効果）が期待される物質である。本発明者らはフラボノイドがヒト皮膚由来のメラノサイト培養細胞（ＨＭＶＩＩ）及びヒト皮膚三次元モデル細胞においてメラニン産生を著しく（対照と比較してメラニン産生量が約７倍）促進させることを見出した。
【０００９】
メラニン産生は、図２に示すようにチロシン→ＤＯＰＡ→ＤＯＰＡキノン→ロイコＤＯＰＡクローム→ＤＯＰＡクローム→メラニンの過程を経るが、フラボノイドによるメラニン産生促進作用は、このメラニン合成の律速段階であるチロシンからＤＯＰＡキノンにいたる反応を触媒する酵素チロシナーゼの発現促進によることが判明した。
【００１０】
本発明に係る前記式（１）〜（５）の基本骨格を有するフラボノイドは前述の如く広く植物界に分布している公知の物質であり、一般に市販されている。必要であればこれらのフラボノイドはそれらを含む植物の溶媒抽出で抽出することができ、また生合成、化学合成することもできる。
【００１１】
本発明において使用するのに好ましいフラボノイドとしては、例えばケルセチン、ダイゼン、ゲニステイン、フィスティン、キリスティン、アピゲニン、ルテオリン、ラムネチン及びケンフェロールをあげることができ、これらは単独又は任意の混合物として使用することができる。
【００１２】
本発明に係る前記式（１）〜（５）の基本骨格を有するフラボノイドからなるメラニン産生促進剤は、それ単独で、又は皮膚外用剤用基剤その他の成分と配合して皮膚外用剤組成物（例えば治療薬、化粧料、頭髪養毛料）として使用することができる。皮膚外用剤組成物として使用する場合のフラボノイドの配合量は、好ましくは組成物全重量当り０．１ｐｐｍ（重量）〜１０重量％、更に好ましくは０．１ｐｐｍ（重量）〜０．６重量％、最も好ましくは０．３〜５０ｐｐｍ（重量）である。
【００１３】
本発明に係る皮膚外用剤を構成するのに適した皮膚外用剤基剤としては、例えばフラボノイドの抽出用に使用した溶剤（例えばクロロホルム、ヘキサン、ブタノール、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ）、水、油（例えばグリセリン、ワセリン、オリーブ油、ハッカ油、ステアリルアルコール、ラノリン）などを用いることができ、これらは溶液状、分散液状、乳化液状、軟膏（剤）状、貼付（剤）状などの形態とすることができる。
【００１４】
本発明に係る皮膚外用剤組成物には、上記基剤に加えて、従来から各種皮膚外用剤に一般的に配合されている添加剤や基剤を本発明の目的を損わない範囲及び量で使用することができる。具体的には、保湿剤（例えばキシリトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、プロデュウ（ＤＬ−ピロリドンカルボン酸＋Ｌ−プロリン＋乳酸ナトリウム＋ソルビトール＋コラーゲンの水溶液）、異性化糖／ペンタバイテン）、紫外線吸収剤（例えばオキシベンゾン、グアイアズレン、サルチル酸フェニル、シノキサート、パラアミノ安息香酸エステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−ベンゾントリアゾール）、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ）、抗酸化剤（例えばコーキュー１０（ＣｏＱ１０）、カロチノイド、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ローズマリー、セージ、オレガノ、セサミノール、カテコール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオン）、油脂（例えばコーン油、オリーブ油）、界面活性剤（例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、酢酸ポリオキシンエチレンラノリンアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム、セチル硫酸ナトリウム、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンラノレン、ポリオキシエチレンラノレンアルコール、ラウリル硫酸塩）、粉体（例えばシクロデキストリン）、着色剤（例えばジハイドロキシアセトン（ＤＨＡ））などがあげられる。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例に従って本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
【００１６】
実施例１
以下にフラボノール類に属するフラボノイドであるケルセチンのメラニン産生促進作用の例を示す。試験に供したケルセチンはＳｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣＯ．から入手した市販品（３，３’，４’，５，７−ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙ−ｆｌａｖｏｎｅ（Ｑ−０１２５），Ｌｏ１０９Ｈ０８８２）である。
【００１７】
図３に示すように、対照（コントロール）としてＤＭＳＯを添加した細胞ＨＭＶＩＩ：理研ジーンバンク（ＲＣＢ０７７７）に比較してケルセチン２０μＭを添加した細胞では焦げ茶色を呈する色素性物質が著明に沈着することが明らかとなった。この細胞株（ＨＭＶＩＩ）はメラニン産生能を持つ細胞であることから、ケルセチンの添加により増加、沈着した色素はメラニンであることが予測された。
そこで実際に、細胞（ＨＭＶＩＩ）に対照（無添加）、対照（ＤＭＳＯ添加）及びケルセチン（２０μＭ）投与後の細胞に含有されるメラニンの量を以下のようにして測定した。約１×１０６　個のＨＭＶＩＩ細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて洗浄後、５００μｌの１Ｍ　ＮａＯＨを加え超音波破砕し、一昼夜放置し細胞を溶解した。この細胞溶解液の吸光度（４７５ｎｍ）を測定し、既知量の合成メラニンの吸光度から計算し、メラニン量を決定した。
図４に示すように、ケルセチン投与後、細胞に含有されるメラニン量は経時的に増加することを確認した。ケルセチンによるメラニン産生促進作用は、投与７日目ではコントロールのＤＥＭＳＯ添加に比較して約６．９倍に達した。
【００１８】
次に、このケルセチンによるメラニン産生促進効果に及ぼすケルセチンの添加量の影響を検討したところ、図５に示すように、添加したケルセチンの濃度に依存してメラニン含量が増加した。
【００１９】
実施例２
細胞内におけるメラニン産生過程の律速段階となる反応は、チロシナーゼによるチロシンからＤＯＰＡ，ＤＯＰＡキノンに至る酵素触媒反応である。すなわちケルセチンによるメラニン産生促進とチロシナーゼ活性の間に何らかの関連があることが推察される。そこでケルセチン添加後のＨＭＶＩＩ細胞のチロシナーゼ活性の変化を以下の通りにして測定した。約１×１０６　個のＨＭＶＩＩ細胞をリン酸緩衝液にて洗浄後、４５μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え細胞を溶解した。この細胞破砕液に５μｌの２０ｍＭ　Ｌ−ｄｏｐａを加え３７℃、６０分間反応させた。この反応溶液の吸光度（４７５ｎｍ）をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ　２５０　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　Ｃｏ，ＵＳＡ）により測定した。既知の酵素活性を有するチロシナーゼ蛋白（マッシュルーム由来）を対照として酵素活性を決定した。
【００２０】
その結果、図６に示すように、ケルセチン投与後チロシナーゼ活性は経時的に有意に増加することが判った。また、図７に示すように、チロシナーゼ活性はケルセチンの投与量に依存して増加した。これらの結果から、ケルセチンによる細胞内メラニン量の増大は、細胞中のチロシナーゼ活性の増大によることが判明した。
【００２１】
実施例３
更に、Ｌ−ＤＯＰＡを基質として、電気泳動のゲル内においてチロシナーゼ活性染色を以下の通りにして行った。１×１０６　個のＨＭＶＩＩ細胞に１００μｌの細胞破砕液（１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍｌアプロチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８））を加え超音波破砕し細胞溶解液を調製した。この破砕液を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルを２００ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にて洗浄した。洗浄を終えたゲルを２００ｍｌの５ｍＭ　Ｌ−ＤＯＰＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸し、３７℃、３０分ゆっくりと振盪しチロシナーゼ活性染色を試行した。
【００２２】
ケルセチン投与後、図８に示すように、１，３，５及び７日と時間を経るに従って、チロシナーゼ蛋白の分子量に相当する位置に認められるチロシナーゼ活性染色腸性のシングルバンドの強さが著明に増大した。また、図９に示すように、そのチロシナーゼ活性染色のバンドの強さはケルセチンの濃度に依存していた。
【００２３】
実施例４
上記に示したケルセチンによるチロシナーゼ活性の増加は、細胞内チロシナーゼ蛋白の増加によるものと推察された。そこで、ケルセチン投与後のチロシナーゼ蛋白の量をイムノブロッティング法により以下の通り観察した。１×１０６　個のＨＭＶＩＩ細胞に１００μｌの細胞破砕液（１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍｌアプロチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８））を加え超音波破砕し細胞溶解液を調製した。この破砕液にドデシル硫酸ナトリウム（最終濃度１％）、２−メルカプトエタノール（最終濃度５％）を加え、９５℃、５分間、熱処理を行った。この溶液をサンプルとして、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動後、ポリアクリルアミドゲル内の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜を５％脱脂ドライミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳ緩衝液（ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｃｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）に浸し、１時間振盪した。次に、ニトロセルロース膜を希釈した抗ヒトチロシナーゼーマウス抗体と室温で１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ含有ＴＢＳ緩衝液（Ｔ−ＴＢＳ）にて５回洗浄した後、ニトロセルロース膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロプリン抗体と室温で１時間反応させた。Ｔ−ＴＢＳにて５回洗浄した後、チロシナーゼ蛋白のバンドを化学発光法により検出した。
【００２４】
その結果、図１０に示すように、イムノブロッティング法により認められるチロシナーゼ蛋白のバンドは、ケルセチンの濃度に依存して、その濃さが増加した。このことから、ケルセチンはチロシナーゼ蛋白の合成を促進することが明らかとなった。
【００２５】
実施例５
市販のダイゼン、ゲニステイン、フィスティン、キリスティン、アピゲニン、ルテオリン、ラムネチン、ケンフェロール、ケルセチンによる、ＨＭＶＩＩ細胞におけるメラニン産生に及ぼす効果を以下の通り測定し、結果を図１１に示す。なお対照としては各フラボノイドの溶媒として用いたＤＭＳＯ液を添加したもの、および無添加とした。
【００２６】
上記試験において、ダイゼン、ゲニステイン、フィスティン、キリスティン、アピゲニン、ルテオリン、ラムネチン、ケンフェロールを添加した際に、対照であるＤＭＳＯを添加したものに比較して有意にＨＭＶＩＩ細胞におけるメラニン含量が増加した。これらのフラボノイドの化学構造を図１２，１３に示す。
【００２７】
実施例６
ダイゼン（図１４）、ゲニステイン（図１５）、フィスティン（図１６）、キリスティン（図１７）、アピゲニン（図１８）、ルテオリン（図１９）、ラムネチン（図２０）及びケンフェロール（図２１）の各フラボノイドの添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。これらの試験は以下の通りに行なった。３７℃、５％ＣＯ２　中において、１×１０４　個のＨＭＶＩＩ細胞を１０％ウシ胎児血清含有Ｈａｍ’ｓＦ１２倍地にて培養した。２４時間後、この培地中にＤＭＳＯを溶媒とする各フラボノイド溶液を最終濃度２０μＭになるように添加した。添加後、１，３，５，７日後に細胞を採取した。採取した細胞（約１×１０６　個）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて洗浄後、５００μｌの１Ｍ　ＮａＯＨを加え超音波破砕し、一昼夜放置し細胞を溶解した。この細胞溶解液の吸光度（４７５ｎｍ）を測定し、既知量の合成メラニンの吸光度から計算し、メラニン量を決定した。上記した方法によりメラニンの量を測定した。
【００２８】
実施例７
以下に本発明に係る皮膚外用剤組成物のいくつかの例の配合例を示す。
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【００２９】
実施例８
男性パネル６名（２０代〜４０代）及び女性パネル９名（２０代〜３０代）に対し０．５％ケルセチン溶液（溶媒：ＤＥＭＳＯ：アセトン＝１：２）を使用し、その効果判定を行った。ケルセチン溶液塗布２４時間及び４８時間後に、効果判定した結果、男性パネル５名以上、女性パネル８名以上に色素沈着が認められた。また、２週間貼付した白斑症患者（１名）ではメラニン色素沈着が認められ、白斑症の症状に改善が認められた。
【００３０】
【発明の効果】
以上のように、種々のフラボノイドによるメラニン産生促進作用が明らかとなった。また、フラボノイドによるメラニン産生促進作用は、チロシナーゼ蛋白の合成促進によるものであると考えられる。これまで全く知られていなかったこのフラボノイドの新しい生理機能の発見をもとに、これを尋常性白斑、白髪といった色素脱失を伴う病態、老化現象の改善に応用することが可能となると考えられる。
本発明の皮膚外用剤組成物は、前述の如く、後天性色素脱失症である尋常性白斑の治療薬として、老化性白毛（白髪）の改善薬（白髪染め、育毛剤、トニック、リンス、シャンプーなどに添加することにより白髪の防止、改善効果が期待できる）として作用し、更に日焼けサロンなどにおいて紫外線による皮膚傷害を最小限に抑えつつ日焼けを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】フラボノイドの基本構造を示す化学構造式（１）〜（５）である。
【図２】チロシンからのメラニン産生機構を示す図面である。
【図３】実施例１でＨＭＶＩＩの細胞にＤＭＳＯを添加した対照に対するケルセチン（２０μＭ）添加のメラニン産生を示す写真図である。
【図４】実施例１におけるケルセチン添加のメラニン産生能の経時的を変化を示すグラフ図である。
【図５】実施例１におけるケルセチン添加量のメラニン産生能に及ぼす効果を示すグラフ図である。
【図６】実施例２におけるケルセチン添加後のチロシナーゼ活性の経時変化を示すグラフ図である。
【図７】実施例２におけるケルセチン添加量のチロシナーゼ活性に及ぼす影響を示すグラフ図である。
【図８】実施例３におけるケルセチン投与後のチロシナーゼ蛋白の活性染色の経時変化を示すグラフ図である。
【図９】実施例３におけるケルセチン添加量のチロシナーゼ蛋白の活性染色に及ぼす影響を示すグラフ図である。
【図１０】実施例４におけるケルセチン添加量のチロシナーゼ蛋白の発現に及ぼす影響を示すグラフ図である。
【図１１】実施例５における各種フラボノイドのメラニン産生効果を示すグラフ図である。
【図１２】実施例５におけるメラニン産生効果を示したフラボノイドの化学構造を示す化学式である。
【図１３】実施例５におけるメラニン産生効果を示したフラボノイドの化学構造を示す化学式である。
【図１４】実施例６におけるダイゼン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図１５】実施例６におけるゲニステイン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図１６】実施例６におけるフィスティン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図１７】実施例６におけるキリスティン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図１８】実施例６におけるアピゲニン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図１９】実施例６におけるルテオリン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図２０】実施例６におけるラムネチン添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図２１】実施例６におけるケンフェロール添加後の細胞内メラニン含量の経時的増加を示すグラフ図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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