(57)【要約】【課題】メタノール資化性酵母を用いて異種蛋白質を発現する際に、異種蛋白質の活性低下を抑制する方法を提供すること。【解決手段】異種蛋白質産生可能なメタノール資化性酵母を培養して組換え蛋白質を発現する際に、メタノール以外の炭素源を用いて培養することを特徴とする組換え蛋白質の活性低下を抑制する方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種蛋白質産生可能なメタノール資化性酵母を培養して組換え蛋白質を発現する際に、メタノール以外の炭素源を用いて培養することを特徴とする組換え蛋白質の活性低下を抑制する方法。
【請求項２】
メタノール資化性酵母がピキア酵母である請求項１記載の方法。
【請求項３】
炭素源がグリセロールまたはブドウ糖である請求項１記載の方法。
【請求項４】
組換え蛋白質の活性低下がホルムアルデヒドによるものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
ホルムアルデヒド消去剤の共存下で培養する請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は組換え蛋白質の活性低下を抑制する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピキア属酵母、特にピキア・パストリスに代表されるメタノール資化性酵母は異種蛋白質の産生に有用な宿主として幅広く用いられている（非特許文献１）。ピキア酵母発現系が成功しているのは強力かつ厳格に異種蛋白質の発現を制御するアルコール・オキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを用いたことによる。当該プロモーターの強力さは、１コピーのＡＯＸ１遺伝子を保持するピキア・パストリスを、メタノールを炭素源として増殖させた際に、その菌体抽出物からアルコール・オキシダーゼが可溶性蛋白質の３０％まで誘導されることが観察されたことで証明された（非特許文献２）。
【０００３】
酵母は炭素源としてメタノールおよびミネラルを含むシンプルで安価な培地中で高密度培養することが可能である（非特許文献３）。従って、上記の強力なプロモーターとこの高密度培養を組合せることにより、極めて高水準の細胞内発現（非特許文献４）あるいは細胞外発現（非特許文献５）で異種蛋白質を産生できるようになった。
【０００４】
その一方で、血漿蛋白質の一種であるアンチトロンビン−ＩＩＩ（以下ＡＴ−ＩＩＩ）を、ピキア・パストリスを用いてメタノール培地中で産生させた後に精製したところ、当該組換えＡＴ−ＩＩＩの比活性が血漿由来品に比較して低下していることが報告された（非特許文献６）。その原因として、ＡＴ−ＩＩＩの反応中心である３８６位のＴｈｒにＯ結合型糖鎖が付加したためと考えられた。また、宿主由来のプロテアーゼにより異種蛋白質が分解されることも知られているが、その場合は異種蛋白質の発現量が劇的に減少することから、単なる活性低下とは現象的に似て非なるものである。
【０００５】
【特許文献１】
特開平４−２９９９８４号公報
【非特許文献１】
モレキュラ・バイオテクノロジ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、２０００年、１６巻、２３〜５２頁
【非特許文献２】
アグリカルチャー・バイオロジカル・ケミストリ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９８０年、４４巻、２２７９〜２２８９頁
【非特許文献３】
バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、１９８９年、３４巻、４０３〜４０４頁
【非特許文献４】
バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８９年、２８巻、４１７〜４２５頁
【非特許文献５】
イースト（ＹＥＡＳＴ）、１９９９年、１５巻、１０８７〜１０９６頁
【非特許文献６】
プロテイン・エクスペリメント・アンド・ピュリフィケーション（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．）、２００１年、２３巻、５５〜６５頁
【非特許文献７】
ジーン（ＧＥＮＥ）、１９９７年、１８６巻、３７〜４４頁
【非特許文献８】
イースト（ＹＥＡＳＴ）、１９８９年、５巻、１６７〜１７７頁
【非特許文献９】
モレキュラ・アンド・ゼネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、１９９４年、２４３巻、４８９〜４９９頁
【非特許文献１０】
モレキュラ・セルラ・バイオロジ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９８５年、５巻、３３７６〜３３８５頁
【非特許文献１１】
ジャーナル・オブ・バクテリアロジ（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉａｌ．）、１９８３年、１５３巻、１６３〜１６８頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、メタノール資化性酵母を用いて異種蛋白質を発現する際に、異種蛋白質の活性低下を抑制する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の事情を考慮して研究を行い、新規な機序として培養中の異種蛋白質の活性低下が培地中に発生するホルムアルデヒドと関係することを見出した。さらに、本発明者らは研究を進めた結果、メタノール以外の炭素源を用いて培養することにより、異種蛋白質の活性低下を抑制できることを見出して、本発明を完成した。すなわち、本発明は、異種蛋白質産生可能なメタノール資化性酵母を培養して組換え蛋白質を発現する際に、メタノール以外の炭素源を用いて培養することを特徴とする組換え蛋白質の活性低下を抑制する方法、に関する。以下に詳細を説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
Ａ．宿主（メタノール資化性酵母）
本発明の宿主であるメタノール資化性酵母は本来、メタノールを栄養素として増殖する性質を有する酵母であれば特に限定されない。具体的には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）などが例示される。
【０００９】
好ましくはピキア・パストリスを用いる。具体的には、ＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ  寄託番号Ｙ−１５８５１）、ＧＳ１９０株（同Ｙ１８０１４）、ＰＰＦ１株（同Ｙ１８０１７）、野生株（同Ｙ１１４３１）などが例示される。また、本発明においてはプロテアーゼＡ欠損株を用いることもできる。具体的にはＳＭＤ１１６８株（インビトロジェン社）などが例示される。
【００１０】
Ｂ．異種蛋白質
本発明で用いられる異種蛋白質としては、生理活性を有するものであれば特に限定されるものではない。具体的には種々の血漿蛋白、例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、血液凝固因子（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子など）、フィブリノゲン・フィブリン、プロトロンビン・トロンビン、アンチトロンビン−ＩＩＩ、ハプトグロビンなど、プラスミノゲン活性化因子（ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子ｔＰＡ、ストレプトキナーゼなど）、コロニー形成刺激因子、各種抗体、エリストポエチン、ホルモン、インスリンなどが例示される。特に好ましいのはアンチトロンビン−ＩＩＩなどの、アルギニン残基がその活性に重要な役割を果たす蛋白質である。これらの異種蛋白質をコードする（構造）遺伝子もまた公知の情報に基いて本発明で利用可能である。
【００１１】
Ｃ．宿主−ベクター発現系
発現系としては、プロモーター、シグナル配列が必要である。プロモーターはピキア酵母において異種蛋白質の発現（分泌）を制御可能なものとして通常利用されているものであれば特に限定されない。具体的にはアルコール・オキシダーゼ由来のプロモーター、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド  ３−ホスフェート  デヒドロゲナーゼ）プロモーター（非特許文献７）などが例示される。アルコールオキシダーゼプロモーターとしては、例えば、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、変異型ＡＯＸ２プロモーター、すなわち、天然型ＡＯＸ２プロモーター（非特許文献８）中の開始コドン上流２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの（特許文献１）やその他の箇所が変異または欠失したもの（非特許文献９）などが挙げられる。
【００１２】
シグナル配列は酵母発現系において公知のものを使用すればよい。例えば、インベルターゼ（ＳＵＣ２）、Ｍα、ヒト血清アルブミンなどに由来するものが例示される。また異種蛋白質由来のｎａｔｉｖｅなものを用いることもできる。
【００１３】
また、ターミネーター、選択マーカーなども公知のものを利用することができる。ターミネーターとしてはＡＯＸ１ターミネーターなどが例示される。選択マーカーとしてはピキア酵母由来のＡＲＧ４、ＨＩＳ４、パン酵母由来のＳＵＣ２、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などのアミノ酸／核酸合成遺伝子あるいはゼオシン、Ｇ４１８などの薬剤耐性遺伝子等が例示される。
【００１４】
また、発現用プラスミドを宿主の染色体上に導入する場合は相同領域を用いることができる。相同領域としては上記のアミノ酸／核酸合成遺伝子、アルコール・オキシダーゼ遺伝子、リボソームＤＮＡ遺伝子、Ｔｙ因子、その他のピキア酵母の既知遺伝子などが例示される。
【００１５】
発現用プラスミド（発現ベクター）は、プロモーターの下流にシグナル配列、異種蛋白質をコードする遺伝子、ターミネーター、選択マーカー、相同領域などを連結することにより調製することができる。
【００１６】
プラスミドをピキア酵母に導入し形質転換体を調製する手段としては公知の手法が用いられる。具体的には、プラスミドを宿主染色体上に組込む方法、細胞内にエピゾーマル型で存在させる方法である。また、形質転換体は当該発現用プラスミドを１または複数個（コピー数で）組込んでいてもよい。複数個（コピー数）のプラスミドを組込む場合、同一種のプラスミドを同一相同領域に複数個組込むこともできるし、相異なる相同領域を用いて構築した複数種のプラスミドを、各々相異なる当該相同領域を利用して順次組込むことにより調製することもできる。
【００１７】
なお、プラスミドを細胞内にエピゾーマル型で存在させるためには、プラスミドに自律複製配列を付加したものを用いればよい。
【００１８】
発現用プラスミドを宿主細胞内に導入する（宿主染色体に組込む、細胞内にエピゾーマル型で存在させる）方法は公知の手法を用いることができる。例えば、アルカリカチオン法、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法などが例示される。
【００１９】
Ｄ．培地成分
基本成分（炭素源以外）としては、酵母の培養で通常使用されるものであれば特に限定されない。具体的には、酵母エキス、蛋白加水分解物（特に植物性のものが好ましい）、無機塩類（電解質、ミネラル）、ビタミン類、微量元素類などが例示される。その添加量としては、酵母エキスが０．５〜３（ｗ／ｖ）％程度、蛋白加水分解物が１〜６（ｗ／ｖ）％程度である。
【００２０】
本発明においては、炭素源としてメタノール以外のものを用いることが特徴である。具体的には、グリセロール、ブドウ糖、エタノール、糖アルコール（ソルビトールなど）、有機酸またはその塩（酢酸塩、乳酸塩など）、スクロース、マルトース、ラクトースなどが例示される。その添加量としては０．０１〜１０（ｗ／ｖ）％程度が挙げられる。好ましくは培養初発（開始）時で１〜５（ｗ／ｖ）％、流加培養時で０．０１〜１（ｗ／ｖ）％程度である。また、培地にはホルムアルデヒド消去剤を添加してもよい。ホルムアルデヒド消去剤としては、カルボヒドラジド、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、アミン、アミド、イミド、ニトリル、カルバメート、アルコール（ただしメタノールは除く）、メルカプタン、アミノ酸などが例示される。
【００２１】
Ｅ．培養
培養条件としてはｐＨ３〜８、温度２０〜４５℃、時間１０〜５００時間程度が例示される。細胞密度としては１０〜１５０ｇ−ＤＷ（乾燥重量）／Ｌ程度が例示される。培養様式としては回分培養、半回分培養（フェドバッチ培養）、連続培養のいずれでもよい。
【００２２】
また、当該本培養に先立って前培養を行うこともできる。前培養用の培地としては、例えば、ＹＮＢ培地（イーストナイトロジェンベースとブドウ糖からなる）、ＹＰＧ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、３％グリセロールからなる）、ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、２％ブドウ糖からなる）などが例示される。前培養の培養条件としては、温度２０〜４５℃、時間１０〜１００時間程度が例示される。
【００２３】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために、以下に実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２４】
実施例
材料および方法
血漿由来ＡＴ−ＩＩＩ
市販品（商品名ノイアート、三菱ウェルファーマ）を用いた。
【００２５】
宿主
ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株（ｈｉｓ４）を用いた。これは非特許文献１０に開示された株ＧＳ１１５と同一のものである。
【００２６】
プラスミド
アンチトロンビン−ＩＩＩ（以下単にＡＴ−ＩＩＩ）発現用プラスミドｐＡＴ１０１は、非特許文献６に開示された方法に準じて構築した。またｐＡＴ１０１のプロモーター領域を別のもの（プラスミドｐＨＯ０６８ＦＲＲ由来、非特許文献９）と置換することによりｐＩＭ１０２を構築した。ｐＡＴ１０１は、大きさが７．９ｋｂ、１コピーの天然型ＡＯＸ２のＵＡＳ領域と変異型ＡＯＸ２のＵＲＳ２領域を組合せたプロモーターおよびインベルターゼ（ＳＵＣ２）由来のシグナル配列を有する（図１）。ｐＩＭ１０２は、大きさが８．４ｋｂ、３コピーの合成ＡＯＸ２−ＵＡＳ領域からなる（ＡＯＸ１由来ＵＲＳ１およびＵＲＳ２を含まない）プロモーターおよびインベルターゼ由来のシグナル配列を有する（図２）。
【００２７】
形質転換
発現用プラスミドをピキア・パストリスＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）株の染色体上のｈｉｓ４配座に組込むために、ＳｔｕＩで消化することにより直線化した。当該直線化プラスミドを用いて酢酸リチウム法（非特許文献１１）により、ＧＴＳ１１５株を形質転換した。
【００２８】
メタノール制限フェドバッチ培養
細胞（酵母）をＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプトン、２％ブドウ糖からなる）中で３０℃１日間前培養した。次いで基本培地Ａ  ２．６６Ｌを用いて１０Ｌ容の通気攪拌型培養装置（ＢｉｏＭａｓｔｅｒＤ型、エイブル社）でフェドバッチ培養を行った。基本培地Ａは（脱イオン水１Ｌ当たり）、グリセロール５０ｇ、リン酸（８５％）２１ｍＬ、硫酸カルシウム・２水和物０．９ｇ、硫酸カリウム１４．３ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物５．７４ｇ、水酸化カリウム（８５％）３．９ｇ、ペプトン５０ｇ、硫酸第一鉄・１水和物９１ｍｇ、硫酸銅・５水和物８．４ｍｇ、硫酸マンガン・４−５水和物５．７４ｍｇ、硫酸亜鉛・７水和物２８ｍｇ、硫酸１２．９μＬ、ヨウ化カリウム１．１２ｍｇ、モリブデン酸２ナトリウム・２水和物０．２８ｍｇ、ホウ酸０．０２８ｍｇ、塩化コバルト０．３７８ｍｇ、ｄ−ビオチン０．１２ｍｇ、チアミン塩酸塩０．８４ｍｇおよび消泡剤（商品名アデカノールＬＧ１０９、旭電化工業）０．３ｇの組成からなる。基本培地Ａ中のリン酸、硫酸カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸カルシウムの濃度は必要に応じて、２０％（基本培地Ｂ）または５０％（基本培地Ｃ）増量した。
【００２９】
初発のグリセロールが全て消費されるまで（約２４時間）、細胞をバッチワイズに増殖させた。基本培地中のグリセロールが全て消費された後（溶存酸素量により確認される）、メタノール・フェドバッチ培地および３２％ペプトンの流加を開始した。メタノール・フェドバッチ培地は（メタノール１Ｌ当たり）、硫酸第一鉄・１水和物０．３２５ｇ、硫酸銅・５水和物０．０３ｇ、硫酸マンガン・４−５水和物２０．５ｍｇ、硫酸亜鉛・７水和物０．１ｇ、硫酸２５μＬ、ヨウ化カリウム４ｍｇ、モリブデン酸２ナトリウム・２水和物１ｍｇ、ホウ酸０．１ｍｇ、塩化コバルト０．１３５ｍｇ、ｄ−ビオチン０．８ｍｇおよびチアミン塩酸塩１２ｍｇの組成からなる。その流加速度は下記の式に従ってフィードフォワード制御様式で制御され、細胞はメタノール制限下で増殖させた。
【００３０】
Ｆ（ｔ）＝５．２９Ｅｘｐ（０．０２ｔ）  （ｔが０から７７．１まで）
Ｆ（ｔ）＝２４．７                      （ｔが７７．１以降）
式中、ｔは流加開始後の時間（ｈｒ）、Ｆ（ｔ）は時間ｔにおけるメタノール・フェドバッチ培地の流加速度（ｇ／ｈｒ）である。３２％ペプトンの流加速度はメタノール・フェドバッチ培地１ｇ添加毎に０．２６ｇとした。バッチ培養期間中、培養装置は温度３０℃に設定し、ｐＨは２８％アンモニア水の添加により５．８５に維持した。流加開始後、温度を３０℃から２５℃にシフトし、ｐＨも必要に応じて変更した。攪拌速度は溶存酸素量が飽和濃度の１０％以上を維持するように適宜増加させた。
【００３１】
分析用に培養サンプルを毎日１回採取した。細胞増殖は分光光度計（ＵＶ−１２００、島津製作所）を用いて波長５４０ｎｍでモニターした。１万ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた上清は分析を行う時まで−８０℃で保存した。またＭｏｃｋ形質転換細胞の場合は、上清を０．２２μｍのフィルター（商品名Ｍｉｌｌｅｘ、ミリポア社）で濾過することにより調製して、実験を行う時まで−８０℃で保存した。
【００３２】
グリセロール制限フェドバッチ培養
細胞（酵母）をＹＰＤ培地中で３０℃１日間前培養した。次いで基本培地Ｃ  ０．８４Ｌを用いて３Ｌ容の通気攪拌型培養装置（ＢｉｏＭａｓｔｅｒＤ型、エイブル社）でグリセロール制限（グリセロールを単一炭素源とする）フェドバッチ培養を行った。
【００３３】
基本培地Ｃの初発グリセロールが全て消費されるまで（約２４時間）、細胞をバッチワイズに増殖させた。基本培地中のグリセロールが全て消費された後、グリセロール・フェドバッチ培地および３２％ペプトンの流加を開始した。グリセロール・フェドバッチ培地は、グリセロール７５０ｇ、脱イオン水２５０ｇ、硫酸第一鉄・１水和物０．３０５ｇ、硫酸銅・５水和物０．０２８１ｇ、硫酸マンガン・４−５水和物１９．２ｍｇ、硫酸亜鉛・７水和物９３．７ｍｇ、硫酸２３．４μＬ、ヨウ化カリウム３．７４ｍｇ、モリブデン酸２ナトリウム・２水和物０．９４ｍｇ、ホウ酸０．０９４ｍｇ、塩化コバルト０．１２７ｍｇ、ｄ−ビオチン０．７５ｍｇおよびチアミン塩酸塩１１．７ｍｇの組成からなる。グリセロール・フェドバッチ培地の流加速度は下記の式に従ってフィードフォワード制御様式で制御され、細胞はグリセロール制限下で増殖させた。
【００３４】
Ｆ（ｔ）＝２．９７Ｅｘｐ（０．０３ｔ）  （ｔが０から４１．６まで）
Ｆ（ｔ）＝２４．７                      （ｔが４１．６以降）
式中、ｔは流加開始後の時間（ｈｒ）、Ｆ（ｔ）は時間ｔにおけるグリセロール・フェドバッチ培地の流加速度（ｇ／ｈｒ）である。３２％ペプトンの流加速度はグリセロール・フェドバッチ培地１ｇ添加毎に０．１９６ｇとした。バッチ培養期間中、培養装置は温度３０℃に設定し、ｐＨは２８％アンモニア水の添加により５．８５に維持した。流加開始後、温度を３０℃から２５℃にシフトし、ｐＨは５．８５から６．５に変更した。攪拌速度は溶存酸素量が飽和濃度の１０％以上を維持するように適宜増加させた。
【００３５】
ＡＴ−ＩＩＩの定量およびヘパリン・コファクター活性の分析
培養上清中のＡＴ−ＩＩＩ濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡはウサギ由来抗ヒトＡＴ−ＩＩＩポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）および西洋ワサビ由来ＰＯＤ標識ヒツジ由来抗ヒトＡＴ−ＩＩＩ  ＩｇＧ（アフィニティ精製品、ＣＥＤＡＬＡＮＥ社）を用いて行われた。
【００３６】
培養上清中のＡＴ−ＩＩＩのヘパリン・コファクター活性は発色基質Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドの２塩酸塩（Ｓ−２２３８）を用いた市販の分析キット（商品名テストチームＡＴＩＩＩ・２キット、第一化学薬品）により測定した。任意のヘパリン・コファクター活性を、ＡＴ−ＩＩＩ特異的なＥＬＩＳＡにより定量されたｒＡＴ−ＩＩＩ濃度で除することにより、ヘパリン・コファクター活性ベースでの比活性を算出した。
【００３７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタン・ブロット分析
培養上清を脱イオン水で１：１０に希釈し、その希釈液５０μＬを緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ＮＯＶＥＸ社）２５μＬ、脱イオン水１５μＬおよび還元剤（ＮｕＰＡＧＥ  ｓａｍｐｌｅ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、ＮＯＶＥＸ社）１０μＬと混合した。混合液を７０℃で１０分間インキュベートし、その１０μＬを電気泳動に付した。製造元（ＮＯＶＥＸ社）により設定された泳動条件下で泳動用緩衝液（ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中で泳動用ゲル（ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナトリウム・ドデシル・スルフェート−ポリアクリルアミドゲル・エレクトロフォレーシス）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した蛋白質をＰＤＶＦ（ポリビニリデン・ジフルオライド）膜（テフコ社）にブロッティングした。当該膜をブロッキング緩衝液（５％スキムミルクを含むＰＢＳ）中で１時間以上インキュベートしてから、ヒトＡＴ−ＩＩＩに対してウサギで調製されたポリクローナル抗体（オリエンタル酵母）を１：１０００に希釈したものとともに室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％を含む緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、西洋ワサビ由来ＰＯＤ標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（バイオ−ラッド社）を１：１０００に希釈したものと室温で３０分間反応させた。該ＰＶＤＦ膜を、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、発色基質液（ＰＯＤ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ  Ｓｅｔ、和光純薬工業）中でインキュベートした。
【００３８】
培養上清中のＰ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａおよびホルムアルデヒドの分析
上清中のＰ、ＭｇおよびＣａの濃度を各々、以下の試薬キット−ＰｈｏｓｐｈａＣ  テスト・ワコー、マグネシウムＢテスト・ワコーおよびカルシウムＣテスト・ワコー（いずれも和光純薬工業）−を用いて測定した。Ｋは電解質自動分析装置（ＮＡＫＬ−２、オリンパス光学）を用いて測定した。ホルムアルデヒドはホルムアルデヒド−テスト・ワコー（和光純薬工業）を用いて測定した。ホルムアルデヒド測定キットはホルムアルデヒドと４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾールをモル比１：１でアルカリ条件下に反応させることを利用して行うものである。その反応生成物である６−メルカプト−Ｓ−トリアゾール［４，３−ｂ］−ｓ−テトラジンを波長５５０ｎｍで測定した。
【００３９】
結果
組換えＡＴ−ＩＩＩ産生における培養ｐＨの効果
ｒＡＴ−ＩＩＩ発現プラスミドｐＡＴ１０１の１コピー形質転換体である組換えピキア株ＲＨ１０１を基本培地Ａで培養した。培養ｐＨは培養期間中、２８％アンモニア水の添加によりｐＨ５．８５に維持された。培地中のグリセロールが全て消費された後（２３ｈｒ）、メタノール・フェドバッチ培地および３２％ペプトンをメタノール制限下で流加した。培養上清中のｒＡＴ−ＩＩＩをＡＴ−ＩＩＩ特異的なＥＬＩＳＡで測定し、その活性はヘパリン・コファクター活性として測定した。ｒＡＴ−ＩＩＩ濃度は１９２時間目まで経時的に増加し、３２４ｍｇ／Ｌに達した（図３Ａ）。その一方で培養上清中のｒＡＴ−ＩＩＩの比活性は培養期間中、徐々に低下した（図３Ｂ）。ｒＡＴ−ＩＩＩの比活性（ヘパリン・コファクター活性ベース、以下同様）は培養後１９２時間目で０．７３ＩＵ／ｍｇと、血漿由来ＡＴ−ＩＩＩのわずかに１０％でしかなかった。
【００４０】
この比活性低下を改善すべく、培養ｐＨの効果を５．８５、６．５および７．０で調べた。培養上清のウェスタン・ブロット分析の結果は分解されたｒＡＴ−ＩＩＩ断片量が培養ｐＨを５．８５から７．０に上げるに従って増加することを示している（図４）。分解されたｒＡＴ−ＩＩＩ断片量は最も少ないにもかかわらず、ｒＡＴ−ＩＩＩの比活性はｐＨ５．８５で培養した時が最も低いものであった（表１）。最も高い比活性（１．１３ＩＵ／ｍｇ）はｐＨ６．５で培養した時に観察された。
【００４１】
【表１】
2004337078.tif 000002
【００４２】
蛋白加水分解に及ぼす無機塩類濃度の効果
ｐＨ６．５での培養期間中、ｒＡＴ−ＩＩＩを蛋白加水分解から保護すべく、無機塩濃度の効果を調べた。基本培地Ａ中のリン酸、硫酸カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸カルシウムの濃度を２０％乃至５０％に増加させた。図５に示すように分解されたｒＡＴ−ＩＩＩ断片量は高塩濃度ほど減少した。ｒＡＴ−ＩＩＩの比活性は塩濃度を５０％に増加することにより１．１３から１．４８ＩＵ／ｍｇに改善された（表２）。
【００４３】
【表２】
2004337078.tif 000003
【００４４】
図６は培養期間中の培養上清におけるＰ、Ｋ、ＭｇおよびＣａの濃度を示す。ＰおよびＫの濃度は初発濃度を増加するほど上昇する一方で、ＭｇおよびＣａの濃度は軽微の上昇に留まった。恐らくは培地中での不溶性塩の形成によるものと思われる。さらに培養期間中にリン酸二アンモニウム液を流加することにより培地中のリン酸塩濃度を上昇させる実験を行ったが、比活性の更なる改善は達成できなかった。
【００４５】
ホルムアルデヒドはＡＴ−ＩＩＩのヘパリン・コファクター活性を減弱する
ｒＡＴ−ＩＩＩの低比活性の原因となる機序を解明すべく、ＡＴ−ＩＩＩ遺伝子を担持しないプラスミドを形質転換したピキア株（Ｍｏｃｋ）を用いてメタノール制限フェドバッチ培養から得られた培養上清を調製した。Ｍｏｃｋ細胞の上清は培養４８時間目および１４４時間目に採取し、０．２２μｍのフィルターで濾過して細胞を完全に除去した。比活性７．０ＩＵ／ｍｇの血漿由来ＡＴ−ＩＩＩを、培養１４４時間目に採取した上清を濾過したものに添加し、終濃度５００ＩＵ／ｍＬとなるように調整した上で、２５℃でインキュベートした。図７に示すようにＡＴ−ＩＩＩの急激な低下がインキュベート２時間後に観察された。ＡＴ−ＩＩＩの残存活性は表３のとおりであった。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
濾過液にメタノールを１ｇ／Ｌとなるように添加するとＡＴ−ＩＩＩ活性の減弱が促進され、インキュベート２４時間後でＡＴ−ＩＩＩ活性はわずかに１６％が残存するだけであった。メタノール１ｇ／Ｌを含むリン酸カリウム緩衝液で同様の実験を行った場合、ＡＴ−ＩＩＩ活性は減弱しなかった。従って、メタノール酸化により産生されるホルムアルデヒドがＡＴ−ＩＩＩ活性低下の原因であると疑われた。ホルムアルデヒドの消去剤であるカルボヒドラジドを上清中に終濃度５０ｍＭとなるように添加したところ、ヘパリン・コファクター活性の損失は抑えられた（図７）。ホルムアルデヒドは培養上清中にも検出された（表４）。
【００４８】
【表４】
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【００４９】
ホルムアルデヒドはｒＡＴ−ＩＩＩ産生株の培養上清中でも検出された。アルコール・オキシダーゼは酸素を電子供与体として、メタノールをホルムアルデヒドおよび過酸化水素への酸化を触媒する。培養上清中のアルコール・オキシダーゼ活性の存在を確認すべく、上清を０．２２μｍフィルターで濾過したものにメタノールを添加してホルムアルデヒドが生成するか否かを実験した。表５に示すようにメタノールの濃度が増加するとともに、また上清を採取する時間が経過するとともにホルムアルデヒドの濃度は上昇した。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
上清中の過酸化水素の産生も４−アミノアンチピリンおよびＮ−エチル−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジンからキノンイミンを形成させることにより検出された。これらの結果は、メタノールで増殖したピキア株の培養上清におけるアルコール・オキシダーゼ活性が培養時間の経過とともに上昇することを示すものであった。
【００５２】
グリセロールにおける組換えＡＴ−ＩＩＩの産生
培養上清中のヘパリン・コファクター活性の損失はホルムアルデヒドによる不活化によるものであることを柱として説明できる。ホルムアルデヒド産生を回避すべく、ｒＡＴ−ＩＩＩ発現用の単一炭素源としてグルセロールを用いた。グリセロール・フェドバッチ培地はメタノール・フェドバッチ培地中のメタノールをグリセロールに置換えて調製されたものである。ｒＡＴ−ＩＩＩ発現プラスミドｐＩＭ１０２の２コピー形質転換体である組換えピキア株ＩＭ１０２をグリセロール制限フェドバッチ様式で培養した。細胞濃度は培養１４４時間目まで増加し、その一方でｒＡＴ−ＩＩＩ濃度とヘパリン・コファクター活性は培養１０１時間目にプラトーに達し、その値は各々、１００ｍｇ／Ｌおよび３００ＩＵ／Ｌであった。培養上清中のｒＡＴ−ＩＩＩの比活性は３ＩＵ／ｍｇを超えていた（図８）。この比活性は血漿由来ＡＴ−ＩＩＩのそれの約５０％に相当する。すなわち、ｒＡＴ−ＩＩＩの比活性は炭素源としてメタノールをグリセロールに置換えることにより血漿由来ＡＴ−ＩＩＩの２０％から５０％にまで改善された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、メタノール資化性酵母の培養による異種蛋白質の発現量をメタノール使用時と比較してそれほど悪化させることなく、その活性低下を抑制することができる。従って、メタノール資化性酵母を用いた異種蛋白質の大量産生に極めて有用な手段となりうることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＡＴ１０１発現プラスミドの構造を概略的に示したものである。
【図２】ｐＩＭ１０２発現プラスミドの構造を概略的に示したものである。
【図３】ｐＡＴ１０１発現プラスミドの１コピー形質転換体であるピキア・パストリス株ＲＨ１０１を用いてｐＨ５．８５でメタノール制限フェドバッチ培養した際のｒＡＴ−ＩＩＩ発現の推移を経時的に示したものである。上図（Ａ）は細胞濃度およびｒＡＴ−ＩＩＩ濃度の推移を、下図（Ｂ）はヘパリン・コファクター活性および比活性の推移を、各々表す。各記号は特定の培養時間における各項目の測定値（または計算値）を各々表す。すなわち、○は細胞濃度を、■は培養上清中のｒＡＴ−ＩＩＩ濃度を、▲は培養上清中のヘパリン・コファクター活性を、□はｒＡＴ−ＩＩＩの比活性を、各々表したものである。
【図４】各種ｐＨでのフェドバッチ培養に由来する培養上清におけるｒＡＴ−ＩＩＩのウェスタンブロットの結果を示したものである。レーン１はｐＨ５．８５で培養１９２時間目のものを、レーン２〜４は各々、ｐＨ６．５で培養１４５、１６９、１９２時間目のものを、レーン５〜７は各々、ｐＨ７．０で培養１４３、１６７、１９２時間目のものを、レーンＮは血漿由来ＡＴ−ＩＩＩを、レーンＭは分子量マーカーを、各々表す。左端矢印はインタクトなｒＡＴ−ＩＩＩの位置を、右端数字は分子量マーカーに相当する分子量（ｋＤａ）を表す。
【図５】各種基本培地を用いたフェドバッチ培養に由来する培養上清におけるｒＡＴ−ＩＩＩのウェスタンブロットの結果を示したものである。レーン１〜３は各々、基本培地Ｃで培養１４３、１６７、１９２時間目のものを、レーン４〜６は各々、基本培地Ｂで培養１４３、１６７、１９２時間目のものを、レーン７は基本培地Ａで培養１９２時間目のものを、各々示す。レーンＮ、レーンＭ、左側矢印、右端数字は図４と同様である。
【図６】各種基本培地を用いたフェドバッチ培養に由来する培養上清におけるＰ、Ｋ、ＭｇおよびＣａの各濃度の推移を経時的に示したものである。図ＡはＰを、図ＢはＫを、図ＣはＭｇを、図ＤはＣａを、各々示す。また、○は基本培地Ａを、△は基本培地Ｂを、▲は基本培地Ｃを、各々示す。
【図７】血漿由来ＡＴ−ＩＩＩのヘパリン・コファクター活性の、活性残存量の推移を経時的に示したものである。□は単に培養上清を用いた場合を、△は培養上清に１ｇ／Ｌのメタノールを添加した場合を、■は培養上清に１ｇ／Ｌのメタノールおよび５０ｍＭのカルボヒドラジドを添加した場合を、各々示す。
【図８】ｐＩＭ１０２発現プラスミドの２コピー形質転換体であるピキア・パストリス株ＩＭ１０２を用いてｐＨ６．５でグリセロール制限フェドバッチ培養した際のｒＡＴ−ＩＩＩ発現の推移を経時的に示したものである。上図（Ａ）、下図（Ｂ）、○、■、▲、□は全て図３と同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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