(57)【要約】【課題】安全かつ安価で、手軽に摂取することができ、十分な免疫賦活効果が期待できる免疫賦活剤及び該免疫賦活剤を含有する食品を提供する。【解決手段】免疫賦活剤の有効成分としてココアを含有させる。本免疫賦活剤を経口摂取することにより、獲得免疫の中心的役割を果たす分子である主要組織適合型複合体（ＭＨＣ）遺伝子の発現を促進することができるので、十分な免疫賦活効果が期待できる。また、本免疫賦活剤は、非常に風味がよいので、そのまま、あるいは食品に配合して、日常的に容易に摂取することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ココアを有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
主要組織適合型複合体（ＭＨＣ）遺伝子の発現を促進することにより免疫を賦活する、請求項１に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の免疫賦活剤を含有することを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ココアを有効成分として含有する免疫賦活剤に関し、更に詳しくは、経口摂取することにより免疫賦活系遺伝子群の発現を亢進して細菌やウイルス等の感染に対する抵抗力を増強する免疫賦活剤及び該免疫賦活剤を含有する食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体は、ウイルスや細菌等の侵入微生物や腫瘍細胞を排除する免疫系という生体防御システムを持っているが、この免疫系は、先天的な自然免疫系と後天的な獲得免疫系に分類される。
【０００３】
自然免疫系は、生来的に備わっている免疫系であり、細胞膜攻撃複合体を形成して細胞に穴をあける補体系や、病原菌・感染細胞を傷害するナチュラルキラー細胞、異物の貪食・抗原提示に関わるマクロファージや樹状細胞等による非特異的防御反応で、獲得免疫系に先だって発動する初期生体防御システムである。
【０００４】
一方、獲得免疫系は、病原菌等に感染することにより獲得される特異的防御反応であり、感染数日後から働き、Ｔ細胞、Ｂ細胞（抗体）や好中球等による液性免疫とＴ細胞、キラーＴ細胞やマクロファージ等による細胞性免疫に大別される。
【０００５】
獲得免疫系が発動するためには、まず、抗原をＴ細胞が認識できるように加工して主要組織適合型複合体（以下、ＭＨＣという。）分子に結合させて提示する抗原提示細胞が必要である。ＭＨＣ分子は自己・非自己の認識を司り、免疫応答の開始及び様々な免疫応答性の制御等において重要な役割を担っており、クラスＩ分子とクラスＩＩ分子の２種類があることが知られている。
【０００６】
そして、クラスＩ分子は内因性抗原ペプチドをＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示することでウイルス感染細胞や腫瘍細胞の破壊を仲介し、クラスＩＩ分子はＢ細胞、樹状細胞、マクロファージ等の抗原提示細胞に発現し、抗原ペプチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示することでサイトカインの分泌を促し、免疫系を活性化することが知られている。
【０００７】
しかしながら、上記のような免疫系の働きは加齢やストレス等により低下するため、免疫系の働きを強化し、ウイルスや細菌等の感染に対する生体防御能を高めるために様々な免疫賦活剤が提案されている。例えば、下記特許文献１には、カカオ豆から得られる抽出物を有効成分とすることを特徴とする免疫賦活剤が開示されており、該抽出物として、生又は加熱処理したカカオ豆、又はカカオハスクから水及び／又は水と相溶性がある有機溶剤で抽出して得られ、分子量が好ましくは１２，０００以上の高分子画分の抽出物が用いられることが記載されている（請求項４、段落番号０００９参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−８６５２６号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
生体防御の観点からは、普段から免疫系の働きを強化することが好ましいが、従来の免疫賦活剤は、副作用の問題や高価である等の問題から日常的に摂取するには問題があったり、十分な免疫賦活作用が期待できない場合が多かった。
【００１０】
また、上記特許文献１に開示された免疫賦活剤は、上記のように生又は加熱処理したカカオ豆、又はカカオハスクを、水及び／又は有機溶媒で抽出して得られる高分子の抽出物を有効成分とするので、一般的に流通している食品素材ではないため、手軽に摂取できないだけでなく、アルカリゼーションを行っていないので、風味がよくないという問題があった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、安全かつ安価で、手軽に摂取することができ、十分な免疫賦活効果が期待できる免疫賦活剤及び該免疫賦活剤を含有する食品を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ココアの生理活性機能を研究する過程で、ココアを摂取することにより、免疫賦活系遺伝子群の発現が亢進されることを見出し、この事実に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明の免疫賦活剤は、ココアを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の食品は、前記免疫賦活剤を含有することを特徴とする。
本発明の免疫賦活剤は、古くから飲食品として摂取されているココアを有効成分とするので安全性が高く、安価に製造することができる。また、非常に風味がよいので、そのまま、あるいは食品に配合して、日常的に容易に摂取することができる。そして、本免疫賦活剤を経口摂取することにより、獲得免疫の中心的役割を果しているＭＨＣ遺伝子の発現を促進することができるので、十分な免疫賦活効果が期待できる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられるココアは、一般的にチョコレートやココア飲料に使用されているココアパウダーを用いることができる。このようなココアパウダーは、例えば、以下のようにして得ることができる。すなわち、カカオの果実からカカオ豆を取り出し、通常、約３０℃の条件下で４〜７日間発酵させた後、乾燥させる。乾燥させたカカオ豆をクリーナーで選別して金属や石等の異物を除去した後、セパレータで砕いて皮や胚芽等を取り除き、カカオニブを得る。得られたカカオニブを、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、酸化マグネシウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ剤をカカオニブの重量に対して０〜５質量％、好ましくは２〜４質量％含む溶液に浸漬し、５０〜１００℃で０〜１５０分間、好ましくは８０〜１００℃で６０〜１２０分間アルカリ処理を行う。このアルカリ処理により、カカオ豆の苦味や渋味を除去することができる。
【００１６】
アルカリ処理後、１００〜１５０℃で２０〜１２０分間焙焼し、グラインダーで磨砕してカカオマスを得る。得られたカカオマスをココアプレスで搾油してココアバターを分離し、ココアミルで粉砕して細かい粉末にすることにより、ココアパウダー（通常、ココアバター含量１５〜２５％程度）を得ることができる。本発明においては、「チョコレート類の表示に関する公正競争規約」で規定されるココアパウダー（ココアバター含量８％以上）だけでなく、上記規約上、ココアパウダーとは言えない脱脂ココア（ココアバター含量８％未満）も用いることができる。
【００１７】
このようにして得られるココアパウダーは、タンパク質、糖質、食物繊維（水溶性難消化性多糖類、ヘミセルロース、セルロース、リグニン等）、リン脂質、無機質（リン、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、銅、カリウム、ナトリウム等）、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＥ（各種トコフェロール等）、ナイアシン、シュウ酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、酢酸、ポリフェノール類（タンニン、エピカテキン、カテキン、ケルセチン等）、無水カフェイン、テオブロミン、各種遊離脂肪酸類（パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等）等を含有している。
【００１８】
本発明の免疫賦活剤の形態は、経口摂取に適した形態であれば特に限定されず、錠剤、粉末（顆粒）、カプセル剤、ドリンク剤等が挙げられる。
【００１９】
本発明の免疫賦活剤の成人１日当たりの有効摂取量は、ココアパウダーとして５〜２５ｇであり、好ましくは１０〜２０ｇである。
【００２０】
本発明の免疫賦活剤は、例えば、ココア飲料（インスタントココアも含む）、チョコレート、錠菓、ババロア、焼き菓子等の各種食品に配合することもできる。食品中におけるココアパウダーの配合量は、上記有効摂取量に基づいて設定すればよく、１〜９０質量％が好ましい。例えば、インスタントココアにおいては、１０〜５０質量％が好ましく、２０〜４０質量％が好ましい。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００２２】
実施例
表１に示す組成のピュアココアパウダー（森永製菓株式会社製）及びココア代替物を用いて、表２に示す組成の飼料（ピュアココア入り飼料：ＨＣ食、ココア代替物入り飼料：ＨＦ食）を調製した。上記ココア代替物は、各種精製飼料原料を用いてココアと栄養成分が等しくなるように調整した飼料原料であり、蒸留水、粉末牛脂（日本クレア株式会社製）、ミルクカゼイン（日本クレア株式会社製）、セルロースパウダー（日本クレア株式会社製）、コーンスターチ（日本クレア株式会社製）、ミネラルミックス（商品名「ＡＩＮ−９３Ｇ−ＭＸ」、日本クレア株式会社製）を表１に示す配合で混合して調製したものである。なお、牛脂は、カカオバターと脂肪酸組成が非常に似ていることから採用した。
【００２３】
そして、上記ＨＣ食及びＨＦ食は、マウス・ラットを用いた栄養研究の標準精製飼料として全世界的に使用されている商品名「ＡＩＮ−９３Ｇ」（日本クレア株式会社製）をベースに、栄養成分組成及び脂肪酸組成が等しくなるように調製した。商品名「ＡＩＮ−９３Ｇ」（日本クレア株式会社製）の配合組成を表３に示す。具体的には、商品名「ＡＩＮ−９３Ｇ」（日本クレア株式会社製）にはコーンスターチが重量比で３９．７４８６％含まれているが、これを３２．５％分減らし（７．２４８６％残し）、替わりに、牛脂２０％分、ピュアココアパウダー（森永製菓株式会社製）又は上記ココア代替物を１２．５％分加え、均一に混合して調製した。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
【表２】
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【００２６】
【表３】
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【００２７】
１週間の予備飼育を行ったＷｉｓｔａｒ系の雄性ラット（日本クレア株式会社より購入）７週齢２０匹を体重の平均値が等しくなるように２群に分け、試験群にはＨＣ食（１２．５質量％ピュアココア入り高脂肪食）を、対照群にはＨＦ食（１２．５質量％ココア代替物入り高脂肪食）を２１日間与えた。飼育期間中、各餌は摂食量（摂取カロリー）が同じになるように与えた。
【００２８】
飼育期間終了後、体重を測定してから解剖を行い、肝臓、腓腹筋、腸間膜白色脂肪組織を摘出し、その重量を測定した。また、血液を採取し、血清中性脂肪値を測定した。そして、これらの測定値を元に、最も標準的な値を示す個体を２匹選んだ。具体的には、体重変動率（（解剖時体重−群分け時体重）／群分け時体重）、肝臓重量比（対・解剖時体重）、腓腹筋重量比（対・解剖時体重）、腸間膜白色脂肪組織重量比（対・解剖時体重）、血清中性脂肪値の５つのパラメータについて、群内平均値から最も隔たりの少ない個体を２匹ずつ選んだ。
【００２９】
選んだ個体の肝臓からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社推奨のプロトコールに則った処理を行った後、ＤＮＡマイクロアレイ法により、免疫関連遺伝子の発現パターンを調べた。具体的には、抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ｃｈｏｉｃｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型にして「Ｂｉｏ  Ａｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ」（商品名、Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてビオチン標識したｃＲＮＡを試験管内で合成した。そして、このｃＲＮＡを断片化した後、ＤＮＡマイクロアレイ（商品名「ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ３４Ａ  Ａｒｒａｙ」（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製））と「ハイブリダイゼーションオーブン」（商品名、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にてハイブリダイゼーションを行い、Ｒ−フィコエリスリン−ストレプトアビジンとの反応及び洗浄操作を「Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ」（商品名、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で行った後、蛍光強度を「Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ」（商品名、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）で測定し、免疫関連遺伝子の発現量の解析を行った。なお、上記ＤＮＡマイクロアレイには、塩基配列が判明しているラットの遺伝子（機能がまだ判明していないものも含まれる）のうち、約３分の１に当る８７４０遺伝子が搭載されており、既に機能が判明しているラットの遺伝子は全てこのチップに載っている。
【００３０】
解析の結果は、個々の遺伝子について、発現量の多い順にＰ（Ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ｍ（Ｍａｒｇｉｎａｌ）、Ａ（Ａｂｓｅｎｔ）と評価される。本実験においては、試験群及び対照群について発現量が「Ｐ］と判定された遺伝子を選び出し、試験群と対照群の間における発現量の比較、すなわち、変動度合いを調べた。なお、変動度合いは、Ｉ（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ；増加）、ＭＩ（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ；境界域・増加）、ＮＣ（Ｎｏ  ｃｈａｎｇｅ；変化なし）、ＭＤ（Ｍａｒｇｉｎａｌｌｙ  Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ；境界域・減少）、Ｄ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ；減少）の５段階で判定し、本実験においては、各群２匹ずつ測定を行っていることから、（試験群−１）ｖｓ（対照群−１）、（試験群−２）ｖｓ（対照群−１）、（試験群−２）ｖｓ（対照群−１）、（試験群−２）ｖｓ（対照群−２）の４パターンについて比較解析を行った。そして、３パターン以上で「Ｉ」と判定された遺伝子を「ココアの摂取で発現量が増加した遺伝子」とみなした。
【００３１】
ココアの摂取により発現量が大きく変動した免疫関連遺伝子の発現変動度合いについて、（対照群−１）に対する（試験群−１）の発現量比、（対照群−１）に対する（試験群−２）の発現量比、（対照群−２）に対する（試験群−１）の発現量比、（対照群−２）に対する（試験群−２）の発現量比をそれぞれ求め、その平均値を求めた。その結果を表４に示す。なお、表４中、「Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．」は、各遺伝子のＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩの核酸配列データベース）における識別番号である。ちなみに、「ＲＴ．１」はラットＭＨＣを指し、その後のアルファベット（Ａ，Ｂ，Ｃ、Ｄ）は遺伝子領域、「ｕ」はＭＨＣのハプロタイプ（遺伝子型）の一つを示す。また、「ＭＨＣ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎ」は、いわば未熟なＭＨＣに付随しているペプチド鎖である。
【００３２】
【表４】
2004359621.tif 000005
【００３３】
表４から、ココアの摂取により、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ及びＩＩのそれぞれ一部分を示す遺伝子の発現量が増えており、ＭＨＣ遺伝子の発現量が亢進されていることが分かる。ＭＨＣ分子は、獲得免疫の中心的役割を果たす分子（「免疫生物学−免疫系の正常と病理」、笹月健彦・訳、南江堂（１９９５）等参照）であることから、ココアの摂取により、肝臓でＭＨＣを代表とする免疫賦活系遺伝子群の発現が亢進され、感染防御能が促進されることが分かった。
【００３４】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、ココアを有効成分として含有することにより、獲得免疫の中心的役割を果しているＭＨＣ遺伝子の発現を促進することができる免疫賦活剤を提供することができる。
【００３５】
本発明の免疫賦活剤は、古くから飲食品として摂取されているココアを有効成分とするので安全性が高く、安価に製造することができる。また、非常に風味がよいので、そのまま、あるいは食品に配合して、日常的に容易に摂取することができ、十分な免疫賦活効果が期待できる。