(57)【要約】　　　（修正有）【課題】セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素に反応性を示すモノクローナル抗体及び該抗体を用いた該酵素の検出又は測定方法の提供を目的とする。【解決手段】ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のシークエンスのうち連続した１３〜１５個のアミノ酸からなるペプチドとキャリア用タンパク質との複合体を免疫原として得られたモノクローナル抗体、上記ペプチドを認識するモノクローナル抗体、又はセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のエピトープと反応性を有するモノクローナル抗体であって、ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のアミノ酸配列中のエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体。これらモノクローナル抗体を使用して免疫学的アッセイを行うことを特徴とする、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出又は測定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のシークエンスのうち連続した１３〜１５個のアミノ酸からなるペプチドとキャリア用タンパク質との複合体を免疫原として得られたモノクローナル抗体。
【請求項２】
ペプチドが、配列番号１で表されるペプチド又は配列番号２で表されるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号１で表されるペプチド又は配列番号２で表されるペプチドを認識するモノクローナル抗体。
【請求項４】
セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のエピトープと反応性を有するモノクローナル抗体であって、ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のアミノ酸配列中のエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体。
【請求項５】
さらに、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ及びリボソームＳ６　プロテインキナーゼの全てのタンパク質に反応性を示す請求項１〜４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド及びそれらのキャリア用蛋白質結合体からなる群から選択される少なくとも１種を免疫抗原として、ヒトを除く温血動物に免疫して得られる請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
マウス抗血清である請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の少なくとも１種を使用して免疫学的アッセイを行うことを特徴とする、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出又は測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素に反応性を示すモノクローナル抗体及び該抗体を用いたセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞の情報伝達系は、主に細胞膜上に伝達された刺激が、細胞膜上の受容体やチャンネルタンパク質などを活性化することにより始まる。次いでカルシウムイオンやｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーの増減や、各種タンパク質リン酸化酵素の活性化及び不活性化が起こることにより、刺激は順次細胞内に伝達されていく（Ｃａｎｏ，Ｅ．，　ａｎｄ　Ｍａｈａｄｅｖａｎ，　Ｌ．　（１９９５）　Ｐａｒａｌｌｅｌ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ａｍｏｎｇ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＭＡＰＫｓ．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　２０，　１１７−１２２）。
【０００３】
それらの一連の情報伝達系で重要な働きを担っているタンパク質リン酸化酵素は、動植物細胞内には、千種類以上が存在すると言われており、これまでに数百種の酵素の一次構造が決定され報告されている。これらのタンパク質リン酸化酵素は大きく二つに分けられる。一つは、ターゲットとなるタンパク質のＴｙｒ残基をリン酸化するタンパク質で、Ｔｙｒタンパク質リン酸化酵素と呼ばれている。このリン酸化酵素は、増殖因子受容体自身である場合が多い。もう一つは、ターゲットとなるタンパク質のＳｅｒ又はＴｈｒ残基をリン酸化するセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素である。セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の代表的なものとして、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、多機能性Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ）、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼなどがあげられる。
【０００４】
これまで報告されたセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の一次構造の比較により、タンパク質リン酸化酵素間で共通に保存された１１ヶ所のサブドメイン構造が存在することが知られている（Ｈａｎｋｓ，　Ｓ．　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ，　Ｔ．　（１９９５）　Ｔｈｅ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：　ｋｉｎａｓｅ　（ｃａｔａｌｙｔｉｃ）　ｄｏｍａｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　９，　５７６−５９６）。従来の研究では、特定の酵素に対し特異性の高い抗体を調製して、目的の酵素の細胞内での動向を調べたり、分布を調べたりすることが盛んに行われてきた。しかし、最近は、ポストゲノムの時代となり、遺伝子の多様な機能を発見することが求められている。そのような状況において、数多くの遺伝子の中から、前記のように情報伝達系で重要な働きを担っているセリンートレオニンタンパク質リン酸化酵素をコードする遺伝子を網羅的に単離同定することは非常に有用である。しかしながら、実用に耐える検出方法は未だ供給されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素に反応性を示すモノクローナル抗体及び該抗体を用いたセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定方法の提供を目的とする。
【０００６】
項１．　ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のシークエンスのうち連続した１３〜１５個のアミノ酸からなるペプチドとキャリア用タンパク質との複合体を免疫原として得られたモノクローナル抗体。
【０００７】
項２．　ペプチドが、配列番号１で表されるペプチド又は配列番号２で表されるペプチドであることを特徴とする項１に記載のモノクローナル抗体。
【０００８】
項３．　配列番号１で表されるペプチド又は配列番号２で表されるペプチドを認識するモノクローナル抗体。
【０００９】
項４．　セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のエピトープと反応性を有するモノクローナル抗体であって、ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のアミノ酸配列中のエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体。
【００１０】
項５．さらに、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ及びリボソームＳ６　プロテインキナーゼの全てのタンパク質に反応性を示す項１〜４に記載のモノクローナル抗体。
【００１１】
項６．　配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド及びそれらのキャリア用蛋白質結合体からなる群から選択される少なくとも１種を免疫抗原として、ヒトを除く温血動物に免疫して得られる項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【００１２】
項７．　マウス抗血清である項６に記載のモノクローナル抗体。
【００１３】
項８．　項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体の少なくとも１種を使用して免疫学的アッセイを行うことを特徴とする、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出又は測定する方法。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示はＩＵＰＡＣ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００１５】
なお、本明細書においては、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼをＣａＭＫと称する。
【００１６】
ＣａＭＫＩＩのサブドメインＶＩＢ部分とは、ＣａＭＫＩＩのαアイソフォームではアミノ酸配列の１３２位〜１４４位をいう（Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ，　Ｔ．，　Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，　Ｉ．，　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｈ．（１９８８）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｂｒａｉｎ　ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＩ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　１６０８２−１６０８６）。本発明では、（１）１３２位から１４６位のアミノ酸配列（配列番号２）のうち連続した１３〜１５個のアミノ酸からなるペプチドとキャリア用タンパク質との複合体を免疫源として得られたモノクローナル抗体、（２）１３２位から１４４位（配列番号１）のペプチド又は１３２位から１４６位（配列番号２）のペプチドを認識するモノクローナル抗体、或いは（３）セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のエピトープと反応性を有するモノクローナル抗体であって、ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のアミノ酸配列中のエピトープに対する反応性を有するモノクローナル抗体をセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定に利用する。
【００１７】
なお、抗体が反応性を有するとは、抗体が抗原抗体反応を示すことをいう。
【００１８】
また、上記のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素としては、例えば、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ、リボソームＳ６　プロテインキナーゼなどが挙げられる。これら酵素は、例えば、ＣａＭＫＩＩα、ＣａＭＫＩＩβなどのように、さらに細かく分類されることがあるが、それら酵素も上記例示の酵素に包含される。
【００１９】
上記（１）〜（３）のいずれかの抗体は、ＣａＭＫＩ、ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、ＣａＭＫキナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ及びリボソームＳ６　プロテインキナーゼから選択される２種以上、好適には３種以上、より好適には４種以上、最も好適には全て、のタンパク質に反応性を示す。
【００２０】
本発明に係るモノクローナル抗体は、ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のシークエンスのうち連続した１３〜１５個のアミノ酸からなるペプチド（好適には、配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド）、これらの混合ペプチド、これらペプチドのキャリア用蛋白質結合体、これらを含む免疫抗原などを利用して、一般的なモノクローナル抗体の製造法に従い製造することができる。
【００２１】
かかる特性を有する本発明抗体は、免疫抗原を温血動物（ヒトを除く）に免疫することにより収得することができ、その方法乃至手法は、常法に従うことができる。例えば、免疫抗原となる配列番号１で表されるペプチドを温血動物に免疫することによって、モノクローナル抗体を該温血動物の血液等の体液内、該温血動物が産卵した卵内などに産生させ、それらより取得することができる。
【００２２】
前記免疫抗原としては、ＣａＭＫＩＩの１３２位から１４６位のシークエンスのうち連続した１３〜１５個のアミノ酸からなるペプチド（好適には配列番号１で表されるペプチド、配列番号２で表されるペプチド）、これらの混合ペプチド、これらペプチドのキャリア用蛋白質結合体、及びそれらの混合物等が使用される。上記ペプチドは常法にしたがったペプチド合成により製造できる。上記のペプチドのキャリア用蛋白質結合体は、該ペプチドを、常法に従い、例えば該ペプチドのＮ末端にシステインを付加し、これにキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　）（ＫＬＨ）とコンジュゲートさせることにより製造される。前記キャリア用蛋白質としては、抗原乃至ハプテンの免疫原性を高めるものとして当該分野で慣用される各種キャリア用蛋白質をいずれも使用できる。その例としては、アルブミン、グロブリン、ヘモシアニン等の各種動物タンパク質やポリリジン等の人工ポリペプチド等を例示できる。これらキャリア用蛋白質は、慣用の試薬を用いた縮合反応等により、ペプチドとの結合体とすることができる。該試薬としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＣＤＩ）等のような水溶性カルボジイミド類や、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）のような縮合剤等が使用される。前記のようにして得られるキャリア用蛋白質結合体は、それ自体所望の免疫原性を有し、本発明抗体製造用の免疫抗原として使用できる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、上記免疫抗原をフロイントの完全アジュバントとともにマウスに１又は複数回投与して免疫化し、抗体を産生させるとともに、例えば細胞融合法等の常法に従い得られる抗体産生細胞と骨髄脾細胞とを融合し、クローニングし、目的とする抗体を産生する単一クローン細胞を分離し、該細胞の培養により取得することができる。
【００２４】
このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、所望により、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の常法に従いさらに精製することができる。
【００２５】
而して、本発明のモノクローナル抗体の取得に際しては、精製されたモノクローナル抗体と免疫抗原との反応性を試験することにより、さらに必要に応じてセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素との反応性を試験することにより、例えば、免疫された温血動物の個体間より、或いはクローン化された単一クローン間より、適宜行うことができる。当該反応性の試験は、モノクローナル抗体と供試物との免疫反応性が確認できる限りにおいて特に制限はなく、例えば後述の実施例に記載の測定法に従い良好に実施することができる。
【００２６】
かくして得られる本発明のモノクローナル抗体を使用し、スクリーニング対象であるタンパク質との反応性を免疫学的アッセイにて確認することによりセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出又は測定が可能である。該免疫学的アッセイとしては、例えば、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ等を制限なく使用することができる。これらのアッセイは、一般的な競合法やサンドイッチ法等の手法に従って実施することができる。好ましくは、ＥＩＡが使用される。
【００２７】
ＥＩＡ法において、本発明の抗体は固相化抗体として使用され、固相化する担体としては、特に制限はなくＥＩＡ法において常用されるものをいずれも使用することができる。例えば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープレートが挙げられる。抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、４℃で一晩静置することによって行える。緩衝液の組成、濃度は常法に従えばよい。本発明の抗体の抗原は、酵素と結合させられ、酵素結合体となる。結合させる方法は酵素と抗原とが結合する方法であれば特に制限はなく、常法に従えばよい。前記のようにして得られた固相化抗体と酵素標識抗原とを用いたＥＩＡ法によって、セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の検出、測定が可能である。
【００２８】
尚、前記セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の測定・検出を行うに際しては、本発明の抗体を有効成分として含有する測定キットを利用するのが簡便である。かかるキットには、本発明抗体に加えて、当該測定・検出を実施するに際して必要な任意の他の試薬を更に包含させることができる。その例としては、前記の標識抗原及び／又は標準抗原液、さらにはアッセイ緩衝液等を例示することができる。
【００２９】
また、本発明のモノクローナル抗体のスクリーニング対象は、タンパク質であれば特に制限されない。
【００３０】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３１】
（ｉ）Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素ＩＩの１３２位〜１４４位のアミノ酸配列（配列番号１）及び１３２位〜１４６位のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端にシステインを付加したペプチド１４ＰＥＮ（配列番号３）及びペプチド１６ＰＥＮ（配列番号４）は、島津製作所製のペプチド固相合成機ＰＳＳＭ８を使用し、フルオレニルメトキシカルボニルペプチド（ｆｍｏｃ）合成法により合成した。合成したペプチドは逆相カラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ−８０Ｔｍ，トーソー社製）を用い、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。ペプチドの分子量決定には、飛行時間型質量分析機（Ｓｈｉｍａｄｚｕ／Ｋｒａｔｏｓ　Ｋｏｍｐａｃｔ　ＭＡＬＤＩ　ＩＩ）を用いた。
【００３２】
（ｉｉ）　ＢＡＬＢ／ｃマウスは、日本クレア株式会社から入手した。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ミエローマ細胞）は、大阪大学微生物研究所から供与を受けたものを使用した。
【００３３】
（ｉｉｉ）ウエスタンブロット法は既存の方法により行った（Ｈａｒｌｏｗ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，　Ｄ．　（１９８８）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）。
【００３４】
（ｉｖ）　ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、プロテインキナーゼＡ、ＭＡＰキナーゼは、次のようにして調製／入手した。
ＣａＭＫＩＩは、次の文献記載の方法に従って、ラット脳から精製した。
（Ｉｓｈｉｄａ，　Ａ．，　Ｋｉｔａｎｉ，　Ｔ．，　Ｏｋｕｎｏ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｈ．　（１９９４）　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＩ　ｂｙ　Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１５，　１０７５−１０８２）
ＣａＭＫＩＶは、次の文献記載の方法に従って、ラット脳から精製した。
（Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，　Ｉ．　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｈ．　（１９９５）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ＩＶ　（ＣａＭ−Ｋｉｎａｓｅ　ＩＶ）　ｆｒｅｅ　ｏｆ　ＣａＭ−ｋｉｎａｓｅ　ＩＶ　ｋｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ　ｃｅｒｅｂｒａｌ　ｃｏｒｔｅｘ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１７，　８５−９０）
プロテインキナーゼ　Ａ（触媒サブユニット）は、次の文献記載の方法に従って、牛心臓から精製した。
（Ｏｋｕｎｏ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｈ．　（１９９０）　Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅａｒｔ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　１０３８，　２０１−２０８）
ＭＡＰキナーゼはＵｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した。
【００３５】
実施例１
（１）抗原溶液の作成
前記（ｉ）において合成された合成ペプチドである１４ＰＥＮ及び１６ＰＥＮのＮ末端のシステインを、それぞれ、キャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ　（ＫＬＨ））と結合させ、抗原性を増した１４ＰＥＮ結合体及び１６ＰＥＮ結合体を得るために、以下の操作を行った。ＫＬＨを１０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　７．２）に溶かし１４．５　（ｍｇ／ｍｌ）の溶液を５４６μｌ作成した。Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（Ｎ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）　（同仁化学製）をジメチルホルムアミドに溶かした溶液（２４．５　ｍｇ／ｍｌ）　を５６μｌ加え、室温で３０分攪拌した。１０，０００ｒｐｍで５分遠心し、上清をゲル濾過クロマトグラフィーＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に負荷し、５０　ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　６．０）で溶出し、２８０　ｎｍにピークのある画分を回収した。１ｍＭ　酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．０）の１ｍｌに合成ペプチドの５ｍｇを溶解した溶液をさらに加え、室温で３時間撹拌し、１４ＰＥＮ抗原溶液及び１６ＰＥＮ抗原溶液を作成した。
【００３６】
（２）マウスの免疫
注射器内で、それぞれの抗原溶液と完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）（ＦＣＡ）を混合して乳濁液を作成し、それぞれの乳濁液をＢＡＬＢ／ｃマウス４匹づつに免疫した。二週間後に不完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）で免疫をしたあとは、それぞれの抗原溶液をそのまま腹腔内注射し、二週間間隔で合計４〜５回の免疫を行った。各マウスの抗体産生をチェックして最も抗体価の上がったマウスをそれぞれ１匹ずつモノクローナル抗体の調製に用いた。
【００３７】
（３）脾臓細胞の調製
マウスの左側腹部を切開し、脾臓を摘出して生理食塩水で１０回洗浄した。さらにダルベッコ変法培地を５ｍｌ加え、ホモジナイザーで脾臓をつぶし、脾細胞懸濁液とした。その後細胞を遠心で集め赤血球溶解試薬（水１００ｍｌ中、ＮＨ４Ｃｌ　８２９ｍｇ、ＫＨＣＯ３　１００ｍｇ及びＥＤＴＡ・２Ｎａ　３７ｍｇを含有する。ｐＨ７．４）を３ｍｌ加えて懸濁し赤血球を破壊した。その後ダルベッコ変法培地１０ｍｌで４回洗浄した。
【００３８】
（４）ミエローマ細胞の調製
ミエローマ細胞はＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞を、１０％胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地で培養したものを用いた。培養したミエローマ細胞はダルベッコ変法培地１０ｍｌで３回洗浄した。
【００３９】
（５）細胞融合
脾細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／０）を以下のようにして細胞融合した。
【００４０】
脾細胞の全細胞とその５分の１のＳｐ２／０細胞を混合、遠心し細胞を集めた。この混合細胞を３７℃で２〜３分静置した後、３７℃に暖めておいた５０％ポリエチレングリコール溶液１ｍｌを加えた。２分間３７℃に静置後、ダルベッコ変法培地７ｍｌを加え、さらに１０％胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地８ｍｌを加えた。遠心後細胞ペレットに１０％胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地２ｍｌを加え細胞を完全に懸濁し、適当量の上記牛血清を含む培地を加え融合細胞懸濁液とした。
この融合細胞懸濁液を４８ウェルプレートに０．２５ｍｌずつ播種し培養を行った。２４時間後に２倍濃度のＨＡＴ選択培養液を０．２５ｍｌずつ加えハイブリドーマ（融合細胞）の選択を行った。その後３日ごとにＨＡＴ選択培養液を交換し融合細胞の選択を行った。なお、ＨＡＴ選択培養液は、ＨＡＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ　１３．６　ｍｇ／ｍｌ，　Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ　０．１８ｍｇ／ｍｌ，　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　３．９ｍｇ／ｍｌ）及び１０％胎児牛血清を含むダルベッコ変法培地のことである。
【００４１】
（６）モノクローナル抗体の産生
細胞融合から３週間後に各ウェルの培養上清を採取し、Ｄｏｔ　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ　Ａｓｓａｙ（ＤＩＡ）により抗体産生の有無を検討した（Ｈａｒｌｏｗ，　Ｅ．，　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，　Ｄ．　（１９８８）　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）。抗原にはペプチド１４ＰＥＮ及びペプチド１６ＰＥＮを用いた。ＤＩＡの結果、陽性と判定されたウェルは限界希釈法により限界希釈し培養した。再度培養上清をサンプリングし、ＤＩＡにより陽性ウェルを確認した。その後、ＤＩＡの結果がすべてのウェルで陽性となるまで繰り返し、モノクローナル抗体産生融合細胞を得た。
【００４２】
また、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に０．５ｍｌプリスタン（２，６，１０，１４テトラメチルペンタデカン）を注射し、２〜３週間後に１０８のハイブリドーマを腹腔内に投与すると、約１週間で腹水が貯留した。この腹水を採取し、この中に非常に高い濃度でモノクローナル抗体が生成した。
【００４３】
モノクローナル抗体産生融合細胞の上清またはＢＡＬＢ／ｃマウス腹水中で増やしたモノクローナル抗体を適当な希釈倍率で薄めて実験に用いた。
【００４４】
（７）モノクローナル抗体の解析
ペプチド１４ＰＥＮに対するモノクローナル抗体は１種類得られ、これを４−Ｄと名付けた。また、ペプチド１６ＰＥＮに対するモノクローナル抗体は２種類得られ、これを１−Ｃ及び８−Ｃと名付けた。これら抗体の反応特異性を調べるために、精製した４種類のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素（ＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、プロテインキナーゼＡ、ＭＡＰキナーゼ）の２０から１００ｎｇをＳＤＳ電気泳動で分離した後、ニトロセルロース膜に転写しタンパク質染色とウエスタンブロット法を行った。モノクローナル抗体は、腹水を１０００分の１希釈したものを用いた。
【００４５】
その結果、４−Ｄ、１−Ｃ抗体及び８−Ｃ抗体はＣａＭＫＩＩ、ＣａＭＫＩＶ、プロテインキナーゼＡ及びＭＡＰキナーゼと反応することが確認された。
【００４６】
また、１−Ｃ抗体及び８−Ｃ抗体と、ラット大脳、小脳及び脳幹のタンパク質とをウエスタンブロット法で反応させたところ、抗体が多くの脳組織中のタンパク質と反応していることが確認された（図１）。
【００４７】
なお、組織抽出液としては１レーンあたり２０μｇのタンパク質をアプライしている。また組織抽出液の調製法としては以下の論文に記載の方法を用いた。
（Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，　Ｉ　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｈ　（１９９６）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｉｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｔｏｗａｒｄ　ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ．Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２３７，　１９８−２０３）
次に８−Ｃ抗体をセファロースに固定化し、ラット大脳抽出液を使用し免疫沈降反応を行った。ラット大脳抽出液と免疫沈降物を合成ペプチド（マルタイド）を用いたゲル内リン酸化法（Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，　Ｉ．，　Ｔａｋｅｔａｎｉ，　Ｓ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ａ．，　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ　Ｈ．　（１９９９）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｓｅｒ／Ｔｈｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２６，　９９１−９９５）で分析したところ、免疫沈降物の方に強く複数のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の活性バンドを検出することができた（図２）。このように８−Ｃ抗体は、ウエスタンブロット法だけでなく、免疫沈降法でもタンパク質リン酸化酵素を検出できることが確認された。
【００４８】
なお、大脳抽出液の調製法は、上記のＫａｍｅｓｈｉｔａ，　Ｉ　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ，　Ｈ　（１９９６）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｉｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｔｏｗａｒｄ　ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｉｎ　ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２３７，　１９８−２０３に記載の方法を用いており、インゲルでの活性検出には１００μｇの大脳抽出液を用いて免疫沈降を行ったサンプルを用いている。またマルタイドの調製法は、Ｋａｍｅｓｈｉｔａ，Ｉ．，　Ｔａｋｅｔａｎｉ，　Ｓ．，　Ｉｓｈｉｄａ，　Ａ．，　ａｎｄ　Ｆｕｊｉｓａｗａ　Ｈ．　（１９９９）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｓｅｒ／Ｔｈｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｗｉｔｈ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２６，　９９１−９９５に記載の方法を用いた。
【００４９】
（８）モノクローナル抗体を使用したセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素のスクリーニング
１−Ｃ抗体と８−Ｃ抗体の混合抗体を使用して、マウス脳組織のｃＤＮＡライブラリー内のさまざまなセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の遺伝子クローニングをおこなった。マウス脳λＺＡＰＩＩライブラリー（ストラタジーン製）を大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株）に感染させ、ＬＢ寒天培地を固めたプラスチックプレート（９ｃｍ径）に蒔き、ファージプラークを形成させた。１０ｍＭＩＰＴＧを染み込ませたニトロセルロース膜をプレートに貼り付け各プラークに含まれるｃＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現を誘導し、同時にニトロセルロース膜にブロットした。タンパク質をブロットした膜を１−Ｃと８−Ｃ抗体の混合抗体と反応させ、抗体と反応するタンパク質を発現しているクローンのスクリーニングを行った。
【００５０】
得られたポジティブクローンの塩基配列を決定し、各種セリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の遺伝子配列と比較したところ、ポジティブクローンは、以下のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素の遺伝子配列を有していた。本発明のモノクローナル抗体が各種のセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出できることが確認された。
カルモジュリンキナーゼＩ
カルモジュリンキナーゼＩ　β−２
カルモジュリンキナーゼＩＩ　α
カルモジュリンキナーゼＩＩ　β
カルモジュリンキナーゼＩＩ　δ
カルモジュリンキナーゼＩＩ　γ
カルモジュリンキナーゼＩＶ
カルモジュリンキナーゼキナーゼα
ＭＡＰキナーゼキナーゼ−５
プロテインキナーゼＡ
リボソームＳ６　プロテインキナーゼ
【００５１】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質の中から網羅的に広くセリン−トレオニンタンパク質リン酸化酵素を検出できる。このため、該酵素の１次スクリーニングに有用である。
【００５２】
【配列表】
2004083429.tif 000002
2004083429.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】ラット脳組織中のタンパク質と、８−Ｃ、１−Ｃモノクローナル抗体の反応性試験（ウエスタンブロット法）の結果を示す。
【図２】ラット大脳抽出液中のタンパク質と８−Ｃモノクローナル抗体の免疫沈降反応及びウエスタンブロット法の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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