(57)【要約】【課題】チロシナーゼ活性阻害作用を有する化合物の開発。【解決手段】式（Ｉ）：【化１】2004083466.tif 000006で示されるキノベオン酸化体、式（ＩＩ）：【化２】2004083466.tif 000007で示されるキノベオン還元体又はこれらの混合物を含んでなるチロシナーゼ活性阻害剤。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004083466.tif 000004
で示されるキノベオン酸化体、式（ＩＩ）：
【化２】
2004083466.tif 000005
で示されるキノベオン還元体又はこれらの混合物を含んでなるチロシナーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１の式（Ｉ）及び／又は式（ＩＩ）の化合物又はその混合物を含むメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
請求項１に記載のキノベオン酸化体（Ｉ）及び／又はキノベオン還元体（ＩＩ）と皮膚外用剤基剤とを含んでなる皮膚外用剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はキノベオン酸化体及び／又はキノベオン還元体からなるチロシナーゼ活性阻害剤及びそれを有効成分として含む外用剤組成物に関する。本発明は、さらに詳しくは、キノベオンを有効成分として含む、色白効果のすぐれた化粧料及びシミ、ソバカスなどの防止効果にすぐれた皮膚外用組成物に関する。
本明細書にいう外用剤組成物とは、化粧品のほかに外用にもちいられる医薬品（軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、乳剤など）を含む意味に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
本発明の皮膚外用剤の有効成分として用いられるキノベオンは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）で示されるキノベオン酸化体及び／又はキノベオン還元体であり、従来よりキノベオンを、薬効成分としては使用することは知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従来、美白化粧料組成物としては、ビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンなどのチロシナーゼ活性阻害剤を配合したものが知られている。本発明者は、キノベオンが、これらのチロシナーゼ阻害剤と比較して、遙かに強いチロシナーゼ活性阻害作用を有することを見出した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明に従えば、式（Ｉ）：
【化３】
2004083466.tif 000002
で示されるキノベオン酸化体、式（ＩＩ）：
【化４】
2004083466.tif 000003
で示されるキノベオン還元体又はこれらの混合物を含んでなるチロシナーゼ活性阻害剤が提供される。
【０００５】
本発明に従えば、前記キノベオン酸化体（Ｉ）及び／又はキノベオン還元体（ＩＩ）と、皮膚外用基剤とを含んでなる皮膚外用剤組成物が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明者は、前述の如く、キノベオンが従来チロシナーゼ活性阻害剤として知られているビタミンＣ及びその誘導体（例えばＬ−アスコルビン酸）、コウジ酸、アルブチンなどに比較して、キノベオンが遙かに高いチロシナーゼ活性阻害作用を有することを見出した。
【０００７】
このキノベオンは前記式（Ｉ）及び（ＩＩ）の酸化体及び還元体又はその混合物の形態をとる化合物として知られており、例えば、特開平６−１９９７２４号公報に記載の方法によって製造することができる。具体的には、例えばシナピン酸１００ｍｇを少量のメタノール溶液に溶解し、蒸留水を加えて１００ｍｌとした溶液を１２０℃で１５分間加熱し、次に２５℃に冷却して等量の酢酸エチルを加える。得られる酢酸エチル層を濃縮し、この濃縮物に１０ｇのセルロースを加えて吸着させ、２５℃で１時間反応させることによってセルロースパウダーに吸着したキノベオンを得ることができる。
【０００８】
メラニン産生は、図１に示すように、チロシン→ＤＯＰＡ→ＤＯＰＡキノン→ロイコＤＯＰＡクローム→ＤＯＰＡクローム→メラニンの過程を経るが、キノベオンは、このメラニン合成の律速段階であるチロシンからＤＯＰＡキノンにいたる反応を触媒する酵素“チロシナーゼ”の酵素活性を抑制することを見出した。
【０００９】
本発明に係る前記式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）のキノベオン酸化体及び／又は還元体からなるチロシナーゼ阻害剤は、それ単独で、又は皮膚外用剤用基剤その他の成分と配合して皮膚外用剤組成物（例えば治療薬、化粧料）として使用することができる。皮膚外用剤組成物として使用する場合のキノベオンの配合量は、好ましくは組成物全重量当り０．０５ｐｐｍ（重量）〜１０重量％、更に好ましくは０．２ｐｐｍ（重量）〜０．５重量％、最も好ましくは０．５〜５０ｐｐｍ（重量）である。
【００１０】
本発明に係る皮膚外用剤を構成するのに適した皮膚外用剤基剤としては、例えば従来から皮膚外用剤に使用する溶剤、水、油（例えばグリセリン、ワセリン、オリーブ油、ハッカ油、ステアリルアルコール、シクロデキストラン）などを用いることができ、これらは溶液状、分散液状、乳化液状、軟膏（剤）状、貼付（剤）状などの形態とすることができる。
【００１１】
本発明に係る皮膚外用剤組成物には、上記皮膚外用剤基剤に加えて、従来から各種皮膚外用剤に一般的に配合されている添加剤や基剤を本発明の目的を損わない範囲及び量で使用することができる。具体的には、保湿剤（例えばキシリトール、ジプロピレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、プロデュウ（ＤＬ−ピロリドンカルボン酸＋Ｌ−プロリン＋乳酸ナトリウム＋ソルビトール＋コラーゲンの水溶液）、異性化糖／ペンタバイテン）、紫外線吸収剤（例えばオキシベンゾン、グアイアズレン、サルチル酸フェニル、シノキサート、パラアミノ安息香酸エステル、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）−ベンゾントリアゾール）、ビタミン類（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ）、抗酸化剤（例えばコーキュー１０（ＣｏＱ１０）、カロチノイド、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ローズマリー、セージ、オレガノ、セサミノール、カテコール、スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオン）、油脂（例えばコーン油、オリーブ油）、界面活性剤（例えば塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、酢酸ポリオキシンエチレンラノリンアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム、セチル硫酸ナトリウム、直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸塩類、ポリオキシエチレンラノレン、ポリオキシエチレンラノレンアルコール、ラウリン硫酸塩）、粉体（例えばシクロデキストリン）、着色剤（例えばジハイドロキシアセトン（ＤＨＡ））などがあげられる。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例に従って本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲をこれらの実施例に限定するものでないことはいうまでもない。
【００１３】
実験に供したキノベオンは下記の方法により化学合成したものを用いた。出発物質であるシリンガアルデヒド２５ｇ（０．１４ｍｏｌ　）とベンゼン５０ｍｌ、無水酢酸ナトリウム０．１７ｇを混合し加温しながら攪拌した。これに無水酢酸２１ｇ（０．２１ｍｏｌ　）を加え、２時間還留し、還留終了後、５０℃まで放冷した後、激しく攪拌しながらヘキサン１００ｍｌを滴下して、シリンガアルデヒドアセチル化物（アセチルシリンガアルデヒド）を得た。このアセチルシリンガアルデヒド２６．９ｇ（０．１２ｍｏｌ　）をメタノール１５０ｍｌに溶解し、攪拌しながら約１０℃に冷却しながら、水素化ホウ素ナトリウム２．２５ｇ（０．０６ｍｏｌ　）を４回に分け１時間で加え、さらに１時間攪拌後、クロロホルムで２回抽出を行った。クロロホルム抽出層を硫酸ナトリウム脱水後、減圧濃縮し、得られた沈殿物にイソプロパノール２４ｍｌを加え、６０℃に加温し溶解させた。これにヘキサン２４ｍｌを加えると結晶が析出した。この結晶をろ過し、減圧乾燥してベンジルアルコール型化合物が得た。ベンジルアルコール型化合物からホスホニウム塩の合成は以下の通りである。即ち、得られたベンジルアルコール型化合物５．１０ｇ（０．０２３ｍｏｌ　）にベンゼン１５ｍｌを加え攪拌しながら氷冷し、チオニルクロライド１．８３ｍｌを３０分間で滴下し、その後１時間攪拌した後、４０℃以下で減圧濃縮した。濃縮物にベンゼン５ｍｌを加え溶解後、さらに減圧濃縮し、濃縮後トルエン２０ｍｌを加え、トリフェニルホスフィン８．７ｇ（０．０３３ｍｏｌ　）を加えて、４時間還留し、還留終了後、析出した結晶をろ過し、減圧乾燥することによりホスホニウム塩を得た。このホスホニウム塩３．３１ｇ（０．００６５ｍｏｌ　）をテトラヒドロフラン１５ｍｌに懸濁し、６０℃に加温しながら、４０％のグリオキサール水溶液０．４３５ｇ（０．００３ｍｏｌ　）を加え、窒素置換し、窒素雰囲気下で、４０％水酸化ナトリウム１．５ｇ（０．０１５ｍｏｌ　）を１０分間で滴下した。２時間攪拌後、反応物を１０℃以下に冷却し、生成した沈殿物をろ過し、沈殿物を蒸留水１５０ｍｌに懸濁し、再度ろ過した。ろ液を分液ロートに入れ、ジエチルエーテル４０ｍｌで３回洗浄し、水層をビーカーに移し、６Ｎ−塩酸で弱酸性にしたところ還元型キノベオンが得られた。析出したキノベオン還元体をろ別し、減圧乾燥した。キノベオン還元体１０ｍｇをクロロホルム５ｍｌに溶解し、過酸化ベンゾイル２０ｍｇを加えて、室温で３０分間攪拌したところキノベオン酸化体が得られた。この酸化体は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、展開溶媒ベンゼン、アセトン、メタノール（７：２：１）によって展開、精製した。さらに、セファデクスＬＨ−２０（アマシャム　バイオサイエンス（株）より入手）カラムクロマトグラフィーを用いて、メタノールにて展開、精製した。最終的には、アルミナカラムクロマトグラフィーによって、展開溶媒ベンゼン、酢酸エチル、メタノール（７：２：１）により精製し純品を得た。
【００１４】
例１
以下に従来からチロシナーゼ阻害剤として知られているコウジ酸、アルブミン及びＬ−アスコルビン酸と比較したキノベオン酸化体のチロシナーゼ阻害活性作用の試験例を示す。なお、試験に供したキノベオン酸化体は化学合成した。
【００１５】
図２に示すように、キノベオン酸化体、コウジ酸、アルブミン及びＬ−アスコルビン酸を用いてこれらの阻害剤がマッシュルームチロシナーゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ　ＭＯより入手）の活性を如何に阻害するかを濃度を１μＭより変化させて以下の方法で試験した。結果を図２に示す（試験は各濃度において１０点の結果の平均値である）。
【００１６】
チロシナーゼ活性は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にて１０μｇ／ｍｌのマッシュルームチロシナーゼ及び１ｍＭのＬ−ＤＯＰＡを基質として加え、３７℃にて４時間あるいは１０分間反応した。反応終了後、吸光度（４７５ｎｍ）を測定し、酵素活性を計算した。
【００１７】
図２に示すように、キノベオン酸化体のチロシナーゼ活性阻害作用は、従来から知られているチロシナーゼ阻害剤として作用し結果的に美白化粧料としての作用を示すビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンに比較して遥かに強い阻害作用を示すことがマッシュルームチロシナーゼを用いた実験により判明した。
【００１８】
例２
例１において、マッシュルームチロシナーゼに代えて、ヒトチロシナーゼを用いて、各阻害剤の阻害活性を同様な条件で試験した。なお、実験に供したヒトチロシナーゼは、ヒトメラニン産生細胞ＨＭＶＩＩ：理研ジーンバンク（ＲＣＢ０７７７）より、Ｓｅｉｊｉらの方法により粗精製したものを用いた。結果を図３に示す。図３に示すように、ヒトのチロシナーゼを用いた実験では、キノベオン酸化体は、従来のチロシナーゼ阻害剤に比較して、さらに強い阻害作用を示すことが明らかとなり、チロシナーゼ阻害作用に基づく美白化粧料として有用であることが示された。
【００１９】
例３
この例ではメラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞（理研ジーンバンク（ＲＣＢ０５５７）より入手）内のチロシナーゼ活性をキノベオン酸化体が阻害するか否かを確認するためチロシナーゼ活性染色の試験を行った。結果は図４に示す通り、顕著に阻害することを認めた。なお、試験方法は以下の通りとした。
【００２０】
Ｌ−ＤＯＰＡを基質として、電気泳動のゲル内においてチロシナーゼ活性染色を以下の通り行った。１×１０６　個のＢ１６細胞に１００μｌの細胞破砕液（１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μｇ／ｍｌアプロチン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８））を加え超音波破砕し細胞溶解液を調製した。この破砕液を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルを２００ｍｌの０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にて洗浄した。洗浄を終えたゲルを２００ｍｌの５ｍＭ　Ｌ−ＤＯＰＡ含有０．１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に浸し、３７℃、３０分ゆっくりと振盪し、チロシナーゼ活性染色を実施した。
【００２１】
例４
この例では、キノベオン酸化体が、Ｂ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させるか否かの確認を行った。その結果が図５に示すように、キノベオン酸化体はＢ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させることが判明した。なお、試験方法は以下の通りとした。
【００２２】
約１×１０６　個のＢ１６細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて洗浄後、５００μｌの１Ｍ　ＮａＯＨを加え超音波破砕し、一昼夜放置し細胞を溶解した。この細胞溶解液の吸光度（４７５ｎｍ）を測定し、既知量の合成メラニンの吸光度から計算し、メラニン量を決定した。
【００２３】
以上、キノベオン酸化体についての実験結果を詳細に説明したが、キノベオン還元体も同様のチロシナーゼ活性阻害作用を有することを確認している。
【００２４】
【発明の効果】
以上の通り、本発明に従ったキノベオン酸化体及び／又は還元体は、メラニン合成の律速段階であるチロシンからＤＯＰＡキノンにいたる反応を触媒する酵素“チロシナーゼ”の酵素活性を効果的に抑制し、そのチロシナーゼ活性阻害作用は、図２に示すように、マッシュルームチロシナーゼを用いた実験により、従来から知られているチロシナーゼ阻害剤として作用し結果的に美白化粧料としての作用を示すビタミンＣ及びその誘導体、コウジ酸、アルブチンに比較して遙かに強い阻害作用を示すことが判明した。さらに、ヒトのチロシナーゼを用いた実験では、キノベオンは他のチロシナーゼ阻害剤に比較してさらに強い阻害作用を示すことも明らかとなり、チロシナーゼ阻害作用に基づく美白化粧料として有用であることが確認できた。
キノベオンは、メラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞内のチロシナーゼ活性を顕著に阻害し、さらにＢ１６細胞内のメラニン量を有意に低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】チロシンからのメラニン産生機構を示す図面である。
【図２】例１のマッシュルームチロシナーゼ活性の阻害率についてコウジ酸、アルブミン及びＬ−アスコルビン酸に対比したキノベオン酸化体の活性を示すグラフ図である。
【図３】例２のヒトチロシナーゼ活性の阻害率について例１と同様にして得られた結果を示すグラフ図である。
【図４】例３におけるキノベオン酸化体のメラニン産生培養細胞株であるＢ１６細胞内のチロシナーゼ活性の阻害効果を示す写真図である。
【図５】例４におけるキノベオン酸化体のＢ１６細胞内の産生メラニン量の低下に及ぼす効果を示すグラフ図である。
【図１】
2004083466.tif 000008
【図２】
2004083466.tif 000009
【図３】
2004083466.tif 000010
【図４】
2004083466.tif 000011
【図５】
2004083466.tif 000012