(57)【要約】【課題】複数の塩基配列における変異を高精度で解析を行い、試料を低減化し、迅速に効率よく解析を行う手段を提供する。【解決手段】キャピラリ構造を複数備えたアレイ基板と、前記キャピラリ構造の内面に核酸プローブが固相化された検出部とを具備したマイクロアレイにおいて、前記検出部には、対照塩基配列に相補的な対照相補プローブと、変異型塩基配列に相補的な変異型相補プローブとを含むプローブユニットの多種類が固相化されており、前記キャピラリ構造に、前記対照塩基配列を含む対照核酸および／または前記変異型塩基配列を含む変異核酸を含有する試料溶液を導入し、前記対照相補プローブおよび／または前記変異型相補プローブと前記試料溶液の核酸とのハイブリッド二本鎖を検出して、前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出するマイクロアレイを提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む複数の試料溶液を別々に流すことができる複数のキャピラリ構造を備えたアレイ基板と、それぞれの前記キャピラリ構造の内面に核酸プローブが固相化された検出部とを具備したマイクロアレイにおいて、
前記検出部には、対照塩基配列に相補的な対照相補プローブと、前記対照塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された変異型塩基配列に相補的な変異型相補プローブとを含むプローブユニットが試料溶液毎に所望の検出を行い得る組み合わせによって固相化されており、
前記複数のキャピラリ構造のそれぞれに、前記対照塩基配列を含む対照核酸および／または前記変異型塩基配列を含む変異核酸を含有する試料溶液を導入し、前記対照相補プローブおよび／または前記変異型相補プローブと前記試料溶液中に含有される核酸とが形成したハイブリッド二本鎖を検出することにより、試料の各々における前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出することを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロアレイであって、前記複数のキャピラリ構造のそれぞれに複数の検出部が設けられ、前記複数の検出部には互いに異なるプローブユニットが固相化されているマイクロアレイ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のマイクロアレイであって、前記対照塩基配列が特定遺伝子の正常型遺伝子の部分配列であるマイクロアレイ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のマイクロアレイであって、前記プローブユニットにおいて、対照塩基配列が特定遺伝子の正常型遺伝子の部分配列であり、且つ前記変異型塩基配列が前記特定遺伝子と同一遺伝子座の対立遺伝子における既知の変異を含む変異型遺伝子の部分配列であるマイクロアレイ。
【請求項５】
請求項４に記載のマイクロアレイであって、前記複数の検出部のうちの一つの検出部に固相された前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブが、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す配列を具備する核酸からなり、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子の２種類の対立遺伝子を特異的に検出するためのプローブであるマイクロアレイ。
【請求項６】
請求項４または５に記載のマイクロアレイであって、前記複数の検出部のうちの一つの検出部に固相された前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブが、それぞれ配列番号４および配列番号５に示す配列を具備する核酸からなり、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子の２種類の対立遺伝子を特異的に検出するためのプローブであるマイクロアレイ。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項で定義したマイクロアレイを用いた核酸の特異的な検出方法であって、
前記複数の試料溶液の各々を調製する工程と、
調製した試料溶液の各々を各々別の前記キャピラリ構造に連続的に導入して特異的な前記ハイブリッド二本鎖を形成させる工程と、
前記ハイブリッド二本鎖を一括して検出する工程と、
を具備し、
前記試料の各々における前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出する方法。
【請求項８】
前記キャピラリ構造の各々には、前記試料溶液ごとに所望の検出を行うための前記プローブユニットを固相していることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の部分塩基配列の差異を検出するマイクロアレイ技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、遺伝子多型、遺伝子変異などを含む遺伝子の塩基配列の差異を検出する手法として、以下の１〜４に説明する技術が存在する。
１．  ＰＣＲ‐ＳＳＣＰ（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism） 法
この方法は、正常型および変異型の核酸に由来するＤＮＡの間でゲル上の移動度に差が生じることを利用する方法である。この移動度の差は、塩基配列の差異が分子内相互作用に影響して、前記ＤＮＡ間で取りうる立体構造が異なることとなり、結果として塩基配列の差異が移動度の違いに反映されることから生じるものである。
【０００３】
この方法においては、まず調べようとするゲノム上のＤＮＡ領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅を行う。次に増幅されたＰＣＲ産物に変性剤を加えて二本鎖から一本鎖に変性させ、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行う。通常は、あらかじめ塩基配列が決定され多型の種類が判明しているサンプル（レファレンス）を多型の種類が判明していない未知サンプルと共に泳動を行い、両者のバンドパターンが一致するか否かで判定を行う。一致した場合は、両者の配列間に差がないと判定される。
【０００４】
ゲル上での展開後は、銀染色法などの高感度の染色を行い検出する。ＳＳＣＰはゲル上での展開で２〜３時間、染色で２時間程度必要とし、ゲル一枚で処理可能な検体数は２０検体程度と少数である。
ＰＣＲ‐ＳＳＣＰ法は、遺伝子変異検出等の遺伝子情報解析に最適な条件を見出すまでに時間を要するとの課題がある。近年は、キャピラリーを用いたＳＳＣＰ法（特許文献１を参照）等、解析の自動化が試みられている。しかしながら、特許文献１の手法であっても、電気泳動に時間を要すことに変わりはない。更に、この手法では一キャピラリー上の一回の泳動において、一遺伝子の変異の解析しかできない。従って、多数の遺伝子の変異を解析する場合には、数に比例した解析時間を要することになる。
【０００５】
２．  塩基配列決定法
この方法は、遺伝子変異が含まれる領域をクローニングまたはＰＣＲなどにより増幅し、直接塩基配列の決定を行うものである。最近はキャピラリータイプの塩基配列決定装置（シークエンサー）が開発されており、一検体あたり２時間程度で結果が出る。しかし、実験にかかるコストも高く、蛍光ラベルおよびその精製などの工程なども時間を要するなど多くの課題がある。遺伝子変異は頻度が少ないものもあるため、すべての検体についての塩基配列を決定することは変異の検出方法として効率が良くないと考えられる。
【０００６】
３．  吸光度変化による計測
この方法は、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに変性する際に、相補的な配列を持った場合と、遺伝子変異があった場合では、変性曲線が異なることを利用して、その差を吸光度の違いとして捉える手法である（非特許文献１を参照）。
また、ＰＣＲで増幅の際、ある二種類の蛍光プライマーを使用し二本鎖から一本鎖に変性する際に二蛍光のエネルギー移動により変性を検出する手法も知られている（特許文献２を参照）。しかしながら、特許文献２においては、検出できるのは、ＧＣ含有量の違いや塩基の欠失や挿入などであり、一塩基変異は検出が難しいとされている。
【０００７】
４．  ＰＣＲ‐ＳＳＰ （PCR − sequence specific primer）
この方法は、ＰＣＲ反応による増幅の有無で変異を判定する方法である。この方法においては、まず変異のある部位に特異的なプライマーを設計し、次にそのプライマーを使用したＰＣＲ反応により変異の存在する箇所の核酸を増幅する。ＰＣＲ反応後、電気泳動・染色の操作を行うが、２時間程度で終了する。この方法は、検査時間は短く、工程も簡易であるが、増幅の有無での判定であるので、注意して行わないとミスタイピングが出る可能性がある。
【０００８】
更に、蛍光検出を利用するＰＣＲ‐ＳＳＰ法については、プレートでＰＣＲを行った後、プレートリーダー等を用いて、増幅の有無を確認するが、以下に説明するような課題がある。
一遺伝子座の多型において、２つの対立遺伝子（アリル）が存在する場合を例に説明する。前記の２つのアリルに対応するプライマーによる増幅を確認するためには、以下１）または２）のような条件が考えられる。
【０００９】
１）  ２アリルともに、同じ標識法を用いる
２）  ２アリル毎に異なる標識法を用いる
１）の場合は、一検体あたり独立した２反応容器が必要となるが、
２）の場合は、それぞれに異なる標識を行うため、同一の反応容器内での反応が可能となる。しかし、標識を２種類用いることは、１）に比べてランニングコストが高価になるという欠点がある。
また、この反応を一遺伝子だけではなく、複数種の遺伝子多型検出を行おうとした場合、においては１）、２）ともに、遺伝子多型の数に比例した異なる反応容器を用いる必要があるため、ハイスループット検出は難しくなる。
【００１０】
以上の述べたように従来技術による変異の検出方法は、検出精度、スループットおよび価格などに課題がある。
【００１１】
更に、現在では核酸等の生体分子を解析する手段としてマイクロアレイ技術が開発されている。マイクロアレイは、多種類のプローブDNAを高密度に固相する方法（特許文献３）と、フォトリソグラフィー技術により半導体基板にＤＮＡプローブを合成する方法を使用して、一定規格のスライドグラス（約７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）上に多種類のプローブを固相化して作成する。
【００１２】
これまではナイロン膜にプローブを固相化することが一般的であり、この場合は一つのスポットが３ｍｍ〜５ｍｍ程度であった。これに対して、マイクロアレイ技術を用いることで、ガラス基板上に１００μｍ〜３００μｍ程度の極微小なスポットが可能になっており、高密度化が図れる。またナイロン膜と異なり、ガラスやシリコン基板は蛍光が少ないためハイブリダイゼーション結果を蛍光検出により行うことが可能になっている。
【００１３】
マイクロアレイによる解析には、以上のような利点があるが、これまで塩基配列の変異を検出する手段として利用する際には以下のような問題があった。即ち、多検体を同時または重複して検査するには複数のチップ（スライドグラス）を並べて処理をしなければならないこと。また、反応を行うアレイの面積が大きいためマイクロアレイの傾きにより、ハイブリむらが見られ、温度効果や拡散速度のばらつきが問題となることなどである。
【００１４】
【特許文献１】
特願平６‐１３８０９０号公報
【００１５】
【特許文献２】
特表平７‐３１５００号公報
【００１６】
【特許文献３】
特願平１１‐１８９３６０号公報
【００１７】
【非特許文献１】
ラズルツスキー（I.V.Razlutuskii）等, ヌクレイック  アシッド  リサーチ（Nucleic Acid Research）, １５巻（vol.15）, １６号（No16）, 1987，p．6665-6676
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、複数の遺伝子などに由来する塩基配列の変異を高精度で解析を行い、試料の低減を図り、なおかつ迅速に効率よく解析を行う手段を提供することを課題とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下に示す手段によって本発明の課題を解決するものである。
即ち、本発明は、
核酸を含む複数の試料溶液を別々に流すことができる複数のキャピラリ構造を備えたアレイ基板と、それぞれの前記キャピラリ構造の内面に核酸プローブが固相化された検出部とを具備したマイクロアレイにおいて、
前記検出部には、対照塩基配列に相補的な対照相補プローブと、前記対照塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された変異型塩基配列に相補的な変異型相補プローブとを含むプローブユニットが試料溶液毎に所望の検出を行い得る組み合わせによって固相化されており、
前記複数のキャピラリ構造のそれぞれに、前記対照塩基配列を含む対照核酸および／または前記変異型塩基配列を含む変異核酸を含有する試料溶液を導入し、前記対照相補プローブおよび／または前記変異型相補プローブと前記試料溶液中に含有される核酸とが形成したハイブリッド二本鎖を検出することにより、試料の各々における前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出することを特徴とするマイクロアレイを提供する。
【００２０】
また、前記マイクロアレイを用いた核酸の特異的な検出方法であって、
前記複数の試料溶液の各々を調製する工程と、
調製した試料溶液の各々を各々別の前記キャピラリ構造に連続的に導入して特異的な前記ハイブリッド二本鎖を形成させる工程と、
前記ハイブリッド二本鎖を一括して検出する工程と、
を具備し、
前記試料の各々における前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出する方法を提供する。
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、新規の特性を付与したマイクロアレイを提供して本発明の課題を解決するものである。
本発明において使用される、「マイクロアレイ」という用語は、複数種類のプローブの各々が、スライドガラスなどの基板上の異なる各微小領域に、所望の配置で高密度に存在していることを特徴とするプローブの集合体を意味するものである。従って、現在のマイクロアレイの作成技術においては、多種類のプローブを点着または吐出により基板上に配する方法と、フォトリソグラフィー技術により半導体基板にＤＮＡプローブを合成する方法とが知られているが、本発明のマイクロアレイは作成技術に限定されない。
また、本発明において使用される、「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど生物において通常検出される核酸、また各種の修飾核酸などをも含んでいる。
【００２３】
以下に本発明のマイクロアレイを詳細に説明する。
本発明のマイクロアレイは、
核酸を含む複数の試料溶液を別々に流すことができる複数のキャピラリ構造を備えたアレイ基板と、それぞれの前記キャピラリ構造の内面に核酸プローブが固相化された検出部とを具備したマイクロアレイにおいて、
前記検出部には、対照塩基配列に相補的な対照相補プローブと、前記対照塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された変異型塩基配列に相補的な変異型相補プローブとを含むプローブユニットが試料溶液毎に所望の検出を行い得る組み合わせによって固相化されており、
前記複数のキャピラリ構造のそれぞれに、前記対照塩基配列を含む対照核酸および／または前記変異型塩基配列を含む変異核酸を含有する試料溶液を導入し、前記対照相補プローブおよび／または前記変異型相補プローブと前記試料中に含有される核酸とが形成したハイブリッド二本鎖を検出することにより、前記試料の各々における前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出することを特徴とするマイクロアレイである。
【００２４】
前記キャピラリ構造は、試料溶液を流すことができるキャピラリ形状の空間が形成される構造を使用することができる。前記キャピラリ形状の空間は、その両端に開口部を有し、且つ該空間に溶液を流せるように適切な部材を適切に組み合わせて形成すればよい。
前記キャピラリ形状の空間は、例えば一体型の管状構造体の内部空間であってもよいが、複数の部材を接合して形成してもよい。この場合、前記複数の部材が接合された接合部は、該空間に導入する液体が他に漏れないような適切な接合手段を用いて接合される。前記接合手段は、前記複数の部材を接合する公知の接着法を使用すればよいが、好ましくはシリコーンゴムなどの部材により接合部が圧着されることによって液密空間が形成される。シリコーンゴムなどにより接合部が圧着される場合には、各部材にかけられる圧力を解除することにより、各部材を容易に分解することができる。
前記キャピラリィ形状の空間のサイズは用途に合わせ種々の大きさに設定することが出来るが、実用的には幅が１０μｍ〜数ｍｍ、深さ１μｍ〜５００μｍ、長さが数ｍｍ〜１００ｍｍ、キャピラリ構造の間隔１０μｍ〜数ｍｍ程度で十分である。但し、反応の効率性を考えると測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡなどの核酸の拡散速度は毎秒で数μｍと遅いので前記キャピラリ形状の空間の断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。
【００２５】
また、前記キャピラリ構造は、前記キャピラリ形状の空間を形成するものが好適に使用されるが、このような空間の形状には限定されない。即ち、前記キャピラリ構造は、前記検出部を備えた独立した液密な空間を具備し、且つ試料溶液を導入してハイブリダイゼーション反応が可能なものであればよい。従って、キャピラリ形状に限定されるものではなく物理的に分離された反応容器が形成され、それぞれに溶液注入口と溶液排出口の両方、またはどちらかで併用できる場合には片方のみが接続されたデバイス構造であればよく、種々の構造が考えられる。従って、前記キャピラリ構造は、例えばウェル形状など他の空間形状を形成する構造であってもよい。
更に、前記キャピラリ構造は、その内面に少なくとも１つの検出部を具備しているが、好ましくは複数の検出部を具備する。
【００２６】
前記検出部は、対照塩基配列に相補的な対照相補プローブと、前記対照塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された変異型塩基配列に相補的な変異型相補プローブとを含むプローブユニットを具備している。少なくとも前記検出部は、ハイブリダイゼーションを検出する手段が蛍光などの光学的な検出手段である場合、光透過性に優れた部材（プラスチック類、シリカ、ガラス、ポリマー等）によりなることが好ましい。また、前記検出部は、粒体状のビーズであってもよい。前記ビーズはその表面に本発明のプローブを適切に固相化できるものであればよいが、光透過性に優れた磁性ビーズが好適に使用される。この場合、前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブを固相化された前記磁性ビーズを、例えば適切な順番で前記キャピラリ構造内に充填し、磁石等の磁力により前記キャピラリ構造の所望の位置に固定すればよく、これにより前記検出部として機能することができる。
【００２７】
前記アレイ基板は、前記キャピラリ構造を複数具備する基板であり、前記複数のキャピラリ構造、を備えるように形成された基板を使用することができる。前記アレイ基板は、検出する対象などに応じて同一セットのプローブユニットを具備する前記キャピラリ構造を複数具備するものであってもよい。この場合、各キャピラリ構造は実質的に同一なので、試料溶液ごとに同一の対象を検出できる。この場合、更に各キャピラリ構造の方向性も同一であれば、同一のプローブユニットに対する試料溶液ごとの反応性を同一線上（例えば、図３〜５では同一のプローブは同一線上に存在している）において一括して検定することもできる。また、異なるセットのプローブユニットを具備する前記キャピラリ構造を複数具備するものであってもよい。この場合、試料溶液ごとに異なる対象を検出できる。
前記アレイ基板に形成される複数の前記キャピラリ構造のそれぞれは、適切に選択された前記プローブユニットが固相化された前記検出部を１以上具備している。
前記アレイ基板は、少なくともハイブリダイゼーション反応を行う前に形成され前記複数のキャピラリ構造を高密度に形成するように組み立てられる。前記複数のキャピラリ構造は独立した液密構造なので、それぞれに異なる試料から採取・調製した試料溶液、異なる組成の洗浄用溶液、異なる発色用試薬など組成の異なる溶液を互いが混合することなく所望のタイミングで導入して使用することができる。例えば、複数の異なる試料溶液を別々の前記キャピラリ構造に連続的に注入することにより、同時並行的にハイブリダイゼーションの反応過程および反応結果をひとまとめに一括して検出することができる。
【００２８】
また、前記アレイ基板は、例えば特開平１１−７５８１２号公報、特開２００１−１３６９６３号公報などに開示されるキャピラリアレイ（ＤＮＡキャピラリ、ＤＮＡキャピラリアレイなどとも呼称される）に準拠する基板を使用することができる。
【００２９】
前記キャピラリアレイは、例えば図６に例示されるような特徴を有するマイクロアレイである。図６のキャピラリアレイは、一端に溶液注入口６を他端に溶液排出口７を、さらに内面にプローブユニット５を有するキャピラリ構造４が、基板本体３上に複数（７本）備えられ、それらを覆うように基板上部２を配置し、注入口連結部８と排出口連結部９とで一体構造に連結してアレイ基板１を構成している。更に、アレイ基板１の下部には、基板の温度を制御するためのヒータ１０が配置されている。図６の（Ａ）は、アレイ基板１を上面から見た図である。図６の（Ｂ）は、アレイ基板１を横からみた図である。
また、本実施の形態では、ヒータが前記キャピラリアレイと別体である１例を示したが、ヒータおよびセンサ並びに必要な配線等が前記キャピラリアレイ中に組み込まれていてもよく、これらを具備していない前記キャピラリアレイであってもよい。
【００３０】
実験に用いられる試料は、溶液注入口６からキャピラリ構造４の内部に注入され、溶液排出口７から排出されるが、逆であってもよい。また、複数の溶液排出口７がお互い連結されて１つの共通出入口を形成していてもよい。この場合、それぞれ異なる試料を溶液注入口６から導入して、所要時間ヒータ１０の温度制御下でインキュ−ベションして生物学的反応をさせた後に、共通出入口から一括して試料を回収除去し、以後、適宜、洗浄液や測定用試薬を同様の流れで処理できるので、自動化し易くひいては測定処理能力の高い装置を構成することが出来る。また、同様に共通出入口から洗浄溶液などの同じ組成からなる溶液を１流路から全てのキャピラリ構造４に注入することもできる。
【００３１】
更に、前記アレイ基板は、通常使用されるような平板上のスライドグラスを用いて形成したアレイ基板（汎用型アレイ基板）を使用することもできる。当業者であれば、通常のマイクロアレイを作成する手段を用いてスライドグラス上にプローブを点着して、その上部に適切な構造体を付与して本発明のアレイ基板を作成できるが、以下にその作成法の概略を説明する。
【００３２】
前記汎用型アレイ基板は、図６に例示されるキャピラリアレイに類似する構造を有するものを使用できる。即ち、前記キャピラリ構造は、スライドグラスに固相化された複数のプローブユニットを、前記キャピラリ形状の空間の内面に具備するように形成されればよい。
前記汎用型アレイ基板は、例えば基板本体となるスライドグラスと、該スライドグラスの上部に配置される基板上部とから作成できる。
例えば、前記基板上部は、以下のような構造を具備する構造体である、即ち、
上面の一端において溶液を前記キャピラリ構造に導入するための複数の溶液注入口と、他端において前記溶液注入口に対応する位置に対となる溶液排出口とを備え；且つ
底面に、スライドグラスと前記基板上部とが接合される際に、前記溶液注入口と前記溶液排出口とを前記キャピラリィ形状の空間に連結し、前記キャピラリ構造の複数を前記汎用型アレイ基板内に複数形成するための複数の溝部と、前記基板本体と前記基板上部とを前記接合手段を用いて接合して前記キャピラリ形状の空間を形成するための接合部とを備えた構造体を使用できる。
【００３３】
前記基板本体となるスライドガラスは、マイクロアレイにおけるプローブの固相化に通常用いられる手法により作成できる。例えば、次のようにスライドガラスを作成することができる。即ち、スライドグラスをアルカリや酸などで洗浄して前処理法を行う。その後、プローブとする核酸の固相に必要な処理を行うが、表面処理としては、ポリＬリジンによりアレイ基板をプラス電荷にさせ、マイナスに帯電したＤＮＡを吸着させる方法や、アミノシラン化剤等を用いて基板にアミノ基を導入し、必要に応じて架橋剤を使用することにより、プローブとアレイ基板との共有結合を実現することもできる。アレイ表面処理後は、市販のピンタイプアレイヤーまたは、インクジェットアレイヤー等の装置を用いて、プローブとする核酸を基板上に配する。次に前記基板上部を取り付けて、前記汎用型アレイ基板を形成する。
【００３４】
前記汎用型アレイ基板は、分解してスライドグラス部分のみを通常のマイクロアレイの測定機器を用いて測定できるなどの利点を有している。即ち、前記アレイ基板は、少なくともハイブリダイゼーション反応を行う際に形成され前記複数のキャピラリ構造が形成される。この場合、前記複数のキャピラリ構造のそれぞれに、異なる試料溶液を導入することができる。その後、前記複数のキャピラリ構造を維持したまま（もしくは分解してスライドグラス部分のみを）適切な洗浄溶液を用いて洗浄操作を行う。測定操作は、前記汎用型アレイ基板を分解して、基板本体であるスライドグラス部分のみを市販のマイクロアレイの測定装置で測定することができる。
【００３５】
前記対照塩基配列は、検査をする塩基配列の変異を検出する際の標準的な塩基配列として参照される塩基配列である。つまり、前記対照塩基配列は、その配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列（変異型塩基配列）が試料に存在するかを検定するための対照となる配列である。従って、マイクロアレイにおいて検査可能であれば、任意の所望の配列を選択することができる。
前記対照塩基配列が、特定遺伝子の変異の存在する領域の塩基配列から選択される場合は、前記対照塩基配列は該領域の正常型遺伝子の塩基配列（つまり前記特定遺伝子の変異が確認されている領域における正常型遺伝子の部分配列）を選択することが好ましい。
【００３６】
また、前記対照塩基配列は、対応する変異型塩基配列を考慮して選択される。つまり、前記対照塩基配列が自己に相補的なプローブ（対照相補プローブ）とはハイブリダイズするが、対応する変異型塩基配列に相補的なプローブ（変異型相補プローブ）とはハイブリダイズしないような特異性要件を満たす前記対照塩基配列が選択される。前記特異性要件は、特異性、Ｔｍ、反応温度、反応時間などのハイブリダイゼーションに影響する種々の要件を考慮した特定のハイブリダイゼーション条件下で達成される。
しかし、同一の前記キャピラリ構造内に他のプローブユニットが存在して、複数のプローブユニットが1つの前記キャピラリ構造中に存在する場合、前記対照塩基配列は、他のプローブユニットの前記要件を含む各種の特性をも考慮して、前記特定のハイブリダイゼーション条件が選択される。
【００３７】
前記特定のハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば例えばタプル法（ＷＯ  ００／４６３６３を参照）などマイクロアレイに使用するプローブを選択する手法を使用して適宜適切な条件を設定できる。一般的なハイブリダイゼーションは、４５℃から６５℃前後の恒温状態で一定の湿度を保ちターゲットの蒸発を防ぎながら、一時間から一晩の間、ターゲットとの反応が行われる。その後、適切な洗浄操作を施すことにより未反応のターゲットを除去し用いた標識法に適した検出を行う。このシステムは、「プローブ固相化反応アレイ」（特開２００２−０３４１９７号公報）に示されるような、自動化装置を用いることが可能である。この形態に従うと、ターゲット注入から洗浄まで自動で行うことができる。
【００３８】
前記対照相補プローブは、前記対照塩基配列に相補的な配列を有する核酸を具備するプローブである。従って、前記対照相補プローブは、適切な条件下で前記対照塩基配列に特異的にハイブリダイズして2本鎖の核酸を形成できる。
【００３９】
前記変異型塩基配列は、前記対照塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された配列である。従って、前記変異型塩基配列は複数想定でき、以下のように適用される。
例えば、遺伝子において遺伝子変異が確認されており変異の存在する部位と種類が特定されている場合には、その特定された変異に応じた前記変異型塩基配列を選択することができる。即ち、変異が遺伝子の一箇所の塩基のみに１種類存在する場合には、前記変異型塩基配列中の当該箇所が変異した塩基と同じ塩基を含む配列が選択される。同様に変異が一箇所の塩基に多種類存在する場合には、前記変異型塩基配列中の当該箇所が変異した塩基と同じ塩基を含むそれぞれの配列が複数選択される。仮に前記対照塩基配列の複数箇所に変異が存在する場合にも、同様に前記変異型塩基配列中のそれぞれ該当する配列が複数選択される。
また、前記対照塩基配列が特定遺伝子の特定領域に存在する部分配列であって、現在は前記特定領域に変異が確認されていない場合、前記変異型塩基配列の定義を充足する多数の配列を選択すれば、前記特定領域の未知の変異を検出するような適用も可能である。
【００４０】
前記変異型相補プローブは、前記変異型塩基配列に相補的な配列を有する核酸を具備するプローブである。従って、前記変異型相補プローブは、適切な条件下で前記変異型塩基配列に特異的にハイブリダイズして2本鎖の核酸を形成できる。
上述の各種のプローブの長さは、１塩基から用いることが可能であるが、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２０〜６０塩基、特に４０塩基付近（例えば、３５〜４５塩基）のものが好ましい。
【００４１】
前記プローブユニットは、前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブを含むプローブの構成単位である。前記プローブユニットは、一般的には１つの前記対照相補プローブおよび１つの前記変異型相補プローブからなる。しかし、前記変異型塩基配列が複数である場合、前記対照相補プローブおよび複数の前記変異型相補プローブが１つのプローブユニットとなる。
また、同一のプローブの再現性などを確認する目的などのため、前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブを複数含む単位をプローブユニットとしてもよい。同様の目的などのために、１種類のプローブユニットを複数、1つの前記キャピラリ構造内の前記検出部位に具備してもよい。更に他の前記キャピラリ構造内の前記検出部位にも具備させ、結果として複数の前記キャピラリ構造のそれぞれが、１種類のプローブユニットを複数具備してもよい。更に、ネガティブコントロールとして、前記対照相補プローブと前記変異型相補プローブの双方に対してミスマッチの配列を有し、どちらとも反応しないプローブ（ミスマッチプローブ、  ＭＭプローブ）を前記プローブユニットに具備してもよい。
【００４２】
更に、前記プローブユニットにおいて、対照塩基配列が特定遺伝子の正常型遺伝子の部分配列であり、且つ前記変異型塩基配列が前記特定遺伝子と同一遺伝子座の対立遺伝子における既知の変異を含む変異型遺伝子の部分配列であってもよい。この場合、同一遺伝子座の対立遺伝子（アリル）における変異を検出することができる。従って、試料を採取した真核生物において、対立遺伝子の接合型を決定することが可能である。
例えば、Ｆｃγレセプター２Ａ（ＦｃγＲ２Ａ）遺伝子の２種類の対立遺伝子を特異的に検出する目的には、前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブとして、それぞれＨアリル解析用プローブ（Ｈプローブ、  配列番号１に示す配列からなる核酸）およびＲアリル解析用プローブ（Ｒプローブ、  配列番号２に示す配列からなる核酸）を選択すればよい。
【００４３】
１つの対立遺伝子の型（ＨアリルまたはＲアリル）を２つ有するホモ接合体（Ｈ／Ｈホモ接合体またはＲ／Ｒホモ接合体）の個体から採取・調製した試料は、対応する遺伝子型のプローブのみと反応する。
２つの対立遺伝子の型（ＨアリルおよびＲアリル）を１つずつ有するヘテロ接合体（Ｈ／Ｒヘテロ接合体）の個体から採取・調製した試料は、対応する遺伝子型のプローブ双方と反応する。
【００４４】
同様にして、Ｆｃγレセプター３Ａ（ＦｃγＲ３Ａ）遺伝子の２種類の対立遺伝子を特異的に検出する目的には、前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブとして、それぞれＦアリル解析用プローブ（Ｆプローブ、  配列番号４に示す配列からなる核酸）およびＶアリル解析用プローブ（Ｖプローブ、  配列番号５に示す配列からなる核酸）を選択すればよい。この場合も上記のＦｃγＲ２Ａ遺伝子の場合と同様にして、接合体の型を決定できる。
【００４５】
更にＦｃγＲ２Ａ遺伝子およびＦｃγＲ３Ａ遺伝子の全てのプローブを１つの前記キャピラリ構造内に固相化して、個体から採取した試料をそのキャピラリ構造内に導入すれば、２Ａおよび３Ａ遺伝子の双方の接合型を検定することができる。他の遺伝子の接合型の決定においても、適切な前記対照相補プローブおよび前記変異型相補プローブを選択して、ＦｃγＲ遺伝子の場合に説明したのと同様に実施すればよい。即ち、前記複数のキャピラリ構造のそれぞれの複数の検出部に互いに異なるプローブユニットを固相化した本発明のマイクロアレイを使用して実施できる。
【００４６】
以上説明したような遺伝子の接合型を判定する態様を、ＦｃγＲ２Ａおよび３Ａ遺伝子を例に図５を参照して説明する。
図５上図には、３つの独立した前記キャピラリ構造が３本縦方向に並んでいる。それぞれのキャピラリ構造には、ＦｃγＲ２Ａを検出するプローブ（Ｈプローブ、Ｒプローブ、およびミスマッチプローブ）並びに３Ａ遺伝子を検出するプローブ（Ｆプローブ、Ｖプローブ、およびミスマッチプローブ）が固相化されている（各プローブは、スポット状に２つ配置される、２つは同じプローブであり同一プローブにおけるばらつきを確認できる）。左側のキャピラリ構造からそれぞれＦｃγＲ２Ａ遺伝子多型Ｈ１３１アリルホモ接合体試料、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子多型Ｆ１７６アリルホモ接合体試料、および両者を混合した試料を導入して、それぞれのキャピラリ構造と反応させた。すべてのキャピラリ構造において、適合すべきプローブのみが反応している（２つのスポット状の蛍光）ことがわかる。
【００４７】
このように、１つの前記キャピラリ構造に複数の遺伝子のプローブを配置しておけば、複数の遺伝子の接合型を判定することができる。
好ましい一実施形態は、試料から採取調製した試料溶液を１つの前記キャピラリ構造中で反応させ、前記試料の複数の遺伝子における接合型を判定することである。この際、同一プローブが複数の前記キャピラリ構造の同一位置に配置され、結果として前記アレイ基板上の同一線上に位置するように配置されていれば、複数の試料の結果を容易に判定することができる。例えば、図５のＨプローブは、複数の前記キャピラリ構造の同一線上（図５のＨを横切る線）に配置され、左（２Ａのみ）および右（２Ａ、３Ａ  Ｍｉｘ）のキャピラリにおいて異なる試料と反応していることが前記同一線上で容易に判定でき、走査機構を有する検出装置による検出も効率良くなる。
【００４８】
前記試料は、人為的に設計された塩基配列を有する合成核酸などを含有する物質であってもよいが、好ましくは生物に由来する塩基配列を有する核酸を含有する生体物質である。また、前記試料は、同一生物種の各個体に由来する塩基配列を有する核酸を含有する生体物質であってもよいが、異なる生物種に由来する塩基配列を有する核酸を含有する生体物質であってもよい。前記生体物質は、前記生物の細胞、好ましくは血球細胞を含有する血液などの体液が使用できる。
【００４９】
前記生物は、ウイルス、原核生物、真核生物など核酸を含む生物全般であるが、好ましくは酵母などの真菌、裸子植物、被子植物などの植物、甲殻類、昆虫などの節足動物、イカ、タコ、貝類などの軟体動物、魚類、鳥類、哺乳類などの脊椎動物などを含む真核生物全般であり、より好ましくはウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの哺乳類全般であり、最も好ましくはヒトである。
【００５０】
前記対照核酸は、前記対照塩基配列を含む核酸である。
前記変異核酸は、前記変異型塩基配列を含む核酸である。
前記試料溶液は、前記試料に由来する前記対照核酸または前記変異核酸の何れか一方、或いはその双方を含有し、マイクロアレイによるハイブリダイゼーション用の組成に調製した溶液である。
前記試料溶液は、好ましくは前記対照核酸または前記変異核酸として、試料中のゲノム内に存在する遺伝子変異が存在する領域（遺伝子変異領域）の配列（前記対照塩基配列または前記変異型塩基配列にあたる）を含む５０ｂｐ〜１０００ｂｐ程度の核酸を含有するものである。前記遺伝子変異領域は、適切なプローブセットを使用したＰＣＲ法、またはＬＡＭＰ法、ＲＣＡ法等既知の手法で増幅することができる。
【００５１】
この際、蛍光標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＵＴＰ）を取り込みながら標識を行う方法や、あらかじめ蛍光標識されたプライマーにより増幅を行い、標識物を導入する方法などがある。また増幅後に、色素を結合させる方法等もあるが、結果として前記核酸が標識されターゲットが作成できればよく、標識手法については限定されない。
前記ターゲットは、標識された前記対照核酸または前記変異核酸である。一般的な適用においては、このような標識されたターゲットを前記対照核酸または前記変異核酸として含有する前記試料溶液を使用することが好ましい。
【００５２】
前記試料溶液を前記キャピラリ構造に導入して、適切な前記特定のハイブリダイゼーション条件下で前記対照相補プローブおよび／または前記変異型相補プローブと接触させ特異的なハイブリッド二本鎖を形成させる。
【００５３】
次に洗浄操作を行うが、ここで使用する洗浄液は、全ての前記キャピラリ構造で共通の性状の洗浄溶液を使用できる。
また、前記キャピラリ構造ごとに使用温度や組成を適宜変えた洗浄溶液を使用することもできる。これにより、前記キャピラリ構造ごとにストリンジェンシーを調節したものを導入でき、前記キャピラリ構造に固相化されたプローブ毎に適切な洗浄条件を達成することができる。
【００５４】
次に、前記キャピラリ構造内の前記検出部に形成された特異的なハイブリッド二本鎖を前記標識に準拠した検出方法によって測定する。このようにして、前記試料中の前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出できる。
【００５５】
更に、本発明は本発明のマイクロアレイを用いた核酸の特異的な検出方法を提供する。前記検出方法は、
前記複数の試料溶液の各々を調製する工程と、
調製した試料溶液の各々を各々別の前記キャピラリ構造に連続的に導入して特異的な前記ハイブリッド二本鎖を形成させる工程と、
前記ハイブリッド二本鎖を一括して検出する工程と、
を具備し、
前記試料の各々における前記対照塩基配列および／または前記変異型塩基配列の存在を検出する方法である。
【００５６】
以下の実施例で更に本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されることはない。
【００５７】
【実施例】
近年、遺伝子多型と細胞機能との関連を示す研究が多数行われている。即ち、多型ごとに遺伝子の機能に差があることが明らかになり、特に病気の発症・予後、薬剤感受性などの医療的な側面において各個体の各事項に関連する遺伝子の多型を解析することが急務となってきている。
【００５８】
本実施例では多型の存在が確認されているＦｃγレセプター遺伝子について本発明のマイクロアレイの一態様を用いて解析を行った。この遺伝子の多型において、各型により免疫複合体に対する白血球の貪食能の違いなどが生じる。個体レベルでは、この多型のいずれの型を有するかで、例えば感染症発症後の予後を左右することが分かっている。また、この多型とリウマチ、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患との関連性なども報告されている。従って、この多型が種々の免疫機能に影響をおよぼすことから、当該遺伝子の多型を迅速簡便に検出・解析して診断、予後予測などに反映できる検査体制の構築が望まれる。
【００５９】
本実施例で例示する、Ｆｃγレセプター２Ａ遺伝子およびＦｃγレセプター３Ａ遺伝子の配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋデータベースのＲｅｆｓｅｑなどから入手することが可能である。また、各々の遺伝子の変異の存在する箇所は、当業者であれば以下に記載される各アリル解析用プローブから配列解析用のソフトウエアなどを用いて即座に決定され、当該箇所を具備する核酸もＰＣＲなどで容易に増幅できる。
【００６０】
＜Ｆｃγレセプター２Ａ遺伝子およびＦｃγレセプター３Ａ遺伝子の遺伝子多型解析＞
上述のとおりＦｃγレセプター２Ａ（ＦｃγＲ２Ａ）遺伝子に多型が存在することが確認されている。
遺伝子多型の原因となる遺伝子の塩基配列の変異は、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子のエクソン4領域に存在している。この変異は結果として、当該遺伝子から翻訳される蛋白質の１３１番目のアミノ酸であるアルギニンをヒスチジンに変化させることになる。この１３１番目のアミノ酸の差異による多型は、それぞれＲ１３１、Ｈ１３１多型と呼ばれている。
【００６１】
また、Ｆｃγレセプター２Ａ遺伝子と同じＦｃレセプターファミリー遺伝子である、Ｆｃγレセプター３Ａ遺伝子（ＦｃγＲ３Ａ）においても、遺伝子多型が存在する。上述のように、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子においても２Ａ遺伝子と同様に、多型により免疫複合体に対する貪食能の違いが生まれる事が知られており、感染症発症後の予後を左右することが分かっている。ＦｃγＲ３Ａは、１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンからバリンに変化しており、それぞれ、Ｆ１７６、Ｖ１７６多型と呼ばれている。
本実施例では、これら２遺伝子において、キャピラリ構造内での同時検出を試みた。
【００６２】
遺伝子多型を解析する原理について簡単に説明する。
ヒト細胞より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、この多型を含む領域をＰＣＲ反応により増幅する。ＰＣＲ反応以降の工程について、図１に示す。蛍光検出が可能となるように、蛍光標識を行ったプライマーを使用している。これは、ＰＣＲ反応時に蛍光標識を行ったｄＮＴＰを取り込ませることでも良い。図２に、本発明のマイクロアレイを用いた遺伝子多型解析模式図を示してあるが、左から、染色体２本のうち、双方に変異がないタイプ、変異がないものと変異を有する染色体を一本ずつ持つタイプ、双方が変異を持つタイプの３タイプに分かれる。これらの試料をキャピラリ構造モジュール上でハイブリダイゼーション反応させると、固定化した各アリルに配列特異的なプローブＤＮＡに対して、サンプル毎に検出される蛍光パターンが異なる。これにより、遺伝子多型の同定が可能となる。
【００６３】
次に、ＦｃγＲ遺伝子を解析するより具体的な手順を説明する。
ＦｃγＲ２Ａ遺伝子およびＦｃγＲ３Ａ遺伝子について、５’末端を蛍光色素Ｃｙ３で標識したプライマーを使用し、ＰＣＲ反応中に、ターゲットＤＮＡに対する標識を行った。ＰＣＲは、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子については、遺伝子変異部を含む２６０ｂｐ領域を増幅し、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子については遺伝子変異部を含む１６０ｂｐ領域を増幅した。ＰＣＲ条件は、９６℃  １０分で変性後、９６℃（１分）→５０℃(１分)→７２℃(１分)を３０サイクル繰り返し、増幅を行った。
【００６４】
図１のようにアレイ基板に表面処理を行った後、この遺伝子多型に対応するプローブをＤＮＡマイクロアレイ作製装置ＳＰＢＩＯ  （日立ソフトウェアエンジニアリング（株））を用いて、アレイ基板に固相化した。プローブを固相化した基板をブロッキング処理後、キャピラリーを装着しハイブリダイゼーション反応に用いた。プローブＤＮＡを基板に固相化した後、ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６５】
試料は、あらかじめＰＣＲ‐ＳＳＰ法で遺伝子型が確認されているＦｃγＲ２Ａ遺伝子３試料およびＦｃγＲ３Ａ遺伝子４試料を用いた。ＦｃγＲ２Ａ遺伝子についてはＨアリルのホモ接合体、ＨアリルおよびＲアリルのヘテロ接合体、およびＲアリルのホモ接合体である。また、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子についてはＦアリルのホモ接合体、ＦアリルおよびＶアリルのヘテロ接合体、およびＶアリルのホモ接合体である。
【００６６】
まず、各遺伝子多型単独での解析を行い、遺伝子多型検出が可能であるかを検討した。
ＦｃγＲ２Ａ遺伝子についての解析は、３試料のＰＣＲ産物５μｌに２×ハイブリダイゼーションバッファーを加え、１０μｌとした。９６℃  ５分熱変性をさせた後急冷し、キャピラリ構造を形成したアレイ基板に、キャピラリ毎に異なる検体試料を各１０μｌを注入した。ハイブリダイゼーション反応は、温度４５℃、湿潤状態で１時間行った。ハイブリダイゼーション反応後、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液にて１０分間の洗浄を行い、基板を乾燥させた。検出は、マイクロアレイ用蛍光観察装置ＧｅｎｅＰｉｘ４０００（Ａｘｏｎ社）を用いて行った。なお、以上の固相化、反応洗浄、検出については、キャピラリアレイ用処理装置（特開２００１−１３６９６３号および特開２００２−３４１９７号を参照）を組み立てて実行した。
【００６７】
結果を、図３に示す。図３上部に蛍光観察画像、下部には画像から得られた蛍光強度を数値化したグラフを示す。白点線でキャピラリ構造を示している。固定化したプローブは、Ｈアリル解析用プローブ（Ｈプローブ、  配列番号１）、Ｒアリル解析用プローブ（Ｒプローブ、  配列番号２）、また双方に反応しないよう、多型部位にさらに異なる塩基を導入したミスマッチプローブ（ＭＭプローブ、  配列番号３）の３種類である。キャピラリー１にはＨアリルのホモ接合体、３にはＲアリルのホモ接合体、５にはＨアリルおよびＲアリルのヘテロ接合体試料を注入した。キャピラリー２、４、６には、検体を中に導入していないため、蛍光が観察されていない。キャピラリーに入れた検体同士のコンタミネーションがないことを示している。各検体においては、ＭＭプローブには反応せず、各遺伝子体型に対応したハイブリダイゼーション結果が得られている。これらの結果より、キャピラリーモジュールを用いたハイブリダイゼーションにおいて、非常に精度良く、遺伝子多型を同定することが可能であることが示された。
【００６８】
次に、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子についてキャピラリー内でのハイブリダイゼーションを試みた結果を示す。
ＦｃγＲ３Ａ遺伝子についての解析は、４試料のＰＣＲ産物５μｌに２×ハイブリダイゼーションバッファーを加え、１０μｌとした。９６℃  ５分熱変性をさせた後急冷し、キャピラリ構造を形成したアレイ基板に、キャピラリ毎に異なる検体試料を各１０μｌ注入した。以下の反応および検出については、上記ＦｃγＲ２Ａ遺伝子解析と同様である。
【００６９】
解析結果を、図４に示す。図４上部に蛍光観察画像、下部には画像から得られた蛍光強度を数値化したグラフを示す。白点線でキャピラリ構造を示している。固定化したプローブは、Ｆアリル解析用プローブ（Ｆプローブ、  配列番号４）、Ｖアリル解析用プローブ（Ｖプローブ、  配列番号５）、また双方に反応しないよう、多型部位にさらに異なる塩基を導入したミスマッチプローブ（ＭＭプローブ、  配列番号６）の３種類である。キャピラリー１にはＦアリルのホモ接合体、３、５にはＶアリルのホモ接合体、７にはＦアリルおよびＶアリルのヘテロ接合体試料を注入した。キャピラリー２、４、６には、検体を注入していないため、蛍光が観察されていない。キャピラリーに入れた検体同士のコンタミネーションがないことを示している。各検体においては、ＭＭプローブには反応せず、各遺伝子体型に対応したハイブリダイゼーション結果が得られている。これらの結果より、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子においても、非常に精度良く、遺伝子多型を同定することが可能であることが示された。
【００７０】
次に、クロスハイブリダイゼーション有無の確認を行うことを目的としてハイブリダイゼーション実験を行った。
用いた試料は、あらかじめＰＣＲ‐ＳＳＰ法で遺伝子型が確認されているＦｃγＲ２Ａ遺伝子多型Ｈ１３１アリルホモ接合体試料およびＦｃγＲ３Ａ遺伝子多型Ｆ１７６アリルホモ接合体試料である。この試料サンプルについて、
１）．  ＦｃγＲ２Ａ遺伝子多型Ｈ１３１アリルホモ接合体試料のみ、
２）．  ＦｃγＲ３Ａ遺伝子多型Ｆ１７６アリルホモ接合体のみ、
３）．  １）および２）の試料を混合させる場合、
の３条件において、キャピラリーモジュールでのハイブリダイゼーションを行った。
【００７１】
３試料のＰＣＲ産物５μｌに２×ハイブリダイゼーションバッファーを加え、10μｌとした。９６℃  ５分程度熱変性をさせた後急冷し、キャピラリーを形成したアレイ基板に、キャピラリー毎に異なる検体試料を各１０μｌ注入した。ハイブリダイゼーション反応は、温度４５℃、湿潤状態で１時間行った。ハイブリダイゼーション反応後、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ溶液にて１０分間の洗浄を行い、基板を乾燥させた。検出は、マイクロアレイ用蛍光観察装置ＧｅｎｅＰｉｘ４０００（Ａｘｏｎ社）を用いて行った。
【００７２】
結果を、図５に示す。図５上部に蛍光観察画像、下部には画像から得られた蛍光強度を数値化したグラフを示す。蛍光観察画像の左から、
Ａ）  ＦｃγＲ２Ａ遺伝子多型Ｈ１３１アリルホモ接合体試料のみの結果、
Ｂ）  ＦｃγＲ３Ａ遺伝子多型Ｆ１７６アリルホモ接合体試料のみの結果、
Ｃ）  両試料を混合した試料の結果、
が示されている。両遺伝子の各種プローブは、図中でキャピラリー上部側に、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子解析用プローブを、下部側にＦｃγＲ３Ａ遺伝子解析用プローブを配している。
【００７３】
前記Ａ）のＦｃγＲ２Ａ遺伝子多型解析の際には、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子プローブについては、Ｈプローブのみの特異的なハイブリダイゼーションが見られているが、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子解析プローブとのクロスハイブリダイゼーションが見られなかった。
【００７４】
前記Ｂ）のＦｃγＲ３Ａ遺伝子多型解析の際には、ＦｃγＲ３Ａ遺伝子のＦプローブのみとの特異的なハイブリダイゼーションが見られているが、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子解析プローブとのクロスハイブリダイゼーションが見られなかった。
【００７５】
前記Ｃ）の混合サンプルについては、前記Ａ）およびＢ）で観察された蛍光パターンを保持したまま、ＦｃγＲ２Ａ遺伝子解析プローブおよびＦｃγＲ３Ａ遺伝子解析プローブに対して特異的な反応が見られている。両試料を混合したため、前記Ａ）およびＢ）と比べて全体的に蛍光検出値が低いがＳ／Ｎ比が高く、両遺伝子とも対立遺伝子の型（アリル型）の判定が可能であった。
これらの結果より、キャピラリーモジュールを用いた複数遺伝子多型の解析を、非常に精度良く行えることが可能であることが示された。
【００７６】
従って、本発明のマイクロアレイは、
多数の前記キャピラリ構造での反応が任意のタイミングで処理しながら並行して進行できるので、多量検体の解析もハイスループットで且つ簡便に行える。  また、遺伝子変異、遺伝子多型のスクリーニングのみならず、遺伝子型判別法にも応用できる。
さらに、多検体を高速で解析でき、しかも検体および試料は微量で済む。
【００７７】
【発明の効果】
これまでの遺伝子変異検査法では難しかった、省資源化、低コスト化が図られ、迅速に精度良く遺伝子変異を検出することが可能となる。
【００７８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はマイクロアレイ実験手順を説明する図である。
【図２】図２は本発明のマイクロアレイを用いた遺伝子変異解析を説明する模式図である。
【図３】図３はＦｃγレセプター２Ａ遺伝子  Ｈ１３１、Ｒ１３１  遺伝子多型タイピングの結果を説明する写真及びグラフである。
【図４】図４はＦｃγレセプター３Ａ遺伝子  Ｆ１７６、Ｖ１７６  遺伝子多型タイピングの結果を説明する写真及びグラフである。
【図５】図５はＦｃγ２Ａ遺伝子およびＦｃγ３Ａ遺伝子多型の同時検出の結果を説明する写真及びグラフである。
【図６】図６は本発明のマイクロアレイの一態様を説明する図である。
【符号の説明】
１…アレイ基板
２…基板上部
３…基板本体
４…キャピラリ構造
５…プローブユニット
５ａ…対照相補プローブ
５ｂ…変異型相補プローブ
６…溶液注入口
７…溶液排出口
８…注入口連結部
９…排出口連結部
１０…ヒータ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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