(57)【要約】【課題】微生物反応を利用し、安価で効率よく、式（Ｉ）で示される化合物に代表されるアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物を製造する方法を提供する。【解決手段】デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸を変換して、式（Ｉ）の化合物を生産する能力を有する微生物を自然界よりスクリーニングした。得られたＭｏｒａｘｅｌｌａ属に属する微生物を、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸と接触させ、生成した該化合物を採集することを特徴とする式（Ｉ）の化合物の製造方法を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示される新規化合物。
【化１】
2004083418.tif 000004
【請求項２】
デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸を変換して、アビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物を生産する能力を有する微生物。
【請求項３】
微生物が、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属である請求項２記載の微生物。
【請求項４】
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属に属する微生物が、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたＭｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ．ＨＲ−６株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７１）である請求項３記載の微生物。
【請求項５】
アビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物が、式（Ｉ）の化合物である請求項２記載の微生物。
【請求項６】
請求項２記載の微生物を、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸と接触させ、生成した該化合物を採集することを特徴とするアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物の製造方法。
【請求項７】
微生物が、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属に属する微生物である請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
アビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物が、式（Ｉ）の化合物である請求項６記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物の製造方法に関する。これらの化合物は、医薬や工業製品などに有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
天然樹脂の一つであるロジンは、マツ科植物から採取される松ヤニを原料とし、それに含まれる精油などの揮発性成分を留去したあとに残る琥珀色、無定型の樹脂である。その組成には若干のばらつきがあるものの、アビエチン酸とその異性体を主成分とする樹脂酸と少量の中性成分の混合物である。ロジンは天然に豊富に存在しており様々な化成品として用いられているが、化学修飾可能な官能基がカルボキシル基の１箇所しか存在しないことからその誘導体には限りがあった。一般的に化学修飾が容易な官能基としてはカルボキシル基の他に水酸基があげられるが、有機合成的手法でアビエチン酸の骨格に直接水酸基を導入することは非常に困難であった。Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８９年、２９２７項）によれば、アビエチン酸メチルエステルに有害物質である４酢酸鉛や２酸化セレンを作用させて水酸化を試みているが、この方法では水酸化されるのは９位でありその収率も最大で３０％と非常に低い値であることが記載されている。また、大部分は脱水素反応が進行したデヒドロアビエチン酸メチルやその水酸化物の混合物であり、水酸化反応のみを選択的に実施することは非常に困難であり、その新規手法の開発が要望されていた。
【０００３】
微生物を用いたアビエチン酸への水酸基の導入については報告例がなく、わずかにアビエチン酸の分解菌について報告されているだけであった。製紙工場に於いては原木からのバージンパルプの製造時アビエチン酸を主成分とするピッチが生成し、いわゆるピッチトラブルの原因となるが、これを分解する微生物のスクリーニングが検討されてきた。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（特開平０７−３１３１４３号）、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ属（特開平０６−２４５７５８号）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（特開平０９−１１９０８５号）またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属（特開平１１−３４６７６３号）等の微生物を用いてロジンを分解除去する方法が記載されている。この方法はロジンを炭素源として生育する微生物を利用してピッチを分解除去するものであるが、例えばアビエチン酸の骨格に水酸基が導入されたような代謝中間体は全く分離されていない。
【０００４】
アビエチン酸の脱水素反応により得られるデヒドロアビエチン酸への微生物による水酸基の導入についてはいくつかの報告例がある。Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０１５項、１９８８年）やＦｕｓａｒｉｕｍ属（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３１項、１９９７年）やＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ属（油化学、１９１項、１９９０年、Ｍｏｋｕｚａｉ　Ｇａｋｋａｉｓｈｉ、５８７項、１９９５年、Ｍｏｋｕｚａｉ　Ｇａｋｋａｉｓｈｉ、１２２６項、１９９４年）を用いる水酸基の導入について報告があるが、微生物を用いて酸素官能基を２カ所同時に導入した例は報告されていない。
【０００５】
植物からアビエチン酸が酸化された化合物が多数分離精製されている。例えば、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻、９１１項、１９９０年には、Ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ　ｉｎｄｉｃａの根の樹皮から３環性ジテルペノイドであるｍａｒｇｏｃｉｎが単離精製されている。しかし、その単離量は樹皮２８ｋｇから９．８ｍｇと非常に少ないことが記載されている。これらのジテルペン類は、抗腫瘍活性（Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　９０巻、５９２３項、１９６８年）、抗白血病（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ、３１巻、１３７項、１９７５年）、抗生物質（Ｐｕｒｅ　Ａｐｐｌ．　Ｃｈｅｍ．、１７巻、３３１項、１９６８年）、細胞分裂阻害活性（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３３８５項、１９７２年）を有することが知られており、これらの化合物を効率よく調製する方法が熱望されてた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸を使用して、安価で効率よく、式（Ｉ）で示される化合物に代表されるアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物を製造する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、工業的に有利な微生物によるデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸への酸素官能基の導入方法について鋭意検討した。その結果、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属に属する微生物がデヒドロアビエチン酸の３位と７位に特異的に酸素官能基を導入し同時に４位のカルボキシル基を脱炭酸することを見いだし、本発明に到達した。また、同じＭｏｒａｘｅｌｌａ属に属する微生物がジヒドロアビエチン酸の３位と７位に特異的に酸素官能基を導入し、４位のカルボキシル基を脱炭酸し同時に１１，１２位及び１３，１４位の脱水素することを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
即ち、本発明はデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸を変換して、アビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物を生産する能力を有する微生物に関する。また、本発明は、この微生物を、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸と接触させ、生成した該化合物を採集することを特徴とするアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物の製造方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明を詳細に説明する。
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ．ＨＲ−６は、岐阜大学構内の土壌から分離した微生物である。以下にその菌学的諸性質を示す。
（１）菌形：桿菌
（２）大きさ：０．７×１．０〜１．５μｍ
（３）グラム染色：−
（４）運動性：−
（５）鞭毛：−
（６）胞子：−
（７）カタラーゼ：＋
（８）オキシダーゼ：＋
（９）ＯＦテスト：−
（１０）コロニー形態
培地：普通寒天、培養時間：４８時間
円形、全縁滑らか、低凸状、光沢あり、クリーム状
同定第一段階の結果、この株はグラム染色陰性、カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陽性を示し、加えてブドウ糖の資化・酸化性を示さず、嫌気条件下で生育できない非運動性の無芽胞桿菌であることからＭｏｒａｘｅｌｌａ属であることが示唆された。
（同定第２段階）
ＡＰＩシステム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、フランス）を用いて試験を実施した。
生化学試験
ＮＯ３（硝酸塩還元）：−
ＴＲＰ（インドール産生）：−
ＧＬＵ（ブドウ糖酸性化）：−
ＡＤＨ（アルギニンヒドロラーゼ）：−
ＵＲＥ（ウレアーゼ）：−
ＥＳＣ（エスクリン加水分解）：−
ＧＥＬ（ゼラチン加水分解）：−
ＰＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ）：−
ＯＸ（チトクロームオキシダーゼ）：＋
資化性試験
ＧＬＵａ（ブドウ糖）：−
ＡＲＡａ（Ｌ−アラビノース）：−
ＭＮＥａ（Ｄ−マンノース）：−
ＭＡＮａ（Ｄ−マンニトール）：−
ＮＡＧａ（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）：−
ＭＡＬａ（マルトース）：−
ＧＮＴａ（グルコン酸カリウム）：−
ＣＡＰａ（ｎ−カプリン酸）：−
ＡＤＩａ（アジピン酸）：−
ＭＬＴａ（ｄｌ−リンゴ酸）：−
ＣＩＴａ（クエン酸ナトリウム）：−
ＰＡＣａ（酢酸フェニル）：−
同定第２段階の結果、Ｍｏｒａｘｅｌｌａの典型性状と一致したことから、　Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ．ＨＲ−６と同定した。本菌株は産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９７１株としてとして寄託されている。
【００１０】
本発明で使用できるデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸としては、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸を含むものであれば特に制限はないが、含量が高いものほど生産性の面から有利のことは明らかである。デヒドロアビエチン酸、ジヒドロアビエチン酸の構造式を下記に示す。
【００１１】
【化２】
2004083418.tif 000002
デヒドロアビエチン酸
【００１２】
【化３】
2004083418.tif 000003
ジヒドロアビエチン酸
また、微生物菌体と接触するときはデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸のままで何ら問題はないが、より微生物菌体と接触しやすいようにデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸の塩として用いても良い。使用できるアビエチン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ金属塩、アンモニア、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン等のアンモニウム塩等が用いられる。
【００１３】
本発明方法において、アビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物を生産する能力を有する微生物の為の培養培地は、その微生物が増殖し得るものである限り特に限定されない。例えば、炭素源として、グルコース、シュークロース等の糖質、エタノール、グリセロール等のアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸及びそのエステル類、菜種油、大豆油等の油類；窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、ふすま、酵母エキスなど；無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸１水素カリウム、燐酸２水素カリウムなど；他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキス等を含有する通常の液体培地が使用され得る。培養は好気的に行い、通常、培養時間、１〜５日間程度、培地のｐＨ、３〜９、培養温度、１０〜５０℃で行い得る。
【００１４】
デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸をアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物に変換される反応は、上記微生物の培養物またはその処理物等と、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸またはそれらの塩を水性媒体中で接触させることにより行うことが出来る。ここで、「微生物の培養物」とは、菌体を含む培養液あるいは培養菌体を意味し、「その処理物等」とは、例えば、粗抽出液、凍結乾燥微生物体、アセトン乾燥微生物体、またはそれら菌体の磨砕物等を意味する。さらにそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定化は、当業者に周知の方法（例えば架橋法、物理的吸着法、包括法等）で行い得る。
【００１５】
反応は通常、反応温度１０〜５０℃、ｐＨ＝５〜８で行う。反応時間は培養物、菌体または菌体処理物の量及び用いるデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸の量により異なるが１〜２４０時間である。反応に用いるデヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸は１〜１００ｇ／Ｌの範囲で用いられる。
【００１６】
本発明のアビエチン酸様骨格の化合物としては、アビエチン酸、デヒドロアビエチン酸、ジヒドロアビエチン酸などの酸の形だけでなく、それらの脱炭酸されたものをも含む。反応で生じたアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物は、常法により精製され得る。例えば、微生物等を用いた場合には必要に応じ遠心分離、濾過等の処理を施して菌体等の懸濁物を除去し、次いで酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去し、そしてクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製され得る。
【００１７】
以上のようにして得られるアビエチン酸様骨格の３位と７位に酸素官能基が導入された化合物の代表としての式（Ｉ）の化合物の理化学的性状は次の通りである。
１．色および形状：白色粉末
２．分子式：Ｃ１９Ｈ２４Ｏ２
３．マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）：２８４，　２６９，　２２７
４．１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：主要なピークを以下に示す。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：０．８６（３Ｈ，　ｓ），　１．１０（３Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝６．８），　１．２６（３Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝６．８），　１．４６（３Ｈ，ｓ），　２．００（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝１３．９，　４．８），　２．１３（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝１２．９，　４．４），　２．４８−２．６２（１Ｈ＋２Ｈ，　ｍ），　２．６４−２．７４（２Ｈ，　ｍ），　２．８４（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝１８．３，　４．４），　２．９５（１Ｈ，　ｑ，　Ｊ＝６．６），７．３４（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝８．４），　７．４５（１Ｈ，　ｄｄ，　Ｊ＝８．４，　１．６），　７．９２（１Ｈ，　ｄ，　Ｊ＝１．６）
５．１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：主要なピークを以下に示す。
δＴＭＳ（ｐｐｍ）：１１．００，　２１．２４，　２３．６８，　２３．７４，　３３．５８，　３６．７０，　３７．２１，　３７．６９，　３９．３７，　４４．９０，　４７．８３，　１２４．４３，　１２５．３６，　１３０．７９，　１３２．７０，　１４７．５５，　１４９．８１，　１９７．３９，　２１０．６９
【００１８】
【実施例】以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１）
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ用培地（酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、燐酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩１ｐｐｍを含みｐＨ７．０に調整した培地）を試験管に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地にＭｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ．ＨＲ−６株を一白金耳植菌し２８℃で３０時間振とう培養し種培養液として用いた。
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ用培地３０ｍｌを坂口フラスコに入れ１２０℃で２０分間殺菌した。これに種培養液（１ｍｌ）を加えて２８℃で３６時間振とう培養を行った。培養終了後、遠心分離にて菌体を集め１０倍の濃度にまで濃縮した。この１０倍濃縮菌体懸濁液（５ｍｌ）に１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，１ｍｌ）と脱イオン水（４ｍｌ）とデヒドロアビエチン酸（１５ｍｇ）を加えて３０℃で２４時間振とうを行って菌体反応を行った。反応終了後の懸濁液に酢酸エチルを加えて抽出し酢酸エチル層を分離した。得られた有機層は無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後に、減圧濃縮した。得られた抽出濃縮物をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で精製し、式（Ｉ）の化合物１１．６ｍｇ（変換率８１．７％）を得た。
【００２０】
（実施例２）
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ用培地（酵母エキス０．２％、ペプトン０．５％、燐酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５％、硫酸鉄７水塩１ｐｐｍを含みｐＨ７．０に調整した培地）を試験管に５ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間殺菌した。この培地にＭｏｒａｘｅｌｌａ　ｓｐ．ＨＲ−６株を一白金耳植菌し２８℃で３０時間振とう培養し種培養液として用いた。
Ｍｏｒａｘｅｌｌａ用培地３０ｍｌを坂口フラスコに入れ１２０℃で２０分間殺菌した。これに種培養液（１ｍｌ）を加えて２８℃で３６時間振とう培養を行った。培養終了後、遠心分離にて菌体を集め１０倍の濃度にまで濃縮した。この１０倍濃縮菌体懸濁液（５ｍｌ）に１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，１ｍｌ）と脱イオン水（４ｍｌ）とジヒドロアビエチン酸（１５ｍｇ）を加えて３０℃で２４時間振とうを行って菌体反応を行った。反応終了後の懸濁液に酢酸エチルを加えて抽出し酢酸エチル層を分離した。得られた有機層は無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後に、減圧濃縮した。得られた抽出濃縮物をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）で精製し、式（Ｉ）の化合物１０．５ｍｇ（変換率７５％）を得た。
【００２１】
【発明の効果】
本発明によれば、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸を変換して式（Ｉ）の化合物を生産する能力を有する微生物を培養し、デヒドロアビエチン酸またはジヒドロアビエチン酸と接触させ、生成した式（Ｉ）の化合物を採集するという極めて簡便な方法によって、従来製造することが困難であった式（Ｉ）の化合物を容易に得ることが出来る。従って本発明は微生物による新規化合物である式（Ｉ）の化合物の工業的生産の効率向上およびコストの低減に大きく寄与するものである。