(57)【要約】【課題】標的配列を有する核酸量が少量であっても、効率よくＰＣＲ産物で合成しうる二本鎖ＤＮＡのうち所望のプライマー伸長鎖を相補鎖側のプライマーに比べて優先的に合成する。【解決手段】試料中に含まれる核酸の少なくとも１つ以上の特定の核酸配列を、標的配列を伸長するためのプライマーと他のプライマーとが異なるＴｍ値を有するプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅する方法であって、上記プライマーセットを構成するプライマーのＴｍ値以下の温度でアニーリングを行う工程と、標的配列を伸長するためのプライマーのＴｍ値以下で、その他のプライマーのＴｍ値よりも高い温度でのアニーリングを行う工程をさらに有する。【選択図】  図１
2004337129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる核酸の少なくとも１つ以上の特定の核酸配列を、少なくとも２つのプライマーから構成され、かつ、ＰＣＲにおけるアニーリングの条件下、該特定核酸配列を伸長するためのプライマーと他のプライマーとが異なるＴｍ値を有しているプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅する方法であって、
前記試料と前記プライマーセットを含む反応液に対して、該プライマーセットを構成するプライマーのＴｍ値以下の温度でのアニーリング工程を有するＰＣＲを行い、前記特定核酸配列を含む断片が増幅された反応液を得る工程と、
前記特定核酸配列を有する断片が増幅された反応液に対して、該反応液中のプライマーセットを構成するプライマーのうちの該特定核酸配列を有する断片を伸長するためのプライマーのＴｍ値以下で、その他のプライマーのＴｍ値よりも高いの温度でのアニーリング工程を有するＰＣＲを行い該特定核酸配列を有する断片を更に増幅する工程と、
を有することを特徴とする核酸配列の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的配列を有する核酸の増幅および標識化技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子配列解析技術が飛躍的に向上し、ヒトゲノムを中心として多くの遺伝子の配列や機能が解明されている。そして機能の解明が進む中で、遺伝子の発現状態や配列の変異が様々な病気や体質と関連していることが判明している。
【０００３】
そのような遺伝子情報の蓄積を背景として、特定の配列を有する核酸を検出する技術のニーズは急速に高まっており、これまでに様々な関連技術が開発されている。
【０００４】
数ある核酸検出技術の中で非常に多く利用されているのは、ハイブリダイゼーションを利用した核酸検出技術である。これは固相上もしくは液相において、検出したい配列の相補鎖に相当する核酸プローブを用意しておき、検体中に含まれる検出対象の核酸がプローブとハイブリダイゼーションしたことをしかるべき方法により検出し、検出対象の配列の有無を調べるものである。
【０００５】
検体中に含まれる標的配列を有する核酸を検出することは、各種の遺伝病の診断に留まらず、がん、感染症等の診断においても、検体中に含まれる核酸とその症例との相関が続々と判明しており、広範な応用が期待されている。
【０００６】
このハイブリダイゼーションを利用した核酸検出方法で近年特に利用されているのが、ＤＮＡチップ、もしくはＤＮＡマイクロアレイを利用した検出技術である。これは、ガラス基板などの固相表面に検出したい配列の相補鎖（プローブ）を固定しておき、あらかじめ蛍光物質等で標識しておいた検体と固相上でハイブリダイゼーション反応させ、基板上から得られる蛍光信号を測定し、検体中に含まれる核酸配列の有無もしくは量を調べる技術である。ＤＮＡチップの作製技術は様々な技術が開発されているが、多種のプローブを高密度に配置できることから、高感度かつ同時多項目の検出が出来る画期的な技術として期待されている。
【０００７】
ＤＮＡチップは高感度検出が可能ではあるが、一般的に検体中に含まれる検出対象核酸の絶対量は極めて少なく、また、適当な方法により蛍光物質等により標識する必要があることから、ＤＮＡチップを利用した核酸配列の検出においては、ＤＮＡチップの作製技術と並んで、検体処理技術の重要性は高い。
【０００８】
様々な核酸増幅技術のなかで最も広く利用されているのが、ポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）と呼ばれる方法であり（例えば、特許文献１〜３参照。）、このＰＣＲ法は試料中に含まれる特定の配列を極めて高い増幅率で増幅する方法である。
【０００９】
ＤＮＡチップ等の固相上ハイブリダイゼーションのために検体調製を行う場合には、固相上に固定してあるプローブ領域を含むように増幅領域を設定し、増幅領域の両末端にプライマーを設計する。そして設計した両プライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、所望のプローブ領域を含む二本鎖核酸を大量に合成する。また、検体を何らかの標識物質で標識したい場合には、ＰＣＲ反応の基質（すなわち核酸のモノマー）に、標識物質の結合した標識モノマーを一定の割合で添加してＰＣＲ反応を行うか、あるいは、プライマーを何らかの標識物質により標識してＰＣＲ反応を行い、標識された二本鎖核酸を得る。
【００１０】
【特許文献１】
米国特許第４６８３１９５号明細書
【特許文献２】
米国特許第４６８３２０２号明細書
【特許文献３】
米国特許第４９６５１８８号明細書
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ハイブリダイゼーション反応を利用した特定配列を有する核酸の検出を行う場合、検体調製においては、プローブの相補鎖側のＤＮＡ鎖を多く合成することが望ましい。すなわち、検体中に含まれる二本鎖のうち、プローブと同じ配列を有するＤＮＡ鎖よりも、プローブとハイブリダイゼーションするＤＮＡ鎖（ターゲット鎖）が多く存在するほうが、ハイブリダイゼーションを効率的に進める上で望ましい。これは、単純にターゲット鎖の濃度が高い方が感度的に良いという理由もあるが、プローブと同じ配列を有するＤＮＡ鎖がプローブのハイブリダイゼーションと競合してしまい、プローブのハイブリダイゼーション効率を下げてしまうため、なるべくターゲット鎖を多くしたいという理由もある。
【００１２】
そのため、ターゲット鎖を効率的に多く合成するため、様々な工夫が行われている。代表的な方法としては、ＰＣＲ反応において、優先的に多く合成したいＤＮＡ鎖を合成するプライマーの濃度を高めに調製してＰＣＲ反応を行う方法（非対称ＰＣＲ）や、あるいは、ターゲット鎖を含む二本鎖ＤＮＡを通常のＰＣＲ反応により合成したのち、ターゲット鎖を合成するプライマーのみを加えて再度ＰＣＲ反応を行う方法（２段階ＰＣＲ）などがある。
【００１３】
しかし、これらの方法は、様々な原因により改善が必要な点もある。具体的には、非対称ＰＣＲに関しては、ＰＣＲ産物量が充分に得られない場合や、充分に得られた場合でもＰＣＲ産物が非対称にならず、結果としてＰＣＲ産物がほとんど二本鎖ＤＮＡとなってしまう場合がある。また２段階ＰＣＲ法では、ＰＣＲ反応を２回行うことによる煩雑さや再現性という観点でのさらなる改良点があることや、２段階目のＰＣＲでプライマーを片鎖のみ加えていることでＰＣＲ反応が全く進行しない等が生じることがある。
【００１４】
従って、より簡便で、再現性が高い検体調製方法、すなわちターゲット鎖の効率的な合成方法が望まれていた。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
より簡便かつ効率的に所望の標的配列を有する一本鎖核酸（ターゲット鎖）検体調製をおこなうために、鋭意研究を進めたところ、ＰＣＲ条件下において増幅領域を挟む２つのプライマーのＴｍ（溶解温度）値が異なるように設計し、ＰＣＲ増幅工程とターゲット鎖合成工程とを行うことにより、上記問題点を解決できることを見出した。すなわち、アニーリング温度を前記２つのプライマーのＴｍ値以下に設定しＰＣＲ反応で増幅工程を行い、ついで何ら精製等を行うことなく、プライマーのテンプレートＤＮＡへのアニーリング温度を、このプライマーセットの２つのプライマーのＴｍ値の間になるようにしてＰＣＲ反応を行うことにより、Ｔｍ値が高いプライマーからの伸長鎖が、Ｔｍ値が低いプライマーからの伸長鎖に比べて多く増幅（ターゲット鎖合成工程）できることを見出した。
【００１６】
２段階ＰＣＲで増幅と標識化とを別工程（別反応容器）で行うことで、効率のよい増幅とターゲット鎖の標識化が可能であるが、本発明では、同一容器内で同様のターゲット鎖を生成できる。すなわち、アニーリング温度をターゲット鎖の相補鎖を伸長するプライマー（低Ｔｍプライマー）のＴｍ値以下の温度に設定してＰＣＲ反応を行い二本鎖核酸を増幅し、次いで、何ら精製等の操作を行うことなく、アニーリング温度をターゲット鎖を伸長するプライマーのＴｍ値とターゲット鎖の相補鎖を伸長するＴｍ値との間の温度に設定してＰＣＲ反応を行うと、ターゲット鎖を優先的に増やすことが可能であることを見出した。
【００１７】
つまり上記目的を達成するための本発明によると、試料中に含まれる核酸の少なくとも１つ以上の特定の核酸配列を、少なくとも２つのプライマーから構成され、かつ、ＰＣＲにおけるアニーリングの条件下、該特定核酸配列を伸長するためのプライマーと他のプライマーとが異なるＴｍ値を有しているプライマーセットを用いてＰＣＲ法により増幅する方法であって、前記試料と前記プライマーセットを含む反応液に対して、該プライマーセットを構成するプライマーのＴｍ値以下の温度でのアニーリング工程を有するＰＣＲを行い、前記特定核酸配列を含む断片が増幅された反応液を得る工程と、前記特定核酸配列を有する断片が増幅された反応液に対して、該反応液中のプライマーセットを構成するプライマーのうちの該特定核酸配列を有する断片を伸長するためのプライマーのＴｍ値以下で、その他のプライマーのＴｍ値よりも高い温度でのアニーリング工程を有するＰＣＲを行い該特定核酸配列を有する断片を更に増幅する工程と、を有する。
【００１８】
ＰＣＲ反応を構成する各プライマーのＴｍ値と、ＰＣＲ反応のアニーリング温度を適宜設定することにより、効率よく増幅したい一本鎖（ターゲット鎖）のＤＮＡ鎖を多く増幅させることが出来る。多くの場合、多く増幅したいＤＮＡ鎖を構成するプライマーのＴｍ値はアニール温度よりも高く設計し、増幅したくない相補鎖側のＤＮＡ鎖を構成するプライマーのＴｍ値はアニール温度よりも低く設定すると所望のＤＮＡ鎖のみを効率的に増幅することが可能である。これは、複数のプライマーセットを同時に使用するマルチプレックスＰＣＲでの利用も可能である。
【００１９】
本発明による標的一本鎖核酸増幅方法は、核酸検出用に作製されたＤＮＡチップなどにハイブリダイゼーションさせる検体の核酸増幅を伴う検体調製に用いることが出来る。すなわち、ＤＮＡチップ上のプローブＤＮＡに対しハイブリダイゼーションする一本鎖のＤＮＡ鎖を効率的に増幅し、またその増幅過程において蛍光物質等の標識物質を取り込ませる事が可能である、標識物質を取り込ませる方法としては、標識化したプライマーを用いる方法や、基質として標識化したヌクレオチドを使用してＰＣＲ反応を行う方法等がある。
【００２０】
従って、上述したとおり、本発明によれば、ＰＣＲ反応においてプライマーのＴｍ値及び反応中のアニール温度を本発明に従い適切に設定することにより、標的配列を有する核酸量が少量であっても、効率よくＰＣＲ産物で合成しうる二本鎖ＤＮＡのうち所望のプライマー伸長鎖を相補鎖側のプライマーに比べて優先的に合成することが可能である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の核酸増幅方法について更に詳細に説明する。
【００２２】
本発明による核酸増幅方法は、まず対象となる核酸の増幅したい領域を挟むプライマーを設計する。プライマー設計においては、増幅したい領域を挟む２つのプライマー（１組のプライマーセット）をＰＣＲ反応条件におけるＴｍ値が異なるように設計する。多くの場合、優先的に多く増幅したいＤＮＡ鎖を構成するプライマーのＰＣＲ反応条件におけるＴｍ値を、もう一方のプライマーのＴｍ値よりも高く設計することで、所望のＤＮＡ鎖を多く増幅することが出来る。本発明では、まず、ターゲット鎖の相補鎖を伸長するプライマー（低Ｔｍプライマー）のＴｍ値以下の温度のアニーリング温度条件でＰＣＲ反応を行い二本鎖核酸を増幅し、ついで、何ら精製等の操作を行うことなく、アニーリング温度を、ターゲット鎖を伸長するプライマーのＴｍ値とターゲット鎖の相補鎖を伸長するＴｍ値との間の温度に設定してＰＣＲ反応を行うことでターゲット鎖を優先的に増やす。Ｔｍ値を所望の温度に設定する方法としては、プライマーとしての配列特異性を著しく損なわない範囲で、プライマーの核酸配列の長さを変えるか、あるいはＧＣ％（核酸配列中のグアニンおよびアデニンの構成率）を変えるようにプライマーの設定をすることが一般的である。また、プライマーのＴｍ値の算出方法は、実際のＰＣＲ反応条件下で温度を変えて吸収強度を測定することによっても可能だが、一般的に良く知られている、最近接塩基対法、Ｗａｌｌａｃｅ法、ＧＣ％法等の方法によって計算することも可能である。
【００２３】
基本的なＰＣＲ反応では、プライマーは増幅したい領域を挟む１組のプライマーセットで構成されるが、本発明による核酸増幅方法は必ずしもこれに限定されない。１組以上のプライマーセットにより１つの領域を増幅する場合や、１組のプライマーセットにより複数の増幅領域を増幅する場合、あるいは、これらを組み合わせた複合的なＰＣＲ増幅においても、本発明の核酸増幅方法を適用することが出来る。複数のプライマーセットを用いたＰＣＲ反応は、１つ以上の核酸の中から、増幅したい１つ以上の核酸を選び、選んだ核酸の中から１つ以上の増幅したい領域を選び、選んだ領域に対してプライマーを設計し、さらにＰＣＲ反応により優先的に増幅したい１つ以上のＤＮＡ鎖を選ぶ工程を行ったのち、本発明の核酸増幅方法に従ってプライマーの設計およびＰＣＲ反応の条件設定を行うことで、本発明の核酸増幅方法が実施可能となる。
【００２４】
設計したプライマーを用いたＰＣＲ増幅反応は、いかなる反応条件においても可能であるが、本発明による核酸増幅方法をより効果的に実施するためには、ＰＣＲ反応におけるアニール温度を、２つのプライマーのＴｍ値以下に設定してＰＣＲ反応を実施する増幅工程と、２つのプライマーのＴｍ値の間に設定してＰＣＲ反応を実施するターゲット鎖合成工程とを、アニール温度の切り替えて行えばよい。これら２つの工程は、個別に実施することも可能であるが、ＰＣＲ反応の温度制御を切り替えることで工程を移行できる。
【００２５】
２つのプライマーのＰＣＲ反応条件におけるＴｍ値に、適当な差があれば本発明の核酸増幅は可能である。Ｔｍ値の差により、より簡便に増幅が可能となり、その温度差は１〜５℃の範囲であればよく、５〜１０℃の範囲であれば望ましい。さらに望ましくは温度差は１０〜２０℃の範囲である。
【００２６】
さらに詳細に説明すると、２つのプライマーのＴｍ値に大きな差異がある場合、本発明の目的である「優先的に増幅したいプライマー伸長鎖を相補鎖より多く増幅する」という観点では好ましい。しかし、ＰＣＲ増幅反応の効率という観点ではあまり好ましくない。従って増幅率よりも増幅産物の非対称化が強く求められる場合には１０〜２０℃、もしくは５〜１０℃のＴｍ値の差を２つのプライマー間に設定し、反対に増幅産物の非対称化よりも増幅率が強く求められる場合にはＴｍ値の差を比較的小さく設定するほうが良い。
【００２７】
増幅工程におけるアニーリング温度は２つのプライマーのＴｍ値により設定するが、少なくとも一つのプライマーのＴｍ値から５℃以内の範囲でアニール温度を設定することが好ましい。
【００２８】
本発明による標的一本鎖核酸増幅方法は、ＰＣＲ増幅が必要な様々な検体調製に特に制限無く応用可能であるが、特にその効果が期待される実施形態としてハイブリダイゼーション反応を利用した、特定の核酸配列の検出に適用可能である。その中でも核酸検出方法として近年広く利用されている応用形態として、固相上に固定されたＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを利用した検出方法がある。固相としてはガラス、プラスチック、金属などがよく用いられ、本発明の増幅方法はこれらに特に制限無く利用可能である。中でも平板状に多数のＤＮＡが固定されたＤＮＡチップあるいはＤＮＡアレイなどは、本発明の増幅方法が最も好適に用いられる核酸検出方法の１つである。また、平板状のＤＮＡチップ以外にも、ＤＮＡを固定したビーズを用いた核酸検出方法も近年よく利用されているが、本発明の増幅方法はこれに用いる検体の調製にも適用可能である。
【００２９】
固相上に固定されたＤＮＡが一本鎖のＤＮＡで、一本鎖ＤＮＡの鎖長が６０ｍｅｒ程度で比較的長い場合、一本鎖ＤＮＡのＴｍ値は高く、比較的強いハイブリダイゼーションが可能である。そのため、検出対象となるＰＣＲ産物がその相補鎖と二本鎖を形成していたとしても、二本鎖を解離し、検出対象となるＤＮＡ鎖とハイブリッドを効率よく形成することができる。しかし、固相上の一本鎖ＤＮＡの鎖長が２０ｍｅｒ程度で比較的短い場合、一本鎖ＤＮＡのＴｍ値は低く、ＰＣＲ産物の二本鎖を解離してハイブリッドを効率よく形成することが不可能となる。その場合、本発明による核酸増幅方法は特に効果的であり、感度の高い検出が可能である。
【００３０】
ＤＮＡチップ等の検体調製として本標的一本鎖核酸増幅方法を実施する場合、多く増幅したいプライマー伸長鎖に何らかの形で標識を施すことが多い。本発明による標的一本鎖核酸増幅方法は標識化を伴う核酸増幅方法にも適用可能であり、その場合、標識方法に制限されること無く実施することが可能である。標識を行う方法としては、プライマーの一部に何らかの標識を行い、標識されたプライマーによるＰＣＲ反応を行う方法が最も良く行われている方法の１つである。特にプライマーの５’側末端等にあらかじめ蛍光物質等を標識しておき、このプライマーを使用してＰＣＲ反応を行う方法がその中でも代表的である。また、この方法以外にもＰＣＲ反応の基質としてＰＣＲ産物に取り込まれるデオキシヌクレオチドを蛍光物質等により標識化し、この基質をＰＣＲ反応液に添加することにより、ＰＣＲ産物を標識化する方法があり、広く用いられている。本発明による標的一本鎖核酸増幅方法は、これらいずれの標識方法にも特に制限されること無く応用可能である。
【００３１】
標識物質としては感度の高さや取扱いの簡便性から蛍光物質による標識が一般的であるが、放射性同位体などによる標識や、ビオチンを標識したＰＣＲ産物に対し標識したアビジンで間接的に標識することも可能である。
【００３２】
また、本発明では本発明によるいずれかの標的一本鎖核酸増幅方法を実施するためのＴｍ値に差がある少なくとも２種以上のプライマーから構成されるプライマーセットについても提案する。
【００３３】
また、本発明によるいずれかの標的一本鎖核酸増幅方法により合成された、ＰＣＲ増幅産物についても提案する。
【００３４】
また、本発明により調整されたＰＣＲ増幅産物を用いてハイブリダイゼーション反応を行い、これにより特定の核酸を検出する核酸検出方法についても提案する。
【００３５】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００３６】
＜実施例１＞  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
ＴａＫａＲａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）の配列中に、下記のプライマー４種を設定した。ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全配列情報に関しては、ＴａＫａＲａ社および公開されているデータベース等から入手した。
【００３７】
2004337129.tif 000003
ただし、Ｔｍ値の算出は最近接塩基対法を用い、計算条件はＰＣＲ反応における諸条件、すなわちＮａ＋５０ｍＭ、Ｍｇ２＋１．５ｍＭ、濃度０．５μＭである。
【００３８】
このプライマーセットのうち、下記の組み合わせでプライマーを用いることにより、所定の鎖長を有する二本鎖部分がＰＣＲ増幅されることになる：
2004337129.tif 000004
【００３９】
（２）プライマーの合成
実施例１の（１）で設計した４種のプライマーの合成を行った。プライマーの合成は定法に従ってＤＮＡ合成機で合成し、さらに５’末端側にヘキサメチレンリンカーを介してアミノ基を修飾した。得られたアミノ修飾ＤＮＡ（プライマー）はカートリッジ精製したのち、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３に関してはアミノ基に結合するＮＨＳタイプＣｙ３標識試薬（アマシャムファルマシア製）で処理し、Ｒ１に関してはＮＨＳタイプＣｙ５標識試薬（アマシャムファルマシア製）にて処理した。得られた標識化プライマーをそれぞれＨＰＬＣ精製し、Ｃｙ３標識Ｆ１、Ｃｙ３標識Ｆ２、Ｃｙ３標識Ｆ３およびＣｙ５標識Ｒ１の４種のプライマーを得た。得られた各プライマーはＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。
【００４０】
（３）標的一本鎖核酸増幅
実施例１の（２）で合成した４種のプライマー、ＴａＫａＲａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰおよびＴａＫａＲａ社製ＰＣＲキット  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ    Ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いてＰＣＲ反応を行った。
【００４１】
プライマーの組み合わせとして上記（１）中に記載した３組のプライマーの組み合わせ、ＰＣＲの反応条件は下記のプロトコルに従い、行った：
2004337129.tif 000005
【００４２】
上記組成の反応液を以下の温度サイクルのプロトコルに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った：
９２℃／２分の保持の後、９２℃（変性）／４５秒、５２℃（アニーリング）／４５秒および７２℃（伸長）／１分を１サイクルとして１５サイクル、続いて９２℃（変性）／４５秒、５８℃（アニーリング）／４５秒および７２℃（伸長）／１分を１サイクルとして２５サイクル、最後に７２℃／１０分保持した。
【００４３】
反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ    Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後の液量は５０μｌとなるように調製した。得られたＰＣＲ産物の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、７６０ｂｐ相当のバンドが出ていることを確認した。電気泳動を図２に示す。なお、上記プライマーの組合せ▲１▼〜▲３▼より得られたＰＣＲ産物をそれぞれＰＣＲ産物▲１▼〜▲３▼とする。
【００４４】
（４）吸収測定
実施例１の（２）で合成したプライマー及び（３）で合成したＰＣＲ産物の吸収を測定した。標識プライマーは０．６μＭの濃度に調製し、標識してある蛍光物質（Ｃｙ３またはＣｙ５）に応じて下記の吸収波長における吸収強度を測定した。また、ＰＣＲ産物については、両波長の吸収強度を測定した。
【００４５】
【表１】
2004337129.tif 000006
【００４６】
【表２】
2004337129.tif 000007
続いて測定された吸収強度から、ＰＣＲ反応による取り込み収率を算出した。この収率を算出することで、ＰＣＲ反応に供給したプライマーのうち何％がＰＣＲ産物として伸長反応したかがわかる。
【００４７】
【表３】
2004337129.tif 000008
Ｃｙ３標識Ｆ２とＣｙ５標識Ｒ１のＴｍ値がほとんど等しいＰＣＲ産物▲２▼に関しては、取り込み収率に大きな違いは無く、二本鎖が均等に合成されていることがわかった。一方で▲１▼に関してはＣｙ３標識Ｆ１のＴｍ値が低いためＣｙ５標識Ｒ１からの伸長物が優先的に合成され、Ｃｙ３標識Ｆ１伸長物の取り込み収率に対しＣｙ５標識Ｒ１伸長物の取り込み収率が大きく上回っていた。また、▲３▼に関しては、Ｃｙ３標識Ｆ３のＴｍ値がＣｙ５標識Ｒ１のＴｍ値よりも高いため、Ｃｙ３標識Ｆ３からの伸長鎖が優先的に合成され、取り込み収率も高くなった。
【００４８】
＜比較例１＞増幅工程を省略した標的一本鎖核酸の作製
（１）標的一本鎖核酸の作製
実施例１の（２）で合成した４種のプライマーおよびＴａＫａＲａ社製ベクター  ｐＵＣ１１８  ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、Ｔａｋａｒａ社製ＰＣＲキット  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ    Ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いてＰＣＲ反応を行った。プライマーの組み合わせは、実施例１と同じとした。
2004337129.tif 000009
【００４９】
上記組成の反応液を以下のプロトコルに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った：
９２℃／１５分の保持の後、９２℃（変性）／４５秒、５７℃（アニーリング）／４５秒および７２℃（伸長）／１分を１サイクルとして４０サイクル、最後に７２℃／１０分保持した。
【００５０】
反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ    Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ    Ｋｉｔ）を用いて精製した。精製後の液量は５０μｌとなるよう調製した。得られたＰＣＲ産物の一部を取り、実施例１と同様に電気泳動を行い、７６０ｂｐ相当のバンドが出ていることを確認した（不図示）。
【００５１】
（２）吸収測定
（１）で合成したＰＣＲ産物の吸収を測定した。標識プライマーは、実施例１の（２）で作製したものを用いた。ＰＣＲ産物については、実施例１同様に各標識剤に対応した２つの波長の吸収強度を測定した。
【００５２】
【表４】
2004337129.tif 000010
【００５３】
【表５】
2004337129.tif 000011
続いて測定した吸収強度から、ＰＣＲ反応による取り込み収率を算出した。この収率を算出することで、ＰＣＲ反応に供給したプライマーのうち何％がＰＣＲ産物として伸長反応したかがわかる。
【００５４】
【表６】
2004337129.tif 000012
各プライマー由来の産物量比（Ｆ１／Ｒ１、Ｆ２／Ｒ１、Ｆ３／Ｒ１）は、実施例１と大きな違いはないが、各産物とも合成量が減少している。実施例１との比較から、テンプレートとなるＤＮＡが少量の場合、低ＴｍプライマーのＴｍ値以下で実施される増幅工程の有効性が確認された。
【００５５】
＜実施例２＞ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーション
（１）ＤＮＡマイクロチップの作製
（１−１）ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００５６】
（１−２）表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００５７】
（１−３）プローブＤＮＡの合成
下記の配列を有するプローブを合成した。なおこの配列は、実施例１におけるＰＣＲ産物▲１▼、▲２▼および▲３▼のＲｅｖｅｒｓｅ側の伸長鎖の一部に対し１００％相補的な配列となっている。プローブＤＮＡはガラス基板に対して共有結合させるため、定法に従って５’末端にチオール化処理を施したのち、ＤＮＡ合成時に副反応を避けるために結合してある保護基を全て除去し、さらにＨＰＬＣ精製および脱塩処理を施した。
【００５８】
名称              配列
Ｐ１    ５’ｃｃｔｔａａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｃｇ  ３’        （配列番号５）
得られたプローブＤＮＡは純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００５９】
（１−４）ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５質量％、チオジグリコール７．５質量％、尿素７．５質量％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０質量％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意したプローブを上記の混合溶媒に規定濃度（１０μＭ）となるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０、キヤノン（株）社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００６０】
なおここで用いたバブルジェットプリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェットプリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００６１】
続いて、この改造バブルジェットプリンターを用いて印字操作を行った。１枚のＤＮＡチップあたり、１６スポットの吐出が行われるよう印字のパターンをあらかじめ作成し、印字した。印字が確実に行われていることを拡大鏡等により確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００６２】
（１−５）洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡチップを得た。
【００６３】
（２）ハイブリダイゼーション
（１）で作製したＤＮＡチップと実施例１で作製したＰＣＲ産物を用いて検出反応を行った。
【００６４】
（２−１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１質量％となるように１００ｍＭ  ＮａＣｌ  ／  １０ｍＭ  リン酸バッファーに溶解し、この溶液に上記作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１質量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，  Ｃ６Ｈ５Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ）３０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【００６５】
（２−２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ産物のターゲット量（モル数）を同じにするため、Ｒｅｖｅｒｓｅ鎖に標識してあるＣｙ５の吸収強度が同じになるよう、３種のＰＣＲ産物の濃度を調製した。続いて、等量のＰＣＲ産物を用いて最終濃度が下記の構成となるよう３種のハイブリダイゼーション溶液を調製した。
【００６６】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
以下にハイブリダイゼーション溶液の組成の一例を示す：
６×ＳＳＰＥ  ／  １０％  ホルムアミド  ／ＰＣＲ産物
（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐＨ  ７．４）
（２−３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ    Ｉｎｃ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ    Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６７】
＜ハイブリダイゼーション条件＞
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し３分間保持した後、さらに９２℃で２分間、続いて４５℃で３時間保持した。その後、２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを用いて２５℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、スピンドライ装置で水切りを行った。
【００６８】
（３）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡチップをＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）を用いで蛍光測定を行った（フォトマル電圧：４００Ｖ、波長５３２ｎｍ）。測定結果を下記に示す。なお、バックグランドに相当するスポットの無い部分からの蛍光強度を引いた値を、また、測定は２回実施してその平均値を測定結果とした。
【００６９】
【表７】
2004337129.tif 000013
この結果から、Ｆｏｒｗａｒｄ鎖とＲｅｖｅｒｓｅ鎖が均等に合成されたＰＣＲ産物▲２▼に比べて、Ｒｅｖｅｒｓｅ鎖が優先的に合成されたＰＣＲ産物▲１▼が最も効率よくＤＮＡチップ上でハイブリダイゼーションしたことがわかった。従って、本発明の核酸増幅方法は、所望のＰＣＲ伸長鎖を効率的に合成することが可能で、ＤＮＡチップに供する検体調製等に好適に適用可能であることがわかった
【００７０】
【発明の効果】
本発明の標的一本鎖核酸増幅方法によれば、ＰＣＲ条件下において増幅領域を挟む２つのプライマーのＴｍ値が異なるように設計し、アニーリング温度を２つのプライマーのＴｍ値以下に設定しＰＣＲ反応で増幅工程を行い、ついでプライマーのテンプレートＤＮＡへのアニーリング温度を、このプライマーセットの２つのプライマーのＴｍ値の間になるように設定することにより、標的配列を有する核酸量が少量であっても効率よくＰＣＲ産物で合成しうる二本鎖ＤＮＡのうち、所望のプライマー伸長鎖を相補鎖側のプライマー伸長鎖に比べて優先的に合成することが可能である。また、本発明によれば、２段階ＰＣＲと同様の効果を、簡便かつ容易に同一反応容器内で得ることが可能である。さらに、この核酸増幅方法は、プローブと相補的な一本鎖の効率的な合成が望まれるＤＮＡチップなどの検体調製に好適に適用可能である。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による核酸増幅方法の基本的な概念図を示す。
【図２】本発明の実施例における電気泳動の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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