(57)【要約】【課題】本発明は、種々の高等植物について遺伝子工学的手法により遺伝子導入を行う際に、目的遺伝子が導入された再生体の獲得効率の向上を図ることを目的とする。また、作出された形質転換植物の初期生育を促進することによる収量の増加または環境ストレス耐性の増強を目的とする。【解決手段】本発明は、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）又はそれをコードしてなる遺伝子からなる形質転換体の獲得効率の向上剤、植物の初期生育の向上剤、植物の収量の増加剤、及び／又は植物の環境ストレス耐性を増強剤、及びそのための方法に関する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）又はそれをコードしてなる遺伝子からなる形質転換体の獲得効率の向上剤、植物の初期生育の向上剤、植物の収量の増加剤、及び／又は植物の環境ストレス耐性の増強剤。
【請求項２】
アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）がそれをコードする遺伝子の導入により細胞内で発現されたものである、請求項１に記載の形質転換体の獲得効率の向上剤、植物の初期生育の向上剤、植物の収量の増加剤、及び／又は植物の環境ストレス耐性の増強剤。
【請求項３】
細胞が植物細胞である、請求項２に記載の形質転換体の獲得効率の向上剤、植物の初期生育の向上剤、植物の収量の増加剤、及び／又は植物の環境ストレス耐性の増強剤。
【請求項４】
細胞に外来遺伝子を導入して形質転換する方法であって、外来遺伝子と共に、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入することを特徴とする形質転換体の獲得効率を向上させる方法。
【請求項５】
細胞が植物細胞である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
植物細胞にアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入して形質転換することからなる植物の初期生育を向上させ、植物の収量を増加させ、及び／又は植物の環境ストレス耐性を増強させる方法。
【請求項７】
植物細胞にアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子の導入が、他の外来遺伝子の導入と共に行われる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子が、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）を発現させるための適当なプロモーターを有するものである請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
植物細胞が、イネである請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）又はそれをコードしてなる遺伝子からなる形質転換体の獲得効率の向上剤、植物の初期生育の向上剤、植物の収量の増加剤、及び／又は植物の環境ストレス耐性の増強剤に関する。
また、本発明は、外来遺伝子と共に、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入することを特徴とする形質転換体の獲得効率を向上させる方法、及び植物細胞にアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入して形質転換することからなる植物の初期生育を向上させ、植物の収量を増加させ、及び／又は植物の環境ストレス耐性を増強させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子工学技術を利用した植物への遺伝子導入は、目的の遺伝子を対象の植物に直接導入することを可能にした。現在、形質転換植物による遺伝子の機能解析は、分子生物学的研究に欠かせない手法のひとつになっている。
また、従来の育種法では、突然変異体の単離や長期に渡る交配の繰り返しにより目標の品種を作出している。しかし、形質転換技術を用いると、比較的短期間で有用な遺伝子のみを導入でき、かつ交配ができない植物間や植物以外の異種生物由来の遺伝子も導入できるので、植物育種という観点からも形質転換は非常に有用な技術である。
【０００３】
形質転換作物の作出目的としては収量の増加、農作業の軽減化（除草剤耐性、病害耐性などを含む）、劣悪環境での収穫、特定栄養価の増加、医薬的利用など非常に様々である。また、世界人口の爆発的増加が予測されていることから、食糧不足を回避するための作物の形質転換は有望な技術と期待されている。既に、農作業の軽減化を目指した形質転換作物など数々が市場に登場したが、食糧不足解消という目標を実現できる形質転換作物の作出はまだ進行段階である。その出発点として、高橋らは、植物が鉄欠乏を呈す石灰質アルカリ土壌においても生育できる鉄欠乏耐性イネを報告している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１９：　４６６−４６９）。このような、低肥料条件や劣悪環境で十分収穫できる新品種作出はこれからの重要課題である。また、形質転換技術の適用は様々な植物種で試みられており、将来的には従来からの作物・園芸育種にとどまらず、環境の保全や緑化に役立つ植物の作出や木質材料木などの形質改善に広く適用されていくものと考えられる。
【０００４】
植物種に関わらず一般に、形質転換体を作出するには、（１）目的遺伝子の植物細胞への導入、（２）核染色体、あるいはオルガネラ染色体への遺伝子配列の挿入、（３）遺伝子導入された細胞（組織）の選抜、（４）選抜された細胞（組織）からの植物体の再分化、という過程を経る。しかし現在の技術では染色体への目的遺伝子の挿入位置や挿入数を制御することはできず、また、目的遺伝子の全長が挿入される確証もない。従って、期待した形質転換体を得るには、（５）得られた再生体群からの適正な個体の選抜、という過程も必要になるが、この選抜過程では、目的遺伝子が導入された再生体の絶対数が多い方が当然有利である。そこで、目的の形質転換植物の作出効率を向上させるには、（ａ）目的遺伝子の細胞への導入効率の向上、（ｂ）遺伝子導入に成功した細胞からの再生体獲得効率の向上、などが重要となる。（ａ）の技術としては、例えば、自然では感染できない植物へのアグロバクテリウム法変法の施用（Ｈｉｅｉ　Ｙ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４）　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　６（２）：　２７１−２８２）や大きなコンストラクトも欠損なく導入できるベクターｐＢＩＧＲＺの使用（特開平１０−１５５４８５号）などが報告されている。また、（ｂ）の技術としては、例えば、目的遺伝子とサイトカイニン関連遺伝子を同時に導入するもの（特開２００１−１７５６６７号）、選択薬剤に植物ホルモンとアナログであるカルベニシリンを使用するもの（Ｌｉｎ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９５）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１０９：　１７１−１７７）などが報告されている。
【０００５】
アデニン・リボースリン酸転移酵素（以下、ＡＰＲＴと略称する。）は、アデニンとホスホリボシルピロリン酸をアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）に一段階で変換する酵素である。生物は広くこの酵素を持ち、大腸菌、酵母、ショウジョウバエ、ヒトなど様々な種から、この遺伝子が同定されている（順に、Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　Ｍ１４０４０、　Ｌ１４４３４、　Ｌ０６２８０、　Ｍ１６４４６）。高等植物ではシロイヌナズナ、オオムギ、コムギなどでこの遺伝子の配列が決定された（順に、Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．　Ｘ５８６４０、　ＡＢ０１２０４６、　Ｕ２２４４２）。ＡＰＲＴの酵素活性または遺伝子発現は、細胞分裂が盛んな時期、あるいは多量の活性メチオニンが必要とされる場合に上昇することが報告されている（Ａｓｈｉｈａｒａ　Ｈ，　（１９８３）　Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｕｒ　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ，　１１３：　４７−６０；　Ｎｏｂｕｓａｗａ　Ｅ，　ａｎｄ　Ａｓｈｉｈａｒａ　Ｈ，　（１９８３）　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１５：　１０５９−１０６５；　Ｌｅｅ　Ｄ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４）　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，　９０：　７３９−７４７；　Ｉｔａｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ，　５１：　１１７９−１１８８）。また、植物のＡＰＲＴはアデニンだけでなく植物ホルモンの一種になるベンジルアデニンのホスホリボシル化も行えるといわれている（Ｂｕｒｃｈ　ＬＲ，　ａｎｄ　Ｓｔｕｃｈｂｕｒｙ　Ｔ，　（１９８６）　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２５：　２４４５−２４４９；　Ｍｏｆｆａｔｔ　Ｂ，　ｅｔ　ａｌａ．，　（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，　９５：　９００−９０８；　Ｓｃｈｎｏｒｒ　ＫＭ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６）　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，　９：　８９１−８９８）。
ＡＰＲＴには前記してきたような作用が報告されているが、これ以外の作用や機能については報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、種々の高等植物について遺伝子工学的手法により遺伝子導入を行う際に、目的遺伝子の導入効率の向上を図ることを目的とする。また、作出された形質転換植物の初期生育を促進することによる収量の増加または環境ストレス耐性の増強を目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、植物の形質転換を行う場合に、適切なプロモーター配列に制御されたアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）遺伝子を目的遺伝子と共に同じ細胞に導入することにより、形質転換体の獲得効率が著しく向上することを見出した。さらに、ＡＰＲＴ遺伝子を適切な時期に発現させることにより、これを有する形質転換植物種子の発芽生長が旺盛となり、初期生育が大きく促進されることを見出した。本発明の目的は目的遺伝子をＡＰＲＴ遺伝子と共に高等植物の細胞に導入することで達成された。
【０００８】
即ち、本発明は、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）又はそれをコードしてなる遺伝子からなる形質転換体の獲得効率の向上剤、植物の初期生育の向上剤、植物の収量の増加剤、及び／又は植物の環境ストレス耐性の増強剤に関する。
また、本発明は、細胞に外来遺伝子を導入して形質転換する方法であって、外来遺伝子と共に、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入することを特徴とする形質転換体の獲得効率を向上させる方法、及び植物細胞にアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入して形質転換することからなる植物の初期生育を向上させ、植物の収量を増加させ、及び／又は植物の環境ストレス耐性を増強させる方法に関する。
【０００９】
アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）は、アデニン塩基とホスホリボシルピロリン酸を一段階でＡＭＰに変換する酵素であり、生物界に広く存在する。ＡＰＲＴ遺伝子は、既に大腸菌、酵母、ショウジョウバエ、ヒトなどや、高等植物ではシロイヌナズナ、オオムギ、コムギなどの様々な種から同定されている。高等植物の多くでは、遊離のアデニンの回収は、ＡＰＲＴによる系が主要であると考えられている。シロイヌナズナの種子の成長過程では、ＡＰＲＴ活性が種子の吸水膨潤から発根までの間に急激に上昇し、双葉の開く頃には減少して一定の強さに落ち着くという現象の報告がある（Ｌｅｅ　Ｄ，　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ　ＢＡ，　（１９９４）　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，　９０：　７３９−７４７）。同様な現象は、マメ科のブラックグラムやコムギの種子でも観察されている（Ａｓｈｉｈａｒａ　Ｈ，　（１９８３）　Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｕｒ　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ，　１１３：　４７−６０；　Ｎｏｂｕｓａｗａ　Ｅ，　ａｎｄ　Ａｓｈｉｈａｒａ　Ｈ，　（１９８３）　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１５：　１０５９−１０６５）。このようなＡＰＲＴ活性の変動は、盛んに細胞分裂が起こる時期の植物細胞がＡＰＲＴによりアデニンを積極的に回収していることを示している。
また、シロイヌナズナでは、ＡＰＲＴを欠損した変異体が単離されている。この変異体を用いて葉からカルス形成を誘導すると、野生株の葉ではカルス形成が盛んになった７日目においても、変異株ではカルス形成がほとんど起こらなかった（Ｌｅｅ　Ｄ，　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ　ＢＡ，　（１９９４）　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，　９０：　７３９−７４７）。さらにこの変異株では、花粉成熟が正常に進行せず雄性不稔を呈した。これらのことも、細胞分裂が盛んな時期におけるＡＰＲＴのアデニン回収の重要さを示唆している。
【００１０】
細胞分裂が盛んな時期以外にもＡＰＲＴ活性が上昇する例も報告されている。例えば、本発明者らは鉄欠乏処理をしたオオムギの根でＡＰＲＴ活性が著しく上昇し、ＨｖＡＰＴ１（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ａｐｒｔ　１）遺伝子の発現も増加していることを報告してきた（Ｉｔａｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ，　５１：　１１７９−１１８８）。
しかしながら、ＡＰＲＴ遺伝子を導入することにより、形質転換体における再生体獲得効率が向上すること、並びに作出された形質転換植物の初期生育が促進されること及び収量の増加または環境ストレス耐性を増強できることについては未だ報告されていない。
【００１１】
本発明者らは、外来遺伝子により細胞、好ましくは植物細胞を形質転換する際に、外来遺伝子と同時にＡＰＲＴ遺伝子を導入する方法を検討してきた。その結果、細胞の形質転換に際して外来遺伝子と同時にＡＰＲＴ遺伝子を導入することにより再生体獲得効率が約２倍に向上し、またこのようにして形質転換された植物体の初期生育が促進され、さらに収量の増加及び環境ストレス耐性も増強されることがわかった。
例えば、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を目的遺伝子として、同時にＡＰＲＴ遺伝子を導入した場合と、導入しなかった場合とを比較検討した。この結果を次の表１に示す。
【００１２】
【表１】
2004073011.tif 000002
【００１３】
表１中で「導入したプラスミド名」の欄に「ｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴ」と記載されているのがＡＰＲＴ遺伝子を含むプラスミドで遺伝子が導入されたものであり、「ｐＢＩＧＲＺ」と記載されているのはＡＰＲＴ遺伝子を含まないプラスミドで形質転換されたイネである。
ＡＰＲＴ遺伝子を導入したカルス１０５個からはハイグロマイシンＢに耐性な再生体が４３個体（４１％）が得られ、これらの再生体４１個体（３９％）から目的のＧＵＳ遺伝子の存在が確認された。また、ＧＵＳ遺伝子のみを導入したカルス８２個からは再生体１８個体（２２％）が得られ、これらの再生体１６個体（１９％）からＧＵＳ遺伝子の存在が確認された。このようにＡＰＲＴ遺伝子を同時に導入することにより、外来遺伝子のみを導入する場合に比べて外来遺伝子が導入された再生体の獲得効率（外来遺伝子導入カルス／遺伝子導入処理カルス）が約２倍に向上することがわかった。
【００１４】
次にＡＰＲＴ遺伝子を導入した形質転換イネの種子と、ＡＰＲＴ遺伝子を導入しなかった形質転換イネ（コントロールイネ）の種子を７０％エタノール、２％の次亜塩素酸の順で表面殺菌した後、ハイグロマイシンＢを５０ｍｇ／ｍＬで含むＭＳ培地上で発芽させた。両者の植物体の草丈が２０ｃｍ以上に生育するまで同じ培地で、同じ期間育生した。このとき、コントロールイネの平均草丈は２４ｃｍであり、ＡＰＲＴ遺伝子を導入したイネの平均草丈は２８ｃｍであり（図４のグラフの０週目の値を参照）、初期生育の段階でＡＰＲＴ遺伝子を導入したイネは、コントロールイネよりも４ｃｍ（１１７％）も大きくなっていた。このようにＡＰＲＴ遺伝子が導入されたイネは、初期生育の促進がされることが明らかとなった。
一般に、発芽直後の植物は気候の変動に弱く、また、光合成に不可欠な太陽光を他の植物よりも多く受け取るためには早く生長することが重要である。初期生育の良い作物の作出は雑草と対抗したり、栽培開始直後の天候の急激な変動に応答する上で農業的に有意義である。さらに、初期成育が良好であればその後の生育も促進され得るので、多毛作を行う地域ではより早く次の播種が行えるという意味を持つ。従って本発明のＡＰＲＴの発現を増強したイネは産業的に有用である。
【００１５】
さらに、これらの形質転換イネの環境ストレス耐性について検討した。この実験では、環境ストレスとして鉄欠乏を採用した。即ち、これらの形質転換イネの草丈が２０ｃｍ以上に生育したときから石灰質アルカリ土壌（貝化石土壌）による土耕を開始した。この実験で使用した石灰質アルカリ土壌は土壌中には十分鉄分を含んでいるものの、高アルカリ性であるために鉄が水酸化鉄Ｆｅ（ＯＨ）３として沈殿しているという土壌である。そのような土壌では植物は鉄の吸収が十分に行えずに鉄欠乏の症状を示し、深刻な場合は死に至るものである。
この結果を図４のグラフに示す。図４のグラフの横軸は石灰質アルカリ土壌による土耕を開始した後の時間（週）を示し、縦軸は最大草丈（ｃｍ）を示す。この結果、コントロールイネは土耕開始時（グラフの０週目）には２４ｃｍであり、３週目から５週目には４４−４９ｃｍの大きさで伸長が一時停滞したが、６週目から再び伸長が大きくなり実験の終わりには６３ｃｍまで生長した。一方、ＡＰＲＴ遺伝子が導入されたイネは０週目に２８ｃｍあり、５週目には７０ｃｍに達した。それ以降もゆるやかに伸長は続き、実験の終わりには７８ｃｍだった。
このように、本発明のＡＰＲＴ遺伝子を導入したイネは、環境ストレスに対しても耐性があることが示された。世界には石灰質土壌は多く存在し、そのようなアルカリ土壌においても稲作などが行えれば食糧不足の解消に役立つ。
このようにしてアルカリ土壌で育てた形質転換イネの種籾を採取し、乾燥してその重量を測定した。結果を次の表２に示す。
【００１６】
【表２】
2004073011.tif 000003
【００１７】
表２中の「Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ」と記載されているのがＡＰＲＴ遺伝子が導入されたイネのものであり、「コントロールイネ」と記載されているには、ＡＰＲＴ遺伝子が導入されていないイネのものである。表２の平均重量（ｇ）中のカッコ内は、標準偏差を示す。
この結果、ＡＰＲＴ遺伝子が導入されたイネの乾燥種籾の重量はポット平均で３．３グラムなのに対し、コントロールイネでは１．５７グラムで、ＡＰＲＴ遺伝子が導入されたイネはコントロールイネに比べて収量が２倍以上であることがわかった。
【００１８】
以上の実験結果からも明らかなように、本発明の方法により、目的遺伝子と同時にＡＰＲＴ遺伝子を導入することにより、目的遺伝子が導入された再生体の獲得効率が向上し、目的遺伝子とＡＰＲＴ遺伝子が導入された個体は、初期生育が促進され、環境ストレス耐性が向上し、かつ収量が増加することが明らかにされた。
【００１９】
本発明におけるアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）又はそれをコードしてなる遺伝子としては、アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）又はそれをコードする遺伝子のいずれであってもよいが、好ましくはアデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を導入して、それを細胞内で発現させたＡＰＲＴタンパク質が挙げられる。アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子としては、生物種を問わず、アデニンとホスホリボシルピロリン酸をアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）に変換するタンパク質をコードする遺伝子であればよい。
アデニン・リボースリン酸転移酵素（ＡＰＲＴ）をコードする遺伝子を発現を制御させるためのプロモーターとしては、当該遺伝子が細胞内で、好ましくは植物細胞内で発現できるものであれば特に制限はないが、発現する時期や環境を制御できるプロモーターが好ましい。このようなプロモーターの例としては、全身過剰発現型のカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）　（Ｏｄｅｌｌ　ＪＴ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１３（６００５）：　８１０−８１２）や、鉄栄養欠乏誘導型で部位特異的発現のＩｄｓ３プロモーター（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｐｌａｎｔａ　２１２：　８６４−８７１）、同じく鉄栄養欠乏誘導型で部位特異的発現のＨｖＮＡＳ１プロモーター（Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２５：　１５９−１６７）など植物細胞の状態で制御されるものの他に、化学物質誘導型のＴｅｔリプレッサー融合型カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Ｇａｔｚ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９１）　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２７（２）：　２２９−２３７）、Ｌａｃオペレーター／リプレッサー系プロモーター（Ｗｉｌｄｅ　ＲＪ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９２）　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１１（４）：１２５１−１２５９）など種々のプロモーター配列を使用することができる。ただし、初期生育を促進する目的には部位特異的発現を示すプロモーターのうちでも種子胚や発芽組織での発現上昇を起こすものがより有効であり、好ましい。
転写を終結させるターミネーター配列としては、ノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナル（ｔＮＯＳ）　（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８２）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１（６）：５６１−５７３）、オクトピン合成酵素のポリアデニル化シグナル（Ｇｉｅｌｅｎ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９８４）　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　３（４）：８３５−４６）などを使用することができる。
【００２０】
本発明においての目的遺伝子とは、産業的に有用な形質を付与する遺伝子、産業的に有用とは限らないが遺伝子発現や機能の研究に利用される遺伝子など種々の目的遺伝子を用いることができる。　また、ＡＰＲＴ遺伝子を制御する適切なプロモーター配列とは、植物の細胞で機能する限り制限はない。このような目的遺伝子の導入は従来公知の方法により行うことができる。
本発明におけるＡＰＲＴ遺伝子コンストラクトの導入も、従来公知の方法により行うことができる。
このような目的遺伝子の導入と本発明のＡＰＲＴ遺伝子の導入は、同一のベクターを用いて同時に行うこともできるし、異なるベクターを用いて同時又は異なる時期に行うことができる。また、目的遺伝子による形質転換とは別に、植物の初期生育を向上させ、植物の収量を増加させ、及び／又は植物の環境ストレス耐性を増強させる目的で、ＡＰＲＴ遺伝子のみを導入することも本発明の方法に包含されるものである。
このような遺伝子の導入方法としては、例えば、一般的にはこれらの遺伝子を適当なベクターに組み込んだ上で、アグロバクテリウム細菌やブロムモザイクウィルスなどを介して間接的に導入するか、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、マイクロインジェクション法、パーティクルボンバードメント法、細胞融合法など直接的に導入する方式がとられる。目的遺伝子とＡＰＲＴ遺伝子とのコンストラクトは同一のベクターに挿入されている必要はなく、別々のベクターを同時に導入するコトランスフォーメーションを行っても良い。ただし、完全長遺伝子を持つ形質転換体を多数得る目的には同一ベクターに挿入されている方が望ましい。
【００２１】
これらの遺伝子が導入される細胞としては、植物細胞が好ましいがこれに限定されるものではない。植物細胞としては、特に制限はないが、産業的な観点からは穀物植物などの栽培植物が好ましい。好ましい植物細胞としては、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシなどが挙げられる。これらの植物細胞としては、カルス細胞が好ましいが、これに限定されるものではない。
また、本発明における環境ストレスとしては、鉄欠乏などの栄養元素の欠乏などが挙げられる。
【００２２】
本発明におけるＡＰＲＴは、細胞の維持に欠かせない酵素としてハウスキーピングエンザイムの一つに数えられるものである。植物のＡＰＲＴについてはアデニン塩基と構造が似ているベンジルアデニンやゼアチンに対しても基質親和性を持つとの報告がある。これらの物質は植物ホルモンサイトカイニンの一種であり、ＡＰＲＴによるホスホリボシル化はこれらの物質によるホルモンシグナルの伝達に関係しているという見方がある（Ｍｏｆｆａｔｔ　Ｂ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　９５：　９００−９０８；　Ｓｃｈｎｏｒｒ　ＫＭ，　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９６）　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　９：　８９１−８９８）が、実際には生体内でのＡＰＲＴとサイトカイニンの関わりは証明されていない。本発明におけるＡＰＲＴの作用は、ＡＰＲＴの持つアデニンの再利用促進という働きが植物に安定した細胞分裂環境をもたらした結果、細胞内の物質の再利用効率が向上して効率的な細胞維持、分裂につながるものと考えられるが、詳細はかならずしも明らかではない。
【００２３】
前記してきた実験においては、目的遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を、ＡＰＲＴのプロモーターとしてＩｄｓ３遺伝子のプロモーターを用いた例を示してきた。
Ｉｄｓ３遺伝子は、ＩＤＳ３タンパク質をコードする遺伝子であり、オオムギのＩＤＳ３タンパク質は、イネ科植物に特有の三価鉄のキレーターであるムギネ酸類を生合成する酵素群の中のひとつであり、デオキシムギネ酸からムギネ酸への水酸化を行う（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　４４：　１９９−２０７；　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｐｌａｎｔａ，　２１２：　８６４−８７１　）（図１参照）。鉄欠乏オオムギ根におけるＨｖＡＰＴ１発現量の上昇は、ムギネ酸類の合成過程で放出される多量のアデニンを回収してＡＴＰを再生させ、このＡＴＰをメチオニンサイクルにて再利用するために起こると考えられた　（Ｉｔａｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ　５１：　１１７９−１１８８）。また、タバコＢＹ−２培養細胞を用いてＨｖＡＰＴ１−緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の融合タンパク質を一過的に発現させたところ、この融合タンパク質が細胞質に広く分布したことからＨｖＡＰＴ１タンパク質は細胞質で機能していることが示唆された（Ｉｔａｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ　５１：　１１７９−１１８８）。
【００２４】
ＩＤＳ３様のタンパク質の存在はオオムギ以外のイネ科作物ではライムギにだけ確認された（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ　Ｈ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　４４：　１９９−２０７）。オオムギにおけるＩｄｓ３遺伝子の発現は根でのみ確認でき、鉄が十分存在する条件での発現は見られないが、鉄欠乏条件になると非常に強く誘導され長期に渡りその発現量が維持される。Ｉｄｓ３の発現は他の微量必須元素（ホウ素、マンガン、銅、亜鉛）の過剰または欠乏条件では誘導されない。このことからＩｄｓ３遺伝子のプロモーター領域には鉄欠乏ストレスに応答するシス配列の存在が予測されてきた。小林らは、オープンリーディングフレームの上流２．２ｋｂを含むＩｄｓ３遺伝子のゲノム断片（２０ｋｂ）をイネにアグロバクテリウム法で導入し、この形質転換イネにおいてもＩｄｓ３遺伝子の発現が鉄欠乏状態の根で誘導されることを確認した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｐｌａｎｔａ，　２１２：　８６４−８７１）。したがってオオムギの遺伝子であるＩｄｓ３のプロモーター領域は、Ｉｄｓ３様遺伝子を持っていないイネにおいてもオオムギ細胞内と同様な遺伝子制御を行うと考えられた。
Ｉｄｓ３プロモーターは細胞の鉄要求性に応じて下流の遺伝子発現を上昇させる。本発明の例示においては、この鉄欠乏誘導性で特に根での発現を誘導するオオムギのＩｄｓ３遺伝子プロモーター２．２ｋｂと細胞質局在を呈すオオムギのＡＰＲＴ遺伝子をつないだコンストラクト（Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳ）を使用した結果を示す（図２参照）。
【００２５】
形質転換用ベクターｐＢＩＧＲＺ（特開平１０−１５５４８５合）には、Ｔ−ＤＮＡの間にカナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性（ＨＰＴ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子などが存在する。後述する本発明の具体例の例示である実施例１では、ＨＰＴ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子の挿入を目安にＩ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳの働きを検定した。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳと共に形質転換した場合、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳを含まない場合に比べＧＵＳ遺伝子が導入された再生体の獲得効率（ＧＵＳ遺伝子保有カルス／遺伝子導入処理カルス）が約２倍に向上した。
また、同実施例２に示すようにｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴを導入した形質転換イネＩ３ｐ−ＡＰＲＴは、種子を選抜したハイグロマイシンＢ入りのＭＳ培地上での初期生育がｐＢＩＧＲＺのみで形質転換したコントロールイネよりも優っていた。さらに、石灰質アルカリ土壌で生育検定を行った場合、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネはコントロールイネよりもよく生育し、鉄欠乏耐性を示した。使用した石灰質アルカリ土壌は土壌中には十分鉄分を含んでいるものの、高アルカリ性であるために鉄がＦｅ（ＯＨ）３として沈殿しているという土壌である。そのような土壌では植物は鉄の吸収が十分に行えずに鉄欠乏の症状を示し、深刻な場合は死に至る。世界には石灰質土壌は多く存在し、そのようなアルカリ土壌においても稲作などが行えれば食糧不足の解消に役立つ。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネに使用したＩｄｓ３プロモーターは、植物の根が鉄欠乏状態の時に持続的に下流遺伝子の発現を上昇させる性質のものであり、石灰質土壌での検定の間中Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネではＡＰＲＴ遺伝子の発現が増加していたと考えられる。
【００２６】
カルス化細胞中や種子発芽中のＩｄｓ３プロモーターの働きについてはこれまで報告されていないが、本実施例によりそれが確認された。分裂の盛んな組織では微量必須元素への要求性が高いゆえ、一時的な鉄欠乏状態に陥っていると考えられる。しかし細胞分裂が盛んなカルスにおいては、潜在的な鉄要求状態にあるとしても培地から十分な鉄供給は受けるので、カルス内でのＩｄｓ３プロモーターによるＡＰＲＴ遺伝子の発現は比較的穏やかだったと考えられる。カルス内での発現を大きく増加させるプロモーターを使用した場合、本発明の方法は形質転換された再生体獲得により高い効果を示すであろう。
本発明の方法によれば、高等植物へ遺伝子工学的手法により遺伝子導入を行う際に、遺伝子導入が成功した細胞からの植物体再生効率を向上させることができる。このことにより、遺伝子導入された多数の個体から、目的とした適正な形質転換植物を選抜することができるということで形質転換植物作出効率全体を向上させることができる。
【００２７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２８】
実施例１　（形質転換体の製造）
（ｉ）　ｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴコンストラクトの作成（図２及び図３参照）
図２のスキームに示したように、ｐＹＨ３７に制限酵素ＳａｌＩサイトとＮｏｔＩのサイトでクローニングされたＨｖＡＰＴ１　ｃＤＮＡ（Ｉｔａｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．，　（２０００）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｂｏｔａｎｙ　５１：　１１７９−１１８）からＢａｍＨＩサイトとＮｏｔＩサイトでオープンリーディングフレーム全域を切り出し、Ｉｄｓ３プロモーター配列とつないだＡＰＲＴ遺伝子、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳコンストラクトを作成した。図３には形質転換用ベクターｐＢＩＧＲＺ（特開平１０−１５５４８５号）を示した。Ｔ−ＤＮＡの間にはハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）、β−グルクロニダーゼ　（ＧＵＳ）遺伝子などが存在する。本実施例ではこのＧＵＳ遺伝子が本願発明における目的遺伝子に相当する。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳをＮｏｔＩサイトでベクターに挿入し、プラスミドｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴを作成した（図３）。ただし、ＮｏｔＩサイトのみで挿入したため、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳが挿入された実際の方向は不明である。
【００２９】
（ｉｉ）形質転換イネＩ３ｐ−ＡＰＲＴの作成
アグロバクテリウム法によりイネ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．　ｖａｒ．　Ｔｓｕｋｉｎｏｈｉｋａｒｉ）に目的遺伝子コンストラクトを導入した。アグロバクテリウム　ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への（ｉ）で作成したプラスミドｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴと、比較例としてのプラスミドｐＢＩＧＲＺの導入はヘルパー大腸菌を用いて行い、これらを感染用アグロバクテリウムとした。
イネ完熟種子を播種して作成した４週目の胚盤カルスを３×１０８　ｃｅｌｌｓ／ｍＬの感染用アグロバクテリウムの懸濁液に３０秒間浸漬した。２日間の感染後、形質転換された細胞の選抜をハイグロマイシンＢで行った。ハイグロマイシンＢによる選抜は、１０ｍｇ／ｍＬで１週間、３０ｍｇ／ｍＬで１週間、５０ｍｇ／ｍＬで２週間行った。再分化誘導は３０ｇ／Ｌスクロース、３０ｇ／Ｌソルビトール、２ｇ／Ｌカゼイン、５ｍＭ　２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、２ｍｇ／Ｌ　α−ナフタレン酢酸、１ｍｇ／ｍＬカイネチン、２５０ｍｇ／ｍＬクラフォラン、５０ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、０．４％ゲランガムを含むＭＳ培地で３週間行った。その後の再分化は３０ｇ／Ｌスクロース、２５０ｍｇ／ｍＬクラフォラン、５０ｍｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、０．８％寒天を含むＭＳ培地で２８℃、１６時間明期、８時間暗期で行った。再分化植物体は市販の人工土壌で栽培し、形質転換イネＩ３ｐ−ＡＰＲＴの種子を得た。
【００３０】
（ｉｉｉ）ＧＵＳ遺伝子挿入の確認
（ｉｉ）において再分化培地から再分化してきたハイグロマイシン耐性再生体を土壌での栽培に移して２週目に、葉の先端をサンプリングした。「新版植物のＰＣＲ実験プロトコール」（細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７、秀潤社）の２−７の方法に従い、葉よりゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことによりＧＵＳ遺伝子のゲノムへの挿入を確認した。
表１に結果を示す。ｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴを導入したカルス１０５個からは再生体が４３個体得られ、これらの再生体４１個体からＧＵＳ遺伝子の存在が確認された。また、比較のためにｐＢＩＧＲＺのみを導入したカルス８２個からは再生体１８個体が得られ、これらの再生体１６個体からＧＵＳ遺伝子の存在が確認された。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳと共に形質転換した場合、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳを含まない場合に比べＧＵＳ遺伝子が導入された再生体の獲得効率（ＧＵＳ遺伝子導入カルス／遺伝子導入処理カルス）が２倍に向上した。用いたＩｄｓ３プロモーターは鉄欠乏状態において持続的に下流遺伝子の発現を上昇させる性質であるが、細胞分裂が盛んなカルスにおいては潜在的な鉄要求状態にあるとしても培地から十分な鉄供給は受けるので、カルス内でのＩｄｓ３プロモーターによるＡＰＲＴ遺伝子の発現は比較的穏やかだったと考えられる。カルス内での発現を大きく増加させるプロモーターを使用した場合、形質転換された再生体獲得により高い効果を示すであろう。
【００３１】
実施例２　（石灰質アルカリ土壌を用いた形質転換イネＩ３ｐ−ＡＰＲＴの生育検定）
実施例１の（ｉｉ）により得られた形質転換イネＩ３ｐ−ＡＰＲＴの種子とベクターのみで形質転換されたコントロールイネの種子は、７０％エタノール、２％の次亜塩素酸の順で表面殺菌した後、ハイグロマイシンＢを５０ｍｇ／ｍＬを含むＭＳ培地上で発芽させた。植物体の草丈が２０ｃｍ以上に生育したところで石灰質アルカリ土壌（貝化石土壌）による土耕を開始した。
この土壌を直径１２ｃｍ、深さ１０ｃｍのビニルポットに詰め、この際に肥料として１ポットあたり１．３ｇの「くみあい微量元素入り被服燐硝安加里ロングトータル３１３−１４０」（旭化成工業株式会社）を加えた。１ポットあたり３個体を植え、対照区（ベクターコントロール）形質転換体は３ライン、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴ区は８ライン８ポットを用意した。ポットはバットにのせ、ポットの底から吸水されるようにバット底から２ｃｍ以下でバットに毎日蒸留水を入れた。栽培はＰ２型天然光人工気象室で行い、昼１４時間３０℃、夜１０時間２５℃であった。生育の度合いはポットごとの最大草丈の測定で検定した。測定は土耕開始後からほぼ週に一度行い、出穂するまで続けた。また実が完熟した後に穂を収穫し、乾燥種籾の重量を測定した。
【００３２】
形質転換イネＩ３ｐ−ＡＰＲＴはハイグロマイシンＢ入りＭＳ培地上での生長がよく、土耕開始以前からｐＢＩＧＲＺのみで形質転換されたコントロールイネよりも大きくなっていた。図４に平均の最大草丈の結果を示す。コントロールイネは土耕開始時（グラフの０週目）には２４ｃｍであり、３週目から５週目には４４−４９ｃｍの大きさで伸長が一時停滞したが、６週目から再び伸長が大きくなり実験の終わりには６３ｃｍまで生長した。一方、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネは０週目に２８ｃｍあり、５週目には７０ｃｍに達した。それ以降もゆるやかに伸長は続き、実験の終わりには７８ｃｍだった。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネの最大草丈は土耕開始時にはすでにコントロールイネよりも４ｃｍ大きくなっており、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネの初期生育の良さが明らかとなった。発芽直後の植物は気候の変動に弱く、また、光合成に不可欠な太陽光を他の植物よりも多く受け取るためには早く生長することが重要である。初期生育の良い作物の作出は雑草と対抗したり、栽培開始直後の天候の急激な変動に応答する上で農業的に有意義である。さらに、初期成育が良好であればその後の生育も促進され得るので、多毛作を行う地域ではより早く次の播種が行えるという意味を持つ。
このように、本発明のＡＰＲＴの発現を増強したイネは産業的に有用である。
【００３３】
表２にアルカリ土壌で育てた形質転換イネの平均種籾収量を示す。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネの乾燥種籾の重量はポット平均で３．３グラムなのに対し、コントロールイネでは１．５７グラムで、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネはコントロールイネに比べて収量が２倍あったことがわかる。
実施例２で使用した石灰質アルカリ土壌は土壌中には十分鉄分を含んでいるものの、高アルカリ性であるために鉄がＦｅ（ＯＨ）３として沈殿しているという特殊な土壌である。そのような土壌では植物は鉄の吸収が十分に行えずに鉄欠乏の症状を示し、深刻な場合は死に至る。世界には石灰質土壌は全陸地面積の２５％も存在する。そこでそのようなアルカリ土壌においても稲作などが可能となれば食糧不足の解消に役立つと考えられている。Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネに使用したＩｄｓ３プロモーターは植物の根が鉄欠乏状態の時に下流の遺伝子発現を上昇させる性質のものであり、石灰質土壌での検定の期間中、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネではＡＰＲＴ遺伝子の発現量が増加していたと考えられる。図４のグラフから明らかなように、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネは確実にコントロールイネよりもよい生育を示しており、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネが鉄欠乏耐性を持ち合わせていることがわかる。さらにＩ３ｐ−ＡＰＲＴイネが鉄欠乏耐性を有していることは、表２に示したように種籾収量が上昇したことにも現れている。
【００３４】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、高等植物へ遺伝子工学的手法により遺伝子導入を行う際に、遺伝子導入が成功した細胞からの植物体再生効率を向上させることができる。　このことにより、遺伝子導入された多数の個体から、目的とした適正な形質転換植物を選抜することができるということで形質転換植物作出効率全体を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、オオムギ根におけるメチオニンサイクルとムギネ酸類（ＭＡｓ）の生合成経路の概要を示すものである。
【図２】図２は、本発明のＡＰＲＴ遺伝子を含むＩ３ｐ−ＡＰＲＴ−ｔＮＯＳの構築のスキームを示すものである。
【図３】図３は、形質転換用ベクターｐＢＩＧＲＺの構造と、本発明のｐＢＩＧＲＺ−ＡＰＲＴの構築の概要を示すものである。
【図４】図４は、Ｉ３ｐ−ＡＰＲＴイネの石灰質アルカリ土壌における生育検定の結果を示すものである。黒丸印はＩ３ｐ−ＡＰＲＴイネを示し、黒三角印はＡＰＲＴを用いないコントロールイネを示す。図４のグラフの横軸は石灰質アルカリ土壌による土耕を開始した後の時間（週）を示し、縦軸は最大草丈（ｃｍ）を示す。
【図１】
2004073011.tif 000004
【図２】
2004073011.tif 000005
【図３】
2004073011.tif 000006
【図４】
2004073011.tif 000007