(57)【要約】【課題】本発明の課題は、ロット間差及び／又はバイアル間差の改善され、品質が改善されたＡＰＴＴ測定試薬を提供することである。【解決手段】ＡＰＴＴ測定試薬調製の最終段階、つまり試薬製造後の検査工程において、ロット間及び／又はバイアル間における測定値の違いを反映しうる検査方法を導入することによる。具体的には、一定の希釈倍率で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いてコントロール血漿のＡＰＴＴを測定する検査方法を導入することによる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一定の希釈倍率で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いてコントロール血漿のＡＰＴＴを測定することを特徴とする該ＡＰＴＴ測定試薬の検査方法。
【請求項２】
希釈倍数が２〜１００倍の範囲から選択される一定の希釈倍率である請求項１に記載のＡＰＴＴ測定試薬の検査方法。
【請求項３】
ＡＰＴＴ測定試薬を含むバイアルを３７℃で１０日加温した後、一定の希釈倍率で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いてコントロール血漿のＡＰＴＴを測定することを特徴とする請求項１又は２に記載のＡＰＴＴ測定試薬の検査方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載のＡＰＴＴ測定試薬の検査方法により検査して得られたＡＰＴＴ測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床検査に用いられる血液凝固能測定用試薬及び血液凝固能の検査用試薬の検査方法に関する。より詳しくは、活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time:以下「ＡＰＴＴ」という。）測定試薬の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＰＴＴの測定は、内因性凝固機序に関係する、凝固第VIII因子、IX因子、XI因子、XII因子等の血液凝固因子の異常を鋭敏に反映し、内因系止血異常のスクリーニングとして必須の検査手段である。
体外診断薬で用いられるＡＰＴＴ測定試薬は、ウサギ、ウシ、ヒトなど動物や植物から得られた粗製リン脂質を主としたＰＴＴ試薬に、カオリン、セライト、エラジン酸を添加した試薬であり、多く市販されている。
【０００３】
ＡＰＴＴ測定試薬の調製は、古くからタンニン酸から誘導させるエラグ酸、カオリン、又はセライト等を活性化剤として用いている。エラグ酸溶液に銅、ニッケル、コバルト類を混合させて活性化する方法が報告されている（米国特許3,486,981、R.E.Speckら、特表平5-506309、R.E.Speckら）。また、銅を用いる方法は、既にP.E.Bockらにより報告されている(Biochemistry,8,7258,1981)。
これらの金属イオンを用いてエラグ酸を活性化させてＡＰＴＴ測定試薬を調製する方法は、溶液での安定性、検体の希釈直線性の面とプレカリクレインに対する反応性で劣ることが問題となっていた。この問題を解決し、検体の希釈直線性や溶液状態での安定性に優れ、プレカリクレインの反応性の高いＡＰＴＴ測定試薬組成物を提供する方法として、アルミニウム化合物を試薬に含有させる方法が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
ＡＰＴＴ測定試薬の品質管理、ＡＰＴＴ分析の質の管理のため等に、ＡＰＴＴ測定の際に血液凝固用コントロール材料が使用されるが、改善されたコントロール材料についても報告されている（特許文献２）。
【０００５】
ＡＰＴＴ測定試薬は、製造元において試薬調製時に性能検査（確認検査）として、血液凝固用コントロール材料のＡＰＴＴの測定を実施する。この測定により、予め設定した規格を満たさないロット又はバイアルについては不合格とすることで、製品として出荷しない。
しかし、確認検査において合格した試薬であっても、実際に臨床検査を行った場合に、ロット間差及び／又はバイアル間差という問題があった。これは、ＡＰＴＴの試薬成分が生物由来であることが原因の一つと考えられる。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−１５６３７９号公報
【特許文献２】
特表２００２−５１９７０３号公報
【０００７】
【解決すべき課題】
本発明の課題は、ロット間差及び／又はバイアル間差の改善され、品質が改善されたＡＰＴＴ測定試薬を提供することである。
【０００８】
【課題を解決する手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ＡＰＴＴ測定試薬調製の最終段階、つまり試薬製造後の検査工程において、ロット間及び／又はバイアル間における測定値の違いを反映しうる検査方法を導入することにより、上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
つまり、本発明は、
１．一定の希釈倍率で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いてコントロール血漿のＡＰＴＴを測定することを特徴とする該ＡＰＴＴ測定試薬の検査方法、
２．希釈倍数が２〜１００倍の範囲から選択される一定の希釈倍率である前項１に記載のＡＰＴＴ測定試薬の検査方法、
３．ＡＰＴＴ測定試薬を含むバイアルを３７℃で１０日加温した後、一定の希釈倍率で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いてコントロール血漿のＡＰＴＴを測定することを特徴とする前項１又は２に記載のＡＰＴＴ測定試薬の検査方法、
４．前項１〜３のいずれか１に記載のＡＰＴＴ測定試薬の検査方法により検査して得られたＡＰＴＴ測定試薬、からなる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の試薬は、広く既知のＡＰＴＴ測定試薬に適用できる。ＡＰＴＴ測定試薬は、ウサギ、ウシ、ヒト等の動物や大豆等の植物を原料とするリン脂質にカオリン、セライト、エラジン酸、アルミニウム等の凝固反応活性化剤を加え、ｐＨ等を調整して調製される。
【００１１】
ＡＰＴＴ測定試薬は有効成分として生物由来の原料を用いていることに加え、凝固時間（ＡＰＴＴ）は試薬中のリン脂質量、リン脂質粒子径、遊離型（非活性型）エラジン酸量などにより影響を受ける。また、試薬バイアルは通常シリコンコーティングされているが、このコーティングが不均一であったり、コーティングの剥離があったりすると、バイアルのガラスに含まれるアルミニウムイオンが溶出して試薬中の遊離型（非活性型）エラジン酸に作用し、凝固時間に影響を及ぼす。その結果、コントロールを用いて測定した場合には、ロット間及び／又はバイアル間において誤差が検出されない場合でも、実際の測定検体を測定した場合にはロット間及び／又はバイアル間において、ＡＰＴＴ測定値が異なる場合が生じる。このように凝固時間に影響を及ぼす要因は多く、ロット間差バイアル間差が発生した場合の原因の特定は容易ではない。
【００１２】
（ＡＰＴＴ測定試薬の品質検査方法）
通常臨床検査において使用されるＡＰＴＴ検査は、市販のＡＰＴＴ測定試薬に添付する説明書に記載の方法に従って行われる。例えば、あらかじめ３７℃に保温した小試験管に血漿0.1mLをとり、約３分加温した後、あらかじめ３７℃に保温したＡＰＴＴ測定試薬0.1mLを加え、軽く振とうし、３７℃で５分間反応させ、ついで20〜25mMの塩化カルシウム液0.1mLを加えると同時にストップウォッチを始動し、フィブリン析出までの時間を測定する方法（臨床検査法提要、1998年、金原出版株式会社発行、第31版、410頁）が挙げられる。
このような検査方法により、正常血漿のＡＰＴＴを測定した場合、通常凝固時間は３０〜４０秒となる。
【００１３】
本発明におけるＡＰＴＴ測定試薬の品質検査は、製造して得られたＡＰＴＴ測定試薬をあらかじめ希釈し、希釈後のＡＰＴＴ測定試薬を用いて、通常品質検査に使用するコントロールのＡＰＴＴ値を測定する希釈ＡＰＴＴ法（ｄＡＰＴＴ法）により行う。
【００１４】
通常は、試薬間のロット間又はバイアル間の測定誤差を軽減させるために、被検試料に対して過剰量のＡＰＴＴ測定試薬有効成分を加えた系で臨床検査を行っている。この系では、コントロールを用いた場合、特にＡＰＴＴ測定試薬ロット間の差が生じにくく、品質検査の段階ではロット間の測定値の変動を予測することが困難であった。
しかし、実際の測定系では、コントロールの系では検出されなかったＡＰＴＴ測定試薬ロット間の誤差が測定値に表れる場合がある。これは、実際の被検試料が異なる個体から採取されることで、個体毎の被検試料含有成分の違いにより、ＡＰＴＴの測定結果に影響を及ぼすことが原因として考えられる。
【００１５】
そこで、ＡＰＴＴ測定試薬の品質検査段階で、ｄＡＰＴＴ法を採用すれば測定感度が上昇することを見出し、ＡＰＴＴ測定試薬のロット間又はバイアル間の測定値のばらつきを予測することができる事を確認した。
【００１６】
（ＡＰＴＴ測定試薬の希釈条件）
本発明の品質検査において希釈するＡＰＴＴ測定試薬の希釈液は、ＡＰＴＴ試薬に含有される成分の機能を害さない溶液であればよく、特に限定されない。例えば、緩衝液はいずれの適当な緩衝液でもよく、好ましくは約６〜８、より好ましくは約７〜８の範囲のｐＨを有する。好ましい緩衝液として、例えば、Ｎ-２-ヒドロキシエチルピペラジン-Ｎ-２-エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、及び、３-(Ｎ-モルホリノ)-プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、ベロナ−ル緩衝液が挙げられ、ベロナ−ル緩衝液が最も好ましい緩衝液である。他の緩衝液の例には、トリス、Ｎ,Ｎ-ビス-(ヒドロキシエチル)-２-アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液、Ｎ-トリス-(ヒドロキシメチル)-メチル-２-アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝液、３-[Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-２-ヒドソキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝液、及び、３-[Ｎ-トリス-(ヒドロキシメチル-メチルアミノ]-プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液等が挙げられる。
【００１７】
本発明のＡＰＴＴ測定試薬の希釈倍数は、希釈したＡＰＴＴ測定試薬を使用して、血漿のＡＰＴＴが測定可能な程度であれば良く、特に制限されないが、例えば２〜１００倍であり、好ましくは２０〜６０倍であり、より好ましくは３０〜４５倍程度である。
【００１８】
（ＡＰＴＴ測定試薬の加温処理）
また、ＡＰＴＴ測定試薬の希釈は、該試薬の保存前または保存後に行うことができるが、好ましくは保存後に行うことができる。該試薬の保存の温度は、２０〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３７℃で行うことができる。また保存日数は、１〜５日、好ましくは３〜１５日、より好ましくは８〜１２日で行うことができる。一般的には、３７℃で１０日保存した後に希釈することができる。試薬バイアルのシリコンコーティングの状態が不良となると、バイアルのガラス中に含まれるアルミニウムイオンが溶出して、試薬中の遊離型エラジン酸に作用を及ぼし、測定系に影響を及ぼすことになる。そこで、３７℃で１０日間保存という過酷な条件でＡＰＴＴ測定試薬を加熱処理することにより、不良なバイアルを多く含むロットを選別し、排除することが可能となる。
【００１９】
（コントロール）
コントロールは、通常ＡＰＴＴ測定に使用されるものであれば良く、特に限定されないが、例えば血液凝固因子を正常量含む血漿が好適に使用される。血漿は、霊長類の血漿及び／又は非霊長類哺乳動物の血漿が挙げられる。
【００２０】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２１】
（実施例１）ＡＰＴＴ測定試薬の調製（１）
ＡＰＴＴ試薬(DADE BEHRING社製)をＡＰＴＴ測定試薬として用いた。該試薬は、ウサギ由来のセファリンを８μL/mL及びエラジン酸を0.0001mol/L含有する。該試薬をオーレンベロナ−ル緩衝液で４０倍に希釈した。
【００２２】
（実施例２）ＡＰＴＴ測定試薬の調製（２）
試薬を充填するバイアルに、ＡＰＴＴ試薬(DADE BEHRING社製)を一定量加え、密栓を施して３７℃の恒温槽中で１０日間置した後、上記と同様に該試薬をオーレンベロナ−ル緩衝液で４０倍に希釈した。
【００２３】
（実施例３）凝固時間検査方法
血漿コントロールを50μLを採取し37℃で60秒間加温した。調製されたＡＰＴＴ測定試薬を50μL混合し、さらに37℃で180秒間加温活性化した。20mM塩化カルシウム液を50μL混合し、凝固時間を測定した。本測定には全自動血液凝固分析装置CA-6000を用いて行った。
【００２４】
（実験例１）ＡＰＴＴ測定試薬ロット間差の測定値の検討
１６種のロットのＡＰＴＴ測定試薬に関し、希釈処理を施さなかった試薬及び実施例１に記載の方法で希釈処理を行った試薬について、実施例３に記載の凝固時間検査方法により血漿コントロールのＡＰＴＴ凝固時間を測定した。
その結果を図１及び図２に示した。図２は示すように、希釈したＡＰＴＴ測定試薬のほうが、ロット間のばらつきが顕著に認められた。
【００２５】
（実験例２）遊離型エラジン酸量の測定
ＡＰＴＴ測定試薬中の遊離型（非活性型）エラジン酸量と凝固時間の関係を調べることを目的として実験を行った。ＡＰＴＴ測定試薬の希釈は、実施例１に記載の方法に従い、凝固時間は実施例３に記載の方法に従った。また、エラジン酸の量は、分光光度計を用いて波長360nmの吸光度を測定した。
その結果、図３に示すように希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いた血漿コントロールの凝固時間及び波長360nmの吸光度の関係は、相関係数0.9728による相関関係が認められた。このことより、凝固時間の測定値から、ＡＰＴＴ測定試薬に含有するエラジン酸量の推定が可能となる。
【００２６】
（実験例３）ヒト検体の凝固時間
採取したヒト血液９容に対し3.2％クエン酸ナトリウム１容を混合して、3000rpmで10分間遠心して、血漿を分取したものをヒト検体とした。
ヒト検体について、ＡＰＴＴ測定試薬及び実施例１に記載の方法で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いて、各々実施例３に記載の方法に従い、ＡＰＴＴ凝固時間を測定した。
その結果、図４に示すように、両試薬を用いた凝固時間は相関係数0.9509による相関関係が認められた。このことより、ヒト検体の凝固時間を希釈したＡＰＴＴ測定試薬で測定した場合も、ＡＰＴＴ凝固時間の推定が可能となる。
【００２７】
（実験例４）第XII因子欠乏血漿の凝固時間
第XII因子欠乏血漿(DADE BEHRING社製)について、ＡＰＴＴ測定試薬及び実施例１に記載の方法で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いて、各々実施例３に記載の方法に従いＡＰＴＴ凝固時間を測定した。
その結果、図５に示すように両試薬を用いた凝固時間は相関係数0.9892による相関関係が認められた。このことより、第XII因子欠乏血漿の凝固時間を希釈したＡＰＴＴ測定試薬で測定した場合も、ＡＰＴＴ凝固時間の推定が可能となる。
【００２８】
（実験例５）血漿コントロールの凝固時間
血漿コントロール(DADE BEHRING社製)について、ＡＰＴＴ測定試薬及び実施例１に記載の方法で希釈したＡＰＴＴ測定試薬を用いて、各々実施例３に記載の方法にＡＰＴＴ凝固時間を測定した。
その結果、図６に示すように、両試薬を用いた凝固時間は相関係数0.8948による相関関係が認められた。このことより、血漿コントロールの凝固時間を希釈したＡＰＴＴ測定試薬で測定した場合も、ＡＰＴＴ凝固時間の推定が可能となる。
【００２９】
（実験例６）試薬バイアルのシリコンコーティングによる凝固時間の検討
血漿コントロール(DADE BEHRING社製)について、実施例２に記載の方法で処理したＡＰＴＴ測定試薬を用いて、実施例３に記載の方法に従い凝固時間を測定した。  その結果、図７に示すようにシリコンコーティングが良品のバイアルに充填されたＡＰＴＴ測定試薬については凝固時間は102秒までの値であったが、シリコンコーティングが不良のバイアルに充填されたＡＰＴＴ測定試薬については凝固時間は106秒以上の値を示した。このことより、ＡＰＴＴ測定試薬が同一ロットであっても、充填用バイアルの違いにより凝固時間の違いが確認され、バイアルの良不良の検査が可能となる。
【００３０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の検査方法により、ＡＰＴＴ測定試薬のロット間の測定結果のばらつきを確認できる他、該試薬中に存在するエラジン酸量の推定が可能となることがわかった。また、ヒト検体、第XII因子欠乏血漿及び血漿コントロールのＡＰＴＴ凝固時間も推定することが可能となった。すなわち、本発明の検査方法を採用することで、製造段階で受入規格に合格するロットを選別することができ、非常に有用である。さらに、本発明の検査方法により、試薬充填用バイアルのシリコンコーティングの良不良によるＡＰＴＴ凝固時間に差が認められたことから、同一ロットのＡＰＴＴ測定試薬を数本検査することにより、シリコンコーティング不良の多いロットをあらかじめ検出することも可能となる。本発明の検査方法によりＡＰＴＴ測定試薬を選別することで、ロット間の凝固時間のばらつき及びロット内での凝固時間のばらつきを抑えた優れたＡＰＴＴ測定試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】希釈処理を施さなかったＡＰＴＴ測定試薬による血漿コントロールの凝固時間を示す図である。（実験例１）
【図２】希釈処理を施したＡＰＴＴ測定試薬による血漿コントロールの凝固時間を示す図である。（実験例１）
【図３】希釈処理を施したＡＰＴＴ測定試薬による血漿コントロールの凝固時間および遊離型エラジン酸量の関係を示す図である。（実験例２）
【図４】希釈処理を施したＡＰＴＴ測定試薬および希釈処理を施さないＡＰＴＴ測定試薬によるヒト検体の凝固時間の関係を示す図である。（実験例３）
【図５】希釈処理を施したＡＰＴＴ測定試薬および希釈処理を施さないＡＰＴＴ測定試薬による第ＸＩＩ因子欠乏血漿の凝固時間の関係を示す図である。（実験例４）
【図６】希釈処理を施したＡＰＴＴ測定試薬および希釈処理を施さないＡＰＴＴ測定試薬による血漿コントロールの凝固時間の関係を示す図である。（実験例５）
【図７】試薬バイアルのシリコンコーティングと凝固時間の関係を示す図である。（実験例６）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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