(57)【要約】【課題】分析における感度や濃度範囲を自由に設定できる特異結合分析方法およびこれに用いるデバイスを提供する。【解決手段】試料が検出部を通過する速度を制御すること、および検出部に不要成分を残留させないことが可能な特異結合分析デバイスを用い、目的とする分析を最適化する。【選択図】　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物を含んだ液状の試料を点着する試料点着部と、前記試料点着部と連結された毛細管現象を呈する空間形成部と、前記空間形成部内において特異結合反応に由来して得られた信号を検出し得る検出部とを具備し、前記点着された前記試料が、毛細管現象により前記空間形成部内の前記検出部に移動して特異結合反応が発生し、当該特異結合反応に由来した信号を検出することで前記分析対象物を定性または定量する特異結合分析デバイスを用い、
前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において、前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を大きくすることを特徴とする特異結合分析方法。
【請求項２】
前記試料が前記検出部を通過する速度を制御することにより、前記特異結合反応が発生している時間を制御することを特徴とする請求項１記載の特異結合分析方法。
【請求項３】
前記空間形成部の外部雰囲気に通じる部分の断面積および距離を制御することにより、前記試料が前記検出部を通過する速度を制御し、前記特異結合反応が発生している時間を制御することを特徴とする請求項２記載の特異結合分析方法。
【請求項４】
前記空間形成部の外部雰囲気に通じる部分に第１の通気性部材を配置することにより、前記試料が前記検出部を通過する速度を制御し、前記特異結合反応が発生している時間を制御することを特徴とする請求項２記載の特異結合分析方法。
【請求項５】
毛細管現象により発現する吸水特性を有する第２の通気性部材を、前記検出部よりも前記試料の移動方向の下流側に配置することにより、毛細管現象による液体輸送力を大きくすることを特徴とする請求項４記載の特異結合分析方法。
【請求項６】
前記分析対象物と特異的に結合しかつ検出可能な標識材により標識された第１の特異結合物質と、前記分析対象物を結合させる工程Ａ、前記分析対象物と特異的に結合しかつ前記検出部に実質的に固定化された第２の特異結合物質と、前記分析対象物を結合させる工程Ｂ、前記検出部で発生し前記標識材に由来して得られた信号の強度を計測する工程Ｃ、および前記工程Ｃにおいて計測された信号の強度に基づいて、前記試料中の分析対象物を定性または定量する工程Ｄを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の特異結合分析方法。
【請求項７】
前記試料点着部に所定容量の前記試料を点着した後、前記工程Ｂにおいて前記第２の特異結合物質と結合しなかった成分を、毛細管現象によって前記空間形成部内の前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側に移動させることを特徴とする請求項６記載の特異結合分析方法。
【請求項８】
前記工程Ｃにおいて、前記第１の特異結合物質と前記第２の特異結合物質とを前記分析対象物を介して結合させることを特徴とする請求項６または７記載の特異結合分析方法。
【請求項９】
前記第１の特異結合物質を、前記試料点着部と前記検出部との間における前記空間形成部の前記試料との接触面上に保持し、前記試料が点着され湿潤状態になることによって、前記第１の特異結合物質を前記接触面で可動化させて前記検出部へ移動させることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の特異結合分析方法。
【請求項１０】
前記信号が呈色、蛍光または発光であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の特異結合分析方法。
【請求項１１】
第１の特異結合物質および第２の特異結合物質の少なくとも一方が抗体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の特異結合分析方法。
【請求項１２】
前記標識材が金属ゾル、染料ゾル、蛍光物質を含んだ粒子または着色ラテックス粒子であることを特徴とする請求項６〜１１のいずれかに記載の特異結合分析方法。
【請求項１３】
分析対象物を含んだ液状の試料を点着する試料点着部と、前記試料点着部と連結された毛細管現象を呈する空間形成部と、前記空間形成部内において特異結合反応に由来して得られた信号を検出し得る検出部とを具備し、前記点着された前記試料が、毛細管現象により前記空間形成部内の前記検出部に移動して特異結合反応が発生し、当該特異結合反応に由来した信号を検出することで前記分析対象物を定性または定量する特異結合分析デバイスであって、
さらに前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を、前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において大きくする手段を具備することを特徴とする特異結合分析デバイス。
【請求項１４】
前記空間形成部の外部雰囲気に通じる部分に配置された第１の通気性部材を具備することを特徴とする請求項１３記載の特異結合分析デバイス。
【請求項１５】
前記手段が、毛細管現象により発現する吸水特性を有し、かつ前記検出部よりも前記試料の移動方向の下流側に配置された第２の通気性部材であることを特徴とする請求項１３または１４記載の特異結合分析デバイス。
【請求項１６】
前記第１の特異結合物質を、前記試料点着部と前記検出部との間における前記空間形成部の前記試料との接触面上に保持し、前記試料が点着され湿潤状態になることによって、前記第１の特異結合物質を前記接触面で可動化させて前記検出部へ移動させることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の特異結合分析デバイス。
【請求項１７】
前記空間形成部が二枚の平板と前記平板の間隔を規定するスペーサとで構成され、前記検出部が前記平板上に設けられ、前記特異結合反応に由来した信号を前記平板を介して検出することを特徴とする請求項１３〜１６のいずれかに記載の特異結合分析デバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の分析対象物の定性または定量分析を行う特異結合分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、家庭内および地域医療の充実や、緊急性の高い臨床検査等の増加に伴い、臨床検査の専門家でなくとも、迅速、簡便かつ正確に計測が実施できる特異結合分析方法の開発がとみに望まれるようになってきた。
特異結合分析方法としては、抗原抗体反応を応用したイムノアッセイ、受容体を用いたレセプターアッセイ、相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを用いた核酸プローブアッセイなど多くの方法が知られている、これらの特異結合分析方法は、その特異性の高さから、臨床検査をはじめとする広い分野で繁用されている。
【０００３】
さらに具体的には、イムノアッセイの１種であるクロマトグラフ分析法が挙げられる。このクロマトグラフ分析法においては、例えば、特異結合物質が不溶化された多孔性担体または微粒子充填型単体からなるマトリクスに液状試料を接触させ、液状試料がマトリクスに沿って毛細管現象による浸透力によって流出することを利用し、試料中の分析対象物の存否を分析する（日本国特許第２５０４９２３号および特許第２６６７７９３号各明細書、ならびに特公平７−７８５０３号、特開平１０−７３５９２号および特開平８−２４０５９１号各公報）。
【０００４】
具体的には、裸眼または光学的方法などにより任意に検知できる標識材によって標識された特異結合物質と分析対象物とを特異結合反応させる。そして、分析対象物と特異結合反応した特異結合物質をマトリクス上に固定化された結合材に結合させ、マトリクス上に固定された標識量に応じて、最終的に試料中の分析対象物の存否を分析するのである。
このクロマトグラフ分析法は、マトリクスにおける担体の表面積が大きいため、多量の特異結合物質を不溶化することができ、特異結合反応を引き起こしうる反応分子間の衝突頻度が液相中における反応の場合に比して大きいため、計測感度および計測時間の面から有利である。
【０００５】
上記の従来のクロマトグラフ分析法では、マトリクスとして、毛細管現象により液体試料を展開輸送可能な吸水性材料を用いることが必要である。この吸水性材料としては、例えばガラス繊維ろ紙、セルロース膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などが挙げられる。これらは、多孔性で１〜５０μｍ程度の孔径を有する孔を持つものが用いられる。
特に、ニトロセルロースは、あらかじめ増感しなくても多量の抗体のような蛋白質と結合する能力を有するため優れている。さらに、種々の孔径を有するニトロセルロースを入手することができるため、これを用いれば試料の流速を選択することも可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記のようなマトリクス材料は繊維状材料からなるが、孔径および表面の親水性を再現性良く制御して生産することが難しい。この孔径の平均値および分布状況、ならびに繊維状表面の親水性は、試料の展開輸送速度、すなわち流速に大きく影響する。特異結合反応が発生している時間はこの流速に大きく依存するため、計測値も流速変化により変動する。すなわち、計測値が、マトリクス材料の特性に非常に敏感に反応するため、計測精度はマトリクス材料の製造精度に依存する。
そして、このマトリクス材料の製造精度を、定量計測の充分な精度を確保するまで向上させることは難しい。したがって、マトリクス材料の選別工程が必要になり、コストがかかるという問題があった。また、孔径の範囲やその製造精度に制限があるため、試料流速の選択幅も限られている。
【０００７】
また、上記に対応して、広い範囲において流速を容易に制御することができ、流速の製造再現性が高い特異結合分析方法およびこれに用いる特異結合分析デバイスが、特願２００１−３２２４４７号明細書に記載されている。しかし、特願２００１−３２２４４７号明細書に開示されている内容では、第２の特異結合物質と結合しなかった成分が検出部に残留することがあり、この残留成分には、標識材が含まれていることがある。したがって、検出部におけるこの残留標識材が、検出信号に重畳されることがあった。すなわち、残留標識材に起因して、検出信号のバックグラウンドが上昇し、この結果、計測のＳ／Ｎが低下することがあった。
【０００８】
そこで、本発明は、流速の制御範囲が広くかつ流速の製造再現性が高く、さらに、検出信号のバックグラウンドの上昇を回避できる特異結合分析方法、およびこれに用いる特異結合分析デバイスを提供することを目的とする。本発明により、試料流速の選択幅を拡大することができ、また製造レベルにおいても流速を高精度に再現できる。さらに、本発明によれば、検出信号のバックグラウンドの上昇を回避できるため、高精度な特異結合分析デバイスを低コストで実現することができる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するために、本発明は、分析対象物を含んだ液状の試料を点着する試料点着部と、前記試料点着部と連結された毛細管現象を呈する空間形成部と、前記空間形成部内において特異結合反応に由来して得られた信号を検出し得る検出部とを具備し、前記点着された前記試料が、毛細管現象により前記空間形成部内の前記検出部に移動して特異結合反応が発生し、当該特異結合反応に由来した信号を検出することで前記分析対象物を定性または定量する特異結合分析デバイスを用い、前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において、前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を大きくすることを特徴とする特異結合分析方法を提供する。
【００１０】
前記特異結合分析方法においては、前記試料が前記検出部を通過する速度を制御することにより、前記特異結合反応が発生している時間を制御するのが好ましい。
また、前記空間形成部の外部雰囲気に通じる部分の断面積および距離を制御することにより、前記試料が前記検出部を通過する速度を制御し、前記特異結合反応が発生している時間を制御するのが好ましい。
また、前記空間形成部の外部雰囲気に通じる部分に第１の通気性部材を配置することにより、前記試料が前記検出部を通過する速度を制御し、前記特異結合反応が発生している時間を制御するのが好ましい。
なお、「空間形成部の外部雰囲気に通じる部分」とは、空間形成部において、試料点着部以外の部分であって、かつ試料が毛細管現象で輸送されるときに押し出される空気が通過できるような位置に相当する部分をいう。
【００１１】
また、毛細管現象により発現する吸水特性を有する第２の通気性部材を、前記検出部よりも前記試料の移動方向の下流側に配置することにより、毛細管現象による液体輸送力を大きくするのが好ましい。
さらに、前記特異結合分析方法は、前記分析対象物と特異的に結合しかつ検出可能な標識材により標識された第１の特異結合物質と、前記分析対象物を結合させる工程Ａ、前記分析対象物と特異的に結合しかつ前記検出部に実質的に固定化された第２の特異結合物質と、前記分析対象物を結合させる工程Ｂ、前記検出部で発生し前記標識材に由来して得られた信号の強度を計測する工程Ｃ、および前記工程Ｃにおいて計測された信号の強度に基づいて、前記試料中の分析対象物を定性または定量する工程Ｄを有するのが好ましい。
【００１２】
また、前記試料点着部に所定容量の前記試料を点着した後、前記工程Ｂにおいて前記第２の特異結合物質と結合しなかった成分を、毛細管現象によって前記空間形成部内の前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側に移動させるのが好ましい。
また、前記工程Ｃにおいて、前記第１の特異結合物質と前記第２の特異結合物質とを前記分析対象物を介して結合させるのが好ましい。
【００１３】
前記第１の特異結合物質を、前記試料点着部と前記検出部との間における前記空間形成部の前記試料との接触面上に保持し、前記試料が点着され湿潤状態になることによって、前記第１の特異結合物質を前記接触面で可動化させて前記検出部へ移動させるのが好ましい。
前記信号は呈色、蛍光または発光であるのが好ましく、前記第１の特異結合物質および第２の特異結合物質の少なくとも一方が抗体であるのが好ましい。また、前記標識材が金属ゾル、染料ゾル、蛍光物質を含んだ粒子または着色ラテックス粒子であるのが好ましい。
【００１４】
さらに、本発明は、分析対象物を含んだ液状の試料を点着する試料点着部と、前記試料点着部と連結された毛細管現象を呈する空間形成部と、前記空間形成部内において特異結合反応に由来して得られた信号を検出し得る検出部とを具備し、前記点着された前記試料が、毛細管現象により前記空間形成部内の前記検出部に移動して特異結合反応が発生し、当該特異結合反応に由来した信号を検出することで前記分析対象物を定性または定量する特異結合分析デバイスであって、さらに前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を、前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において大きくする手段を具備することを特徴とする特異結合分析デバイスに関する。
【００１５】
前記特異結合分析デバイスは、前記空間形成部の外部雰囲気に通じる部分に配置された第１の通気性部材を具備するのが好ましい。
また、前記手段は、毛細管現象により発現する吸水特性を有し、かつ前記検出部よりも前記試料の移動方向の下流側において配置された第２の通気性部材であるのが好ましい。
【００１６】
また、前記特異結合分析デバイスにおいては、前記第１の特異結合物質を、前記試料点着部と前記検出部との間における前記空間形成部の前記試料との接触面上に保持し、前記試料が点着され湿潤状態になることによって、前記第１の特異結合物質を前記接触面で可動化させて前記検出部へ移動させることが有効である。
【００１７】
また、前記空間形成部が二枚の平板と前記平板の間隔を規定するスペーサとで構成され、前記検出部が前記平板上に設けられ、前記特異結合反応に由来した信号を前記平板を介して検出することが有効である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、分析対象物を含んだ液状の試料を点着する試料点着部と、前記試料点着部と連結された毛細管現象を呈する空間形成部と、前記空間形成部内において特異結合反応に由来して得られた信号を検出し得る検出部とを具備し、前記点着された前記試料が、毛細管現象により前記空間形成部内の前記検出部に移動して特異結合反応が発生し、当該特異結合反応に由来した信号を検出することで前記分析対象物を定性または定量する特異結合分析デバイスを用い、
前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において、前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を大きくすることを特徴とする特異結合分析方法に関する。
【００１９】
ここで、液体輸送力とは、毛細管現象により液体を輸送する能力を意味する。液体輸送力が大きいということは、空間形成部の液体と接触する面の親水性が高くかつ液体の保持量が大きいということである。したがって、前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において、前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を大きくすると、前記検出部に液体が到達すると、全液体が下流側に輸送される。ただし、点着された前記試料の量が、下流側液体の保持量以下であることが必要である。
【００２０】
さらに、本発明は、かかる特異結合分析方法に用いる特異結合分析デバイスにも関する。この特異結合分析デバイスは、分析対象物を含んだ液状の試料を点着する試料点着部と、前記試料点着部と連結された毛細管現象を呈する空間形成部と、前記空間形成部内において特異結合反応に由来して得られた信号を検出し得る検出部とを具備し、前記点着された前記試料が、毛細管現象により前記空間形成部内の前記検出部に移動して特異結合反応が発生し、当該特異結合反応に由来した信号を検出することで前記分析対象物を定性または定量する特異結合分析デバイスであって、さらに前記空間形成部で呈する毛細管現象による液体輸送力を、前記検出部よりも前記試料の移動方向における下流側において大きくする手段を具備することを特徴とする。
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る特異結合分析デバイスの構成を示す概略断面図である。また、図２は、図１に示すＺ方向から見た前記特異結合分析デバイスの概略図である。
このデバイスは、例えば内径（ｄ１）が５ｍｍ、長さ（Ｌ）が３０ｍｍの空間形成部を構成するガラス製の第１の毛細管１、および内径（ｄ２）が０．５ｍｍ、長さ（Ｌ２）が３ｍｍ、外径が約５ｍｍの通気抵抗制御手段としての役割を果たすガラス製の第２の毛細管２で構成されている。
【００２２】
図１に示すように、第２の毛細管２は第１の毛細管１の管内に挿入されている。ここで、第２の毛細管２の外側面と第１の毛細管１の内側面は密着しており、実質的に空気はこの間を透過できない。第２の毛細管２と第１の毛細管１とは、例えば接着剤で密着して接合されている。
第１の毛細管１の内部には検出部３が設けられており、この検出部３は、結合材として第２の特異結合物質が第１の毛細管１の内壁に固定化されて形成されている。また、この検出部３は、第１の毛細管１の開口部４（第２の毛細管２が挿入されていない側）からの距離（Ｚ１）約２ｍｍの部分に位置しており、Ｚ方向における検出部３の長さは約１ｍｍである。なお、Ｚ１は、開口部４の端部から検出部３の中心までの距離を示している。
【００２３】
また、第１の毛細管１の内部には、ガラス繊維濾紙ＧＡ２００（東洋株式会社製）を直径５ｍｍ、長さ（Ｌ２）２０ｍｍの寸法に加工して得た通気性部材である吸水性部材５が挿入されている。吸水性部材５の一端は、第１の毛細管１内の開口部４より距離（Ｚ２）約３ｍｍの部分に位置しており、検出部３に接している。本実施の形態においては、開口部４が試料点着部としての役割を果たす。
【００２４】
図１に示す特異結合分析デバイスを、開口部４を下に向け、かつ前記デバイスの長さ方向が水平方向に対して実質的に垂直になるように配置し、開口部４を試料の表面に接触させる。そうすると、試料の液面が毛細管現象によりＺ方向へ移動する。すなわち、試料の液面が上昇する。このとき、試料の表面張力の鉛直方向成分と、上昇した試料の柱に働く重力とが釣り合うまで、試料の液面が移動（上昇）する。
【００２５】
図１に示す特異結合分析デバイスから第２の毛細管２および吸水性部材５を取り除き、通常の大気圧および室温の雰囲気で、試料として尿などの水溶液を用いた場合、試料の液面の移動（上昇）距離Ｚは約６ｍｍであった。このとき、液面は約２〜３秒間で６ｍｍ移動して静止した。
しかし、図１に示すデバイスから吸水性部材５のみを除き、通常の大気圧および室温の雰囲気で、試料として尿などの水溶液を用いた場合、移動（上昇）距離Ｚは約６ｍｍであった。このとき、液面は、約３０秒間で６ｍｍ移動して静止した。これは、以下の理由からである。
【００２６】
毛細管現象により試料が上に移動するのに伴って、空気は試料に押されるため空気も移動する。ここで、第１の毛細管１の開口部４の反対側が完全に封止されていれば、空気が圧縮されるため圧力が上昇する。そして、この圧縮された空気の圧力と大気圧との差、すなわち上昇した圧力分がさらに重力に加わるため、試料は６ｍｍも上昇せずに静止する。ところが、第１の毛細管１の開口部４の反対側が完全には封止されていなければ、試料の移動により圧縮された空気は徐々に抜けるため、最終的には大気圧と平衡状態になり、試料は６ｍｍ上昇して静止する。
【００２７】
ただし、静止するまでの時間は、第１の毛細管１の開口部４の反対側が完全に開放されている場合（第２の毛細管２が無い状態）に比べると増加する。換言すると、試料の移動速度は低下する。この移動速度の低下度合いは、第１の毛細管１の開口部４の反対側の通気抵抗に依存する。この通気抵抗は第２の毛細管２の有無で変化するため、移動速度も第２の毛細管２の有無で変化する。具体的には、第２の毛細管２が無い場合は、ある場合に比べると通気抵抗が低下し、移動速度が増加する。
【００２８】
これらのことから、第１の毛細管１の開口部４の反対側の通気抵抗を制御することで、試料の移動速度を制御できることがわかる。ここで、第２の毛細管２の内径（ｄ２）が小さいほど、換言すると内部空間（空間形成部）の断面積が小さいほど通気抵抗が大きくなり、第２の毛細管２の長さが長いほど通気抵抗が大きくなる。例えば、第２の毛細管２の内径（ｄ２）が１．０ｍｍ、長さ（Ｌ）が３ｍｍの場合は、７〜１０秒間で６ｍｍ上昇して静止した。また、第２の毛細管２の内径（ｄ２）が０．５ｍｍ、長さ（Ｌ）が２ｍｍの場合は、２０〜２５秒間で６ｍｍ上昇して静止した。
【００２９】
上述した移動速度は、吸水性部材５が無い場合の移動速度である。吸水性部材５を挿入すると当然通気抵抗が大きくなるため、第２の毛細管２の有無、第２の毛細管２の内径および長さが上記と同一条件であっても、移動速度は上記よりも小さくなる。ただし、図１に示すような配置を採用した場合は、吸水性部材５の一端が、第１の毛細管１内の開口部４より距離（Ｚ２）約３ｍｍの部分に位置しているため、試料の液面は、６ｍｍ上昇する前に、吸水性部材５の一端に到達する。そして、試料は吸水性部材５に吸収される。
【００３０】
つぎに、試料点着部に点着される試料の容量について述べる。試料の容量が、液面が６ｍｍ上昇するのに必要な容量以上である場合は、液面が吸水性部材５の一端に到達するので、これに吸収される。ここで、検出部３上にある第２の特異結合物質に結合しなかった成分すべてを吸水性部材５に吸収させ、検出部３に残留させないようにする必要がある。したがって、試料点着部に点着される試料の容量は、吸水性部材５に吸水され得る試料の最大容量以下である必要がある。
【００３１】
具体的には、上記構造の吸水性部材５が吸水し得る試料の最大容量は約０．２ｍｌ以上であった。また、試料の液面を６ｍｍ上昇させるのに必要な前記試料の容量は約０．１２ｍｌであった。したがって、試料の容量が０．１２〜０．２ｍｌの範囲であれば、検出部３上にある第２の特異結合物質に結合しなかった試料中の成分すべてを、吸水性部材５に吸収させて、検出部３に残留させないことができた。一般的に述べると、毛細管現象により移動する試料の液面が到達しうる位置に吸水性部材５の一端（下端）を配置し、同時に点着する試料の容量が、吸水性部材５の下端に到達し得る容量以上で、かつ吸水性部材５が吸水し得る最大容量以下であてばよい。
【００３２】
以上のように、第１の毛細管１の開口部４の反対側の通気抵抗を制御することで、試料が検出部３を通過する速度を制御し、特異結合反応が発生している時間を制御することができる。したがって、特異結合反応の反応を反映する信号強度も制御することができ、分析における感度や濃度範囲を自由に設定することができる。さらに、第１の毛細管１内で呈する毛細管現象による液体輸送力を、検出部よりも試料の移動方向における下流側で、吸水性部材５の存在により大きくすることができる。そのため、第２の特異結合物質と結合しなかった成分が検出部に残留することがなく、検出信号のバックグラウンドが上昇することを回避することができ、信号のＳ／Ｎの低下を防止することができる。なお、上記した数値は、開口部４を下に向け、かつ前記デバイスの長さ方向が水平方向に対して実質的に垂直になるように配置した場合に得られる。これ以外の配置の場合は、上記の数値は異なるが、当業者であれば実験的に適宜選択し得る。
【００３３】
また、開口部４の反対側の通気抵抗を、吸水性部材５自身の通気抵抗によって制御することで、移動速度を制御することもできる。ここでは、必要な吸水能力を確保した上で、ガラス繊維濾紙ＧＡ２００の密度および長さなどを制御することで、通気抵抗を制御することができる。すなわち、吸水性部材５に吸水効果と通気抵抗制御効果を発揮させることで、実現することができる。
以下に、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
《実施例１および比較例１》
本実施例では、上述した図１に示す本発明に係る特異結合分析デバイスを用い、分析対象物として尿中のヒト絨毛性性線刺激ホルモン（ｈＣＧ）を分析した。第１の特異結合物質および第２の特異結合物質としては、ｈＣＧとのサンドイッチ反応に参加し得る抗ｈＣＧモノクローナル抗体を用い、標識材としては金コロイドを用いた。ここで、金コロイドのような着色粒子を用いる場合、着色粒子が微細なため、標識を小さな区域または容積の中に集中させることが可能であり、検出部３において第１の特異結合物質の標識材である金コロイドが寄与する反応に由来する信号を用いてｈＣＧの定性または定量を正確に行うことができた。また、第１の毛細管１にスキムミルクの分散水溶液を通すことによってその内壁をブロッキングした。
【００３５】
まず、尿と金コロイドで標識された抗ｈＣＧモノクローナル抗体との混合溶液を調製し、この混合溶液を試料とした。この状態の試料中では、分析対象物であるｈＣＧとが金コロイドで標識された抗ｈＣＧモノクローナル抗体と結合していた。この試料を試料点着部である開口部４に約０．１５ｍｌ点着したところ、試料は毛細管現象により上昇し検出部３を通過した。そして、約１分経過後には、見かけ上、液体成分すべて吸水性部材５に吸収され検出部３上には液体成分は残留しなかった。
【００３６】
このとき、点着された試料中の分析対象物は、第２の特異結合物質と特異結合した。これにより、分析対象物は、第２の特異結合物質を介して検出部３に固定された。すなわち、金コロイドで標識された第１の特異結合物質である抗ｈＣＧモノクローナル抗体は、分析対象物ｈＣＧを介して検出部３に固定化された第２の特異結合物質である抗ｈＣＧモノクローナル抗体と結合した。これにより検出部３において、分析対象物ｈＣＧの濃度に応じて発色した。ここで、検出部３上には、第２の特異結合物質と特異結合しなかった金コロイド成分が残留しなかったため、吸水性部材５が存在しない場合に比べて、コントラストは遥かに大きかった。
【００３７】
ｈＣＧ濃度が実質的にゼロである精度管理用のコントロール尿に、ｈＣＧを添加して種々の濃度の試料を調製した。これらの各試料を用い、上述のような原理に基づいて検出部３における金コロイドによる発色度合いを確認した。各試料のｈＣＧ濃度は、それぞれ０（ＩＵ／Ｌ）、３（ＩＵ／Ｌ）、１０（ＩＵ／Ｌ）、３０（ＩＵ／Ｌ）、１００（ＩＵ／Ｌ）、３００（ＩＵ／Ｌ）、１０００（ＩＵ／Ｌ）、３０００（ＩＵ／Ｌ）および１００００（ＩＵ／Ｌ）であった。その結果、１０（ＩＵ／Ｌ）以上のｈＣＧ濃度を有する試料を用いると発色を確認することができた。
【００３８】
つぎに、吸水性部材５を省略した場合についても、同様に実験を行った。この場合は、試料が毛細管現象によって上昇し、試料の上面が約３０〜３５秒間で約５ｍｍ移動して静止した。そして、３００（ＩＵ／Ｌ）以上のｈＣＧ濃度を有する試料を用いると発色を確認することができた。
さらに、吸水性部材５および第２の毛細管２を省略した場合についても、同様に実験を行った。この場合は、試料が毛細管現象によって上昇し、試料の上面が約２〜３秒間で約５ｍｍ移動して静止した。そして、１００００（ＩＵ／Ｌ）のｈＣＧの濃度を有する試料を用いた場合のみ発色を確認できた。
【００３９】
以上、説明したように、本発明に係る特異結合分析デバイスによると、第１の毛細管１の開口部４の反対側の通気抵抗を制御することで、試料が検出部３を通過する速度を制御することがでた。さらに、第１の毛細管１内で呈する毛細管現象による液体輸送力を、検出部よりも試料の移動方向における下流側で、吸水性部材５の存在により大きくすることができた。そのため、第２の特異結合物質と結合しなかった成分が検出部に残留せず、検出信号のバックグラウンドが上昇することを回避でき、信号のＳ／Ｎの低下を防止することができた。これらにより信号強度の制御と、信号のＳ／Ｎの向上による最小検出濃度を向上させることができた。
【００４０】
なお、本実施例では、点着前に金コロイドで標識された第１の特異結合物質と尿とを混合したが、当該第１の特異結合物質を、試料点着部である開口部４と検出部３との間に乾燥状態で保持させてもよい。これにより、尿をそのまま開口部４に点着して分析することができる。この場合、液体試料である尿により、乾燥状態で保持された第１の特異結合物質が湿潤状態になって自由に移動することができ、分析対象物と第１の特異結合物質とが結合した状態で、検出部３に移動し、同様に濃度に応じた発色をさせることができる。
【００４１】
《実施例２》
つぎに、図３に示す本発明に係る特異結合分析デバイスを用い、分析対象物として尿中のヒト絨毛性性線刺激ホルモン（ｈＣＧ）を分析した。図３に、本発明の別の実施の形態に係る特異結合分析デバイスの構成を示す概略断面図を示した。また、図４に、図３に示すＺ方向から見た前記特異結合分析デバイスの概略図を示した。
図３において、第１の毛細管１、検出部３および試料点着部である開口部４は、図１のものと同じとした。ただし、第２の毛細管２は存在せず、吸水性部材５の長さＬ１を変化させ、通気抵抗を制御した。言い換えると、吸水性部材に通気性部材としての機能も発揮させた。
【００４２】
本実施例においては、実施例１と同様にガラス繊維濾紙ＧＡ２００（東洋株式会社製）を直径５ｍｍ、長さ（Ｌ２）２０ｍｍの寸法に加工して得た吸水性部材５と、直径５ｍｍ、長さ２５ｍｍの寸法に加工し得た吸水性部材５’を用いた。これ以外は実施例１で用いた特異結合分析デバイスと同じ構成を採用した。吸水性部材５’は吸水性部材５よりも体積が大きいため、その吸水能力および通気抵抗も吸水性部材５よりも大きかった。
【００４３】
まず、吸水性部材５を用いた図３および４に示すデバイスで、本実施例においても、実施例１と同様に尿と金コロイドで標識された抗ｈＣＧモノクローナル抗体との混合溶液を調製し、この混合溶液を試料として開口部４に点着した。この試料を試料点着部である開口部４に約０．１５ｍｌ点着したところ、試料は毛細管現象により上昇し検出部３を通過した。そして、約３０〜４０秒経過後には、見かけ上、液体成分すべて吸水性部材５に吸収され検出部３上には液体成分は残留しなかった。
【００４４】
また、実施例１と同様にして、ｈＣＧ濃度が実質的にゼロである精度管理用のコントロール尿にｈＣＧを添加して種々の濃度の試料を調製し、検出部３における金コロイドによる発色度合いを確認した。各試料のｈＣＧ濃度は、それぞれ０（ＩＵ／Ｌ）、３（ＩＵ／Ｌ）、１０（ＩＵ／Ｌ）、３０（ＩＵ／Ｌ）、１００（ＩＵ／Ｌ）、３００（ＩＵ／Ｌ）、１０００（ＩＵ／Ｌ）、３０００（ＩＵ／Ｌ）および１００００（ＩＵ／Ｌ）とした。その結果、３０（ＩＵ／Ｌ）以上のｈＣＧ濃度を有する試料を用いた場合は発色を確認することができた。
【００４５】
つぎに、長さを変化させた吸水性部材５’を用いた図３および４に示すデバイスで、上記と同様に試料を試料点着部である開口部４に約０．１５ｍｌ点着した。試料は毛細管現象により上昇し検出部３を通過した。そして、約５０〜６０秒経過後には、見かけ上、液体成分すべて吸水性部材５に吸収され検出部３上には液体成分は残留しなかった。さらに、上記と同様にして、ｈＣＧ濃度が実質的にゼロである精度管理用のコントロール尿にｈＣＧを添加して種々の濃度の試料を調製し、検出部３における金コロイドによる発色度合いを確認した。
【００４６】
各試料のｈＣＧ濃度は、それぞれ０（ＩＵ／Ｌ）、３（ＩＵ／Ｌ）、１０（ＩＵ／Ｌ）、３０（ＩＵ／Ｌ）、１００（ＩＵ／Ｌ）、３００（ＩＵ／Ｌ）、１０００（ＩＵ／Ｌ）、３０００（ＩＵ／Ｌ）および１００００（ＩＵ／Ｌ）とした。その結果、１０（ＩＵ／Ｌ）以上のｈＣＧ濃度を有する試料を用いた場合は発色を確認することができた。
以上のように、吸水性部材５の長さを変化させることにより、通気抵抗を変化させ、移動速度を制御することができ、各濃度に対する発色度合いを調整することができた。
【００４７】
以上、説明したように、本実施例に係る特異結合分析デバイスによれば、ガラス製の第１の毛細管１の開口部４の反対側の通気抵抗を吸水性部材で制御することで、信号強度も制御することができた。ここでは、必要な吸水能力を確保した上で、ガラス繊維濾紙ＧＡ２００の密度、長さ等を制御することで、通気抵抗を制御することができる。即ち、吸水性部材５に吸水効果と通気抵抗制御効果を発揮させることで、実現することができた。
【００４８】
《実施例３》
本実施例においては、図５および６に示す特異結合分析デバイスを用いた。図５に、本発明に係る別の特異結合分析デバイスの分解斜視図を示した。図５に示すように、本特異結合分析デバイスは、ガラスまたは樹脂で構成された基板６、ガラスまたは樹脂または金属などで構成されたスペーサー７および８（ｘ方向の厚みは５０μｍ程度）、ガラス繊維濾紙ＧＡ２００（東洋株式会社製）で構成された吸水性部材９（ｘ方向の厚みは５０μｍ程度）、ならびにガラスまたは樹脂からなる透明基板１０を用いて作製した。また、基板６上には、第２の特異結合物質であるｈＣＧとのサンドイッチ反応に参加し得る抗ｈＣＧモノクローナル抗体を固定化して検出部１１を形成した。
【００４９】
図６に、図５に示す特異結合分析デバイスの合体斜視図を示した。図６に示すように、透明基板１０を、スペーサー７および８を介して基板６と重ねた。これによって、基板６、スペーサー７および８ならびに透明基板１０で、内部に空間形成部を構成した。そして、同時にこの空間形成部へ試料を導入することができる試料点着部１２を構成できた。なお、本デバイスでは、通気抵抗は、スペーサー７および８の厚さ（ｘ方向）、吸水性部材９を構成するガラス繊維濾紙の密度、吸水性部材９とスペーサー７および８との隙間（ｙ方向）、または前記隙間の長さ（ｚ方向）を調整することによって制御することができた。
【００５０】
本実施例では、図５および６に示す本発明に係る特異結合分析デバイスを用い、分析対象物として尿中のヒト絨毛性性線刺激ホルモン（ｈＣＧ）を分析した。第１の特異結合物質および第２の特異結合物質としては、ｈＣＧとのサンドイッチ反応に参加し得る抗ｈＣＧモノクローナル抗体を用い、標識材としては蛍光ラッテクス用いた。本実施例では、反射吸光分光計を用い、検出部の第２の特異結合物質と特異結合した蛍光ラテックスによる蛍光強度を計測し、ｈＣＧの定量を正確に行うことができた。具体的には、検出部１１に、本蛍光ラテックスの励起波長に相当する光を照射し、検出部１１で発生した蛍光波長に相当する光のみを分光して計測した。
また、検出部１１を作成した後、基板６および透明基板１０で構成された空間形成部の内壁にスキムミルクの分散水溶液を塗布し、乾燥することによって前記内壁をブロッキングした。
【００５１】
まず、尿と金コロイドで標識された抗ｈＣＧモノクローナル抗体との混合溶液を調製し、この混合溶液を試料とした。この状態の試料中では、分析対象物であるｈＣＧとが金コロイドで標識された抗ｈＣＧモノクローナル抗体と結合していた。この試料を試料点着部である開口部４に所定容量点着した。この所定容量とは、毛細管現象で吸水性部材９の一端に到達し得る容量以上の容量であり、吸水性部材９が吸水し得る最大容量以下とした。ただし、定量性を確保するためには、毎回同一容量を点着する必要があった。点着後、試料は毛細管現象により上昇し検出部１１を通過した。そして、約５分経過後には、見かけ上、液体成分すべて吸水性部材９に吸収され検出部１１上には液体成分は残留しなかった。
【００５２】
このとき、点着された試料中の分析対象物は、第２の特異結合物質と特異結合した。これにより、分析対象物は、第２の特異結合物質を介して検出部３に固定された。すなわち、蛍光ラッテクスで標識された第１の特異結合物質である抗ｈＣＧモノクローナル抗体は、分析対象物ｈＣＧを介して検出部３に固定化された第２の特異結合物質である抗ｈＣＧモノクローナル抗体と結合した。これにより検出部３において、分析対象物ｈＣＧの濃度に応じた蛍光を発した。ここで、検出部１１上には、第２の特異結合物質と特異結合しなかった蛍光ラッテクスが残留しなかったため、吸水性部材９が存在しない場合に比べて、バックグラウンドは、大幅に低下した。
【００５３】
ｈＣＧ濃度が実質的にゼロである精度管理用のコントロール尿に、ｈＣＧを添加して種々の濃度の試料を調製し、上述のような原理に基づいて検出部１１における蛍光ラッテクスによる蛍光強度を計測した。各試料のｈＣＧ濃度は、それぞれ０（ＩＵ／Ｌ）、３（ＩＵ／Ｌ）、１０（ＩＵ／Ｌ）、３０（ＩＵ／Ｌ）、１００（ＩＵ／Ｌ）、３００（ＩＵ／Ｌ）、１０００（ＩＵ／Ｌ）、３０００（ＩＵ／Ｌ）および１００００（ＩＵ／Ｌ）であった。その結果、１０（ＩＵ／Ｌ）以上のｈＣＧ濃度を有する試料で蛍光を確認でき、かつこの蛍光強度の直線性は１０００（ＩＵ／Ｌ）まで確認できた。すなわち、１０（ＩＵ／Ｌ）から１０００（ＩＵ／Ｌ）までの定量性を確認できた。
この定量特性は、通気抵抗を調整することで、制御することができた。すなわち、最低検出濃度や、直線性を示す最高濃度を制御することができた。
【００５４】
以上、説明したように、本実施の形態による特異結合分析デバイスによると、試料点着部１２の反対側の通気抵抗を制御することで、試料が検出部１１を通過する速度を制御することができた。さらに、空間形成部内で呈する毛細管現象による液体輸送力を、検出部１１よりも試料の移動方向側で、吸水性部材９の存在により大きくする吸水性部材９の効果で、第２の特異結合物質と結合しなかった成分が検出部に残留することがないため、検出信号のバックグラウンド低減でき、信号のＳ／Ｎが向上した。これらにより定量性の制御と、信号のＳ／Ｎの向上による最小検出濃度を向上させることができた。
【００５５】
なお、本実施例では、点着前に標識された第１の特異結合物質と尿とを混合していたが、当該第１の特異結合物質を、試料点着部１２と検出部１１との間に乾燥状態で保持させてもよい。これにより、尿をそのまま試料点着部１２に点着して分析することができる。この場合、液体試料である尿により、乾燥状態で保持された第１の特異結合物質が湿潤状態になって自由に移動することができ、分析対象物と第１の特異結合物質とが結合した状態で、検出部１１に移動し、同様に濃度に応じた蛍光を発生させることができる。
以上、説明したように、本実施例に係る特異結合分析デバイスによると、分析における感度や濃度範囲を自由に設定することができた。
【００５６】
【発明の効果】
以上のように、本発明の特異結合分析方法およびこれに用いるデバイスによれば、試料が検出部を通過する速度を制御することができ、さらに、検出部に第２の特異結合物質により固定化されなかった成分が残留しにくいため感度や濃度範囲を自由に設定することができ、感度も向上した。これらにより、本発明は実用上極めて有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態に係る特異結合分析デバイスの構成を示す概略断面図である。
【図２】図１に示すＺ方向から見た前記特異結合分析デバイスの概略図である。
【図３】本発明の別の実施の形態に係る特異結合分析デバイスの構成を示す概略断面図である。
【図４】図３に示すＺ方向から見た前記特異結合分析デバイスの概略図である。
【図５】本発明のさらに別の実施の形態に係る特異結合分析デバイスの分解斜視図である。
【図６】図５に示す特異結合分析デバイスの合体斜視図である。
【符号の説明】
１　　第１の毛細管
２　　第２の毛細管
３　　検出部
４　　開口部
５　　吸水性部材
【図１】
2004003976.tif 000003
【図２】
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【図３】
2004003976.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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