(57)【要約】【課題】ポリ乳酸等の生体吸収性ポリマー材料に細胞接着性の−ＲＧＤ基を固定した細胞接着性生体吸収材料、人工血管及びそれらの製造方法の提供。【解決手段】生体吸収性ポリマー材料からなる基体１０の表面に構造式（１）【化１】2004159849.tif 000008で示される−ＲＧＤ基が固定されたことを特徴とする細胞接着性生体吸収材料１１、該細胞接着性生体吸収材料で作られた人工血管、およびそれらの製造方法を提供する。【選択図】  図１
2004159849.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性ポリマー材料からなる基体の表面に構造式（１）
【化１】
2004159849.tif 000005
で示される−ＲＧＤ基が固定されたことを特徴とする細胞接着性生体吸収材料。
【請求項２】
前記−ＲＧＤ基が、前記基体の表面の１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの濃度で存在する請求項１記載の細胞接着性生体吸収材料。
【請求項３】
前記生体吸収性ポリマー材料が、ポリ乳酸、ポリリシンおよびポリ乳酸・グリコール酸からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１または２記載の細胞接着性生体吸収材料。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞接着性生体吸収材料からなる中空糸または管を含むことを特徴とする人工血管。
【請求項５】
構造式（１）
【化２】
2004159849.tif 000006
で示される−ＲＧＤ基と不飽和アシル基とを結合させて不飽和アシル化ペプチドを含む溶液を形成する工程と、
生体吸収性ポリマー材料からなる基体にプラズマを照射して表面活性化基体を形成する工程と、
前記表面活性化基体と、前記不飽和アシル化ペプチドを含む溶液とを接触させ、該基体の表面に−ＲＧＤ基が固定された細胞接着性生体吸収材料を得る工程とを含むことを特徴とする細胞接着性生体吸収材料の製造方法。
【請求項６】
前記−ＲＧＤ基が、前記基体の表面の１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの濃度で存在する請求項５記載の細胞接着性生体吸収材料の製造方法。
【請求項７】
前記生体吸収性ポリマー材料が、ポリ乳酸、ポリリシンおよびポリ乳酸・グリコール酸からなる群から選択される少なくとも１種である請求項５または６記載の細胞接着性生体吸収材料の製造方法。
【請求項８】
構造式（１）
【化３】
2004159849.tif 000007
で示される−ＲＧＤ基と不飽和アシルとを結合させて不飽和アシル化ペプチドを含む溶液を形成する工程と、
生体吸収性ポリマー材料からなる中空糸または管状の中空基体にプラズマを照射して表面活性化中空基体を形成する工程と、
前記表面活性化中空基体と、前記不飽和アシル化ペプチドを含む溶液とを接触させ、該中空基体の表面に−ＲＧＤ基が固定された人工血管を得る工程とを含むことを特徴とする人工血管の製造方法。
【請求項９】
前記−ＲＧＤ基が、前記中空基体の表面の１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの濃度で存在する請求項８記載の人工血管の製造方法。
【請求項１０】
前記生体吸収性ポリマー材料が、ポリ乳酸、ポリリシンおよびポリ乳酸・グリコール酸からなる群から選択される少なくとも１種である請求項８または９記載の人工血管の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、人工血管、人工皮膚、人工器官などとして使用される細胞接着性生体吸収材料、それを用いた人工血管およびそれらの製造方法に関し、更に詳細には、生体吸収性ポリマー材料からなる基体表面に、細胞接着性ペプチドである−ＲＧＤ基を固定し、表面への細胞接着性を向上させた細胞接着性生体吸収材料、人工血管およびそれらの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、生体吸収性ポリマー材料（生体吸収材料、生体分解性材料などとも称される）であるポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリ乳酸・グリコール酸（ＰＬＧＡ）等を人工血管の材料に用いることは知られている。また血管内皮細胞を刺激誘因する物質を、アガロース、デキストラン、ポリ乳酸、ゼラチン、フィブリノーゲン等の生体分解性ポリマー中に分散して複合化した人工血管も知られている（例えば、特許文献１参照）。なお、該特許文献１において、血管内皮細胞を刺激誘因する物質としては、ラミニン、γ−グロブリン、卵白アルブミン、トランスフェリン、ＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、ＥＣＧＳ（内皮細胞成長因子）、ＦＧＦ（繊維芽細胞成長因子）、Ｎ−ホルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−スレオニル−Ｌ−リシル−Ｌ−プロリンが開示されている。
【０００３】
生体吸収性ポリマー材料と細胞接着を促進する物質とを組み合わせた他の技術としては、ポリリシン（ＰＬＬ）に細胞接着性のペプチド（ＧＲＧＤＳ）を結合させ、それをポリ乳酸膜の表面に接着させる技術が知られている（例えば、非特許文献１参照）。この非特許文献１には、ポリ乳酸に官能基がないために細胞接着性のペプチドを固定することが困難であることが記載されている。また同文献には、０．０１％のＰＬＬ−ＧＲＧＤＳで表面をコートしたポリ乳酸膜上でウシ大動脈内皮細胞を培養すると、未処理膜に比べて細胞がよく伸展すること、およびＰＬＬ−ＧＲＧＤＳの濃度を高くすると、細胞の伸展が阻害されることが記載されている。
【０００４】
細胞接着性のペプチド（以下、細胞接着性材料と記す）としては、その他にＲＧＤ（アルギニル−グリシニル−アスパラギン酸）ペプチドが知られており、このＲＧＤペプチドを生体吸収性のないポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）の表面に導入した材料も知られている（例えば、非特許文献２参照）。この非特許文献２に記載された材料は、ＰＭＭＡの表面にチオールリンカーあるいはアクリルアミドリンカーを介して環状ＲＧＤを導入している。ＲＧＤペプチドは細胞側のインテグリンαｖβ３やαｖβ５によって認識される。チオールリンカーを用いて環状ＲＧＤを導入したＰＭＭＡでは、ヒト骨芽細胞、ヒト骨前駆体細胞、ラット骨芽細胞、マウス骨芽細胞の接着性が高くなった。インテグリンαｖβ３やαｖβ５を発現していないヒトメラノーマ細胞は接着しなかった。アクリルアミドリンカーを用いて環状ＲＧＤを導入したＰＭＭＡでは、リンカーが長い方がマウス骨芽細胞の接着性が高かった。また、環状ＲＧＤを導入したＰＭＭＡの動物実験においても、骨形成が促進されていたことが記載されてる。
【０００５】
一方、細胞接着性材料を用いずに、ポリ乳酸膜の細胞増殖性を高めるために、プラズマ処理を施すことが提案されている（例えば、非特許文献３参照）。この非特許文献３では、ポリ乳酸膜をアンモニアプラズマ処理によって表面改質している。この処理をした膜上でヒト臍帯静脈内皮細胞とウサギ微小血管内皮細胞を培養すると、未処理膜やフィブロネクチンをコートしたポリ乳酸膜に比べて細胞の増殖性が良くなったことが記載されている。
【０００６】
【特許文献１】
特開平５−７６５８８号公報
【非特許文献１】
Ｒｏｂｉｎ  Ａ．  Ｑｕｉｒｋ，  Ｗｅｎｇ  Ｃ．  Ｃｈａｎ，  Ｍａｒｔｙｎ  Ｃ．  Ｄａｖｉｅｓ，  Ｓａｕｌ  Ｊ．Ｂ．  Ｔｅｎｄｌｅｒ，  Ｋｅｖｉｎ  Ｍ．  Ｓｈａｋｅｓｈｅｆｆ、「ポリ乳酸用の生体模倣性表面修飾剤としてのポリ（Ｌ−リシン）−ＧＲＧＤＳ（Ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）−ＧＲＧＤＳ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２  （２００１）  ８６５−８７２
【非特許文献２】
Ｍａｒｔｉｎ  Ｋａｎｔｌｅｈｎｅｒ，  Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｄｉｒｋ  Ｆｉｎｓｉｎｇｅｒ，  Ｊｏｒｇ  Ｍｅｙｅｒ，  Ａｌｆｒｅｄ  Ｊｏｎｃｚｙｋ，  Ｂｅａｔｅ  Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｎｉｅｓ，  Ｇｕｎｔｅｒ  Ｈｏｌｚｅｍａｎｎ，  Ｓｉｍｏｎ  Ｌ．  Ｇｏｏｄｍａｎ，  ａｎｄ  Ｈｏｒｓｔ  Ｋｅｓｓｌｅｒ、「環状ＲＧＤペプチドでの表面コーティングは骨芽細胞接着と増殖および骨形成を促進する」（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｃｙｃｌｉｃ  ＲＧＤ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、ＣＨＥＭＢＩＯＣＨＥＭ  ２０００，  １，  １０７−１１４
【非特許文献３】
Ｃｅｃｉｌｉａ  Ｆ．Ｌ．  Ｃｈｕ，  Ａｌｂｅｒｔ  Ｌｕ，  Ｍａｒｋ  Ｌｉｓｚｋｏｗｓｋｉ，  Ｒａｊｅｎｄｅｒ  Ｓｉｐｅｈｉａ、「生体分解性ポリマー上の動物及びヒト内皮細胞の増大した増殖（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４７２  （１９９９）、４７９−７８５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従来技術において、生体吸収性ポリマー材料であるポリ乳酸にＲＧＤ等の細胞接着性材料を固定することは困難であり、従来は細胞接着性材料を人工血管等に用いるために、細胞接着性材料をポリマー材料中に分散して使用したり（特許文献１参照）、ＰＬＬに細胞接着性材料を結合させたものをポリ乳酸膜に接着させたり（非特許文献１参照）、あるいはＰＭＭＡなどの細胞接着性をもたないポリマーに固定して用いる（非特許文献２参照）方法を採用していた。
【０００８】
しかしながら、特許公報１に記載されたように、細胞接着性材料をポリマー材料に分散する方法では、ポリマー材料の表面から細胞接着性材料が抜け出し易いために、人工血管として使用する場合にその表面に細胞を接着させる効果が十分に得られない問題がある。
【０００９】
また非特許公報１に記載されたように、ＰＬＬに細胞接着性材料を結合させたものをポリ乳酸膜に接着させる方法も、ポリ乳酸膜から細胞接着性材料が抜け出し易く、人工血管として使用する場合にその表面に細胞を接着させる効果が十分に得られない問題がある。また、この方法で長尺の管の内壁面に均一に細胞接着性材料を分布させた高品質の人工血管を製造するのは困難であり、しかも製造工程が複雑になって製造コストが高くなる問題がある。
【００１０】
さらに非特許公報２に記載されたように、ＰＭＭＡなどの細胞接着性をもたないポリマー基体に細胞接着性材料を固定して用いる方法は、人工血管として使用した後、ポリマー基体が生体内でなくならずに残存することから、生体内で徐々に細胞と入れ替わりながら、最終的に生体内から消滅するという生体吸収性ポリマー材料の長所を享受できない。
【００１１】
また、非特許公報３に記載されたように、細胞接着性材料を用いず、ポリ乳酸膜をプラズマ処理によって表面改質する方法は、人工血管として使用する場合にその表面に細胞を接着させる効果が十分に得られない問題がある。
【００１２】
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、従来技術では製造困難であったポリ乳酸等の生体吸収性ポリマー材料に細胞接着性の−ＲＧＤ基を固定した細胞接着性生体吸収材料、人工血管及びそれらの製造方法の提供を目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明は、生体吸収性ポリマー材料からなる基体の表面に構造式（１）
【００１４】
【化４】
2004159849.tif 000003
【００１５】
で示される−ＲＧＤ基が固定されたことを特徴とする細胞接着性生体吸収材料を提供する。
本発明の細胞接着性生体吸収材料において、前記−ＲＧＤ基は、前記基体の表面の１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの濃度で存在することが好ましい。もちろんこの濃度範囲に限定されることなく、細胞接着性生体吸収材料の用途に応じて前記−ＲＧＤ基は幅広い濃度範囲で存在することが可能である。
また前記生体吸収性ポリマー材料は、ポリ乳酸、ポリリシンおよびポリ乳酸・グリコール酸からなる群から選択される１種が好ましい。
また本発明は、前記細胞接着性生体吸収材料からなる中空糸または管を含むことを特徴とする人工血管を提供する。
【００１６】
さらに本発明は、前記構造式（１）で示される−ＲＧＤ基と不飽和アシル基とを結合させて不飽和アシル化ペプチドを含む溶液を形成する工程と、
生体吸収性ポリマー材料からなる基体にプラズマを照射して表面活性化基体を形成する工程と、
前記表面活性化基体と、前記不飽和アシル化ペプチドを含む溶液とを接触させ、該基体の表面に−ＲＧＤ基が固定された細胞接着性生体吸収材料を得る工程とを含むことを特徴とする細胞接着性生体吸収材料の製造方法を提供する。
【００１７】
また本発明は、前記構造式（１）で示される−ＲＧＤ基と不飽和アシル基とを結合させて不飽和アシル化ペプチドを含む溶液を形成する工程と、
生体吸収性ポリマー材料からなる中空糸または管状の中空基体にプラズマを照射して表面活性化中空基体を形成する工程と、
前記表面活性化中空基体と、前記不飽和アシル化ペプチドを含む溶液とを接触させ、該中空基体の表面に−ＲＧＤ基が固定された人工血管を得る工程とを含むことを特徴とする人工血管の製造方法を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞接着性生体吸収材料は、生体吸収性ポリマー材料からなる基体の表面に構造式（１）
【００１９】
【化５】
2004159849.tif 000004
【００２０】
で示される−ＲＧＤ基を固定したことを特徴とする。
【００２１】
この細胞接着性生体吸収材料の基体として用いる生体吸収性ポリマー材料としては、生（生体）分解性ポリマーなどとも称されている周知の各種生体吸収性ポリマー材料の中から適宜選択して用いることができる。本発明において特に好適な生体吸収性ポリマー材料としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリリシン（ＰＬＬ）およびポリ乳酸・グリコール酸（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される１種または２種以上をブレンドした材料を挙げることができる。これらの材料は、フィルム、中空糸を含む糸状、テープ状、極細フィラメントなどの各種の形態を製造することができ、あるいは適当な市販品があればそれを用いることもできる。基体の形状、厚み、寸法などは、本発明の細胞接着性生体吸収材料の使用用途に応じて適宜決定され、例えば人工血管用には多孔質の管状基体（大・中人工血管用）、中空糸基体（小人工血管用）が用いられ、人工皮膚用には適当な厚みのシート状基体、織物基体、多孔質シート基体などが用いられ、また種々の人工器官用には、管状基体やシート状基体を適宜接合して所望形状としたり、あるいは成形型を用いて所望形状に成形加工した基体を用いることができる。さらに本発明の細胞接着性生体吸収材料は、顆粒や粉体の形態として、あるいは製薬上許容される溶剤、賦形剤、可塑剤、結合剤、乳化剤、分散剤などの添加物を加えて、懸濁液、乳液、軟膏、クリーム、ペーストなどの注入や塗布に好適な形態とすることもできる。
【００２２】
この基体に固定される−ＲＧＤ基は、前記構造式（１）で表される通り、アルギニン残基、グリシン残基およびアスパラギン酸がこの順に結合してなるトリペプチドの基である。非特許公報２に記載されている通り、−ＲＧＤ基自体は公知であり、また該基が生体内において細胞接着性を有することも知られている。しかし従来技術では、ポリ乳酸などの生体吸収性ポリマー材料からなる基体表面に直接該−ＲＧＤ基を固定することは困難であり、利用方法としてはポリマー材料中にペプチドを分散させるか、ＰＭＭＡなどの生体吸収性でないポリマーに固定して用いるしかなかった。本発明では、ポリ乳酸などの生体吸収性ポリマー材料からなる基体に−ＲＧＤ基を固定した新規な細胞接着性生体吸収材料である。本発明の好適な形態において、該−ＲＧＤ基は、Ｒ（アルギニン残基）の一端（アミノ基側）がリンカー（アクリロイル基などの不飽和アシル基）の結合によって該基体に固定されている。
【００２３】
この−ＲＧＤ基は周知のペプチド合成法を含めた種々の製造方法を用いて作製できる。このような合成はペプチド合成の分野で周知の技法、特に、市販の各種ペプチド合成機を用いて実施できる。
例えば、アスパラギン酸のカルボキシル基を、表面に適当な官能基を有する樹脂などの基材に結合させ、該アスパラギン酸のアミノ基とグリシンのカルボキシル基とを前記との間にペプチド結合を形成させる（ＧＤ形成）。次に、一端に不飽和アシル基などのリンカーを結合してあるアルギニンのカルボキシル基とＧＤ中グリシン残基のアミノ基との間にペプチド結合を形成させて得ることができる。
あるいは、適当な基材の表面に、まずアルギニンのアミノ基を結合させる。次に、該基材をグリシン溶液（ペプチド合成用酵素又は触媒を含む）と接触させ、該アルギニンのカルボキシル基とグリシンのアミノ基との間にペプチド結合を形成させる（−ＲＧ形成）。次いで、該基材をアスパラギン酸溶液（ペプチド合成用酵素又は触媒を含む）と接触させ、グリシンのカルボキシル基とアスパラギン酸のアミノ基との間にペプチド結合を形成させる（ＲＧＤ形成）。最後に、基材から該ペプチドを脱離することによってＲＧＤペプチドが合成される。さらに、該ＲＧＤペプチドは、塩化アクリロイル等の不飽和アシル基含有化合物と接触させることでアルギニン残基のアミノ基側にリンカーとなる不飽和アシル基を結合させる。
【００２４】
この細胞接着性生体吸収材料において、基体に固定された−ＲＧＤ基の表面濃度は、基体表面の１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲とすることが好ましい。−ＲＧＤ基の表面濃度が前記範囲より少ないと、得られる細胞接着性生体吸収材料の細胞接着性向上効果が十分に得られず、該基を固定していない基体と比べて細胞接着特性に有意の差がなくなる。一方、−ＲＧＤ基の表面濃度が前記範囲より大きいと、製造が困難になり、また却って細胞接着性向上効果が減じられる可能性がある。しかし、生体材料の用途によって−ＲＧＤ基の濃度範囲は自由に選択することが可能であり、化学的、生物的に許容される範囲内で調整することができる。
【００２５】
この細胞接着性生体吸収材料は、生体内に移植、埋入または皮膚に貼着して用いることで、表面の−ＲＧＤ基が周囲の細胞（血管内皮細胞、骨芽細胞、繊維芽細胞、表皮内皮細胞など）を接着し、基体の表面に該細胞を固定化し、増殖させる。一方、基体は時間の経過とともに徐々に生体内吸収され、漸次薄肉化する。最終的に該細胞接着性生体吸収材料は、表面に接着、増殖した細胞によって基体が置換された状態となり、基体自体は自己細胞からなる組織と置換して消滅する。
【００２６】
本発明の細胞接着性生体吸収材料は、生体吸収性ポリマー材料からなる基体の表面に前記構造式（１）で示される細胞接着性の−ＲＧＤ基が固定されたものなので、生体内に移植、埋入または皮膚に貼着して用いる際に、細胞接着性の−ＲＧＤ基が基体から抜け出すことがなく、長期にわたり良好な細胞接着性能が維持されるので、基体表面に自己細胞を接着、増殖させて自己細胞からなる層や組織を形成する自己修復効果に優れている。
また基体が生体吸収性ポリマー材料からなるものなので、基体表面に自己細胞からなる層や組織が形成されるとともに基体が消滅して生体内に残らない生体吸収性ポリマー材料の長所を有している。
さらに基体に固定された−ＲＧＤ基の表面濃度を基体表面１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲としたことによって、特に優れた細胞接着性能を得ることができ、基体表面に自己細胞を接着、増殖させて自己細胞からなる層や組織を形成する自己修復の確率を高めることができる。
【００２７】
本発明の人工血管は、生体吸収性ポリマー材料からなる中空糸または管状基体の表面に前記構造式（１）で示される細胞接着性−ＲＧＤ基が固定された構造になっている。これに用いられる中空糸または管状基体は、透液性の無い平膜、透液性のある多孔質膜、多数のフィラメントを織って作られた管状織物、管状不織布などの形態とすることができる。これらの形態は、人工血管の適用部位などに応じて適宜選択でき、例えば、直径５ｍｍ以下の小口径人工血管用には、平膜の中空糸や多孔質中空糸（管）を用いることができ、それ以上の直径を有する中または大口径人工血管には、強靭な管状織物基体を用いることができる。
【００２８】
この中空糸または管状基体の材料は、前述した通り、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリリシン（ＰＬＬ）およびポリ乳酸・グリコール酸（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される１種または２種以上をブレンドした材料が好ましい。また基体に固定された−ＲＧＤ基の表面濃度は、基体表面１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲が好ましい。
【００２９】
本発明の人工血管の好ましい一例として、直径５ｍｍ以下の小口径人工血管を挙げることができる。従来技術によって製造された人工血管は、直径５ｍｍ以上のものが使用され、それより小径の人工血管は実験段階でしばしば血管閉塞が見られるために使用されていない。本発明では、生体吸収性ポリマー材料からなる中空糸または管状基体（以下、中空基体と記す）の表面に前記構造式（１）で示される細胞接着性の−ＲＧＤ基が固定された構造とし、生体内で血管内皮細胞などの血管壁構築細胞を接着して増殖させることで、閉塞せずに血管再生を可能とする小口径人工血管を提供し得る。
【００３０】
これに用いる中空基体は、ポリ乳酸などの生体吸収性ポリマーを用いた人工血管の製造方法として種々の文献に記載された従来公知のプロセス（例えば前掲の特許文献１、非特許文献１、２参照）を用いて種々の直径および口径のものを製造でき、または生体吸収性ポリマー材料からなる好ましい寸法の中空基体が市販されているならば、それを用いることもできる。例えばポリ乳酸からなる中空基体を製造するには、ポリ乳酸をメタノール、ジオキサンなどの溶媒に１０〜４０質量％程度の濃度で溶かしてポリマー溶液を作り、環状のスリットを設けたノズル（環の中心には水供給路を有する）から、水などの凝固液中に該ポリマー溶液を押し出し、ポリマーを中空糸または管状に凝固させて製造し得る。その際、凝固液の組成を水あるいは水と所望濃度のメタノール、ジオキサン等の混合液の中から適宜選択して用いることによって、中空基体を構成する膜が、実質的に透液性のない膜から透液性を有する多孔質膜まで変更することができる。例えば、凝固液として水を用いる場合には、実質的に透液性のない膜を作製でき、水と前記溶媒とを質量比３：７〜７：３程度の比率で混合した凝固液を用いる場合には、透液性を持った多孔質中空基体を製造できる。このような多孔質中空基体で作られた人工血管は、平滑表面の人工血管に比べて細胞接着性および増殖性に優れている点で好ましい。
【００３１】
本発明の人工血管の好ましい別な形態として、中または大口径人工血管用の管状織物基体の表面に前記細胞接着性の−ＲＧＤ基が固定された人工血管を挙げることができる。この管状織物基体の材料は、前述した通り、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリリシン（ＰＬＬ）およびポリ乳酸・グリコール酸（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される１種または２種以上をブレンドした材料が好ましい。また基体に固定された−ＲＧＤ基の表面濃度は、基体表面１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲が好ましい。
【００３２】
これに用いられる管状織物基体は、生体吸収性ポリマー材料からなる極細のフィラメントを管状に織り上げて作製される。この管状織物基体は、透液性があり薄手でありながら、機械的強度に優れ、強靭であり、しかも取り扱い性に優れた素材である。また該人工血管は、管状織物基体をベースとしているために、その端部と生体内の血管端部とを接合する際に、容易に縫合ができ、強固に接続することができる。また、−ＲＧＤ基による細胞接着性、大きな表面積、基体の透液性、柔軟性、薄さなどの構造的特質によって、破損しにくく安全性が高い、細胞接着性および増殖性に優れる、血管再生が速やかに行われる、などの長所が得られる。
【００３３】
本発明は、前記細胞接着性生体吸収性材料および人工血管の製造方法も提供する。
図１は本発明の細胞接着性生体吸収性材料および人工血管の製造方法の一実施形態を示す図である。この図中符号１０は基体、１１は細胞接着性生体吸収性材料または人工血管（以下、細胞接着性生体吸収性材料と記す）、１２は表面活性化基体を示す。本実施形態では、図１中に概略的に示す（ａ）〜（ｄ）の工程を順に行うことで、基体１０の表面に前記構造式（１）で示される−ＲＧＤ基をリンカーである不飽和アシル基の典型例であるアクリロイル基を介して固定した細胞接着性生体吸収性材料１１を製造する。
【００３４】
基体１０は、前記の通り、種々の生体吸収性ポリマー材料を用いることができ、好ましくはポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリリシン（ＰＬＬ）およびポリ乳酸・グリコール酸（ＰＬＧＡ）からなる群から選択される１種または２種以上をブレンドした材料を挙げることができる。基体１０の形状は、製造するべき細胞接着性生体吸収性材料１１に応じて適宜選択でき、中空基体、管状織物基体、フィルム基体などを使用し得る。
【００３５】
本実施形態による製造方法では、まず前記構造式（１）で示される−ＲＧＤ基とアクリロイル基とを結合させてアクリロイル化ペプチド（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＲＧＤ）を含む溶液を形成する。該アクリロイル化ペプチドを合成する方法は、前述した通り、ペプチド合成機を用いて合成した保護ＲＧＤペプチドの溶液ないしはＲＧＤを合成したペプチド固相担体に、アクリロイル化反応剤を加えて該アクリロイル化ペプチドを合成する方法、ＧＤペプチドにアクリロイル化アルギニンをペプチド縮合する方法などを用いることができる。またアクリロイル化反応剤としては、塩化アクリロイルなどのハロゲン化アクリロイルやアクリル酸とジシクロヘキシルカルボジイミドなどの有機化学的に許容される脱水剤の組み合わせから自由に選ぶことができる。また、不飽和アシル基としては、前記アクリロイル基に限定されることなく、メタクロイル基、クロトニル基など二重結合を有するアシル基からなる群から選択される基を用いることができ、またその導入法も酸塩化物を用いる方法、カルボン酸と脱水剤を用いる方法などから自由に選ぶことができる。
【００３６】
次に、生体吸収性ポリマー材料からなる基体１０にＡｒプラズマを照射して表面活性化基体１２を形成する［図１中（ａ）、（ｂ）参照］。この表面活性化基体１２を形成するために用いるプラズマ処理は、Ａｒプラズマ以外に、アンモニアガス、酸素ガス、水素ガス、他の不活性ガスなどの雰囲気中でのプラズマ処理を用いることができるが、基体１０表面に均一に多数のラジカルを形成できること、処理が容易であることなどの点から、Ａｒプラズマを用いることが望ましい。Ａｒプラズマで基体１０を処理するための装置は特に限定されず、従来公知のプラズマ表面処理用、スパッタリング用の装置を用いて実行し得る。このプラズマ処理の条件は、得られる表面活性化基体１２に前記アクリロイル化ペプチド溶液を接触させた際に、−ＲＧＤ基の表面濃度が基体１０表面１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲となるように調整することが好ましい。具体的には、アルゴンガスの圧力０．０１〜１ｔｏｒｒ、出力１０〜５０Ｗ、処理時間１０〜６０秒の条件下でプラズマ処理するのが好ましい。
【００３７】
このプラズマ処理によって、図１（ｂ）に示すように、生体吸収性ポリマー材料からなる基体１０の表面に多数のラジカルが発生する。ＲＧＤペプチドと結合させた前記アクリロイル基は、このラジカルと反応して共有結合を形成する。
【００３８】
次に、前記表面活性化基体１２と、前記アクリロイル化ペプチドを含む溶液とを接触させ基体１０の表面に−ＲＧＤ基が固定された細胞接着性生体吸収材料１１を得る［図１（ｃ）、（ｄ）参照］。該溶液中のアクリロイル化ペプチドの濃度は、−ＲＧＤ基の表面濃度が基体１０表面１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲となるように調整され、通常は０．０１〜１モル／Ｌ程度とされる。この反応温度は３０〜９０℃、好ましくは４０〜７０℃程度とするのが好ましい。
【００３９】
表面活性化基体１２表面のラジカルと、アクリロイル化ペプチドとの反応によって、アクリロイル基の一端が基体１０表面と共有結合し、該アクリロイル基を介して−ＲＧＤ基が基体１０に結合する。この反応は、中空糸、管状基体あるいは管状織物基体の管内壁でも均一に生じるため、これらの管状基体の内壁に−ＲＧＤ基を容易に且つ確実に固定することができる。
【００４０】
表面活性化基体１２とアクリロイル化ペプチドとの反応によって、基体１０の表面に−ＲＧＤ基が固定された細胞接着性生体吸収材料１１［図１（ｄ）参照］が得られる。この細胞接着性生体吸収材料１１は、生体内に移植、埋入または皮膚に添付して用いた場合、図１（ｅ）に示すように、血管内皮細胞、繊維芽細胞などの細胞が基体１０表面の−ＲＧＤ基を認識して基体１０表面に接着し、増殖して自己細胞からなる層や組織を形成する。一方、基体１０は生体吸収性ポリマー材料からなるものなので、基体１０表面に自己細胞からなる層や組織が形成されるとともに該基体１０は漸次吸収され、消滅する。
【００４１】
本発明の細胞接着性生体吸収性材料または人工血管の製造方法は、生体吸収性ポリマー材料からなる基体１０にプラズマ処理して多数のラジカルを発生させた表面活性化基体１２とアクリロイル化ペプチド溶液とを接触させ、基体１０表面にアクリロイル基を介して−ＲＧＤ基を固定することによって、生体吸収性ポリマー材料からなる基体１０の表面に−ＲＧＤ基が固定された細胞接着性生体吸収材料１１を製造することができる。
また、管状基体を外側からプラズマ処理することで、管外面だけでなく内壁面にラジカルを生じさせることができ、その後アクリロイル化ペプチド溶液と接触させることで、管内壁面にも−ＲＧＤ基を固定することができるので、管外面だけでなく内壁面に均一な濃度で−ＲＧＤ基を有する中空糸、管状、管状織物からなる人工血管を製造することができる。
以下、実施例により本発明の作用効果を明確にする。
【００４２】
【実施例】
（ＲＧＤペプチドの調製）
ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製、Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用い、アスパラギン酸プレロード樹脂（ＮＯＶＡ社製ＦｍｏｃＡｓｐ  ＴＧＡ樹脂）に保護グリシンとＬ−アルギニンを順次結合させ、保護ＲＧＤペプチドを固相上に合成した。合成したＲＧＤペプチド２６０μｇを３０ｍＬのＤＭＦに溶かし、ＲＧＤペプチド溶液とした。塩化アクリロイル４０６μＬを前記ＲＧＤペプチド溶液に混合し、室温で６０分間撹拌して反応させ、ＲＧＤペプチドのアミノ末端にアクリロイル基が結合したアクリロイル化ＲＧＤペプチドを固相上に形成した。次いで、ＴＦＡ・Ｈ２Ｏ・ＴＩＰＳ（９５：２．５：２．５）を加え、室温で２時間撹拌し、濾過して得られた濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を水に溶解し、エーテルで２回注出して水相を減圧濃縮し、アクリロイルＲＧＤを得た。
【００４３】
（細胞接着性生体吸収材料の製造）
基体としてポリ乳酸（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社製、ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ），Ｍｗ１００，０００）を用いた。この基体をＳａｍｃｏ社製プラズマ照射装置（商品名ＲＦ  ＰＯＷＥＲ  ＭＥＴＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ＰＭ−４３  ＲＦ  Ｍａｔｃｈｉｎｇｇ  Ｕｎｉｔ  ＭＤ−２  ＲＦＧ−２００）に接続したチャンバー内に入れ、チャンバー内を真空排気した後、プラズマガスとして０．１ｔｏｒｒのアルゴン雰囲気とし、出力１０Ｗで６０秒間、基体にアルゴンプラズマを照射し、表面活性化処理をした。チャンバーから取り出した表面活性化基体を、前記アクリロイル化ＲＧＤペプチドを各種濃度で含む水溶液中に浸漬し、５０〜６０℃で浸透しながら２４時間放置した。その後、基体表面に−ＲＧＤ基を固定した細胞接着性生体吸収材料を蒸留水で洗浄し、８時間減圧乾燥した。
【００４４】
前記の通り作製した−ＲＧＤ基を固定した膜（以下、実施例の膜という）と、比較のために−ＲＧＤ基を固定していないポリ乳酸膜（以下、比較例の膜という）とのそれぞれの膜に対するＨＵＶＥＣ（正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）の接着性を調べた。
東洋紡社製ＨＵＶＥＣ細胞を内皮細胞増殖培地（東洋紡社製）に懸濁させた。前記実施例と比較例のそれぞれの膜の破片（０．９５ｃｍ２）を組織培養ポリスチレンプレートの各ウェルに入れ、前記細胞懸濁培地１ｍＬを該ウェルに入れ、３７℃で培養した。各ウェル内の播種細胞数は１×１０５細胞／ウェルとした。細胞播種後、４時間及び２４時間経過時点で膜に接着している細胞のみをカウントし、各膜の細胞接着性を調べた。細胞数測定は、取り出した膜を洗浄後、接着細胞のみをトリプシン処理して剥がし、血球計算盤を用いてカウントした。
【００４５】
ポリ乳酸からなる基体表面に−ＲＧＤ基を固定した実施例の膜は、−ＲＧＤ基を固定していない比較例の膜に比べ、接着細胞数が大きく、−ＲＧＤ基による細胞接着性が認められた。
また基体表面の−ＲＧＤ基濃度は１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌ程度が好ましいことが判った。
【００４６】
【発明の効果】
本発明の細胞接着性生体吸収材料は、生体吸収性ポリマー材料からなる基体の表面に細胞接着性の−ＲＧＤ基が固定されたものなので、生体内に移植、埋入または皮膚に貼着して用いる際に、−ＲＧＤ基が基体から抜け出すことがなく、長期にわたり良好な細胞接着性能が維持されるので、基体表面に自己細胞を接着、増殖させて自己細胞からなる層や組織を形成する自己修復効果に優れている。
また基体が生体吸収性ポリマー材料からなるものなので、基体表面に自己細胞からなる層や組織が形成されるとともに基体が消滅して生体内に残らない生体吸収性ポリマー材料の長所を有している。
さらに基体に固定された−ＲＧＤ基の表面濃度を基体表面１ｃｍ２当たり１ｐｍｏｌ〜５ｎｍｏｌの範囲としたことによって、特に優れた細胞接着性能を得ることができ、基体表面に自己細胞を接着、増殖させて自己細胞からなる層や組織を形成する自己修復の確率を高めることができる。
本発明の人工血管は、生体吸収性ポリマー材料からなる中空糸または管状基体の表面に細胞接着性の−ＲＧＤ基が固定された構造とし、生体内で血管内皮細胞などの血管壁構築細胞を接着して増殖させることで、閉塞せずに血管再生を可能とする小口径人工血管を提供し得る。
本発明の細胞接着性生体吸収性材料または人工血管の製造方法は、生体吸収性ポリマー材料からなる基体にプラズマ処理して多数のラジカルを発生させた表面活性化基体と不飽和アシル化ペプチド溶液とを接触させ、基体表面に−ＲＧＤ基を固定することによって、生体吸収性ポリマー材料からなる基体の表面に−ＲＧＤ基が固定された細胞接着性生体吸収材料を製造することができる。
また、管状基体を外側からプラズマ処理することで、管外面だけでなく内壁面にラジカルを生じさせることができ、その後不飽和アシル化ペプチド溶液と接触させることで、管内壁面にも−ＲＧＤ基を固定することができるので、管外面だけでなく内壁面に均一な濃度で−ＲＧＤ基を有する中空糸、管状、管状織物からなる人工血管を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞接着性生体吸収性材料の製造方法を説明するための概略図である。
【符号の説明】
１０    基体
１１    細胞接着性生体吸収材料
１２    表面活性化基体
【図１】
2004159849.tif 000009