(57)【要約】【課題】潅流方式を利用して簡単にそしてより高精度に薬剤の作用を評価することが可能な生体内薬剤濃度シミュレーションシステム、及びそのシステムに用いるデバイス、及びこのシステムを利用した薬剤の評価方法を提供する。【解決手段】薬剤溶液浸透性材料に被検体が埋め込まれてなる生体内薬剤濃度シミュレーションシステム用デバイス。潅流槽内に上記デバイスを装着させたデバイス装着潅流槽が組み込まれてなる生体内薬剤濃度シミュレーションシステム。【選択図】　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤溶液浸透性材料に被検体が埋め込まれてなる生体内薬剤濃度シミュレーションシステム用デバイス。
【請求項２】
該デバイスが、さらに保持材料で担持されている請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
上記保持材料が、メッシュ状のストリップである請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
薬剤溶液浸透性材料が、その分解酵素によって消化可能な材料である請求項１乃至３のいずれかの項に記載のデバイス。
【請求項５】
薬剤溶液浸透性材料が、寒天又はコラーゲンである請求項１乃至４のいずれかの項に記載のデバイス。
【請求項６】
被検体が、細菌、又は細胞である請求項１乃至５のいずれかの項に記載のデバイス。
【請求項７】
薬剤溶液を送入するための送入口と該槽内からオーバーフローさせた潅流液を排出させるための排出口とを備えた潅流槽内に請求項１乃至６のいずれかの項に記載のデバイスを装着させたデバイス装着潅流槽が組み込まれてなる生体内薬剤濃度シミュレーションシステム。
【請求項８】
請求項７に記載のシステムを利用して潅流を行い、所定時間経過後にデバイスを取り出した後、該デバイスの分解酵素でその浸透性材料を消化させることにより、該浸透性材料に含まれている被検体の数を数えて該被検体に対する薬剤の評価を行う薬剤評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体内に投与した薬剤の作用を試験管内でより正確に評価できる生体内薬剤濃度シミュレーションシステム、及びそれに用いられるデバイス、並びに該システムによる薬剤評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
単回静注、点滴静注、あるいは経口投与などの方法により生体内に投与された薬剤は、吸収、代謝、排泄により時間と共にその濃度が変化し、薬剤が一定濃度でその対象物（細菌や細胞）に作用することはない。このような生体内での薬剤の濃度変化を比較的忠実に反映でき、その薬剤の作用を試験管内で評価する方法としては従来から潅流希釈法が用いられている。潅流希釈法には、所謂１−コンパートメントモデル（例えば、Ｓ．　ＧＲＡＳＳＯ，ｅｔ　ａｌ．，　による「Ｎｅｗ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｏｄｅｌｔｏ　Ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒａｔｅ　ｏｆ　Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｎ　Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，　Ａｐｒ．，１９７８，　ｐ．　５７０−５７６を参照）と２−コンパートメントモデル（例えば、村川他、「生体内濃度にシミュレートしたＩｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｍｏｄｅｌ　における抗生物質の殺菌作用（２）」Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｊａｎ．，１９８０，　ｐ．　２６−３０を参照）がよく知られている。１−コンパートメントモデルは、一定濃度の薬剤を潅流により被検体に経時的に作用させながらその被検体に対する薬剤の作用を評価する方法であるため、生体内の薬剤の濃度変化に対応したものではない。この点、薬剤の濃度変化をコントロールできるようにされた２−コンパートメントモデルは、生体内での薬剤濃度変化を比較的忠実にシミュレートでき、またその薬剤の作用を実際の投与方法に合った方法で評価できるため、より有利な方法と云うことができる。
【０００３】
上記のモデルを利用した薬剤の作用は、潅流槽（被検体、薬剤、及び培養液を含む槽）からオーバーフローした液（潅流液）を一定時間経過後毎に回収して経時的に調べるという手法で行われるが、この手法では、オーバーフローした潅流液に含まれる被検体も系外に流出することになる。即ち、薬剤の潅流によって被検体自体も流出し、その数も希釈される（減少する）ことになる。従って、例えば、上記のような潅流希釈法を用いて薬剤の作用をより精度良く評価するためには、通常複雑な補正（被検体濃度の減少を理論上の式を用いて行う補正）を行う必要がある。なお、フィルター等を用いて潅流液からの被検体の流出を防止することも考えられるが、流出する被検体量が多い場合にはすぐに目詰まりを起し、うまく潅流が行えなくなる。
【０００４】
例えば、細菌に対する抗菌力を評価する場合に、細菌数が多い場合には、希釈による菌数の減少に比べて増殖する菌数が多いので上記のような補正を行うことも可能である。しかし、被検菌の種類、薬剤の濃度などによっては、潅流による希釈で菌数の減少が、増殖による菌数の増加するスピードを上回るような場合もあり、そのような場合には、薬剤の作用で殺菌、増殖抑制が行われているにも拘わらず、それらの動態が測定結果に忠実に反映されなくなることも生じる。従って薬剤の作用をより正確に評価するには、更に煩雑な補正が必要となる。特に例えば、被検菌が複数の種類からなり、その中に極少量存在する菌についての薬剤の作用を調べようとする場合などでは、潅流方式では、目的の菌を検出することが困難になる場合もあり、従ってこのような場合には、更に別のファクターによる補正を考慮することが必要になる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、潅流方式を利用して簡単にそしてより高精度に薬剤の作用を評価、解析することが可能な生体内薬剤濃度シミュレーションシステム、及びそのシステムに用いるデバイス、及びこのシステムを利用した薬剤の評価方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従来の潅流方式による薬剤の評価方法では、例えば、抗菌力の評価は、菌を液体培地中に浮遊状態にして薬剤と接触させ、薬剤の濃度変化に合わせて菌濃度を測定することで行っており、従ってこの操作には、必ず潅流による菌の流出（減少）が伴うことになるため、上記のような複雑な補正が必要である。本発明者の研究により、薬剤が浸透して浮遊状態にある場合と同じような状態で被検体に接触できるような特定のデバイス中に被検体を分散させることで、薬剤の希釈による被検体の流出を防止でき、より高精度で被検体に対する薬剤の評価を行うことができることを見出した。
【０００７】
本発明は、薬剤溶液浸透性材料に被検体が埋め込まれてなる生体内薬剤濃度シミュレーションシステム用デバイスにある。
また本発明は、薬剤溶液を送入するための送入口と該槽内からオーバーフローさせた潅流液を排出させるための排出口とを備えた潅流槽内に上記のようなデバイスを装着させたデバイス装着潅流槽が組み込まれてなる生体内薬剤濃度シミュレーションシステムにある。
さらに本発明は、上記システムを利用して潅流を行い、所定時間経過後にデバイスを取り出した後、該デバイスの分解酵素でその浸透性材料を消化させることにより、該浸透性材料に含まれている被検体の数を数えて該被検体に対する薬剤の評価を行う薬剤評価方法にある。
【０００８】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の生体内薬剤濃度シミュレーションシステム用デバイス（以下、単に本発明のデバイスと称する）を説明する。本発明のデバイスに用いられる材料は、生体内で用いられる各種の薬剤溶液を速やかに拡散させ、その材料全体に浸透でき、それ自体は殆ど溶解、変形などが生じることのない浸透性材料であれば良いが、好ましくは、その材料の分解酵素によって容易に消化可能な材料である。このような材料の好ましい例としては、例えば、寒天（消化酵素：アガラーゼ）、ゼラチン（消化酵素：ゼラチナーゼ）、コラーゲン（消化酵素：コラゲナーゼ）を挙げることができる。
【０００９】
本発明のデバイス１は、図１に示すように、上記のような材料を水、温水などに膨潤、溶解させて液状態にした後、それをゲル化させることで容易に固形物として得ることができる。固形物として得られるデバイスの形状、大きさは、問わないが、通常直径３〜５ｍｍの円形状で最大厚み１〜２ｍｍである。本発明のデバイスは、サンプル評価時の容易なハンドリング性を付与するために、更に保持材料２で担持されていることが好ましい。保持材料２は、薬剤浸透性材料に対して浸透性を損なわないで固着、固定できる材料であれば、特に制限はない。保持材料の例としては、樹脂（ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのプラスチックなど）、金属（アルミニウム、鉄、ステンレススチール、合金など）、ガラス、複合材料（セラミックなど）を挙げることができるが、保持材料はフレキシブル性に富み、またデバイスに対して全方向から薬剤がほぼ均等に浸透できるような形態（例えば、メッシュ状）にあることが好ましい。図１に示すデバイスは、メッシュ状の保持材料（例えば、ナイロンなどのプラスチック製のネット）に担持させたものであるが、このようなデバイスは、例えば、上記の薬剤浸透性材料からなる液を保持材料に所定量滴下し、固めることで得ることができる。一つの保持材料には図１に示すように、薬剤浸透性材料を複数設けることができる。これによって複数の同一、あるいは異なった被検体を同時に評価することもできる。
【００１０】
上記薬剤浸透性材料に埋め込ませる被検体（対象物）としては、例えば、細菌、細胞（あるいは組織）を挙げることができる。被検体を液状の薬剤浸透性材料の中に混ぜ込み、固まらせることでその材料の中に被検体を埋め込ませることができる。勿論、得られたデバイスは、被検体がその材料の中に分散状態にあるため被検体の一部が表面上に現れている場合もある。なお、被検体に対する薬剤の評価をする場合には、被検体は、薬剤浸透性材料の中に混ぜ込む前に増殖できるような状態に予め調整しておくことが望ましい。
【００１１】
次に、上記デバイス１を潅流槽に装着したデバイス装着潅流槽を説明する。添付の図２は、デバイス装着潅流槽３の一例を示すものであって、該デバイス装着潅流槽３は、薬剤溶液を送入するための送入口４と該槽内からオーバーフローさせた潅流液を排出させるための排出口５とを備えている。排出口５は、一定流量の潅流を維持させるために所定の高さに設けられている。また槽内には、均一な濃度を確保するために通常撹拌手段６が設けられている。デバイスは、上記のように予め被検体を埋め込んだ状態でセットしておき、例えば、図２に示すように槽内に垂直状態で固定する。デバイスは、複数個セットすることができる。これにより、被検体の種類、濃度などを変えて同時に評価することができる。
【００１２】
上記デバイス装着潅流槽３は、１−コンパートメントモデルや２―コンパートメントモデルなどの従来から知られている潅流希釈法を利用するあらゆるタイプの生体内薬剤濃度シミュレーションシステムに組み込んで用いることができる。添付の図３は、より簡単な方法で生体内薬剤濃度変化をシミュレートできるように従来の１−コンパートメントモデルを改良し、更に上記デバイス装着潅流槽３を組み込んだ本発明の好ましいシステム７の模式図である。図３に示すように、本発明のシステム７は、比較的薄い濃度の薬剤が入った槽ＢとそのリザーバーＤ、比較的濃い濃度の薬剤が入った槽Ｃ、及び本発明のデバイス装着潅流槽Ａからなり、Ａ槽にはオーバーフローした潅流液を受けるための槽ａがポンプＰを介して繋がれている。そしてそれぞれの槽は、三方活栓Ｔを介して連結され、その三方活栓ＴとＡ槽との間には、薬剤を一定流量で移送させるためのポンプＰが付設されている。
【００１３】
生体内に投与した薬剤の濃度変化が上記システム７を用いることによって忠実にシミュレートできることを示す。以下の例は、薬剤の投与法として点滴静注を行った場合の薬剤の血中濃度の変化をシミュレートする場合である。先ず、三方活栓ＴでＢ槽からの回路を閉じておく、そしてＣ槽から薬剤をＡ槽に潅流させる（Ｃ→Ａ）。所定時間経過した時点で今度はＣ槽からの回路を閉じ、Ｂ槽からの回路を開いてＢ槽からＡ槽に潅流を行う（Ｂ→Ａ）。このような操作を行うことで、実際に所定の条件で生体内に点滴静注を行って得た血液中の薬剤濃度変化に沿ったグラフに一致したＡ槽内の薬剤濃度変化を示すグラフを得ることができる。
【００１４】
例えば、Ａ槽の容量を１０ｍｌ、Ｂ槽の容量を５５ｍｌとして、Ｂ槽には６０μｇ／ｍｌの濃度の薬剤を、Ｃ槽には１８０μｇ／ｍｌの濃度の薬剤をそれぞれ入れて、上記の操作に従って毎分０．４ｍｌの一定流速で潅流させた場合、Ａ槽内の薬剤濃度は、図４に示すグラフのように変化する（即ち、Ａ槽内の薬剤濃度は、Ｃ槽から流入した薬剤とＢ槽から流入した薬剤との和として求められる）。このグラフは、薬剤１ｇを３０分間かけて実際に点滴静注した場合のグラフに一致する。即ち、この条件の実際の点滴静注は、上記システムを用い、かつ上記の潅流条件に従って薬剤濃度を調整することで試験管内で再現することができる。以上のように、上記システムを用いることで、点滴静注を行ったときの生体内の薬剤の濃度変化をほぼ正確に試験管内でシミュレートすることが可能である。なお、このシステムでは、点滴静注以外の投与法においても生体内薬剤濃度を試験管内でシミュレートすることができる。その場合は、勿論、その投与法に従って、潅流条件を変更する。
【００１５】
次に、上記システムのデバイス装着潅流槽Ａ内に被検体を入れて、薬剤の作用を評価する場合を説明する。上記シミュレートした潅流条件では、２５分間でＡ槽の容量（１０ｍｌ）と等しい量の薬剤がＡ槽に流入する。更にこの条件で潅流を続けると、Ａ槽内の薬剤濃度は急激に低下し（希釈され）、それに伴って流入した分が潅流液としてオーバーフローして槽ａに流出する。その間、デバイスには、潅流液（培養液及び薬剤）が希釈され、その薬剤濃度変化に応じた濃度で経時的に浸透し、被検体に接触することになる。しかし、被検体は、デバイスの中に埋め込まれているので、オーバーフローした潅流液と共に系外（槽ａ）に流出することはない。即ち、デバイスによって被検体の潅流による減少が防止される。所定時間潅流を行った後、Ａ槽からデバイスを取り出す。そして取り出したデバイスを容器（例えば、エッペンドルフなど）に移して固体状態を細かく解体した後、該デバイスを構成する材料に対する分解酵素（例えば、デバイスが寒天からなるものであれば、アガラーゼ）を用いて処理し、その材料を消化させ、被検体を浮遊状態で回収する。回収した被検体をその生体に応じた通常の方法に従ってその数を測定する。例えば、被検体が細菌の場合には、得られた被検体を適宜希釈し、寒天平板に塗布し、培養して形成されたコロニーをカウントすることで細菌数を測定する。なお、細胞数をカウントする場合には既存の染色法（アルシャンブルー染色などを用いた染色法）を利用する。測定された被検体の数は、薬剤の作用により増殖、死滅した被検体の数に忠実に反映されるため、薬剤の作用をより正確に評価、解析することができる。上記のような被検体の回収操作を所定時間毎に繰り返して行うことで薬剤の経時的な作用を評価することができる。
【００１６】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を記載する。
【００１７】
［実施例］
図３に示す本発明のシステムを用いて下記の潅流条件で下記混合菌株に対する薬剤の作用を血中濃度変化に沿ってシミュレートし、評価した。その評価結果を図５に示す。なお、今回菌株として、下記のようなＭＲＳＡとＭＳＳＡの二つの混合菌株を用いたが、これは、使用した薬剤は、ＭＳＳＡには有効であるが、ＭＲＳＡには殆ど効果が無く、従って、この混合菌集団から使用薬剤の投与によりＭＲＳＡが選択されるかを検討するために行われた実験である。
【００１８】
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【００１９】
システムの潅流条件は下記の通りである。
Ａ槽の容量：１０ｍｌ
Ｂ槽の容量：５５ｍｌ、６０μｇ／ｍｌの濃度の薬剤を含有
Ｃ槽：１８０μｇ／ｍｌの濃度の薬剤を含有
潅流速度：０．４ｍｌ／分
【００２０】
図５に示された結果から、ＭＲＳＡに対しては、使用薬剤は、その濃度が高い１〜２時間の間は静菌的（増殖抑制）に作用するが、その後は、菌の増殖を許していることがわかる。一方、ＭＳＳＡに対しては、使用薬剤は殺菌的に作用し、菌数は減少するが、その薬剤濃度が低下した８時間以降では、ＭＳＳＡは増殖に転じていることがわかる。即ち，本発明のデバイスを用いた場合には、菌数の少ないＭＲＳＡの場合であっても、薬剤濃度の変化に応じてその動態が細かく反映されるため、従って、グラフは、薬剤に対してより正確な評価、解析が可能になることを示している。
【００２１】
また、グラフから、ＭＲＳＡの場合、前培養では薬剤なしの培地で育てられているため、一部には薬剤耐性の無い（又は弱い）菌が出現してくるが、これらの菌に対しては１回目の薬剤投与によって薬剤が作用し、本来の耐性の持った菌が選択されていくことがわかる。因みに、１２時間後に、上記潅流条件と同じ条件で再び薬剤を作用させた場合（即ち、２回目の薬剤の投与に該当）には、図６に示すグラフから明らかなように、使用薬剤は、ＭＳＳＡに対しては、殺菌効果があるが、ＭＲＳＡに対しては殆ど無効である。
【００２２】
［参考例］
図３に示すシステムにおいて、本発明のデバイス装着潅流槽３の代わりに、本発明のデバイスを装着しない従来の潅流槽（薬剤及び培養液の混合液の中に菌が浮遊状態で含まれた潅流液を含む）を用いた以外は上記実施例と同様な方法で潅流を行った。なお、菌数の測定は、一定時間毎にＡ槽から流出した液を回収し、１０倍希釈系列で適宜希釈し、ミューラーヒントン寒天培地上で培養して、コロニー数をカウントすることにより行った。その結果を図７に示す。
【００２３】
図７に示された結果から、両方の菌株共に潅流に伴って測定菌株は減少している。そしてＭＲＳＡの減少の比率は、ＭＳＳＡより穏やかであるが、二つのグラフを見る限りでは、使用薬剤は両方の菌株に対して有効であるように見える。これは、特にＭＲＳＡの場合のように菌数が少ない場合には、潅流による希釈で菌の流出が大きく影響するため（即ち，菌数の減少量が増殖量を上回るために）、菌の増殖が行われているにも拘わらず、測定値（グラフ）には現れてこないことを示しており、その結果、使用薬剤はＭＲＳＡ菌に対しても有効であるような評価となる。なお、２２時間後では、ＭＳＳＡは検出されないが、ＭＲＳＡは検出されている。これは、菌が単に槽内に浮遊した状態にのみあるのではなく、槽の壁面などにも付着している場合もあり、これらの流出を免れた菌がこれを種に増殖したものと考えられるが、ＭＲＳＡの耐性菌によるものかは明らかではない。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のデバイスを用いることで潅流による被検体の流出を防止することができるため、薬剤の作用をより正確に評価、解析すことができる。またデバイスは、システムに複数個セットすることが可能であるため、同時に異なった条件での評価を行うことができる。また本発明のシステムを利用することで、細菌に対する薬剤の抗菌性などの評価のみならず、例えば、癌細胞などを用いることで癌細胞に対する抗癌剤の効果を評価することができる。また正常細胞を用いることでその副作用を評価することもできる。特に本発明のシステムは、上記のＭＳＳＡとＭＲＳＡとを含む混合菌の場合のように、大きな菌集団に僅かな量の菌が存在するような場合にこれらの菌に対する抗菌薬の抗菌性の有無の検討を誤りなく評価する場合などには有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の生体内薬剤濃度シミュレーションシステム用デバイスの一例を示す模式図である。
【図２】図１に示すデバイスを装着した状態にあるデバイス装着潅流槽の一例を示す模式図である。
【図３】本発明の生体内薬剤濃度シミュレーションシステムの模式図である。
【図４】点滴静注を行った場合の血液中の薬剤濃度変化を図３に示す本発明のシステムを用いてシミュレートしたときのグラフである。
【図５】本発明のシステムを用いて混合菌株に対する薬剤の作用を薬剤１回投与した場合の血中の濃度変化に沿ってシミュレートし、評価した時のグラフである。
【図６】図５の１回目の薬剤の評価に続いて、薬剤を２回投与した場合の血中の濃度変化に沿ってシミュレートし、評価した時のグラフである。
【図７】従来の潅流希釈法に基づいて混合菌株に対する薬剤の作用を薬剤１回投与した場合の血中の濃度変化に沿ってシミュレートし、評価した時のグラフである。
【符号の説明】
１　本発明の生体内薬剤濃度シミュレーションシステム用デバイス
２　保持材料
３　デバイス装着潅流槽
４　送入口
５　排出口
６　撹拌器
７　本発明のシステム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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