(57)【要約】【課題】本発明により、後述方法において、センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた劣化による影響を回避可能な方法等を提供すること。【解決手段】金属薄膜センサー結合生体分子含有チップを用いて、当該生体分子と被験物質との結合状態を表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出・解析する、生体分子と前記被験物質との相互作用予測方法において、１）被験物質の前記変化検出、２）検出データから、生体分子が１種類以上の結合サイトを持ち、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを１つ以上含む複数の数学モデルにより各結合パラメーターの算出、３）算出結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率の算出、及び４）算出結合率に基づき前記生体分子と前記被験物質との相互作用の評価、を有する方法等が提供可能になった。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において、
（１）被験物質の複数の供試濃度について前記変化を検出する工程、
（２）検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出する工程
（３）算出された各々の結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出する工程
（４）前記複数の数学モデルによりシミュレートされた結合量と検出された変化に対応するデータとの合致度から所望の数学モデルを選択し、選択された数学モデルにより算出された結合パラメーターにより算出された結合率を、前記生体分子と前記被験物質との結合率として確定する工程、及び
（５）確定された結合率に基づき前記生体分子と前記被験物質との相互作用を評価する工程
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
生体分子が蛋白質性分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
蛋白質性分子が、哺乳動物の血清由来の蛋白質であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
蛋白質性分子がアルブミンであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを非線形最小ニ乗法により算出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において使用されるコンピュータプログラムであって、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出することを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項７】
少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において使用されるコンピュータプログラムであって、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出する部分プログラム及び算出された各々の結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出する部分プログラムからなることを特徴とするコンピュータプログラム。
【請求項８】
請求項６又は７記載のコンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項９】
請求項８載の記録媒体を有することを特徴とする分析装置。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか記載の方法により評価された、生体分子と被験物質との相互作用に基づき、所望の薬物動態学的性質を有する被験物質を探索・選抜することを特徴とする薬物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体分子と薬物との相互作用の予測方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法が知られていた。
具体的には、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデル（以下、単結合サイト型数学モデルと記すこともある。）により、当該数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出するものであり、算出された結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合重量を算出するものであった。そして当該結合重量に基づき前記生体分子と前記被験物質との相互作用（例えば、結合レベル）を評価することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用（例えば、結合レベル）についての予測の可能性を示唆していた。（特許文献１及び非特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】
国際特許出願第ＷＯ００／７９２６８（Ａ３）号公開公報
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ４３，  １９８６−１９９２  （２０００）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子を有するセンサーチップは、使用回数や使用日数等に応じて劣化（例えば、８日後には初日の３分の２程度の感度に減じるような劣化）を生じる為に、生体分子と被験物質との結合重量に基づく前記生体分子と被験物質との相互作用（例えば、結合レベル）の評価では、多くの場合において、被験物質が生体内で存在する濃度よりも極端に高い濃度で、相対的に結合の強さを比較するというような、限られた目的にしか使用できないという問題があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出し、次いで算出された各々の結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出することにより、生体分子と被験物質との結合重量に基づく代わりに、生体分子と被験物質との結合率に基づく前記生体分子と被験物質との相互作用の評価を行うことを可能とし、その結果として、前記センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた劣化による影響を回避できることを見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において、
（１）被験物質の複数の供試濃度について前記変化を検出する工程、
（２）検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデル（以下、複結合サイト型数学モデルと記すこともある。）を少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出する工程
（３）算出された各々の結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出する工程
（４）前記複数の数学モデルによりシミュレートされた結合量と検出された変化に対応するデータとの合致度から所望の数学モデルを選択し、選択された数学モデルにより算出された結合パラメーターにより算出された結合率を、前記生体分子と前記被験物質との結合率として確定する工程、及び
（５）確定された結合率に基づき前記生体分子と前記被験物質との相互作用を評価する工程
を有することを特徴とする方法（以下、本発明と記すこともある。）；
２．生体分子が蛋白質性分子であることを特徴とする前項１記載の方法；
３．蛋白質性分子が、哺乳動物の血清由来の蛋白質であることを特徴とする前項１記載の方法；
４．蛋白質性分子がアルブミンであることを特徴とする前項１記載の方法；
５．複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを非線形最小ニ乗法により算出することを特徴とする前項１記載の方法；
６．少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において使用されるコンピュータプログラムであって、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出することを特徴とするコンピュータプログラム（以下、本発明プログラムと記すこともある。）；
７．少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において使用されるコンピュータプログラムであって、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出する部分プログラム及び算出された各々の結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出する部分プログラムからなることを特徴とするコンピュータプログラム；
８．前項６又は７記載のコンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（以下、本発明記録媒体と記すこともある。）；
９．前項８載の記録媒体を有することを特徴とする分析装置（以下、本発明分析装置と記すこともある。）；
１０．前項１〜５のいずれか記載の方法により評価された、生体分子と被験物質との相互作用に基づき、所望の薬物動態学的性質を有する被験物質を探索・選抜することを特徴とする薬物のスクリーニング方法（以下、本発明スクリーニング方法と記すこともある。）；
等を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明方法は、生体分子と薬物との相互作用の予測方法等に関するものであり、本発明方法により、薬物が有する、生体分子と被験物質との結合率に基づいて薬物動態学的性質を早期に把握できるため、所望の薬物動態学的性質を有する薬物のスクリーニング研究等に最適である。
【０００８】
本発明方法は、少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測するような公知の方法（例えば、国際特許出願第ＷＯ００／７９２６８（Ａ３）号公開公報に記載される方法）における改良発明である。
【０００９】
本発明方法における第一工程は、被験物質の複数の供試濃度について前記変化を検出する工程である。
まず、各種濃度に調製された被験物質の試料溶液を準備する。通常は、４種類以上、より好ましくは、４〜８種類程度の供試濃度（希釈系列）を用意することが好ましい。
試料溶液を調製するために使用される溶媒としては、例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、および各種緩衝液、ならびにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトニトリル、および各種水溶性有機溶媒等をあげることができ、好ましくは、５％ＤＭＳＯ含有リン酸緩衝生理食塩水があげられる。
また試料溶液におけるｐＨとしては、例えば、３〜９をあげることができ、好ましくはｐＨ５〜８があげられ、通常ｐＨ７．４が汎用される。
用意される供試濃度は、生体分子と被験物質との関係等の各種試験条件に応じて適宜選択することが可能であるが、通常は、０．００１μＭ以上で、好ましくは０．１μＭ〜１ｍＭ程度の供試濃度であることが好ましい。より具体的には、生体分子が蛋白質性分子である場合には、例えば、１μＭ〜１ｍＭ程度の供試濃度をあげることができる。特に、生体分子がアルブミン等の哺乳動物の血清由来の蛋白質である場合には、例えば、１μＭ〜０．２ｍＭ程度の供試濃度を好ましいものとしてあげることができる。
【００１０】
次いで、準備された試料溶液について、上記のような公知の方法（例えば、国際特許出願第ＷＯ００／７９２６８（Ａ３）号公開公報に記載される方法、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ４３，  １９８６−１９９２  （２０００）  に記載される方法）に準じて、生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化を検出すればよい。このような検出には、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ３０００（ビアコア社製：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｒｅ．ｃｏｍ）等の市販の装置を利用すればよい。
尚、下記（ａ）〜（ｃ）の方法については、例えば、国際特許出願第ＷＯ００／７９２６８号公開公報、国際特許出願第ＷＯ９７／０９６１８号公開公報、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ４３，  １９８６−１９９２  （２０００）  、ビアコア社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｒｅ．ｃｏｍ）、米国特許第５４９２８４０号、米国特許第５４３６１６１号、米国特許第５３１３２６４号等に詳細な説明が記載されている。
（ａ）少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）の調製方法、
（ｂ）前項（ａ）記載の生体分子（リガンド）を有するセンサーチップの調製方法、
（ｃ）前項（ｂ）記載のセンサーチップを用いて、生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出する方法、
【００１１】
さらに、被験物質の溶解性を高めるために、測定系内に、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の水溶性有機溶媒を添加してもよい。例えば、ジメチルスルホキシドの場合には、その添加濃度は、例えば、２０％以下で、好ましくは２％〜１０％である。
【００１２】
本発明方法における第二工程は、検出された変化に対応するデータから、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルであって、かつ、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを少なくとも１つ以上含む複数の数学モデルにより、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出する工程である。
当該工程において使用される、生体分子が被験物質との１種類以上の結合サイトを持つことが表現された複数の数学モデルには、生体分子が被験物質との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデル（即ち、複結合サイト型数学モデル）を少なくとも１つ以上含む。当該複結合サイト型数学モデルと他の単結合サイト型数学モデルとを組み合わせた、複数の数学モデルからなる数学モデルセットを使用することが本発明の一つの重要な技術的事項である。さらに加えて、本発明の他の重要な技術的事項である、後述の複数の数学モデルから所望のモデル（好ましくは、最適なモデル）を選択することにより確定した、前記生体分子と前記被験物質との結合率を利用すること（即ち、第三及び四工程）により、結果として特定な生体分子と特定な被験物質との生理的条件を考慮した結合率を予測することが可能となり、より現実的な評価結果を得ることができるようになる。
当該両技術的事項は、過度の試験を伴う試行錯誤の結果（複結合サイト型数学モデルと、生体分子と被験物質との結合率との両者に着目し、使用回数や使用日数等に応じたセンサーチップの劣化等を気にせずに、常にほぼ一定の値（結合率）に基づく前記生体分子と前記被験物質との相互作用の評価が可能となると判断した。）として新たに見出されたものである。
【００１３】
まず、第一工程において検出された変化に対応するデータ（具体的には、ＲＵ（≒ｐｇ／ｍｍ２）として表示される「結合量」）から、例えば、数２で示されるような、下記の複数の数学モデル（数２参照：数式１〜数式３で示される３つの数式）により、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーター（具体的には、ＲＵｍａｘとして表示される、被験物質（アナライト）の生体分子（リガンド）への「最大結合量」、及び、Ｋｄとして表示される、生体分子（リガンド）と被験物質（アナライト）との「解離定数」）を算出する。
尚、複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出するには、例えば、非線形最小ニ乗法等を利用すればよい。ここで、「非線形最小二乗法」とは、実験によって設定したｘに対する反応ｙに関して、（ｘ１，  ｙ１），  （ｘ２，  ｙ２），  （ｘ３，  ｙ３），  ・・・，  （ｘｎ，  ｙｎ）のｎ個のデータが得られたときに、ｙ＝ｆ（ｘ）となるような関数を求めたい場合に使用する手法であり、ｎ個のデータを使ってｆ（ｘ）の中に存在する定数を求める方法を意味している。
【００１４】
【数１】
Ｓ＝Σ（ｙｉ−ｆ（ｘｉ））２／ｗｉ
【００１５】
という新たな数式を定義し、Ｓが小さくなるように求めたい定数を変化させていきＳが最小と判断されたときに、それが求める定数であると判断する。尚、この計算においてデータの重みｗｉを１，ｙｉ，  ｙｉ２の中から適宜選択する。このような計算を行うアルゴリズムは、例えば、「ＭＵＬＴＩ」（Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｄｙｎ．  ４，  ８７９  （１９８１））と呼ばれているプログラムとして公開されており、それを利用すればよい。実際には後述の実施例では、８種類の試料溶液の濃度（希釈系列）毎に表面プラズモン共鳴シグナルの変化に対応するデータ（即ち、結合量）を測定しているので、当該データ数は最大８個となり、これらのデータを使って、当該複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーター（即ち、ＲＵｍａｘ：被験物質の生体分子への最大結合量、及び、Ｋｄ：生体分子と被験物質との解離定数）を算出することになる。
【００１６】
【数２】
2004257741.tif 000002
【００１７】
ここで、数式１及び２は、生体分子が被験物質との１種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデルとして使用され、また数式３は、生体分子が被験物質との２種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデルとして使用する。
【００１８】
また、ここで、
「結合量」：ＲＵで示されており、第一工程において検出された変化に対応するデータ（測定値）を意味する。但し、正確には、検出された変化に対応する生データには試料溶液を調製するために使用される溶媒等の影響が含まれているため、別途作成された補正用検量線により補正された数値を使用する。通常４〜１０種類程度（希釈系列）の被験物質（アナライト）の試料溶液の濃度毎に存在する値である。
Ｃ：被験物質（アナライト）の「試料溶液の濃度」を意味する（既知の数値）。通常は、４〜１０種類程度の供試濃度（希釈系列）が用意される。
Ｏｆｆｓｅｔ：試験誤差等の「原因未特定の結合量」
ＲＵｍａｘ：被験物質（アナライト）の生体分子（リガンド）への「最大結合量」
ＲＵｍａｘｉ：被験物質（アナライト）の生体分子（リガンド）が有する「サイトｉへの最大結合量」
Ｋｄ：生体分子（リガンド）と被験物質（アナライト）との「解離定数」
Ｋｄｉ：生体分子（リガンド）が有する結合サイトｉと被験物質（アナライト）との「結合サイトｉでの解離定数」
を意味している。
【００１９】
このようにして複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出するには、コンピュータを利用することが好ましく、そのために必要となるコンピュータプログラム（即ち、本発明プログラム）、当該コンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（即ち、本発明記録媒体）、当該記録媒体を有する分析装置（即ち、本発明分析装置）も本発明に含まれることは言うまでもない。
【００２０】
本発明方法における第三工程は、算出された各々の結合パラメーターにより、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出する工程である。
【００２１】
第二工程において算出された各々の結合パラメーター（即ち、ＲＵｍａｘ：被験物質の生体分子への最大結合量、及び、Ｋｄ：生体分子と被験物質との解離定数）により、前記生体分子と前記被験物質との結合率を算出するには、
（ａ）まず、結合サイト数（ｎ）を１つの結合パラメーター（ＲＵｍａｘ：被験物質の生体分子への最大結合量）を利用して、数３で示されるような、下記の数式（数３参照）により算出する。
尚、数式３（即ち、生体分子が被験物質との２種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデル）の場合には、２種類の結合サイト毎に各々の結合サイト数（ｎ１、ｎ２）を算出する。
【００２２】
【数３】
2004257741.tif 000003
【００２３】
ここで、
ＲＵｍａｘ：被験物質（アナライト）の生体分子（リガンド）への「最大結合量」
ＲＵＡｌｂ：センサーチップに固定された「生体分子（リガンド）の量」
ＭＷｄｒｕｇ：被験物質（アナライト）の分子量
ＭＷＡｌｂ：生体分子（リガンド）の分子量
を意味している。
【００２４】
（ｂ）次いで、結合薬物濃度（Ｃｂ）及び非結合薬物濃度（Ｃｆ）の両者を、算出された結合サイト数（ｎ）及び他の１つの結合パラメーター（Ｋｄ：生体分子と被験物質との解離定数）の両者を利用して、数４で示されるような、下記の数式（数４参照）により算出する。
尚、数４で示される数式のうち、上段の数式は、生体分子が被験物質との１種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデルであり、下段の数式は、生体分子が被験物質との２種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデル）であって、２種類の結合サイト毎の各々の結合サイト数（ｎ１、ｎ２）を利用して算出する。
【００２５】
【数４】
2004257741.tif 000004
【００２６】
ここで、
Ｃｂ：結合薬物濃度
Ｃｆ：非結合薬物濃度
［Ａｌｂ］：
ｎ：生体分子（リガンド）が有する結合サイトでの結合サイト数
ｎ１：生体分子（リガンド）が有する結合サイト１での結合サイト数
ｎ２：生体分子（リガンド）が有する結合サイト２での結合サイト数
Ｋｄ：生体分子（リガンド）と被験物質（アナライト）との「解離定数」
Ｋｄ１：生体分子（リガンド）が有する結合サイト１と被験物質（アナライト）との「結合サイト１での解離定数」
Ｋｄ２：生体分子（リガンド）が有する結合サイト２と被験物質（アナライト）との「結合サイト２での解離定数」
を意味している。
【００２７】
（ｃ）そして最後に、生体分子と被験物質との結合率を、上記（ｂ）のようにして算出される結合薬物濃度（Ｃｂ）及び非結合薬物濃度（Ｃｆ）の両者を利用して、数５で示されるような下記の数式（数５）により算出する。具体的な算出手段としては、例えば、マイクロソフト社製のエクセルＴＭにおけるゴールシーク機能を利用して、ＣｂとＣｆとの和が目的の薬物濃度（例えば、血漿中の薬物濃度の代表値として１０μＭを設定）となるように、Ｃｂ及びＣｆを求めることにより、生体分子と被験物質との結合率を算出する手段をあげることができる。
尚、上記（ｂ）で算出される結合薬物濃度（Ｃｂ）及び非結合薬物濃度（Ｃｆ）の両者が、生体分子が被験物質との１種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデル（上記（ｂ）数４で示される数式のうち、上段の数式）であれば、生体分子が被験物質との１種類の結合サイトを持つ場合における、生体分子と被験物質との結合率が算出でき、また、上記（ｂ）で算出される結合薬物濃度（Ｃｂ）及び非結合薬物濃度（Ｃｆ）の両者が、生体分子が被験物質との２種類の結合サイトを持つことが表現された数学モデル（上記（ｂ）数４で示される数式のうち、下段の数式）であれば、生体分子が被験物質との２種類の結合サイトを持つ場合における、生体分子と被験物質との結合率が算出できる。
【００２８】
【数５】
2004257741.tif 000005
【００２９】
ここで、
Ｃｂ：結合薬物濃度
Ｃｆ：非結合薬物濃度
を意味している。
【００３０】
このようにして生体分子と被験物質との結合率を算出するには、コンピュータを利用することが好ましく、そのために必要となるコンピュータプログラム、当該コンピュータプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体（即ち、本発明記録媒体）、当該記録媒体を有する分析装置（即ち、本発明分析装置）も本発明に含まれることは言うまでもない。尚、当該コンピュータプログラムは、通常、複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターを算出する部分プログラム及び算出された各々の結合パラメーターにより、生体分子と被験物質との結合率を算出する部分プログラムの両者からなるものである。
【００３１】
本発明方法における第四工程は、検出された変化に対応するデータを解析するために用いた複数の数学モデルの中から、前記生体分子と前記被験物質との結合様式を適切に表しているような所望の数学モデル（好ましくは、最適な数学モデル）を選択することによって、前記生体分子と前記被験物質との生理的条件を考慮した結合率を確定する工程である。前記生体分子と前記被験物質の結合様式を適切に表しているような所望の数学モデルを選択する際には、前記複数の数学モデルによりシミュレートされた結合量（予想値）と検出された変化に対応するデータ（実測値）とを１つ以上のグラフで表示し、実測値と予想値との合致度から、前記生体分子と前記被験物質の結合様式を適切に表しているような所望の数学モデル（好ましくは、最適な数学モデル）を選択することができる。また、複数の数学モデルで個別に解析した際に、結果とともに得られる赤池の情報量規準（マイコンによる薬物体内動態解析法、ｐ８９、南江堂）を複数の数学モデル間で比較することによって、前記生体分子と前記被験物質の結合様式を適切に表しているような所望の数学モデルを選択してもよい。
【００３２】
本発明方法における第五工程は、確定された結合率に基づき前記生体分子と前記被験物質との相互作用を評価する工程である。当該工程により、結果として特定な生体分子と特定な被験物質との生理的条件を考慮した結合率を利用することにより、前記相互作用についてのより現実的な評価結果を得ることができるようになる。
第四工程により確定された結合率が高い値（例えば、目安としては９０％以上）であれば、当該被験物質は、当該生体分子との相互作用が存在すると判断でき、逆に第四工程により確定された結合率が低い値（例えば、目安としては前記値未満）であれば、当該被験物質は、当該生体分子との相互作用が低いと判断することができる。このようにして、確定された結合率に基づき前記生体分子と前記被験物質との相互作用を評価すればよい。
【００３３】
もちろん、第四工程により確定された結合率と、対照（即ち、基準物質において同様にして確定された結合率とを比較することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を評価してもよい。この場合にはいかなる方法を用いて比較してもよいが、例えば、コンピュータを利用して自動化するような場合には、基準物質における結合率を予め蓄積したデータベースにアクセスすることにより、対照との比較を行い、これにより得られる差異に基づき、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を評価してもよい。例えば、当該評価では、被験物質での結合率が対照（基準物質での結合率）よりも高い値であれば、該被験物質は該基準物質よりも当該生体分子との相互作用が高いと評価する。一方、被験物質での結合率が対照（基準物質での結合率）よりも低い値であれば、該被験物質は該基準物質よりも当該生体分子との相互作用が低いと評価する。
【００３４】
さらに、本発明方法により評価された、生体分子と被験物質との相互作用に基づき、所望の薬物動態学的性質を有する被験物質を探索・選抜することにより、薬物のスクリーニングを行うこともできる。
【００３５】
【実施例】
以下に、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  （第一工程：被験物質の複数の供試濃度における、表面プラズモン共鳴シグナル変化の検出）
まず、各種の基本測定条件を以下に記載した。
＜基本測定条件＞
１．被験物質の複数の供試濃度における、表面プラズモン共鳴シグナル変化の検出には、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ３０００（ビアコア社製）が使用された。キャリヤー液には、５％ＤＭＳＯが含有された等張リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、組成（ｌＬ中）：Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ／ＫＨ２ＰＯ４／ＮａＣｌ＝１９．３ｇ／１．７ｇ／４．１ｇ）が使用された。測定温度は２５℃とした。流速は３０μｌ／ｍｉｎとした。洗浄液には、５０％ＤＭＳＯ水溶液、再生液には、１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．０）：エチレングリコール＝１：１の溶液、及び等張リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）：エチレングリコール＝１：１の溶液が使用された。
２．生体分子（リガンド）には、ヒト由来の血清アルブミンおよびラット由来の血清アルブミンが使用された。
３．金属薄膜からなるセンサーを有するセンサーチップには、カルボキシメチルで修飾されたデキストラン高分子化合物上に、ガラス保護された金薄膜が積層されてなるセンサーチップであるＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（ビアコア社製）が使用された。
４．上記のセンサーチップに上記の生体分子（リガンド）を結合させるには、国際特許出願第ＷＯ００／７９２６８号公開公報の第４１頁第２５行〜第４２頁第４行に記載されるようなアミンカップリングによる固定化方法が使用された。
５．被験物質としては、Ｎａｐｒｏｘｅｎが使用された。
６．試料溶液を調製するために使用される溶媒には、ＤＭＳＯ（被験物質濃度２０ｍＭ）が使用された。
７．８種濃度（１．２５μＭ〜１６０μＭ）に調製された被験物質の試料溶液が準備された。
８．ＤＭＳＯ検量線用試料として、７種の濃度（４．５％〜６．０％）に調製されたＤＭＳＯの試料溶液が２組準備された。
次に、基本操作手順を以下に記載した。
＜基本操作手順＞
１．センサーチップ上の４つのフローセル（以下セルと略す）の内、セル２にヒト血清由来のアルブミン（Ｓｉｇｍａ社より購入）を、セル４にラット血清由来のアルブミン（Ｓｉｇｍａ社より購入）を、それぞれアミンカップリング法により固定化し、これを、リガンドを固定したセンサーチップ上のセルとして使用した。一方、セル１及び３については未修飾のまま、これを何も固定していないリファレンスセルとして使用した。
２．まず、試料溶液を調製するために使用されるＤＭＳＯによる影響（バルクレスポンス）が、リガンドを固定したセンサーチップ上のセルと何も固定していないリッファレンスセルとで異なるため、これを補正する際に使用するＤＭＳＯ検量線を作成するための測定を行った。なお、ＤＭＳＯ検量線を作成するための測定は、被験物質の測定の前後に１回ずつ行った。
３．次に、各種濃度に調製された被験物質の試料溶液を準備し、これらを試料とした測定を行った。
４．次に、４つのセルで検出された変化に対応するデータ値（ＲＵ：結合量）を用い、リガンドを固定したセル（セル２及びセル４）と何も固定していないリッファレンスセル（セル１及びセル３）での測定値について、前者から後者を差し引いた補正データ値（ＲＵ：結合量）を求めた。
５．次に、上記４記載の補正データ値（ＲＵ：結合量）に対して、上記１記載のバルクレスポンスの補正を行い、正確なデータ値（ＲＵ：結合量）を求めた。
因みに、これらの試験条件は、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ４３，  １９８６−１９９２  （２０００）  に記載される実験条件とほぼ同様な条件であった。
＜測定結果＞
ＤＭＳＯ検量線用試料およびＮａｐｒｏｘｅｎの試料溶液を検体とした時の、各セルにおけるセンサーへの結合量（表面プラズモン共鳴シグナル変化量、単位：ＲＵ）、および基本操作手順３の補正を行った値（ＲＵ：結合量）を表１に示す。
ＤＭＳＯ検量線用試料における測定値は、Ｎａｐｒｏｘｅｎの試料溶液の測定の前後で測定した同一の濃度の試料について平均値を算出し、セル２の値からセル１の値を差し引いた値とセル１の値との間で回帰式を算出し、同様に、セル４の値からセル３の値を差し引いた値とセル３の値との間で回帰式を算出した（表２参照）。
表１に示された結合量について、表２に示されたＤＭＳＯの検量線を用いてバルクレスポンスの補正を行った値（補正結合量）を表３に示す。尚、バルクレスポンスの補正は以下の数６又は数７で示される数式により行った。
【００３７】
【数６】
補正結合量＝［セル２−セル１］−（［セル１］×［傾き］＋［切片］）
【００３８】
又は
【００３９】
【数７】
補正結合量＝［セル４−セル３］−（［セル３］×［傾き］＋［切片］）
【００４０】
【表１】
2004257741.tif 000006
【００４１】
【表２】
2004257741.tif 000007
【００４２】
【表３】
2004257741.tif 000008
【００４３】
実施例２  （第二工程：検出変化に対応するデータからの、複数の数学モデルにおける各々の結合パラメーターの算出）
実施例１において検出された変化に対応するデータ（ＲＵ：結合量）から、前述の３種類の数学モデル（数２参照：数式１〜数式３で示される３つの数式）により、当該３種類の数学モデルにおける２種類の結合パラメーター（ＲＵｍａｘ：被験物質の生体分子への最大結合量、Ｋｄ：生体分子と被験物質との解離定数、及びＯｆｆｓｅｔ：試験誤差等の原因未特定の結合量を含めた合計９個のパラメータ）を、非線形最小二乗法（データ数は８個）を利用して算出した。
実施例１に記載した表３の数値を用い、数２で示される３種類の数学モデル（数式１〜数式３で示される３つの数式）について、非線形最小二乗プログラムＭＵＬＴＩを利用して、結合パラメータを算出した。得られた結合パラメータを表４に示す。
【００４４】
【表４】
2004257741.tif 000009
【００４５】
実施例３  （第三工程：各々の結合パラメーターからの、生体分子と被験物質との結合率の算出）
まず、数２における数式１又は２で表される１種類の結合サイトを持つ数学モデルでは、１つの結合パラメーター（ＲＵｍａｘ：被験物質の生体分子への最大結合量）を利用して、前述の数式（数３参照）により、１種類の結合サイトでの結合サイト数（ｎ）、数２における数式３で表される２種類の結合サイトを持つ数学モデルでは、１種類の結合サイトを持つ数学モデルと同様にして、２種類の結合サイト毎での各々の結合サイト数（ｎ１、ｎ２）を算出した。
なお、セル２に結合したヒト血清アルブミン量１１０８０．１及びセル４に結合したラット血清アルブミン量７７９４．２を用いて、結合サイト数を算出した。得られた結合サイト数を表５に示す。
【００４６】
【表５】
2004257741.tif 000010
【００４７】
次いで、数２における数式１又は２で表される１種類の結合サイトを持つ数学モデルでは、算出された１種類の結合サイトでの結合サイト数（ｎ）、及び、生体分子と被験物質との解離定数（Ｋｄ）を利用し、また、数２における数式３で表される２種類の結合サイトを持つ数学モデルでは、２種類の結合サイト毎での各々の結合サイト数（ｎ１、ｎ２）、及び、生体分子と被験物質との解離定数（Ｋｄ１，Ｋｄ２）を利用し、表５に示された結合サイト数及び血清アルブミン濃度の血清中濃度の代表値として６００μＭを用いて、前述の数式（数４参照）により、非結合薬物濃度（Ｃｆ）が０．００１μＭ〜１０μＭの濃度における結合薬物濃度（Ｃｂ）を算出した。
次に、算出された結合薬物濃度（Ｃｂ）と非結合薬物濃度（Ｃｆ）との和が１０μＭ（血漿中の薬物濃度の代表値として設定）となるような、Ｃｆをマイクロソフト社製のエクセルＴＭにおけるゴールシーク機能を利用して求め、この時のＣｂを算出した。
そして最後に、結合薬物濃度（Ｃｂ）と非結合薬物濃度（Ｃｆ）を数５に代入して、数２における３種類の数学モデルに対応する生体分子と被験物質との結合率をそれぞれ算出した。得られた結合率のうち、ヒト血清アルブミンに関する結合率を表６に示す。またラット血清アルブミンに関する結合率を表７に示す。
【００４８】
【表６】
2004257741.tif 000011
【００４９】
【表７】
2004257741.tif 000012
【００５０】
実施例４  （第四工程：所望の数学モデルの選択による、被験物質の結合率の確定）
実施例３で使用した３種類の数学モデルの中から、検出された変化に対応するデータ（ＲＵ：結合量）を最も適切に表現したモデルを選択するために、検出された変化に対応するデータ（ＲＵ：結合量）と、数２に示された３種類の数学モデルによりシミュレートされる結合量を３種類の異なるグラフでそれぞれ表示した（図１参照）。３種類の異なるグラフとして、濃度に対して結合量をプロットしたグラフ（図１上段）、低濃度領域で濃度に対して結合量をプロットしたグラフ（図１中段）、結合量に対して、結合量と濃度との比をプロットしたグラフ（図１下段）を利用した。図中の黒丸は、表３に示されたヒト血清アルブミンに関する結合量（ＲＵ：結合量）を意味し、また図中の実線は前記３種類の数学モデルによりシミュレーションされた結合量（予想量）を意味している。検出された変化に対応するデータ（黒丸）と、各数学モデルによりシミュレートされた結合量（実線）が最も一致していると考えられる数学モデルを目視により、図１の場合には数式３で示される数学モデルが最適であると判断できた。表６から明らかなように、数式３で示される数学モデルを利用して求めた結合率は、９９．２２％であり、これを被験物質（Ｎａｐｒｏｘｅｎ）と生体分子（ヒト血清アルブミン）との生理的条件を考慮した結合率として確定した。
【００５１】
実施例５  （確定された結合率に基づいた、生体分子と被験物質との相互作用の評価）
実施例４での手順と同様にして生理的条件を考慮した結合率を得る操作を、１日１回で８回繰り返した。このようにして得られた結合率（％）の変化（図２左欄：本発明方法）と、被験物質（Ｎａｐｒｏｘｅｎ）の濃度が８０μＭの時である場合の結合量（ＲＵ）の変化（図２右欄：従来方法）とを図２に示した。
その結果、図２から明らかなように、本発明方法では、結合率に経日変化は認められず、センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた劣化による影響を回避できることが確認された。これに対して従来方法では、結合量に経日変化が認められ、８日後には初日の３分の２程度の感度に減じるような劣化が確認された。
このように、本発明では、結合量を結合率に変換すること等により、センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた劣化による影響を回避することに成功した。
また、当該結合率は実施例４で確定されたように、９９．２２％という極めて高い値であることから、当該被験物質は、当該生体分子との相互作用が存在すると判断することができた。
【００５２】
実施例６  （生体分子と被験物質との相互作用の評価（その２））
Ｎａｐｒｏｘｅｎの代わりに他の被験物質を用いて、ヒト血清アルブミンに対する結合率を実施例１〜６に記載される方法と同様な方法により確定した。その結果を表８に示す。
表８から明らかなように、Ｗａｒｆａｒｉｎ  におけるヒト血清アルブミンに対する結合率が、Ｎａｐｒｏｘｅｎにおけるヒト血清アルブミンに対する結合率と同様に９０％以上の高い値であるから、これら被験物質は、当該生体分子との相互作用が存在すると判断することができた。一方、Ｄｉａｚｅｐａｍにおけるヒト血清アルブミンに対する結合率が９０％未満の低い値であるから、それら被験物質は、当該生体分子との相互作用の可能性が低いと判断することができた。
【００５３】
【表８】
2004257741.tif 000013
実施例６  （再現性）
１２種類の各種化合物（化合物Ａ〜化合物Ｌ）を用いて、ヒト血清アルブミンに対する結合率を実施例６と同様にして確定する操作を３回繰り返した。その結果を表９に示す。変動係数が１０％未満で、バラツキの少さい評価ができることが確認された。
【００５４】
【表９】
2004257741.tif 000014
【発明の効果】
本発明により、少なくとも１つ以上の、金属薄膜からなるセンサー表面に結合された生体分子（リガンド）、を有するセンサーチップを用いて、当該生体分子と被験物質（アナライト）との結合状態を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により生じる表面プラズモン共鳴シグナルの変化として検出し、検出された変化に対応するデータを解析することにより、前記生体分子と前記被験物質との相互作用を予測する方法において、前記センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた劣化による影響を回避できるような、生体分子と薬物との相互作用の予測方法等が提供可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３で使用した３種類の数学モデルの中から、検出された変化に対応するデータ（ＲＵ：結合量）を最も適切に表現したモデルを選択するために、検出された変化に対応するデータ（ＲＵ：結合量）と、数３に示された３種類の数学モデルによりシミュレートされる結合量を３種類の異なるグラフ（左から数式１、数式２、数式３の順である。）でそれぞれ表示した図である。３種類の異なるグラフとして、濃度に対して結合量をプロットしたグラフ（上段）、低濃度領域で濃度に対して結合量をプロットしたグラフ（中段）、結合量に対して、結合量と濃度との比をプロットしたグラフ（下段）を利用した。図中の黒丸は、表３に示されたヒト血清アルブミンに関する結合量（ＲＵ：結合量）を意味し、また図中の実線は前記３種類の数学モデルによりシミュレーションされた結合量（予想量）を意味している。検出された変化に対応するデータ（黒丸）と、各数学モデルによりシミュレートされた結合量（実線）が最も一致していると考えられる数学モデルを目視により、数式３で示される数学モデルが最適であると判断できる。
【図２】図２は、確定された結合率に基づいた生体分子と被験物質との相互作用の評価が従来方法に比較して優れることを示した図である。実施例５において、実施例４での手順と同様にして生理的条件を考慮した結合率を得る操作を１日１回で８回繰り返して得られた結合率（％）の変化（左欄：本発明方法）と、被験物質（Ｎａｐｒｏｘｅｎ）の濃度が８０μＭの時である場合の結合量（ＲＵ）の変化（右欄：従来方法）とを示した。図から明らかなように、本発明方法では、結合率に経日変化は認められず、センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた劣化による影響を回避できることが確認できる。これに対して従来方法では、結合量に経日変化が認められ、８日後には初日の３分の２程度の感度に減じるような劣化が確認される。
【図１】
2004257741.tif 000015
【図２】
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