(57)【要約】【課題】本発明の課題は、結合アッセイの欠点を持たず、一般に用いられる活性アッセイよりも効率の良い、転写活性調節因子の生物活性の決定のための信頼できる容易な方法を提供することである。【解決手段】本発明は、以下の段階を含む、化合物の生物活性を決定するための新規な方法を提供する：a）宿主を化合物と接触させる段階；b）宿主の全般的な転写性遺伝子応答を決定する段階；および、c）前記化合物によって誘導された全般的な転写性遺伝子応答を定量する段階。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子転写を調節しうる化合物の生物活性を決定するための新規な方法であって、以下の段階を含む方法：
a）宿主を化合物と接触させる段階；
b）宿主の全般的な転写性遺伝子応答（general transriptional gene response）を決定する段階；および
c）該化合物によって誘導された全般的な転写性遺伝子応答を定量する段階。
【請求項２】
全般的な転写性遺伝子応答がDNAアレイ技術によって決定される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
DNAアレイ技術がオリゴヌクレオチドアレイ技術である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
化合物が修飾化合物である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
修飾化合物が修飾タンパク質である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
修飾タンパク質がペグ化タンパク質である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ペグ化タンパク質が、ペグ化タンパク質特異的な、単離されたアイソフォームである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
ペグ化タンパク質がEpoまたはINFである、請求項6または7記載の方法。
【請求項９】
転写性に調節される遺伝子が、配列番号：1〜29からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
修飾タンパク質の相対的な転写活性が、修飾化合物の生物活性と未修飾化合物の生物活性との比を算出することによって決定される、修飾化合物の相対的な生物活性を決定するための方法であって、以下の段階を含む方法：
修飾化合物および各々の未修飾化合物の生物活性を請求項1〜7のいずれか一項記載の方法によって測定する段階。
【請求項１１】
修飾化合物が化学的または酵素的に修飾された化合物である、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
修飾化合物がペグ化タンパク質である、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
第2の化合物の存在下で測定された第1の化合物の生物活性が該第2の化合物の非存在下で測定された第1の化合物の生物活性と有意に異なる場合に、遺伝子転写を間接的に調節する化合物が同定される、遺伝子転写を間接的に調節する化合物を同定するための方法であって、以下の段階を含む方法：
遺伝子転写の既知の調節因子である第1の化合物の生物活性を第2の化合物の存在下または非存在下で請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によって決定する段階。
【請求項１４】
遺伝子転写の既知の調節因子がEpoまたはIFNである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子転写を調節する、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法によって同定された化合物。
【請求項１６】
遺伝子転写を調節する化合物を同定するための、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法の使用。
【請求項１７】
請求項1〜14のいずれか一項記載の方法を実施するための構成要素を含むキット。
【請求項１８】
構成要素がDNAアレイを含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
請求項15記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項15記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の、疾患、好ましくはウイルス疾患または癌の治療用の医薬品の調製のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子転写を調節しうる化合物の生物活性を決定するための新規な方法、ならびに、本方法に基づく、化合物の相対的な生物活性の決定のための方法、および遺伝子転写を調節しうる化合物の同定のための方法に関する。本発明の方法は、罹患した細胞および組織の内部での遺伝子転写の調節に依存する疾患の治療に有用と思われる化合物を同定するために特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖またはウイルス防御などの細胞機能を調節する化合物の生物活性は一般に、これらの因子および/または化合物の、天然型または組換え型の受容体に対する結合活性の増加または減少を、インビトロで、または細胞系結合アッセイにおいて測定することによって決定される。化合物の生物活性の評価のためのこれらのアッセイの欠点は、結合親和性が化合物の結合活性と必ずしも相関しないという事実にある。
【０００３】
より直接的かつしたがってより信頼性の高い、化合物の生物活性測定は、細胞増殖アッセイ、細胞生存アッセイまたは細胞遊走アッセイなどの公知のアッセイによって行うことができる。しかし、このようなアッセイ、特に大規模スクリーニングは手間がかかる。多くの場合、この種の細胞活性を調節する化合物は遺伝子転写も調節する。このため、このような化合物の生物活性は遺伝子転写の調節を測定することによって決定されうる（これは一般にレポーターアッセイによって行われる）が、これには適したレポーター構築物を発現する組換え細胞の作製が必要である。または、このような化合物の生物活性を、適した標的遺伝子の発現を測定することにより、例えば、ノーザンブロット分析または定量的PCRにより決定することもできるが、しかしこれは効率的でない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、結合アッセイの欠点を持たず、一般に用いられる活性アッセイよりも効率の良い、転写活性調節因子の生物活性の決定のための信頼できる容易な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚いたことに、化合物によって転写性に調節される遺伝子のシグナル強度の定量化を含む、前記化合物によって誘導される全般的な転写性遺伝子応答の決定に基づく新規方法により、前記化合物の生物活性をより確実に決定できうることが明らかになった。
【０００６】
本発明は、遺伝子転写を調節しうる化合物の生物活性を決定するための新規な方法であって、以下の段階を含む方法を提供する：a）宿主を化合物と接触させる段階；b）宿主の全般的な転写性遺伝子応答を決定する段階；およびc）前記化合物によって誘導された全般的な転写性遺伝子応答を定量する段階。好ましくは、前記化合物の生物活性は、段階c）で定量したシグナル強度の正規化平均差の合計によって得られる。本発明のより好ましい1つの態様において、全般的な転写性遺伝子応答はDNAアレイ技術によって決定される。さらにより好ましい1つの態様において、アレイ技術はオリゴヌクレオチドアレイ技術である。DNAアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイは、高密度DNAアレイまたはオリゴヌクレオチドアレイであることが好ましい。このようなアレイ、および、このようなアレイを用いるDNAまたはRNAの分析方法は、例えば、欧州特許第0834575号、欧州特許第0834576号、国際公開公報第96/31622号、米国特許第5837832号または国際公開公報第98/30883号により、既に記載されている。国際公開公報第97/10365号は、高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いて非常に多数の遺伝子の発現レベルを観測するための方法を提供している。最も好ましい1つの態様において、オリゴヌクレオチドアレイはジーンチップ（GeneChip）アレイである。
【０００７】
本発明に係る方法においては、（１）遺伝子転写を調節しうる化合物の生物活性を決定するための新規な方法であって、以下の段階を含む方法であることを特徴とする：
a）宿主を化合物と接触させる段階；
b）宿主の全般的な転写性遺伝子応答（general transriptional gene response）を決定する段階；および
c）該化合物によって誘導された全般的な転写性遺伝子応答を定量する段階。
【０００８】
また、本発明に係る方法においては、（２）全般的な転写性遺伝子応答がDNAアレイ技術によって決定される、上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明に係る方法においては、（３）DNAアレイ技術がオリゴヌクレオチドアレイ技術である、上記(2)記載の方法であることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明に係る方法においては、（４）化合物が修飾化合物である、上記(1)〜(3)のいずれか一つ記載の方法であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る方法においては、（５）修飾化合物が修飾タンパク質である、上記(4)記載の方法であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る方法においては、（６）修飾タンパク質がペグ化タンパク質である、上記(5)記載の方法であることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る方法においては、（７）ペグ化タンパク質が、ペグ化タンパク質特異的な、単離されたアイソフォームである、上記(6)記載の方法であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明に係る方法においては、（８）ペグ化タンパク質がEpoまたはINFである、上記(6)または(7)記載の方法であることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係る方法においては、（９）転写性に調節される遺伝子が、配列番号：1〜29からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子である、上記(1)〜(8)のいずれか一つ記載の方法であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る方法においては、（１０）修飾タンパク質の相対的な転写活性が、修飾化合物の生物活性と未修飾化合物の生物活性との比を算出することによって決定される、修飾化合物の相対的な生物活性を決定するための方法であって、以下の段階を含む方法であることを特徴とする：
修飾化合物および各々の未修飾化合物の生物活性を上記(1)〜(7)のいずれか一つ記載の方法によって測定する段階。
【００１７】
また、本発明に係る方法においては、（１１）修飾化合物が化学的または酵素的に修飾された化合物である、上記(8)記載の方法であることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る方法においては、（１２）修飾化合物がペグ化タンパク質である、上記(9)記載の方法であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る方法においては、（１３）第2の化合物の存在下で測定された第1の化合物の生物活性が該第2の化合物の非存在下で測定された第1の化合物の生物活性と有意に異なる場合に、遺伝子転写を間接的に調節する化合物が同定される、遺伝子転写を間接的に調節する化合物を同定するための方法であって、以下の段階を含む方法であることを特徴とする：
遺伝子転写の既知の調節因子である第1の化合物の生物活性を第2の化合物の存在下または非存在下で上記(1)〜(9)のいずれか一つ記載の方法によって決定する段階。
【００２０】
また、本発明に係る方法においては、（１４）遺伝子転写の既知の調節因子がEpoまたはIFNである、上記(13)記載の方法であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る化合物においては、（１５）遺伝子転写を調節する、上記(1)〜(14)のいずれか一つ記載の方法によって同定された化合物であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る使用においては、（１６）遺伝子転写を調節する化合物を同定するための、上記(1)〜(14)のいずれか一つ記載の方法の使用であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係るキットにおいては、（１７）上記(1)〜(14)のいずれか一つ記載の方法を実施するための構成要素を含むキットであることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る方法においては、（１８）構成要素がDNAアレイを含む、上記(17)記載の方法であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る組成物においては、（１９）上記(15)記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る使用においては、（２０）上記(15)記載の化合物または薬学的に許容されるその塩の、疾患、好ましくはウイルス疾患または癌の治療用の医薬品の調製のための使用であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、以下の段階を含む、化合物の生物活性を決定するための新規な方法が提供された：
a）宿主を化合物と接触させる段階；
b）宿主の全般的な転写性遺伝子応答を決定する段階；および
c）前記化合物によって誘導された全般的な転写性遺伝子応答を定量する段階。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本明細書で用いる「全般的な転写性遺伝子応答」という用語は、応答性のある宿主において前記化合物によって調節される遺伝子のシグナル強度の正規化平均差の合計によって得られる、化合物の生物活性を指す。全般的な転写性遺伝子応答の決定は、処理した宿主由来の標識cDNAを、DNAアレイ、またはより好ましくはオリゴヌクレオチドアレイとハイブリダイズさせることによって行われる。次に、例えば、（非制限的な例として）共焦点レーザースキャナ（Hewlett Packard、米国）を用いてアレイの生データを測定し、一般に知られた方法を用いてピクセルレベルを分析する。各遺伝子の発現レベルを、ミスマッチオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションとの比較による強度の正規化平均差として算出し、任意単位（AD）で表現する。差次的に発現する遺伝子を選択するために、以下の4つの基準を適用する：（1）処理細胞の強度値は未処理細胞の強度値よりも少なくとも2倍高い；（2）処理細胞における強度値は少なくとも50任意単位（AD）、またはそれを上回らねばならない；（3）未処理細胞の強度値は50AD未満でなければならない；（4）標準偏差は平均差の変化の絶対値よりも有意に小さくなければならず、遺伝子の信頼水準の算出値は97％超（p値＜0.03）に設定する必要がある。続いて、化合物によって誘導された宿主の全般的な転写性遺伝子応答を、シグナル強度の正規化平均差の合計（任意単位の合計、ΣAD）を求めることによって定量化する。
【００２９】
以下に記載する非制限的な例により、本発明の新規方法によって得られた結果が結合アッセイよりも確実に生物活性と相関しており、かつ効率的であるというさらなる利点も有することが示される。それらはまた、本発明の方法による全般的な転写性遺伝子応答の決定が、個々の遺伝子または選択した少数の遺伝子の転写発現レベルの決定よりも信頼性が高いことも示している。
【００３０】
本発明の方法に用いられる宿主は、トランスジェニック動物またはノックアウト動物を非制限的に含む、非ヒト生物の個体全体；肝臓、心臓、腎臓を非制限的に含む、任意の種に由来する特定の種類の組織、または、血液細胞もしくは組織から単離された初代細胞などの初代細胞単離物、または細胞系のいずれでもよい。本発明による化合物の生物活性の決定に用いられる宿主は、関心対象の化合物に対して応答性でなければならない。本明細書で用いる「応答性である」という用語は、宿主が化合物に応答して遺伝子の転写の増加または減少を示しうることを指す。非制限的な一例として、黒色腫細胞株ME15（国際公開公報第02/18633号におけるCNCM I-2546）は、本発明の方法によるPEG-IFNまたはPEG-IFNアイソフォームの生物活性の決定に用いうる。
【００３１】
一般に用いられる活性アッセイ、またはレポーターアッセイもしくはノーザンブロット法などの遺伝子転写の決定のための方法との比較による本発明の主な利点とは、本方法がレポーター構築物をトランスフェクトした任意の細胞系の調製を必要としないこと、および、転写性に調節される多数の遺伝子の容易かつ効率的な分析が可能になること、したがって活性アッセイをより効率的かつ確実なものにすることである。さらに、図4に示されているように、結合活性は必ずしも生物活性とは相関しないが、全般的な転写性遺伝子応答の決定に基づく化合物の転写活性の決定値は相関する。このため、本発明の方法により、結合アッセイよりも化合物の生物活性をより正確に決定することが可能になる。
【００３２】
1つの態様において、本明細書において上述された本方法の化合物は修飾化合物であり、より好ましくは修飾タンパク質、さらにより好ましくはペグ化タンパク質であり、または最も好ましくは、ペグ化タンパク質特異的な、単離されたアイソフォームである。ペグ化タンパク質は、エリスロポエチン（EPO）またはインターフェロン（IFN）であることが好ましい。
【００３３】
本明細書で用いる「PEG-IFN」という用語には、任意の天然材料（例えば、白血球、線維芽細胞、リンパ球）もしくはそれに由来する材料（例えば細胞系）に由来するIFN-α、または組換えDNA技術を用いて調製された材料が含まれる。IFNαのクローニングおよびその直接発現（特に大腸菌における）の詳細は多くの刊行物の主題となっている。組換えIFNαの調製は、例えば、Goeddelら（1980）Nature 284、316-320および（1981）Nature 290、20-26、ならびに欧州特許第32134号、第43980号および第211148号によって知ることができる。IFNαには、IFNαI、IFNα2などの多くの種類があり、さらにIFNα2A、IFNα2B、IFNα2CおよびIFNαII（IFNαIIまたはω-IFNとも呼ばれる）を非制限的に含むサブタイプがある。「IFNα」という用語には、Amgenから入手しうるコンセンサスIFNα、または天然および/もしくは組換えIFNαの混合物も含まれる。IFNα2Aの使用が好ましい。IFNα2Aの製造については欧州特許第43980号および第211148号に記載されている。
【００３４】
IFN-αをポリアルキレングリコール（置換型または非置換型）などのポリマー、例えばポリエチレングリコールと結合させるとPEG-IFN-α結合物が形成される。結合は、当技術分野で知られた種々のリンカー、特に、例えば欧州特許出願第0510356号、同第0593868号および同第0809996号に記載されたものなどによって行われうる。ポリマー（ポリエチレングリコールが好ましい）の分子量は300ダルトン〜70,000ダルトンの範囲であってよく、かつ、1つまたは複数の、好ましくは1つ〜3つのポリマーをIFN-αと結合させてよい。好ましいPEG-IFN-α結合物は、下記式を有する：
【化１】
2004337154.tif 000002
ここでRおよびR'はメチルであり、XはNHであり、nおよびn'は独立してまたは共に、420または520のいずれかである。
【００３５】
本明細書で上述した方法のもう1つの好ましい態様において、転写性に調節される遺伝子は、配列番号：1〜29からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子であるが、これらは表1にも列挙されている。
【００３６】
本発明の方法は、任意の種類の宿主における遺伝子転写を調節する任意の化合物の分析に適している。遺伝子転写の調節には、遺伝子転写のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの両方が含まれる。
【００３７】
本明細書で上述した方法は、修飾化合物および各々の未修飾化合物の生物活性を上述の方法によって測定する段階を含む、修飾化合物の相対的な生物活性を決定するための方法の基本原理であって、ここで、修飾タンパク質の相対的な転写活性は、修飾化合物の生物活性と未修飾化合物の生物活性との比を算出することによって決定される。修飾化合物は、化学的または酵素的に修飾された化合物であることが好ましい。より好ましくは、修飾化合物はペグ化タンパク質である。したがって、本方法は、修飾化合物の生物活性をその未修飾カウンターパートと比較するための簡単なアッセイを提供する。 1つの好ましい態様において、本発明は、アイソフォームの混合物から、最も好ましくはペグ化タンパク質から単離された、生物活性が最も高い化合物のアイソフォームを選択することを可能にする。
【００３８】
本発明の方法によって生物活性を決定しうる化合物には、遺伝子転写を調節しうる任意の化合物が含まれる。これらの化合物は、タンパク質、ポリペプチド、核酸、高分子または低分子のいずれでもありうる。多くのタンパク質、ポリペプチド、核酸、高分子または低分子は、転写因子として作用することによって直接的に、または、最終的に遺伝子転写をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートするシグナル伝達カスケードを誘導することによって、もしくは代替的に、遺伝子転写を調節する他の化合物を妨げることによって間接的に、遺伝子転写を調節することができる。本発明の方法によって生物活性を決定しうる化合物の以下の一覧は、本発明の方法を用いうる、タンパク質およびポリペプチドを含むさまざまな種類の化合物を非制限的な様式で例示するものである。
【００３９】
これらの非制限的な例には、転写因子である核内ホルモン受容体を誘導するレチノイン酸などのホルモンがある（A. Rowe、Retinoid X receptors、Int. J. Biochem. Cell Biol.、29 (1997)、275-278；およびCK. Glass、Some new twists in the regulation of gene expression by thyroid hormone and retinoic acid receptors、J. Endorinol、150 (1996)、349-357）。本発明の方法は、この種のホルモンおよびその核内ホルモン受容体の生物活性を決定するために用いることができ、かつこの種の核内ホルモン受容体の転写活性を妨げる化合物を同定するために用いることもできる。したがって、本発明は、例えば、RXRまたはLXRなどの核内ホルモン受容体の阻害物質の同定および分析を行うために有用である。
【００４０】
核内ホルモン受容体を活性化するホルモンの他に、最終的には遺伝子転写の調節に至るシグナル伝達カスケードを活性化する他のホルモンの生物活性を決定するために、本発明の方法を用いることもできる。非制限的な一例として、この種のホルモンには、遺伝子転写を調節することが知られたエリスロポエチン（Epo）が含まれる（Z.Z. Chongら、Hematopoietic factor erythropoietin foster neuroprotection through novel signal transduction cascades、J. Cereb. Blood Flow Metab.、22 (2002)、503-514；D.M. WojchowskiおよびT.C. He、Signal transduction in the erythropoietin receptor system、Stem. Cells、11 (1993)、381-392；J.L. Spivak、The mechanism of action of erythropoietin、Int. J. Cell Cloning、4 (1986)、139-166；ならびにL. Mulcahy、The erythropoietin receptor、Semin. Oncol. 28 (2001)、19-23）。
【００４１】
サイトカインおよび増殖因子は、遺伝子転写の調節に至るシグナル伝達カスケードを誘導することが知られている。したがって、非制限的な一例として、本発明の方法を用いて、サイトカインおよび増殖因子のアゴニストまたはアンタゴニストを同定すること、ならびにそれらの生物活性を決定することもできる。このようなサイトカインおよび増殖因子には、インターフェロン、腫瘍壊死因子、血管内皮増殖因子が非制限的に含まれる（T. HanadaおよびA. Yoshimura、Regulation of cytokine signaling and inflammation、Cytokine Growth Factor Rev.、13 (2002)、413-421；ならびにY. Satoら、Properties of two VEGF receptors, Flt-1 and KDR, in signal transduction、Ann. N Y. Acad. Sci.、902 (2000)、201-207）。
【００４２】
このほかに、本発明の方法を用いて、修飾型または変異型のタンパク質またはポリペプチドの生物活性を決定することもできる。修飾は、化学的修飾または酵素的修飾のいずれでもよい。この用途の非制限的な一例は、ペグ化インターフェロンの異なるアイソフォームの生物活性の決定であり、これは本明細書に添付された図に示されている。したがって、本発明により、修飾化合物およびそれぞれの未修飾化合物の生物活性を本明細書で上述した方法によって測定する段階を含む、修飾化合物の相対的な生物活性の決定が提供されるが、ここで、修飾タンパク質の相対的な転写活性は、修飾化合物の生物活性と未修飾化合物の生物活性との比を算出することによって決定される。修飾化合物は、化学的または酵素的に修飾された化合物であることが好ましい。最も好ましくは、修飾化合物はペグ化タンパク質である。
【００４３】
本発明の方法を、下流事象として遺伝子転写の調節を引き起こしうる、酵素の調節因子の同定および特徴決定のために用いることもできる。このような酵素の非制限的な一例は、ホスホジエステラーゼ（PDE）、好ましくはPDE4、最も好ましくはPDE4Dイソ酵素である。PDE4Dイソ酵素は、PDE4D1、PDE4D2、PDE4D3、PDE4D4、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D7およびPDE4D8からなる群より選択されることが好ましい。PDEは、遺伝子転写を調節しうる二次メッセンジャーであるサイクリックAMPを分解する（G.S. McKnight、Cyclic AMP second messenger systems、Curr. Opin. Cell Biol.、3 (1991) 213-7）が、強力なPDE阻害物質は遺伝子転写を調節することが示されている（B. Wagnerら、7-Benzylamino-6chloro-2piperazino-4-pyrrolidino-pteridine, a potent inhibitor of cAMP-specific phosphodiesterase, enhancing nuclear protein binding to the CRE consensus sequence in human tumour cells、Biochemical Pharmacology、63（2002）659-668；Y. Nishioら、Cilostazol、a cAMP phosphodiesterase inhibitor, attenuates the production of monocyte chemoattractant protein-1 in response to tumor necrosis factor-alpha in vascular endothelial cells、Hormone & Metabolic Research、29 (1997) 491-495）。したがって、本発明の方法を、この種の酵素の調節因子のスクリーニングに用いることもできる。
【００４４】
同定および分析が可能な化合物の中には、機能性抗体もある。機能性抗体とは、それが結合したタンパク質の機能を阻害または刺激する抗体のことである。この種の抗体は数多くの標的タンパク質に対して産生されており、これらの抗体の一部には治療的価値もある。その非制限的な一例として抗Her2/ErbB2抗体があり、これはハーセプチン（Herceptin）抗体とも呼ばれる。これらの抗体を用いた乳癌の治療が成功している。それらは、乳癌を含む多くの種類の癌で中心的な役割を果たすヒト上皮増殖因子受容体Her2/ErbB2の活性化を阻害することによって機能する。他の多くの増殖因子受容体と同様、Her2はそのリガンドと結合すると、遺伝子転写の調節を含むシグナル伝達を媒介する。ハーセプチンはHer2/ErbB2を発現する細胞における遺伝子転写を調節しうることが示されている（A.H. Talukderら、Antihuman epidermal growth factor receptor 2 antibody herceptin inhibits autocrine motility factor (AMF) expression and potentiates antitumor effects of AMF inhibitors、Clin. Cancer Res. 8 (2002)、3285-3289；およびR. Mandlerら、Modification in synthesis strategy improve the yield and efficacy of geldanamycin-herceptin immunoconjugates、Bioconjugate Chemistry、13 (2002)、786-791）。現在、8種類の別々のハーセプチン抗体が存在し、さらにそれ以上も産生される可能性がある。一般に、機能性抗体の場合には、どの抗体が最も高い生物活性を示し、かつ治療用途に最も適すると考えられるかを判定するために、本発明の方法が用いられうる。したがって、本発明の方法はまた、抗体の生物活性を決定するため、例えば、阻害性または刺激性の抗体の同定のためにも適している。1つの好ましい態様において、抗体は治療的価値のある抗体である。より好ましい1つの態様において、抗体はハーセプチン抗体である。
【００４５】
ホルモン、サイトカイン、増殖因子、酵素などの第2の化合物の生物活性を阻害または刺激することによって間接的に作用する化合物の同定および分析のために、本発明は、遺伝子転写の既知の調節因子である第1の化合物の生物活性を第2の化合物の存在下または非存在下で本明細書で上述した方法によって決定する段階を含む、遺伝子転写を間接的に調節する化合物を同定するための方法を提供するが、ここで、前記第2の化合物の存在下で測定した第1の化合物の生物活性が前記第2の化合物の非存在下で測定した第1の化合物の生物活性と有意に異なる場合に、遺伝子転写を間接的に調節する化合物が同定される。
【００４６】
本発明は、本明細書で上述した、遺伝子転写を調節する方法によって同定された化合物を提供する。遺伝子転写を調節する化合物を同定するための、本明細書で上述した方法の使用も同じく提供される。本発明は、本明細書で上述した方法を実施するための構成要素を含むキットも提供する。前記構成要素はDNAアレイ、より好ましくはオリゴヌクレオチドアレイを含むことが好ましい。
【００４７】
さらに、本明細書で上述した方法によって同定された化合物、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物も提供する。任意の好都合な担体材料を利用することができる。担体材料は、経腸投与、経皮投与または非経口的投与のために適した有機材料または無機材料でありうる。適した担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、ワセリンなどが含まれる。さらに、薬学的製剤が他の薬学的に活性な物質を含んでもよい。着香料、安定剤、乳化剤、緩衝剤などの補足的な添加物を薬剤配合の慣例に従って添加してもよい。
【００４８】
さらに、本発明は、薬学的組成物の製造のための方法であって、化合物を本発明の方法によって同定する段階、同定された化合物を修飾する段階、および、得られた化合物を薬学的に許容される担体または希釈剤とともに製剤化する段階を含む方法も提供する。
【００４９】
本発明はまた、本明細書で上述した方法によって同定された化合物または薬学的に許容されるその塩の、疾患、好ましくはウイルス性疾患またはガンの治療用の医薬品の調製のための使用も提供する。
【００５０】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される」という用語は、適切な医学的判断の範囲において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症をもたらすことなく、妥当な恩典/リスク比に相応して、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適している、化合物、材料、組成物および/または剤形を指す。
【００５１】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される塩」とは、親物質がその酸性塩または塩基性塩を生じることによって修飾された、同定された作用物質の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、ならびにカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが非制限的に含まれる。薬学的に許容される塩には、非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の、従来の非毒性塩または四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような従来の非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来する塩；および、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。
【００５２】
特に前記の例に関連した、本明細書で上述した方法、化合物、キットおよび使用も、同じく主張される。
【００５３】
ここまで本発明の一般的な説明を行ってきたが、これは、具体的な例（これらは例示のみを目的として本明細書に含まれるものであり、別に特記しない限り、制限を意図したものではない）を、添付の図面とともに参照することにより、さらに良く理解されると考えられる。
【実施例】
【００５４】
IFNの抗ウイルス的および抗増殖的な役割
インターフェロンα-2a（IFN）は、抗ウイルス応答および抗増殖応答の媒介において、ならびに免疫応答の調節において、重要な役割を果たす（G.R. Stark、How cells respond to interferons、Annu. Rev. Biochem. 67 (1998)、227-264）。これらの生物活性のために、IFNは疾患の発病の阻害因子として重要となり、かつウイルス感染症および一部の癌の治療に有用となった（S. Zeuzemら、Peginterferon alfa-2a in patients with chronic hepatitis C、New England Journal of Medicine 343 (2000)、1666-72）。1986年以来、組換えヒトIFN（ROFERON-A）はウイルス性疾患および腫瘍性疾患の患者を治療するための重要な治療薬となってきた（S. Zeuzemら、Peginterferon alfa-2a (40 kDa) monotherapy: a novel agent for chronic hepatitis C therapy、Expert Opinion on Investigational Drugs 10 (2001)、2201-2213）。
【００５５】
臨床施設におけるIFN療法の成功は、IFNの血清中半減期が短い（4時間〜6時間）ため、ある程度限定的である。IFNの濃度は静脈内投与または皮下投与から3時間〜8時間後に最高となり、各投与後の血清中濃度は大きく変動しうる。24時間後には体内に残存する外因性IFNの量が無視しうる程度となるため、週3回の投与方式では、抗ウイルス活性に必要な濃度が維持される可能性は低い（J.M. Harrisら、Pegylation: A novel process for modifying pharmacokinetics、Clin. Pharmacokinet. 40 (2001)、539-551；P. Bailonら、Rational design of a potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated Interferon-2a for the treatment of hepatitis C、Bioconjugate Chem. 12 (2001)、195-202）。
【００５６】
IFNの投与頻度は疾患に依存的である。例えば、IFNの標準的な治療的適用は、300万国際単位を週3回、最長48週間にわたって皮下投与することからなるが（J.M. Harrisら、Pegylation: A novel process for modifying pharmacokinetics、Clin. Pharmacokinet. 40 (2001)、539-551）、一方である種の腫瘍性適応には毎日の投与が必要でありうる（P. Bailonら、Rational design of a potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated Interferon-2a for the treatment of hepatitis C、Bioconjugate Chem. 12 (2001)、195-202）。IFNの薬物動態上および薬力学上の特性を改良するために、IFNにポリ（エチレングリコール）（PEG）が結合された。
【００５７】
数年前から、種々のPEGのサイズおよびPEGの種類がインビトロおよびインビボでの生物活性に及ぼす影響を評価するための研究が行われている。これらの結果から、PEGの特徴と生物活性との間の重要な相関が示された。例えば、分枝状PEG部分は線状PEG結合よりもより効果的にIFNを覆い隠してタンパク質分解から防御すると考えられ、かつさらにタンパク質の吸収特性および分布特性を向上させると考えられる。もう1つの影響は、PEG部分の分子量が大きくなるほど治療分子の隙間（clearance）が低下し、これによりウイルスに対する持続的な曝露が生じることである（J.M. Harrisら、Pegylation: A novel process for modifying pharmacokinetics、Clin. Pharmacokinet. 40 (2001)、539-551）。この知見と最近のペグ化手順の進歩とが相まって、持続性で分枝状のモノペグ化IFNが開発された（P. Bailonら、Rational design of a potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated Interferon-2a for the treatment of hepatitis C、Bioconjugate Chem. 12 (2001)、195-202）。
【００５８】
アミド結合によって分枝状の40kDa PEGと結合したインターフェロンα-2a（PEG-IFN）は持続的な吸収および腎クリアランスの低下を示し、その結果、週1回の投与スケジュール全体にわたって強力な抗ウイルス圧が得られる（M.C. PerryおよびB. Jarvis、Peginterferon-α-2a (40 kD): A review of its use in the management of chronic hepatitis C、Drugs 15 (2001)、2263-2288；ならびにM.W. LambおよびE.N. Martin、Weight Based versus fixed dosing of peginterferon (40 kDa) alfa-2a、The Annals of Pharmacotherapy 36 (2002)、933-938）。このPEG-IFN混合物の特徴分析により、リジンがモノペグ化された9種の位置異性体であるK31、K49、K70、K80、K112、K121、K131、K134およびK164が示された。位置異性体はいずれも、抗ウイルスアッセイにおけるMDBK細胞のウイルス防御を誘導した。
【００５９】
実施例1：PEG-IFNの調製
PEG-IFNはホフマン-ラ・ロシュ社（Hoffmann-La Roche Inc.）により製造された。ペグ化インターフェロンα-2aは、インターフェロン分子表面のリジンのε-アミノ基と分子量40000Daの活性化された分枝状ポリエチレングリコール誘導体との結合によって調製された（Bailon, P.ら、Rational design of a potent, long-lasting form of interferon: A 40 kDa branched polyethylene glycol-conjugated Interferon-2a for the treatment of hepatitis C、Bioconjugate Chem. 12 (2001)；195-202；欧州特許第809996号）。PEG-IFNの異性体の単離および特徴決定については以下に述べる。他のすべての試薬および化学物質は入手しうる最も高純度のものとした。
【００６０】
PEG-IFNはモノペグ化IFN分子の混合物からなる。各分子中では1個のリジンがPEG部分の結合によって化学修飾され、これにより複数種の混合物が生じる。リジンが11個、および遊離N末端アミノ基が1つ存在するために、12種のモノペグ化種が予想されるが、9種のリジン修飾種しか見いだせなかった（K31、K49、K70、K83、K112、K121、K131、K134およびK164）。
【００６１】
実施例2：PEG-IFN位置異性体の精製および特徴分析
本発明者らは、これらの種の効率的な分離を可能にする調製用二段階クロマトグラフィー法を開発した。調製された位置異性体の純度は分析用イオン交換法によって検査することができ、これについては例えば、図1の溶出プロフィールを参照されたい。分離は、タンパク質部分に存在するペグ化部位の差異に起因する異性体の局所的な電荷の違いに基づく。ベースラインの吸収がクロマトグラムの終わりに近づくにつれて減少することは、さらに長い保持時間で溶出するIFNのモノペグ化種が他に存在しないことを示唆する。二段階分離によって9種の位置異性体が精製され、これらの異性体の特徴決定により、ペグ化側が全てリジン上にあることが示されている：K31、K49、K70、K83、K112、K121、K131、K134およびK164。
【００６２】
実施例3：位置異性体の分離
二段階での単離および精製方式を用いて、PEG-インターフェロンα2aのモノペグ化アイソフォームを調製した。
【００６３】
a）第1の段階は、弱い陽イオン交換マトリックスを用いた調製用低圧液体クロマトグラフィーカラムによる位置異性体の分離とした（TOSOH-BIOSEP、Toyopearl CM-650S、樹脂バッチ番号82A：イオン交換能力は123mEq/mlであり、カラムの直径は16mm、長さは120cm）。酢酸ナトリウム濃度を徐々に高める直線的なpH勾配（25mMでpH 4.0から75mMでpH 7.8まで）を流速0.7mL/分で適用した。検出は280nmとした。このクロマトグラフィー段階により、種1、2、5、6、ならびに種3、4、4a、7および8の混合物を収集することができた（表1参照）。
【００６４】
b）これらの画分を第2の調製段階でさらに分離および精製した。上記の分析用の強力な陽イオン交換カラムと同じマトリックスを用いるが、寸法がそれより大きく（内径30mmおよび長さ70mm）、さらに流速が大きく流出期間の長い調製用カラムを用いた。分析方法に関しては、3.4mM酢酸ナトリウム、10％エタノールおよび1％ジエチレングリコールをpH 4.4に調整したもの（緩衝液A）によってカラムをあらかじめ平衡化した。PEG-IFN試料のローディング後にカラムを緩衝液Aで洗い、その後、10mMリン酸水素二カリウム、10％エタノールおよび1％ジエチレングリコールをpH 6.6に調整したもの（緩衝液B）まで高める直線的勾配を用いた。流速は1.0mL/分とし、検出は218nmで行った。
【００６５】
PEG-IFNα2a異性体のタンパク質濃度は、PEG-IFNα2aのタンパク質部分の280nm吸光度に基づき、分光法によって決定した。
【００６６】
180μgのPEG-IFNα2aを分析した溶出プロフィールを図1に示している。この方法の結果、8つのピークが分離され、うち2つのピークはベースライン分離であり、6つのピークは部分分離である。ベースラインの吸収がクロマトグラムの終わりに近づくにつれて減少することにより、さらに長い保持時間で溶出するIFNα2aのモノペグ化種が他には存在しないことが示唆される。
【００６７】
さらに、IEC-クロマトグラムを詳細に観察したところ、検出限界に近いもう1つのピークがピーク2と3との間に認められ、このことから、PEG-IFNα2a混合物の比活性に同じく寄与すると考えられるもう1つの位置異性体の存在が示された。インターフェロンα-2a分子にはペグ化部位が12個認められるため（リジン11個およびN末端）、さらに別の種も予想された。しかし、これらの種の存在量が少なかったため、単離および特徴決定は行えなかった。
【００６８】
最適なIEC動作によって得られた異性体試料を、単離直後（t＝0）および5℃で2週間保存した後に調べた。分光法によって測定されたタンパク質含量に関して、IECピークに由来するタンパク質についての有意な差は観察されず、モノペグ化部位、オリゴ-PEG-IFNα2aの含量、凝集物の量およびバイオアッセイ活性についても変化は全く検出されなかった。個々の異性体の相対的存在量（IEC法により決定）および比活性（抗ウイルスアッセイにより決定）を考慮に入れると、単離に用いたPEG-IFNα2a混合物の生物学的比活性のほぼすべてが回収された（約93％）。
【００６９】
IEC画分中の他の位置異性体の混入に関して、個々の異性体の純度を確かめるために分析用IE-HPLCを用いた。ピーク2、3、4、4a、5および7の純度は98％を上回り、ピーク1および8は93％であり、ピーク6は88％であった。
【００７０】
（表１）異性体のLys-C消化スペクトルと標準対照物質との比較によって同定されたPEG-ペプチド
2004337154.tif 000003
a132〜133は小さすぎて検出されず
a,bRP-HPLC
【００７１】
これらの画分の特徴分析を、本明細書に記載の方法によって行った。
【００７２】
実施例4：質量分析ペプチドマッピングによる画分の分析
質量スペクトルをMALDI-TOF MS装置（PerSeptive Biosystems Voyager-DE STR、遅延引き出しを用いる）によって記録した。各IEC（イオン交換クロマトグラフィー）画分を透析によって脱塩し、0.02M 1,4-ジチオ-DL-トレイトール（DTT）によって還元した後0.2M 4-ビニルピリジンによってアルキル化した。続いて、pH 8.5の0.25M Tris（トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン）中にて、エンドプロテイナーゼLys-C（Wako Biochemicals）により、酵素：タンパク質比を概ね1：30としてタンパク質を消化した。反応を37℃で一晩行った。
【００７３】
20mg/mlのα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸および12mg/mlのニトロセルロース（アセトン/イソプロパノール40/60（v/v）中）の溶液をマトリックスとして用いた（薄層で適用）。まず、0.5μLのマトリックスを標的の上に載せて乾燥させた。続いて、試料1.0μLを添加した。加速電圧20.000Vおよびグリッド電圧95％とした直線的陽イオン化モードでのスペクトルを得た。スポット全域をカバーする少なくとも190回のレーザーショットを各スペクトルに関して蓄積した。Des-Arg1-ブラジキニンおよびウシインスリンを内部較正のために用いた。
【００７４】
実施例5：高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）ペプチドマッピング
ペプチドの特徴分析を逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）ペプチドマッピングによって行った。MALDI-TOF MSペプチドマッピングに関して説明した通りに、IEC画分を還元し、アルキル化した後、エンドプロテイナーゼLys-Cで消化処理した。消化された異性体の分析は、Waters Alliance HPLCシステムにより、Vydac RP-C18分析用カラム（5μm、2.1×250mm）および同じ充填材料を用いるプレカラムを用いて行った。溶出は1％〜95％アセトニトリル（水中）勾配により、105分にわたり流速0.2mL/分で行った。いずれの溶媒にも0.1％（v/v）TFAを含めた。100μLの各消化試料を注入し、215nmでモニタリングした。
【００７５】
実施例6：未消化タンパク質のMALDI-TOFスペクトル
トランス-3-インドールアクリル酸の18mg/ml溶液（アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸70/30（v/v）中）を同じ容積の試料溶液とあらかじめ混合した。続いて1.0μLの混合物を標的表面に適用した。通常は平均150〜200回のレーザーショットを直線的陽イオン化モードで用いた。加速電圧は25.000V、グリッド電圧は90％に設定した。ウシアルブミンM＋およびM２＋を外部較正のために用いた。
【００７６】
実施例7：SE-HPLC（サイズ排除HPLC）
SE-HPLCは、TosoHaas TSK ゲルG 4000 SWXLカラム（7.8×300mm）を装着したWaters Alliance 2690 HPLCシステムを用いて行った。タンパク質を、0.02M NaH２PO４、0.15M NaCl、1％（v/v）ジエチレングリコールおよび10％（v/v）エタノール（pH 6.8）を含む移動相によって流速0.4mL/分で溶出させ、210nmで検出した。注入量は各異性体20μgとした。
【００７７】
サイズ排除HPLCおよびSDS-PAGEを用いて、種々のIEC画分におけるオリゴ-PEG-IFNα2a形態および凝集物の量を決定した。対照材料は2.3％凝集物および2.2％オリゴマーを含む。
【００７８】
ピーク1、4、4a、5、6および8は0.7％未満のオリゴペグ化IFNα2a形態を含み、一方、ピーク2、3および7におけるオリゴペグ化IFNα2a形態の割合は検出限界を下回った（＜0.2％）。凝集物に関しては異なる傾向を認めることができた。すなわち、いずれのピークにおいても凝集物の量は0.9％未満である。
【００７９】
実施例8：SDS-PAGE
非還元条件および還元条件の両方の下で、16％のTris-Glycineゲル（1.5mm、10ウェル）を用いてSDS-PAGEを行った。質量範囲が2.5kDa〜200kDaであるNovex Mark 12分子量マーカーを較正のために用い、ウシ血清アルブミン（BSA）を感度標準（2ng）として用いた。全試料の約1μgおよび標準物質の0.5μgをゲルに適用した。泳動条件は、125Vおよび6Wで120分間とした。タンパク質を固定し、Novex社の銀染色キットSilverXpressを用いて染色した。
【００８０】
非還元条件下でIEC画分1〜8に関して記録したゲルは、PEG-IFNα2a標準対照物質と同等のパターンを示す。
【００８１】
還元条件下のゲルは、標準物質と比較して約90kDaのマイナーバンドの強度の増加を示す。ピーク6、7および8に関しては6kDa〜10kDaの複数のタンパク質断片が認められる。これらの双方のバンド全体で、消化した（clipped）材料の約1％に相当する。異性体1、5、6、7、8のレーンにおいて100kDaを上回る別のバンドが認められるが、これらはまた標準物質にも存在する。これらはオリゴマーと見なされうる。このように、SDS-PAGEにより、SE-HPLC分析の結果が裏づけられる。
【００８２】
まとめると、RP-HPLC実験およびSDS-PAGE実験により、IEC画分の純度がPEG-IFNα2a標準対照物質と同等と見なされうることが示される。
【００８３】
9種のIEC画分に由来するPEG-IFNα2a種の構造を、上述の戦略を用いた上記の方法の結果に基づいて同定した。
【００８４】
実施例9：インビトロ抗ウイルス防御活性
単離された異性体の抗ウイルス活性を、Madin-Darbyウシ腎臓（MDBK）細胞に対する水疱性口内炎ウイルス（VSV）の細胞変性作用の低下によって評価した。細胞系は10％ウシ胎仔血清を含むMEM培地中で培養した。有効濃度の検出のために、異性体およびPEG-IFNを最終濃度10ng/ml（アッセイ開始濃度）に希釈した。この有効濃度（EC５０）を、細胞の50％をVSVから防御するのに必要な濃度として決定した。すべての測定において、PEG-IFN異性体の添加から4時間後に、細胞培養物をVSVにに供した。37℃で18時間増殖させた後に、細胞をクリスタルバイオレット（crystal violet）（登録商標）によって染色し、無傷細胞の数を決定した。
【００８５】
9種の位置異性体の抗ウイルス活性を決定するために、EC50値を測定した。このアッセイではPEG-IFNを基準物質として試験した。
【００８６】
図2Aは、異性体の比活性（U/μg、グレーのカラム）を示している。このアッセイではすべての位置異性体が活性を有していたが、そのレベルは異なっていた。異性体K31はPEG-IFNに対して170％の値を示し、K134は125％の値を示した。K164は混合物と等しかったが、K49、K70、K83、K112、K121およびK131の活性はそれよりも低かった。
【００８７】
実施例10：抗増殖活性アッセイ
このアッセイのためには、ヒト黒色腫転移性細胞（ME15）の初代細胞培養物を用いた。この細胞系は2000年8月17日に、ブダペスト条約の条項に準拠して、パスツール研究所の国立微生物培養物収集施設（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、Institut Pasteur、Paris）に登録名CNCM I-2546として寄託された。この細胞系を、10％FCS、2mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、10mM非必須アミノ酸およびHEPES緩衝液（いずれもGibco Life Sciences、英国より購入）を添加したRPMI培地中で培養した。集密に達した時点で、細胞をトリプシン処理によって継代した。平底96ウェルプレートにおける1ウェル当たり約5000個〜6000個の細胞を、個々の濃度のIFN、PEG-IFNおよび異性体の存在下または非存在下における5日間の細胞増殖アッセイの出発点として用いた。続いて、生細胞の数を、テトラゾリウム塩MTSのホルマザンへの分解の比色的検出に基づく細胞染色キット（Promega、Madison、米国）を用いて決定した。MTS反応溶液を製造者の推奨に従って添加して37℃に4時間おき、この期間の後に、490nmでの吸収を分光計で記録した。
【００８８】
異性体の抗増殖性比活性は、IFN感受性黒色腫細胞株（ME15）および市販のアッセイを用いて決定した。位置異性体および、基準物質としてのPEG-IFNを、濃度100U/mlで用いた（図2B）。実験に用いた異性体の生物単位（U）を定義し、PEG-IFNを標準対照物質として用いて、本明細書で上述した抗ウイルスアッセイにおいて決定した。
【００８９】
本アッセイではいずれの異性体も活性があり、異性体K31はPEG-IFNに対して159％、K134は115％であった。K164はPEG-IFNと同じ活性を示し、他のすべての異性体は対照物質よりも活性が低かった。
【００９０】
この結果によって、活性は、本質的には抗ウイルスアッセイにおける活性と同じ順序にランク付けされるが、これは、同じ活性が共通の誘因またはシグナル伝達事象に由来することを示す。
【００９１】
以上2つの実験において9種の位置異性体の比活性が異なることの説明の1つとして、それぞれタンパク質安定性が異なることが考えられる。この点を明らかにするために、本発明者らは、ME15細胞株を用いた経時的な実験において、いくつかの異性体を別々の濃度で検討した。本発明者らは、最も活性が高かった異性体であるK31およびK134、ならびに最も活性の低かった異性体であるK121を選択し、基準物質としてのIFNおよびPEG-IFNとともに用いた（図3参照）。種々の濃度のIFN、PEG-IFNおよび位置異性体（500U/ml、125U/mlおよび15U/ml）を、5日間にわたるME15細胞の処理に用いた。24時間毎に細胞数を計測した。
【００９２】
この場合も、本発明者らは上記の抗増殖活性との顕著な相関を見いだし、K134が最も活性が高く、次に高いのはK31およびPEG-IFNであった。予想通り、活性が最も低かったのはK121およびIFNであった。
【００９３】
濃度を低下させることによって増殖阻害が減少することが確認されうる。興味深いことに、PEG-IFNを濃度500U/mlで用いると、5日後に125U/mlで用いた異性体K134と同じ抗増殖活性が認められるが、一方、IFNおよびK121は少なくとも125U/mlの濃度で用いた場合も5日後の抗増殖活性はほとんどまたは全く認められなかった。
【００９４】
3種類の独立した生物学的アッセイにより、本発明者らは、PEG部分の分子内結合部位と生物活性との相関を実証した。要約すると、異性体K31およびK134は一貫して市販の混合物よりも高い比活性を示したが、残りの7種の異性体は市販の混合物（K164）と同程度の比活性を有していた。活性の範囲が170％〜20％であったことは、位置異性体間のタンパク質の比活性の違いが顕著であることを示している。
【００９５】
実施例11：インターフェロン受容体2の組換え細胞外ドメインの大腸菌由来の発現および精製
インターフェロン受容体2の細胞外ドメイン（IFNR2-EC）を、N末端His-Tag（登録商標）を有するpET15bベクター（Invitrogen、US）中にクローニングした。このベクター構築物を用いてIFNR2-ECを大腸菌内で発現させた。標的タンパク質は細胞内に封入体の形態で沈降した。十分量の培地中での発酵後に、大腸菌ペレットを、50mM Tris、10％サッカロース、0.02％アジ化ナトリウム、10mM塩化マグネシウムおよびEDTA非含有プロテアーゼ阻害薬を含む可溶化緩衝液中に再懸濁した。フレンチプレスによるホモジネート化および遠心処理（13000rpm）の後に、封入体を8M尿素中に溶解させた。第1のクロマトグラフィー段階は、0mM〜500mMイミダゾールの直線的勾配を10カラム倍量にわたって用いるニッケルキレートクロマトグラフィーとした。イミダゾールを除去するために、プールしたIFNR2のピークを8M尿素に対して透析した。この透析の後に、150mM Tris/HCL pH 8.0を含む8M尿素によって試料を0.1 A280に希釈し、Ellmanアッセイが陰性になるまで室温で保存した。再フォールディングのために、酸化されたIFNR2-ECを50mM Tris pH 8.4に対して透析した。50mM Tris pH 8.4を、第2のクロマトグラフィーの開始時緩衝液としても用いた。第2のクロマトグラフィー段階は、陰イオン交換樹脂（HiTrap Q HP、5×5ml、Amersham Biosciences）を用いて0mM〜500mM NaCl勾配でおこなった。
【００９６】
すべての精製段階を還元条件下および非還元条件下でのSDS-PAGEによって分析した。タンパク質の純度は、Superdex（登録商標）75および200 HR（PC 3.2/30、Amersham Biosciences）を用いる分析用サイズ排除クロマトグラフィーによってモニタリングした。このクロマトグラフィー法を、結合活性および能力の決定にも用いた（データは示さず）。
【００９７】
実施例12：光学的バイオセンサーシステムを用いた、IFNおよびPEG-IFN異性体とIFNR2-ECとの相互作用の特徴分析
IFNR2-ECの固定化はビオチンによる標識によって行った。このビオチン化タンパク質をストレプトアビジンセンサー表面（SA Sensor、BIAcore）に対して係留した。
【００９８】
ビオチン化は、タンパク質貯蔵溶液（10mM酢酸、pH 7.5）をHepes（10mM、pH 8.4）によって最終タンパク質濃度0.23mg/mlタンパク質（8.65μM）に希釈することによって行った。ビオチンアミドカプロエート-n-ヒドロキシスクシンイミドエーテル（Fluka）の8.65mM溶液（DMSO中）を上記溶液に添加して、ビオチン化試薬の最終濃度を86.5μMにした。この混合物を1時間反応させた後に、Hepes緩衝液（10mM、pH 8.4、150mM NaCl）に対して一晩透析し、低分子量の反応生成物を除去した。この溶液を固定化手順に用いた。固定化はビオチン化タンパク質を含む溶液をSAセンサー表面と接触させることによって行った。固定化されたタンパク質の量は接触時間によって調節した。結合実験のために、約4ng/mm2のタンパク質に相当する4000RUを固定化した。
【００９９】
結合実験は、Hepes緩衝液（10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％ポリソルベート20、pH 7.4）をランニングバッファーとして行った。インターフェロン溶液は、タンパク質の貯蔵溶液をランニングバッファーで希釈することによって調製した。すべての実験で流速は5μl/分に設定した。インターフェロン溶液を、5分間にわたって固定化IFNR2-ECと接触させた。
【０１００】
結合データの算出：
解離定数（KD）値は、1/1複合体の形成に関する単純な速度論モデルに基づく数学的フィッティングによる時間依存的応答曲線のフィッティングを行うことによって決定した。このフィッティングによってkｏｎ値およびkｏｆｆ値を得た。KDはkｏｆｆ/kｏｎ比を表す。
【０１０１】
表面プラスモン共鳴（SPR）などの非標識固相検出によるタンパク質の相互作用の検討には、互いに相互作用する化合物の一方の固定化が必要である。
【０１０２】
本発明者らは、IFNまたはIFNR2-ECをセンサー表面に固定化するために2種類のカップリング戦略を用いた。IFNをカルボキシル化デキストランセンサー表面の遊離アミノ基を介して固定化し、IFNR2-ECはビオチンで標識した上でストレプトアビジンセンサー表面に対して係留した。これら2種類のセンサーおよび対応するIFNをそれぞれ用いてIFNR2-EC結合試験を行った。速度定数および結合親和性に関して一貫した値が得られた。結果により、結合親和性が固定化法および固定化されたタンパク質に依存しないことが示された（データは示さず）。これらの予備的な試験は、異性体を用いる測定の精度を高めるため、および1/1複合体形成という単純な速度論モデルを検証するために必要であった。
【０１０３】
親和性および速度論的定数の決定のために、本発明者らは、生物学的比活性の活性範囲の全体をカバーする5種類の異性体（K31、K121、K131、K134およびK164）を用いた（図2A、図2B参照）。速度論的パラメーターおよび平衡パラメーターの有意性を高めるために、本発明者らは固定化されたIFNR2-ECに対して種々の濃度の異性体を用いる結合試験を行った。IFNおよびPEG-IFNを基準物質として用いた。1/1複合体の形成に関する速度論モデルに基づく結合曲線のフィッティングの結果を表2に示す。
【０１０４】
（表２）野生型IFN、PEG-IFNおよびいくつかの位置異性体の相互作用に関する速度論的定数
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【０１０５】
上記の表は、測定された親和性および速度論的データを示している。速度論的定数の算出は、1/1複合体形成に関する速度論的モデルに基づく。IFNR2-ECはビオチンで標識された。このビオチン化タンパク質をストレプトアビジンセンサー表面（SA Sensor、BIAcore）に対して係留した。結合実験では、Hepes緩衝液（10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％ポリソルベート20、pH 7.4）をランニングバッファーとして用いた。
【０１０６】
得られたKＤ値は、IFNのペグ化がINFR2-ECに対する親和性の低下を引き起こすことを示している。親和性の低下はペグ化の位置に依存する。親和性の変化は一般に会合定数（kｏｎ）の変化に起因する。例えば、異性体K134では親和性は概ね15倍変化する。kｏｎの減少は10倍を上回るが、kｏｆｆは約4倍増加するに過ぎない。
【０１０７】
異性体K31については、タンパク質濃度が極めて少量であったためにKＤの推定しか行えなかった。
【０１０８】
抗ウイルス性比活性または抗増殖性比活性によるデータをIFNR2-EC親和性試験と組み合わせると、図4に見られるように興味深い相関が観察された。これは、所定の異性体のIFNR2-EC親和性が高いほど（低KD）、生物学的比活性が低いことを示している。この相関は、KDが低く生物活性が高いリガンドを探索するために主として用いられる一般的な薬剤スクリーニングのドグマとは反対である。
【０１０９】
実施例13：異性体とIFNとの転写応答の比較
数千種の遺伝子の発現レベルの同時測定を可能にするDNAマイクロアレイにより、位置異性体がいかにしてゲノム規模での細胞代謝および調節に影響を及ぼすかを明らかにするための包括的な枠組みがもたらされる。
【０１１０】
IFNの転写活性に対するペグ化部位の影響を評価するために、本発明者らは、IFNにより誘導される黒色腫細胞株ME15の遺伝子発現パターンをオリゴヌクレオチドアレイ技術によって測定した。
【０１１１】
ME15細胞を、100U/mlのIFN、PEG-IFNまたはPEG-IFNアイソフォームとともに48時間インキュベートした。48時間後に培養細胞を剥離によって収集し、全細胞RNAをRNA-Bee（商標）によって抽出した。各試料からの全細胞RNA10μgを逆転写（Invitrogen、米国）し、標識（Ambion、米国）して、製造者の指示に従い市販のキットを用いて処理した。アルカリ加熱断片化およびその後のcDNAとU95Av2 GeneChipアレイとのハイブリダイゼーションは、マイクロチップの製造者（Affymetrix、米国）によって用意された標準的な手順でおこなった。オリゴヌクレオチドアレイ分析を行うための手順のさらなる例は、Fambroughら、Diverse signaling pathways activated by growth factor receptors induce broadly overlapping, rather than independent, sets of genes、Cell 97 (1999)、727-741に記載されている。
【０１１２】
アレイの生データを共焦点レーザースキャナー（Hewlett Packard、米国）を用いて測定し、GeneChip v3.1ソフトウエア（Affymetrix、米国）を用いてピクセルレベルを分析した。各遺伝子の発現レベルを、ミスマッチオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションとの比較による蛍光強度の正規化平均差として算出し、任意単位（AD）で表した。試料それぞれの測定を、3つの別々の細胞プレート由来の標識cRNAを用いて3回ずつ行った。
【０１１３】
未処理細胞と比較して、IFN、PEG-IFNまたはPEG-IFNアイソフォームによる処理後に差次的に発現する遺伝子に関して、以下の4つの基準を選択した：（1）処理細胞の強度値は未処理細胞の強度値よりも少なくとも2倍高い；（2）処理細胞における強度値は少なくとも50AD、またはそれを上回らねばならない；（3）未処理細胞の強度値は50AD未満でなければならない；（4）標準偏差は平均差の変化の絶対値よりも有意に小さくなければならず、かつ遺伝子の信頼水準の算出値は97％超（p値＜0.03）に設定される。
【０１１４】
これらの実験のために、本発明者らは抗増殖アッセイと同じ細胞系（ME15）を用いた。本発明者らは、100U/mlの各異性体またはIFNおよびPEG-IFNにより、細胞を48時間処理した。IFNを基準物質として用いた。この処理後にME-15細胞から全RNAを単離した。cRNAの調製法、ならびにハイブリダイゼーションおよびU95Av2 GeneChipアレイのスキャニングに至るその後の段階は上記の通りである。アガロースゲル電気泳動による処理前の全RNA試料の視覚的検査では、試料における分解または生成に関する徴候は全く認められなかった。各異性体、IFNおよびPEG-IFNに関する反復試験の数（n＝3）により、実験的なばらつきを明らかにするためのデータ解析用統計学的アルゴリズムを適用することが可能である。未処置細胞中では50AD未満であるが処置細胞中では少なくとも2倍にアップレギュレートされ、かつAD値は少なくとも50となる遺伝子を対象として、データ解析を行った。
【０１１５】
標準偏差は平均差の変化の絶対値よりも有意に小さくなければならず、遺伝子の信頼水準の算出値を97％超（p値＜0.03）に設定する必要がある。
【０１１６】
これらの基準を適用することにより、アップレギュレートされた遺伝子29種の発現プロファイルを観察した。この発現パターンにおいて、抗増殖経路および抗ウイルス経路に関与する13種の既知のIFN誘導性遺伝子はIFNよりも高度にアップレギュレートされた（表3）。階層クラスター（図5B）により、すべての異性体が転写活性を有するが、強度は異なることが示される。
【０１１７】
各アイソフォームおよびIFNに関して、誘導された遺伝子のADの合計（ΣAD）を決定し、IFNを基準物質として転写活性、抗ウイルス活性および増殖活性を比較した。抗ウイルス活性および抗増殖活性をPEG-IFNと比較して決定したとおり、生物活性が上昇したアイソフォームでは転写活性も高く、また一方、生物活性の低いアイソフォームの転写活性は低いこと、すなわち、生物活性と結合アッセイとの比較とは異なり、生物活性と転写活性との間には正の相関が存在することが、図5Aにより示される。
【０１１８】
全般的な転写性遺伝子応答に対する異性体の作用のほかに、個々の遺伝子のアップレギュレーションの違いも観察された。例えば、インターフェロンで誘導される核内リンタンパク質の遺伝子は、K134またはK131に対してよりもK49およびK31に対して曝露された時に高発現することが示されている。K49およびK31異性体では、K134またはK131よりも、全般的な転写性遺伝子応答が弱い。この観察所見により、関心対象の化合物の転写活性の決定のためには、個々の遺伝子または選択した少数の遺伝子の転写発現レベルを測定するのではなく、本発明の方法によって決定されるような全般的な転写性遺伝子応答を分析する必要があることが強調されている。
【０１１９】
また、マイクロアレイチップのデータを、何らかの異性体による細胞の代謝または生存性に対して望ましくない影響を示す可能性のある、転写特異的な副作用に関しても分析した。これらの分析に関する基準は、各異性体に関するデータを交差比較した点を除いて、上記と同様である。この分析の結果、いずれの位置異性体にも特異的副作用はないことが示された。
【０１２０】
（表３）ペグ化側に依存的な、IFNで調節される遺伝子
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【０１２１】
誘導される遺伝子を同定するために、ME15細胞株を、100U/mlのIFNまたはPEG-IFN試料の非存在下（未処置細胞）または存在下で48時間培養した。各遺伝子の発現レベルを、ミスマッチオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションと比較した蛍光強度の正規化平均差として算出し、任意単位で表した。試料それぞれの分析は、3つの別々の細胞プレート由来の標識cRNAを用いて3回ずつ行った。未処置細胞と比較して、IFNまたはPEG-IFN試料を用いた処理により差次的に発現する遺伝子の基準は以下の通りとした：平均値が未処置細胞よりも少なくとも2倍に増加し、かつ処置細胞における平均値が、少なくとも50単位またはそれを上回ること。未処置細胞の平均値は50単位未満である必要がある。さらに、標準偏差は平均差の変化の絶対値よりも有意に小さくなければならず、かつ遺伝子の信頼水準の算出値を97％超（p値＜0.03）に設定する必要がある。これらの基準を適用することにより、29種の遺伝子が調節されていることが見いだされた。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】180μgのPEG-IFNの分析用IEC-HPLCを示す。位置異性体を分離するために分析用の強力な陽イオン交換カラムを用いた（TOSOH-BIOSEP、SP-5PW、粒径10μm、直径7.5mm、および長さ7.5cm）。
【図２】図2Aは、9種の位置異性体およびPEG-IFNの抗ウイルス性比活性を示す。この図は、位置異性体の抗ウイルス性比活性［U/μg］を示している。抗ウイルス活性は水疱性口内炎ウイルスに感染させたMDBK細胞で決定された。図2Bは、異性体およびPEG-IFNの抗増殖性比活性を示す。この図は、100U/mlの各々の位置異性体およびPEG-IFNによるME15細胞の増殖の特異的阻害［OD４９０ｎｍ/μg］を示している。結果は、3回の独立したアッセイの平均を示している。PEG-IFNの抗ウイルス性比活性および抗増殖性比活性を比較のために提示している（斜線）。
【図３】黒色腫細胞株（ME15）における増殖の時間依存的阻害を示す。ME15細胞株を種々の濃度（500、125および15U/ml）のIFN、PEG-IFNおよび異性体の存在下で5日間培養した。細胞の増殖を24時間毎に計測した。5日後の対照細胞の密度を基準として100％に設定した。データは3回の独立した培養試験によるものである。
【図４】PEG-IFNならびに、抗ウイルス性比活性の高い（K134）、中間（K131、K164）および低い（K121）異性体の、速度論的な（kinetic）解離定数と抗ウイルス性比活性との相関を示す。
【図５】図5Aは、各異性体の抗ウイルス性比活性、抗増殖性比活性および特異的転写応答の相関を示す。PEG-IFNを100％の基準値として設定した。斜線はPEG-IFNの生物活性および転写活性を示す。相対的mRNA存在量（AD）の合計（Σ）は、各異性体に関するすべての誘導性遺伝子の合計として示されている。図5Bは、100U/mlのIFN、PEG-IFNおよび異性体による種々の全般的な転写性遺伝子応答のADの階層クラスター化を示す。IFNおよびペグ化バリアントのインキュベーション時間を48時間とした。用いた細胞系はIFN感受性黒色腫細胞株（ME15）である。データ解析のための条件は本文中に記載されている。遺伝子の種々の発現プロファイルに関するデータは表3に報告されている。
【図６】PEG-IFNを介したインターフェロン応答に関する3D構造に基づくモデルを示す。抗ウイルス性比活性および抗増殖活性により、4つの群におけるPEG-IFN位置異性体を配置した。ヒトインターフェロンα-2aの高分解能構造は、NMR分光法によって決定された（Klausら、The three-dimensional high resolution structure of human interferon alpha-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in solution、J. Mol. Biol. 274 (1997)；661-675）。インターフェロンα-2aのペグ化部位は赤色で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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