(57)【要約】【課題】本発明の目的は、簡便且つ迅速な方法で、総合的な環境の特性や状況を判定して、的確に環境の診断ができる環境診断方法を提供することである。【解決手段】診断対象の環境から採取した試料単位重量当たりのＤＮＡ量を測定し、該ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を判定することを特徴とする環境診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
診断対象の環境から採取した試料単位重量当たりのＤＮＡ量を測定し、該ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を判定することを特徴とする環境診断方法。
【請求項２】
診断対象の環境から採取した試料からＤＮＡを溶出し、該ＤＮＡ量を定量することにより、該試料単位重量当たりのＤＮＡ量を測定することを特徴とする、請求項１に記載の環境診断方法。
【請求項３】
ＥＤＴＡ、セチルトリメチルアンモニウムブロミド及びプロテイナーゼＫを含有するＤＮＡ溶出溶液を用いて、診断対象の環境から採取した試料からＤＮＡを溶出することにより、該試料単位重量当たりのＤＮＡ量の測定を行うことを特徴とする、請求項２に記載の環境診断方法。
【請求項４】
診断対象の環境が土壌である、請求項１乃至３のいずれかに記載の環境診断方法。
【請求項５】
診断対象の環境から採取した試料に存在するＤＮＡを溶出し、該ＤＮＡを回収するＤＮＡ溶出・回収手段と、
前記試料から回収したＤＮＡ量を測定するＤＮＡ測定手段と、
前記ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を評価する評価手段と
を備えていることを特徴とする、環境診断システム。
【請求項６】
前記ＤＮＡ溶出・回収手段は、
ＤＮＡ溶出用溶液を用いて、前記試料からＤＮＡを溶出するＤＮＡ溶出手段と、前記溶出手段で取得された第一ＤＮＡ溶出溶液からＤＮＡを回収するＤＮＡ回収手段と
を備えている、請求項５に記載の環境診断システム。
【請求項７】
所定の溶液を収容する第一回収容器、第二回収容器及び第三回収容器を支持すると共に、各容器を遠心分離する遠心分離手段を備え、
前記ＤＮＡ溶出手段は、
前記試料及びＤＮＡ溶出溶液を収容する溶出容器と、
前記溶出容器内にＤＮＡ溶出溶液を注入する第一注入手段と、
前記溶出容器内を混合するための混合手段と、
溶出処理して得られた第一ＤＮＡ溶出液を前記第一回収容器に供給する供給手段と
を備えており、
前記ＤＮＡ回収手段は、
前記第一ＤＮＡ溶出液の上清の一定量を前記第一回収容器から抜き出して前記第二回収容器に注入する第二注入手段と、
前記第一ＤＮＡ溶出液と層分離する不純物除去用溶液を前記第二回収容器に注入する第三注入手段と、
前記第二注入手段と前記第三注入手段で取得された第二ＤＮＡ溶出液のＤＮＡ含有層の一定量を前記第二回収容器から抜き出して前記第三回収容器に注入する第四注入手段と、
ＤＮＡ沈殿剤を前記第三回収容器に注入する第五注入手段と
を備えており、
更に、前記各回収容器が所定の前記各注入手段に対応するように位置決めする位置決め手段を備えている、請求項６に記載の環境診断システム。
【請求項８】
ＤＮＡ溶出用溶液を用いて環境から採取した試料からＤＮＡを溶出するＤＮＡ溶出手段と、
前記溶出手段で取得された第一ＤＮＡ溶出溶液からＤＮＡを回収するＤＮＡ回収手段とを備えているＤＮＡ溶出回収装置であって、
所定の溶液を収容する第一回収容器、第二回収容器及び第三回収容器を支持すると共に、各容器を遠心分離する遠心分離手段を備え、
前記ＤＮＡ溶出手段は、
前記試料及びＤＮＡ溶出溶液を収容する溶出容器と、
前記溶出容器内にＤＮＡ溶出溶液を注入する第一注入手段と、
前記溶出容器内を混合するための混合手段と、
溶出処理して得られた第一ＤＮＡ溶出液を前記第一回収容器に供給する供給手段と
を備えており、
前記ＤＮＡ回収手段は、
前記第一ＤＮＡ溶出液の上清の一定量を前記第一回収容器から抜き出して前記第二回収容器に注入する第二注入手段と、
前記第一ＤＮＡ溶出液と層分離する不純物除去用溶液を前記第二回収容器に注入する第三注入手段と、
前記第二注入手段と前記第三注入手段で取得された第二ＤＮＡ溶出液のＤＮＡ含有層の一定量を前記第二回収容器から抜き出して前記第三回収容器に注入する第四注入手段と、
ＤＮＡ沈殿剤を前記第三回収容器に注入する第五注入手段と
を備えており、
更に、前記各回収容器が所定の前記各注入手段に対応するように位置決めする位置決め手段を備えている、ＤＮＡ溶出回収装置。
【請求項９】
環境診断用のＤＮＡ溶出回収装置である、請求項８に記載のＤＮＡ溶出回収装置。
【請求項１０】
対象となる環境が土壌である、請求項８又は９に記載のＤＮＡ溶出回収装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、環境診断方法に関する。より詳細には、本発明は、簡便且つ迅速な方法で、総合的な環境の特性や状況を判定して、的確に環境の診断ができる環境診断方法に関する。更に、本発明は、当該環境診断方法を利用した環境診断システムに関する。また、本発明は、ＤＮＡ溶出回収装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、産業活動の副産物として生み出された多くの化学物質が、水圏や土壌等の環境中に流出して環境汚染を引き起こしている。このような環境汚染が、人々の健康や自然生態系等に悪影響を及ぼすことが懸念されている。このため、環境を保全或いは浄化することに加えて、環境の汚染の程度を的確に把握し、監視することが必要とされている。
【０００３】
また、農業分野では、農作物の生育や収穫量は農地の土壌環境に大きく依存しているため、農地の土壌環境を農作物の栽培に適する状態にコントロールすることが重要となっている。そのため、農地の土壌環境を把握し、土壌環境が農作物の栽培に適しているかを評価する技術が求められている。
【０００４】
更に、活性汚泥処理や排水処理等の水処理の分野でも、水処理の工程管理を適切に行うために、水処理槽内の環境を的確に把握することが望まれている。
【０００５】
このように、様々な技術分野で、各種の環境の特性や状況を把握して、これを評価する技術が必要とされている。従来、このような環境特性の評価は、環境ホルモンや残留農薬等の特定の化学物質を個別に測定したり、ＢＯＤやＣＯＤを測定することにより行われている。しかしながら、これらの方法では、測定に高価な装置を要する、測定に長時間必要である、ＢＯＤやＣＯＤは土壌環境の指標にならない等の欠点がある。更に、特定の化学物質の濃度、ＢＯＤ及びＣＯＤは、環境の特性の一つの側面を表す指標でしかなく、これらのパラメータでは総合的の特性や状況を的確に判断できないという問題点もある。
【０００６】
このような従来技術を背景として、簡便且つ迅速な方法で、総合的な環境の特性や状況を正確に診断する方策の開発が望まれている。
【０００７】
ところで、土壌や水圏等の環境から微生物を検出する方法として、プレート法やＤＡＰＩ（４’，６ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）染色法等が既に知られている。しかしながら、プレート法による微生物の検出では、操作が煩雑で時間がかかる上、実際に存在する微生物の０．１〜１％程度しか検出できず、特定の微生物を定量できるに過ぎないことが分かっている。また、ＤＡＰＩ染色法による微生物の検出では、操作が煩雑で時間がかかり、しかも土壌等の夾雑物を含む環境中から微生物を定量性をもって検出できない場合があることが知られている。
【０００８】
一方、環境に存在する全微生物量或いは全ＤＮＡ量を測定することにより、該環境の総合的な特性や状況を推定できることについては知られていない。
【０００９】
【非特許文献１】
Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｐ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｄｏｍｓｃｈ，  Ｋ．  Ｈ．  （１９７８）：  Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０，  ２１５−２２１．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ，  Ｄ．  Ｓ．  ａｎｄ  Ｐｏｗｌｓｏｎ，  Ｄ．  Ｓ．  （１９７６）：  Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ８，  ２０９−２１３．
【００１１】
【非特許文献３】
Ｂｒｏｏｋｅｓ，  Ｐ．  Ｃ．，  Ｌａｎｄｍａｎ，  Ａ．，  Ｐｒｕｄｅｎ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ，  Ｄ．  Ｓ．  （１９８５）：  Ｓｏｉｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １７，  ８３７−８４２．
【００１２】
【非特許文献４】
Ｔｏｒｓｖｉｋ，  Ｖ．，  Ｓｏｒｈｅｉｍ，  Ｒ．，  Ｇｏｋｓｏｙｒ  Ｊ．  （１９９６）：  Ｊ．  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １７，  １７０−１７８．
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明の目的は、上記従来の問題を解決して、各種の環境を診断する方法を提供することである。具体的には、本発明は、簡便且つ迅速な方法で、総合的な環境の特性や状況を判定して、的確に環境の診断ができる環境診断方法を提供することを目的とするものである。更に、本発明は、総合的な環境の診断が可能である環境診断システムを提供することを目的とするものである。また、本発明は、上記環境診断方法又は環境診断システムに好適に使用される、ＤＮＡ抽出回収装置を提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、診断対象の環境から採取した試料に存在するＤＮＡ量を測定し、該ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境の総合的な特性や状況を推定できることを見出した。本発明は、このような知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものである。
【００１５】
即ち、本発明は、下記に掲げる環境診断方法である。
項１．  診断対象の環境から採取した試料単位重量当たりのＤＮＡ量を測定し、該ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を判定することを特徴とする環境診断方法。
項２．  診断対象の環境から採取した試料からＤＮＡを溶出し、該ＤＮＡ量を定量することにより、該試料単位重量当たりのＤＮＡ量を測定することを特徴とする、項１に記載の環境診断方法。
項３．  ＥＤＴＡ、セチルトリメチルアンモニウムブロミド及びプロテイナーゼＫを含有するＤＮＡ抽出用溶液を用いて、診断対象の環境から採取した試料からＤＮＡを溶出することにより、該試料単位重量当たりのＤＮＡ量の測定を行うことを特徴とする、項２に記載の環境診断方法。
項４．  診断対象の環境が土壌である、項１乃至３のいずれかに記載の環境診断方法。
【００１６】
また、本発明は、下記に掲げる環境診断システムである。
項５．  診断対象の環境から採取した試料に存在するＤＮＡを溶出し、該ＤＮＡを回収するＤＮＡ溶出・回収手段と、
前記試料から回収したＤＮＡ量を測定するＤＮＡ測定手段と、
前記ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を評価する評価手段と
を備えていることを特徴とする、環境診断システム。
項６．  前記ＤＮＡ溶出・回収手段は、
ＤＮＡ溶出用溶液を用いて、前記試料からＤＮＡを溶出するＤＮＡ溶出手段と、前記溶出手段で取得された第一ＤＮＡ溶出溶液からＤＮＡを回収するＤＮＡ回収手段と
を備えている、項５に記載の環境診断システム。
項７．  所定の溶液を収容する第一回収容器、第二回収容器及び第三回収容器を支持すると共に、各容器を遠心分離する遠心分離手段を備え、
前記ＤＮＡ溶出手段は、
前記試料及びＤＮＡ溶出溶液を収容する溶出容器と、
前記溶出容器内にＤＮＡ溶出溶液を注入する第一注入手段と、
前記溶出容器内を混合するための混合手段と、
溶出処理して得られた第一ＤＮＡ溶出液を前記第一回収容器に供給する供給手段と
を備えており、
前記ＤＮＡ回収手段は、
前記第一ＤＮＡ溶出液の上清の一定量を前記第一回収容器から抜き出して前記第二回収容器に注入する第二注入手段と、
前記第一ＤＮＡ溶出液と層分離する不純物除去用溶液を前記第二回収容器に注入する第三注入手段と、
前記第二注入手段と前記第三注入手段で取得された第二ＤＮＡ溶出液のＤＮＡ含有層の一定量を前記第二回収容器から抜き出して前記第三回収容器に注入する第四注入手段と、
ＤＮＡ沈殿剤を前記第三回収容器に注入する第五注入手段と
を備えており、
更に、前記各回収容器が所定の前記各注入手段に対応するように位置決めする位置決め手段を備えている、項６に記載の環境診断システム。
【００１７】
また、本発明は、下記に掲げるＤＮＡ溶出回収装置である。
項８．  ＤＮＡ溶出用溶液を用いて環境から採取した試料からＤＮＡを溶出するＤＮＡ溶出手段と、
前記溶出手段で取得された第一ＤＮＡ溶出溶液からＤＮＡを回収するＤＮＡ回収手段とを備えているＤＮＡ溶出回収装置であって、
所定の溶液を収容する第一回収容器、第二回収容器及び第三回収容器を支持すると共に、各容器を遠心分離する遠心分離手段を備え、
前記ＤＮＡ溶出手段は、
前記試料及びＤＮＡ溶出溶液を収容する溶出容器と、
前記溶出容器内にＤＮＡ溶出溶液を注入する第一注入手段と、
前記溶出容器内を混合するための混合手段と、
溶出処理して得られた第一ＤＮＡ溶出液を前記第一回収容器に供給する供給手段と
を備えており、
前記ＤＮＡ回収手段は、
前記第一ＤＮＡ溶出液の上清の一定量を前記第一回収容器から抜き出して前記第二回収容器に注入する第二注入手段と、
前記第一ＤＮＡ溶出液と層分離する不純物除去用溶液を前記第二回収容器に注入する第三注入手段と、
前記第二注入手段と前記第三注入手段で取得された第二ＤＮＡ溶出液のＤＮＡ含有層の一定量を前記第二回収容器から抜き出して前記第三回収容器に注入する第四注入手段と、
ＤＮＡ沈殿剤を前記第三回収容器に注入する第五注入手段と
を備えており、
更に、前記各回収容器が所定の前記各注入手段に対応するように位置決めする位置決め手段を備えている、ＤＮＡ溶出回収装置。
項９．  環境診断用のＤＮＡ溶出回収装置である、項８に記載のＤＮＡ溶出回収装置。
項１０．  対象となる環境が土壌である、項８又は９に記載のＤＮＡ溶出回収装置。
【００１８】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）環境診断方法
本発明の環境診断方法は、診断対象の環境から採取した試料（単位重量当たり）に存在するＤＮＡ量を測定し、該ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を判定することを特徴とするものである。
【００１９】
本発明の環境診断方法において、診断対象となる環境については特に制限されない。このような環境として、具体的には、水田、畑、山林、庭、公園、庭園、花壇、工場跡地、工場敷地、焼却場土壌、宅地、資材置き場、道路、運動場、ゴルフ場、サッカー場、野球場等の土壌土壌；河川、海、湖、池、排水溝等の水圏環境；その他水処理施設の処理槽内やコンポスト処理槽内等の環境を例示することができる。従来の方法では総合的な診断が不可能であった土壌環境について、的確にその特性や状況を判定して総合的な診断ができるという本発明の効果に鑑みれば、診断対象となる環境として、好ましくは土壌環境を挙げることができる。
【００２０】
また、本発明の環境診断に使用される試料とは、上記診断対象の環境から採取（サンプリング）される土壌や水等のことである。当該試料の取得方法については、特に制限されない。診断対象の環境の診断を適正に判断するという観点からは、例えば診断対象試料の採取を、雨等によって診断対象の環境が通常の状態でない時期を避けて行うことが好ましい。
【００２１】
上記診断対象の環境から採取した試料単位重量当たりのＤＮＡ量（以下、これを環境ＤＮＡ量という。）は、当該診断対象の環境の総合的な特性や状況を反映しているので、この環境ＤＮＡ量に基づいて、診断対象の環境の特性や状況を判定し、該環境を診断することができる。なお、ここでいう環境ＤＮＡ量は、環境から採取した試料（単位重量当たり）に存在するＤＮＡの量［具体的には、そのＤＮＡの由来に関わらず、該試料（単位重量当たり）に存在するＤＮＡの総量］を示すが、該試料中に存在する全ての微生物に由来するＤＮＡの総量であっても環境の総合的な特性や状況を反映しているので、環境から採取した試料（単位重量当たり）に存在する微生物由来のＤＮＡの総量を環境診断の指標とすることもできる。
【００２２】
本発明の環境診断方法では、診断対象の環境の環境ＤＮＡ量を測定し、該ＤＮＡ量に基づいて、断対象の環境の特性や状況を判定し、該環境を診断する。具体的には、環境の特性や状況と環境ＤＮＡ量との相関関係を予め求めておき、診断対象の環境から採取した試料の環境ＤＮＡ量を上記相関関係に照合することによって、その環境の特性や状況を判定して、環境の診断を行うことができる。
【００２３】
例えば、水田や畑などの農地等の土壌では、環境ＤＮＡ量が多い程、農作物生育が良好であり、収穫量が多くなるという傾向がみられる。また、環境ＤＮＡ量は、栽培作物の種類によっても、環境ＤＮＡ量が変動する傾向がみられる。そのため、農作物の生育特性や栽培作物の適正等と環境ＤＮＡ量との相関関係を予め求めておくことにより、農地から採取した土壌の環境ＤＮＡ量から、その農地が農作物の栽培に適しているか否か、或いはどのような農作物の栽培に適しているか等の農地の適正について判定することができる。具体例を挙げると、農地として適している土壌であると判定される基準として、該環境から採取された土壌１ｇ中に例えば２５μｇ以上のＤＮＡが存在していること（即ち、環境ＤＮＡ量が、２５μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ以上）が挙げられる。また、農作物の生育が良好であって農地として特に適している土壌であると判定される基準として、例えば、該環境から採取された土壌１ｇ中に例えば３０μｇ以上のＤＮＡが存在していること（即ち、環境ＤＮＡ量が、３０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ以上）が挙げられる。
【００２４】
また例えば、各種の土壌又は水圏環境では、汚染の程度が高い程、環境ＤＮＡ量が少ない傾向にある。従って、予め、各種の環境の汚染の程度と環境ＤＮＡ量との相関関係を求めておくことにより、環境ＤＮＡ量から環境の汚染の程度を判定することができる。また、経時的に環境ＤＮＡ量を測定しておくことによって、その環境の汚染の有無及びその程度について経時的に把握することが可能となる。具体例を挙げると、汚染されている土壌であると判定される基準として、環境から採取された土壌１ｇ中に例えば０〜１０μｇのＤＮＡが存在していること（即ち、環境ＤＮＡ量が、０〜１０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ以上）が挙げられる。
【００２５】
また例えば、水処理施設の処理槽内やコンポスト処理槽内の環境における環境ＤＮＡ量は、その処理状況を反映している。そのため、予め環境ＤＮＡ量と上記処理槽内環境の状況との相関関係を求めておくことにより、当該環境における環境ＤＮＡ量をモニタリングすることで、処理状況を的確に把握することが可能となる。
【００２６】
診断対象の環境の環境ＤＮＡ量の測定は、例えば診断対象の環境から採取した試料（以下、診断対象試料という。）に存在するＤＮＡを溶出し、該ＤＮＡの量を定量することにより行うことができる。
【００２７】
診断対象の環境の環境ＤＮＡ量の測定は、診断対象試料を取得した後、直ちに行うことが望ましい。なお、取得された診断対象試料は、例えば低温（例えば−４℃〜−８０℃度程度、好ましくは−２０℃〜−８０℃度程度）で１日〜３週間程度保存しておくこともできる。
【００２８】
診断対象試料に含まれる全微生物からＤＮＡを溶出する方法としては、ＤＮＡが顕著に分解或いはせん断され、その定量に悪影響が及ぼされるものでない限り、特に制限されない。例えば、当該ＤＮＡの溶出方法の一態様として、診断対象試料をＤＮＡ溶出溶液で処理する方法を挙げることができる。
【００２９】
ここで使用されるＤＮＡ溶出溶液としては、微生物や植物からＤＮＡを溶出するために一般的に使用されている溶液を挙げることができる。具体的には、当該ＤＮＡ抽出用溶液としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のＤＮＡ分解酵素の阻害剤、及びセチルトリメチルアンモニウムブロミド（以下ＣＴＡＢという）、ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳという）等の陰陽イオン性界面活性剤を含有する緩衝液を挙げることができる。ＤＮＡの抽出効率を向上させるという観点からは、更にプロテイナーゼＫ、サーモライシン、サチライシン等のタンパク質分解酵素を含有するものが好ましい。
【００３０】
特に、上記ＤＮＡ溶出溶液として、ＥＤＴＡ、ＣＴＡＢ及びプロテイナーゼＫを含有するものは、ＤＮＡの溶出効率が高く、本発明において好適に使用することができる。ＥＤＴＡ、ＣＴＡＢ及びプロテイナーゼＫを含有するＤＮＡ溶出溶液において、各成分の配合割合は、ＤＮＡの抽出を著しく阻害しない限り、特に制限されない。一例として、２０〜１５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５〜２重量％のＣＴＡＢ及び２〜１２ユニット／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有するＤＮＡ溶出溶液；好ましくは５０〜１３０ｍＭのＥＤＴＡ、０．７〜１．５％のＣＴＡＢ及び４〜１０ユニット／ｍｌプロテイナーゼＫを含有するＤＮＡ溶出溶液；更に好ましくは７０〜１１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．８〜１．２％のＣＴＡＢ及び６〜８ユニット／ｍｌプロテイナーゼＫを含有するＤＮＡ溶出溶液を挙げることができる。より具体的には、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ  ２Ｎａ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１．５Ｍの塩化ナトリウム、１重量％のＣＴＢＡ及び７ユニット／ｍｌのプロテイナーゼＫからなるＤＮＡ溶出溶液（ｐＨ８．０）を例示することができる。
【００３１】
上記ＤＮＡ溶出溶液を用いたＤＮＡの溶出処理において、ＤＮＡの溶出条件については、特に制限されない。例えば、溶出処理に供される土壌１ｇに対して、上記ＤＮＡ抽出溶液を２〜２０ｍｌ、好ましくは５〜１５ｍｌ、更に好ましくは８〜１２ｍｌを添加混合することにより、ＤＮＡの溶出を行うことができる。
【００３２】
また、溶出温度については、使用するＤＮＡ溶出溶液や溶出処理に供される土壌の種類等に応じて、適宜設定することができる。例えばタンパク質分解酵素を含有するＤＮＡ溶出溶液を使用する場合であれば、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃、更に好ましくは３０〜３７℃を；また例えばタンパク質分解酵素を含まないＤＮＡ溶出溶液を使用する場合であれば、３０〜７５℃、好ましくは４５〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃を挙げることができる。
【００３３】
溶出時間については、使用するＤＮＡ抽出用溶液の種類、溶出処理に供される土壌の種類、溶出温度等によって異なり、一律に規定することはできないが、一例として、０．１〜４時間、好ましくは０．２〜２時間、更に好ましくは０．５〜１時間を挙げることができる。
【００３４】
かくして溶出されたＤＮＡを定量することによって、診断対象試料に存在するＤＮＡ量を求めることができる。ＤＮＡの定量については、特に制限されないが、例えば、溶出されたＤＮＡ必要に応じて精製した後に、これを回収して、公知又は慣用のＤＮＡ定量方法により定量することができる。
【００３５】
ここで、ＤＮＡを精製する方法については特に制限されず、常法に従って行うことができる。ＤＮＡを精製する方法として、例えば、上記のようにしてＤＮＡ溶出処理した後の溶液を遠心分離して、その上清を回収する工程；前記工程で得られた上清に、クロロホルム、クロロホルム−イソアミルアルコール、フェノール等の上記上清と層分離する不純物除去用溶液を添加して、混合する工程；前記工程で得られた混合液からＤＮＡを含有する層を取り出すことにより、不純物を除去する工程、及び前記工程で得られたＤＮＡを含有する層にイソプロピルアルコール、エタノール、ポリエチレングリコール等のＤＮＡ沈殿剤添加してＤＮＡを沈殿させ、これを回収する工程を含有する方法を挙げることができる。
【００３６】
より具体的には、ＤＮＡを精製する方法として、以下の▲１▼〜▲５▼の工程を経て行う方法を例示できる；▲１▼上記のようにして得られたＤＮＡが溶出された溶液を遠心分離して上清を回収する工程、▲２▼該上清にクロロホルム又はクロロホルム−イソアミルアルコール（体積比で、クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を混合した後に、水層を回収する工程、▲３▼該水層にイソプロピルアルコール（該水層中での最終濃度が約３７．５重量％）又はエタノール（該水層中での最終濃度が約７０％）を添加し、生じた沈殿を回収する工程、▲４▼得られた沈殿を約３７．５重量％イソプロピルアルコール水溶液又は約７０重量％エタノール水溶液で洗浄する工程、及び▲５▼得られた沈殿を乾燥する工程。
【００３７】
また、ＤＮＡの定量方法としては、具体的には、精製することにより回収したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供した後に、エチジウムブロマイドで該ＤＮＡを染色して、ゲル上のＤＮＡのバンドの蛍光強度を測定する方法を挙げることができる。また例えば、精製することにより回収したＤＮＡを緩衝液に溶解して、該溶液の２６０ｎｍの吸光度を測定する方法を挙げることもできる。
【００３８】
なお、ＤＮＡの抽出効率は、診断対象試料の種類によって異なることがあるため、予め各環境試料におけるＤＮＡの抽出効率を測定しておき、当該抽出効率に基づいて各診断対象試料毎に補正を行った上で、その環境ＤＮＡ量を求めて、その環境特性を判定することが望ましい。ここでいうＤＮＡ抽出効率とは、診断対象試料中に含まれるＤＮＡ量に対して、該試料から実際に溶出・定量されるＤＮＡ量の割合を意味する。
【００３９】
このように、診断対象試料毎の抽出効率を考慮した上で、環境ＤＮＡ量を求める方法としては、具体的には、下記方法を例示できる；▲１▼診断対象試料を加熱処理（例えば１２１℃、６０分間）等によって該試料中のＤＮＡを完全に分解し、該ＤＮＡ分解処理後の診断対象試料に濃度既知の微生物培養液を一定量混合して微生物濃度既知土壌を調製する、▲２▼前記▲１▼で得られた微生物濃度既知土壌を用いて、上記の方法に従い該土壌から得られるＤＮＡ量を測定する、▲３▼前記微生物濃度既知土壌と同量の微生物を含む微生物培養液を用いて、上記と同様の方法で、該培養液から得られるＤＮＡ量を測定する、▲４▼前記▲３▼で測定したＤＮＡ量を１００％とした場合の前記▲２▼のＤＮＡ量の割合を求め、これを診断対象試料のＤＮＡの抽出効率（％）とする、▲５▼下記式に従って、環境ＤＮＡ量を算出する。
【００４０】
【数１】
2004337027.tif 000002
【００４１】
（ＩＩ）環境診断装置
更に、本発明は、前述する（Ｉ）環境診断方法を実施するための環境診断システムを提供する。
【００４２】
本発明の環境診断システムは、診断対象の環境から採取した試料に存在するＤＮＡを溶出し、該ＤＮＡを回収するＤＮＡ溶出・回収手段と、前記試料から回収したＤＮＡ量を測定するＤＮＡ測定手段と、前記ＤＮＡ量に基づいて、上記診断対象の環境特性を判定する判定手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００４３】
本発明の環境診断システムでは、まず、診断対象の環境から採取した試料に存在するＤＮＡをＤＮＡ溶出・回収手段により取得し、そのＤＮＡの量をＤＮＡ測定手段により測定する。次いで、得られたＤＮＡ量に基づいて、診断対象の環境特性を判定手段により判定することによって、環境の診断を行うことができる。
【００４４】
ＤＮＡ溶出・回収手段としては、それを具現化する方法・手法は特に問わない。当該ＤＮＡ溶出・回収手段の一例として、ＤＮＡ溶出用溶液を用いて、前記試料からＤＮＡを溶出するＤＮＡ溶出手段１と、当該溶出手段１でＤＮＡ溶出処理して得られた溶液（これを、第一ＤＮＡ溶出溶液という。）からＤＮＡを回収するＤＮＡ回収手段２とを備えているものを挙げることができる。
【００４５】
具体的に、本発明の環境診断システムのＤＮＡ溶出・回収手段の一実施形態について、図面を用いて説明する。
【００４６】
ＤＮＡ溶出・回収手段は、所定の溶液を収容する第一回収容器、第二回収容器及び第三回収容器を支持すると共に、各容器を遠心分離する遠心分離手段３を備えている（図１、２及び３参照）。当該遠心分離手段３は、上記各回収容器を支持するための支持部材３ａと、当該支持部材３ａに支持された上記各回収容器を遠心分離をするための遠心モーター３ｂを備えている。当該支持部材３ａには、上記各回収容器を支持するための容器支持部３ｃを備えている。図２は、上記各回収容器をそれぞれ２個ずつ支持できるように６つの容器支持部３ｃを備えた支持部材３の上面図を示している。また、図３は、２個の異なる大きさの容器を支持させた場合の支持部材３の側面図を示している。なお、上記支持部材３ａに備えられている容器支持部３ｃの数は、制限されるものでなく、支持するのに必要な各回収容器の数に応じて適宜設定できる。また、各容器の大きさについても、特に制限されず、適宜設定すればよい。一例として、第一回収容器であれば容積１〜５０ｍｌ程度のものを、また第二回収容器及び第三回収容器であれば容積０．５〜５ｍｌ程度のものを例示することができる。
【００４７】
また、ＤＮＡ溶出・回収手段は、ＤＮＡ溶出手段１として、ＤＮＡの溶出処理を行うためのＤＮＡ溶出容器４と、ＤＮＡ溶出溶液を該ＤＮＡ溶出容器４内に注入する第一注入手段５と、該溶出容器４内を混合する混合手段６とを備えている（図１及び４参照）。上記ＤＮＡ溶出容器４は、ＤＮＡ溶出溶液を該容器内に注入するための注入口４ａと、開閉制御手段４ｂにより開閉制御可能な供給口４ｃを有している。また、上記ＤＮＡ溶出容器４は、当該ＤＮＡ溶出・回収手段から脱着可能となっている。上記開閉制御手段４ｂ及び供給口４ｃにより、第一ＤＮＡ溶出液を前記第一回収容器に供給可能となっており、これらが供給手段１３に相当する。また、上記第一注入手段５は、注入管５ａ及び注入用ポンプ５ｂを有している。上記混合手段６は、攪拌以外の手段であっても、該溶出容器４内を混合できるものであれば、特に制限されない。本発明の一実施形態を示す図１及び３〜９では、上記混合手段６として、攪拌モーター９と、先端に攪拌羽を備える攪拌軸１０を有している。
【００４８】
また、ＤＮＡ溶出手段１には、必要に応じて、上記溶出容器４を加温する加温手段１１が設けられていてもよい。本発明の一実施形態を示す図１では、上記溶出容器４を加熱ヒーターユニット１２が上記溶出容器４の周囲を加熱・保温できるように設置されている。
【００４９】
なお、当該ＤＮＡ溶出手段１は、上記ＤＮＡ溶出容器４を少なくとも１個有していればよいが、これを２個以上備えていてもよい。上記ＤＮＡ溶出容器４を２個以上備えていれば、２以上の試料を同時にＤＮＡの溶出処理を行うことが可能となる。本明細書においてＤＮＡ溶出・回収手段について示す図には、上記ＤＮＡ溶出容器４を２個備えているものについて示す。
【００５０】
ＤＮＡ回収手段２は、前記第一ＤＮＡ溶出液の上清の一定量を抜き出して前記第二回収容器に注入する第二注入手段１５を備えている。当該第二注入手段１５は、一定量の前記第一ＤＮＡ溶出液を測りとるための抜き取り・注入用ポンプ１５ａと、第一回収容器からの抜き取り及び第二精製容器への注入を行う挿入管１５ｂとを備えている。当該挿入管１５ｂは、図１に示すｚ軸方向に駆動可能であり、先端に脱着可能なピペットチップ１５ｃを有している。
【００５１】
また、当該ＤＮＡ回収手段２は、前記第一ＤＮＡ溶出液と層分離する不純物除去用溶液を前記第二回収容器に注入する第三注入手段１６を備えている。ここで、「前記第一ＤＮＡ溶出液と層分離する不純物除去用溶液」とは、前記（Ｉ）の環境診断方法において記載する不純物除去用溶液と同様である。当該第三注入手段１６は、不純物除去用溶液を注入するための注入用ポンプ１６ａと、該溶液を第二回収容器内へ注入を行う挿入管１６ｂとを備えている。当該挿入管１６ｂは、図１に示すｚ軸方向に駆動可能であり、先端に脱着可能なピペットチップ１６ｃを有している。なお、当該第三注入手段１６の挿入管１６ｂとピペットチップ１６ｃについては、前記第二注入手段１５の挿入管１５ｂとピペットチップ１５ｃで代用することもできる。本発明の一実施形態を示す図１及び３〜９には、当該第三注入手段１６の挿入管１６ｂとピペットチップ１６ｃは、前記第二注入手段１５の挿入管１５ｂとピペットチップ１５ｃによって代用されているものを示す。
【００５２】
また、ＤＮＡ回収手段２は、前記第二注入手段と前記第三注入手段で取得された前記第一ＤＮＡ溶出液及び前記不純物除去用溶液の混合溶液（これを、第二ＤＮＡ含有溶液という。）のＤＮＡ含有層の一定量を抜き出して前記第三回収容器に注入する第四注入手段１７を備えている。当該第二注入手段１７は、一定量の前記第二ＤＮＡ含有溶液のＤＮＡ含有層を測りとるための抜き取り・注入用ポンプ１７ａと、第二回収容器からの抜き取り及び第三回収容器への注入を行う挿入管１７ｂとを備えている。当該挿入管１５ｂは、図１に示すｚ軸方向に駆動可能であり、先端に脱着可能なピペットチップ１５ｃを有している。なお、上記抜き取り・注入用ポンプ１７ａについては、当該第二注入手段１５の抜き取り・注入用ポンプ１５ａで代用することもできる。なお、本発明の一実施形態を示す図１及び３〜９には、当該抜き取り・注入用ポンプ１７ａを、前記第二注入手段１５の抜き取り・注入用ポンプ１５ａで代用しているものを示す。
【００５３】
また、ＤＮＡ回収手段２は、ＤＮＡ沈殿剤を前記第三回収容器に注入する第五注入手段１８を備えている。当該第五注入手段１８は、ＤＮＡ沈殿剤を注入するための注入用ポンプ１８ａと、該溶液を第三回収容器内へ注入を行う挿入管１８ｂとを備えている。当該挿入管１８ｂは、図１に示すｚ軸方向に駆動可能であり、先端に脱着可能なピペットチップ１８ｃを有している。なお、当該第五注入手段１８の挿入管１８ｂとピペットチップ１８ｃについては、前記第四注入手段１７の挿入管１７ｂとピペットチップ１７ｃで代用することもできる。本発明の一実施形態を示す図１及び３〜９には、当該第五注入手段１８の挿入管１８ｂとピペットチップ１８ｃは、前記第四注入手段１７の挿入管１７ｂとピペットチップ１７ｃによって代用されているものを示す。
【００５４】
なお、ＤＮＡ回収手段２は、上記挿入管１５ｂ、１６ｂ、１７ｂ及び１８ｂを、少なくともそれぞれ１個備えていればよいが、これらの挿入管をそれぞれ２個以上備えていてもよい。これらの挿入管をそれぞれ２個以上備えていれば、２以上の第一ＤＮＡ溶出溶液からＤＮＡの回収を同時又は連続的に実施することが可能となる。本明細書においてＤＮＡ溶出・回収手段について示す図（図１及び３〜９）には、上記挿入管１５ｂ及び挿入管１７ｂをそれぞれ２個（なお、挿入管１６ｂ及１８ｂは、それぞれ挿入管１５ｂ及び１７ｂで代用されている。）備えているものについて示す。
【００５５】
また、上記挿入管１５ｂ、１６ｂ、１７ｂ及び１８ｂが駆動するｚ軸方向の角度θは、上記支持部材の容器支持部の角度と等しくなるように設定される（図４参照）。
【００５６】
更に、当該ＤＮＡ溶出・回収手段は、前記各回収容器が所定の前記各注入手段に対応するように位置決めする位置決め手段を備えている。図１に示す本実施形態では、ＤＮＡ溶出容器４、挿入管１５ｂ及び挿入管１７ｂを固定した搬送テーブル１９（図１に示すｘ軸方向に駆動可能）と、回転可能な上記支持部材３ａを備えており、これらが位置決め手段となっている。
【００５７】
また、必要に応じて、当該ＤＮＡ溶出・回収手段には、条件設定器２０を有していてもよい。
【００５８】
以下に、図１に例示するＤＮＡ溶出・回収手段の作用・動作について、具体的に、▲１▼ＤＮＡ溶出処理工程、▲２▼第一回収容器への供給工程、▲３▼不純物の除去工程、▲４▼ＤＮＡの沈殿工程に分けて、説明する。
【００５９】
▲１▼溶出処理工程（図４）
当該ＤＮＡ溶出・回収手段を用いて、診断対象から採取した試料からＤＮＡを取得するには、まず、対象となる試料を適当量、好ましくは０．５〜５ｇ程度を正確に測り取り、これを取り外しておいたＤＮＡ溶出容器４に入れる。次いで、当該ＤＮＡ溶出容器４をＤＮＡ溶出手段１の所定の場所に装着した後、第一注入手段５により当該ＤＮＡ溶出容器４内にＤＮＡ溶出用溶液を適当量、好ましくは３〜５０ｍｌ程度を正確に注入する。その後、加熱ヒーターユニット１２により２５℃〜５０℃程度に保温しながら、攪拌手段７によりＤＮＡ溶出容器４内を５０〜５００ｒｐｍ程度で攪拌して、０．１〜５時間程度溶出処理を行う。かかる溶出処理工程は、例えば図４に示す各手段の位置構成で実施することができる。なお、後述する遠心分離についても、当該図４に示す各手段、支持部材の位置構成で実施することができる。
【００６０】
▲２▼第一回収容器への供給工程（図５）
上記ＤＮＡ溶出処理によって得られた第一ＤＮＡ溶出液を上記供給手段により、即ち、開閉制御手段４ｂにより供給口４ｃを開いて、第一ＤＮＡ溶出液をＤＮＡ溶出容器４から第一回収容器に供給する。当該供給工程は、特に制限されないが、例えば、以下に示すように位置決め手段により位置決めすることによって行うことができる。
【００６１】
搬送テーブルの図４のｘ軸方向への駆動と支持部材３ａの回転によって、ＤＮＡ溶出容器４の供給口と支持部材３ａに支持された第一回収容器とを位置決めする（図５に示す位置構成）。次いで、開閉制御手段４ｂによりＤＮＡ溶出容器４の供給口を開いて、上記溶出処理により得られた第一ＤＮＡ溶出溶液を第一回収容器内に供給する。なお、第一ＤＮＡ溶出溶液の第一回収容器内への供給は、次工程で必要とされる量（例えば、０．５〜２０ｍｌ程度）が確保できればよいので、必ずしも得られた第一ＤＮＡ溶出溶液の全量について供給する必要はない。なお、ＤＮＡ溶出手段１として、ＤＮＡ溶出容器４を２個備えるものを用いて、２種の試料についてＤＮＡの溶出を同時に行った場合には、それぞれの第一ＤＮＡ溶出溶液の供給を順次行ってもよく、また図５に示すようにそれぞれの第一ＤＮＡ溶出溶液の供給を同時に行えるように位置決めさせて同時に行うこともできる。
【００６２】
▲３▼不純物の除去工程（図６）
第一回収容器内に入れられた第一ＤＮＡ溶出溶液を遠心分離（例えば、５０１００００ｇ、０．５〜３０分間、３〜４０℃の条件下）して、固形分と上清に分離する。次いで、搬送テーブルの図６のｘ軸方向への駆動と支持部材３ａの回転によって、支持部材３ａに支持された第一回収容器と挿入管１５ｂとを位置決めし、該挿入管１５ｂを図６に示すｚ軸の＋方向に駆動させてピペットチップ１５ｃを第一回収容器内に入れる。その後、第二注入手段１５により、上記第一ＤＮＡ溶出溶液の上清を適当量、好ましくは０．０１〜２ｍｌ程度を正確に抜き取る。その後、該挿入管１５ｂを図６に示すｚ軸の−方向に駆動させてピペットチップ１５ｃを第一回収容器から引き出した後、支持部材３ａの回転によって、支持部材３ａに支持された第二回収容器と該挿入管１５ｂを位置決めする。次いで、該挿入管１５ｂをｚ軸の＋方向に駆動してピペットチップ１５ｃを第二回収容器内に挿入した後、第二注入手段１５により、正確に抜き取っておいた特定量の第一ＤＮＡ溶出溶液の上清を第二回収容器内に注入する。更に、第三注入手段１６により、挿入管１５ｂを介して、不純物除去用溶液を適当量（例えば０．０１〜２ｍｌ程度）を第二回収容器内に注入して、第二ＤＮＡ溶出溶液を調製する。また、必要に応じて、挿入管１５ｂを用いて、第二回収容器内で第二ＤＮＡ溶出溶液の吸引・注入を繰り返すことによって、該溶液を混合することができる。その後、該挿入管１５ｂをｚ軸の−方向に駆動させて、ピペットチップ１５ｃを第二回収容器から引き出す。
【００６３】
なお、挿入管１５ｂを２個備えるものを用いて、２種の第一ＤＮＡ溶出溶液から不純物を除去する場合には、例えば、一方の第一ＤＮＡ溶出溶液を片方の挿入管１５ｂを介して不純物の除去工程（例えば図６に示す位置構成）を行った後に、もう一方の第一ＤＮＡ溶出溶液について他方の挿入管１５ｂを介して不純物の除去工程（例えば図７に示す位置構成）を行うように設定することができる。
【００６４】
▲４▼ＤＮＡの沈殿工程（図８）
第二回収容器内に入れられた第二ＤＮＡ溶出溶液を遠心分離（例えば、５００〜３００００ｇ、０．５〜３０分間、３〜４０℃の条件下）して、該溶液を不純物含有層とＤＮＡ含有層に分離した後、搬送テーブルの図８のｘ軸方向への駆動と支持部材３の回転によって、支持部材３に支持された第二回収容器と第四注入手段１７の挿入管１７ｂとを位置決めする。次いで、該挿入管１７ｂを図８に示すｚ軸の＋方向に駆動して、ピペットチップ１７ｃを第二回収容器内の上記ＤＮＡ含有層に挿入する。その後、第四注入手段１７により、上記第二ＤＮＡ含有溶液のＤＮＡ含有層を適当量、好ましくは０．１〜５ｍｌ程度を正確に抜き取る。次いで、該挿入管１７ｂを図８に示すｚ軸の−方向に駆動してピペットチップ１７ｃを第二回収容器から抜き取った後、支持部材３ａの回転によって、支持部材３ａに支持された第三回収容器と挿入管１７ｂとを位置決めし、挿入管１７ｂをｚ軸の＋方向に駆動して、第三回収容器内にピペットチップ１７ｃを挿入する。その後、第四注入手段１７により、正確に抜き取っておいた特定量の第一ＤＮＡ溶出溶液のＤＮＡ含有層を第三回収容器内に注入する。更に、第五注入手段１８により、挿入管１７ｂを介して、ＤＮＡ沈殿剤の適当量（例えば０．５〜２５ｍｌ程度）を第三回収容器内に注入して、第三ＤＮＡ溶出溶液を調製する。また、必要に応じて、挿入管１７ｂを用いて、第三回収容器内で第三ＤＮＡ含有溶液の吸引・注入を繰り返すことによって、該溶液を混合することができる。その後、該挿入管１７ｂをｚ軸の−方向に駆動させて、ピペットチップ１７ｃを第三回収容器から抜き取る。
【００６５】
なお、挿入管１７ｂを２個備えるものを用いて、２種の第二ＤＮＡ溶出溶液のＤＮＡ含有層からＤＮＡを沈殿させる場合には、例えば、一方の第二ＤＮＡ含有溶液について片方の挿入管１７ｂによりＤＮＡの沈殿工程（例えば図８に示す位置構成）を行った後に、もう一方の第二ＤＮＡ含有溶液について他方の挿入管１７ｂにより不純物の除去工程（例えば図９に示す位置構成）を行うように設定することができる。
【００６６】
斯くして得られた第三ＤＮＡ含有溶液には、ＤＮＡが沈殿しており、これを回収することによって、診断対象の環境から採取した試料に存在するＤＮＡを得ることができる。
【００６７】
斯くしてＤＮＡ溶出・回収手段によって回収されたＤＮＡの量をＤＮＡ測定手段により測定する。当該ＤＮＡ測定手段については、特に制限されず、公知のＤＮＡ測定手段を用いることができる。具体的には、上記（Ｉ）の環境診断方法において例示しているように、精製されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供した後に、エチジウムブロマイドで染色して、ゲル上のＤＮＡのバンドの傾向強度を測定する手段、或いは精製されたＤＮＡを緩衝溶液に溶解してその２６０ｎｍの吸光度を測定する手段等が挙げられる。
【００６８】
上記ＤＮＡ測定手段によって得られたＤＮＡ量は、上記（Ｉ）の環境診断方法において記載しているように、診断対象の環境特性を反映している。故に、該ＤＮＡ量に基づいて、診断対象の環境特性を評価する評価手段によって、環境の診断を行うことができる。当該評価手段としては、具体的には、上記ＤＮＡ測定手段によって得られたＤＮＡ量から算出した環境ＤＮＡ量を、環境ＤＮＡ量と各環境特性との相関関係に照合することによって診断対象の環境特性を評価する手段を挙げることができる。
【００６９】
ここで、環境ＤＮＡ量を、環境ＤＮＡ量と各環境特性との相関関係に照合する方法としては、特に制限されず、その診断目的や診断内容等に応じて適宜設定すればよい。一例として、上記環境ＤＮＡ量と、上記相関関係に基づいて設定された一定の基準値とを比較する方法；上記環境ＤＮＡ量を、上記相関関係に示すグラフに照合する方法；及び上記環境ＤＮＡ量を、上記相関関係を示すデータを格納したデータベースに照合する方法等を挙げることができる。
【００７０】
なお、環境ＤＮＡ量と各環境特性や状況との相関関係の具体例については、上記（Ｉ）環境診断方法において記載する通りである。
【００７１】
（ＩＩＩ）ＤＮＡ溶出回収装置
また、上記に記載する環境診断システムに使用されるＤＮＡ溶出・回収手段は、環境から採取された試料に含まれるＤＮＡの溶出回収装置としても有用である。即ち、本発明は、更に上記ＤＮＡ溶出・回収手段から構成されるＤＮＡ溶出回収装置を提供する。
【００７２】
本発明のＤＮＡ溶出回収装置は、その用途は特に制限されない。例えば、環境診断のためのＤＮＡの回収、環境に存在する微生物量の推定のためのＤＮＡの回収、或いは環境に存在する微生物を同定するためのＤＮＡの回収等の用途のために使用することができる。特に、本発明のＤＮＡ溶出回収装置は、環境診断のために好適に使用される。換言すれば、本発明のＤＮＡ溶出回収装置の好ましい一実施態様は、環境診断用のＤＮＡ溶出回収装置といえる。
【００７３】
また、本発明のＤＮＡ溶出回収装置は、水圏環境に比して、夾雑物を多く含み、ＤＮＡの回収が困難である土壌環境からも、ＤＮＡの抽出が簡便且つ容易に行うことができるので、特に土壌環境から採取された試料からＤＮＡを溶出・回収するために好適に使用される。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例及び試験例により本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はかかる実施例等によって何ら制限されるものではない。
【００７５】
試験例１  土壌環境中の微生物量と該環境から回収されるＤＮＡ量との相関関係についての検討
土壌環境に存在する微生物からのＤＮＡ抽出の正確性、及び得られたＤＮＡ量と土壌微生物量の相関性について検討するために、以下の試験を行った。
【００７６】
まず土壌を１２１℃で１時間加熱し、土壌中に存在する微生物のＤＮＡを完全に分解した。得られたＤＮＡ無含有土壌にＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（宝酒造（株）より入手）、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＴ−２、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｆ７２１、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＭＦ２０を各々所定量接種して、微生物含量既知の各種人工土壌を作成した。なお、本試験で使用した上記微生物は、全て土壌から単離されたものである。
【００７７】
かくして得られた人工土壌１ｇを８ｍｌのＤＮＡ抽出用溶液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭＥＤＴＡ  ２Ｎａ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウム、及び１重量％  ＣＴＢＡ）に混合し、更にこれに１００μｌのプロテイナーゼＫ溶液（７ユニット／ｍｌ）を添加して、２００ｒｐｍの攪拌条件下で、３７℃で３０分間、ＤＮＡ抽出処理を行った。その後、これに１ｍｌの２０％ＳＤＳを添加した後に、遠心分離（６０００ｇ、１０分間、２０℃）を行い、得られた上清７００μｌを回収した。次いで、該上清に７００μｌのクロロホルム−イソアミルアルコール（体積比で、クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を混合した後に、遠心分離（１６０００ｇ、１０分間、２０℃）を行い、水層６００μｌを回収した。回収した水層に３６０μｌのイソプロピルアルコールを添加してＤＮＡを沈殿させ、遠心分離（１６０００ｇ、２０分間、２０℃）により沈殿を回収した。得られたＤＮＡの沈殿を１ｍｌの７０重量％エタノール水溶液を用いて洗浄し、更にこれを乾燥した後、５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁して抽出ＤＮＡ溶液を調製した。
【００７８】
かくして得られた抽出ＤＮＡ溶液５μｌを１５〜１００ｎｇのＤＮＡ量を含むマーカー（ｓｍａｒｔ  ｌａｄｄｅｒ、ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）と共に、アガロースゲル電気泳動を行った。電気泳動後に、ゲルにＵＶを照射し、ＫＯＤＡＫ  １Ｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＫＯＤＡＫ社製）を用いて、エチジウムブロマイドを標識としたＤＮＡバンドの蛍光強度の測定を行った。ｓｍａｒｔ  ｌａｄｄｅｒの蛍光強度の測定値から、バンドの蛍光強度に対するＤＮＡ量の標準曲線を作成し、これを基づいて各抽出ＤＮＡ溶液のバンドの蛍光強度からバンドに含まれるＤＮＡ量を求めた。得られたＤＮＡ量に基づいて、各人工土壌１ｇあたりのＤＮＡ回収量を算出した。
【００７９】
得られた結果を図１０〜１３に示す。図１０には、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す。図１１には、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＴ−２を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す。図１２には、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｆ７２１を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す。図１３には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＭＦ２０を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す。
【００８０】
この結果、４種類のいずれの人工土壌においても、土壌中の微生物量とＤＮＡ回収量との間に相関関係があることが確認できた。また、図１３から、人工土壌中の微生物量が比較的少ない場合においても、土壌中の微生物量とＤＮＡ回収量との間に相関関係が認められたことから、土壌中に存在する微生物からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡ量を定量することによって、土壌中の微生物が少ない場合でも、土壌中の微生物量を正確に推定できることが明らかとなった。
【００８１】
従って、本試験に採用したＤＮＡ抽出方法及び定量方法によれば、微生物の種類を問わず、また土壌中の微生物量が少ない場合であっても、土壌中に存在する微生物からＤＮＡを抽出して総ＤＮＡ量を正確に定量でき、これによって土壌中の微生物量を推定できることが確認された。
【００８２】
試験例２  様々な土壌におけるＤＮＡの抽出効率の検討
土壌の種類がＤＮＡの抽出効率に及ぼす影響を検討するために、以下に記載する試験を行った。
【００８３】
それぞれの特性が分かっている各種土壌（表１に示す。）を用いて、上記試験例１と同様の方法で、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を含有する人工土壌を作成し、該土壌１ｇ当たりのＤＮＡ回収量を測定した。また、同時に、上記人工土壌中に含まれるＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９と同微生物量のＥ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９培養液から試験例１と同様の方法でＤＮＡを抽出し、その回収量を測定した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９培養液からのＤＮＡ回収量を１００％とした場合の上記各種人工土壌から１ｇ当たりのＤＮＡ回収量の割合をＤＮＡ抽出効率（％）として算出した。
【００８４】
【表１】
2004337027.tif 000003
【００８５】
得られた各土壌のＤＮＡ抽出効率を図１４に示す。図１４から分かるように、大部分の土壌については８０％以上の高い抽出効率を示した。一方、Ｎｏ．２（愛知県豊田市）、Ｎｏ．６（立命館大  ＢＫＣ）、Ｎｏ．１４（立命館大  ＢＫＣ）、Ｎｏ．２１（京都府）等のいくつかの土壌では、５０〜６０％程度と低い抽出効率を示した。このことから、本試験で採用したＤＮＡ抽出方法は大部分の土壌から効率良くＤＮＡを抽出できるが、抽出効率の低い土壌も存在することが明らかとなった。特に、比較的目の細かい土壌において、ＤＮＡの抽出効率が低くなる傾向が認められた。このことから、粘土質を多く含む土壌からはＤＮＡが抽出されにくく、土壌からのＤＮＡ抽出効率は粘土質の含有量によって影響を受けることが示唆された。
【００８６】
以上の結果から、診断対象試料１ｇ当たりのＤＮＡ回収量の測定値を、各土壌のＤＮＡ抽出効率によって補正することによって、より正確に各土壌中に存在する全微生物量を反映した環境ＤＮＡ量を求めることができることが確認された。
試験例３  微生物量、環境ＤＮＡ量、及び土壌の特性の相関関係
（１）各土壌中に存在する微生物量と環境ＤＮＡ量の相関関係
試験例２で測定した表１に示す各土壌のＤＮＡ回収量及びＤＮＡ抽出効率を用いて、下記式に従って、診断対象試料の環境ＤＮＡ量（補正後）（μｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）を算出した。また、併せて、下記の方法に従って、表１に示す各種土壌に存在する全微生物量をＤＡＰＩ染色法によって計測した。
【００８７】
【数２】
2004337027.tif 000004
【００８８】
（ＤＡＰＩ染色法）
土壌０．１ｇを滅菌水で最適な濃度に段階希釈した。これら希釈液に孔径０．２２μｍのＤｉｓｐｏｓａｌ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ  ＴＯＹＯ社製）で濾過滅菌した２５％グルタルアルデヒド溶液（和光純薬工業社製）を最終濃度１％になるように加え、菌体を固定した。同様に濾過滅菌した０．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（４’，６ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、  ナカライテスク社製）溶液を最終濃度１μｇ／ｍｌになるように添加し、よく攪拌した後、冷暗所で１日間保存し染色した。これら染色後のサンプル１ｍｌを孔径０．２０μｍのヌクレポアフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ製、Ｆｉｌｔｅｒ  ｔｙｐｅ  ＧＴＢＰ）で吸引濾過し、フィルター上に菌体を採取した。次いで、スライドガラス上にイマージョンオイルを置き、その上に菌体を採取したヌクレポアフィルターを乗せ、さらにイマージョンオイル、カバーガラスを順に乗せて検鏡試料を作成した。この試料を落射蛍光顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ製：高級システム顕微鏡ＢＸ５０、ユニバーサル落射蛍光装置ＢＸ‐ＦＬＡ）を用いて検鏡した（×１０００倍）。紫外線によって土壌中の鉱物が黄色く発光するため、青白く発光するものを菌体として計数した。検鏡試料１枚につき、方眼接眼ミクロメーターの１０×１０方形（５０μｍ×５０μｍ）を１視野としてその中の菌数を数え、計２０の異なる視野について２連計数した。合計４０視野の平均菌数を求め、土壌１ｇ当たりの全菌数を次式で算出した。
【００８９】
【数３】
2004337027.tif 000005
【００９０】
得られた診断対象の土壌の環境ＤＮＡ量（補正後）（μｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）とＤＡＰＩ染色法により計測した土壌に存在する全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を図１５に示す。図１５から明らかなように、由来が異なる様々な土壌サンプルにおいても、環境ＤＮＡ量と土壌微生物量との間に相関関係が認められた。
【００９１】
このことから、本試験に採用したＤＮＡ抽出方法及び定量方法によれば、土壌の種類の別を問わず、土壌中に存在する全微生物量を把握できることが確認された。
【００９２】
（２）水田土壌環境中の微生物量と環境ＤＮＡ量
水田から採取した数種の土壌を用いて、試験例１の方法に準じて該土壌から採取した試料中に存在するＤＮＡを抽出し、これを回収して該試料１ｇ当たりのＤＮＡ量を測定し、更に該ＤＮＡ量の測定値を試験例３に記載の式２に従って補正して、環境ＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）を求めた。また、併せて、下記の方法に従って、表１に示す各種土壌に存在する全微生物量（ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）をＤＡＰＩ染色法によって計測した。
【００９３】
水田から採取した数種の土壌において、得られた環境ＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）と全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を図１６に示す。
【００９４】
水田土壌において、土壌微生物量は約０．５×１０１０〜６．０×１０１０  ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌの範囲であり、環境ＤＮＡ量は１０〜８０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌの範囲を示すことが確認された。また、環境ＤＮＡ量が２５μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ以上の水田土壌では、他の水田土壌に比して、稲の生育が優れているという傾向があることが分かった。特に、環境ＤＮＡ量が３０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌの水田土壌では、他の水田土壌に比して、稲の生育がより一層優れている傾向があることが確認された。この結果から、環境ＤＮＡ量を指標として、水田土壌の稲栽培の好適性について診断可能であることが明らかとなった。本結果に併せて、更に各水田で栽培する稲の種類、稲の生育特性、収穫率等のデータと組み合わせて、データベースを作成することで、環境ＤＮＡ量を測定することによって、より一層詳細な水田土壌の診断が可能になると考えられる。
【００９５】
（３）畑土壌環境中の微生物量と環境ＤＮＡ量
畑から採取した数種の土壌を用いて、上記（２）と同様の方法で、該土壌の環境ＤＮＡ量（補正後）（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）及びＤＡＰＩ染色法による該土壌中の全微生物量（ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）を求めた。得られた結果を図１７に示す。
【００９６】
各種畑土壌では土壌微生物量が約０．２〜６．０×１０１０  ｃｅｌｌｓ／ｇの範囲で、診断対象試料の環境ＤＮＡ量が２〜８０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌの範囲にあり、水田土壌と非常によく似た傾向を示していることが明らかとなった。
また、環境ＤＮＡ量が２５μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ以上の畑土壌では、他の畑土壌に比して、農作物の生育が優れているという傾向があることが分かった。特に、環境ＤＮＡ量が３０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌの畑土壌では、他の畑土壌に比して、農作物の収穫高が高く、畑土壌として優れているという傾向があることが確認された。この結果から、環境ＤＮＡ量を指標として、畑土壌適性について診断可能であることが明らかとなった。
【００９７】
本結果に、更に、各畑で栽培する作物の種類、作物の生育特性、収穫率等のデータと組み合わせて、データベースを作成することによって、農地の適正や収穫率予想などの診断が可能となると考えられる。
【００９８】
（４）一般土壌環境中の微生物量と環境ＤＮＡ量
数種の一般土壌からを用いて、上記（２）と同様の方法で、該土壌の環境ＤＮＡ量（補正後）（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）及びＤＡＰＩ染色法による該土壌中の全微生物量（ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）を求めた。得られた結果を図１８に示す。
【００９９】
一般土壌では土壌微生物量が約０．１〜４．０×１０１０  ｃｅｌｌｓ／ｇの範囲で、診断対象試料の環境ＤＮＡ量が１〜６０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌの範囲にあることが確認された。一般土壌は、水田や畑の土壌に比して、その土壌微生物量及び環境ＤＮＡ量が少ない傾向にあることが認められた。中でも特に、汚染土壌では、土壌微生物量及び環境ＤＮＡ量が顕著に少ないことが確認された。具体的には、本試験結果から、汚染の程度が高い土壌では、環境ＤＮＡ量が１０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ以下であることが分かった。
【０１００】
以上の結果から、一般土壌から測定された回収した環境ＤＮＡ量は、その土壌の汚染の程度を反映しており、診断対象となる土壌の環境ＤＮＡ量を測定することにより、土壌の汚染度の診断が可能となることが確認された。
【０１０１】
（５）一般土壌環境中の微生物量と環境ＤＮＡ量
琵琶湖の周辺で採取した数種の土壌を用いて、上記（２）と同様の方法で、該土壌の環境ＤＮＡ量（補正後）（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）及びＤＡＰＩ染色法による該土壌中の全微生物量（ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）を求めた。得られた結果を図１９に示す。
【０１０２】
琵琶湖周辺の土壌では、主として、土壌微生物量が約０．１〜２．０×１０１０  ｃｅｌｌｓ／ｇの範囲で、診断対象試料１ｇ中の環境ＤＮＡ量が１〜２０μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌの範囲にあることが確認された。当該土壌微生物量及び環境ＤＮＡ量は、一般土壌に比して少なく、汚染土壌より少し多い程度のものであった。
【０１０３】
以上の（１）〜（５）から明らかなように、土壌の環境ＤＮＡ量は、土壌の特性や状況を反映していることが確認された。土壌の環境ＤＮＡ量は、土壌微生物量を反映しており、該環境ＤＮＡ量から、土壌中の微生物量を推定できることが確認された。
【０１０４】
試験例４  水圏環境中の微生物量と該環境から回収されるＤＮＡ量との相関関係についての検討
油脂分解能を有することが知られているＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  ＴＨＬ７、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＤＷ１５−２、及びＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  ＤＷ２−１を用いて、水圏環境中の微生物濃度と該環境から回収されるＤＮＡ量との関係を検討するために以下の試験を行った。
【０１０５】
油脂廃液処理槽内から採取した油脂含有廃液を１２１℃で６０分間加熱処理して、該廃液中に存在するＤＮＡを完全に分解した。次いで、得られたＤＮＡ無含有油脂含有廃液に上記２種の微生物をそれぞれ各種濃度となるように、添加した。得られた上記微生物を含む油脂含有廃液から、各菌株の濃度と該液１ｇから回収されるＤＮＡ量を求めた。
【０１０６】
水圏環境中の各菌株の濃度は、ＬＢ寒天培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用い、３０℃、２４時間静置培養後、コロニー・フォーミング・ユニット（ＣＦＵ）を計測した。上記微生物を含む油脂含有廃液１ｇから回収されるＤＮＡ量は、試験例１の方法に従って測定した。
【０１０７】
得られた結果を図２０に示す。図２０から明らかなように、水圏環境中の各菌株の濃度と該廃液から回収されるＤＮＡ量との間には、比例関係があることが分かった。従って、本試験で採用したＤＮＡ抽出及び定量方法は水圏環境中に存在する微生物量を推定する方法として適していることが確認された。
【０１０８】
試験例５  水圏環境中の油分が該環境から回収されるＤＮＡ量に及ぼす影響についての検討
水圏環境中の油分が該環境の試料から回収されるＤＮＡ量に及ぼす影響を解析するために、以下の試験を行った。
【０１０９】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ  ＴＨＬ７を用いて、油分としてサラダ油１％添加した水道水と油分を添加していない水道水を作成し、これらを１２１℃で６０分間加熱処理した。このようにして作成されたサラダ油１％含有無菌水道水及び無菌水道水を水圏環境モデルとして用いて、試験例４と同様の方法で試験を行い、それぞれの水圏環境中の菌株濃度と該環境から回収されるＤＮＡ量を測定した。得られた結果を図２１に示す。
【０１１０】
図２１から分かるように、水圏環境中の油分の有無によらず、該環境から回収されるＤＮＡ量は一定であった。この結果から、本試験で採用したＤＮＡ抽出及び定量方法は油脂の影響を受けないことが明らかとなった。
【０１１１】
【発明の効果】
本発明の環境診断方法は、環境ＤＮＡ量を指標として、診断対象の環境の総合的な特性や状況を判定して、該環境の診断を行う。本発明の環境診断で指標とする環境ＤＮＡ量の測定は、プレート法により環境に存在する微生物を検出する場合に比して、迅速、簡便かつ安価に実施することができる。更に、当該環境ＤＮＡ量の測定は、従来全微生物量を定量する手段として知られているＤＡＰＩ染色法に比して極めて簡便な操作によって微生物量を反映でき、しかもＤＡＰＩ染色法で使用するような高価な装置を必要としないという点で、実用的である。
【０１１２】
それ故、本発明の環境診断方法によれば、簡便且つ迅速な方法で、しかも総合的な環境の特性を正確に判定して、的確に環境診断を行うことができる。このため、本発明の環境診断方法を利用して、例えば、水田や畑等の農地について、栽培作物毎の農地の適正を診断したり、またその収穫量を予想したりすることが可能となる。また、本発明の環境診断方法によって、例えば、各環境の汚染の有無や程度について、的確に診断することが可能となる。
【０１１３】
また、本発明の環境診断方法において環境診断の指標として使用する環境ＤＮＡ量から、当該環境に存在する全微生物量を推定できるので、該環境ＤＮＡ量の測定は、環境から採取された試料に存在する全微生物量を推定するための手段としても有用である。
【０１１４】
更に、本発明の環境診断システムによれば、簡便且つ迅速に総合的な環境の診断をすることが可能となる。
【０１１５】
また、本発明のＤＮＡ溶出回収装置によれば、各種環境、特に土壌に存在するＤＮＡを簡便かつ迅速に回収することができる。そのため、上記環境診断方法や環境診断システムに好適に使用することができる。また、環境に存在するＤＮＡ量から該環境に存在する微生物量を推定することが可能であるので、本発明のＤＮＡ溶出回収装置は、環境に存在する微生物量を推定するために好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＮＡ抽出・回収手段の一実施形態を示す装置の側面図である。
【図２】支持部材３ａの上面図である。
【図３】２種の容器を支持させた支持部材３ａの側面図である。
【図４】溶出処理工程及び遠心分離時の、各手段、支持部材の位置構成の一例を示す図である。
【図５】第一回収容器への供給工程時の、各手段、支持部材の位置構成の一例を示す図である。
【図６】不純物の除去工程時の、各手段、支持部材の位置構成の一例を示す図である。
【図７】不純物の除去工程時の、各手段、支持部材の位置構成の一例を示す図である。
【図８】ＤＮＡの沈殿工程時の、各手段、支持部材の位置構成の一例を示す図である。
【図９】ＤＮＡの沈殿工程時の、各手段、支持部材の位置構成の一例を示す図である。
【図１０】試験例１において、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す図である。
【図１１】試験例１において、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＴ−２を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す図である。
【図１２】試験例１において、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｆ７２１を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す図である。
【図１３】試験例１において、Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＭＦ２０を含有する人工土壌中の微生物量［ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ  ｓｏｉｌ）］とＤＮＡの回収量［ｌｏｇ（ｎｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）］の関係を示す図である。
【図１４】試験例２において、各種土壌のＤＮＡ抽出効率を示す図である。
【図１５】試験例３の（１）において、各種土壌の環境ＤＮＡ量（補正後）（μｇ／ｇ  ｓｏｉｌ）とＤＡＰＩ染色法により計測した全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を示す図である。
【図１６】試験例３の（２）において、水田から採取した数種の土壌の環境ＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）とＤＡＰＩ染色法により計測した全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を示す図である。
【図１７】試験例３の（３）において、各種の畑から採取した数種の土壌の環境ＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）とＤＡＰＩ染色法により計測した全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を示す図である。
【図１８】試験例３の（４）において、一般土壌の環境ＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）とＤＡＰＩ染色法により計測した全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を示す図である。
【図１９】試験例３の（５）において、琵琶湖周辺から採取した数種の土壌の環境ＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｇ  ｓｏｉｌ）とＤＡＰＩ染色法により計測した全微生物量（土壌微生物量）（×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｇ  ｓｏｉｌ）の関係を示す図である。
【図２０】試験例４において、水圏環境中の全微生物量と該環境から回収されたＤＮＡ量との関係を示す図である。
【図２１】試験例５において、油分が存在又は非存在の水圏環境から回収されたＤＮＡ量と該環境中の全微生物量との関係を示す図である。
【符号の説明】
３ａ  支持部材
３ｂ  遠心モーター
３ｃ  容器支持部
４  ＤＮＡ溶出容器
４ａ  注入口
４ｂ  開閉制御手段
４ｃ  供給口
５ａ  注入管
５ｂ、１６ａ、１８ａ  注入用ポンプ
９  攪拌モーター
１０  攪拌軸
１２  加熱ヒーターユニット
１５ａ  抜き取り・注入用ポンプ
１５ｂ、１７ｂ  挿入管
１５ｃ、１７ｃ  ピペットチップ
１６注入用ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2004337027.tif 000020
【図１６】
2004337027.tif 000021
【図１７】
2004337027.tif 000022
【図１８】
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【図１９】
2004337027.tif 000024
【図２０】
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【図２１】
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