(57)【要約】      （修正有）【課題】  天然フミン酸と液体クロマトグラフィーで同一のピーク位置なるフェノールポリマーを合成方法で製造する。【解決手段】  ポリフェノール化合物を、ｐＨ８〜１１の塩基性水溶液に溶解し、アルカリ性過ヨウ素酸塩又はアルカリ土類過ヨウ素酸塩を加え、３５−８０℃で３０分〜１００時間反応させ、アルカリ硫化物、アルカリ土類硫化物等を加えて放置し、約５００〜１０，０００ダルトン以下の分子を除去してから、濃縮するフェノールポリマーおよびその製造方法、用途を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理化学的特性及び性質に再現性があり、市販されている典型的な天然フミン酸の液体クロマトグラフのピーク位置と実質的に同一の位置にピークを有する合成フェノールポリマー成分を製造する方法であって、
ａ）
【表１】
2004169007.tif 000007
【表１−２】
2004169007.tif 000008
及び
【表２】
2004169007.tif 000009
【表２−２】
2004169007.tif 000010
に示した化合物から成るグループから選択した１種類または複数の出発有機化合物を、蒸留水または水酸化ナトリウムから成る水溶液中に溶解するステップと、
ｂ）段階ａ）で得られた水溶液のｐＨを、必要に応じて８〜１１に調整するステップと、
ｃ）段階ｂ）で得られた水溶液に、アルカリ性過ヨウ素酸塩またはアルカリ土類過ヨウ素酸塩を加えるステップと、
ｄ）段階ｃ）で得られた溶液の温度を３５〜８０℃に３０分から１００時間保つステップと、
ｅ）ホウ酸、ホウ酸塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、アルカリ性硫化物、アルカリ土類硫化物、遷移金属硫化物から成るグループから選択した１種類または複数の化合物を、段階ｄ）で得られた水溶液に加えるステップと、
ｆ）段階ｅ）で得られた水溶液を撹拌しながらまたは撹拌せずに室温で２から４８時間放置するステップと、
ｇ）段階ｆ）で得られた溶液から約５００〜１０，０００ダルトン以下の分子を除去するステップと、
ｈ）段階ｇ）で得られた溶液を濃縮するステップと、
ｉ）段階ｈ）で得られた溶液から、必要に応じて水を除去するステップとを含む方法。
【請求項２】
水酸化アンモニウム水溶液または他のアルカリ性酸化物または水酸化物水液、アルカリ土類酸化物または水酸化物水溶液、遷移金属酸化物または水酸化物水溶液、塩酸または他の無機酸のいずれかを加えることにより、段階ａ）で得られた水溶液のｐＨを８〜１１に調整する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階ｂ）で得られた溶液にアルカリ硫化物またはアルカリ土類硫化物を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
段階ｂ）で得られた溶液に遷移金属硫化物を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階ｃ）で得られた溶液にアルカリ硫化物またはアルカリ土類硫化物を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階ｃ）で得られた溶液に遷移金属硫化物を加える、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階ｆ）で得られた溶液に生じたいかなる沈殿物も遠心分離によって除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
分子量カットオフ５００〜１０，０００ダルトンのサンドイッチ型の膜から成るフロースルー透析器を用いて、貯留液の導電率が２００μs以下になるまで、段階ｆ）で得られた溶液を透析することによって段階ｇ）が実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
透析器貯留液の容量が減るように貯留液を産生するフロースルー透析器を用いて、段階ｇ）で得られた溶液を段階ｈ）で濃縮する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
孔の大きさが０．２〜０．４μのフィルターを用いて、段階ｇ）で得られた溶液をろ過して滅菌溶液を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
段階ｇ）で得られた溶液を１００〜１５０℃のオートクレーブに５〜６０分間入れ、滅菌溶液を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
孔の大きさが０．２〜０．４μのフィルターを用いて、段階ｈ）で得られた溶液をろ過して滅菌溶液を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
段階ｈ）で得られた溶液を１００〜１５０℃のオートクレーブに５〜６０分間入れ、滅菌溶液を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｈ）で得られた溶液から水を段階ｉ）で除去する前に、マンノースなどの静電気抑制材料を前記溶液に加える、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
スプレードライまたは温度誘発性蒸発または真空または凍結乾燥によって段階ｉ）を達成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
段階ｉ）で得られた乾燥粉末を１００〜１５０℃のオートクレーブに５〜６０分間入れ、滅菌粉末を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
段階ｆ）で得られた溶液から分子を除去するのに、筒型、毛細管型、らせん型または平面型の透析膜を段階ｇ）で使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
孔の大きさが０．２〜０．４μのフィルターを用いて、段階ｇ）で得られた溶液をろ過して滅菌溶液を得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階ｇ）で得られた溶液を１００〜１５０℃のオートクレーブに５〜６０分間入れ、滅菌溶液を得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
透析器貯留液の容量が減るように貯留液を産生するフロースルー透析器を用いて、段階ｇ）で得られた溶液を段階ｈ）で濃縮する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
分子量カットオフ３０，０００〜１００，０００ダルトンのサンドイッチ型の膜から成るフロースルー透析器を用いて、段階ｇ）で得られた溶液をさらに透析し、分子量の下限が５００〜１０，０００ダルトンで上限が３０，０００〜１００，０００ダルトンの合成フェノールポリマー成分を含有するろ過水溶液を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記透析に筒型、毛細管型、らせん型または平面型の透析膜を使用する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
孔の大きさが０．２〜０．４μのフィルターを用いて、段階ｇ）で得られた溶液をろ過して滅菌溶液を得る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
段階ｇ）で得られた溶液を１００〜１５０℃のオートクレーブに５〜６０分間入れ、滅菌溶液を得る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
透析器貯留液の容量が減るように貯留液を産生するフロースルー透析器を用いて、段階ｇ）で得られた溶液を段階ｈ）で濃縮する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の方法に従って製造した抗ウイルス量の合成フェノールポリマー成分を血液製剤と組み合わせた血液製剤混合物。
【請求項２７】
前記血液製剤がヒト全血である、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２８】
前記血液製剤がヒト血小板である、請求項２６に記載の混合物。
【請求項２９】
抗ウイルス量が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）活性を低下させるのに十分な量である、請求項２８に記載の混合物。
【請求項３０】
抗ウイルス量が、エンベロープを持たないウイルスの活性を低下させるのに十分な量である、請求項２８に記載の混合物。
【請求項３１】
エンベロープを持たないウイルスがパルボウイルスである、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３２】
エンベロープを持たないウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項３０に記載の混合物。
【請求項３３】
前記血液製剤がヒト血漿である、請求項２６に記載の混合物。
【請求項３４】
前記血液製剤がヒト血液タンパクである、請求項２６に記載の混合物。
【請求項３５】
前記ヒト血液タンパクがヒト血清アルブミンまたはヒト血清ガンマグロブリンである、請求項３４に記載の混合物。
【請求項３６】
前記血液製剤がヒト血友病因子である、請求項２６に記載の混物。
【請求項３７】
ヒト血友病因子が第ＶＩＩＩ因子である、請求項３６に記載の混合物。
【請求項３８】
ヒト血友病因子が第ＩＸ因子である、請求項３６に記載の混合物。
【請求項３９】
抗ウイルス量が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）活性を低下させるのに十分な量である、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４０】
抗ウイルス量が、エンベロープを持たないウイルスの活性を低下させるのに十分な量である、請求項３６に記載の混合物。
【請求項４１】
エンベロープを持たないウイルスがパルボウイルスである、請求項４０に記載の混合物。
【請求項４２】
エンベロープを持たないウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項４０に記載の混合物。
【請求項４３】
請求項１に記載の方法に従って製造した抗ウイルス量の合成フェノールポリマー成分を血液製剤と接触させることによって、前記血液製剤中のウイルスの量を減少させる方法。
【請求項４４】
一方に滅菌した前記血液製剤、もう一方に抗ウイルス量の滅菌した前記合成フェノールポリマー成分が入っている２つの部分をつなぐ連絡路の封印を滅菌的に取ることによって前記接触を実現する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ウイルス量を含有する滅菌溶液を前記血液製剤に注入することによって前記接触を実現する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルスがＡ型肝炎ウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルスがパルボウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
ウイルス活性を低下させる血液処理法を１つまたは複数追加する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
追加する血液処理法が溶媒・洗浄剤（ＳＤ）法である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１に記載の方法に従って製造される抗ウイルス量の合成フェノールポリマー成分及び少なくとも１種類の生理学的に認められる担体または賦形剤から成る、ヒトまたは動物のウイルス性疾患の治療用または予防用製剤。
【請求項５５】
ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５６】
ウイルスが単純ヘルペスウイルスＩ型またはＩＩ型である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５７】
ウイルスがピコルナウイルスである、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５８】
生理学的に認められる賦形剤が注射可能な溶液用賦形剤である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項５９】
生理学的に認められる賦形剤が外用剤用賦形剤である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項６０】
生理学的に認められる賦形剤が経口摂取可能な賦形剤である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項６１】
生理学的に認められる賦形剤が鼻内スプレー用賦形剤である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項６２】
生理学的に認められる賦形剤が計量吸入剤用賦形剤である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項６３】
生理学的に認められる賦形剤が膣錠用または座剤用賦形剤である、請求項５４に記載の製剤。
【請求項６４】
生理学的に認められる賦形剤が医療用具の消毒または保存に適している、請求項５４に記載の製剤。
【請求項６５】
請求項１に記載の方法に従って製造される抗菌量の合成フェノールポリマー成分及び少なくとも１種類の生理学的に認められる賦形剤から成る、ヒトまたは動物の微生物誘発性疾患の治療用または予防用製剤。
【請求項６６】
生理学的に認められる賦形剤が注射可能な溶液用賦形剤である、請求項６５に記載の製剤。
【請求項６７】
生理学的に認められる賦形剤が外用剤用賦形剤である、請求項６５に記載の製剤。
【請求項６８】
生理学的に認められる賦形剤が経口摂取可能な賦形剤である、請求項６５に記載の製剤。
【請求項６９】
生理学的に認められる賦形剤が鼻内スプレー用賦形剤である、請求項６５に記載の製剤。
【請求項７０】
生理学的に認められる賦形剤が計量吸入剤用賦形剤である、請求項６５に記載の製剤。
【請求項７１】
生理学的に認められる賦形剤が膣錠用または座剤用賦形剤である、請求項６５に記載の製剤。
【請求項７２】
生理学的に認められる賦形剤が医療用具の消毒または保存に適している、請求項６５に記載の製剤。
【請求項７３】
医療用具がコンタクトレンズである、請求項７２に記載の製剤。
【請求項７４】
出発物質が、最低１個の水酸基及び最低１個のカルボキシル基を持つ、請求項１の表１及び表２に示した化合物から選択した１種類または複数の化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項７５】
出発物質が、２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）である、請求項１記載の方法。
【請求項７６】
全ステップを通じてＰＨ７以上に保つ、請求項１記載の方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はフェノールポリマーからなる合成土壌抽出物質と、その調整法と、合成物質を水溶液または乾燥粉末として精製及び単離するためのプロセスと、血液製剤中のウイルス活性を低下または消失させるためにこれら合成フェノールポリマーを使用するための組成物及び方法と、ヒトまたは動物のウイルス性疾患を治療または予防するための抗ウイルス組成物と、ヒトまたは動物の細菌性疾患を治療または予防するための抗菌組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
土壌抽出物質、特に総称して「腐植」、「腐植質」、「フミン酸」、「フミン酸塩」として知られる物質類は、F.J.StevensonがHumus Chemistry.Genesis Composition Reactions; New York: Wiley,1964で、またもっと最近になってA.PiccoloがHumic Substances in Terrestrial Ecosystems; New York; Elsevier,1996で概説しているとおり、長年にわたり多くの応用例で広く用いられてきた。
【０００３】
天然及び合成土壌抽出物は園芸及び関係する産業で、特に土壌強化並びに土壌改良剤としてすでに広く用いられている。さらに、天然及び合成土壌抽出物は有機造園及び修景並びに淡水水槽の添加剤として使用されている。合成土壌抽出物でも天然土壌抽出物でもいくつかの医療上の利点が主張されている。
【０００４】
R.H.Faustは、１９９６年１０月にデンマークのコペンハーゲンで行われたConference of the International Federation of Organic Agriculture Movementsでの論文の２ページ２０行で、農業におけるフミン酸塩の利益について報告している。一般に、腐植物質は作物収量を含む植物の成長を約１０〜３０％促進することができると判明している。
【０００５】
土壌抽出物、特にフミン酸は様々な金属をキレート化する。その結果、腐食物質はM.A.RashidがSoil Sci,1971,111,298-306で報告しているとおり、重金属汚染を除去するための土壌改良に用いられてきた。フミン酸はまた、石油製品で汚染された帯水層からの芳香族炭化水素の除去を促進するためにも用いられてきた。
H.Xu, S.Lesage, L.Durham, and K.Novakowski, in Proceedings of the Fourth Annual Symposium on Groundwater and Soil Remediation; アルバータ州カルガリー：１９９４年９月２１〜２３日；６３５〜６４６ページ
S.Lesage, H.Xu, K.S.Novakowski, S.Brown, and L.Durham, in Proceedings of the Fifth Annual Symposium on Groundwater and Soil Remediation；オンタリオ州トロント：１９９５年１０月２〜６日。
【０００６】
フミン酸塩物質は家禽飼料添加剤として用いられてきた。ブロイラー鶏の飼料にフミン酸塩物質を添加すると、収量が平均で５〜７％増加し、家禽の安全性も３〜５％上昇する：
L．M．Stepchenko，L．V．Zhorina， and L.V.Kravtsova,Biol Nauki 1991, 10, 90-95。
【０００７】
T.A.Huck、N.Porter、及びM.E.Bushellは、J.Gen.Microbio1. 1991, 137(10), 2321-2329で、土壌単離物が抗生物質産生のための有効な培地添加剤で、微生物増殖促進の程度は種、培地、及び環境によって非常に大きくなりうると報告している。好熱性カンピロバクター属抽出物を単離するための培地として土壌亜炭フミン酸塩の選択したバッチを使用する報告も、K.Weinrich, K.Winkler, and E.Heberer, DTWDtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1990, 97(12), 511-515により出されている。
さらに、B.Grundaは、Zentralbl.Bakteriol.Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. 1970, 125(6), 584-593で培養中の土壌微生物数に対するフミン酸の効果について述べている。
【０００８】
フミン酸塩はT.D.Lotoshが、Biol.Nauki 1991,10,99-103で詳述しているとおり、様々な病気に対する民間療法として長く用いられてきた（F.K.Achard, Crells Chem. Ann. 1786, 11, 391-403）。
【０００９】
泥炭から単離したフミン酸は、子宮角と前腹壁腹膜の両方に標準化病変を有する雌ラットで試験したところ、癒着に対する著しい効果を示した:M.Mesrogli, D.H.Maas, B.Mauss, S.Plogmann, W.Ziechmann, and J.Schneider, Zentralbl. Gynakol. 1991, 113(10), 583-590。
【００１０】
天然フミン酸のアナフィラキシー感作及び肥満細胞分泌機能に影響を及ぼす能力が、J.Wyczolkowska, T.Michon, Z.Slusarczyk, B.Kolago, and C.Maslinski, Acta Pol. Pharm. 1993, 50(6), 475-480によって明らかにされた。体重１キログラムあたり２０及び５０ミリグラム用量の腐食物質は、ｉｎｖｉｔｒｏで抗ＩｇＥまたはコンカナバリンＡで攻撃したマウス腹膜肥満細胞からのヒスタミン放出を低下させた。
【００１１】
泥炭及びフミン酸ナトリウムを含む腐食物質は、抗炎症作用を示すことが知られている:M.Kuhnert, V.Fuchs, and S.Golbs, Arch.Exp. Veterinarmed. 1982, 36(2), 169-177; S.B.Ye, J.K.Chen, and Z.X.Zeng, Ssu Chuan I Hsueh Yuan Hsueh Pao 1985, 16(2), 127-129。子宮頚の炎症状態、特に子宮膣部びらん（一般には子宮頚管炎として知られている）を腐植製剤で治療することができる:J.Woyton, M.Gabrys, T.Bie1anow, M.Zimmer, J.Sokalski, R.Geneja, and M.Zborowski, Arch.Immunol. Ther.Exp.(Warsz)1993, 41(1), 99-103。
【００１２】
腐食物質は抗菌作用を示すことが知られている。天然及び合成腐食物質が抑制作用を有することが明らかにされている種には、カンジダアルビカンス、エンテロバクタークロアカエ、プロテウス−ブルガリス、緑膿菌、サルモネラ−チフィムリウム、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿連鎖球菌(R.Ansorg and W.Rochus, Arzneimittelforschung 1978, 28(12), 2195-2198; 大腸菌及び大便連鎖球菌は影響を受けなかった)、及びミュータンス連鎖球菌（sobrinus）(Y.Nakamura, H.Kuwashima, S.Aoki, and T.Masuhara, Shika Kiso Igakkai Zasshi 1989, 31(3), 329-332)が含まれる。概して、５０〜２０００百万分率（ｐｐｍ）の範囲の濃度が通常は有効であるが、細胞毒性はまだないK.D.Thiel, B.Helbig, R.Klocking, P.Wutzler, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1981, 36(1), 50-53。
【００１３】
腐食物質は抗ウイルス作用を示すことが長い間知られており(H.Schultz, Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1962, 69, 613; 1965, 72(13), 294-297; R.Klocking and M.Sprossig, Experientia 1972, 28(5), 607-608)、特にレトロウイルスに有効である（G.Sydow, V.Wunderlich, R.Klocking, and B.Helbig, Pharmazie 1986, 41(12), 865-868）。
土壌抽出物質が有効であることが明らかにされているウイルス性病原体には、特にコクサッキーウイルスＡ９（Griggs-Baylor）(R.Klocking and M.Sprossig, Experientia 1972, 28(5), 607-608)、単純庖疹ウイルス１型(B.T.Rouse(Ed.), Herpes Simplex Virus; Berlin:Springer-Verlag, 1992; R.Klocking, K.D.Thiel, P.Wutzler, B.Helbig, and P.Drabke, Pharmazie 1978, 33(8), 539; F.Schiller, R.Klocking, P.Wutzler, and I.Farber, Dermatol. Monatsschr. 1979, 165(7), 505-509; B.Helbig, A.Sauerbrei, R.Klocking, P.Wutzler, N.Wicht, U.Wiedemann, and G.Herrmann, J.Med.Viro1.1987, 23(3), 303-309; R.Klocking and B.Helbig, in Humic Substances in the Aquatic and Terrestrial Environment; Berlin: Springer-Verlag, 1991; 407-412;)及び2型(anon. Zentrabl. Bakteriol.［Orig. A］1976, 234(2), 159-169; K.D.Thiel, R.Klocking, H.Schweizer, and M.Sprossig, Zentralbl. Bakteriol.［Orig. A］1977, 239(3), 304-321; K.D.Thiel, B.Helbig, R.Klocking, P.Wutzler, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1981, 36(1), 50-53; K.D.Th1el, B.Helbig, M.Sprossig, R.Klocking, and P.Wutzler, Acta Virol. 1983, 27(3), 200-208; K.D.Thiel, P.Wutzler, B.Helbig, R.Klocking, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1984, 39(11), 781-782)、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）(M.Cushman, P.Wang, S.H.Chang, C.Wild, E.De Clereq, D.Schols, M.E.Goldman, and J.A.Bowen, J.Med.Chem. 1991, 34(1), 329-337; M.Cushman, S.Kanamathareddy, E.De Clereq, D.Schols, M.E.Goldman, and J.A.Bowen, J.Med.Chem. 1991, 34(1), 337-342; D.Schols, P.Wutzler, R.Klocking, B.Helbig, and E.De Clereq, J.Acqu1r. Immune Defic.Syndr.1991, 4(7), 677-685; S.Loya, R.Ta1, A.Hizi, S.Issacs, Y.Kashman, and Y.Loya, J.Nat.Prod.1993, 56(12), 2120-2125; J.Schneider, R.Weis, C.Manner B.Kary, A.Werner, B.J.Seubert, and U.N.Riede, Virology 1996, 218(2), 389-395、インフルエンザウイルスＡ型(Krasnodar/101/59/H2N2) (R.Mentel, B.Helbig, R.Klocking, L.Dohner, and M.Sprossig, Biomed. Biochim. Acta 1983, 42(10), 1353-1356)、及びＢ型(J.Hils, A.May, M.Sperber, R.Klocking, B.Helbig, and M.Sprossig, Biomed.Biochim.Acta 1986, 45(9), 1173-1179)、並びに他の気道感染媒介物（A.Jankowski, B.Nienartowicz, B.Polanska, and A.Lewandowicz- Uszynska, Arch.Immunol.Ther.Exp. (Warsz)1993, 41(1), 95-97）が含まれる。
【００１４】
腐食物質が多くのウイルスの細胞変性作用を阻害するメカニズムがいくらか詳しく調べられている。この物質は、ウイルスのエンベロープ蛋白（ＨＩＶの場合はｇｐ１２０ＳＵ）上に吸着し、それによりウイルス粒子の細胞表面への吸着を阻止することによってウイルスの複製を妨害すると考えられている:K.D.Thiel, R.Klocking, H.Schweizer, and M.Sprossig, Zentralbl.Bakteriol.［Orig.A］1977, 239(3), 304-321; D.Schols, P.Wutzler, R.Klocking, B.Helbig, and E.De Clereq, J.Acquir. Immune Def. Syndr. 1991, 4(7), 677-685; anon., Fortschr. Med. 1995, 113(7), 10; J.Schneider, R.Weis，C.Manner, B.Kary, A.Werner, B.J.Seubert, and U.N.Riede, Virology 1996, 218(2), 389-395。病原体に結合する化学薬品による病原体の細胞外阻止はよく知られた免疫学的防御法である(D.M.Shankel, S.Kuo, C.Haines, and L.A.Mitscher, in Antimutagenesis and Anticarcinogenesis Mechanisms III;G.Bronzetti, H.Hayatsu, S.De Flora, M.D.Waters, and D.M.Shankel(Eds.); New York: Plenum, 1993; 65-74)。このような物質は、T.Kada及びK.ShimoiがBioassays,1987,7,113-116で提唱した「脱変異原物質」に関する用語にならって、「脱病原体物質despathogens」と呼んでもよいであろう。
【００１５】
フミン酸を摂氏１２０度で１５分間熱処理しても、突然変異誘発要因に対するその阻害作用は変わらないことが報告されている:T.Sato, Y.Ose. and H.Nagase, and Mutat, Res. 1986, 162(2), 173-178; T.Sato, Y.Ose, H.Nagase, and K.Hayase, Sci. Total Environ. 1987, 62(4), 305-310)。すなわち、フミン酸はオートクレーブにより滅菌可能である。
【００１６】
酵素的に合成したフミン酸と非酵素的に合成したものとの直接比較により、庖疹１型及び２型の治療において後者は前者よりも約１０倍有効であることが明らかにされた:K.D.Thiel, P.Wutzler, B.Helbig, R.Klocking, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1984, 39(11), 781-782。
【００１７】
移植したウシ・ヒドロキシアパタイト・カルシウムは骨伝導性が高く、新しく発生しつつある骨組織の沈着に対し「ガイドライン」として宿主組織の役に立つ。しかし、この物質の耐容性は高いが、非常にゆっくりとしか再吸収されない。
ウシ・ヒドロキシアパタイトに合成フミン酸を含浸させると再吸収プロセスがはっきりと促進される。
【００１８】
Ｘ線回折解析で調べると、腐植物質の膠原線維への高度の共有結合が水素結合と同様に認められる(架橋結合も確実に認められる):U.N.Riede, I.Jonas, B.Kirn, U.H.Usener, W.Kreutz, and W.Schlickewey, Arch.Orthop.Trauma Surg. 1992, 111(5), 259-264。これにより鍵の強度が７５％も増大する。
【００１９】
天然及び合成フミン酸は、１４日間の試験期間中に１日１００〜３００ミリグラムの用量でヒト顆粒球の食細胞及び殺菌作用を促進することが明らかにされている:U.N.Riede, G.Zeck-Kapp, N.Freudenberg, H.U.Keller, and B.Seubert, Virchows Arch.B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 1991, 60(1), 27-34; M.Kowalska, A.Denys, and J.Bialek, Acta Pol. Pharm. 1993, 50(4-5), 393-395。その他の興味深い点は、１日６００ミリグラムの用量では顆粒球の食細胞及び殺菌作用の一過性でわずかな上昇を引き起こすにすぎないという知見である。
【００２０】
天然及び合成フミン酸の止血に対する影響が調べられている:H.P.Klocking, Arch. Toxicol. Suppl. 1991, 14, 166-169; W.Buczko, B.Malinowska, M.H.Pietraszek, D.Pawlak, and E.Chabielska, Acta Pol.Pharm.1993, 50(6), 507-511。フミン酸は体重１キログラムあたり１００〜３００ミリグラムの用量で出血時間、凝固時間、トロンビン時間、プロトロンビン時間、カオリン−ケファリン時間、ユーグロブリン溶解時間、フィブリノゲン濃度、血小板数、またはＡＤＰ血小板凝集に全く影響がなかった。
【００２１】
様々な合成フミン酸はウサギ網状赤血球の精製リポキシゲナーゼ活性を強く阻害するが、ヒツジ胞状腺のプロスタグランジンＨシンターゼはわずかに阻害されるだけである：C.Schewe, R.Klocking, B.Helbig, and T.Schewe, Biomed. Biochem. Acta 1991, 50(3), 299-305。最も有効なフミン酸はコーヒー酸、２，５−ジヒドロキシトルエン、及び３，４−ジヒドロキシトルエンの誘導体である。
【００２２】
天然フミン酸の肝組織再生応答に対する効果が３分の２肝切除を受けたラットで調べられた。結果は事実上２倍と考えられた。まず、フミン酸を１日に体重１キログラムあたり２０ミリグラムの用量で短期間適用すると、オルニチン・デカルボキシラーゼ活性を阻害し、同じくスペルミジン生成並びにＤＮＡ及びＲＮＡの減少を来し、その結果、肝復旧が全体的に低下することになった。対照的に、フミン酸を長期間適用すると、オルニチン・デカルボキシラーゼの促進、スペルミジン及びヒスタミンとＲＮＡ及びＤＮＡ量の増加、並びに全体の肝臓量増加を引き起こした。この効果は、少なくとも部分的には、フミン酸によるポリアミン生合成の阻害によるものかもしれない:C.Maslinski, W.A.Fogel, and W.Andrzejewski, Acta Pol. Pharm. 1993, 50(4-5), 413-416。
【００２３】
泥炭から抽出したフミン酸並びにフルボ酸は、１ミリリットル中４０〜３６０マイクログラムの濃度でラット肝ミトコンドリアの呼吸を促進することが明らかにされている。また、１ミリリットル中４０〜４００マイクログラム濃度の腐食物質はin vitroで、特に１時間以上接触させた後に、ミトコンドリアの酸化的リン酸化の効率を上昇させた:S.A.Visser, Sci. Total Environ. 1987, 62(4), 347-354。
【００２４】
天然、合成、及び市販のフミン酸はすべて、ヒトのプラスミン活性阻害能を有している:F.J.Lu and Y.S.Lee, Sci.Total Environ. 1992, 114(4), 135-139。したがって、１ミリリットル中２０マイクログラムの濃度で残存プラスミン活性はそれぞれ７０、９３、及び４０％となった。コーヒー酸及び３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸から作られた合成フミン酸はまた、ブタ耳の単離血管標本におけるプラスミノーゲン活性化因子の活性を高めることが明らかにされている(H.P.Klocking, R.Klocking, and B.Helbig, Farmakol. Toksikol. 1984, 47(1), 93-95)。
【００２５】
泥炭由来の天然フミン酸は、αキモトリプシン及びサブチリシンによるＮ−アセチル−Ｌ−チロシン・エチルエステル及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−ロイシン・メチルエステルの加水分解を阻害することが明らかにされている:Sh.Zh.Zhorobekova and K.A.Kydralieva, Biol. Nauki 1991, 10, 151-154。
【００２６】
G.G.Pukhova, N.A.Druzhina, L.M.Stepchenko, and E.E.ChebotarevがRadiobiologiia 1987, 27(5), 650-653で報告しているとおり、フミン酸ナトリウムは致死量の６０Ｃｏ放射線に曝露した雑種ラットの寿命を延ばすことが明らかにされている。
【００２７】
天然フミン酸製剤はインターフェロン−γ、インターフェロン−α、及び腫瘍壊死因子−α(A.D.Inglot, J.Zielinksa-Jenczylik, and E.Piasecki, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 1993, 41(1), 73-80) 、並びにインターフェロン-β (Z.Blach-Olszewska, E.Zaczynksa, E.Broniarek, and A.D.Inglot, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz), 1993, 41(1), 81-85) を含むサイトカインの生成を促進することが明らかにされている。
【００２８】
病態生理学的研究及び超微細構造研究により、天然フミン酸は胸腺活性促進に特有の形態学的変化を引き起こしうることが明らかにされている:J.A.Madej, J.Kuryszko, and T.Garbulinski，Acta Pol. Pharm. 1993, 50(4-5), 397-404。
培養したヒト臍静脈内皮細胞を天然フミン酸または合成フミン酸のいずれかとインキュベートすると、組織因子活性の細胞表面での発現を促進することが明らかにされている。細胞内の２価のカルシウム濃度にも変化がある:H.L.Yang, F.J.Lu, S.L.Wung, and H.C.Chiu, Thromb. Haemost. 1994, 71(3), 325-330。
【００２９】
ラットに予防的に投与した天然フミン酸は、エタノールによる胃粘膜の損傷量を有意に減らすことができる。フミン酸はまた、実験的に発生させた胃及び十二指腸潰瘍の治癒プロセスを有意に加速する:T.Brzozowski, A.Dembinski, and S.Konturek, Acta Pol. Pharm. 1994, 51(1), 103-107。
【００３０】
M.Kuhnert, V.Fuchs, H.Knauf, and U.Knoll, Arch.Exp.Veterinarmed. 1985, 39(3), 344-349、及びM.Kuhnert, V.Fuchs, and S.Golb, Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1989, 96(1)， 3-10で報告及び議論されているとおり、フミン酸は家畜治療薬としても用いられてきた。例えば、H.Schultz, Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1962, 69, 613; 1965, 72(13), 294-297で、ブタ口蹄病の伝染を予防するために泥炭ムルを用いて好結果が得られている。
【００３１】
ニワトリにおけるフミン酸ナトリウムの薬物動態が、J.Hampl, I.Herzig, and J.Vlcek, Vet.Med. (Praha), 1994, 39(6), 305-313で集中的に調べられている。遊離またはリポソーム封入フミン酸ナトリウムを鶏に心内、経口、及び皮下投与して、多くの薬物動態パラメーターが調べられた。リポソーム封入フミン酸ナトリウムの血中クリアランスは、投与法に関係なく遊離フミン酸ナトリウムよりも高かった。一方、排出半減期は心内投与後よりも血管外投与後の方が長かった。最高薬物濃度の値から、フミン酸ナトリウムの注入部位から血液循環への浸透は非常に遅いことが示された。フミン酸ナトリウムの生物学的利用能も、投与法及び投与形態によって異なった。心内投与は別にして、遊離フミン酸ナトリウムの皮下投与後に最高のバイオアベイラビリティが認められた。合成フミン酸は１％の水／油エマルジョンから真皮に非常に速く浸透し、次いで角質層に貯留層を形成することが明らかにされている:W.Wohlrab, B.Helbig, R.Klocking, and M.Sprossig, Pharmazie 1984, 39(8), 562-564。また、外用塗布の約３０分後には塗布した全量の１〜３％の濃度に達し、この濃度はその後も実質的に変わらなかった。
【００３２】
天然フミン酸の毒性は非常に低い（K.D.Thiel, B.Helbig, R.Klocking, P.Wutzler, M.Sprossig, and H.Schweizer,Pharmazie 1981, 36(1), 50-53; U.N.Riede, I.Jonas, B.Kirn, U.H.Usener, W.Kreutz, and W.Schlickewey, Arch. Orthop. Trauma Surg. 1992, 111(5), 259-264; H.Czyzewska-Szafran, Z.Jastrzebski, D.Soltysiak-Pawluczuk, M.Wutkiewicz, A.Jedrych, and M.Remiszewska, Acta Pol.Pharm. 1993, 50(4-5), 373-377; H.L.Yang, F.J.Lu, S.L.Wung, and H.C.Chiu, Thromb. Haemost. 1994, 71(3), 325-330）。[フミン酸を含む抗ウイルス物質の細胞毒性は通常、生物学的(生存度及び細胞の形態学的変化)及び生化学的試験法(５１Ｃｒ放出)により評価される:K.D.Thiel, U.Eichhorn, H.Schweizer, and R.Klocking, Arch. Toxicol. Suppl. 1980, 4, 428-430]。ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）に対する天然フミン酸の細胞毒性（ＣＤ５０）は１ミリリットル中１〜９ミリグラムであることが判明した。さらに、J.Schneoidrr, R.Weis, C.Manner, B.Kary, A.Werner, B.J.Seubert, and U.N.Riede, Virology 1996, 218(2), 389-395で、ヒドロキノンから作った合成フミン酸のＭＴ−２細胞に対する細胞毒性は１ミリリットル中約６００ミリグラムであると報告された。天然土壌物質から単離したフミン酸から作った医薬品は、発がん性でもなく(シリアンハムスター胚細胞変換試験：J.Koziorowska and E.Anuszewska, Acta Pol. Pharm. 1994, 51(1), 101-102) 、突然変異原性もなかった (T.Sato, Y.Ose, and H.Hagase, Mutat. Res. 1986, 162(2), 173-178; V.M.Sui, A.I.Kiung, and T.I.Veidebaum, Vopr. Kurotol. Fiozioter. Lech. Fiz. Kult. 1986, 2(3-4), 34-37; J.Koziorowska, B.Chlopkiewicz, and E.Anuszewska, Acta Pol.Pharm.1993, 50(4-5), 379-382)。体重１キログラムあたり５〜５０ミリグラムの１日用量のフミン酸製剤で、出生前（S.Golbs, V.Fuchs, M.Kuhnert, and C.Polo, Arch.Exp.Veterinarmed. 1982, 36(2), 179-185）及び胚芽毒性並びに催奇作用（T.Juszkiewicz, M.Minta, B.Wlodarczyk, B.Biernacki, and J.Zmudzki, Acta Pol.Pharm.1993, 50(4-5), 383-388）も認められない。水溶液で１０％(w／v)という高用量で皮膚に塗布した場合(K.Wiegleb, N.Lange, and M.Kuhnert, Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1993, 100(10), 412-416)、局所用製剤はさらに耐容性が高い(V.V.Soldatov and M.N.Cherepanova, Vopr.Kurortol. Fizioter. Lech. Fiz. Kult. 1970, 35(3), 256-259; H.Czyzewska-Szafran, Z.Jastrzebski, D.Soltysiak- Pawluczuk, M.Wutkiewicz, A.Jedrych, and M.Remiszewska, Acta Pol. Pharm. 1993, 50(4-5), 373-377)。
【００３３】
腐蝕質を含む土壌抽出物は、土壌採集源や抽出とその後の処置法によって組成が大きく異なる有機及び無機ポリマー化合物の非常に複雑な混合物である:D.Vaughan and R.E.Malcolm, Plant Soil Sci. 1985, 16, 1-443(N.Senesi, Y.Chen, and M.Schnitzer, Soil Biol. Viochem. 1977, 9, 397-404も参照のこと)。
【００３４】
腐蝕質を含む土壌抽出物の化学的特徴付けに用いる方法には、キャピラリー電気泳動(S.Pompe, K.Heise, and H.Nitsche, J.Chromatogr. A, 1996, A723(1), 215-218)、超遠心(R.S.Cameron, B.K.Thornton, R.S.Swift, and A.M.Posner, J.Soil Sci.1972, 23(4), 394-408; A.E.Wilkinson, J.J.Higgo, and M.N.Jones, Biochem. Soc. Trans.1991, 19(4), 414S) 、電子常磁性共鳴及び赤外分光分析 (G．Tollin and C．Steelink, Biochim. Biophys. Acta, 1966, 112(2), 377-379)、様々な溶媒及び他の分別法(R.S.Cameron, B.K.Thornton, R.S.Swift, and A.M.Posner, J.Soil Sci.1972, 23(4), 394-408; C.E.Clapp, M.H.Hayes, and R.S.Swift, Agricultural Research Service Report Number 0000042025; M.H.Hayers, R.L.Malcom, and C.E., Clapp, Agricultural Research Service Report Number 0000042035; I.Csiky, G.Marko-Varga, and J.A.Jonsson, Anal Chim.Acta 1985, 178, 307-312: J.A.Amador, P.J.Milne, C.A.Moore, and R.G.Zika, Mar.Chem. 1990, 29, 1-17)、ガスクロマトグラフィ(I.Arsenie, H.Boren, and B.Allard, Sci.Total Environ. 1992, 116(3), 213-220）、ガスクロマトグラフィ質量分析(H.-R.Schulten and M.Schnitzer, Soil, Sci.1992, 153(3), 205-224; G.Chiavari, G.Torsi, D.Fabbri, and G.C.Galletti,Analyst（London）1994,119(6),1141-150)、ゲル浸透クロマトグラフィ(B.KosinKiewicz, Acta Microbiol.Pol.1977, 26(4), 387-392; S.Mori, M.Hiraide, and A.Mizuike, Anal.Chim.Acta 1987, 193,231-238)、高性能液体クロマトグラフィ(M.A.Curtis, A.F.Witt, S.B.Schram, and L.B.Rogers, Anal.Chem.1981, 53, 1195-1199; K.Ravichandran, J.J.Lewis, I.-H.Yin, M.Koenigbauer, C.R.Powley, P.Shah, and L.B. Rogers, J.Chromatogr.1988, 439, 213-226; J.Knuutinen, L.Virkki, P.Mannila, P.Mikkelson, J.Paasivirta, and S.Herve, Wat. Res. 1988, 22(8), 985-990, M.Susic and K.G.Boto, J.Chromatogr. 1989, 482(1), 175-187) 、質量分析 (H. -R.Schulten, G.Abbt-Braun, and F.H.Frimmel, Environ. Sci. Technol. 1987, 21(4), 349-357; C.Sorge, R.Mueller, P.Leinweber, and H.R.Schulten, Fresenius'J. Anal.Chem. 1993, 346(6-9), 697-703; M.Remmler, A.Gerogi, and F. -D.Kopinke, Eur.Mass Spectrom. 1995, 1(4), 403-407)、核磁気共鳴（F.J.Vila, H.Lentz, and H.D.Ludemann, Biochem.Biophys.Res.Commun.1976, 72(3), 1063-1070; G.Almendros, R.Frund, F.J.Gonzalez-Vi1a, K.M.Haider, H.Knicker, and H.D.Ludermann, FEBS Lett.1991, 282(1), 119-121）、及びポルアクリルアミド・ゲル電気泳動（R.Klocking, J.Chromatogr. 1973, 78, 409-416; L.P.Giazkova, V.S.Ulashchik, and F, A.Puntus, Vopr. Kurortol. Fizioter. Lech. Flz. Kult. 1984, 2(2), 21-24）が含まれていた。
【００３５】
L.B.Sonnenberg,Ph.D.Thesis,University of North Carolina at Chapel Hill, 1989; Dissertation Services Order No．9007318で概説されている還元的変性により、フミン酸を含む土壌抽出物の構造的特徴付けに関する非常に多くの研究が実施されている。膜の物理化学的性質に基づく腐植質の構造モデルも、R.L Wershaw, Environ. Health Perspect. 1989,83(11), 191-203によって展開されている。
【００３６】
R.R.Engebretson and R.von Wandruszka,Environ.Sci.Technol.1994，28，1934では、溶解したフミン酸の微小構成を、その二次構造に関して、すなわちこれらの大きな分子が溶液中で三次元に配列する途中で、特徴付けるための取り組みについて述べられている。この分子は樹枝状、すなわち、いくぶん荷馬車の車輪スポークに似て中心核から広がり、多くのカルボキシ及びヒドロキシ末端基を含む分岐の多いフラクタル様構造であると考えられている：T.H.Mourey, S.R.Turner, M.Rubinstein, J.M.J.Frechet, C.J.Hawker, and K.L.Wooley, Macromolecules 1992, 25, 2401-2406。フミン酸のクラスター凝集の平均直径は７００〜１７００オングストロームで、大きなクラスターは２．３のフラクタル次元を有する:R.Osterberg and K.Mortensen, Radiat. Environ. Biophys. 1994, 33(3), 269-276。
【００３７】
K.Murray and P.W.Lindor,J.Soil Sci.1983,34,511-523が指摘しているとおり、腐蝕物質は化学的に明確でないため、物理化学的性質が天然物質によく似た合成フミン酸の調整は非常に困難である。それにも関わらず、この分野でいくつかの注目に値する進歩があった。おおざっぱに言えば、３つの一般的戦略が出てきた。いずれも分子量がヒドロキシ安息香酸程度の明確な分子から出発し、次いでこの分子どうしを重合させてより大きな分子を生成するという方法による。方法の差は原因因子で、微生物的、化学的、または酵素的に引き起こすことができる。
【００３８】
微生物由来のフミン酸が、M.Robert-Gero, C.Hardisson, L.Le Borgne, and G.Pignaud, Ann. Inst. Pasteur (Paris) 1966, 111(6), 750-767とM.Robert-Gero, C.Hardisson, L.Le Borgne, and G.Vidal, Ann. Inst. Pasteur (Paris) 1967, 113(6), 903-909により報告及び議論されている。
【００３９】
フミン酸の化学合成は、R.Klocking、B.Helbig他が最初に実施した:R.Klocking, B.Helbig, and P.Drabke,Pharmazie 1977, 32, 297; R.Klocking, B.Helbig, K.D.Thiel, T.Blumohr, P.Wutzler, M.Sprossig, and F.Schiller, Pharmazie 1979,34(5-6), 293-294; R.Mentel, B.Helbig, R.Klocking, L.Dohner and M.Sprossig, Biomed. Biochem. Ata 1983, 42(10), 1353-1356; H.P.Klocking, R.Klocking, and B.Helbig, Farmakol. Toksikol. 1984，47(1), 93-95; K.D.Thiel, P.Wutz1er, B.Helbig, R.Klocking, M.Sprossig，and H.Schweizer, Pharmazie 1984, 39(11), 781-782; J.Hils, A.May, M.Sperber, R.Klocking, B.Helbig, and M.Sprossig, Biomed.Biochim. Acta 1986, 45(9), 1173-1179; B.Helbig, A.Sauerbrei, R.Klocking, P.Wutzler, N.Wicht, U.Wiedemann, and G.Herrmann, J.Med.Virol. 1987, 23(3), 303-309; K.I.Hanninen, R.Klocking, and B.Helbig, Sci.Total Environ.1987, 62, 201-210; R.Klocking and B.Helbig, in Humic Substances in the Aquatic and Terrestrial Environment; New York: Springer-Verlag, 1989; 407-412; C.Schewe, R.Klocking, B.Helbig, and T.Schewe, Biomed.Biochim. Acta 1991, 50(3), 299-305; D.Schols, P.Wutzler, R.Klocking, B.Helbig, and E.De Clereq, J.Acquir. Immune Defic. Syndr. 1991, 4(7), 677-685。通常、出発物質である小さい分子のフェノール化合物１０ミリモルを蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液でｐＨを８．５に調整し、次いで、２〜５ミリモルの過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を加える。溶液を５０℃で３０分間加温し、次いで終夜放置する。得られたフミン酸様重合生成物を硝酸鉛(ＩＩ)［Ｐｂ（ＮＯ３）２］により沈殿させて単離する。沈殿したポリマーを水酸化ナトリウム水溶液に再溶解し(ｐＨ８．５)、８−ヒドロキシキノリンと共に１００℃で３０分間加熱する。生成した沈殿は鉛（ＩＩ）キレートで、ろ過により除去する。残存する８−ヒドロキシキノリンをクロロホルムで抽出し、次いで酢酸、酢酸エチル、及びエタノールの様々な組み合わせを加えることにより水溶液から所望のポリマー物質を沈殿させる。腐蝕様物質の合成に用いられてきた出発化合物には、４−［ビス（ｐ−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２，５−シクロヘキサジエー１−オン(アウリン)、４−［ビス（３−カルボキシ−４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２−カルボキシ−２，５−シクロヘキサジエン−１−オン(アウリントリカルボン酸)、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロペノン酸（コーヒー酸）、１，２−ジヒドロキシベンゼン(カテコール)、１，３，４，５−テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロペノエート(クロロゲン酸)、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸(ホモプロトカテチュ酸)、１−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２−（Ｎ−メチルアミノ）エタノール(エピネフリン)、３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−２−プロペノン酸(フェルラ酸)、３，４−５−トリヒドロキシ安息香酸(没食子酸)、２，５−ジヒドロキシ安息香酸(ゲンチジン酸)、２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸(ホモゲンチジン酸)、３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロピオン酸(ヒドロコーヒー酸)、１，４−ジヒドロキシベンゼン(ヒドロキノン)、２，３−ジヒドロキシトルエン(３−メチルカテコール)、３，４−ジヒドロキシトルエン(４−メチルカテコール)、２，５−ジヒドロキシトルエン(２−メチルヒドロキノン)、４，４’−（２，３−ジメチルテトラメチレン）−ジ−（１，２−ジヒドロキシベンゼン）(ノルジヒドログアヤレト酸)、１−（３���４−ジヒドロキシフェニル）−２−アミノエタノール(ノルエピネフリン)、３，４−ジヒドロキシ安息香酸(プロトカテチュ酸)、１，２，３−トリヒドロキシベンゼン(ピロガロール)、１，３−ジヒドロキシベンゼン(レゾルシノール)、及び４−ヒドロキシ−３−メトキシ安息香酸（バニリン酸）が含まれる。腐蝕様物質の化学合成に対する他の注目に値する取り組みには、アウリントリカルボン酸、その誘導体、及び関係する化合物に関するDe Clereq他の研究が含まれる:M.Cushman, P.Wang, S.H.Chang, C.Wild, E.DeClercq, D.Schols, M.E.Goldman, and J.A.Bowen, J.Med.Chem. 1991, 34(1), 329-337; M.Cushman, S.Kanamathareddy, E.De Clercq, D.Schols, M.E.Goldman, and J.A.Bowen, J.Med.Chem. 1991, 34(1), 337-342。関係する取り組みが、M.Robert-Gero, C.Hardisson, L.Le Borgne, and G.Vidal, Ann.Inst. Pasteur (Paris) 1967, 113(6), 903-909; M.Jakubiec, E.Miszczak, and J.Szczerkowska, Acta Microbiol. Pol. [B] 1971, 3(1), 63-66; R.Ansorg and W.Rochus, Arzeimitte1forchung 1978, 28(12), 2195-2198; J.Pornmery, M.Imbenotte, A.F.Urien, D.Marzin, and F.Erb, Mutat. Res. 1989, 223(2), 183-189; F.J.Lu and Y.S.Lee, Sci.Total Environ. 1992, 114, 135-139; K.Wiegleb, N.Lange, and M.Kuhnert, DTW Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1993, 100(10), 412-416; H.L.Yang, F.J.Lu, S.L.Wung, and H.C.Chiu, Thromb.Haemost. 1994, 71(3), 325-330; W.Seffner, F.Schiller, R.Heinze, and Breng, Exp.Toxicol.Pathol. 1995, 47(1), 63-67; and J.Schneider, R.Weis, C.Manner, B.Kary, A.Werner, B.J.Seubert, and U.N.Riede, Virology 1996, 218(2), 389-395からも報告されている。
【００４０】
フミン酸の酵素触媒合成は１９６１年頃のR.E.Hampton and R.W.Fulton, Virology 1961, 13, 44-52 (R.E.Hampton, Phytopathology 1970, 60, 1677-1681も参照のこと)による研究にさかのぼり、彼らは酵素的に酸化したフェノールが植物病原体（すなわち、植物に関係する）ウイルスを不活化することを見いだした。通常、腐植様物質の酵素的合成にはo−ジフェノール・オキシダーゼが用いられてきた：匿名Zentralbl. Bakteriol. [Org.A]1976, 234(2), 159-169; R.Klocking, B.Helbig, and P.Drabke, Pharmazie 1977, 32(5), 297; K.D.Thiel, B.Helbig, R.Klocking, P.Wultzler, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1981，36(1), 50-53; K.D.Thiel, B.Hellig, M.Sprossig, R.Klocking, and P.Wultzler, Acta Virol. 1983, 27(3), 200-208; K.D.Thiel, P.Wutzler, B.Helbig, R.Klocking, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1984, 39(11), 781-782; and G.Sydow, V.Wunderlich, R.Klocking, and B.Helbig, Pharmazie 1986, 41(12), 865-868。
【００４１】
酵素的及び非酵素的に合成したフミン酸とコーヒー酸及びヒドロコーヒー酸との直接の比較により、この２つの合成経路では（ヒト）庖疹１型及び２型ウイルスの抑制に対する効力にいくぶん差がある物質を生成することが明らかにされている:K.D.Thiel, P.Wultzer, B.Helbig, R.Klocking, M.Sprossig, and H.Schweizer, Pharmazie 1984, 39(11), 781-782。
【００４２】
Wagnerに発行されたドイツ特許第ＤＥ３８３０３３３Ｃ１号（１９９０年３月１５日）は、庖疹ウイルスによる水痘疹の局所治療用に一部フミン酸からなる医薬品組成物を開示している。用いたフミン酸の調整法については開示されていない。
【００４３】
Cronje他に発行された米国特許第４，９９９，２０２号（１９９１年３月１２日）は、殺菌または静菌作用を有し、適当な担体中に酸化炭由来のフミン酸またはその塩もしくは誘導体を活性成分として含む組成物を開示している。活性成分は石炭由来フミン酸のアルカリ金属塩であることが好ましく、担体は水であることが好ましい。調整法には、塩酸などの酸によりｐＨ２まで酸性化した後、沈殿によりフミン酸を回収する方法が含まれる。
【００４４】
Riede他からの欧州特許出願第０５３７４３０Ａ１号（１９９３年４月２１日）は、天然または合成の、修飾または未修飾フミン酸アンモニウムまたはフミン酸アルカリ金属塩のウイルス、特にＨＩＶなどのレトロウイルスに対する利用を開示している。Riede他は、毒性が低く突然変異誘発要因でも催奇形因子でもないフミン酸塩を開示している。Riede他はまた、出発物質の酸化完了に１０〜１５日も必要で、その期間中反応温度を４０℃未満に維持する、前述のフミン酸塩の特別な合成的調整法を開示している。合成後、溶液をｐＨ４〜５に酸性化し、その後、分離用クロマトグラフィ、限外ろ過、遠心分離、または電気透析などの公知の精製法を用いる。酸化剤または出発物質以外の無機塩は合成中または合成後に用いない。
【００４５】
Zanettiからの国際特許出願第９５／０８３３５（１９９５年３月３０日発行）は米国特許出願第０８／３１０，６７５号（１９９４年９月２２日提出）と同じで、ヒト免疫不全ウイルスに感染した患者の白血球、末梢血単核細胞、及びリンパ球を天然フミン酸市販製剤の抗免疫不全ウイルス活性を示す量と接触させることを含む、ヒト免疫不全ウイルス阻害法を開示している。合成フミン酸製剤も開示されている。開示された合成法は、出発物質の酸化のために過ヨウ素酸ナトリウムを用いる以外は無機塩を全く用いない。
開示された合成法は、合成生成物の６Ｍ ＨＣｌによるｐＨ１未満への酸性化を用いる。
この溶液を終夜放置する。合成生成物の沈殿が生じ、これを１Ｍ ＨＣｌで数回洗浄する。
最終段階は沈殿の凍結乾燥を含む。
【００４６】
フミン酸などのフェノールポリマーは、前述の条件及びＣｒｏｎｊｅ ’２０２の条件で塩酸に曝露すると、塩素化される可能性がある。すなわち、１つまたは複数の塩素原子がフェノールポリマーの芳香環に付加するかもしれない:R.B.Wagner and H.D.Zook,Synthetic Organic Chemistry,New York:J.Wiley & Sons,March 1963,88-147。塩酸存在下ではフミン酸生成物の選択的Ｏ−脱メチル化などの他の変化も起こるかもしれない:M.Fieser and L.F.Fieser,Reagents For Organic Synthesis,New York,Wiley-Interscience,Vol.4,1974,250。フミン酸の水溶液中での塩素化はエイムス／サルモネラ・平板試験で直接作用突然変異誘発性のある化合物を生成することになるとの報告がある。塩素化されていないフミン酸に突然変異誘発性はない:J.R.Meier, R.D.Lingg, R.J.Bull, Mutat.Res., 1983, 118(1-2), 25-41。また、凍結乾燥した塩素化フミン酸が不揮発性の直接作用突然変異誘発性及び／またはアルキル化剤を含むという報告もある:S.C.Agarwal, J.Neton, Sci.Total Environ., 1989, 79(1), 69-83。９０日間の亜慢性毒性試験が塩素化フミン酸及び塩素化されていないフミン酸で雄のSprague-Dawleyラットを用いて実施されている。１．０ｇ／ｌの塩素化フミン酸群で血尿の頻度及び重症度上昇が認められた:L.W.Condie, R.D.Laurie, J.P.Bercz, J.Toxicol.Environ.Health, 1985, 15(2), 305-14。したがって、塩素化フミン酸を生成する可能性のあるフミン酸製造のための合成法は避けるべきである。
【００４７】
本発明に関連したその他の関係技術分野は、ウイルス及び微生物活性を低下させる血液製剤組成物及び血液製剤処理法からなる。血小板を含む様々なヒト血液製剤があり、重大な医療上の必要性に応えている。ウイルスに関する安全性はドナーの選択とスクリーニングにかかっている。今日までに、血液製剤を十分にスクリーニングし、ウイルス混入がないという完全な保証を提供することが重要であると判明している。これらの血液製剤は、ＨＩＶ−ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型、Ｂ型及びＣ型を含む肝炎ウイルス、その他のウイルスが不注意により混入する可能性がある。血小板を含む血液製剤を処理するために溶媒／界面活性剤（ＳＤ）法があるが、この方法は主に脂質エンベロープを有するウイルスに限られ、Ａ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９及びピコルナウイルスなどのエンベロープを持たないウイルスには無効であることが知られている:P.M.Mannucc1, et al., Ann.Intern.Med., 1994, 120(1), 1-7; and L.Gurtler, Infusionsther. Transfusions med., 1994, 21(Suppl 1), 77-90さらに、ＳＤ法ではダイズ油またはヒマシ油による抽出及び不溶化Ｃ１８樹脂でのクロマトグラフィを用いて血液製剤から界面活性剤を分離する必要がある:B.Horowitz et al., Blood, 1992, 79(3), 826-31; and Y.Piquet et al., Vox Sang. 1992, 63(4), 251-6。
【００４８】
血液製剤を処理するためのパスツリゼーション法が開発されている。このプロセスには安定化タンパク水溶液の６０℃、１０時間の熱処理が含まれる。しかし、安定化製剤を１０時間熱処理した後でも、残存する感染性Ａ型肝炎ウイルスが認められている：J.Hilfenhaus and T.Nowak, Vox Sang., 1994, 67(suppl 1), 62-6。溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）法でもパスツリゼーション法でも単独では熱及び有機溶媒に強い抵抗力のあるウイルスを不活化するのに十分ではない。このような状況では、ヒト・パルボウイルスＢ１９及びＡ型肝炎ウイルスが特に問題である:H.Schwinn et al., Arznneimittelforschung, 1994, 44(2), 188-91。
【００４９】
製造プロセス中すでに溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）法で処理した血漿由来第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）濃縮物の安全性を高めるために、追加のウイルス不活化段階として最終的な高熱処理（１００℃で３０分間）が開発された。高熱処理の有効性が２つの非脂質エンベロープを持つウイルス（Ａ型肝炎ウイルスとポリオウイルス１）の不活化において示された。しかし、高熱処理中のＦＶＩＩＩ凝血促進活性の減損は、凝固及び色素産生分析の両方で推定して約１５％であった:S.Arrighi et al.,Thromb.Haemost.,1995,74(3),863-73。
【００５０】
ウイルスの不活化及びタンパクとのその適合性増強のために、反応性酸素種のクエンチャーによる短波長紫外線（ＵＶＣ）照射を用いたヒト血液製剤処理法が開発されている。しかし、血液タンパクの回収率は通常、わずか７５％程度であった:S.Chin et al.,  Blood,  1995,  86(11),  4331-6。紫外線照射法はさらに、細胞血液製剤に適用できないと報告されている:C.M.Allen, Photochem. Photobiol., 1995, 62(1), 184-9。
【特許文献１】ドイツ特許第３８３０３３３Ｃ１号
【特許文献２】米国特許第４,９９９,２０２号
【特許文献３】欧州特許出願第０５３７４３０Ａ１号
【特許文献４】国際特許出願第９５／０８３３５号
【特許文献５】米国特許出願第０８／３１０,６７５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５１】
以上のことをまとめてみると、血液製剤または血液製剤活性を損失することなく脂質エンベロープを持つウイルス及びエンベロープを持たないウイルスの活性を低下または消失させるための、すべてのヒト血液製剤に対する安全、有効、かつ単純な処理法の必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【００５２】
天然の土壌から抽出または他の方法で得た腐蝕質の物理化学的性質の多様性並びに生物活性及び毒性の大きなばらつきが詳細に報告されている。この多様性とばらつきは、土壌の採集源、抽出及び／または単離法、並びに原料土壌から抽出物をいったん分離及び単離した後にこれを扱うために用いた方法などの要因のばらつきが原因である。天然の土壌から抽出した物質の性質は再現不可能であるため、このような物質の市場価値は非常に小さくなっている。加えて、医薬品として不適当となる。また、腐食物質または同様の物質の単離、合成、及び／または調整の様々な局面に対する多くの実験室規模のプロセスはすでに報告されているが、工業用レベルにまで直接スケールアップするのに適し、経済的に許容できる収率を提供し、かつ医薬品の安全性と有効性の見地から調整法を最適化する方法による、このような純粋な合成フミン酸または同様の物質の調整及び単離の報告はない。公知の合成法はすべて、毒性が生じる可能性のある沈殿法（硝酸鉛（ＩＩ）沈殿）
とその後の複雑な単離法、突然変異誘発要因となる可能性がある化合物を生成する塩酸沈殿、または１０日間もかかる長い合成段階を用いている。解決法は、物理化学的性状が再現可能で、少なくとも典型的な市販土壌抽出物の性状を模した、安価で安全な物質を産する単純な合成法を考案することである。本発明は、この解決法並びに本発明の方法により調整した合成物質を用いた組成物及び方法を企図するものである。
【００５３】
本発明の一態様は、物理化学的性質及び性状が再現可能で、典型的な市販天然フミン酸及び他の土壌抽出物の物理化学的性質及び性状を模した合成フェノールポリマー物質を調製する方法である。この方法には、
ａ）表１及び表２に挙げた化合物からなるグループから選択した１種または複数の出発有機化合物を、蒸留水または水酸化ナトリウムを含む水溶液に溶解する段階と、
ｂ）必要があれば、段階ａ）から得た水溶液のｐＨを８から１１の間に調整する段階と、
ｃ）段階ｂ）から得た水溶液にアルカリ金属またはアルカリ土類金属の過ヨウ素酸塩を加える段階と、
ｄ）段階ｃ）から得た溶液の温度を３０分間から１００時間、３５から８０℃に保つ段階と、 
ｅ）ホウ酸、ホウ酸塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、アルカリ金属硫化物、アルカリ土類金属硫化物、または遷移金属硫化物からなるグループから選択した１種または複数の化合物を、段階ｄ）から得た水溶液に加える段階と、
ｆ）段階ｅ）から得た水溶液を室温で２から４８時間撹拌しながらまたは撹拌せずに放置する段階と、
ｇ）段階ｆ）から得た溶液から約５００から約１０，０００ダルトン未満の分子を除去する段階と、
ｈ）段階ｇ）から得た溶液を濃縮する段階と、
ｉ）必要があれば、段階ｈ）から得た溶液から水を除去する段階とを含む。
【００５４】
プロセスのひとつの実施形態において、段階ａ）から得た水溶液のｐＨを、水酸化アンモニウム水溶液、または他のアルカリ金属酸化物もしくは水酸化物水溶液、またはアルカリ土類金属酸化物もしくは水酸化物水溶液、または遷移金属酸化物もしくは水酸化物水溶液、または塩酸もしくは他の無機酸を加えることにより調整する。
プロセスの別の実施形態において、段階ｂ）から得た溶液に硫化アルカリ金属またはアルカリ土類金属を加える。または、段階ｃ）から得た溶液に硫化アルカリ金属またはアルカリ土類金属を加える。
プロセスの別の実施形態において、段階ｂ）から得た溶液に硫化遷移金属を加える。または、段階ｃ）から得た溶液に硫化遷移金属を加える。
プロセスの別の実施形態において、段階ｆ）から得た溶液から沈殿が生じれば、どのような沈殿も遠心分離で除去する。
プロセスの別の実施形態において、分子量カットオフ値５００〜１０，０００ダルトンのサンドイッチ型膜からなる流通器具を用い、段階ｆ）から得た溶液を滞留溶液の伝導率が２００マイクロジーメンス以下に下がるまで透析することにより、段階ｇ）を実施する。段階ｇ）の透析に続くプロセスの別の実施形態において、透析器具滞留溶液の量を下げられるような滞留溶液を生じる流通透析器具を用いることにより、段階ｇ）から得た溶液を段階ｈ）で濃縮する。プロセスの別の実施形態において、段階ｇ）から得た溶液をポアサイズが０．２から０．４ミクロンのフィルターを通過させ、滅菌溶液を得る。プロセスの別の実施形態において、段階ｇ）から得た溶液を１００から１５０℃で５から６０分間オートクレーブし、滅菌溶液を得る。プロセスの別の実施形態において、段階ｈ）から得た溶液をポアサイズが０．２から０．４ミクロンのフィルターを通過させ、滅菌溶液を得る。
プロセスの別の実施形態において、段階ｈ）から得た溶液を１００から１５０℃で５から６０分間オートクレーブし、滅菌溶液を得る。
プロセスの別の実施形態において、段階ｉ）で溶液から水を除去する前に、段階ｈ）から得た溶液にマンノースまたは他の静電気減少物質を加える。
プロセスの別の実施形態において、段階ｉ）を噴霧乾燥または熱による蒸発または真空または凍結乾燥により実施する。
プロセスの別の実施形態において、段階i）からの乾燥粉末を、１００から１５０℃で５から６０分間オートクレーブし、滅菌粉末を得る。
プロセスの別の実施形態において、段階ｆ）から得た溶液から分子を除去するために、段階ｇ）で管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いる。
段階ｇ）で管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いるプロセスの別の実施形態において、段階ｇ）から得た溶液をポアサイズが０．２から０．４ミクロンのフィルターを通過させ、滅菌溶液を得る。または、管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いた段階ｇ）から得た溶液を１００から１５０℃で５から６０分間オートクレーブし、滅菌溶液を得る。
段階ｇ）で管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いるプロセスの別の実施形態において、透析器具滞留溶液の量を下げられるような滞留溶液を生じる流通透析器具を用いることにより、段階ｇ）から得た溶液を段階ｈ）で濃縮する。
本発明の方法の別の実施形態において、段階ｇ）で得た溶液を分子量カットオフ値３０，０００〜１００，０００ダルトンのサンドイッチ型膜からなる流通器具を用いてさらに透析し、分子量下限が５００から１０，０００ダルトンで分子量上限が３０，０００から１００，０００ダルトンの合成フェノールポリマー物質を含むろ過水溶液を得る。
さらに透析を行う先のプロセスの別の実施形態において、前述のさらなる透析に管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いる。段階ｇ）で管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いる先のプロセスの別の実施形態において、段階ｇ）から得た溶液をポアサイズが０．２から０．４ミクロンのフィルターを通過させ、滅菌溶液を得る。または、管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いた段階ｇ）から得た溶液を１００から１５０℃で５から６０分間オートクレーブし、滅菌溶液を得る。段階ｇ）で管状、毛管、コイルらせん、または平面透析膜を用いる先のプロセスの別の実施形態において、透析器具滞留溶液の量を下げられるような滞留溶液を生じる流通透析器具を用いることにより、段階ｇ）から得た溶液を段階ｈ）で濃縮する。
【００５５】
本発明の別の態様において、本発明の方法により製造した合成フェノールポリマー物質の抗ウイルス活性を示す量と血液製剤を含む血液製剤組成物を提供する。血液製剤組成物のひとつの実施形態において、前述の血液製剤はヒト全血である。血液製剤組成物の別の実施形態において、前述の血液製剤はヒト血小板である。ヒト血小板血液製剤組成物の別の実施形態において、抗ウイルス活性を示す量はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）活性を低下させるのに十分な量である。
ヒト血小板血液製剤組成物のさらに別の実施形態において、抗ウイルス活性を示す量はエンベロープを持たないウイルスの活性を低下させるのに十分な量である。エンベロープを持たないウイルスはパルボウイルスまたはサイトメガロウイルスであることが好ましい。血液製剤組成物の別の実施形態において、前述の血液製剤はヒト血清である。血液製剤組成物の別の実施形態において、前述の血液製剤はヒト血液タンパクである。前述のヒト血液タンパクはヒト血清アルブミンまたはヒト血清ガンマグロブリンであることが好ましい。血液製剤組成物の別の実施形態において、前述の血液製剤はヒト血友病因子である。ヒト血友病因子は第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子であることが好ましい。前述の血液製剤がヒト血友病因子である血液製剤組成物の別の実施形態において、抗ウイルス活性を示す量はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）活性を低下させるのに十分な量である。または、抗ウイルス活性を示す量はエンベロープを持たないウイルスの活性を低下させるのに十分な量である。エンベロープを持たないウイルスはパルボウイルスまたはサイトメガロウイルスであることが好ましい。
【００５６】
本発明のさらに別の態様において、本発明の方法により製造した合成フェノールポリマー物質の抗ウイルス活性を示す量と血液製剤を接触させることにより、この血液製剤中のウイルス量を減少させる方法を提供する。血液製剤中のウイルス量を減少させる方法のひとつの実施形態において、前述の接触は、一方は前述の血液製剤を無菌状態で含み、もう一方は前述の合成フェノールポリマー物質の前述した抗ウイルス活性を示す量を無菌状態で含む、２つの別のチャンバー間の接続路におけるシールを無菌的に破ることからなる。前述の方法の別の実施形態において、前述の接触は、前述の血液製剤中に前述の抗ウイルス活性を示す量を含む無菌溶液を注入することからなる。
前述の方法の別の実施形態において、前述のウイルスはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であることが好ましい。前述の方法の別の好ましい実施形態において、前述のウイルスはＡ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、またはサイトメガロウイルスである。
前述の方法の別の実施形態において、ウイルス活性低下のための１つまたは複数の追加の血液処理法を用いる。追加の血液処理法は溶媒／界面活性剤（ＳＤ）法であることが好ましい。
【００５７】
本発明の別の態様において、本発明の方法により製造した合成フェノールポリマー物質の抗ウイルス活性を示す量と少なくとも１つの生理学的に許容できる担体または賦形剤とを含む、ヒトまたは動物のウイルス起因疾患を治療または予防するための組成物を提供する。ウイルスはヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、単純庖疹ウイルスＩ型もしくはＩＩ型、またはピコルナウイルスであることが好ましい。生理学的に許容できる担体または賦形剤は注入可能な溶液賦形剤、局所製剤用賦形剤、摂食可能な賦形剤、鼻噴霧用賦形剤、用量測定吸入器用賦形剤、膣もしくは肛門坐剤用賦形剤、または医療器具の消毒もしくは保管に適した賦形剤であることが好ましい。
【００５８】
本発明のさらに別の態様において、本発明の方法により製造した合成フェノールポリマー物質の抗菌活性を示す量と少なくとも１つの生理学的に許容できる賦形剤とを含む、ヒトまたは動物の細菌起因疾患を治療または予防するための組成物を提供する。生理学的に許容できる担体または賦形剤は注入可能な溶液賦形剤、局所製剤用賦形剤、摂食可能な賦形剤、鼻噴霧用賦形剤、用量測定吸入器用賦形剤、膣もしくは肛門坐剤用賦形剤、または医療器具の消毒もしくは保管に適した賦形剤であることが好ましい。医療器具はコンタクトレンズ、眼内レンズ、義歯、心臓弁などの移植用医療器具、または内視鏡もしくはカテーテルなどの体に接触する医療機器であることが好ましい。
【発明の効果】
【００５９】
本発明では、物理化学的性質及び性状が再現可能で、典型的な市販天然フミン酸及び他の土壌抽出物の物理化学的性質及び性状を模しており、イオン塩または他の分子量５００ダルトン未満の化合物を含まず、最小分子量が５００ダルトンで、かつ、そのプロセスが経済的に許容できる収率を提供する工業レベルへの直接スケールアップに適した、合成フミン酸としても知られている合成フェノールポリマー物質を調整する化学的方法の新規で改善された組み合わせを提供できる。
【００６０】
また、本発明では、前述のプロセスにより調整した合成フミン酸の抗ウイルス活性を示す量を含む、ヒトまたは動物の血液製剤組成物を提供できる。
また、本発明では、前述のプロセスにより調整した合成フミン酸の抗ウイルス活性を示す量を前述の血液製剤と接触させることにより、ヒトまたは動物の血液製剤中のウイルス量を減少または消失させる方法を提供できる。
また、本発明では、ヒトまたは動物のウイルス性疾患を治療または予防するための、前述のプロセスにより調整した合成フミン酸の抗ウイルス活性を示す量を含む組成物を提供できる。
また、本発明では、ヒトまたは動物の細菌性疾患を治療または予防するための、前述のプロセスにより調整した合成フミン酸の抗菌活性を示す量を含む組成物を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明によれば、合成フミン酸製造のための化学的方法で用いる出発化合物は、容易に購入できる公知の物質である。
概して、本発明の合成フミン酸調整のための化学的方法は、
ａ）出発有機化合物または有機化合物混合物を蒸留水または水酸化ナトリウムを含む水溶液に溶解する段階と、
ｂ）必要があれば、段階ａ）から得た水溶液のｐＨを８から１１の間に調整する段階と、
ｃ）段階ｂ）から得た水溶液にアルカリ金属の過ヨウ素酸塩またはアルカリ土類金属の過ヨウ素酸塩を加える段階と、
ｄ）段階ｃ）から得た溶液の温度を３０分間から１００時間、３５から８０℃までに維持する段階と、
ｅ）ホウ酸、ホウ酸塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩、硫化アルカリ金属、硫化アルカリ土類金属、または硫化遷移金属からなるグループから選択した１つもしくは複数の化合物を、段階ｄ）から得た水溶液に加える段階と、
ｆ）段階ｅ）から得た水溶液を室温で２から４８時間撹拌または撹拌せずに放置する段階と、
ｇ）段階ｆ）から得た溶液から約５００から約１０，０００ダルトン未満の分子を除去する段階と、
ｈ）段階ｇ）から得た溶液を濃縮する段階と、
ｉ）必要があれば、段階ｈ）から得た溶液から水を除去する段階
とからなることを特徴とする。
前述の段階ａ）の出発有機化合物は、表１及び２に示した出発有機化合物群の１つまたは異なる複数の化合物の組み合わせでもよい。表１に示した出発有機化合物は、Ｒ１〜Ｒ６の６つの置換基を有する単一のベンゼン環からなり、このＲ１〜Ｒ６はこのうちの少なくとも１つが水酸基（−ＯＨ）であれば、表記の原子または官能基のどれでもよい。Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも１つが水酸基（−ＯＨ）で、残りの置換基Ｒ１〜Ｒ６の少なくとも１つがカルボキシル基を含むことが好ましい。Ｒ１〜Ｒ６の２つが水酸基（−ＯＨ）で、残りの置換基Ｒ１〜Ｒ６の１つがカルボン酸基を含むことがさらに好ましい。ホモゲンチジン酸、すなわち２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸が特に好ましい出発有機化合物である。
【００６２】
出発有機化合物は蒸留水中、様々な初期濃度で用いることができ、下限または上限を一様に決める必要はない。出発有機化合物の希釈液として、０．１規定などの低濃度水酸化ナトリウム溶液を用いることもできる。１つまたは複数の出発有機化合物の適当な初期濃度は、必要とされる合成収率と、１つまたは複数の出発有機化合物の水溶性の上限など、固有の必要条件によって決まる。１つまたは複数の出発有機化合物の適当な初期濃度を求めるためには従来の方法を用いる。
段階ｂ）で、水酸化アンモニウム水溶液、または他の酸化もしくは水酸化アルカリ金属水溶液、または酸化もしくは水酸化アルカリ土類金属水溶液、または酸化もしくは水酸化遷移金属水溶液を加えることにより、１つまたは複数の出発有機化合物を含む水溶液のｐＨを８〜１１の間に調整することができる。さらに、初期水溶液が０．１規定水酸化ナトリウムなどの低濃度の塩基を含み、かつ、初期溶液ｐＨが高すぎる場合は、塩酸などの酸を用いてｐＨを所期の値に調整してもよい。ｐＨ調整のために他の無機酸を用いることもできる。ｐＨを初期の高値から下方調整するために塩酸を用いる場合は、ｐＨを８未満にしないよう注意しなければならないことに留意されたい。突然変異誘発性の塩素化フミン酸物質が生成する可能性を排除するために、塩酸存在下ｐＨ７未満の酸性状態を避けなければならない。
【００６３】
【表１】
2004169007.tif 000002
【００６４】
【表１−２】
2004169007.tif 000003
【００６５】
【表２】
2004169007.tif 000004
【００６６】
【表２−２】
2004169007.tif 000005
【００６７】
段階ｃ）において、出発有機化合物の酸化剤または重合開始剤としてアルカリ金属の過ヨウ素酸塩またはアルカリ土類金属の過ヨウ素酸塩を用いてもよい。過ヨウ素酸ナトリウムが特に好ましい。アルカリ金属の過ヨウ素酸塩またはアルカリ土類金属の過ヨウ素酸塩濃度は通常、１つまたは複数の出発有機化合物のモル比で１０％から１００％までである。したがって、１０ミリモルの出発有機化合物を用いる場合、１から１０ミリモルのアルカリ金属過ヨウ素酸塩を用いることができる。１つまたは複数の出発有機化合物モル濃度の１０％〜５０％の過ヨウ素酸塩モル濃度を用いることが好ましい。１つまたは複数の出発有機化合物モル濃度の２５％〜３５％の過ヨウ素酸塩モル濃度を用いることが最も好ましい。用いる正確な濃度は、従来の合成収率を最適化する方法により決めることができる。
【００６８】
ｐＨ調整段階ｂ）の後で、段階ｃ）の過ヨウ素酸塩添加の直前、同時、またはその後に、１つまたは複数の出発有機化合物を含む初期水溶液に硫化アルカリ金属、硫化アルカリ土類金属、または硫化遷移金属を任意に加えてもよい。硫化物はフェノールポリマーの構造、構造の安定性、及びその生物活性に貢献する。硫化ナトリウム九水和物は特に好ましい硫化物である。硫化物の濃度は通常、１つまたは複数の出発有機化合物の１％から２０％までである。したがって、１０ミリモルの出発有機化合物を用いる場合、０．１から２ミリモルの硫化物を用いることができる。１つまたは複数の出発有機化合物モル濃度の５％〜１５％の硫化物モル濃度を用いることが好ましい。１つまたは複数の出発有機化合物モル濃度の８％〜１２％の硫化物モル濃度を用いることが最も好ましい。用いる硫化物の正確な濃度は、従来の合成収率を最適化する方法により決めることができる。
【００６９】
段階ｄ）で、出発有機化合物、過ヨウ素酸塩、及び任意の硫化物を含むｐＨ調整した水溶液を、３５℃から８０℃の水浴中または他の恒温加熱装置内に３０分から１００時間置く。または、水溶液自体を３０分から１００時間、３５℃から８０℃の一定温度に保ってもよい。温度と時間は５０℃で３０分間が好ましい。
前述の時間経過後、段階ｄ）から得た溶液に特定の無機化合物を添加する。ホウ酸、及びホウ素、カルシウムなどのアルカリ土類金属、並びに鉄などの遷移金属を含む塩が好ましい。このような塩はさらに、フェノールポリマー構造、その安定性、及び生物活性に貢献する。硫酸カルシウム２水和物などのアルカリ土類金属塩及び硫酸第１鉄７水和物などの遷移金属塩と同じく、ホウ酸またはホウ酸ナトリウムなどのホウ素含有ホウ酸塩が特に好ましい。用いるそれぞれの塩の濃度は通常、１つまたは複数の出発有機化合物の０．１モル％から２０モル％の間である。１つまたは複数の出発有機化合物モル濃度の０．２％から１０％までのモル濃度の塩を用いることが好ましい。１つまたは複数の出発有機化合物モル濃度の０．２％から２％までのモル濃度の塩を用いることが最も好ましい。用いる正確な濃度は、従来の合成収率を最適化する方法により決めることができる。
【００７０】
段階ｆ）において、段階ｅ）から得た溶液を室温で２から４８時間撹拌または撹拌せずに放置する。この段階で生じた沈殿はどのようなものでも、通常の遠心分離法により除去する。
【００７１】
段階ｇ）において、約５００から約１０，０００ダルトン未満の分子を段階ｆ）から得た溶液から除去する。分離用クロマトグラフィ、限外ろ過、または透析などの様々な公知の従来法を用いることができる。段階ｇ）において、分子量カットオフ下限値５００〜１０，０００ダルトンのサンドイッチ型膜からなる流通開水路またはスクリーン膜器具を用いて溶液の伝導率が２００マイクロジーメンス以下に下がるまで透析することにより、段階ｆ）から得た溶液から分子を除去することが好ましい。段階ｇ）において、溶液の伝導率が３０マイクロジーメンス以下に下がるまで透析することにより、段階ｆ）から得た溶液から分子を除去することが最も好ましい。溶液の透析には、Pall Filton Ultrasette(R)Tangential Flow DeviceまたはMini-Ultrasette(R)Tangential Flow DeviceをPall Filtron Ultralab(R)Specialized Pump及びReservoir Systemと共に用いることが好ましい。前述の段階ｇ）で処理した溶液の伝導率は、流通伝導率セル及び伝導率計により簡便にモニターすることができる。または、単純で安価な手動式の伝導率セル−伝導率計セット（例えばNalcometer Model MLN）を用いることもできる。
【００７２】
前述の段階ｈ）で溶液から水を除去する前に、前述の段階ｇ）から得た溶液を、分子量カットオフ値５０，０００ダルトンのサンドイッチ型膜からなる流通器具でさらに透析してもよい。この場合、滞留液ではなくろ液を回収し、段階ｈ）及びｉ）による濃縮及び処理をさらに行う。得られた生成物は５００〜５０，０００ダルトンまでの分子量を有することになる。前述の段階ｇ）またはｈ）のいずれかから得た溶液を後で、例えば抗ウイルス治療液剤、抗ウイルス療法、抗菌療法、噴霧式肥料、または土壌改良剤として用いるために長期間水溶液で保存する場合、細菌及びウイルスを除去するために標準の０．２から０．４ミクロンのフィルターでろ過する、すなわちろ過により滅菌することができる。または、段階ｇ）またはｈ）のいずれかからの水溶液を１００〜１５０℃で５〜６０分間オートクレーブして無菌溶液とすることもできる。
【００７３】
本発明の方法における最終の任意段階ｉ）は、段階ｈ）から得た溶液から水を除去する段階である。前述の段階ｉ）で水の除去法として凍結乾燥を用いる場合、得られる生成物は、静電気の影響を受けやすい、軽くて飛散性の色の濃い粉末である。これらの影響を最小限にするために、段階ｈ）から得た溶液に少量のマンノースまたは他の糖を凍結乾燥の直前に加えてもよい。生成物からの水の除去は、前述の段階ｉ）における凍結乾燥以外に、熱による真空または常圧蒸発、回転蒸発、噴霧乾燥、または水溶液に都合がよく、かつ経済的な他の溶媒除去法により実施することができる。前述の段階ｉ）から得た乾燥粉末を、１００〜１２０℃で１５〜３０分間オートクレーブして無菌粉末とすることができる。
【００７４】
本発明の化学的方法並びに分離及び単離法により製造した合成フミン酸物質は、典型的な市販天然フミン酸及び他の土壌抽出物の物理化学的性質及び性状を示す。
前述の段階ａ）からｈ）、またはそれらの変法により得た生成物の物理化学的特徴を調べる簡便な方法は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣからこのようにして得られるクロマトグラフィ上のフィンガープリント・パタンは、１つの生成物と別の生成物とを比較する場合、並びに各生成物と天然フミン酸及び他の土壌抽出物質とを比較する場合の便利な手段にもなる。
【００７５】
従って、ＨＰＬＣ法は、合成フェノールポリマー物質の物理化学的性質及び性状の再現性を調べるため、並びに前述の性質及び性状が典型的な天然市販フミン酸及び他の土壌抽出物の物理化学的性質及び性状を模しているかどうかを調べるために用いる。後者の性状を模しているかどうかの試験は、ＨＰＬＣを用いた通常の方法、例えば物質のＨＰＬＣクロマトグラフィ上のフィンガープリント・パタンを肉眼的及び定量的に比較することにより行う。合成フェノールポリマー物質の物理化学的性質及び性状が天然フミン酸の物理化学的性質及び性状を模していると結論付けるために、１つは合成、もう１つは天然の２つの物質のフィンガープリント・パタンが１００％同じである必要はない。合成物質が天然物質を模していると結論付けるためには、前述のＨＰＬＣフィンガープリント・パタン間におおよその対応があるだけでよい。一般に、２つのＨＰＬＣフィンガープリント・パタンに肉眼で見て７５％の対応があるだけで、一方が他方を模していると結論付けることができる。
【００７６】
天然及び合成土壌抽出物質の有用なフィンガープリント・パタンは次のようにして得られる。カラムは粒子サイズ５ミクロンの充填剤、通常は逆相ポリマーPRP-1(Hamilton Co.)からなる、長さ１５０ｍｍ、内径４．１ｍｍのものである。移動相は３種類の溶液からなる。溶液Ａは０．１規定水酸化ナトリウム水溶液である。溶液Ｂは０．０５規定のいわゆるPrideauz汎用緩衝液で、４．２５グラムの硝酸ナトリウム(ＮａＮＯ３)、１２．３７グラムのホウ酸(Ｈ３ＢＯ３)、２３．０６グラムのリン酸(Ｈ３ＰＯ４)、及び１．２．０１グラムの酢酸（ＣＨ３ＣＯ２Ｈ）を４リットルの蒸留水と合わせて作る。溶液Ｃは１００％メタノール（ＣＨ３ＯＨ）である。ＨＰＬＣの実行に用いる移動相の勾配は、開始時には溶液Ａ４０％＋溶液Ｂ６０％からなり、組成を直線的に変化させて２０分後に溶液Ａ１００％とする。次いで、移動相を再び直線的に変化させ、次の５分間で１０％Ａ＋９０％Ｃとし、この最終組成をカラム洗浄のために続く３５分間維持する。移動相の流速は毎分１ミリリットルとする。検出器はＵＶ−可視で、３４０ナノメートルに設定する。チャートスピードは通常、毎分０．５センチメートルである。試料ループのサイズは５〜２０マイクロリットルである。乾燥試料１〜１０グラムをｐＨ８〜１０の０．１規定水酸化ナトリウム水溶液１００ミリリットルに溶解して、分析用に溶液を調整する。
【００７７】
本発明の化学的方法並びに分離及び単離法は、経済液に許容できる収率を提供する工業レベルへの直接のスケールアップに適している。本発明の化学的方法並びに分離及び単離法では、１００％に近い合成生成物収率を得ることができる。さらに一般的に、３００ｍｌ中１０ミリモルの１つまたは複数の出発有機化合物から約０．０８から０．６５ｇの合成フミン酸が得られる。これらの手順は、１つまたは複数の出発有機化合物を含む初期溶液１０，０００から２０，０００リットル以上を用いる医薬品製造規模にスケールアップすることができる。１０，０００リットルの保温ジャケット付きステンレス・タンクで３００ｍｌ中１０ミリモルの出発有機化合物濃度を用いて、全収量約２．７から２１．７ｋｇまでの合成フミン酸が得られる。１回の抗ウイルス治療にミリグラム量の合成フミン酸を用いてもよい。合成フミン酸２０ｋｇはユニット当たり１０ｍｇで２００万ユニットの抗ウイルス製剤に相当する。ユニット当たり０．１０＄の治療コストでも、これは合成フミン酸２００，０００＄に相当する。本発明で用いる出発有機化合物は比較的安価であるため、本発明の化学的方法並びに分離及び単離法の合成収率は経済的に非常に良好である。
【００７８】
実施例１から９は、本発明の方法で用いることのできる様々な出発有機化合物の実例である。様々な出発化合物を例示するために本発明の方法の全段階を実施する必要はないと考えられた。特に、実施例１から９は本発明の方法の段階ｅ）を除く全段階の実例である。
【実施例１】
【００７９】
２，５−ジオキシ安息香酸（ゲンチシン酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１は−ＣＯ２Ｈ、Ｒ２及びＲ５は−ＯＨ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は−Ｈである。ゲンチシン酸１．５５ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。６ＮのＨＣｌで溶液のｐＨを８．５に調整する。過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．５４ｇ（２．５ｍＭ）を加え、溶液を５０℃のウォーターバスに３０分入れる。その後、溶液を室温で一晩放置する。沈殿物はすべて遠心分離で除去する。３，０００ダルトンのカットオフフロースルーオープンチャンネルまたはスクリーン膜システム（Pall Filtron Ultrasette（Ｒ）7 Tangential Flow DeviceまたはMini-Ultrasette（Ｒ）7 Tangential Flow DeviceをPall Filtron Ultralab（Ｒ）7 Specialized Pump and Reservoir Systemと共に使用）を用いて、蒸留水に対して導電率３０μｓ以下になるまで溶液を透析する。次に、この透析器を用いて溶液を約２００ｍＬに濃縮する。その後の使用に備えて、この濃縮液をこの時点で水溶液として保存することが可能である。また、凍結乾燥して粉末にすることも出来る(凍結乾燥前に、マンノースなど適切な炭水化物０．０５〜０．２ｇを溶液に加え、凍結乾燥粉末による静電気作用を抑えることが可能である)。合成土壌抽出物の収量は０．２ｇである。
以下の実施例２〜９では、実施例１の溶液のｐＨ調整以降の合成手順を採用している。
【実施例２】
【００８０】
３，４−ジオキシフェニル酢酸（ホモプロトカテチュ酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物である３，４−ジオキシフェニル酢酸を表１に示す。本化合物のＲ１は−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、Ｒ３及びＲ４は−ＯＨ、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６は−Ｈである。ホモプロトカテチュ酸１．６８ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．２４ｇである。
【実施例３】
【００８１】
ｄｌ−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ヒドロキシ酢酸（ｄｌ−３，４−ジヒドロキシマンデル酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物であるｄｌ−（３，４−ジヒドロキシフェニル）ヒドロキシ酢酸を表１に示す。本化合物のＲ１は-ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ２Ｈ、Ｒ３及びＲ４は−ＯＨ、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６は−Ｈである。ｄｌ−３，４−ジヒドロキシマンデル酸１．８４ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．０８ｇである。
【実施例４】
【００８２】
オーリントリカルボン酸からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物の化学構造を表２に示す。オーリントリカルボン酸４．２ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は４．７ｇである。
【実施例５】
【００８３】
３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）プロペノイン酸（カフェイン酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１は−ＣＨＣＨＣＯ２Ｈ、Ｒ３及びＲ４は−ＯＨ、Ｒ２、Ｒ５及びＲ６は−Ｈである。カフェイン酸１．８０ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．６５ｇである。
【実施例６】
【００８４】
テトラヒドロキシベンゾキノンからの合成フミン酸の調製
出発有機化合物の化学構造を表２に示す。テトラヒドロキシベンゾキノン１．７２ｇ(１０ｍＭ)を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．０１６ｇである。
【実施例７】
【００８５】
１，４−ジヒドロキシベンゼン（ヒドロキノン）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１及びＲ４は−ＯＨ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は−Ｈである。ヒドロキノン１．１０ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．１６ｇである。
【実施例８】
【００８６】
３，４，５−トリオキシ安息香酸（没食子酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１は−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は-ＯＨ、Ｒ２及びＲ６は−Ｈである。没食子酸１．７０ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．１０ｇである。
【実施例９】
【００８７】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１は-ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、Ｒ２及びＲ５は−ＯＨ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は−Ｈである。ホモゲンチジン酸１．６８ｇ（1０mM）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。これ以降の手順は実施例１と同じである。合成土壌抽出物の収量は０．２０ｇである。
【００８８】
以下の実施例１０〜１３に、段階ｅ）を含む本発明の過程全体を示す。実施例１０〜１３は、本発明の化学的処理・分離・単離過程に従って産生された合成フミン酸成分が、入手可能な典型的な天然フミン酸及びその他の土壌抽出物の性質及び物理化学的特性を示していることを説明している。また、実施例１０〜１３は、本発明の化学的処理・分離・単離過程に従って産生された合成フミン酸の治療適応が、一般に土壌抽出物及びフミン酸の治療適応、すなわちウイルス関連障害及びその他の障害、炎症、微生物などによる疾患であることも示している。
【実施例１０】
【００８９】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）からの合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１は-ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、Ｒ２及びＲ５は−ＯＨ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は−Ｈである。ホモゲンチシン酸１．０ｇ（６ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。６ＮのＨＣｌで溶液のｐＨを８．５に調整する。過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．３２ｇ（１．５ｍＭ）及び硫化ナトリウム九水和物（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）０．１２ｇ（０．５ｍＭ）を加え、溶液を５０℃のウォーターバスに一晩入れる。続いて、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）０．００１ｇ(０．０１６ｍＭ)、硫酸第一鉄(ＦｅＳＯ4・７Ｈ２Ｏ)０．０２１ｇ(０．０７５ｍＭ)、硫酸カルシウムニ水和物（ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ）０．００６ｇ（０．０３５ｍＭ）を加え、溶液を室温で２時間撹拌する。沈殿物はすべて遠心分離で除去する。３０００ダルトンのカットオフフロースルーオープンチャンネルまたはスクリーン膜システム(Pall Filtron Ultrasette（Ｒ）7 Tangential Flow DeviceまたはMini-Ultrasette（Ｒ）7 Tangential Flow DeviceをPal1Filtron Ultralab(Ｒ)7 Specialized Pump and Reservoir Systemと共に使用)を用いて、蒸留水に対して導電率３０μs以下になるまで溶液を透析する。次に、この透析器を用いて溶液を約２００ｍＬに濃縮する。その後の使用に備えて、この濃縮液をこの時点で水溶液として保存することが可能である。また、凍結乾燥して粉末にすることも出来る(凍結乾燥前に、マンノースなど適切な炭水化物０．０５〜０．２ｇを溶液に加え、凍結乾燥粉末による静電気作用を抑えることが可能である)。合成土壌抽出物の収量は０．２３ｇである。
【００９０】
本実施例で得られた合成土壌抽出物のＨＰＬＣの結果を図１に示す。ピーク１〜６は本実施例によって生じたものである。ピーク５はピーク４の肩の下に重なっており、はっきりしない。時間対検出信号の数学的一次導関数により、ピーク５を明らかに示すことが可能である。図２は、典型的な市販の天然フミン酸のＨＰＬＣの結果である。図１及び図２のピーク６は９０〜１００％ｖ／ｖメタノールによるカラム洗浄によって生じたもので、合成フミン酸も含有している。ピーク２、ピーク４及びピーク６中の成分の相対量を除くと、図１及び図２のＨＰＬＣの結果の他のピークは本質的に等しいことがわかる。したがって、本発明の合成方法は、市販の土壌抽出物と本質的に等しい物理化学的特性を有するフミン酸を産生したと言える。
【実施例１１】
【００９１】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）からの他の合成フミン酸の調製
出発有機化合物を表１に示す。本化合物のＲ１は−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、Ｒ２及びＲ５は−ＯＨ、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は−Ｈである。ホモゲンチシン酸１．６８ｇ（１０ｍＭ）を０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液３００ｍＬに溶解する。６ＮのＨＣｌで溶液のｐＨを８．５に調整する。過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）０．７５ｇ（３．５ｍＭ）及び硫化ナトリウム九水和物（Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ）０．２４ｇ（１ｍＭ）を加え、溶液を５０℃のウォーターバスに一晩入れる。続いて、ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）０．００６ｇ（０．１ｍＭ）、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）０．２８ｇ(１ｍＭ)、硫酸カルシウムニ水和物（ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ）０．０１７ｇ（０．１ｍＭ）を加え、溶液を室温で４８時間撹拌する。沈殿物はすべて遠心分離で除去する。３，０００ダルトンのカットオフフロースルーオープンチャンネルまたはスクリーン膜システム（Pall Filtron Ultrasette ＴＭ 7 Tangential Flow DeviceまたはMini-Ultrasette ＴＭ 7 Tangential Flow DeviceをPall Filtron Ultralab ＴＭ 7 Specialized Pump and Reservoir Systemと共に使用）を用いて、溶液を透析する。次に、この透析器を用いて溶液を約２００ｍＬに濃縮する。その後の使用に備えて、この濃縮液をこの時点で水溶液として保存することが可能である。また、凍結乾燥して粉末にすることも出来る(凍結乾燥前に、マンノースなど適切な炭水化物０．０５〜０．２ｇを溶液に加え、凍結乾燥粉末による静電気作用を抑えることが可能である)。合成土壌抽出物の収量は０．４７ｇである。本実施例で得られた合成土壌抽出物のＨＰＬＣの結果は、実施例１０に記載し、図１に示した結果と全く同じである。
【実施例１２】
【００９２】
実施例１０及び１１に従って調製した合成フミン酸の抗ウイルス特性
実施例１０及び１１に従って数百ｍｇの合成フミン酸を調製する。以下の方法により、合成フミン酸の抗ウイルス特性を調べた。
American Type Culture Collection（米国メリーランド州ロックビル）から入手したJurkat細胞を、Ｌ−グルタミン２ｍＭ及び１５％ウシ胎児血清（FBS）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて５日ごとに継代培養する。Coulter粒子カウンター（Coulter社、米国フロリダ州ハイアリーア）を用いて細胞数を数える。細胞にＨＩＶ−１プラスミドｐＮＬ４−３（A.Adachi, H.E.Gendleman, S.Koenig, T.Folks, R.Willey, A.Rabson, and M.A.Martin, J.Virol.1986, 59, 284-291:これによって処理した細胞培養は、電子顕微鏡で数えて約１×１０７個という高レベルのＨＩＶ−１を産生する）を接種する。Ｌ−グルタミン２ｍＭ、１５％ウシ胎児血清、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（１ｍＬ当たりペニシリン１００Ｕ及びストレプトマイシン１００ｍｇ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地から成る完全培地で感染細胞を培養する。安定したＨＩＶ−１産生を得るため、使用前に細胞を約４週間観察する。
合成フミン酸の抗ウイルス作用をテストする前に、Jurkat細胞培養上澄み液のＨＩＶ−１ ｐ２４産生をまず調べ、前処理ベースラインを確立する。ウイルス産生のレベルを確認した後、増殖培地を変え、細胞数を１ｍＬ当たり１．５×１０６個に調整する。次に、テストする合成フミン酸の投与２日前に、感染細胞を正常の未処理の細胞と等量混合し、ウイルス産生レベルをＨＩＶ−１ｐ２４イムノアッセイの範囲内にする。２４時間後、既知の量の合成フミン酸を細胞混合液に加える。合成フミン酸を投与して一定の日数が過ぎた後、ＨＩＶ−１抗原用の固相アッセイ（ＨＩＶＡＧ−１:Abbott Laboratories,Diagnostic Division、米国イリノイ州アボットバーク:Abbott Quantum II ELISA reader and data reduction module 1.21）でＨＩＶ−１ ｐ２４発現を測定する。
実施例１０及び１１に記載された方法に従って調製した合成フミン酸が、実施例１２の手順に従って測定したＨＩＶ陽性細胞のｐ２４発現に対して及ぼす影響を図３に示す。図３中の実施例１１ａは実施例１１の手順に従って調製したものである。図３中の実施例１１ｂは、実施例１１の手順に最終溶液の凍結乾燥を追加した方法に従って調製したものである。比較のため、実施例１−１１に記載されているとおりに透析した天然フミン酸の結果と、実施例１−１１に記載されているとおりに透析した後に凍結乾燥させた天然フミン酸の結果も図に示す。これらの結果は、すべてのサンプルでｐ２４の発現が有意に低下したことを示している。また、１２日目には、方法の実験誤差内でｐ２４は検出されなかった(Ｃ−対照よりも高いものはなかった)。
【実施例１３】
【００９３】
実施例１０に従って調製した合成フミン酸の毒性
実施例１０の手順に従って数百ｍｇの合成フミン酸を調製する。ヒト全血４５０ｍＬを１単位とし、５単位をＣＰ２Ｄ／ＡＳ−３ＬｅｕｋｏｔｒａｐＲＣ−ＰＬシステムに採取する。血液は室温で３時間放置する。各サンプルの重量を測定した後、２８２０ｒｐｍ（２３１２Ｇ）で３分４４秒遠心分離する。続いて、ＡＴＳ−ＬＰＬフィルターを用いて血液を血小板保存バッグ内にろ過する。その際、ろ過時間を記録する。ＬＲ−ＰＲＰを３６００ｒｐｍ（３７６８Ｇ）で７分間遠心分離する。血小板含有量の少ない血漿５５ｇを残し、他の血漿を各サンプルから除去する。血小板濃縮液を室温で９０分間放置した後、重量を測定し、血小板インキュベーターに入れる。ＲＣＭＩフィルターをＡＳ−３溶液で処理する。重力でろ過できるように、空のＡＳ−３バッグの上方６０インチの高さに予備バッグを吊す。ろ過時間を記録し、ＲＣＭＩフィルターの下方３インチの部分でＬＲ−ＲＣＣシステムを密閉する。各ＲＣＭＩフィルターの重量を、長さ６インチのチューブとＬＲ−ＲＣＣシステム（提供者のＩＤチューブ部分を含む）と共に測定する。ろ過後のテスト（ＬＲ−ＲＣＣ）のために、この時点でサンプルを取っておく。１日目に、各血小板濃縮液に合成フミン酸を十分加え、濃度を１ｍＬ当たり２５μｇにする。この血小板濃縮液を血小板インキュベーターに１時間入れ、テストのために各血小板濃縮液のサンプルを取っておく。その後のテストのために、５日目にもサンプルを取る。実施例１０に記載された方法で調製した合成フミン酸が血小板濃縮液の生育能力に及ぼす作用を、本実施例の方法で測定した結果を表３に示す。
【００９４】
【表３】
2004169007.tif 000006
【００９５】
結果はすべて許容範囲内であり、合成フミン酸は血小板の生育能力に全く影響を与えない（つまり、毒性はない）ことが示された。血小板は様々な化学薬品に対して感受性が高いことが知られているため、この結果は特に注目に値する。血小板用の安全な抗ウイルス治療がほとんどないのは、この高い感受性のためである。
実施例１２及び１３は、前述の方法及び本発明の分離・単離手順に従って調製した合成フミン酸を抗ウイルス量で血液製剤と配合して血液製剤混合物を作ることが可能であることを示している。抗ウイルス量の合成フミン酸をヒトまたは動物の血液製剤、例えば全血や血漿、血小板など、血液蛋白（例：血友病第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｖ因子、ＩｇＧ、ＩｇＭ）あるいはウイルス活性を低下または消失させる血液成分を含む血液製剤に加えてもよい。合成フミン酸は、液体の血液製剤にも固体の血液製剤にも抗ウイルス量で添加してよい。合成フミン酸は血液成分（溶媒・洗浄剤［ＳＤ］処理法が適用されるすべての血液成分を含む）に適用されるだろう。ＳＤ処理法と直接比較した場合、ＳＤ処理法はエンベロープを持たないウイルスには無効であるのに対し、本発明に従って調製した合成フミン酸はエンベロープを持つウイルスにもエンベロープを持たないウイルスにも抗ウイルス活性を有し、より広い適用範囲を持つ。合成フミン酸の抗ウイルス量は、フミン酸の抗ウイルス量に関する先行技術から、ウイルス活性を低下または消失させるのに有用であることが知られている量である。一般に、液体血液製剤中でウイルス活性を低下または消失させるのに血液製剤中で有用な抗ウイルス量は、液体血液製剤１ｍＬ当たり合成フミン酸５〜１０００μｇである。この濃度範囲は、使用前に溶液に溶解する乾燥合成フミン酸を含有する固形血液製剤にも適用される。ウイルス活性を低下または消失させるのに利用される正確な量はウイルスや血液製剤の種類によって異なるが、技術上既知の従来の抗ウイルステスト法で測定可能である。ＨＩＶや肝炎ウイルスによる汚染が疑われたり、あるいはこれらのウイルスによって汚染されている全血や血漿などの血液製剤は、例えば約１０〜２００μｇ／ｍＬの合成フミン酸を添加することにより修飾が可能である。実施例１４及び１５に、本発明の処理及び分離・単離手順に従って調製した合成フミン酸を抗ウイルス量含有する血液製剤を示す。
【実施例１４】
【００９６】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）から調製した合成フミン酸２５μｇ／ｍＬを含有するヒト全血製剤 
本血液製剤の組成は以下のとおりである。
ヒト全血： １Ｌ 
合成フミン酸： ２５ｍｇ
【実施例１５】
【００９７】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）から調製した合成フミン酸を含有するヒト血有病第ＶＩＩＩ因子製剤
本血液製剤の組成は以下のとおりである。
ヒト血有病第ＶＩＩＩ因子： １〜５ｍＬバイアル＊ 
合成フミン酸： １２５μｇ 
注：これは、注射可能な滅菌食塩水５ｍＬで溶解するための滅菌高度精製凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子濃縮物と、蛋白質濃度１００ＩＵ／ｍｇで３９００単位（ＩＵ）の第ＶＩＩＩ因子を含有するバイアルである。
【００９８】
本発明の前述の処理及び分離・単離手順に従って調製した合成フミン酸は、ヒトまたは動物の血液製剤中のウイルス量を減少または除去させる方法に、前述の定義の抗ウイルス量で利用することが可能である。一般に、このような方法では、抗ウイルス量の合成フミン酸と血液製剤とを何らかの方法で接触させなければならない。抗ウイルス量の合成フミン酸を含有する滅菌溶液を血液製剤に直接注入するなど、様々な接触方法が利用されている。特に好ましい方法には、静脈内投与溶液用のいわゆる「デュアルバッグ」技術が使われている。この方法では、内部が２つの部分に分かれているが、相互に交通のあるプラスチック製バッグが使われている。内部の２つの部分の各容量や両者の容量比は様々である。また、この２つの部分には各々異なる薬剤を入れてもよい。本発明の場合では、一方に血液製剤を、もう一方に合成フミン酸を入れる。使用準備が整うまで、両剤は互いに接触しないようにする。両剤を接触させるには２つの部分の間の弁を開くか、あるいは封印を取る。通常、封印は両剤の滅菌性を損なわずに取ることが出来る。滅菌デュアルバッグは米国イリノイ州のAbbott Laboratories社や米国カリフォルニア州のMcGaw社などから入手可能である。これ以外の方法として、患者に使用する最終容器に血液製剤を入れる最終加工段階中またはその前に抗ウイルス量の合成フミン酸と血液製剤とを接触させてもよい。本発明で調製した合成フミン酸は毒性は持たないため、血液製剤の使用前に合成フミン酸と血液製剤を分ける必要はない。溶媒・洗浄剤（ＳＤ）血液処理法における洗浄剤は、大豆またはヒマシ油との抽出及び不溶性Ｃ１８樹脂のクロマトグラフィを利用している血液製剤と分ける必要があることはすでに本書で開示してある。合成フミン酸を利用してヒト血液製剤中のウイルス量を減少または消失させる方法には、ＳＤ法と異なり、脂質エンベロープを持つウイルスも持たないウイルスも不活化できるという特長がある。さらに、血液製剤の様々な熱処理法や紫外線照射法と異なり、合成フミン酸による処理法では基本的に血液製剤の量は減らない。合成フミン酸を利用してヒト血液製剤中のウイルス量を減少または消失させる方法は、溶媒・洗浄剤（ＳＤ）血液処理法や他の血液処理法、例えば熱処理や紫外線照射などと組み合わせることも可能である。これらの血液処理法のうち１つまたは複数をフミン酸処理法と組み合わせてもよい。
実施例１６に、本発明の前述の処理及び分離・単離手順に従って調製した合成フミン酸が、ヒト血液製剤中のウイルス量を減少させる方法に抗ウイルス量で使用できることを示す。
【実施例１６】
【００９９】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）から調製した合成フミン酸を用いてヒト血液バッグ中のウイルス量を減少させる方法
実施例１０の手順に従って調製した合成フミン酸の抗ウイルス特性を以下の方法で調べる。本実施例では、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を抗ウイルス活性の標準ウイルスとして使用する。ＢＶＤＶは脂質エンベロープを持つウイルスで、抗ヒト免疫不全ウイルス活性などの抗ウイルス活性の良い指標であることが知られている。１０Ｅ−７のＴＣＩＤ５０で滴定したＢＶＤＶのウイルスストックを用意する。血小板を含有する血液バッグを１２袋用意する(フミン酸濃度０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬに対し各々１袋。これを３セット用意)。合成フミン酸を用いてヒト血液バッグ中のウイルス量を減少させる方法では、容積測定量の滅菌合成フミン酸水溶液を各血液バッグに加えるだけでよい。正確には、濃度１００μｇ／ｍＬの滅菌合成フミン酸液を蒸留水に溶解させたものを、血液製剤４０〜６０ｍＬを含む血液バッグに加え、フミン酸の最終濃度が１０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのいずれかになるようにする。以下の間隔で血液バッグからサンプルを採取する。接種前の対照としてＴ０時間、ウイルスストック接種後Ｔ１時間(フミン酸添加接種後Ｔ１時間目)、接種後Ｔ２時間にサンプルを採取する。さらに、Ｔ２４時間、Ｔ７２時間、Ｔ１２０時間にもサンプルを採取する。採取したサンプルを用いて定量的ウイルス培養を行い、各フミン酸濃度についてＴＣＩＤ５０及び対数減少を求める。このテストの結果は、ヒト血液製剤中のウイルス量を減らす方法に、本発明に従って調製した合成フミン酸が利用できることを示している。
【０１００】
本発明の前述の処理及び分離・単離手順に従って調製した合成フミン酸は、ヒトまたは動物のウイルス性疾患の治療用または予防用の混合物に抗ウイルス量で使用できる。合成フミン酸を含有する混合物は、天然フミン酸が有用であると示されているヒトまたは動物のウイルス性疾患の治療または予防に適している。
したがって、合成フミン酸混合物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）や単純ヘルペスウイルスなどヒトのウイルスによって生じるヒトの疾患の治療または予防に適している。また、合成フミン酸混合物は、（１）Apthovirus属、（２）Cardiovirus属、（３）Hepatovirus属(旧Enterovirus属)、（４）Renterovirus属(主に旧Rhinovirus属と旧Enterovirus属の組み合わせから成る)、（５）エコーウイルス２２単独から成る新たな属の計５属が現在認められているピコルナウイルス科によって生じる疾患の治療または予防にも適している。様々な投与経路や特定のウイルス性疾患に適した混合物を調製することが可能である。特定のウイルス性疾患用の合成フミン酸の抗ウイルス量は、同じ疾患に有用であることが知られている天然フミン酸の既知の抗ウイルス量から決めることが可能である。抗ウイルス量の合成フミン酸及び生理学的に認められる賦形剤（最低１剤）から成る様々な混合物を調製可能である。既知の賦形剤及び方法を用いて、静脈内注射剤や筋肉内注射剤、外用剤、経口剤、鼻内スプレー、計量吸入剤、膣錠、座剤などに適した、生理学的に認められる賦形剤を使用した製剤が調製可能である。  実施例１７〜２１にこれらの製剤を示す。
【実施例１７】
【０１０１】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）から調製した抗ウイルス量の合成フミン酸及び注射可能な溶液用賦形剤を含有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染治療用注射剤
塩化ナトリウム： ９．００ｇ 
合成フミン酸： ５００ｍｇ 
蒸留水： 適量（１Ｌ未満）
上記溶液のｐＨは、蒸留水を全部加える前に１Ｎの水酸化ナトリウムで７．４に調整できる。本注射剤は、滅菌注射剤の従来の製造法で調製できる。
【実施例１８】
【０１０２】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）から調製した抗ウイルス量の合成フミン酸及び外用剤用賦形剤を含有する、ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩまたはＨＳＶ−ＩＩ）感染治療用軟膏
合成フミン酸： ３．０ｇ 
セトステアリルアルコール： ２７ｇ 
流動パラフィン： ２０ｇ 
白色ワセリン： ５０ｇ
【実施例１９】
【０１０３】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）から調製した抗ウイルス量の合成フミン酸及び外用剤用賦形剤を含有する、ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩまたはＨＳＶ−ＩＩ）感染治療用クリーム
合成フミン酸： ２．４ｇ
セトステアリルアルコール： ５ｇ 
流動パラフィン： ５０ｇ 
蒸留水： １００ｇまで添加
【実施例２０】
【０１０４】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）から調製した抗ウイルス量の合成フミン酸及び外用剤用賦形剤を含有する、ヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩまたはＨＳＶ−ＩＩ）感染治療用外用液剤
合成フミン酸： ２．４ｇ 
硫化ナトリウム： １．０ｇ 
コロイド硫黄： １．４ｇ 
塩化ナトリウム ： ２．２ｇ 
カリウムソルベート： ０．２ｇ 
蒸留水： 適量（１００ｍＬ未満）
上記の製剤は、ドイツ特許ＤＥ３８３０３３３号でWagnerが開示しているのと同量のフミン酸を含有している。
【実施例２１】
【０１０５】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）から調製した抗ウイルス量の合成フミン酸及びトローチ剤用賦形剤を含有する、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染治療用トローチ剤
合成フミン酸： ５００ｍｇ 
メントール： ３．６ｍｇ 
塩化セチルピリジニウム： １．４ｍｇ 
サクランボ香料： １００ｍｇ 
ブドウ糖： ５００ｍｇ 
ショ糖： ５００ｍｇ
上記の組成に他の賦形剤を加えてもよい。Ｄ＆Ｃ赤色３３号やＦＤ＆Ｃ赤色４０号などの着色剤を使用してもよい。塩化セチルピリジニウム以外の保存剤と共に他の香料もトローチ剤に使用してもよい。前述の賦形剤やここに記載されていない他の賦形剤はすべて技術上知られており、トローチ剤ですでに使用されている量で使用することが可能である。実施例２１に示した混合物は、ライノウイルス科に属するウイルスによって生じる普通感冒の治療にも有用である。合成フミン酸を含有する鼻内スプレーも普通感冒の治療に特に有用である。
【０１０６】
医療用具の消毒及び保存に適した、生理学的に認められる賦形剤を含有する製剤を既知の賦形剤及び方法を用いて調製することが可能である。合成フミン酸を含有する製剤を用いて、身体に接触する様々な医療用具を消毒または保存することが可能である。このような医療用具は、身体接触の前または後に消毒または保存して、ウイルス感染を予防することが可能である。合成フミン酸を含有する製剤を用いて、コンタクトレンズや眼内レンズ、歯科用インプラント、移植可能な医療用具(例：心臓弁)、身体に接触する医療器具（例：内視鏡、カテーテル）などを消毒または保存することが可能である。
【０１０７】
本発明の前述の処理及び分離・単離手順に従って調製した合成フミン酸は、ヒトまたは動物の微生物疾患の治療用または予防用製剤に抗菌量で使用可能である。合成フミン酸の抗菌量は、フミン酸の抗菌量に関して本書で引用されている先行技術から、抗菌活性を低下または消失させるのに有用であることが知られている量である。一般に、液体製剤中で抗菌活性を低下または消失させるのに製剤中で有用な抗菌量は、液体製剤１ｍＬ当たり合成フミン酸５０〜２０００μｇである。この濃度範囲は、使用前に溶液に溶解する乾燥合成フミン酸を含有する固形製剤にも適用される。Cronjeらは米国特許４，９９９，２０２号に、これよりも高い濃度のフミン酸を含有する殺菌剤または静菌剤を開示している。Cronjeらが使用している濃度はここでも使用可能である。抗菌活性を低下または消失させるのに利用される正確な量は微生物や製剤の種類によって異なるが、技術上既知の従来の抗菌テスト法で測定可能である。
本発明の合成フミン酸は、本書で引用されている他の合成フミン酸や天然フミン酸の抗菌活性に匹敵する抗菌活性を有する。したがって、本発明の合成フミン酸は、クリプトスポリジウムやCandida albicans、Enterobacter cloacae、Proteus vulgaris、緑膿菌、ネズミチフス菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、Streptococcus mutans、大腸菌などに対して活性を有するだろう。
【０１０８】
抗菌量の合成フミン酸及び生理学的に認められる賦形剤（最低１剤）から成る様々な混合物が調製可能である。既知の賦形剤及び方法を用いて、静脈内注射剤や筋肉内注射剤、外用剤、経口剤、鼻内スプレー、計量吸入剤、膣錠、座剤などに適した、生理学的に認められる賦形剤を使用した製剤が調製可能である。実施例１８〜２０の外用剤も抗菌活性を有し、抗菌剤を示している。
【０１０９】
既知の賦形剤及び方法を用いて、コンタクトレンズのような医療用具の消毒及び保存に適した、生理学的に認められる賦形剤を含有する製剤を調製することが可能である。合成フミン酸を含有する製剤を用いて、身体に接触する様々な医療用具を消毒または保存することが可能である。身体接触の前または後にこのような医療用具を消毒または保存し、微生物感染を予防することが可能である。合成フミン酸を含有する製剤を用いて、コンタクトレンズや眼内レンズ、歯科用インプラント、移植可能な医療用具(例：心臓弁)、身体に接触する医療器具（例：内視鏡、カテーテル）などを消毒または保存することが可能である。
【０１１０】
後述の実施例２２には、コンタクトレンズの消毒及び保存に適した製剤を示す。実施例２２に示す製剤は、１本でレンズの消毒、保存、洗浄、すすぎ、再湿潤に使用可能な多目的溶液である。本溶液は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）のコンタクトレンズ溶液用消毒効果ガイドラインで定められた、必要な抗菌消毒活性を有する。本溶液には毒性がなく、眼に優しいため、別の食塩水ですすがずに直接眼に装着することが可能である。本溶液は、従来のハードコンタクトレンズやソフトコンタクトレンズ、酸素透過性レンズ、シリコンレンズなど、あらゆる種類のコンタクトレンズに使用可能であるが、ヒドロキシエチルメタクリレートやビニルピロリドン、グリセロメタクリレート、メタクリル酸またはメタクリル酸エステル及びその類似化合物のようなモノマーから製造した、一般にヒドロゲルレンズと呼ばれるソフトコンタクトレンズに使用するのが望ましい。また、米国特許５，３５６，５５５号に開示されている蛋白分解酵素のように、コンタクトレンズの洗浄に使用されている蛋白分解酵素を、本発明の方法に従って調製した合成フミン酸を含有するコンタクトレンズ用多目的溶液と配合することも可能である。合成フミン酸を含有する多目的溶液を蛋白分解酵素と配合する方法や、使用する酵素や賦形剤の量は、本書に引用している米国特許５，３５６，５５５号に開示されているものと同じである。一般に、本発明の目的のため、０．００１０〜０．０１００ｗ／ｖ％の合成フミン酸消毒剤を含有する水溶液をコンタクトレンズ用多目的溶液として使用してもよい。本発明の方法に従って調製した合成フミン酸を含有するコンタクトレンズ用多目的溶液には、他の消毒剤を含有する先行技術のコンタクトレンズ用多目的溶液よりも優れた特長がある。合成フミン酸を含有する多目的溶液は、より快適な装着感をコンタクトレンズ装着者に提供しながら、先行技術の多目的溶液と同等またはそれ以上の消毒作用を発揮する。これは、コンタクトレンズ用多目的溶液に現在使用されている先行技術の消毒剤と比較して、合成フミン酸消毒剤の細胞毒性または毒性が本質的に低いことによる。また、コンタクトレンズに適用した際の合成フミン酸の特長は、その中性陰イオンポリマーの性質の結果でもある。現在利用されているコンタクトレンズ用多目的溶液は、本質的に中性〜陰イオンのコンタクトレンズポリマーにかなり高い親和性を有するポリクォータニウム１やポリヘキサメチレンビグアニド（ＰＨＭＢ）などのような陽イオンポリマー消毒剤を含有している。しかし、本発明に従って調製した合成フミン酸は、色の着いた成分である。例えば、濃度０．００２５ｗ／ｖ％の溶液は非常に淡い茶褐色を呈する。したがって、美容的理由から、すべての溶液が受け入れられるわけではない。しかし、合成フミン酸は中性〜陰イオンポリマーであるため、プラスチック素材に対する親和性が低く、合成フミン酸製剤を適切に製造しても退色しないだろう。
【実施例２２】
【０１１１】
２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチシン酸）から調製した抗菌量の合成フミン酸を含有する、１本で消毒、保存、洗浄、すすぎ、再湿潤に使用可能なコンタクトレンズ用多目的溶液
本水溶液の組成は以下のとおりである。
成分                           ％ｗ／ｖ
合成フミン酸                       ０．００２５ 
エデト酸ナトリウム（ＵＳＰ）       ０．０５０ 
ヒドロキシプロピルメチルセルロース ０．２０ 
ホウ酸（ＮＦ）                     ０．３９
ホウ酸ナトリウム（ＮＦ）           ０．２０ 
塩化ナトリウム（ＵＳＰ）           ０．４０
プルロニックＦ−１２７             ０．１０
ＮａＯＨまたはＨＣｌでのｐＨ調整   ７．４ 
本発明はいくつかの実施例を特に強調しながら十分かつ完全に記載されているが、前述の範囲内で特に記載されていない限り、本発明は付属の請求の範囲内で実施してもよいことを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】実施例１０及び１１に記載の、２，５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲンチジン酸）から得た合成フミン酸の高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）記録を示す図
【図２】典型的な市販天然フミン酸の高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）記録を示す図
【図３】実施例１０及び１１に記載のとおり調整した合成フミン酸による処理の６及び８日後に回収したＨＩＶ−陽性細胞のｐ２４発現を示す図である。比較のために、透析した天然フミン酸と、透析及び凍結乾燥した天然フミン酸による結果
【図１】
2004169007.tif 000011
【図２】
2004169007.tif 000012
【図３】
2004169007.tif 000013