(57)【要約】【課題】ＲＮＡｉ表現型をもつマウスなどの哺乳動物を新規な方法で作製する方法を開発し、新たな子孫への伝達機構によるＲＮＡｉ発現子孫の生産を可能とすること。さらに、ＲＮＡｉ表現型をもつマウスなどの哺乳動物の取得効率を向上させるために、ｄｓＲＮＡの導入方法を改良すること。【解決手段】標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞の核に注入することを含む、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物の作製方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞の核に注入することを含む、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項２】
標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を受精卵の核に注入することを含む、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物の作製方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法により作製される、標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部。
【請求項４】
標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を核に注入した受精卵。
【請求項５】
請求項４に記載の受精卵から発生した胚。
【請求項６】
請求項５に記載の胚を、対応する非ヒト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児又はその子孫又はその一部。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いてＲＮＡｉ表現型を有する非ヒト哺乳動物を作製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、個体レベルにおけるＤＮＡの機能解明においては、遺伝子ノックアウト動物を作成し、その表現系を解析するという方法で行われてきた。しかしながら、このノックアウト法は多大な労力と時間がかかり、数多くの遺伝子機能解析には実用的ではない。従って、これまでのノックアウト法より有効でかつ、より簡便な、動物個体での遺伝子機能抑制方法が望まれている。
【０００３】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある遺伝子（標的遺伝子とよぶ）の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、ターゲット遺伝子の発現が抑制される現象を言う。１９９８年、生体内へのｄｓＲＮＡの導入が導入遺伝子と同じ遺伝子の発現に対して抑制作用を持つことが，線虫において発見された（Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１（６６６９）  ８０６−８１１，  １９９８）。その後、真菌類、植物Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｕｍとＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、プラナリア、トリパノソーマＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７５（５１）  ４０１７４−４０１７９，  ２０００）、ハエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｃｅｌｌ，  ９５（７）  １０１７−１０２６，  １９９８）及び脊椎動物であるゼブラフィッシュでも観察され、ＲＮＡｉは種を越えて普遍的に存在する現象であると考えられるようになった。
【０００４】
ＲＮＡｉの技術的応用については、線虫において、遺伝子ノックアウト技術として確立し、線虫全ゲノム配列決定計画により得られた全塩基配列情報を用いた、ゲノム機能解析の主要な手段として利用されている（Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８（６８１０）  ３２５−３３０，２０００；Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８（６８１０）  ３３１−３３６，２０００）。哺乳動物のゲノム機能解析においても、遺伝子ノックアウトより時間的、労力的に負担の少ない方法として、効率的な遺伝子発現抑制の方法として期待されている。
【０００５】
哺乳類では、マウスの初期胚（Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２（２）  ７０−７５，  ２０００）にｄｓＲＮＡをインジェクションする実験においてＲＮＡｉ効果が初めて報告されたが、その効果は初期胚に限られ、誕生した時にはＲＮＡｉ効果が消失していた。この理由としては、１細胞期受精卵に導入したｄｓＲＮＡが胚の分割増殖に依存して希釈され、ＲＮＡｉに必要な濃度を維持できなくなっていると考えられているが、その他、哺乳類には生物学的に線虫と異なるメカニズムが存在する可能性もある。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１（６６６９）  ８０６−８１１，  １９９８
【非特許文献２】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７５（５１）  ４０１７４−４０１７９，  ２０００
【非特許文献３】
Ｃｅｌｌ，  ９５（７）  １０１７−１０２６，  １９９８
【非特許文献４】
Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８（６８１０）  ３２５−３３０，  ２０００
【非特許文献５】
Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８（６８１０）  ３３１−３３６，２０００
【非特許文献６】
Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２（２）  ７０−７５，  ２０００
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した従来法の問題点を解決することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、ＲＮＡｉ表現型をもつマウスなどの哺乳動物を新規な方法で作製する方法を開発し、新たな子孫への伝達機構によるＲＮＡｉ発現子孫の生産を可能とすることを解決すべき課題とした。さらに、ＲＮＡｉ表現型をもつマウスなどの哺乳動物の取得効率を向上させるために、ｄｓＲＮＡの導入方法を改良することを解決すべき課題とした。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞質以外の部位にｄｓＲＮＡを導入することにより、ＲＮＡｉ表現型をもつ非ヒト哺乳動物を取得することを試みた。ＥＧＦＰのｄｓＲＮＡをＥＧＦＰマウス受精卵の核に導入してブラストシストまで培養したところ、減光したブラストシストが認められた。減光したブラストシストをレシピエントマウス子宮へ移植し、妊娠１２．５日に解剖してＥＧＦＰ蛍光を観察したところ蛍光が減光した個体（胎児）が観察された。一方、ＥＧＦＰのｄｓＲＮＡを受精卵の細胞質へ導入してブラストシストまで培養したところ減光したブラストシストが認められたが、これらのブラストシストをレシピエントマウス子宮へ移植し、妊娠１２．５日に解剖したところ、胎児個体の取得率が著しく低く、またＥＧＦＰ蛍光を観察したところ、ＥＧＦＰ蛍光の減光は認められなかった。さらに、ＥＧＦＰマウス受精卵の核へＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡを導入して２細胞期にレシピエントマウスへ移植し、誕生した産仔の中に、ＥＧＦＰ蛍光の減少したマウスが認められた。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞の核に注入することを含む、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物の作製方法が提供される。
好ましくは、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は受精卵の核に注入される。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により作製される、標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を核に注入した受精卵、当該受精卵から発生した胚、並びに、当該胚を対応する非ヒト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児又はその子孫又はその一部が提供される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞の核に注入することによって、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する方法に関するものである。なお、本明細書において言う「標的遺伝子の機能が抑制されている」とは、ＲＮＡｉ表現型を有することを意味する。
【００１２】
本発明者らはこれまでに、導入したｄｓＲＮＡの細胞内濃度を維持することを目的として、逆向き反復配列を含む遺伝子を哺乳類発現ベクターの下流に連結した遺伝子を構築し、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの受精卵へ導入し、胚をマウス卵管へ移植することによりＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ発現ベクター遺伝子導入マウスを作成した。このマウスにおいては、ターゲット遺伝子（ＥＧＦＰ）発現の抑制された表現型を示す個体が観察された（特願２００１−４６０８９）が、その取得効率は低く、ＲＮＡｉ効果を用いてマウス個体において遺伝子機能解析を行うためにはさらなる改良が望まれていた。
【００１３】
本発明においては、標的遺伝子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を受精卵などの細胞の核に注入することによって、該標的遺伝子の機能が抑制されている（即ち、ＲＮＡｉ表現型を有する）非ヒト哺乳動物の作製する方法を採用した。この手法を用いることにより、標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を効率良く作製できることが今回初めて見出された。
【００１４】
（１）標的遺伝子
本発明で用いる標的遺伝子としては任意の遺伝子を使用できる。本発明の方法を用いて標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する場合、標的遺伝子は発現を抑制することを意図する遺伝子である。このような標的遺伝子としては、クローニングはされているが機能が未知の遺伝子も含まれる。
【００１５】
あるいは、標的遺伝子は、外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子であってもよい。このような外来性レポータータンパク質またはその変異タンパク質の遺伝子を標的遺伝子として使用した場合は、本発明による細胞の核にｄｓＲＮＡを導入する手法により、ＲＮＡｉ効果を容易に検出及び評価することができる。
【００１６】
外来性レポータータンパク質としては、エンハンスド・グリーン・フルオレッセント・プロテイン（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｉｅｎ）、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｉｅｎ）、エクオリン、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどが挙げられる。
【００１７】
外来性レポータータンパク質の変異タンパク質としては、上記した野生型のレポータータンパク質のアミノ酸配列中に１〜複数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個）のアミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入を有するタンパク質であって、好ましくは野生型のレポータータンパク質と同等以上の機能を維持している。
【００１８】
レポータータンパク質の変異タンパク質の遺伝子として具体的には、レポータータンパク質の遺伝子中の塩基配列の一部が欠損した遺伝子、レポーター遺伝子の塩基配列が他の塩基配列で置換された遺伝子、レポーター遺伝子の一部に他の塩基配列が挿入された遺伝子などが用いられる。欠損、置換または付加を受ける塩基の数は、特に限定されないが、通常、１ないし６０個程度、好ましくは１から３０個程度、より好ましくは１ないし１０個程度である。なお、これらの変異遺伝子は、レポーター遺伝子としての機能を維持していることが望ましい。
【００１９】
変異タンパク質の遺伝子は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。具体的には、天然型レポータータンパク質をコードするＤＮＡに対して変異原となる薬剤を接触作用させたり、紫外線を照射したり、あるいはＰＣＲ法などの遺伝子工学的手法を用いることにより変異タンパク質をコードする遺伝子を取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから特に有用であり、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎＤ  ＥＤ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）等に記載の方法に準じて実施することができる。
【００２０】
（２）二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とは、標的遺伝子のセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡとを混合して両者をアニーリングすることにより調製することができる。具体的には、先ず、標的遺伝子のセンス鎖ＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡ及びアンチセンス鎖ＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡをそれぞれ当業者に公知の遺伝子組み換え手法により調製する。次いで、これらのＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡを用いて常法によりＲＮＡの転写を行なう。ＲＮＡの転写は、ＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  −  Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）などの市販のキットを用いて実施することもできる。転写反応の反応産物はＤＮａｓｅ処理を行い、さらにフェノール−クロロホルム、クロロホルム抽出、及びエタノール沈殿などの常法により転写ＲＮＡを精製することができる。最後に、上記で調製したセンスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡを好ましくは等量になるように混合し、アニーリング操作を行なうことにより２本鎖を形成させ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を作製することができる。なお、過剰に存在する一本鎖ＲＮＡは適当なヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）で処理し、フェノール−クロロホルム、クロロホルム抽出及びエタノール沈殿などの常法によりｄｓＲＮＡを精製することができる。
【００２１】
（３）細胞の核への導入
本発明において標的遺伝子のｄｓＲＮＡを導入する細胞の種類は特に限定されないが、非ヒト哺乳動物を効率の作製という目的から見て、好ましくは、発生系列の細胞であり、具体的には、受精卵、未受精卵、精子およびその始原細胞を含む生殖細胞を挙げることができ、さらに好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚形成初期の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階で、かつ一般に８細胞期以前）を挙げることができる。これらの細胞の核にｄｓＲＮＡを導入し、この細胞を用いて個体を発生させることにより、標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製することができる。本発明において好ましくは、標的遺伝子のｄｓＲＮＡは、受精卵の核に導入される。
【００２２】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の細胞の核への導入は、当業者に公知の方法により行なうことができ、例えば、核内注入は、位相差顕微鏡下でマイクロインジェクションにより行なうことができる。
【００２３】
（４）非ヒト哺乳動物の作製
本発明においては、上記（３）で得られた標的遺伝子のｄｓＲＮＡを核に導入した細胞を用いて、該標的遺伝子の機能が抑制されている非ヒト哺乳動物を作製する。得られる非ヒト哺乳動物又はその子孫又はその一部も本発明の範囲内のものである。即ち、本発明は、標的遺伝子のｄｓＲＮＡを核に導入した受精卵、未受精卵、精子又はＥＳ細胞などから発生した胚、並びにこの胚を、対応する非ヒト哺乳動物の子宮または卵管へ移植して発生させた胎児にも関する。
【００２４】
該非ヒト哺乳動物の一部としては、非ヒト哺乳動物の細胞内小器官、細胞、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびサルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非ヒト哺乳動物としてはマウス、ラット、モルモットなどの齧歯目の哺乳動物が好ましく、マウス又はラットが特に好ましい。マウスとしては、例えば、純系としてはＣ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統などが挙げられ、交雑系としてはＢ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統などが挙げられる。ラットの具体例としては、例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなどが挙げられる。
【００２５】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を非ヒト哺乳動物またはその先祖の受精卵に導入する際に用いられる受精卵は、同種の雄非ヒト哺乳動物と雌非ヒト哺乳動物とを交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。好ましいホルモンの投与量及び投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類により適宜決定できる。
【００２６】
受精卵の核に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入した後、雌非ヒト哺乳動物に人工的に移植・着床することにより、ｄｓＲＮＡが導入された非ヒト哺乳動物が得られる。黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）あるいはその類縁体を投与後、雄非ヒト哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌非ヒト哺乳動物に、ｄｓＲＮＡが導入された受精卵を人工的に移植・着床させる方法が好ましい。ＬＨＲＨあるいはその類縁体の投与量ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は非ヒト哺乳動物の種類等により適宜選択できる。
【００２７】
ｄｓＲＮＡの導入後の作出動物の生殖細胞においてもｄｓＲＮＡが存在することは、作出動物の後代が、ＲＮＡｉ効果を示すことを意味する。ＲＮＡｉ効果を受け継いだこの種の動物の子孫も本発明の範囲内である。
【００２８】
本発明の方法により作製される非ヒト哺乳動物においては、ＲＮＡｉ効果により標的遺伝子の発現は抑制されていることが期待される。このような標的遺伝子の機能がノックアウトしているモデル動物は、新規遺伝子の機能解析などに有用である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
実施例１：ｄｓＲＮＡの調製
インジェクションに用いたＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡ、コントロールとして用いたＨＰＲＴ  ｄｓＲＮＡは以下に示す方法で調製した。
（１）ＥＧＦＰ  ＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡの調製
ｐＣＥ  ＥＧＦＰ−１（文献名：  Ｔａｋａｄａ，  Ｔ．，  他、  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １５：４５８−４６１，  １９９７）を制限酵素Ｎｃｏ  Ｉ、Ｄｒａ  Ｉで切断し１％アガロース電気泳動で分離後、８００ｂｐのバンドを切り出しＤＮＡを回収し、挿入用フラグメントとした。このフラグメントを、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＶ処理したＬｉｔｍｕｓ  ２８ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とライゲーションして大腸菌ＪＭ１０９をトランスフォームし、ＥＧＦＰ遺伝子が組み込まれたプラスミドＥＧＦＰ  ＬＩを取得した。その後、ＥＧＦＰ  ＬＩプラスミドをＳｐｅ  Ｉ処理してＥＧＦＰセンスＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡとし、Ａｆｌ  ＩＩ処理してＥＧＦＰアンチセンスＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡとした。
【００３０】
（２）ＨＰＲＴ  ＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡの調製
ＨＰＲＴ  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＨＰＴ５はＡＴＣＣより分譲を受けた（ＡＴＣＣ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３７４２４）。ｐＨＲＴ５をＡｇｅ  Ｉ及びＢａｌ  Ｉで処理して得られたフラグメントを、Ａｇｅ  Ｉ及びＥｃｏＲＶ処理後、ＣＩＰ処理したＬｉｔｍｕｓ２８ベクターにライゲーションしてＨＰＲＴ遺伝子が組み込まれたプラスミドＨＰＲＴ  ＬＩを取得した。その後、ＨＰＲＴ  ＬＩプラスミドをＳｐｅ  Ｉ処理してＨＰＲＴセンスＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡとし、Ａｆｌ  ＩＩ処理してＨＰＲＴアンチセンスＲＮＡ転写用テンプレートＤＮＡとした。
【００３１】
（３）ＲＮＡの調製
ＲＮＡの転写はＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  −  Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施した。転写の条件は添付資料に従い、それぞれの遺伝子について、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを独立に転写した。転写後、添付資料の条件に従ってＤＮａｓｅ処理を行い、フェノール−クロロホルム、クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により転写ＲＮＡを精製した。
【００３２】
（４）インジェクションに用いるｄｓＲＮＡの調製
調製したセンスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡを等量になるように混合し、アニーリング操作により２本鎖を形成させた。過剰に存在する一本鎖ＲＮＡを除去する為、ＭｕｎｇＢｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴａＫａＲａ）処理し、フェノール−クロロホルム、クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりｄｓＲＮＡを精製した。精製したｄｓＲＮＡは５μｇ／μｌ水溶液として凍結保存し、使用時はＰＢＳ（−）溶液とした。
【００３３】
実施例２：受精卵の作出
受精卵の作出は、豊田らの手法に従い（マウス卵子の体外受精に関する研究、家畜繁殖誌１６：１４７−１５１、１９７１）体外受精で行った。すなわち、メスマウスに４８時間間隔でＰＭＧＳ及びｈＣＧ（７．５単位）を腹腔内注射し、その後１６−１８時間に卵子を採取し、ＥＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｍａｓａｒｕ  Ｏｋａｂｅ，  ｅｔ  ａｌ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０７（  １９９７  ）  ３１３−３１９）精子（卵子採取の約１．５時間前に精子採取）を媒精した（約１００−１５０精子／μｌ）。媒精約６時間後に卵子の第２極体の放出と雌雄両前核の有無を確認し、受精卵のみ選抜した。得られた前核期受精卵は中尾らの手法（１９９７）に従って、簡易ガラス化法を用い凍結保存した。凍結された受精卵は実験前に融解し、顕微注入操作に供した。
【００３４】
実施例３：ｄｓＲＮＡインジェクション
受精卵前核へのｄｓＲＮＡインジェクションは、勝木らの手法（発生工学実験マニュアル  トランスジェニックマウスの作り方、１９８７）に従って行った。受精卵は修正ウィッテン培地（ｍＷＭ培地）の液滴に移し、核内注入では、位相差顕微鏡（ＤＭＩＲＢ、Ｌｅｉｃａ社）下で雄性前核を確認した後、精製したｄｓＲＮＡ溶液（２．０μｇ／μｌ）を約２ｐｌ注入した。細胞質内注入では、細胞質内にｄｓＲＮＡ溶液を約２ｐｌ注入した。生残胚はｍＷＭ培地に移し、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒ、３７℃の条件下で培養した。インジェクション後４日目に蛍光実体顕微鏡（ＭＺ．  ＦＬ  ＩＩＩ，  Ｌｅｉｃａ社）を用いてＥＧＦＰの発現を観察し、ＥＧＦＰ発現が抑制された胚（減光胚）の存在を確認した。これらの減光胚を含む胚を偽妊娠の雌ＩＣＲ系統マウスの子宮へ移植し、着床させた。
【００３５】
インジェクション後１４日目に解剖して胎児を取り出し、蛍光実体顕微鏡を用いてＥＧＦＰの発現を観察した。ＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡをインジェクションした受精卵より作成した胎児の中にＥＧＦＰ発現が抑制された胎児の存在を確認した（図１）。
ＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡインジェクションの胚盤胞観察の結果を以下の表１に示し、胚移植の結果（解剖観察）の結果を以下の表１に示す。
【００３６】
【表１】
2004180641.tif 000002
【００３７】
【表２】
2004180641.tif 000003
【００３８】
実施例４：ｄｓＲＮＡインジェクションによる産仔取得
実施例３と同様な方法で、ＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡを受精卵前核及び細胞質内へインジェクションした。生残胚をｍＷＭ培地に移し、５％ＣＯ２、９５％Ａｉｒ、３７℃の条件下で培養し、翌日２細胞期の段階で偽妊娠の雌ＩＣＲ系統マウスの卵管へ移植し、着床させた。移植後１８日目に誕生した産仔に、暗室内で３６５ｎｍ紫外線ランプ（ＵＶＰ社ＵＶＬ−５６型）を照射し、ＥＧＦＰ蛍光観察を行ったところ、ＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡを核にインジェクションした仔マウスの中に、体表ＥＧＦＰ蛍光が減少した仔マウスが認められた（図２）。
【００３９】
【発明の効果】
本発明により、従来の方法よりも効率的に、ＲＮＡｉ表現型非ヒト哺乳動物を取得することができる。さらに、ＲＮＡｉ効果を用いた疾病等の関連遺伝子の解析、医薬品のターゲット遺伝子の解析等において、これまでのマウスよりもより確実に遺伝子の抑制が可能となり、産業上大いに貢献すると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＥＧＦＰ  ｄｓＲＮＡをインジェクションした受精卵より作成した胎児を取り出し、蛍光実体顕微鏡を用いてＥＧＦＰの発現を観察した結果を示す。上段はインジェクションなしの胎児を示す、下段左は減光した胎児を示し、下段中央は若干減光した胎児を示し、下段右は減光しなかった胎児を示す。
【図２】図２は、産仔に、暗室内で３６５ｎｍ紫外線ランプを照射し、ＥＧＦＰ蛍光観察を行った結果を示す。左の２匹はインジェクションなしのマウスを示し、真中の二匹は減光しなかったマウスを示し、右から２番目のマウスは減光したマウスを示し、右から一番目のマウスは若干減光したマウスを示す。
【図１】
2004180641.tif 000004
【図２】
2004180641.tif 000005