(57)【要約】【解決手段】高濃度のイオン性界面活性剤で試料を抽出することを特徴とする、試料中に含まれるオボムコイド等の所定のタンパク質の免疫測定法を提供する。【効果】該免疫測定法を用いることにより、所定のタンパク質の抽出効率が顕著に改善されるとともに、引き続く免疫測定での抗原−抗体反応が維持され、結果として測定系全体の感度が飛躍的に向上する。また当該方法においてはイオン性界面活性剤の除去／希釈が必要とされないので測定方法全体を簡便化し得る。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１から１０％（ｗ／ｖ）のイオン性界面活性剤を含む溶液中のオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を測定する免疫測定法。
【請求項２】
イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルサルコシンナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウムから成る群より選択される請求項１に記載の免疫測定法。
【請求項３】
酵素免疫測定法である請求項１または２に記載の免疫測定法。
【請求項４】
固相サンドイッチ法である請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫測定法。
【請求項５】
抗オボムコイド抗体、抗カゼイン抗体、抗β−ラクトグロブリン抗体、抗そばタンパク質抗体、抗小麦タンパク質抗体または抗落花生タンパク質抗体を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の免疫測定法に用いるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体に含まれるオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質等の簡便かつ高感度な免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品の安全性への関心が、近年、益々高まっている。特に食物アレルギーは、重度の場合、重篤な全身性アナフェラキシー（咽頭の水腫、重度の喘息或いは低血圧等）を引き起こし、時には致命的な障害をもたらす場合もあるため、これらの食物アレルギー症状を有する消費者のみならず食品製造業者・監督官庁にとっても食品の安全性を保全する立場から極めて重要な課題である。現在、当該食物アレルギーによる症状の発生を防止する最も有効な方法は、それらの食物アレルギー発症履歴を有するか潜在的に有する対象者がその食物アレルゲンと接触することを防止するものであるが、厚生労働省は、当該観点から「アレルギー物質を含む食品については、特定のアレルギー体質を持つ方の健康危害の発生を防止する観点から、食物アレルギーを引き起こすことが明らかになった食品のうち、特に発症数、重篤度から勘案して表示する必要性の高い小麦、そば、卵、乳及び落花生の５品目（以下「特定原材料」という。）を食品衛生法施行規則（昭和２３年厚生省令第２３号。以下「規則」という。）別表第５の２に掲げ、これらを含む加工食品については、規則第５条に定めるところにより当該特定原材料を含む旨を記載しなければならない」とし、当該５品目を含む食品に対してそれら原材料を含む旨の表示を製造者に義務づけている。また、消費者の商品選択の幅を不当に狭めることのないよう、当該表示においては、「入っているかもしれません。」「入っている恐れがあります。」などの可能性表示を禁止し、製品への「特定原材料」混入の監視・検査義務を明確にしている。更に、食品を生産する際に、原材料としては使用していないにも関わらず、特定原材料等がごく微量混入（コンタミネーション）してしまう場合にも当該混入が必ず起こり得るならば表示を必要とし、消費者の高度の安全を確保する立場から原則として数μｇ／ｇ以上程度の混入についても表示するよう求めている。従って、食品製造業者は、上記施行規則を遵守するのは勿論のこと、更なる消費者の安全と適切な商品選択の機会を提供すべく、自らの製品について十分な監視と高い測定感度での検査を行うことが望まれている。
【０００３】
このような高度の検査を達成する検査方法としては、ＰＣＲを用いた特異的遺伝子の増幅に基づく検査法があげられるが、当該方法は、現在までのところ、熟練した技術と高い費用や比較的長い検査時間を要し、製造現場での迅速且つ簡便な検査という観点から不利益がある。そこで、現時点において当該検査を実行する際の他の最も有効な選択肢として、上記食品原材料に由来する成分に対する抗体を利用した免疫学的検査方法（免疫測定法）が注目され、一部実用化されている。特に、免疫測定法はＥＬＩＳＡ法等として広く普及しており、その操作も高度の熟練を必要とせず、精度のよい結果も短時間で得られるので、当該検査の目的には好適である。
【０００４】
しかしながら、たとえ上記免疫測定法を用いたとしても、卵、乳、小麦、そば、或いは落花生等からなる食品原材料は、その組成や、形態、製造方法が一様でなく、更にはこれらの原材料が引き続く食品加工の段階で変性・難溶化することもあり、完成した加工食品中に含まれるこれらの多種多様な形態をとりうる食品原材料を、少なくとも１０μｇ／ｇという極めて高感度で検査するのは容易でない。しかして、当該免疫測定法に用いる抗体の特異性と抗原結合能を飛躍的に向上させる努力が精力的になされており、本出願人は、そのような極めて高感度の測定を実現する抗体に関し、特願２００２−１３０９８６号等の特許出願を行っている。当該抗体等の使用は、ある種の食品原材料の測定感度を飛躍的に向上させることに成功したが、より高い測定感度を得るためには、測定用抗体の改良のみならず、加工食品等からの抗原の抽出法を含めた免疫測定系全体を改良していく必要がある。とりわけ、測定対象となる抗原タンパク質が、完成した加工食品中において他の固形成分と強固に結合している場合等には、該タンパク質が固形成分から抽出され難いために十分な感度で測定ができない場合があり、特に小麦を使用した製品（例えばビスケット）中に含まれるタンパク質は、小麦由来のグルテンと極めて強固に結合しているため、通常のタンパク質の抽出に使用される非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ含有水溶液ではこれらを十分に抽出できず、その測定感度が低下する原因となると考えられる。
【０００５】
一方で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのイオン性界面活性剤は、タンパク質に対し極めて高い親和性をもち、水に難溶性の物質、特に生体膜タンパク質を水に可溶化させるために汎用される界面活性剤である。したがって、上記のような難溶性タンパク質を食品から抽出する場合において、比較的高濃度のイオン性界面活性剤を用いることにより、抗原タンパク質の抽出効率を改善し得ることが期待できる。しかしながら、測定試料にイオン性界面活性剤が含まれている場合には、該界面活性剤が抗原抗体反応を阻害することが知られており、たとえば特許文献１には、イオン性界面活性剤であるＳＤＳの免疫反応溶液中の好ましい濃度は０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）であるとされている。したがって、ＳＤＳ等のイオン性界面活性剤の比較的高濃度で抽出した抽出液中のタンパク質を従来の免疫測定法により測定する場合には、予め該抽出液から該界面活性剤を除去するか、或いはこれを十分に希釈して、イオン性界面活性剤の濃度を免疫反応に悪影響を与えない程度まで低下させる必要がある。
【０００６】
上記のイオン性界面活性剤除去方法に関しては、当該抽出液を、１）セロハンチューブなどを用いて透析する、２）遠心濃縮器などを用いて界面活性剤を含まない溶液に置換する、３）ゲル濾過やイオン交換クロマトグラフィーによって界面活性剤を含まない溶液に置換する、４）化学物質を添加して界面活性剤のみを沈殿させる方法などが慣用される。しかしながら、イオン性界面活性剤は、タンパク質と容易にミセルを形成するため、界面活性剤のみを除くことは非常に困難である場合が多く、上記の除去処理を行うことによって、目的とするタンパク質の回収率が著しく低下する原因となる。また、比較的高濃度のイオン性界面活性剤を使用してより高い抽出効率を達成したとしても、当該イオン性界面活性剤の濃度低下のみのために抽出液全体を大幅に希釈したのでは、測定すべき抽出タンパク質の濃度も同時に低下して、結局、引き続く免疫反応における検出感度が一向に向上しない。すなわち、一般に、抗原タンパク質を効率よく試料から抽出するためのイオン性界面活性剤の使用は、引き続く免疫反応を有効に行わせることとは両立しないものと考えられていたのである。
【０００７】
【特許文献１】
特開平９−７７７９８号公報（第６頁、左欄、第００３３段落）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、極めて高感度で検出・測定することが要求される特定の抗原タンパク質を、試料からの高い抽出効率を維持したままで、引き続く免疫反応により鋭敏かつ簡便に検出する方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
今や、免疫測定法を用いて抽出液中のオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質又は落花生タンパク質濃度を測定する場合、一般的に考えられていたこととは異なり、高濃度のイオン性界面活性剤の存在下でも当該測定における抗原抗体反応が阻害されない、との驚くべき知見が得られた。本発明者は、かかる知見に基き、高感度かつ簡便なオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質に代表されるタンパク質の免疫測定法を完成させた。即ち、本発明によれば、試料中に含有されるオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質等のタンパク質を比較的高濃度のイオン性界面活性剤溶液（タンパク質抽出用溶液）によって抽出し、得られた抽出液の溶媒置換或いは溶液希釈を行うことなく、直接、免疫測定法によってそれらのタンパク質を測定することを特徴とする高感度かつ簡便な免疫測定法および該測定法に使用する測定キットが提供される。
【００１０】
したがって、本発明の第１は、
（１）０．１から１０％（ｗ／ｖ）のイオン性界面活性剤を含む溶液中のオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質からなる群から選択される一のタンパク質を測定する免疫測定法である。
【００１１】
上記イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルサルコシンナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウムを例示できる。したがって、本発明の第２は、
（２）イオン性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ラウリルサルコシンナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルピリジニウムから成る群より選択される上記（１）の免疫測定法である。
【００１２】
また、本発明の免疫測定法は、例示的に、酵素免疫測定法や固相サンドイッチ法にも応用することができ、更に本発明の免疫測定法は、簡便にはキットの形態の試薬類を用いて行うことができる。したがって、本発明の第３乃至５は、
（３）酵素免疫測定法である上記（１）または（２）の免疫測定法、
（４）固相サンドイッチ法である上記（１）から（３）のいずれかに記載の免疫測定法、および
（５）抗オボムコイド抗体、抗カゼイン抗体、抗β−ラクトグロブリン抗体、抗そばタンパク質抗体、抗小麦タンパク質抗体又は抗落花生タンパク質抗体を含む上記（１）から（４）のいずれかの免疫測定法に用いるキットである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（試料中に含まれるオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質、落花生タンパク質の測定法）
本発明の方法においては、上記抗原タンパク質の試料からの効率的な抽出のために、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．３〜１０％（ｗ／ｖ）のイオン性界面活性剤を含むタンパク質抽出用溶液で測定対象となる各種試料を抽出する。たとえば、試料を必要に応じて粉砕した後、これに上記イオン性界面活性剤を含むタンパク質抽出用溶液を加えて、試料に含有される抗原タンパク質を抽出する。当該抽出用溶液には、所望により、不溶性成分とジスルフィド結合したタンパク質を可溶化させるために該検体希釈液に２−メルカプトエタノールなどの還元剤を加えることもでき、また、リン酸緩衝液等を加えてそのｐＨを調整してもよい。
【００１４】
１つの具体例においては、測定対象である食品試料に対して２０倍抽出となるように上記のタンパク質抽出用溶液を加え、これを常温にて家庭用ミキサー等を用いて約３０秒間ホモジナイズする。その後、得られた抽出液に対して常温にて３０００×ｇで遠心分離を行いその上清を分取するか、または所望により分取した上清を更にＮｏ．５Ａの濾紙等を用いて濾過して測定試料溶液を得る。
【００１５】
次いで、得られた測定試料溶液を直接の対象にするか、或いは当該溶液中に存在する抗原タンパク質の濃度が著しく低下しない程度に希釈した溶液を対象にして免疫測定法を実施し、該抽出液等中のオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質或いは落花生タンパク質濃度を測定する。免疫測定法は、例えばプレート上に固相化した１次抗体に、測定試料溶液中の抗原タンパク質を反応させ、次いで、生成された抗原−１次抗体複合体に酵素標識した二次抗体を更に反応させ、標識酵素の作用による基質の発色反応で固相に結合した酵素活性を測定する酵素免疫測定法、或いはラジオアイソトープで標識された抗原を用いるラジオイムノアッセイ法などの公知の免疫測定法を用いて実施できる。そして、本発明のオボムコイド、カゼイン、β−ラクトグロブリン、そばタンパク質、小麦タンパク質、落花生タンパク質の測定系においては、試料抽出の際のタンパク質抽出用溶液に由来する比較的高濃度のイオン性界面活性剤の存在にも拘らず、引き続く免疫測定においてこれらの抗原タンパク質と抗体との反応が該界面活性剤により実質的に阻害されることがない。また、該測定系では、高濃度のイオン性界面活性剤を除去し或いはこれを希釈するという余剰の工程が省略し得る。
【００１６】
更に本発明の好ましい態様の一つであるＥＩＡによる固相サンドイッチ法についてより詳細に説明すると、該方法では、まず、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素で標識した抗体を調製する。また、使用する固相には標的とする抗原を認識する抗体を吸着させておく。次に固相の抗体非吸着面に対し、その反応系には影響しないタンパク質、例えばウシ血清アルブミンなどでブロッキング処理を行う。なお、上記で用いられる抗体やその適用量は、所望とする検出感度に応じて、適宜、選択・調整することができる。
【００１７】
次いで、上記のようにして調製した測定試料溶液と、所望により測定のスタンダードを上記の固相に添加し、第一ステップの抗原抗体反応を行わせる。反応後、固相を洗浄し、上述の酵素標識抗体を添加して固相化抗体と反応した抗原と、第二ステップの抗原抗体反応を行わせる。なお、試料またはスタンダードと酵素標識抗体を同時に添加することも可能である。過剰の酵素標識抗体を洗浄操作で除去した後、使用した酵素に応じた発色基質、例えば１，２−フェニルジアミンとＨ２Ｏ２、Ｐ−ニトロフェニルリン酸、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等を反応系に加えてこれらを酵素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいては試料中の抗原量に依存するため、発色最終産物の量を測定することにより、標的とする抗原を定量することが出来る。
【００１８】
固相サンドイッチ法において、標識酵素−発色基質の組合わせを、標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素−蛍光基質などの組合わせに変えることが可能である。この場合、酵素−発光基質の代表的な組合わせは、アルカリフォスファターゼ−ＡＭＰＰＤ、ホースラディッシュペルオキシダーゼルミノール、ルシフェラーゼ−ルシフェリンなどがあり、酵素−蛍光基質の代表的な組合わせは、アルカリフォスファターゼ−ウンベリフェリルフォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ｐ−ハイドロキシフェニルプロピオン酸などがある。
【００１９】
更に、酵素に代えて放射性物質や化学発光物質或いは蛍光物質で直接或いは間接的に標識された抗体や抗原を用い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、試料中の抗原を測定することも可能である。放射性物質としては、１２５Ｉや１３１Ｉなどが一般に使用されており、化学発光物質の代表的なものには、アクリジニウムエステルなどがある。また、蛍光強度を測定する場合には、より高感度な方法として、抗体或いは抗原にキレート剤を直接或いは間接的に結合させ、励起光照射後にそのキレート剤から発せられる蛍光の強度を時間分解的に測定することにより、試料中の抗原を測定する方法（時間分解蛍光免疫測定法）も有用である。なお、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあげられる。
【００２０】
（イオン性界面活性剤）
本発明で使用するイオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、３，５−ジヨードサリチル酸リチウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンドデシルスルフェート、コール酸ナトリウム、Ｎ−ラウリルサルコシン、Ｎ−ドデカノイルサルコシン酸ナトリウムその他の陰イオン界面活性剤または臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（以下ＨＤＴＭＡＢと略す）、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＤＴＭＡＣと略す）または塩化ヘキサデシルピリジニウム（ＨＤＰＣと略す）その他の陽イオン界面活性剤であって、タンパク質を可溶化させるために一般に使用される界面活性剤であれば、いずれの界面活性剤であってもよい。
【００２１】
（抗体）
本明細書において、「抗体」にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗血清が含まれる。また、抗体はペプシンなどのタンパク質分解酵素で分解されたＦ（ａｂ’）２或いはＦａｂ’などの抗原結合性フラグメントであっても良い。目的の抗体がポリクローナル抗体である場合は、免疫した動物から得られる抗血清を硫酸アンモニウムで塩析し、沈殿画分を溶解後、ＤＥＡＥ−セルロースなどの陰イオン交換樹脂に供し、素通り画分であるＩｇＧ画分を回収したのち、透析などによって目的の溶媒に置換する。
【００２２】
モノクローナル抗体を調製する場合には、免疫した動物の脾細胞とミエローマ細胞株などの細胞融合用のペアレントセルを融合させ、得られたハイブリドーマの中から好適なものと選択してクローン化し、次いで、その融合細胞を生体外または生体内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモノクローナル抗体を採取する。
【００２３】
上記のようにして得た抗体は、必要に応じて精製を行う。精製方法は、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を組合わせて実施し得る。
【００２４】
上記のとおり、本発明においては、モノクローナル抗体の他にもポリクローナル抗体やそれらの抗体の抗原結合性フラグメント及び抗血清が使用可能であり、その使用濃度等の最適化も当業者にとって容易であろう。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例をもって本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の各種態様の一例として示すものであり、したがって本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００２６】
なお、以下において、特にことわりのない限り濃度（％）は、重量／容量（ｗ／ｖ）％をさす。
【００２７】
実施例１  固相サンドイッチ法による、ＳＤＳを含む検体中のオボムコイドの測定
（１）抗オボムコイド抗体の固相化
ウサギ抗オボムコイドポリクローナル抗体を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍｌになるように溶解した。これをマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社、マイクロモジュールプレート、Ｍａｘｓｏｒｐ−Ｆ８）に１００μｌずつ分注し、常温で２時間放置した。
【００２８】
（２）マイクロタイタープレートのブロッキング
各ウェルから上記抗体溶液を除去後、３００μｌのブロッキング溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ウシ血清アルブミンを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４））を加え常温で２時間放置した。
【００２９】
（３）オボムコイドの測定
各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに検体希釈溶液（０．１％ウシ血清アルブミン：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０：０％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％または１％のＳＤＳ含有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４））で段階希釈したオボムコイド標準品（商品名：卵製トリプシンインヒビター、ナカライテスク社製）を１００μｌ加え、常温で２時間放置した。
【００３０】
なお、以下に示す種々の検体の実際の測定において、当該検体に含まれるオボムコイド量が上記系での測定範囲以外となる場合には、当該検体を更に検体希釈溶液で希釈して上記系の測定範囲内となるようにしてから測定した。
【００３１】
次いで、各ウェルを洗浄液３００μｌで６回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗オボムコイドポリクローナル抗体を０．１％ＢＳＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０含有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を１００μｌずつ加え、常温で３０分間放置した。
【００３２】
次に、各ウェルを洗浄液３００μｌで５回洗浄後、ＴＭＢ溶液（３、３’、５、５’テトラメチルベンジジン）を１００μｌずつ加え、常温で遮光し１０分間反応させた。
【００３３】
その後、１規定硫酸を１００μｌずつ各ウェルに加え反応を停止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍで測定した。
【００３４】
得られた標準曲線を図１に示す。
【００３５】
図１からわかるように、０．０１〜１．０％のＳＤＳ溶液中の検体による標準曲線は、ＳＤＳを添加していない溶液中の検体による曲線とほぼ同等であることから、本測定系においてＳＤＳ存在下でもオボムコイドの定量が可能であることが確認された。
【００３６】
なお、実際に種々の検体中のオボムコイド量を測定する場合には、このようにして得られた標準曲線をもとに検体中のオボムコイド量を換算した。
【００３７】
（４）検体の免疫測定
上記の試験法に従って、実際に検体の免疫測定試験を行った。市販品の三種類のマヨネーズを、１％ＳＤＳを含む検体希釈液でそれぞれ３倍段階希釈し、同時に測定した標準オボムコイドから得られた標準曲線に基いて、検体のオボムコイド濃度を算出した。
【００３８】
図２の結果に示すとおり、原点を通る良好な直線性が得られた。
【００３９】
（５）添加回収試験
上記の試験法に従って抗原の添加回収試験を行った。
【００４０】
市販品の３種類のビスケットを検体として、その１％ＳＤＳ含有抽出液を調製した。すなわち、当該ビスケットを均一に粉末化し、当該粉末の２ｇを秤取した。これに３８ｍｌの１％ＳＤＳ含有検体希釈液を加え、ホモジナイザーを用いて３０秒Ｘ２回の攪拌を行い、得られた混合液を３，０００Ｘｇで２０分間遠心分離した。得られた上清を５Ａの濾紙で濾過し、当該濾液を食品抽出液（１％ＳＤＳ含有抽出液）として測定に用いた。次いで、該抽出液に標準オボムコイドを添加して免疫測定を実施し、測定値から添加したオボムコイド量の回収率を求めた。回収率は、添加抗原量を１００％とし、該添加抗原量に対する測定値から固有の検体含有抗原量を引いた値の割合で示す。
【００４１】
以下の表１に示すとおり、添加回収率は８８．７から９６．１％と良好な結果が得られ、本発明の方法により食品中のオボムコイドが正確且つ鋭敏に測定し得ることが示された。
【００４２】
【表１】
2004239885.tif 000002
【００４３】
実施例２  固相サンドイッチ法による、各種イオン性界面活性剤または非イオン界面活性剤を含む検体中のオボムコイドおよびオボアルブミンの測定
上記実施例と同様の条件で、本発明の陰イオン性界面活性剤の一種であるＳＤＳ、ドデシル硫酸リチウムおよびラウリルサルコシンナトリウム、陽イオン性界面活性剤の一種である臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、塩化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化ヘキサデキシルピリジニウム、並びに参考として非イオン界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０、ルプロールＰＸおよびＴｒｉｏｎＸ−１００ならびにステロイド骨格を有する界面活性剤であるデオキシコール酸の、オボムコイドおよびオボアルブミン（参考例）の免疫測定系に対する影響を検討した。
【００４４】
すなわち、１ｍｌあたり６４μｇのオボアルブミンおよび６４μｇのオボムコイドを含む検体について、上記の各種界面活性剤の種々の濃度における免疫測定を行って吸光度を測定し、その結果を以下の表２〜５および図３〜６に示す。
【００４５】
【表２】
2004239885.tif 000003
【００４６】
【表３】
2004239885.tif 000004
【００４７】
【表４】
2004239885.tif 000005
【００４８】
【表５】
2004239885.tif 000006
【００４９】
本試験の結果、オボアルブミンの測定系においては比較的高濃度（例えば０．１％以上）のイオン性界面活性剤が測定感度を著しく低下させ、免疫測定を阻害するのに対し、オボムコイドの測定系においては１０％程度の極めて高い濃度のイオン性界面活性剤存在下においてもその測定が十分可能なことが明らかとなった。このことから、本発明の方法は、本発明のイオン性界面活性剤の有する高いタンパク質抽出能力とあわせて、優れた検出感度と正確性を達成する免疫測定系を提供することが実証された。なお、参考とした非イオン界面活性剤およびデオキシコール酸は、オボアルブミンおよびオボムコイドのいずれの測定系にも影響しなかった。
【００５０】
実施例３  カゼイン及びβ−ラクトグロブリンの測定
抗オボムコイド抗体の代わりに抗カゼイン抗体又は抗β−ラクトグロブリン抗体を使用した他は、実施例１とほぼ同様な手順でカゼイン又はβ−ラクトグロブリンの測定を行った。すなわち、ＳＤＳ濃度を１０％から０．１５６％まで段階希釈した検体希釈液に、それぞれ１ｍｌあたり牛乳タンパク質量として６４ｎｇの牛乳タンパク質を添加して測定用の試料溶液を作製した。当該試料中のカゼイン又はβ−ラクトグロブリンを実施例１と同様のプロトコールで実施される市販のカゼイン用牛乳免疫測定キット又はβ−ラクトグロブリン用牛乳免疫測定キット（ともに株式会社森永生科学研究所より入手。商品名、モリナガ特定原材料測定キット：牛乳測定キット（カゼイン）及びモリナガ特定原材料測定キット：牛乳測定キット（β−ラクトグロブリン））で測定した。結果を図９および図１０に示した。
【００５１】
図９および図１０から明らかなように、カゼインおよびβ−ラクトグロブリンにおいてもＳＤＳに代表されるようなイオン性界面活性剤の高濃度存在下で、免疫測定が良好に実施できることが示された。
【００５２】
実施例４  そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質の測定
実施例３と同様にして、そばタンパク質、小麦タンパク質（グリアジン）及び落花生タンパク質の測定に対するイオン性界面活性剤の影響を検証した。なお、添加実験に用いたそばタンパク質は、そばの子実を磨砕し、当該磨砕物に塩化ナトリウム等の塩類を含む緩衝液（トリス−塩酸緩衝液等）を加えて成分を抽出することで得られた抽出物を遠心分離してその上清を回収し、次いで、該上清をスーパーデックスＧ−２００やスーパーロース６（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のゲル濾過カラムに供し、分子量７０〜５００ｋＤの範囲に溶出される画分を回収することにより調製した。
【００５３】
また、小麦タンパク質（グリアジン）は、アサマ化成（株）より入手した市販品を用い、落花生タンパク質は、落花生の子実を磨砕し、当該磨砕物に塩化ナトリウム等の塩類を含む緩衝液（トリス−塩酸緩衝液等）を加えて成分を抽出することで得られた抽出物を遠心分離してその上清を回収し、次いで、該上清をスーパーデックスＧ−２００やスーパーロース６（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）のゲル濾過カラムに供し、分子量３０〜１００ｋＤの範囲に溶出される画分を回収することにより調製した。
これらの試料を用いた免疫測定法による試験は、各市販の測定キット（株式会社森永生科学研究所製、モリナガ特定原材料測定キット：そば測定キット、モリナガ特定原材料測定キット：小麦測定キット（グリアジン）及びモリナガ特定原材料測定キット：落花生測定キット）により実施した。結果を図１１乃至１３に示した。
【００５４】
図１１乃至図１３から、そばタンパク質、小麦タンパク質及び落花生タンパク質においても、高濃度のイオン性界面活性剤の存在下で免疫測定が良好に実施できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】標準オボムコイドを順次段階希釈し、本発明の実施例の方法（ＥＩＡの原理に基く固相サンドイッチ法）により測定波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍでの吸光度を測定した結果を示す。
【図２】オボムコイドを含む未知濃度検体（検体ａ乃至ｃ）を測定系に用いて、本発明の実施例の方法（ＥＩＡの原理に基く固相サンドイッチ法）により測定波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍでの吸光度を測定した結果を示す。
【図３】ＨＤＴＭＡＢ、ＨＤＴＭＡＣおよびＨＤＰＣの存在下におけるオボアルブミンの測定結果を示す（参考例）。横軸は各界面活性剤の濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。
【図４】ＬＤＳ、ラウリルサルコシンナトリウムおよびＳＤＳの存在下におけるオボアルブミンの測定結果を示す（参考例）。横軸は各界面活性剤の濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。
【図５】ＨＤＴＭＡＢ、ＨＤＴＭＡＣおよびＨＤＰＣの存在下におけるオボムコイドの測定結果を示す。横軸は各界面活性剤の濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。
【図６】ＬＤＳ、ラウリルサルコシンナトリウムおよびＳＤＳの存在下におけるオボムコイドの測定結果を示す。横軸は各界面活性剤の濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。
【図７】Ｔｗｅｅｎ２０、ルブロールＰＸ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＤＯＣの存在下におけるオボアルブミンの測定結果を示す（参考例）。横軸は各界面活性剤の濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。
【図８】Ｔｗｅｅｎ２０、ルブロールＰＸ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＤＯＣの存在下におけるオボムコイドの測定結果を示す（参考例）。横軸は各界面活性剤の濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。
【図９】ＳＤＳの存在下におけるカゼインの測定結果を示す。横軸は界面活性剤（ＳＤＳ）濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。（■）は抗原有り、（◆）は抗原なし（対照）。
【図１０】ＳＤＳの存在下におけるβ−ラクトグロブリンの測定結果を示す。横軸は界面活性剤（ＳＤＳ）濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。（■）は抗原有り、（◆）は抗原なし（対照）。
【図１１】ＳＤＳの存在下におけるそばタンパク質の測定結果を示す。横軸は界面活性剤（ＳＤＳ）濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。（■）は抗原有り、（◆）は抗原なし（対照）。
【図１２】ＳＤＳの存在下における小麦タンパク質（グリアジン）の測定結果を示す。横軸は界面活性剤（ＳＤＳ）濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。（■）は抗原有り、（◆）は抗原なし（対照）。
【図１３】ＳＤＳの存在下における落花生タンパク質の測定結果を示す。横軸は界面活性剤（ＳＤＳ）濃度（％）を示し、縦軸は吸光度を示す。（■）は抗原有り、（◆）は抗原なし（対照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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