(57)【要約】【課題】屈折率の高い試料の測定において、赤色光源を用いた場合にも、正確な粒子分析を行うことができる粒子分析装置用シース液を提供することを目的とする。【解決手段】測定用試料中に含まれる粒子をフローサイトメータを用いて分析するために、該粒子の周囲を包囲して細管中を通過させるシース液であって、２５℃でのナトリウムＤ線の波長における屈折率が、１．３３８０〜１．３４５０の範囲である粒子分析装置用シース液。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２５℃でのナトリウムＤ線の波長における屈折率が１．３３８０〜１．３４５０の範囲である粒子分析装置用シース液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、粒子分析装置用シース液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞又は微粒子の識別又は分析のために、シースフローシステムを用いた機器が出現し、血液や尿等の生体試料の識別又は分析の自動化・高速化が進んでいる。
シースフローシステムとは、例えば、フローサイトメータの細管中を最適流量・最適流速で、細胞又は粒子をそのままあるいは懸濁又は希釈試料として、その周囲をシース液流により包囲された状態で一列に並べて通過させて、細胞又は粒子が、細管中の検出部を通過するとき発生する電気的あるいは光学的パルスを検出することにより、細胞又は粒子の計数や形態情報の取得を行う方法である。
例えば、測定される細胞又は粒子等を含む試料が、シース液流により検出部に導かれると、そこでレーザー光源からのレーザー光が照射光集束用レンズを経て照射される。照射光ストッパを介して直射光が停止され、細胞又は粒子によって生じた散乱光のうち、前方散乱光のみが前方散乱光検出用レンズを経て、前方散乱光検出器により測定される。一方、側方散乱光は、側方散乱光検出用レンズを経て、側方散乱光検出器により測定される。そして、検出器によって測定された電圧レベルが分析器に入力され、これらの値に基づいて、表示装置に前方及び側方散乱光によるスキャッタグラムが表示され、細胞又は粒子が計数される（たとえば特許文献１〜４）。
【０００３】
【特許文献１】
特開平８−１２２３２７号公報
【特許文献２】
特公平８−３３３８８号公報
【特許文献３】
特公平７−８２０１０号公報
【特許文献４】
特開昭６２−８７２３３号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、照射光源に、Ｈｅ−Ｎｅレーザー、半導体レーザー等の赤色の光源を用いる場合、血液のように試料を高倍率で希釈した試料では問題とならないが、尿のようにそのままあるいは低倍率で希釈した試料では正確な測定結果を得られない。
【０００５】
つまり、尿のようにもともと屈折率が高い試料の場合には、赤色付近の波長において、試料の屈折率とシース液の屈折率との差が大きくなり、その結果、前方散乱光信号のベースラインがゆらぎ、試料中に粒子が存在しないにもかかわらず、あたかも多量の粒子が存在するかのように、スキャッタグラム上に集団が現れる。したがって、測定試料中の粒子成分を正確に計数することができない。
本発明は上記課題に鑑みなされたものであり、屈折率の高い試料の測定において、赤色光源を用いた場合にも、正確な粒子分析を行うことができる粒子分析装置用シース液を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、２５℃でのナトリウムＤ線の波長における屈折率が１．３３８０〜１．３４５０の範囲である粒子分析装置用シース液が提供される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のシース液は、通常、測定用試料中に含まれる粒子を、フローサイトメータを用いて分析するために、粒子の周囲を包囲して細管中を最適流量、最適流速で通過させるものである。
シース液の組成は、測定用試料中の粒子又は細胞に影響を与えない限り特に限定されるものではなく、測定用試料の種類、濃度、フローサイトメータで用いる光源の種類等によって適宜調整される。シース液は、通常、緩衝剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、キレート剤、防黴／防菌剤、有機溶媒、水等を含有して構成されており、本発明においても、これらの成分の１種以上、好ましくは複数種類を組み合わせて構成することができる。特に、水、有機溶媒又はそれらの混合物を媒体として、その中に、緩衝剤、界面活性剤、キレート剤、防黴／防菌剤の１種以上が含有されていることが適当である。なお、測定用試料中の粒子又は細胞の溶解等を防ぐために、浸透圧調整剤を使用してもよい。浸透圧調整剤としては、無機塩類やプロピオン酸塩等の有機塩類、糖類などが用いられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等、プロピオン酸塩としては、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸アンモニウム等、他の有機塩類としてはシュウ酸塩、酢酸塩等、糖類としては、ソルビトール、グルコース、マンニトール等が挙げられる。
具体的には、緩衝剤は、例えば、ｐＨをｐＨ６．０〜８．５程度、好ましくは７．０〜８．５程度の範囲に保つために用いられる。緩衝剤としては、従来公知のものを使用することができる。例えば、トリス緩衝液、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳのようなグッド緩衝剤、燐酸水素二ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ベロナールナトリウム−塩酸、コリジン−塩酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸等を挙げることができる。濃度は、用いる緩衝剤の緩衝能に応じて適宜調整することができ、例えば、５〜５０ｍＭ程度が挙げられる。
【０００８】
界面活性剤は、必ずしも含有させることを要しないが、測定系に悪影響を与えない限り、カチオン、アニオン、ノニオン、両性のいずれでも用いることができる。なかでも、ノニオン性界面活性剤が好ましい。例えば、
式：Ｒ−Ｏ‐（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）ｎ−Ｈ
（式中、Ｒは炭素数８〜２２のアルキル又はアルキレン基、ｎは２５〜３５の整数である）
で表されるポリオキシエチレンアルキルエーテル型（具体的には、Ｃ１２Ｈ２５−Ｏ‐（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３０−Ｈ、Ｃ１８Ｈ３５−Ｏ‐（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３０−Ｈ、Ｃ８Ｈ１７−Ｏ‐（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３０−Ｈ、Ｃ２２Ｈ４５−Ｏ‐（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３０−Ｈ等特開平８−１２２３２７号公報参照）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型（炭素数９〜２０のアルキル基、オキシエチレンの付加モル数が２０〜６０である、具体的には、ニッサンノニオンＮＳ−２４０（登録商標）、特公平８−３３３８８号公報参照）、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル型（炭素数１６以上のアルキル基、オキシエチレンの付加モル数が１５〜４０である、花王（株）社製のレオドールＴＷ−０１２０（登録商標）、特公平７−８２０１０号公報参照）、
式：ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−［（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ］−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
（式中、ｓ及びｍは、同一又は異なって、３９〜７７である）
で表される末端にヒドロキシ基を有するポリオール共重合体（具体的には、ＢＡＳＦワイアンドッテ社製プルロニックＰ−１０５、Ｐ−８４、Ｐ−８５、Ｐ−８７、Ｐ−７５等、例えば、特開昭６２−８７２３３号公報参照）、ＭＥＧＡ−８、シュクロースモノカプレート、デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ等が好ましい。界面活性剤は、例えば、５〜５０００ｍｇ／ｌ程度、好ましくは１００〜３０００ｍｇ／ｌ程度で用いることができる。
【０００９】
キレート剤は、測定用試料中に出現する無晶性塩類（例えば、リン酸アンモニウム・マグネシウム、炭酸カルシウム）を溶解したり、抗酸化の目的で使用され、例えば、ＥＤＴＡ塩、ＣｙＤＴＡ、ＤＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＥＤＤＡ、ＥＤＤＰ、ＧＥＤＴＡ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＥＤＤＰＯ等が挙げられる。濃度は、０．０５〜５Ｗ／Ｗ％程度の範囲が挙げられる。
防黴／防菌剤は、特に制限されるものではなく、例えば、トリアジン系抗菌剤、ＢＩＴ（ベンズイソチアゾロン）のようなチアゾール系抗菌剤、ＰＴＯ（ピリチオン）、１−ヒドロキシピリジン−２−チオナトリウムのようなピリジン系抗菌剤、２−フェノキシエタノールなどが使用可能である。これらの剤は、測定系に悪影響を与えない濃度で添加することが必要である。
有機溶媒としては、水溶性有機溶媒が適当であり、例えば、低級アルカノール、低級アルキレングリコールまたは低級アルキレングリコールモノ低級アルキルエーテルが挙げられる。具体的には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテルなどを使用することができる。なかでもエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコールが好ましく、測定試料中の細胞への影響や粘性などを考慮するとエチレングリコールがもっとも好ましい。
【００１０】
本発明においては、シース液は、シース液を構成する各成分の種類及び／又は使用濃度を変化させることにより、屈折率を調整することができる。例えば、塩化ナトリウムを用いる場合には、シース液の屈折率を０．００１上昇させるのに約６．２ｇ／リットル、エチレングリコールを用いる場合には約１１ｇ／リットル添加することができる。また共存させる試薬の種類例えば、緩衝剤や抗菌剤の種類によって、組成に合わせて適宜調整することが好ましい。したがって、測定用試料に含まれる細胞や粒子、その他の成分を考慮して、これらに悪影響を与えない成分を単独又は組み合わせて、適当な濃度で用いることができる。
【００１１】
本発明のシース液は、ナトリウムＤ線（λ＝５８９．３ｎｍ）の波長における屈折率が、好ましくは、２５℃での測定用試料の屈折率と同等に設定される。ここで同等とは、測定用試料の屈折率の±０．５％の範囲、好ましくは±０．３％の範囲の屈折率を有することを意味する。
また、測定用試料とは、特に限定されるものではなく、いわゆる生物学的試料であることが適当であり、具体的には、尿のほか、血液、髄液等が挙げられる。測定用試料は、２５℃でのナトリウムＤ線の波長における屈折率が１．３３４０以上であることが適当であり、１．３３８０〜１．３４５０の範囲であることがより適切であり、さらに１．３４００〜１．３４２０程度であることがより好ましい。なかでも、本発明のシース液は、尿の分析に有用であり、尿を測定用試料とする場合には、１．３３８０〜１．３４５０の範囲であることが好ましい。
【００１２】
さらに、本発明においては、ナトリウムＤ線の波長における屈折率に基づくものであるが、５００ｎｍ程度以上、さらに５００〜８００ｎｍ程度の範囲の波長の光を光源（Ｈｅ−Ｎｅレーザー、赤色半導体レーザーなど）として用いるフローサイトメータに適用する場合に、その波長における屈折率を、測定用試料とシース液とで同等としてもよい。また、シース液の屈折率は２５℃における測定用試料の屈折率と同等であるとしているが、測定用試料の種類、測定用試料中での反応等を考慮して、シース液と測定用試料とをフローセルに流すときの温度、例えば、２５℃〜４５℃程度における屈折率を同等としてもよい。
【００１３】
本発明において、測定用試料中に含まれる粒子を、フローサイトメータを用いて分析する方法としては、一般に、図１に示すフローサイトメータを用いる方法が挙げられる。まず、弁１及び２を所定時間開けることにより、廃液チャンバからの陰圧により、吸引ノズル３から試料が弁１及び２間に満たされる。次いで、弁１及び２を閉じ、シリンジ４が液を押し出すことにより、試料用ノズル６から試料が吐出されると同時に、弁８を開けることにより、シース液チャンバ９から、フローセル５のチャンバ７にシース液が供給される。これによって試料はチャンバ７の内径にしたがって細く絞られ、シースフローを形成し、オリフィス１１を通過する。オリフィス１１は、内径の一辺が１００〜３００μｍ程度の角柱形状をし、光学硝子（石英硝子も含む）によって形成されている。このようにシースフローを形成することによって粒子を１個ずつオリフィス１１の中心を一列に整列して流すことができる。オリフィス１１を通過した試料は、シース液とともにチャンバ７に設けた回収管１４を通って排出される。
【００１４】
さらに、オリフィス１１のほぼ中心のサンプル流２６へ、レーザー１７から発振したレーザー光がコンデンサレンズ１８で楕円状、つまり、試料の流れの方向には血球粒子径と同程度、例えば１０μｍ前後と狭く、試料の流れ方向及び照射光軸方向と直交する方向の形状は、血球粒子径より十分広く、例えば１５０〜３００μｍ程度に絞られて照射される。サンプル流２６に照射されたレーザー光で細胞（有形物）に当たらずそのままフローセル５を透過した透過光はビームストッパ１９で遮光される。細胞（有形物）に照射され、狭い角度で発せられる前方散乱光はコレクターレンズ２０により集光され、遮光板３０のピンホール２１を通過する。そして、ダイクロイックミラー２２に到達する。散乱光はダイクロイックミラー２２で反射され、フォトダイオード３１で受光されて電気信号２８に変換されて出力される。
そして、これらの出力が分析器に入力され、これらの値に基づいて、表示装置に前方散乱光によるスキャッタグラムが表示され、細胞又は粒子を計数することができる。
【００１５】
本発明のシース液は、散乱光、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光を測定する場合に有用である。散乱光としては、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好ましくは、前方散乱光に特に有用である。
なお、本発明では、例えば、測定用試料中に含まれる粒子の周囲を包囲してフローサイトメータの細管中を通過させるためのシース液を、測定用試料の２５℃でのナトリウムＤ線の波長における屈折率とほぼ同等に設定することからなる粒子分析装置用シース液の調製方法としてもよく、さらに、測定用試料中に含まれる粒子を、フローサイトメータにより分析する際に、粒子の周囲を、測定用試料の２５℃でのナトリウムＤ線の波長における屈折率とほぼ同等の屈折率を有するシース液で包囲して、フローサイトメータの細管中を通過させることからなる粒子分析方法としてもよい。また、別の観点から、測定用試料中に含まれる粒子を、フローサイトメータにより分析するためにこの粒子の周囲を包囲して細管中を通過させるシース液であって、このシース液のナトリウムＤ線の波長における屈折率が、２５℃での測定用試料の屈折率とほぼ同等である粒子分析装置用シース液としてもよい。
以下に、本発明の粒子分析装置用シース液の実施例を詳細に説明する。
フローサイトメータを用いて分析するための測定用試料として、０．２２μｍフィルターでろ過して粒子成分を除去した尿サンプルを用いるために、以下の組成のシース液１及び２を調製した。なお、尿サンプルは、２５℃でのナトリウムＤ線の波長での屈折率は１．３４１９であった。
【００１６】
【表１】
2004003978.tif 000002
【表２】
2004003978.tif 000003
また、比較のために、従来品として、特公平７−８２０１０号公報記載のシース液を調製した。
このシース液の物性を測定したところ、ｎＤが１．３３５、ｐＨが７．２であった。
【００１７】
シース液１と比較用のシース液とを、６３３ｎｍの波長を有する光源を搭載したフローサイトメータに用いて、尿サンプルの前方散乱光を測定した。
その結果を図２（ａ）及び図３（ａ）に示す。
図２（ａ）によれば、シース液１の屈折率を尿サンプルの屈折率とほぼ同等としたことから、前方散乱光信号のベースラインのゆらぎが抑制された。この結果、図２（ｂ）に示したスキャッタグラムのように、尿サンプルにおける擬似成分のカウントを抑制することができ、正確な尿サンプルの分析を行うことが可能になった。
一方、従来のシース液では、尿サンプルの屈折率との差異により、図３（ａ）に示したように、前方散乱光信号のベースラインに大きなゆらぎが生じた。この結果、図３（ｂ）に示したスキャタグラムのように、尿サンプルにおいて擬似成分が多数カウントされた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のシース液を好適に使用することができる粒子分析装置の概略模式図である。
【図２】（ａ）本発明の粒子分析装置用シース液１を用いて前方散乱光信号を測定した場合のベースラインを示すグラフ、（ｂ）本発明のシース液１を用いて前方散乱光を測定した場合のスキャッタグラムである。
【図３】（ａ）従来の粒子分析装置用シース液を用いて前方散乱光信号を測定した場合のベースラインを示すグラフ、（ｂ）従来のシース液を用いて前方散乱光を測定した場合のスキャッタグラムである。
【符号の説明】
１、２、８　弁
３　吸引ノズル
４　シリンジ
５　フローセル
６　試料用ノズル
７、２５　チャンバ
９　シース液チャンバ
１１　オリフィス
１４　回収管
１７　レーザー
１８　コンデンサレンズ
１９　ビームストッパ
２０　コレクターレンズ
２１　ピンホール
２２　ダイクロイックミラー
２６　サンプル流
２８　電気信号
３０　遮光板
３１　フォトダイオード
【図１】
2004003978.tif 000004
【図２】
2004003978.tif 000005
【図３】
2004003978.tif 000006