(57)【要約】【課題】生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを得ることにある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、バックグランドとのコントラストが高く、吸着・結合等の測定が容易に行えるバイオチップを得る。【解決手段】金属結合性官能基と、炭素数８以下のヘテロ原子を含まないアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が表面に結合しているバイオチップ。上記分子中の高分子部は末端がヒドロキシ基あるいはメトキシ基で分子量が１，０００以上のポリエチレングリコールであることが好ましく、金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基であることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属結合性官能基と、炭素数８以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が表面に結合していることを特徴とするバイオチップ
【請求項２】
親水性高分子部の末端がヒドロキシ基あるいはメトキシ基であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ
【請求項３】
親水性高分子部の分子量が１，０００以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ
【請求項４】
親水性高分子部がポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載のバイオチップ
【請求項５】
金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載のバイオチップ
【請求項６】
チップ表面が金であることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載のバイオチップ
【請求項７】
チップの基板が透明基板であることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載のバイオチップ
【請求項８】
チップが表面プラズモン共鳴で測定されるものであることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載のバイオチップ
【請求項９】
チップが表面プラズモン共鳴イメージングで測定されるものであることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載のバイオチップ
【請求項１０】
チップ上が生体分子を固定化する部分（固定化部）と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、金属結合性官能基と、炭素数８以下のヘテロ原子を含まないアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が固定化されていることを特徴とする請求項１〜９いずれか記載のバイオチップ
【請求項１１】
チップが金で被覆された水晶発振子である請求項１〜６いずれか記載のバイオチップ
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体分子の非特異的吸着を抑制したバイオチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生体分子の相互作用解析、発現分子のプロファイリング、もしくは診断に用いるバイオチップが注目を集めている。基板上に生体分子が固定化されることで操作が容易になり、場合によっては非常に多くの物質の相互作用を解析することができる。
チップ基板には生体分子だけではなく、親水性物質が固定化される方法が発明されている。たとえば特許文献１には区画された部位にＤＮＡが、その他の部分にポリエチレングリコールが固定化されたバイオチップアレイが示されている（特許文献１参照）。ＤＮＡが固定化されていない部位への非特異的吸着を抑制し、ＤＮＡハイブリダイゼーション、さらには蛋白との相互作用の解析に成功している。しかし、この方法では一旦保護基を全面に固定化した後に紫外線照射により区画化、ＤＮＡを固定化した後に周囲部の保護基を外し、反応性官能基であるスクシンイミド基を有するポリエチレングリコールを固定化する。よってチップ作製は非常に煩雑であり、多くのステップが必要である。
【０００３】
また、非特許文献１には、ビオチン末端の物質とポリエチレングリコールが混合されて表面に固定化する手法が示されている（非特許文献１参照）。この方法によりビオチンが表面に効率よく導入されるだけでなく、非特異吸着を抑制すると予想される。この発明に用いられたポリエチレングリコールは炭素数１１のアルキル鎖、末端に金属結合性官能基であるチオール基が設けられている。しかし、このような化合物は疎水性部のアルキル鎖と親水性部のポリエチレングリコール鎖を有するため、合成は困難である。場合によってはミセルを形成し、バイオチップ表面への結合を制御するのが難しい場合がある
よって、容易にかつ安価に非特異的吸着を抑制されたバイオチップが求められている。
【０００４】
【特許文献１】
米国特許６１２７１２９号明細書
【非特許文献１】
Ｊｕｎｇ  ｅｔ．ａｌ．  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １６（２０００）９４２１−９４３２
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、生体分子の非特異的吸着を抑制するバイオチップを得ることにある。特に表面プラズモンイメージング測定に用いた際に、バックグランドとのコントラストが高く、吸着・結合等の測定が容易に行えるバイオチップを得ることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．金属結合性官能基と、炭素数８以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が表面に結合しているバイオチップ
２．アルキル部の炭素数が４以下である１記載のバイオチップ
３．アルキル部の炭素数が２である１乃至２記載のバイオチップ
４．親水性高分子部の末端がヒドロキシ基あるいはメトキシ基である１〜３いずれか記載のバイオチップ
５．親水性高分子部の分子量が１，０００以上である１〜４いずれか記載のバイオチップ
６．親水性高分子部がポリエチレングリコールである１〜５いずれか記載のバイオチップ
７．金属結合性官能基がチオール基あるいはジスルフィド基である１〜６いずれか記載のバイオチップ
８．チップ表面が金である１〜７いずれか記載のバイオチップ
９．チップが金で被覆された透明基板である１〜８いずれか記載のバイオチップ
１０．チップが表面プラズモン共鳴で測定される１〜９いずれか記載のバイオチップ
１１．チップが表面プラズモン共鳴イメージングで測定される１〜１０いずれか記載のバイオチップ
１２．チップ上が生体分子を固定化する部分（固定化部）と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、金属結合性官能基と、炭素数８以下アルキル部と、親水性高分子部から成る分子が固定化されている１〜１１いずれか記載のバイオチップ
１３．チップが金で被覆された水晶発振子である１〜８いずれか記載のバイオチップ
【０００７】
本発明のバイオチップは、金属結合性官能基と、炭素数８以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子（以下親水性化合物と表すことがある）が表面に結合している。バイオチップ表面に結合される当該親水性化合物は、Ｘ−Ｒ１−Ｒ２、もしくはＲ２−Ｒ１−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２の化合式で表されることが好ましい。ここで、Ｘは表面の金属に結合するための官能基、Ｒ１はアルキル鎖でヘテロ原子を含まないものであり、Ｒ２は親水性高分子鎖である。この親水性化合物は、Ｘによりバイオチップ表面に固定化され、Ｒ２の親水性高分子により、チップ表面への非特異的吸着を抑制する。
【０００８】
この親水性化合物は区画が分けられてスポットの周囲部のみに固定化される、もしくは他の物質と混合され、チップ全面にわたって固定化される、またはその両方の手段を併用するかは特に限定されるものではない。
【０００９】
本発明において、チップの基板は金属であり、特に金属の薄層であることが好ましい。該親水性化合物の化合式のＸは金属に直接結合、吸着することのできる官能基である。Ｒ１のアルキル鎖は炭素数８以下であることが好ましい。８以下の場合、分子全体に対するアルキル鎖の疎水性が大きな問題とならず、合成が容易となる。８以下でも表面に結合し、表面の親水性を保持するには十分である。
炭素数４以下の場合がさらに好ましく、炭素数２の場合が最も好ましい。
親水性高分子の末端は非特異的吸着を抑制するため反応性が低いことが求められる。末端の官能基としては低反応性かつ非イオン性の点でヒドロキシ基あるいはメトキシ基が好ましい。
【００１０】
親水性高分子の分子量は１０００以上であることが好ましい。１０００未満である場合、バイオチップ表面が十分に親水性でなく、非特異吸着を抑制することができない場合があるからである。親水性高分子の分子量の上限は特に定めるものではないが、分子量が２００００を越えると、溶液の粘性が上昇し、高分子が絡み合ったまま表面に固定化されることがある。共有結合で固定化されていない高分子が徐々に脱離するために、センサーのベースラインが変化することがあり、好ましくない場合がある。
【００１１】
親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、カルボン酸もしくはその塩やスルホン酸もしくはその塩を含有するモノマーまたはポリエチレングリコール等の親水性部分を共重合させたポリエステルやポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、さらにはキトサン、カラギーナン、グルコマンナンなどの多糖類が挙げられる。
これらの中でも、ポリエチレングリコール、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリビニルピロリドン等のＯＨ基、カルボン酸やその塩、アミン、イミンなど反応性を有する部分を持たないものが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは親水性が高く、反応性の有する官能基がないため非特異吸着を抑制する効果が高い。なお、これら親水性高分子は高分子とＲ１とが結合する部分を含んでいても良い。
【００１２】
バイオチップ表面に結合される化合物Ｘ−Ｒ１−Ｒ２もしくはＲ２−Ｒ１−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２において、表面の金属に結合するための官能基Ｘはチオール基もしくはジスルフィド基であることが好ましい。Ｘがチオール基の場合はＸ−Ｒ１−Ｒ２の形をとり、Ｘがジスルフィド基の場合はＲ２−Ｒ１−Ｘ−Ｒ１−Ｒ２の形をとる。これらの官能基は金属、特に金基板への吸着結合に最適であり、バイオチップ基板は金であることが好ましい。
【００１３】
バイオチップの検出方法としては表面プラズモン共鳴法もしくは水晶発振子法が好ましい。いずれも生体分子を放射線同位体や蛍光分子でラベルする必要がなく、物質間の相互作用をリアルタイムに評価することができる。
【００１４】
表面プラズモン共鳴法による分析に供されるためには、本発明のバイオチップは金で被覆された透明基板であることが好ましい。
特に表面プラズモン共鳴イメージング法は、バイオチップ表面に複数の物質を固定化したアレイを作製し、同時に複数の物質の相互作用を観察することができるため好ましい。
【００１５】
バイオチップは生体分子を固定化する部分（固定化部）と、生体分子を固定化しないバックグラウンド部に区画化されており、バックグラウンド部に、金属結合性官能基と、炭素数８以下のアルキル部と、親水性高分子部から成る分子が固定化されていることが好ましい。バックグラウンド部に非特異的吸着を抑制する親水性高分子を固定化することで、固定化部とバックグラウンド部のシグナルの変化が明確となり、バイオチップとして非常に好ましい。
【００１６】
基板上に親水性化合物を固定化する方法としては、コート法が好ましく、スプレーコート、ディッピング、ローラーコート、ナイフコート（ブレードコート）等、公知のコート法を用いることができる。
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１７】
［実施例］
（ステップ１）
アルキル鎖の炭素数が２であり、末端の官能基がチオール基であるＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭの濃度で７ｍｌのエタノール：水＝６：１の混合溶液に溶解させた。ＰＥＧチオールの分子量は５０００であり、親水性が非常に高い。また、ＰＥＧの末端はメトキシ基であり、反応性をほとんど有さない。
【００１８】
１８ｍｍ四方、１ｍｍ厚のＬａｋ１０ガラススライドにクロムを３ｎｍ蒸着し、金を４５ｎｍ蒸着した金蒸着スライドを、上記ＰＥＧチオール溶液に３時間浸漬させ、金基板全体にＰＥＧチオールを結合させた。
【００１９】
（ステップ２）
このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、固定化部のＰＥＧチオールを除去した。
【００２０】
（ステップ３）
次に１１−アミノ−１−ウンデカンチオール・ハイドロクロライド（１１−ＡＵＴ：同仁化学研究所）の１ｍＭ溶液中にスライドを２時間浸漬し、固定化部にアミノ基を導入した。
【００２１】
（ステップ４）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とマレイミド基を有する分子量３４００のＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社製）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で固定化部に１時間反応させ、マレイミド基を導入した。
【００２２】
（ステップ５）
ここに４種類の５’チオール末端ＤＮＡ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）を１ｍＭの濃度（リン酸緩衝液）に調製し、１５時間反応させて固定化した。４種類のチオール末端ＤＮＡのシーケンスを下に示す。５’末端にチオール基を有し、Ｔが１５塩基スペーサーとして入っている配列になっている。
【００２３】
４種類のチオール末端ＤＮＡのシーケンス
Ａ：５’ＨＳ−（Ｔ）１５−ＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＴＴＡＴＣＴＧＣＴ  ３’
Ｂ：５’ＨＳ−（Ｔ）１５−ＣＧＧＣＡＡＣＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＴＣＣＣ  ３’
Ｃ：５’ＨＳ−（Ｔ）１５−ＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡ  ３’
Ｄ：５’ＨＳ−（Ｔ）１５−ＣＡＡＴＧＡＧＴＣＡＴＴＧ  ３’
【００２４】
このように５つのステップで簡易にＤＮＡアレイを作製することができた。こうして得られたＤＮＡアレイを表面プラズモン共鳴イメージング装置（ＧＷＣ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）にセットし、リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を注入した。そして、４種類のＤＮＡ（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）のＴが１５塩基続くスペーサー部を除いた相補的ＤＮＡを１μＭでリン酸緩衝液に溶解した液を順に流し、それぞれをハイブリダイゼーションさせた。そのＳＰＲシグナルを図３に示す。それぞれの部位のシグナルが増大し、ハイブリダイゼーションがおこったことを示している。このときのバックグラウンド部にはほとんど吸着しておらず、非特異的吸着がないことを示している。
このように非特異的吸着が抑制されたバイオチップを容易に得ることができた。
【００２５】
［比較例］
（ステップ１）
１１−ＡＵＴの１ｍＭ溶液に金蒸着ガラススライドを３時間浸漬し、表面にアミノ基を導入した。
【００２６】
（ステップ２）
Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ社製）０．５ｍｇをＤＭＳＯ２００μｌに溶解させ、リン酸緩衝液３００μｌを加え、ガラススライドに２時間反応させた。
【００２７】
（ステップ３）
このスライドの上に図１に示すフォトマスクを載せ、５００Ｗ超高圧水銀ランプ（ウシオ電機製）で２時間照射し、固定化部のＰＥＧチオールを除去した。
【００２８】
（ステップ４）
次に１１−ＡＵＴの１ｍＭ溶液中にスライドを２時間浸漬し、固定化部にアミノ基を導入した。
【００２９】
（ステップ５）
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とマレイミド基を有する分子量３４００のＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社製）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度で固定化部に１時間反応させ、マレイミド基を導入した。
【００３０】
（ステップ６）
ここに三種類の５’チオール末端ＤＮＡを１ｍＭの濃度（リン酸緩衝液）に調製し、１５時間反応させて固定化した。
【００３１】
（ステップ７）
Ｔｒｉｓ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ  ０．０９ｍｌ、ジメチルホルムアミド０．５１ｍｌの混合溶液に５分浸漬する工程を二回繰り返し、Ｆｍｏｃを除去した
【００３２】
（ステップ８）
片末端にスクシンイミド基を有する分子量２０００のＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）を反応させ、バックグラウンド部にＰＥＧを固定化する
こうしてバックグラウンド部にＰＥＧを有するＤＮＡアレイを得るのに８ステップが必要であり、アレイの作製は煩雑である。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、非特異的吸着が抑制されたバイオチップを簡便に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例、比較例で使用したフォトマスク
【図２】ハイブリダイゼーションによるＳＰＲシグナルの変化
【図１】
2004279204.tif 000002
【図２】
2004279204.tif 000003