(57)【要約】【課題】統合失調症およびアルツハイマー病の検査薬の提供。【解決手段】抗ミッドカイン抗体を有効成分とする統合失調症およびアルツハイマー病の診断薬であって、該抗体を用いて血液、唾液、尿などのヒトサンプル中のミッドカイン濃度を測定することによって、統合失調症およびアルツハイマー病が診断される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ミッドカインを主成分とすることを特徴とする統合失調症およびアルツハイマー病の検査薬。
【請求項２】
患者の血液、唾液、尿などのサンプル中のミッドカイン濃度を測定する請求項１記載の統合失調症およびアルツハイマー病の検査薬
【請求項３】
抗ミッドカインおよび標識化抗ミッドカイン抗体からなる請求項１または２記載の統合失調症およびアルツハイマー病の検査薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、統合失調症およびアルツハイマー病の検査薬に属する。さらに詳しくは抗ミッドカイン抗体を主成分とすることを特徴とする統合失調症およびアルツハイマー病の検査薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
統合失調症は、人口の約１％の割合で起こり、思春期から２０代の若い時期に発症する。症状としては、幻覚、妄想などの陽性症状、感情鈍麻、意欲減退、社会的引きこもりなどの陰性症状、および認知機能障害などがある。病態の特殊性から早期診断、治療、社会復帰活動、再発予防といった包括的な治療体系の確立が望まれている。統合失調症の治療には、薬物治療が不可欠であり、フェノチアジン系化合物、ブチロフェノン系化合物、ベンズアミド系化合物、イミノジベンジル系化合物、チエピン系化合物、インドール系化合物およびセロトニン・ドーパミン受容体遮断薬などが投与されている。
統合失調症の病態には、遺伝的要因および環境要因が関与していることが知られており、発達段階における障害、いわゆる「統合失調症の発達障害仮説」が提唱されている。現在のところ、統合失調症を診断する生物学的マーカーは報告されていない。血液や尿などの患者のサンプルを用いた研究が数多く行なわれてきたが、未だに確立されたものは無い。
一方、現在日本では１５０万人，米国では４００万人がアルツハイマー病を発病していると推定される。この数は，先進国を中心とした高齢者人口の拡大によって増加し，２５年後には，世界全体で約２２００万人の人々がこの病気で苦しむことになるという予測もある。アルツハイマー病は長い間，原因不明の病気とされてきた。現在でも，有効な予防法や治療法はわかっていない。しかし，疫学や遺伝学，分子生物学など，さまざまな分野での研究成果がつながることで，発症メカニズムが解明されつつある。血液や尿などの患者のサンプルを用いた研究が数多く行なわれてきたが、未だに確立されたものは無い。このように、現在のところアルツハイマーを診断する生物学的マーカーは報告されていない。
ところでミッドカインは、塩基性の低分子量蛋白質で、細胞の増殖、生存、移動を促進するなど多彩の活性を有している（村松喬；蛋白質・核酸・酵素，４７：１２５９−１２６７，２００２年）。ミッドカインの発現は中期胚で強く、生体では弱い。また癌化に伴い、そして組織障害の修復過程でミッドカインの強い発現増強が起こることが知られている。アルツハイマー病の患者の脳内では老人斑と呼ばれる病理学的特徴が観察され、アミロイドβを中心としたペプチドが沈着していると考えられている。アルツハイマー病の脳の老人斑にミッドカインが沈着していることが報告されている（Ｙａｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９２：２４６−２５１，１９９３）。最近、ミッドカインはアミロイドβと強く結合することが報告され（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ２５４：１２５−１２８，１９９８）、アルツハイマー病の病態においてミッドカインが重要な役割を果たしていることが示唆されている。
一方、統合失調症やアルツハイマー病などの精神神経疾患の患者の血液等のサンプル中のミッドカイン濃度を測定した報告はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
統合失調症やアルツハイマー病による入院患者は日本の病院の総ベッド数のかなりの割合を占め、医療経済という点からも問題は大きい。医療の現場から統合失調症やアルツハイマー病の早期に診断するような検査薬および検査方法の開発が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、統合失調症やアルツハイマー病患者の血液中ミッドカイン濃度が、健常者のそれと比較して有意に増加していることを見出し、本発明にかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００５】
すなわち、本発明は；
１．抗ミッドカイン抗体を主成分とすることを特徴とする統合失調症やアルツハイマー病の検査薬；
２．患者の血液中のミッドカイン濃度を測定する上記１に記載の統合失調症やアルツハイマー病の検査薬；
３．抗ミッドカイン抗体および標識化抗ミッドカイン抗体を含む上記１または２に記載の統合失調症やアルツハイマー病の検査薬；
４．抗ミッドカイン抗体を主成分とすることを特徴とする統合失調症やアルツハイマー病の診断キット；
５．患者の血液中のミッドカイン濃度を測定するための上記４に記載の統合失調症やアルツハイマー病の検査用キット；
６．抗ミッドカイン抗体および標識化抗ミッドカイン抗体を含む上記４または５に記載の統合失調症やアルツハイマー病の検査キット；
７．抗ミッドカイン抗体を用いることを特徴とする統合失調症やアルツハイマー病の検査用キット；
８．抗ミッドカイン抗体を用いることを特徴とする統合失調症やアルツハイマー病の治療薬の検定方法；
９．動物の血液中のミッドカイン濃度を測定する上記７に記載の統合失調症やアルツハイマー病の検定方法；
１０．抗ミッドカイン抗体および標識化抗ミッドカイン抗体を含む上記８または９に記載の統合失調症やアルツハイマー病の治療薬の検定方法；
１１．統合失調症やアルツハイマー病の治療薬としてのミッドカインを減少させる化合物；等に関する。
以下、本明細書における用語の意味あるいは定義について述べる。「抗ミッドカイン抗体」とは、ミッドカインを抗原として用いて精製された抗体をいう。該抗体は、ミッドカインに結合する能力があればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を含む。また好ましいものとしては、特異的にミッドカインに結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げられる。
「標識化抗ミッドカイン抗体」とは、ミッドカイン抗体をペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等の酵素、デルフィニウム等の蛍光標識、放射性同位元素標識または同位元素標識、ビオチン等を結合させ、ミッドカインを定量化できるように工夫された抗体をいう。更に、「標識化抗ミッドカイン抗体」には、ビオチン、２、４−ジニトロフェノール等で修飾した抗ミッドカイン抗体も含まれる。この際には、該標識化抗ミッドカイン抗体に標識化したアビジン、標識化抗２、４−ジニトロフェノール抗体を更に用いて定量化できる。
「統合失調症」とは、主として思春期、青年期に発症し、自我障害、思考障害を根幹に持ち、幻覚・妄想などの陽性症状を繰り返すことにより、しだいに重篤化していく慢性疾患である。「アルツハイマー病」とは、一般には６０歳以上で発病し、老年期痴呆とよばれるもので認知機能障害を中軸に進行し、しだいに重篤化していく慢性の神経変性疾患である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明による統合失調症やアルツハイマー病の診断は、例えば次のようにして行なうことが出来る。ヒトの血液から血清を調製し、血清中のミッドカインの量を種々の方法により定量する。望ましくはミッドカインに対して特異性の高い抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによってミッドカインを検出・定量する。統合失調症やアルツハイマー病患者の血清中ミッドカインの濃度が、健常者の値より有意に高いことを利用し、統合失調症やアルツハイマー病を診断する。
具体的な血清中のミッドカインを測定する方法としては、例えば
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セファロース等の固相に抗ミッドカイン抗体を固定する工程；
２．診断する患者の血清を固相に加える、または接触させる工程；
３．固相を洗浄する工程；
４．標識化された抗ミッドカイン抗体を加える、または接触させる工程；
５．該標識を用いて、ミッドカインの量を測定する工程からなる方法等が挙げられる。
更に、具体的な血清中のミッドカインを測定する方法としては、例えば、
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セファロース等の固相に抗ミッドカイン抗体を固定する工程；
２．診断する患者の血清を固相に加える、または接触させる工程；
３．固相を洗浄する工程；
４．ビオチンまたは２、４−ジニトロフェノールで修飾した抗ミッドカイン抗体を加える、または接触させる工程；
５．標識化アビジンまたは標識化２、４−ジニトロフェノール抗体を加える、または接触させる工程；
６．該標識を用いて、ミッドカインの量を測定する工程からなる方法等が挙げられる。
更に、具体的な血液中のミッドカインを測定する方法としては、例えば、
１．ポリスチレン、ナイロン、ガラス、シリコンラバー、セファロース等の固相に抗ミッドカイン抗体を固定する工程；
２．診断する患者の血液を固相に加える、または接触させる工程；
３．固相を洗浄する工程；
４．ビオチンで修飾した抗ミッドカイン抗体を加える、または接触させる工程；
５．標識化アビジンを加える、または接触させる工程；
６．該標識を用いて、ミッドカインの量を測定する工程からなる方法；からなる方法等が挙げられる。固相の形状として小球、ウェル、試験管等が挙げられる。
抗原またはＥＬＩＳＡのスタンダードとして用いられるミッドカインは市販されているか、または以下の方法で調製することができる。遺伝子工学的手法を用いる場合、ミッドカインをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適切な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換の培養上清から目的とする組換えミッドカインを得ることができ、均質な多量のミッドカインの生産に好適である。上記宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、植物または動物細胞を用いることができる。
抗ミッドカイン抗体は、ミッドカインを抗原として、ウサギ、ニワトオリ、シチメンチョウなどに免疫することにより、調製される。標識化抗ミッドカイン抗体は、抗ミッドカイン抗体をビオチン化試薬や架橋剤付きペルオキシダーゼの市販されているキットを用いて、反応させ、調整することができる。
本発明方法は、また統合失調症やアルツハイマー病の治療薬の判定にも有用である。すなわち、ミッドカインを減少させる作用を有する化合物は、統合失調症やアルツハイマー病の治療薬として有用である可能性がある。また、ミッドカインの量が高いモデル動物（マウスやラットなど）は、統合失調症やアルツハイマー病のモデルとしても有用である。従って、この検定方法を利用することにより、新しい統合失調症やアルツハイマー病の治療薬のスクリーニングも行なうことが可能である。このような方法で見出される治療薬には、非経口的または経口的に投与できる薬物が含まれ得る。その治療薬の正確な投与量および投与計画は、個々の治療対象毎の所要量、治療方法、疾病または必要性の程度、および、当然医師の判断によることが必要である。非経口的投与する場合の投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、例えば注射剤として皮下または静脈に投与する場合、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲から投与量が選択され、例えば噴霧剤として気管に投与する場合、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．１ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲から投与量が選択される。投与計画としては、連日投与または間欠投与またはその組み合わせがある。経口的投与する場合の投与量、投与回数は症状、年齢、体重、投与形態等によって異なるが、例えば、成人の患者の体重１ｋｇ、一日当たり約０．５ｍｇ〜約２５００ｍｇの範囲、好ましくは約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲から投与量が選択される。
本発明の方法で得られる統合失調症やアルツハイマー病の治療薬を薬学的に許容しうる非毒性の担体と混和することから成る医薬組成物を製造することができる。このような組成物を、非経口投与用（皮下注射、筋肉注射、または静脈注射）に調製する場合は、特に溶液剤形または懸濁剤形がよく、膣または直腸投与用の場合は、特にクリームまたは坐薬のような半固形型剤形がよく、経鼻腔投与用の場合、特に粉末、鼻用滴剤、またはエアロゾル剤形がよい。
組成物は一回量投与剤形で投与することができ、また例えばレミントンの製薬科学（マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡ、１９７０年）に記載されているような製薬技術上良く知られているいずれかの方法によって調製できる。注射用製剤は医薬担体として、例えば、アルブミン等の血漿由来蛋白、グリシン等のアミノ酸、マンニトール等の糖を加えることができる。注射剤形で用いる場合には更に緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を添加することもできる。また、水溶製剤、凍結乾燥製剤として使用する場合、凝集を防ぐためにＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）などの界面活性剤を添加するのが好ましい。また注射剤以外の非経口投与剤形は、蒸留水または生理食塩液、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、植物起源の油、水素化したナフタレン等を含有してもよい。例えば坐薬のような膣または直腸投与用の製剤は、一般的な賦形剤として例えばポリアキレングリコール、ワセリン、カカオ油脂等を含有する。膣用製剤では、胆汁塩、エチレンジアミン塩、クエン酸塩等の吸収促進剤を含有しても良い。吸入用製剤は固体でも良く、賦形剤として例えばラクトースを含有してもよく、また経鼻腔滴剤は水または油溶液であってもよい。
【０００７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明する。ヒトより血液を採取した後、通常の方法で血清を得る。我々が開発した高感度ミッドカイン測定方法（Ｈ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１７１−１１７５，１９９６）を用いて測定した。統合失調症群と健常者群において、年齢及び性差はマッチングさせた
【０００８】
（実施例１）  アフィニティー精製したウサギの抗ミッドカイン抗体１μｇを５０μｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衡液（ｐＨ８．０）に溶解し、９６穴プレート（ファルコン３９１５）に加え、３時間、室温に保った。抗体液を除き、穴をダルベッコの生理的食塩水リン酸緩衡液［ＰＢＣ（−）］で洗った。洗浄緩衡液［０．４ＭＮａＣｌ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ＮａＮ３、１ｍＭＭｇＣｌ２含有１００ｍＭトリス塩酸緩衡液（ｐＨ７．５）］を、加え、１時間待ち、洗浄洗浄緩衡液を除いた。穴にＰＢＳ（−）で２倍に希釈した血清５０μｌを加え、室温で保った。検体を除いた後で、穴を洗浄緩衡液で洗った。次にビオチン化抗ミッドカイン抗体０．７ｎｇを５０μｌの洗浄緩衡液に溶解して、穴に加え４℃で一晩保った。５ｍＵのストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼを５０μｌの洗浄緩衡液溶解して加え、１時間室温に保った。溶液を除き、穴を洗浄緩衡液で洗い、５μｌの４メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシドを５０μｌの洗浄緩衡液に溶解して加え、室温で４時間保った。２００μｇの０．１Ｍグリシン緩衡液ｐＨ１０．３を加え、遊離した４メチルウンベリフェリルをマイクロプレート蛍光リーダーを用いて定量した。
【０００９】
統合失調症群と健常者群において、ヒト血清中のミッドカインの含量をこのサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にて測定した。全ての健常者の血清中ミッドカイン濃度は、０．８ｎｇ／ｍｌ値であるので、この値をカットオフ値と設定した。統合失調症群の未治療群では１５例中４例（２７％）、治療中患者では２５例中２例（８％）がカットオフ値より高かった（図１）。健常者は３９例中すべてカットオフ以下であった。フィシッヤー検定で解析した結果、統計学的に有意であった（ｐ＝０．００３）。
次にカットオフ値以下の群についてＡＮＯＶＡ解析したところ、未治療の患者の血清中ミッドカイン濃度は、健常者の値と比較して有意（ｐ＝０．０１８，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＰＬＳＤｔｅｓｔ）に低下していることがわかった。治療中の患者の血清中ミッドカイン濃度は、健常者と未治療患者の間であった。
【００１０】
（実施例２）
アルツハイマー病群と健常者群において、ヒト血清中のミッドカインの含量を実施例１と同じサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法にて測定した。６００ｐｇ／ｍｌの値をカットオフ値と設定した。アルツハイマー病群では、３６例中１７例（４７％）がカットオフ値以上で、健常者３２例はすべてカットオフ値以下であった（図２）。フィシャッヤー検定で解析した結果、この差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。
【００１１】
以上図示し、説明したように本発明のように血清ミッドカイン値を測定する試薬は、統合失調症とアルツハイマー病の検査薬となる。
【００１２】
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の一実施例に関わる統合失調症患者および健常者の血清ミッドカイン値を比較したグラフである。
【図２】この発明の一実施例に関わるアルツハイマー病患者と健常者の血清ミッドカイン値を比較したグラフである。
【図１】
2004251865.tif 000002
【図２】
2004251865.tif 000003