(57)【要約】【課題】低温でタンパク質を発現することができる誘導型発現ベクターおよび該ベクターを用いて低温でタンパク質を発現させる方法の提供。【解決手段】約１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能な宿主細胞中で誘導発現し得る誘導型発現ベクター。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクターであって、該宿主以外の宿主の好適生育温度範囲以下の温度で発現し得る発現ベクター。
【請求項２】
宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクターであって、１５℃以下の温度で発現し得る発現ベクター。
【請求項３】
４℃で発現し得る請求項１または２記載の発現ベクター。
【請求項４】
宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌である、請求項１から３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項５】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
誘導物質がチオストレプトンである、請求項１から５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
外来遺伝子が、１５℃を超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
【請求項１１】
宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、該宿主細胞の好適生育温度範囲より低い好適生育温度範囲を有する他の宿主細胞中で誘導物質により誘導発現し得る誘導型発現ベクター。
【請求項１２】
４℃で発現し得る請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌である、請求項１１または１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、請求項１３記載の発現ベクター。
【請求項１５】
誘導物質がチオストレプトンである、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
【請求項１８】
請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
【請求項１９】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター。
【請求項２０】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、請求項１９記載の発現ベクター。
【請求項２１】
誘導物質がチオストレプトンである、請求項１９または２０記載の発現ベクター。
【請求項２２】
ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第１のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第２のプロモーター配列およびＴｉｐＡ遺伝子を含む誘導カセット、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の発現ベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌形質転換体。
【請求項２４】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
【請求項２５】
１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で誘導発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【請求項２６】
ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第１のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第２のプロモーター配列およびＴｉｐＡ遺伝子を含む誘導カセット、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、外来遺伝子を低温条件下で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で誘導発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【請求項２７】
さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域を含み、大腸菌中で複製可能な請求項２６記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【請求項２８】
ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターがＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターである請求項２６または２７に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【請求項２９】
配列番号１０６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号１０７に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号１０８に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号１０９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号１１０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号１１１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号１１２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号１１３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１からなる群から選択される請求項２６から２８のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【請求項３０】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【請求項３１】
請求項２５から３０のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌形質転換体。
【請求項３２】
外来遺伝子として１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質を低温で産生させる方法。
【請求項３３】
１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、１５℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、請求項３２記載のタンパク質を低温で産生させる方法。
【請求項３４】
１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で１５℃を超える中高温で発現させた場合に不活性な封入体を作るタンパク質である、請求項３２記載のタンパク質を低温で産生させる方法。
【請求項３５】
好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質をコードする遺伝子を含む請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質を低温で産生させる方法。
【請求項３６】
外来遺伝子を含む請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、１５℃を超える中高温条件下および低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養し、１５℃以下の低温条件下でのみ発現される遺伝子を選択することを含む、１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項３７】
１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、１５℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、請求項３６記載の１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項３８】
大腸菌に導入し１５℃を超える中高温で発現させよとした場合に、発現しないかまたは大腸菌の増殖を阻害する遺伝子を選択し、次いで該遺伝子を外来遺伝子として含む請求項２５〜３０のいずれか１項に記載のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養したときに発現しうる遺伝子を選択することを含む、１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項３９】
１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌の増殖を３０℃以上で阻害するタンパク質である、請求項３８記載のタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項４０】
１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で１５℃を超える中高温で発現させた場合に封入体を作るタンパク質である、請求項３８記載のタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項４１】
１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、１５℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、請求項３８記載の１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項４２】
請求項３６から４１のいずれか１項に記載のスクリーニングする方法により得られた１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を誘導発現し得る発現ベクターに関する。
【０００２】
また、本発明は、低温において宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現することができる誘導型発現ベクターおよび該ベクターを用いて低温で組み換えタンパク質を発現させる方法に関する。さらに、本発明は約１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で誘導発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターおよび該ベクターを含む低温条件下で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を用いて約１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害する組み換えタンパク質を低温で発現させる方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
現在、真核生物由来のタンパク質を組み換え体として大量調製するためには大腸菌を宿主とした発現システムが広く用いられている（Ｗｅｉｃｋｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　７　４９４−４９９　（１９９６）、　Ｂａｎｅｙｘ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１０４１１−４２１　（１９９９））。大腸菌は中温菌で、１８℃から３７℃で生育するが、組み換えタンパク質を発現させるための培養温度も上記温度範囲内でなければならない。しかし、真核生物由来のタンパク質がその活性を示すのもまた同じ温度範囲内であり、そのため、いくつかのタンパク質は組み換え体として大腸菌内で発現させると、大腸菌の生育を阻害してしまい、その結果、有意な量の組み換えタンパク質が得られないことがある。
【０００４】
大腸菌以外ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　（Ｃｅｒｅｇｈｉｎｏ　ａｎｄＣｒｅｇｇ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１０　４２２−４２７　（１９９９））、Ｓｆ９細胞（Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｄｅｖ．　３　９７−１０１　（１９９３））など真核細胞を宿主として用いた発現システムが知られているが、これらも培養温度が３０℃前後でないと組み換えタンパク質を効率よく発現させることが出来ず、同様の理由からその調製が困難な場合がある。例えば、組み換えタンパク質の産生に通常用いられている昆虫細胞Ｓｆ９を用いて外来タンパク質の産生を行う場合、その産生のための至適温度は約２８℃であり、最低温度は約１８℃である（Ａｇａｔｈｏｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎ．　Ｎ．Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　５８９３７２−３９８（１９９０）、Ｆａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｙｅａｓｔ　１１　１３３１−１３４４　（１９９５））。また、酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて外来タンパク質の産生を行う場合、その産生のための至適温度は約３０℃であり、最低温度は約１５℃である（Ｂｒｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｅｍｂｒ．　Ｂｉｏｌ．　１８０　１４７−１６１　（２００１）、Ｓａｒｒａｍｅｇｎａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　２４　２１２−２２０　（２００２））。すなわち、昆虫細胞Ｓｆ９の好適生育温度範囲は約１８℃以上であり、酵母の好適生育温度範囲は約１５℃以上である。またこれらを宿主とした場合、いくつかのタンパク質は糖鎖などの修飾を受けてしまい、その後の立体構造解析などの機能解析に不都合なことがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、大腸菌をはじめとする他の組み換えタンパク質発現システムで発現させることが出来ないタンパク質を発現させることを目的とする。例えば、１５℃を超える中高温条件下で大腸菌等の形質転換宿主細胞中で発現させることができないタンパク質を低温で発現させることを目的とする。
また、本発明は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を用いて外来の組み換えタンパク質を誘導発現させることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決するためには、組み換えタンパク質の活性を抑制するために、低温で発現させることが有効だと考えられる。大腸菌においては、低温誘導性プロモーターを用いた１５〜１６℃での発現システムが、最も低い温度で組み換えタンパク質を産生させた例である（特公平１０−５０３０９０、　Ｍｕｊａｃｉｃ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　２３８　３２５−３３２　（１９９９））。また、上述のように昆虫細胞や酵母でも１５℃〜１８℃での組み換えタンパク質の産生が従来知られていた最も低い温度での組み換えタンパク質の産生である。従って、従来の公知の宿主細胞を用いての組み換えタンパク質を発現させ得る最低温度である１５℃〜１８℃以下、好ましくは４℃前後で発現させることが有効であると考えられた。しかし、１５℃以下、特に４℃前後では上述の宿主細胞はいずれも生育が困難であり、タンパク質の産生も不可能であるため、約１５℃以下の低温、特に４℃前後でも生育できる細菌を宿主とした発現システムを用いれば良いと考えられる。そこで、本発明者らは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌を宿主とした、広範な温度域（４℃から３２℃前後）において、外来蛋白質を発現せしめる誘導型発現ベクターを構築することによって、かかる問題を解決しようとした。
【０００７】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（Ｌａｒｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ　７４　１３３−１５３　（１９９８））は４℃から３５℃までの広範な温度域で生育する放線菌で、同菌と大腸菌との両細胞種で自律複製可能な複合ベクター（Ｄｅ　Ｍｏｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１４３　３１３７−３１４７　（１９９７））も開発されており遺伝子工学の研究も容易である。またＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌全般でも、大腸菌との複合ベクターが開発されており（特開平５−６４５８９、特開平８−５６６６９）、外来遺伝子を構成的に発現せしめる汎用的発現ベクターも存在する（特開平１０−２４８５７８）。
【０００８】
しかし、効率よく迅速に低温でタンパク質を発現させるためには、容易に、厳密に、強力にタンパク質の発現調節が出来る誘導型発現ベクターの開発が不可欠である。すなわち、まず発現を抑制した状態で、３０℃において細胞を増殖させ、その後温度を例えば４℃に下げて発現を誘導するのである。しかし、これまでに同菌においてそのような誘導型発現ベクターの報告がなく、他種の細菌由来の発現誘導システムを流用することが有効だと考えられた。
【０００９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓと同じく放線菌の一種で、同菌では抗生物質チオストレプトンの添加によって発現が誘導される一連の遺伝子群が知られていた（Ｍｕｒａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７１　１４５９−１４６６　（１９８９））。そのうちの一つＴｉｐＡ遺伝子は２５３アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、このＴｉｐＡタンパク質はチオストレプトンと共有結合し、自身のプロモーター領域にＴｉｐＡ−チオストレプトン複合体として作用し、自身の構造遺伝子からの転写を強力に促進することが知られていた（Ｈｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊ．　１２　３１８３−３１９１　（１９９３）、　Ｃｈｉｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５　２３３２−２３４１　（１９９６））。また、このＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとＴｉｐＡ構造遺伝子を用いた誘導型発現ベクターも開発されており、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属内で外来タンパク質を発現させた例がある（Ｅｎｇｕｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．　１３７　１３５−１４０　（１９９６））。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいても、ＴｉｐＡ構造遺伝子、並びにＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの下流に標的タンパク質の構造遺伝子を連結した遺伝子群を導入したベクターを構築すれば、このＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌同様に、誘導型発現ベクターになりうると考えられるが、その報告はなかった。
【００１０】
また、約１５℃以下の低温、特に４℃で組み換えタンパク質を生産可能になれば、宿主の増殖を阻害するタンパク質を生産させるだけでなく、以下に述べるような利点もあると考えられる。
【００１１】
大腸菌で組み換えタンパク質を３７℃で発現させると、封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作る場合がある。しかし、同一のタンパク質でも発現時の温度を３０℃以下にすると活性のある可溶性のタンパク質が生産される例が多数知られている（Ｓｃｈｅｉｎ　ａｎｄ　Ｎｏｔｅｂｏｒｎ，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　２９１−２９４　（１９８８）、　Ｐｉａｔａｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３　４８３７−４８４３　（１９８８）、　Ｓｃｈｉｒａｎｏ　ａｎｄ　Ｓｈｉｂａｔａ，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２７１　１２８−１３０　（１９９０）、　Ｖａｓｎｉａ　ａｎｄ　Ｂａｎｅｙｘ，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　９　２１１−２１８　（１９９７）、　Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　１　１６９−１７６　（１９９０））。従って、約１５℃以下の低温、特に４℃前後での発現システムが構築されればこの可溶化の問題も解決されると考えられる。
【００１２】
さらに、好適生育温度範囲が２０℃以下の細菌である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質も約１５℃以下の低温、特に４℃前後での生産が好ましいと考えられる。これは、これらのタンパク質は温度が高い場合、活性のあるタンパク質として発現されないことがあると考えられるからである。これに関しては、好冷菌由来のα−ａｍｙｌａｓｅを好冷菌を宿主として発現させた例が唯一存在するものの（Ｔｕｔｉｎｏ　ａｔ　ａｌ．，　Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ　５　２５７−２６４　（２００１））、発現誘導型のベクターではなく、迅速に大量生産させるのは困難だと考えられる。
【００１３】
そこで本発明者らは、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来タンパク質を誘導発現し得る発現ベクターおよび約１５℃以下の低温で外来タンパク質を誘導発現し得る発現ベクターの構築について鋭意検討を行い本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）　宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクターであって、該宿主以外の宿主の好適生育温度範囲以下の温度で発現し得る発現ベクター。
（２）　宿主細胞中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクターであって、１５℃以下の温度で発現し得る発現ベクター。
（３）　４℃で発現し得る（１）または（２）の発現ベクター。
（４）　宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌である、（１）から（３）のいずれかの発現ベクター。
（５）　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、（４）の発現ベクター。
【００１５】
（６）　誘導物質がチオストレプトンである、（１）から（５）のいずれかの発現ベクター。
（７）　外来遺伝子が、１５℃を超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする、（１）〜（６）のいずれかの発現ベクター。
（８）　誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む（１）〜（７）のいずれかの発現ベクター。
（９）　（１）〜（８）のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体。
（１０）　（１）〜（８）のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
【００１６】
（１１）　宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、該宿主細胞の好適生育温度範囲より低い好適生育温度範囲を有する他の宿主細胞中で誘導物質により誘導発現し得る誘導型発現ベクター。
（１２）　４℃で発現し得る（１１）の発現ベクター。
（１３）　宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌である、（１１）または（１２）の発現ベクター。
（１４）　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、（１３）の発現ベクター。
（１５）　誘導物質がチオストレプトンである、（１１）から（１４）のいずれかの発現ベクター。
【００１７】
（１６）　誘導物質により発現を調節し得るプロモーター配列、外来遺伝子を導入可能なマルチクローニング部位を含む（１１）〜（１５）のいずれかの発現ベクター。
（１７）　（１１）〜（１６）のいずれかの発現ベクターを含む形質転換体。
（１８）　（１１）〜（１６）のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
（１９）　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌中で外来遺伝子を誘導物質により誘導発現し得る発現ベクター。
（２０）　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、（１９）の発現ベクター。
【００１８】
（２１）　誘導物質がチオストレプトンである、（１９）または（２０）の発現ベクター。
（２２）　ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第１のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第２のプロモーター配列およびＴｉｐＡ遺伝子を含む誘導カセット、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、（１９）〜（２１）のいずれかの発現ベクター。
（２３）　（１９）〜（２２）のいずれかの発現ベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌形質転換体。
（２４）　（１９）〜（２２）のいずれかの発現ベクターを用いてタンパク質を産生する方法。
（２５）　１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質をコードする遺伝子を、低温条件下で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で誘導発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【００１９】
（２６）　ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、外来遺伝子を導入可能な第１のマルチクローニング部位および転写終結配列を含む発現カセット、第２のプロモーター配列およびＴｉｐＡ遺伝子を含む誘導カセット、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域ならびにチオストレプトン耐性遺伝子を含む、外来遺伝子を低温条件下で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で誘導発現し得るＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
（２７）　さらに大腸菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域を含み、大腸菌中で複製可能な（２６）のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
（２８）　ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターがＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターである（２６）または（２７）のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
（２９）　配列番号１０６に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ１、配列番号１０７に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＮＨ２、配列番号１０８に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ１、配列番号１０９に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＣＨ２、配列番号１１０に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、配列番号１１１に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、配列番号１１２に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、配列番号１１３に表される塩基配列を有するｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１からなる群から選択される（２６）から（２８）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
（３０）　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌がＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓおよびＲ．　ｏｐａｃｕｓからなる群から選択される、（２５）〜（２９）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター。
【００２０】
（３１）　（２５）から（３０）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを含むＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌形質転換体。
（３２）　外来遺伝子として１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をコードする遺伝子を含む（２５）〜（３０）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、１５℃を超える中高温条件下では発現産物が宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質を低温で産生させる方法。
（３３）　１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、１５℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、（３２）のタンパク質を低温で産生させる方法。
（３４）　１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で１５℃を超える中高温で発現させた場合に不活性な封入体を作るタンパク質である、（３２）のタンパク質を低温で産生させる方法。
（３５）　好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質をコードする遺伝子を含む（２５）〜（３０）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養することを含む、好冷菌または低温環境下に生存する動物もしくは植物由来のタンパク質を低温で産生させる方法。
【００２１】
（３６）　外来遺伝子を含む（２５）〜（３０）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、１５℃を超える中高温条件下および低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養し、１５℃以下の低温条件下でのみ発現される遺伝子を選択することを含む、１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
（３７）　１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、１５℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、（３６）の１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
（３８）　大腸菌に導入し１５℃を超える中高温で発現させよとした場合に、発現しないかまたは大腸菌の増殖を阻害する遺伝子を選択し、次いで該遺伝子を外来遺伝子として含む（２５）〜（３０）のいずれかのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクターを低温で増殖可能なＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌に導入し、低温条件下でチオストレプトンを含む培地を用いて前記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用誘導型発現ベクター導入細菌を培養したときに発現しうる遺伝子を選択することを含む、１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
（３９）　１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌の増殖を３０℃以上で阻害するタンパク質である、（３８）のタンパク質をスクリーニングする方法。
（４０）　１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、大腸菌で１５℃を超える中高温で発現させた場合に封入体を作るタンパク質である、（３８）のタンパク質をスクリーニングする方法。
【００２２】
（４１）　１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質が、１５℃を超える中高温条件下では宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質である、（３８）の１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質をスクリーニングする方法。
（４２）　（３６）から（４１）のいずれかのスクリーニングする方法により得られた１５℃を超える中高温で発現させることが困難なタンパク質。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
１．本発明の発現ベクターの構築
本発明の発現ベクターは、低温で増殖可能な細胞中で自律複製可能で、該ベクター中に組込まれた外来遺伝子を誘導的に発現し得るベクター、すなわち誘導型発現ベクターである。
【００２４】
低温で増殖可能な細胞は限定されず、低温で増殖できる細胞ならば大腸菌、酵母等のいずれの微生物、昆虫細胞、哺乳類細胞等も使用しうる。確実に低温で増殖し得るという点でＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、好ましくはＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒ．　ｏｐａｃｕｓ等が挙げられる。これら３種類のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌のうち、Ｒ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓが４℃での増殖速度が最も大きく他の２種はそれよりも劣る。しかし、本発明のベクターを用いたタンパク質の産生においては、細胞を増殖に適した温度で増殖させた後に、該細胞を低温に移して誘導的に発現させタンパク質を産生させ得る。従って、４℃で組み換え外来タンパク質を発現産生可能な限り増殖速度は問題とならず、Ｒ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒ．　ｏｐａｃｕｓの３種のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する種すべてを好適に用い得る。
【００２５】
低温とは、通常の細菌の至適増殖温度よりも低い温度をいい、４℃から１８℃、好ましくは４℃から１５℃、特に好ましくは４℃前後の温度をいう。通常の細菌の好適生育温度範囲は細菌の種類によっても異なるが約１５℃から約４０℃または約１８℃から約４０℃であり、本明細書においては約１５℃を超える温度を中高温という。
【００２６】
外来遺伝子とは、本発明のベクターを用いて発現産生させようとする標的タンパク質をコードする遺伝子であり、宿主細胞以外の生物由来のタンパク質をコードする遺伝子をいう。本発明のベクターに組込む外来遺伝子は、約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質をコードする遺伝子である。約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質とは約１５℃を超える中高温で発現させようとしても、発現効率が低いか全く発現しないタンパク質をいう。このようなタンパク質として宿主細胞の至適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその微生物の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主微生物の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、好適生育温度範囲が２０℃以下である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２７】
ある遺伝子を大腸菌に基づく発現系で約１５℃を超える中高温で発現させようとしたとき、または該遺伝子を本発明の発現ベクターに含ませＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で約１５℃を超える中高温で発現させようとしたときに、発現しないかまたは発現量が外来遺伝子を本発明の発現ベクターに含ませＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で低温で発現させたときの発現量より有意に低い場合に、該タンパク質は約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質であるといえる。
【００２８】
例えば、通常組み換えタンパク質の発現産生によく用いられる大腸菌を用いて発現させようとした場合に、大腸菌の好適生育温度範囲である１８℃から３７℃で発現できないか、大腸菌に致死的となるか、大腸菌の増殖を阻害するか、大腸菌内で凝集し不活性な封入体を作るタンパク質をコードする遺伝子を、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓに導入してＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを４℃から１８℃の低温で増殖させることにより前記タンパク質を効率的に大量に産生させることができる。また、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを用いて約１５℃を超える温度で発現させようとした場合に、発現できないか、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓに致死的となるか、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓの増殖を阻害するようなタンパク質を、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを用いて４℃から１５℃の低温で増殖させても前記タンパク質を効率的に大量に産生させることができる。
【００２９】
約１５℃を超える中高温条件下で宿主細胞の増殖を阻害するタンパク質の種類は限定されないが、例えば後述の実施例に記載のタンパク質を例示することができる。これらのタンパク質をコードする遺伝子は、後述のプロモーターの下流にマルチクローニング部位を含ませておきその部位にコードする遺伝子を組込めばよい。
【００３０】
外来遺伝子を誘導的に発現し得るベクターとは、一定の処理を施すことにより組込まれた外来遺伝子の発現が誘導されるベクターをいう。例えば、特定の調節物質で発現を誘導し得るプロモーターをベクターに組込むことにより誘導型発現ベクターを構築することが可能である。このようなプロモーターとして宿主細胞の培養培地中に誘導物質である薬剤を導入することにより特異的に誘導するプロモーターがあり、例えばチオストレプトン誘導性プロモーターであるＴｉｐＡ遺伝子プロモーターが挙げられる。このような誘導性プロモーターを組込んだベクターを導入した宿主細胞を１５℃から１８℃以上の細胞の増殖に適した温度で十分増殖させた後に、タンパク質の発現を誘導する薬剤を添加することにより目的のタンパク質を大量に発現させることができる。さらに、ＴｉｐＡタンパク質をコードするＴｉｐＡ遺伝子、ＴｉｐＡ遺伝子の発現を誘導するＴｈｃＡ遺伝子プロモーター等の適当なプロモーターを組込めばよい。宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌である場合、該細菌はチオストレプトンに対して感受性であるため、チオストレプトンに対しての耐性を付与するチオストレプトン耐性遺伝子等を組込む。
また、本発明の発現ベクターは、薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００３１】
さらに、複数の宿主細胞に適合させるために複合ベクター（シャトルベクター）であってもよい。例えば、大腸菌およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌のいずれにも導入可能でこれらの宿主細胞中で外来遺伝子を発現しうるベクターが挙げられる。このようなベクターを構築する場合、それぞれの宿主細胞でプラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域を組込んでおく必要がある。例えば、大腸菌とＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌に適した複合ベクターの場合、大腸菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域としてＣｏｌＥ１配列を、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌用プラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域としてＲｅｐＡおよびＲｅｐＢ遺伝子を組込めばよい。このような複合ベクターは大腸菌を用いて大量に複製することが可能である。
【００３２】
本発明の発現ベクターは、少なくとも第１のプロモーター活性を有するＤＮＡ配列、外来遺伝子を組込むための第１のマルチクローニング部位を含む。さらに、第１のプラスミドの自律複製に必須なＤＮＡ領域、第１の薬剤耐性遺伝子、第１のマルチクローニング部位に連結された外来遺伝子、第１の転写終結配列を含む。第１のプロモーター活性を有するＤＮＡ配列としてＴｉｐＡ遺伝子プロモーターが挙げられ、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを含む場合、ＴｉｐＡ遺伝子、およびＴｉｐＡ遺伝子を発現させるためのＴｈｃＡ遺伝子プロモーター等の第２のプロモーター配列、ＴｉｐＡ遺伝子下流の第２の転写終結配列を含む。ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター等のその配列を改変させたものでもよい。さらに、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター誘導発現系を含む場合であって、宿主細胞がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌である場合には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌にチオストレプトンに対する耐性を付与するためにチオストレプトン耐性遺伝子を含んでいる必要がある。
【００３３】
プロモーター活性を有するＤＮＡ配列、外来遺伝子および転写終結配列は発現カセット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）を構成し、ＴｉｐＡ遺伝子およびＴｉｐＡ遺伝子発現用プロモーターは誘導カセット（Ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅ）を構成する。
【００３４】
本発明のＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌用発現ベクターは、タンパク質自体が１５℃を超える中高温で発現可能なものならば低温ばかりでなく１５℃を超える中高温においても該タンパク質を発現させ得る。
【００３５】
本発明の発現ベクターとして、図９に記載のｐＴｉｐベクターが挙げられ、マルチクローニング部位の構造により図９ａに示すようにｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２、がある。ｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２ベクターの配列はそれぞれ、配列番号１０６〜１１３に示される。さらに、本発明の発現ベクターとして、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２において、マルチクローニング部位のＸｈｏＩ部位以降の読み枠を市販のｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の読み枠と一致させるためにＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ部位を分けたｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１がある。
本発明のベクターは、後述の実施例の記載および図１から図８のベクター構築図に従えば容易に構築することができる。
【００３６】
２．本発明のベクターの使用
本発明の発現ベクターを用いて、約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質を産生させることができる。このようなタンパク質として、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質、好適生育温度範囲が２０℃以下である好冷菌、低温環境下に生存する変温動物、低温環境下に生存する植物由来のタンパク質が挙げられる。
【００３７】
これらのタンパク質をコードする遺伝子を本発明の発現ベクターのマルチクローニング部位に適当な制限酵素を用いて組込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、宿主細胞を低温条件下で培養することにより前記タンパク質を発現させることができる。宿主細胞は、低温で増殖し得る細胞である必要があり、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、好ましくはＲ．　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｒ．　ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒ．　ｏｐａｃｕｓ等が挙げられる。これらの細胞は低温で増殖可能であるが、増殖に好適な温度は１５℃以上、さらに好適な温度は１８℃以上、特に好適な温度は約３０℃前後であり、遺伝子を組込んだタンパク質を発現させる前に、増殖に適した温度で十分増殖させたのちに、低温条件下に移しベクター中に含まれる誘導型プロモーターの機能を利用して適当な薬剤を用いてタンパク質を発現させることができる。
【００３８】
本発明のベクターが、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを含む場合、チオストレプトンを培地に添加することによりタンパク質の発現が誘導される。この際チオストレプトンは、終濃度０．１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１μｇ／ｍｌ以上となるように添加すればよい。ただし、１０μｇ／ｍｌを越えると生育が悪くなる。
【００３９】
本発明のベクターを用いて、約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質をスクリーニングすることができる。このようなタンパク質として、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現できないが同一のまたは異なる種類の宿主細胞を用いた場合にその細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温で発現できるタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に封入体と呼ばれる不活性なタンパク質の凝集を作るが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温でそれらの宿主細胞で発現させた場合に活性のある可溶性タンパク質となるタンパク質が挙げられる。
【００４０】
例えば、適当な動物種の適当な組織からｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成し、発現ベクターに組込む。次いで、該ベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、発現ライブラリーを構築し、３０℃で増殖発現させた場合に、増殖が阻害されるクローンから組込まれた遺伝子を単離することにより、宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞にとって致死性となるが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度よりも低温ではそれらの宿主細胞に致死性でないタンパク質または宿主細胞の好適生育温度範囲内の温度で発現させた場合に該宿主細胞の増殖を阻害するが同一のまたは異なる種類の宿主細胞の至適温度よりも低温ではそれらの宿主細胞の増殖を阻害しないタンパク質をコードする遺伝子を選択する。この際、発現ベクターに適当な薬剤で誘導されるプロモーターを組込んでおき薬剤で発現を誘導した場合に宿主細胞の増殖が阻害され、誘導しない場合には宿主細胞が増殖するようなクローンを選択すればよい。次いで、単離した遺伝子を本発明の発現ベクターに組込んで、該組み換え発現ベクターでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換し、４℃から１５℃の低温で増殖発現させ、増殖が阻害されることなく前記遺伝子を発現するクローンを選択することにより、上記タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。また、ｃＤＮＡライブラリーの遺伝子を本発明の発現ベクターに組込んで、該組み換え発現ベクターでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを形質転換し、低温または約１５℃を超える中高温で培養し、増殖が阻害されることなく組込んだ遺伝子を発現するクローンを選択するか、または発現誘導させたときに発現される遺伝子を組込んだクローンを選択することにより上記タンパク質をコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。
【００４１】
前記スクリーニングにより得られた約１５℃を超える中高温で発現させることが困難であるかまたは不可能なタンパク質も本発明に包含される。このようなタンパク質として、後述の実施例に記載されたタンパク質が例示できる。
【００４２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来の、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製可能なプラスミドの分離とその一部ＤＮＡ配列の決定
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓと大腸菌の複合ベクターを作成するために、まずＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内に存在する小型の内在性プラスミドを検索した。すると、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ２８９５　株にその存在が確認された。このプラスミドにｐＲＥ２８９５と名前を付けた。以下にプラスミドの分離と、そのＤＮＡ配列決定について具体的に述べる。
【００４３】
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ２８９５株を５ｍｌのＬＢ培地（１％　Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１．０％　塩化ナトリウム）にて、３０℃で３０時間培養した菌体からＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｐＲＥ２８９５を精製した。この際、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｐ１　２５０μｌに懸濁後、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｐ２　２５０μｌを加える前に、５μｌのリゾチーム（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え３７℃で３０分インキュベートした点を除いては、使用説明書通りに作業した。
【００４４】
上記ＤＮＡサンプルを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分）に供したところ、約５．４ｋｂのＤＮＡ断片１本の存在が確認された。
この約５．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、使用説明書通りに精製した。得られたＥｃｏＲＩ断片を常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．）に従って、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（＋）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローンし、このプラスミドにｐＨＮ７９と名前を付けた。
【００４５】
ｐＨＮ７９をＲｅｖｅｒｓｅ、Ｍ１３−２０　両プライマー（共にＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（Ｒ）　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）を用いて、使用説明書に準じて、ｐＨＮ７９の塩基配列を約４００塩基ずつそれぞれ決定した。相同性検索の結果、ｐＨＮ７９にサブクローンされたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ２８９５株由来のＤＮＡ領域はその９９．８％の配列がＧｅｎＢａｎｋに受入番号ＡＦ３１２２１０として登録されている５４０３塩基対の環状ＤＮＡ、ｐＮ３０と一致した。
【００４６】
分離したｐＲＥ２８９５は全塩基配列を決定しなかったが、ｐＮ３０との相同性は極めて高く、また制限酵素切断地図もｐＮ３０の配列から予想されるものと一致したことから、これらの相同性はプラスミド全体にわたっていると予想された。また、ｐＮ３０はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ　００２株から分離された内在性プラスミドｐＡＬ５０００　（Ｒａｕｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　７１　３１５−３２１　（１９８８）、　Ｓｔｏｌｔ　ａｎｄ　Ｓｔｏｋｅｒ，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１４２２７９５−２８０２　（１９９６））、　Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＮＩ８６／２１株から分離されたｐＦＡＪ２６００（Ｄｅ　Ｍｏｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１４３　３１３７−３１４７　（１９９７））と相同性が高く、類似の機構で自律複製していると考えられた。ｐＡＬ５０００は推定ＲｅｐＡ遺伝子、推定ＲｅｐＢ遺伝子、推定複製開始点を含む領域のみで各細菌内で自律複製するために十分であるため、本発明者らが分離したｐＲＥ２８９５も同様の領域のみを発現ベクター中に組み込めば、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製するために十分と考えられた。
【００４７】
〔実施例２〕
ベクタープラスミドｐＨＮ１３６の構築
実施例１で分離したｐＲＥ２８９５の一部と大腸菌内で自律複製可能なプラスミドの一部を用いて両菌の複合ベクターを作成するため以下の作業を行った（図１）。
【００４８】
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（−）　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）をテンプレートとして、配列表中の配列番号１、２に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下プライマーと略記）を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、ＰＣＲと略記：　Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３９　４８７−４９１　（１９８８））によるＤＮＡの増幅を行った。なお、用いたＰＣＲ用の酵素はＰｆｕ　ｔｕｒｂｏ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）である。その結果、アンピシリン耐性遺伝子（図中においてはＡｍｐｒと表記）と大腸菌内で自律複製させるために必要なＣｏｌＥ１配列領域を含む２．０ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｃＩとＢｓｒＧＩで二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分）に供し、該ＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて、使用説明書に準じて精製した。
【００４９】
一方、ｐＮ３０（実施例１）の配列をもとにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で自律複製するために必要と思われる領域を増幅するプライマーを設計した。なお、同プライマーの配列は配列表中の配列番号３、４で示される。プラスミドｐＨＮ７９をテンプレートとして、両プライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行ったところ１．９ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳａｃＩで二重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、３０分）に供し、該ＤＮＡ断片を切り出し、上述の方法と同様に精製した。
【００５０】
上記２つの精製されたＤＮＡ断片をＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、使用説明書通りにライゲーションし、得られたプラスミドにｐＨＮ１２９と名前を付けた。
【００５１】
次にｐＨＮ１２９に存在する制限酵素認識部位ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、ｐＨＮ１２９をテンプレートとして、配列表中の配列番号５、６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。このＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩとＰｓｔＩで二重消化して得られた０．５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１２９のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位にサブクローンした。結果、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩで連結された部分においては推定ＲｅｐＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム（以下ＯＲＦと略記）内であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＢａｍＨＩ認識部位が除去された。またＳａｌＩ認識部位はＢａｍＨＩ認識部位のごく近傍に存在したが、配列番号５に記載のプライマー中において、ＳａｌＩ認識部位が除かれ、かつ、コードされるアミノ酸が置換されないよう設計されていることから、ＢａｍＨＩ認識部位と同時にＳａｌＩ認識部位も除去されている。このプラスミドにｐＨＮ１３５と名前を付けた。
【００５２】
次にｐＨＮ１３５に存在する制限酵素認識部位ＢｇｌＩＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１３５をテンプレートとして、配列表中の配列番号５、６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。このＰＣＲ断片をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで二重消化して得られた０．５ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１３５のＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ部位にサブクローンした。結果、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで連結された部分においては推定ＲｅｐＢ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＢｇｌＩＩ認識部位が除去された。この結果得られたプラスミドにｐＨＮ１３６と名前をつけた。
【００５３】
〔実施例３〕
ベクタープラスミドｐＨＮ１４３の構築
タンパク質の発現誘導には抗生物質チオストレプトンを用いるが、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓは同物質に対して感受性であるために、耐性を付与させなければならない。そこでＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｚｕｒｅｕｓが持つチオストレプトン耐性遺伝子、ｔｓｒ遺伝子（Ｂｉｂｂ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９９　２６−３６　（１９８５）：図中においては、Ｔｈｉｏｒと表記する）を複合ベクター中に組み込むこととした。なお、この遺伝子がＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ内で機能し、チオストレプトン耐性を付与することはすでに報告されている（Ｓｈａｏ　ａｎｄ　Ｂｅｈｋｉ，　Ｌｅｔｔ．　Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　２１　２６１−２６６　（１９９５））。以下に、同遺伝子の分離について具体的に述べる（図２）。
【００５４】
まず、ＰＣＲのテンプレートに使用するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｚｕｒｅｕｓ　ＪＣＭ４２１７株のゲノムＤＮＡを以下のように調製した。５ｍｌのＳＢ培地（１％　Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％　塩化ナトリウム、０．１％　Ｇｌｕｃｏｓｅ、５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５％　グリシン）にて３０℃で培養した同菌株を５００μｌのＳＥＴバッファー（７５ｍＭ　塩化ナトリウム、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に懸濁した。そこに、５μｌのリゾチーム溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分インキュベートした。そして、１４μｌのプロテアーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）と６０μｌの硫酸ドデシルナトリウム溶液（１０％）を加え、よく混合した後５５℃で２時間インキュベートした。その後、２００μｌの塩化ナトリウム溶液（５Ｍ）と５００μｌのクロロホルムを加え、２０分間室温で回転撹拌した。遠心分離し、７００μｌの上清をとった。これをイソプロパノール沈殿後、乾燥させ、５０μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．０））に溶解した。
【００５５】
上記のように精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｚｕｒｅｕｓ　ＪＣＭ４２１７株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号７、８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、チオストレプトン耐性遺伝子を含む１．１ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。なおこのＤＮＡ断片はプラチナ　Ｐｆｘ　ＤＮＡ　　ポリメラーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を用いたため、その末端は平滑末端である。このＤＮＡ断片を精製し、常法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（１９８９），　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎ．Ｙ．）に従い５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からＨｉｎｄＩＩＩ認識部位−ｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−ＥｃｏＲＩ認識部位である）。このプラスミドにｐＨＮ１３７と名前を付けた。
【００５６】
次にｐＨＮ１３７に存在する制限酵素認識部位ＳａｌＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１３７をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた０．６ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ１３７をテンプレートとして、配列表中の配列番号１１、１２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＥｃｏＲＩで消化して得られた０．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはｔｓｒ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＳａｌＩ認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ１４３と名前を付けた。
【００５７】
〔実施例４〕
ベクタープラスミドｐＨＮ６２の構築
チオストレプトンによって誘導型発現をさせるためにはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内にＴｉｐＡタンパク質を存在させなければならない。そのために、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓから構成的なプロモーターを分離し、その下流にＴｉｐＡタンパク質をコードする構造遺伝子を連結した（図３）。構成的に機能するプロモーターとしてはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓのアルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするＴｈｃＡ遺伝子（Ｎａｇｙ　ｅｔ　　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７７　６７６−６８７　（１９９５））のプロモーター配列を用いた。
【００５８】
テンプレートに使用するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｚｕｒｅｕｓからゲノムＤＮＡを調製したときと同様に作業し、精製した。また、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株のゲノムＤＮＡは５ｍｌのＬＢ培地で培養した点を除いてはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｚｕｒｅｕｓからゲノムＤＮＡを調製したときと同様に作業し、精製した。
【００５９】
上述のように精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号１３、１４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ並びにその下流の転写終結配列を含むＤＮＡ（図中においてはＴｉｐＡと表記）を得た。
【００６０】
このＰＣＲ断片の片方の末端をＢｇｌＩＩで消化して得られた０．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、上述のように精製したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号１５、１６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、アルデヒドデヒドロゲナーゼ様タンパク質をコードするＴｈｃＡ遺伝子（Ｎａｇｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７７６７６−６８７　（１９９５））のプロモーター配列（図中においてはＡＬＤＨｐと表記）を含むＤＮＡを得た。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｂａＩで消化して得られた０．２ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ部位にサブクローンした結果、ＴｈｃＡ遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ並びに転写終結配列を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ３３と名前を付けた。
【００６１】
次にｐＨＮ３３に存在する制限酵素ＮｃｏＩ認識部位２カ所（以下、ＮｃｏＩ（１）、ＮｃｏＩ（２）と表記する）を除去するため以下の作業をおこなった。
まず、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｂａＩで消化して得られた０．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号１８、１２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＫｐｎＩで消化して得られた０．６ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＮｃｏＩ（１）認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ５０と名前を付けた。
【００６２】
次にｐＨＮ３３に存在する制限酵素認識部位ＮｃｏＩ（２）を除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号９、１９に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｂａＩで消化して得られた０．８ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ３３をテンプレートとして、配列表中の配列番号２０、１２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＫｐｎＩで消化して得られた０．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはＴｉｐＡ遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＮｃｏＩ（２）認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ５１と名前を付けた。
【００６３】
最後に以下の作業を行った。ｐＨＮ５０をＸｂａＩとＳａｃＩで二重消化して得られた０．７ｋｂのＤＮＡ断片とｐＨＮ５１をＳａｃＩとＫｐｎＩで二重消化した０．４ｋｂの断片を同時にプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした。結果、ＮｃｏＩ（１）とＮｃｏＩ（２）両方の制限酵素部位を欠いたＴｉｐＡ遺伝子を持つプラスミドを取得し、これにｐＨＮ６２と名前をつけた。
【００６４】
〔実施例５〕
ベクタープラスミドｐＨＮ１５３の構築
目的のタンパク質を誘導的に発現せしめることができるかどうか確認するために、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーターの下流にレポーター遺伝子としてＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ由来のプロリンイミノペプチダーゼ（Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３９８　１０１−１０５　（１９９６）：以下ＰＩＰと略記する）をコードする遺伝子のＯＲＦ（図中においてはＰＩＰ　ＯＲＦと表記）を連結し、さらにその下流に転写のリードスルーを抑制するために転写終結配列を連結した。以下に具体的に述べる（図４）。
【００６５】
実施例４にて精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、２２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーター配列（図中においてはＴｉｐＡｐと表記）を含む０．２ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（＋）のＳｍａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からＫｐｎＩ認識部位−ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列−ＳａｃＩ認識部位である）。このプラスミドにｐＨＮ１５０ｕと名前を付けた。
【００６６】
次に、プラスミドｐＲＳＥＴ−ＰＩＰ　（Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３９８　１０１−１０５　（１９９６）：以下ＰＩＰと略記する）をテンプレートとして、配列表中の配列番号２３，２４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なお、配列表中の配列番号２４のプライマーはＰＩＰ遺伝子の終止コドンを除いて、かつタンパク質の精製を容易にするために６×ＨｉｓタグがＰＩＰタンパク質のＣ末端に付くように設計されている。６×Ｈｉｓタグは、６つの連続したヒスチジン残基から成る連続配列で、これを融合したタンパク質は、ニッケルイオン等に高い親和性を示すようになる。従って、ニッケルイオン等を用いた金属キレートクロマトグラフィーで精製が容易になる（Ｃｒｏｗｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　３１　３７１−３８７　（１９９４））。このＰＩＰ遺伝子を含む０．９ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＨＮ１５０ｕのＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にＰＩＰ遺伝子のＯＲＦを含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１５１ｕと名前を付けた。
【００６７】
次に、実施例４にて精製したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号２５，２６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｈｃＡ遺伝子の転写終結配列（Ｎａｇｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７７　６７６−６８７　（１９９５）：　図中においてはＡＬＤＨｔと表記）を含むＤＮＡを得た。この０．２ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩとＸｂａＩで二重消化し、ｐＨＮ１５１ｕのＳｐｅＩ、ＸｂａＩ部位にサブクローンした。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にＰＩＰ遺伝子のＯＲＦを含み、またそのすぐ下流にＴｈｃＡ遺伝子の転写終結配列を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１５３と名前を付けた。
【００６８】
〔実施例６〕
ベクタープラスミドｐＨＮ１６９の構築
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓをプラスミドで形質転換するためには適当な形質転換マーカーが必要になる。そこでＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で機能する強力なプロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子を連結し、使用することとした。プロモーターとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属細菌由来の　Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＴｕをコードするＴｕｆ１遺伝子プロモーターを用いることとしたが、これは同プロモーターが強力に下流の遺伝子を転写せしめるとの報告があるからである（Ｗｅｚｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ　１２１９　５４３−５４７　（１９９４））。また、薬剤耐性遺伝子は入手が容易なテトラサイクリン耐性遺伝子を用いた。以下に具体的に述べる（図５）。
【００６９】
実施例４にて精製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ　Ａ３（２）株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号２７、２８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、Ｔｕｆ１遺伝子のプロモーター配列（図中においてはＴｕｆ１ｐと表記）を含む０．２ｋｂの増幅されたＤＮＡを得た。なおこのＰＣＲにはプラチナＰｆｘ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。この断片を精製し、常法により５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した後、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（＋）　のＨｉｎｃＩＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からＫｐｎＩ認識部位−Ｔｕｆ１遺伝子プロモーター配列−ＥｃｏＲＩ認識部位である）。このプラスミドにｐＨＮ１５８と名前を付けた。
【００７０】
次に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Ｒｏｓｅ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６　３５５　（１９８８））をテンプレートとして、配列表中の配列番号２９、３０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、テトラサイクリン耐性遺伝子（図中においてはＴｅｔｒと表記）を含むＤＮＡを得た。この１．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＨＮ１５８のＳａｌＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした結果、Ｔｕｆ１遺伝子のプロモーター配列のすぐ下流にテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１５９と名前を付けた。
【００７１】
次にｐＨＮ１５９に存在する制限酵素認識部位ＢａｍＨＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表３１、３２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＤＮＡ断片はＰｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　ポリメラーゼを用いたため、その末端は平滑末端である。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｈｏＩで消化して得られた０．５ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号３３、３４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはＰｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＮｏｔＩで消化して得られた１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（＋）のＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＢａｍＨＩ部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ１６５と名前を付けた。
【００７２】
次にｐＨＮ１５９に存在する制限酵素認識部位ＳａｌＩを除去するため以下の作業をおこなった。まず、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号３１、３５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはＰｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＸｈｏＩで消化して得られた０．８ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。一方、プラスミドｐＨＮ１５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号３６、３４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。なおこのＰＣＲにはＰｆｕ　ｔｕｒｂｏ　ＤＮＡ　　ポリメラーゼを用いた。このＰＣＲ断片の片方の末端をＮｏｔＩで消化して得られた０．８ｋｂのＤＮＡ断片を精製し、さらに常法により平滑末端側の５’末端をＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化した。これら２つのＰＣＲ断片を同時にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）　のＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ部位にサブクローンした結果、平滑末端同士で連結された部分においてはテトラサイクリン耐性遺伝子のＯＲＦ部分であるが、コードされるアミノ酸が置換されることなく、ＳａｌＩ認識部位が除去された。このプラスミドにｐＨＮ１６６と名前を付けた。
【００７３】
最後に以下の作業を行った。ｐＨＮ１６６をＳｐｈＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた０．９ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１６５のＳｐｈＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果、ＢａｍＨＩとＳａｌＩ両方の制限酵素認識部位を欠くテトラサイクリン耐性遺伝子クローンを取得し、このプラスミドにｐＨＮ１６９と名前をつけた。
【００７４】
〔実施例７〕
ベクタープラスミドｐＨＮ１７０、ｐＨＮ１７１の構築
実施例２から６までに分離してきた遺伝子群を連結し、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌内で誘導可能な発現ベクターを構築するために以下の作業を行った（図６）。
【００７５】
ｐＨＮ１４３をＳａｃＩで消化して得られた１．１ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１３６のＳａｃＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向から推定ＲｅｐＢ遺伝子ＯＲＦ−ｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦである）。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１４４と名前をつけた。
【００７６】
次に、ｐＨＮ６２をＸｂａＩとＫｐｎＩで二重消化して得られた１．１ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１４４のＸｂａＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１５２と名前をつけた。
【００７７】
次に、ｐＨＮ１５３をＢｓｒＧＩとＸｂａＩで二重消化して得られた１．２ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１５２のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１５４と名前をつけた。
【００７８】
次に、ｐＨＮ１６９をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた１．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１５４のＸｂａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−テトラサイクリン耐性遺伝子ＯＲＦ−ＴｈｃＡ遺伝子プロモーター配列である）。その結果ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの制御下に置かれたＰＩＰ遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにｐＨＮ１７０と名前をつけた。
【００７９】
また組み換えタンパク質の高発現化のため、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター下流のリボソーム結合部位を翻訳効率の良いとされるラムダファージｇｅｎｅ１０由来の配列（Ｇｏｌｄ　ａｎｄ　Ｓｔｏｒｍｏ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１８５　８９−９３　（１９９０））に変化させた（図６）。以下に具体的に述べる。
【００８０】
プラスミドｐＨＮ１７０をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１，３７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとラムダファージｇｅｎｅ１０由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドプロモーター（以下ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターと表記する：　図中に置いてはＴｉｐＡ−ＬＧ１０ｐと表記）を得た。この０．２ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｃｏＩで二重消化し、ｐＨＮ１７０のＢｓｒＧＩ、ＮｃｏＩ部位にサブクローンした。その結果ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＰＩＰ遺伝子を含むプラスミドが作成され、できたプラスミドにｐＨＮ１７１と名前をつけた。図２２にＴｉｐＡプロモーター配列を、図２３にＴｉｐＡプロモーターのＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターへの改変のためのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列の改良を示す。
【００８１】
〔実施例８〕
ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１の構築
実施例７で述べたプラスミドからレポーターであるＰＩＰ遺伝子を除き、マルチクローニング部位を導入するため以下の作業を行った（図７）。
【００８２】
配列表中の配列番号３８、３９に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、７０℃で１０分処理し、２０分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。その結果、その末端はＮｃｏＩとＳｐｅＩで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ　Ｌｉｎｋｅｒ　ＮＮｃｏと表記）をｐＨＮ１７０のＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＮＨ１と名前をつけた。また、配列表中の配列番号４０、４１に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を同様に２本鎖化させた合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ　Ｌｉｎｋｅｒ　ＣＮｃｏと表記）をｐＨＮ１７０のＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ１と名前をつけた。
【００８３】
実施例７で述べたＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列とラムダファージｇｅｎｅ１０由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドＤＮＡを制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｃｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＮＨ１とｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＮｃｏＩ部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１とそれぞれ名前を付けた。
【００８４】
〔実施例９〕
ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２の構築
実施例８で述べたプラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１
、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１において、マルチクローニング部位の最も上流のＮｃｏＩ部位をＮｄｅＩに変更するために以下の作業を行った（図８）。
【００８５】
プラスミドｐＨＮ１７０をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを含むＤＮＡを得た。この０．２ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで二重消化し、ｐＨＮ１７０のＢｓｒＧＩ、ＮｄｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＨＮ１８３と名前を付けた。
【００８６】
配列表中の配列番号４３、４４に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドはマルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ。これら２つを等モル量ずつ混合し、７０℃で１０分処理し、２０分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。その結果、その末端はＮｄｅＩとＳｐｅＩで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、この２本鎖化した合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ　Ｌｉｎｋｅｒ　ＮＮｄｅと表記）をｐＨＮ１８３のＮｄｅＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＮＨ２と名前をつけた。また、配列表中の配列番号４５、４６に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（マルチクローニング部位になる配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を同様に２本鎖化させた合成ＤＮＡ（図中においてはＭＣＳ　Ｌｉｎｋｅｒ　ＣＮｄｅと表記）をｐＨＮ１８３のＮｄｅＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ２と名前をつけた。
【００８７】
プラスミドｐＴｉｐ−ＬＮＨ１をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、４７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとラムダファージｇｅｎｅ１０由来リボソーム結合部位からなるハイブリッドＤＮＡを得た。この０．２ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＮｄｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＮＨ２とｐＴｉｐ−ＣＨ２のＢｓｒＧＩ、ＮｄｅＩ部位にそれぞれサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２とそれぞれ名前を付けた。
【００８８】
実施例８，９で作成したプラスミドのマップと、マルチクローニング部位周辺の配列をまとめて図９に示す。該図中、実線の矢印はＴｉｐＡ遺伝子プロモーター中に存在するＩｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ配列を示す。斜線の矢印はＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列に存在するＩｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ配列を示す。また、原核生物のプロモーター領域に一般的に存在し、遺伝子の転写に重要な−１０領域、−３５領域、ＲＢＳは四角で囲んである。またＲＢＳの中でも最も重要なＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ　ａｎｄ　Ｄａｌｇａｒｎｏ，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５７　２２１−２３０　（１９７５））は下線を引いてある。
【００８９】
〔実施例１０〕
ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１の構築実施例８及び９で述べたプラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２において、マルチクローニング部位のＸｈｏＩ部位以降の読み枠を市販のｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）の読み枠と一致させるために以下の作業を行った（図１０）。
【００９０】
プラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ１をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、１０４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ１．１と名前を付けた。
【００９１】
プラスミドｐＴｉｐ−ＣＨ２をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、１０４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＣＨ２．１と名前を付けた。
【００９２】
プラスミドｐＴｉｐ−ＬＣＨ１をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、１０４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１と名前を付けた。
【００９３】
プラスミドｐＴｉｐ−ＬＣＨ２をテンプレートとして、配列表中の配列番号２１、１０４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターとマルチクローニング部位を含むＤＮＡを得た。この０．３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｒＧＩとＳｐｅＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。結果得られたプラスミドにｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１と名前を付けた。
【００９４】
〔実施例１１〕
ベクタープラスミドｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３の構築
発現の誘導が厳密に調節されているかを調べるために以下のようなコントロール実験用プラスミドを作成した（図１１）。
【００９５】
ｐＨＮ１６９をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた１．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１４４のＸｂａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−テトラサイクリン耐性遺伝子ＯＲＦ−アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦである）。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１７２と名前をつけた。
【００９６】
次に、ｐＨＮ１５３をＢｓｒＧＩとＸｂａＩで二重消化して得られた１．２ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１４４のＢｓｒＧＩ、ＳｐｅＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１６４と名前をつけた。次いで、ｐＨＮ１６９をＸｂａＩとＳｐｅＩで二重消化して得られた１．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＨＮ１６４のＸｂａＩ部位にサブクローンした（サブクローンされた向きはＤＮＡの５’方向からｔｓｒ遺伝子ＯＲＦ−テトラサイクリン耐性遺伝子ＯＲＦ−アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＦである）。その結果できたプラスミドにｐＨＮ１７３と名前をつけた。
【００９７】
ｐＨＮ１７０は、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、その下流にＰＩＰ　ＯＲＦ、さらにその下流にＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列、の３因子が連結された遺伝子カセット（以下Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅと表記）と、ＴｈｃＡ遺伝子プロモーター、その下流にＴｉｐＡ遺伝子、の２因子が連結された遺伝子カセット（以下Ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅと表記）両方をもつ。ｐＨＮ１７３はＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅのみをもち、ｐＨＮ１７２は両ｃａｓｓｅｔｔｅを持たない。
【００９８】
〔実施例１２〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌の形質転換
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をＬＢ培地１００ｍｌにて対数増殖期に至るまで３０℃で振とう培養する。培養液を３０分間氷冷し、遠心分離し、菌体を回収する。これに１００ｍｌの氷冷滅菌水を加え、よく撹拌し、再び遠心分離し、菌体を回収する。これに１００ｍｌの氷冷１０％グリセリン溶液を加え、よく撹拌し、遠心分離し、菌体を回収する。この氷冷１０％グリセリン溶液での洗浄をもう一度繰り返し、菌体を５ｍｌの氷冷１０％グリセリン溶液に懸濁する。４００μｌずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し、使用するまで−８０℃にて保存した。−８０℃から菌体を取り出し、氷上にて融解し、プラスミドｐＨＮ１７０、またはｐＨＮ１７２、またはｐＨＮ１７３を３μｌ　（それぞれ約３００ｎｇ）加えた。この菌体とＤＮＡの混合液をエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社：０．２ｃｍ　ギャップキュベット）に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて、電場強度１２．５ｋＶ／ｃｍで、パルスコントローラーの設定はキャパシタンス２５μＦ、外部抵抗４００Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１ｍｌのＬＢ培地に混合し、３０℃にて４時間培養した後集菌し、２０μｇ／ｍｌテトラサイクリン入りＬＢ寒天培地（寒天は濃度１．８％）に塗布し、３０℃にて３日培養し、それぞれの形質転換体を得た。
【００９９】
〔実施例１３〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌におけるＰＩＰ活性の測定１
構築された発現ベクターにはレポーター遺伝子としてＰＩＰ遺伝子が組み込まれており、チオストレプトンによる誘導性、誘導の強さなどを、ＰＩＰの酵素活性を測定することで、確認することができる。菌体中に存在するＰＩＰの量は人工基質Ｈ−Ｐｒｏ−βＮＡ（Ｂａｃｈｅｍ社製）を加水分解する活性を調べることで容易に定量が可能である。
【０１００】
実施例１２にて作成したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株の形質転換体を８μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で３０℃にて培養し、６００ｎｍの波長で測定したオプティカルデンシティー（Ｏ．Ｄ．６００）が０．６になった時点で、終濃度１μｇ／ｍｌになるようにチオストレプトン（溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え、ＰＩＰの発現を誘導させた。
【０１０１】
１６時間後に培養液の一部を取り出し、８μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で２００μｌにメスアップし、６０℃にて１分加温する。そこにＰＩＰの基質として２μｌのＨ−Ｐｒｏ−βＮＡ（１００ｍＭ：溶媒はジメチルスルホオキサイド）を加え６０℃にて２０分インキュベートする（ＰＩＰは６０℃が至適温度）。ＰＩＰよってＨ−Ｐｒｏ−βＮＡから加水分解されて遊離したβＮＡを観察するために、発色剤として１３４μｌのＦａｓｔ　Ｇａｒｎｅｔ　ＧＢＣ　Ｓａｌｔ　溶液（和光純薬社製で濃度０．５ｍｇ／ｍｌ　：　１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．２）、１０％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００が溶媒）を加える。ＰＩＰが発現していなければ上記混合液は黄色を呈するが、発現していれば赤色を呈する。また、呈色した赤色を吸光分光光度計を用い、５５０ｎｍでの吸光度（Ａ５５０）を測定し、ＰＩＰ活性を定量した。測定はＦａｓｔＧａｒｎｅｔ　ＧＢＣ　Ｓａｌｔを加えた後、滅菌水６６６μｌを加え希釈して行った。
【０１０２】
その際、５５０ｎｍでは細胞のオプティカルデンシティーも測定してしまうので、５５０ｎｍでの細胞のオプティカルデンシティー（Ｏ．Ｄ．５５０）は別測定し、測定時に使用したＯ．Ｄ．５５０に相当する値をＡ５５０の値から差し引いて補正した値をＡｃ５５０とする。すなわち、Ａｃ５５０＝Ａ５５０？Ｏ．Ｄ．５５０×ＰＩＰの活性測定に使用した培養液量（ｍｌ）で計算される。ユニット値は「２０分間の測定で得られる、培養液１ｍｌあたり、Ｏ．Ｄ．６００＝１あたりのＡｃ５５０の値」とし、「Ａｃ５５０÷ＰＩＰの活性測定に使った培養液量（ｍｌ）÷Ｏ．Ｄ．６００」で計算した。
【０１０３】
ｐＨＮ１７０で形質転換した細胞において、チオストレプトンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、加えた場合赤色を呈した。ｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３で形質転換した細胞においては、チオストレプトンの有無に関わらず、黄色を呈した。
【０１０４】
実施例１２にて作成したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株の形質転換体を８μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地で３０℃にて培養し、Ｏ．Ｄ．６００が２．０になったら、直ちに４℃に温度を下げ、菌体を馴化させるために、１時間振とう培養した。そこに終濃度１μｇ／ｍｌになるようにチオストレプトンを加え、ＰＩＰの発現を誘導させた。４０時間後に培養液の一部を取り出し、上記３０℃と同様の実験を行った。
【０１０５】
ｐＨＮ１７０で形質転換した細胞において、チオストレプトンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、加えた場合赤色を呈した。ｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３で形質転換した細胞においては、チオストレプトンの有無に関わらず、黄色を呈した。
【０１０６】
以上の結果をまとめて図１２に示す。
図１２に示すようにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０、ｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３で形質転換し、３０℃、４℃でＰＩＰを発現させた時と発現させない時、それぞれのＰＩＰ活性を測定した。図１２には終濃度１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを加えたか否か（＋または−）、活性値、培養温度、活性測定に使用した培養液量、形質転換したプラスミド、プラスミドの持つ「Ｃａｓｓｅｔｔｅ」の有無（＋または−）が示されている。
この結果から、広範な温度域において、チオストレプトンによって誘導可能な発現ベクターが構築されたことが確認された。
【０１０７】
〔実施例１４〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌におけるＰＩＰ活性の測定２
実施例１２にて作成したＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０、ｐＨＮ１７１で形質転換体した細胞のＰＩＰ活性を実施例１３に準じて測定した。
【０１０８】
図１３に終濃度１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを加えてから時間を追ってＰＩＰ活性を測定した結果を示す。該図はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０で形質転換し、３０℃、４℃でＰＩＰを発現させた時の活性を時間を追って測定したものを示す。図１３中、縦軸はＰＩＰの活性値（ユニット）、横軸は終濃度１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを加えてからの時間（分）を示す。４℃の「○」はＯ．Ｄ．６００が１．０の時に発現誘導開始させた時、「□」はＯ．Ｄ．６００が２．０の時に発現誘導開始させた時の活性を示す。３０℃の「○」はＯ．Ｄ．６００が０．６の時に発現誘導開始させた時、「□」はＯ．Ｄ．６００が１．０の時に発現誘導開始させた時の活性を示す。
【０１０９】
また、図１４に加えるチオストレプトンの終濃度を変化させて測定した結果を示すが、発現誘導時間は４℃がＯ．Ｄ．６００＝２．０で誘導開始し、２４００分（４０時間）で、３０℃がＯ．Ｄ．６００＝　０．６で誘導開始し、９６０分（１６時間）である。図１４に示す実施例においては、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０で形質転換し、３０℃、４℃でＰＩＰを発現させた時の活性を加えるチオストレプトンの濃度を変えて測定したものを示す。図１４中、縦軸はＰＩＰの活性値（ユニット）、横軸は培地中に添加したチオストレプトンの終濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【０１１０】
この結果から、発現誘導には３０℃でも４℃でも、１μｇ／ｍｌのチオストレプトンで十分なことが判明した。また、発現誘導の時期によるが、３０℃の場合は５００から１０００分（約８−１６時間）程度、４℃の場合は３０００分（５０時間）からそれ以上で細胞あたりのＰＩＰの発現量は最大に達することが示された。
【０１１１】
〔実施例１５〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌におけるＰＩＰ活性の測定３
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉａｎｓ　ＪＣＭ１０００２株、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ　ＤＳＭ４４１９３株において実施例１２と同様にｐＨＮ１７０による形質転換を行った。その結果、ｐＨＮ１７０によってＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓのみならず、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓをも形質転換することができた。従って、ｐＨＮ１７０中に導入された、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ２８９５株由来の自律複製起点はＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓにおいても機能することが示された。また、これらの形質転換体を用いて、実施例１３に準じてＰＩＰ活性を測定した。なお、いずれの菌株においても、発現誘導時間は４℃がＯ．Ｄ．６００＝２．０で誘導開始し、２４００分（４０時間）で、３０℃がＯ．Ｄ．６００＝　０．６で誘導開始し、９６０分（１６時間）である。結果を図１５に示す。図１５には、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉａｎｓ　ＪＣＭ１０００２株、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ　ＤＳＭ４４１９３株をｐＨＮ１７０で形質転換し、３０℃、４℃でＰＩＰを発現させた時と発現させない時、それぞれのＰＩＰ活性を測定した。図には終濃度１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを加えたか否か（＋または−）、活性値、培養温度、活性測定に使用した培養液量、ｐＨＮ１７０で形質転換された宿主、が示されている。
【０１１２】
ｐＨＮ１７０で形質転換されたすべてのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌において、チオストレプトンを加えずに培養した場合は黄色を呈したが、加えた場合赤色を呈した。しかし、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉａｎｓ　ＪＣＭ１０００２株、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ　ＤＳＭ４４１９３株においてはＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株に比べて発現は低かった。
【０１１３】
〔実施例１６〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における外来タンパク質の発現と精製１
ｐＨＮ１７０（実施例７に記載）、ｐＨＮ１７１（実施例７に記載）を用いて、実施例１２と同様にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株を形質転換し、実施例１３に準じてＰＩＰを３０℃、４℃でそれぞれ発現させた。ここでは、終濃度１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを加えた後、時間を追って菌体を回収し、ＰＩＰの精製を行った。ＰＩＰのＣ末端には６×Ｈｉｓタグがついており、Ｎｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、その使用説明書に準じて精製を行った。
【０１１４】
以下に具体的な精製法を示すが、精製の作業は４℃で行った。タンパク質を発現させた菌体　（２０ｍｌ培養液分）　を回収し、１ｍｌのＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール）に懸濁し、１ｇのガラスビーズ（直径０．１０５−０．１２５ミリメートル）を加えた。これをＦａｓｔ−ｐｒｅｐ　ＦＰ１２０（ＳＡＶＡＮＴ社製）にて６ｍ／秒の速度、２０秒間往復振とうさせることで、細胞を破壊した。２０，０００×ｇにて遠心し、その上清７００μｌに、予めＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗをベッド体積４０μｌになるように加えた。これを１時間回転撹拌しながらＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズと６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、１２０μｌのＮＴＥ−Ｂｕｆｆｅｒ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、　１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、４００ｍＭイミダゾール）に３回懸濁することで、ビーズから６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質を溶出させた。
【０１１５】
上記サンプルのうち１０μｌを常法に従い、１２％　ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した結果を図１６に示す。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０　（ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターからの発現：左２枚の図）、ｐＨＮ１７１（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターからの発現：右２枚の図）で形質転換し、４℃（上２枚の図）、３０℃（下２枚の図）でＰＩＰを発現させた。終濃度１μｇ／ｍｌのチオストレプトンを加えてから、時間を追って菌体を回収し、ＰＩＰのＣ末端につけられた６×Ｈｉｓタグを利用してＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗを用いて精製した。菌体を回収した時間は４℃においては、０分（一番左のレーン）、１８０分（左から２番目のレーン）、４２０分（左から３番目のレーン）、１０８０分（左から４番目のレーン）、１４４０分（左から５番目のレーン）、１８６０分（左から６番目のレーン）、２５２０分（左から７番目のレーン）、３０６０分（左から８番目のレーン）で、３０℃においては、０分（１番左のレーン）、１２０分（左から２番目のレーン）、２４０分（左から３番目のレーン）、４２０分（左から４番目のレーン）、５４０分（左から５番目のレーン）、７２０分（左から６番目のレーン）、９００分（左から７番目のレーン）、１４４０分（左から８番目のレーン）である。図１６の各図中、一番右のレーンは誘導せずに（すなわちチオストレプトンを加えずに）培養を続けた菌体から精製したサンプルを示す。３０℃においては、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターからの発現に比べるとＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターからの発現は若干低かったが、４℃においては、逆にＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターからの発現の方が高かった。また、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターにおいても発現の誘導は厳密にコントロールされていた。
両プロモーターからの発現量の詳細な比較は実施例１８に詳しく述べる。
【０１１６】
〔実施例１７〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における外来タンパク質の発現と精製２
ｐＨＮ１７０（実施例７に記載）、ｐＨＮ１７１（実施例７に記載）を用いて、実施例１２と同様にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株を形質転換し、実施例１３に準じてＰＩＰを３２℃、３０℃、１５℃、４℃でそれぞれ発現させた。なお、発現誘導時間は４℃がＯ．Ｄ．６００＝２．０で誘導開始し、２４００分（４０時間）で、１５℃がＯ．Ｄ．６００＝１．０で誘導開始し、１５００分（２５時間）で、３０℃がＯ．Ｄ．６００＝０．６で誘導開始し、９６０分（１６時間）で、３２℃がＯ．Ｄ．６００＝　０．６で誘導開始し、９６０分（１６時間）である。加えたチオストレプトンは終濃度１μｇ／ｍｌである。精製は実施例１６と同様に行った。
【０１１７】
上記サンプルのうち１０μｌを常法に従い、１２％　ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した結果を図１７に示す。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０（ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターからの発現：レーン１、３、５、７）、ｐＨＮ１７１（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターからの発現：レーン２、４、６、８）で形質転換し、４℃（レーン７、８）、１５℃（レーン５、６）、３０℃（レーン３、４）、３２℃（レーン１、２）、でＰＩＰを発現させた。ＰＩＰのＣ末端につけられた６×Ｈｉｓタグを利用してＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗを用いて精製した。
【０１１８】
３２℃から４℃の広範な温度域において、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター、並びにＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターからのＰＩＰの発現が確認された。３２℃、３０℃においてはＴｉｐＡプロモーターからのＰＩＰの発現量の方が多かったが、１５℃、４℃においてはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターからの発現の方が多かった。
【０１１９】
〔実施例１８〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌における外来タンパク質の発現と精製３
ＰＩＰ以外のタンパク質も該発現ベクターを用いて、発現させることができるかどうか調べるために、以下の実験を行った。
【０１２０】
プラスミドｐＲＳＥＴ−ＡＴＰＩＰをテンプレートとして、配列表中の配列番号４８、４９に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ由来ＰＩＰ遺伝子（Ｔａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　３９８　１０１−１０５　（１９９６）：以下ＡｔＰＩＰと略記）を含むＤＮＡを得た。この１．０ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、並びにｐＴｉｐ−ＬＣＨ１のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にそれぞれサブクローンした結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターもしくはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＡｔＰＩＰ遺伝子（６×ＨｉｓタグをＣ末端に持つ）を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１７６、ｐＨＮ１７７とそれぞれ名前を付けた。
【０１２１】
プラスミドｐＴｒｃ９９ａ−ＧＦＰをテンプレートとして、配列表中の配列番号５０、５１に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、Ａｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａ由来蛍光緑色タンパク質をコードする遺伝子（以下ＧＦＰと略記）を含むＤＮＡを得た。０．８ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳｍａＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＮＨ１並びにｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｃｏＩ、ＳｎａＢＩ部位にそれぞれサブクローンした結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターもしくはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＧＦＰ（６×ＨｉｓタグをＮ末端に持つ）遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１８７、ｐＨＮ１８６とそれぞれ名前を付けた。
【０１２２】
プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャムバイオサイエンス社）をテンプレートとして、配列表中の配列番号５２、５３に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子（以下ＧＳＴと略記）を含むＤＮＡを得た。０．７ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＮＨ２、並びにｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にそれぞれサブクローンした結果、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターもしくはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＧＳＴ遺伝子（６×ＨｉｓタグをＮ末端に持つ）を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８２、ｐＨＮ２８３とそれぞれ名前を付けた。
【０１２３】
ｐＨＮ１７０（実施例７に記載）、ｐＨＮ１７１（実施例７に記載）、ｐＨＮ１７６、ｐＨＮ１７７、ｐＨＮ１８７、ｐＨＮ１８６、ｐＨＮ２８２、ｐＨＮ２８３を用いて、実施例１２と同様にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株を形質転換し、実施例１３に準じてＰＩＰ、ＡｔＰＩＰ、ＧＦＰ、ＧＳＴ各タンパク質を３０℃、４℃でそれぞれ発現させた。いずれも、発現誘導時間は４℃がＯ．Ｄ．６００＝２．０で誘導開始し、２４００分（４０時間）で、３０℃がＯ．Ｄ．６００＝０．６で誘導開始し、９６０分（１６時間）で、加えたチオストレプトンは終濃度１μｇ／ｍｌである。なお、４℃では５０ｍｌ、３０℃では２０ｍｌの培養液から精製を行った。
上記４種のタンパク質には全て６×Ｈｉｓタグがついており、実施例１６に準じて精製を行った。
【０１２４】
上記サンプルのうち１０μｌを常法に従い、１２％　ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した結果を図１８に示す。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株をｐＨＮ１７０（ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの下流にＰＩＰ：レーン１、９）、ｐＨＮ１７１（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの下流にＰＩＰ：レーン２、１０）、ｐＨＮ１７６（ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの下流にＡｔＰＩＰ：レーン３、１１）、ｐＨＮ１７７（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの下流にＡｔＰＩＰ：レーン４、１２）、ｐＨＮ１８７（ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの下流にＧＦＰ：レーン５、１３）、ｐＨＮ１８６（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの下流にＧＦＰ：レーン６、１４）、ｐＨＮ２８２（ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターの下流にＧＳＴ：レーン７、１５）、ｐＨＮ２８３（ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの下流にＧＳＴ：レーン８、１６）で形質転換し、４℃（レーン９から１６）３０℃（レーン１から８）で各タンパク質を発現させた。各タンパク質の末端につけられた６×Ｈｉｓタグを利用してＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗを用いて精製した。
【０１２５】
また、デンシトメーターにてバンドの密度を測定し、定量した結果を図１９に示すが、これは図１８で示されたＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動像のバンドから定量したものである。該図では、それぞれの外来タンパク質が１リットルの培養液からどれだけ精製されたかを示す。単位はｍｇで示されている。一番右のカラム（倍率）は、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターを用いて発現させた場合に比べて、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターを用いて発現させた場合、何倍のタンパク質が精製されるか示されている。この結果、４℃において、ＴｉｐＡ遺伝子プロモーターよりもＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターから発現させる方が、得られる組み換えタンパク質の量が多いことがわかった。しかし、３０℃の場合は必ずしもＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターから発現させる方が、得られる組み換えタンパク質の量が多いとは限らなかった。
【０１２６】
〔実施例１９〕
大腸菌に対して３０℃で増殖阻害効果を示すマウス由来タンパク質の分離
具体的にどの遺伝子が発現されると宿主に対して増殖阻害効果を示すのかを調べるために、マウス肝臓由来のＰｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて大腸菌用発現ライブラリーを構築した。以下に具体的に述べる。
【０１２７】
大腸菌用発現ベクターはアラビノース誘導性ベクターを用いることとした。まず該ベクター、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において、ｃＤＮＡの導入を容易にするために、マルチクローニング部位を改変したｐＢＡＤ−Ｌｉｎｋｅｒを作成した。以下にその作成過程を述べる。配列表中の配列番号５４、５５に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ認識部位からなるクローニング配列を含み、お互いに相補的な配列を持つ）を等モル量ずつ混合し、７０℃で１０分処理し、２０分かけて室温に冷却し、２本鎖化させた。結果、その末端はＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化されたベクターと連結可能な状態になり、これをｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＢＡＤ−Ｌｉｎｋｅｒと名前をつけた。
【０１２８】
ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔを用い、その使用説明書に従って、上記Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡより２本鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、このｃＤＮＡをｐＢＡＤ−ＬｉｎｋｅｒのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ部位にライゲーションした。このライゲーション産物を常法に従い、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬＢ寒天培地上にて、５万個の形質転換体を得た。その寒天培地のレプリカを５０μｇ／ｍｌアンピシリンと０．２％　Ｌ−アラビノースを含んだＬＢ寒天培地にＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製Ｅａｓｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｒｅｐｌｉｃａ　Ｐｌａｔｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅを用いて作成し、タンパク質の発現を誘導させ、３０℃にて一晩インキュベートした。その結果、アラビノースを含まない培地上では生育できるが、アラビノースを含む培地上では生育できないコロニーが４２６個選別された。
【０１２９】
この４２６個のＴＯＰ１０形質転換体を１．５ｍｌの５０μｇ／ｍｌアンピシリン入りＬＢ培地にて培養した後、常法に従いプラスミドを分離、精製した。得られたプラスミドは制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩの二重消化後、１％アガロース電気泳動に供し、マウス由来のｃＤＮＡ断片の長さを見積もった。さらに、得られたプラスミドは配列表中の配列番号５６記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチド用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩＰＲＩＳＭ（Ｒ）　３１００　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒにて、マウス由来ｃＤＮＡ部分の塩基配列を約５００塩基決定した。その結果を図２０に示す。該図はＢＬＡＳＴプログラムを用いて、決定されたＤＮＡ配列を元に相同性検索を行い、遺伝子を同定した結果を示す。
【０１３０】
〔実施例２０〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、並びに大腸菌における外来タンパク質の発現と精製
実施例１９にて分離した遺伝子のうち、Ｓｅｒｕｍ　ａｍｙｌｏｉｄ　Ａ　（Ｓａａ１）、ＮＡＤＨ　ｄｅｈｙｄｏｒｏｇｅｎａｓｅ　１　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｃｏｍｐｌｅｘ　４、　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５　ｌｉｋｅ　、ＲＩＫＥＮ１５０００１５Ｇ１８、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−Ｖ、　Ｐａｎｔｏｔｅｎａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　１β、Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４、　ＲＩＫＥＮ１３０００１７Ｊ０２　（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｈｏｍｏｌｏｇ）をＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１と大腸菌ＴＯＰ１０を宿主として発現させた。また、以下の４群、１０種類のタンパク質も同様に発現させた。１群）大腸菌で発現させると不活性な封入体となることが知られている３種類のプロテアーゼ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｄ、Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　６、２群）その生理活性から大腸菌での発現が困難だと予想される２種類のＤＮＡｓｅ、ＬＳＤＮＡｓｅ、ＤＬＡＤ、３群）他のグループの研究で、その細胞増殖阻害活性により大腸菌での発現が困難だとされているもの、ＨＭＧ−１、Ｋｉｄ１、Ｂａｘ　ａｌｐｈａ、４群）他のグループの研究で、低温依存的に可溶化されるとされているもの、Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ、　ｐ３７Ａ。なお、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓにおいては３０℃と４℃で、大腸菌は３０℃で組み換えタンパク質をそれぞれ発現させた。以下に詳しく述べる。
【０１３１】
プラスミドＬＥ２０をテンプレートとして、配列表中の配列番号５７、５８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｓｅｒｕｍ　Ａｍｙｌｏｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　　タンパク質（Ｍｅｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　３０　３８１−３８７　（１９９８））をコードするＳａａ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ１１１３１）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＳａａ１遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２０５と名前を付けた。また、プラスミドＬＥ２０をテンプレートとして、配列表中の配列番号５９、６０に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｓａａ１遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＫｐｎＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＳａａ１遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１９３と名前を付けた。
【０１３２】
プラスミドＬ１１３をテンプレートとして、配列表中の配列番号６１、６２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＮＡＤＨ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１　ａｌｐｈａ　ｓｕｂｃｏｍｐｌｅｘ　４をコードする遺伝子（Ｗａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２２６　１０５１−１０７２　（１９９２）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ０１１１１４：以下ＮＡＤＨ４と略記）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＮＡＤＨ４遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２０６と名前を付けた。また、プラスミドＬ１１３をテンプレートとして、配列表中の配列番号６３、６２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＮＡＤＨ４遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＮＡＤＨ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１９５と名前を付けた。
【０１３３】
プラスミドＬ３をテンプレートとして、配列表中の配列番号６４、６５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５　ｌｉｋｅタンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＫ００２４２６：以下Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５ｌと略記）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５ｌ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２０８と名前を付けた。また、プラスミドＬ３をテンプレートとして、配列表中の配列番号６６、６５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５ｌ遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　ｂ５ｌ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ１９９と名前を付けた。
【０１３４】
プラスミドＬＥ１２３をテンプレートとして、配列表中の配列番号６７、６８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来機能不明な推定上のタンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＃０２５４３９：以下ＬＥ１２３と略記）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＬＥ１２３遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８７と名前を付けた。また、プラスミドＬＥ１２３をテンプレートとして、配列表中の配列番号６９、６８に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＬＥ１２３遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＬＥ１２３遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７６と名前を付けた。
【０１３５】
プラスミドＬＥ２８０をテンプレートとして、配列表中の配列番号７０、７１に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎをコードする遺伝子（Ｍａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　２３　１４２−１５０　（２００１）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ０２２９８６）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８９と名前を付けた。また、プラスミドＬＥ２８０をテンプレートとして、配列表中の配列番号７２、７１に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７７と名前を付けた。
【０１３６】
プラスミドＬＥ２９５をテンプレートとして、配列表中の配列番号７３、７４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−Ｖをコードする遺伝子（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｌｉｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７６　４４５１２−４４５２０　（２００１）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＃０８０４３４：以下Ａｐｏａ５と略記）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＡｐｏａ５遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８８と名前を付けた。また、プラスミドＬＥ２９５をテンプレートとして、配列表中の配列番号７５、７４に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ａｐｏａ５遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＡｐｏａ５遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８１と名前を付けた。
【０１３７】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号７６、７７に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲ　（Ｌａｒｒｉｃｋ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　１０　１４６−１５２　（１９９２））による増幅を行った。ＲＴ−ＰＣＲにはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製のＰｒｏＳＴＡＲ　Ｕｌｔｒａ　ＨＦ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍを用い、その使用説明書通りに行った（以下全てのＲＴ−ＰＣＲは同キットを用いて行った）。その結果、マウス由来Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｄ遺伝子（Ｇｒｕｓｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８　４００８　（１９９０）、Ｂａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１７　２１３−２５２　（２０００）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５２８８６）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＣａｔｈｅｐｓｉｎＤ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７０と名前を付けた。また、ｐＨＮ２７０をＮｃｏＩとＳａｌＩで二重消化して得られた１．２ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ２７３と名前をつけた。
【０１３８】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号７８、７９に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ遺伝子（Ｄｅｇｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９　４８７−４９８　（１９９０）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ５２３０８）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＰｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７１と名前を付けた。
【０１３９】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号８０、８１に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　６遺伝子（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６２　８０２７−８０３４　（１９８７）、Ｂａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１７　２１３−２５２　（２０００）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＃０１０６３９）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１のＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ６遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７２と名前を付けた。また、ｐＨＮ２７２をＮｃｏＩとＳａｌＩで二重消化して得られた０．７ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ２７５と名前をつけた。
【０１４０】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号８２、８３に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＬＳＤＮＡｓｅ遺伝子（Ｂａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　２１５　２９１−３０１　（１９９８）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ０４７３５５）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＬＳＤＮＡｓｅ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２９９と名前を付けた。
【０１４１】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号８４、８５に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＤＬＡＤ遺伝子（Ｓｈｉｏｋａｗａ　ａｎｄ　Ｔａｎｕｍａ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２７　４０８３−４０８９　（１９９９）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１２８８８８）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＤＬＡＤ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８４と名前を付けた。
【０１４２】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号８６、８７に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＨＭＧ−１遺伝子（Ｐａｕｋｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍａｍｍ．　Ｇｅｎｏｍｅ　５　９１−９９　（１９９４）、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　２２５　９７−１０５　（１９９８）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ００４３１）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＨＭＧ−１遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８５と名前を付けた。また、プラスミドｐＨＮ２８５をテンプレートとして、配列表中の配列番号８８、８７に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来ＨＭＧ−１遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＨＭＧ−１遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ３０５と名前を付けた。
【０１４３】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号８９、９０に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｋｉｄ１遺伝子（Ｔｅｋｋｉ−Ｋｅｓｓａｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　２４０　　１３−２２　（１９９９）、Ｓｕｔｅｒ−Ｃｒａｚｚｏｌａｒａ　ａｎｄ　Ｕｎｓｉｃｋｅｒ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１９　２０２−２０４　（１９９５）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１８４１１１）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＫｉｄ１遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８６と名前を付けた。
【０１４４】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号９１、９２に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｂａｘ　ａｌｐｈａ遺伝子（Ｏｌｔｖａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　７４　６０９−６１９　（１９９３）、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　２２　４２２−４２９　（２００１）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ２２４７２）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＢａｘ　ａｌｐｈａ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２１７と名前を付けた。また、プラスミドｐＨＮ２１７をテンプレートとして、配列表中の配列番号９３、９２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｂａｘ　ａｌｐｈａ遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＢａｘ　ａｌｐｈａ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２１２と名前を付けた。
【０１４５】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表中の配列番号９４、９５に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ遺伝子（Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．　Ｐｕｒｉｆ．　１　１６９−１７６（１９９０）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ０１１１３９）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたＧｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２９８と名前を付けた。また、ｐＨＮ２９８をＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重消化して得られた１．４ｋｂのＤＮＡ断片をｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした。その結果できたプラスミドにｐＨＮ３０６と名前をつけた。
【０１４６】
ｐＥＴ２２ｂ−Ｄｍｐ３７Ａを用いて、配列表中の配列番号１０５、９６に記載のプライマーにて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来ｐ３７Ａをコードする遺伝子（Ｈｏｌｚｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１５０　１１９−１２９　（２０００）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ１４５３１２）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重消化し、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２のＮｄｅＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、ＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーターの制御下に置かれたｐ３７Ａ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２９１と名前を付けた。また、プラスミドｐＨＮ２９１をテンプレートとして、配列表中の配列番号９７、２５に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来ｐ３７Ａ遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩで消化後、ＮｃｏＩで部分消化し（ｐ３７Ａ内部のＮｃｏＩで切断しないように）、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたｐ３７Ａ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ３０８と名前を付けた。
【０１４７】
プラスミドＬＥ５９をテンプレートとして、配列表中の配列番号９８、９９に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　１　ｂｅｔａタンパク質をコードする遺伝子（Ｒｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７５　１３７７−１３８３　（２０００）：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦ２００３５７：以下ＰａｎＫと略記）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＰａｎＫ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７９と名前を付けた。
【０１４８】
マウス肝臓Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、配列表１００、１０１に記載のプライマーにて、ＲＴ−ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ０１９５７８）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＫｐｎＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＰｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ　４遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２７８と名前を付けた。
【０１４９】
プラスミドＬＥ１５６をテンプレートとして、配列表中の配列番号１０２、１０３に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによる増幅を行った。その結果、マウス由来Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ様タンパク質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＫ００５０３５：以下ＴＦＬと略記）を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローンした結果、アラビノース誘導性プロモーターの制御下に置かれたＴＦＬ遺伝子を含むプラスミドが作成され、ｐＨＮ２８０と名前を付けた。
【０１５０】
また、上述したタンパク質のうち、シグナルペプチドを持つものは全てシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を除いてサブクローンされている。また、Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎは成熟Ｔｈｒｏｍｂｉｎになる直前の「Ｐｒｅｔｈｒｏｍｂｉｎ−２」をコードするＤＮＡ配列（Ｓｏｅｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１３０　２６９−２７７　（２００１））がサブクローンされている。
【０１５１】
ｐＨＮ１７１（実施例７に記載）、ｐＨＮ２０５、ｐＨＮ２０６、ｐＨＮ２０８、ｐＨＮ２８７、ｐＨＮ２８９、ｐＨＮ２８８、ｐＨＮ２７０、ｐＨＮ２７１、ｐＨＮ２７２、ｐＨＮ２９９、ｐＨＮ２８４、ｐＨＮ２８５、ｐＨＮ２８６、ｐＨＮ２１７、ｐＨＮ２９８、ｐＨＮ２９１を用いて、実施例１２と同様にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＪＣＭ３２０１株を形質転換し、実施例１３に準じて各タンパク質を３０℃、４℃でそれぞれ発現させた。
【０１５２】
これらのタンパク質には全て６×Ｈｉｓタグが末端についており、実施例１６と同様に精製を行った。またこれに加え、今回は細胞破壊後に２０，０００×ｇにて遠心してできた沈殿（実施例１６に記載）からも精製を行った。具体的に以下に沈殿物からの精製法を示すが、その作業は室温で行った。１ｍｌのＤＮ−Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、８Ｍ尿素）に沈殿物を懸濁し、２０，０００×ｇにて遠心し、その上清７００μｌに、予めＤＮ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗをベッド体積４０μｌになるように加えた。これを１時間回転撹拌しながらＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズと６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをＤＮ−Ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、１２０μｌのＤＮＥ−Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．０）、８Ｍ尿素、４００ｍＭイミダゾール）に３回懸濁することで、ビーズから６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質を溶出させた。
【０１５３】
ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＨＮ１９３、ｐＨＮ１９５、ｐＨＮ１９９、ｐＨＮ２７６、ｐＨＮ２７７、ｐＨＮ２８１、ｐＨＮ２７３、ｐＨＮ２７５、ｐＨＮ３０５、ｐＨＮ２１２、ｐＨＮ３０６、ｐＨＮ３０８、ｐＨＮ２７９、ｐＨＮ２７８、ｐＨＮ２８０を用い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＢＡＤ／Ｈｉｓキットの使用説明書の通りに、大腸菌にてタンパク質の発現を行った。
【０１５４】
以下に具体的な精製法を示す。タンパク質を発現させた菌体を回収し、１ｍｌのＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒに懸濁した。これを超音波発生器　ＵＤ−２０（ＴＯＭＹ社製）を用いて細胞を破壊した。２０，０００×ｇにて遠心し、その上清９００μｌに、予め、ＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒで平衡化されたＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗをベッド体積４０μｌになるように加えた。これを１時間回転撹拌しながらＮｉ−ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズと６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質とを結合させた。このビーズをＮＴ−Ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、１２０μｌのＮＴＥ−Ｂｕｆｆｅｒに３回懸濁することで、ビーズから６×Ｈｉｓタグのついたタンパク質を溶出させた。上記の作業はすべて４℃で行った。
【０１５５】
また、細胞破壊後、２０，０００×ｇにて遠心してできた沈殿からも精製を行ったが、その作業工程は上述した方法と同様である。
【０１５６】
上記サンプルのうち１０μｌを常法に従い１２％　　ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供し、デンシトメーターにてバンドの密度を測定し、定量した結果を図２１に示す。該図において、左から２番目のカラムは発現させたタンパク質の名前を示す。左から３番目のカラムは発現させたタンパク質のＮ末端、Ｃ末端どちらに６×Ｈｉｓタグを付けたかを示す。左から４番目のカラムは、シグナル配列等を含めた完全長のタンパク質の推定分子量（ｋＤａ）を示すが、括弧内の数字は実際に発現させたタンパク質部分の推定分子量を示す。左から５、９番目のカラムはタンパク質を発現させた時に用いたプラスミドの名前を示す。左から６、８、１０番目のカラムは１リットルの培養液あたり、得られた組み換えタンパク質の質量を示すが（単位はミリグラム）、２０，０００×ｇでの上清画分（Ｓｕｐ）から精製したときと、沈殿画分（Ｐｐｔ）から精製したときとに分けて示してある。左から７、１１番目のカラム中の＋、−はそれぞれの形質転換体を発現誘導剤（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓの場合は１μｇ／ｍｌのチオストレプトン、大腸菌の場合は０．２％　Ｌ−アラビノース）を含んだ寒天培地上に塗布した時の、増殖の速度を表している。最も早く増殖した形質転換体が＋＋＋で、全く増殖しなかった形質転換体が−である。また、用いた宿主、発現誘導時の温度が最上部に示されている。Ｎ．Ｄ．　（Ｎｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｅｄ）は検出限界以下だったことを示す。
【０１５７】
表１に実施例で用いた各プラスミドのリストを、表２に実施例で用いた菌株のリストを示す。
【０１５８】
【表１】
2004073032.tif 000002
【０１５９】
【表２】
2004073032.tif 000003
【０１６０】
【発明の効果】
実施例１３から１８並びに実施例２０に示されるように、本発明の発現ベクターを用いることにより、４℃という低温条件下で外来遺伝子のコードするタンパク質を発現産生させることが可能である。
【０１６１】
【配列表】
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【０１６２】
【配列表フリーワード】
配列１〜１０５：プライマー
配列１０６〜１１３：ベクター
【図面の簡単な説明】
【図１】誘導型発現ベクターのバックボーンになるプラスミドｐＨＮ１３６の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。
【図２】チオストレプトン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨＮ１４３の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰはＣａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを、Ｂｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を意味する。
【図３】Ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅを持つプラスミドｐＨＮ６２の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。Ｂｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を意味する。
【図４】Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅを持つプラスミドｐＨＮ１５３の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰは（Ｃａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　ＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅをＢｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を意味する。
【図５】テトラサイクリン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＨＮ１６９の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰはＣａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを、Ｂｌｕ．は平滑末端（Ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を意味する。
【図６】ＰＩＰをレポーター遺伝子として持つ誘導型発現ベクタープラスミドｐＨＮ１７０、ｐＨＮ１７１の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。ＣＩＡＰはＣａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを意味する。
【図７】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。
【図８】マルチクローニング部位を持つ誘導型発現ベクタープラスミドｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置をしめす。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。
【図９ａ】ａ）ｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２のマップを示す図である。各領域の機能と、プラスミドのマップを示す。
【図９ｂ】ｂ）ｐＴｉｐ−ＮＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ１のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図９ｃ】ｃ）ｐＴｉｐ−ＣＨ１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図９ｄ】ｄ）ｐＴｉｐ−ＮＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＮＨ２のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図９ｅ】ｅ）ｐＴｉｐ−ＣＨ２、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ２のＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列、またはＴｉｐＡ−ＬＧ１０プロモーター配列から、マルチクローニング部位、ＴｈｃＡ遺伝子転写終結配列までのＤＮＡ配列を示す。
【図１０】ｐＴｉｐ−ＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＬＣＨ１．１、ｐＴｉｐ−ＣＨ２．１およびｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．１のマップを示す図である。
【図１１】ＰＩＰ活性測定のためのコントロールプラスミドｐＨＮ１７２、ｐＨＮ１７３の構築図である。図中に制限酵素認識部位と構造遺伝子の位置を示す。数字は塩基対（キロベースペアー：ｋｂ）を示す。また、ＣＩＡＰはＣａｌｆ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを意味する。ｐＨＮ１７０は、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ」と「Ｉｎｄｕｃｅｒ　ｃａｓｓｅｔｔｅ」両方をもつのに対して、ｐＨＮ１７３は「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅ」のみをもち、ｐＨＮ１７２は両ｃａｓｓｅｔｔｅを持たない。
【図１２】誘導型発現ベクターを用いたＰＩＰ活性の測定１の結果を示す図である。
【図１３】誘導型発現ベクターを用いたＰＩＰ活性の測定２ａの結果を示す図である。
【図１４】誘導型発現ベクターを用いたＰＩＰ活性の測定２ｂを示す図である。
【図１５】誘導型発現ベクターを用いたＰＩＰ活性の測定３の結果を示す図である。
【図１６】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製１の結果を示す図である。
【図１７】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製２の結果を示す図である。
【図１８】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製３ａの結果を示す図である。
【図１９】誘導型発現ベクターを用いた外来タンパク質の精製３ｂの結果を示す図である。
【図２０】大腸菌の増殖を３０℃で阻害するタンパク質のリストを示す図である。
【図２１】Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、大腸菌を宿主とした外来タンパク質の発現を示す図である。
【図２２】ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター配列を示す図である。
【図２３】ＴｉｐＡ遺伝子プロモーター中のＲＢＳ配列（ＷＴ　ＲＢＳ）のＬＧ１０　ＲＢＳへの改良を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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