(57)【要約】      （修正有）【課題】神経栄養因子の分泌を調節する、新規なタンパク質ＣＥＲＡＩＮとその遺伝子を提供する。【解決手段】本発明のタンパク質は顆粒細胞の平行線維においてプルキンエ細胞とのシナプス前部に存在して、神経栄養因子の分泌に関わっていることが本発明者らにより示された。神経栄養因子は活性依存的シナプス可塑性にも関与すると考えられており、本発明のタンパク質は神経回路の増強に効果を発揮しうる。したがって、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーおよび特異的に検出するプローブ、ＣＥＲＡＩＮタンパク質に対する抗体など、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子およびタンパク質の検出・分析に利用可能な物質に関する。また、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能を調節する物質のスクリーニング方法およびそれにより取得した物質に関する。さらに、本発明は、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療のための医薬組成物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項２】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列に、１ないし複数の塩基が欠失、置換、挿入または付加した塩基配列を有し、および、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列に相補的なＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、および、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能が、神経栄養因子の分泌を調節する機能である、請求項３または４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＣ２ドメインおよびＰＨドメインを含むことを特徴とするタンパク質をコードする配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項７】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質からＣ２ドメインおよびＰＨドメインを除いたアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質をコードする配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項８】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする配列番号４の塩基配列を含むＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質を発現させるためのベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターによってＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を外因的に導入した、遺伝子組み換え宿主細胞。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列の一部であって１０から４０塩基で構成されるＤＮＡ、および、配列番号４の塩基配列の相補鎖の一部であって１０から４０塩基で構成されるＤＮＡ、からなるプライマー対であって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子またはその一部を特異的に増幅するためのプライマー対。
【請求項１２】
プライマー対が、配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ、および、配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡからなる、請求項１１に記載のプライマー対。
【請求項１３】
配列番号１の塩基配列の相補鎖の一部であって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子を特異的に検出可能なプローブ。
【請求項１４】
１０から１０００塩基で構成される、請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１５】
プローブの配列が配列番号７の塩基配列である、請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１６】
配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＥＲＡＩＮタンパク質。
【請求項１７】
配列番号８のアミノ酸配列に、１ないし複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列を有し、および、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項１８】
神経栄養因子の分泌を調節する機能を有する、請求項１６または１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
配列番号８のアミノ酸配列の一部を含み、および、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項２０】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＣ２ドメインおよびＰＨドメインを含むことを特徴とする、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２１】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質からＣ２ドメインおよびＰＨドメインを除いたアミノ酸配列を有することを特徴とする、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２２】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質に対する抗体。
【請求項２３】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質（以後、ＣＥＲＡＩＮタンパク質）の特定の機能を調節する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
１）ＣＥＲＡＩＮタンパク質および候補物質を接触させ；
２）ＣＥＲＡＩＮタンパク質に結合した物質を選択し；
３）選択した物質のＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能を調節する能力を評価し；および、
４）ＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能を調節する能力を有する物質を選択する；
ことを含む、上記スクリーニング方法。
【請求項２４】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能を調節する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
１）ＣＥＲＡＩＮタンパク質を発現している細胞の培養物中に候補物質を添加し；および、
２）候補物質を添加しない場合と比較して、細胞からの神経栄養因子の分泌量に変化を与えた物質を、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能を調節する物質として選択する；
ことを含む、上記スクリーニング方法。
【請求項２５】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能の調節が、神経栄養因子の分泌を調節する機能の阻害である、請求項２３または２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能の調節が、神経栄養因子の分泌を調節する機能の促進である、請求項２３または２４に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２２から２６のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によるスクリーニングで得られた、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の特定の機能を調節する物質。
【請求項２８】
ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡ量を半定量する方法であって、以下の工程：
１）試料となる細胞からトータルＲＮＡまたは所望によりｍＲＮＡを抽出し；
２）請求項９または請求項１０に記載のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）を行い；および
３）増幅されたＤＮＡ断片の量を評価する；
ことを含む、上記方法。
【請求項２９】
ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡ量を定量する方法であって、以下の工程：
１）試料となる細胞からｍＲＮＡを抽出し；
２）抽出したｍＲＮＡについてノーザンハイブリダイゼーション行い、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡを請求項１１から１３のいずれか１項に記載のプローブで検出し；および、
３）検出されたＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのバンドを評価する；
ことを含む、上記方法。
【請求項３０】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の量を定量する方法であって、以下の工程：
１）試料となる細胞のホモジネートから、請求項２０に記載の抗体を結合した担体を用いてＣＥＲＡＩＮタンパク質を回収し、
２）回収したＣＥＲＡＩＮタンパク質のウエスタンブロットを行い、請求項２０に記載の抗体で検出し；および
３）検出されたＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのバンドを評価する；
ことを含む、上記方法。
【請求項３１】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の量を定量する方法であって、以下の工程：
１）試料となる細胞のホモジネートから、請求項２０に記載の抗体を結合した担体を用いてＣＥＲＡＩＮタンパク質を回収し、
２）回収したＣＥＲＡＩＮタンパク質のＥＬＩＳＡを行い、請求項２０に記載の抗体で検出し；および
３）検出されたＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのバンドを評価する；
ことを含む、上記方法。
【請求項３２】
神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療のための、ＣＥＲＡＩＮタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３３】
神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療のための、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子を含む、医薬組成物。
【請求項３４】
神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療のための、ＣＥＲＡＩＮタンパク質に対する抗体を含む、医薬組成物。
【請求項３５】
神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患が、神経性疾患である、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症を含む疾患から選択される、請求項３２から３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経栄養因子の分泌を調節する、新規なタンパク質ＣＥＲＡＩＮ（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅより本発明者らが命名）およびＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子に関する。また、本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能を調節する物質のスクリーニング方法、および、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療のための医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経栄養因子は分泌性のペプチドであり、神経細胞膜上に存在する受容体に作用して、神経細胞の生存および分化の調節に不可欠な役割を果たしている（非特許文献１を参照）。最近の研究成果はまた、神経栄養因子が、学習および記憶に関連する長期増強のようなシナプス可塑性など多くの神経機能を調節する（非特許文献２を参照）こと、および、アルツハイマー病、パーキンソン病、および筋萎縮性側索硬化症を含む神経疾患にも関わる重要な神経調節因子である（非特許文献３および４を参照）、ことを示している。神経栄養因子は神経終末などに存在する小胞に含有されており、開口放出によって分泌されると考えられている。
【０００３】
小脳顆粒細胞は、生後初期に外側胚層（ＥＧＬ）中のそれらの前駆体細胞の極めて活発な増殖によって生まれ、脳中の神経細胞の約半分に当たる膨大な数の細胞をもたらす。そのような膨大な数の顆粒細胞は、同時に分化し、平行線維を伸ばし、発生中のプルキンエ細胞樹状突起とシナプス接触を形成し、そして内側顆粒層（ＩＧＬ）へ向かって下方に移動するが、それらは全て、マウスにおいては生後３週間以内に完了する。一方、プルキンエ細胞は、その樹状突起が活発に発達し、最終的には、平行線維を連結する多数の棘を有する精巧な樹枝状分枝を形成する。多くの報告は、発生中の小脳においてＮＴ−３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ３）およびＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）を含む複数の神経栄養因子が合成され、それらが生後の小脳における上記のような発達を調節すると記載している（非特許文献５−９を参照）。この期間に、ＮＴ−３およびＢＤＮＦは、顆粒細胞中の生後１０日と生後２０日の間で逆の発現パターンを示す；すなわち、生後１０日では下方制御されるのに対して、生後２０日では上方制御される（非特許文献１０−１３を参照）。ＮＴ−３の受容体ＴｒｋＣ（非特許文献１４を参照）、および、ＢＮＤＦの受容体ＴｒｋＢ（非特許文献１および１５を参照）は、共に、発達期特異的にプルキンエ細胞ならびに顆粒細胞で発現され（非特許文献１０−１３および１６を参照）、次いで顆粒細胞で産生されて放出されたＢＤＮＦおよびＮＴ−３は、自己分泌作用−近隣分泌作用および順行性の様式で適切に機能する（非特許文献８，９，１７および１８を参照）。また、ＮＴ−３およびＢＮＤＦの遺伝子を遺伝的に欠いているマウスは、小脳神経細胞の生存および分化における神経栄養因子の重要性を示した（非特許文献８および１７を参照）。さらに、ＢＮＤＦは、平行線維−プルキンエ細胞シナプスの短期可塑性を調節する役割を有することが示され（非特許文献１９を参照）、発生が終了した段階におけるシナプス可塑性に対しても、重要な役割を果たす可能性が示唆された。
【０００４】
このように、神経系の様々な側面における神経栄養因子の機能的関与が、重視されている。しかしながら、それにもかかわらず、神経栄養因子が分泌されるメカニズムの詳細、および、神経細胞からの神経栄養因子類の放出を調節する特定分子の存在について証明されている報告例は未だなく、神経栄養因子類の分泌・放出に関する詳細は解明されていないままである。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｅ．  Ｊ．  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｌ．  Ｆ．  Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２００１，  Ｖｏｌ．２４，  ｐ．６７７−
【０００６】
【非特許文献２】
Ｂ．  Ｌｕ  ａｎｄ  Ａ．  Ｆｉｇｕｒｏｖ，  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９７，  Ｖｏｌ．８，  ｐ．１−
【０００７】
【非特許文献３】
Ｍ．  Ｇ．  Ｍｕｒｅｒ，  Ｑ．  Ｙａｎ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｒａｉｓｍａｎ−Ｖｏｚａｒｉ，  Ｐｒｏｇ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  ，  ２００１，  Ｖｏｌ．６３，  ｐ．７１−
【０００８】
【非特許文献４】
Ｍ．  Ａ．  Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｃｕｌｌｅｎ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｌ．  Ｗｅｌｌｍａｎ，  Ｅｘｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １９９５，  Ｖｏｌ．１３１，  ｐ．２２９−
【０００９】
【非特許文献５】
Ｒ．  Ａ．  Ｓｅｇａｌ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｐｏｍｅｒｏｙ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｄ．  Ｓｔｉｌｅｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９５，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．４９７０−
【００１０】
【非特許文献６】
Ｄ．  Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，  Ｓ．  Ｈａｍｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｕ．  Ｚｉｒｒｇｉｅｂｅｌ，  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  Ｄｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，  １９９７，  Ｖｏｌ．５，  ｐ．８３−
【００１１】
【非特許文献７】
Ｍ．  Ｌ．  Ｄｏｕｇｈｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９８，  Ｖｏｌ．１０，  ｐ．３００７−
【００１２】
【非特許文献８】
Ｂ．  Ｂａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９９，  Ｖｏｌ．２，  ｐ．１１５−
【００１３】
【非特許文献９】
Ｄ．  Ｌｉｎｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．１２２，  ｐ．４４３−
【００１４】
【非特許文献１０】
Ｎ．  Ｒｏｃａｍｏｒａ，  Ｆ．  Ｊ．  Ｇａｒｃｉａ−Ｌａｄｏｎａ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｐａｌａｃｉｏｓ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｍｅｎｇｏｄ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．１７，  ｐ．１−
【００１５】
【非特許文献１１】
Ｒ．  Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  １９９７，  Ｖｏｌ．６９，  ｐ．３４−
【００１６】
【非特許文献１２】
Ｒ．  Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ２００１，  Ｖｏｌ．７７，  ｐ．７１−
【００１７】
【非特許文献１３】
Ｋ．  Ｐ．  Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００１，  Ｖｏｌ．１０３，  ｐ．７３９−
【００１８】
【非特許文献１４】
Ｊ．  Ｊ．  Ｖｅｌｉｅｒ，  Ｊ．  Ａ．  Ｅｌｌｉｓｏｎ，  Ｒ．  Ｓ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｖ．  Ｖｉｎｔｅｒｓ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．，  １９９７，  Ｖｏｌ．５０，  ｐ．６４９−
【００１９】
【非特許文献１５】
Ｗ．  Ｑ．  Ｇａｏ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｚｈｅｎｇ，  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋａｒｉｈａｌｏｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９５，  Ｖｏｌ．１５，  ｐ．２６５６−
【００２０】
【非特許文献１６】
Ｒ．  Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａ，  Ｉ．  Ｋ．  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ｒ．  Ｓｅｍｂａ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｋａｔｏ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ２０００，  Ｖｏｌ．７４，  ｐ．１９２３−
【００２１】
【非特許文献１７】
Ｐ．  Ｍ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９７，  Ｖｏｌ．１９，  ｐ．２６９−
【００２２】
【非特許文献１８】
Ｈ．  Ｔ．  Ｍｏｕｎｔ，  Ｃ．  Ｆ．  Ｄｒｅｙｆｕｓ，  ａｎｄ  Ｉ．  Ｂ．  Ｂｌａｃｋ，  Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，  １９９４，  Ｖｏｌ．５，  ｐ．２４９７−
【００２３】
【非特許文献１９】
Ａ．  Ｒ．  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｃ．  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ａ．  Ｓｅｇａｌ，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．２２，  ｐ．１３１６−
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、神経栄養因子の分泌を調節する、新規なタンパク質ＣＥＲＡＩＮを提供する。本発明はＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列および、当該遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列を提供する。さらに、本発明はＣＥＲＡＩＮタンパク質の変異体の遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を提供する。また、本発明は、これらから派生する遺伝子組み換え体、ＰＣＲプライマー、プローブ、および抗体を提供する。本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能を調節する物質のスクリーニング方法、および、本発明のスクリーニング方法によって取得した物質も提供する。さらに、本発明は、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療ののための医薬組成物を提供する。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
ＣＥＲＡＩＮ遺伝子
本発明者らは、神経栄養因子の分泌を調節しているタンパク質を同定するために、生後発達期のマウス小脳に特異的に発現量が増加するｍＲＮＡを、後述の実施例１に示すように、蛍光ディファレンシャルディスプレイ（ＦＤＤ）法によって探索した。その結果、軸索形成、樹状突起形成、およびシナプス形成のような様々な細胞発達事象が活発に起こっている、生後１２日のマウス小脳において、その発現がピークに達する遺伝子を単離した。この遺伝子の配列を解析し、配列番号１の塩基配列を有することを同定した。本発明者らはこの遺伝子を、ＣＥＲＡＩＮ（ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ａｂｕｎｄａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ；神経栄養因子放出に関与する小脳に豊富なタンパク質）遺伝子と名付けた。さらに、本発明者らは、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の分布と局在、および、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能を突き止めた。
【００２６】
後述の実施例２および４に詳細を記載するが、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡは、中枢神経系では小脳に特異的に発現しており、生後２１日のマウス小脳においては小脳の内側顆粒層（ＩＧＬ）の顆粒細胞に卓越して局在していた。一方、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は生後２１日のマウス小脳においては、分子層（ＭＬ）に局在しており、ｍＲＮＡが内側顆粒層（ＩＧＬ）に局在している事実とは対照的である（後述の実施例４を参照）。このことは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が平行線維と呼ばれる顆粒細胞の軸索中で細胞内に分布することを示すものである。このことは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が、プルキンエ細胞の樹状突起の周囲に存在することを確認できた（後述の実施例５を参照）ことからも裏付けられた。したがって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は顆粒細胞の平行線維−プルキンエ細胞の間のシナプスにおける、平行線維側、すなわち、当該シナプス前末端に存在していることが明らかとなった。
【００２７】
小脳の細胞の細胞成分分画を分析したところ（後述の実施例６を参照）、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、ＮＴ−３およびＢＮＤＦとともに存在していることが明らかとなった。このことは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が神経栄養因子を含む、分泌小胞に結合していることを示すものである。また、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が神経栄養因子と共にプルキンエ細胞の樹状突起の棘に接続する平行線維末端部に局在することも確認した（後述の実施例７を参照）。
【００２８】
さらに、後述の実施例９および１０で詳細を述べるが、ＣＥＲＡＩＮタンパク質を発現した細胞においては、細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を誘導するＫＣｌによる刺激に応答して、神経栄養因子の放出を亢進することが明らかとなった。
【００２９】
したがって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、神経栄養因子の分泌を調節する分子として、本発明者らにより初めて同定されたものである。
本発明の、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡである。各アミノ酸をコードするコドンには縮重があるので、配列番号８のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、配列番号１の塩基配列以外の塩基配列を有する遺伝子も、本発明のＣＥＲＡＩＮ遺伝子に含まれる。さらに、配列番号１の塩基配列に１ないし複数の塩基が欠失、置換、挿入または付加した塩基配列であっても、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする可能性が高く、それらも本発明の遺伝子に含まれる。ここで、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能とは、神経栄養因子の分泌を調節する機能であってもよい。
【００３０】
さらにまた、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは配列番号１の塩基配列の相補鎖を有するＤＮＡとハイブリダイズ可能であってもよい。好ましくは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、配列番号１の塩基配列の相補鎖を有するＤＮＡとストリンジェントな条件（例えば６５℃および０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５  Ｎａ３クエン酸  ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズ可能であってよい。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能、とは、ハイブリダイゼーションの条件がストリンジェントな条件であってもハイブリダイズ可能であり、または、洗浄の条件がストリンジェントな条件であってもなおハイブリダイズ可能であることを意味する。すなわち、ハイブリダイゼーションの過程において、ＤＮＡ同士がハイブリダイズするのに最も過酷な条件がストリンジェントな条件であってもハイブリダイズ可能であることを意味する。このような配列番号１の塩基配列の相補鎖を有するＤＮＡとハイブリダイズ可能なＤＮＡも、本発明のＣＥＲＡＩＮ遺伝子に含まれる。
【００３１】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質オルソログとしてマウス以外の生物においても存在する可能性が高い。そのようなＣＥＲＡＩＮタンパク質オルソログをコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ＣＥＲＡＩＮタンパク質オルソログをコードするＤＮＡは、上記のＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡに包含されるであろう。
【００３２】
本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質を発現する細胞、例えば生後発達期の動物の小脳顆粒細胞のｍＲＮＡから、実施例１および２に記載した方法と同様にして得ることができる。あるいは、配列番号１をもとにＣＥＲＡＩＮタンパク質を特異的に増幅するプライマー、例えば、後述の本発明のプライマーをデザインして、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）により上記細胞のｍＲＮＡからＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードするＤＮＡを増幅して得てもよい。または、ＣＥＲＡＩＮをコードする遺伝子の断片を、ホスホルアミダイト法などの当業者に既知の核酸合成法によって、手動または自動で合成して得て、それらの断片をＰＣＲ技術によりつなぎ合わせることで、完全長のＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを得てもよい。本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、天然の細胞材料から単離されたもの以外に、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子に、任意の位置に任意の変異を導入して得てもよく、または、所望の位置に所望の変異を導入して得てもよい。任意の位置に任意の変異を導入するには、当業者に既知のエラープローンＰＣＲなどの手法を用いることができる。また、所望の位置に所望の変異を導入するには、変異を含むプライマーを用いてＰＣＲを行うなど、当業者に既知の変異導入方法を使用することができる。
【００３３】
本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする配列番号４に記載の塩基配列を含むＲＮＡをも含む。本発明のＲＮＡを得るためには、上記のＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等のタンパク質をコードする遺伝子の二本鎖ＤＮＡをテンプレートにしてＲＮＡポリメラーゼ、たとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなど、を使用して転写反応により得ることができる。
【００３４】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質
本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を有する。ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、アミノ酸配列の相同性解析を行ったところ、Ｃａ２＋依存性分泌アクチベータータンパク質（ＣＡＰＳ）と７０．４％のアミノ酸同一性を有する（図１Ｃ）。また、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、ＣＡＰＳタンパク質においてその機能のために必須のＣ２ドメインを有し、さらに、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインに類似の領域を含む構造特徴を有する（図２Ａ）。
【００３５】
本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質と７０．４％の相同性を有するＣＡＰＳタンパク質は、神経内分泌細胞からの神経ペプチドやカテコールアミンなどの分泌を調節するタンパク質で、ラット脳の精製形質膜および有芯小胞（ＤＣＶ）と会合している（Ｂ．  Ｂｅｒｗｉｎら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９８，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ．１３７−；を参照）。アメフラシ運動ニューロン中においては、神経ペプチドを含むＤＣＶは、活性帯から離れて、および近くに位置する（Ｔ．  Ｋａｒｈｕｎｅｎ  ら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２００１，  Ｖｏｌ．２１，  ＲＣ１２７；を参照）が、そのような電気有芯小胞（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｄｅｎｓｅ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ）構造は、平行線維−プルキンエ細胞シナプス中には観察されていない。したがって、ＣＡＰＳタンパク質はＤＣＶと会合して比較的偏在的に発現し、および、ＤＣＶ構造が見られない平行線維−プルキンエ細胞シナプス中には観察されないが、本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質は神経栄養因子（ＮＴ−３およびＢＮＤＦ）を含む小胞と会合して平行線維−プルキンエ細胞シナプスのシナプス前部に局在する。このことは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質はＣＡＰＳタンパク質とは異なる部位で働いていることを示している。
【００３６】
また、ＣＡＰＳタンパク質は、膜透過性化したＰＣ１２細胞におけるＣａ２＋誘発ＤＣＶエキソサイトーシスに必須なことが以前に報告され（Ａ．  Ｔａｎｄｏｎら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９８，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ．１４７−；を参照）、また、ショウジョウバエにおいても、ショウジョウバエＣＡＰＳオルソログ（ｄＣＡＰＳ）を欠いた個体を用いた実験から、ｄＣＡＰＳが神経筋接合部におけるＤＣＶエキソサイトーシスに必要なことが示された（Ｒ．  Ｒｅｎｄｅｎら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  ２００１，  Ｖｏｌ．３１，  ｐ．４２１−；を参照）。ＣＡＰＳのＣａ２＋誘発ＤＣＶエキソサイトーシスには、Ｃａ２＋依存性脂質結合に関係することが知られるＣ２ドメインが不可欠な領域であることが報告されている（Ｂ．  Ｂｅｒｗｉｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９８、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１３７−；Ａ．  Ｔａｎｄｏｎら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９８，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ．１４７−；を参照）。本発明においてはＣＥＲＡＩＮタンパク質は神経栄養因子の放出に関連していることを明らかにし、したがって、ＣＡＰＳタンパク質とは７０．４％のアミノ酸同一性を有しながらも異なる機能を有する。
【００３７】
したがって、本発明は配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＥＲＡＩＮタンパク質を含む。別の態様において、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列に、１ないし複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、または付加したアミノ酸配列を有し、および、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質であってもよい。ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と少なくとも７０．４％より大きいアミノ酸同一性を有し、望ましくは８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上である。アミノ酸同一性は、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング）などを用いたホモロジーサーチによって決定することができる。ここで、ＣＥＲＡＩＮと同等の機能とは、神経栄養因子の分泌を調節する機能であってよい。
【００３８】
本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質には、マウス以外の生物におけるＣＥＲＡＩＮタンパク質オルソログも包含されるであろう。
【００３９】
さらに、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列の一部を含み、およびＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含む。
本発明のタンパク質は、それらを発現している細胞から抽出・精製して得てもよい。また、それらをコードする本発明の遺伝子を後述する適当なベクターに組み込んで、微生物または動物細胞などに形質転換して、それらタンパク質を発現させ、その細胞から所望のタンパク質を抽出・精製して得てもよい。遺伝子の形質転換方法、タンパク質の抽出・精製方法は、当該技術分野で知られた種々の方法を用いてもよい。
【００４０】
後述の実施例９に詳細を述べるが、ＣＥＲＡＩＮタンパク質におけるＣ２ドメインおよびＰＨドメインは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能にとって重要であることが本発明者らにより確認された。
【００４１】
上記の経緯から、本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＣ２ドメインおよびＰＨドメインを含むことを特徴とするタンパク質をコードする配列番号２の塩基配列を含むＤＮＡを含む。また、本発明はＣＥＲＡＩＮタンパク質からＣ２ドメインおよびＰＨドメインを除いたアミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質をコードする配列番号３の塩基配列を含むＤＮＡを含む。加えて、本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＣ２ドメインおよびＰＨドメインを含むことを特徴とする、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。また、本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＣ２ドメインおよびＰＨドメインを除いたアミノ酸配列を有することを特徴とする、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００４２】
上記のＣＥＲＡＩＮの一部のドメインを含むタンパク質のＤＮＡを得るには、そのＤＮＡの断片を、ホスホルアミダイト法などの当業者に既知の核酸合成法によって、手動または自動で合成して得て、それらの断片をＰＣＲ技術によりつなぎ合わせることで、目的のＤＮＡを得てもよい。また、上記のＣＥＲＡＩＮの一部のドメインを含むタンパク質を得るには、それらをコードする遺伝子を微生物または動物細胞などに形質転換して、それらタンパク質を発現させ、その細胞から所望のタンパク質を抽出・精製して得てもよい。遺伝子の形質転換方法、タンパク質の抽出・精製方法は、当該技術分野で知られた種々の方法を用いてもよい。
【００４３】
ＣＥＲＡＩＮ遺伝子を有するベクターおよび組み換え体
さらに、本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質を発現させるために、それらのタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含む。ここで、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミドなどであってもよい。本発明はまた、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質コードする遺伝子を外因的に導入した、遺伝子組換え宿主細胞を含む。
【００４４】
プライマーおよびプローブ
本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の一部を特異的に増幅するためのプライマー対を含む。目的のタンパク質をコードする遺伝子の配列が同定されれば、その遺伝子の一部を特異的に増幅するためのプライマーは、市販のプライマー設計用ソフトウェア（例えばＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング）など）などを用いることで、容易に選択することができる。望ましい態様においては、本発明は、配列番号１の塩基配列の一部であって、１０から４０塩基で構成されるＤＮＡ、および、配列番号４の塩基配列の相補鎖の一部であって１０から４０塩基で構成されるＤＮＡからなるプライマー対であって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子の一部を特異的に増幅するためのプライマー対を含む。さらに望ましい態様は、配列番号５の塩基配列を有するＤＮＡ、および、配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡからなるプライマー対である。
【００４５】
また、本発明はＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を特異的に検出可能なプローブを含む。一態様においては、本発明のプローブは、配列番号１の塩基配列の相補鎖の一部であって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子を特異的に検出可能なプローブである。望ましくは、本発明のプローブは、１０塩基から１０００塩基で構成される。さらに望ましくは、本発明のプローブは、配列番号７の塩基配列を有するプローブである。ここで、本発明のプローブはＤＮＡであってもよく、またはＲＮＡであってもよい。また、本発明のプローブは、標識のための部位を含んでいてよく、標識は、放射性元素標識、蛍光標識、ジゴキシゲニン標識、ビオチン標識、などであってよい。
【００４６】
本発明のプライマーおよびプローブは、ホスホルアミダイト法などの当業者に既知の核酸合成法によって、手動または自動で合成して得ることができる。標識は、核酸合成の過程で連結してもよいし、核酸合成の後に連結してもよい。
【００４７】
本発明のプライマーは、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子を特異的に増幅するほか、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）によって半定量する方法にも用いることができる。具体的には、以下の工程：
１）試料となる細胞からトータルＲＮＡまたは所望によりｍＲＮＡを抽出し；
２）本発明のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）を行い；および
３）増幅されたＤＮＡ断片の量を評価する；
ことを含んでいてよい。具体的な操作については、例として実施例２に記載するが、実施例はあくまで一例であり、本発明はこれに限定されない。
【００４８】
本発明のプローブは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、組織中のｍＲＮＡの検出を行うために用いることができる。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは当業者に既知の方法で行うことができる。具体的には、実施例４に一例を示すが、実施例はあくまで一例であり、本発明はこれに限定されない。
【００４９】
また、本発明のプローブは、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションによって定量する方法にも用いることができる。具体的には、以下の工程：
１）試料となる細胞からｍＲＮＡを抽出し；
２）抽出したｍＲＮＡについてノーザンハイブリダイゼーション行い、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡを本発明のプローブで検出し；および、
３）検出されたＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのバンドを評価する；
ことを含んでいてよい。
【００５０】
抗体
本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質に対する抗体を含む。本発明の抗体は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質に対して作成してもよいし、または、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質のフラグメントに対して作成してもよい。ここで、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質のフラグメントは、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、または少なくとも３０アミノ酸を含むフラグメントである。抗体は、上記のタンパク質またはフラグメントを、当該技術分野において抗体作成のために用いられる動物、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギなど、に免疫して作成してもよい。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。抗体は、当業者に既知の抗体作成方法に基づいて作成することができる。
【００５１】
本発明の抗体は、免疫組織化学分析において組織中のＣＥＲＡＩＮタンパク質を検出するのに用いることができ、試料細胞のホモジネートからＣＥＲＡＩＮタンパク質をアフィニティー精製により回収するのに用いることができ、または、細胞中のＣＥＲＡＩＮタンパク質の量を定量する方法にも用いることができる。細胞中のＣＥＲＡＩＮタンパク質の量を定量する方法は、例えば、ウエスタンブロットによる方法と、ＥＬＩＳＡによる方法がある。ウエスタンブロットによる方法は、以下の工程：
１）試料となる細胞のホモジネートから、本発明の抗体を結合した担体を用いてＣＥＲＡＩＮタンパク質を回収し、
２）回収したＣＥＲＡＩＮタンパク質のウエスタンブロットを行い、本発明の抗体で検出し；および
３）検出されたＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのバンドを評価する；
ことを含んでいてよい。
【００５２】
またはＥＬＩＳＡによる方法は、以下の工程：
１）試料となる細胞のホモジネートから、本発明の抗体を結合した担体を用いてＣＥＲＡＩＮタンパク質を回収し、
２）回収したＣＥＲＡＩＮタンパク質のＥＬＩＳＡを行い、本発明の抗体で検出し；および
３）検出されたＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのバンドを評価する；
ことを含んでいてもよい。
【００５３】
スクリーニング方法
本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する物質をスクリーニングする方法を提供する。ここで、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する物質の候補は、タンパク質、ペプチド、抗体、または低分子化合物などであってよい。本発明の一態様において、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程：
１）ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質、および、候補物質を接触させ；
２）ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質に結合する物質を選択し；
３）選択した物質のＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する能力を評価し；および、
４）ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する能力を有する物質を選択すること；を含む。
【００５４】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質と、候補物質とを接触させ、当該タンパク質に結合した候補物質を選択するには、たとえば、以下の方法を用いることができる。一態様においては、当該タンパク質をマルチウェルプレートのウェル中、またはビーズ上などの支持体に固定化する。ここで、当該タンパク質の支持体上への固定化には当業者に既知の方法、たとえば、ａ）当該タンパク質の第１級アミノ基と支持体上のカルボキシル基をアミノカップリングにより共有結合的に結合する方法、ｂ）当該タンパク質をＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として作成し、支持体上に被覆されたグルタチオンに結合させ、当該タンパク質を支持体上に固定化する方法、またはｃ）当該タンパク質をヒスチジンタグで標識して、金属キレート担体（たとえば、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−ニトリロ三酢酸））を固定化した支持体上に当該タンパク質を固定化する方法などを用いることができる。次に、標識した候補物質の溶液を、当該タンパク質が固定化されたウェル中にまたはビーズと共に加えて、所望の条件下でインキュベートして候補物質と当該タンパク質を接触させる。その後、当該タンパク質に結合していない成分を洗浄する。当該タンパク質に結合した候補物質については、候補物質の標識により検出して、当該タンパク質との結合の確認できた候補物質を識別し、当該タンパク質に結合する物質として選択する。ここで、候補物質に付する標識は、当業者に既知のいずれかの標識を用いることができるが、たとえば、蛍光標識、放射性元素標識、またはビオチンによる標識、などを用いることができる。別の態様においては、候補物質をそれぞれマルチウェルプレートのウェル中に固定化し、そこに当該タンパク質の溶液を添加し、結合しなかったタンパク質を洗浄した後、候補物質に結合している当該タンパク質の存在をＥＬＩＳＡなどの方法によって検出する。当該タンパク質の存在が確認されたウェルに固定化した候補物質を、当該タンパク質に結合する物質として選択する。
【００５５】
ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質に結合した候補物質について、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する能力を有するか否かを評価するには、たとえば、以下の方法を用いることができる。まず、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を、神経栄養因子をコードする遺伝子と共に、細胞（たとえば、ＰＣ１２細胞、ＡｔＴ−２０細胞など）に形質転換してＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質および神経栄養因子を発現させる。次に、その形質転換細胞をＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質に結合した候補物質の存在下、および非存在下で培養する。所定の時間培養した後、形質転換細胞から分泌された神経栄養因子の量を測定し、候補物質が存在しない場合と比較して、神経栄養因子の分泌量を変化させることができた物質を、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する能力を有する物質であると判断する。具体的には、例えば実施例９および１０に記載の実験系と同様の実験系を用いて、候補物質の存在下および非存在下での神経栄養因子の分泌量を評価し、それにより候補物質のＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する能力の有無を評価することができる。当業者は、実施例に記載の方法を適宜変更して用いることもできるし、または、当業者に既知のいずれかの方法を用いて評価系を構築することもでき、それらも本発明の範囲内である。
【００５６】
本発明の別の態様において、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程：
１）ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質を発現している細胞の培養液に候補物質を添加し；および
２）候補物質を添加しない細胞と比較して、神経栄養因子の分泌量に変化のあった物質を、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する物質として選択する；
ことを含む。神経栄養因子の分泌量を評価するには、前述の方法を用いることができる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法において、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能は、神経栄養因子の分泌を調節する機能である。したがって、本発明のスクリーニング方法において、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能の調節は、神経栄養因子の分泌を調節する機能の阻害であってもよく、または促進であってもよい。なお、神経栄養因子の分泌の調節とは、分泌の亢進であってもよく、または分泌の抑制であってもよい。
【００５８】
本発明は、本発明のスクリーニング方法で得られた、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する能力を有する物質をも含む。
【００５９】
診断
神経栄養因子類、特にＢＤＮＦについては、平行線維−プルキンエ細胞シナプスの短期シナプス可塑性において調節的な役割を有し、およびシナプス小胞の数および分布を調節することが示されている（Ａ．  Ｒ．  Ｃａｒｔｅｒら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．２２，  ｐ．１３１６−；を参照）。神経栄養因子の発現及び放出が活性依存的だとすると、神経栄養因子は、より活性なシナプスにおいて可塑性が強化されるメカニズムによって神経回路が形成されるとする、ヘッブの原理による可塑性の重要なメディエーターであるかもしれない（Ａ．  Ｒ．  Ｃａｒｔｅｒら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．２２，  ｐ．１３１６−；を参照）。したがって、完全に発生が終了した小脳の神経回路においても、神経栄養因子の分泌を調節することは、神経回路の増強に関与することが考えられる。ＣＥＲＡＩＮタンパク質による神経栄養因子の分泌を調節する機能は、活性依存性シナプス可塑性を生じるための鍵となりうる。
【００６０】
神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患においては、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の顆粒細胞内での存在のレベルが疾患の状態に影響していることも考えられる。したがって、本発明のプライマー、プローブ、または抗体は、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の診断のために用いることができる。ここで、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患は、神経性疾患などであり、望ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症などである。
【００６１】
本発明のプライマーは、当業者に既知のＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ＰＣＲ）などによって、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの半定量など行うことにより、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の診断に用いてもよい。この場合に、ＰＣＲの過程は定量的ＰＣＲによるものであってもよい。
【００６２】
本発明のプローブは、当業者に既知のノーザンハイブリダイゼーションなどによって、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの定量を行うことで、当該疾患の診断に用いてもよい。また、本発明の抗体は、当業者に既知のウエスタンブロットおよび／またはＥＬＩＳＡによって、細胞内のＣＥＲＡＩＮタンパク質発現量を検査するなど、当該疾患の診断に用いてもよい。
【００６３】
医薬組成物
前述したとおり、神経栄養因子の分泌の調節が神経回路の増強に関与しうるので、ＣＥＲＡＩＮタンパク質およびそれと同等の機能を有するタンパク質、または、それらのタンパク質の機能を調節する能力を有する分子は、神経栄養因子の分泌を調節することで神経回路の増強に寄与するであろう。従って、本発明のＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、ＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質に対する抗体、または、本発明のスクリーニング方法により得られたＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質の機能を調節する物質（以降本明細書において、本発明の有効成分、と表記する。）は、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療に有効である。それらを含む医薬組成物は本発明の範囲内である。ここで、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患は神経性疾患であり、望ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮側索硬化症などである。
【００６４】
本発明の医薬組成物は、本発明の有効成分を単独で含んでいてもよいが、一般にはそれらに加えて、所定の経路および標準的な製剤方法に関して適切に選択された医薬的に許容できるキャリアー、希釈剤、および賦形剤なども含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアー、希釈剤、および賦形剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の活性には全く影響を与えないものである。
【００６５】
本発明の有効成分の、特にＣＥＲＡＩＮタンパク質もしくはそれと同等の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子については、プラスミド、コスミド、またはファージミドなどのベクターに組み込まれていてもよい。そして、この遺伝子またはベクターに組み込まれた遺伝子は、リポソーム、またはアデノウイルスベクターなどのウイルスベクター中に含まれていてもよい。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、非経口で、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与されるように調製されてよい。この場合、本発明の医薬組成物は液剤、または懸濁液剤などの形態であってよく、これらの液剤または懸濁液剤は溶液を血液と等張にするために十分な塩類またはグルコースその他の物質を含んでいてよい。これらの溶液は、必要に応じて適切に緩衝される（好ましくはｐＨ３〜９）。また、これらの溶液は、無菌状態の形態であることが最も適切である。無菌条件下での適切な非経口製剤の製造は、当業者には周知の標準的な製材技術によって容易に行うことができる。
【００６７】
または、本発明の医薬組成物は、経口で、または経粘膜で投与されるように調製してもよい。この場合、本発明の医薬組成物は、液剤、懸濁液剤、錠剤、カプセル、オビュール、エリキシル剤などの形態であってよい。錠剤は、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシンなどの賦形剤、例えばデンプン（好ましくはコーンスターチ、じゃがいもデンプンまたはタピオカデンプン）、ナトリウムデンプングリコレート、クロスカルメロースナトリウム及び特定の複合ケイ酸塩類などの崩壊剤、並びに、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ショ糖、ゼラチン及びアラビアゴムなどの造粒結合剤を含んでよい。加えて、滑沢剤の例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、グリセリルベヘネート及びタルクなどを含んでよい。これらを、ゼラチンカプセル中に充填してカプセル剤としてもよい。この点に関して好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液剤及び／またはエリキシル剤の場合、様々な甘味剤または香味剤、着色物質または染料、乳化剤及び／または懸濁化剤、および希釈剤の例えば水、エタノール、プロピレングリコールまたはグリセリン、ならびにその組合せを含んでもよい。
【００６８】
本発明の医薬組成物において、本発明の有効成分の１日用量レベルは、医師が経験に基づいて決定することができる。実際の投与量は、個々の治療を受ける対象の体重、年齢、疾患の状態および応答によって変化するであろう。医師であれば、任意の個々の対象に最も適した実際の用量を決定できるであろう。医師によって決定される投与量の範囲は、本発明に含まれる。また、本発明の医薬組成物は単回投与されてもよいし、または分割投与であってもよい。また、本発明の医薬組成物は、短期間に投与されてもよく、また、長期に渡って継続的に投与されてもよい。
【００６９】
【実施例】
実施例１  ＣＥＲＡＩＮ遺伝子の同定
生後発達期のマウス小脳に特異的に発現量の増加するｍＲＮＡの探索を、蛍光ディファレンシャルディスプレイ（ＦＤＤ）法によって行ない、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子を同定した。
【００７０】
種々の発達期（胎齢１８日、生後０日、生後３日、生後７日、生後１２日、生後１５日、生後２１日または生後５６日）のＩＣＲマウス（Ｎｉｐｐｏｎ  ＳＬＣ、静岡、日本）の小脳から、ＤＮＡを含まないトータルＲＮＡを得た。トータルＲＮＡ２．５μｇを、１０μｌのＤＥＰＣ（ジエチルピロカルボネート）処理水中の５０ｐｍｏｌのアンカーオリゴｄＴプライマー（５’−ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ−３’（配列番号１１）：以下、アンカープライマー）と混合し、７０℃で１０分加熱し、氷水にチューブを浸すことで冷却した。この溶液に、２００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州、ロックビル）を含有する２ｘＲＴ溶液（１ｘＲＴ溶液は２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，５０ｍＭ  ＫＣｌ，２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡおよび０．５ｍＭ各ＮＴＰ）を１０μｌ加えて、よく混合し、２５℃で１０分間および４２℃で５０分間インキュベートして、トータルＲＮＡの逆転写反応を行った。９０℃で５分間加熱した後、反応溶液は８０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加えて５倍に希釈し、使用するまで−２０℃で保存した。
【００７１】
９６穴マイクロタイタープレートのそれぞれのウェル中に、上記の逆転写反応で得られたｃＤＮＡ溶液２μｌ、５ｐｍｏｌのアンカープライマー、および１０ｐｍｏｌの任意の１０塩基のプライマーを用意して、ＥｘＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔ（宝酒造、京都、日本）を用いて、添付のプロトコルに従って２０μｌの容量でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。ＰＣＲは、９４℃、３分；４０℃、５分；７２℃、５分の後、９５℃、１５秒；４０℃、２分；７２℃、１分を２０−２５サイクル行い、さらに最終的な伸長工程として７２℃で５分間加熱した。
【００７２】
ＰＣＲ産物は６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、蛍光色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（宝酒造）で染色した後、コンピュータ制御の蛍光イメージ分析器、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いて分析した。任意の１０塩基のプライマーのうち、５’−ＡＧＧＴＧＡＣＣＧＴ−３’（配列番号１２）を使用したウェルにおけるＰＣＲ産物に、生後発達期のマウス小脳において特異的に発現量が増加するバンドが確認された（データは示さない）。
【００７３】
上記のバンドをポリアクリルアミドから切り出し、切り出したゲルを５０（または１００）μｌのＰＣＲ反応液に加え、ＰＣＲを行って再増幅した。通常はＰＣＲを３０サイクル行うことで十分な量のＰＣＲ産物が得られた。再増幅したＤＮＡ断片はｐＴ７Ｂｌｕｅ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ウイスコンシン州、マディソン）にクローニングし、ダイデオキシ法により配列解析を行った。その結果、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子（配列番号１）を同定した。
実施例２  逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）による解析
ＲＴ−ＰＣＲ
マウス小脳の生後発達期におけるＣＥＲＡＩＮの発現量の推移を調べるために、実施例１に示した種々の発達期におけるマウス小脳のトータルＲＮＡ  ２０ｎｇについて、実施例１のディファレンシャルディスプレイで得られたバンドの内部配列を特異的に増幅するプライマーの対（５’−ＣＧＴＧＴＣＴＧＡＧＣＴＴＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号５）および５’−ＧＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣ−３’（配列番号６））を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で１分加熱した後、９４℃、３０秒−６０℃、１分−７２℃、１分のサイクルを２４サイクル繰り返す条件で行った。ＰＣＲ産物は６％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、蛍光色素ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（宝酒造）で染色した。
【００７４】
ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの発現についての組織分布を調べるためには、生後５６日のマウスの種々の組織（脳全体、小脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉（骨格筋）、精巣、子宮、卵巣）から得られたトータルＤＮＡを用いた。また、内部標準としてグリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のＲＴ−ＰＣＲを、５’−ＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣ−３’（配列番号１３）および５’−ＧＣＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１４）を用いて行った。
【００７５】
マウス小脳の生後発達期におけるＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡ発現量の推移
種々の発達期におけるマウス小脳のＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を図１Ａに示す。Ｅ１８は胎齢１８日を表し、Ｐｘ（ｘには数字が入る）は生後ｘ日目であることを表す。ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡは生後１２日（Ｐ１２）頃に発現量がピークを示し、その後徐々に成体レベルへ減少した。生後１２日頃というのは、軸索形成、樹状突起形成、およびシナプス形成のような様々な細胞発生事象が活発に起こっている時期である。
【００７６】
ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの発現についての組織分布
生後５６日のマウスの種々の組織のＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの結果を図１Ｂに示す。ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡは中枢神経系の中では小脳で卓越して発現された。非神経細胞組織においても、胚、脾臓、精巣、子宮および卵巣においては低いレベルで検出されるが、その他の組織においてはほとんど発現されなかった。
実施例３  ＣＥＲＡＩＮタンパク質の相同性分析
実施例１で得たＣＥＲＡＩＮ遺伝子（配列番号１）がコードするアミノ酸配列を導出し、これをＣＥＲＡＩＮタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号８）とした。
【００７７】
ＢＬＡＳＴサーチを用いてアミノ酸配列相同性検索を行ったところ、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が、Ｃａ２＋依存型分泌アクチベータータンパク質である、マウスＣＡＰＳタンパク質と７０．４％のアミノ酸同一性を有することが明らかとなった（図１Ｃ）。このデータは、ＣＥＲＡＩＮがＣＡＰＳのパラログ（ゲノム内の複製で生じて新機能を獲得した遺伝子）であることを示す。また、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、ＣＡＰＳタンパク質においてＣａ２＋依存性脂質結合に関連し、Ｃａ２＋誘発ＤＣＶ（有芯小胞）エキソサイトーシスに不可欠であるＣ２ドメイン（Ｂ．  Ｂｅｒｗｉｎら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９８，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ．１３７−；Ａ．  Ｔａｎｄｏｎら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９８，  Ｖｏｌ．２１，  ｐ．１４７−；を参照）を、対応する領域（配列番号８のアミノ酸残基３６９−４５２）に有し、さらに、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインに類似の領域（配列番号８のアミノ酸残基４９４−５９６）を含む構造特徴を有することが示唆された（図２Ａ）。図２Ａは、推定ＣＥＲＡＩＮタンパク質（１，２６４アミノ酸残基）の概略を図示したものであり、Ｃ２ドメイン、ＰＨドメイン、および、Ｍｕｎｃ１３−１と相同な領域（配列番号８のアミノ酸残基６７７−１１６６）を四角の枠で示し、ならびにシンタキシン相互作用ドメイン（ＳＩＤ：配列番号８のアミノ酸残基９７４−１１４１）を外側の枠で示した。
【００７８】
さらに、ＣＥＲＡＩＮ配列（配列番号１）についてＮＣＢＩデータベースのＢＬＡＳＴサーチを行った結果、最近登録されたマウスＣＡＰＳ２のｃＤＮＡ配列はＣＥＲＡＩＮのものとは相違しており、したがって、推定されるアミノ酸配列も異なる（図１Ｃ）。しかしながら、いずれかの配列に存在する２カ所の伸長部分は、おそらく選択的スプライシング事象に由来するものと考えられる。したがって、ＣＥＲＡＩＮおよびＣＡＰＳ２は同一の遺伝子に由来し、同一の機能を有するものと考えられる。
実施例４  ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の小脳内局在
１）ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの局在
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法によって、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの小脳内局在を分析した。傍矢状切片について、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡをジゴキシゲニン標識アンチセンスｃＲＮＡプローブ（配列番号７）でプローブして、当業者に既知のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した。
【００７９】
生後２１日および生後７日のマウス脳のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学の結果をそれぞれ、図２Ｂ〜Ｄ、および、図３Ａ〜Ｃに示した。生後２１日における結果については、図２Ｂでマウス全脳、図２Ｃでマウス小脳、および図２Ｄで小脳皮質での結果を示した。生後２１日においては、ＣＥＲＡＩＮｍＲＮＡは小脳の内側顆粒層（ＩＧＬ）の顆粒細胞に卓越して局在（図２Ｂ、ＣおよびＤ）し、海馬領域および脚間核では低レベルで検出された（図２Ｂ）。生後７日における結果については、図３Ａでマウス全脳、図３ＢおよびＣでマウス小脳、での結果を示した。生後７日においては、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡは内側顆粒層（ＩＧＬ）で検出された。また、外側胚層（ＥＧＬ）の内側半分である前移動帯で検出されたが、外側半分である増殖帯では検出されなかった（図３Ｃ）。このことは、ＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡは有糸分裂後の、分化中および分化後の顆粒細胞に特異的に発現することが示された。
【００８０】
２）ＣＥＲＡＩＮタンパク質の局在
免疫組織化学分析によって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の小脳内局在を分析した。
【００８１】
生後７日および生後２１日のマウス脳の傍矢状切片について、ウサギポリクローナル抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−８９）抗体を用いて免疫組織化学分析を行った。
【００８２】
生後７日目および生後２１日目のＩＣＲマウスを４％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）でかん流固定後、脳を取り出し、再度、４％ＰＦＡで１時間後固定した。１５％ショ糖溶液に４℃で１昼夜浸して置換後、ＯＣＴコンパウンド（サクラ精器（株））に入れて凍結させる。凍結ブロックを１４μｍ厚の切片にクリオスタットで薄切りする。凍結切片を３％Ｈ２Ｏ２、３％メタノール水溶液で１５分間処理した後、５％正常血清で１時間ブロッキングした。１／２００に希釈した１次抗体（抗ＣＥＲＡＩＮ抗体）と４℃で一昼夜反応させた。次いで、１／２０に希釈した二次抗体（ビオチン標識抗ウサギ抗体）を室温で１時間反応させた。ＡＢＣＥｌｉｔｅキット（ベクター社）で抗体反応を発色させＣＥＲＡＩＮタンパク質を検出した。
【００８３】
生後７日および生後２１日のマウス脳の免疫組織化学分析の結果をそれぞれ、図３Ｄ〜Ｆおよび図２Ｅ〜Ｇに示した。生後７日における結果については、図３Ｄは全脳、図３ＥおよびＦは小脳皮質におけるＣＥＲＡＩＮタンパク質の分布を示す。生後２１日における結果については、図２Ｅは全脳、図２Ｆは小脳、および図２Ｇは小脳皮質におけるＣＥＲＡＩＮタンパク質の分布を示す。生後７日においては、ＣＥＲＡＩＮタンパク質はｍＲＮＡと同様、内側顆粒層（ＩＧＬ）および前移動帯で検出された（図３Ｆ）。一方、生後２１日においては、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は分子層（ＭＬ）に特異的に局在し（図２Ｇ）、ｍＲＮＡが内側顆粒層（ＩＧＬ）局在している（図２Ｄ）こととは顕著に対照的である。このことは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は平行線にと呼ばれる顆粒細胞軸索中に細胞下で分布することを示すものである。
【００８４】
３）ＣＡＰＳ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の局在
前述したのと同様に免疫組織化学分析によって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質のパラログであるＣＡＰＳタンパク質の小脳内局在を分析した。
【００８５】
生後７日および生後２１日のマウス脳の傍矢状切片について、ウサギポリクローナル抗ＣＡＰＳ（アミノ酸残基１８−１０７）抗体を用いて免疫組織化学分析を行った。
【００８６】
生後２１日のマウス小脳におけるＣＡＰＳタンパク質の免疫組織化学分析の結果を、図２ＨおよびＩに示した。ＣＡＰＳタンパク質はＣＥＲＡＩＮタンパク質とは対照的に全脳にわたってほとんど偏在的に発現し（データは示さない）、小脳においては主に内側顆粒層（ＩＧＬ）（糸球体ロゼットおよび顆粒細胞−苔状線維−ゴルジ細胞シナプス中に）に顕著に、また分子層（ＭＬ）のプルキンエ細胞の樹状突起にも低レベルで局在した（図２ＨおよびＩ）。
【００８７】
また、ＣＡＰＳ  ｍＲＮＡについてもｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織分析によってｍＲＮＡの局在を評価したところ、内側顆粒層（ＩＧＬ）中に卓越して局在が観察された（データは示さない）。
【００８８】
したがって、ＣＥＲＡＩＮは軸索により、ＣＡＰＳは樹状突起により、それぞれ異なる局在化経路により輸送され、そして小脳において、特異の役割を果たすと考えられる。
実施例５  ＣＥＲＡＩＮタンパク質の細胞内局在
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の細胞内局在を調べるために、１４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ｄａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：以下ＤＩＶ）で培養した小脳初代培養物中のＣＥＲＡＩＮタンパク質の細胞内局在をウサギまたはモルモットポリクローナル抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−１０７）抗体を用いて免疫細胞化学分析を行った。
【００８９】
マウス小脳初代培養細胞（１４ＤＩＶ）を４％ＰＦＡで室温にて１５分固定した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ溶液で５分間処理した。その後、５％正常血清で１時間ブロッキングした。１／２００に希釈した１次抗体（抗ＣＥＲＡＩＮ抗体）と４℃で一昼夜反応させた。次いで、１／２０に希釈した二次抗体（ビオチン標識抗ウサギ抗体）を室温で１時間反応させた。ＡＢＣＥｌｉｔｅキット（ベクター社）で抗体反応を発色させＣＥＲＡＩＮタンパクを検出した。
【００９０】
免疫染色した細胞は、共焦点顕微鏡で観察した。抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−１０７）抗体による染色は緑色を呈し、プルキンエ細胞の樹状突起を染色する抗カルビンジン抗体およびシナプス後性マーカータンパク質ＰＳＤ９５を染色する抗ＰＳＤ９５抗体による染色は赤色を呈する。結果を図４ＡおよびＢに示す。
【００９１】
ＣＥＲＡＩＮの免疫反応性はカルビンジン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）に対して免疫染色されたプルキンエ細胞（図４においてＰｕ）の樹状突起の周りに密集する点状パターンとして観察された（図４Ａ）。これらの免疫陽性点は、シナプス後性マーカータンパク質ＰＳＤ９５のものの近くにあったことから（図４Ｂ），ＣＥＲＡＩＮタンパク質のシナプス前部での局在が示唆された。
【００９２】
このことを確認するために、６週齢マウス小脳の分子層（ＭＬ）の、前包埋金粒子銀増感法による免疫−金電子顕微鏡観察を行った。具体的には、マウス脳切片とウサギ抗ＣＥＲＡＩＮ抗体と反応させた。続いて、金粒子を結合させた抗ウサギＩｇＧ  Ｆａｂ断片と反応させた。銀増感後、エポン樹脂に包埋して超薄切片を作成した。これを電子顕微鏡を用いて観察した。その結果を図４Ｃに示す。
【００９３】
ＣＥＲＡＩＮに対する免疫金は、プルキンエ細胞の樹状突起棘を連結する平行線維末端部に濃縮され、分泌小胞構造体（ｖ）、ならびに、活性帯およびシナプス外の部位の周りの領域（矢印で示した）に局在した（図４Ｃ）。これらのデータは、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が、顆粒細胞の平行線維のシナプス前末端に存在することを示す。
実施例６  細胞成分分画の分析
１）スクロース密度勾配遠心分離による細胞成分分画の分析
ＣＥＲＡＩＮタンパク質を含む細胞成分分画の性質を調べた。生後２１日のマウス小脳をホモジナイズ溶液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  スクロース、プロテアーゼインヒビター）で氷冷下でホモジナイズした。これを８００ｘｇ、１０分間、４℃で遠心して、上清を回収し、９倍量の水を加えた。さらに、１００，０００ｘｇで４℃、１時間、超遠心にかけ、沈査（ペレット（Ｐ２画分））を回収して解析に用いた。Ｐ２画分を、０．３から１．８Ｍスクロースの連続勾配での浮上アッセイにより更に分画した。遠心分離後、細画分を、それぞれＣＥＲＡＩＮ、神経栄養因子ＢＮＤＦ、シナプス小胞（ＳＶ）についてはＳＶマーカータンパク質であるシナプトフィシン（Ｓｙｎ）、または有芯小胞（ＤＣＶ）についてはＤＣＶマーカータンパク質であるセクレトグラニンＩＩ（ＳｇＩＩ／クロモグラニンＣ）についてウエスタンブロッティングにより分析した。染色は、ＣＥＲＡＩＮについてはウサギ抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−１０７）、ＢＮＤＦについてはウサギ抗ＢＤＮＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｉｎｃ．，米国）、シナプス小胞（ＳＶ）マーカータンパク質シナプトフィシン（Ｓｙｎ）についてはマウスモノクローナル抗シナプトフィシン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）、または、ＤＣＶ（有芯小胞）マーカータンパク質セクレトグラニンＩＩ（ＳｇＩＩ／クロモグラニンＣ）については抗セレクトグラニンＩＩ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ＳｇＩＩ（Ｍ−２０），Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＣ−１４９１）をそれぞれ用いた。結果を図５Ａに示す。
【００９４】
シナプトフィシンに対して陽性であったシナプス小胞は低密度画分（上から下へ、画分番号２−４）に回収された一方、セクレトグラニンＩＩに対して陽性であった有芯小胞は高密度画分（画分番号１０−１２）に回収された。ＣＥＲＡＩＮタンパク質に対する免疫反応性は、これらの小胞画分とは一致せず、中間画分（画分番号７−９）に回収された。さらに、このＣＥＲＡＩＮに対して陽性であった画分は、ＢＤＮＦに対しても免疫反応性を有していたことから、この画分はＢＤＮＦを含む小胞または複合体であることが示唆された。
【００９５】
２）免疫アフィニティー精製による細胞成分分画の分析
抗体被服磁気性ビーズ（抗体は、それぞれウサギ抗ＣＥＲＡＩＮまたはマウス抗シナプトフィシン、もしくは、対照としてウサギＩｇＧまたはマウスＩｇＧを用いた）を用いることにより、小胞を免役アフィニティー精製し、それらのタンパク質成分をウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡにより分析した。
【００９６】
免疫アフィニティー精製
免疫アフィニティー精製には、ヒツジ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０；Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ．）で共有結合的に被覆された２５０μｇの超常磁性ポリスチレンビーズを、４℃でリン酸緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ＢＳＡ）中で、一次抗体と共に一晩インキュベートした。一次抗体には、ウサギポリクローナル抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基２３５−５５６）またはマウスモノクローナル抗シナプトフィシン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）、対照の一次抗体としてウサギＩｇＧまたはマウスＩｇＧ（ＩＮＣ  Ｉｎｃ．）を用いた。生後１５日のマウス小脳を解剖して取り出し、低スクロース均質化緩衝液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０３Ｍスクロース，プロテアーゼインヒビターカクテル）中でホモジナイズした。ホモジネートを８００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清中の粗製の膜を、前吸収のために、５００μｇの磁性ビーズと共にやはり一晩インキュベートした。上清はその後４℃で１時間インキュベーション緩衝液中（ＰＢＳ（ｐＨ７．４），５％ウシ胎児血清，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、前記一次抗体結合ビーズと共にインキュベートした。次いで、ビーズを回収し、インキュベーション緩衝液で４回、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで２回、各１５分間洗浄した。結合画分は引き続きウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡにより分析した。
【００９７】
ウエスタンブロッティング
免疫アフィニティー精製で得られた各結合画分のをウエスタンブロッティングにより分析した。染色のための抗体には、ウサギポリクローナル抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−８９）、マウスモノクローナル抗シナプトフィシン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）、ウサギ抗シナプトタグミンＩ抗体（Ｍ．  Ｆｕｋｕｄａら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．２７７，  ｐ．４６０１−；を参照）、ウサギ抗シナプトタグミンＩＩ抗体（Ｍ．  Ｆｕｋｕｄａら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００２，  Ｖｏｌ．２７７，  ｐ．４６０１−；を参照）、ウサギ抗ＢＤＮＦ抗体（Ｒ．  Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  １９９７，  Ｖｏｌ．６９，  ｐ．３４−；Ｒ．  Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，  ２００１，  Ｖｏｌ．７７，  ｐ．７１−；を参照）を用いた。
ＥＬＩＳＡ
Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｅｍａｘ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により、製造者の説明書に指示されているように測定した。
結果
抗シナプトフィシンビーズで免疫アフィニティー精製した画分は、ＳＶマーカータンパク質シナプトフィシンならびにシナプトタグミンＩおよびＩＩを含んでいた（図５Ｂ）。それに対して、抗ＣＥＲＡＩＮビーズで免疫アフィニティー精製した画分はＣＥＲＡＩＮに対する免疫反応性は持っていたが、これらのＳＶタンパク質に対しては持たなかったことは、これら二つの画分は、当該抗体に対する特異的な免疫親和性による有意な交差汚染はなく相互に分離できたことを示している。ＣＥＲＡＩＮ免疫精製画分が、シナプトフィシン免疫精製画分、マウスＩｇＧ免疫精製画分およびウサギＩｇＧ免疫精製画分と違って、ＢＮＤＦに対応する１４ｋＤａのバンドに対して免疫反応性を示したことは注目する必要がある（図５Ｂ）。二部位酵素免疫測定法により、ＣＥＲＡＩＮ免疫精製画分に顕著な量のＮＴ−３を検出したが、シナプトフィシン免疫精製ＳＶ画分には検出しなかった（図５Ｃ）これらのデータはＣＥＲＡＩＮ免疫精製画分がＢＤＮＦおよびんＴ−３を含む小胞画分であることを示している。顆粒細胞中に発現することが知られるＮＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦ（Ｎ．  Ｒｏｃａｍｏｒａら，  Ｍｏｌ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．１７，  ｐ．１−；Ｌ．  Ａ．  Ｏｐａｎａｓｈｕｋ  と  Ｋ．  Ｆ．  Ｈａｕｓｅｒ，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，  １９９８，  Ｖｏｌ．８０４，  ｐ．８７−；を参照）は、ＣＥＲＡＩＮ免疫精製画分におけるウェスタンブロットでは検出されなかった（データは示さない）。また、有芯小胞（ＤＣＶ）マーカータンパク質クロモグラニンＡおよびＢもウエスタンブロットではいずれの画分に検出されなかった（データは示さない）。これは、クロモグラニンＡおよびＢは小脳顆粒細胞中で発現することは示されていない（Ａ．  Ｔ．  Ｙａｃｈｎｉｓら，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｎｅｕｒｏｌ．，  １９９３，  Ｖｏｌ．３３４，  ｐ．３５６−；Ｓ．  Ｋｒｏｅｓｅｎら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９６，  Ｖｏｌ．８，  ｐ．２６７９−；を参照）こととも一致する。したがって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、ＤＣＶ膜と結合しているＣＡＰＳタンパク質とは異なり、ＤＣＶとは会合せず、マウス小脳中でＢＮＤＦおよびＮＴ−３を含む小胞と結合している示唆される。
実施例７  ＣＥＲＡＩＮタンパク質と神経栄養因子の細胞内局在
ＣＥＲＡＩＮタンパク質と神経栄養因子の細胞内局在の一致を確かめるために、１４日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した小脳初代培養物中のＣＥＲＡＩＮタンパク質の細胞内局在をＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン）で標識したウサギまたはモルモットポリクローナル抗ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−１０７）抗体、および、それぞれＡｌｅｘａ５９６（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）で標識したヒツジ抗ＮＴ−３抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，米国）、ウサギ抗ＢＤＮＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｉｎｃ．，米国）、マウスモノクローナル抗シナプトフィシン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．）、または抗シナプシンＩ抗体（マウス抗体−Ｓｙｎａｐｓｉｎ  Ｉ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ３５５；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を用いて実施例５と同様に免疫細胞化学分析を行った。結果の共焦点蛍光顕微鏡写真を図４Ｄ−Ｆに示す。抗ＣＥＲＡＩＮ抗体による染色は緑色（図５Ｄ−Ｆ）で、および抗ＮＴ−３抗体（図５Ｄ）、抗ＢＮＤＦ抗体（図５Ｅ）、または抗シナプトフィシン抗体（図５Ｆ）による染色は赤色を呈する。
【００９８】
実施例５に示したように、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は分子層（ＭＬ）中の平行線維末端部に局在していた。また、ＢＮＤＦもＭＬ中に局在するとの報告がある（Ｐ．  Ｍ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚら，  Ｎｅｕｒｏｎ，  １９９７，  Ｖｏｌ．１９，  ｐ．２６９−；を参照）。ＣＥＲＡＩＮタンパク質の大部分の免疫反応性点は、１４ＤＩＶのプルキンエ細胞（図５においてＰｕ）の樹状突起分枝を囲む領域中のＮＴ−３のもの（図５Ｄ）およびＢＮＤＦのもの（図５Ｅ）と共局在していた。一方、ＣＥＲＡＩＮはシナプトフィシン（図５Ｆ）またはシナプシンＩ（データは示さない）と部分的に共局在するにすぎなかった。図２Ｃに示した免疫電子顕微鏡観察を考慮すると、これらの知見は神経栄養因子を含むＣＥＲＡＩＮタンパク質がプルキンエ細胞の棘に接続する平行線維末端部に局在することを示唆する。
実施例８    抗体の作成
ＣＥＲＡＩＮおよびＣＡＰＳに対するウサギ及びモルモットポリクローナル抗体を、バクテリアで発現したＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ標識ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基１８−１９）、ＧＳＴタグ標識ＣＥＲＡＩＮ（アミノ酸残基２３５−３３６）およびＧＳＴタグ標識ＣＡＰＳ（アミノ酸残基１８−１０７）に対して作成した。得られた抗血清を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに共有結合させたＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグ標識抗原タンパク質配列に対してアフィニティー精製して、抗体を得た。
実施例９  ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＰＣ１２細胞中での異種発現
ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能を調べるために、ＰＣ１２細胞にＣＥＲＡＩＮタンパク質を神経栄養因子と共に外因的に発現させ、神経栄養因子の分泌について分析した。
【００９９】
１）発現プラスミド
マウスＢＤＮＦ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５５５７３）およびＮＴ−３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５３２５７）をコードするＤＮＡをＥＦ−１αプロモーターを含むｐＥＦ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）へサブクローン化し、それぞれ、ｐＥＦ−ＢＤＮＦおよびｐＥＦ−ＮＴ３と名付けた。ＣＥＲＡＩＮをコードするＤＮＡ（配列番号１）をＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）中へサブクローン化し、ｐｃＤＮＡ３−ＣＥＲＡＩＮ（ｗｔ）を作成した。ＣＥＲＡＩＮタンパク質のＣ２およびＰＨドメインに対応するアミノ酸残基３４７−５９８の欠失を有するＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）を発現させるために、配列番号＊＊に示したｃＤＮＡを用いてプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）を構築した。ＣＥＲＡＩＮタンパク質のアミノ酸残基３４４−５９８からなるＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）を含むタンパク質を発現させるために、配列番号＊＊に示したｃＤＮＡをｐＣＭＶ−ＨＡプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）中へサブクローン化し、単一分子としてＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）のＨＡ標識（ヘマグルチニンタグ標識）タンパク質を発現するｐＣＭＶ−ＨＡ−ＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）を作成した。
【０１００】
２）形質転換と神経栄養因子分泌研究
ＰＣ１２細胞を、、ｐＥＦ−ＮＴ３もしくはｐＥＦ−ＢＤＮＦのいずれかのみを、または、ｐＥＦ−ＮＴ３もしくはｐＥＦ−ＢＤＮＦのいずれかと共に、ｐｃＤＮＡ３−ＣＥＲＡＩＮ（ｗｔ）、ｐＣＭＶ−ＨＡ−ＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）もしくはｐｃＤＮＡ３−ＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）のいずれかを同時に、リポフェクトアミン２０００（ＬＡ２０００；ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅｔｅｃｈ社）を用いて、リポフェクションにより形質転換した。
【０１０１】
形質転換後２４時間において、ＰＣ１２細胞を、対照として０．２％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で１５分間インキュベートした。次いで、当該培地を刺激培地（５０ｍＭ  ＫＣｌおよび０．２％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ）と置換し、細胞を更に１５分間インキュベートした。対照および刺激培地を集め、当該培地中の神経栄養因子含量をＥＬＩＳＡ法で、ＮＴ−３／ＢＤＮＦ  Ｅｍａｘ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）により、製造者の説明書に指示されているように測定した。ＤＭＥＭの代わりに改変Ｈａｎｋ緩衝液（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１．２ｍＭＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１μＭ  ＺｎＣｌ２，１０ｍＭグルコース，２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．２％ＢＳＡ，ｐＨ７．４）を用いても同様な結果が得られ、そして、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび８０ｍＭ  ＮａＣｌを含む改変Ｈａｎｋ緩衝液中で脱分極が誘導された。
【０１０２】
３）結果
ＰＣ１２細胞はＣＡＰＳを発現するが、ＣＥＲＡＩＮ、ならびにＮＴ−３およびＢＮＤＦは発現しない（データは示さない）。また、ＰＣ１２細胞中で外因的に発現させたＮＴ−３およびＢＮＤＦは、活性依存的に放出可能なことが報告されている（Ｌ．  Ｊ．  Ｇｏｏｄｍａｎら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，  １９９６，  Ｖｏｌ．７，  ｐ．２２２−；Ｊ．  Ｖ．  Ｈｅｙｍａｃｈ  Ｊｒ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  Ｖｏｌ．２７１，  ｐ．２５４３０−；を参照）。
【０１０３】
先に記載の手順に従って、ＮＴ−３もしくはＢＮＤＦのいずれかのみを、または、ＮＴ−３もしくはＢＮＤＦのいずれかと共に、ＣＥＲＡＩＮ、ＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）、もしくはＣＥＲＡＩＮ（ΔＣ２＋ＰＨ）のいずれかを同時に、ＰＣ１２細胞に形質転換し、ＮＴ−３またはＢＮＤＦ分泌アッセイを行った。結果を図６Ａ（ＮＴ−３の分泌）およびＢ（ＢＤＮＦの分泌）に示す。非形質転換ＰＣ１２細胞においては５０ｍＭ  ＫＣｌによる刺激を与えた、または、与えなかった培養物のいずれの培地中にも有意な量のＮＴ−３またはＢＮＤＦの分泌は検出されなかった。一方、ＮＴ−３またはＢＤＮＦのみを形質転換した細胞の培養培地中には、５０ｍＭ  ＫＣｌで刺激したときにＮＴ−３およびＢＮＤＦの分泌量がそれぞれ刺激していないときの２．５および３倍に増加し、外因的に発現された神経栄養因子類の脱分極依存的な分泌を示した。神経栄養因子類と共にＣＥＲＡＩＮタンパク質を共発現させたときには、培養培地中へのＮＴ−３およびＢＤＮＦの分泌は、刺激依存的にそれぞれ、約２および１．５倍に増加した。しかしながら、ＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）またはＣＥＲＡＩＮ（Ｃ２＋ＰＨ）を神経栄養因子類と共発現させた時には、神経栄養因子類を単独で発現させたときと比較して、神経栄養因子類の分泌を増加させることはなかった。このことは、ＣＥＲＡＩＮの神経栄養因子の分泌を亢進する活性について、（Ｃ２＋ＰＨ）のドメインのみでは当該活性を有しないが、このドメインが欠けることでも当該活性を失うことを示している。すなわち、（ＣＨ＋ＰＨ）ドメインが当該活性について重要な領域の一部であることを示している。また、これらの結果は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が神経栄養因子類の脱分極依存性分泌に関与することを示唆している。
実施例１０  小脳顆粒細胞におけるＣＥＲＡＩＮタンパク質による神経栄養因子の分泌
小脳顆粒細胞でＣＥＲＡＩＮタンパク質により仲介される神経栄養因子分泌を調べるため、ＣＥＲＡＩＮタンパク質を小脳顆粒細胞で発現させた。
【０１０４】
１）組換えウイルスの調製
２つの複製に欠陥のあるアデノウイルス、ＡｘＣＡ−ＣＥＲＡＩＮ（ｗｔ）およびＡｘＣＡ−ＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）を、先に報告されているようにＣＯＳ−ＴＰＣ法により作製した（Ｓ．  Ｍｉｙａｋｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９６，  Ｖｏｌ．９３，  ｐ．１３２０−；を参照）。簡単には、ＣＥＲＡＩＮ遺伝子類をｐＡｘＣＡｗｔコスミドカセット（宝酒造）のＣＡＧプロモーター発現ユニット中へ挿入した。組換えウイルスはＨＥＫ２９３細胞中でのＥｃｏＴ２２Ｉ消化Ａｄ５−ｄｌｘ  ＤＮＡ末端タンパク質複合体と組換えコスミドベクターとの相同組み換えにより作製した。生成した組換えアデノウイルスは、ＨＥＫ２９３細胞中で増殖させ、次いで濃縮し、塩化セシウム二段勾配遠心分離により精製した。ウイルス力かはＨＥＫ２９３細胞上で測定した。これらのウイルスは、全ての実験で３７℃、１時間、感染多重度３０で、７ＤＩＶの小脳顆粒細胞に感染させた。免疫細胞化学分析は実施例７と同様に行った。ＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）の検出についてＣＥＲＡＩＮと同様に行った。ＮＴ−３の分泌検定は実施例９と同様に行った。
【０１０５】
２）結果
７ＤＩＶ小脳顆粒細胞に、完全長ＣＥＲＡＩＮ（ｗｔ）ならびに、Ｃ２およびＰＨドメインを欠くＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）をアデノウイルスベクター遺伝子送達系を利用して、外因的に発現させた。８ＤＩＶ培養物（すなわち、感染後２４時間の培養物）中においてＣＥＲＡＩＮタンパク質の局在を評価した。対照としてＣＥＲＡＩＮ類の挿入体を持たないアデノウイルスベクターで感染させた小脳顆粒細胞については、内因性ＣＥＲＡＩＮタンパク質は顆粒細胞の細胞体および神経突起に局在していた（図６Ｃ）。組換え体アデノウイルスで感染すると、外因的に発現されたＣＥＲＡＩＮ（ｗｔ）およびＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）の両方とも、同様に顆粒細胞の細胞体および神経突起に観察された（それぞれ図６ＤおよびＥ）。
【０１０６】
これらの培養物を用いて、５０ｍＭ  ＫＣｌによる刺激の前後の、培養培地中のＢＤＮＦおよびＮＴ−３レベル（図４Ｆ）の変化を調べた。ＢＤＮＦについては刺激の前後ともに、ＢＤＮＦを検出することはできなかった（データは示さない）。一方、全ての感染培養物でＮＴ−３の量は５ｍＭ  ＫＣｌを含む培地中ではほとんど検出不能であった。アデノウイルスベクターのみで感染させた培養物では５０ｍＭ  ＫＣｌによる刺激に応答してＮＴ−３放出を示し、培養顆粒細胞は脱分極依存性ＮＴ−３放出のための機構を有することを明らかにした。ＣＥＲＡＩＮ（ｗｔ）を過剰発現する培養物では、ＫＣｌ増加に応答するこのＮＴ−３放出は約２倍に亢進された。ＣＥＲＡＩＮ（△Ｃ２＋ＰＨ）を発現する培養物では、１．３倍の増加が観察されただけであった。これらの結果は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質が脱分極依存的に顆粒細胞からの神経栄養因子放出を調節することを示唆している。
【０１０７】
実施例３で示したように、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、ＣＡＰＳタンパク質のＣ２ドメインと対応する領域に、Ｃ２ドメインを有する。ＣＡＲＡＩＮタンパク質が細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を誘導するＫＣｌによる刺激に応答して、実施例９のＰＣ１２細胞、および本実施例の培養顆粒細胞からの神経栄養因子の放出を亢進することを示した。したがって、ＣＥＲＡＩＮタンパク質は、ＣＡＰＳタンパク質によるＤＣＶエキソサイトーシスと同様の様式で、小胞エキソサイトーシスを調節すると考えられる。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明は、神経栄養因子の分泌を調節する、新規なタンパク質ＣＥＲＡＩＮの提供に貢献する。本発明のタンパク質は顆粒細胞の平行線維においてプルキンエ細胞とのシナプス前部に存在して、神経栄養因子の分泌に関わっていることが本発明者らにより示された。神経栄養因子は活性依存的シナプス可塑性にも関与すると考えられており、したがって、本発明のタンパク質は神経回路の増強に効果を発揮しうる。
【０１０９】
また、本発明はＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子ならびに、ＣＥＲＡＩＮタンパク質と同等の機能を有する変異体の遺伝子および変異タンパク質の提供に貢献する。本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマー、およびＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子を特異的に検出するプローブの提供に貢献する。また、本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質に対する抗体の提供に貢献する。本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質をコードする遺伝子を外因的に導入した遺伝子組み換え体の提供に貢献する。本発明は、ＣＥＲＡＩＮタンパク質の機能を調節する物質のスクリーニング方法、および、本発明のスクリーニング方法によって取得した物質を提供することに貢献する。さらに、本発明は、神経栄養因子の分泌の調節が、神経回路の強化に大きな役割を果たしうることから、神経栄養因子の分泌の調節が必要な疾患の予防および／または治療ののための医薬組成物の提供にも貢献する。
【０１１０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、発生中の小脳におけるＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。図１Ｂは、生後５６日のマウスの様々な組織におけるＲＴ−ＰＣＲの結果を示す、ゲル電気泳動の写真である。図１Ｃは、マウスＣＥＲＡＩＮタンパク質（上列）、ＣＡＰＳ２タンパク質（中列）、およびＣＡＰＳタンパク質（下列）のアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸配列は一文字コードで示し、同一性は黒色のバックグラウンドで示す。
【図２】図２Ａは、推定ＣＥＲＡＩＮタンパク質（１，２６４アミノ酸残基）の概略図である。図２Ｂ−Ｄは、生後２１日のマウス脳の、全脳（図２Ｂ）、小脳（図２Ｃ）および小脳皮質（図２Ｃ）における、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析によるＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの局在化を示す写真である。図２Ｅ−Ｇは、生後２１日のマウス脳の、全脳（図２Ｅ）、および小脳（図２ＦおよびＧ）における、免疫組織化学分析によるＣＥＲＡＩＮタンパク質の局在化を示す写真である。図２ＨおよびＩは、生後２１日のマウス小脳における免疫組織化学分析によるＣＡＰＳタンパク質の局在かを示す写真である。図中、ＭＬは分子層；ＰＣＬはプルキンエ細胞層；ＩＧＬは内側顆粒層；ＷＭは白質；を表す。スケールバーは、図２ＢおよびＥでは２ｍｍ；図２Ｃ、ＦおよびＨでは５００μｍ；図２Ｄ、ＧおよびＩでは５０μｍである。
【図３】図３Ａ−Ｃは、生後７日のマウス脳の、全脳（図３Ａ）および小脳（図３ＢおよびＣ）における、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析によるＣＥＲＡＩＮ  ｍＲＮＡの局在化を示す写真である。図３Ｄ−Ｆは、生後７日のマウス脳の、全脳（図３Ｄ）、および小脳（図３ＥおよびＦ）における、免疫組織化学分析によるＣＥＲＡＩＮタンパク質の局在化を示す写真である。図中、ＭＬは分子層；ＩＧＬは内側顆粒層；を表す。スケールバーは、図３ＡおよびＤでは２ｍｍ；図３ＢおよびＥでは５００μｍ；図３ＣおよびＦでは５０μｍである。
【図４】図４Ａは抗ＣＥＲＡＩＮ抗体（緑色）および抗カルビンジン抗体（赤色）で免疫染色した小脳培養物（１４ＤＩＶ）の蛍光共焦点顕微鏡の画像である。図中、Ｐｕはプルキンエ細胞を表す。スケールバーは１０μｍである。図４Ｂは、抗ＣＥＲＡＩＮ抗体（緑色）および抗ＰＳＤ９５抗体（赤色）で免疫染色した小脳培養物（１４ＤＩＶ）の蛍光共焦点顕微鏡の画像である。差し込み図は高倍率での画像である。図中、Ｐｕはプルキンエ細胞を表す。スケールバーは１０μｍである。図４Ｃは、抗ＣＥＲＡＩＮ抗体の免疫金と反応した６週齢マウス小脳の分子層の電子顕微鏡写真。図中、ｖは分泌小胞；ｍはミトコンドリア；ｓｐは棘；ＰＳＤはシナプス高密度；を表す。スケールバーは２００ｎｍである。
【図５】図５Ａは細胞内小胞画分のウエスタンブロット分析を示す写真である。図５Ｂは、対照マウスＩｇＧ、対照ウサギＩｇＧ、抗シナプトフィシン（Ｓｙｎ）抗体、および抗ＣＥＲＡＩＮ抗体で被覆した磁気性ビーズを用いて免疫生成した画分のウエスタンブロット分析結果を示す写真である。図５Ｃは、シナプトフィシン（Ｓｙｎ）免疫精製およびＣＥＲＡＩＮ免疫精製した小胞画分のＮＴ−３についての好感度二部位酵素免疫測定の結果を示すグラフである。各値は４つの個別実験の平均値±標準偏差を示す（＊  Ｐ＜０．０２）。図５Ｄ−Ｆは抗ＣＥＲＡＩＮ抗体（緑色）および、抗ＮＴ−３抗体（図５Ｄ）、抗ＢＮＤＦ抗体（図５Ｅ）または抗シナプトフィシン抗体（図５Ｆ）（それぞれ赤色）とともに用いることによる、小脳培養神経細胞（１４ＤＩＶ）の免疫組織化学の共焦点顕微鏡画像である。図中、Ｐｕはプルキンエ細胞を表す。スケールバーは１０μｍである。
【図６】図６ＡおよびＢは、ＰＣ１２細胞からのＣＥＲＡＩＮタンパク質によるＮＴ−３（図６Ａ）およびＢＮＤＦ（図６Ｂ）の放出を示すグラフである。データ点は３回（図６Ａ）または４回（図６Ｂ）の個別の実験で得た値の平均値±標準偏差を表す（＊  Ｐ＜０．０２、＊＊  Ｐ＜０．０１）。図６Ｃ−Ｅは、アデノウイルスベクターで感染させた小脳顆粒細胞（８ＤＩＶ）の、抗ＣＥＲＡＩＮ抗体による蛍光免疫細胞化学を示す写真である。スケールバーはそれぞれ１０μｍである。図６Ｆは、５０ｍＭ  ＫＣｌによる刺激前後の小脳培養物（８ＤＩＶ）からのならし培地中のＮＴ−３レベルのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。データ点は４回の個別の実験で得た値の平均値±標準偏差を表す（＊＊  Ｐ＜０．０１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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