(57)【要約】【課題】プロテアソーム阻害活性を示す新規な環状ヘキサペプチドを提供することを目的とする。【解決手段】シクロ（−Ｘ−フェニルアラニル−プロリル−Ｘ−フェニルアラニル−プロリル）の構造を有する新規な環状ヘキサペプチドを合成し、それがプロテアソーム阻害活性を示すことを見出した。Ｘはα−アミノ酸残基を示し、その側鎖の官能基は保護または修飾されていてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）
2004083427.tif 000012
〔式中、Ｒは水素または通常のα−アミノ酸の側鎖、あるいは官能基を保護された通常のα−アミノ酸の側鎖、あるいは官能基を修飾された通常のα−アミノ酸の側鎖を表す〕で表される環状ヘキサペプチド。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｒが水素であるか、または通常のα−アミノ酸としてアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスバラギン酸、アスパラギン、クルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンのアミノ酸側鎖を表すか、あるいは保護基または修飾基で保護または修飾されたセリン、トレオニン、チロシン、アスバラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンのアミノ酸側鎖を表すものである、請求項１に記載の環状ヘキサペプチド。
【請求項３】
請求項２において保護基または修飾基で保護または修飾されたアミノ酸側鎖（Ｒ）がアスバラギン酸ベンジルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、ベンジル基のベンゼン環に置換基があってもよいベンジルオキシカルボニルリジン、ε−Ｒ２−ＣＨ２−リジン、ε−（Ｒ３）（Ｒ４）−ＣＨ−リジン［式中、Ｒ２は置換基のあってもよいフェニル基、ピリジル基、フリル基、シクロヘキシル基を表わし、Ｒ３とＲ４はそれぞれ同一の低級アルキル基であるか、又はＲ３とＲ４は合併して１個の低級アルキレン鎖を表わす］のアミノ酸側鎖である、請求項１に記載の環状ヘキサペプチド。
【請求項４】
請求項１の式（Ｉ）においてフェニルアラニンがＤ体であり、プロリンがＬ体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
請求項２においてフェニルアラニンがＤ体であり、プロリンがＬ体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
請求項３においてフェニルアラニンがＤ体であり、プロリンがＬ体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
次式（Ｉａ）
2004083427.tif 000013
のシクロヘキサペプチド；あるいは次式（Ｉｂ）
2004083427.tif 000014
のシクロヘキサペプチド；または式（Ｉｂ）のシクロヘキサペプチドのリジン部分（Ｌｙｓ）のアミノ基がベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２−フリルメチル基、３−ピリジルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシル基またはイソプロピル基で保護された誘導体；あるいは次式（Ｉｃ）
2004083427.tif 000015
のシクロヘキサペプチド；または式（Ｉｃ）のシクロヘキサペプチドのグルタミン酸部分（Ｇｌｕ）のカルボキシル基がベンジル基で保護された誘導体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１の式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドを有効成分とするプロテアソーム阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアソーム阻害活性を示す新規な環状ヘキサペプチドに関する。さらに本発明は、その新規な環状ヘキサペプチドを有効成分とするプロテアソーム阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々な多数の酵素阻害物質が知られており、また種々な多数の生理活性物質が知られている。酵素に阻害活性を有する物質、すなわち酵素阻害剤をもって、抗炎症剤あるいは抗腫瘍剤を含めて幅広い疾病に有効な薬剤として応用するための多くの研究がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
癌細胞の増殖や炎症が起きる際に、極めて重要な役割を果たす酵素にプロテアソームが挙げられる。この酵素の阻害物質を提供することによって、従来知られているまたは使用されている既知の抗炎症性化合物とは、異なる作用点を有し且つ新規な化学構造を有した抗炎症性を示す化合物の創製が期待され、そのための研究が行われている。また抗腫瘍性物質は、一般に強い毒性を有するものが多く、その抗腫瘍剤としての使用に当たって大きな制約となっている。そこで、毒性が低く且つ新規な化学構造を有する抗腫瘍性物質を発見または創製することが常に望まれており、そのための研究が行われている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の要望に応えることができる新規なプロテアソーム阻害活性物質を提供することを目的に、従来より有用な生理活性物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その結果、放線菌の一種であるストレプトミセス属に属するストレプトミセス　ｓｐ．ＭＫ６００−ＣＦ７株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１６６０９として寄託）が新しい構造骨格を有する生理活性物質を生産していることを見い出した。この新規生理活性物質を単離することに成功し、化学構造を決定し、それぞれを生理活性物質ＭＫ６００−Ａ，Ｂ，ＣおよびＤと命名した。更に、この新規生理活性物質がプロテアソーム阻害活性を有すことを見出した（特願２００１−９５５１１号、「新規生理活性物質ＭＫ６００−Ａ，　Ｂ，　ＣおよびＤとその製造方法」）。
【０００５】
前記のＭＫ６００−Ａ物質、ＭＫ６００−Ｂ物質、ＭＫ６００−Ｃ物質およびＭＫ６００−Ｄ物質はそれぞれ下記の式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）および式（Ｄ）で表される環状ヘキサペプチドである。
【０００６】
2004083427.tif 000002
【０００７】
上記のＭＫ６００−Ａ，　Ｂ，　ＣおよびＤ物質の構造をつぶさに検討すると、共通部分としてフェニルアラニル−プロリン（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）の配列を含有する６個のアミノ酸からなる環状ヘキサペプチド構造を見出すことができる。そこで、本発明者らはＭＫ６００物質の活性増大を意図して研究を行い、Ｘ−フェニルアラニル−プロリン配列（但し、Ｘは第三のアミノ酸を表す）からなる保護されたトリペプチド誘導体を合成し、次にこれの２量体を作り、さらに保護されたトリペプチド２量体を環化し且つ脱保護して環状のヘキサペプチドを合成することに成功した。さらにそのプロテアソーム阻害活性を検討し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、第１の本発明では、次式（Ｉ）
2004083427.tif 000003
〔式中、Ｒは水素を表すか、または通常のα−アミノ酸側鎖、あるいは官能基を保護された通常のα−アミノ酸の側鎖、官能基を修飾されたα−アミノ酸側鎖を表す〕で表された環状ヘキサペプチドが提供される。ここで通常のα−アミノ酸とは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、クルタミンであり、また官能基を保護又は修飾された通常のα−アミノ酸としてはセリン、トレオニン、チロシン、アスバラギン酸、グルタミン酸、のエステル類、ヒスチジン、リジン、アルギニン等が挙げられる。
【０００９】
また、前記された通常のα−アミノ酸側鎖とは、既知のα−アミノ酸のα炭素に側鎖として結合しているアルキル基、あるいは官能基（水酸基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキサミド基、イミダゾール基、グアニジル基またはフェニル基など）を置換されているアルキル基を指す。
【００１０】
第１の本発明による式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドの好ましい具体例には、次式（Ｉａ）
2004083427.tif 000004
のシクロヘキサペプチド；あるいは次式（Ｉｂ）
2004083427.tif 000005
のシクロヘキサペプチド；または式（Ｉｂ）のシクロヘキサペプチドのリジン部分（Ｌｙｓ）のアミノ基がベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、２−フリルメチル基、３−ピリジルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシル基またはイソプロピル基で保護された誘導体；あるいは次式（Ｉｃ）
2004083427.tif 000006
のシクロヘキサペプチド；あるいは式（Ｉｃ）のシクロヘキサペプチドのグルタミン酸部分（Ｇｌｕ）のカルボキシル基がベンジル基で保護された誘導体が包含される。
【００１１】
なお、上記の式（Ｉａ）、式（Ｉｂ）、式（Ｉｃ）のそれぞれのシクロヘキサペプチドは、各々の式の６番目のＰｒｏの後の部位で切断された直鎖状アミノ酸配列を有するものと見なした場合について、それらシクロヘキサペプチドのアミノ酸配列を後記の配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３にそれぞれ示される。
【００１２】
第１の本発明の環状ヘキサペプチドは、通常実施されるペプチド合成法を組み合わせて合成することができる。すなわちプロリンのベンジルエステルまたはトリクロロエチルエステルなどのエステルを、該エステル形成基とは異なる反応条件で脱保護可能なアミノ保護基でアミノ基を保護されたフェニルアラニン、たとえばＢｏｃ−フェニルアラニンと縮合してジペプチドエステルを生成し、その後、そのジペプチドエステルのフェニルアラニン部分（Ｐｈｅ）のアミノ基を脱保護により遊離させる。アミノ基がＢｏｃ（すなわち第３級ブトキシカルボニル基）で保護されている場合はＴＦＡまたは塩化水素−ジオキサン溶液、塩化水素−酢酸エチル溶液などの通常用いられる試薬をアミノ基からの脱保護に用いる。
【００１３】
次に、ここに得られた遊離アミノ基をもつジペプチドエステルに対して、官能基を保護された第三のアミノ酸（Ｘ）をアミド縮合して保護トリペプチドエステルを合成する。この段階で十分精製をしたのち保護トリペプチドエステルの量を２分し、一方の保護トリペプチドエステルのアミノ末端を脱保護し、もう一方の保護トリペプチドエステルのカルボン酸末端を脱保護する。この場合の脱保護には通常の方法が用いられる。すなわちアミノ末端を脱保護するには、前述のＴＦＡまたは塩化水素溶液を用いて脱保護でき、さらにカルボン酸末端を脱保護するにはベンジルエステルの場合では接触還元、接触水素移動還元、ケン化のいずれかの方法が用いられ、またトリクロロエチルエステルの場合では亜鉛−酢酸還元法が用いられる。
【００１４】
次に、ここで得られた二種類の直鎖状の保護トリペプチドの遊離アミノ基をもつものと遊離カルボキシル基をもつものとをアミド縮合することによって、繰り返えされたアミノ酸配列を含有する保護ヘキサペプチドを合成する。次に、この保護ヘキサペプチドからカルボキシル保護基を前述の方法で除去し、次いでアミノ基から脱保護することによって直鎖状のヘキサペプチドのＴＦＡ又は塩酸塩とする。
【００１５】
得られた直鎖状ヘキサペプチドの塩を大量のＤＭＦまたはＮ−メチルピロリドンに溶解し、その溶液に過剰の炭酸水素ナトリウムを加え氷水で冷却攪拌し、さらにペプチドの環化に良く用いられる縮合剤、例えばＤＰＰＡ（ジフェニル燐酸アジド）、ＰＦＰＤＰ（ペンタフロロジフェニルフォスフィネート）などを加えてから室温〜５℃の程度の低温で３〜７日間攪拌して環化反応させる。環化の反応液を必要ならば減圧下に濃縮し、水で希釈後に酢酸エチルなどの溶媒で環状ヘキサペプチド生成物を抽出する。抽出液中には縮合剤の残滓が含まれるので、濃縮後にメタノールで平衡化したセファデックスＬＨ２０のカラムを通すことにより、容易に低分子のこれらの残滓を除く事ができる。得られた環状ヘキサペプチドは、さらに必要ならばシリカゲル、ＯＤＳ−シリカゲルなどのクロマトグラフィーで精製することができる。
【００１６】
前記の第三のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスバラギン酸、アスパラギン、クルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アルギニンをあげることができる。
【００１７】
前記の第三のアミノ酸が官能基を有したものであって、それが保護されていれば、通常の方法で脱保護してもよい。例えば、リジンのε−アミノ基がカルボベンジルオキシ基で保護されている場合には、接触還元または接触水素移動還元法で脱保護する。さらに、ここで新たに遊離した官能基は、通常行われている修飾をすることができる。例えばリジンのε−アミノ基は、アシル化、ウレタン化、アルキル化などの修飾を受けることができる。中でも、アルデヒド、ケトンとシアノ水素化ホウ素による還元的アルキル化は修飾に有効である。このようにして修飾された式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドもシリカゲル、ＯＤＳ−シリカゲル、セファデックスＬＨ２０　などのクロマトグラフィーで精製することができる。
【００１８】
前記の式（１）で示される環状ヘキサペプチドのうちの代表的な化合物の中に存在する基Ｒの具体例を以下の表１に示す。また、表１には、その環状ヘキサペプチドの合成に第三のアミノ酸（Ｘ）として用いられたアミノ酸も併記する。表１で、Ｚはカルボベンジルオキシ基（すなわちベンジルオキシカルボニル基）の略号である。
【００１９】
【表１】
2004083427.tif 000007
【００２０】
さらに、第１の本発明の環状ヘキサペプチドはプロテアソーム阻害活性を有するものである。
【００２１】
本発明による環状ヘキサペプチドのプロテアソーム阻害活性は下記の表２に示される。このプロテアソーム阻害活性は、以下のようにして測定した。即ち、マウス肝臓から調製したプロテアソームを含む画分を酵素として用い、またキモトリプシン様ペプチダーゼの蛍光基質（Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ、ペプチド研究所製）を基質として用いた。これらの酵素と基質とを、ＡＴＰ（アデノシン−５’−３リン酸）とともに本発明の環状ヘキサペプチドの存在下または非存在下で３７℃にて３０分間反応させた。反応終了後、プロテアソームにより分解され遊離した物質の蛍光強度を測定して、本発明の環状ヘキサペプチドの存在下の反応の場合と非存在下の反応の場合との比較によって、蛍光強度が環状ヘキサペプチドにより抑制される程度を測定し、この測定によって本発明の環状ヘキサペプチドのプロテアソーム阻害活性のＩＣ５０値を判定した。
【００２２】
【表２】
2004083427.tif 000008
【００２３】
従って、第２の本発明においては、式（Ｉ）の環状ヘキサペプチドを有効成分とするプロテアソーム阻害剤が提供される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、実施例中に示されたアミノ酸のＤ，Ｌは特記されているもの以外はＬ体である。
【００２５】
以下の実施例において、薄層クロマトグラフィーではプレートとしてメルク社製品（ＳＩＬＩＣＡＧＥＬ６０Ｆ−２５４）を用いてＲｆ値を測定した。展開溶媒として酢酸エチル−ｎ−ヘキサン（１：１）を用いた場合にはＲｆ１値として表示し、またクロロホルム−メタノール　（１０：１）を用いた場合にはＲｆ２値として表示した。プレートとしてメルク社製品（ＲＰ−１８Ｆ−２５４）を用い且つ展開溶媒として４％酢酸カリウム＋０．８％クエン酸緩衝液−アセトニトリル（１：１）を用いた場合にはＲｆ３値として表示した。
【００２６】
【実施例１】
（ａ）　Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステルの合成
Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン　１．５ｇ（５．６６ｍｍｏｌ）、　Ｌ−プロリン　ベンジルエステル、Ｔｏｓ　１．５１ｇ（６．２５ｍｍｏｌ，１．１当量）、Ｂｏｐ試薬２．７６ｇ（１．１当量）、ＨＯＢｔ　０．８５ｇ　（１．１当量）をナス型フラスコに入れ、ＤＭＦ１２ｍｌを加えてマグネチックスターラーで攪拌下に溶解した。得られた溶液を氷水で冷却し、トリエチルアミン２．３８ｍｌを加えた。３０分後に氷水浴を取り除き、室温で１夜攪拌してアミド縮合反応を行った。
得られた反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で順次に洗浄し、飽和食塩水で１回洗浄した。その後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色水飴状物質２．９３ｇを与えた（理論収量は２．５６ｇ）。これをクロロフォルムに溶かし、１００ｍｌのシリカゲルカラムにつけクロロフォルム−酢酸エチル（３：１）で展開、ＵＶでモニター、濃縮乾固すると、２．６６ｇの表題物質を得た。
【００２７】
（ｂ）　Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステル　塩酸塩の合成
上記Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステルを５ｍｌ無水ＴＨＦに溶解し、その溶液に１５ｍｌの４Ｎ塩酸／ジオキサンを加えた。溶液を収容するフラスコの口にしぼんだ風船をつけて外気と遮断し、室温で１時間放置した（Ｂｏｃの脱離反応）。１時間後に濃縮する。さらに酢酸エチルを加えて濃縮を繰り返して乾固すると、表題物質を得た。
【００２８】
（ｃ）　Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステルの合成
４ｍｍｏｌのＢｏｃ−Ｄ−フェニルアラニンから上記の（ｂ）で合成したＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステル塩酸塩（２工程で１００％と計算する）に対して１０９７ｍｇ（１．１当量）のＢｏｃ−Ｌ−ロイシン１水和物、１９４６ｍｇ（１．１当量）のＢｏｐ試薬、５９５ｍｇ（１．１当量）のＨＯＢｔを加えてＤＭＦ１２ｍｌ程度に溶解した。その溶液に１．６８　ｍｌ（３当量）のトリエチルアミンを加えて１夜攪拌してアミド縮合反応をする。その反応液を減圧下に濃縮乾固した。１５０ｍｌの酢酸エチルに溶かし、その溶液を実施例１（ａ）と同様に酸、アルカリで洗浄後、乾燥して濃縮乾固する。得られた乾燥固体をクロロフォルムに溶かし、１００ｍｌのシリカゲルカラムにつけクロロフォルム−酢酸エチル（３：１）で展開、ＵＶでモニター、濃縮乾固すると、２０１２ｍｇの表題物質（保護トリペプチド）を得た。
【００２９】
（ｄ）　Ｂｏｃ−（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−）２　ベンジルエステルの合成
（ｉ）実施例１（ｃ）で得られたＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステル　６３０ｍｇを酢酸エチル１０ｍｌに溶かし、その溶液へパラジウム黒５０ｍｇを加えた。常温常圧下で一夜水素還元する（ベンジル基の脱離）。触媒を濾過して除き濃縮乾固してＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンを得た。
（ｉｉ）同じく実施例１（ｃ）で得られた６３０ｍｇのＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステルを１ｍｌの脱水ＴＨＦに溶解し、その溶液に３ｍｌの４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液を加え常温一時間反応した（Ｂｏｃの脱離）。その後濃縮、シロップ状の残滓に酢酸エチルを加え濃縮乾固してＬ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　ベンジルエステル塩酸塩を得た。
【００３０】
（ｉｉｉ）上記の（ｉｉ）の生成物に上記（ｉ）で得たＢｏｃ−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンとＢｏｐ試薬の５９１ｍｇ（１．２当量）とＨＯＢｔの１６６ｍｇ（１．１当量）とＤＭＦの１０ｍｌを加え溶解し、これを氷水で冷却し、トリエチルアミン０．４６８ｍｌを加えた。３０分後に氷水浴を取り除き、室温で１夜攪拌してアミド縮合反応を行った。
生成された線状の保護ヘキサペプチドを含む反応液に酢酸エチル１００ｍｌを加え、１００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液、で洗浄し、さらに飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色水飴状物質１２００ｍｇを与えた。これをクロロフォルムに溶かし、１００ｍｌのシリカゲルカラムにつけクロロフォルム−酢酸エチル（３：１）で展開、ＵＶでモニター、濃縮乾固して９９０ｍｇの表題物質（保護ヘキサペプチド）を得た。
【００３１】
（ｅ）　シクロ（−Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）２の合成
実施例１（ｄ）（ｉｉｉ）で得られたＢｏｃ−（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−）２　ベンジルエステル　９００ｍｇを、酢酸エチル１５ｍｌに溶かし、その溶液にパラジウム黒８０ｍｇを加え常温常圧下に一夜水素還元する（ベンジル基の脱離）。触媒を濾過して除き濃縮乾固してＢｏｃ−（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−）２−ＯＨを得た。
【００３２】
次に得られた固体に、トリフロロ酢酸１０ｍｌを加え常温一時間反応してＢｏｃを脱離させた。その後、濃縮、得られたシロップ状の残滓に酢酸エチルを加え濃縮乾固する。得られた（Ｌ−ロイシル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル）２−ＯＨにＤＭＦ９０ｍｌを加えて溶かし、炭酸水素ナトリウム１ｇ、を加え氷水で冷却、攪拌し、この溶液に０．３ｍｌのＤＰＰＡ（ジフェニル燐酸アジド）を加え５℃の低温実験室で９０時間攪拌した（環化反応）。
【００３３】
この環化反応液に酢酸エチル４００ｍｌを加え４００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、さらに飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥し、ろ過、濃縮すると淡黄色の油状物質を得る。
【００３４】
これを少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填した５００ｍｌのセファデックスＬＨ２０カラムに注ぎ、メタノールで展開し、ＵＶ吸収をモニターして最初のピークを集める。溶媒を減圧で除き残滓を６０％アセトニトリルに溶解し、ＯＤＳシリカゲル　３７ｍｍＩＤ×３００ｍｍのカラムに吸着させて段階的にアセトニトリルの濃度を高めて展開する。溶出液をＵＶ吸収をモニターしてアセトニトリル９０％で主生成物を得た。濃縮乾固して１８０ｍｇの目的の表題物質（環状ヘキサペプチド）を無色固体として得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝７１５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ２＝０．５３
【００３５】
【実施例２】
（ａ）　Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩２．６３７ｇ、Ｂｏｃ−Ｄ−フェニルアラニン　２．５９４ｇ、Ｂｏｐ試薬４．６９５ｇ、ＨＯＢｔ１．３８３ｇをＤＭＦ　１６ｍｌに溶解し、その溶液を氷水で冷却攪拌してトリエチルアミン３．９１５ｍｌを加えて３０分攪拌、室温で一夜攪拌した（アミド縮合反応）。
反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色固体として表題物質の４．５６５ｇを与えた。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝４９３（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ１＝０．７４
【００３６】
（ｂ）　Ｂｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
実施例２（ａ）で得られたＢｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル　２．６６７５ｇをＴＨＦ１０ｍｌに溶解し、その溶液に４Ｎ塩酸ジオキサン溶液２０ｍｌを加えて室温で一時間放置した後、減圧で塩酸、溶媒を溜去すると、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩を得た。
これにＢｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル）−Ｌ−リジンの２．２６６ｇ、Ｂｏｐ試薬の２．６４７ｇ、ＨＯＢＴの８０９ｍｇを添加し、１５ｍｌのＤＭＦに溶解し、氷水で冷却攪拌してトリエチルアミン２．２７１ｍｌを加えて冷却下に３０分攪拌、室温で一夜攪拌した（アミド縮合反応）。
【００３７】
反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると、無色固体としてＢｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルの３．３７２ｇを得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝７５５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ１＝０．３２
【００３８】
（ｃ）　Ｂｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
（ｉ）実施例２（ｂ）で得られた物質３．３４ｇを二等分した。一方をＴＨＦ３ｍｌに溶解し、４Ｎ塩酸−ジオキサン溶液１２ｍｌを加えて室温一時間放置してＢｏｃを脱離した。その後、減圧で塩酸、溶媒を溜去し、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩を得た。
（ｉｉ）もう一方を、１５ｍｌの９０％酢酸に溶解し、攪拌下に亜鉛末２ｇを三回に分け加え、一夜攪拌した（２，２，２−トリクロロエチル基の脱離反応）。過剰の亜鉛を含む不溶物を濾別し濾液を減圧下に濃縮した。残滓を１００ｍｌ酢酸エチルに溶解し、水１００ｍｌで二回洗浄し飽和食塩水で洗浄し、さらに硫酸ナトリウムで乾燥後に減圧下に濃縮乾固してＢｏｃ−（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル）−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリンを得た。
【００３９】
（ｉｉｉ）これら両者、すなわち上記の（ｉ）の生成物と（ｉｉ）の生成物を併せＢｏｐ試薬１０７７ｍｇ、ＨＯＢｔ３３０ｍｇを加えて１０ｍｌＤＭＦに溶解し、氷冷攪拌下にトリエチルアミン０．３３ｍｌを加えた。一時間後室温に戻し一夜攪拌した（アミド縮合反応）。　　反応液に酢酸エチル２００ｍｌを加え、２００ｍｌ×２の１０％クエン酸水溶液、４％炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で１回洗浄後、硫酸ナトリウムで１時間乾燥した。ろ過、濃縮すると無色固体２．５８６ｇを得た。これを１０ｍｌのメタノールに溶解しメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０、１Ｌのカラムに注ぎメタノールで展開した。溶出液を紫外部吸収をモニターして分画した。前半はＨＰＬＣ分析で単一であったので濃縮乾固して１．１７８ｇの固体を得た。後半は不純物を含み１．０３６ｇであった。これをクロロフォルムに溶解して２００ｍｌのシリカゲルカラムに吸着、クロロフォルム：メタノール（４０：１）で展開し、８３７ｍｇの目的物を得た。合計収率：２．００５ｇ。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝１１７５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ１＝０．１０
【００４０】
（ｄ）　シクロ（−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例２（ｃ）で得られた生成物の物質１．５５ｇを１１ｍｌの９０％酢酸に溶解して、その溶液に攪拌下に亜鉛末１ｇを三回に分け加え、一夜攪拌下に反応した。過剰の亜鉛を含む不溶物を濾別し濾液を減圧濃縮した。残滓を１００ｍｌ酢酸エチルに溶解し水１００ｍｌで洗浄し減圧濃縮乾固した。残滓にメタノールを加え溶解しメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０、２００ｍｌのカラムに注ぎ、メタノールで展開した。ＵＶでモニターして最初のピークを集めて減圧濃縮乾固し１．３４３ｇを得た。
このうち１．３０３ｇにトリフルオロ酢酸１４ｍｌを加えて一時間攪拌した。減圧下トリフルオロ酢酸を溜去し残滓にトルエン３ｍｌを加えて減圧濃縮を二回行って遊離したアミノ基およびカルボキシル基を有したヘキサペプチドのトリフルオロ酢酸塩を得た。これを１００ｍｌＤＭＦに溶解し、炭酸水素ナトリウム７６０ｍｇを加えて氷水で冷却下に攪拌してジフェニル燐酸アジド０．６ｍｌを加えた。５℃の低温実験室で６４時間攪拌した。
【００４１】
反応液を６００ｍｌの酢酸エチルで希釈し、４００ｍｌの４％炭酸水素ナトリウム水溶液で二回、１０％クエン酸水溶液、飽和食塩水溶液で洗浄後硫酸ナトリウムで一時間乾燥、ろ過、濃縮すると、淡黄色の油状物質を得る。これを少量のメタノールに溶解し、メタノールで充填した５００ｍｌのセファデックスＬＨ２０カラムに注ぎ、メタノールで展開し、ＵＶ吸収をモニターして最初のピークを集める。溶媒を減圧で除き１．０３６ｍｇの無色固体として得た。これを少量のクロロフォルムに溶解し、クロロフォルムで充填したシリカゲル２００ｍｌのカラムに注ぎクロロフォルム：メタノール（４０：１）ついで（２０：１）で展開した。ＵＶ吸収をモニターして分画を集め濃縮乾固して８８５ｍｇの無色固体を得た。６０％アセトニトリルに溶解しＯＤＳシリカゲルクロマトグラフィーでさらに精製をすると、７２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝１０１３（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ２＝０．４４
【００４２】
（ｅ）　シクロ（−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例２（ｄ）の生成物３８０ｍｇを５ｍｌのメタノールに溶解して、その溶液に少量の水で湿したパラジウム黒４８ｍｇを加えて攪拌し、これに５％蟻酸アンモニウムのメタノール溶液６ｍｌを加えた攪拌を続ける。７時間後ＨＰＬＣで原料物質の消失を認めたので濾過、減圧濃縮して残滓を２ｍｌのメタノールに溶解しメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０のカラムに注ぎメタノールで展開し３１２ｍｇの表題物質の蟻酸塩を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝７４５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．５７
【００４３】
【実施例３】
（ａ）　Ｂｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
実施例２（ｂ）と同様にして、Ｂｏｃ−ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジンの代わりに用いられるＢｏｃ−グルタミン酸δ−ベンジルエステル６１４ｍｇと、８０７ｍｇのＢｏｃ−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン−Ｌ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルから製造したＤ−フェニルアラニル−プロリンＬ−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル塩酸塩とを用いて、アミド縮合した。反応液を実施例２（ｂ）と同様に処理し８７２ｍｇの表題物質を得た。
【００４４】
（ｂ）　Ｂｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステルの合成
実施例３（ａ）で得られたＢｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル７７６ｍｇを二等分した。実施例
２（ｃ）と同様に一方を酢酸−亜鉛末で処理して且つもう一方を塩酸−ジオキサンで処理した後にＢｏｐ試薬とＨＯＢｔでアミド縮合した。実施例２（ｃ）と同様に後処理をして表題物質の６０５．４ｍｇを得た。
【００４５】
（ｃ）　シクロ−（−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）２の合成
実施例３（ｂ）で得られたＢｏｃ−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−（δ−ベンジル）グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリン　２，２，２−トリクロロエチルエステル５８０ｍｇを実施例２（ｄ）と同様に酢酸−亜鉛末で処理し且つＴＦＡ処理して遊離のへキサペプチドを得た。さらに、希釈ＤＭＦ溶液中でＤＰＰＡ−炭酸水素ナトリウムで環化し反応を行った。反応液から抽出、セファデックスＬＨ２０クロマトグラフィー、ＯＤＳ−シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、表題物質３０２ｍｇを得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９２７（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ２＝０．４２
なお、上記（ｃ）の生成物を実施例２（ｅ）と同様にパラジウム黒の存在下にベンジル基の脱離のため水素還元すると、シクロ−（−グルタミル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル）２が合成できた。
【００４６】
【実施例４】
シクロ（−ε−ベンジルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−ベンジルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例２（ｅ）で得られたシクロ（−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）４０ｍｇをメタノール２ｍｌに溶解し、その溶液にベンズアルデヒド５０μｌ、シアノトリヒドロ硼酸ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）１３ｍｇを加えて室温６時間攪拌した。
反応液をメタノールで充填したセファデックスＬＨ２０、５００ｍｌカラムに注ぎメタノールで展開し、最初に溶出する紫外部吸収を示す分画を集めた。溶媒を減圧で溜去し、残滓を５０％アセトニトリルに溶解しＯＤＳシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９２５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．３８
【００４７】
【実施例５】
シクロ（−ε−（ｐ−クロロベンジル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−（ｐ−クロロベンジル）−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、ｐ−クロロベンズアルデヒド５０ｍｇを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２９ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９８５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．３７
【００４８】
【実施例６】
シクロ（−ε−（ｐ−メトキシベンジル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−（ｐ−メトキシベンジル）−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、ｐ−メトキシベンズアルデヒド５０ｍｇを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２７ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９９３（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．２４
【００４９】
【実施例７】
シクロ（−ε−（２−フリルメチル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−（２−フリルメチル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、フルフラール５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２５ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９０５（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．２５
【００５０】
【実施例８】
シクロ（−ε−（３−ピリジルメチル）リジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリルε−（３−ピリジルメチル）−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、３−ピリジンカルボアルデヒド５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２５ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９２７（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．４２
【００５１】
【実施例９】
シクロ（−ε−シクロヘキシルメチルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリルε−シクロヘキシルメチルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成実施例４のベンズアルデヒドに代えて、シクロヘキサンカルボアルデヒド５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９３７（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．２３
【００５２】
【実施例１０】
シクロ（−ε−シクロヘキシルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリルε−シクロヘキシルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、シクロヘキサンノン５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝９０９（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．３５
【００５３】
【実施例１１】
シクロ（−ε−イソプロピルリジル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−ε−イソプロピル−Ｄ−フェニルアラニル−プロリル−）の合成
実施例４のベンズアルデヒドに代えて、アセトン５０μＬを加えて実施例４と同様に反応を行った。精製をして２８ｍｇの表題物質を得た。
ＦＡＢ−ＭＳ：　ｍ／ｚ＝８２９（Ｍ＋Ｈ）＋
Ｒｆ３＝０．５５
【００５４】
【配列表】
2004083427.tif 000009
【００５５】
2004083427.tif 000010
【００５６】
2004083427.tif 000011