(57)【要約】【課題】神経幹細胞や前駆細胞を選択的に認識することにより、神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離しうる新規モノクローナル抗体を提供する。【解決手段】ヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を選択的に認識する特性を有することにより、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上記上衣層および上衣下層領域を選択的に免疫染色しうるモノクローナル抗体である。脳神経細胞のうちの神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識することにより、ヒトの脳組織から神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離できる。神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識するため、目的とする幹細胞や前駆細胞に蛍光物質が沈着しないため、分離された幹細胞や前駆細胞の安全性が確保できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を選択的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層および上衣下層領域を選択的に染色することが可能であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項３】
脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を選択的に認識せず、これ以外の部位に存在する細胞の抗原を選択的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項４】
脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層および上衣下層領域以外の部位を選択的に染色することが可能であることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項５】
ヒストンＨ１抗原を選択的に認識する請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
核内あるいは細胞質内に存在するヒストンＨ１を認識せず、細胞表面に存在するヒストンＨ１抗原を選択的に認識する請求項５記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項８】
１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を用いてマーキングすることにより、上記抗体が認識した抗原を有する細胞を分離することを特徴とする神経系の細胞の分離方法。
【請求項９】
請求項８記載の分離方法により分離された神経系の細胞。
【請求項１０】
請求項８記載の分離方法により分離された神経系以外の組織由来の細胞。
【請求項１１】
１〜６のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体による抗原抗体反応を利用したことを特徴とする免疫学的診断法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経系もしくは他の組織由来の細胞を選別，分離，調整する際、ならびに脳神経組織における蛋白質の部位特異的発現を調べる際に有用なモノクローナル抗体，ハイブリドーマ，神経系もしくは他の組織由来の細胞の分離方法，分離された細胞，免疫学的診断法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
疾病や外傷等で損傷したり失われたりした人体の組織を修復するため、従来から臓器移植と人工臓器を用いた治療が研究され、行なわれてきた。しかしながら、人工臓器は未だ開発段階であり、体内に埋め込んだ状態での永久使用に耐えるようなものは殆ど存在しない。また、臓器移植に関しては、臓器提供数が絶対的に不足している状況でその限界が指摘されているうえ、拒絶反応や倫理的問題等により未だ一般的な治療方法として定着していない。
【０００３】
このような状況のもと、近年では、人口臓器や臓器移植による治療に代わるものとして、複数の前駆細胞および分化細胞に分化する多分化能を有し、その組織を作り出すことができる幹細胞を利用した再生医療の研究が盛んに行なわれている。幹細胞は、複数の前駆細胞および分化細胞に分化する多分化能を有し、その組織を作り出すことができる細胞であり、幹細胞を培養し増殖・分化させたのち組織に戻すことにより、組織の再生を目指す再生治療は、上述した人口臓器や臓器移植による治療に代わる方法としてその進歩に大きな期待が寄せられている。
【０００４】
このような幹細胞には、大別して胚性幹細胞と体性幹細胞の２種類が存在し、いずれも再生治療への応用可能性があり、研究が進められている。これらのうち、胚性幹細胞は、培養による無限増殖が可能で、しかもどのような細胞にも分化しうる万能性を有することから注目を浴びている。ところが、ヒトの胚性幹細胞が、受精卵に由来するものでデザイナーベビーやクローンの作製につながる可能性もあり、倫理上の観点からヒトへの応用はその是非が議論されている。
【０００５】
胚性幹細胞より分化が進んだ体性幹細胞は、分化される細胞系列が限定され、成人の組織中にも存在することが確認されており、受精卵を必要としないことから、目的に合った安全な細胞としてヒトの再生治療への応用が期待されている。
【０００６】
脳や脊髄等の中枢神経系においては、生後まもなく分化を完了し、アルツハイマー病や脳出血等の病気や事故による損傷を受けても、成人では全く再生しないものと考えられてきた。ところが、近年、ヒトの成人の脳にも神経幹細胞が確認され、一定の条件下において増殖や分化をさせることが可能であることがわかってきた。これらの神経幹細胞の増殖・分化をコントロールすれば、脳神経系の疾患に対する有効な治療が可能になると考えられる。
【０００７】
このような体性幹細胞を再生治療に応用するためには、幹細胞もしくは前駆細胞を治療に必要な量まで分化させ増殖する必要があり、そのため、まず、目的とする細胞や組織に分化しうる幹細胞をいずれかのソースから効率的に分離しなければならない。
【０００８】
幹細胞を効率的に分離する方法としては、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いた分離法等がある。この方法は、幹細胞に発現する選択的な表面マーカーの発現様式を、蛍光標識したモノクロナール抗体で認識し、その蛍光強度により幹細胞を分離する方法である。
【０００９】
しかしながら、神経幹細胞に関する表面マーカーは、ＣＤ１３３抗体が認識する表面マーカーに関する報告があるに留まる。ところが、このＣＤ１３３抗体は、神経幹細胞を直接認識して反応するものであることから、この抗体を用いて分離された神経幹細胞には、蛍光物質の沈着が避けられない。このように蛍光物質が沈着した神経幹細胞を増殖・分化させて医療に利用した場合、その長期的な安全性については全く確認されていないのが実情である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明らは、本発明者は、脳神経細胞のうち、神経系の幹細胞もしくは前駆細胞を選択的に認識する抗体、あるいは逆に神経系の幹細胞もしくは前駆細胞以外の細胞を選択的に認識するモノクローナル抗体があれば、効率的でかつ安全な幹細胞の分離が可能となり、神経幹細胞の医療への応用が実現するのではないかとの着想に基づき、鋭意研究を重ねた。
【００１１】
それら一連の研究のなかで、ヒト脳神経組織に由来する細胞破砕標品を感作抗原として使用してモノクローナル抗体を作製したところ、新規モノクローナル抗体が得られた。
【００１２】
そして、この取得されたモノクローナル抗体のあるものは、ヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を認識し、また別の抗体はヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に細胞に発現する抗原は認識せずにこれ以外の部位に存在する細胞に発現する抗原を認識する性質を有するものであることを見いだし、これらの抗体を用いて細胞の選別が可能であることを示し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、神経系の幹細胞もしくは前駆細胞を選択的に認識・結合することによりこれらの細胞を効率的に分離しうる新規モノクローナル抗体、もしくは神経系の幹細胞もしくは前駆細胞以外の細胞を選択的に認識・結合することにより、逆にこれらの抗体が認識・結合しない神経幹細胞もしくは前駆細胞を効率的に分離しうる新規モノクローナル抗体を提供することを目的とするものであり、さらには、当該モノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを提供することを目的とするものである。また、このようなモノクローナル抗体を用いた神経系の幹細胞もしくは前駆細胞の分離方法を提供することを目的とするものであり、さらには、上記方法で分離された神経系の幹細胞もしくは前駆細胞や神経系以外の組織由来の細胞を提供することを目的とするものである。さらに、このようなモノクローナル抗体を用いた免疫学的診断法を提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト脳組織の断面における上衣層および上衣下層の領域に局在する神経系の幹細胞もしくは前駆細胞に発現する抗原を選択的に認識する新規なモノクローナル抗体、ならびに、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上記上衣層および上衣下層の領域を選択的に免疫染色しうるモノクローナル抗体に係るものである。
【００１５】
また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト脳組織の上衣層および上衣下層領域に局在する細胞に発現する抗原を認識せず、これ以外の部位に存在する細胞に発現する抗原を認識する新規なモノクローナル抗体、ならびに、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層および上衣下層領域以外の部位を選択的に染色可能なモノクローナル抗体、ならびにこれらの抗体による細胞分離方法と分離された細胞に係るものである。
【００１６】
これらモノクローナル抗体は、神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞の細胞に発現する抗原を選択的に認識・結合することにより、これらの細胞を除去して、神経幹細胞を効率的に分離しうる機能を有するとともに、分離された神経幹細胞や前駆細胞には蛍光物質の沈着がなく極めて安全な神経幹細胞を分離しうるものとして極めて有用なものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
このような本発明のモノクローナル抗体は、基本的には、例えば、次のようにして作製することができる。
【００１８】
すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒト胎児の脳細胞を感作抗原として使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用して免疫し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合させ、通常のクローン化法を応用してクローン化したのち、スクリーングすることによって作製することができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体の作製方法は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、ヒト胎児の脳細胞を使用し、当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクローン化し、その中から前記細胞株を認識する本発明の抗体を産生するクローンを選別し、これを培養して目的とする抗体を回収する方法が好適なものとして例示される。
【００２０】
このようなモノクローナル抗体の作製方法において、前記感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択するのが好ましく、一般的には、マウス、ラット、ハムスター等が好適なものとして使用される。
【００２１】
つぎに、免疫は、一般的方法により、例えば、前記ヒト胎児の脳細胞を哺乳動物に腹腔内注射等により投与することにより、行われる。より具体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを、動物に１ヶ月毎に数回投与することが好ましい。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。
【００２２】
つぎに、前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７８）〕、ｐ３−Ｕ１〔ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃｅｌｌ，８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７８）〕、およびＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。
【００２３】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には通常の方法、例えば、ミルシュタインら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎｅｔａｌ．）の方法〔ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８１）〕等に準じて行うことができる。
【００２４】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施される。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに、所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を適宜添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程度とするのが好ましい。また、前記細胞融合に用いる培地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、この種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用することも可能である。
【００２５】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによって行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とするハイブリドーマが形成される。
【００２６】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充分な時間、通常、数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が実施される。
【００２７】
このようにして作製される本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００２８】
当該ハイブリドーマから本発明のモノクローナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法に従って培養し、その培養上清から得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した方法であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適した方法である。
【００２９】
さらに、前記した方法により得られる抗体は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラフィー等の通常の精製手段を応用して高純度に精製することができる。
【００３０】
このようにして作製される本発明のモノクローナル抗体は、脳神経細胞のうちの神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識することにより、ヒトの脳組織から神経幹細胞を効率的に分離できる。しかも、神経幹細胞以外の細胞を選択的に認識するため、幹細胞に蛍光物質が沈着しないため、分離された幹細胞の安全性が確保できる。
【００３１】
そして、本発明は、上記モノクローナル抗体を用いてマーキングすることにより、上記抗体が認識した抗原を発現する細胞を分離する神経系の幹細胞もしくは前駆細胞の分離方法に係るものであり、さらには、上記分離方法により分離された神経系の幹細胞もしくは前駆細胞に係るものである。
【００３２】
上記細胞の分離方法としては、上記抗体を使用して表面マーキングすることにより細胞を分離しうる方法であれば各種の方法を適用することができる。例えば、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁性分離（磁性ビーズに複合体化した抗体を使用する）、および特定の細胞表面「マーカー」として知られるタンパク質に対する抗体の親和性による他の方法が包含されるがこれらに限定されない。
【００３３】
このようにして、安全な神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離し、これらの神経幹細胞や前駆細胞の増殖・分化をコントロールすれば、脳神経系の疾患に対する医療診断や再生治療への応用が可能となる。
【００３４】
また、本発明は、上記モノクローナル抗体による抗原抗体反応を利用した免疫学的診断法に関するものである。
【００３５】
上記免疫学的診断法としては、上記モノクローナル抗体による抗原抗体反応を利用して免疫組織診断や生化学的診断を行いうる方法であれば、各種の方法を適用することができる。
【００３６】
例えば、上記モノクローナル抗体に蛍光色素等の色素を結合させて標識抗体として、モノクローナル抗体の結合の有無等を観察する蛍光抗体法や化学染色法、蛍光色素の代わりに酵素を用いて上記モノクローナル抗体を標識抗体とする酵素抗体法，酵素で標識した二次抗体を用いて抗原量等を測定するエライザ法，上記モノクローナル抗体をアイソトープで標識して標識抗体とするラジオイノムアッセイ，抗原抗体反応による凝集反応を利用する免疫沈降法等をあげることができる。
【００３７】
また、タンパク質をゲル電気泳動で分画し、これを上記モノクローナル抗体で検出するウェスタンブロット法をあげることができる。このようなウェスタンブロット法によれば、上記モノクローナル抗体に対する抗原タンパク質をコードするＤＮＡを直接クローニングするのに有用である。なお、上記ウェスタンブロット法としては、ウェスタン法，サウスウェスタン法，ノースウェスタン法，ウェストウェスタン法等のウェスタンブロット変法も含まれる趣旨である。
【００３８】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について詳しく説明する。
【００３９】
モノクローナル抗体作製法
【００４０】
動物の免疫：
モノクローナル抗体の作製は、Ｏｒｌｉｋ，Ｏ　＆　Ａｌｔａｎｅｒ，Ｃ　（Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ．１１５：５５−５９，１９９８）による変法に従い、鼡径部リンパ節細胞を用いて行った。胎齢９，１４，２３週のヒト脳組織をすり潰した破砕物の懸濁液（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ）を抗原として、生後６週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス４−５匹に注射し免疫した。抗原は１回につき０．２ｍｌづつＲＩＢＩ　Ａｄｊｕｖａｎｔ（フナコシ）との混合液として、両足底より３−４日おきに３回接種した。更に５日後に最後の抗原注射（Ｌａｓｔ　ｂｏｏｓｔｅｒ）を単独で接種した。
【００４１】
ハイブリドーマ細胞の作製：
株化Ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｌ　であるＦＯ−１　ｃｅｌｌを１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）、８ａｚａｇｕａｎｉｎｅ（２０μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で３７℃、ＣＯ２インキュベーターを用いて培養。細胞融合の前２−３日は８ａｚａｇｕａｎｉｎｅを除去した同上組成の培地にて培養した。
Ｌａｓｔ　ｂｏｏｓｔｅｒ後、３日で下記の方法にて細胞融合を行いハイブリドーマ細胞を作製した。
４−５匹のマウスの両鼡径部リンパ節を摘出。培養液にいれて、２枚のスリガラスに挟んでスリ合わせるようにしてリンパ球を取り出した（約１×１０８個）。
２−４×１０７個のＦＯ−１細胞を用意した。
【００４２】
操作１および２の細胞を増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１５％ＦＣＳ）の５０ｍｌ中で混合。１０００ｒｐｍ（回転数／分）、５分間室温で遠心分離後、上清を捨て２０ｍｌの増殖培地に細胞を懸濁した。
５０％　Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　（ＰＥＧ）水溶液を１００μｌ加えて、３７℃のＣＯ２インキュベーターに９０分間入れて保温。１０００ｒｐｍ，５分遠心分離後、上清を捨て、さらに数秒度程度の回転数にて遠心分離して上清を出来るだけ吸いとった。
３７℃の恒温水槽の水面に細胞試料の入った容器を軽く打ち付けるようにして温めながら上記遠心分離沈殿を、ほぐした。
３７℃であらかじめ温めた５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の水溶液１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振とうし、更に１ｍｌを１分間かけてゆっくり添加して振とうする。さらに８ｍｌを２−３分間かけて添加して混ぜてから１０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００４３】
細胞からなる上記遠心分離の沈殿をＨＡＴ培地（増殖培地１００ｍｌあたりに５０ｘ　ＨＡＴ２ｍｌを加える）の５０ｍｌに懸濁し、９６穴培養プレート（９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）に０．１ｍｌ／ｗｅｌｌで播種（５ｐｌａｔｅｓ）して培養。このとき胸腺細胞をＦｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌ（細胞の増殖を助けるため共存させる他の種類の細胞）として約１×１０５／ｗｅｌｌの割合で加えた。
３日目にＨＡＴ培養液を５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。以後ＨＡＴ培地の添加、交換を行い、ハイブリドーマ細胞の増殖コロニーが培養プレートの穴の１／４〜１／３程度になるまで待った。
細胞増殖巣が適当な大きさになったら培養上清をとり、抗体産生の陽性・陰性試験を行った。試験は胎齢９−１４週のヒト胎児脳パラフィン包埋切片で免疫組織染色を行うことで実施した（キット：ニチレイマルチステインを使用）。
【００４４】
抗体産生の認められたハイブリドーマ細胞については、限界希釈法によりハイブリドーマ細胞のクローニングを行った。すなわち、約０．５個ハイブリドーマ細胞／ｗｅｌｌになるように限界希釈したハイブリドーマ細胞を９６穴培養プレートに植え、培養液をＨＴ培養液＋Ｂｒｉｃｌｏｎｅ（増殖因子、大日本製薬）に替えて、ハイブリドーマ細胞のみが生存・増殖しやすい環境に置くことにより、ハイブリドーマ細胞１個由来の均質な細胞集団を得た。
【００４５】
上記のハイブリドーマ細胞の増殖コロニー形成から限界希釈法によるクローニングまでの行程を３回繰り返した。ただし培養液はＨＴ培養液＋Ｂｒｉｃｌｏｎｅを用い、ハイブリドーマ細胞中の抗体産生クローンの割合がほぼ１００％になった時点で、増殖のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンをとって増殖培地で増やした。
【００４６】
ハイブリドーマ細胞の増殖：
２−３週間前からｐｒｉｓｔａｎｅを０．５ｍｌずつ２−３回腹腔内に接種しておいたマウスの腹腔内に１×１０７のハイブリドーマ細胞を接種した。
７−１０日後、腹水が多量に貯まってくるので、注射器等を用いて腹水を採取し、液体窒素にて急速凍結。−８０℃にて凍結保存した。
【００４７】
モノクローナル抗体の性質試験法
【００４８】
ＨＦＢ１１５抗体が認識する分子の同定
【００４９】
１１５抗体の認識する抗原の精製：
Ｃａｒｐｅｎｔａｒ等の方法（ＭＫＣａｒｐｅｎｔｅｒＭＫ他、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌ．ｏｇｙ１５８巻　２６５〜２７８頁、１９９９年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）により培養したヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を、３００×ｇ，５分間で遠心し、上清の培地を取り除いた。その後、沈殿した細胞凝集塊をＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ，８．１ｍＭＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ，２．６８ｍＭＫＣｌ，１．４７ｍＭＫＨ２ＰＯ４）で３回（３００×ｇ，５分間）洗浄し、液体窒素で凍結後、−８０℃下で保存した。
【００５０】
マイナス８０℃下で保存している細胞塊を氷上で融かし、プロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ社製，ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｃｋｔａｉｌ，ｐ−８３４０）を加えたホモジェナイズバッファー（ＨＢ；０．１４７ｍＭＫＣｌ，５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］，１ｍＭＥＤＴＡ）５ｍｌを加え、ホモジェナイズ（５００ｒｐｍ，５回）した。これを、８，０００×ｇ，１５分間で遠心し、上清は新たな遠沈管に移した。沈殿は、再度、プロテアーゼインヒビターを加えたＨＢを５ｍｌ加え、ホモジェナイズ（１０００ｒｐｍ，５回）後、８，０００×ｇ，１５分間で遠心し、上清を先に分取したものと合わせた。合わせた上清画分を１００，０００×ｇ，９０分間で遠心し、沈殿を得た。この沈殿にＨＢ，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（以降ＨＢ’と呼ぶ）２ｍｌを加え、ホモジェナイズ（５０００ｒｐｍ，２０回）した。これを、３０，０００×ｇ，３０分間で遠心し、上清を細胞膜画分とした。
【００５１】
細胞膜画分のカラムクロマトグラフィーを、ＨｉｔｒａｐＨｅｐａｒｉｎＨＲ１ｍｌ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて下記の条件で行った。平衡化バッファーにＨＢ’、溶出バッファーにＨＢ’，１ＭＮａＣｌを用いた。ヘパリンカラムに細胞膜画分２ｍｌをアプライし、平衡化バッファー２ｍｌでカラムの洗いを行った。この後、５０％溶出バッファー５ｍｌで溶出を行い、この溶出画分を１ｍｌずつ（Ｎｏ．Ａ８−Ａ１２）分取した。続いて５０％溶出バッファーから１００％まで１５ｍｌのグラジエントの溶出を行い、溶出画分を０．５ｍｌずつ（画分Ｎｏ．Ｂ１２からＤ８）分取した。
【００５２】
ヘパリンカラムクロマトグラフィーの各溶出画分を、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ，２２７，ｐ６８０−６８５）の方法に従って、５％−２０％ポリアクリルアミドゲル濃度勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、セミドライトランスファー法によりニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）にゲル中の蛋白質を転写した。
【００５３】
抗体の膜への非特異的吸着を抑止するためＰＢＳ，０．５％ｔｗｅｅｎ２０（以下、ＰＢＳ−Ｔ），５％スキムミルクで室温で１時間処理した後、ＰＢＳ−Ｔで希釈した一次抗体溶液（抗ＨＦＢ１１５モノクローナル抗体；１０００倍）を加え、４℃下で一晩抗原抗体反応を行った。この後ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、二次抗体との反応を行った。二次抗体には抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰもしくはＩｇＭ−ＨＲＰ（イムノグロブリンＧと西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼの架橋物，ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１００００倍希釈したものを用い、室温で１時間反応させた。この後、ＰＢＳ，０．５％ｔｗｅｅｎ２０でよく洗い、ＥＣＬＰｌｕｓｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の方法に従い、化学発光を行った。この膜をＸ線フィルムと一緒にカセットに入れて暗室で露光し現像した。
【００５４】
抗ＨＦＢ１１５抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、ＨＦＢ１１５抗原タンパク質を含むＢ２からＣ２画分を分取した。
【００５５】
図１にＨＦＢ１１５抗原タンパク質の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇの結果を例示する。ＨＦＢ１１５抗原タンパク質は、分子量約３３ｋＤａの分子であることが分った。また、ＨＦＢ１１５抗原タンパク質は、ヘパリンカラムを用いた精製法で精製されることも確認した。
【００５６】
抗体２７番および抗体１６番の認識する抗原：
前述のＣａｒｐｅｎｔａｒらの方法により培養したヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）を５０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０），ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を含むＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ中で破砕した試料（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅｓ）を調製し、前項の方法で、５％−２０％ポリアクリルアミドゲル濃度勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った後、セミドライトランスファー法によりＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ社製）にゲル中の蛋白質を転写し、ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇをおこなった。
【００５７】
抗体２７番は１６ｋＤａおよび３４ｋＤａのバンドを認識、抗体１６番は３４ｋＤａのバンドを認識した。
【００５８】
図２は、抗体１１５番の抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果の第２例である。ＩｇＧ−ＨＲＰもしくはＩｇＭ−ＨＲＰを二次抗体として用いたこれらＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇの実験結果ならびに抗体サブクラス検定キットを用いた測定により、抗体１１５番、抗体２７番はＩｇＭに属し、抗体１６番、抗体２１１番はＩｇＧに属すると考えられた。
【００５９】
ＨＦＢ１１５抗体の認識する抗原タンパク質の内部アミノ酸配列の解析
ＨＦＢ１１５抗原タンパク質を含むＢ２，Ｂ１，Ｃ１，Ｃ２画分をアセトン沈殿法で濃縮した。各画分サンプル４００ｕｌにアセトン（−８０℃）を１２００ｕｌ加え、−８０℃で３時間放置した。これを２０，０００×ｇ，１５ｍｉｎ遠心し、沈殿したＨＦＢ１１５抗原タンパク質を得た。この沈殿を乾かし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー１５ｕｌでとかした。これを１２％不連続ポリアクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーＧ−２５０で染色・脱色後、ＨＦＢ１１５抗原タンパク質のバンド（３３ｋＤａ）を切りだし−２０℃で保存した。このバンドの内部アミノ酸配列を解析した（株式会社アプロサイエンス）。
【００６０】
図３にＨＦＢ１１５抗原蛋白質の内部アミノ酸配列の解析結果を例示する。３種のペプチド、最長１３アミノ酸配列を解析した結果、ＨＦＢ１１５抗原蛋白質はｈｕｍａｎｈｉｓｔｏｎｅＨ１．Ｄ（Ｈ１．２）と１００％のホモロジーがあった。
【００６１】
前述のＣａｒｐｅｎｔａｒらの方法により培養したヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）の凍結切片を作成した。切片をＰＢＳで洗い、１０％ＧｏａｔＳｅｒｕｍ，０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ＰＢＳで室温、１時間ブロッキングした。一次抗体（抗ＨＦＢ１１５抗体；５００倍、抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体；５００倍、抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体；５００倍，ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）で４度、一晩反応した。反応後、ＰＢＳで洗い、二次抗体（Ａｌｅｘｓａａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＭａｎｔｉｂｏｄｙ６４７，Ａｌｅｘｓａａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ４８８，Ａｌｅｘｓａａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ５６８，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅ社製）で室温、１時間反応した。ＰＢＳ，ｄｄＨ２Ｏで洗った後、マウントした。共焦点レーザースキャン顕微鏡（ＬＳＭ５１０，ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）で観察を行った。
【００６２】
抗ＨＦＢ１１５抗体と抗ヒストンＨ１抗体（市販品）の認識部位の比較
図４に示すように、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ凍結切片で抗ＨＦＢ１１５抗体と抗ヒストンＨ１抗体の認識部位の比較を行った結果、両者の認識部位が異なることがわかった。抗ＨＦＢ１１５抗体は、細胞膜、もしくは細胞間を認識し、抗ヒストンＨ１抗体は核を（抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体）、細胞質（抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体）を認識していた。
【００６３】
抗体を用いたヒト胎児脳の免疫染色：
パラフィンブロックより切り出した切片を脱パラフィン処理の為、ヒストクリアにて１０分間、３回処理した後、１００％、９５％、９０％、８０％、７０％の各濃度のエタノール水溶液にて上記の順番に５分間づつ処理した。ＰＢＳで５分間、３回洗浄後、ブロッキング溶液（１０％正常ヤギ血清、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むＰＢＳ）にて１時間洗浄し抗体の非特的吸着を抑制する為のブロッキングを行った。１０％正常ヤギ血清、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含むＰＢＳに０．０２％に希釈した抗体をこれらの組織切片試料に４℃、１５時間反応させた。ＰＢＳにて５分間、５回洗浄した後、ブロッキング溶液に０．０２％程度に希釈した抗マウスイムノグロブリン−ＦＩＴＣ複合体を含む二次抗体溶液を室温で１時間反応させた。ＰＢＳにて５分間、５回洗浄した後、蛍光顕微鏡にて観察し、染色部位を確認した。４種のモノクローナル抗体は、図２に抗体１１５番の例をもって示したように、ウェスタンブロット法等の生化学的診断法に用いることが可能である。
【００６４】
図５〜図８は、ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番の免疫染色像を示す。これらのうち図５はＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像、細胞の所在を示すもの、図６は神経幹細胞または前駆細胞に発現することが既知のマーカー蛋白質ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する抗体による免疫染色像、図７は抗体２７番による免疫染色像、図８は上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。抗体２７番では、脳室近くの上衣層、上衣下層付近が選択的に染色されている。同様の順序にて図９〜図１２に抗体１６番、図１３〜図１６に抗体１１５番、図１７〜図２０に抗体２１１番の免疫染色像を示す。抗体１６番、２１１番では上衣層は脳室壁付近がごく一部染色されているものの、上衣下層は殆ど染色されておらず、上衣層、上衣下層以外の部分は染色されている。抗体１１５番では、上衣層、上衣下層は殆ど染色されておらず、これら以外の脳室から遠い部位が染色されている。
【００６５】
以上の結果より、抗体２７番はヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層および上衣下層領域を選択的に染色することの可能なモノクローナル抗体であり、抗体１６番、抗体１１５番、抗体２１１番の３種類のモノクローナル抗体は、ヒト脳組織切片を用いた免疫染色試験において上衣層、上衣下層領域を選択的に染色せず、上衣層、上衣下層以外の部位を選択的に染色することの可能なモノクローナル抗体であることが明らかである。上記４種のモノクローナル抗体は、脳組織切片の免疫組織化学診断法に用いることが可能である。
【００６６】
細胞の標識とＦＡＣＳ：
ヒト胎児由来の神経幹細胞もしくは神経系前駆細胞を含む細胞凝集塊（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）の構成細胞をパスツールピペットにて出し入れして、物理的にバラバラに分離し、３００ｇ、５分間程度の遠心分離で細胞を集めた。０．８％一次抗体、１７％ヤギＩｇＧを含む培地にて４℃、３０分処理した後、一次抗体を含まない培地にて５分間、３回洗浄。二次抗体溶液（１％の抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合体、もしくは抗マウスＩｇＭ−ＦＩＴＣ複合体）を加えて４℃、２５分間、遮光条件にて反応させ、二次抗体を含まない培地にて５分間、３回洗浄した後、１ｕｇ／ｍｌの７−ａｍｉｎｏ−ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＶＩＡ−ＰＲＯＢＥ）を含む培地に細胞を懸濁してＦＡＣＳ分析の試料とし、セルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ　ＳＥ）を用いてソーテイングを行った。Ｊｕｒｋａｔを用いた場合には、ＶＩＡ−ＰＲＯＢＥの代わりにＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を用いた。
【００６７】
図２１に抗体１１５番を用いたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ構成細胞のソーテイング結果の例を示す。横軸は二次抗体のＦＩＴＣに由来する蛍光強度を示し、細胞表面に結合した抗体の量を反映している。縦軸は死細胞を選択的に染色する色素による蛍光強度を示し、この値が高い細胞は死細胞である可能性が高い。図２１中の細胞の集団は２つのクラスターに分かれているが、縦軸の中央部、横軸で見るとやや左よりの水平方向に伸びた細胞集団は死細胞を多く含む可能性が考えられた。一方、図２１の左下から右側中央部にのびる細胞集団は、細胞外に抗原を持つ生細胞である可能性が高い。以上のような検討より、抗体１１５番を用いたソーテイングでは、Ｒ２の枠内に含まれる細胞が多く見られたので、細胞表面抗原を認識していると考えられた。抗体１６番、２１１番についてもこれにほぼ類似したソーテイング結果を得た。
【００６８】
図２２に抗体２１１を用いた、リンパ球系の細胞Ｊｕｒｋａｔのソーテイング結果の例を示す。この例に示されるように、神経系以外の細胞でも、同じ抗原を発現していれば、モノクローナル抗体をソーテイング等の方法により細胞分離に用いることができる。
【００６９】
上述したように、４種類のモノクローナル抗体の一つの１１５番抗体（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７８０）の抗原は、ヒストンＨ１であることが同定された。通常、ヒストンＨ１は細胞核あるいは細胞質に存在し、市販されている抗ヒストンＨ１抗体は核（抗ヒストンＨ１モノクローナル抗体）、細胞質（抗ヒストンＨ１ポリクローナル抗体）に存在するヒストンＨ１を認識する。しかし今回開発した１１５番抗体は他の市販されている抗体とは異なり、核内あるいは細胞質内に存在するヒストンＨ１を認識せず、むしろ細胞表面に存在するヒストンＨ１を認識していると考えられる。このことは、１１５番抗体は細胞表面に存在するヒストンＨ１の特異的な抗原を認識しているためと考えられる。
【００７０】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、新規な融合細胞であり、公的微生物寄託機関である特許微生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、下記のとおりである。
抗体　１６番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７７８
抗体　２７番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７７９
抗体１１５番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７８０
抗体２１１番産生ハイブリドーマ：ＦＥＲＭ　Ｐ−１８７８１
【００７１】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、脳神経細胞のうちの神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識することにより、ヒトの脳組織から神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離できる。しかも、神経幹細胞や前駆細胞以外の細胞を選択的に認識するため、目的とする幹細胞や前駆細胞に蛍光物質が沈着しないため、分離された幹細胞や前駆細胞の安全性が確保できる。そして、安全な神経幹細胞や前駆細胞を効率的に分離し、これらの神経幹細胞や前駆細胞の増殖・分化をコントロールすれば、脳神経系の疾患に対する医療診断や再生治療への応用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＦＢ１１５抗原タンパク質の精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。
【図２】抗体１１５番の抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果の一例である。
【図３】ＨＦＢ１１５抗原蛋白質の内部アミノ酸配列の解析結果を示す。
【図４】抗ＨＦＢ１１５抗体と抗ヒストンＨ１抗体の認識部位の比較を行なった結果を示す。
【図５】ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図６】ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図７】ヒト胎児脳組織に対する抗体２７番の免疫染色像である。
【図８】抗体２７番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図９】ヒト胎児脳組織に対する抗体１６番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図１０】ヒト胎児脳組織に対する抗体１６番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図１１】ヒト胎児脳組織に対する抗体１６番の免疫染色像である。
【図１２】抗体１６番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図１３】ヒト胎児脳組織に対する抗体１１５番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図１４】ヒト胎児脳組織に対する抗体１１５番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図１５】ヒト胎児脳組織に対する抗体１１５番の免疫染色像である。
【図１６】抗体１１５番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図１７】ヒト胎児脳組織に対する抗体２１１番のＤＮＡ染色色素ＴＯ−ＰＲＯ−３を用いた核染色による染色像である。
【図１８】ヒト胎児脳組織に対する抗体２１１番のネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）に対する免疫染色像である。
【図１９】ヒト胎児脳組織に対する抗体２１１番の免疫染色像である。
【図２０】抗体２１１番による上記３つの染色像の重ね合わせた多重染色像である。
【図２１】抗体１１５番を用いたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ構成細胞のソーテイング結果の一例である。
【図２２】抗体２１１を用いたリンパ球系の細胞Ｊｕｒｋａｔのソーテイング結果の一例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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