(57)【要約】【課題】動脈硬化性疾患を発症する危険因子としてのより正確な診断マーカとなりうる物質を提供する。【解決手段】スルホン酸基を有するイオン交換カラムに血液試料を注入し、マグネシウムイオン存在下でリポ蛋白を吸着させ、次いで、塩化マグネシウムなどの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が１５０から２５０ｍＭである溶液で吸着力の弱いリポ蛋白を溶出し、その後、塩化マグネシウムなどの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が３００から４００ｍＭである溶液で溶出してリポ蛋白画分を得、その中のコレステロール値を測定し、その値を動脈硬化性疾患の危険因子として用いることを特徴とする、動脈硬化性疾患の診断方法。【選択図】　　図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホン酸基を有するイオン交換カラムに血液試料を注入し、マグネシウムイオン存在下でリポ蛋白を吸着させ、次いで、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウム、及びフッ化マグネシウムから成る群から選ばれた少なくとも１つの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が１５０から２５０ｍＭである溶液で吸着力の弱いリポ蛋白を溶出し、その後、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウム、及びフッ化マグネシウムから成る群から選ばれた少なくとも１つの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が３００から４００ｍＭである溶液で溶出して得られることを特徴とする、リポ蛋白画分。
【請求項２】
請求項１に記載のリポ蛋白画分において、以下の特性を有することを特徴とするリポ蛋白画分；
・少なくともアポ蛋白Ｂ１００とアポ蛋白Ｂ４８の両者を含む、
・含有される中性脂肪の割合は、カイロマイクロン中の中性脂肪の割合よりは小さく、超低比重リポ蛋白中の中性脂肪の割合よりは大きい、かつ
・含有されるリン脂質の割合は、カイロマイクロン中のリン脂質の割合よりは大きく、超低比重リポ蛋白中のリン脂質の割合よりは小さい。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のリポ蛋白画分中のコレステロール値を測定し、その値を動脈硬化性疾患の危険因子として用いることを特徴とする、動脈硬化性疾患の識別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、スルホン酸基を有するイオン交換カラムとマグネシウムイオンを含む溶離液を用いてリポ蛋白を分離する際に、特定の塩濃度で溶出して得られるリポ蛋白画分、及びその画分中のコレステロール値を用いた動脈硬化性疾患の識別方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血中のコレステロールレベル、または、低比重リポ蛋白（以下、ＬＤＬ）に含まれるコレステロールレベルは、冠動脈疾患を初めとする動脈硬化性疾患の危険因子であり、これらのレベルを一定レベル以下にコントロールすることは動脈硬化性疾患を予防する上で重要である。また、近年では、ＬＤＬが体内で酸化されたリポ蛋白である酸化ＬＤＬをマクロファージが無制限に取り込むことによって泡沫化し、血管内膜に蓄積することにより動脈硬化が進むことが明らかになり、これらのことから、血中の酸化ＬＤＬの量を見ることにより、より正確な動脈硬化性疾患の危険因子としての診断マーカーになると考えられている。
【０００３】
また、日本動脈硬化学会が提案している高脂血症治療ガイドラインを見ると、その他の危険因子として、高血圧、糖尿病、喫煙、年齢（男性４５歳以上、女性５５歳以上）をあげており、これらに該当する人は、該当しない人に比べ、血中のコレステロールレベル、または、ＬＤＬコレステロールレベルをより低く管理することとしている。
【０００４】
これまで、さまざまな視点から、動脈硬化性疾患を予防・管理するための診断マーカーは研究され、多くの報告がされている。１つは、動脈硬化部位にコレステロールが多く含有されており、血中のコレステロールはリポ蛋白中に含まれることから、どのようなリポ蛋白が原因となり動脈硬化が進むのかという原因物質を特定するアプローチ、もう１つは、動脈硬化を血管内皮の障害ととらえ、血液凝固に関連した物質や炎症に関連した物質を検討するアプローチである。
【０００５】
酸化ＬＤＬは前者のアプローチから検討されている物質である。これまで報告されている酸化ＬＤＬに関する測定方法としては、酸化ＬＤＬ中にある酸化リン脂質に特異性のあるモノクロナール抗体を用いた測定方法、酸化ＬＤＬの１つであるマロンジアルデヒド化ＬＤＬに特異性のあるモノクロナール抗体を用いた測定方法、また、血中のＬＤＬを取得し銅イオン存在化で酸化させ、ＬＤＬ被酸化性を測定する方法などがある。酸化ＬＤＬは、さまざまな測定方法があり、測定方法により数値の特性も異なることから、動脈硬化性疾患を予防するための診断マーカーとしてどの程度有用であるかは結論が出ていない。
【０００６】
またリポ蛋白については、高比重型リポ蛋白（以下、ＨＤＬ）、ＬＤＬなどが、冠動脈疾患との関連が研究されてきた。しかしながら、中間型リポ蛋白（以下、ＩＤＬ）、超低比重型リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬ）やカイロマイクロン（以下、ＣＭ）などの粒子形状の大きなリポ蛋白については、その定量方法が超遠心分離機を用いた方法しかなく、手技が煩雑なため、特に大規模な臨床研究には不向きであった。
【０００７】
炎症により血中濃度が高くなることが知られているＣＲＰ（Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）も検討されているが、これは後者のアプローチである（例えば非特許文献１参照）。動脈硬化性疾患を予防するための診断マーカーとして非常に有用である報告がなされているが、かぜや骨折など、動脈硬化以外の多く疾患において血中濃度が高くなるため、検査時においては、これら疾患がないことが条件となる。
【０００８】
冠動脈疾患を初めとする動脈硬化性疾患を予防することは、きわめて重要であることから、動脈硬化性疾患を発症する危険因子として、より正確な診断マーカーが切望され、現在でも多くの研究が進行中である。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｐａｕｌ　Ｍ．　Ｒｉｄｋｅｒら、　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ．　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　ｐ８３６、　（２０００）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、冠動脈疾患を初めとする動脈硬化性疾患を予防するための、言い替えれば、動脈硬化性疾患を発症する危険因子として、より正確な診断マーカーは重要である。本発明は、この診断マーカーとなりうる物質を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、スルホン酸基を有するイオン交換カラムに血液試料を注入し、マグネシウムイオン存在下でリポ蛋白を吸着させ、次いで、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウム、及びフッ化マグネシウムから成る群から選ばれた少なくとも１つの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が１５０から２５０ｍＭである溶液で吸着力の弱いリポ蛋白を溶出し、その後、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウム、及びフッ化マグネシウムから成る群から選ばれた少なくとも１つの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が３００から４００ｍＭである溶液で溶出して得られることを特徴とする、リポ蛋白画分（以下、ピークｘ画分とする）である。
【００１２】
また本発明は、上述のピークｘ画分中のコレステロール値を測定し、その値を動脈硬化性疾患の危険因子として用いることを特徴とする、動脈硬化性疾患の識別方法である。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１３】
本発明で使用される、スルホン酸基を有するイオン交換カラムとしては特に限定はないが、特にスルホプロピル基などを有するイオン交換カラムを例示することができる。このカラムの平衡化に使用する溶液としては特に限定はないが、１００ｍＭ以下のマグネシウムイオンを含むものが好ましい。
【００１４】
血液試料としては、血漿又は血清が好ましい。
【００１５】
平衡化させたカラムに血液試料を注入し吸着させるが、これはマグネシウムイオン存在下で行う。血液試料はそのまま注入するか、または血液試料中にマグネシウムイオンをあらかじめ加えてから注入する。吸着時のマグネシウムイオンは１００ｍＭ以下であることが好ましい。また合計の塩濃度は２５０ｍＭ以下にすることが必要である。それは、目的とするピークｘを確実にカラムに吸着させるためである。これらの操作により血液試料をカラムに吸着させるが、その中でもＨＤＬは吸着力が弱いので、ほとんど吸着されずにそのまま溶出する。またＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬは、吸着時の塩濃度によって吸着されるか否かが異なるため、それらの分離溶出の必要性に応じて適宜塩濃度を決定すればよい。
【００１６】
次いで、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウム、及びフッ化マグネシウムから成る群から選ばれた少なくとも１つの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が１５０から２５０ｍＭである溶液で吸着力の弱いリポ蛋白を溶出させる。具体的には、カラムに吸着していたＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬなどを溶出させる。例えば、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋１５５ｍＭ硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５の溶液であれば、カラム体積の５倍程度でＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを溶出することが出来る。また溶離液の塩濃度を順次上げていくことにより、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬを順番に溶出することも可能である。
【００１７】
その後、ピークｘ画分を溶出させる。溶離液としては、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、臭化マグネシウム、及びフッ化マグネシウムから成る群から選ばれた少なくとも１つの塩を含み、それ以外に含まれる塩濃度が１００ｍＭ以下であり、かつ合計の塩濃度が３００から４００ｍＭである溶液を用いる。例えば、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋３００ｍＭ硝酸マグネシウムｐＨ７．５があげられる。このとき溶離液中の総計した塩濃度が４００ｍＭを越えると、リポ蛋白の構造を壊してしまう危険性があり好ましくない。また、溶液の粘度が高くなり、カラム圧力上昇も生じ、またマグネシウムイオンを含む溶液であることから、空気中の炭酸ガスの影響で炭酸マグネシウムの沈殿が生じやすくなり、扱いにくくもなる。
【００１８】
以上のようにしてピークｘ画分が得られる。
【００１９】
一例を挙げれば、スルホプロピル交換基を持つイオン交換カラムを、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋１０ｍＭ硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５の溶液で平衡化しておき、血清試料を３μＬ注入する。同一の溶液を流すと、１番目のピークとしてＨＤＬが溶出する。続いて、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋６８ｍＭ硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５の溶液でリポ蛋白を溶出させると２番目のピークとしてＬＤＬが溶出する。続いて、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋８８ｍＭ硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５の溶液でリポ蛋白を溶出させると３番目のピークとしてＩＤＬが溶出する。続いて、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋１５５ｍＭ硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５の溶液でリポ蛋白を溶出させると４番目のピークとしてＶＬＤＬが溶出する。続いて、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液＋３００ｍＭ硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５の溶液でリポ蛋白を溶出させると５番目のピークとしてピークｘ画分が溶出する。
【００２０】
ピークｘ画分の組成については、以下のとおりである。即ち、患者検体からＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数４００より大きな画分）を超遠心分法により取得し、前述のカラムを用いた分離分析法で測定するとピークｘ画分の位置にピークが確認される。しかしながら、溶液の密度が１．００６ｇ／ｍＬにおいて浮上係数が６００より大きな画分のＣＭはカラム中から溶出してこない。また、患者検体からＶＬＤＬ画分を超遠心分離法により取得し、前述のカラムを用いた分離分析法で測定すると、その一部がピークｘ画分の位置に溶出する。これらのことから、少なくともピークｘ画分は、ＶＬＤＬ画分の一部と浮上係数６００以下の粒子径の小さなＣＭ画分が含まれることがわかる。
【００２１】
またピークｘ画分を分取して、組成分析、ゲルろ過分析、アポ蛋白分析うと、以下の通りであった。即ち、組成分析においては実施例３表２に示すとおり、中性脂肪についてはピークｘ画分中の存在割合は、ＣＭ中の存在割合より小さく、ＶＬＤＬ中の存在割合より大きい。またリン脂質、蛋白質については、ピークｘ画分中の存在割合はＣＭ中のそれぞれの存在割合よりは大きく、ＶＬＤＬ中のそれぞれの存在割合よりは小さい。一方、ピークｘ画分中のエステル型コレステロールおよび遊離型コレステロールの存在割合は、ＶＬＤＬ中のそれぞれの存在割合に近いものである。ゲルろ過による分析においては、ピークｘ画分のピークトップの分子量は約１．７×１０７である。ピークｘ画分を構成するものとしては、分子量の分布からみて大きなものはカラムの排除限界である約２．５×１０９以上のものまで含まれ、小さなものは約４．５×１０５のものであることがわかる（図１３）。
【００２２】
アポ蛋白分析については、実施例３表３に示したが、アポ蛋白で特に注目すべきは、アポ蛋白Ｂ１００とアポ蛋白Ｂ４８との両方を含むことである（図１５，１６）。アポ蛋白Ｂ１００はＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬに含まれるアポ蛋白であり、アポ蛋白Ｂ４８はＣＭに含まれるアポ蛋白である。ピークｘ画分は、ゲルろ過の結果から、非常に幅広い分子量分布を有していることがわかる。このことから推測すると、ピークｘ画分はアポ蛋白Ｂ４８を含むＣＭに近い比較的粒子径が小さいリポ蛋白、アポ蛋白Ｂ１００を含むＶＬＤＬに近い比較的粒子径の大きなリポ蛋白の両方を含んでいる可能性がある。また、アポ蛋白Ｂ１００とアポ蛋白Ｂ４８の両方を含む異常なリポ蛋白が含まれている可能性もある。
【００２３】
これらの結果から、ピークｘ画分の特徴としてはっきりしていることは、
・少なくともアポ蛋白Ｂ１００とアポ蛋白Ｂ４８の両者を含む、
・含有される中性脂肪の割合は、ＣＭ中の中性脂肪の割合よりは小さく、ＶＬＤＬ中の中性脂肪の割合よりは大きい、かつ
・含有されるリン脂質の割合は、ＣＭ中のリン脂質の割合よりは大きく、ＶＬＤＬ中のリン脂質の割合よりは小さい、
ということである。
【００２４】
ところでこのピークｘ画分中のコレステロールは、該画分をコレステロールオキシダーゼなどを含んだ溶液と混合反応させたり、コレステロールオキシダーゼを用いた酵素電極を用いたりして、特異的に検出し測定することができる。
【００２５】
ピークｘ画分中のコレステロール値は、動脈硬化性疾患の診断マーカーとして利用できる。即ち、健常人男性２３名について、喫煙の有無、酸化ＬＤＬ、前述したリポ蛋白分析法によるＩＤＬ、ＶＬＤＬ、ピークｘ画分中のコレステロール値を比較した。その結果、ピークｘ画分中のコレステロール値と酸化ＬＤＬは正の相関を示した。また、喫煙の有無で２つの集団に分けたところ、喫煙者の方が非喫煙者に比べ、ピークｘ画分中のコレステロール値は有意に高いことが確認された。酸化ＬＤＬは動脈硬化性疾患に関する危険因子であり、また喫煙もライフスタイル中の動脈硬化性疾患に関する重要な危険因子の一つであることから、ピークｘ画分中のコレステロール値は、動脈硬化性疾患の危険因子の１つであり、診断マーカーとして利用できることが証明できたわけである。
【００２６】
また健常人群と高脂血症患者群でピークｘ画分中のコレステロール値を比較したところ、健常人群に比べ、高脂血症患者群が明らかに高い値を示した（実施例４）。高脂血症は動脈硬化性疾患の１つの危険因子であることが知られている。さらに、これらの検体について、レムナント様リポ蛋白コレステロール（以下、ＲＬＰ−Ｃ）を測定した。ＲＬＰ−Ｃは動脈硬化性疾患患者で有意に高値になることが知られている検査マーカーである（山田信博、日本臨床５７、ｐ２４−２７、１９９９年増刊号）。健常人群のピークｘ画分中のコレステロール値および高脂血症患者群のピークｘ画分中のコレステロール値それぞれと、ＲＬＰ−Ｃとの相関を見たところ（図１７，１８）、どちらも正の相関があった。これらのことから、ピークｘ画分は動脈硬化性疾患の危険因子となることが確認出来た。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１
実施例に用いた装置は図１に示す。溶離液Ａ（１）は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋１０ｍＭ　硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５、溶離液Ｂ（２）は５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋３００ｍＭ　硝酸マグネシウム　ｐＨ７．５である。溶離液ＡとＢを流すポンプ（４）はＣＣＰＭ２（東ソー（株）製）を用いた。ＣＣＰＭ２は、ポンプヘッドを２つもち、溶離液２液のグラディエントを行えるポンプである。溶離液ＡとＢを混合するミキサー（５）はスタティックミキサーＣ（東ソー（株）製）を用いた。オートサンプラー（６）はＡＳ−８０２１（東ソー（株）製）を、カラムオーブン（９）はＣＯ−８０２１（東ソー（株）製）を用いた。カラム（８）は、スルホプロピル基を有するものとしてＳＰ−ＮＰＲ　カラムサイズ４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２０ｍｍ（東ソー（株）製）を、フィルター（７）はＨＬＣ−７２３ＧＨｂ３型用のカラムフィルターＳタイプ（東ソー（株）製）を用いた。
【００２９】
コレステロール反応液（１１）はコレステロールＥテストワコー（和光純薬製）を、反応液ラインの洗浄液（１０）は純水を用いた。コレステロール反応液と洗浄液の切り替えに３方電磁弁（１２）を設置し、ポンプ直前にエアートラップ（１３）を設置した。コレステロール反応液のためのポンプ（１４）はＤＰ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液ＡとＢおよびコレステロール反応液については、デガッサー（３）を設置した。コレステロール反応液のラインに、抵抗管（１５）０．１ｍｍＩ．Ｄ．×２ｍを２つ直列につないで設置した。反応コイル（１６）は、０．４ｍｍＩ．Ｄ．×２５ｍとした。検出器（１７）はＵＶ−８０２０（東ソー（株）製）を用いた。溶離液はＡとＢをあわせて０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速とし、コレステロール反応液の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。カラムオーブンの温度は２５℃とし、反応コイルは３７℃に保温した。
【００３０】
検出器は６００ｎｍで検出した。溶離液のグラディエントパターンは、０分から４分まではＡ１００％、Ｂ０％からＡ８０％、Ｂ２０％の割合にリニアグラディエントを行い、４分から８分まではＡ８０％、Ｂ２０％の割合で固定で流し、８分から９分まではＡ８０％、Ｂ２０％からＡ７３％、Ｂ２７％の割合にリニアグラディエントを行い、９分から１２分まではＡ７３％、Ｂ２７％の割合で固定で流し、１２分から１３分まではＡ７３％、Ｂ２７％からＡ５０％、Ｂ５０％の割合にリニアグラディエントを行い、１３分から１５分まではＡ５０％、Ｂ５０％の割合で固定で流し、１５分から１７分まではＡ０％、Ｂ１００％の割合で固定で流し、１７分以降はＡ１００％、Ｂ０％の割合で固定で流した。２５分サイクルごとに試料を注入した。試料注入量は３μＬとした。測定中は３方電磁弁をＯＮとし、コレステロール酵素液を流し、測定終了後、３方電磁弁をＯＦＦとし洗浄水を流してから装置を停止した。
【００３１】
この方法による健常人血清の測定結果を図２に、また高脂血症患者血清の測定結果を図３に示す。さらにこの患者血清から超遠心分離法により分離した、ＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数６００より大きな画分）、ＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数４００より大きな画分）、ＶＬＤＬ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数１２〜４００）、ＩＤＬ画分（比重１．００６〜１．０１９ｇ／ｍＬ）、ＬＤＬ画分（比重１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍＬ）、ＨＤＬ画分（比重１．０６３〜１．２１ｇ／ｍＬ）のこの方法による測定結果をそれぞれ図４、５、６、７、８、９に示す。図中、縦軸は吸光度を、横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。
【００３２】
ＨＤＬ画分は患者血清で見られる１番目のピークに、ＬＤＬ画分は患者血清で見られる２番目のピークに相当する位置にピークが確認された。ＩＤＬ画分では、患者血清で見られる２，３，４番目のピークに相当する位置にピークが確認され、これは、ＩＤＬ画分が非常に幅広い特性を持つリポ蛋白の集団であることによると考えられる。ＶＬＤＬ画分は患者血清で見られる４番目と５番目のピークに相当するピークの位置にピークが確認された。ＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数４００より大きな画分）では、患者血清で見られる５番目のピークに相当するピークの位置にピークが確認された。ＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数６００より大きな画分）ではピークは検出されなかった（溶離液の塩濃度の変化に起因するベースラインノイズのみであり、その変化は０．５ｍＶ以内と小さい。）。
【００３３】
これらのことから、健常人血清および患者血清のクロマトグラムの各ピークの主要なリポ蛋白の成分は、溶出時間の早い順から、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＩＤＬ、ＶＬＤＬであることがわかる。最後のピークは本発明のピークｘ画分であり、ＶＬＤＬの一部と浮上係数の小さなＣＭが含まれる。
【００３４】
実施例２
喫煙者および禁煙者を含む健常人男性２３名（平均年齢３８．４歳）について、酸化ＬＤＬの値、実施例１の測定方法によるＩＤＬ画分、ＶＬＤＬ画分、ピークｘ画分のコレステロール値を測定した。結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
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禁煙者と喫煙者とをグループ分けし、それぞれのグループの測定値について有意差検定を行ったところ、酸化ＬＤＬ、ＩＤＬ画分のコレステロール値、ＶＬＤＬ画分のコレステロール値、ピークｘ画分のコレステロール値はそれぞれ０．０２５９、０．２４７、０．５５２、０．０８０１となり、酸化ＬＤＬの次にピークｘ画分のコレステロール値が有意差が高いという結果が得られた。また、酸化ＬＤＬとピークｘ画分のコレステロール値との相関を図１０に示したところ、正の相関を示した（相関係数Ｒ２＝０．４７８６）。これらの結果から、ピークｘ画分のコレステロール値は、酸化ＬＤＬと同様に動脈硬化の危険因子として有用であり、これを用いて動脈硬化性疾患の診断を行うことができる。
【００３６】
なお、各画分のコレステロール値の測定は液体クロマトグラフにより行った。即ち、あらかじめトータルコレステロール値のわかった健常人血清を液体クロマトグラフにより測定し、そのトータルコレステロール値とトータル面積との関係を用いて、各ピークの面積値より、各ピーク画分のコレステロール値を算出した。酸化ＬＤＬの測定方法は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社のＭｅｒｃｏｄｉａ　ＡＢ−ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ＬＤＬ　ＥＬＩＳＡを用いて測定した。酸化ＬＤＬの単位はｍＵ／Ｌである。また、本実施例で測定された男性２３名はトータルコレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロールを測定し健常者であることを確認した（表１）。本測定には、Ｔｃｈｏ−Ｌキット（和光純薬製）、ＴＧ−ＬＨキット（和光純薬製）、コレステストＮ　ＨＤＬ（第一化学薬品製）、コレステストＬＤＬ（第一化学薬品製）を用いた。
【００３７】
実施例３
実施例１と同じ装置、同じ溶離液を用いた。但し、溶離液のグラディエントパターンは、０分から９．５分まではＡ１００％、Ｂ０％からＡ５０％、Ｂ５０％の割合にリニアグラディエントを行い、９．５分から１２分まではＡ５０％、Ｂ５０％の割合で固定で流し、１２分から１５分まではＡ０％、Ｂ１００％の割合で固定で流し、１５分以降はＡ１００％、Ｂ０％の割合で固定で流した。２８分サイクルごとに試料を注入した。
【００３８】
健常人血清の測定結果を図１１に示す。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。高脂血症患者血清の測定結果を図１２に示す。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。両者の最初に確認されるピークはＨＤＬであり、２番目に確認されるピークはＬＤＬである。高脂血症患者血清で確認される３番目のピークはＶＬＤＬであり、４番目のピークはピークｘ画分である。この高脂血症患者血清のピークｘ画分を分取し、１０ｍＭ　ＭＯＰＳＯ＋０．０１ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎａ＋２．５％シュクロース溶液で透析し、濃縮した（なおＭＯＰＳＯとは、２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄである）。このピークｘ画分サンプルについて組成分析、ゲルろ過分析、電気泳動による分析を行った。
【００３９】
組成分析の結果を表２に示す。また参考までにＣＭおよびＶＬＤＬの組成比も記載した。ＣＭの組成比は、「血清脂質、その臨床、基礎、分析法、山本章編著、中外医学者１９８１」から引用し、ＶＬＤＬの組成比については、ＶＬＤＬ（１）は「血清脂質、その臨床、基礎、分析法、山本章編著、中外医学者１９８１」から、ＶＬＤＬ（２）は「Ｊ．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２８，ｐ９２（１９８６）」より引用した。
【００４０】
【表２】
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なお中性脂肪、総コレステロール、遊離型コレステロール、リン脂質については和光純薬（株）のキットを用いて測定した。エステル型コレステロールは、総コレステロールと遊離型コレステロールの差から算出した。蛋白質はＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いた。
【００４１】
次にピークｘ画分について、ゲルろ過により分析を行った。カラムはＴＳＫｇｅｌ　Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ　ＸＬ（東ソー（株）製）を２本直列につなぎ、溶離液の組成を５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ＋３５０ｍＭ　ＮａＣｌＯ４　ｐＨ７．５とし、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎとした。実施例１と同じように、カラムからの溶出液にコレステロール反応液を流速０．３５ｍｌ／ｍｉｎとして混合し５分反応させ６００ｎｍで検出した。その結果を図１３に示す。横軸は試料を導入してからの時間（分）を示す。フェリチン、牛血清アルブミン、ラクトグロブリンの溶出時間から、分子量を推定した。ピークｘ画分は分子量約４．５×１０５以上に分布し、ピークトップの分子量は約１．７×１０７であった。
【００４２】
次にＳＤＳアクリルアミド電気泳動によりピークｘ画分に含まれるアポ蛋白について解析を行った。即ち、アクリルアミド１５％濃度の電気泳動後、コマシブリリアントブルにより蛋白染色を行った結果を図１４に示す。分子量マーカー（ＭＫ１）、ピークｘ画分、超遠心で分離したＬＤＬを同時に電気泳動した。図中、ａｐｏＢ，ａｐｏＥ，ａｐｏＡ，ａｐｏＣはそれぞれアポ蛋白Ｂ，アポ蛋白Ｅ，アポ蛋白Ａ，アポ蛋白Ｃを示す。またａｐｏＢ１００はアポ蛋白Ｂ１００を示す。
ピークｘ画分のアポ蛋白組成は表３のようになった。
【００４３】
【表３】
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またアクリルアミド５％濃度の電気泳動後、コマシブリリアントブルにより蛋白染色を行った結果を図１５に、アポ蛋白Ｂに特異的な抗体によりウエスタンブロットを行った結果を図１６に示す。図中、ａｐｏＢ４８はアポ蛋白Ｂ４８を示す。図１５では２種類の分子量マーカー（ＭＫ１、ＭＫ２）、ピークｘ画分、及び超遠心で分離したＬＤＬを同時に電気泳動を行った。これらの結果をみると、図１５および図１６どちらにおいてもアポ蛋白Ｂ１００とアポ蛋白Ｂ４８の両方が確認された。
【００４４】
実施例４
健常人１７名と高脂血症患者３４名について、実施例３の方法によりピークｘ画分中のコレステロール値を測定した。同時にＲＬＰ−Ｃを測定した。ＲＬＰ−Ｃの測定キットはＪＩＭＵＲＯ−ＩＩ（日本抗体研究所製）を用いた。結果を表４に示す。
【００４５】
【表４】
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ｔ検定により有意差検定を行ったところ、ピークｘ画分及びＲＬＰ−Ｃの両者において、健常人に比べ高脂血症患者で有意に高値であった。
【００４６】
また、健常人群、高脂血症患者群それぞれについて、ピークｘ画分中のコレステロール値とＲＬＰ−Ｃについて相関図を作成した（図１７、１８）。両者ともに正の相関が得られた。
【００４７】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、スルホン酸基を有するイオン交換カラムとマグネシウムイオンを含む溶離液を用いたリポ蛋白の分離において、特定の塩濃度で溶出するリポ蛋白画分中のコレステロール値が動脈硬化疾患の危険因子として有用であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で使用した測定装置の構成を示す図である。
【図２】実施例１の健常人血清の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図３】実施例１の患者検体の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図４】実施例１の患者検体由来ＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数６００より大きな画分）の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図５】実施例１の患者検体由来ＣＭ画分（溶液密度１．００６ｇ／ｍＬにおいて、浮上係数４００より大きな画分）の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図６】実施例１の患者検体由来ＶＬＤＬ画分の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図７】実施例１の患者検体由来ＩＤＬ画分の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図８】実施例１の患者検体由来ＬＤＬ画分の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図９】実施例１の患者検体由来ＨＤＬ画分の測定結果を示す図（クロマトグラム）である。
【図１０】実施例２の酸化ＬＤＬとピークｘ画分中のコレステロール値の相関図である。
【図１１】実施例３の健常人血清の測定結果（クロマトグラム）を示す図である。
【図１２】実施例３の高脂血症患者血清の測定結果（クロマトグラム）を示す図である。
【図１３】分離精製したピークｘ画分のゲルろ過による測定結果（クロマトグラム）を示す図である。
【図１４】分離精製したピークｘ画分のＳＤＳアクリルアミド電気泳動（１５％）の測定結果を示す図である。
【図１５】分離精製したピークｘ画分のＳＤＳアクリルアミド電気泳動（５％）の測定結果を示す図である。
【図１６】分離精製したピークｘ画分のＳＤＳアクリルアミド電気泳動（５％）後、アポ蛋白Ｂ抗体によるウエスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図１７】実施例４の健常人群のピークｘ画分とＲＬＰ−Ｃとの相関図である。
【図１８】実施例４の高脂血症患者群のピークｘ画分とＲＬＰ−Ｃとの相関図である。
【符号の説明】
１　溶離液Ａ
２　溶離液Ｂ
３　デガッサー
４　溶離液用ポンプ
５　ミキサー
６　オートサンプラー
７　フィルター
８　カラム
９　カラムオーブン
１０　洗浄液
１１　コレステロール反応液
１２　３方電磁弁
１３　エアートラップ
１４　反応液用ポンプ
１５　抵抗管
１６　反応コイル
１７　検出器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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