(57)【要約】【課題】グルタチオン生合成に用いられる前駆体アミノ酸の供給法とは別の方法または併用する方法として、細胞内におけるグルタチオン合成能を増加させるという観点から、前駆体アミノ酸以外の有効成分を添加した、生体内（組織内、細胞内）のグルタチオン・レベルを高く維持するために、細胞内でのグルタチオン生合成を促進させることができる、経口摂取用の組成物を提供する。【解決手段】ルブロフサリン配糖体の少なくとも一種を生体内グルタチオン濃度を増加させる有効量で含有する、生体細胞内グルタチオン濃度を増加させるための経口組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルブロフサリン配糖体の少なくとも一種を細胞内グルタチオンを増加させる有効量で含有する、細胞内グルタチオン濃度を維持または増加させるための経口組成物。
【請求項２】
ルブロフサリン配糖体が、ルブロフサリン配糖体を含有する植物から抽出されたものである、請求項１の組成物。
【請求項３】
ルブロフサリン配糖体を含有する植物がケツメイシまたはハブソウである、請求項２の組成物。
【請求項４】
ルブロフサリン配糖体の全部または主成分が、ルブロフサリンゲンチオビオサイドである、請求項１〜３のいずれか１項の組成物。
【請求項５】
ルブロフサリン配糖体の含有量が、固形分当たり０．５重量％以上かつ３０重量％以下である、請求項１〜４のいずれか１項の組成物。
【請求項６】
ルブロフサリン配糖体含有飲食物である、請求項１〜５のいずれか１項の組成物。
【請求項７】
ルブロフサリン配糖体含有健康食品である、請求項１〜５のいずれか１項の組成物。
【請求項８】
ルブロフサリン配糖体含有医薬である、請求項１〜５のいずれか１項の組成物。
【請求項９】
細胞内グルタチオン生合成の前駆体、および場合によりビタミンＣ成分も含有し、細胞内グルタチオン濃度を相乗作用的に増加させる、請求項１〜８のいずれか１項の組成物。
【請求項１０】
細胞内グルタチオン生合成の前駆体が、卵白、卵膜、乳清、酵母蛋白質、大豆等の植物性蛋白質、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニンからなる群から選択される、請求項９の組成物。
【請求項１１】
細胞内グルタチオン生合成をさらに補強するための前駆体をＬ−システインあるいはＬ−メチオニン含有量として固形分あたり０．１重量％以上かつ１０重量％以下含有する請求項９あるいは請求項１０の組成物。
【請求項１２】
破砕したケツメイシあるいはハブソウ種子を水あるいは１０〜１００％有機溶媒で抽出した粗抽出物を、吸着用樹脂に接触させ、１０〜１００％有機溶媒で溶出して採取したものを有効成分とする、細胞内グルタチオン濃度を維持または増加させるための経口組成物。
【請求項１３】
有機溶媒としてエタノールを用いて抽出及び溶出したものである請求項１２の組成物。
【請求項１４】
ルブロフサリン配糖体を、固形分当たり０．５重量％以上かつ３０重量％以下含有する請求項１２あるいは１３の組成物。
【請求項１５】
ルブロフサリン配糖体がルブロフサリンゲンチオビオサイドである請求項１４の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有効成分としてルブロフサリン配糖体を含み、生体内グルタチオン濃度を増加させることが可能な経口摂取用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタミン酸、システイン、グリシンからなるトリペプチドであるグルタチオンは、細胞内に１〜１０ｍＭと高濃度含有される多機能性の生体成分である。グルタチオンはそれ自体が抗酸化活性を有しているほか、グルタチオンペルオキシダーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の基質として過酸化水素や過酸化脂質の消去に重要な役割を果たし、生体異物代謝酵素の一つであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の基質として解毒代謝に関わっている。また、生体内で酸化されたアスコルビン酸の再活性化（還元）のためにグルタチオンデヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の基質としても利用されている。さらに、近年、細胞内の酸化還元（レドックス）状態により生体シグナル伝達が変動することが明らかにされつつあり、高濃度に存在するグルタチオンが細胞内レドックス・バッファーとしての役割を演じていることも示唆されている（これに関わる総説：Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　５２，　７１１，　１９８３，　Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｇｕｌ．　３６，　１，２０００，　Ｃｕｒｒ．　Ｔｏｐ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｇｕｌ．　３６，　１５１，　２０００）。
【０００３】
現在、社会生活の急激な変化や高齢化が進む中、糖尿病などに代表される生活習慣病およびその前駆的な状態やパーキンソン病、アルツハイマー病などの脳疾患の増加が危惧されている。これらの病態に生体内の酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ）が深く関わっていることが明らかにされており、これを評価する指標として組織内グルタチオン濃度低下の度合を測定することがよくなされている。このように、酸化ストレスに起因する多くの疾患において、また加齢に伴う老化においても、組織内／細胞内のグルタチオン・レベルの低下が認められることから、生体内のグルタチオン濃度を高めることが予防的に有意義であると考えられる（これに関わる総説：Ａｎｎ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．　２９，　１２６３，　１９９５，　Ａｌｔ．　Ｍｅｄ．　Ｒｅｖ．　２，　１５５，　１９９７，　Ｆｒｅｅ　Ｒａｄ．　Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．　２８，　１４０５，　２０００，　Ｐｒｏｇ．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．　６２，　６４９，２０００）。
【０００４】
生体内グルタチオン・レベルの増加を図る方法として、グルタチオンを経口摂取することが容易に考えられるが、消化管内や肝臓においてグルタチオン分解酵素（ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ）により速やかに分解されてしまうことや、高用量のグルタチオンを摂取しても血中グルタチオン濃度の増加が認められないことなどから、経口摂取したグルタチオンが直接、生体組織内のグルタチオン増加には寄与しないことが知られている（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　４３，　６６７，　１９９２）。
【０００５】
このように、グルタチオンそのものを投与しても血中半減期が数分と短く組織内グルタチオン増加に有効でないことが指摘されていることを受けて、これを解決する試みが医薬品開発を目的として行われている。
【０００６】
すなわち、ＷＯ９４／１２５２７にはγ−Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−システインのアシル誘導体が内因性グルタチオンの生合成を促進する化合物として開示されており、この化合物が、酸化的な組織障害、とくに過剰なフリー・ラジカルによる障害の関わる病的状態のようなグルタチオンの低下・欠乏によって起こる様々な疾患の治療に有効である旨の開示がある。ここで述べられている疾患の例としては、アルコール多飲、生体異物、放射線障害、肝疾患によって起こる細胞内の酸化状態、医薬やその他の化合物による中毒、重金属による中毒、脳の生理学的な加齢（例えば、記憶および学習能力の喪失や、生体酸化物質に対する防御機構の変化に伴うグルタチオン濃度の減少に起因した脳の衰退であるパーキンソン病）、ならびに、急性および慢性の神経疾患（急性の病状としては、急性の虚血状態としての大脳の発作、低血糖症およびてんかん発作などを、慢性の病状として筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー症、ハンチントン舞踏病などを挙げることができる）、免疫機構の機能異常、とくにガンに対する免疫能低下、不妊症、とくに雄性不妊が挙げられている。さらに、上記の化合物が、フリー・ラジカルの主たる原因となる臓器の虚血・再灌流障害にも適すると開示されている。
【０００７】
また、特開平１−２６５１６には、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインメチルエステルがグルタチオン濃度を上昇させる化合物として白内障、肝疾患および腎疾患をはじめとする各疾患の治療および予防に有効であると開示されている。
【０００８】
さらに、Ｓ−低級脂肪酸グルタチオン誘導体が抗炎症、抗アレルギー、肝障害抑制剤（ＷＯ９１／１２２６２、ＷＯ９１／１６３３７）、糖含有グルタチオン誘導体が肝臓保護剤（特開平９−２５２９２）として開示されているなど組織グルタチオンを増加させることにより広汎な疾患に対する治療および予防に有効であることが示されている。
【０００９】
グルタチオン・エステル誘導体については、以下に列記するような組織／細胞障害に対し防御的な効果を示す知見が報告されている。すなわち、ブチオニンスルフォキシミン誘発白内障（Ｐｒｏ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８６，　８７２７，　１９８８）、アセトアミノフェン誘発肝障害（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　３９，　１８７７，　１９９０）、抗がん剤（シスプラチンやアルキル化剤）による障害（ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　４，　３２５１，　１９９０、Ｃａｎｃｅｒ　６２，　１２７５，　１９８８）、紫外線ＵＶＢによる細胞障害（Ｂｉｏｌ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　１８，　１２１９，　１９９５）、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド誘発胃細胞障害（Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　３５１，３６３，　１９９８）、肝臓虚血再灌流障害（Ｊ．　Ｓｕｒｇ．　Ｒｅｓ．　８６，　２，　１９９９）など。また、システインのプロドラッグであり組織内グルタチオン濃度を増加させるＬ−２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸についての近年の知見として、セルレイン誘発膵炎（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１１２，　１６８１，　１９９７）や冠動脈症患者の血管内皮機能（Ｊ．Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　１０１，　１４０８，　１９９８）の改善、エンドトキシン誘発心機能不全の予防（Ａｍ．　Ｊ．　Ｒｅｓｐｉｒ．　Ｃｒｉｔ．　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．　１５８，　１１０９，　１９９８）、慢性アルコール肝障害の抑制（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　３１，　３９１，　２０００）、脊髄外傷に伴う二次障害の軽減（ＦＡＳＥＢ　Ｊ．　１５，　２４３，　２００１）などを挙げることができる。
【００１０】
ただし、このような治療を主たる目的とする試みは医薬的なものであり、緊急を要する、あるいは重篤な場合の対処法である。生活の質（ＱＯＬ）の向上を目指した日常的な健康管理の観点からみれば、グルタチオンが「生体自らが合成してまかなう」生体物質であるという特性に即し、低レベルとなった組織内グルタチオンの上昇をはかるような試みが待たれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、グルタチオン生合成に用いられる前駆体アミノ酸の供給法とは別の方法または併用する方法として、細胞内におけるグルタチオン合成能を増加させるという観点から、前駆体アミノ酸以外の有効成分を添加した、生体内（組織内、細胞内）のグルタチオン・レベルを高く維持するために、細胞内でのグルタチオン生合成を促進させることができる、経口摂取用の組成物を提供する。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的に適う細胞内におけるグルタチオン合成能を増加させる有効成分の探索を広く食経験を有する素材を用いて行い、ケツメイシ抽出物に有効成分が存在することを見出し、この有効成分がルブロフサリン配糖体であることを特定した。細胞内のグルタチオン濃度を増加させるものとして、合成化合物であるβ−ナフトフラボン（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９９８）　２７３、１４６８３）などや天然物由来の化合物であるシリマリン（Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ．　５５，　４２０，　１９８９）、シアノヒドロキシブテン（Ｔｏｘｉｃｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ／　１２３，　２５７，　１９９３）、アポシニン（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　４４３，　２３５，　１９９９）などがすでに知られているが、ルブロフサリン配糖体の細胞内のグルタチオン濃度を増加させる作用についてはこれまで知られていない。
【００１３】
なお、ケツメイシはマメ科に属する和名エビスグサ（Ｃａｓｓｉａ　ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）の種子であり、焙煎したものが昔から煎じて飲用されている。『中薬大辞典』（上海科学技術出版社　小学館編）によれば、ケツメイシには「肝を清める、目を明らかにする、水を利す、便を通す、の効能がある」として、とりわけ「青盲、目淫膚、赤白膜、目の充血と痛み、涙が出て止まらないものを治し、長く服用すれば精光（眼光）を益す」（神農本草経）などの経典を引用して目に有効な生薬であることを紹介しており、『中医臨床のための中薬学』（医歯薬出版）のケツメイシの項にも「眼科常用の薬物」と称されるとあるが、目におけるケツメイシの効能のメカニズムについては明らかではなかった。他方、水晶体をはじめ眼組織にグルタチオンが著量蓄積され機能していることが知られているとともに、グルタチオンは医薬品として、初期老人性白内障、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、角膜炎に対する眼科用薬（白内障治療薬）に適用されている（『薬剤師のための常用医薬品情報集』（廣川書店））。以上の知見を本発明の知見と組み合わせると、ケツメイシの医薬としての効能のメカニズムは、含有されているルブロフサリン配糖体が眼組織の細胞内グルタチオン濃度を増加させることに基づいて、目の機能を保持・改善させ有効に働くものと思われる。このようなケツメイシの効果に関しては、そのメカニズムも有効成分の実体が何であるかも本発明前には知られていなかった。
【００１４】
本発明は、有効成分としてルブロフサリン配糖体を添加した、生体内（組織内、細胞内）のグルタチオン・レベルを高く維持するための、ルブロフサリン配糖体を含有する経口摂取用組成物である。
【００１５】
ルブロフサリン配糖体は、次式：
【００１６】
【化１】
2004002231.tif 000002
【００１７】
（式中、Ａは糖成分である）
で表される。糖成分Ａの例として、ゲンチオビオース、グルコース等があげられる。好ましい糖成分はゲンチオビオースであり、その場合のルブロフサリン配糖体はルブロフサリンゲンチオビオサイドである。
【００１８】
ルブロフサリン配糖体は、天然物からの抽出物中に含有され、原料となる天然物の例として、ケツメイシ（Ｃａｓｓｉａ　ｏｂｔｕｓｉｆｏｌｉａ）、カッシア属に属するハブソウ（Ｃａｓｓｉａ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等がある。
【００１９】
ルブロフサリン配糖体は、純粋な物質として本発明の組成物の有効成分としてもよく、天然物からの抽出物の状態で組成物の有効成分としてもよい。原料となる天然物の好ましいものは、ケツメイシであるが、ルブロフサリン配糖体を含有する素材であればケツメイシに限定されず、ハブソウ、その他も同様に利用することができる。
【００２０】
本発明の目的で、ルブロフサリン配糖体をケツメイシ自体として摂取するとすれば、毎日５−３０ｇを煎じるなどして服用することが必要となるが、現在のライフ・スタイルなどを考えてみると継続することが容易ではなく、また、特有のにおいやエグ味、苦みなどのため敬遠する向きも多いと思われる。近年、市販されている配合茶にも香り付け、味付け等の目的でハブ茶として焙煎したケツメイシが配合されているものもあるが、これらに含まれるルブロフサリン配糖体含有量は著しく低く、本発明の目的に適うものとは言い難い。なぜなら、ケツメイシ乾燥種子を焙煎処理すると、ルブロフサリン配糖体の含有量が著しく低下するからである（実施例３参照）。
【００２１】
したがって、ルブロフサリン配糖体を含有するケツメイシ乾燥種子などの素材から抽出操作をはじめとする目的に即した処理を行い、ルブロフサリン配糖体を所定量含有する濃縮組成物を使用するとよい。
【００２２】
天然物原料からルブロフサリン配糖体を抽出するために用いられる溶媒は水あるいは有機溶媒である。有機溶媒の例としては、エタノール、メタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、メチルエチルエーテルなどのエーテル類などを用いることができる。これらの水または有機溶媒は２種類以上組み合わせて使用してもよいが、飲食物をめざす場合には水あるいはエタノール水溶液を用いるのが妥当である。
【００２３】
ケツメイシを原料として本発明のルブロフサリン配糖体を含有する抽出濃縮物を調製する一例を示すと次のとおりである。この場合、濃縮物中にルブロフサリン配糖体ができるだけ多くの割合で含有されるような方法および条件を採用すべきである。例えば、濃縮物（乾燥固形物）当たりルブロフサリン配糖体を１〜３０重量％の割合で含有する濃縮物であるのが望ましい。ケツメイシを直接、または抽出効率を高める目的で通常の破砕処理を加えた後に溶媒を加え、例えば約３０分〜４時間の加温下あるいは１〜３日の室温下抽出を行い、抽出液をろ過し、粗抽出ろ液を得る。その際の加温の温度は、５０℃〜９５℃であることが好ましい。抽出のため添加する溶媒量は原材料に対して、例えば３〜１０倍量が用いられる。
【００２４】
抽出により得られるろ液中のルブロフサリン配糖体の含有量および純度は、７０％エタノール抽出では２．２％、熱抽出では１．１％（表１参照）程度であるが、さらに純度を高めることが望ましい場合がある。この目的のために、例えば工業的に汎用されているダイヤイオンＨＰ２０（三菱化学社製）などの吸着用樹脂や活性炭を利用することができる。水でルブロフサリン配糖体の抽出を行った場合は、抽出ろ液を直接樹脂に、また、エタノール水溶液を溶媒として用いて抽出を行った場合は減圧濃縮操作などによりエタノール濃度を下げた後の抽出液を、樹脂と接触させる。エタノール濃度の低下は、ルブロフサリン配糖体を十分に吸着させるために好ましい。エタノール濃度は好ましくは２０％以下にまで低下させる。
【００２５】
樹脂からの有効成分の溶出は、それぞれの目的に応じた成分含有濃度（重量％）設定を行い、それに適う方法を選択できる。例えば、エタノール溶液を用いてステップワイズや濃度勾配などの方法で溶出することができる。ステップワイズ溶出においては、非限定的例示として、２０％エタノール洗浄／８０％エタノール溶出、３０％エタノール洗浄／６０％エタノール溶出などの組み合せが可能である。
【００２６】
このようにして得られた溶出液は通常の減圧濃縮、凍結乾燥などの方法により濃縮あるいは乾燥粉体化することができる。また、乾燥粉体化が容易でない濃縮物の場合には、常用のデキストリン、高分子澱粉加水分解物、あるいは高分子ペプチドなどを賦形剤として用いて乾燥粉体化物を製造することができる。
【００２７】
さらに高純度のルブロフサリン配糖体（例えば、高純度のルブロフサリンゲンチオビオサイド）を調製するには、上記の抽出濃縮物を用いてカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、液々交流分配クロマトグラフィー等の常法に従って処理することにより目的とする純度のものを得ることができる。たとえば、逆相系クロマトグラフィーを用い、溶媒系として０．１％トリフルオロ酢酸含有アセトニトリル水溶液の１０％−８０％（アセトニトリル濃度）の濃度勾配溶出により、分離度のよいピークとして再現性よく有効成分が溶出されるので、これを分取すればほぼ単一成分としてルブロフサリン配糖体（例えば、ルブロフサリンゲンチオビオサイド）を得ることができる。
【００２８】
上記の抽出・精製過程でルブロフサリンの純度や収率をモニターするには、実施例２に記載した測定方法が使用出来る。
ルブロフサリン配糖体は、後記表１に示すとおり、ケツメイシの生種子１ｇ当たり３ｍｇ以上含まれる成分であり、昔から常時、決明子煎液やハブ茶として一日に５〜３０ｇ生種子相当を飲用されており、経口摂取での実績もあり安全性が高いと考えられる。本発明のルブロフサリン配糖体の含有設定においてもこれらの知見が反映されるべきである。したがって、本発明の組成物は、有効成分であるルブロフサリン配糖体の配合量に実質的上限はないが、好ましくは固形分当たり０．５重量％以上ないし３０重量％、より好ましくは、１重量％以上ないし１５重量％以下配合する。
【００２９】
ルブロフサリン配糖体を、純粋な物質として、または天然原料からの濃縮物として用いることにより、簡便に有効量を摂取できる経口摂取用組成物を提供することができる。ルブロフサリン配糖体は、ｐＨ、水分、酸化、光等に対する安定性が十分高く、幾分の苦みを呈する。そのため、本発明の経口摂取用組成物は、目的に応じて飲食品、調味料、アルコール飲料、機能食品、医薬品等の種々の形態にでき、酸化ストレスにより引き起こされる細胞内／組織・臓器内のグルタチオン低下の緩和あるいはレベルの維持を図ることができる。例えば、酸化ストレスに起因すると考えられている肝臓機能、脳機能、視覚機能、免疫能などの保持・改善や疲労倦怠の緩和、解毒代謝の促進に伴う臓器障害の抑制や発癌リスクの低減化、免疫機能の保持・活性化、筋肉疲労回復、肌のくすみ予防、生活習慣病予防、喫煙障害予防、ＡＩＤＳによる慢性疲労症候群の治療、老化防止などの効能がある。
【００３０】
組成物の具体的形態としては、固形状、半流動状、流動状などを挙げることが出来る。固形状食品としては、ビスケット状、シート状、タブレットやカプセルなどの錠剤、顆粒粉末などの形態の一般食品および健康食品があげられる。半流動状食品としては、ペースト状、ゼリー状、ゲル状などの、また、流動状食品としては、ジュース、清涼飲料、茶、ドリンク剤などの形態の一般食品および健康食品があげられる。
【００３１】
本発明の組成物は、細胞内のグルタチオン濃度を増加させるという機能を奏する量のルブロフサリン配糖体を含有していて、経口摂取して安全であること以外は、特別の制限はない。
【００３２】
さらに、上述の各種飲食物形態のいずれにおいても、ルブロフサリン配糖体が単一の有効成分として含まれていてもよく、あるいはまた、細胞内グルタチオン生合成のための前駆体、とりわけ栄養学的に律速となっているアミノ酸であるＬ−システイン／Ｌ−シスチン（ただし、著量の遊離Ｌ−システインを経口投与すると毒性を示すことが知られている、Ａｍ．　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｎｕｔｒ．　５０，　１４０１，　１９８９）、Ｌ−メチオニンを配合させることにより、グルタチオン増加機能の相乗作用をめざすこともできる。相乗作用とは、ルブロフサリン配糖体のみを含有する組成物の細胞内グルタチオン濃度増加作用と、前駆体のみを含有する組成物の当該作用との合計に比べ、両者を同時に含有する組成物の当該作用の方が大きいことを意味する。前駆体の例は、Ｌ−システイン／Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン含有量の高い卵白や卵膜、ミルク・ホエー（乳精）等の動物性、大豆などの植物性および酵母等に由来する蛋白質あるいはそれらから加工調製されたペプチド、また、食品添加物として認可されているＬ−シスチン、Ｌ−メチオニンの添加などをあげることができる。これらの前駆体もしくはそれを高含量で含む食品は、Ｌ−システイン含有量として固形物あたり約０．１〜１０重量％組成物中に配合することが好ましい。
【００３３】
また、グルタチオンの細胞内濃度を維持させ有効に機能させる目的からは、グルタチオン前駆体による生合成の促進とともに、グルタチオン消費の低減を図る機能を有するビタミンＣ（アスコルビン酸）を同時補給することが好ましいと考えられる。
【００３４】
経口摂取用組成物は、既に上述したような生活習慣に関わる身体の不具合の緩和に有効である。使用法としては、食事前後、食中、食間いずれでもよいが、とりわけ食間が望ましく、使用頻度としては、毎日３回摂取するのが望ましいがこれに限定されるものではなく、随時摂取でも構わない。実施例１０に示したタブレットはこのような設定に則って設計してある。本経口摂取用組成物の使用を特に勧める人としては、眼の充血や視力低下の気になる人、加齢にともない老人性白内障が気になる人、喫煙障害が気になる人、喫煙、太陽光を含む紫外線、加齢などにともなう肌あれ、シワ、シミなどが気になる人などをあげることができる。
【００３５】
【実施例】
実施例１：有効成分の特定
ケツメイシの７０％（ｖ／ｖ）エタノール抽出物をダイヤイオンＨＰ２０吸着カラムにのせ、３０％エタノール溶液洗浄後に７０％エタノール溶液で溶出させ得られた抽出濃縮物を用い、逆相系高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製を行い、本発明の有効成分の特定を行った。
【００３６】
逆相系高速液体クロマトグラフィーは、３次元モニター付きの装置でＨＧ５カラム（６　ｘ　１００ｍｍ）を用い、上記の抽出濃縮物（８９　ｍｇ／ｍｌ水溶液）を１０μｌインジェクトさせ、０．１％トリフルオロ酢酸含有の２５−４０％アセトニトリル直線的濃度勾配（１２分間）条件下で溶出を行い、１５秒間隔で分取した分画物をそれぞれ減圧乾固させた後に、２０μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。
【００３７】
各分画物ＤＭＳＯ溶液の６μｌを１９４μｌのＲＰＭＩ１６４０（１０％血清添加）培地で希釈した後に、さらにＲＰＭＩ１６４０培地で２倍希釈４段階の希釈サンプルを調製し細胞内グルタチオン増加活性を測定した。
【００３８】
細胞内グルタチオン増加活性は、ヒト肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞を用い測定した。さらに具体的には、９６穴マイクロプレートにＲＰＭＩ１６４０培地にて培養したＨｅｐＧ２細胞の２．５ｘ　１０４細胞（１００μｌ）を加え細胞を壁に定着させた後に、上記のサンプルの各２５μｌを加えＣＯ２インキュベーターにて４８時間の培養を行った。培養後、培養液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一回洗浄した後に、２５μｌの０．２５ｍＭモノクロロバイマン（ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｍａｎｅ）含有ＰＢＳ溶液を添加しＣＯ２インキュベーター（３７℃）に４５分間放置し、室温に戻した後に７５μｌの蒸留水を添加し均一化させた。モノクロロバイマンとグルタチオンの反応により生成する蛍光物質の蛍光強度を３５５ｎｍ／４６０ｎｍの条件で測定し、細胞内グルタチオン含量の変動をみた。これにより、用量依存性が認められ、かつ強い細胞内グルタチオン増加活性を示す画分が見出された。
【００３９】
この画分を再度、上記と同じ条件で逆相系高速液体クロマトグラフィーに供したところほぼ単一のピークであることが確認できたので、構造を特定する目的で核磁気共鳴分析（プロトン−ＮＭＲ）および質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）を行った結果、質量分析で（Ｍ＋Ｈ）＋が５９７．２であることなどから本発明の有効成分の本体がＫｉａｔｎａｋａ　＆　Ｔａｋｉｄｏ　（１９８８）　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．３６，　３９８０および　Ｈａｔａｎａｋａら　（１９９９）　ｉｂｉｄ．　４７，　１１２１に記載のルブロフサリン　６−Ｏ−β−ゲンチオビオサイド（ｒｕｂｒｏｆｕｓａｒｉｎ　６−Ｏ−β−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｉｄｅ）であることが明らかとなった。
【００４０】
実施例２：ルブロフサリン配糖体の定量法
抽出物をはじめ各種グレードのサンプル中に含有するルブロフサリン配糖体を簡便に定量する必要がある。実施例１に示した方法で精製・単離したルブロフサリン　６−Ｏ−β−ゲンチオビオサイド標品について、メタノール条件におけるモル吸光係数（ＵＶλｍａｘ　ｎｍ　（ｌｏｇε）＝　２７６（４．７２）（Ｋｉａｔｎａｋａ　＆　Ｔａｋｉｄｏ　（１９８８）　Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　３６，　３９８０）から重量を算出した標品を調製し、これの一定量を実施例１に示した逆相系高速液体クロマトグラフィーに供し、２８０ｎｍの吸収ピークの高さを測定したところ、定量性が確認できた。従って、この方法によりルブロフサリン配糖体含量をクロマトグラフィー操作により微量のサンプルにおいても簡便に測定できる。
【００４１】
実施例３：焙煎に伴うルブロフサリン配糖体含量の低下
生種子および焙煎種子の破砕処理したものにそれぞれ１０倍容の７０％（ｖ／ｖ）エタノールを加え２日間（室温）抽出、または破砕種子に２０倍容の水を加え、９５℃、３０分加温抽出した後に、フィルターろ過したろ液を調製し、これに含まれる固形分重量および実施例２に示した方法にしたがいルブロフサリン配糖体含量を測定した。結果を表１にまとめる。
【００４２】
【表１】
2004002231.tif 000003
【００４３】
この表から、焙煎することにより、ルブロフサリン配糖体の含量が著しく低下することが明らかになった。抽出総量は生種子および焙煎種子いずれにおいても７０％（ｖ／ｖ）エタノール抽出よりも熱水抽出の方が高いが、これは粘性の高い多糖などに起因しているものと考えられ、ルブロフサリン配糖体抽出量は比率的にも絶対量的にも７０％（ｖ／ｖ）エタノール抽出の方が優れている。なお、焙煎種子抽出物は茶飲料に適う芳ばしい香りを有するのに対して、生種子抽出物は青臭さ、生臭さが認められた。
【００４４】
実施例４：濃縮物の製造
非焙煎の破砕処理したケツメイシ１００ｇに１．０Ｌの７０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液を加え、室温下で１日抽出し、フィルターろ過によりろ液を得た（乾燥重量：１４．５ｇ、ルブロフサリン配糖体　３．０重量％）。ろ液を減圧濃縮し、最終５００ｍｌの２０％（ｖ／ｖ）エタノール溶解液とした後に、ダイヤイオンＨＰ２０吸着カラム（１００ｍｌ）にのせ、１００ｍｌの２０％エタノール溶液で非吸着成分を洗浄した（非吸着物の乾燥重量：１０．８ｇ）。１０００ｍｌの３０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液、ついで各１００ｍｌの４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、１００％（ｖ／ｖ）エタノール溶液の順にステップワイズに溶出させたときの乾燥重量およびルブロフサリン配糖体の重量％を表２にまとめる。
【００４５】
【表２】
2004002231.tif 000004
【００４６】
この条件で３０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液で充分に洗浄した後に、５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液で溶出させることにより、ケツメイシ１００ｇから乾燥重量０．８９ｇ、ルブロフサリン配糖体含有量１３３ｍｇ（１４．９重量％、回収率３０．５％）の抽出濃縮物が得られた。
【００４７】
実施例５：細胞内グルタチオン増加効果の経時的誘導性
ヒト肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞を用いて、細胞内グルタチオン濃度に与えるルブロフサリン配糖体の経時的誘導性をみた。操作法は実施例１に準ずる。すなわち、ＨｅｐＧ２細胞をマイクロプレートの各ｗｅｌｌあたり２．５ｘ　１０４細胞（１００μｌ）を分注し定着させた後、ＲＰＭＩ１６４０培地に所定濃度に希釈した評価標品を２５μｌ添加し、さらに０時間から６、１２、２４、４８時間まで経時的に培養を行った。評価標品としては、実施例４の方法にしたがって調製した本発明の濃縮物（ルブロフサリンゲンチオビオサイド　１０．２％（ｗ／ｗ）含有物）、および比較の目的で、ラットで組織内グルタチオン・レベルの増加が報告されているシリマリン（Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ．　５５，　４２０，　１９８９）の主要活性成分であるシリビニン（シグマ社製）を用い、細胞内グルタチオン濃度の推移をみた（図１）。この図では、全てのポイントにおいて無添加対照を１００％とした相対表示で結果を示している。シリビニンとの濃度比較を明瞭にするため、濃縮物に含まれるルブロフサリン配糖体（ルブロフサリンゲンチオビオサイド）の濃度で示してある（最終濃度：１．２５、２．５、５．０μＭ）。図１から明らかなように、本発明の濃縮物の添加１２時間後に顕著な細胞内グルタチオン・レベルの増加が認められ、用量依存的であった。他方、シリビニンはｖｉｔｒｏ細胞評価系では細胞毒性が強いためか、添加１２時間後に一過的な弱いグルタチオン・レベルの増加が認められる結果となった。
【００４８】
実施例６：細胞内グルタチオン増加効果の用量依存性
ヒト肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞を用いて、細胞内グルタチオン濃度に与えるルブロフサリン配糖体の用量依存性をみた。操作法は実施例５に準ずる。すなわち、ＨｅｐＧ２細胞をマイクロプレートの各ｗｅｌｌあたり２．５ｘ　１０４細胞（１００μｌ）を分注し定着させたものに、ＲＰＭＩ１６４０培地により所定濃度に２倍希釈系列化した濃縮物を２５μｌ添加（活性成分であるルブロフサリンゲンチオビオサイド換算で最終濃度０〜２０μＭ）し、さらに４８時間培養を行った後に、細胞内グルタチオン濃度をサンプル無添加、および比較化合物としてのβ−ナフトフラボン（ナカライ社製）、シリビニン（シグマ社製）との相対比較でみた結果を図２に示す。なお、β−ナフトフラボンは、本実施例と同様の細胞レベルにおける解析から、グルタチオン生合成系の律速酵素であるγ−グルタミルシステイン・シンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）活性および細胞内グルタチオン濃度を用量依存的に増加させることが知られている化合物である（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２，　７４４５，　１９９７）。これから明らかなように、本有効成分であるルブロフサリン配糖体のグルタチオン増加活性はβ−ナフトフラボンとほぼ同等であるが、高濃度域における細胞毒性が弱いことが示された。シリビニンは細胞毒性の影響でグルタチオン増加活性は認められなかった。
【００４９】
実施例７：過酸化化合物に対する防御作用
ヒト肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞を用いて、ルブロフサリン配糖体を与えることにより過酸化化合物に対して耐性を示すことをみた。操作法は実施例５に準ずる。すなわち、ＨｅｐＧ２細胞をマイクロプレートの各ｗｅｌｌあたり２．５ｘ　１０４細胞（１００μｌ）を分注し定着させた後に、ＲＰＭＩ１６４０培地で濃縮物のルブロフサリンゲンチオビオサイド換算で最終濃度が１０μＭとなるようにした希釈した濃縮物を２５μｌ添加し、さらに４８時間培養を行った後に、最終的に０〜１ｍＭとなるように過酸化化合物であるｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ｂｕｔｙｌ　ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ：ｔ−ＢＨＰ）を添加し、３時間後の生存率をサンプル無添加、および比較化合物としてのβ−ナフトフラボン（６μＭ）、シリビニン（１０μＭ）との相対比較でみた結果を図３に示す。細胞の生存率はＷＳＴ−１染色法を用いて、ｔ−　ＢＨＰ無添加対照を１００％として算出した。図３に示すように、ｔ−　ＢＨＰに対する防御作用はβ−ナフトフラボンに比べ幾分弱いものの、本有効成分であるルブロフサリン配糖体がグルタチオンペルオキシダーゼの基質であるグルタチオンを増加させることにより、ｔ−ブチルヒドロペルオキシドをモデルとした生体内過酸化化合物の細胞毒性を軽減させることが示された。
【００５０】
実施例８：前駆体との相乗作用
ヒト肝細胞由来のＨｅｐＧ２細胞を用いて、細胞内グルタチオン増加活性を有するルブロフサリン配糖体とグルタチオン生合成のための前駆体との相乗作用をみた。操作法は実施例１に準ずるが、ＲＰＭＩ１６４０培地には前駆体であるＬ−シスチンが充分量含有しているために本実施例の目的に即さないことから、Ｌ−シスチンを含まないＤ−ＭＥＭ（１０％血清添加）培地を調製して用いた。すなわち、ＨｅｐＧ２細胞をマイクロプレートの各ｗｅｌｌあたり２．５ｘ　１０４細胞（１００μｌ）を分注し定着させた後に、上記のＬ−シスチンを含まないＤ−ＭＥＭ培地（１００μｌ）に培地交換させた。Ｌ−シスチンを含まないＤ−ＭＥＭ培地でルブロフサリン配糖体最終濃度が１０μＭとなるようにした希釈した濃縮物および所定のシスチン溶液を調製し、それぞれ２５μｌずつ添加し４０時間培養を継続した。その後、細胞内グルタチオン濃度を測定した。結果を図４に示すように、Ｌ−シスチンの添加濃度に従いグルタチオンの細胞内濃度は増加するが、前駆体であるＬ−シスチンを含有しない条件での本発明濃縮物によるグルタチオン濃度の増加は認められなかった。しかし、グルタチオン前駆体であるＬ−シスチンが存在する条件では、Ｌ−シスチン単独以上の増加がみられ、これはグルタチオン増加活性を有するルブロフサリン配糖体とグルタチオン前駆体を併用すると相乗的に細胞内グルタチオン濃度が増加することを示している。
【００５１】
実施例９：拘束ストレス／臓器グルタチオンレベルの抑制
拘束ストレスに伴う臓器内のグルタチオンレベルの低下に対するルブロフサリン配糖体の保護・改善作用についてみた。被検動物としてマウス　Ｃ５７ＢＬ／　６（雄）６週齢、１群６匹を用い、あらかじめ上記の濃縮物の０．５％　ｔｗｅｅｎ８０懸濁液を１日１回、２００ｍｇ／ｋｇ（ルブロフサリン配糖体として　１２ｍｇ／ｋｇ相当）を８日間、強制経口投与を行った後に、拘束ネットに８時間固定させ拘束ストレスを与えた。非拘束対照群（ｎ＝６）、拘束対照群（ｎ＝６）いずれも０．５％　ｔｗｅｅｎ８０水溶液を同じ条件で強制経口投与し、拘束対照群は同様の拘束ストレスを与えた。拘束開放直後に肝臓および小脳を含まない脳組織を摘出し、各臓器のグルタチオン含量および過酸化脂質（チオバルビツール酸反応物：ＴＢＡＲＳ）含量を測定した。さらに具体的には、摘出し−８０℃にて保存した各臓器の重量あたり９　（　ｗ／ｖ　）倍量の氷冷ホモジェネーション溶液（１５４　ｍＭ　ＫＣｌ，　５　ｍＭ　ＤＴＰＡ，　１０　ｍＭ　ＫＰｉ　ｂｕｆｆｅｒ，　ｐＨ　６．８）を加えフィスコトロン（日音医理科器械製作所製）を用いてホモジェネートを作製し、Ｏｈｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　９５．　３５１−３５８，　１９７９の方法に準じて、ＴＢＡＲＳ値を算出した。また、各ホモジェネートに等量の酸性緩衝液（４０　ｍＭ　ＨＣｌ，　１０　ｍＭ　ＤＴＰＡ，　２０　ｍＭ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ，　１０　％　ＴＣＡ）を添加し、遠心処理により除蛋白したものを用い、Ｓｅｎｆｔ　ｅｔ　ａｌ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２８０，　８０−８６，　２０００の方法に準じてグルタチオン含量を算出した。
【００５２】
結果を図５、６に示すように、拘束ストレスを与えると、肝臓および脳組織いずれもグルタチオン含量が低下し、同時に過酸化脂質量を示すＴＢＡＲＳ値が上昇する。これに対して、ルブロフサリン配糖体を含有する本発明の組成物をあらかじめ投与することにより、肝臓においては改善する傾向が、また脳組織においては有意に（Ｐ＜０．０５）に改善することがわかった。
【００５３】
実施例１０：濃縮物含有タブレットの組成
表３に示した配合物を均一に混合した後に、打錠機を用い圧縮成型し１錠３００　ｍｇの錠剤とした。抽出濃縮物は実施例４の方法に従いルブロフサリン配糖体１０重量％として調製したものを用い、ホエーペプチドはＤＭＶ　ＪＡＰＡＮ社製のＬＥ８０ＧＦを用いた。１日の摂取目安量は３００ｍｇ錠で６錠が好ましく、この場合にタブレット１、２、３からルブロフサリン配糖体をそれぞれ、９０ｍｇ、４０ｍｇ、２０ｍｇ、またＬ−システイン／Ｌ−メチオニンをそれぞれ０ｍｇ／０ｍｇ、２０ｍｇ／１３ｍｇ、３２ｍｇ／４５ｍｇ補給することができる。
【００５４】
【表３】
2004002231.tif 000005
【００５５】
実施例１１：濃縮物含有飲料の組成
実施例４の方法に従い製造したルブロフサリン配糖体１０重量％含有抽出濃縮物２．５ｇ、ホエーペプチド（ＤＭＶ　ＪＡＰＡＮ社製　ＷＥ８０Ｂ）　１７．７ｇ、アスコルビン酸ナトリウム１．２ｇ、ショ糖２６．５ｇ、クエン酸２．１ｇ、溶解水９５０ｇの配合割合の原料を溶解し、１２０ｍｌずつ褐色瓶に分注した後にレトルト殺菌（１２１℃、１５分）し飲料を作成した。この飲料１本から３０ｍｇのルブロフサリン配糖体、３４ｍｇのＬ−システインを補給できる。
【００５６】
【発明の効果】
以上のように、ルブロフサリン配糖体を含有する本発明の濃縮物を摂取することにより、細胞内／組織内のグルタチオン濃度を維持・増加させることができ、これにより生活習慣病やその前駆状態や脳の機能低下などに深く関わっている酸化ストレスを防御あるいは緩和することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ルブロフサリン配糖体によりヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度が経時的に増加することをシリビニンとの比較で示すグラフである。
【図２】ルブロフサリン配糖体によりヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度が用量依存的に増加することをβナフトフラボン、シリビニンとの比較で示すグラフである。
【図３】ブロフサリン配糖体によりｔ−ブチルヒドロペルオキシドに対するヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞の死滅の防御効果を陽性対照として用いたβナフトフラボンとの比較で示すグラフである。
【図４】ブロフサリン配糖体とグルタチオン前駆アミノ酸であるシスチンが相乗的にヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度の増加に寄与することを示すグラフである。
【図５】ルブロフサリン配糖体含有濃縮物の経口投与が、拘束ストレスによる肝臓組織内グルタチオン・レベルの低下および脂質過酸化（ＴＢＡＲＳ値）の上昇に対し抑制的に作用することを示すグラフである。
Ａ：　肝臓グルタチオン含量；
Ｂ：　肝臓ＴＢＡＲＳ値。
【図６】ルブロフサリン配糖体含有濃縮物の経口投与が、拘束ストレスによる脳組織内グルタチオン・レベルの低下および脂質過酸化（ＴＢＡＲＳ値）の上昇に対し抑制的に作用することを示すグラフである。
Ａ：　脳組織グルタチオン含量；
Ｂ：　脳組織ＴＢＡＲＳ値。
【図１】
2004002231.tif 000006
【図２】
2004002231.tif 000007
【図３】
2004002231.tif 000008
【図４】
2004002231.tif 000009
【図５】
2004002231.tif 000010
【図６】
2004002231.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月28日(2003.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的に適う細胞内におけるグルタチオン合成能を増加させる有効成分の探索を広く食経験を有する素材を用いて行い、ケツメイシ抽出物に有効成分が存在することを見出し、この有効成分がルブロフサリン配糖体であることを特定した。細胞内のグルタチオン濃度を増加させるものとして、合成化合物であるβ−ナフトフラボン（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）　２７３、１４６８３）などや天然物由来の化合物であるシリマリン（Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄ．５５，　４２０，　１９８９）、シアノヒドロキシブテン（Ｔｏｘｉｃｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ／　１２３，　２５７，　１９９３）、アポシニン（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．　４４３，　２３５，　１９９９）などがすでに知られているが、ルブロフサリン配糖体の細胞内のグルタチオン濃度を増加させる作用についてはこれまで知られていない。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
逆相系高速液体クロマトグラフィーは、３次元モニター付きの装置でＤｅｖｅｌｏｓｉｌＯＤＳ−ＨＧ５カラム（６　ｘ　１００ｍｍ，野村化学製）を用い、上記の抽出濃縮物（８９　ｍｇ／ｍｌ水溶液）を１０μｌインジェクトさせ、０．１％トリフルオロ酢酸含有の２５−４０％アセトニトリル直線的濃度勾配（１２分間）条件下で溶出を行い、１５秒間隔で分取した分画物をそれぞれ減圧乾固させた後に、２０μｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
この画分を再度、上記と同じ条件で逆相系高速液体クロマトグラフィーに供したところほぼ単一のピークであることが確認できたので、構造を特定する目的で核磁気共鳴分析（プロトン−ＮＭＲ）および質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）を行った結果、質量分析で（Ｍ＋Ｈ）＋が５９７．２であることなどから本発明の有効成分の本体がＫｉｔａｎａｋａ　＆　Ｔａｋｉｄｏ　（１９８８）　Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．３６，　３９８０および　Ｈａｔａｎａｋａら（１９９９）　ｉｂｉｄ．４７，　１１２１に記載のルブロフサリン　６−Ｏ−β−ゲンチオビオサイド（ｒｕｂｒｏｆｕｓａｒｉｎ６−Ｏ−β−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｉｄｅ）であることが明らかとなった。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
実施例２：ルブロフサリン配糖体の定量法
抽出物をはじめ各種グレードのサンプル中に含有するルブロフサリン配糖体を簡便に定量する必要がある。実施例１に示した方法で精製・単離したルブロフサリン　６−Ｏ−β−ゲンチオビオサイド標品について、メタノール条件におけるモル吸光係数（ＵＶλｍａｘ　ｎｍ　（ｌｏｇε）＝　２７６（４．７２）（Ｋｉｔａｎａｋａ　＆　Ｔａｋｉｄｏ　（１９８８）　Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．　３６，　３９８０）から重量を算出した標品を調製し、これの一定量を実施例１に示した逆相系高速液体クロマトグラフィーに供し、２８０ｎｍの吸収ピークの高さを測定したところ、定量性が確認できた。従って、この方法によりルブロフサリン配糖体含量をクロマトグラフィー操作により微量のサンプルにおいても簡便に測定できる。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ルブロフサリン配糖体によりヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度が経時的に増加することをシリビニンとの比較で示すグラフである。
【図２】ルブロフサリン配糖体によりヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度が用量依存的に増加することをβ−ナフトフラボン、シリビニンとの比較で示すグラフである。
【図３】ルブロフサリン配糖体によりｔ−ブチルヒドロペルオキシドに対するヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞の死滅の防御効果を陽性対照として用いたβナフトフラボンとの比較で示すグラフである。
【図４】ルブロフサリン配糖体とグルタチオン前駆アミノ酸であるシスチンが相乗的にヒト肝細胞由来ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度の増加に寄与することを示すグラフである。
【図５】ルブロフサリン配糖体含有濃縮物の経口投与が、拘束ストレスによる肝臓組織内グルタチオン・レベルの低下および脂質過酸化（ＴＢＡＲＳ値）の上昇に対し抑制的に作用することを示すグラフである。
Ａ：　肝臓グルタチオン含量；
Ｂ：　肝臓ＴＢＡＲＳ値。
【図６】ルブロフサリン配糖体含有濃縮物の経口投与が、拘束ストレスによる脳組織内グルタチオン・レベルの低下および脂質過酸化（ＴＢＡＲＳ値）の上昇に対し抑制的に作用することを示すグラフである。
Ａ：　脳組織グルタチオン含量；
Ｂ：　脳組織ＴＢＡＲＳ値。