(57)【要約】【課題】短時間で効率的に脱リン活性を有する微生物を得る方法を提供すること【解決手段】澱粉を含む培養液を用いて培養する、脱リン活性を有する微生物の培養方法は、澱粉以外を炭素源として培養する場合と比較して、極めて早い速度で脱リン活性を有する微生物を生育させることができる、優れた培養方法である。また、培養にあたって、培養液中の溶存酸素を１ｍｇ／Ｌ以上に保持することによって、より効率的に脱リン活性を有する微生物を培養することができる。さらに、脱リン活性を有する微生物の比増殖速度が、２．０（１／ｄａｙ）以上であると、微生物を工業的に生産するにあたって好適である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
澱粉を含む培養液を用いて培養する、脱リン活性を有する微生物の培養方法。
【請求項２】
前記培養液の溶存酸素濃度を１ｍｇ／Ｌ以上に保持する請求項１に記載の微生物の培養方法。
【請求項３】
前記微生物の比増殖速度が、２．０（１／ｄａｙ）以上である請求項１又は２に記載の微生物の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脱リン活性を有する微生物を短時間で効率的に培養する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、脱リン活性を有する微生物を利用しようとする動きが盛んになってきている。脱リン活性を有する微生物は、Ａ２Ｏ法や嫌気・好気循環型廃水処理法等のプロセス能力アップや安定性の確保、またはスタートアップを早期実現する微生物として有用である。
【０００３】
脱リン活性を有する微生物としては、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）様ＮＭ−１株［ＦＥＲＭ　Ｐ−９９７１］（特許文献１参照）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）様ＮＭ−２株［ＦＥＲＭ　Ｐ−１０１１５］（特許文献２参照）が知られている。
また、ミクロコッカス様ＮＭ−１株の培養を行う方法として、０．０５％グルコースを炭素源に使用する方法が知られているが（非特許文献１参照）、その比増殖速度は１．３（１／ｄａｙ）であり、著しく低い。従って、工業的に短時間で高収量の脱リン活性を有する培養微生物体を得る方法としては実用的でない。
【０００４】
また、従来、活性汚泥中に存在する脱リン活性を有する微生物は、嫌気条件と好気条件を循環することでポリリン酸態リンの生合成及び増殖をするという知見から、嫌気条件と好気条件が伴った環境でのみ増殖すると考えられていたため、ミクロコッカス様ＮＭ−１株及びミクロコッカス様ＮＭ−２株も、静置培養等の微好気条件下で培養されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１−２６５８８３号公報
【特許文献２】
特開平２−３１６７２号公報
【非特許文献１】
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（１９９１）４
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、短時間で効率的に脱リン活性を有する微生物を得る方法を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明の第一の要旨は、澱粉を含む培養液を用いて培養する、脱リン活性を有する微生物の培養方法、である。
【０００８】
前記培養液の溶存酸素濃度を１ｍｇ／Ｌ以上に保持すると、増殖速度が高くなるため好ましい。
【０００９】
前記微生物の比増殖速度が、２．０（１／ｄａｙ）以上であると、効率的に脱リン活性を有する微生物を得る事ができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００１１】
本発明の培養方法でいう微生物の脱リン活性とは、嫌気性条件下でリン酸態リンを放出し、好気性条件下でリン酸態リンを取込む性質を有し、微生物体中にポリリン酸態リンを蓄積する能力をいう。
【００１２】
本発明の培養方法を適用する微生物は、脱リン活性を有するものであり、具体的には、前述のミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）様ＮＭ−１株［ＦＥＲＭ　Ｐ−９９７１］、ミクロコッカス様ＮＭ−２株［ＦＥＲＭ　Ｐ−１０１１５］等の微生物を好適な例として挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、その他脱リン活性を有するものであれば使用することができる。
【００１３】
本発明の培養方法は、使用する培養液中に、炭素源として澱粉を含む。澱粉の他に、他の炭素源を含んでいてもよい。
脱リン活性を有する微生物を効率的に培養するための澱粉濃度の下限は、０．０１質量％以上が好ましく、０．１質量％以上がより好ましい。一方、濃度が高すぎると、培養液の粘度が高くなって酸素の溶解効率が低下する等の問題があるため、澱粉濃度の上限は１５質量％以下が好ましく、１０質量％以下がより好ましい。
【００１４】
本発明に使用する培養液は、窒素源として、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等を含んでも良い。
また、有機栄養源として、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、味液等を含んでも良い。
また、無機塩として、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、コバルト塩、銅塩、その他微量金属塩等を含んでもよい。
【００１５】
また、上記成分は、バッチで調整してもよいし、連続的に添加して培養してもよい。連続的に添加する場合は、全部の成分を添加してもよいし、一部を添加してもよい。
【００１６】
本発明に使用する培養液のｐＨは、４〜１０の範囲とすることができ、好ましくは６〜９の範囲である。
【００１７】
本発明に使用する培養液の温度は、２０〜５０℃の範囲とすることができ、好ましくは２５〜４０℃である。
【００１８】
本発明に使用する培養液の溶存酸素濃度は、１ｍｇ／Ｌ以上に保持することにより、脱リン活性を有する微生物を効率的に培養することができる。その一方で、溶存酸素濃度を高く保持するためには多量の曝気を行ったり、激しく撹拌したりする必要があるため、あまり高い濃度に維持するとエネルギー効率が悪いことから、溶存酸素濃度の上限は８ｍｇ／Ｌ以下とすることが好ましく、６ｍｇ／Ｌ以下とすることがより好ましい。
【００１９】
培養器は、０．５〜１Ｌ容量の坂口フラスコ、三角フラスコ、５〜１０００００Ｌのファーメンター等が、好適に用いられる。
【００２０】
本発明の培養方法による脱リン活性を有する微生物の比増殖速度は、２．０（１／ｄａｙ）以上であると、工業的な見地から見て好ましく、より好ましくは３．０（１／ｄａｙ）であり、４．０（１／ｄａｙ）であるとさらに好ましい。
なお、ここでいう比増殖速度とは、微生物の増殖速度を微生物量で割った値をいい、以下の式で表される。
増殖速度（Ｖ）＝ｄＸ／ｄｔ
比増殖速度（μ）＝Ｖ／Ｘ
ここで、Ｘは微生物量、ｔは時間である。
【００２１】
本発明の培養方法によって脱リン活性を有する微生物を培養した後、実際の水処理に微生物を使用するにあたっては、培養液を処理槽に直接添加することもできるし、培養液を緩衝液等で洗浄しながら遠心分離機または膜で微生物を濃縮した後に、処理槽に添加するか、或いは、濃縮した微生物を凍結乾燥後に処理槽に添加することもできる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】
＜実施例１＞
１．前培養
培養液１は、表１に示す成分濃度に調整し、ｐＨは７．０とした。
【００２４】
１２４ｍ／ｍ×２００ｍ／ｍ試験管に培養液１を１０ｍｌ分注し、シリコン栓をして、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌したあと、滅菌した澱粉を０．２５％（質量／体積）となるように添加した。
この培養液に、寒天プレートを用いて培養したミクロコッカス様ＮＭ−１株のコロニーを接種した。そして、２５℃にて４日間振盪しながら前培養を行った。
【００２５】
２．本培養
培養液２は、表１に示す成分濃度に調整し、ｐＨを７．０とした。
そして、５００ｍｌ三角フラスコに培養液２を２００ｍｌ分注し、綿栓をして、１２１℃、２０分間オートクレーブで滅菌したあと、滅菌した澱粉を２％（質量／体積）となるように添加し、前培養にて得られたミクロコッカス様ＮＭ−１株の培養液２ｍｌを接種し、２５℃にて３〜１０日間振盪しながら本培養を行った。
【００２６】
３．生育量の測定
本培養の開始から２４時間置きに培養液を無菌的にサンプリングし、微生物濃度に応じて２０〜２００倍に希釈した希釈液を、吸光度計（島津サイエンス株式会社製、ＵＶ−１２０−０２）にて波長６３０ｎｍの吸光度を測定し、測定値に希釈倍率を掛けて希釈前の吸光度を求め、微生物生育量の指標とした。結果を表２に示す。
【００２７】
４．脱リン活性の測定
培養液３は、表３に示す成分濃度に調整し、ｐＨを７．０とした。
産業排水処理場から余剰汚泥（ＭＬＳＳ：約１００００ｍｇ／Ｌ）を採取し、５００ｍｌ三角フラスコに、余剰汚泥１８０ｍｌ、本培養後の培養液２０ｍｌを分注し綿栓をした。
【００２８】
次に１日あたり培養液３を５ｍｌ分注し、２５℃の振盪培養器中で８時間静置してリン酸態リンを放出させ、その後１６時間振盪してリン酸態リンを取り込ませた。このサイクルを１０日間継続し、汚泥容積１Ｌ当たりのリン酸態リン取り込み量の合計、および１サイクルにおける汚泥容積１Ｌ当たりのリン酸態リン放出量を求め、脱リン活性を調べた。結果を表４に示した。
【００２９】
＜実施例２＞
ミクロコッカス様ＮＭ−１株の代わりに、ミクロコッカス様ＮＭ−２株を用いたこと以外は、実施例１と同様にして前培養、本培養、生育量の測定、脱リン活性の測定を行った。
尚、生育量の測定にあたって、ＮＭ−２株は培養中で一部凝集するので、サンプリングした培養液を試験管に分注して、超音波洗浄器（株式会社井内盛栄堂製、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ　ＣＬＥＡＮＥＲ　ＶＳ−１５０）で２分間超音波処理することで凝集した微生物体を分散した後に、生育量の測定を実施した。結果を表２と表４に示した。
【００３０】
＜比較例１＞
前培養及び本培養で澱粉を添加する代わりに、グルコースを添加した以外は、実施例１と同様な方法によって前培養、本培養、生育量の測定を行った。結果を表２に示した。
【００３１】
＜比較例２＞
ミクロコッカス様ＮＭ−１株の代わりに、ミクロコッカス様ＮＭ−２株を用い、澱粉の代わりにグルコースを用いたこと以外は、実施例１と同様な方法によって前培養、本培養、生育量の測定を行った。結果を表２に示した。
【００３２】
＜比較例３＞
ミクロコッカス様ＮＭ−１株の培養液を添加せず、余剰汚泥を２００ｍｌ用いたこと以外は、実施例１と同様にして脱リン活性の測定を行った。結果を表４に示した。
【００３３】
【表１】
2004073092.tif 000002
【００３４】
【表２】
2004073092.tif 000003
【００３５】
【表３】
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【００３６】
【表４】
2004073092.tif 000005
【００３７】
以上の実施例及び比較例より、本発明の培養方法は、短時間で効率的に脱リン活性を有する微生物を得ることができることが明らかである。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の培養方法は、澱粉を含む培養液を用いて培養するので、脱リン活性を有する微生物を短時間で効率的に生育させることができる。
また、培養液を溶存酸素濃度１ｍｇ／Ｌ以上に保持して培養を行うことにより、さらに効率的に、脱リン活性を有する微生物を生育させることができる。
また、脱リン活性を有する微生物の比増殖速度が、２．０（１／ｄａｙ）以上であると、微生物を工業的に生産するにあたって好適である。