(57)【要約】【課題】特殊な装置を用いることなく、簡単かつ短時間に微生物を収集できる方法を提供する。【解決手段】微生物を捕捉可能な孔径の収集フィルター１３で内部が上下に分けられている遠心チューブ１の前記フィルター１３上に前記液状試料を載せ、この状態で、前記遠心チューブ１を遠心して前記フィルター１３上に前記微生物を捕捉して収集する。収集フィルターの孔径は、０．１〜１．０μｍの範囲である。遠心条件は、例えば、５０００Ｇで１分間である。前記収集フィルターの上に夾雑物を捕捉するプレフィルターを配置してもよい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状試料から微生物を収集する方法であって、前記微生物を捕捉可能な孔径の収集フィルターで内部が上下に分けられている遠心チューブを準備し、この遠心チューブの前記収集フィルター上に前記液状試料を置き、この状態で、前記遠心チューブを遠心分離して前記収集フィルター上に前記微生物を捕捉して収集する方法。
【請求項２】
前記遠心チューブにおいて、前記収集フィルターの上に、プレフィルターが配置され、このプレフィルター上に前記液状試料を載せ、この状態で、前記遠心チューブを遠心分離し、前記プレフィルターで夾雑物を除去し、前記収集フィルターで微生物を収集する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記プレフィルターが前記収集フィルター上に直接積層されている請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記収集フィルターの孔径が、１ｎｍ〜１０μｍの範囲である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記プレフィルターの孔径が、１０ｎｍ〜１００μｍの範囲である請求項２から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記遠心の条件が、５００〜１３０００Ｇで３秒〜６０分間である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
収集の対象となる微生物が、抗酸菌、非定型抗酸菌、淋菌、レジオネラ、マイコプラズマ、スピロヘータ、梅毒スピロヘータ−、クラミジア、リケッチア、らい菌、鼠咬症スピリルム、ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌、ペスト菌、ウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＡＴＬＶ、ＨＩＶおよびエボラ出血熱ウイルスからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
抗酸菌が、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からなる群から選択される少なくとも一つである請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記液状試料が、痰、髄液、糞、唾液、血液、組織、スワブ、胃洗浄液、尿およびこれらの生体試料を前処理した試料からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
微生物の遺伝子を特異的に増幅若しくは検出する方法であって、請求項１から９のいずれかに記載の方法により微生物を収集し、これに非イオン性界面活性剤を含む抽出試薬液を添加して加熱することにより微生物から遺伝子を抽出し、この遺伝子を特異的に増幅もしくは検出する方法。
【請求項１１】
前記加熱温度が、７０℃以上１００℃未満である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記加熱時間が、１〜３０分間である請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記加熱条件が、９６℃で１０分間の条件である請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出試薬液のｐＨが、ｐＨ７．０〜１２．０の範囲である請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記抽出試薬液中の前記非イオン界面活性剤の濃度が、０．０１〜１０重量％の範囲である請求項１０から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
非イオン界面活性剤が、ｄ−ソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステルおよびポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つである請求項１０から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
さらに、前記抽出試薬液が、金属キレート剤を含む請求項１０から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記抽出試薬液中の前記金属キレート剤の濃度が、０．１〜１００ｍＭである請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記金属キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ｏ−フェナンスロリンおよびサリチル酸からなる群から選択された少なくとも一つである請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子の特異的な増幅もしくは検出方法が、ポリメラーゼ  チェーン  リアクション（ＰＣＲ）法である請求項１０から１９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液状試料からの微生物の収集方法およびそれを用いた遺伝子の増幅若しくは検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
結核は、今なお、世界的に重要な細菌性疾患であり、その治療方法のみならず診断方法は極めて重要である。結核の最終的確認は、培養法により行われるが、結核菌の増殖速度は極めて遅いため、培養法の前段階で実施される予備的診断方法の確立が望まれている。このような予備的診断方法として、注目されているのは、ポリメラーゼ  チェーン  リアクション（ＰＣＲ法）を適用した遺伝子検査法である。この方法は、結核菌の遺伝子に特異的なプライマーを用い、結核菌の遺伝子を増幅して検出することにより、結核菌の有無を判定する方法である。
【０００３】
前記ＰＣＲ法を適用した予備的診断方法では、その前処理として結核菌を喀痰等の液状試料から菌を集菌する必要がある。従来の集菌方法は、例えば、つぎのようにして実施されていた（非特許文献１参照）。まず、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）と水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の溶液（ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ溶液）を加えて粘性を除去した試料液を調製する。この試料液に対し、１３０００ｇで１０分間の遠心分離をすることにより、菌を沈殿させて集菌する。しかしながら、この従来法での遠心分離による集菌では、その遠心条件が厳しく、煩雑な操作であり、しかも時間もかかり、高価な遠心分離機が必要である。また、この集菌に続く溶菌処理から遺伝子の増幅もしくは検出処理においても、従来の方法には、問題がある。従来の溶菌方法としては、例えば、有機溶媒等を用いた化学的方法、超音波や凍結・融解を繰り返す物理的方法等がある。しかし、結核菌は、その細胞壁の脂質含量が高く、従来の溶菌法では、遺伝子の抽出を十分に行うことができなかった。また、十分な抽出を行うためには、処理条件を過酷なものにする必要があり、それに伴い、特殊な装置や試薬を使用する必要があり、これに加え、処理時間の長期化や操作の煩雑化等の問題があった。このような集菌、溶菌および遺伝子の増幅等における問題は、結核菌を含む抗酸菌全体の問題でもあり、その他の菌およびウイルスにおいても起こり得る問題でもある。
【０００４】
【非特許文献１】
新  結核菌検査指針  ２０００、ｐ．２８−２９、財団法人結核予防会発行
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、特殊な装置を用いることなく簡単かつ短時間に微生物を収集できる方法の提供を第１の目的とし、特殊な装置や試薬を用いることなく簡単かつ短時間に微生物を検出できる遺伝子の特異的増幅若しくは検出方法の提供を第２の目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
前記第１の目的を達成するために、本発明の微生物の収集方法は、液状試料から微生物を収集する方法であって、前記微生物を捕捉可能な孔径の収集フィルターで内部が上下に分けられている遠心チューブを準備し、この遠心チューブの前記収集フィルター上に前記液状試料を載せ、この状態で、前記遠心チューブを遠心分離して前記収集フィルター上に前記微生物を捕捉して収集する方法である。
【０００７】
この方法によれば、前記収集フィルターで簡単に微生物を捕捉できるため、厳しい条件の遠心分離をする必要がない。
【０００８】
つぎに、前記第２の目的を達成するために、本発明の遺伝子の検出若しくは増幅方法は、微生物の遺伝子を特異的に増幅若しくは検出する方法であって、前記本発明の収集方法により微生物を収集し、これに非イオン性界面活性剤を含む抽出試薬液を添加して加熱することにより微生物から遺伝子を抽出し、この遺伝子を特異的に増幅もしくは検出する方法である。
【０００９】
この方法は、前記本発明の収集方法と組み合わせた方法であり、非イオン界面活性剤を含む抽出試薬液を添加して過熱するだけで遺伝子の抽出を行うことができ、その後の増幅等の操作に速やかに移ることができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１１】
本発明の収集方法に使用する遠心チューブの一例を図１に示す。図示のように、この遠心チューブ１は、チューブ本体１１と、キャップ１２と、収集フィルター１３とから構成されている。チューブ１１本体内部には、有底円筒状の支持体１５が嵌め込まれ、この支持体１５の底の部分に収集フィルター１３が配置されている。前記支持体１５の底部分は複数の孔が形成されている（図示せず）。また、チューブ本体１１の上部外周面には、ネジ山１１１が形成され、キャップ１２の内周面には、ネジ溝１２１が形成され、前記本体と前記キャップは、これらのネジ山１１１とネジ溝と１２１とで結合可能となっている。
【００１２】
本発明の収集方法における前記遠心チューブにおいて、前記収集フィルターの上に、プレフィルターが配置され、このプレフィルター上に前記液状試料を載せ、この状態で、前記遠心チューブを遠心分離し、前記プレフィルターで夾雑物を除去し、前記収集フィルターで菌を集菌することが好ましい。夾雑物は、その後の操作に悪影響を及ぼすおそれがあるからである。前記プレフィルターの配置は、特に制限されず、前記収集フィルターに直接積層してもよいし、一定の間隙を設けて配置してもよい。
【００１３】
図２に、収集フィルター１３の上に、一定の間隙を設けてプレフィルター１４を配置した遠心チューブ１の一例を示す。図示のように、この遠心チューブ１では、収集フィルター１３の有底円筒状支持体１５の内部に、さらに有底円筒状支持体１６が配置され、この底部にプレフィルター１４が配置された構造となっており、収集フィルター１３とプレフィルター１４との間には一定の距離が設けられている。前記プレフィルター１４の支持体の底部には複数の孔が設けられている（図示せず）。その他に部分において、図１と同一部分には同一符号を付している。本発明において、収集フィルターの上にプレフィルターを一定の間隙を持って配置する場合、前記間隙の距離は特に制限されず、例えば、０．１〜１００ｍｍ、好ましくは０．１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．１〜５ｍｍである。
【００１４】
図３に、収集フィルター２３の上にプレフィルター２４を直接積層した遠心チューブ２の一例を示す。図示のように、この遠心チューブ２は、チューブ本体２１と、内部キャップ２５と、外部キャップ２２とから構成されている。内部キャップ２５は、その内部に円筒状の支持体２６を有し、その中央部に前記積層した収集フィルター２３とプレフィルター２４とが配置されている。内部キャップ２５の内周面下部には、ネジ溝２５２が形成されており、チューブ本体２１の外周面上部に形成されたネジ山２１１と結合可能となっている。また、内部キャップ２５の外周面上部には、ネジ山２５１が形成されており、外部キャップ２２の内周面に形成されたネジ溝２２１と結合可能となっている。本発明において、収集フィルターとプレフィルターの積層方法は、特に制限されない。例えば、収集フィルターの上に、そのまま、プレフィルターを配置してもよいし、接着剤を用いて一体化してもよいし、加熱により融着させてもよい。
【００１５】
本発明において、収集フィルターの孔径は、菌やウイルス等の微生物を捕捉可能であれば、特に制限されず、例えば、１ｎｍ〜１０μｍの範囲であり、好ましくは０．１〜１．０μｍの範囲であり、より好ましくは０．１〜０．３μｍの範囲である。収集フィルターの材質は、特に制限されず、例えば、ポリフッ化ビニリデン、ニトロセルロース、親水性ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリマーアロイ、アセチルセルロース等があり、このなかで、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネートが好ましく、より好ましくはポリフッ化ビニリデンである。
【００１６】
本発明において、プレフィルターの孔径は、特に制限されず、例えば、１０ｎｍ〜１００μｍの範囲であり、好ましくは０．１〜２０μｍの範囲であり、より好ましくは０．１〜１０μｍの範囲である。プレフィルターの材質は、特に制限されず、例えば、ポリフッ化ビニリデン、ニトロセルロース、親水性ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリマーアロイ、アセチルセルロース等があり、このなかで、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネートが好ましく、より好ましくはポリカーボネートである。
【００１７】
本発明の収集方法は、例えば、前述のような遠心チューブの収集フィルター若しくはプレフィルター上に液状試料を載せ、この状態で遠心分離して前記収集フィルター上に菌を捕捉することにより実施される。前記遠心分離条件は、特に制限されず、例えば、５００〜１３０００Ｇで３秒〜６０分間、好ましくは１０００〜１００００Ｇで１０秒〜１０分間、より好ましくは５０００Ｇで１分間である。遠心分離器も特に制限されず、例えば、卓上遠心分離器を使用してもよい。
【００１８】
つぎに、本発明の遺伝子の増幅若しくは検出方法に方法において、前記抽出試薬液の加熱温度は、特に制限されないが、７０℃以上１００℃未満が好ましい。加熱温度が、１００℃未満であれば、突沸して試料が飛び散ることが無く、また温度コントロールが容易になって、特別の加熱器を必要としない等の利点がある。前記加熱温度は、より好ましくは８０℃以上１００℃未満であり、最適には９６℃である。また、加熱時間は、例えば、１〜３０分であり、好ましくは１０分間である。前記液体のｐＨは、例えば、ｐＨ７．０〜１２．０の範囲であり、好ましくはｐＨ８．０である。前記抽出試薬液中の前記非イオン界面活性剤の濃度は、例えば、０．０１〜１０重量％であり、好ましくは０．５〜２．０重量％であり、より好ましくは１．０重量％である。
【００１９】
前記非イオン界面活性剤としては、例えば、Ｓｐａｎ２０，Ｓｐａｎ４０，Ｓｐａｎ６０，Ｓｐａｎ６５，Ｓｐａｎ８０，Ｓｐａｎ８５等（以上、ナカライテスク社製等）のｄ−ソルビトールの脂肪酸エステル、Ｔｗｅｅｎ２０，Ｔｗｅｅｎ２１，Ｔｗｅｅｎ４０，Ｔｗｅｅｎ６０，Ｔｗｅｅｎ６５，Ｔｗｅｅｎ８０，Ｔｗｅｅｎ８１，Ｔｗｅｅｎ８５等（以上、ナカライテスク社製等）のポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等（以上、ナカライテスク社製等）のポリオキシエチレングリコールｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル等がある。これらは、単独で使用してもよいし、２種類以上で併用してもよい。このなかで、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ２１が好ましく、より好ましいのはＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【００２０】
本発明の遺伝子の増幅若しくは検出方法において、さらに、前記抽出試薬液は、金属キレート剤を含むことが好ましい。試料中には、ＤＮａｓｅ等の遺伝子分解酵素が含まれており、金属キレート剤は、これによる遺伝子の分解を防止する作用等を発揮する。前記抽出試薬液中の前記金属キレート剤の濃度は、例えば、０．１〜１００ｍＭであり、好ましくは１．０ｍＭである。前記金属キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ｏ−フェナンスロリン、サリチル酸等がある。これらは、単独で使用してもよいし、２種類以上で併用してもよい。このなかで、好ましいのは、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡであり、より好ましいのは、ＥＤＴＡである。
【００２１】
本発明の対象となる微生物は、特に制限されず、例えば、抗酸菌、非定型抗酸菌、淋菌、レジオネラ、マイコプラズマ、スピロヘータ、梅毒スピロヘータ−、クラミジア、リケッチア、らい菌、鼠咬症スピリルム、ブドウ球菌、連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌、ペスト菌、ウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＡＴＬＶ、ＨＩＶおよびエボラ出血熱ウイルス等がある。抗酸菌としては、例えば、鳥型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィラム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）等がある。
【００２２】
本発明において、前記液状試料としては、例えば、痰、髄液、糞、唾液、血液、組織、尿、これらの生体試料を前処理した試料等がある。前記前処理試料としては、例えば、喀痰をＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）と水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で処理した試料がある。
【００２３】
つぎに、本発明の遺伝子の増幅若しくは検出方法は、例えば、以下のようにして実施できる。すなわち、まず、前記所定ｐＨの緩衝液に、必要に応じてＥＤＴＡ等の金属キレート剤を添加し、さらに非イオン界面活性剤を添加して抽出試薬液を調製する。前記緩衝液としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＰＳバッファー、ＴＡＰＳバッファー、リン酸バッファー等がある。この抽出試薬液は、オートクレイブにより高圧蒸気滅菌することが好ましい。他方、試料液を調製する。例えば、喀痰検体を、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン−ＮａＯＨ法（ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ法）等により、均質化および雑菌処理する。前記処理をした検体を、その内部に収集フィルターが配置された遠心チューブ（例えば、図１、図２若しくは図３に記載のもの）の前記収集フィルター若しくはプレフィルター上に載せ、これを遠心分離（例えば、５０００Ｇ、１分間）して収集フィルターで微生物を捕捉する。この収集フィルターに前記抽出試薬液を加え、よく攪拌して微生物を前記抽出試薬液に分散させる。この抽出試薬液を別のチューブに移し、ヒートブロック等を用い、前記所定の温度で加熱することにより、抽出処理を行う。なお、加熱方法としては、前記ヒートブロックの他に、例えば、ウォーターバス、マイクロウェーブオーブン、エアーバス等がある。このようにして抽出処理した検体は、そのまま、若しくは前処理を施して遺伝子増幅若しくは検出処理を行うことができる。前記遺伝子増幅若しくは検出方法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ等のＰＣＲの変法等がある。また、分析対象となる遺伝子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡがある。
【００２４】
【実施例】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。
【００２５】
（実施例１）
結核菌を、商品名マイコブロス（極東製薬工業社製）を使用し、３５℃で一週間培養し、これを滅菌蒸留水で、ＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度に調整した。その後、ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理済非結核性喀痰（１０種類）で１０倍希釈系列の試料を作成した。ＮＡＬＣ−ＮａＯＨ処理は、喀痰に、倍量のＮＡＬＣ−ＮａＯＨ溶液を加えて良く混合することにより行った。前記試料１００μｌを、図２に示す構造の遠心チューブ（収集フィルター上に一定の間隙でプレフィルターが配置されているもの）のプレフィルター上に載せて、５０００Ｇで１分間遠心分離した。前記遠心チューブの収集フィルター（商品名Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ  ＭＣ  ０．２２μｍ、ミリポア社製）の孔径は０．２２μｍであり、プレフィルター（商品名Ｍｉｃｒｏｃｏｎに、商品名アイソポアのフィルターを付け替えたもの、いずれもミリポア社製）の孔径は３μｍである。他方、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０）に１重量％の濃度で商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ナカライ社製）を溶解し、これをオートクレーブで高圧高温滅菌したものを抽出試薬液とした。前記抽出試薬液１５０μｌを、前記メインフィルター上に添加し、５回ピペッティングすることで、菌を前記抽出試薬液に分散させ、これを別のチューブに移した。このチューブをヒートブロックで、９６℃、１０分間の加熱処理をすることにより、溶菌（抽出）処理した。また、比較例１として、商品名アンプリコア検体前処理キット（日本ロシュ社製）を用い、このキットのマニュアルどおりに、前記試料について菌の収集および溶菌（抽出）処理した。
【００２６】
このようにして得られた各抽出試料液について、商品名アンプリコアマイコバクテリウムツベルクロース増幅試薬セット（日本ロシュ社製）および商品名アンプリコアマイコバクテリウムツベルクロース検出試薬セット（日本ロシュ社製）を用いて、前記セットのマニュアルどおりにして、ＰＣＲ法による結核菌遺伝子の増幅・検出を行った。この結果を、下記の表１に示す。
【００２７】
2004180551.tif 000003
【００２８】
前記表１から、実施例１では、収集フィルターによって、結核菌が捕捉され、遺伝子の抽出も十分であり、感度も従来の方法（比較例１）とほぼ同じであったことがわかる。しかも、実施例１では、比較例１に比べて、収集処理および抽出処理を簡単にかつ短時間に行うことができた。
【００２９】
（実施例２、比較例２）
淋菌をチョコレート寒天培地（ニッスイ社製）により３５℃で一晩培養し、形成されたコロニーを生理食塩水に溶かし、ＭｃＦａｒｌａｎｄ＃１の濁度に調整した。これを、健常者の尿（５種類）で希釈して１０倍希釈系列を調製し、これを試料とした。この試料について、実施例１と同じ方法で菌の収集および遺伝子の抽出処理をした。一方、比較例２として、商品名アンプリコアＳＴＤ検体前処理キット（日本ロシュ社製）を用い、前記試料について、前記キットのマニュアルどおりに、菌の収集および遺伝子の抽出処理をした。
【００３０】
このようにして得られた各抽出試料液について、商品名アンプリコア  ＳＴＤ−１クラミジアトラコマチス・ナイセリアゴノレア増幅試薬セット（日本ロシュ社製）および商品名アンプリコア  ＳＴＤ−ナイセリアゴノレア検出試薬セットＩＩ（日本ロシュ社製）を用いて、前記セットのマニュアルどおりにして、ＰＣＲ法による淋菌遺伝子の増幅・検出を行った。この結果を、下記の表２に示す。
【００３１】
2004180551.tif 000004
【００３２】
前記表２から、実施例２では、収集フィルターによって、淋菌が捕捉され、遺伝子の抽出も十分であり、感度も従来の方法（比較例２）と同等以上であったことがわかる。しかも、実施例２では、比較例２に比べて、菌の収集処理および遺伝子の抽出処理を簡単にかつ短時間に行うことができた。
【００３３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の収集方法は、特殊な装置を用いることなく、簡単かつ短時間に微生物を収集できる方法である。したがって、本発明の方法を、遺伝子の増幅・検出法による微生物検査の試料の前処理に適用することにより、検査の高効率化を簡単に実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の収集方法に使用する遠心チューブの構造の一例を示す断面図である。
【図２】図２は、本発明の収集方法に使用する遠心チューブの構造のその他の例を示す断面図である。
【図３】図３は、本発明の収集方法に使用する遠心チューブの構造のさらにその他の例を示す断面図である。
【符号の説明】
１、２  遠心チューブ
１１、２１  チューブ本体
１２  キャップ
２２  外部キャップ
１３、２３  収集フィルター
１４、２４  プレフィルター
１５、１６、２６  支持体
２５  内部キャップ
１１１、２１１、２５１  ネジ山
１２１、２５２、２２１  ネジ溝
【図１】
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【図２】
2004180551.tif 000006
【図３】
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