(57)【要約】【課題】高速液体クロマトグラフ法において、リポ蛋白質（ＬＤＬ）及び変性ＬＤＬを、短時間で高精度に分離するイオン交換体並ＬＤＬ等の分離方法を提供する。【解決手段】多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面を親水化処理した表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に、イオン交換基を導入して得られるイオン交換体であって、該親水化処理が、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に環状エーテル基又は／親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を付加反応させ、次いで環状エーテル基又は／親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合させることにより行われ、かつ、イオン交換容量が乾燥イオン交換体１ｇ当たり０．１５ミリ当量以下であり、化合物（Ｂ）の導入量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対して０．１〜４５重量％であり、化合物（Ｃ）の共重合量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）と化合物（Ｂ）の付加生成物に対して５〜６０重量％であるところのリポ蛋白質分離用イオン交換体、及び該イオン交換体を用いたＬＤＬの分離方法。【選択図】　図２
2004083561.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面を親水化処理した表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に、イオン交換基を導入して得られるイオン交換体であって、該親水化処理が、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に環状エーテル基又は／及び親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を付加反応させ、次いで環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合させることにより行われ、かつ、イオン交換容量が乾燥イオン交換体１ｇ当たり０．１５ミリ当量以下であり、化合物（Ｂ）の導入量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対して０．１〜４５重量％であり、化合物（Ｃ）の共重合量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に化合物（Ｂ）を付加反応させて得られた付加生成物に対して５〜６０重量％であることを特徴とするリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項２】
イオン交換容量が乾燥イオン交換体１ｇ当たり０．１２ミリ当量未満であることを特徴とする請求項１に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項３】
イオン交換容量が乾燥イオン交換体１ｇ当たり０．００１ミリ当量以上であることを特徴とする請求項１に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項４】
化合物（Ｂ）の導入量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対して５〜２０重量％であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項５】
化合物（Ｃ）の共重合量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に化合物（Ｂ）を付加反応させて得られた付加生成物に対して５〜３０重量％であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項６】
該イオン交換体のイオン交換基が陰イオン交換基であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項７】
多孔質有機重合体粒子（Ａ）が水不溶性、親水性多孔質粒子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項８】
多孔質有機重合体粒子（Ａ）が、モノビニル単量体から誘導される単位を０〜９０重量％、架橋性ポリビニル単量体から誘導される単位を１０〜１００重量％含有し、且つモノビニル単量体から誘導される単位または架橋性ポリビニル単量体から誘導される単位の少なくとも一方は親水基を有していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項９】
リポ蛋白質含有液をカラムに充填されたイオン交換体に接触させた後、カラムに移動相をステップワイズモードあるいはグラジエントモードで通液する事によりリポ蛋白質を溶出させるイオン交換体であり、カラムに流入する移動相中の塩化ナトリウム濃度が０．１３モル／Ｌ以下の時に高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）がカラムから溶出してピークとして検出され、且つ該移動相中の塩化ナトリウム濃度がＨＤＬ溶出時の該濃度の１．６倍以上である時に低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）が溶出することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のリポ蛋白質分離用イオン交換体。
【請求項１０】
カラムに充填された請求項１に記載のイオン交換体に、リポ蛋白質含有液を接触させ、ついで移動相をステップワイズモードあるいはグラジエントモードで通液する事によりリポ蛋白質を溶出させることを特徴とするリポ蛋白質の分離方法。
【請求項１１】
リポ蛋白質が、人又は動物由来の高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び／又は変性リポ蛋白質であることを特徴とする請求項１０に記載のリポ蛋白質の分離方法。
【請求項１２】
変性リポ蛋白質が酸化変性ＬＤＬであることを特徴とする請求項１１に記載のリポ蛋白質の分離方法。
【請求項１３】
イオン交換体を充填したカラムから溶出したリポ蛋白質含有液を酵素と反応させ、その後蛍光検出法により定量することを特徴とする請求項１０〜１２のいずれかに記載のリポ蛋白質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポ蛋白質分離用イオン交換体並びにそれを用いたリポ蛋白質の分離方法に関するものである。詳しくは、本発明は高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び／又は変性リポ蛋白質を高精度で分離するのに有用なイオン交換体並びにそれを用いたリポ蛋白質及び変性リポ蛋白質の分離方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液中にはコレステロール、リン脂質、中性脂肪（トリグリセリド）等の脂質が含まれているが、これらの内、コレステロールの定量は動脈硬化、肝疾患、糖尿病あるいは一時的な脂質代謝障害のスクリーニング検査として広く利用されている。コレステロールは、血液中では蛋白質、リン脂質、トリグリセリド等と複合体を形成し、リポ蛋白質として存在している。リポ蛋白質には、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、及び変性リポ蛋白質等があり、各リポ蛋白質の分析は臨床診断において有用である。
【０００３】
リポ蛋白質を高速液体クロマトグラフ法で分離する方法としていくつかの方法が提案されている。例えば、特開平９−１５２２５号公報では、分子サイズにより分離を行うゲルろ過法が示されているが、この方法では分離に長時間を要し、又各リポ蛋白質ピークの重なり部分が多いため、精密な分離が出来ないという問題があった。
また、特開平１１−１８０９９６号公報では、多孔質粒子の表面を被覆する親水性高分子層を有し、実質的に該高分子層のみに官能基を有するイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフ法による方法が提案されているが、カラムに注入されたリポ蛋白質の溶離性が悪く、カラムの耐久性が劣る欠点を有していた。更に、特開平１１−１８０９９６号公報で示されているイオン交換体は、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）のカラム溶出時の移動相中の塩化ナトリウム濃度と、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）溶出時の該移動相中の塩化ナトリウム濃度の差が小さいため、ＨＤＬとＬＤＬの分離が不充分であり、分析精度の面で実際の臨床診断に応用出来るレベルに到達していなかった。
【０００４】
一方、変性リポ蛋白質の血漿中の存在量、中でも低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）が生体内で酸化作用を受けて生成する酸化変性ＬＤＬ（変性ＬＤＬの一態様）の血漿中での増加程度は、病態をより強く反映している事が明らかとなってきた。従って、血漿中の酸化変性ＬＤＬの増加程度を調べる事が出来れば、臨床所見上極めて有用な情報を得ることが出来る訳であるが、現在これらを正確にかつ幅広く求める事が出来る分析方法は存在していない。
【特許文献１】特開平９−１５２２５号公報
【特許文献２】特開平１１−１８０９９６号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、高速液体クロマトグラフ法において、リポ蛋白質及び変性リポ蛋白質を、短時間で高精度に分離し得るイオン交換体並びにそれを用いたリポ蛋白質及び変性リポ蛋白質の分離方法を提供するものであり、上述のごとき問題点を有しないリポ蛋白質分離用イオン交換体を提供することを目的とし、特に高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び変性リポ蛋白質を短時間で高精度に分離するイオン交換体及び該イオン交換体を用いた該リポ蛋白質類の分離方法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは鋭意検討した結果、多孔質粒子の表面を親水性高分子層で被覆したイオン交換体において、親水性高分子層を特定のグラフト共重合により生成し、かつイオン交換容量を所定値以下にすることによって、リポ蛋白質の分離に優れたイオン交換体が得られることを見出し、本発明に到達した。
更に、高速液体クロマトグラフ法において、移動相をいわゆるステップワイズモードあるいはグラジエントモードでカラムに通液する事によりリポ蛋白質を分離する場合、その特定のイオン交換体が、カラムに流入する移動相中の塩化ナトリウム濃度が特定の濃度範囲の時に、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）と低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）をそれぞれカラムから溶出する性能を有することを見出し、該イオン交換体が充填されたカラムを用いてリポ蛋白質を分離し得ることを知得した。
【０００７】
即ち、本発明の第１の要旨であるイオン交換体は、多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面を親水化処理した表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に、イオン交換基を導入して得られるイオン交換体であって、該親水化処理が、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に環状エーテル基又は／及び親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を付加反応させ、次いで環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合させることにより行われ、かつ、イオン交換容量が乾燥イオン交換体当たり０．１５ミリ当量以下であり、化合物（Ｂ）の導入量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対して０．１〜４５重量％であり、化合物（Ｃ）の共重合量が多孔質有機重合体粒子（Ａ）に化合物（Ｂ）を付加反応させて得られた付加生成物に対して５〜６０重量％であることを特徴とするリポ蛋白質分離用イオン交換体に存する。
【０００８】
本発明の他の要旨は、カラムに充填された上記のイオン交換体に、リポ蛋白質、特に人又は動物由来の高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）及び／又は変性リポ蛋白質の含有液を接触させ、ついで移動相をステップワイズモードあるいはグラジエントモードで通液する事によりリポ蛋白質を溶出させることを特徴とするリポ蛋白質の分離方法に存する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のリポ蛋白質分離用イオン交換体は、イオン交換基を有する多孔質有機重合体粒子から構成されるが、前記の如く該イオン交換体を充填したカラムを用いた高速液体クロマトグラフ法において、移動相中の塩化ナトリウム濃度が特定の濃度範囲の時に、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）と低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）をそれぞれカラムから溶出する性能を有し、この性能は、多孔質有機重合体粒子の表面の親水化処理を特定のグラフト共重合により行い、かつイオン交換容量が特定の範囲である場合に特に達せられる。
【００１０】
本発明のイオン交換体を製造する方法は種々考えられるが、例えば以下の方法が好適に用いられる。すなわち、まず、粒子径分布の狭い種粒子を用い、これに更に親水基を有するビニル単量体を含浸させて重合する、所謂シード重合法を利用してイオン交換体の母体となる重合体粒子を製造する。このシード重合時に多孔質化剤を存在させ、多孔質重合体粒子を製造する。ついで、得られた該粒子の表面を親水化処理し、これにイオン交換基を導入することによりイオン交換体が容易に得られる。ここでは本発明の好ましいイオン交換体の製造方法の一例として、シード重合法について説明する。
【００１１】
＜種粒子の製造＞
シード重合において、種粒子として用いられる有機重合体粒子は、乳化重合、ソープフリー乳化重合、分散重合、懸濁重合等の一般に良く知られた造球重合により製造出来る。中でも、乳化重合、ソープフリー乳化重合、分散重合で得られる重合体粒子は、懸濁重合により製造されたものに比較して、その粒子径分布が狭く種粒子として好ましい。
種粒子としての重合体粒子は、芳香族モノビニル単量体及び／又は脂肪族モノビニル単量体からなる重合体が好適である。これらは、単独重合体もしくは２種以上の単量体の共重合体の何れでも良く、１重量％以下の架橋性ポリビニル単量体との共重合体であっても良い。代表的には、ポリスチレンもしくはポリメタクリル酸エステルからなる粒子が好ましい。粒子の大きさは、通常０．１〜１０００μｍの範囲で、目的に応じ任意に選ぶ事が出来る。
【００１２】
＜シード重合＞
前述の如く製造された有機重合体粒子からなる種粒子に、通常モノビニル単量体０〜９０重量％を含む架橋性ポリビニル単量体を含浸させる。モノビニル単量体は４０〜９０重量％が好ましく、特に６０〜９０重量％が好ましい。モノビニル単量体及びポリビニル単量体の少なくとも１種は、後述する環状エーテル基又は／及び親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を粒子表面に導入するための官能基を有しているものである。該官能基は、通常は親水基であり、例えば水酸基が挙げられる。
【００１３】
該架橋性ポリビニル単量体としては、芳香族ポリビニル単量体、脂肪族ポリビニル単量体が好適であり、芳香族ポリビニル単量体としてはジビニルベンゼン、ビスビフェニルアルカンが、脂肪族ポリビニル単量体としては多価アルコールのポリ（メタ）アクリレートやアルキレンポリ（メタ）アクリルアミドが好ましい。具体的には、例えばエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラヒドロキシブタンジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、メチレンビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド等が挙げられ、これらは単独でも混合物としても用いられるが、特にエチレングリコールジ（メタ）アクリレートが好ましい。
【００１４】
架橋性ポリビニル単量体以外のビニル単量体として、モノビニル単量体が使用される。該モノビニル単量体としては、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等の水酸基を１個以上有する（メタ）アクリル酸の多価アルコールエステル、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−置換（メタ）アクリルアミド、アクリルアミド、メタアクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレートあるいはこれらの混合物等が挙げられる。特にシード重合時に使用する多孔質化剤としての有機溶媒よりも水性媒体の方に分配しやすい親水性ビニル単量体が好適であり、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート或いはこれらの混合物が好ましい。
【００１５】
これらのモノビニル単量体及びポリビニル単量体の種類及び量は、使用する種粒子の大きさと目的とする粒子の大きさを考慮して適宜決定される。種粒子に含浸させるビニル単量体中の架橋性ポリビニル単量体の量は通常１０〜１００重量％であり、好ましくは１０〜６０重量％、より好ましくは１０〜４０重量％である。
更に、本発明では多孔性架橋重合体粒子の特性を良好にするために、シード重合を多孔質化剤の存在下実施することが望ましい。そのための多孔質化剤、即ち種粒子に含浸させる多孔質化溶媒としては、シード重合時に相分離剤として作用し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族、芳香族炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類が挙げられる。このような溶媒としては、例えば、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられ、これらは単独もしくは混合して使用することが出来る。また、場合によっては多孔質化溶媒の種類の選定、例えば芳香族炭化水素類であるか或いはアルコール類であるかによっても架橋共重合体粒子に所望の特性を付与することもできる。
【００１６】
シード重合時のラジカル重合開始剤は、通常用いられているものが使用出来るが、例えば過酸化ベンゾイル、ブチルパーオキシヘキサノエート等の過酸化物系開始剤、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリル等のアゾ系開始剤が好ましい。これら重合開始剤は、ビニル単量体或いは多孔質化溶媒に溶解し、ビニル単量体の含浸と同時にまたはその前後に種粒子に含浸させる。また、これらビニル単量体、多孔質化溶媒、ラジカル重合開始剤等を種粒子に含浸させる際に、場合により種粒子に対して親和性が高い溶媒で希釈し、含浸させる事も出来る。このような溶媒としては、アルコール、アセトン等の水混和性溶媒やジクロロエタン、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等が挙げられる。これら含浸を促進する溶媒は、シード重合開始のために、重合温度に昇温される前に減圧留去してもよい。
【００１７】
本発明においては、好ましくは前述のようにビニル単量体、多孔質化溶媒、重合開始剤を含浸させ種粒子を肥大化した後、水性媒体中に懸濁して重合を行う。該水性媒体中には、シード重合中に凝集、変形、融着する事を防止し、その分散安定性を増すために、分散安定剤を含有させることが好ましい。該分散安定剤としては、公知のアニオン系、ノニオン系の界面活性剤及びポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ビニルアルコール／酢酸エチル共重合体等が好ましい。シード重合は、重合温度に昇温される事によって開始される。この重合温度は使用する重合開始剤の種類にもよるが、５０℃〜８０℃が好ましい。また、シード重合の重合時間は、重合開始剤の半減期前後、又はそれ以上が好ましく、例えば、３時間〜４８時間が好ましい。
【００１８】
本発明におけるシード重合は、それ自体公知の他の一般的な方法によっても実施できる。例えば、乳化重合法またはソープフリー乳化重合法で製造された０．１〜１．５μｍの重合体を種粒子とする場合には、まずフタル酸ジメチル等の膨潤助剤による一次膨潤の後、シード重合することにより、１００μｍ程度までの粒子径が均一な多孔質粒子が製造出来る方法（Ｊ．Ｕｇｅｌｓｔａｄ　ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｅ　Ｃｈｅｍｉｅ，８０，７３７（１９７９））が好適に用いられる。また、分散重合により製造された１〜１０μｍの重合体粒子を種粒子としてシード重合する方法（例えば特開昭６４−２６６１７号公報）も好適に使用出来る。更に、シード重合完結後、種粒子として用いた有機重合体粒子の良溶媒を用いて、生成架橋重合体粒子を洗浄する事により、種粒子由来の重合体の一部または全部を除去する事によって、所望の多孔度のイオン交換体の母体粒子を得る方法も採用することが出来る。
【００１９】
以上の様にして、イオン交換体の母体となる多孔質有機重合体粒子（Ａ）を得ることが出来る。得られる多孔質有機重合体粒子（Ａ）は、水不溶性、親水性多孔質粒子であることが好ましい。また、多孔質有機重合体粒子（Ａ）は、モノビニル単量体から誘導される単位を０〜９０重量％、架橋性ポリビニル単量体から誘導される単位を１０〜１００重量％含有し、且つモノビニル単量体から誘導される単位または架橋性ポリビニル単量体から誘導される単位の少なくとも一方は親水基を有していることが好ましい。
得られる多孔質有機重合体粒子（Ａ）の乾燥状態での好ましい細孔物性としては、平均細孔半径として１〜２００ｎｍ、好ましくは１〜１８０ｎｍであり、更に好ましくは７．５〜１５０ｎｍである。又、細孔容積として０．２〜１．８ｍＬ／ｇ、好ましくは０．４〜１．２ｍＬ／ｇであり、比表面積として１〜１０００ｍ２／ｇ、好ましくは５〜５００ｍ２／ｇである。平均細孔半径と細孔容積は水銀圧入法で測定され、比表面積は窒素吸着法で測定される。
【００２０】
＜表面親水化反応＞
上述の如くして得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）に、単にイオン交換基を導入して得られたイオン交換体（例えば、特開平９−１２６２９号）では、リポ蛋白質がイオン交換体に不可逆吸着を起こし、実用に耐える事が難しい。これはリポ蛋白質が強い疎水性を示すために、イオン交換体に存在する疎水性部位と疎水吸着することに由来すると考えられる。よって、高精度にリポ蛋白質を分離すると言う本発明の目的を達成するためには、多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面を親水化し、その後イオン交換基を導入する方法が有効である。親水化の方法としては、例えば特開平７−８８３６６号公報に記載されている方法が好適に用いられる。即ち、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に、環状エーテル基並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を付加させた後に、該重合性不飽和二重結合に重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合させることにより、本発明の目的に好適に使用出来る表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）が得られる。本発明では、化合物（Ｂ）及び重合性ビニル単量体（Ｃ）として環状エーテル基又は／及び親水基を有するものを使用し、化合物（Ｂ）及び重合性ビニル単量体（Ｃ）で多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面を親水化する。本発明では化合物（Ｂ）の導入量及びビニル単量体（Ｃ）の共重合量を特定の範囲にすると共に、イオン交換容量を特定の範囲にすることに特徴がある。この両者の組み合わせにより、リポ蛋白質が高精度で分離できる。
【００２１】
環状エーテル基又は／及び親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を構成する環状エーテル基としては、オキサシクロプロピル基、２−オキサシクロブチル基、３−オキサシクロブチル基、２−オキサシクロペンチル基、３−オキサシクロペンチル基等の炭素数２〜６で環を形成する飽和の環状モノエーテルが挙げられるが、好ましくはオキサシクロプロピル基および２−オキサシクロペンチル基が、特に好ましくはオキサシクロプロピル基が挙げられる。環状エーテル基又は／及び親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を構成する親水基としては、例えばスルホン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アミノ基、シアノ基等が例示できる。また、重合性二重結合を有する官能基としては、ビニル基、アリル基、イソプロペニル基等が挙げられる。これらにより構成される化合物（Ｂ）の具体例としては、３，４−エポキシ−１−ブテン、４，５−エポキシ−３−オキソ−１−ペンテン、ビニルグリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル等が挙げられるが、好ましくはアリルグリシジルエーテル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリルが、特に好ましくはアリルグリシジルエーテルおよびメタクリル酸グリシジルが挙げられる。
【００２２】
これらの環状エーテル基又は／及び親水基、並びに重合性不飽和二重結合を有する化合物（Ｂ）を、多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面に導入する方法については、酸触媒、アルカリ触媒等を用いた付加反応が挙げられる。また特に多孔質有機重合体粒子（Ａ）表面に存在する環状エーテル基に結合し得る反応部位が環状エーテル基である場合には、下記のような触媒を用いたイオン重合法を行うと、多孔質有機重合体粒子（Ａ）表面に存在する一個の環状エーテル基に対して複数個の化合物（Ｂ）が開環重合する。このイオン重合法に用いられる触媒としては、例えば硫酸、リン酸等のプロトン酸、三フッ化ホウ素、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート、塩化アルミニウム、四塩化チタン等のルイス酸等が挙げられる。反応は公知の方法に従って、溶媒の存在下或いは不存在下行なわれる。
【００２３】
溶媒を使用する場合は、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に付加する化合物（Ｂ）を溶解出来る化合物であれば特に限定されない。多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対しては、これを膨潤させる親和性の高い溶媒及び膨潤させない親和性の低い溶媒のいずれも使用できるが、一般に多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対しては、親和性が高くない方が得られるイオン交換体の性能面で好ましい。すなわち、該粒子（Ａ）の表面付近に化合物（Ｂ）の付加反応がより集中して起こるため、付加した化合物（Ｂ）の表面付近の密度が高くなるためである。多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対する溶媒としては、１，２−ジクロロエタン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、トルエン、シクロヘキサン等広く一般に使用されている種々の有機溶媒が挙げられる。
化合物（Ｂ）が環状エーテル基を有する場合には、化合物（Ｂ）の導入後、常法にしたがって化合物（Ｂ）の環状エーテル基を開環させる。
化合物（Ｂ）の多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対する導入量は、付加反応前の多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対して０．１〜４５重量％であり、上限は、好ましくは３５重量％以下、更に好ましくは２０重量％以下、更に好ましくは１８重量％以下であり、下限は、好ましくは５重量％以上であり、更に好ましくは１０重量％以上である。尚、この化合物（Ｂ）の導入量は、付加反応前の多孔質有機重合体粒子（Ａ）の重量を基準として、化合物（Ｂ）の付加反応後の重量増加量を表す。化合物（Ｂ）の導入量が多すぎると、化合物（Ｂ）の炭素鎖に起因するリポ蛋白質の疎水吸着が起こるため却って逆効果となり、導入量が少なすぎると、イオン交換体の表面親水化の程度が不充分になる。化合物（Ｂ）が環状エーテル基を有する場合には、化合物（Ｂ）の多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対する導入量とは、開環後の化合物（Ｂ）の多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対する導入量を表す。
【００２４】
この化合物（Ｂ）由来の複数個の重合性不飽和二重結合に環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合させることにより、多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面が親水性層でより確実に覆われることになり、その結果、得られたイオン交換体は、リポ蛋白質の不可逆吸着を抑制することが可能となる。また、イオン交換体周辺の環境変化によって生ずる多孔質有機重合体粒子（Ａ）表面の高分子層の広がりの変化を抑制できる。
多孔質有機重合体粒子（Ａ）に対して化合物（Ｂ）を付加させた後に、（Ｂ）中の該重合性不飽和二重結合と重合性ビニル単量体（Ｃ）とを共重合させる方法としては、ラジカル重合法、イオン重合法、熱重合法、紫外線照射法等が用いられるが、中でもラジカル重合法が好ましい。この場合に用いられる重合開始剤としては、例えば２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４−アゾビス（４−シアノペンタン酸）等のアゾ系重合開始剤、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジ−ｔ−ブチルペルオキシド、ベンゾイルペルオキシド、ジ−イソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ−ブチルペルオキシイソブチレート及び過酸化水素、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の過酸化物系重合開始剤またはこれらにアミン、重亜硫酸ナトリウム等の還元剤を添加した系等を挙げることが出来る。重合反応は公知の方法に従い、例えば０〜１００℃の温度で３０分〜２４時間の範囲にて行われ、必要により溶媒等を用いて行なわれる。
【００２５】
本発明で使用される環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）を構成する環状エーテル基としては、オキサシクロプロピル基、２−オキサシクロブチル基、３−オキサシクロブチル基、２−オキサシクロペンチル基、３−オキサシクロペンチル基等の炭素数２〜６で環を形成する飽和の環状モノエーテルが挙げられるが、好ましくはオキサシクロプロピル基および２−オキサシクロペンチル基が、特に好ましくはオキサシクロプロピル基が挙げられる。本発明で使用される環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）を構成する親水基としては、例えばスルホン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、カルボニル基、アミノ基、シアノ基等が例示できる。
本発明で使用される環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）としては、所望のイオン交換体に必要な官能基を導入することができるもので、広い範囲から選択することができる。具体的には、（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸等の不飽和カルボン酸類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸オクタデシル等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸３−クロロ−２−ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２−クロロエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸２，３−ジヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸ジエチルアミノエチル、塩化（メタ）アクリル酸エチルトリメチルアンモニウム、（メタ）アクリル酸テトラヒドロフルフリル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、（３−（メタクリロイルアミノ）プロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸等の（メタ）アクリルアミド誘導体が挙げられる。
【００２６】
また、他の環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）としては、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アリルアルコール及びそのエステル類；アリルアミン、ジアリルアミン、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド等のアリルアミン誘導体：Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド等のビニルアミン誘導体；（メタ）アクリロニトリル、アクロレイン、ビニルスルホン酸ナトリウム、アリルスルホン酸ナトリウム、ｐ−スチレンスルホン酸ナトリウム、ビニルピロリドン等の他のビニル化合物が挙げられる。これらの重合性ビニル単量体は単独でも二種類以上の混合物としても用いることが出来、前記化合物（Ｂ）と同種であっても良い。
本発明では、環状エーテル基又は／及び親水基を有する重合性ビニル単量体（Ｃ）に、環状エーテル基及び親水基を有さない重合性ビニル単量体を、本発明の効果を損なわない範囲で併用してもよい。環状エーテル基及び親水基を有さない重合性ビニル単量体としては、スチレン、メチルスチレン、α−メチルスチレン、クロロスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン及びそのアルキルまたはハロゲン置換体；メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル、オクタデシルビニルエーテル等のビニルエーテル類；アリルアルコールのエーテル類；ビニルピリジン等が挙げられる。
重合性ビニル単量体（Ｃ）が環状エーテル基を有する場合には、重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した後に、常法にしたがって重合性ビニル単量体（Ｃ）の環状エーテル基を開環させる。
【００２７】
重合性ビニル単量体（Ｃ）の共重合量は、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に化合物（Ｂ）を付加反応させて得られた付加生成物に対して５〜６０重量％であり、上限は、好ましくは４０重量％以下、更に好ましくは３０重量％以下、更に好ましくは２０重量％以下であり、下限は、好ましくは１０重量％以上である。尚、この共重合量は、多孔質有機重合体粒子（Ａ）に化合物（Ｂ）を付加反応させて得られた付加生成物の重量を基準として、重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した後の重合性ビニル単量体（Ｃ）による重量増加量を表す。この量が少なすぎると、得られる表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）の表面親水化度が不充分となり、リポ蛋白質及び血液成分のイオン交換体への不可逆吸着を抑制する事が難しくなる。他方、多過ぎると該多孔質重合体粒子の細孔が塞がれ、リポ蛋白質のイオン交換体への保持が不充分となり、所望の分離を得ることが出来なくなると共に、リポ蛋白質の回収率が低くなる。
【００２８】
本発明における好ましいリポ蛋白質分離用イオン交換体は、前述した方法により得られた表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に陰イオン交換基を導入したものである。導入される陰イオン交換基としては、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノエチル基等のジアルキルアミノ基等をはじめとする各種アミノ基、各種４級アンモニウム基等が挙げられる。該表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に陰イオン交換基を導入する方法は、公知の方法に従って行われる。例えばイオン交換体の母体粒子（マトリックス）を構成するビニル単量体がエポキシ基を有する場合には、エポキシ基を水、グリセリン又はエチレングリコール等により開環変性し、生成した水酸基に陰イオン交換基を導入する方法、或いは該エポキシ基に直接陰イオン交換基を結合させる方法等を挙げることが出来る。また、導入される陰イオン交換基の量としては、乾燥イオン交換体重量１ｇあたり０．１５ミリ当量以下であり、好ましくは０．１２ミリ当量未満であり、より好ましくは０．１ミリ当量未満であり、更に好ましくは０．０７ミリ当量以下であり、また下限は、通常０．００１ミリ当量以上であり、好ましくは０．００５ミリ当量以上であり、より好ましくは０．０１ミリ当量以上であり、更に好ましくは０．０２ミリ当量以上である。上記範囲より多いとカラムに注入されたリポ蛋白質の溶離性が悪化する傾向にあり、上記範囲より少ないとリポ蛋白質の溶出速度が速くなりすぎる傾向になる。導入される陰イオン交換基量の調整は、反応試剤であるアミノ化合物の量を調整する事により行うことができる。
【００２９】
本発明におけるリポ蛋白質分離用イオン交換体は、表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に陽イオン交換基を導入したものでもよい。導入される陽イオン交換基としては、スルホン酸基等が挙げられる。親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）に陽イオン交換基を導入する方法としては、公知の方法が用いられる。また、導入される陽イオン交換基の量としては、陰イオン交換基の導入量と同様である。
尚、重合性ビニル単量体（Ｃ）を構成する環状エーテル基を開環させて水酸基を生成させると同時に、グリセリン等の多価アルコールを反応させたものを表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）として用いることが好ましい。また、重合性ビニル単量体（Ｃ）を構成する水酸基等にグリセリン等の多価アルコールを反応させたものを表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）として用いてもよい。
【００３０】
＜リポ蛋白質の分離方法＞
上述のようにして得られたイオン交換体を用い高速液体クロマトグラフ法によりリポ蛋白質を高精度で分離することができる。即ち、本発明のリポ蛋白質分離用イオン交換体は、これをカラムに充填し、このカラムに充填されたイオン交換体にリポ蛋白質含有液を接触させた後、移動相をステップワイズモードあるいはグラジエントモードで通液する事によりリポ蛋白質を溶出するが、カラムに流入する移動相中の塩化ナトリウム濃度が０．１３モル／Ｌ以下の時に高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）がカラムから溶出してピークとして検出され、且つ移動相中の塩化ナトリウム濃度がＨＤＬ溶出時の該濃度の１．６倍以上、より好ましくは１．７倍以上である時に低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）が溶出する特性を有するのである。
尚、ここでイオン交換体の性能は、後述の試験法に記載の液体クロマトグラムの操作条件下で測定することにより特定するものである。
【００３１】
本発明のリポ蛋白質分離用のイオン交換体をカラムに充填する方法は特に限定されないが、ここでは湿式法により充填カラムを得た。カラムの材質は、ステンレス製、ガラス製、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製等、通常の高速液体クロマトグラフ用カラムとして充分な機械的強度を有するものであれば、いずれの材質でも使用可能である。カラムのサイズは、内径１〜１０ｍｍ、長さ２０〜１００ｍｍの物が使用出来るが、好ましくは内径３〜８ｍｍ、長さ３０〜６０ｍｍの物を使用する事により、分離操作時間とカラム操作圧力のバランスの取れた充填カラムを得ることが出来る。このイオン交換体充填カラムを用い、高速液体クロマトグラフの手法によりリポ蛋白質を分離する。
高速液体クロマトグラフ法における移動相の通液方法には、単一移動相によるアイソクラティック法、２種類以上の移動相を用いるステップワイズ法あるいはグラジエント法等が挙げられるが、リポ蛋白質のように分子サイズ、疎水度、解離度等その性状が大きく異なる物質群を同時に分離するには、ステップワイズ法あるいはグラジエント法が好適に用いられる。
【００３２】
本発明では、移動相として特に２液（Ａ液及びＢ液）によるステップワイズ法を採用する事により、精密にしかも短時間でリポ蛋白質を分離する事が出来る。移動相Ａ液には緩衝液を用いる事により、再現性良く分離を行う事が出来る。この時の緩衝液としては、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸塩緩衝液、フタル酸塩緩衝液等、蛋白質をイオン交換クロマトグラフ法で分離する際に通常使用される緩衝液を本発明においても使用する事が出来るが、中でもリン酸塩緩衝液を好適に使用する事が出来る。リン酸緩衝液の濃度は、０．００１Ｍ〜０．１Ｍが使用出来るが、好ましくは０．００１Ｍ〜０．０５Ｍである。緩衝液のｐＨは２〜１２の範囲で使用出来るが、リポ蛋白質を陰イオン交換法で分離を行うためには７以上が好ましい。Ｂ液としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム等の無機塩の水溶液を用いる事が出来、中でも塩化ナトリウム水溶液が好適に使用される。塩化ナトリウム水溶液は、０．０１Ｍ〜２Ｍの濃度が使用出来るが、好ましくは０．１Ｍ〜０．７Ｍである。溶離液中の金属イオンは、ポストカラム反応系での酵素反応を妨害するため、金属イオンをマスキングするためにＥＤＴＡ等のキレート剤を添加してもよい。
【００３３】
図１は、本発明のリポ蛋白質分離用のイオン交換体を充填したカラムを用いたリポ蛋白分離試験法のシステムを示す概略図である。図１において、１：オートサンプラー、２：移動相Ａの貯槽、３：移動相Ｂの貯槽、４：イオン交換体充填カラム、５：酵素反応槽Ａ、６：酵素溶液貯槽、７：ＮａＯＨ水溶液貯槽、８：発蛍光反応槽Ｂ、９：蛍光検出器、１０：記録計を表す。図１に従い分離操作を説明する。
初め上記移動相としてＡ液をポンプＡにより空間速度（ＳＶ）３０／ｈｒ．以上の流速でカラムに通液しながら、リポ蛋白質含有液（以下、注入試料と称する）をオートサンプラー（１）を介してＡ液に注入し上記充填カラム（４）に導入する。その後、カラムに流入する移動相Ａ液とポンプＢにより供給されるＢ液とが混合され、移動相中のＢ液の比率を予め定めておいた時間毎に、予め定めておいた比率にステップ状に上げていくステップワイズ法により通液し、液体クロマトグラフ法によりリポ蛋白質を分離する。操作時の充填カラム（４）の温度は、２０℃〜４０℃の間で一定に保持する事が好ましい。
【００３４】
注入試料は、人あるいは動物の血液から得られた血漿又は血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）液を用いて５〜２０ｖｏｌ倍に希釈し、カラムの容積の０．８％〜１２％の容量をカラムに導入する。カラム内で分離されたリポ蛋白質を含む移動相は、溶出液としてポストカラム反応系へと導かれ検出される。血漿や血清中には、アルブミン、グロブリン等の蛋白質を始め様々な物質が含まれており、これらもカラム中を移動し、カラムから溶出する移動相（溶出液）中に含まれる事になる。このような物質を含む溶出液中のリポ蛋白質を、例えば高速液体クロマトグラフの検出方法で多用されている、紫外吸光度検出法、可視吸光度検出法、示差屈折率検出法等の方法を用いてリポ蛋白質のみを検出しようと試みても、前記夾雑物の影響を受けるため目的とするリポ蛋白質のクロマトグラムを得る事は事実上不可能である。そこで、リポ蛋白質を特異的に検出するために、リポ蛋白質の構成成分であるコレステロールやコレステロールエステルと特異的に反応する酵素を利用したポストカラム反応が、本発明の目的を達成するための優れた方法として使用する事が出来る。
【００３５】
この方法として、例えばＡｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ　Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍａ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｊｕｎ　Ｈａｇｉｎａｋａ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３２，　１６３−１７１，（１９９５））に記載された方法が好適に使用される。この方法は、リポ蛋白質構成成分のコレステロールと酵素との反応により定量的に発生する過酸化水素によりホモバニリン酸を酵素的に発蛍光物質に変換した後、蛍光検出器で検出を行うもので、夾雑物の影響を受けることがない。
ポストカラム反応系では、充填カラムからの溶出液に酵素溶液貯槽（６）の酵素溶液をポンプＣにより流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ．で供給し、ミキサー（図示せず）で混合した後、４５℃に維持された酵素反応槽Ａ（５）に通液する。酵素溶液は、酵素としてコレステロールエステルハイドラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびポリオキシダーゼ、発蛍光試薬としてホモバニリン酸のそれぞれを所定量リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して予め調製したものである。酵素反応槽を通過する間に、溶出液中のリポ蛋白質中のコレステロールが酵素と反応して過酸化水素を生成し、生成した過酸化水素は、酵素溶液中のホモバニリン酸と反応する。
【００３６】
酵素反応槽Ａを通過した溶出液は、ポンプＤにより流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ．で供給される０．１ＭＮａＯＨ水溶液とミキサー（図示せず）で混合された後、発蛍光反応槽Ｂ（８）に導かれそこを通過する間に、過酸化水素とホモバニリン酸との反応混合物が蛍光物質に変化する。この蛍光物質を蛍光検出器（９）で励起波長３２５ｎｍ、蛍光波長４２０ｎｍで検出し、データを記録計（１０）で記録する。
【００３７】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を逸脱しない限り、これらの実施例によって制約を受けるものではない。
【００３８】
実施例１
（１）多孔質有機重合体粒子（Ａ）の合成
平均粒子径２μｍのポリメタクリル酸グリシジル種粒子を用い、シード重合法によりメタクリル酸グリシジルとエチレングリコールジメタクリレートとを（重量比で７０：３０）共重合することにより、平均粒径５．７μｍ、細孔容積０．６３ｍＬ／ｇ、細孔の最頻度半径６０ｎｍ、比表面積３７ｍ２／ｇの多孔質有機合成体粒子（Ａ）を得た。
【００３９】
（２）表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）の合成反応
攪拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に前記（１）で得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）１００．０ｇを入れ、メタクリル酸グリシジル［化合物（Ｂ）］１０．０ｇ、トルエン８７０．０ｇおよび三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート１．１３ｇを加え、３０℃にて３時間反応を行った。反応後の粒子をトルエン、アセトン及びメタノールにて順次洗浄した後、５％Ｈ２　ＳＯ４　水溶液１０００ｇ中、５０℃の温度下で５時間加熱することにより加水分解を行ない、エポキシ環の開環反応を行なった。反応終了後、重合体粒子をろ別し、脱塩水にて十分洗浄し、乾燥した。得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面にメタクリル酸グリシジル（Ｂ）を付加した重合体粒子の重量は１１４．０ｇ［化合物（Ｂ）が１４．０重量％付加］であった。
【００４０】
攪拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に、この多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面にメタクリル酸グリシジル（Ｂ）を付加した重合体粒子４５．０ｇを入れ、メタクリル酸グリシジル［重合性ビニル単量体（Ｃ）］９．０ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル０．１８ｇおよび溶媒として酢酸エチル４０５．０ｇを加えた。反応器を窒素ガス置換した後に、窒素雰囲気下にて７０℃に加熱して６時間重合を行った。反応終了後、重合体粒子をろ別し、酢酸エチル、アセトン、メタノールにて順次洗浄し、乾燥した。得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面にメタクリル酸グリシジル（Ｂ）を付加し、更に重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した重合体粒子の重量は５１．２ｇ［化合物（Ｃ）が１３．８重量％付加重合］であった。
攪拌器、コンデンサー、及び温度計を備えた反応器に、重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した重合体粒子１００ｇを入れ、これにグリセリン４００ｍＬ、エチレングリコール４００ｍＬ、９５％硫酸３．２ｍｌを加えた。５０℃水浴中で６時間撹拌を行った。反応後、脱塩水を８００ｍＬ添加した後、吸引濾過を行い、表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）を得た。
【００４１】
（３）ジエチルアミノエチル化反応
攪拌器、コンデンサー及び温度計を備えた反応器中に、前記（２）の表面親水化反応で得られた表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）１０ｇを入れ、これに１．８０５Ｍ−ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを加え含浸させた。次いで、ジエチルアミノエチルクロライドを３０．０ｇ添加し、５０℃にて５時間反応させ、ジエチルアミノエチル基を導入した。反応終了後、重合体粒子をろ別し、脱塩水、１Ｍ−ＨＣｌ水溶液、脱塩水の順で洗浄した。得られた重合体粒子の陰イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．０４ミリ当量であった。
【００４２】
実施例２
実施例１で合成した多孔質有機重合体粒子（Ａ）［平均粒子径５．７μｍ、比表面積３７ｍ２／ｇ、細孔の最頻度半径６０ｎｍ］に、メタクリル酸グリシジル（Ｂ）を付加して得た重合体粒子（化合物（Ｂ）が１４．０重量％付加）を用いて以下の反応により表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）を合成した。
攪拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中に、この重合体粒子（化合物（Ｂ）が１４．０重量％付加）２５ｇを入れ、メタクリル酸グリシジル（重合性ビニル単量体（Ｃ））１０．０ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル０．２０ｇおよび溶媒として酢酸エチル２２５．０ｇを加えた。反応器を窒素ガス置換した後に、窒素雰囲気下にて７０℃に加熱して６時間重合を行った。反応終了後、重合体粒子をろ別し、酢酸エチル、アセトン、メタノールにて順次洗浄し、乾燥した。得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面にメタクリル酸グリシジル（Ｂ）を付加し、更に重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した重合体粒子の重量は３１．４ｇ［化合物（Ｃ）が２５．７重量％付加重合］であった。
【００４３】
攪拌器、コンデンサー、及び温度計を備えた反応器に、重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した重合体粒子１００ｇを入れ、これにグリセリン４００ｍＬ、エチレングリコール４００ｍＬ、９５％硫酸３．２ｍｌを加えた。５０℃水浴中で６時間撹拌を行った。反応後、脱塩水を８００ｍＬ添加した後、吸引濾過を行い、表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）を得た。
得られた表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）１０．０ｇに、１．８０５Ｍ−ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを加え含浸させた。次いで、ジエチルアミノエチルクロライドを３０．０ｇ添加し、５０℃にて５時間反応させ、ジエチルアミノエチル基を導入した。反応終了後、重合体粒子をろ別し、脱塩水、１Ｍ−ＨＣｌ水溶液、脱塩水の順で洗浄した。得られた重合体粒子の陰イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．０９ミリ当量であった。
【００４４】
比較例　１
実施例１で得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）にメタクリル酸グリシジル（化合物（Ｂ））を付加（１４．０重量％付加）した後、更にメタクリル酸グリシジルを共重合した重合体粒子（重合性ビニル単量体（Ｃ）が１３．８重量％付加重合）に実施例１と同様な方法でグリセリンを反応させて得られた表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）を用いて以下の反応を実施しイオン交換基を導入した。
攪拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中で、この重合体粒子１０．０ｇに２．００Ｍ−ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを加え含浸させた。次いで、ジエチルアミノエチルクロライドを３０．０ｇ添加し、５０℃にて５時間反応させ、ジエチルアミノエチル基を導入した。反応終了後、重合体粒子をろ別し、脱塩水、１Ｍ−ＨＣｌ水溶液、脱塩水の順で洗浄した。得られた重合体粒子の陰イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．３３ミリ当量であった。
【００４５】
実施例　３
実施例１に準じて合成した多孔質有機重合体粒子（Ａ）［平均粒子径５．３μｍ、比表面積３２ｍ２／ｇ、細孔の最頻度半径５５ｎｍ］にメタクリル酸グリシジル（化合物Ｂ）を付加した重合体粒子［化合物（Ｂ）が１１．６重量％付加］を用いて以下の反応を実施した。
攪拌器、コンデンサー、温度計及び窒素ガス導入管を備えた反応器中にこの重合体粒子［化合物（Ｂ）が１１．６重量％付加］２０．０ｇを入れ、メタクリル酸グリシジル（重合性ビニル単量体（Ｃ））２０．０ｇ、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル０．１０ｇおよび溶媒として酢酸エチル７２．０ｇを加えた。反応器を窒素ガス置換した後に、窒素雰囲気下にて７０℃に加熱して６時間重合を行った。反応終了後、重合体粒子をろ別し、酢酸エチル、アセトン、メタノールにて順次洗浄し、乾燥した。得られた多孔質有機重合体粒子（Ａ）の表面にメタクリル酸グリシジル（Ｂ）を付加し、更に重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した重合体粒子の重量は２９．３ｇ［化合物（Ｃ）が４６．４重量％付加重合］であった。
【００４６】
攪拌器、コンデンサー、及び温度計を備えた反応器に、重合性ビニル単量体（Ｃ）を共重合した重合体粒子１００ｇを入れ、これにグリセリン４００ｍＬ、エチレングリコール４００ｍＬ、９５％硫酸３．２ｍｌを加えた。５０℃水浴中で６時間撹拌を行った。反応後、脱塩水を８００ｍＬ添加した後、吸引濾過を行い、表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）を得た。
得られた表面親水化多孔質有機重合体粒子（Ｄ）１０．０ｇに１．７９６Ｍ−ＮａＯＨ水溶液１００ｍＬを加え含浸させた。次いで、ジエチルアミノエチルクロライドを３０．０ｇ添加し、５０℃にて５時間反応させ、ジエチルアミノエチル基を導入した。反応終了後、重合体粒子をろ別し、脱塩水、１Ｍ−ＨＣｌ水溶液、脱塩水の順で洗浄した。得られた重合体粒子の陰イオン交換容量は乾燥重量１ｇ当たり０．０８ミリ当量であった。
【００４７】
試験例（リポ蛋白質の分離）
図１に示すシステムに従い、リポ蛋白質含有液（注入試料）を分離カラムに導入した後、ステップワイズ法により移動相を通液してリポ蛋白質を分離した。その後、溶出した移動相をポストカラム反応系に導いた。ポストカラム反応系では酵素反応が行われ、コレステロール存在量に応じて定量的に過酸化水素が発生する。この過酸化水素によりホモバニリン酸を酵素的に発蛍光物質に変換した後、蛍光検出器で検出した。
【００４８】
以下に、リポ蛋白質分離方法の例を記す。
尚、ステップワイズ条件以外は、すべての試験カラムで同一である。
条件：
試験カラム：実施例１及び２並びに比較例１で合成した各イオン交換体０．２７ｇ（乾燥重量）を、湿式法によって内径４．６ｍｍ，長さ３５ｍｍのステンレススチール製カラムに充填して用いた。
移動相：以下の２種類の移動相を用いた。
Ａ液＝２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液＋１ｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎａ（ｐＨ７．０）
Ｂ液＝０．５Ｍ　塩化ナトリウム＋１ｍＭ　ＥＤＴＡ−２Ｎａ
ステップワイズ方法
：試料注入後、２．５ｍｉｎ．・５．０ｍｉｎ．・７．５ｍｉｎ．経過時点で、Ｂ液の比率を各カラムに応じた値に上げる事により、分離を行った。
【００４９】
酵素液：▲１▼　酵素
コレステロールエステルハイト゛ラーセ゛（東洋紡製、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）５９Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシタ゛ーセ゛（東洋紡製、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）２４Ｕ／Ｌ
ヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛（東洋紡、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）　２６３０Ｕ／Ｌ
▲２▼　発蛍光試薬：ホモバニリン酸　５０ｍｇ／Ｌ
発蛍光反応助剤：０．１Ｍ　ＮａＯＨ
ポストカラム反応槽：酵素反応槽＝３．９ｍＬ（テフロン（登録商標）製チューブを使用）
発蛍光反応槽＝０．０９８ｍＬ（テフロン（登録商標）製チューブを使用）
注入試料：人血漿をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）液にて１０倍容量に希釈した液を２０μＬ注入した。
尚、人血漿は採取した人血液に、最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるようにエチレンジアミン四酢酸−２Ｎａを添加し、１５００ｇで１０分間遠心し、分離した血漿を使用した。
ポストカラム反応温度：４５℃（酵素反応槽）
蛍光検出器：励起波長＝３２５ｎｍ　　蛍光波長＝４２０ｎｍ
カラム温度：２５℃（イオン交換体充填カラム）
移動相流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．（Ａ液＋Ｂ液）
酵素液流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ．
発蛍光反応助剤流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ．
【００５０】
結果
各試験カラムにおける、高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、及び低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を溶出させるのに必要な、カラムに流入する移動相中の塩化ナトリウム濃度を表−１に示す。
【００５１】
【表１】
2004083561.tif 000003
上記表−１中、塩化ナトリウム濃度は、ステップワイズにおけるＡ液とＢ液の供給速度及び配管中の容量から算出した移動相のカラム入口における値で示した。
【００５２】
実施例１及び２で製造したイオン交換体は、移動相中の塩化ナトリウムが低濃度でＨＤＬが溶出する、いわゆる溶離性の良いイオン交換体であった。更に、ＬＤＬが溶出する時の塩化ナトリウム濃度が高濃度であるので、ＨＤＬピークとＬＤＬピークの分離が優れていた。
実施例１及び比較例１のイオン交換体を用いた試験カラムによる人血漿の分離を行った結果を示すクロマトグラムを図２及び図３に示す。　又、実施例３で合成した陰イオン交換体を用い、上記試験例と同様にしてリポ蛋白質の分離を行ったところ、実施例２の陰イオン交換体の場合とほぼ同様な結果が得られ、正常なクロマトグラムが得られた。
本発明のイオン交換体を用いることにより、極めて高精度で高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、及び超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）を分離出来ることが判る。
【００５３】
実施例４
ステップワイズモードのＢ液比率を変更した以外は実施例２と同様にして、リポ蛋白質の分離を行った。その結果を示すクロマトグラムを図４に示す。図４のＬＤＬ１及びＬＤＬ２は酸化変性ＬＤＬを表し、ＬＤＬ１とＬＤＬ２は酸化の程度が異なる。本発明のイオン交換体を用いることにより、酸化変性ＬＤＬを精度よく分離できることがわかる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、特定のイオン交換体を用いることにより、血漿や血清中のリポ蛋白質を極めて精度良く分離、検出することができるため、臨床診断において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例におけるリポ蛋白質分離試験法のシステムを示す概略図
【図２】実施例１におけるイオン交換体を充填したカラムを用いて得られた人血漿の分離結果を示すクロマトグラム
【図３】比較例１におけるイオン交換体を充填したカラムを用いて得られた人血漿の分離結果を示すクロマトグラム
【図４】実施例２におけるイオン交換体を充填したカラムを用いて得られた人血漿の分離結果を示すクロマトグラム
【符号の説明】
１：オートサンプラー
２：移動相Ａの貯槽
３：移動相Ｂの貯槽
４：イオン交換体充填カラム
５：酵素反応槽Ａ
６：酵素溶液貯槽
７：ＮａＯＨ水溶液貯槽
８：発蛍光反応槽Ｂ
９：蛍光検出器
１０：記録計
【図１】
2004083561.tif 000004
【図２】
2004083561.tif 000005
【図３】
2004083561.tif 000006
【図４】
2004083561.tif 000007