(57)【要約】【課題】散乱光を利用して、微量な核酸をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出しうる検出方法を提供すること。【解決手段】標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して該標的配列を検出することを特徴とする、核酸検出方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して該標的配列を検出することを特徴とする、核酸検出方法。
【請求項２】
リピート構造を有する核酸が、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いた増幅法によって提供される、請求項１記載の方法。
（ａ）  鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）  鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
【請求項３】
増幅法がＬＡＭＰ法である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、核酸検出方法：
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して、上記標的配列を検出する工程。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法において、散乱光をリアルタイムモニタリングすることを特徴とする、核酸検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法において、リピート構造を有する核酸を標的配列を特異的に切断しうる制限酵素で処理し、その処理後の核酸から生じる散乱光を処理しない場合と比較して、該標的配列の有無を判断することを特徴とする、核酸検出方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法を利用して標的配列上の多型を検出することを特徴とする、核酸検出方法。
【請求項８】
以下の工程を含む請求項７記載の方法：
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸を、標的配列上の多型部位を特異的に切断しうる制限酵素で処理する工程；
３）上記制限酵素処理後の核酸に照射光をあて、生じる散乱光を制限酵素で処理しない場合と比較し、上記標的配列上に多型が存在するか否かを判断する工程。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法に利用されるキットであって、以下のｉ）〜ｉｖ）の少なくとも一つ以上を含むことを特徴とする、前記キット。
ｉ）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のインナープライマー
（ａ）  鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）  鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
ｉｉ）以下の（ｃ）及び／又は（ｄ）のアウタープライマー
（ｃ）  鋳型核酸鎖上の任意配列Ｆ２ｃよりも３’末端方向に任意配列Ｆ３ｃを選択したとき、該Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー
（ｄ）  鋳型核酸鎖上の任意配列Ｒ２よりも５’末端方向に任意配列Ｒ３を選択したとき、該Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
ｉｉｉ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼ
ｉｖ）要素ｉｉｉ）の基質となるヌクレオチド
【請求項１０】
さらに、以下の（ｅ）及び／又は（ｆ）のループプライマーを含む、請求項９記載のキット。
（ｅ）  インナープライマー上のＦ１ｃ及びＦ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
（ｆ）  インナープライマー上のＲ１ｃ及びＲ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、散乱光を利用した核酸検出方法に関する。より詳細には、標的配列をＬＡＭＰ増幅し、得られるリピート構造を有する核酸を散乱光を利用して検出する核酸検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、散乱光を利用して高分子やコロイドの分子量を測定する方法は公知である。例えば、大塚電子（株）製のスタティック光散乱光度計  ＳＬＳ−６０００シリーズは、タンパク、核酸、ウイルス等の生体高分子や各種合成高分子の分子量測定、または高分子相分離現象解析を行うことができる。また、核酸分子を不溶化し、この不溶化した核酸分子に光を照射して、生じる散乱光から該核酸分子の大きさを分析する方法も開発されている（例えば、特許文献１等参照）。
【０００３】
しかし、核酸の場合、散乱光を用いた分析では、分子量が小さい短鎖の核酸分子では著しく感度が悪くなる。そのため、前述の方法で測定対象とされる核酸分子は十分に大きなものでなければならず、例えば、不溶化核酸分子の分析方法では、直径５０ｎｍ〜２００ｎｍ前後の核酸沈殿物が用いられている。したがって、ＰＣＲで得られるような短い核酸増幅産物は、光散乱法による検出には不向きである。
【０００４】
一方、発明者らは、ＰＣＲ法で不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法：ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の開発に成功している（例えば、特許文献２及び非特許文献１参照）。ＬＡＭＰ法では、特有のプライマーを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。生成した増幅産物は、相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする別なプライマー（ループプライマー）による伸長反応によって、リピート構造（同一鎖上に互いに相補的な配列が繰り返し含まれる構造）を有する長鎖の増幅産物を生成する。発明者らは、このＬＡＭＰ法の高い増幅効率を利用して、目視（濁度）による遺伝子の検出方法等（例えば、非特許文献２参照）を報告している。しかし、この方法では、核酸増幅反応の副産物であるピロリン酸マグネシウムの沈澱を検出するため、沈澱がまだ形成されていないような増幅初期段階で核酸検出を行うことはできない。
【０００５】
【特許文献１】
特開平９−６８５２５２号（特許２９７３８８７号）
【特許文献２】
国際公開００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献１】
納富継宣ら（Ｔｓｕｇｕｎｏｒｉ  Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．），「Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．」，ヌクレイック  アシッド  リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．），  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．１２：  ｅ６３，  （２０００）
【非特許文献２】
森安義、長嶺憲太郎ら，「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．」，バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），  Ｖｏｌ．  ２８９，  Ｎｏ．１，  １５０−１５４，  （２００１）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、散乱光を利用して、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出しうる核酸検出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、標的配列のＬＡＭＰ増幅で得られるような、リピート構造を有する核酸は、光散乱法によって感度よく検出しうることを見出した。そして、この方法を利用すれば、微量検体を高感度に検出できるばかりか、増幅産物のリアルタイムモニタリングやＳＮＰ等の多型検出も可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１０）を提供する。
（１）  標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して該標的配列を検出することを特徴とする、核酸検出方法。
（２）  リピート構造を有する核酸が、以下のプライマー（ａ）及び／又は（ｂ）を用いた増幅法によって提供される、上記（１）記載の方法。
（ａ）  鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）  鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（３）  増幅法がＬＡＭＰ法である、上記（２）記載の方法。
（４）  以下の工程を含む、核酸検出方法：
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して、上記標的配列を検出する工程。
（５）  上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法において、散乱光をリアルタイムモニタリングすることを特徴とする、核酸検出方法。
（６）  上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法において、リピート構造を有する核酸を標的配列を特異的に切断しうる制限酵素で処理し、その処理後の核酸から生じる散乱光を処理しない場合と比較して、該標的配列の有無を判断することを特徴とする、核酸検出方法。
（７）  上記（６）記載の方法を利用して標的配列上の多型を検出することを特徴とする、核酸検出方法。
（８）  以下の工程を含む上記（７）記載の方法：
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列及びこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸を、標的配列上の多型部位を特異的に切断しうる制限酵素で処理する工程；
３）上記制限酵素処理後の核酸に照射光をあて、生じる散乱光を制限酵素で処理しない場合と比較し、上記標的配列上に多型が存在するか否かを判断する工程。
（９）  上記（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法に利用されるキットであって、以下のｉ）〜ｉｖ）の少なくとも一つ以上を含むことを特徴とする、前記キット。
ｉ）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のインナープライマー
（ａ）  鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）  鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
ｉｉ）以下の（ｃ）及び／又は（ｄ）のアウタープライマー
（ｃ）  鋳型核酸鎖上の任意配列Ｆ２ｃよりも３’末端方向に任意配列Ｆ３ｃを選択したとき、該Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー
（ｄ）  鋳型核酸鎖上の任意配列Ｒ２よりも５’末端方向に任意配列Ｒ３を選択したとき、該Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
ｉｉｉ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼ
ｉｖ）要素ｉｉｉ）の基質となるヌクレオチド
（１０）  さらに、以下の（ｅ）及び／又は（ｆ）のループプライマーを含む、上記（９）記載のキット。
（ｅ）  インナープライマー上のＦ１ｃ及びＦ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
（ｆ）  インナープライマー上のＲ１ｃ及びＲ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して該標的配列を検出することを特徴とする核酸検出方法、および該方法を利用した多型の検出方法、ならびにこれら方法のためのキットに関する。
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．用語の定義
核酸：本明細書中における「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。該核酸には、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及びＰＮＡ等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
【００１１】
標的配列：本明細書中における「標的配列」又は「標的核酸」とは、検出すべき核酸配列又は核酸分子を意味する。また、標的配列とは、標的核酸の塩基配列を意味する。
【００１２】
リピート構造：本発明にかかる「リピート（反復）構造」とは、特定の配列が同一鎖上に（縦列して）繰り返し含まれる構造であるが、特に本明細書中においては、互いに相補的な２つの配列が同一鎖上に繰り返し含まれる構造を意味するものとする。このリピート構造については、次項で詳述する。
【００１３】
鋳型と相補鎖：本明細書中における「鋳型」とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。
【００１４】
鋳型核酸：本発明において「鋳型核酸」とは、本来の検出対象であって、その分子中に標的配列を含み、リピート構造を有する核酸増幅産物調製やそのためのプライマー設計の基礎となる核酸を意味する。
【００１５】
ハイブリダイズ：「ハイブリダイズ」と「アニール」とは、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく相補的塩基対結合によって２本鎖を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が同一鎖上にあっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、ハイブリダイズ、あるいはアニールである。本発明において、ハイブリダイズとアニールは、核酸が塩基対結合による２本鎖構造を構成する点で同義である。
【００１６】
２．  リピート構造を有する核酸
２．１  リピート構造
本発明の方法で用いられるリピート構造を有する核酸は、「標的配列とこれに相補的な配列が縦列した構造」を同一鎖上に１回又は２回以上反復して含む。
【００１７】
本発明のリピート構造を有する核酸の鎖長は、特に限定されないが、通常少なくとも１００塩基長以上、平均１０００塩基長程度が好ましい。これは、核酸の鎖長が長いほど散乱光の強度が高く、高感度な検出が可能になるためである。
【００１８】
また、前記リピート構造を有する核酸中に含まれる「標的配列とこれに相補的な配列が縦列した構造」の反復数は特に限定されないが、通常少なくとも１〜１０回程度、平均１０回以上が好ましい。該核酸中に含まれる標的配列の数が多いほど、散乱光の強度が高く、高感度な検出が可能になるためである。
【００１９】
なお、リピート構造を有する核酸は、後述するような核酸増幅反応によって提供されるものであるため、必ずしも均一ではなく、様々な鎖長、増幅率のものが含まれる。したがって、上記鎖長や反復数の好ましい数値については、「平均」という表現を用いるものとする（なお、平均は通常の相加平均を意味する）。
【００２０】
本発明のリピート構造を有する核酸中に含まれる「標的配列」は、検出対象とする核酸（ゲノム遺伝子やｍＲＮＡ）の一部であっても、全部であってもよい。含まれる領域は、検出対象とする核酸に特異的な配列を選択して用いることが好ましく、例えば、構造遺伝子ならば繰り返し配列を含まない、ｍＲＮＡ３’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分、多型解析であれば当該多型近傍部位等を好適に用いることができる。
【００２１】
また「これに相補的な配列」とは、例えば、５’−ａｇｔｔｃａｔｃ−３’に対して、その相補的配列３’−ｔｃａａｇｔａｇ−５’を意味するが、これらは同一鎖上に含まれるため、後者は５’−ｇａｔｇａａｃｔ−３’として逆方向に配置される。この意味で、本発明のリピート構造はインバーテッドリピート（逆反復）ともいえる。この互いに相補的な２つの配列は少なくとも一部において、鎖内アニール（同一鎖内でアニール）することによってループ構造を形成しうる。そして、このループ形成は本発明のリピート構造を有する核酸に特異な２次（あるいは３次）構造を与える。例えば、同一鎖上の両端にループが形成されると、本発明のリピート構造を有する核酸はダンベル型構造となり、同一鎖上に多数のループが形成されれば、該リピート構造を有する核酸はカリフラワー型構造となる。本発明のリピート構造を有する核酸が、散乱光によって高感度で検出しうるのは、その長い鎖長と標的配列の高い反復数（高い増幅効率）に加えて、このような特異な構造が寄与していると考えられる。
【００２２】
２．２  リピート構造を有する核酸の調製
本発明のリピート構造を有する核酸は、本来の検出対象であるゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等を鋳型核酸として用い、その少なくとも一部を標的配列として、調製することができる。調製方法は特に限定されず、化学的合成等の公知の核酸合成法や、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法等の公知の核酸増幅法を適宜選択しうるが、後述するＸ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法（例えば、ＬＡＭＰ法等）を利用すれば、効率的に調製することができる。
【００２３】
（１）Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーを用いた増幅法
Ｘ１ｃ＋Ｘ２構造を有するプライマーは、具体的には以下のようにして設計する。
（ａ）  鋳型核酸鎖上の標的配列の３’側から当該鋳型核酸鎖上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）  鋳型核酸鎖上の標的配列の５’側から当該鋳型核酸鎖上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
【００２４】
なお、上記プライマーは（ａ）（ｂ）をペアとして用いてもよいし、（ａ）（ｂ）どちらか一方と通常のプライマーをペアにして用いてもよい。
増幅反応は、例えば上記プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド基質及びＤＮＡ（ＲＮＡ）ポリメラーゼを用いて、通常のＰＣＲ法により達成できる。
【００２５】
さらに、前記増幅反応はポリメラーゼとして鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば、等温条件下で行うこともできる。これは、プライマーがＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するため、該プライマーからの伸長生成物はＸ１ｃ＋（Ｘ２＋）Ｘ１の相補的配列（下線部）を含み、これが鎖内アニールして、合成された２本鎖核酸上に１本鎖部分を生成するためである。すなわち、２本鎖を高温で解離させなくとも、伸長生成物上には鎖内アニールによる新たな鎖置換反応の開始点が与えられる。この反応の概略は後述するＬＡＭＰ法を参照されたい。
【００２６】
なお、前記鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）等が挙げられる。
【００２７】
（２）ＬＡＭＰ法
１）ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法の概要
前記増幅法の好適な態様として、ＬＡＭＰ法による増幅法を用いることができる。「ＬＡＭＰ法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、２種、４種或いは６種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（６５℃前後）でＤＮＡ又はＲＮＡを迅速かつ安価に増幅する方法である。ＬＡＭＰ法の概要については、文献：Ｎｏｔｏｍｉ，  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８（１２）：ｅ６３（２０００）、特許：国際公開ＷＯ  ００／２８０８２号、あるいは栄研化学（株）ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／）を参照されたい。
【００２８】
ＬＡＭＰ法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を１本鎖に解離させていく。解離した１本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、ＬＡＭＰ法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、ＤＮＡの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、本発明で用いられるリピート構造を有する核酸を効率的に合成できる。
【００２９】
２）ＬＡＭＰ法用プライマー
ＬＡＭＰ法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
【００３０】
インナープライマーとはＬＡＭＰ法に必須のプライマーであって、鋳型ＤＮＡのそれぞれの鎖において、３’側に存在する任意配列Ｘ２ｃ、これより５’側の任意配列Ｘ１ｃを選択したとき、該Ｘ２ｃに相補的配列Ｘ２と該Ｘ１ｃと同一の配列Ｘ１ｃを３’側から５’側にこの順で含む（Ｘ１ｃ＋Ｘ２の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のＸ２は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、Ｘ１ｃは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
【００３１】
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（すなわち鋳型の３’側）の任意配列Ｘ３ｃに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
【００３２】
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記Ｘ１（Ｘ１ｃ）、Ｘ２（Ｘ２ｃ）、Ｘ３（Ｘ３ｃ）の長さは５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。
【００３３】
上記インナープライマー及びアウタープライマーは、２本鎖（Ｆ及びＲ）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（Ｆ１ｃ＋Ｆ２、Ｒ１ｃ＋Ｒ２）、アウタープライマー（Ｆ３、Ｒ３）の各々２種が設計される。
【００３４】
各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
【００３５】
また、ループプライマーとは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’末端に含むプライマー２種（２本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはＬＡＭＰ法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。
【００３６】
３）増幅用鋳型核酸
ＬＡＭＰ法で用いられる増幅用鋳型核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、組織又は細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の５’側及び３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
【００３７】
４）反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２あるいは（ＮＨ４）２ＳＯ４等が、酵素の活性維持とＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度（Ｔｍ）調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
【００３８】
５）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（ｉ）（ｉｉ）（ｉｉｉ）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）  インナープライマー２種、或いはさらにアウタープライマー２種、或いはさらにループプライマー２種
（ｉｉ）  鎖置換型ポリメラーゼ
（ｉｉｉ）基質ヌクレオチド
【００３９】
３．  核酸検出方法の具体的手順
本発明における、リピート構造を有する核酸の調製から検出までの具体的な手順は以下の工程を含む。
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ法等を用いて増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸に照射光をあて、生じる散乱光を利用して、上記標的配列を検出する工程。
【００４０】
３．１  標的配列の増幅
まず、鋳型核酸上の標的配列を増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る。
【００４１】
例えば、生物試料中の特定遺伝子の検出であれば、周知の方法に従って細胞より全ＲＮＡあるいはｍＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡとして増幅してリピート構造を有する核酸を調製してもよい。解析対象とする核酸量が少ない場合には、さらに前記ｃＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってｃＲＮＡとして増幅して用いてもよい。増幅方法としては、前述したＸ１ｃ＋Ｘ２の構造を有するプライマーを用いた増幅反応や、ＬＡＭＰ法を好適に用いることができる。
【００４２】
３．２  散乱光による標的配列の検出
散乱光の検出のため、リピート構造を有する核酸を含む試料をセルに入れ、その一面に光源からの照射光をあてる。セルは、通常の分析に用いられるような、ガラス、石英等の透明材料からなる方形セルを用いることができる。前記セルは、静止セルでもフローセルでもよい。また、照射光の光源は特に限定されず、Ｈｅ−Ｎａレーザー光源、Ａｒレーザー光源、またはこれらを組み合わなど、散乱光検出に通常用いられるものを使用することができる。試料への光照射は、直接であってもよいし、ミラー、フィルター、集光レンズ、偏光素子あるいは光ファイバ等を通して行っても良い。
【００４３】
散乱光検出器は、光源からの光を受ける面とは別なセルの一面（側方または後方）に配置され、試料から生じる散乱光を直接、あるいは、偏光素子、集光レンズ、ピンホール、光ファイバ等を通して検出する。散乱光の検出は、微弱光を感度良く検出できる、フォトンカウンティング法を利用したシステムが好ましい。検出された光は、通常、検出器に付属したソフトを用いてリアルタイムで処理解析することができる。このような散乱光検出のための光源、検出器（フォトンカウンター等）は、既に当該技術分野で周知のものであり、市販のものを（大塚電子製、島津製作所製等）を好適に利用することができる。
【００４４】
４．  散乱光検出装置
図１に、本発明の核酸検出方法のために利用しうる装置の一例を示す。この装置は、大きく、光源、反応部（試料挿入部、ホットプレート等）、検出部（散乱光検出器、カウンタメモリ等）からなり、光源と反応部、反応部と検出部はそれぞれ光ファイバＡ及びＢで連結されている。試料挿入部にはセルに入れられた試料が挿入され、光ファイバＡを通して光源からの照射光があてられる。セルは、入射光の入射および散乱光の検出を妨げないように設計したヒートブロックによって保持される。ヒートブロックは温度コントローラーによって温度制御され、セル中の反応液を所定の温度に保持することができる。なお、反応液は加熱による揮発防止のため、ミネラルオイル等を重層することが好ましい。散乱光は、入射光に対して例えば９０°方向の散乱光を光ファイバＢを通して検出、解析される。
【００４５】
上記装置は例示であって、本発明の実施には、生体高分子等の分子量測定に用いられる他の市販の光散乱光度計（大塚電子製、スタティック光散乱光度計  ＳＬＳ−６０００シリーズ等）等を利用することもできる。
【００４６】
５．標的配列の核酸検出方法用キット
本発明はまた、本発明の検出方法に用いられるキットを提供する。該キットは、以下のｉ）〜ｉｖ）の少なくとも一つ以上を含む。
【００４７】
ｉ）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）のインナープライマー
（ａ）  鋳型核酸上の標的配列の３’側から該鋳型核酸上の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃを選択したとき、該Ｆ１ｃと同一の配列及び該Ｆ２ｃに相補的な配列Ｆ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
（ｂ）  鋳型核酸上の標的配列の５’側から該鋳型核酸上の５’末端方向に向かって、順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２を選択したとき、該Ｒ１に相補的配列Ｒ１ｃ及び該Ｒ２と同一の配列Ｒ２を５’側から３’側にこの順で含むプライマー
ｉｉ）以下の（ｃ）及び／又は（ｄ）のアウタープライマー
（ｃ）  鋳型核酸鎖上の任意配列Ｆ２ｃよりも３’末端方向に任意配列Ｆ３ｃを選択したとき、該Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー
（ｄ）  鋳型核酸鎖上の任意配列Ｒ２よりも５’末端方向に任意配列Ｒ３を選択したとき、該Ｒ３と同一の配列を含むプライマー
ｉｉｉ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼ
ｉｖ）要素ｉｉｉ）の基質となるヌクレオチド
上記キットは、ＬＡＭＰ増幅をより効率的に進めるために、以下の（ｅ）及び／又は（ｆ）のループプライマーをさらに含んでいてもよい。
（ｅ）  インナープライマー上のＦ１ｃ及びＦ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
（ｆ）  インナープライマー上のＲ１ｃ及びＲ２の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
【００４８】
本発明のキットには、上記必須構成要素のほか、必要に応じて融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド等）、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な他の試薬類を含んでいても良い。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。
前記キットはまた、次項に説明する制限酵素処理の有無や、多型の検出方法のためにも用いられる。
【００４９】
６．本発明の検出方法の利用
６．１  ＬＡＭＰ産物のリアルタイムモニタリング
本発明はＬＡＭＰ反応と組み合わせることによって、微量核酸の測定、特にＬＡＭＰ産物のリアルタイムモニタリングに使用できる。ＬＡＭＰ産物は、反応副産物であるピロリン酸マグネシウムによる反応液の白濁を利用して、目視により検出することも可能である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ），  Ｖｏｌ．  ２８９，  Ｎｏ．１，  １５０−１５４，  （２００１））。しかしながら、合成されたＤＮＡそのものに基づく散乱光を利用した本発明の検出方法は、増幅反応副産物であるピロリン酸マグネシウムを検出する前記方法よりも信頼性が高く、迅速性にも優れている。すなわち、本発明の方法は、沈澱が生じていないＬＡＭＰ反応初期段階での微量増幅ＤＮＡ分子を高感度に検出することができる。
【００５０】
６．２  制限酵素消化の検出
また、本発明の方法は、制限酵素処理の有無を電気泳動等の煩雑な操作を行うことなく、簡便に検出することができる。すなわち、標的配列に制限酵素サイトが含まれている場合、リピート構造を有するＬＡＭＰ産物ではその構造中に多数の制限酵素サイトが含まれることになる。したがって、制限酵素消化を受けると著しく分子量が減少し、これは散乱光の減少となって明確に観察される。こうした効果は、ＰＣＲ産物のような単純な増幅産物ではみられない。
【００５１】
このような制限酵素消化の有無の検出は、（１）増幅反応の特異性の検証、（２）マルチプレックスＬＡＭＰ（同一チューブ内で複数のＬＡＭＰ産物を増幅する場合）による、増幅核酸の確認のほか、次項に説明する（３）多型（ＳＮＰ等）の検出に利用できる。
【００５２】
６．３  多型（ＳＮＰ等）の検出
本発明の方法を利用することにより、標的配列上の多型の検出を行うことができる。該方法は、例えば以下の工程を含む。
１）鋳型核酸上の標的配列をＬＡＭＰ増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記リピート構造を有する核酸を、標的配列上の多型部位を特異的に切断しうる制限酵素で処理する工程；
３）上記制限酵素処理後の核酸に照射光をあて、生じる散乱光を制限酵素で処理しない場合と比較し、上記標的配列上に多型が存在するか否かを判断する工程。上記多型にはＳＮＰも含まれる。
【００５３】
本発明の検出方法は、散乱光を利用して、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。この方法は処理の自動化やリアルタイムモニタリングも可能であることから、生物試料中に含まれる微量な遺伝子の検出やＳＮＰを含む多型の検出等、種々の核酸の検出への応用が期待される。
【００５４】
高分子であるＤＮＡが光を散乱することは公知の事実であるが、遺伝子増幅反応を散乱光測定によって検出する方法は、これまで報告されていない。これはおそらく、散乱光測定に有利な長鎖のＤＮＡを多量に精度良く合成できる増幅法がなかったためと推測される（たとえばＰＣＲの増幅効率は、ＬＡＭＰより２桁悪く、特異性も悪い）。本発明の方法は、リピート構造というＬＡＭＰ産物の特徴を生かし、生物試料中の微量遺伝子をその鎖長にかかわらず高感度に検出できるばかりか、制限酵素反応の有無やＳＮＰ等の多型の検出にも利用できる。また、本発明によれば、核酸増幅反応の検出と、その産物の検証を一度に行う方法、あるいはそのための装置も提供される。
【００５５】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕  散乱光測定によるＬＡＭＰ反応のモニタリング
１．試験方法
（１）ＬＡＭＰ反応
ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ；配列番号１）を鋳型に、以下のＬＡＭＰプライマーを用いて、ＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、表１に示す反応液組成にて、６０℃、４０分反応させた。
ＰＳＡ用ＬＡＭＰプライマー：
ＦＩＰ；  ５’−ＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＧＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２）
ＲＩＰ；  ５’−ＴＧＣＴＧＧＧＴＣＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧ−３’（配列番号３）
Ｆ３；  ５’−ＴＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＧ−３’（配列番号４）
Ｒ３；  ５’−ＧＧＧＴＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧ−３’（配列番号５）
（ＦＩＰ、ＲＩＰはそれぞれＦｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｅｓｅ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒを、Ｆ３、Ｒ３はそれぞれＦｏｒｗａｒｄ  Ｏｕｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｏｕｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒを示す。）
【００５７】
【表１】
2004257901.tif 000002
【００５８】
（２）散乱光測定
浜松ホトニクス株式会社が、図１に示すような散乱光検出装置を作製した。前項で調整したＬＡＭＰ反応液の散乱光をこの装置を用いて測定した。光源としては、５０ワットの白色キセノンランプを用い、直径１ｍｍφの光ファイバーＡを通して、全ての波長の光をサンプルに照射した。サンプル用セルとしては、３ｍｍ×３ｍｍ角の方形セル（石英製）を用いた。セルは、入射光の入射および散乱光の検出を妨げないように設計したヒートブロックによって保持されるが、このヒートブロックを加熱することで、セル中の反応液を所定の温度に保持することができる。なお、反応液には、揮発防止のためにミネラルオイルを重層した。検出は、入射光に対して９０°方向の散乱光を、光ファイバＢを通して高感度光電子増倍管を用いてフォトンカウンティング法で検出した。
【００５９】
〔実施例２〕  散乱光の由来確認
１．試験方法
観察されている散乱光が、ピロリン酸マグネシウムの沈澱に由来するのか、ＬＡＭＰ産物（長鎖ＤＮＡ分子）に由来するのかを次のようにして確認した。
【００６０】
耐熱性Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｐｐａｓｅ）をＬＡＭＰ反応液に共存させておくと、ピロリン酸マグネシウムの沈殿が生成しないことがわかっている。そこで、Ｐｐａｓｅ（２０  ｍＵ  Ｔｔｈ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ；Ｒｏｃｈｅ社製）共存下で、実施例１と同様にＬＡＭＰ反応を行い、実施例１の結果と比較した。結果を図２に示す。
【００６１】
２．試験結果
Ｐｐａｓｅ無添加の場合、反応開始後約１０分から１５分の間で穏やかな散乱光増加がみられ、約１７分（図中矢印）から爆発的な散乱光の増加がみられた。Ｐｐａｓｅを添加した場合、約１０分から１５分の間の穏やかな散乱光増加はみられたが、１７分からの爆発的な散乱光増加は観察されなかった。したがって、１７分からの爆発的な散乱光増加は、ピロリン酸マグネシウムの沈殿生成に由来しており、約１０分からみられる穏やかな散乱光増加は、長鎖ＤＮＡ（ＬＡＭＰ産物）に由来していると考えられた。この結果から、ピロリン酸マグネシウムからの散乱光を検出するよりも、ＬＡＭＰ反応によって合成された長鎖ＤＮＡからの散乱光を検出する方が、迅速性に優れていることが確認された。
【００６２】
〔実施例３〕  散乱光測定によるＬＡＭＰ産物の制限酵素消化反応のモニタリング
１．試験方法
増幅したＤＮＡを制限酵素処理することによって、その増幅反応の特異性を検証することが広く行われている。そこで、ＬＡＭＰ反応液にＬＡＭＰ産物を認識しない制限酵素：ＥｃｏＲＩ  （宝酒造社製；認識配列  ＧＡＡＴＴＣ）、又はＬＡＭＰ産物を認識する制限酵素：Ｓａｕ３ＡＩ  （宝酒造社製；認識配列  ＧＡＴＣ）をそれぞれ同一ユニット数（５０Ｕ／ｔｕｂｅ）添加し、散乱光の変化をみた。なお、配列表の配列番号１に示されるＰＳＡの塩基配列中、ヌクレオチド番号２２８から２３１のＧＡＴＣ配列部分が、Ｓａｕ３ＡＩ認識部位にあたる。
【００６３】
また、酵素消化の有無を直接確認するため、各制限酵素反応後のサンプルについて、アガロースゲル電気泳動分析を行った。
【００６４】
２．試験結果
図３に示すように、ＥｃｏＲＩを添加しても、散乱光強度はほとんど変化しなかったが（散乱光強度の低下：３％）、Ｓａｕ３ＡＩを添加すると、散乱光強度が著しく減少した（散乱光強度の低下：３０％）。このことは、合成されたＤＮＡがＳａｕ３ＡＩによって消化され、断片化したために散乱効率が低下したためであり、ＬＡＭＰ反応液で観測される散乱光強度の増加がＬＡＭＰ反応によって合成された長鎖ＤＮＡによるものであることを示す。
【００６５】
図４に示すように、電気泳動の結果、ＥｃｏＲＩ処理後のサンプルの泳動パターン（レーン２）は、制限酵素未処理のＬＡＭＰ産物の泳動パターン（レーン１）と一致し、Ｓａｕ３ＡＩ処理後のサンプルの泳動パターン（レーン３）には、分解されたＤＮＡ由来のバンド（図中矢印）が観察された。これにより、Ｓａｕ３ＡＩ処理による散乱光強度の低下は、Ｓａｕ３ＡＩによって長鎖ＤＮＡが断片化したためであることが証明された。
【００６６】
通常、制限酵素反応の有無はアガロース電気泳動という煩雑な操作によって調べられているが、本発明の方法を用いれば、散乱光測定によって増幅産物の制限酵素消化の有無を簡単にチューブ内で検出することができる。ＬＡＭＰ産物は、リピート構造を持つ長鎖ＤＮＡであるため、一本のＤＮＡの中に多数の制限酵素サイトを有している。そのため、制限酵素処理による分子量低下が著しく、散乱光強度の減少度も大きい。つまり、ＬＡＭＰ産物は、ＰＣＲ産物のような単純なＤＮＡよりも高感度に、酵素消化の有無を検出することができると考えられる。
【００６７】
〔実施例４〕  散乱光測定によるＰＣＲ産物とＬＡＭＰ産物の検出結果の比較
１．試験方法
同一の標的配列について、そのＬＡＭＰ産物とＰＣＲ産物間で、散乱光測定による検出結果を比較した。ＬＡＭＰ反応は実施例１と同様の方法で実施し、ＰＣＲ反応はＬＡＭＰプライマーのアウタープライマーをプライマーとして用い、以下に示す反応液組成（表２）と反応条件で、一般的なプロトコールにしたがって実施した。
【００６８】
【表２】
2004257901.tif 000003
【００６９】
2004257901.tif 000004
【００７０】
２．試験結果
ＰＣＲ反応液では、バックグランド（蒸留水）に対する散乱光増加はほとんど観察されなかった。この結果から、増幅領域が同じ場合、リピート（インバーテッドリピート）構造の長鎖ＤＮＡを多量に合成するＬＡＭＰ反応のほうがＰＣＲ反応よりも散乱光検出に適していることが確認された。ＰＣＲ産物を効率よく散乱光で検出するためには、今回より長い領域を多量に増幅する必要があるが、それは一般的に非常に困難である。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、散乱光を利用して、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。また、この方法は処理の自動化やリアルタイムモニタリングも可能であることから、生物試料中に含まれる微量な遺伝子の検出やＳＮＰを含む多型の検出等、種々の核酸の検出への応用が期待される。
【００７２】
【配列表】
2004257901.tif 000005
2004257901.tif 000006
2004257901.tif 000007
【００７３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号２−人工配列の説明：プライマー
配列番号３−人工配列の説明：プライマー
配列番号４−人工配列の説明：プライマー
配列番号５−人工配列の説明：プライマー
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の方法に使用するための散乱光検出器を示す図である。
【図２】図２は、光散乱法によるＬＡＭＰ産物（ＰＳＡ）のリアルタイム検出結果を示すグラフである。図中、上の曲線はＰＰａｓｅ無添加（ピロリン酸マグネシウム生成）、下の曲線はＰＰａｓｅ添加（ピロリン酸マグネシウム生成せず）の結果を示す。また、矢印は、ピロリン酸マグネシウム沈澱の検出開始点を示す。
【図３】図３は、ＬＡＭＰ産物の散乱光強度に及ぼす制限酵素処理の影響を示すグラフである。図中、上の曲線はＥｃｏＲＩ（ＰＳＡを認識しない酵素）、下の曲線はＳａｕ３ＡＩ（ＰＳＡを認識する酵素）による結果を示す。
【図４】図４は、制限酵素処理後の反応液の３％アガロース電気泳動結果を示す。図中左より、Ｍ：１００ｂｐラダー、１：制限酵素未処理ＬＡＭＰ反応液（ＰＳＡ）、２：ＥｃｏＲＩ処理後、３：Ｓａｕ３ＡＩ処理後。また、矢印はＳａｕ３ＡＩ反応産物のバンドを示す。
【図５】図５は、散乱光検出におけるＬＡＭＰ法とＰＣＲ法を比較した結果を示すグラフである。
【図１】
2004257901.tif 000008
【図２】
2004257901.tif 000009
【図３】
2004257901.tif 000010
【図４】
2004257901.tif 000011
【図５】
2004257901.tif 000012