(57)【要約】      （修正有）【課題】ソライロアサガオ等の真核生物において、複製を介して転移することにより変異原として働くローリング・サークル型トランスポゾンを取得し、分子育種に利用する。【解決手段】特定配列で表される塩基配列（約１１．５ｋｂ）に少なくとも９８％相同のＤＮＡから成るトランスポゾン遺伝子を提供する。このトランスポゾン遺伝子は、転移に必要と思われる２つの遺伝子（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ７０ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＲＰＡ７０）とＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ（Ｒｅｐ／Ｈｅｌ））を有していることから、自律性トランスポゾンであると考えられる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９８％相同のＤＮＡから成るトランスポゾン遺伝子。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスポゾン遺伝子を含有するプラスミド。
【請求項３】
請求項１に記載のトランスポゾン遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項４】
宿主が植物である請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
前記植物がシロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ、トウモロコシ又はイネである請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の形質転換体において、前記トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換した植物又はその種。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、トランスポゾン遺伝子に関し、より詳細には、ソライロアサガオから見出されたローリング・サークル型と考えられるトランスポゾン遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トランスポゾンは、転移の様式によりＲＮＡ中間体を介して転移するクラスＩ因子と、ＤＮＡの切り出しを伴い転移するクラスＩＩ因子の２種に大別される。さらに、原核生物では、ローリングサークルを介した複製によりＤＮＡの切り出しを伴わずに転移する、どちらのクラスにも属さないローリング・サークル型トランスポゾンが知られている。２００１年７月には、塩基配列のデータベース解析より見いだされた、真核生物（シロイヌナズナ、イネ、線虫）のローリング・サークル型トランスポゾンも報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、真核生物のゲノム中に存在する多くのトランスポゾンが、進化の過程でゲノム中に固定化し、現在では転移しえないことが知られており、これらのローリング・サークル型トランスポゾンが転移活性を有するのか否かは明らかにされていない（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ  Ｖ．  Ｖ．  ａｎｄ  Ｊｕｒｋａ  Ｊ．  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８（１５）：  ８７１４−８７１９
【非特許文献２】
Ｃｅｄｒｉｃ  Ｆｅｓｃｈｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｕｓａｎ  Ｒ．  Ｗｅｓｓｌｅｒ  （２００１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８（１６）：  ８９２３−８９２４
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、転移活性を有して変異原として働くローリング・サークル型のトランスポゾンを取得し、分子育種に利用することを目的とした研究の成果として得られたものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、後述の実施例にあるように、アントシアニン色素の呈色により青色花を咲かせるソライロアサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｔｒｉｃｏｌｏｒ）より分離した白色花をもつ変異体について、原因遺伝子の同定を行い、この変異にローリング・サークル型トランスポゾン（配列番号１）が関与することを見出した。この結果は、ローリング・サークル型トランスポゾンについて、真核生物で初めて転移活性を確認したものであり、ローリング・サークル型トランスポゾンが他のクラスに属するトランスポゾンと同様に変異原として働くことを示している。
【０００６】
即ち、本発明は、配列番号１で表される塩基配列に少なくとも９８％相同のＤＮＡから成るトランスポゾン遺伝子である。
本発明は、また、上記に記載のいずれかのトランスポゾン遺伝子を含有するプラスミドである。ここで用いることのできるプラスミドとして、Ｔｉプラスミド、ｐＢＩ−１２１プラスミド等のバイナリーベクターが挙げられる。通常の遺伝子工学的手法を用いて、この遺伝子を上記プラスミドに挿入することができる。
また、本発明は、上記のいずれかのトランスポゾン遺伝子が導入された形質転換体である。この宿主は植物であることが好ましく、この植物としては、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ、トウモロコシ又はイネが好ましい。いずれも形質転換の方法が確立しており、研究および産業上で重要な植物である。このような植物を形質転換するには、上記トランスポゾン遺伝子が導入されたプラスミドを用いてこの植物を形質転換すればよい。
【０００７】
本発明はまた、上記形質転換体において、前記トランスポゾン遺伝子が転移して形質転換した植物又はその種である。配列番号１のトランスポゾンは転移に必要な転移酵素遺伝子を有していると考えられるため、これらの遺伝子を強制発現させるキメラ遺伝子を構築してトランスポゾンと共存させることで転移を促進させることが可能である。たとえば、転移酵素遺伝子あるいはそのｃＤＮＡの上流に３５Ｓプロモーターを融合させたキメラ遺伝子と、配列番号１のトランスポゾンあるいはその改変配列を同時に異種植物に導入することにより、トランスポゾンを転移促進することができる。この植物としては、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ペチュニア、アブラナ、ワタ、トウモロコシ又はイネが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
従来多くのトランスポゾンは転移活性を持たず、ゲノム中に固定化した、いわば化石であった。シロイヌナズナ、イネ、線虫などにもローリングサークル型のトランスポゾンが存在することは知られていたが、転移が確認された（すなわち変異原として働く）ローリングサークル型トランスポゾンは、真核生物において見出されていなかった。本発明は、ソライロアサガオにおいてこのようなトランスポゾン遺伝子を始めて明らかにした。
本発明のトランスポゾン遺伝子（配列番号１）は、後述の実施例で明らかにされるが、転移に必要と思われる２つの遺伝子（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ７０  ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＲＰＡ７０）とＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ（Ｒｅｐ／Ｈｅｌ））を有していることから、自律性トランスポゾンであると考えられる。
【０００９】
本発明において、このトランスポゾンの配列（配列番号１）が解明されたため、この配列中の適当な配列にプライマーを設計し、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法等により、転移したトランスポゾンが挿入されることにより破壊された遺伝子を特定することができる。このトランスポゾンの配列（配列番号１）を、他の植物に導入して転移させることにより、遺伝子が破壊された変異体を得ることが出来る。このような変異体とその遺伝子との相関を解明することにより、その遺伝子の機能を知ることができる。この場合、上記の方法により、転移したトランスポゾンにより破壊された遺伝子を特定することができる。
【００１０】
本発明のトランスポゾン遺伝子の利用法として、これを変異原として利用し、所望の植物等において、トランスポゾンタグ系統を作出することができる。
本発明を利用して、ランダムに本トランスポゾンを転移させた系統を数万系統をつくり出すことができる。ソライロアサガオ以外の植物においても形質転換法により本発明のトランスポゾンを導入すれば、同様に転移を誘発することが可能である。
このようにして得た変異体は、遺伝学的解析法や逆遺伝学的解析法により解析することができる。
この遺伝学的解析法とは、変異体の表現型からその原因遺伝子を単離する方法であり、本トランスポゾンと変異体の表現型がリンクしていれば、このタグ（トランスポゾン）を利用して、容易に原因遺伝子の単離を行える。
また、逆遺伝学的解析法とは、遺伝子からその遺伝子の機能が失われた変異体を単離する方法である。多数の変異体よりＤＮＡを抽出し、プールを作る。トランスポゾンタグ系統のＤＮＡを購入し、その中から、目的の遺伝子にトランスポゾンが挿入した変異体をＰＣＲ法により釣りあげることができる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
野生型のソライロアサガオは、アントシアニン色素の呈色により青色の花を咲かせる。５０年程前に、このような野生型系統から白色花を咲かせる系統（白色花変異体）が分離された。
本実施例では、この白色花を与える変異遺伝子を同定することを目的として、先ず、一連のアントシアニン色素生合成系遺伝子について、野生型のソライロアサガオ（ＨＥＭ−ＺＡＤＥＮ（１６０７  ＺＧ  ＨＥＭ，  Ｈｏｌｌａｎｄ）から入手）と白色花変異体のソライロアサガオ（サカタのタネから入手）の花弁における転写産物の蓄積量をノザン法により解析した。
ノザン法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、ラジオアイソトープ（３２Ｐ）を用いて行った。ノザン法のプローブ配列には、近縁種のアサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ）由来のＣＨＳ−Ｄ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ−Ｄ、ＤＤＢＪ：  ＡＢ００１８１８）、ＣＨＩ（ｃｈａｌｃｏｎｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、配列番号２）、Ｆ３Ｈ（ｆｌａｖａｎｏｎ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、ＤＤＢＪ：  Ｄ８３０４１）、ＤＦＲ−Ｂ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ  ４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＤＢＪ：  ＡＢ００６７９２）、ＡＮＳ（ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＤＤＢＪ：  ＡＢ０７３９１９）、ＵＦ３ＧＴ（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ：ｆｌａｖｏｎｏｉｄ３−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、配列番号３）遺伝子の各ｃＤＮＡを用い、ＲＮＡはグアニジンチオシアン酸塩を用いて抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１０μｇ使用した。ＲＮＡは１．０％の濃度のアガロース（ＬＯ３、ＴａＫａＲａ社）ゲルで分画し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転写した。その結果を図１に示す。
図１において明らかなように、野生型と比較して白色花変異体の花弁では、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ蓄積量のみが有意に低下しており、変異の原因がＤＦＲ−Ｂ遺伝子にあるものと推測された。
【００１２】
実施例２
本実施例では、各遺伝子のゲノム上の構造を調べるために、サザン法による検討を行った。
ソライロアサガオの葉よりＣＴＡＢ法にＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）を組み合わせて抽出したゲノムＤＮＡを、それぞれ１０μｇずつ、ＳｐｅＩ又はＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素により消化した。消化したＤＮＡは０．８％のアガロース（ＬＯ３、ＴａＫａＲａ社）ゲルで分画し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転写した。
実施例１で用いた６種の遺伝子のｃＤＮＡをプローブとしたサザン法による解析を行った。サザン法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、ラジオアイソトープ（３２Ｐ）を用いて行った。
図２にプローブ配列としてアサガオ由来のＤＦＲ−Ｂ遺伝子ｃＤＮＡを用いた結果を示す。ＤＦＲ−Ｂ遺伝子遺伝子領域でのみ、ＤＮＡの再編成に由来すると思われる野生型とは異なるバンドのパターン（多型）が検出された。
【００１３】
実施例３
更に、野生型のソライロアサガオより、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子のｃＤＮＡを単離し、塩基配列を決定した。
ツボミよりグアニジンチオシアン酸塩を用いてＲＮＡを抽出し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＤＹＮＡＬ社）を用いてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて得られたｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いてλＥｘＣｅｌｌにクローン化し、さらにＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｏｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  パッケージングを行ってライブラリーを作成した。ライブラリーはアサガオのＤＦＲ−Ｂ遺伝子ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングを行った。
さらに、より完全長に近いｃＤＮＡの配列を決定するために、５’ＲＡＣＥ法及び３’ＲＡＣＥ法によりＤＦＲ−Ｂ遺伝子ｃＤＮＡの両末端領域をクローニングした。
【００１４】
５’ＲＡＣＥ法には、５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ＥＮＤｓ，  Ｖｅｒ．  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、これに付属するプライマーとＴＤＢ−Ｅ４Ｒ２（配列番号５）とＴＤＢ−Ｅ３Ｒ２（配列番号６）での２度のＰＣＲにより５’末端領域を増幅した。
３’ＲＡＣＥ法では、ＮｏｔＩ−ｄ（Ｔ）１８（配列番号７）を逆転写反応のプライマーとしてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりｃＤＮＡを合成し、ＴＤＢ−Ｅ４Ｆ１（配列番号８）とＮｏｔＩ  ｏｎｌｙ（配列番号９）プライマーを用いてＰＣＲによる増幅を行った後、さらに増幅産物をＴＤＢ−Ｅ５Ｆ１（配列番号１０）とＮｏｔＩ  ｏｎｌｙプライマーにより増幅した。
５’ＲＡＣＥと３’ＲＡＣＥともに５０μｌの反応系で、２．５ＵのＥｘ  Ｔａｑ、１Ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、１μＭの各プライマーに２μｌのｃＤＮＡもしくは１度目のＰＣＲによる増幅産物を加えた。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、さらに７２℃で１分を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応した。それぞれの反応産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローン化した。
得られたｃＤＮＡクローンは、シーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列（配列番号４）を決定した。
【００１５】
次に、ＰＣＲ法によりＤＦＲ−Ｂ遺伝子領域の構造を検討した。
プライマーにはｃＤＮＡ配列の情報をもとに作成したＴＤＢ−ＬＡＦ２−５（配列番号１１）とＴＤＢ−ＬＡＲ４−５（配列番号１２）のペア、及びＴＤＢ−ＬＡＦ１（配列番号１３）とＴＤＢ−ＬＡＲ５（配列番号１４）のペアを用い、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社）をＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとして説明書に従いＰＣＲ反応を行った。図３にソライロアサガオのＤＦＲ−Ｂ遺伝子の構造と用いたプライマーの位置を示す。
反応系は５０μｌで、２．５ＵのＬＡ  Ｔａｑ、１Ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、０．２μＭの各プライマーに１００ｎｇのゲノムＤＮＡが含まれるよう調製した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃で１分の後、９８℃で１０秒、６８℃で１５分を１サイクルとして１４サイクル行い、さらに６８℃の伸長反応時間をサイクル毎に１５秒ずつ伸ばして１６サイクル行い、最後に７２℃で１０分間反応した。反応産物は、０．８％のアガロース（ＬＯ３、ＴａＫａＲａ社）ゲルで分画した。
その結果を図４に示す。図４の左図に示すように、ＴＤＢ−ＬＡＦ２−５とＴＤＢ−ＬＡＲ４−５のプライマーペアを用いた時のみ、変異体（レーン４）で野生型（レーン３）より約１１．５ｋｂ大きなバンドが得られた。
この結果は、白色花変異体のＤＦＲ−Ｂ遺伝子の第５エキソンから第６エキソンの間に１１．５ｋｂの挿入配列が存在することを示している。
【００１６】
実施例４
本実施例では、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子の劣性変異により絞り花を咲かせる絞り花変異体と、白色花変異体を交配した。得られた次世代の植物は絞り花を咲かせた。その結果を図５に示す。
それぞれの変異形質を相補しなかったことから、白色花変異体もＤＦＲ−Ｂ遺伝子の変異体であることが明らかになった。
実施例１〜５の結果から、ソライロアサガオの白色花に係わる遺伝子は、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子であることが明らかになり、１１．５ｋｂの挿入配列が変異の原因であることが示唆された。
【００１７】
実施例５
本実施例では、１１．５ｋｂの挿入配列（配列番号１）の構造解析を行った。
挿入配列（配列番号１）を含むＤＦＲ−Ｂ遺伝子領域を４つの断片に分けて単離した。その断片と挿入配列の関係を図６に示す。
ＤＦＲ−Ｂ遺伝子の５’側上流域から挿入配列の５’末端を含む断片（１６ｋｂ）と、挿入配列の中央から３’側とＤＦＲ−Ｂ遺伝子の第６エキソンを含む断片（８ｋｂ）は、それぞれλＤＡＳＨＩＩとλＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のファージベクターにクローン化した。５０μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ショ糖密度勾配遠心によりサイズ分画を行った。ついで、ＨｉｎｄＩＩＩで処理した各ファージベクターに、目的のサイズが含まれた画分中のゲノムＤＮＡを結合させて、ＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｏｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  パッケージングを行った。ファージは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従ってスクリーニングし、それぞれｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ−とｐＢＫ−ＣＭＶにサブクローニングを行った。
【００１８】
さらに、１６ｋｂと８ｋｂの断片間にある挿入配列の中央領域（６ｋｂ）と第６エキソンの下流領域（２ｋｂ）は、ＰＣＲを用いてクローン化した。
中央領域を増幅するプライマーはＤＦＲ−Ｂ遺伝子の第３エキソン内にＴＤＢ−ＬＡＦ４（配列番号１５）と挿入配列内にＰＩ−ＬＲ２（配列番号１６）を設計して用い、下流領域の増幅には第６エキソン内にＴＤＢ−Ｅ６Ｆ２（配列番号１７）と第６エキソンの下流にＷ３−Ｆ１Ｒ１（配列番号１８）を作成した。中央領域のＤＮＡ断片を増幅する反応系は５０μｌで、２．５ＵのＬＡ  Ｔａｑ、１Ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、０．２μＭの各プライマーに１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなるよう調製した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃で１分の後、９８℃で１０秒、６８℃で１５分を１４サイクル行い、さらに６８℃で１５分の伸長反応時間をサイクル毎に１５秒ずつ伸ばして１６サイクル行い、最後に７２℃で１０分間反応した。
【００１９】
一方、下流領域の増幅も５０μｌの反応系で、２．５ＵのＥｘ  Ｔａｑ、１Ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、１μＭの各プライマーに１００ｎｇのゲノムＤＮＡを含むように調製した。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、さらに７２℃で１分を１サイクルとして３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応した。それぞれの反応産物は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローン化した。
【００２０】
さらに、対照となる野生型ソライロアサガオからも、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子領域を２つの断片に分けてクローン化した。
ＤＦＲ−Ｂ遺伝子の５’側上流域から第４エキソンの５’側を含む断片（６ｋｂ）と、第４エキソンの３’側から第６エキソンの下流までを含む断片（７ｋｂ）を、λＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）にクローン化した。５０μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素、ＳｐｅＩで処理し、ショ糖密度勾配遠心によりサイズ分画を行った。ついで、ＳｐｅＩで処理したλＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓに、目的のサイズが含まれた画分中のゲノムＤＮＡを結合させて、ＧＩＧＡＰＡＣＫ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｏｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  パッケージングを行った。ファージは、変異体のＤＦＲ−Ｂ遺伝子領域のクローニングと同様にスクリーニングし、ｐＢＫ−ＣＭＶにサブクローニングを行った。
【００２１】
得られたゲノムクローンは、シーケンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を決定し、各種のソフトウェアにより塩基配列の解析を行った。この野生型（配列番号１９）と変異体（配列番号２０）の塩基配列の解析により、白色花変異体のＤＦＲ−Ｂ遺伝子の第５イントロン内に、野生型には存在しない１１，４６８ｂｐの挿入配列（配列番号１）が見い出された。白色花変異体のＤＦＲ−Ｂ遺伝子と転写産物の構造を図６に示す。
野生型を示す配列番号１９において、第１エキソンは４５４５〜４７８３位、第２エキソンは４８９４〜５０６３位、第３エキソンは５３１１〜５５０５位、第４エキソンは５９５３〜６１１２位、第５エキソンは６２０２〜６３９４位、第６エキソンは７６４０〜８２６１位に位置し、トランスポゾンの挿入位置は７０３８位のＡと７０３９位のＴとの間である。一方、白色花変異体を示す配列番号２０において、第１エキソンは４０３６〜４２７４位、第２エキソンは４３８５〜４５５４位、第３エキソンは４８０２〜４９９６位、第４エキソンは５４４４〜５６０３位、第５エキソンは５６９３〜５８８５位、第６エキソンは１８５９９〜１９２１９位に位置し、トランスポゾン（配列番号１）は６５３０〜１７９９７位に挿入されている。
このトランスポゾンは、ＡＴの２塩基の間に挿入し、クラスＩやＩＩのトランスポゾンが挿入に際して形成する標的配列の重複は存在しなかった。また、５’末端がＴＣ、３’末端はＣＴＡＧであり、両末端近傍に短い逆反復配列を持っていた。トランスポゾンの挿入部位の配列と両末端領域の配列を図７に示す。
【００２２】
さらに、内部領域には転移に必要な酵素と思われるＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ７０ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＲＰＡ７０）とＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ（Ｒｅｐ／Ｈｅｌ）の２つの遺伝子と相同な配列が存在した（図８、９）。
これらの特徴は、塩基配列のデータベース解析より見いだされた、真核生物（シロイヌナズナ、イネ、線虫）のローリング・サークル型トランスポゾン（非特許文献１）と共通していることから、配列番号１は新規のローリング・サークル型トランスポゾンであると考えられる。
なお、Ｒｅｐ／ＨｅｌとＲＰＡ７０をコードする遺伝子の転写の方向と、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子のそれとは逆向きであり、新規トランスポゾンはＤＦＲ−Ｂ遺伝子に対して逆向きに挿入していた（図７）。
トランスポゾンを示す配列番号１において、ＲＰＡ７０の第１エキソンは５３６〜６０３位、第２エキソンは７６９〜９５３位、第３エキソンは１４３３〜１５２０位、第４エキソンは１６０３〜１７３５位、第５エキソンは１８２６〜２１１０位、第６エキソンは２１８９〜２４１６位、第７エキソンは２５０６〜２６７９位に位置し、Ｒｅｐ／Ｈｅｌの第１エキソンは４４９４〜４５６０位、第２エキソンは５８５２〜５９７１位、第３エキソンは６１０１〜６２０８位、第４エキソンは６５０８〜６６６３位、第５エキソンは６７６６〜７２０７位、第６エキソンは７３０９〜７６６４位、第７エキソンは７７７２〜８２３３位、第８エキソンは８４１６〜８８５９位、第９エキソンは８９１８〜９５３２位、第１０エキソンは９６２０〜１１２８０位に位置する。
【００２３】
また推定されるＲＰＡ７０のアミノ酸配列は、ＲＰＡ７０のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端及びＲＰＡサブユニット間の結合ドメインを有し、この領域（図８）ではイネ、ヒト、分裂酵母のＲＰＡ７０と２１％、２０％、１９％の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が見られた。
さらに、Ｒｅｐ／Ｈｅｌのアミノ酸配列もシロイヌナズナのローリング・サークル型トランスポゾンがもつＲｅｐ／Ｈｅｌと比較して、Ｒｅｐ領域の２つのドメイン（図９Ａ）で６３％、Ｈｅｌｉｃａｓｅの８つに分かれたドメイン（図９Ｂ）で８０％の相同性が存在した。
【００２４】
実施例６
本実施例では、トランスポゾン（配列番号１）に相同な配列はソライロアサガオのゲノム中に数１０コピー程度散在し、系統間により挿入部位が異なることをサザン法により明らかにした。
材料には、野生型のソライロアサガオ２系統（ＨＥＭ−ＺＡＤＥＮ（１６０７  ＺＧ  ＨＥＭ，  Ｈｏｌｌａｎｄ））、白色花変異体（サカタのタネ）、赤色花変異体（Ａｒｋａｎｓａｓ，  ＵＳＡで採種）、ＤＦＲ−Ｂ遺伝子の欠損変異体（サカタのタネ）、薄青色花変異体（ＨＥＭ−ＺＡＤＥＮ（１６０７  ＺＧ  ＨＥＭ，  Ｈｏｌｌａｎｄ））の６系統を用いた。サザン法の詳細は、実施例１と同様にＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従い、ラジオアイソトープ（３２Ｐ）を用いて行った。ゲノムＤＮＡは、ＣＴＡＢ法にＧｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（ＱＩＡＧＥＮ社）を組み合わせて葉より抽出し、１０μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。消化したＤＮＡは０．８％の濃度のアガロース（ＬＯ３、ＴａＫａＲａ社）ゲルで分画し、ナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に転写した。また、プローブにはトランスポゾン内のＲｅｐ／Ｈｅｌ遺伝子領域を用いた。
解析の結果、用いた６種のソライロアサガオの系統いずれにも、トランスポゾンに極めて相同性が高い配列が数１０コピー程度存在し、系統間によりバンドのパターンに多型が見られることから、挿入部位がそれぞれ異なることが示唆された（図１０Ａ）。また、一つの系統においても個体間で少数の多型が見られ、最近に起きた転移の痕跡であるか、集団の中で固定されていないコピーが存在すると思われた（図１０Ｂ）。
【００２５】
さらに、検出された相同配列の内部を白色花変異体よりクローン化し、配列を決定して配列番号１との相同性を比較した。内部配列はＰＣＲ法により増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてクローン化した。増幅には配列番号１のトランスポゾンの内部にＲＣ−ＬＦ１（配列番号２１）とＲＣ−ＬＲ１（配列番号２２）を設計した。中央領域のＤＮＡ断片を増幅する反応系は５０μｌで、２．５ＵのＬＡ  Ｔａｑ、１Ｘ  ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒＩＩ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、０．２μＭの各プライマーに１００ｎｇのゲノムＤＮＡからなるよう調製した。ＰＣＲのサイクルは、９４℃で１分の後、９８℃で１０秒、６８℃で１５分を１４サイクル行い、さらに６８℃で１５分の伸長反応時間をサイクル毎に１５秒ずつ伸ばして１６サイクル行い、最後に７２℃で１０分間反応した。
得られた１８クローンの７８５ｂｐ（配列番号１の７３７６〜８１６０位に相当）について比較したところ、配列番号１に対して１〜９塩基の置換しかなく、９８．９％から９９．９％の相同性を有していた。即ち、サザン法により検出された相同配列の多くは、配列番号１に対して９８％以上、特に９９％以上の相同性と転移活性を有したトランスポゾンであることが示唆された。
多くのトランスポゾンは、ゲノム中に複数のコピーを有することが知られている。とくにローリング・サークル型のトランスポゾンは複製的に転移することから、今回得られたトランスポゾンおよびその相同配列がソライロアサガオゲノム中に多コピー存在することは自然なことである。系統間、あるいは個体間で挿入部位に違いがあることも、これらのトランスポゾンがかつて転移したことを強く示唆している。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ソライロアサガオの花弁の転写産物をノザン法により解析した結果を示す図である。アサガオ由来のアントシアニン色素生合成系遺伝子のｃＤＮＡ配列をプローブに用いた。レーン１は野生型ソライロアサガオ、レーン２は白色花変異体を示す。
【図２】ソライロアサガオの葉より抽出したゲノムＤＮＡを制限酵素（ＳｐｅＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ）により消化してサザン法により解析した結果を示す図である。プローブ配列はアサガオ由来のＤＦＲ−Ｂ遺伝子ｃＤＮＡを用いた。レーン１は野生型ソライロアサガオ、レーン２は白色花変異体を示す。
【図３】ソライロアサガオのＤＦＲ−Ｂ遺伝子の構造と用いたプライマーの位置を示す図である。四角形はＤＦＲ−Ｂ遺伝子のエキソン配列（Ｅ１〜６は第１〜６エキソン）を示す。上下の矢印は用いたプライマー配列の位置を示す。
【図４】ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。図の上は用いたプライマーを示す。レーン１はλＨｉｎｄＩＩＩマーカー、レーン２は１ｋｂ  ラダーマーカー、レーン３は野生型、レーン４は白色花変異体を示す。
【図５】白色花変異体とＤＦＲ−Ｂ遺伝子を欠損するソライラアサガオの系統との交配実験を示す図である。
【図６】白色花変異体のＤＦＲ−Ｂ遺伝子と転写産物の構造を示す図である。ＰＬ、ＰＬＴ、ＰＭ、ＰＤ３’の４つのＤＮＡ断片に分けてクローン化した。白い四角形はＤＦＲ−Ｂ遺伝子の６つのエキソン（下にＥ１〜６と付記）と、第５イントロン内に挿入した新規ローリング・サークル型トランスポゾン（配列番号１）。トランスポゾン内部の矢印は、それぞれ転移に必要と思われる酵素遺伝子で、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ（Ｒｅｐ／Ｈｅｌ）とＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ７０  ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  （ＲＰＡ７０）をコードする領域を示す。また、この変異遺伝子では、Ｔ１及びＴ２の様な構造を持つｍＲＮＡが転写される。各エキソンに対応する配列を塗りつぶした四角形で、スプライスアウトされるイントロンに相当する領域を点線で示す。
【図７】トランスポゾンの挿入部位の配列と、両末端領域の配列を示す図である。真核生物のローリング・サークル型トランスポゾンに特徴的な末端配列（下線部）と矢印で示した逆反復配列を有する。
【図８】トランスポゾン（配列番号１）とイネ（Ｏ．  ｓａｔｉｖａ）、ヒト（Ｈ．  ｓａｐｉｅｎｃｅ）及び分裂酵母（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵素（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ７０  ｋＤａ  ｓｕｂｕｎｉｔ（ＲＰＡ７０））の配列の比較を示す図である。配列番号１は、ＲＰＡ７０で保存されている３つのドメインのうち、ＤＮＡ結合ドメインの一部、ＲＰＡサブユニット間の結合ドメインを有する。アスタリスクは４つの配列で保存されている推定アミノ酸を示す。
【図９】トランスポゾン（配列番号１）の酵素（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ｈｅｌｉｃａｓｅ）の配列の比較を示す図である。Ａは、ローリング・サークル型の複製に必要な酵素に見られる保存領域を示す。シロイヌナズナと線虫のローリング・サークル型トランスポゾン（ＨＥＬＩＴＲＯＮ  ＡＴ及びＨＥＬＩＴＲＯＮ  ＣＥ）及びＡｃｔｉｎｏｂａｖｉｌｌｕｓａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｉｔａｎｓの持つローリング・サークル型の複製を行うプラスミドＤＮＡ（Ｒｅｐ  ＡＡ）の比較を示す。Ｂは、ＤＮＡ  ｈｅｌｉｃａｓｅに見られる保存領域を示す。シロイヌナズナと線虫のローリング・サークル型トランスポゾン（ＨＥＬＩＴＲＯＮ  ＡＴ及びＨＥＬＩＴＲＯＮ  ＣＥ）、分裂酵母（ＰＩＦ１）及びＴ４バクテリオファージ（ＨＥＬ  Ｔ４）が持つｈｅｌｉｃａｓｅの比較を示す。ローマ数字は、ｈｅｌｉｃａｓｅのドメイン番号を示す。アスタリスクは配列間で一致する推定アミノ酸の位置を示す。
【図１０】トランスポゾン（配列番号１）に相同な配列のサザン法による解析結果を示す図である。図１０（Ａ）において、レーン１、２は野生型、レーン３は白色花変異体、レーン４は赤色花変異体、レーン５はＤＦＲ−Ｂ遺伝子の欠損変異体、レーン６は薄青色花変異体のそれぞれソライロアサガオの異なる品種を示す。図１０（Ｂ）は１個体の白色花変異体の次世代植物間での比較を示す。プローブ配列は、いずれもトランスポゾン（配列番号１）内のＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡＨｅｌｉｃａｓｅをコードする遺伝子領域の一部（ＩＶ）であり、ゲノムＤＮＡの消化にはＨｉｎｄＩＩＩを用いた。白抜きの三角で示したサイズのバンドには多型（バンドの有無）が見られ、配列番号１と同じか相同性の極めて高いトランスポゾンの挿入部位が、系統間、あるいは一つの系統でも個体間で異なることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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