(57)【要約】【課題】Ｓ／Ｎ比をよくするとともに、微量な測定対象物でも時間分解蛍光偏光解消法による測定を可能にする。【解決手段】パルスレーザー装置６からのパルス励起光が偏光板１０により特定の偏光方向をもつ直線偏光にされ、ダイクロイックミラー８から顕微鏡４を通してマイクロチップ２中の微小空間内にある１μＬ以下の試料に照射される。試料から発生した蛍光は、顕微鏡４を通ってダイクロイックミラー８を透過し、偏光板１０と同一の偏光方向に設定された検光子（偏光子）１２を通過した後、励起光成分を除去するカットオフフィルタ１４を経てストリークスコープ１６に導かれて検出される。データ処理装置は、ストリークスコープ１６で検出された検出信号のうち、蛍光発生から２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲の検出信号を使用して蛍光偏光解消を評価するようになっている。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の測定対象物を蛍光標識タンパク質と結合させ、その結合した前記測定対象物を前記試料中で時間分解蛍光偏光解消法による測定により分析する方法であって、
前記蛍光標識タンパク質の蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内の少なくとも一部で前記測定を行なうとともに、前記結合反応及び測定を前記試料の体積が１μＬ以下の状態で行なうことを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記時間分解蛍光偏光解消法による測定は、試料に特定の偏光方向の直線偏光の励起光を照射し、受光した蛍光のうち励起光の偏光方向と等しい偏光方向の直線偏光成分に基づいて行なう請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記時間分解蛍光偏光解消法による測定は、試料に特定の偏光方向の直線偏光の励起光を照射し、受光した蛍光のうち励起光の偏光方向と等しい偏光方向及びそれに直交する偏光方向のそれぞれの直線偏光成分に基づいて蛍光異方性を求めるものである請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記時間分解蛍光偏光解消法による測定は、励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後の経時変化を測定するものである請求項２又は３に記載の分析方法。
【請求項５】
前記試料は、免疫物質を産生する生体細胞と、その免疫物質を測定対象物として特異的に認識して結合する蛍光標識タンパク質とを含む請求項１から４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
前記蛍光剤はＲｕ錯体である請求項１から５のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
微小領域に試料が収容された試料容器を保持する試料保持部と、
パルス励起光を出力するパルス励起光源部と、
前記パルス励起光源部から出力された前記パルス励起光を特定の偏光方向をもつ直線偏光にする偏光手段と、
前記偏光手段により偏光方向が規定されたパルス励起光を前記試料保持部に保持された試料容器中の試料に照射する照射光学系と、
前記パルス励起光の照射により前記試料から発生した蛍光のうち少なくとも励起光の偏光方向と等しい偏光方向をもつ成分を受光する受光光学系と、
前記受光光学系により受光された蛍光を検出する検出手段と、
前記検出手段による検出信号のうち、前記パルス励起光による試料の励起開始後、２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲の検出信号に基づいて偏光解消を求める演算手段とを備えたことを特徴とする分析装置。
【請求項８】
前記受光光学系は受光した蛍光の直線偏光成分を取り出す偏光素子と、その偏光素子の偏光方向を回転させる回転機構を含む光学系を備え、
前記演算手段は検出されたそれぞれの直線偏光成分に基づいて蛍光異方性を求めるものである請求項７に記載の分析装置。
【請求項９】
前記受光光学系は受光した蛍光を励起光の偏光方向と等しい偏光方向及びそれに直交する偏光方向のそれぞれの直線偏光成分に分割する光学系を備え、
前記検出手段は前記受光光学系により分割されたそれぞれの直線偏光成分を検出するものであり、
前記演算手段は検出されたそれぞれの直線偏光成分に基づいて蛍光異方性を求めるものである請求項７に記載の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新作物、新農薬、機能性食品、医薬品などの開発分野において、生体試料の挙動を研究するのに使用される分析方法と装置に関し、特に試料中の測定対象物を蛍光標識タンパク質と結合させ、その結合した測定対象物を試料中で時間分解蛍光偏光解消法により測定する分析方法と装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
新作物、新農薬、機能性食品、医薬品などの開発分野において、高度な新製品を効率良く開発するために、物質が細胞に与える効果（例えば、遺伝子を導入した細胞が産生するタンパク質）を経時的に解析し、その効果が発現するメカニズムを捉えたいという要請がある。
【０００３】
従来、細胞の機能を解析する際には、効果を確認したい物質を導入した細胞を容器の中で数時間から数日の間培養し、その上清液を分離して分析することにより細胞の機能解析が行われていた。この場合、得られる情報は、培養時間中に細胞が産生した物質の総和であり、経時的な細胞の応答を解析することは困難であった。
【０００４】
経時的な細胞の応答を解析する方法の１つに蛍光偏光解消法がある（特許文献１参照。）。蛍光偏光解消法は蛍光プローブを使用し、励起光により励起された蛍光プローブから発生する蛍光の偏光性の解消により蛍光プローブで標識されたターゲットの運動性を知るものである。すなわち、ターゲットを標識している蛍光プローブが励起光により励起されて発生する蛍光の偏光性は、蛍光プローブで標識されたターゲットがブラウン運動により不規則な回転を行うことにより解消されていくことに基づいている。
【０００５】
蛍光偏光解消法は１９５０年代にＰｅｒｉｎによって理論化されたもので、溶液中や膜内に固定化された状態の蛍光剤の運動性を評価できることから、蛍光標識を施した生体分子の運動性の変化を観測することにより生体分子の微量検出に応用されている。蛍光偏光解消法は、蛍光プローブを検出系から分離することなく溶液中における対象分子の相互作用を解析できる特徴がある。
【０００６】
時間分解蛍光偏光解消法は、蛍光偏光解消法を定常光光源ではなくパルス光源で行うことで、蛍光剤の蛍光寿命を測定することができる。
また、蛍光偏光度を測定する方法において、蛍光プローブとして、蛍光寿命が１０ナノ秒から２００ナノ秒の間にある蛍光色素が示されている（特許文献２参照。）。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１０−１０４０７９号公報
【特許文献２】
特許第３２５５２９３号公報
【非特許文献１】
Ｔ．Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
Ｎｏ．１，  ｐｐ．１４３−１４４
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
刺激等により細胞が発現する物質を経時的に検出することを目的とした場合、蛍光偏光解消法は発現物質の濃度を測定することが原理的に可能であるが、測定したい蛍光以外に試料中の培地やレンズから発生する自家蛍光（背景光）がノイズとして含まれるため、これを除去しなければならない。
【０００９】
特許文献１には、自家蛍光の蛍光寿命より長い蛍光寿命を有する蛍光プローブを用い、自家蛍光が充分に減衰した時点で蛍光強度を測定することにより、蛍光プローブから発生した蛍光の強度のみを測定できることが記載されている。しかし、どのような蛍光プローブを用いると自家蛍光を除去できるのかについては、具体的に記載されていない。
【００１０】
仮に特許文献２に記載されているような蛍光プローブを使用したとしても、蛍光寿命が２００ナノ秒以下の蛍光プローブではノイズと目的の蛍光との分離が困難である。
【００１１】
測定対象物の一例として、細胞が産生する物質を挙げることができるが、細胞が産生する物質は極めて微量なため、試料を入れる容器の容積が大きいと、産生物質が不用意に薄められてしまうため、高感度な検出器を用いても検出が困難となる。特に時間分解蛍光偏光解消法では、定常光励起による蛍光偏光解消法に比べて蛍光強度が微弱になるので、測定に長時間を要することになり、経時的な測定となり得なくなってしまう。
【００１２】
そこで、本発明は、蛍光プローブとして適当な蛍光寿命をもつものを選択して測定対象物の蛍光をノイズから分離してＳ／Ｎ（信号対ノイズ）比をよくするとともに、微量な測定対象物でも時間分解蛍光偏光解消法による測定を可能にすることである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明の分析方法は、試料中の測定対象物を蛍光標識タンパク質と結合させ、その結合した前記測定対象物を前記試料中で時間分解蛍光偏光解消法による測定により分析する方法であって、蛍光標識タンパク質の蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命の少なくとも一部で時間分解蛍光偏光解消法による測定を行なうとともに、前記結合反応及び測定を前記試料の体積が１μＬ（マイクロリットル）以下の状態で行なうことを特徴とする。
【００１４】
自家蛍光の寿命は比較的短く、２００ナノ秒より短いことがわかった。そのため、本発明により、細胞の産生物質などの測定対象物と特異的に結合する蛍光標識タンパク質の蛍光剤の蛍光寿命を２００ナノ秒以上とし、時間分解法にて２００ナノ秒以上の領域の蛍光強度を測定対象とすることで、自家蛍光によるノイズを除去することができ、蛍光プローブを検出系から分離することなく溶液中における対象分子の相互作用を経時的に解析することができるようになる。
【００１５】
また、蛍光標識タンパク質の蛍光剤として蛍光寿命が２マイクロ秒より長いものを使用すると、測定時の繰返し周波数を２マイクロ秒以下の場合に可能な２００ｋＨｚに比べて半分以下にする必要があり、積算に時間を要することになるだけでなく、蛍光剤の発光強度が弱いものが多くなるため、適当ではない。
【００１６】
測定対象物と蛍光標識タンパク質との結合反応及び時間分解蛍光偏光解消法による測定を試料の体積が１μＬ以下の状態で行なうために、測定対象物を不用意に薄めることがなくなり、微量測定が可能となる。
【００１７】
この分析方法を実現する本発明の分析装置は、微小領域に試料が収容された試料容器を保持する試料保持部と、パルス励起光を出力するパルス励起光源部と、前記パルス励起光源部から出力された前記パルス励起光を特定の第１の偏光方向をもつ直線偏光にする偏光手段と、前記偏光手段により偏光方向が規定されたパルス励起光を前記試料保持部に保持された試料容器中の試料に照射する照射光学系と、前記パルス励起光の照射により前記試料から発生した蛍光のうち少なくとも前記第１の偏光方向をもつ成分を受光する受光光学系と、前記受光光学系により受光された蛍光を検出する検出手段と、前記検出手段による検出信号のうち、前記パルス励起光による試料の励起開始後、２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲の検出信号に基づいて偏光解消を求める演算手段とを備えている。
【００１８】
【発明の実施の形態】
蛍光偏光解消法による第１の測定方法は、試料に特定の偏光方向の直線偏光の励起光を照射し、受光した蛍光のうち励起光の偏光方向と等しい偏光方向の直線偏光成分に基づいて行なう方法である。
【００１９】
蛍光偏光解消法による第２の測定方法は、試料に特定の偏光方向の直線偏光の励起光を照射し、受光した蛍光のうち励起光の偏光方向と等しい偏光方向及びそれに直交する偏光方向のそれぞれの直線偏光成分に基づいて蛍光異方性ｒを求める方法である。蛍光異方性ｒは励起偏光と平行な成分と直交する成分との蛍光強度の差を全蛍光強度で除した値である。蛍光異方性ｒの時間変化関数ｒ（ｔ）と分子の回転運動を表す回転相関時間（θ）には以下に次に示すような関連があるため、蛍光標識タンパク質と結合した測定対象物の回転運動を読み取ることができる。ここで示したように、複数の回転運動成分が存在する場合でも、ｒ（ｔ）を多成分の指数関数で近似することで個々に評価することが可能となる。
【００２０】
2004279143.tif 000003
【００２１】
ここで、
ＩＶＶ：蛍光の縦偏光成分強度
ＩＶＨ：蛍光の横偏光成分強度
Ｄ：回転拡散係数
η：粘度
Ｖ：分子の体積
ｋ：ボルツマン定数
Ｔ：絶対温度（Ｋ）
Ｉ：個々の分子（あるいは結合部位）を表わし、上記の説明では回転運動成分
ａｉ：比例係数（存在割合の比）で、ａｉをすべて足すと１になる
【００２２】
第１の測定方法により検出される蛍光も、第２の測定方法により求められる蛍光異方性ｒも分子の回転運動により減衰していくが、励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後のそれらの値の変化は測定対象物量の増減を表わす。そこで、本発明の好ましい態様は、時間分解蛍光偏光解消法による測定を励起光の照射又は蛍光発生から一定時間後の測定値の経時変化として行なうものである。
【００２３】
測定対象物の一例は生体細胞が産生する免疫物質であり、その場合プローブに用いる蛍光標識タンパク質としてその免疫物質を特異的に認識して結合する蛍光標識タンパク質を用いる。したがって、その場合の試料は、培地にそのような生体細胞と蛍光標識タンパク質を含むものである。
【００２４】
蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にある蛍光剤としては、Ｒｕ（ルテニウム）錯体をあげることができる。Ｒｕ錯体は別の目的で合成されたものである（非特許文献１参照。）が、本発明の目的の蛍光材として使用することができる。Ｒｕ錯体としては、［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］Ｃｌ２（ｔｒｉｓ−１，１０−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ  ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）などを挙げることができる。
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］Ｃｌ２をタンパク質にラベルする際には、例えば
［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）２（ｐｈｅｎ−ＮＨＣＯ（ＣＨ）２ＣＯＯＨ）］（ＰＦ６）２（ｂｉｓ−（１，１０−Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ），（Ｎ−（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｙｌ）−ｓｕｃｃｉｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）ｄｉｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）という化合物にして用いる。
【００２５】
測定対象物と蛍光標識タンパク質との結合反応及び時間分解蛍光偏光解消法による測定を試料の体積が１μＬ以下の状態で行なうようにするために、試料の体積が１μＬ以下となるように形成されたマイクロチップを試料容器に使用することができる。例えば石英ガラスを用いたそのようなマイクロチップ中の微小空間で試料溶液中の細胞を培養し、刺激等を行い、そのマイクロチップに細胞を収容したままで時間分解蛍光偏光解消法を適用して測定することができる。
【００２６】
そのようなマイクロチップに関しては、近年、μＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＯＣ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ）と称される、マイクロマシニング技術を利用してガラスやシリコンの基板上に化学分析や化学合成の機能を集積しチップ化する研究が盛んに行われており、容易に入手することができる。μＴＡＳやＬＯＣは、主として分析装置の超小型化や微小空間での化学反応が研究の対象であるが、最近は細胞操作に関する研究が注目されつつある。いずれも共通の特徴として、１）使用する試薬や試料の大幅な低減、２）分析や反応の高速化（短時間化）、３）並列処理による分析や合成操作件数のハイスループット化、４）機能の集積による高機能化・自動化・省力化、５）システム全体の小型化などがあり、様々な分野で将来の新市場を形成するものと期待されている。
【００２７】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
本発明の分析装置の一実施例を図１に示す。
試料が収容された試料容器として、１μＬ以下の試料を収容するマイクロチップ２を使用する。マイクロチップ２は顕微鏡４の試料保持台に保持する。パルス励起光を出力するパルス励起光源部としてパルスレーザー装置６が設けられており、パルスレーザー装置６からのパルス励起光をマイクロチップ２の試料に照射するために、励起光波長の光を反射し、試料からの蛍光を透過させるダイクロイックミラー８が設けられている。パルスレーザー装置６から出力されたパルス励起光を特定の偏光方向、例えば縦方向の偏光方向をもつ直線偏光にする偏光手段として偏光板１０が、パルスレーザー装置６とダイクロイックミラー８の間の光路上に配置されている。これにより、偏光板１０により偏光方向が規定されたパルス励起光が顕微鏡４を通してマイクロチップ２中の微小空間内にある試料に照射される。ダイクロイックミラー８と顕微鏡４は照射光学系を構成している。
【００２８】
パルス励起光の照射により試料から発生した蛍光は、顕微鏡４を通ってダイクロイックミラー８を透過し、偏光板１０と同一の偏光方向に設定された検光子（偏光素子）１２を通過した後、励起光成分を除去するカットオフフィルタ１４を経て検出手段のストリークスコープ１６に導かれて検出される。顕微鏡４、検光子１２及びカットオフフィルタ１４は受光光学系を構成している。
【００２９】
演算手段（図示略）は、ストリークスコープ１６で検出された検出信号のうち、蛍光発生から２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲の検出信号を使用して蛍光偏光解消を評価するようになっている。演算手段はデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
【００３０】
検出に用いるストリークスコープ１６は、検出すべき光量が少ない場合には、フォトンカウンティングモードで高感度な検出が可能であり、光量が多い場合にはアナログ計測により高速の検出ができるという特徴をもっている。しかし、ストリークスコープ１６に替えて、ＴＡＣ（時間―電圧変換器）法を用いたＴＣＳＰＣ（時間相関単一格子計数法）方式の検出器を用いてよい。
【００３１】
検光子１２を偏光板１０と同方向に設置した場合に、ＩＶＶすなわち蛍光の縦偏光成分強度が得られ、検光子１２を偏光板１０と直交する方向に設置した場合にはＩＶＨすなわち蛍光の横偏光成分強度が得られる。そこで、他の実施例として、受光光学系に検光子１２を回転させる回転機構を設けることができる。検光子１２を回転させることによりＩＶＶとＩＶＨを得ることができる。検光子１２の回転は手動と自動のどちらでもよい。
【００３２】
さらに他の実施例として、検光子を用いずに、入射光の縦偏光と横偏光を分離することのできる偏光ビームスプリッターを受光光学系に設け、その偏光ビームスプリッターを使用して蛍光の縦偏光成分と横偏光成分を検出器に導いてＩＶＶとＩＶＨを同時に検出するようにしてもよい。この場合にはストリークスコープ等の検出器が２個必要となる。
得られたＩＶＶ、ＩＶＨを演算手段で演算することで蛍光異方性を求めることができる。この演算手段もデータ処理装置の機能に含ませることもできる。
【００３３】
培養液中やレンズ等に含まれる蛍光物質のノイズ成分を除去する目的と時間分解蛍光偏向解消法を行うために、本発明では蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒である蛍光剤を使用する。そのため、一実施例では、Ｒｕ錯体である［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］Ｃｌ２を用いる。この蛍光剤の蛍光寿命は、１３００〜１４００ｎｓｅｃであり、ノイズ成分の除去はもちろん、かなり遅い運動（偏光解消）も測定可能であるため、計測できる用途が広い。比較のために示すと、一般に良く用いられるフルオレセインの蛍光寿命は４ｎｓｅｃである。
【００３４】
この実施例において使用したマイクロチップ２の一例を図２に示す。（Ａ）は平面図、（Ｂ）はその流路に沿った断面図である。
マイクロチップ２は３枚のガラス基板２０，２２，２４が接合されて構成されている。ガラス基板２０は厚みが１．０ｍｍの石英ガラス、ガラス基板２２は厚みが０．５ｍｍの石英ガラス、ガラス基板２４は厚みが０．１７ｍｍのカバーガラスである。カバーガラスの材質は限定されないが、石英、ＢＫ−７、パイレックス（登録商標）など、自家蛍光の少ないものが望ましい。
【００３５】
ガラス基板２０の片面には、数百μｍ以下の幅と深さを持つ微小な流路溝２６と、流路溝２６の両端部に位置する試料導入（Ｉｎｌｅｔ）及び排出（Ｏｕｔｌｅｔ）のための貫通穴２８，３０が形成されている。ガラス基板２２には流路溝２６の中央部に該当する位置に直径が１ｍｍの細胞培養室用の貫通穴３２があけられている。ガラス基板２４は加工を施していない平坦な板である。
【００３６】
ガラス基板２０の流路溝２６が形成されている面とガラス基板２２の片面とを向かい合わせて密着させ、さらにガラス基板２２の裏面にガラス基板２４を密着させた状態で、それぞれのガラス基板間を例えばフッ酸溶液による接合などの手段で液密に接合することにより、このマイクロチップ２が構成されている。
マイクロチップ２中の培養室３２の形状は直径１ｍｍ、深さが０．５ｍｍで、容量は約０．４μＬである。
【００３７】
次に、この実施例により測定した結果を示す。
まず、時間分解測定により自家蛍光ノイズが除去できることを図３により説明する。図３のデータは、培養室に培地（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファ液（ｐＨ７．５））のみを導入した場合と、その培地に濃度１０μＭのＲｕ錯体（［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］Ｃｌ２）蛍光プローブを加えた場合について、波長４１０ｎｍで励起し、検出器側に５００ｎｍ以下をカットするフィルターを設け、中心波長５８３ｎｍで蛍光を検出し、繰返し周波数２００ｋＨｚ、積算時間６００秒でそれぞれの蛍光寿命を測定し比較したものである。横軸は時間、縦軸はストリークスコープのフォトンカウンティングモードで測定したカウント値である。
【００３８】
図３から分かるように、培地等の自家蛍光の寿命は２００ナノ秒以下であり、蛍光発光開始から２００ナノ秒以降の測定結果に着目することでノイズの除去が可能である。
【００３９】
次に、細胞の産生する物質を経時的に捉えた例として、マイクロチップ中において細胞（ハイブリドーマ）により産生されるＩｇＧ抗体を、Ｒｕ錯体（［Ｒｕ（ｐｈｅｎ）３］Ｃｌ２）と結合したプロテインＡ（抗体［ＩｇＧ］を特異的に認識し結合する）を蛍光標識タンパク質（蛍光プローブ）に用いて検出を試みた結果を図４に示す。これは、ハイブリドーマをマイクロチップ２の培養室３２に導入し、マイクロチップ２の試料導入口２８から培地を水頭差により導入して交換した時を時間ゼロとして、そのゼロ時の状態と、４時間後の状態とで蛍光異方性の時間変化関数を比べたものである。
【００４０】
この結果によれば、時間ゼロ時にはほぼゼロであった蛍光異方性が、４時間後には初期値が０．１程度にまで増加していることわかる。これは、プロテインＡにＩｇＧが結合したために分子量が増えて分子の回転が遅くなり、蛍光異方性が増加したことを示しており、本発明により細胞の産生する物質を経時的に捉えることができることを示している。
【００４１】
細胞からの発現物質を経時的に解析するための実施例のマイクロチップ及び測定装置は、細胞の直接観察が可能な構成であるため、細胞そのものを経時的に解析する装置としても応用可能である。例えば、ＤＮＡウイルスワクチンなどの遺伝子を導入することにより細胞表面に出現する抗原をリアルタイムで検出したり、物質導入による細胞の形態変化の様子をリアルタイムで観察することができる。さらには、細胞内に蓄積される物質のリアルタイム検出などにも応用可能であり、細胞の機能解析分野において様々な用途に利用されるものと期待できる。
【００４２】
【発明の効果】
本発明では、時間分解蛍光偏光解消法による測定において、蛍光プローブの蛍光剤として蛍光寿命が２００ナノ秒から２マイクロ秒の範囲にあるものを使用してその蛍光寿命内の少なくとも一部で測定を行なうとともに、反応及び測定を試料の体積が１μＬ以下の状態で行なうようにしたので、自家蛍光によるノイズを除去することができ、測定対象物を不用意に薄めることがなくなり、微量測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一実施例の分析装置を示す概略構成図である。
【図２】同実施例において使用したマイクロチップの一例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）はその流路に沿った断面図である。
【図３】時間分解測定により求められた培地とＲｕ錯体のそれぞれの蛍光を示すグラフである。
【図４】細胞（ハイブリドーマ）により産生されるＩｇＧ抗体による蛍光異方性を示すグラフである。
【符号の説明】
２      マイクロチップ
４      顕微鏡
６      パルスレーザー装置
８      ダイクロイックミラー
１０      偏光板
１２      検光子
１６      ストリークスコープ
【図１】
2004279143.tif 000004
【図２】
2004279143.tif 000005
【図３】
2004279143.tif 000006
【図４】
2004279143.tif 000007