(57)【要約】【課題】ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の特定の多型を利用した、核酸試料の遺伝子型を検出する方法を提供する。【解決手段】以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、（ａ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析する工程、及び（ｂ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
（ａ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析する工程、及び
（ｂ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析する工程。
【請求項２】
以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる、統合失調症のリスク診断方法、
（ｉ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型、及び５０８−３６位の多型を解析する工程、
（ｉｉ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
（ｉｉｉ）決定された遺伝子型から統合失調症の遺伝的リスクを求める工程。
【請求項３】
以下の（１）及び（２）の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析するための核酸、及び
（２）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析するための核酸。
【請求項４】
以下の（１）及び（２）の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
（１）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析するための核酸、及び
（２）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析するための核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、統合失調症に関連するヒトセロトニン５−ＨＴ４遺伝子の多型に関する。詳しくはヒトセロトニン５−ＨＴ４遺伝子において特定の多型を利用した遺伝子型の検出方法、該方法に利用されるキット等に関する。統合失調症の遺伝的リスクを診断することに本発明を利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
セロトニン５−ＨＴ４受容体（５−ＨＴ４）は、統合失調症（非特許文献３〜５を参照）の中心的障害の一つであろうと重要視されている認知機能（非特許文献１、２を参照）に関連する。更に、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子（ＨＴＲ４）が位置する染色体の５ｑ３３．２座位（非特許文献６を参照）は連鎖解析によって統合失調症の疾患易罹患性座位であることが示されている。
【０００３】
疾患易罹患性に関与する候補遺伝子を選択する際に重要な観点は、疾患の病態生理学的仮説と、連鎖解析で疾患易罹患性との関連が示された座位であることの両方である。この観点からみて、以下に示すように、ＨＴＲ４は統合失調症と関連する重要な候補遺伝子の一つである。
認知機能を調整する分子メカニズムは、統合失調症における病態生理学の重要な調節機構であろう。なぜなら、認知機能はこの疾患の基本的な障害であると見なされてきたからである（非特許文献３〜５を参照）。以下の理由から、５−ＨＴ４受容体は認知機能と関係する神経伝達物質の受容体であると一般的に信じられている（非特許文献１、２を参照）。一番目の理由は、５−ＨＴ４活性化によって引き起こされるｃＡＭＰの増加が、海馬におけるｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ（ＬＴＰ）の重要な調節をしていることである。ＬＴＰは学習や記憶を司る基本的な細胞メカニズムである（非特許文献９を参照）。５−ＨＴ４アゴニストであるＳＣ５３１１６によって誘導されたＬＴＰフォーメーションの活性化は、スコポラミンと同様に、選択的５−ＨＴ４アンタゴニストであるＧＲ１１３８０８によって阻害される（非特許文献１０を参照）。二番目の理由は、ラットの行動実験からの知見による。つまり、５−ＨＴ４アゴニストとアンタゴニストは短期記憶や長期記憶に関連する認知の過程を調整する（非特許文献１１を参照）。それ故、これらの研究から、統合失調症の病態生理において重要な役割を担うであろう学習や記憶といった認知の過程が５−ＨＴ４の活性化によって調整されることが示唆される。
【０００４】
統合失調症の易罹患性座位という観点からみると、ＨＴＲ４（５ｑ３１−５ｑ３３）が位置する５ｑ３３．２が統合失調症の易罹患性座位であることは、多くの研究で行われたゲノムワイド（ｇｅｎｏｍｅ  ｗｉｄｅ）な連鎖解析によって確認されている（非特許文献６、１２、１３を参照）。それ故ＨＴＲ４はこの疾患の認知障害仮説のみではなく、染色体の座位による候補解析にも基づいた、有力な統合失調症易罹患性の候補遺伝子である。
【０００５】
更に、遺伝子多型を検索する為にはＨＴＲ４の特徴にも注意を払わないといけない。すなわち、ＨＴＲ４の全長は１３０ｋｂ以上有り、５つのエクソンと９つのスプライスバリアント（５−ＨＴ４（ａ）、５−ＨＴ４（ｂ）、５−ＨＴ４（ｃ）、５−ＨＴ４（ｄ）、５−ＨＴ４（ｈ）、５−ＨＴ４（ｇｅｆ）、５−ＨＴ４（ｎ）、図６を参照）から構成される（非特許文献１４〜１７を参照）。これらの多型は脳内の各部位でｍＲＮＡ発現レベルが違っており、かつ、異なった薬理学的特徴を持つ。とりわけ、海馬、視床、及び小脳においては個人毎に異なったスプライスバリアントが様々な発現レベルで存在することが報告されている（非特許文献１７、１８を参照）。これらの領域は認知機能に重要な領域である。Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃＡＭＰテストでは、スプライスバリアント毎に異なった薬理作用であることが認められており、それ故、個人毎に異なるスプライスバリアントの発現パターンの違いは認知機能の多様性を反映しているのかもしれない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｂｕｈｏｔ  ＭＣ  （１９９７）  Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ７：２４３−５４
【非特許文献２】
Ｂｕｈｏｔ  ＭＣ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｓ，  Ｓｅｇｕ  Ｌ  （２０００）  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｉｎ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．  Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ３２：２１０−２１
【非特許文献３】
Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ＮＣ，  Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＤＳ，  Ｃｉｚａｄｌｏ  Ｔ，  Ａｒｎｄｔ  Ｓ，  Ｒｅｚａｉ  Ｋ，  Ｐｏｎｔｏ  ＬＬ，  Ｗａｔｋｉｎｓ  ＧＬ，  Ｈｉｃｈｗａ  ＲＤ  （１９９６）  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｙｓｍｅｔｒｉａ：  ａ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ−ｔｈａｌａｍｉｃ−ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：９９８５−９０
【非特許文献４】
Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ＮＣ，  Ｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｐ，  Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＤＳ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＤ，  Ｗａｓｓｉｎｋ  Ｔ，  Ｆｌａｕｍ  Ｍ  （１９９９）  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ：  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｙｓｍｅｔｒｉａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｎｅｕｒａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ４６：９０８−２０
【非特許文献５】
Ｅｌｖｅｖａｇ  Ｂ，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＴＥ  （２０００）  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｉｓｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  １４：１−２１
【非特許文献６】
Ｇｕｒｌｉｎｇ  ＨＭ，  Ｋａｌｓｉ  Ｇ，  Ｂｒｙｎｊｏｌｆｓｏｎ  Ｊ，  Ｓｉｇｍｕｎｄｓｓｏｎ  Ｔ，  Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ｒ，  Ｍａｎｋｏｏ  ＢＳ，  Ｒｅａｄ  Ｔ，  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｐ，  Ｂｌａｖｅｒｉ  Ｅ，  ＭｃＱｕｉｌｌｉｎ  Ａ，  Ｐｅｔｕｒｓｓｏｎ  Ｈ，  Ｃｕｒｔｉｓ  Ｄ  （２００１）  Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｃｏｎｆｉｒｍｓ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｉ  ｆｏｒ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ，  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  １ｑ３２．２，  ５ｑ３３．２，  ａｎｄ  ８ｐ２１−２２  ａｎｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｏ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ，  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  １１ｑ２３．３−２４  ａｎｄ  ２０ｑ１２．１−１１．２３．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８：６６１−７３
【非特許文献７】
Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＪＩ，  Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ  ＭＮ，  Ｏｅｆｎｅｒ  ＰＪ  （２０００）  Ｈｉｇｈ−ａｃｃｕｒａｃｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｂｙ  ＤＨＰＬＣ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１０８４−９０，  １０９２
【非特許文献８】
Ｏｔｍａｋｈｏｖａ  ＮＡ，  Ｏｔｍａｋｈｏｖ  Ｎ，  Ｍｏｒｔｅｎｓｏｎ  ＬＨ，  Ｌｉｓｍａｎ  ＪＥ  （２０００）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆｔｈｅ  ｃＡＭＰ  ｐａｔｈｗａｙ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｅａｒｌｙ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｔ  ＣＡ１  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｙｎａｐｓｅｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０：４４４６−５１
【非特許文献９】
Ｂｌｉｓｓ  ＴＶ，  Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ  ＧＬ  （１９９３）  Ａ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ：  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：３１−９
【非特許文献１０】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｔｏｇａｓｈｉ  Ｈ，  Ｍｏｒｉ  Ｋ，  Ｕｅｎｏ  Ｋ，  Ｏｈａｓｈｉ  Ｓ，  Ｋｏｊｉｍａ  Ｔ，  Ｙｏｓｈｉｏｋａ  Ｍ（２００１）  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ５−ＨＴ（４）  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ：  ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ，  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２９６：６７６−８２
【非特許文献１１】
Ｌｅｔｔｙ  Ｓ，  Ｃｈｉｌｄ  Ｒ，  Ｄｕｍｕｉｓ  Ａ，  Ｐａｎｔａｌｏｎｉ  Ａ，  Ｂｏｃｋａｅｒｔ  Ｊ，  Ｒｏｎｄｏｕｉｎ  Ｇ  （１９９７）５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｓｏｃｉａｌ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ３６：６８１−７
【非特許文献１２】
Ｋｅｎｄｌｅｒ  ＫＳ，  Ｍｙｅｒｓ  ＪＭ，  Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ＦＡ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｒ，  Ｍｕｒｐｈｙ  Ｂ，  ＭａｃＬｅａｎ  ＣＪ，  Ｗａｌｓｈ  Ｄ，  Ｓｔｒａｕｂ  ＲＥ  （２０００）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５ｑ，  ６ｐ，  ８ｐ，  ａｎｄ  １０ｐ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｒｉｓｈ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １５７：４０２−８
【非特許文献１３】
Ｌｅｖｉｎｓｏｎ  ＤＦ，  Ｈｏｌｍａｎｓ  Ｐ，  Ｓｔｒａｕｂ  ＲＥ，  Ｏｗｅｎ  ＭＪ，  Ｗｉｌｄｅｎａｕｅｒ  ＤＢ，  Ｇｅｊｍａｎ  ＰＶ，  Ｐｕｌｖｅｒ  ＡＥ，  Ｌａｕｒｅｎｔ  Ｃ，  Ｋｅｎｄｌｅｒ  ＫＳ，  Ｗａｌｓｈ  Ｄ，  Ｎｏｒｔｏｎ  Ｎ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＮＭ，  ＳｃｈｗａｂＳＧ，  Ｌｅｒｅｒ  Ｂ，  Ｍｏｗｒｙ  ＢＪ，  Ｓａｎｄｅｒｓ  ＡＲ，  Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ  ＳＥ，  Ｂｌｏｕｉｎ  ＪＬ，  ＤｅＬｅｕｚｅ  ＪＦ，  Ｍａｌｌｅｔ  Ｊ  （２０００）  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ５ｑ，  ６ｑ，  １０ｐ，  ａｎｄ  １３ｑ：  ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐ  ＩＩＩ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６７：６５２−６３
【非特許文献１４】
Ｂｌｏｎｄｅｌ  Ｏ，  Ｇａｓｔｉｎｅａｕ  Ｍ，  Ｄａｈｍｏｕｎｅ  Ｙ，  Ｌａｎｇｌｏｉｓ  Ｍ，  Ｆｉｓｃｈｍｅｉｓｔｅｒ  Ｒ  （１９９８）  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｈｕｍａｎ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ  ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｔｅｒｍｉｎｕｓ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７０：２２５２−６１
【非特許文献１５】
Ｂｅｎｄｅｒ  Ｅ，  Ｐｉｎｄｏｎ  Ａ，  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  Ｉ，  Ｚｈａｎｇ  ＹＢ，  Ｇｏｍｍｅｒｅｎ  Ｗ，  Ｖｅｒｈａｓｓｅｌｔ  Ｐ，  Ｊｕｒｚａｋ  Ｍ，  Ｌｅｙｓｅｎ  Ｊ，  Ｌｕｙｔｅｎ  Ｗ  （２０００）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ５−ＨＴ４ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ５−ＨＴ４  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ７４：４７８−８９
【非特許文献１６】
Ｃｌａｅｙｓｅｎ  Ｓ，  Ｓｅｂｂｅｎ  Ｍ，  Ｂｅｃａｍｅｌ  Ｃ，  Ｂｏｃｋａｅｒｔ  Ｊ，  Ｄｕｍｕｉｓ  Ａ  （１９９９）  Ｎｏｖｅｌ  ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｓｈｏｗ  ｍａｒｋｅｄ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５５：９１０−２０
【非特許文献１７】
Ｖｉｌａｒｏ  ＭＴ，  Ｄｏｍｅｎｅｃｈ  Ｔ，  Ｐａｌａｃｉｏｓ  ＪＭ，  Ｍｅｎｇｏｄ  Ｇ  （２００２）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ｔｈａｔ  ｌａｃｋｓ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｃａｒｂｏｘｙ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｘｏｎ．  ＲＴ−ＰＣＲ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ．  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４２：６０−７３
【非特許文献１８】
Ｍｅｄｈｕｒｓｔ  ＡＤ，  Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ  Ｆ，  Ｆｉｓｃｈｍｅｉｓｔｅｒ  Ｒ，  Ｍｉｄｄｌｅｍｉｓｓ  ＤＮ，  Ｓａｎｇｅｒ  ＧＪ  （２００１）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ＴａｑＭａｎ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅＲＴ−ＰＣＲ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ９０：１２５−３４
【非特許文献１９】
Ｈｏｏｇｅｎｄｏｏｒｎ  Ｂ，  Ｏｗｅｎ  ＭＪ，  Ｏｅｆｎｅｒ  ＰＪ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｎ，  Ａｕｓｔｉｎ  Ｊ，  Ｏ’Ｄｏｎｏｖａｎ  ＭＣ  （１９９９）  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １０４：８９−９３
【非特許文献２０】
Ｋｒｕｇｌｙａｋ  Ｌ  （１９９９）  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２２：１３９−４４
【非特許文献２１】
Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｙ，  Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｋａｎｅｋｏ  Ｈ，  Ｍｏｒｉｓａｋｉ  Ｈ，  Ｍｏｒｉｓａｋｉ  Ｔ，  Ｔｏｙａｍａ  Ｋ，  Ｋａｍａｔａｎｉ  Ｎ  （２００２）  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  （ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）  ｆｏｒ  ｅａｃｈ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＥＭ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．  Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６６：１８３−９３
【非特許文献２２】
Ｈａｌｉａｓｓｏｓ  Ａ，  Ｃｈｏｍｅｌ  ＪＣ，  Ｔｅｓｓｏｎ  Ｌ，  Ｂａｕｄｉｓ  Ｍ，  Ｋｒｕｈ  Ｊ，  Ｋａｐｌａｎ  ＪＣ，  Ｋｉｔｚｉｓ  Ａ  （１９８９）  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：３６０６
【非特許文献２３】
Ｗｅｉｒ  ＢＳ  （１９９６）  Ｇｅｎｅｉｃ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ＩＩ．  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ
【非特許文献２４】
Ｓｈａｍ  ＰＣ，  Ｃｕｒｔｉｓ  Ｄ  （１９９５）  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｌｏｃｉ．  Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５９  （  Ｐｔ  １）：９７−１０５
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
これまでの研究成果によって、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子と統合失調症との間には何らかの関係があることが示されているものの、当該遺伝子の多型と統合失調症の遺伝的（発症）リスクとの間の関連性については明確にされていない。
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであって、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の特定の多型を利用した検出方法、及び検出用キット等を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは以上の目的を達成すべく、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子のコード領域と選択的スプライシングに影響するイントロン領域のブランチサイトの多型検索を行った。まず、ＤＨＰＬＣ  （非特許文献７を参照）を用いた解析により、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子内にアミノ酸置換を伴わない１つのサイレントミューテーションとイントロン領域の６つのＳＮＰを確認した。続いてこれらのＳＮＰと統合失調症との関連を調べるために関連解析及びハプロタイプ解析を行った。関連解析の結果、２つのＳＮＰが連鎖不平衡にあることが判明した。そこでこれら２つのＳＮＰを用いてハプロタイプ解析を行ったところ、統合失調症の患者において特定のハプロタイプが正常対照者よりも有意に減少していることが認められた。即ち、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子内の２つの多型が統合失調症に強く関連することが明らかとなった。このことから、これらの多型を解析することが統合失調症の遺伝的罹患リスクの把握、統合失調症の判定、治療法の選択などに有用な手段になると考えられた。本発明はかかる知見に基づき完成されたものであり、次の構成を提供する。
［１］以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、核酸試料の遺伝子型を検出する方法、
（ａ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析する工程、及び
（ｂ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析する工程。
［２］以下の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる、統合失調症のリスク診断方法、
（ｉ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型、及び５０８−３６位の多型を解析する工程、
（ｉｉ）前記工程によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び
（ｉｉｉ）決定された遺伝子型から統合失調症の遺伝的リスクを求める工程。
［３］以下の（１）及び（２）の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析するための核酸、及び
（２）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析するための核酸。
［４］以下の（１）及び（２）の核酸が不溶性支持体に固定されてなる固定化核酸、
（１）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型を解析するための核酸、及び
（２）ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型を解析するための核酸。
【０００９】
尚、本明細書においてはヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体を略称して「５−ＨＴ４」、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子を略称して「ＨＴＲ４」とも呼ぶ。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の第１の局面は核酸試料の遺伝子型を検出する方法に関し、（ａ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の３５３＋６位の多型（以下、「３５３＋６位多型」ともいう）を解析する工程、及び（ｂ）核酸試料における、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子の５０８−３６位の多型（以下、「５０８−３６位多型」ともいう）を解析する工程を含んで構成される。尚、以上の工程の結果得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定することにより統合失調症の遺伝的リスクを求めることができる。
各多型の位置は、エクソン領域内に存在する場合には、転写開始点を１番としてエクソン領域の通し番号で表し、イントロン領域内に存在する場合には、エクソン領域内に位置し且つ当該多型位置に最も近い塩基を基準とし、当該塩基からの位置によって表す。具体的には、まず基準となるエクソン領域内の塩基の番号を記載し、当該塩基よりも下流（３’側）に位置するのであれば基準塩基から数えた番号をプラス表示し、上流（５’側）に位置するのであれば同様にマイナス表示する。例えば、３５３＋６であれば、転写開始点を１番としてエクソン領域の通し番号で３５３番目に位置する塩基から下流方向に数えて６番目の塩基位置を意味し、５０８−３６であれば、転写開始点を１番としてエクソン領域の通し番号で５０８番目に位置する塩基から上流方向に数えて３６番目の塩基位置を意味する。また、後述の実施例におけるｖａｒｉａｎｔ  ｄ−２５は、スプライスバリアント５−ＨＴ４（ｄ）のエクソンｄ（Ｂｅｎｄｅｒ，Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ５−ＨＴ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ５−ＨＴ４  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，  ２０００．  ７４（２）：  ｐ．４７８−８９．）から上流方向に数えて２５番目にある塩基位置を表す。
尚、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）に登録されているヒト第５染色体の配列（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＴ＿００６８５９、ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＴ＿００６８５９．１０  ＧＩ：２２０５２７６０、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ５  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｎｔｉｇ．）において９６４４８２番、ｒｓ２２７８３９２番塩基がＨＴＲ４の３５３＋６位の塩基に相当し、同様にＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＴ＿００６８５９の９２５８８０番、ｒｓ３７３４１１９番の塩基がＨＴＲ４の５０８−３６位の塩基に相当する。
一方、Ｇ＞Ａのような表記は、当該塩基位置の多型がＧ（グアニン）又はＡ（アデニン）である二つの遺伝子型からなり、且つＧである多型の方が頻度が高いことを意味する。
３５３＋６Ｇ＞Ａは、第３エクソンにある３５３位の塩基から下流方向に数えて６番目にあるイントロン領域の塩基がＧもしくはＡであることを意味する。５０８−３６Ｔ＞Ｃは、第５エクソンにある５０８位の塩基から上流方向に数えて３６番目にあるイントロン領域の塩基がＴもしくはＣであることを示している。
【００１１】
本発明において「多型を解析する」とは、解析対象の多型について核酸試料がどのような遺伝子型を有するかを調べることを意味し、多型が存在する位置の塩基（塩基配列）を調べることと同義である。典型的には、３５３＋６位多型の解析を例に採れば核酸試料における当該多型部分の遺伝子型がＧＧ（３５３＋６位塩基が両アレル共にＧのホモ接合体）、ＧＡ（３５３＋６位塩基がＧのアレルとＡのアレルとのヘテロ接合体）、及びＡＡ（３５３＋６位塩基が両アレル共にＡのホモ接合体）の中のいずれであるかを調べることを意味する。
【００１２】
各多型を解析する方法は特に限定されるものではなく例えば、アレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、ＰＣＲ法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって解析する方法や、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を利用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限酵素断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：単鎖高次構造多型）法（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８６，  ２７６６−２７７０（１９８９）等）、ＰＣＲ−ＳＳＯ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：特異的配列オリゴヌクレオチド）法、ＰＣＲ−ＳＳＯ法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたＡＳＯ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：アレル特異的オリゴヌクレオチド）ハイブリダイゼーション法（Ｓａｉｋｉ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２４，  １６３−１６６（１９８６）等）、又はＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法（Ｌｉｖａｋ，  ＫＪ，  Ｇｅｎｅｔ  Ａｎａｌ，１４，１４３（１９９９），Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４，２９３３（１９９６））、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７，２９２（１９９９））、プライマー伸長法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ）法（Ｈａｆｆ  ＬＡ，  Ｓｍｉｒｎｏｖ  ＩＰ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７，３７８（１９９７））、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｙｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（Ｌｉｚａｒｄｉ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９，２２５（１９９８））、ＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法（Ｗａｎｇ  ＤＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，１０７７（１９９８）等）、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ９８，  ５０３−５１７（１９７５））等、公知の方法を採用できる。さらに、解析対象の多型部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。尚、これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。
【００１３】
核酸試料が少量の場合には検出感度ないし精度の面から遺伝子増幅反応を伴う方法により解析することが好ましい。このような方法としては例えば、ＰＣＲ法を利用した方法（例えばＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）を挙げることができる。ＰＣＲ法又はＰＣＲ法を応用した方法などの遺伝子増幅法により核酸試料を予め増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。
一方、多数の核酸試料を解析する場合には、アレル特異的ＰＣＲ法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、プライマー伸長法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ）法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｙｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、又はＤＮＡチップ又はマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で解析することが可能な解析方法を用いることが特に好ましい。
【００１４】
以上の方法では各方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸（本発明において、「多型解析用核酸」ともいう）が使用される。多型解析用核酸は、それが使用される解析方法（上述したアレル特異的核酸等を用いたＰＣＲ法を利用する方法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等）において、解析対象の多型部分を含むＤＮＡ領域又はそれに対応するｍＲＮＡを特異的に増幅できるもの（プライマー）又は特異的に検出できるもの（プローブ）として設計される。
【００１５】
ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を実行するための核酸の場合には例えば、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素処理した場合に遺伝子型が識別されるように、特定の多型を有する場合に当該多型部分において特定の制限酵素部位が形成されるように設計される。このような多型解析用核酸の例としては、後述の実施例で使用される次のプライマーセットを挙げることができる。
（３５３＋６位多型解析用）
順方向プライマー
５’−ＴＣＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡＡ−３’：配列番号１
逆方向プライマー
５’−ＣＣＧＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＣＧＧＴ−３’：配列番号２
（５０８−３６位多型解析用）
順方向プライマー
５’−ＣＡＴＧＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＴＧＣＴ−３’：配列番号３
逆方向プライマー
５’−ＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＡＧＴ−３’：配列番号４
【００１６】
以上の核酸プライマーは単なる一例であって、目的の増幅反応を支障なく行える限度において一部の塩基配列に改変が施されたものであってもよい。ここでの「一部の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／又は付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば１〜７個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは、１〜３個である。尚、このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行われる。
【００１７】
多型解析用核酸の他の例としては、ＨＴＲ４において解析対象の多型部位を含む一定領域（部分ＤＮＡ領域）に相補的な配列を有する核酸を挙げることができる。このような核酸としては、例えば、３５３＋６位多型が解析対象の場合には３５３＋６位の塩基がＧ（グアニン）であるＨＴＲ４の当該３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は３５３＋６位の塩基がＡ（アデニン）であるＨＴＲ４の当該３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸が該当する。
【００１８】
多型解析用核酸の他の具体例としては、解析対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ当該多型部位を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には解析対象の多型部位を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む部分ＤＮＡ領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。このような核酸セットとしては３５３＋６位多型が解析対象の場合には、ＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、３５３＋６位塩基がＧ（グアニン）であるＨＴＲ４のアンチセンス鎖において３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セット、又は３５３＋６位塩基がＡ（アデニン）であるＨＴＲ４のアンチセンス鎖において３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットが該当する。ここで、増幅される部分ＤＮＡ領域の長さはその検出に適した範囲で適宜設定され例えば５０ｂｐ〜２００ｂｐ、好ましくは８０ｂｐ〜１５０ｂｐである。
【００１９】
多型解析用核酸（プローブ、プライマー）には解析方法に応じて適宜ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が用いられる。多型解析用核酸の塩基長はそれぞれの機能が発揮される長さであればよく、プライマーとして用いられる場合の塩基長の例としては１０〜５０ｂｐ程度、好ましくは１５〜４０ｂｐ程度、更に好ましくは１５〜３０ｂｐ程度である。尚、プライマーとして用いられる場合には増幅対象に特異的にハイブリダイズし、目的のＤＮＡフラグメントを増幅することができる限り鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。プローブの場合も同様に、検出対象の配列と特異的なハイブリダイズが行える限り、検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては１〜数個、好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個である。
多型解析用核酸（プライマー、プローブ）はホスホジエステル法など公知の方法によって合成することができる。尚、多型解析用核酸の設計、合成等に関しては成書（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参考にすることができる。
【００２０】
本発明における多型解析用核酸を予め標識物質で標識しておくことができる。このような標識化核酸を用いることにより例えば、増幅産物の標識量を指標として多型の解析を行うことができる。また、多型を構成する各遺伝子型の遺伝子における部分ＤＮＡ領域をそれぞれ特異的に増幅するように設計された２種類のプライマーを互いに異なる標識物質で標識しておけば、増幅産物から検出される標識物質及び標識量によって核酸試料の遺伝子型を判別できる。
【００２１】
多型解析用核酸の標識に用いられる標識物質としては３２Ｐなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、テキサスレッドなどの蛍光物質を例示でき、標識方法としてはアルカリフォスファターゼ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた５’末端標識法、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼやＫｌｅｎｏｗ断片を用いた３’末端標識法、ニックトランスレーション法、ランダムプライマー法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）などを例示できる。以上の多型解析用核酸を不溶性支持体に固定化した状態で用いることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。
【００２２】
核酸試料については、被験者の血液、皮膚細胞、粘膜細胞、毛髪等から公知の抽出、精製方法を用いて調製することができる。多型解析対象の遺伝子を含むものであれば任意の長さのゲノムＤＮＡを核酸試料として用いることができる。尚、核酸試料においてＨＴＲ４が完全な状態（即ち、遺伝子の全長が存在する状態）でなくても、少なくとも解析される多型部位が存在している限りにおいて断片的、部分的なものであってもよい。
【００２３】
各多型の解析は多型ごとに、又は両者が同時に行われる。前者の場合としては例えば、被験者から得た核酸試料を解析対象の多型の数（二つ）に合わせて分注し、各多型の解析を個別に行う。後者の場合としては例えば、ＤＮＡチップまたはマイクロアレイによって行うことができる。尚、ここでいう同時とは解析過程のすべての操作が同時に行われることのみを意味するのではなく、一部の操作（例えば核酸増幅操作、プローブのハイブリダイズ、又は検出）が同時に行われる場合も含む。
【００２４】
遺伝子型の違いが転写産物に反映される多型については、ＨＴＲ４の転写産物であるｍＲＮＡを利用して多型の解析を行うこともできる。例えば被験者の血液、尿等からＨＴＲ４のｍＲＮＡを抽出、精製した後、ノーザンブロット法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，７．４２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ドットブロット法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，７．４６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，８．４６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ＤＮＡチップ（ＤＮＡアレイ）を用いた方法などを実行することにより、ｍＲＮＡを出発材料として多型解析を行うことができる。
【００２５】
以上説明した本発明の検出方法を実行することにより得られる多型情報を、統合失調症の遺伝的リスクの診断に利用することができる。即ち、本発明は以上の検出方法によって得られる多型情報から核酸試料の遺伝子型を決定する工程、及び決定された核酸試料の遺伝子型から遺伝的リスクを求める工程を含んでなる、統合失調症のリスク診断方法も提供する。ここでの遺伝子型の決定は、典型的には、検出対象の多型に関して核酸試料の両アレルがいずれの遺伝子型をそれぞれ有するかを決定することである。３５３＋６位の多型が検出対象である場合を例に採れば、典型的には核酸試料における３５３＋６位における遺伝子型がＧＧ（３５３＋６位塩基が両アレル共にＧのホモ接合体）、ＧＡ（３５３＋６位塩基がＧのアレルとＡのアレルとのヘテロ接合体）、及びＡＡ（３５３＋６位塩基が両アレル共にＡのホモ接合体）の中のいずれであるかを決定することである。
【００２６】
統合失調症の遺伝的リスクを診断することにより将来的に統合失調症を罹患するおそれの程度（発症し易さ）、即ち発症リスク（発症脆弱性）が予測され、また遺伝子型という客観的指標に基づいて統合失調症の認定や病状の把握を行うことが可能となる。換言すれば本発明の診断方法によって統合失調症の発症リスクの評価、統合失調症に罹患していることの認定、又は症状の把握を行うことができる。中でも発症リスクの評価を行えることは臨床上極めて有意義である。発症リスクを事前に知ることは統合失調症に対する適切な予防措置を講じることを可能にするからである。
本発明の診断方法によって得られる情報は、適切な治療法の選択や予後の改善、患者のＱＯＬ（クオリティー・オブ・ライフ）の向上、又は発症リスクの低減などに利用され得る。
【００２７】
本発明の診断方法を実行することにより統合失調症の発症リスク等をモニターすることができる。このようなモニターの結果、ある外的因子（環境因子、薬剤の投与など）と発症リスク等の増加との間に相関関係が認められれば、当該外的因子を危険因子と認定し、この情報を基に発症リスク等の低減を図ることが可能と考えられる。
【００２８】
本発明で得られる統合失調症の発症に関連する遺伝情報は、統合失調症の治療（予防的処置を含む）にも利用され得ると考えられる。例えば、本発明の診断方法を実施した結果、統合失調症の発症リスクを高める遺伝子型であった場合に、発症リスクの低い遺伝子型を有する遺伝子を生体内に導入して発現させれば、当該遺伝子が発現することによって発症の抑制、発症リスクの軽減、症状の軽減などを期待できる。発症リスクの高い遺伝子型を有する遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖を導入し、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する方法によっても、同様の治療効果が期待される。
【００２９】
遺伝子又はアンチセンス鎖の導入については例えば、遺伝子導入用プラスミド又はウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１，  ７１６１−７１６５（１９８４））、超音波マイクロバブル（Ｌａｗｒｉｅ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，  ２０２３−２０２７  （２０００））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，  Ｐ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４，７４１３−７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ｍ．  ＆  Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ７３，３６６−３７０（１９７６））等の方法により行うことができる。これらの方法を利用して所望の遺伝子などを生体に対して直接的に導入（ｉｎ  ｖｉｖｏ法）又は間接的に導入（ｅｘ  ｖｉｖｏ法）することができる。
【００３０】
本発明の第２の局面は、上述した本発明の検出方法又は診断方法に使用されるキット（遺伝子型検出用キット、又は統合失調症診断用キット）を提供する。かかるキットには上記の各多型を解析するための核酸（多型解析用核酸）が含まれる。以下に本発明において提供されるキットの具体例を示す。
【００３１】
以下の（１）及び（２）の核酸を含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）３５３＋６位塩基がＧであるＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は３５３＋６位塩基がＡであるＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、及び
（２）５０８−３６位塩基がＴであるＨＴＲ４の５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸、又は５０８−３６位がＣであるＨＴＲ４の５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域に相補的な配列を有する核酸。
【００３２】
以下の（１）及び（２）の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）核酸試料中のＨＴＲ４の３５３＋６位塩基がＧである場合にのみ、該ＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のＨＴＲ４の３５３＋６位塩基がＡである場合にのみ、該ＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、及び
（２）核酸試料中のＨＴＲ４の５０８−３６位塩基がＣである場合にのみ、該ＨＴＲ４の５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット、又は核酸試料中のＨＴＲ４の５０８−３６位塩基がＴである場合にのみ、該ＨＴＲ４の５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セット。
【００３３】
以下の（１）及び（２）の核酸セットを含んでなる遺伝子型検出用キット、
（１）ＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、３５３＋６位塩基がＧであるＨＴＲ４の３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマー及び／又は３５３＋６位塩基がＡであるＨＴＲ４において３５３＋６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、ＨＴＲ４の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、からなる核酸セット、及び
（２）ＨＴＲ４の５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、５０８−３６位塩基がＣであるＨＴＲ４において５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマー及び／又は５０８−３６位塩基がＴであるＨＴＲ４において５０８−３６位塩基を含む部分ＤＮＡ領域、に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーと、ＨＴＲ４の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、からなる核酸セット。
【００３４】
以上の各キットにおいては、キットの使用方法に応じた一又は二以上の試薬（バッファー、反応用試薬、検出用試薬など）などを組み合わせてもよい。以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。
【００３５】
【実施例】
実施例における対象及び実験方法は次の通りとした。
［対象］
１８９名の統合失調症の患者と２９９名の正常対照者を対象とした。患者は藤田保健衛生大学精神科を受診した患者である。ＤＳＭ−ＩＶに基づいた診断は、非構造化面接と医療情報を基にして、少なくとも２人の経験を積んだ精神科医師が行うこととした。重症な身体疾患やＤＳＭ−ＩＶにおける他のＡｘｉｓ−Ｉに該当する疾患を合併したものはいなかった。正常対照者は病院のスタッフと医学生から構成されており、構造化面接による精神症状の評価は行わなかった。しかしながら、正常対照者は良好な社会的機能を有し、その健康状態は良好であった。全ての対象は互いに血縁関係のない日本人である。本研究について説明を行った後、各対象者からは文書によるインフォームドコンセントを得ている。この研究は藤田保健衛生大学倫理審査委員会の承認を得た上で行った。
【００３６】
［ＳＮＰの同定方法］
１）ＰＣＲ増幅方法
ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）の抽出にはＰＵＲＥＧＥＮＥＴＭ  （Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ５５４４７，  ＵＳＡ）を使用した。ゲノムＤＮＡの増幅は図３及び４のプライマーセットで行った。これらのプライマーセットによって１７の領域を増幅しており、その内のいくつかは互いに重なり、５−ＨＴ４（ｎ）を除きこれまでに報告されている全ての５−ＨＴ４のコーディング領域と近傍のイントロン領域をカバーする。これらはブランチサイトを含んでいる。エクソンとイントロンの境界は公表されているヒトのシークエンス配列（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＮＴ＿００６８５９、ＶＥＲＳＩＯＮ  ＮＴ＿００６８５９．１０  ＧＩ：２２０５２７６０、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮ  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ５  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｎｔｉｇ．）に基づいており、スプライスバリアントの位置は各スプライスバリアントに基づいている。ＤＮＡの増幅にはＧｅｎｅＡｍｐＴＭ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用いた。ＰＣＲの反応溶液は４０ｎｇ  のサンプルＤＮＡ、それぞれ６ｎＭ  のプライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、１  Ｘ  ＰＣＲ  Ｇｏｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、１．５又は２．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．３  Ｕ  のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄＴＭ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）からなり、トータルで１２μｌとした。ＰＣＲ反応の条件は次の通りとした。即ち、最初の熱変性を９５℃で９分間、４０  サイクルの熱変性をそれぞれ９５℃で１５  秒間、各プライマー毎に設定したアニーリング温度による反応を２０秒間、伸長反応を７２℃で３０秒間行い、そして最終反応後の伸長反応として７２℃で７分間反応させた。
【００３７】
２）ＤＨＰＬＣ解析法
ＰＣＲ産物を９５℃、４分で熱変性した後、４５分かけて２５℃まで冷却した。ヘテロ接合（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）ＤＮＡだけがハイブリダイゼーションの過程で（ミスマッチ塩基配列）ヘテロ二本鎖（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成する。各ＰＣＲ産物を、ＤＮＡｓｅｐＴＭカラム  （Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．）を使用したＷＡＶＥＴＭＤＨＰＬＣ  自動解析装置で解析した。ＰＣＲ産物の分離条件は直線的アセトニトリルグラディエント、０．９  ｍｌ／ｍｉｎの流速とした。カラムの移動相には２５％のアセトニトリルを含む（Ｂバッファー）又は含まない（Ａバッファー）トリエチル酢酸アンモニウム（０．１  Ｍ）を用いた。ＵＶ検出器でＤＮＡの溶出を測定した。推奨される解析温度とグラディエントのパラメーターをＷＡＶＥＴＭ解析装置に付属のＷＡＶＥＴＭ  Ｍａｋｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３．４；  Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）でＰＣＲ産物ごとに計算した。ヘテロ二本鎖が溶出してくる温度がＰＣＲ産物のＧ−Ｃ含量などの遺伝子配列によって相違することを利用して未知の変異を検索した。ＰＣＲ産物の全領域を解析するために、２つ若しくは３つの温度条件で各ＰＣＲ産物の検索を行った  （図３、４）。
【００３８】
３）サイクルシークエンス法
２つの方法を用いてＰＣＲ産物を精製した。一の方法は次のとおりである。ＤＨＰＬＣ解析のピーク波形からヘテロ二本鎖であろうと予想されたＰＣＲ産物をＷＡＶＥＴＭ解析装置のフラグメントコレクターを用いて精製した。ＷＡＶＥＴＭ解析装置の条件をダブルストランド・シングルフラグメントメソッドにしてＰＣＲ産物を流し、ピーク部分のサンプルを回収した。そして、回収したサンプルをＡｍｐｌｉｃｏｎＴＭ  ＭｉｃｒｏｃｏｎＴＭ−ＰＣＲ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒ．）  を用いて２０ｎｇ／μｌ  に濃縮した。ＤＨＰＬＣでの解析結果では明らかにヘテロ二本鎖の波形を取るにもかかわらず、通常のシークエンス解析では変異が同定できない場合に、ＡｄｖａｎＴａｇｅＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）  を用いた、他の精製方法を利用した。ＰＣＲ産物はＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  を用いて、ＡＭＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３７７  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で解析した。
【００３９】
［ＳＮＰジェノタイピング］
１）ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
図５にＰＣＲ−ＲＦＬＰ  解析で用いたプライマーセット、並びに制限酵素及びその条件を示した。３５３＋６Ａと  ５０８−３６Ｃについては、一塩基の置換が導入されたプライマーを使用し、増幅産物中に人工的制限酵素サイトが形成されるようにした（非特許文献２２を参照）。  ＰＣＲ産物に１−３Ｕの制限酵素を添加し、１  Ｘ  バッファーを含む溶液内（１０μｌ）で３７℃、３時間反応させた。得られたＤＮＡ  フラグメントを６％のアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。
【００４０】
２）ＤＨＰＬＣを使用したプライマー伸長（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法
３５３＋６Ａと  ５０８−３６Ｃについては、修飾されたプライマーセットを用いたためＰＣＲ−ＲＦＬＰでは十分な結果が期待できなかった。これら２つのＳＮＰを解析するために、次に示すような、ＤＨＰＬＣを使用したプライマー伸長法を施行した（非特許文献１９を参照）。ＰＣＲ反応の条件は上記の方法と同じとし、反応液のトータルボリュームは６μｌとした。反応に使用されなかったプライマーとｄＮＴＰｓを除去するために、ＰＣＲ産物を０．５Ｕ  Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａと０．５Ｕ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  Ｉ（ともにＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）で３７℃、１時間処理し、その後８０℃で１５分間処理することにより酵素を失活させた。プライマー伸長反応は、メーカーの推奨するバッファーに３０ｎｇのＰＣＲ産物、２５μＭのｄｄＮＴＰｓ、１２．５ｐｍｏｌのプライマー、及び０．２５ＵのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．）を混合した反応液（トータルボリューム１０μｌ）内で行った。Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒを用い、最初の熱変性を９６℃で１０秒間行い、次に４３℃で１５秒間反応させ、続いて６０℃で１分間反応させた。最後に９６℃で１分間加熱した後、直ちに氷上に移した。使用したＰＣＲプライマーセットとその塩基配列を図３〜５に示す。５μｌの反応産物を７０℃に条件設定したＷＡＶＥＴＭＤＨＰＬＣ  自動解析装置（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｊａｐａｎ  Ｌｔｄ．）による解析に供した。
【００４１】
［統計学的解析］
Ｗｅｉｒによって陳述され（非特許文献２３を参照）、Ｌｅｗｉｓ  とＺａｙｋｉｎによって書かれたソフトウェア（２００１；  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  （ＧＤＡ），  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０  （ｄ１６ｃ））で実施される様に、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡から予想されるジェノタイプの偏差を、イグザクトテストを用いて検討した。ペアワイズに連鎖不平衡の検定をするためにＤ  （ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）、Ｄ’（ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）とΔ２（ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）を計算した。
ハプロタイプ頻度の推定についてはｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ（ＥＭ）アルゴリズムを用いた（非特許文献２１を参照）。各個人で関連する座位と連鎖している遺伝子の組み合わせは、二つのハプロタイプの組み合わせとして予想される（ディプロタイプ形：ｄｉｐｌｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）。
シングルマーカーの関連解析は、モンテカルロ法によってエンピリカルＰ値が計算されるＣＬＵＭＰ（非特許文献２４を参照）を用いて行った。
オッズ比（ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏｎ：  ＯＲｓ）でハプロタイプを評価し、その計算には統計学的ソフトウェアであるＪＭＰ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０，  ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ，  Ｔｏｋｙｏ）を使用した。それ故、全てのオッズ比は２Ｘ２テーブルで２ｗｏ−ｓｉｄｅテストを適用して計算された。ムルティプル  テストは８回（４回の関連解析、及び４回のハプロタイプ解析）行った。
【００４２】
［実施例１］    ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子（ＨＴＲ４）内の多型検索
ＨＴＲ４のコーディング領域と選択的スプライシングに影響するイントロン領域のブランチサイトの多型検索をＤＨＰＬＣ（非特許文献７を参照）を用いて行った。まず、９６名の日本人の統合失調症患者のＨＴＲ４においてＤＨＰＬＣによる多型の検索を行った。その後、ダイレクトシークエンスによって各核酸試料の遺伝子多型の同定を行った。このようなＨＴＲ４の解析によって、アミノ酸置換を伴わない１つのサイレントＳＮＰ（６１２Ａ＞Ｇ）とイントロン領域に存在する６つのＳＮＰ（２６＋１４Ｔ＞Ｃ、３５３＋６Ｇ＞Ａ、５０８−３６Ｔ＞Ｃ、ｄ−２５Ｔ＞Ｃ、ｄ＋２２Ｇ＞Ａ、ｄ＋２７，ｄｅｌＴ）が確認された（図６）。これらのＳＮＰの中でイントロン領域内のＳＮＰ（５０８−３６Ｔ＞Ｃ）は、第５エクソンの５’側の選択的（オルタナティブ）スプライシングに影響するブランチサイトに相当する部位に位置する。本発明者らはこれらのＳＮＰと統合失調症との関連を調べるために、民族を一致させた健常者を正常対照として以下の関連解析及びハプロタイプ解析を行った。
【００４３】
［実施例２］  遺伝子型の決定
関連解析を行うためにまず、実施例１で確認された各ＳＮＰのジェノタイプを決定した。ジェノタイピングにはＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ）法、又はＤＨＰＬＣ  を利用したプライマー伸長（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法（非特許文献１９を参照）を用いた。
１８９名の日本人の統合失調症患者をジェノタイプした結果、ｒａｒｅアレル（ａｌｌｅｌｅ）の頻度は６１２Ｇ、２６＋１４Ｃ、３５３＋６Ａ、５０８−３６Ｃ、及びｄ−２５Ｃにおいてそれぞれ０．００４，  ０．１，  ０．２７，  ０．２８，及び  ０．４７であった。民族を一致させたこれらのジェノタイプはＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｓに従った（図１）。
【００４４】
頻度の低いＳＮＰｓの検索は、それ自体が機能変化を起こすもの無ければ、その有意さを見ても意味が無く、また、頻度が低ければマーカーとしての意味もないので、アレル頻度が１０％以上のものを対象として比較した。健康健康対照者２９９名ｒａｒｅアレル６１２Ｇ、２６＋１４Ｃ、３５３＋６Ａ、５０８−３６Ｃ、及びｄ−２５Ｃの頻度はそれぞれ０．０８、０．２６、０．２４、及び０．４２であった。各バリアントと統合失調症との間の関連は認められなかった  （図１）。
【００４５】
［実施例３］  関連解析及びハプロタイプ解析
疾患共通変異共通祖先遺伝子仮説（Ｃｏｍｍｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔ−ｃｏｍｍｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）の概念（非特許文献２０を参照）からすると、いくつかの遺伝子変異が統合失調症の病因に関係しており、複数のＳＮＰの組み合わせがこの疾患では重要な意味を持つと考えられる。本発明者らは４つのＳＮＰ（２６＋１４Ｔ＞Ｃ、３５３＋６Ｇ＞Ａ、５０８−３６Ｔ＞Ｃ、ｄ−２５Ｔ＞Ｃ）についてＬＤの解析を行った。その結果、これらのＳＮＰの中で３５３＋６Ｇ＞Ａ、及び５０８−３６Ｔ＞Ｃが強い連鎖不平衡にあった（Ｄ’＝０．９６）。そこで、この２つのＳＮＰでのハプロタイプ解析を行った。患者と正常対照者一人一人のハプロタイプを、ＬＤＳＵＰＰＯＲＴソフトウェア（非特許文献２１を参照）を使って計算した。３５３＋６Ｇ＞Ａと５０８−３６Ｔ＞Ｃは、それぞれのジェノタイプが、３５３＋６Ｇ＞ＡはＧかＡであり、５０８−３６Ｔ＞ＣはＴかＣであることを示している。そして、この二つのＳＮＰｓの組み合わせをハプロタイプといい、Ｇ−ＴとＡ−ＣとＧ−Ｃ及びＡ−Ｔの組み合わせがあり得る。この４つのハプロタイプの推定頻度は、統合失調症の患者でそれぞれ、７１．７％（Ｇ−Ｔ）、２６％（Ａ−Ｃ）、１．５％（Ｇ−Ｃ）、及び０．８％（Ａ−Ｔ）であった。次に本発明者らは患者と正常対照者との間でそれぞれのハプロタイプで比較した。結果、統合失調症の患者においてハプロタイプＡ−Ｔが正常対照者よりも有意に減少していることが認められた（図２）。正常対照者では２０６名中１５名にハプロタイプＡ−Ｔが認められたが、統合失調症患者では１９８名中２名にしかこのハプロタイプは認められなかった（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ｐ＝０．０１４，  ＯＲ＝０．１３，  ９５％  ＣＩ［０．０３−０．５８］）。
【００４６】
以上のように統計学的解析の結果、統合失調症とＨＴＲ４のハプロタイプＡ−Ｔとの関連が強いこと、即ちＨＴＲ４内の２つの多型（３５３＋６５０位多型、５０８−３６位多型）が統合失調症と密接に関係することが明らかにされた。尚、ｅｆｆｅｃｔ  ｓｉｚｅは統合失調症が多遺伝子（ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ）  と多因子（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ）によるものと予想される結果と一致する。
【００４７】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば統合失調症に関連する遺伝子多型が解析され、そして核酸試料の遺伝子型が検出される。この遺伝子型の検出によって得られる多型情報を用いることにより、統合失調症のリスク診断を行うことができる。したがって、本発明は統合失調症の発症リスクを事前に知る有効な手段となり、統合失調症の予防への貢献が期待できる。また、本発明によれば統合失調症の診断に有用な補助的情報が得られ、より適切な治療を可能とし予後の改善などを図ることができる。更には本発明を、ヒトセロトニン５−ＨＴ４受容体遺伝子が統合失調症の病態生理に果たしている役割を明らかにする手段として用いることができ、当該疾患に対する創薬（ゲノム創薬）に貢献するものと考えられる。
【００４９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は１９８名の統合失調症患者と２１１名の正常対照者におけるＨＴＲ４の  ジェノタイプを示す表である。尚、統計学的解析については、コンピュータープログラムのＣＬＵＭＰを使用して行った。
【図２】図２は統合失調症と各ＨＴＲ４ハプロタイプとの関連を示す表である。表中のｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ｐ値は、図１に示したもの（全部で８テスト）に加えて、この表ではいくつかのテストによって求められたｕｎｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ｐ値を掛け合わすことによって決定された。各ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ｐ値は８つのテストで調整された。ＮＳは有意差なし、を表す。
【図３】図３はＤＨＰＬＣ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、及びプライマー伸長法でそれぞれ用いたプライマーを示す表である。
【図４】図４は図３と同様に、ＤＨＰＬＣ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、及びプライマー伸長法でそれぞれ用いたプライマーを示す表である。
【図５】図５はＰＣＲ−ＲＦＬＰ法とプライマー伸長法に用いたプライマー、及びその他の条件をまとめた表である。
【図６】図６はダイレクトシークエンスの結果に基づくヒト５−ＨＴ４受容体遺伝子（ＨＲＴ４）座位の構成を模式的に表した図である。各ボックスはエクソン領域を表す。表中の塩基番号は開始コドンを基準に数えている。ＰＣＲ反応又はシークエンシングに使用したプライマーは水平の矢印で示される。また、垂直の矢印は多型位置を示す。アルファベットで記載したエクソン（コーディング）領域はスプライスバリアントである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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