(57)【要約】【課題】担体表面に予め調製した多種類の核酸が効率良く高密度で固定化され、かつ、低コストで製造できる核酸固定担体を提供すること。【解決手段】核酸が固定化されている核酸固定化担体であって、ａ）固定化された核酸は、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分二本鎖を形成し、ｂ）部分二本鎖核酸は、核酸の片側の末端付近から長さ方向で途中までが二本鎖であり、それ以外は一本鎖であり、ｃ）部分二本鎖核酸の二本鎖を形成している末端側で、短い核酸分子の末端が担体に固定化されており、ｄ）部分二本鎖核酸の長い核酸分子の塩基配列が異なっている二種類以上の部分二本鎖核酸が担体上の別の領域に固定化されており、ｅ）固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部または一部が、共通の塩基配列を有すること、のａ）〜ｅ）の全てを満たすことを特徴とする核酸固定化担体。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸が固定化されている核酸固定化担体であって、
ａ）固定化された核酸は、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分二本鎖を形成し、
ｂ）部分二本鎖核酸は、核酸の片側の末端付近から長さ方向で途中までが二本鎖であり、それ以外は一本鎖であり、
ｃ）部分二本鎖核酸の二本鎖を形成している末端側で、短い核酸分子の末端が担体に固定化されており、
ｄ）部分二本鎖核酸の長い核酸分子の塩基配列が異なっている二種類以上の部分二本鎖核酸が担体上の別の領域に固定化されており、
ｅ）固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部または一部が、共通の塩基配列を有すること、
のａ）〜ｅ）の全てを満たすことを特徴とする核酸固定化担体。
【請求項２】
核酸の末端と担体が、共有結合を介して固定化されていることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。
【請求項３】
担体上の同一領域に、部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方が固定されていることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。
【請求項４】
２価もしくは３価カチオンを含む核酸固定化用溶液を用いて作製されたことを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。
【請求項５】
マグネシウム、カルシウムの少なくとも一つを含む核酸固定化用溶液を用いて作製されたことを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。
【請求項６】
部分二本鎖核酸が電極上に固定化されていることを特徴とする請求項１記載の核酸固定化担体。
【請求項７】
請求項１記載の核酸固定化担体の固定化された核酸と検体核酸とのハイブリッドを検出する方法であって、二本鎖核酸を特異的に認識して結合しかつ電気化学的に活性な二本鎖認識体の電流値を検出または／および測定するハイブリッド検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析に非常に有用なＤＮＡチップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
各種生物の遺伝情報解析の研究が進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの生体高分子の機能については、各種の方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンハイブリダイゼーション、あるいはサザンハイブリダイゼーションのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンハイブリダイゼーションに代表されるような、蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開発され、注目を集めており、一部は販売されている。これらの方法は、いずれも核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。これらの技術は、マイクロアレイ又はチップと呼ばれる平面基板片上に、多数のＤＮＡ断片が整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺伝子発現量を迅速に推定できる。
【０００４】
核酸を基板上に固定化するための技術としては、上記ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に固定化する方法の他、ガラス等の基板の上にポリリジン等をコーティングして固定化する方法などが開発されている。
【０００５】
予め調製したＤＮＡを固相担体表面に固定する方法としては、一般的に、次の方法が用いられている。すなわち、固定するＤＮＡをＰＣＲによって増幅し、その産物（ＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）をＤＮＡチップ作製装置を用いて、ポリ陽イオンで表面処理した固相担体表面に点着し、ＤＮＡの荷電を利用して、固相担体に静電結合をさせ、次いで余分な陽イオンをブロッキングするのが一般的である。
【０００６】
また、特殊な方法であるが、シリカＤＮＡチップ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とする。この部位をプラスに荷電させることでビオチン化ＤＮＡを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法がある（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｇ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４，１１１９−１１２３（１９９７））。
【０００７】
ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法として、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（クエン酸緩衝食塩水）に懸濁させ、これをシリル化したスライドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。
【０００８】
また、電気化学的反応に基づく方法では、金・銀などの電極上に、一本鎖ＤＮＡの５’もしくは３’末端にチオール基を導入し、金・銀などと硫黄との配位結合を介して、固定化されることが一般的である。そして、電極上に固定化されたＤＮＡと検体とをハイブリダイゼーションさせる。その後、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを識別し、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合するリガンド（二本鎖結合性リガンド）による電気化学的シグナル（酸化電流値）を読みとるという手段が一般的に用いられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記の固定方法では、固定化できるＤＮＡの量が一定にできないため、測定の度にデータがばらつき、データの再現性がとれない、二本鎖のＤＮＡ（例えばＰＣＲ産物）を固定化した場合では、点着された各種ＤＮＡのメルティングポイント（二本鎖が一本鎖に乖離する温度）が統一されておらず、最適な状態でハイブリダイゼーションが行えない、一本鎖のＤＮＡ（例えば合成オリゴＤＮＡ）を固定化した場合では、固定化した一本鎖ＤＮＡ自体が高次構造をとり、最適な状態でハイブリダイゼーションが行えない、さらには、基板上に固定化されたＤＮＡの密度が小さく、結果的に低発現量遺伝子の検出ができない等の種々の問題を抱えている。このような問題を解決するためには、この問題を根本的に解決し、ＤＮＡの固定化効率を高め、なおかつ低コストでＤＮＡを固定する方法の開発が必要である。
【００１０】
本発明の具体的な目的は、担体表面に予め調製した多種類の核酸が効率良く高密度で固定化され、かつ、低コストで製造できる核酸固定担体を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、核酸が固定化されている核酸固定化担体であって、
ａ）固定化された核酸は、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分二本鎖を形成し、
ｂ）部分二本鎖核酸は、核酸の片側の末端付近から長さ方向で途中までが二本鎖であり、それ以外は一本鎖であり、
ｃ）部分二本鎖核酸の二本鎖を形成している末端側で、短い核酸分子の末端が担体に固定化されており、
ｄ）部分二本鎖核酸の長い核酸分子の塩基配列が異なっている二種類以上の部分二本鎖核酸が担体上の別の領域に固定化されており、
ｅ）固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部または一部が、共通の塩基配列を有すること、
のａ）〜ｅ）の全てを満たすことを特徴とする核酸固定化担体である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の核酸高分子固定化担体の詳細について述べる。
【００１３】
１．担体
担体として、好ましく用いられるのは、ガラス、シリコンに代表される無機材からなるものや、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸セルロース、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などのポリマーが挙げられる。これらは、固体であることが必要である。耐薬品性が優れ表面処理が容易であることから、ガラス、シリコンが特に好ましい。これらの担体には、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基が基板表面と共有結合により導入されていることが好ましい。この官能基の中でも、特に、アミノ基、アルデヒド基が好ましい。このような官能基は、シランカップリング剤を用いて担体表面を処理することで得られる。このようなシランカップリング剤としては３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシラン、３−（２−アミノエチルアミノプロピル）ジメトキシメチルシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、ジメトキシ−３−メルカプトプロピルメチルシランなどが挙げられる。
【００１４】
さらに担体としては、疎水性、あるいは親水性に乏しい固相担体であることが好ましい。担体の形状としては、スライドガラスや、シリコンウェーハーなどの平面状のものを好ましく用いることができるが、特に限定されるものではない。
【００１５】
また、ガラス、シリコンに代表される無機材からなるものや、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、酢酸セルロース、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）などのポリマー上に電極を設けた担体を用意し、この上に核酸を固定化しても良い。このような担体は、好ましくは電気化学的な方法により、ハイブリダイズの検出を行うことができる。
【００１６】
電極として、好ましく用いられるのは、金、銀、白金に代表される金属や、カーボン、ＩＴＯなどが挙げられる、この中でも好ましくは金が用いられる。その理由は、後述するように、金とチオール基の配位結合により核酸を固定化することが容易であるからである。また、担体上に多数の電極を設け、各々の電極に外部に出力する端子を設け、各々の電極上には塩基配列の違う核酸を固定化するれば、一度に多数の遺伝子発現、変異、多型等の同時解析が可能となる。この際、各々の電極の核酸を固定化する部分の面積は、同一であることが好ましい。
【００１７】
２．核酸
本発明の担体に固定化する核酸にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡがあるが、特にＤＮＡが好ましい。本発明でいう部分二本鎖核酸の模式図を図１に示す。すなわち、本発明でいう部分二本鎖核酸とは、長い核酸分子と短い核酸分子からなる部分的に二本鎖を形成する核酸を指す。すなわち、核酸の全体が二本鎖を形成しているのではなく、核酸の一部が二本鎖を形成し、その他の部分が一本鎖であるものをいう。また、図１に示すように、本発明の部分二本鎖核酸は、末端付近から途中までは二本鎖を形成し、かつ、その他の部分で一本鎖であることが必要である。なお、本発明における核酸の末端付近とは、核酸の末端（５’末端、もしくは、３’末端）から１０塩基以内のことを指す。
【００１８】
核酸が担体表面に固定化された時の模式図を図２に示す。本発明によると、二本鎖部分によって、担体上に固定化した核酸を「立たせる」ことが可能となり、結果的に、効率よく担体表面に核酸を高密度で固定化することが可能となる。そして、一本鎖部分を検体核酸と反応する（ハイブリダイゼーションする）部分として用いれば、検体と、固定化された核酸とのハイブリダイゼーションの高速化が可能となる。
【００１９】
また、本発明では、共有結合により核酸を担体に結合させることが好ましい。したがって、核酸に化学的修飾を施すことが好ましい。以下に具体例を述べて説明する。まず、５’末端もしくは、３’末端に官能基を導入した一本鎖の核酸を用意する。この核酸の長さは特に限定されないが、５ｍｅｒから、２００ｍｅｒ程度が好ましい。より好ましい範囲は、１０ｍｅｒから５０ｍｅｒの間である。さらに好ましくは、１０ｍｅｒから３０ｍｅｒの間である。また、核酸の末端に導入する官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、ビオチン、リン酸基、−ＳＨ基（チオール基）などが挙げられるが、この中でも、アミノ基、チオール基が特に好ましく用いることができる。例えば、アミノ基の導入に関しては、ＤＮＡの５’末端のリン酸にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する公知の方法（例えばＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１１（１８），６５１３−（１９８３））を用いて調製することができる。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を導入するように化学合成すればよい。そして、この末端に別の一本鎖核酸を用意することが必要である。別の一本鎖核酸とは官能基を導入した核酸の官能基側末端付近からの塩基配列に対し相補的な塩基配列を有するものである。この核酸は、後述する理由により官能基を導入した核酸よりも長いことが必要である。そして、上記二つの核酸をハイブリダイゼーションさせて、官能基が導入されている末端から途中までは二本鎖、それ以外は一本鎖である核酸（部分二本鎖核酸）を調整する。この時のハイブリダイゼーションの条件としては、何ら限定されるものではないが、例えば、前記二種類の核酸溶液を混合し、９５℃程度まで温度を上げた後、アニーリングするなどの方法が挙げられる。そして、前記の一本鎖部分が、検体とハイブリダイゼーションする部分となる。なお、一本鎖部分の長さとして好ましい範囲は、塩基数で１０以上１００以下であり、特に好ましくは１５以上、７０以下である。塩基数が１００より大きいと、一本鎖部分が高次構造を取ってしまうことがある。逆に塩基数が１０より小さいと、ハイブリダイゼーションしても熱的に不安定であり、結果的に検出できないことがある。
【００２０】
このように調整した末端に官能基が導入され、かつ、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を有する核酸（部分二本鎖核酸）と、先に述べた官能基が共有結合で導入された担体とを結合する。例えば、ＤＮＡ末端にアミノ基が導入され、担体表面にカルボキシル基がある場合では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等の縮合剤、ＤＮＡ末端にアミノ基が導入され、担体表面にアミノ基がある場合ではグルタルアルデヒドなどの架橋剤を用いて共有結合をさせることができる。また、ＤＮＡ末端にアミノ基が導入され、担体表面にアルデヒド基がある場合は、該ＤＮＡの水溶液を担体表面に点着することで、共有結合させることができる。共有結合させる際の温度は、５℃〜９５℃が好ましく、１５℃〜６５℃が更に好ましい。処理時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好ましい。
【００２１】
このように調整した末端に官能基が導入され、かつ、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を有する核酸（部分二本鎖核酸）とまた、先に述べた電極とを結合する場合にはでは、以下のようにすればよい。すなわち、部分二本核酸の末端にチオール基を導入し、電極として金を用いた場合では、金電極上に該核酸を含む溶液を滴下や点着し、数時間放置することにより電極に該核酸が固定化できる。
【００２２】
なお、プローブ（固定化された部分二本鎖核酸）の密度を調整する観点から、部分二本鎖核酸の二本鎖部分と同じ長さである別の二本鎖核酸を用意し、これらを混合して、電極に固定化する手段も好ましく用いられる。
【００２３】
本発明では、部分二本鎖核酸の一本鎖部分の塩基配列（すなわち、長い核酸分子の塩基配列）が異なるものを二種類以上、担体に固定化する必要がある。具体的には、このような一本鎖部分の塩基配列の異なる各々の部分二本鎖核酸を別々に溶液にしておく。そして、例えば市販のＤＮＡチップ製造装置を用い、各々の部分二本鎖核酸の溶液を別々のスポットに点着し、多種の部分二本鎖核酸を担体表面上に固定化することができる。この場合、担体上に点着した同一のスポットの中では、担体に固定化されている部分二本鎖核酸は同一種類であるが、スポットが異なると、一本鎖部分の塩基配列が異なる部分二本鎖核酸が担体に固定化されていることになる。ただし、スポットが異なると、その中に含まれる部分二本鎖核酸が必ずしも異なる必要はない。すなわち、スポットが別でも、固定化されている部分二本鎖核酸が同じであっても構わない。本発明で重要なのは、一本鎖部分の塩基配列の異なる部分二本鎖核酸が、二種類以上固定化されていることである。このように多種の部分二本鎖核酸を担体に固定化することにより、一度の検体との反応（ハイブリダイゼーション）で遺伝子の発現、変異、多型等の同時解析が可能となる。
【００２４】
先に述べたように、官能基を末端に導入した核酸分子の長さの方が長い場合と、逆に、官能基を末端に導入した核酸分子の長さの方が短い場合を比較すると、以下のような違いがある。
【００２５】
まず、官能基を導入していない一本鎖核酸よりも、官能基を末端に導入した一本鎖核酸が短い場合において、多種の部分二本鎖核酸を担体上に固定した時は、次のような利点がある。この時、二本鎖部分の塩基配列を部分二本鎖核酸の種類によらず、全部共通にしておくと（すなわち、固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部が、共通の塩基配列を有する：図２では２の部分が共通）、末端に官能基を導入した核酸（短い核酸分子）は一種類のみ用意すればよい。一般に、官能基を核酸末端に導入するコストは大きいが、このような場合は、大幅なコストダウンが可能となる。また、固定化された部分二本鎖核酸の短い核酸分子の全部が共通の塩基配列を有しておらず、固定化された部分二本鎖核酸のうち、一部の短い核酸分子の塩基配列が共通の場合でも、同様の効果が得られる。逆に、官能基を導入していない一本鎖核酸よりも、官能基を末端に導入した一本鎖核酸が長い場合においては、担体に固定化する部分二本鎖核酸の種類分だけ官能基を末端に導入した一本鎖核酸が必要となり、コスト的に不利である。
【００２６】
なお、本発明に於いて上記ＤＮＡを担体に固定化する際に溶解させる溶液は、ＳＳＣ（クエン酸緩衝食塩水）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの一般的な溶液を用いることができるが、溶液中に２価、もしくは３価のカチオンが含まれていることが好ましい。その様な例としては、Ｂａ、Ｃａ、Ｍｇ、Ａｌ、Ｍｎ、Ｓｅ、Ｚｎ、Ｃｒ、Ｇａ、Ｆｅ、Ｃｄ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｏ等のカチオンを含む溶液が挙げられる。この中でも、Ｍｇ、Ｃａのカチオンを含む溶液が特に好ましい。具体的には、ＭｇＣｌ２、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＭｇＩ２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＣａＩ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、を含む溶液が挙げられる。
【００２７】
本発明により得られた核酸分子固定化担体は、固定化された核酸の一本鎖部分をプローブとして、検体と反応させてハイブリダイゼーションを行うことにより、検体中の特定の塩基配列を有する核酸の検出に用いることができる。
【００２８】
ハイブリッドの検出には、ハイブリッドを特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。
【００２９】
この中でも、電気化学的な方法は、検体核酸に標識を施す必要がないので好ましい。この場合、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを識別し、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合するリガンド（二本鎖結合性リガンド）による電気化学的シグナル（酸化電流値）を読みとるという手段が挙げられる。このリガンドとしては、ヘキスト３３２５８、メチレンブルー、ＦＮＤ（Ｆｅｒｒｏｃｅｎｙｌ　ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ　ｄｉｉｍｉｄｅ）などの公知のものが挙げられる。
【００３０】
電極に固定化されたＤＮＡと検体ＤＮＡとの反応の結果は、電極に電位を印加し、その際に流れる電流を測定することにより判断することができる。サイクリックボルタンメトリー、ポテンショスタットなどが好ましく用いることができる。
【００３１】
一方、検体中の核酸に標識体（蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなど）を作用させる場合には、この標識体を検出することでハイブリッドの検出が行える。これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。
【００３２】
また、本発明の核酸分子固定化担体に対して用いる検体としては、一本鎖であることが好ましい。このような例としては、ｍＲＮＡから逆転写により合成された、ｃＤＮＡを挙げることができる。この理由は、検体も一本鎖にすることにより、固定化されたＤＮＡとのハイブリダイゼーションの効率を高くすることが可能となるからである。
【００３３】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
スライドガラスの処理
スライドガラス（松浪ガラス（株）製、白縁磨フロストＮｏ．１）を３ｍｏｌ／ｌ、ＮａＯＨ水溶液に３０分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。そして、１０体積％３−アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液に５時間浸した。その後、スライドガラスを引き上げ、アセトンで洗浄した。乾燥後、１重量％グルタルアルデヒド水溶液に１時間浸した。このような処理を施すことにより、図２に示すように、ガラス表面に共有結合を介して、アルデヒド基を導入した。
【００３５】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＴ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧ−３’（ＤＮＡ１）
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧ−３’（ＤＮＡ２）
５’−ＣＣＴＡＣＧＴＡＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡ−３’（ＤＮＡ３；５’末端アミノ化）
５’−ＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣ−３’（ＤＮＡ４；５’末端ＦＩＴＣ化）
なお、ＤＮＡ３の５’末端はアミノ化されており、また、ＤＮＡ４の５’末端は蛍光体であるＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−４−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識されている。また、ＤＮＡ１とＤＮＡ３の途中にあるＡの配列が続く部分は、スペーサーに当たる。
【００３６】
次に、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３の３種類のＤＮＡを１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２水溶液に溶解し、それぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。ついで、ＤＮＡ１の溶液にＤＮＡ３の溶液を等量混合し、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却し、ＤＮＡ１とＤＮＡ３をハイブリダイゼーションした。これにより、末端（ＤＮＡ１の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ５とする。ＤＮＡ５は長鎖部分がＤＮＡ１、短鎖部分がＤＮＡ３である）。同様に、ＤＮＡ２の溶液にＤＮＡ３の溶液を等量混合して、末端（ＤＮＡ２の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ６とする。ＤＮＡ６は長鎖部分がＤＮＡ２、短鎖部分がＤＮＡ３である）。
【００３７】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
上記ＤＮＡ５とＤＮＡ６の溶液を針先で、先に調整したスライドガラスの上に点着した。これを湿度１００％のプラスチック容器に入れて、室温で一晩放置した。次いで、０．２重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）水溶液の中にスライドを入れ、２分間振とうし、さらに、純水中で２分間振とうした。さらに、１．５ｇのＮａＢＨ４に４５０ｍｌのＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたもの）、１００％エターノールを１３３ｍｌ加えた溶液を準備した。溶液の準備後、素早く前記スライドグラスをこの溶液に浸し、５分後、スライドガラスを取りだした。このようにして、ＤＮＡと結合していない、スライドガラス上の余分なアルデヒド基をブロッキングした。次いで、０．２重量％ＳＤＳ水溶液、純水の順に洗浄し、乾燥した。
【００３８】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣとは、ＮａＣｌ　８７．６ｇ、Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ；クエン酸３ナトリウム水和物　４４．２ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたものである。またＮａＣｌを４３．８ｇ、クエン酸３ナトリウム水和物を２２．１ｇ純水にとかし、１ｌにメスアップしたものを１×ＳＳＣと表記し、これの１０倍濃縮液を１０×ＳＳＣ、５倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）にＭｇＣｌ２を溶解し、ＭｇＣｌ２の濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌとなるように調整した水溶液にＤＮＡ４を溶解し、ＤＮＡ４の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ５とＤＮＡ６を固定化したスライドガラスにこの溶液を滴下し、室温で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次に、２×ＳＳＣの中でスライドグラスを揺らし、カバーガラスを自然に剥離し、洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣの順に洗浄した。
【００３９】
ついで、このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察した。そのところ、ＤＮＡ５をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ６をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。
【００４０】
また、検体溶液中の検体量（ＤＮＡ４のモル数）を振って、検出限界を調べたところ、検出限界としては、検体量が数百ａｍｏｌと推定された。
【００４１】
実施例２
実施例１と同様なＤＮＡを用意し、スライドガラスにスポッティングする際の溶液とハイブリダイゼーションの際の溶液を、表１の水溶液に変化させた以外は、実施例１と同様な操作を行った。実施例１と同様に、ＤＮＡ５をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ６をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。また、表１に本実施例における、ＤＮＡ５をスポットした部分の蛍光強度を示す。
【００４２】
【表１】
2004003913.tif 000002
【００４３】
この結果より、スポッティングする際の溶液とハイブリダイゼーションの際の溶液は、Ｍｇ、Ｃａを含むことがより好ましいとわかった。
【００４４】
比較例１
スライドガラスの調整
スライドガラス（松浪ガラス製、白縁磨フロストＮｏ．１）を３ｍｏｌ／ｌ、ＮａＯＨ溶液に３０分浸し、次いで、超純水で十分に洗浄して乾燥した。１０体積％のポリ−Ｌ−リシン（シグマ社製）水溶液に１時間浸水した。このものをプレート用遠心機で遠心し、室温にて乾燥した。
【００４５】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＴ−３’（ＤＮＡ１１）
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣ−３’（ＤＮＡ１２）
５’−ＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣ−３’（ＤＮＡ１３；５’末端ＦＩＴＣ化）
ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２は化学的な修飾は行っていない。ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２を３×ＳＳＣに溶かしそれぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。
【００４６】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
上記ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２の溶液を針先で、先に調整したスライドガラスの上に点着した。乾燥後６０ｍＪのＵＶ光を当てて、クロスリンキングした。次に、ＤＮＡと結合していないスライドガラス表面の余計なアミノ基をブロックするため、ホウ酸、純水、ｐＨ調整用ＮａＯＨ、無水コハク酸、１―メチル−２−ピロリドンを混合した溶液（無水コハク酸　３ｇを１８７ｍｌ　１―メチル−２−ピロリドンに溶解し、使用直前に１７ｍｌ　１Ｍ　Ｎａ−ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ８．０）　溶液を加えたもの）に核酸が固定された面を浸し、振とうした。その後、洗浄して乾燥した。
【００４７】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣの水溶液にＤＮＡ１３を溶解し、ＤＮＡ１３の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ１１とＤＮＡ１２を固定化したスライドガラスにこの溶液を滴下し、室温で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次に、２×ＳＳＣの中でスライドグラスを揺らし、カバーガラスを自然に剥離し、洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣの順に洗浄した。
【００４８】
ついで、このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察した。そのところ、ＤＮＡ１１をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ１２をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。しかしながら、ＦＩＴＣからの蛍光の強度は、実施例１の１／１０であった。これは、本比較例ではスライドガラス上に固定化されたＤＮＡの量が少ないため、結果的にハイブリダイゼーションできる検体ＤＮＡが少なく、蛍光が弱くなったものであると推定された。
【００４９】
比較例２
スライドガラスの調整は実施例１と同様に行った。
【００５０】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＴ−３’（ＤＮＡ１４；５’末端アミノ化）
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣ−３’（ＤＮＡ１５；５’末端アミノ化）
５’−ＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣ−３’（ＤＮＡ１６；５’末端ＦＩＴＣ化）
ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５をＰＢＳに溶かしそれぞれ濃度１００ｐｍｏｌ／μｌとした。
【００５１】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
上記ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５の溶液を針先で、先に調整したスライドガラスの上に点着した。これを湿度１００％のタッパーに入れて、室温で一晩放置した。次いで、０．２重量％ＳＤＳ水溶液の中にスライドを入れ、２分間振とうし、さらに、純水中で２分間振とうした。ついで、１．５ｇのＮａＢＨ４を４５０ｍｌのＰＢＳに溶かし、１００％エターノールを１３３ｍｌ加えた溶液を準備した。素早く前記スライドグラスをこの溶液に浸した。５分後、スライドを取りだした。このようにして、ＤＮＡと結合していないスライドガラス上の余分なアルデヒド基をブロッキングした。次いで、０．２％ＳＤＳ水溶液、純水の順に洗浄し、乾燥した。
【００５２】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣ水溶液にＤＮＡ１６を溶解し、ＤＮＡ１６の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ１４とＤＮＡ１５を固定化したスライドガラスにこの溶液を滴下し、室温で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次に、２×ＳＳＣの中でスライドグラスを揺らし、カバーガラスを自然に剥離し、洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣの順に洗浄した。
【００５３】
ついで、このスライドグラスを蛍光顕微鏡で観察した。そのところ、ＤＮＡ１４をスポットした部分からは、ＦＩＴＣからの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ１５をスポットした部分からは、蛍光は観察されなかった。しかしながら、ＤＮＡ１４をスポットした部分からのＦＩＴＣからの蛍光の強度は、実施例１の１／１０であった。これは、本比較例ではスライドガラス上に固定化されたＤＮＡの量が少ないため、結果的にハイブリダイゼーションできる検体ＤＮＡが少なく、蛍光が弱くなったものであると推定された。
【００５４】
実施例３
スライドガラスの調整は、実施例１と同様に行った。
【００５５】
ＤＮＡの処理
実施例１で用いた、ＤＮＡ１〜ＤＮＡ６に加えて、ＤＮＡ３と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ７を準備した。ＤＮＡ７の具体的な塩基配列は、以下のようになる。
５’−ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧ−３’（ＤＮＡ７）
なお、ＤＮＡ７は化学的な修飾を施していない。
【００５６】
次に、ＤＮＡ７を１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２水溶液に溶解し、ＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。同様に調整したＤＮＡ３と、ＤＮＡ７の溶液を等量混合して、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却した。このようにして、ＤＮＡ３とＤＮＡ７からなる二本鎖核酸を準備した（以降ＤＮＡ８とする。）。
【００５７】
ＤＮＡのスライドガラスへの固定
実施例１と同様に準備したＤＮＡ５（部分二本鎖核酸）の溶液と、ＤＮＡ８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合した。また、同様に調整したＤＮＡ６（部分二本鎖核酸）の溶液とＤＮＡ８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合した。次いで、これらの混合核酸溶液を実施例１と同様にスライドガラス上に固定化した。このようにして、スライドグラス上の各々の領域に部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を固定した。
【００５８】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
次いで、実施例１と同様にＤＮＡ４を調整し、ハイブリダイゼーションを行い、実施例１と同様な測定を行った。その結果、ＤＮＡ５とＤＮＡ８の両方がスポットされている部分からは、ＦＩＴＣの蛍光が観察されたが、ＤＮＡ６とＤＮＡ８の両方がスポットされている部分からは蛍光は観察されなかった。一方、ＤＮＡ５がスポットされている領域からの蛍光の強度は、実施例１の１．６倍であった。
【００５９】
このように、担体上のプローブ（固定化された部分二本鎖核酸）の密度を調整すると、Ｓ／Ｎが改善できることがわかった。
【００６０】
実施例４
担体上への電極の作製
スライドガラスにクロム、金の順にスパッタリングを行い、面積１ｍｍ２、表面が金である電極をスライドガラス上に作製した。なお、クロムと金の厚さはそれぞれ、５ｎｍ、５００ｎｍとした。なお、一つのスライドガラス上には、８個の電極を設け、各々外部に出力する端子を設けた。
【００６１】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＴ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧ−３’（ＤＮＡ２１）
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧ−３’（ＤＮＡ２２）
５’−ＣＣＴＡＣＧＴＡＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡ−３’（ＤＮＡ２３；５’チオール化）
５’−ＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣ−３’（ＤＮＡ２４）。
【００６２】
なお、ＤＮＡ２３の５’末端はチオール化されている。その他のＤＮＡは、化学的な修飾を行っていない。また、ＤＮＡ２１とＤＮＡ２３の途中にあるＡの配列が続く部分は、スペーサーに当たる。
【００６３】
次に、ＤＮＡ２１、ＤＮＡ２２、ＤＮＡ２３の３種類のＤＮＡを１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２水溶液に溶解し、それぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。ついで、ＤＮＡ２１の溶液にＤＮＡ２３の溶液を等量混合し、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却し、ＤＮＡ２１とＤＮＡ２３をハイブリダイゼーションした。これにより、末端（ＤＮＡ２１の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ２５とする。ＤＮＡ２５は長鎖部分がＤＮＡ２１、短鎖部分がＤＮＡ２３である）。同様に、ＤＮＡ２２の溶液にＤＮＡ２３の溶液を等量混合して、末端（ＤＮＡ２２の３’末端）から途中までが二本差であり、それから先は一本差であるＤＮＡを得た（以降ＤＮＡ２６とする。ＤＮＡ２６は長鎖部分がＤＮＡ２２、短鎖部分がＤＮＡ２３である）。
【００６４】
ＤＮＡの電極への固定
上記ＤＮＡ２５とＤＮＡ２６の溶液を１０μｌを電極全体が浸されるように滴下して、乾燥しないように注意しながら、４℃で２時間放置した。なお、ＤＮＡ２５はスライドガラス上のうち４つの電極に滴下した。また、ＤＮＡ２６は、それ以外の残りの電極に滴下した。次いで、電極を純水で洗浄した。これにより、電極上にＤＮＡ２５、ＤＮＡ２６を電極上に固定した。
【００６５】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
続いて、２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣとは、ＮａＣｌ　８７．６ｇ、Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ；クエン酸３ナトリウム水和物　４４．２ｇを純水にとかし、１ｌにメスアップしたもの）水溶液にＤＮＡ２４を溶解し、ＤＮＡ２４の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ２５とＤＮＡ２６を固定化した電極に、この溶液を滴下して、４０℃で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次いで、カバーガラスを静かに剥離し洗浄した。ハイブリダイゼーション後、１０μｍｏｌ／ｌのヘキスト３３２５８溶液中でボルタンメトリーを行い、ヘキスト３３２５８の酸化電流値を測定した。そのときの条件は、掃引速度１００ｍＶ／ｓ、掃引範囲−２００ｍＶから＋８００ｍＶとした。そして、電位が７００ｍＶ付近の電流ピークを測定した。なお、ハイブリダイゼーションを行う前にも同様な測定で電流ピークを測定しておき、ハイブリダイゼーション前後での電流ピークの差を、計８つの電極について、それぞれ求めた。その結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
2004003913.tif 000003
【００６７】
以上より、電極に固定されたＤＮＡと検体ＤＮＡとがハイブリダイゼーションを形成したかどうかを再現性良く検出できることが分かった。
【００６８】
また、検体溶液中の検体量（ＤＮＡ２４のモル数）を振って、検出限界を調べたところ、検出限界としては、検体量が数十ａｍｏｌと推定された。
【００６９】
実施例５
実施例４と同様なＤＮＡを用意し、電極上に滴下する際の溶液を表３の水溶液に変化させた以外は、実施例４と同様な操作を行った。表３にその結果を示す。なお、ＰＢＳとは、ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものである。
【００７０】
【表３】
2004003913.tif 000004
【００７１】
電極に点着する際の溶液が２価もしくは３価のカチオンを含まない場合、再現性にとぼしいことが分かった。またこのカチオンのうちでもＭｇ、Ｃａのカチオンが溶液中に含まれている場合、Ｓ／Ｎが良好となることがわかった。
【００７２】
実施例６
担体上への電極の作製
実施例４と同様に行った。
【００７３】
ＤＮＡの処理
実施例４で用いた、ＤＮＡ２１〜ＤＮＡ２６に加えて、ＤＮＡ２３と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ２７を準備した。ＤＮＡ２７の具体的な塩基配列は以下のようになる。
５’−ＴＡＣＡＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＧＴＡＧＧ−３’（ＤＮＡ２７）
なお、ＤＮＡ２７は化学的な修飾を施していない。
【００７４】
次に、ＤＮＡ２７を１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２水溶液に溶解し、ＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。同様に調整したＤＮＡ２３と、ＤＮＡ２７の溶液を等量混合して、９５℃に一分間保持した後、徐々に冷却した。このようにして、ＤＮＡ２３とＤＮＡ２７からなる二本鎖核酸を準備した（以降ＤＮＡ２８とする。）。
【００７５】
ＤＮＡの電極への固定
実施例４と同様に準備したＤＮＡ２５（部分二本鎖核酸）の溶液と、ＤＮＡ２８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合した。次いで、この混合した溶液を実施例４と同様の電極を設けた担体上に、実施例４と同様に電極に固定した。また、同様に調整したＤＮＡ２６（部分二本鎖核酸）の溶液とＤＮＡ２８（二本鎖核酸）の溶液を等量混合し、同様に電極に固定した。このようにして、各々の電極に部分二本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を固定した。
【００７６】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
次いで、実施例４と同様にＤＮＡ２４を調整して、ハイブリダイゼーションを行い、実施例４と同様の測定を行った。その結果を表４に示す。
【００７７】
【表４】
2004003913.tif 000005
【００７８】
このように電極上のプローブ（固定化された部分二本鎖核酸）の密度を調整すると、Ｓ／Ｎが改善できることが分かった。また、再現性にも問題がなかった。
【００７９】
比較例３
担体上への電極の作製
実施例４と同様に行った。
【００８０】
ＤＮＡの処理
次の塩基配列を持つデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）４種類を合成した。
５’−ＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＴＣＴ−３’（ＤＮＡ３１；５’末端チオール化）
５’−ＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣ−３’（ＤＮＡ３２；５’末端チオール化）
５’−ＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣ−３’（ＤＮＡ３３）
ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２は５’末端をチオール化した。一方ＤＮＡ３３は、化学的な修飾は行っていない。ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２を１０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ２水溶液に溶解し、それぞれのＤＮＡの濃度を１００ｐｍｏｌ／μｌとした。
【００８１】
ＤＮＡの電極への固定
上記ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２の溶液１０μｌを電極全体が浸されるように滴下して、乾燥しないように注意しながら、４℃で２時間放置した。なお、ＤＮＡ３１はスライドガラス上のうち４つの電極に滴下した。また、ＤＮＡ３２は、それ以外の残りの電極に滴下した。次いで、電極を純水で洗浄した。これにより、電極上にＤＮＡ３１、ＤＮＡ３２を電極上に固定した。
【００８２】
検体とのハイブリダイゼーションとその結果
２×ＳＳＣの水溶液にＤＮＡ３３を溶解し、ＤＮＡ３３の濃度を５０ｐｍｏｌ／μｌとした。ＤＮＡ３１とＤＮＡ３２を固定化した電極上にこの溶液を滴下し、４０℃で３０分放置してハイブリダイゼーションを行った。この際には、溶液が乾燥しないように、溶液の上にカバーガラスをかぶせた。次いで、カバーガラスを静かに剥離した後、洗浄し、反応後、実施例４と同様に、１０μｍｏｌ／ｌのヘキスト３３２５８溶液中でボルタンメトリーを行い、ヘキスト３３２５８の酸化電流値を測定した。その結果を表５に示す。
【００８３】
【表５】
2004003913.tif 000006
【００８４】
これより、この方法では、電流値のばらつきが大きく、再現性にとぼしいことが分かった。
【００８５】
【発明の効果】
本発明によれば、あらかじめ調整した多種類の核酸を担体表面に高密度で固定化できる。このため、検出する際のＳ／Ｎが良好である。また、データの再現性も改善でき、かつ、低コストで核酸固定化担体を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で用いる部分二本鎖核酸の模式図
【図２】担体に部分二本鎖核酸を固定化したときの模式図
【図３】実施例１で行った、ガラス表面処理の模式図
【符号の説明】
１　　長い核酸分子
２　　短い核酸分子
４　　官能基
６　　担体
７　　ガラス基板
【図１】
2004003913.tif 000007
【図２】
2004003913.tif 000008
【図３】
2004003913.tif 000009