(57)【要約】【課題】ＧＭＰ−１４０に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対する抗体を提供すること。【解決手段】ＧＭＰ−１４０に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対する抗体。この糖タンパク質リガンドは、シアリルＬｅｘ部分を含むフコシル化シアリル化糖タンパク質を含み、そして還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの評価により約１２０，０００の見かけの相対分子量を有する。この抗体は、ＧＭＰ−１４０に対する糖タンパク質リガンドへのＧＭＰ−１４０の結合を特異的にブロックするのに有効である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物を含む単離された糖タンパク質に対する抗体であって、該炭水化物は、ＧｌｃＮＡｃへα１，３結合したフコースを含み、該ＧｌｃＮＡｃにはＧａｌがβ１，４結合を介して結合し、さらにα２，３結合を介して該Ｇａｌに結合したシアル酸を含み、そしてここで、ＧＭＰ−１４０への該糖タンパク質の結合は、ＧＭＰ−１４０に対するＧ１モノクローナル抗体によりブロックされ、そしてＧＭＰ−１４０に対するＳ１２モノクローナル抗体によりブロックされず、そしてＧＭＰ−１４０へのカルシウム依存性結合を有し、そしてここで、該糖タンパク質は、好中球へのＧＭＰ−１４０の結合を阻害する、抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターを含むセレクチン類（Ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ）との結合反応をともなう炎症反応の治療法と予防法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
発明の背景
本発明は米国国立心臓、肺臓および血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅａｒｔ，　Ｌｕｎｇ　ａｎｄＢｌｏｏｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の助成金によるものであるから、米国政府は本発明に権利をもっている。
【０００３】
血小板とリンパ球の血管表面への付着は炎症反応の重要な要素であり、かつ補体系、凝血系および免疫系の同時におこる相互に関連する活性化を伴う一連の複雑な反応の一部である。
【０００４】
トロンビンおよびヒスタミンのような「迅速」活性化因子に暴露された内皮は２〜１０分以内に好中球に対して付着性になるが、一方腫瘍壊死因子およびインターロイキン−１のようなサイトカイン類に暴露された内皮は、１〜６時間後に付着性になる。迅速な内皮依存性のリンパ球の付着は、細胞表面での脂質媒介物血小板活性化因子（ＰＡＦ）の発現と関連があり、およびおそらくその他の内皮リンパ球の表面レセプターの出現と関連がある。サイトカインで誘発される、内皮のリンパ球に対するゆっくりした付着は、少なくとも一部分は、内皮細胞レセプターのＥＬＡＭ−１で媒介される。このＥＬＡＭ−１は内皮細胞がサイトカイン類に暴露された後に合成され、次いで細胞表面に輸送され、そこで好中球を補足する。ＥＬＡＭ−１の単離、特性決定およびクローニングについては、ＢｅｖｉｌａｃｑｕａらがＳｃｉｅｎｃｅ　　２４３巻、１１６０〜１１６５頁、１９８９年で概説している。末梢リンパ節ホーミングレセプターは、「ネズミＭｅｌ　１４抗原」、「Ｌｅｕ８」、「Ｌｅｕ８抗原」および「ＬＡＭ−１」とも呼ばれるが、末梢リンパ節において高内皮性小静脈にリンパ球を結合させる好中球、単球およびリンパ球上の別の構造体である。このタンパク質の特性決定とクローニングについては、Ｌａｓｋｙら、Ｃｅｌｌ　５６巻、１０４５〜１０５５頁、１９８９年（マウス）およびＴｅｄｄｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　１７０巻、１２３〜１３３頁、１９８９年に概説されている。
【０００５】
ＧＭＰ−１４０（顆粒膜タンパク質１４０）はＰＡＤＧＥＭとして知られているが、システインに富んだ、強くグリコシル化された膜内存在性糖タンパク質であり、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定した見かけの分子量は１４０，０００である。ＧＭＰ−１４０は、ＭｃＥｖｅｒとＭａｒｔｉｎが最初にヒト血小板から精製した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９巻、９７９９〜９８０４頁、１９８４年）。このタンパク質は、Ｓｔｅｎｂｅｒｇら（１９８５年）が報告しているように、休止血小板のα顆粒中に存在しているが血小板を活性化してから迅速に細胞膜に再分布される。
ＧＭＰ−１４０が内皮細胞内に存在しこれらの細胞によって生合成されることは、ＭｃＥｖｅｒら、Ｂｌｏｏｄ７０（５）Ｓｕｐｐｌ．１：３５５ａ，Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ．１２７４（１９８７年）に報告された。内皮細胞中で、ＧＭＰ−１４０は、ワイベルパレイド（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ）体として知られている貯蔵顆粒に見られる。またＧＭＰ−１４０（ＰＡＤＧＥＭと呼ばれている）は、活性化された血小板と、好中球および単球との相互作用も媒介すると報告されている（Ｌａｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ　５９巻、３０５〜３１２頁、１９８９年１０月およびＨａｍｂｕｒｇｅｒとＭｃＥｖｅｒ、Ｂｌｏｏｄ　７５巻、５５０〜５５４頁、１９９０年）。
【０００６】
そのｃＤＮＡ由来アミノ酸配列は、Ｊｏｈｏｎｓｔｏｎら、Ｃｅｌｌ　５６巻、１０３３〜１０４４頁、１９８９年３月２４日および１９８９年３月８日出願の米国特許出願第０７／３２０，４０８号に報告されたが、独立して折り重なっているようである多数のモジュールドメインを含有していることを示している。Ｎ末端から始まって、これらのドメインは、１つの「レクチン」ドメイン、１つの「ＥＧＦ」ドメイン、補体結合タンパク質中のものと類似の９つの縦列共通反復構造、トランスメンブランドメイン（分化スプライシングから得られる可溶性形を除く）および細胞質テールを含有している。
【０００７】
血小板もしくは内皮細胞がトロンビンのような媒介物で活性化されると、貯蔵顆粒の膜は原形質膜とともに溶解して顆粒性の可溶性内容物が外部環境に放出され、膜に結合していたＧＭＰ−１４０が、数秒以内に細胞表面に提供される。ＧＭＰ−１４０が活性化された結果血小板および内皮細胞の表面に迅速に再分布するということは、この糖タンパク質が炎症もしくは血管の破裂の部位で重要な役割をし得るということを示唆している。
【０００８】
ＥＬＡＭ−１、ホーミングレセプター、およびＧＭＰ−１４０はその構造と機能が関連していることから「セレクチン類」と称されている。
【０００９】
血小板リンパ球の相互作用のインビボでの重要性はまだ綿密には研究されていない。しかし血管の損傷に応答して、血小板は、内皮下面に付着して活性化され凝血を助けることが知られている。また血小板および他の細胞は、微生物の侵入を防止するためにリンパ球を創傷内に補充するのに重要な役割を果たす。逆に、リンパ球は、Ｉｓｓｅｋｕｔｚら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．４９巻、７１６頁、１９８３年に報告されているように、炎症部位の組織中に血小板を補充する。
【００１０】
凝血と炎症の経路は、組織の損傷に応答して協調方式で調節される。例えば、活性化された内皮細胞は、リンパ球に対して付着性になるのに加えて、その細胞表面に組織因子を発現させ、それらの表面がトロンボモジュリンを発現するのを減少させて、最終的に、細胞表面で凝血反応を起こり易くする。場合によっては、単一のレセプターが、炎症と凝血のプロセスの両者に関与できる。
【００１１】
止血経路と炎症経路に関与するタンパク質は、ヒトの疾患の診断および治療を行うのに重要である。しかしタンパク質を治療に用いるには多くの問題がある。タンパク質は、患者に投与するのに十分であるように大量生産すると、通常は経費がかかる。更に、タンパク質を患者に複数回投与した後そのタンパク質に対する反応が起こり得る。従って、対象のタンパク質と同じかまたはより優れた活性を有し、安価に合成可能で、再現性があり、比較的無害なペプチドを開発することが望ましい。また、インビトロとインビボの両方で用いて、セレクチン類の結合作用を対象のタンパク質分子と同等に有効に調節することができて、かつ合成に要する経費が少なく、より再現性が高く、反応を起こすことが少ないと考えられる炭水化物の分子を開発することが望ましい。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターを含むセレクチン類と相互に作用するペプチドを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、ＧＭＰ−１４０に対するリンパ球リガンドの構造に基づいた構造を有し、ＧＭＰ−１４０性付着相互作用を阻害する炭水化物べースの薬剤を提供することである。
【００１４】
それ故に本発明の目的は、ＥＬＡＭ−１のような他のセレクチン類とは全く異なるセレクチンである、ＧＭＰ−１４０に対するレセプターの一部を形成する炭水化物構造体を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いてリンパ球が内皮もしくは血小板に付着するのを抑制する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、これらのぺプチドおよび炭水化物構造体を用いて免疫応答と止血経路を調節する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターに関する診断上のアッセイに用いる炭水化物およびペプチドを提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、ＧＭＰ−１４０に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対する抗体を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ＧＭＰ−１４０への好中球および単球の結合を阻害するＧＭＰ−１４０のレクチン様ドメイン由来の単離されたペプチドが提供される。
【００２０】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、ＣＱＮＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫＮＥ、ＡＥＮＷＡＤＮＥＰＮＮＫＲＮＮＥＤ、ＲＫＮＮＫＴＷＴＷＶＧＴＫＫＡＬＴＮＥ、ＫＫＡＬＴＮＥＡＥＮＷＡＤ、ならびにＧＭＰ−１４０への好中球および単球の結合を阻害するこれらの部分からなる群から選択されるペプチドを含む。
【００２１】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、ＣＱ．ＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫ．Ｅ、ＲＫ．Ｎ．．ＷＴＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴＥＥ、ＡＥＮＷＡＤＧＥＰＮＮＫ．Ｎ．ＥＤ、Ｃ．．．ＹＴ．ＬＶＡＩＱＮＫ．Ｅ、ＲＫ．．．．Ｗ．ＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴ．Ｅ、Ａ．ＮＷ．．．ＥＰＮＮ．．．．ＥＤ、および．Ｋ．ＫＴ．ＥＡ．ＮＷ．．からなる群から選択され、ここで、”．”は任意のアミノ酸である。
【００２２】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、レクチンドメインペプチドのアミノ酸１９−３４、１９−３０、２３−３４、２１−３０、２２−３０、２３−３０、５４−７２、５４−６３、７３−８９、７３−８３、７３−８５、７７−８９およびその組合せからなる群より選択されるペプチドを含む。
【００２３】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、キャリヤー分子に結合される。
【００２４】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、身体へ移植するために不活性基質に結合される。
【００２５】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、患者へ投与するために、受容可能な薬学的キャリヤー中にある。
【００２６】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、蛍光、放射、および酵素標識からなる群から選択される検出可能な標識をさらに含む。
【００２７】
本発明によれば、α１，３−フコシル化、α２，３−シアル化ラクトサミノグリカン構造を含む、セレクチンに結合する単離された炭水化物が提供される。
【００２８】
１つの実施態様では、上記炭水化物は、シアリルＬｅｘ、ジフコシルシアリルＬｅｘ、およびより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカン（ｐｏｌｙａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）からなる群から選択される。
【００２９】
好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒであり、そしてＲはタンパク質または他の炭水化物構造である。
【００３０】
別の実施態様では、上記炭水化物は、タンパク質をさらに含む。
【００３１】
別の実施態様では、上記炭水化物は、ＧＭＰ−１４０の単球および好中球への結合を阻害する。
【００３２】
好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ＥＬＡＭ−１の血小板および内皮細胞への結合を阻害しない。
【００３３】
別の実施態様では、上記炭水化物は、身体へ移植するために不活性基に結合される。
【００３４】
別の実施態様では、上記炭水化物は、患者へ投与するために受容可能な薬学的キャリヤー中にある。
【００３５】
別の実施態様では、上記炭水化物は、蛍光、放射および酵素標識からなる群から選択される検出可能な標識をさらに含む。
【００３６】
本発明によれば、ＧＭＰ−１４０の結合を阻害して生物学的機能を変化させるペプチド、ＧＭＰ−１４０に結合される炭水化物、およびＧＭＰ−１４０のレクチンドメインから単離されたペプチドからなる群から選択される物質の有効な量を投与することを含む、炎症応答を調節する方法が提供される。
【００３７】
１つの実施態様では、上記ペプチドは、好中球のＧＭＰ−１４０への結合を阻害するＧＭＰ−１４０のレクチン様ドメイン由来のペプチドから選択される。
【００３８】
好ましい実施態様では、上記ペプチドは、ＣＱＮＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫＮＥ、ＡＥＮＷＡＤＮＥＰＮＮＫＲＮＮＥＤ、ＲＫＮＮＫＴＷＴＷＶＧＴＫＫＡＬＴＮＥ、ＫＫＡＬＴＮＥＡＥＮＷＡＤ、および好中球のＧＭＰ−１４０への結合を阻害するこれらの部分からなる群から選択される。
【００３９】
別の好ましい実施態様では、上記ペプチドは、ＣＱ．ＲＹＴＤＬＶＡＩＱＮＫ．Ｅ、ＲＫ．Ｎ．．ＷＴＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴＥＥ、ＡＥＮＷＡＤＧＥＰＮＮＫ．Ｎ．ＥＤ、Ｃ．．．ＹＴ．ＬＶＡＩＱＮＫ．Ｅ、ＲＫ．．．．Ｗ．ＷＶＧＴ．Ｋ．ＬＴ．Ｅ、Ａ．ＮＷ．．．ＥＰＮＮ．．．．ＥＤ、および．Ｋ．ＫＴ．ＥＡ．ＮＷからなる群から選択され、ここで、”．”が任意のアミノ酸である。
【００４０】
別の実施態様では、上記ペプチドは、レクチンドメインペプチドのアミノ酸１９−３４、１９−３０、２３−３４、２１−３０、２２−３０、２３−３０、５４−７２、５４−６３、７３−８３、７３−８９、７３−８５、７７−８９およびその組合せからなる群より選択される。
【００４１】
別の実施態様では、上記物質をキャリヤー分子に結合する工程をさらに包含する。
【００４２】
別の実施態様では、身体へ移植するために不活性基質に上記物質を結合する工程をさらに包含する。
【００４３】
別の実施態様では、上記物質と、患者に投与するために受容可能な薬学的キャリヤーとを組み合わせる工程をさらに包含する。
【００４４】
別の実施態様では、蛍光、放射および酵素標識の群から選択される検出可能な標識で、上記物質を標識する工程をさらに包含する。
【００４５】
別の実施態様では、インビボにおける半減期を増大させるために、上記物質を化学的に改変する工程をさらに包含する。
【００４６】
好ましい実施態様では、上記キャリヤーは、マイクロスフェア、マイクロカプセル、およびリポソームからなる群から選択される。
【００４７】
別の実施態様では、上記炭水化物は、α１，３−フコシル化、α２，３−シアル化ラクトサミノグリカン構造、糖タンパク質、および炭水化物または糖タンパク質に対する抗体からなる群から選択され、この方法は、炎症応答を調節する。
【００４８】
好ましい実施態様では、上記炭水化物は、シアリルＬｅｘ、ジフコシルシアリルＬｅｘ、およびより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群から選択される。
【００４９】
より好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａ１β１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒであり、そしてＲはタンパク質または他の炭水化物構造である。
【００５０】
別の好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ＧＭＰ−１４０の単球および好中球への結合を阻害する。
【００５１】
別の好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ＥＬＡＭ−１の血小板および内皮細胞への結合を阻害しない。
【００５２】
別の好ましい実施態様では、上記炭水化物は、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１の結合を阻害し、ＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１の結合を実質的に阻害するのに有効な量の炭水化物を投与する工程を含む。
【００５３】
別の実施態様では、上記炎症応答は、腫瘍に対するものであり、上記物質は、該腫瘍の転移を阻害するのに有効な量で投与される。
【００５４】
本発明により、セレクチンに結合する単離された炭水化物に対する抗体であって、該炭水化物が、α１，３−フコシル化、α２，３−シアル化ラクトサミノグリカン構造を含む、抗体が提供される。
【００５５】
１つの実施態様では、上記炭水化物は、シアリルＬｅｘ、ジフコシルシアリルＬｅｘ、およびより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカンからなる群から選択される。
【００５６】
別の実施態様では、上記炭水化物は、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒであり、Ｒはタンパク質または他の炭水化物構造である。
【００５７】
本発明により、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１２０，０００ダルトンの分子量を有し、Ｏ−グリコシル化のための複数の部位を有する、セレクチンに対するリガンドの単離されタンパク質成分が提供される。
【００５８】
１つの実施態様では、上記タンパク質はロイコシアリンである。
【００５９】
本発明により、ＧＭＰ−１４０に特異的な結合を有する糖タンパク質リガンドに対する抗体が提供される。
【００６０】
【発明の実施の形態】
発明の要旨
ＧＭＰ−１４０のレクチン結合領域の３つの領域由来のペプチドは、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターを含む「セレクチン類」と選択的に相互に作用することが見い出されている。この３つの領域は、上記ペプチドに含有される残基の番号にしたがってアミノ酸番号１９〜３４、５４〜７２および６６〜８９を含有している。なお残基１は、シグナルペプチドを切断した後の前記成熟タンパク質のＮ末端と定義する。該ペプチドは、長さが５〜８アミノ酸の短いものであり、標準的な技法で容易に調製することができる。
【００６１】
ＧＭＰ−１４０と結合する、フコシル化シアル化（Ｓｉａｌｙａｔｅｄ）ラクトサミン構造体も発見されている。この構造体は、α（２，３）シアル酸で置換されたラクトサミノグリカン類を含有する受容体を改変できるα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ類を発現させることによって生成される。骨髄性細胞には存在するがリンパ球もしくは赤血球の細胞には存在しない共通の三糖構造体であるＬｅｘすなわちＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ（式中Ｒはタンパク質もしくは他の炭水化物構造体）が、上記シアル酸化構造体のコアを形成している。実際の構造体はシアリルＬｅｘすなわちＮｅｕＡｃα２−３Ｃａｌβ１−４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒであってもよい。他の可能な構造体には、ジフコシルシアリルＬｅｘ、すなわちより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカン（ｐｏｌｙｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｐｏｌｙａｃｔｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）または類縁の変異体が含まれる。これらの構造体のいくつかは、種々のアフィニティー度でＧＭＰ−１４０に結合できる。
【００６２】
実施例は、これらのペプチドが好中球に結合してＧＭＰ−１４０が好中球と結合するのを阻害し、ＩＣ５０（好中球が固定されたＧＭＰ−１４０に付着するのを５０％まで阻害するのに必要な投与量）が５０から３００マイクロモルの範囲内にあることを実証している。その結合親和性は、ＥＧＦドメイン由来配列と、このＥＧＦドメインとレクチンドメインの両方に結合する二価のカオチンを用いて調節することができる。全セレクチンまたは個々のセレクチン類、特にＧＭＰ−１４０の結合を阻害するこれらのペプチドの変異体をスクリーニングするのに有用なアッセイも示してある。
【００６３】
特異的グリコシルトランスフェラーゼでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を用いる実施例によって、ＧＭＰ−１４０に対するオリゴ糖リガンドがシアル化フコシル化構造体であり、そのシアル酸の結合がＧａｌへのα２，３結合であり、およびフコースの結合はＧｌｃＮａｃへのα１，３結合であり、そのＧｌｃＮａｃにＣａｌがβ１，４結合で結合していることが確認されている。
【００６４】
シアリルＬｅｘ、ジフコシルシアリルＬｅｘ、またはより長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカン変異体（合成で製造するかまたは遺伝子工学で作製した細胞内で発現させる）を含む本発明のペプチドもしくは炭水化物の構造体は、診断用薬として有用であり、かつ適切な医薬用キャリヤーを組合わせて凝血過程もしくは炎症過程を調節もしくは阻害する臨床の適用に有用である。また本発明のペプチドと炭水化物は、そのアミノ酸を化学的に改変するかまたはキャリヤー分子もしくは不活性基質に結合させることによって、改変してインビボでの半減期を増大することができる。またこれらの構造体に対する抗体も、診断用薬として、および凝血もしくは炎症のプロセスの調節に用いる医薬として有用である。
【００６５】
ＧＭＰ−１４０の構造と生合成法を詳細に分析した。ＧＭＰ−１４０の全アミノ酸配列を、精製された血小板ＧＭＰ−１４０由来のペプチドフラグメントのタンパク質配列決定の結果を組み合わせ、ヒト内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーからＧＭＰ−１４０をコードするｃＤＮＡをクローニングすることによって決定した。ＧＭＰ−１４０は、その構造と機能の研究に基づいて、好中球に対するレセプターとして作用し、かつ補体タンパク質Ｃ３ｂおよび抗凝血性補因子のプロテインＳと相互に作用する。
【００６６】
ＧＭＰ−１４０のｃＤＮＡとアミノ酸配列
ＧＭＰ−１４０に対する遺伝子のクローニングは、Ｇ．Ｉ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｒ．Ｇ．ＣｏｏｋおよびＲ．Ｐ．ＭｃＥｖｅｒが初めてＡｂｓｔｒａｃｔ　１２３８　Ｓｕｐｐｔｍｅｎｔ　ＩＩＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７８（４）（１９８８年１０月）に報告している。オリゴヌクレオチドを、ＧＭＰ−１４０のペプチドのＮ末端アミノ酸の配列決定結果に基づいて調製して、ヒト内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用した。７２７のアミノ酸からなるタンパク質をコードする３．０ｋｂのクローンを単離した。多くのシステイン、リシンおよびチロシンを含有する１１８の残基からなるＮ末端ドメインは、アシアロ糖タンパク質のレセプターに類似しているが、このＮ末端ドメインに、ＥＧＦ型の反復ドメイン構造と、各々６２のアミノ酸からなる８つの縦列反復構造（ただし６番目の縦列反復構造のみ７０のアミノ酸で構成されている）とが続いている。これらの反復構造は、Ｃ３ｂとＣ４ｂを調節するタンパク質を含むタンパク質類のファミリーに見いだされる反復構造と相同であるが、１反復構造当り６つの保存システインを含有し、これは一般に４つの保存システインを含有しているのと異なる独特の構造である。これらに対して、２４のアミノ酸のトランスメンブラン領域と３５のアミノ酸の細胞質テールが続いている。同じ遺伝子の転写体、可溶性形と膜または顆粒結合形を選択的にスプライスすることによってもたらされる少なくとも２つの形のタンパク質、が存在するようである。
【００６７】
内皮細胞ＧＭＰ−１４０の予測アミノ酸配列（図１ＡおよびＢに示す）には、６つの異なる構造ドメインが存在することを示唆している。これらの領域の１つは、Ｃ末端の近くにある２４残基の疎水性セグメントであり、メンブランスパニングドメインの特徴を有する。そのタンパク質の大部分はこのドメインのＮ末端側に位置し、細胞質外に存在しているようである。すなわち分泌顆粒のルーメンに体面しているが、または細胞が活性化された後、細胞外環境に暴露される。
【００６８】
Ｎ末端から始まる第１のドメインは４１の残基（図１Ａに−４１から−１の標識をつけて示す）を含有し、シグナルペプチドの特徴を有する。これらの残基中にはいくつかの正の電荷を有するアミノ酸を含有し、次いで疎水性ドメインが続き、次に極性残基が多い領域が続いている。−３および−１の位置に見られる電荷をもっていない小さな残基は、シグナルペプチダーゼによって開裂される部位に見られる一般的な残基である。その上に、血小板ＧＭＰ−１４０のＮ末端のアミノ酸配列は、残基１から２７の２７個の位置のうち２５個が内皮細胞の推定配列に一致している。
【００６９】
シグナルペプチドに続いて、翻訳されるｃＤＮＡ配列によって、７８９の残基で構成された成熟タンパク質が予測される。血小板ＧＭＰ−１４０ペプチドの配列を内皮細胞の推定配列とを比べると、３４１の帰属アミノ酸のうち３３７が一致することが分かったが、このことは、両方の細胞型が同じタンパク質を合成することを示唆している。
【００７０】
共通配列ＮｘＳ／Ｔを有する、１２の潜在的アスパラギン連結グリコシル化部位がある。これらはすべて分子の細胞質外の部分に位置しており、かつ血小板ＧＭＰ−１４０の炭水化物の組成に基づいてグリコシル化されているようである。その成熟タンパク質は、全アミノ酸の８％を占める６５のシステインを含有している。これらの大部分はジスルフィド架橋で組織化されていると予測されるが、その理由は、ヨードアセトアミドで処理した非還元ＧＭＰ−１４０の試料中にごく少量のカルボキシメチルシステインを同定できるからである。
【００７１】
第２のドメインは残基１から始まり、その成熟タンパク質の最初の１１８のアミノ酸が含まれる。この領域は、リシン（１２％）、チロシン（１０％）、アスパラギン（１３％）およびトリプトファン（６％）の残基を豊富に含有している。ＧＭＰ−１４０のこの領域は、このモチーフを有するタンパク質の多くが炭水化物を結合するので「レクチンドメイン」と称される。
【００７２】
第３のドメインは残基１１９から始まり、６つのシステインを含有する４０のアミノ酸の配列を有する。ＧＭＰ−１４０のこの領域を、ＮＢＲＦのデータベースの配列と比較すると、同じシステインの配列を含有する多数のタンパク質がある。このモチーフで報告された最初のタンパク質は上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆物質であり、１０の相同コピーを含有している（Ｇｒａｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３０３巻、２３６〜２４０頁、１９８３年；Ｓｃｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ　２２１巻、　２３６〜２４０頁、１９８３年）。
【００７３】
第４のドメインは残基１５９から始まり、各々６２のアミノ酸を含有する９つの縦列共通反復構造で構成され、その上に、８つの残基と４つの残基の延長部分がそれぞれ７番目と９番目の反復構造の末端にみとめられる。このドメインの境界部は、最初の反復構造の最初のシステインと推定トランスメンブランドメインの前の最後の残基とともに任意に設定される。共通配列により、９つの反復構造のうちの少なくとも５つで多数のアミノ酸が生成することが分かる。すべて反復構造が６つの保存システイン、３つのグリシン、および１つずつのトリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、およびロイシンを含有している。そのシステイン残基は、「ＥＧＦ」ドメインに見られる６つのシステインとは異なるモチーフで配列されている。その反復構造は、互いに、アミノ酸レベルで３１％から５６％同一であり、ヌクレオチドレベルで４２％から６２％同一である。反復構造間の配列を最大にするのにギャップを必要としない。
【００７４】
第５のドメインは残基７３１から始まる２４残基の推定トランスメンブランドメインである。この第５ドメインに続いて第６ドメインがあり、この第６ドメインは、高電荷を有するいくつかの残基で始まりそのタンパク質のＣ末端の残基７８９で終わる３５残基の推定細胞質セグメントである。セリン、トレオニンおよびチロシンの残基、ならびに翻訳後に修飾されるかもしれないシステインには、ホスホリル化されうる部位がある。
【００７５】
２つの異なる枠内欠失部（ｉｎ−ｆｒａｍｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ）が、詳細に試験された４つの内皮細胞クローンの配列中に同定される。第１の欠失部は１８６ｂｐである。この欠失によって、第７の共通反復構造から６２のアミノ酸が除かれ、９つの反復構造の代わりに８つの反復構造を含有するタンパク質が予測される。第２の欠失部は１２０ｂｐであり、第９の反復構造の末端の直後の４０のアミノ酸を除去されている。欠失した領域は、トランスメンブラン領域と、細胞質領域の最初のいくつかの残基を含んでいる。Ｃ末端における残りの２８の残基は第９の反復構造の直後に続くと予測される。親水性を示す図（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　１５７巻、１０５〜１３２頁、１９８２年）は、この形態のＧＭＰ−１４０が可溶性であるこ
とを予報している。
【００７６】
ＧＭＰ−１４０は、血小板および内皮細胞に存在するレセプターであり、好中球と単球の表面リガンドに結合して炎症過程を促進することが実証されている。
【００７７】
ＧＭＰ−１４０は、リンパ球が活性化された内皮細胞および血小板に付着するためのレセプターとして働くという結論は、本来次のようないくつかの観察結果に基づいてなされた。すなわちトロンビンもしくはヒスタミンで刺激された内皮の表面のＧＭＰ−１４０の迅速な出現が、これらのアゴニストによって刺激された内皮への好中球の誘発性付着と平行して起こること；ＧＭＰ−１４０の細胞表面への再分布を起こすトロンビンのようなアゴニストで血小板を刺激した後だけ起こり、ＡＤＰのような血小板アゴニストでは起こらない、好中球もしくは単球と血小板との相互作用；リンパ球が内皮を通過して組織へ移行する前に内皮に結合する主要な部位である後毛細管静脈におけるＧＭＰ−１４０の濃度；組織培養マイクロタイターウェルにコートしたＧＭＰ−１４０に対する精製された好中球の特異的付着；ヒスタミンによって刺激された培養ヒト臍静脈内皮細胞への好中球の付着の６０〜９０％がＧＭＰ−１４０に対するポリクローナル抗体で阻止されること；ＧＭＰ−１４０のｃＤＮＡ由来アミノ酸配列が、ＥＬＡＭ−１、好中球に結合することがすでに知られている内皮細胞タンパク質、およびリンパ球ホーミングレセプターのアミノ酸配列に相似していることである。続く研究によって、Ｃａ２＋の存在下、ＧＭＰ−１４０はまた刺激された血小板への好中球の付着を媒介するが、刺激されていない血小板については媒介しないことが実証された。血小板の好中球への結合は、ＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル抗体および精製されたＧＭＰ−１４０によって阻害された。
【００７８】
他の研究によって、ＧＭＰ−１４０が、補体系タンパク質であるＣ３ｂ、および抗凝血性補因子夕ンパク質であるプロテインＳに結合することが実証された。ＧＭＰ−１４０は、血漿タンパク質のＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）と配列相同性を共有しており、このＣ４ｂｐは血漿タンパク質Ｃ４ｂと相互に作用するのみならずプロテインＳと相互に作用する。
【００７９】
ＧＭＰ−１４０由来のペプチドが、診断用薬として有用であり、およびリンパ球がＧＭＰ−１４０を認識するのを阻止できるペプチドの治療上の有効量を患者に投与して患者の止血応答と炎症応答を調節するのに有用であることが発見されたのである。
【００８０】
また、他のタンパク質、特にＥＬＡＭ−１およびそのホーミングレセプターのレクチンドメインと相同性のＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン内のペプチド配列は、好中球が精製されたＧＭＰ−１４０に付着するのを選択的に阻害するので、患者およびこれらの分子による結合性の変化を特徴とする疾患の診断上のアッセイ、ならびにこの結合を変化させる化合物のスクリーニングアッセイに用いることができ、および凝血および／または炎症の過程を伴う、リンパ球と、血小板もしくは内皮細胞との相互作用を抑制もしくは調節するのに臨床上有用に違いないことが発見されたのである。
【００８１】
ＧＭＰ−１４０のｃＤＮＡ由来の一次構造によって、血管系におけるＧＭＰ−１４０の機能についていくつかのことが分かる。最も注目すべき観察結果は、ＧＭＰ−１４０が、血管細胞にみられ最近クローニングされた２つの他のレセプターと構造が著しく類似していることである。
【００８２】
これらの類似したレセプターの第１のものはＥＬＡＭ−１である。ＥＬＡＭ−１は未刺激の内皮中には存在しない内皮細胞タンパク質である。しかし、内皮が腫瘍壊死因子またはインターロイキン−１のようなサイトカイン類に暴露されると、ＥＬＡＭ−１の遺伝子が転写されてＲＮＡを産生し、次いでそのＲＮＡはタンパク質に翻訳される。その結果、ＥＬＡＭ−１はタンパク質に翻訳される。その結果、ＥＬＡＭ−１は、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４巻、９２３８〜９２４２頁、１９８７年に記載されているように、サイトカイン類に暴露されてから１−４時間後に内皮細胞の表面に発現される（顆粒内に貯蔵されて活性化後数秒以内に細胞表面に現れるＧＭＰ−１４０とは異なる）。ＥＬＡＭ−１は、好中球が、サイトカインで処理された内皮に付着するのを媒介することが判明し、従って、リンパ球をサイトカインで刺激された内皮を通過させて組織中へ移行させるのに重要であるらしい。ＥＬＡＭ−１の一次構造は、ＥＬＡＭ−１が「レクチン」ドメイン、ＥＧＦドメインおよび補体調節タンパク質の反復構造に類似の６つの反復構造（ＧＭＰ−１４０の９つの反復構造の代わりに）、トランスメンブランドメイン、および短い細胞質テールを含有することを示している。ＧＭＰ−１４０とＥＬＡＭ−１間には、両方のタンパク質を通じて広範囲の相同配列が存在するが、その相似性がレクチンドメインとＥＧＦドメインにおいて特に顕著である。
【００８３】
ＧＭＰ−１４０に構造全体が類似している第２分子は、リンパ球に見出されるホーミングレセプターである。ホーミングレセプターは、高内皮性細胞もしくは高内皮性小静脈と呼ばれる、リンパ組織中の特殊な内皮細胞にリンパ球を結合させるリンパ球表面構造体である（ＹｅｄｎｏｃｋおよびＲｏｓｅ，Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　４４巻、Ｆ．Ｉ．Ｄｉｘｏｎ編集、３１３〜３７８頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９年に概説されている）。この結合によって、リンパ球は内皮を通過してリンパ組織に移行し、そこで処理された抗原に暴露される。そのリンパ球は次にリンパ系を通じて血液中に再び入る。そのホーミングレセプターは、レクチンドメイン、ＥＧＦドメイン、２つの補体結合性反復構造、トランスメンブランドメイン、および短い細胞質テールを含有している。このホーミングレセプターも、特にレクチンドメインおよびＥＧＦドメインが、ＧＭＰ−１４０と広範囲の相同配列を共有している。
【００８４】
ＧＭＰ−１４０，ＥＬＡＭ−１およびこのホーミングレセプター（ＬＥＵ−８）それぞれのレクチンドメイン間の比較を表１に示す、これらの配列相似性に基づいて、好中球がＧＭＰ−１４０に結合するのを阻害するペプチドであって、ＥＬＡＭ−１、そのホーミングレセプター、および他の相同セレクチン類が炎症過程の成分に結合するのを阻害するか、または逆にＧＭＰ−１４０の結合だけを阻害するペプチドを選択することが可能なはずである。
【００８５】
ＧＭＰ−１４０に結合するフコシル化シアル化ラクトサミン構造体を発見された。この構造体は、α（２，３）シアル酸置換ラクトサミノグリカンを含有する受容体を改変することができるα（１，３）フコシルトランスフェラーゼを発現することによって生成することができる。骨髄細胞に存在するがリンパ球もしくは赤血球細胞には存在しない共通の三糖構造体であるＬｅｘすなわちＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ（式中、Ｒはタンパク質もしくは他の炭水化物構造）は、上記のシアル化構造のコアを形成している。実際の構造はシアリルＬｅｘ、すなわちＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒであってもよい。他の可能な構造には、ジフコシルシアリルＬｅｘ、より長いポリフコシル化ポリアクトサミノグリカン、または類縁の変異体が含まれる。これらの構造体のいくつかは、種々の親和度でＧＭＰ−１４０に結合できる。
【００８６】
そのリガンドの炭水化物の部分は、ＧＭＰ−１４０と相互に作用する、骨髄もしくは他の細胞の１つ以上のタンパク質に保持されていると考えられる。骨髄の糖タンパク質は単離されていないが、そのいくつかの特徴についての予備情報は得られている。
【００８７】
この構造は、プロテアーゼおよびノイラミニダーゼによる消化、およびトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を用いて推定した。
【００８８】
実施例５に記載したように、好中球をニューカッスル病ウイルス由来のノイラミニダーゼ、これはビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ）由来のノイラミニダーゼと同様に、シアル酸のα２，３結合を切断するがα２，６結合を切断しない、で処理することによって結合が少なくとも部分的に減少するので、リガンド中の重要な結合の少なくともいくつかにα２，３結合が含まれている。上記両方の型の酵素はともにα２，８結合を切断するが、骨髄細胞には存在しない。
【００８９】
実施例６に詳細に記載されているトランスフェクトされた細胞系についての他のデータは、α２，３結合のシアル酸を有するシアル化フコシル化ラクトサミンは充分に認識されることを示している。Ｌｅｘに対する抗体は、１２５Ｉ［ＧＭＰ−１４０］が好中球に結合するのを阻害しないので、その炭水化物はＬｅｘだけではないと考えられる。ＧＭＰ−１４０と２種の多価ネオ複合糖質の結合を比較する試験を、シアリルＬｅｘもしくはＬｅｘを、ウシ血清アルブミンに約１０：１のモル比にて、高濃度で（６．５μＭの複合体、６５μＭのオリゴ糖）結合させて行ったが、結合を阻害することができなかった。このことは、ＬｅｘもシアリルＬｅｘ自体もリガンドではないか、またはこれらのオリゴ糖のＧＭＰ−１４０に対する親和性が非常に低いので、このアッセイでは測定できないことを示唆している。
【００９０】
ＧＭＰ−１４０に対する糖タンパク質のリガンドの炭水化物の部分は、ＥＬＡＭ−１に対する糖タンパク質リガンドの炭水化物の部分と類似しているかまたは同じであるとはいえ、阻害物の試験がＧＭＰ−１４０とＥＬＡＭ−１の認識特異性に差があることを示すことは確かである。これらのことは、各セレクチンによって認識されるオリゴ糖の構造のわずかの差、または同じ構造体に結合する親和性の差が原因である。
【００９１】
本願に記載されていないオリゴ糖構造もＧＭＰ−１４０と相互に作用することができる。例えば、α２，６シアル酸結合を有するシアル化フコシル化ラクトサミノグリカンは結合するかもしれないが、この構造は真核細胞については報告されていない。
【００９２】
シアル化フコシル化ラクトサミン、または多数のシアル化フコシル化ラクトサミンは多数のシアル化フコシル化ラクトサミンが結合した炭水化物もしくはタンパク質の分子を用いて、ＧＭＰ−１４０のリガンドヘの結合をインビボで操作することが可能である。単一の分子に結合した多数シアル化フコシル化ラクトサミンを使用すれば、天然のリガンド以上に、人工の分子に対してＧＭＰ−１４０の親和性を増大させることができる。
【００９３】
【実施例】
以下の実施例によって上記の結論をもたらした物質、方法および試験結果をさらに説明するが本発明を限定するものではない。
実施例１：ＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン由来のペプチドによる、好中球の固定化ＧＭＰ−１４０への結合の競合阻害の証明。
【００９４】
分子内部に引っ込んでいると予想される２つの疎水性ストレッチを除いて、レクチンドメインの１１８個の残基のほとんどすべてにまたがる一連のペプチドを合成することにより、ＧＭＰ−１４０レクチンドメインの役割をテストした。また、レクチンドメインにつづくＥＧＦ様ドメイン（３６個の基）を含むペプチドをも合成した。また対照として、分子の共通反復構造、トランスメンブラン領域、およびＣ末端（細胞質テール）のうちのひとつから、ペプチドを得た。レクチンドメイン由来の活性ペプチドを表１に示す。表１はまたＥＬＡＭ−１およびホーミングレセプターであるＬＥＵ−８のレクチンドメインの関連する配列の配置をも示す。ｔ−Ｂｏｃの化学的特性を利用したＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ自動ペプチド合成機か、または、Ｆｍｏｃの化学的特性を利用したＤｕｐｏｎｔ　ＲＡＭＰＳ手動ペプチド合成機かのいずれかで、ペプチドを調製した。合成が行われた樹脂からの開裂後、逆相高性能液体クロマトグラフィーにより、すべてのペプチドを精製した。
【００９５】
プラスチックウェル上に固定化された精製ＧＭＰ−１４０への好中球の付着を阻害する、ペプチドの能力を調べるために、Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３、７５７−７６０（１９９０）に記載のアッセイを用いて、ペプチドをスクリーニングした。
【００９６】
Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製Ｍｏｎｏ−Ｐｏｌｙ分離媒体における密度勾配遠心分離法により、ヒト好中球をヘパリン処理した全血から単離する。好中球懸濁液は、９８％より高い純度およびトリパンブルー排除法による９５％より高い生存度を有する。付着アッセイのために、好中球を、５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（ＨＢＳＳ／ＨＳＡ）と共に１．２６ｍＭ　Ｃａ２＋および０．８１　ｍＭ　Ｍｇ２＋（ＨＢＳＳ，Ｇｉｂｃｏ）を含むハンクス平衡塩類溶液中に、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で懸濁する。付着アッセイを、Ｃｏｒｎｉｎｇ製９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて３回行い、様々なタンパク質溶液５０マイクロリットルを用いて４℃で一晩インキュベートする。
【００９７】
以下のように、抗体Ｓ１２−セファロースＴＭでのイムノアフィニテイークロマトグラフィーおよびＭｏｎｏ−ＱＴＭカラム（ＦＬＰＣ，　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でのイオン交換クロマトグラフィーにより、ＧＭＰ−１４０をヒト血小板溶解産物から単離する。
【００９８】
血液銀行から得て４℃で貯蔵した使用期限の過ぎたヒト血小板パック（１００ユニット）をプールし、ｐＨ７．５の５ｍＭ　ＥＤＴＡに調整し、１リットルボトル中で３０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離する。次いで、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス　ｐＨ７．５（ＴＢＳ）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭベンズアミジンを含む１リットル溶液で３回洗浄する。
【００９９】
次に、ペレットを最小量の洗浄緩衝液中に再懸濁し、ＤＩＦＰ中で１ｍＭにし、次いで、−８０℃で５０ｍｌスクリュートップ管中で冷凍させる。
【０１００】
冷凍ペレットを解凍し、５０ｍｌ　ＴＢＳ、５ｍＭベンズアミジン、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７．５、１００Ｍロイペプチンを含む溶液中に再懸濁する。懸濁液を、６００ｍｌ凍結解凍フラスコを用いてドライアイス−アセトン浴中で２回冷凍および解凍し、次いで、ガラス／テフロン（登録商標）乳鉢中で乳棒を用いてホモジナイズし、ＤＩＦＰ中で１ｍＭにする。４Ｍ　ＮａＣｌの貯蔵溶液を用いて、ＮａＣｌの濃度を０．５Ｍに調整する。懸濁液を４℃で撹拌した後、４℃で６０分間、３３，０００ｒｐｍでポリカーボネート管中で遠心分離する。上澄み（０．５Ｍ　ＮａＣｌ洗浄液）を取り出し貯蔵する。この上澄みは、可溶形態のＧＭＰ−１４０を含む。上澄みと共にペレットの上部を除去しないように注意する。次いで、抽出緩衝液（ＴＢＳ、５ｍＭベンズアミジン、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７．５、１００Ｍロイペプチン、２％トリトンＸ−１００）中でペレットをホモジナイズする。４℃で２５分間、１９，５００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄みを取り出す。この抽出手順をペレットを用いて反復し、上澄みを最初の上澄みと合せる。メンブラン形態のＧＭＰ−１４０を含む混合抽出物を、０．５Ｍ　ＮａＣｌに調整する。
【０１０１】
可溶画分（０．５Ｍ　ＮａＣｌ洗浄液）およびメンブラン抽出画分（これもまた０．５ＭＮａＣｌに調整している）を、前もって４℃で２時間、５ｍｇ／ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌ（アフィゲル）（Ｂｉｏｒａｄ）にカップリングしておいたモノクローナル抗体Ｓ１２（ヒトＧＭＰ−１４０に対する）の別々のプールを用いて吸収させる。樹脂を沈降させた後、上澄みを除く。次いで、結合ＧＭＰ−１４０を含むＳ１２アフィゲルをカラムに充填し、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス　ｐＨ７．５、０．０１％　Ｌｕｂｒｏｌ（ルブロール）ＰＸを含む４００ｍｌ溶液を用いて４℃で一晩洗浄する。
【０１０２】
８０％エチレングリコール、１ｍＭ　ＭＥＳ　ｐＨ６．０、０．０１％ルブロールＰＸを含む１００ｍｌ溶液を用いて、Ｓ１２アフィゲルから結合したＧＭＰ−１４０を溶出する。２８０ｎｍにおいて吸光度がピークである画分をプールする。溶出液を、０．０５％ルブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）を含むＴＢＳに対して透析し、次いで、Ｍｏｎｏ　Ｑカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａのＦＰＬＣ）にかける。濃縮タンパク質を、２Ｍ　ＮａＣｌ、２０ｍＭトリスｐＨ７．５（およびメンブラン画分用の０．０５％ルブロールＰＸ）を含む溶液を用いて段階的に溶出する。ピーク画分をＴＢＳ　ｐＨ７．５（およびメンブラン画分用の０．０５％ルブロールＰＸ）を含む溶液に透析する。
【０１０３】
ＧＭＰ−１４０を、５マイクログラム／ｍｌにプレートし、対照タンパク質、すなわち、ヒト血清アルブミン（Ａｌｂ）、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＩＩｂ）、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）、フィブリノーゲン（ＦＩＢ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）、ゼラチン（ＧＥＬ）またはヒト血清（ＨＳ）を５０マイクログラム／ｍｌで添加する。すべてのウェルを、１０ｍｇ／ｍｌ　ＨＳＡを含む３００マイクロリットルＨＢＳＳを用いて、２２℃で２時間ブロックし、次いで、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＨＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳで１回洗浄する。細胞（ウェル毎に２×１０５個）をウェルに添加し、２２℃で２０分間インキュベートした。次いで、ウェルをＨＢＳＳ／ＨＳＡで満たし、アセテートテープ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）で密封し、５分間１５０ｇで遠心分離してひっくり返した。非付着細胞および上澄みを廃棄した後、各ウェルの含有物を、Ｓｉｇｍａ製０．５％臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムの５０ｍＭリン酸カリウム溶液ｐＨ６．０、２００マイクロリットルを用いて可溶化し、Ｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ　７３，　１３２４−１３３０（１９８９）に記載のように、ミエロペルオキシダーゼ活性についてアッセイする。結合した細胞の数を、ミエロペルオキシダーゼ活性対細胞の数の標準曲線から導き出した。すべてのアッセイ条件下において、細胞は、全ミエロペルオキシダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼの５％未満を放出した。結果を表１に示す。負の対照としてのＣ末端ペプチド（ＧＭＰ−１４０のアミノ酸残基７６１−７７７）の存在下で、１００％の付着が見られ、この値は、細胞にペプチドも抗体も添加されない対照の場合と同じである。５％という値は特異的付着の９５％が阻害されたことを意味するので、阻害を、より低い付着率と解釈する。
【０１０４】
ＧＭＰ−１４０のＥＧＦドメイン由来のペプチドは、どれも付着を阻害しなかった。
しかし、レクチンドメインの３つの非隣接領域由来のペプチドは、付着を阻害した。そのレクチンドメイン由来の３つの領域とは、アミノ酸１９から３４、アミノ酸５４から７２、アミノ酸７３から８９、およびアミノ酸６６−７８の重複ペプチドである。アミノ酸は、ペプチドに含まれる残基の数に基づいて番号付けられ、残基１は、シグナルペプチドの開裂後の成熟タンパク質のＮ末端と定義づけられる。
【０１０５】
現在、活性を有することが知られている、これらの配列に由来する最も短いペプチド配列は、それが由来するレクチンドメインの面積にある程度依存して変化する、８個から１３個のアミノ酸の範囲にある。より短いペプチドのいくつかは、より長いペプチド配列よりも高い活性を有する。この時点で特徴づけられる最も短い活性ペプチドは、レクチンドメインアミノ酸２３から３０であり、レクチンドメインアミノ酸１９から３４由来のものである。このペプチドは、ＥＬＡＭ−１中の単一のアミノ酸の違いを除いて、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１、およびホーミングレセプターの間で同一であり、従って、３個のセレクチンすべてによって媒介された細胞−細胞接触を阻害する。現時点で周知の、レクチンドメインアミノ酸５４から７２由来の最も短い活性ペプチドは、アミノ酸５４から６３である。現時点で周知の、レクチンドメインアミノ酸７８−８９由来の最も短い活性ペプチドは、アミノ酸７３から８３である。さらに、アミノ酸６６から７８にまたがる重複ペプチドは、非常に活性が高い。アミノ酸６６から８３にまたがる領域から、２つの、活性があってより短い、非重複ペプチドを設計することが可能であり得る。
【０１０６】
表１に示すように、これらの領域のいくつかは、他の領域よりも、セレクチンの間でより高度に保存されている。その結果、全セレクチンを含む、相互作用を調節するための高度に保存された領域由来のペプチドを用いること、およびＧＭＰ−１４０のみを含む、相互作用を調節するためのセレクチンの間でより低い程度で保存されている領域からのペプチドを用いることが可能である。例えば、レクチン領域１９−３４（残基２３−３０）の中心コアは、３つの分子の間で非常に高度に保存されている。対照的に、レクチン領域５４から７２由来のアミノ酸配列５４から６０は、セレクチンの間で多くの違いを有する。
【０１０７】
【表１】
2004002444.tif 000002
ａ．固定化ＧＭＰ−１４０に結合した細胞の数を、Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：７５７−７６０（１９９０）に記載のように決定した。対照Ｃ末端ペプチド（残基７６１−７７７）の存在下において結合した細胞の数を１００％に標準化した。この値は、ペプチドを含まないときに観察されたものと同一であった。ペプチドによる付着の阻害は、１００％よりも大幅に低い付着値により示される。例えば、５％という値は、対照において見られる付着が９５％阻害されたということを示す。すべてのペプチドを加えて、１．５ｍＭという最終濃度にした。
【０１０８】
実施例２：ＧＭＰ−１４０のレクチンドメイン由来のペプチドによる、固定化ＧＭＰ−１４０へのモノクローナル抗体の結合の競合阻害の証明。
【０１０９】
実施例１は、ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインの３つの領域由来のペプチドが、表面に固定化されたＧＭＰ−１４０に対する好中球の結合を阻害するということを示す。そのペプチドがまた、固定化ＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル抗体の結合をも阻害するかどうかを決定するための研究も行った。
【０１１０】
ＧＭＰ−１４０に対する好中球の付着をブロックする３つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発生させ、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３と命名した。精製タンパク質を用いた競合ＥＬＩＳＡに基づいて、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３は各々、異なる、または部分的に重複したエピトープを認識する。１．５ｍＭペプチドを、２．５マイクログラム／ｍｌの濃度でビオチニル化ｍＡｂに添加し、次いで、得られた物質を、実施例１に記載のように、ＧＭＰ−１４０を含むウェルに添加した。結合を、アビジン検出システムを用いたＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１１１】
モノクローナル抗体を、以下のようにビオチニル化した。０．５ｍｌの精製ＩｇＧ抗体（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）に、３．２ｍＭ　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンのジメチルスルホキシド溶液５０μｌおよび１Ｍ　ＮａＨＣ０３　５０μｌを添加した。室温で２時間、暗所でインキュベートした後、５０μｌの１Ｍ　ＮＨ４Ｃｌにより反応を停止した。次いで、ＰＢＳ中で平衡させたＰＤ−１０カラム上でゲル濾過して、ビオチニル化抗体を他の成分から分離した。ＥＬＩＳＡを以下のように行った。全工程を室温で行った。
【０１１２】
１．５ｍＭペプチドを有するまたは有さない、ビオチニル化抗体（２．５μｇ／ｍｌ）を、実施例１に記載のように、ＧＭＰ−１４０によりコートしたウェルでインキュベートした。２時間インキュベートした後、抗体を除去し、ウェルを洗浄し、そして、ＨＢＳＳ／ＨＳＡ中で１：１，０００に希釈した、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したステップアビジン（ｓｔｅｐａｖｉｄｉｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ）０．１ｍｌを３０分間添加した。次いで、ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）０．１ｍｌを１５分間添加した。呈色反応を４０５ｎｍにおいて読み取った。
結果を表２に示す。
【０１１３】
【表２】
2004002444.tif 000003
ａ．固定化ＧＭＰ−１４０を含むマイクロタイターウェルに溶液を添加する前に、ペプチド（１．５ｍＭ）をｍＡｂ（２．５マイクログラム／ｍｌ）に添加した。
ｂ．固定化ＧＭＰ−１４０へのビオチニル化ｍＡｂ　Ｇ１、Ｇ２、またはＧ３の結合を、アビジン検出システムを用いたＥＬｌＳＡにより測定した。
ｃ．Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３は、固定化ＧＭＰ−１４０への好中球の付着を防止する、ＧＭＰ−１４０に結合する抗体である。
【０１１４】
実施例３：好中球の固定化ＧＭＰ−１４０への結合の、ペプチドによる阻害に対する、濃度の影響。
【０１１５】
ＧＭＰ−１４０のレクチン様ドメイン由来のペプチドを、実施例１に記載のアッセイにおいて、固定化ＧＭＰ−１４０への好中球の付着を阻害する、前記ペプチドの能力をアッセイした。テストした濃度は、０．１ｍＭから１．５ｍＭの範囲であった。
【０１１６】
４つのペプチドに関する結果を図２に示す。ＧＭＰ−１４０レクチンドメイン、すなわち、アミノ酸６６−７８、アミノ酸７３−８３、アミノ酸５４−６３、およびアミノ酸２３−３０由来のペプチドが、投与量に依存して結合を阻害したということは明白である。付着を５０％阻害するために必要なペプチドの投与量であるＩＣ５０は、ペプチドによって、約５０μＭから約３００μＭの範囲内で変化する。これらの範囲は、例えば、Ｒｕｏｓｌａｇｈｔｉらの米国特許第４，７９２，５２５号に記載のように、細胞付着および食作用を変更するためにインビボで用いられるＲＧＤ含有ペプチドとの比較に基づくと、ペプチドをインビボで投与する際の効果的な濃度に十分属する。
【０１１７】
実施例４：ペプチドの改変およびＧＭＰ−１４０への付着力の比較
いくつかの場合においては、インビボで分子の半減期を増大させるために、アミノ酸自身の変更、またはキャリヤー分子への付着により、ペプチドを改変することが必要である。
【０１１８】
Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから市販されているＩｍｊｅｃｔキットのような標準的な手順を用いて、レクチンペプチド１９−３４を、そのＮ末端システインにより、キャリヤータンパク質キーホールリンペットヘモシアニンに結合した。次いで、このペプチド−ＫＬＨ複合体を実施例１に記載のアッセイでテストし、結合した細胞の数を決定した。
【０１１９】
図３（ａ）および図３（ｂ）は、（１）ペプチドをコートしていない、（２）ＫＨＬに結合したレクチンドメインペプチド１９−３４をコートした、または（３）ＫＬＨに結合した対照カルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基７６１−７７７）をコートした、マイクロタイターウェルに対して行われ、液相競合体の存在下において、各ウェルに２×１０５個の好中球を添加する前に、ヒト血清アルブミンを含むハンクス平衡塩類溶液によりブロックした、好中球の特異的付着を比較したものである。ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は、皆無（対照）、精製血小板糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ（対照）、または、精製ＧＭＰ−１４０（パネルａ）；あるいは、皆無（対照）、１．５ｍＭ　Ｃ末端ペプチド７６１−７７７（対照）、１．５ｍＭレクチンドメインペプチド１９−３４（パネルｂ）であった。
【０１２０】
グラフより、レクチンペプチド−ＫＨＬ結合体は、プラスチック上に固定化された場合は、天然のＧＭＰ−１４０ほど効果的ではないが、好中球の付着を直接支持するということが明白である。比較のために、ウェルに２００，０００個の好中球を添加した時、レクチンペプチド１９−３４は４０，０００個を結合し、ＧＭＰ−１４０は１２０，０００個を結合した。単にプラスチックヘのペプチドのコートを促進するために、ペプチドをＫＬＨにカップリングする。液相精製ＧＭＰ−１４０およびレクチンペプチド１９−３４を用いるが、他のタンパク質またはペプチドを用いない、付着に関する競合能力は、付着が特異的であるということを示す。他の研究においては、レクチンドメインの他の領域、ＥＧＦドメイン、およびＧＭＰ−１４０の散在した他の領域の多くのペプチドは、固定化ＧＭＰ−１４０に対する好中球の付着を阻害しない。
【０１２１】
実施例５：酵素消化によるＧＭＰ−１４０に対する「リガンド」または「カウンターレセプター」の特性付け
レクチン１９−３４ペプチドは、ＧＭＰ−１４０の白血球との相互作用をブロックする３つのモノクローナル抗体すべてがＧＭＰ−１４０と結合するのを妨げる。これにより、白血球の認識におけるレクチンドメインの重要性がさらに証明される。このデータから、レクチンドメインのコンフォメーションがＥＧＦドメインと相互作用することにより調節され、これらの相互作用は次に、レクチンドメインおよびＥＧＦドメインの両方に結合し得る二価カチオンにより調節されることが仮定される。この結果、好中球および単球上のレセプターに結合する親和性および特異性を付与する３次元コンフォメーションのレクチンドメインが得られる。
【０１２２】
好中球を単離し、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋がないＨＢＳＳに１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡおよび１ｍＭのＣａ２＋を補充した（ＨＢＳＳ／ＨＳＡ／Ｃａ）に４×１０６／ｍｌとなるように懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【０１２３】
好中球をトリプシンまたはエラスターゼのいずれかのプロテアーゼで処理して、このレセプターがプロテアーゼ感受性タンパク質成分を含有しているかどうかを決定した。ＨＢＳＳ／１０ｍＭ　ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５（ＨＢＳＳ／ＭＯＰＳ）中に懸濁した好中球を、２ｍＭのジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）で２２℃で１０分間、２回処理して、内因性血清プロテアーゼを不活性化した。次に細胞をＨＢＳＳ／ＭＯＰＳで洗浄し、８分の１容量の８％パラホルムアルデヒドで２２℃で３０分間、固定して、次に、８分の１容量の０．５Ｍグリシン／０．２５Ｍトリス、ｐＨ７．５を加えた。固定したＨＢＳＳ／ＭＯＰＳ中の好中球（７．５×１０６／ｍｌ）をＴＰＣＫ−トリプシン（０．７７μＭ、４１Ｕ／ｍｌ）と一緒に１０分間、またはエラスターゼ（４０μＭ、７．８Ｕ／ｍｌ）と一緒に３０分間、３７℃でインキュベートした。コントロール細胞をＤＦＰまたは緩衝液のみで予め不活性化した同一濃度の酵素と一緒に同一の条件下でインキュベートした。インキュベーション期間の後、ＤＦＰを加えて２ｍＭとし、細胞を、４００ｇで５分間ペレット化した。細胞をＨＢＳＳ／ＭＯＰＳで再懸濁し、さらにＤＦＰを加えて２ｍＭとした。４００ｇで５分間遠心分離した後、細胞ペレットをＨＢＳＳ／ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／Ｃａ中に４×１０６／ｍｌとなるように再懸濁し、［１２５Ｉ］ＧＭＰ−１４０の特異的結合を決定した。０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭアセテート、ｐＨ６．０、１０ｍｇ／ｍｌ　ＨＳＡ、９ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．０５％アジ化ナトリウム（消化緩衝液）中にＤＦＰ処理して固定した好中球（１．６×１０７／ｍｌ）を、ノイラミニダーゼ、エンド−β−ガラクトシダーゼ、または緩衝液と一緒に、２０μＭロイペプチン、３０μＭアンチパイン、０．６４ｍＭベンザミジン、および１００ＫｌＵ／ｍｌアプロチニンの存在下で、３７℃で時間を変えてインキュべートした。いくつかのインキュべーションでは、消化緩衝液に溶解した０．５から２０ｍＭのノイラミニダーゼインヒビターＮｅｕ２ｅｎ５Ａｃを加えてインキュベーションした。このような濃度では、インヒビターによる反応混合物のｐＨへの影響はなかった。酵素による処理の後、細胞を冷たいＨＢＳＳ／ＨＳＡ／Ｃａで２回洗浄し、ＨＢＳＳ／ＨＳＡ／Ｃａ中に４×１０６／ｍｌとなるように再懸濁して、その後、［１２５Ｉ］ＧＭＰ−１４０の結合を測定した。使用したＮＤＶノイラミニダーゼはウィルス粒子の懸濁液であった。これら粒子の各々は約１０３個のノイラミニダーゼ分子を含有し、一方、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ酵素は溶液中に存在する。
【０１２４】
［１２５Ｉ］ＧＭＰ−１４０の好中球への結合はプロテアーゼによって４から５％に減少したが、ジイソプロピルフルオロホスフェートで不活性化されたエラスターゼまたはトリプシンによっては減少しなかった。これにより、ＧＭＰ−１４０に対する白血球カウンターレセプターの少なくとも実質的なフラクションは、プロテアーゼ感受性タンパク質成分を含有、またはこれに結合することが示される。
【０１２５】
Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，　ＩＮ）またはニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）（Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５４：２１２０−２１２４（１９７９）に記載のように単離）のいずれかから得られるノイラミニダーゼ、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から得られるエンド−β−ガラクトシダーゼにより、好中球を処理した。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａから得られるノイラミニダーゼはα２−３−、α２−６−、α２−８−結合したシアル酸を開裂させる。ＮＤＶノイラミニダーゼは、α２−３−およびα２−８−結合したシアル酸のみを開裂させる。
【０１２６】
好中球をＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａから精製したノイラミニダーゼで処理すると、１２５［ＧＭＰ−１４０］のヒト好中球への結合、および好中球の固定化ＧＭＰ−１４０への付着の両方が著しく減少した。これにより、シアル酸残基がＧＭＰ−１４０に対する白血球のカウンターレセプターの実質的な成分を構成することがわかる。０．１からＯ．２Ｕ／ｍｌのＶ．ｃｈｏｌｅｒａまたはＮＤＶノイラミニダーゼと一緒に１０から３０分間インキュベートすると、ＧＭＰ−１４０の特異的な結合は、偽処理されたコントロールと比較すると各々２８±９および５２±９％（平均値±標準偏差、ｎ＝７）に減少した。この効果はノイラミニダーゼ調整物中の内因性好中球プロテアーゼまたはプロテアーゼの混入のいずれかによるものであるという可能性を最小限にするために、好中球を固定化する前にＤＦＰで処理し、内因性血清プロテアーゼを不活性化した。そして、１０ｍｇ／ｍｌ　ＨＳＡおよびいくつかのプロテアーゼインヒビターの存在下でノイラミニダーゼをインキュベーションした。ノイラミニダーゼ効果の特異性はさらに、ノイラミニダーゼの競合インヒビターＮｅｕ２ｅｎ５Ａｃが、ＧＭＰ−１４０の好中球への結合がノイラミニダーゼにより減少するのを阻止し得ることにより示された。Ｎｅｕ２ｅｎ５Ａｃは、用量依存的にノイラミニダーゼの効果を阻害し、ＩＣ５０は２．５ｍＭであった。
【０１２７】
これらの結果により、ＧＭＰ−１４０に対する白血球上のカウンターレセプター、またはリガンドは糖タンパク質であり、ここでは、レセプター機能のためにはシアル酸が必要であることが示される。好中球はα２−３−およびα２−６−結合したシアル酸を共に含有するが、α２−８−結合は検出されていない。ＮＤＶノイラミニダーゼで処理した後、ＧＭＰ−１４０の結合が一部失われることから、レセプター中のシアル酸結合の少なくともいくつかはα２−３−型であることが示唆される。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ酵素を使用してさらに大きな阻害が観察されたことは、α２−６−結合がまたレセプター機能のためにも必要であることを意味し得、または、これらの結果は、無傷ウィルスの成分であるＮＤＶ酵素によって本質的な結合のすべてに接近し得ないためであり得る。
【０１２８】
赤血球細胞およびリンパ球細胞とは対照的に、骨髄細胞は、α２−３−またはα２−６−結合シアル酸を末端とし得るポリラクトサミノグリカンが豊富である。これらラクトサミノグリカンの多くはフコシル化されている。これらの構造は好中球の糖タンパク質および糖脂質の両方に存在する。ＧＭＰ−１４０の認識におけるこれらグリカンの可能な役割を調べるために、細胞を、糖タンパク質の分枝していないポリラクトサミニル側鎖のガラクトースとＮ−アセチルグルコサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）との間のβ１−４結合を加水分解するエンド−β−ガラクトシダーゼで処理した。固定した好中球をＯ．２Ｕ／ｍｌまでのＥ．ｆｒｅｕｎｄｉｉエンド−β−ガラクトシダーゼで３０分間、または０．４Ｕ／ｍｌまでのＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓエンド−β−ガラクトシダーゼで６０分間、前処理してもＧＭＰ−１４０の特異的結合に対する影響はなかった。これらの酵素が結合に影響を与えないことは、ＧＭＰ−１４０を認識する構造がポリラクトサミン側鎖上には存在しないことと一致する。別の可能性として、および恐らくより高い可能性として、関連する側鎖はこれらの条件下では酵素による加水分解に対して非感受性であり得る。分枝したポリラクトサミノグリカンは好中球には存在しないが、高度にフコシル化したおよび／または分枝したポリラクトサミノグリカンはこの酵素による加水分解に耐性である。さらに、Ｎ−またはＯ−結合構造のコアに直接結合する単一のラクトサミノグリカンは酵素に耐性であり得る。
【０１２９】
実施例６：シアル化したフコシル化構造がＧＭＰ−１４０に結合するための必要条件
以下の研究は、ジョージア大学のＲｉｃｈａｒｄ　Ｃｕｍｍｉｎｇｓによりチャイニーズハムスターの卵巣細胞、すなわちＣＨＯ細胞を使用して行われた。使用した細胞系には、Ａｄｅ−Ｃ細胞および特異的グリコシルトランスフェラーゼで永久にトランスフェクトされたＡｄｅ−Ｃ細胞が含まれる。Ａｄｅ−Ｃ細胞は、これらが非常に低レベルの内因性α（１，３）フコシルトランスフェラーゼを含有するために選択された。これらの細胞は以下に述べる研究では野生型細胞と呼ばれる。トランスフェトされた細胞は、野生型細胞上には存在しない特定の型のオリゴ糖を発現する。Ｌｅｃ８　ＣＨＯと呼ばれる、使用する別のＣＨＯ細胞系にはＵＤＰＧａｌに対するトランスポーターを欠く。この結果、細胞にはガラクトシル化およびシアル化した複合糖質がない（ＤｅｕｔｓｃｈｅｒおよびＨｉｒｓｃｈｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６１：９６−１００，１９８６）。これらのいくつかの細胞に存在するオリゴ糖構造およびその細胞の型を表３に示す。関連する細胞としては、野生型細胞（ＣＨＯ）、ネオルイス（Ｎｅｏ　Ｌｅｗ）、ネオルイス関連細胞（Ｎｅｏ　Ｌｅｗ（ｒｅｌ））、およびＬｅｃ８　ＣＨＯ細胞（Ｌｅｃ８）がある。
【０１３０】
【表３】
2004002444.tif 000004
以下の方法を用いて細胞を培養およびトランスフェクトした。
【０１３１】
ＣＨＯ系のＡｄｅ−Ｃ（０ａｔｅｓおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、Ｓｏｍ．　Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．　３：５６１−５７７（１９７７）；Ｖａｎ　Ｋｅｕｒｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３８：７９３−８０４（１９８６））を、１０％のウシ胎児血清を補充したα−改変イーグル培地で増殖させた。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＩＢＣ０）（活性薬剤）を補充した培地で増殖させた。
【０１３２】
前述のように、Ａｄｅ−Ｃ　ＣＨＯ細胞をα（１，３／１，４）フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで安定にトランスフェクトすることにより、Ｎｅｗ　Ｌｅｗ　ＣＨ０細胞を調製した（Ｌｏｗｅら、Ｃｅｌｌ　６３：４７５−４８４，１９９０、この文献ではこの細胞をＣＨ０−ＦＴと呼んだ）。野生型ＣＨＯ細胞を、ＧＤＰフコースが非シアル化ラクトサミノグリカンのみに転移するのを触媒するα（１，３）フコシルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡで同様の方法により安定にトランスフェクトすることにより、Ｎｅｏ　Ｌｅｗ（ｒｅ１）（ｒｅ１）関連細胞を調製した。このトランスフェラーゼは、Ｌｏｗｅら、Ｃｅｌｌ　６３：４７５−４８４、１９９０に記載されている。これらトランスフェクトされた細胞系は共にミシガン大学のＤｒ．Ｊｏｈｎ　Ｌｏｗｅから贈与されたものである。
【０１３３】
ＧＭＰ−１４０を含有するセレクチンが結合する炭水化物に関する結果および結論野生型ＣＨＯ細胞およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞により生成される構造を表３に示す。野生型ＣＨＯ細胞はＧａｌβ１，４　ＧｌｃＮＡｃβ１，３二糖類の単位を繰り返し発現し、これらのうちのいくつかはα２，３結合する末端シアル酸（ＮｅｕＡｃ）を有する。これらはα２，６結合するシアル酸結合を有せず、またフコース結合を有しない。さらに、これらはＩＩ型構造（３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１）を合成するが、Ｉ型構造（３Ｇａ１β１，３ＧｌｃＮＡｃβ１）は合成しない。ＮｅｏＬｅｗｉｓ細胞はα１，３（４）フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされ、これはドナーとしてＣＤＰフコースを使用し、そしてフコースがＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに付加するのを触媒してＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成させる。これはＬｅｘ構造である（時には、ＳＳＥＡ−１抗原としても知られている）。同じ酵素は、フコースをシアル化基質ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａ１β１，４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに転移して、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する。これはシアリルＬｅｘ構造である。他の２つの関連する構造、ＶＩＭ−２およびジフコシルＬｅｘもまた、表に示すように、ＮｅｏＬｅｗｉｓ細胞および他の多種類のシアル化したポリフコシル化ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン型構造により生成される。ＮｅｏＬｅｗｉｓ関連細胞を、異なるフコシルトランスフェラーゼである、α１，３フコシルトランスフェラーゼでトランスフェクトした。これは、ＧＤＰフコースがＧａ１β１，４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒの非シアル化基質のみに転移するのを触媒する。これは、Ｌｅｘ構造を生成する（表３参照）。
【０１３４】
これらの細胞のＧＭＰ−１４０と相互作用する能力を試験するために、好中球およびＨＬ６０細胞に対して使用される付着アッセイ（Ｊ．−Ｇ．Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：７５７−７６０，１９９０）を僅かに改変した方法を、精製されたＧＭＰ−１４０およびＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル抗体と共に使用した。ＧＭＰ−１４０を濃度を高めながらプラスチックのウェルに固定し、次にウェルをアルブミンを含有する緩衝液でブロックした。［３５Ｓ］メチオニンで代謝的に標識されたＣＨＯ細胞またはＨＬ−６０細胞を、Ｃａ２＋の存在下または非存在下でウェルに加えて、結合した細胞を可溶化し、そして放射能を定量することにより付着力を測定した。
【０１３５】
結合アッセイの結果を図４Ａ（ＣＨＯのＧＭＰ−１４０への結合）；図４Ｂ（Ｌｅｃ　８ＣＨＯのＧＭＰ−１４０への結合）；図４Ｃ（ＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨＯのＧＭＰ−１４０への結合）；および図４Ｄ（ＨＬ６０細胞のＧＭＰ−１４０への結合）に示す。
【０１３６】
Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：７５７−７６０（１９９０）に記載のように、ＨＬ−６０細胞は、Ｃａ２＋に依存的にＧＭＰ−１４０でコートしたウェルに特異的に結合した。野生型ＣＨＯ細胞、Ｌｅｃ　８　ＣＨＯ細胞、およびＮｅｏＬｅｗｉｓ関連ＣＨＯ細胞は結合しなかった。しかし、ＨＬ−６０細胞のように、ＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨＯ細胞は、Ｃａ２＋に依存的に固定したＧＭＰ−１４０に強く結合した。付着は特異的であった。これは、図５に示すように、ＧＭＰ−１４０に対するブロッキングモノクローナル抗体であるＧ１により阻害されるが、非ブロッキング抗体であるＳ１２によっては阻害されなかったためである。付着性は決定的にシアル酸に依存した。これは、ＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨ０細胞をＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａから得られるノイラミニラーゼで処理することにより、結合が破壊されたためである。ＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨ０細胞をトリプシンで予め処理することにより結合が６０％減少した。これにより、細胞上のＧＭＰ−１４０に対するオリゴ糖リガンドの少なくとも実質的なフラクションがタンパク質により運ばれることが示唆される。
【０１３７】
これらのデータにより、ＧＭＰ−１４０に対するオリゴ糖リガンドはシアル化したフコシル化構造であることが確認される。シアル酸結合は、ＣＨＯ細胞がα２，６結合を有しないため、Ｇａｌにα２，３結合し得る。フコース結合はＧｌｃＮＡｃにα１，３結合し、ＧｌｃＮＡｃにはβ１，４結合によりＧａｌが結合している。可能な構造としては、シアリルＬｅｘ自体、ジフコシルシアリルＬｅｘ、シアリルＬｅｘのより長いポリフコシル化ポリラクトサミノグリカン変異株、または上記成分の要素を含有する分枝構造がある。Ｌｅｘ自体は結合に対する必要な親和性または特異性を提供しない。末端シアル酸に最も近いＧｌｃＮＡｃに結合するＦｕｃがないシアル化構造を有するＶｌＭ−２は、この構造はＧＭＰ−１４０に結合しないＮｅｏＬｅｗｉｓ関連細胞上に存在するため、ＧＭＰ−１４０に対して親和性を有し得る。しかし、ＮｅｏＬｅｗｉｓ関連細胞上に存在するＶＩＭ−２の数量は知られていない。数量が少ない場合は、ＶＩＭ−２がＧＭＰ−１４０に対していくらか親和性がある場合でも、細胞は十分には結合しない。
【０１３８】
別の研究により、高濃度のＬｅｘは付着を阻害することが示されているが、Ｌｅｘ三糖類を含むＬＮＦＩＩＩは、３００μＭまでの濃度では、精製され固定化されたＧＭＰ−１４０への好中球の結合には全く影響を及ぼさない。
【０１３９】
実施例７：ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１によるリガンドの結合における相違の証明
ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０に対するリガンドが同一または非常に類似していることを示すデータにもかかわらず、そうではないことを示す２つの証拠がある。
【０１４０】
まず第１に、ＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への好中球の付着は、両タイプのトランスフェクトされた細胞に対して特異的な付着を示す。Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）に記載されているように、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされた細胞への付着を、ＧＭＰ−１４０に対するモノクローナル抗体Ｇ１によりブロックし、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞への付着を、ＥＬＡＭ−１に対するモノクローナル抗体Ｈ１８／７によりブロックした。しかし液相ＧＭＰ−１４０は、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされた細胞への付着をブロックしたが、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞への付着には影響を与えなかった（図６）。
【０１４１】
第２に、豊富な量のシアリルＬｅｘを含むヒトがん腫細胞系ＨＴ−２９は、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞に結合するが、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされた細胞には結合しない（図７）。
【０１４２】
図６および図７のデータは、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１が、若干異なる構造のリガンドを認識し、そして／または同じリガンドを認識する親和性の点で異なることを示している。ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１はそれぞれ、親和性の程度が異なる関連したオリゴ糖構造の範囲に結合し得る。
【０１４３】
ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０による結合を比較研究するために使用される方法および物質は、以下のものであった：
細胞の単離および培養物
Ｍｏｏｒｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１２、４９１−４９９（１９９１）に記載されているように、モノポリ分離媒体を用いて、正常なボランティアからヒト好中球を単離した。ヒトＨＬ−６０前骨髄細胞およびＨＴ−２９ヒト結腸がん腫細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ＨＬ−６０細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ウシ胎児血清中に保存した。ＨＴ−２９細胞を、１０％ウシ胎児血清（ｆｃｓ）を補充したＭｃＣｏｙの５ａ培地の培養物中に保存した。ＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ血清を補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＨＧ−ＤＭＥＭ）中に保存した。
【０１４４】
ＣＯＳ７細胞トランスフェクションおよび好中球ロゼッティングアッセイＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１をコードする全長ｃＤＮＡを、Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９９０）により記載されているように、ＣＤＭ８に挿入した。ＣＯＳ７細胞を、１０％ウシ血清を補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）（ＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ）を含む１０ｃｍペトリ皿において、約８０％コンフルエンスになるまで増殖させた。５０μｌのトランスフェクチンＴＭ試薬（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、５０μｌの水中２０μｇのｃＤＮＡまたは水のみと混合し、室温で１５分間放置した。ＣＯＳ細胞を３ｍｌの０ｐｔｉＭＥＭＴＭＩ還元血清血清培地（ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で２回洗浄した後、ｃＤＮＡ−リポフェクチン試薬混合物を加え、５％のＣ０２雰囲気中３７℃で一昼夜インキュベートした。６ｍｌのＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳを加え、細胞をさらに２４時間インキュベートした。次いで、Ｃａ＋２およびＭｇ＋２を含まないＨＢＳＳで単層を１回洗浄し、０．０２％のＥＤＴＡを用いて細胞を分離し、遠心分離によりペレット化し、次いで１２ｍｌのＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳ中で再懸濁した。２ｍｌの細胞懸濁液を、３ｍｌのＨＧ−ＤＭＥＭ／１０％　ＣＳを含む６−ウェルの組織培養物（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含む各ウェルにプレートし、さらに２４時間増殖した。付着アッセイの前に、ウェルをＨＢＳＳで２回洗浄した。ウェルを、３０μｇ／ｍｌのＧ１　Ｆ（ａｂ’）２、Ｈ１８／７　Ｆ（ａｂ’）２または緩衝液のみを含む０．５ｍｌのＨＢＳＳと一緒に２２℃で３０分間インキュベートし、これを２回繰り返した。次いで、３０μｇ／ｍｌのＧＭＰ−１４０または希釈液の存在下で３０分間インキュベートして新たに単離したヒト好中球（ＨＢＳＳ中２×１０６／ｍｌ）１ｍｌを単層に加え、２２℃で２０分間インキュベートした。
【０１４５】
新たに単離したヒト好中球または３５Ｓ−メチオニンで標識したＨＴ−２９細胞（ＨＢＳＳ中２×１０６／１％ＨＳＡ）を１ｍｌ加え、２２℃で２０分間インキュベートした。いくつかの実験において、付着アッセイの前に、好中球を、精製されたＧＭＰ−１４０（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）と一緒に２２℃で３０分間、インキュベートした。
【０１４６】
細胞付着をアッセイするために、５ｍｌのＨＢＳＳ／１％　ＨＳＡで５回洗浄した後、付着した好中球を、５０ｍＭのリン酸カリウム中０．５％のヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム（ｐＨ６．０）２００μｌで可溶性にした。Ｇｅｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３，７５７−７６０（１９９０）により記載されているように、付着した好中球をミエロペルオキシダーゼで２回繰り返しアッセイした。ＨＴ−２９細胞付着をアッセイするために、付着細胞を１％のトリトンＸ１００で可溶性にし、液体シンチレーションカウンティングにより定量した。界面活性剤を加える前に、単層を位相差顕微鏡検査により検査し、単層が十分に洗浄され、ＣＯＳ細胞単層が無傷であることを確認した。
【０１４７】
結果
ＧＭＰ−１４０は、ＧＭＰ−１４０をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞への好中球の付着を阻害するが、ＥＬＡＭ−１をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞への付着は阻害しない。ＣＯＳ７細胞を、ＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１をコードするｃＤＮＡで偽トランスフェクトまたはトランスフェクトした。精製されたＧＭＰ−１４０、Ｇ１　Ｆ（ａｂ’）２またはＨ１８／７　Ｆ（ａｂ’）２（最終濃度はすべて１０μｇ／ｍｌ）が、トランスフェクトされたＣＯＳ７細胞に好中球がロゼッティングするのを阻害する能力を、図６に示す。データは、２つの独立したトランスフェクション実験からの結果である。各トランスフェクションにおいて、ＧＭＰ−１４０およびＧ１　Ｆ（ａｂ’）２またはＨ１８／７　Ｆ（ａｂ’）２の存在下または非存在下で、付着アッセイを単層上で２回繰り返し行った。結果を、結合した好中球の数（平均±ＳＤ）として表す。
【０１４８】
この結果は、好中球が、ＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞に結合し、その結合が適切なモノクローナル抗体により阻害されることを明確に示している。すなわち、抗ＥＬＡＭ−１抗体（Ｈ１８／７）は、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞への好中球の結合をブロックし、抗ＧＭＰ−１４０抗体（Ｇ１）は、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への好中球の結合をブロックする。しかし、液相ＧＭＰ−１４０は、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への好中球の付着を完全にブロックするが、ＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞への好中球の付着には影響を与えない。
【０１４９】
次いで、大量のシアリルＬｅｘ構造を含むＨＴ−２９細胞の結合における相違を調べるために、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞を用いた。図７に示す結果は、ＨＴ−２９細胞がＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされた細胞に強く結合するが、ＧＭＰ−１４０でトランスフェクトされた細胞には全く結合しないことを示している。従って、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１は両方とも、α（２，３）シアル化α（１，３）フコシル化ラクトサミノグリカンを含むオリゴ糖構造を認識するが、ＨＴ−２９細胞と、ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１でトランスフェクトされたＣＯＳ細胞との相互作用は、同一ではない。
【０１５０】
実施例８：好中球におけるＧＭＰ−１４０リガンドのタンパク質成分の特性付け
トリプシンによる好中球の処理により、特異的なＧＭＰ−１４０の結合が破壊された。このことは、好中球におけるＧＭＰ−１４０に対する優勢なリガンドがグリコスピンゴリピドではなく表面糖タンパク質であることを示している。図８に示すように、ＨＬ−６０細胞およびＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨＯ細胞のトリプシン処理もまた、ＧＭＰ−１４０へのそれらの付着を著しく減少させた。このことは、糖タンパク質成分は、これらの細胞におけるＧＭＰ−１４０に対する主要なリガンドでもあることを示している。ＣＨＯ細胞により合成された単一糖脂質は、トランスフェクトされたフコシルトランスフェラーゼの基質ではないため、糖脂質リガンドは、ＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨＯ細胞上では期待されない。ＧＭＰ−１４０により認識されるオリゴ糖構造を有する表面タンパク質は、ヒト骨髄細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞においては同一ではないようである。このことは、リガンドへのＧＭＰ−１４０の強い親和性結合は、タンパク質間の相互作用を必要としないことを示唆している。
【０１５１】
トリプシン処理については、ＨＥＰＥＳ緩衝液Ａ中で懸濁したＮｅｏＬｅｗｉｓ　ＣＨ０細胞を、０．１％のＤＰＣＣ−トリプシンと一緒に３７℃で１０分間インキュベートした。コントロール細胞を、ＤＦＰで不可逆的に不活性化したＤＰＣＣ−トリプシンと一緒に、同一条件下でインキュベートした。トリプシン処理後、細胞を氷上で冷凍し、最終濃度が２ｍＭになるようにＤＦＰを加えて酵素を不活性化した。トリプシンで処理した後、アッセイする前に、細胞を氷で冷却したＨＥＰＥＳ緩衝液Ａで２回洗浄した。
【０１５２】
好中球の場合、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、ＧＭＰ−１４０で認識された主要な糖タンパク質の、見かけ上のＭｒは約１２０，０００であることが証明されている。ヒト好中球の原形質膜フラクションを調製し、その調製物を「リガンドブロッティング」で分析した。この調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、イモビロン膜に移し換え、［１２５Ｉ］ＧＭＰ−１４０でプローブした。還元条件下では、標識されたＧＭＰ−１４０は１２０−ｋＤバンドに一貫して結合しているのが観察された。この結合は特異的である。なぜなら、Ｃａ２＋依存性であり、抗体Ｇ１によりブロックされるが、Ｓ１２によってはブロックされず、ノイラミニダーゼによる膜の前処理により除去されるからである。このタンパク質は、小麦胚芽凝集素アフィニティーカラム上に定量的に結合し、このことは、シアル化されたオリゴ糖を広く含むことを示している。
【０１５３】
このタンパク質は、ＡｆｆｉｇｅｌＴＭに結合したＧＭＰ−１４０のアフィニティーカラムに結合し、カラムから溶出され得る。部分的に精製されたタンパク質は、銀およびクーマシーブルーではあまり染色されない。このタンパク質は、同様の見かけ上のＭｒを有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に染色パターンを有するロイコシアリンとして公知の、強く０−グリコシル化されたタンパク質を示し得る。さらに、低用量のノイラミニダーゼでこのタンパク質を処理すると、タンパク質からはすべてのシアル酸が除去されるわけではないが、結果としてゲル上の移動度はゆるやかになり、特定の強く０−グリコシル化されたタンパク質が部分的に脱シアル酸化されたパターンと一致する。
【０１５４】
ＧＭＰ−１４０に対するオリゴ糖リガンドを有する骨髄細胞には、他のタンパク質が存在し得る。リガンドブロッティングにより決定されるように、１２０−ｋＤａ糖タンパク質は、ＧＭＰ−１４０に最も強い親和性で結合する最も豊富なリガンドおよび／またはその構造を示し得る。
【０１５５】
ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインまたはＧＭＰ−１４０と相互作用する炭水化物由来のペプチドからの診断試薬および治療薬の調製上記のペプチドおよび炭水化物は、診断試薬として様々に応用され、特に、多くの炎症性疾患の治療に適用される。
【０１５６】
診断試薬
ＧＭＰ−１４０に結合するペプチドおよび抗体または炭水化物に対する他のプローブはまた、ＧＭＰ−１４０のリガンドを欠くヒトの疾患の検出に使用され得る。このような疾患は、白血球が活性化された血小板または内皮に結合し得ない感染症に感染しやすい患者に多く見られる。テストされる細胞、通常白血球を、医学的に容認されている標準技術で集めてスクリーニングする。検出システムには、ＥＬｌＳＡ法、放射標識された抗体の固定化された活性化細胞への結合、フローサイトメトリー、または当業者に公知の他の方法が含まれる。
【０１５７】
レクチンドメインペプチドの存在下および非存在下での結合の阻害は、セレクチン結合における欠陥または改変を検出するのに使用され得る。このような疾患は、ＧＭＰ−１４０に対する白血球のリガンドがないために、白血球が血小板および内皮に対して結合しない感染症に感染しやすい患者に多く見られる。ＧＭＰ−１４０ペプチドを、蛍光タッグで放射的に、酵素的に、または電子顕微鏡の金のような高電子密度物質で標識する。検査される細胞、通常白血球は、標識されたＧＭＰ−１４０ペプチドと一緒にインキュベートされ、結合は、ＧＭＰ−１４０に対する抗体を用いて上記の方法により評価されるか、または当業者に公知の他の方法により評価される。ＧＭＰ−１４０に対するリガンドが血漿中にも見いだされると、それらはまた、検出試薬として抗体の代わりに標識されたＧＭＰ−１４０ペプチドを用いて、標準ＥＬｌＳＡ法またはラジオイムノアッセイ法により測定され得る。
【０１５８】
同様のアプローチは、ＧＭＰ−１４０の定性的または定量的な疾患を決定するのにも使用され得る。炭水化物を標識し、ＧＭＰ−１４０に欠陥があると思われる疾患を有する患者からの活性化血小板におけるＧＭＰ−１４０への炭水化物の結合能力をテストする。
【０１５９】
臨床上の応用
ＧＭＰ−１４０は、白血球付着、炎症および凝血に関連したいくつかの機能を有するため、ＧＭＰ−１４０ならびに／あるいは、ＥＬＡＭ−１およびＬＥＵ−８を含む、ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物のような他のセレクチン結合に相互作用する臨床上の化合物は、これらの応答を調節するために使用され得る。
【０１６０】
例えば、ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物は、活性化された血小板または内皮細胞の表面にあるＧＭＰ−１４０のレセプターへ競合的に結合することにより、白血球の付着を競合的に阻害するのに使用され得る。この種の治療法は、白血球により媒介される炎症の阻害が望ましい急性の状況下において特に有用であり得、効果的であるが一時的である。ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物の注入による慢性治療法もまた、いくつかの状況では可能である。
【０１６１】
炎症応答は、もし再チェックされなければ、宿主を損傷し得る。なぜなら、白血球は、正常な組織を損傷し得る有毒な分子を多く放出するためである。これらの分子には、タンパク質分解酵素およびフリーラジカルが含まれる。白血球が組織に損傷を与え得る病理的状態の例としては、虚血および再灌流からの傷害、細菌性敗血症、血管内凝固症候群、成人呼吸性困難症候群、腫瘍転移、慢性関節リウマチ、およびアテローム硬化症が挙げられる。
【０１６２】
灌流傷害は、臨床心臓学において主要な問題である。虚血性心筋層における白血球付着を減少させる治療剤は、血栓崩壊性剤の治療的効能を著しく引き上げ得る。組織プラスミノゲン活性剤またはストレプトキナーゼのような物質による血栓崩壊性療法は、可逆的な心筋細胞死の前の深刻な心筋虚血を有する多くの患者における環状動脈閉塞を和らげ得る。しかし、このような患者の多くは、血流の回復にもかかわらず心筋神経症を煩っている。この「再灌流傷害」は、心筋領域における血管内皮への白血球の付着と関連していることが知られている。これは、一部には、白血球に対して付着性とする、トロンビンおよびサイトカインによる血小板および内皮の活性化のためであろう（Ｒｏｍｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　６７：１０１６−１０２３，１９８３）。これらの付着白血球は、内皮を通じて拡散し、血流の回復により救済されるように心筋虚血を破壊し得る。
【０１６３】
心筋および再灌流により、発作、腸間膜および末梢血管、臓器移植、および循環器系統のショック（この場合、多くの臓器は血流の回復により傷害を与えられる）を含む、血管表面への白血球の付着による臓器傷害が引き起こされる、多数の他の通常の臨床上の疾患がある。
【０１６４】
細菌性敗血症および血管内凝固症候群はしばしば重症の患者には同時に発生する。これらは、トロンビン、サイトキンおよび他の炎症性媒介物、血小板および内皮の活性化、白血球の付着、ならびに血管系全体における血小板の凝集と関連している。白血球に依存する臓器傷害は、これらの症状の重要な特徴である。
【０１６５】
成人呼吸性困難症候群は、敗血症または肺循環における白血球の広範囲な付着および凝集と関連する以下の外傷を有する患者において発生する荒廃する肺疾患である。これにより、大量の血漿が肺に溢血し、肺組織が破壊される。大抵、これらは両方とも白血球産物により媒介される。
【０１６６】
しばしば致命的な２つの関連した肺疾患は、同種間の骨髄移植を受ける免疫抑制患者、およびインターロイキン−２で処理されたＬＡＫ細胞（リンフォカイン活性リンパ球）を用いた治療により生じる血管漏れに起因する合併症を煩うがん患者において見られる。ＬＡＫ細胞は、血管壁に付着し、内皮に毒性と思われる産物を放出することが公知である。ＬＡＫ細胞が内皮に付着するメカニズムは知られていないが、このような細胞は、内皮を活性化する分子を潜在的に放出し、次いで好中球において作用するメカニズムと同様のメカニズムにより内皮に付着する。
【０１６７】多くの悪性腫瘍（がん腫、リンパ腫および肉腫）からの腫瘍細胞は、血管系を通じて遠位部位に転移し得る。腫瘍細胞が内皮に付着するメカニズムおよびそれに続く移行は、あまりよく理解されていないが、少なくともいくつかの点で、白血球のメカニズムと同様であり得る。血小板と転移腫瘍細胞との結合については詳しく記載されており、いくつかのがんの蔓延における血小板の役割を示唆している。
【０１６８】
血小板−白血球の相互作用は、アテローム硬化症において重要であると考えられる。血小板は、単球がアテローム硬化プラークに補充される際の役割を果たし得る。単球の蓄積は、アテローム発生中の最も初期に検出可能な症状の１つであることが知られている。完全に発達したプラークが破裂すると、血小板の沈着、活性化、血栓形成の促進、ならびに虚血領域への好中球の初期補充が引き起こされ得る。
【０１６９】
他の領域における可能な応用は、慢性関節リウマチの治療である。
【０１７０】
これらの臨床上の応用では、適切な薬学的キャリヤー中のペプチドまたは炭水化物またはその混合物は、迅速な緩和を必要とする場所に静脈注射により投与されるのが好ましい。ペプチドもしくは炭水化物はまた、キャリヤー分子に結合したペプチドもしくは炭水化物として、筋肉内、腹膜内、皮下、経口により、または薬物送達装置によっても投与され得る。ペプチドまたは炭水化物は、インビボにおける半減期を増加させるために、さらに化学的に改変され得る。
【０１７１】
ペプチドは、ＧＭＰ−１４０のタンパク質分解的開裂、または好ましくは実施例１においてペプチドを調製するために使用したような合成手段により調製され得る。これらの方法は、当業者により公知である。例としては、米国特許第４，７９２，５２５号において使用され、米国特許第４，２４４，９４６号において記載されている、Ｊ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　８５，２１４９（１９６４）により記載の固相合成が挙げられる。この合成では、保護されたαアミノ酸は、適切な樹脂に結合され、Ｃ末端から開始するペプチドの合成を開始する。他の合成方法については、米国特許第４，３０５，８７２号および第４，３１６，８９１号に記載されている。これらの方法は、ＧＭＰ−１４０と同一の配列を有するペプチド、またはアミノ酸の置換物または付加物を合成するのに使用され得、これらは、実施例１および２に記載されているように、その活性を調べるためにスクリーニングされ得る。
【０１７２】
ペプチドはまた、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸のような有機酸との反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、およびモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリルアミンのような有機塩基、および置換エタノールアミンとの反応により形成される薬学的に受容可能な酸または塩基付加塩として投与され得る。
【０１７３】
シクロプロピルアミノ酸、または同様に誘導されるアミノ酸を含むペプチドもまた使用され得る。これらのペプチドは、その最初の活性を保持するが、インビボにおいて半減期を増加した。アミノ酸を改変することが知られている方法、およびその使用については、例えば、Ｓｔａｍｍｅｒの米国特許第４，６２９，７８４号に記載されているように、当業者に公知である。
【０１７４】
炭水化物は、天然に、またはトランスフェクトされたＣｏｓ細胞の例において記載されているような遺伝子工学の結果、または好ましくは合成手段により、炭水化物を発現する細胞から単離され得る。これらの方法は、当業者に公知である。さらに、多数のグリコシルトランスフェラーゼがクローニングされている（Ｊ．Ｃ．ＰａｕｌｓｏｎおよびＫ．Ｊ．Ｃｏｌｌｅｙ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６４：１７６１５−１７６１８，１９８９）。従って、当業者は、調合薬または診断試薬を調製するために、合成化学および酵素的合成を組み合わせて使用することができる。
【０１７５】
生物学的に活性なペプチドおよび炭水化物は、ＧＭＰ−１４０への好中球および単球の結合を阻害するもの、またはＥＬＡＭ−１および／またはホーミングレセプターの媒介による白血球の内皮への付着を阻害するものである。
【０１７６】
患者への投与に適切な薬学ビヒクルは、当業者に公知である。非経口投与では、ペプチドまたは炭水化物は、通常、滅菌水または生理食塩水中で溶解または懸濁され得る。腸内投与では、ペプチドまたは炭水化物は、錠剤、液体またはカプセル形態で不活性キャリヤーに導入され得る。適切なキャリヤーは、デンプンまたは砂糖であり、潤滑剤、香料、結合剤および同じ特性を有する他の物質が含まれる。ＧＭＰ−１４０ペプチドまたは炭水化物はまた、創傷部または炎症部位に、特異的には溶液またはクリームで塗布して局部投与され得る。
【０１７７】
あるいは、ペプチドまたは炭水化物は、リポソームまたはマイクロスフェア（または微量粒子）で投与され得る。患者へ投与するためのリポソームおよびマイクロスフェアを調製するための方法は、当業者に公知である。米国特許第４，７８９，７３４号は、リポソーム中に生物学的物質をカプセル化する方法について記載している。実質的に、物質は、水溶液に溶解され、必要に応じて、界面活性剤と共に適切なリン脂質および脂質が添加され、物質は、必要に応じて透析または超音波処理される。公知の方法は、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１４章、”Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”，Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｐｐ．２８７−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９７９）により詳しく記載されており、その教示は本願で参考のために援用している。ポリマーまたはタンパク質により形成されるマイクロスフェアは、当業者に公知であり、胃腸管を通じて血流に直接送達されるように設計され得る。
あるいは、ペプチドまたは炭水化物が導入され、マイクロスフェアまたはマイクロスフェアの複合体が数日から数カ月の期間に渡ってゆっくりと放出されるように移植され得る。例えば、米国特許第４，９０６，４７４号、第４，９２５，６７３号および第３，６２５，２１４号を参照。
【０１７８】
主題のペプチドは、一般に、体重１ｋｇ当り約１μｇより多い量で非経口投与されると活性となる。大抵の炎症性疾患の治療には、投与量は、体重１ｋｇ当り０．１から３０ｍｇの間である。実施例で特徴づけられるペプチドの中には、７０ｍｇ／ｋｇの投与量が必要なものもある。この投与量は、一部には、１つ以上のペプチドが投与されるか否かに依存し得る。レクチンドメインの３つの領域の結合に関して記載されているように、相乗効果は、レクチンドメインの異なるまたは重複する領域からのペプチドの組合せ、またはＧＭＰ−１４０のＥＧＦドメイン由来のペプチドとの組合せにより見られる。
【０１７９】
炭水化物は、非経口または他の手段により投与されるときに、活性とならなければならない。必要な量は、インビトロアッセイにおけるＧＭＰ−１４０の骨髄性細胞への結合の阻害に必要な濃度、および注入された炭水化物のクリアランス速度に基づく。この投与量は、一部には、１つまたはそれ以上の炭水化物が投与されるか否かに依存し得る。相乗効果は、炭水化物の組合せ、または多価形態の天然のリガンドもしくはＧＭＰ−１４０に対する親和性および／または親和力を増加させるために設計されたリガンドの誘導体により見られる。
【０１８０】
ペプチドまたは炭水化物はまた、白血球の血小板または内皮への付着を防止するために、身体に注入される補てつ物として使用されるために、基質にコーティングされ得る。
【０１８１】
ＧＭＰ−１４０、そのペプチドまたは炭水化物の抗体を用いた治療理学療法に対する応答を評価するための基準は、特定の条件により左右され、通常、標準的な医学的実践に従う。例えば、心筋梗塞の拡張を防止するために有効な投与量の基準は、心電図、生存徴候および臨床応答をモニターして、血漿中の心筋懐死のマーカー酵素を観察することにより、当業者により決定され得る。急性呼吸性困難症候群の治療では、動脈酸素および肺浸潤物の分解における改善、ならびに呼吸困難および頻呼吸の減少により測定される臨床上の改善が調べられる。ショックを起こした（低血圧）の患者の治療では、有効な投与量は、臨床上の応答、および血圧回復後の、肝臓および腎臓のような生体臓器の機能の特異的な測定に基づく。神経機能は、発作を起こした患者においてモニターされる。移植された臓器の機能をモニターするために、特異的なテストが使用され、例えば、腎臓移植を受けた患者の血清、尿流、および血清電解質がモニターされる。
【０１８２】
本発明の変更および改変、ＧＭＰ−１４０由来のペプチドを用いたＧＭＰ−１４０を含む結合反応を調節する方法、またはＧＭＰ−１４０リガンドの部分を形成する方法は、上記の詳細な記載より当業者に自明である。このような変更および改変は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【０１８３】
ＧＭＰ−１４０のレクチン結合領域の３つの領域由来のペプチドは、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターを含む、「セレクチン類」と選択的に相互作用することが発見された。３つの領域には、アミノ酸１９−３４、５４−７２および６６−８９が含まれる。この番号は、シグナルペプチドを開裂した後の成熟タンパク質のＮ末端を残基１と定義した、ペプチド中の残基の番号に基づく。
ＧＭＰ−１４０に結合するフコシル化シアル化ラクトサミン構造もまた発見された。
この構造は、α（２，３）シアル酸で置換したラクトサミノグリカン類を含む受容体を改変し得るα（１，３）フコシルトランスフェラーゼ類の発現により形成される。ＬｅｘＧａｌβ１，４（Ｆｕｃα１，３）ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ（ここで、Ｒはタンパク質または他の炭水化物構造である）は、このシアル化構造のコアを形成する。ペプチドおよび炭水化物構造は、診断薬、および凝血過程または炎症過程の調節または阻害への臨床上の応用において有用である。
【０１８４】
【発明の効果】
本発明により、ＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１およびリンパ球ホーミングレセプターを含むセレクチン類と相互に作用するペプチドが提供される。また、本発明により、ＧＭＰ−１４０に対するリンパ球リガンドの構造に基づいた構造を有し、ＧＭＰ−１４０性付着相互作用を阻害する炭水化物ベースの薬剤、ＧＭＰ−１４０に対するレセプターの一部を形成する炭水化物構造体、これらのペプチドおよび炭水化物構造体を用いてリンパ球が内皮もしくは血小板に付着するのを抑制する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１は内皮細胞ＧＭＰ−１４０のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列である。読取り枠の翻訳アミノ酸配列は、一文字コードで示してある。終止コドンは星印で示している。細い下線は、血小板ＧＭＰ−１４０のＮ末端を含むＮ末端から２６のペプチドから決定したアミノ酸配列の一致している位置を示す。シグナルペプチドは−４１から−１の位置に相当する。推定トランスメンブランドメインには太い下線をつけてある。システイン残基は丸で囲み、アスパラギンが連結した潜在的なグリコシル化部位（ＮＸＳ／Ｔ）は黒丸で示してある。３’未翻訳領域における２つの潜在的なポリアデニル化シグナルには上側と下側に線をつけてある。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。
【図２】図２は、ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインである、アミノ酸６６−７８（三角印）、アミノ酸７３−８３（四角印）、アミノ酸５４−６３（丸印）およびアミノ酸２３−３０（黒丸印）が、ペプチドによって結合が阻害されるのを、ペプチドのｍＭの値に対して結合した細胞の数を比較して実証したグラフである。
【図３】図３（ａ）および（ｂ）は、次のようなマイクロタイターウェルヘの好中球の特異的付着性を比較した図であり、すなわち、（１）ペプチドをコートしていないウェル；（２）ＫＨＬに結合されたレクチンドメインペプチド１９−３４をコートしたウェル；または（３）ＫＬＨに結合された対照のカルボキシ末端ペプチド（アミノ酸残基７６１〜７７７）をコートしたウェル；をヒト血清アルブミンを含有するハンクスの平衡塩類溶液で遮断したのちに、各ウェル毎に液相競合体の存在下２×１０５の好中球を添加して比較した。ウェルに入れる前に好中球に添加した液相競合体は次の通りである。図３（ａ）；含有せず（黒バー印）、精製血小板の糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ（斜線バー印）、または精製ＧＭＰ−１４０（点彩バー印）；ならびに図３（ｂ）；含有せず（黒バー印）、１．５ｍＭ　Ｃ末端ペプチド７６１−７７７（斜線バー印）および１．５ｍＭレクチンドメインペプチド１９−３４（点彩バー印）である。
【図４Ａ】図４Ａは、トランスフェクトされた野生型のＣＨＯ細胞と、ＨＬ６０細胞に対するＧＭＰ−１４０の結合性を、ウェルをコートするのに使用したＧＭＰ−１４０の濃度（ｕｇ　ＧＭＰ−１４０／ｍｌ）、Ｃａ２＋の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてＣＰＭ　５１Ｃｒとして測定した結果を示すグラフである。図４Ａは、ＣＨＯのＧＭＰ−１４０に対する結合性を示す［ＣＨ０＋Ｃａ２＋（四角印）、ＣＨ０−Ｃａ２＋（黒ひし形印）］。
【図４Ｂ】図４Ｂは、トランスフェクトされた野生型のＣＨＯ細胞と、ＨＬ６０細胞に対するＧＭＰ−１４０の結合性を、ウェルをコートするのに使用したＧＭＰ−１４０の濃度（ｕｇＧＭＰ−１４０／ｍｌ）、Ｃａ２＋の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてＣＰＭ　５１Ｃｒとして測定した結果を示すグラフである。図４Ｂは、Ｌｅｃ８ＣＨ０のＧＭＰ−１４０に対する結合性を示す［Ｌｅｃ８＋Ｃａ２＋（四角印）、Ｌｅｃ８−ＬｅｃＣａ２＋（黒ひし形印）］。
【図４Ｃ】図４Ｃは、トランスフェクトされた野生型のＣＨＯ細胞と、ＨＬ６０細胞に対するＧＭＰ−１４０の結合性を、ウェルをコートするのに使用したＧＭＰ−１４０の濃度（ｕｇＧＭＰ−１４０／ｍｌ）、Ｃａ２＋の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてＣＰＭ　５１Ｃｒとして測定した結果を示すグラフである。図４Ｃはネオルイス（Ｎｅｏ　Ｌｅｗｉｓ）ＣＨ０のＧＭＰ−１４０に対する結合性を示す［ネオルイス＋Ｃａ２＋（四角印）、ネオルイス、ノイラミニダーゼ（黒ひし形）、およびネオルイス、ＥＤＴＡ（黒四角印）］。
【図４Ｄ】図４Ｄは、トランスフェクトされた野生型のＣＨＯ細胞と、ＨＬ６０細胞に対するＧＭＰ−１４０の結合性を、ウェルをコートするのに使用したＧＭＰ−１４０の濃度（ｕｇＧＭＰ−１４０／ｍｌ）、Ｃａ２＋の存在もしくは非存在、およびノイラミニダーゼ処理の関数としてＣＰＭ　５１Ｃｒとして測定した結果を示すグラフである。図４Ｄは、ＨＬ６０細胞のＧＭＰ−１４０に対する結合性を示す［ＨＬ６０＋Ｃａ２＋（四角印）、ＨＬ６０、ノイラミニダーゼ（黒ひし形印）およびＨＬ６０，ＥＤＴＡ（黒四角印）］。
【図５】図５は、ネオルイスＣＨＯ細胞の固定化ＧＭＰ−１４０への結合性に対するモノクローナル抗体の作用を示すグラフであり、対照（黒色バー）の結合％を対照として、Ｇ１抗体（／／／印）、Ｓ１２抗体（＋＋＋＋印）およびＥＤＴＡ（／／／印）それぞれの存在下での結合性を％で示したグラフである。
【図６】図６は、可溶性のＥＬＡＭ−１もしくはＧＭＰ−１４０によって結合される、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞を示すグラフである［対照および以下の阻害剤の存在下：ＥＬＡＭ−１なし、ＧＭＰ−１４０、およびＨ１８／７（ＥＬＡＭ−１の結合を阻害するがＧＭＰ−１４０の結合を阻害しない）；ならびにＧＭＰ−１４０なし、ＧＭＰ、およびＧ１の場合について示す。］
【図７】図７は、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞が結合したＰＭＳ細胞とＨＴ−２９細胞（これらの細胞はシアリルＬｅｘを発現する）を示す（×１０−４）グラフである。すなわち対照；ＥＬＡＭ−１のみの場合と、さらにＥＬＡＭ−１による結合を阻害するがＧＭＰ−１４０による結合を阻害しないＨ１８／７抗体が存在する場合；およびＧＭＰ−１４０のみの場合と、さらにＧＭＰ−１４０による結合を阻害するがＥＬＡＭ−１による結合を阻害しないＧ１抗体が存在する場合について示す。
【図８】図８は、ネオルイスＣＨＯ細胞の固定化ＧＭＰ−１４０への結合性に対するトリプシンの作用を示すグラフであり、対照（黒色バー）の結合性を１００％とした場合の、トリプシンによる処理時（／／／印）およびＥＤＴＡの存在下（細いバー印）での結合性を％で示したグラフである。
【図１Ａ】
2004002444.tif 000005
【図１Ｂ】
2004002444.tif 000006
【図２】
2004002444.tif 000007
【図３】
2004002444.tif 000008
【図４Ａ】
2004002444.tif 000009
【図４Ｂ】
2004002444.tif 000010
【図４Ｃ】
2004002444.tif 000011
【図４Ｄ】
2004002444.tif 000012
【図５】
2004002444.tif 000013
【図６】
2004002444.tif 000014
【図７】
2004002444.tif 000015
【図８】
2004002444.tif 000016