(57)【要約】      （修正有）【課題】ＳＹＴ−ＳＳＸ由来のペプチドＳＳ３９３（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ）の第９位のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規な改変ペプチド、当該改変ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用した癌ワクチンなどを提供すること。【解決手段】特定の配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ペプチドやポリヌクレオチド等を有効成分として含有する癌ワクチン等。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：２）、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）、および
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ（配列番号：５）
のなかから選ばれるいずれかの配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号：２、３、４および５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターを含有する細胞。
【請求項６】
請求項５記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項１または２記載のペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項１または２記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項８】
請求項１記載のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞。
【請求項９】
配列番号：２、３、４および５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、請求項８記載の抗原提示細胞。
【請求項１０】
請求項１記載のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１１】
配列番号：２、３、４および５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、請求項１０記載の細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１２】
請求項１または２記載のペプチド、請求項３記載のポリヌクレオチド、請求項４記載の発現ベクター、請求項５記載の細胞、請求項８または９記載の抗原提示細胞、あるいは請求項１０または１１記載の細胞傷害性Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物。
【請求項１３】
癌ワクチンとして使用される、請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１または２記載のペプチドを含有してなる腫瘍の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳＹＴ−ＳＳＸ由来の改変ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、ＳＹＴ−ＳＳＸに由来し、ＨＬＡ−Ａ２４抗原に拘束性の改変型腫瘍抗原ペプチド、および当該ペプチドの癌ワクチンとしての使用などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体による腫瘍（癌）の排除には、免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（非特許文献１を参照）、メラノーマからは自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（以下、ＣＴＬという）が比較的容易に分離されている（非特許文献２、３および４を参照）。また、該ＣＴＬの移入によるメラノーマ治療の臨床結果からも、腫瘍排除におけるＴ細胞の重要性が示唆されている（非特許文献５を参照）。
【０００３】
自己の腫瘍細胞を攻撃するＣＴＬが標的とする分子については長い間不明であったが、最近の免疫学および分子生物学の進歩により次第に明らかになってきた。すなわちＣＴＬは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、腫瘍抗原ペプチドと呼ばれるペプチドと主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原（ＭＨＣクラスＩ抗原、ＨＬＡ抗原とも呼ばれる）との複合体を認識することにより、自己の腫瘍細胞を攻撃していることが明らかとなった。
【０００４】
腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍に特有のタンパク質、すなわち腫瘍抗原タンパク質が細胞内で合成された後、プロテアソームにより細胞内で分解されることによって生成される。生成された腫瘍抗原ペプチドは、小胞体内でＭＨＣクラスＩ抗原（ＨＬＡ抗原）と結合して複合体を形成し、細胞表面に運ばれて抗原提示される。この抗原提示された複合体を腫瘍特異的なＣＴＬが認識し、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍効果を示す。このような一連の作用の解明に伴い、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをいわゆる癌ワクチンとして利用することにより、腫瘍患者の体内の腫瘍特異的ＣＴＬを増強させる治療法が可能となった。
【０００５】
腫瘍抗原タンパク質としては、１９９１年にＴ．Ｂｏｏｎらが初めてＭＡＧＥと名付けたタンパク質をヒトメラノーマ細胞から同定した（非特許文献６を参照）。その後、いくつかの腫瘍抗原タンパク質が、主にメラノーマ細胞から同定されている。メラノーマ抗原としては、メラノサイト組織特異的タンパク質であるｇｐ１００（非特許文献７を参照）、ＭＡＲＴ−１（非特許文献８を参照）、チロシナーゼ（非特許文献９を参照）などのメラノソームタンパク質、メラノーマだけでなく各種腫瘍細胞と正常精巣細胞に発現するＭＡＧＥ関連タンパク質群（非特許文献１０を参照）、腫瘍特異的なアミノ酸変異を持つβ−カテニン（非特許文献１１を参照）、ＣＤＫ４（非特許文献１２を参照）などが同定されている。また、メラノーマ以外の腫瘍抗原タンパク質としては、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（非特許文献１３を参照）、ｐ５３  （変異型）  （非特許文献１４を参照）などの腫瘍遺伝子産物、ＣＥＡ（非特許文献１５を参照）、ＰＳＡ（非特許文献１６を参照）などの腫瘍マーカー、ＨＰＶ（非特許文献１７を参照）、ＥＢＶ（非特許文献１８を参照）などのウイルスタンパク質などが同定されている。これらについては、総説（非特許文献１９、２０および２１を参照）の記述に詳しい。
【０００６】
ところで滑膜肉腫には特定の染色体転座が存在することが知られている。滑膜肉腫の染色体転座では、１８番染色体上のＳＹＴ遺伝子とＸ染色体上のＳＳＸ遺伝子とが融合した転座遺伝子ＳＹＴ−ＳＳＸが形成される。この転座遺伝子ＳＹＴ−ＳＳＸは、ＳＹＴタンパク質（３８７アミノ酸）のＣ末端側の８アミノ酸が、ＳＳＸタンパク質（１８８アミノ酸）のＣ末端側の７８アミノ酸で置換されたキメラタンパク質（４５７アミノ酸）をコードしている（非特許文献２２および２３を参照）。
【０００７】
ＳＹＴ遺伝子は正常組織で発現するが、ＳＳＸ遺伝子は一部の悪性腫瘍（非特許文献２４、２５および２６を参照）と精巣でのみ発現する。一方、転座遺伝子ＳＹＴ−ＳＳＸは、同じ滑膜肉腫患者の体内でも正常細胞では発現しないが、滑膜肉腫の９０％以上で特異的に発現することが知られている（非特許文献２２および２７を参照）。従って、転座遺伝子ＳＹＴ−ＳＳＸの転座部位からＳＳＸ側の遺伝子がコードするポリペプチド鎖は滑膜肉腫に特異的なアミノ酸配列であると考えられる。
【０００８】
本発明者らは、ＳＹＴ−ＳＳＸの転座領域より、ＨＬＡ−Ａ２４と結合することが予想されるペプチドを合成し、末梢血からペプチド刺激によるＣＴＬの誘導を試み、ペプチドＳＳ３９３（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ；配列番号：１）が良好なＣＴＬ誘導活性を有することを報告している（非特許文献２８を参照）。
【０００９】
【非特許文献１】
Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．，１２６：２００  ，１９９０
【非特許文献２】
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，８：３８５  ，１９８７
【非特許文献３】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：９８９  ，１９８７
【非特許文献４】
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５２：５２，１９９２
【非特許文献５】
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８６：１１５９，１９９４
【非特許文献６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，２５４：１６４３，１９９１
【非特許文献７】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：１００５，１９９４
【非特許文献８】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：３５１５，１９９４
【非特許文献９】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：４８９，１９９３
【非特許文献１０】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：９２１，１９９４
【非特許文献１１】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：１１８５，１９９６
【非特許文献１２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ  ，２６９  ：１２８１，１９９５
【非特許文献１３】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９，１９９５
【非特許文献１４】
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４７０４，１９９６
【非特許文献１５】
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．  ，８７：９８２，１９９５
【非特許文献１６】
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，８９：２９３，１９９７
【非特許文献１７】
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５９３４，１９９５
【非特許文献１８】
Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：６５３  ，１９９５
【非特許文献１９】
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１８：２６７，１９９７
【非特許文献２０】
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：７２５  ，１９９６
【非特許文献２１】
Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：６２８  ，１９９６
【非特許文献２２】
Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  ７：５０２−５０８，  １９９４
【非特許文献２３】
ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４：２３３３−２３４０，  １９９５
【非特許文献２４】
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，  ７７：１９−２３，  １９９８
【非特許文献２５】
Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６０：  １６５４−１６６２，  ２０００
【非特許文献２６】
Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，  ４：  １０９７−１０９９，  １９９５
【非特許文献２７】
Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６：１５４９，  １９９７
【非特許文献２８】
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６９：１６１１，  ２００２
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＳＹＴ−ＳＳＸ由来のペプチドＳＳ３９３（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ；配列番号：１）の第９位のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規な改変ペプチド、および当該改変ペプチドの癌ワクチンとしての使用などを提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前述のようにペプチドＳＳ３９３は良好なＣＴＬ誘導能を有するペプチドである。本発明者らは、当該ＳＳ３９３よりさらにＨＬＡ−Ａ２４抗原への結合親和性が高く、癌ワクチンとして臨床適用可能なペプチドを見出すべく種々検討を行った。その結果、ＳＳ３９３（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ；配列番号：１）の第９位のアミノ酸残基（Ｌｙｓ）をロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）またはトリプトファン（Ｔｒｐ）に置換することにより、ＨＬＡ−Ａ２４抗原への結合親和性が劇的に向上し、良好なＣＴＬ誘導活性を示すことを見出した。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１２】
即ち本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）  以下のアミノ酸配列：
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：２）、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）、および
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ（配列番号：５）
のなかから選ばれるいずれかの配列を含むアミノ酸配列を有するペプチド、
（２）  ９〜１００アミノ酸からなる、前記（１）記載のペプチド、
（３）  ９〜５０アミノ酸からなる、前記（１）記載のペプチド、
（４）  配列番号：２、３、４および５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなる、前記（１）記載のペプチド、
（５）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（６）  前記（５）記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、
（７）  前記（６）記載の発現ベクターを含有する細胞、
（８）  前記（７）記載の細胞を、ペプチドの発現可能な条件下で培養することを特徴とする、前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチドの製造方法、
（９）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチドに特異的に結合する抗体、
（１０）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞、
（１１）  配列番号：２、３、４および５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている、前記（１０）記載の抗原提示細胞、
（１２）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する細胞傷害性Ｔ細胞、
（１３）  配列番号：２、３、４および５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識する、前記（１２）記載の細胞傷害性Ｔ細胞、
（１４）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチド、前記（５）記載のポリヌクレオチド、前記（６）記載の発現ベクター、前記（７）記載の細胞、前記（１０）または（１１）記載の抗原提示細胞、あるいは前記（１２）または（１３）記載の細胞傷害性Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する医薬組成物、
（１５）  癌ワクチンとして使用される、前記（１４）記載の医薬組成物、
（１６）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチドを含有してなる腫瘍の診断薬、
（１７）  前記（１）〜（４）いずれか記載のペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との結合複合体の４量体を含有してなる、前記（１６）記載の腫瘍の診断薬、ならびに
（１８）  前記（９）記載の抗体を含有してなる腫瘍の診断薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（Ｉ）本発明のペプチド
本発明のペプチドとは、ＳＹＴ−ＳＳＸ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  ７：５０２−５０８，  １９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４：２３３３−２３４０，  １９９５、ＮＣＢＩデータベースＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｘ７９２００、ＮＭ＿００５６３７）由来のペプチドであるＳＳ３９３（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ；配列番号：１）の第９位のアミノ酸残基が特定のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬ誘導活性を有するものである。
【００１４】
具体的には本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列：
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：２）、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）、および
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ（配列番号：５）
のなかから選ばれるいずれかの配列を含むアミノ酸配列を有する。
【００１５】
このうちＧｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するペプチドおよびＧｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）を含むアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく、Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  ＩｌｅＭｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）を含むアミノ酸配列を有するペプチドがより好ましい。
【００１６】
本発明のペプチドは、本発明ペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＣＴＬを誘導するという特性を有する限り、何ら制限されないが、その長さは通常連続する９〜１００アミノ酸であり、より好ましくは連続する９〜５０アミノ酸である。ここに、腫瘍抗原ペプチドとは、抗原提示細胞に提示される、ＣＴＬ誘導活性を導くペプチドとして定義される。
【００１７】
本発明ペプチドは、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて合成することができる。合成方法としては、文献（ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ  ２  ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．  ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；ペプチド合成，丸善（株），１９７５；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），１９８５；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成，広川書店，１９９１）などに記載されている方法が挙げられる。
【００１８】
また本発明のペプチドは、本発明ペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。当該ＤＮＡ合成や各種プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収などの操作は、当業者に周知の方法、文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））、あるいは後述の（ＩＩ）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００１９】
本発明のペプチドは、抗原提示細胞内にて要すればプロセッシングを受け、生じた腫瘍抗原ペプチドが抗原提示細胞に提示され、ＨＬＡ−Ａ２４抗原拘束性にＣＴＬを誘導するという特性を有するものである。当該腫瘍抗原ペプチドとしての特性は、例えば、  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４，ｐ２２５７，１９９５に記載の測定方法により調べることができる。具体的には、ＨＬＡ−Ａ２４抗原陽性のヒトから末梢血リンパ球を単離し、イン・ビトロで本発明のペプチドを添加して刺激した場合に、該ペプチドをパルスしたＨＬＡ−Ａ２４陽性細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されることにより、測定することができる。ここでＣＴＬの誘導の有無は、例えば、抗原ペプチド提示細胞に反応してＣＴＬが産生したＩＦＮ−γの量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定することによって調べることができる。
【００２０】
また、５１Ｃｒで標識した抗原ペプチド提示細胞に対するＣＴＬの傷害性を測定する方法（５１Ｃｒリリースアッセイ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４  ）によっても調べることができる。また、ＨＬＡ−Ａ２４のｃＤＮＡ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：４２４８−４２５２  （１９９５）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ６４７４０）を発現する発現プラスミドを、例えばＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ１６５１）やＶＡ−１３細胞（理化学研究所細胞銀行）に導入した細胞に対して本発明のペプチドをパルスし、この細胞に対して、前記で調製したＣＴＬなどを反応させ、該ＣＴＬが産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γやＴＮＦ−α）の量を測定することによっても、調べることができる。
さらに、ＷＯ  ０２／４７４７４  号公報および  Ｉｎｔ  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ：１００，５６５−５７０  （２００２）に記述されたＨＬＡ−Ａ２４モデルマウスを用いることによっても調べることができる。
以下、ここで述べたような測定法を「腫瘍抗原ペプチドの測定法」と称することもある。
【００２１】
以下、本発明のペプチドについてより詳細に説明する。
本発明は前述のように、ＳＹＴ−ＳＳＸ由来のペプチドであるＳＳ３９３（配列番号：１）の第９位のリジンをロイシン、フェニルアラニン、イソロイシンまたはトリプトファンに置換した置換型ペプチド（配列番号：２〜５）が、オリジナルのペプチドＳＳ３９３よりも高いＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を有し、よって良好なＣＴＬ誘導活性を有するという新たな知見を得たことに基づく。これら置換型ペプチドのいずれかを含有する本発明のペプチドは、癌免疫療法におけるＣＴＬ誘導剤の有効成分として、また癌ワクチンの有効成分として有用である。
【００２２】
本発明のペプチドとして、より具体的には以下の（１−１）〜（１−３）に挙げるペプチドを例示することができる。
【００２３】
（１−１）  配列番号：２〜５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド
配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドの具体例として、以下に示す腫瘍抗原ペプチドを例示することができる：
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：２）からなる腫瘍抗原ペプチド、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）からなる腫瘍抗原ペプチド、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）からなる腫瘍抗原ペプチド、および
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ（配列番号：５）からなる腫瘍抗原ペプチド。
【００２４】
このうちＧｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）からなる腫瘍抗原ペプチドおよびＧｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）からなる腫瘍抗原ペプチドが好ましく、Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）からなる腫瘍抗原ペプチドがより好ましい。これらのペプチドは、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。また、前記「腫瘍抗原ペプチドの測定法」等によりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
【００２５】
（１−２）  配列番号：２〜５のいずれかの配列を含むアミノ酸配列を有するエピトープペプチド
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したペプチド（エピトープペプチド）が、効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，  １６１：  ３１８６−３１９４には、腫瘍抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，  −Ａ３，  −Ａ１１，  Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープを連結した約３０ｍｅｒのペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。
【００２６】
またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたペプチド（エピトープペプチド）により、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。ここでヘルパーエピトープとはＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる作用を有するペプチドを指すものであり（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．，  １：７５１，  １９９４）、例えばＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが知られている。当該ヘルパーエピトープにより活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＣＴＬの分化の誘導や維持、およびマクロファージなどのエフェクター活性化などの作用を発揮するため、抗腫瘍免疫応答に重要であると考えられている。このようなヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープとを連列したペプチドの具体例として、例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，  １６２：  ３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープより構成されるペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。また実際に、ＣＴＬエピトープ（メラノーマ抗原ｇｐ１００の第２８０位〜２８８位からなる腫瘍抗原ペプチド）とヘルパーエピトープ（破傷風毒素由来Ｔヘルパーエピトープ）とを連結したペプチドが臨床試験に供されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００１，７：３０１２−３０２４）。
【００２７】
従って、前記（１−１）に記述したような本発明の腫瘍抗原ペプチドを含む複数のエピトープを連結したペプチド（エピトープペプチド）であってイン・ビボでＣＴＬ誘導活性を有するペプチドも、本発明のペプチドの具体例として例示することができる。
ここで、本発明の腫瘍抗原ペプチドに連結させるエピトープがＣＴＬエピトープの場合、用いるＣＴＬエピトープとしては、ＳＹＴ−ＳＳＸ由来のＨＬＡ−Ａ１，  −Ａ０２０１，  −Ａ０２０４，  −Ａ０２０５，  −Ａ０２０６，  −Ａ０２０７，  −Ａ１１，  −Ａ２４，  −Ａ３１，  −Ａ６８０１，  −Ｂ７，  −Ｂ８，  −Ｂ２７０５，  −Ｂ３７，  −Ｃｗ０４０１，  −Ｃｗ０６０２などに拘束性のＣＴＬエピトープが挙げられる。これらＣＴＬエピトープは複数個連結することが可能であり、１つのＣＴＬエピトープの長さとしては、各種ＨＬＡ分子に結合している抗原ペプチドの解析により（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，４１：１７８，１９９５）、８〜１４アミノ酸程度を挙げることができる。
【００２８】
また本発明の腫瘍抗原ペプチドに連結させるエピトープがヘルパーエピトープの場合、用いるヘルパーエピトープとしては、前述のようなＢ型肝炎ウイルス由来のＨＢＶｃ１２８−１４０や破傷風毒素由来のＴＴ９４７−９６７などが挙げられる。また当該ヘルパーエピトープの長さとしては、１３〜３０アミノ酸程度、好ましくは１３〜１７アミノ酸程度を挙げることができる。
【００２９】
本発明のエピトープペプチドとして、より具体的には、例えば配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上（好ましくは配列番号：４のアミノ酸配列を含む）とヘルパーエピトープとを連結させたペプチドを挙げることができる。より具体的には、例えば配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上（好ましくは配列番号：４のアミノ酸配列を含む）と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：７）とを連結させたペプチドや、配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上（好ましくは配列番号：４のアミノ酸配列を含む）とＡｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  ＳｅｒＬｙｓ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ（配列番号：８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたペプチドなどが挙げられる。
【００３０】
このような複数のエピトープを連結させたペプチド（エピトープペプチド）は、前述のように一般的なペプチド合成法によって製造することができる。またこれら複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて、通常のＤＮＡ合成および遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。すなわち、当該ポリヌクレオチドを周知の発現ベクターに挿入し、得られた組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換して作製された形質転換体を培養し、培養物より目的の複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを回収することにより製造することができる。これらの手法は、前述のように文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，  ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））や後述の（ＩＩ）項に記載の方法などに準じて行うことができる。
【００３１】
以上のようにして製造された複数のエピトープを連結させたエピトープペプチドを前記「腫瘍抗原ペプチドの測定法」に供すること等によりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。
【００３２】
（１−３）  配列番号：２〜５のいずれかの配列を含むアミノ酸配列からなり、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基が修飾されたペプチド前記（１−１）〜（１−２）に例示したような本発明のペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾することも可能である。
【００３３】
ここでＮ末端アミノ酸のアミノ基の修飾基としては、例えば１〜３個の炭素数１から６のアルキル基、フェニル基、シクロアルキル基、アシル基が挙げられ、アシル基の具体例としては炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基、炭素数２から６のアルコキシカルボニル基、フェニル基で置換されたアルコキシカルボニル基、炭素数５から７のシクロアルコキシで置換されたカルボニル基、フェノキシカルボニル基等が挙げられる。
Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を修飾したペプチドとしては、例えばエステル体およびアミド体が挙げられ、エステル体の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル、炭素数５から７のシクロアルキルエステル等が挙げられ、アミド体の具体例としては、アミド、炭素数１から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
【００３４】
以上のような本発明のペプチドは、例えば、▲１▼後述するＣＴＬの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、また▲２▼後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
【００３５】
（ＩＩ）本発明のポリヌクレオチド、発現ベクターおよび形質転換細胞
本発明はまた、前記本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であっても良い。これら本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列情報およびそれによりコードされるＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
【００３６】
このような本発明のポリヌクレオチドとしては、以下に示すポリヌクレオチドが例示される：
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ（配列番号：２）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、および
Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ（配列番号：５）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００３７】
このうちＧｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ（配列番号：３）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＧｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ（配列番号：４）を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドがより好ましい。
【００３８】
具体的には、例えば前記（１−２）に記述したような配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列を有するエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。より具体的には、例えば配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上（好ましくは配列番号：４のアミノ酸配列を含む）とヘルパーペプチドとを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができ、例えば配列番号：２〜５のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上（好ましくは配列番号：４のアミノ酸配列を含む）と破傷風毒素由来のヘルパーペプチド（例えばＰｈｅ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ；配列番号：７）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドや、配列番号：３〜７のいずれかのアミノ酸配列の１種または２種以上（好ましくは配列番号：４のアミノ酸配列を含む）とＡｌａ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  ＡｌａＡｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ（配列番号：８、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００１，７：３０１２−３０２４）とを連結させたペプチドをコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３９】
前記で作製された本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、本発明のペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。
ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
【００４０】
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
【００４１】
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
【００４２】
以上のような本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターを前記「腫瘍抗原ペプチドの測定法」に供することによりＣＴＬ誘導活性を測定することができる。また以下に挙げる方法によっても測定することができる。
すなわちまず、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）やＶＡ−１３細胞（理化学研究所細胞開発銀行）といった細胞に対し、本発明のポリヌクレオチドを有する発現ベクターと、ＨＬＡ−Ａ２４抗原をコードするｃＤＮＡ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：４２４８−４２５２（１９９５）、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ６４７４０）を有する発現ベクターとをダブルトランスフェクトする。該トランスフェクトは、例えばリポフェクトアミン試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いたリポフェクチン法などにより行うことができる。その後、ＨＬＡ−Ａ２４に拘束性のＣＴＬを加えて作用させ、該ＣＴＬが反応して産生する種々のサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法や  ＴＮＦ  ｒｅｌｅａｓｅアッセイ法などで測定することによって、本発明のポリヌクレオチドがＣＴＬ誘導活性を有するか否かを調べることができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはそれを含有する発現ベクターは、例えば、▲１▼後述する本発明のペプチドの製造において、▲２▼後述する遺伝子治療において、また▲３▼後述する抗原提示細胞の作製において、有効に用いることができる。
【００４３】
前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。
ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
【００４４】
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；  Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
【００４５】
以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のペプチドを製造することができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリぺプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
【００４６】
（ＩＩＩ）本発明の抗体
本発明は、本発明のペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、本発明のペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体であっても、またモノクローナル抗体であっても良い。
本発明の抗体は前記のように本発明のペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限されないが、具体的には、配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチドに特異的に結合する抗体を挙げることができる。
【００４７】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．１２〜１１．１３、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｌａｎｅ，  Ｈ，  Ｄ．ら編，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  出版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９）。
【００４８】
具体的には、本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）を免疫原として用い、家兎等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）をマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
【００４９】
本発明のペプチドに対する抗体の作製は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントなどがある。
【００５０】
以上のように本発明のペプチドを用いて常法により適宜動物を免疫することにより、ペプチドを認識する抗体、さらにはその活性を中和する抗体が容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等が挙げられる。免疫学的診断は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。このような免疫学的診断は、ＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子が発現している腫瘍、すなわち滑膜肉腫等の診断において有効である。
【００５１】
（ＩＶ）本発明の抗原提示細胞
本発明は、本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞を提供する。具体的には、本発明は、配列番号：２〜５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞を提供する。
本発明の抗原提示細胞は、好ましくは配列番号：３または４のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞であり、より好ましくは配列番号：  ４のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体が提示されている抗原提示細胞である。
【００５２】
後述の実施例において、本発明のペプチドによりＣＴＬ誘導活性が認められたが、これは、本発明のペプチドを抗原提示用細胞にパルスすることにより、本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が生じ、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとの複合体の提示された抗原提示細胞は、後述する細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００５３】
細胞療法（ＤＣ療法）において用いられる抗原提示細胞は、腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、この細胞に本発明のペプチドを体外でパルスするか、または本発明のポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターを細胞内に導入して、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を細胞表面に提示させることにより作製される。ここで「抗原提示能を有する細胞」とは、本発明のペプチドを提示可能なＨＬＡ−Ａ２４抗原を細胞表面に発現している細胞であれば特に限定されないが、抗原提示能が高いとされている樹状細胞が好ましい。
また、前記抗原提示能を有する細胞にパルスされるものとしては、本発明のペプチドであっても良いし、また本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドやそれを含有する発現ベクターであっても良い。
【００５４】
本発明の抗原提示細胞は、例えば腫瘍患者から抗原提示能を有する細胞を単離し、該細胞に本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）を体外でパルスし、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を作製することにより得られる（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９）。樹状細胞を用いる場合は、例えば、腫瘍患者の末梢血からフィコール法によりリンパ球を分離し、その後非付着細胞を除き、付着細胞をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４存在下で培養して樹状細胞を誘導し、当該樹状細胞を本発明のペプチドと共に培養してパルスすることなどにより、本発明の抗原提示細胞を調製することができる。
【００５５】
また、前記抗原提示能を有する細胞に本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載の配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド）あるいはそれを含有する発現ベクターを導入することにより本発明の抗原提示細胞を調製する場合は、当該ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合は  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６や  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：  ｐ５６０７，１９９８などを参考にして行うことができる。また、ＤＮＡのみならずＲＮＡの形態でも同様に抗原提示細胞を調製することができ、この場合は、  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １８４：  ｐ４６５，１９９６などを参考できる。
以上のようにして作製された本発明の抗原提示細胞は、後述するＣＴＬの誘導剤、癌ワクチンの有効成分として、細胞療法（ＤＣ療法）において有効に用いられる。
【００５６】
（Ｖ）本発明のＣＴＬ
本発明は、本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬを提供する。具体的には、本発明は、配列番号：２〜５のなかから選ばれるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬを提供する。
本発明のＣＴＬは、好ましくは配列番号：３または４のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬであり、より好ましくは配列番号：  ４のアミノ酸配列からなるペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＣＴＬである。
【００５７】
後述の実施例において、本発明のペプチドによりＣＴＬ誘導活性が認められた。これは、これは、本発明のペプチドを抗原提示用細胞にパルスすることにより、本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体の提示された抗原提示細胞が生じ、そして、この抗原提示細胞を特異的に認識するＣＴＬが誘導されたことを示すものである。このような、ＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明のペプチド由来の腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬは、後述する養子免疫療法において有効に用いられる。
【００５８】
養子免疫療法において用いられるＣＴＬは、患者の末梢血リンパ球を単離し、これを本発明のペプチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）、あるいは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載の配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド）やそれを含有する発現ベクターでイン・ビトロで刺激する等により作製される（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９９，  １９０：  １６６９）。
【００５９】
以上のようにして作製された本発明のＣＴＬは、癌ワクチンの有効成分として、養子免疫療法において有効に用いられる。
【００６０】
（ＶＩ）癌ワクチンとしての医薬組成物
以上に記載した本発明のペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、本発明の抗原提示細胞、および本発明のＣＴＬは、それぞれの物質に応じた適切な形態とすることにより、ＣＴＬの誘導剤、すなわち癌ワクチンの有効成分とすることができる。以下、具体的に説明する。
【００６１】
（６−１）  本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチン
本発明のペプチドは、ＣＴＬの誘導能を有するものであり、誘導されたＣＴＬは、細胞傷害作用やリンフォカインの産生を介して抗腫瘍作用を発揮することができる。従って本発明のペプチドは、腫瘍の治療または予防のための癌ワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンの有効成分となるペプチドとしては、配列番号：３または４に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドが好ましく、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドがより好ましい。
【００６２】
本発明の癌ワクチンをＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＳＹＴ−ＳＳＸ陽性の患者に投与すると、抗原提示細胞のＨＬＡ−Ａ２４抗原にペプチド（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）が提示され、提示されたＨＬＡ−Ａ２４抗原複合体特異的ＣＴＬが増殖して腫瘍細胞を破壊することができ、従って、腫瘍の治療または予防が可能となる。本発明の癌ワクチンは、ＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う腫瘍、例えば滑膜肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
よって、本発明は別の態様として、本発明の癌ワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＳＹＴ−ＳＳＸ陽性の患者に投与することにより、腫瘍を治療または予防するための方法を提供する。
【００６３】
本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、単一のＣＴＬエピトープ（例えば配列番号：２〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる腫瘍抗原ペプチド）を有効成分とするものであっても、また他のペプチド（ＣＴＬエピトープやヘルパーエピトープ）と連結したエピトープペプチドを有効成分とするものであっても良い。すなわち近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドが、イン・ビボで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９８，  １６１：  ３１８６−３１９４には、腫瘍抗原タンパク質ＰＳＡ由来のＨＬＡ−Ａ２，  −Ａ３，  −Ａ１１，  Ｂ５３拘束性ＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結した約３０ｍｅｒのエピトープペプチドが、イン・ビボでそれぞれのＣＴＬエピトープに特異的なＣＴＬを誘導したことが記載されている。またＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドにより、効率的にＣＴＬが誘導されることも示されている。このようなエピトープペプチドの形態で投与した場合、抗原提示細胞内に取り込まれ、その後、細胞内分解を受けて生じた個々の抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体に特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。このようにして腫瘍の治療または予防が達成される。
【００６４】
また本発明のペプチドを有効成分とする癌ワクチンは、細胞性免疫が効果的に成立するように、医薬として許容されるキャリアー、例えば適当なアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，  ７：２７７−２８９，  １９９４）に記載のものなどが応用可能であり、具体的には、菌体由来成分、サイトカイン、植物由来成分、海洋生物由来成分、水酸化アルミニウムの如き鉱物ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオールの如き界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、または油乳濁液（エマルジョン製剤）などを挙げることができる。また、リポソーム製剤、直径数μｍ  のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤なども考えられる。
【００６５】
投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明のペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ  〜１０ｍｇであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００６６】
（６−２）  本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または発現ベクターを有効成分とするＤＮＡワクチン
前記本発明のペプチドのみならず、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびそれを含有する発現ベクターもまた、腫瘍の治療または予防のためのＤＮＡワクチンの有効成分とすることができる。すなわち本発明は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、または当該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分として含有する癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明の癌ワクチンの有効成分となるポリヌクレオチドとしては、配列番号：３または４に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドがより好ましい。
【００６７】
また、本発明は別の態様として、本発明のＤＮＡワクチンの有効量をＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＳＹＴ−ＳＳＸ陽性の患者に投与することにより、腫瘍を治療または予防するための方法を提供する。
【００６８】
近年、複数のＣＴＬエピトープ（抗原ペプチド）を連結したエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはＣＴＬエピトープとヘルパーエピトープとを連結させたエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的にＣＴＬ誘導活性を有することが示されている。例えばＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９，  １６２：  ３９１５−３９２５には、ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド６種類、ＨＬＡ−Ａ１１拘束性抗原ペプチド３種類、およびヘルパーエピトープを連結したエピトープペプチドをコードするＤＮＡ（ミニジーン）が、イン・ビボでそれぞれのエピトープに対するＣＴＬを効果的に誘導したことが記載されている。
【００６９】
従って、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを１種または２種以上連結させることにより、また場合によっては他のペプチドをコードするポリヌクレオチドも連結させることにより作製されたポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込むことにより、癌ワクチンの有効成分とすることができる。
【００７０】
本発明のポリヌクレオチドを癌ワクチン（ＤＮＡワクチン）の有効成分として適用する際には、以下の方法が使用され得る。
すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス，  １９９４年４月号，  ２０−４５頁、月刊薬事，  ３６（１），  ２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，  １２（１５），  （１９９４）、およびこれらの引用文献等）のいずれの方法も適用することができる。
【００７１】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに本発明のＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００７２】
本発明のポリヌクレオチドを実際に医薬として作用させるには、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入する  ｉｎ  ｖｉｖｏ法、およびヒトからある種の細胞を採集し体外でＤＮＡを該細胞に導入しその細胞を体内に戻す  ｅｘ  ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス，  １９９４年４月号，  ２０−４５頁、月刊薬事，  ３６（１），  ２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，  １２（１５），  （１９９４）、およびこれらの引用文献等）。ｉｎ  ｖｉｖｏ法がより好ましい。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のポリヌクレオチドを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のポリヌクレオチドを含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
製剤中の本発明のポリヌクレオチドの含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常、０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明のポリヌクレオチドを、数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００７４】
以上のような本発明のポリヌクレオチドの腫瘍患者への投与により、抗原提示細胞内で当該ポリヌクレオチドに対応するポリペプチドが高発現する。その後、細胞内分解を受けて生じた個々の腫瘍抗原ペプチドがＨＬＡ抗原と結合して複合体を形成し、該複合体が抗原提示細胞表面に高密度に提示され、この複合体特異的なＣＴＬが体内で効率的に増殖し、腫瘍細胞を破壊する。以上のようにして、腫瘍の治療または予防が達成される。本発明のポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを有効成分とする癌ワクチンは、ＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う腫瘍、例えば滑膜肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
【００７５】
（６−３）  本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンを提供する。
近年、腫瘍患者の末梢血からリンパ球を分離し、その中から樹状細胞を誘導し、イン・ビトロでペプチド等をパルスして調製した抗原提示細胞を皮下投与などにより患者に戻す細胞療法（ＤＣ療法）が報告されている  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４６：８２，１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：ｐ１７９６，１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９：ｐ１１８４，１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：ｐ５６７２，１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：  ｐ５６０７，１９９８、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １８４：  ｐ４６５，１９９６）。従って前記本発明の抗原提示細胞を、細胞療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
【００７６】
本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、抗原提示細胞を安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量は、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＳＹＴ−ＳＳＸ陽性の患者の体内で効率良く特異的なＣＴＬが誘導され、腫瘍を治療または予防することができる。本発明の抗原提示細胞を有効成分とする癌ワクチンは、ＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う腫瘍、例えば滑膜肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
【００７７】
（６−４）  本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン
本発明は、本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチン（癌ワクチンとしての医薬組成物）を提供する。本発明のＣＴＬは、以下の養子免疫療法において有効に用いられる。
【００７８】
メラノーマにおいて、患者本人の腫瘍内浸潤Ｔ細胞を体外で大量に培養し、これを患者に戻す養子免疫療法に治療効果が認められている（Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｎｓｔ．，  ８６：  １１５９，  １９９４）。またマウスのメラノーマでは、脾細胞をイン・ビトロで腫瘍抗原ペプチドＴＲＰ−２で刺激し、腫瘍抗原ペプチドに特異的なＣＴＬを増殖させ、該ＣＴＬをメラノーマ移植マウスに投与することにより、転移抑制が認められている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８５：４５３，１９９７  ）。これは、抗原提示細胞のＨＬＡ抗原と腫瘍抗原ペプチドとの複合体を特異的に認識するＣＴＬをイン・ビトロで増殖させた結果に基づくものである。従って、本発明のペプチドあるいは本発明のポリヌクレオチドや発現ベクターを用いて、イン・ビトロで患者末梢血リンパ球を刺激して腫瘍特異的ＣＴＬを増やした後、このＣＴＬを患者に戻す治療法は有用であると考えられる。従って前記本発明のＣＴＬを、養子免疫療法における癌ワクチンの有効成分として使用することができる。
【００７９】
本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＣＴＬを安定に維持するために、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地等を含むことが好ましい。投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与が挙げられる。また投与量としては、前記文献記載の投与量が例示される。
前記癌ワクチンを患者の体内に戻すことにより、ＨＬＡ−Ａ２４陽性かつＳＹＴ−ＳＳＸ陽性の患者の体内でＣＴＬによる腫瘍細胞の傷害作用が促進され、腫瘍細胞を破壊することにより、腫瘍を治療することができる。本発明のＣＴＬを有効成分とする癌ワクチンは、ＳＹＴ−ＳＳＸ遺伝子の発現レベルの上昇を伴う腫瘍、例えば滑膜肉腫等の予防または治療のために使用することができる。
【００８０】
（ＶＩＩ）本発明の診断薬
本発明は、本発明のペプチドを含有してなる腫瘍の診断薬を提供する。
近年、抗原ペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を用いて抗原特異的ＣＴＬを検出する新しい検出方法が確立されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：ｐ９４，１９９６）。ＳＹＴ−ＳＳＸは、滑膜肉腫の９０％以上で特異的に発現することが知られており（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  ７：５０２−５０８，  １９９４、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ６：１５４９，  １９９７）、さらに本発明において、配列番号：２〜５に記載のペプチドがＨＬＡ−Ａ２４抗原に対する高い結合親和性を有することが明らかとなった。よって本発明のペプチドとＨＬＡ抗原との複合体を当該検出方法に供し、腫瘍抗原特異的ＣＴＬを検出することにより、腫瘍の早期発見、再発、転移を診断することができる。また本発明のペプチド等を有効成分とする医薬の適応可能な腫瘍患者の選択や、当該医薬による治療効果の判定などにも利用できる。すなわち本発明においては、本発明のペプチドを有効成分の一部として含有する、腫瘍の診断薬を提供するものである。
【００８１】
具体的には、文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：ｐ９４，１９９６）に記載の方法に従って蛍光標識したＨＬＡ−Ａ２４抗原と本発明ペプチドとの複合体の４量体を作製し、これを用いて腫瘍が疑われる患者の末梢血リンパ球中の抗原ペプチド特異的ＣＴＬをフローサイトメーターにより定量することにより、前記診断を行うことができる。
【００８２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００８３】
実施例１
改変ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性の検討
ペプチドＳＳ３９３（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ；配列番号：１）と、ＳＳ３９３のＣ末端のＬｙｓをＬｅｕに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｌ（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ；配列番号：２）、Ｐｈｅに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｆ（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ；配列番号：３）、Ｉｌｅに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉ（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ；配列番号：４）、およびＴｒｐに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｗ（Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ；配列番号：５）の４種類の改変ペプチド、およびＥＢウイルス由来のペプチド（Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ；配列番号：６）は、アミノ酸合成機を用いてＦ−ｍｏｃ法で合成した。
【００８４】
これらのペプチドのＨＬＡ−＊Ａ２４０２（ＨＬＡ−Ａ２４の一種）への結合親和性の測定は、文献（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：２５６５，  ２０００）に記載の方法に従い実施した。ＭＨＣクラスＩ分子を発現していないマウスリンパ腫由来の細胞株ＲＭＡ−ＳにＨＬＡ−＊Ａ２４０２とＨ−２ＫｂのキメラＭＨＣの遺伝子（国際公開第ＷＯ０２／４７４７４号パンフレット）を安定的に導入した細胞株ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２細胞を２６℃で１８時間培養した。ＲＭＡ−Ｓ−Ａ＊２４０２細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、３μＬ／ｍＬのヒトβ２−ミクログロブリンと１００μＬ／ｍＬの各種ペプチドを含有する培養液ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁して２６℃で３時間、３７℃で３時間培養した。この細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体により４℃で３０分間処理した。さらに細胞をＰＢＳ溶液で洗浄後、フィコエリスリン（ＰＥ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体により４℃で３０分間処理した。細胞を洗浄後、１％ホルマリンを含むＰＢＳ溶液１ｍＬに懸濁して固定した。細胞はフローサイトメーター装置ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社）で測定し、平均蛍光強度によりペプチドの結合親和性を求めた。上記の６種類のペプチドの結合親和性を測定した結果を図１に示した。
【００８５】
文献（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：３３２５，  １９９７）でＨＬＡ−Ａ２４に結合することが報告されているＥＢウイルス由来のペプチドは強い結合能を示した。ＳＳ３９３のペプチドに比較して、Ｃ末端のＬｙｓを置換したＳＳ３９３Ｋ９Ｌ、ＳＳ３９３Ｋ９Ｆ、ＳＳ３９３Ｋ９ＩおよびＳＳ３９３Ｋ９Ｗの改変ペプチドは非常に高い結合能を示した。特に結合能が高かったのはＳＳ３９３Ｋ９Ｉであった。以上のように改変によりＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性が向上したことが明らかとなった。
【００８６】
実施例２
改変ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導
文献（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：１６１１，  ２００２）と同様の方法で行った。ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性の滑膜肉腫患者から比重遠心法により末梢血を分離し、ＡＩＭ−Ｖ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて培養した。２４時間後、非接着性の細胞を回収して、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含んだＡＩＭ−Ｖを用いて培養した。抗原提示細胞調製のため、接着性の細胞は、１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４と１０００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦを含むＡＩＭ−Ｖ培養液で５日間培養した後、１０μＭのペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉ（配列番号：４）を添加して１日間培養し、さらに１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦと１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−αを加えて培養した。非接着性の細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を抗ＣＤ８抗体結合マグネチックビーズで分離し、上記のペプチドをパルスした抗原提示細胞とともに培養した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した残りの非接着性細胞は、１μｇ／ｍＬのＰＨＡと１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖ培地で３日間培養した後、ＰＨＡを除いた培地で４日間培養し、２回目、３回目のペプチド刺激用の抗原提示用細胞としてストックした。ペプチド刺激をしたＣＤ８陽性Ｔ細胞に対しては、１回目のペプチド刺激から７日後と１４日後に、ストックの抗原提示用細胞にペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉを２時間パルスし、５０００ｒａｄでＸ線照射した細胞を添加して２回目、３回目のペプチド刺激を行った。３回目の刺激から１週間後のＴ細胞の細胞傷害活性を５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した。標的細胞として、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２遺伝子をＴ２細胞（ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１９９２）に安定的に導入したＴ２−Ａ＊２４０２細胞、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＳＹＴ−ＳＳＸが陽性の滑膜肉腫由来細胞株のＦｕｊｉ細胞（Ａｃｔａ．  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｊｐｎ．  ４０：４８６，  １９９０）および  ＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞（Ｌａｂ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ６７：４９８，  １９９２）、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＳＹＴ−ＳＳＸが陰性の滑膜肉腫由来細胞株  ＳＷ９８２（ＡＴＣＣ株番号ＨＴＢ−９３）および慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２４３）を用いた。
【００８７】
標的細胞は、１００μＣｉの５１Ｃｒで１時間ラベルした。Ｔ２−Ａ＊２４０２細胞にペプチドをパルスした標的細胞は、１０μＭのペプチドで一晩培養した後に５１Ｃｒでラベルした。５×１０３個の標的細胞に対して、３倍、１０倍、または３０倍のエフェクター細胞（ペプチド刺激したＴ細胞）を添加し、４時間培養して細胞傷害活性を測定した。結果を図２に示した。ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉで刺激したＴ細胞は、ＳＳ３９３Ｋ９ＩをパルスしたＴ２−Ａ＊２４０２細胞を傷害したが、ペプチドをパルスしていないＴ２−Ａ＊２４０２細胞を傷害しなかった。このことから、改変ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉの刺激により、ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉを認識するＣＴＬが誘導されていることが明らかとなった。また、ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉで刺激したＴ細胞は、改変前の天然型ペプチドＳＳ３９３をパルスしたＴ２−Ａ＊２４０２細胞、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＳＹＴ−ＳＳＸが陽性の滑膜肉腫由来細胞株のＦｕｊｉ細胞およびＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞を傷害したことから、改変ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉが誘導したＣＴＬは、ペプチドＳＳ３９３Ｋ９ＩのみならずペプチドＳＳ３９３も認識することが示された。
【００８８】
実施例３
改変ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｆによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導
実施例２と同様の方法により、ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｆ（配列番号：３）でヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導を試みた。結果を図３に示した。ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｆで刺激したＴ細胞は、ペプチドをパルスしていないＴ２−Ａ＊２４０２細胞よりもＳＳ３９３Ｋ９ＦをパルスしたＴ２−Ａ＊２４０２細胞を強く傷害した。また、ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉで刺激したＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＳＹＴ−ＳＳＸが陽性の滑膜肉腫由来細胞株のＦｕｊｉ細胞およびＨＳ−ＳＹ−ＩＩ細胞を傷害したことから、ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉのみならず癌細胞株が提示するペプチドＳＳ３９３も認識することが示された。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、ＳＹＴ−ＳＳＸ由来のペプチドＳＳ３９３の第９位のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換した新規な改変ペプチド、当該改変ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれらペプチドやポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用した癌ワクチンなどが提供される。本発明の癌ワクチンは、滑膜肉腫等に罹患した多くの腫瘍患者を処置することができるといった利点を有する。
【００９０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＳ３９３のＣ末端のＬｙｓをＬｅｕに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｌ（図中Ｋ９Ｌ）、Ｐｈｅに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｆ（図中Ｋ９Ｆ）、Ｉｌｅに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉ（図中Ｋ９Ｉ）、およびＴｒｐに置換したペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｗ（図中Ｋ９Ｗ）の４種類の改変ペプチドと、改変前のペプチドＳＳ３９３（図中ＳＳ３９３）および陽性コントロールであるＥＢウイルス由来ペプチド（図中ＥＢＶ）の、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２への結合親和性を示したグラフである。図中、縦軸は平均蛍光強度（結合親和性）を示す。
【図２】図２は、改変ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｉによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導活性を、５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した結果を示したグラフである。図中、縦軸はＣＴＬによる細胞傷害活性（％  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）を示す。また図中、Ｔ２−Ａ２４ペプチド（−）はペプチドをパルスしていないＴ２−Ａ＊２４０２細胞を標的細胞として用いた結果を、Ｔ２−Ａ２４ＳＳ３９３はペプチドＳＳ３９３をパルスしたＴ２−Ａ＊２４０２細胞を標的細胞として用いた結果を、Ｔ２−Ａ２４Ｋ９ＩはペプチドＳＳ３９３Ｋ９ＩをパルスしたＴ２−Ａ＊２４０２細胞を標的細胞として用いた結果を示す。また図中、ＦｕｊｉおよびＨＳ−ＳＹＩＩは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＳＹＴ−ＳＳＸが陽性の滑膜肉腫由来細胞株を示す。また図中、ＳＷ９８２およびＫ５６２は、それぞれＨＬＡ−Ａ＊２４０２とＳＹＴ−ＳＳＸが陰性の滑膜肉腫由来細胞株および慢性骨髄性白血病由来細胞株を示す。灰色棒はＥ／Ｔ比が３０：１の結果を、黒棒は１０：１の結果を、白棒は３：１の結果を示す。
【図３】図３は、改変ペプチドＳＳ３９３Ｋ９Ｆによるヒト末梢血単核球からのＣＴＬ誘導活性を、５１Ｃｒリリースアッセイにより測定した結果を示したグラフである。図中縦軸、Ｔ２−Ａ２４ペプチド（−）、Ｆｕｊｉ、ＨＳ−ＳＹＩＩおよびＳＷ９８２は、図２におけると同義である。また図中、Ｔ２−Ａ２４Ｋ９ＦはペプチドＳＳ３９３Ｋ９ＦをパルスしたＴ２−Ａ＊２４０２細胞を標的細胞として用いた結果を示す。灰色棒はＥ／Ｔ比が３０：１の結果を、黒棒は１０：１の結果を、白棒は３：１の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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