(57)【要約】【課題】胞子とパラスポラルボディとを含み、コガネムシ科昆虫の幼虫に対して優れた防除効果を示すバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を高い生産性で製造する方法を提供することにある。【解決手段】コガネムシ科昆虫の幼虫の効果的な防除に必要である、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養し製造する方法であって、マグネシウムを５０〜１００ｐｐｍ含みかつ、マンガンを１０〜４０ｐｐｍ若しくはカルシウムを５０〜１００ｐｐｍ含む培地で培養するバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養し胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を製造する方法であって、マグネシウムを５０〜１００ｐｐｍ含みかつ、マンガンを１０〜４０ｐｐｍ若しくはカルシウムを５０〜１００ｐｐｍ含む培地で培養することを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項２】
前記培地がマグネシウムを５０〜１００ｐｐｍと、マンガンを１０〜４０ｐｐｍと、カルシウムを５０〜１００ｐｐｍとを含む請求項１記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項３】
硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムおよびこれらの水和物、並びに水酸化マグネシウムからなる群から選ばれる一種以上のマグネシウム化合物を培地に対し添加することにより培地のマグネシウム含有量を調整する請求項１または２記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項４】
前記マグネシウム化合物を培地に対し０．５〜４．１１ｍＭ添加する請求項３記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項５】
硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン及びこれらの水和物からなる群から選ばれる一種以上のマンガン化合物を培地に対し添加することにより培地のマンガン含有量を調整する請求項１または２のいずれかに記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項６】
前記マンガン化合物を培地に対し０．１〜０．７３ｍＭ添加する請求項５記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項７】
塩化カルシウム、酢酸カルシウムおよびこれらの水和物、炭酸カルシウム、並びに水酸化カルシウムからなる群から選ばれる一種以上のカルシウム化合物を培地に対し添加することにより培地のカルシウム含有量を調整する請求項１または２記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項８】
前記カルシウム化合物を培地に対し０．１〜１．０５ｍＭ添加する請求項７記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項９】
前記培地が、プロリン、グルタミン酸及びその塩からなる群から選ばれる一種以上を含む請求項１または２に記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【請求項１０】
前記培地が、ペプトン、酵母エキス、ラクトアルブミン水解物、トレハロース、ピルビン酸またはその塩、および吸着剤を含む請求項１または２に記載のバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養することにより、コガネムシ科昆虫の幼虫防除に有用なバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢（以下、単に胞子嚢と言うことがある）を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（コガネムシ幼虫による被害とバチルス・ポピリエに属する菌の防除剤としての利用）
コガネムシ科昆虫の幼虫は、芝や農園芸作物や樹木等の広範囲な植物の根を食餌し、多大な被害を与えることが知られている。これらコガネムシ科昆虫の幼虫は地中に棲息するため、地上から散布する化学農薬では防除効果が得にくく、また幼虫の棲息場所も特定しにくい。このため広範囲に多量の農薬を散布して地中に農薬を浸透させる必要があり、自然環境や人体に対する悪影響が懸念されるため、より有効な防除方法が切望されていた。
【０００３】
バチルス・ポピリエに属する菌はコガネムシ科昆虫の幼虫に経口的に感染して乳化病を発病させ最終的にこれらを死に至らしめることが知られている。このため化学農薬が効きにくいコガネムシ科昆虫の防除に該菌の胞子嚢を利用しようとする試みが古くから行われてきた。
【０００４】
（バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢の難生産性）
バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を生産する方法としては例えば、寄生宿主であるコガネムシ科昆虫の幼虫を利用した方法が従来から知られていた。即ち、胞子嚢を含む腐葉土中で幼虫を飼育して経口的に摂取させる、あるいは直接虫体に胞子嚢を注射するなどして幼虫体内で増殖させ、その後虫体を切開するなり擂り潰すなりして得た体液から胞子嚢を回収する方法である。しかし、この方法ではコガネムシ科昆虫の幼虫を大量に飼育することが必要であり、装置、人員、コストなどの観点から事実上工業生産は難しかった。そこで工業生産に適する、コガネムシ科昆虫の幼虫を必要としない人工培養方法に関する多くの研究がなされてきた。
【０００５】
ところで、バチルス・ポピリエに属する菌は図１の生活環で示すように、まず休眠状態の胞子嚢が発芽して活動状態の栄養細胞へと変化する。次に、これが分裂サイクルを繰り返すことでその数を増やしていき、増殖する。最終的に栄養細胞は再び胞子嚢へと変化し、休眠状態に戻る。このとき、栄養細胞のうち胞子嚢形成のサイクルに移行するものの割合が高ければ高いほど、それだけ多くの胞子嚢を生産できたことになる。よって、胞子嚢の高生産を達成するためには、十分な栄養細胞の増殖と高い胞子嚢化率を両立させることが必要である。しかし実際には、他の微生物に用いられるような培地でバチルス・ポピリエに属する菌を培養しても栄養細胞を増殖させることすら困難で、更に、栄養細胞を増殖し得たとしてもすぐに急激な死滅を起こし、胞子嚢形成に到達させることは極めて困難であった。
【０００６】
（従来の培養技術（金属化合物未添加培地））
それでも、選抜された菌株を用いたり、培地成分を工夫したりすることで胞子嚢生産を可能とする技術が一部開発されている。
例えば、バチルス・ポピリエに属する菌のうち、ＮＲＲＬ  Ｂ−２３０９ＳやＮＲＲＬ  Ｂ−２３０９Ｍといった選抜株を用いて人工培養により胞子嚢が得られたとする報告が知られている。しかし、その生産性は低かった。また、前者においては経口投与でのコガネムシ科昆虫の幼虫に対する防除効果の記述がなく、不明である。後者に至っては、経口投与での効果は全くないことが明らかにされている（例えば、非特許文献１参照）。またこれに対し、培地にグルタミン酸などを含ませることにより胞子嚢が培地１ｍｌ当たり５×１０７〜１×１０９個得られ、それが防除効果を有することも示されている（例えば、特許文献１参照。
）。しかし、工業レベルでの胞子嚢製造という観点では必ずしも満足できる生産性ではなかった。
【０００７】
（従来の培養技術（金属化合物添加培地））
また、マグネシウム、マンガン、カルシウムのうちの一種以上を含んだ培地でバチルス・ポピリエに属する菌を培養して胞子嚢を得ようと試みた例も知られている。
【０００８】
胞子（胞子嚢ではない）形成補助剤として硫酸マンガンを培地に０．０００５〜０．０２５質量％（マンガンとして１．８２〜９０．９１ｐｐｍ）添加している例が知られている。しかし、マグネシウム及びカルシウムの化合物を添加したとの記載はない。該特許の培養法により、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子（胞子嚢ではない）を得たとしている（例えば、特許文献２参照）。しかし、コガネムシ科昆虫の幼虫に対する殺虫効果は弱い。そもそも、該特許で好ましく用いられる菌株として列挙されているものが、バチルス・ポピリエに属する菌ではなかったということが後になって指摘されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００９】
また、０．００５質量％の硫酸マンガン水和物（マンガンとして１１．３９ｐｐｍ）及び０．００５質量％の塩化カルシウム（カルシウムとして１８．０５ｐｐｍ）を含んだ培地を用いた例が知られている（例えば特許文献３。）。しかし、マグネシウム化合物を添加したとの記述はない。培養の結果、培地１ｍｌ当たり３〜５×１０８個の胞子嚢が得られたとしているが、これもやはり工業レベルでの胞子嚢生産という観点では必ずしも満足できるものではない。更に、その胞子嚢にコガネムシ科昆虫の幼虫に対する防除効果があるか否かについては記述がなく、不明である。
【００１０】
更に、Ｃｈａｒ  Ｗａｓｔｅ  Ｗａｔｅｒ（砂糖精製工程で排出される廃液の一種）を培地に用いる方法が開示されている（例えば、特許文献４参照。）。分析の結果、Ｃｈａｒ  Ｗａｓｔｅ  Ｗａｔｅｒには６０〜１５０ｐｐｍのマグネシウム、０．１〜０．８ｐｐｍのマンガン及び５００〜１５００ｐｐｍのカルシウムが含まれるとしている。しかし、これを用いた培養での胞子嚢の生産性、及び得られた胞子嚢のコガネムシ科昆虫の幼虫に対する防除効果については情報がない。
いずれにせよ、コガネムシ科昆虫の防除に有効なバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を工業レベルの高い生産性で製造する方法はこれまで提供されていなかった。また、胞子嚢の生産性を高める目的でマグネシウム濃度を５０〜１００ｐｐｍに調整し、更に１０〜４０ｐｐｍのマンガン、５０〜１００ｐｐｍのカルシウムのうち一方または両方を含ませた培地を用いた培養例は存在しなかった。
【００１１】
【特許文献１】
特開２００２−３５５０３０号公報
【特許文献２】
米国特許  ＵＳＰ  Ｎｏ．４８２４６７１
【特許文献３】
米国特許  ＵＳＰ  Ｎｏ．３５０３８５１
【特許文献４】
米国特許  ＵＳＰ  Ｎｏ．３９５０２２５
【非特許文献１】
イー  エス  シャーペ、グラント  セイント  ジュリアン、クラレンス  クロウェル（Ｅ．  Ｓ．  Ｓｈａｒｐｅ，  Ｇｒａｎｔ  Ｓｔ．  Ｊｕｌｉａｎ，  ａｎｄ  Ｃｌａｒｅｎｃｅ  Ｃｒｏｗｅｌｌ），「アプライド  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，１９７０年，第１９巻，Ｐ．６８１−６８８
【非特許文献２】
ディー  ピー  スターリー、エム  ジー  クライン（Ｄ．  Ｐ．  Ｓｔａｈｌｙ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｇ．  Ｋｌｅｉｎ），「ジャーナル  オブ  インバーテブレイト  パソロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」，１９９２年，第６０巻，Ｐ．２８３−２９１
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、胞子とパラスポラルボディとを含み、コガネムシ科昆虫の幼虫に対して優れた防除効果を示すバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を高い生産性で製造する方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コガネムシ科昆虫の幼虫の効果的な防除には、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢が必要であることを明らかにした。そして、特定の金属を特定の濃度範囲で含有した培地を用いてバチルス・ポピリエに属する菌を培養することにより、コガネムシ科昆虫の幼虫に対して高い防除効果を示す胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の生産性が飛躍的に向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、バチルス・ポピリエに属する菌を培地で培養し胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を製造する方法であって、マグネシウムを５０〜１００ｐｐｍ含みかつ、マンガンを１０〜４０ｐｐｍ若しくはカルシウムを５０〜１００ｐｐｍ含む培地で培養することを特徴とするバチルス・ポピリエに属する菌の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の製造方法である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
（使用するバチルス・ポピリエに属する菌）
本発明で用いるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌の細菌学的性質は、非特許文献３によれば、長さが１．３〜５．２μｍ、幅が０．５〜０．８μｍのグラム陰性桿菌で、生育温度が２０〜３５℃であり、図２に示す模式図の如く胞子嚢の中に胞子とパラスポラルボディとを有する。しかし、バチルス・ポピリエはパエニバチルス・ポピリエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に再分類されるべきとのパターソンらの学説（非特許文献４）が提示されており、現段階ではその分類扱いが明確になっていないため、本発明においてはバチルス・ポピリエに属する菌とはパエニバチルス・ポピリエに属する菌をも包含するものとする。
【００１６】
本発明で使用されるバチルス・ポピリエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）に属する菌株としては、バチルス・ポピリエ・セマダラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｓｅｍａｄａｒａ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６８）、バチルス・ポピリエ・マメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｖａｒ．  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｍａｍｅ、ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６９）、バチルス・ポピリエ・ヒメ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｖａｒ．  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｈｉｍｅ、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６６０）、バチルス・ポピリエ・サクラ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｖａｒ．  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｓａｋｕｒａ、ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６６２）、バチルス・ポピリエ・デュトキ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  Ｄｕｔｋｙ、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１４７０６）、バチルス・ポピリエ・メロロンサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｌｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａｅ）等が挙げられる。
尚、バチルス・ポピリエ・セマダラは、平成１０年５月２１日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６８１８で寄託され、平成１４年５月２１日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６８が付与されている。また、バチルス・ポピリエ・マメは、平成１１年１１月２５日に工業技術院生命工学工業技術研究所（現  独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６６１で寄託され、平成１４年６月１０日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０６９が付与されている。
【００１７】
（マグネシウム、マンガン、カルシウム）
本発明に用いる培地はマグネシウムと共に、マンガン、カルシウムのどちらか一方または両方を含ませること以外特に限定はなく、微生物を培養する公知の培地を使用することができる。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成を強く促進することから、培地中の前記金属の含有濃度をマグネシウムが５０〜１００ｐｐｍ、マンガンが１０〜４０ｐｐｍ、カルシウムが５０〜１００ｐｐｍとなるよう調整することが好ましい。しかし、通常用いられる培地組成により供給されるこれらの濃度は低く不十分であるため、別途金属化合物を添加することでこれを補う必要がある。
【００１８】
マグネシウムを供給するための化合物として、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、乳酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム及びこれらの水和物、水酸化マグネシウムが好ましく、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．５〜４．１１ｍＭとすることが好ましい。
【００１９】
マンガンを供給するための化合物としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン及びこれらの水和物が好ましく、硫酸マンガン、塩化マンガンがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．１〜０．７３ｍＭとすることが好ましい。
【００２０】
カルシウムを供給するための化合物としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム、クエン酸カルシウム、硝酸カルシウム及びこれらの水和物などが例示される。バチルス・ポピリエに属する菌の増殖及び胞子嚢形成促進効果が優れていることから、塩化カルシウム、酢酸カルシウム及びこれらの水和物、炭酸カルシウム、水酸化カルシウムが好ましく、塩化カルシウムがより好ましい。培地への添加濃度は培地組成によって異なるが、前述の濃度範囲に対応するため、０．１〜１．０５ｍＭとすることが好ましい。
本発明者らは培地中に含まれるマグネシウム、マンガン、カルシウムの好適な濃度に関して詳細な検討を重ね、実施例でも示すとおり、胞子嚢の高生産のためには上述の濃度範囲内に厳密に調整されることが不可欠であることを見出した。
即ち、マグネシウム、マンガン、カルシウムが不足していると全菌数、胞子嚢化率共に低いため得られる胞子嚢数は非常に少なく、逆に過多であると全菌数はある程度高い値が得られるものの、胞子嚢化率が急激に低下するため、やはり胞子嚢数は少なくなってしまう。よって、バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を製造するにあたり、高い生産性を達成するためには培地中のマグネシウム、マンガン、カルシウムを本発明の濃度範囲に調整することが非常に重要である。
【００２１】
（プロリン、グルタミン酸）
本発明に使用する培地はプロリンを含有していても良い。プロリンの培地中の含有率は、菌の増殖を促進し、かつ胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の単位体積当たりの生産数を高くできることから培地の０．１〜０．７質量％であり、より好ましくは０．２〜０．６質量％である。該含有率が０．１質量％未満である場合、及び０．７質量％を超える場合、菌の増殖促進効果が低下するだけでなく培地単位体積当たりの胞子嚢の生産数も低下する。
【００２２】
本発明に使用する培地はグルタミン酸及びその塩を含有していても良い。グルタミン酸及びその塩としては、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、グルタミン酸アンモニウム、グルタミン酸塩酸塩等が挙げられる。これらの培地中の濃度は０．２〜４．０質量％であり、より優れた菌の増殖及び胞子嚢化率を呈する点で０．４〜１．０質量％が好ましい。
【００２３】
（その他の培地成分）
また本発明の培地は、前記の金属化合物、プロリン、グルタミン酸及びその塩以外にペプトン、酵母エキス、ラクトアルブミン水解物、トレハロース、ピルビン酸及びその塩等を含んでいてもよい。
【００２４】
ペプトンとしては、通常の微生物培養に用いられるものであれば特に限定されないが、「ポリペプトンＳ」（日本製薬株式会社製）や「ポリペプトンＹ」（日本製薬株式会社製）、「細菌用ペプトン」（ＯＸＯＩＤ社製）や「ソイペプトン」（ＯＸＯＩＤ社製）、「トリプトン」（Ｄｉｆｃｏ社製）などが挙げられ、これらのうち胞子嚢形成促進効果が高いことからポリペプトンＳ、ポリペプトンＹが好ましい。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましい。
【００２５】
酵母エキスとしては、例えば、ＯＸＯＩＤ社製あるいはＤｉｆｃｏ社製の「酵母エキス」などが挙げられる。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましい。
【００２６】
ラクトアルブミン水解物としては特に限定されないが、例えば「ラクトアルブミン水解物」（和光純薬社製）、「オルプラスＷ３」（オルガノ社製）、「オルプラスＷ１」（オルガノ社製）、「ラクトアルブミン加水分解物」（ＯＸＯＩＤ社製）、「バクトＴＣラクトアルブミン加水分解物」（Ｄｉｆｃｏ社製）などが挙げられる。これらのうち胞子嚢形成促進効果が高いことから「ラクトアルブミン水解物」（和光純薬社製）、「オルプラスＷ３」（オルガノ社製）が好ましい。培地への添加濃度は０．００１〜５質量％とすることが好ましい。
【００２７】
トレハロースの培地への添加濃度は、優れた菌の増殖促進効果が得られることから０．００１〜５質量％とすることが好ましい。
【００２８】
本発明のピルビン酸及びその塩としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム等が挙げられる。菌の増殖促進及び胞子嚢生産数を高めるためには培地へのピルビン酸及びその塩の添加濃度を０．００１〜０．５質量％とすることが好ましく、０．０１〜０．３質量％とすることがより好ましい。
【００２９】
（吸着剤）
更に本発明に用いる培地は、バチルス・ポピリエに属する菌の生育を阻害する物質の除去を目的とした吸着剤を含んでいてもよい。該吸着剤としては活性炭、吸着樹脂、アロフォサイト又はモレキュラーシーブ等が挙げられる。培養における胞子嚢生産性がより高いことから、活性炭及び吸着樹脂が好ましい。
本発明に用いる活性炭の形状は、粉末状、粒状又はシート状等、いずれであってもよいが、単位質量当たりの分解又は吸着能が最も高い粉末状の活性炭を使用するのが好ましい。
【００３０】
吸着樹脂は、吸着能を有する多孔質重合体を意味し、例えば粒子状に成型された架橋性多孔質重合体で、粒子内部にまで達する細孔構造により水溶液中の生育阻害物質を効率よく吸着しうる合成樹脂である。具体的には、三菱化学社製の芳香族系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０」、「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２１」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ８２５」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ８５０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ７０」、「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ７００」、置換芳香族系合成樹脂吸着剤「ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７」、アクリル系合成樹脂吸着剤「ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２ＭＧ」などを挙げることができる。
【００３１】
本発明に用いる培地中の吸着剤の含有率は、培地の０．０５〜５質量％が好ましい。０．０５質量％以上であれば菌の生育阻害物質の吸着、除去効果を十分発揮し、５％以下であれば菌の増殖に必要な栄養源の吸着も少ないため、該範囲内で菌の高い増殖促進効果を示す。
【００３２】
（液体培地、固体培地）
本発明の製造方法に用いる培地は、液体培地であっても固体培地であっても良いが、胞子嚢生産性や操作性の観点から液体培地が好ましい。固体培地の場合には、培地組成に寒天などの多糖類を加えればよい。その添加濃度は０．５〜５質量％であり、優れた菌の増殖を呈することから１〜３質量％が好ましい。液体培地による培養は、回分培養、連続培養、半回分培養又は流加培養など、いずれの方式で行っても良い。
【００３３】
（培養条件）
本発明に用いるバチルス・ポピリエに属する菌の増殖に適した培養温度は２５〜３２℃である。また、培地のｐＨは６．５〜８．５が好ましく、７．０〜８．０がより好ましい。更に好ましくは、培養中、培地のｐＨを常に７．０〜８．０に制御する。ｐＨの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。通気量は０．１〜２ｖｖｍ（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ／ｍｉｎｕｔｅ）に調整することが好ましく、優れた菌の増殖及び胞子嚢生産性が得られることから０．５〜１．５ｖｖｍとすることがより好ましい。これら最も好ましい条件で培養を行うためには、液体培養、特に発酵槽を用いた液体培養が適している。
【００３４】
培地に接種する菌体としてはバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を用いる。接種する菌体の接種量は少なすぎると、単位培地当たりの生産量を増やすことが難しく、逆に接種量を多くしても生産量が接種量に比例して上がらず、生産量は飽和してしまう。このため、接種量としては培地１ｍｌ当たり１×１０３〜１×１０８個が好ましく、１×１０５〜１×１０７個の胞子嚢の接種が特に好ましい。
【００３５】
培養時間は培養方法、培養温度、培養ｐＨ又は接種菌体量によって異なるが、通常、回分液体培養の場合で５〜１０日である。
【００３６】
（胞子嚢の生産性と回収）
液体培養終了後に培養物から胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を回収する方法は、培養液から遠心分離や濾過等の一般的な分離方法で該胞子嚢を含む菌体を分離し回収すればよい。この際、必要に応じて水や緩衝液を使った洗浄操作を加えてもよい。固体培養の場合は、培地表面に生えた菌体に水などをかけて懸濁させ、後の操作は液体培養の場合と同様に行えばよい。
【００３７】
本発明の製造方法によれば、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢の数を、菌数に対し３０〜６０％の割合で製造することができ、かつ該胞子嚢の数を培養液１ｍｌ当たり１．２×１０９個〜２．５×１０９個（１２億個〜２５億個）の割合で製造することができる。
【００３８】
（防除対象コガネムシ幼虫）
本発明の製造方法により得られた胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢はコガネムシ科昆虫の幼虫に殺虫活性又は生育抑制等の防除効果を示し、コガネムシ科昆虫の防除剤として有用である。
【００３９】
防除対象のコガネムシ科昆虫としては、ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ  ｃｕｐｒｅａ）、セマダラコガネ（Ｂｌｉｔｏｐｅｒｔｈａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、マメコガネ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ウスチャコガネ（Ｐｈｙｌｌｏｐｅｒｔｈａ  ｄｉｖｅｒｓａ）、チャイロコガネ（Ａｄｏｒｅｔｕｓ  ｔｅｎｕｉｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ヒメコガネ（Ａｎｏｍａｌａ  ｒｕｆｏｃｕｐｒｅａ）、チビサクラコガネ（Ａｎｏｍａｌａ  ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄｔｉ）等の幼虫が挙げられる。
【００４０】
（バチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢製剤及びその使用方法）
本発明の製造方法により製造した胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢は、それらを懸濁した液のままコガネムシ科昆虫の防除剤として用いても良く、または乾燥して粉末にして散布しても良い。また乾燥した粉末を水あるいは緩衝液との懸濁液とし、土壌に散布しても良い。しかし、通常は該胞子嚢を農薬に用いられる慣用の添加剤と共に通常の微生物農薬の製造方法で製剤化してコガネムシ科昆虫の防除剤として施用することが好ましい。また本発明の製造方法により得られる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を他の微生物製剤に混合して使用することも可能である。前記防除剤中に含まれる胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の含有率は、コガネムシ科昆虫に防除効果を示す範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、施用に際して水和剤、乳剤では防除剤１リットル当たり胞子嚢が１×１０９〜１×１０１３個程度となるよう調製することが好ましく、粉剤、粒剤では防除剤１ｇ当たり１×１０８〜１×１０１２個程度となるよう調製することが好ましい。
【００４１】
防除剤の施用方法としては、剤型や対象作物等によって適宜選択され、例えば、地上液剤散布、地上固形散布、空中液剤散布、空中固形散布、施設内施用、土壌混和施用又は土壌潅注施用等の方法を挙げることができる。また、他の薬剤、すなわち殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、殺菌剤、植物生長調節剤、肥料又は土壌改良資材（泥炭、腐植酸資材又はポリビニルアルコール系資材等）等と混合して施用、あるいは混合せずに交互施用または同時施用することもできる。
【００４２】
前記防除剤の施用量は、コガネムシ科昆虫の種類、適用植物の種類及び剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、地上散布する場合、本発明の胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の施用量が１アール当たり１０１０〜１０１５個、好ましくは１アール当たり１０１１〜１０１４個程度となるようにすればよい。
【００４３】
（非特許文献３）：アール  イー  ブヒャナン、エヌ  イー  ギボンズ（Ｒ．  Ｅ．  Ｂｕｃｈａｎａｎ，  Ｎ．  Ｅ．  Ｇｉｂｂｏｎｓ），「バージェイズ  マニュアル  オブ  デターミネイティブ  バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＶＥ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ）」，１９７４年，第８版
（非特許文献４）：バーティル  パターソン、カレン  イー  リップレ、アランエー  ユーステン、ファーガス  ジー  プリースト（Ｂｅｒｔｉｌ  Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，  Ｋａｒｅｎ  Ｅ．  Ｒｉｐｐｅｒｅ，  Ａｌｌａｎ  Ａ．  Ｙｏｕｓｔｅｎ，  Ｆｅｒｇｕｓ  Ｇ．  Ｐｒｉｅｓｔ），「インターナショナル  ジャーナル  オブ  システマティック  バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，１９９９年，第４９巻，Ｐ．５３１−５４０
【００４４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。
（参考例１）
（各培地成分に含まれる金属元素の分析）
培地に用いる各成分に含有されるマグネシウム、マンガン及びカルシウムの量を原子吸光（フレーム法）により測定した。測定に供した成分サンプルは、ポリペプトンＳ（日本製薬社製）、酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、ラクトアルブミン水解物（和光純薬社製）、オルプラスＷ３（オルガノ社製）、活性炭素粉末（関東化学社製）、トリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）であった。これらをそれぞれ超純水に溶解後、測定に供した。但し、活性炭素粉末についてはマイクロウェーブ試料分解装置ＭＩＬＥＳＴＯＮＥ社製ＭＬＳ１２００ＭＥＧＡ（分解試薬として精密分析用硝酸を添加）で分解処理を行った後、測定に供した。用いた分析装置はセイコー電子社製ＳＡＳ７５００であった。
結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
（表１）
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【００４６】
（参考例２）
（各培地に含まれる金属元素量の算出）
表１のデータを基に、従来バチルス・ポピリエに属する菌の培養に用いられている下記培地（ａ）〜（ｄ）中のマグネシウム、マンガン及びカルシウム含有量を算出した。結果を表２に示す。
培地（ａ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、０．５質量％オルプラスＷ３、０．５質量％トレハロース（和光純薬社製特級）、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．２質量％プロリン（和光純薬社製特級）、０．３質量％活性炭素粉末／水酸化カリウムにてｐＨを８．２に調整
培地（ｂ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、１．０質量％ラクトアルブミン水解物、０．５質量％トレハロース（和光純薬社製特級）、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．０５質量％ピルビン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．３質量％活性炭素粉末／水酸化カリウムにてｐＨを７．６に調整
培地（ｃ）：０．７５質量％ポリペプトンＳ、０．７５質量％酵母エキス（ＯＸＯＩＤ社製）、１．０質量％ラクトアルブミン水解物、０．５質量％トレハロース（和光純薬社製特級）、０．６４質量％グルタミン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．２質量％プロリン（和光純薬社製特級）、０．０５質量％ピルビン酸ナトリウム（和光純薬社製特級）、０．３質量％活性炭素粉末／水酸化カリウムにてｐＨを７．６に調整
培地（ｄ）：０．５質量％トリプトン、１．５質量％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．３質量％リン酸水素二カリウム（和光純薬社製特級）、０．２質量％グルコース（和光純薬社製特級）
【００４７】
【表２】
（表２）
2004337002.tif 000003
【００４８】
金属化合物を添加しない上記通常の培地では、各成分からのマグネシウム及びマンガンの持ち込み量は少なく、本発明の濃度範囲とは大きな開きがあることが分かる。またカルシウムについては、培地組成によってはしばしば本発明の濃度範囲よりも低く、不足している。
【００４９】
（参考例３）
（マグネシウム濃度検討／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
参考例２の培地（ａ）及び、これに硫酸マグネシウム七水和物をそれぞれ０．４ｍＭ、０．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．８ｍＭ、４．０ｍＭとなるように添加した培地を１００ｍｌずつ作成した。但し、培地の溶媒には蒸留水を用いた（以下全て同様）。このときの各培地中のマグネシウム、マンガン、カルシウムの濃度を表３に示す。これらを三角フラスコに入れ、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
【００５０】
【表３】
（表３）
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【００５１】
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を１×１０９個／ｍｌとなるよう蒸留水に懸濁し、プラスチックチューブに分注してヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。該胞子嚢液を各培地に１００μｌずつ接種し（胞子嚢濃度１×１０６個／培地ｍｌ）、振盪１００ｒｐｍ、３０℃の条件で７日間培養した。
【００５２】
培地に含まれるマグネシウム濃度と培養によって得られた胞子嚢数及び全菌数との関係を図３に示す。培地中マグネシウム濃度を５０〜１００ｐｐｍとしたときに胞子嚢生産性が顕著に上昇することが明らかとなった。
尚、本実験はあくまでもマグネシウム濃度と胞子嚢生産性の関係を調べるのが目的であるため、操作性を優先させる都合上、フラスコを用いた培養を行っている。そのため全体的に得られた胞子嚢数が低くなっているが、同様の培地を用いて通気量及びｐＨ制御可能な発酵槽での培養を行えば値は全て底上げされて高くなる。以下の参考例４、５、６も同様。
【００５３】
（参考例４）
（マンガン濃度検討／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
参考例２の培地（ａ）及び、これに硫酸マンガン五水和物をそれぞれ０．０８ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．８ｍＭ、２．０ｍＭとなるように添加した培地を１００ｍｌずつ作成した。このときの各培地中のマグネシウム、マンガン、カルシウムの濃度を表４に示す。以下、参考例３と同様にして培養を行った。
【００５４】
【表４】
（表５）
2004337002.tif 000005
【００５５】
培地に含まれるマンガン濃度と培養によって得られた胞子嚢数及び全菌数との関係を図４に示す。培地中マンガン濃度を１０〜４０ｐｐｍとしたときに胞子嚢生産性が顕著に上昇することが明らかとなった。
【００５６】
（参考例５）
（カルシウム濃度検討／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
参考例２の培地（ａ）及び、これに塩化カルシウム二水和物をそれぞれ０．１４ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．７ｍＭ、１．４ｍＭ、３．５ｍＭとなるように添加した培地を１００ｍｌずつ作成した。このときの各培地中のマグネシウム、マンガン、カルシウムの濃度を表５に示す。以下、参考例３と同様にして培養を行った。
【００５７】
【表５】
（表５）
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【００５８】
培地に含まれるカルシウム濃度と培養によって得られた胞子嚢数及び全菌数との関係を図５に示す。培地中カルシウム濃度を５０〜１００ｐｐｍとしたときに胞子嚢生産性が上昇することが明らかとなった。
【００５９】
（参考例６）
（マグネシウム、マンガン、カルシウム添加／フラスコ培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ）
参考例２の培地（ａ）及び、これに硫酸マグネシウム七水和物を２．０ｍＭとなるように添加した培地（ｅ）、硫酸マンガン五水和物を０．４ｍＭとなるように添加した培地（ｆ）、塩化カルシウム二水和物を０．７ｍＭとなるように添加した培地（ｇ）を１００ｍｌずつ作成した。また、培地（ａ）に硫酸マグネシウム七水和物を２．０ｍＭ、硫酸マンガン五水和物を０．４ｍＭ、塩化カルシウム二水和物を０．７ｍＭとなるように加えた培地（ｈ）を１００ｍｌ作成した。このときの各培地中のマグネシウム、マンガン、カルシウムの濃度を表６に示す。以下、参考例３と同様にして培養を行った。
【００６０】
【表６】
（表６）
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【００６１】
各培地において培養後に得られた胞子嚢数を図６に示す。マグネシウム、マンガン、カルシウムによる胞子嚢形成促進効果は、これらを混合して添加したとき上乗せされて胞子嚢生産性の向上に寄与していた。
【００６２】
（実施例１）
（マグネシウム、マンガン、カルシウム添加／発酵槽培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ、マメ、ヒメ、サクラ／活性炭）
参考例２の培地（ｃ）に硫酸マグネシウム七水和物を２．０ｍＭ、硫酸マンガン五水和物を０．４ｍＭ、塩化カルシウム二水和物を０．７ｍＭ、消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）を０．１質量％となるように加えた培地（ｃ’）を１Ｌ作成した。該培地のマグネシウム、マンガン、カルシウムの含有量はそれぞれ７２ｐｐｍ、２３ｐｐｍ、９０ｐｐｍであった。これを、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
【００６３】
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢約１×１０９個を１ｍｌの蒸留水に懸濁してプラスチックチューブに入れ、ヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。この胞子嚢液を発酵槽に接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
【００６４】
バチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラについても同様の操作を行った。
【００６５】
各菌株における胞子嚢生産性を表７に示す。いずれも１．２×１０９個／ｍｌ以上の胞子嚢、及び３５％以上の胞子嚢化率が得られ、高い生産性が認められた。
【００６６】
【表７】
（表７）
2004337002.tif 000008
【００６７】
（実施例２）
（マグネシウム、マンガン、カルシウム添加／発酵槽培養／バチルス・ポピリエ・セマダラ／吸着樹脂）
参考例２の培地（ｂ）及び（ｃ）の活性炭素粉末の代わりに０．５質量％の吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ８２５（三菱化学社製）を用い、更に硫酸マグネシウム七水和物を２ｍＭ、硫酸マンガン五水和物を０．４ｍＭ、塩化カルシウム二水和物を０．７ｍＭ、消泡剤（日本油脂社製「ディスホームＣＡ−１２３」）を０．１質量％となるように加えた培地（ｂ’’）（ｃ’’）をそれぞれ１Ｌ作成した。これら培地のマグネシウム、マンガン、カルシウムの含有量は両者等しく、それぞれ７２ｐｐｍ、２３ｐｐｍ、９０ｐｐｍであった。これらを、ｐＨ電極を備えた発酵槽（丸菱バイオエンジ社製）に移し、１２１℃、６０分間のオートクレーブ処理にて殺菌した。
【００６８】
バチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を約１×１０９個／ｍｌとなるよう蒸留水に懸濁し、１ｍｌずつプラスチックチューブに分注してヒートブロックで７０℃、２０分間の加熱処理を行った。該胞子嚢液を培地（ｂ’’）（ｃ’’）の発酵槽にそれぞれ接種し、撹拌１５０ｒｐｍ、通気１ｖｖｍ、３０℃、ｐＨ７．６制御の条件で７日間培養した。
【００６９】
培地（ｂ’’）（ｃ’’）における胞子嚢生産性を表８に示す。いずれも１．３×１０９個／ｍｌ以上の胞子嚢、及び４０％以上の胞子嚢化率が得られ、高い生産性が認められた。
【００７０】
【表８】
（表８）
2004337002.tif 000009
【００７１】
（試験例１）
（殺虫活性試験）
本発明の製造方法により得られた胞子嚢によるコガネムシ科昆虫の幼虫の防除効果試験を行った。
【００７２】
実施例１の培地（ｃ’）を用いた培養で取得したバチルス・ポピリエ・セマダラの胞子嚢を蒸留水に２×１０８個／ｍｌとなるよう懸濁させた。腐葉土を約１５ｇずつ入れた直径６ｃｍのプラスチックカップ２０個に胞子嚢懸濁液を１ｍｌずつ散布し、よく混和した。各カップにドウガネブイブイ２令幼虫を１頭ずつ入れ、２５℃のインキュベーター内で２０日間飼育し、幼虫の死亡率を計測した。
【００７３】
同様の操作をバチルス・ポピリエ・マメ、バチルス・ポピリエ・ヒメ、バチルス・ポピリエ・サクラについても行った。また、対照試験区では胞子嚢懸濁液の代わりに水を用いた。
【００７４】
表９に示した結果から明らかなように、本発明の方法により製造された胞子嚢はいずれの菌株においてもコガネムシ科昆虫の幼虫に対し優れた防除効果を有することが確認された。
【００７５】
【表９】
（表９）
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【００７６】
【発明の効果】
本発明は胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を効率良く製造する方法を提供できる。すなわち、本発明は５〜１０日程度の培養で、胞子とパラスポラルボディとを含むバチルス・ポピリエに属する菌の胞子嚢を３０〜６０％の胞子嚢化率で製造することができ、また、培養液１ｍｌ当たり、胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢を１．２×１０９〜２．５×１０９個の割合で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】バチルス・ポピリエに属する菌の生活環を示した図である。
【図２】胞子とパラスポラルボディとを含む胞子嚢の模式図である。
【図３】培地中のマグネシウム濃度と培養によって得られた胞子嚢数及び全菌数との関係を示したグラフである。
【図４】培地中のマンガン濃度と培養によって得られた胞子嚢数及び全菌数との関係を示したグラフである。
【図５】培地中のカルシウム濃度と培養によって得られた胞子嚢数及び全菌数との関係を示したグラフである。
【図６】マグネシウム、マンガン、カルシウムを培地に単独で、あるいは混合して添加したときの胞子嚢生産性を示したグラフである。
【符号の説明】
１  胞子嚢
２  パラスポラルボディ
３  胞子
４  栄養細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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