(57)【要約】【課題】標識修飾を用いなくとも目的遺伝子の検出が可能であり、また標識修飾を用いた場合も検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがない生化学検体の検出方法と検出チップの提供。【解決手段】ループ構造を形成しているプローブＤＮＡは、目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されてプローブＤＮＡが伸びるため、ハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡと、ループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとは基板からの高さに明確な違いを生じ、ハイブリダイゼーションの有無をこの高さの違い、立体的な段差として検出する。ハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡに選択的に種々の標識修飾が可能であり、プローブＤＮＡ同士の高さの違いにさらに修飾した標識の大きさを加えてループ構造のプローブＤＮＡとの段差を拡大してこれを検出・識別する。【選択図】　　　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項２】
基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡまたは検体ＤＮＡあるいは両方に標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項３】
プローブＤＮＡに標識を修飾する工程、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項４】
基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに予め標識修飾した検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有する生化学検体の検出方法。
【請求項５】
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。
【請求項６】
基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。
【請求項７】
基板上の２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとの高さの違いを検出する方法が、電子又は光学顕微鏡観察法、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法、ＳＴＭ，ＳＴＳ，ＡＦＭ観察法、電子回折法、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ法、Ｘ線表面回折法のいずれかである請求項１から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。
【請求項８】
標識がプローブＤＮＡより大きい請求項２又は請求項４に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項９】
標識がプローブＤＮＡより小さい請求項３に記載の生化学検体の検出方法。
【請求項１０】
標識が、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞のいずれかである請求項２から請求項４のいずれかに記載の生化学検体の検出方法。
【請求項１１】
基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその基板表面に固定されない解放端側が基板側に位置するようループ構造を有する生化学検体の検出チップ。
【請求項１２】
基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその標識を修飾可能にした部位が基板側に位置するようループ構造を有する生化学検体の検出チップ。
【請求項１３】
基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその標識を修飾した部位が基板側に位置するようループ構造を有する生化学検体の検出チップ。
【請求項１４】
プローブＤＮＡの塩基数が６０以上である請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項１５】
基板表面に貴金属薄膜を有する請求項１１から請求項１３のいずれかに記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項１６】
標識が、金属微粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス微粒子、染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞のいずれかである請求項１３に記載の生化学検体の検出チップ。
【請求項１７】
基板がガラスまたは半導体シリコンからなり、表面に金薄膜を有する請求項１６に記載の生化学検体の検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ハイブリダイゼーションして２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている１本鎖のプローブＤＮＡとの高さの違いをを検出して目的の生化学検体を検出する方法に係り、基板に配列されたプローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端側が基板側に向くように構成することで、目的ＤＮＡがある場合にハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションして２本鎖を形成したプローブＤＮＡは他のループ構造のプローブＤＮＡと高さが異なること利用し、顕微鏡観察やＸ線回折などの手段で容易に目的遺伝子の検出が可能になる生化学検体の検出方法と検出チップに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡチップの基本原理は、ＤＮＡが相補的な二重螺旋構造を形成することを利用するものである。Ａ（アデニン）とＴ（チミン）、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）が対をなすことから、例えば、ＡＧＧＴＴＡＣのＤＮＡ配列を持つ遺伝子を検出するには、プローブとしてＴＣＣＡＡＴＧの配列を持つＤＮＡを作成し、サンプリング検体遺伝子中に目的遺伝子が存在すると、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、プローブＤＮＡの配列にＡＧＧＴＴＡＣの配列が結合して二重螺旋構造を取るため、これを検出することで検体ＤＮＡを容易に選別できることになる。
【０００３】
二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、検体ＤＮＡ（サンプリング遺伝子ＤＮＡ）に蛍光標識の修飾を施しておき、プローブＤＮＡと前記のＤＮＡハイブリダイゼーション操作を行い、二重螺旋構造を呈したＤＮＡ、すなわち蛍光シグナルを発する物を検出する、蛍光法が知られている。
【０００４】
蛍光標識としては、蛍光色素そのものの他、蛍光色素により直接染色された染色体、糖蛋白や糖脂質から切り出された糖鎖体に修飾したイオン性蛍光物質、あるいはタンパク質、核酸、酵素、細胞等を蛍光色素でタグ化するなど、種々方法並びに物質で蛍光を発する標識が提案されている。
【０００５】
そこで、検体ＤＮＡに蛍光色素の修飾を行わずに二重螺旋構造のＤＮＡを検出する方法として、屈折率変化を検出するＳＰＲ分光法を用いた方法が提案されている。詳述すると、ガラス基板に金属薄膜を形成してこの薄膜上にプローブＤＮＡを固定しておき、これとサンプリング遺伝子をハイブリダイゼーション操作させることにより二重螺旋構造のＤＮＡを形成させ、基板裏面側からの金属薄膜への反射光強度の測定を行い、ハイブリダイゼーション前の金属薄膜の屈折率と二重螺旋構造のＤＮＡを有する場合の屈折率との変化を測定する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーションの検出には、検体ＤＮＡへの蛍光標識の修飾操作が煩雑であること、また、施術者の技量によって前記修飾効果が異なること、種々条件で蛍光色素の光消失が発生すること、未反応吸着物によるバックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下すること等の問題が指摘されている。
【０００７】
前記ＳＰＲ分光法において、前述したハイブリダイゼーション前後の金属薄膜の屈折率の変化を測定するが、基板裏面側からの金属薄膜への入射角度と反射率との関係として解析する際に、当該変化が僅かであるため、さらに高精度に検体ＤＮＡを検出するには、ＳＰＲ応答の増幅を図るなどの改良を施す必要がある。
【０００８】
この発明は、バックグラウンドノイズの上昇で検出精度が低下する蛍光法やＳＰＲ応答の増幅を図る必要があるＳＰＲ分光法など異なり、従来の標識修飾を用いなくとも目的遺伝子の検出が可能であり、また標識修飾を用いた場合も検出工程を再現性よく簡素化でき、測定者に過度の技量を要求することがない、簡単な工程からなる生化学検体の検出方法と検出チップの提供を目的としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、前記蛍光法を用いたＤＮＡハイブリダイゼーション検出に問題を有することから、光退色の懸念がある蛍光法に換えてＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分光法を用いた方法を検討しており、このＳＰＲ応答の増幅を目的にプローブＤＮＡへの金微粒子修飾の有効性を検討中に、金薄膜表面に対するプローブＤＮＡの吸着固定量は、ＤＮＡ塩基数（鎖長）によらずほぼ一定であること、金微粒子修飾量はＤＮＡ塩基数に依存することを知見し、これよりプローブＤＮＡ塩基数の違いによってプローブＤＮＡの立体的構造が変化していることを知見した。
【００１０】
そこで、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討を行い、プローブＤＮＡの塩基数の違いによるＳＰＲ応答、すなわち金微粒子修飾を行ったプローブＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを施し、その後のＳＰＲ角度のシフト量についての変化や挙動を検討したところ、塩基数１０では金微粒子修飾量が少なく、塩基数３０では修飾量が増大するが、いずれも該シフト量の増大効果が少ないこと、塩基数６０では金微粒子修飾ができないこと、すなわち塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないことを知見した。
【００１１】
また、発明者らは、プローブＤＮＡ鎖長の検討、特に塩基数６０以上の長いプローブＤＮＡにおけるＳＰＲ応答の増幅を目的に種々検討した結果、前述のごとく検出チップに吸着固定したプローブＤＮＡに先に金微粒子修飾するのではなく、まず先にサンプルとのハイブリダイゼーションを施すと、検出チップの薄膜上でループ状となって配列していたプローブＤＮＡが伸びて金微粒子修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後に金微粒子修飾を行う工程にて、長いプローブＤＮＡにも修飾が可能となり、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ金微粒子修飾することが可能であることを知見した。
【００１２】
さらに、発明者らは、基板に配列させたループ構造を形成しているプローブＤＮＡにおいて、目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されてプローブＤＮＡが伸びることで、ハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡと、ハイブリダイゼーションせずにループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとは基板からのその高さに明確な違いを生じることになり、ハイブリダイゼーションの有無をこの高さの違い、すなわち立体的な段差として検出可能であることを知見し、この発明を完成した。
【００１３】
すなわち、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、基板表面に固定されない解放端側が基板側に位置するように、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。
【００１４】
また、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、ハイブリダイゼーションの実行中又は実行後のプローブＤＮＡまたは検体ＤＮＡあるいは両方にプローブＤＮＡより大きな標識を修飾する工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。なお、プローブＤＮＡより大きな標識とは、プローブＤＮＡの長さなどの寸法あるいはその形態より大きな寸法や形態を有する標識をいう。
【００１５】
また、この発明は、プローブＤＮＡにより小さな標識を修飾する工程、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成している基板上のプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。なお、プローブＤＮＡより小さな標識とは、プローブＤＮＡの長さなどの寸法あるいはその形態より小さな寸法や形態を有する標識をいう。
【００１６】
また、この発明は、基板表面にプローブＤＮＡを配列する工程、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡに予め標識修飾した検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する工程を有することを特徴とする生化学検体の検出方法である。
【００１７】
さらに、この発明は、基板上に配列されたプローブＤＮＡを有し、配列したプローブＤＮＡはその基板表面に固定されない解放端側が基板側に位置するよう、また標識を修飾可能にした部位が基板側に位置するよう、あるいは標識を修飾した部位が基板側に位置するようループ構造を有することを特徴とする生化学検体の検出チップである。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下にこの発明の特徴である各プローブＤＮＡがループ構造を形成して解放末端が基板表面側にあるように構成した検出チップ並びにループ構造について説明する。
【００１９】
まず、検出チップの作製について説明すると、ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００２０】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、プローブの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ　７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。なお、プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００２１】
金コロイド修飾方法は、上記の検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ　７．４）で洗浄後、窒素ガスでおだやかに乾燥させ、表面にアビジンをコートした金コロイド（粒径１０ｎｍ、ＳＩＧＭＡ製）を滴下し１〜３時間、飽和水蒸気中で放置することで、ビオチンとアビジンの特異的結合を利用して修飾させた。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００２３】
ＳＰＲ測定は、検出チップをＲ−ＢＦＲ溶液で洗浄後に窒素ガスで乾燥し速やかにＳＰＲ測定を行なった。
【００２４】
上記方法で、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製した。この時、プローブＤＮＡの金薄膜への吸着量をＳＰＲ測定により評価した。プローブＤＮＡの塩基数が大きくなるにつれ、ＳＰＲ角度のシフトが大きくなった。また、ＳＰＲ角度シフトを分子量で割った値は、吸着量に比例するため、これを求めたところ、プローブＤＮＡの吸着効率は、塩基数１０が最もよく、３０、６０では、大きな変化がないこと、さらに塩基数による吸着効率の変化は、１０、１００倍と大きく変化するものではなく、塩基長によらずオーダーとしてほぼ一定であることを確認した。なお、ここでは基板への被覆率約２５％を達成した。
【００２５】
また、１０〜６０の塩基数のプローブＤＮＡをそれぞれ固定した検出チップを作製し、それぞれ上記金コロイド修飾方法により修飾を行い、塩基数による金コロイド修飾量の変化をＡＦＭ（原子間力顕微鏡）で観察し、修飾された金コロイド粒子数を計測したところ、塩基長１０では、約４００個／μｍ２、塩基長３０では、約７００個／μｍ２の金コロイドの修飾が観察されたが、塩基長６０では、金コロイドの修飾が全く観察されなかった。
【００２６】
これを確認するため、ＳＰＲ法を用いｉｎ−ｓｉｔｕでのＤＮＡプローブに対する金コロイド修飾の挙動を観察した。すなわち、検出チップをプリズム上に接着し、基板表面を上述のＲ−ＢＦＲ溶液で満たし、これに、金コロイド溶液を滴下し、ある一定入射角での反射光強度を継時的に観測したところ、金コロイド修飾が行なわれた場合にはＳＰＲ角度がシフトし、反射光強度の上昇が観察されるが、塩基数６０のＤＮＡでは、反射強度の変化が無くＡＦＭでの観察と同様、金コロイドの修飾が行なわれないことを確認した。
【００２７】
検出チップ金薄膜へのプローブＤＮＡの吸着は、プローブＤＮＡの鎖長に依らずオーダー的にほぼ一定であるのに対し、金薄膜に固定化されたプローブＤＮＡに対する金コロイドの修飾効率は、プローブＤＮＡの鎖長に大きく依存することが判明し、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイド修飾が起こらないことを確認した。
【００２８】
前述の合成によるプローブＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９　ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これと相補的に結合する末端３０塩基、中央３０塩基、中央６０塩基の３種類をプローブＤＮＡとし、前述と同様の方法で検出チップを作製した。
【００２９】
上記の３種のプローブＤＮＡに対して前述した金コロイド修飾方法を行い、その後実際の長いＤＮＡ鎖を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００３０】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化を示す表に明らかなように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、末端、中央、共に、ハイブリダイゼーションによる有意差が小さく、また、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、全く金コロイドが修飾されず、実際の長い遺伝子を目的遺伝子とした場合、上記の条件では、ＳＰＲ法によるハイブリダイゼーションの検出は困難であることを確認した。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
表１のプローブＤＮＡ塩基長によるＳＰＲ角度シフトの変化から、８５６ｂｐの長いＤＮＡを目的遺伝子とした場合、プローブ鎖と比べて、目的遺伝子が約１４〜２８倍長いため、立体的な制約によりプローブＤＮＡと反応する確率が低いと考えられる。従って、ハイブリダイゼーションしたプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合と、ハイブリダイゼーションしていないプローブ鎖に金コロイドが修飾される場合とでＳＰＲ角度のシフトにバラツキがみられると推測される。
【００３３】
そこで先の工程、すなわち金コロイド修飾方法を行い、その後ハイブリダイゼーションを実施しする工程とは逆に、上記と同じプローブＤＮＡの検出チップに対してハイブリダイゼーションを実施した後、金コロイド修飾方法を行い、その後ＳＰＲ法による前記ハイブリダイゼーションの検出を実施した。
【００３４】
すなわち、塩基数６０のプローブＤＮＡでは、ループ構造を形成しているため、金コロイド修飾が行なわれないと推測される。ループ構造をとっている長い１本鎖ＤＮＡはハイブリダイゼーションによりそのループ構造が解消された後に、金コロイド修飾を行なえば金コロイド修飾が可能であると推測される。そこで６０塩基のＤＮＡプローブにおいても同様の手法を用いれば金コロイド修飾が可能であると考えた。図１Ａ，Ｂ参照。
【００３５】
換言すれば、目的遺伝子がない場合には、ハイブリダイゼーションは起こらずかつ金コロイド修飾が行なわれない。これに対して、目的遺伝子がある場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されることにより、ハイブリダイゼーションしたＤＮＡプローブにのみ選択的に金コロイド修飾が起こり、ＳＰＲ測定でハイブリダイゼーションによるシフトに金コロイド修飾によるシフトが加わった大きなＳＰＲ角度シフトの差が得られると考えた。
【００３６】
そこで、実際の長いＤＮＡ鎖を目的遺伝子とした検出チップを用い、前述の各工程で、プローブＤＮＡの基板への付着、ハイブリダイゼーション、金コロイド修飾を実施し、水溶液中でのＳＰＲ角度シフト並びに空気中でのＳＰＲ角度シフトを測定した。
【００３７】
プローブＤＮＡのみの場合には、金コロイド修飾を行なってもＳＰＲ角度シフトが見られないが、プローブＤＮＡにハイブリダイゼーションが起こった場合には、ＳＰＲ角度が大きくシフトして金コロイド修飾が行われていることが明らかになった。
【００３８】
すなわち、空気中でのＳＰＲ角度シフトの測定結果を表２に示すように、３０塩基のプローブＤＮＡでは、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトの増幅作用が小さく、また、サンプル間における偏差も大きかった。それに対して、６０塩基のプローブＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾した場合には、金コロイド修飾によるＳＰＲ角度シフトが約４〜５倍増幅され、かつサンプル間における偏差も小さかった。
【００３９】
要するに、ハイブリダイゼーション後に金コロイド修飾を行うことにより、溶液中、空気中ともに、６０塩基プローブＤＮＡの金コロイド修飾が可能となった。すなわち、６０塩基プローブＤＮＡの立体構造（ループ構造）を利用することにより、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡのみに選択的に金コロイド修飾させることが可能であり、その結果、大きなＳＰＲ角度シフトの増幅が可能で、サンプル間の偏差を小さくすることが可能であることを確認した。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
この発明は、以上の知見に基づきなされたもので、ループ構造を形成しているプローブＤＮＡにおいて、目的ＤＮＡがある場合にのみハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されてプローブＤＮＡが伸びることを目的遺伝子の検出に利用するものである。すなわち、前述のようにハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションせずにループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとは基板からのその高さに明確な違いを生じており、これを公知の方法で検出・識別し、当該高さの違いあるいは立体的な段差をもってハイブリダイゼーションの有無の確認や目的遺伝子の検出が実施できるのである。
【００４２】
また、この発明は、ハイブリダイゼーションされたプローブＤＮＡに選択的に種々の標識修飾が可能であることから、プローブＤＮＡ同士の高さの違いにさらに修飾した標識の大きさを加えてループ構造を保持したままのプローブＤＮＡとの段差を拡大してこれを検出・識別することが可能であり、標識としてはある程度の大きさがあるものであればいずれのものも利用でき、またハイブリダイゼーション後に２本鎖を形成した目的ＤＮＡにも標識修飾して前記の高さの違いを拡大させることも可能である。
【００４３】
この発明において、基板には、ガラス基板、樹脂基板、シリコン基板等のプローブＤＮＡの配列が実施可能な基板であればいずれの材質も採用できる。また、基板に貴金属薄膜を成膜する場合は、その表面粗度はできるだけ平坦なものが好ましい。洗浄、乾燥方法としては、実施例に示すごとく、半導体ウエーハや各種デバイスを製造する際に採用される、各種溶剤による洗浄、純水中の超音波洗浄、各種酸溶液による洗浄、ブロー乾燥、スピン乾燥など公知の基板の洗浄、乾燥方法を適宜選択、組合せて採用できる。ガラス基板としては、公知のホウケイ酸ガラス等が利用でき、厚みは厚いほうが取り扱いやすいが、いずれの厚みのものも利用できる。
【００４４】
この発明において、プローブＤＮＡの配列を容易にするため、基板上に金、白金、銀などの貴金属薄膜を設けることができる。成膜方法としては膜厚みを一定に制御するため、スパッタリング、イオンプレーティング、ＣＶＤ等の公知の気相成長による方法が好ましい。なお、基板と薄膜との密着性を向上させるために下地層を適宜成膜することができる。例えば、ガラス基板、石英基板にＣｒ層を設けたり、シラン化合物によって表面改質するなどの手段を採用できる。
【００４５】
この発明において、基板上、あるいはさらに貴金属薄膜表面にプローブＤＮＡを配列する工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば薄膜上を酸や純水で洗浄後、プローブＤＮＡと緩衝液を用いて飽和水蒸気雰囲気中で配列させることができる。
【００４６】
また、緩衝液としては、例えばＫＨ２ＰＯ４とＫ２ＨＰＯ４を配合して所要ｐＨにした溶液が採用できる。他には、ＰＳＢや、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌとＥＤＴＡを用いるなど、所要ｐＨにするため公知の薬液を選定配合した溶液等も採用できる。
【００４７】
この発明において、プローブＤＮＡは、その末端を一方は基板表面あるいは貴金属薄膜に固定し、他方端あるいはその近傍には後述の標識を修飾するために、各々の前記末端を前記基板表面あるいは標識と接合可能な物質で修飾しておくことが望ましい。
【００４８】
この発明において、プローブＤＮＡの塩基数は特に限定しないが、ハイブリダイゼーション後に、目的ＤＮＡと２本鎖を形成したプローブＤＮＡにのみ標識を修飾するには、チップ基板上にあるプローブＤＮＡはハイブリダイゼーション前にループ構造を形成して解放末端側あるいは修飾可能な部位が薄膜側にある必要がある。
【００４９】
この発明において、プローブＤＮＡは、その製造過程中又は製造後にループ構造を形成していて基板に配列されるか、基板に配列する際にループ構造を形成するか、基板に配列後にループ構造を形成するように構成するか、いずれの構成、方法も採用できる。
【００５０】
例えば、図２Ａ，Ｂに示すごとく、相補的な二重螺旋構造を形成可能な対をなすＤＮＡの配列を予め形成しておき、ループ構造を形成し得るように構成することが可能であり、塩基数は特に限定しないが、比較的長鎖の構成を有するものが望ましく、好ましくは塩基数が６０以上である。さらに塩基数が１００を超えたり、１０００程度の場合であってもこの発明を適用できる。
【００５１】
この発明において、基板表面に配列したプローブＤＮＡに検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程は、特に限定されるものでなく、公知のいずれの方法も採用でき、例えば基板の洗浄後に検体ＤＮＡと緩衝溶液を用いてハイブリダイゼーションさせることができる。緩衝溶液としては、例えばＮａＣｌとＴｒｉｓ−ＨＣｌを配合して所要ｐＨに保持した溶液が採用できる。また、ガラス基板に金薄膜を設ける場合では、ハイブリダイゼーション時の温度を３０〜４０℃に保持することが好ましい。
【００５２】
この発明において、標識には、金属粒子（Ｓｉを含む）、セラミックス粒子、公知の蛍光標識、あるいは生化学検体の検出に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞など、プローブＤＮＡ又は検体ＤＮＡに修飾してループ構造を形成しているプローブＤＮＡとの高さの差を拡大できるものであればいずれのものも利用できる。
【００５３】
金属微粒子標識は、Ｓｉを含み、Ａｕ、Ａｌ、Ｔｉ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｏなどの各種金属の微粒子を用いるもので、特に微粒子の形状や粒径寸法や均一性は任意に適宜選択でき、特に必須条件ではないが、ＤＮＡの所要部位に修飾可能とすること、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られる微粒子が好ましい。
【００５４】
この発明において、セラミックス微粒子標識には、公知のいずれの形態も採用できるが、微粒子表面に成膜可能なことなどから、５μｍ以下、さらに１μｍ以下が好ましく、検出方法に応じて数ｎｍ〜数百ｎｍの範囲で所定粒径が均一でかつ工業安定的に得られるＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、Ａｌ２Ｏ３、ＭｇＯなどのセラミックス微粒子が好ましい。
【００５５】
この発明において、蛍光標識には、公知のいずれの形態も採用でき、市販されている蛍光色素によりタグ化された染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞、微粒子等を標識自体の性質を利用したり後述のごとく抗原−抗体反応を利用して修飾させることが可能である。また、この発明では蛍光自体は必須でないため、蛍光標識等に利用されている染色体、糖鎖体、タンパク質、核酸、酵素、細胞をそのまま利用することも可能である。
【００５６】
この発明において、上述の金属微粒子、セラミックス微粒子などの各種標識をプローブＤＮＡに修飾する方法としては、例えば金属微粒子等の粒子自体の性質を利用したり、公知の蛍光標識を修飾する方法などのように抗原−抗体反応を利用して修飾するなど、公知のいずれの方法も採用できる。また、中性のコロイダル液のごとく、金属微粒子を均一分散させた溶液の形態を利用することで修飾が容易になる。
【００５７】
また、プローブＤＮＡの末端にビオチンを修飾しておき、ストレプトアビジンをコートした金属微粒子をビオチン−アビジンの高い結合能力を利用して標識となすことができる。さらに、プローブＤＮＡの末端にＩｇＧや抗プロテイン物質を付加することで、タンパクをコートした金属微粒子を抗原−抗体反応を利用して修飾させることが可能である。
【００５８】
さらに、検体ＤＮＡに前記各種の標識を修飾することも可能で修飾方法は、検体ＤＮＡの所要箇所を適宜標識化できればよく、公知のいずれの方法も採用でき、特に末端を修飾するには上述の方法などいずれの方法も採用できる。
【００５９】
この発明において、２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとを高さの違いで検出・識別する方法には、標識の修飾の有無にかかわらず、例えば半導体ウェーハやデバイスの表面性状や形状、表層部を評価するために採用されている公知の各種計測評価方法並びにその装置を適宜利用することが可能である。
【００６０】
例えば、電子線計測評価手法として、電子顕微鏡を用いた視野法、電子回折法など、Ｘ線計測評価手法として、Ｘ線回折法、Ｘ線トポグラフ、表面回折法、Ｘ線干渉法など、電界磁界計測評価手法として、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）、走査トンネル分光（ＳＴＳ）、ＳＴＭファミリーのＡＦＭなど、光学的測評価手法として、光伝導法、光学顕微鏡法などがある。さらに、Ｘ線顕微鏡観察法、レーザー顕微鏡観察法も利用できる。雰囲気も上記の評価方法により異なるが、真空中又は所要溶液中のいずれでも評価できる。
【００６１】
また、基板に前記手法の検査対象であるシリコンウェーハを用いたり、標識の種類や性質を利用して前記手法の検出対象や信号発生源等にすることもできる。また、前記の各種評価方法において、得られた信号、画像や回折像をさらに画像処理化して３次元画像化する公知の手法や装置を併用して、ハイブリダイゼーション後の２本鎖を形成したプローブＤＮＡとループ構造を取っている他プローブＤＮＡとの高さの違いを検出、識別することができる。
【００６２】
【実施例】
実施例１
ガラス基板をアセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、１０％フッ酸で表面を２０秒間エッチングを行ない、さらに、アセトン、メタノール、超純水中で超音波洗浄した後、窒素ガスで乾燥させた。
その後、スパッタ装置（ＵＬＶＡＣ）を用いガラス基板にまず約１ｎｍ厚みのＣｒ層を設け、さらに約５０ｎｍ厚みのＡｕ層を設けた。
【００６３】
前記基板を濃硫酸中１〜２時間浸漬後、超純水で洗浄した後、３０塩基、６０塩基のプローブＤＮＡの３’端側をＳＨ（チオール）基で、５’端側をビオチンで修飾したプローブＤＮＡ−Ｄ−ＢＦＲ溶液（ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ　７．０）を基板上に滴下し、飽和水蒸気中に約１５時間放置し、プローブＤＮＡをガラス基板の金薄膜上に付着させて検出チップとなした。プローブＤＮＡには日清紡製を使用した。
【００６４】
プローブＤＮＡと完全に相補的な６０塩基の目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、Ｒ−ＢＦＲ溶液とＨ−ＢＦＲ溶液（ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ｐＨ　７．４）で洗浄後乾燥せずに、検体ＤＮＡのＨ−ＢＦＲ溶液を所要濃度となるように滴下し、約１６時間放置して実施した。
【００６５】
プローブＤＮＡの修飾には、前述のごとくビオチンで修飾した５’端側とシリカ粒子とをビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートしたシリカ粒子を用いて、ｐＨ　７．４のコロイダルシリカとなして実施した。コロイダルシリカとしては粒径が１００ｎｍの粒径のものを用いた。
【００６６】
ハイブリダイゼーションを検出する方法として、ＳＴＭ、ＳＴＳ、ＡＦＭの３種を実施した。３０塩基の検出チップでは全てのプローブＤＮＡにシリカ微粒子標識がされているようでハイブリダイゼーション前後で差が見られなかった。
【００６７】
塩基数６０のプローブＤＮＡにおいては、目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション前ではシリカ微粒子標識の修飾が全く実施できず、ハイブリダイゼーション後ではシリカ微粒子標識の修飾が行われたことから、ハイブリダイゼーション前後で１００ｎｍ〜１２０ｎｍの段差を確認した。なお、ハイブリダイゼーション後に標識の修飾を行わない場合は、８ｎｍ〜２０ｎｍの段差を確認した。又、いずれの検出方法でも画像処理化することで、検出チップ表面に段差があるかないかを簡単に確認できた。
【００６８】
実施例２
実施例１の合成による目的ＤＮＡに換えて、実際のＯ−１９　ｇｙｒＢ遺伝子変異部周辺の８５６ｂｐという長い遺伝子を目的ＤＮＡ（試験遺伝子）とし、これらと相補的に結合する中央６０塩基をプローブＤＮＡとし、実施例１と同様の方法で検出チップを作製した。
【００６９】
上記のプローブＤＮＡに対して実際の長いＤＮＡ鎖を用いて実施例１と同様にハイブリダイゼーションを実施した後、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾方法を行った。すなわち、５’端側とビオチン−アビジン結合させるため、予めアビジンコートした平均粒径が１μｍ程度のＦｅ微粒子を用いて、ｐＨ　７．４のコロイダル液となして実施した。
【００７０】
ハイブリダイゼーションを検出する方法として、走査反射電子顕微鏡による観察を実施したところ、１０００ｎｍ〜１０５０ｎｍの段差を確認した。
【００７１】
また、上記のハイブリダイゼーションを実施する際に、目的遺伝子がある場合と、ない場合を設定して、Ｆｅ微粒子コロイダル修飾を行い、その後、微分干渉顕微鏡にて観察を行った結果を図３に示す。図３に明らかなように、目的遺伝子がある場合には、Ｆｅ微粒子を多数観察されたが、目的遺伝子がない場合には、Ｆｅ微粒子はほとんど観察されず、上記の段差の検出結果と一致した。
【００７２】
【発明の効果】
この発明は、例えば、プローブＤＮＡの解放末端側が基板側に向くようにループ構造を取る構成を採用することで、目的検体がある場合にはハイブリダイゼーションが起こり、ループ構造が解消されるため、ハイブリダイゼーションしたプローブＤＮＡにのみ金属やセラミックス微粒子などの標識の修飾が可能になり、この２本鎖を形成して伸びたプローブＤＮＡの解放末端に標識が修飾されると、ループを形成している他のプローブＤＮＡとの高さの差が顕著になり、検出チップ表面にある段差の程度とその密度をみることでハイブリダイゼーションの有無、目的遺伝子の存在の確認が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ハイブリダイゼーションによるループ構造の解消と金コロイド修飾の状況を示す模式図であり、Ａは目的遺伝子がない場合、Ｂは目的遺伝子が有る場合を示す。
【図２】Ａ、Ｂはこの発明におけるプローブＤＮＡのループ構造の概念を示す説明図である。
【図３】Ａ、Ｂはこの発明による検出チップを微分干渉顕微鏡にて観察を行った際の顕微鏡写真の模写図であり、Ａは目的遺伝子がある場合、Ｂは目的遺伝子がない場合である。
【図１】
2004003871.tif 000005
【図２】
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【図３】
2004003871.tif 000007