(57)【要約】【課題】プレートへのＤＮＡスポット量を増やす。【解決手段】プローブを付着させるピンヘッドがアーチ状に窪み、アーチ状の窪みに少なくとも１つの溝、例えば十字型の溝を形成しスポットピン、あるいは平坦なピンヘッドを有し、ピンヘッドに少なくとも１つの溝、例えば十字型の溝を形成したスポットピンを用いる。【選択図】　図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プレートにプローブを植え付けるのに使用されるスポットピンにおいて、
プローブを付着させるアーチ状に窪んだピンヘッドを有し、当該ピンヘッドに少なくとも１つの溝が形成されていることを特徴とするスポットピン。
【請求項２】
請求項１記載のスポットピンにおいて、前記少なくとも一つの溝が十字型の溝であることを特徴とするスポットピン。
【請求項３】
プレートにプローブを植え付けるのに使用されるスポットピンにおいて、
プローブを付着させる平坦なピンヘッドを有し、当該ピンヘッドに少なくとも１つの溝が形成されていることを特徴とするスポットピン。
【請求項４】
請求項３記載のスポットピンにおいて、前記ピンヘッドに十字型の溝が形成されていることを特徴とするスポットピン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数種類のプローブをプレートにスポットするためのスポットピンに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、複数種類のＤＮＡ、ＲＮＡ、たんぱく質等の生体高分子からなるプローブをガラスなどのプレートにスポットして、バイオチップを製造することが行われていた。図４は、この従来の方法の原理を説明する図である。図４（ａ）に示すように、複数種類のプローブＤＮＡ１が入っているマイクロプレート２を用意する。一方、図４（ｂ）に示すよう、プレート３としてガラス板を用意しておき、図４（ｃ）で示すように、プレート３の表面にｐｏｌｙ−ｌ−ＬｙｓｉｎｅをＤＮＡとガラスの結合剤４としてコーティングする。この後、図４（ｄ）で示すように、マイクロプレート２に入っているプローブＤＮＡ１をスポットピンに付着させ、表面にＤＮＡとガラスの結合剤（ｐｏｌｙ−ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）４がコーティングしてあるガラスプレート３の上に、スポットピン５に付着させたプローブＤＮＡ１を接触させてスポットする。マイクロプレート２に入っている全てのプローブＤＮＡをスポットし終わるまでこの作業を繰り返し、図４（ｅ）に示すバイオチップを製造していた。このように、従来はプレートに予めＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングし、その上にＤＮＡをプロットしてバイオチップを製造していた。
【０００３】
図５は、バイオチップを利用したハイブリダイゼーションの原理を説明する図である。図５（ａ）に示すように、プローブＤＮＡ１が結合剤４でガラスのプレート３にスポットされているバイオチップと、蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　　ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｄｅ　ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【０００４】
このとき、サンプルＤＮＡ１１とバイオチップ上のプローブＤＮＡ１が相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合せず、蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１がガラスのプレート３上にコーティングされている結合剤４と結合し、ガーベージとして残る。
【０００５】
その後、図５（ｂ）に示すように、ガラスのプレート３上に残った蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を水１２の中に入れて洗い流すと、プローブＤＮＡ１と結合していないサンプルＤＮＡ１１は排出される。その後、図５（ｃ）に示すように、プローブＤＮＡと結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質をランプ１４からの光エネルギーで励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤなどの光センサー１３で検出することでハイブリダイゼーションの検出を行う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
バイオチップを用いた実験では、バイオチップにサンプルＤＮＡをふりかけ、バイオチップにスポットしてあるプローブＤＮＡとハイブリダイズさせ、どのプローブＤＮＡとサンプルＤＮＡが結合したかを検出している。検出の前処理として、ハイブリダイズしたあとに、結合しなかったサンプルＤＮＡを排除するためにバイオチップを水で洗っている。しかし、プレートにＤＮＡとガラスの結合剤を全面コーティングしているため、プローブＤＮＡと結合しなかったサンプルＤＮＡが必要以外の部分、すなわち、プローブＤＮＡがスポットされていない結合剤部分に張り付き、結合剤４と結合しているサンプルＤＮＡ１１は水洗いによってもガラスのプレート３上から除去されない。それが検出時ノイズとなって現われ、感度が低くなっていた。つまり、サンプルＤＮＡの一部がプローブＤＮＡとの特異結合ではなく単に結合剤４に張り付いた状態でバイオチップ上にガーベージとして残り、そのサンプルＤＮＡに標識されている蛍光物質も励起されて発光するため、ノイズとして検出され、Ｓ／Ｎが悪くなるという問題があった。
【０００７】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みなされたもので、プレートのプローブをプロットした以外の部分にサンプルＤＮＡが付着することのないバイオチップを提供すること、及びそのバイオチップの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明では、プローブをスポットするプレート上の特定部分にだけプローブとガラスの結合剤を付着させる。すなわち、プレートにプローブをスポットした部分以外にはプローブとガラスの結合剤を付着させないため、サンプルＤＮＡを入れてハイブリダイズさせた後、プローブと結合しなかったサンプルＤＮＡは水で洗い流せばチップ上から無くなるため、検出時ノイズが無くなりＳ／Ｎを向上させることができ、高感度となる。
【０００９】
すなわち、本発明によるバイオチップは、プレート上の複数の位置にプレートとプローブとを結合させる結合剤を用いてプローブを植え付けたバイオチップにおいて、結合剤はプローブが植え付けられている位置に局在していることを特徴とする。
【００１０】
本発明によるバイオチップの製造方法は、プレートに該プレートとプローブを結合させる結合剤を用いてプローブを植え付けてバイオチップを製造するバイオチップの製造方法において、プローブと結合剤とを混合した混合物をプレートに植え付けることを特徴とする。
【００１１】
本発明によるバイオチップの製造方法は、また、プレートにプローブを植え付けてバイオチップを製造するバイオチップの製造方法において、プローブを植え付けるべきプレート上の位置に、プローブとプレートとの結合剤を局所的に付着させるステップと、結合剤が付着しているプレート上の位置にプローブを植え付けるステップとを含むことを特徴とする。
プレートはガラス製とすることができる。また、ピンヘッドが窪んだスポットピンを用いてプローブを植え付けるのが好ましい。
【００１２】
本発明のプレートにプローブを植え付けるのに使用されるスポットピンは、プローブを付着させるアーチ状に窪んだピンヘッドを有し、アーチ状の窪みに少なくとも１つの溝があることを特徴とする。例えば十字型の溝を形成するのが好ましい。また、本発明のプレートにプローブを植え付けるのに使用されるスポットピンは、プローブを付着させる平坦なピンヘッドを有し、当該ピンヘッドに少なくとも１つの溝、例えば十字型の溝が形成されていることを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。ここでは、プローブとしてＤＮＡを用いる場合について説明する。しかし、プローブとして用いることができるのはＤＮＡに限られず、ＲＮＡあるいはたんぱく質をプローブとして用いることもできる。また、プレートとしてガラスプレートを用いた例で説明するが、ガラス以外にナイロン製のメンブレン等も使用可能である。
【００１４】
図１は、本発明の第１の実施の形態の原理を説明する図である。図１（ａ）に示すように、マイクロプレート２には複数種類のプローブＤＮＡ１が入っている。図１（ｂ）に示すように、バイオチップのプレートとしてはガラスのプレート３を使用する。図１（ｃ）に示すように、ＤＮＡとガラスとの結合剤４をマイクロプレートの各ウェルに分注し、プローブＤＮＡ１と混合する。ＤＮＡとガラスとの結合剤４としては、例えばｐｏｌｙ−ｌ−Ｌｙｓｉｎｅあるいはカルボジイミドを用いることができる。
【００１５】
次に、図１（ｄ）に示すように、結合剤４とプローブＤＮＡ１を混ぜたものをピン５で吸い上げ（もしくは溶液をピン５の先に付着させて）、プレート３にスポットする。この処理をマイクロプレート２に入っているすべてのプローブＤＮＡに対して繰り返し行うことで、図１（ｅ）に示すように、必要な部分にのみ結合剤４が付着し、プローブをスポットした以外の部分には結合剤４が付着していないバイオチップ２０を作ることができる。
【００１６】
図２は、本発明の第２の実施の形態の原理を説明する図である。図２（ａ）に示すように、マイクロプレート２にはプローブＤＮＡ１が入っている。図２（ｂ）に示すように、バイオチップのプレートとしてガラスプレート３を使用する。図２（ｃ）に示すように、結合剤４を例えば毛細管６で吸い上げ、ガラスプレート３上のプローブＤＮＡをスポットする位置に吐き出す。こうすることで、ガラスプレート３上のプローブＤＮＡ１をスポットする位置に、予め結合剤４をスポットして付着させておく。その後、図２（ｄ）に示すように、マイクロプレート２に入っているプローブＤＮＡ１を結合剤４でフォーマットされたプレート３に、ピン５で吸い上げ（もしくはピン５に溶液を付着させて）繰り返しスポットする。こうして、図２（ｅ）に示すように、必要な部分にのみ結合剤４が付着し、プローブをスポットした以外の部分には結合剤４が付着していないバイオチップ２０を作ることができる。
【００１７】
図６に、本発明で用いたスポットピン５のヘッド形状を示す。図６（ａ）に示したスポットピン５ａは、ヘッド部分、すなわちプローブを付着させる部分がアーチ型に窪んだピンである。また、図６（ｂ）に示したスポットピン５ｂは、ヘッド部分がアーチ型に窪み、さらに窪みの中に十字型に溝を切ったピンである。ピンのヘッドをアーチ状に窪ませることで、スポットするプローブの中にピンを入れたときに表面張力でうまくピンヘッドにプローブ溶液が吸い込まれるしくみになっている。アーチの深さは任意である。このスポットピンを使うことで、ヘッドが平坦な従来のスポットピンを用いる場合より、プレートへのＤＮＡスポット量を約１０倍に増やすことができる。図６（ｃ）に示したスポットピン５ｃは、平坦なヘッドの表面に十字型に溝を切ったものである。このスポットピンによってもヘッドが単に平坦な従来のスポットピンに比較してスポット量を増やすことができる。
【００１８】
図３は、本発明によるバイオチップを利用したハイブリダイゼーションの原理を説明した図である。図３（ａ）に示すように、プローブＤＮＡ１が結合剤４でガラスプレート３にスポットされているバイオチップ２０と、蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を、ともにハイブリダイゼーション溶液に入れてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアルデヒド、ＳＳＣ（ＮａＣｌ，　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ）、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆａｔｅ）、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｄｉａｍｉｄｅ　ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）、蒸留水などからなる混合液であり、混合比率は使用するＤＮＡの性質により異なる。
【００１９】
このとき、サンプルＤＮＡ１１とバイオチップ上のプローブＤＮＡ１が相補鎖ＤＮＡであれば、両者は二重らせん構造をとり結合する。一方、両者が相補鎖でなければ結合せず、蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１がガラスのプレート３上にガーベージとして残る。図３（ｂ）に示すように、ガラスのプレート３上に残った蛍光物質１０で標識したサンプルＤＮＡ１１を水１２の中に入れて洗い流すと、ガラスとＤＮＡは結合が弱いため、ガーベージのサンプルＤＮＡ１１が排出され、ガラスのプレート３上から無くなる。図３（ｃ）に示すように、ハイブリダイゼーションの検出は結合しているサンプルＤＮＡに標識している蛍光物質をランプ１４の光で励起させ、蛍光物質が励起して発光する光をＣＣＤ等の光センサー１３で検出する。このとき、バイオチップ２０上にガーベージのサンプルＤＮＡが無いため、検出のＳ／Ｎ比が向上する。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によると、プローブをスポットする部分のみに結合剤を付着させたバイオチップを製造することができ、バイオチップ読取り時、検出感度を向上させることができる。また、本発明のスポットピンを用いると、プレートへのＤＮＡスポット量を増やすことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるバイオチップの製造方法の一例を説明する図。
【図２】本発明によるバイオチップの製造方法の他の例を説明する図。
【図３】本発明のバイオチップを用いたハイブリダイゼーションと検出の説明図。
【図４】従来のバイオチップの製造方法を説明する図。
【図５】従来のバイオチップを用いたハイブリダイゼーションと検出の説明図。
【図６】本発明によるプローブ付着用のスポットピンの説明図。
【符号の説明】
１…プローブＤＮＡ、２…プローブ格納用マイクロプレート、３…ガラスのプレート、４…結合剤、５…スポットピン、６…毛細管、１０…蛍光物質、１１…サンプルＤＮＡ、１２…水、１３…光センサー、１４…ランプ、２０…バイオチップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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