(57)【要約】      （修正有）【課題】哺乳動物宿主細胞における導入遺伝子の安定化方法の提供。【解決手段】本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写とが同じ配向の構造であることを特徴とするベクター、該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写が正面衝突する領域に、複製開始領域からの複製フォークを阻害する配列またはｐｏｌｙ（Ａ）付加配列を含む構造であることを特徴とするベクター、または該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写が正面衝突する領域に、核マトリックス結合領域を含まない構造であることを特徴とするベクターを提供する。【選択図】    図５
2004337066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
前記複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写とが同じ配向の構造であることを特徴とするベクター。
【請求項２】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写が正面衝突する領域に、複製開始領域からの複製フォークを阻害する配列またはｐｏｌｙ（Ａ）付加配列を含む構造であることを特徴とするベクター。
【請求項３】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写が正面衝突する領域に、核マトリックス結合領域を含まない構造であることを特徴とするベクター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクターであって、さらに薬剤耐性遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項４または５のに記載のベクターであって、
前記任意の遺伝子は、目的遺伝子または薬剤耐性遺伝子であることと、
前記転写は、前記目的遺伝子または前記薬剤耐性遺伝子の転写であることを特徴とするベクター。
【請求項７】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子の増幅を向上させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
前記複製開始領域からの複製フォークは、該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写と正面衝突する構造であることと、
前記複製と転写が正面衝突する領域にｐｏｌｙ（Ａ）付加配列または複製フォーク阻害配列が存在しないことと、
前記複製と転写が正面衝突する領域に前記核マトリックス結合領域を含むことと、
を特徴とするベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターであって、さらに薬剤耐性遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項９】
請求項７または８に記載のベクターであって、さらに目的遺伝子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のベクターであって、
前記任意の遺伝子は、目的遺伝子または薬剤耐性遺伝子であることと、
前記転写は、前記目的遺伝子または前記薬剤耐性遺伝子の転写であることを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載のベクターであって、
前記核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域からなる群から選択されるベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１１に記載のベクターであって、
前記哺乳動物内で機能する複製起点は、ＥＢウイルス潜在複製起点（ＥＢＶ  ｌａｔｅｎｔ  ｏｒｉｇｉｎ）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座の複製起点、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製起点およびβ−グロビン遺伝子座の複製起点からなる群から選択されるベクター。
【請求項１３】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させる方法であって、請求項５に記載の組換え型ベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクションすることを含む方法。
【請求項１４】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させる方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、および
目的遺伝子を含むベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、
を含む方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を増幅させる方法であって、請求項１０に記載のベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクションすることを含む方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞内に目的遺伝子を増幅させる方法であって、請求項７または８に記載のベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、および
目的遺伝子を含むベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物細胞内でトランスフェクションした目的遺伝子を安定化させるため、または増幅させるためのベクターおよび方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物細胞で導入遺伝子の細胞内コピー数を増加させる方法として唯一知られている方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ；  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞を宿主とし、これに目的遺伝子をジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ；  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子と同時にトランスフェクションしてジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子産物の阻害剤であるメトトレキセート（ＭＴｘ；  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を培養液中に加えて選択する方法である（非特許文献１）。この方法は、現在、広く医薬品等有用物質の大量生産に利用され、重要な技術となっている。
【０００３】
しかし、この方法は、適用できる宿主細胞がＣＨＯ細胞等に限定され、汎用性に欠けるという問題がある。また、選択薬剤であるメトトレキセートを使用して長期間にわたって遺伝子導入細胞を選択する必要がある。しかも、メトトレキセートの細胞毒性作用を考慮しつつ、濃度を少しずつ増加させて選択しなければならない。したがって、遺伝子導入細胞に対して相当の配慮を必要とし、経験および熟練をも必要とする。さらに、この方法は導入遺伝子が比較的短い場合にのみ適用することができ、導入遺伝子のサイズの範囲が狭いという問題がある。
【０００４】
一般に、タンパク質はその種類によってリン酸化、アセチル化等の種々の修飾をうけることが多い。同じタンパク質でも、発現する細胞、発現時期、細胞への刺激等の条件により、修飾の種類および修飾をうける部位が異なることが知られている。したがって、本来は目的タンパク質を発現していない宿主細胞に目的タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクションして発現させた場合、そのタンパク質の本来の性状を正確に反映する保証はない。また、タンパク質が機能するためには、一般的に特異的な修飾が必要とされることが多い。したがって、トランスフェクションする遺伝子に応じた修飾がなされるように、宿主細胞を適宜選択できることが好ましい。上述の細胞内コピー数を増加させる方法では、適用できる細胞がＣＨＯ細胞に限られてしまう。したがって、適切な修飾がなされないことも多い。また、哺乳動物細胞内で医薬品等の有用タンパク質を生産する上で大きな障害となっている。
【０００５】
このような問題を解決するために応用できる知見として、哺乳動物複製起点および核マトリクス結合領域を有するプラスミドを使用してＤＭｓを有する細胞にトランスフェクションすると、該プラスミドがＤＭｓおよびＨＳＲに組み込まれること、およびＤＭｓを持たない細胞に該プラスミドをトランスフェクションすると、ＨＳＲに組み込まれると共にＤＭｓ様の構造を形成することを以前に見出した（非特許文献２）。すなわち、該プラスミドを使用することにより、トランスフェクションした細胞内において自立複製させることが可能で、且つ娘細胞に安定して分配させることが可能となった。また、上記プラスミドを使用した場合、細胞内でプラスミドを高度に増幅させることができる。
【０００６】
しかし、トランスフェクションしたプラスミドは、コピー数が増加されるだけでなく、細胞内で安定して存在することが必要である。したがって、配列を不安定化せずにプラスミドの増幅を向上させる技術が望まれている。また、宿主細胞にトランスフェクションした遺伝子を増幅させないための技術も必要とされている。
【０００７】
一方、トランスフェクションしたプラスミドが不安定であるときに、プラスミドがＨＳＲに組み込まれることを見いだした。すなわち、ＨＳＲに組み込まれにくいプラスミドは、安定性が高いことになる。したがって、プラスミドをより安定化させるために、ＤＭにのみプラスミドを組み込む技術が望まれる。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｏｍａｓａ，  Ｔ．、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、“Ｊ．  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ”、２００２年、９４巻、ｐ．６００−６０５
【０００９】
【非特許文献２】
Ｎｏｒｉａｋｉ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｙｕｒｉ  Ｍｉｕｒａ，  Ｙｕ  Ｓａｋａｍｏｔｏ，  ａｎｄ  Ｋｅｎ  Ｔｓｕｔｓｕｉ、Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ａ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｅ  ｔｈｅ  Ｅｖｅｎｔ  Ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ１．、“Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００１年、６１巻、ｐ．６９８７−６９９０
【００１０】
【非特許文献３】
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、広範な哺乳動物細胞を宿主として使用することができ、トランスフェクションした目的遺伝子を安定化させることを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を達成するために鋭意研究を重ね、特定の構造を有するようにベクターを構築することにより、哺乳動物細胞内でトランスフェクションした遺伝子の安定性を制御することができるという知見を得て本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写とが同じ配向の構造であることを特徴とするベクターを提供する。
【００１４】
また、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写が正面衝突する領域に、複製開始領域からの複製フォークを阻害する配列またはｐｏｌｙ（Ａ）付加配列を含む構造であることを特徴とするベクターを提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
該ベクターの複製開始領域からの複製フォークと該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写が正面衝突する領域に、核マトリックス結合領域を含まない構造であることを特徴とするベクターを提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、さらに薬剤耐性遺伝子を含むことを特徴とするベクターを提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、さらに目的遺伝子を含むことを特徴とするベクターを提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、
任意の遺伝子は、目的遺伝子または薬剤耐性遺伝子であることと、
転写は、前記目的遺伝子または前記薬剤耐性遺伝子の転写であることを特徴とするベクターを提供する。
【００１９】
また、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子の増幅を向上させるためのベクターであって、哺乳動物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域を含み、
複製開始領域からの複製フォークは、該ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの転写と正面衝突する構造であることと、
複製と転写が正面衝突する領域にｐｏｌｙ（Ａ）付加配列または複製フォーク阻害配列が存在しないことと、
複製と転写が正面衝突する領域に前記核マトリックス結合領域を含むことと、を特徴とするベクターを提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、さらに目的遺伝子を含むことを特徴とするベクターを提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、任意の遺伝子は、目的遺伝子または薬剤耐性遺伝子であることと、
転写は、前記目的遺伝子または前記薬剤耐性遺伝子の転写であることと、を特徴とするベクターを提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、
核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域からなる群から選択される結合領域のいずれか１つに由来するベクターを提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、哺乳動物内で機能する複製起点は、ＥＢウイルス潜在複製起点（ＥＢＶ  ｌａｔｅｎｔ  ｏｒｉｇｉｎ）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座の複製起点、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製起点およびβ−グロビン遺伝子座の複製起点からなる群から選択される複製起点のいずれか１つに由来するベクターを提供する。
【００２４】
また、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させる方法であって、上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることを含む方法を提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を安定化させる方法であって、
上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、および
目的遺伝子を含むベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、
を含む方法を提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を増幅させる方法であって、上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることを含む方法を提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、哺乳動物細胞内にトランスフェクションした遺伝子を増幅させる方法であって、
上記ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、および
目的遺伝子を含むベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることと、を含む方法を提供する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
ここで、細胞の遺伝子増幅機構について説明する。遺伝子増幅は、腫瘍細胞が無制限の成長または薬剤抵抗性を獲得する主要な機構である。細胞遺伝学的に言えば、増幅遺伝子は、インビボにおいて、染色体外のダブルマイニュート染色体（ＤＭ）あるいは染色体の均一染色領域（ＨＳＲ；ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）に検出される。長期にわたってインビトロで継代することにより、通常はＨＳＲを有する細胞が優勢的に増殖することが知られている。これまでの研究により、腫瘍細胞からＤＭ上の増幅された遺伝子を除去すると、腫瘍表現型を呈する状態から正常状態に復帰し、細胞分化を呈することが示されている。この種の除去過程は、分裂細胞から放出される微小核へのＤＭの選択的取り込みによって仲介されている。このような微小核形成（ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）過程は、細胞周期に伴うＤＭの細胞内挙動と密接に関連している。ＤＭは様々なサイズの無動原体環状ＤＮＡから構成され、無動原体性であるにもかかわらず、有糸分裂する染色体に付着して娘細胞へと安定に分離される。最近の関連する重要な知見として、牛パピローマウイルス、ＥＢウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよびＳＶ４０を含むいくつかのウィルス性核内プラスミド（ｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）が、細胞分裂の際に同様の機構を利用することが示されている。さらに、最近の研究では、ＥＢウイルス・レプリコンを有するプラスミドが、腫瘍細胞においてＤＭに組込まれ得ることが示されている。また、複製のＳＶ４０起点を有するプラスミドでの付着過程が成立するためには、ウィルスのラージＴ抗原の発現を必要とするが、ラージＴ遺伝子が細胞由来の核マトリックス結合領域（ＭＡＲ；  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）と置換しても達成されることが示されている。実際に、核マトリックス結合領域は、哺乳動物ゲノムの複製起点の近傍で頻繁に認められており、マトリックス付着がゲノム複製において重要であることを示唆している。また、上記遺伝子増幅現象において認められた知見から、哺乳動物複製起点および核マトリックス結合領域を有するベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクションすると、該ベクターは、高度に増幅され、かつ娘細胞へ分離・分配されることが明らかとなっている。
【００２９】
一方、以下の実施例に示したように、転写ユニット、ｐｏｌｙ（Ａ）付加配列、ＲＦＢおよびＭＡＲ配列が複製起点に対して特定の構造に配置されるときに、ＨＳＲが形成されにくくなることが明らかとなった。
【００３０】
本発明は、上記知見に基づいて、ＨＳＲが形成されにくいベクターを構築することに成功し完成されるに至った。
【００３１】
以下、本発明のベクターについて詳細に説明する。
【００３２】
本発明のベクターは、哺乳動物複製起点および核マトリックス結合領域（ＭＡＲ）を有することを特徴とする。
【００３３】
複製起点としては、たとえば、ＥＢウイルス潜在複製起点（ＥＢＶ  ｌａｔｅｎｔ  ｏｒｉｇｉｎ）、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、β−グロビン遺伝子座等の複製起点に由来する配列を使用することができる。また、核マトリックス結合領域として、たとえば、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域を使用することができる。
【００３４】
また、本発明のベクターには、薬剤耐性遺伝子が含まれていてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、たとえば、ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子等があげられる。これらの遺伝子を細胞内で発現させるためには、ベクター内の適切なプロモータの支配下に適切な配向で挿入する必要がある。
【００３５】
また、前記ベクターは適宜目的に応じて、大腸菌内でクローニングを行うために必要な遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子等の形質転換細胞を選択するための遺伝子またはその他の配列を有していてもよい。これらの遺伝子を含むベクターで形質転換された細胞は、薬剤耐性遺伝子に基づく薬剤選択、セルソータ等によるマーカータンパク質発現細胞の選択等により、形質転換細胞を選別等することができる。
【００３６】
また、本発明のベクターには、目的遺伝子が組み込まれていてもよい。目的遺伝子とは、哺乳動物細胞内でその遺伝子によってコードされるタンパク質を発現させたい遺伝子である。目的遺伝子を細胞内で発現させるためには、ベクター内の適切なプロモータの支配下に適切な配向で挿入する必要がある。
【００３７】
上記遺伝子は、当業者であれば、一般的な遺伝子組換え技術を使用して容易に作成することができるであろう。たとえば、上記核酸配列は既知であるので、増幅したい核酸を含むように設計されたプライマーを使用して、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ等を行うことによって増幅することができる。テンプレートとして、これらの遺伝子を発現している細胞由来のＲＮＡまたはｃＤＮＡなどを使用することができる。また、市販のベクター等を使用して、該ベクターに組み込まれている配列を制限酵素で消化することによっても取得することもできる。
【００３８】
本発明のベクターは、上記遺伝子を適切なベクターに組み込むことによって作製することができる。たとえば、上記遺伝子を市販のベクターに組み込むことによって作製することができる。ベクターの作製は、当業者であれば、一般的な遺伝子組換え技術を使用して容易に作成することができるであろう。たとえば、ベクターおよび各遺伝子の末端を適切な制限酵素で切断しておき、定法に従ってライゲーションすることによって作製することができる。
【００３９】
一方、本発明のベクターは、上記遺伝子が特定の構造を有するように構築する必要がある。以下、導入したベクターの安定性を向上させたい場合について具体的に説明する。
【００４０】
本発明のベクターは、組み込まれた遺伝子が以下の構造の少なくとも１つを有する必要がある。
【００４１】
（１）複製開始領域からの複製フォークとベクターに組み込まれた任意の遺伝子（たとえば、薬剤耐性遺伝子または目的遺伝子）からの転写とが正面衝突しない配向の構造。
【００４２】
具体的には、ｐΔＢ（図５下段）は、複製起点Ｏｒｉβからの複製フォークがＳＲαプロモータからの転写と正面衝突する構造を有する。逆に、ｐΔＢにおいて、ＳＲαプロモータが逆配向で組み込まれていた場合、ＳＲαプロモータからの転写は、転写複製起点Ｏｒｉβからの複製フォークと同じ配向となり、正面衝突する構造とはならないであろう。ただし、複製起点Ｏｒｉβからは、両方向に複製フォークが形成されるため、一方からの複製フォークがプロモータからの転写と同じ配向であっても、他方からの複製フォークが逆配向となってしまうことがある。このようなときは、後者の複製フォークの形成を阻害する構造にする必要がある。たとえば、複製フォーク阻害配列（ＲＦＢ）を組み込んで阻害することができる。
【００４３】
（２）複製と転写が正面衝突する領域に、ｐｏｌｙ（Ａ）付加配列または複製フォーク阻害配列（ＲＦＢ）が存在する構造。
【００４４】
複製と転写が正面衝突する領域とは、複製フォークの進行方向と遺伝子が転写される方向とが逆配向であるときに、該複製開始領域と転写開始領域とで挟まれた領域である。たとえば、ｐΔＢ．ＲＦＢ  Ｄｉｒ．（図５下段）の場合、複製起点Ｏｒｉβからの複製フォークとＳＲαプロモータとは逆配向であり、且つ両者の間にＲＦＢが挿入されている。このとき、Ｏｒｉβからの複製フォークはＲＦＢで阻害されるであろう。また、ＨＳＶｔｋプロモータからの転写と複製起点Ｏｒｉβからの複製フォークとは、逆配向であり、且つ両者の間にｐｏｌｙ（Ａ）付加配列が挿入されているので本構造に該当する。このとき、ＨＳＶｔｋプロモータからの転写は、ｐｏｌｙ（Ａ）付加配列で阻害されるであろう。
【００４５】
（３）複製と転写が正面衝突する領域に、核マトリックス結合領域が配置されていない構造。
【００４６】
複製と転写が正面衝突する領域に核マトリックス結合領域が配置されていない構造とは、上記複製開始領域と転写開始領域の間の領域に核マトリックス結合領域が含まれていない構造をいう。上述のように、本発明のベクターは核マトリックス結合領域を含む構造であるが、上記領域以外に存在する場合は、本発明のベクターに含まれる。
【００４７】
さらに、複製開始領域および核マトリックス結合領域は、それぞれ複数であってもよい。しかし、上記条件を満たすように構築されている必要がある。
【００４８】
本発明の導入したベクターの安定性を向上させるためのベクターは、上記３つの条件の全てを満たすように構築されていることが好ましい。
【００４９】
一方、トランスフェクションした遺伝子の複製を増大させることを目的とする場合、上記条件の全てを避けるような構造とすればよい。すなわち、複製開始領域からの複製フォークが遺伝子からの転写と正面衝突する構造であることと、複製と転写が正面衝突する領域に、ｐｏｌｙ（Ａ）付加配列または複製フォーク阻害配列が存在しない構造であることと、および複製と転写が正面衝突する領域に、核マトリックス結合領域が配置されている構造であることという条件を満たすようにベクターを構築すればよい。
【００５０】
たとえば、図５に示したｐＳＦＶｄｈｆｒの場合、ＯｒｉβからＭＡＲ方向へ複製が進む際の複製フォークは、ＳＲαプロモータからの転写と正面衝突する構造である。さらに、上記複製開始領域と転写開始領域の間の領域にｐｏｌｙ（Ａ）付加配列および／または複製フォーク阻害配列は含まれていない。そして、上記ＯｒｉβとＳＲαプロモータの間の領域にＭＡＲを有している。したがって、本発明のトランスフェクションした遺伝子の増幅を向上させるためのベクターに該当する。
【００５１】
一方、ｐＳＦＶｄｈｆｒは、ＯｒｉβからＨＳＶＰｏｌｙ（Ａ）付加配列方向へ複製が進む際の複製フォークがＨＳＶｔｋプロモータからの転写と正面衝突する構造であるが、ベクター内にｐｏｌｙ（Ａ）付加配列および／または複製フォーク阻害配列が含まれている。このような構造は、上記構造を満たしていない。しかし、このような構造を有していても、ベクター内に上記条件を満たす構造を有していれば遺伝子の増幅を向上させるためのベクターに含まれる。
【００５２】
上記構造を有するようにベクターは、通常の遺伝子組換え技術を使用して構築することができる。たとえば、所望のベクターおよび各遺伝子の両末端を、上記配向でライゲーションされるように、種々の制限酵素で切断する。これらを適切な構造を有するように、定法に従ってライゲーションすることによって作製することができる。また、組み込んだ遺伝子がいずれの配向でベクターに組み込まれているのかを確認するために、作製したベクターの配列（特に、組み込んだ遺伝子の末端を含む部分）をシーケンシングすることが好ましい。たとえば、上記遺伝子を組み込んだベクターをテンプレートとし、組み込んだ遺伝子の末端が増幅されるように設計したプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物をシーケンシングすればよい。
【００５３】
また、本発明のベクターは、哺乳動物複製起点および核マトリックス結合領域を有していれば、プラスミドの他、ラムダファージ、コスミド等の自己環状化できる核酸を使用することもできる。
【００５４】
次に、本発明のベクターを使用して哺乳動物細胞内でトランスフェクションした遺伝子の安定性および増幅を制御する方法について説明する。
【００５５】
哺乳動物細胞内でトランスフェクションした遺伝子（たとえば目的遺伝子）を安定化させたいときは、哺乳動物細胞内に上記安定性を向上させるためのベクターをトランスフェクションすればよい。
【００５６】
特に、上記ベクター内の適切なプロモータの下流に適切な配向で目的遺伝子が挿入されている場合は、該ベクターのみをトランスフェクションするだけで、目的遺伝子がコードするタンパク質を発現させることができる。すなわち、この態様は、目的遺伝子がシス（本発明のベクターの構造体）に配置されることとなる。
【００５７】
また、本発明のベクターとは異なるベクターの適切なプロモータの下流に目的遺伝子を組み込み、これを本発明のベクター（目的遺伝子を含まないもの）とともに哺乳動物細胞にコトランスフェクションしてもよい。つまり、この態様は、目的遺伝子がトランス（本発明のベクターとは異なる構造体）に配置される場合である。このとき使用するベクターは、プラスミドの他、ラムダファージ、コスミド等の粘着末端を持ち自己環状化できる核酸を使用することもできる。この態様においては、２種類のベクターをコトランスフェクションすればよい。また、両者の重量比は１対１であることが最も好ましい。この態様によれば、より長鎖長の目的遺伝子をトランスフェクションすることができる。
【００５８】
上述のように哺乳動物細胞にトランスフェクションした場合、上記ベクターはＨＳＲに組み込まれにくくなる。
【００５９】
一方、哺乳動物細胞内でトランスフェクションした遺伝子（たとえば目的遺伝子）の増幅を増大させたいときは、哺乳動物細胞内に増幅を増大させるためのベクターをトランスフェクションすればよい。
【００６０】
上記安定化させる方法と同様に、本発明のベクター内に目的遺伝子を組み込んでトランスフェクションしてもよく、また目的遺伝子を本発明のベクターとは異なるベクターに組み込んで、本発明のベクターと共にトランスフェクションしてもよい。以下の実施例に示したように、上記３つの条件の１つを有するベクターをトランスフェクションした場合、該ベクターは、ＨＳＲに組み込まれ易くなる。したがって、導入遺伝子の増幅が増大される。
【００６１】
以前に開発したベクターは、単に哺乳動物複製開始領域および核マトリックス結合領域を含むだけのベクターであり、ＤＭまたはＨＳＲのいずれに組み込まれ易いベクターであるのか判断することができなかった。しかし、本発明のベクターは、ＨＳＲに組み込まれないようにすること、またはＨＳＲに組み込まれやすくすることを制御することができる。また、以下の実施例に示したように、目的遺伝子をシスに配置した場合だけでなく、トランスに配置した場合であっても、ＨＳＲには本発明のベクターと共に目的遺伝子を含むベクターも組み込まれる。
【００６２】
上記ベクターをトランスフェクションする宿主細胞は、哺乳動物細胞であればいずれの細胞を使用してもよい。たとえば、組織等であってもよい。
【００６３】
ベクターを細胞にトランスフェクション方法は、電気穿孔法、リポフェクション法など、当業者に周知の方法を使用すればよい。たとえば、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ  ２  リポフェクションキット（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によって細胞にトランスフェクションすることができる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明のベクターを使用することにより、どのような哺乳動物細胞でも目的遺伝子の安定性を向上させることができる。また、目的遺伝子の増幅を増大させることができる。本発明のベクターは、どのような長さの遺伝子でも増幅させることが可能であり、ゲノム上の広範な目的遺伝子を導入することもできる。また、本発明の方法は、簡便であり、目的遺伝子をその鎖長や構造によらず、哺乳動物細胞内で目的遺伝子を安定に増幅することができる。したがって、そのタンパク質産物を大量生産するために有用である。また、遺伝子治療用のベクターの構築など、多方面に応用可能である。
【００６５】
【実施例】
以下、知見を得た実験および本発明のベクターの一態様に従って遺伝子増幅の制御を行った実施例を示す。
【００６６】
（物質および方法）
プラスミドおよびＤＮＡ。
ｐ６ＸＮＢｅｔａ（１４．２ｋｂｐ）は、ＭＡＲを含むヒトβ−グロブリン  複製開始領域（７．８ｋｂｐ）に由来するゲノム配列を有する（Ａｌａｄｊｅｍ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ｒｏｄｅｗａｌｄ，  Ｌ．  Ｗ．，  Ｋｏｌｍａｎ，  Ｊ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｇ．  Ｍ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｕｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８１：  １００５−１００９，  １９９８）。さらに、このプラスミドは、形質転換体を選択するためのＢｓｒも有する。
【００６７】
ｐ６ＸＮ（６．４ｋｂｐ）は、ｐ６ＸＮＢｅｔａのベクタープラスミドである。これらのプラスミドは、Ｍｉｒｉｔ  Ｉ  Ａｌａｄｊｅｍ博士（ＮＩＨ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）から供与された。
【００６８】
ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４およびｐＳＦＶｄｈｆｒの供与源および構造は、すでに記載したとおりである（非特許文献２）。簡単には、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４は、ｃ−ｍｙｃ  ＩＲ（２．４ｋｂｐ）を含むゲノム領域、ＳＶ４０初期領域由来の外因性ＭＡＲ配列およびネオマイシン耐性遺伝子を有する。
【００６９】
ｐＳＦＶｄｈｆｒは、Ｏｒｉ  βと名付けたＤＨＦＲゲノム領域由来のＩＲ（４．６ｋｂｐ）を有する（Ｌｅｕ，  Ｔ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｈａｍｌｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒｋ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎ−ｇｅｌ  ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：  ５２３−５３１，  １９８９、Ｐｅｍｏｖ，  Ａ．，  Ｂａｖｙｋｉｎ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈａｍｌｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９５：  １４７５７−１４７６２，  １９９８）。
【００７０】
次に、ｐＳＦＶｄｈｆｒから１０種類のプラスミドを作製した。これらのプラスミドは図５に示した。ｐＳＦＶｄｈｆｒは、ＢｓｒおよびＨｙｇの２つの薬剤耐性遺伝子を有する。Ｈｙｇは、その下流にＨＳＶ由来のｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルを有するが、Ｂｓｒは、３’−プロセシングシグナルを有していない。また、図中のＤＨＦインサートＤＮＡ（４．６ｋｂｐ）内に、ＭＡＲ活性を示す配列が同定されている（非特許文献２）。このプラスミドからＤＨＦＲインサートを全て削除したプラスミド（ｐＳＦＶ−Ｖ）、およびＮｏｔ  Ｉ消化してＤＨＦＲインサート配向を反転したプラスミド（ｐＩＮＶ．ＮｏｔＩ）を作製した。
【００７１】
Ｂｓｒは、３’−プロセシングシグナルを持たないため、ＤＨＦＲインサートから複製が開始されるとき、その転写が複製フォークと衝突する。そこで、ＨＳＶ  ｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナル配列、Ｉｇ  κイントロン（ＡＲ１）由来のＭＡＲ配列またはヒトのリボソームＤＮＡリピート由来の複製フォーク阻害配列（ＲＦＢ）をＢｓｒの下流に挿入したプラスミド構築物をいくつか作製した。これらの配列を挿入するためのプラスミドとして、Ｈｙｇ転写ユニットのほとんど全て、またはＨＳＶ  ｐｏｌｙ（Ａ）の２０２ｂｐの配列をそれぞれ削除したプラスミドを構築した（ｐΔＢＮおよびｐΔＢ）。ｐＳＶ．ＳＢ２は、Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  Ｇｒｕｍｍｔ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｒｚｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）から供与された。このプラスミドは、ヒトｒＤＮＡリピート由来ＲＦＢの１１０ｂｐの配列を含む（Ｐｕｔｔｅｒ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｇｒｕｍｍｔ，  Ｆ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＴＴＦ−Ｉ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｎｔｒａｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，  ３：  １４７−１５２，  ２００２）。
【００７２】
このプラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用し、ＰＣＲによってＲＦＢ配列を増幅した。使用したプライマ配列は、以下の通りである：
ＲＦＢｎｏｔ１Ｌ（３１ｍｅｒ）（５’−ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  Ｃ−３’）（配列番号１）；
ＲＦＢｎｏｔ１Ｒ（３６ｍｅｒ）（５’−ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＣＣＧ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＡＡＡ−３’）（配列番号２）。
【００７３】
ＰＣＲ産物をＮｏｔＩ処理して切断し、ｐΔＢプラスミドのＮｏｔＩ部位に挿入した。挿入したＲＦＢ配列の配向を決定するために、上記のプライマのいずれかを使用してＰＣＲを行い、ｐΔＢプラスミドのＮｏｔＩ部位の側面に位置する配列を確認した。ｐＡＲ１の供与源は、すでに記載したとおりである（非特許文献２）。このプラスミドは、Ｉｇκイントロン由来の３７７ｂｐの配列を有し、強いＭＡＲ活性を示す。
【００７４】
細胞培養およびトランスフォーメーション。
ヒト結腸直腸ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ腫瘍株は、非特許文献２に記載した通りに得て、維持した。全てのプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を使用して精製し、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ  ２  リポフェクションキット（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によって細胞にトランスフェクションした。
【００７５】
形質転換体を選択するために、ｐ６ＸＮＢｅｔａ、ｐＳＦＶｄｈｆｒおよびその誘導体については５μｇ／ｍｌのブラスティサイジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎｅ）（フナコシ（東京））を使用し、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４およびその誘導体については４００μｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）を使用した。コトランスフェクション実験については、ブラスチシジンまたはネオマイシンのいずれかを上述した濃度で使用した。
【００７６】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）。
公開されているプロトコールに従って、分裂中期試料、プローブ調製およびＦＩＳＨを行った（Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｎ．，  Ｏｃｈｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｉｔｏｎａｇａ，  Ｋ．  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｒｅｌａｔｅｓ  ｔｏ  ｉｎｔｒａｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｒ  Ｇ／Ｒ  ｂａｎｄ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  ２６８：  ２０１−２１０，  ２００１）。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ増殖細胞に対するＦＩＳＨも、すでに記載した通りに行った（Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｎ．  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｇ１  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌａｍｉｎ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｓ  ｐｈａｓｅ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１３：  ６９７−７０７，  ２０００）。クロマチン繊維は、公開されたプロトコール（Ｐａｒｒａ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｗｉｎｄｌｅ，  Ｂ．  Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ５：  １７−２１，  １９９３）を改良して調製した。簡単には、細胞をＰＢＳで二回洗浄して１〜２×１０６細胞／ｍｌの密度にした。次いで、５μｌの懸濁液をスライドにスポットして、スライドを完全に乾燥させた。スライドを、あらかじめ３７℃に加熱しておいたＳＤＳ細胞溶解バッファ（０．５％ＳＤＳ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４）に浸漬して３分間インキューベートした。次いで、スライドをゆっくり一定速度で引き上げ、４５°に傾けて完全に空気乾燥した。次いで、スライドを、メタノール／酢酸（３／１）により室温で５分間固定して、再び空気乾燥した。図１ＦおよびＧに示した実験のために、ｐＳＦＶｄｈｆｒから切除したＤＩＧラベルしたＤＨＦＲ  ＩＲ  ＤＮＡ（４．６ｋｂｐ）およびビオチンラベルしたベクターＤＮＡ（ｐＳＦＶ−Ｖ；４．６ｋｂｐ）を混合して、共にスライドにハイブリダイズさせた。図３に示した実験のために、ＤＨＦＲ  ＩＲ  ＤＮＡに加えて、ｃ−ｍｙｃ  ＩＲ（２．４ｋｂｐ）およびγ−ｇｌｏｂｉｎ  ＩＲ（７．８ｋｂｐ）をｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４およびｐ６ＸＮ  Ｂｅｔａからそれぞれ切除した。ベクター配列のコンタミネーションを回避するために、バンドの切出しに続いて電気泳動を行うという連続的ラウンドを２回行った。得られたＩＲ  ＤＮＡおよび完全なラムダファージＤＮＡには、ビオチンまたはＤＩＧにより別々にラベルした。コンタミネーションしたベクター配列によって引き起こされるクロスハイブリダイゼーションを抑制するために、ラベルしたプローブの混合物を大過剰のラベルされていないベクターＤＮＡ（ｐＳＦＶ−Ｖの規制変異消化物すなわち）と、ハイブリダイゼーションを行う前に予めハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたプローブの検出は、以前に報告したプロトコールと本質的に同じものを使用し、テキサスレッド結合ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）またはＦＩＴＣ結合−抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して行った。ベクター配列によるクロスハイブリダイゼーションが生じないことは、ｐＳＦＶｄｈｆｒでトランスフォームされた細胞に由来するスライドにおいて、ｃ−ｍｙｃおよびγ−ｇｌｏｂｉｎ  ＩＲプローブのハイブリダイゼーションによるシグナルが生じないことなどにより確かめた。
【００７７】
サザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲおよびシーケンシング。
【００７８】
培養細胞からの高分子量ゲノムＤＮＡの単離、制限酵素による消化およびアガロースゲル電気泳動は、分子生物学において使用される標準的なプロトコールに従って行った。電気泳動後、アルカリブロッティング法によって全てのゲルをナイロン膜に移した（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋；  Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＵＫ）。ＡｌｋｐｈｏｓＤｉｒｅｃｔプローブラベリングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  ＵＫ）でラベルしたプローブと膜とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたシグナルをＣＤＰＳｔａｒ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＥＣＬ  Ｍｉｎｉ−ｃａｍｅｒａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって検出した。クローン１２（図２Ｂ）で見られた組換え部位を同定するためのプライマ配列は、次の通りである：Ｌ３（１９ｍｅｒ）（５’−ＣＡＧ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  Ｃ−３’）（配列番号３）；Ｒ３（２０ｍｅｒ）（５’−ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＧＡＧ  ＡＴ−３’）（配列番号４）。請求があれば、Ｌ１、Ｌ２、Ｒ１およびＲ２配列を提供することができる。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用して標準的なプロトコールにしたがって行った。ＰＣＲ産物は、Ｌ３およびＲ３プライマのいずれかを使用して、塩基−シーケンシング解析をＥｓｐｅｃ  Ｏｌｉｇｏ  Ｓｅｒｖｉｃｅ社、筑波、日本に依頼することにより行った。
【００７９】
（結果）
ＤＨＦＲまたはｃ−ｍｙｃ遺伝子座に由来するＩＲを使用して以前に行った実験により、哺乳動物ＩＲおよびＭＡＲを有するプラスミドは、遺伝子増幅と同様のプロセスを開始することが示されている（非特許文献２）。本実施例では、第三のＩＲを使用した結果を提供する。ｐ６ＸＮＢｅｔａは、ＩＲとＭＡＲ活性を有する領域とを含むヒトγ−ｇｌｏｂｉｎ座に由来する７．８ｋｂｐゲノム領域を有する（Ａｌａｄｊｅｍ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ｒｏｄｅｗａｌｄ，  Ｌ．  Ｗ．，  Ｋｏｌｍａｎ，  Ｊ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗａｈｌ，  Ｇ．  Ｍ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｌｏｃｕｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８１：  １００５−１００９，  １９９８）。このプラスミドをヒトＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞にトランスフェクションし、プールした安定形質転換体から分裂中期試料を調製した。プラスミドプローブを使用したＦＩＳＨにより、プラスミド配列の局在を調査した。ハイブリダイゼーションシグナルは、調査した中期細胞のＤＭｓまたは染色体ＨＳＲのそれぞれにおいて、４３％（１７／４０）または７８％（３１／４０）で検出された。代表的なイメージを図１ＡおよびＢに示す。対照的に、ベクタープラスミド（ｐ６ＸＮ）をトランスフェクションした培養に由来する中期細胞では、ＤＭｓにシグナルを示すものはほとんど示されず（調査した中期の３％；１／３５）、ＨＳＲにシグナルを示すものはなかった（調査した中期の０％；０／４０）。ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭにおけるオリジナルのアンプリコンを検出するためのプラスミドプローブとｃ−ｍｙｃコスミドプローブとのコハイブリダイゼーションにより、増幅されたプラスミドは、既存のＤＭｓ中に組み込まれるか、独立してＤＭｓを生じるか、またはオリジナルのアンプリコンから独立してＨＳＲを生じることが示されている（非特許文献２）。これらの構造は、単一細胞中に同時に出現することもある。これらの構造に加えて、異常に大きい環状染色体も見出された（図１Ｅ）。この構造の出現頻度は少なかったが、その有意性について後の節で議論する。
【００８０】
増幅された領域の分子構造。
ｐＳＦＶｄｈｆｒで安定にトランスフォームされたＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞を独立して１６クローン獲得した。ＦＩＳＨによる解析では、ＤＭｓ（１０クローン）、ＨＳＲ（３クローン）または両方とも（３クローン）のいずれかのプラスミド局在を示すクローンが同定された。以下の研究では、これらの中でＤＭに組み込まれたクローン（ＤＭクローン）としてクローン番号１２（図１Ｃ）および１４を使用し、ＨＳＲを形成したクローン（ＨＳＲクローン）としてクローン２２（図１Ｄ）および２４を使用した。このようなクローンから分離した高分子量ゲノムＤＮＡを制限酵素で処理し、生成物をサザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した（図２ＢおよびＣ）。第一の所見は、各細胞におけるプラスミド配列のコピー数が驚くほど多いことであった。ハイブリダイズしたシグナルの強さから、ＤＭクローンでは２〜４，０００コピー／細胞、ＨＳＲクローンでは１０，０００コピー／細胞以上のコピー数であると見積もられた。第二の所見は、ゲノム消化物から得られたバンドが、特にＤＭクローン（１２および１４クローン）において、驚くほど鮮明であるということであった。星印を付けた断片を除いて、各断片は、環状ｐＳＦＶｄｈｆｒを同様に消化した断片とよく一致していた。ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４でトランスフォームしたＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞の６つの独立したクローンを使用した場合も、本質的に同様の結果が得られた（データ示さず）。ＰＦＡで固定した細胞で行ったＦＩＳＨでは、大多数のプラスミド配列が、増幅された領域に存在することを示した（データ示さず）。したがって、特にＤＭｓにおいて、非常に多くのプラスミド配列が整列して増幅されていた。実際に、一箇所を消化する実験により、頭−尾に縦列の配列であることが示された。通常、トランスフェクションした遺伝子は、染色体の組込み部位に縦列配列で配置されることが知られているが、分子機序は明らかにされていない（Ｐａｌｍｉｔｅｒ，  Ｒ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｌ．  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２０：  ４６５−４９９，  １９８６）。ここで得られた結果は、ＩＲを有するプラスミドの増幅は、おそらく形質転換の初期の段階で上記同様の機構を媒介していることを示唆した。しかし、数千のプラスミド配列が増幅されるときに、頭−尾のダイレクトリピート配列がもとの構造のままであったことは、注目に値することである。これは、ＤＭｓへの組込みは、配列を不安定化せずにコピー数を増加することができることを示唆している。
【００８１】
クローン１２で行ったサザンブロット解析により、星印を付けた異常な断片は、組換え産物を反映していることが明らかとなった（図２Ｂ）。そこで、さらにいくつかの制限酵素を使用したサザンハイブリダイゼーションを行い、異常な断片を生じた組換え部位を分析した（データ示さず）。その結果、ＤＨＦＲ中のＭＡＲ活性を示す領域とハイグロマイシン耐性遺伝子との間の配列が直列につながるように組換えが生じていた。これは、プラスミドの縦列反復の２つの部位が切断された後に、各末端が再結合したことを示唆している。クローン１２由来の組換え部位（図２Ａ）およびゲノムＤＮＡを含む一連のＰＣＲプライマを使用してＰＣＲを行い、最も短い産物（Ｌ３−Ｒ３）をシーケンシング反応にかけた。得られた配列をオリジナルのｐＳＦＶｄｈｆｒ配列とともに図２Ｄに示した。結合部に挿入はなく、また組換え配列間に相同性もなく、非相同的末端結合の産物であると解される。複数のＤＭｓを有する細胞に由来するゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したにもかかわらず、ＰＣＲ産物からは鮮明なシーケンシングパターンが得られた。これは、ＤＭｓに組み込まれた配列は、細胞増殖の際も安定であることを示唆している。
【００８２】
増幅された領域の巨視的構造から洞察を得るために、のばしたクロマチン繊維（Ｐａｒｒａ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｗｉｎｄｌｅ，  Ｂ．  Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ５：  １７−２１，  １９９３）を使用してＦＩＳＨ解析を行った。得られた代表的なイメージを図１ＦおよびＧに示す。通常この技術では、得られたシグナルがビーズの紐のように見える。特異的ハイブリダイゼーションシグナルが出現した全てのクロマチン繊維において、ベクターとＤＨＦＲインサートが交互に出現している。これは、増幅されたプラスミド配列が間断なく伸長していることを示している。クローン１２における反復の長さを交互に現れるシグナルに基づいて見積もると、リピートあたり数十から百コピーのプラスミドを有していた。クローン１２細胞は、約２０〜３０のＤＭｓを含み、ＤＭｓ中にこの反復が１〜５回組込みまれていることから、細胞あたりのコピー数が２〜４０００であるというサザンブロットから得られた数値を説明することができる。予想されてとおり、増幅されたプラスミド配列は、ＨＳＲクローン２２から調製したクロマチン繊維中により長く挿入されていた（図１Ｇ）。
【００８３】
これらの結果をあわせると、１０〜１００コピーのプラスミドの縦列反復で構成された大きな環状分子は、形質転換の初期で形成されたことを示唆する。分裂中期試料において、プラスミドプローブとハイブリダイズした小さな対のシグナルが観察され、これは超顕微鏡的にも環状プラスミド多量体と一致していた（データ示さず）。この多量体は、既存のＤＭｓと再結合するか、互いに再結合してＤＭｓと同じサイズに増大するか、または染色体に組み込まれるであろう。
【００８４】
コトランスフェクション実験による初期の多量体化プロセスの解析。
種々のＩＲおよび／またはラムダファージＤＮＡを有するプラスミドの２つをコトランスフェクションして、増幅された構造がどのように出現するか調査した。コトランスフェクションされた配列は、トランスフェクション後の初期に一連の非相同的な分子間組換えを受けて、混在構造を形成することは既知である（Ｐｅｒｕｃｈｏ，  Ｍ．，  Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｗｉｇｌｅｒ，  Ｍ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ，  ２２：  ３０９−３１７，  １９８０）。しかし、ＦＩＳＨによる構造解析では、報告されていなかった。
【００８５】
安定形質転換体から分裂中期試料を調製し、トランスフェクションした両方の配列をそれぞれ２−色ＦＩＳＨで検出することによって調査した。図３ＡおよびＢの代表的なイメージに示されるように、コトランスフェクションされた配列は、常に増幅された構造の混合物として検出された。さらに、ＩＲを有するプラスミドとともにトランスフェクションした場合、ラムダファージＤＮＡもともに増幅された。面白いことに、異なったＩＲを有する２つのプラスミドをコトランスフェクションした場合、共に増幅された構造は必ずＨＳＲで検出され、ＤＭｓでは検出されなかった（図３Ａ）。その一方で、ファージとプラスミドをコトランスフェクションすると、ＤＭｓにシグナルが出現した（図３Ｂ）。但し、大多数の細胞はＨＳＲを有していた。
【００８６】
次いで、クロマチン繊維のＦＩＳＨにより、増幅された構造を分析した。図３Ｃ〜Ｈに代表的なイメージを示した。増幅された領域におけるラムダ配列は、常にプラスミド配列に結合していた。しかし、通常この配列は、クロマチン繊維に沿って長い一続きの配列を形成し、ラムダＤＮＡの１〜１０分子以上の大きさと一致する（図３Ｃ）。これは、おそらくラムダＣＯＳ部位間の結合が鎖状体分子の形成を引き起こすことを反映している。異なったＩＲを有する２種類のプラスミドをコトランスフェクションすることにより、混在構造を生じたことから、非相同的組換えが頻繁に起こっていることを示している（Ｐｅｒｕｃｈｏ，  Ｍ．，  Ｈａｎａｈａｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｗｉｇｌｅｒ，  Ｍ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ，  ２２：  ３０９−３１７，  １９８０）。しかし、クロマチン繊維に沿っていずれかのプラスミド配列が延長されている構造が、頻繁に検出された。この構造の長さは、プラスミドの数十コピーの長さと一致した（図３Ｃ〜Ｅ）。このような現象は、分子間相同組換えによって説明される。しかし、ｐＳＦＶｄｈｆｒ（１１ｋｂｐ）およびｐ６ＸＮＢｅｔａ（１４ｋｂｐ）は、６．３ｋｂｐの共通配列を有し、２つのプラスミドとｐＮｅｏ．ｍｙｃ−２．４（９ｋｂｐ）の間は２ｋｂｐが共通である。したがって、いずれのプラスミド配列においても見出される長い中断されない延長は、相同組換えによって説明することはできない。さらに、この活性は、哺乳動物細胞（より下等な真核生物と異なる）では低いことが既知である。一方、図３ＦおよびＧに示したとおり、一部のクロマチン繊維では、プラスミドおよびラムダファージ配列がタンデムダイレクトリピートに配置されていた。上記クロマチン繊維に沿った連続するプラスミド配列は、いずれも複製を介した多量体化プロセスの結果として生じた可能性がある。また、環状ゲノムＤＮＡの二量体化は、細菌細胞において複製終止変異体において観察されている（Ｂａｒｒｅ，  Ｆ．  Ｘ．，  Ｓｏｂａｌｌｅ，  Ｂ．，  Ｍｉｃｈｅｌ，  Ｂ．，  Ａｒｏｙｏ，  Ｍ．，  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｒａｔｔ，  Ｎ．  Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．  ｐ２４  Ｄ．  Ｃｉｒｃｌｅｓ：  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８：  ８１８９−８１９５，  ２００１．、Ｌｅｍｏｎ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｋｕｒｔｓｅｒ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  Ａ．  Ｄ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９８：  ２１２−２１７，  ２００１）。
【００８７】
ＨＳＲは、プラスミドリピートで始まるＢＦＢサイクルによって生じる。
ＨＳＲ由来プラスミドを有する細胞をＦＩＳＨで検査する際に、２つの有糸分裂娘細胞間または有糸分裂後の娘細胞間で、プラスミド配列によって構成されたブリッジが観察された。このようなブリッジは、通常の染色体標本中で観察することができる（図４Ｄ）。ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞は培養基板に接着しないので、ヒトＨｅＬａ細胞で調査した。ｐＳＦＶｄｈｆｒをトランスフェクションすると、これらの細胞においてもＨＳＲを生じた。このような形質転換体をチャンバースライドで培養し、ＰＦＡによりｉｎ  ｓｉｔｕで固定して、プラスミドプローブを使用したＦＩＳＨによって解析した。プラスミド配列で構成されるブリッジは、分裂後期（図４Ａ）および分裂終期／細胞質分裂（図４Ｂ）で検出された。ブリッジは、Ｇ１期の初期（図４Ｃ）で破壊された。一部の細胞では、壊れたクロマチンの一部が細胞質に残ったままとなり、微小核を生じた。一方、分裂中期試料におけるＨＳＲのプラスミド配列の大部分は、染色体アームの末端で検出された（たとえば、図１を参照）。これら２つの前提に基づくと、ＢＦＢサイクル（図４Ｅにおいて図解した）は、プラスミド由来のＨＳＲの生成および増大に関与していると結論づけられる。ＢＦＢサイクルがプラスミド配列で惹起されるには、プラスミドリピートにおいて頻繁にＤＮＡ鎖の切断が生じることが必要である。
【００８８】
複製および転写の間の制御可能な衝突によりＨＳＲが生じる。
ｐＳＦＶｄｈｆｒに由来する１０種類のプラスミドを構築した。これらを図５に示した。ｐＳＦＶｄｈｆｒは、２つの薬物選択マーカー遺伝子（ブラスチシジン耐性（Ｂｓｒ）およびハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ））を有する。これらのプラスミドをＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ細胞にトランスフェクションし、ブラスティサイジンで細胞を選択した。プールした形質転換体のプラスミド分布をＦＩＳＨによって分析した（図１）。これらのプラスミドについて、３回以上の独立したトランスフェクションおよび解析を行った。ＤＭｓでシグナルを示す分裂中期細胞の割合は、種々のトランスフェクション間で変動しやすかったが、ＨＳＲでシグナルを示す分裂中期細胞の割合は、かなりの再現性があった。代表的な結果を図６に示した。この実験では、トランスフェクションしてから２、３および４週間後に解析した。ｐＳＦＶｄｈｆｒをトランスフェクションした場合、２０〜４０％の形質転換細胞は、プラスミド配列で構成されたＨＳＲを有していたが（図６Ａ）、ｐＳＦＶ−Ｖの場合では、全くＨＳＲを有していなかった（図６Ｂ）。これは、ＨＳＲの生成にＤＨＦＲ  ＩＲが必須であることを示しており、ＩＲからの複製がＤＮＡ鎖の切断を誘導しているかもしれないことを示唆した。他方、上記したように、Ｂｓｒ転写ユニットは、その下流にｐｏｌｙ（Ａ）付加配列を有していない。ｐｏｌｙ（Ａ）付加は、転写終結に関連しているので（最近の総説については、Ｒｅｆ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，  Ｒ．  Ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｍｏｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍａｃｈｉｎｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１６：  ４９９−５０６，  ２００２を参照）、複製がＤＨＦＲ  ＩＲから開始された場合、転写と複製の間で正面衝突することが予想される。増幅されたプラスミド配列は、ダイレクトリピートとして配置され、それぞれの配列間の相互の配向がもとの環状構築物と同じであることは、重要である。そこで、Ｂｓｒの下流にｐｏｌｙ（Ａ）配列を配置することとした（ｐΔＢＮ．ｐｏｌｙＡおよびｐΔＢ．ｐｏｌｙＡ）。これらのプラスミドをトランスフェクションしてもＨＳＲがほとんど産生されなかったが、もとのプラスミド（ｐΔＢＮおよびｐΔＢ）では、多数のＨＳＲを産生した（それぞれ、図６ＦおよびＩ〜ＤおよびＧとを比較）。ｐｏｌｙ（Ａ）シグナルを、転写と複製が衝突するような部位に配置すると、ＨＳＲの産生をほとんど完全に抑制することが示された。ｐΔＢでは、ｐＳＦＶｄｈｆｒまたはｐΔＢＮ（以下、全部は直さないが、プラスミド表記の統一に注意）よりも比較的低い頻度でＨＳＲを産生した。ＨＳＶ  ｐｏｌｙ（Ａ）の末端２０２ｂｐの配列は、ｐΔＢを構築する際に削除されてしまう。しかし、Ｈｙｇは選択に使用していないにもかかわらず、Ｈｙｇからの転写が何らかの効果を有しているかもしれない。
【００８９】
さらに、ＲＦＢを使用することにより、複製フォーク阻害の効果を確認した。本研究に使用したＲＦＢは、ヒトｒＤＮＡリピートに由来する。ＲＦＢは、配向依存的にＤＮＡ複製フォークの進行を阻止し、その複製の間にもｒＤＮＡ転写を可能にする（Ｐｕｔｔｅｒ，  Ｖ．  ａｎｄ  Ｇｒｕｍｍｔ，  Ｆ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＴＴＦ−Ｉ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｃｏｎｔｒａｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，  ３：  １４７−１５２，  ２００２）。本実施例により、ＲＦＢは、配向依存的にＨＳＲの産生を抑制することが示された（６Ｊ図およびＫ）。すなわち、ＲＦＢがＤＨＦＲ  ＩＲからの複製を遮断する配向（ｐΔＢ．ＲＦＢ  Ｄｉｒ．）に配置された場合、ＨＳＲを有する細胞は観察されなかったが、ＲＦＢを逆配向に配置した場合は、よくＨＳＲが観察された（ｐΔＢ．ＲＦＢ  Ｒｅｖ．）。後者の場合、複製はＢｓｒからの転写に直接衝突する構造である。これらの結果をあわせると、ＤＨＦＲ  ＩＲからの複製がＢｓｒからの転写と衝突する場合に、ＤＮＡ鎖が破壊されることを示唆している。また、衝突は、ＩＲからの複製を遮断する配向でｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルまたはＲＦＢを配置することによって解消された。
【００９０】
次に、ＭＡＲの効果について述べる。ｐΔＢＮ．ＡＲ１およびｐΔＢ．ＡＲ１は、Ｂｓｒの下流に強いＭＡＲ活性を示す配列（ＡＲ１）を有する。これらのプラスミドをトランスフェクションした結果、この位置にＭＡＲを配置すると、ＨＳＲ産生が増大されることが明らかとなった（図６ＥおよびＨをＤおよびＧと比較）。この結果から、複製と転写との間にＭＡＲが存在すると、ＤＮＡ鎖の破壊が引き起こされるのであろうと推定される。一方、ｐＩＮＶ．ＮｏｔＩをトランスフェクションすると、ＨＳＲ形成は非常にまれにしか出現しなかった。もとのｐＳＦＶｄｈｆｒがこのプラスミドと唯一相違する点は、ＤＨＦＲが挿入されている向きであった。この場合、Ｂｓｒ転写に関してＯｒｉｓと内因性ＭＡＲとの順番が入れ代わっている。もとの構築物では、内因性ＭＡＲは、Ｂｓｒから比較的離れているにもかかわらずＤＮＡ鎖の破壊に寄与している。ＤＨＦＲインサートを入れ換えた場合、複製と転写の間にＭＡＲが存在しない構造となる。この結果から、ｐＩＮＶ．ＮｏｔＩによってＨＳＲがほとんど生じなかった理由が説明される。さらに、以前の論文で報告した結果も、上記仮定によく適合している（非特許文献２）。すなわち、ネオマイシン抵抗性遣伝子の下流からＳＶ４０  ３’−プロセシングシグナルが欠失すると、ｐｏｌｙ（Ａ）付加シグナルとしてだけでなくＭＡＲとして機能してＨＳＲ形成が完全に抑制された。この構築物では、ネオマイシン抵抗性遣伝子からの転写がＭＡＲを挟むことなくｃ−ｍｙｃ  ＩＲからの複製と直接衝突した。ＳＶ４０配列の代わりに、もう一つのＭＡＲ配列（ＡＲ１）を挿入すると、非常にＨＳＲ形成が観察された。したがって、全てのデータが推測と一致していた。すなわち、複製と転写の間にＭＡＲが存在するときにＤＮＡ鎖の破壊が引き起こされた。
【００９１】
（考察）
上記実験では、哺乳類ＩＲを有するプラスミドがどのように遺伝子増幅を模倣しているかを示唆した。第一に、トランスフェクションしたプラスミドは、プラスミドタンデムダイレクトリピートからなる大きな環状分子を形成した。現在、このようなダイレクトリピートは、リピート誘導性の遺伝子サイレンシングの標的であることが知られている（ＭｃＢｕｒｎｅｙ，  Ｍ．  Ｗ．，  Ｍａｉ，  Ｔ．，  Ｙａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｊａｒｄｉｎｅ，  Ｋ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｒｅｐｅａｔｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，  ２７４：  １−８，  ２００２）。実際に、逆転写酵素を媒介したＰＣＲを使用した予備実験では、増幅されたプラスミド配列に由来する非常に低い発現が示されている（データ示さず）。さらに、５μｇ／ｍｌ以下のブラスティサイジン（この研究で形質転換体を選択するために使用した）の存在下で増殖するためには、１コピーに由来するＢｓｒの発現のみで十分であった。したがって、ＩＲを有するプラスミドが細胞内で莫大なコピー数に増幅されるのは、適用する選択圧力によるものではなく、プラスミド固有の性質に由来するものであった。
【００９２】
プラスミドリピート環が相互組換えされることにより、ＤＭｓと見分けがつかない大きさに達するであろう。あるいは、これらの環とあらかじめ存在するＤＭｓとの組換えが生じることにより、ＤＭｓに統合されることとなる。ＤＭｓに組込まれるためには、環状プラスミドリピートの自律複製および安定性維持が少なくとも限られた時間必要とされると推測される。この推論は、プラスミドがＤＭｓに組み込まれるためには、哺乳動物ＩＲおよびＭＡＲを有していなければならないことに基づいている。さらに、ＥＢウィルスに基づくプラスミド（このプラスミドは、染色体外の自律複製および分離を示すことが周知である）のトランスフェクションでは、ＤＭｓにプラスミドシグナルが出現したが、ＨＳＲでは出現しなかった（非特許文献２）。ＩＲもＭＡＲも有していないｐＳＦＶ−Ｖのトランスフェクションでは、頻度は非常に低いが、ＤＭｓに組み込まれるであろう（図６Ｂ）。これは、いずれの配列も、哺乳動物細胞の複製開始部位となる可能性を有することから推論される（Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｍａｋｉｎｇ  ｓｅｎｓｅ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９４：  ９６−１００，  ２００１３５）。
【００９３】
また、コトランスフェクション実験では、トランスフェクションの最初の段階で非相同的な遺伝子組換えが起こることが示された。異なったＩＲと２つのプラスミドとの間の遺伝子組換えにより、複製と転写の間の衝突が頻繁に生じる構築物を産生する。このようなアイデアは、異なったプラスミドをコトランスフェクションするとＨＳＲのみを生じるがＤＭｓは生じなかったこと（図３）の理由となるであろう。すなわち、異なったＩＲと２つの異なったプラスミドとの間の組換え体は、染色体外で維持されることが困難であり、ＤＭｓに組み込まれないのであろう。一方、組換え体が染色体アームに組み込まれた場合、これが頻繁に崩壊することによりＨＳＲが効果的に誘導される。培養を続けるとＤＭｓにおけるシグナルが減少することが示されているが、ＨＳＲでのシグナルの頻度は増加していた（図６）。この結果は、ヒト癌細胞を患者から単離した後に継代していると、ＤＭｓを有する細胞がＨＳＲに有する細胞に置き換わってしまうことと同様である。これは、プラスミドリピートを有するＤＭｓが染色体と再結合し、その結果ＢＦＢサイクルを開始してＨＳＲを生じ得ることによって説明される。あるいは、ＤＭｓにおけるプラスミドリピートは、上記機構によりＤＮＡ鎖が破壊される原因にもなるはずである。以前に示したように、ＤＭｓが切断されると、次のＭ期において有糸分裂染色体からＤＭｓを脱離させた後、細胞からＤＭｓを除去されるであろう（Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｎ．  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｇ１  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌａｍｉｎ  ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｓ  ｐｈａｓｅ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１３：  ６９７−７０７，２０００）。
【００９４】
驚くべきことに、ダイレクトリピートは、ＤＭｓにおいて非常に高コピー数であるにもかかわらず規則正しく配置され、組換え配列の安定性が維持され、並びにＤＭｓの配列は非常に安定であった（図２）。これは、ＤＭｓが破壊された場合、ＤＭｓが排除されたことによって説明される。
【００９５】
染色体外の分子間における分子間組換えは、非常に一般的なようである。この現象には、核内で、これらが共に局在するという性質が関与しているであろう。ＤＭｓまたはウイルス性プラスミドなどの細胞体外遺伝因子は、染色体に付着することにより分配され、これらは有糸分裂後に核の周辺部に局在する。また、染色体外遺伝子の組換えは、ヒト癌において生じることが報告されている。すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて癌細胞で観察される天然の増幅された構造は、複合体であり且つ非連続的であることが既知であり、この構造には、いくつかの遺伝子が共に増幅されたものが含まれている（総説については、Ｓｃｈｗａｂ，  Ｍ．  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，  ２０：  ４７３−４７９，  １９９８を参照）。さらに、コルヒチンによってＭＤＲ遺伝子の増幅を誘導すると、８９０ｋｂｐの超顕微鏡的なエピソームが二量体化してＤＭｓを生じる（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ，  Ｐ．  Ｖ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｄ．  Ｗ．，  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｍ．  Ｍ．  Ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  １  ａｎｄ  ２  ｇｅｎｅｓ  ａｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡｓ  ｉｎ  ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ＫＢ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ３：  ５０７−５２０，  １９９２）。また、ＤＭｓ間で相互に組換えが生じることも示されている。これは、ＤＭｓにおいてメチル化レベルが低いことが関与しているかもしれない（Ｒｉｚｗａｎａ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｈａｈｎ，  Ｐ．  Ｊ．  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  １１２：  ４５１３−４５１９，  １９９９）。
【００９６】
プラスミドダイレクトリピートの大きな環が染色体アームに組み込まれた場合、ＢＦＢサイクルが誘導されてＨＳＲの生成が引き起こされた。ＢＦＢサイクルは、プラスミド配列が切断されることによって開始されるはずである。実際に、ＨＳＲを有する細胞において、プラスミド配列で構成される大きな環状染色体が観察されている（図１Ｅ）。これは、ＨＳＲ内の２つの部位で同時に切断された後、それぞれの末端と再結合した結果であると説明できる。さらに、ＤＭｓ内の増幅されたプラスミドアレーにおいて、組換え配列を同定した（図２Ｄ）。これは、ダイレクトリピート内の２カ所が切断されて、各末端が再結合して生じた結合産物である。また、２本鎖切断の代わりに、娘染色分体間における組換えによっても二動原体染色体が生じ、ＢＦＢサイクルが開始されることも重要である。
【００９７】
転写と複製との間の衝突により、プラスミドリピート内に破壊を生じ、ＢＦＢサイクルが引き起こされることが示唆された。この衝突は、ｐｏｌｙ（Ａ）付加配列を配置すること、またはＩＲからの複製を遮断する配向にＲＦＢを配置することによって回避された。細菌またはより下等の真核細胞を使用した多くの研究において、転写と複製との間の衝突により、組換えまたはＤＮＡ鎖破壊が誘導されることが記載されている（総説については、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，  Ｒ．，  Ｍｉｃｈｅｌ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｇａｎｇｌｏｆｆ，  Ｓ．  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒｋ  ｐａｕｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｒ  ”ｇｉｍｍｅ  ａ  ｂｒｅａｋ”．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，  １４：  １−１０，  ２０００を参照）。また、哺乳類ヒト細胞におけるプラスミドの自律複製は、転写によって抑制されることが報告されている（Ｈａａｓｅ，  Ｓ．  Ｂ．，  Ｈｅｉｎｚｅｌ，  Ｓ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，  Ｍ．  Ｐ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｎ．  Ｂｉｏｌ．，  １４：  ２５１６−２５２４，  １９９４）。複製阻害剤によって複製フォークの阻止することにより、ＤＮＡ鎖破壊が引き起こされるという多数の報告もある（Ｓａｉｎｔｉｇｎｙ，  Ｙ．，  Ｄｅｌａｃｏｔｅ，  Ｆ．，  Ｖａｒｅｓ，  Ｇ．，  Ｐｅｔｉｔｏｔ，  Ｆ．，  Ｌａｍｂｅｒｔ，  Ｓ．，  Ａｖｅｒｂｅｃｋ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，  Ｂ．  Ｓ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：  ３８６１−３８７０，  ２００１）。しかし、実際に哺乳動物複製起点を使用した場合に、衝突によるＤＮＡ鎖の破壊およびゲノムの不安定化を生じることは報告されていなかった。
【００９８】
ＭＡＲを転写と複製との間に配置した場合、ＤＮＡ鎖破壊が誘導されてＨＳＲ形成が検出された。これは、クローン１２で同定された組換えには、破壊されたＭＡＲ配列が含まれていることと一致していた（図２）。さらに、ＣＨＯ細胞において、ＭＡＲは、増幅されたＤＨＦＲ領域内のアンプリコン間の結合部に位置していた（Ｄｉｊｋｗｅｌ，  Ｐ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｈａｍｌｉｎ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｅｄ  ｎｅａｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ，  ｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎ  ｉｎｔｅｒａｍｐｌｉｃｏｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：  ５３９８−５４０９，  １９８８）。この場合、もとのＣＨＯ細胞におけるＤＨＦＲ領域の増幅は、メトトレキセートの濃度を増加して細胞を処理することによって誘導された。ＤＨＦＲ転写ユニットおよび複製ＩＲを含む２７３ｋｂｐのアンプリコンは、頭−尾アレーに組み込まれていた。したがって、我々のプラスミドモデルと一致していた。
【００９９】
従来、自律的複製を示すプラスミドの構築が不可能であったため、哺乳動物複製起点の解析が行われることはなかった。本実施例においてＤＨＦＲ  Ｏｒｉｓを使用して提供した結果により、複製フォークが実際にＩＲに由来すること示唆された。さらに、プラスミド配列の安定のためには、転写ユニット、ｐｏｌｙ（Ａ）付加配列、ＲＦＢおよびＭＡＲ配列を、複製起点に対して適切に配置することが重要であることが示された。
【０１００】
【配列表】
2004337066.tif 000003
2004337066.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】哺乳類ＩＲを有するプラスミドによって生じた増幅構造を示す写真であって、ｐ６ＸＮＢｅｔａ（Ａ、Ｂ）またはｐＳＦＶｄｈｆｒ（Ｃ〜Ｇ）をＣＯＬＯ３２０ＤＭにトランスフェクトしたときの顕微鏡写真。
【図２】増幅された構造の分子解析を行った結果であって、ｐＳＦＶｄｈｆｒのマップ（Ａ）、ｐＳＦＶｄｈｆｒ（Ｃ〜Ｇ）をＣＯＬＯ３２０ＤＭにトランスフェクトすることによって得られた安定クローンをサザンブロットハイブリダイゼーションで解析した結果を示す電気泳動写真（Ｂ、Ｃ）、および接合部配列をもとのｐＳＦＶｄｈｆｒとともに示した図（Ｄ）。
【図３】プラスミドＤＮＡまたはファージＤＮＡを同時トランスフェクションすることによって産生される増幅された構造の解析結果を示す顕微鏡写真であって、ｐＳＦＶｄｈｆｒとｐＮｅｏ．ｍｙｃ−２．４の混合物（Ａ）、ラムダファージとｐＳＦＶｄｈｆｒの混合物（Ｂ、Ｃ）、ｐＳＦＶｄｈｆｒとｐ６ＸＮＢｅｔａの混合物（Ｄ）、ｐＮｅｏ．ｍｙｃ−２．４とｐ６ＸＮＢｅｔａの混合物（Ｄ）、およびｐＮｅｏ．ｍｙｃ−２．４とラムダファージの混合物（Ｆ、Ｇ）をＣＯＬＯ３２０ＤＭに同時トランスフェクションした結果を示す顕微鏡写真。
【図４】ＢＦＢサイクルによるＨＳＲの生成を示す顕微鏡写真であって、ＢＦＢサイクルによって形成されるＨＳＲの生成の模式図（Ｅ）、およびｐＳＦＶｄｈｆｒでトランスフォーメーションされたＨｅＬａ細胞（Ａ〜Ｃ）、ＣＯＬＯ３２０ＤＭにｐＳＦＶｄｈｆｒをトランスフェクションすることによって得たＨＳＲを有するクローン２２細胞（Ｄ）を示す顕微鏡写真。
【図５】実施例において使用したプラスミド構築物の構造を示す模式図。
【図６】種々のプラスミド構築物をトランスフェクションすることによる増幅された構造の生成頻度を示す図。
【図１】
2004337066.tif 000005
【図２】
2004337066.tif 000006
【図３】
2004337066.tif 000007
【図４】
2004337066.tif 000008
【図５】
2004337066.tif 000009
【図６】
2004337066.tif 000010