(57)【要約】【課題】　閉経後エストロゲン低下または欠乏に起因する身体的状態の処置の方法を提供すること。【解決手段】　閉経後の被験体において閉経後エストロゲン減少により生じる身体的状態を処置するための方法であって、この方法は、被験体において、約５ｐｇ／ｍｌと約１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である量のエストロゲンを、該被験体へ投与する工程を包含する、方法。また、他の局面として、たとえば、閉経後エストロゲン低下に起因する身体的状態を罹患したあるいはこれに罹患しやすい消費者による使用のためのキットであって、以下：ａ）１日あたり約２０μｇ未満のエストロゲンを経皮的に投与するための経皮パッチ；および、ｂ）該消費者における骨粗しょう症性骨折の危険性を低下させるための経皮パッチを使用する方法を記載する説明書を包含する、キット。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉経後の被験体において閉経後エストロゲン減少により生じる身体的状態を処置するための方法であって、該方法は、該被験体において、約５ｐｇ／ｍｌと約１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である量のエストロゲンを、該被験体へ投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
　（発明の背景）
　内因性エストロゲンは、自然な閉経または外科的な閉経の後、劇的に減少する。そしてこの減少は、骨量低下および引き続く骨折の著明な増加を生じる。内因性エストロゲンは、若年女性において骨格の健康を維持するために明らかに重要である。しかし、高齢女性における内因性エストロゲンの重要性はあまり確かでない。
【０００２】
　６５歳を超える女性における内因性エストロンレベルは、引き続く股関節部または脊椎の骨折には関係ないということが以前に示されている。Ｓ．Ｒ．Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１０（補遺　Ｉ）：Ｓ１７４（１９９５）。しかし、エストラジオールはエストロンより強力なエストロゲンである、そしてエストラジオールと骨折との関係の研究は結論に達していない。閉経前の女性における血清エストラジオールレベルは平均１００ｐｇ／ｍｌを超える。ホルモン置換療法を用いて処置されていない閉経後女性における血清エストラジオールのレベルは、２０ｐｇ／ｍｌ未満に低下する。そして、３０〜５０％もの閉経後女性が、従来の高感度アッセイ法では検出されない血清エストラジオールレベル（すなわち、５ｐｇ／ｍｌ未満）を有する。閉経後の女性のための従来の処置には、血清エストラジオールレベルを４０〜６０ｐｇ／ｍｌを超えて維持するのに十分な用量でのエストロゲン置換療法が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　従来のホルモン置換療法は、閉経後エストロゲン減少に起因する身体的状態の処置について有用であると証明されている。この療法は、骨密度の減少の低下（または骨密度の増加さえ）含み、そして骨折の危険性の減少を含む。しかし、研究は、ホルモン置換療法が、乳癌および子宮内膜癌のリスク増加、ならびに子宮からの血液凝固および出血のリスク増加に関連し得ることを示している。従って、当該分野において、閉経後エストロゲン低下または欠乏に起因する身体的状態の処置の方法についての必要性が残っている。また、当該分野において、ホルモン置換療法の副作用を減少させながら、このような身体的状態を処置する必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
項目１　閉経後の被験体において閉経後エストロゲン減少により生じる身体的状態を処置するための方法であって、該方法は、該被験体において、約５ｐｇ／ｍｌと約１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である量のエストロゲンを、該被験体へ投与する工程を包含する、方法。
項目２　前記身体的状態が、骨粗しょう症性骨折の危険性上昇および骨密度減少からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
項目３　前記投与される量のエストロゲンが、前記被験体において、約５ｐｇ／ｍｌと約１０ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である、項目１に記載の方法。
項目４　前記量のエストロゲンを非経口的に投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
項目５　前記量のエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
項目６　１日あたり約１５μｇ以下のエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
項目７　１日あたり約５μｇと１５μｇとの間のエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
項目８　前記エストロゲンがエストラジオールである、項目１に記載の方法。
項目９　閉経後骨粗しょう症に罹患している、またはこれに罹患しやすい被験体において、骨粗しょう症性骨折の危険性を低下させるための方法であって、該方法は、該被験体において、約５ｐｇ／ｍｌと約１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である量のエストロゲンを、該被験体へ投与する工程を包含する、方法。
項目１０　前記投与される量のエストロゲンが、前記被験体において、約５ｐｇ／ｍｌと約１０ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である、項目９に記載の方法。
項目１１　前記量のエストロゲンを非経口的に投与する工程を包含する、項目９に記載の方法。
項目１２　前記量のエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目９に記載の方法。
項目１３　１日あたり約１５μｇ以下のエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目９に記載の方法。
項目１４　１日あたり約５μｇと１５μｇとの間のエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目９に記載の方法。
項目１５　前記エストロゲンがエストラジオールである、項目９に記載の方法。
項目１６　閉経後のエストロゲン減少により生じる身体的状態を罹患したまたはこれに罹患しやすい消費者による使用のためのキットであって、以下：
　ａ）１日あたり約１５μｇ未満のエストロゲンを経皮的に投与するための経皮パッチ；および
　ｂ）該消費者における骨粗しょう症性骨折の危険性を低下させるための経皮パッチを使用する方法を記載する説明書
を備えるキット。
項目１７　　閉経後の被験体における閉経後エストロゲン減少により生じる身体的状態を処置するための方法であって、該方法は、外因性プロゲスチンの実質的な非存在下で、該被験体に、１日あたり約２０μｇ未満のエストロゲンを経皮的に投与する工程を含む、方法。
項目１８　　前記身体的状態が、骨粗しょう症性骨折の危険性上昇および骨密度減少からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
項目１９　前記投与が、前記被験体の子宮摘出の前である、項目１７に記載の方法。
項目２０　項目１７に記載の方法であって、さらに、被験体の血清エストラジオールレベルを試験する工程、および処置される被験体の血清エストラジオールレベルが、被験体と同年齢の群における閉経後の女性について正常であることを決定する工程、を包含する、方法。
項目２１　１日あたり約５μｇと１５μｇとの間のエストロゲンを投与する工程を包含する、項目１７に記載の方法。
項目２２　１日あたり約１０μｇのエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目１７に記載の方法。
項目２３　前記エストロゲンがエストラジオールである、項目１７に記載の方法。
項目２４　閉経後骨粗しょう症に罹患した、またはこれに罹患しやすい被験体において骨粗しょう症性骨折の危険性を低下させるための方法であって、該方法は、外因性プロゲスチンの非存在下で、該被験体に、約２０μｇ未満のエストロゲンを投与する工程を含む、方法。
項目２５　前記投与が、前記被験体の子宮摘出の前である、項目２４に記載の方法。
項目２６　項目２４に記載の方法であって、さらに、被験体の血清エストラジオールレベルを試験する工程、および処置される被験体の血清エストラジオールレベルが、被験体と同年齢の群における閉経後の女性について正常であることを決定する工程、を包含する方法。
項目２７　１日あたり約５μｇと１５μｇとの間のエストロゲンを投与する工程を包含する、項目２４に記載の方法。
項目２８　１日あたり約１０μｇのエストロゲンを経皮的に投与する工程を包含する、項目２４に記載の方法。
項目２９　前記エストロゲンがエストラジオールである、項目２４に記載の方法。
【０００５】
　（発明の要旨）
　最初の局面として、本発明は、閉経後の被験体におけるエストロゲン低下に起因する身体的状態の処置のための方法を提供する。この方法は、約５ｐｇ／ｍｌと約１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である量のエストロゲンを、被験体へ投与する工程を包含する。
【０００６】
　第二の局面として、本発明は、閉経後骨粗しょう症を罹患したあるいはこれに罹患しやすい被験体において骨粗しょう症性骨折の危険性の低下のための方法を提供する。この方法は、約５ｐｇ／ｍｌと約１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを生じるために有効である量のエストロゲンを、被験体へ投与する工程を包含する。
【０００７】
　第三の局面として、本発明は、閉経後エストロゲン低下に起因する身体的状態を罹患したあるいはこれに罹患しやすい消費者による使用のためのキットを提供する。このキットは以下を包含する：ａ）１日あたり約２０μｇ未満のエストロゲンを経皮的に投与するための経皮パッチ；および、ｂ）該消費者における骨粗しょう症性骨折の危険性を低下させるための経皮パッチを使用する方法を記載する説明書。
【０００８】
　第四の局面として、本発明は、閉経後の被験体において閉経後エストロゲン低下に起因する身体的状態の処置のための別の方法を提供する。この方法は、外因性プロゲスチンの非存在下で、１日あたり約２０μｇ未満のエストロゲンを投与する工程を含む。
【０００９】
　第五の局面として、本発明は、骨粗しょう症に罹患したあるいはこれに罹患しやすい被験体における、骨粗しょう症性骨折の危険性を低下させるための別の方法を提供する。この方法は、外因性プロゲスチンの非存在下で、１日あたり約２０μｇ未満のエストロゲンを投与する工程を含む。
【００１０】
　本発明のこれらおよび他の局面は、以下の本発明の、図面、好ましい実施態様の説明、および実施例にさらに記載される。
【発明の効果】
【００１１】
　本発明によって、閉経後エストロゲン低下または欠乏に起因する身体的状態の処置の方法を提供される。また、本発明によって、ホルモン置換療法の副作用を減少させながら、このような身体的状態を処置する方法を提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
　（好ましい実施態様の説明）
　別に規定しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、当該分野における従来の意味を有する。本明細書で用いたように、以下の用語は、それらに割り当てた意味を有する。
【００１３】
　「閉経後エストロゲン低下に起因する身体的状態」とは、閉経後女性の間で共通する身体的状態、および少なくとも一部で体におけるエストロゲンの低下により発生する身体的状態をいう。これらの状態には、骨粗しょう症、頭痛、悪心、抑うつ、のぼせ、骨密度の低下、骨折の危険性または頻度の上昇（椎骨および／または股関節部の骨折を含む）が挙げられるが、これに限られない。
【００１４】
　「閉経後の被験体」とは、閉経後の生存期間における女性をいう。閉経後症状に罹患した被験体には、閉経後に前記のいずれかの身体的状態を示す閉経後の女性、および特に、椎骨、股関節部もしくは他の部位における骨密度の低下を示す（または椎骨もしくは股関節部の骨折のいずれかを経験した）閉経後の女性が挙げられる。閉経後のエストロゲン低下に起因する身体的状態に罹患しやすい被験体には、閉経前女性に比べて血清エストラジオールレベルの低下を示す、閉経期の発症に近付きつつある女性、および血清中エストラジオールレベルの低下を示すが、閉経後エストロゲン低下により生じる身体的状態をまだ示していない閉経期後の女性が挙げられる。血清エストラジオールレベルの低下を示す被験体には、２０ｐｇ／ｍｌ以下の血清エストラジオールレベルを示す被験体が挙げられる。これには検出不能レベルの血清エストラジオールを示す被験体を含む。本発明の目的のために、血清エストラジオールレベルを含む性ホルモンレベルを、抽出およびカラム分離後、ラジオイムノアッセイを用いることにより測定した。検出限界は、エストラジオール５ｐｇ／ｍｌである。
【００１５】
　「骨粗しょう症性骨折」とは、代表的には、骨粗しょう症がその原因因子である、椎骨または股関節部における骨折をいう。
【００１６】
　本発明の方法は、閉経後被験体、特に本明細書でこれまでに議論したタイプの閉経後身体的状態に罹患した、またはこれに罹患しやすい被験体の処置のために有用である。本発明の方法は、被験体における、所望される血清エストラジオールレベルを生じるのに有効な量のエストロゲンの投与を含む。本明細書で用いられる用語「身体的状態の処置」は、このような状態に罹患した被験体においてこのような身体的状態の重篤度または頻度を除去または軽減することを企図する。
そして、閉経後エストロゲン低下の結果としてこのような状態に罹患しやすい患者において閉経後の身体的状態の発生を予防することも企図する。これらの閉経後の身体的状態の処置は、それらに罹患した被験体におけるそのような状態の完全な排除を含み得るが、この状態の完全な除去は、本発明により企図される用語の定義に適合する必要はない。従って、本発明は、閉経後骨粗しょう症に罹患したまたはこれに罹患しやすい被験体において、エストロゲン低下から生じる身体的状態の処置のため、および骨粗しょう症性骨折の危険性の減少のための、超低用量のエストロゲンの使用を含む。
【００１７】
　本発明の方法はまた、処置される閉経後被験体の血清エストラジオールレベルを試験すること、および処置される被験体の血清エストラジオールレベルが、被験体の同年齢の群における閉経後女性に対して正常であることを決定するさらなる工程を含み得る。言い換えれば、本発明の方法は、同年齢群の閉経後女性の平均よりも低い正常未満の血清エストラジオールレベルを有する女性の処置のためには保留されない。本発明の方法は、同年齢群の閉経後女性に対して血清エストラジオールが正常である閉経後被験体の処置のために用いられ得る。本明細書において用いられるように、「正常な」血清エストラジオールレベルとは、同年齢群の女性に対して平均の血清エストラジオールレベルに比較的近い血清エストラジオールレベルである。
【００１８】
　本発明者らは、骨密度の減少が、閉経後骨粗しょう症に罹患した患者において骨粗しょう症性骨折の危険性の増加を導く、唯一の寄与因子ではないということを、予期せずに発見した。低レベルの血清エストラジオール（すなわち、５ｐｇ／ｍｌ未満）は、特に１μｇ／ｄｌ以上のレベルの性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）と一緒の場合、股関節部および椎骨の骨折の危険性を実質的に増加させる。さらに、低血清レベルの１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤもまた、股関節部骨折の危険性上昇を導く。骨粗しょう症性骨折の危険性評価の方法は、予測値と椎骨骨折との間の関係を分析するために、ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａにより開発されたロジスティックモデル、および予測値と股関節部骨折との間の関係を分析するために、ケース−コホートサンプリングデザインを考慮する比例危険（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ　ｈａｚａｒｄｓ）モデルの使用を含む。この分析は、基準の年齢および体重について調整され、そして９５％信頼区間の相対危険として報告される。種々のホルモンレベルに起因する骨折の比率は、Ｗ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎｅｒ，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　１２３：１４３（１９８６）（この開示はその全体が、参考として本明細書に援用される）に記載の技術を用いて見積もられる。「骨粗しょう症性骨折の危険性の減少」とは、本発明の方法を用いた処置の前の所定の被験体と比べて、本発明の方法を用いて処置される同じ被験体について危険性（前記の技術を用いる測定により）が低いことを意味する。従って、骨粗しょう症性の骨折の危険性は、骨粗しょう症性骨折に罹患しているかまたはこれに罹患しやすい未処置の閉経後被験体と比べて、本発明の方法を用いて処置された被験体について低下する。
【００１９】
　本発明者らはまた、エストロゲン低下に由来する身体的状態の処置が、プロゲスチン投与の必要性なしに、超低用量のエストロゲンにより影響され得ることを予期せずに発見した。プロゲスチンの投与を除いたエストロゲンの投与は、子宮および卵巣を有する閉経後女性の処置のために有効であることが、本発明者らによって今回見出された。以前のホルモン置換療法は、有効的な処置のためのプロゲスチンの同時投与（特に、子宮摘出または卵巣摘出をうけていない女性での）に依存していた。
【００２０】
　本発明の方法において使用するための外因性エストロゲンの供給は、被験体への投与のためのエストロゲンの任意の適切な形態を含み得る。外因性エストロゲンの適切な形態は、エストロゲンの活性を示す天然化合物および合成化合物の療法を含む。外因性エストロゲンのいくつかの形態は、市販されている。例えば、外因性エストロゲンの適切な形態には、エストラジオール（α−エストラジオール、１７β−エストラジオール、エチニルエストラジオール、安息香酸エストラジオールおよびシピオン酸エストラジオール１７βを含む）；エストロン；エストリオール、結合体化ウマエストロゲン；および前記の塩が挙げられるがこれに限られない。前記は、すべて、エストロゲン活性を示すステロイドの例である。エストロゲン活性を示す非ステロイド化合物の例には、ジエチルスチルベストロール二リン酸、ジエチルスチルベストロールジプロピオン酸およびヘキセストロールが挙げられるがこれに限られない。現在、本発明の方法において使用のための外因性エストロゲンの好ましい形態は、エストラジオールである。
【００２１】
　被験体に投与される外因性エストロゲンの量は、少なくとも約５ｐｇ／ｍｌであるが２０ｐｇ／ｍｌ以下で、そして好ましくは１５ｐｇ／ｍｌ以下の血清エストラジオールレベルを得るために十分である。言い換えれば、本発明の方法に従って、十分な外因性エストロゲンが投与されて、少なくとも約５ｐｇ／ｍｌおよび約２０ｐｇ／ｍｌの血清総エストラジオールレベルが得られる。非処置の被験体の血清エストラジオールレベルは、それぞれの個体について異なるので、異なる個体は、要求される血清エストラジオールを得るために異なる用量のエストロゲンの投与を必要とし得る。処置されているそれぞれの被験体の血清エストラジオールレベルが、５ｐｇ／ｍｌと２０ｐｇ／ｍｌとの間に増加する必要はない；むしろ処置されたそれぞれの被験体の血清総エストラジオールレベルが、少なくとも約５ｐｇ／ｍｌおよび２０ｐｇ／ｍｌ以下でなければならない。しばしば、投与される外因性エストロゲンの量は、約５ｐｇ／ｍｌと１０ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルを得るために十分である。以前の理解に反して、本発明者らは、５ｐｇ／ｍｌと１５ｐｇ／ｍｌとの間の血清エストラジオールレベルが、椎骨および股関節部の骨折の危険性の低下を有利に引き起こすことを今回発見した。この従来の外因性エストロゲン量より低い投与は、ホルモン置換療法に関連する望ましくない副作用の危険性減少のさらなる利点を有する。
【００２２】
　外因性エストロゲンの投与は、任意の適切な経路により達成され得る。例えば、外因性エストロゲンの経口投与および非経口投与のための処方は、当該分野で公知であり、そして本発明の方法において使用され得る。経口投与のために適切な処方は、個々の単位（例えば、カプセル、カシェ剤、トローチ剤、または錠剤）で（それぞれは、予定された量の活性な化合物を含む）；粉末もしくは顆粒として；あるいは溶液、分散剤または水性液体もしくは非水性液体中の液体としての懸濁物として提供され得る。このような処方物は、活性な化合物と適切なキャリアー（これは、１つ以上の補助構成成分を含み得る）との結合をさせる工程を含む薬学の任意の適切な方法により調製され得る。一般的に、本発明の処方は、活性な化合物と液体もしくは微細に分割された固体キャリア（またはその両方）との、均一および緊密な混和、次いで、必要であれば得られた混合物の成型により調製される。例えば、錠剤は、必要に応じて１つ以上の補助成分とともに、活性な化合物を含有する粉末または顆粒を圧縮または型形成することにより調製され得る。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、および／または表面活性剤／分散剤を必要に応じて混合した粉末または顆粒のような自由流動形態の化合物を適切な装置で圧縮することにより調製され得る。鋳型成型錠剤は、不活性な液体結合剤を用いて湿潤化された粉末化化合物を、適切な打錠器中で成型することにより製造され得る。
【００２３】
　経口処方物中の外因性エストロゲンの量は、投与されるエストロゲンの正確な形態に依存する超低用量のエストロゲンであるが、代表的には１日あたり０．５ｍｇ未満である。好ましくは、経口投与されるエストロゲンの量は、１日あたり約０．１ｍｇと約０．２５ｍｇとの間のエストロゲンである。例えば、経口投与されるエストラジオールの量は、１日あたり約０．１ｍｇと約０．２５ｍｇとの間である。エストロゲンの他の形態の等価の用量を同様に決定することは、十分当業者の技術の範囲内である。
【００２４】
　本発明の好ましい実施態様において、エストロゲンは、経口的によりもむしろ非経口的にまたは経皮的に投与される。非経口または経皮的投与経路は、経口投与よりも好ましい。なぜなら、エストロゲンの経口投与は、グロブリンと結合する性ホルモンのレベルを上昇させ得るからである。グロブリンと結合する性ホルモンは、閉経後被験体、特に骨粗しょう症の兆候または骨密度の減少を示す被験体へのエストロゲン投与の有益な効果を減少させ得る。経口投与は好ましい経路ではないが、本発明の方法は、経口処方を用いて実行され得る。
【００２５】
　非経口投与のために適切な本発明の処方物には、都合の良いことに、活性な化合物の無菌水性調製物が含まれる。この調製物は、好ましくは意図するレシピエントの血液と、等張である。これらの調製物は、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、皮内注射または膣リングの手段で投与され得る。このような調製物は、好都合にも、活性な成分、エストロゲンと水またはグリシン緩衝液とを混合すること、ならびに得られた溶液を、無菌に、および血液と等張にすることにより調製され得る。
【００２６】
　非経口の処方物中での外因性エストロゲンの量は、投与されるエストロゲンの正確な形態に依存して超低用量のエストロゲンであるが、代表的には１日あたり２０μｇ未満である。好ましくは、非経口投与されるエストロゲンの量は、１日あたり約５μｇと約１５μｇとの間のエストロゲンであり、より好ましくは、１日あたり約１０μｇのエストロゲンである。例えば、非経口投与されるエストラジオールの量は、１日あたり約５μｇ〜約１５μｇである。エストロゲンの他の形態の等価の用量を同様に決定することは十分、当業者の技術の範囲内である。
【００２７】
　より好ましくは、本発明の方法には、外因性エストロゲンの経皮投与が挙げられる。エストロゲンの経皮投与のための適切な処方は、当該分野において公知であり、そして本発明の方法において用いられ得る。例えば、外因性エストロゲンの投与のための適切な経皮パッチ処方は、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、米国特許第４，４６０，３７２号、Ｋｗｉａｔｅｋら、米国特許第４，５７３，９９６号、Ｎｕｗａｙｓｅｒ、米国特許第４，６２４，６６５号、Ｅｃｋｅｒｔら、米国特許第４，７２２，９４１号、およびＮｅｌｓｏｎら、米国特許第５，２２３，２６１号に記載されている。これらの開示は、それらの経皮パッチ技術の議論のために参考として本明細書に援用される。
【００２８】
　本発明の方法における使用のための経皮パッチの適切なタイプの１つを図１に示す。通常、適切な経皮パッチ１０は、非浸透性の裏打ち層１２、浸透性表層１３、浸透性表層１３を実質的に連続的にコートする接着性層（非表示）、ならびに裏打ち層１２と浸透性表層１３との間に位置するまたは挟まれているリザーバ１６を含み、そのため裏打ち層１２が貯留１６の横に伸長し、そして浸透性表層１３の末端で浸透性表層１３に結合される。リザーバ１６は、エストロゲンを含み、そして、浸透性表層１３と液体接触する。経皮パッチ１０は、浸透性表層１３上の接着性層により皮膚に接着し、結果として、浸透性表層１３は、経皮パッチ１０が皮膚に接着しているときに、実質的に持続して皮膚に接触する。経皮パッチ１０が、被験体の皮膚に接着している間、経皮パッチのリザーバー１６に含有されるエストロゲンは、浸透性表層１３を介して、リザーバー１６から、接着層を通り、そして被験体の皮膚へおよび皮膚を通して、移行する。経皮パッチ１０はまた、皮膚を通したエストロゲンの浸透を増強する１つ以上の浸透増強剤を、必要に応じてリザーバー１６に含む。
【００２９】
　裏打ち層を含み得る適切な物質の例は、経皮パッチ送達の当該分野において周知であり、そして任意の従来の裏打ち層物質は、本発明の経皮パッチに用いられ得る。適切な裏打ち層物質の特定の例には、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレンまたはポリエチレンの混成物のようなポリエステルフィルム；ポリプロピレン；塩化ポリビニル、塩化ポリビニリデン；酢酸エチレンビニル共重合体；などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
　適切な浸透性表層物質の例もまた、経皮パッチ送達の当該分野において周知であり、そして投与される活性な成分（すなわちエストロゲン）に対して浸透性である任意の従来の物質は、本発明の経皮パッチに使用され得る。浸透性表層のために適切な物質の特定の例には、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、アクリル系共重合体、ポリスルホン、ハロゲン化ポリマー、ポリクロロエーテル、アセタールポリマー、アクリルリ樹脂などから構成されるもののような高密度なまたは多孔性ポリマーフィルム挙げられるが、これに限定されない。従来の浸透性膜物質のこれらのタイプの特定の例は、Ｚａｆｆａｒｏｎｉ、米国特許第３，７９７，４９４号に記載されている。
【００３１】
　接着性層を提供するために裏打ち層上でコートされ得る適切な接着剤の例もまた、当該分野において周知であり、そして、例えば、アクリルおよび／またはメタアクリルポリマーを含むような感圧性接着剤を含む。適切な接着剤の特定の例には、以下が挙げられる；アルキル酸またはアクリル酸のエステルのポリマー（例えば、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、イソペンタノール、２−メチルブタノール、１−メチルブタノール、１−メチルペンタノール、３−メチルペンタノール、３−メチルペンタノール、３−エチルブタノール、イソオクタノール、ｎ−デカノール、もしくはｎ−ドデカノールまたはそれらのエステル）単独、またはアクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルコキシメチルアクリルアミド、Ｎ−アルコキシメチルメタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアルキルアミド、イタコン酸、酢酸ビニル、Ｎ−分枝Ｃ10-24アルキルマレインアミド酸、グリコールジアクリル酸、もしくは前記の混合物のようなエチレン性不飽和モノマーの共重合体；シリコンゴム、スチレンブタジエンゴム、ブチルエーテルゴム、ネオプレンゴム、ニトリルゴム、ポリイソブチレン、ポリブタジエンおよびポリイソプレンのような天然ゴムまたは合成ゴム；ポリウレタンエラストマー；ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドンおよびポリ酢酸ビニルのようなビニルポリマー；ホルムアルデヒド尿素樹脂；フェノールホルムアルデヒド樹脂；レゾルシノールホルムアルデヒド樹脂；エチルセルロース、メチルセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロースブチレートおよびカルボキシメチルセルロースのようなセルロース誘導体；ならびにグアー、アラビアゴム、ペクチン、スターチ、デキストリン（ｄｅｓｔｒｉａ）、ゼラチン、カゼインなどのような天然ゴム。当業者には明白であるように、接着層は、活性成分、エストロゲンに対して不活性であるべきであり、そして、浸透性表層を通したエストロゲンの経皮送達を妨害すべきでない。感圧性接着剤は、被験体の皮膚に対するパッチの適用を容易にするための経皮パッチの接着層のために好ましい。
【００３２】
　適切な浸透増強剤もまた、当該分野において周知である。従来の浸透増強剤の例には、エタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノールなどのようなアルカノール；ヘキサン、シクロヘキサン、イソプロピルベンゼンのような炭化水素；シクロヘキサノン、アセトアミドのようなアルデヒドおよびケトン；Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド, Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドのようなＮ，Ｎ−ジ（低級アルキル）アセトアミド；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アセトアミド；Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキルスルホキシドのようなエステル；プロピレングリコール、グリセリン、モノラウリン酸グリセロール、ミリスチン酸イソプロピル、およびオレイン酸エチルのような必須油脂；サリチル酸；ならびに上記のいずれかの混合物。
【００３３】
　図２は、本発明に従うエストロゲンの経皮送達に適切な経皮パッチの第二のタイプの例である。この例では、活性な成分は、リザーバーに含有されているのではなくむしろ接着層に組み込まれている。これらのタイプのパッチの例は、従来より公知であり、そして例えば、Ｂｅｒｌｅｘから入手可能であるＣＬＩＭＥＲＡ（登録商標）が挙げられる。この経皮パッチ２０は、裏打ち層２２および接着／薬物層２４を含む。この接着／薬物層２４は、被験体の皮膚へのパッチ２０の接着、および投与される活性な成分、エストロゲンを含有するという組み合わせた機能を有する。この活性な成分は、パッチが皮膚に接着されるとき、接着／薬物層２４から、被験体の皮膚に対して、および被験体の皮膚を通じて浸出する。
【００３４】
　本明細書の上記に記載される任意のバッキング（ｂａｃｋｉｎｇ）層は、この実施態様においても同様に使用され得る。さらに、前述の任意の適切な接着剤もまた使用され得る。この接着剤／薬物層は、選択された接着剤および活性成分の比較的均質な混合物を含む。代表的には、この接着剤／薬物層は、バッキング層の１つの表面を実質的にカバーするコーティングを含む。この接着剤／薬物層はまた、透過増強薬剤を接着剤および活性成分の実質的に均一な混合物内に組込むことにより、前述のような透過増強薬剤を含む。
【００３５】
　当業者に容易に明白であるように、本発明に従った経皮パッチは、活性薬剤、特にステロイド性の活性薬剤の経皮投与を容易にするために、従来使用される種々のさらなる賦形剤を含み得る。そのような賦形剤の例としては、キャリア、ゲル化剤、懸濁剤、分散剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの各型の賦形剤の特定の例は、当該分野で周知であり、そして任意の従来の賦形剤は、本発明の経皮パッチにおいて使用され得る。しかし、本発明の経皮パッチは、プロゲスチンを除くことに注意することが重要である。したがって、プロゲスチンは、本発明の経皮パッチ処方物における使用のための適切な賦形剤ではない。
【００３６】
　経皮パッチ処方物における外来性エストロゲンの量は、極めて低い用量のエストロゲンであり、投与されるエストロゲンの正確な形態に依存するが、しかし１日当たり、２０μｇより少ない送達で十分であり、そして代表的には１５μｇより多くない。好ましくは、経皮パッチを経て投与されるエストロゲンの量は、１日当たり、約５μｇおよび約１５μｇの間のエストロゲンである。より好ましくは、投与されるエストロゲンの量は、１日当たり約１０μｇである。本発明の方法に従った代表的なエストロゲンの用量は、２０μｇより少ないが、２５μｇ程度の用量も使用され得る。例えば、非経口的に投与されるエストラジオールの量は、１日当たり、約５μｇ〜約１５μｇである。エストロゲンの他の形態の等価的な投薬量を決定することはまた、当業者間にとって十分に技術範囲内である。本発明の方法で使用される極めて低いレベルのエストロゲンにより、閉経後の女性における骨粗しょう症性骨折の危険度を、実質的に減少することが、予想外に見出された。
【００３７】
　代表的には、経皮パッチは、交換が必要とされるまで数日間着用されるように設計される。従って、リザーバー内のエストロゲンの量は、数日の期間、１日当たり２０μｇより少ない投与を許容するのに十分でなければならない。例として、１日当たり１０μｇのエストロゲンを７日間投与するよう設計される、本発明に従う経皮パッチは、約１ｍｇのエストロゲンを含む。１日当たり１５μｇで７日間の投与に適切なパッチは、約１．４ｍｇのエストロゲンを含む。これらの特定の例に基づいて、当業者は、正確な日用量のエストロゲンの送達を達成するために、経皮パッチに含まれるための必要量のエストロゲンを認識し得る。
【００３８】
　有利にも、本発明はまた、閉経後の症状を罹患した、またはその症状に罹患しやすい消費者による使用のためのキットを提供し、このキットは消費者において閉経後の症状を処置するおよび／または骨粗しょう症性骨折の危険度を減少するための経皮パッチ、およびその経皮パッチの使用法を記載する説明書を含む。この説明書は、その消費者に経皮パッチを付着することを指示し（その接着剤を、例えば上腕で直接的に皮膚表面上で使用して）、そのパッチから極めて低用量のエストロゲンの経皮投与を達成し、それによりその消費者の血清エストロゲンレベルを、約５ｐｇ／ｍｌと約２０ｐｇ／ｍｌの間に上昇させる。その説明書はまた、必要な場合、この経皮パッチを交換して、必要な場合、エストロゲンの投与を継続し、この血清エストラジオールレベルを経皮パッチを使用することにより維持することをその消費者に指示する。特に、７日用パッチが、キット内で利用される場合、この説明書は、７日毎に経皮パッチを交換することをその消費者に指示し、１日当たり、２０μｇより少ない、そして好ましくは１０μｇのエストロゲンの投与を確保し得る。そのようなキットは、有利にも、単一、または複数のパッチ単位で、パッケージされ、そして販売され得る。
【００３９】
　以下の実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４０】
　（実施例１）
　以下の実施例およびデータは、血清エストラジオールレベルと骨粗しょう症性骨折の危険度間の相関性を実証し、そして骨粗しょう症性骨折の危険度を減少するため、および閉経後の症状の処置のための、極めて低用量の外来性エストロゲンの使用の有効性をまた実証する。
【００４１】
　（１．実験個体群）
　骨粗しょう症性骨折の研究は、米国の４つの地域社会（ボルチモア、ミネアポリス、ピッツバーグ、およびポートランド）における、人口に基づくリストから募集した９，７０４人の女性のコホートの将来に向けての研究である。Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：７６７−７７３（１９９５）を参照のこと。６５歳以上の年齢の女性を郵便で研究に参加するように求めた。実験個体群からは、股関節骨折の危険度が低いことから、黒人女性を排除し、そして両側の股関節置換を有するか、または歩行に他人の助けが必要な女性を排除した。参加者に、エストロゲン、カルシウム供給剤、およびビタミンＤ含有総合ビタミン剤の、現在または最近の使用に関して質問した。
【００４２】
　（２．臨床的測定）
　骨密度（すなわち、骨のカルシウム量）を、ＯｓｔｅｏＡｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｏｓｔｅｏｎ、Ｗａｈｉａｗａ、Ｈａｗａｉｉより入手した、単一光子吸光光度計を用いて測定した。臨床センター間のこの測定に対する平均変動係数は、１．２％であった。Ｓｔｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．７：６２５（１９９２）を参照のこと。
【００４３】
　（３．血清サンプル）
　全参加者に、試験前の終夜および朝に、無脂肪の食事制限に従うように指示し、そしてアッセイを妨害する脂血症を最小化した。血液を、午前８時および午後２時の間に採取し、そしてその直後に血清を−２０℃で凍結させた。２週間以内に、全サンプルを、メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）のＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに輸送し、そこで、それらを液体窒素中（−１９０℃）で保存した。
【００４４】
　（４．骨折の確認）
　はがきにより、または周期的な診察室訪問で、女性と４ヶ月毎に接触し：生命状態および股関節骨折の発生の経過観察を、９９．７％を越えて完了した。股関節骨折は、手術前の放射線写真の観察により確認した。基線の放射線写真の撮影の平均３．３年後に、７２９９人の女性（生存者の７９％）から、再度外側脊柱の写真を撮り；７２３８対の放射線写真を、起こり易い椎骨骨折の評価に適切であると判断した。本発明者らは、Ｂｌａｃｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０:８９０（１９９５）に記載される定量的体型測定を用いて骨折に関する放射線写真を評価した。任意の椎骨の高さが、基線と経過観察の放射線写真との間で、２０％以上および４ｍｍ以上減少した場合、女性を、椎骨骨折が起こり易いものと分類する。Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ　ｏｎ　Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ　Ｆｒａｃｔｕｒｅｓ、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０：５１８（１９９５）を参照のこと。放射線写真を評価する人々は、参加者の血清のアッセイの結果を知らなかった。
【００４５】
　（５．症例およびコホートサンプルの選択）
　Ｐｒｅｎｔｉｃｅ，Ｒ．Ｌ．、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ　７３：１（１９８６）に記載される症例−コホートアプローチを使用し、そして基線でのホルモン置換治療を使用する女性を排除して、本発明者らは、その後、最初の股関節骨折を罹患した１３３人の参加者からの血清サンプル、および椎骨骨折が起こり易かった参加者から１３８人を無作為に選択した。本発明者らはまた、そのコホートから、その後股関節骨折が起きた１２人の女性、およびその後、椎骨骨折を起こした１４人の女性を含む、３５９人の女性のサンプルを無作為に選択した。股関節骨折の解析のために、本発明者らは、基線が来診の前に股関節骨折を罹患した対照（ｎ＝４）を排除し；椎骨骨折の解析のために、本発明者らは、経過観察の放射線写真を撮らなかった、あるいはその基線または経過観察の放射線写真が、体型測定に対して技術的に不適切であった対照（ｎ＝８）を排除した。
【００４６】
　（６．生化学的解析）
　本発明者らは、ベースラインにおけるレベル、および−１９０℃での保存の３．５年後に再度、レベルをアッセイすることにより、５１人の閉経後の女性における選択された型のホルモン測定の安定性を測定した。２つの測定の間の相関（Ｐ＜０．００１であり、全て有意）は、以下のとおりである：中央領域の副甲状腺ホルモン（ｒ＝０．９９）、２５（ＯＨ）ビタミンＤ（ｒ＝０．８８）、テストステロン（ｒ＝０．９９）、エストロン（ｒ＝０．９８）。これらの物質の平均値の減少は、あったとしても、ほとんどないものであった。副甲状腺ホルモンについてのイムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）は、ベースライン測定がなされた時は利用可能ではなかった：ＩＲＭＡによって測定されたレベルと中央領域技術によって測定されたレベルとの間の相関は、０．７８であった。
【００４７】
　全てのアッセイを、症例および対照の混合バッチにおいて、参加者の骨折病歴については盲検法にて、行った。サンプルを直接、解凍することなく貯蔵から分析研究室に送った。初期の計画は、エストロンレベルの分析（エストラジオンではなく）を必要とした。アッセイの最初のバッチを完了した後に、本発明者らは、測定パネルにエストラジオールを添加し、そして８９の股関節骨折の症例、９６の椎骨骨折の症例、および２０４のいずれの型の骨折も有さない女性においてこれらの測定を行った。
【００４８】
　性ホルモンおよび性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）をＥｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃａｌａｂａｓａｓ　Ｈｉｌｌｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａによってアッセイした。エストラジオールおよびエストロンを抽出および１Ｈ2Ｏカラム分離の後にラジオイムノアッセイによって測定した。エストラジオールのアッセイ間の変動は、８％〜１２．５％の範囲であり、エストロンについては６．２％〜７．０％の範囲であった。検出可能性の下限は、エストラジオールについて５ｐｇ／ｍｌであった。全テストステロンを、抽出およびＡｌ2Ｏ3カラムクロマトグラフィー後にラジオイムノアッセイによって測定し、アッセイ間の変動は、６．１％〜１３．４％であった。ＳＨＢＧ結合能力を直接、血清内において、置換技術を用いて測定し、アッセイ間の変動は、４．１％〜１４．４％であった。遊離のテストステロン濃度を、Ｆｕｒｕｙａｍａら（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ　１６：４１５（１９７０）；およびＭａｙｅｓ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２８：１１６９（１９６８）に記載される硫酸アンモニウム沈殿手順によって決定する。このアッセイ間の変動は、１０．７％〜１５．５％であった。
【００４９】
　カルシウム向性ホルモンをＳａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣａｌｆｏｒｎｉａのＵＣＳＦ　Ｃａｌｃｉｏｔｒｏｐｉｃ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでアッセイした。インタクトな副甲状腺ホルモンをラジオイムノアッセイによって測定し、アッセイ内の変動が５．２％であり、アッセイ間の変動が８．５％であった。本発明者らは、ラジオイムノアッセイ技術を使用して２５（ＯＨ）ビタミンＤおよび１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤを測定し、その両方についてアッセイ内の変動が６．６％であり、それぞれについてアッセイ間の変動が１５％および２４．４％であった。クレアチニンレベルを自動化学分析機を使用して測定した。
【００５０】
　（７．データ解析）
　本発明者らは、ホルモンおよびビタミンレベルを、連続変数として、およその５分位数によって解析し、そして関連する場合、二分変数（検出閾値を越えるかまたは下回る）として解析した。本発明者らは、ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃａｒｙ（Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発されたロジスティックモデルを使用して、予測因子と椎骨骨折との間の関係、および症例−コホートサンプリング設計を考慮する比例危険モデル（Ｅｐｉｃｕｒｅ、Ｈｉｒｏｓｏｆｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を解析し、そして予測因子と股関節骨折との間の関係を解析した。全ての解析を、ベースラインの年齢および体重について調整し、そして９５％の信頼区間を有する相対的な危険度（オッズ比または危険比として近似）として報告する。本発明者らは、Ｂｒｏｗｎｅｒ（Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１２３：１４３（１９８６））に記載される標準的な技術を使用して、種々のホルモンレベルに起因する骨折の割合を推定した。本発明者らは、一般的な線形モデルを使用して、異なる群における年齢で調整した骨質量を比較した。
【００５１】
　（８．結果）
　表１は、偶発性の股関節または椎骨の骨折に罹患した参加者の特徴に関して収集されたデータを示す。
【００５２】
【表１】
2004083599.tif 000002
【００５３】
　データは、偶発性の股関節または椎骨骨折を罹患した参加者が、コントロールより、より高齢であり、より体重が少なく、より喫煙する可能性があり、そしてより骨質量が少ないことを示す。
【００５４】
　コホートの無作為サンプル中の約３分の１（２４７人中８１人）の女性が、検出不可能なエストラジオールレベルを有した（＜５ｐｇ／ｍｌ）。体重および年齢について調整した相対的危険度に関するデータを以下の表２に示す。
【００５５】
【表２】
2004083599.tif 000003
【００５６】
　このデータは、検出不可能なエストラジオールのレベルを有する女性が、このホルモンの検出可能なレベルを有する女性よりも、股関節骨折および椎骨骨折の２．５倍大きな危険度を有したことを、実証した。本発明者らは、このコホートの股関節骨折の３３％および椎骨骨折の３２％が検出不可能なエストラジオールレベルと関係したことを推定した。このデータは、５ｐｇ／ｍｌ以上のエストラジオール濃度に関連する危険度における閾値の減少を反映するようである。５〜１０ｐｇ／ｍｌの全エストラジオールレベルを有する女性は、５ｐｇ／ｍｌ未満のレベルの女性よりも、股関節骨折の６２％より低い危険度（危険比＝０．３８；０．２０〜０．７２）および５７％より低い椎骨骨折の危険度（オッズ比＝０．４３；９５％信頼区間０．２５〜０．７６）を有した。
【００５７】
　ＳＨＢＧのより高いレベルが、股関節骨折および椎骨骨折の増加する危険度と関連した。年齢を調整した後、ＳＨＢＧにおける各１．０μｇ／ｄｌの増加が、股関節骨折の危険度における１．４４倍（１．１６〜１．８０）増加、および椎骨骨折の危険度における１．６５倍（１．３０〜２．１０）の増加と関連した。股関節骨折について、この効果は、部分的に体重に媒介されるようである。
【００５８】
　コホートの無作為サンプルにおいて、２６％（２４４人のうち６３人）が、検出不可能なエストラジオールレベル、および１μｇ／ｄｌ以上のＳＨＢＧレベルの両方を有し；これらの女性は、他の女性よりも、股関節骨折の１４倍高い危険度を有し（９５％信頼区間；３．０〜６２）、そして椎骨骨折の１２倍高い危険度（３．３〜４１）を有した。体重の調整は、股関節骨折（危険比＝６．９；１．５〜３２）および椎骨骨折（オッズ比＝７．９；２．２〜２８）の両方について、これらの関係を幾分鈍らせた。エストラジオール、ＳＨＢＧと偶発性の椎骨骨折との間の関係は、ベースラインでの椎骨骨折を有する女性、および有さない女性のサブグループにおいて、類似であった。この組み合わせを有する女性２６％についての起因し得る危険度は、股関節骨折について６０％であり、椎骨骨折について６４％であった。
【００５９】
　椎骨骨折に関する表２のデータを、データによって拡張し、以下の表３に示す。
【００６０】
【表３】
2004083599.tif 000004
【００６１】
　表２のデータは、最も低い５分位数（≦１．４ｎｇ／ｄｌ）におけるエストロン値を有する女性がより高いレベルを有する女性よりも椎骨骨折のより低い危険度を有することを示す。より低いエストロンを有する女性は、より低いエストラジオールレベルを有する傾向があるが、エストロンレベルとエストラジオールレベルとの間の相関関係は、中程度であり（ｒ＝０．５７）、そして低レベルのエストロンが、表３に示すように、依然としてエストラジオールレベルの調整後に、椎骨骨折の減少した危険度と関連する。
【００６２】
　１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤレベルが最も低い５分位数（≦２３ｐｇ／ｍｌ［≦５５．２ｐｍ／Ｌ］）である女性は、以下の表４に示したように、股関節骨折の顕著に増加した危険度を有した（危険比＝２．１；１．２〜３．５）。
【００６３】
【表４】
2004083599.tif 000005
【００６４】
　この関係は、エストラジオールおよびＳＨＢＧレベルを調整した後も、依然として有意であった（危険比＝２．２；１．０〜４．８）。血清クレアチニンについてのさらなる調整は、差異を生じなかった（危険比＝２．３；１．０〜５．２）。
【００６５】
　ビタミンＤ補給剤を摂取する女性を除いた後に、２５（ＯＨ）ビタミンＤのレベル（平均±ＳＤ）は、１月〜６月に採取したサンプル（２８．４±１０．２ｎｇ／ｍｌ［８３．６±２５．５ｎｍ／Ｌ］）において、７月〜１２月に採取したサンプル（２５．５±１０．４ｎｇ／ｍｌ［６３．６±２５．９ｎｍ／Ｌ］、Ｐ＜０．０１）よりも有意により高かった。４月〜９月におけるビタミンＤレベルを、１０月〜３月に採取されたものと比較したとき、有意な差異は存在しなかった。２５（ＯＨ）ビタミンＤの低血清レベルと股関節骨折または椎骨骨折の危険度との間に、月、季節、または臨床についての調整後でさえ、あるいはビタミンＤ補充剤を摂取する女性を含むか含まないかにかかわらず、統計的に有意な関係は存在しなかった（表２を参照のこと）。
【００６６】
　骨質量の、ホルモンおよび骨折危険度の多重変数モデルへの添加は、ほんのわずかに、エストラジオール、ＳＨＢＧと股関節または椎骨骨折の危険度との間の関連の強度を弱めた。表３および４を参照のこと。骨質量についての調整は、１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤと股関節骨折との間、またはエストロンと椎骨骨折との間の関係の強度に実質的に影響しなかった。
【００６７】
　６５歳を越える女性における股関節骨折および椎骨骨折の危険度を示す組み合わせたデータは、エストラジオールの血清濃度が５ｐｇ／ｍｌ（アッセイの検出限界）未満である場合に、実質的に増加する。偶発性の股関節骨折および椎骨骨折の約３分の１が、この非常に低いレベルのエストラジオールに起因し得る。わずかに高レベルのエストラジオールを有する女性（５〜１０ｐｇ／ｍｌの範囲において）は、これらの骨折のはるかに低い危険度を有する。
【００６８】
　エストラジオールの検出不可能な濃度を有する女性はまた、より少ない骨質量を有した。しかし、踵骨骨質量についての調整は、中程度に骨折の危険度を増加を弱めたのみであった。このことは、非常に低レベルのエストラジオールと骨折の危険度との間の関連が少なくとも部分的に骨質量に依存しないことを示唆する。
【００６９】
　ＳＨＢＧレベルはまた、股関節骨折および椎骨骨折の危険度に対する強力で独立した影響を示した。１．０μｇ／ｄｌ以上のＳＨＢＧ濃度および検出不可能なエストラジオールレベルを有する女性は、より低いＳＨＢＧおよびより高いエストラジオールレベルを有する女性よりも、股関節骨折および椎骨骨折の７倍大きな危険度を有した。ＳＨＢＧは、循環中のエストラジオールに強力に結合し、その結果、増加したＳＨＢＧレベルは、エストラジオールの減少した生物学的利用可能性と関連する。従って、生物学的に利用可能なエストラジオールの濃度は、この研究において本発明者らが測定した全エストラジオールのレベルよりも、なおさらにより強力に骨折と関係し得る
　（実施例２）
　この実施例は、閉経後の女性における骨損失の防止に対する、７日間のエストロゲンの経皮治療システムを用いて、エストロゲンの異なる量を投与することの効果の比較を示す。
【００７０】
　（１．方法）
　健康で、子宮摘出された４５〜６５歳の閉経後１〜５年で、二重エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）により測定された、４５歳以内の正常な女性に対して平均の２．５Ｓ．Ｄ．内のＬ２〜Ｌ４でのベースライン骨密度（ＢＭＤ）を有する女性が適切であった。被験体は、エストラジオールＴＴＳの４つの用量（０．０２５、０．０５、０．０６、および０．１ｍｇ／日のエストラジオールをそれぞれ送達する６．５、１２．５、１５、および２５ｃｍ2のパッチ）または偽薬の内の１つに無作為化した。１週間あたり１つのパッチを、２年の試行期間の間、腹部に着用した。大腿頚部および前腕のＬ２〜Ｌ４でのＢＭＤ、血清オステオカルシン（ＯＳＴ）および尿中のデオキシピリジノリン架橋／クレアチニン比（ＤＰＤ）を６ヶ月ごとに測定した。１８ヶ月の処置後の結果を示す。
【００７１】
　（２．結果）
　平均年齢５１．２歳の１７６人の女性を登録した。合計１０３人の被験体が、１８ヶ月の処置を完了した。全時点での全用量によるＢＭＤの損失を示した。１８ヶ月で、偽薬で処置された患者は、腰部のＢＭＤにおいて０．０２５、０．０５、０．０６、および０．１ｍｇ／日の群に対して、それぞれ−０．７±４．１対３．６±４．７、３．２±３．１、３．０±３．６および４．８±５．５という平均パーセントの変化を有した（全ての差はｐ＜０．０５対偽薬）。１２ヶ月で、ＯＳＴレベルは、全ての活性な処置群においてベースラインから低下した（それぞれ−３０．４±４２．９、−１７．９±５０．７、−１３．０±３７．６および−２６．９±２９．８のパーセントの変化；全ての差はｐ＜０．０５対偽薬＋２７．６±６０．４）。ＤＰＤはまた、１２ヶ月で全ての活性な処置群においてベースラインから低下した（それぞれ、−５．８±３．４、−６．０±８．５、−５．１±７．４および−１．８±１０．８ｎｍｏｌ／ｍｍｏｌという変化）。４つの活性な処置のうちの３つは、偽薬とは有意差があった。しかし、ＤＰＤはまた、偽薬で処置された被験体において低下した。
【００７２】
　（３．結論）
　現在利用可能な強さのＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）ＴＴＳ（０．０５および０．１ｍｇ／日）、ならびに０．０２５ｍｇ／日を送達する６．５ｃｍ2の低用量のＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）ＴＴＳの両方からの経皮性のエストラジオールは、閉経後の骨損失を防止する。１０〜１５μｇ／日を送達するＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）ＴＴＳパッチが、骨格損失に対して効果を有することが期待される。
【００７３】
　（実施例３）
　以下の実施例およびデータは、血清エストラジオールレベルと骨密度の損失の間の相関を示す。本実施例はまた、骨密度の損失を減少するために超低用量の外来性エストロゲンを用いることの効力を示す。
【００７４】
　（１．実験集団）
　被験体は、骨粗しょう症性骨折（ＳＯＦ）の研究における参加者であった。その詳細は、実施例１に記載される。この研究は、そしてベースライン実験および１９９３〜９４年の追跡実験の両方で採血され、そして測定された技術的に適当な踵骨ＢＭＤを有する２６１人のＳＯＦの参加者の無作為に抽出されたサブコホートに基づく。これらの中でも、２４１人の女性は、１９９０年の２年目の研究および１９９３〜９４年の追跡実験の両方で、技術的に適切な寛骨密度測定を行なった。最終結果は、完全な踵骨および股関節部のＢＭＤ走査対で、ベースラインの問診の間に、エストロゲン補充治療の最近の使用を報告しなかったそれぞれ２３１人および２１８人の女性のサブコホートに基づく。個々のアッセイに関する試料サイズは、失われた値に起因して変化する。また、試料サイズは、別のアッセイに関してよりもエストラジオールに関して小さい。なぜなら、本発明者らは、研究が行なわれた後、時々、アッセイのセットに、エストラジオールを添加したからである。
【００７５】
　（２．測定）
　１９８６〜１９８８年のベースラインの来診で、詳細な質問票を考えた。この質問票の中では、エストロゲン、カルシウムおよびビタミンＤ含有総合ビタミン剤の最近または以前の使用について質問した。被験体を、身長および体重の測定値を得るために調べた。
【００７６】
　ベースラインおよび平均５．９年後の１９９３〜１９９４年における追跡来診で単一フォトン吸光光度法を用いて、踵骨質量を測定した。生存している元々のコホートのうちの８２％の間で、１９８８〜１９９０年の２回目の来診で、二重Ｘ線吸光光度法を用いて、股関節部およびその小領域の骨密度を測定した。繰り返しの股関節部骨密度を、平均３．５年後、１９９３〜１９９４年に、追跡来診で測定した。踵骨および大腿頚部の両方に対する中間値の間で、１．２％の平均の変動係数（ＣＶ）を、各場所を訪れたスタッフメンバーによる複数の測定値を用いて見積もった。脊椎骨密度測定は、本研究に含めるのを保証するのに十分な数の被験体について行なわなかった。
【００７７】
　（３．血清試料）
　ベースライン調査で、午前８時と午後２時との間で血液を採取し、そして血清を−２０℃で保存した。２週間以内に、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に試料を輸送し、そして−１９０℃で液体窒素中に保存した。１９９４年に、選択された参加者に関する血清を融解し、そして循環ホルモンのレベルおよび他の生化学的測定値に関するアッセイを行なった。アッセイを行なう研究室には、参加者の骨折状態がわからなかった。
【００７８】
　経時的な選択されたホルモン測定値の安定性を、ベースラインのレベルを試験すること、および−１９０℃での３．５年の貯蔵の後に再び再試験することにより５１人の女性において決定した。測定値対間の相関は、以下のようであった：エストロン（ｒ＝０．９８）、全テストステロン（ｒ＝０．９９）、中間領域副甲状腺ホルモン（ｒ＝０．９９）および２５（ＯＨ）Ｄ（ｒ＝０．８８）。全ての相関は、ｐ＜０．００１で有意であった。ベースライン測定を行なった当時は、ＰＴＨについてのイムノラジオメトリックアッセイは、利用可能ではなかった。保存の３．５年後に測定された試料におけるＰＴＨ（ＩＲＭＡ）と中間領域との間の相関は、０．７８であった。平均ホルモンレベルは、２つの試料間で実質的に異ならなかった。
【００７９】
　（４．生化学アッセイ）
　エストラジオール、エストロンおよび全テストステロンの血清濃度を、ラジオイムノアッセイにより測定した。性ホルモン結合グロブリンの結合能力を、置換技術を用いて測定した。遊離テストステロンレベルを、硫酸アンモニウム沈澱手順から決定した場合の全テストステロンと非ＳＨＢＧ結合ステロイドの百分率との積として算出した。インタクトな副甲状腺ホルモンである２５（ＯＨ）Ｄおよび１，２５（ＯＨ）2Ｄを、ラジオイムノアッセイにより測定した。全アッセイに関する精度を、平均および標準偏差ならびにそれぞれのホルモンに対する４分位点範囲についての説明的なデータとともに表５に報告した。
【００８０】
【表５】
2004083599.tif 000006
【００８１】
　（５．統計分析）
　エストラジオールを除く全ての生化学的変数を、４分位数によっておよび連続変数として分析した。エストラジオールレベルの３６％が、最小検出レベル（５ｐｇ／ｍＬ）よりも小さかったので、エストラジオール値を、最低カテゴリーとして検出不可能なレベルを設定し、そして残りの検出可能なレベルを３分位数に分けることにより４つのグループに分けた。エストラジオールのカテゴリーを、４分位数として単純さのために表において報告する。連続モデルについて、検出不可能なエストラジオールレベルを、０値に割り当てた。
【００８２】
　ホルモンレベルとＢＭＤにおける年間のパーセントの変化との間の関連を分析するために、年齢および体重に関して調整して、線形回帰分析を使用した。ＢＭＤにおける年間の絶対変化に関する結果および共分散としての臨床部位を含む結果は、類似していたが示さない。ホルモンレベルと骨損失との間の関連は、大腿頚部に関して弱く、そして全股関節部と比較した転子領域に関して類似しており、従って、本発明者らは、全寛骨損失に関する結果だけを示す。最小二乗法手順を用いて各ホルモンの４分位点により、ＢＭＤにおける年齢および体重を調整された平均のパーセントの変化ならびに９５％信頼区間を算出し、そして４分位数を超える傾向（年齢および体重に関する調整）についての試験を、統計的な有意性を評価するために使用した。各ホルモンのレベルにおける標準偏差の増加あたりのＢＭＤにおける年間のパーセントの変化の差異を示す、連続ホルモンレベルとＢＭＤにおける年間のパーセントの変化との間の関連を標準化β係数として報告する。
【００８３】
　どの生化学的変数が、他のホルモンレベルに関して制御した後に骨損失の予測値から独立しているか決定するために、多変数モデルを構築した。エストラジオールおよびエストロンのレベルが、このコホートにおいて適度に相関するので（ｒ＝０．６４）、これらの変数だけを、別のモデルにおいて分析した。
【００８４】
　（６．結果）
　この研究に用いた無作為な副試料の特性を、表２に記載する。そしてこの特性は、この試料を抽出したコホートの特性と実質的に異なっていなかった。この副次試料における女性の平均年齢は、７１．３歳であった。平均年間骨損失は、踵骨から約１．５％および全股関節部および大腿頚部の両方から０．５％であった。
【００８５】
【表６】
2004083599.tif 000007
【００８６】
　踵骨ＢＭＤ変化とホルモンとの関連を表７に報告する。年齢および体重を調整した線形回帰モデルにおいて、ＳＨＢＧだけが、踵骨損失の有意な予測値であった。
【００８７】
【表７】
2004083599.tif 000008
【００８８】
　最高の４分位数におけるＳＨＢＧレベル（≧２．４μｇ／ｄＬ）を有する女性は、最小の４分位数のレベルを有する女性（＜１．１μｇ／ｄＬ；平均変化＝−１．２％；−１．６％、−０．７）と比較して２倍多い年間踵骨損失（平均編か＝−２．２％；９５％ＣＩ＝−２．９％、−１．６％）を経験した。この関連は、血清エストラジオール、エストロンおよびテストステロンのレベルに関して調整した後でさえ、強く有意なままであった（ｐ＜０．００２）。踵骨損失の増加とホルモンレベルの減少とに関するトレンドは、全ての性ステロイドに関して明白であるが（表７を参照のこと）、いずれも統計学的に有意でない。連続変数としてモデル化された血清エストロン濃度と踵骨損失との間に境界（ｐ＜０．１０）逆転の統計学的な関連がある。
【００８９】
　ホルモンと全股関節部ＢＭＤ変化との関連に関するデータ（表８を参照のこと）は、エストロンおよびエストラジオールの両方のレベルが低いほど、より大きい股関節部骨損失と有意に関連したことを示す。
【００９０】
【表８】
2004083599.tif 000009
【００９１】
　例えば、年齢および体重に対して調整した後、１０ｐｇ／ｍＬまたはそれより高いエストラジオールレベルを有する女性は、追跡の間に骨質量の僅かな増加（平均年間変化＝０．１％；−０．５、−０．７）を経験したが、５ｐｇ／ｍＬ未満のエストラジオールレベルを有する女性は、平均速度より高い股関節部骨損失（平均年間変化＝−０．８％；−１．２、−０．３）を経験した。
【００９２】
　テストステロンレベルの４分位数による股関節部骨密度における平均年間パーセント変化の調査は、閾値を示唆した：２６ｎｇ／ｄＬまたはそれより高い（最高の４分位数）全テストステロンレベルを有する女性は、２６ｎｇ／ｄＬ未満（組み合わせた４分位数１から３）を有する女性の−０．６％（−０．８％、−０．４％）と比較してたった−０．１％（−０．５％、０．３％）の平均年間パーセントの変化を経験した。この差異は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。ＳＨＢＧの４分位数にまたがる股関節部骨損失の増加が観察されたが、このトレンドは、年齢および体重を調整した回帰モデルにおいて統計的に有意でなかった（ｐ＝０．２７）。
【００９３】
　年齢および体重に加えてＳＨＢＧ、エストラジオールおよびテストステロンのレベルを含む多変数モデルにおいて、より低い全テストステロンおよびより高いＳＨＢＧ濃度は、股関節部ＢＭＤにおける変化と独立して関連した。データを表９に報告する。
【００９４】
【表９】
2004083599.tif 000010
【００９５】
　多くの女性がエストラジオール測定を受けなかったため、多変数モデルにおけるＳＨＢＧと寛骨損失間との有意な関連性が、他のホルモンレベルについての調整から生じるか否か、またはＳＨＢＧと寛骨損失間との強い関連性が、女性のこのサブコホート（ｓｕｂｃｏｈｏｒｔ）に存在したか否かは明らかでなかった。従って、年齢調整および体重調整したＳＨＢＧと寛骨損失間との関連性を、エストラジオール測定を受けた女性中で再検査し、そして統計的有意性があることが見出された。表９を参照のこと。
【００９６】
　連続変数として表す場合、エストラジオールは、テストステロンおよびＳＨＢＧに対する調整の前後のいずれにおいても、股関節ＢＭＤにおける変化と有意に関連しなかった。しかし、エストロンの４分位数にわたるトレンドは、有意性の境界（ｐ＜０．０６）にあるのに対して、エストラジオールの４分位数にわたるトレンド（ｔｒｅｎｄ　ａｃｒｏｓｓ　ｑｕａｒｔｉｌｉｅｓ）の試験は、ＳＨＢＧおよびテストステロンレベルに対する調整後で、依然、有意なままであった。
【００９７】
　２５（ＯＨ）Ｄレベルのみが、冬期（１月〜６月）をその年の残期（７月〜１２月）と比較した場合、平均値２４．０（冬期）および２６．９（残期）（ｐ＝０．０１）で、有意に異なった。カルシウム向性（ｃａｌｃｉｏｔｒｏｐｉｃ）ホルモンレベルの、１１月〜４月までと比較した５月〜１０月までに実施した測定の比較においては、有意な差異はなかった。
【００９８】
　カルシウム向性ホルモンまたはカルシウムレベルのいずれも、年齢および体重に対する調整後で、踵骨ＢＭＤにおける変化と有意に関連しなかった。表７を参照のこと。このことは、季節（７月〜１２月対１月〜６月）およびクリニックに対する調整後、ならびにカルシウムまたはビタミンＤ含有総合ビタミン剤の現在の使用者に対する調整、あるいはそれら使用者の排除後のいずれでさえ、依然、当てはまった。
【００９９】
　低レベルの２５（ＯＨ）Ｄは、寛骨損失の増大と有意に関連した。表９を参照のこと。最も高い４分位数（３２ｐｇ／ｍＬ以上）の２５（ＯＨ）Ｄレベルを有する女性は、最も低い４分位数（２１ｐｇ／ｍＬ未満）の２５（ＯＨ）Ｄレベルを有する女性間では、−０．７（−１．１、−０．４）と比較して、年間平均−０．１％（−０．５、０．３）のＢＭＤにおける変化を経験した。このトレンドは、クリニック、季節、ならびにカルシウムおよびビタミンＤ含有総合ビタミン剤の使用に対する調整後で、依然、有意なままであった。
【０１００】
　副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベルといずれの部位からの骨の損失との間には、一貫した関連性がなかった。表７および８を参照のこと。ＰＴＨの４分位数のトレンドの試験により、中心の値域（２次および３次４分位数）におけるＰＴＨレベルに対する、より大きな寛骨損失、ならびにより極端な値（最も低い、および最も高い４分位数）を有する女性間での、より低度な骨の損失を有する異常パターンが明らかになる。
【０１０１】
　（７．結論）
　このデータにより、年齢、体重、ならびにＳＨＢＧおよびテストステロンレベルに対する制御後でさえ、低レベルの血清エストロゲンが、高齢の女性における寛骨損失の増大と有意に関連することが実証される。実際、検出不可能なエストラジオールレベル（５ｐｇ／ｍＬ未満）の女性は、１年でほぼ１％（−０．８％；−１．２、−０．３）の速度で股関節から骨を損失したが、エストラジオールレベルが１０ｐｇ／ｍＬ以上の女性は、経過観察中、平均してわずかの骨質量増加があった（年平均変化＝０．１％；９５％ＣＩ＝−０．５、０．７）。骨の損失は、高齢の女性において股関節骨折の重要な危険因子であり得るために、これらの知見は、ホルモン循環レベルの緩やかな増加でさえ、骨の損失および骨折の割合の減少に効果的であり得ることを示唆する。
【０１０２】
　ＳＨＢＧ濃度は、踵骨および股関節の両方の損失に強く関連し、年齢、体重、および性ホルモンレベルに独立とあった。ＳＨＢＧは、血清エストラジオールおよびテストステロンに強い親和力で結合し、そしてこの関連性は，生物学的利用可能な性ホルモンレベルの減少に伴って、骨の損失の危険度の増大に反映し得る。しかし、この関連性の強さは、血清エストラジオールおよびテストステロンのレベルに対する調整後でさえ、骨に対するＳＨＢＧの他の影響が存在し得ることを示唆する。
【０１０３】
　より低い２５（ＯＨ）Ｄレベルは、股関節からのより急速な骨の損失に関係する（しかし踵骨からの損失には関係しない）。前述の断面の研究の結果を、合わせると：２つの研究によって、より低い２５（ＯＨ）Ｄレベルの閉経後の女性では、骨密度がより低いことが見出されたが（Ｖｉｌｌａｒｅａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂ．７２（３）：６２８−６３４（１９９１）；Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５５（４）：２５３−２５６（１９９４）を参照のこと）、少なくとも他の１つの断面的研究では、２５（ＯＤ）Ｄと、遠位橈骨、中位橈骨、または腰椎脊椎での骨密度との間に有意な関連性は見出されなかった（Ｔｓａｉら、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　４０（５）：２４１−２４３（１９８７）を参照のこと）。しかし、Ｔｓａｉらの研究では、広い年齢範囲（３３−９４）を有し、そして高齢の女性に対して、関連性を切り離して報告していなかった。
【０１０４】
　本発明者らの研究においては、ＰＴＨレベルは、踵骨または股関節からの骨の損失に関連しなかった。このことは、季節に対する調整、およびカルシウムまたはビタミンＤ供給剤を摂取している女性の排除後でさえ、当てはまった。
【０１０５】
　本研究は、将来に向けての研究であり、断面的骨質量測定よりむしろ、骨質量における変化の速度を測定する。血清サンプルを、骨質量における変化の測定に先立って採取した。このサンプルのサイズは、他の多くの関連研究におけるサイズより、かなり大きく、そして被験体は、米国内の４つの離れた地域社会に在住する高齢の女性のコホートからサンプリングした。
【０１０６】
　結論として、本結果は、ＳＨＢＧおよび内在性エストロゲンが、高齢の女性における骨の損失の重要な決定要因であることを実証する。より低い２５（ＯＨ）Ｄレベルは、股関節からのより急速な骨の損失に関係する（しかし踵骨からの損失には関係しない）。ＰＴＨおよび他のカルシウム向性ホルモンは、高齢の女性における骨の損失に有意な影響を与えない。
【０１０７】
　（実施例４）
　以下の実施例およびデータは、血清エストラジオールレベルおよび骨密度の間の相関性を実証する。
【０１０８】
　（１．実験個体群）
　この解析における被験体は、骨粗鬆症性骨折の研究（ＳＯＦ）の参加者であり、実施例１に記載される。
【０１０９】
　全部で９７０４人のＳＯＦ参加者を、１９８６年〜１９８８年の基線来診の間に、臨床センターの１で問診および試験した。来診時に、医師が診断した医学的状態および過去の投薬についての詳細なデータを収集した。本発明者らは、身長、体重、および体力の標準的評価を行った。本発明者らは、単一光子吸光光度計を使用して、踵骨および近位の第３橈骨のＢＭＤを測定した。胸部および腰部の脊椎の側面の放射線写真を獲得した。血清サンプルは、各参加者から収集した。
【０１１０】
　参加者は、年一回、質問票に完答し、そしてクリニックへの３度の隔年の経過観察来診を行った。最初の経過観察来診（１９８８年〜１９９０年に実施された）では、本発明者らは、二重エネルギーＸ線吸光光度計（ｄｕａｌ−ｅｎｅｒｇｙ　ｘ−ｒａｙ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）（ＤＸＡ）を使用して、大腿骨の近位端のＢＭＤを測定した。これらの測定方法、およびデンシトメトリーのための精度管理の手段の詳細は、Ｓｔｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．７：６２５−６３２（１９９２）に記載される。
【０１１１】
　（２．血清サンプルおよび生化学試験）
　全参加者に、終夜、無脂肪の食事制限に従うように指示し、そしてアッセイを妨害する試験日の朝の脂血症を最小化した。血液は、午前８時と午後２時との間に採取し、そして血清を−２０℃で凍結させた。２週間以内に、全サンプルを、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に輸送し、そこで、それらを液体窒素中（約−１９０℃）で保存した。これらのサンプルの長期間の安定性を、−２０℃で２週間保存後に得たエストラジオールの結果と、−１９０℃で３．５年保存後に得た結果と比較して決定した；５１サンプルについての相関係数は０．９４であり、その平均値（±ＳＤ）は、２週間後で１１．８（９．０）、および３．５年後で１０．９（９．０）であった。
【０１１２】
　初期のコホートの研究において、基線の血清を使用した生化学試験は、４００人の無作為に選択された参加者からの利用可能なものであった。この解析のために、本発明者らは、血清エストラジオールを測定しなかった女性（ｎ＝１３４）と全身性エストロゲン治療の当時の使用を報告した女性（ｎ＝３９）を排除し、２４７人の女性が、当時の解析に利用可能であった。
【０１１３】
　以下の生化学的解析を、各対象に関して実施した：カルシウム、２５−ヒドロキシビタミンＤ、１．２５−ジヒドロキシビタミンＤ、および副甲状腺ホルモンを含む、カルシウム向性因子；インシュリン様成長因子−１およびインシュリン様成長因子結合タンパク質３を含む、成長因子；骨特異的アルカリフォスファターゼおよびオステオカルシンを含む、骨形成マーカー；エストラジオール、エストロン、テストステロン（全ての型および遊離型）、ＳＨＢＧ，硫酸デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡＳ）を含む、性ホルモンおよび副腎ホルモン；甲状腺刺激（ＴＳＨ）を含む、他の内分泌試験。これらの生化学的解析の方法はＲｅｇｉｎｓｔｅｒら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｌ．５１：３４０−３４３（１９９２）に記載される。エストラジオールの免疫アッセイは、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｔａｒｚａｎａ，ＣＡ）が実施し、そこでは、５−ｐｇ／ｍＬの検出低限を有する高感度アッセイを使用した。
【０１１４】
　独立したコホートにおける本発明者らの知見を確認するために、本発明者らは、初期の解析サンプルと同じ包含および排除の判断基準を満たす、２２２人のＳＯＦ参加者の第２次の無作為サンプルから、基線の血清エストラジオールを測定した。第２のコホートにおける血清エストラジオールの測定は、Ｃｏｒｎｉｎｇ
　Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ　Ｊｕａｎ　Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ）で実施し、そこでは、２−ｐｇ／ｍＬの感度低限を有する高感度アッセイを使用した。２つの基準の研究所で測定された、２２の分割した血清試料からの結果は、同様の結果を示した（相関係数＝０．９、傾斜１．３）
　（３．椎骨変形の確認）
　放射性体型計測を、基線で、罹患した椎骨変形を診断するために使用した；罹患した変形に対する判断基準は、少なくとも１つの椎骨の前部、中部、または後部椎骨の高さのいずれかにおける、３ＳＤより多い減少である。Ｂｌａｃｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１０：８９０−９０２（１９９５）を参照のこと。
【０１１５】
　（４．統計的分析）
　サンフランシスコ、カリフォルニア大学にあるＳＯＦコーディネーティングセンターにて、分析を行った。
【０１１６】
　第１のサンプル（ｎ＝２４７）において、女性を彼女らの血清エストラジオールレベルに基づいて４つの群に階層化した：階層１には、エストラジオールが検出されない女性全て（＜５ｐｇ／ｍＬ、ｎ＝８１、３２．８％）を含んだ；残りの女性を、５〜６ｐｇ／ｍＬ、７〜９ｐｇ／ｍＬ、および１０〜２５ｐｇ／ｍＬのエストラジオールレベルに基づいて、ほぼ等しい３つの群に階層化した；これらの階層中の被験者の数は、５５（２２．３％）、６３（２５．５％）、および４８（１９．４％）であった。第２の（確認）サンプル（ｎ＝２２２）において、同一の血清エストラジオールのカットポイントを使用した；これらの階層の被験者の割合は、２５．２％、２７．５％、２４．８％、および２２．５％であった。
【０１１７】
　結果を調べ、被験者の体重および年齢について調整した。なぜなら体重およびＢＭＩは高度な相関関係が有り、そしてなぜなら体重はＢＭＤとより強い関連を示すからである。Ｂａｕｅｒら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１８：６５７〜６６５（１９９３）を参照のこと。本発明者らは、後のモデルに包含するために体重を選択した。次いで本発明者らは、本発明者らが、骨密度または骨粗鬆症の骨折の潜在的な予測因子であると考えた変数をまず調べることで、共変量（ｃｏｖａｒｉａｔｅ）の可能性のある寄与を評価した。任意の可能性のある混乱因子がこれらのエストラジオールにわたって一貫したトレンド（線形トレンドに関する試験の分散分析）を示した場合は、本発明者らは、その結果が目的の４つの骨格部位での骨密度である、多変量モデルにおけるその効果をさらに評価した。これらのモデルは、年齢、臨床部位、および血清エストラジオールならびに候補予測因子である変数を含んだ。この候補変数がこれらのモデルのほとんどで保持された場合は、その候補変数を混乱因子であると考えた。本発明者らはまた、このモデルに握力強度および当時の喫煙を加えた。なぜならこれらの変数は、本発明者らの以前の研究において、ＢＭＤ（Ｂａｕｅｒら、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１８：６５７〜６６５（１９９３）参照のこと）および骨折（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：７６７〜７７３（１９９５）参照のこと）の予測因子を提供したからである。
【０１１８】
　分散分析を使用して、調整した平均ＢＭＤをエストラジオールの各階層について計算した。より高い３つの階層各々に対する最も低い階層（エストラジオール検出不能）との間の調整したＢＭＤの相違の統計的有意性を決定するために、ダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）の試験を使用した。ロジスティック回帰モデルを使用して、最も低い階層に対するエストラジオールのより高い３つの階層の各々に関する、多重調整したオッズ比（ＯＦ）および羅患した脊椎変形の危険に対する９５％信頼区間を計算した。ＳＡＳ（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して、これらの分析を行った。
【０１１９】
　（５．エストラジオールレベルによる被験者の特徴）
　本研究における女性の臨床的測定値を表１０に示す。
【０１２０】
【表１０】
2004083599.tif 000011
2004083599.tif 000012
【０１２１】
　平均して、本研究における女性らは、年齢約７２歳であった（表１０）。平均エストラジオールは年齢によって変化した；６５〜７４歳の女性は、平均（ＳＤ）エストラジオール５．８（５．１）ｐｇ／ｍＬを有し、８０歳以上の女性に関する６．３（４．９）ｐｇ／ｍＬと比較した。身長はエストラジオール階層にわたって異ならなかった。体重は、最もエストラジオールが高い階層において、統計的に有意に女性の中でより高かった。エストラジオール階層にわたって大きな、または一貫した違いを示さなかった生化学試験は、カルシウム向性（ｃａｌｃｉｏｔｒｏｐｉｃ）因子、成長因子、骨特異的アルカリホスファターゼ、およびＤＨＥＡＳを含んだ（結果を示さず）。エストロンおよび全テストステロンは、最も高いエストラジオールレベルの女性において、エストラジオール検出不能である女性と比べて約２倍高かった。いくつかの変数（体重に関する変数を含む）は、エストラジオール階層にわたり著しくかつ一貫して異なっていた。オステオカルシンはエストラジオールのレベルがより高い場合により低くなる傾向があった；最も高い階層は、エストラジオールの最も低い(検出不能）階層よりも１０．９％低かった。体重およびＳＨＢＧもまたエストラジオール階層にわたり相違を示し、そしてこの４つのＢＭＤの結果とかなり一貫した関係を示したので、これらを年齢、握力強度、および当時の喫煙とともにモデルに含めた。
【０１２２】
　４つの骨格部位全ての年齢調整および体重調整したベースラインＢＭＤは、エストラジオールレベルがより高い場合により高くなる同様の傾向を示した。血清エストラジオール５ｐｇ／ｍＬ未満の女性と比較して、１０〜２５ｐｇ／ｍＬのレベルの女性は全ての骨格部位で統計的に有意により大きな平均ＢＭＤを有した；その相違は全股関節、踵骨、近位の橈骨、および脊柱（各々の比較についてｐ＜０．０５）に関して４．６％、６．１％、５．８％、および７．１％であった。多重調整の後、この相違は統計的に有意のままであった：全股関節、踵骨、近位の橈骨、および脊柱に関して５．７％、６．３％、６．５％、および６．９％。
【０１２３】
　確認研究の女性は、本発明者らの最初の研究の女性と、血清エストラジオールレベルを含めて同様の特徴を示した。血清エストラジオールレベルとＢＭＤとの間の同様の関連は、確認コホートにおいて見られた。４つの骨格部位全てにおける年齢調整および体重調整したＢＭＤは、最初のコホートと同様のトレンドを示した。５ｐｇ／ｍＬ未満の血清エストラジオールを有する女性と比較して、１０〜２５ｐｇ／ｍＬのレベルの女性は、全股関節、踵骨、近位の橈骨、および脊柱で４．９％、９．６％、７．３％、および６．８％より大きいＢＭＤを有した。多重調整の後、この相違は統計的に有意のままであった：全股関節、踵骨、近位の橈骨、および脊柱で３．８％、７．０％、５．４％、および６．９％より大きいＢＭＤ。
【０１２４】
　エストラジオールが最も低い階層（＜５ｐｇ／ｍＬ）の女性は、他の３つの階層において７〜１９％の範囲のより低い有病率なのに対して、３０％が１以上の羅患した脊椎変形を有した。年齢調整および体重調整の後、羅患した脊椎変形は、検出不能なエストラジオールレベル（ＯＲ＝０．４、９５％信頼区間（ＣＩ）０．２〜０．８）を有する女性と比較して、５〜２５ｐｇ／ｍＬの間のエストラジオールレベルを有する女性では、６０％より少ない可能性であった；この比は、多重調整（ＯＲ＝０．４、ＣＩ、０．２〜０．７）によって最小限の影響しか受けなかった。この確認コホートにおいて、本発明者らはエストラジオールレベルと脊椎変形の有病率との間の関連に対するいかなるトレンドをも発見しなかった；有病率は全ての階層にわたり同様であり、そして１５％から１９％までの範囲であった。
【０１２５】
　（６．結論）
　このデータは、５ｐｇ／ｍＬより下の血清エストラジオールレベルが、より高齢の女性における骨格の健康に有害であることを実証する。年齢調整および体重調整の後、このデータは、エストラジオール＜５ｐｇ／ｍＬである女性が全ての骨格部位で実質的により少ないＢＭＤを有したことを示す。さらに、このデータは、骨代謝回転の指示物質であるオステオカルシンが、より低い血清エストラジオールレベルの女性においてより高くなる傾向があることを示す。従って、低いレベルのエストラジオールは、年配の女性の骨格に対して臨床的に重要な影響
をもたらす。可能性のある説明は、エストラジオールが低濃度で存在する場合、骨格の再造形を減少させ、骨のより良好な質および質量の両方を可能にし、そしてそれによって骨折率を減少するというものである。
【０１２６】
　本発明者らが観察したＢＭＤにおける相違は、実質的であり、そして多重因子についての調整後でさえ、約０．４標準偏差（ＳＤ）に対応した。この相違は３０％まで股関節骨折の危険を減少させる、と予期した（１．０ＳＤ＝．１１ｇ／ｃｍ2および１．０ＳＤ相違＝ＲＲ２．８と仮定する）。同様の計算を用いて、本発明者らは１０〜２５ｐｇ／ｍＬ（約０．４ＳＤに等しい）の血清エストラジオールと関連する脊柱密度の恩恵は、２３％（１．０ＳＤ＝．１７ｇ／ｃｍ2および１．０ＳＤ相違＝ＲＲ２．１と仮定する）まで脊柱骨折の危険を減少させると予期されることであると評価した。
【０１２７】
　エストロンは、閉経後の女性の間での骨格の健康の予測因子として広く試験されている。ＢＭＤは、黒人女性および白人女性の両方における血清エストロンレベルと断面的に関連するということが見出されている。（Ｃａｕｌｅｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄ．１３９：１０３５〜１０４６（１９９４）を参照のこと。）しかし、本研究は、エストラジオールレベルが半数以上の女性において検出の限界を下回るので、制限された。エストロンは起こりやすい股関節骨折の予測とならなかった。閉経後の女性において、エストロンは、量的に優勢なエストロゲンであり、そして主に副腎のアンドロステンジオンの変換から生成される。エストラジオールは、エストロンの還元を通じて、および卵巣テストステロンおよび副腎テストステロン（アンドロステンジオンおよびＤＨＥＡの変換由来である）の芳香族化を通じて生成される（Ｃａｕｌｅｙら、Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄ．１３９：１０３５〜１０４６（１９９４）を参照のこと）。このデータはエストロンの血清レベルと最初のサンプル（ｒ＝０．６５）および確認サンプル（ｒ＝０．７８）の両方におけるエストラジオールとの間に比較的高い相関関係を示す。エストラジオール(エストロンではない）は、核レセプターでのエフェクターホルモンであると考えられる。（Ｇｒｏｄｉｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．３６：２０７〜２１４（１９７３）を参照のこと）。エストラジオールはまた、エストロンよりも４〜１０倍より強力である。従って、エストラジオールが、骨格の結果に対して強く、一貫し、そして積極的な関連を有する主要な性ステロイドホルモンであるということを、予測し得た。
【０１２８】
　エストラジオールは、いくつかの可能性のある機構を通じて有益な骨格の効果を生成し得た：エストラジオールは、骨代謝単位の活性化を減少させる；エストラジオールは、骨吸収の副甲状腺ホルモンの刺激に拮抗する；エストラジオールは、局所的サイトカインまたは他の成長因子を介して骨芽細胞の生存を増強し得る；エストラジオールは、胃腸のカルシウム吸収および腎臓のカルシウム保存の両方の効率を向上させる。これらの作用のいくつかまたは全ては、とても低いレベルのエストラジオールに対し応答し得る。本発明者らのデータはまた、骨代謝回転の減少に対するエストラジオールの効果を支持する。間接的には、エストラジオールは、体重を介して骨に影響し得たが、本発明者らのデータは、体重について調整し、なおも強力な関連を見出した。
【０１２９】
　過去に、エストラジオールの効果の研究は、感度の低いアッセイによって妨げられてきた。とても敏感かつ正確な方法のみが、低い（＜３０ｐｇ／ｍＬ）エストラジオールレベルととても低い（＜５ｐｇ／ｍＬ）エストラジオールレベルとの間を区別し得る。２０ｐｇ／ｍＬより低い、より低い検出の限度を有するエストラジオールアッセイを提供する商業的研究所はほとんどない。このような感度の高いアッセイの欠如は、他の人がこれらの関連を見出すのを妨げてきた。とても低い内因性エストラジオール生成に対する低い内因性エストラジオール生成の影響は、微妙であり、そしてＢＭＤにおける相違を明らかにするために多くの年月を要し得た。本発明者らの断面的データは、エストラジオールレベルが、６５歳より後の加齢によって減少しないことを示唆する。
【０１３０】
　本発明者らの結果は、低い骨質量および骨折に対する低いレベルのエストラジオールの防御効果を示す；この効果は、いくつかの骨格部位での骨密度、股関節および踵骨での骨の損失、および脊柱骨折の危険として観察し得るので、一貫している。これらの発見は、異なる研究所の高度に感受性のエストラジオールアッセイを使用することにより、再現された。年配者におけるエストラジオールの有益な骨格効果は、以前に生理学的影響を有さないと考えられていたレベルで生じる。
【０１３１】
　好ましい実施態様および実施例の前述の記載は、本発明の例示であって、そしてその限定として解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲（その中に含まれる特許請求の範囲の等価物をともない）により規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、本発明の方法において使用され得る経皮パッチの１つのタイプの横断面図である。
【図２】図２は、本発明の方法において使用され得る経皮パッチの第二ののタイプの横断面図である。
【図１】
2004083599.tif 000013
【図２】
2004083599.tif 000014