(57)【要約】      （修正有）【課題】  改変ヒト第VIII因子ｃＤＮＡの提供。【解決手段】  このｃＤＮＡは改変ヒト第VIII因子ｃＤＮＡであって、野生型か、またはＢドメインが部分的または完全に欠失しＤＮＡリンカーセグメントで置換された第VIII因子ｃＤＮＡのいずれかに変異が挿入され、Ａ）ブタ第VIII因子ｃＤＮＡの同じ位置に対応するコドンと同一でないヒト第VIII因子ｃＤＮＡの１またはそれ以上のコドンが、以下のいずれかの方法：ヒト配列が中性アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含む場合、又、ヒト配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が中性アミノ酸に関するコドンを含む場合、逆の電荷のアミノ酸に関するコドンをヒト配列に導入する、Ｂ）血友病患者の第VIII因子ｃＤＮＡで見出された１またはそれ以上の荷電アミノ酸に関するコドンが、逆の電荷のアミノ酸に関するコドンで置換されるものからなる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型第VIII因子ｃＤＮＡか、または、Ｂドメインが部分的または完全に欠失しＤＮＡリンカーセグメントで置換された第VIII因子ｃＤＮＡのいずれかに変異が挿入され、
Ａ）ブタ第VIII因子ｃＤＮＡの同じ位置に対応するコドンと同一でないヒト第VIII因子ｃＤＮＡの１つまたはそれ以上のコドンが、以下のいずれかの方法：
・ヒト配列が中性アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含む場合、ブタ配列で見出されたのと同じ電荷を有するアミノ酸に関するコドンをヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が中性アミノ酸に関するコドンを含む場合、中性アミノ酸に関するコドンまたは逆の電荷のアミノ酸に関するコドンをヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が逆の電荷を有するアミノ酸に関するコドンを含む場合、逆の電荷を有するアミノ酸に関するコドンをヒト配列に導入する
により異なるコドンで置換される、または、
Ｂ）血友病患者の第VIII因子ｃＤＮＡで見出された１つまたはそれ以上の荷電アミノ酸に関するコドンが、逆の電荷のアミノ酸に関するコドンで置換される
ことを特徴とする、改変ヒト第VIII因子ｃＤＮＡ。
【請求項２】
適切な宿主細胞における発現のための転写調節因子をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の第VIII因子ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター。
【請求項３】
野生型第VIII因子、または、Ｂドメインが部分的または完全に欠失し、そしてリンカーで置換された第VIII因子のいずれかに変異が挿入され、
Ａ）ブタ第VIII因子の同じ位置において対応するアミノ酸と同一ではないヒト第VIII因子の１つまたはそれ以上のアミノ酸が、以下のいずれかの方法：
・ヒト配列が中性アミノ酸を含み、その一方でブタ配列が荷電アミノ酸をを含む場合、荷電ブタ配列で見出されたのと同じ電荷を有する荷電アミノ酸をヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸を含み、その一方でブタ配列が中性アミノ酸をを含む場合、中性アミノ酸または逆の電荷のアミノ酸をヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸を含み、その一方でブタ配列が逆の電荷を有するアミノ酸をを含む場合、逆の電荷を有するアミノ酸をヒト配列に導入する
により異なるアミノ酸で置換される、または、
Ｂ）血友病患者の第VIII因子アミノ配列で見出された１つまたはそれ以上の荷電アミノ酸が逆の電荷のアミノ酸に関するコドンで置換される
ことを特徴とする、改善された安定性を有する生物学的に活性な改変組換えヒト第VIII因子。
【請求項４】
その活性型の血漿内半減期が、３分を超過する、好ましくは１０分を超過する、最も好ましくは３０分を超過する、請求項３に記載の生物学的に活性な改変組換えヒト第VIII因子。
【請求項５】
請求項３に記載の１つまたはいくつかのアミノ酸の置換によりＡ２ドメインを安定化することを特徴とする、改変ヒト第VIII因子。
【請求項６】
適切な宿主細胞系により発現された第VIII因子タンパク質をクロマトグラフ法により精製することを特徴とする、細胞懸濁液中または固体支持体上のいずれかでの、槽細胞培養、または、調整培地での連続生産を伴う潅流細胞培養による、請求項３に記載の改変ヒト第VIII因子の組換えの製造方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載の改変第VIII因子ｃＤＮＡをコードする転写単位が、該特定のｃＤＮＡをそれらのゲノムに統合した特定の細胞クローンの単離を容易にするために、優性の選択マーカーを含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ゲノムに統合された請求項１に記載の第VIII因子ｃＤＮＡを含む脊椎動物由来の動物細胞系であることを特徴とする、請求項３に記載の第VIII因子タンパク質を発現させるための宿主細胞系。
【請求項９】
請求項３に記載の生物学的に活性な改変組換えヒト第VIII因子を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の改変第VIII因子ｃＤＮＡを含むことを特徴とする、血友病Ａの遺伝子治療用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された安定性を有する生物学的に活性な組換えヒト第VIII因子およびその誘導体をコードする改変ＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに、該組換えヒト第VIII因子およびその誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、ヒト遺伝子治療に用いるための該改変ＤＮＡ配列を含むトランスファーベクターも含む。
【背景技術】
【０００２】
典型的な血友病または血友病Ａは、最も一般的な遺伝性の出血障害である。これは染色体Ｘ連鎖の血液凝固第VIII因子欠損により発症し、１０,０００人中１〜２人の発現率で
もっぱら男性が罹患する。Ｘ染色体異常は、女性保因者（自分自身は血友病ではない）により遺伝する。血友病Ａの臨床的な症状発現は、異常出血傾向であり、第VIII因子濃縮物で治療しなければ、重度の血友病患者の平均寿命は２０年未満である。血漿からの第VIII因子濃縮物の使用により、血友病患者の状態はかなり改善されてきた。平均寿命は高く引き上げられ、事実上通常の寿命を生きる可能性が多くの患者に与えられている。しかしながら、血漿由来の濃縮物とその使用に関してある種の問題があり、その中でも最も深刻な問題は、ウイルス感染である。これまで、エイズ、肝炎Ｂ、および非Ａ非Ｂ肝炎を引き起こすウイルスは、人々を深刻に打ちのめしている。近年、異なるウイルス不活性化法や新規の高精製第VIII因子濃縮物が開発されているが、不注意の汚染を防ぐことができない。また、ヒト血漿原料の供給が限られているために、第VIII因子濃縮物はかなり高価である。
【０００３】
組換え材料から得られた第VIII因子産物は、血友病Ａ治療のための血漿由来第VIII因子濃縮物の使用に関する問題をかなりの程度まで解決しているようである。しかしながら、組換え第VIII因子の開発は、いくつかの困難、例えば十分に高い収率での生産を達成すること、殊に完全長分子について達成すること、について問題がある。
【０００４】
プロテアーゼ阻害剤存在下で調製された新鮮な血漿において、第VIII因子は、２８０ｋＤａの分子量を有し、２つのポリペプチド鎖（それぞれ２００ｋＤａと８０ｋＤａ）から成ることがわかっている（Andersson，L．−O.，et al．（1986）Proc．Natl．Acad．Sci．USA83，2979−2983）。これらの鎖は、金属イオン架橋で共に結合している。多かれ少なかれ、第VIII因子分子のタンパク質分解により分解した形態は、市販の濃縮物から精製した第VIII因子材料において、活性断片として見出すことができる（前述の Andersson，L．−O.，et al.：Andersson, L．−O.，et al．（1985）EP 0197901）。２６０ｋＤａから１７０ｋＤａの分子量を有する第VIII因子の断片化形態は、１８０ｋＤａから９０ｋＤａの範囲の分子量を有する１つの重鎖からなり、この場合、全ての変異体は、１つの８０ｋＤａの軽鎖と組み合わせて同一のアミノ末端を有する。重鎖のアミノ末端領域は、第VIII因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列データから推測することができる単鎖第VIII因子ポリペプチドの領域と同一である（Wood, W．I.，et al．（1984）Nature 312，330−336；Vehar，G．A.，et al．（1984）Nature 312，337−342）。
【０００５】
分子量１７０ｋＤａを有する第VIII因子の最も小さい活性型は、１つの９０ｋＤａ鎖と１つの８０ｋＤａ鎖からなり、トロンビンにより、より大きい分子量形態と同程度に活性化することができ、従って非活性型を示す。血友病のイヌで試験したところ、インビボで完全な生物活性を有することも示されている（Brinkhous，K．M.，et al．（1985）Proc
．Natl．Acad．Sci．USA 82，8752−8756）。従って、１７０ｋＤａ形態の止血の有効性
は、第VIII因子の高分子量形態と同じである。
【０００６】
アミノ酸Ａｒｇ７４０〜Ｇｌｕ１６４９に存在する第VIII因子ポリペプチド鎖の中央部の重度グリコシル化領域が、完全な生物活性に必要ではないようにみえるという事実により、数人の研究員が、この領域が欠失した組換え第VIII因子の誘導体の作製を試みている。これは、第VIII因子の中央部の重度グリコシル化領域を完全または部分的にコードするｃＤＮＡの部分を除去することによって達成されている。
【０００７】
例えば、J．J．Toole等は、アミノ酸９８２〜１５６２、および、７６０〜１６３９が
それぞれ除去された第VIII因子の構造および発現を報告した（Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1986）83，5939−5942）。D．L．Eaton等は、アミノ酸７９７〜１５６２が欠失した第VIII因子の構造および発現を報告した（Biochemistry（1986）25，8343−8347）。R．J．Kaufmanは、アミノ酸７４１〜１６４６が欠失した第VIII因子の発現を説明した（ＰＣＴ出願番号ＷＯ ８７／０４１８７）。N．Sarver等は、アミノ酸７４７〜１５６０が欠失した第VIII因子の構造および発現を報告した（DNA（1987）6，553−564）。M．Pasekは、アミノ酸７４５〜１５６２、およびアミノ酸７４１〜１６４８がそれぞれが欠失した第VIII因子の構造および発現を報告した（ＰＣＴ出願番号ＷＯ ８８／００８３１）。K．-D．Langnerは、アミノ酸８１６〜１５９８、およびアミノ酸７４１〜１６８９がそれぞれが欠失した第VIII因子の構造および発現を報告した（Behring Inst．Mitt.，（1988）No．82，16−25，ＥＰ０２９５５９７）。P．Meulien等は、アミノ酸８６８〜１５６２、およびアミノ酸７７１〜１６６６がそれぞれが欠失した第VIII因子の構造および発現を報告した（Protein Engineering（1988）2（4），301−306，ＥＰ ０３０３５４０）。哺乳動物細胞で第VIII因子ｃＤＮＡのこれら欠失形態を発現させる場合、生産レベルは、通常完全長第VIII因子と比べて１０倍高い。
【０００８】
ＦVIIIは、Ａ１とＡ３ドメインとの間の２価金属イオンの非共有結合で連結した重鎖（ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ）と軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）とからなるヘテロ二量体として血漿中に分泌される。血漿中で、ＦVIIIは、フォン−ウィルブランド因子に結合することにより安定化される。
【０００９】
トロンビンによるタンパク分解の活性化の際、ＦVIIIは、２つの重鎖断片（Ａ１，５０ｋＤａ断片、および、Ａ２，４３ｋＤａ断片）と、軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２，７３ｋＤａ断片）とからなるヘテロ三量体に活性化される。従って、ＦVIII活性型（ＦVIIIａ）は、２価金属イオン結合を介してトロンビン−開裂Ａ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖に連結するＡｌ−サブユニットと、Ａ１ドメインに連結する遊離のＡ２サブユニットとからなる。その遊離のＡ２サブユニットのヘテロ三量体からの解離は、トロンビン活性化の後のＦVIIIａ不活性化における律速段階と考えられている（Fay，P．J．et al，J．Biol．Chem．266：8957（1991），Fay PJ & Smudzin TM，J．Biol．Chem．267：13246−50（1992））。血漿中でのＦVIIIａの半減期は、わずか２.１分である（Saenko et al.，Vox Sang．83：89−96（2002））。ＦVIIIａの半減期を増すことにより、より長く作用するＦVIIIａが得られる可能性があり、また、このようなＦVIII製剤の注入頻度を少なくするとも解釈できる。Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ５６２での開裂による活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を介したＦVIIIａ不活性化は、律速段階とは考えられていない。Ａ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合で付着させ、ＡＰＣ開裂部位に変異を導入することにより不活性化耐性のＦVIIIａを作製する試みがなされている（Pipe and Kaufman，PNAS，94：11851−11856）。しかしながら、このようなＦVIIIａは、ほとんど完全に不活性化耐性であるため、凝血形成の可能性（thrombogenic potential）がある。それゆえに、本発明の目的は、完全に不活性化をブロッキングすることなくＡ２ドメインが安定化されたＦVIIIａを作製することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＦVIIIは、ＦVIIIの血漿内半減期が約１２時間であるために、１週間に約３回、予防の治療を受けている血友病患者に静脈内投与される。従って、増強された血漿内半減期を有するＦVIIIを製造し、それによりより少ない頻度で投与されるＦVIII製剤を得ることが強く望まれる。本発明は、Ａ２のＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２への連結が増強された改変ＦVIII分子により、この問題の解決方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これら改変の特徴は、ヒトＡ２ドメインの解離はブタＡ２の解離に比べて３倍強いと知られていることから、ブタＦVIII配列とヒトＦVIII配列とを比較することにより同定された（Lollar et al.，J Biol．Chem.，267：23652−23657（1992））。配列比較（表１）
により、いくつかの違いが明らかになった。これらの違いの部分集合は、異なる電荷を有するアミノ酸からなる。ヒトＦVIIIの変異体は、以下のガイドラインに従って構築された。ヒト配列が中性アミノ酸を有し、その一方でブタ配列が荷電アミノ酸を有する場合、荷電ブタ配列で見出されたのと同じ電荷を有するアミノ酸がヒト配列に導入された。ヒト配列が荷電アミノ酸を含み、その一方でブタＦVIIIが中性アミノ酸を含む場合、中性アミノ酸または逆の電荷のアミノ酸が導入されており、例えば、ヒトＦVIIIがブタＦVIIIが中性アミノ酸を含む位置に酸性アミノ酸を含む場合、塩基性アミノ酸も導入されている。ヒト配列が荷電配列を含み、その一方でブタＦVIIIが荷電アミノ酸を含む場合、ブタアミノ酸で見出されたのと同じ電荷を有するアミノ酸がヒト配列に導入されている。その活性型の血漿内半減期が３分を超過する、好ましくは１０分を超過する、さらにより好ましくは３０分を超過する改善されたＦVIIIをもたらすこのような変異の例を表２に列挙する。
【００１２】
改善されたＦVIIIに関するその他の変異は、血友病に関連するＡ２ドメインのより速い解離をもたらす自然に存在するヒトＦVIIIの変異を分析することにより推測された。このような変異により、ＦVIII凝固活性の測定の際に二段階分析と一段階分析とで違いが生じ、その一方で、二段階分析では数分のインキュベート時間で不安定なＡ２ドメインを解離させるため、二段階分析の結果は一段階分析の結果より低い（Saenko et al.，Vox Sang.，83：89−96（2002））。上記の場合において、このような増強された不安定性が荷電アミノ酸の導入の結果である場合、そのアミノ酸は、逆の電荷のアミノ酸に変異されるべきである、と推測された。その活性型の血漿内半減期が、３分を超過する、好ましくは１０分を超過する、さらにより好ましくは３０分を超過する改善されたＦVIIIをもたらすこのような変異の例を表３に列挙する。
【００１３】
変異導入の基礎として、好ましくは改変第VIII因子ｃＤＮＡが用いられるが、これは、ヒト第VIII因子のアミノ酸１〜７４０をコードする第一のＤＮＡセグメントと、ヒト第VIII因子のアミノ酸１６４９〜２３３２をコードする第二のＤＮＡセグメントとを含む。これら２つのセグメントは、リンカーＤＮＡセグメントにより相互連結されてもよいが、本発明はまた、完全長ＦVIIIへの変異導入も含む。
【００１４】
それゆえに本発明の主題は、改変ヒト第VIII因子ｃＤＮＡであり、ここで、野生型第VIII因子ｃＤＮＡか、または、Ｂドメインが部分的または完全に欠失しＤＮＡリンカーセグメントで置換された第VIII因子ｃＤＮＡのいずれかに変異が挿入され、
【００１５】
Ａ）ブタ第VIII因子ｃＤＮＡの同じ位置に対応するコドンと同一でないヒト第VIII因子ｃＤＮＡの１またはそれ以上のコドンが、以下のいずれかの方法：
・ヒト配列が中性アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含む場合、ブタ配列で見出されたのと同じ電荷を有するアミノ酸に関するコドンをヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が中性アミノ酸に関するコドンを含む場合、中性アミノ酸に関するコドンまたは逆の電荷のアミノ酸に関
するコドンをヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸に関するコドンを含み、その一方でブタ配列が逆の電荷を有するアミノ酸に関するコドンを含む場合、逆の電荷を有するアミノ酸に関するコドンをヒト配列に導入する
により異なるコドンで置換される、または、
Ｂ）血友病患者のＦVIII ｃＤＮＡで見出された１またはそれ以上の荷電アミノ酸に関
するコドンが逆の電荷のアミノ酸に関するコドンで置換される。
【００１６】
第VIII因子タンパク質の適切な宿主細胞での高レベル生産は、組換え発現ベクター中で、上述の改変第VIII因子ＤＮＡを適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築することが必要であり、該ベクターは、当業者既知の方法に従ってＥ．coli で増殖させることができる。効率的な転写調節因子は、それらの天然の宿主としてウイルスを有する動物細胞から、または、動物細胞の染色体ＤＮＡから得ることができる.好ましくは、プロモーター−エンハンサーの組み合わせは、サルウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、またはラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから得られ、また、プロモーター−エンハンサー組み合わせは、動物細胞で構造的に強く転写された遺伝子（β−アクチンまたはＧＲＰ７８など）も用いることができる。安定して高いレベルで第VIII因子ＤＮＡから転写されるｍＲＮＡを達成するために、転写単位は、転写終結ポリアデニル化配列をコードするその３’近接部分のＤＮＡ領域に含まれるべきである。好ましくは、この配列は、サルウイルス４０初期転写領域、ウサギβ−グロビン遺伝子、または、ヒト組織プラスミノゲンアクチベーター遺伝子から得られる。
【００１７】
続いて、第VIII因子ｃＤＮＡは、第VIII因子タンパク質を発現させるために適切な宿主細胞系のゲノムに組み込まれる。好ましくは、この細胞系は、正確なフォールディング、ジスルフィド結合形成、アスパラギン結合グリコシル化、および、その他の翻訳後修飾、同様に培地への分泌を確実にするために、脊椎動物由来の動物細胞系であるべきである。その他の翻訳後修飾の例としては、チロシンＯ−硫酸化や新生ポリペプチド鎖のタンパク分解プロセシングが挙げられる。用いることができる細胞系の例としては、サルＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞が挙げられ、好ましくはＣＨＯ細胞である。
【００１８】
第VIII因子ｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、数々の異なる方法で動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、様々な動物ウイルスをベースとしたベクターから製造することができ、その例としては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、好ましくはウシパピローマウイルスをベースにしたベクターが挙げられる。
【００１９】
第VIII因子ＤＮＡをコードする転写単位はまた、組換えＤＮＡをゲノムに統合した特定の細胞クローンの単離を容易にするために、これらの細胞で優性な選択マーカーとして機能し得る他の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入することができる。このタイプの優性の選択マーカー遺伝子の例としては、Geneticin（Ｇ４１８）耐性が付与されたＴｎ５アミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシン耐性を付与されたハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、および、ピューロマイシン耐性を付与されたピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、第VIII因子ｃＤＮＡをコードしたベクターと同じベクターに存在するか、または、同時に導入された別のベクターにコードされ、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、のいずれかであり、しばしば異なる転写単位間の堅い物理的結合が生じる。
【００２０】
第VIII因子ＤＮＡと共に用いることができるその他のタイプの選択マーカー遺伝子は、
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位をベースとする。このタイプの遺伝子を内因性ｄｈｆｒ活性を欠く細胞、好ましくはＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１，ＤＧ−４４）に導入した後、これらをヌクレオシド非含有培地で培養することができる。このような培地の例としては、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシン非含有Ｈａｍ'ｓ２が挙げられる。これらｄｈｆｒ遺伝子は、第VIII因子ｃＤＮＡ転写単位と共
に、上記タイプのＣＨＯ細胞に、同じベクターまたは異なるベクターにいずれかに連結させて導入することができ、それにより組換え第VIII因子タンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性細胞系を製造することができる。
【００２１】
上記細胞系を細胞毒性のｄｈｆｒ阻害剤メトトレキセート存在下で培養した場合、メトトレキセート耐性の新しい細胞系を得ることができる。結合したｄｈｆｒと第VIII因子転写単位との数が増幅されたために、これらの細胞系は、速い速度で組換え第VIII因子タンパク質を産生することができる。これらの細胞系をメトトレキセート濃度を増加させて（１〜１００００ｎＭ）増殖させる場合、第VIII因子タンパク質をａｔ  非常に高い速度で生産する新しい細胞系を得ることができる。
【００２２】
第VIII因子タンパク質を生産する上記細胞系は、懸濁培養液中で、または様々な固体支持体上で大規模培養が可能である。このような支持体の例は、デキストランまたはコラーゲンマトリックスベースのマイクロキャリアー、または、中空繊維形態の固体支持体、または、様々なセラミック材料が挙げられる。細胞懸濁培養液中で、またはマイクロキャリアー上で培養した場合、上記細胞系の培養は、槽培養で、または長期間にわたる調整培地での連続生産を伴う潅流培養で実施することができる。従って、本発明に従って、上記細胞系は、ヒト血漿から単離することができる組換え第VIII因子生産のための工業的プロセスの開発によく適している。
【００２３】
上記タイプのＣＨＯ細胞の培地に蓄積された組換え第VIII因子タンパク質は、多様な生化学的方法およびクロマトグラフ法、例えば細胞培地中における組換え第VIII因子タンパク質と他の物質との間の、大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的親和性等の差を利用した方法により、濃縮、精製することができる。
【００２４】
このような精製の例としては、固体支持体に固定されたモノクローナル抗体への組換え第VIII因子タンパク質の吸着が挙げられる。脱離させた後、第VIII因子タンパク質を、上記特性に基づく多様なクロマトグラフ技術でさらに精製することができる。
【００２５】
本発明に記載の第VIII因子活性を有する組換えタンパク質は、治療用途のために医薬配合物に配合することができる。精製第VIII因子タンパク質は、医薬配合物を提供するために、一般的な生理学的に適合可能な水性緩衝溶液に溶解させることができ、そこに任意に医薬アジュバントを加えてもよい。
【００２６】
本発明の改変第VIII因子ＤＮＡはまた、ヒト遺伝子治療に用いるためのトランスファーベクターに統合することもできる。
【００２７】
本発明のさらなる主題は、その活性型の血漿内半減期が改善された生物学的に活性な改変組換えヒト第VIII因子であり、ここで、野生型第VIII因子、または、Ｂドメインは部分的または完全に欠失しリンカーで置換されたＦVIIIのいずれかに変異が挿入され、
Ａ）ブタ第VIII因子の同じ位置において対応するアミノ酸と同一ではないヒト第VIII因子の１またはそれ以上のアミノ酸が、以下のいずれかの方法：
・ヒト配列が中性アミノ酸を含み、その一方でブタ配列が荷電アミノ酸をを含む場合、荷電ブタ配列で見出されたのと同じ電荷を有するアミノ酸をヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸を含み、その一方でブタ配列が中性アミノ酸をを含む場合、
中性アミノ酸または逆の電荷のアミノ酸をヒト配列に導入する；
・ヒト配列が荷電アミノ酸を含み、その一方でブタ配列が逆の電荷を有するアミノ酸を含む場合、逆の電荷を有するアミノ酸をヒト配列に導入する
により異なるアミノ酸で置換される、または、
Ｂ）血友病患者のＦVIIIアミノ配列で見出された１またはそれ以上の荷電アミノ酸が逆の電荷のアミノ酸に関するコドンで置換される。
【００２８】
さらに、以下の実施例で本発明をより詳細に説明する。この本発明の特定の実施形態の説明は、表と併せてなされる。
【００２９】
〔実施例〕
ＦVIII変異体の製造
ＦVIII変異体を得るために、初めに、ＦVIII ｃＤＮＡの適切なサブフラグメント（例
えばアミノ酸２２６〜９７８を含むＡvaＩ−ＳacＩ）を適切なクローニングベクターにサブクローニングし、その後の配列解析の労力を軽減する。次に、市販の変異誘発キット（例えばＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＳｉｔｅＤｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用説明書に従って用いて部位特異的変異誘発を行う。変異誘発に用いられるプライマーを配列表と以下に列挙し、ここで変異塩基は太字で示される。
【００３０】
【化１】
2004180682.tif 000002
【００３１】
【化２】
2004180682.tif 000003
【００３２】
【化３】
2004180682.tif 000004
【００３３】
【化４】
2004180682.tif 000005
【００３４】
クローン単離および配列確認の後、変異サブフラグメントを個々の発現ベクターに再挿入する。
【００３５】
ＦVIII変異体の発現
ＦVIII変異体クローンのトランスフェクション、および、変異ＦVIII分子の発現を、前述した通りに、当業者既知のように行う（例えば Plantier JL et al．Thromb．Haemost
．86：596−603（2001））。
【００３６】
Ａ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２に対するＡ２サブユニットの親和性の測定
Ａ２サブユニットのＡ１／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２に対する増加した親和性は、上述のように、機能分析（Fay PJ & Smudzin TM．J．Biol．Chem．267：13246−50（1992）；Lollar P
et al．J．Biol．Chem．267：23652−57（1992））で、同様に、表面プラスモン共鳴を
用いた物理的分析（Persson E et al．Biochemistry 34：12775−81（1995））で測定で
きる。
【００３７】
ブタ第VIII因子の配列を配列表の配列３３に示し、ヒト第VIII因子配列を配列３４に示す。
【００３８】
表１は、ブタとヒトとのＦVIIIタンパク質配列の比較を示す。数字は成熟ヒトＦVIIIを参照し、ブタ配列においては、異なるアミノ酸のみが示され、同一のアミノ酸は「.」で
示す。
【表１】
2004180682.tif 000006
【００３９】
表２は、ブタＦVIII（本発明において可能な変異を全く含まない）とのタンパク質比較
に基づくヒトＦVIIIの変異を示す。
【表２】
2004180682.tif 000007
【００４０】
表３は、Ａ２ドメインの増強された解離をもたらす、ヒト変異の存在の分析に基づくヒトＦVIIIの変異を示す（本発明において可能な変異を全く含まない）。
【表３】
2004180682.tif 000008
【００４１】
以下の配列表において、配列１〜３２は、特定の変異をＦVIIIに導入するのに用いられるオリゴヌクレオチドを記載する。配列３３は、完全長成熟ブタＦVIIIのアミノ酸配列であり、配列３４は、完全長成熟ヒトＦVIIIのアミノ酸配列である。
【配列表】
2004180682000001.app