(57)【要約】【課題】環境から銀を効率の良く除去できる微生物及び該微生物を用いてより効率的に銀を除去又は回収する方法を提供すること。【解決手段】Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属に属し、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる、銀の除去又は回収用細菌を提供した。また、上記本発明の細菌を、銀化合物含有液と接触させ、該銀化合物含有液中の銀を前記細菌に担持させることにより該銀化合物含有液中の銀の濃度を低下させることを含む、銀の除去方法を提供した。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属に属し、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる、銀の除去又は回収用細菌。
【請求項２】
前記細菌は、銀濃度３００ｐｐｍの硝酸銀含有ＮＢ培地で生育可能な請求項１記載の細菌。
【請求項３】
前記細菌は、銀を、短径１００ｎｍ以上の金属銀粒子として坦持することが可能な細菌である請求項１又は２記載の細菌。
【請求項４】
前記細菌が、ＣＲＧＤ−１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９５６）若しくはＣＲＧＡ−１株（受託番号ＦＥＲＭ−１８９５５）又はこれらの子孫である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に細菌を、銀化合物含有液と接触させ、該銀化合物含有液中の銀を前記細菌に担持させることにより該銀化合物含有液中の銀の濃度を低下させることを含む、銀の除去方法。
【請求項６】
前記細菌と、前記銀化合物含有液との接触時間は、これらの混合物の濁度をモニターすることにより設定される請求項５記載の方法。
【請求項７】
請求項５又は６記載の方法により、前記銀化合物含有液中の銀を前記細菌に担持させた後、銀を担持させた細菌から銀を回収する工程をさらに含む、銀の回収方法。
【請求項８】
乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できるＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ。
【請求項９】
前記細菌は、銀を、短径１００ｎｍ以上の金属銀粒子として坦持することが可能な細菌である、請求項８記載のＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ。
【請求項１０】
前記細菌が、ＣＲＧＤ−１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９５６）若しくはＣＲＧＡ−１株（受託番号ＦＥＲＭ−１８９５５）又はこれらの子孫である請求項９記載のＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ。
【請求項１１】
銀化合物含有排水中に含まれる微生物を、銀の存在下で培養する工程と、増殖した微生物のうち、乾燥体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる微生物を選択する工程とを含む、銀担持微生物のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法によりスクリーニングされた銀担持微生物。
【請求項１３】
銀化合物含有排水中に含まれる微生物を、銀の存在下で培養する工程と、増殖した微生物のうち、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる微生物を選択する工程と、選択した微生物を培養する工程と、培養した微生物を銀化合物含有液と接触させ、該銀化合物含有液中の銀を前記微生物に担持させることにより該銀化合物含有液中の銀の濃度を低下させることを含む、銀の除去方法。
【請求項１４】
請求項１３記載の方法により、前記銀化合物含有液中の銀を前記微生物に担持させた後、銀を担持させた微生物から銀を回収する工程をさらに含む、銀の回収方法。
【請求項１５】
前記銀化合物含有排水が、写真感光材料生産工場の排水である請求項１１、１３又は１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、銀担持細菌及びそれを用いた銀の除去又は回収方法に関する。さらに、本発明は、銀担持細菌のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
銀及び銀化合物（たとえばハロゲン化銀）は多く写真用感光材料に使われており、フィルムや印画紙の現像処理の際には銀化合物を含んだ排水がでる。従来では、化学的あるいは電気的な処理によってある程度の銀は回収され再利用されてはいるが、これらの処理によっても処理後の排液中にも僅かな銀が残留し回収に限度があった。また、廃フィルムを処理・銀回収する工場において、回収作業に大がかりな設備が必要になりより簡便で安全な銀回収設備が望まれる。その他に現在では銀を含んだ抗菌グッズが数多く出回っている。銀は古くから抗菌活性が高く、環境中への銀の流出は、微量であっても土壌や水中の生態系に何らかの影響を与える可能性は否めず、近年、海外では環境中への銀流出の規制が厳しくなりつつある。排出・流出される銀を回収し排出・流出量を極力減少させることは、資源保全の観点からもさらに環境的な観点から重要な課題である。特に低濃度の銀を含む水から銀を回収し除去するには従来の化学的、電気的方法ではその有効性は十分で無く、効率的な方法が望まれていた。
【０００３】
一方、重金属イオンを植物体や微生物菌体に吸着させ、これを除去する技術はバイオソープションとよばれている。これまでに、カドミウム（Ｖｏｌｅｓｋｙ  Ｂ，ＭａｙＨ，ＨｏｌａｎＺＲ（１９９３）Ｃａｄｍｉｕｍ  ｂｉｏｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ４１：８２６−８２９）、銅（ｄｅ  Ｒｏｍｅ  Ｌ，Ｇａｄｄ  ＧＭ．（１９８７）Ｃｏｐｐｅｒ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓａｒｒｈｉｚｕｓ，Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｒｅｓｉｎａｅ，ａｎｄ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｉｔａｌｉｕｍ．  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：８４−９０）、水銀（Ｔｏｂｉｎ  ＪＭ，Ｃｏｏｐｅｒ  ＤＧ，Ｎｅｕｆｅｌｄ  ＲＪ（１９８４）  Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｌ  ｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ  ｂｉｏｍａｓｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏ  ４７：８２１−８２４）金、（Ｋｕｙｕｃａｋ  Ｎ，Ｖｏｌｅｓｋｙ  Ｂ（１９８９）Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｂｙ  ａｌｇａｌ  ｂｉｏｓｏｒｂｅｎｔ．Ｂｉｏｒｅｃｏｖｅｒｙ１：１８９−２０４）、ウラン（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ  Ｌ，ＪｏｈａｎｓｓｏｎＢ，Ｈａｃｋｅｔｔ  ＴＪ，ＭｃＨａｌｅ  Ｌ，ＭｃＨａｅ  ＡＰ  （１９９５），Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆ  ｕｒａｎｉｕｍ  ｂｙ  Ｔａｒａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ  ＣＢＳ  ８１４．７０  ｂｉｏｍａｓｓ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４２：８０７−８１１）などの重金属の除去あるいは回収の方法が報告されている。しかしながら、銀のバイオソープションに関しては報告例がほとんどない。
【０００４】
銀を吸着・坦持する微生物については、Ｒｏｂｉｎ  Ｍ．  Ｓｌａｗｓｏｎ，  Ｊａｃｋ  Ｔ  Ｔｒｅｖｏｒｓ，  Ｈｕｎｇ  Ｌｅｅ（１９９２  Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １５８：３９８−４０４）、Ｃｈａｒｌｅｙ，  Ｒ．Ｃ．，  Ｂｕｌｌ，  Ａ．Ｔ．（１９７９    Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ１２３：２３９）、Ｐｏｏｌｅｙ，  Ｆ．Ｄ．（１９８２  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：６４２）などに報告されているが、いずれも乾燥重量当りの銀坦持量は３００ｍｇ／ｇ以下であり、銀の回収・除去に用いるにはその能力は十分でない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、環境から銀を効率の良く除去できる微生物を提供することにある。また、該微生物を用いてより効率的に銀を除去又は回収する方法を提供することである。さらに、本発明は、上記微生物をスクリーニングする方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、写真感光材料生産工場の排水に含まれる細菌を、銀含有培地で培養し、増殖してきた細菌の中に、外界から銀を吸収して担持する能力の高い新規な銀担持細菌を見出した。また、これらの銀担持細菌と、銀化合物含有液とを接触させることにより、銀化合物含有液中の銀を該細菌に担持させることができ、それによって、該銀化合物含有液中の銀を除去することができ、さらに、銀担持細菌に担持させた銀を回収することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属に属し、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる、銀の除去又は回収用細菌を提供する。また、本発明は、上記本発明の細菌を、銀化合物含有液と接触させ、該銀化合物含有液中の銀を前記細菌に担持させることにより該銀化合物含有液中の銀の濃度を低下させることを含む、銀の除去方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の方法により、前記銀化合物含有液中の銀を前記細菌に担持させた後、銀を担持させた細菌から銀を回収する工程をさらに含む、銀の回収方法を提供する。さらに、本発明は、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓを提供する。さらに、本発明は、銀化合物含有排水中に含まれる微生物を、銀の存在下で培養する工程と、増殖した微生物のうち、乾燥体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる微生物を選択する工程とを含む、銀担持微生物のスクリーニング方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明のスクリーニング方法によりスクリーニングされた銀担持微生物を提供する。さらに、本発明は、銀化合物含有排水中に含まれる微生物を、銀の存在下で培養する工程と、増殖した微生物のうち、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる微生物を選択する工程と、選択した微生物を培養する工程と、培養した微生物を銀化合物含有液と接触させ、該銀化合物含有液中の銀を前記微生物に担持させることにより該銀化合物含有液中の銀の濃度を低下させることを含む、銀の除去方法、並びに、この銀の除去方法において、銀を担持させた微生物から銀を回収する工程をさらに含む、銀の回収方法を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の銀の除去又は回収用細菌は、写真感光材料生産工場の排水中の細菌を、銀含有培地上で培養し、増殖してきた銀耐性を有する細菌のうち、特に銀担持能力の優れた細菌を選択することより創製された。具体的な創製方法は、下記実施例に詳述されている。なお、銀耐性を有する細菌としては、銀濃度３００ｐｐｍの硝酸銀含有ニュートリエントブロス（ＮＢ）培地で生育可能なものが好ましい。
【０００９】
上記本発明の細菌は、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属に属するものである。下記実施例では、優れた銀担持能力を有する細菌として、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ  ＣＲＧＤ−１株およびＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ  ＣＲＧＡ−１株が単離され、それぞれ、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９５６及びＦＥＲＭ  Ｐ−１８９５５の受託番号で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。なお、ＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の菌学的特性並びに１６ＳｒＤＮＡ（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子）塩基配列は、下記実施例に詳述されている。１６ＳｒＤＮＡ塩基配列をもとにしたＤＮＡシークエンシング結果から、これらの微生物が、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓに分類されるものと同定した。Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓのみならずＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ属細菌に、本発明で述べたような銀担持能力を持つものは知られていなかった。このことから本発明の菌株は新菌株であることがわかる。ＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株は、本発明の細菌の好ましい実施例であるが、これらの子孫も、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる限り好ましい実施例である。なお、ここで、「子孫」とは、上記菌株の分裂により得られた菌であって、上記菌株と比較して何らかの変異を有するもの（変異株）を意味する。なお、上記菌株の分裂により得られた菌であって、全く変異を有さないものは、上記菌株そのものである。
【００１０】
上記本発明の銀担持細菌は、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できるものである。銀担持量は以下のようにして調べることができる。銀イオン濃度が最小生育阻害濃度の５０％〜１００％になるように硝酸銀添加ＮＢ液体培地を調製する。ＮＢ液体培地にて前培養した微生物を、調製した硝酸銀添加ＮＢ液体培地に１／５０〜１／１００量添加し、暗所にて細菌の至適温度近傍（下記実施例では３２℃）で７〜１０日間培養する。菌の増殖は１ｍｌあたりの生菌数と濁度の測定によって確認する。随時、一定量の液体培地を取り出し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）にて２回以上水洗することで菌濃縮液を作成する。菌濃縮液を凍結乾燥した後、銀の定量分析（たとえば、マイクロウエーブ式分解装置で硫硝酸分解後にＩＣＰ発光分析）を行い、乾燥菌体当たりの銀量を求める。なお、最小生育阻害濃度（ＭＩＣ）は、段階的に希釈された硝酸銀を添加したＮＢ寒天培地に前日至適温度（下記実施例では３２℃）で培養した細菌液を白金耳で線描しのち、室温にて３日間培養する。培養後ＮＢ寒天培地に生育が認められなかった最小の硝酸銀濃度をみることにより決定される。なお、ＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の銀担持能力の測定に用いた具体的な方法は下記実施例に詳述されている。なお、培養条件により銀担持量が異なる場合には、多い方の銀担持量が乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上であればよい。
【００１１】
上記本発明の銀担持細菌は、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる細菌であればよいが、銀を、短径１００ｎｍ以上の金属銀粒子として坦持することが可能な細菌であることが好ましい。なお、ここで、「短径１００ｎｍ以上の金属銀粒子として坦持する」とは、銀粒子が成長過程にある場合等もあるので、全ての銀粒子がこの大きさを有することを意味するのではなく、これよりも小さな銀粒子が含まれている場合も包含される。このような大きな金属銀粒子として銀を担持できる細菌は、銀担持能力が大きいのみならず、菌体からの銀の回収も容易であり、好ましい。坦持される銀の形状については、菌を純水に分散させたサンプルを調製し、これを透過型電子顕微鏡にて観察する事で可能である。本発明のＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株については、上記条件で観察したところ、矩形、多角形及び不定形の微粒子が多数観察された。微粒子の元素分析は、電子顕微鏡観察の際に局所Ｘ線エネルギー分析法（ＥＤＳ）により可能であり、本発明のＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株では金属銀の微粒子と確認できた。観察された銀微粒子の多くが短径１００ｎｍ以上、最長で２００ｎｍの矩形、多角形の銀微粒子であった。
【００１２】
上記本発明の銀の除去方法では、上記銀担持細菌を銀化合物含有液と接触させる。ここで、銀化合物含有液としては、銀を除去又は回収したい液であればいずれのものでもよいが、水系の液（主成分として水を含む）が好ましい。好ましい銀化合物含有液として、現像処理後の定着排液から電位分解により一定量の銀を回収した後の電解処理後排液や、写真感光材料生産工場の銀含有排水（通常、数ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ程度の銀が残留）等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。銀化合物含有液と接触させる細菌の量は、特に限定されるものではなく、銀化合物含有液の銀濃度や、細菌の銀担持能力等に応じて、ルーチンな実験により適宜設定することができる。例えば、電気分解による銀回収後の現像処理後の定着廃液を処理する場合には、通常、細菌の濃度で１０４〜１０５個／ｍｌ程度が適当である。また、接触時の温度は、細菌が生育可能な温度であれば特に限定されるものではなく、一定時間内における銀の回収量が最大となるようにルーチンな実験により適宜設定できるし、また、室温下で行えば、温度調整の手間とコストが不要になるという利点がある。通常、室温〜４０℃程度が適当である。また、接触時間は、特に限定されず、銀化合物含有液からの銀の除去が、目標とするレベルにまで到達する時間であり、銀化合物含有液の銀濃度、用いる銀担持細菌の量、銀担持能力、処理温度等に応じてルーチンな実験により適宜設定できる。通常、２日間〜１０日間程度が適当である。なお、接触時間は、液の濁度をモニターすることにより設定することも可能であり、好ましい。すなわち、本発明者らは、本発明の細菌を例えば硝酸銀添加ＮＢ液体培地中にて培養すると培地自体が泥状に濁ることを見出し、菌体中の銀坦持の程度を把握でき、その結果、銀化合物含有液からの銀の回収や除去の状況を把握することを可能とする方法として、銀化合物含有液の濁度を測定する方法を開発した。濁度は、必要であれば攪拌その他の手段で液全体あるいは一部を均一にして測定される。測定波長は特に制限されないが、４００−７００ｎｍが好ましい。どの程度の濁度に達するまで接触を行うかは、それぞれの系に応じて、ルーチンな実験により容易に設定することができる。
【００１３】
上記方法により、銀化合物含有液中の銀が銀担持細菌の菌体内に担持され、銀化合物含有液中の銀濃度が低下する。なお、銀濃度は必ずしも０にはならないが、銀濃度が低下すれば、銀の少なくとも一部が除去されたことになる。従って、本明細書でいう「銀の除去方法」には、銀を完全には除去しないが、銀濃度を低下させる場合も包含される。
【００１４】
上記銀の除去方法において、銀担持細菌に担持された銀を回収することができる。従って、本発明は、上記本発明の銀の除去方法により、前記銀化合物含有液中の銀を前記細菌に担持させた後、銀を担持させた細菌から銀を回収する工程をさらに含む、銀の回収方法をも提供する。銀の回収は、例えば、細菌菌体を遠心分離により回収し、そのまま、又は凍結乾燥処理した後、例えば硝酸のような、銀を溶解できる試薬を作用させることにより、金属銀を溶液の形態で菌から取り出し、回収することができる。硝酸を用いる場合には、硝酸の濃度は特に限定されないが、５〜２０％程度が適当である。あるいは、回収した微生物に対し、卵白リゾチームなどの分解酵素や界面活性剤などを作用させ、菌体を破壊し、必要に応じて遠心分離又は密度勾配遠心分離等を行う事で、金属銀粒子として回収することができる。
【００１５】
本発明はさらに、銀化合物含有排水中に含まれる微生物を、銀の存在下で培養する工程と、増殖した微生物のうち、乾燥体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる微生物を選択する工程とを含む、銀担持微生物のスクリーニング方法を提供する。
【００１６】
このスクリーニング方法において用いられる銀化合物含有排水は、銀化合物を含有し栄養源である有機化合物の豊富なものが好ましく、例えば、写真感光材料の生産工場からの銀含有排水等が好ましい。このような排水には、銀及びタンパク成分が高濃度に含有され、所望の微生物の分離に有利である。本発明のスクリーニング方法では、このような銀化合物含有排水中に含まれる微生物を、銀の存在下で培養する。これは、例えば、銀化合物含有排水又はその希釈物に、硝酸銀やチオ硫酸銀等の水溶性の銀化合物を添加して培養し、次いで、硝酸銀等の可溶性の銀含有化合物を含む又は含まない固形培地上で培養することにより行うことができる。あるいは、排水又はその希釈物を、直接銀含有固形培地上で培養してもよい。また、銀化合物含有排水又はその希釈物に、硝酸銀等の可溶性の銀含有化合物を添加して培養し、次いで、硝酸銀等の可溶性の銀含有化合物を含まない固形培地上で培養し、増殖してきた微生物を、前記排水に添加した銀の濃度よりも高濃度に銀を含む固形培地上で培養してもよい。排水に銀化合物を添加する場合、所望により適当な培地を添加してもよい。また、排水中での培養は、通常、２〜３０日間程度行うことが好ましい。固形培地は、その微生物の培地として周知のものを用いることができ、例えば、細菌の場合には、ＮＢ寒天培地等を用いることができる。銀含有固形培地は、硝酸銀やチオ硫酸銀のような水溶性の銀化合物又は銀ゼオライトなどの含銀無機物等を培地に添加して固化させることにより容易に調製することができる。固形培地上での培養は、微生物のコロニーが形成されるまで行えばよいが、通常２〜３０日間程度である。また、排水中での培養も固形培地上での培養も、培養温度は特に限定されないが、多くの微生物が生育可能な温度が好ましく、室温〜４０℃程度が好ましい。室温で行えば、手間とコストがかからない利点がある。上記方法により、銀濃度３００  ｐｐｍの培地で生育可能な微生物を選択することが好ましい。
【００１７】
上記した培養により、生育してくる微生物は、銀含有培地で生育してくる微生物であるから当然、銀耐性を有しているので、次に、それらの微生物の銀担持能力を調べる。もっとも、銀含有培地で生育してくる微生物のコロニーが多数得られた場合等に、より銀耐性の高い微生物を選択するために、生育してきた微生物の銀耐性を確認してもよい。銀耐性の確認は、日本薬局方（１４改正版）にて記載され薬剤耐性の確認方法に準じて行うことができる。銀に対する耐性は、色々な濃度の銀化合物、たとえば硝酸銀やチオ硫酸銀などの水溶性銀化合物や銀ゼオライトなどの含銀無機物等を添加した寒天培地（たとえばＮＢ寒天培地）に、液体培地（たとえばＮＢ液体培地）中で前培養した上記の分離微生物を接種し、生育阻害の有無を見る。最小生育阻害濃度の高い細菌を銀耐性菌として選抜する。本発明のＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株では、銀濃度５００ｐｐｍ（最大で７００ｐｐｍ）の硝酸銀含有ＮＢ寒天培地にて生育が可能であった。なお、培地にたとえば硝酸銀など水溶性銀化合物を添加した後に光に長時間さらすと、培地中のタンパク成分と光の作用によりコロイド状の銀微粒子が培地中に生じ、結果にばらつきを生じるため、培養は暗所にて行う事が望ましい。
【００１８】
次に、上記工程により得られた銀耐性微生物の銀担持能力を測定し、乾燥体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持できる微生物を選択する。銀担持能力の測定は、上記銀の除去又は回収用細菌について説明した方法（下記実施例も含む）に準じて行うことができる。なお、担持された金属銀粒子の定量は、上記と同様に行われるが、微生物の培養条件は、各微生物について至適な条件下で行うことができる。
【００１９】
本発明はさらに、上記本発明のスクリーニング方法により得られた微生物を用いた、銀の除去方法及び銀の回収方法をも提供する。銀の除去工程及びその後の回収工程は、上記した本発明の銀の除去又は回収用細菌を用いた、上記した銀の除去工程及びその後の回収工程と同様にして行うことができる。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
Ａ．微生物のスクリーニング
東京都にある感光材料生産工場の含銀排水２０ｍｌを採取し、マグネチックスターラーを用い２５℃で撹拌培養した。１日置きに硝酸銀水溶液を添加し、スタート時の銀濃度１５ｐｐｍから最終的に１５０ｐｐｍに上げた。攪拌培養１４日目に該排水サンプルから一部を取り出し、無菌状態のＮＢ液体培地に添加し３２℃２０時間前培養を行った後、銀濃度５０ｐｐｍの硝酸銀添加ＮＢ液体培地にて２５℃７日間培養した。その希釈液をＮＢ寒天培地に播種し、コロニーの増菌が確認されたところでコロニーから菌を分離し、順次銀濃度を上げた硝酸銀添加ＮＢ培地中にて２５℃培養した。最終的に銀濃度３００ｐｐｍの硝酸銀添加ＮＢ培地で増殖可能な菌株を複数単離した。なお、培地は１２１℃２０分間高圧蒸気滅菌で、無菌状態にした後、硝酸銀水溶液を添加した。
【００２２】
Ｂ．銀耐性の確認
Ａ．にて得られた菌株を、ＮＢ培地で３２℃２０時間前培養後、色々な濃度の硝酸銀を添加したＮＢ寒天培地（直径９．５ｃｍ）に０．１ｍｌを塗沫した。室温で１週間培養し、生育阻害の有無を確認することで銀耐性の強い菌株を選び出した。その結果、ＣＲＧＤ−１株、ＣＲＧＡ−１株と名付けた２種の菌株が特に強い銀耐性を示した。硝酸銀の最小生育阻害濃度はそれぞれ７００ｐｐｍ、５００ｐｐｍであった。
【００２３】
Ｃ．菌株の同定
本発明の菌株ＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の菌学的特性を表１に、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号１に、および系統樹を図１に示す。なお、ＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は完全に一致しており、したがって、系統樹も完全に一致している。したがって、配列番号１及び図１は、ＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の両者に共通のものである。菌株の主な性状の調査方法は、通常公知の試験方法にて行った。具体的には「微生物の簡易検査方法」（衛生技術協会、１９８０年）に記載されている方法を参考にした。追加で市販のブドウ糖非発酵性グラム陰性桿菌同定キット（ＡＰＩ２０ＮＥ  ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  ｓａ）を用いて試験した。また、１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（５’末端側から５００ｂｐの部分配列）のシークエンシングに関しては、ゲノムＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの基本槽操作はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３０８１３２  Ｒｅｖ．Ａ）に従った。菌株ＣＲＧＤ−１株、ＣＲＧＡ−１株について得られたそれぞれの１６ＳｒＤＮＡ塩基配列から相同性検索を行った。両菌株とも１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列は相同率１００％でＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ  の１６Ｓ  ｒＤＮＡと一致した。さらに相同性検索された上位１０菌株を合わせて、菌株ＣＲＧＤ−１株、ＣＲＧＡ−１株それぞれに対して分子系統樹を作成した。その結果分子系統樹上でも両菌株とも１６Ｓ  ｒＤＮＡはＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ  の１６Ｓ  ｒＤＮＡと同じ場所に位置した。上記の結果から、本発明の菌株ＣＲＧＤ−１株、ＣＲＧＡ−１株はＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｔｅｍｐｅｒａｎｓ  に帰属する菌株であることが推定される。なお、本発明の菌株ＣＲＧＤ−１株、ＣＲＧＡ−１株は、平成１４年（２００２年）７月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９５６及びＦＥＲＭ  Ｐ−１８９５５である。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
Ｄ．銀担持量の確認
ＮＢ液体培地にて３２℃２０時間前培養した本発明の菌株ＣＲＧＤ−１株、ＣＲＧＡ−１株を、硝酸銀添加ＮＢ液体培地（銀濃度２５０ｐｐｍ）に１／５０〜１／１００量添加し、暗所にて３２℃１１日間培養した。培養中一定期間ごとに培養液４０ｍｌを採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）にて２回水洗し菌体濃縮液を作成した。菌体濃縮液を−３０℃で予備冷却したのち真空凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ  ｆｒｅｅｚｄｒｙｅｒ  ＦＤ−１、東京理化機器製）で３時間処理した。凍結乾燥サンプル総重量を０．０１ｍｇの桁まで測定する。次にサンプル全量をフラスコに入れ、マイクロウエーブ式湿式分解装置（Ｍｉｃｒｏｄｉｇｅｓｔ  ３．６、プロラボ社製）で硫硝酸分解を行う。分解に用いた酸は関東化学社製ＥＬグレード硫酸およびＥＬグレード硝酸を用いた。分解後の溶液は超純水を用いて１００ｍｌに調製した。溶液化した試料の測定には、ＩＣＰ発光分析装置（測定条件；分析波長３２８．０６８ｎｍ、出力１．３ｋｗ  ＳＰＳ４０００、セイコー電子製）を用いた。検量線作成用には、試料無しで硫酸分解を行った分解液に、Ａｇ基準試薬（関東化学社製原子吸光用  １０００ｐｐｍ）を添加したものを用いた。検量線をもとに試料の銀の定量分析を行い、凍結乾燥サンプル中の銀坦持量を得た。凍結乾燥サンプル総重量から銀坦持量を減じた値を乾燥菌体重量とし、乾燥菌体当たりの銀坦持量を計算により求めた。結果を図２に示す。
【００２６】
Ｅ．銀担持菌の形態観察
本発明のＣＲＧＡ−１株及びＣＲＧＤ−１株を銀濃度３５０ｐｐｍの硝酸銀添加ＮＢ培地にて３２℃７日間培養した後、培養液５０ｍｌを採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）にて２回水洗し菌体濃縮液を作成した。菌体濃縮液約１０μｌを適当に超純水に分散させ、電子顕微鏡（２０００ＦＸ  日本電子製）にて倍率１万〜２万５千倍で観察したところ、観察された銀微粒子の多くが短径１００ｎｍ以上、最長で２００ｎｍの矩形、多角形の銀微粒子であった。最大で一辺が２００ｎｍの銀粒子が菌体に担持されている事が確認された。電子顕微鏡写真を図３に示す。なお、この場合の銀粒子の坦持最大重量は、乾燥菌体重量１ｇあたりＣＲＧＤ−１株では７１０ｍｇ、ＣＲＧＡ−１株では６２５ｍｇであった。
【００２７】
Ｆ．銀粒子の元素分析
菌体表面に担持されている銀粒子の成分分析をするため、上記Ｅ．の電子顕微鏡観察サンプルに対し局所Ｘ線エネルギー解析機（ＥＤＳ  シリーズＩＩ、ＴｒａｃｏｒＮｏｒｔｈｅｒｎ製）で元素分析を行った。その結果、Ａｇのみのエネルギーが検出された（図４）。よって細菌体に担持されている銀粒子は、金属銀であるということがわかった。なお、後方に見られるＣｕの２つのピークは、銅製メッシュに由来するものである。
【００２８】
Ｇ．定着廃液からの銀化合物除去
電気分解による銀回収後の現像処理後の定着廃液を、ＮＢ液体培地にて３０、６０倍希釈し、試験液１，２を調製した。各試験液５ｍｌに対して、ＮＢ液にて３２℃１８時間前培養した本発明のＣＲＧＡ−１株、ＣＲＧＤ−１株それぞれを全液量に対し１／５０量添加し、暗所下３２℃にて培養した。４日後に試験液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）し、その上澄み中の含有銀量を上記Ｅ．と同等の方法でＩＣＰ−ＡＥＳにて測定したところ、最大で７１％の銀量低下が見られた（表２）。
【００２９】
【表２】
表２  ；  定着廃液からの銀の除去
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【００３０】
Ｈ．菌体担持銀の回収
ＮＢ液体培地にて３２℃２０時間前培養した本発明のＣＲＧＤ−１株を、銀濃度２５０ｐｐｍの硝酸銀添加ＮＢ液体培地に１／５０〜１／１００量添加し、暗所にて３２℃７〜１０日間培養する。培養中一定期間ごとに培養液４０ｍｌを採取し、純水を添加して１００ｍｌに調整後、濁度を濁度計（波長条件７００ｎｍ、  汚泥濃度計ＭＬ−５３、セントラル科学製）で測定した。その後、該培養液に対し上記Ｄと同様に実施し、菌体に担持されている銀量を測定した。培養液４０ｍｌ中に含まれる初期の銀量は１０ｍｇであり、菌体に担持されている銀量との比から、銀回収率を求めた。図４に結果を示す。濁度が１００００ｐｐｍに達したところで菌体に担持される銀量が最大になった。濁度が上昇するに伴い銀回収率が向上する事から、濁度から銀の回収の程度が判断できることが明確になった。
【００３１】
Ｉ．菌体担持銀から銀の回収
上記Ｄと同様な方法で得た凍結乾燥サンプル１８．９ｍｇ（含銀量７．２７ｍｇ）（乾燥菌体当たりの銀坦持量：６２５ｍｇ／ｄｒｙ菌ｇ、培養液５０ｍｌに相当）を取り、１０％硝酸１ｍｌを添加し７０℃で３０分間処理した後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）にて上清として回収液８００μｌを得た。回収液に対し上記Ｅ．と同様のＩＣＰ発光分析による銀量分析を実施した。その結果、回収液の銀濃度は９０３７ｐｐｍ（９．０３７ｍｇ／ｍｌ）であり、凍結乾燥サンプルからの銀の回収率は９９．４％であった。また、銀濃度の濃縮培率は３６倍（２５０ｐｐｍから９０３７ｐｐｍ）であり、高い効率で銀を回収・濃縮できることが分かった。また、上記と同様の実験系で、硝酸処理をする際に７０℃３０分と２５℃１日で比較したところ、それぞれの回収率は、９９．０％と９９．８％であり、熱分解よりも安全な方法で銀を回収濃縮できることが出来た。
【００３２】
以上の結果から、本発明の菌株は可溶化している銀化合物から銀を微粒子として担持する能力に優れており、含銀液中からの銀化合物を効率よく除去することが出来る。また、含銀液中からの銀を効率よく回収することが出来る。
【００３３】
【発明の効果】
本発明により、写真の定着廃液等の銀化合物含有液から、銀を吸収して多量に担持できる細菌及びそれを用いた銀の除去又は回収方法が初めて提供された。本発明の方法に用いられる銀担持細菌は、乾燥菌体重量１グラム当たり６００ｍｇ以上の金属銀粒子を担持でき、また、担持された金属銀粒子を容易に回収できるので、本発明は、写真の定着廃液等の銀化合物含有液からの銀の除去又は回収に大いに貢献するものと考えられる。さらに、本発明により、銀化合物含有液から、銀を吸収して多量に担持できる微生物のスクリーニング方法が初めて提供された。
【００３４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例で得られたＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の分類学上の位置を示す系統樹である。
【図２】本発明の実施例で得られたＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の銀担持量の経時変化を示す図である。
【図３】本発明の実施例で得られたＣＲＧＤ−１株及びＣＲＧＡ−１株の透過型電子顕微鏡写真である。
【図４】本発明の実施例で得られたＣＲＧＤ−１株の局所Ｘ線エネルギー解析結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例で得られたＣＲＧＤ−１株の、培養時間と、濁度及び銀回収率との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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