(57)【要約】【目的】  微生物ゲノム中に、分断されてクローニングされている外来遺伝子を構成するゲノムDNAを効率よく再構成する方法を提供する。【構成】  50kb以上の目的DNAを有するプラスミドを用いて、該プラスミド中の目的DNAをはさむ2つの相同配列を予め挿入したゲノムを有する微生物を形質転換することにより、50kb以上の目的DNAを一度に微生物ゲノム中に導入した。本法を用いて、プラスミド中に分断されてクローニングされている外来遺伝子を構成するゲノムDNAを微生物ゲノム中に再構成することができ、再構成されたゲノム遺伝子を遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製等に好適に用いることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する方法であって、以下の工程から成ることを特徴とする方法。
（ａ）同一のベクターに外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡの全長の異なる部分配列が目的ＤＮＡとして挿入され、かつ各目的ＤＮＡがいずれかの他の目的ＤＮＡとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で調製された目的ＤＮＡを含むいずれかのプラスミドにより、該プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を予め挿入したゲノムを有する微生物細胞を形質転換する工程、
（ｃ）上記工程（ａ）で調製され上記工程（ｂ）で用いたプラスミド中の目的ＤＮＡと重複配列を有する目的ＤＮＡを含む他のプラスミドを選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｂ）で形質転換された微生物細胞を、上記工程（ｃ）で選択されたプラスミドにより形質転換する工程、
（ｅ）上記工程（ｄ）で形質転換された微生物細胞から、上記工程（ｂ）及び（ｄ）で用いた２つのプラスミド中の目的ＤＮＡが、それぞれ重複配列と相同配列における相同組換えにより連結されたＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、
（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物細胞に導入することにより、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する工程。
【請求項２】
微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する方法であって、以下の工程から成ることを特徴とする方法。
（ａ）ベクターに外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡの全長の異なる部分配列が目的ＤＮＡとして挿入され、かつ各目的ＤＮＡがいずれかの他の目的ＤＮＡとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する工程、
（ｂ）同一のゲノムを有する微生物細胞に、上記工程（ａ）で調製された各プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を微生物ゲノム中の同じ位置に予め挿入し、該微生物細胞を各々のプラスミドにより形質転換する工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で形質転換された、いずれかの目的ＤＮＡをゲノム中に有する微生物細胞から、ゲノムＤＮＡを抽出する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で抽出したゲノムＤＮＡ中の目的ＤＮＡと重複配列を有する他の目的ＤＮＡをゲノム中に有する微生物細胞を、上記工程（ｃ）で得られたゲノムＤＮＡにより形質転換する工程、
（ｅ）上記工程（ｄ）で形質転換された微生物細胞から、上記工程（ｃ）及び（ｄ）で用いた２つの微生物ゲノム中の目的ＤＮＡが、それぞれ重複配列と微生物ゲノム中の共通配列における相同組換えにより連結されたＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、
（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物に導入することにより、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する工程。
【請求項３】
微生物ゲノムが、２つの相同配列の間に２つ以上のｃＩリプレッサー遺伝子を有し、各ｃＩリプレッサー遺伝子の間にスペーサーが挿入されたものであって、かつ、該ゲノム上の他の位置にＰｒプロモーターの制御下に置かれたマーカーＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
形質転換体の選択が、マーカーＤＮＡを用いて行われる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
宿主として用いる微生物が、Bacillus属細菌又は高度好熱菌である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法により作製された微生物。
【請求項７】
外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡの全長を含み、かつその長さが１００ｋｂ以上であることを特徴とするプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載のプラスミドを用いることを特徴とする遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製方法。
【請求項９】
５０ｋｂ以上の目的ＤＮＡを有するプラスミドから微生物ゲノムへの目的ＤＮＡの移し換え方法であって、プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を予め挿入したゲノムを有する微生物を目的ＤＮＡが挿入されたプラスミドで形質転換する方法。
【請求項１０】
プラスミドがＢＡＣベクターである請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物ゲノム中に、分断されてクローニングされている外来遺伝子を構成するゲノムDNAを効率よく再構成する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物あるいは植物等の真核生物の遺伝子は、ゲノム中で数10kbから数100kbに渡るものも多く、さらに、遺伝子から100kb離れたところに、cisに作用する配列が存在している例もある。特に発生段階特異的もしくは組織特異的に発現する遺伝子を観察するためには、数100kb程度までの領域のDNAが一度に取り扱えることが望ましい。このような動物または植物等の真核生物のゲノムから数10kb以上の巨大DNAをクローニングし、改変した後、該改変巨大DNAを元の動物または植物の個体、組織、及び培養細胞等に導入することにより、遺伝子改変動植物を作製する一連の操作技術においては、(1)巨大DNAを少ない操作回数でクローニングできること、(2)DNA改変が簡便にできること、(3)クローニングされたDNAが安定に保持されること、及び(4)クローニングされた目的DNAの回収が簡便にできること等が重要な課題となっている。
【０００３】
上記した(1)〜(3)の課題について、本発明者らは枯草菌のゲノム中に巨大DNAを挿入し、挿入したDNAについて改変操作する方法を提案している（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。また、本発明者らは、上記(4)の課題についても、標的DNAをプラスミドとして簡便かつ高純度に回収する方法を提案している（例えば、特許文献２参照）。
しかし、上記(1)の課題については、巨大DNAを予め断片化して枯草菌のゲノム中に挿入する方法等は提供されているものの、例えば、操作性及び安定性に優れたプラスミドとしてクローニングされている50kb以上の巨大DNAを、一度の形質転換で枯草菌ゲノム中に移し換える方法は報告されていない。枯草菌では、プラスミドのように環状のDNAも任意の場所で切断されて線状になって取り込まれることが知られており、切断される位置が不特定であることから、特にプラスミドに含まれる導入されるべきDNAが50kb以上の巨大なものである場合には所望の相同組換えが生じる確率が非常に低いと考えられているためである。
【０００４】
近年、巨大なDNAのクローニングが可能なベクターとして、BAC（例えば、非特許文献２参照）やYAC（例えば、非特許文献３参照）が開発されている。例えば、BACは100kb以上のDNAを保持でき、YACは1000kb以上のDNAをも保持できることから、このようなベクターを用いたゲノムライブラリーが多数構築されている。
従って、50kb以上の巨大DNAを有するプラスミドから枯草菌等の微生物ゲノムへの巨大DNAの移し換え方法が確立されれば、このようなゲノムライブラリー中のクローンを用いて簡便にゲノム由来の巨大DNAを利用することができるようになると期待されていた。また、このような手法が確立されることにより、最終的に、前述したような動物又は植物等の真核生物がゲノム中に有する数10kbから数100kbに渡る遺伝子を一度に取り扱うことができるようになると期待されていた。
【特許文献１】特開2000-93号公報
【特許文献２】特開2002-17350号公報
【非特許文献１】板谷光泰、「自然に学んだ枯草菌ゲノムベクター」、バイオサイエンスとインダストリー、vol.57, No.8, 540-543 (1999)
【非特許文献２】Shizuya, H.,他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87, 8242-8247(1990)
【非特許文献３】Burke,D.T.,他、Science, 236, 806-811(1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、微生物ゲノム中に、分断されてクローニングされている外来遺伝子を構成するゲノムDNAを効率よく再構成する方法等を提供するためになされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、BACベクターに挿入されている50kb以上のゲノムDNAの部分断片を、一度の形質転換で枯草菌ゲノム中に導入できることを見出した。また、該部分断片同士を相同組換えにより連結していくことによって、外来遺伝子を構成するゲノムDNAを枯草菌ゲノム中で再構成できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
【０００７】
すなわち本発明によれば、下記（１）の方法が提供される。
（１）微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する方法であって、以下の工程から成ることを特徴とする方法。
（ａ）同一のベクターに外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡの全長の異なる部分配列が目的ＤＮＡとして挿入され、かつ各目的ＤＮＡがいずれかの他の目的ＤＮＡとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で調製された目的ＤＮＡを含むいずれかのプラスミドにより、該プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を予め挿入したゲノムを有する微生物細胞を形質転換する工程、
（ｃ）上記工程（ａ）で調製され上記工程（ｂ）で用いたプラスミド中の目的ＤＮＡと重複配列を有する目的ＤＮＡを含む他のプラスミドを選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｂ）で形質転換された微生物細胞を、上記工程（ｃ）で選択されたプラスミドにより形質転換する工程、
（ｅ）上記工程（ｄ）で形質転換された微生物細胞から、上記工程（ｂ）及び（ｄ）で用いた２つのプラスミド中の目的ＤＮＡが、それぞれ重複配列と相同配列における相同組換えにより連結されたＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、
（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物細胞に導入することにより、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する工程。
【０００８】
また、本発明の別の態様によれば、下記（２）の方法が提供される。
（２）微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する方法であって、以下の工程から成ることを特徴とする方法。
（ａ）ベクターに外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡの全長の異なる部分配列が目的ＤＮＡとして挿入され、かつ各目的ＤＮＡがいずれかの他の目的ＤＮＡとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する工程、
（ｂ）同一のゲノムを有する微生物細胞に、上記工程（ａ）で調製された各プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を微生物ゲノム中の同じ位置に予め挿入し、該微生物細胞を各々のプラスミドにより形質転換する工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で形質転換された、いずれかの目的ＤＮＡをゲノム中に有する微生物細胞から、ゲノムＤＮＡを抽出する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で抽出したゲノムＤＮＡ中の目的ＤＮＡと重複配列を有する他の目的ＤＮＡをゲノム中に有する微生物細胞を、上記工程（ｃ）で得られたゲノムＤＮＡにより形質転換する工程、
（ｅ）上記工程（ｄ）で形質転換された微生物細胞から、上記工程（ｃ）及び（ｄ）で用いた２つの微生物ゲノム中の目的ＤＮＡが、それぞれ重複配列と微生物ゲノム中の共通配列における相同組換えにより連結されたＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、
（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物に導入することにより、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡを再構成する工程。
【０００９】
また、これらの本発明の好ましい態様によれば、
（３）微生物ゲノムが、２つの相同配列の間に２つ以上のｃＩリプレッサー遺伝子を有し、各ｃＩリプレッサー遺伝子の間にスペーサーが挿入されたものであって、かつ、該ゲノム上の他の位置にＰｒプロモーターの制御下に置かれたマーカーＤＮＡが挿入されていることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の方法、
（４）形質転換体の選択が、マーカーＤＮＡを用いて行われる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５）宿主として用いる微生物が、Bacillus属細菌又は高度好熱菌である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法
が提供される。
【００１０】
また、本発明の別の態様によれば、（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法により作製された微生物が提供される。
さらに、本発明の別の態様によれば、
（７）外来遺伝子を構成するゲノムＤＮＡの全長を含み、かつその長さが１００ｋｂ以上であることを特徴とするプラスミド、
（８）上記（７）に記載のプラスミドを用いることを特徴とする遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製方法、
（９）５０ｋｂ以上の目的ＤＮＡを有するプラスミドから微生物ゲノムへの目的ＤＮＡの移し換え方法であって、プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を予め挿入したゲノムを有する微生物を目的ＤＮＡが挿入されたプラスミドで形質転換する方法、
が提供される。
【００１１】
上記（９）の発明の好ましい態様によれば、（１０）プラスミドがＢＡＣベクターである上記（９）に記載の方法が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、BAC等のベクターを用いたゲノムライブラリーを利用して微生物ゲノム中で外来遺伝子を構成するゲノムDNAを簡便に再構成することができ、プラスミド等の状態でその全長を取得することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
１．微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する方法（方法１）
本発明の微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する方法の第1は、以下の工程から成ることを特徴としている。
（ａ）同一のベクターに外来遺伝子を構成するゲノムDNAの全長の異なる部分配列が目的ＤＮＡとして挿入され、かつ各目的ＤＮＡがいずれかの他の目的ＤＮＡとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する工程、
（ｂ）上記工程（ａ）で調製された目的ＤＮＡを含むいずれかのプラスミドにより、該プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を予め挿入したゲノムを有する微生物細胞を形質転換する工程、
（ｃ）上記工程（ａ）で調製され上記工程（ｂ）で用いたプラスミド中の目的ＤＮＡとの重複配列を有する目的ＤＮＡを含む他のプラスミドを選択する工程、
（ｄ）上記工程（ｂ）で形質転換された微生物細胞を、上記工程（ｃ）で選択されたプラスミドにより形質転換する工程、
（ｅ）上記工程（ｄ）で形質転換された微生物細胞から、上記工程（ｂ）及び（ｄ）で用いた２つのプラスミド中の目的ＤＮＡが、それぞれ重複配列と相同配列における相同組換えにより連結されたＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、
（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物細胞に導入することにより、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する工程。
【００１４】
この方法１の概要を模式的に図３に示す。以下、各工程の詳細について説明する。
方法１の工程（ａ）
本発明において用いられる外来遺伝子を構成するゲノムDNA（以下、これを「ゲノム遺伝子」と称することがある）とは、これを導入する微生物以外のある遺伝子座に存在する全てのイントロン及びエクソンを含むDNAを意味するが、再構成されて用いられた時にこれと同様の機能を有するものであれば必ずしも元のゲノム遺伝子の全てを含んでいなくてもよい。また、再構成された後に挿入、置換、欠失、変異等の遺伝子工学的な改変を加えたもの等も、本発明のゲノム遺伝子の全長に含まれる。ゲノム遺伝子は、これを導入する微生物以外のいかなる生物種由来のものでも、いかなる機能を有する遺伝子を構成するものでもよく、大きさ等は特に限定されないが、100kb以上のものが好ましく用いられる。生物種としては、具体的には、例えば、哺乳動物、植物等が挙げられ、哺乳動物としては、ヒト等の哺乳類、マウス、ラット等の齧歯類等が挙げられる。また、例えば、癌、免疫、代謝異常、成長、耐寒、耐乾燥、二次代謝等に関連する遺伝子を構成するゲノムDNAが好ましく用いられる。
【００１５】
このようなゲノム遺伝子の全長の異なる部分配列が同一のベクターに目的DNAとして挿入され、かつ各目的DNAがいずれかの他の目的DNAとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する。目的DNAとは、ゲノム遺伝子のいずれかの部分配列のうち、好ましくは50kb以上、より好ましくは100kb以上の長さを有するものであり、これらはお互いに重複配列を有し、全部でゲノム遺伝子の全長をカバーするものである。また、その重複配列は、相同組換えが起こるのに十分な長さであればよく、具体的には、1kb以上、10kb以下であることが好ましい。これらの目的DNAは、その塩基配列の全てが決定されている必要はないが、ある目的DNAが他のどの目的DNAとどの位の長さの重複配列を有するかが認識できる程度に解析されている必要がある。
【００１６】
目的DNAが挿入されるベクターとしては、該DNAを安定的に保持できるものであればいかなるものでもよいが、50kb以上の巨大な目的DNAを安定的に保持する能力を有するものが好ましく用いられる。具体的には、例えば、BAC（Bacterial artificial chromosome）、YAC（Yeast artificial chromosome）等のベクターが挙げられるが、YACについては、クローニング操作中に物理的なDNAの損傷やクローニング効率、安定性等の面で問題が生じやすいことから（Larionov,V.,他、Nucleic Acids Research, 22,20,4154(1994)；Neil,D.L.,他、Nucleic Acids Research, 18, 6,1421(1990)）、特にBACベクターが好ましく用いられる。より具体的には、例えば、前記プラスミド群として、任意の生物種由来のゲノムDNAの部分断片が挿入されているBACライブラリー等のゲノムライブラリーから、目的遺伝子を構成するゲノムDNAの全長の異なる部分配列を有し、かつ各部分配列がいずれかの他の部分配列とお互いに重複配列を有するクローン群を選択し、該クローンを増幅、精製したものを用いることができる。このようなゲノムライブラリーとしては、市販のもの等を好ましく用いることができるが、対象となる生物試料（組織又は細胞など）から抽出したゲノムDNAを適当な制限酵素で消化して適切な長さの断片にするか、又は、超音波破砕機等を用いて物理的に適当な長さに分断し、これに適当な制限酵素認識配列を有するアダプターを付加した後、これらを同一の制限酵素認識配列を有する、例えばBACベクター中に連結し、これを宿主に形質転換することによってゲノムライブラリーを構築する方法を用いて調製することもできる。
【００１７】
上記プラスミド群の選択のための解析方法としては、目的遺伝子の一部の塩基配列を有するプローブまたはプライマー等を用いて、ゲノムライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを選択した後に、該クローンに含まれる挿入DNAが目的ゲノム遺伝子のどの部分の部分配列（断片）であるかをゲノムマッピング法等の公知の方法で解析することにより行うことができる。
【００１８】
方法１の工程（ｂ）
上記工程（ａ）において調製されたプラスミド群中のいずれかのプラスミドにより、該プラスミド中の目的DNAをはさむ2つの相同配列を予め挿入したゲノム（以下、これを「相同配列挿入ゲノム」と称することがある）を有する微生物細胞を形質転換する。このとき、プラスミドは任意に選択することができ、どの部分配列を目的DNAとして含むものでもよい。該プラスミド中の目的DNAをはさむ2つの相同配列としては、目的DNAの両末端に隣接する配列を用いればよく、その長さは特に限定されないが、一般的には1kb以上、好ましくは2kb以上である。例えば、BACベクターの配列（以下、これを「BACベクター配列」と称することがある）を用いる場合には、BACベクターの全長（約7kb）を約1/2ずつ挿入することが好ましい。
【００１９】
なお、ここで、本明細書において相同組換えとは、1対の二本鎖DNAの相同的な塩基配列をもつ部分に起こる組換えを意味する。また、本明細書で言う相同配列とは、所望の相同組換えを引き起こすことができる限り、100%の配列同一性を有する必要はない。すなわち、2つの相同配列は実質的に相同であればよく、例えば、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、特に好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相同性を有していればよい。
【００２０】
相同配列の微生物ゲノムへの挿入は、相同配列挿入ゲノムをプラスミドで形質転換した際に、相同配列における相同組換えが生じ、その結果、相同配列に挟まれた目的DNAが該ゲノムに組み込まれるように行う必要がある。これを図３を用いて詳細に説明する。選択したプラスミド（図３の「プラスミド」参照）は矢印で示される２つの相同配列を有し、それに挟まれるように目的DNA（図３の「Ａ」で示される黒線）を有する。この相同配列を微生物ゲノムへ挿入する場合、それぞれの相同配列は、図３の「微生物ゲノム」に示されるように、目的DNAを挟んでプラスミド中で存在していたとおりの方向になるように微生物ゲノム中へ挿入する。これを逆向きに微生物ゲノムへ挿入すると、相同組換えにより微生物ゲノムが目的DNAに置き換わってしまうめ、形質転換体は得られない。
【００２１】
このような相同配列を予め挿入する微生物としては、本発明のゲノム遺伝子を自己のゲノム上に保持することができ、ゲノム遺伝子に改変を導入できる微生物であればいかなるものでもよいが、Bacillus属細菌又は高度好熱菌が好ましく用いられる。Bacillus属細菌の種類は特に限定されないが、例えば、B.subtilis（枯草菌）、B.megaterium（巨大菌）、B.anthracis（脾脱疽菌）、B.cereus、B.stearothermophilus（中度好熱菌）などが挙げられる。好ましくは、DNAを取り込む能力と組換え能力に優れたB.subtilis（枯草菌）が用いられる。高度好熱菌とは、高温下でのみ生育できる細菌の総称である。
【００２２】
形質転換及び相同組換えは常法により行うことができ、具体的には、例えば、通常の条件下で培養された前記微生物細胞を含む培養液に、上記プラスミド群中のいずれかのプラスミドを含むDNA溶液を添加すればよい。枯草菌はDNA溶液からDNA断片を自発的に取り込む性質を有し、菌体内に取り込まれたDNAは、ゲノム中に予め組み込まれた相同配列で相同組換えを起こす。その結果、目的DNAを枯草菌ゲノム中に導入することができる。微生物ゲノム中の相同配列を組み込む位置としては、相同配列や目的DNAの挿入によって該微生物が死滅することがない限り、いかなる位置であってもよいが、例えば枯草菌の場合には、proB遺伝子等のアミノ酸要求性遺伝子の内部等が挙げられる。形質転換および相同組換えの詳細は、小倉光雄、バイオサイエンスとインダストリー、Vol.57, No.8, 532-535(1999)、板谷光泰、日本農芸化学会誌、Vol.67, No.4, 703-706 (1993)、並びに板谷光泰、日本農芸化学会誌、Vol.68, No.11, 1545-1550 (1994)等に記載されている。
【００２３】
かくして得られる形質転換体は通常用いられる培地で、適当な条件下、適当な時間培養する。培地は液体でも固体でもよいが、液体培地が好ましい。培養温度については、本発明の方法に用いる細菌が増殖できる温度であれば特に制限はないが、通常20〜80℃の範囲で行われる。また培養途中のpHについても宿主細菌が生育できる範囲であればいかなるものであってもよい。
【００２４】
ここで、好ましくは、前記プラスミド群中のいずれかのプラスミド中の目的DNAが、該プラスミド中の目的DNAをはさむ2つの相同配列における相同組換えによりゲノム中に正しく導入された形質転換体を選択する。選択方法としては、予め微生物ゲノム中に2つの相同配列の間にマーカーDNAが存在するようにこれらを挿入しておき（図３の「微生物ゲノム」の「M1」で示される位置）、該マーカーDNAの発現が失われたことを指標に選択する方法、PCR法等により配列を解析して正しく導入されたことを確認する方法等が挙げられるが、マーカーDNAを用いる方法が好ましい。マーカーDNAとしては、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子、及びそれらを制御する機能を有するDNA等が挙げられ、薬剤耐性遺伝子が好ましく用いられる。その具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンS耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２５】
さらに、目的DNAが正しく導入された微生物細胞のみが生育する条件下でのポジティブ選択と、特定の形質が発現することにより細胞が死滅するような選択条件下でのネガティブ選択とを組み合わせた二重選択等により、形質転換体を選択することもできる。
また、リプレッサー遺伝子を利用することにより、2種以上のマーカーを組み合わせた選択を行うこともできる。具体的には、例えば、ゲノム中の他の位置にPrプロモーターにより発現が制御されているネオマイシン耐性遺伝子(Pr-neo)を有する微生物に、2つの相同配列の間にスペクチノマイシン耐性遺伝子及びcIリプレッサー遺伝子を有するDNAを挿入すると、cIリプレッサー遺伝子が発現している株はcIリプレッサータンパクがPrプロモーターに結合して下流のネオマイシン耐性遺伝子の発現を抑制するため、ネオマイシン感受性となる。また、スペクチノマイシン耐性遺伝子の発現によりスペクチノマイシン耐性を示す。この微生物細胞を上記したような方法で形質転換すると、2つの相同配列における相同組換えにより目的DNAが導入され、スペクチノマイシン耐性遺伝子及びcIリプレッサーが失われる。cIリプレッサータンパクが供給されなくなった株は、Prプロモーターの発現抑制が解除されるためにネオマイシン耐性遺伝子が発現してネオマイシン耐性を示し、かつスペクチノマイシン感受性となる。この薬剤耐性の変化を利用して、目的の形質転換体を選択することができる（Itaya,M., Biosci.Biotech.Biochem., 63, 602-604(1999)）。
【００２６】
また、リプレッサー遺伝子は、1つの微生物ゲノム中に2つ以上を導入して用いることができる。すなわち、1つのプロモーターに対して2つ以上を用いることもできる。特に、cIリプレッサー遺伝子の場合には、形質転換等の過程で自然に変異を生じることがあり、目的DNAが正しく導入されていないにも関わらずコロニーが形成されてしまうことがある。このようなコロニーが多数生じると、目的DNAが導入されたコロニーを取得できる確率が低下したり、これらを選択するためのスクリーニングがさらに必要になるという問題がある。しかし、1つのPrプロモーターに対して2つ以上のcIリプレッサー遺伝子を用いれば、2つ以上のcIリプレッサー遺伝子に同時に変異が生じる確率は非常に低いため、前記の問題を回避することができる。導入するcIリプレッサー遺伝子の数は、好ましくは1つのプロモーターに対して2つ以上、特に好ましくは2つである。
【００２７】
ここで、1つの微生物ゲノム中に2つ以上のcIリプレッサー遺伝子を導入して用いる場合には、各cIリプレッサー遺伝子の間にスペーサーを挿入することが好ましい。ごく近傍に連続して2つ以上のcIリプレッサー遺伝子が存在すると、これらの間で相同組換えを生じてしまうことがあるが、適当なスペーサーを挿入することによりこのような相同組換えを回避することができる。スペーサーとしては、目的DNAや微生物ゲノム中の配列と相同性を有さないものを用いることが好ましい。具体的には、これらの配列との相同性が50%以下、好ましくは40%以下のものを用いる。また、スペーサーの長さは、2つのcIリプレッサー遺伝子間で相同組換えが生じるのを回避できるような長さであればよいが、好ましくは50kb以上、より好ましくは100kb以上である。上限は、好ましくは300kb以下である。  さらに、スペーサーとして用いるDNAとして、そのGC含量が50%程度のものを選択することも好ましい。
【００２８】
このようなスペーサーの具体例としては、例えば、BACクローンF1O22（かずさDNA研究所製）が有するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のミトコンドリアゲノムの部分配列等が挙げられる。F1O22は、IGF Arabidopsis BAC library (Mozo, T. et al., Mol. Gen. Genet. 258, 562-570 (1998))から得られたもので、pBeloBAC11由来のBACベクター (pBeloBAC-Kan)に、約100kbのシロイヌナズナのミトコンドリアゲノムの部分配列が挿入されている。
【００２９】
上記のようなcIリプレッサー遺伝子を用いる方法においては、Prプロモーターの制御下に置かれるポジティブ選択用（目的DNAが正しく導入され、cIリプレッサー遺伝子が失われたことにより発現する）のマーカーDNAの他に、さらに、スクリーニング用（目的DNAが導入されていない場合に発現する）のマーカーDNAを組み合わせて用いることが好ましい。マーカーDNAとしては、前記したようなものが用いられる。
【００３０】
上記した1つのPrプロモーターに対して2つ以上のcIリプレッサー遺伝子を用いる方法について、2つのcIリプレッサー遺伝子と、Prプロモーターにより発現制御されるポジティブ選択用のネオマイシン遺伝子、スクリーニング用のスペクチノマイシン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子を組み合わせて用いる場合を例に挙げて、以下にさらに詳述する。
【００３１】
まず、微生物ゲノム中の2つの相同配列の間に、スペーサーとなるDNA、例えば、BACクローンF1O22（かずさDNA研究所製）が有するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のミトコンドリアゲノムの部分配列を導入する。この微生物は、ゲノム中の他の位置にPrプロモーターにより発現制御されているネオマイシン耐性遺伝子（Pr-neo）を有している。次に、このスペーサーの一端に、cIリプレッサー遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子を連結したもの（cI-Spc）を導入する。例えば、このcI-Spcをスペーサーの3'末端側に導入した場合、もう一方の5'末端側にcIリプレッサー遺伝子とブラストサイジンS耐性遺伝子を連結したもの（cI-BS）を導入する。このとき、cI-SpcとcI-BSはどちらがスペーサーの3'末端側または5'末端にあってもよいが、2つのcIリプレッサー遺伝子がゲノム中で互いに逆向きになるように挿入することが好ましい（例えば、図5の「枯草菌BEST6528株」を参照）。例えば、前記cI-SpcとcI-BSを導入する場合には、スペーサー側にそれぞれの薬剤耐性遺伝子が隣接し、相同配列側にcIリプレッサー遺伝子が隣接するように導入する。このような順序に導入することにより、2つのcIリプレッサー遺伝子間で相同組換えが起こる確率を抑制することができ、また、もし2つのcIリプレッサー遺伝子の間で相同組換えが生じたとしても、スペーサーや薬剤耐性遺伝子が失われるのを回避することができる。
【００３２】
かくして作製された微生物細胞は、cIリプレッサータンパクの発現によりPrプロモーターが抑制され、ネオマイシン耐性遺伝子の発現が抑制されているため、ネオマイシン感受性、かつ、スペクチノマイシン及びブラストサイジンSには耐性である。この微生物細胞を前記したような方法で形質転換すると、2つの相同配列における相同組換えにより目的DNAが導入され、cI-Spc、cI-BS、及びスペーサーが失われる。その結果、cIリプレッサータンパクが供給されなくなり、Prプロモーターに対する抑制が解除され、該プロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子が発現してネオマイシン耐性となる。その一方で、スペクチノマイシン及びブラストサイジンSには感受性となる。この薬剤耐性の変化を利用して、目的の形質転換体を選択することができる。
【００３３】
マーカーDNAとして薬剤耐性遺伝子を用いて形質転換体の選択を行う場合には、前記培地にそれぞれの薬剤耐性遺伝子に適した薬剤等を添加して培養を行う。具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子が挿入されたゲノムを有する微生物（例えば、図２のneo（ネオマイシン耐性遺伝子）が導入されている枯草菌ゲノムを参照）を用いた場合、培地中に5〜10μg/mlのネオマイシンを添加すればよい。
【００３４】
方法１の工程（ｃ）
次に、前記プラスミド群の中から、上記工程（ｂ）において形質転換に用いたプラスミド中の目的DNAとの重複配列を有する目的DNAを含む他のプラスミドを選択する。選択されるプラスミドは、先に形質転換に用いられたプラスミド中の目的DNAの3'末端側との重複配列を有するものでも、5'末端側との重複配列を有するものでもよい。
【００３５】
方法１の工程（ｄ）
上記工程（ｂ）において形質転換された微生物細胞を、上記工程（ｃ）において選択されたプラスミドにより形質転換する（図３の「挿入後」参照）。形質転換は、上述した方法と同様に行うことができる。
【００３６】
方法１の工程（ｅ）
上記工程（ｄ）で得られた微生物細胞から、上記工程（ｂ）及び（ｄ）で用いた2つのプラスミドが有する目的DNAが、重複配列と相同配列における相同組換えにより連結されたDNAをゲノム中に有する形質転換体を選択する。上記工程（ｄ）の形質転換の結果、該工程で用いたプラスミド中の目的DNA中の、上記工程（ｂ）の形質転換により微生物ゲノム中に導入されたプラスミド中の目的DNAとの重複配列と、これと逆の末端に隣接するプラスミド中の相同配列とで相同組換えが起こることにより、2つの目的DNAが連結される（図３の「連結後」参照）。このようなDNAをゲノム中に有する形質転換体の選択は、上記（２）に詳述した方法と同様に、マーカーDNAを用いる方法、PCR法により配列を確認する方法等により行うことができる。
【００３７】
ここで、上記の相同組換えにより連結した形質転換体をマーカーDNAを用いて選択する場合、マーカーDNAは、すでに微生物ゲノムに挿入された目的DNAの重複配列と相同配列の間（図３の「挿入後」の「M2」で示される位置）に挿入することが好ましい。このとき用いるマーカーDNAは、上記（２）で用いたマーカーDNAと同じものでもよいし、異なるものであってもよい。
【００３８】
方法１の工程（ｆ）
上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製されたプラスミド群中に含まれる全ての目的DNAを前記微生物に導入することにより、微生物ゲノム中で外来の遺伝子を構成するゲノムDNAが再構成される。
【００３９】
Bacillus属細菌又は高度好熱菌、中でも特にB.subtilis（枯草菌）は、巨大なDNAをそのゲノム中で安定的に保持する能力を有し、また、ゲノム中で該DNAにゲノム工学的な操作を加えて改変することが容易である（板谷光泰、自然に学んだ枯草菌ゲノムベクター、バイオサイエンスとインダストリー、57、540-543(1999)）。従って、例えば、該微生物ゲノム中に再構成されたゲノム遺伝子に、公知の方法を用いて挿入、置換、欠失等の改変を行うことができる。
【００４０】
２．微生物ゲノム中に、外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する方法（方法２）
本発明の微生物ゲノム中で外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する方法の第2は、以下の工程から成ることを特徴としている。
（ａ）ベクターに外来遺伝子を構成するゲノムDNAの全長の異なる部分配列が目的ＤＮＡとして挿入され、かつ各目的ＤＮＡがいずれかの他の目的ＤＮＡとお互いに重複配列を有するプラスミド群を調製する工程、
（ｂ）同一のゲノムを有する微生物細胞に、上記工程（ａ）で調製された各プラスミド中の目的ＤＮＡをはさむ２つの相同配列を微生物ゲノム上の同じ位置に予め挿入し、該微生物細胞を各々のプラスミドにより形質転換する工程、
（ｃ）上記工程（ｂ）で得られたいずれかの目的ＤＮＡをゲノム中に有する微生物細胞から、ゲノムDNAを抽出する工程、
（ｄ）上記工程（ｃ）で抽出したゲノムDNA中の目的ＤＮＡと重複配列を有する他の目的ＤＮＡをゲノム中に有する微生物細胞を、上記工程（ｃ）で得られたゲノムDNAにより形質転換する工程、
（ｅ）上記工程（ｄ）で形質転換された微生物細胞から、上記工程（ｃ）及び（ｄ）で用いた２つの微生物ゲノム中の目的ＤＮＡが、それぞれ重複配列と微生物ゲノム上の共通配列における相同組換えにより連結されたＤＮＡを有する形質転換体を選択する工程、
（ｆ）上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物に導入することにより、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する工程。
【００４１】
この方法２の概要を模式的に図４に示す。以下、各工程の詳細について説明する。
方法２の工程（ａ）
本工程で調製されるプラスミド群は、上記方法１の工程（ａ）に詳述した方法と同様にして調製することができる。目的DNAとして用いられる外来遺伝子を構成するゲノムDNAの部分配列、ベクター等についても同様のものを用いることができる。ただし、本法においては、後記工程（ｅ）において詳述するとおり、相同組換えが2つの目的DNAの重複配列と微生物ゲノム中の共通配列において起こることから、各目的DNAが挿入されるベクターが全て同一である必要はない。しかし、組換えの効率、操作の簡便性等の観点から、同一のベクターに挿入されることが好ましい。また、該ベクターはBACベクターであることがより好ましく、上記方法１の工程（ａ）と同様に市販のBACライブラリー等から適当なものを選択して用いることができる。
【００４２】
方法２の工程（ｂ）
次に、同一のゲノムを有する微生物細胞に、上記工程（ａ）で調製された各プラスミド（図４の「プラスミド」参照）において目的DNAをはさむ２つの相同配列を微生物ゲノム中の同じ位置に予め挿入し、該微生物細胞を各々のプラスミドにより形質転換する（図４の「微生物ゲノム」参照）。
【００４３】
同一のゲノムを有する微生物細胞としては、上記方法１の工程（ｂ）に詳述したものと同様のものから選択すればよい。このような微生物細胞に、上記工程（ａ）で調製した各プラスミドにおいて目的DNAをはさむ２つの相同配列を上記方法１の工程（ｂ）と同様に予め挿入する。ここで、プラスミドを構成しているベクターが同一の場合には、相同配列を挿入した微生物細胞は1種類作製すればよいが、ベクターが異なる場合にはそれぞれのベクター中の適当な配列を予め挿入し、各々のプラスミド用の微生物細胞を作製する。このとき、相同配列は、微生物ゲノム中において同じ位置に挿入する。本法においては、後記工程（ｅ）において詳述するとおり、相同組換えが2つの目的DNAの重複配列と微生物ゲノム中の共通配列において起こることから、該重複配列と該共通配列が、適切な相同組換えが起こり得る位置に存在することが必要である。すなわち、ここで「同じ位置」とは、配列上で全く同位置である必要はなく、前記した相同組換えが起こり得る範囲内であればよい。
【００４４】
プラスミド中の目的DNAをはさむ2つの相同配列の長さ、微生物ゲノム中の相同配列が組み込まれる位置、形質転換及び相同組換えの方法、目的DNAが正しく導入された形質転換体の選択方法等は、上記方法１の工程（ｂ）と同様に行うことができる。
【００４５】
方法２の工程（ｃ）
次いで、上記工程（ｂ）で調製されたいずれかの目的DNAを含むゲノムを保持する微生物細胞から、ゲノムDNAを抽出する。ゲノムDNAの抽出は、それ自体公知の通常用いられる方法により行うことができ、例えば、リゾチーム-SDS処理法（Saito,H. and Miura,K., Biochem.Biophys.Acta., 72, 619-629(1963)）等が挙げられる。かくして調製されたゲノムDNA抽出液の中には、微生物ゲノムが断片化されて含まれるが、上記工程（ｂ）で導入された目的DNAと微生物ゲノム上の共通配列を一続きに有しているものが含まれていればよい。
【００４６】
方法２の工程（ｄ）
上記工程（ｃ）でゲノムDNAを抽出するために用いた微生物ゲノム中の目的DNAとの重複配列を有する他の目的DNAを含む微生物細胞を、上記工程（ｃ）で得られたゲノムDNAにより形質転換する（図４の「挿入後」参照）。形質転換は、前述の方法と同様にして行うことができる。ここで用いられる微生物細胞に含まれる目的DNAは、先に形質転換された微生物細胞中の目的DNAの3'末端側との重複配列を有するものでも、5'末端側との重複配列を有するものでもよい。
【００４７】
方法２の工程（ｅ）
上記工程（ｄ）で得られた微生物細胞から、上記工程（ｃ）及び（ｄ）で用いた２つの微生物ゲノム中の目的DNAが、重複配列と微生物ゲノム中の共通配列における相同組換えにより連結されたDNAを有する形質転換体を選択する。上記工程（ｄ）の形質転換の結果、上記工程（ｃ）で得られたゲノムDNA中に含まれる目的DNA中の、微生物細胞のゲノム中に含まれる目的DNAとの重複配列と、これと逆の末端に隣接する共通配列とで相同組換えが起こることにより、2つの目的DNAが連結される（図４の「連結後」参照）。このようなDNAをゲノム中に有する形質転換体の選択は、上記方法１の工程（ｂ）に詳述した方法と同様に、マーカーDNAを用いる方法、PCR法により配列を確認する方法等により行うことができる。
【００４８】
方法２の工程（ｆ）
上記（ｃ）〜（ｅ）の各工程を繰り返し、上記工程（ａ）で調製された全ての目的ＤＮＡを前記微生物に導入することにより、微生物ゲノム中で外来の遺伝子を構成するゲノムDNAが再構成される。
Bacillus属細菌又は高度好熱菌、中でも特にB.subtilis（枯草菌）は、巨大なDNAをそのゲノム中で安定的に保持する能力を有し、また、ゲノム中で該DNAに遺伝子工学的な操作を加えて改変することが容易である（板谷光泰、自然に学んだ枯草菌ゲノムベクター、バイオサイエンスとインダストリー、57、540-543(1999)）。従って、例えば、該微生物ゲノム中に再構成されたゲノム遺伝子に、公知の方法を用いて挿入、置換、欠失等の改変を行うことができる。
【００４９】
３．外来遺伝子を構成するゲノムDNAの全長を含むプラスミド
本発明の別の態様によれば、外来遺伝子を構成するゲノムDNAの全長を含み、かつその長さが100kb以上であることを特徴とするプラスミドが提供される。
このようなプラスミドは、例えば、上記１又は２に詳述した方法により作製された微生物から取得することができる。具体的には、該方法により作製された微生物ゲノムから、特開2002-17350号公報等に記載の方法を用いて外来遺伝子を構成するゲノムDNAの全長を含む部分をプラスミドとして回収し、精製して取得することができる。また、ゲノム遺伝子の5'末端及び3'末端にレアカッター認識配列を予め導入しておいた場合、このレアカッターを用いてゲノム遺伝子を処理することによりゲノム遺伝子を切り出して回収することができる。レアカッターとは、例えば、８塩基以上から成る塩基配列を認識して、該配列を特異的に切断するようなエンドヌクレアーゼを言い、例えば、I-PpoI、I-SceI等が挙げられる。
【００５０】
外来遺伝子を構成するゲノムDNAの全長は、100kb以上、好ましくは200kb以上である。外来遺伝子とは、例えば、上記１に記載のものと同様のものが挙げられる。すなわち、ゲノムとしての機能を有している限り、必ずしも全長を有していなくてもよく、また、元のゲノムDNAに挿入、置換、欠失、変異等のゲノム工学的な改変が加えられたもの等を含む。
【００５１】
かくして得られる本発明のプラスミドは、遺伝子改変非ヒト動物又は植物を作製するためのトランスジーン等として好適に用いることができる。遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製においては、人工的に作製されたトランスジーンを用いるよりも、遺伝子を構成するゲノムDNAそのものを改変して用いた方がより効率がよいと考えられており、本発明のプラスミドは非常に有用である。
【００５２】
また、例えば、再構成された外来遺伝子を構成するゲノムDNAがBacillus属細菌又は高度好熱菌の菌体内で有効な発現制御領域等の制御下におかれるように構成すれば、特定の蛋白質の生産性が高まった形質転換体や、機能の改良された蛋白質を生産する形質転換体等も、簡便に得ることができる。
【００５３】
４．本発明のプラスミドを用いる遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製方法
上記３に記載の本発明のプラスミドを用いて、遺伝子改変非ヒト動物又は植物を作製することができる。特に、上記１又は２に記載の方法により作製された微生物から取得されるプラスミドは、該微生物のゲノム中で容易にゲノム工学的な改変を加えることができることから、遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製に好適である。
【００５４】
上記３に記載の本発明のプラスミドを、ヒト以外の動物の未受精卵、受精卵、精子及びその始原細胞を含む胚芽細胞、生体の臓器、組織細胞、培養細胞、又は植物の個体、器官、組織、培養細胞等に導入することにより、遺伝子改変非ヒト動物または動物及び植物の遺伝子改変組織、培養細胞の作製を行うことができる。
遺伝子改変を行う動物または植物としては、個体のみでなく、動物では生体臓器、組織、培養細胞が、また植物では器官、組織、培養細胞がそれぞれ含まれる。その種類は動物個体としてはヒトを除くが、その他は何ら限定されず、例えばマウスの卵細胞、ＥＳ細胞等が挙げられる。
【００５５】
本発明のプラスミドの、ヒト以外の動物の未受精卵、受精卵、精子及びその始原細胞を含む胚芽細胞、生体の臓器、組織細胞、培養細胞、または植物の個体、器官、組織、培養細胞等への導入においては、用いるDNAの形態に特に制限はなく、例えば得られた環状のプラスミドを直接ドナーDNAとして供してもよいし、得られたプラスミドを制限酵素で切断して電気泳動等の分離手段で所望の配列のみを分離・精製し、ドナーDNAとして用いてもよい。
【００５６】
また、該プラスミドの導入方法も特に限定されず、通常用いられている方法を用いることができる。例えば、受精卵の前核に直接DNAをマイクロインジェクトする方法（Palmiter, R. D. et al., Annu. Rev. Genet., 20, 465-499 (1986)）、胚性幹細胞（ES細胞）にエレクトロポレーションによりDNAを導入する方法（Karin, M. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 7161-7165 (1984)）、脂質に包んだドナーDNAをＥＳ細胞と融合するリポフェクション法（Strauss, W. M. et al., R. EMBO J., 11, 417-422 (1992)）、プラスミドを持つドナーの菌をプロトプラストにしてES細胞のスフィロプラストと融合する方法（Davies, N. P. et al., Biotechnology, 11, 911-914 (1993)）、未受精卵への細胞質内精子注入法（Perry, A. C. F. et al., Science,284, 1180-1183 (1999)）、精子を用いて未受精卵細胞にDNAを導入する精子ベクター法（Lavitrano, M. et al., Cell , 57, 717-723 (1989)）等による方法を用いて前記した細胞等に導入することができる。また本発明のプラスミドにアデノウイルスを用いたり（Chartier, C. et al.,J. Virol., 70, 4805-4810 (1996)）、あるいはレトロウイルス等を用いることにより、卵細胞あるいはES細胞等にウイルスを感染させることで遺伝子を導入する方法を用いることもできる。
【００５７】
また、上記したようなDNA導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞等に再構成されたゲノム遺伝子あるいはその変異体を導入し、細胞培養、組織培養等を行うこともできるし、さらにこれらの細胞を上述の胚芽細胞とそれ自体既知の細胞融合法により融合させることにより本発明の非ヒト遺伝子変異動物を作成することもできる。
植物の場合には、個体、または葉、花弁、茎、根、種子等の器官、あるいは表皮、師部、木部、柔組織、維管束等の組織について、それ自体既知の動物に行う場合と同様の方法、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法等によりDNAの導入を行うことができる。かくして得られる再構成されたゲノム遺伝子またはその変異体が導入された形質転換体の選択は、マーカーDNAを同時に導入しておいた場合には該マーカーDNAに適した薬剤等により選択した後、さらに、PCRやサザン分析で導入されたDNAを解析することにより行うことができる。
【００５８】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
なお、下記実施例において、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ネオマイシンの抗生物質は、シグマ社から購入した。ブラストサイジンSの抗生物質はフナコシ社から購入した。制限酵素NotIは宝酒造から購入した。I-PpoIヌクレア-ゼはPromega社から購入した。他の制限酵素及びAlkaline phosphatase (E. coli)、T4 DNA ligaseは、東洋紡社から購入した。PCRによる遺伝子増幅には宝酒造社のTaKaRa Ex Taq HSを用い、添付の説明書に従い行った。PCRの反応条件は、94℃、5分の反応の後、以下の温度サイクルを30サイクル行った。94℃、1秒：60℃、1秒：72℃、2秒。LB培地の培地成分及び寒天は、ベクトン  ディッキントン社製のものを用いた。他の全ての生化学試薬は、シグマ社及びナカライテスク社製のものを使用した。
【００５９】
特記したもの以外のプラスミドの構築は、大腸菌JA221株（ATCC37436株としてAmerican Type Culture Collectionより入手可能）を用いて行った。サザンハイブリダイゼーションは、Roche社のDIG DNA Labeling and Detection Kit を使用した。構築したプラスミドの抽出、検定、大量調製などの操作法は、標準プロトコール（Sambrook. J. et al.,  Molecular Clonoing: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))に従った。パルスフィールド電気泳動 Counter clumped gel  Electrophoresis(CHEF)の装置及び使用法は既報(Itaya, M. and Tanaka, T., J. Mol. Biol., 220, 631-648 (1991)、及び、特開2001-321170号公報)の通りに行った。コンピテント大腸菌JA221及びコンピテント枯草菌の形質転換についても、既報（Itaya,M. Mol. Gen. Genet., 241, 287-297 (1993))の通り行った。
【実施例１】
【００６０】
BACベクターの配列をゲノム中に有する枯草菌の作製
目的DNAを組み込む微生物として枯草菌を、目的DNAを含むプラスミドとしてBACベクターを用いた。まず、枯草菌に目的DNAを導入するための相同配列として、BACベクターの配列を枯草菌のゲノム中に挿入した。
（１）土台となる枯草菌の作製
枯草菌RM125株(Itaya, M., Biosci. Biotech. Biochem. 61, 56-64 (1997)；及びUozumi, T.  et al., Mol. Gen. Genet., 152, 65-69 (1977))のゲノム中に、組み込み場所を指定するproB::pBRTc(proB遺伝子中のNotI認識部位にpBR322配列とテトラサイクリン耐性遺伝子を含む構造；Itaya, M., Mol. Gen. Genet., 241, 287-297(1993))と、ポジティブ選択用のネオマイシン耐性遺伝子(Itaya, M., Biosci. Biotech. Biochem. 63, 602-604 (1999))を保持した構造を有する、枯草菌BEST7003株を作製した。枯草菌RM125株系統は、取り込むDNAの由来を問わないという性質を有する株である。
【００６１】
まず、ポジティブ選択用のネオマイシン耐性遺伝子として大腸菌のλファージ由来のPrプロモーターによって発現制御されるネオマイシン耐性遺伝子(以下、「Pr-neo」と称することがある)を組み込み、BEST6225株を作製した。この株はRM125株にPr-neo組み込み用プラスミドpNEXT4-PN2を形質転換し、ネオマイシン耐性株を取得することで得られ、ゲノム中のyvfC-yveP(3516.219kb-3522.452kb)の位置にPr-neo遺伝子を有する。
【００６２】
大腸菌プラスミドpNEXT4-PN2は次のようにして作製した。Prプロモーターを有するプラスミドpBS52(Breitling, R., et al., Gene, 93, 35-40. (1990)) 由来の約5kbのPstI断片をT4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化した後、ネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子のみを持つプラスミドpBEST515(Itaya, M. and Tanaka, T. J. Mol. Biol., 220, 631-648. (1991))のSmaI認識部位に導入して、ネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子の上流にPrプロモーターを連結したプラスミドpBEST515Aを作製した。このプラスミドをEcoRIで切断し、電気泳動により精製することでPr-neo断片を得た。あらかじめT4 polynucleotide kineae(東洋紡社製) を用いて5'突出末端をリン酸化したEcoRI/NotI/BamHI Adaptor（宝酒造社製）を調製し、これを前記Pr-neo断片の両端にT4 DNA Ligaseにより連結した後、アガロースゲル電気泳動により精製した。次に、AdaptorのNotI認識部位をNotIで切断することにより、Pr-neo断片のNotIカセットを作製して、このカセットをpBEST43 (Toda, T., et al. Biosci. Biotech.  Biochem., 60, 773-778. (1996))のNotI認識部位にクローニングし、pBEST533を得た。枯草菌ゲノム中のyvfC-yvePを含むPstI断片を持つプラスミドpNEXT4(Itaya, M., and Tanaka, T. J. Mol.Biol., 220, 631-648. (1991))を制限酵素NotIで消化し、yvfC-yveP間の約1kbのNotI断片を取り除いた後、代わりにpBEST533をNotIで消化することにより得られたPr-neo/NotIカセットを挿入して、Pr-neo組み込み用プラスミドpNEXT4-PN2とした。
【００６３】
Pr-neoを組み込んだBEST6225株は、このプラスミドを用いてRM125株を形質転換し、ネオマイシン耐性で選択して得た。BEST6006株(特開2001-321170号公報)のゲノムDNAを用いてこのBEST6225株を形質転換し、テトラサイクリン耐性株をPr-neoとproB::pBRTcの双方を保持するBEST7003株として取得した。BEST7003株は、Pr-neo挿入時にpNEXT4-PN2を用いているため、エリスロマイシン感受性である。
【００６４】
（２）枯草菌BEST7003株へのBACベクター配列の挿入
上記（１）で作製したBEST7003株にBACベクター配列を挿入するために、大腸菌プラスミドp310-108(NHBN)MIMCISP-5を構築した（図１）。
まず、大腸菌BACベクターpBAC108L(Shizuya, H. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 89, 8794-8797 (1992))を制限酵素NotIで消化し、セルフライゲーション後、大腸菌に形質転換して、内在性の64bpのNotI断片を除去し、プラスミドpBAC108Nを作製した。次に、NotI/BamHI/HindIII/NotIの配列を持つリンカーをこのpBAC108NのNotI認識部位に挿入し、プラスミドpBAC108NHBNを大腸菌で得た。
【００６５】
pBAC108NHBNのEcoRV認識部位のうち、片方(parA遺伝子に近い方)にMluI認識部位を導入する目的で、このEcoRV認識部位からrepE遺伝子内のSSe8387I認識部位までの335bpをPCRによって増幅した。すなわち、pBAC108NHBNを鋳型とし、プライマー１（配列番号：１）及びプライマー２（配列番号：２）を用いたPCRを行った。この時用いたEcoRV側のプライマーには、予めHincII-MluI配列を付加しておき、PCRで増幅された断片をHincIIとSSe8387Iで消化することにより、335bpのHincII-SSe8387I断片を取得した。pBAC108NHBNをEcoRVとSSe8387Iで消化した直鎖断片(6.5kb)をアガロースゲル電気泳動によって精製し、これに前記PCR増幅断片(HincII-SSe8387I断片)を連結させた。EcoRVとHincIIは平滑末端を与え、連結後EcoRV認識配列が消滅するのでMluI認識部位を有するpBAC108NHBN-Mluが得られた。
【００６６】
続いて、I-PpoI認識部位を導入するため、pBAC108NHBN-MluのMluI認識部位にMluI/I-PpoI/MluIの配列を有するリンカーを挿入し、pBAC108NHBN-MIMを構築した。このプラスミドのHindIII-BamHI認識部位にcIリプレッサータンパクをコードする遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子を含むcIカセットを連結させて、pBAC108(NHBN)MIM-CISPを作成した。cIカセットは、pCISP310B (Itaya, M. et al. J. Biochem., 128, 869-875 (2000))由来のHindIII-BamHI消化断片をアガロースゲル電気泳動で精製して使用した。このBACベクター由来のプラスミドpBAC108(NHBN)MIM-CISPをI-PpoIで完全消化した断片に、I-PpoIで完全消化したpCISP310Bを連結させることによって、p310-108(NHBN)MIMCISP-5を構築し、足場となるBACベクター配列を組み込むためのプラスミドとした。
【００６７】
BACベクター配列を組み込んだ枯草菌BEST310株は、p310-108(NHBN)MIMCISP-5のpBR322由来の配列を利用して上記（１）で作製したBEST7003株を形質転換し、スペクチノマイシン耐性株として取得した。p310-108(NHBN)MIMCISP-5の構造を図1に示した。
【実施例２】
【００６８】
マウスゲノムDNAの部分配列の枯草菌ゲノムへの導入
（１）目的DNAを有するプラスミドの選択
枯草菌BEST310株に導入される目的DNAとして、2つのBACクローンを用いた。1つは、BACベクター(pBeloBAC11)にマウス13番染色体に由来する約90kbの129/SV系統のマウスゲノムが挿入されたBACクローンpKARUDで、同マウスゲノム領域中にvesl-1遺伝子（Kato,A. et al., FEBS Letters, 412, 183-189(1997)）を構成するゲノムDNAの部分配列が含まれることが示されている。もう1つは、同じBACベクター(pBeloBAC11)に、マウス13番染色体に由来する約110kbの129/SV系統のマウスゲノムDNAが挿入されたBACクローンpKANEIで、同マウスゲノム領域中には、jmj遺伝子（Takeuchi,T. et al., Genes & Development, 9, 1211-1222(1995)）を構成するゲノムDNAの部分配列が含まれることが示されている。前者は三菱化学生命科学研究所の井ノ口主任研究員より供与され、後者は同研究所の竹内主任研究員より供与された。
【００６９】
BACベクター(pBeloBAC11)については、Kim, U-J. et al., Genomics, 34, 213-218. (1996)に詳細が開示されており、上記実施例１で枯草菌ゲノム中に相同配列として組み込んだBACベクターpBAC108Lとほぼ同等の構造をしている。2つのBACクローンは、標準プロトコール（Sambrook.J.etal.,  Molecular Clonoing: ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))に従い、超遠心法により精製してから使用した。
【００７０】
（２）vesl-1遺伝子を構成するゲノムDNAの部分配列の枯草菌への導入
上記実施例１で作製した枯草菌BEST310株に、約90kbのマウスゲノムDNAを保持するBACクローン(pKARUD)を用いてvesl-1遺伝子を構成するゲノムDNAの部分配列を組み込んだ。pKARUDは、vesl-1遺伝子の3'領域を含んでおり、インサートDNAのサイズは、パルスフィールド電気泳動(CHEF)でNotI、XhoI、SalIの制限酵素地図を作製して決定した。
【００７１】
BEST310株に相同配列として組み込んだ２つのBACベクター配列は、図1及び図2に示すようにpBAC108L由来のそれぞれ約3.5kbの半分づつの領域を有するため、pKARUDを用いて形質転換を行うと、コンピテントのBEST310株に取り込まれたpKARUDのBACベクター配列と枯草菌ゲノム中のBACベクター配列との間で相同組換え(double crossing-over)を生じ、pKARUDのインサートDNA全体が枯草菌ゲノム中に組み込まれる。
【００７２】
インサートDNAが組み込まれた枯草菌株の選択は、文献 Itaya,M.Biosci. Biochem. Biotech., 63 602-604. (1999)、特開2001-321170号公報等に記載された方法に準じて行った。すなわち、BEST310株中の２つの相同配列(BACベクター配列)間にはcIカセット(cIレプレッサータンパクをコードする遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子)が組み込まれており、一方同株はゲノム中のyvfC-yveP(3516.219kb-3522.452kb)にPrプロモーターにより発現が制御されているネオマイシン耐性遺伝子(Pr-neo)を保持している。cI遺伝子が発現しているBEST310株はスペクチノマイシン耐性であり、cIリプレッサータンパクがPrプロモーターに結合して下流のネオマイシン耐性遺伝子の発現を抑制するため、ネオマイシン感受性である。pKARUDを取り込んだ株は両相同配列間のcIカセットを失い、cIカセット中のスペクチノマイシン耐性遺伝子が欠落することによりスペクチノマイシン感受性になると同時に、cIリプレッサー遺伝子も欠落する。cIリプレッサータンパクが供給されなくなったこの株は、Prプロモーターの発現抑制が解除されるためにネオマイシン耐性遺伝子が発現し、ネオマイシン耐性株になる。
【００７３】
pKARUDは、超遠心法により環状のDNAとして精製した。BEST310株の形質転換には、pKARUDを約5μg使用した。その結果、216個のネオマイシン耐性コロニーが選択され、このうち100個をスペクチノマイシン感受性でスクリーニングした結果、50個がスペクチノマイシン感受性の株として得られた。これら50個のコロニーを5個づつ混合してゲノムDNAを精製し、I-PpoIヌクレアーゼを用いてBACクローンに含まれていたインサートDNAの有無を確認した。枯草菌BEST310株には、相同配列として挿入されたBACベクター配列のすぐ外側に２つのI-PpoI認識部位が組み込まれており（図2）、I-PpoIで消化し、パルスフィールド電気泳動(CHEF)を行うことにより分離確認できるようになっている。その結果、5個づつ混合した10組(計50個)すべてが約90kbのI-PpoI断片を与えた。1組について含まれる5株のゲノムDNAを別々に調製して、再度パルスフィールド電気泳動にかけ、約90kbのI-PpoI断片を与えることを確認した。さらに詳細に調べるために、うち2株について６塩基認識の制限酵素(EcoRI、EcoRV、HindIII)で消化後、pKARUDをプローブとしたゲノムサザンを行ったところ、いずれも同じシグナルを与えた。これらの結果は、枯草菌ゲノム中に約90kbのマウスゲノムDNAの部分配列を一度の形質転換で正確にクローニング出来たことを意味する。
【００７４】
（３）jmj遺伝子を構成するゲノムDNAの部分配列の枯草菌への導入
次に、上記（２）と同様にして、枯草菌BEST310株に約110kbのマウスゲノムDNAを保持するBACクローン(pKANEI)を用いて、jmj遺伝子を構成するゲノムDNAの部分配列を組み込んだ。pKANEIは、jmj遺伝子の3'領域を含んでおり、インサートDNAのサイズはパルスフィールド電気泳動(CHEF)でNotI、XhoI、SalIの制限酵素地図を作製して決定した。
【００７５】
pKANEIも上記（２）で用いたpKARUDと同様にpBeloBAC11ベクターにクローニングされているため、BEST310株に組み込んだBACベクター配列を相同配列として使用した。作製された株の選択法及び原理は、上記（２）と同様にして行った。pKANEIも超遠心法により精製した環状のDNA約5μgを用いて形質転換を行い、248個のネオマイシン耐性コロニーが得られた。うち100個をスペクチノマイシン感受性でスクリーニングした結果、35個がスペクチノマイシン感受性の株であった。このうち10個について別々にゲノムDNAを精製し、I-PpoIヌクレアーゼを用いてBACクローンに含まれていたインサートDNAの有無を確認したところ、6つの株が約110kbのI-PpoI断片を与えた。さらに2株について６塩基認識の制限酵素(EcoRI、EcoRV、HindIII)で詳細に調べたところ、pKANEIをプローブとしたゲノムサザンで同じシグナルを与えた。これらの結果は、枯草菌ゲノムベクター中に約110kbのマウスゲノムDNAの部分配列を一度の形質転換で正確にクローニング出来たことを示す。
【実施例３】
【００７６】
2つのcIリプレッサー遺伝子を利用したマウスゲノムDNAの部分配列の枯草菌ゲノムへの導入法
上記実施例2のように、枯草菌BEST310株でcIリプレッサー遺伝子1つを用いてマウスゲノム等の巨大DNAの導入を行った場合、最初に得られたネオマイシン耐性コロニーの全てが導入されたDNAを有する株ではなく、さらなるスクリーニングが必要となることがあった。この原因として、一定の頻度でcIリプレッサー遺伝子中に生じる変異が考えられた。すなわち、一定の頻度でcIリプレッサー遺伝子に変異が生じることにより、cIリプレッサータンパクが発現されず、目的DNAが挿入されていないにもかかわらずコロニー（以下、このようにして生成した株を「バックグラウンド株」と称することがある）が形成されてしまうと予想された。
そこで、cIリプレッサー遺伝子を2つ導入することにより、この問題を回避する方法について検討した。
【００７７】
（１）100kbのスペーサーDNA配列の枯草菌ゲノムへの導入
枯草菌ゲノム中に2つのcIリプレッサー遺伝子を配置すると、それらがお互いに相同組換えを起こしてしまうことが考えられた。そこで、この相同組換えの頻度を抑えるために、長大なスペーサーDNA配列を用いた。
スペーサーDNA配列として、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のミトコンドリアゲノムの部分配列を使用した。スペーサーDNA配列の導入は、約100kbのBACクローンF1O22を用いて、上記実施例2と同様の方法で枯草菌BEST310株を形質転換することによって行った。
【００７８】
F1O22は、IGF Arabidopsis BAC library (Mozo, T. et al., Mol. Gen. Genet. 258, 562-570 (1998))から得られたもので、pBeloBAC11由来のBACベクター (pBeloBAC-Kan)にシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のミトコンドリアゲノムの部分配列が挿入されている。該BACクローンはかずさDNA研究所より供与された。BACベクター (pBeloBAC-Kan)については、Mozo, T. et al., Mol. Gen. Genet. 258, 562-570 (1998)に詳細が開示されており、上記実施例1で枯草菌ゲノム中に相同配列として組み込んだBACベクターpBAC108Lとほぼ同等の構造をしている。F1O22も超遠心法により精製し、環状のまま使用した。
【００７９】
F1O22によるBEST310株の形質転換の結果、553個のネオマイシン耐性コロニーが選択され、これらのうち69％がスペクチノマイシン感受性株としてスクリーニングされた。得られたコロニーを、上記実施例2と同様にして、I-PpoI消化とゲノムサザンの解析によって解析したところ、F1O22全体が正しく導入された2株(BEST6487株とBEST6488株)が得られた。
【００８０】
（２）2つのcIリプレッサー遺伝子を導入した枯草菌株の作製
cIリプレッサー遺伝子を持つcIカセットとして、「cI-Spc (cIリプレッサータンパクをコードする遺伝子とスペクチノマイシン耐性遺伝子を連結したもの)」と「cI-BS(cIリプレッサータンパクをコードする遺伝子とブラストサイジンS耐性遺伝子を連結したもの)」の2つを使用した。これらは最終的にBACベクターに挿入して用いたが、このとき、cI-BSを持つBACベクターについては、cI-BSはBACベクターに対して逆向きに挿入した。cI-Spcは、BACベクターに対して順方向に挿入した。
【００８１】
両カセットの挿入は以下のように行った。まず、F1O22のインサートの両端約2kbずつをそれぞれPCRで増幅した。F1O22のインサートの配列は、NCBIホームページ（ACCESSION No. NC_001284；  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NC_001284）に公開されている。次に、予め作製しておいたcI-Spcを持つBACベクターと、pBeloBAC由来のインサートを持たないBACベクターに、これらの増幅された断片を挿入した。まず、増幅された断片の一方（前記インサートの5'末端側の断片）を、予めcI-Spcを挿入しておいたBACベクターに、スペクチノマイシン耐性遺伝子の次に該断片が連結されるように挿入し、プラスミドpBAC-CISP-F1Aを構築した。他方の断片（前記インサートの3'末端側の断片）は、pBeloBAC由来のインサートを持たないBACベクターに挿入し、続いてこれにcI-BSをBACベクターに対して逆向きに、ブラストサイジンS耐性遺伝子が該断片に隣接して連結されるように挿入し、プラスミドpBAC-CIBS-F1Bを構築した。
【００８２】
かくして得られた2つのプラスミドを用いて、上記（１）で得たBEST6487株を形質転換することにより、図5に示すような、2つのcIリプレッサー遺伝子を有する枯草菌BEST6528株を作製した。枯草菌BEST6528株は、2つの相同配列の間に、それぞれカセットとして薬剤耐性遺伝子と連結された2つのcIリプレッサー遺伝子を有し、これらは互いに逆向きになっている。また、2つのカセットの間にはスペーサーが挿入されている。
【００８３】
（３）バックグラウンド株出現頻度の比較
2つのcIリプレッサー遺伝子を枯草菌ゲノムに導入することにより、cIリプレッサー遺伝子が1つしか導入されていない枯草菌で生じたバックグラウンド株の出現頻度が抑えられるかどうかを検証した。検証のために、枯草菌BEST310株と、上記（２）で取得したBEST6528株のそれぞれについて、通常形質転換に用いているのと等量の菌体を一晩培養し、それぞれの株からどの程度の頻度でネオマイシン耐性コロニー（バックグラウンド株）が形成されるかを調べた。
【００８４】
その結果、BEST310株からは185個のネオマイシン耐性コロニーが形成された。これに対し、BEST6528株から形成されたネオマイシン耐性コロニーは0個であった。
このことから、形質転換を行う際にcIリプレッサー遺伝子2つ同時に変異が起こる確率は低いことが解った。すなわち、cIリプレッサー遺伝子を2つ有する枯草菌株を用いれば、バックグラウンド株の出現を抑制することができ、正しく目的DNAが導入された株を高い確率で得られるので、より効率的に形質転換が行えることがわかった。
【００８５】
（４）マウスゲノムDNAの部分配列の枯草菌BEST6528株への導入
実際に、上記（２）で取得したBEST6528株を用いてマウスゲノムDNAの導入を行った。マウスゲノムDNAの部分配列としては、上記実施例2で用いたpKARUDを使用した。BEST6528株に該BACクローンが導入された枯草菌ゲノムの構造は、cIリプレッサー遺伝子を1つしか有していない前記BEST310株に該クローンを導入した場合と、結果的に全く同じ構造となる（図5参照）。
【００８６】
実施例2と同様に、超遠心で精製した環状のDNA(pKaruD)を約2マイクログラム用いて、形質転換を行った。BEST310株では147個のネオマイシン耐性コロニーが得られ、その27％がスペクチノマイシン感受性株であった。これらをさらにI-PpoI消化とゲノムサザンの解析したところ、最初のネオマイシン耐性コロニー中の10.8％に、目的のマウスゲノムDNAの部分配列(pKaruD)が導入されていることが確認された。一方、BEST6528株からは12個のネオマイシン耐性コロニーが得られ、そのうち11個がスペクチノマイシン感受性であった。これは、91.7%と非常に高い確率であった。これらをさらにI-PpoI消化とゲノムサザン解析により確認した結果、最初のネオマイシン耐性コロニーの36％に前記部分配列(pKaruD)が導入されていた。
【００８７】
これらの結果から、ゲノム中の相同配列の間に2つのcIリプレッサー遺伝子を有する枯草菌株を用いれば、マウスゲノムDNAなどの巨大DNAの枯草菌ゲノムへの導入をさらに効率よく選択出来ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のゲノムDNAを再構成する方法によれば、BAC等のベクターを用いたゲノムライブラリーを利用して微生物ゲノム中で外来遺伝子を構成するゲノムDNAを簡便に再構成することができ、プラスミド等の状態でその全長を取得することができる。また、再構成されたゲノム遺伝子には微生物ゲノム中でゲノム工学的な改変等を加えて、これをプラスミドとして取得することもでき、かくして取得されるプラスミドは遺伝子改変非ヒト動物又は植物の作製等に好適に用いることができる。微生物としてBacillus属細菌又は高度好熱菌を用いれば、組み込んだゲノム中のDNAの安定性が高く、該菌胞子を形成させること等により長期保存や運搬が容易である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】枯草菌ゲノム中に、2つの相同配列としてBACベクター配列を組み込むために用いるプラスミドp310-108(NHBN)MIMCISP-5の構造を示す図である。図中、「cI」はcIリプレッサー遺伝子を示し、「spcR」はスペクチノマイシン耐性遺伝子を示す。
【図２】BACクローンを用いて、BACベクター配列及びマーカーDNAを予め挿入した枯草菌細胞を形質転換する工程を示した図である。「cI」はcIリプレッサー遺伝子を示し、「spc」はスペクチノマイシン耐性遺伝子、「neo」はネオマイシン耐性遺伝子を示す。
【図３】本発明の、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する方法の第1（方法１）を模式的に示した図である。図中、黒矢印及び白矢印は2つの相同配列を示し、黒四角は重複配列を示す。「M1」及び「M2」はマーカーDNAを意味する。
【図４】本発明の、微生物ゲノム中に外来遺伝子を構成するゲノムDNAを再構成する方法の第2（方法２）を模式的に示した図である。図中、4つの矢印はそれぞれ異なる相同配列を示し、黒四角は重複配列を示す。波線は共通配列を示す。「M1」及び「M2」はマーカーDNAを意味する。
【図５】BACクローンを用いて、BACベクター配列及びマーカーDNAを予め挿入した枯草菌細胞を形質転換する工程を示した図である。cIリプレッサー遺伝子を1つしか有していない枯草菌BEST310株と、cIリプレッサー遺伝子を2つ有し、かつ、その間にスペーサーを有する枯草菌BEST6528株では、BACクローンにより形質転換された結果に生じる枯草菌株の構造が同じであることを示している。図中、「cI」はcIリプレッサー遺伝子、「Spc」はスペクチノマイシン耐性遺伝子、「BS」はブラストサイジンS耐性遺伝子、「neo」はネオマイシン耐性遺伝子を示す。neoの前に連結された三角は、Prプロモーターを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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