(57)【要約】【課題】　骨髄細胞から任意の組織細胞へ分化誘導することを可能とする。【解決手段】　患者から採取した培養すべき組織細胞１を、同じ患者から採取した幹細胞４を含む細胞２と混合して培養する組織細胞１の培養方法を提供する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
　患者から採取した培養すべき組織細胞を、同じ患者から採取した幹細胞を含む細胞と混合して培養する組織細胞の培養方法。
【請求項２】
　組織細胞と幹細胞を含む細胞とを混合して所定の培地内において一次培養した後に、生体組織補填材と混合して二次培養する請求項１に記載の組織細胞の培養方法。
【請求項３】
　幹細胞を含む細胞および組織細胞を別々に所定の培地内において一次培養した後に、一次培養された幹細胞を含む細胞と組織細胞とを混合し、さらに生体組織補填材を混合して二次培養する請求項１に記載の組織細胞の培養方法。
【請求項４】
　幹細胞を含む細胞を所定の培地内において一次培養し、組織細胞を生体組織補填材とともに所定の培地内において一次培養した後に、一次培養された幹細胞を含む細胞と生体組織補填材に付着した組織細胞とを混合して二次培養する請求項１に記載の組織細胞の培養方法。
【請求項５】
　幹細胞を含む細胞と、ヒト繊維芽細胞とを混合して培養する細胞の培養方法。
【請求項６】
　放射線を用いて増殖能を失わせる処理をヒト繊維芽細胞に施した後に、幹細胞を含む細胞と混合する請求項５に記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
　ヒト繊維芽細胞を培養容器に播いた後に、培養容器上に播かれたヒト繊維芽細胞上に、幹細胞を含む細胞を播いて培養する細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　この発明は、組織細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
　近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨組織に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成するいわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
　一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系幹細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。この場合において、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させるには、例えば、デキサメタゾンのような分化誘導因子が有効であることが知られている。したがって、このような分化誘導因子とともに培養されることにより、骨芽細胞が骨補填材を足場にして増殖した状態の培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる（例えば、非特許文献１参照。）。
【非特許文献１】植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
　しかしながら、骨組織以外の他の多くの組織細胞においては、いかなる分化誘導因子を使用すれば、間葉系幹細胞を所望の組織細胞に分化させることができるのかについては明らかではない。例えば、骨髄細胞から培養した間葉系幹細胞から軟骨細胞へ分化させることは困難である。
【０００５】
　この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、骨髄細胞から任意の組織細胞へ分化誘導することを可能とし、培養期間を短縮することができる組織細胞の培養方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
　上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
　請求項１に係る発明は、患者から採取した培養すべき組織細胞を同じ患者から採取した幹細胞を含む細胞と混合して培養する組織細胞の培養方法を提供する。
　この発明によれば、同じ患者から採取した組織細胞と幹細胞を含む細胞とを共培養することにより、組織細胞によって当該組織細胞への幹細胞の分化を誘導することが可能となる。
【０００７】
　請求項２に係る発明は、請求項１に記載の組織細胞の培養方法において、組織細胞と幹細胞を含む細胞とを混合して所定の培地内において一次培養した後に、生体組織補填材と混合して二次培養する培養方法を提供する。
　この発明によれば、共培養されることにより組織細胞へ分化誘導された幹細胞を生体組織補填材と混合して二次培養することにより、生体組織補填材を足場として成長した組織細胞を有する補填体を製造することが可能となる。
【０００８】
　請求項３に係る発明は、請求項１に記載の組織細胞の培養方法において、幹細胞を含む細胞および組織細胞を別々に所定の培地内において一次培養した後に、一次培養された幹細胞を含む細胞と組織細胞とを混合し、さらに生体組織補填材を混合して二次培養する培養方法を提供する。
　この発明によれば、幹細胞を含む細胞および組織細胞は、別々に一次培養されることにより、それぞれ他の細胞に分化することなく成長させられる。この後に、両者を混合し、さらに生体組織補填材を混合して二次培養することにより、充分な量の幹細胞から分化した充分な量の組織細胞が生体組織補填材を足場として成長した補填体を得ることが可能となる。
【０００９】
　請求項４に係る発明は、請求項１に記載の組織細胞の培養方法において、幹細胞を含む細胞を所定の培地内において一次培養し、組織細胞を生体組織補填材とともに所定の培地内において一次培養した後に、一次培養された幹細胞を含む細胞と生体組織補填材に付着した組織細胞とを混合して二次培養する培養方法を提供する。
【００１０】
　この発明によれば、組織細胞に分化させる幹細胞を、一次培養によって充分な量となるまで培養することができる。また、組織細胞を生体組織補填材とともに一次培養することにより、幹細胞の分化を充分に誘導し得る量の組織細胞が生体組織補填材に付着したものを製造することができる。そして、この後に両者を混合して二次培養することにより、幹細胞を所望の組織細胞へ分化させつつ、生体組織補填材に付着させることが可能となる。
【００１１】
　請求項５に係る発明は、幹細胞を含む細胞と、ヒト繊維芽細胞とを混合して培養する細胞の培養方法を提供する。
　この発明によれば、ヒト繊維芽細胞の分泌するサイトカイン（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＦＣ）とマトリクス（コラーゲン）などの因子の相互作用により、幹細胞の増殖を促進することが可能となる。
【００１２】
　請求項６に係る発明は、請求項５に記載の組織細胞の培養方法において、放射線（例えば、Ｘ線、γ線）を用いて増殖能を失わせる処理をヒト繊維芽細胞に施した後に、幹細胞を含む細胞と混合する培養方法を提供する。
　この発明によれば、ヒト繊維芽細胞の増殖能が放射線を用いた処理により失われるので、幹細胞と混合された状態での培養工程において、ヒト繊維芽細胞が増殖して培養すべき幹細胞の増殖を抑えてしまうことを防止できる。
【００１３】
　請求項７に係る発明は、ヒト繊維芽細胞を培養容器に播いた後に、培養容器上に播かれたヒト繊維芽細胞上に、幹細胞を含む細胞を播いて培養する細胞の培養方法を提供する。
　この発明によれば、最初に培養容器内に播かれたヒト繊維芽細胞の作用により、幹細胞の培養容器底面への接着効率を向上することが可能となる。その結果、培養の開始時に即座に増殖可能な幹細胞数を増やし、培養効率を向上することができる。
【発明の効果】
【００１４】
　本発明に係る組織細胞の培養方法によれば、種々の生体組織細胞に分化可能な幹細胞とともに、所望の組織細胞を混合して共培養するので、幹細胞の当該組織細胞への分化を誘導して、効率的に当該組織細胞の補填体を製造することができるという効果を奏する。特に、分化誘導因子の存在が知られていない組織細胞の補填体の製造に有効である。
　また、共培養する細胞同士の相互作用により、培養期間を短縮し、培養効率を向上することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
　この発明の第１の実施形態に係る組織細胞の培養方法について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る培養方法は、患者から採取した培養すべき組織細胞を同じ患者から採取した幹細胞を含む細胞と混合して培養する組織細胞の培養方法を提供するものである。
　ここで、幹細胞を含む細胞とは、例えば、骨髄細胞である。
【００１６】
　さらに具体的には、本実施形態に係る培養方法は、図１に示されるように、患者から採取した所定の組織細胞１および骨髄細胞２を所定の培地Ａ内において培養する一次培養ステップと、培養されることにより成長した組織細胞３および間葉系幹細胞４を所定の培地Ｂ内においてさらに培養する二次培養ステップとを備えている。
　なお、この培養方法を実施するために、まず、患者から採取した骨髄液を、例えば、遠心分離機にかけることにより骨髄細胞２を抽出しておく。また、同一の患者から、正常な組織細胞１を採取しておく。
【００１７】
　前記一次培養ステップは、まず、準備された骨髄細胞２および組織細胞１を、所定の培地Ａ、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）および抗生物質を適当な比率で混合することにより構成された培地Ａ内に投入する。次いで、所定の培養条件、例えば、３７±０．５℃およびＣＯ２濃度５％に設定したインキュベータ内で約１０日間にわたって培養する。培養途中において、定期的に培地Ａを交換する。
【００１８】
　このようにして、一次培養ステップにおいては、培養容器の底面に骨髄細胞２中の間葉系幹細胞４が、組織細胞３とともに付着して成長する。この際に、組織細胞３は、間葉系幹細胞４に接触することにより、間葉系幹細胞４のその組織細胞３への分化を誘導し始める。
　この状態で、例えば、トリプシンのような蛋白質分解酵素を用いて間葉系幹細胞４および組織細胞３を培養容器の底面から剥離させた後、遠心分離機にかけることにより回収する。
【００１９】
　次いで、二次培養ステップは、回収された間葉系幹細胞４および組織細胞３を補填材５とともに培養容器に投入し、所定の培地Ｂ、例えば、一次培養に使用された培地とは異なり、ＭＥＭ、ＦＢＳや抗生物質の他にビタミンＣのような栄養剤、成長因子等が混合された培地に浸漬された状態で行われる。補填材５は、例えば、βリン酸三カルシウムとポリ乳酸との混合体である。培養条件は、例えば、上述した一次培養ステップと同様に、例えば、３７±０．５℃およびＣＯ２濃度５％に設定したインキュベータ内で約２週間にわたって行われる。培養途中において、定期的に培地Ｂを交換する点も一次培養ステップと同様である。
【００２０】
　二次培養ステップにおいては、間葉系幹細胞４が、一緒に存在する組織細胞３に誘導されてその組織細胞３へと分化させられるとともに、補填材５に付着することにより、補填材５を足場として成長する。これにより、補填材５が組織細胞３へと部分的に置換した生体組織補填体６が製造されることになる。このような生体組織補填体６は、生体内の生体組織に生じた欠損部に補填されることにより、極めて早期に生体組織が再生され欠損部を修復することができる。したがって、術後の修復速度を向上して、患者の負担を軽減することができる。
【００２１】
　なお、本実施形態に係る培養方法では、所定の組織細胞１が、骨髄細胞２に含有される間葉系幹細胞４とともに一次培養ステップから共培養される。したがって、本実施形態の培養方法を適用できる組織細胞１としては、所定の条件下で間葉系幹細胞４のその組織細胞１への分化を抑えつつ、間葉系幹細胞４自体の成長を行わせることができる組織細胞１、例えば、軟骨細胞が適している。
【００２２】
　次に、この発明の第２の実施形態に係る組織細胞の培養方法について、図２を参照して以下に説明する。
　なお、本実施形態に係る培養方法の説明において、上述した第１の実施形態に係る培養方法の説明と共通する構成要素には同一符号を付して説明を簡略化することにする。
　本実施形態に係る培養方法は、一次培養ステップにおいて、第１の実施形態に係る培養方法と相違する。本実施形態に係る培養方法では、骨髄細胞２と所定の組織細胞１とを別々の培養容器において、所定の培地Ａと混合して培養する。培養条件は、第１の実施形態に係る培養方法と同様である。
【００２３】
　本実施形態に係る培養方法によれば、骨髄細胞２から抽出される間葉系幹細胞４および組織細胞１が、それぞれ、他の細胞から影響を受けることなく、純粋に培養されるので、必要量の補填体６を得るのに充分な量の間葉系幹細胞４および組織細胞３を早期に得ることができる。また、他の細胞から影響を受けることなく培養されるので、その培養状態の管理が容易であるという利点がある。
【００２４】
　このようにして製造された間葉系幹細胞４と組織細胞３とは、第１の実施形態と同様にして、トリプシン等の蛋白質分解酵素を作用させることにより、培養容器から剥離された後に、遠心分離機にかけられてそれぞれ別々に回収される。その後、培養容器内に、所定の培地Ｂおよび所定の補填材５とともに、一次培養ステップで得られた間葉系幹細胞４および組織細胞３が投入されて、二次培養ステップが行われる。これにより、第１の実施形態に係る培養方法と同様の補填体６が得られることになる。
【００２５】
　なお、本実施形態に係る培養方法では、所定の組織細胞が、骨髄細胞２に含有される間葉系幹細胞４とは別に、一次培養ステップを行われる。したがって、本実施形態の培養方法を適用できる組織細胞１としては、間葉系幹細胞４のその組織細胞１への分化誘導作用が高い組織細胞１、例えば、軟骨細胞が適している。
【００２６】
　次に、この発明の第３の実施形態に係る組織細胞の培養方法について、図３を参照して、以下に説明する。
　本実施形態に係る培養方法は、骨髄細胞２のみについて上記と同様の一次培養ステップを行い、所定の組織細胞１については、一次培養ステップからその組織細胞１を所定の補填材５とともに混合して行う。
【００２７】
　この方法によれば、第２の実施形態に係る培養方法と同様に、単独で培養される間葉系幹細胞４は、他の細胞に影響されることなく成長することができ、早期に必要量の間葉系幹細胞４に達することができる。また、所定の組織細胞１においては、最初から補填材５とともに培養されることにより、補填材５内に充分に浸透することができる。
【００２８】
　そして、間葉系幹細胞４が充分な量に成長した時点で、既に補填材５とともに培養されている組織細胞１と混合されて二次培養ステップが行われる。これにより、接触させられる組織細胞１に間葉系幹細胞４が分化誘導され、補填材５を足場として組織細胞１への成長が促進される。この場合に、分化を誘導する組織細胞１が補填材５に浸透するように成長しているので、補填材５の内部においても間葉系幹細胞４の分化が促進され、内部まで充分に組織細胞１への置換が行われた補填体６を製造することが可能となる。
【００２９】
　なお、本実施形態に係る培養方法では、第２の実施形態に係る培養方法と同様に、組織細胞１としては、間葉系幹細胞４のその組織細胞１への分化誘導作用が高い組織細胞１、例えば、軟骨細胞が適している。
【００３０】
　このように上記各実施形態に係る培養方法によれば、適当な分化誘導因子が知られておらず、間葉系幹細胞４からの人工的な分化誘導が困難であった組織細胞１の補填体６を簡易かつ迅速に製造することができる。
　なお、上記各実施形態においては、幹細胞として骨髄細胞２から抽出した間葉系幹細胞４を例示したが、これに代えて、臍帯血や末梢血等の他の体液から採取した間葉系幹細胞、あるいは、体性幹細胞を用いてもよい。
　また、間葉系幹細胞からの分化誘導作用が高い組織細胞として、軟骨細胞を例に挙げて説明したが、これに代えて、神経細胞、骨細胞、皮膚等を用いることにしてもよい。
【００３１】
　また、培地４に加える成分として、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。また、エストロゲン等のホルモン剤や他の栄養剤を混合することにしてもよい。
【００３２】
　この場合に、培養すべき間葉系幹細胞４や組織細胞２の活性度に応じて、これらの成長因子やホルモン剤もしくは栄養剤の配合割合を決定することにしてもよい。また、抗生剤として、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００３３】
　また、補填材５として、βリン酸三カルシウムとポリ乳酸との混合物を使用したが、これに代えて、他の多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸あるいはこれらの組合せを採用してもよい。βリン酸三カルシウム、コラーゲン、ポリ乳酸等は生分解性を有し、生体に吸収されるので除去の必要がなく、またアパタイト等はその強度が高いという特徴を有する。当業者であれば、移植する部位等に応じて、適切な種類の補填材５を選択することができる。
【００３４】
　次に、この発明の第４の実施形態に係る細胞の培養方法について、以下に説明する。
　本実施形態に係る培養方法は、幹細胞を含む細胞と、ヒト繊維芽細胞とを混合して培養する培養方法である。具体的には、本実施形態に係る培養方法は、培養容器内に、幹細胞を含む細胞とヒト繊維芽細胞とを投入して、上記と同様の培養条件により培養する。
　この培養方法によれば、ヒト繊維芽細胞から分泌されるサイトカイン（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、ＧＭ−ＣＦＣ）やマトリクス（コラーゲン）などの成長因子の相互作用により、幹細胞を効率的に増殖させることができる。
【００３５】
　この場合において、幹細胞を含む細胞と混合されるヒト繊維芽細胞は、１５〜５０Ｇｙのγ線照射によりその増殖能を抑制しておくことが好ましい。ヒト繊維芽細胞の増殖能が高い場合には、幹細胞を含む細胞から分泌される成長因子によって本来培養すべき幹細胞ではなくヒト繊維芽細胞が増殖してしまう不都合があるからである。
【００３６】
　また、培養容器内に幹細胞を含む細胞とヒト繊維芽細胞とを同時に投入して混合する方法に代えて、まず、ヒト繊維芽細胞を培養容器内に播いた後に、そのヒト繊維芽細胞の上から幹細胞を含む細胞を播くことにすれば効果的である。すなわち、ヒト繊維芽細胞は培養容器底面への幹細胞の接着を促進する作用を有する。幹細胞は、培養容器の底面に接着して所定のコロニーを形成しながら増殖するため、培養される際には早期に培養容器の底面に接着させておく必要がある。現在、１ｍｌの骨髄液中に２８００個の幹細胞が存在すると考えられているが、骨髄液をそのまま培地内に投入するだけでは、培養容器の底面に接着する細胞数は非常に少なかった。
【００３７】
　本実施形態に係る培養方法によれば、培養の開始時から早期に培養容器の底面に接着する幹細胞の細胞数を大幅に増加させることができるので、結果として、短期間で大量の細胞を得ることができるという効果がある。すなわち、培養効率を向上して、培養期間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】この発明の第１実施形態に係る組織細胞の培養方法を示すフローチャートである。
【図２】この発明の第２実施形態に係る組織細胞の培養方法を示すフローチャートである。
【図３】この発明の第３実施形態に係る組織細胞の培養方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３９】
　１　組織細胞
　２　骨髄細胞（幹細胞を含む細胞）
　４　間葉系幹細胞（幹細胞）
　５　補填材（生体組織補填材）
　Ａ，Ｂ　培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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