(57)【要約】【課題】本発明は、反応効率および再現性に優れたプローブ固相化反応アレイおよび視覚的に容易に確認可能なプローブ固相化反応アレイを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、前記支持体は、内部に第1から第nまでの反応部（ここでnは2以上の整数である）を備え、前記プローブは、前記第1から第nまでの反応部毎にグループ化されて配置されているとともに、各反応部におけるプローブの固定化位置は、各反応部の末端から同一距離にある1以上のライン上にプローブが位置するように、各反応部の同じ位置であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。【選択図】    図１
2004191253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、
前記支持体は、内部に第1から第nまでの複数の反応部（ここでnは2以上の整数である）を並列して備え、
前記プローブは、前記第1から第nまでの反応部毎にグループ化されて配置されているとともに、各反応部におけるプローブの固定化位置は、各反応部の末端から同一距離にある1以上のライン上にプローブが位置するように、各反応部の同じ位置であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項２】
請求項1に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記グループ化は、プローブ特性によって分類されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項３】
請求項2に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブ特性は、プローブの構造的特性であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項４】
請求項1に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記グループ化は、標的物質の特性によってグループ化されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項５】
請求項4に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記標的物質の特性は、標的物質の機能的特性であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項６】
請求項1〜5に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、ペプチド、タンパク質、抗原および抗体からなる群より選択されることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項に記載のプローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、キャピラリ形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プローブ固相化反応アレイに関する。具体的には、核酸およびタンパク質などの解析に使用するためのプローブ固相化反応アレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子発現頻度を検出する手法の一つとして、プローブアレイを使用した解析が行われている。従来、このプローブアレイ解析では、核酸ハイブリダイゼーション反応による検出を行う基板としてナイロン膜を使用し、DNAの有するマイナス電荷によってプローブDNAを基板上に固相化していた（特許文献1を参照）。また、ハイブリダイゼーション反応後の検出は、化学発光またはラジオアイソトープによって行われていた。
【０００３】
近年、マイクロアレイ技術によって一定規格のスライドグラス（約7.5cm×2.5cm）に多種類のプローブDNAを高密度に固相する方法（特許文献2を参照）、およびフォトリソグラフィー技術によって半導体基板においてDNAプローブを合成する方法などが知られている。これらのマイクロアレイ技術を用いることにより、従来のナイロン膜では一つのスポットが3mm〜5mmであったが、ガラス基板では、100um〜300umの極微小なスポットが可能になり、スポットの高密度化が可能となった。そのため、一枚のマイクロアレイ上に数千から数万のプローブを配置することが可能となり、大規模な遺伝子発現頻度解析の有用な手段となっている。その他にも、検出感度の向上、マイクロ化によるサンプルの節約、データ取得の自動化およびデータ処理の簡便化などの点で、マイクロアレイ技術が期待されている。
【０００４】
現在行われている遺伝子発現頻度解析の主流は、二蛍光標識法において上記のようなDNAマイクロアレイを使用して、ディファレンシャルな遺伝子発現を見る系である。その原理は、二つの検体における遺伝子発現頻度差を検出するものである。すなわち、二つの検体から得たmRNAまたはtRNAに対して異なる蛍光物質を標識し、これら二検体を、DNAマイクロアレイ上で競合的にハイブリダイゼーション反応させ、そのDNAマイクロアレイ上に得られる両方の蛍光を測定することにより、二検体の遺伝子発現を比較する方法である。一般的に上述のようなDNAマイクロアレイにより解析されるべき検体は、組織または細胞より抽出したmRNAまたは全RNAなどのRNAである。したがって、上述のような蛍光は、RNAからcDNAが合成される際に標識される、Ｃｙ３−ｄＵＴＰやＣｙ５−ｄＵＴＰなどの標識物質に由来するものである。また、オリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーと逆転写酵素とを用いて、cDNAを合成する際にラベリングが行われることも多い。
【０００５】
しかし、このようなDNAマイクロアレイを使用して核酸の解析を行う方法には、以下のような問題があった。同一支持体上に固定化されるDNAプローブは、互いに塩基配列が異なった多種類の配列を有しているのが一般的であり、それぞれのDNAプローブについてのハイブリダイゼーション反応条件は一定ではない。したがって、従来のＤＮＡマイクロアレイでは、固相化されている全てのプローブを効率よく利用することは難しく、所望する全ての標的が効率よく検出されているとは言い難い。そのために、従来では、ＤＮＡマイクロアレイを用いて得た検出結果は再現性の低いものである。
【０００６】
また、従来のマイクロアレイ実験では、複数のプローブがランダムにアレイ上にスポットされているため、蛍光観察画像を取得し画像データを数値化した後でないと結果解析が行えなかった。マイクロアレイ実験では、一般的に画像データを数値化した後で、その数値データに基づいて発現頻度解析を行うが、アレイ実験の信頼性を容易かつ迅速に確認するために、画像データに関しても視覚的な見やすさがあることが望ましい。
【０００７】
【特許文献１】
特開2000-135081号公報
【０００８】
【特許文献２】
特開2001-17166号公報
【０００９】
【非特許文献１】
N.Uchikoga、 A. Suyama、“Genome Infomatics”、1998年、9巻、p.388-389
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上記のような状況に鑑み、本発明は、反応効率および再現性に優れたプローブ固相化反応アレイおよび視覚的に容易に確認可能なプローブ固相化反応アレイを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために鋭意研究の結果、プローブをグループ化する手段に想到し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、プローブが支持体に固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、
前記支持体は、内部に第1から第nまでの複数の反応部（ここでnは2以上の整数である）を並列して備え、
前記プローブは、前記第1から第nまでの反応部毎にグループ化されているとともに、各反応部におけるプローブの固定化位置は、各反応部の末端から同一距離にある1以上のライン上にプローブが位置するように、各反応部の同じ位置であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１３】
また、本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、上記グループ化は、プローブ特性によって分類されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１４】
本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、上記プローブ特性は、プローブの構造的特性であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１５】
本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、上記グループ化は、標的物質の特性によってグループ化されていることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１６】
本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、上記標的物質の特性は、標的物質の機能的特性であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１７】
本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、核酸であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１８】
本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記プローブは、ペプチド、タンパク質、抗原および抗体からなる群より選択されることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００１９】
本発明は、上記プローブ固相化反応アレイであって、前記反応部は、キャピラリ形状であることを特徴とするプローブ固相化反応アレイを提供する。
【００２０】
かかる構造によれば、反応部毎、すなわちプローブ群毎に一つの至適反応条件を適用することができ、並行して複数の反応部において反応を進行させることができるとともに、解析結果を視覚的に容易に比較可能となる。また、グループ化の態様によっては、それぞれのプローブ群について最良の反応結果を得ることが可能となる。したがって、プローブ固相化反応アレイの反応効率のみならず再現性が格段に向上する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明のプローブ固相化反応アレイは、支持体にプローブが固相化されたプローブ固相化反応アレイであって、前記プローブ固相化反応アレイは、第1〜第nまでの反応部を並列して複数備え、該プローブは、前記第1〜第nまでの反応部毎にグループ化されて配置されているとともに、各反応部におけるプローブの固定化位置は、各反応部の末端から同一距離にある1以上のライン上にプローブが位置するように、各反応部の同じ位置であることを特徴とする。したがって、支持体の第1〜第ｎまでの各反応部のそれぞれに含まれるプローブは、反応部毎にグループ化されたプローブ群である。
【００２２】
グループ化は、目的に応じて、プローブ特性、標的物質の特性、反応条件その他に基づいて行う。プローブ特性は、たとえば核酸プローブ特性であれば、プローブのTm値、自己構造化指標値（自由エネルギーΔG）その他のプローブの特性であり、これらに基づいてグループ化を行えばよい。タプル法（Tmや発現頻度に基づいて効率よくグループ化される）を利用してグループ化することもできる。
【００２３】
たとえば、Tm値を指標とするのであれば、使用するプローブのTm値を計測し、Tm値が同じプローブを同じグループとする。自己構造化指標値に基づいてグループ化するのであれば、下記の実施例にも示したように、エネルギーΔG値を指標にして同じΔG値のプローブを同一グループとする。また、これらを組み合わせてグループ化してもよい。
【００２４】
上述のように、プローブ特性の指標としてTm値を挙げることもできるが、プローブとして用いる核酸が長鎖になった場合には、Tm値の与える影響よりも、プローブ自身が自己構造を取ることによってハイブリダイゼーションを妨げる可能性が考えられる。このような場合には、プローブの構造的特性によってグループ化するために、プローブの自己構造化を計算により算出してプローブ特性指標とすることが好ましく、プローブ特性にTm値を指標として使用することは望ましくない。
【００２５】
また、グループ化を標的物質の特性に基づいて行うのであれば、機能的特性（たとえば、レセプター／リガンドの関係など）その他の特性を指標として行えばよい。たとえば、遺伝子の機能的特性によってグループ化するのであれば、以下の実施例に示したようにTNFファミリー遺伝子解析用のプローブ固相化アレイとして、各反応部に各リガンド／レセプターの遺伝子に対するプローブを対にして配置することが考えられる。
【００２６】
このような遺伝子特性によるグループ化は、レセプター／リガンドの関係などの相互作用によるグループ化だけでなく、その他の遺伝子機能毎のグループ化も可能である。たとえば、TNF/TNFRファミリー遺伝子群においては、個体発生や恒常性維持にとって不可欠であるアポトーシスの機能が知られており、このうちTNFα、FasおよびTRAILはアポトーシスを誘導できる代表的なサイトカインである。TNFαはTNFR1、FasリガンドはFasを介して、さらにTRAILはTRAILレセプターを介してアポトーシスを誘導する。これらのレセプターは、細胞内領域にデスドメインと呼ばれる特徴的な塩基配列ドメインを持っている。この特徴を利用して、あるドメイン（共通するドメインなど）の有無などの遺伝子構造および遺伝子機能による差異を利用してグループ化を行うことも考えられる。
【００２７】
また、各反応部におけるプローブ固定化位置は、図2に示すように各反応部の末端から同一距離にある1またはそれ以上のライン上にプローブが位置するように、各反応部において同じ位置にプローブを固相化すればよい。全ての反応部で、同数のプローブが固定化されている必要はなく、また、各反応部の少なくとも一部のプローブが、各反応部間で同じライン上に固定化されていればよい。さらに、同じライン上にある全ての反応部にプローブが固定化されていなくてもよく、固定化されていない反応部があってもよい。たとえば、図2のような場合であってもよく、左端のプローブは、全ての反応部において同じライン上に固定化されているが、一番右のプローブは、キャピラリ4の反応部のみ固定化されている。図3に示すように、各反応部に同じプローブを同じライン上に固相化することによってグループ化してもよい（図では、種々のリガンド／レセプター対を同じ配置で各反応部に固相化した）。特に、このようにグループ化することによって、異なった被検物質における発現を同時に視覚化し、迅速に解析することができる。たとえば、図4に示したように発現の経時変化等を容易に比較可能となる。
【００２８】
また、グループ化を反応条件に基づいて行うのであれば、プローブをハイブリダイズさせる温度、塩濃度、反応時間またはこれらの組み合わせを指標としてプローブをグループ化することができる。
【００２９】
さらに、上述のグループ化は、レセプター／リガンドの関係などの機能的特性によるグループ化とプローブ特性によるグループ化を組み合わせるなど、それぞれを組み合わせてグループ化してもよい。
【００３０】
ここで、本明細書において使用される「核酸」の語は天然に存在する種々のDNAおよびRNA、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびS-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類似体などを指す。
【００３１】
本明細書において使用される「標的物質」の語は、プローブにより検出されるべき物質をいう。また、標的核酸は、標的物質が核酸である場合を意味する。一般的に、核酸プローブであれば、標的核酸に相補的な塩基配列を有するように設計される。被検試料に含まれる被検核酸が標的配列が有する塩基配列を有している場合には、核酸プローブと標的配列の間にハイブリダイゼーションが生じる。したがって、このハイブリダイゼーションを検出することにより被検試料に含まれる核酸を解析することが可能である。ハイブリダイゼーションの検出はそれ自身公知の手段により行ってよい。標的核酸の標的になる塩基配列を「標的配列」と称す。
【００３２】
本明細書において使用される「被検試料」の語は、生物個体から採取した細胞、組織、臓器、血液、血清、リンパ液、組織、毛髪および耳垢などの生物試料を所望に応じて調製した試料や、人工的に合成または製造した物質を含む試験に供したい試料をいう。また、「被検試料」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であってもよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応じて当業者によって選択され得るであろう。
【００３３】
本明細書において使用される「個体」の語は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む任意の哺乳動物、並びに植物および昆虫など哺乳動物以外の生物を示す。
【００３４】
以下、上述のようにプローブがグループ化されたプローブ固相化反応アレイについて、核酸プローブを例にしてその一実施形態を説明する（図2）。
【００３５】
図2（A）は、本態様であるプローブ固相化反応アレイ1の上面から見た平面図である。プローブ固相化反応アレイ1は、透明なガラス製の基板30とシリコン基板31を用いて製造されたプローブ固相化反応アレイの例である。
【００３６】
プローブ固相化反応アレイ1の基板の内部には複数のキャピラリ2、3、4、5、6、7および8が、同一平面上に並列して平行に形成されている。それぞれのキャピラリは互いに独立して形成されるので、他のキャピラリに含まれる流体と互いに混じり合うことはない。また、それぞれのキャピラリの両端には、開口部が形成されている。具体的には、キャピラリ2、3、4、5、6、7および8には、それぞれ試料注入口16、17、18、19、20、21および22と、試料排出口23、24、25、26、27、28および29が形成されている。キャピラリ2、3、4、5、6、7および8の内部には、それぞれグループ分けされた核酸プローブ群9〜核酸プローブ群15が固定されている。
【００３７】
図2（B）は、本態様であるプローブ固相化反応アレイ１をキャピラリ4に沿って切断した断面図である。
【００３８】
上記のプローブ固相化反応アレイ1は、たとえば、次のように製造することが可能である。同じ大きさのガラス基板とシリコン基板を用意し、基板30と基板31とする。基板31にエッチングにより溝を形成する。所望のプローブは、上述したように予めグループ分けしておく。これらのプローブは、グループ毎に溝の底部に対してスポッティングすることによって固定すればよい。一方、基板30には、基板31の溝の両端に対応する部分に対して貫通穴が空けられる。次に、基板30と基板31を接合する。それぞれの開口部に所望の長さのガラス管を接着することにより連結部34aおよび34bを形成するとともに、キャピラリ2〜8を形成する。前記キャピラリ形状の空間のサイズは、用途に合わせて種々の大きさに設定することができるが、実用的には幅が10μm〜数mm、深さ1μm〜500μm、長さ数mm〜100mm、DNAキャピラリ間隔10μm〜数mm程度で充分である。ただし、反応の効率性を考えると測定対象となるmRNA、またはmRNAから転換したcDNAなどの核酸の拡散速度が毎秒数μmと遅いので、前記キャピラリ形状の空間の断面形状は、幅を広くしても深さは浅くするような扁平構造をとることにより、反応時間の短縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。
【００３９】
上記の例では、基板31に溝を形成したが、基板30でもよいし基板30と基板31の両方に形成されていてもよい。また、支持体の材料として、蓋として用いる基板にはガラス製基板を使用し、溝を形成する基板にはシリコン基板を使用したが、これに限定されるものではなく、蓋として用いる基板にシリコン基板を使用し、溝を形成する基板にガラス製基板を使用してもよい。また、使用される2枚の基板を同じ材質としてもよい。また、観察の方向に透過性部材が配置されるように、使用する部材を決定してもよい。あるいは、プラスチック樹脂やゴムなどで形成された支持体を使用してもよい。また、これらの材質、ガラス、シリコン、プラスチック樹脂およびゴムなどの材質で形成された支持体を組み合わせて使用してもよい。また、上記の例では支持体として板状の基板を使用しているが、これに限定されるものではない。
【００４０】
ガラスやシリコンウエハ様の基板では、たとえば、フォトリソ−エッチングなどの技術により溝および貫通穴を形成することが可能である。また、プラスチック樹脂やゴムなどの場合には機械加工やモールド加工などにより溝および貫通穴を形成することが可能である。核酸プローブの固定手段は、それ自身公知の何れかの手段、たとえば、スポッティング法および光固相化法などを使用してよい。上記の例では、基板31の溝の底部に核酸プローブを固定したが、基板30にそれを固定してもよく、また、各反応部の側面にそれを固定してもよい。
【００４１】
また、図2では、1つのキャピラリに種々の数のスポットが存在する例を示した。しかしながら、1キャピラリに固相化されるスポット数はこれに限定されるものではなく、スポットの数は１以上であれば任意の数でスポットしてもよく、キャピラリ毎に異なるスポット数としてもよい。また、プローブ固相化反応アレイに含まれる全てのキャピラリが複数種類のプローブを含んでいる必要はなく、また、何も固相化していない対照用のキャピラリを具備していてもよい。
【００４２】
また、2枚の基板の接合は、それ自身公知の手段によって、核酸プローブの固定の前または固定後に行われればよい。固定前に接合した場合には、光固相化法（たとえば特表平6-504997参照）を適用して核酸プローブを固定化するのが好ましい。たとえば、シリコン−石英ガラスの場合には、接着剤をスクリーン印刷機により印刷して接着すればよい。たとえば、シリコン−パイレックスガラスの場合には、半導体プロセスで使用される陽極接合法により、高温および高電圧の下で接合を行えばよい。
【００４３】
このように形成したプローブ固相化反応アレイ1は、それぞれの反応部に具備されるプローブに適した反応条件でハイブリダイゼーションが、高密度に集積した領域内で並行して行われる。たとえば、それぞれのキャピラリ毎に温度管理をしてもよく、全ての反応部を一定の温度に維持してイオン濃度および塩濃度によって至適反応条件を得てもよい。
【００４４】
たとえば、1つのヒータ33だけを使用して、至適反応温度の異なる全ての反応部について夫々の至適温度を維持しようとする場合には、ハイブリダイゼーション時に使用する反応液に含まれる塩濃度を調節すればよい。すなわち、各反応部における至適濃度が異なっている場合であっても、たとえば標的核酸を含む被検試料の溶液として使用する緩衝液等の塩濃度を調節することによって達成することが可能である。また、実際のハイブリダイゼーション反応において用いられる溶液の成分にDNAの変性剤などが含まれる場合には、適宜、さらに塩濃度を調整する必要がある。
【００４５】
また、ハイブリダイゼーション反応後の処理としての洗浄も、精密な反応を実現するためには大切である。DNAのハイブリダイゼーション反応では、ミスマッチをできるだけ少なくし、かつ、できるだけ標的核酸とのハイブリダイゼーション効率を高める必要がある。そのためには、正常にハイブリダイゼーション反応が生じている標的核酸は除去しないように、ミスマッチにより核酸プローブと結合している被検核酸だけを取り除く必要がある。ミスマッチした核酸の場合、核酸プローブと問題の被検核酸とにより形成される２本鎖における水素結合の数はマッチした場合に比較して少ない。したがって、ミスマッチの場合のＴｍはより低くなる。したがって、温度または洗浄液の塩濃度を制御することにより、ミスマッチした被検核酸を特異的に取り除くことが期待される。ミスマッチした被検核酸は、ミスマッチの箇所や数によりＴｍが変わるので、そのＴｍをどのような場合についても一括してここに定義することは難しい。しかしながら、このような条件は、各グループ分けされたキャピラリ毎に実験を行えば、所望の解析における最適条件を設定することが可能である。このようなミスマッチを防止する方法も本発明の範囲内に含まれる。
【００４６】
本発明の態様に従い、プローブ固相化反応アレイ１を利用することにより、ハイブリダイゼーション反応時の条件設定や洗浄の条件設定を、キャピラリ毎に個別にまたは複数のキャピラリからなる単位毎に行うことが可能である。したがって、本発明の態様に従えば、再現性に優れ且つ高精度に標的配列の検出を行うことが可能となる。また、さらにハイブリダイゼーションにおけるミスマッチを防止することも可能である。
【００４７】
本実施の形態では、プローブ固相化反応アレイ1に含まれる反応部の形態をキャピラリとしたが、この形状に限定されるものではない。すなわち、物理的に互いに隔離された反応部が形成されたデバイス構造の種々の構造が考えられる。上記の例では、プローブ固相化反応アレイ1に含まれる反応部を7つとし、反応部のそれぞれに試料注入口および／または試料排出口として使用できる1以上の開口部を形成したが、この数に限定されるものではなく、1以上の反応部を具備すればよい。
【００４８】
本発明に従うプローブ固相化反応アレイに具備される反応部は、その領域において、化学反応または生化学反応等の使用者が意図する反応および処理を行う領域をいう。したがって、上述の態様では、反応部がキャピラリ形状である例を示したが、反応部の形状はこれに限定されるものではない。該反応部は、互いに独立していればよく、たとえば、凹部または凸部により仕切られた領域に開口部を有する蓋または底部を配置し、有効容積のある反応部を形成すればよい。本発明の反応アレイの各々の反応部の容量は0.01μＬから1ｍＬであってよい。
【００４９】
また、本発明の態様に従うと、基板内部に内腔よりなる反応部を形成した閉鎖系の反応アレイばかりではなく、互いに独立し、かつ任意の方向に並列して複数の反応部を支持体に備えたものであれば、単に凹部または凸部により仕切られた容器に対しても、または平面からなる特に仕切のない領域であっても、充分に離間しているかあるいは多数の垂直孔によって液の拡散が妨げられていることで、互いに独立していれば本発明の態様に使用することが可能である。このような装置およびそれを使用した反応方法も本発明の範囲に含まれる。
【００５０】
また、反応部の形状は、底面が角型、円または楕円であるようなウェル形状であってもよい。また、反応部の底面と天井面の面積は、等しくても異なっていてもよい。ここで使用される「ウェル形状」とは、たとえば、キャピラリ形状のように反応部の底面および天井面が特定の方向へのみに広がりを示すような形態ではなく、底面や天井面を構成する二次元の何れの方向に対してもある程度同じような広がりを示すような形状で、かつ複数のプローブ固定部位がグループとして一括処理できる程度に分割された凹部もしくは多孔質部を有するものを指す（たとえば、特表平9-504864を参照）。
【００５１】
また、本実施の形態では、ヒータが本発明に従う反応アレイと別体である１例を示したが、ヒータおよびセンサ並びに必要な配線等が反応アレイ中に組み込まれていてもよく、これらを具備していない反応アレイであってもよい。
【００５２】
本発明に従う「プローブ固相化反応アレイ」とは、上記のようなグループ化したプローブが固相化された複数の反応部を同一支持体上に所望に応じたパターンで配置した装置であればよい。このようなプローブ固相化アレイは、そこにおいて、プローブとそのプローブに特異的な高親和性を有する標的物質とを反応させることが可能であればよい。また、前記反応により生じた結合は、前記支持体に含まれたままで観察され得ることが好ましい。たとえば、被検試料を視覚的に認識可能な標識（蛍光色素など）で標識しておくことにより、プローブと結合した標的物質の蛍光をそのまま視覚的に認識できるであろう。
【００５３】
また、本実施の形態では、核酸プローブを支持体に固定した核酸プローブ固相化反応アレイの例を示したが、プローブとしての核酸に変えて、タンパク質またはペプチド、抗原または抗体、あるいはその組み合わせをプローブとして使用してもよい。その場合、検出すべき標的物質に特異的に結合する物質をプローブとして、その物質特性に応じてグループ化するとともに、比較したいプローブ同士が隣り合うように各グループを配置して支持体に固定すればよい。
【００５４】
近年、複数のタンパク質やペプチドを支持体に固定したプロテインチップが幾つか開示されている。たとえば、DNAマイクロアレイ用のスポッターを用いて1万を越えるタンパク質を固定したチップを開示している(Science(2000)Sep 8;289(5485):1673)。また、サイファージェン社では、プロテインチップと質量分析機を組み合わせたタンパク質の構造解析、およびそれらの相互作用解析システムを提案している。本発明は、このようなそれ自身公知の従来のプロテインチップにも応用することが可能である。
【００５５】
【実施例】
ここで、本発明のプローブ固相化アレイについて具体例を示す。
【００５６】
実施の態様1
（TNFファミリー遺伝子解析用マイクロアレイ）
アレイ実験において使用するDNAプローブとしては、オリゴヌクレオチドからなるプローブと、cDNAプローブがある。オリゴヌクレオチドプローブは、cDNAプローブより以下の点で優れている：（1）クロスハイブリダイゼーションによるエラーが少ない；（2）クローニングおよびPCR反応など、従来必要とされた操作が不要である；；（3）ハイブリダイゼーションの時間が短い；（4）選択転写、選択スプライシングの区別が可能である。オリゴヌクレオチドプローブの設計には、ゲノムDNAの塩基配列が十分に決定されていることが必要とされるが、ゲノムプロジェクトの急速な進展に伴って多くの生物でこのような条件が整ってきた。
【００５７】
本発明のプローブ固相化アレイに使用する核酸プローブ（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ等）の塩基配列を設計する方法について説明する。本発明のプローブ固相化反応アレイには、Tmや発現頻度で効率よくグループ化されたプローブ配列を設計する方法であるタプル法（非特許文献1を参照）を利用することも可能である。タプル法は、タプルと呼ばれる数塩基程度の短い塩基配列が、全遺伝子の中で何回出現するかを数え上げ、その結果を基にして使用する塩基配列を決定する方法である。この数え上げは、始めに一度だけ行えばよい。
【００５８】
まず、あらかじめ選択した候補の塩基配列に含まれるタプルを調べ上げて、高頻度に出現しているタプルがないかを調べる。次いで、その候補が全遺伝子のうちで「ありふれた」配列であるかどうかの特異性を計算し、特異性を評価する。実際には、最初にタプル頻度を計算した後で候補配列をタプルで評価し、特異性の高い配列を選択する。途中、実験条件によって定まる制限を適用した後で、実験に適した熱特性をもつ候補だけを通すフィルターに掛けて候補を絞る。さらに、DNAは相補的に結合する性質があるので、一本鎖DNAだけでも十分に長ければ、自己分子内で結合してしまいハイブリダイゼーションを起こしにくくなることがある。したがって、このような構造を採り得るかどうかも計算で予想して排除している。
【００５９】
次に、プローブ自己構造化の指標として、予測されるDNA分子内の二本鎖領域の自由エネルギーΔＧ値を二次構造の予測に用いることが行われている。DNAが最も取りやすい構造はエネルギー的にも最も安定な構造であり、特定されたある領域の可能な組み合わせから、ΔＧ値が最大になる構造を予測する。構造が安定であればあるほど、ΔＧの値が小さくなる。以上の手法を組み合わせた計算フィルターの例を図1に示す。
【００６０】
上述の方法によって、ヒトTNF/TNFRファミリー遺伝子の解析用プローブの設計を行った。
【００６１】
TNF (tumor necrosis factor：腫瘍壊死因子)は、多くのファミリーメンバーが同定され、リガンドおよびレセプターを合わせて40以上の遺伝子がスーパーファミリーを形成している。機能としては、アポトーシスの誘導、阻害、細胞増殖や分化の促進など多岐にわたり、個体の発生分化から免疫応答まで、さまざまな生命現象において重要な役割を果たしている。これらのTNFファミリー遺伝子を解析することによって、病気の診断、TNFファミリー遺伝子の機能解析等の基礎研究に応用することが可能となり、有用な解析ツールとなり得る。
【００６２】
現在、同定されているTNFファミリー遺伝子を表1に示す。これら45遺伝子に対するプローブ配列の設計を行った。
【００６３】
【表１】
2004191253.tif 000003
プローブの長さを75merに設定し、計算を行った結果を表2に示す。
【００６４】
【表２】
2004191253.tif 000004
【００６５】
計算結果から、45遺伝子において、Tm値が71℃±1℃とほぼ同一となったが、自己構造化の指標であるΔＧ値は、-2〜-30とばらつきがあった。プローブにより反応条件を揃えるための指標としてTmが挙げられるが、長鎖になるとTm値よりもより自己構造化がより強い影響を起こすものと思われる。
【００６６】
今回の計算結果から、自己構造化数値を指標として、自己構造化の高いプローブ、低いプローブ、またはその中間のプローブと、グループ分けを行うことで、これら特性の異なるプローブにおいても、至適反応条件にてハイブリダイゼーション反応を行うことが可能となる。
【００６７】
たとえば、図2に示すようなキャピラリ構造のアレイ基板を使用した場合、自己構造化の予測結果をもとにしてハイブリダイゼーション条件を変更することが可能である。図2ａにおいて、デバイス1には複数のキャピラリ2、3、4、5、6、7および8が形成されている。このキャピラリ内部に、自己構造化ΔＧ値の違いに基づいてグループ化されたDNAプローブが固定される。自己構造化ΔＧ値を段階的にグループ分けし、キャピラリ2には、ΔＧ値が最も高いＴＡＣＩ遺伝子プローブ（図では1種類）を固定化し、キャピラリ3には、ΔG値が-12〜-16であるプローブ（図では3種類）、キャピラリ4には、ΔG値が-16〜-18であるプローブ（図では12種類）という順に独立のキャピラリに搭載した。また、各キャピラリにおけるプローブの１つ以上がなるべく多く隣り合うようにプローブ群の一端を、基板の端縁から同一距離上にそろえるとともに、他のプローブ同士もキャピラリをまたいで基板の端縁から同一距離において隣り合うように配置した。今回は7グループに分けたが、これ以上でもこれ以下でも制限されることはなく、またΔＧ値のグループ化閾値もこれに限定されない。
【００６８】
ここではグループ分けされた複数のDNAプローブの1つをそれぞれDNAプローブ9、10、11、12、13、14および15とした。また、キャピラリアレイには、それぞれ試料注入口16、17、18、19、20、21および22、並びに試料排出口23、24、25、26、27、28および29が形成されている。キャピラリ4における断面図が図2Bに示されており、デバイス1の蓋基板30と溝形成基板31、また、デバイスの下には温度制御用のヒータ33が設置されている。このように形成したデバイス1はヒータ33で一定温度、たとえば45℃に保持されそこに試料注入口から試料が注入する。
【００６９】
ターゲット試料の調製は、通常組織または細胞より抽出したmRNAもしくはtotal RNAからcDNAを合成する際に、Cy3-dUTPまたはCy5-dUTPを用いてラベルする。オリゴdTプライマーまたはランダムプライマーおよび逆転写酵素を用いて第一鎖cDNAを合成する際にラベリングする。ハイブリダイゼーション反応は、一般的に45℃から65℃前後の恒温状態で一定の湿度を保ちターゲットDNAの蒸発を防ぎながら、一時間から一晩の間、ターゲットDNAとの反応が行われる。
【００７０】
このデバイス構造を利用することにより、ハイブリ反応時の条件設定や洗浄の条件設定を個別にまたは併用しても使い分けることが出来るので、再現性の良い、高精度の測定が可能である。
【００７１】
実施の様態2
（遺伝子機能に基づいてグループ化されたTNFファミリー遺伝子解析用プローブ固相化アレイ）
TNF/TNFRファミリー遺伝子は、上述の通り45種類以上が知られており、レセプター/リガンドの関係が解明されている遺伝子が多い。表3にTNF/TNFRファミリー遺伝子間におけるレセプターとそのリガンドとの関係の一例を示す。
【００７２】
【表３】
2004191253.tif 000005
【００７３】
これらレセプター／リガンドとの関係等、遺伝子の機能に着目して、プローブのグループ化を行うことが可能である。グループ化を行った例を図3に示す。キャピラリ34、35、36、37、38、39および40には、レセプターおよびそのリガンドに対する5グループのプローブ群を配置した。7本のキャピラリは、いずれも同じ種類のプローブからなる同じグループとし、キャピラリ間で同種のグループ同士が隣り合うように、それぞれ基板の端縁から同一距離に並ぶ配置にした。このプローブ固相化アレイを用いた解析例を示す。
【００７４】
従来、ある細胞または個体において抗体刺激等によって引き起こされる遺伝子発現量の経時的変化を調べる場合、独立のプローブアレイ基板を使用し実験を行っていた。しかし、異なる独立のアレイを使用するとアレイ作製時、ハイブリダイゼーションおよび洗浄操作時、検出時点などのばらつきが大きく、本来の遺伝子変化量を調べることが難しいという状況があった。図4は、図3に示したプローブアレイを用いた解析の結果を示した模式図である。キャピラリ42、43、44、45、46、47、48には、細胞に抗体刺激を加えた後の遺伝子変化の経時的変化の検出の例である。キャピラリ42〜48は、ヒト単球U937細胞に対してTNFα抗体によって抗体刺激を加えた後、0時間、1時間、3時間、6時間、12時間、24時間、48時間経過後の細胞から、実施の態様1に述べた要領で標識化ターゲットを用意する。そのターゲットを同一基板上でハイブリダイゼーションさせることによって、図4に示したような遺伝子変化パターンを得ることが出来るであろう。TNFαによる抗体刺激によって、そのレセプターであるTNFR1の発現が6時間後から上昇し始め、経時的にさらに発現頻度上昇が見られ、それに呼応するように、遅れて24時間後にTNFα遺伝子の発現頻度が上昇するであろう。これまでは、画像データ取得後、解析ソフトを用いて数値化を行った後に、はじめて遺伝子発現頻度差の結果を得ることが出来たが、この遺伝子特性によるグループ化をおこなったプローブ固相化アレイをキャピラリーアレイシステム（たとえば特開2001-136963を参照）に使用することによって、いずれのレセプター／リガンド対の発現が変化しているのか、視覚的に経時変化を捉えることが出来る。また、一枚の基板上でハイブリダイゼーションおよび洗浄を行うことで、より再現性の高い結果を得ることが可能となる。上記の通り、プローブ群毎に一つの至適反応条件を適用して各プローブ群がいずれも最良の結果を得ることが可能となる。プローブ特性の指標としてTm値が挙げられるが、プローブとして使用するDNAが長鎖になった場合には、Tm値よりもプローブ自身が自己構造を取ることによりハイブリダイゼーションの阻害可能性が問題となる。このため本発明で示したように、プローブの自己構造化を計算により算出し、プローブ特性指標としてグループ化を行えば最良の結果を得ることが可能である。また、プローブ特性だけではなく、標的物質（たとえば標的核酸）の特性、特に標的物質の機能的特性によりグループ分けを行うことにより、これまで行うことができなかった視覚的に被検試料中の標的物質量の変化を捉えることが可能となる。
【００７５】
本発明の態様に従うと、ハイブリダイゼーションにおける従来における問題点が解決される。そればかりか従来では問題とされているこのような特徴を利用してしまうという逆転の発想により、反応効率に優れ、かつ再現性に優れたプローブ固相化反応アレイと、これを用いた反応方法が提供される。プローブ特性や、標的物質の機能的特性に着目して、プローブのグループ化または配置レイアウトの工夫を行うことで、より再現性に優れた、視覚的に見易いプローブ反応アレイ実験を実現することが可能となる。
【００７６】
【発明の効果】
本発明のプローブ固相化アレイを使用することにより、プローブ特性や、標的物質の機能的特性に着目して、プローブのグループ化または配置レイアウトの工夫を行うことで、より再現性に優れた、視覚的に見易いプローブ反応アレイ実験を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】計算フィルターの例を示すフローチャート図。
【図２】TNF/TNFRファミリー遺伝子を自己構造化指標によってグループ化したレイアウト図。
【図３】TNF/TNFRファミリー遺伝子の遺伝子機能によってグループ化したレイアウト図。
【図４】TNF/TNFRファミリー遺伝子の遺伝子機能によってグループ化したアレイの解析例を示す図。
【符号の説明】
1  プローブ固相化反応アレイ
２，３，４，５，６，７，８，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８  キャピラリ
９，１０，１１，１２，１３，１４，１５  核酸プローブ群
１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２  試料注入口
２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９  試料排出口
３０，３１  基板
３３  ヒータ
３４a、３４ｂ  連結部
【図１】
2004191253.tif 000006
【図２】
2004191253.tif 000007
【図３】
2004191253.tif 000008
【図４】
2004191253.tif 000009