(57)【要約】【課題】液体サンプル中の糖化タンパク質を定量するための多層試薬試験片並びにこれを使用する方法およびキットを提供する。【解決手段】多層試薬試験片は少なくともフィルター層、プロテイナーゼ層およびケトアミンオキシダーゼ信号生成および液流制御系層を含む。この試験片の使用において、液体サンプルを試験片に適用し、サンプル中の糖化タンパク質レベルを定量するのに使用できる信号を生成する。次いで、定量された糖化タンパク質レベルを用いて液体サンプル中の糖化タンパク質の量を決定することができる。また、この試験片を含むキットおよび系も提供され、本発明の方法に使用される。本発明の組成物および方法は特に糖化タンパク質のモニタリングの用途に使用される。【選択図】　　　　図１
2004004071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）血漿から赤血球を分離するための血液分離エレメント、
（ｂ）該血液分離エレメントと液体連絡連絡しているプロテアーゼ層、および
（ｃ）該プロテアーゼ層と液体連絡しているケトアミンオキシダーゼ信号生成系
を備える多層試験片。
【請求項２】
（ａ）請求項１記載の多層試験片、および
（ｂ）該多層試験片上に生成された信号を検出するための信号検出装置
を備える、液体連絡サンプル中の糖化タンパク質の量を測定するための測定系。
【請求項３】
（ａ）生理学的サンプルを請求項１記載の多層試験片に適用し、
（ｂ）該試験片上に生成された信号を検出して該生理学的サンプル中の糖化タンパク質を定量する
ことを含む、生理学的サンプル中の糖化タンパク質の定量方法。
【請求項４】
（ａ）請求項１記載の多層試薬試験片、および
（ｂ）（ｉ）生理学的サンプルを取得するための手段、および
（ｉｉ）コントロール
の少なくとも一方
を含む、生理学的サンプル中の糖化タンパク質の濃度決定に使用するキット。
【請求項５】
請求項１記載の多層試薬試験片を備える信号検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は検体検出、特に糖化タンパク質の検出である。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者は異常に血糖値が高いが、これは一般に膵臓が十分な量の活性ホルモンであるインスリンを血流中に分泌して炭水化物代謝を制御していないからである。血糖過多状態として知られる異常に高い血糖値が長期間続いたままにしておくと、患者は、網膜症、腎症、神経障害および心臓血管病を始めとする糖尿病の慢性合併症に罹る。研究によれば、正常に近い血糖コントロールを維持できる糖尿病患者はこれらの悲惨な合併症に罹る可能性が非常に低くなる。従って、血糖状態を測定しコントロールするためにいくつかの試験が開発されている。
【０００３】
血糖状態をコントロールするための一般的な医学テストの一つは糖尿病患者による血糖値の直接測定である。ある一日を通してみると血糖値は個々の病例の性質と重篤度とに応じて食事、活動および処置に影響されて顕著に変動するので、患者によっては一日に７回までも血糖値を測定している。測定された血糖値で観察されたパターンに基づいて、患者と医師が一緒に食事、運動およびインスリン摂取量を調整してこの病気をよりよく管理している。明らかに、この情報は患者が直ちに入手できなければならない。
【０００４】
しかしながら、血糖値は一日の内で頻繁に変動するので、患者の食事、活動および／または処置とは独立した、かつ血糖値のより長期的な表示を提供する試験も開発されている。これらの試験は糖化タンパク質、すなわち「タンパク質結合グルコース」（ＰＢＧ）の濃度を測定するものである。タンパク質、例えば全血、血清その他の体液中に存在するタンパク質は非酵素的条件下でグルコースと反応して糖化タンパク質を生成する。この反応の程度は血中のグルコース濃度に直接依存する。
【０００５】
最初に開発された糖化タンパク質試験の一つは糖化ヘモグロビン、すなわちヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を測定しているが、これは約２ヶ月〜３カ月にわたる血糖コントロールを反映している。他のそのような試験は血清タンパク質、例えば全糖化血清タンパク質、または特定の糖化血清タンパク質、すなわち糖化アルブミンを測定している。糖化アルブミンは約２週間〜３週間の期間の中間的血糖コントロールを反映している。
【０００６】
血糖濃度を間接的に評価するさらに他の方法は糖化タンパク質の濃度を分析することである。血漿タンパク質は生体内でグルコースと血中タンパク質の利用可能なアミノ基、主にリジン残基のγ−アミノ基、タンパク質の末端アミノ酸のα−アミノ基との間の非酵素的反応により糖化される。このグルコースはタンパク質のアミノ基に結合してシッフ塩基、すなわちアルジミンを形成し、このアルジミンは分子転移して安定なケトアミンを形成する。当技術において、そのようなケトアミン類は「フラクトースアミン」と総称されている。タンパク質の糖化およびフラクトースアミンの形成の程度は血中グルコース濃度に直接比例する。血清または血漿糖化タンパク質値の測定は糖尿病コントロールをモニターするのに有効であるが、この理由は、血清または血漿中の糖化タンパク質濃度は約半月の期間にわたる血糖値の平均値を反映しているからである。
【０００７】
血中糖化タンパク質値を正確に決定する現在使用されている検定法の一例はゲンザイム社（ＧｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から市販されているグリプロ（ＧｌｙＰｒｏ（商標））であり、この検定方法は特許文献４に記載されている。この検定方法は正確な結果を提供するものの、臨床検査室で熟練した技術者が複雑な器具を用いてこれを行っているため、家庭でまたは医師のオフィスで使用するのには適していない。
【０００８】
特許文献１、特許文献２および特許文献３はフラクトースアミン定量用の多層試薬試験片を記載しており、ここでは試験片は家庭および医師のオフィスでの使用に合わせてデザインされている。しかしながら、上記特許文献に記載されている試験片により得られる測定は不正確になりやすい。それは、液体連絡サンプル中のフラクトースアミン検体以外の物質も信号生成系と反応し、この系により発声された信号に影響し、そのような試験片を用いて行う最終的なフラクトースアミン定量に不正確さをもたらすからである。
【文献１】
米国特許第５，４７０，７５２号公報
【文献２】
米国特許第５，６９５，９４９号公報
【文献３】
米国特許第５，７２５，７７４号公報
【文献４】
米国特許第６，００８，００８号公報
【文献５】
特許協力条約特許出願公開第ＷＯ　９６／３１２７０号公報
【文献６】
特許協力条約特許出願公開第ＷＯ　９６／３１６１９号公報
【文献７】
特許協力条約特許出願公開第ＷＯ　９６／３４９７７号公報
【文献８】
ヨーロッパ特許第ＥＰ８２１０６４号公報
【文献９】
ヨーロッパ特許第ＥＰ７３７７４４号公報
【考案の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、糖化タンパク質の定量に適した形態であって、家庭および医師のオフィスでの使用に適しており、かつ現在使用されている臨床検査室に基づいた手順を用いて達成された高度に正確な測定を提供する追加の多層試薬試験片の形態の開発に引き続き関心が持たれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
液体連絡サンプル中の糖化タンパク質を定量するための多層試薬試験片およびこれを使用する方法が提供される。本発明の多層試験片は少なくともフィルター層、プロテアーゼ層およびケトアミンオキシダーゼ信号生成および液流制御系層とを含む。本発明の試験片を使用する際に、液体サンプルがこの試験片に適用され、サンプル中の糖化タンパク質を定量するのに使用できる信号が生成される。本発明の試験片を含み、本発明の方法を実施するのに利用できるキットおよび系も提供される。本発明の組成物および方法は他の用途のうち、特に糖化タンパク質のモニタリング用途に利用できる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、糖化タンパク質の定量に適した形態であって、家庭および医師のオフィスでの使用に適しており、かつ現在使用されている臨床検査室に基づいた手順を用いて達成された高度に正確な測定を提供する追加の多層試薬試験片並びにこの試験片を含むキットおよび系が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
液体サンプル中の糖化タンパク質を定量するための多層試薬試験片およびこれを使用する方法が提供される。本発明の多層試薬試験片は少なくともフィルター層、プロテアーゼ層およびケトアミンオキシダーゼ信号生成液流制御系層を含む。本発明の試験片を使用する際に、液体サンプルがこの試験片に適用され、サンプル中の糖化タンパク質の定量に使用できる信号が生成される。
【００１３】
本発明をさらに説明する前に、本発明は下記の特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲内で特定の実施形態に種々の変更をすることが可能であることが了解されるべきである。また、特定の実施形態を説明するために使用されている用語は限定的であることは意図されておらず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により決まることが了解されるべきである。
【００１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形は特にそうでない旨明記されていない限り複数の場合についての言及も含む。別の定義がなされていない限り、ここで使用されている技術および科学用語はすべて本発明の属する分野の当業者に普通に了解されるものと同じ意味を有する。
【００１５】
数値範囲が示されている場合、文脈が明確にそうでないことを示していない限り、下限値の単位の１０分の１までのその範囲の上下限値間のそれぞれの中間値、およびその規定された範囲における任意の規定された値または中間値が本発明に含まれる。これらの小範囲の上下限値は、その規定された範囲に特に除外される限界があればそれに従うことを条件として、これら小範囲内にそれぞれ独立に含まれていてもよく、これらも本発明に包含される。
【００１６】
別様に定義されていない限り、ここで使用されている技術的および化学的用語は本発明が属する技術分野における当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載されているものと同様または同等の任意の方法、装置および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法、装置および材料を以下に説明する。
【００１７】
本明細書中に言及されている刊行物はすべて、これら刊行物に記載され、かつ今説明している発明に関して使用することができるかもしれない細胞株、ベクターおよび方法を説明し開示する目的で、本明細書において参照されることによって本発明の一部をなす。
【００１８】
以上、要約したように、本発明はサンプル中の糖化タンパク質を定量するための多層試薬試験片並びに本発明の試験片を含む系およびキットを提供する。さらに本発明を説明すると、はじめに試験片を詳細に説明し、引き続きこれらの試験片を使用して糖化タンパク質レベルを定量する方法を検討する。最後に、本発明による代表的系およびキットの検討をする。
【００１９】
多層試薬試験片
以上要約したように、本発明は多層試薬試験片を提供し、この試験片は以下に詳細に説明するように、液状組成物中の糖化タンパク質を定量する用途がある。本発明の試薬試験片は多層試薬試験片であり、本発明の試薬試験片が複数の異なる層を含み、これらの層が順次液体連絡しており、複数層の内の第一の層に適用された液体連絡がこれら複数層の内の他の層に順次移動するようになっていることを意味する。
【００２０】
本発明の試験片を構成する分離している層の数は変化し得るが、典型的には約２層〜１０層、多くの実施形態で通常３層〜７層である。多くの実施形態で、本発明の試験片は最低３層の異なる層を含み、これらの層は順次（ａ）血漿から赤血球を分離するための血液フィルター層、（ｂ）プロテアーゼ層、および（ｃ）ケトアミンオキシダーゼ信号生成および液流制御系層である。そのようなものとして、本発明の試験片は多くの実施形態で少なくとも上述の層を順次含んでおり、第２のプロテアーゼ層が第１の血液フィルター層に液体連絡しており、第３のケトアミンオキシダーゼ層が第２のプロテアーゼ層と液体連絡している。多くの実施形態で、追加の機能を提供する一層以上の追加の層も存在している。
【００２１】
血液分離層
本発明の多層試薬試験片の第一のエレメントは全血から血漿を製造するのに役立つ血液分離エレメントであり、ここで血漿は次いでさらなる処理／分析のための次の層内に流入する。このエレメントは２層分離エレメントとしてまたは１層分離エレメントとして存在してよい。これらの異なる実施形態のそれぞれについて以下にさらに詳細に説明する。
【００２２】
２層血液分離／フィルターエレメント
ある実施形態では、２層構造を用いて全血から血漿を製造しているが、この場合２層としては血液分離層とフィルター層を含み、これらの層は直列に動作して無赤血球血漿を製造し、次にこの無赤血球血漿が次の層で試験される。本明細書において使用されているように、「血漿」は全血から本発明の分離方法および装置により赤血球を除去した後に得られる実質的に無色の液体を意味する。本発明の試験片の血液分離／フィルター層は分離マトリックスとフィルター層を含む。
【００２３】
本発明の分離マトリックスはガラス繊維を含まない透過性マトリックスであり、従って「透過性非ガラス繊維マトリックス」と呼ばれる。「透過性」は液体に透過性であること、例えば血漿に対して透過性であること、並びにマトリックスがポリオールの不存在下に提供されたときに赤血球に対して透過性または浸透性であることを意味する。本明細書において使用されているように、「ポリオールの不存在下に赤血球に対して浸透性のマトリックス」は、ポリオールがマトリックス中にまたはマトリックス上に含まれていないと赤血球が簡単にほとんど直ちにマトリックスを通過することを意味する。ポリオールが存在しないと赤血球は濾過その他により、マトリックスに保持されない。
【００２４】
マトリックス中または上に含まれるポリオールは全血サンプルと化学的に反応して赤血球を凝集させる。本明細書において使用されているように、「凝集」は全血サンプル中に分布している赤血球を集めて集合体または群にすることを意味する。いかなる理論または機作に束縛されるつもりはないが、凝集はポリオールと赤血球の間の膠着、凝固その他の相互作用の結果であり得る。
【００２５】
有効な透過性マトリックスは織られた材料または不織材料であることができ、かつ親水性であってもなくてもよい、吸収性または非吸収性材料であることができる。マトリックス用に特に好適な材料としては、例えば織られたまたは不織の、吸収性または非吸収性のナイロン、レーヨン、綿、アクリルおよびポリエステルが挙げられる。本発明の一実施形態において、マトリックスは不織の非吸収性ポリエステルである。このポリエステルはポリ（パラフェニレンテレフタレート）、例えばソンタラ（Ｓｏｎｔａｒａ（登録商標））（デュポン社、米国デラウェア州ウィルミントン市）として市販されている好適なポリエステルに用いられているものが好ましい。他の好ましいマトリックスは織られた吸収性ナイロンであるテテックス（Ｔｅｔｅｘ（登録商標）３−３７１０）（テトコ社（Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ランカスター市）である。
【００２６】
マトリックスの多孔率等の性質によって、凝集した赤血球はマトリックス中に保持されるかまたはフィルター材料により下記のように濾過される。上述のマトリックス材料の内のあるもの、例えば不織の非吸収性ポリエステルは従来の意味での、すなわち、例えば孔径（μｍ）で測定できる「細孔」を持たない。本発明のポリオールの不存在下では、そのような材料は本質的に多孔率に制限がなく、平均の大きさが５μｍである赤血球に対して浸透性である。そのような巨大細孔（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）材料では、ポリオールが存在しないと、赤血球はマトリックスをほとんど直ちに通過する。多孔率に基づいて特徴づけることができるそれらのマトリックス材料に対して、本発明で用いられるマトリックスは一般に約２μｍ〜約１０μｍの孔径を持つことができる。このような孔径は凝集した赤血球を保持するのに有効であり得うる。マトリックスの多孔率、厚さ（一般に２００μｍ〜１，１００μｍである）および他の性質、例えば吸収力によって、凝集した赤血球はマトリックス中に保持されるか、または以下に説明するように最終フィルター内に捕獲される。
【００２７】
ポリオール含有マトリックスはサンプルを適用するための第一の表面と血漿を受容し追加の分離のために利用可能となる第二の表面とを有する。一般に、第一の表面および第二の表面はマトリックスの対向面に提供される。全血サンプルは、第一の表面から第二の表面に向かって、そのような方向性を持った流れを生じる条件下で、例えば重力、真空または外圧下で、流入する。この方法を単純化するために、所望により、分離を重力のみにより行うことができる。分離マトリックスが垂直方向の流れを、好ましくは重力により提供するのが好適である。
【００２８】
この分離方法および装置はポリオールを含有する透過性非ガラス繊維マトリックスを含む。本明細書で使用されているように、「ポリオールを含有するマトリックス」および「ポリオール含有マトリックス」という用語はポリオールがマトリックスに別個に添加され、セルロース濾紙のようにマトリックスの組成または構成中に元来見出される成分ではないことを意味する。さらに、「ポリオールを含有するマトリックス」はポリオールがマトリックス内またはマトリックス上にマトリックスに対して共有結合によりもしくはまたは非共有結合により含浸させることができることを意味する。好適な実施形態では、このポリオールはマトリックス内に含浸される。
【００２９】
本明細書において使用されているように、「ポリオール」という用語は２個以上のヒドロキシル基を含有するアルキルまたは芳香族であるポリヒドロキシアルコールを意味する。「ポリオール」に使用されている「ポリ」という用語はアルキルまたは芳香族化合物がモノマー反復単位から構成される大きなポリマーであることを意味するのではなく、この化合物に２個以上のヒドロキシル基が存在することを意味している。以下にさらに詳細に述べるように、多糖類を除いて、本発明で用いられているポリオール類は単純な糖類または糖アルコール類、オリゴ糖類その他の天然または非天然産の非ポリマー性アルキルもしくは芳香族化合物である。従って、「ポリオール」という用語は糖類、糖類のアルコール誘導体、ここでの名称では糖アルコール類、その他の天然または非天然産の非ポリマー性ポリオール類を包含する。
【００３０】
本明細書において使用されているように、「糖類」は単糖類、オリゴ糖類および多糖類を含む。単糖はアルデヒド基またはケトン基を含有する直鎖状、分岐鎖状もしくは環状ポリヒドロキシアルコールである。単糖類の例としては、限定されないが、マンノース、グルコース、タロース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、リキソース、リボース、およびフラクトースが挙げられる。オリゴ糖は２個〜２０個の単糖ユニットがグリコシド結合により結合されてなる直鎖状もしくは分岐鎖状炭水化物である。本発明で使用できるオリゴ糖類としては、限定されないが、二糖類、例えばスクロース、トレハロース、ラクトース、およびマルトースが挙げられる。本発明で使用できる大きなオリゴ糖類の例としてはシクロデキストリン、例えばα−シクロヘキシルアミロース、β−シクロヘプタンアミロース、およびγ−シクロオクトアミロース並びに当技術において周知の他のオリゴ糖類が挙げられる。多糖はグリコシド結合により結合された１０個より多い単糖類を有する直鎖状または分岐鎖状の任意のポリマーである。多糖類の例としては、限定されないが、フィコール、ポリスクロースおよびヒドロキシエチル澱粉が挙げられる。
【００３１】
「糖」に包含されるのは天然産の糖類並びに植物または動物中に天然に存在することが知られてはいるが未だ同定されていない糖類である。例えば、５種類の天然に存在するアルドヘキソースが存在し、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−タロース、Ｄ−ガラクトース、およびＬ−ガラクトースを含む。しかしながら、アルドヘキソース構造は４個のキラル炭素を有するため、６０個の可能な立体異性体は、すべて知られているが、わずか上記５種類のみが天然に植物または動物中に存在することが同定されているにすぎない。このように、「糖」は鏡像異性体（エナンチオマー）をＤ−またはＬ−形の糖並びにそれらのラセミ混合物として包含する。
【００３２】
本発明のポリオールはまた「糖アルコール」であってもよい。「糖アルコール」は一般に単糖またはオリゴ糖上のアルデヒドもしくはケトン部分の還元により形成される単糖またはオリゴ糖のアルコール誘導体である。糖アルコール例としては、限定されないが、マンニトール、ソルビトール、アラビトール、イノシトール、ガラクチトール、エリスリトールおよびスレイトールが挙げられる。「糖アルコール」の定義には、上述の単糖類およびオリゴ糖類のアルコール誘導体も含まれている。
【００３３】
糖アルコールにキラル炭素が存在する場合は、この糖アルコールはＤ−スレイトールまたはＬ−スレイトールのようにＤ−形でもＬ−形でもよく、あるいはＤ−形およびＬ−形の両方のラセミ混合物であってもよい。糖アルコールは天然産のものであってもよいが、これに限定されない。すなわち、糖アルコールは基地の天然産の糖の誘導体であってもよく、あるいはまた、存在する事が知られているが天然に存在することが同定されていないＤ−またはＬ−配置を有していてもよい。糖アルコールはまた還元された形で自然界に見出される糖であってもよく、または誘導体としては自然界に存在することが知られていない糖のアルコール誘導体であってもよい。
【００３４】
糖または糖アルコールに加えて、ポリオールは非ポリマー性の天然産もしくは非天然産のポリオールであってもよく、かかるポリオールとしては２個以上のヒドロキシル基を含有する直鎖状、分岐鎖状もしくは環状のアルキルまたは芳香族化合物が挙げられる。本明細書において使用されているように、「非ポリマー性」という用語はこのアルキルまたは芳香族化合物がポリマーではないことを意味する。ポリマー類は、開いていても、閉じていても、直鎖状、分岐鎖状であっても、もしくは架橋していてもよい、長鎖からなる高分子量化合物として定義され、この長鎖は同じでも異なっていてもよいモノマーと呼ばれる反復単位からなるものである。本明細書において使用されているように、「天然産の」ポリオール類は自然界に存在するポリオール類であり、また「非天然産の」ポリオール類は自然界には見出されない。一般に、これらの天然産または非天然産のアルキルもしくは芳香族化合物は大きさが炭素数３〜２０（Ｃ３〜Ｃ２０）、好ましくは炭素数３〜１０（Ｃ３〜Ｃ１０）の範囲内である。そのような天然産、非天然産のポリオール類の例としては多くの脂質類中に存在する三炭素トリヒドロキシアルコールであるグリセロール、およびキニン酸、すなわち１，３，４，５−テトラヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、が挙げられ、この酸は塩の形であってもよい。非天然産、非ポリマー性ポリオール類の例としてはペンタエリスリトールおよびジペンタエリスリトールが挙げられる。
【００３５】
一実施形態では、ポリオールをマトリックスに適用するために、ポリオールを単に水溶液に溶解してもよい。単独で使用するときには濃度は約２０％であり、ポリカチオン性ポリマーと組み合わせるときは約１０％の濃度である。この場合、ポリカチオン性ポリマーの濃度は以下に詳細に述べるように約０．５％〜５％の濃度で存在する。所望により、ポリオールを低濃度で含有する多層マトリックス、例えば５％ポリオールを含有する４層マトリックスも使用することができる。ポリオールと、存在する場合、ポリカチオン性ポリマーとは生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）、燐酸バッファ食塩水（ＰＢＳ）、有機溶媒等から選んだ一種に溶解することができる。
【００３６】
ポリオールに加えて、ポリカチオン性ポリマーをマトリックスに添加することができるが、添加は必須ではない。マトリックスにポリオールを添加するのと同様に、ポリカチオン性ポリマーもマトリックス内または上に共有結合によりまたは非共有結合により物理的に含浸、塗布することができる。ポリカチオン性ポリマーは赤血球を凝集させるのに有効であり、凝集した赤血球を安定化するのにも有効である。
【００３７】
ポリカチオン性ポリマー成分は２個以上のカチオン性部位を有する任意のポリマーであってもよく、一般にアミン基を含有するモノマーに主成分としている。好適なポリカチオン性ポリマーとしては、例えばヘキサジメスリンブロマイド、トリメチリレンヘキサメチレンジアンモニウム・ブロマイド、ポリリシン、ポリアリルアミン、ポリアルギニン、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートとメチルメタクリレートの共重合体、ポリエチレンイミン、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（１，１−ジメチル−３、５−ジメチレンピペリジニウム・クロライド）およびこれらの混合物が挙げられる。重合した正に帯電したアミノ酸類、例えばポリリシンはアミノ酸類がＤ形またはＬ形のいずれかであってもよく、例えばポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｄ−リシンあるいはそれらのラセミ混合物、例えばポリ−Ｄ，Ｌ−リシンが挙げられる。
【００３８】
上述のように、一実施形態では、ポリカチオン性ポリマーをマトリックスに適用するためには、ポリカチオン性ポリマーを、例えば水、生理食塩水、ＰＢＳ、有機溶媒等の溶液中に溶解し、次いでマトリックスをポリマー含有溶液中に浸漬する。一般に、ポリマーの濃度は約０．５％〜５％である。マトリックスにポリオールとポリマーの両方が含まれている場合、ポリオールとポリマーをマトリックスに適用する順序は無関係である。たとえば、ポリオールとポリマーを上述のような水溶液または溶媒に同時にまたは順次溶解してポリオールとポリマーの両方を下記の実施例に記載したようにマトリックスに同時に適用してもよい。あるいはまた、ポリオールとポリマーを任意の順序でマトリックスに順次適用してもよい。
【００３９】
非溶血性洗剤、例えばプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（プラグマチクス社（Ｐｒａｇｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、米国インディアナ州エックハルト市）を上述の水溶液または溶媒に一般に０．０１％〜０．１％の濃度で添加することができる。そのような洗剤はポリオールのマトリックスへの含浸を最大化するのを助け、全血サンプルと血漿の流量を改善する。流量をさらに向上することができる他の任意的剤としては、例えばポリビニルピロリドンまたは類似のポリマー類およびマトリックスと下記のフィルター材料に強さを与える他の充填剤が挙げられる。
【００４０】
加えて、マトリックスは緩衝を取り除くための一種以上の追加の試薬、例えばアスコルビン酸干渉を取り除くためのＫＩＯ３、ＫＭｎＯ４、ＦｅＳＯ４、尿酸干渉を取り除くためのウリカーゼを含んでいてもよい。
【００４１】
上述のように、フィルター材料を本発明のマトリックスと組み合わせて使用することができる。好適なフィルター材料としては、例えばナイロン、セルロースアセテート、ポリスルホン、合成繊維およびポリカーボネートが挙げられる。フィルターは膜であることができるが、必ずしも膜でなくてもよい。例示的なフィルターおよび膜としては、例えばＢＴＳポリスルホン膜（メムテック社（Ｍｅｍｔｅｋ，Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州サンジエゴ市）、アールシュトローム（Ａｈｌｓｔｒｏｍ）合成繊維シート、例えば９４−３０Ａ（アールシュトローム・フィルトレーション社（ＡｈｌｓｔｒｏｍＦｉｌｔｒａｔｒｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、米国ペンシルバニア州マウント・ホーリースプリング市）、バイオダインＡ（ＢｉｏｄｙｎｅＡ（登録商標）ナイロン膜（ポール社（ＰａｌｌＣｏｒｐ．）、米国ニューヨーク州イースト・ヒルズ市）、アルトラバインド（Ｕｌｔｒａｂｉｎｄ）４５０（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）社、米国ミシガン州アン・アーバー市）、およびニュークリオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（登録商標）、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市）が挙げられる。
【００４２】
なんらかの追加のフィルター材料が必要であるか否かは大幅にマトリックスの多孔率、厚さ、吸収性等の性質によって決まる。例えば、凝集した赤血球はマトリックスの上述の性質に基づいてマトリックス中に保持する事ができる。それとは別に、あるいはそれに加えて、最終フィルター材料を任意の追加の赤血球凝集体を捕獲または保持するのに使用することができる。存在する場合、フィルター材料は一般に約１２μｍ以下、好ましくは１０μｍ未満、さらに好ましくは５μｍ以下の多孔率を有することができる。
【００４３】
フィルター材料はポリオール含有分離マトリックスのしたに置き、それによりマトリックスを支持することができる。
【００４４】
本発明の好適な実施態様では、血液分離方法および装置はマンニトールを含浸した不織の非吸収性ポリエステルマトリックスとマトリックスの下のナイロンまたはポリスルホン膜とを含む。このマトリックスはさらにヘキサジメスリンとＫＩＯ３を含んでいるのが好ましい。
【００４５】
上述の二層濾過エレメントはさらに米国特許第５，４７０，７５２号、同第５，６９５，９４９号および同第５，７２５，７７４号公報明細書にさらに詳しく記載されており、これらの公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。
【００４６】
単層濾過層
他の実施形態では、血液分離は単層濾過層から構成されるエレメントにより達成される。これらの実施形態では、単一濾過層は典型的には多孔性マトリックスであり、この場合サンプルがマトリックスの一端から他端に移動するにつれて分離が起きる。その分離を達成する代表的なマトリックスは赤血球をトラップする一般に孔径約０．１μｍ〜約５μｍの孔を有していてもよい。ある実施形態では、この膜は孔径の範囲について異方性であり、例えば孔径範囲が広い。マトリックスが異方性膜を含むときは、非濾過血液が適用される第一の面は大孔径面であってもよい。例えば、約０．１μｍ〜約１５０μｍの孔径の勾配が膜を通して広がっていてもよい。大孔径側では、孔径は約３０μｍ〜約４０μｍの範囲内であるのが好ましい。孔が最小である膜面（すなわち、液が次の層に通過する耐えに存在する面）では、空孔体積は比較的小さく、かつ膜上の材料は一般に非常に密であり、典型的には膜厚の２０％以下を構成することができる層内にある。この層内では、孔径はある場合には約０．１％〜約０．８％の範囲内であり、正常な孔径は約０．３μｍであることが多い。ある実施形態では、マトリックスは赤血球をトラップするだけでなく赤血球の溶血を最低限にし、その結果、液流の方向に下流の層にマトリックスを通して通過するサンプルのいずれの部分も約７００ｎｍにおいて認識し得るほどの光を吸収することがないようにするマトリックスである。
【００４７】
分離層のマトリックスは一般に親水性多孔質膜である。このマトリックスはそれを通して水性媒質が流れることが可能である。ポリスルホン類およびポリアミド類（ナイロン類）は好適なマトリックス材料の例である。匹敵する性質を有する他のポリマー類を使用してもよい。分離層のマトリックスを形成する多孔質材料を調製するための好適な方法はこのポリマーを支持コアなしに流延することである。そのようなマトリックスは、例えばメムテック社から入手できる異方性ポリスルホン膜である。「マトリックス」および「膜」という用語は本明細書では相互交換可能に用いられている。各用語は単一層に限定されないことが了解され、例えば吸収性層を含んでいてもよい。約５００μｍ未満の厚さのマトリックスが通常使用され、約１１５μｍ〜１５５μｍが好ましい。約１３０μｍ〜１４０μｍの厚さがもっとも好ましく、特にマトリックスがナイロンまたは異方性ポリスルホンであるときに好ましい。マトリックスは一般に湿潤時に変形せず、その最初の形状および大きさを保持するため、通常の製造を行うことができる湿潤強さを十分にもっている。
【００４８】
プロテアーゼ層
血液分離エレメント／層から液流方向に下流には本発明の多層試薬試験片のプロテアーゼ層がある。この層はマトリックスまたは膜材料およびプロテアーゼ酵素を含む。このマトリックス材料は多孔質材料でありマトリックスを通してサンプル液の流れを提供する。この層に用いられているマトリックスは典型的には不活性多孔質マトリックスであり、プロテアーゼ成分を支持するものである。そのようなものとして、このマトリックスは水溶液流に対して透過性であり、プロテアーゼがマトリックス通過液中に存在するタンパク質に作用を及ぼすのに十分な空孔スペースを提供する。多数の異なる種類の多孔質材料が種々の検体の検出検査用に開発されており、それらのマトリックスは材料、孔径、大きさ等に関して異なっていてもよいが、典型的なマトリックスとしては米国特許第５，９３２，４３１号、同第５，８７４，０９９号、同第５，８７１，７６７号、同第５，８６９，０７７号、同第５，８６６，３２２号、同第５，８３４，００１号、同第５，８００，８２９号、同第５，８００，８２８号、同第５，８９８，１１３号、同第５，６７０，３８１号、同第５，６７３，０５４号、同第５，４５９，０８０号、同第５，４５９，０７８号、同第５，４４１，８９４号および同第５，２１２，０６１号公報明細書に記載されているものが挙げられる。これらの公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。試験片の大きさおよび多孔率は大きく異なっていてもよく、マトリックスは例えばサンプル適用領域に大きな孔および検出領域には小さな孔を持つ多孔率の勾配を有していてもよく、有していなくてもよい。具体的に関心のあるマトリックス材料の例としてはポリアミド（ナイロン）、ポリスルホン、ポリエステル、ポリアクリレート、セルロース、ポリカーボネート、ニトロセルロース等が挙げられる。
【００４９】
プロテアーゼ層はまたプロテアーゼ、すなわちプロテアーゼ活性を有する酵素を含む。このプロテアーゼ層の膜またはマトリックスは典型的にはプロテアーゼの活性が保存される仕方でプロテアーゼを塗布されている。このプロテアーゼ層のプロテアーゼはタンパク質分子を切断して到達可能なケトアミン結合を生じるものである。任意の好都合なプロテアーゼを使用することができ、代表的プロテアーゼとしてはプロテアーゼＸＩＶ、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、サブスチリシン（ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ）、トリプシン等が挙げられる。
【００５０】
信号生成および液流制御系層
上述のプロテアーゼ層層と液体連絡し、かつその下流にケトアミンオキシダーゼ信号生成および液流制御系層がある。この信号生成層は多孔質マトリックスまたは膜エレメント、例えば上述のようなものを含み、ケトアミンオキシダーゼ信号生成系を含む。本発明の試験片では、信号生成系の一つ以上の構成要素は共有結合により、または非共有結合によりマトリックスの少なくとも一部分（すなわち、検出部分）に、そして多くの実施形態では実質的にすべての多孔質マトリックスに結合されて連絡されている。多くの実施形態において、マトリックスまたは膜成分は典型的にはケトアミンオキシダーゼ信号生成系の試薬を塗布されている。
【００５１】
多層試薬試験片のこの特定の層のケトアミンオキシダーゼ信号生成系は酸化信号生成系である。酸化信号生成系とはサンプル中のケトアミン濃度からの検出可能な信号を生成する際に、ケトアミン結合がケトアミンオキシダーゼにより酸化されて基質の酸化型と相当するまたは比例する量の過酸化水素とを生成することを意味する。次いで、過酸化水素は、今度は一種以上の指示化合物（本明細書ではクロモゲン系と総称する）からの検出可能な生成物を生成するために使用され、この場合、信号生成系により生成される検出可能な生成物の量、すなわち信号は次いで最初のサンプル中のケトアミンの量に関係づけられる。そのようなものとして、本発明の試験片中に存在するケトアミンオキシダーゼ酸化信号生成系は過酸化水素−基信号生成系または過酸化物生成信号生成系としても正確に特徴づけられる。
【００５２】
上述のように、本発明の信号生成系の一つの構成要素はケトアミンオキシダーゼである。本発明の試薬系に用いられる関心のあるケトアミンオキシダーゼは結合されたケトアミンを特異的に酸化して酸化された基質と相当する量の過酸化水素を生成するものである。ここで、相当する量とは生成される過酸化水素の量がサンプル中に存在するケトアミンの量に比例することを意味する。広範な異なる好適なケトアミンオキシダーゼが当業者に知られており、本発明において使用することができる。関心のあるケトアミンオキシダーゼの代表例としては米国特許第５，７１２，１３８号、同第６，００８，００６号公報明細書に記載されているもの並びにヨーロッパ特許第ＥＰ８２１０６４号および同第ＥＰ７３７７４４号公報明細書に記載のものが挙げられる。これらの公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。
【００５３】
信号生成系のケトアミンオキシダーゼ活性に加えて、信号生成系は本明細書ではクロモゲンと総称される指示化合物も一種以上含み、この場合クロモゲン系は過酸化水素の存在下で発色性生成物を生成する。
【００５４】
この信号生成系は過酸化水素の存在下で色素基質の検出可能な生成物への転換を贖罪する酵素を含んでいてもよい。この場合、この反応により生成される検出可能な生成物の量は存在する過酸化水素の量に比例する。この第２の酵素は一般にペルオキシダーゼであり、好適なペルオキシダーゼとしては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、大豆ペルオキシダーゼ、組み換えにより製造されたペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ活性を有する合成類縁体等が挙げられる（例えば、シ（Ｃｉ）他、（１９９０年）アナリチカ・キミカ・アクタ（ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ）、２３３：２９９〜３０２）。
【００５５】
色素基質はペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素により酸化されて所定の波長範囲の光を吸収する生成物、すなわち指示色素を生成する。この指示色素はサンプルまたは試験試薬が強く吸収する波長とは異なる波長で強く吸収するのが好ましい。この指示薬の酸化体は膜の試験面の色の変化を実証する着色した、わずかに着色したまたは無色の最終生成物であってもよい。すなわち、試験試薬は着色された領域が脱色されることにより、あるいはまた無色の領域が発色することによりサンプル中の検体の存在を指示することができる。
【００５６】
本発明において有効な色素基質は尿素誘導体色素が挙げられる。尿素誘導体としては特開平０１−１１８７６８号、特開平０９−０１９２９６号、ヨーロッパ特許第ＥＰ３８９２０５号、同第ＥＰ１２４２８７号、同第ＥＰ２５１２９７号公報明細書に開示されているものの内、少なくともいくつかが挙げられる。これらの公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより本発明の一部をなす。色素基質は一般に尿素誘導体であり、負電荷を帯びている。この場合、好適な負帯電尿素誘導体としてはカルボキシレート基またはスルホネート基を有するものが挙げられる。関心のある尿素誘導体色素は下式
Ｒ１Ｒ２ＮＣＯＮＨＲ３
（式中、Ｒ１，Ｒ２は一緒になってＮ，Ｎ−二置換アミノアリール基を形成し、Ｒ３はカルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリールスルホニル、スルホアリールおよびカルボキシアリールからなる群から選ばれる）により表される。
【００５７】
Ｒ１およびＲ２のアリール基はＳ（イオウ）を介して結合して色素のフェノチアジン誘導体型となっていてもよく、このものは下記の式により表される。
【化学式１】
2004004071.tif 000003
【００５８】
（式中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立にＮＲ２およびＯＲから選ばれ、ここでＲは水素、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）−アルケニル、アリール、置換アリール、アリールアルキルまたは置換アリールアルキルであり、Ｒ２，Ｒ３は上記の通りであり、かつＲ６およびＲ７はそれぞれ独立に水素、（Ｃ１−Ｃ６）−アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）−アルケニル、アシル、カルボキシル、スルホニル、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）−アルコキシルはたはヒドロキシ−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルから選ばれる。）
【００５９】
あるいはまた、Ｒ１およびＲ２のアリール基はＯ（酸素）を介して結合して色素のフェノチアジン誘導体型となっていてもよく、このものは下記の式により表される。
【化学式２】
2004004071.tif 000004
（式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６およびＲ７は上記と同じである。）
【００６０】
さらに他の実施形態では、Ｒ１　およびＲ２　のアリール基は結合されておらず、このものは下記のジフェニルアミン式により表される。
【化学式３】
2004004071.tif 000005
（式中、Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６およびＲ７は上記と同じである。）
【００６１】
例示的尿素化合物としては１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ロイコメチレンブルー）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、１０−プロピオン酸フェノチアジンおよびこれらの塩類が挙げられる。好適な実施形態では、尿素誘導体色素は１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩である。
【００６２】
特に好適なケトアミン酸化信号生成系層は米国特許出願第０９／５９３，８２７号明細書（この明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす）に記載のものであり、上述のようにケトアミンオキシダーゼを含む。
【００６３】
多くの実施形態において、ケトアミンオキシダーゼ信号生成系層は層中に水性材料が入るのを遅延させる疎水性層であり、試験片上で検査中のサンプルの血漿画分がプロテアーゼ層中に、信号生成系層が疎水性にされなかった場合よりも長い時間、例えば少なくとも約５分間、典型的には少なくとも約１０分間長い時間滞留するようにしている。信号生成系のこの特徴により、プロテアーゼが血漿中に存在するタンパク質を十分に切断して到達可能なケトアミンを生成するのに十分な時間の間、血漿がプロテアーゼ層中に存在することが確実になる。
【００６４】
信号生成系層は任意の都合のよい手順を用いて疎水化することができる。特に関心のある手順の一つは米国特許出願第号明細書（本出願と同時提出の「少なくとも一層の液流制御層を有する多層試薬試験片およびこれを使用する方法」（整理番号ＬＩＦＥ−１２０；ＬＦＳ２３６）に記載されているものであり、その内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。この手順では、信号生成系を含む多孔質マトリックスはたとえば膜を有機溶媒に浸漬することより有機溶媒を塗布されている。関心のある有機溶媒としては、限定されないが、クロロホルム、ジクロロメタン、ハロゲン化炭化水素、炭化水素、酢酸エチル等が挙げられる。信号生成系を疎水性にする他の関心ある手順は膜に脂肪酸その他の液体保持剤、例えば米国特許第５，４４７，６８９号公報明細書に記載されているもので塗布する手順である。この公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。
【００６５】
追加の層
上述の特定のフィルター層、プロテアーゼ層およびケトアミンオキシダーゼ信号生成系層に加えて、本発明の多層試薬試験片は多数の追加の層を含んでいてもよい。
【００６６】
上述の層の上には、次のまたは下にある層を一緒に保持するのに役立つメッシュ層があってもよい。このメッシュ層は任意の都合のよい材料、例えば上述のような不活性マトリックス材料から作製されてもよい。加えて、透明のポリマー性層、例えばポリエステルまたは類似のポリマー性材料層が信号生成系層の下に存在していてもよい。この層は血漿流を増強させることおよび血漿サンプルが検査の完了前に乾燥しないように保護することに役立つ。
【００６７】
上述の層は図１に示すように「積層」構造で存在していることが多く、上方保護片および支持エレメントにより画成されるチャンバ内に存在していてもよい。
【００６８】
代表的な例示的実施形態
図１は本発明による多層試験片の展開図である。図１において、多層試薬試験片１０は射出成形された保護エレメント１１をメッシュ層の頂部に備え、メッシュ層は分離層１３およびフィルター層１４の上に存在し、メッシュ層１３とフィルター層１４は一緒に血液分離エレメントを構成する。この分離エレメントの直下にはプロテアーゼ層１５がある。プロテアーゼ層１５の鹿には信号生成層１６があり、この層はポリマー性フィルム層１７の上を横切って存在する。上述の層は支持エレメント１８上に存在し、支持エレメント１８は手動保持領域１８ａとサンプル検査領域１８ｂとを含む。
【００６９】
図１から判るように、区別できる層のそれぞれがディスク形の層であり、これらの分離された層が順次積層された形状で配置されている。多くの実施形態で、これらの分離された層のそれぞれの表面積は典型的には約０．１ｃｍ２〜約０．２５ｃｍ２、通常約０．１２５ｃｍ２〜約０．１８ｃｍ２であり、図１に示す実施形態においてディスク形層は一般に直径が約０．３５ｃｍ〜約０．６ｃｍ、通常約０．４ｃｍ〜約０．５ｃｍとなるように構成されている。
【００７０】
支持体エレメント１８の全体の大きさは都合のよいハンドヘルド装置を提供するように選択され、支持エレメントの幅が典型的には約０．２５インチ〜約０．７インチ、通常約０．４５インチ〜約０．５５インチおよび長さが約１．５インチ〜約３インチ、通常約２インチ〜約２．５インチとなるように構成されている。
【００７１】
射出成形された保護片１１は典型的には幅が約０．１８インチ〜約０．５インチ、通常約０．３インチ〜約０．３８インチの範囲内であり、長さが約０．３５インチ〜約０．６８インチ、通常約０．４５インチ〜約０．５６インチの範囲内である。
【００７２】
試験片の作製
本発明の試薬試験片は任意の都合のよい手順を用いて作製することができる。典型的には、種々の層を別個に、例えば一種以上の試薬溶液に浸漬する慣用の手順を用いることにより作製し、次いで最終的な試験片に組み立てる。代表的作製手順は下記の実験部分に提供されている。
【００７３】
糖化タンパク質の検出方法
上記多層試薬試験片はサンプル中のタンパク質のケトアミン基の存在およびしばしばその量を検出する方法における用途がある。原則として本発明の方法は種々の異なる生理学的サンプル、例えば尿、涙、唾液等におけるケトアミン基の存在およびしばしば濃度を決定するために使用することができるが、それらの方法は血液または血液画分、例えば血液由来サンプルおよびさらに詳しくは全血中のケトアミン基の濃度を決定する用途に特に適している。
【００７４】
本発明の方法の重要な特徴は、過酸化水素の高感度検出を提供する尿素誘導体色素を含む本発明の信号生成系の使用にある。そのようなものとして、過酸化水素は本発明の安定な乾式試薬形態、例えば試験片を用いてミリモル未満の濃度で検出することができる。ここで、ミリモル未満の濃度とは典型的には０．０１０ｍＭ〜１ｍＭ、通常約０．０５０ｍＭ〜０．８ｍＭの範囲内の濃度を意味する。尿素誘導体色素を含む本発明の信号生成系を使用すると尿素誘導体色素以外の色素基質、例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、４−アミノアンチピリンを含む信号生成系と比べて過酸化水素の検出がより敏感になる。
【００７５】
本発明の方法の実施において、第一の工程は生理学的サンプルの一定量を試験片に適用することである。この場合、試験片は上記のものである。試験片に適用される生理学的サンプル、例えば血液の量は変わることがあるが、一般には約２μｌ〜４０μｌ、通常約５μｌ〜２０μｌである。本発明の試験片の性質のために、試験片に提供される血液サンプルサイズは比較的小さく、約２μｌ〜４０μｌ、通常５μｌ〜２０μｌである。血液が生理学的サンプルである場合、種々の異なるヘマトクリット値の血液サンプルを本発明の方法を用いて検査することができる。この場合、ヘマトクリット値は約２０％〜６５％、通常約２５％〜６０％の範囲内であってもよい。
【００７６】
サンプルを試験片に適用した後、サンプルを試験片の種々の層に順次流通させ、分離エレメントで分離され、プロテアーゼ層で消化され、信号生成系層で信号生成系の構成要素と反応してサンプル中に存在する関心のあるケトアミン基の最初の量に比例する量で存在する検出可能な生成物を生成する。検出可能な生成物の量、すなわち、信号生成系により生成された信号を次いで決定し、最初のサンプル中の糖化タンパク質の量に関連づける。
【００７７】
用途
上述の方法は液体サンプルを試験してその中に存在するタンパク質のケトアミン基の濃度を決定することが望まれる任意の用途に用途がある。特に関心のあるのは本発明を使用して血糖値を決定／モニターすることである。そのような用途において、本発明の方法により提供されたケトアミン基検出濃度は、当技術において知られているように、試験サンプル中の糖化タンパク質の量を決定するのに使用される。この糖化タンパク質の量は、今度は例えば、糖尿病患者の治療および管理において望ましいように、血糖値をモニターするのに用いられる。本発明の試験片の用途はさらに米国特許第５，４７０，７５２号、同第５，６９５，９４９号、同第５，７２５，７７４号および同第６，００８，００６号公報明細書に記載されている。これらの公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。
【００７８】
検出系
本発明の方法を実施するのに有効な検出系は上述の試薬試験片と信号検出装置すなわち読取器を含む。そのような系では、生理学的サンプルを上述の試験片に適用し、信号生成系により生成された信号を検出し、上記装置によりサンプル中に存在する糖化タンパク質と関連づける。上述の反応、検出および関連づけ工程並びにこれらを実行する装置はさらに米国特許第４，７３４，３６０号、同第４，９００，６６６号、同第４，９３５，３４６号、同第５，０５９，３９４号、同第５，３０４，４６８号、同第５、３０６、６２３号、同第５，４１８，１４２号、同第５，４２６，０３２号、同第５，５１５，１７０号、同第５，５２６，１２０号、同第５，５６３，０４２号、同第５，６２０，８６３号、同第５，７５３，４２９号、５，５７３，４５２号、同第５，７８０，３０４号、同第５，７８９，２５５号、同第５，８４３，６９１号、同第５，８４６，４８６号、同第５，９０２，７３１号、同第５，９６８，８３６号および同第５，９７２，２９４号公報明細書に記載されている。これらの公報明細書の内容は本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。関連づけ工程において、導かれた糖化タンパク質濃度は観察された信号に対する競争反応の一定の寄与を考慮に入れており、これは例えば装置をそれに従って較正することにより行われる。
【００７９】
キット類
本発明により本発明の方法を実施するために使用されるキット類も提供される。本発明のキット類は上述の試薬試験片および上記生理学的サンプルを得るための手段の少なくとも一つ、例えば指を刺突するためのランス、ランス作動手段当並びに標準、例えば標準濃度のケトアミンまたはその前躯体、例えば糖化タンパク質を含有する糖化タンパク質コントロール溶液を含む。ある実施形態では、これらのキット類はサンプル適用後に試験片上に生成された生成物の量を検出し、検出された生成物量をサンプル中の検体の存在（そしてしばしば量）に関連づけるための上述の検出装置も含む。最後にこれらキット類は本発明のキット成分を生理学的サンプル中の糖化タンパク質濃度の決定に本発明のキット成分を使用するための装置類を含む。これらの装置類はキット類中に存在する一種以上のパッケージング、ラベルインサート、容器等の上に存在していてもよい。
【００８０】
以下の実施例は本発明を説明するために提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００８１】
Ｉ．試薬試験片の調製
Ａ：血液分離層
メッシュ：テトコ（Ｔｅｔｏｋｏ）メッシュ＃７−２８０／４４を１％プルロニック（プラグマチクス社）洗剤溶液中に１分間置いた。余分の洗剤を除去し、メッシュを６０℃１０分間加熱することにより乾燥した。
血液分離マトリックス：１０％マンニトール、１．２５％ヘキサジメスリンブロマイドおよび１％ＫＩＯ３を生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）に溶解した溶液を自動含浸／乾燥ユニット（ＡＦＭエンジニアリング、米国カリフォルニア州サンタ・アンナ市）上でソンタラ（Ｓｏｎｔａｒａ（登録商標））＃８００７（デュポン社）に含浸した。乾燥温度は１００℃で約１０分間乾燥した。
メンテックポリスルホン膜は未反応であった。
Ｂ：消化層
２００ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＸＩＶ（シグマ社）を１００ｍＭ　ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０に溶解した。ナイロンメッシュ３−２００／３９（ＳＥＦＡＲ）をプロテアーゼＸＩＶ溶液に含浸した。余分の溶液を除去し、メッシュを５６℃１０分間加熱することにより乾燥した。
Ｃ：色形成および液流制御層
Ａディップ：３００Ｕ／ｍｌの２０ｍＭ　ＰＢＳ中ＫＡＯ、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍｌＨＲＰ、１％ＰＶＰ（ＭＷ＝３６０Ｋ）および５０ｍｇ／ｍｌマンニトールを含有する。このナイロン膜（ポール社）を上述の溶液に浸漬し、余分の溶液を除去し、膜を５６℃で５分間加熱することにより乾燥した。
Ｂディップ：Ａディップ浸漬後、ナイロン膜をさらに１ｍＭ　７０％メタノール中ＤＡ−６０を含有するＢディップに浸漬した。浸漬した膜を５６℃１０分間加熱することにより乾燥した。
Ｃディップ：ＡおよびＢディップに浸漬した膜を、ジクロロメタン溶媒を通して素早く引き出した。余分の溶液を除去し、膜を換気フード下、室温で２分間乾燥した。
Ｄ：試験片の組立
各層を直径０．４７６ｃｍ（３／１６インチ）のディスクに切断し、これらのディスクを順次図１に示すように組み立てて最終試験片とした。
【実施例２】
【００８２】
ＩＩ．実施例Ｉで調製した試薬試験片を用いた糖化タンパク質の検査
図２：一層血液分離層試験片デザインを用いた。すなわち、血液分離層はポリスルホン膜のみを有する。１５μｌの患者の全血を試験片に適用し、この試験片を３７℃で５分間インキュベートし、次いでマクベス（Ｍａｃｂｅｔｈ）反射光分光計で色強度を読み取った。
図３：一層対二層血液分離試験片デザインの比較　一層はポリスルホン膜のみを血液分離層とした。二層はソンタラ（Ｓｏｎｔａｒａ（登録商標））フィルター材料とポリスルホン膜の両方からなる。低、中および高レベルの糖化タンパク質の全血１５μｌを試験片に適用した。この試験片を４０℃で約５分間インキュベートした。マクベス（Ｍａｃｂｅｔｈ）反射光分光計で色強度を読み取った。二層デザインにおいては種々の糖化タンパク質レベルの間で色強度の傾きの顕著な増加が見られることから、より良好な解像度幅がはっきりと得られた。図３中のデータ点はすべて８例の反復例の平均値を表し、ＣＶは両試験片ともに約１０％であった。
【００８３】
上述の結果および説明から本発明は信頼性および正確さにおいて現在臨床検査質の設定においてのみ達成されるものに匹敵する結果を、非検査質設定、例えば家庭または医師のオフィスにおいて患者または医師により使用可能な系において、提供することができる高感度かつ正確な糖化タンパク質検出系を提供するものであることが明らかである。そのようなものとして、本発明は当技術に対して顕著な貢献をしている。
【００８４】
本明細書において引用されている刊行物および特許文献はすべて、あたかも各個別の刊行物または特許文献が具体的に個別に本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなすことを示されているように、本明細書において参照されることにより、本発明の一部をなす。任意の刊行物の引用は本出願の出願日前の開示に対するものであり、本発明がそのような刊行物を先発明により先の日付を享有行する資格がないことを自認するものと解釈されるべきではない。
【００８５】
上述の発明は明確な理解のための説明および例示としてある程度詳細に説明したが、当業者には容易に判るように、本発明の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲を逸脱しない限り本発明に種々の変更および改変をなすことができる。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、糖化タンパク質の定量に適した形態であって、家庭および医師のオフィスでの使用に適しており、かつ現在使用されている臨床検査室に基づいた手順を用いて達成された高度に正確な測定を提供する追加の多層試薬試験片並びにこの試験片を含むキットおよび系が提供される。
【００８７】
好適な実施態様の例示
本発明の好適な実施形態は次の通りである。ただし、本発明はこれらの好適な実施形態に限定されない。
（１）ケトアミンオキシダーゼ信号生成系は疎水性である請求項１記載の多層試験片。
（２）前記層は積層形態で存在する実施形態（１）記載の多層試験片。
（３）前記プロテアーゼ層は多孔質マトリックスと、タンパク質を切断してケトアミンオキシダーゼが到達可能なケトアミン基を生成するプロテアーゼとを含む、請求項１、実施形態（１）および実施態様（２）のいずれか一項に記載の多層試験片。
（４）前記ケトアミンオキシダーゼ信号生成系層は多孔質マトリックスと、ペルオキシダーゼと、少なくとも一種の指示化合物とを含む請求項１および実施態様（１）〜実施態様（３）のいずれか一項に記載の多層試験片。
（５）（ａ）実施態様（１）〜実施態様（４）のいずれか一項に記載の多層試験片、および（ｂ）該多層試験片上に生成された信号を検出するための信号検出装置を備える、液体連絡サンプル中の糖化タンパク質の量を測定するための測定系。
【００８８】
（６）（ａ）生理学的サンプルを実施態様（１）〜実施態様（４）のいずれか一項に記載の多層試験片に適用し、（ｂ）該試験片上に生成された信号を検出して該生理学的サンプル中の糖化タンパク質を定量することを含む、生理学的サンプル中の糖化タンパク質の定量方法。
（７）（ａ）実施態様（１）〜実施態様（４）のいずれか一項に記載の多層試薬試験片、および（ｂ）（ｉ）生理学的サンプルを取得するための手段、および（ｉｉ）コントロールの少なくとも一方を含む、生理学的サンプル中の糖化タンパク質の濃度決定に使用するキット。
（８）実施態様（１）〜実施態様（４）のいずれか一項に記載の多層試薬試験片を備える信号検出装置。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明の一実施態様による多層試薬試験片の展開図である。
【図２】一層の血液分離層構成の試験片を用いて行った検定結果を示すグラフである。
【図３】二層の血液分離層構成の試験片を用いて行った検定結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００９０】
１０　多層試薬試験片
１１　保護エレメント
１２　メッシュ層
１３　分離層
１４　フィルター層
１５　プロテアーゼ層
１７　信号生成層
１８　支持エレメント
１８ａ　手動保持領域
１８ｂ　サンプル検査領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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