(57)【要約】      （修正有）【課題】煩雑な遺伝子固定化技術を用いずに、かつ、遺伝子増幅後のハイブリダイゼーション工程を行なうことなく、迅速かつ経済的に目的遺伝子の検出操作が行なえる、アレー型の遺伝子検出用チップを提供する。【解決手段】遺伝子の増幅・検出を行なう際、酵素的増幅反応を行う反応混合相を操作温度によって液状、ゲル状、又は固体状を呈するようにすることにより、検体間の相互汚染が防止され高集積化された、操作性及び経済性に優れたアレー型の遺伝子検出用チップを提供することが可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するプライマーの存在下で被検遺伝子の酵素的増幅反応を行い、その増幅量の多寡によって目的遺伝子であるか否かを判定する遺伝子検出用チップにおいて、酵素的増幅反応を行う反応混合相が、温度によって液状、ゲル状、又は固体状に変化することを特徴とする遺伝子検出用チップ。
【請求項２】
反応混合相が、被検遺伝子の酵素的増幅反応を行う４０〜１００℃の温度範囲で液状を呈する、請求項１記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項３】
反応混合相が、被検遺伝子の酵素的増幅反応を行った後、被検遺伝子の増幅量の多寡を定量する４０℃よりも低い温度範囲で、ゲル状、又は固体状を呈する、請求項１に記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項４】
反応混合相を、温度によって液状、ゲル状、又は固体状に変化させる成分として、低温溶融性アガロースを用いた、請求項１から３の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項５】
反応混合相に含まれる低温溶融性アガロースが０．１から２ｗｔ％である、請求項４に記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項６】
被検遺伝子の増幅量の多寡を検出する方法が、遺伝子二重鎖結合性化合物の電気化学的反応に基づく検出方法である、請求項１から５の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項７】
被検遺伝子の増幅量の多寡を検出する方法が、遺伝子二重鎖結合性化合物の蛍光反応に基づく検出方法である、請求項１から５の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項８】
被検遺伝子の増幅量の多寡を検出する方法が、遺伝子の酵素的増幅反応時に遺伝子二重鎖分子内に取り込まれる蛍光性化合物の蛍光反応に基づく検出方法である、請求項１から５の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項９】
測定対象の目的遺伝子が、通性或いは偏性嫌気性の細菌のものである、請求項１から８の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項１０】
遺伝子検出用チップの検出端開口面に被検遺伝子の試料溶液を一括して供給し、予め用意された該検出端空間に被検遺伝子の試料溶液を満した後、検出端部分以外の余分な被検遺伝子の試料溶液を除いて酵素的増幅反応を実施することができる、請求項１から９の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
【請求項１１】
請求項１から１０の何れかに記載の遺伝子検出用チップを用いた遺伝子検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ    Ｒｅａｃｔｉｏｎ法）に代表される遺伝子の酵素的増幅反応による二重鎖ＤＮＡ増幅反応技術を利用した、複数プライマーによる被検遺伝子の同定をワンチップ上で行えるように改良した遺伝子検出用チップ、及び該検出用チップを用いた遺伝子の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子の酵素的増幅技術や塩基配列のシーケンス技術の発達により生物の遺伝子レベルでの理解が急速に進み、さらには集積回路技術やコンビナトリアルケミストリー技術、情報科学技術と言った高度技術との融合により、膨大な遺伝情報を一括処理し実用に役立てる動きが盛んになっている。この様な動きの中心をなすものが遺伝子チップ技術（遺伝子マイクロアレー技術）であり、医療、製薬、食品など様々な研究応用分野で期待が高まっている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
遺伝子マイクロアレー技術には、半導体工業で使用されるリソグラフ技術を基に、基板上で予め設計されたオリゴＤＮＡプローブを１塩基ずつ合成して行く技術や、別途合成されたＤＮＡプローブや生物由来の遺伝子断片を基板上にインクジェットやプロットピンによりプロットし、固定化してチップを製造する技術がある（例えば、特許文献３、４参照）。この様な技術により製造される遺伝子チップは、集積度が高く、少量の検体試料でも極めて多くの情報を得ることが可能となった。しかしながら、この様なチップでは、相補的な遺伝子同士が一定条件下で水素結合し二重鎖を形成する、所謂ハイブリダイゼーション技術により目的遺伝子を検出することが一般的で、ハイブリダイゼーションに要する時間が長いことや、多種のプローブに対して同時に高い検出精度が得られるようにハイブリダイゼーションの条件設定を行うことが難しいなどの問題を抱えている。さらには、チップ基板にプローブを固定化するこの様なチップの場合、検出部の面積によりプローブ固定量が制限されるため、検出部分が高密度で微細になると各検出部分でのプローブ担持量に限界が生じ絶対量の不足が起こる。そのため、被検サンプル中に類似配列の遺伝子が多量に共存すると目的遺伝子の検出に影響を及ぼし、検出精度の低下を来すという問題も抱えている。また、検出に際しては、試料遺伝子を予め増幅し標識した後、チップへの分注、ハイブリダイゼーション、チップの洗浄、蛍光検出と言った一連の操作が必要であり、全ての操作をチップ上で行うことは原理上難しく、迅速性には一定の限界がある。
【０００４】
一方、製造面においては、プローブの固定化に先立ち、プローブ量の増大と被検液中に含まれる挟雑成分の非特異的吸着を防止する基板表面処理などが高度で煩雑なうえ、別途合成したプローブを微少量かつ正確に基板上にスポッティングするプローブの固定化技術に難しさを伴う。これに対して、プローブを基板上で一塩基ずつコンビナトリアルケミストリー的に合成するプローブの調製技術もあるが、高度な技術を要する他、製造に多大な時間を要し、きわめて高価となる欠点を有していた。
【０００５】
これに対し、遺伝子プローブなどを固定化せずに目的遺伝子を検出するチップ技術として、遺伝子の酵素的増幅反応技術を基にしたものがある。この様な酵素的増幅反応技術を基にしたチップでは、プローブなどの固定化に要する高度かつ煩雑な製造技術を必要とせず、また、長時間にわたるハイブリダイゼーション操作に伴う精緻な制御技術が不要なことから、低価格でしかも測定を迅速かつ簡便に行い得るチップの製造技術として期待が高い。この様なチップでは、目的遺伝子に対し相補的で特異的な配列を有する数十塩基のプライマーと呼ばれるオリゴＤＮＡと目的遺伝子の部分的二重鎖形成後に、目的遺伝子一重鎖部分の合成を繰り返す方法で目的遺伝子を増幅し、検出する方法が一般的である。
【０００６】
この様なＤＮＡチップでは、チップ上で酵素的増幅反応を行うことで、検出の迅速性が更に高まると言う可能性を有するが、複数遺伝子の検出では、多数のプライマーを数十ｍｍ角サイズの同一基板上で扱わなければならず、隣接するプライマー間のコンタミネーション防止に高度な操作技術が要求されることとなってしまう。特に実際の検査工程における増幅反応系への検体試料の供給においては、各プライマー間の汚染を防ぐ工程管理は必要不可欠のものであり、ＤＮＡチップの集積度を上げるうえでの大きな障害要因となっている。
【０００７】
このことから、酵素的増幅反応技術を利用したチップでは、単独配列の増幅反応の有無を検出する、いわゆる単独検出型のチップが一般的であり、複数種の配列を同時並行的に増幅するいはゆる同時多数検出のアレー型チップは未だ実用化されるに至っていない。従って、この様な酵素的増幅反応技術を、目的遺伝子の全体像の検出が必要な検出用チップにも適用できるようにする新技術の開発が強く望まれていた。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第５４４５９３４号明細書
【特許文献２】
米国特許第５７４４３０５号明細書
【特許文献３】
米国特許第５４２４１８６号明細書
【特許文献４】
米国特許第５８０７５２２号明細書
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記事情に鑑みてなされた本発明の課題は、煩雑な遺伝子固定化技術を用いずに、かつ、遺伝子増幅後のハイブリダイゼーション工程を行うことなく、迅速に目的遺伝子の検出作業が行える経済的に有利な遺伝子チップを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
このような、検体分注時や測定操作時に起こりやすいウェル間での相互汚染を防ぐためには、目的遺伝子の酵素的増幅反応を行う温度域においてのみ液状となり、検体分注や測定操作を行う室温域においてはゲル状又は固体状に変化させるような成分を含んだ増幅反応混合液を用いることで課題を解決することが出来る。
即ち、本発明の方法は、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて該遺伝子の増幅量を検出し、該遺伝子の有無を検出する遺伝子チップにおいて、増幅操作を行う際の反応混合相を、温度によって液状、ゲル状、又は固体状に変化させるような成分を含んだ（１）から（１１）に示す遺伝子検出用チップおよび該チップを用いた目的遺伝子の検出方法に関する。
（１）検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するプライマーの存在下で被検遺伝子の酵素的増幅反応を行い、その増幅量の多寡によって目的遺伝子であるか否かを判定する遺伝子検出用チップにおいて、酵素的増幅反応を行う反応混合相が、温度によって液状、ゲル状、又は固体状に変化することを特徴とする遺伝子検出用チップ。
（２）反応混合相が、被検遺伝子の酵素的増幅反応を行う４０〜１００℃の温度範囲で液状を呈する、（１）記載の遺伝子検出用チップ。
（３）反応混合相が、被検遺伝子の酵素的増幅反応を行った後、被検遺伝子の増幅量の多寡を定量する４０℃よりも低い温度範囲で、ゲル状、又は固体状を呈する、（１）に記載の遺伝子検出用チップ。
（４）反応混合相を、温度によって液状、ゲル状、又は固体状に変化させる成分として、低温溶融性アガロースを用いた、（１）から（３）の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
（５）反応混合相に含まれる低温溶融性アガロースが０．１から２ｗｔ％である、（４）に記載の遺伝子検出用チップ。
（６）被検遺伝子の増幅量の多寡を検出する方法が、遺伝子二重鎖結合性化合物の電気化学的反応に基づく検出方法である、（１）から（５）の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
（７）被検遺伝子の増幅量の多寡を検出する方法が、遺伝子二重鎖結合性化合物の蛍光反応に基づく検出方法である、（１）から（５）の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
（８）被検遺伝子の増幅量の多寡を検出する方法が、遺伝子の酵素的増幅反応時に遺伝子二重鎖分子内に取り込まれる蛍光性化合物の蛍光反応に基づく検出方法である、（１）から（５）の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
（９）測定対象の目的遺伝子が、通性或いは偏性嫌気性の細菌のものである、（１）から（８）の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
（１０）遺伝子検出用チップの検出端開口面に被検遺伝子の試料溶液を一括して供給し、予め用意された該検出端空間に被検遺伝子の試料溶液を満した後、検出端部分以外の余分な被検遺伝子の試料溶液を除いて酵素的増幅反応を実施することができる、（１）から（９）の何れかに記載の遺伝子検出用チップ。
（１１）（１）から（１０）の何れかに記載の遺伝子検出用チップを用いた遺伝子検出方法。
【００１１】
具体的には、反応混合相が、目的遺伝子の酵素的増幅反応を行う４０〜１００℃の温度域では液状を呈し、それ以外の検体試料の分注や検出などを行う４０℃よりも低い温度領域ではゲル状又は固体状を呈する反応混合液がウェル内に充填されている遺伝子検出用チップである。また、反応混合液にプライマー類、酵素類、遺伝子増幅用モノマー、マグネシウム塩や緩衝液などの塩類の他、増幅反応に必要なその他の因子、及び状態制御成分としての高分子成分やゲル化剤成分を含む遺伝子検出用チップである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明における反応混合相の状態制御成分には、酵素的増幅反応を阻害する物質を含まなければどの様な成分でも使用でき、アガロース、ゼラチンなどを例示することがでる。例えばアガロースにあっては、その１％水溶液のゲル又は固化温度が４０℃よりも低い低融点アガロースが好適に用いられる。
【００１３】
本発明における状態制御成分の添加量は、反応混合液の組成、ｐＨ、塩濃度などによってゲル状又は固体状を呈する温度が異なってくるため一概には言えないが、上記したゲル化又は固化温度が４０℃よりも低い低融点アガロースの場合、０．１％から２％の範囲が選択され、好ましくは０．１％から１％の範囲が選択される。一方、添加量が０．１％より低い場合、反応混合液がゲル化又は固化せず、一括して試料液を導入する際、ウェル間の液同士が相互に混じり合ってしまう危険性が増大するため、それを回避するにはウェルごとに試料を添加する必要が生じ、著しい操作性の低下を来たす。
また、添加量が２％より高い場合には、増幅反応時の反応効率の低下を来たし検出結果が安定しない。従って、添加量は０．１％から２％の範囲で選択される。
低融点アガロース以外のゲル化剤を単独或いは複数種混合・併用する場合、その個々の濃度は一概に言えないが、測定温度２０℃におけるゲル強度が１ｇ／ｃｍ２から１８００ｇ／ｃｍ２の範囲であればその目的を達する。従来のＰＣＲ法などに於いてポリエチレングリコールやゼラチンなどを共存させる手法もあるが、これらは酵素の安定性など増幅反応の補助的な作用を目的にしており、増幅反応液の状態を変化させるほど高濃度に添加した例はない。
【００１４】
本発明において増幅反応混合液を保持する容器構造は、ウェル状、チューブ状、スリット状等、増幅反応温度において液体状となった反応液を漏洩することなく保持できる構造を持つものであれば、制限なく使用できる。本発明の具体的な使用形態によれば、微小空間に保持されたプライマーをはじめとする増幅反応溶液の占有部分を除いた空間に検体試料溶液が供給され、その後に、チップ上で増幅反応が実施される。従って、チップ表面に開口部を有する容器構造が適宜配置されたチップが良好に使用できる。
【００１５】
酵素増幅反応液の相変化を伴う本発明では、反応液の容量が極端に少ないと反応液粘度などの影響により試料溶液と反応液が充分混合されず、増幅反応が不充分となる。また、反応液の量を極端に多くすると、使用する薬品量が増し、高コストとなってしまう。即ち、本発明に使用される反応容積は、１から５０μｌ程度が適当な範囲と言える。
【００１６】
本発明に使用されるチップ材料には、ガラス、シリコン、セラミック、熱硬化性樹脂、熱可塑性樹種、金属などが使用でき、キレート作用を有する物質、酸性物質、塩基性物質や遺伝子結合性の物質など増幅反応を阻害的する物質を溶出せず、プライマー類を強く吸着することも無く、検出時においてはそれ自体蛍光性が無く、蛍光性物質を溶出せず、あるいは、検出の電極電位において変化せず、電気化学的活性種を溶出しないなど、検出反応を阻害しない材質であって、１００℃より低い温度で増幅反応液を保持できればどの様なものでも使用できる。
また、プライマー類を吸着する材質を使用した場合でも、表面をコーティング、或いは化学処理して吸着性を失わせることで問題なく使用することが出来る。
【００１７】
本発明の特徴は、酵素的増幅反応を行う温度域では液体状、それ以外の、チップ
保存時、検体分注時、及び検出時にはゲル又は固体状となる増幅反応液を使用することであって、増幅反応用プライマーを特別な方法によりチップ基板に固定化することなく、基板上の微小な容積空間に保持することにある。
本発明によれば、複数のプライマーを同一基板上で扱うことが困難であった従来の酵素的遺伝子増幅技術に基づくチップにおいても、予め基板上に構築された複数の微小な容積空間にプライマーをはじめとする増幅反応溶液を保持することが可能となり、微量の検体試料を一括して複数の微小な容積空間に供給することが可能となる。つまり、試料溶液をチップ上の検出端開口面に供給し、該試料溶液が予め用意された検出端上部の容積空間に分配充填され重層化した後、チップ面の余分な試料溶液をこそぎ取る、あるいは、拭き取るなどして除去し、その後、反応液の蒸発を抑えるため、ＰＣＲ用粘着シート、熱融着シート、又はシリコンゴムシートなどで開口部を覆い、密着させて、増幅反応を行う。
微小空間に保持された増幅反応溶液は、検体試料を供給する際には、ゲル状或いは固体状となっており、近傍の微小空間に保持された他のプライマーを含む増幅反応液と混合、汚染されることが無く、検体試料を容易に一度の操作で供給することが出来る。また、増幅反応を行う際には、該反応液は液体状となり、通常の増幅反応が支障なく成され、担体などにプライマーを固定化したチップに見られる反応効率の著しい低下が無い。さらに、増幅反応を終了した後の検出工程においても、反応液が微小空間に有効に保持され、反応液の漏洩、汚染がなく、高い操作性のもと検出作業が可能となる。
【００１８】
本発明に利用される遺伝子二重鎖の検出には、遺伝子二重鎖結合性化合物の電気化学的反応に基づく検出方法、遺伝子二重鎖結合性化合物の蛍光反応に基づく検出方法、或いは、遺伝子の酵素的増幅反応時に遺伝子二重鎖分子内に取り込まれる蛍光性化合物の蛍光反応に基づく検出方法などが利用可能であるが、遺伝子二重鎖の多寡を判別できる方法であればどのような方法でも利用可能である。例えば、このような方法には、エチジュームブロマイド、ヘキスト３３２５８、サイバーグリーン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎなどの遺伝子二重鎖結合性化合物、いわゆるインターカレーターによる蛍光強度の差を読み取る方法などがある。また、ヘキスト３３２５８やフェロセン系のインターカレーターなどの電気化学的に活性なインジケーターを用い、遺伝子二重鎖の多寡を測定する方法も利用可能である。
【００１９】
本発明のチップを製造する際には、目的遺伝子に相補的なプライマーなどを定量的に含む増幅反応混合液を、単純にチップ上の反応液保持用の微少な容積空間に供給すればよい。プライマーなどが定量的に分散保持されている本発明チップでは、固定化された遺伝子断片と目的遺伝子のハイブリダイゼーションによる検出を行うチップの様に検出時に遺伝子断片プローブの固定化効率などを考慮する必要がなく、簡便に検出結果の解析ができ多くの試料の処理が行える。
本発明のチップは、本来、酵素的遺伝子増幅反応技術を基にしたチップであるため、ハイブリダイゼーション技術を基にしたチップと異なり、ハイブリダイゼーションを行う必要がないため検出に多大の時間を要することもなく、また、複数プローブのハイブリダイゼーションに伴う煩雑な条件設定や効率の差による検出結果の二次的な処理も必要なく、極めて迅速で簡便なチップである。
【００２０】
本発明における遺伝子増幅反応には、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法などが利用でき、目的遺伝子と相補的なプライマーを用い、温度を制御することで遺伝子を増幅する増幅技術であれば、どのような増幅反応でも利用可能である。
【００２１】
このように検体の分注作業や検出測定時に起こる反応混合液間の相互汚染を回避できる本発明によれば、従来、単独検出型が一般的であった遺伝子の酵素的増幅反応技術を基にしたチップを複数同時検出可能なアレー型とすることが可能となり、目的遺伝子に特異的な塩基配列を基にしたプライマーによる検出ばかりではなく、目的遺伝子内の複数箇所の塩基配列に対応したプライマーの組み合わせによる変異箇所の検出や多様性の検出にも応用可能となる。
【００２２】
【実施例】
以下の実施例及び比較例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
厚さ５ｍｍ、一辺が３０ｍｍの正方形をしたポリプロピレン板に、直径２ｍｍ、深さ４ｍｍのウェルを中心間の距離が３ｍｍとなる様に２５個造成した。
センスプライマーとアンチセンスプライマーには、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ及びＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓの３菌種それぞれのの１６ｓリボゾーム遺伝子配列を増幅し得るプライマーの内、組み合わせにより３菌種を識別できる、センスプライマー５種とアンチセンスプライマー５種の合計１０種のプライマーを用いた。これらのプライマーを表１の組み合わせで下記の成分の反応液に添加し、図１の配置で１０μＬずつ分注した。分注に際しては、Ｔａｑ    ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅとａｇａｒｏｓｅを除く成分を混合溶解後にａｇａｒｏｓｅを添加、９８℃にてａｇａｒｏｓｅの溶解を確認した後４５℃に冷却し、これにＴａｑ    ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加して所定のウェルに分注した。その後、４℃にてゲル化、保存した（チップＡ）。
反応液成分
１０ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）
５０ｍＭ    ＫＣｌ
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
各０．２ｍＭ    ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）
０．２％  ａｇａｒｏｓｅ
（ゲル化温度が３０℃のアマシャム社製ローメルトａｇａｒｏｓｅ）
０．２５Ｕ／１０μＬ    Ｔａｑ  ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
０．２μＭ    センスプライマー
０．２μＭ    アンチセンスプライマー
【表１】
2004337064.tif 000002
次にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ及びＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓをそれぞれ嫌気培養し、その培養菌体懸濁液２ｍＬを遠心分離し、上清を捨てた後、滅菌水０．５ｍＬを加え再懸濁、９５℃で５分間加熱した。この処理液を再度遠心分離し、上清を試料液とした。
この試料液を４℃にて保存しておいたチップＡ上に滴下、全ウェルにのゲル上部を満たす様にゴムへらで引き伸ばした後、ポリプロピレン板上に残った液滴をこそぎ取った。
これを５５℃から９５℃の間で３０サイクルのＰＣＲ反応を行った後、ウェル上部にエチジュームブロマイド溶液を滴下、一定時間後の蛍光（１５分後、ゲル状、ＵＶ３１５ｎｍ）を検出した。
プライマー組み合わせ  １−▲１▼をブランクとし、５−▲５▼をポジティブコントロールとして、蛍光強度の組合せから、遺伝子的に類縁のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ及びＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓを検出同定することが出来た。
【００２３】
実施例２
実施例１における、エチジュームブロマイドをヘキスト３３２５８とし、４０×４０ｍｍ、厚さ０．０３ｍｍのポリスチレン製薄板の表裏面に金蒸着を施した後、幅１．５ｍｍに切断した短冊状の金電極と０．１ｍｍ銀電極を挿入し、金電極の一方を作用極、他方を対極、銀電極を参照極として、各ウェルにおけるヘキスト３３２５８の電極酸化電流を測定した。プライマー組み合わせ１−▲１▼ウェルを基準とし、電流量減少の差の組合せから、遺伝子的に類縁のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ及びＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓを検出同定することが出来た。
【００２４】
比較例１
実施例１における、ａｇａｒｏｓｅを除いた反応液を使用し、他は同様に行った。菌体培養液由来の試料をウェルに満たす際に、ウェル内の反応液が試料溶液と混じったため、チップ上の余分な液滴を除いた際にウェル内の増幅反応液組成が変化し、検出結果が安定しなかった。また、隣接するウェル間でのプライマー類のコンタミネーションのため、検出の組合せが安定しなかったため、各ウェルごとにマイクロピペットを用い個別に一定量の試料を供給し、ＰＣＲ反応を行った。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ    ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ及びＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ  の存在を検出確認することは出来たが、試料溶液の一括供給が出来ず、実施例１による検出作業の２０倍の手間を要し、検出までに要する時間は５倍であった。
また、増幅反応後のチップからの検出操作では、傾斜、振動等により、しばしば、隣接ウェル間の混合が起こり、試料供給、増幅反応と検出操作をやり直さなければならず、検出操作においても細心の注意が必要となり、操作性が著しく低かった。
【００２５】
比較例２
実施例１のａｇａｒｏｓｅ添加量を２％とし、さらにゲル化温度が４８℃の一般的なａｇａｒｏｓｅを使用した。ウェル内のゲルの溶融時間に差があり、また、溶融後の粘度が高いためＰＣＲ反応が安定せず、検出時にポジティブコントロールの蛍光強度が極端に低い、蛍光強度が実験ごとに大きく変化する、或いは、蛍光の組み合わせパターンが実験ごとに大きく異なるなど、安定した結果が得られなかった。
【００２６】
比較例３
ゲル化温度が４８℃の一般的なａｇａｒｏｓｅを用い、Ｔａｑ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの添加温度およびウェルへの分注温度を５０℃とした以外は実施例１と同様にして、１．５％の濃度のａｇａｒｏｓｅを添加しＰＣＲ反応を行った。この時のゲル化温度は４６℃で、室温に置けるゲル強度は２０００ｇ／ｃｍ２であった。その後、実施例２と同様に電気化学的な検出を試みたが、ＰＣＲ反応が不充分であり明確な電気量の差が見られず、検出同定ができなかった。検出に充分な増幅量を得るため、ＰＣＲ反応の回数を５０サイクルとして反応を行ったが、非特異的な増幅反応と思われる増幅が特異的な増幅と同程度となり、同様に電気量の明確な差が見られず、検出同定ができなかった。
【００２７】
【発明の効果】
酵素的遺伝子増幅反応に基づく遺伝子検出用チップの集積度が増し、特別な遺伝子固定化方法を必要としない、高迅速性で安価なＤＮＡチップを容易に製造できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例で用いた遺伝子検出用チップのウェルの配置図である。
【符号の説明】各ウェルの反応混合相に含まれる表１に示したセンスプライマーとアンチセンスプライマーの組合せ番号を示す。
【図１】
2004337064.tif 000003