(57)【要約】【課題】　Ｃ型肝炎ウイルスにおいてポリタンパク質をプロセシングするのに必要なプロテアーゼの同定、クローニング、および発現を提供する。特定のポリペプチドの開裂、およびＨＣＶに特異的な抗ウイルス剤のアッセイおよび設計に有用な、プロテアーゼ、切り形プロテアーゼおよび改変プロテアーゼ。【解決手段】　以下の部分的内部アミノ酸配列を有する、精製されたＨＣＶプロテアーゼまたは活性短縮型ＨＣＶプロテアーゼアナログ：【化３２】2004073212.tif 000044【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に示すアミノ酸配列：
【化３３】
2004073212.tif 000035
をコードするヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドはＨＣＶプロテアーゼ活性を有し、
ただし、該ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
【化３４】
2004073212.tif 000036
【化３５】
2004073212.tif 000037
【化３６】
2004073212.tif 000038
【化３７】
2004073212.tif 000039
【化３８】
2004073212.tif 000040
または
【化３９】
2004073212.tif 000041
または
【化４０】
2004073212.tif 000042
または
【化４１】
2004073212.tif 000043
を有するポリペプチド、および上記アミノ酸配列を有するポリペプチドに融合した適切な融合パートナーを含む、融合タンパク質を含まない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　（関連出願に関する参照事項）
　本願は、１９９０年４月４日出願の米国特許出願第０７／５０５，４３３号の一部継続出願である。
【０００２】
　（技術分野）
　本発明は分子生物学およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルス学に関する。より詳しくは、本発明は、ＨＣＶによって生成される新規のプロテアーゼ、発現方法、組換えプロテアーゼ、プロテアーゼ変異体、およびＨＣＶプロテアーゼのインヒビターに関する。
【背景技術】
【０００３】
　（発明の背景）
　非Ａ・非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウイルスにより誘発されると考えられている伝染性疾病（あるいは疾病フ７ミリー）であり、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）あるいはエブスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などによって引き起こされるようなその他の形態のウイルス関連肝臓疾患と区別される。疫学的証拠によって、ＮＡＮＢＨには、飲料水媒介伝染型；血液または注射針関連型；および単独発生（地域獲得）型の３種類があると考えられる。しかし、病原因子の数は未知である。しかし、最近になって、新規のウイルス種であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が血液関連型ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の（唯一ではないにしろ）主要な要因であると見いだされている。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０４６６９９号：１９８９年１２月２１日出願の米国特許出願第７／４５６，６３７号；および１９８９年１２月２１日出願の米国特許出願第７／４５６，６３７号を参照のこと。これらは参考のために本明細書に援用する。Ｃ型肝炎は、合衆国および日本を含む多くの国において、輸血に伴う肝炎の主要形態であると思われる。また、ＨＣＶが肝細胞癌の誘発に関係しているという証拠もある。従って、ＨＣＶ感染の効果的な治療方法が望まれているが、現在のところそれは存在しない。
【０００４】
　アデノウイルス、バキュロウイルス、コモウイルス、ピコルナウイルス、レトロウイルスおよびトガウイルスを含む多くのウイルスが、ポリペプチドをその当所の翻訳された形態から成熟した活性タンパク質へとプロセシングするための、特異的な、ウイルスにコードされたプロテアーゼに依存している。ピコルナウイルスの場合には、全てのウイルスタンパク質が単一のポリタンパク質の開裂から生じると考えられている（Ｂ．Ｄ．Ｋｏｒａｎｔ，ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９８８）８：１４９−５７）。
【０００５】
　Ｓ．Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓらは、「Ｖｉｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　Ａｓ　Ｔａｒｇｅｔｓ　Ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ．１９８９）ｐｐ．２１５−２２において、ＨＩＶ−１で見られるウイルスプロテアーゼの発現を開示している。このＨＩＶプロテアーゼは、ＨＩＶプロテアーゼ前駆体をコードするＤＮＡを、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）をコードするＤＮＡに融合させ、その生成物をＥ．ｃｏｌｉで発現させることによって、融合タンパク質の形態で得られた。形質転換された細胞は、３６および１０ｋＤａの生成物（ｈＳＯＤプロテアーゼ融合タンパク質およびプロテアーゼのみに対応）を発現したが、これはこのプロテアーゼが自己触媒作用によるタンパク質分解が可能な形態で発現したことを示している。
【０００６】
　Ｔ．Ｊ．ＭｃＱｕａｄｅらは、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４７：４５４−５６に、特異的にＨＩＶ−１プロテアーゼを阻害できる模擬ペプチドの調製を開示した。ＨＩＶにおいては、プロテアーゼは当初のｐ５５　ｇａｇ前駆体転写物の、コア構造タンバク質（ｐ１７、ｐ２４、ｐ８およびｐ７）への開裂に関与していると考えられている。１μＭのインヒビターを培養中のＨＩＶ感染末梢血リンパ球に加えると、プロセシングされたＨＩＶ　ｐ２４の濃度が約７０％減少した。ウイルス成熟および感染ウイルスのレベルは、プロテアーゼインヒビターによって減少した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
　（発明の開示）
　我々は、組換えＨＣＶプロテアーゼ、ＨＣＶプロテアーゼ融合タンパク質、切り形および改変されたＨＣＶプロテアーゼ、クローニングおよびそのための発現ベクター、およびＨＣＶ治療に効果的な抗ウイルス剤を同定する方法を発明した。
【０００８】
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに由来する、精製されたタンパク質分解ポリペプチドを含有する組成物を包含する。
【０００９】
　１つの実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列：
【００１０】
【化３】
2004073212.tif 000002
【００１１】
であり得る組成物を提供する。
【００１２】
　別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列：
【００１３】
【化４】
2004073212.tif 000003
【００１４】
であり得る組成物を提供する。
【００１５】
　なお別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に以下の部分的内部配列
【００１６】
【化５】
2004073212.tif 000004
【００１７】
を有し得る組成物を提供する：
　さらに別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが、実質的に図１に示すアミノ酸配列を有し得る組成物を提供する。
【００１８】
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質分解ポリペプチドと融合された、適切な融合パートナーを含有する融合タンパク質を包含する。
【００１９】
　１つの実施形態において、本発明は、上記融合パートナーがヒトスーパーオキシドジスムターゼを含有する融合タンパク質を提供する。
【００２０】
　別の実施形態において、本発明は、上記タンパク質分解ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列：
【００２１】
【化６】
2004073212.tif 000005
【００２２】
を有し得る融合タンパク質を提供する。
【００２３】
　なお別の実施形態において、本発明は、上記タンパク質分解ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列：
【００２４】
【化７】
2004073212.tif 000006
【００２５】
を有する融合タンパク質を提供する。
【００２６】
　さらに別の実施形態において、本発明は、上記タンパク質分解ポリペプチドが、以下の配列：
【００２７】
【化８】
2004073212.tif 000007
【００２８】
を部分的内部配列として有し得る融合タンパク質を提供する。
【００２９】
　なお別の実施形態において、上記融合パートナーがユビキチンである融合タンパク質を提供する。
【００３０】
　本発明は、ＨＣＶプロテアーゼまたは活性ＨＣＶプロテアーゼアナログのみをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を包含する。
【００３１】
　１つの実施形態において、本発明は、上記ポリヌクレオチドが図１のＨＣＶプロテアーゼをコードする組成物を提供する。
【００３２】
　本発明は、ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶプロテアーゼアナログ、および融合パートナーを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を包含する。
【００３３】
　１つの実施形態において、本発明は、上記融合パートナーが、ｈＳＯＤ、酵母α−因子、ＩＬ−２Ｓ、ユビキチン、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択される組成物を提供する。
【００３４】
　別の実施形態において、本発明は、上記ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶプロテアーゼアナログが、実質的に以下の配列：
【００３５】
【化９】
2004073212.tif 000008
【００３６】
を有するポリペプチドを含有する組成物を提供する。
【００３７】
　さらに別の実施形態において、本発明は、上記ＨＣＶプロテアーゼまたはアナログが、以下の配列：
【００３８】
【化１０】
2004073212.tif 000009
【００３９】
を有するポリペプチドを含有する組成物を提供する。
【００４０】
　なお別の実施形態において、本発明は、上記ポリペプチドが以下の配列：
【００４１】
【化１１】
2004073212.tif 000010
【００４２】
を有する組成物を提供する。
【００４３】
　本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに対する化合物の活性をアッセイする方法を包含し、この方法は、活性なＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼを提供する工程；このプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ活性を阻害することができる化合物と接触させる工程；およびこのＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼのタンパク質分解活性阻害を測定する工程を包含し得る。
【００４４】
　本発明は、ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶプロテアーゼアナログを宿主細胞内で産生するための発現ベクターを包含し、このベクターは、ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたこの宿主細胞内で機能する転写および翻訳制御配列；および選択可能なマーカーを含有する。
【００４５】
　１つの実施形態において、本発明は、発現の際に融合タンパク質を形成するために、上記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される融合パートナーをコードする配列をさらに含有するベクターを提要する。
【００４６】
　別の実施形態において、本発明は、上記融合パートナーが、ｈＳＯＤ、酵母α−因子、ＩＬ−２Ｓ、ユビキチン、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群より選択されるベクターを提供する。
【００４７】
　なお別の実施形態において、上記融合パートナーが、ユビキチン、ｈＳＯＤおよび酵母α−因子からなる群より選択されるベクターを提供する。
【００４８】
　さらに別の実施形態において、本発明は、上記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが実質的に以下の配列：
【００４９】
【化１２】
2004073212.tif 000011
【００５０】
を有するポリペプチドをコードするベクターを提供する。
【００５１】
　なおさらに別の実施形態において、本発明は、上記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下の配列：
【００５２】
【化１３】
2004073212.tif 000012
【００５３】
を有するポリペプチドをコードするベクターを提供する。
【００５４】
　なおさらに別の実施形態において、本発明は、上記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下の配列：
【００５５】
【化１４】
2004073212.tif 000013
【００５６】
を有するポリペプチドをコードするベクターを提供する。
【発明の効果】
【００５７】
　本願発明により、Ｃ型肝炎ウイルスにおいてポリタンパク質をプロセシングするのに必要なプロテアーゼの同定、クローニング、および発現がもたらされる。プロテアーゼ、切り形プロテアーゼおよび改変プロテアーゼもまたもたらされ、特定のポリペプチドの開裂、およびＨＣＶに特異的な抗ウイルス剤のアッセイおよび設計に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
　（発明を実施する方法）
　（Ａ．定義）
　「Ｃ型肝炎ウイルス」および「ＨＣＶ」という用語は、ＢＢ−ＮＡＮＢＨの主要な病原因子であるウイルス種のことであり、そのプロトタイプ単離物はＰＣＴ第ＷＯ８９／０４６６９９号；ＥＰＯ公開第３１８，２１６号；１９８９年５月１８日出願のＵＳＳＮ第７／３５５，００８号；およびＵＳＳＮ第７／４５６，６３７号に同定されており、それらの開示を本明細書に参考のために援用する。本明細書で用いられる「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎を引き起こし得る病原性菌株、および弱毒菌株またはそれに由来する欠陥干渉性粒子をも包含する。ＨＣＶゲノムはＲＮＡから成る。ＲＮＡ含有ウイルスは、取り込まれたヌクレオチドあたり１０-3から１０-4のオーダーと報告されているように、自然突然変異の速度が比較的速いということが知られている（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ，「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（１９８６，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．））。遺伝子型の不均一性および流動性は、ＲＮＡウイルスに固有の特性であるため、ＨＣＶ種には多数の菌株／単離物があり、これらは毒性でも非毒性でもあり得る。
【００５９】
　様々な異なるＨＣＶの菌株／単離物、特にＣＤＣ／ＨＣＶ１（ＨＣＶ１とも呼ばれる）菌株または単離物に関する情報を本明細書に開示する。部分ゲノム配列などの、１つの菌株または単離物からの情報は、当業者が標準的な技術を用いて、新たな菌株／単離物を単離し、このような新たな菌株／単離物がＨＣＶであるか否かを同定するのに十分なものである。例えば、様々な菌株／単離物を以下に説明する。これらの菌株は、多くのヒト血清から（そして様々な地理的領域から）得られたものであり、ＨＣＶ１のゲノム配列から得た惰報を用いて単離された。
【００６０】
　本明細書に提供される情報によって、ＨＣＶがフラビウイルスの遠縁にあたることが示される。フラビウイルスファミリーには、ヒトの病原体となる小さくてエンベロープを有する多くのウイルスが含まれる。フラビウイルス粒子の形態学および構成は公知であり、Ｍ．Ａ．Ｂｒｉｎｔｏｎ著「Ｔｈｅ　Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｈｅ　Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ　Ａｎｄ　Ｆ１ａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（シリーズ編集、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ、本巻編集、ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）．ｐｐ．３２７−３７４で論じられている。一般に、形態学に関しては、フラビウイルスは脂質二重層によって囲まれた中心ヌクレオカプシドを含有している。ビリオンは球形であり、約４０〜５０ｎｍの直径を有している。そのコアの直径は約２５〜３０ｎｍである。ビリオンのエンベロープの外表面に沿って、長さ約５〜１０ｎｍで直径約２ｎｍの末端瘤を有する突起物がある。このファミリーの典型的な例としては、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、およびデング熱ウイルスが挙げられる。これらは、ＨＣＶよりわずかに大きく、約３５００のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする正鎖のＲＮＡゲノム（約１１，０００のヌクレオチド）を有している。個々のウイルスタンパク質はこの前駆体ポリペプチドから開裂する。
【００６１】
　ＨＣＶのゲノムは、約１０，０００のヌクレオチドを有する一本鎖ＲＮＡであると思われる。このゲノムは正鎖であり、約３，０００個のアミノ酸のポリタンパク質をコードする連続的翻訳オープンリーディングフレイム（ＯＲＦ）を有している。このＯＲＦにおいて、構造タンパク質は、Ｎ末端領域の最初の４分の１にコードされており、主たるポリタンパク質は非構造タンパク質に当てられている。すべての既知のウイルス配列と比較すると、小さいが重要な共直線性の相同性が、フラビウイルスファミリーの非構造タンパク質およびペスチウイルス（現在ではフラビウイルスファミリーの一部であると考えられている）との間に見られる。
【００６２】
　（例として黄熱病ウイルスを用いた）フラビウイルスポリタンバク質と、ＨＣＶゲノムの主要なＯＲＦにコードされた推定ポリタンパク質の、可能な領域の記号化した配列を図１に示す。ＨＣＶポリタンパク質の可能なドメインを図に示す。黄熱病ウイルスポリタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に向けて、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｃ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、および非構造タンパク質１、２（ａ＋ｂ）、３、４（ａ＋ｂ）および５（ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）を含有している。ＨＣＶ１のヌクレオチド配列にコードされた推定アミノ酸に基づいて、ＨＣＶポリタンパク質のＮ末端の一番端の小さなドメインは、サイズにおいても塩基性残基の含有率が高いことにおいても、フラビウイルスポリタンパク質のＮ末端に見られるヌクレオカプシドタンパク質（Ｃ）に類似しているように思われる。アミノ酸配列は分岐するが、ＨＣＶおよび黄熟病ウイルス（ＹＦＶ）の非構造タンパク質２、３、４および５（ＮＳ２−５）は、同様のサイズおよびハイドロパシシティの等価物を有していると思われる。しかし、Ｍ、ＥおよびＮＳ１タンパク質を含有するＹＦＶポリタンパク質の領域に対応するＨＣＶの領域は、配列が異なるのみならず、サイズおよびハイドロパシシティにおいてもかなり異なっているように思われる。従って、ＨＣＶゲノムの或ドメインは、本明細書では、例えばＮＳ１またはＮＳ２として言及され得るが、これらの名称は参照の便を図るためのものにすぎず、ＨＣＶファミリーとフラビウイルスとの問には、はっきりと認識すべき、かなりの差があり得ることを理解されたい。
【００６３】
　ＨＣＶの菌株または単離物の進化的関係によって、推定ＨＣＶ菌株および単離物はポリペプチドのレベルでその相同性によって同定され得る。本明細書に開示される単離物に関しては、新たなＨＣＶ菌株または単離物は、少なくとも約４０％、いくつかは約７０％以上、さらにいくつかは約８０％以上相同であることが予測される。いくつかは、ポリペプチドのレベルで約９０％以上相同であり得る。アミノ酸配列の相同性を判断する技術は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸配列は直接決定され、本明細書に提供される配列と比較され得る。あるいは、推定ＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列は、（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）決定され得、そこでコードされるアミノ酸配列を決定し、対応する領域を比較することができる。
【００６４】
　「ＨＣＶプロテアーゼ」という用語は、タンパク質分解活性を示すＨＣＶ由来の酵素、特にＨＣＶゲノムのＮＳ３ドメインにコードされているポリペブチドのことである。少なくとも１つのＨＣＶの菌株は、実質的に以下の配列によって、または以下の配列内にコードされていると考えられるプロテアーゼを含有している：
【００６５】
【化１５】
2004073212.tif 000014
【００６６】
　上記ＮおよびＣ末端は推定であり、実際の末端は、全ＮＳ３ドメインをコードするＤＮＡ構築物の適切な宿主内での発現およびプロセシングにより明示される。ＨＣＶのようなＲＮＡウイルスは広範囲の多様性を示すことが知られているため、この配列は菌株によって改変すると考えられている。さらに、プロテアーゼは前駆体ポリタンパク質から開裂するため、実際のＮおよびＣ末端は変動し得る：プロテアーゼアミノ酸配列が変動すると、様々な点でのポリタンパク質からの開裂が起こる。従って、アミノ末端およびカルボキシ末端は、ＨＣＶの菌株によって異なり得る。上記の最初のアミノ酸は、図１の残基６０に対応する。しかし、活性に必要な最小配列は、通常の方法によって決定され得る。この配列は、（コーディング配列の５’または３’末端での開裂の後）あらゆる所望の数の塩基対を除去するためにエキソヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクターを処理することにより、その両端を切断し得る。その後、得られるコーディングポリヌクレオチドが発現され、配列が決定される。このように、得られる生成物の活性は、アミノ酸配列と相関し得る。（徐々により多くの数の塩基対を除去していく）そのような限定された一連の実験は、プロテアーゼ活性に必要な最低限の内部配列を決定する。この配列は、特にカルボキシ末端で実質的に切断され、明らかに十分にプロテアーゼ活性を保持し得ることを我々は見いだした。カルボキシ末端におけるタンパク質の一部がヘリカーゼ活性を示し得ると現在考えられている。しかし、ヘリカーゼ活性は、本発明のＨＣＶプロテアーゼには必要ではない。アミノ末端もまた、プロテアーゼ活性を失うことなくある程度切断され得る。
【００６７】
　上記で下線を施したアミノ酸は、推定フラビウイルスのセリンプロテアーゼに対する配列の相同性に基づいて、触媒活性に必要な残基であると考えられている。表１は、ＨＣＶプロテアーゼおよび黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス、マリーバレー熱ウイルスおよびクンジン（Ｋｕｎｊｉｎ）ウイルスから得られるプロテアーゼの３つのセリンプロテアーゼ触媒作用残基の配列を示している。その他の４つのフラビウイルスプロテアーゼ配列は、ＨＣＶに対してより、互いに対してより高い相同性を示すが、ＨＣＶともある程度の相同性が見られる。しかし、この相同性は、現在得られる配列ソフトウェアによって示すには十分ではない。示されたアミノ酸には、上記の配列において、Ｈｉｓ79、Ａｓｐ103およびＳｅｒ161（図１におけるＨｉｓ139、Ａｒｇ163およびＳｅｒ221）の番号が付されている。
【００６８】
【表１】
2004073212.tif 000015
【００６９】
　あるいは、構造的相同性に基づいて触媒作用残基配列を作ることも可能である。表２は、構造的研究に基づく、いくつかのよい特性を有するセリンプロテアーゼ：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓからのプロテアーゼＡ、α−位分解プロテアーゼ、ウシトリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼの触媒部位に対してのＨＣＶの配列を示す（Ｈ．Ｊａｍｅｓら、Ｃａｎ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７８）５６：３９６）。ここでも、ある程度の相同性が見られる。同定されるＨＣＶ残基は、上記配列においてＨｉｓ79、Ａｓｐ125、およびＳｅｒ161の番号が付されている。
【００７０】
【表２】
2004073212.tif 000016
【００７１】
　活性部位に必須の残基を立証する最も直接的な方法は、各残基をそれぞれステアリンと同等のサイズの残基と置き替えることである。これは、部位特異的変異誘発および当該分野で公知の同様の方法によって、容易に行われ得る。特定の残基を等量寸法の残基と置き替えると活性が失われる場合は、置き替えられた残基の本質的性質が確認される。
【００７２】
　「ＨＣＶプロテアーゼアナログ」とは、天然プロテアーゼのアミノ酸配列の欠失、改変および／または付加によって全長プロテアーゼ配列から改変しているポリペプチドのことである。ＨＣＶプロテアーゼアナログには、上記の切り形プロテアーゼ、およびＨＣＶプロテアーゼ変異タンパク質およびＨＣＶプロテアーゼ、切り形プロテアーゼまたはプロテアーゼ変異タンパク質を含有する融合タンパク質が含まれる。ＨＣＶプロテアーゼ変異タンパク質を形成するための改変は、同類アミノ酸置換であることが好ましく、その際アミノ酸は同様の特性を有するその他の天然発生アミノ酸と置換される。例えば、以下の置換が「同類」と考えられる：
【００７３】
【表３】
2004073212.tif 000017
【００７４】
　非同類的な改変は、一般に、上記のアミノ酸の１つを異なる群からのアミノ酸へ置換することであり（例えば、ＡｓｎをＧｌｕに置換する）、あるいはＣｙｓ、Ｍｅｔ、ＨｉｓまたはＰｒｏを上記のアミノ酸のいずれかと置換することである。天然のアミノ酸を含む置換は、所望のタンパク質をコードする発現ベクターの部位特異的変異誘発によって好ましく行われ、改変された形態の発現が得られる。また、合成または半合成方法によってアミノ酸を改変させることも可能である。例えば、単離されたタンパク質を適切に化学的処理することによって、システインまたはセリン残基をセレノシステインに変換することができる。または、標準的なインビトロのタンパク質合成方法によって、非天然のアミノ酸を組み込むこともできる。一般的には、変異タンパク質の天然配列に対し行われる改変、欠失あるいは付加される残基の合計数は、約２０を越えない、あるいは約１０を越えないことが好ましく、約５を越えないことが最も好ましい。
【００７５】
　一般に、融合タンパク質とは、２つ以上の個別のタンパク質から引き出されたアミノ酸配列を含有するポリペプチドのことである。本発明では、「融合タンパク質」とは、ＨＣＶプロテアーゼ、切り形、変異タンパク質またはそれらの機能部分を含有し、非ＨＣＶタンパク質またはポリペプチド（「融合パートナー」）に融合したポリペプチドの意味で用いられる。融合タンパク質は、融合遺伝子の発現によって生成することが最も便利であり、この融合遺伝子は、１つのポリペプチドの５’末端部分と、異なるポリペプチドの３’末端部分をコードし、その異なる部分同志は結合されて適切な宿主において発現し得る１つのリーディングフレイムとなる。現在では、ＨＣＶプロテアーゼまたはアナログを融合タンパク質のカルボキシ末端に位置させ、機能酵素のフラグメントをアミノ末端に用いることが（必要とされているわけではないが）好ましい。ＨＣＶプロテアーゼは通常大きなポリタンパク質内に発現するため、細胞輸送シグナル（例えば輸出または分泌シグナル）を含むことは期待できない。適切な機能酵素フラグメントは、ＨＣＶプロテアーゼと融合して発現される時に定量可能な活性を示すポリペプチドである。例としての酵素には、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、β−ラクタマーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）、ウレアーゼなどが制限なしに挙げられる。生成される融合タンパク質の量が簡単な比色分析によって定量できるため、これらの酵素は便利である。または、融合パートナーに特異的な抗体を用いて、融合タンパク質を簡単に検出および定量するために、抗原タンパク質またはフラグメントを用いることもできる。現在好ましい融合パートナーはｈＳＯＤである。
【００７６】
　（Ｂ．一般的な方法）
　本発明を実施するにあたっては、一般に、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を用い、これらは当該分野の技術範囲内のものである。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８９）：「ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」，Ｖｏｌ．Ｉ　ａｎｄ
　ＩＩ（Ｄ．Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編　１９８５）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編　１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）：「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ
　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編　１９８４）：「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編　１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌ１ｓ　Ａｎｄ
　Ｅｎｚｙｍｅｓ」（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８４）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」のシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編　１９８７，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８７）１５４および１５５（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編，Ｗｕ編）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７），「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　Ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ」，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８７）；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ−ＩＶ（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編　１９８６）などを参照のこと。
【００７７】
　指定された宿主と適合する、適切な制御配列を用いる場合には、原核および真核宿主細胞の両方が、所望のコーディング配列を発現するのに有用である。原核宿主の中で、Ｅ．ｃｏｌｉが最もよく用いられる。原核細胞の制御配列には、任意にオペレーター部分を含有するプロモーター、およびリボソーム結合部位が含まれる。原核細胞宿主に適合する転移ベクターは、一般に、例えば、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含有するプラスミドであるｐＢＲ３２２、およびやはり抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含有している種々のｐＵＣベクターから由来する。これらのプラスミドは、商業的に入手可能である。これらのマーカーは、選択によって、優れた形質転換体を得るのに用い得る。一般に用いられる原核制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８０）８：４０５７）およびラムダ誘導ＰLプロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）およびｔｒｐおよびｌａｃ　ＵＶ５プロモーターの配列に由来するハイブリッドｔａｃプロモーター（Ｄｅ　Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８３）２９２：１２８）が含まれる。上述のシステムは、特にＥ．ｃｏｌｉに適合する：所望の場合には、バシラスまたはシュードモナスの菌株のようなその他の原核宿主を、対応する制御配列と共に用いることもできる。
【００７８】
　真核宿主には制限なしに、培養システム中の酵母および哺乳動物細胞を含む。酵母発現宿主には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｉｃｉａなどが含まれる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓが最もよく用いられる酵母宿主であり、便利な菌類宿主である。酵母適合ベクターは、原栄養性を栄養要求性突然変異体にまたは野生型菌株に重金属耐性に付与することによって、優れた形質転換体を選択することのできるマーカーを有する。酵母適合ベクターは、２μの複製起点を用い（Ｂｒｏａｃｈら、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：３０７）、複製を確実にするためにＣＥＮ３およびＡＲＳ１の組み合せ、または宿主細胞ゲノムに適切なフラグメントを組み込む配列のような他の手段を活用し得る。酵母ベクターの制御配列は、当該分野では公知であり、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８０）２５５：２０７３）を含む、解糖酵素の合成のためのプロモーターが含まれる（Ｈｅｓｓら、Ｊ
　Ａｄｖ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ（１９６８）７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９７８），１７：４９００）。エノラーゼ遺伝子に由来するもののようなターミネーターも含まれる（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８１）２５６：１３８５）。特に有用な制御システムは、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモーター、ＧＡＰＤＨにも由来するターミネーター、および分泌が必要な場合には酵母α−因子に由来するリーダー配列を含有するものである（参考までに本明細書に援用する、米国特許第４，８７０，００８号参照）。
【００７９】
　現在のところ、好ましい発現システムは、融合パートナーとしてユビキチン（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ）リーダーを用いている。１９８９年８月７日に出願された同時係属中の第ＵＳＳＮ　７／３９０，５９９号は、酵母ユビキチン融合タンパク質を高率に発現するためのべククーを開示している。酵母ユビキチンは、発現によって自動的に融合タンパク質から開裂する。７６アミノ酸ポリペプチドを提供する。ユビキチンのアミノ酸配列は以下のものである：
【００８０】
【化１６】
2004073212.tif 000018
【００８１】
　また、Ｏｚｋａｙｎａｋら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：６６３−６６も参照のこと。ユビキチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ｂａｒｒら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８８）２６８：１６７１−７８の技術に従い　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８０Ａ　ＤＮＡ合成器を用いるなど、標準的な方法で合成し得る。適切なリンカーを用いると、ユビキチン遺伝子を適当なベクターに挿入し、ＨＣＶプロテアーゼまたはそのフラグメントをコードする配列に結合することができる。
【００８２】
　さらに、作動可能なように連結された転写調節領域および転写開始領域は、野生型有機体には自然には関連しないものにし得える。これらのシステムは、１９８４年１０月３日公開のＥＰＯ第１２０，５５１号；１９８４年８月２２日公開のＥＰＯ第１１６，２０１号：１９８５年１２月１８日公開のＥＰＯ第１６４，５５６号に詳細に説明されており、これらはすべて本発明と同一出願人によるものであるため、参考までに本明細書に詳しく援用される。
【００８３】
　発現の宿主として入手可能な哺乳動物細胞系は、当該分野では公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞および多くのその他の細胞株を含む、多くの不滅細胞系が含まれる。哺乳動物細胞に適当なプロモーターもまた当該分野で公知であり、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７３：１１３）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）およびウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）などからのウイルスプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞は、また、ターミネーター配列およびポリ−Ａ付加配列を必要とすることがある。発現を増大させるエンハンサー配列を含むことも可能であり、遺伝子を増幅する配列もまた望ましい（例えば、メトトレキセート耐性遺伝子）。これらの配列は当該分野では公知である。
【００８４】
　哺乳動物細胞における複製に適切なベクターは、当該分野で公知であり、これには、ウイルスレプリコン、またはＨＣＶエピトープを宿主ゲノムにコードするのに適切な配列の宿主ゲノムヘの組み込みを確実にする配列を含み得る。例えば、外来ＤＮＡを発現するのに用いられるその他のベクターは、ワクシニアウイルスである。この場合、異種ＤＮＡはワクシニアゲノムに挿入される。外来ＤＮＡをワクシニアウイルスゲノムに挿入する技術は当該分野では公知であり、例えば、相同組換えを用いることができる。異種ＤＮＡは、一般に、ウイルスに必須ではない遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）に挿入され、これによって選択可能なマーカーがまた提供される。組換えウイルスの構築を大きく促進するプラスミドベクターは、すでに記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ（１９８４）４９：８５７；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、「Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ（１９８５）５：３４０３；Ｍｏｓｓ、Ｇｅｎｅ　ＴＲＡＮＳＦＥＲ　ＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲ　ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８７），ｐ．１０を参照のこと）。その後、活動組換えワクシニアウィルスに感染した細胞または動物中で、ＨＣＶポリペプチドが発現する。
【００８５】
　ＨＣＶポリペプチドがワクシニアベクターから発現するか否かを判断するために、ＢＳＣ　１細胞を組換えベクターで感染させ、発現可能な条件の下で顕微鏡スライド上に増殖させることもできる。次に細胞をアセトン固定し、組換え発現ベクターのＨＣＶセグメントが由来している、ＨＣＶゲノムの領域にコードされたポリペプチドに対する抗ＨＣＶ抗体を含有するとわかっている血清を用いて、免疫蛍光アッセイが行われる。
【００８６】
　真核またはウイルスゲノムの発現のためのその他のシステムには、昆虫細胞およびこれらの細胞で用いるのに適切なベクターが含まれる。これらのシステムは当該分野で公知であり、例えば、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する昆虫発現転移ベクターが含まれ、これはヘルパー独立のウイルス発現ベクターである。このシステムに由来する発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するための、強いウイルス性のポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子プロモーターを用いる。現在、ＡｃＮＰＶに外来遺伝子を導入するために最も一般的に用いられる転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である（ＰＣＴ第ＷＯ８９／０４６６９９号およびＵＳＳＮ第７／４５６，６３７号参照）。当業者に公知のその他の多くのベクターも発現を向上させるよう設計されてきた。この中には、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに改変させ、そのＡＴＴから３２ｂｐ下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌ（１９８９）１７：３１参照）が含まれる。非融合外来タンパク質を高度に発現するためのＡｃＮＰＶ転移ベクターは、同時係属中のＰＣＴ出願番号第ＷＯ８９／０４６６９９号およびＵＳＳＮ第７／４５６，６３７号に記載されている。唯一のＢａｍＨＩ部位は、ポリヘドリン遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに関して、８位後ろにある。ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｂａＩまたはＳｓｔＩについての開裂部位はない。非融合外来タンパク質を良好に発現するためには、通常、理想的には、ＡＴＧ開始シグナルに先行する、適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を持つ外来遺伝子が必要である。このプラスミドもポリヘドリンポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のための複製起点を含有している。
【００８７】
　異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入する方法は当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ（１９８３）３：２１５６−２１６５：およびＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌ（１９８９）１７：３１参照のこと）。例えば、異種ＤＮＡを、相同組換えによってポリヘドリン遺伝子のような遺伝子に、または所望のバキュロウイルス遺伝子内に構築された制限酵素部位に挿入することができる。挿入される配列は、全てのまたは様々なポリタンパク質のセグメントをコードするもの、もしくはウイルスポリペプチドをコードするその他のｏｒｆであり得る。例えば、この挿入物は、ポリタンパク質から以下の番号のアミノ酸セグメントをコードすることができた：アミノ酸１−１０７８；アミノ酸３３２−６６２；アミノ酸４０６−６６２；アミノ酸１５６−３２８およびアミノ酸１９９−３２８。
【００８８】
　シグナルペプチド開裂、タンパク質分解開裂およびリン酸化などの、翻訳後改変のためのシグナルは、昆虫細胞によって認識される。分泌および核内蓄積に要求されるシグナルも、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間に保存されている。無脊椎動物細胞において効果的な脊椎動物細胞からのシグナル配列の実例は、当該分野では公知であり、例えば、細胞からの分泌をシグナルとして送るヒトインターロイキン−２シグナル（ＩＬ２S）が認識され、昆虫細胞内で適切に除去される。
【００８９】
　形質転換は、例えば、ウイルス内のポリヌクレオチドをパッケージングして、宿主細胞をそのウイルスで形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する公知の方法のいずれによっても、および直接ポリヌクレオチドを取り込むことによっても行われ得る。用いられる形質転換方法は、形質転換される宿主によって異なる。直接取り込みによるバクテリアの形質転換では、一般に、カルシウムまたは塩化ルビジウムによる処理を用いる（Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９７２）６９：２１１０；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８２）。直接取り込みによる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９の方法を用いて行われ得る。直接取り込みによる哺乳動物細胞の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌ（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱方法を用いて、または公知の様々なこの方法の改変を用いて行われ得る。組換えポリヌクレオチドを細胞に、特に哺乳動物細胞に導入するその他の方法としては、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラストフュージョン、電気穿孔法、リポソーム内へのポリヌクレオチドの包み込み、および核へのポリヌクレオチドの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。
【００９０】
　ベクター構築には当該分野で公知の技術を用いる。部位特異的ＤＮＡ開裂は、一般にこれらの市販の酵素の製造によって特定される条件の下で、適切な制限酵素で処理することによって行われる。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列が、約２０μＬの緩衝溶液中で１単位の酵素によって、３７℃で１〜２時間のインキュベーションを行うことによって、開裂される。制限酵素によるインキュベーションの後、タンパク質をフェノール／クロロホルム抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノールによる沈澱によって回収する。開裂したフラグメントは、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９−５６０に記載されている一般的処理に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動法を用いて分離され得る。
【００９１】
　付着末端の開裂フラグメントは、この混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）により平滑末端にされ得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理も用い得、これは、あらゆる一本鎖ＤＮＡ部分を加水分解することになる。
【００９２】
　標準の緩衝液および温度条件の下で、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを用いて、連結反応を行う：付着末端連結反応で必要なＡＴＰおよびリガーゼは、平滑末端連結反応より少ない。ベクターフラグメントを連結混合物の一部に用いる場合には、そのベクターフラグメントは細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）または仔牛腸由来のアルカリホスファターゼによって処理され、５’リン酸基を除去してベクターの再連結を防ぐことが多い。あるいは、不要のフラグメントの制限酵素分解はまた、連結を防ぐのに用いることもできる。
【００９３】
　連結混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉなどの適切なクローニング用宿主に形質転換し、組み込まれたマーカー（例えば抗生物質耐性）を用いて優れた形質転換体を選択し、正しい構築物をスクリーニングする。
【００９４】
　合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ，ＤＮＡ（１９８４）３：４０１に記載されている自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製することができる。必要に応じて、標準的な反応条件の下で、32Ｐ−ＡＴＰの在在下、ポリヌクレオチドキナーゼで処理することによって、合成鎖を32Ｐで標識することができる。
【００９５】
　ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものも含めて、ＤＮＡ配列は、公知の技術、例えば、部位指定変異誘発によって、改変することができる（例えば、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８２）１０：６４８７）。簡単に言うと、改変すべきＤＮＡを一本鎖配列としてファージ内にパッケージングし、改変すべきＤＮＡの一部に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡに変換し、この時所望の改変はプライマー配列に含まれる。得られる二本鎖ＤＮＡで、ファージを保持する宿主バクテリアを形質転換する。このファージの各鎖のコピーを含む形質転換されたバクテリアの培養は、寒天培地にプレートし、プラークが得られる。理論的には、新しいプラークの５０％は、変異した配列を有するファージを含有し、そして残りの５０％は元々の配列を有する。プラークの複製物は非改変配列をもたない正しい鎖とのハイブリダイゼーションを可能にする温度と条件下で標識した合成プローブとハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションによって同定された配列が回収され、クローニングされる。
【００９６】
　ＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓのＰｒｏｃ
　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９７５）７３：３９６１の方法を用いて調べることができる。簡単に言えば、この方法では、調べるべきＤＮＡをニトロセルロースフィルターに固定化し、変性させ、０〜５０％ホルムアミド、０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０２％（ｗｔ／ｖ）の各ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドンおよびＦｉｃｏｌｌ（登録商標）、５０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4（ｐＨ６．５）、０．１％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍＬのキャリア変性ＤＮＡを含有する緩衝液で、プレハイブリダイズする。緩衝液内でのホルムアミドのパーセンテージ、およびプレハイブリダイゼーションとそれに続くハイブリダイゼーション工程との時間および温度条件は、必要とされるストリンジェンシーによって改変する。一般に、低いストリンジェンシーを必要とするオリゴマープローブは、低いパーセントのホルムアミド、より低い温度、およびより長いハイブリダイゼーション時間で用いられる。ｃＤＮＡまたはゲノム配列に由来するものなど、３０または４０より多いヌクレオチドを含有するプローブは、一般に、例えば約４０〜４２℃の高い温度、および例えば５０％という高いホルムアミドのパーセンテージで用いる。プレハイブリダイゼーションの後、５’−32Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に加え、ハイブリダイゼーション条件の下で、この混合物内でフィルターをインキュベートする。洗浄した後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーにかけ、ハイブリダイズしたプローブの位置を示す；当初のアガー培養上の対応する位置にあるＤＮＡを、所望のＤＮＡ源として用いる。
【００９７】
　通常のベクター構築のために、結合反応混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉのＨＢ１０１株またはその他の適切な宿主に形質転換し、優れた形質転換体が抗生物質耐性またはその他のマーカーによって選択される。そして、形質転換体からのプラスミドを、Ｃｌｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９６９）６２：１１５９の方法に従って、通常、クロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ，Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ（１９７２）１１０：６６７）に引き続いて調製する。ＤＮＡは、通常制限酵素分析および／主たは配列決定法によって、単離され、分析される。配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７７）７４：５４６３の方法で、さらにＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８１）９：３０９によって説明されているジデオキシ法によって、あるいはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８０）６５：４９９の方法によって行うことができる。バンド圧縮の問題は、ＧＣ豊富領域で見られることがあるが、Ｂａｒｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８６）４：４２８に従ってＴ−デアゾグアノシン（ｄｅａｚｏｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を用いることによって克服された。
【００９８】
　酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を、抗原または抗体濃度のいずれかを測定するのに用いることができる。この方法は、酵素の、抗原または抗体いずれかへの連結に依存し、定量可能標識として結合酵素活性を用いる。抗体を測定するためには、既知の抗原を固相（例えば、マイクロタイターディッシュ、プラスチックカップ、ディップスティック、プラスチックビーズなど）に固定し、テスト血清希釈物とインキュベートし、洗浄し、酵素で標識された抗イムノグロブリンでインキュベートし、再び洗浄する。標鐵に適切な酵素は、当該分野では公知であり、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が含まれる。固相に結合した酵素活性は、通常、特定の基質を添加し、物質の生成または比色分折により基質の使用を判断することによって測定される。結合酵素活性は、結合抗体量の直接的関数である。
【００９９】
　抗原を測定するためには、既知の特定の抗体を固相に固定し、抗原を含有するテスト物質を添加し、インキュベーションの後、固相を洗浄し、第二の酵素標識抗体を添加する。洗浄した後、基質を添加し、酵素活性を比色的に測定し、抗原濃度と関連づけられる。
【０１００】
　本発明のプロテアーゼの活性は、検出可能な開裂生成物を提供する基質を開裂することによってアッセイすることもできる。ＨＣＶプロテアーゼは、ゲノムポリタンパク質から開裂すると考えられるため、タンパク質の発現をアッセイし、活性を測定するために、この自己触媒活性を用いることもできる。例えば、ＨＶＣプロテアーゼＮ末端開裂シグナル（Ａｒｇ−Ａｒｇ）が含まれるようにプロテアーゼが融合パートナーと結合されると、発現生成物は、融合パートナーおよび活性ＨＣＶプロテアーゼに開裂する。生成されたタンパク質がサイズにおいて、融合パートナーおよびプロテアーゼタンパク質に対応することを立証するために、例えばウェスタンブロットによってこの生成物をアッセイすることもできる。現在では、小さなペプチドｐ−ニトロフェニルエステルまたはメチルクマリンを用いることが好ましい。そうすると、開裂の後、分光光度計測定または蛍光アッセイを行い得るためである。Ｅ．Ｄ．Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４７：２３１−３５に記載された方法に従って、蛍光標識を基質の一端に、クエンチング分子を他端に添加することもできる：そして得られる蛍光の増加を測定することによって開裂が判断される。適切な酵素または抗原を融合パートナーとして用いると、生成されるタンパク質の量は簡単に測定できる。あるいは、ＨＣＶプロテアーゼＮ末端開裂シグナル（自己開裂を抑制する）を排除し、天然のプロセシングシグナルまたは合成アナログを含有するＨＣＶ　ＮＳ３ドメインのフラグメントなどの、別の開裂基質を添加することもできる。
【０１０１】
　このプロテアーゼ活性がなければ、ＨＣＶポリタンパク質はプロセシングされない形態のままであり、そのためウイルスを非感染性にする。従って、プロテアーゼ活性を十分に抑制する成分がウイルス感染性も阻害するため、このプロテアーゼは、ＨＣＶの制御のための薬剤アッセイに有用である。このようなインヒビターは有機成分、特にプロテアーゼによって認識されるＨＣＶの開裂部位を模倣する成分の形態をとり得る。ＨＣＶポリタンパク質の３つの推定開裂部位は、以下のアミノ酸配列を有する：
【０１０２】
【化１７】
2004073212.tif 000019
【０１０３】
　これらの部位は、開裂部位の直前に２つの塩基性アミノ酸が存在することによって特徴づけられ、その他のフラビウイルスプロテアーゼによって認識される開裂部位に類似している。従って、ＨＣＶ開裂部位の塩基性／塩基性／小中性モチーフを模倣し、不安定結合を天然基質において開裂したペプチド結合と置換する、適切なプロテアーゼインヒビターが調製し得る。適切なインヒビターとしては、ペプチドトリフルオロメチルケトン、ペプチドボロン酸、ペプチドα−ケトエスチル、ペプチドジフルオロケト化合物、ペプチドアルデヒド、ペブチドジケトンなどが挙げられる。例えば、ペプチドアルデヒドＮ−アセチル−フェニルアラニル−グリシンアルデヒドは、プロテアーゼパパインの有力なインヒビターである。参考までに本明細書に援用する、１９８８年５月２日出願の米国特許出願第７／１８９，３１８号（ＰＣＴ第ＷＯ８９／１０９３１号として公開）に開示された方法を用いて、ペプチドの大量の混合物を調製し、アッセイすると便利である。この出願は、ペプチドの混合物を、全ての可能なアミノ酸配列を有するヘキサペプチドまで生成する方法を教示しており、さらに、プロテアーゼと結合可能なこれらのペプチドを同定する方法を教示している。
【０１０４】
　その他のブロテアーゼインヒビターは、タンパク質、特に抗体および抗体誘導体であり得る。組換え発現システムを用いて、このプロテアーゼに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するのに十分な量のプロテアーゼを生成することもできる。プロテアーゼを阻害するための適切な抗体は、酵素活性を減少または排除するような様式で、典型的には活性部位をおおい隠すように、このプロテアーゼに結合する。適切なＭＡｂを、当該分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂフラグメント、キメラ抗体、改変された抗体、一価の抗体およびシングルドメイン抗体などの誘導体を生成するのに用いることもできる。
【０１０５】
　プロテアーゼインヒビターは、本発明の方法を用いてスクリーニングされる。一般には、酵素の天然基質を模倣し、開裂した時には定量可能なシグナルを提供する基質を用いる。シグナルは比色法または蛍光法によって検出することが好ましい：しかし、ＨＰＬＣまたはシリカゲルクロマトグラフィ、ＧＣ−ＭＳ、核磁気共鳴等のその他の方法も有効である。最適な基質および酵素の濃度を決定した後、候補となるプロテアーゼインヒビターを濃度の範囲で反応混合物に添加する。アッセイ条件は、インビボで、プロテアーゼが阻害される条件、つまり生理学的ｐＨ、温度、イオン強度等に類似のものであることが理想である。適切なインヒビターは、被験体に毒性副作用を起こさせない濃度で、強いプロテアーゼ阻害を示す。プロテアーゼ活性部位への結合について競合するインヒビターは、基質濃度と同等あるいはそれ以上の濃度を必要とし、他方、プロテアーゼ活性部位に不可逆的に結合することのできるインヒビターは、酵素濃度のオーダーの濃度で添加し得る。
【０１０６】
　本願の好ましい実施形態においては、活性酵素ではなく、不活性のプロテアーゼ変異タンパク質を用いる。プロテアーゼの活性部位内の重要残基を置き替え（例えば、セリンプロテアーゼの活性部位Ｓｅｒを置き替え）ても、酵素の構造を有意には改変させず、結合特異性が保たれる。改変させられた酵素は、それでも適切な基質を認識し、それに結合するが、開裂を起こさせることはできない。従って、本発明の方法の１つによると、不活性化されたＨＣＶプロテアーゼは固定化され、候補となるインヒビターの混合物が添加される。酵素の好ましい認識配列を詳細に模倣するインヒビターは、その他の候補のインヒビターよりうまく結合のために競合する。うまく結合できない侯捕は、そこで分けられ、結合の強いインヒビターが決定される。例えば、ＨＣＶプロテアーゼは、ＡｌａをＳｅｒ221（図１の）に置き換えて調製され、ＨＣＶプロテアーゼ基質に結合は可能であるが、それを開裂させることはできない酵素を提供する。そして、得られたプロテアーゼ変異タンパク質は、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）ビーズなどの固体支持物に結合され、カラムに詰められる。そして、候補のプロテアーゼインヒビターの混合液をカラムに通し、画分を集める。溶出する最後の画分は、量も結合の強い化合物を含有し、好ましいプロテアーゼインヒビター候補を提供する。
【０１０７】
　プロテアーゼインヒビターは、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、鼻腔内など、様々な方法で投与し得る。好ましい投与経路は、インヒビターの性質による。有機化合物として調製されたインヒビターは、吸収性がよい場合には、経ロで投与される（一般にこれが好ましい）。（ほとんどの抗体誘導体などの）タンパク質を基礎とするインヒビターは、一般に、非経口的経路による投与を行わねばならない。
【実施例】
【０１０８】
　（Ｃ．実施例）
　下記に示す実施例は当該分野の通常の技術を有する実験者にさらなるガイドとして提供されるものであって、本発明をいかなる点においても限定することを意図するものではない。
【０１０９】
　（実施例１：ＨＣＶ　ｃＤＮＡの調製）
　ＨＣＶ　ｃＤＮＡのゲノムライブラリーを、ＰＣＴ　ＷＯ８９／０４６６９９およびＵＳＳＮ　７／４５６，６３７に記載のように調製した。このライブラリー、ＡＴＣＣ受託番号第４０３９４号は、以下に説明するように寄託されている。
【０１１０】
　（実施例２：クローン５−１−１にコードされたポリペプチドの発現）
　（Ａ）クローン５−１−１（実施例１参照）内にコードされたＨＣＶポリペプチドは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）との融合ポリペプチドとして発現した。これは、下記のように発現ベクターｐＳＯＤＣＦ１（Ｋ．Ｓ．Ｓｔｅｉｍｅｒら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ（１９８６）５８：９；ＥＰＯ１３８，１１１）内にクローン５−１−１　ｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングすることによって達成した。このＳＯＤ／５−１−１発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞に形質変換した。Ｅ．ｃｏｌｉ内のＣｆ１／５−１−１と命名されたこれらの細胞は、以下に説明するように寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第６７９６７号を有している。
【０１１１】
　まず始めに、ｐＳＯＤＣＦ１から単離されたＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理し、下記のリンカーを、制限酵素によって生じた直鎖状ＤＮＡに連結した：
【０１１２】
【化１８】
2004073212.tif 000020
【０１１３】
クローニングした後、この挿入物を有するプラスミドを単離した。
【０１１４】
　この挿入物を有するプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。クローン５−１−１内のＨＣＶ　ｃＤＮＡ挿入物を、ＥｃｏＲＩで切り出し、このＥｃｏＲＩ直鎖化したプラスミドＤＮＡに連結した。このＤＮＡ混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｄ１２１０（Ｓａｄｌｅｒら，Ｇｅｎｅ（１９８０）８：２７９）を形質転換するために使用した。図１に示したＯＲＦを発現するための適切な配向にある５−１−１
　ｃＤＮＡの組み換え体を、制限地図の作成およびヌクレオチド配列決定によって同定した。
【０１１５】
　１つのクローン由来の組み換え体バクテリアを、ＩＰＴＧの存在下でバクテリアを増殖させて、ＳＯＤ−ＨＣＶ5-1-1ポリペプチドを発現するよう誘導した。
【０１１６】
　３つの新たなリンカー（ＡＢ、ＣＤ、およびＥＦ）を、ベクターｐＳＯＤＣＦ１をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで完全に消化し、その後アルカリホスファターゼで処理して得られたＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントに連結して、３つの異なる発現ベクター（ｐｃｆ１ＡＢ、ｐｃｆ１ＣＤ、およびｐｃｆ１ＥＦ）を作成した。これらのリンカーは、６つのオリゴマー、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦから作成した。その相補的オリゴマーにアニーリングする前に、各オリゴマーを、ＡＴＰ存在下でキナーゼ処理し、リン酸化した。合成リンカーの配列は、下記の通りであった：
【０１１７】
【化１９】
2004073212.tif 000021
【０１１８】
　３つのリンカーの各々は、本来のＥｃｏＲＩ部位を破壊し、リンカー内（但し別のリーディングフレーム内）に、新しいＥｃｏＲＩ部位を形成する。従って、クローンから単離されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ　ＥｃｏＲＩフラグメンは、発現ベクターに挿入された後、３つの異なるリーディングフレーム内に存在していた。
【０１１９】
　指定のｇｔ１１クローン内のＨＣＶ　ｃＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消化して切り出した；各フラグメントを、ｐｃｆ１ＡＢ、ｐｃｆ１ＣＤ、およびｐｃｆ１ＥＦ内に挿入した。その後、これらの発現構築物をＤ１２１０　Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、この形質転換体をクローニングし、ポリペプチドを以下のＢ項に記載するように発現させた。
【０１２０】
　（Ｂ）指定されたＨＣＶ　ｃＤＮＡの発現生成物の抗原性を、Ｈｅｌｆｍａｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８３），８０：３１に記載の方法の改変を用い、コロニーの直接的免疫学的スクリーニングによって、試験した。簡潔に述べると、アンピシリンプレートを覆ったニトロセルロースフィルター上にバクテリアをプレートし、フィルター当り約４０コロニーを得た。コロニーを、ニトロセルロースフィルター上にレプリカプレートし、このレプリカを一晩２ｍＭ　ＩＰＴＧおよびアンピシリン共存下で再増殖させた。ＣＨＣｌ3蒸気の飽和雰囲気中で約１５から２０分間ニトロセルロースフィルターを懸濁し、バクテリアのコロニーを溶解した。その後、各フィルターを、１０ｍＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ2、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、４０μｇ／ｍＬ　リゾチーム、および０．１μｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅを含む別々の１００ｍｍペトリ皿に入れた。このプレートを、室温で少なくとも８時間穏やかに攪拌した。このフィルターをＴＢＳＴ（５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．００５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）で洗浄した。インキュベートの後、細胞残渣を洗浄し、１０％ヒツジ血清を含むＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を除いたＴＢＳＴ）中で１時間インキュベートした。その後、フィルターを、ＮＡＮＢＨを有する個体からのＴＢＳ中の前処理された血清でインキュベートした。これらの個体は、チンパンジー３匹；ＨＣＶ　Ｃ１００−３ポリペプチド（Ｃ１００とも呼ばれる）に対する抗体に陽性を示す血清を持つ、慢性ＮＡＮＢＨを有する患者８人；抗Ｃ１００抗体に対して陰性を示す血清を持つ、慢性ＮＡＮＢＨを有する患者８人：抗Ｃ１００抗体に対して陰性を示す血清を持つ、回復期患者１人：および抗Ｃ１００抗体に対して強い陽性を示す血清を有する１人、抗Ｃ１００抗体に対してぎりぎりの陽性を示す血清を有する１人を含む、地域獲得性ＮＡＮＢＨを有する患者６人を含む。ＴＢＳで希釈された血清を、３７℃で少なくとも３０分間ｈＳＯＤで前吸収することにより、前処理した。インキュベーションの後、フィルターをＴＢＳＴで３０分間ずつ２回洗浄した。血清中で抗体と結合した発現タンパク質を、125Ｉ−標識されたヒツジ抗ヒト抗体で２時間にわたってインキュベートして、標識した。洗浄の後、フィルターをＴＢＳＴで３０分間ずつ２回洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行った。
【０１２１】
　（実施例３：ＳＯＤ−プロテアーゼ融合タンパク質全長のクローニング）
　（Ａ）ｐＢＲ３２２−Ｃ２００：
　以下で使用したＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、これらのファージから切り出されたｃＤＮＡをクローン５−１−１から単離したｃＤＮＡで置換したこと以外は、実質的に上記で記載したようにして決定した。
【０１２２】
　クローンＣ３３ｃを、下記の配列：
【０１２３】
【化２０】
2004073212.tif 000022
【０１２４】
を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて、単離した。クローンＣ３３ｃ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列を、図８に示す。図８は、その中にコードされているアミノ酸も示す。
【０１２５】
　クローン３５を、配列
【０１２６】
【化２１】
2004073212.tif 000023
【０１２７】
を有する合成ポリヌクレオチドでスクリーニングして、単離した。５０，０００個のクローン中約１個が、プローブとハイブリダイズした。Ｃ３５のポリヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、図７に示す。
【０１２８】
　クローンＣ３１を、図６に示す。図６は、その中にコードされているアミノ酸も示す。Ｃ２００カセットを、クローンＣ３３ｃ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｆＩで消化して得られた７１８ｂｐフラグメント、クローンＣ３１　ＤＮＡをＨｉｎｆＩおよびＢｇｌＩで消化して得られた１７９ｂｐフラグメント、およびクローンＣ３５　ＤＮＡをＢｇｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られた３７７ｂｐフラグメントを連結することにより、構築した。フラグメントを連結して得たこの構築物を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＢＲ３２２−Ｃ２００を生成した。
【０１２９】
　（Ｂ）Ｃ７ｆ＋Ｃ２０ｃ：
　クローン７ｆを、配列：
【０１３０】
【化２２】
2004073212.tif 000024
【０１３１】
を有するプローブを用いて、単離した。クローン７ｆ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびその中にコードされたアミノ酸を、図５に示す。
【０１３２】
　クローンＣ２０ｃを、下記の配列：
【０１３３】
【化２３】
2004073212.tif 000025
【０１３４】
を用いて単離する。
【０１３５】
　クローンＣ２０ｃ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびその中にコードされたアミノ酸を、図２に示す。
【０１３６】
　クローン７ｆおよびＣ２０ｃをＥｃｏＲＩおよびＳｆａＮＩで消化し、４００ｂｐおよび２６０ｂｐフラグメントをそれぞれ形成した。その後、これらのフラグメントをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ベクターＣ７ｆ＋Ｃ２０ｃを形成し、ＨＢ１０１細胞に形質変換した。
【０１３７】
　（ｃ）Ｃ３００：
　クローン８ｈを、クローン３３ｃ中のヌクレオチド配列に基づいたプローブを用いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は、
【０１３８】
【化２４】
2004073212.tif 000026
【０１３９】
であった。クローン８ｈ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびその中にコードされたアミノ酸を、図４に示す。
【０１４０】
　クローンＣ２６ｄを、下記の配列：
【０１４１】
【化２５】
2004073212.tif 000027
【０１４２】
を有するプローブを用いて単離する。
【０１４３】
　クローンＣ２６ｄの配列およびアミノ酸配列を、図３に示す。
【０１４４】
　クローンＣ２６ｄおよびＣ３３ｃ（上記Ａ項を参照）を、メチル化マイナスＥ．ｃｏｌｉ株ＧＭ４８に形質変換した。クローンＣ２６ｄをＥｃｏＲＩＩおよびＤｄｅＩで消化し、１００ｂｐフラグメントを得た。クローンＣ３３ｃをＥｃｏＲＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、７００ｂｐフラグメントを得た。クローンＣ８ｈをＥｃｏＲＩおよびＤｄｅＩで消化し、２０８ｂｐフラグメントを得た。その後、これらの３つのフラグメントを、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１に形質変換し、ベクターＣ３００を得た。
【０１４５】
　（Ｄ）クローン全長の調製
　ＥｃｏＲＩおよびＮａｅＩで消化してＣ７ｆ＋Ｃ２０ｃから６００ｂｐフラグメントを得、Ｃ３００からの９４５ｂｐ　ＮａｅＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントに連結して、この構築物をｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａから市販で入手可能）のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００を形成した。
【０１４６】
　Ｃ７ｆＣ２０ｃＣ３００を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、８９２ｂｐフラグメントを得た。これは、Ｃ２００をＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得られた１１６０ｂｐフラグメントに連結した。得られた構築物を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００を得た。このベクターの構造を、図９に図式的に示す。
【０１４７】
　（実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの調製）
　（Ａ）ｃｆ１ＳＯＤｐ６００
　このベクターは、機能性ｈＳＯＤリーダーに融合した、全長のＨＣＶプロテアーゼコーディング配列を含んでいる。ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００を、ＥｃｏＲＩで開裂して２０００ｂｐフラグメントを得た。これを、その後プラスミドｃｆ１ＣＤのＥｃｏＲＩ部位に連結した（実施例２Ａ）。得られたベクターは、ｈＳＯＤのアミノ酸１−１５１およびＨＣＶのアミノ酸９４６−１６３０（図１のアミノ酸１−６８６に対応して、ポリプロテインの始めから番号付けされている）をコードする。このベクターは、Ｃｆ１ＳＯＤｐ６００と明示され（しばしばＰ６００と呼ばれる）、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞に形質転換された。これらの細胞（ＡＴＣＣ受託番号第６８２７５号）を以下で説明するように寄託した。
【０１４８】
　（Ｂ）Ｐ１９０：
　切り形のＳＯＤプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、Ｃ７ｆ＋Ｃ２０ｃから６００ｂｐ　ＥｃｏＲｌ／ＮａｅＩフラグメントを切り出し、このフラグメントをクレノウフラグメントで平滑にし、ｃｆ１ＥＦのクレノウで平滑にされたＥｃｏＲＩ部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した（実施例２Ａ）。このポリヌクレオチドは、ｈＳＯＤのアミノ酸１−１５１およびＨＣＶプロテアーゼのアミノ酸１−１９９を有する融合タンパク質をコードする。
【０１４９】
　（Ｃ）Ｐ３００：
　さらに長い切り形のＳＯＤプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、Ｃ７ｆＣ２０ｃＣ３００から８９２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＮａｅＩフラグメントを切り出し、このフラグメントをクレノウフラグメントで平滑にし、ｃｆ１ＥＦのクレノウで平滑にされたＥｃｏＲＩ部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した。このポリヌクレオチドは、ｈＳＯＤのアミノ酸１−１５１およびＨＣＶプロテアーゼのアミノ酸１−２９９を有する融合タンパク質をコードする。
【０１５０】
　（Ｄ）Ｐ５００：
　さらに長い切り形のＳＯＤプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、Ｃ７ｆＣ２０ｃＣ３００から１５５０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを切り出し、このフラグメントをｃｆ１ＣＤのＥｃｏＲＩ部位に連結して調製し、Ｐ５００を形成した。このポリヌクレオチドは、ｈＳＯＤのアミノ酸１−１５１およびＨＣＶプロテアーゼのアミノ酸９４６−１４５７を有する融合タンパク質をコードする（図１のアミノ酸１−５１３）。
【０１５１】
　（Ｅ）ＦＬＡＧ／プロテアーゼ融合物
　このベクターは、Ｈｏｐｐら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４−１２１０のＦＬＡＧ配列に融合した全長のＨＣＶプロテアーゼコーディング配列を含んでいる。ＰＣＲを用いて、クローニングを容易にするための特定の制限末端を有する、ＨＣＶプロテアーゼ遺伝子を生成した。プラスミドｐ５００を、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩで消化し、９００ｂｐフラグメンントを生成した。このフラグメントおよび２つのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応に使用し、１９９０年１０月４日公開のＷＯ９０／１１０８９の図１７に示されるように、ＨＣＶ−１のアミノ酸１００９位で固有のＢｇｌＩＩ部位を有し、アミノ酸１２６２位でＳａｌＩ部位を有する停止コドンを有するものを導入した。このプライマーの配列は下記のとおりである：
【０１５２】
【化２６】
2004073212.tif 000028
【０１５３】
ＰＣＲの３０サイクルの後、反応物をＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで消化し、７１０ｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントをアニールし、下記の二本鎖に連結した。
【０１５４】
【化２７】
2004073212.tif 000029
【０１５５】
この二本鎖は、ＦＬＡＧ配列、イニシエーターであるメチオニン、および５’ＮｃｏＩ制限部位をコードする。得られたＮｃｏＩ／ＳａｌＩフラグメントをｐＣＦ１の誘導体に連結した。
【０１５６】
　その後、この構築物をＥ．ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞に形質転換し、ＩＰＴＧを加えてプロテアーゼの発現を誘発した。
【０１５７】
　ＦＬＡＧ配列をＨＣＶプロテアーゼに融合し、精製を促した。ＦＬＡＧでコードされたペプチドに結合するカルシウム依存性モノクローナル抗体を、厳しい溶離条件を用いずに融合タンパク質を精製するために使用する。
【０１５８】
　（実施例５：ＳＯＤ−プロテアーゼ融合タンパク質のＥ．ｃｏｌｉ発現）
　（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞を、ｃｆ１ＳＯＤｐ６００で形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むルリア液（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）中で、ＯＤを０．３−０．５まで増殖させた。その後、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度まで加え、細胞を培養して、０．９から１．３の最終ＯＤにした。その後、この細胞を溶解し、ＵＳＳＮ　７／４５６，６３７に記載のように抗ＨＣＶ血清を用いてウェスタンブロット法により、溶解物を分析した。
【０１５９】
　全長（理論的にはＭｒ　９３　ｋＤａ）の生成物はゲル上に現れなかったので、その結果、開裂の発生が示された。ｈＳＯＤ融合パートナーおよび分離したＨＣＶプロテアーゼに対応するバンドは、約３４、５３、６６ｋＤａの相対分子量で現れた。３４ｋＤａバンドは、ＮＳ３ドメインの一部分のｈＳＯＤパートナー（約２０ｋＤａ）に対応し、５３および６６ｋＤａのバンドは、（恐らくバクテリアによる）プロセシングの種々の程度のＨＣＶプロテアーゼに対応する。
【０１６０】
　（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞を、Ｐ５００で形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むルリア液中で０．３−０．５のＯＤまで増殖させた。その後、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度まで加え、細胞を培養して、０．８から１．０の最終ＯＤにした。その後、この細胞を溶解し、溶解物を上記のように分析した。
【０１６１】
　全長（理論的にはＭｒ　７３ｋＤａ）の生成物はゲル上に現れなかったので、その結果、ここでも開裂の発生が示された。ｈＳＯＤ融合パートナーおよび切り形のＨＣＶプロテアーゼに対応するバンドは、約３４および４５ｋＤａの分子量でそれぞれ現れた。
【０１６２】
　（Ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞を、ベクターＰ３００およびＰ１９０で形質転換し、上記のように増殖させた。
【０１６３】
　全長（理論的にはＭｒ　５１ｋＤａ）の生成物はゲル上に現れなかったので、Ｐ３００発現の結果は開裂の発生を示した。ｈＳＯＤ融合パートナーに対応するバンドは、約３４の相対分子量で現れた。ＮＳ３ドメインのこの部分は生成物を検出するために使用される血清によって認識されないので、対応するＨＣＶプロテアーゼバンドは目視により確認されなかった。しかし、ｈＳＯＤバンドが５１ｋＤａではなく、３４ｋＤａで現れているので、開裂が生じていることがわかる。
【０１６４】
　Ｐ１９０発現産物は、開裂のない全長の（コードされた）生成物としてのみ現れ、約４０ｋＤａのバンドを形成した。これは、開裂していない生成物の理論的分子量に対応する。これは、ＨＣＶプロテアーゼの最小必須配列が、アミノ酸の１９９位と２９９位との間の領域にわたることを示している。
【０１６５】
　（実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ発現プロテアーゼの精製）
　実施例５で発現したＨＣＶプロテアーゼおよびフラグメントは、下記のように精製され得る。
【０１６６】
　ポリペプチドが発現したバクテリア細胞を、浸透圧ショックおよび機械分断にかけ、プロテアーゼを含む不溶性画分を単離し、アルカリ性−ＮａＣｌ溶液により分離抽出し、この抽出物中のポリペプチドを、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）およびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）のカラム上でクロマトグラフィーにかげて精製した。
【０１６７】
　浸透圧ショックおよび機械分断によって得られた粗製の抽出物を、０．０２Ｍ
　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０％　スクロースを含む１０ｍＬの溶液中で１ｇの充填細胞を懸濁し、氷上で１０分間インキュベートして調製する。その後、この細胞を４°Ｇで４，０００×ｇで１５分間遠心し、ペレット化する。上清を除去した後、１０ｍＬの緩衝液Ａ１（０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１４ｍＭ　β−メルカプトエタノール「βＭＥ」）中に、この細胞ペレットを再懸濁し、１０分間氷上でインキュベートする。この細胞を、４°Ｇで４，０００×ｇで１５分間再びペレット化する。透明な上清（ペリプラズム画分１）を除去した後、この細胞ペレットを緩衝液Ａ１中で再懸濁し、１０分間氷上でインキュベートし、再び４°Ｇで４，０００×ｇで１５分間遠心する。透明な上清（ペリプラズム画分ＩＩ）を除去し、この細胞ペレットを５ｍＬの緩衝液Ｔ２（０．０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、ｐＨ７．５、１４ｍＭ　βＭＥ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ）中に再懸濁する。細胞を破壊するために、懸濁液（５ｍＬ）および７．５ｍＬの鉛を含有しない酸性洗浄されたＤｙｎｏ−ｍｉｌｌガラスビーズ（直径０．１０−０．１５ｍｍ）（Ｇｌｅｎ−Ｍｉｌｌｓ，Ｉｎｃ．より入手可能）をＦａｌｃｏｎチューブに入れ、トップスビードで２分間回転させた後、氷上で少なくとも２分間冷却する。この回転冷却工程を、さらに４回繰り返す。回転の後、スラリーを、弱い吸引を用いて、焼結したガラス漏斗を介して濾過し、このガラスビーズを緩衝液Ａ２で２回洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせた。
【０１６８】
　粗製の抽出物の不溶性画分を、４℃で２０，０００×ｇで１５分間遠心して集め、緩衝液Ａ２　１０ｍＬで２回洗浄し、５ｍＬのＭｌＬＬＩ−Ｑ水中に再懸濁する。
【０１６９】
　この懸濁液にＮａＯＨ（２Ｍ）およびＮａＣｌ（２Ｍ）を加えてそれぞれが２０ｍＭとなる最終濃度物を生成し、この混合物を１分間回転し、これを４℃で２０，０００×ｇで２０分間遠心し、上清を維持することにより、ＨＣＶプロテアーゼを含む画分を不溶性物質から単離する。
【０１７０】
　その後、この部分的に精製されたプロテアーゼを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて精製する。このプロテアーゼは、ウエスタンブロット法により同定され得、このバンドはゲルから切り出される。その後、プロテアーゼをこのバンドから溶出し、アミノ酸配列を確認するために分析する。Ｎ末端配列は自動アミノ酸シークエンサーを使用して分析され得、Ｃ末端配列は一連のトリプシン消化フラグメントの自動アミノ酸シークエンシングにより分析され得る。
【０１７１】
　（実施例７：酵母発現ベクターの調製）
　（Ａ）６５０（ＳＯＤ／プロテアーゼ融合物）
　このベクターは、５’末端でＳＯＤコーディング配列と融合した野生型全長ＨＣＶプロテアーゼのコーディング配列を含んでいるＨＣＶ配列を有する。２つのフラグメント（クローン１１ｂ由来の４４１ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントおよび発現ベクターＰ５００由来の１４７１ｂｐ　ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント）を、野生型全長ＨＣＶプロテアーゼコーディング配列を再構築するために使用する。これらの２つのフラグメントは、ｐＳ３５６ベクターをＥｃｏＲＩで消化したベクターに連結して、発現カセットを生成した。この発現カセットは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッド酵母プロモーター、ヒトＳＯＤ、ＨＣＶプロテアーゼ、およびＧＡＰＤＨ転写ターミネーターをコードする。得られたベクターを、ＢａｍＨＩで消化し、４０５２ｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントを、ｐＡＢ２４をＢａｍＨＩで消化したベクターに連結して、ｐ６５０を生成した。ｐ６５０は、１９９０年１０月４日公開のＷＯ９０／１１０８９の図１７に示されるように、アミノ末端から、ｈＳＯＤのアミノ酸１−１５４、オリゴペプチド−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−、およびＨＣＶ−１のアミノ酸８１９から１４５８までを含む、ポリプロテインを発現する。
【０１７２】
　クローン１１ｂを、上記実施例３Ａに記載のように下記の配列：
【０１７３】
【化２８】
2004073212.tif 000030
【０１７４】
を有するハイブリダイゼーションプローブを用いて、ＨＣＶ　ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号第４０３９４号）のゲノムライブラリーから単離した。この工程もまた、ＥＰＯ公報第３１８２１６号、実施例ＩＶ．Ａ．１７に記載されている。
【０１７５】
　ｐＢＲ３２２からの誘導体であるベクターｐＳ３ＥＦは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の遺伝子の上流にＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッド酵母プロモーター、アダプター、および下流に酵母機能性転写ターミネーターを含む。これらのコントロールエレメントおよびスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を含む同様の発現ベクターは、Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９８７）Ｇｅｎｅ　６１：２６５、および１９８６年１０月１日に公開された同時係属中の出願ＥＰＯ１９６，０５６に記載されている。しかし、ｐＳ３ＥＦは、異種プロインシュリン遺伝子およびイムノグロブリンヒンジを欠失しており、ＳＯＤのＧｌｎ154がＥｃｏＲＩ部位を有するアダプター配列に続いている点で、Ｃｏｕｓｅｎｓらのものとは異なっている。このアダプターの配列は：
【０１７６】
【化２９】
2004073212.tif 000031
【０１７７】
である。このＥｃｏＲＩ部位は異種配列の挿入を促進し、一度ｐＳ３ＥＦに挿入されると、ＳＯＤが異種配列に結合しているオリゴペプチドを含むＳＯＤ融合物が発現する。ｐＳ３ＥＦは、ｐＳ３５６が異なるアダプターを有する点を除いてｐＳ３５６と全く同じである。このアダプターの配列を以下に示す：
【０１７８】
【化３０】
2004073212.tif 000032
【０１７９】
ｐＳ３５６（ＡＴＣＣ受託番号第６７６８３号）は、下記に説明されるように寄託される。
【０１８０】
　プラスミドｐＡＢ２４は酵母用シャトルベクターであり、ｐＢＲ３２２配列、酵母のＤＮＡ複製のための完全な２μ配列（Ｂｒｏａｃｈ（１９８１）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐ．４４５，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｐｒｅｓｓに記載）、およびＥＰＯ公報第１１６２０１に記載のプラスミドｐＣ１／１に由来する酵母ＬＥＵ2d遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＡＢ２４を、部分的な２ミクロン配列を除去するようＹＥｐ２４をＥｃｏＲＩで消化し、このベクターに再連結して、構築した。得られたプラスミドであるＹＥｐ２４デルタＲＩを、ＣｌａＩで直鎖化し、ＣｌａＩで直鎖化された完全な２ミクロンプラスミドに連結した。その後、得られたプラスミドであるｐＣＢｏｕをＸｂａＩで消化し、８６０５ｂｐベクターフラグメントをゲル上で単離した。この単離されたＸｂａＩフラグメントを、ｐＣ１／１から単離されたＬＥＵ2d遺伝子を含む４４６０ｂｐ　ＸｂａＩフラグメントと連結した；ＬＥＵ2d遺伝子の配向は、ＵＲＡ３遺伝子と同じである。
【０１８１】
　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ，２１５０−２−３（ｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ２）（受託番号第２０８２７号）は、下記に説明するようにＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。このプラスミドｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ２は、酵母細胞から周知の技術で回収され得る。ＧＡＰ−ｅｎｖ２発現カセットは、ｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ２をＢａｍＨＩで消化して除去され得る。ｐＡＢ２４を、このＢａｍＨＩ挿入物を持たないベクターに再連結して回収する。
【０１８２】
　（実施例８：ＳＯＤ−プロテアーゼ融合タンパク質の酵母発現）
　ｐ６５０をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ株ＪＳＣ３１０，Ｍａｔａ，ｌｅｕ２，ｕｒａ３−５２，ｐｒｂ１−１１２２，ｐｅｐ４−３，ｐｒｃ１−４０７，ｃｉｒ°：ＤＭ１５（ｇ４１８耐性）中に、形質転換した。この形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７５：１９２９によって記載されているように行なった。形質転換された細胞を、８％グルコースのｕｒａ−プレート上で選択した。このプレートを３０℃で４−５日間インキュベートした。この形質転換体を、多数のｐ６５０プラスミドを推定して、さらに８％グルコースのｌｅｕ−プレート上で選択した。ｌｅｕ−プレートからのコロニーを、３％グルコースのｌｅｕ−培地に接種した。この培養物を３０℃で２日間振とうし、その後、２％グルコースのＹＥＰＤ溶媒中に１／２０に希釈し、３０℃でさらに２日間振とうした。
【０１８３】
　Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ　ＪＳＣ３１０は、１９８９年１１月８日公開のＥＰＯ公報第３４０９８６号に記載のＤＭ１５　ＤＮＡを含む。このＤＭ１５　ＤＮＡは、異種タンパク質のＡＤＨ２統制発現を強化する。ｐＤＭ１５（受託番号第４０４５３号）は、下記に説明されるようにＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。
【０１８４】
　（実施例９：成熟ＨＣＶプロテアーゼの酵母ユビキチン発現）
　成熟ＨＣＶプロテアーゼを、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００をＥｃｏＲＩで開裂して２Ｋｂコーディング配列を得、ここに参考として援用されている１９８８年４月７日公開のＷＯ８８／０２４０６または１９８９年８月７日出願のＵＳＳＮ　７／３９０，５９９に記載のように、適切なリンカーを用いて、この配列をユビキチン発現ベクターに挿入することにより、調製する。成熟ＨＣＶプロテアーゼを、適切な宿主、特に酵母中のベクターでの発現により回収する。特に、実施例８に記載の酵母発現プロトコールを、ユビキチン／ＨＣＶプロテアーゼベクターを発現するために使用する。
【０１８５】
　（実施例１０：インビトロ発現ベクターの調製）
　（Ａ）ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚ／黄熱病リーダーベクター
　４つの合成ＤＮＡフラグメントをアニールし、連結して**ＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ黄熱病リーダーをつくり、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）からのＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩ消化したｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚベクターに連結した。この４つのフラグメントの配列を以下に挙げる：
【０１８６】
【化３１】
2004073212.tif 000033
【０１８７】
　ＨＣＶプロテアーゼのインビトロ翻訳のために、新しいｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚ黄熱病リーダーベクターを、ＢａｍＨＩで消化し、クレノウで平滑にした。
【０１８８】
　（Ｂ）ｐ６０００からのＰｖｕＩＩ構築物
　クローンｐ６０００を、ＡＴＣＣ受託番号第４０３９４号であるＨＣＶ　ｃＤＮＡのゲノムライブラリーから入手可能な配列から構築した。ｐ６０００のＤＮＡ配列をコードするＨＣＶは、１９９０年１０月４日公開のＷＯ９０／１１０８９の図１７のヌクレオチド−２７５からヌクレオチド６３７２と同一である。ｐ６０００をＰｖｕＩＩで消化して、この消化物から２，８６４ｂｐフラグメントを単離した。この２，８６４ｂｐフラグメントを、上記のように、調製されたｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚ黄熱病リーダーベクターフラグメントに連結した。
【０１８９】
　（実施例１１：ＨＣＶプロテアーゼのインビトロ発現）
　（Ａ）転写
　ｐＧＥＭ（登録商標）−３Ｚ／黄熱病リーダー／ＰｖｕＩＩベクターを、ＸｂａＩで直鎖化し、ＰｒｏｍｅｇａのＲｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）Ｇｅｍｉｎｉ　ＩＩ　Ｃｏｒｅシステムからの材料およびプロトコールを用いて転写した。
【０１９０】
　（Ｂ）翻訳
　上記のプロトコールにより生成されたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａのウサギ網状赤血球溶解産物、マイナスメチオニン、イヌ膵臓ミクロソーム膜、および他の必要な材料およびＰｒｏｍｅｇａからの指示に基づいて翻訳した。
【０１９１】
　（寄託された生物体：）
　下記の物質を、メリーランド州、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託した：
【０１９２】
【表４】
2004073212.tif 000034
【０１９３】
　上記の生物体は、示された受託番号でＡＴＣＣに寄託されている。これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下で維持される。これらの寄託物は、当業者の利用のために提供され、米国特許法第１１２条で要求されているものではない。寄託された生物体内に維持されるポリヌクレオチド配列、およびこれによりコードされたポリペプチドのアミノ酸配列は、ここに参考のために援用されており、ここに記載されている配列に関するいかなる争議の事態も規制する。この寄託された生物体の製造、使用、または販売には、ライセンスが必要であり、いかなるそのようなライセンスもここでは与えられない。
【０１９４】
　Ｃ型肝炎ウイルスにおいてポリタンパク質をプロセシングするのに必要なプロテアーゼを、同定し、クローニングし、発現させる。特定のポリペプチドの開裂、およびＨＣＶに特異的な抗ウイルス剤のアッセイおよび設計に有用な、プロテアーゼ、切り形プロテアーゼおよび改変プロテアーゼを開示する。
【産業上の利用可能性】
【０１９５】
　本発明の組換えＨＣＶプロテアーゼ、ＨＣＶプロテアーゼ融合タンパク質、切り形および改変されたＨＣＶプロテアーゼ、クローニングおよびそのための発現ベクター、およびＨＣＶ治療に効果的な抗ウイルス剤を同定する方法により、ＨＣＶ感染の効果的な治療に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。
【図２】図２は、クローンＣ２０ｃのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、クローンＣ２６ｄのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、クローンＣ８ｈのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、クローンＣ７ｆのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、クローンＣ３１のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、クローンＣ３５のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、クローンＣ３３ｃのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、クローンＣ３３ｃのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００の組立を略図的に説明している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００の組立を略図的に説明している。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ベクターＣｆ１ＳＯＤｐ６００の配列を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ベクターＣｆ１ＳＯＤｐ６００の配列を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ベクターＣｆ１ＳＯＤｐ６００の配列を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ベクターＣｆ１ＳＯＤｐ６００の配列を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、ベクターＣｆ１ＳＯＤｐ６００の配列を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、ベクターＣｆ１ＳＯＤｐ６００の配列を示す。
【図１Ａ】
2004073212.tif 000045
【図１Ｂ】
2004073212.tif 000046
【図１Ｃ】
2004073212.tif 000047
【図１Ｄ】
2004073212.tif 000048
【図１Ｅ】
2004073212.tif 000049
【図１Ｆ】
2004073212.tif 000050
【図２】
2004073212.tif 000051
【図３】
2004073212.tif 000052
【図４】
2004073212.tif 000053
【図５】
2004073212.tif 000054
【図６】
2004073212.tif 000055
【図７】
2004073212.tif 000056
【図８Ａ】
2004073212.tif 000057
【図８Ｂ】
2004073212.tif 000058
【図９Ａ】
2004073212.tif 000059
【図９Ｂ】
2004073212.tif 000060
【図１０Ａ】
2004073212.tif 000061
【図１０Ｂ】
2004073212.tif 000062
【図１０Ｃ】
2004073212.tif 000063
【図１０Ｄ】
2004073212.tif 000064
【図１０Ｅ】
2004073212.tif 000065
【図１０Ｆ】
2004073212.tif 000066