(57)【要約】【課題】　哺乳動物細胞のレトロウイルス感染を予防または治療する新規な方法、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるヒト細胞の感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む関連疾患を予防する新規な方法を提供すること。【解決手段】　レトロウイルス感染を阻害するための方法であって、該処置を必要とする宿主に、該レトロウイルスによる該宿主の感染をブロックするのに十分な量のセリン白血球プロテアーゼインヒビター、もしくはそれらのアナログまたは誘導体（ＳＬＰＩ）を投与する工程を包含する、方法。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　レトロウイルス感染を処置する医薬の製造のための、ＣＬＰＩ、または１つもしくは数個のアミノ酸の付加、置換、もしくは欠失を有し、かつＳＬＰＩの活性を有する、ＣＬＰＩの変異タンパク質を含む組成物であって、ここで、細胞のレトロウイルス感染が、該ＣＬＰＩまたはＣＬＰＩの変異タンパク質によって阻害される、組成物。
【請求項２】
　レトロウイルス感染を阻害するための組成物であって、該レトロウイルスによる細胞の感染をブロックするのに十分な量のＣＬＰＩ、または１つもしくは数個のアミノ酸の付加、置換、もしくは欠失を有し、かつＳＬＰＩの活性を有する、ＣＬＰＩの変異タンパク質を含む、組成物。
【請求項３】
　前記レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
　前記ＣＬＰＩの変異タンパク質が、ＣＬＰＩのＰｈｅ　２５変異タンパク質、ＣＬＰＩのＧｌｙ　２５変異タンパク質、およびＣＬＰＩのＶａｌ　２５変異タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、レトロウイルス感染症の治療、さらに特定すれば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症および関連疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
　レトロウイルス因子は、癌、自己免疫疾患およびＡＩＤＳを含む多くの疾患に関連している。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ＣＤ４＋細胞）の慢性の進行性欠乏およびマクロファージの感染症を引き起こし、後天性の免疫不全症候群となる。現在では、チミジンのアナログであるジドブジン（ＡＺＴ）は、ＨＩＶ感染症の治療に用いられた最初の抗ウイルス薬剤であるが、類似の作用機構を有する他の２つの薬剤であるジデオキシイノシン（ｄｄＩ）およびジデオキシシトシン（ｄｄＣ）もまた用いられる。Ｃｏｌｌｅｙ，　Ｔ．　Ｐ．ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　（１９９０）　３２２：１３４０−４５；Ｆｉｓｃｈｌ，　Ｍ．　Ａ．ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　（１９８７）　３１７：１８５−９１。これらの薬剤は、ウイルスの複製を阻害するのに効果的であり、そしてＣＤ４＋細胞濃度を安定化し得るが、これらは、主なウイルスの貯蔵器官の１つであるＨＩＶに感染したマクロファージを排除し得ない。Ｇａｒｔｎｅｒ，　Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９８６）　２３３：２１５−１９。特にＨＩＶ宿主骨髄に伴う激しい毒性もまた、ＡＺＴ治療のより多い投与量に関連しており、そしてＡＩＤＳ患者におけるこの薬剤の有益な効果は、長引く治療により減少される；ＡＺＴに耐性であるＨＩＶ株もまた、治療を受けた患者で観察された。これらの発見は、ＨＩＶ感染症の治療のための代替薬剤、特に異なる機構で作用する薬剤の探求を促進した。
【０００３】
　ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）であるレトロウイルスは、ＡＩＤＳの病因学的原因である。ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０は、Ｔリンパ球上、ならびに単球およびマクロファージ上のＣＤ４レセプターに特異的に結合する。Ｔリンパ球の感染には、細胞増殖およびＤＮＡ合成が必要であるが、単球の増殖的感染が、細胞のＤＮＡ合成とは無関係に生じ得る（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，　Ｊ．　Ｂ．ら、（１９９１）Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．　１７４：１４７７−８２）。ＨＩＶ−１感染がＣＥ４＋リンパ球を活性化する場合、それは致死的であるが、感染した単球は、ウイルスによる破壊に比較的抵抗する。従って、これらの細胞は、一旦ＨＩＶ−１に感染すると、このウイルスのための長期生存貯蔵器官としてふるまう。これらの細胞は、ウイルスを複製する源であるだけでなく、これら細胞のウイルスに介在される機能不全が、ＡＩＤＳの特徴である日和見感染へのかかり易さの増加に貢献する。
【０００４】
　単球−マクロファージが、ＨＩＶ−１の貯蔵器官としてふるまうので、Ｔリンパ球に加えて、この個体群を選択的に標的とすることは、さらなる研究を正当化する（Ｆｉｎｂｅｒｇ，　Ｒ．　Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１７０３−０５，　１９９１。Ｆｏｘのグループからの初期の報告（ＪＡＤＡ　１１８：７０９−７１１，　１９８９）は、ヒト唾液成分がＨＩＶ複製をブロックすると指摘した。さらに最近、Ｈａｔｔｏｒｉ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　２４８：４８−５２，　１９８９）は、トリプターゼ（トリプシン様の酵素）のインヒビターが、ＨＩＶにより誘発されるＴ−細胞の合胞体形成を阻害し得ることを示した。
【０００５】
　ＨＩＶ−１感染の種々の強力なモジュレーターの調査において、本発明者らは、最近、ＨＩＶ−１感染および／または複製を遅滞させる阻害活性の内因性の源を同定した。
【０００６】
　抗ウイルス活性に応答し得るこの因子は、セリン白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）である。ＳＬＰＩは、ヒト白血球エラスターゼおよびカテプシンＧ、ならびにヒトトリプシンの強力なインヒビターであり、そして耳下腺分泌物から精製された（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｒ．　Ｃ．およびＫ．　Ｏｈｌｓｓｏｎ，　（１９８６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８３：６６９２−９６；および米国特許第４，７６０，１３０号、これらはいずれも本明細書中に参考として援用されている）。現在では、ＳＬＰＩは、組換えＤＮＡ技術により作成されて入手可能である；１９９１年６月７日出願の米国特許出願第０７／７１２，３５４号、１９８５年１２月４日出願のＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０３５１９号、および１９８５年１２月４日出願の欧州特許出願第８５　９０５　９５３．７号、これらはそれぞれ本明細書中に参考として援用されている）。
【０００７】
　ＨＩＶ−１感染および／または複製をブロックするＳＬＰＩおよび／またはその誘導体およびアナログの能力は、ＨＩＶ−１感染における治療的介入の基礎を提供し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
　本発明の目的は、哺乳動物細胞のレトロウイルス感染を予防または治療する新規な方法、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるヒト細胞の感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む関連疾患を予防する新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
　本発明の範囲に含まれるのは、レトロウイルス感染症（特にヒトのＨＩＶ感染症）を治療するためのセリン白血球プロテアーゼインヒビター（ＳＬＰＩ）、あるいはそれのアナログまたは誘導体、および薬学的に受容可能な担体を含む薬学的な組成物である。
【００１０】
　本発明は、ＳＬＰＩあるいはそのアナログまたは誘導体の効果的な量をヒト細胞に投与することを包含する、ヒト細胞のＨＩＶ感染の治療方法もまた包含する。　本発明は、レトロウイルス感染を阻害するための方法であって、この処置を必要とする宿主に、このレトロウイルスによるこの宿主の感染をブロックするのに十分な量のセリン白血球プロテアーゼインヒビター、もしくはそれらのアナログまたは誘導体（ＳＬＰＩ）を投与する工程を包含する、方法である。
【００１１】
　好適な実施形態においては、上記レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、方法である。
【００１２】
　好適な実施形態においては、上記ＳＬＰＩのアナログまたは誘導体が、ＳＬＰＩのＰｈｅ　７２変異タンパク質、ＳＬＰＩのＧｌｙ　２０変異タンパク質、ＳＬＰＩのＧｌｙ　７２変異タンパク質、ＳＬＰＩのＶａｌ　７２変異タンパク質、ＣＬＰＩのＰｈｅ　２５変異タンパク質、ＣＬＰＩのＧｌｙ　２５変異タンパク質、およびＣＬＰＩのＶａｌ　２５変異タンパク質からなる群から選択される、方法である。
【００１３】
　本発明は、レトロウイルス感染に必要な宿主細胞の酵素機能をブロックすることを包含する、細胞のレトロウイルス感染を阻害する方法であって、この宿主細胞が、単球または単球の前駆体である、方法である。
【００１４】
　好適な実施形態においては、上記宿主細胞が単球である、方法である。
【００１５】
　好適な実施形態においては、上記宿主細胞が前単球である、方法である。
【００１６】
　本発明は、キモトリプシンおよびエラスターゼを阻害するが、トリプシンを阻害しない、単離されたセリンプロテアーゼインヒビターである。
【００１７】
　好適な実施形態においては、以下のアミノ酸配列：
【００１８】
【化１】
2004002455.tif 000002
を有する、請求項７に記載の単離されたプロテアーゼインヒビターである。
【００１９】
　好適な実施形態においては、以下のアミノ酸配列：
【００２０】
【化２】
2004002455.tif 000003
ここで、Ｒ７がアラニン、そして
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８が、同じまたは異なるアミノ酸であって、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシンおよびアルギニンからなる群から選択される：
を有する、単離されたプロテアーゼインヒビターである。
【００２１】
　好適な実施形態においては、Ｒ８が、フェニルアラニン、グリシン、およびバリンからなる群から選択される、単離されたプロテアーゼインヒビターである。
【００２２】
　好適な実施形態においては、上記のセリンプロテアーゼインヒビターをコードする、単離された核酸である。
【００２３】
　好適な実施形態においては、以下のアミノ酸配列：
【００２４】
【化３】
2004002455.tif 000004
を有するセリンプロテアーゼインヒビターをコードする、上記の単離された核酸である。
【００２５】
　好適な実施形態においては、以下のアミノ酸配列：
【００２６】
【化４】
2004002455.tif 000005
ここで、Ｒ７がアラニン、そして
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８が、同じまたは異なるアミノ酸であって、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシンおよびアルギニンからなる群から選択される：
を有するセリンプロテアーゼインヒビターをコードする、上記の単離された核酸である。
【００２７】
　好適な実施形態においては、以下のヌクレオチド配列：
【００２８】
【化５】
2004002455.tif 000006
を有する、上記の単離された核酸。
【００２９】
　本発明は、少なくとも１つのセリンプロテアーゼ阻害活性を有する活性部位を有するセリンプロテアーゼインヒビターを組換え生産する方法であって、以下の工程：
　（ａ）宿主生物に以下のアミノ酸配列：
【００３０】
【化６】
2004002455.tif 000007
ここで、
　Ｒ７がアラニン、そして
　Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８、およびＲ９が、同じまたは異なり、そして、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシンおよびアルギニンからなる群から選択される：
を含むタンパク質を産生することを導き得る核酸を調製する工程；
　（ｂ）この核酸を、作動可能にする構成要素を含むベクターであって、宿主微生物に転移し、そして宿主微生物中で複製し得るベクター中にこの核酸をクローニングする工程；
　　（ｃ）この核酸および作動可能にする構成要素を含むこのベクターを、このセリンプロテアーゼインヒビターを発現し得る宿主微生物中へ　転移させる工程；
　（ｄ）この宿主微生物を、このベクターの増幅およびこのインヒビターの発現に好適な条件下で培養する工程；
　（ｅ）このインヒビターを回集する工程；および
　（ｆ）このインヒビターに、セリンプロテアーゼインヒビター活性を有する活性三次構造をとらせる工程；
を包含する、方法である。
【発明の効果】
【００３１】
　本発明によれば、哺乳動物細胞のレトロウイルス感染を予防または治療する新規な方法、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるヒト細胞の感染および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む関連疾患を予防する新規な方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
　本発明は、レトロウイルスの予防方法、特に哺乳動物細胞（特にヒト細胞）のＨＩＶ感染、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む関連疾患の予防方法に関する。
【００３３】
　本明細書で用いた用語「薬学的に受容可能な担体」とは、非毒性であり、活性成分に対して一般的に不活性な賦形剤であり、この賦形剤は、成分および処方物を投与される患者に対し不利な作用を及ぼさない。
【００３４】
　本明細書で用いた用語「効果的な量」とは、ＳＬＰＩまたはアナログまたはそれらの誘導体のインビボでＨＩＶに効果を及ぼすのに十分な、前もって測定された量のことである。
【００３５】
　本発明によれば、レトロウイルス感染症は、このような感染の影響を減少するのに十分な投与量で抗レトロウイルス薬剤を投与することにより治療される。レトロウイルス感染症は、癌、自己免疫疾患、および後天性免疫不全症候群を含むがこれらに限定されない多くの疾患と深いつながりがある。ヒト免疫不全ウイルス感染は、本発明の特に関心の対象である。
【００３６】
　種々の抗レトロウイルス薬剤が、本分野では公知である。これらの大部分は、レトロウイルスの逆転写酵素の活性を阻害し、そしてこれらには、チミジンのアナログであるジドブジン（ＡＺＴ）、ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、およびジデオキシシトシン（ｄｄＣ）を包含する。ジドブジンは、ＨＩＶ感染症の治療に使用された最初の抗ウイルス薬剤である。抗ウイルス薬剤は、一般的に約５０ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の範囲の投与量が効果的であり、さらに特定すると約１００ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、そしてジドブジンの場合は、特に約３００ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日である。これらの薬剤は、一般的には経口処方物として投与される。
【００３７】
　本発明で用いられるプロテアーゼインヒビターは、当業者に周知の方法により調製され得る（例えば、米国特許第４，７６０，１３０号；欧州特許出願第８５　９０５　９５３．７号、ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０３５１９号、および米国特許出願第０７／７１２，３５４号、前出を参照のこと）。
【００３８】
　本発明は、純粋な形態で単離されたプロテアーゼインヒビターに関する。好ましくは、本発明のセリンプロテアーゼインヒビターは、単一ポリペプチド鎖のタンパク質であり、これは、ヒト耳下腺分泌物から単離した天然のセリンプロテアーゼインヒビターと実施上相同であり、そして最も好ましくは、生物学的に等価である。天然のセリンプロテアーゼインヒビターはまた、天然の耳下腺インヒビターとも呼ばれる。本明細書および請求の範囲の全体で用いた「生物学的に等価」は、ＳＬＰＩにより阻害される単球由来プロテアーゼを阻害する能力を有するが、同じ程度である必要はない組成物を意味する。以下の明細書および請求の範囲全体で用いた「誘導体」は、天然の耳下腺インヒビターに対するアミノ酸の相同性の程度を意味し、好ましくは４０％より高く、最も好ましくは５０％より高く、特に好ましいタンパク質の基と天然の耳下腺インヒビターとの相同性は、６０％より高い。上記の相同性の比率は、２つの配列のうちの小さい方で見いだされ、２つの配列のうちの大きい方でも見いだされる成分のパーセントとして計算される。この成分は４つの連続したアミノ酸の配列として解釈される。
【００３９】
　１つの有用なＳＬＰＩ誘導体は、ＣＬＰＩ、つまり天然の耳下腺インヒビターの最後の６０アミノ酸のみを有する欠損ＳＬＰＩ分子である。これらの６０アミノ酸は以下の通り：
【００４０】
【化７】
2004002455.tif 000008
　以下のヌクレオチド配列は、上記の６０アミノ酸分子をコードするために用いられた：
【００４１】
【化８】
2004002455.tif 000009
　ＣＬＰＩは、米国特許出願第０７／７１２，３５４号に記載のように、ＳＬＰＩ遺伝子から、シグナル配列および成熟ＳＬＰＩタンパク質の最初の４７アミノ酸に対応するヌクレオチドを、欠失させることにより構築した。ＣＬＰＩはまた、ＰＣＴ出願第ＷＯ８６／０３５１９号および欧州特許出願第８５　９０５　９５３．７号の両方に記載の実施例８の方法により作成され得る。これらの２つの出願の実施例８は、ＳＬＰＩの作成方法を提唱しているが、この方法もまたＣＬＰＩを作成するのに用い得る。ＣＬＰＩは、ＳＬＰＩを精製するのに有用な抗体を産生するのに用いられ得る。例えば、抗体は、Ｅ．　ＨａｒｌｏｗおよびＤ．　Ｌａｎｅ著、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、９２−１１４頁（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　１９８８）において検討された方法により産生され得る。
【００４２】
　本明細書で用いた「アナログ」は、ＨＩＶ感染の阻害において、ＳＬＰＩと機能的に生物学的に等価なあらゆる化合物（例えば、小さな有機化合物を含む）を意味する。このような誘導体およびアナログは、ＳＬＰＩが単球に結合するのを予防する化合物をスクリーニングするために単球を用いることを包含する、当業者に周知の方法により単離され得る。アナログもまた、天然のタンパク質と少なくとも等価な活性、およびある場合にはそれよりも高い活性を有する特定のＳＬＰＩ変異タンパク質を含む。特に有用なＳＬＰＩ変異タンパク質は、列挙した残基の位置で以下のアミノ酸の置換を含む：Ｇｌｙ　２０、Ｇｌｙ　７２、Ｖａｌ　７２、およびＰｈｅ　７２。
【００４３】
　ＣＬＰＩ変異タンパク質もまた、本発明の範囲内にある。ＳＬＰＩ変異タンパク質のＧｌｙ　７２、Ｖａｌ　７２、およびＰｈｅ　７２に対応するＣＬＰＩ変異タンパク質は、本明細書中でそれぞれＧｌｙ　２５、Ｖａｌ　２５、およびＰｈｅ　２５と呼ばれる。いくつかの企図されたＣＬＰＩ変異タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する：
【００４４】
【化９】
2004002455.tif 000010
ここで、Ｒ７がアラニン、そしてＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８が、同じまたは異なるアミノ酸であり、そして、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ８のうち１つ以上が、メチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシンまたはアルギニンである。アナログとしては、例えば天然のＳＬＰＩタンパク質より改善された薬学的特徴を有するＳＬＰＩまたはＣＬＰＩのＰＥＧ化形態を包含する。ＰＥＧ化に好適な変異タンパク質は、ＳＬＰＩの１３、２３、５２、５８、６８、および／または７５位、およびＣＬＰＩの対応する５、１１、２１、および２８位にシステイン残基を有する変異タンパク質を包含する。ＰＥＧ化するためのシステイン変異タンパク質の調製は、１９９２年３月１３日出願のＰＣＴ出願第ＷＯ９２／１６２２１号に記載されており、それは本明細書中に参考として明確に援用されている。変異タンパク質を作成する有用な工程は、タンパク質を含有する溶液にシステインを添加する再生工程を含み得る。上記システインは、再生を促進し得、そして変異タンパク質中で置換された遊離システインと結合し得る。当業者に周知の標準的な生化学的技術を用いて、単球から、ＳＬＰＩに阻害され得るタンパク質（ＳＩＰ）もまたヒト単球細胞から単離し得、そしてＳＬＰＩにより阻害されるタンパク質加水分解活性を有するタンパク質を精製し得る。このタンパク質の精製（そして必要であればその配列を決定し、その遺伝子をクローニングし、そして宿主細胞中で発現、すなわちＳＩＰを組換え技術で作成）後、当業者に周知の方法によりＳＩＰのインヒビターをスクリーニングし得る。あるいは、当業者に周知の方法により、その構造を決定し得、そしてそこからインヒビターもまた設計し得る。
【００４５】
　ＳＬＰＩ、あるいはそのアナログまたは誘導体（以下、本化合物）が、ＨＩＶ感染症に抵抗するためにヒトに用いられる場合、本化合物は１つ以上の薬学的に受容可能な担体を含有する賦形剤中で、経口投与または非経口投与され得、その比率は、本化合物の可溶性および化学的性質、選択した投与経路および標準的な生物学的経験により決定される。経口投与のためには、ＳＬＰＩ、あるいはそのアナログまたは誘導体は、薬学的に受容可能な担体中、患者１人につき１日あたり約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは患者１人につき１日あたり約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、さらに好ましくは患者１人につき１日あたり約２０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲において前もって測定された量の活性成分をそれぞれ含有するカプセル、または錠剤などの単位投与量形態で処方され得る。
【００４６】
　非経口投与のためには、ＳＬＰＩ、あるいはそのアナログまたは誘導体は、薬学的に受容可能な賦形剤または担体との組成物中で、静脈内注射、皮下注射、または筋内注射により投与される。注射による投与のためには、滅菌水性媒体中での溶液状態の化合物を用いるのが好ましく、この媒体には、バッファーまたは保存薬などの他の溶質、および溶液を等張にする薬学的に受容可能な十分量の塩またはグルコースが含有され得る。皮下注射は、好ましい投与経路である。これらの場合の投与量は、経口投与に関して上述した投与量と実質的に同様である。
　上記の処方物に好適な賦形剤または担体は、一般的な薬学上のテキスト中（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｅａｓｔｏｎ，　ＰＡ，　１９８０年刊）に見出され得、そしてこれは本明細書中に参考として援用されている。
【００４７】
　本化合物の投与量は、投与形態および特定の選択した活性薬剤により変化する。さらに、それは治療を受ける特定の患者または宿主（ヒトを含む哺乳動物を含む）により変化する。一般的に、治療は、本化合物の最適投与量より実質上少ない投与量で開始される。その後、投与量は、到達した状況下で最適効果になるまで少しずつ増加される。概して、本化合物は、いかなる危険または有害な副作用も引き起こすことのない抗ウイルス性の効果的な結果を一般的にもたらす濃度レベルで投与されるのが最も望ましい。宿主細胞のレトロウイルス感染を阻害するのに十分なレベルの本化合物の血中レベルを維持するのが望ましい。これは、宿主細胞のレトロウイルス感染（例えば、単球へのＨＩＶ感染）を予防するのに効果的である化合物量をインビトロにおいてアッセイし、次いで、標準的な薬動学技術を用いて、同じ阻害性のレベルまたは１０〜１００倍以上までのレベルに血漿中のレベルを保つのに必要である化合物量を測定することにより概算され得る。
【００４８】
　上記の処方物は、ＨＩＶ感染症を治療するために効果的であり比較的安全な薬物であるが、これらの処方物を他の抗ウイルス性薬物または薬剤と同時に投与して有益な結果が得られる可能性は、排除されない。このような他の抗ウイルス性薬物または薬剤には、可溶性ＣＤ４、ジドブジン、ジデオキシシチジン、ホスホノホルマート、リババリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）、抗ウイルス性インターフェロン（例えば、アルファ−インターフェロンまたはインターロイキン−２）、またはエアロゾルペンタミジンが含まれる。
【００４９】
　本発明は、以下の実施例により例示される。
【実施例１】
【００５０】
　実施例１．　末梢血単球（ＰＢＭ）を、健康な提供者から水簸により単離し、培養プレートに蒔き、そして数日間インキュベートした。ＳＬＰＩをＨＩＶ（Ｂａｌ）と混合し、そして３７℃で１時間ＰＢＭに加えた。細胞を洗浄し、そして培地を交換してさらに培養し、３日毎に上清の逆転写酵素の測定を行った。本発明者らは、１μｇ／ｍｌの濃度で、ＳＬＰＩが効果的にＨＩＶ複製をブロックすることを見出した（図１）。≦２０μｇ／ｍｌの濃度では、ＳＬＰＩ阻害が減少する。阻害性効果が長く続き、１８日間かなりの阻害が観察される（図２）。
【実施例２】
【００５１】
　実施例２．　ＰＢＭを、実施例１と同様にプレートに蒔いてインキュベートした。ＳＬＰＩを約１時間細胞に加えて、次いで細胞を洗浄し、そしてＨＩＶで処理した。培地を交換して、実施例１のようにアッセイした。本発明者らは、細胞をＳＬＰＩで前処理した場合は、細胞をＳＬＰＩおよびＨＩＶの混合物で処理した場合より、ＨＩＶのブロッキングにおいてＳＬＰＩがより効果的であることを発見した。
【実施例３】
【００５２】
　実施例３．　本発明者らはまた、単球をＴ−細胞に替えてはいるが本質的に実施例１と同じプロトコールを用いて、Ｔ−細胞中でＳＬＰＩがＨＩＶ複製の阻害に効果的であることを証明した。
【実施例４】
【００５３】
　実施例４．　ヒトＴ−リンパ球性細胞株（Ｈ−９）を、１０％　ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１リットルあたり２００マイクログラムのゲンタマイシンの入ったＲＰＭＩ　１６４０中での懸濁培養で維持した。ＳＬＰＩを、１ミリリットルあたり１００マイクログラムの最終濃度で、培養培地に添加した。２４時間後、細胞を洗浄し、ＨＩＶ株ＩＩＩＢで４時間接種し、再度洗浄し、そして１ミリリットルあたり細胞５００，０００個の密度で再懸濁した。再懸濁直後（Ｔ＝０）または再懸濁の２日後（Ｔ＝２）に、培地が供給され、そして１ミリリットルあたり１００マイクログラムの最終濃度でＳＬＰＩを維持した。２日毎に培養上清を集めて、そして培養物には培地を補給した。感染後８日目に集めた上清を、ポリ（ｒＡ）−オリゴ（ｄＴ）テンプレートへのトリチウム化チミジンの取り込みを測定することにより、逆転写酵素活性についてアッセイした。
【００５４】
　表１に示すように、ＳＬＰＩで前処理した細胞では、ＳＬＰＩを感染直後または感染後２日目に添加すると、ウイルスの複製をそれぞれ約６２％および約５４％阻害した。
【００５５】
【表１】
2004002455.tif 000011
【実施例５】
【００５６】
　実施例５．　１０００倍に濃縮したＨＩＶ株ＩＩＩＢを、接種前に氷上で６時間、１ミリリットルあたり１００マイクログラムのＳＬＰＩとインキュベートした以外は、実施例４に記載したように実験を行った。このＨＩＶ／ＳＬＰＩ混合物を、接種の４時間前に１０００倍に希釈した。
【００５７】
　表２に示したように、ＳＬＰＩで前処理したウイルスおよび細胞を用いて、ＳＬＰＩを感染直後および感染後２日目に添加すると、ウイルスの複製をそれぞれ約６４％および約２６％阻害した。
【００５８】
【表２】
2004002455.tif 000012
【実施例６】
【００５９】
　実施例６．　細胞が純粋であった、すなわち接種前にＳＬＰＩと培養しなかった以外は、実施例５にあるように実験を行った。純粋な細胞およびＳＬＰＩで前処理したウイルスを用いて、ＳＬＰＩを感染直後および感染後２日目に添加すると、ウイルスの複製をそれぞれ約５９％および約３２％阻害した（表３）。
【００６０】
【表３】
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【実施例７】
【００６１】
　実施例７．　細胞もウイルスも接種前にＳＬＰＩにさらさなかった以外は、実施例４−６にあるように実験を行った。純粋な細胞および純粋なウイルスを用いて、ＳＬＰＩを感染直後および感染後２日目に添加すると、ウイルスの複製をそれぞれ約５０％および約４２％阻害した（表４）。表５は、感染後４日目、６日目、および８日目にアッセイした培養上清中に存在する逆転写酵素活性を示す。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５】
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【実施例８】
【００６４】
　実施例８．　ウイルス複製に及ぼす種々のＳＬＰＩ変異タンパク質の効果もまた研究した。純粋なＨ−９細胞を、実施例７にあるように純粋なウイルスと４時間インキュベートした。洗浄後、細胞を１ミリリットルあたり細胞５００，０００個の密度で、１ミリリットルあたり３０マイクログラムのＳＬＰＩまたは表６に示したＳＬＰＩ変異タンパク質を含む培地に再懸濁した。培養上清を、逆転写酵素活性について８日後にアッセイした（表６）。
【００６５】
【表６】
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【実施例９】
【００６６】
　実施例９．　接種後に、細胞を１ミリリットルあたり１００マイクログラムのＳＬＰＩまたはＰｈｅ　７２変異タンパク質を含む培地に再懸濁した以外は、実施例８にあるように実験を行った。培養上清を、逆転写酵素活性について、感染後２日目、４日目、６日目、８日目および１０日目にアッセイした（表７）。表６および７は、Ｐｈｅ−７２変異タンパク質の効果が、特に顕著であったことを示す。
【００６７】
【表７】
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【実施例１０】
【００６８】
　実施例１０．　ＳＬＰＩ単独の影響を測定するために、１ミリリットルあたり１００マイクログラムのＳＬＰＩと培養したまたはＳＬＰＩと培養しなかった２００，０００個のＨ−９細胞を用いて、Ｈ−９細胞増殖を評価した。培養物に２．５マイクロキュリーのトリチウム化チミジンを含む培地を、０日目、１日目、および２日目に加えた；取り込み総数を、１日目、２日目、および３日目に測定した。表８に示すように、ＳＬＰＩはこれらの細胞にとって毒性ではない。
【００６９】
【表８】
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【実施例１１】
【００７０】
　実施例１１．　本発明者らは、前単球細胞株Ｕ１を用いて、慢性的に感染した細胞からのウイルス産生の阻害もまた研究した。Ｕ１の懸濁培養物を、１０％　ＦＣＳおよび１リットルあたり２００マイクログラムのゲンタマイシンの入ったＲＰＭＩ中に維持した。細胞を集め、洗浄し、そして１ミリリットルあたり細胞２５０万個の密度で懸濁した。懸濁した細胞を、１ミリリットルあたり１００または２００マイクログラムのＳＬＰＩを含む培地中または培地だけの中で終夜培養した。１３−ホルボール−１２−ミリステートアセテート（ＰＭＡ）を１マイクロモラーの最終濃度での添加により、ウイルスが誘発された。４８時間後、細胞培養上清を逆転写酵素活性について、実施例４−９にあるようにアッセイした。表９に示すように、ＳＬＰＩは、これらの慢性的に感染した細胞からのウイルス産生を著しく阻害した。
【００７１】
【表９】
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　本発明についての以上の記載は、例示および説明の目的のための典型である。種々の改変は、本発明の主旨および範囲から逸脱せずに成し得ることは、理解されるべきである。従って、ここに記載の請求の範囲は、このような全ての改変を含んで解釈されるように意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ＳＬＰＩが投与量に依存して単球中のＨＩＶ複製をブロックすることを示す。水簸したヒト単球をプレートに蒔き、３７℃で１時間ＨＩＶ±ＳＬＰＩにさらし、洗浄し、そして４日毎に上清を除去して新しい培地を添加しながら３７℃で培養した。この実験でのＥＣ５０は、＜０．１μｇ／ｍｌ（８．５ｎＭ）であった。このときの完全阻害は、１０μｇ／ｍｌ（８５０ｎＭ）である。
【図２】図２は、ＳＬＰＩ阻害効果が長持ちすることを示す。１８日目においても、ＨＩＶはいまだ９０％阻害される。
【図１】
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【図２】
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