(57)【要約】【課題】本発明は、物質およびレチノイドＸレセプターを含む溶液を合わせる工程、およびホモダイマー形成の存在を測定する工程を包含する、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成に影響を及ぼす能力について物質をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成に影響を及ぼす能力について物質をスクリーニングする方法であって、該物質とレチノイドＸレセプターを含む溶液とを合わせる工程、およびホモダイマー形成の存在を測定する工程であって、ここで該ホモダイマー形成の存在が該レチノイドＸレセプターホモダイマーによる転写の活性化を検出することにより測定される、工程を包含する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製レチノイドＸレセプターホモダイマー。 
【請求項２】
レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成に影響を及ぼす能力について物質をスクリーニングする方法であって、該物質とレチノイドＸレセプターを含む溶液とを合わせる工程、およびホモダイマー形成の存在を測定する工程であって、ここで該ホモダイマー形成の存在が該レチノイドＸレセプターホモダイマーによる転写の活性化を検出することにより測定される、工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にレチノイドレセプターによる遺伝子発現の調節に関し、そしてより特定すれば、レチノイドＸレセプター、ならびに、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、ビタミンＤレセプターおよび甲状腺レセプターによる遺伝子発現の調節において有用である、新規の架橋二環式芳香族化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＡ代謝生成物全−トランス−レチノイン酸（ＲＡ）およびその天然および合成誘導体（レチノイド）は、広範囲の生物学的効果を奏する１，２。臨床的に、レチノイドは皮膚病および癌の治療において重要な治療薬である３−６。多数のレチノイドの作用が分子レベルでどのように仲介され得るかの理解は、特定の核レセプター、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）７−１２およびレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）１３−１７のクローニングおよび特徴付けによって顕著に高められた。ＲＡＲおよびＲＸＲはステロイド／甲状腺ホルモンレセプタースーパーファミリーの一部である１８，１９。両方のタイプのレセプターは、３つの異なった遺伝子（α、β、およびγ）によってコード化され、それから、ＲＡＲの場合多重イソ型が生成され得る２０−２２。興味深いことに、ＲＡＲは脊椎動物では特異的であるが、その一方ＲＸＲはショウジョウバエからヒトまでよく保存されている１７，２３。近年レチノイドレセプター作用の分子機構の理解がかなり進んでいるにもかかわらず、天然に存在しているレチノイドについて異なる分子経路が存在するかどうかという中心的な問題については、いまだ答えが出ていない。ＲＡの立体異性体９−シス−ＲＡがＲＸＲに高親和性で結合するという最近の観察２３，２４は、全−トランス−ＲＡの経路とは異なるレチノイド応答経路を示唆した。しかしながら、ＲＡＲが効果的にＤＮＡ結合および機能するために補助レセプターとの相互作用を必要とし、しかもＲＸＲがそのような補助レセプターであるということが、いくつかの研究室によってほぼ同時に発見された１５，１６，２６−２９。従って、ＲＡＲは、ヘテロダイマー性ＲＡＲ／ＲＸＲ複合体として、またはさらに同定される必要のある相当する補助タンパク質との組合せでのみ効果的に機能するようである。同様に、ＲＸＲは、効果的なＤＮＡ結合のために、ＲＡＲ、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）、またはビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ）を必要とすることが示された１５，１６，２６−２９。従って、これらのＤＮＡ結合研究から、ＲＸＲは、専ら補助レセプターとしてでなくても優先的に機能し得ることが明らかとなり、それによって、転写調節の高度な多様性および特異性を発生させ、ならびにリガンド活性化レセプターの少なくとも３つの異なるクラスに対するＤＮＡ親和性および特異性を増加することにより異なるホルモンの非常に多面的な効果を仲介することにおいて重要な役割を行う。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの知見とは反対に、本発明は、ＲＸＲがホモダイマーを形成することを提供する。本発明は、これらホモダイマーが補助レセプターの非存在下で特異的な応答エレメントに効果的に結合し、そしてそれらのＤＮＡ結合特異性がヘテロダイマーを含有するＲＸＲのＤＮＡ結合特異性と異なることを提供する。本発明は、レチノイドの作用について新規の機構を説明し、それによって、リガンド誘導ホモダイマーが異なったレチノイド経路を仲介する。さらに、ＲＸＲホモダイマー形成を選択的に活性化するリガンドが提供される。
【０００４】
本発明はまた、本明細書で詳細に記載されるように、架橋二環式芳香族化合物の形態の新規なクラスのレチノイドを提供する。これら新規化合物は、レチノイン酸ファミリー中のレセプター（例えば、ＲＡＲ、ＲＸＲ、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモンレセプター（ＴＨＲ））による選択的遺伝子発現の調節および／または誘発のために効果的である。理論によって束縛されることは意図しないが、本明細書で開示され、そして請求項に記載の化合物は、前述のレセプターに結合するレセプタータンパク質と相互作用するそれらの能力のために調節遺伝子発現に有効である。前記化合物はまた、ＲＡＲ−ＲＸＲ、ＶＤＲ−ＲＸＲ、およびＴＨＲ−ＲＸＲヘテロダイマーに加えて、ＲＸＲホモダイマーの形成を誘導することにより、調節遺伝子発現において有用である。
【０００５】
新規化合物は、従って、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、および９−シス−レチノイン酸のようなレチノイド（ＲＸＲに対する天然リガンド）により調節される細胞プロセスを制御するために有用である。それ故、座瘡、白血病、乾癬、および皮膚老化（すべてはレチノイン酸により調節される）は、骨石灰化作用（ビタミンＤによって調節され得る）およびエネルギーレベル（甲状腺ホルモンによって調節され得る）と同様に、本発明の化合物を用いて治療され得る。先行技術の合成レチノイドとは異なって、本発明化合物は、実質的に減少した副作用および奇形遺伝性を提供すると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成に影響を及ぼす能力について物質をスクリーニングする方法であって、上記物質およびレチノイドＸレセプターを含む溶液を合わせる工程、およびホモダイマー形成の存在を測定する工程を包含する、方法を提供する。
【０００７】
２．好ましい実施形態において、上記ホモダイマー形成の存在が、上記レチノイドＸレセプターホモダイマーによる転写の活性化を検出することにより測定される、上記項１に記載の方法を提供する。
【０００８】
３．好ましい実施形態において、上記ホモダイマー形成の存在が、共沈澱により測定される、上記項１に記載の方法を提供する。
【０００９】
４．好ましい実施形態において、上記影響がホモダイマー形成の誘導である、上記項１に記載の方法を提供する。
【００１０】
５．好ましい実施形態において、上記影響がホモダイマー形成の阻害である、上記項１に記載の方法を提供する。
【００１１】
６．好ましい実施形態において、上記レチノイドＸレセプターがレチノイドＸレセプターαである、上記項１に記載の方法を提供する。
【００１２】
７．好ましい実施形態において、上記物質がレチノイドＸレセプターヘテロダイマーを誘導するかどうかを測定する工程、およびレチノイドＸレセプターホモダイマーの形成を選択的に誘導する上記物質を選択する工程をさらに包含する、上記項４に記載の方法を提供する。
【００１３】
８．一つの局面において、本願発明は、以下の工程を包含する、レチノイドＸレセプターホモダイマーよりもレチノイドＸレセプターヘテロダイマーの形成を選択的に誘導する能力について物質をスクリーニングする方法を提供する：
ａ）上記物質がレチノイドＸレセプターホモダイマー形成を誘導するかどうかを測定する工程；
ｂ）上記物質がレチノイドＸレセプターヘテロダイマー形成を誘導するかどうかを測定する工程；および
ｃ）レチノイドＸレセプターホモダイマーよりもレチノイドＸレセプターヘテロダイマーの形成を選択的に誘導する化合物を選択する工程。
【００１４】
９．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマーのＤＮＡを結合する能力への影響について物質をスクリーニングする方法であって、上記物質を上記ホモダイマーと合わせる工程、およびＤＮＡを結合するホモダイマーの能力への化合物の影響を測定する工程を包含する、方法を提供する。
【００１５】
１０．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマーと結合するための応答エレメントをスクリーニングする方法であって、上記応答エレメントを上記レチノイドＸレセプターホモダイマーと合わせる工程、および結合の存在を検出する工程を包含する、方法を提供する。
【００１６】
１１．好ましい実施形態において、上記結合の存在が、上記応答エレメントに作動可能に連結されるマーカーの転写活性化により検出される、上記項１０に記載の方法を提供する。
【００１７】
１２．一つの局面において、本願発明は、精製レチノイドＸレセプターホモダイマーを提供する。
【００１８】
１３．一つの局面において、本願発明は、以下の構造式を有する二環式芳香族化合物：
【００１９】
【化１】
2004159664.tif 000002
ここで、
Ｒ１は、低級アルキルおよびアダマンチルからなる群より選択され；
Ｒ２は、−Ｏ−Ｒ６または−Ｓ−Ｒ６であり、ここでＲ６は低級アルキルであり；または、Ｒ１がＲ２に対してオルトであるとき、Ｒ１およびＲ２が互いに連結して５または６員のシクロアルキレン環を形成し得、非置換であるかまたは１〜４個の低級アルキル基で置換され、そして任意にＯ、Ｓ、およびＮＲからなる群より選択される１または２個のヘテロ環式原子を含み、ここでＲは水素または低級アルキルであり；
Ｒ３は、カルボニル、
【００２０】
【化２】
2004159664.tif 000003
からなる群より選択され、ここでＸ１およびＸ２は、独立して、Ｏ、Ｓ、およびメチレンからなる群より選択され、ここでＸ１およびＸ２の少なくとも１つはＯまたはＳであり、またはＸ１およびＸ２の１つがＮＲでありそして他方がメチレンであり、ｍは２または３であり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立して、水素または低級アルキルであり、ただし、ｎが０、Ｒ６およびＲ７であるときは両方とも水素ではなくそしてＲ８およびＲ９は両方とも水素ではなく、またはＲ８およびＲ９は互いに連結して３〜６個の炭素原子を含むシクロアルキレン環を形成し得、そして＊は分子の残りの部分へのＲ３置換基の付加位置を示し；そして
Ｒ４は、
【００２１】
【化３】
2004159664.tif 000004
からなる群より選択され、ここでＲ１０は水素またはメチルであり、ｌは０または１であり、そして＊＊は分子の残りの部分へのＲ４置換基の付加位置を示し、
Ｒ５は、独立して、低級アルキルおよび低級アルコキシからなる群より選択され；そして
ｎは０、１、２、または３であり、
ただし、ｎが０であるとき、Ｒ３はカルボニル、＊Ｃ＝ＣＨ２、またはＣＨ２以外であり、
および上記化合物の薬学的に受容可能なエステル、アミド、および塩を提供する。
【００２２】
１４．
【００２３】
【化４】
2004159664.tif 000005
からなる群より選択される構造を有する、上記項１３に記載の化合物であって、ここでＲ１１がＯ、Ｓ、（ＣＨ３）２Ｃ、およびＣＨ２からなる群より選択され、そしてＲ１２が水素またはメチルである、化合物を提供する。
【００２４】
１５．好ましい実施形態において、上記構造式（ＩＩ）を有する、上記項１４に記載の化合物を提供する。
【００２５】
１６．好ましい実施形態において、ｎが０である、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００２６】
１７．好ましい実施形態において、Ｒ４が
【００２７】
【化５】
2004159664.tif 000006
であり、そしてｌが１である、上記項１６に記載の化合物を提供する。
【００２８】
１８．好ましい実施形態において、Ｒ４が
【００２９】
【化６】
2004159664.tif 000007
である、上記項１７に記載の化合物を提供する。
【００３０】
１９．好ましい実施形態において、Ｒ４が
【００３１】
【化７】
2004159664.tif 000008
である、上記項１７に記載の化合物を提供する。
【００３２】
２０．好ましい実施形態において、Ｒ３が構造式
【００３３】
【化８】
2004159664.tif 000009
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００３４】
２１．好ましい実施形態において、Ｒ３が構造式
【００３５】
【化９】
2004159664.tif 000010
を有する、上記項１７に記載の化合物を提供する。
【００３６】
２２．好ましい実施形態において、Ｒ３が構造式
【００３７】
【化１０】
2004159664.tif 000011
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００３８】
２３．好ましい実施形態において、Ｒ３が構造式
【００３９】
【化１１】
2004159664.tif 000012
を有する、上記項１７に記載の化合物を提供する。
【００４０】
２４．好ましい実施形態において、Ｒ３が
【００４１】
【化１２】
2004159664.tif 000013
からなる群より選択される、上記項２３に記載の化合物を提供する。
【００４２】
２５．好ましい実施形態において、Ｒ３が構造式
【００４３】
【化１３】
2004159664.tif 000014
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００４４】
２６．好ましい実施形態において、Ｒ３が構造式
【００４５】
【化１４】
2004159664.tif 000015
を有する、上記項１７に記載の化合物を提供する。
【００４６】
２７．好ましい実施形態において、Ｒ３が
【００４７】
【化１５】
2004159664.tif 000016
からなる群より選択される、上記項２６に記載の化合物を提供する。
【００４８】
２８．好ましい実施形態において、構造式
【００４９】
【化１６】
2004159664.tif 000017
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００５０】
２９．好ましい実施形態において、構造式
【００５１】
【化１７】
2004159664.tif 000018
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００５２】
３０．好ましい実施形態において、構造式
【００５３】
【化１８】
2004159664.tif 000019
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００５４】
３１．好ましい実施形態において、構造式
【００５５】
【化１９】
2004159664.tif 000020
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００５６】
３２．好ましい実施形態において、構造式
【００５７】
【化２０】
2004159664.tif 000021
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００５８】
３３．好ましい実施形態において、構造式
【００５９】
【化２１】
2004159664.tif 000022
を有する、上記項１５に記載の化合物であって、ここで、Ｘ１およびＸ２が、独立して、ＯおよびＳからなる群より選択される化合物、および上記化合物のアンモニウム塩を提供する。
【００６０】
３４．好ましい実施形態において、構造式
【００６１】
【化２２】
2004159664.tif 000023
を有する、上記項１５に記載の化合物であって、ここで、Ｘ１およびＸ２が、独立して、ＯおよびＳからなる群より選択される化合物、および上記化合物のアンモニウム塩を提供する。
【００６２】
３５．好ましい実施形態において、構造式
【００６３】
【化２３】
2004159664.tif 000024
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００６４】
３６．好ましい実施形態において、構造式
【００６５】
【化２４】
2004159664.tif 000025
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００６６】
３７．好ましい実施形態において、構造式
【００６７】
【化２５】
2004159664.tif 000026
を有し、Ｒ１がＯまたはＳである、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００６８】
３８．好ましい実施形態において、構造式
【００６９】
【化２６】
2004159664.tif 000027
を有する、上記項１５に記載の化合物、および上記化合物のアンモニウム塩を提供する。
【００７０】
３９．好ましい実施形態において、構造式
【００７１】
【化２７】
2004159664.tif 000028
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００７２】
４０．好ましい実施形態において、構造式
【００７３】
【化２８】
2004159664.tif 000029
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００７４】
４１．好ましい実施形態において、構造式
【００７５】
【化２９】
2004159664.tif 000030
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００７６】
４２．好ましい実施形態において、構造式
【００７７】
【化３０】
2004159664.tif 000031
を有する、上記項１５に記載の化合物を提供する。
【００７８】
４３．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターヘテロダイマーの活性を阻害する方法であって、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成を誘導する工程を包含し、それにより上記レチノイドＸレセプターのヘテロダイマー形成を抑制し、そして生じるヘテロダイマー活性を抑制する、方法を提供する。
【００７９】
４４．好ましい実施形態において、上記活性が転写の活性化または抑制化である、上記項４３に記載の方法を提供する。
【００８０】
４５．好ましい実施形態において、上記レチノイドＸレセプターヘテロダイマーが甲状腺ホルモンレセプターおよびレチノイドＸレセプターである、上記項４３に記載の方法を提供する。
【００８１】
４６．一つの局面において、本願発明は、細胞中でレチノイドＸレセプターホモダイマーにより活性化される遺伝子の転写を促進する方法であって、上記細胞を、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成を促進し得る量の合成化合物と接触させる工程を包含する、方法を提供する。
【００８２】
４７．好ましい実施形態において、上記化合物が構造式
【００８３】
【化３１】
2004159664.tif 000032
を有する、上記項４６に記載の方法を提供する。
【００８４】
４８．好ましい実施形態において、上記化合物が構造式
【００８５】
【化３２】
2004159664.tif 000033
を有する、上記項４６に記載の方法を提供する。
【００８６】
４９．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成を抑制する工程を包含する、上記レチノイドＸレセプターホモダイマーの活性を阻害する方法を提供する。
【００８７】
５０．好ましい実施形態において、上記活性が転写の活性化または抑制化である、上記項４９に記載の方法を提供する。
【００８８】
５１．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマーのその応答エレメントへの結合を抑制する工程を包含する、上記レチノイドＸレセプターホモダイマーの活性を阻害する方法を提供する。
【００８９】
５２．好ましい実施形態において、上記活性が転写の活性化または抑制化である、上記項５１に記載の方法を提供する。
【００９０】
５３．一つの局面において、本願発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマー形成に関連する病状の増加の確率を測定する方法であって、被験体において、正常被験体と比較したときのレチノイドＸレセプターホモダイマー形成の減少を検出する工程を包含する、方法を提供する。
【００９１】
５４．一つの局面において、本願発明は、被験体においてレチノイドＸレセプターホモダイマーに関連する病状を治療する方法であって、上記被験体においてレチノイドＸレセプターホモダイマー形成を誘導する工程を包含し、それによりレチノイドＸレセプターホモダイマーにより活性化され得る遺伝子の発現を増加する、方法を提供する。
【００９２】
５５．好ましい実施形態において、レチノイドＸレセプターホモダイマー形成が構造式
【００９３】
【化３３】
2004159664.tif 000034
を有する化合物の添加により誘導される、上記項５４に記載の方法を提供する。
【００９４】
５６．好ましい実施形態において、レチノイドＸレセプターホモダイマー形成が構造式
【００９５】
【化３４】
2004159664.tif 000035
を有する化合物の添加により誘導される、上記項５４に記載の方法を提供する。
【００９６】
５７．好ましい実施形態において、上記病状が皮膚に関連する、上記項５４に記載の方法を提供する。
【００９７】
５８．好ましい実施形態において、上記皮膚の病状が座瘡および乾癬からなる群より選択される、上記項５４に記載の方法を提供する。
【００９８】
５９．好ましい実施形態において、上記病状が癌である、上記項５４に記載の方法を提供する。
【００９９】
６０．好ましい実施形態において、上記遺伝子がアポリポタンパク質ＡＩ遺伝子である、上記項５４に記載の方法を提供する。
【０１００】
６１．一つの局面において、本願発明は、細胞中でレチノイドＸレセプターホモダイマー形成を選択的に活性化する方法であって、ホモダイマー形成特異的リガンドを上記細胞に添加する工程を包含し、それにより上記細胞中の上記レチノイドＸレセプターホモダイマー形成を選択的に活性化する、方法を提供する。
【０１０１】
６２．好ましい実施形態において、上記化合物が構造式
【０１０２】
【化３５】
2004159664.tif 000036
を有する、上記項６１に記載の方法を提供する。
【０１０３】
６３．好ましい実施形態において、上記化合物が構造式
【０１０４】
【化３６】
2004159664.tif 000037
を有する、上記項６１に記載の方法を提供する。
【０１０５】
６４．一つの局面において、本願発明は、細胞中での９−シス−ＲＡの発現を包含する、上記細胞におけるレチノイドＸレセプターホモダイマー形成を促進する方法を提供する。
【０１０６】
６５．一つの局面において、本願発明は、上記項１３に記載の化合物の有効に調節する量を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、レチノイン酸、ビタミンＤ、または甲状腺ホルモンにより調節される細胞プロセスの制御ための薬学的組成物を提供する。
【０１０７】
６６．一つの局面において、本願発明は、上記項１５に記載の化合物の有効に調節する量を、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む、レチノイン酸、ビタミンＤ、または甲状腺ホルモンにより調節される細胞プロセスの制御ための薬学的組成物を提供する。
【０１０８】
６７．一つの局面において、本願発明は、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺レセプターからなる群より選択されるレセプターにより、被験体における遺伝子発現を調節する方法であって、上記項１３に記載の化合物の有効に調節する量またはその薬学的組成物を上記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
【０１０９】
６８．一つの局面において、本願発明は、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺レセプターからなる群より選択されるレセプターにより、被験体における遺伝子発現を調節する方法であって、上記項１５に記載の化合物の有効に調節する量またはその薬学的組成物を上記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
【０１１０】
６９．一つの局面において、本願発明は、レチノイド、甲状腺ホルモン、またはビタミンＤにより調節される細胞分化プロセスの機能不全により生じる病気に罹患した被験体を治療する方法であって、治療的に有効な量の上記項１３に記載の化合物またはその薬学的組成物を上記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
【０１１１】
７０．一つの局面において、本願発明は、レチノイド、甲状腺ホルモン、またはビタミンＤにより調節される細胞分化プロセスの機能不全により生じる病気に罹患した被験体を治療する方法であって、治療的に有効な量の上記項１５に記載の化合物またはその薬学的組成物を上記被験体に投与する工程を包含する、方法を提供する。
【０１１２】
（発明の要旨）
本発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成に影響する能力について物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、この物質とレチノイドＸレセプターを含有する溶液とを合わせる工程、およびホモダイマー形成の存在を測定する工程を包含する。また、ＤＮＡに結合するレチノイドＸレセプターホモダイマーの能力に関する影響について物質をスクリーニングする方法が提供され、この方法は上記物質をホモダイマーと合わせる工程、およびＤＮＡに結合するホモダイマーの能力に関して上記化合物の影響を測定する工程を包含する。また、レチノイドＸレセプターホモダイマーの形成を増加させる工程を包含し、それによってレチノイドＸレセプターがヘテロダイマーを形成することを抑制し、そして得られるヘテロダイマーの活性を抑制するレチノイドＸレセプターヘテロダイマー活性を阻害する方法が提供される。さらに、レチノイドＸレセプターホモダイマーの活性を阻害する方法も提供される。レチノイドＸレセプターホモダイマー形成と関連する病状が増加する確率を測定、およびそのような病状を治療する方法がさらに提供される。さらに、レチノイドＸレセプターホモダイマーとの結合について応答エレメントをスクリーニングする方法が提供される。最後に、本発明は、レチノイドＸレセプターホモダイマー形成を活性化する方法を提供する。
【０１１３】
さらに、レセプターのレチノイン酸ファミリー中のレセプターにより、遺伝子発現を調節するために有用な新規の化合物を提供することにより、上記で述べた当該技術分野での要求を満たすことが、本発明の第１の目的である。本発明の別の目的は、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、および／または９−シス−レチノイン酸のようなレチノイドにより調節される細胞分化プロセスを制御するために有用な新規化合物を提供することである。本発明のさらに別な目的は、架橋された二環式構造形態の新規化合物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、１つまたはそれ以上の新規化合物を含有する薬学的組成物を提供することである。本発明のさらに別の目的は、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺レセプターから成る群から選択されるレセプターの遺伝子発現を調節するための方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ、および／または９−シス−レチノイン酸のようなレチノイドにより調節される細胞分化プロセスを制御するための方法を提供することである。
【０１１４】
本発明のさらなる目的、利点および新規の特徴は、以下の記載で部分的に提示され、そして一部は以下を読めば当業者に明らかとなり得、または本発明の実施により学ばれ得る。  次に、１つの局面で、本発明は構造式（Ｉ）を有する新規の化合物に関する：
【０１１５】
【化３７】
2004159664.tif 000038
ここで、
Ｒ１は低級アルキルおよびアダマンチルから成る群から選択され；
Ｒ２は−Ｏ−Ｒ６または−Ｓ−Ｒ６であり、ここでＲ６は低級アルキルであり；または
ここでＲ１はＲ２に対してオルトであり、Ｒ１およびＲ２は共に連結して、５員環または６員環シクロアルキレン環を形成し、このシクロアルキレン環は、炭素数１〜４個の低級アルキル基で置換されないまたは置換され、そして必要に応じてＯ、ＳおよびＮＲからなる群から選択される１個または２個のヘテロ環原子を含み、ここでＲは水素または低級アルキル、好ましくは芳香族環に隣接し；
Ｒ３はカルボニル、
【０１１６】
【化３８】
2004159664.tif 000039
からなる群より選択され、
ここで、Ｘ１およびＸ２はＯ、Ｓおよびメチレンからなる群から独立して選択され、ここでＸ１およびＸ２の少なくとも１つはＯまたはＳであり、またはここでＸ１およびＸ２の１つはＮＲであり、および他はメチレンであり、ｍは２または３であり、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立して水素または低級アルキルであり、ただし、ｎが０のとき、Ｒ６およびＲ７は両方とも水素でなくかつＲ８およびＲ９は両方とも水素でなく、またはＲ８およびＲ９は共に連結して、３〜６個の炭素原子を有するシクロアルキレン環を形成し得、そして＊は分子の残り部分へのＲ３置換基の結合位置を示す；そして
Ｒ４は以下からなる群から選択され、
【０１１７】
【化３９−１】
2004159664.tif 000040
【０１１８】
【化３９−２】
2004159664.tif 000041
ここで、Ｒ１０は水素またはメチルであり、ｌは０または１であり、＊＊は分子の残りへのＲ４置換基の結合位置表し、
Ｒ５は低級アルキルおよび低級アルコキシからなる群から独立して選択され；そして
ｎは０、１、２または３であり、
ただし、ｎが０のとき、Ｒ３はカルボニル、＊Ｃ＝ＣＨ２またはＣＨ２以外である。
【０１１９】
本発明はまた、以下に詳細に説明されるように、薬学的に受容可能なエステル、アミドおよびそのような化合物の塩を包含する。
【０１２０】
他の局面では、本発明は、前述の化合物を含有する薬学的組成物、ならびにレセプターのレチノイン酸ファミリーに属するレセプターによる選択的遺伝子発現を調節するための上記化合物を使用する方法に関する。
【０１２１】
発明の詳細な説明
定義および名称：
本発明の化合物、組成物、および方法を開示・記載するにあたり、本発明は、特定の合成方法、特定の薬学上のキャリア、あるいは特定の薬学的製剤または投与のレジメ（ｒｅｇｉｍｅｎ）に限定されずに当然変化し得ることを理解すべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を記載するためだけに使用され、制限することを意図しないこともまた理解すべきである。
【０１２２】
本明細書中および添付の請求項中で使用されるとき、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明らかに指示しない場合、複数形の指示対象を包含する。従って、例えば「二環式芳香族化合物」に関しては、二環式芳香族化合物の混合物を包含し、「薬学的キャリア」に関しては、２種またはそれ以上のそのようなキャリアの混合物などを包含する。
【０１２３】
本明細書および添付の請求項において、多くの用語になされ得る参照は以下の意味を有すると規定される：
本明細書で使用する用語「アルキル」は、分枝または分枝していない１〜２４個の炭素原子の飽和炭化水素基をいう。即ち、それらは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどである。本明細書における好ましいアルキル基は１〜１２個の炭素原子を含む。用語「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子のアルキル基を意図し、好ましくは、１〜４個の炭素原子を意図する。用語「シクロアルキル」は、３〜８個、好ましくは５または６個の炭素原子の環状アルキル基を意図する。  
【０１２４】
本明細書中で使用した用語「アルコキシ」は、一重の末端エーテル結合を介して結合したアルキル基を意図する；即ち、「アルコキシ」基は、Ｒが上記で定義されたようなアルキルである−ＯＲと定義され得る。「低級アルキル」基は、１〜６個、さらに好ましくは１〜４個の炭素原子を含有するアルキル基を意図する。
【０１２５】
本明細書中で使用した用語「アルキレン」は、１〜２４個の炭素原子を含む、二官能性の飽和分枝または分枝していない炭化水素鎖をいい、そして例えばメチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ポリエチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、２メチルプロピレン［−−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−］、へキシレン［−（ＣＨ２）６−］などを包含する。「低級アルキレン」は、１〜６個、さらに好ましくは１〜４個の炭素原子のアルケン基をいう。本明細書中で使用した用語「シクロアルキレン」は、環状アルキレン基、代表的には５−または６−員環をいう。
【０１２６】
本明細書中で使用した用語「アルケン」は、２〜２４個の炭素原子のモノ不飽和またはジ不飽和炭化水素基を意図する。このクラスにはいる好ましい基は、２〜１２個の炭素原子を含有する。（ＡＢ）Ｃ＝Ｃ（ＣＤ）のような不斉構造は、ＥおよびＺ異性体の両方を含むことを意図する。このことは、本明細書の構造式において仮定され得、ここで不斉アルケンが存在し、または結合シンボル
【０１２７】
【化３９−３】
2004159664.tif 000042
で明瞭に示され得る。
【０１２８】
「任意の」または「必要に応じて」は引き続いて記載される事象または状況が生じ得または生じ得ないことを意味し、そしてこの記載はこの事象または状況が生じる例および生じない例を包含する。例えば、語句「必要に応じて置換されたフェニル」は、フェニルが、置換され得または置換され得ないことを意味し、しかもこの記載は、非置換フェニルおよび置換があるフェニルの両者を包含する。
【０１２９】
本明細書中で提供される化合物の、用語「有効量」により、非毒性であって所望の遺伝子発現の調節を提供するに十分な化合物の量を意味する。以下で指摘され得るように、正確な必要量は被験体によって変化し得る。それは、種、年齢、被験体の一般的状態、治療されている病気の重篤度、用いた特定の二環式化合物、その投与方法などによる。従って、正確な「有効量」を明細書に記載することは不可能である。しかし、適切な有効量は、ルーチンの実験のみを用い当業者により決定され得る。
【０１３０】
用語「薬学的に受容可能」は、生物学的にまたはその他に所望されない材料ではないことを意味する。すなわち、望ましくない任意の生物学的影響を生じることなく、または薬学的組成物に含まれる任意の他の成分と心身に有害な様式で相互作用することのなく、選択された二環式化合物とともに個体に投与され得る材料であり得る。
【０１３１】
選択的な遺伝子発現の「誘導」「調節」または「調整」は、化合物が、特定のレセプター（すなわち、レチノイン酸ファミリー）により遺伝子発現のアクティベーターまたはアンタゴニストとして作用し得ることを意味することを意図する。
【０１３２】
レセプターの「レチノイン酸ファミリー」は、「レチノイドレセプター」とも呼ばれ、レチノイン酸レセプター、レチノイドＸレセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターを包含することを意図する。前述の３つの群のレセプターはまた、本明細書では「レチノイン酸レセプター」と広く呼ばれる。すなわち、この用語は、レチノイド酸レセプターそれ自身に加えて、レチノイドＸレセプター、ビタミンＤレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターを含有する。
【０１３３】
「架橋二環式芳香族化合物」は、式（Ｉ）の構造に包含される全ての化合物を示す。これらの化合物はまた、「レチノイド」と呼ばれ、その用語はさらにレチノイン酸および９−シスレチノイン酸のような種を包含することを意図する。
【０１３４】
本発明は、ＲＸＲホモダイマーの形成に影響を及ぼす能力について物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、この物質およびＲＸＲを含む溶液を合わせる工程、およびホモダイマー形成の存在を測定する工程を包含する。ホモダイマー形成の存在は、例えば、ＲＸＲホモダイマーまたは共沈により転写の活性化を検出することにより決定され得る。この影響は、ホモダイマー形成の誘導、例えば、９−シス−ＲＡにより活性化された活性に類似の活性または、ヘテロダイマー形成に対してホモダイマー形成を選択的に活性化する活性であり得る。用語「選択的に活性化する」は、ホモダイマー形成を活性化するが、ヘテロダイマーを顕著に活性化しない化合物を意味する。あるいは、「選択的に活性化する」は、ヘテロダイマー形成を活性化するが、ホモダイマー形成を顕著に活性化しない化合物を包含する。用語「顕著な活性化」は、被験体に有害な薬理学的影響を起こすに十分な活性化を包含する。この影響はまた、ホモダイマー形成の阻害であり得る。阻害の例は、９−シス−ＲＡのレセプターへの結合に対し競争するが、それ自身は二量体化を活性化または誘導しない物質、またはその活性をブロックするために９−シス−ＲＡを結合する物質を包含する。物質のこのようなスクリーニングは被験体が居れば、ホモダイマー形成の発見をルーチンに実施し得る。以下に提示される特定のアッセイセットは、９−シス−ＲＡを、目的の物質で単に置換することで、スクリーニングのために一般に使用され得る。このような「物質」をスクリーニングするための良好な出発点は、本明細書中に記載される９−シス−ＲＡ活性である。９−シス−ＲＡに関する置換体は、９−シス−ＲＡアナログを作成するために変化し得、およびホモダイマー形成の任意の増加または減少を測定するための方法でスクリーニングされ得る。しかし、任意の物質が、ホモダイマー形成について任意の影響を測定するために、このアッセイでスクリーニングされ得る。このような化合物は、次いで細胞中でホモダイマー形成および遺伝子転写を促進するために用いられ得る。本明細書中で用いられる細胞は、インビトロまたはインビボのいずれにか見い出される細胞を包含する。従って、ＲＸＲホモダイマー形成に影響を与え、そしてＲＸＲホモダイマーにより活性化される遺伝子の転写を促進するためにヒト被験体にこれら化合物が投与され得る。このような化合物を、以下の実施例に提示する。
【０１３５】
以下の本明細書で提示されたデータはＲＸＲαを利用する。しかし、ＲＸＲα、β、およびγの間で高い相同性が与えられれば各タンパク質は、ホモダイマーを形成すべきであり、そしてＲＸＲαホモダイマーについて記載された活性を有する。関連して、ホモダイマーは異なったＲＸＲ間で形成され得る。例えば、ホモダイマーは、ＲＸＲαとＲＸＲβの間、あるいはＲＸＲβとＲＸＲγの間、あるいはＲＸＲαとＲＸＲγの間で形成され得る。これらのホモダイマーの活性は、本明細書で提示される方法を用いて確認され得る。
【０１３６】
本発明はまた、ＲＸＲホモダイマーのＤＮＡを結合する能力に関する影響について物質をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、この物質を上記ホモダイマーと合わせる工程、およびＤＮＡと結合するホモダイマーの能力への化合物の影響を測定する工程を包含する。例えば、ホモダイマーを結合し得る、またはＲＸＲホモダイマーにより認識されるＤＮＡ応答エレメントを結合し得る化合物は、この方法でスクリーニングされ得る。
【０１３７】
本発明は、さらに、ＲＸＲ含有ヘテロダイマーの活性を阻害する方法を提供し、この方法は、ＲＸＲホモダイマーの形成を増加させ、それによってＲＸＲがヘテロダイマーの形成を抑制しそして得られるヘテロダイマー活性を抑制する工程を包含する。この活性は、任意の活性であり得るが、一般には転写の活性化または抑制化である。この活性は、例えば、そうでなければヘテロダイマーを形成するために利用され得るＲＸＲを、ホモダイマーを形成するために利用することによりブロックされ得る。ヘテロダイマーの数が減少するので、ヘテロダイマーの活性は減少する。１つの実施例では、ＲＸＲヘテロダイマーは、甲状腺ホルモンレセプターおよびＲＸＲから成る。ＲＸＲ／ＴＲヘテロダイマーの活性は減少した。その他のヘテロダイマーを、本明細書で提示された標準方法を用いて試験し得る。
【０１３８】
本発明はまた、ＲＸＲレセプターホモダイマーの活性を阻害する方法を提供し、この方法は、ＲＸＲホモダイマー形成を抑制する工程を包含する。このような阻害は、例えば、９−シス−ＲＡ、または９−シス−ＲＡによる転写または活性化を阻害することにより得られ得る。この阻害される活性は、一般に転写の活性化または抑制化である。
【０１３９】
本発明はまた、ＲＸＲホモダイマーの活性を阻害する方法を提供し、この方法は、ＲＸＲホモダイマーのその応答エレメントへの結合を抑制する工程を包含する。例えば、同じ応答エレメントと競合するレセプターの活性が促進され得る。一般に、阻害される活性は、転写の活性化または抑制化である。
【０１４０】
本発明は、ＲＸＲホモダイマー形成に関連する病状の増加の確率を測定する方法をさらに提供し、この方法は、被験体において正常被験体と比較したときのＲＸＲホモダイマー形成の調節を検出する工程を包含する。この調節は、ホモダイマー形成を増加または減少し得る。このような調節は、例えば、変異したＲＸＲから生じ得る。この減少は、サンプル中でホモダイマーについてのアッセイにより、またはホモダイマー形成を減少することが知られている変異体を検出することにより検出され得る。
【０１４１】
関連して、本発明は、被験体においてホモダイマー形成を調節する工程を包含する、被験体中でＲＸＲホモダイマー形成に関連する病状を治療する方法を提供する。この調節は、病状に依存して増加または減少され得る。このような増加は、例えば、ＲＸＲ転写を促進する化合物を利用して達成され得る。この病状は、例えば座瘡および乾癬のような皮膚に関連し得る。さらに、この病状は癌であり得る。このような化合物の正確な必要量は、被験体によって変化し得、それは、種、年齢、被験体の一般的状態、治療されている病気の重篤度、用いられる特定の化合物、その投与方法などに依存する。従って、正確な活性促進量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、本明細書で教示が与えられれば、ルーチンの実験のみを用いて当業者により決定され得る。
【０１４２】
本発明はまた、精製されたＲＸＲホモダイマーを提供する。用語「精製された」は、天然環境中でＲＸＲホモダイマーに関連する少なくとも数種の細胞成分が無いこと意味する。
【０１４３】
本発明は、ＲＸＲホモダイマーとの結合するための応答エレメントをスクリーニングする方法を提供し、この方法は、この応答エレメントを上記ＲＸＲホモダイマーと合わせる工程、および結合の存在を検出する工程を包含する。結合の存在を、多くの標準的な方法により決定し得る。１つの方法では、応答エレメントに作動可能に連結するマーカーの転写活性化により結合を検出する。用語「作動可能に連結」は、転写アクティベーターの存在下でマーカーが転写され得ることを意味する。
【０１４４】
本研究は、天然のビタミンＡ誘導体９−シス−ＲＡのレチノイドレセプターＤＮＡ結合および転写活性化に関する影響の研究から得られる。全−トランス−ＲＡと反対に、９−シスアナログは、１０−９〜１０−８Ｍ濃度で、天然ＴＲＥまたはＥＲＥへのではなくいくつかのＲＸＲ−特異的ＲＡＲＥへのＲＸＲα結合を劇的に促進する。この影響は、ＲＸＲα、βまたはγの応答エレメントへの結合を、９−シス−ＲＡが誘導しないので、ＲＸＲに特異的である（図１、図３）。ゲルシフトアッセイにおける移動パターンから判断して、ＲＸＲトリマーまたはテトラマーを包含するより大きな複合体が生じ得るが（特にＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥの場合）、９−シス−ＲＡがホモダイマー形成を誘導すると推定される。このようなトリマーまたはテトラマー形成は、本明細書に提示の方法を用いて試験され得る。
【０１４５】
ＲＸＲαホモダイマーは、ヘテロダイマーと異なる応答エレメント特異性を奏する。ｒＣＲＢＰＩ応答エレメントは、ＲＸＲホモダイマーと相互作用せず、その一方ＣＲＢＰＩＩ応答エレメント（完全繰返しを含むこれまでに同定された天然のＲＡＲＥ）のみが、９−シス−ＲＡで誘導されるＲＸＲαホモダイマーの強力なバインダーであった。この応答エレメントがＲＸＲα２４，３０により良好に活性化されることは先に示されていた。この応答エレメントはまた、ＲＸＲα−ＲＡＲαヘテロダイマー（図３）２７，２９により効果的に結合されるが、ヘテロダイマーはリプレッサー機能を有するようである３０。
【０１４６】
ＣＶ−１細胞は、試験された全ての他のほ乳類組織培養細胞のように、部分的に影響を不明瞭にし得る内因性のレチノイドレセプターを包むけれども、転写活性化研究で得られた結果は、ＤＮＡ結合研究で得られた結果と良く一致する。それにもかかわらず、９−シス−ＲＡ−ＲＸＲαホモダイマーと強く結合する応答エレメントはまた、９−シス−ＲＡの存在下で同時トランスフェクトしたＲＸＲαに強く応答する。その一方、ＲＸＲαホモダイマーに良好に結合しない応答エレメントは、ｒＣＲＢＰＩ−ＲＡＲＥまたはＭＨＣ−ＴＲＥのように、ＲＸＲα単独によっては活性化され得なかった。
【０１４７】
核ホルモンレセプターの二量体化−ホモ二量体化またはヘテロ二量体化は、レセプターとそれらの同族の応答エレメントとの高親和性の相互作用に重要である一般に信じられている。ＲＸＲは溶液中で主にモノマーとして存在し１６、効果的なＤＮＡ結合活性を示すために高濃度またはＲＡＲ、ＴＲあるいはＶＤＲの存在を１３，１５，１６，２６−３０必要とする。９−シス−ＲＡの存在下で増加した協同ＲＸＲ  ＤＮＡ結合活性の観察は、９−シス−ＲＡが、ＤＮＡに対する増加した親和性を有するＲＸＲホモダイマーの形成を誘導したことを示す。従って、９−シス−ＲＡのＲＸＲへの結合は、構造変換を誘導し得、それはホモ二量体化を起こす。９−シス−ＲＡおよびＲＡがＲＡＲに結合し得るが２４，２５、それらはＲＡＲホモダイマー形成を誘導しないことは興味深い。
【０１４８】
ＲＸＲαホモダイマー形成は、ＤＮＡ非存在下の溶液中で生じ得る。従って、９−シス−ＲＡが細胞に利用されるようになる場合、モノマー性とダイマー性レセプターとの間の平衡が変化し、そしてさらなる種、ＲＸＲホモダイマーが形成され得、新規の応答経路を与える。インビトロのゲルシフトアッセイにより観察されるようにリガンド誘導ホモダイマー結合の概念は、変異したエストロゲンレセプター（ＥＲ−ｖａｌ−４００）を除く核レセプターについて先に観察されている４４，４５。
【０１４９】
関連ＴＲについて、リガンドの影響は、ホモダイマー結合に関して報告されているが４６，４７、しかし、リガンド（Ｔ３）は、ホモダイマー応答エレメント相互作用を減少させた。ＴＲおよびＲＡＲのカルボキシ末端の半分が、リガンドおよび二量体化機能の両方をコード化するので３６，４６，４８、ここで観察されるように二量体化に関するリガンドの強い影響は、全く驚くべきことではない。しかし、この影響の特異性は、ヘテロダイマー形成ではなくホモダイマー形成のみに影響するようなので、きわめて劇的である。全体像は、その相互に混合されたドメインを介するレセプターのカルボキシ末端領域（転写活性化領域もまた含有する）４９が、他の制御タンパク質５０との相互作用をも含み得る個々のレセプター多重の活性を許容することから生じる。
【０１５０】
本出願に記載のデータは、２つの機能を有するＲＸＲの中心の役割を実証した。それは、ヘテロ二量体化を通じてＲＡＲ、ＴＲおよびＶＤＲのホルモンレセプターの３つのクラスについて補助レセプターとして作用することを可能にする。ＲＸＲの２つの機能−ホモ二量体化およびヘテロ二量体化−は、２つの別個の転写調節制御を説明する。それは、別個の生理的プロセスに影響すると予想され得る。従って、９−シス−ＲＡは、全−トランス−ＲＡの治療特性とは別個の治療特性を有し得る。
【０１５１】
本明細書で提供される新規化合物は、上記の構造式（Ｉ）により定義される化合物である。この一般構造に入る好ましい化合物は以下を包含する：
【０１５２】
【化４０−１】
2004159664.tif 000043
【０１５３】
【化４０−２】
2004159664.tif 000044
ここで、Ｒ１１は、Ｏ、Ｓ、（ＣＨ３）２ＣおよびＣＨ２からなる群から選択され、そしてＲ１２は水素またはメチルである。この群に入る特に好ましい化合物は構造式（ＩＩ）に示されるような化合物である。
【０１５４】
好ましいＲ３置換体は、Ｒ３が、以下の一般構造を有する場合であり、
【０１５５】
【化４１】
2004159664.tif 000045
以下よりなる群から選択される：
【０１５６】
【化４２】
2004159664.tif 000046
。
好ましいＲ３置換体は、Ｒ３が以下の一般構造の場合であり、
【０１５７】
【化４３】
2004159664.tif 000047
以下よりなる群から選択される：
【０１５８】
【化４４】
2004159664.tif 000048
。
式（ＩＩ）に包含される好ましい構造の例は以下を包含する：
【０１５９】
【化４５−１】
2004159664.tif 000049
【０１６０】
【化４５−２】
2004159664.tif 000050
【０１６１】
【化４５−３】
2004159664.tif 000051
式（ＩＩ）により定義される化合物のクラスに入る特定の詳細な好ましい化合物の例は以下を包含する：
【０１６２】
【化４６−１】
2004159664.tif 000052
【０１６３】
【化４６−２】
2004159664.tif 000053
本発明はまた、カルボン酸部分を含む式（Ｉ）の化合物の薬学的に受容可能な無毒性エステル、アミド、および塩の誘導体を包含する。
【０１６４】
薬学的に受容可能な塩は、遊離酸を適量の薬学的に受容可能な塩基で処理することにより調製される。代表的な薬学的に受容可能な塩基は、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化亜鉛、水酸化銅、水酸化アルミニウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、リジン、アルギニン、ヒスチジンなどである。反応は、水中で、水のみまたは不活性な水と混和し得る有機溶媒と組み合わせて、約０℃〜約１００℃の温度で、好ましくは室温で行われる。用いられる塩基に対する構造式（Ｉ）の化合物のモル比は、任意の特定の塩に所望の比を提供するように選択される。例えば、遊離酸出発物質のアンモニウム塩（本明細書中の特に好ましい実施態様）の調製については、この出発物質は、約１当量の薬学的に受容可能な塩基で処理されて中性塩が得られ得る。カルシウム塩が調製される場合、約１／２モル当量の塩基を用いて中性塩が得られるが、アンモニウム塩については、約１／３モル当量の塩基が用いられる。
【０１６５】
エステル誘導体は、代表的には、化合物の酸形態に対する前駆体として調製され（以下の実施例に例示する）、したがってプロドラッグとして用いられ得る。一般的には、これらの誘導体は、アセテート、プロピオネートなどの低級アルキルエステルである。アミド誘導体の、−（ＣＯ）ＮＨ２、−（ＣＯ）ＮＨＲ、および−（ＣＯ）ＮＲ２（ここでＲは低級アルキルである）は、カルボン酸含有化合物とアンモニアまたは置換アミンとの反応により調製され得る（以下の実施例ＶＩＩに例示する）。
【０１６６】
合成方法：
本発明の化合物は、有機合成化学者に一般に公知の技法を用いて容易に合成され得る。架橋二環式芳香族化合物の製造および誘導体化に適切な実験方法は、例えば、上記の要約したＭａｉｇｎａｎらの特許に記載されており、その特許の開示内容は参考として本明細書中に援用されている。本発明の特定のおよび好ましい化合物の製造方法は、以下の実施例ＩＩＩ〜ＸＶＩＩに詳細に記載されている。
【０１６７】
有用性および投与：
構造式（Ｉ）で定義される本発明の化合物（その薬理学的に受容可能なエステル、アミド、または塩を含む）は、レチノイン酸ファミリーにおけるレセプターによる選択的遺伝子発現を誘導および／または調節すること、およびレチノイド、ビタミンＤ、および／または甲状腺ホルモンにより調節される細胞分化プロセスを制御することに有用である。したがって、上記のように、本発明の化合物は、座瘡（ａｃｎｅ）、白血病、乾癬、皮膚の老化、骨の石灰化、およびエネルギーレベル、ならびにレチノイン酸、ビタミンＤ、甲状腺ホルモン、および９−シス−レチノイン酸により調節される細胞プロセスに関連する他の徴候を治療することに有用である。
【０１６８】
本発明の化合物は、薬学的に受容可能なキャリアと共に１つまたはそれ以上の化合物から構成される薬学的組成物中に好都合に処方され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）は、代表的なキャリア、および本発明の化合物の処方物の調製に関連して用いられ得る薬学的組成物の従来の調製方法を開示していることを参照のこと。
【０１６９】
化合物は、経口的、非経口的（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、局所的、経皮的などにより投与され得るが、代表的には経口または局所投与が好ましい。もちろん、投与される活性化合物の量は、治療される被験体、被験体の体重、投与方法、処方する医師の判断に依存する。しかし、一般に、投与量はレチノイン酸の投与に代表的な量に近似しており、好ましくは約２μｇ／ｋｇ／日〜２ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０１７０】
所定の投与の態様に依存して、薬学的組成物は、固体形態、半固体形態、または液体投与形態であり得、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤などであり得、好ましくは、正確な単回投与用量に適切な単位投与形態であり得る。この組成物は、上記のように、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、選択された有効量の薬物を含み、そしてさらに、他の医用剤、薬用剤、キャリア、アジュバント、希釈剤などを含み得る。
【０１７１】
固体組成物については、従来の無毒性固体キャリアには、例えば、薬用グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本明細書に記載のような活性化合物および任意の薬学的アジュバントを、例えば、水、生理食塩液、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどの賦形剤中に、溶解、分散などすることにより調製されて、それにより溶液または懸濁液を形成し得る。所望であれば、投与される薬学的組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエートなど）の少量の無毒性の補助剤を含み得る。このような投与形態を調製する実際の方法は、当該技術分野の当業者に公知または明らかであり、例えば、上記参考のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。
【０１７２】
経口投与については、微細粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤、および／または界面活性剤を含み得、そして水中にまたはシロップ中に、乾燥状態ではカプセルまたは袋（ｓａｃｈｅｔ）中に、または懸濁化剤が含まれ得る非水性溶液または懸濁液中に、結合剤または滑沢剤が含まれ得る錠剤中に、または水またはシロップ中の懸濁液中に存在し得る。所望であればまたは必要であれば、矯味剤、保存剤、懸濁化剤、濃稠化剤、または乳化剤が含まれ得る。錠剤および顆粒剤は好ましい経口投与形態であり、そしてこれらはコーティングされ得る。
【０１７３】
非経口投与は、用いるのであれば、一般に注射により特徴づけられる。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体中での溶液または懸濁液に適切な固体形態として、または乳化剤としてのいずれかで、従来の形態で調製され得る。非経口投与の最近再検討されたアプローチには、一定レベルの投与量が維持されるような、徐放性または持効性システムの使用が含まれる。例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照のこと。これは、本明細書中に参考として援用されている。
【実施例】
【０１７４】
（実験）
以下の実施例は、本明細書中で請求項に挙げた方法、組成物および化合物を、どのように作製し評価したかという完全な開示および記載を、当業者に提供するために提出した。そして実施例は、発明者らの発明の範囲を制限することは意図していない。数値（例えば、量、温度など）について正確さを保証する努力をしたが、いく分かの誤差および偏差を考慮しなければならない。特に指示がない限り、部は重量部、温度は℃、そして圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１７５】
記載中の基および置換基の位置は、以下の番号付けシステムを実施例を通じて採用する：
【０１７６】
【化４７】
2004159664.tif 000054
実施例Ｉ
ホモダイマー形成の同定
９−シス−ＲＡは、ＴＲＥｐａｌ上でＲＸＲホモダイマー結合を誘導する
ＲＸＲを高濃度で用いる場合、ＲＸＲがＲＡ応答エレメント（ＲＡＲＥ）に結合することを示されているが２８，３０，３１、さらに最近の研究により、ＲＸＲは溶液中でモノマーとして主に存在すること１０、そして効果的なＤＮＡ相互作用に、ＲＡＲまたはＴＲまたはＶＤＲとのヘテロダイマー形成が必要であること１５，１６，２６−２９が明らかになった。種々の応答エレメントへのヘテロダイマーの結合は、リガンド非依存性であることが見出された３２。新たに発見された天然のＲＡ異性体９−シス−ＲＡは、ＲＡＲまたはＴＲのいずれも含んでいないことが知られているＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞中のＲＸＲの効果的なアクティベーターであることが報告された１７，２４。９−シス−ＲＡが、ＲＸＲに対する確かに真のリガンドである場合、このリガンドが、ＲＸＲ応答エレメント相互作用を調節すると予想される。従って、コレセプター（ＴＲおよびＲＡＲ）の非存在下および存在下で、パリンドローム性ＴＲＥ（ＴＲＥｐａｌ）、ＲＸＲ応答エレメント１４へのＲＸＲαの結合に及ぼす９−シス−ＲＡの影響を研究した。
【０１７７】
ＲＸＲα、ＲＡＲβ、またはＴＲαのレセプターｃＤＮＡのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）へのクローニングは、先に記載されている２６。フラッグ−ＲＸＲαを、ＡＴＧコドンを含む２本鎖のオリゴヌクレオチドとＲＸＲαのＮ末端に相当するフラッグ（Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）［配列番号：１］をコードするＤＮＡ配列とのライゲーションにより、先の記載３３のように構築した。次いで、融合生成物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした。インビトロでの転写／翻訳系を用いるレセプタータンパク質の合成、および合成したレセプタータンパク質および２本鎖ＴＲＥｐａｌを用いるゲル遅延アッセイ３４は、記載されたとおりである３３。９−シス−ＲＡ（融点１８４−１８７℃）を、ＨＯＡｃ−ＭｅＯＨの存在下で２段階の連続ＭｎＯ２酸化３５により、９−シス−レチナールから調製し、メチルエステル（６９％）を得、続いて２５％  ＭｅＯＨ水溶液中の０．５Ｎ  ＫＯＨ中で加水分解（８０％）し、そして結晶化した（ＭｅＯＨ）；ＨＰＬＣ（Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ１８、３２％  ＭｅＣＮ、２７％  ＭｅＣＨ、１６％  Ｉ−ＰｒＯＨ、２４％  Ｈ２Ｏ、１％  ＨＯＡｃ、１．９ｍＬ／分、２６０ｎＭ）ｔＲ  １５．４分（１００％）。ホルモンの影響を分析するために、ＤＮＡ結合アッセイを行う前に、レセプタータンパク質を適切な濃度のホルモンと、室温で３０分間インキュベートした。抗フラッグ抗体（Ｉｍｍｕｎｅｘ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて、ＤＮＡ結合アッセイを行う前に、１μｌの抗血清をレセプタータンパク質と、室温でさらに３０分間インキュベートした。
【０１７８】
リガンド非存在下では、ＲＸＲ単独ではＴＲＥｐａｌに効果的に結合せず、そして応答エレメント相互作用のためにＴＲまたはＲＡＲを必要としたが、ＲＸＲの結合は、９−シス−ＲＡの存在下で劇的に増加し（図１ａ）、そしてＴＲまたはＲＡＲを必要としなかった。９−シス−ＲＡの存在下で観察されるＲＸＲ特異的バンドは、ヘテロダイマーＴＲ−ＲＸＲおよびＲＡＲ／ＲＸＲ複合体を用いて得たバンドと同じくらい目立った。ＲＸＲ複合体は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーＴＲＥｐａｌ複合体の位置と非常に似た位置に、ＴＲ−ＲＸＲ複合体に比べより遅くと移動した。従って、これらのデータは、９−シス−ＲＡがＲＸＲホモダイマー形成を誘導することを示す。９−シス−ＲＡで誘導されるＲＸＲホモダイマー複合体と同じ位置でのＲＡＲ−ＲＸＲ複合体が移動するため、両方の複合体が形成されるか否かを、この実験において決定し得なかった。特筆すべきことには、全−トランス−ＲＡを１０−６Ｍの濃度で添加した場合もまた、ＲＸＲαホモダイマー結合をある程度誘導したが、Ｔ３は誘導しなかった。ＲＡの影響は、幾つかの用時調製ＲＡ溶液を用いて観察し得たが、ＲＡの存在下におけるこのホモダイマー形成が、本明細書で用いた全−トランス−ＲＡ溶液中の９−シス−ＲＡ不純物のせいであるか、または全−トランス−ＲＡの直接の影響であるのかは現時点では明確ではない（以下を参照のこと）。興味深いことには、９−シス−ＲＡは、ＲＸＲに対するその影響とは異なって、ＲＡＲには結合し得ると報告２４されているが、９−シス−ＲＡが、ＴＲＥｐａｌへのＲＡＲホモダイマー結合を誘導することは見出されなかった。
【０１７９】
９−シス−ＲＡの存在下で観察された複合体が、確かにＲＸＲ複合体であるという証拠をさらに提供するために、ＤＮＡ結合実験をフラッグ−ＲＸＲを用いて行った。この誘導体は、抗フラッグ（αＦ）抗体により特異的に認識される８個のアミノ酸アミノ末端エピトープを保持する３３。図１ｂに示したように、αＦは、９−シス−ＲＡ誘導複合体をシフトさせたが、非特異的抗体はしなかった。このことは、９−シス−ＲＡの存在下でＴＲＥｐａｌにより観察された複合体が、確かにＲＸＲタンパク質を含有することを証明した。９−シス−ＲＡ誘導ホモダイマー形成が、ＲＸＲタンパク質の濃度にどのように依存しているかを調べるために、インビトロでの翻訳されたＲＸＲタンパク質の増加する濃度を、９−シス−ＲＡの存在下または非存在下で、標識したＴＲＥｐａｌと混合した（図２ａ）。これらの混合物を、ゲル遅延アッセイにより分析した場合、ホモダイマーのＤＮＡ結合に、ＲＸＲαタンパク質濃度に正の相関で依存する、強い協同の影響が見られた（図２ａ，ｂ）。高濃度のＲＸＲを用いた場合、ＲＸＲのわずかな結合を観察し得るが、用いた全てのレセプター濃度において、９−シス−ＲＡが効果的な複合体形成に必要であった。用いた全てのレセプター濃度において、ホモダイマー複合体形成に必要な９−シス−ＲＡの濃度をさらに決定した。ホモダイマー複合体形成に必要な９−シス−ＲＡの濃度をさらに決定した。１０−９Ｍで著しい影響が既に観察されたが、最適結合は１０−８Ｍで見られた（図２ｃ）。従って、効果的なＲＸＲホモダイマーＤＮＡ相互作用は、ＲＸＲタンパク質濃度に依存し、そして低レベルの９−シス−ＲＡで生じ得る。
【０１８０】
９−シス−ＲＡは、特定の応答エレメントとのホモダイマーの相互作用を誘導する
ＲＸＲ含有ヘテロダイマーは、種々の天然の応答エレメントとの高い特異的な相互作用を有し、ＴＲ−ＲＸＲヘテロダイマーはＴＲＥと強く結合するだけであり、ＲＡＲＥとは結合しない。ところが、ＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマーについては、逆が真実である１５，３２。多数の天然および合成応答エレメントを用いて、９−シス−ＲＡ誘導ＲＸＲホモダイマーのＤＮＡ結合に必要な配列を調べた（図３ａ）。
【０１８１】
インビトロで合成されたレセプタータンパク質を用いるゲル遅延アッセイを、図１説明に記載する。以下のオリゴヌクレオチドおよびそれらの相補鎖を、図３および図４においてプローブとして用いた。ＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥ、２ｂｐスペーサーを有する直接反復応答エレメント３１、
【０１８２】
【化４８】
2004159664.tif 000055
［配列番号：２］；ＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥ、１ｂｐスペーサーを有する直接反復ＲＸＲ特異的応答エレメント３０、
【０１８３】
【化４９】
2004159664.tif 000056
［配列番号：３］；βＲＡＲＥ、ＲＡＲβプロモーターに存在するＲＡ応答エレメントの直接反復３６，３７、
【０１８４】
【化５０】
2004159664.tif 000057
［配列番号：４］；ＣＲＢＰＩ−ＲＡＲＥ、ラットＣＲＢＰＩプロモーターに存在する直接反復ＲＡ特異的応答エレメント３８、
【０１８５】
【化５１】
2004159664.tif 000058
［配列番号：５］；ＭＨＣ−ＴＲＥ、ラットα−ミオシンＨ鎖遺伝子に存在する、直接反復Ｔ３特異的応答エレメント４０、
【０１８６】
【化５２】
2004159664.tif 000059
［配列番号：６］；ＭＥ−ＴＲＥ、ラットリンゴ酸酵素遺伝子に存在する直接反復Ｔ３特異的応答エレメント４１、
【０１８７】
【化５３】
2004159664.tif 000060
［配列番号：７］；ＤＲ−４、４ｂｐのスペーサーを有する理想化した直接反復Ｔ３特異的応答エレメント３９、
【０１８８】
【化５４】
2004159664.tif 000061
［配列番号：８］；ＤＲ−５、５ｂｐスペーサーを有する理想化した直接反復ＲＡ特異的応答エレメント３９、
【０１８９】
【化５５】
2004159664.tif 000062
［配列番号：９］；ＥＲＥ、完全なパリンドローム性のＥＲ応答エレメント４２、
【０１９０】
【化５６】
2004159664.tif 000063
［配列番号：１０］。ＴＲＥｐａｌ配列［配列番号：１１］を、比較のために示す。
【０１９１】
ＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥ（２ｂｐのスペーサーを含む直接反復応答エレメント）は、ＲＸＲ特異的であると示唆３１されているが、９−シス−ＲＡの存在下で強いＲＸＲ複合体として得られ、そしてＲＡ（１０−６Ｍ）とはより低い程度の複合体として得られた。ＲＸＲ−ＲＡＲヘテロダイマーはまた、この応答エレメントと効果的に結合した。ヘテロダイマー複合体は、ＲＸＲホモダイマーと同じ位置で移動したので、９−シス−ＲＡのＲＸＲ−ＲＡＲヘテロダイマーの影響は明確には決定され得ない。ＲＡＲホモダイマー結合は、９−シス−ＲＡにより誘導されなかった（図３ｂ）。他のＲＸＲ応答エレメント３０、つまりＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥへのＲＸＲ結合を誘導する９−シス−ＲＡを研究したところ、（リガンドの非存在下で）ヘテロダイマーよりさらに遅く移動した複合体を観察したが、９−シス−ＲＡおよびＲＡＲの存在下では、ホモダイマー結合およびヘテロダイマー結合のいずれもがその強さに減少が見られた（図３）；同様の影響が、高ＲＡ濃度において、または９−シス−ＲＡおよびＲＡがいずれも存在する場合において見られた。９−シス−ＲＡはまた、ＲＸＲのβＲＡＲＥ、（５ｂｐのスペーサーを含むヒトＲＡＲβプロモーター由来のＲＡＲ応答エレメント３６，３７）との相互作用を誘導した（図４ａ）。しかし、ＲＸＲホモダイマーバンドは、用いたタンパク質濃度において、ＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマーバンドよりかなり弱い。興味深いことに、ラットＣＲＢＰＩプロモーター由来の他の天然のＲＡＲＥ３８（２ｂｐのスペーサーを含むＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥに似ている）は、９−シス−ＲＡの存在下で、ＲＸＲのいかなる結合も示さなかった（図４ａ）。これは、反復コアモチーフの実際の配列が、ＲＸＲホモダイマー結合に重要であることを示している。同様に、ＤＲ−５−ＲＡＲＥ、つまりβ−ＲＡＲＥ由来の完全な反復エレメント３９は、９−シス−ＲＡの存在下ではＲＸＲとの相互作用を示さなかったが、ＲＡＲＥが存在する場合に、ＲＸＲと強く相互作用する（図４ａ）。
【０１９２】
ＲＸＲホモダイマー結合が特定のＲＡＲＥに特異的であるか否かを決定するために、ラットα−ミオシンＨ鎖プロモーター（ＭＨＣ−ＴＲＥ）由来のＴ３応答エレメント４０、ラットリンゴ酸酵素（ＭＥ−ＴＲＥ）由来のＴ３応答エレメント４１、および完全な反復ＤＲ−４由来のＴ３応答エレメント３９を用いてゲルシフト実験をまた行った。３つの場合の全てにおいて、９−シス−ＲＡの存在下または非存在下でＲＸＲの特異的な結合は観察され得なかったが、３つの応答エレメントの全ては、ＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーと効果的に結合し、これらのエレメントは、レチノイドによって誘導されないという見解と一致する。同様に、完全なパリンドローム性ＥＲＥ４２はまた、ＲＸＲホモダイマーと相互作用しなかった（図４ｃ）。
ＤＮＡの非存在下で９−シス−ＲＡで誘導されるホモダイマー形成が生じる
ＲＸＲは、溶液中に主にモノマーとして存在することが報告された１６。重要な問題は、９−シス−ＲＡで誘導されるＲＸＲホモダイマー（ヘテロダイマー含有のＲＸＲに似ている）が、ＤＮＡの非存在下で溶液中で形成し得るか否かということである。この問題に解決するためにフラッグ−ＲＸＲ誘導体の利点、即ち、抗フラッグ抗体と特異的に沈殿し得るが、ＲＸＲ野生型は沈殿し得ないという利点を用いた。
【０１９３】
フラッグ−ＲＸＲαを、発現ベクターｐＧｅｘ  ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に読み取り枠を合わせてクローニングし、そして製造業者により提供された手順を用いて細菌中で発現させた。タンパク質を、予め充填されたグルタチオンセファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で部分精製し、そして抗フラッグ抗体を用いるゲル遅延アッセイおよびウエスタンブロッティングにより、その機能について試験した。免疫共沈殿アッセイを、本質的には記載２６されたように行った。簡単に言えば、インビトロにおいて３５Ｓ標識した１０μｌの合成ＲＸＲαタンパク質を、５μｌ（約０．１μｇ）の部分精製した細菌で発現させたフラッグ−ＲＸＲα融合タンパク質または同様に調製したグルタチオントランスフェラーゼ対照タンパク質と、１００μｌ緩衝液（１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、および１０％  グリセロール含有）中で、室温で３０分間インキュベートした。化学的架橋剤またはオリゴヌクレオチドの存在下でアッセイした場合、ＤＭＳＯに溶解した２μｌの１００ｍＭ  ジチオビススクシンイミジルプロピオネート（ＤＳＰ）、または１０ｎｇのオリゴヌクレオチドを添加し、そして室温で１５分間インキュベートを続けた。次いで、反応混合物を１μｌの抗フラッグ抗体または非特異的プレ免疫血清と、氷上で２時間インキュベートした。免疫複合体を、５０μｌのプロテイン−Ａ−セファローススラリーを添加し、そして低温室で１時間連続的に混合することにより沈殿させた。免疫複合体を、１０−７Ｍ９−シス−ＲＡ含有の冷ＮＥＴ−Ｎ緩衝液（２０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ＮＰ−４０）でよく洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。ゲルを固定し、乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１９４】
フラッグ−ＲＸＲを、インビトロにおいて標識した３５Ｓ−ＲＸＲタンパク質と混合した場合、標識ＲＸＲは、抗フラッグ抗体の存在下では沈殿し得たが、非特異的血清の存在下で沈殿し得なかった（図５）。ＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥ存在下では、共沈殿効率はわずかに増加したが、ＭＨＣ−ＴＲＥの存在下では増加しなかった。さらに、架橋剤（ＤＳＰ）とのインキュベートにより、標識ＲＸＲの共沈殿がさらに増強された。全ての場合において、特異的な共沈殿は、９−シス−ＲＡの存在下でのみ観察された。従って、これらのデータにより、９−シス−ＲＡ誘導ＲＸＲホモダイマー形成が、溶液中で生じ、そしてＲＸＲ−ＤＮＡ相互作用を必要としないという仮説が強く指示される。
９−シス−ＲＡおよびＲＸＲαによる応答エレメント特異的転写活性化
９−シス−ＲＡ／ＲＸＲαホモダイマー応答エレメント相互作用が、９−シス−ＲＡ／ＲＸＲ複合体によるそのような応答エレメントによる転写活性化と関連し得るか否かを研究するために、ＣＶ−１細胞において一連の一時的なトランスフェクションアッセイを行った。ここでは、レセプター発現ベクターを、ｔｋプロモーターの種々の上流の応答エレメントを有するＣＡＴリポーター構築物で同時トランスフェクトした。ＣＶ−１細胞を、先に記載４３のように改変したリン酸カルシウム沈殿手順を用いて、一時的にトランスフェクトした。同時トランスフェクトしたβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来の酵素活性を測定することにより、ＣＡＴ活性をトランスフェクション効率について標準化した。トランスフェクトした細胞を、１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡまたは全−トランス−ＲＡの非存在下または存在下で生育させた。
【０１９５】
ＴＲＥｐａｌ含有リポーターを用いて、９−シス−ＲＡの存在下でのＲＸＲαによる強い活性化、およびＲＡを添加した場合活性化がほとんど観察されなかった。活性化は、ＲＡＲαの同時トランスフェクションによりさらに増強され得た。しかし、この場合、ＲＡはまた、９−シス−ＲＡほど効率的ではないが、効果的なアクティベーターとして機能した。全体で、ＲＡＲαおよびＲＸＲαの存在下で、９−シス−ＲＡによる活性化は、ＲＸＲα単独でみられた強さの約２倍であり、両方のレセプターが存在した場合、結合が９−シス−ＲＡの存在下でヘテロダイマーおよびホモダイマーの両者によって観察された、ＤＮＡ結合データと一致する（図６ａ）。βＲＡＲＥを試験したとき（図６ｂ）、この応答エレメントは、先の観察３７，４２と一致して、内因性のＣＶ−１細胞レセプターにより高く活性化されることが観察されたが、低濃度の同時トランスフェクトしたレセプターによるさらなる活性化は観察され得なかった。しかし、９−シス−ＲＡは、興味深いことに、１０−７Ｍにおいて、ＲＡより強い活性化剤であった。従って、これらのデータは、ＣＶ−１細胞が内因性レチノイドレセプター活性を含んでおり、その活性はβＲＡＲＥについて特に活性であり、そして９−シス−ＲＡに応答性であるということを示す。
【０１９６】
ＡｐｏＡＩエレメント含有リポーターはまた、９−シス−ＲＡの存在下でＲＸＲαにより非常に効果的に活性化されたが（図６ｃ）、ＲＸＲαの非存在下で得られるレベルを超えてＲＡは誘導しなかった。ＴＲＥｐａｌと同様に、レセプターＲＸＲαおよびＲＡＲαの両方を同時トランスフェクトした時、最大の活性化がみられた。これらの条件下で、ＲＡはまた強い活性化に至った。それに対して、ＣＲＢＰＩエレメント（ここでは、９−シス−ＲＡの存在下でＲＸＲによるＤＮＡ結合は観察されなかった）はまた、一時的なトランスフェクション研究においてＲＸＲおよび９−シス−ＲＡにより活性化されなかったが（図６ｄ）、ＲＡＲα単独で、大体において９−シス−ＲＡ依存性である顕著な活性化に至った。ヘテロダイマーＲＡＲαＲＸＲαは、９−シス−ＲＡの存在下で最大の活性化を可能にした。予測しなかったことではないが、ＲＸＲαおよび９−シス−ＲＡによる誘導は、ＭＨＣ−ＴＲＥ、ＭＥ−ＴＲＥ、またはＥＲＥについては観察されなかった。これらのインビボでの分析は、インビトロでのＤＮＡ結合研究で得られた結果に顕著な相関を示した。そこでは、９−シス−ＲＡの存在下でＲＸＲαによる強い活性化が、９−シス−ＲＡ誘導ＲＸＲαホモダイマーと強く相互作用する応答エレメントについてのみ観察される。
９−シスレチレイン酸は、ＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーによる活性化を阻害する
甲状腺ホルモン（Ｔ３）の存在下で、甲状腺ホルモンレセプター／ＲＸＲヘテロダイマーにより活性化されるＣＡＴでリポートされた遺伝子は、９−シス−ＲＡを添加することにより阻害され得る。この型の阻害は、トランスフェクションアッセイを用いて最も容易に測定される。
【０１９７】
実施例ＩＩ
ＲＸＲ活性を誘導する化合物の同定および選択
ＴＲＥｐａｌ−ｔｋ−リポーター遺伝子を、本質的には記載５１のように一時的なトランスフェクションアッセイに用い、ＲＸＲ活性の誘導について化合物を評価した。簡単に言えば、ＣＶ−１細胞またはＨｅｐ  Ｇ２細胞を、１０％ウシ胎児血清を補填したＤＭＥ培地中で生育させた。細胞は、トランスフェクション前に２４ウェルプレート中１６〜２４時間でウェル当たり１．０×１０５個にプレート培養した。一般的に、１００ｎｇのリポータープラスミド、１５０ｎｇのβ−ガラクトシダーゼ発現ベクター（ｐＣＨ１１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、およびレセプター発現ベクターの種々の量を、キャリアＤＮＡ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）と混合し、ウェル当たり１，０００ｎｇ全ＤＮＡとした。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を、先に記載５２のように対応するβ−ガラクトシダーゼ活性によりトランスフェクション効率を標準化した。実施例Ｉに示したように、ＴＲＥｐａｌは、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーおよびＲＸＲホモダイマーの両方により活性化される応答エレメントを表す。ＲＸＲ発現ベクターをＴＲＥｐａｌ−ｔｋ−リポーター遺伝子と、ＣＶ−１細胞に同時トランスフェクションする場合、全−トランス−ＲＡは、リポーターを効果的に活性化しないが、９−シス−ＲＡは活性化する。一連のレチノイドの評価は、幾つかがＲＸＲとの活性を示すことを指摘した。次いで、これらの構造物の薬効を有する（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｉｃ）エレメントを組み合わせ、そしてさらに改変してＲＸＲに対する活性化プロフィールが、９−シス−ＲＡのそれに類似するレチノイドのサブセットを生成した。ＲＸＲとの幾つかのレチノイド活性についての誘導曲線を図７ａに示す。興味深いことには、活性化合物のいずれもが、１０−８Ｍでは活性を示さなかったが、１０−７Ｍでは、全てが９−シス−ＲＡと同様の活性を示した。次に細胞質レチノール結合タンパク質ＩＩ（ＣＲＢＰＩＩ）のＲＡＲＥ３０を有するリポーター遺伝子を用いた。これは、ＲＸＲホモダイマーによってのみ活性化されるが、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーによっては活性化されない応答エレメントである。この応答エレメントにより得られた誘導プロフィールは、ＴＲＥｐａｌ応答物に似ていた（図７ｂ）。従って、合成レチノイドのＳＲ１１２０３、ＳＲ１１２１７、ＳＲ１１２３４、ＳＲ１１２３５、ＳＲ１１２３６、およびＳＲ１１２３７は、ＲＸＲαの効果的なアクティベーターのようであった。化合物の構造は、以下の通りである：
【０１９８】
【化５７】
2004159664.tif 000064
この一連のレチノイドについての活性ランキングは、ＴＲＥｐａｌおよびＣＲＢＰＩＩリポーター遺伝子の両者について同じであった。ケタールＳＲ１１２３７が最も活性であり、続いてイソプロピリデニルレチノイドＳＲ１１２１７、ヘミチオケタールＳＲ１１２３５およびチオケタールＳＲ１１２３４であった。ジチアンＳＲ１１２０３およびジオキサンＳＲ１１２３６は最も低い活性を有した。構造分析により、これらのレチノイドは、９−シス−ＲＡの親油性の頭部およびカルボキシル末端の空間的配向と類似の空間的配向を有し、しかも、活性がテトラヒドロナフタレンおよびフェニル環系に結合している置換基（ＣＲＲ１）の長さおよび体積に関係し得ることが示された。
【０１９９】
実施例Ｉに、ＲＸＲαホモダイマー形成を誘導することにより、９−シス−ＲＡがＲＸＲαを特異的に活性化することを示したので、ゲル遅延アッセイを用いて、ＴＲＥｐａｌへのレチノイド誘導ＲＸＲホモダイマー結合を研究した。簡単に言えば、ゲル遅延アッセイを、本質的には先に記載３３のように行った。インビトロで翻訳したレセプターレセプタータンパク質（翻訳効率に依存して１〜５ｍｌ）を、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドと２０ｍｌの反応混合物（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ  ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ、１０％グリセロール、および１ｍｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）含有）中で、２５℃、２０分間インキュベートした。次いで、反応混合物を、０．５×ＴＢＥ（１×ＴＢＥ＝０．０８９Ｍ  トリスボレート、０．０８９Ｍ  ホウ酸、および０．００２Ｍ  ＥＤＴＡ）含有の５％非変性ポリアクリルアミドゲル上にロードした。
【０２００】
９−シス−ＲＡの非存在下で、ＲＸＲはこの応答エレメントに結合しなかった。レチノイドＳＲ１１２１７、およびＳＲ１１２３７は、濃度に依存する様式で、応答エレメントへのＲＸＲホモダイマー結合を誘導した。レチノイド１１２０３（これは、一時的なトランスフェクションアッセイにおいて弱いアクティベーターとしてふるまった）はまた、弱いＲＸＲ結合のみを誘導した。ＳＲ１１２３１（これは、ＲＸＲホモダイマーを活性化しなかった）はまた、ＲＸＲホモダイマー結合を誘導し得なかった。同様の結果が、ＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥおよびＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥで得られた。従って、本明細書中において、ＲＸＲαを活性化する合成レチノイドのクラスを、ホモダイマー形成およびＤＮＡへの結合により規定した。
【０２０１】
重要な問題は、９−シス−ＲＡ様のこれらのＲＸＲ活性化化合物がまた、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを活性化し得るか、あるいは、それらが真にＲＸＲ選択性であり得るか否かであった。この問題を分析するために、以下のいずれかを保持する４つの異なるリポーター構築物を用いた：ｉ）ラット細胞質レチノール結合性タンパク質Ｉ（ＣＲＢＰＩ）遺伝子ＲＡＲＥ３８であり、これだけがＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーにより結合され活性化される；ｉｉ）ＲＡＲβ２遺伝子プロモーターＲＡＲＥ３６、３７、これはヘテロダイマーにより最も効率的に結合されるが、ＲＸＲホモダイマーによってもまたある程度までは活性化される；ｉｉｉ）ＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥ、これはＲＸＲホモダイマーによってのみ活性化され、そしてＲＡＲはＲＸＲ活性を抑制する３０；ｉｖ）アポリポプロテインＡＩ（ａｐｏＡＩ）遺伝子ＲＡＲＥ３１であり、これはＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーにより、およびＲＸＲホモダイマーにより結合され、そして活性化される。４つの異なるリポーター構築物を、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、ＲＸＲαで、またはＲＸＲαとＲＡＲαで一緒に同時トランスフェクトした５１。レチノイドを、５×１０−７の濃度で分析した（示した投与量でほとんど完全な誘導が得られた（図７））。
【０２０２】
ＣＶ−１細胞を、１００ｎｇのリポータープラスミドのａ）ＣＲＢＰＩ−ｔｋ−ＣＡＴ、ｂ）βＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ、ｃ）ＣＲＢＰＩＩ−ｔｋ−ＣＡＴ、およびｄ）ａｐｏＡＩ−ｔｋ−ＣＡＴで、同時トランスフェクトした。レチノイドを、５×１０−７Ｍで適用した。代表的な実験の結果を示す。
【０２０３】
ＲＸＲ特異的レチノイドは、ＲＸＲホモダイマーを活性化するのみであるが、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを活性化しない点で、９−シス−ＲＡ（またはＲＡ）とは著しく異なって作用する。９−シス−ＲＡとのように、ＳＲ１１２１７およびＳＲ１１２３７の両者は、ＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥ（すなわち、ＲＸＲホモダイマーによってのみ顕著に活性化されるＲＡＲＥ）の強いアクティベーターである。しかし、９−シス−ＲＡに比べて、それらは、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーによってのみ活性化されるＣＲＢＰＩ−ＲＡＲＥを誘導しなかった。従って、ＳＲ１１２１７およびＳＲ１１２３７は、ＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥについて、９−シス−ＲＡに非常に似た作用をするが、それらはＣＲＢＰＩ−ＲＡＲＥについては応答を示さず、ここでは、９−シス−ＲＡは最適のアクティベーターである。βＲＡＲＥは、ＳＲ１１２１７およびＳＲ１１２３７によりわずかに活性化され、この応答エレメントについてのＲＸＲホモダイマーの比較的低い親和性と一致した。ａｐｏＡＩ−ＲＡＲＥは、９−シス−ＲＡの存在下で、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーにより最も効果的に活性化された。ＣＶ−１細胞中で見出された活性に加えて、レチノイドＳＲ１１２１７およびＳＲ１１２３７により、顕著なそしてＲＸＲ特異的な活性化がまた、種々の他の細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を含む）においても観察され、ここでは、特に高い応答が観察された。ＲＡＲαおよびＲＡＲβは、同時トランスフェクトしただけの場合は、試験した任意の応答エレメントについても、任意の合成レチノイドによっても顕著に活性化されなかった。同様のネガティブな結果がＲＡＲγについて得られた。ＲＡＲαおよびβは、ＣＶ−１細胞中で、内因性のＲＸＲ様タンパク質とヘテロダイマーを形成すると仮定される。従って、これらのヘテロダイマーはまた、合成レチノイドに非応答性である。
【０２０４】
これらのデータは、新規なクラスのレチノイド類を同定したことを示す。これらのレチノイド類は、ＲＸＲホモダイマー形成を特異的に誘導し、そして特異的に応答エレメントについてＲＸＲホモダイマーを活性化するが、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを活性化しない。これらのレチノイド類は、ＲＸＲ選択的応答経路の特異的な活性化を可能にするが、ＲＡＲ依存性応答経路の誘導はしない。これらのレチノイド類は、現在用いられているＲＡ異性体または他のレチノイドに比べさらに制限された生理学的応答を提供する。
【０２０５】
実施例ＩＩＩ
【０２０６】
【化５８】
2004159664.tif 000065
（ａ．）メチル４−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］ベンゾエート（３）：
１．５ｍＬの１，２−ジクロロメタン中の塩化アルミニウム（１．１３ｇ、８．５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃で、アルゴン雰囲気下にて、６ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４−テトラメチルナフタレン１（１．４５ｇ、７．７ｍｍｏｌ）（Ｋａｇｅｃｈｉｋａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：２１８２（１９８８））および４−カルボメトキシベンゾイルクロライド２（１．５６ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の溶液を添加した（４−カルボメトキシベンゾイルクロライド２は、Ａｌｄｒｉｃｈから容易に入手可能なモノメチルテレフタレートから、１工程（ＳＯＣｌ２、ＤＭＦ）により得た）。得られた溶液を室温まで昇温し、その後１６時間撹拌した。反応混合物を、氷水上に注ぎ、４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。溶液を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して橙色の固体（４．５ｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物３を、淡黄色の固体（２．０７ｇ）として得た。ジクロロメタン／ヘキサンからの再結晶により、所望の生成物３を、白色の結晶性固体として得た（１．９６ｇ、５０％）：融点１４６〜１４８℃；Ｒｆ  ０．１４（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２０７】
（ｂ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−ジチアン（４）：
３ｍＬのクロロホルム中のケト−エステル３（９７ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、アルゴン雰囲気下にて、１，３−プロパンジオール（３３μＬ、３６ｍｇ、０．３３２ｍｍｏｌ）の溶液、続いて三フッ化ホウ素エーテル錯体（１７μＬ、０．１４０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、０℃で１時間撹拌し、次いで一晩室温まで温めた。反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液中に注ぐことによりクエンチし、そしてジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して黄色の固体（０．１０８ｇ）を得た。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶により、所望のジチアン４を、白色の結晶性固体として得た（０．０８７ｇ、７１％）：融点１９５〜１９７℃；Ｒｆ  ０．３２（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２０８】
（ｃ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチルナフタレン−２−イル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−ジチアン（５）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル４（８５ｍｇ、０．１９３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０．０２４ｇの水酸化カリウムを添加し、そして混合物を５０℃でこの物質が溶解するまで２時間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液で酸性にし、次いで８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ベンゼン／ヘキサンからの再結晶により、所望の酸５を、白色粉末として得た（０．０７６ｇ、９２％）：融点２２９〜２３１℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２０９】
実施例ＩＶ
【０２１０】
【化５９】
2004159664.tif 000066
（ａ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−ジチオラン（６）：
ジクロロメタン（２ｍＬ）中のケト−エステル３（８０ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、アルゴン雰囲気下にて、ジクロロメタン（０．５ｍＬ）中のエタンジチオール（２６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）、続いて三フッ化ホウ素エーテル錯体（０．０４ｍＬ、０．３ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、０℃で１時間撹拌し、次いで一晩室温まで温めた。反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液中に注ぐことによりクエンチし、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（３０；４０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、所望のジチアン６を白色固体として得た（０．０８８ｇ、９０％）：融点１０５〜１０７℃；Ｒｆ  ０．３３（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２１１】
（ｂ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−ジチオラン（７）：
７５％水性メタノール溶液（３ｍＬ）中のエステル６（８５ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１１ｇ）を添加し、そして混合物を７０℃でこの物質が溶解するまで１時間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液で酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン−ヘキサンからの再結晶により、所望の酸７を、白色粉末として得た（０．０６４ｇ、７９％）：融点２１８〜２２１℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２１２】
実施例Ｖ
【０２１３】
【化６０】
2004159664.tif 000067
（ａ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−ジオキソラン（８）：
１ｍＬのベンゼン中のケト−エステル３（８０ｍｇ、０．２２８）の溶液に、エチレングリコール（１ｍＬ）、１，２−ビス（トリメチルシリルオキシ）エタン（２ｍＬ）、および触媒量のｐ−ＴｓＯＨを添加した。反応混合物を４時間還流加熱し、次いで室温まで冷却した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、所望のケタール８を白色固体として得た（０．０８２ｇ、９１％）：融点１４５〜１４７℃；Ｒｆ  ０．１６（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２１４】
（ｂ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−ジオキソランアンモニウム塩（１０）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル８（５０ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１ｇ）を添加し、そして反応混合物を７０℃でこの物質が溶解するまで１時間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液で酸性にし、次いで８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体９を得た。この酸９を、アルゴン雰囲気下にてジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解し、そして溶液中にアンモニアガスを凝縮し、それを５分間、−３３℃で撹拌した。溶液を２０分間室温まで温め、アンモニアをエバポレートし、そして濃縮してアンモニウム塩１０を白色粉末として得た（４７ｍｇ、９３％）：融点２５９〜２６１℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２１５】
実施例ＶＩ
【０２１６】
【化６１】
2004159664.tif 000068
（ａ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−オキサチオラン（１１）：
２ｍＬのベンゼン中のケト−エステル３（８８ｍｇ、０．２５１）の溶液に、２−メルカプトエタノール（１ｍＬ）、および触媒量のｐ−ＴｓＯＨを添加した。反応混合物を一晩還流加熱し、次いで室温まで冷却した。溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、所望のケタール１１を白色固体として得た（０．０９ｇ、８７％）：融点１２２〜１２４℃；Ｒｆ  ０．２４（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２１７】
（ｂ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−オキサチオラン（１２）：
７５％水性メタノール溶液（３ｍＬ）中のエステル１１（６４ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１２ｇ）を添加し、そして反応混合物を７５℃でこの物質が溶解するまで１時間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液で酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン−ヘキサンからの再結晶により、所望の酸１２を、白色粉末として得た（０．０６ｇ、９７％）：融点２１６〜２１７．５℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２１８】
実施例ＶＩＩ
【０２１９】
【化６２】
2004159664.tif 000069
（ａ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−ジオキサン（１３）：
５ｍＬのベンゼン中のケト−エステル３（１５０ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）の溶液に、１，３−プロパンジオール（１．５ｍＬ）、および触媒量のｐ−ＴｓＯＨを添加した。反応混合物を、一晩還流加熱し、次いで室温まで冷却した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、所望のケタール１３を白色固体として得た（０．１６４ｇ、９４％）：融点１５７〜１５９℃；Ｒｆ  ０．２４（５％酢酸エチル／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２０】
（ｂ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−ジオキサンアンモニウム塩（１５）：
７５％水性メタノール溶液（３ｍＬ）中のエステル１３（０．１ｇ、０．２４５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１２ｇ）を添加した。反応混合物を８０℃でこの物質が溶解するまで３０分間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液で酸性にし、次いで８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体１４を得た。酸１４を、アルゴン雰囲気下にてジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解した。アンモニアガスをフラスコ中に凝縮し、そして混合物を５分間、−３３℃で撹拌した。溶液を、２０分間で室温まで温め、アンモニアをエバポレートし、そして濃縮してアンモニウム塩１５を、白色粉末として得た（０．２３８ｇ、９７％）：融点２２８〜２３０℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２１】
実施例ＶＩＩＩ
【０２２２】
【化６３】
2004159664.tif 000070
（ａ．）メチル４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−エテニル］ベンゾエート（１６）：
５ｍＬのベンゼン中のメチルトリフェニルホスホニウムブロマイド（０．７８ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、ヘキサメチルジシラジドカリウムの０．５Ｍトルエン溶液（４．４ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を添加し、そして黄色の溶液を５分間撹拌した。７ｍＬのベンゼン中のケトエステル３（０．５１ｇ、１．４５５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そして橙色の溶液を、１時間室温で撹拌した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、シリカゲルのプラグを通して濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（３０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物１６を白色固体として得た（０．４０５ｇ、８０％）：融点１１７〜１１８℃；Ｒｆ  ０．２（２５％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２３】
（ｂ．）［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−（４−カルボメトキシフェニル）］シクロプロパン（１７）：
１０ｍＬのベンゼン中のエテン１６（０．１３０ｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、ジエチル亜鉛の１Ｍヘキサン溶液（５．６ｍＬ、５．６ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を６０℃まで加熱した。２ｍＬのベンゼン中のジヨードメタン（０．４８ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を５分間滴下した。反応混合物を室温まで冷却し、そして酸素を３時間通じた。濁った溶液を、４０％酢酸エチル／ヘキサンで希釈し、そして塩酸水溶液、水、および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（３０％；４０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、所望の生成物１７を白色固体として得た（０．０８ｇ、５９％）：融点１００〜１０２℃；Ｒｆ  ０．３６（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２４】
（ｃ．）［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−（４−カルボキシフェニル）］シクロプロパン（１８）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル１７（６０ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１２ｇ）を添加し、そして反応混合物を７０℃でこの物質が溶解するまで１時間撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液で酸性にし、次いで８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン−ヘキサンから再結晶により、所望の酸１８を、白色粉末として得た（０．０５５ｇ、９５％）：融点３３３〜３３５℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２５】
実施例ＩＸ
【０２２６】
【化６４】
2004159664.tif 000071
（ａ．）メチル４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−メチル−１−プロペニル］ベンゾエート（１９）：
３ｍＬのベンゼン中のイソプロピルトリフェニルホスホニウムヨージド（０．３５ｇ、０．８０７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、トルエン（１．８ｍＬ、０．８９ｍｍｏｌ）中のヘキサメチルジシラジドカリウムの０．５Ｍ溶液を添加し、そして赤色の溶液を、５分間撹拌した。３ｍＬのベンゼン中のケト−エステル３（０．１６９ｇ、０．４８１ｍｍｏｌ）を添加し、そして、約４ｍＬのベンゼンが蒸発する間、赤色の溶液を１１０℃まで加熱した。１時間後、反応混合物を、４０％の酢酸エチル／ヘキサンで希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、シリカゲルのプラグを介して濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（４０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物１９を白色粉末として得た（０．１２８ｇ、７１％）：Ｒｆ  ０．４４（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２７】
（ｂ．）４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−メチル−１−プロペニル］安息香酸（２０）：
７５％水性メタノール溶液（３ｍＬ）中のエステル１９（０．１１５ｇ、０．３０４ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１２ｇ）を添加した。混合物を、この物質が溶解するまで１時間、７５℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して所望の酸２０を白色粉末として得た（０．１１ｇ、９９％）：融点２０４〜２０６℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２２８】
実施例Ｘ
【０２２９】
【化６５】
2004159664.tif 000072
（ａ．）メチル４−［（４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）カルボニル］ベンゾエート（２２）（Ｍａｉｇｎａｎ，Ｊ．ら、ＢＥ  １，０００，１９５）：
１ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の塩化アルミニウム（１．６ｇ、１２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて９ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン２１（１．５ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）（Ｄａｗｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１５１６−１５３１（１９８４））および４−カルボメトキシベンゾイルクロライド２（１．７９ｇ、９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、氷水上に注ぎ、４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して黄色の固体（３．２４ｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（８０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物２２を白色粉末として得た（１．４２ｇ、４９％）：融点１２９〜１３１℃；Ｒｆ  ０．２６（ＣＨ２Ｃｌ２）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３０】
（ｂ．）［２−（４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−ジチアン（２３）：
ジクロロメタン（３ｍＬ）中のケト−エステル２２（０．１５２ｇ、０．４６９ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でアルゴン雰囲気下にて１，３−プロパンジチオール（０．０６１ｇ、０．５６３ｍｍｏｌ）を添加し、続いて三フッ化ホウ素エーテル錯体（０．０７ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を０℃で１時間、そして常温で一晩撹拌した。反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液に注いでクエンチし、次いで、４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮してオイルを得た。フラッシュクロマトグラフィー（８０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望のジチアン２３を白色固体として得た（０．１７５ｇ、９０％）：融点１０３〜１０５℃；Ｒｆ  ０．２（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３１】
（ｃ．）［２−（４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−ジチアン（２４）：
７５％水性メタノール溶液（４ｍＬ）中のジチアン２３（０．１４５ｇ、０．３４９ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化ナトリウム１粒（０．１０６ｇ）を添加した。反応混合物を、この物質が溶解するまで１時間、７０℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン−ヘキサンから再結晶することにより、所望の酸２４を白色粉末として得た（０．１２７ｇ、９０％）：融点２０４〜２０５℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３２】
実施例ＸＩ
【０２３３】
【化６６】
2004159664.tif 000073
（ａ．）メチル４−［（４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６−イル）カルボニル］ベンゾエート（２６）：
１ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の塩化アルミニウム（１．６５ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下で、９ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン２５（１．６５ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）（Ｗａｕｇｈ，Ｋ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：１１６−１２４（１９８５））および４−カルボメトキシベンゾイルクロライド２（１．８ｇ、９．０６ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を、一晩撹拌し、氷水上に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して緑色の固体（２．１ｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（８０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物２６を白色粉末として得た（１．２３ｇ、４０％）：融点１１８〜１２０℃；Ｒｆ  ０．３５（ＣＨ２Ｃｌ２）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３４】
（ｂ．）［２−（４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６−イル）−２−（４−カルボメトキシフェニル）］−１，３−ジチアン（２７）：
ジクロロメタン（３ｍＬ）中のケト−エステル２６（０．１２ｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でアルゴン雰囲気下にて１，３−プロパンジチオール（０．０６ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加し、続いて三フッ化ホウ素エーテル錯体（０．０７ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加した。得られる混合物を０℃で１時間撹拌し、そして室温で一晩温めた。反応混合物を、飽和Ｎａ２ＣＯ３水溶液中に注いでクエンチし、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮してオイルを得た。フラッシュクロマトグラフィー（８０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）により、所望のジチアン２７を白色固体として得た（０．１４５ｇ、９６％）：融点１６４〜１６６℃；Ｒｆ  ０．２７（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３５】
（ｃ．）［２−（４，４−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン−６−イル）−２−（４−カルボキシフェニル）］−１，３−ジチアン（２８）：
７５％水性メタノール溶液（４ｍＬ）中のジチアン２７（０．１ｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１２ｇ）を添加した。反応混合物を、この物質が溶解するまで１時間、７５℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン／ヘキサンからの再結晶により、所望の酸２８を白色粉末として得た（０．０８９ｇ、９２％）：融点２１１〜２１２．５℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３６】
実施例ＸＩＩ
【０２３７】
【化６７】
2004159664.tif 000074
（ａ．）メチル［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］ベンゾエート（３０）：
３０ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の塩化アルミニウム（１．１０ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下で、１５ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４，６−ペンタメチルナフタレン２９（１．５２ｇ、７．５ｍｍｏｌ）（Ｋａｇｅｃｈｉｋａ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：２１８２（１９８８））および４−カルボメトキシベンゾイルクロライド２（１．５７ｇ、７．８７ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を一晩撹拌し、氷水上に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。溶液を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して褐色の固体（２．５６ｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（６０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物３０を白色の結晶性固体として得た（１．７３３ｇ、６４％）：融点１４６〜１４９℃；Ｒｆ  ０．１１（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３８】
（ｂ．）［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］安息香酸（３１）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル３０（０．１２０ｇ、０．３２９ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム（０．０５５ｇ）を添加した。反応混合物を、この物質が溶解するまで１時間、６０℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た（０．１０９ｇ）。ベンゼン／ヘキサンからの再結晶により、３１を白色の結晶性固体として得た（０．１０２ｇ、８９％）：融点２０９〜２１２℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２３９】
実施例ＸＩＩＩ
【０２４０】
【化６８】
2004159664.tif 000075
（ａ．）メチル４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）−１−エテニル］ベンゾエート（３２）：
１ｍＬのベンゼン中のメチルトリフェニルホスホニウムブロマイド（０．１９６ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、トルエン（１．２ｍＬ、０．６ｍｍｏｌ）中のヘキサメチルジシラジドカリウムの０．５Ｍ溶液を添加し、そしてこの黄色溶液を５分間撹拌した。１．５ｍＬのベンゼン中のケト−エステル３０（０．１ｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そして橙色の溶液を室温で３時間撹拌した。反応混合物を、４０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルのプラグを介して濾過した。濾液を濃縮して、固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（３０％；４０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、所望の生成物３２を白色の結晶性固体として得た（０．０７７ｇ、７８％）：融点１６７〜１６８℃；Ｒｆ  ０．４（５０％ジクロロメタン／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２４１】
（ｂ．）［４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）−１−エテニル］安息香酸（３３）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル３２（０．０５８ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１ｇ）を添加した。混合物を、この物質が溶解するまで１時間、７０℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン／ヘキサンからの再結晶により、所望の酸３３を白色の結晶性固体として得た（４２ｍｇ、９１％）：融点２３０〜２３１℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２４２】
実施例ＸＩＶ
【０２４３】
【化６９】
2004159664.tif 000076
（ａ．）５−カルボエトキシチオフェン−２−カルボン酸（３５）：
１０ｍＬのＴＨＦ中のジイソプロピルアミン（３．６ｍＬ、２５．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、−７８℃でアルゴン雰囲気下にて、ヘキサン（１６．１ｍＬ、２５．７５ｍｍｏｌ）中のｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液を添加した。混合物を１５分間撹拌し、そして５ｍＬのＴＨＦ中の２−チオフェンカルボン酸３４（１．５ｇ、１１．７０５ｍｍｏｌ）（２−チオフェンカルボン酸３４はＡｌｄｒｉｃｈより容易に入手可能である）の溶液を徐々に添加した。混合物を１５分間撹拌し、そしてエチルクロロホルメート（２．７ｍＬ、２８．３３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、そして次の３０分間で０℃まで昇温した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、そして８０％酢酸エチル／ヘキサンで洗浄した。水層を酢酸で酸性にし、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して黄色の固体を得た。フラッシュクロマトグラフィーにより、所望の酸３５（１．７６ｇ、７５％）を白色固体として得た：融点は３００℃を超える。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２４４】
（ｂ．）５−カルボエトキシチオフェン−２−カルボニルクロライド（３６）：
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の酸３５（０．６４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、ジクロロメタン（２．４ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）中の（ＣＯＣｌ）２の２．０Ｍ溶液およびＤＭＦ２滴を添加し、１時間撹拌した。過剰の（ＣＯＣｌ）２およびジクロロメタンを減圧下で除去し、そして粘性の明るい黄色の生成物を、一晩乾燥し、所望のベンゾイルクロライド３６を黄色の固体として得た。生成物の構造もまた、ＩＲ、および１Ｈ  ＮＭＲ分光法を用いて確認した。
【０２４５】
（ｃ．）エチル５−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］チオフェン−２−カルボキシレート（３７）：
１ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の塩化アルミニウム（０．５ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、３．５ｍＬの１，２−ジクロロエタンの１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４，６−ペンタメチルナフタレン２９（０．７１２ｇ、３．５２ｍｍｏｌ）および３６（０．７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。反応混合物を一晩撹拌し、次いで、氷水上に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。溶液を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して黄色固体（１．５ｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５０％ジクロロメタン／ヘキサン）により、明るい黄色の固体を得た。ジクロロメタン／ヘキサンからの再結晶により、３７を白色の結晶性固体として得た（０．６２ｇ、５０％）：融点１１１〜１１２℃；Ｒｆ  ０．２（５０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２４６】
（ｄ．）５−［（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］チオフェン−２−カルボン酸（３８）：
７５％水性メタノール溶液（３ｍＬ）中のエステル３７（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム１粒（０．１ｇ）を添加した。反応混合物を、この物質が溶解するまで１．５時間、７０℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た（４６ｍｇ）。メタノールからの再結晶により、所望の酸３８を白色の結晶性固体として得た（４２ｇ、９１％）：融点２１４〜２１５℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２４７】
実施例ＸＶ
【０２４８】
【化７０】
2004159664.tif 000077
（ａ．）２−アセチル−３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロナフタレン（３９）：
１ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の塩化アルミニウム（０．９６ｇ、７．１７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、室温でアルゴン雰囲気下にて、９ｍＬの１，２−ジクロロエタン中の１，２，３，４−テトラヒドロ−１，１，４，４，６−ペンタメチルナフタレン２９（１．２ｇ、５．９３ｍｍｏｌ）およびアセチルクロライド（０．５１ｇ、６．５２ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を１時間撹拌し、次いで、氷水上に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。溶液を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、シリカゲルのプラグを介して濾過し、そして濃縮して白色固体３９を得た（１．４５ｇ、９９％）：融点５４〜５７℃；Ｒｆ  ０．６２（１０％酢酸エチル／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２４９】
（ｂ．）エチル（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−６−オキソ−６−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）−２−ヘキセノエート（４１）：
７ｍＬのＴＨＦ中のジイソプロピルアミン（０．５ｍＬ、３．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、−７８℃でアルゴン雰囲気下にて、ヘキサン（２．２ｍＬ、３．５２ｍｍｏｌ）中のｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液を添加した。混合物を２５分間撹拌し、そして４ｍＬのＴＨＦ中のケトン３９（０．７８ｇ、３．２ｍｍｏｌ）の溶液を徐々に添加した。混合物を２０分間撹拌し、そして３ｍＬのＴＨＦ中のエチル（Ｅ）−３−ホルミル−２−ブテノエート４０（０．４５ｇ、３．２ｍｍｏｌ）（エチル（Ｅ）−３−ホルミル−２−ブテノエート４０はＦｌｕｋａより容易に入手可能である）の溶液を徐々に添加した。混合物を−７８℃で３５分間撹拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液中に注ぎ、そして４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して明るい黄色の固体を得た。フラッシュクロマトグラフィーにより、所望のアルコール４１を白色の結晶性固体として得た（０．９８ｇ、８０％）：融点１２６〜１２８℃；Ｒｆ  ０．１３（１０％酢酸エチル／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２５０】
（ｃ．）エチル（２Ｅ，４Ｅ）−６−オキソ−６−（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）−２，４−ヘキサジエノエート（４２）：
８ｍＬのＴＨＦ中の４１（０．３３ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、トリエチルアミン（０．５ｍＬ、４ｍｍｏｌ）および２ｍＬのＴＨＦ中のメチルスルホニルクロライド（０．１０６ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の溶液を徐々に添加した。混合物を０℃で１時間撹拌し、そして３０分間室温まで昇温した。混合物を、１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカゲルのプラグを介して濾過した。濾液を濃縮して、４２を明るい黄色の固体として得た。ジクロロメタン／ヘキサンからの再結晶により、所望の酸４２を黄色の粉末として得た（０．３ｇ、９５％）：融点１０１〜１０２℃；Ｒｆ  ０．４２（１０％酢酸エチル／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２５１】
（ｄ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボエトキシ−２Ｅ，４Ｅ−３−メトキシブタジエニル）］−１，３−ジオキソラン（４３）：
２ｍＬのベンゼン中のケト−エステル４２（０．１２ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、エチレングリコール（０．８ｍＬ）、１，２−ビス（トリメチルシリルオキシ）エタン（２ｍＬ）および触媒量のｐ−ＴｓＯＨを添加した。反応混合物を２日間還流加熱し、次いで、室温まで冷却した。溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中に注ぎ、４０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して固体を得た。フラッシュクロマトグラフィー（５％酢酸エチル／ヘキサン）により、所望のケタール４３を無色のオイルとして得た（０．１０９ｇ、８０％）：Ｒｆ  ０．４３（１０％酢酸エチル／ヘキサン）。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２５２】
（ｅ．）［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−３，５，５，８，８−ペンタメチル−２−ナフタレニル）−２−（４−カルボキシ−２Ｅ，４Ｅ−３−メチルブタジエニル）］−１，３−ジオキソラン（４４）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル４３（３０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化カリウム１粒（０．１ｇ）を添加した。反応混合物を、この物質が溶解するまで０．５時間、６０℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、１Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、８０％酢酸エチル／ヘキサンで抽出した。合わせた有機層を、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ジクロロメタン／ヘキサンからの再結晶により、所望の酸４４を白色の結晶性固体として得た（２７ｍｇ、９６％）：融点１８９〜１９０℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２５３】
実施例ＸＶＩ
【０２５４】
【化７１】
2004159664.tif 000078
（Ｅ）および（Ｚ）−４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）プロペン−１−イル］安息香酸（４６および４７）：
１ｍＬのＴＨＦ中のエチルトリフェニルホスホニウムブロマイド（１６０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の懸濁液に、０℃でアルゴン雰囲気下にて、トルエン（０．９５ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）中のヘキサメチルジシラジドカリウムの０．５Ｍ溶液を添加し、そして反応混合物を、５分間撹拌した。０．８ｍＬのＴＨＦ中のケト−エステル３の溶液（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加し、そして橙色の溶液を室温で３時間撹拌した。反応混合物を２０％酢酸エチル／ヘキサンで希釈し、そして２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いてシリカのプラグを介して濾過した。溶液を濃縮して黄色のゴム状物を得た。クロマトグラフィー（３８％ジクロロメタン／ヘキサン）により、４５の混合物を淡黄色のゴム状物として得た（５１ｍｇ、５０％）：Ｒｆ  ０．４３、０．４７（４０％ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｒａｄｉａｌｐａｋ  Ｎｏｖａｐａｋシリカ、８ｍｍ×１０ｃｍ、２％エーテル／ヘキサン、１．０ｍＬ／分、２６０ｎｍ）により、無色のガム状物４５ａ（２０ｍｇ、ｔｒ＝９．８分）および白色の固体４５ｂ（２５ｍｇ、ｔｒ＝１０．８分）を得た。
【０２５５】
０．５ｍＬのエタノール中のエステル４５ａ（２０ｍｇ）の懸濁液に、水酸化カリウム（０．２ｇ）の４０％水溶液を添加し、そして反応混合物を、この物質が溶解するまで２時間、７０℃でアルゴン雰囲気下にて撹拌した。次いで、溶液をアルゴン雰囲気下で濃縮した。残渣を室温まで冷却し、１Ｎの硫酸水溶液を用いてｐＨ２〜３に酸性にし、次いで、濾過した。沈殿物を繰り返し水（６回×１ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥して白色粉末（２０ｍｇ）を得た。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶により、酸４６を白色粉末として得た（１６ｍｇ、全収率１６％）：融点２１２℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。４６の位置化学（ｒｅｇｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を１Ｈ  ｎＯｅ  ＮＭＲ分光法により確認した。
【０２５６】
エステル４５ｂを上記のように加水分解して２５ｍｇの淡黄色の固体を得た。酢酸エチル／ヘキサンからの再結晶により、酸４７を淡黄色の粉末として得た（２１ｍｇ、全収率２０％）：融点２２９℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。４７の位置化学を１Ｈ  ｎＯｅ  ＮＭＲ分光法により確認した。
【０２５７】
実施例ＸＶＩＩ
【０２５８】
【化７２】
2004159664.tif 000079
（ａ．）４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−エテニル］安息香酸（４８）：
７５％水性メタノール溶液（２ｍＬ）中のエステル１６（９４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、水酸化カリウム（０．０４５ｇ）を添加し、そして反応混合物を、この物質が溶解するまで１４時間、５０℃で撹拌した。溶液を室温まで冷却し、２Ｎの塩酸水溶液を用いて酸性にし、次いで、エーテルで抽出した。合わせた有機層を、水および塩水で洗浄した。次いで、有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、そして濃縮して白色固体を得た。ベンゼン−ヘキサンからの再結晶により、所望の酸４８を白色の結晶性固体として得た（０．０７４ｇ、８２％）：融点２０１〜２０４℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２５９】
（ｂ．）４−［１−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−１−エチル］安息香酸（４９）：
オレフィン４８（０．０１０５ｇ、０．０３１４ｍｍｏｌ）を、室温および大気圧下で、チャコール担持５％パラジウムで水素化した。１当量（０．７ｍＬ）の水素を取り込ませた後、触媒を小さなセライトパッドを介して濾過することにより取り除いた。溶媒を真空下で取り除き、粗製の酸を白色固体として得た（０．０１９ｇ）。ベンゼン−ヘキサンからの再結晶により、所望の酸４９を白色の結晶性固体として得た（０．００７８ｇ、７４％）：融点１８６〜１８８℃。生成物の構造もまた、ＩＲ、１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分析を用いて確認した。
【０２６０】
上記の実施例は、本発明を限定するのではなく、例示するためものであることが意図される。それらが使用され得る代表的なものである一方で、当業者に公知の他の手順が、代わりに用いられ得る。
【０２６１】
本出願を通して、種々の刊行物が番号により援用される。それにより、それらの刊行を完全に引用する。これらの刊行物における開示は全体として、本発明が属する当該分野の状態をより充分に記載するために、本出願に参考として援用される。
【０２６２】
【化７３−１】
2004159664.tif 000080
【０２６３】
【化７３−２】
2004159664.tif 000081
【０２６４】
【化７３−３】
2004159664.tif 000082
【０２６５】
【化７４−１】
2004159664.tif 000083
【０２６６】
【化７４−２】
2004159664.tif 000084
【０２６７】
【化７４−３】
2004159664.tif 000085
【０２６８】
【化７４−４】
2004159664.tif 000086
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】図１は、９−シス−レチノイン酸がＴＲＥｐａｌに関してＲＸＲホモダイマー結合を誘導することを示す。
【０２７０】
（ａ）インビトロで合成されたＲＸＲαを、インビトロ合成ＴＲαまたはＲＡＲβの存在下または非存在下のいずれかで、示されたホルモン（１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡ；１０−６Ｍ  ＲＡ；１０−６Ｍ  Ｔ３）とともに（＋）またはなし（−）のいずれかで室温で３０分間インキュベートした。このプレインキュベーションの後、反応混合物をプローブとして３２Ｐ−標識ＴＲＥｐａｌを使用してゲル遅延アッセイにより分析した。レーン１は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を表す。白三角は、非プログラム化網状赤血球溶解液で観測される非特異的複合体を示す。黒三角は、特異的ＴＲα−ＲＸＲαヘテロダイマー結合を示す。矢印は、特異的ＲＸＲαホモダイマー結合を示す。ＲＸＲα／ＲＡＲβヘテロダイマーは、ＲＸＲαホモダイマーと同じ位置に移動する。比較のために、ＲＡＲβ結合に関する９−シス−ＲＡの影響を示す。
【０２７１】
（ｂ）９−シス−ＲＡで誘導されたＤＮＡ結合複合体がＲＸＲαタンパク質を含むことを測定するために、フラッグ（Ｆｌａｇ）−ＲＸＲα（Ｆ−ＲＸＲ）（特異的抗フラッグモノクローナル抗体によって認識され得る、アミノ末端に８個のアミノ酸のエピトープ（フラッグ）を含むＲＸＲα誘導体である）を構築した。インビトロ合成Ｆ−ＲＸＲαを、特異的抗フラッグ抗体（αＦ）または非特異的プレ免疫血清（ＮＩ）のいずれかの存在中で１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡとともに（＋）またはなし（−）のいずれかで室温で３０分間インキュベートした。次に、９−シス−ＲＡの存在下でＦ−ＲＸＲα結合に関する抗フラッグ抗体の影響を、プローブとして３２Ｐ−標識ＴＲＥｐａｌを用いるゲル遅延アッセイにより分析した。レーン１は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を示す（白三角）。矢印は、特異的Ｆ−ＲＸＲαホモダイマーおよびＲＡＲ−ＲＸＲヘテロダイマー結合を示す。菱形は、抗フラッグ抗体で上にシフトしたＦ−ＲＸＲホモダイマーを示す。
【図２−１】図２は、ＴＰＥｐａｌに関する９−シス−ＲＡで誘導されたＲＸＲホモダイマーの特徴付けを示す。
【０２７２】
（ａ）９−シス−ＲＡで誘導されたＲＸＲαホモダイマーの協同的結合。１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡの存在下または非存在下で異なるレセプター濃度でのＲＸＲ−ＤＮＡ複合体の形成を、プローブとして標識ＴＰＥｐａｌを使用するゲル遅延アッセイにより分析した。白三角は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を示す。矢印は、特異的にＲＸＲが結合した複合体を示す。
【０２７３】
【図２−２】（ｂ）９−シス−ＲＡの存在下の異なるレセプター濃度でのＲＸＲ結合複合体の定量。図２（ａ）に示した９−シス−ＲＡ存在下のＲＸＲ結合複合体を含有するゲルスライスを切除し、そしてシンチレーションカウンターで計測しそしてプロットした。
【０２７４】
【図２−３】（ｃ）ＴＲＥｐａｌに関するＲＸＲホモダイマーの９−シス−ＲＡ濃度依存性結合。等量のインビトロ合成ＲＸＲタンパク質を、９−シス−ＲＡの示された濃度を用いてインキュベートした。次に、反応混合物をプローブとして標識ＴＰＥｐａｌを使用するゲル遅延アッセイにより分析した。白三角は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を示す。矢印は、特異的にＲＸＲが結合した複合体を示す。
【図３−１】図３は、９−シス−ＲＡが、ＲＸＲ特異的応答エレメントに関してＲＸＲホモダイマー結合を誘導することを示す。
【０２７５】
（ａ）本研究で使用した核レセプター結合エレメント。これらのオリゴヌクレオチドを、小文字で示したように両端の適切な制限部位を有して合成した。ＡＧＧ／ＴＴＣＡモチーフに緊密に関連する配列を矢印で示す。
【図３−２】（ｂ）ＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥまたはＣＲＢＰＩＩ−ＲＡＲＥのＲＸＲホモダイマー結合に関する９−シス−ＲＡの影響を、本質的に図１ａに記載されるように分析した。レーン１は非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を表し、これは白三角により示される。黒三角は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体を示す。矢印は特異的にＲＸＲが結合した複合体を示す。
【図４−１】図４は、ＲＸＲホモダイマーの応答エレメント特異的結合を示す。ＲＡ特異的応答エレメント（ａ）、Ｔ３特異的応答エレメント（ｂ）、またはエストロゲン特異的応答エレメント（ｃ）上のＲＸＲ結合に関する９−シス−ＲＡの影響を、図１ａで記載されたようなゲル遅延アッセイにより分析した。比較として、ＲＸＲ／ＲＡＲヘテロダイマー（ａ）、ＲＸＲ／ＴＲヘテロダイマー（ｂ）またはエストロゲン（ｃ）の結合を示す。白三角は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を示す。黒三角形は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体（ａ）、ＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体（ｂ）またはＥＲ複合体（ｃ）を示す。
【図４−２】図４は、ＲＸＲホモダイマーの応答エレメント特異的結合を示す。ＲＡ特異的応答エレメント（ａ）、Ｔ３特異的応答エレメント（ｂ）、またはエストロゲン特異的応答エレメント（ｃ）上のＲＸＲ結合に関する９−シス−ＲＡの影響を、図１ａで記載されたようなゲル遅延アッセイにより分析した。比較として、ＲＸＲ／ＲＡＲヘテロダイマー（ａ）、ＲＸＲ／ＴＲヘテロダイマー（ｂ）またはエストロゲン（ｃ）の結合を示す。白三角は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を示す。黒三角形は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体（ａ）、ＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体（ｂ）またはＥＲ複合体（ｃ）を示す。
【図４−３】図４は、ＲＸＲホモダイマーの応答エレメント特異的結合を示す。ＲＡ特異的応答エレメント（ａ）、Ｔ３特異的応答エレメント（ｂ）、またはエストロゲン特異的応答エレメント（ｃ）上のＲＸＲ結合に関する９−シス−ＲＡの影響を、図１ａで記載されたようなゲル遅延アッセイにより分析した。比較として、ＲＸＲ／ＲＡＲヘテロダイマー（ａ）、ＲＸＲ／ＴＲヘテロダイマー（ｂ）またはエストロゲン（ｃ）の結合を示す。白三角は、非プログラム化網状赤血球溶解液の非特異的結合を示す。黒三角形は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体（ａ）、ＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマー複合体（ｂ）またはＥＲ複合体（ｃ）を示す。
【図５】図５は、ＲＸＲホモダイマー化が溶液中で起こることを示す。３５Ｓ−標識インビトロ合成ＲＸＲαタンパク質を、示されたように応答エレメントまたは化学的架橋剤ＤＳＰの存在下または非存在下のいずれかで、部分精製された細菌発現フラッグ−ＲＸＲ（Ｆ−ＲＸＲ）（＋）または同様に調製されたグルタチオントランスフェラーゼ制御タンパク質（−）とともにインキュベートした。インキュベーション後、抗フラッグ抗体（Ｆ）または非特異的プレ免疫血清（ＮＩ）のいずれかを添加した。１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡを作業プロセスの間維持した。１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡの存在下で免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液中で沸騰し、そして１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。３５Ｓ−標識インビトロ合成ＲＸＲαタンパク質を右のパネルに示した。
【図６−１】図６は、ＲＸＲおよびＲＡＲαの転写活性化を示す：天然応答エレメントに関する９−シス−ＲＡによるＲＸＲヘテロダイマー。１００ｎｇのレポータープラスミド（ａ）ＴＲＥｐａｌ−ｔｋ−ＣＡＴ  （ｂ）βＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ  （ｃ）ＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ  および（ｄ）ＣＲＢＰＩ−ＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴならびに５ｎｇの空（ｅｍｐｔｙ）ｐＥＣＥ発現ベクター、ｐＥＣＥ−ＲＸＲα、ｐＥＣＥ  ＲＡＲαまたは示されたような両者の組み合わせでＣＶ−１細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ホルモンなし（白棒）、１０−７Ｍ  ＲＡ（斜線棒）、または１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡ（濃斜線棒）で処理した。２回行った代表的な実験の結果を示す。
【図６−２】図６は、ＲＸＲおよびＲＡＲαの転写活性化を示す：天然応答エレメントに関する９−シス−ＲＡによるＲＸＲヘテロダイマー。１００ｎｇのレポータープラスミド（ａ）ＴＲＥｐａｌ−ｔｋ−ＣＡＴ  （ｂ）βＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ  （ｃ）ＡｐｏＡＩ−ＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴ  および（ｄ）ＣＲＢＰＩ−ＲＡＲＥ−ｔｋ−ＣＡＴならびに５ｎｇの空（ｅｍｐｔｙ）ｐＥＣＥ発現ベクター、ｐＥＣＥ−ＲＸＲα、ｐＥＣＥ  ＲＡＲαまたは示されたような両者の組み合わせでＣＶ−１細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ホルモンなし（白棒）、１０−７Ｍ  ＲＡ（斜線棒）、または１０−７Ｍ  ９−シス−ＲＡ（濃斜線棒）で処理した。２回行った代表的な実験の結果を示す。
【図７】図７は、レポーター構築物  （ａ）ＴＲＥｐａｌ−ｔｋ−ＣＡＴ  （１０）または（ｂ）ＣＲＢＰＩＩ−ｔｋ−ＣＡＴ  （１０）ＲＸＲα−依存性のトランス活性化を、９−シス−ＲＡまたはレチノイドＳＲ１１２０３、ＳＲ１１２１７、ＳＲ１１２３４、ＳＲ１１２３５、ＳＲ１１２３６、およびＳＲ１１２３７により示す。４回実行した代表的な実験の結果を示す。４つの独立した実験において誘導プロフィルは有意に変化しなかった。ＣＡＴ活性を、トラスフェクションについて、および同時トランスフェクトしたβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（ｐＣＨ１１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）由来の酵素活性を測定することにより回収効率について標準化した。
【図１】
2004159664.tif 000087
【図２−１】
2004159664.tif 000088
【図２−２】
2004159664.tif 000089
【図２−３】
2004159664.tif 000090
【図３−１】
2004159664.tif 000091
【図３−２】
2004159664.tif 000092
【図４−１】
2004159664.tif 000093
【図４−２】
2004159664.tif 000094
【図４−３】
2004159664.tif 000095
【図５】
2004159664.tif 000096
【図６−１】
2004159664.tif 000097
【図６−２】
2004159664.tif 000098
【図７】
2004159664.tif 000099