(57)【要約】【課　　題】本発明は、アシル化、糖化、リン酸化等の修飾を含むペプチド又は蛋白質を効率的かつ高品質で得ることができる製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、側鎖が修飾されたアミノ酸残基を含むペプチド断片を弱酸性離脱樹脂を用いて化学的に製造し、側鎖が修飾されたアミノ酸残基を含まないペプチド断片を遺伝子組換法又は／及び酵素法を用いて製造し、ついで得られた２種のペプチド断片を縮合することを特徴とする側鎖が修飾されたアミノ酸残基を含むペプチド又は蛋白質を製造する方法。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、そのうち少なくとも１のアミノ酸又は非アミノ酸が式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している修飾のために導入された置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、かつ、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護基により保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、ついで、弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱することを特徴とする、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法。
【請求項２】
（ａ）アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護基により保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、（ｂ）前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上から離脱させることなく、置換基Ｒにより修飾をうけるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性官能基に保護基が導入されている場合は、当該保護基を脱保護し、（ｃ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾し、（ｄ）弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることを特徴とする請求項１に記載のペプチド断片の製造方法。
【請求項３】
置換基Ｒにより修飾を受けるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性官能基の保護基が、シリル系保護基であり、前記保護基の脱保護にフッ化四級アンモニウムを用いることからなる請求項２に記載のペプチド断片の製造方法。
【請求項４】
シリル系保護基が、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリイソブチルシリル（ＴＩＢＳ）、ｔ−ヘキシルジメチルシリル（ＴｈｘＤＭＳ）又はトリフェニルシリル（ＴＰＳ）であり、フッ化四級アンモニウムがテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＦ）又はアンモニウムフルオリドである請求項３に記載のペプチド断片の製造方法。
【請求項５】
Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を介してＡの側鎖の反応性置換基に結合していることからなる請求項１〜４に記載のペプチド断片の製造方法。
【請求項６】
Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖の水酸基に結合していることからなる請求項５に記載のペプチド断片の製造方法。
【請求項７】
ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体、又は前記グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含むペプチド断片である請求項６に記載のペプチド断片の製造方法。
【請求項８】
（ａ）請求項１〜７に記載の方法によって修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）のペプチド断片とは別個に、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まず、かつ、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造されたペプチド断片を縮合することを特徴とする修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項９】
ペプチド断片の縮合が、縮合剤を用いて行われることからなる請求項８に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１０】
縮合剤が、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジフェニルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である請求項９に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片（ａ）と（ｂ）の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）の存在下で行われることからなる請求項９に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１２】
修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、酵素法又は／及び遺伝子組換法により製造することからなる請求項８〜１１に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、下記方法；
工程（１）；前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本項において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列、又は目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列のいずれかを有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において融合蛋白質を採取した場合、得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとを切断分離し、所望により目的ペプチドをさらに精製する工程；
工程（３）；工程（１）又は（２）で得られた目的ペプチドの側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基を保護基により保護する工程；
を含む方法により製造することからなる請求項１２に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
工程（２）における保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離が、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体及びＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体を用いて２段階で行われることからなる請求項１３に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
リンカー配列が、配列番号２７に記載の配列である請求項１３又は１４に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１６】
ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする請求項１２〜１５に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１７】
修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、ｐＨ４〜８の溶液中で精製及び保存することを特徴とする請求項１２〜１６に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１８】
保護基がＢｏｃ基である請求項１２〜１７に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【請求項１９】
工程（１）；所望のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本項において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列のいずれかを有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において融合蛋白質を採取した場合、得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとを切断分離し、所望によりさらに精製する工程；
工程（３）；工程（１）又は（２）で得られた目的ペプチドの側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護する工程；
工程（４）；工程（３）で得られた保護されている目的ペプチドを、ｐＨ４〜８の溶液中で精製及び保存する工程；
を含む方法により製造することを特徴とする修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法。
【請求項２０】
保護基がＢｏｃ基である請求項１９に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法。
【請求項２１】
工程（２）における保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離が、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体及びＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体を用いて２段階で行われることからなる請求項１９又は２０に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法。
【請求項２２】
リンカー配列が、配列番号２７に記載の配列である請求項１９〜２１に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法。
【請求項２３】
ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする請求項１９〜２２に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、及び前記製造方法に好適に用いられる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オーファンレセプターの一つである成長ホルモン分泌促進因子レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）に対する内因性成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）が１９９９年ラット胃から精製単離され、グレリンと命名された（Ｋｏｊｉｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，　４０２巻，　ｐ．６５６−６６０、１９９９年）。本ペプチドは、セリン残基の水酸基が脂肪酸でアシル化された特徴的な構造を有することで知られる。さらにラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス又はイヌからも３位のセリン残基又はスレオニン残基が脂肪酸修飾部位を有するグレリンが単離、あるいはｃＤＮＡから推定された（表１）。例えばヒトグレリンはアミノ酸２８個からなり、３位のセリン側鎖が脂肪酸（ｎ−オクタン酸）でアシル化されている。この新規ペプチドは強力な成長ホルモン分泌促進活性を有し、３位セリン又はスレオニンの脂肪酸修飾はその活性発現に必須であることが分かっている（Ｋｏｊｉｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，　４０２巻，　ｐ．６５６−６６０、１９９９年）。また、胃から分泌されたグレリンは、血中ホルモンとして成長ホルモン分泌の調節に機能することが解明され、グレリンの生理的役割と医薬品への適用に関して興味がもたれている。
【０００３】
【表１】
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オクタノイル基（Ｃ８）以外にも、ブタノイル基　（Ｃ４）、ヘキサノイル基（Ｃ６）、デカノイル基（Ｃ１０）、ドデカノイル基（Ｃ１２）修飾体が存在する。また、不飽和脂肪酸による修飾体も存在する。
【０００４】
グレリンやコレシストキニンのように、ペプチド又は蛋白質の中には、アミノ酸配列中のある特異的なアミノ酸残基がアシル化やスルホン化、糖付加又はリン酸化等の修飾を受けることにより、その生理学的役割を発現するものがある。これらの修飾は生体内における精緻な酵素系により施されると考えられており、修飾を有するペプチド又は蛋白質を、高品質かつ効率的に大量に製造する一般的な方法はこれまで報告されていない。たとえば、グレリンは長鎖脂肪酸により特定のアミノ酸側鎖が修飾を受けることで成長ホルモン分泌促進作用を示すことから、脂肪酸修飾は必須の構造的要素であるが、生体がどのような酵素系を駆使して、脂肪酸を特定のアミノ酸側鎖の水酸基上にエステル結合させるのか、あるいは脂肪酸が伸長していくのか現時点では明らかにされていない。特にグレリンは、アミノ酸側鎖の水酸基が脂肪酸で修飾された構造を有することが初めて明らかにされた生理活性ペプチドであるために、本ペプチドが摂食障害治療薬、成長ホルモン分泌促進薬等の医薬品として期待される有用なペプチド性ホルモンであるにもかかわらず、特定の水酸基含有アミノ酸側鎖に脂肪酸修飾を有するペプチドの製造は一般化されていない、即ち、大量に製造するのに有利な工業的製造方法が確立されていないのが現状である。
【０００５】
現在、インスリン、成長ホルモン、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ＬＨ−ＲＨ誘導体、副腎皮質刺激ホルモン誘導体など種々のペプチド又は蛋白質製剤が医薬品として使用されている。これらのペプチド又は蛋白質の製造方法としては、化学合成法、酵素法、遺伝子組換法による製造方法が知られている。いずれの方法を選ぶかは適宜選択されるが、一般的に残基数が少ない場合には化学合成法が、残基数が多い場合は酵素法もしくは遺伝子組換法が選択される。
【０００６】
例えば、化学合成法は最も確実にグレリン等の修飾をもつ生理活性ペプチド又は蛋白質を製造できる方法である。修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法として、化学合成法による製造方法はすでに数多く報告されている。グレリンの例では、Ｂｅｄｎａｒｅｋら（Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．，　４３巻、ｐ．４３７０−４３７６，　２０００年）、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　２８４巻、ｐ．６５５−６５９、２００１年）により報告されている。また、国際公開番号：ＷＯ　０１／０７４７５に、グレリン及びグレリン誘導体であるペプチド又はその塩の製造方法として、化学合成法による方法が記載されている。しかし、化学合成法による製造方法においては、一定の品質（純度）を保って合成できるペプチドの鎖長に通常制限がある。液相化学合成法は高純度のペプチドを合成することが可能であるが、長鎖ペプチドの合成には、溶解度、長い製造工程、反応処理に要する特別の技術等の点で一般的でない。即ち、効率的に大量に製造することは、液相化学合成法を用いる製造方法では難しい。一方、樹脂上でペプチド鎖を延長する固相化学合成は、工程が単純化されており、大量生産にはより有利であるが、本法も一定品質の目的物を得るにはおのずと構築可能な鎖長に制限がある。加えて、試薬を過剰に用いるために、特に長鎖ペプチドの製造において経済性で劣るという問題もある。
【０００７】
また、酵素法のようにペプチド断片を酵素的に結合させていく方法は、アミノ酸側鎖の保護を最小に出来る点で優れているが、本法においては、通常加水分解の逆反応を用いるために、原理的に条件の設定が難しく実用的ではない。
一方、遺伝子組換法による生理活性ペプチド又は蛋白質の製造は、大量生産に適した有用な製造方法である。しかしながら、生産性の高い大腸菌等の原核生物を用いる方法は、原核生物が翻訳後修飾の系をもたないため、修飾部位をもつペプチドの直接的な製造は難しい。酵母や各種卵細胞のような真核細胞を用いる遺伝子組換法においては、糖修飾、アシル化、スルホン化、リン酸化等の修飾は可能であるが、例えば脂肪酸に関して、一定長の脂肪酸のみを導入することは難しい。単離されたグレリンのなかには、オクタン酸（Ｃ８）だけではなく、ブタン酸（Ｃ４）、デカン酸（Ｃ１０）、あるいはこれらの不飽和脂肪酸を有するものが発見されていることからも、特定鎖長の脂肪酸の導入を制御することの困難さは明らかである。加えて、真核細胞による生産性は一般的に低いことからも、修飾の系を有する酵母や各種卵細胞の生産系はグレリン等の修飾を受けたペプチド又は蛋白質の大量生産という観点からは、多くの改良の余地がある。
【０００８】
以上述べてきたように、修飾ペプチド又は蛋白質を合成する方法として化学合成法があり、すでに種々の報告がなされているが、大量に製造するためには、収率、コストの点において改良の余地がある。大腸菌等の原核細胞を用いた遺伝子組換法で直接的に翻訳修飾を受けたペプチド又は蛋白質を製造するのは難しい。また、酵母等の真核細胞を用いた遺伝子組換法による製造も、単一性又は生産性の点で問題があり、これを克服するために改良の余地がある。加水分解反応の逆反応を使う酵素法は、各々の縮合条件の設定が困難であり、大量生産に有利な方法であるとはいえない。
このように、従来知られている、化学合成法、酵素法、遺伝子組換法を単独で適用して、糖修飾、アシル化、スルホン化、リン酸化等の修飾を有するペプチド又は蛋白質を、品質と量的な要素を満足させ、かつ効率よく製造することについては、更なる改良の余地があった。
【０００９】
そこで、上記方法の長所を生かし、欠点を補う方法の一つに、化学合成法と遺伝子組換法を組み合わせた半合成法が挙げられる。本製造方法の重要な点は、縮合に適した形態のペプチド断片を効率よく製造することである。修飾されたアミノ酸残基を有するペプチド断片（以下、修飾成分ともいう。）及び修飾されたアミノ酸残基を有さないペプチド断片（以下、非修飾成分ともいう。）は、Ｎ末端側又はＣ末端側の何れであっても良く、また、修飾成分が複数であっても良い。適宜、目的とするペプチド又は蛋白質に合わせて、製造方法を設計することができる。一例として、修飾成分がＮ末端側に存在し、当該ペプチド断片（修飾成分）と縮合される他方のペプチド断片が非修飾成分である場合について詳細に言及する。
近年注目されている、Ｎａｔｉｖｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｌｉｇａｔｉｏｎ法（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２６６巻、ｐ．７７６−７７９、１９９４年）は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ部位にＣｙｓ残基が残る欠点があったが、最近、本方法を改良したチオエステル法が提案された。例えば、Ｋａｗａｋａｍｉらにより、チオエステルを用いた方法でリン酸化ペプチドの合成が報告されている（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ，　４１巻，　ｐ．２６２５−２６２８、２０００年）。
【００１０】
前記チオエステル法の具体例を以下に示す。リン酸化されたｐ２１Ｍａｘ蛋白質の合成例において（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，　３９巻、ｐ．７９０１−７９０４，　１９９８年）、固相化学合成法でリン酸修飾部位を含むペプチド断片（修飾成分）（１３　ｍｅｒ）をチオエステルとして製造する。一方、非修飾成分のＮ末端に一アミノ酸残基を付加させた配列を有するペプチド断片を大腸菌で製造し、このものに２価銅又はニッケルイオン存在下で、グリオキシル酸を作用させ、Ｎ末端に付加したアミノ酸残基をαケトアシル基に変換したのち、側鎖アミノ基をＢｏｃ基で保護する。次に、フェニレンジアミンでαケトアシル基を除去することで、Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基のみが遊離したペプチド断片（非修飾成分）を調製している。最後にこれらの両断片を銀塩、過剰のＨＯＯＢｔ等の活性エステル化剤を加え縮合している。
【００１１】
上記方法においても、まだ下記のような課題が残る。ペプチド断片（修飾成分）の製造において、そのチオエステルの安定性上の課題があり、収率は１１％と記載されている。また、ペプチド断片（非修飾成分）の製造において、αケトアシル基を用いる本方法はＮ末端アミノ基を遊離させる化学的方法として選択性が高いが、αケトアシル基が不安定であること、及び本基の脱離にフェニレンジアミン等の変異原性物質を使用する点で、医薬品用の生理活性ペプチド又は蛋白質の製造の場合、安全性の課題が残る。また、両断片の縮合反応において、銀塩、過剰のＨＯＯＢｔ等の活性エステル化剤を使用しており、ラセミ化、毒性、コストの点でも課題がある。
【００１２】
化学合成法と遺伝子組換法を組み合わせた半合成法は、国際公開番号：ＷＯ　０１／０７４７５にも、グレリン及びグレリン誘導体であるペプチド又はその塩の製造方法として記載されている。より具体的には、化学合成法により調製したラットグレリン（１−５）と遺伝子組換法により調製したラットグレリン（６−２８）を縮合してラットグレリン（１−２８）を調製する方法が記載されている。しかし、かかる方法においてもまた下記のような課題を有することから、効率のよい工業的製造に有利な製造方法とするには、多くの改良の余地がある。即ち、ＴＦＡによりペプチド鎖を樹脂から離脱させてラットグレリン（１−５）を得る際に、同時にＢｏｃ基、ｔ−Ｂｕ基が除去されるため、再度Ｂｏｃ基をＮ末端に導入する必要があること、また、Ｓｅｒ側鎖が無保護になるために、ラットグレリン（６−２８）との縮合に、強い活性化剤を使用できない等の点において、生産性を向上させる余地がある。また、保護ラットグレリン（１−５）及び保護ラットグレリン（６−２８）を縮合する過程において、アシルペプチド断片部のＣ末端アミノ酸がラセミ化しうるため、これを抑制するために改良の余地があった。なお、グレリン（ｍ−ｎ）は、グレリンのＮ末端からｍ番目〜ｎ番目のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。以下も同様である。
【００１３】
また、保護ペプチド断片（非修飾成分）を調製する際にもいくつかの課題がある。国際公開番号：ＷＯ　０１／０７４７５に記載された保護ラットグレリン（６−２８）の製法は、基本的には２段階酵素処理法（国際公開番号ＷＯ９９／３８９８４）を採用しており、そのプロセッシング酵素として組換えＶ８プロテアーゼ誘導体（ｒＶ８Ｄ５）（特開平９−４７２９１）とＫｅｘ２プロテアーゼ（特開平１０−２２９８８４）の２種類の酵素を使用している。しかしながら保護ラットグレリン（６−２８）を含む融合たんぱく質を発現するプラスミド（ｐＧ９７ｓ　ｒＧＲ）は大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒト副甲状腺ホルモン（１−３４）との融合蛋白質を高発現するプラスミド　（特開平９−２９６０００）を元に構築したものなので、保護ペプチド断片（非修飾成分）を調製する際には、そのアミノ酸配列に適したリンカー配列を選択する必要が生じる場合がある。
さらに、保護ラットグレリン（６−２８）は水溶液中で保護基が離脱するという現象があり、精製における回収率は１０％と非常に低くグレリンを大量に安定供給するという側面においてなお課題を有する。
以上、化学合成法と遺伝子組換法の組み合わせによっても、効率がよく、かつ得られた製品を医薬品として使用できるような安全性の高い、修飾された生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法の実現には更なる課題がある。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、修飾をうけたペプチド又は蛋白質の簡便で効率のよい工業的製造方法を提供することを目的とするものである。具体的には、本発明は、修飾部位を含むペプチド断片（修飾成分）を化学合成法により製造し、修飾部位を含まないペプチド断片（非修飾成分）を遺伝子組換法により製造し、両者を縮合することで効率よく高品質の修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質を製造する方法を提供することを目的とするものである。前述したように、これらの各ペプチド断片（修飾成分及び非修飾成分）は、Ｎ末端側断片又はＣ末端側断片の何れであっても良く、また、修飾成分が複数であっても良い。適宜、目的とするペプチド又は蛋白質に合わせて、製造方法を設計することができる。また、本発明は、縮合反応に適した、保護されているペプチド断片（修飾成分）を修飾部位の構造に影響を与えない温和な条件で製造する方法、及び保護されているペプチド断片（非修飾成分）との縮合に適した保護されているペプチド断片（修飾成分）の製造方法を提供することを目的とするものである。さらに、本発明は、得られた製品を医薬品として使用できるような安全性の高い、修飾された生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法を提供することを目的とするものである。特に本発明は、グレリン及びグレリン誘導体の簡便で効率のよい工業的製造方法を提供することを目的とするものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グレリンを素材に、グレリン又はその誘導体の中のアシル基により修飾されたアミノ酸を含むペプチド断片（修飾成分）の合成方法の改良を行い、ペプチド断片（修飾成分）の製造工程を大幅に簡略化かつ効率化しうる方法を確立した。即ち、２−クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂上でペプチド断片（修飾成分）のペプチド主鎖配列を構築し、引き続き、残基選択的修飾を施した後、酢酸等の弱酸処理により固相樹脂上から保護修飾ペプチドを切り出すことができることを見出した。従来の技術として、トリフルオロ酢酸等で樹脂から切り出せるＷａｎｇ樹脂等の樹脂上で修飾基を導入した後、樹脂からの切り出しとともに保護基も脱離させる方法が知られていた。しかし、本法においては、切り出したペプチド断片（修飾成分）は、引き続き、もう一方のペプチド断片（非修飾成分）との縮合反応に供するため、樹脂からの切り出しとともに保護基も脱離されてしまう従来技術による方法は、再び保護基を導入しなければならないため、簡便で効率的な製造という観点からは好ましくない。そこで、本発明者らは、ペプチド断片（修飾成分）の樹脂からの切り出しには、アミノ酸側鎖の保護基を脱離させにくい弱酸（希釈された強酸を含む）を用い、一方で、ペプチドが樹脂から離脱せずに、樹脂上で特定のアミノ酸側鎖の保護基を脱離させて残基選択的修飾を施す方法として、フッ化四級アンモニウムを用いる方法が有効であることを鋭意検討の結果、見出した。従来、フッ化四級アンモニウムのなかでも、テトラブチルアンモニウムフロオリド（ＴＢＡＦ）は固相樹脂からペプチドを離脱させる試薬として用いられていた（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，　Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，　ｐ．４１４−４１５，１９８８年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　３４巻，　ｐ．７５９９−７６０２，１９９３年）が、本発明者らは弱酸性離脱樹脂上に構築したペプチドはＴＢＡＦ処理によって樹脂から離脱しないことを見出した。この結果、ＴＢＡＦを用いれば、ペプチドが樹脂から離脱することなく、そのゆえに、樹脂上で特定のアミノ酸側鎖の保護基を脱離させて残基選択的修飾を施すことができ、ついで、アミノ酸側鎖の保護基を脱離させにくい弱酸（希釈された強酸を含む）を用いペプチド断片（修飾成分）を樹脂から切り出すことにより、次工程のペプチド断片（非修飾成分）との縮合反応の際に、事前にペプチド断片（修飾成分）を保護する工程が必要なくなり、修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質の製造工程を大幅に簡略化かつ効率化することができた。
【００１６】
さらに本発明者らは、グレリンの保護ペプチド断片（非修飾成分）の調製方法を改良し、保護グレリン（８−２８）断片を２段階酵素処理法で大量に調製するために最適なリンカー配列を見出した。さらに本発明者らは、保護基が離脱しないｐＨ条件で精製することで保護ペプチド断片（非修飾成分）の製造工程を大幅に簡略化かつ効率化しうる方法を確立した。すなわち、保護ペプチドの調製時に保護基が離脱する現象は水溶液のｐＨ及び温度に依存しており、水溶液のｐＨを４−８とすることにより保護基の離脱が阻止でき、収率よく保護ペプチド（非修飾成分）を調製できることを見出した。
【００１７】
また、各ペプチド断片の縮合方法を改良し、アミノ酸の活性化時、及び縮合時のラセミ化を抑制し、グレリン又はグレリン誘導体をより高品質かつ高収率で得ることができる製造方法を見出した。特に、弱酸性離脱樹脂を用いたグレリンの製造方法は、副反応により生じるジケトピペラジンの形成を抑制することができるという利点がある。即ち、Ｃ末端アミノ酸残基が７位のプロリンであるので、ジペプチド（−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−）に３個目のアミノ酸（Ｌｅｕ）を縮合する時に、ジケトピペラジンを巻いて樹脂から離脱する副反応を最小限に抑えることができる。
この知見に基づき、さらに、アルキル基はいうまでもなく、アシル基、リン酸基又は硫酸基を、グリコシド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合又はアミド結合等を介してアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖に結合した種々の修飾構造を有する生理活性ペプチド又は蛋白質の製造にも容易に適用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１８】
即ち、本発明は、
（１）　弱酸性離脱樹脂を用いることを特徴とする、式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している置換基を示す、）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法、
（２）　（ａ）弱酸性離脱樹脂上に、側鎖が保護されているアミノ酸又は／及び非アミノ酸の所望の配列を有するペプチド断片を作製し、（ｂ）前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上から脱離させることなく、置換基Ｒにより修飾をうけるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖の保護基を脱保護し、（ｃ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾し、（ｄ）弱酸性離脱樹脂からペプチド断片を切り出すことを特徴とする前記（１）に記載のペプチド断片の製造方法、
（３）　アミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖の保護基が、シリル系保護基であり、前記保護基の脱保護にフッ化四級アンモニウムを用いることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のペプチド断片の製造方法、
（４）　シリル系保護基が、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリイソブチルシリル（ＴＩＢＳ）、ｔ−ヘキシルジメチルシリル（ＴｈｘＤＭＳ）又はトリフェニルシリル（ＴＰＳ）であり、フッ化四級アンモニウムがテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＦ）又はアンモニウムフルオリドであることを特徴とする前記（３）に記載のペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００１９】
また、本発明は、
（５）　Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合等を介してＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（１）〜（４）に記載のペプチド断片の製造方法、
（６）　Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（５）に記載のペプチド断片の製造方法、
（７）　ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体、又は前記グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含む部分であることを特徴とする前記（６）に記載のペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００２０】
また、本発明は、
（８）　（ａ）式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している置換基を示す、）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を、弱酸性離脱樹脂を用いて製造し、前記（ａ）のペプチド断片とは別個に、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造されたペプチド断片を縮合することを特徴とする修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（９）　修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を、前記（２）〜（４）に記載の方法で製造することを特徴とする前記（８）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１０）　Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合によりＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（８）又は（９）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１１）　Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖に結合していることを特徴とする前記（１０）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１２）　修飾ペプチド又は蛋白質が、グレリン又はその誘導体であることを特徴とする前記（１１）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２１】
また、本発明は、
（１３）　ペプチド断片の縮合が、縮合剤を用いて行われることを特徴とする前記（８）〜（１２）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１４）　縮合剤が、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジフェニルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であることを特徴とする前記（１３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１５）　縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）の存在下、行われることを特徴とする前記（１３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２２】
より具体的に、本発明は、修飾をうけたペプチド又は蛋白質を断片縮合により製造する過程において、（ａ）修飾基を含むペプチド断片を製造するとき、２−クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂を用いて合成することを特徴とする、修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法、（ｂ）酸で脱離しやすいアシル基、硫酸基等を含むペプチド断片を合成する際、２−クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂を用いて製造することを特徴とする、修飾を有する生理活性ペプチド又は蛋白質、特にグレリン又はグレリン誘導体の製造方法、（ｃ）修飾を含むペプチド断片（修飾成分）と修飾を含まないペプチド断片（非修飾成分）との縮合を行うとき、活性化させるＮ末端側断片のＣ末端残基にプロリンを介することにより、構成アミノ酸のラセミ化を抑制したことを特徴とするグレリン又はグレリン誘導体の製造方法、（ｄ）グレリン又はグレリン誘導体の製造に顕著に良好であった縮合剤に関する。
【００２３】
更に、本発明は、
（１）　アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、そのうち少なくとも１のアミノ酸又は非アミノ酸が式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している修飾のために導入された置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基により保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、ついで、弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱することを特徴とする、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法、
（２）　（ａ）アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基により保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、（ｂ）前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上から離脱させることなく、置換基Ｒにより修飾をうけるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性官能基に保護基が導入されている場合は、当該保護基を脱保護し、（ｃ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾し、（ｄ）弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることを特徴とする前記（１）に記載のペプチド断片の製造方法、
（３）　（ａ）弱酸性離脱樹脂上で、アミノ酸又は／及び非アミノ酸の所望の配列を有し、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の反応性置換基が保護基により保護されているペプチド断片を作製し、ついで、（ｂ）弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させ、（ｃ）離脱させたペプチド断片の少なくとも１のアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性置換基の保護基を脱保護し、（ｄ）前記脱保護した側鎖を置換基Ｒで修飾することを特徴とする式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００２４】
また、本発明は、
（４）　置換基Ｒにより修飾を受けるアミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖における反応性置換基の保護基が、シリル系保護基であり、前記保護基の脱保護にフッ化四級アンモニウムを用いることからなる前記（２）又は（３）に記載のペプチド断片の製造方法、
（５）　シリル系保護基が、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリイソブチルシリル（ＴＩＢＳ）、ｔ−ヘキシルジメチルシリル（ＴｈｘＤＭＳ）又はトリフェニルシリル（ＴＰＳ）であり、フッ化四級アンモニウムがテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）、テトラエチルアンモニウムフルオリド（ＴＥＦ）又はアンモニウムフルオリドである前記（４）に記載のペプチド断片の製造方法、
（６）　Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、Ｒがエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を介してＡの側鎖の反応性官能基に結合していることからなる前記（１）〜（５）に記載のペプチド断片の製造方法、
（７）　Ａがセリン又はスレオニンであり、Ｒがエステル結合を介してＡの側鎖の水酸基に結合していることからなる前記（６）に記載のペプチド断片の製造方法、
（８）　ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体、又は前記グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含むペプチド断片である前記（７）に記載のペプチド断片の製造方法、
に関する。
【００２５】
また、本発明は、
（９）　（ａ）前記（１）〜（８）に記載の方法によって修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）のペプチド断片とは別個に、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まず、かつ、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基およびカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護されているペプチド断片を製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造されたペプチド断片を縮合することを特徴とする修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１０）　ペプチド断片の縮合が、縮合剤を用いて行われることからなる前記（９）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１１）　縮合剤が、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジフェニルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）である前記（１０）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１２）　縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片（ａ）と（ｂ）の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）の存在下で行われることからなる前記（１０）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２６】
また、本発明は、
（１３）　修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、酵素法又は／及び遺伝子組換法により製造することからなる前記（９）〜（１２）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１４）　修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、下記方法；
工程（１）；前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本項において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列のいずれかを有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において融合蛋白質を採取した場合、得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとを切断分離し、所望により目的ペプチドをさらに精製する工程；
工程（３）；工程（１）又は（２）で得られた目的ペプチドの側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護する工程；
を含む方法により製造することからなる前記（１３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１５）　工程（２）における保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離が、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体及びＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体を用いて２段階で行われることからなる前記（１４）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１６）　リンカー配列が、配列番号２７に記載の配列である前記（１４）又は（１５）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１７）　ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする前記（１３）〜（１６）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１８）　修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を、ｐＨ４〜８の溶液中で精製及び保存することを特徴とする前記（１３）〜（１７）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
（１９）　保護基がＢｏｃ基である前記（１３）〜（１８）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２７】
また、本発明は、
（２０）　工程（１）；所望のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、本項において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列のいずれかを有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において融合蛋白質を採取した場合、得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとを切断分離し、所望によりさらに精製する工程；
工程（３）；工程（１）又は（２）で得られた目的ペプチドの側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護する工程；
工程（４）；工程（３）で得られた保護されている目的ペプチドを、ｐＨ４〜８の溶液中で精製及び保存する工程；
を含む方法により製造することを特徴とする修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２１）　保護基がＢｏｃ基である前記（２０）に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２２）　工程（２）における保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離が、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体及びＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体を用いて２段階で行われることからなる前記（２０）または（２１）に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２３）　リンカー配列が、配列番号２７に記載の配列である前記（２０）〜（２２）に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
（２４）　ペプチド断片が、グレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする前記（２０）〜（２３）に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明を説明するに際し、下記用語を以下のように定義する。
「アミノ酸」とは、同一分子内にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物であり、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸等あらゆるアミノ酸を含む。
「天然アミノ酸」とは、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸をいう。
「非天然アミノ酸」とは、α−アミノ酸におけるα炭素が天然アミノ酸又はそれに対応するＤ−アミノ酸に存在しない任意の置換基で修飾されている化合物をいう。即ち、α−アミノ酸を下記式；
【化１】
2004002378.tif 000003
で表したとき、Ｒ’、Ｒ”で示される置換基として、天然アミノ酸又はそれに対応するＤ−アミノ酸に存在しない任意の置換基又は水素原子（但し、Ｒ’及びＲ”がともに水素原子である場合を除く。）を有する化合物が挙げられる。
「非アミノ酸」とは、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選ばれる１種以上の原子からなるアミノ酸の類似体であって、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸に含まれない化合物をいう。なかでも、分子鎖長がペプチド相当長又はジペプチド相当長の化合物が好ましい。例えば、ＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ３、ＣＨ３−ＣＨ（Ｒ１１）−ＣＯＯＨ、ＣＨ３−ＣＨ（Ｒ１１）−　ＣＨ３（何れも分子鎖長がペプチド相当長）、又はＮＨ２−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｃ（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）３−ＣＯＯＨ、　ＮＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−　ＣＨ３、ＮＨ２−（ＣＨ２）３ＣＨ（Ｒ１１）−　ＣＨ３（何れも分子鎖長がジペプチド相当長）等が本発明でいう「非アミノ酸」に含まれる。ここで、Ｒ１１は、天然アミノ酸の側鎖を表す。ペプチドにおける「非アミノ酸残基」としては、例えば、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１１）−ＣＯ−、−ＣＨ２−ＣＨ（Ｒ１１）−ＣＨ２−（何れも分子鎖長がペプチド相当長）、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＯ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＣＯ−、−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）３−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＯ−、−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−（ＣＨ２）３ＣＨ（Ｒ１１）−ＣＨ２−（何れも分子鎖長がジペプチド相当長）等が挙げられ、隣接するアミノ酸との結合はペプチド結合でない場合がありえる。
【００２９】
「ペプチド」又は「ペプチド断片」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合で連なった化合物のことをいう。ここで、非アミノ酸を含む場合は、当該非アミノ酸と隣接するアミノ酸との結合はペプチド結合ではない場合があるが、この場合の化合物もペプチド又はペプチド断片と総称する。
「保護されているペプチド断片」とは、ペプチド断片のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して又はペプチド断片の縮合反応に際して、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基によって保護されているペプチドの断片をいう。以下、本明細書においては、「保護ペプチド断片」と略称する。
【００３０】
「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」は、式１；−Ａ（Ｒ）−（式中、Ａはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、ＲはＡの側鎖に結合している修飾のために導入された置換基を示す。）で表わされる。
上記置換基Ｒは、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基又はカルボキシル基から水素原子を除去して形成される基に結合している場合もあるし、アミノ酸又は非アミノ酸のα炭素に直接結合している場合もある。置換基Ｒは、アミノ酸又は非アミノ酸の修飾された側鎖であってもよい。
上記置換基Ｒとしては、特に限定されない。例えば、Ｒとしては、式２；−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ−Ｑ（式中、ｎは１〜１０の整数を示し、Ｐは、−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＣＳ−Ｓ−、−Ｓ−ＣＳ−、−Ｓ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＳ−ＮＨ−ＣＳ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＳ−ＮＨ−又は−ＮＨ−ＣＳ−を示し、Ｑは、水素原子、又はＣ１−３５、好ましくはＣ１−２０のアルキル基、Ｃ６−２０のアリール基もしくはＣ７−１６のアラルキル基を示す。）で表わされる基、式３；−Ｐ−Ｑ（式中、Ｐ及びＱは前記と同意義。）で表わされる基、又は式４；−Ｑ（式中、Ｑは前記と同意義。）で表わされる基等が挙げられる。なかでも、上記Ｒとしては、アミノ酸又は非アミノ酸のα炭素に直接結合している場合、炭素数１以上のアルキル基を介して又は介さずに、エステル、エーテル、チオエステル、チオエーテル、アミド又はカルバミドからなる群から選ばれる結合により、Ｃ１−３５、好ましくはＣ１−２０のアルキル基、Ｃ６−２０のアリール基又はＣ７−１６のアラルキル基が結合している基が好ましい。置換基Ｒがアミノ酸又は非アミノ酸のα炭素に直接結合している場合、置換基Ｒは天然アミノ酸においてα炭素に結合している置換基を含まない。置換基Ｒがアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における反応性置換基に結合している場合、当該置換基Ｒは式４；−Ｑ（式中、Ｑは前記と同意義。）で表わされる基であることが好ましい。
【００３１】
ここで、上記「アルキル基」とは、環状、直鎖又は分枝鎖アルキル基を表し、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ネオペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基、３，３−ジメチルブチル基、ヘプチル基、１−プロピルブチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基又はペンタデシル基等が挙げられ、これらは部分的に不飽和炭素結合を含んでいてもよく、炭素数は１乃至３５、より好ましくは１乃至２０、さらに好ましくは１乃至１０である。
上記「アリール基」とは、例として、フェニル基、１−もしくは２−ナフチル基、ビフェニル基、１−，２−もしくは９−アントリル基、１−，２−，３−，４−もしくは９−フェナントリル基、アセナフチル基、アントラセニル基、アズレニル基等が挙げられる。炭素数は６乃至２０、より好ましくは６乃至１５である。
上記「アラルキル基」としては、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３，４−ジメトキシベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ベンズヒドリル基、トリチル基等が挙げられる。炭素数は、好ましくは７乃至１６である。
さらに、これらアルキル基、アリール基及びアラルキル基は、当技術分野で通常用いられる置換基を化学的に許容される位置及び個数で有していてもよい。
【００３２】
「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」としては、アミノ酸又は非アミノ酸Ａがセリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン又はアスパラギンであり、置換基Ｒが式５；−（ＣＨ２）ｎ−Ｐ１−Ｑ１（式中、ｎは前記と同意義。Ｐ１は、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を表し、Ｑ１は、前記Ｑと同意義。）で示される基である場合が好ましい。
具体的には、例えば、アミノ酸Ａがセリン、スレオニン、チロシン又はオキシプロリンである場合、そのアミノ酸は側鎖に水酸基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖の水酸基がエーテル化又はエステル化されているセリン、スレオニン、チロシン又はオキシプロリンが挙げられる。アミノ酸Ａがシステインである場合は、そのアミノ酸は側鎖にメルカプト基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖のメルカプト基がチオエーテル化、チオエステル化又はジスルフィド化されているシステインが挙げられる。アミノ酸Ａがリジン、アルギニン又は２，３−ジアミノプロピオン酸である場合は、側鎖にアミノ基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖のアミノ基がアミド化、チオアミド化、カルバミド化、チオカルバミド化又はアルキル化されているリジン、アルギニン又は２，３−ジアミノプロピオン酸が挙げられる。アミノ酸Ａがヒスチジン、トリプトファン、プロリン又はオキシプロリンである場合は、側鎖にアミノ基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」としては、側鎖のアミノ基がアミド化、チオアミド化、イミノエーテル化、イミノチオエーテル化、アルキル化されているヒスチジン、トリプトファン、プロリン又はオキシプロリンが挙げられる。
なかでも、「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」としては、側鎖の水酸基がエステル化されているセリン又はスレオニンが好ましい。
【００３３】
さらに、上記置換基Ｒとしては、アミノ酸又は非アミノ酸Ａの側鎖に−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ−又は−ＮＨ２を含む場合、これらをアシル化して形成される基がより好適な例として挙げられる。そのためのアシル基としては、例えば有機カルボン酸、有機スルホン酸、有機リン酸化合物から水酸基を除去して形成される基が挙げられる。前記有機カルボン酸としてはより具体的には、脂肪酸が挙げられ、その炭素数は好ましくは２〜３５、より好ましくは６〜１８、最も好ましくは８〜１６である。そのような脂肪酸としては、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、酪酸、カプロン酸、ウンデシル酸、パルミチン酸、デカン酸、ノナデカン酸、ベヘン酸、モンタン酸もしくはラクセン酸等の飽和脂肪酸、例えばアクリル酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸もしくはアアテアロール酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。不飽和脂肪酸はモノエンであってもよいし、ポリエンであってもよい。なかでも、オクタン酸（好ましくは、カプリル酸）、デカン酸（好ましくは、カプリン酸）、ドデカン酸（好ましくは、ラウリル酸）等が好適な例として挙げられる。前記有機スルホン酸又は有機リン酸化合物についても、その炭素数は２〜３５のものが好ましい。
【００３４】
「修飾ペプチド又は蛋白質」とは、ペプチド又は蛋白質中に、上述の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を、１以上含むペプチド又は蛋白質をいう。
「グレリン」とは、内因性成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）のことであり、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及び成長ホルモンの分泌を誘導する活性を有する。なかでも、ヒト、ラット、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス又はイヌ由来のグレリンが好ましい。より具体的には、「グレリン」としては、配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、３位セリン又はスレオニンの側鎖水酸基の水素原子が、ｎ−オクタノイル基、ブタノイル基、ヘキサノイル基、デカノイル基又はドデカノイル基のいずれかで置換されている蛋白質、又は配列番号１〜２１のいずれに記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端の１番目から４番目までのアミノ酸配列以外の部分で、１〜１０個、好ましくは１〜数個程度のアミノ酸が置換、付加又は欠失しているアミノ酸配列を有し、３位セリン又はスレオニンの側鎖水酸基の水素原子が、ｎ−オクタノイル基、ブタノイル基、ヘキサノイル基、デカノイル基又はドデカノイル基のいずれかで置換されており、かつ細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有する蛋白質が挙げられる。
【００３５】
「グレリン誘導体」としては、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有し、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含むことを特徴とするペプチド又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。なかでも、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてアミノ末端から４番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から５番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から６番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から７番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から８番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から９番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から１０番目までのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチド又はその薬学的に許容される塩が好ましい。さらに、配列番号１〜２１に記載のアミノ酸配列において、アミノ末端から４番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から５番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から６番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から７番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から８番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から９番目までのアミノ酸配列、好ましくはアミノ末端から１０番目までのアミノ酸配列以外の部分で、少なくともひとつのアミノ酸、好ましくは１〜１０個程度のアミノ酸、より好ましくは１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むペプチド又はその薬学的に許容される塩が好ましい。なかでも、上記態様の全てのペプチド又はその薬学的に許容される塩においては、アミノ末端から２番目又は３番目のアミノ酸、より好ましくはアミノ末端から３番目のアミノ酸が、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であることが特に好ましい。
【００３６】
また、配列番号１〜２１に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列の少なくともひとつのアミノ酸、好ましくは１〜１０個程度のアミノ酸、より好ましくは１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列において、アミノ末端から４番目までのアミノ酸配列が、式６；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−（式中Ａはアミノ酸、非アミノ酸、又はないことを示し、Ｂはアミノ酸、非アミノ酸、又はないことを示す。ただし、Ａ＋Ｂの分子鎖長がジペプチド相当長ある。Ｃ又はＤは同一であっても異なっていてもよく、（ａ）修飾されたアミノ酸、（ｂ）疎水性側鎖を有するアミノ酸、又は（ｃ）塩基性側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片に置き換えられているペプチド又はその薬学的に許容される塩も好ましい態様として挙げられる。前記「疎水性側鎖を有するアミノ酸」としては、ロイシン、バリン、ノルロイシン、ホモロイシン、ホモイソロイシン、ナフチルアラニン類、トリプトファン、フェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン等、あるいは、これらのＮ−メチルアミノ酸又はＤ−体などが挙げられる。前記「塩基性側鎖を有するアミノ酸」としては、リジン、アルギニン又はヒスチジン又はこれらのＤ−体などが挙げられる。中でも、前記式６中、Ｃが、上記修飾をうけたアミノ酸であり、Ｄが疎水性側鎖を有するアミノ酸であることがより好ましい。
【００３７】
前記式６；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−で表されるペプチド断片の代わりに、次式７；Ａ１−Ｂ１−Ｃ１−Ｄ１−（式中、Ａ１はアミノ酸又は非アミノ酸、好ましくは天然アミノ酸又はそのＤ−体を示す。Ｂ１又はＣ１は、少なくとも一方が修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、Ｂ１又はＣ１のうち一方のみが修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸である場合、他方は修飾をうけていないアミノ酸又は非アミノ酸、好ましくは天然アミノ酸又はそのＤ−体である。また、Ａ１＋Ｂ１の分子鎖長がジペプチド相当長ある。Ｄ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸又は塩基性側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片を用いてもよい。
また、前記式６；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−で表されるペプチド断片の代わりに、次式８；Ｂ２−Ｃ２−Ｄ２−（式中、Ｂ２は、ジペプチド相当長の分子鎖長を有する非アミノ酸であり、Ｃ２は修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、Ｄ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸又は塩基性側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片を用いてもよい。
【００３８】
さらに、「グレリン誘導体」としては、上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容される塩のアミノ末端やカルボキシル末端に修飾が施されていてもよい。具体的には、上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容される塩のカルボキシル末端に、更に塩基性アミノ酸が結合していることが好ましい。また、上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容される塩のアミノ末端が炭素数１以上の飽和あるいは不飽和アルキル基又はアシル基により修飾され及び／又はカルボキシル末端のカルボキシル基のＯＨがＯＺ又はＮＲ２Ｒ３（Ｚは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又は非分枝鎖アルキル基、Ｒ２及びＲ３は、水素原子及び低級（Ｃ１−６）の分枝鎖又は直鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を示す）に変換されていることが好ましい。さらには、これらの修飾が組み合わされていてもよい。
【００３９】
本発明にかかる修飾ペプチド又は蛋白質を製造する方法は、（ａ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片を、弱酸性離脱樹脂を用いて製造し、また（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片を、前記（ａ）の保護ペプチド断片とは別個に製造し、前記（ａ）及び（ｂ）で製造された保護ペプチド断片を縮合するという３工程からなることを特徴とする。
以下に、修飾ペプチド又は蛋白質の製造における各工程についてより具体的に述べる。
【００４０】
本発明の製造方法によって得られる修飾ペプチド又は蛋白質、又はそれらの断片はペプチド性のものであるので、自体公知のペプチド合成法によって合成することができる。ここで、修飾ペプチドもしくは蛋白質、又はそれらの断片とは、これらの反応性官能基が保護基で保護された化合物も含む。ペプチドの合成方法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。即ち、粗修飾ペプチドもしくは蛋白質、又はそれらの断片を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離方法としては、例えば、以下の文献１〜３に記載された方法が挙げられる。
１．　泉屋信夫他「ペプチド合成の基礎と実験」丸善株式会社発行（１９８５年）
２．　矢島治明及び榊原俊平「生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ」日本生化学会編、東京化学同人発行（１９７７年）
３．　矢島治明監修「続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成」廣川書店発行
【００４１】
修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片を製造する工程は、弱酸性離脱樹脂上でペプチド鎖を延長する固相化学合成を用いることを特徴とする。より具体的には、弱酸性離脱樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖における、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基を適当に保護したアミノ酸又は非アミノ酸を、目的とするペプチド断片の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、弱酸性離脱樹脂上で縮合させ、作製された保護ペプチド断片を保護基を脱離させることなく弱酸性離脱樹脂から離脱させることにより、目的とする保護ペプチド断片を得ることができる。
【００４２】
上記弱酸性離脱樹脂とは、ペプチド合成に用いられる樹脂であって、樹脂上に作製されたペプチド断片を弱酸性条件で樹脂から離脱させることができる樹脂をいう。例えば、弱酸性離脱樹脂としては、酢酸、トリフルオロ酢酸もしくはギ酸などのカルボン酸類、およびトリフルオロエタノールもしくはヘキサフルオロイソプロパノールなどのフッ素化アルコール類からなる群からなる１以上の化合物を含む溶液中で、樹脂上に作製されたペプチド断片を樹脂から離脱させることができる樹脂が好ましい。より具体的には、弱酸性離脱樹脂としては、例えば、２−クロロトリチル樹脂、トリチル樹脂、４−メチルトリチル樹脂、４−メトキシトリチル樹脂、Ｒｉｎｋ　Ａｍｉｄｅ　Ｂａｒｌｏｓ樹脂等のトリチル系樹脂や、Ｓｉｅｂｅｒ　Ａｍｉｄｅ樹脂等を挙げることができる。
【００４３】
α−アミノ基と側鎖における反応性官能基（以下単に、側鎖官能基という。）の保護基としては、特に限定されない。例えば、　α−アミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリクロロエチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルもしくはピリジン−４−メトキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基；シクロペプチルオキシカルボニルもしくはシクロヘキシルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（ｐＭＺ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−メチルフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシ−α，α−ジメチルベンジルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンズヒドリル、トリチル等の置換基を有していてもよいアラルキル基；トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル等の置換基を有していてもよいアシル基；ジチアスクシノイル、２−ニトロフェニルチオ、ジフェニルホスフィニル、ジフェニルホスフィノチオイル、ジメチルホスフィノチオイル等が挙げられる。
【００４４】
セリン等の水酸基は、例えば、アセチル基等の低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基等のアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基等で保護できる。
アルギニンのグアニジノ基は、例えば、ニトロ基、Ｚ基、Ｔｓ基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル基（Ｍｂｓ）、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル基（Ｍｄｓ）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基（Ｍｔｒ）、メシチレン−２−スルホニル基（Ｍｔｓ）、２，３，４，５，６−ペンタメチルベンゼンスルホニル基（Ｐｍｅ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホニル基（Ｍｔｂ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基（Ｐｍｃ）、２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル基（Ｐｂｆ）等で保護できる。
また、システインのメルカプト基は、例えば、トリチル基、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基、ブチルチオ基等で保護できる。
ヒスチジンのイミダゾリル基の保護基としては、例えば、Ｂｏｃ基、トリチル（Ｔｒｔ）基、Ｔｓ基、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）基、ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）基、ｔ−ブトキシメチル（Ｂｕｍ）基、Ｆｍｏｃ基等が用いられる。
また、トリプトファンのインドリル基は、例えば、ホルミル基、Ｚ基、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル基、トリクロロエチルオキシカルボニル基、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル基、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルホニル基等で保護できる。
【００４５】
固相合成法による縮合反応は、上述の弱酸性離脱樹脂にアミノ酸を１個ずつ順次縮合させる逐次延長法、２個以上のアミノ酸で構成されたペプチド断片を縮合させる断片縮合法やこれらの方法を組み合わせた方法の何れの方法で行ってもよい。前記２個以上のアミノ酸で構成されたペプチド断片は、各アミノ酸から慣用の液相法、固相法等により製造することができる。
【００４６】
まず、上記のようなα−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸又は非アミノ酸（以下、特に断りのない限り、保護アミノ酸と略称する。）を活性化し、弱酸性離脱樹脂に活性化された保護アミノ酸を縮合する。その際、保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等の酸アミド類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；トリフルオロエタノール、フェノール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフラン等のエーテル類；アセトニトリル，プロピオニトリル等のニトリル類；酢酸メチル，酢酸エチル等のエステル類又はこれらの適宜の混合物等が用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応の反応温度と同一であってよく、通常約−２０℃〜５０℃程度の範囲から適宜選択される。活性化された保護アミノ酸は通常１〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸又はアセチルイミダゾールを用いて未反応保護アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００４７】
ついで、弱酸性離脱樹脂に縮合された保護アミノ酸に、所望の配列どおりに、保護アミノ酸を縮合させていく。各保護アミノ酸の縮合反応は、慣用の方法、例えば、Ｃ端活性化法、カップリング試薬を用いるカップリング法等により行うことができる。Ｃ端活性化法には、活性エステル法、対称酸無水物法等が含まれる。前記活性エステル法で用いる活性エステルとしては、例えば、シアノメチルエステル等のアルキルエステル；チオフェニルエステル、ｐ−ニトロチオフェニルエステル、ｐ−メタンスルホニルフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、２，４，６−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル等のフェニルエステル；１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシフタル酸イミドエステル、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のジカルボン酸イミドエステル；８−ヒドロキノリンエステル、Ｎ−ヒドロキシピペリジンエステル、２−ヒドロキシピリジンエステル等のヒドロキシルアミン誘導体等が挙げられる。
【００４８】
上記カップリング試薬を用いるカップリング法としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）等を用いるカルボジイミド法；ＤＣＣ−アディティブ法；カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）法；ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）反応剤（Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホン酸塩）もしくはＮ−エチル−２’−ヒドロキシベンズイソオキサゾリウムトリフルオロホウ酸塩等のイソオキサゾリウム塩、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＥＥＤＱ）、１−エトキシカルボニル−２−イソブトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＩＩＤＱ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−フォスホニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロフォスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）を用いる方法等が例示される。
【００４９】
上記カルボジイミド法で用いられる水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）には、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−モルホリノエチルカルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）シクロヘキシルカルボジイミド等が含まれる。水溶性カルボジイミドは、塩酸塩等の塩であってもよい。
また、上記ＤＣＣ−アディティブ法には、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ法、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法、ＤＣＣ−ＨＯＮＢ法、ＤＣＣ−２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステル法、ＷＳＣ−ＨＯＳｕ法、ＷＳＣ−ＨＯＢｔ法等が含まれる。
【００５０】
好ましい縮合反応には、カルボジイミド法、活性エステル法、ＤＣＣ−アディティブ法が含まれる。さらに好ましい縮合反応には、ラセミ化を抑制する方法、例えば、活性エステル法、ＤＣＣ−アディティブ法（例えば、ＤＣＣ−ＨＯＢｔ法、ＤＣＣ−ＨＯＳｕ法、ＷＳＣ−ＨＯＳｕ法、ＷＳＣ−ＨＯＢｔ法等）等が含まれる。
【００５１】
目的とする保護ペプチド断片には、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む。ペプチド鎖に修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を挿入する方法としては、下記２通りの方法が挙げられる。
第一の方法としては、所望のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖を特異的に予め修飾しておき、かかるアミノ酸又は非アミノ酸（以下、残基特異的に修飾されたアミノ酸又は非アミノ酸という。）を、ペプチド鎖の伸長段階で導入するという方法が挙げられる。より具体的には、残基特異的に修飾されたアミノ酸又は非アミノ酸（これらのαアミノ基に保護基を付した化合物を含む）は、自体公知の合成方法によって合成することができる。例えば、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、アシル化反応、アルキル化反応などが挙げられ、これらは当業者に周知の方法により行われ得る。さらに、これを前述した縮合反応のいずれかによりペプチド鎖に導入することができる。この場合、その弱酸性離脱樹脂からの保護ペプチド断片の脱離は後述する条件から適宜選択されるが、好ましくは目的とする残基特異的に修飾されたアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の置換基Ｒを脱離させない条件から適宜選択されることが好ましい。
【００５２】
第二の方法としては、アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有するペプチド断片を上記方法により作製し、その後、所望のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖を特異的に修飾する（以下、残基特異的修飾という。）という方法が挙げられる。前記の残基特異的修飾の方法は特に限定されず、公知の方法を用いてよい。例えば、エステル化反応、アミド化反応、エーテル化反応、アシル化反応、アルキル化反応などが挙げられ、これらは当業者に周知の方法により行われ得る。さらに、リン酸化修飾する方法としては、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ，　４１巻，　ｐ．４４５７−４４６１，２０００年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，　６０巻，　ｐ．３−３１，　２００１年等が挙げられる。また、糖修飾する方法としてはＩｎｔ．　Ｊ．　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．，　４２巻，　ｐ．１６５−１７０，　１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２９１巻，　ｐ．２３４４−２３５０，　２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２９１巻，　ｐ．２３５７−２３６４，
２００１年等が挙げられる。
【００５３】
かかる方法は、下記２通りの場合に分けられる。即ち、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の官能基が保護基により保護されている場合、かかる保護基の脱保護の際に同時に保護ペプチド断片が樹脂から離脱してしまう場合と、かかる保護基の脱保護の際には保護ペプチド断片は樹脂から離脱しない場合とに大別される。前者の場合、Ｃ末端のカルボキシル基を保護基により保護した後、自体公知の合成方法により残基特異的修飾を施し、その後、Ｃ末端のカルボキシル基を後述する方法から適宜選択して脱保護することにより目的のペプチド断片を得ることができる。また、後者の場合、樹脂上で自体公知の合成法により残基特異的修飾を施すことができ、その後、目的のペプチド断片を、後述する方法から適宜選択して樹脂から離脱すればよい。
【００５４】
本発明においては、アミノ酸又は／及び非アミノ酸からなる所望の配列を有するペプチド断片を上記方法により作製し、その後、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の反応性官能基が保護基により保護されている場合は、その保護基を脱保護し、樹脂上で自体公知の合成法により残基特異的修飾を施し、ついで、後述する弱酸性離脱樹脂からの保護ペプチド断片の離脱、及び所望により各保護基の脱保護を行うという方法が最も好ましい。
上記方法において、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の保護基としては、かかる保護基を脱保護する際に保護ペプチド断片が樹脂から離脱しないものであれば特に限定されないが、好ましくはｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等のシリル基等が挙げられる。このような保護基を脱保護する際は、保護ペプチド断片が樹脂から離脱されず、かつ、残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基を特異的に脱保護することができる試薬を用いる。かかる試薬は、弱酸性離脱樹脂及び前記保護基の種類に応じて適宜選択されるが、前記保護基がシリル基である場合は、フッ化四級アンモニウムを用いることが好ましく、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）を用いることがより好ましい。
【００５５】
上記のように保護基を選択すると、ペプチド伸長の縮合のためＮ末端アミノ基を脱保護する際に、各保護アミノ酸の側鎖官能基の保護基及び弱酸性離脱樹脂から保護ペプチド断片が脱離せず、また、得られたペプチド−樹脂結合体から弱酸性離脱樹脂を脱離する際に、各アミノ酸残基の側鎖官能基の保護基が脱離しない。しかも、このことに起因して、副反応物の生成を抑制することができる。そのため、側鎖官能基が保護基により保護されたペプチド断片を、高い純度で収率よくしかも簡易に得ることができる。このペプチド断片は、側鎖官能基が保護されているので、新たに保護基を導入する必要がなく、次工程において、液相法により目的とする修飾ペプチド又は蛋白質を製造する際の原料として、好適に使用することができる。
【００５６】
最後に、作製された保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させる。このとき、保護ペプチド断片における保護基、即ち、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基が脱保護されない弱酸性条件で行う。弱酸性条件とは、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸もしくはギ酸などのカルボン酸類、および／またはトリフルオロエタノールもしくはヘキサフルオロイソプロパノールなどのフッ素化アルコール類を含む溶液中に、弱酸性離脱樹脂を懸濁させた条件が挙げられる。具体的には、上記溶液中で、所望時間、好ましくは５分〜４時間程度、より好ましくは１０分〜２時間程度攪拌することにより、作製された保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることができる。より具体的には、例えば、Ｂａｒｌｏｓらの方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ，　Ｖｏｌ．３０，　ｐ．３９４７，１９８９）等に記載されている公知の方法、例えば、０．５％トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン、あるいは酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン＝１／２／７、あるいは酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン＝２／２／６等の溶媒に懸濁させる方法に従えばよい。
【００５７】
本発明においては、ペプチド鎖に修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を挿入することなく、保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させ、ついで所望のアミノ酸残基に残基特異的修飾を施すことによっても、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含むペプチド断片を製造することができる。残基特異的修飾の方法は、上記と同一である。
【００５８】
以上述べてきた製造方法は、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片であれば、特に制限なく適用されうる。中でも、下記式９で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片又はその塩の作製に、上記方法を用いるのが好ましい。
即ち、式９；（Ｒ１）ｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（Ｘ１）−Ａ（Ｒ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（Ｘ２）−Ｐｒｏ−ＯＲ２
（式中、−Ａ（Ｒ）−は、上記修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ化合物である。なかでも、Ａは、セリン、スレオニン、システイン、ホモシステイン、リジン、オルニチン、グルタミン酸、２−アミノアジピン酸、ジアミノ酢酸、２−アミノマロン酸、アスパラギン酸、チロシン、アスパラギンが好ましく、Ｒは、アシル基、糖、リン酸基、硫酸基、アルキル基、アラルキル基、アロイル基等の修飾基が好ましく、ＲがＡの側鎖の反応性置換基にエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、Ｏ−グリコシド結合又はＮ−グリコシド結合を介して結合していることが好ましい。
Ｒ１は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリクロロエチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニルもしくはピリジン−４−メトキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアルコキシカルボニル基；シクロペプチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいシクロアルキルオキシカルボニル基；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（ｐＭＺ）、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−メチルフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシ−α，α−ジメチルベンジルオキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアラルキルオキシカルボニル基；ベンジル（Ｂｚｌ）、ベンズヒドリル、トリチル等の置換基を有していてもよいアラルキル基；トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル、２，４−ジニトロフェニルスルフェニル、３−ニトロ−２−ピリジルスルフェニル等の置換基を有していてもよいアシル基；ジチアスクシノイル、２−ニトロフェニルチオ、ジフェニルホスフィニル、ジフェニルホスフィノチオイル、ジメチルホスフィノチオイルを示し、
ｎは、１もしくは２であり、
Ｘ１及びＸ２は、セリン側鎖の水酸基の保護基を示し、アセチル基等の低級（Ｃ１−６　）アルカノイル基；ベンゾイル基等のアロイル基；ベンジルオキシカルボニル基もしくはエトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基を示すか、又は、側鎖に上述の置換記Ｒをエーテル結合を介して結合させるというエーテル化に適する基として、例えば、ｔ−ブチル基、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、トリチル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基等のシリル基を示し、
Ｒ２は、保護基又は保護基が無いことを示し、保護基がある場合は、アルキルエステル基（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ｔ−ブチルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル、シクロオクチルエステル、２−アダマンチルエステル等の直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル基）、アラルキルエステル基（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル基）、フェナシルエステル基、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド基、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド基、トリチルヒドラジド基を示す。）
で表されるペプチド又はその塩等である。
【００５９】
式９中、Ｒ１はＢｏｃ基、Ｚ基、ｐＭＺ基又はＦｍｏｃ基が好ましく、Ｘ１及びＸ２で表される保護基としては、好ましくはｔ−ブチル基又は３４ベンジル基、さらに好ましくはｔ−ブチル基が挙げられる。Ｒ２は、水素あるいはチオエステル基が好ましい。
【００６０】
さらに、以上述べてきた製造方法は、グレリン、好ましくはヒト、ラット、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマスもしくはイヌのグレリン、又はグレリン誘導体を製造する際に好適に用いられる。また、前記グレリン又はグレリン誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含む部分を製造する際にも好適に用いられる。前記各生物のグレリンの構造は、表１に記載している。
より具体的には、（ａ）配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、少なくともＮ末端の１番目から４番目のアミノ酸配列を有し、好ましくは当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から５番目のアミノ酸配列からなるか、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から７番目のアミノ酸配列からなり、（ｂ）Ｎ末端から３番目のセリン又はスレオニンの側鎖の水酸基が、アシル化、好ましくは飽和又は不飽和の炭素数２〜３５、好ましくは６〜１８のアルキル基によりアシル化されており、（ｃ）アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されているペプチド断片の製造に、以上述べてきた製造方法は有用である。
【００６１】
本発明においては、修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片を、前記修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ酸を含む保護ペプチド断片とは別個に製造する。
本発明におけるペプチド又は蛋白質の、アシル化、糖化、リン酸化等の修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片は、自体公知の遺伝子組換法もしくは酵素法により製造することができる。例えば、前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド（以下、目的ペプチドという。）をコードする塩基配列を有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から目的ペプチドを採取する工程、及び前記工程で得られた目的ペプチドの側鎖官能基のうち、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する官能基を保護基により保護する工程を含む方法により製造することができる。発現ベクターの作製方法は、当技術分野における常法に従って行うことができる。発現ベクター作製の際には、目的ペプチドの高発現に必要なその他の要素、例えばプロモーター、ターミネーター、スプライス部位等についても従来の方法において既に知られているものを適宜用いることができる。前記発現ベクターにより形質転換される宿主細胞も特に限定されるものではなく、従来の方法において既に用いられている原核細胞又は真核細胞、例えは大腸菌等の微生物細胞、酵母又は動物細胞等から、目的ペプチドをコードする塩基配列が好適に発現できるものを適宜選択して用いることができる。目的ペプチドの側鎖官能基の保護も、上述と同一の方法で行えばよい。
【００６２】
修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片は、
工程（１）；（ａ）目的ペプチドに所望によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列を有する発現ベクターにより形質転換された細胞を培養して、当該培養物から前記融合蛋白質を採取する工程；
工程（２）；工程（１）において得られた融合蛋白質から、保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドと切断分離し、所望によりさらに精製する工程；
工程（３）；（２）で得られた目的ペプチドの側鎖官能基のうち、望ましくない副反応を惹起する可能性を有する官能基を保護基により保護する工程；
を含む方法により製造することもできる。
【００６３】
保護ペプチドは、目的ペプチドが宿主細胞内で酵素により分解されるのを抑制する目的で用いられるものであり、当該目的を達成できるものであれば特に限定されないが、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼに係るアミノ酸配列を有するフラグメントを用いることができる。当該酵素に係るアミノ酸配列は当業者にとって公知であり、β−ガラクトシダーゼ由来のペプチドフラグメントは広く当業者により融合蛋白法における保護ペプチドとして用いられている。
リンカー配列は、工程（２）において保護ペプチドと目的ペプチドとの切断分離に適した酵素がない等、保護ペプチドと目的ペプチドとの切断分離がうまくいかない場合、保護ペプチドと目的ペプチドとの間に挿入される配列である。従って、工程（２）においてリンカー配列と目的ペプチドとの切断分離がうまくいくように、その配列を適宜選択することができる。
【００６４】
保護ペプチド及び所望によりリンカー配列と目的ペプチドと切断分離は、酵素的又は／及び化学的な方法で行うことができる。
酵素的及び化学的な切断方法としてはＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，１８５巻，Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｖｉｄ　Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、出版社ＡＣＡＤＥＭＩＣ　ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ）に記載されている方法も用いることができる。
化学的切断方法としては、メチオニンのＣ末端側をブロムシアンで切断する方法（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７６，ｐ１０６−１１０，１９７９）、−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−配列の間を蟻酸で切断する方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．４０，ｐ１１７３，１９７０）、−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−配列の間をヒドロキシルアミンで切断する方法及びトリプシンのＣ末端側をＢＮＰＳ−スカトール又はＮ−クロロスクシンイミドで切断する方法等が挙げられる。例えば、目的ペプチドに係るアミノ酸配列中にメチオニンが含まれない場合は目的ペプチドに隣接する切断部位領域の末端にメチオニンを導入し、ブロムシアン処理により化学的に切断部位領域での切断を行うことができる。
また、酵素的切断方法としては、切断処理に用いる酵素が基質として特異的に認識することができる切断部位領域を設定すれば良く、それらの例としては、アルギニン−アルギニン、リジン−リジン、アルギニン−リジンおよびリジン−アルギニンの塩基性アミノ酸対の中央のペプチド結合、またはアルギニン−メチオニン、アルギニン−アラニンもしくはアルギニン−バリンのアミノ酸対の中央のペプチド結合を大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼ（Ｓｕｇｉｍｕｒａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｎｉｓｈｉｈａｒａ，　Ｔ．　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７０：　５６２５−５６３２，　１９８８）で、Ｘ−Ｇｌｙ又はＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列の−Ｘ−Ｇｌｙ−配列の間をコラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，ｐ４６９２−４６９６，１９８４）で、−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−配列（配列番号：２２）のＬｙｓのＣ末端側をエンテロキナーゼ（Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）で、−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−配列（配列番号：２３）のＡｒｇのＣ末端側を血液凝固因子Ｘａ（ｂｌｏｏｄ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｘａ）（特開昭６１−１３５５９１）で、−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−配列のＡｒｇのＣ末端側をトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）（特開昭６２−１３５５００）で、−Ａｒｇ−のＣ末端側をトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）又はクロストリパイン（Ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）で、Ａｒｇ又はＬｙｓのＣ末端側をエンドプロテアーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）Ａｒｇ−Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２８５，ｐ４５６−４６１，１９８０）で、Ｌｙｓ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ又はＰｒｏ−Ａｒｇ配列のＣ末端側をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｋｅｘ２プロテアーゼ及びその誘導体（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．１４４，ｐ８０７−８１４，１９８７、特開平１−１９９５７８、特開平１０−２２９８８４）で、ＬｙｓのＣ末端側をリシルエンドペプチダーゼ（ｌｙｓｌ　ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）又はエンドペプチダーゼ（ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ｌｙｓ−Ｃ（特開昭６１−２７５２２２）で、Ａｓｐ又はＧｌｕのＣ末端側をスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８プロテアーゼ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，ｐ３５０６−３５０９，１９７２）で、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−配列のＣ末端側をカリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）（特開昭６２−２４８４８９）で、−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−配列（配列番号：２４）のＬｅｕ−Ｌｅｕの間をレニン（ｒｅｎｉｎ）で（特開昭６０−２６２５９５）、−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−配列のＣ末端側をウロキナーゼ（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）（特開平２−１００６８５）で、Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ配列（配列番号：２５）のＣ末端側をエンテロペプチダーゼ（ｅｎｔｅｒｏ−ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，ｐ１２０４−１２１０，１９８８）で、ｐｏｌｙ−ＧｌｙのＣ末端側をリソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）（特開平１−１６０４９６）で、Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ａｒｇ−Ａｒｇ又はＰｒｏ−Ａｒｇ等のＣ末端側をクリベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｌｓ）（特開平１−１２４３９０）で切断する方法等が挙けられる。
【００６５】
本方法における発現ベクター、宿主細胞及び目的ペプチドの側鎖官能基の保護については、上記方法と同様である。
さらに、遺伝子組換法もしくは酵素法を用いた修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片の製造方法は、国際公開番号：ＷＯ９９／３８９８４に記載されている方法を用いることもできる。
【００６６】
修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片が、グレリン及びグレリン誘導体の修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片（以下、グレリン断片（非修飾成分）という。）である場合、国際公開番号：ＷＯ　０１／０７４７５に、遺伝子組換法及び酵素法による製造方法が記載されている。
【００６７】
さらに、国際公開番号：ＷＯ　００／５２１９３に記載されているＧｌｕｃａｇｏｎ　ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ−１の生産で使用している保護たんぱく質及びリンカー配列を適応させて、ＯｍｐＴプロテアーゼ又はその誘導体、ならびにＫｅｘ２プロテアーゼ又はその誘導体による２段階酵素法を用いてもグレリン断片（非修飾成分）を製造することができる。この方法では宿主である大腸菌の内在性ＯｍｐＴプロテアーゼを活用することが可能なため、酵素を別途調製する必要がない。前記ＯｍｐＴプロテアーゼまたはＫｅｘ２プロテアーゼの誘導体としては、ＯｍｐＴプロテアーゼまたはＫｅｘ２プロテアーゼと同一の活性を有するものであれば特に限定されない。ＯｍｐＴプロテアーゼ誘導体としては大腸菌のＯｍｐＰプロテアーゼ、サルモレラのｐｇｔＥプロテアーゼに代表されるＯｍｐｔｉｎファミリーに属する酵素やＯｍｐＴプロテアーゼの活性部位を含む部分ペプチドなどが挙げられ、Ｋｅｘ２プロテアーゼ誘導体としては、特開平１０−２２９８８４に記載の誘導体およびＦｕｒｉｎ、ＰＣ１／３に代表されるＫｅｘ２ファミリーに属する酵素などが挙げられる。
本方法では、実施例１３に示すように、国際公開番号：ＷＯ　００／５２１９３に記載されているリンカー配列ＥＰＨＨＨＨＰＧＧＲＱＭＨＧＹＤＡＤＶＲＬＹＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ（配列番号２６）の代わりに、当該配列における３５番目プロリン残基をアルギニン残基に置換した配列ＥＰＨＨＨＨＰＧＧＲＱＭＨＧＹＤＡＤＶＲＬＹＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ（配列番号２７）をリンカー配列として用いることにより、ＯｍｐＴプロテアーゼ及びＫｅｘ２プロテアーゼを使用した２段階酵素処理法で、グレリン断片（非修飾成分）、なかでもグレリン（８−２８）断片、特にヒトグレリン（８−２８）断片を効率よく得ることができる。新たに見出された配列番号２７に記載のリンカー配列内にはＯｍｐＴプロテアーゼの切断認識部位以外にも別箇に切断認識部位が生じるにもかかわらず、目的の部位でのみ正常に切断が起きている（実施例３参照）。
【００６８】
さらに、保護ペプチド断片（非修飾成分）を精製・保存する際に、精製又は保存に用いる溶液のｐＨを４−８に調整することにより保護基の離脱を防ぐことができる。そして、保護基の脱離を抑制することにより、高回収率で高純度の修飾ペプチド又は蛋白質を調製することができる。前記精製又は保存に用いる溶液としては、水溶液が好ましい。具体的には、水、好ましくは限外ろ過水、酢酸ナトリウム溶液などが挙げられる。水溶液中での保護ヒトグレリン（８−２８）断片の安定性を調べた実施例１５から明らかなように、Ｂｏｃ基により保護されたペプチド断片は水溶液状態によってその安定性が異なり、特にｐＨ２以下の水溶液状態においては明らかな本保護基の離脱が認められたことから、保護基としてＢｏｃ基を用いた場合は、特に精製・保存時の溶液のｐＨを４−８の間に設定することが好ましい。
【００６９】
ついで、本発明においては、以上のようにして得られた（ａ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片と、（ｂ）修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片とを、縮合し、所望により、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基を脱保護する。
【００７０】
上記縮合反応は、液相法により行われることが好ましい。また、上記（ａ）及び（ｂ）のペプチド断片を液相法により縮合する反応において、前記ペプチド断片の各アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基は、通常、保護基で保護されている。前記保護基としては、各官能基の保護基として上記に例示した保護基が挙げられる。好ましい保護基としては、前記（ａ）及び（ｂ）の保護ペプチド断片の保護基を、同様の脱離条件下で脱離することができる保護基が挙げられる。なお、この場合には、弱酸性離脱樹脂がすでに脱離しているため弱酸性離脱樹脂の脱離条件を考慮する必要はなく、また、この場合の側鎖官能基の保護基としては、Ｎ末端アミノ基の脱離条件で脱離する保護基がより好ましい。
【００７１】
前記（ａ）及び（ｂ）の保護ペプチド断片を液相法により縮合する反応において、縮合に用いる試薬や条件等は上述のアミノ酸縮合反応において記載したものから適宜選択される。好ましくは、ペプチド又は蛋白質のラセミ化異性体等の不純物をより副生しにくい方法から選択される。特に、縮合に用いる試薬（縮合剤）としては、例えば、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１−ヒドロベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジフェニルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等が好適な例として挙げられる。中でも、縮合剤が、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）であり、前記縮合剤を用いるペプチド断片の縮合が、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）又は３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）の存在下、行われることがより好ましい。
【００７２】
縮合した反応生成物において、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の保護基は適宜脱保護することができる。この場合における脱保護の試薬や条件等は、好ましくは、ペプチド又は蛋白質のラセミ化異性体等の不純物をより副生しにくい方法から選択される。
各保護基の脱離条件は、例えば、前記「ペプチド合成の基礎と実験」等に記載されている公知の方法に従えばよい。保護基の脱離方法には、強酸、弱酸、塩基、還元試薬（接触還元、金属、チオール等）、酸化試薬、親核試薬、親電子試薬、イオン、電子、光、溶媒、酵素等をそれぞれ利用する方法があり、前記保護基の選択には、これらの脱離方法の脱離条件を考慮して行うことができる。
【００７３】
保護基の除去方法（脱保護反応）としては、例えば、トリフルオロ酢酸、酢酸、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、あるいはこれらの混合液等（好ましくはトリフルオロ酢酸、酢酸等）による酸処理；ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理；Ｐｄ−炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元；酢酸中亜鉛末処理（Ｚｎ／ＡｃＯＨ）；又は、テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）処理等も用いられる。上記の脱保護反応は一般に約４０℃以下の温度で行なわれるが、好ましくは約２５℃以下で行うことにより、保護ペプチド断片のラセミ化異性体の副生を効果的に抑制することができる。上記の脱保護反応の反応時間は通常約０．５〜約５時間である。
【００７４】
上記酸処理においては、例えば、水、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、フェノール、アニソール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオール等（好ましくはフェノール等）のようなカチオン捕捉剤を添加することが好ましい。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去される。
【００７５】
本発明により得られた反応生成物は、例えば、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、電気泳動法等の慣用の分離精製手段により、単離精製できる。また、精製する生成物は、最終目的とする修飾されたペプチド又は蛋白質に限らず、修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を１以上含む保護ペプチド断片、もしくは修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片、又はこれらの製造工程における中間体として得られた生成物を、上述の分離精製手段により適宜精製することができることは言うまでも無い。
【００７６】
以上のようにして、修飾ペプチド又は蛋白質を製造することができる。本発明にかかる上記製造方法は、修飾ペプチド又は蛋白質であれば、特に制限なく適用されうる。中でも、グレリン、好ましくはヒト、ラット、マウス、ブタ、ニワトリ、ウナギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、カエル、ニジマス、もしくはイヌのグレリン、又はグレリン誘導体を製造する際に好適に用いられる。なお、前記各生物のグレリンの構造は、表１に記載している。本発明により得られるグレリン又はグレリン誘導体は、従来の技術により得られるグレリン又はグレリン誘導体に比べ、不純物（特にグレリン又はグレリン誘導体のラセミ化異性体）の量が大幅に少ない極めて高品質のグレリン又はグレリン誘導体である。その結果、より簡便な精製方法により十分な精製を効果的に行うことができ、作業時間を短縮し、高収率でグレリン又はグレリン誘導体を製造することができる。この点からも従来技術に比べ、本発明の製造方法はグレリン又はグレリン誘導体の工業的製造方法として極めて有利な方法である。
【００７７】
上記「高品質のグレリン又はグレリン誘導体」としてより具体的には、例えば、総類縁物質の含量が約１％以下（好ましくは約０．９％以下、より好ましくは約０．８％以下、更に好ましくは約０．７％以下）である精製グレリン又はグレリン誘導体又はその塩等が挙げられる。ここで、総類縁物質とは、高速液体クロマトグラフィー等により検出される、全ての不純物の合計を意味し、不純物としては、グレリン又はグレリン誘導体のラセミ化異性体、高極性類縁物質、その他の不純物が挙げられる。
【００７８】
本発明にかかる修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法の特に好ましい態様は、以下の通りである。すなわち、
工程１；（ａ）配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、少なくともＮ末端の１番目から４番目のアミノ酸配列を有し、好ましくは当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から５番目のアミノ酸配列からなるか、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端の１番目から７番目のアミノ酸配列からなり、（ｂ）Ｎ末端から３番目のセリン又はスレオニンの側鎖の水酸基が、アシル化、好ましくは飽和又は不飽和の炭素数２〜３５、好ましくは６〜１８のアルキル基によりアシル化されており、（ｃ）アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製及び下記工程（４）におけるペプチド断片の縮合反応に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されているペプチド断片を、弱酸性離脱樹脂上で製造する工程、
工程（２）；弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることなく前記ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させる工程、
工程（３）；配列番号１〜２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、工程（１）及び（２）で作製されたペプチド断片が有するアミノ酸配列以外のアミノ酸配列、好ましくは当該アミノ酸配列においてＮ末端の６番目から２８番目のアミノ酸配列からなるか、又は当該アミノ酸配列においてＮ末端の８番目から２８番目のアミノ酸配列からなり、かつ、アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、水酸基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる１種以上の、ペプチド断片作製及び下記工程（４）におけるペプチド断片の縮合反応に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されているペプチド断片を製造する工程、
工程（４）；前記工程（２）で製造されたペプチド断片と工程（３）で製造されたペプチド断片を縮合し、ついで、所望により反応性官能基の保護基を脱保護する工程
を含む修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法である。
【００７９】
本発明にかかる方法により得られる修飾ペプチド又は蛋白質は、反応条件により、遊離のペプチド又はその塩の形態で得られる。遊離のペプチドとその塩は、慣用の方法により相互に変換可能である。遊離のペプチドを、薬理的に許容できる塩とする場合には、例えば、次記例示の無機酸、有機酸等と反応させればよい。上記のペプチド又は蛋白質の塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、このような塩としては、該ペプチド又は蛋白質がアミノ基等の塩基性基を有する場合、無機酸（無機の遊離酸とも称する）（例、炭酸、重炭酸、塩酸、硫酸、硝酸、ホウ酸等）、有機酸（有機の遊離酸とも称する）（例、コハク酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸等）等との塩があげられる。該ペプチド又は蛋白質がカルボキシル基等の酸性基を有する場合、無機塩基（無機の遊離塩基とも称する）（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属等）や有機塩基（有機の遊離塩基とも称する）（例、トリエチルアミン等の有機アミン類、アルギニン等の塩基性アミノ酸類等）等との塩があげられる。また、該ペプチド又は蛋白質は金属錯体化合物（例、銅錯体、亜鉛錯体等）を形成していてもよい。
【００８０】
本発明にかかる方法で製造される修飾ペプチド又は蛋白質は、種々の用途に利用することができる。例えば、上記の精製グレリン又はグレリン誘導体は、低毒性であり、哺乳動物（例、ヒト、サル、イヌ、ラット、マウス）に対して、摂食障害治療薬、成長ホルモン分泌促進薬、心疾患治療薬、胃機能性疾患治療剤、腸管粘膜保護剤もしくは経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤、骨粗鬆症治療剤、慢性疾患による悪液質の減少剤、肺機能不全治療剤等の医薬品として、投与することができる。また、上記の精製グレリン又はグレリン誘導体は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、徐放性製剤等として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤、徐放性製剤等の注射剤；溶液、懸濁液剤等の経鼻投与製剤；噴霧剤もしくは吸入剤等の経肺投与製剤；座剤の形で非経口的に投与できる。上記の精製グレリン又はグレリン誘導体を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって上記製剤を製造することができる。
【００８１】
【実施例】
本発明を以下の実施例で更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例において用いた試験法と機器は、特に記載しない限り以下に記載のものを使用した。
〔主な略号〕
ＨＢＴＵ；２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェイト（２−（１Ｈ−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ），　ＤＣＣ；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ），
ＨＯＢｔ；１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ），
ＨＯＯＢｔ；３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−４−ｏｘｏ−１，２，３−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅ），
ＴＦＡ；トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ），
ＴＩＰＳ；トリイソプロピルシラン（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ），
ＤＩＰＥＡ；ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ），
ＴＢＡＦ；テトラブチルアンモニウムフルオリド（ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ），ＴＦＥ；トリフルオロエタノール（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｏｌ），
Ｆｍｏｃ；フルオレニルメトキシカルボニル（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），
Ｂｏｃ；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），
ｔＢｕ；ｔ−ブチル（ｔ−ｂｕｔｙｌ），
ＴＢＤＭＳ；ｔ−ブチル　ジメチルシリル（ｔ−ｂｕｔｙｌ　ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ），
Ｔｒｔ；トリチル（ｔｒｉｔｙｌ），
Ｐａｃ；フェナシル（ｐｈｅｎａｃｙｌ），
ＤＭＦ；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ），
ＤＣＭ；ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ），
ＮＭＰ；Ｎ−メチルピロリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ），
Ｅｔ２Ｏ；ジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ），
ＤＭＡＰ；４−ジメチルアミノピリジン（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ），
ＥＤＣ　；１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（　１−ｅｈｔｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）
【００８２】
〔合成に使用した保護アミノ酸と樹脂〕
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ＴＢＤＭＳ），　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ），　Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ，　Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ（以上、渡辺化学工業社製又はアプライドバイオシステム社製），プロリル−２−クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製）。
【００８３】
〔使用機器〕
（ａ）ペプチド自動合成機
アプライドバイオシステム社製：４３３Ａ合成機
（ｂ）分析用ＨＰＬＣシステム
機器：島津ＬＣ−１０Ａシステム
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ又はＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ　ＡＰ−３０２又はＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｃ８　（全て４．６　ｍｍφ×１５０　ｍｍ）
カラム温度：４０℃
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を最高１００％まで直線的に変化させた。
流速：１　ｍＬ／分
検出：ＵＶ　（２１０　ｎｍ又は２１４ｎｍ）
注入量：１０〜５０μＬ
【００８４】
2004002378.tif 000004
流速、溶出液等の条件は別途実施例に記載した。
2004002378.tif 000005
流速、溶出液等の条件は別途実施例に示した。
（ｄ）分取用ＨＰＬＣシステム
機器：Ｗａｔｅｒｓ　６００　Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ　（５μｍ，　２０　ｍｍ　ｘ　２５０　ｍｍ）又はＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＰＲＯＴＥＩＮ−ＲＰ　（５μｍ，　Ｃ４，　２０　ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍ）
溶出液：０．１％トリフルオロ酢酸中、適宜アセトニトリル濃度を最高１００％まで直線的に変化させた。
流速：１０　ｍＬ／分
検出：２１０　ｎｍ及び２６０　ｎｍ
注入：１０〜２０００μＬ、２０００μＬ以上はポンプにより注入
【００８５】
（ｅ）質量分析機
機器１：フィニガンＭＡＴ　ＴＳＱ７００
イオン源：ＥＳＩ
検出イオンモード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
スプレー電圧：４．５ｋＶ
キャピラリー温度：２５０℃
移動相：０．２％酢酸・メタノール混液（１：１）
流速：０．２　ｍＬ／分
スキャン範囲：ｍ／ｚ　３００〜１，５００
機器２：ＡＰＩ３０００（宝酒造）
検出イオンモード：　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ
スキャンタイプ：　Ｑ１ｓｃａｎ
流速：　０．３　ｍＬ／分
１　ｃｏｕｎｔ／０．１ｍｓｅｃ　ｄｕｒｉｎｇ　５ｍｉｎ　ｃｈａｓｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｒａｎｇｅ　５００〜３０００　Ｍａｓｓ
（ｆ）アミノ酸配列分析
機器：パーキンエルマー社製　アプライドバイオシステム　４７７Ａ型シークエンサー
（ｇ）アミノ酸組成分析
機器：日立製作所製　Ｌ−８５００型アミノ酸分析機計
試料：封管中、０．１％フェノールを含む６Ｍ塩酸で１１０℃、２４時間加水分解した。
【００８６】
〔　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ヒト由来グレリン（８−２８）の製造スケールと概要〕
以下、実施例２から実施例８は最終精製品として０．６　ｇ程度の［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）（ｈＧｈｒｅｌｉｎはヒト由来グレリンを示す。以下も同様である。）とを得ることを目的とした培養及び精製結果である。大腸菌に実施例１に示す発現ベクターを形質転換し、同実施例に示すアミノ酸配列を持つ融合蛋白質を発現させた。培養は２Ｌ培養槽を用いた高密度培養で行い、封入体を回収した。回収した封入体の半量を用いて精製を開始した。ＯｍｐＴ反応［０．９　Ｌスケール］、陽イオン交換ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｉｇ　ｂｅａｄｓ［１６０　ｍＬスケール］、Ｂｏｃ化反応［０．５　Ｌスケール］、逆相カラムＹＭＣ　ＯＤＳ−１２０　ｓ５０　［８０　ｍＬスケール］、Ｋｅｘ２反応　［０．３　Ｌスケール］はそれぞれ一回ずつ行い、最終精製の逆相カラムＶｙｄａｃ　Ｃ４［　２５　ｍＬスケール］は２回実施した。最終精製工程のみ直線濃度勾配による溶出で分画分析を実施した。また、脱溶媒にはエバポレーターを、濾過にはガラス繊維濾紙（ワットマン社）を用いた減圧濾過を実施した。
【００８７】
実施例１　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）誘導体発現ベクターｐ１１７　８−２８ｏＲＲの構築
ｈＧｈｒｅｌｉｎのｃＤＮＡ遺伝子配列（Ｋｏｊｉｍａら、Ｎａｔｕｒｅ，　４０２巻，　ｐ．　６５６−６６０、１９９９年）に基づき、全合成オリゴＤＮＡ　（ファルマシアバイオテック社）を用いてアニーリング法によりｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のＤＮＡ断片を得た。アニーリングに用いた全合成オリゴＤＮＡならびにアミノ酸配列を図１Ａに示す。
このＤＮＡ断片を大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体とヒトＧｌｕｃａｇｏｎ　ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ−１との融合蛋白質遺伝子を導入したプラスミドｐＧＰ１１７ｏｍｐＰＲ（国際公開番号：ＷＯ　００／　５２１９３）に挿入するため、ｐＧＰ１１７ｏｍｐＰＲを制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩＩで処理し、ヒトＧｌｕｃａｇｏｎ　ｌｉｋｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ−１遺伝子を欠失させたＤＮＡ断片を寒天ゲル電気泳動により調製した。さらにアルカリホスファターゼ処理後、先にＳａｃＩＩ処理、Ｔ４　ＤＮＡキナーゼ処理を施したｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）誘導体遺伝子断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼにより連結させた。連結したプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、プラスミドｐ１１７　８−２８ｏＰＲを得た。当該プラスミドはｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のアミノ酸配列とβガラクトシダーゼの部分断片１１７アミノ酸残基をＥＰＨＨＨＨＰＧＧＲＱＭＨＧＹＤＡＤＶＲＬＹＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ（配列番号２６）というアミノ酸配列を有するリンカー配列で繋いだ融合蛋白質を発現する。
【００８８】
さらに、このプラスミドｐ１１７　８−２８ｏＰＲを鋳型とし、酵素としてＫＯＤ　ｐｌｕｓポリメラーゼ（東洋紡）、プライマーには以下の２種のプライマー
ＯＲＩ−ＲＲ：　ＧＧＴＴＣＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣ（配列番号２８）
ＳＡＬ＊Ｒ　：　ＡＴＡＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧ（配列番号２９）
を用いＰＣＲを行い増幅断片を電気泳動ゲルから切り出した。さらに、これを制限酵素ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩで処理した。先にｐ１１７　８−２８ｏＰＲを同じく制限酵素ＳａｌＩ、ＢａｍＨＩ処理し精製したものとこの断片とをＴ４　ＤＮＡリガーゼで連結させ、連結したプラスミドを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、プラスミドｐ１１７　８−２８ｏＲＲを得た。当該プラスミドはｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のアミノ酸配列とβ−ガラクトシダーゼの部分断片１１７アミノ酸残基をＥＰＨＨＨＨＰＧＧＲＱＭＨＧＹＤＡＤＶＲＬＹＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ（配列番号２７）というアミノ酸配列を有するリンカー配列で繋いだ融合蛋白質を発現する。発現する融合蛋白質を以下図１Ｂに示す。
【００８９】
実施例２　大腸菌での組換えｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質の発現と封入体回収
実施例１で作成したプラスミドｐ１１７　８−２８ｏＲＲを大腸菌Ｗ３１１０株に形質転換した大腸菌を用いて３Ｌ培養槽にて２Ｌの培養を実施した。なおこの発現プラスミドはｐＢＲ３２２由来のプラスミドでｌａｃ　ｐｒｏｍｏｔｅｒで発現誘導される。また薬剤耐性遺伝子としてテトラサイクリン耐性遺伝子を保持する。前培養はＬＢ　ｂｒｏｔｈにて３２℃で１４時間振とう培養した。本培養には以下の組成の培地を使用した。培地組成は４ｇ／Ｌ酵母エキス、４ｇ／Ｌ　Ｋ２ＨＰＯ４、４ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、２．７　ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ　ＮＨ４Ｃｌ、１．２ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０　ｍｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２、４０　ｍｇ／Ｌ　ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０　ｍｇ／Ｌ　ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ、１０　ｍｇ／Ｌ　ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４　ｍｇ／Ｌ　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２　ｍｇ／Ｌ　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２　ｍｇ／ＬＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１　ｍｇ／Ｌ　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５　ｍｇ／Ｌ　Ｈ３ＢＯ４である。炭素源としてはグルコースを最初培地中に１　％添加して、３７℃で培養を開始した。グルコースが枯渇した後、グリセロールを添加して培養を行った。その後培養液を加圧式菌体破砕機（マントンゴーリン）にて菌体を破砕し、さらに遠心機にて約８０　ｇの封入体を回収した。さらに、この封入体を脱イオン水２　Ｌで再懸濁したのち、遠心分離機で回収することで封入体を洗浄した。最終的にＯＤ６６０値が５３０である封入体懸濁液２００　ｍＬを得た。
以下の実施例はこの封入体懸濁液の半分の量である１００　ｍＬを用いて行った。
【００９０】
実施例３　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質の内在性ＯｍｐＴプロテアーゼによるプロセッシング
実施例２で得られた封入体懸濁液をＯＤ６６０の値が１００．０になるように下記の反応条件に示す添加物と脱イオン水で希釈し、以下の反応条件でＯｍｐＴ反応を実施した。
反応条件：
４Ｍ尿素、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ　７．４、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、反応容量：８００　ｍＬ、反応温度３２℃、反応時間４０分
封入体を１００ＯＤ６６０／　ｍＬになるように８Ｍ尿素４００　ｍＬで溶解希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＮａＣｌを上記の濃度になるように添加し、脱イオン水で８００　ｍＬになるようにメスアップする。さらにｐＨを７．４に調整して反応を開始させた。反応開始０分、２０分、４０分でサンプリングしＨＰＬＣにて分析を行い切断率が８０％を超えた４０分で反応を停止させた。反応停止は５Ｎ　ＮａＯＨによりｐＨ１１まで上昇させて行った。反応停止後、低速遠心により残渣を除去し、上清を得た。
［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）濃度：　２．２３　ｍｇ／　ｍＬ
溶液量：　８００　ｍＬ
ペプチド含量：　１．７　ｇ
ＨＰＬＣ測定結果、及び質量分析の結果、正常にプロセシングが起きており、［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）が遊離していることが示された。フィニガンＭＡＴ社の質量分析計（ＴＳＱ−７００）で行ったＥＳＩ−ＭＳでの測定値は４０７８（理論値；４０７７）であった。
【００９１】
実施例４　［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の精製（陽イオン交換による精製）実施例３で得られたＯｍｐＴプロテアーゼ反応液上清を陽イオンクロマトグラフィーにより精製を行った。
方法：
使用カラム：ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｂｉｇ　ｂｅａｄｓ　（ＸＫ２６／３０）（１６０　ｍＬ）
（アマシャムファルマシア社製樹脂）内径　２６ｍｍ　ｘ長さ　３００ｍｍ
平衡化、洗浄液：　　　１．５　Ｍ尿素，　５０　ｍＭ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ１１
溶出液：　　　　　　　１．５　Ｍ尿素，０．５　Ｍ　ＮａＣｌ，　５０　ｍＭ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ１１
初期化、再生液：　　　　　０．４Ｍ　ＮａＯＨ
流速：　　　　　　　　　　　　　　　１０　ｍＬ／ｍｉｎ　（２．５ｃｍ／ｍｉｎ）
操作：
初期化、平衡化：　０．４Ｍ　ＮａＯＨ２カラムボリューム→脱イオン水２カラムボリューム→平衡化液：１００％　３カラムボリューム
サンプル負荷：サンプルを負荷し、平衡化、洗浄液でＵＶが下がってくるまで洗浄する（約４カラムボリューム程度）
溶出：　溶出液１００％のステップワイズで実施した。
結果：溶出液で得られたペプチドの純度は９０％で、工程回収率は９１．６％であった。
［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）濃度：４．７５　ｍｇ／ｍＬ
溶液量：　３００　ｍＬ
ペプチド含量：　１．４３　ｇ
【００９２】
実施例５　［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のＢｏｃ化
精製した［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）にＢｏｃ基の付加反応を行い、Ｎ末端のαアミノ基及び配列中に含まれるＬｙｓ残基の側鎖のアミノ基をＢｏｃ基により保護する。
方法：陽イオンクロマト溶出液３００　ｍＬ全量をガラスビーカーに移し、５０％アセトニトリルになるように等量（３００　ｍＬ）のアセトニトリルを加えた。さらに攪拌しながら、１Ｍの（Ｂｏｃ）２Ｏを［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）内に存在するαアミノ基とリジン残基側鎖のεアミノ基数（計５箇所）の５倍モル量にあたる８．８　ｍＬ（終濃度２０ｍＭ，２５当量）加えた。さらにｐＨが９を下らないように５Ｎ　ＮａＯＨで調整し、スターラーで攪拌しながら室温で６０分間反応させた。
反応効率の測定はＨＰＬＣ分析及び分子量の測定によりモニターした。
反応終了後ただちにエバポレーターにより脱溶媒を実施した。脱溶媒後、酢酸にてｐＨを５．５にあわせて沈殿をガラス繊維濾紙（ワットマン社）にて減圧濾過を行った。この工程により［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４　（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を１７４０　ｍｇ含む溶液、５８０　ｍＬを得た。
工程回収率：　１１６％　（工程回収率が１００％より大きいのは、Ｂｏｃ基付加によりＨＰＬＣでの吸光度が上昇し、見かけの回収率が増加したためであると考えられる。）
質量分析はフィニガンＭＡＴ社の質量分析計（ＴＳＱ−７００）を使用した。行ったＥＳＩ−ＭＳでの測定値は４５７８（理論値；４５７７）であった。
Ｂｏｃ化前（測定分子量＝４０７７、理論上分子量＝４０７７）に比べ反応後では分子量が５００多くなったもの（測定分子量＝４５７８、理論上分子量＝４５７７）が主に見られた。このピークはｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）配列内のリジン残基側鎖に存在する４個所のεアミノ基、及びＮ末端のαアミノ基がＢｏｃ化された［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）であると推定された。
【００９３】
実施例６　［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）１６，１９，２０，２４］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の逆相カラムによる精製
実施例５にて得られた［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を逆相カラムにて精製した。
方法：
使用カラム：ＹＭＣ−ＯＤＳ　１２０　ｓ５０　（ＨＲ２６／１５）　　８０　ｍＬ　（ＹＭＣ社製樹脂）　内径２６ｍｍ　ｘ長さ１５ｍｍ
平衡化、洗浄液：　１０％アセトニトリル，　３０　ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ　５．５
溶出液：５０％アセトニトリル，　３０　ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ　５．５
再生液：８０％アセトニトリル
流速：７　ｍＬ／分　（２ｃｍ／分）
平衡化液で３カラムボリューム平衡化の後、サンプルを負荷し、平衡化液にて３カラムボリューム（ＵＶが下がるまで）カラムを洗浄する。溶出は溶出液１００％のステップワイズ溶出で行った。溶出後再生液でカラムを洗浄した。
溶出液は１７７０　ｍｇの［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を含む１５０　ｍＬの溶液で得られた。これに限外濾過水を７５　ｍＬ添加することで１．５倍希釈し、エバポレーターにて溶液中に含まれるアセトニトリルを留去した。
工程回収率：　９８％
【００９４】
実施例７　Ｋｅｘ２プロテアーゼによる［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の製造
実施例６で得られたペプチド溶液を以下に示す条件に調製してＫｅｘ２反応を実施した。すなわち、ＯＤＳ溶出液を限外濾過水で８　ｍｇ／　ｍＬに希釈後、１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３を５０　ｍＭになるように添加した。さらに０．２５Ｍ　ＣａＣｌ２を５　ｍＭになるように添加し、３０℃　１０ｍｉｎプレインキュベート後、Ｋｅｘ２プロテアーゼ（特開平１０−２２９８８４）溶液（１ｘ１０７　ｕｎｉｔ／ｍＬ）を２．５ｘ１０４ｕｎｉｔとなるように加えて、スターラーで攪拌しながら、３０℃の恒温槽で１２０分間反応させた。反応後、酢酸を用いてｐＨ　５．５に調整し反応を停止させた。ＨＰＬＣ、質量分析及びアミノ酸分析から、切断前後で原料である［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）は消失し、　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）が出現増加していることがわかり、正常にプロセシングされていることが分かった。
【００９５】
実施例８　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）体の精製
実施例７で得られた［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を含む反応後溶液を逆相カラムにて以下の条件で精製した。
方法：
使用逆相カラムＶｙｄａｃ　Ｃ４　（ＨＲ１０／３０）　２３　ｍＬカラム（Ｖｙｄａｃ社）内径１０ｍｍ　ｘ長さ３００ｍｍ
条件：
平衡化、洗浄液１０％アセトニトリル，　０．１％　ＴＦＡ　ｐＨ　３
溶出液：　５０％アセトニトリル，　　０．１％　ＴＦＡ　ｐＨ　３
流速：２　ｍＬ／分　（線流速３ｃｍ／分）
３カラムボリューム平衡化液を流した後、Ｋｅｘ２反応後溶液を２回に分けて負荷（２０　ｍｇ／ｍＬ樹脂）し、溶出液１０％で２カラムボリューム洗浄した後、溶出液１０％〜８０％の直線濃度勾配を８カラムボリュームで終了するプログラムで溶出させ、続いて溶出液１００％で２カラムボリューム洗浄し、この間の溶出液を６　ｍＬずつフラクション分取した。フラクションはＨＰＬＣ分析し、リンカー　［Ｎα−Ｂｏｃ］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］及び、未切断体［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を含まないフラクションをプールした。
結果：
収率：８４．４％　純度９７．５％
［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）濃度：５．６２　ｍｇ／　ｍＬ
溶液量：　１２０　ｍＬ
ペプチド含量：　　６００　ｍｇ
溶出した溶液をエバポレーターにて脱溶媒を行った後、凍結乾燥を実施し、ＯｍｐＴプロテアーゼ誘導体によるプロセッシングで得られた１７００　ｍｇの前駆体（実施例３）より、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４　（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を６００　ｍｇ得た（図２）。
【００９６】
実施例９　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４　（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）体の精製回収率、純度表
以下に実施例３から実施例８で示した［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の製造収率一覧表を表２に示す。
【表２】
2004002378.tif 000006
【００９７】
実施例１０
（１０−１）Ｎ末端側断片（［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ２，　６（ｔＢｕ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−７））の合成（方法１）
プロリル−２−クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、１．３９　ｇ、１．０　ｍｍｏｌ）をガラスフィルター付き反応容器に入れ、順次ＨＢＴＵによるＦｍｏｃ−アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｎ末端残基にＢｏｃ−Ｇｌｙを導入して、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＴＢＤＭＳ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル樹脂を構築した。得られた保護ペプチド樹脂を０．１　Ｍ　ＴＢＡＦ／ＤＭＦ溶液（５０　ｍＬ）で３０分間処理した。ペプチド樹脂を濾取し、ＤＭＦ（３０　ｍＬ）で数回洗浄した後、イソプロピルアルコール、次いでＤＣＭ（３０　ｍＬ）で洗浄した。次に、得られた脱ＴＢＤＭＳペプチド樹脂をＮＭＰ　（５　ｍＬ）に膨潤させ、ＤＭＡＰ（３７４　ｍｇ，　３．１　ｍｍｏｌ）存在下、オクタン酸（５８８　ｍｇ，４．１　ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（８４８　ｍｇ，　４．４　ｍｍｏｌ）を加え１６時間反応させた。樹脂を濾取し、ＮＭＰ、イソプロピルアルコール、ＤＣＭで順次洗浄し、減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂を得た。このものに、０．５％　ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液３０　ｍＬを加え、室温で３０分間攪拌し、保護ペプチドを樹脂から離脱させた。樹脂を濾去し、濾液を濃縮後、残査に水を加え沈殿とした。沈殿を濾取した後、さらにヘキサン中で攪拌して洗浄し、再度濾取した。これを終夜、減圧して乾燥し、目的物７４２　ｍｇ（収率７２％）を得た。ＨＰＬＣによりこのものの純度を調べたところ、９４％であった。
【００９８】
（１０−２）Ｎ末端側断片（［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ２，　６（ｔＢｕ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−７））の合成（方法２）
プロリル−２−クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、１．９５　ｇ、１．０　ｍｍｏｌ）をガラスフィルター付き反応容器に入れ、順次ＨＢＴＵによるＦｍｏｃ−アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル樹脂を構築した。次にＨＯＯＢｔ／ＤＣＣによりＦｍｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨを導入し、次いで脱ＦｍｏｃとＨＯＯＢｔ／ＤＣＣによる縮合を繰り返し、Ｎ末端残基にＢｏｃ−Ｇｌｙを導入して、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル樹脂を構築した。得られたペプチド樹脂をＮＭＰ　（５　ｍＬ）に膨潤させ、ＤＭＡＰ（３７４　ｍｇ，　３．１　ｍｍｏｌ）存在下、オクタン酸（５７９　ｍｇ，　４．０　ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（８４７　ｍｇ，　４．４　ｍｍｏｌ）を加え１６時間反応させた。樹脂を濾取し、ＮＭＰ、イソプロピルアルコール、ＤＣＭで順次洗浄し、減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂を得た。このものに、０．５％　ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液３０　ｍＬを加え、室温で３０分間攪拌し、保護ペプチドを樹脂から離脱させた。樹脂を濾去し、濾液を濃縮後、残査に水を加え沈殿とした。沈殿を濾取した後、さらにヘキサン中で攪拌して洗浄し、再度濾取した。これを終夜、減圧して乾燥し、目的物７１５　ｍｇ（収率６９％）を得た。ＨＰＬＣによりこのものの純度を調べたところ、７４％であった。
【００９９】
実施例１１　断片縮合と脱保護
それぞれ実施例１０−１と実施例８で得られた［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）２，６］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−７）及び［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を、あらかじめアミノ酸分析計を用い定量したのち、縮合反応に供した。［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）２，６］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−７）、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡそれぞれ０．１９　ｍｍｏｌをＤＭＦ　１　ｍＬに溶解し、３０分間室温で撹拌した。その後、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を０．１６　ｍｍｏｌ及びＤＩＰＥＡ　０．４８ｍｍｏｌをＤＭＦ　１．５　ｍＬに溶解し、撹拌下、前述の活性化Ｎ末端側断片溶液を滴下した。１時間後、反応溶媒を減圧留去し、残査にＥｔ２Ｏを加え析出させ、洗浄後、乾燥した。得られた粉末にＴＦＡ　６　ｍＬを加え、３０分間室温でゆるやかに撹拌した。ＴＦＡを減圧留去し、残査にＥｔ２Ｏを加え析出させ、洗浄、乾燥を経て、白色粉末状の粗ペプチド０．７０　ｇを得た。このものを分析用ＨＰＬＣで分析した結果、チャート上の目的物純度は８０％であり、また全化学合成品と保持時間が一致した。さらに半合成品及び全化学合成品をコインジェクションしたところクロマト上ピークが一致した。縮合前後のＨＰＬＣチャートを図３に示す。
【０１００】
実施例１２　ｈＧｈｒｅｌｉｎの精製
実施例１１で得られた白色粉末状の粗ペプチド０．７０　ｇを５％酢酸で７　ｍｇ／ｍＬに溶解し、以下の条件で精製を実施した。
方法、条件；
使用カラム：Ｓｏｕｒｃｅ　３０ＲＰＣ　（ＨＲ１０／３０）　２３　ｍＬ　カラム
（アマシャムファルマシア社製樹脂）　内径１０ｍｍ　ｘ長さ３０ｍｍ
平衡化、洗浄液：　１０％アセトニトリル，　５０ｍＭ酢酸
溶出液：６０％アセトニトリル，　５０ｍＭ酢酸
再生液：８０％アセトニトリル
流速：２．５　ｍＬ／分（２ｃｍ／分）
平衡化液で３カラムボリューム平衡化の後、ｈＧｈｒｅｌｉｎ溶解液を２分し、半量ずつを負荷し、平衡化液にて３カラムボリューム（ＵＶが下がるまで）カラムを洗浄する。溶出は溶出液０％から１００％までの直線濃度勾配を６カラムボリュームで終了するプログラムで溶出させた。溶出液は５　ｍＬずつフラクション分画し、適時ＨＰＬＣで分析し、ｈＧｈｒｅｌｉｎを含むフラクションをプールした。プールはエバポレーターで脱溶媒した後、凍結乾燥を実施した。結果、純度９８％のｈＧｈｒｅｌｉｎを５１２　ｍｇ（回収率７３％）得た。精製ｈＧｈｒｅｌｉｎのＨＰＬＣでの分析結果を図４に示す。
【０１０１】
以下の実施例１３から１５までは、上記の実施例１から１２までに示した条件の最適化に関するものである。したがって、本発明が下記条件に限定されないことは言うまでもない。
実施例１３　融合蛋白質の配列の違いによるＫｅｘ２の切断効率の違い
Ｋｅｘ２の切断効率はその基質の認識配列により大きく異なる。その切断効率はｉｎｖｉｖｏでＫｅｘ２切断配列ＫＲ（１０）＞＞ＲＲ（５）＞＞ＴＲ（１．２）　＞ＰＲ（１．０）　［（）内はＰＲを１とした際の切断効率］の順で切れにくくなる（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　９５　ｐ１０３８４−１０３８９
１９９８）ことが報告されている。
以下図５に実施例１で作成したｐ１１７ｓ　８−２８ｏＰＲ、ｐ１１７　８−２８　ｏＲＲとさらに、ｐ１１７　８−２８ｏＰＲを鋳型にしてＰＣＲで作成したプラスミドｐ１１７　８−２８ｏＫＲが発現する蛋白質を示す。
これら３種類の蛋白質を発現するプラスミドを保持する大腸菌Ｗ３１１０を用いてそれぞれ培養を実施し、実施例２から６に示した方法の約１０分の１のスケールで精製を行い、それぞれ［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）（以下ＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８））、［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４　（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）（以下ＲＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８））、［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＫＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）（以下ＫＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８））の３種類のペプチドを調製した。
調製したペプチドについて、実施例７で示した方法を用いてＫｅｘ２プロテアーゼ処理を実施した。反応開始６０分のＨＰＬＣの分析プロファイルを図６に示す。
図６に示すように切断率の順番ではＲＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）＞ＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）＞ＫＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）でＲＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）が一番切断率が高かった。またＫＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）についてはＢｏｃ基がＫＲのリジン残基を保護してしまい、リジンの電荷を消失させることになるため、切断がまったく起きなかった。またＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）は切断効率が低く、ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）内で切断が生じた。このｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）内での分解はｈＧｈｒｅｌｉｎのアミノ酸番号１５のアルギニンと１６のリジンの間で切断が生じていた。
【０１０２】
実施例１４　大腸菌の培養に適した融合蛋白質の構築
培養に適した融合蛋白質を得るため、実施例１３図５で示した融合蛋白質以外にも以下図７に示すような融合蛋白質を発現するプラスミドを作成した。図７に示すいずれの融合蛋白質ともｐ１１７　８−２８ｏＰＲを鋳型にしてそれぞれ異なるプライマーからＰＣＲで作成した。ｐ１１７　８−２８ｏＲＲに対して、蛋白質の等電点の低下を目的として変異体を構築した。
作成した融合蛋白質プラスミドをそれぞれ大腸菌Ｗ３１１０株に形質転換した大腸菌を用いて３Ｌ培養槽にて２Ｌの培養を実施した。前培養はＬＢ　ｂｒｏｔｈにて３２℃で１４時間振とう培養した。本培養の培地組成は実施例２で示したものと同一である。炭素源としてはグルコースを最初培地中に１％添加して、３２℃で培養を開始した。グルコースの枯渇後、グリセロールを添加して培養を行った。またグルコースの枯渇時に培養温度を３７℃に上昇させ、培養後は加圧式菌体破砕機（マントンゴーリン）にて菌体を破砕した。培養の成果については最終濁度と菌体破砕時の濁度で判断した。菌体の濁度及び、菌体破砕前後の濁度の比が高いものほど封入体の生産性が高い菌と判断した。結果を図８のグラフＡ，Ｂに示す。
グラフＡ，Ｂから分かるように最終濁度、菌体破砕後の濁度比率から、構築した融合蛋白質の中で１１７　８−２８ｏＲＲ融合蛋白質がもっとも高い生産性を示した。実施例１３、１４の結果から実施例２では当該蛋白質を発現するプラスミドｐ１１７　８−２８ｏＲＲが培養にも適していると考えられた。
【０１０３】
実施例１５　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の安定性
実施例６、７、８において、［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４　（Ｂｏｃ）］−［ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＲＲ］−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）及び［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）において１〜１０％程度Ｂｏｃ基が脱離するという現象が認められた。［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）は付加したＢｏｃ基が一箇所でも脱離すると、その後の縮合工程で大幅な縮合率低下につながるため、Ｂｏｃ基の脱離を防ぐ目的で［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の安定性を調べた。
分解に影響を及すパラメータとしては保存中のｐＨと保存温度が考えられた。そこで以下のような条件での安定性をＨＰＬＣにより分析し、評価した。
方法：新たに精製した［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を３０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液に溶解し、ｐＨ２，３，４はＴＦＡをもちいて、ｐＨ６，７，８は５Ｎ　ＮａＯＨを用いてｐＨを調整し、さらに、４℃、２０℃、３７℃、４２℃の恒温槽で１週間放置した。放置開始後、０時間、２時間、６時間、９時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間でサンプリングを行い、ＨＰＬＣにて分析を実施した。解析方法としてはＨＰＬＣでの分析結果の総ピーク面積に対する［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のピーク面積の割合（％）を経時的に評価することで行った。
結果：以下図９及び１０に保存温度毎にまとめたグラフを４種類示す。ｐＨが低いほど（ｐＨ３以下）、温度が高いほど、分解物が増加することがわかった。またｐＨ４以上であれば、４２℃でも安定であることがわかった。よってｐＨをコントロールすることが、この分解物生成の抑制に重要であることが判明した。
【０１０４】
実施例１６　ｈＧｈｒｅｌｉｎ　（１−２８）の製造（方法２）
（１）　ｈＧｈｒｅｌｉｎ　（８−２８）誘導体発現ベクターｐ１１７−８−２８ｏｋの構築
実施例１と同一の方法で、プラスミドｐ１１７−８−２８ｏｋを得た。実施例１で作成したプラスミドｐ１１７　８−２８ｏＰＲとプラスミドｐ１１７−８−２８ｏｋの相違は、前者のリンカー配列がＥＰＨＨＨＨＰＧＧＲＱＭＨＧＹＤＡＤＶＲＬＹＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ（配列番号２６）であるのに対し、後者のリンカー配列はＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ（配列番号３５）である点のみである。
（２）　大腸菌での組換えｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質の発現
ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質発現プラスミドｐ１１７−８−２８ｏｋを大腸菌Ｗ３１１０株に形質転換し、形質転換株を得た。この株をグルコース及びグリセロールを炭素源とする２０　Ｌの培地で培養を行い、最終ＯＤ６６０値が５４の培養液を得た。
（３）　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質の内在性ＯｍｐＴプロテアーゼによるプロセッシング
前記（２）で得られた培養液より菌体（約６８０　ｇ）をＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０）バッファー２０　Ｌに懸濁後、高圧ホモジナイザーを用いて菌体の破砕処理を２回行った。その後、遠心分離で封入体を回収し、脱イオン水で再度懸濁し、遠心分離することで封入体を洗浄した。次に遠心分離により得られた封入体ペレット（湿重量約１７０　ｇ）を少量の脱イオン水で懸濁し、ＯＤ６６０値が８２６の封入体濃縮液５５０　ｍＬを得た。５５０　ｍＬの封入体濃縮液より５０　ｍＬを採取後、ＯＤ６６０の値が５０．０になるように脱イオン水で希釈し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．２）、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）をそれぞれ終濃度５０ｍＭ、１ｍＭになるように加え、尿素（終濃度４．０Ｍ）により封入体を溶解させた。尿素により封入体を溶解することで、内在性のＯｍｐＴプロテアーゼにより融合蛋白質のリンカー配列ＲＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ（配列番号３５）のＡｒｇ−Ａｒｇ間を切断させた。即ち、反応溶液を３０℃で５分保温後、３０℃で１５分ＯｍｐＴプロテアーゼ処理を行った。その後３％ＡｃＯＨを添加して反応を停止させた。本処理により、ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を１．３　ｇ得た。ＥＳＩ−ＭＳ　４０１９（理論値；４０１８）
ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質の内在性ＯｍｐＴプロテアーゼによるプロセッシング工程の高速液体クロマトグラフィーによる解析の結果、ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）が遊離していることが示された。
【０１０５】
（４）　ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の精製（陽イオン交換による精製）
前記（３）で得られたＯｍｐＴプロテアーゼ反応液（９００　ｍＬ）を、平衡化液（１．５Ｍ　Ｕｒｅａ，２０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３）にて平衡化させた陽イオン交換カラムＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　５５０−ｃ（ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ　５５　ｍＬ、１６ｍｍＩＤ　ｘ　２８０ｍｍ　ＴＯＳＯＨ社製）に４回に分けて負荷した。各回、平衡化液で十分カラムを洗浄後、平衡化液７５％、溶出液（１．５Ｍ　Ｕｒｅａ，１．５Ｍ　ＮａＣｌ，　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３）２５％から溶出液１００％の濃度勾配を１．５カラムボリュームで完了するプログラムで溶出を行った。５　ｍＬ毎にサンプリングを行い、各分画を高速液体クロマトグラフィーで分析し、大腸菌β−ガラクトシダーゼ誘導体の含まないピークを分取した。４回分の合計収量は約９５０　ｍｇであった。
上記精製溶出液（６６０　ｍＬ）を２等分し、２％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡで平衡化したＹＭＣ−ＯＤＳ　ＡＭ（粒径２０μｍ、ＹＭＣ社製）２１．５ｍｍＩＤ　ｘ　３００ｍｍカラムに２回負荷した。平衡化液で十分洗った後、溶出液　［　５０％アセトニトリル、０．０９５％ＴＦＡ　］で溶出を行った。溶出ピークを分取後、溶出液中に含まれるアセトニトリルはロータリーエバポレーターにて除去し、ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を７２０　ｍｇ含む溶液２２０　ｍＬを得た。（３）、（４）で用いた高速液体クロマトグラフィーの条件を以下に示す。
カラム；ＹＭＣ　ＯＤＳ　ＡＰ−３０２、検出器；Ｈｉｔａｃｈｉ高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｄ７０００）、流速；１　ｍＬ／ｍｉｎ、溶出；バッファーＡ　［　１．０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ］　１００％からバッファーＢ　［　５０．０％アセトニトリル、０．１％　ＴＦＡ　］　１００％の２０分間直線濃度勾配。
【０１０６】
（５）　ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）化
前記（４）で得られた試料２２０　ｍＬ（ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を７２０　ｍｇ含む）をガラス三角フラスコに移し、等量のアセトニトリル（２２０　ｍＬ）を加えた。これに１Ｍの二炭酸ジ−ｔ−ブチルをＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）内に存在するαアミノ基とＬｙｓεアミノ基数（計５箇所）の５倍モル量にあたる４．４　ｍＬ（終濃度１０ｍＭ，２５当量）加えた。さらにトリエチルアミンにてｐＨ９に調整し、スターラーで攪拌しながら室温で６０分反応させた。反応の停止は酢酸を終濃度０．５％になるように添加し、ｐＨを中性付近にした後、速やかにロータリーエバポレーターによりアセトニトリルを除去し、Ｂｏｃ−ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を５３０　ｍｇ含む溶液、３００　ｍＬを得た。ＥＳＩ−ＭＳ；　４５１９　（理論値；４５１８）。
Ｂｏｃ化前後のＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の溶出プロファイル、及びマススペクトロメトリー測定結から、Ｂｏｃ−ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の生成を確認した。本反応のモニターには以下のクロマトシステムを使用した。カラム；ＹＭＣ−Ｃ８、検出器；Ｈｉｔａｃｈｉ高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｄ７０００）、流速；１　ｍＬ／ｍｉｎ、溶出；バッファーＡ　［　１．０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ］　１００％からバッファーＢ　［　６０．０％アセトニトリル、０．０９５％　ＴＦＡ　］　１００％の２０分間の直線濃度勾配。
【０１０７】
（６）Ｋｅｘ２プロテアーゼによる［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の製造
前記（５）で得られたＢｏｃ−ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を逆相カラムにて精製した。２％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で平衡化したＹＭＣ−ＯＤＳ　ＡＭ（粒径２０μｍ、ＴＯＳＯＨ社製）２１．５ｍｍＩＤ　ｘ　３００ｍｍカラムに上記Ｂｏｃ誘導体（約５００　ｍｇ）を負荷した。平衡化液で十分洗った後、溶出液　［　７０％アセトニトリル、０．０９５％ＴＦＡ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５　］で溶出した。Ｂｏｃ−ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲ−［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）（４２０　ｍｇ）を含む溶出ピークを分取後、アセトニトリルをエバポレーターにて除去した。本溶液に２５０ｍＭ塩化カルシウム溶液、１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．２をそれぞれ終濃度５ｍＭ、５０ｍＭになるように添加した。３０℃、５分間保温後、Ｋｅｘ２プロテアーゼ（特開平１０−２２９８８４）溶液（１ｘ１０７　ｕｎｉｔ／ｍＬ）を３ｘ１０４　ｕｎｉｔ／ｍＬになるように添加し、３０℃、４５分間反応した。
本工程の高速液体クロマトグラフィーによる解析の結果、ｌｉｎｋｅｒ配列ＲＨＨＧＳＧＳＰＳＲＨＰＲと［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）とが切断されていることが示された。
【０１０８】
（７）　　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）体の精製
前記（６）で得られた［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）　（３２０　ｍｇ）を含む反応後溶液（３００　ｍＬ）を酢酸でｐＨ３．５に調整後、１０％アセトニトリル、０．０９５％ＴＦＡで平衡化した逆相クロマトカラムＯＤＳ−８０Ｔｓ（２１．５ｍｍＩＤ　ｘ　３００ｍｍカラム（１０８　ｍＬ）粒径２０ｕｍ，　ＴＯＳＯＨ社製）に負荷した。平衡化液で２カラムボリューム洗浄後、バッファーＡ　［１０％アセトニトリル、０．０９５％ＴＦＡ］　７０％、バッファーＢ　［６５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ］３０％からバッファーＢ　１００％の濃度勾配を５カラムボリュームにて完了するプログラムを行い、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）体を溶出させた。フラクション（５　ｍＬずつ）を分取し、高速液体クロマトグラフィー（条件は（６）と同様である）にて分析を行った。　［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の溶出画分を集め。濃縮後、凍結乾燥し、１３６　ｍｇの［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）体を得た。ＯｍｐＴプロテアーゼ誘導体によるプロセッシングで得られた１３００　ｍｇの前駆体（前記（３））より１３６　ｍｇの［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）体最終標品を得た。
【０１０９】
（８−１）Ｎ末側断片（［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ２，　６（ｔＢｕ）］　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）の合成（方法１）
プロリル−２−クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、５４８　ｍｇ、０．２５　ｍｍｏｌ）上に、ペプチド自動合成機を用いて、順次ＨＢＴＵによるＦｍｏｃ−アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｎ末端残基にＢｏｃ−Ｇｌｙを導入して、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＴＢＤＭＳ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル樹脂を構築した。得られた保護ペプチド樹脂　（７５７　ｍｇ　）を０．１　Ｍ　ＴＢＡＦ／ＤＭＦ溶液（５　ｍＬ）で１時間処理した。ペプチド樹脂をろ取し、ＤＭＦ（１０　ｍＬ）で数回洗浄した後、イソプロピルアルコール、ついで塩化メチレン（１０　ｍＬ）で洗浄した。次に、得られた脱ＴＢＤＭＳペプチド樹脂をＤＭＦ　（１０　ｍＬ）に膨潤させ、ＤＭＡＰ（３１　ｍｇ，　０．２５　ｍｍｏｌ）存在下、オクタン酸（１４４．２　ｍｇ，　１．０　ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２１１　ｍｇ，　１．１　ｍｍｏｌ）を加え１６時間反応させた。樹脂をろ取し、ＤＭＦ、イソプロピルアルコール、塩化メチレンで順次洗浄し、減圧下乾燥して、３位セリン側鎖がオクタノイル化された保護ペプチド樹脂を得た。このものに、酢酸　２　ｍＬ　／　ＴＦＥ　２　ｍＬ　／塩化メチレン　６　ｍＬの混合溶液を加え、室温で１時間攪拌し、保護ペプチドを樹脂から離脱させた。樹脂をろ去し、ろ液を濃縮後、残査にエーテルを加え沈殿とした。沈殿をろ取、乾燥し、粗ペプチド２４８　ｍｇ（収率９６％）を得た。本品を酢酸水及びアセトニトリルの混液約２　ｍＬに溶解し、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（２０　ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル４０％から８０％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０　ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥し、２１０　ｍｇの目的物を得た。
【０１１０】
（８−２）Ｎ末側断片（［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ２，　６（ｔＢｕ）］　Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）の合成（方法２）
プロリル−２−クロロトリチル樹脂（ノバビオケム社製、４６６　ｍｇ、０．２５　ｍｍｏｌ）上に、ペプチド自動合成機を用いて、順次ＨＢＴＵによるＦｍｏｃ−アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｎ末端残基にＢｏｃ−Ｇｌｙを導入して、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−２−クロロトリチル樹脂を構築した。この樹脂を１％　ＴＦＡ，　５％　ＴＩＰＳ　／ジクロロメタンで３０　ｍｉｎ処理することにより、Ｔｒｔ基の除去及び樹脂からの切断を同時に行った。樹脂をろ去した後、ジクロロメタンを減圧留去して濃縮し、これにＥｔ２Ｏを加えて析出させ乾燥したところ、白色沈殿としてＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨを１６５　ｍｇ得た。次に、臭化フェナシル（Ｐｈｅｎａｃｙｌ　Ｂｒｏｍｉｄｅ、４０　ｍｇ、１．１当量）、トリエチルアミン（２０　ｍｇ、１．１当量）を加え、ＤＭＦ約３　ｍＬ中で２　ｈｒ反応させた。反応後、反応溶液を約５倍量の酢酸エチル中に入れ、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、これをろ去した後濃縮し、Ｅｔ２Ｏで析出させ乾燥したところ、白色沈殿としてＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＰａｃを得た。次に、オクタン酸（１８．２　ｍｇ、１．１当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２６．４　ｍｇ、　１．２当量）、ＤＭＡＰ（１．４　ｍｇ、０．１当量）を加え、ＤＭＦ約２　ｍＬ中で終夜反応させた。、反応溶液を約５倍量の酢酸エチル中に入れ、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを加え乾燥させ、これをろ去した後濃縮、Ｅｔ２Ｏで析出させ乾燥し、白色沈殿としてＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＰａｃを１４４　ｍｇ得た。次に、酢酸　１．５　ｍＬ、亜鉛末（Ｚｉｎｃ　Ｐｏｗｄｅｒ、１６３　ｍｇ、２０当量）を加え１　ｈｒ反応させた後、ろ過し、冷水を加え析出させ、Ｅｔ２Ｏで洗浄し乾燥した。白色沈殿としてＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｏｃｔａｎｏｙｌ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨを６５　ｍｇ得た。本品を酢酸水及びアセトニトリルの混液約２　ｍＬに溶解し、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ　ＯＤＳ−Ａ（２０　ｍｍ　ｘ　２５０ｍｍに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル４０％から８０％までの６０分間直線グラジエント（流速：１０　ｍＬ／ｍｉｎ）で溶出させた。目的画分を分取後、凍結乾燥して目的物５０　ｍｇを得た。
【０１１１】
（９）　断片縮合と脱保護
それぞれ前記（８−１）と前記（７）で得られた　［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）２，　６］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）及び［Ｌｙｓ１６，　１９，　２０，　２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を、あらかじめアミノ酸分析計を用い定量したのち、縮合反応に供した。［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）２，　６］−Ｇｈｒｅｌｉｎ（１−７）を１９．３μｍｏｌ、ＨＢＴＵ　２０．３μｍｏｌ及びＤＩＰＥＡ　２０．３μｍｏｌをＤＭＦ　５００μＬに溶解し、１時間室温で撹拌した。その後、［Ｌｙｓ１６，　１９，　２０，　２４（Ｂｏｃ）］　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を１８．４μｍｏｌ及びＤＩＰＥＡ　５５．２μｍｏｌをＤＭＦ　１　ｍＬに溶解し、撹拌下、前述の活性化Ｎ末側断片溶液を滴下した。３時間後、反応溶媒を減圧留去し、残査にＥｔ２Ｏを加え析出させ、洗浄後、乾燥した。えられた粉末にＴＦＡ　３　ｍＬを加え、３０　ｍｉｎ室温でゆるやかに撹拌した。ＴＦＡを減圧留去し、残査にＥｔ２Ｏを加え析出させ、洗浄、乾燥を経て、白色粉末状の粗ペプチド７７　ｍｇを得た。このものを分析用ＨＰＬＣで分析した結果、チャート上の目的物純度は８３％であり、また化学合成品と保持時間が一致した。さらに半合成品及び全合成品をコインジェクションしたところクロマト上ピークが一致した。
【０１１２】
（１０）　ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）体の精製
前記（９）で得られた白色粉末状の粗ｈＧｈｒｅｌｉｎ　６７　ｍｇを１％酢酸で１　ｍｇ／ｍＬに溶解し、０．１　Ｍ酢酸で平衡化した逆相クロマトカラムＴＳＫ−ＯＤＳ−８０Ｔｓ　１０８　ｍＬ　（ＩＤ２１．５ｍｍ　ｘ　３００　ｍｍ）に負荷した。平衡化液で２カラムボリューム洗浄後、バッファーＡ［０．１Ｍ酢酸］　１００％からバッファーＢ　［４０％アセトニトリル、０．１Ｍ酢酸］１００％の濃度勾配を５カラムボリュームにて完了するプログラムを行い、ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）体を溶出させた。高純度の画分を集め、凍結乾燥してｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−２８）　３４．４　ｍｇを得た。
ＥＳＩ−ＭＳ　３３７１　（理論値　３３７０．８６）、６Ｎ塩酸化水分解後のアミノ酸組成比　Ａｌａ　；　１．０１（１），　Ａｒｇ　；　２．９７（３），　Ｇｌｘ　；　５．９５（６），　Ｇｌｙ　；　１．０２（１），　Ｈｉｓ　；　１．００（１），　Ｌｅｕ　；　２（２），　Ｌｙｓ　；　４．０１（４），　Ｐｈｅ　；　１．００（１），　Ｐｒｏ　；　４．０１（４），　Ｓｅｒ　；　３．６０（４），　Ｖａｌ　；　１．００（１）（括弧内は理論値）、Ｃａ　ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ活性　１．３　ｎＭ（ｒｅｆ．１．５　ｎＭ）
【０１１３】
実施例１７　Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＴＢＤＭＳ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨの脱ＴＢＤＭＳ条件とオクタノイル化条件の最適化
実施例１６（８−１）の方法に従って、３位セリンＴＢＤＭＳ基の除去反応及びオクタノイル化反応の最適条件について検討した。プロリル−２−クロロトリチル樹脂上に、ペプチド自動合成機（アプライドバイオシステムジャパン（株）製、４３３Ａ）を用いて、順次ＨＢＴＵによるＦｍｏｃ−アミノ酸の導入とピペリジンによる脱Ｆｍｏｃを繰り返し、Ｎ末端残基はＢｏｃ−Ｇｌｙを導入することにより、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ＴＢＤＭＳ）−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−２クロロトリチル樹脂を構築した。次に、樹脂を０．０５　ｍｍｏｌ（約１５０　ｍｇ）ずつに分け、表３及び表４に示す条件でオクタノイル化を行った。樹脂の洗浄、樹脂からのペプチド切断等の条件は、実施例１６（８−１）と同様に行った。
その結果、ＴＢＤＭＳ基の除去反応は０．１　Ｍ　ＴＢＡＦ溶液を用いて３０分間から１時間反応させることが好ましく、またオクタノイル化反応はオクタン酸４当量、ＥＤＣ　４．４当量、ＤＭＡＰ　１当量を用いて８〜１６時間反応させることが好ましいことが明らかになった。
【表３】
2004002378.tif 000007
ａ　；　ＴＢＤＭＳ基の除去率は、ＴＢＡＦ処理したペプチド樹脂をオクタノイル化したのち、脱保護して得られるオクタノイル体とＴＢＤＭＳ未除去を示すデスオクタノイル体との比で求めた。オクタノイル化は、オクタン酸４当量、ＥＤＣ　４．４当量、ＤＭＡＰ　１当量を用い、２４時間反応。
ｂ　；　プロリル−２−クロロトリチル樹脂の置換率を基準に算出。
ｃ　；　目的物純度及び比率は、分析用ＨＰＬＣにより算出。
ｄ　；　Ｎ．Ｄ．検出されず。
【表４】
2004002378.tif 000008
ａ　；　全てのサンプルは０．１　Ｍ　ＴＢＡＦで１時間処理して、ＴＢＤＭＳ基を除去した。
ｂ　；　プロリル−２−クロロトリチル樹脂の置換率を基準に算出。
ｃ　；　目的物純度及び比率は、分析用ＨＰＬＣにより算出。
ｄ　；　Ｎ．Ｄ．検出されず。
【０１１４】
実施例１８　断片縮合条件の検討
［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）２，６］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−７）と［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）を用い、種々の縮合試薬の反応効率を検討したところ、ＨＢＴＵがもっとも良い結果を与えたが、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＥＤＣ／ＨＯＳｕ、ＤＰＰＡでも反応が進行することが明らかになった。
【表５】
2004002378.tif 000009
【０１１５】
【発明の効果】
本発明の製造方法により、非常に高品質の修飾ペプチド又は蛋白質を高収量で得ることができる。
【０１１６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の全合成オリゴＤＮＡならびにアミノ酸配列を表している。図１Ｂは、ｐ１１７　８−２８ｏＲＲにより発現されるｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
【図２】図２は、精製した［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のＨＰＬＣ分析結果を示している。ピークア）は、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のピークを示す。
【図３】図３は、断片の縮合反応を示している。ピークＡは［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ２，６（ｔＢｕ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１−７）のピークを、ピークＢは［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のピークを、ピークＣは［Ｎα−Ｂｏｃ，　Ｓｅｒ２，６（ｔＢｕ），　Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎのピークを、ピークＤはｈＧｈｒｅｌｉｎのピークを示す。
【図４】図４は、精製したｈＧｈｒｅｌｉｎのＨＰＬＣ測定結果を示している。
【図５】図５は、Ｋｅｘ２プロテアーゼの切断認識部位が異なる融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
【図６】図６は、図５で作成した各融合蛋白質のＫｅｘ２切断効率をＨＰＬＣで分析した結果を示している。図６Ａは、ＰＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のＫｅｘ２酵素反応後のＨＰＬＣ分析結果を示す。図６Ｂは、ＲＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のＫｅｘ２酵素反応後のＨＰＬＣ分析結果を示す。図６Ｃは、ＫＲ−ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のＫｅｘ２酵素反応後のＨＰＬＣ分析結果を示す。ピークア）は、リンカー配列を含む［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のピークを示す。ピークイ）は、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）のピークを示す。ピークウ）は、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（１６−２８）のピークを示す。
【図７】図７は、培養に最適な融合蛋白質を決定するために作成した各ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
【図８】図８Ａは、融合蛋白質の違いによる培養結果の差を示し、図８Ｂは、各融合蛋白質での培養液の菌体破砕前の濁度に対する菌体破砕後の濁度（融合蛋白質による相違）を示している。
【図９】図９は、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の安定性評価結果を示している。
【図１０】図１０は、［Ｌｙｓ１６，１９，２０，２４（Ｂｏｃ）］ｈＧｈｒｅｌｉｎ（８−２８）の安定性評価結果を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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