(57)【要約】【課題】  ヒトの身体の治療および／または外科的処置において使用するための医薬組成物の調製。【解決手段】  異種ＤＮＡ配列を含む動物起源の組み換えアデノウイルスの使用。 【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素、血液誘導物、ホルモン、リンホカイン、成長因子、神経伝達物質もしくはそれらの前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子、アポリポタンパク質、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン、腫瘍抑制物質および血液凝固に関与する因子から選ばれる治療的なタンパク質生産物をコードしている、少なくとも１個の挿入された遺伝子を含む、動物起源の組み換えアデノウイルス。
【請求項２】
少なくとも１個の挿入されたアンチセンス配列を含む、動物起源の組み換えアデノウイルス。
【請求項３】
挿入された治療遺伝子もしくは遺伝子群の発現を可能にするプロモーター配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１もしくは請求項２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
誘導されるべき治療遺伝子の発現産物の分泌を可能にするシグナル配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
該アデノウイルスが、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、トリおよびサルのアデノウイルスから選ばれることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
該アデノウイルスが、好ましくは、ＣＡＶ−２アデノウイルス株から選ばれるイヌ・アデノウイルスであることを特徴とする、請求項５記載のアデノウイルス。
【請求項７】
ゲノムが、少なくとも、複製に必要な配列を欠くことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
他の動物もしくはヒトのアデノウイルスの領域をさらに含むことを特徴とする、請求の範囲７記載のアデノウイルス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の１種ないしそれ以上のアデノウイルスを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なウイルスベクター、それらの調製および遺伝子治療におけるそれらの使用に関する。また、本発明は、該ウイルスベクターを含有する医薬組成物にも関する。より具体的には、本発明は、遺伝子治療のためのベクターとして、動物起源の組み換えアデノウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、冒された細胞もしくは器官中に遺伝情報を導入することによって、欠失もしくは異常（突然変異、異常な発現、等）を矯正することにある。この遺伝情報は、器官から抽出された細胞中にイン・ビトロで導入され、次いで、改変された細胞が身体に再導入されるか、または直接、適当な組織中にイン・ビボで導入されるか、いずれでもよい。この第２の場合には、ＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストラン(非特許文献１）、ＤＮＡと核タンパク質（非特許文献２）、そしてＤＮＡと脂質（非特許文献３）の複合体を伴う種々のトランスフェクションの技術、リポソームの使用（非特許文献４）、およびそれに類するものを含む種々の技術が存在する。より最近では、遺伝子伝達のためのベクターとしてのウイルスの使用が、これらの物理的トランスフェクション技術にとって確実な一つの選択であることが分かってきた。これに関連して、種々のウイルスが、ある種の細胞集団に対するその感染能について試験された。これは、特に、レトロウイルス（ＲＳＶ，ＨＭＳ，ＭＭＳ等）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスに適合する。
【０００３】
これらのウイルスの中で、アデノウイルスは、遺伝子治療での使用にとって有利な一定の性質を示す。特に、それらは、かなり広い宿主範囲をもち、休止細胞に感染することができ、そして感染細胞のゲノムに組み込まれない。これらの理由により、アデノウイルスは、既に、イン・ビボの遺伝子伝達に対して使用されてきた。この目的のために、アデノウイルスに由来する種々のベクターが、調製され、異なる遺伝子（β−ｇａｌ，ＯＴＣ，α−１ＡＴ，サイトカイン等）が組み込まれてきた。ヒトの遺伝子治療に使用するために、先行技術に記載されたアデノウイルス由来のすべてのベクターは、これまでは、ヒト起源のアデノウイルスから調製されてきた。これらは、実際に、そのような使用にとって最も適切であると思われた。イン・ビボでの増殖の危険および感染粒子の形成を制限するために、使用されたアデノウイルスは、一般に、感染細胞で複製できなくするように改変される。したがって、先行技術に述べられた構築物は、Ｅ１（Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂ）と、場合によりＥ３領域が欠失され、その領域の部位に目的の塩基配列が挿入されたアデノウイルスである（非特許文献５; 非特許文献６）。しかしながら、この必要な改変段階に加えて、先行技術記載のベクターは、遺伝子治療においてそれらの利用を限定するその他の欠点、特に、野生型アデノウイルスとの組み換えの危険を保持している。本発明は、この問題に対する有利な解決を提供する。
【非特許文献１】Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891
【非特許文献２】Kaneda et al., Science 243 (1989) 375
【非特許文献３】Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413
【非特許文献４】Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431
【非特許文献５】Levrero et al., Gene 101 (1991) 195
【非特許文献６】Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、実際に、ヒトにおける遺伝子治療のために、動物起源の組み換えアデノウイルスを使用することにある。本発明は、動物起源のアデノウイルスが、ヒト細胞に非常に効率的に感染できるという例証の結果である。また、本発明は、動物起源のアデノウイルスが、それらが試験されたヒト細胞では増殖できないという例証に基づいている。最後に、本発明は、動物起源のアデノウイルスが、ヒト起源のアデノウイルスによって決してトランス相補されることはなく、そのために、感染性粒子の形成に至る可能性のあるヒトアデノウイルスの存在下での、イン・ビボの組み換えと増殖の危険を完全に除去するという驚くべき発見に基づいている。それゆえ、本発明のベクターは、病原性、伝達、複製、組み換え、等のような、遺伝子治療におけるベクターとしてのウイルスの使用に固有の危険が、大きく減少されるか、全くなくなるので、特に有利である。
【０００５】
したがって、本発明は、ヒトにおいて望まれるＤＮＡ配列の伝達および／または発現のために、特に好適であるウイルスベクターを提供する。
【０００６】
それゆえ、本発明の第１の主題は、ヒトの身体の治療および／または外科的処置を意図した医薬組成物の調製のための、異種ＤＮＡ配列を含む動物起源の組み換えアデノウイルスの使用に関する。
【０００７】
本発明の文脈上、使用できる動物起源のアデノウイルスは、ヒトのアデノウイルスを除く、様々な起源のものであってもよい。ヒト・アデノウイルスは、人間において自然に感染性であるもの、一般に、用語ＨＡｄもしくはＡｄにより示されるものである。
【０００８】
特に、本発明の文脈上、使用できる動物起源のアデノウイルスは、イヌ、ウシ、ネズミ（例えば：Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81）、ヒツジ、ブタ、トリ、あるいはまたサル（例：ＳＡＶ）起源のものであってもよい。
【０００９】
より具体的には、トリ・アデノウイルスの中では、例えば、Ｐｈｅｌｐｓ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４３２）株、Ｆｏｎｔｅｓ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２８０）株、Ｐ７−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２７）株、ＩＢＨ−２Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２８）株、Ｊ２−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８２９）株、Ｔ８−Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８３０）株、Ｋ−１１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２１）株、あるいはまた、ＡＴＣＣ  ＶＲ−８３１〜８３５株に当てはまるような、ＡＴＣＣにおいて入手できる血清型１〜１０を挙げることができる。ウシ・アデノウイルスの中では、種々の既知の血清型が使用されてもよく、特に、引例ＡＴＣＣ  ＶＲ−３１３、３１４、６３９〜６４２、７６８および７６９としてＡＴＣＣで入手できるもの（型１〜８）が使用される。また、ネズミ・アデノウイルスＦＬ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５５０）およびＥ２０３０８（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５２８）、ヒツジ・アデノウイルス型５（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４３）もしくは型６（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１３４０）；ブタ・アデノウイルス５３５９）、または特に、番号ＶＲ−５９１〜５９４、９４１〜９４３、１９５〜２０３等々のＡＴＣＣ番号で引用されるアデノウイルスのようなサル・アデノウイルスを挙げることができる。
【００１０】
本発明の文脈上、イヌ起源のアデノウイルス、特に、ＣＡＶ２アデノウイルス［例えば、マンハッタンもしくはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８００）株］の全ての株を使用することが適切である。イヌ・アデノウイルスは、多くの構造研究の主題を形成してきた。したがって、ＣＡＶ１およびＣＡＶ２アデノウイルスの完全な制限酵素地図は、先行技術に記述されており（Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989）165)、そしてＥ１ａおよびＥ３遺伝子ならびにＩＴＲ塩基配列は、クローン化されて、配列決定されている（特に、Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linne, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525、参照）。さらに、イヌ・アデノウイルスは、既に、狂犬病、パルボウイルスおよびそれに類するものに対して、イヌを免疫することを意図したワクチンの調製のために使用されてきた（WO 91/11525）。しかしながら、これまでは、ヒトの遺伝子治療のためにこれらのアデノウイルスを使用することの可能性は、先行技術においては全く示唆されてなかった。さらにまた、そのような使用の利点は、全く評価されてなかった。
【００１１】
本発明の文脈上、使用されるアデノウイルスは、好ましくは、欠陥のあるもの、すなわち、それらが投与される身体においては、自律的に増殖できないものでなければならない。上述のように、本発明者は、動物起源のアデノウイルスが、ヒト細胞に感染可能であるが、そこでは増殖できないことを示した。それゆえ、この意味において、それらは、必然的にヒトにおいては欠陥があり、そしてヒト・アデノウイルスの使用とは異なり、この関連における遺伝子改変を必要としない。しかしながら、これらのアデノウイルスの欠陥性が、ゲノムの遺伝子改変によって、特に、細胞中での該ウイルスの複製に必要な塩基配列の改変によって増幅されるかも知れない。これらの領域は、除去される（全部もしくは部分的に）か、または非機能性にされるか、または他の配列、特に異種ＤＮＡ配列の挿入によって改変されるか、いずれをされてもよい。
【００１２】
アデノウイルスの起源によって、複製に必要な配列は、いくらか変ることがある。それにもかかわらず、それらは、一般に、ゲノムの末端に近く配置される。したがって、ＣＡＶ−２の場合には、Ｅ１ａ領域は、同定され、クローン化され、そして配列決定されている(Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241）。それは、アデノウイルスゲノムの左手末端の２−ｋｂ断片上に位置する。
【００１３】
さらに、他の遺伝子改変が、これらのアデノウイルスにおいて、特に、ヒトにとって望ましくないウイルスタンパク質の生産を避けるために、大きい異種ＤＮＡ配列の挿入を可能とするように、そして／またはその他の動物もしくはヒト・アデノウイルスのゲノムの特別な領域（例えば、Ｅ３遺伝子）を挿入するように行われてもよい。
【００１４】
本発明の目的のために、用語「異種ＤＮＡ配列」は、ウイルス中に導入され、ヒトにおいて伝達および／または発現が望まれる、いかなるＤＮＡ配列をも指す。
【００１５】
特に、その異種ＤＮＡ配列は、１個以上の治療遺伝子および／または１個以上の抗原ペプチドをコードしている遺伝子を含むことができる。
【００１６】
それゆえ、特定の態様において、本発明は、より具体的には、ヒトに治療遺伝子を伝達することを意図した医薬組成物の調製のための、動物起源のアデノウイルスの使用に関する。この方法において伝達できる治療遺伝子は、いかなる遺伝子でもよく、その転写および、場合により翻訳が、標的細胞において治療効果をもつ生産物を生む。
【００１７】
特に、それらは、治療効果をもつタンパク質性生産物をコードしている遺伝子であり得る。したがって、コードされたタンパク質性生産物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸およびそれに類するものである。このタンパク質性生産物は、標的細胞に関して相同であってもよい（すなわち、標的細胞が、いかなる病状をも示さない時に、標的細胞で正常に発現される生産物）。この場合には、そのタンパク質の発現は、例えば、その細胞における不十分な発現、または改変されて不活性もしくは弱い活性になったタンパク質の発現を補償するか、あるいはまた、該タンパク質を過剰に発現することを可能にする。また、治療遺伝子は、増強された安定性、改変された活性などをもつ細胞タンパク質の変異体をコードすることができる。また、タンパク質性生産物は、標的細胞に関して非相同であってもよい。この場合には、例えば、細胞が、病気を克服できるように、細胞に欠けている活性を補足するか供給することができる。
【００１８】
本発明の目的のための治療的な生産物の中には、より具体的には、酵素、血液誘導物、ホルモン、リンホカイン、すなわちインターロイキン、インターフェロン等（FR 92/03120）、成長因子、神経伝達物質もしくはその前駆物質もしくは合成酵素、栄養因子、すなわちＢＤＮＦ，ＣＮＴＦ，ＮＧＦ，ＩＧＦ，ＧＭＦ，ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＮＴ３，ＮＴ５およびそれに類するもの；アポリポタンパク質、すなわちＡｐｏＡＩ，ＡｐｏＡＩＶ，ＡｐｏＥおよびそれに類するもの（FR 93/05125），ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（FR 91/11947）、腫瘍抑制遺伝子、すなわちｐ５３，Ｒｂ，Ｒａｐ１Ａ，ＤＣＣ，ｋ−ｒｅｖおよびそれに類するもの（FR 93/04745）そして血液凝固に関与する因子、すなわちＶＩＩ，ＶＩＩＩ，ＩＸ因子等をコードしている遺伝子を挙げることができる。
【００１９】
また、治療遺伝子は、アンチセンス遺伝子もしくは配列であってもよく、標的細胞におけるその発現が、細胞遺伝子の発現もしくは細胞ｍＲＮＡの転写を制御できる。そのような配列は、欧州特許第140,308号記載の技術により、例えば、標的細胞中で細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに転写され、その結果、それらのタンパク質への翻訳を阻止することができる。
【００２０】
上記のように、また、異種ＤＮＡ配列は、ヒトに免疫応答を生むことができる抗原ペプチドをコードしている１個以上の遺伝子を含んでもよい。それゆえ、この特定の態様においては、本発明は、特に微生物もしくはウイルスに対してヒトを免疫にするワクチンを生産させることを可能にする。そのような抗原ペプチドは、特に、エプスタイン・バールウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（欧州特許第185,573号）または偽狂犬病ウイルスに特異的であるか、あるいはまた腫瘍特異性（欧州特許第259,212号）であってもよい。
【００２１】
また、一般に、異種ＤＮＡ配列は、治療遺伝子および／または感染細胞において抗原ペプチドをコードしている遺伝子の発現を可能にする塩基配列を含む。そのような配列は、これらの配列が、感染細胞において機能できる場合、問題の遺伝子の発現に本来関与しているものであってもよい。また、それらは、異なる起源の配列（その他のタンパク質の発現に関与するものか、またはたとえ合成のものでも）であってもよい。特に、それらは、真核生物もしくはウイルスの遺伝子のプロモーター配列でもよい。例えば、それらは、感染が望まれる細胞のゲノムから得られるプロモーター配列でもよい。同様に、それらは、使用されるアデノウイルスを含むウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。例えば、Ｅ１Ａ，ＭＬＰ，ＣＭＶ，ＲＳＶ等の遺伝子のプロモーターが、これに関連して挙げることができる。その上、これらの発現配列は、活性化、調節等の配列の付加によって改変されてもよい。さらに、挿入される遺伝子が、発現配列を含む場合には、それは、そのような配列の下流に、欠陥ウイルスのゲノム中に挿入されてもよい。
【００２２】
さらに、また、異種ＤＮＡ配列は、特に、治療遺伝子の上流に、合成された治療生産物を標的細胞の分泌経路中に向かわせるシグナル配列を含むこともできる。このシグナル配列は、治療生産物の本来のシグナル配列でもよいが、それは、また他のいかなる機能的シグナル配列もしくは人工的シグナル配列でもよい。
【００２３】
本発明による欠陥アデノウイルスは、当業者に既知のいかなる技術によっても調製することができる。特に、それらは、国際公開（WO）第 91/11525号明細書に記載のプロトコールに従って調製されてもよい。慣用の調製技術は、動物アデノウイルスと、なかでも、挿入が望まれる異種ＤＮＡ配列を担持するプラスミドとの間の相同組み換えに基づいている。相同組み換えは、適切な細胞系中に該アデノウイルスとプラスミドの同時トランスフェクションの後に起きる。使用される細胞系は、好ましくは、該要素によって形質転換できるべきであり、そして動物起源の改変アデノウイルスが使用される場合には、その細胞系は、必要により、組み換えの危険を避けるために、好ましくは組み込み形において、欠陥アデノウイルスゲノムの部分を相補することができる配列を含むこともできる。細胞系の例としては、ＧＨＫグレイハウンド腎細胞系（Ｆｌｏｗ研究所）もしくはＭＤＣＫ細胞系が挙げられる。細胞の培養および、ウイルスもしくはウイルスＤＮＡの調製の条件は、また、文献に記載されている（特に、Macatnay et al., Science 44 (1988) 9; Fowlkes et al., J. Mol. Biol. 132 (1979) 163、参照）。
【００２４】
その後、増殖されたベクターが、回収され、分子生物学の慣用の技術に従って精製される。
【００２５】
本発明のその他の主題は、少なくとも１個の上記治療遺伝子を含む異種ＤＮＡ配列を担持する動物起源の組み換えアデノウイルスからなる。
【００２６】
また、本発明の主題は、上記動物起源の組み換えアデノウイルスを含むいかなる医薬組成物でもある。本発明の医薬組成物は、局所的、経口的、非経口的、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内等の投与の目的で製剤化されてもよい。
【００２７】
好ましくは、その医薬組成物は、注射剤のために薬学的に受容できる媒体を含む。これらは、特に、滅菌、等張塩類溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウム等）、または、場合により、滅菌水もしくは生理食塩水を添加して、注射液剤を作成できる乾燥された、特に凍結乾燥された組成物でもよい。
【００２８】
注射のために使用されるウイルスの投与量は、種々のパラメーターに従って、特に、使用される投与方法、問題の病変、発現される遺伝子、もしくは処置の望まれる期間に従って適合される。一般的に言えば、本発明による組み換えアデノウイルスは、１０４〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは、１０６〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌの投与形で製剤化され、そして投与される。用語ｐｆｕ（プラーク形成単位）は、ウイルス溶液の感染力に対応し、そして適当な細胞培養に感染させ、一般に５日後に、感染細胞のプラーク数を計測することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の決定技術は、文献において詳しく報告されている。
【００２９】
挿入される異種ＤＮＡ配列により、本発明のアデノウイルスは、遺伝病（ジストロフィー、嚢胞性繊維症、等）、神経変性病（アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、等）、がん、血液凝固障害もしくは異常リポタンパク血症に関連した病変、ウイルス感染に関連した病変（肝炎、ＡＩＤＳ等）およびそれに類するものを含む、多数の病変の治療もしくは予防のために使用することができる。
【００３０】
本発明は、次に示す実施例によってより完全に記述されるであろうが、その実施例は、例示であり、そして限定されないと考えるべきある。
【００３１】
分子生物学の一般的技術
分子生物学において使用される慣例の方法、例えば、プラスミドＤＮＡの調製的抽出、塩化セシウム濃度勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡ断片の精製、タンパク質のフェノールもしくはフェノール−クロロホルム抽出、生理食塩水中でのＤＮＡのエタノールもしくはイソプロパノール沈殿、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等における形質転換は、当業者にとって周知であり、広く文献に記述されている［Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al., (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York 1987 ]。
【００３２】
ｐＢＲ３２２およびｐＵＣタイプのプラスミド、およびＭ１３シリーズのファージは、市販のものである(Bethesda Research Laboratoies）。
【００３３】
連結反応を実施するために、ＤＮＡ断片が、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動によってそれらのサイズに従って分別され、フェノールもしくはフェノール／クロロホルム混合液を用いて抽出され、エタノールを用いて沈殿され、次いで供給先の指示に従ってファージＴ４のＤＮＡリガーゼ（Biolabs)の存在でインキュベートされる。
【００３４】
突出５’末端のフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ）は、供給先の指示に従ってＥ．コリのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Biolabs)を用いて行われる。突出３’末端の破壊は、製造者の指示に従って使用されるファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs)の存在で行われる。突出５’末端の破壊は、ヌクレアーゼＳ１によるコントロール処理によって実施される。
【００３５】
合成オリゴデオキシヌクレオチドによるイン・ビトロでの部位特異的変異誘発は、Taylor et al.［Nucleic Acids Res.13 (1985) 8749−8764]による方法に従って、Amershamによって市販されるキットを用いて実施される。
【００３６】
いわゆるＰＣＲ［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ポリメラーゼに触媒される連鎖反応） , Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350］技術によるＤＮＡ断片の酵素的増幅は、製造元の指示に従って、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus）を用いて行われる。
【００３７】
ヌクレオチド配列の確認は、Sangerらにより開発された方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467］によって、Amersham市販のキットを用いて実施される。
【実施例１】
【００３８】
Ｅ１．  イヌ起源のアデノウイルスによるヒト細胞の感染。
【００３９】
この実施例は、ヒト細胞への動物（イヌ）起源アデノウイルスの感染力を例証する。
【００４０】
Ｅ１．１．  使用される細胞系
この実施例においては、次の細胞系が使用された：
−ヒト胎児性腎細胞系２９３（Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59）。この系統は、特に、そのゲノムに組み込まれて、Ａｄ５ヒトアデノウイルスゲノムの左手部分（１２％）を含む。
【００４１】
−ＫＢヒト細胞系：ヒト表皮がん由来、この細胞系は、その培養条件とともにＡＴＣＣ（引用ＣＣＬ１７）から入手できる。
【００４２】
−Ｈｅｌａヒト細胞系：ヒト上皮がん由来、この細胞系は、その培養条件とともにＡＴＣＣ（引用ＣＣＬ２）から入手できる。
【００４３】
−ＭＤＣＫイヌ細胞系：ＭＤＣＫ細胞の培養条件は、特に、Macatney et al., Science 44 (1988) 9 において述べられている。
【００４４】
Ｅ１．２．  感染
上記細胞系の細胞は、ＣＡＶ２ウイルス（マンハッタン株）によって感染される。この目的のために、細胞（約１０７／ペトリ皿）を、ウイルス１０ｐｆｕ／ｃｅｌｌの存在下で３７℃で１時間培養した。次いで、培養培地５ｍｌを添加し、培養を、３７℃で約４８時間継続した。この時点で、感染細胞中にエピソーム形で存在するＤＮＡが分析された：得られた結果は、すべての細胞系が、それらの核にＣＡＶ２ＤＮＡを保持することを示し、それによって、それらが、イヌ・アデノウイルスによって感染できることを例証した。
【実施例２】
【００４５】
Ｅ２．  ヒト細胞におけるイヌ起源アデノウイルスの増殖の欠如。
【００４６】
この実施例は、イヌ・アデノウイルスが、ヒト細胞に感染できるけれども、そこでは増殖されないことを例証する。
【００４７】
実施例１による細胞の感染後、ＣＡＶ２ＤＮＡの量を、次のプロトコールに従って継時的にアッセイした：細胞中に存在するエピソームＤＮＡを、Hirtら（J. Virol. 45 (1983) 91）により記載の技術に従って回収し、そのＤＮＡ量を、標準群と比較してアッセイした。得られた結果は、ウイルスＤＮＡの量は、ＫＢと２９３細胞中では増加せず、これらの細胞中でのＣＡＶ２の複製の完全な欠如を例証していることを示す。ＭＤＣＫとＨｅｌａ細胞中では、ＣＡＶ２ウイルスＤＮＡ量のわずかな増加が、観察される。しかしながら、ウイルス粒子の形成のアッセイでは、ＣＡＶ２の増殖は、２９３、ＫＢおよびＨｅｌａヒト細胞中で起きず、ＭＤＣＫイヌ細胞系でのみ起きることを示す。増殖は、感染した細胞を収得し、凍結／融解によってすべてのウイルスを放出させ、それによって得られた上澄液を用いて、上記条件下でＭＤＣＫ細胞を感染させることによって測定された。培養４８時間後、この方法で感染されたＭＤＣＫ細胞中にウイルスＤＮＡが存在しないことは、ウイルス増殖が、ヒト細胞中では起きなかったことを例証している。
【００４８】
これらの結果は、イヌ・アデノウイルスが、ヒト細胞中で増殖できないことを明らかに示している。
【実施例３】
【００４９】
Ｅ３．  ヒト・アデノウイルスによるイヌ・アデノウイルスのトランス相補の欠如の例証。
【００５０】
この実施例は、ヒト細胞中でのイヌ・アデノウイルスの増殖の欠如が、ヒト・アデノウイルスの存在によって、トランス相補されないことを示す。
【００５１】
２９３、ＫＢおよびＨｅｌａヒト細胞系およびＭＤＣＫイヌ細胞系の細胞が、ＣＡＶ２アデノウイルスとＡｄ５ヒト・アデノウイルスを用いて、同時感染された。その細胞中でのウイルス（イヌおよびヒト）ＤＮＡの存在が、実施例Ｅ１のように例証され、そしてＤＮＡ量を、増殖とともに継時的にアッセイした。得られた結果は、ＣＡＶ２ＤＮＡ量は、ＫＢと２９３細胞中では継時的に増加しないことを示し、それによってＡｄ５ヒト・アデノウイルスの存在が、これらの細胞中でのＣＡＶ２の複製を、トランス相補によって誘導しないことを例証している。ＫＢ、２９３およびＨｅｌａ細胞から由来する可能性のあるウイルスを用いて感染されたＭＤＣＫ細胞中のウイルスＤＮＡの不在は、ヒト細胞系におけるＣＡＶ２アデノウイルスの増殖が、ヒト・アデノウイルス存在下でさえも起きないことを例証する。
【実施例４】
【００５２】
Ｅ４．  ＣＡＶ２ゲノムＤＮＡライブラリーの構築。
【００５３】
プラスミドのライブラリーは、ＣＡＶ２アデノウイルスゲノムの制限酵素断片から構築された。このライブラリーは、酵素ＳｍａＩとＰｓｔＩを用いるＣＡＶ２の消化、そしてベクターｐＧｅｍ３Ｚｆ＋（Promega）中への、ＳｍａＩ断片、すなわちＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＩおよびＪ、ならびにＰｓｔＩ断片、すなわちＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨ（図１）のクローニングによって得られた。次いで、ＳｍａＩ断片Ｃを担持するプラスミドを、ＭＤＣＫ細胞中に、プラスミドｐＵＣ４ＫＩＸＸ（Pharmacia）とともに同時トランスフェクションして、ＣＡＶ２のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を構成的に発現するＭＤＣＫ細胞系を確立した。この細胞系は、これらの領域が欠失されている組み換えウイルスの構築を可能にする（Ｅ５．２．参照）。
【実施例５】
【００５４】
Ｅ５．  Ａｄ２のＭＬＰプロモーターの調節下にあるインターロイキン−２遺伝子を担持する組み換えイヌ・アデノウイルスの構築。
【００５５】
ヒトＡｄ２のＭＬＰプロモーターの調節下にあるインターロイキン−２遺伝子を担持する組み換えイヌ・アデノウイルスの構築について２つの戦略が考案された。
【００５６】
Ｅ５．１．  第１は、ＳｍａＩ制限部位において、Ｅ４領域と全ＣＡＶ２ゲノムの右手ＩＴＲとの間に、目的の異種ＤＮＡ配列（ＭＬＰプロモーター−インターロイキン−２遺伝子）を挿入することにある。そのような組み換え体の構築は、目的の異種ＤＮＡ配列とＣＡＶ２ゲノムの間の、連結反応によるか、イン・ビボの組み換えによるかの、いずれかで遂行される。ＭＬＰプロモーターの調節下のインターロイキン−２遺伝子を担持する組み換えアデノウイルスを得るために使用されるプラスミドは、次の方法（図２）で構築される：
−ｐ１と命名された第１のプラスミドは、特に、右手ＩＴＲ、ＳｍａＩ部位およびＥ４遺伝子を含む、ＣＡＶ２のＳａｌＩ断片Ｂ（図１）を、プラスミドｐＧｅｍ３Ｚｆ＋（Promega）中にクローニングすることによって得られる；ＳｍａＩ部位は、ｐ１上にただ１個である；
−異種ＤＮＡ配列（ＭＬＰプロモーター−インターロイキン−２遺伝子）が、プラスミドｐ１のＳｍａＩ部位に導入されて、プラスミドｐ２を得る；そして
−次に，ゲノムライブラリーのＰｓｔＩ断片Ｄに含まれ、Ｅ３遺伝子の一部分を担持するＰｓｔＩ−ＳａｌＩ断片が、ｐ２における対応する部位にクローン化されて、プラスミドｐ３を得る（図２）。
【００５７】
そのようにして得られたプラスミドが、次の２つのプロトコールに従って組み換えアデノウイルスを調製するために使用される（図３参照）：  ａ）ＳａｌＩで消化されたプラスミドｐ２の、ＣＡＶ２のＳａｌＩ断片Ａへのイン・ビトロでの連結反応、そしてＭＤＣＫ細胞中への連結反応産物のトランスフェクション（図３ａ）、
ｂ）ＭＤＣＫ細胞への同時トランスフェクション後の、プラスミドｐ３と、ＣＡＶ２のＳａｌＩ断片Ａとの間の組み換え（図３ｂ）。次いで、得られた組み換えアデノウイルスが、当業者に既知の技術によって単離され、増幅される。
【００５８】
これらの操作は、インターロイキン−２遺伝子を担持する組み換えイヌ・アデノウイルスの構築を可能にし、それが、ヒトにおけるこの治療遺伝子の伝達に使用される（図３）。
【００５９】
Ｅ５．２．  考案された第２の戦略は、ＣＡＶ２のＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を構成的に発現するＭＤＣＫ細胞系の使用に基づいている（実施例Ｅ４参照）。この細胞系は、実際に、これらの領域を欠失されたイヌ・アデノウイルスのトランス相補を可能にし、その結果、異種ＤＮＡ配列が、Ｅ１領域と置換された組み換えウイルスの構築を可能にする。この目的のために、ＣＡＶ２ゲノムの左手末端（ＩＴＲ配列と包膜配列）と異種ＤＮＡ配列とを含むプラスミドが、構築される。このプラスミドは、それ自身の左手末端を欠失されたＣＡＶ２アデノウイルスのゲノムの存在において、上記ＭＤＣＫ細胞中に同時トランスフェクションされる。作製された組み換えイヌ・アデノウイルスは、回収され、適宜、増幅され、そしてヒトに、それを使用するために保存される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１：ＣＡＶ２アデノウイルス・マンハッタン株の制限酵素地図（Spibey et al., 前掲による）。
【図２】図２：プラスミドｐ１，ｐ２（図２ａ）およびｐ３（図２ｂ）の地図。
【図３】図３：異種ＤＮＡ配列をもつ組み換えイヌ・アデノウイルスの構築戦略。
【００６１】
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図１】
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