(57)【要約】【課題】膝を切開することなく軟骨組織再生を昂進させ、関節障害の治癒を促すため患者の負担を大きく低減する等の効果を奏する軟骨組織再生用注入剤を提供すること。【解決手段】（１）重量平均一次分子量が８０万より大きいヒアルロン酸から形成されていることを特徴とする架橋ヒアルロン酸を含む軟骨組織再生用注入剤組成物（２）架橋ヒアルロン酸の架橋点が加水分解性であることを特徴とする（１）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物を構成とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均一次分子量が８０万より大きいヒアルロン酸から形成されていることを特徴とする架橋ヒアルロン酸を含む軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項２】
架橋ヒアルロン酸の架橋点が加水分解性であることを特徴とする請求項１記載の軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項３】
架橋ヒアルロン酸の架橋構造がエステル結合であることを特徴とする請求項２記載の軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項４】
架橋ヒアルロン酸の架橋構造が自己架橋エステル結合であることを特徴とする請求項３記載の軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項５】
生体内の軟骨欠損部分に注射により注入できることを特徴とする請求項１記載の軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項６】
生体内の軟骨欠損部分が関節軟骨、肋軟骨、気管軟骨、咽頭軟骨、歯槽骨、歯周組織からなる群より選択した１種であることを特徴とする請求項５記載の軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項７】
架橋ヒアルロン酸の形状がヒドロゲル粒子であり、その粒子径が２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１記載の軟骨組織再生用注入剤組成物。
【請求項８】
生体内の軟骨欠損部分に注入することにより軟骨細胞組織の再生を促進させるための請求項１記載の軟骨組織再生用注入剤組成物を用いた治療法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、架橋ヒアルロン酸からなる軟骨組織再生用注入剤組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本及び欧米など先進国では社会の高齢化に伴い関節障害により日常生活が損なわれる患者が年々増加する傾向にある。これら関節障害の大部分は変形性関節症や慢性リウマチなど、関節の軟骨組織の損傷に起因しており、もし損傷を受けた軟骨組織を再生する事ができれば患者の大きな福音となる。
【０００３】
これら疾患の治療としては、一般的に自己の非加重部の軟骨組織や他家の軟骨組織を損傷部へ移植することが行われている。このうち他家移植は拒絶反応や感染の問題があり、その適応数は少ない。一方、自己移植も、移植する組織の供給の問題、大きな欠損は修復困難、そして外科手術の患者への負担などの問題がある。移植以外では欠損部へのｄｒｉｌｌｉｎｇやａｂｒａｓｉｏｎ、ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅなどの方法が適応されているが、これらの修復法では完全に硝子軟骨の修復ができず、再生組織は繊維軟骨であり経時的には変性が生じる問題があった。
【０００４】
最近では新たな治療方法として組織再生医療が注目を集めており、軟骨組織の再生に関しても積極的な検討が進められている。軟骨細胞、幹細胞、骨髄細胞やＥＳ細胞とその増殖・分化を促進する生理活性物質、及び組織培養・誘導の足場となる基材を利用して軟骨組織を再生する。例えば、非加重部分の自己の軟骨細胞を採取、培養後、欠損部分に移植する細胞移植が行われる。これらの処置法では、移植時に関節を大きく切開し、損傷を受けた軟骨面を治療せざるを得ないため、術前／術中の抗生物質の投与、器具／手術着の完全な滅菌、さらに無菌手術など患者への苦痛と医療機関への時間／経済的な負担があった。
【０００５】
このように外科的治療法としては現行では確立されたものはなく、一般的に治療には長期の入院と高額な治療費が必要であり、患者のみならず医療機関／医療財政などにも負担となっている。このため低浸襲の治療法が望まれており、この面から注入により損傷を受けた軟骨を修復する方法が考案されてきた。
例として、生分解性のコラーゲンを成分とする軟骨修復のための注入材が挙げられる（例えば、特許文献１参照。）。また、ヒアルロン酸誘導体を成分とする軟骨修復のための注入剤などが挙げられる（例えば、特許文献２参照）。
しかし、コラーゲンは生分解性があるものの、抗原性を完全には除去することは困難であり、また未知のウイルス感染などの危険性が否定できないなどの課題があった。
【０００６】
【特許文献１】
欧州特許出願公開第１１５４７３４号明細書
【０００７】
【特許文献２】
国際公開第００／３７１２４号パンフレット
【０００８】
ヒアルロン酸は関節軟骨を形成する細胞外基質の構成成分そのものであり軟骨との親和性も高い。そしてヒアルロン酸は生合成プロセス及び組織の成長に深く影響することが証明されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９７２：６９，１３８４）。  そして正常な関節液のヒアルロン酸の分子量は２００万〜７００万であり、ヒアルロン酸は創傷治癒を促進し、また軟骨修復を昂進する薬理作用を有することが知られている。
（Ｗｅｎｎｅｒ−Ｇｒｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ，ｖｏｌ．７２．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｒｏｒｔｌａｎｄ  Ｐｒｅｓｓ；１９９８．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；１９９１：３０５−３４１．  Ａｒｃｈ  Ｈｉｓｔｏｌ  Ｃｙｔｏｌ  ６１：１２５−１３５，１９９８．  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ４：９９−１１０，１９９６）
【０００９】
ヒアルロン酸は組織修復にも理想的な素材と考えられるが、ヒアルロン酸水溶液の生体内貯留性が短いため、細胞の足場としては利用できない。
ヒアルロン酸の優れた生体適合性を生かして、各種目的、例えば癒着防止剤やＤＤＳ用担体などの医療材料として利用するため、ヒアルロン酸の生体内貯留性を向上させる目的で、ヒアルロン酸を化学的に架橋・修飾するなどする方法が考案されてきた。例えば、ジビニルスルホン、ビスエポキシド類、ホルムアルデヒド等の二官能性試薬を架橋剤に使用して、得られた高膨潤性の架橋ヒアルロン酸ゲル（米国特許第４，５８２，８６５号明細書、特公平６−３７５７５号公報、特開平７−９７４０１号公報、特開昭６０−１３０６０１号公報参照）などを挙げることができる。ヒアルロン酸誘導体の生体内貯留性は向上するが、ヒアルロン酸の修飾度は大きいため、ヒアルロン酸自体が本来有していた機能は大きく変化している。
【００１０】
ヒアルロン酸誘導体を成分とする軟骨修復のための注入剤（ＷＯ００／３７１２４号）で開示されているヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸のベンジルエステル誘導体とエステル化度が３〜１５％の範囲の自己架橋ヒアルロン酸である。注入剤として、これらのヒアルロン酸誘導体が付与している機能は高粘度特性だけである。ヒアルロン酸誘導体自体の分子構造に起因する特性への言及はない。
そして、ヒアルロン酸誘導体に関する多くの知見の中で、架橋ヒアルロン酸の一次分子量に着目した事例は皆無であり、実際の測定例もない。
【００１１】
ヒアルロン酸の薬理作用、すなわち軟骨破壊の抑制、障害軟骨の被覆保護などは、ヒアルロン酸の分子量が数十万の低分子量より２００万程度の高分子量ほど優れていることが知られている。例えば、ウサギ膝関節軟骨細胞の単離培養に於いて、ヒアルロン酸の分子量依存的に３５Ｓ標識プロテオグリカンの培養液中の放出が抑制され、ヒアルロン酸の分子量が高いほど軟骨破壊の抑制効果が高いことが報告されている。（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．１，１２．１９９４）また、ラット大腿骨顆粒部軟骨に穿孔を形成するモデルに於いて、ヒアルロン酸の分子量が高いほど損傷軟骨の修復効果が高いことが報告されている（関節外科，１３（４），３９１，１９９４）。
【００１２】
また、ヒアルロン酸の軟骨との親和性は、ヒアルロン酸の分子量が高いほど優れていることが知られている。例えば、変形性膝関節炎の軟骨組織をヒアルロン酸分解酵素で処理し除去した後、蛍光標識した各種分子量の異なるヒアルロン酸を加え親和性を検討したところ、ヒアルロン酸の分子量が高いほど軟骨への親和性が高いことが報告されている（炎症，１４，１４３，１９９４）。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
我々は、ヒアルロン酸自体が本来有する生体材料としての理想的な特性を損なうことなく、ヒアルロン酸を架橋し、ゲル化する方法を提案してきた（ＷＯ９９／１０３８５など）。
更に得られた架橋ヒアルロン酸の分子構造の精査と製造条件の検討を行い、その結果、ヒアルロン酸の優れた特性を損なうことなく重量平均一次分子量が８０万より大きいヒアルロン酸から形成されたことを特徴とする架橋ヒアルロン酸を考案することができた（特願２００２−３１４０９０号）。
【００１４】
この架橋ヒアルロン酸を生体内に投与、注入すると、架橋ヒアルロン酸の架橋点が加水分解し、架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルの表面から重量平均の一次分子量が８０万より大きい高分子量のヒアルロン酸が離脱していく。
また、架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルの表面は高分子量ヒアルロン酸の分子鎖を有しており、高分子量ヒアルロン酸の有する各種特徴、すなわち軟骨への親和性、軟骨破壊の抑制、障害軟骨の被覆保護などの薬理作用を、架橋ヒアルロン酸のヒドロゲル自身が有していることがわかった。
すなわち、この方法で得た架橋ヒアルロン酸のヒドロゲル粒子を軟骨組織欠損を有する関節の関節腔に注入すると、この高分子量のヒアルロン酸を有している架橋ヒアルロン酸のヒドロゲルが軟骨欠損部分に対して高い親和性を有しているため、驚くべきことに軟骨組織がある程度、再生することを見出し本発明を完成するに至った。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、（１）重量平均一次分子量が８０万より大きいヒアルロン酸から形成されていることを特徴とする架橋ヒアルロン酸を含む軟骨組織再生用注入剤組成物、（２）架橋ヒアルロン酸の架橋点が加水分解性であることを特徴とする（１）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物、（３）架橋ヒアルロン酸の架橋構造がエステル結合であることを特徴とする（２）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物、（４）架橋ヒアルロン酸の架橋構造が自己架橋エステル結合であることを特徴とする（３）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物、（５）生体内の軟骨欠損部分に注射により注入できることを特徴とする（１）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物、（６）生体内の軟骨欠損部分が関節軟骨、肋軟骨、気管軟骨、咽頭軟骨、歯槽骨、歯周組織からなる群より選択した１種であることを特徴とする（５）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物、（７）架橋ヒアルロン酸の形状がヒドロゲル粒子であり、その粒子径が２ｍｍ以下であることを特徴とする（１）１記載の軟骨組織再生用注入剤組成物、（８）生体内の軟骨欠損部分に注入することにより軟骨細胞組織の再生を促進させるための（１）記載の軟骨組織再生用注入剤組成物を用いた治療法である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で言う軟骨組織再生用注入剤組成物とは、関節軟骨障害及び欠損部位を機能的かつ生理学的に、適切な組織に修復することのできるものである。
更に、本発明の組成物は、機能的な関節軟骨の再生を加速することができる。
本発明で言う注入剤は、流動性を有するものである。
【００１７】
本発明に用いられるヒアルロン酸は、動物組織から抽出したものでも、また発酵法で製造したものでもその起源を問うことなく使用できる。
発酵法で使用する菌株は自然界から分離されるストレプトコッカス属等のヒアルロン酸生産能を有する微生物、又は特開昭６３−１２３３９２号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−１００（微工研菌寄第９０２７号）、特開平２−２３４６８９号公報に記載したストレプトコッカス・エクイＦＭ−３００（微工研菌寄第２３１９号）のような高収率で安定にヒアルロン酸を生産する変異株が望ましい。上記の変異株を用いて培養、精製されたものが用いられる。
【００１８】
本発明に用いられるヒアルロン酸の分子量は、約１×１０６〜約１×１０７ダルトンの範囲内のものが好ましい。本発明にいうヒアルロン酸は、そのアルカリ金属塩、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウムの塩をも包含する概念で使用される。
【００１９】
本発明でいう架橋ヒアルロン酸は、三次元網目構造を有している高分子体であり、媒質に膨潤した状態がゲルである。架橋ヒアルロン酸は、生理的に受容可能な媒質中で膨潤してヒドロゲルになる。
【００２０】
本発明で言う重量平均一次分子量が８０万より大きいヒアルロン酸から形成された架橋ヒアルロン酸とは、架橋ヒアルロン酸の架橋点を切断したとき、重量平均分子量が８０万より大きい直鎖状のヒアルロン酸が生成することを意味する。架橋点を切断することによって生成するヒアルロン酸の重量平均分子量と分岐度はＧＰＣ−ＭＡＬＬＳによって容易に測定することができる。
【００２１】
ヒアルロン酸の分子構造が熱や酸、アルカリ、ラジカル等に弱く、主鎖切断に伴う分子量低下が容易に起こることは広く知られている。多くの架橋ヒアルロン酸の合成反応でも、原料ヒアルロン酸の重量平均分子量がどんなに大きいものを使用した場合でも、反応時に低分子量化が進行してしまう。例えば、架橋剤等の作用、反応条件が高温であったり、低ｐＨ条件或いは高ｐＨ条件、また反応時間が長かったりすると架橋反応時にヒアルロン酸の重量平均分子量は容易に低下してしまう。さらに架橋ヒアルロン酸を合成した後の工程でも、ゲルを破砕したり、微粒子化する際の物理的な負荷でも同様に容易に低分子化してしまう。さらに製剤化後の滅菌工程、例えば高圧蒸気滅菌などの滅菌処理により、ヒアルロン酸の重量平均分子量は容易に低下してしまう。
架橋ヒアルロン酸の合成目的は、生体内の貯留性の向上にあったため、得られた架橋ヒアルロン酸を構成するヒアルロン酸分子の分子量が考慮された例、及び実際にその分子量が測定された例はない。
【００２２】
本発明で言う架橋ヒアルロン酸の架橋点が加水分解性であるとは、生理的な条件下、例えば３７℃、ｐＨ７．４、生理的食塩水中で、ヒアルロン酸の主鎖分解に優先して架橋点が分解する性質を意味する。
ヒアルロン酸の主鎖分解よりも加水分解性の優れている架橋構造は、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、ヒドラジド結合やリン酸エステル結合などが挙げられるが、最も代表的な構造はエステル結合である。
【００２３】
架橋構造がエステル結合である架橋ヒアルロン酸としては、多価アルコールとヒアルロン酸のカルボキシル基のエステル、多価カルボン酸とヒアルロン酸の水酸基とのエステル、多価エポキシ化合物とヒアルロン酸のカルボキシル基のエステルなどが挙げられる。
【００２４】
架橋構造が自己架橋エステル結合である架橋ヒアルロン酸とは、ヒアルロン酸のカルボキシル基と水酸基間が直接エステル結合した架橋ヒアルロン酸である。自己架橋エステル結合ヒアルロン酸の製造方法は、一部またはすべてのカルボキシ基が同一の多糖鎖または他の多糖鎖のアルコール基でエステル化された、自己架橋エステル結合ヒアルロン酸がＥＰ０３４１７４５Ｂ１に、ＨＡの水溶液を酸性に調整し、該水溶液を凍結し、次いで解凍することを少なくとも１回行うことによって生成する自己架橋エステル結合ヒアルロン酸がＷＯ９９／１０３８５に、凍結を行わずとも５％以上の濃度になるようにヒアルロン酸と酸性溶液を混合・該共存状態を保持することで生成する自己架橋エステル結合ヒアルロン酸がＷＯ０１／５７０９３に開示されている。
【００２５】
自己架橋エステル結合ヒアルロン酸の安全性は、加水分解により放出される天然のヒアルロン酸が生理学的代謝経路により代謝されるので、別の架橋反応により製造された架橋ヒアルロン酸より良好である可能性がある。
【００２６】
また、本発明でいう架橋ヒアルロン酸を形成させる際にヒアルロン酸と同様に生体適合性に優れる材料、例えば、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース等を混合、複合化して架橋ヒアルロン酸を形成させることができるものであり、何ら制限されないものである。
また、架橋ヒアルロン酸を形成させる際に、薬学的又は生理学的に活性な物質を添加して、これらを含有する架橋ヒアルロン酸を形成させることもできるものであり、何ら制限されないものである。
【００２７】
架橋ヒアルロン酸を含む軟骨再生用注入剤組成物を注射により注入する場合、注射針を通して軟骨欠損部分に注入するため、架橋ヒアルロン酸は生理的に受容可能な媒質に分散した懸濁液にする必要がある。懸濁液は、架橋ヒアルロン酸をその製造工程か、精製工程のいづれかの段階で、ミキサーやホモジナイザーのような破砕機を用いて破砕することにより調整できる。架橋ヒアルロン酸のヒドロゲル粒子の粒子径は、軟骨注入剤組成物の物理化学的な性質や効果を制御するため任意に調整することができる。架橋ヒアルロン酸を、生理的に受容可能な媒質に分散した後、ホモジナイザーで処理すれば、０．０５ｍｍ〜２．０ｍｍの分散粒子径に容易に調整できる。
【００２８】
架橋ヒアルロン酸は、生理的に受容可能な媒質中で膨潤してゲルになる。ゲルの平衡膨潤倍率は、架橋ヒアルロン酸の架橋度によって任意に調整することができる。例えば、平衡膨潤倍率が１００倍の場合、生理的に受容可能な媒質中のヒアルロン酸濃度は１．０％になる。平衡膨潤倍率が１０倍の場合、生理的に受容可能な媒質中のヒアルロン酸濃度は１０％になる。軟骨再生用注入剤組成物中の架橋ヒアルロン酸の濃度は高い方が、注入容積を減じることができるため治療の自由度は大きくなる。但し、ヒアルロン酸分子自体が水に対して大きな親和性を有するため、架橋ヒアルロン酸の濃度を２０％よりも大きくすることは、分散液の流動性を著しく損なうため実用的ではない。
【００２９】
架橋ヒアルロン酸のヒドロゲル粒子の形状は、その使用目的や軟骨再生用注入剤組成物設計によって、任意に調整することができる。ヒドロゲル粒子の表面特性を重視する場合、ヒドロゲル粒子は多孔質で表面積の大きい形状の方が有利である。但し、多孔質で表面積の大きい形状のヒドロゲル粒子の場合、同一平衡膨潤倍率の多孔質性のないヒドロゲル粒子と同一の架橋ヒアルロン酸濃度で比較して、ヒドロゲル粒子の分散液の流動性は低下する。多孔質で表面積の大きい形状のヒドロゲル粒子では、軟骨再生用注入剤組成物中の架橋ヒアルロン酸の濃度を大きく設計する面では不利である。
【００３０】
本発明の架橋ヒアルロン酸を含有する軟骨組織再生用注入剤組成物は、それ自体で、あるいは他の生理活性物質、生体適合性物質、抗生物質等と組み合わせて利用できる。
【００３１】
生理活性物質としては、軟骨細胞の成長を促進する因子があげられ、例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ、ＣＳＦ，ＥＰＯ、ＩＬ及びＩＦ等が挙げられる。これらの生理活性物質は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。ＢＭＰはｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ−４、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈＢＭＰ−６、ｒｈＢＭＰ−７（ｒｈＯＰ−１）、ｒｈＢＭＰ−８、ｒｈＢＭＰ−９、ｒｈＢＭＰ−１２、ｒｈＢＭＰ−１３、ｒｈＢＭＰ−１５、ｒｈＢＭＰ−１６、ｒｈＢＭＰ−１７、ｒｈＢＭＰ−１８、ｒｈＧＤＦ−１、ｒｈＧＤＦ−３、ｒｈＧＤＦ−５、ｒｈＧＤＦ−６、ｒｈＧＤＦ−７、ｒｈＧＤＦ−８、ｒｈＧＤＦ−９、ｒｈＧＤＦ−１０、ｒｈＧＤＦ−１１、ｒｈＧＤＦ−１２、ｒｈＧＤＦ−１４を包含する。さらに、これらのホモダイマー、ヘテロダイマー、修飾体、部分欠失生成物、あるいは２種またはそれ以上の混合物として使用できる。例えば、ＢＭＰとアクチビン、インヒビンおよびＴＧＦ−β１のごときＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーとのヘテロダイマーであってもよい。
【００３２】
本発明の架橋ヒアルロン酸を含有する軟骨組織再生用注入剤組成物は、それ自体で、あるいは他の生理活性物質、生体適合性物質、抗生物質等と組み合わせて、更には組織再生能を有する細胞とも組み合わせて利用できる。
【００３３】
生体適合性物質としては、軟骨細胞の接着を促進する物質が重要であり、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、アルブミン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、及び核酸等が挙げられる。また記載された多糖はオリゴ糖としても利用できる。
抗生物質としては、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びアンホテリシンＢ等が挙げられる。
細胞としては軟骨細胞の他、軟骨細胞に分化、増殖する幹細胞、中でも間葉系幹細胞等が挙げられる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【００３５】
実施例１
重量平均分子量３２０万のヒアルロン酸ナトリウム１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、水溶液のｐＨを１Ｎ塩酸で１．５に調製した。
ｐＨ１．５に調整したヒアルロン酸水溶液を−２０℃に設定した冷凍庫に入れ、２０日間凍結した。室温で解凍後、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルを蒸留水で洗浄し、リン酸緩衝塩水溶液中に浸漬して中和した。得られたヒアルロン酸ゲルを、カップミキサーで平均粒子径約４００μｍに破砕した。
破砕したヒアルロン酸ゲルを、ｐＨ７．４、１０ｍＭのリン酸緩衝生理的食塩水中に、ヒアルロン酸のポリマー濃度が２．５％になるように分散し、ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。
ヒアルロン酸ゲルスラリーに終濃度０．０５Ｎになるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で２時間放置後、終濃度０．０５Ｎになるように硫酸を添加して中和し、ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳにより重量平均分子量を測定した。ヒアルロン酸ゲルの重量平均一次分子量は２２０万だった。
【００３６】
実施例２
重量平均分子量１３０万のヒアルロン酸ナトリウムを使って、実施例１と同様の操作でヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。実施例１と同様の操作で測定した、ヒアルロン酸ゲルの重量平均分子量は１００万だった。
【００３７】
比較例１
重量平均分子量３５万のヒアルロン酸ナトリウムを使って、実施例１と同様の操作で、凍結時間を４０日間にして、ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。ヒアルロン酸ゲルの重量平均一次分子量は３０万だった。
【００３８】
比較例２
重量平均分子量１３０万のヒアルロン酸ナトリウム１ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、水溶液のｐＨを１Ｎ塩酸で４．７５に調整した。この水溶液に１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．２ｇを溶解した。このヒアルロン酸水溶液を−２０℃に設定した冷凍庫に入れ、５日間凍結した。室温で解凍後、スポンジ状のヒアルロン酸ゲルを蒸留水で洗浄し、リン酸緩衝塩水溶液中に浸漬して中和した。得られたヒアルロン酸ゲルを、カップミキサーで平均粒子径約４００μｍに破砕した。
破砕したヒアルロン酸ゲルを、ｐＨ７．４、１０ｍＭのリン酸緩衝生理的食塩水中に、ヒアルロン酸のポリマー濃度が２．５％になるように分散し、ヒアルロン酸ゲルスラリーを得た。
実施例１と同様の操作で測定したヒアルロン酸ゲルの重量平均一次分子量は５５万だった。
【００３９】
実施例３
軟骨骨欠損モデルへのヒアルロン酸ゲルスラリーの注入
９ヶ月齢、平均体重３．５ｋｇのリタイアー家兎（チャールズリバージャパン）１０羽をペントバルビタール（２０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、後脚膝関節の大腿骨側の大腿関節丘の軟骨に直径５ｍｍ、深さ４ｍｍの穴をドリルで作成した。この大きな軟骨欠損では自発的な軟骨再生が困難である。軟骨を欠損させた後脚膝関節部を縫合した。
術後１日後、実施例１、２及び比較例１、２で得られたヒアルロン酸ゲルスラリー０．２５ｍｌを、軟骨欠損を作成したウサギ膝関節腔に注射用シリンジを用いて注入した。
術後２、４、６、８週後、同様にヒアルロン酸ゲルスラリー０．２５ｍｌを、軟骨欠損を作成したウサギ膝関節腔に注射用シリンジを用いて注入した。
そして術後、１２週後、屠殺し評価した。
【００４０】
実施例４
軟骨骨欠損関節の評価
実施例３のヒアルロン酸ゲルスラリー注入群と対照群として生理的食塩水注入群を比較した。術後、１２週後、各群１０羽を屠殺して、関節の外見および切片を作成して組織像を検討した。
軟骨再生の程度は組織学的等級づけにより評価した（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｓｕｒｇ．７９−Ａ：１４５２−１４６３（１９９７））。等級づけは周囲組織と再生組織の差を評価するもので、再生組織が完全に周囲の正常軟骨に修復される場合、評点は０，全く修復されない場合は３１となる。
対照群の生理的食塩水注入群では平均評点が２８と高く、軟骨組織の再生が認められなかった。
これに対し実施例１のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは、平均評点１３と低く、軟骨、骨の再生が観察された。また実施例２のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは、平均評点１５と、軟骨の再生が観察された。
一方、比較例１のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは、平均評点２６、また比較例２のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは、平均評点２５と、対照群の生理的食塩水注入群の平均評点が２８とほぼ同様な値であり、軟骨組織の再生が認められなかった。
欠損部位の再生組織の充填率（％）は、対照群の生理的食塩水注入群では充填率が３８％と低く、組織の修復があまり認められなかったのに対し、実施例１のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは、充填率が８０％と高い組織の修復が観察された。また実施例２のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは、充填率７５％と高い組織の修復が観察された。
一方、比較例１のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは充填率４０％、また比較例２のヒアルロン酸ゲルスラリーを用いたものは充填率４３％と、対照群の生理的食塩水注入群の充填率３８％とほぼ同様な値であり、低い組織の修復しか認められなかった。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
これらの結果は、本発明が関節軟骨欠損部位を生理学的に、適切な組織に修復、または再生を加速することを示唆する。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により架橋ヒアルロン酸を含有する軟骨組織再生用注入剤組成物を提供することができる。かかる本発明の軟骨組織再生用注入剤組成物は、膝を切開することなく軟骨組織再生を昂進させ、関節障害の治癒を促すため患者の負担を大きく低減する等の効果を奏する。