(57)【要約】      （修正有）【課題】海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設へのクラゲ成体の大量来襲を根本的に防止する新規な方法を提供する。【解決手段】（１）〜（６）を含む、海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設に来襲することを予防する方法。（１）来襲したクラゲ成体集団からサンプルクラゲ成体を採集する。（２）サンプルクラゲ成体の遺伝子型を分析することにより、クラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度を推定する。（３）成体集団を発生させたポリプ集団の棲息地と推定される複数の近隣海域において、各近隣海域のポリプ集団からサンプルポリプを採集する。（４）サンプルポリプの遺伝子型を分析することにより、各ポリプ集団における各遺伝子型の頻度を推定する。（５）成体集団と各ポリプ集団における遺伝子型の頻度との類似性を分析し、成体集団の発生源として特定する。（６）特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制する。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（６）を含むことを特徴とする、海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設にクラゲ成体が集団で来襲することを予防する方法：
（１）  前記海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設に来襲したクラゲ成体集団からサンプルクラゲ成体を採集する；
（２）  ある遺伝子座についてサンプルクラゲ成体の遺伝子型を分析することにより、来襲したクラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度を推定する；
（３）  前記クラゲ成体集団を発生させたポリプ集団の棲息地と推定される複数の近隣海域において、各近隣海域のポリプ集団からサンプルポリプを採集する；
（４）  サンプルクラゲ成体で分析した遺伝子座と同一の遺伝子座についてサンプルポリプの遺伝子型を分析することにより、各ポリプ集団における各遺伝子型の頻度を推定する；
（５）  来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度と各ポリプ集団における遺伝子型の頻度との類似性を分析し、類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定する；及び
（６）  来襲したクラゲ成体集団の発生源であると特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制する。
【請求項２】
海水利用プラントが火力発電所又は原子力発電所であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
クラゲがミズクラゲであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
サンプルクラゲ成体の数及びサンプルポリプの数が来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度及び各ポリプ集団における遺伝子型の頻度の統計学的に有意な推定を与えるのに十分な数であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ステップ（２）及び（４）において分析される遺伝子座がクラゲ同一種内で多型を有する遺伝子座であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ステップ（２）及び（４）において遺伝子型の分析がＤＮＡ塩基の配列の決定又はアイソザイム分析によって行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ステップ（２）及び（４）において分析される遺伝子座がクラゲＣＯ１遺伝子座であり、遺伝子型の分析がＤＮＡ塩基配列の決定によって行われることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ステップ（２）及び（４）において複数の遺伝子座を分析し、ステップ（５）において複数の遺伝子座全てについて類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設にクラゲ成体が集団で来襲することを予防する方法に関する。特に本発明は、来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を特定してこれを除去又は増殖抑制することにより、クラゲ成体の来襲を根本的に予防することができる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
クラゲは、刺胞動物（あるいは腔腸動物）に属する動物である。傘径が十数ｃｍ以上に成長する比較的大型のクラゲの多く、例えばミズクラゲは、一生の中で浮遊クラゲ世代と着生ポリプ世代を交代することが知られている。その生活史の概略は以下の通りである（図１参照）。すなわち、クラゲの受精卵が発生して繊毛の生えたほぼ球状のプラヌラ幼生となり、これが適切な基盤に着生変態してポリプとなる。ポリプは分裂・出芽等により無性的に増殖し、コロニーを形成する。これらのポリプは水温低下等の条件によって体部に多数の横くびれが生じ横分体（ストロビラ）を形成する。この横分体の一つ一つのくびれがくびれきれることによって多数のエフィラ幼生が無性的に遊離し遊泳を開始する。このエフィラ幼生は遊泳生活中に胃水管系や触手を生じ、寒天層が発達して変態・成長しクラゲ成体となる。
【０００３】
これらのクラゲ成体は火力発電所、原子力発電所等の海水利用プラントの取水口付近にしばしば大量に来襲し、海水利用プラントの海水取水を妨げる。かかるクラゲ成体の大量来襲による海水の取水障害は機器の性能低下、発電出力の低下、取水及び発電停止等の極めて深刻な被害をもたらす。また、クラゲ成体は漁業施設にもしばしば大量に来襲する。この場合、クラゲ成体は定置網等の漁網に入り込み、漁網中の魚類の窒息、死亡、品質低下及び漁網破損等の被害を発生させる。
【０００４】
このようなクラゲ成体大量来襲による被害への対策として、現在、クラゲ成体出現状況の監視、海水取水口前面でのクラゲ成体防止網の設置、船舶・人手やスクリーンによるクラゲ成体回収、クラゲ成体来襲予知による対策の早期化等の様々な対策がなされている（例えば特許文献１を参照されたい）。しかし、これらの対策は全て大量来襲したクラゲ成体にどう対応するかという対症療法的な対策に過ぎないため、突発的に大量来襲した場合、対策が追いつかず深刻な被害が生じているのが現状である。また、回収したクラゲ成体の運搬・処理にも苦慮しているのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】
特開平１０−２０４８５６号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設へのクラゲ成体の大量来襲を根本的に防止する新規な方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するためにクラゲ成体のみならずクラゲの着生世代であるポリプにも着目し、来襲するクラゲ成体集団と近隣海域に棲息するポリプ集団との間の因果関係を遺伝的多型解析手法を用いて鋭意研究した。その結果、来襲するクラゲ成体集団は近隣海域に棲息するポリプ集団からランダムに来襲するのではなく、特定のポリプ集団を発生源としていることを見出した。かかる知見に基づき、本発明者らは近隣海域に棲息するポリプ集団の中から来襲するクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を遺伝的多型解析により特定し、その特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制すれば、発生源の段階でクラゲ成体の大量来襲を根本的にかつ選択的に防止することができることに想到し、ついに本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下のステップ（１）〜（６）を含むことを特徴とする、海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設にクラゲ成体が集団で来襲することを予防する方法が提供される：
（１）  前記海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設に来襲したクラゲ成体集団からサンプルクラゲ成体を採集する；
（２）  ある遺伝子座についてサンプルクラゲ成体の遺伝子型を分析することにより、来襲したクラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度を推定する；
（３）  前記クラゲ成体集団を発生させたポリプ集団の棲息地と推定される複数の近隣海域において、各近隣海域のポリプ集団からサンプルポリプを採集する；
（４）  サンプルクラゲ成体で分析した遺伝子座と同一の遺伝子座についてサンプルポリプの遺伝子型を分析することにより、各ポリプ集団における各遺伝子型の頻度を推定する；
（５）  来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度と各ポリプ集団における遺伝子型の頻度との類似性を分析し、類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定する；及び
（６）  来襲したクラゲ成体集団の発生源であると特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制する。
【０００９】
本発明の方法の好ましい実施態様においては、海水利用プラントは火力発電所又は原子力発電所であり、来襲を予防されるクラゲ成体はミズクラゲ成体である。
【００１０】
本発明の方法の好ましい実施態様においては、サンプルクラゲ成体の数及びサンプルポリプの数は来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度及び各ポリプ集団における遺伝子型の頻度の統計学的に有意な推定を与えるのに十分な数である。
【００１１】
本発明の方法の好ましい実施態様においては、ステップ（２）及び（４）において分析される遺伝子座はクラゲＣＯ１遺伝子座の如きクラゲ同一種内で多型を有する遺伝子座であり、遺伝子型の分析はＤＮＡ塩基の配列の決定又はアイソザイム分析によって行われる。
【００１２】
本発明の方法の好ましい実施態様においては、ステップ（２）及び（４）において複数の遺伝子座を分析し、ステップ（５）において複数の遺伝子座全てについて類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設にクラゲ成体が集団で来襲することを予防する方法であり、来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を遺伝的多型解析により特定してこれを除去又は増殖抑制することによりクラゲ成体の来襲を根本的に予防するものである。
【００１４】
クラゲ成体はクラゲの着生世代であるポリプから発生する。このポリプは浮き桟橋等の人工構造物にしばしば密集棲息し、コロニーを形成することが知られている。しかし、海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設に大量に来襲するクラゲ成体がどのポリプコロニーから発生するのかについては従来全く研究されていなかった。さらにポリプから発生したクラゲ成体の移動・分散についても不明な点が多く、来襲するクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を特定するための有効な方法も不明であった。
【００１５】
そこで、本発明者らが若狭湾において複数のミズクラゲ成体集団と複数のポリプ集団の遺伝的多型解析を行ったところ、ミズクラゲは若狭湾という比較的限定された海域内においても単一の遺伝子型から構成されているのではなく、遺伝的系統の異なるいくつかの集団（型）に識別化されることが判明した。従って、遺伝的多型解析は海水利用プラントの取水口又は漁業施設に来襲するクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を特定するための有効な方法であることが判明した。さらに、本発明者らが若狭湾においてある海水利用プラントの取水口に大量に来襲したミズクラゲ成体集団とその海水利用プラントの近隣海域に棲息するポリプ集団との因果関係を遺伝的多型解析手法を用いて調査したところ、来襲するクラゲ成体集団は近隣海域に棲息する複数のポリプ集団全てから来襲するのではなく、特定のポリプ集団から来襲することが判明した。この理由は未だ完全には解明されていないが、おそらく海流の影響によるところが大きいと考えられる。クラゲ成体は海中において上下方向には自力で移動することができるが、水平方向には自力でほとんど移動することができず、海流に乗って移動する。それ故、水温の低下等に伴ってポリプ集団から一斉に発生したクラゲ成体集団はその後も海流に乗って集団で移動し、海水利用プラントに大量に来襲したものと考えられる。
【００１６】
以上の知見に基づけば、海水利用プラントの取水口や漁業施設の近隣海域に棲息するポリプ集団の中から、海水利用プラントの取水口付近や漁業施設に来襲するクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を遺伝的多型解析によって特定することができることは明らかである。そして、その特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制してやれば、クラゲ成体の大量来襲を未然に防止することができることは明らかである。
【００１７】
ここで注意すべきことは、ポリプ集団の寿命はほぼ永久的であり、無性生殖による増殖を繰り返すことにより継続的にクラゲ成体を発生させる能力を有しているということである。従って、海水利用プラントの取水口付近や漁業施設に来襲するクラゲ成体集団の発生源であると特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制するという本発明の方法によれば、そのポリプ集団からのクラゲ成体の発生を防止することになるので、クラゲ成体集団の来襲を根本的に防止することができる。これは、来襲するクラゲ成体を網で阻止したりする対症療法的な従来のクラゲ成体来襲防止方法と比較して圧倒的に有利である。
【００１８】
本発明の方法において、海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設へのクラゲ成体の集団来襲は具体的には以下のステップ（１）〜（６）を実行することによって予防される：
（１）  前記海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設に来襲したクラゲ成体集団からサンプルクラゲ成体を採集する；
（２）  ある遺伝子座についてサンプルクラゲ成体の遺伝子型を分析することにより、来襲したクラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度を推定する；
（３）  前記クラゲ成体集団を発生させたポリプ集団の棲息地と推定される複数の近隣海域において、各近隣海域のポリプ集団からサンプルポリプを採集する；
（４）  サンプルクラゲ成体で分析した遺伝子座と同一の遺伝子座についてサンプルポリプの遺伝子型を分析することにより、各ポリプ集団における各遺伝子型の頻度を推定する；
（５）  来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度と各ポリプ集団における遺伝子型の頻度との類似性を分析し、類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定する；及び
（６）  来襲したクラゲ成体集団の発生源であると特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制する。
【００１９】
本発明の方法において、クラゲ成体の集団来襲の予防対象となる施設は海水利用プラント又は漁業施設である。海水利用プラントは取水口より海水を取水してそれを利用するプラントであれば特に限定されないが、例えば火力発電所、原子力発電所又は淡水化プラントであることができる。また、漁業施設は例えば定置網等の漁網であることができる。
【００２０】
本発明の方法のステップ（１）においては、来襲したクラゲ成体集団からサンプルとしていくつかのクラゲ成体が採集される。これは、来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度を推定するためである。サンプルクラゲ成体の採集は常法により行えばよく、例えば来襲したクラゲ成体集団を単に網で捕獲することにより行うことができる。サンプルクラゲ成体の採集数は来襲したクラゲ成体集団の遺伝子型の頻度の統計学的に有意な推定を与えるのに十分な数であることが発生源ポリプ集団を確実に特定するために好ましい。また、採集されたサンプルクラゲ成体は腐敗によるサンプル劣化を防止するためにその場で前処理されることが好ましい。前処理はステップ（２）における遺伝子型分析の種類によって異なる。ＤＮＡ分析を行う場合はサンプルクラゲ成体をエタノール処理し、アイソザイム分析を行う場合はサンプルクラゲ成体をドライアイスで凍結させる。
【００２１】
本発明の方法のステップ（１）において採集されたサンプルクラゲ成体は次にステップ（２）においてある遺伝子座について遺伝子型を分析され、これにより来襲したクラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度が推定される。分析される遺伝子座はクラゲ同一種内で多型を有する遺伝子座、つまり変異が大きく種内や近縁種間の系統解析に適している遺伝子座であることがクラゲ成体集団及びポリプ集団において集団間変異が発見される確率が高いので好ましい。かかる遺伝子座の例としてはエステラーゼ、ＭＤＨ（リンゴ酸脱水素酵素）などの各種のアイソザイム遺伝子座、ＩＴＳ−１（ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ  ｏｎｅ）遺伝子座、ＣＯ１（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｎｅ）遺伝子座を挙げることができる。分析される遺伝子座の数は一つでも十分であるが、複数の遺伝子座を分析することが信頼性の高い結果を得るために好ましい。遺伝子型の分析方法は分析する遺伝子座の種類に応じて決定される。例えば上述のＩＴＳ−１遺伝子座やＣＯ１遺伝子座の如きゲノム上のＤＮＡ領域である場合は遺伝子型の分析はＤＮＡ塩基の配列決定により行われ、各種のアイソザイム遺伝子座の場合は遺伝子型の分析はアイソザイム分析によって行われる。これらの分析方法は当業者には周知であるのでここでは詳しく述べない。
【００２２】
遺伝子型が既に十分に類型化されている遺伝子座について遺伝子型を分析する場合はその既知の類型化に従って判明した各サンプルクラゲ成体の遺伝子型を分類すればよい。しかし、遺伝子型が類型化されていない遺伝子座について遺伝子型を分析する場合は、クラゲ成体の遺伝子型をまず類型化する必要がある。遺伝子型の類型化は厳密に行う必要はない。例えば、ゲノム上のＤＮＡ領域である遺伝子座を分析する場合、ＤＮＡ塩基の配列決定により多数の配列変異が発見されることがあるが、それらがその変異パターンに応じていくつかのグループに分類されることができるのなら便宜上各グループを一つの遺伝子型とみなして類型化してもよい。また、アイソザイム分析の場合、複雑なバンドパターンが現れることがあるが、それらがいくつかのグループに分類されることができるのなら便宜上各グループを１つの遺伝子型とみなして類型化してもよい。また、クラゲ成体集団における類型とポリプ集団における類型との間に相関性があることを確認するべきである。
類型化により各サンプルクラゲ成体の遺伝子型が一対の対立遺伝子の組として判明すれば各対立遺伝子に記号を割りあて、遺伝子型を２つの記号の組として表せばよい。しかし、アイソザイム分析の場合、バンドパターンが複雑で各サンプルクラゲ成体の遺伝子型を一対の対立遺伝子の組として把握することが困難なことがある。この場合は各遺伝子型に記号を割りあて、遺伝子型を１つの記号で表せばよい。
【００２３】
各サンプルクラゲ成体の遺伝子型分析が終了すればその結果を集計しサンプルクラゲ成体における各遺伝子型の頻度を求め、来襲したクラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度の推定とする。ここで各サンプルクラゲ成体の遺伝子型が一対の対立遺伝子の組として判明している場合は遺伝子型の頻度に加えて各対立遺伝子の頻度も求めることができる。本発明の方法における遺伝子型の頻度はかかる場合の各対立遺伝子の頻度も含む広い概念である。
【００２４】
本発明の方法のステップ（３）及び（４）においては、同様のサンプル採集、遺伝子型分析及び各遺伝子型の頻度の推定がポリプについて行われる。すなわち、本発明のステップ（３）においては海水利用プラントの取水口付近又は漁業施設に来襲したクラゲ成体集団を発生させたポリプ集団の棲息地と推定される複数の近隣海域において各近隣海域のポリプ集団からサンプルポリプが採集され、本発明のステップ（４）においてはサンプルクラゲ成体で分析した遺伝子座と同一の遺伝子座についてサンプルポリプの遺伝子型を分析することにより、各ポリプ集団における各遺伝子型の頻度が推定される。
【００２５】
本発明のステップ（３）において、ポリプ集団の棲息地は例えば潜水探査により発見することができる。具体的にはエフィラ幼生が多数発生する地点又はクラゲ成体が多数集積する地点で浮き桟橋や防波堤のオーバーハング等の構造物を有する海域等を中心として人口構造物等の水平裏面部等を潜水探査し、ポリプ集団の棲息地を発見することができる。なお、本発明のステップ（３）において用語「近隣海域」は海水利用プラント又は漁業施設からの実際の距離によってその範囲を限定されるものではなく、来襲したクラゲ成体集団を発生させた可能性があるポリプ集団が棲息する全ての海域を含むものとする。クラゲ成体は上述の通り海流に乗って移動するため、発生源であるポリプ集団が予想以上に距離的に遠方にあることもあり得るからである。例えば、関西地方の海域のポリプ集団から発生したクラゲ成体集団が海流に乗って関東地方の海水利用プラントに来襲することもあり得、この場合は「近隣海域」に関西地方の海域も含まれることになる。
【００２６】
本発明の方法のステップ（３）においては各近隣海域のポリプ集団からのサンプルポリプの採集はカキ、イガイの貝殻などに付着して棲息しているポリプ集団を潜水により貝殻ごと採集して海水を充填したプラスチック容器に収容することにより行うことができる。採集したポリプ集団は１個体ずつ分割してシャーレに収容し、数週間飼育して数十個体の同一クローンのポリプ集団に成長させてからステップ（４）の遺伝子型分析に供することが十分な量のＤＮＡ又はアイソザイムを確保するために好ましい。
【００２７】
本発明の方法のステップ（３）及び（４）におけるサンプルポリプの採集数の設定、ポリプの遺伝子型分析に先立つ所望の前処理、遺伝子型の分析及び各遺伝子型の頻度の推定はステップ（１）及び（２）においてクラゲ成体について説明したことと同様にして行うことができるのでここでは説明を省略する。
【００２８】
なお、本発明の方法のステップ（１）とステップ（３）を行う順序は特に限定されるものではなく、ステップ（１）をステップ（３）の前に行ってもよいし、ステップ（３）をステップ（１）の前に行ってもよいし、ステップ（１）とステップ（３）を同時に行ってもよい。要はサンプルクラゲ成体とサンプルポリプの両方を準備できればよい。
【００２９】
以上のステップ（１）〜（４）により来襲したクラゲ成体集団における各遺伝子型の頻度及び各ポリプ集団における各遺伝子型の頻度が推定された後、本発明の方法のステップ（５）に進み、来襲したクラゲ成体集団における遺伝子型の頻度と各ポリプ集団における遺伝子型の頻度との類似性を分析し、類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定する。ステップ（２）及び（４）において複数の遺伝子座を分析した場合は、分析した全ての遺伝子座について類似性が最も高いポリプ集団を来襲したクラゲ成体集団の発生源として特定すればよく、これにより結果の信頼性を更に高めることができる。
【００３０】
来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団が特定されれば、次に本発明の方法のステップ（６）においてその特定されたポリプ集団を除去又は増殖抑制する。ポリプ集団の除去又は増殖抑制はこのポリプ集団からのクラゲ成体の発生を有効に阻止できる限りいかなる方法によっても行うことができるが、例えば同一出願人が別途同日付で出願した「ポリプの除去又は増殖抑制方法」と題する特許出願に開示されている方法（低塩水もしくは淡水暴露処理、空気暴露処理、又は高温水暴露処理）を用いて行うことができる。
【００３１】
本発明の方法においては来襲予防対象となるクラゲ成体はいかなるクラゲの成体であることもでき、例えばミズクラゲの成体であることができる。なお、本発明の方法において、「クラゲ成体」という用語は、成熟クラゲ個体のみならず未成熟クラゲ個体も含むものとする。
【００３２】
以上、本発明の方法は来襲するクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を遺伝的多型解析により確実に特定してこれを除去又は増殖抑制するものである。かかるクラゲ成体の来襲予防方法によればクラゲ成体集団の来襲をその発生源の段階で根本的に防止することができ、クラゲ成体集団の来襲により海水利用プラントや漁業施設にもたらされる被害を根本的に防止することができる。
【００３３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３４】
１．サンプルクラゲ成体及びサンプルポリプの採集
若狭湾にある海水利用プラントＡに来襲するミズクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団を特定するため、２００２年夏（６月１８日から２０日および７月１２日）に若狭湾各海域よりミズクラゲ成体および野生ポリプを採集した（図２および図３参照）。サンプルクラゲ成体の採集は海水利用プラントＡの取水口付近のみならず、近隣海域の漁港Ａ〜Ｅ及び海岸Ａでも行った。これは遺伝子型の類型化を確実に行うことができるようにするためである。また、サンプルポリプの採集は海水利用プラントＡの近隣海域の漁港Ａ，Ｂ及びＥに棲息する野生ポリプコロニーを対象として行った。クラゲ成体は漁港等の岸壁より網により採集し、その場で傘部分の周辺の触手を含む組織を切断し、１００％エタノールに浸してＤＮＡ分析用に前処理をした。一方、ポリプは潜水により各漁港の浮桟橋などの構造物の裏側のコロニーをカキ、イガイの殻などに付着した状態のまま採集し、海水を充たしたプラスチック容器に収容した。各採集地における採集日および採集サンプルの内訳は以下の表１に示す。
【表１】
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【００３５】
２．遺伝子型分析のためのポリプクローンの増殖
１．で採集し、実験室に持ち帰った各野生ポリプコロニーより一部のポリプを取り出して用いた。１個体のポリプを１個のプラスチックシャーレに収容し、約１週間静置してプラスチックシャーレ底面にポリプを付着させた。付着が確認されたシャーレは餌としてアルテミアの幼生を与えた後、換水する作業を週３回行なって継続飼育し、約一月後に数十個体のクローンを得た。これらのクローンから約１０個体の大型ポリプをピックアップして１００％エタノールに浸し、ＤＮＡ分析用に前処理をした。
【００３６】
３．サンプルクラゲ成体及びサンプルポリプの遺伝子型分析
（１）サンプルクラゲ成体及びサンプルポリプからのＤＮＡ抽出
ａ．ｔｏｔａｌ  ＤＮＡの抽出
ｔｏｔａｌ  ＤＮＡの抽出はインビトロジェンＥａｓｙ−ＤＮＡ  Ｋｉｔを使用して以下の手順で行った。
【００３７】
（ａ）前処理したサンプル成体又はサンプルポリプをキムワイプの上に取り、エタノールを除く。
（ｂ）１．５ｍｌチューブにサンプルを入れる。
（ｃ）５０μｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａを加え、ｐｌａｓｔｉｃ  ｐｅｓｔｌｅですり潰す。
（ｄ）３００μｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａを加えｖｏｌｔｅｘ。
（ｅ）６５℃で１０分間インキュベートする。
（ｆ）１５０μｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂを加えｖｏｌｔｅｘ。
（ｇ）５００μｌクロロホルムを加えｖｏｌｔｅｘ。
（ｈ）１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心（４℃）。
（ｉ）水層（上層）を別のチューブに移す。
（ｊ）１ｍｌの１００％エタノール（−２０℃）を加えｖｏｌｔｅｘ。
（ｋ）氷上（０℃）で３０分間インキュベート。
（ｌ）１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心（４℃）。
（ｍ）エタノールを除く（先の細いチップで）。
（ｎ）５００μｌの８０％エタノール（−２０℃）を加え、３−５回チューブをひっくり返して混合。
（ｏ）１２，０００ｒｐｍで３−５分間遠心（４℃）し、８０％エタノールを除く（先の細いチップで）。
（ｐ）１２，０００ｒｐｍで２−３分間遠心（４℃）し、残りのエタノールを除き、沈澱を約５分間空気乾燥する。
（ｑ）沈澱を１００μｌのＴＥ  ｂｕｆｆｅｒに溶かし、２μｌの２ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを加える（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）。
（ｒ）３７℃で３０分間インキュベートし、４℃（長期保存の場合は−２０℃）に保存する。
【００３８】
ｂ．ＤＮＡ定量
島津分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ−ｍｉｎｉの二重らせんＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）簡易定量モードにて各抽出液のＤＮＡ濃度を測定した。
実際には各抽出液１０μｌにＤＷ  ４９０μｌを加えた５０倍希釈溶液の２６０ｎｍの吸光度にｄｓＤＮＡ用の係数をかけて濃度を求めた。
【００３９】
（２）ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）によるＩＴＳ遺伝子及びＣＯ１遺伝子増幅
ａ．プライマーの準備
文献より得られたクラゲＩＴＳおよびＣＯ１遺伝子のプライマーの合成を株式会社日本バイオサービスに依頼し、下記のプライマー（オリゴヌクレオチド）を得た。各プライマーは１００ｐｍｏｌ／μｌとなるように純水（遺伝子実験用）に溶解してストック溶液とし、−２０℃で保存した。なお、使用前にストック溶液を純水で１０倍希釈し１０ｐｍｏｌ／μｌとしてＰＣＲを行った。
＜ＩＴＳ用プライマー＞
ＩＴＳ−Ｆ：  ５’−  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＡＧＧ  ＴＧＡ  ＡＣＣ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ−３’
ＩＴＳ−Ｒ：  ５’−  ＣＧＣ  ＡＣＧ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’
＜ＣＯ１用プライマー＞
ＣＯ１−Ｆ：  ５’−  ＴＡＡ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＴＧＡ  ＣＣＡ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＣＡ−３’
ＣＯ１−Ｒ：  ５’−  ＧＣＣ  ＣＧＴ  ＹＹＴ  ＡＡＴ  ＡＧＧ  ＭＧＧ  ＧＴＴ  ＴＧＧ−３’
なお、プライマー配列中の塩基の略語は以下の通りである。
Ａ：アデニン、Ｃ：シトシン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミン、Ｍ：Ａ又はＣ、Ｙ：Ｃ又はＴ
【００４０】
ｂ．ＰＣＲ反応液の調製
ｔｏｔａｌ  ＤＮＡは濃度が２０ｎｇ／μｌとなるように希釈した。
各プライマーは１０ｐｍｏｌ／μｌとなるように希釈した。
【表２】
2004279138.tif 000003
上記表２に従い、（必要チューブ数＋１）本分の反応液を調製し、ピペッティング後、各チューブに１８μｌずつ分注した。そこにＤＮＡを各２μｌ（又は１μｌ）ずつ添加した。
【００４１】
ｃ．ＰＣＲの実行
反応液をサーマルサイクラーにセットした。
サーマルサイクラーは  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２７００  （ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
以下のサイクルに従い、ＩＴＳ遺伝子およびＣＯ１遺伝子を増幅した。
＜ＩＴＳ遺伝子増幅のためのサイクル＞
2004279138.tif 000004
＜ＣＯ１遺伝子増幅のためのサイクル＞
2004279138.tif 000005
【００４２】
ｄ．ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動による確認
ＰＣＲ終了後のサンプル５μｌを１％アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、目的の遺伝子が増幅されているかどうかを確認した。なお、ＤＮＡバンドは臭化エチジウムで染色し、紫外線ルミノメータで観察、写真撮影を行った。
ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果の例を図４および図５に示す。図に示したように増幅されたＩＴＳ遺伝子のバンドは約３００塩基対（ｂｐ）付近に、ＣＯ１遺伝子は約５００ｂｐ付近にみられた。どちらもほぼシングルバンドであった。ＩＴＳ遺伝子は２本のバンドが重なっているように見える場合があったが、これはわずかに長さの違うヘテロの遺伝子が存在することを示唆する。実際、シーケンス解析で一部塩基対（３塩基対）の欠損が認められる配列が存在した（後述の「４．発生源ポリプ集団の特定」を参照されたい）。
【００４３】
（３）ＤＮＡシーケンス解析（塩基配列解析）、遺伝子型分析及び遺伝子型頻度の推定
電気泳動で目的の遺伝子が十分増幅していることが確認できたＰＣＲ産物を島津製作所ジェノミックリサーチセンターに送付し、シングルパスシーケンスを依頼した。一部のサンプルは東京都立大学理学部生物学教室において林文男助手の指導によりアプライドバイオシステムズ社（ＡＢＩ）ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシーケンシングシステムにて解析をした。
なお、シーケンス反応にＲ側のプライマーを用いた配列結果（それぞれの    遺伝子の３’末端側から読んだ配列）を解析に使用した。実際には解析可能と思われる部分の配列（ＩＴＳでは１５０塩基対、ＣＯ１では３６０塩基対）に便宜的に配列番号を付けた。解析データから、それぞれの遺伝子に数箇所の変異が存在することが明らかになった。その配列データおよび変異によるタイプ分けを図６および図７に示す。
さらに、各解析サンプルの変異型の一覧を以下の表３におよび各採集地点におけるＩＴＳ、ＣＯ１のそれぞれの変異型の出現頻度を以下の表４および表５並びに図８〜１１に示す。なお、表３のＩＴＳおよびＣＯ１の欄の空白は、ＰＣＲによる遺伝子増幅に失敗したことを示す。
【００４４】
【表３】
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2004279138.tif 000007
2004279138.tif 000008
【００４５】
【表４】
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【００４６】
【表５】
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【００４７】
４．海水利用プラントＡに来襲したクラゲ成体集団の発生源であるポリプ集団の特定
（１）ＩＴＳ遺伝子の解析
ＩＴＳ遺伝子の変異に注目した場合、本調査範囲（若狭湾北西部〜中央部沿岸）において、１５０塩基対の中で３箇所に変異がみられた。すなわち、１０番目の塩基がシトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）、４１番目の塩基がチミン（Ｔ）またはアデニン（Ａ）、そして７１から７３番目にＴＴＡの挿入が存在するかしないか、という変異が認められた。そこで、図６に示したＡ、Ｂ、Ｃの３種の配列型（対立遺伝子）に分類した。実際は、このＩＴＳは核内ＤＮＡの領域であり、各サンプルはいずれかの配列を２本持つと考えられる。詳細なデータ解析の結果、それぞれの配列型のホモ接合体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ）以外にヘテロ接合体（ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ）も存在することが判明した。そこで、得られた配列データから、成体、ポリプをこれら６種の遺伝子型に分類した。
【００４８】
成体サンプルの分析結果の採集海域別の頻度については表４とグラフ（図８）に示す。なおグラフでは、Ａ、Ｂ、Ｃのそれぞれの対立遺伝子（配列型）の頻度を示した。漁港Ｄで採集された４個体は遺伝子型がすべてＡＡであり、その他の採集海域では２種以上の配列が混在していた。これらの中でＣ型は、漁港Ａ、漁港Ｅ、海水利用プラントＡで採集された成体で認められ、他海域では認められなかった。これらの結果から、若狭湾のミズクラゲは遺伝的系統の異なるいくつかの集団（型）に識別化されることが判明した。
【００４９】
ポリプの分析結果は表４とグラフ（図９）に示す。ここで、サンプル名は採集地・採集区画（約４００  ｃｍ２以内の範囲、同一サンプル瓶）番号・個体（クローン）番号を示すが、同一サンプル瓶の複数のポリプ由来のクローンはすべて遺伝子型が一致した。例えば、ＷＰ−２３（漁港Ａポン８−２）、ＷＰ−２４（漁港Ａポン８−３）、ＷＰ−２５（漁港Ａポン８−４）、ＷＰ−２６（漁港Ａポン８−５）およびＷＰ−２７（漁港Ａポン８−６）はすべてＡＢ型であった。そこで、対立遺伝子の頻度を表す場合（グラフ作成の際）は同一採集区画の複数サンプルは１サンプルとして計算した。３漁港でのサンプルにはＡ、Ｂ、Ｃそれぞれの対立遺伝子を含むポリプが混在していたが、その頻度には特徴がみられた。すなわち、漁港Ａで採集されたポリプでは、対立遺伝子Ａの頻度が非常に高かった（８４．４％）のに対し、漁港Ｂ、漁港Ｅのポリプでは５０％以下であり、対立遺伝子Ｂの頻度が比較的高かった。これらの傾向を海水利用プラントＡで採集された成体の対立遺伝子の頻度（対立遺伝子Ｂの頻度が５０％と高い）と比較してみると、漁港Ａポリプ集団とは異なり、漁港Ｂ、漁港Ｅのポリプ集団の対立遺伝子の頻度が２００２年７月１２日に採集された海水利用プラントＡの成体のものに近いことがわかる。
【００５０】
（２）ＣＯ１遺伝子の解析
一方、ＣＯ１遺伝子の変異は、図７に示すような箇所で確認され、１１のハプロタイプに分類できた。これらの変異の中で、１２番目（ＴまたはＣ）、１９２番目（ＡまたはＧ）、３０３番目塩基（ＡまたはＧ）の３箇所の変異から大きく３つの配列型グループ（ａ型、ｂ型、ｃ型）に分けることができると考えられた。そこで、グラフ（図１０および図１１）では、各配列型グループの頻度を表した（なお、ＣＯ１遺伝子はミトコンドリアゲノム上の遺伝子であるので、各サンプルは１つの対立遺伝子のみを有する。従って、ＣＯ１遺伝子座については各遺伝子型の頻度は各対立遺伝子の頻度と一致する）。なお、成体の３サンプル（Ａ−１０、Ａ−１６、Ａ−１９）においては、正確なハプロタイプは判定できなかったが３グループのうちどのグループに属するかが判別できたので、そのデータも解析結果に加えた。
【００５１】
成体サンプルの解析結果（表５および図１０）は、以下の通りである。すなわち、漁港Ａ、漁港Ｂおよび海水利用プラントＡで採集されたクラゲはすべてａ型に属するのに対し、海岸Ａ、漁港Ｄではａ型とｃ型が、漁港Ｃ、漁港Ｅではａ型と少数のｂ型がみられた。これらの結果から、若狭湾のミズクラゲは遺伝的系統の異なるいくつかの集団（型）に識別化されることが判明した。
【００５２】
一方、ポリプサンプルの解析結果は表５および図１１に示す。これらＣＯ１の解析においても、ＩＴＳと同様に、同一サンプル瓶すなわち約４００  ｃｍ２以内という狭い範囲の同一区画内で採集された複数のポリプは全く同じハプロタイプを示した。例えば漁港Ａポン８−Ｘはすべてｃ−２で、漁港Ｂ４−Ｘはすべてａ−６であった。そこで、ＣＯ１においてもＩＴＳ同様、同一採集区画における複数サンプルは１サンプルとしてデータ解析を行った。３漁港のポリプ集団における各配列型グループの出現頻度を比べると、特徴的な結果が得られた。漁港Ａのポリプはｃ型が多数を占め、漁港Ｅではａ、ｂ、ｃが混在するのに対し、漁港Ｂで採集されたポリプはすべてａ型であることが判明した。興味深いことに、海水利用プラントＡで採集された成体サンプルはすべてａ型であり、漁港Ａおよび漁港Ｅのポリプ集団の頻度とは大きく異なり、漁港Ｂのポリプ集団と一致した。
【００５３】
（３）総合的判断
以上、２００２年７月１２日に海水利用プラントＡの取水口で採集されたクラゲ成体群と、漁港Ａ、漁港Ｂおよび漁港Ｅの３箇所の漁港内で発見されたポリプコロニーのＩＴＳおよびＣＯ１領域の遺伝的多型を解析した結果、７月１２日に海水利用プラントＡに来襲したクラゲ成体集団は漁港Ｂのポリプコロニー由来である可能性が極めて高いと判断される。従って、漁港Ｂに棲息するポリプコロニーを何らかの方法で除去又は増殖抑制すれば、海水利用プラントＡの取水口へのクラゲ成体の大量来襲は確実に予防できるものと考えられる。
【００５４】
なお、本実施例ではデータを示さなかったが、本実施例で用いたサンプルをエステラーゼアイソザイム分析およびＭＤＨアイソザイム分析に供したところ、やはり遺伝的背景の異なる複数のタイプの集団から構成されていることが判明している。
【００５５】
【発明の効果】
本発明のクラゲ成体の来襲予防方法は上述の通りクラゲ成体の発生源であるポリプ集団を確実に特定してからこれを除去又は増殖抑制するので、クラゲ成体の集団来襲をその発生源であるポリプ集団の段階で根本的に防止することができる。かかる方法によればクラゲ成体集団の集団来襲により海水利用プラントや漁業施設に従来もたされていた被害を根本的に防止することができる。
【００５６】
【配列表】
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配列表フリーテキスト
配列番号１はＩＴＳ用プライマーの配列である。
配列番号２はＩＴＳ用プライマーの配列である。
配列番号３はＣＯ１用プライマーの配列である。
配列番号４はＣＯ１用プライマーの配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ミズクラゲの生活史を示す模式図である。
【図２】ミズクラゲ成体および野生ポリプ集団のサンプル採集地点を示す。
【図３】漁港Ａ、ＢおよびＥにおける野生ポリプサンプル採集場所を示す。
【図４】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動結果（ＩＴＳ）の例を示す。
【図５】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動結果（ＣＯ１）の例を示す。
【図６】ＩＴＳ遺伝子塩基配列の変異と変異タイプの詳細を示す。
【図７】ＣＯ１遺伝子塩基配列の変異と変異タイプの詳細を示す。
【図８】各採集地点におけるミズクラゲ成体ＩＴＳの各対立遺伝子（配列型）の出現頻度を示す。
【図９】海水利用プラントＡにおいて採集した成体、および各採集地点におけるポリプＩＴＳの各対立遺伝子（配列型）の出現頻度を示す。
【図１０】各採集地点におけるミズクラゲ成体ＣＯ１の各配列型グループの出現頻度を示す。
【図１１】海水利用プラントＡにおいて採集した成体、および各採集地点におけるポリプＣＯ１の各配列型グループの出現頻度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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