(57)【要約】【課題】グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制する抗体を提供する。【解決手段】グラム陽性菌から調製された細胞抽出液を分画して得られ、免疫増強活性を有する複合糖質画分を抗原とする複合糖質活性抑制抗体は、グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制でき、グラム陽性菌の検出や、グラム陽性菌感染の検査等に利用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制する抗体であって、
グラム陽性菌から調製された細胞抽出液を分画して得られ、免疫増強活性を有する複合糖質画分を抗原とすることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【請求項２】
上記グラム陽性菌として、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅが用いられることを特徴とする請求項１に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項３】
上記複合糖質画分は、グラム陽性菌を脱脂した脱脂菌体を、フェノール／水抽出することにより得られる画分であることを特徴とする請求項１または２に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項４】
上記複合糖質画分として、濃度依存的にインターロイキン６及び腫瘍壊死因子αの少なくとも一方の産生を誘導するものが用いられることを特徴とする請求項１、２または３に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１ないし４の何れか１項に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項６】
上記複合糖質画分で免疫したマウス脾臓細胞と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させてなるハイブリドーマ細胞により産生されることを特徴とする請求項５に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項７】
上記ハイブリドーマ細胞が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７１のハイブリドーマＨＣＭ０１、または受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７２のハイブリドーマＨＣＭ０３であることを特徴とする請求項６に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項８】
上記抗体の免疫グロブリンクラスが、ＩｇＭであることを特徴とする請求項５、６または７に記載の複合糖質活性抑制抗体。
【請求項９】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の複合糖質活性抑制抗体を用いて、検出対象となる試料から、グラム陽性菌の有無を検出するグラム陽性菌の検出方法。
【請求項１０】
上記複合糖質活性抑制抗体を、検出対象となる試料と反応させる免疫反応工程と、
複合糖質活性抑制抗体による免疫反応の有無を判定する免疫反応判定工程とを含むことを特徴とする請求項９に記載のグラム陽性菌の検出方法。
【請求項１１】
上記免疫反応判定工程では、免疫反応を判定する手法として、酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、蛍光免疫測定法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法の何れかが用いられることを特徴とする請求項９または１０に記載のグラム陽性菌の検出方法。
【請求項１２】
グラム陽性菌感染の検査に用いられることを特徴とする請求項９、１０または１１に記載のグラム陽性菌の検出方法。
【請求項１３】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の複合糖質活性抑制抗体を含むグラム陽性菌の検出用試薬。
【請求項１４】
請求項１３に記載の検出用試薬を含むグラム陽性菌の検出キット。
【請求項１５】
請求項１ないし８の何れか１項に記載の複合糖質活性抑制抗体を含み、グラム陽性菌感染の予防および／またはグラム陽性菌感染による疾患の治療に用いられる薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制する抗体（複合糖質活性抑制抗体と称する）、およびその利用に関するものであり、例えば、グラム陽性菌のリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＬＴＡ）の免疫増強活性を抑えるモノクローナル抗体を有効成分とする薬剤や、当該モノクローナル抗体を用いたグラム陽性菌感染の検査方法等に用いることができる複合糖質活性抑制抗体とその利用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ等のグラム陽性菌の表層には、ＬＴＡと称される高分子量の糖脂質である複合糖質が存在する。これは、宿主に感染する際に、自然免疫の活性化を促す物質であるとされている。
【０００３】
このＬＴＡには、血管平滑筋細胞からの一酸化窒素生成誘導する作用、補体成分と直接反応して古典経路を介して補体を活性化する作用などがある。
【０００４】
また、ＬＴＡを表面に結合した宿主細胞は抗ＬＴＡ抗体と補体との作用によって破壊され、また抗体依存・細胞媒介細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を被る。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ａ．，  Ｕｓａｍｉ，  Ｈ．，  Ｎａｇａｍｕｔａ，  Ｍ，  Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ｙ．，  Ｈａｍａｄａ，  Ｓ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．，  Ｋａｔｏ，  Ｋ．，  Ｋｏｋｅｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｏｔａｎｉ，  Ｓ．  （１９８５）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ５１，  ７３９−７４２
【０００６】
【非特許文献２】
Ｔａｋａｄａ，  Ｈ．，  Ｋａｗａｂａｔａ，  Ｙ．，  Ａｒａｋａｋｉ，  Ｒ．，  Ｋｕｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．，  Ｆｕｋａｓｅ，  Ｋ．，  Ｓｕｄａ，  Ｙ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｋｏｋｅｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｋａｔｏ，  Ｋ．，  Ｋｏｍｕｒｏ，  Ｔ．，  Ｔａｎａｋａ，  Ｎ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｍ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｓａｔｏ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｋｏｔａｎｉ，  Ｓ．  （１９９５）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ，  ６３，  ５７−６５
【０００７】
【非特許文献３】
Ｓｕｄａ，  Ｙ．，  Ｔｏｃｈｉｏ，  Ｈ．，  Ｋａｗａｎｏ，  Ｋ．，  Ｔａｋａｄａ，  Ｈ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｋｏｔａｎｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｕｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９５）  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １２，  ９７−１１２
【０００８】
【非特許文献４】
Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｙａｓｕｏｋａ，  Ｊ．，  Ｓｕｄａ，  Ｙ．，  Ｔａｋａｄａ，  Ｈ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｔ．，  Ｋｏｔａｎｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｋｕｓｕｍｏｔｏ，  Ｓ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １２１，  ７７９−７８６
【０００９】
【非特許文献５】
Ｍｏｒａｔｈ，  Ｓ．，  Ｇｅｙｅｒ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｔｕｎｇ，  Ｔ．  （２００１）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９３，  ３９３−３９７
【００１０】
【非特許文献６】
Ｍｏｒａｔｈ，  Ｓ．，  Ｓｔａｄｅｌｍａｉｅｒ，  Ａ．，  Ｇｅｙｅｒ，  Ａ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｒ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｔｕｎｇ，  Ｔ．  （２００２）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９５，  １６３５−１６４０
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ＬＴＡは、産出する菌種が異なれば、化学構造が異なり、従って「物性」は多岐にわたり、免疫増強活性も菌種、菌株、菌の培養条件の差によって変化する。また、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ（Ｅ．  ｈｉｒａｅ）由来のＬＴＡには、大部分を占める活性がない複合糖質と、数パーセント混在する免疫増強活性がある複合糖質とがあることが、本発明者らによって解明された（非特許文献３参照）。この免疫増強活性がある複合糖質を、以下では微量複合糖質と呼ぶことにする。
【００１２】
このように、ＬＴＡは様々な種類があるため、あるＬＴＡを抗原とする抗体があったとしても、様々な種のグラム陽性菌のＬＴＡを抗原とするとは限らない。また、活性の無いＬＴＡの抗体を生産しても、それは、グラム陽性菌の感染による疾患の防止等において利用価値がなく、別の抗体が必要であった。
【００１３】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、グラム陽性菌感染に対する検出や予防、治療等に利用可能な抗体と、その様々な利用方法等を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、従来の技術が抱える上記技術的困難さを克服するために、鋭意研究を重ねた結果、Ｅ．  ｈｉｒａｅ由来の免疫増強活性のある複合糖質だけでなく、他の細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＬＴＡの免疫増強活性を抑えるモノクローナル抗体を見いだした。その結果、次に示す各発明を完成するに至った。
【００１５】
Ａ）  グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制する抗体であって、グラム陽性菌から調製された細胞抽出液を分画して得られ、免疫増強活性を有する複合糖質画分を抗原とすることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００１６】
Ｂ）  Ａ）の複合糖質活性抑制抗体であって、上記グラム陽性菌として、Ｅ．  ｈｉｒａｅが用いられることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００１７】
Ｃ）  Ａ）またはＢ）の複合糖質活性抑制抗体であって、上記複合糖質画分は、グラム陽性菌を脱脂した脱脂菌体を、フェノール／水抽出することにより得られる画分であることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００１８】
Ｄ）  Ａ）〜Ｃ）の何れかの複合糖質抑制抗体であって、上記複合糖質画分として、濃度依存的にインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の少なくとも一方の産生を誘導するものが用いられることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００１９】
Ｅ）  Ａ）〜Ｄ）の複合糖質活性抑制抗体であって、モノクローナル抗体であることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００２０】
Ｆ）  Ｅ）の複合糖質活性抑制抗体であって、上記複合糖質画分で免疫したマウス脾臓細胞と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させてなるハイブリドーマ細胞により産生されることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００２１】
Ｇ）  Ｆ）の複合糖質活性抑制抗体で
あって、上記ハイブリドーマ細胞が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７１のハイブリドーマＨＣＭ０１、または受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７２のハイブリドーマＨＣＭ０３であることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００２２】
Ｈ）  Ｅ）〜Ｇ）の何れかの複合糖質活性抑制抗体であって、上記抗体の免疫グロブリンクラスが、ＩｇＭであることを特徴とする複合糖質活性抑制抗体。
【００２３】
Ｉ）  Ａ）〜Ｈ）の何れかの複合糖質活性抑制抗体を用いて、検出対象となる試料から、グラム陽性菌の有無を検出するグラム陽性菌の検出方法。
【００２４】
Ｊ）  Ｉ）のグラム陽性菌の検出方法であって、上記複合糖質活性抑制抗体を、検出対象となる試料と反応させる免疫反応工程と、
複合糖質活性抑制抗体による免疫反応の有無を判定する免疫反応判定工程とを含むことを特徴とするグラム陽性菌の検出方法。
【００２５】
Ｋ）  Ｉ）またはＪ）のグラム陽性菌の検出方法であって、上記免疫反応判定工程では、免疫反応を判定する手法として、酵素免疫測定法、放射線免疫測定法、蛍光免疫測定法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法の何れかが用いられることを特徴とするグラム陽性菌の検出方法。
【００２６】
Ｌ）Ｉ）〜Ｋ）の何れかのグラム陽性菌の検出方法であって、グラム陽性菌感染の検査に用いられることを特徴とするグラム陽性菌の検出方法。
【００２７】
Ｍ）  Ａ）〜Ｈ）の何れかの複合糖質活性抑制抗体を含むグラム陽性菌の検出用試薬。
【００２８】
Ｎ）  Ｍ）の検出用試薬を含むグラム陽性菌の検出キット。
【００２９】
Ｏ）  Ａ）〜Ｈ）の何れかの複合糖質活性抑制抗体を含み、グラム陽性菌感染の予防および／またはグラム陽性菌感染による疾患の治療に用いられる薬剤。
【００３０】
本発明において、「免疫増強活性を有する複合糖質画分」とは、グラム陽性菌から調製された細胞抽出液を分画して得られる複合糖質画分に含まれ、自然免疫の活性化を促す複合糖質画分のことである。
【００３１】
また、本発明において、「グラム陽性菌」は、グラム染色で陽性に染まる細菌のことであり、その形状や形態は問わない。
【００３２】
また、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体は、ハイブリドーマが産出するモノクローナル抗体が好ましいが、ポリクローナル抗体であってもかまわない。
【００３３】
また、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体は、例えば、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等の目的として、人為的に改変したものであってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物のモノクローナル抗体である複合糖質活性抑制抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とからなるキメラ抗体であってもよい。このような複合糖質活性抑制抗体の人為的改変については、公知の方法を用いて行えばよい。例えば、遺伝子組み換えの技法が用いられるが、これに限定されることはない。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。
【００３５】
以降の説明では、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体およびその生産方法、並びに、その利用についてそれぞれ説明する。
【００３６】
（１）本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体およびその生産方法
本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体は、グラム陽性菌由来で免疫増強活性を有する複合糖質の活性を抑制する抗体であって、グラム陽性菌から調製された細胞抽出液を分画して得られ、免疫増強活性を有する複合糖質画分を抗原とするものである。
【００３７】
＜微量複合糖質＞
本発明において複合糖質活性抑制抗体を産生（取得）するために用いられる複合糖質画分は、ＬＴＡを豊富に含む画分であり、かつ、上記微量複合糖質、すなわち免疫増強活性がある複合糖質を含むものである。前述したように、ＬＴＡには様々な種類があるため、あるＬＴＡを抗原とする抗体があったとしても、それが、様々なグラム陽性菌のＬＴＡを抗原とするとは限らない。また、活性の無いＬＴＡの抗体を生産しても、それは、グラム陽性菌の感染による疾患の防止等において利用価値がない。それゆえ、本発明では、上記微量複合糖質を実質的な抗原として抗体を得ることにより、グラム陽性菌感染に対する検出や予防、治療等に当該抗体を利用することが可能となる。
【００３８】
上記微量複合糖質の構造は特に限定されるものではなく、グラム陽性菌の細胞抽出液から得られ、ＬＴＡを豊富に含む複合糖質画分に含まれる、免疫増強活性を有する複合糖質であればよい。
【００３９】
また、微量複合糖質（抗原）の入手源は、特定の微生物に限定されるものではなく、上記微量複合糖質を産生する任意の微生物から入手することができる。また、微生物などにより産生される天然のもののみならず、化学合成により上記微量複合糖質を得てもよい。本発明に用いられる微量複合糖質は、グラム陽性菌由来であることが好ましく、中でも、Ｅ．  ｈｉｒａｅ由来、特に、Ｅ．  ｈｉｒａｅ  ＡＴＣＣ  ９７９０由来であることが好ましい。
【００４０】
本発明に用いられる微量複合糖質を産生する微生物から当該微量複合糖質を取得するための方法は、特に限定されるものではなく、公知の単離・精製方法を適宜組み合わせることによって実施することができる。
【００４１】
例えば、細菌を適当な培地（一般的には、炭素源、窒素源、金属塩、無機塩などを含む）中で培養した後、菌を回収する。なお、培地、培養条件（温度、時間等）は、所望の微量複合糖質が産生されるように適宜調節することができる。次いで、通常の方法を用いて菌の遊離脂質を除去して脱脂菌体する。
【００４２】
この脱脂菌体から複合糖質を含む成分を抽出する。抽出には、例えば、水−フェノールによる抽出であるＷｅｓｔｐｈａｌ抽出等を用いればよい。具体的には、脱脂菌体を適当な緩衝液に懸濁し、これにフェノールや緩衝液等を加え攪拌し、その後遠心することで、水層から複合糖質を含む成分を抽出することができる。ここで、水−フェノールによる抽出は、温水−フェノールによる抽出であることが好ましく、攪拌する際に、温水浴中で、特に６５℃の水浴中で行うことが好ましい。また、攪拌後に氷冷してから遠心することが好ましい。この抽出物を通常の方法を用いて、透析、濃縮、凍結乾燥し、さらに核酸分解酵素処理し、透析、濃縮、乾燥すると粗複合糖質画分が得られる。ここで、粗複合糖質画分の製造方法は上記に限定されない。
【００４３】
さらに、この粗複合糖質画分を、疎水性相互作用を利用する分離法（例えば、バッチ式分画法またはクロマトグラフィー）に付し、次いで、イオン性相互作用を利用する分離法（例えば、バッチ式分画法またはクロマトグラフィー）に付することによって、より精製された複合糖質画分を得ることができる。また、ゲル濾過クロマトグラフィーなどのような生体物質の単離または精製に慣用される他の手段を適宜組み合わせて用いることもできる。
【００４４】
疎水性相互作用を利用する分離法においては、オクチルセファロース、フェニルセファロース、ポリスチレンゲルなどの疎水性基を有する担体などを吸着剤として使用することができる。例えば、オクチルセファロースを使用する疎水性相互作用を利用する分離法においては、粗複合糖質画分をオクチルセファロースに吸着させた後、適当な溶出液によりＬＴＡを溶出させる。溶出液としては、例えば、適当な濃度の１−プロパノールを含有する緩衝液を使用することができる。例えば、カラムクロマトグラフィー方式で溶出させる場合には、１５％〜７０％の濃度勾配の１−プロパノールを溶出液として使用することができ、バッチ式で分離する場合には、例えば、１５％、４０％または６０％などの濃度の１−プロパノールを含有する緩衝液を溶出液として使用することができる。これらの溶出液の種類および濃度は、吸着剤との組み合わせにおいて適宜選択すればよい。
【００４５】
また、イオン性相互作用を利用する分離法においては、イオン交換膜、あるいは強塩基性イオン交換基を有するイオン交換樹脂などを使用することができる。例えば、イオン交換膜を使用するイオン性相互作用を利用する分離法においては、粗複合糖質画分を当該膜に吸着させた後、適当な溶出液により複合糖質画分を溶出させる。溶出液としては、適当な濃度（例えば３５％など）の１−プロパノールを含有する緩衝液を使用することができ、また、適当な濃度または濃度勾配（例えば０〜１Ｍ）を有する塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ギ酸アンモニウム等）を含む緩衝液を使用することができる。
【００４６】
なお、上記のような分離法で得られた複合糖質画分は、ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなどによりその構造を詳細に決定することができる。また、加水分解、アセチル化／脱アセチル化、アルカリ処理などにより生成物を適宜処理することにより、化学構造の決定に役立てることができる。
【００４７】
＜複合糖質画分＞
上記分離により得られた複合糖質画分から、微量複合糖質を含む複合糖質画分を選択するには、例えば、サイトカイン誘導活性ある複合糖質画分を選択すればよい。この選択には、ＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ−ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）等の通常の方法を用いればよい。
【００４８】
微量複合糖質を含む上記複合糖質画分は、濃度依存的にＩＬ−６の産生を誘導する。
【００４９】
また、微量複合糖質を含む上記複合糖質画分は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、およびＴＮＦ−αの産出も誘導する。
【００５０】
なお、微量複合糖質を含む上記複合糖質画分中にリポ多糖（ＬＰＳ）がコンタミネーションしているか否かを測定するには、例えば、リムルス活性の測定を行えばよい。
【００５１】
＜複合糖質活性抑制抗体＞
本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体は、上述した微量複合糖質を含む複合糖質画分を用いて免疫することにより得られる抗体であれば特に限定されるものではないが、上述したように、グラム陽性菌として、Ｅ．  ｈｉｒａｅが用いられることが好ましく、さらには、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００５２】
本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が、モノクローナル抗体である場合、これを取得するための本発明にかかるハイブリドーマ細胞の作製方法（生産方法）としては、特に限定されるものではなく、上記微量複合糖質を含む複合糖質画分で免疫したマウス脾臓細胞と、マウスの骨髄腫細胞とを融合させた後、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすればよい。
【００５３】
より具体的には、以下のように行えばよい。
【００５４】
本発明にかかるモノクローナル抗体を産出する本発明にかかるハイブリドーマ細胞を作成するための被免疫動物は、特に限定はされない。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヒツジ等が挙げられる。特に、免疫グロブリンを生産しない腫瘍細胞株が確立されているＢａｌｂ／Ｃマウスが好適である。
【００５５】
上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、上記微量複合糖質を含む複合糖質画分をＰＢＳに溶解し、完全フロイントアジュバンドと混合し、被免疫動物の腹腔内または皮下に、２〜３週間毎に数回接種する方法等を挙げることができる。
【００５６】
上記のように免疫した被免疫動物の抗体値が上昇したら、最終免疫から３〜５日後に当該動物の免疫細胞を採取し、骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）と細胞融合させる。この免疫細胞としては、脾臓またはリンパ節から分離した細胞が使用できるが、特に脾臓から摘出したものが好ましい。また、上記骨髄腫細胞は、免疫を行った動物と同種の細胞株であることが好ましいが、異種動物間のものでもかまわない。骨髄腫細胞の例として、ｐ３（ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８），Ｐ３Ｕ１，ＮＳ−１，ＭＰＣ−１１，ＳＰ２／０，ＦＯ，Ｓ１９４，Ｒ２１０等の細胞が好適に用いられる。
【００５７】
上記細胞融合は、公知の方法に従って実施すればよい。例えば、細胞融合は、融合させる細胞を懸濁した融合培地に細胞融合促進剤を加えることによって実施することができる。細胞融合促進剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコールや、センダイウイルス等を挙げることができ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。この際、更に融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の補助剤やＩＬ−６等のサイトカインを融合培地に添加することも出来る。免疫細胞に対する骨髄腫細胞の混合比は、例えば、骨髄腫細胞に対し、免疫細胞を約１倍から１０倍程度用いるのが好ましい。上記の融合培地としてはＥＲＤＦ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地等の通常の各種培地を使用することができ、細胞融合時は通常、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清を培地から抜いておくのがよい。
【００５８】
細胞融合は、例えば、上記の免疫細胞と骨髄腫細胞との所定量を上記の培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温しておいたポリエチレングリコール溶液を２０％から５０％程度加え、好ましくは３０℃から３７℃で１分から１０分程度反応させることによって実施すればよい。この細胞融合により、目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。以降、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰り返すことにより、ハイブリドーマの生育には好ましくない細胞融合剤等を除去することができる。
【００５９】
本発明において、上記のようにして得られたハイブリドーマは、例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキチンサン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）等の通常の選択培地で培養して選択することができる。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常では数日から数週間行えばよい。目的とする抗体を産生するハイブリドーマをＥＬＩＳＡ法により選択後、限界希釈により単クローン化を行い、増殖および抗体産生能において安定した株を確立することができる。
【００６０】
このようにして得られた単クローン化されたハイブリドーマ細胞は、通常の培地で継代培養でき、液体窒素中で容易に長期保存が可能である。なお、抗体の精製は、硫酸アンモニウムなどによる塩析、ジエチルアミノエチルセルロースなどを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの一般的なタンパク質の単離・精製方法を用いて行われる。
【００６１】
また、上記単クローン化されたハイブリドーマ細胞を、公知の方法で培養して精製することにより得られた培養上清を目的のモノクローナル抗体（複合糖質活性抑制抗体）を精製する原料とする。ハイブリドーマ細胞の培養は、培地中で培養することにより行うことが好ましい。また、得られた単クローン化されたハイブリドーマをあらかじめプリステンを投与したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に移植し、１０日から１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、目的のモノクローナル抗体を精製する原料としてもよい。この様にして得たモノクローナル抗体の精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、硫安塩析法等の公知の方法により行うことができる。
【００６２】
本発明にかかるハイブリドーマとしては、例えば、後述する実施例に示すように、ＨＣＭ０１（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７１）、ＨＣＭ０３（寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３７２）を挙げることができる。これらのハイブリドーマは、平成１５年５月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託（原寄託）されたものである。また、これらハイブリドーマ細胞により産生される複合糖質活性抑制抗体には、本発明者らによってｍＡｂＥｈ１およびｍＡｂＥｈ３の名称が付与された。これら抗体の免疫グロブリンクラスはＩｇＭである。
【００６３】
なお、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体は、例えば、遺伝子組み換え等の技術を用いて、改変してもかまわない。例えば、上記モノクローナル抗体をヒトに対する異種抗原性を低下させるように改変することで、グラム陽性菌感染による疾患の診断や治療により有用なモノクローナル抗体を得ることができる。このように改変された複合糖質活性抑制抗体も本発明に含まれる。
【００６４】
（２）本発明の利用方法
本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体の利用方法は特に限定されるものではないが、代表的なものとして、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体を用いて、検出対象となる試料から、グラム陽性菌の有無を検出するグラム陽性菌の検出方法を挙げることができる。この検出方法は、単純に試料からグラム陽性菌の有無を検出できるだけでなく、例えば、グラム陽性菌感染の検査に好適に用いることができる。
【００６５】
本発明にかかるグラム陽性菌の検出方法の具体的な構成は特に限定されるものではないが、例えば、上記複合糖質活性抑制抗体を、検出対象となる試料と反応させる免疫反応工程と、複合糖質活性抑制抗体による免疫反応の有無を判定する免疫反応判定工程とを含む方法を挙げることができる。
【００６６】
上記免疫反応判定工程では、免疫反応を判定する手法として、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡあるいは、ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法、蛍光免疫測定法、ウエスタンブロット法、イムノクロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法の何れかが用いられる。しかし、上記免疫反応を判定する方法は、これらに限定はされない。
【００６７】
これらの免疫反応を判定する方法は、例えば、サンドイッチ法、競合法等により、標識剤で標識された抗体を用い、目的とする抗原を測定することができる。標識剤としては、酵素、酵素基質、１２５Ｉ等の放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等を用いればよい。
【００６８】
ここで用いる酵素としては、ｔｕｒｎ  ｏｖｅｒ  ｎｕｍｂｅｒが大きく、かつ酵素と結合しても安定であること、基質と特異的に反応して発色させることができる等の条件を満たす物であれば特に制限されるものではなく、通常の酵素免疫アッセイに用いられる酵素を使用することができる。好ましい酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を挙げることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。
【００６９】
これら酵素とモノクローナル抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。
【００７０】
マーカーとして用いる放射性同位元素としては、１２５Ｉや３Ｈ等の通常のラジオイムノアッセイで用いられているものを使用することができる。モノクローナル抗体への放射標識は公知の方法を用いて行うことができる。
【００７１】
上記蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネートやテトラメチルローダミンイソチオシアネート等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、上記発光物質としては、イソルミノールやアクリジンエステル等を用いることができる。この際、標識の方法は活性化エステル法やイソシアネート法を採用することにより容易に行うことができる。また、上記着色物質としては、例えば、着色ラテックス粒子、金コロイド等を挙げることができる。
【００７２】
本発明にかかるグラム陽性菌の検出方法として、上記サンドイッチ法を実施するには、例えば、生物増強活性を有する複合糖質を含有する検体を、公知の手段で物理的又は化学的に、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体を結合させた固相に加えて反応させる。その後上記の標識剤で標識した本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体を加えて反応させる。
【００７３】
次に、必要な場合には固相をよく洗浄した後で、固相上に結合している標識剤の活性を測定する。上記標識剤が酵素である場合、基質を加えて放置し、比色法又は蛍光法により酵素活性を測定する。上記標識剤が放射性同位元素（ＲＩ）である場合、ウェル・カウンター又は液体シンチレーション・カウンターを用いて測定する。標識剤が蛍光物質、発光物質、着色物質であっても、それぞれ公知の方法に従って測定することができる。これにより、検体中のグラム陽性菌を検出することができる。
【００７４】
なお、本発明にかかるグラム陽性菌の検出方法は、上述されたものに限定されることはない。
【００７５】
本発明にかかる検出方法は、微量複合糖質だけでなく、他の免疫増強活性を有する複合糖質を認識することができるため、様々なグラム陽性菌の検出を行うことができ、よってグラム陽性菌への感染を判定できるため、非常に優れている。
【００７６】
本発明にかかるグラム陽性菌の検出用薬は、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体を標識することにより作製できる。この検出用試薬は、上記したモノクローナル抗体を含有すること以外は、従来公知の同種の免疫学的検査薬と同様の構成成分を用いて構成することができる。
【００７７】
標識剤としては、上記のように酵素、酵素基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、ビオチン、着色物質等を挙げることができる。
【００７８】
また、本検出用試薬は、ＬＴＡを特異的に染色することが可能な、免疫組織学的染色のための試薬として使用することができる。また、放射性同位体を標識した場合には、体内に投与することによって、グラム陽性菌感染による病変部を画像化するために使用することもできる。
【００７９】
この検出用試薬を含むグラム陽性菌の検出キットも本発明に含まれる。そのため、本発明にかかるグラム陽性菌の検出方法を実施する際、本発明にかかる検出キットを用いてもかまわない。本発明にかかる検出キットは、グラム陽性菌体又は免疫増強活性を有する複合糖質の存在を免疫学的に検出することができる。本発明にかかる検出キットでは、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体はあらかじめ固相化されていてもよく、また、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体はあらかじめ上記標識剤で標識されていてもよい。
【００８０】
本発明にかかる検出キットにおいて用いる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレン等のポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、グラスフィルター等の不溶性担体を挙げることができる。
【００８１】
本発明にかかる検出キットは、更に他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては特に限定されず、例えば、標識に用いる酵素、その基質、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質、着色物質、緩衝液、プレート等を挙げることができ、これらとしては上記に挙げたものを用いることができる。
【００８２】
本発明にかかる検出キットの形態としては特に限定されないが、迅速かつ簡便に検出を行うためには、構成成分が一体となった一体型の検出キットであることが好ましい。上記一体型の検査キットとしては特に限定されず、例えば、カセット型、カートリッジ型等を挙げることができる。
【００８３】
上記カセット型の態様としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用い、反応カセット内にメンブレンが収納されており、そのメンブレン上の一端（下流側）には本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が固相化されており、メンブレン上の逆の一端（上流側）には、展開液が装着されており、その近傍の下流側には、上記標識剤の基質が添加されたパッドが配置されており、メンブレンの中間部には上記標識剤で標識された本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が添加されたパッドが配置されている態様等を挙げることができる。
【００８４】
上記に例示したカセット型の態様を有する検査キットを使用する場合、上記標識剤で標識された本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が添加されたパッド上に検体を添加し、検体に含まれる免疫増強活性を有する複合糖質と上記標識剤で標識された本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体との結合体を形成させた後、上記展開液を展開させると、形成された結合体は、上記複合糖質活性抑制抗体が固相化されている箇所まで移送され、そこで免疫増強活性を有する複合糖質と、上記標識剤で標識された上記複合糖質活性抑制抗体と、固相化された本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体との複合体が形成される。次いで、上記標識剤と上記基質が反応し発色等する。この発色等を感知することによって、グラム陽性菌の検出ができる。また、この検出によりグラム陽性菌への感染を判定できる。
【００８５】
検体を充分な量の展開液で希釈してからメンブレン上に滴下する態様を採用する場合は、あらかじめメンブレン上に展開液を装着しておかなくともよい。また、上記標識剤として着色ラテックス粒子等の着色物質を用いる場合は、基質は不要であり、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が固相化されている箇所で上記複合体が形成されたか否かは、着色物質による着色により判断される。
【００８６】
上記カートリッジ型の態様としては、例えば、反応が上記競合法である場合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識されたグラム陽性菌等を含む液状試薬（例えば、バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例えば、バッファー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができる。
【００８７】
また、反応がサンドイッチ法である場合には、複数のウェルを有するカートリッジであり、（ａ）本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が固相化された不溶性担体が収納されたウェル、（ｂ）上記標識剤で標識された本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体を含む液状試薬（例えば、バッファー溶液）が収納されたウェル、（ｃ）上記標識剤の基質を含む液状試薬（例えば、バッファー溶液）が収納されたウェル、が一体的に形成されてなるカートリッジ等を挙げることができる。
【００８８】
上記に例示したカートリッジ型の本発明にかかる検出キットを使用する場合は、通常、競合法やサンドイッチ法を実施する際と同様に、反応及び測定を行うことができる。本発明にかかる検出キットは、上記競合法と上記サンドイッチ法のいずれの方法を実施するものであってもよい。上記サンドイッチ法は、感度が高く、反応時間が短くてすみ、精度に優れるという利点を有する。上記サンドイッチ法としてイムノクロマトグラフィー法を用いると、試験操作が簡便で、結果の判定も目視で容易に行うことのできる検出キットを作製することができる。また、ＥＬＩＳＡ法として上記サンドイッチ法を用いると、測定対象物質の量に依存して酵素反応生成物が生じるので、グラム陽性菌への感染が陽性である場合の発色等を目視で確認できるような系の設定が容易である。
【００８９】
上記本発明にかかる検出キットは、グラム陽性菌の測定が簡便であり、医療現場等で非常に有用である。
【００９０】
また、上記複合糖質活性抑制抗体を含み、グラム陽性菌感染の予防および／またはグラム陽性菌感染による疾患の治療に用いられる薬剤も、本発明に含まれる。
【００９１】
本発明にかかるグラム陽性菌感染の予防薬および／またはグラム陽性菌感染による疾患の治療薬は、本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体が有効成分として含まれていればよい。また、これら薬剤は、常法に従って製剤化することができる。例えば、上記の薬剤を注射用製剤とするなら、精製された複合糖質活性抑制抗体を溶剤に溶解し、吸着防止剤等を加えることで作成される。上記溶剤は、例えば、生理用食塩水、緩衝液等が挙げられる。また、上記吸着防止剤としては、ゼラチン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。しかし、本発明にかかる予防薬およびまたは治療薬の作成方法は、上記に限定されることなく、投与する形態に応じて、常法に従い製剤化すればよい。
【００９２】
本発明にかかる予防薬および／または治療薬は、免疫増強活性のあるＬＴＡの免疫増強活性を抑制できるため、グラム陽性菌感染の予防や、グラム陽性菌感染によって引き起こされる疾患、例えばエンドトキシン様ショックの治療に有用に用いることができる。
【００９３】
以下、実施例を用いて本発明につき、詳細にかつ具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００９４】
【実施例】
本発明の実施例について、実験１ないし実験６に基づいて以下に説明する。
【００９５】
〔実験１〕使用菌株の培養
菌株は、Ｅ．  ｈｉｒａｅ  ＡＴＣＣ  ９７９０を使用した。種菌は単コロニーであると確認したものを用いた。Ｅ．  ｈｉｒａｅを、Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商品名）７．５ｇ、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ（商品名）２．０ｇ、およびＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（商品名）２．０ｇ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）にリン酸水素二カリウム１．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．５ｇ、炭酸ナトリウム１．０ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ、およびグルコース５．０ｇを加えた培地５００ｍｌに接種し、８時間以上前培養した。得られた菌体を大型培養装置（商品名、ＫＦ９０ＬＳ）にて、上記の１２０倍のスケール（６０Ｌ）で６時間培養し、その後、連続遠心分離器ｈｉｍａｃ  ＣＲ２１（商品名、日立工機、大阪）により、７０００ｇ（ｒｏｔｏｒ；Ｒ１０Ｃ）で２０分間遠心して集菌し、アセトン中で４℃にて保存した。
【００９６】
〔実験２〕脱脂菌体の調製
実験１で集菌しアセトン中に保存しておいた菌体を濾別し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．０）を用いて３回洗浄した後、３００ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に懸濁させた。これに等容量のクロロホルムと倍容量のメタノールとを加えて終夜攪拌した。この攪拌した懸濁液を７０００ｇで２０分間遠心して、水層とクロロホルム層とをデカンテーションして除いた。その後、菌体をメタノールで２回洗浄し、デシケータ中で減圧下にて乾燥させた。上記のような操作により、Ｅ．  ｈｉｒａｅの脱脂菌体を製造した。
【００９７】
〔実験３〕脱脂菌体から糖脂質画分の温水−フェノールによる抽出（Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出）
実験２で製造した脱脂菌体を乳鉢ですりつぶして粉末状とし、この粉末を１ｇにつき６．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に懸濁した。これに８０％（ｖ／ｖ）フェノール、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）を等容量加えて、６５℃の水浴中で４５分間攪拌し、氷冷後、７０００ｇで２０分間遠心して、水層に糖脂質画分を抽出した（Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出）。この水層を分取し、残ったフェノール層及び菌体に再び等容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）を加えて、６５℃で４５分間攪拌し、氷冷後、７０００ｇで２０分間遠心して水層を分取した。この水層と先の水層と合わせて、イオン交換水に対して４８時間透析後、濃縮、凍結乾燥してＷｅｓｔｐｈａｌ抽出物を収率１０％で得た。
【００９８】
〔実験４〕活性成分の分画・抽出
（４−１）核酸分解酵素処理
実験３で得たＷｅｓｔｐｈａｌ抽出物１ｇに、５ｍＭのＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．０）４０ｍｌ、ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＥＣ  ３．１．２７．５）（購入元、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）１ｍｇ、及びｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ（ＥＣ  ３．１．２７．５）（購入元、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）３ｍｇを加えて室温で２４時間攪拌した。精製水に対して２４時間透析後、濃縮、凍結乾燥し、核酸分解酵素処理したＷｅｓｔｐｈａｌ抽出物（ＮＤ−ＷＥ）を脱脂菌体から６％の収率で得た。なお、上記透析に用いた精製水とは、ＴＯＲＥＹ  ＰＵＲＥ−３０８（商品名、東レ、東京）により精製した水であり、以下では単に精製水という。
【００９９】
（４−２）再Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出
上記（４−１）で得たＮＤ−ＷＥを、１ｍｇにつき６．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に懸濁し、これに８０％（ｖ／ｖ）フェノールと０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）とを等容量加えて、６５℃の水浴中で４５分間攪拌した。その後、氷冷し、７０００ｇで２０分間遠心して水層を分取した。残ったフェノール層及び菌体に再び等容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）を加えて６５℃で４５分間攪拌後、氷冷、遠心して水層を分取した。この水層と先の水層と合わせて、イオン交換水に対して４８時間透析後、濃縮、凍結乾燥して再Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出物（Ｒｅ−ＷＥ）を、脱脂菌体から４．８％の収率で得た。
【０１００】
（４−３）活性成分の精製
上記（４−２）で得たＲｅ−ＷＥの精製について以下で説明する。なお、この精製については、図１のスキームを参照するとよい。
【０１０１】
初めに、上記（４−２）で得たＲｅ−ＷＥ画分を各画分に分けるためにイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。
【０１０２】
すなわち、上記（４−２）で得たＲｅ−ＷＥ画分２．６ｇを、３５％（ｖ／ｖ）の１−プロパノールを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶かし、同緩衝液で平衡化したＭａｃｒｏ−ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ  Ｓｕｐｐｏｒｔカラム（３．０  ｃｍ  ｘ  １５  ｃｍ）（商品名、ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）に添加、吸着させた。そして、塩化ナトリウム濃度０，０．０１，０．０５，０．１，１Ｍの段階溶出で、それぞれ３００ｍｌずつ溶出させ、ＨＱ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−Ｄとした。これらの得られたＨＱ画分を精製水に対して７２時間以上透析後、濃縮、凍結乾燥し、Ｒｅ−ＷＥ画分からそれぞれ１０，１０，２６，３６％の収率でＨＱ画分を得た。
【０１０３】
次に、さらにＨＱ画分を分画するために、疎水クロマトグラフィーを行った。
【０１０４】
つまり、高いＩＬ−６誘導活性を有するＨＱ−Ａの５４ｍｇを、１５％（ｖ／ｖ）１−プロパノールを含む０．１Ｍギ酸アンモニウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶かし、同緩衝溶液で平衡化したＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（２．５  ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ）（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）に添加し、吸着させた。そして、１−プロパノール濃度１５〜６０％（ｖ／ｖ）の直線勾配で、流速２４ｍｌ／ｈで溶出させた。溶出液の３ｍｌを１フラクションとして分取して、リン含量より２つの画分に分画した。２つの画分のうち、先に分取された方をＯＳＡ−Ｐ、後に分取された方をＯＳＡ−Ｒとした。この疎水クロマトグラフィーによる分画の結果が図２（ａ）である。このＯＳＡ−Ｐ及びＯＳＡ−Ｒを精製水に対して４８時間透析後、濃縮、凍結乾燥し、ＨＱ−Ａからそれぞれ８７％、６．４％の収率で得た。
【０１０５】
同様に、ＨＱ−Ｂに対してもＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムを用いて疎水クロマトグラフィーを行った。その結果、２つの画分ＯＳＡ−Ｐ及びＯＳＢ−Ｒを、それぞれ、ＨＱ−Ｂに対し収率８４％と１４％とで得た。この疎水クロマトグラフィーの結果が図２（ｂ）である。
【０１０６】
このように、疎水クロマトグラフィー得られた各画分、ＯＳＡ−Ｐ、ＯＳＡ−Ｒ、ＯＳＢ−Ｐ、及びＯＳＢ−Ｒに対してＩＬ−６誘導活性を調べたところ、ＯＳＡ−Ｒ及びＯＳＢ−Ｒに、ＩＬ−６誘導活性が確認された。そこで、ＯＳＡ−Ｒ及びＯＳＢ−Ｒの一部を、３０％（ｖ／ｖ）１−プロパノールを含む０．１Ｍギ酸アンモニウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に溶解し、同緩衝溶液で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲカラム（１  ｃｍ  ｘ  ２５  ｃｍ）（商品名、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に添加させ、同緩衝溶液で流速２０ｍｌ／ｈで溶出させ、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。溶出液の４ｍｌを１フラクションとして分取し、リン含量を測定した。このゲル濾過クロマトグラフィーの結果が図３（ａ）および（ｂ）である。同図（ａ）はＯＳＡ−Ｒの、同図（ｂ）はＯＳＢ−Ｒの、ゲル濾過クロマトグラフィーの結果である。このゲル濾過クロマトグラフィーにより、ＯＳＡ−Ｒから精製された複合糖質をＨＧＬ−Ａ、ＯＳＢ−Ｒから精製された複合糖質をＨＧＬ−Ｂ１、−２とする。これらが、目的の微量複合糖質（低イオン性の高分子糖脂質）である。
【０１０７】
（４−４）サイトカイン誘導活性
上記のように得た微量複合糖質について免疫誘導活性を調べた。
【０１０８】
被検試料（ＨＧＬ−Ａ、−Ｂ１、−Ｂ２、コントロール）の存在下で、ヒト末梢全血細胞もしくはヒト単球細胞ＴＨＰ−１（ヒューマンサイエンス振興財団）を培養し、細胞から誘導された培養上清中のサイトカインをＥＬＩＳＡ法によって定量した。つまり、培養用プレート９６孔蓋付き丸底（♯２８７０−０９６、岩城硝子、千葉）の各ウェルに、生理食塩水（大塚製薬）で希釈した試料溶液２５μｌにＲＰＭＩ１６４０培地（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  ＵＫ）７５μｌ及び健康人肘静脈より得た末梢全血（ヘパリン処理をしたもの）を２５μｌ、もしくは５０ｎｇ／ｍｌの活性型（１，２５−ジヒドロキシ）ビタミンＤ３（ＤＨＶＤ３）の存在下、７２時間前培養したＴＨＰ−１細胞（ＤＨＶＤ３−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ＴＨＰ−１）を含むＲＰＭＩ１６４０培地１００μｌ（細胞数１．０  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ  ／ｍｌ、２％ウシ胎児血清を含む、または血清を含まない）を加えた。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、遠心分離し培養上清を得た。
【０１０９】
なお、上記の実験で用いたサイトカインは、それぞれ以下のキットまたは、ハーフキットを用い、それぞれに付属のマニュアルに添って測定を行った。
【０１１０】
ＴＮＦ−α：ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ    Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ−α（商品名、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）
ＩＬ−６：ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｋｉｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６（商品名、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ．）
ＩＬ−１２：Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１２＋ｐ４０  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （商品名、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒａｎｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）
ＩＬ−１８：Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１８  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（商品名、ＭＢＬ  医学生物学研究所（株）、名古屋）
ポジティブコントロールとして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｉｌ  Ｏ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．）、ネガティブコントロールとして、上記実験４で得たＨＱ−Ｃ及び−Ｄ（高−陰イオンフラクション）を用いた。
【０１１１】
測定の結果、ＨＧＬ−Ａ、ＨＧＬ−Ｂ１、及びＨＧＬ−Ｂ２は、上記の培養細胞から、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αを強く誘導した。
【０１１２】
これらの結果の一部が図４（ａ）〜（ｄ）である。同図（ａ）に示すように、ＨＧＬ−Ａ、ＨＧＬ−Ｂ１、ＨＧＬ−Ｂ２共に、ＩＬ−６を誘導しており、この誘導は、濃度依存的である。なお、ポジティブコントロールとして用いたＬＰＳにも誘導活性が見られた。また、同図（ｂ）〜（ｄ）に示すように、ＨＧＬ−Ｂ１は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＩＬ−１２に対しても誘導活性があった。また、ポジティブコントロールとして用いたＬＰＳには、誘導活性確認され、ネガティブコントロールとして用いた高陰イオンフラクションには、誘導活性が確認されなかった。
【０１１３】
上記複合糖質（ＨＧＬ−Ａ、ＨＧＬ−Ｂ１、ＨＧＬ−Ｂ２）間の構造上の違いは少ないと考え、これらの複合糖質を合わせてＡＦ−９９ｍ（ＡＦ−ＬＥＳ）とした。
【０１１４】
（４−５）リムルス活性
ＡＦ−９９ｍ中のＬＰＳコンタミネーションの有無を定量化するために、リムルス活性の測定を行った。
【０１１５】
エンドスペシーＥＳ−５０（生化学工業）を用いリムルス活性の測定を行った。９６穴のＥＬＩＳＡ用マルチウエルプレートＭＳ−８５９６（商品名、住友ベークライト、東京）のウェルに試料（ＡＦ−９９ｍ）を注射用精製水（大塚製薬、東京）で段階希釈した。このサンプル２０μｌに、氷水浴中エンドスペシーＥＳ−２００セットの主剤溶液３０μｌを加え、攪拌後３７℃で３０分間加熱した。下記のジアゾ化試薬（１）、（２）、（３）を順次７５μｌづつ加えた後、波長５４５ｎｍの吸光度を測定した。なおポジティブコントロールとしてＬＰＳのリムルス活性も同時に測定した。これにより、試料（ＡＦ−９９ｍ）のリムルス活性をＬＰＳ相当量（ｇ／ｇ）として算出した。
【０１１６】
ジアゾ化試薬
（１）硝酸ナトリウム４０ｍｇを濃塩酸４ｍｌと水９６ｍｌとに溶かした溶液。
（２）スルファミン酸アンモニウム３００ｍｇを水１００ｍｌに溶かした溶液。
（３）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩７０ｍｇを水１００ｍｌに溶かした溶液。
【０１１７】
〔実験５〕モノクローナル抗体の調製
（５−１）免疫
実験４で得られたＡＦ−９９ｍのＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌとフロイント完全アジュバンド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）０．２５ｍｌとを混合し、マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）の腹腔内に投与した。３週間後、再び上記の混合物を腹腔投与した。３日後屠殺して脾臓を取り出して脾臓細胞を分離し、この脾臓細胞と不死化している骨髄腫細胞（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）とを、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、ハイブリドーマを得た。
【０１１８】
（５−２）ハイブリドーマの調製と単クローン化
ハイブリドーマをヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えた培地（ＨＡＴ培地）中で１４日間、３７℃、５％ＣＯ２下で培養し、生細胞を単クローン化した。ＤＨＶＤ３−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ＴＨＰ−１細胞とＡＦ−９９ｍとを血清の非存在下、３７℃、５％、ＣＯ２下で２４時間共培養させる系に、上記の単クローン化したハイブリドーマの培養上清を添加して、ＴＨＰ−１細胞からＩＬ−６活性を抑制したハイブリドーマを２種（ＨＣＭ０１、ＨＣＭ０３）選択した。なお、この実験は上記（４−４）と同様に行えばよい。
【０１１９】
（５−３）ハイブリドーマの培養
これら２種のハイブリドーマは引き続き無血清下で培養を続け、それぞれの培養上清を得た。培養上清の抗体の培養上清の抗体のタイピングはコスモバイオ（株）のＴｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  （ＲＫ００８）（商品名）を用いて行った。抗体は、共にＩｇＭであることを確認し、ｍＡｂＥｈ１、ｍＡｂＥｈ３と命名した。
【０１２０】
（５−４）ハイブリドーマから産出された抗体のＩＬ−６誘導活性に対する抑制効果
ｍＡｂＥｈ１、ｍＡｂＥｈ２についてのＩＬ−６誘導活性に対する抑制効果を調べた。ＤＨＶＤ３−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６誘導活性に対する抑制効果を測定した。抗マウスＣ５抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｂ）と培地（ｍｅｄｉｕｍ）とをネガティブコントロールとして用いた。このＩＬ−６誘導活性に対する抑制活性の測定結果が図５である。
【０１２１】
図５に示すように、ｍＡｂＥｈ１は、６５０ｎｇ／ｍｌのＡＦ−９９ｍが誘導する活性を希釈率依存的に抑えた。なお、同図では、各試料それぞれに３本のバーがあるが、左のバーほど抗体の希釈率が小さい。
【０１２２】
また、ｍＡｂＥｈ３は、３００ｎｇ／ｍｌのＡＦ−９９ｍが誘導する活性を希釈率依存的に抑えた。一番左のバーが示すように１０分の１の希釈率で抗体を加えると活性がほとんど消失した。
【０１２３】
一方ネガティブコントロールとして用いた抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｂ）や培地（ｍｅｄｉｕｍ）それ自体では、抗体の希釈率によらず３本のバーは同じ高さであり、抑制活性はみられなかった。なお、この実験も上記（４―４）に記述した方法と同様の方法で行った。
【０１２４】
〔実験６〕Ｅ．  ｈｉｒａｅ以外のグラム陽性菌からのＬＴＡと本発明の抗体との反応（６−１）ブタノール抽出
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから従来の抽出法（Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出）とは異なるブタノール抽出法で得たＬＴＡ（以下ＬＴＡ−ＳＡと略す）には免疫生物活性が存在するという報告がなされた（非特許文献５、６参照）。このＬＴＡ−ＳＡはドイツのコンスタンツ大学のＤｒ．  Ｇｕｎｔｈａｒｄ  Ｓｔｕｅｂｓから供与を受けた。同様なブタノール抽出法は、Ｅ．  ｈｉｒａｅにも適用し、以下のような抽出の操作によって、ＬＴＡ画分を部分精製した。
【０１２５】
実験２で得た粉末状のＥ．  ｈｉｒａｅの脱脂菌体を、１ｇにつき６．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）に懸濁し、これに１−ブタノールを等容量加えて６５℃の水浴中で４５分間撹拌した。これを氷冷後、遠心（５０００  ｒｐｍ、２０  ｍｉｎ）して水層に粗ＬＴＡを抽出した。この水層を分取し、残ったブタノール層及び菌体に再び等容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）を加えて６５℃、４５分間撹拌後、氷冷、遠心して水層を分取した。先の水層と合わせ精製水に対して３日間透析後、濃縮凍結乾燥して粗ＬＴＡ−Ｂ（ＬＴＡ−Ｂｕｔｈａｎｏｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）を得た。
【０１２６】
次に、上記粗ＬＴＡ−Ｂの１ｇに、５ｍＭのＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．０）４０ｍｌ、ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ１ｍｇ、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ３ｍｇ加えて、室温で２４時間撹拌した。これを精製水に対して２４時間透析後、濃縮、凍結乾燥した。この酵素処理を施したＬＴＡ画分をＮＴ−ＬＴＡ−Ｂ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ＬＴＡ  Ｂｕｔｈａｎｏｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）とした。
【０１２７】
そして、ＮＴ−ＬＴＡ−Ｂ約２０ｍｇを１５％（ｖ／ｖ）の１−プロパノールを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ４．５）１５０ｍｌに溶かし、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ  ３００ｍｌを加えてよく撹拌した。これを４℃で２０分間静置した後、濾過した。この操作を５回繰り返した溶出液を集め、濃縮し、３日間透析、濃縮、凍結乾燥し得られた画分をＢＯＳ−Ｂ１５（Ｂａｔｃｈ−ｗｉｓｅ  Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＬＴＡ−Ｂｕｔｈａｎｏｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）と名付けた。同様にして１−プロパノール濃度４０％で溶出を行い、ＢＯＳ−Ｂ４０と名付けたＬＴＡ画分、１−プロパノール濃度６０％で溶出を行いＢＯＳ−Ｂ６０と名付けたＬＴＡ画分を得た。
【０１２８】
（６−２）Ｔｒｉｃｉｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／アルシアンブルー染色によるＢＯＳ−Ｂ４０、ＢＯＳ−Ｂ６０、ＢＯＳ−Ｗ４０、ＢＯＳ−Ｗ６０、ＡＦ−９９ｍ及びＬＴＡ−ＳＡの比較
初めにトリシンゲル用の溶液を以下のように調製した。
【０１２９】
溶液Ａ：アクリルアミド４８．０ｇ、Ｎ，Ｎ’―メチレンビスアクリルアミド１．５ｇを水１００ｍｌに溶かした。
【０１３０】
溶液Ｂ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３６．３ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム０．３０ｇを水１００ｍｌに溶かし、塩酸でｐＨ８．８にした。
【０１３１】
溶液Ｄ：過硫酸アンモニウム０．１０ｇを水１ｍｌに溶かした。
【０１３２】
なお、溶液Ａ、Ｂ及びＤは全て冷蔵保存した。
【０１３３】
そして、トリシンゲルを以下のように作成した。
【０１３４】
ゲル作成用の枠には、ラピダス・ミニスラブ電気泳動装置付属品（アトー株式会社）を用いた。トリシンゲルは、上記溶液Ａ２．０ｍｌ、上記溶液Ｂ２．０ｍｌ、及び水２．０ｍｌを混合して撹拌し、さらに上記溶液Ｄ２０μｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１０μｌを加えて撹拌、これを予め組んでおいたゲル作成用の枠に流し入れて重合させた。その後、溶液Ａ０．４１ｍｌ、溶液Ｂ０．６７ｍｌ、水０．９３ｍｌを混合して撹拌し、さらに溶液Ｄ１０μｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１０μｌを加えて撹拌、これをトリシンゲルの上に流して入れた。最後に溶液Ａ０．１６ｍｌ、溶液Ｂ０．５０ｍｌ、水０．３４ｍｌを混合して撹拌し、さらに溶液Ｄ２０μｌ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１０μｌを加えて撹拌、これを流して入れてコームを差し込み、スタッキングゲルとした。ゲルは４℃で保存した。
【０１３５】
次に、試料、すなわち、ＢＯＳ−Ｂ４０、ＢＯＳ−Ｂ６０、ＢＯＳ−Ｗ４０、ＢＯＳ−Ｗ６０、ＡＦ−９９ｍ及びＬＴＡ−ＳＡをそれぞれ変性させ電気泳動を行った。具体的には、以下のように行った。
【０１３６】
試料変性用緩衝液：ラウリル硫酸ナトリウム２ｇ、２−メルカプトエタノール２ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン２４２ｍｇ、グリセリン４０ｍｇ、及びクマシーブリリアントブルー２０ｍｇを水に溶かして１００ｍｌとし、塩酸でｐＨ６．８に合わせた。
【０１３７】
電気泳動用緩衝液：
アノード緩衝液  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３６．３４ｇを水に溶かして１００ｍｌとし塩酸でｐＨ８．９に合わせ、この溶液７．３５ｍｌを水に溶かして１００ｍｌとした。
【０１３８】
カソード緩衝液  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１４．５４ｇ、トリシン２１．５０ｇ、ラウリル硫酸ナトリウム１．２ｇを水に溶かして１００ｍｌとし、この溶液１４．２ｍｌを水に溶かして１００ｍｌとした。
【０１３９】
各試料に上記試料変性用緩衝液を加えて、９５℃以上で１０分間加熱して変性させた後、上記トリシンゲルに注入し、上記電気泳動用緩衝液を用いて２０ｍＡの定電流で約１２０分間泳動した。
【０１４０】
なお、上記ＢＯＳ−Ｗ４０とＢＯＳ−Ｗ６０とは、Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出を行った後、１−プロパノール濃度４０％で分画したＥ．  ｈｉｒａｅのＬＴＡ画分と、１−プロパノール濃度６０％で分画したＥ．  ｈｉｒａｅのＬＴＡ画分のことである。
【０１４１】
その後、ＬＴＡ画分の検出を以下のように行った。
【０１４２】
ＬＴＡを確認するためにアルシアンブルー染色を行った。アルシアンブルー染色液は以下のように調製した。塩化マグネシウム六水和物０．１２５ｇ、酢酸０．３７５ｍｌアルシアンブルー溶液（１ｍｇ／ｍｌ）（ナカライテスク）２５ｍｌを精製水１００ｍｌに溶解した。この染色液で、上記（６−２−２）で電気泳動したトリシンゲルを２時間染色後、０．０５Ｍ塩化マグネシウムを含む３％酢酸水溶液に４〜５時間浸して脱色し、バンドを可視化した。
【０１４３】
この結果が図６である。図６に示すように、ブタノール抽出由来のＬＴＡ画分（ＢＯＳ−Ｂ４０）、Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出由来のＬＴＡ画分（ＢＯＳ−Ｗ４０，ＢＯＳ−Ｗ６０）、実験４で得られたＡＦ−９９ｍ、およびＬＴＡ−ＳＡに、同様な幅広いバンドが確認された。詳細な構造は未定であるが、いずれも負に帯電した高分子糖脂質であると考えられる。
【０１４４】
（６−３）免疫・生物学的活性の測定
試料をヒトの末梢全血細胞またはヒト末梢血単核細胞と培養し、培養上清に誘導されたサイトカインをＥＬＩＳＡ法によって定量した。
【０１４５】
（６−３−１）末梢全血細胞培養
９６穴丸底培養プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（株）１６３３２０  ＢＡＴＣＨ  ０６５３７７，  ＮＹ，  ＵＳＡ）上で、試料を適当な濃度まで生理食塩水（大塚製薬、徳島）で希釈し、各ウェルに２５μｌずつ入れた。ＲＰＭＩ１６４０（３％メイロン含有）培地を各ウェルに７５μｌずつ加え、さらに、テルモシリンジＳＳ−５０ＥＳＺ（表品名、テルモ（株）、東京）を用いて、ヒト上腕部から採血したヘパリン化ヒト末梢全血を２５μｌずつ加えた。これを５％ＣＯ２下、３７℃で２５時間培養した後、遠心して培養上清を得た。
【０１４６】
（６−３−２）末梢血単核細胞培養
ヘパリン化ヒト末梢全血をコニカルチューブ（５０ｍｌ）（ＩＷＡＫＩ，旭テクノグラス（株）、東京）に１５ｍｌずつ入れ、ＲＰＭＩ１６４０（３％メイロン含有、１０％ＦＢＳなし）で１／２に希釈して、軽く混ぜた。これにコニカルチューブに小分けしたＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ  ＩＮＣ．）１５ｍｌを、長い注射針（商品名、テルモカテラン針  ２０Ｇ、テルモ（株）、東京）を付けたシリンジを用いて下からゆっくりと加え、４００ｇで３０分間、室温で遠心した。血しょうと、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ  １０７７の境界面にできた白く濁った部分約１０ｍｌをピペットでゆっくりと吸い取り、白濁液と同量の上記と同じＲＰＭＩ１６４０を加え、軽く混ぜ、２５０ｇで１０分間遠心した。
【０１４７】
上清を捨て、一方には１０％ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ（＋のＲＰＭＩとする）を、また別の方には１０％ＦＢＳなしのＲＰＭＩ（−のＲＰＭＩとする）を約１５ｍｌ入れ、２５０ｇで１０分間遠心した。上清を捨て、一方に＋のＲＰＭＩを、別の方には−のＲＰＭＩをプレートに合わせて適当な量を加え、それぞれの細胞数を顕微鏡下で数えた。なお、細胞数は、＋または−のＲＰＭＩで希釈し、１．５〜２  ｘ  １０６  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに合わせた。
【０１４８】
９６穴丸底培養プレート上で試料を適当な濃度まで生理食塩水（大塚製薬）で希釈し、各ウェルに２５μｌずつ入れた。また抗体を加えたときは、９６穴丸底培養プレート上でｍＡｂＥｈ１を適当な濃度まで生理食塩水で希釈し、各ウェルに１２．５μｌずつ入れた。次に、一定濃度の試料を各ウェルに１２．５μｌずつ入れた。末梢単核細胞含有の＋のＲＰＭＩ培地または−のＲＰＭＩ培地を各ウェルに１００μｌずつ加えた。５％ＣＯ２下、３７℃で２４時間培養した後、遠心して培養上清を得た。
【０１４９】
（６−３−３）ＩＬ−６誘導活性
マウスの抗ヒトＩＬ−６抗体（ｋｉｔ中）に１．０ｍｌのＰＢＳを加え３６０μｇ／ｍｌとした。これを９６穴平底ＥＬＩＳＡプレート（ＭＳ−８５６９Ｆ、（株）住友ベークライト、東京）の各ウェルに１００μｌずつ入れ、４℃で終夜放置した後、抗ＩＬ−６血清を吸い取り、ＰＢＳ溶液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含有）４００μｌ／ウェルで３回洗浄した（以下この操作をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎによる洗浄とする）。次に１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を各ウェルに３００μｌずつ入れ、８時間以上放置した後、ＢＳＡ溶液を吸い取りＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。プレートを減圧乾燥して、４℃で保存した。
【０１５０】
プレートの各ウェルにサンプル希釈溶液８０μｌずつ加え、さらに各試料存在下に、ヒト末梢全血またはヒト末梢血単核細胞を培養して得た培養上清を２０μｌずつ加え、Ｓｔａｎｄａｒｄとして０，６２．５，１２５，２５０，５００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６溶液（ｋｉｔ中）各１００μｌを加えて、室温で２時間以上、または、４℃で終夜放置した。ＥＬＩＳＡプレートから培養上清とＳｔａｎｄａｒｄを吸い取り、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ４００μｌで３回洗浄した後、各ウェルに、ビオチン化したヤギ抗ヒトＩＬ−６抗体（ｋｉｔ中）に希釈溶液１．０ｍｌ加えて３６μｇ／ｍｌとしたものを１００μｌ入れて室温で２時間以上、または、４℃で終夜放置した。これを吸い取った後、各ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ４００μｌで３回洗浄し、各ウェルに西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）化アビジン（ｋｉｔ中）を１００μｌ加えて２０分以上放置した。溶液を除き、各ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ４００μｌで３回洗浄した後、基質溶液を１００μｌずつ入れて室温で最大３０分間静置して発色させた。なお、上記基質溶液は、２，２’−ａｚｉｎｏｂｉｓ  （３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）  ｄｉａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＡＢＴＳ）７．２ｍｇに過酸化水素水１０．８μｌを加えて、室温の０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム溶液１２ｍｌに使用直前に溶かして使用した。１．０Ｍのシュウ酸８０μｌを加えて酵素反応を止め、マイクロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍを対照として、４１５ｎｍの吸光度を測定した。ＳｔａｎｄａｒｄのＩＬ−６で検量線を描き、試料によってヒト末梢全血細胞またはヒト末梢単核細胞から産生誘導されたＩＬ−６を算出し、ＬＰＳによる産生誘導量と比較して評価した。
【０１５１】
（６−３−４）ＴＮＦ−α誘導活性
マウスの抗ヒトＴＮＦ−α抗体（ｋｉｔ中）に１．０ｍｌのＰＢＳを加え７２０μｇ／ｍｌとした。これを９６穴平底ＥＬＩＳＡプレート（ＭＳ−８５６９Ｆ）の各ウェルに１００μｌずつ入れ、４℃で終夜放置した後、抗ＴＮＦ−α血清を吸い取りＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。次に１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を各ウェルに３００μｌずつ入れ、８時間以上放置した後、ＢＳＡ溶液を吸い取りＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。プレートを減圧乾燥して、４℃で保存した。
【０１５２】
プレートの各ウェルにサンプル希釈溶液８０μｌずつ加え、さらに各試料存在下にヒト末梢全血またはヒト末梢血単核細胞を培養して得た培養上清を２０μｌずつ加え、Ｓｔａｎｄａｒｄとして０，３１．２５，６２．５，１２５，２５０ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−α溶液（ｋｉｔ中）各１００μｌ加えて室温で２時間以上、または、４℃で終夜放置した。ＥＬＩＳＡプレートから培養上清とＳｔａｎｄａｒｄを吸い取り、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ４００μｌで３回洗浄した後、各ウェルに、ビオチン化したヤギ抗ヒトＴＮＦ−α抗体（ｋｉｔ中）に希釈溶液１．０ｍｌ加えて５４μｇ／ｍｌとしたものを１００μｌ入れて室温で２時間以上、または、４℃で終夜放置した。これを除去した後、各ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ４００μｌで３回洗浄し、各ウェルにＨＲＰ化アビジン（ｋｉｔ中）を１００μｌ加えて２０分以上放置した。溶液を除き、各ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ４００μｌで３回洗浄した後、基質溶液を１００μｌずつ入れて室温で最大３０分間静置して発色させた。なお、基質溶液は、ＡＢＴＳ７．２ｍｇに過酸化水素水１０．８μｌを加えて、室温のリン酸二水素ナトリウム溶液１２ｍｌに使用直前に溶かして使用した。１．０Ｍのシュウ酸８０μｌを加えて酵素反応を止め、マイクロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍを対照として、４１５ｎｍの吸光度を測定した。ＳｔａｎｄａｒｄのＴＮＦ−αで検量線を描き、試料によってヒト末梢全血細胞またはヒト末梢単核細胞から産生誘導されたＴＮＦ−αを算出し、ＬＰＳによる産生誘導量と比較して評価した。
【０１５３】
（６−３−５）ヒト末梢全血細胞からのＩＬ−６、ＴＮＦ−α誘導活性の測定結果
各精製段階において得られた画分について、上記（６−３−３）と（６−３−４）とに基づき、ヒト末梢全血細胞からのＩＬ−６誘導活性とＴＮＦ−α誘導活性とを測定した。この結果を、ＩＬ−６誘導活性については図７（ａ）及び（ｂ）、ＴＮＦ−α誘導活性については図８（ａ）及び（ｂ）に示す。図７（ａ）及び（ｂ）に示すように、ブタノール抽出由来のＢＯＳ−Ｂ４０とＢＯＳ−Ｂ６０とは、どちらも強いＩＬ−６誘導活性を示した。また、図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、ブタノール抽出由来のＢＯＳ−Ｂ４０とＢＯＳ−Ｂ６０とは、どちらも強いＴＮＦ−α誘導活性を示した。しかし、Ｗｅｓｔｐｈａｌ抽出由来のＢＯＳ−Ｗ４０とＢＯＳ−Ｗ６０とは、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αに対して非常に弱い活性しか示さなかった。
【０１５４】
（６−３−６）ヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−６、ＴＮＦ−α誘導活性の測定結果
強い誘導活性を示したＢＯＳ−Ｂ４０について、ヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−６誘導活性とＴＮＦ−・誘導活性とを測定し、血清の影響をみた。さらに、ＡＦ−９９ｍとＬＴＡ−ＳＡと
についても、ヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−６誘導活性とＴＮＦ−・誘導活性とを測定した。
以上の結果を、ＩＬ−６誘導活性については図９、ＴＮＦ−α誘導活性については図１０に示す。なお、これらの図では、ＡＦ−９９ｍをＡＦ−ＬＥＳと記載している。図９及び図１０に示すように、ＢＯＳ−Ｂ４０は、ＡＦ−９９ｍと同様に血清の添加により、誘導活性が抑制された。
【０１５５】
（６−３−７）ｍＡｂＥｈ１抗体による活性の抑制（ヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−６誘導活性に対する抗体の効果）
ヒト末梢血単核細胞を用いて、実験５で得られたｍＡｂＥｈ１と活性成分（ＬＰＳ、ＢＯＳ−Ｂ４０、ＡＦ−９９ｍ、ＬＴＡ−ＳＡ）とを共存させてＩＬ−６誘導活性を測定した。その結果を図１１に示す。なお、図１１では、ＡＦ−９９ｍをＡＦ−ＬＥＳと記載している。図１１に示すように、いずれの試料でも、血清の有無に関わらず誘導活性を抑制した。図９と図１１とを比較して分かるように、ｍＡｂＥｈ１が濃度依存的にＢＯＳ−Ｂ４０、ＡＦ−ＬＳＥ（ＡＦ−９９ｍ）、ＬＴＡ−ＳＡのＩＬ−６誘導活性を抑えている。
【０１５６】
【発明の効果】
本発明にかかる複合糖質活性抑制抗体は、Ｅ．  ｈｉｒａｅ由来の微量複合糖質だけでなく、他のグラム陽性菌のＬＴＡとも抗原抗体反応を示し、これらの免疫増強活性を抑制することができる。
【０１５７】
従って、本発明は、グラム陽性菌の検出や、グラム陽性菌への感染から引き起こされるエンドトキシン様ショック等の疾患の治療薬に用いることができる。よって、本発明は、特に医療分野において有効に利用することができるため、非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｅ．  ｈｉｒａｅ細胞株由来の複合糖質を分画するためのスキームを示す図である。
【図２】ＩＬ−６誘導活性の高い画分、同図（ａ）ではＨＱ−Ａ、同図（ｂ）ではＨＱ−Ｂを、それぞれ疎水クロマトグラフィーに供した際の溶出プロファイルを表すグラフである。
【図３】同図（ａ）はＯＳＡ−Ｒ、同図（ｂ）はＯＳＢ−Ｒをゲル濾過カラムに通過させた際の溶出プロファイルを表すグラフである。
【図４】同図（ａ）は、微量複合糖質（ＨＧＬ−Ａ１，−Ｂ１，−Ｂ２）のＩＬ−６誘導活性を示すグラフである。
同図（ｂ）は、ＨＧＬ−Ｂ１のＴＮＦ−αの誘導活性を表すグラフである。
同図（ｃ）は、ＨＧＬ−Ｂ１のＩＬ−１２の誘導活性を表すグラフである。
同図（ｄ）は、ＨＧＬ−Ｂ１のＩＬ−１８の誘導活性を表すグラフである。
【図５】モノクローナル抗体（ｍＡｂＥｈ１，ｍＡｂＥｈ３）及びコントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ  Ａｂ，  ｍｅｄｉｕｍ）の、Ｅ．  ｈｉｒａｅ由来の誘導活性成分（ＡＦ−９９ｍ）に対する活性抑制の効果のグラフである。
【図６】各複合糖質の電気泳動の結果を表す図である。
【図７】同図（ａ）と（ｂ）とは、各試料のヒト末梢全血細胞からのＩＬ−６誘導活性を示すグラフである。
【図８】同図（ａ）及び（ｂ）は、各試料のヒト末梢全血細胞からのＴＮＦ−α誘導活性を示すグラフである。
【図９】血清の有無によるヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−６誘導活性を示すグラフである。
【図１０】血清の有無によるヒト末梢血単核細胞からのＴＮＦ−α誘導活性を示すグラフである。
【図１１】ｍＡｂＥｈ１と共存させた活性成分のヒト末梢血単核細胞からのＩＬ−６誘導活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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