(57)【要約】【課題】五炭糖と六炭糖とが共存し、かつ発酵阻害物質が存在する木質系バイオマスの加水分解液を、予め糖質の分離回収や、発酵阻害物質の除去をしたり、糖質濃度を調整したりすることなく発酵させることが可能で、しかも速い発酵速度と高いエタノール収率が得られるエタノールの製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】木質系バイオマスを加水分解して得られる加水分解液を、酵母を含む微生物を用いて発酵させる１次発酵工程と、前記１次発酵工程によって得られる１次発酵液からエタノールを分離する分離工程と、前記エタノール分離工程後の残存液を、五炭糖発酵性微生物を含む微生物を用いて発酵させる２次発酵工程とを有する。さらに、前記１次発酵工程後、前記エタノール分離工程前に、前記１次発酵液から菌体を除去する菌体除去工程を有する。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
木質系バイオマスから発酵によってエタノールを製造する製造方法において、
木質系バイオマスを加水分解して得られる加水分解液を、酵母を含む微生物を用いて発酵させる１次発酵工程と、
前記１次発酵工程によって得られる１次発酵液からエタノールを分離する分離工程と、
前記エタノール分離工程後の残存液を、五炭糖発酵性微生物を含む微生物を用いて発酵させる２次発酵工程とを有するエタノールの製造方法。
【請求項２】
前記酵母を含む微生物が酵母からなり、前記五炭糖発酵性微生物を含む微生物が五炭糖発酵性微生物からなることを特徴とする請求項１に記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
前記１次発酵工程後、前記エタノール分離工程前に、
前記１次発酵液から菌体を除去する菌体除去工程を有する請求項１または２に記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
前記木質系バイオマスが廃建材であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、廃建材等の木質系バイオマスを用いて、発酵によりエタノールを製造する製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、再生可能な資源であるバガスや稲わらのような草木系バイオマス、木材チップのような木質系バイオマスなどの天然系の資源からエタノールを製造し、エネルギーや化学原料として利用する研究が進められている。このような収集したバイオマス原料は、加水分解等の糖化工程により糖質に分解した後、微生物の発酵工程によりエタノールに変換して、エネルギーや化学原料として利用される。
【０００３】
バイオマス原料のなかでも、木質系バイオマスは、五炭糖（キシロース、アラビノースなど）および六炭糖（グルコース、ガラクトース、マンノースなど）を構成単位とするヘミセルロースと、グルコースを構成単位とするセルロースとを含んでいる。このうちヘミセルロースは、セルロースに比べて酸やアルカリによる加水分解によって糖化されやすく、通常、８０〜９０％の収率で糖質を回収することができる。そのため、バイオマス資源として非常に有望である。
【０００４】
しかしながら、ヘミセルロースを加水分解後微生物で発酵させても、加水分解液中の五炭糖を資化することは通常困難である。例えば、糖質をエタノールに変換する微生物としてよく知られている酵母のほとんどの種類は、六炭糖を資化できるが、五炭糖を資化することはできない。
【０００５】
そこで、近年、遺伝子組換え操作により、五炭糖からエタノールを生産可能な微生物が提案されている。このような微生物として、例えば、五炭糖および六炭糖の両方を資化するがエタノールは生産しない大腸菌に、エタノールを生産する微生物の遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え大腸菌や、アルコール発酵性の細菌であるザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物に五炭糖の代謝遺伝子を組み込んだものなどが挙げられる（特許文献１および２参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
特表平５−５０２３６６号公報
【特許文献２】
特表平６−５０４４３６号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、五炭糖と六炭糖の両方をエタノールに変換する前記遺伝子組換え微生物は、五炭糖と六炭糖の共存下では、通常、六炭糖（特にグルコース）から資化する。そのため、五炭糖の資化速度が五炭糖のみ単独で存在する場合に比べて遅くなると共に、五炭糖が一部資化されないで残るという問題点があった。
【０００８】
そのため、従来は、木質系バイオマスの加水分解液から、六炭糖と五炭糖を分離して回収し、それぞれ別々に発酵工程を行うという煩雑な方法を採っていた。
【０００９】
また、木質系バイオマスの加水分解後の液には、ヘミセルロースに含まれる酢酸、フルフラール、レブリン酸などの糖質の過分解物質が含まれている。さらに、廃建材を原料とした場合には、この他に接着剤や塗料なども含まれている。これらの物質は微生物の発酵を阻害する作用があるという問題点があった。
【００１０】
このような発酵阻害物質は、発酵工程前にイオン交換処理や活性炭処理などで一部を取り除くこともできるが、手間やコストが掛かる。そこで、発酵阻害物質の除去処理を不要とするため、発酵阻害物質となる不純物に対する浸透圧耐性の高い微生物の使用が要求される。高い浸透圧耐性をもつ微生物を使用することにより、高濃度の不純物の存在下でも微生物が生存、増殖し、発酵力を維持することができる。
【００１１】
また、発酵が進行すると、発酵液中のエタノール濃度は徐々に高くなるので、微生物のエタノール耐性も要求される。すなわち、高濃度のエタノールの存在下でも微生物が生存、増殖し、発酵力を維持できることが要求される。微生物のエタノール耐性が低い場合には、発酵液中のエタノール濃度を下げるために発酵液を希釈して糖質濃度を調整するなどの煩雑な処理が必要となり、好ましくない。
【００１２】
しかしながら、遺伝子組換え操作により、五炭糖からエタノールを生産可能な微生物は、不純物に対する浸透圧耐性も、エタノール耐性も低いとういう問題があった。
【００１３】
本発明は、上記従来技術の問題点に鑑み、五炭糖と六炭糖とが共存し、かつ発酵阻害物質が存在する木質系バイオマスの加水分解液を、予め糖質の分離回収や、発酵阻害物質の除去をしたり、糖質濃度を調整したりすることなく発酵させることが可能で、しかも速い発酵速度と高いエタノール収率が得られるエタノールの製造方法を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、木質系バイオマスから発酵によってエタノールを製造する製造方法において、木質系バイオマスを加水分解して得られる加水分解液を、酵母を含む微生物を用いて発酵させる１次発酵工程と、前記１次発酵工程によって得られる１次発酵液からエタノールを分離する分離工程と、前記エタノール分離工程後の残存液を、五炭糖発酵性微生物を含む微生物を用いて発酵させる２次発酵工程とを有するエタノールの製造方法を提供する。
さらに、前記１次発酵工程後、前記エタノール分離工程前に、前記１次発酵液から菌体を除去する菌体除去工程を有する製造方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
［第１実施形態］
本実施形態の製造方法は、図１に示すように加水分解、中和、１次発酵、エタノール分離（１）、２次発酵、エタノール分離（２）、エタノール精製の各工程から構成される。
【００１６】
（木質系バイオマス）
原料である木質系バイオマスとしては、木材チップや廃建材などが挙げられる。廃建材としては、廃棄木質建材、廃パレット、廃梱包材等が挙げられる。廃建材は単独で用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、廃建材には、酢酸、フルフラール、レブリン酸、ギ酸等の発酵阻害物質や接着剤、塗料等の不純物が含まれていても差し支えない。
【００１７】
（加水分解工程）
加水分解工程では、従来から公知の酸加水分解法やアルカリ加水分解法を用いることができる。そのなかでも、酸加水分解法が好ましい。酸加水分解法に用いる酸としては、硫酸、塩酸、硝酸などが挙げられるが、硫酸を用いるのが好ましい。
【００１８】
（中和工程）
加水分解工程後、酸加水分解法、アルカリ加水分解法を用いた場合には、中和工程が必要である。酸加水分解法で加水分解した後に中和工程で用いるアルカリとしては、Ｃａ（ＯＨ）２、ＮａＯＨなどが挙げられるが、比較的安価なＣａ（ＯＨ）２を用いるのが好ましい。
【００１９】
（１次発酵工程）
中和工程後、得られた加水分解液は１次発酵工程に供される。１次発酵工程では、酵母を含む微生物による発酵によってエタノールが生成される。酵母としては、公知の酵母を用いることができるが、そのなかでも、サッカロミセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などが好ましい。酵母は、浸透圧耐性が細菌より高いので、発酵阻害物質となる接着剤、塗料等の不純物を除去処理することなく、発酵を安定的に進行させることができる。また、酵母は、エタノール耐性が細菌より高いので、発酵液中のエタノール濃度を下げるために、加水分解液を予め希釈して糖質濃度を調整することなく、発酵を行うことができる。
【００２０】
１次発酵で使用する微生物としては、酵母を単独で用いることが好ましいが、他の微生物を共存させることもできる。共存させる微生物も浸透圧耐性、エタノール耐性を備えることが好ましい。このような微生物としては、遺伝子組換えによって五炭糖の発酵能力を有する微生物である遺伝子組換え大腸菌などが挙げられる。なお、ここで、遺伝子組換え微生物とは、エタノール等への変換に必要な酵素遺伝子を有していない微生物に、遺伝子工学技術によりこれら遺伝子を導入し、エタノール等への発酵を可能にしたものをいう。このような遺伝子組換え微生物としては、例として、エタノール発酵性を有する遺伝子組換え大腸菌等が挙げられる。
【００２１】
（エタノール分離工程）
前記１次発酵工程後得られた１次発酵液は、発酵により生成したエタノールを分離する分離工程に供される。１次発酵液中のエタノール濃度をいったん下げてから２次発酵を行う方が２次発酵が速やかに進行するため、好ましいからである。エタノールを分離する方法は、蒸留、浸透気化膜等の公知の方法が用いられるが、なかでも蒸留が好ましい。
【００２２】
（２次発酵工程）
エタノール分離工程後得られた残存液は、２次発酵工程に供される。２次発酵工程では、五炭糖発酵性微生物を含む微生物による発酵によってエタノールが生成される。五炭糖発酵性微生物としては、公知の五炭糖発酵性微生物を用いることができるが、そのなかでも、五炭糖からエタノールを生産可能な遺伝子組換え大腸菌が好ましい。２次発酵工程に供する残存液中の糖質濃度は、１次発酵工程に用いる加水分解液中の糖質濃度より低いので、エタノール耐性の低い五炭糖発酵性微生物を用いることができる。
【００２３】
（エタノール精製工程）
２次発酵工程後、生成したエタノールは分離され、１次発酵工程後分離したエタノールと共に精製工程に供される。精製法としては、公知の方法、例えば蒸留等を用いることができる。
【００２４】
原料となる加水分解液中には五炭糖と六炭糖の両方が存在する。五炭糖と六炭糖との両方を資化する微生物は、このような五炭糖と六炭糖との共存下では、六炭糖（特にグルコース）から資化し、五炭糖の資化速度は五炭糖のみ単独で存在する場合に比べて遅くなる。一方、酵母は五炭糖を資化することはできないが、六炭糖は資化できる。そこで、１次発酵工程では、まず、酵母を含む微生物によって六炭糖を選択的にエタノールに変換させ、次いで２次発酵工程では、１次発酵工程で資化されずに残存する五炭糖を、五炭糖発酵性微生物を含む微生物によって選択的に発酵させる。本実施形態によれば、予め加水分解液を六炭糖と五炭糖に分離させたり、発酵阻害物質の除去をしたり、加水分解液の糖質濃度を調整したりすることなく発酵を進行させることができるため、工程全体としての発酵速度は速くなりエタノール収率を向上させることができる。
【００２５】
［第２実施形態］
第２実施形態において第１実施形態と異なるのは、１次発酵工程後、エタノール分離工程前に、１次発酵液から菌体を除去する菌体除去工程を有していることである。加水分解工程、中和工程、１次発酵工程、エタノール分離工程、２次発酵工程、エタノール精製工程については、第１実施形態と同様であるので説明を省略する。以下、菌体除去工程について説明する。
【００２６】
（菌体除去工程）
菌体除去工程では、１次発酵工程で使用した微生物等の菌体をいったん除去する。菌体除去方法としては、公知の方法を用いてよいが、そのなかでも熱がかからない点から遠心分離法が好ましい。また、除去した菌体は、１次発酵工程に再度使用してもよい。除去した菌体の再使用は、発酵液中の菌の濃度を高め、より環境に馴致した菌体の比率を増やす効果があり、発酵速度が向上するからである。
【００２７】
本実施形態によれば、第１実施形態で得られる効果に加えて、以下のような効果が得られる。
まず、加水分解液中に存在する発酵阻害物質となる不純物は、発酵中に酵母等の微生物の内部に取り込まれたり、菌体に吸着したりする場合がある。１次発酵工程後に、不純物を取り込んだ菌体を分離することによって、菌体と共にこれらの不純物を除去することができる。
また、１次発酵液に酵母等の微生物を存在させたまま、エタノール分離工程に進むと、例えばエタノール分離工程で蒸留を用いる場合、酵母等の微生物内部に取り込まれた不純物が、蒸留時の熱によって放出されたり、酵母等の微生物の一部が溶菌して有機酸などの別の発酵阻害物質を溶出したりする場合がある。エタノール分離工程前に、１次発酵工程で使用した菌体をいったん除去することで、２次発酵工程の発酵阻害要因となる上記不純物を取り除き、最終的なエタノール収率をさらに向上させることができる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明の実施例について説明する。
＜実験条件＞
（原料となる加水分解液）模擬廃建材の加水分解液をＣａ（ＯＨ）２で中和した液を、各実施例、比較例の原料とした。
ここで、模擬廃建材の加水分解液とは、杉、米松、米栂、ラワン合板を２：２：１：５の割合で混合した混合材を１．５質量％の希硫酸で１５０℃で１０分間で加水分解した後、ろ過によって残渣を除去したものである。
なお、得られた加水分解液については、発酵阻害物質の除去や糖質濃度の調節、糖質の分離等の処理は行わず、そのまま各実施例の１次発酵工程、各比較例の発酵工程に供した。
原料となる加水分解液中の糖質濃度は、下記の条件の液体クロマトグラフィーにて測定した。
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【００２９】
［実施例１］
（１）１次発酵工程
前記方法で得た加水分解液（原料液）５００ｍＬをフラスコに入れ、下記の栄養源を加え、これに下記の菌種の酵母を接種して、３０℃、８０ｒｐｍで３０時間発酵を行った。
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【００３０】
発酵終了後、溶液中のエタノール収量（ｇ）を下記の条件のガスクロマトグラフィーにより、また、糖質濃度（ｇ／Ｌ）を上記と同様に液体クロマトグラフィーにより測定した。
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また、測定したエタノール収量（ｇ）を液量（ｍＬ）で除してエタノール濃度（ｇ／Ｌ）を求めた。
また、以下の式（Ｉ）により、１次発酵後のエタノール発酵率（％）を求めた。
１次発酵後のエタノール発酵率（％）＝（１次発酵後のエタノール濃度）／（原料液の糖質合計濃度）／０．５１×１００                          （Ｉ）
なお、式（Ｉ）において、０．５１は係数で、糖質が発酵反応により完全にエタノールと二酸化炭素に変化する際における生成するエタノールの糖質に対する質量比である。これらの結果を表１の「１次発酵（酵母）」の欄に示す。
【００３１】
（２）エタノール分離工程
得られた１次発酵液中のエタノールをロータリーエバポレーターを用いて７０℃で、１次発酵液中のエタノール濃度が２ｇ／Ｌ  以下になるまで蒸留した。エタノール分離後の糖質濃度（ｇ／Ｌ）を上記と同様に液体クロマトグラフィーにより測定した。この結果を表１の「エタノール分離」の欄に示す。
【００３２】
（３）２次発酵工程
エタノール分離後得られた残存液３６１ｍＬをフラスコに入れ、下記の栄養源を加え、これに下記の菌種の細菌を接種して、３５℃、８０ｒｐｍで４０時間発酵を行った。
・菌株：遺伝子組換え大腸菌（ＡＴＣＣ５５１２４）
・栄養源：コーンスティープリカー（ＳＩＧＭＡ製）  １８ｇ
【００３３】
発酵終了後、１次発酵工程と同様の条件で、溶液中のエタノール収量（ｇ）および糖質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）を求めた。
また、以下の式（ＩＩ）により、２次発酵後のエタノール発酵率（％）を求めた。
２次発酵後のエタノール発酵率（％）＝（２次発酵後のエタノール濃度）／（エタノール分離後の糖質合計濃度）／０．５１×１００                （ＩＩ）
これらの結果を表１の「２次発酵（大腸菌）」の欄に示す。
【００３４】
また、以下の式（ＩＩＩ）により、トータル収率としてのエタノール発酵率（％）を求めた。
トータルのエタノール発酵率（％）＝（トータルのエタノール濃度）／（原料液の糖質合計濃度）／０．５１×１００                              （ＩＩＩ）
この結果を表１の「トータル収率」の欄に示す。
【００３５】
［実施例２］
（１）１次発酵工程
実施例１の１次発酵工程と同様の条件で発酵を行い、同様の条件でエタノール収量（ｇ）および糖質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）および１次発酵後のエタノール発酵率（％）を求めた。これらの結果を表１の「１次発酵（酵母）」の欄に示す。
（２）菌体除去工程
得られた１次発酵液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理（コクサン製、ＨＭ−５Ｒ型）し、上澄み液４９５ｍＬをエタノール分離工程に供した。
（３）エタノール分離工程
実施例１のエタノール分離工程と同様の条件で蒸留を行い、同様の条件で糖質濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。この結果を表１の「エタノール分離」の欄に示す。
（４）２次発酵工程
実施例１の２次発酵工程と同様の条件で発酵を行い、同様の条件でエタノール収量（ｇ）および糖質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）および２次発酵後のエタノール発酵率（％）を求めた。これらの結果を表１の「２次発酵（大腸菌）」の欄に示す。
また、同様にしてトータル収率としてのエタノール発酵率（％）を求めた。この結果を表１の「トータル収率」の欄に示す。
【００３６】
［比較例１］
実施例１の１次発酵工程と同様の条件で、発酵時間を７０時間にして発酵を行い、同様の条件でエタノール収量（ｇ）および糖質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）およびエタノール発酵率（％）を求めた。また、同様にしてトータル収率としてのエタノール発酵率（％）を求めた。これらの結果を表１の「発酵（酵母）」および「トータル収率」の欄に示す。
【００３７】
［比較例２］
実施例１の２次発酵工程と同様の条件で、発酵時間を７０時間にして発酵を行い、同様の条件でエタノール収量（ｇ）および糖質濃度（ｇ／Ｌ）を測定し、エタノール濃度（ｇ／Ｌ）およびエタノール発酵率（％）を求めた。また、同様にしてトータル収率としてのエタノール発酵率（％）を求めた。これらの結果を表１の「発酵（大腸菌）」および「トータル収率」の欄に示す。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
実施例１と比較例１とを比べると、トータルのエタノール収率は５４％から８５％まで上昇した。エタノール収率は、２段階の発酵を行うことによって、酵母による１段階の発酵の１．６倍向上した。また、実施例１と比較例２とを比べると、トータルのエタノール収率は６８％から８５％まで上昇した。エタノール収率は２段階の発酵を行うことによって、遺伝子組換え大腸菌による１段階の発酵の１．２５倍向上した。
【００４０】
実施例２と比較例１とを比べると、トータルのエタノール収率は５４％から９１％まで上昇した。エタノール収率は、１次発酵後菌体除去を行い２次発酵を行うことによって、酵母による１段階の発酵の１．７倍向上した。また、実施例２と比較例２とを比べると、トータルのエタノール収率は６８％から９１％まで上昇した。エタノール収率は、１次発酵後菌体除去を行い２次発酵を行うことによって、遺伝子組換え大腸菌による１段階の発酵の１．３倍向上した。
【００４１】
実施例１と実施例２とを比べると、トータルのエタノール収率は８５％から９１％まで上昇した。エタノール収率は、１次発酵後菌体除去を行い２次発酵を行うことによって、菌体除去を行わない２段階発酵の１．１倍向上した。
【００４２】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明のエタノールの製造方法は、五炭糖と六炭糖とが共存し、かつ発酵阻害物質が存在する木質系バイオマスの加水分解液を、予め糖質の分離回収や、発酵阻害物質の除去をしたり、糖質濃度を調整したりすることなく発酵させることが可能で、しかも速い発酵速度と高いエタノール収率が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態のエタノール製造方法の工程図である。
【図１】
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