(57)【要約】      （修正有）【課題】リムルステストに代わる新規なエンドトキシン（ＥＴ）の測定法を提供する。つまり測定手法として表面プラズモン共鳴測定法（ＳＰＲ）を利用することで、測定における機械化を達成し、さらに高価な試薬を使うことなく容易にＥＴの測定法を提供する。【解決手段】ＳＰＲを使ってＥＴを測定する際に、ポリミキシンＢ等のＥＴを特異的に吸着する能力を有する物質をＳＰＲ測定用担体上に固定化しておき、それを測定用センサとして用いれば検体からＥＴを極めて容易に迅速に測定可能であり、さらに測定後センサを再生して繰り返し測定できる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドトキシン（以下ＥＴ）と特異的に結合する能力を有する物質を金属薄膜担体に固定化したことを特徴とする、表面プラズモン共鳴（以下ＳＰＲ）を用いてＥＴ測定するためのセンサ（以下ＥＴ測定用センサ）。
【請求項２】
ＥＴと特異的に結合する能力を有する物質が、ポリミキシンＢ（以下ＰＭＸ）又は抗ＥＴ抗体である請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
担体が、金薄膜である請求項１又は２に記載のセンサ。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一に記載のセンサを、測定試料と接触させた後にＳＰＲによってＥＴを測定する方法。
【請求項５】
測定試料と接触後、さらに抗ＥＴ抗体又はＰＭＸを反応させた後にＳＰＲによってＥＴを測定する請求項４に記載のＥＴを測定する方法。
【請求項６】
抗ＥＴ抗体もしくはＰＭＸを反応させた後に、さらに抗ＥＴ抗体に対してもしくはＰＭＸに対して反応性を持つ抗体、又は修飾化されたこれらの抗体を反応させた後にＳＰＲによってＥＴを測定する請求項４に記載のＥＴを測定する方法。
【請求項７】
ＥＴが、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（以下ＬＰＳ）、内毒素、リポ多糖、発熱物質、又はパイロジェンである請求項４〜６の何れか一に記載のＥＴを測定する方法。
【請求項８】
測定試料が、生体試料、培養液、血液透析液及びその廃液、注射用水、医薬品、純水から選ばれる請求項７に記載のＥＴを測定する方法。
【請求項９】
請求項８のＥＴを測定する方法による細菌感染症の診断方法。
【請求項１０】
請求項７のＥＴを測定する方法によるＥＴ夾雑の判定方法。
【請求項１１】
請求項４〜８の何れか一に記載の測定が完了した後、ＥＴ測定用センサから捕捉されたＥＴを溶出することが可能な再生液を接触させて、ＥＴ測定用センサを再生させるＥＴ測定用センサの再生方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のＥＴ測定用センサの製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜３の何れか一に記載のセンサ、請求項４〜８の何れか一に記載の測定方法に使用する試薬、及び請求項１１に記載の再生に使用する試薬の少なくとも１を含むＥＴ測定のためのセンサ又は試薬。
【請求項１４】
請求項４〜８の何れか一に記載のＳＰＲによってＥＴを測定する方法に使用するＳＰＲ用担体チップ（ＳＰＲ測定用センサーチップ）の用途。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はエンドトキシン（以下ＥＴという）の測定に使用するセンサ、及びそのセンサを使ったＥＴの測定方法に関する。さらには、測定したＥＴ値より、測定試料を判定する方法、及び測定後のセンサの再生方法に関する。特に、本発明のＥＴの測定は、表面プラズモン共鳴（以下ＳＰＲという）法によるものである。
【０００２】
【従来技術】
ＥＴは、大腸菌、コレラ、緑膿菌、サルモネラ、赤痢菌などの出すリポ多糖の高分子複合体で細菌菌体の構成成分であって細胞の破壊により遊離される。その作用は、毒性は比較的弱く、強い発熱性、耐熱性、腫瘍細胞への破壊作用等が特徴ある性質である。
医薬品や血液に直接接触する医療用具がＥＴで汚染された場合、ごく微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらのＥＴ汚染量は厳密に管理されなければならず、米国や日本の薬局方にもＥＴ試験法が収載されている。また、グラム陰性菌感染による敗血症の早期診断、グラム陰性菌感染症の治療効果及び予後の判定のため、血中のＥＴを定量する試みも行われている。
このようにＥＴは様々な分野で関心が持たれ種々のＥＴを測定する手法が提案されてきた。
【０００３】
ＥＴを測定する手法として、従来、ウサギ発熱試験、鶏胚致死試験、ラジオイムノアッセイ、ガスマススペクトル、リムルステストがあり、これらの中で最も鋭敏、簡便かつ迅速なのはリムルステストであり、医薬品、水、透析液などの汚染試験、臨床検査などで使用されている。
このリムルステストを用いたＥＴ測定法は、カブトガニの血球抽出液（ライセート）にＥＴが加わると、Ｃ因子（ＥＴ感受性因子）が活性化され、それに続く連鎖的酵素反応がそれぞれ別の経路によって順次惹起され、最終的に活性化された凝固酵素が反応基質を加水分解することを利用した方法である。一般的には、１）ＥＴとライセート中のＣ因子系反応によって最終的に活性化された凝固酵素が、そのプロテアーゼ活性により、コアグロゲンをコアグリンに変換してゲル化させる過程で生じる濁度変化を光学分析装置により測定する比濁法と、２）ＥＴとライセート中のＣ因子系反応によって最終的に活性化された凝固酵素が、そのプロテアーゼ活性により、コアグロゲンをコアグリンに変換する際のコアグロゲンの水解部位のアミノ酸配列と類似の配列を持つ合成ペプチドに、発色基ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）を結合させた発色合成基質を用い、凝固酵素のアミダーゼ活性によって遊離するｐＮＡの吸光度を測定する比色法の２種類が使用されている。
しかし、従来のリムルステストを用いたＥＴ測定は、用手法であるため、測定者間により、測定値のばらつきが生じ、また、測定毎にセンサが必要になるなどの問題点があった。
【０００４】
さらにリムルステストの改良としてβ−１，３−グルカナーゼを含んでなるＥＴ測定用試薬（特許文献１）、比濁時間分析法を利用したＥＴの測定方法（特許文献２）、或はＥＴ吸着体を用いた測定方法（特許文献３）等も提案されている。その他、ＥＴ活性を中和する物質としてポリミキシンＢ（以下ＰＭＸという）が知られておりその相互作用をＳＰＲで分析する方法が報告されている（非特許文献１及び２）
【０００５】
【先行文献】
【特許文献１】特開平１１−１７８５９９
【特許文献２】特開平８−２１１０６３
【特許文献３】特開平２−１９３０７２
【非特許文献１】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４５（１９９９）４２０−４２４
【非特許文献２】Ｊ．Ｂ．Ｃ．  ２７４（４２）  ２９６２４−２９６２７（１９９９）
【０００６】
【発明が解決しようとしている課題】
本発明の課題は、リムルステストに代わる新規なＥＴの測定法を提供するものである。つまり測定手法としてＳＰＲを利用することで、測定における機械化を達成し、容易にＥＴの測定法を提供しようとするものである。ＥＴ活性を中和する物質としてＰＭＸが知られておりその相互作用をＳＰＲで分析する方法が前記非特許文献１及び２によって公知であったが、この方法では大量の測定試料から迅速に容易にＥＴを測定する手段を開示も示唆もしていない。
【０００７】
【課題を解決する方法及び手段】
本発明者らは、ＳＰＲを使ってＥＴを測定する際に、ＰＭＸ等のＥＴを特異的に吸着する能力を有する物質をＳＰＲ測定用担体上に固定化しておき、それを測定用センサとして用いれば測定試料からＥＴを極めて容易に迅速に測定可能であり、さらに測定後センサを再生して繰り返し測定できることを見出し本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下よりなる。
１．エンドトキシン（以下ＥＴ）と特異的に結合する能力を有する物質を金属薄膜担体に固定化したことを特徴とする、表面プラズモン共鳴（以下ＳＰＲ）を用いてＥＴ測定するためのセンサ（以下ＥＴ測定用センサ）。
２．ＥＴと特異的に結合する能力を有する物質が、ポリミキシンＢ（以下ＰＭＸ）又は抗ＥＴ抗体である前項１に記載のセンサ。
３．担体が、金薄膜である前項１又は２に記載のセンサ。
４．前項１〜３の何れか一に記載のセンサを、測定試料と接触させた後にＳＰＲによってＥＴを測定する方法。
５．測定試料と接触後、さらに抗ＥＴ抗体又はＰＭＸを反応させた後にＳＰＲによってＥＴを測定する前項４に記載のＥＴを測定する方法。
６．抗ＥＴ抗体もしくはＰＭＸを反応させた後に、さらに抗ＥＴ抗体に対してもしくはＰＭＸに対して反応性を持つ抗体、又は修飾化されたこれらの抗体を反応させた後にＳＰＲによってＥＴを測定する前項４に記載のＥＴを測定する方法。
７．ＥＴが、Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（以下ＬＰＳ）、内毒素、リポ多糖、発熱物質、又はパイロジェンである前項４〜６の何れか一に記載のＥＴを測定する方法。
８．測定試料が、生体試料、培養液、血液透析液及びその廃液、注射用水、医薬品、純水から選ばれる前項７に記載のＥＴを測定する方法。
９．前項８に記載のＥＴを測定する方法による細菌感染症の診断方法。
１０．前項７に記載のＥＴを測定する方法によるＥＴ夾雑の判定方法。
１１．前項４〜８の何れか一に記載の測定が完了した後、ＥＴ測定用センサから捕捉されたＥＴを溶出することが可能な再生液を接触させて、ＥＴ測定用センサを再生させるＥＴ測定用センサの再生方法。
１２．前項１〜３に記載のＥＴ測定用センサの製造方法。
１３．前項１〜３の何れか一に記載のセンサ、請求項４〜８の何れか一に記載の測定方法に使用する試薬、及び請求項１１に記載の再生に使用する試薬の少なくとも１を含むＥＴ測定のためのセンサ又は試薬。
１４．前項４〜８の何れか一に記載のＳＰＲによってＥＴを測定する方法に使用するＳＰＲ用担体チップ（ＳＰＲ測定用センサーチップ）の用途。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のＥＴ測定用センサは、ＰＭＸ等のＥＴを特異的に吸着する能力を有する物質をＳＰＲ測定用担体上に固定化して調製される。
【００１０】
本発明のＳＰＲの手段は、前記非特許文献１に詳しい。そして、そのＳＰＲ測定用担体（ＳＰＲ測定用センサーチップ）も公知であり、広く市販されている。本発明では、このＳＰＲの技術及びＳＰＲ測定用担体を利用し、援用する。このＳＰＲの技術及びＳＰＲ測定用担体の系としては現在ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）社のバイオセンサーが効果的に利用可能であるが、これに限定されるものではない。ＳＰＲ測定用担体としては、種々のグレイドのセンサーチップが市販されており、これらを利用できる。例えばＣＭ５センサーチップを実施例では例示した。
【００１１】
ＥＴと特異的に結合する能力を有する物質は、ＰＭＸ又は抗ＥＴ抗体が好適であるが、特異的にＥＴとの結合能力を有する限りこれらに限定されない。たとえば、ヒスチジン、ヒスタミンおよびアデニンから選ばれる含窒素複素環式化合物も利用可能である。ＰＭＸは市販されており、それをそのまま或は精製して使用可能である。抗ＥＴ抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を適宜公知の手法により調製可能であるが、これらも市販されているので容易に入手可能である。例えば、抗ＥＴ抗体はナノツール社（Ｎａｎｏｔｏｏｌｓ  Ａｎｔｉｋｏｒｐｅｒｔｅｃｈｎｉｋ：独）、キューイーティ−社（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｃ．：米）、標識抗ＥＴ抗体はバイオジェネシス社（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＬＴＤ．：英）がある。なお、ＥＴは多様な呼び名で一般的に呼称されるが、ＬＰＳ、内毒素、リポ多糖、発熱物質、パイロジェン等が対象であり、抗体を作るためにはこれらを適当なアジュバントと共に動物に投与し調製するか、さらにその後ハイブリドーマの調製技術によって調製可能である。
【００１２】
ＳＰＲ測定用担体とＥＴと特異的に結合する能力を有する物質の結合は、直接又はスペーサーを介して行われる。スペーサーとしては、チオール基やジチオール基を有する化合物による単分子層膜や、カルボキシメチルデキストラン、ストレプトアビジン、チオールアルカン等が挙げられるがこれに限らない。ＥＴと特異的に結合する能力を有する物質の、ＳＰＲ測定用担体に対する結合量は、１．０−２．５ｎｇ／ｍｍ２で固定化することが好適である。
【００１３】
本発明のＥＴ測定用センサは、予めＳＰＲ測定用担体とＥＴと特異的に結合する能力を有する物質の固定化されたものをセンサとして提供してもよいが、用時調製用に、ＳＰＲ測定用担体、ＥＴと特異的に結合する能力を有する物質及びＳＰＲ測定用担体から選ばれる少なくとも２つをキット化して提供することも可能であるし、ＳＰＲ測定用担体自体をＳＰＲを利用するＥＴ測定方法に使用する用途を目的として提供可能である。
【００１４】
本発明のセンサを使ったＥＴの測定の測定試料は、ＥＴが夾雑する可能性ある対象物である限り特に限定されない。血液や尿などの生体試料、培養液、血液透析液およびその廃液、注射用水、医薬品、純水等広く適用可能である。なお、脂質成分中のＥＴ測定には、予め界面活性剤等による前処理を必要とするが、いずれも測定試料が液体化している限り、好適に測定にふすことが出来る。測定対象のＥＴは、ＬＰＳ、内毒素、リポ多糖、発熱物質、パイロジェン等が本質的に同等物として検出できる。センサは、測定試料と接触させて測定試料中のＥＴを選択的に捕捉し、捕捉されたＥＴ値をＳＰＲ測定によって定量的におこなう。
【００１５】
測定試料とセンサの接触時の混合比は、センサに対して測定試料３０−９００μｌを２−６０分、好ましくは測定試料９０−３６０μｌを６−２４分かけて接触させることで行う。
【００１６】
微量測定試料の測定のためには、測定試料とセンサの接触後、捕捉されたＥＴに対してさらに抗ＥＴ抗体又はＰＭＸを反応させた後にＳＰＲ測定を行うことにより測定感度の上昇が確認された。添加量は、約５０−３００μｌ（抗ＥＴ抗体の場合その濃度が約５−３００μｇ／ｍｌに調整した溶液、ＰＭＸでは約０．０５−１μｇ／ｍｌに調整した溶液）である。
【００１７】
さらに、より一層の測定感度の上昇を得るためには、前記抗ＥＴ抗体もしくはＰＭＸを反応させた後に、さらに抗ＥＴ抗体に対してもしくはＰＭＸに対して反応性を持つ抗体、又は修飾化されたこれらの抗体を反応させ、その後にＳＰＲ測定を行うことはより高感度にＥＴを測定することが可能である。ここで抗ＥＴ抗体に対してもしくはＰＭＸに対して反応性を持つ抗体とは、前者であれば広く市販の抗ＩｇＧ抗体が利用できる。修飾化されたこれらの抗体とはタンパク質（アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、アルブミン等）やデキストラン等の高分子化合物で修飾したコンジュゲート抗体を意味し、修飾には酵素等の抗体の標識化において繁用されている手段をそのまま利用出来る（臨床検査提要  免疫的定量法  金原出版）。抗ＩｇＧ抗体（約５−３００μｇ／ｍｌ）の添加量は、約５０〜３００μｌである。
【００１８】
以上のＳＰＲによる測定で、測定試料中のＥＴの増加は、図１に示すような検量線を提供可能であり、ＥＴの定量分析に本発明のセンサ及び測定法は極めて有用であることが確認された。
【００１９】
かくして本発明の測定法は、広くＥＴが夾雑している測定試料の測定に応用可能であり、特に細菌感染症の診断方法、ＥＴ夾雑判定法等（血液や尿などの生体試料、培養液、血液透析液およびその廃液、注射用水、医薬品、純水等）に好適に利用出来る。
【００２０】
本発明にあっては、以上のようにＥＴ測定用センサを使ってＥＴの測定完了後さらに再生処理により再使用可能であるという利点をもつ。再生処理とは、ＥＴ測定用センサによって測定試料中から捕捉されたＥＴを、該センサから溶離することをいい、溶離によって該センサが使用前の状態にもどることをいう。再生処理のためには、以下のような再生液を十分量接触させることによって可能であり、約１０回程度まで、所望の感度をもって再使用可能である。
再生液は、アルカリ性溶液、酸性溶液、もしくは界面活性剤を含む溶液であれば良く、アルカリ性溶液としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＯＡｃ、ＫＯＡｃなどの水溶液が挙げられ、酸性溶液はＨＣｌ、ＡｃＯＨ、ＮＨ４Ｃｌ、グリシン、クエン酸などの水溶液が挙げられる。界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルやポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテルに代表される非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸に代表される胆汁酸類の界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウムに代表される陰イオン界面活性剤であればよく、また、界面活性剤をアルカリ性水溶液もしくは酸性水溶液に含有させてもよい。使用量は、界面活性剤を０．００１−０．５％含有した１−２０ｍＭのアルカリ溶液が好適に例示される。
【００２１】
以上の説明から明らかなように、本発明からなるＥＴ測定用センサは、その測定に使用する或はその再生に使用する各種試薬及び／又は溶液を組合わせてキット化し、ＥＴの測定のために、或はＥＴ測定用センサの再生のために提供可能である。
【００２２】
【実施例＆実験例】
以下に本発明を実施例及び実験例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、ＳＰＲを使ってＥＴを測定する際に、ＥＴを特異的に吸着する能力を有する物質をＳＰＲ測定用担体上に固定化しておき、それをＳＰＲ測定用センサとして用いる限り全て本発明の技術思想に包含される。
【００２３】
【実施例１】
ＥＴ測定用センサ（ＥＴ測定用センサチップ）の調製
ＳＰＲの測定には、表面プラズモン共鳴測定装置（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用し、ＳＰＲ測定用担体（センサチップ）としてＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＢＩＡＣＯＲＥ社製品）を用いた。ランニングＢｕｆｆｅｒとしてＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ製品）を用い、センサチップ表面の活性化剤である、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（３７．５ｍｇ／ｍｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（５．７５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液を流しセンサチップを活性化した。その後、１０ｍｇ／ｍｌのＰＭＸを含むｐＨ４．５酢酸水溶液の３６０μｌを流し、センサチップ（１−１．２ｍｍ２）と２４分間接触させ、ＰＭＸを固定化し、最後に、１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ水溶液（ＢＩＡＣＯＲＥ社製品）の１８０μｌを加えて、ブロッキングを行い、ＥＴ測定用センサチップ（ＥＴ測定用センサ）とした。
【００２４】
【実験例１】（ＥＴ高濃度の測定）
測定対象物となるＥＴとして、ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ）を用いた。実施例１で調製したＥＴ測定用センサチップを使った。１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び３．４ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液を、ＥＴ除去フィルタによりろ過してランニングＢｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）とした。測定試料溶液は、ＬＰＳをこのランニングＢｕｆｆｅｒに溶解し調整し、ＥＴ測定を行った。ＬＰＳ水溶液１８０μｌを１２分間流したところ、得られた測定値は、ＬＰＳ濃度に比例しており、１０ｎｇ／ｍｌ以上の測定が可能であった。
【００２５】
【実験例２】（ＥＴ低濃度の測定）
実験例１のＥＴ測定の操作において、測定対象物を加えた後、ａｎｔｉ−ＥＴ抗体（ｎａｎｏＴｏｏｌｓ）の濃度が１０μｇ／ｍｌになるようにランニングＢｕｆｆｅｒを用いて調製したａｎｔｉ−ＥＴ抗体溶液１８０μｌを、１２分間かけて加えた後に得られる測定値は、ＬＰＳ濃度に比例しており、１０ｐｇ／ｍｌ以上の測定が可能であった（図１）。
【００２６】
【実験例３】（ＥＴ低濃度の測定）
実験例２のＥＴ測定の操作において、ａｎｔｉ−ＥＴ抗体溶液を加えた後、さらに、二次抗体（ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＩＧＭＡ））を１００倍希釈した溶液１８０μｌを１２分間加えた。この二次抗体を流した後に得られるシグナルは、ＬＰＳ濃度に比例し、１ｐｇ／ｍｌ以上の測定が可能であった。二次抗体としては、ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＡＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを用いた。
【００２７】
【実験例４】（再生）
実験例１〜３に共通して、ＬＰＳ等のＥＴ濃度の測定操作が終了後、使用済みのＥＴ測定用センサチップ（ＥＴ測定用センサ）に対して再生液（例えば１２ｍＭ水酸化ナトリウム＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を流すことで、繰り返して実験例１〜３の操作を行うことが可能であった。図２は実験例２で１０ｎｇ／ｍｌＬＰＳ、ａｎｔｉ−ＬＰＳの添加後、再生液として１２ｍＭＮａＯＨ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を流して再生した後、繰り返しＥＴの測定が可能であることを示した図である。同様に、再生液（１２ｍＭ水酸化ナトリウム＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を用いた場合には、１回目の測定と２回目の測定によって得られる測定値が約１／２となったが、その後は一定値となり繰り返し測定が可能であった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のＥＴ測定用センサは、ＥＴと特異的に結合するＰＭＸ等をＳＰＲ測定用担体（ＳＰＲセンサチップ）に固定化したものであり、サンプルにＥＴが含まれている場合、センサチップ上のＰＭＸ等によってＥＴが捕捉され、その結果センサ表面の状態が変化することを利用した、ＥＴのＳＰＲによる測定手段を提供するものである。また、本ＥＴ測定用センサは、ＥＴの測定終了後に再生液を用いることで、連続測定が可能である。本発明を用いたＥＴ測定は簡便で、かつ、連続測定が可能である効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例２でＬＰＳ、ａｎｔｉ−ＥＴを流した後の、ＬＰＳ濃度と測定値の関係、及び、実験例３で、さらにａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ抗体を用いた時のＬＰＳ濃度と測定値の関係を示した図である。
【図２】実験例２で１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、ａｎｔｉ−ＬＰＳの添加後、１２ｍＭＮａＯＨ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の再生液を流し繰り返し再生した場合の測定値を示す。
【図１】
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【図２】
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