(57)【要約】【課題】食経験が豊富なサッカロミセス・セレビシエに属し、遺伝子組換え手法を用いることなく、グルタチオンを今までにない高力価（乾燥重量当り５重量％以上のグルタチオン含有）で生産可能とした酵母菌株を得て、該菌株を培養することにより、安全イメージの高い食品、医薬品、化粧品の原料を安価に供給する。【解決手段】サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、遺伝子操作技術を用いずに、突然変異の操作を加えた菌株をスクリーニングすることにより、グルタチオンを乾燥菌体当り５重量％以上含有する遺伝子組換体でない酵母を得、該酵母を親株として培養し、所望の用途に用いる。特に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２、Ｐ−１９０７３、Ｐ−１９０７４からなる群から選出された一種又は２種以上を用いる事が有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、遺伝子操作技術を用いずに得た、グルタチオンを乾燥菌体当り５重量％以上含有する遺伝子組換体でない酵母。
【請求項２】
酵母菌株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２、Ｐ−１９０７３、Ｐ−１９０７４からなる群から選出された一種又は２種以上であることを特徴とする請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）で３０℃、２４時間培養した時にグルタチオンを乾燥菌体当り５重量％以上となる、遺伝子操作技術を用いずに得た酵母。
【請求項４】
親株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２、Ｐ−１９０７３、Ｐ−１９０７４からなる群から選出された一種又は２種以上であることを特徴とする請求項３に記載の酵母。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載された酵母を含有する食品、又は医薬品、又は化粧品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
食品又は医薬品又は化粧品として有用なグルタチオン、グルタチオン高含有酵母エキス、グルタチオン高含有酵母菌体を生産するのに有用な菌株の取得に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グルタチオンは、システイン、グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝など、生体にとって重要な化合物である。これまでグルタチオンは医薬品用に主に有機合成法で生産されているが、食品用として酵母の培養により生産する方法も行なわれてきた。含量を増加させる試みとしてこれまで、培地中に原料となるシステイン、グルタミン酸、グリシンを添加して培養する方法（特許文献１、２、３、４）や、亜鉛を添加することでグルタチオンを高含有させる方法（特許文献５）などの工夫が報告されている。しかし、培地中に添加するシステインが高価であったり、また亜鉛等の添加も安全性の観点からすると必ずしも好ましい方法とは言えない。一方、菌そのものを改良して高含量蓄積可能な菌株に作り上げる報告もある。例えば、突然変異処理により、キャンディダ属酵母からエチオニンおよび亜硫酸塩を含む培地に生育可能な株を選択する方法（特許文献６、７，８）、グルタチオン合成に関与する酵素を遺伝子組替えにより酵母菌体導入する方法（特許文献９，１０、１１、１２）、突然変異処理により、サッカロミセス属酵母から亜鉛耐性株を選択する方法（特許文献１３）、遺伝子導入によりγ−グルタミルシステイン合成遺伝子を導入したサッカロミセス属酵母から突然変異処理により、アザセリン耐性株を選択する方法（特許文献１４）、過酸化物耐性を付与する遺伝子を導入し、過酸化物耐性にしたサッカロミセス属酵母を得る方法（特許文献１５）などである。同じ酵母でも、ビール、日本酒、ワインなどの醸造やパンの製造に古くから使用されてきたサッカロミセスセレビシエに属する菌株とそれ以外のキャンディダ属酵母などでは食経験の違いに基づく消費者の安全性のイメージが大きく違うため、上記のキャンディダ属酵母を利用した報告もこの点で問題が残る。また食品製造に関しては、遺伝子組替え技術を用いることは一般的に未だ一般国民からの根強い反発があり、その技術の利用は極めて限られた範囲でしか行なわれていないのが現状である。従って上記報告のうち、遺伝子組み替え（導入）法を使用した方法は食品製造の分野では使用が困難である。また上記の中で遺伝子導入していないサッカロミセス属酵母を使用した報告（特許文献１６）はあるが、乾燥菌体当り３％程度しか含有せず、含量的にまだまだ不充分であった。
【０００３】
以上のように、サッカロミセス・セレビシエに属する菌株から遺伝子組み替え手法を用いずにグルタチオンを乾燥菌体当り５％以上生産できる菌株はこれまで存在しなかった。
【０００４】
【特許文献１】
特開昭４７−１６９９０号公報
【０００５】
【特許文献２】
特開昭４８−９２５７９号公報
【０００６】
【特許文献３】
特開昭５１−１３９６８６号公報
【０００７】
【特許文献４】
特開昭５３−９４０８９号公報
【０００８】
【特許文献５】
特開２０００−２７９１６４号公報
【０００９】
【特許文献６】
特開昭５９−１５１８９４号公報
【００１０】
【特許文献７】
特開平０３−１８８７２号公報
【００１１】
【特許文献８】
特開平１０−１９１９６３号公報
【００１２】
【特許文献９】
特開昭６１−５２２９９号公報
【００１３】
【特許文献１０】
特開昭６２−２７５６８５号公報
【００１４】
【特許文献１１】
特開昭６３−１２９９８５号公報
【００１５】
【特許文献１２】
特開平４−１７９４８４号公報
【００１６】
【特許文献１３】
特開平０２−２９５４８０号公報
【００１７】
【特許文献１４】
特開平６−７０７５２号公報
【００１８】
【特許文献１５】
特開平８−７０８８４号公報
【００１９】
【特許文献１６】
特開平０２−２９５４８０号公報
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
食経験が豊富なサッカロミセスセレビシエに属し、遺伝子組換え手法を用いることなく、グルタチオンを今までにない高力価（乾燥菌体当り５重量％以上の含量）で生産可能とした酵母菌株を得て、該菌株を培養することにより、安全イメージの高い食品、医薬品、化粧品を安価に供給する。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、遺伝子操作技術を用いずに、安全なグルタチオン高含有酵母菌体が取得可能であると考え、鋭意研究した結果、遺伝子組換体でない酵母でも乾燥菌体当り５重量％以上のグルタチオンを含む酵母菌体が得られ、食品、医薬品、化粧品用として安全で有利な素材が製造可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
即ち、本発明の第１は、サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、遺伝子操作技術を用いずに得た、グルタチオンを乾燥菌体当り５重量％以上含有する遺伝子組換体でない酵母に関する。好ましい実施態様としては、上記酵母菌株がＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２、Ｐ−１９０７３、Ｐ−１９０７４（これら３つの菌株は、２００２年１０月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）に寄託されている）からなる群から選出された一種又は２種以上であることを特徴とする上記に記載の酵母に関する。本発明の第２は、サッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）で３０℃、２４時間培養した時にグルタチオンを乾燥菌体当り５重量％以上となる、遺伝子操作技術を用いずに得た酵母に関する。本発明の第３は、上記記載の酵母を含んでなる食品に関する。
【００２３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明者らはすでに醸造業や製パン業などで使用されて食経験が豊富で安全性が実証されているサッカロミセス・セレビシエに属する菌株を親株とし、遺伝子操作技術を用いずに、グルタチオン高生産菌株をスクリーニングしようと試みた。スクリーニングの方法は特に限定しないが、目的の菌株を得るための効率アップの手段としては、スクリーニングには出来るだけ簡便で精度が良い方法を採用することと、時間をかけても目的の菌株が見つからない場合は必要に応じて突然変異の操作を加えることが重要である。
【００２４】
即ち、親株をそのまま、又はＵＶ、エチルメタンスルフォン酸、ニトロソグアニジン、或いはその他放射線等通常変異操作に使われる変異誘発剤による変異操作を行った後、滅菌水等の希釈液で希釈して寒天プレート（例えばＹＰＤ；イーストエキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％、寒天２％）に塗布するか液体培地で希釈培養するなどして単一細胞より増殖した菌株集団（コロニー）を多数集め、その培養菌体の抽出液中のグルタチオン濃度を測定し、高力価を示す菌株を選別し、その株を親株としてそこからさらに同様の操作を繰り返して乾燥菌体当たり５重量％以上という高い力価を示す健康食品用のグルタチオン生産菌を得た。ここで、希釈液は特に限定はないが、滅菌水、滅菌生理食塩水や滅菌ＹＰＤ培地などが例示でき、その他希釈用に使用可能な液体であれば何でも使用できる。
【００２５】
上記スクリーニングにおいて、簡便性と精度を満足させるという観点から鋭意検討した結果、培養、菌体量測定、グルタチオンの抽出と測定を次のような小スケールで簡便な方法に従い行った。すなわち、培養は試験管培養で行い、菌体量は乾燥重量を測定する代わりに培養液の一部を一定量取り出し（０．１ｍｌ程度で良い）、一定量の水で希釈して吸光度（ＯＤ６６０値など）を測定し、予め求めておいた吸光度と菌体乾燥重量との関係（予備実験でいろいろな培養段階で測定したＯＤ６６０値と、その培養液を一定量取って遠心分離で集菌し、それから水洗浄し、１０５℃で５時間以上加熱して求めた乾燥重量との関係を最小二乗法により求めた式）より菌体量（乾燥重量）を計算する。グルタチオンの抽出は、ＯＤ６６０値測定のために採取した残りの培養ブロス中の菌体を充分に水洗後、４０％エタノール水溶液で縣濁し、３０℃で、１時間保温する。抽出液（遠心分離で菌体を沈殿した上清液）中の、グルタチオン含量をアロキサン法で測定した。ここでいうアロキサン法とは、０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を０．４ｍｌ、サンプル（エタノール抽出液）を４０μｌ、Ｍ／３０アロキサン水溶液を１．２ｍｌ加えて攪拌し、３０℃で６分間反応させた後、１ＮのＮａＯＨを１ｍｌ加えて攪拌して反応を終了させ、３０５ｎｍの吸光度を測定するというものである。念のため、アロキサン水溶液の代わりに水１．２ｍｌを加えたものでバックグラウンドを測定しておく。グルタチオン標準液としてはグルタチオン標品を４０％エタノールに０〜１ｇ／ｍｌの間で２００μｇ／ｍｌ毎に６段階程度希釈したものを用いる。
【００２６】
ある程度スクリーニングが進んだ段階で選択株の力価を再確認する段階では、試験管培養した液をさらに５００ｍｌ容量の坂口フラスコに移し、５０ｍｌの糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）において３０℃で２４時間培養し、菌体を集め、水で洗浄し、一部をとり、上と同様に抽出、グルタチオンを測定し、残りの菌体を１０５℃で４時間以上乾燥させ、乾燥菌体重量を測定すると良い。
【００２７】
グルタチオンの測定方法としてはここではアロキサン法を用いた例を示すが、精度と操作性に問題がなければ酵素法、ヨード滴定法、液体クロマトグラフ法等その他の方法も使用可能である。
【００２８】
上記のようにして得た本発明の酵母は、その菌株を培養することにより、安全イメージの高い食品、医薬品、化粧品として用いることができる。食品の例としては、該酵母やその菌体抽出エキスを含有した飲料水、錠剤、顆粒、粉末、カプセル状の健康食品、調味料、タレやソース類、マーガリンや味噌その他のペースト状食品、かまぼこなどの練り製品、寒天やゼリーを含む菓子又は栄養補給用の半固形食品、ビスケット、チョコレート、ガム類、製パン用イースト又は添加剤等が挙げられる。医薬品の例としては、肝機能改善薬、解毒剤、抗アレルギー薬、皮膚用軟膏、白内障や角膜炎、角膜損傷などの眼科用薬、等が挙げられる。化粧品の例としては、該酵母の菌体抽出エキスを含有した美白用、又は日焼けや炎症後の色素沈着防止用の化粧水、乳液、クリーム等が挙げられる。これらの用途には、該酵母を生菌で使用しても良いし，滅菌及び酵素処理菌体、または菌体抽出エキスとしても良い。さらに応用としては動物や魚貝類用飼料等も考えられる。
【００２９】
【実施例】
以下に、実施例にて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
（比較例１）
パン酵母（商品名：カネカイーストレッド、鐘淵化学工業（株）製）を糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖蜜を糖として重量換算で４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に植菌して３０℃、２４時間培養した。培養後の菌体量はＯＤ６６０値で測定し、予め用意しておいたＯＤ６６０値と乾燥菌体量との関係式から乾燥菌体量を計算したところ、グルタチオン含量は乾燥菌体当たり０．８１重量％であった（表１）。
【００３１】
【表１】
2004180509.tif 000002
【００３２】
（実施例１）
パン酵母（商品名：カネカイーストレッド、鐘淵化学工業（株）製）を保存スラントからＹＰＤ液体培地（培地１Ｌ当たりイーストエキス１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、グルコース２０ｇ）５ｍｌ入り試験管に１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とう培養後の培養液の一部を滅菌した生理食塩水で希釈し、ＵＶ照射（死滅率９９％以上）した。それをＹＰＤプレートに塗布し、３０℃、３日間培養後出現してくるコロニーを保存用プレートに移して保存するとともに糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖蜜を糖として重量換算で４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５ｍｌ入り試験管に植菌して３０℃、２４時間培養した。培養後の菌体量はＯＤ６６０値で測定し、予め用意しておいたＯＤ６６０値と乾燥菌体量との関係式から乾燥菌体量を計算した。グルタチオン含量は培養ブロスを水で洗浄後、遠心ペレットを４０％エタノール液で３０℃、１時間抽出し、アロキサン法で測定した。増殖及びグルタチオン含量において優れた菌株を選別し、それを新たな親株として、そのまま、又はＵＶ照射した後、同様な操作を繰り返した。こうしてスクリーニングを繰り返した結果、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２株を見出した。それを糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖蜜を糖として重量換算で４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に植菌して３０℃、２４時間培養した。培養後に乾燥（１０５℃、５時間）菌体当りのグルタチオン含量を測定したところ、グルタチオン含量は乾燥菌体当たり７．３８重量％であった（表１）。
【００３３】
（実施例２）
実施例１においてスクリーニングを繰り返した結果、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７３を見出し、それを糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖蜜を糖として重量換算で４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に植菌して３０℃、２４時間培養した。培養後の菌体量はＯＤ６６０値で測定し、予め用意しておいたＯＤ６６０値と乾燥菌体量との関係式から乾燥菌体量を計算したところ、グルタチオン含量は乾燥菌体当たり６．６３重量％であった（表１）。
【００３４】
（実施例３）
実施例１においてスクリーニングを繰り返した結果、ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７４を見出し、それを糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖蜜を糖として重量換算で４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）に植菌して３０℃、２４時間培養した。培養後の菌体量はＯＤ６６０値で測定し、予め用意しておいたＯＤ６６０値と乾燥菌体量との関係式から乾燥菌体量を計算したところ、グルタチオン含量は乾燥菌体当たり７．２５重量％であった（表１）。
【００３５】
（実施例４）
スクリーニング株を糖蜜培地でのジャー培養を行った結果を以下に示す。ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２株を糖蜜培地（培地１Ｌ当たり、糖蜜を糖として重量換算で４０ｇ、尿素３ｇ、硫酸アンモニウム０．８ｇ、リン酸水素２アンモニウム０．４ｇ）５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）で６本培養したものを種母とし、５Ｌ容ミニジャーファーメンターに、糖蜜３６ｇ（糖換算）、尿素２．４ｇ、リン酸２．４ｇを含む培地１．７Ｌを加えて殺菌し、種母の全量を加えて２Ｌとした後、糖蜜２７０ｇ（糖換算）を流加方式で加えながら、温度３０〜３５℃、ｐＨ５〜５．５（安水でコントロール）、撹拌速度６００ｒｐｍ、通気量２Ｌ／分で１４時間培養を行った。得られた培養液を遠心分離、水洗後、ヌッチェろ過して酵母菌体を得た。得られた菌体は２６６．４ｇ（湿重量）、グルタチオン力価は１０５℃で５時間乾燥した菌体当り６．６１重量％であった。
【００３６】
（実施例５）
グルコースを炭素源とした培地を用いてスクリーニング株をジャー培養した結果を示す。ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７２株を表２に示すグルコース培地５０ｍｌ入り坂口フラスコ（５００ｍｌ容量）１０本で２０時間培養したものを種母とし、グルコース培地３Ｌの入った５Ｌジャー２台にそれぞれ坂口フラスコ５本分の種母を加え、温度３１〜３５℃、ｐＨ下限５．０（安水でコントロール）、通気量２Ｌ／分、攪拌６００ｒｐｍで２４時間培養した。得られた菌体は乾燥重量にして４９．３ｇ、グルタチオン含量は乾燥菌体当たり５．０７重量％であった。
【００３７】
実施例１、実施例４、実施例５を比較する事で、同じ菌株を培養した時でも培地が異なれば、乾燥菌体当たりのグルタチオン含量が変わる事がわかる。
【００３８】
【表２】
2004180509.tif 000003
【００３９】
（実施例６）
実施例４で得た菌体を凍結乾燥機（東京理科機械ＦＤ−１）で凍結乾燥し、得られた乾燥菌体をミルにかけ、均一粉末を得た。この粉末を打錠機（畑鉄工所ＨＵ−Ｔ）にかけ、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤を作製した。
【００４０】
【発明の効果】
食経験の豊富な安全な酵母菌株由来で遺伝子組替え操作を用いることなく作成され、菌体中に少なくとも５重量％のグルタチオンを含有する本菌株を培養することにより、グルタチオンリッチで安全な食品、又は医薬品又は化粧品が供給可能となる。