(57)【要約】【課題】濾過性能の優れた濾過膜を提供する。【解決手段】多孔膜が有する孔の内面に酵素を固定し、前記酵素による基質の反応生成物である高分子性化合物を前記酵素に結合した。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔膜が有する孔の内面に酵素を固定し、前記酵素による基質の反応生成物である高分子性化合物を前記酵素に結合したことを特徴とする酵素固定膜。
【請求項２】
前記酵素を吸着によって前記孔の内面に固定したことを特徴とする請求項１に記載の酵素固定膜。
【請求項３】
前記酵素を、前記孔の内面に導入したグラフト高分子鎖を介して固定したことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の酵素固定膜。
【請求項４】
前記酵素を、デキストランシュークラーゼ，スターチホスホリラーゼ，デキストリンデキストラーゼ，アミロシュークラーゼ，イヌシュークラーゼ，レバンシュークラーゼ，グリコーゲン合成酵素，セルロース合成酵素，キチン合成酵素，及びグルカン合成酵素のうちの少なくとも１種としたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の酵素固定膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、濾過性能の優れた濾過膜に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多孔体等の担体に酵素を固定する技術は古くから知られており、例えば、千畑一郎編「固定化生体触媒」（株式会社講談社サイエンティフィック、１９８６年発行）や野本正雄著「酵素工学」（株式会社学会出版センター、１９９３年発行）等に記載されている。
【０００３】
また、多孔体の有する孔の内面に導入したグラフト高分子鎖に酵素を固定することにより（すなわち、酵素をグラフト高分子鎖を介して多孔体に固定することにより）、多孔体へ固定する際に生じる酵素の失活を低減できることも報告されている（特開平９−１９１８７７号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの例は全て、固定した酵素を反応触媒として利用するものであって、膜に酵素を固定することにより濾過性能の向上を図った例は知られていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、多孔性濾過膜が有する孔の内面に特定の特性を有する酵素（酵素による基質の反応生成物である高分子性化合物を該酵素自身に結合する特性を有する酵素）を固定することにより、濾過膜の濾過性能を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明に係る請求項１の酵素固定膜は、多孔膜が有する孔の内面に酵素を固定し、前記酵素による基質の反応生成物である高分子性化合物を前記酵素に結合したことを特徴とする。
また、本発明に係る請求項２の酵素固定膜は、請求項１に記載の酵素固定膜において、前記酵素を吸着によって前記孔の内面に固定したことを特徴とする。
【０００７】
さらに、本発明に係る請求項３の酵素固定膜は、請求項１又は請求項２に記載の酵素固定膜において、前記酵素を、前記孔の内面に導入したグラフト高分子鎖を介して固定したことを特徴とする。
さらに、本発明に係る請求項４の酵素固定膜は、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素固定膜において、前記酵素を、デキストランシュークラーゼ，スターチホスホリラーゼ，デキストリンデキストラーゼ，アミロシュークラーゼ，イヌシュークラーゼ，レバンシュークラーゼ，グリコーゲン合成酵素，セルロース合成酵素，キチン合成酵素，及びグルカン合成酵素のうちの少なくとも１種としたことを特徴とする。
【０００８】
このような構成であれば、酵素を固定することにより濾過膜の表面が改質されるので、濾過膜の濾過性能が向上する。
以下に、本発明の酵素固定膜について詳細に説明する。
まず、多孔膜について説明する。本発明に適用可能な多孔膜の種類は特に限定されるものではなく、１ｎｍ〜数十μｍ程度の直径の孔を有する多孔膜を好ましく用いることができる。すなわち、限外濾過膜や精密濾過膜と同程度の直径の孔を有する多孔膜を好ましく用いることができる。
【０００９】
また、多孔膜の形状も特に限定されるものではなく、中空糸状，平膜状，管状等のいずれでも差し支えない。ただし、単位容積当たりに充填できる濾過膜の面積を大きくとることができ単位容積当たりの濾過能力を高くすることができるため、中空糸状の膜が最も好ましい。
さらに、多孔膜の素材についても特に限定されるものではないが、静電相互作用により酵素を直接的に吸着させ多孔膜に固定することができるので、荷電性の素材が好ましい。多孔膜はその全体が荷電性の素材で構成されていてもよいし、荷電性の素材を混合した素材で構成されていてもよい。また、グラフト高分子鎖の導入が容易であることから、ポリエチレン，ポリプロピレン等のポリオレフィンやポリフッ化ビニリデンが特に好ましい素材である。
【００１０】
次に、酵素について説明する。固定する酵素は、該酵素による基質の反応生成物である高分子性化合物（分子量１０００以上）を該酵素自身に結合（共有結合）する特性を有していることが必要である。このような酵素の例としては、デキストランシュークラーゼ，スターチホスホリラーゼ，デキストリンデキストラーゼ，アミロシュークラーゼ，イヌシュークラーゼ，レバンシュークラーゼ，グリコーゲン合成酵素，セルロース合成酵素，キチン合成酵素，及びグルカン合成酵素等をあげることができる。
【００１１】
これら酵素のうちの１種又は２種以上を、多孔膜が有する孔の内面に固定し、そこに該酵素の基質を供給すると、基質は酵素により高分子性化合物に転化される。そして、生成した高分子性化合物は前記酵素と結合し固定される。このようにして、酵素反応生成物である高分子性化合物が酵素を介して固定された多孔膜が形成される。
【００１２】
このとき、固定した酵素への基質の供給量を制御することによって、酵素に結合・固定される高分子性化合物の分子量を制御することができる（基質の供給量を増やせば、高分子性化合物の分子量が大きくなる）。多孔膜が有する孔の内面に固定された酵素に高分子性化合物が結合すると、孔の内部に高分子性化合物が充填されることとなるが、このようにして高分子性化合物の分子量を制御すれば、高分子性化合物による孔の充填度合いを制御することができる。つまり、固定した酵素への基質の供給量を制御することにより、得られる多孔膜の孔の直径を制御することが可能である。
【００１３】
酵素を固定する位置は、多孔膜の表面近傍（例えば、中空糸状の多孔膜であれば、外表面近傍又は内表面近傍）でもよいし、多孔膜の内部でもよい。ただし、酵素及び高分子性化合物が固定されると孔の直径が小さくなるため、濾過抵抗が高くなってしまう傾向がある。よって、酵素を固定する位置は表面近傍であることが好ましい。また、多孔膜の有する２つの表面（例えば、中空糸状の多孔膜であれば、外表面及び内表面）のうち一方のみに、酵素の固定を行うことが好ましい。
【００１４】
例えば、多孔膜の孔の内面に酵素としてデキストランシュークラーゼを固定し、基質であるショ糖を供給すると、ショ糖はデキストランシュークラーゼによりデキストラン（高分子性化合物）に転化する。そして、生成したデキストランは酵素に結合し固定される。このようして、デキストランシュークラーゼを介してデキストランが固定された多孔膜を得ることができる。
【００１５】
デキストランは水溶性であるので、水と接触しても溶解しないように膜表面に固定することは、通常は困難である。しかしながら、上記のような膜は、デキストランがデキストランシュークラーゼを介して膜に固定されているので、水に不溶である。
このようにデキストランを固定することにより、多孔膜が有する孔を小径化し且つ親水性化（汚染されにくくする）することができるから、多孔膜の表面を改質して濾過性能を大幅に向上させることができる。
【００１６】
次に、多孔膜への酵素の固定方法について説明する。酵素の固定方法としては、共有結合による固定や吸着による固定など、既知の手法を採用することができる。例えば、前述の千畑一郎編「固定化生体触媒」や野本正雄著「酵素工学」に記載の方法等である。ただし、固定時に生じる酵素の失活を低減させるためには、吸着による固定方法、特に静電相互作用による吸着固定方法が好ましい。
【００１７】
なお、静電相互作用による吸着固定方法をはじめとする吸着固定法は、酵素の固定力が比較的弱いため、固定した酵素の脱着が生じやすい。この欠点を防ぐためには、酵素の吸着に寄与する官能基を有するグラフト高分子鎖を多孔膜が有する孔の内面に固定し、前記官能基によってグラフト高分子鎖に酵素を吸着して固定する方法が特に有効である。このような方法であれば、酵素が前記官能基を有するグラフト高分子鎖に多点において吸着されるから、酵素の固定力が向上する。
【００１８】
また、このようなグラフト高分子鎖を用いる方法は、多孔膜の孔の直径を制御することが可能であるという利点も有している。前述したように酵素及び高分子性化合物が固定されると孔の直径が小さくなるが、グラフト高分子鎖を介して酵素を固定すると、酵素は多孔膜の孔の内面に対し多層状に吸着する場合があることが知られている（Ｓ．Ｔｓｕｎｅｄａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，６８９（１９９５）２１１−２１８やＳ．Ｍａｔｏｂａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１３（１９９５）７９５−７９７等）。このような現象を利用して吸着する酵素の層数を制御し、高分子性化合物による孔の充填度合いを制御すれば、得られる濾過膜の孔の直径を制御することが可能である。
【００１９】
酵素を吸着し固定するためには、グラフト高分子鎖は、下記の（Ａ）群及び（Ｂ）群のそれぞれから選ばれた１種以上の官能基を有していることが好ましい。
（Ａ）群：水酸基，ヒドロキシアルキル基，ジオール基，ピロリドニル基
（Ｂ）群：スルホン基，オキソスルホン基，メチルスルホン基，エチルスルホン基，リン酸基，ホスホン酸基，カルボキシル基，１級アミノ基，２級アミノ基，３級アミノ基，４級アミノ基，４級アンモニウム塩基，トリメチルアンモニウム塩基，アミドキシム基，イミノジ酢酸基，アルキル基，フェニル基
（Ａ）群の官能基は、吸着時の酵素の失活の低減に寄与する親水性官能基である。また、（Ｂ）群の官能基は、吸着に寄与する吸着性官能基である。（Ｂ）群に列挙した官能基の中で、スルホン基からトリメチルアンモニウム塩基までの官能基は静電相互作用による吸着を行う官能基であり、アミドキシム基及びイミノジ酢酸基はアフィニティ作用による吸着を行う官能基であり、アルキル基及びフェニル基は疎水性相互作用による吸着を行う官能基である。
【００２０】
次に、上記の（Ａ）群及び（Ｂ）群の官能基を有するグラフト高分子鎖を多孔膜へ導入し固定する方法について説明する。グラフト重合法としては、例えば、反応開始剤重合法や電離性放射線重合法を用いることができる。この場合、重合条件を適宜制御することによって、所望の重合度を得ることができる。電離性放射線重合法においては、紫外線，電子線，Ｘ線，α線，β線，及びγ線等の電離放射線を使用することができる。
【００２１】
このような方法により、例えば、エポキシ基を有する重合性単量体、親水性基を有する重合性単量体、静電相互作用による吸着を行う官能基（カチオン性解離基又はアニオン性解離基）を有する重合性単量体を重合し、多孔膜が有する孔の内面に結合することができる。エポキシ基は反応性が高いので、適当な試薬と反応させることによって、親水性官能基，静電相互作用による吸着を行う官能基（イオン交換基），疎水性相互作用による吸着を行う官能基，又はアフィニティ作用による吸着を行う官能基に変換することができる。
【００２２】
エポキシ基を有する重合性単量体として特に有用なものには、グリシジルメタクリレートやグリシジルアクリレートがある。
親水性基としては、例えば、水酸基，ヒドロキシアルキル基（アルキル基は好ましくは低級アルキル基である），ジオール基，及びピロリドニル基等があげられる。この中では、水酸基及びヒドロキシルアルキル基が特に好ましい。そして、このような親水性基を有する重合性単量体として特に有用なものには、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート，ヒドロキシプロピルアクリレート，ビニルピロリドン，ジメチルアクリルアミド，エチレングリコールメタクリレート，エチレングリコールアクリレート，エチレングリコールジメタクリレート，トリエチレングリコールジアクリレート，及びトリエチレングリコールメタクリレート等がある。この中では、ヒドロキシエチルメタクリレートが特に好ましい。
【００２３】
静電相互作用による吸着を行う官能基には、カチオン性解離基（対イオンがカチオンであるイオン交換基）とアニオン性解離基（対イオンがアニオンであるイオン交換基）とがある。
カチオン性解離基としては、例えば、カルボキシル基，スルホン基，リン酸基等があげられる。この中では、スルホン酸基及びカルボキシル基が特に好ましい。そして、このようなカチオン性解離基を有する重合性単量体として有用なものには、例えば、アクリル酸，メタクリル酸，アリルスルホン酸，ビニルスルホン酸，スチレンスルホン酸及びその塩、並びに２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等がある。
【００２４】
アニオン性解離基としては、例えば、４級アンモニウム塩基，アミノ基，メチルアミノ基，ジメチルアミノ基，及びジエチルアミノ基等のような１級〜３級アミノ基があげられる。この中では、４級アンモニウム塩基及びアミノ基が好ましい。そして、このようなアニオン性解離基を有する重合性単量体として有用なものには、例えば、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジエチルアミノメチルメタクリレート、ｔ−ブチルアミノエチルメタクリレート、ｔ−ブチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、アクリルアミド、アリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド等がある。この中では、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩及びジエチルアミノエチルメタクリレートが特に好ましい。
【００２５】
なお、アニオン性解離基に変換可能な基を有する重合性単量体も使用可能である。このような重合性単量体としては、クロロメチルスチレンがあげられる。
本発明におけるグラフト高分子の重合性単量体は、１種以上の親水性基を有していてもよい。また、１種以上のカチオン性解離基又はアニオン性解離基を有していてもよい。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明に係る酵素固定膜の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、本実施形態は本発明の一例を示したものであって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
〔実施例１〕
ポリエチレン製多孔中空糸膜（外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、平均孔径０．３μｍ、空孔率７０％）に電子線を２００ｋＧｙ照射した後、グリシジルメタクリレートの１０質量％メタノール溶液に浸漬してグリシジルメタクリレートのグラフト重合を行った。このとき、多孔中空糸膜の重量増加率は１３０％であった。
【００２７】
このようにしてグリシジルメタクリレートのグラフト重合体を孔の内面に固定した膜を、エタノールアミンに３０℃で２４時間浸漬した。これにより、グラフト高分子鎖に、アニオン性解離基である２−ヒドロキシエチルアミノ基が導入された。
さらに、この膜にデキストランシュークラーゼ溶液（酵素）を内表面側から透過させた。すると、前記グラフト高分子鎖にデキストランシュークラーゼが固定され、膜１グラム当たり８０ユニットのデキストランシュークラーゼが吸着固定された膜が得られた。
【００２８】
このデキストランシュークラーゼを固定した膜に４ｇ／Ｌのショ糖溶液（基質）を内表面側から透過すると、ショ糖はデキストランシュークラーゼによりデキストラン（高分子性化合物）に転化し、生成したデキストランはデキストランシュークラーゼに結合し固定された。以上のような操作により、酵素を固定した濾過膜が得られた。
【００２９】
膜の体積（中空部を除く体積）の１２倍量のショ糖水溶液を透過させた後に、圧力１００ｋＰａ、温度２３℃の条件で濾過膜の純水透過流束を測定したところ、ショ糖水溶液透過前に比べて純水透過流束が２０分の１に減少した。
そこで、ショ糖水溶液透過前後の膜の断面を電子顕微鏡で観察して比較した。その結果、図１から分かるように、ショ糖水溶液透過後の膜は、酵素反応により生成したデキストランが膜の表面（内表面）に堆積しているため孔の直径が小さくなっていた。なお、図１の（ａ）はショ糖水溶液透過前の膜の拡大断面図であり、（ｂ）はショ糖水溶液透過後の膜の拡大断面図である。また、符号１で示したものが、デキストランが堆積して形成された層である。
【００３０】
〔実施例２〕
実施例１と同様にして、ポリエチレン製多孔中空糸膜にグリシジルメタクリレートのグラフト重合体を放射線グラフト重合法によって固定し、エタノールアミノと反応させた。そして、デキストランシュークラーゼを膜１グラム当たり６０ユニット吸着固定し、ショ糖水溶液を内表面側から透過させた。
【００３１】
膜の外表面側から流出してきた液を採取し、酵素による反応生成物の一つであるフラクトース（ショ糖がデキストランに転化する際の反応副生成物）の濃度を測定して、膜に固定されたデキストラン量を算出した。その結果、１平方メートルあたり２７グラムであった。
また、膜の断面を電子顕微鏡で観察したところ、厚さ約４μｍのデキストラン堆積層が内表面に観察された。さらに、純水透過流束の測定結果及びハーゲン・ポアズイユの式から、膜が有する孔の直径が６０ｎｍに減少していることが分かった。
【００３２】
【発明の効果】
以上のように、本発明の酵素固定膜は、酵素の固定により濾過膜の表面が改質されているので、孔の直径が小さい、汚染されにくいなど、膜の濾過性能が優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の中空糸膜の拡大断面図である。
【符号の説明】
１　　デキストラン層
【図１】
2004073943.tif 000002