(57)【要約】　　　（修正有）【課題】マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム又はその断片のヌクレオチド配列及びその使用法の提供。【解決手段】マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の全ゲノムのヌクレオチド配列、該ゲノムのタンパク質コード断片、および該断片の発現を調節する任意の調節要素。伝染性の程度および毒性の特徴を決定する遺伝子の同定。前記ゲノムのヌクレオチド配列又はその断片を含む組成物、及び医学的診断、治療及び製薬開発におけるその使用を開示する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムまたはその断片のヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は分子生物学の分野に関する。本発明は、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）ゲノムのヌクレオチド配列またはその断片を含む組成物、および医学的診断、治療および製薬開発におけるその使用を開示する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
関連技術背景
マイコプラズマは、知られた最も小さな自由生活性細菌生物である（非特許文献１）。マイコプラズマは高等グラム−陽性細菌から遺伝要素を消失することにより進化してきたと考えられている（非特許文献２）。マイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍ．ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）は、そのゲノムの分子サイズが僅か５７０−６００ｋｐであると示されているので（非特許文献３；非特許文献４）、最小の自己複製性生体系であると広く考えられている。マイコプラズマは全て細胞壁を持たず、小さなゲノムおよび特徴的に低いＧ＋Ｃ含有量を有する（非特許文献５；非特許文献４）。マイコプラズマ・ジェニタリウムを含む幾つかのマイコプラズマは特殊化したコドン使用法を有し、それによってＵＧＡは停止コドンとして機能するよりむしろトリプトファンをコードする（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００３】
マイコプラズマは、ヒト、動物および植物の重要な病原体であることが広く知られている（非特許文献２）。マイコプラズマの代謝系は一般的に生合成的に不完全であり、ゆえに不可欠前駆体分子、すなわちアミノ酸、脂肪酸、およびステロールなどを得るために、宿主細胞に特徴的に接着することによって宿主細胞の微小環境に依存しているのである（非特許文献９）。
【０００４】
とりわけ、新たに発見された種であるマイコプラズマ・ジェニタリウムは、非淋菌性尿道炎に感染したヒト男性の尿道から１９８０年に初めて単離された病原病因性因子である（非特許文献１０；非特許文献１１）。マイコプラズマ・ジェニタリウムはまた、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の共単離物（ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅ）として肺炎患者の標本中にて同定されている（非特許文献１２）。マイコプラズマ・ジェニタリウムによる日和見感染はしばしばヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）に感染した個人に観察されている（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。マイコプラズマはまた、ＨＩＶ複製を増強させるかもしれない腫瘍壊死因子を含む様々なサイトカインを誘導することができる（非特許文献１６）。
【０００５】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの接着タンパク質と幾つかのヒトクラスＩＩ主要組織適合性複合タンパク質（ＨＬＡ）の並んだタンパク質との間に高いアミノ酸ホモロジーがあり、これはマイコプラズマ・ジェニタリウム感染が自己免疫メカニズムを引き起こし、それによって後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の免疫不全の特徴を更に悪化させるのに重要な役割を果たしているかもしれないことを示唆している（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。マイコプラズマ・ジェニタリウム抗原の幾つかに特異的なモノクローナル抗体を使用することによるマイコプラズマ・ジェニタリウム感染検出のための診断用イムノアッセイが開発されている（特許文献１）。
【０００６】
ゲノムの大きさが小さいために、マイコプラズマ・ジェニタリウムは宿主から独立した存在（ｈｏｓｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）に必要な遺伝子およびタンパク質生成物の最少数を決定するための有用なモデルを提供する。マイコプラズマ・ジェニタリウムは特徴的に塩基対数が少なく、Ｇ＋Ｃ含有量が少ないため、ＵＧＡトリプトファンコドンと相まって、従来技術によるシークエンシングに対して障害となっていた（非特許文献５；非特許文献２０；非特許文献２１）。マイコプラズマ・ジェニタリウムは、単一の環状染色体を持つ（非特許文献２０；非特許文献４）。マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムの特徴付けはまた、栄養要求性変異体の欠如、遺伝子交換系の欠如によっても妨害され、逆方向の遺伝学的アプローチを不可能にしている。それゆえ、マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムのシークエンシングは、どのようにしてマイコプラズマ・ジェニタリウムが様々な侵入性または免疫不全性の疾患を引き起こしあるいは助長するのか、およびマイコプラズマ感染に医学的に対処する最良の方法を理解する手立てとなるであろう。
【０００７】
パルスフィールドゲル電気泳動法の使用によるマイコプラズマの染色体の構造および遺伝子配列を特徴付けるこれまでの試み（非特許文献３；非特許文献２２）によれば、マイコプラズマが広範囲にわたる大きさのゲノムを持つということを示している。マイコプラズマ・ジェニタリウムの消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションは、よく知られたヒト病原体であるマイコプラズマ・ニューモニエに比較して、総体的に約６−８％の低いホモロジー値を示す（非特許文献２３）。しかしながら、マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびマイコプラズマ・ニューモニエの接着遺伝子間には高いホモロジーが報告されている（非特許文献２４）。よく知られた種であるマイコプラズマ・ニューモニエとの比較によるマイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムの特徴付けに関する初期の研究は、両種とも約５Ｋｂの染色体セグメントにかたまった３つのｒＲＮＡ遺伝子を持ち、古型的な原核生物の様式に組織された単一のオペロンを形成するが、各々の制限部位間に差異があることを示している（非特許文献２３）。
【０００８】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの制限酵素マッピングはゲノムが約６００Ｋｂであることを示す。単一のリボソームオペロンおよびＭｇＰａ細胞接着タンパク質（ｃｙｔａｄｈｅｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子を含む数種の遺伝子もまたマッピングされている（非特許文献２５；非特許文献１）。マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムの全ての制限酵素地図はまた、２０の重複したコスミドと１つのλクローンのきちんとしたライブラリーにてクローニングされている（非特許文献２６）。
【０００９】
マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムを特徴付けるためのランダムシークエンシング技術を使用する初期の研究は、４４の部分的に配列決定されたランダムクローンを得る結果となった；幾つかの長いオープンリーディングフレームもまた発見された（非特許文献２７）。５０８のランダムな未同定クローンのランダムシークエンシングを使用したその後の研究では、マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムの約１７％（１００，９９３ヌクレオチド）まで配列情報が集められた（非特許文献４）。配列情報は、マイコプラズマ・ジェニタリウムの小さなゲノムが様々な代謝過程に関与する多数の遺伝子を含むことを示している。該ゲノムは約３９０のタンパク質をコードすると推定され、それによってマイコプラズマ・ジェニタリウムがその限られたＤＮＡ量を非常に効率的に使用していることを示している（非特許文献４）。
【００１０】
マイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて同定された個々の遺伝子をシークエンシングし特徴付けるために幾つかの研究がなされている。とりわけ、マイコプラズマ・ジェニタリウムの医学的に重要な側面は、この生物の伝染性の程度および毒性の特徴を決定する遺伝子に関心を向けることを助長している。ＭｇＰａ接着遺伝子、すなわちマイコプラズマ・ジェニタリウムの表面細胞接着タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列およびそれから導びかれたアミノ酸配列は、完全な遺伝子が１５９，６６８Ｄａのタンパク質をコードする４，３３５ヌクレオチドを含むことを示している（非特許文献２８）。さらに、マイコプラズマ・ジェニタリウムのＭｇＰａ接着遺伝子のその後のヌクレオチドシークエンシングは、この重要な遺伝子の特殊なコドン順序を明らかにした（非特許文献２９）。ＭｇＰａ接着遺伝子はまた制限断片長多型を表すことが示されている（非特許文献３０）。よく知られ非常によく保存された原核生物の複製起点遺伝子（ｇｙｒＡ）とのヌクレオチドホモロジーがマイコプラズマ・ジェニタリウムに関して言及されている（非特許文献２）。その非常によく保存された原核生物の延長因子であるＴｕ（ｔｕｆ遺伝子によりコードされる）がマイコプラズマ・ジェニタリウムについて言及およびシークエンシングされ、約３９３アミノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むことが見いだされた（非特許文献３１）。マイコプラズマ・ジェニタリウムのｔｕｆ遺伝子はまた開始コドンに先立つシャイン・ダルガーノ配列（リボソーム結合部位）以外のシグナルを使用すると決定されている（非特許文献３２）。
【００１１】
【特許文献１】
米国特許第５，１５８，８７０号明細書
【非特許文献１】
コルマン（Ｃｏｌｍａｎ，　Ｓ．　Ｄ．）ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，　１９９０，４：　ｐ．６８３−６８７
【非特許文献２】
ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ，　Ｃ．　Ｃ．）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，　１９９４，　１７６：　ｐ．５８１４−５８１９
【非特許文献３】
パイル（Ｐｙｌｅ，　Ｌ．　Ｅ．）ら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，　１９８８，　１６（１３）：　ｐ．６０１５−６０２５
【非特許文献４】
ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，　Ｓ．　Ｎ．）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，　１９９３，　１７５：　ｐ．７９１８−７９３０
【非特許文献５】
レイジン（Ｒａｚｉｎ，　Ｓ．）ら、“Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ”，　１９８５，　４９（４）：　ｐ．４１９−４５５
【非特許文献６】
イナミネ（Ｉｎａｍｉｎｅ，　Ｊ．　Ｍ．）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，　１９９０，　１７２：　ｐ．５０４−５０６
【非特許文献７】
タナカ（Ｔａｎａｋａ，　Ｊ．　Ｇ．）ら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，　１９９１，　　１９：　ｐ．６７８７−６７９２
【非特許文献８】
ヤマオ（Ｙａｍａｏ，　Ｆ．　Ａ．）ら、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ”，　１９８５，　８２：　ｐ．２３０６−２３０９
【非特許文献９】
ベースマン（Ｂａｓｅｍａｎ，　Ｊ．　Ｂ．）、“マイコプラズマ・セル・メンブレンズ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）”、２０巻、ザ・プレナム・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８７
【非特許文献１０】
タリー（Ｔｕｌｌｙ，　Ｊ．　Ｇ．）ら、“Ｌａｎｃｅｔ”，　１９８１，　１：　ｐ．１２８８−１２９１
【非特許文献１１】
タリー（Ｔｕｌｌｙ，　Ｊ．　Ｇ．）ら、“Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，　１９８３，　３３：　ｐ．３８７−３９６
【非特許文献１２】
ベースマン（Ｂａｓｅｍａｎ，　Ｊ．　Ｂ．）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”，　１９８８，　２６：　ｐ．２２６６−２２６９
【非特許文献１３】
ロー（Ｌｏ，　Ｓ．　−Ｃ．）ら、“Ａｍｅｒ．　Ｊ．　Ｔｒｏｐ．　Ｍｅｄ．　Ｈｙｇ．　”，　１９８９，　４１：ｐ．６０１−６１６
【非特許文献１４】
ロー（Ｌｏ，　Ｓ．　−Ｃ．）ら、“Ａｍｅｒ．　Ｊ．　Ｔｒｏｐ．　Ｍｅｄ．　Ｈｙｇ．　”，　１９８９，　４１：ｐ．６０１−６１６
【非特許文献１５】
ササキ（Ｓａｓａｋｉ，　Ｙ．）ら、“ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ．　Ｈｕｍ．　Ｒｅｔｒｏｖ．　”，　１９９３，　９（８）：　ｐ．７７５−７８０
【非特許文献１６】
チャウドハリー（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，　Ｉ．　Ｈ．）ら、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ”，　１９９０，　１７０：　ｐ．１３６５−１３７０
【非特許文献１７】
モンタニエー（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ，　Ｌ．）ら、“Ｃ．　Ｒ．　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐａｒｉｓ”，　１９９０，　３１１（３）：　ｐ．４２５−４３０
【非特許文献１８】
ルート−バーンスタイン（Ｒｏｏｔ−Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，　Ｒ．　Ｓ．）ら、“Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，　１９９１，　１４２：　ｐ．５１９−５２３
【非特許文献１９】
ビセット（Ｂｉｓｓｅｔ，　Ｌ．　Ｒ．）、“Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ”，　１９９２，　１４：　ｐ．１６７−１６８
【非特許文献２０】
コルマン（Ｃｏｌｍａｎ，　Ｓ．　Ｄ．）ら、“Ｇｅｎｅ”，　１９９０，　８７：　ｐ．９１−９６
【非特許文献２１】
ディビッグ（Ｄｙｂｖｉｇ，　Ｋ．）、１９９２：マニロフ（Ｍａｎｉｌｏｆｆ，　Ｊ．）（編）“マイコプラズマズ：モレキュラー・バイオロジー・アンド・パソジェネシス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．）”、アメリカン・ソサイエティ・オブ・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン，Ｄ．Ｃ．中のジーン・トランスファー（Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、ｐ．３５５−３６２
【非特許文献２２】
ネイマーク（Ｎｅｉｍａｒｋ，　Ｈ．　Ｃ．）ら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，　１９９０，　１８（１８）：　ｐ．５４４３−５４４８
【非特許文献２３】
ヨゲフ（Ｙｏｇｅｖ，　Ｄ．）ら、“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，　１９８６，　３６（３）：　ｐ．４２６−４３０
【非特許文献２４】
ダロ（Ｄａｌｌｏ，　Ｓ．　Ｆ．）ら、“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”，　１９８９，　６：　ｐ．６９−７３
【非特許文献２５】
スー（Ｓｕ，　Ｃ．　Ｊ．）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”，　１９９０，　１７２：　ｐ．４７０５−４７０７
【非特許文献２６】
ルシエール（Ｌｕｃｉｅｒ，　Ｔ．　Ｓ．）ら、“Ｇｅｎｅ”，　１９９４，　１５０：　ｐ．２７−３４
【非特許文献２７】
ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，　Ｓ．　Ｎ．）ら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｖｉｅｗ”，　１９９１，　１９：　ｐ．６０２７−６０３１
【非特許文献２８】
ダロ（Ｄａｌｌｏ，　Ｓ．　Ｆ．）ら、“Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，　１９８９，　５７（４）：　ｐ．１０５９−１０６５
【非特許文献２９】
イナミネ（Ｉｎａｍｉｎｅ，　Ｊ．　Ｍ．）ら、“Ｇｅｎｅ”，　１９８９，　８２：　ｐ．２５９−２６７
【非特許文献３０】
ダロ（Ｄａｌｌｏ，　Ｓ．　Ｆ．）ら、“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”，　１９９１，　１０：　ｐ．４７５−４８０
【非特許文献３１】
レシェル（Ｌｏｅｃｈｅｌ，　Ｓ．）ら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，　１９８９，　１７（２３）：　ｐ．１０１２７
【非特許文献３２】
レシェル（Ｌｏｅｃｈｅｌ，　Ｓ．）ら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，　１９９１，　１９：　ｐ．６９０５−６９１１
【００１２】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明はマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのシークエンシングに基づく。得られた一次ヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。
本発明は当業者により容易に使用され、分析され、そして解釈され得る形態における、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの得られたヌクレオチド配列、またはその代表的断片を提供する。１つの態様において、本発明は配列番号：１に示すヌクレオチド配列に対応する一連の一次配列情報を提供する。
本発明はさらに配列番号：１のヌクレオチド配列に少なくとも９９．９％一致するヌクレオチド配列を提供する。
【００１３】
配列番号：１のヌクレオチド配列、その代表的な断片、または配列番号：１のヌクレオチド配列に少なくとも９９．９％一致するヌクレオチド配列は、その使用を容易にするため様々な媒体にて提供することができる。この態様の１つの応用において、本発明の配列はコンピュータで読み取り可能な媒体に記録される。このような媒体は以下のものを含むがこれに限られることはない：フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープのような磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭのような光学記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電気記憶媒体；および磁気／光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリイの混成物である。
さらに本発明はシステム、とりわけデータ記憶手段に記憶された本明細書に記載の配列情報を含むコンピュータに基づくシステムを提供する。このようなシステムはマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの商業的に重要な断片を同定するべく設計されている。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの単離された断片に関する。本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片は、ペプチドをコードする断片（以下、本明細書においてはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）という）、機能的に結合したＯＲＦの発現を調節する断片（以下、本明細書においては発現調節断片（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）（ＥＭＦ）という）、細胞内に結合ＤＮＡ断片の取り込みを媒介する断片（以下、本明細書においては取り込み調節断片（ｕｐｔａｋｅ　ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）（ＵＭＦ）という）、およびサンプル中のマイコプラズマ・ジェニタリウムの存在を診断するのに使用することができる断片（以下、本明細書においては診断断片（ｄｉａｇｎｏｔｉｃ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）（ＤＦ）という）を含むがこれらに限られるものではない。
【００１５】
表１（ａ）、１（ｃ）、および２に開示されているマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの各ＯＲＦ断片、および該ＯＲＦの５’側に見られるＥＭＦは、ポリヌクレオチド試薬として多くの仕方で使用することができる。該配列はサンプル中の特定の微生物の存在のため、商業的に重要な薬品の製造のため、および遺伝子発現を選択的に制御するための診断プローブまたは診断増幅プライマーとして使用され得る。
【００１６】
本発明はさらに本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの１つまたはそれ以上の断片を含む組換え構築物を含む。本発明の組換え構築物はマイコプラズマ・ジェニタリウムの断片が挿入されたプラスミドやウイルスベクターのようなベクターを含む。
本発明はさらに、本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムの単離された断片のうちの任意の１つを含む宿主細胞を提供する。該宿主は哺乳類の細胞のような高等真核生物宿主、酵母細胞のような下等真核生物細胞または細菌細胞のような原核細胞であってよい。
【００１７】
本発明はさらに、本発明のＯＲＦによりコードされた単離されたタンパク質に関する。当該技術において知られる様々な方法論は本発明のタンパク質のうちの任意の１つを得るために利用することができる。最も簡単なレベルでは、アミノ酸配列は市販のペプチド合成機を使用することにより合成することができる。別法において該タンパク質は天然に該タンパク質を産生する細菌細胞から精製される。最後に、本発明のタンパク質は、所望のタンパク質を発現するように変えられた細胞から精製され得る。
【００１８】
本発明はさらに本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片のホモログおよび本発明のＯＲＦによりコードされるタンパク質のホモログを得る方法を提供する。特に、本明細書にプローブまたはプライマーとして開示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を使用すること、およびＰＣＲクローニングおよびコロニー／プラ−クハイブリダイゼーションのような技術を使用することにより、当業者はホモログを得ることができる。
【００１９】
さらに、本発明は本発明のタンパク質のうちの１つに選択的に結合する抗体を提供する。このような抗体はモノクローナルおよびポリクローナル抗体両方を含む。
本発明はさらに、上記の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは特異的なモノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞株である。
【００２０】
本発明はさらに、本発明のＯＲＦ、またはそのホモログのうちの１つを発現する細胞由来の試験用サンプルを同定する方法を提供する。このような方法は、本発明の１つまたはそれ以上の抗体、または１つまたはそれ以上の本発明のＤＦで試験用サンプルを、サンプルがＯＲＦまたはそれらから産生された産物を含むかどうかを、当業者が決定することができる条件下でインキュベートすることを含む。
【００２１】
本発明のもう１つの態様において、上記のアッセイを実行するために必要な試薬を含むキットが提供される。
特に、本発明は、（ａ）本発明の抗体のうちの１つ、またはＤＦのうちの１つを含む容器；および（ｂ）以下の物を１つまたはそれ以上含む１つまたはそれ以上の他の容器：洗浄試薬、結合した抗体またはハイブリダイズしたＤＦの存在を検出することができる試薬、を含む１つまたはそれ以上の容器を密に詰め込んで収容すべく区画化されたキットを提供する。
【００２２】
本発明の単離されたタンパク質を使用することにより、本発明はさらに、本発明の該ＯＲＦのうちの１つによってコードされるタンパク質に結合することができる試薬を得る方法および同定する方法を提供する。特に、このような試薬には、抗体（上記）、ペプチド、炭水化物、薬剤などが含まれる。このような方法は以下の工程からなる：
（ａ）本発明の該ＯＲＦのうちの１つによってコードされる単離されたタンパク質に試薬を接触させ；ついで
（ｂ）該試薬が該タンパク質に結合するかどうかを決定する。
【００２３】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの完全なゲノム配列は、この生物を用いて研究する全ての研究所にとっておよび様々な商業上の目的のために非常に価値あるものであるだろう。マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの多くの断片は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）またはタンパク質データベースに対する類似性検索によって直ちに同定され、マイコプラズマの研究者たちにとって直接的価値があり、タンパク質の製造または遺伝子発現の制御にとって直接商業的価値があるであろう。具体的な例はＰＨＡシンターゼに関する。ポリヒドロキシブチレートがマイコプラズマ・ジェニタリウムの膜に存在し、その量が形質転換能のレベルに関係していると報告されている。このポリマーを合成するＰＨＡシンターゼが、多数の細菌において同定されシークエンシングされているが、これらの１つとしてマイコプラズマ・ジェニタリウムに進化的に近縁のものはない。この遺伝子はなお、ハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲ技術の使用によりマイコプラズマ・ジェニタリウムから単離されなければならない。しかしながら、本発明の該ゲノム配列は以下に記載の検索手段を利用することにより該遺伝子の同定を可能とする。
【００２４】
細菌の全ゲノム配列および他の小さなゲノムを解明するための方法論と技術の開発は、染色体構造を分析し理解する能力を非常に高めてきており今後もそうであるだろう。とりわけ、配列が明らかとなったゲノムは、ゲノムＤＮＡの大きなセグメント内の遺伝子を同定する能力、調節要素の構造、位置およびスペーシング、産業化可能な遺伝子の同定、およびゲノムおよび分子的な系統発生を比較する能力を含む、染色体構造および機能の分析のための開発手段のモデルを与えるであろう。
【００２５】
【発明の実施の形態】
好ましい態様の詳細な説明
本発明はマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのシークエンシングに基づいている。得られた一次ヌクレオチド配列は配列番号：１に提示されている。本明細書に使用する「一次配列」とは、ＩＵＰＡＣ学名分類体系によって表示されるヌクレオチド配列をいう。
配列番号：１に提示されている配列は、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの複製起点の両側にあることが知られている２つの遺伝子（ＤＮＡＡおよびＤＮＡジャイレースとの関係で方向づけられている。当業者はこの開始／終了点が便宜上選択されたものであって構造の意義を反映していないということを簡単に認めることができるであろう。
本発明は、当業者によって簡単に使用され、分析され、そして解釈され得る形態において、配列番号１のヌクレオチド配列、またはその代表的な断片を提供する。１つの態様においては該配列は配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列に対応する一連の一次配列情報を提供する。
【００２６】
本明細書において使用する「配列番号１に記載されているヌクレオチド配列の代表的な断片」とは、公的に利用できるデータベース内には現在表されていない配列番号：１の任意の部分をいう。本発明の好ましい代表的な断片は、オープンリーディングフレーム、発現調節断片、取り込み調節断片、およびサンプル中のマイコプラズマ・ジェニタリウムの存在を診断するのに使用され得る断片である。このような好ましい断片の制限されない同定は表１（ａ）、１（ｃ）および２に提示されている。
【００２７】
配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列情報は、メガベースショットガンシークエンシング法（ｍｅｇａｂａｓｅ　ｓｈｏｔｇｕｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）の使用によりマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムをシークエンシングすることにより得られた。配列番号：１に提示されている該ヌクレオチド配列は、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのヌクレオチド配列の必ずしも１００％完全ではないけれども非常に正確な表示である。
【００２８】
詳細に以下で検討するように、配列番号：１および表１（ａ）、１（ｃ）および２に提示されている情報を用い、常套のクローニングおよびシークエンシング法を利用することにより、当業者はマイコプラズマ・ジェニタリウムタンパク質の様々な多様物をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む全ての関心が持たれる「代表的な断片」をクローニングすることおよびシークエンシングすることが可能であろう。非常に希ではあろうが、これは配列番号：１に開示されているヌクレオチド配列に存在するヌクレオチド配列の誤りを明らかにするかもしれない。それゆえ、一旦本発明が利用可能になれば（すなわち一旦配列番号：１および表１（ａ）、１（ｃ）および２に提示されている情報が利用可能になれば）、配列番号：１における希にあるシークエンシングの誤りを明らかにすることは、当業者が充分になし得ることであろう。ヌクレオチド配列編集ソフトウェアは公的に利用できる。例えば、アプライド・バイオシステム（（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（ＡＢ））の（ＡＢ）オートアセンブラーＴＭ（Ａｕｔｏ　ＡｓｓｅｍｂｌｅｒＴＭ）はヌクレオチド配列の視覚的検査の間補助器具として使用され得る。
【００２９】
たとえ配列番号：１における非常に希なシークエンシングの誤りが全て正されたとしても、その結果として得られるヌクレオチド配列はなお、配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列に少なくとも９９．９％一致するであろう。
マイコプラズマ・ジェニタリウムの異なる株からのゲノムのヌクレオチド配列は僅かに異なる。しかしながら、全てのマイコプラズマ・ジェニタリウム株のゲノムのヌクレオチド配列は配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列に少なくとも９９．９％一致するであろう。
【００３０】
それゆえ、本発明はさらに、当業者によって容易に使用され、分析され、そして解釈され得る形態において配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列に少なくとも９９．９％一致するヌクレオチド配列を提供する。あるヌクレオチド配列が配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列に少なくとも９９．９％一致するかどうかを決定する方法は、当業者にとって日常的で容易に利用できるものである。例えば、非常によく知られているファスタアルゴスリズム（ｆａｓｔａ　ａｌｇｏｔｈｒｉｔｈｍ）がヌクレオチド配列の一致パーセントを算出するために使用され得る（ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４（１９８８））。
【００３１】
コンピュータ関連の態様
配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列、その代表的な断片、または配列番号：１に少なくとも９９．９％一致するヌクレオチド配列は、その使用を容易にするために種々の媒体中入れて「準備」することができる。ここでいう準備というのは、単離された核酸分子を除き、本発明のヌクレオチド配列、すなわち配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列、その代表的な断片、または配列番号：１に少なくとも９９．９％一致するヌクレオチド配列を含む一連のものの製造のためである。このような製造には、天然に存在するままの状態、または精製された形態のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムまたはその部分集合の検査には直接適用できない手段を使用して当業者が該製造を検査することができるような形態にてマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムまたはその部分集合（例えば、マイコプラズマ・ジェニタリウムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を準備する。
【００３２】
この態様の１つの応用において、本発明のヌクレオチド配列はコンピュータで読み取り可能な媒体に記録され得る。ここでいう「コンピュータで読み取り可能な媒体」とは、コンピュータにより読み取り直接アクセスできる媒体をいう。このような媒体には、以下のものが含まれるがこれらに限られるものはない：フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープなどの磁気記憶媒体；ＣＤ−ＲＯＭのような光学記憶媒体；ＲＡＭおよびＲＯＭのような電気記憶媒体；および磁気／光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリイの混成物である。当業者は、本発明のヌクレオチド配列を記録したコンピュータで読み取り可能な媒体を含む製造を創造するためにどのように現在知られたコンピュータで読み取り可能な媒体が使用され得るかを容易に認識することができる。
【００３３】
ここでいう「記録された」とは、コンピュータで読み取り可能な媒体上に情報を記憶する工程をいう。当業者であれば本発明のヌクレオチド配列情報を含む製品を産出するためのコンピュータで読み取り可能な媒体上に情報を記録するため、コンピュータで読み取り可能な媒体上に情報を記憶させるために現在のところ知られている方法のいずれをも容易に採用できる。
当業者は本発明のヌクレオチド配列を記録しているコンピュータで読み取り可能な媒体を創作するために様々なデータ記憶構造物を利用できる。データ記憶構造物の選択は一般に記憶された情報にアクセスするために選択された手段に基づかれるであろう。加えて、様々なデータプロセッサプログラムおよびフォーマットはコンピュータで読み取り可能な媒体上に本発明のヌクレオチド配列情報を記憶するために使用され得る。該配列情報は、ワードパーフェクト（ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ）およびマイクロソフト・ワード（ＭｉｃｒｏＳｏｆｔ　Ｗｏｒｄ）のような市販のソフトウェアにフォーマットされたワードプロセッシングテキストファイル中に表示することができ、または、ＤＢ２、サイベース（Ｓｙｂａｓｅ）、オラクル（Ｏｒａｃｌｅ）などのデータベースアプリケーションに記憶されたＡＳＣＩＩファイルの形式で表示することができる。当業者は、本発明のヌクレオチド配列情報を記録したコンピュータで読み取り可能な媒体を得るためにデータプロセッサ構造化フォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）のいずれをも容易に適合させることができる。
【００３４】
配列番号：１のヌクレオチド配列、その代表的な断片、または配列番号：１に少なくとも９９．９％一致するヌクレオチド配列をコンピュータで読み取り可能な形態で提供することにより、当業者は様々な目的のために該配列情報に日常的にアクセスすることができる。コンピュータソフトウェアは公的に利用することができ、それにより当業者はコンピュータで読み取り可能な媒体に提供された配列情報にアクセスすることができる。以下の例は、サイベースシステム上でＢＬＡＳＴ（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））およびＢＬＡＺＥ（ブルトラグ（Ｂｒｕｔｌａｇ）ら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１７：２０３−２０７（１９９３））検索アルゴリズムを行なうソフトウェアが、どのようにして他の生物からのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはタンパク質にホモロジーを持つ該マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内のＯＲＦを同定するために使用されたかを示す。このようなＯＲＦはマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内のタンパク質コード断片であり、発酵反応および商業的に有用な代謝産物の製造において使用される酵素のような商業的に重要なタンパク質を産生するのに有用である。
【００３５】
本発明はさらに、システム、とりわけ本明細書に記載の配列情報を含んでいるコンピュータに基づいたシステムを提供する。このようなシステムはマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの商業的に重要な断片を同定するのに設計されている。
ここでいう「コンピュータに基づいたシステム」とは、本発明のヌクレオチド配列情報を分析するために使用されるハードウェア手段、ソフトウェア手段、およびデータ記憶手段をいう。本発明のコンピュータに基づいたシステムの最小限のハードウェア手段には中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段が含まれる。当業者は、現在利用することができるコンピュータに基づいたシステムの任意の１つが本発明において使用するのに適していると容易に認識することができる。
【００３６】
上記のように、本発明のコンピュータに基づいたシステムは、本発明のヌクレオチド配列を記憶しているデータ記憶手段および検索手段を補助し実行するために必要なハードウェア手段およびソフトウェア手段を含む。ここでいう「データ記憶手段」とは本発明のヌクレオチド配列情報を記憶することができるメモリ、または本発明のヌクレオチド配列情報を記録している製造物にアクセスできるメモリアクセス手段をいう。
本明細書で使用する「検索手段」とは、標的配列または標的構造モチーフをデータ記憶手段内に記憶されている配列情報と比較するためにコンピュータに基づいたシステム上で行なう１つまたはそれ以上のプログラムをいう。検索手段は、ある特定の標的配列または標的モチーフに合ったマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片または領域を同定するために使用される。様々な既知のアルゴリズムは公的に開示されており、検索手段を遂行するための様々な市販のソフトウェアが利用可能であり、本発明のコンピュータに基づいたシステムにおいて使用され得る。このようなソフトウェアの例にはＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ（ＮＣＢＩＡ）が含まれるが、これらに限られるものではない。当業者は、利用可能な任意の１つのアルゴリズムまたはホモロジー検索を行なうための実行用ソフトウェアパッケージを本発明のコンピュータに基づいたシステムにおいて使用するために適合させ得ることを容易に認識できる。
【００３７】
本明細書で使用する「標的配列」とは、６またはそれ以上のヌクレオチドまたは２またはそれ以上のアミノ酸の任意のＤＮＡまたはアミノ酸の配列であり得る。当業者は、標的配列が長ければ長いほど、該標的配列はデータベース内にランダムに現れにくくなるということを容易に認識することができる。標的配列の最も好ましい配列長は、約１０〜１００アミノ酸または約３０〜３００ヌクレオチド残基である。しかしながら、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの商業的に重要な断片例えば、遺伝子発現およびタンパク質プロセシングに関与する配列断片の検索はより短い配列長であるかもしれないということは充分に認識される。
【００３８】
本明細書で使用する「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」とは、標的モチーフの折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）後に形成される３次元配置に基づいて選択される、合理的に選択された配列または配列の組み合わせをいう。当該技術分野において様々な標的モチーフが知られている。タンパク質標的モチーフには酵素活性部位およびシグナル配列が含まれるが、これらに限られるものではない。核酸標的モチーフにはプロモーター配列、ヘアピン構造、および誘導可能な発現要素（タンパク質結合配列）が含まれるがこれらに限られるものではない。
入力および出力手段のための様々な構造フォーマットは、本発明のコンピュータに基づいたシステムにおける情報を入力および出力するために使用され得る。出力手段のための好ましいフォーマットは、該標的配列または標的モチーフへのホモロジーの様々な程度を有するマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片を位置付ける。このような表示は、当業者に様々な量の標的配列または標的モチーフを持つ配列の位置づけを与え、同定された断片に含まれるホモロジーの程度を同定する。
【００３９】
様々な比較手段はマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの配列断片を同定するため、データ記憶手段と標的配列または標的モチーフを比較するのに使用され得る。本発明の例においては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＺＥアルゴリズム（アルチュル、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を実行する実行用ソフトウェアを用い、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内のオープンリーディングフレームを同定した。当業者は公的に利用可能なホモロジー検索プログラムの任意の１つが本発明のコンピュータに基づいたシステムのための検索手段として使用され得るということを容易に認識できる。
【００４０】
この態様の１つの応用は図２に提示されている。図２は本発明を行なうのに使用され得るコンピュータシステム１０２のブロックダイヤグラムを提示している。該コンピュータシステム１０２はバス１０４に接続したプロセッサ１０６を含む。バス１０４にはまたメインメモリ１０８（好ましくはランダムアクセスメモリ、ＲＡＭとして実行される）およびハードドライブ１１２および除去可能な媒体記憶デバイス１１４のような様々な二次的記憶デバイス１１０も接続されている。除去可能な媒体記憶デバイス１１４は例えば、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、磁気テープドライブなどであってよい。制御論理および／またはそこに記録されたデータを含む除去可能な記憶媒体１１６（フレキシブルディスク、コンパクトディスク、磁気テープなど）は、除去可能な媒体記憶デバイス１１４中に挿入してよい。該コンピュータシステム１０２は一旦除去可能な媒体記憶デバイス１１４に挿入されたら、除去可能な媒体記憶デバイス１１４からの制御論理および／またはデータを読み取るための適切なソフトウェアを含んでいる。
本発明のヌクレオチド配列はメインメモリ１０８、二次的記憶デバイス１１０のうちの任意のもの、および／または除去可能な媒体記憶デバイス１１６によく知られた方法で記憶させてよい。ゲノム配列にアクセスおよび処理するためのソフトウェア（検索手段、比較手段など）は実行している間、メインメモリ１０８中にある。
【００４１】
生化学的態様
本発明のもう１つの態様はマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの単離された断片に関する。本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片にはペプチドをコードする断片（以下、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）という）、機能的に連結されたＯＲＦの発現を調節する断片（以下、発現調節断片（ＥＭＦ）という）、結合されたＤＮＡ断片を細胞内に取り込むのを媒介する断片（以下、取り込み調節断片（ＵＭＦ）という）、およびサンプル中のマイコプラズマ・ジェニタリウムの存在を診断するのに使用され得る断片（以下、診断断片（ＤＦ）という）が含まれるが、これらに限られるものではない。
【００４２】
本明細書で使用する「単離された核酸分子」または「マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの単離された断片」とは、通常、精製手段に供することにより、組成物に結合した化合物の数を該組成物から少なくする特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子をいう。様々な精製手段は、本発明の単離された断片を得るのに使用され得る。これらには電荷、溶解度、または大きさに基づいて構成要素を分離する方法が含まれるが、これらに限られるものではない。
【００４３】
１つの態様において、マイコプラズマ・ジェニタリウムＤＮＡは長さ１５−２０ｋｂの断片を産生するために機械的に切断され得る。ついで、これらの断片は下記実施例に記載されているようにそれらをラムダクローンに挿入することによりマイコプラズマ・ジェニタリウムライブラリーを生成するのに使用され得る。ついで、例えば、表１（ａ）、１（ｃ）または２に提示されているＯＲＦの両側にあるプライマーは、配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列を使用することにより産生され得る。ついで、ＰＣＲクローニングは該ラムダＤＮＡライブラリーから該ＯＲＦを単離するのに使用され得る。ＰＣＲクローニングは当該技術分野においてよく知られている。それゆえ、配列番号：１、表１（ａ）、１（ｃ）および表２の利用可能性が与えられると、本発明の任意のＯＲＦまたは他の代表的な断片を単離するのは日常的なこととなるであろう。
本発明の単離された核酸分子には、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＲＮＡが含まれるがこれらに限られるものではない。
【００４４】
本明細書で使用する「オープンリーディングフレーム」、ＯＲＦとは、１つも終止コドンなしにアミノ酸をコードする一連のトリプレットを意味し、タンパク質に翻訳可能な配列である。表１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）および２はマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにおけるＯＲＦｓを同定している。とりわけ、表１（ａ）は、括弧内に示す生物からのタンパク質配列とマッチするホモロジーに基づき、列挙されたタンパク質をコードするマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内にあるＯＲＦの位置（すなわちアドレス）を示している（表１（ａ）の５番目の欄を参照せよ）。
【００４５】
表１（ａ）の最初の欄は、ある特定のＯＲＦの「ＵＩＤ」（任意の同定番号）を提示する。表１（ａ）の２番目と３番目の欄は、配列番号：１に提示されている該ヌクレオチド配列におけるＯＲＦの位置を示している。当業者によりＯＲＦはマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにおいて反対の方向に置かれていてもよいことが認識されるであろう。このことは欄２および３に反映されている。
表１（ａ）の４番目の欄は、該ＯＲＦにマッチするデータベースの受け入れ番号を与える。上記のように、表１（ａ）の５番目の欄は該ＯＲＦにマッチするデータベースの名称を提示している。
【００４６】
表１（ａ）の６番目の欄は、５番目の欄にある括弧内に示す生物からの対応タンパク質とＯＲＦによりコードされたタンパク質との同一性パーセントを示す。
表１（ａ）の７番目の欄は、５番目の欄にある括弧内に示す生物からの対応タンパク質とＯＲＦによりコードされたタンパク質との類似パーセントを示している。２つのポリペプチド配列の同一性パーセントおよび類似パーセントの概念は当該技術分野においてよく理解されている。例えば、２つのポリペプチド、長さ１０のアミノ酸で３つのアミノ酸の位置が異なっている（例えば、１、３、および５という位置で）ものは７０％の同一性パーセントを有するといわれる。しかしながら、これらと同じ２つのポリペプチドは、例えば５の位置で該アミノ酸残基が同一ではないけれど「類似している」（すなわち同様の生化学的特徴を有している）ならば、８０％の類似パーセントを有するとされるであろう。表１（ａ）の８番目の欄は、該ＯＲＦのヌクレオチド長を示している。
【００４７】
表１（ｂ）は、該ＯＲＦの全長わたって、以前に公表されたマイコプラズマ・ジェニタリウム配列にマッチするデータベースを有するＯＲＦのリストである。表１（ｂ）の表題は以下の２つの例外を除いて表１（ａ）と同一である：（ＩＩ）表１（ａ）の８番目の欄の表題（すなわち該ＯＲＦのヌクレオチド長）は表１（ｂ）においては以下のものに置き換えられている：「マッチインフォ（Ｍａｔｃｈ　ｉｎｆｏ）」である。「マッチインフォ」は該ＯＲＦおよび以前に公表されたマイコプラズマ・ジェニタリウム配列のマッチ座標（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）をいう。例えば、「ＭＧ００２（９３０のうちの１−９３０）ＧＢ：Ｕ０９２５１（６１４０のうちの２９８−１２２７）」は、長さが９３０ヌクレオチド長であるＯＲＦ　ＭＧ００２については、全長で６１４０ヌクレオチドの受け入れ番号ＧＢ：Ｕ０９２５１にマッチするデータベースがあるということを示している。該ＯＲＦは２９８〜１２２７の位置で該受け入れ番号とマッチする。（ＩＩ）あるＯＲＦが以前に公表されたマイコプラズマ・ジェニタリウム配列および以前に公表された異なる生物からの配列の両方にホモロジーマッチを示す場合には、表１（ｂ）の３、４、５、および６番目の欄はそれぞれ、受け入れ番号、タンパク質の名称（および括弧内に生物名称）、以前に公表されたマイコプラズマ・ジェニタリウム配列とよりはむしろ「他の生物」との同一性パーセントおよび類似パーセントを提示する。（しかしながら、このシナリオにおいては、マイコプラズマ・ジェニタリウム配列の受け入れ番号はなお、８番目の欄に提示されている）。
【００４８】
表１（ｃ）は、以前に公表されたマイコプラズマ・ジェニタリウム配列にマッチするデータベースを該ＯＲＦの一部に関してのみ有するＯＲＦを提示している。表の表題は上記の表１（ｂ）のものと同様である。
表１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）において独特の識別名（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ）が列挙されたＯＲＦの同定に使用されている（例えば「ＭＧ１２３」）。親出願第０８／４８８，０１８号および第０８／４７３，５４５号において、列挙されたＯＲＦは「ＭＯＲＦ」識別名を使用することにより同定されている。表１（ｄ）は、どの新旧識別名が同じＯＲＦを表しているかを列挙している。例えば、表１（ｄ）の最初の見出しは、本出願においてＭＧ００１として同定されているＯＲＦが親出願番号第０８／４８８，０１８号および第０８／４７３，５４５号においてＭＯＲＦ−２００７２として以前に同定されていたものと同じＯＲＦであることを示している。同様に、表１（ｄ）の３番目の見出しは、本出願においてＭＧ００３として同定されているＯＲＦが親出願においてＭＯＲＦ−１９８１８およびＭＯＲＦ−２００７３として以前に同定されていたものと同じＯＲＦであることを示している。
【００４９】
表２はマイコプラズマ・ジェニタリウムかまたは他の生物のいずれかの既知の配列との「ホモロジーマッチ」を引き出さなかったマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのＯＲＦを提示している。
表６は各ＯＲＦをその機能範疇によって分類したものである（リレイ（Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：８６２（１９９２）から改変）。遺伝子同定、最適マッチに対応する公記録保管所からの受け入れ番号、アミノ酸同一性パーセント、およびアミノ酸におけるマッチ長もまた表１（ａ−ｃ）に上記のように各見出しごとに列挙されている。ヘモフィルス・インフルエンゼにおける遺伝子ともマッチするマイコプラズマ・ジェニタリウムにおける遺伝子群はアステリスク（＊）によって示されている。表６および７および図４の目的上、ＭｇＰａの繰り返しが転写されないかもしれないということを示唆する証拠があるとしても、これらの繰り返し要素の各々にはＭＧ番号が付されている。
【００５０】
表７はヘモフィルス・インフルエンゼおよびマイコプラズマ・ジェニタリウムにおける遺伝子内容を機能範疇によって分類している。各範疇における遺伝子の数は各生物について列挙されている。括弧内の数字は各機能範疇に委ねられた推定同定遺伝子のパーセントを示している。割り当てられていない遺伝子範疇については、括弧内に示されている該ゲノムのパーセントは推定コーディング領域の総数のパーセントを示している。
ホモロジー検索に使用されているアルゴリズムおよび基準に関する詳細は以下の実施例に示される。
当業者は、本発明のコンピュータに基づくシステムを用いての確認可能なものに加えて、同定されたＯＲＦの反対鎖によって重複するまたコードされるＯＲＦのような、表１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）および２において列挙されているもの以外のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム中のＯＲＦを簡単に同定することができる。
【００５１】
本明細書で使用する「発現調節断片」、ＥＭＦとは、機能的に連結したＯＲＦまたはＥＭＦの発現を調節する一連のヌクレオチド分子を意味している。
本明細書において、配列の発現がＥＭＦの存在によって変えられる場合に、該配列は「機能的に連結した配列の発現を調節する」といわれる。ＥＭＦは、プロモーター、およびプロモーター調節配列（誘導可能な要素）を含むが、これらに限られるものではない。ＥＭＦの１つのクラスは、ある特定の調節因子または生理学的事象に応答して機能的に連結したＯＲＦの発現を誘導する断片である。マイコプラズマ由来の既知のＥＭＦの概説は、（トム（Ｔｏｍｂ）ら、Ｇｅｎｅ　１０４：１−１０（１９９１）、チャンドラー（Ｃｈａｎｄｌｅｒ，Ｍ．Ｓ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１６２６−１６３０（１９９２））によって記載されている。
【００５２】
ＥＭＦ配列は、表１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）および２において提示されているＯＲＦに近接していることによってマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内に同定され得る。表１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）または２のＯＲＦのうちの任意の１つの５’側から得られる長さが約１０〜２００ヌクレオチドの遺伝子間セグメントまたは遺伝子間セグメントの断片は、天然に結合したＯＲＦ配列で認められるものと同様の様式で機能的に連結した３’ＯＲＦの発現を調節するであろう。本明細書で使用する「遺伝子間セグメント」とは、本明細書に記載されている２つのＯＲＦ間にあるマイコプラズマゲノムの断片をいう。別法として、ＥＭＦは本発明のコンピュータに基づくシステムにおける標的配列または標的モチーフとして既知のＥＭＦを使用することで同定され得る。
【００５３】
あるＥＭＦの存在と活性はＥＭＦ捕捉ベクター（ｔｒａｐ　ｖｅｃｔｏｒ）の使用により確認され得る。ＥＭＦ捕捉ベクターはマーカー配列の５’側にクローニング部位を含んでいる。マーカー配列は、抗生物質耐性または栄養要求補足因子（ｃｏｍｐｌｅｔｉｎｇ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ　ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）などの同定可能な表現型をコードし、これは適切な条件下で適切な宿主内に該ＥＭＦ捕捉ベクターが置かれた場合に、同定または分析することができる。上記のように、ＥＭＦは機能的に連結したマーカー配列の発現を調節するであろう。様々なマーカー配列のより詳細な考察は、以下に提示されている。
ＥＭＦであると思われる配列は、該ＥＭＦ捕捉ベクターにおけるマーカー配列の上流の１つまたはそれ以上の制限部位中に、全ての３つのリーディングフレームにてクローニングされている。ついで、該ベクターを既知の手法を用いて適切な宿主を形質転換し、適切な条件下で形質転換された宿主の表現型を調べる。上記のように、ＥＭＦは機能的にに連結したマーカー配列の発現を調節するであろう。
【００５４】
本明細書で使用する「取り込み調節断片」ＵＭＦとは、結合されたＤＮＡ断片の細胞内への取り込みを媒介する一連のヌクレオチド分子を意味する。ＵＭＦは、上記のコンピュータに基づくシステムに標的配列または標的モチーフとして既知のＵＭＦを使用することによって容易に同定され得る。
ＵＭＦの存在と活性は該ＵＭＦと思われるものをマーカー配列に結合させることにより同定され得る。その結果得られる核酸分子はついで適切な条件下の適切な宿主とともにインキュベートされ、マーカー配列の取り込みが決定される。上記のように、ＵＭＦは結合されたマーカー配列の取り込み頻度を増加させるであろう。マイコプラズマにおけるＤＮＡ取り込みの概説は、グッドゴール（Ｇｏｏｄｇａｌｌ，Ｓ．Ｈ．）らによりＪ．Ｂａｃｔ．１７２：５９２４−５９２８（１９９０）に提示されている。
【００５５】
本明細書で使用する「診断断片」ＤＦとは、マイコプラズマ・ジェニタリウム配列に選択的にハイブリダイズする一連のヌクレオチド分子を意味する。ＤＦは、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内の独特の配列を同定することによって、または増幅またはハイブリダイゼーション選択性を決定する適切な診断フォーマット中の該ＤＦ配列からなるプローブまたは増幅プライマーを産生および試験することによって容易に同定され得る。
【００５６】
本発明の範囲内に含まれる配列は本明細書に記載されている特定の配列に限るものではなく、その対立遺伝子的なおよび種の変異体をも含む。対立遺伝子的なおよび種の変異は常套的に配列番号：１に提示されている配列、その代表的な断片、または配列番号：１に少なくとも９９．９％同一のヌクレオチド配列を同種の他の単離物からの配列と比較することにより決定され得る。さらに、コドンの変異に適応するために、本発明は本明細書に開示されている特定のＯＲＦがコードするのと同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。換言すると、あるＯＲＦのコーディング領域において１つのコドンを同じアミノ酸をコードする他のもので置換することは明らかに期待できることである。
【００５７】
本明細書に開示されている任意の特定の配列は、ＯＲＦのようなある特定の断片を両方向に再度シークエンシングすること（すなわち、両鎖のシークエンシング）により誤りを容易にスクリーニングされ得る。別法として、問題となっている断片の一部または全部をプローブまたはプライマーとして使用することにより単離されたマイコプラズマ・ジェニタリウム由来の対応ポリヌクレオチドをシークエンシングすることにより誤りのスクリーニングは行なわれ得る。
表１（ａ）、１（ｂ）、１（ｃ）および２において開示されているマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの各ＯＲＦおよび該ＯＲＦの５’側に見られるＥＭＦは、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。該配列は、サンプル内にマイコプラズマ・ジェニタリウムのようなある特定の微生物の存在を検出するために診断プローブまたは診断増幅プライマーとして使用され得る。これは特に、マイコプラズマ・ジェニタリウムに対して非常に選択的であろう表２の断片またはＯＲＦに特に当てはまる。
【００５８】
加えて、本発明の断片は、広く記載されているように、三重螺旋の形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡによって遺伝子を制御することに使用され得るが、これら両方法は、ポリヌクレオチド配列のＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づくものである。これらの方法に使用するのに適しているポリヌクレオチドは、通常２０−４０塩基長であり、転写に関係する遺伝子領域に（三重螺旋−リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃｏｏｎｅｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄｅｒｖａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３６０（１９９１）参照）、またはｍＲＮＡそのものに（アンチセンス−オカノ（Ｏｋａｎｏ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオタイズ・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ＣＲＣプレス、ボカ・レイトン、フロリダ（１９８８））相補的であるよう設計されている。
【００５９】
三重螺旋−形成は、最適にはＤＮＡからＲＮＡ転写の停止という結果となり、一方、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を妨害する。両方の技術はモデル系において有効であると証明されている。本発明の配列に含まれる情報は、アンチセンスまたは三重螺旋オリゴヌクレオチドを設計するのに必要である。
【００６０】
本発明はさらに、本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの１つまたはそれ以上の断片を含む組換え構造体を提供する。本発明の組換え構造体は正方向または逆方向にマイコプラズマ・ジェニタリウムの断片が挿入されているプラスミドやウイルスベクターのようなベクターを含む。本発明のＯＲＦのうちの１つを含むベクターの場合、該ベクターはさらに、例えばプロモーター、機能的に連結したＯＲＦを含む調節配列を含んでいてよい。本発明のＥＭＦおよびＵＭＦを含むベクターに関しては、該ベクターはさらに、マーカー配列またはＥＭＦまたはＵＭＦに機能的に連結した異種のＯＲＦを含んでいてよい。多くの適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、そして本発明の組換え構造体を産生するのに市販されている。以下のベクターが例示として提供される。細菌由来：ｐＢｓ、ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））。真核生物由来：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア）。
【００６１】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能なマーカーを有する他のベクターを使用することにより所望の任意の遺伝子から選択し得る。適当な２つのベクターは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。特定の命名された細菌プロモーターにはｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、およびｔｒｃが含まれる。真核生物プロモーターにはＣＭＶの直接初期の、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲｓ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は、充分に当業者レベルである。
【００６２】
本発明はさらに、本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの単離された断片のうちの任意の１つを含む宿主細胞を提供し、その際、該断片は既知の形質転換法を使用し宿主細胞中に導入される。宿主細胞は哺乳動物細胞のような高等真核生物宿主細胞、酵母細胞のような下等真核生物宿主細胞であってよく、または宿主細胞は細菌細胞のような原核生物細胞であってもよい。宿主細胞への組換え体の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより行なうことができる（デイビス（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．）ら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８６））。
【００６３】
本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片のうちの１つを含む宿主細胞は、（ＯＲＦの場合には）該単離された断片によってコードされている遺伝子産物を産生するための従来の方法にて使用され得、または該ＥＭＦの制御下で異種タンパク質を産生するのに使用され得る。
本発明はさらに、本発明の核酸断片または本発明の核酸断片の縮重変異体によってコードされる単離ポリペプチドを提供する。「縮重変異体」とは、ヌクレオチド配列では本発明の核酸断片（例えばＯＲＦ）と異なっているが、遺伝コードの縮重により同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド断片をいう。本発明の好ましい核酸断片は表１（ａ）、１（ｃ）および２に記載されているＯＲＦである。
【００６４】
当該技術分野において知られる様々な方法論は本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの任意の１つを得るために利用され得る。最も単純なレベルではアミノ酸配列は市販のペプチド合成機を使用して合成され得る。これは小さなペプチド、および一層大きなポリペプチドの断片を産生するのに特に有用である。断片は例えば、天然のポリペプチドに対する抗体産生において有用である。別法として、ポリペプチドまたはタンパク質は、ポペプチドまたはタンパク質を天然に産生する細菌細胞から精製される。当業者は本発明の単離されたポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを得るために、ポリペプチドおよびタンパク質を単離する既知の方法に容易に従うことができる。これらには、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーが含まれるがこれらに限られるものではない。
【００６５】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、別法として所望のポリペプチドまたはタンパク質を発現するよう改変された細胞から精製され得る。本明細書において、細胞が通常全く産生しないか、または通常低いレベルでしか産生しないポリペプチドまたはタンパク質を産生するように遺伝子操作によってされている場合に、該細胞は所望のポリペプチドおよびタンパク質を発現するよう改変されたといわれる。当業者は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質のうちの１つを産生する細胞を産出するために真核生物または原核生物中に組換え配列かまたは合成配列のいずれかを導入し、発現させるために手法を容易に改変することができる。
【００６６】
任意の宿主／ベクター系は、本発明の１つまたはそれ以上のＯＲＦを発現するように使用され得る。これらには、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような原核生物細胞宿主同様、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖ−１細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳｆ９細胞のような真核生物宿主細胞が含まれるが、これらに限られるものではない。最も好ましい細胞は、通常は該特定のポリペプチドまたはタンパク質を発現しないか、または、該ポリペプチドまたはタンパク質を天然では低レベルでしか発現しない細胞である。
【００６７】
本明細書で使用する「組換え」とは、あるポリペプチドまたはタンパク質が組換え（例えば微生物、または哺乳類の）発現系由来であることを意味する。「微生物」とは、細菌または真菌（例えば酵母菌）の発現系において作られた組換えポリペプチドまたはタンパク質をいう。生成物として、「組換え微生物」は、天然の内生の物質を本質的に含んでおらず、天然のグリコシル化を伴わないポリペプチドまたはタンパク質と定義する。たいていの細菌培養において（たとえば大腸菌において）発現されるポリペプチドまたはタンパク質はグリコシル化を含んでいないだろう；酵母において発現されるポリペプチドまたはタンパク質は、哺乳類細胞において発現されるものとは異なるグリコシル化パターンを有するであろう。
【００６８】
「ヌクレオチド配列」はデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーをいう。一般に、本発明によって提供されるポリペプチドおよびタンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、微生物またはウイルスオペロン由来の調節要素を含む組換え転写単位において発現されることができる合成遺伝子を与える。
【００６９】
「組換え発現ビヒクルまたはベクター」とは、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からのポリペプチドを発現するためのプラスミドまたはファージまたはウイルスまたはベクターをいう。該発現ビヒクルは、（１）例えば、プロモーターまたはエンハンサーのような遺伝子発現において調節機能を有する遺伝子要素、（２）ｍＲＮＡに転写されタンパク質に翻訳される構造またはコーディング配列、および（３）適当な転写開始配列および転写終結配列の集合を含む転写単位を含んでいてよい。酵母または真核生物の発現系における使用を意図した構造単位は、好ましくは、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。別の態様として、リーダーまたは輸送配列なしに組換えタンパク質が発現される場合にはＮ−末端メチオニン残基が含まれる。この残基は、最終産物を提供するために、発現された組換えタンパク質からその後、開裂されてもよいし、開裂されなくてもよい。
【００７０】
「組換え体発現系」は、染色体ＤＮＡに組換え転写単位が安定的に組み込まれているかまたは染色体外に組換え転写単位を有する宿主細胞を意味している。該細胞は、原核生物または真核生物の細胞であり得る。本明細書に定義されている組換え発現系は、発現させようとする該ＤＮＡセグメントまたは合成遺伝子に結合した調節要素の誘導により異種ポリペプチドまたはタンパク質を発現するであろう。
【００７１】
成熟タンパク質は適当なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌その他の細胞に発現され得る。セルフリーの翻訳系もまた本発明のＤＮＡ構造体由来のＲＮＡを使用してかかるタンパク質を産生するのに用いられ得る。原核生物および真核生物宿主で使用する適当なクローニングおよび発現ベクターは、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らにより、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）に記載されている（この開示を参照のため本明細書に引用する）。
【００７２】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１遺伝子、および下流の構造配列の転写を指令する高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ａ−因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質、その他のような解糖酵素をコードするオペロン由来のものであり得る。異種構造配列は翻訳開始および終結配列、および好ましくは翻訳されたタンパク質をペリプラスミック部位または細胞外媒体に分泌するのを指令することができるリーダー配列と適当な相において集められる。随意に、異種配列は所望の特徴、例えば発現された組換え産物の安定性または単純化された精製を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードしていてよい。
【００７３】
細菌を使用する有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターに対して作動し得る読み取り相にて適当な翻訳開始および終結シグナルとともに所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。該ベクターは該ベクターの維持を確実にするため、および所望なら宿主内で増幅を可能とするため、１つまたはそれ以上の表現型的に選択可能なマーカーおよび複製起点を有するであろう。形質転換のために適する原核生物宿主には、選択問題の結果としてその他のものが選ばれることも有り得るが、大腸菌、バシラス・サチリス、サルモネラ・ティフィムリウム、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびスタフィロコッカス属内の様々な種が含まれる。
【００７４】
代表的ではあるが非限定的な例として、細菌使用の有用な発現ベクターは選択可能なマーカーおよびよく知られたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝的要素を含む市販のプラスミド由来の細菌性複製起点を含んでいてよい。このような市販のベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウプサラ、スウェーデン）およびＧＥＭ１（プロメガ・バイオテク（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、マディソン、ウィスコンシン、米国）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部位を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。
適当な宿主株の形質転換および該宿主株の適当な細胞密度への増殖後、選択されたプロモーターは適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）により脱抑圧され、細胞はさらに培養される。細胞は一般に遠心により集められ、物理的または化学的手段にて破壊され、その結果得られたの粗製抽出物はさらに精製するため保持される。
【００７５】
様々な哺乳類細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するのに使用され得る。哺乳類発現系の例にはサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（グルズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）、Ｃｅｌｌ、２３：１７５（１９８１）に記載）および適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）ベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳類発現ベクターは複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、および必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位は、要求された非転写遺伝要素を提供するのに使用してもよい。
【００７６】
細菌培養中に産出された組換えポリペプチドおよびタンパク質は通常、細胞ペレットからの初期の抽出、ついで１またはそれ以上の塩析、水性のイオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程によって単離する。タンパク質再度折りたたみ工程は必要であるなら成熟タンパク質の立体配置を完成するのに使用され得る。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は最終精製工程のために使用され得る。タンパク質の発現に使用される微生物細胞は凍結−解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の便利な方法によって破壊され得る。
【００７７】
本発明はさらに、実質的に本明細書に開示されているものと等価のものである単離されたポリペプチド、タンパク質、および核酸分子を含む。本明細書で使用する、実質的な等価とは、核酸およびアミノ酸の両配列に関して、例えば、１つまたはそれ以上の置換、欠失、または付加により参照配列とは異なるが、その正味の効果は参照配列と当該の配列との間の不都合な機能的相異とはならない変異体配列をいう。本発明の目的のためには、等価な生物学的活性を有する配列および等価な発現特性を有する配列は特徴は実質的に等価であるとされる。等価の決定の目的のためには、成熟配列の切断は無視されるべきである。
【００７８】
本発明はさらに、マイコプラズマ・ジェニタリウムの他の株からのホモログ、本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片からのホモログ、および本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質のホモログを得る方法を提供する。本明細書において、マイコプラズマ・ジェニタリウムの配列またはタンパク質は、本発明のマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片のうちの１つまたは本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされるタンパク質と有意の相同性を有する場合に、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片のホモログとして、または本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされるタンパク質のホモログとして、定義される。特に、本明細書中にプローブまたはプライマーとして開示されている配列、およびＰＣＲクローニングおよびコロニー／プラークハイブリダイゼーションのような技術を使用することにより、当業者はホモログを得ることが可能である。
【００７９】
本明細書において、２つの核酸分子またはタンパク質は、その２つが８５％を超える配列（アミノ酸または核酸）相同性を処理する領域を有する場合に「有意の相同性を有する」といわれる。
配列番号：１に提示されているヌクレオチド配列由来、または少なくとも９９．９％配列番号：１に一致するヌクレオチド配列由来の領域特異的プライマーおよびプローブは、既知の方法を使用することによりホモログをコードするクローニングされたＤＮＡを含むコロニーを同定するのと同様に、ＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅を提供するのに使用され得る（アイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、ＰＣＲプロトコールズ（ＰＣＲ　ｐｒｏｃｏｌｓ）、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア（１９９０））。
【００８０】
配列番号：１由来または少なくとも９９．９％配列番号：１に一致するヌクレオチド配列由来のプライマーを使用する際、当業者は高ストリンジェンシー条件（ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）（例えば、アニーリング温度５０−６０℃）を使用することにより、該プライマーに７５％を超える相同性を有する配列のみが増幅されるということを認識するであろう。低ストリンジェンシー条件（ｌｏｗｅｒ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）（例えば、アニーリング温度３５−３７℃）を使用することにより、該プライマーに４０−５０％を超える相同性を有する配列も増幅されるであろう。
【００８１】
配列番号：１由来または少なくとも９９．９％配列番号：１に一致するヌクレオチド配列由来のＤＮＡプローブをコロニー／プラークハイブリダイゼーションに使用する際、当業者は高ストリンジェンシー条件（例えば、５０−６５℃にて、５ＸＳＳＰＣおよび５０％ホルムアミド中でハイブリダイズし、５０−６５℃、０．５ＸＳＳＰＣにて洗浄する）を使用することにより、該プローブに９０％を超える相同性を有する領域を有する配列が得られること、および低ストリンジェンシー条件（例えば、３５−３７℃にて、５ＸＳＳＰＣおよび４０−４５％ホルムアミド中でハイブリダイズし、４２℃、ＳＳＰＣにて洗浄する）を使用することにより、該プローブに３５−４５％を超える相同性を有する領域を有する配列が得られるであろうということを認識するであろう。
このようなタンパク質を天然に発現するかそれをコードする遺伝子を含む限り、任意の生物が本発明のホモログの採取源として使用され得る。ホモログを単離するのに最も好ましい生物は、マイコプラズマ・ジェニタリウムに密接に関連した細菌である。
【００８２】
本発明の物質の用途
表１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）に提示されている各ＯＲＦは、リレイ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　５７（４）：８６２（１９９３））から応用される生物学的役割のカテゴリイに入る。これにより当業者は同定された各コーディング配列の使用を決定できる。表１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）はさらに各ＯＲＦによってコードされるポリペプチドのタイプの同定を与える。その結果、当業者は本発明のポリペプチドを、推定ポリペプチドの同定タイプに一致して、商業的、治療学的および産業上の目的のために使用することができる。
【００８３】
このような同定は、当業者に、該同定がなされた既知のタイプの配列に類似した方法にてマイコプラズマ・ジェニタリウムＯＲＦを使用することができるようにしている；例えば、ある特定の糖源を発酵させること、またはある特定の代謝産物を産生することである。（商工業上に使用される酵素の概説については、バイオケミカル・エンジニアリング・アンド・バイオテクノロジー・ハンドブック（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ）第２版、マクミラン・パブリッシャー（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ．Ｌｔｄ．）、ニューヨーク（１９９１）およびバイオキャタリスツ・イン・オーガニック・シンセスィズ（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ）、トランパー（Ｊ．Ｔｒａｍｐｅｒ）ら編、エルセビエ・サイエンスパブリッシャーズ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、アムステルダム、オランダ（１９８５）を参照）。
【００８４】
１．生合成酵素
代謝中間産物の分解に関係する酵素、中心の中間代謝に関係する酵素、好気および嫌気両方の呼吸に関係する酵素、発酵に関係する酵素、ＡＴＰプロトン駆動力変換に関係する酵素、広範な制御機能に関係する酵素、アミノ酸合成に関係する酵素、ヌクレオチド合成に関係する酵素、補因子およびビタミン合成に関係する酵素を含む、中間および巨大分子代謝、小分子の生合成、細胞過程他の機能に関与する触媒反応を媒体するのに関係するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは産業上の生合成に使用され得る。マイコプラズマに存在する様々な代謝経路は、表１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）に同定されている様々な酵素を検討することによるのと同様に絶対的栄養要求性に基づいて同定され得る。
【００８５】
中間代謝のカテゴリイに同定されているので、表１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）中の同定されたＯＲＦによりコードされている多くのタンパク質は、非巨大分子代謝同様、中間代謝の分解に特に関与している。該同定された酵素のうちの幾つかにはアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびカタラーゼが含まれる。
タンパク質加水分解酵素は商業的に重要な酵素の別の部類である。タンパク質加水分解酵素は、アマおよび他の植物繊維の処理を含む多数の工業上の処理、果実ジュースの抽出、浄化および脱ペクチン化、植物油の抽出および単細胞果実を得るための果実および野菜の軟化において用途が見出されている。食物産業において使用されているタンパク質加水分解酵素の詳細な概説はロンボウツ（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ）ら、Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ　２１：７９（１９８６）およびボラーゲン（Ｖｏｒａｇｅｎ）ら、バイオキャタリスト・イン・アグリカルチュラル・バイオテクノロジー（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ホワイテイカー（Ｊ．Ｒ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ）ら編、アメリカン・ケミカル・ソサイエティー・シンポジウム・シリーズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ）３８９：９３（１９８９）に提供されている。
【００８６】
グルコース、ガラクトース、フルクトースおよびキシロースの代謝はマイコプラズマの一次代謝の重要な部分である。これらの糖の分解に関係している酵素は工業用発酵に使用され得る。商業的観点から、重要な糖転換酵素の幾つかは、グルコースイソメラーゼのような糖イソメラーゼを含んでいる。ケトグロン酸（ＫＧＡ）を産生するグルコースオキシダーゼのような他の代謝酵素には市販されているものがある。ＫＧＡは、ライヒシュタインの方法を使用したアスコルビン酸の商業的生産における中間体である（クルエゲル（Ｋｒｕｅｇｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６（Ａ）、ライン（Ｒｈｉｎｅ，Ｈ．Ｊ．）ら編、フェアラーク・プレス（Ｖｅｒｌａｇ　Ｐｒｅｓｓ）、ワインハイム（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、ドイツ（１９８４）参照）。
【００８７】
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は市販されており、ビールの脱酸素化のため、固定形態においてと同様に精製された形態にて使用されている。ハートメイアー（Ｈａｒｔｍｅｉｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１：２１（１９７９）を参照。ＧＯＤの最も重要な応用はグルコン酸の工業的スケールの発酵である。洗剤、織物、皮革、写真、製薬、食品、飼料およびコンクリート産業にて使用されているグルコン酸の市場（ビゲリス（Ｂｉｇｅｌｉｓ）、ジーン・マニピュレーションズ・アンド・ファンジャイ（Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｆｕｎｇｉ）、ベネット（Ｂｅｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．）ら編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９８５）、３５７頁参照）。産業上の応用に加えて、ＧＯＤは最近、デンプンおよびセルロース加水分解物からのシロップを分析するためのバイオテクノロジーにおいて、体液中にあるグルコースの定量決定のための医薬に応用できることがわかっている。オウス（Ｏｗｕｓｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ．Ａｃｔａ．８７２：８３（１９８６）参照。
【００８８】
今日の世界において使用されている主要甘味料はサトウダイコン（テンサイ）およびサトウキビから生じる砂糖である。工業的酵素の分野においてはグルコースイソメラーゼ過程は今日の市場において最も大きい広がりを見せている。最初に、可溶性酵素が使用され、後に固定化酵素が開発された（クルエゲルら、バイオテクノロジー、ザ・テキストブック・オブ・インダストリアル・マイクロバイオロジー（Ｔｈｅ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、シナウエル・アソシエイテッド・インコーポレイテッド（Ｓｉｎａｕｅｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ（１９９０））。今日では、グルコース産生−高フルクトースシロップの使用は固定化酵素を使用する断然最大の工業ビジネスである。これらの酵素の工業上の使用の概説はヨーゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ）、Ｓｔａｒｃｈ　４０：３０７（１９８８）に提示されている。
【００８９】
アルカリセリンプロテイナーゼのようなプロテイナーゼは洗剤添加物として使用され、それゆえ、工業部門において使用されている微生物酵素の最大量のうちの１つを代表している。それらの産業上の重要性のため、工業過程におけるこれらの酵素の使用に関しての公表および未公表の情報がたくさんある（フォールトマン（Ｆａｕｌｔｍａｎ）ら、アシッド・プロテアーゼズ・ストラクチャー・ファンクション・アンド・バイオロジー（Ａｃｉｄ　Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、タン（Ｔａｎｇ，Ｊ．）編、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９７７）およびゴッドフレイ（Ｇｏｄｆｒｅｙ）ら、インダストリアル・エンザイムズ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）、マクミラン出版社、サリー（Ｓｕｒｒｅｙ）、英国（１９８３）およびヘプナー（Ｈｅｐｎｅｒ）ら、１９９０年までのリポート・インダストリアル・エンザイムズ（Ｒｅｐｏｒｔ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｂｙ　１９９０）、ヘル・ヘプナー・アンド・アソシエイツ（Ｈｅｌ　Ｈｅｐｎｅｒ　＆　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、ロンドン（１９８６）参照）。
【００９０】
本発明の商業的に使用可能なタンパク質の他の部類は表１（ａ）、１（ｂ）および１（ｃ）に同定されている微生物のリパーゼである（マクラエ（Ｍａｃｒａｅ）ら、Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｒａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｌｏｎｄｏｎ　３１０：２２７（１９８５）およびポセルケ（Ｐｏｓｅｒｋｅ）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　６１：１７５８（１９８４）参照）。リパーゼの主要な用途は、油脂産業において、容易に利用できるトリグリセリドリパーゼにより触媒化されたエステル交換（ｉｎｔｅｒ−ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を使用した中性グリセリドの産生である。リパーゼの応用には洗浄工程のうちに織物の脱脂を容易にするための洗剤添加物としての使用が含まれる。
【００９１】
複雑な有機分子の合成における重要なステップのための触媒としての酵素の使用、特に、微生物酵素の使用は非常な速さで普及している。非常に興味深い１つの分野は、キラル中間体の調製である。キラル中間体の調製は、広範囲の合成化学者、特に、新薬、農薬、芳香剤および香味料の調製に関係している科学者たちにとって興味深い（デイビス（Ｄａｖｉｅｓ）ら、リースント・アドバンスィズ・イン・ザ・ジェネレーション・オブ・キラル・インターミーディエイツ・ユージング・エンザイムズ（Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｒａｌ　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＣＲＣ出版社、ボカ・レイトン、フロリダ（１９９０）参照）。酵素により触媒された下記反応は、有機化学者たちにとって興味深いものである：カルボン酸エステル、リン酸エステル、アミドおよびニトリルの加水分解、エステル化反応、エステル交換反応、アミドの合成、アルカノンおよびオキソアルカノンの還元、アルコールのカルボニル化合物への酸化、スルフィドのスルホキシドへの酸化、およびアルドール反応のような炭素結合形成反応。バイオトランスフォーメーションおよび有機合成のために本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされる酵素の使用を考慮する際には、単離された酵素とは対照的に微生物を使用する利益および不利益各々を考慮することがしばしば必要である。一方では全体の細胞系を使用し、他方では、単離された部分的に精製された酵素を使用することの賛否両論は、バッド（Ｂｕｄ）ら、ケミストリー・イン・ブリテン（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｂｒｉｔａｉｎ）（１９８７）１２７頁に詳細に記載されている。
【００９２】
アミノ酸の生合成および代謝に関係している酵素であるアミノトランスフェラーゼは、アミノ酸の触媒的製造において有用である。微生物に基づいた酵素系を使用する利点は、アミノトランスフェラーゼ酵素がｌ−アミノ酸のみの立体選択的合成を触媒し、一般に一様に高い触媒率を有するということである。アミノ酸製造のためのアミノトランスフェラーゼの使用の記載はロセル−デイビッド（Ｒｏｓｅｌｌ−Ｄａｖｉｄ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１３６：４７９（１９８７）において提供されている。
【００９３】
２．抗体の産生
本明細書で記載されているように、本発明のタンパク質並びにそのホモログは、現在他のタンパク質に応用されている当該技術分野にて知られる様々な手順および方法にて使用され得る。本発明のタンパク質はさらに、該タンパク質に選択的に結合する抗体を産生するのに使用され得る。このような抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体並びにこれらの抗体の断片のいずれであってよく、ヒト化された形態であり得る。
【００９４】
本発明はさらに、本発明のタンパク質の１つに選択的に結合する抗体およびこれらの抗体を産生するハイブリドーマを提供する。ハイブリドーマは特異的なモノクローナル抗体を分泌することができる不死化細胞株である。
概して、所望の抗体を産生することができるハイブリドーマ同様ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を調製する技術は当該技術分野においてよく知られている（カンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．）、モノクローナル・アンティボディー・テクノロジー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、エルセビア・サイエンス出版社、アムステルダム、オランダ（１９８４）；セント・グロス（Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５：１−２１（１９８０）；コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ技術（ｔｒｉｏｍａ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（ｈｕｍａｎ　Ｂ−ｃｅｌｌ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２（１９８３）；コール（Ｃｏｌｅ）ら、モノクローナル・アンティボディーズ・アンド・キャンサー・セラピー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン・アール・リス・インコーポレーティッド（Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）（１９８５）、７７−９６頁）。
【００９５】
抗体を産生することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ、等）は偽遺伝子のポリペプチドで免疫され得る。免疫の方法は当該技術分野にてよく知られている。このような方法にはポリペプチドの皮下、または腹膜内注射が含まれる。当業者は、免疫に使用される本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質の量が免疫された動物、ペプチドの抗原性および注射部位に基づき変わることを認識するであろう。
免疫抗原として使用するタンパク質は、タンパク質の抗原性を増加するために修飾し、またはアジュバント中で投与することができる。タンパク質の抗原性を増加する方法は当該技術分野においてよく知られており、異種タンパク質（グロブリンまたはβ−ガラクトシダ−ゼのようなもの）と抗原を結合したり、または免疫の間、アジュバントを含ませたりすることが含まれるが、これらに限られるものではない。
【００９６】
モノクローナル抗体に関しては、免疫された動物から脾臓細胞は除去され、ＳＰ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞のようなミエローマ細胞と融合させられ、ついでモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞となることができる。
当該技術分野にてよく知られている多数の方法のうちの任意の１つは、所望の特徴を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定するのに使用され得る。これらには、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイによるハイブリドーマのスクリーニングが含まれる（ルッツ（Ｌｕｔｚ）ら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１７５：１０９−１２４（１９８８））。
所望の抗体を分泌するハイブリドーマはクローニングされ、そのクラスおよびサブクラスは当該技術分野において知られた手順を使用して決定される（カンベル、モノクローナル・アンティボディー・テクノロジー：ラボラトリー・テクニクス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー、エルゼビア・サイエンス出版社、アムステルダム、オランダ（１９８４））。
単鎖抗体の産生を記述した技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は本発明のタンパク質に対する単鎖抗体を産生するのに改変され得る。
【００９７】
ポリクローナル抗体に関しては、抗体を含有する抗血清は免疫された動物から単離され、上記の手順のうちの１つを使用することにより所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングされる。
本発明はさらに、検出可能な標識をされた形態において上記の抗体を提供する。抗体はラジオアイソトープ、アフィニティー標識（ビオチン、アビジンなどのようなもの）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどのようなもの）、蛍光標識（ＦＩＴＣまたはローダミンなどのようなもの）、常磁性原子などの使用によって検出可能に標識され得る。このような標識を達成するための手順は当該技術分野においてよく知られている。例えば、スターンバーガー（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ａ．）ら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１８：３１５（１９７０）；ベイヤー（Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６２：３０８（１９７９）；エングバル（Ｅｎｇｖａｌ，Ｅ．）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：１２９（１９７２）；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３：２１５（１９７６）を参照。
【００９８】
本発明の標識された抗体は、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片が発現されている細胞または組織を同定するためにイン・ビトロ、イン・ビボおよびイン・シトゥアッセイに使用され得る。
本発明はさらに、固体支持体に固定化された上記の抗体を供給する。このような固体支持体の例にはポリカーボネートのようなプラスチック、アガロースおよびセファロースのような複合炭水化物、ポリアクリルアミドのようなアクリル樹脂およびラテックスビーズが含まれる。このような固体支持体への抗体の結合のための技術は当該技術分野においてはよく知られている（ワイアー（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．）ら、「ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第４版、ブラックウェル・サイエンティフィック出版社（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、オックスフォード、イングランド、第１０章（１９８６）；ジャコビー（Ｊａｃｏｂｙ，Ｗ．Ｄ．）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．３４　アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９７４））。本発明の固定化抗体は、本発明のタンパク質のイムノアフィニティー精製のためと同様にイン・ビトロ、イン・ビボおよびイン・シトゥアッセイに使用され得る。
【００９９】
３．診断アッセイおよびキット
本発明はさらに、本発明のＤＦまたは抗体のうちの１つを使用することにより、試験サンプル中の本発明のＯＲＦ、またはそのホモログのうちの１つの発現を同定する方法を提供する。
詳細には、このような方法は、本発明の１つまたはそれ以上の抗体または１つまたはそれ以上のＤＦとともに試験サンプルをインキュベートし、ついで試験サンプル内の成分に対する該ＤＦまたは抗体の結合をアッセイすることからなる。
【０１００】
試験サンプルとともにＤＦまたは抗体をインキュベートする条件は様々である。インキュベーション条件はアッセイにおいて用いられる様式、用いられる検出方法、およびアッセイに使用されるＤＦまたは抗体のタイプおよび性質に依存する。当業者は、通常利用可能なハイブリダイゼーション、増幅、または免疫学的アッセイ態様のうちの任意のものが本発明のＤＦまたは抗体を用いるのに容易に改変され得ることを認識するであろう。このようなアッセイの例は、チャード（Ｃｈａｒｄ，Ｔ．）、アン・イントロダクション・トゥー・ラジオイムノアッセイ・アンド・リレイティッド・テクニクス（Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、エルセビア・サイエンス出版社、アムステルダム、オランダ（１９８６）；ブロック（Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．）ら、テクニクス・イン・イムノサイトケミストリー（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）アカデミック・プレス、オーランド、フロリダ　第１巻（１９８２）、第２巻（１９８３）、第３巻（１９８５）；ティジッセン（Ｔｉｊｉｓｓｅｎ，Ｐ．）、プラクティス・アンド・セオリー・オブ・エンザイム・イムノアッセイズ（Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）：ラボラトリー・テクニクス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー、エルセビア・サイエンス出版社、アムステルダム、オランダ（１９８５）に記載されている。
【０１０１】
本発明の試験サンプルには細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、または痰、血液、血清、血漿、または尿のような生物学的液体が含まれる。上記の方法において使用される試験サンプルは、アッセイの様式、検出法の性質および、アッセイをされるべきサンプルとして使用された組織、細胞または抽出物に基づき多様であろう。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は当該技術分野においてよく知られており、利用する系に適合するサンプルを得るために容易に改変され得る。
【０１０２】
本発明の他の態様としては、本発明のアッセイを行なうために必要な試薬を含むキットが提供される。
特に、本発明は、（ａ）本発明のＤＦ、または抗体のうちの１つを含む容器；および（ｂ）以下の物を１つまたはそれ以上含む１つまたはそれ以上の他の容器：洗浄試薬、結合した抗体またはハイブリダイズしたＤＦの存在を検出することができる試薬、を含む１つまたはそれ以上の容器を密に詰め込んで収容すべく区画化されたキットを提供する。
【０１０３】
詳細には、区画化されたキットには試薬が別々の容器に含まれている任意のキットが含まれる。このような容器には、小さなガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックまたは紙のストリップが含まれる。このような容器により、サンプルおよび試薬が互いに混ざることなく（ｎｏｔ　ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）試薬をある１つの区画から他の区画へ効率良く移すことができ、また、各容器の試薬または溶液を、ある１つの区画から他の区画へ定量的な流儀により加えることができる。このような容器には、試験サンプルを受納するであろう容器、アッセイに使用される抗体を含む容器、洗浄試薬を含む容器（リン酸緩衝食塩水、トリス−バッファーのようなものなど）、および結合した抗体またはＤＦを検出するのに使用される試薬を含む容器が含まれる。
【０１０４】
検出試薬のタイプには標識された核酸プローブ、標識された二次抗体、また代わるものとして、もし一次抗体が標識されているなら、該標識抗体と反応することができる酵素または抗体結合試薬が含まれる。当業者は、開示された本発明のＤＦおよび抗体が当該技術分野においてよく知られている確立されたキット様式のうちの１つに容易に組み入れられることができると容易に認識するであろう。
【０１０５】
４．結合試薬のスクリーニングアッセイ
本発明の単離されたタンパク質を使用することにより、本発明はさらに本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされているタンパク質に結合するまたは本明細書に開示されているマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片のうちの１つに結合する試薬を得る方法および同定する方法を提供する。
詳細には、該方法は下記工程からなる：
（ａ）本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされる単離されたタンパク質またはマイコプラズマゲノムの単離された断片に試薬を接触させ；ついで
（ｂ）該タンパク質または該断片に該試薬が結合するかどうかを決定する。
上記アッセイにおいてスクリーニングされる試薬には、ペプチド、炭水化物、ビタミン誘導体、または他の医薬品が含まれるがこれらに限られるものではない。該試薬ランダムに選択およびスクリーニングされてよいし、またはタンパク質モデリング技術を使用して合理的に選択または設計することが可能である。
【０１０６】
ランダムスクリーニングに関しては、ペプチド、炭水化物、医薬品などの試薬はランダムに選択され、本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質に結合する能力についてアッセイされる。
代わりに、試薬は合理的に選択されまた設計されてよい。本明細書において、試薬は、特定のタンパク質の立体配置に基づいて選択される場合に「合理的に選択または設計される」といわれる。例えば、当業者は、合理的に設計された抗ペプチドペプチド（例えばハービー（Ｈｕｒｂｙ）ら、アプリケーション・オブ・シンセティック・ペプチド（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）：アンチセンス・ペプチド″（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、シンセティック・ペプチド（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、ア・ユーザーズ・ガイド（Ａ　Ｕｓｅｒ’ｓ　Ｇｕｉｄｅ）、フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク（１９９２）、２８９−３０７頁、およびカスプザーク（Ｋａｓｐｃｚａｋ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２８：９２３０−８（１９８９）を参照）、または医薬品などを産生するために、ある特定のペプチド配列に結合することができるペプチド、医薬品などを生成するために目下利用可能である手順を容易に改変することが可能である。
【０１０７】
上記に加えて、本発明の試薬の１つのクラスは、広く記載されているように、本発明のＯＲＦまたはＥＭＦのうちの１つに結合することにより、遺伝子発現を調節するのに使用され得る。上記のとおり、このような試薬は、ランダムにスクリーニングされるかまたは合理的に設計される／選択されることができる。ＯＲＦまたはＥＭＦをターゲティングすることにより、当業者は、発現調節のため同じＥＭＦに依存している１つのＯＲＦまたは複数のＯＲＦのいずれかの発現を調節する、配列特異的または要素特異的な試薬を設計することが可能である。
【０１０８】
ＤＮＡ結合試薬のうちの１つのクラスは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合することによってハイブリダイズするまたは三重螺旋構造を形成する塩基残基を含む試薬である。このような試薬は古型的なリン酸ジエステルによる、リボ核酸骨格に基づき得るか、または塩基接着能力を有する様々なスルフヒドリルまたはポリマー誘導体であり得る。
【０１０９】
これら方法における使用に適している試薬は、通常、２０〜４０塩基を含み、転写に関係する遺伝子領域に相補的に（三重螺旋−リー（Ｌｅｅ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）；クーニー（Ｃｏｏｎｅｙ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１；４５６（１９８８）；およびダーバン（Ｄｅｒｖａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１；１３６０（１９９１））、またはｍＲＮＡそのものに相補的に（アンチセンス−オカノ（Ｏｋａｎｏ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；オリゴデオキシヌクレオチズ・アズ・アンチセンス・インヒビターズ・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ＣＲＣ出版社（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ）、ボカ・レイトン、フロリダ（１９８８））設計されている。三重螺旋の形成は、最適にはＤＮＡからＲＮＡへの転写の遮断（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）という結果となるのに対して、アンチセンスＲＮＡハイブリダイゼーションはｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を妨害する。両技術はモデル系において有効であることが証明されている。本発明の配列に含まれている情報は、アンチセンスまたは三重螺旋オリゴヌクレオチドおよび他のＤＮＡ結合試薬の設計に必要である。
【０１１０】
本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされるタンパク質に結合する試薬は、該ＯＲＦによってコードされるタンパク質の活性を調節することにより細菌感染の制御において、診断試薬として使用され得る。本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされるタンパク質に結合する試薬は、マイコプラズマの成育および感染をコントロールすることにおける使用のため、公知の技術を用いて調合して医薬組成物とすることができる。
【０１１１】
５．ワクチンおよび医薬組成物
本発明はさらに、マイコプラズマ・ジェニタリウムまたは他の関連した生物の成育の調節にイン・ビボまたはイン・ビトロにて使用され得る医薬を提供する。本明細書において使用する「医薬」とは、公知の技術を使用することにより調合して医薬組成物を提供することができる物の組成物として定義されている。本明細書において使用する「本発明の医薬」とは、本発明のＯＲＦによってコードされるタンパク質由来の医薬、または本明細書に記載のアッセイを使用することにより同定される医薬をいう。
【０１１２】
本明細書において、医薬は、該医薬が問題となっている生物の成育の速度、分裂の速度、または生存能力を減少させる場合に「イン・ビボまたはイン・ビトロにおいてマイコプラズマ種または関連した生物の成育を調節した」といわれる。本発明の医薬は多くの仕方で、生物の成育を調節することできるが、活性の基礎をなすメカニズムの理解は本発明の医薬の使用を実行するのに必要ではない。医薬のうちの幾つかは、重要なタンパク質に結合することにより該タンパク質の生物学的活性を妨害することにより成育を調節するであろうし、他の医薬は結合を妨害するかまたは生物体の生体本来の免疫系をより活性化する生物の外表面の成分に結合する。代わりに、医薬には本発明のＯＲＦのうちの１つによってコードされているタンパク質が含まれ、ワクチンとして機能してよい。表面膜成分、例えばＬＰＳに基づくワクチンの開発および使用は当該技術分野においてよく知られている。
【０１１３】
本明細書において使用する「関連した生物」とは、その成育が本発明の医薬の１つにより調節され得るあらゆる生物を含む広範な意味の語句である。一般に、このような生物は、医薬の標的であるタンパク質またはワクチンとして使用されるタンパク質のホモログを含むであろう。このように、関連した生物は細菌である必要はなく、真菌またはウイルス病原体であってもよい。
本発明の医薬および医薬組成物は経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によってのような簡便な方法にて投与できる。医薬組成物は特定の適応症の処置および／または予防に有効な量にて投与される。概して、それらは少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の量にて投与され、たいていの場合、１日あたり約８ｍｇ／Ｋｇ体重を超えない量にて投与されるであろう。殆どの場合、投与量は投与経路、徴候などを考慮して、毎日約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／Ｋｇ体重の範囲である。
【０１１４】
本発明の医薬は天然の形態にて使用され得るかまたは化学的誘導体を形成すべく修飾され得る。本明細書において、分子は、普通は該分子の一部ではない付加的な化学残基を含む場合に、他の分子の「化学的誘導体」といわれる。このような残基は分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善するかもしれない。代わりに、これら残基は該分子の毒性を減少させ、該分子の望ましくない、副作用を除去または減弱させるかもしれない。このような効果を媒体することができる残基はレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８０）に開示されている。
【０１１５】
例えば、所定の抗体への親和性のような機能的誘導体の免疫学的特徴における変化は、競合タイプのイムノアッセイによって測定される。免疫調節（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）活性における変化は適当なアッセイによって測定される。酸化還元または熱安定性、生物学的半減期、疎水性、タンパク質加水分解への感受性または担体とのまたは多量体への凝集の傾向のようなタンパク質特性の修飾は、当業者によく知られている方法によってアッセイされる。
【０１１６】
本発明の医薬の治療学的効果は、任意の適当な手段（すなわち、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、経腸、または非経口）によって患者に該医薬を提供することにより得ることができる。該生物の成育が制御される血液または組織内の有効濃度を達成するように、本発明の医薬を投与することが好ましい。
有効血中濃度を達成するため、好ましい方法は注射によって医薬を投与することである。投与は、連続注入または１回または多数回にわたる注射によってよい。
【０１１７】
患者に本発明の医薬の１つを与える場合に、投与された医薬の用量は患者の年齢、体重、身長、性別、一般的な医療条件、既往症などのような因子に依存して変化するであろう。概して、約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲にわたる医薬の服用量を受領者に与えるのが望ましいが、より低いまたはより高い服用量が投与されてもよい。該治療学的に効果的な服用量は本発明の医薬または他の医薬の組み合わせによって低くすることができる。
【０１１８】
本明細書において、２つまたはそれ以上の化合物または医薬は、（１）各化合物の生理学的効果、または（２）各化合物の血清濃度が同時に測定され得る場合、互いに「組み合わせて」投与されるといわれる。本発明の組成物は他の医薬の投与と同時に、それに先立ち、またはそれに引き続いて投与され得る。
本発明の医薬は標的生物の成育速度（上記で定義したように）を減少させるのに十分である量にて受領患者に与えられるよう意図されている。
【０１１９】
本発明の医薬の投与は「予防上」または「治療上」の目的のいずれであってもよい。予防上の目的で与えられる場合、医薬は生物の成育を示す任意の徴候に先立って与えらえる。該医薬の予防上の目的での投与は、その後の感染の開始を防ぎ、減弱し、または開始の割合を減少させる。治療上の目的で与えられる場合、医薬は感染の徴候の開始時に（またはそのすぐ後に）与えられる。該化合物の治療上の目的での投与は感染の病理上の徴候を弱め、回復速度を上昇させる。
【０１２０】
本発明の医薬は製薬学的に許容しうる形態にておよび治療上の目的に有効な濃度にて哺乳類に投与される。組成物は、その投与が受領患者において許容しうる場合に「薬理学上許容しうる」といわれる。このような医薬は、その投与量が生理学的に有意である場合、「治療学的に有効な量」にて投与されているといわれる。医薬は、その存在が受領患者の生理機能における検出可能な変化という結果となるならば、生理学的に有意であるといわれる。
【０１２１】
本発明の医薬は、製薬上有用な組成物を調製するための公知の方法により調合することができ、それによってこれらの物質、またはその機能的な誘導体が製薬学上許容しうる担体ビヒクルに混合される。適当なビヒクルおよびその調合は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含めて例えばレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（第１６版、オソル（Ｏｓｏｌ，Ａ．）編、マック（Ｍａｃｋ）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）ペンシルベニア（１９８０））に記載されている。有効な投与に適した製薬学的に許容しうる組成物を生成するには、このような組成物は、適当な量の担体ビヒクルと共に、本発明の医薬の１つまたはそれ以上を有効量含むであろう。
【０１２２】
別の製薬方法を作用の持続時間を制御するために使用してよい。制御放出製剤は、本発明の医薬の１つまたはそれ以上と複合体を形成しまたは吸収するポリマーの使用によって達成し得る。制御された送達は適当な巨大分子（例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、酢酸ビニルエチレン（ｅｔｈｙｌｅｎｅｖｉｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン、硫酸塩）および、巨大分子の濃度の選択並びに制御放出のための導入方法によって行なうことができる。制御放出製剤による作用の持続の制御のための他の可能な方法は、本発明の医薬をポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどのポリマー物質の粒子に導入することである。別法として、ポリマー粒子にこれらの医薬を導入する代わりに、これらの物質を例えば、コアセルベーション法または界面重合により調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル中、またはコロイド状薬物送達システム、例えば、リポソーム、アルブミン微小球、（ａｌｂｕｍｉｎ　ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、マイクロエマルジョン、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、およびナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ）またはマクロエマルジョン中に捕捉することが可能である。このような技術は、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（１９８０）に開示されている。
【０１２３】
本発明はさらに、本発明の医薬組成物の成分の１つまたはそれ以上を充填した１つまたはそれ以上の容器が含まれる製薬パックまたはキットを提供する。このような容器に関連して医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を統制している政府機関によって、規定された形態において注意書があり、それにはヒトの投与のための製造、使用、または販売の当局による認可を反映しているのである。加えて、本発明の医薬は他の治療上の化合物と共に使用されてよい。
【０１２４】
【実施例】
実験
実施例１
実験計画および方法の概要
１．ショットガンシークエンシング戦略
全ゲノムシークエンシングへのショットガンアプローチの全体の戦略は、表３に略述されている。ショットガンシークエンシングの理論は、ポワソン分布ｐｘ＝ｍｘｅ／ｘ（式中、ｘはある事象の起こる数であり、ｍは起こる数の平均値である）の等式の適用に従う。ある量のランダム配列を生成した後に所定の塩基がシークエンシングされない確率を決定するため、Ｌはゲノムの長さ、ｎはシークエンシングされたクローン挿入端の数、ｗはシークエンシングで読み取れた長さとするなら、ｍ＝ｎｗ／Ｌであり、所定の塩基に先立つ、ｗ塩基のうちのいずれにおいてもクローンが得られない確率、すなわち、塩基がシークエンシングされない確率はｐ０＝ｅ−ｍである。単位形態として倍数カバレッジ（ｆｏｌｄ　ｃｏｖｅｒａｇｅ）を使用すると、配列の５８０ｋｂがランダムに生成した後は、ｍ＝１で、１Ｘカバレッジを表すことがわかる。この場合、ｐ０＝ｅ−１＝３７であり、それゆえ約３７％がシークエンシングされていない。５Ｘカバレッジ（両挿入端からシークエンシングされた約３１５０クローン）ではｐ０＝ｅ−５＝０．００６７、すなわち６７％がシークエンシングされていないことになる。総ギャップ長はＬｅ−ｍで、ギャップの平均の大きさはＬ／ｎである。５Ｘカバレッジは平均約８０ｂｐの大きさの約４８ギャップを残すであろう。この処理は本質的にランダー（Ｌａｎｄｅｒ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）のものである。表４は平均的な断片の大きさ４００ｂｐにて５８０ｋｂのカバレッジのランダムシークエンシング実験のコンピュータシミュレーションを示している。
【０１２５】
２．ランダムライブラリーの構築
実際のシークエンシング間に上記のランダムモデルを正確に近づけるために、クローン化されたゲノム断片の殆ど理想的なライブラリーが要求される。マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの染色体ＤＮＡを機械的に切断し、平滑末端を作るのにＢＡＬ３１ヌクレアーゼにて消化し、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画した。２．０ｋｂの大きさの範囲の断片を切り出し、回収した。これらの断片を、ＳｍａＩにて切断されホスファターゼ処理された、ｐＵＣ１８ベクターにライゲートし、ライゲーションした産物をアガロースゲル電気泳動によって分画した。線形になったベクターおよび挿入バンドを切り出し、回収した。線形になった組換え体分子の末端をＴ４ポリメラーゼ処理によって修復し、ついで該分子をライゲーションして環状にした。この２つの段階の手順は、二重挿入キメラ（＜１％）または遊離のベクター（＜１％）からの最少の汚染を有し、二重挿入プラスミド組換え体からの最少の汚染を有する単一挿入プラスミド組換え体の分子的にランダムなコレクションという結果となった。ランダムさからの偏差はクローニングの間に最も起こり易い。全ての組換えおよび制限機能が欠失している大腸菌宿主細胞を、再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）、欠失、および制限によるクローンの損失を防ぐのに使用した。形質転換された細胞を、抗生物質を撒いたプレートに直接プレーティングして通常のブロス回収期を回避し、最も速く成育している細胞の増殖および選択を可能にした。全てのコロニーが大きさに関係無く鋳型の調製に取られた。「有毒な（ｐｏｉｓｏｎ）」ＤＮＡまたは有害な遺伝子産物のために失われたクローンのみをライブラリーから除き、期待されたよりもギャップの数が僅かに増加した。
【０１２６】
マイコプラズマ・ジェニタリウムランダム挿入ライブラリーの品質を評価するため、配列データをＭ１３Ｆプライマーを使用することにより約２０００の鋳型から得た。ランダム配列断片は５００、１０００、１５００、および２０００配列断片が得られた後、ザ・インスティチュート・フォー・ゲノミック・リサーチ（Ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（ＴＩＧＲ）のオートアセンブラーソフトウェアを使用することによってアセンブルされ、独特のアセンブル塩基対の数を決定した。アセンブリーの進行は、２０００配列断片までのアセンブリーから得た実際のデータを使用してプロットされ、理想的なプロットにて提供されているデータと比較した。理想的なプロットからの実際のアセンブリーデータの逸脱は本質的に見られず、このことは本発明者らが二重−挿入キメラまたは遊離のベクターからの汚染が最小である理想的なランダムライブラリーに近いものを構築したことを示している。
【０１２７】
３．ランダムＤＮＡシークエンンシング
５７６０のプラスミド鋳型が、製造業者たちによって示唆されたように、ＡＧＴＣ（ゲイザーズバーグ（Ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド）と共同で開発された「ボイラービード（ｂｏｉｌｅｒ　ｂｅａｄ）」調製方法によって調製された。該ＡＧＴＣ法は細菌増殖から最終ＤＮＡ精製にいたるまでのＤＮＡ調製の全ての段階について９６−ウェル様式にて行なわれる。鋳型濃度は、ヘキストダイ（Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｄｙｅ）およびミリポアーサイトフルオアー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ）によって決定された。ＤＮＡ濃度は調節されず、低産生鋳型が同定され、可能な場合にシークエンシグされなかった。シークエンシング反応を、Ｍ１３正（−２１Ｍ１３）プライマーおよびＭ１３逆（ＲＰ１）プライマーのためのアプライド・バイオシステムズ・ＰＲＩＳＭ・レディ・リアクション・ダイ・プライマー・サイクル・シークエンシング・キッツ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＲＩＳＭ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｙｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔｓ）とともにＡＢ・キャタリスト・ラブ・ステーション（ＡＢ　Ｃａｔａｌｙｓｔ　Ｌａｂ　ｓｔａｔｉｏｎ）またはパーキン−エルマー・９６００・サーモサイクラーズ（　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　９６００　Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒｓ）を使用してプラスミド鋳型に対して行なった。染料ターミネーターシークエンシング反応を、アプライド・バイオシステムズ・レディ・リアクション・ダイ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キッツ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔｓ）を用い、パーキン−エルマー・９６００・サーモサイクラー上でラムダ鋳型に対して行なった。９，８６４のシークエンシング反応が２カ月をかけて平均１０台のＡＢ３７３ＤＮＡシークエンサーを使用して４人によりプロジェクトのランダム相の間に行なわれた。全てのシークエンシング反応は、ＡＢ３７３のストレッチモディフィケーション（Ｓｔｒｅｔｃｈ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用い、主として３６ｃｍの読み取り充分な距離を使用して分析された。全体のシークエンシング成功率はＭ１３−２１配列では８８％であり、Ｍ１３ＲＰ１配列では８４％であった。平均使用可能な読み取り長はＭ１３−２１配列では４８５であり、Ｍ１３ＲＰ１配列では４４１であった。
【０１２８】
当該技術は、ショットガンアセンブリープロジェクトにおいての整列群（ｃｏｎｔｉｇｓ）の整列を容易にするためにシークエンシング鋳型の両端からの配列を使用する価値を記載している。当業者はＭ１３−２１（正）プライマーに比較してＭ１３ＲＰ１（逆）プライマーを用いて行なわれたシークエンシング反応の読み取り長が短く成功率が低いことに対して両端シークエンシングの望ましさ（低い総鋳型数の低減少したコストを含む）を比較考慮しなければならない。このプロジェクトでは本質的に全ての鋳型は両端からシークエンシングされた。
【０１２９】
４．自動化サイクルシークエンシングのプロトコール
５台のＡＢＩキャタリスト・ロボット（ＡＢＩ　Ｃａｔａｌｙｓｔ　ｒｏｂｏｔｓ）および１０台のＡＢＩ３７３自動化・ＤＮＡ・シークエンサー（ＡＢＩ３７３　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ）を使用してシークエンシングは構成された。該キャタリスト・ロボットはＤＮＡシークエンシング反応のために特別に開発された公的に利用可能な高性能のピペッティングおよび温度制御ロボットである。該キャタリストは、前もってアリコートされた鋳型と、デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド、Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、蛍光標識されたシークエンシングプライマーおよび反応緩衝液からなる反応混合物と混合する。反応混合物および鋳型はアルミニウム９６−ウェルサーモサイクリングプレート（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ　ｐｌａｔｅ）のウェル中で混合された。３０回連続の線形増幅（例えば、１つのプライマー合成）の工程が、変性、プライマーおよび鋳型のアニーリング、およびＤＮＡ合成の伸長を含み行なわれた。サーモサイクリングプレート上のゴム製ガスケットを有する加熱された蓋により、油を上にかぶせる必要なく蒸発が妨げられた。
【０１３０】
２つのシークエンシングのプロトコールが使用された：染料で標識されたプライマー（ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ）法および染料で標識されたジデオキシ・チェーン・ターミネーター（ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）法である。ショットガンシークエンシングには４つの染料で標識されたプライマーが使用され、４つのターミネーターヌクレオチドの各々のために１つずつ使用される。各染料−プライマーは異なる蛍光染料にて標識され、これにより個々の４つの反応は電気泳動、検出、および塩基呼び出し（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ）のために３７３ＤＮＡシークエンサーの１つのレーンに合わせることができるのである。目下、ＡＢＩはシークエンシングのために必要な鋳型以外の全ての試薬を含む前もって混合された反応混合物を大容量のパッケージに提供している。シークエンシングは、プラスミド鋳型が一般的により長い使用可能な配列を持っているが、プラスミド鋳型およびＰＣＲにより得られた鋳型の両方で、殆ど等しい複製度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を持った染料プライマー法および染料ターミネーター法で行なわれ得る。
【０１３１】
総数９６０のサンプルのために、３２の反応が毎日３７３シークエンサーにかけられた。電気泳動は製造業者のプロトコールに従って夜通し流され、そのデータは１２時間で収集された。電気泳動および蛍光検出に続いて、ＡＢＩ３７３にて自動化レーントラッキング（ｌａｎｅ　ｔｒａｃｋｉｎｇ）および塩基呼び出しが行なわれる。レーントラッキングは視覚的に確かめられた。各配列の電気泳動図（または蛍光レーントレース）が視覚的に調べられ、その品質が評価された。低い品質の引きずった配列は除去され、配列そのものはソフトウェアサイベース（Ｓｙｂａｓｅ）データベースを介してシークエンサーにかけられた（８ｍｍテープに毎日保管された）。リーディングベクターポリリンカー配列（Ｌｅａｄｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐｏｌｙｌｉｋｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は自動的にソフトウェアプログラムによって除去された。ＡＢＩ３７３シークエンサーからストレッチ・ライナーズ（Ｓｔｒｅｔｃｈ　Ｌｉｎｅｒｓ）へ変換された配列の平均編集長は約４６０ｂｐであった。
【０１３２】
情報科学
１．データ管理
大スケールのシークエンシングラボのため多数の情報管理システム（ＬＩＭＳ）が開発されている。使用者の誤りを減少させるため可能な場合は常に自動化されたデータフローを可能とするシステムが使用された。得られた配列情報を収集しアセンブルさせるのに使用された該システムは、サイベースＲＤＢＭＳ（Ｓｙｂａｓｅ　ＲＤＢＭＳ）を使用して作られた関係データ管理システムに集中させられている。該データベースは鋳型の調製からゲノムの最終分析にいたる全演算を行う間に集められた全ての情報を記憶し相互に関連づけるよう設計されている。ＡＢ３７３シークエンサーの未処理出力はマッキントッシュプラットフォームに基づき、選択されたデータ管理システムはユニックス（ＵｎｉｘＴＭ）プラットフォームに基づいているので、使用者の最小限の努力により分析結果同様未処理データがデータベースに継目なくフローできるための様々なマルチユーザ、クライエントサーバアプリケーションが設計され実行されることが必要であった。
【０１３３】
２．アセンブリー
８，４７２配列断片からの配列データはマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムをアセンブリーするのに使用された。該アセンブリーはＴＩＧＲにて開発された新規のアセンブリー機関（ＴＩＧＲアセンブラー−以前に設計されたＡＳＭＧ）を使用することにより行なわれた。該ＴＩＧＲアセンブラーは同時にゲノムの断片を群らがらせアセンブルさせる。必要な速度を得るため、ＴＩＧＲアセンブラーは潜在配列断片のリストを作るために１０ｂｐのオリゴヌクレオチドサブ配列の寄せ集め表を作る。各断片の潜在的重なりの数は、どの断片が繰り返し要素に相当しやすいかを決定する。単一のシード配列断片から開始し、該ＴＩＧＲアセンブラーは、オリゴヌクレオチドの含量に基づき最適にマッチした断片を加えようと試みることにより現行の整列群（ｃｏｎｔｉｇ）を拡張する。現行の整列群および候補断片は最適なギャップアラインメント（ｏｐｔｉｍａｌ　ｇａｐ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を提供するスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムの改良版を使用して並べられる。現行の整列群はマッチの質の厳重な基準に適合する場合にのみ、該断片によって伸長される。マッチの基準には重なりの最少の長さ、マッチしていない端の最大長、およびマッチの最小パーセントが含まれる。これらの基準は、自動的に該ＴＩＧＲアセンブラーによって最小カバレッジ領域において低められ、繰り返し要素を含む良い機会の領域においては高められる。散在的キメラ断片および繰り返し要素の境界を表す断片はしばしばアラインメントの端の部位における部分的なミスマッチに基づき拒絶され、該現行の整列群から排除される。該ＴＩＧＲアセンブラーは各鋳型の両端からのシークエンシングと合わせてクローンの大きさの情報を利用するよう設計されている。該ＴＩＧＲアセンブラーは同じ鋳型の２端からの配列断片が該整列群において互いに向き合い、ある範囲の塩基対（所定のライブラリーの公知のクローンの大きさに基づき限定可能な各クローン）内に位置することを強制する。マイコプラズマ・ジェニタリウムの８，４７２の配列断片のアセンブリーはＳＰＡＲＣｅｎｔｅｒ２０００上にてのＣＰＵ時間の１０時間が必要であった。全ての整列群は、該整列群内にての各断片の位置および共通の配列そのものについての広い情報を表すサイベース構造にかけられた。この工程の結果は２つのグループに整理された約４０の整列群であった（下記参照）。該ＴＩＧＲアセンブラーの工程の高ストリンジェンシーのために、お互いに対して該ＴＩＧＲアセンブラー工程により作られた全ての整列群のＦＡＳＴＡ（ＧＲＡＳＴＡ）アラインメントを行なうのが有用であることがわかった。この方法にてさらに重なりが検出され、２グループにおける２６整列群にデータセットの圧縮を可能にした。
【０１３４】
閉鎖の達成
完全なゲノム配列は整列群間のギャップのシークエンシングにより得られた。他のゲノムシークエンシングプロジェクトではギャップの充満が時間および費用の主要部分を占めたが、それは本発明においては最小であった。これは主に、１）ランダムクローンの数およびシークエンシング反応を行った結果としてのゲノムの飽和、２）ストレッチ・ライナーズから得られたより長い読み取り長、３）整列群をつなぐために得られたアンカー末端（ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｅｎｄｓ）、および４）高スループットシークエンシング能力（ｈｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｆａｃｉｌｉｔｙ）の全体としての性能および効率によるものであった。
【０１３５】
ギャップは表４に示されているように推定されたランダムベースで起こり、シミュレートされたランダムシークエンシングを示している。これらのギャップは一般に、大きさにして２００ｂｐより小さかった。全てのギャップはギャップに接している鋳型上でさらにシークエンシングすることにより閉じられた。これらの場合、ギャップ両端からの配列伸長のためのオリゴプライマーは当該技術分野において公知の技術を使用して作られた。これは、ギャップ領域に二重標準カバレッジを与えた。
【０１３６】
ショットガン法によって得られた配列情報が多く重複することは非常に正確な配列を与えた。本発明者らの配列の正確さは、得られた配列情報をジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに存在する公知のマイコプラズマ・ジェニタリウム遺伝子に対して比較することによって確証された。本発明者らの染色体構造の正確さは制限酵素による消化を公知のマイコプラズマ・ジェニタリウムの制限酵素地図と比較することによって確認された。マイコプラズマ・ジェニタリウムのＥｃｏＲＩによる制限酵素地図は図１に示されており、表５に表にして示されている。
【０１３７】
遺伝子の同定
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムＤＮＡに特異的な成分マトリクス（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｍａｔｏｒｉｃｅｓ）を使用することによりジーンワークスプログラム（ｔｈｅ　ｐｒｏｇｒａｍ　ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ）にてコーディングの可能性を評価することによってマイコプラズマ・ジェニタリウムのＯＲＦをまず定めた。該ＯＲＦ配列（およびフランキング配列の３００ｂｐ）は非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）細菌タンパク質（ＮＲＢＰ）のデータベースに対して検索するのに使用される。重複分（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）は２段階にてＮＲＢＰから除去された。（１）すべてのＤＮＡコーディング配列をジーンバンク（リリース８５）から抽出し、同じ種からの配列を互いに検索した。＞１００ヌクレオチドの領域にわたって９７％の類似性を有する配列を結合した。（２）該配列は翻訳され、スイス−プロット（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ）（リリース３０）における全ての配列とタンパク質比較に使用された。同じ種に属し、３３のアミノ酸にわたって＞９８％の類似性を有する配列が結合された。ＮＲＢＰは２３７５１のジーンバンク配列からの２１４４５の配列および１０９９の異なる種からの１１１８３のスイス−プロット配列からなる。
【０１３８】
検索は、（１）タンパク質データベースに対する検索のための全部で６つのリーディングフレーム（読み枠（ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ））において疑問となるＤＮＡ配列を翻訳し、（２）疑問となっている部分にマッチするタンパク質配列を同定し、（３）改変されたスミス−ウォーターマンアルゴリズムを使用してタンパク質−タンパク質マッチを並べるアルゴリズムを使用して行なわれた。ＤＮＡ配列において挿入または欠失がフレームシフトエラーを生み出す場合においては、アラインメントアルゴリズムは最大の類似性のタンパク質領域で開始し、３００ｂｐフランキング領域を使用して同じデータベースマッチにアラインメントを拡張した。フレームシフトエラーを含むことが知られている領域はデータベースに保存され、訂正の可能性を評価された。役割のカテゴリイはリレイらによって大腸菌の産物のために以前に定義されたものから採用された。役割の割り当ては、該ＯＲＦＳのタンパク質配列とリレイデータベース中のスイス−プロット配列を結合することによってタンパク質配列レベルでマイコプラズマ・ジェニタリウムＯＲＦＳについてなされた。
【０１３９】
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのシークエンシング、ゲノム分析およびゲノムの比較の詳細な記載
本発明者らは、ヘモフィルス・インフルエンゼゲノムの分析にうまく応用されている、全染色体ショットガンシークエンシングおよびアセンブリー法（フレイシュマン（Ｒ．Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））を使用することにより、該マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの完全なヌクレオチド配列（５８０，０７１ｂｐ）を決定した。これらのデータは真正細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの完全なゲノム配列（１．８３Ｍｂ）の記載と共に、全ゲノムレベルでゲノムを比較する機会を初めて提供した。本発明者らの最初の全ゲノム比較は、マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼの異なる生理学的および代謝的能力を反映しているゲノム内容におけるの根本的な差異を明らかにしている。
【０１４０】
全ゲノムショットガンシークエンシングおよびアセンブリーのための方法および戦略は、以前にヘモフィルス・インフルエンゼのために記載されたものと同様である（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））。とりわけ、全部で５０μｇの精製されたマイコプラズマ・ジェニタリウム株Ｇ−３７ＤＮＡ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．３３５３０）はヘイフリックの培地（Ｈａｙｆｌｉｃｋ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）にて成育された細胞から単離された。ＤＮＡ５０μｇ、３００ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび３０％グリセロールを含む混合物（９９０μｌ）はネブライザーチャンバにおいて０℃に冷やされ、６０秒間４ｌｂｓ／ｉｎ２で切断された。該ＤＮＡはエタノール沈澱され、５０μｌのトリス−ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーに平滑末端を作るために再溶解された；その一部４０μｌが２単位のＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）で８５μｌのＢＡＬ３１バッファーにて３０℃で１０分間消化された。該ＤＮＡはフェノール抽出され、エタノール沈澱され、６０μｌのＴＥバッファーに溶解され、１％低溶解アガロースゲル上で分画された。ある画分（２．０ｋｂ）が切り出され、フェノール抽出され、２０μｌのＴＥバッファーに再溶解された。２段階のライゲーション手順が、＞９９％が単一挿入であるような挿入が組換え体の９９％に含まれるプラスミドライブラリーを生成するのに使用された。最初のライゲーション混合物（５０μｌ）は約２μｇのＤＮＡ断片、２μｇのＳｍａＩ＋細菌アルカリホスファターゼｐＵＣ１８ＤＮＡ（ファルマシア）、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）１０単位が含まれ、４℃にて５時間インキュベートされた。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、該ＤＮＡは２０μｌのＴＥバッファーに溶解され、１％低溶解アガロースゲル上の電気泳動により分離された。挿入（ｉ）、ベクター（ｖ）、ｖ＋ｉ、ｖ＋２ｉ、ｖ＋３ｉなどの大きさで同定され臭化エチジウム染色され線形化されたＤＮＡバンドのはしごが、３６０ｎｍの波長の紫外線によって視覚化された。ｖ＋ｉ　ＤＮＡは切り出されて２０μｌのＴＥバッファーに回収された。該ｖ＋ｉ　ＤＮＡは、供給者によって推薦されたバッファー条件の下、線形化されたｖ＋ｉ断片、４つのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（各２５μＭ）、およびＴ４ポリメラーゼ３単位（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を含む反応混合物（５０μｌ）中において３７℃で５分間Ｔ４ポリメラーゼ処理することにより平滑末端化された。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、修復されたｖ＋ｉ線形断片は２０μｌのＴＥに溶解された。環形成のための最終ライゲーションは、５μｌのｖ＋ｉ　ＤＮＡおよびＴ４リガーゼ５単位を含む反応混合物（５０μｌ）において１５℃で一夜行なわれた。該反応混合物は６７℃にて１０分間加熱され、−２０℃にて保存された。
【０１４１】
形質転換に関しては、エピキュリアン・シュアー・２・スーパーコンピテント・セルズ（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　ＳＵＲＥ　２　Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ）（ストラタジーン２００１５２）の１００μｌ部分が氷上で溶かされ、氷上で冷やされたファルコン２０５９（Ｆａｌｃｏｎ　２０５９）チューブに移された。１．４２Ｍのβ−メルカプトエタノールが１．７μｌの容量にて、最終濃度が２５ｍＭとなるように細胞に加えられた。細胞は、氷上で１０分間インキュベートされた。最終ライゲーション混合物のサンプル１μｌが細胞に加えられ、氷上で３０分間インキュベートされた。該細胞は４２℃にて３０秒間熱処理され、２分間氷上に戻された。液体培養における成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）期は形質転換された任意の細胞の優先的な成育を最小にするため省かれた。代わりに、該形質転換された細胞は栄養素が豊富である５ｍｌのＳＯＢアガーの底面層を含む（１．５％ＳＯＢアガーは、２０ｇのトリプトン、５ｇの（酵母エキス）、０．５ｇのＮａＣｌ、および１．５％ジフコアガー／ｌからなる）ＳＯＢプレート上に直接置かれた。該５ｍｌ底面層はＳＯＢアガー１００ｍｌあたり０．４ｍｌのアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加された。１５ｍｌのＳＯＢアガー表面層はＳＯＢアガー１００ｍｌあたり１ｍｌのＭｇＣｌ２（１Ｍ）および１ｍｌのＭｇＳＯ４（１Ｍ）を添加された。１５ｍｌのＳＯＢアガー表面層はプレーティングの直前に注がれた。ライブラリーの力価は形質転換の１０μｌアリコートあたり約１００コロニーであった。
【０１４２】
完全なヘモフィルス・インフルエンゼゲノムのシークエンシングおよびアセンブリーから学んだ教訓の１つは、整列群の整列とギャップ閉鎖は該プロジェクトのランダムシークエンシングフフェイズが少なくとも６倍のカバレッジにてシークエンシングされたゲノムの少なくとも９９．８％−９９．９％まで続けられた場合に最も効率良いということであった。マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのためにこのカバレッジを得るために必要なランダムシークエンシング反応の数を計算するため、本発明者らはポワソン分布のランダーおよびウォーターマンの応用［ランダー（Ｅ．Ｓ．Ｌａｎｄｅｒ）およびウォーターマン（Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２：２３１（１９８８）］（その際、ｐｘ＝ｅ−ｎｗ／Ｌである）を使用した。ｐｘは所定の任意の塩基がシークエンシングされない確率、ｎはシークエンシングされたクローン挿入端の数、ｗはｂｐにおける各鋳型の平均読み取り長、およびＬはｂｐにおけるゲノムの大きさである。編集後に、平均シークエンシング読み取り長が４５０ｂｐである５８０ｋｂのゲノムに関して、約８６５０のシークエンシング反応（または両端からシークエンシングされた４３２５のクローン）は理論上ゲノムの９９．８５％のカバレッジを提供するに違いない。このカバレッジのレベルはシークエンシングされていない平均７０ｂｐの大きさの約１０のギャップを残すに違いない。
【０１４３】
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムライブラリーの質を査定するために、配列データはＭ１３正（Ｍ１３−２１）およびＭ１３逆（Ｍ１３ＲＰ１）プライマーの両方を使用して約６００の鋳型の両端から得られた。配列断片はＴＩＧＲアセンブラーを使用してアセンブリーされ、５８０ｋｂのライブラリーの平均読み取り長が４５０ｂｐである断片が大体ポワソン分布にあてはまることが分かり、これによって該ライブラリーが本質的にランダムであることが示された。
【０１４４】
このプロジェクトに関して、総数５７６０の二本鎖ＤＮＡプラスミド鋳型がボイリングビーズ法を使用する９６−ウェルフォーマットにて調製された。調製された鋳型の９４％は＞３０ｎｇ／μｌのＤＮＡ濃度を与え、シークエンシング反応に使用された。整列群の整列を容易にするため各鋳型は両端からシークエンシングされた。Ｍ１３正（Ｍ１３−２１）およびＭ１３逆（Ｍ１３ＲＰ１）プライマーのためのアプライド・バイオシステムズ・ＰＲＩＳＭ・レディー・リアクション・ダイ・プライマー・サイクル・シークエンシング・キットとともにＡＢ・キャタリスト・ラブ・ステーションを使用して反応は行なわれた。Ｍ１３−２１プライマーで編集した後の成功率および平均読み取り長はそれぞれ８８％および４４４ｂｐであり、Ｍ１３ＲＰ１プライマーではそれぞれ８４％および４３５ｂｐであった。鋳型調製から該プロジェクトの最終分析にいたる全てのデータは、ＴＩＧＲにて開発された関連データ管理システムに保存された［カーラベッジ（Ａ．Ｒ．Ｋｅｒｌａｖａｇｅ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・２６ｔｈ・アニュアル・ハワイ・インターナショナル・カンファレンス・オン・システム・サイエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｉｘｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｈａｗａｉｉ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ＩＥＥＥ　コンピュータ・ソサイエティー・プレス（ＩＥＥＥ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン、Ｄ．Ｃ．、１９９３）、５８５頁］。各整列群の整列を容易にするため各鋳型は両端からシークエンシングされた。総数９８４６のシークエンシング反応が、１日平均８台のＡＢ３７３ＤＮＡシークエンサーを使用し５人が全部で８週間かかって行なった。ピーターソンら（ピーターソンら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：７９１８（１９９３））からの２９９のランダムゲノム配列とともに８４７２の質の高いマイコプラズマ・ジェニタリウム配列断片のアセンブリーが、ＴＩＧＲアセンブラーにて行なわれた。アセンブリー過程は総数３，８０６，２８０ｂｐの一次ＤＮＡ配列データを含む３９の整列群（大きさの範囲：６０６〜７３，３５１ｂｐ）を生み出した。整列群は同じクローンの正および逆シークエンシグ反応由来の情報に基づく整列群を直結するプログラムＡＳＭ　ＡＬＩＧＮによって整列された。
【０１４５】
ＡＳＭ　ＡＬＩＧＮ分析は３９のギャップ全てが小さい挿入ゲノムＤＮＡライブラリーからの存在している鋳型によりカバーされている（すなわち、配列アセンブリー内に物理的ギャップは全く無かったことを明らかにした）。整列群の整列は、マイコプラズマ・ジェニタリウム染色体の物理的地図上の既知の位置と（ルシエールら、Ｇｅｎｅ　１５０：２７（１９９４）；ピーターソンら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３１９９（１９９５））、アセンブリーに組み入れられているピーターソンらからのランダムゲノム配列の整列（ピーターソンら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：７９１８（１９９３））を比較することにより確証された。ＴＩＧＲアセンブラーの高ストリンジェンシーのため、該３９の整列群はＧＲＡＳＴＡ（改良されたＦＡＳＴＡ（ブルトラグ（Ｂ．Ｂｒｕｔｌａｇ）ら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１：２０３（１９９３））で互いに検索された。ＢＬＯＳＵＭ６０アミノ酸置換マトリクスは、最初のアセンブリー過程間にて見逃されるであろう重なり（＜３０ｂｐ）を検出するために全てのタンパク質−タンパク質比較にて使用された［ヘニコッフ（Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコッフ（Ｊ．Ｇ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１（１９９２）］。１１の重なりがこのアプローチで検出され、ギャップの総数が３９から２８へと減少した。
【０１４６】
該配列のギャップ各々をカバーする鋳型が同定され、オリゴヌクレオチドプライマーが各整列群の末端にある配列から設計された。全てのギャップは３００ｂｐより少なかった；それゆえ各鋳型の両端からのプライマーウォークは閉鎖に十分であった。全ての電気泳動図は最初の配列編集のためＴＩＧＲエディター（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））で視覚的に調べられた。明らかななされた割り当てにおいて不一致が解決され得ない場合は、自動塩基呼び出し（ｂａｓｅ　ｃａｌｌｓ）は変化させずにおいた。
【０１４７】
シークエンシングの完了を決定するのための幾つかの基準は、ヘモフィルス・インフルエンゼゲノムシークエンシングプロジェクトについては確立されており、これらの同じ基準はこの研究に応用された。アセンブルしたマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにわたり、平均６．５倍の配列の重複がある。完成した配列には１％未満の単一の配列カバレッジが含まれる。編集後残っている５３の曖昧なものおよび配列類似性検索後発見された２５の潜在的なフレームシフトについては、適当な鋳型が別のシークエンシング化学によって（ダイターミネーター対ダイプライマー）曖昧さを解決するために再度シークエンシングされた。配列の正確さを査定することは非常に困難ではあるけれど、本発明者らは、オープンリーディングフレームにおけるシフトの頻度、解決されなかった曖昧さ、未処理データの全体的な質、および倍数・カバレッジ（ｆｏｌｄ　ｃｏｖｅｒａｇｅ）に基づき、誤りの割合が１００塩基に１塩基より少ないと見積もっている。
【０１４８】
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのシークエンシング、アセンブリー、および注釈のための直接的なコストの見積もりは、ライブラリー構築、鋳型の調製およびシークエンシング、ギャップの閉鎖、配列の確認、注釈、および刊行の準備、および塩基対における該ゲノムの大きさによる分割のための試薬および労力のコストを合計することによって決定された。これは終了した塩基対１つにつき３０セントの最終コストをもたらした。
【０１４９】
ゲノムの分析
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムは５８０，０７１ｂｐの環状染色体である。全体のＧ＋Ｃ含有量は３２％（Ａ、３４％；Ｃ、１６％；Ｇ、１６％；およびＴ、３４％）である。該ゲノム全般にわたるＧ＋Ｃ含有量は２７および３７％間（５０００ｂｐの枠（ｗｉｎｄｏｗ）を使用して）で変わり、最も低いＧ＋Ｃ含有量の領域は該生物の推定複製起点の両側にある。ヘモフィルス・インフルエンゼにおけるように（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））、マイコプラズマ・ジェニタリウムにおけるｒＲＮＡオペロンは、ｔＲＮＡ遺伝子がそうであるように（５２％）、該ゲノムの残りの部分よりＧ＋Ｃ含有量が高い（４４％）。これらの領域におけるより高いＧ＋Ｃ含有量は、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡにおける二次構造のために必須のＧ＋Ｃ塩基対形成を保持する必要性を反映している（ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．）ら、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２０：７６８（１９８４））。
【０１５０】
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムはコスミドマッピングデータ（ルシエールら、Ｇｅｎｅ　１５０：２７（１９９４）；ピーターソンら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３１９９（１９９５））によって予測されるように、７４のＥｃｏＲＩ断片を含む。配列分析から決定されたＥｃｏＲＩ断片の順序と大きさは、以前に報告されたもの（ルシエールら、Ｇｅｎｅ　１５０：２７（１９９４）；ピーターソンら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３１９９（１９９５））に一致するが、該配列において座標６２，７０８および９４，５７３の間に１つの明らかな不一致が存在する。しかしながら、ゲノム配列分析からの結果と照らし合わせてのコスミドハイブリダイゼーションデータの再評価により該配列データが正しいことが確認され、コスミドマップのこの領域における余分な４．０ｋｂＥｃｏＲＩ断片はコスミドＪ−８および２１間の重なりの誤った解釈（ルシエールら、未公開の観察）を反映している。整列化されたコスミドライブラリーからの各クローンの末端はシークエンシングされ、図４内の環状染色体に示されている。配列分析に基づいたコスミドの整列は、物理的なマッピングによって決定されたもの（ルシエールら、Ｇｅｎｅ　１５０：２７（１９９４）；ピーターソンら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３１９９（１９９５））に完全に一致している。
【０１５１】
本発明者らは推定複製起点（ベイリーおよびボット（Ｂａｉｌｅｙ　＆　Ｂｏｔｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５８１４（１９９４））基づいてマイコプラズマ・ジェニタリウムの染色体配列の最初のｂｐを定義した。幾つかの原核生物における複製起点の研究は、ＤＮＡ合成がｄｎａＡおよびｄｎａＮ間の転写されないＡＴに富む領域にて開始されることを示している（オガサワラ（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｎ．）ら、ザ・バクテリアル・クロモソウム（Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、クルリカ（Ｋｒｌｉｃａ）およびリレイ編、アメリカン・ソサイエティー・フォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９９０）、２８７−２９５頁；オガサワラおよびヨシカワ（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６２９（１９９２））。大腸菌、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの共通「ＤｎａＡボックス」を用いて推定複製起点の周りの「ＤｎａＡボックス」についてマイコプラズマ・ジェニタリウム配列を検索したところ、有意なマッチが存在しないことがわかった。本発明者らは該起点を正確に位置付けることはできなかったが、染色体の４０００ｂｐ領域にｄｎａＡおよびｄｎａＮが共に位置すること（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、それがマイコプラズマ・ジェニタリウムの複製起点であるという仮説を支持している（オガサワラら、ザ・バクテリアル・クロモソウム、クルリカおよびリレイ編、アメリカン・ソサイエティー・フォー・マイクロバイオロジー、ワシントン、Ｄ．Ｃ．（１９９０）、２８７−２９５頁；オガサワラおよびヨシカワ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：６２９（１９９２）、ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ，Ｍ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：４８１６（１９９３））。本発明者らは、ｄｎａＮが該ゲノムにて最初のオープンリーディングフレームとして番号付けられるようにｄｎａＡおよびｄｎａＮ間の非転写領域を選択した。図４に示されているように、この領域の右側にある遺伝子はプラス鎖から優先的に転写され、この領域の左側にある遺伝子はマイナス鎖から優先的に転写される。遺伝子転写における見かけの極性は該ゲノムの各半分にわたって維持されている（図４および図５Ａ〜図５Ｒ）。これは、複製起点の周囲に見かけの転写極性が示されていないヘモフィルス・インフルエンゼと著しく対照的である。この観察の意義は、未だ決められてはいない。
【０１５２】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの予測されたコーディング領域は、最初に１００アミノ酸を超えるオープンリーディングフレームについて全ゲノムを検索することにより定義づけられた。翻訳は、ＵＧＡがトリプトファンをコードするマイコプラズマ種の遺伝暗号を使用してなされた。全てのオープンリーディングフレームはＢＬＡＺＥ（ブルターグら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１：２０３（１９９３））で検索された。ＢＬＯＳＵＭ６０アミノ酸置換マトリクスは、４０９６のマイクロプロセッサを有する大規模並列コンピュータ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ）ＭａｓＰａｒ　ＭＰ−２上でＴＩＧＲにて開発された非重複細菌タンパク質データベース（ＮＲＢＰ）（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））に対して全てのタンパク質−タンパク質比較（ヘニコフおよびヘニコフ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１（１９９２））に使用された。タンパク質マッチは、改良されたスミス−ウォーターマン（ウォーターマン、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６４：７６５（１９８８））であるＰＲＡＺＥアルゴリズムにて並べられた。該ゲノムの推定コーディング領域間のセグメントはＧｅｎＰｅｐｔ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、およびＰＩＲからの全てのタンパク質配列に対するさらなる検索に使用された。マイコプラズマ・ジェニタリウムの推定オープンリーディングフレームおよび公的保管所からの配列間の対様式（ｐａｉｒｗｉｓｅ）のアラインメントが調べられた。モチーフマッチは配列の類似性が推定コーディング領域における短いドメインに限られている場合に注釈付けられた。１７０の未同定コーディングオープンリーディングフレームのコーディングの可能性は、３０８のマイコプラズマ・ジェニタリウム配列で調整された（ｔｒａｉｎｅｄ）ＧｅｎｅＭａｒｋ（ボロドフスキー（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ）およびマックアイニンチ（ＭｃＩｎｉｎｃｈ、同書、１２３頁）にて分析された。コーディング可能性が低く（ＧｅｎｅＭａｒｋ分析に基づき）１００ヌクレオチド（総数５３）より小さいオープンリーディングフレームは、最終的な推定コーディング領域のセットより除去された。別の分析において、オープンリーディングフレームはヘモフィルス・インフルエンゼからの翻訳された配列の完全なセット（ＧＳＤＢアクセッションＬ４２０２３、（フレイッシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５）参照）に対して検索された。全体で、これらの処理の結果、４８２の推定コーディング領域が同定され、そのうち３６５は推定的に同定され（表６の該タンパク質マッチ２３はモチーフとして注釈付けられた。これらのデータマッチは完全長タンパク質のマッチではないがそれにもかかわらず、有意のアミノ酸類似性の領域を示した）、１１７はその他のいかなる生物におけるタンパク質配列に対してもマッチを有していなかった。
【０１５３】
公的配列の記録物からのタンパク質配列にマッチした該３６５の推定コーディング領域は、生物学的役割を割り当てられた。該役割の分類はリレイ（リレイら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：８６２（１９９２））から発展されたものであり、ヘモフィルス・インフルエンゼ割り当てにおいて使用されているもの（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））と同じものであった。本発明者らがマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにて遺伝子を検出することができない場合には別の検索手順が使用された。大腸菌、バシラス・サチリス、マイコプラズマ・カプリコラム、およびヘモフィルス・インフルエンゼのような真正細菌から利用できる問題となるペプチド配列は全ゲノム配列の６つの全てのリーディングフレーム翻訳に対する調査に使用され、該アラインメントが検討された。現行の検索方法、問題となっている配列の不完全なセット、またはデータベースマッチの主観的分析は、あるマイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子配列を同定するためには感受性が充分でないという可能性がある。
【０１５４】
推定的同定が割り当てられ得たマイコプラズマ・ジェニタリウムにおける全ての推定コーディング領域の半分は、グラム陽性細菌（例えばバシラス・サチリス）またはマイコプラズマ種からのタンパク質に対して最大程度類似性を示す。この知見の意義はＮＲＢＰが大腸菌からの３８８５の配列を含むがバシラス・サチリスからは１９７５の配列しか含まないという事実によって強調される。マイコプラズマ・ジェニタリウムコーディング領域が大腸菌およびバシラス種両方からの配列にマッチした場合の大多数において、より一層のマッチは大腸菌からの配列に対してより（平均で５６％の類似性）バシラスからの配列に対して（平均で６２％の類似性）の方であった。マイコプラズマとラクトバシラス−クロストリジウムのグラム陽性菌門の分枝間の進化関係は小サブユニットｒＲＮＡ配列から演繹されている（メイダク（Ｍａｉｄａｋ，Ｂ．Ｌ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ２２：３４８５（１９９４））。本発明者らの全ゲノム分析からのデータはこの仮説を支持している。
【０１５５】
ゲノムの比較：マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼ
マイコプラズマ・ジェニタリウムにおける遺伝子およびその構成の検索により、生存に必要とされる遺伝子の最少のセットの記載が可能となる。極小の細胞は複製および翻訳、少なくとも１つのｒＲＮＡオペロンおよび１組のリボソームタンパク質、ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼ、環境から栄養物を得るための輸送タンパク質、ＡＴＰおよび還元力を生み出すための代謝経路、および細胞の恒常性を維持するためのメカニズムのための遺伝子を含まなければならないと予測されるであろう。マイコプラズマ・ジェニタリウムにて同定されている遺伝子とヘモフィルス・インフルエンゼにて同定されている遺伝子との比較により、これら２種に保存されている遺伝子の基本的な補足物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の同定ができ、最も単純な自己複製原核生物の１つとより複雑なグラム陰性細菌との間にある生理学的差異に対する洞察が与えられる。
【０１５６】
ヘモフィルス・インフルエンゼでは１，７２７の配列が同定されている（（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））のに比較して、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムは４８２の推定コーディング配列（表６）を含む。表７は両生物体の遺伝子内容を役割のカテゴリイによってまとめているものである。細胞エンベロープ、細胞プロセス（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、エネルギー代謝、プリンおよびピリミジン代謝、複製、転写、輸送、およびその他のカテゴリイに関係する遺伝子をコードするマイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼにおける総ゲノムのパーセントは類似しているが、これらのカテゴリーにおける遺伝子総数はマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいてはかなり少ない。マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにおいてはヘモフィルス・インフルエンゼに比較して、アミノ酸生合成、補因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）の生合成、中心の中間代謝（ｃｅｎｔｒａｌ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、脂肪酸およびリン脂質代謝、および調節機能に関する遺伝子をコードするもののパーセントは少ない。マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼの両方の生物におけるリボソームタンパク質およびｔＲＮＡシンテターゼの数の類似によって示されているように、ヘモフィルス・インフルエンゼに比べてマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにおいては多くのパーセントが翻訳に関係するタンパク質をコードする。
【０１５７】
マイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて４８２の推定コーディング領域（平均的な大きさは１１００ｂｐ）は該ゲノムの８５％をカバーし（平均、各１１６９ｂｐごとに１つの遺伝子）、これは１７２７の推定コーディング領域（平均的な大きさは９００ｂｐ）が該ゲノムの９１％をカバーする（各１０４２ｂｐごとに１つの遺伝子）ヘモフィルス・インフルエンゼにおいて見られるものとほぼ同様の値である。これらのデータはマイコプラズマ内に起こるゲノムの大きさの減少が遺伝子密度における増加または遺伝子の大きさにおける減少ということにはならないことを示している（ボーク（Ｂｏｒｋ，Ｐ．）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：９５５（１９９５））。マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼゲノムの包括的な検索は遺伝子の整列、特にリボソームタンパク質の２つのかたまりの短い保存領域を明らかにしている。
【０１５８】
複製　２つの主要なタンパク質複合体が複製の間に形成される：プライモソームおよびレプリソームである。本発明者らは、プライモソームタンパク質ＤｎａＡ、ＤｎａＢ、ＧｙｒＡ、ＧｙｒＢ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、およびプライマーゼタンパク質、ＤｎａＥのマイコプラズマ・ジェニタリウム同系物（ｉｓｏｌｏｇｓ）を含む複製過程に不可欠であるタンパク質の多くをコードする遺伝子を同定している。、プライモソーム複合体の放出において機能するかもしれない熱ショックタンパク質であるＤｎａＪおよびＤｎａＫもまたマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて認められる。ＤｎａＢをプライモソームに引き渡すことを担うＤｎａＣタンパク質をコードする遺伝子はまだ同定されていない。
【０１５９】
マイコプラズマ・ジェニタリウムにおけるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの不可欠サブユニットタンパク質の殆どをコードする遺伝子もまた同定された。ｐｏｌＣ遺伝子はポリメラーゼ活性を含むαサブユニットをコードする。本発明者らは、同じ遺伝子からの別の産物としてのγおよびｔサブユニットをコードするバシラス・サチリスにおけるｄｎａＨ（大腸菌におけるｄｎａＸ）の同系物をも同定している。これらのタンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの連続移動性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）に必要である。βサブユニットをコードするｄｎａＮの同系物は以前にマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて同定され（ベイリーおよびボット（Ｂｏｔｔ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：５８１４（１９９４））、該ポリメラーゼをＤＮＡ鋳型にしっかり留める過程に関係する。本発明者らは３’−５’プルーフリーディング（校正）活性を担うεサブユニットをコードする遺伝子を依然として同定しなければならないが、この活性は以前に記載されたように（サンジャンワラ（Ｓａｎｊａｎｗａｌａ，Ｂ．）およびガネサ（Ｇａｎｅｓａ，Ａ．Ｔ．）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２６：４６７（１９９１）；サンジャンワラおよびガネサン（Ｇａｎｅｓａｎ，Ａ．Ｔ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：４４２１（１９８９））αサブユニット内にコードされている可能性がある。最後に、本発明者らはラギング鎖の合成間に形成された岡崎フラグメントの結合に必要であるＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子を同定している。
【０１６０】
本発明者らはＤＮＡ複製に不可欠であると考えられる多くの同系物をコードする遺伝子を同定しているが、重要な機能を有するタンパク質をコードする幾つかの遺伝子はなお同定する必要がある。これらの例には、上記のＤｎａＣタンパク質、並びに機能はあまりよく理解されていないがポリメラーゼＩＩＩのアセンブリーおよび連続移動性に関与していると考えられているＤｎａθおよびＤｎａδがある。また、ラギング鎖の合成の間に合成されたＲＮＡプライマーの加水分解を担う特異的ＲＮアーゼＨタンパク質も明らかに存在していない。
【０１６１】
ＤＮＡの修復　大腸菌においては１００もの多くの遺伝子がＤＮＡ修復に関係し（コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ，Ｔ．Ａ．）、ＤＮＡレプリケーション（ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）第２版、ダブリュー・エッチ・フリーマン・アンド・コ（Ｗ．Ｈ．　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．）、ニューヨーク（１９９２））、ヘモフィルス・インフルエンゼにおいては推定的に同定されたＤＮＡ修復酵素の数は約３０である（（フレイシュマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６（１９９５））ということが示唆されている。マイコプラズマ・ジェニタリウムはＤＮＡにおけるより一般的な傷害の多くを修復するために必要である遺伝子を有しているようであるが、その仕事に専心する遺伝子の数ははるかに少ない。塩基が欠落した領域の（アプリン酸／アピリミジン酸（ＡＰ）部位）の除去修復は、エンドヌクレアーゼＩＶ（ｉｎｆｏ）、ＰｏｌＩ、およびリガーゼが関与する経路によって起こり易いであろう。ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼをコードするｕｎｇ遺伝子は存在している。この活性は、ＤＮＡからウラシル残基を除去し、これは通常は自発的なシトシンの脱アミノ化によって生じる。これによってＡＰ部位が生じ、ついでこれは上記のように修復される。
【０１６２】
ｕｖｒＡＢＣエクシヌクレアーゼ（ｅｘｉｎｕｃｌｅａｓｅ）の産生に必要である３つの遺伝子全ては存在し、ＰｏｌＩ、ヘリカ−ゼＩＩ、およびリガーゼと共に、架橋（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）のような両鎖の置換を必要とする損傷の修復のためのメカニズムを提供するに違いない。大腸菌において単一の一本鎖ＤＮＡに結合するときに活性化され、それによりＳＯＳ応答を開始するｒｅｃＡは存在するが、本発明者らはＳＯＳ遺伝子を調節するリプレッサーをコードするｌｅｘＡ遺伝子の証拠は見出していない。本発明者らは、ＵＶにより誘導されたピリミジン二量体を修復するマイコプラズマ・ジェニタリウムにおけるフォトリアーゼ（ｐｈｒ）、または傷害の除去および置換よりむしろＤＮＡ損傷の逆戻し（ｒｅｖｅｒｓａｌ）に関与する他の遺伝子は同定していない。
【０１６３】
転写　転写に重要な成分はマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて同定された。コアＲＮＡポリメラーゼのａ、ｂ、およびｂ−プライムサブユニットに加えてマイコプラズマ・ジェニタリウムは単一のσ因子をコードすると思われるのに対し、大腸菌およびバシラス・サチリスでは少なくともそれぞれ６および７つをコードする。本発明者らは、Ｒｈｏ終結因子遺伝子のホモログは検出していないので、大腸菌におけるＲｈｏ独立終結に類似したメカニズムはマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて作用しているようである。本発明者らは転写を調節する他の僅か２つの遺伝子のホモログであるｎｕｓＡおよびｎｕｓＧのはっきりした証拠を有している。
【０１６４】
翻訳　マイコプラズマ・ジェニタリウムは、１６ＳｒＲＮＡ（１５１８ｂｐ）−スペーサー（２０３ｂｐ）−２３ＳｒＲＮＡ（２９０５ｂｐ）−スペーサー（５６ｂｐ）−５ＳｒＲＮＡ（１０３ｂｐ）の順番に３つのｒＲＮＡサブユニットを含む１つのｒＲＮＡオペロンを有している。小サブユニットｒＲＮＡの配列は、「シミラリティー・ヤンク（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｙａｎｋ）」プログラムを有するリボソームデータベースプロジェクト（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ）（メイダクら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２２：３４８５（１９９４））の原核生物データベースと比較された。本発明者らの配列はそこに預けられたマイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｇ３７株）の配列と同一であり、この検索によって戻された１０の最も類似した分類群もまたマイコプラズマ属に存在する。
【０１６５】
総数３３のｔＲＮＡ遺伝子がマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて同定され、これらは５つのクラスターと９つの単一遺伝子とに構成された。全ての場合において、マイコプラズマ・ジェニタリウムにおける各ｔＲＮＡ遺伝子に最高にマッチするのはマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）において対応する遺伝子であった（シモヌー（Ｓｉｍｏｎｅａｕ，Ｐ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：４９６７（１９９３））。さらに、ｔＲＮＡのクラスター（ｔｒｎＡ、ｔｒｎＢ、ｔｒｎＣ、ｔｒｎＤ、およびｔｒｎＥ）へのグループ分けは該クラスター内における遺伝子の整列（シモヌーら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：４９６７（１９９３））同様マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびマイコプラズマ・ニューモニエにおいて同一であった。ｔＲＮＡ遺伝子構成に関して観察されたマイコプラズマ・ジェニタリウムおよびマイコプラズマ・ニューモニエ間における唯一の違いはｔｒｎＤとＧＴＧ間の逆位であった。ヘモフィルス・インフルエンゼおよび他の多くの真正細菌とは対照的に、マイコプラズマ・カプリコラムについて報告されたのと同様（サワダ（Ｓａｗａｄａ，Ｍ．）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８２：５０２（１９８１））、マイコプラズマ・ジェニタリウムのｒＲＮＡオペロンにおける１６Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域においてｔＲＮＡは認められなかった。
【０１６６】
ｔＲＮＡシンテターゼ遺伝子に関するマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの検索によって、グルタミニルｔＲＮＡシンテターゼを除く全ての期待された遺伝子が同定された。本発明者らはこの遺伝子がマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの中に存在していることを期待するが、類似性の検索によってはそれを同定することはできなかった。最近のジーンバンクリリース（リリース８９）には細菌種からのグルタミニルｔＲＮＡシンテターゼに関しては、ただ１つの見出しのみが入っている；これは、マイコプラズマにきわめて縁遠いグラム陰性生物である大腸菌からのものであった。一般に、バシラス・サチリスのようなグラム陽性生物由来のｔＲＮＡシンテターゼ配列は、大腸菌由来の対応配列よりもマイコプラズマ・ジェニタリウム由来のものにより一層類似性を示し、これは大腸菌およびマイコプラズマ・ジェニタリウムグルタミニルｔＲＮＡシンテターゼ間の類似性が検出されるほど十分高くなかったかもしれないという考えを支持する。
【０１６７】
代謝経路　マイコプラズマ種間のゲノムの大きさの減少は、これらの生物において生合成経路の数および成分における顕著な減少を伴い、これらの生物にその宿主からの代謝産物を使用することを要求している。研究室において、マイコプラズマ・ジェニタリウムは既知組成培地において成育されていない。この生物の複雑な成育条件は、アミノ酸生合成、新規のヌクレオチド生合成、および脂肪酸生合成に関与する酵素の殆ど完全な欠如によって説明され得る（表６および図５Ａ〜図５Ｒ）。中心の中間代謝、エネルギー代謝、および脂肪酸およびリン脂質の代謝のカテゴリイにおける遺伝子の数を合計すると、ヘモフィルス・インフルエンゼおよびマイコプラズマ・ジェニタリウム間の顕著な遺伝子含量における差異が明らかである。例えば、ヘモフィルス・インフルエンゼゲノムはアミノ酸生合成に関与する６８の遺伝子を含むのに対して、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムはただ１つを含む。全体で、ヘモフィルス・インフルエンゼゲノムは代謝経路に関連している１６７の遺伝子を含むのに対し、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムはようやく４２の遺伝子を有するにすぎない。ゲノムの大きさがマイコプラズマ・ジェニタリウムの２倍ほどの関連生物であるマイコプラズマ・カプリコラムからの２１４ｋｂの配列の最近の分析は（ボーク（Ｂｏｒｋ，Ｐ．）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：９５５（１９９５））、マイコプラズマ・カプリコラムがマイコプラズマ・ジェニタリウムにはない多くの生合成酵素を含むことを明らかにしている。この観察は、マイコプラズマ・カプリコラムの一層大きなゲノムが同化作用のより高い能力を与えていることを示唆している。
【０１６８】
マイコプラズマ・ジェニタリウムはグルコースおよびおそらく他の糖を乳酸および酢酸への解糖を介して発酵する条件性嫌気性生物である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の構成要素、ホスホトランスアセチラーゼ、および酢酸キナーゼを含む解糖系の全ての酵素をコードする遺伝子が同定された。ＡＴＰ合成のための主要ルートは、基質レベルのリン酸化であるかもしれない。なぜなら全くチトクロムが存在していないからである。マイコプラズマ・ジェニタリウムはまたトリカルボン酸回路の全ての構成要素をも欠如している。グリコーゲンまたはポリ−β−ヒドロキシ酪酸産物をコードする遺伝子はいずれも同定されておらず、このことは炭素およびエネルギー貯蔵の能力が限定されていることを示している。６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびトランスケトラーゼをコードする遺伝子のみが同定されているので、ペントースリン酸回路もまた限定されているようである。マイコプラズマ・ジェニタリウムの限定された代謝能力は、ヘモフィルス・インフルエンゼにおける異化経路の複雑さとは明らかに対照的であり、このことはヘモフィルス・インフルエンゼにみられるエネルギー代謝に関与する遺伝子の数が４倍多いことを反映している。
【０１６９】
輸送　ヘモフィルス・インフルエンゼにおいて同定されたトランスポーター（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）はある範囲の栄養基質に特異的である。タンパク質輸送を例として挙げると、オリゴペプチドトランスポーターおよびアミノ酸トランスポーターの両方が代表的である。１つの興味深いペプチドトランスポーターはラクトコクシントランスポーター（ＩｃｎＤＲ３）および関連バクテリオシントランスポーターにホモロジーを有しているが、このことはマイコプラズマ・ジェニタリウムが抗菌活性を有する小さなペプチドを輸出するかもしれないことを示唆している。マイコプラズマ・ヒョリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）ｐ３７高親和性輸送系のヘモフィルス・インフルエンゼ同系物はまた、保存された脂質修飾部位を有しており、これはマイコプラズマ結合タンパク質依存輸送系がグラム陽性細菌に類似した様式によって構成されていることのさらなる証拠を与えている（ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ，Ｅ．）ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．７：３９７１（１９８８））。
【０１７０】
ホスホエノールピルビン酸：糖トランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を介してのグルコースの輸送に機能するタンパク質をコードする遺伝子がマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて同定されている。これらには、酵素Ｉ（ＥＩ）、ＨＰｒおよび糖特異的酵素ＩＩ（ＥＩＩ）が含まれる（ポストマ（Ｐｏｓｔｍａ，Ｐ．Ｗ．）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：５４３（１９９３））。ＥＩＩは、少なくとも３つのドメイン、ＥＩＩＡ、ＥＩＩＢおよびＥＩＩＣの複合体からなっている。幾つかの細菌においては（例えば大腸菌）、ＥＩＩＡは可溶タンパク質であり、一方他の細菌においては（バシラス・サチリス）、単一の膜タンパク質が３つの全てのドメイン、ＥＩＩＡ、Ｂ、およびＣを含んでいる。ＥＩＩ複合体を作りあげているタンパク質におけるこれらの変異は進化の過程でのドメインの融合または分離のためであり、機械作用的な差異であるとは考えられていない（ポストマら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：５４３（１９９３））。マイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて、ＥＩＩＡ、Ｂ、およびＣはバシラス・サチリスにてみられるタンパク質に類似している単一のタンパク質中に位置している。マイコプラズマ・カプリコラムにおいて、ＨＰｒをコードする遺伝子であるｐｔｓＨはモノシストロン性転写ユニット上に位置しているが、一方、ＥＩ（ｐｔｓＩ）およびＥＩＩＡ（ｃｒｒ）をコードする遺伝子はジシストロン性オペロン（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　ｏｐｅｒｏｎ）上に位置している（ズー（Ｚｈｕ，Ｐ．Ｐ．）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．３：２１１５（１９９４）；ズーら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６５３１（１９９３））。今日まで研究されている殆どの細菌種において、ｐｔｓＩ、ｐｔｓＨ、およびｃｒｒはポリシストロン性オペロン（ｐｔｓオペロン）の一部である。マイコプラズマ・ジェニタリウムでは、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩおよびＥＩＩＡＢＣ残基をコードする遺伝子はゲノムの異なる位置にあり、それゆえ、これらの遺伝子の各々はモノシストロン性転写ユニットを構築するかもしれない。本発明者らはまた、フルクトースを取り込むためのＥＩＩＢＣ構成要素をも同定した：しかしながら、該フルクトースＰＴＳの他の構成要素は認められなかった。従って、マイコプラズマ・ジェニタリウムはエネルギー源としてグルコースの使用に限られるかもしれない。対照的に、ヘモフィルス・インフルエンゼは少なくとも６つの異なる糖を炭素およびエネルギー源として使用する能力を有している。
【０１７１】
調節系　他の細菌にみられる調節系はマイコプラズマ・ジェニタリウムには欠如しているようである。例えば、２つの成分系は多数のグラム陽性細菌に関して記載されているが、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムにおいてセンサーおよび応答レギュレーター遺伝子は全くみられない。さらに、熱ショックσ因子の欠如は熱ショック反応がどのようにして調節されているのかという疑問を提起する。全ての代謝的に活性状態の生物が直面する他のストレスは、スーパーオキシドアニオンおよび過酸化水素のような反応性の酸素中間体の発生である。ヘモフィルス・インフルエンゼは、カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ同様にｏｘｙＲホモログを有するが、マイコプラズマ・ジェニタリウムはＮＡＤＨペルオキシダーゼ同様これらの遺伝子を欠如している。宿主細胞の損傷におけるこれらの反応性中間体分子の重要性は、まだ同定はされていない幾つかの防護機構が細胞内に存在しているかもしれないことを示唆する。
【０１７２】
抗原の変異　ビルレンス潜在能力に影響を与える抗原的および機能的変異を提供するメカニズムとしてのＤＮＡ再配列によって変化する外膜タンパク質を発現している微生物病原体の多くの例が存在する（バーグストーム（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：３８９０（１９８６）；メイエル（Ｍｅｉｅｒ，Ｊ．Ｔ．）ら、Ｃｅｌｌ　４７：６１（１９８６）；マジワ（Ｍａｊｉｗａ，Ｐ．Ａ．Ｏ．）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９７：５１４（１９８２））。ヒトはマイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼ両方の本来の宿主であるため、これらの生物において抗原変異を生成するメカニズムを比較するのは興味深かった。ヘモフィルス・インフルエンゼにおいて、該遺伝子のリーディングフレームが変化し、その発現が変えられるように、複製の間に１つまたはそれより多くの繰り返し単位の頻繁な付加および欠失を起こすタンデムテトラマー繰り返しを膜タンパク質をコードする多数のビルレンス−関連遺伝子は含んでいる（バイセル（Ｗｅｉｓｅｒ，Ｊ．Ｎ．）ら、Ｃｅｌｌ　５９：６５７（１９８９））。
【０１７３】
マイコプラズマ・ジェニタリウムは宿主の免疫反応を回避するため異なるシステムを使用しているようである。マイコプラズマ・ジェニタリウムの１４０ｋＤａの接着タンパク質はこの生物の分化端（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ　ｔｉｐ）で密集して群集しており、ヒトおよび実験的に感染させた動物において強い免疫応答を誘発する（コリエール（Ｃｏｌｌｉｅｒ，Ａ．Ｍ．）ら、Ｚｂｌ．Ｂｋｔ．Ｓｕｐｐｌ．２０：７３（１９９２））。マイコプラズマ・ジェニタリウムにおける該接着タンパク質（ＭｇＰａ）オペロンは、それぞれ６および１　ｎｔの介在領域にて２９ｋＤａのＯＲＦ、該ＭｇＰａタンパク質（１６０ｋＤａ）および１１４ｋＤａのＯＲＦを含む（イナミネ（Ｉｎａｍｉｎｅ，Ｊ．Ｍ．）ら、Ｇｅｎｅ　８２：２５９（１９８９））。ハイブリダイゼーション実験に基づき（ダロ（Ｄａｌｌｏ，Ｓ．Ｆ．）およびベースマン（Ｂａｓｅｍａｎ，Ｊ．Ｂ．）、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．８：３７１（１９９０））、該マイコプラズマ・ジェニタリウムＭｇＰａ遺伝子および１１４ｋＤａのＯＲＦの領域の複数のコピーが該ゲノム中にわたって存在することが知られている。
【０１７４】
マイコプラズマ・ジェニタリウムからの完全なゲノム配列を利用できることは、ＭｇＰａ繰り返しの包括的なマッピングを可能にしている（図４および６）。完全なオペロンに加えて、ＭｇＰａオペロンの特定領域の構成要素である９つの繰り返し要素が発見された。繰り返し要素および該ＭｇＰａ遺伝子間の配列の同一性のパーセントは７８％〜９０％の範囲にある。該繰り返しの幾つかにおいて、以前に記載されているように（ピーターソン、博士論文、大学番号カロライナ１９９２、大学Ｍｉ．学位論文授与番号第６２４６号（ＰｈＤ　ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖ．Ｎｏ．Ｃａｒｏｌｉｎａ　１９９２，Ｕｎｉｖ．Ｍｉ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ＃６２４６）ＭｇＰａ−関連配列は変化する長さでＡ−Ｔに富むスペーサー配列により分離されている。染色体中に散在している該ＭｇＰａオペロンおよび９つの繰り返しに含まれる配列は、全ゲノム配列の４．５％に相当する。一見すると、これは最小のゲノムの期待と矛盾するように思える。しかしながら、繰り返し要素および該ＭｇＰａオペロン間の組換えに関する最近の証拠が報告されている（ピーターソンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、印刷中（１９９５））。このような組換えにより、マイコプラズマ・ジェニタリウムは集団内で抗原の変異を誘導するメカニズムを通して宿主の免疫応答を回避することができる。マイコプラズマ・ジェニタリウムは本来、哺乳類宿主から必要な栄養物を得ることにより生き残るので、免疫応答を回避するための効果的なメカニズムはこの最小のゲノムの必要部分であるのかもしれない。
【０１７５】
マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムはヘモフィルス・インフルエンゼにおいて明らかに存在しない９３の推定的に同定された遺伝子を含む。これらの遺伝子の殆ど６０％はグラム陽性細菌または他のマイコプラズマ種からの既知または仮想タンパク質にデータベースマッチを有しており、このことはこれら遺伝子が制限された系統発生的な分布を有するタンパク質をコードするかもしれないことを示唆している。マイコプラズマにおける１１７の潜在的にコーディング可能な領域は、ヘモフィルス・インフルエンゼの全ゲノムを含む公的な記録物におけるいかなる配列にもデータベースマッチを全く有していない；それゆえ、これらはマイコプラズマ・ジェニタリウムおよび関連した生物における新規遺伝子を表しているようである。
【０１７６】
仮想ＯＲＦ、モチーフマッチを有するＯＲＦおよび既知のペプチド配列に類似性を全く示さないＯＲＦの推定コーディング配列が分析された。使用された２つのプログラムは、１１残基の範囲を有するカイト−ドゥーリトルアルゴリズム（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（カイト（Ｋｙｔｅ，Ｊ．）およびドゥーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５（１９８２））およびＷＷＷ　ｓｉｔｅ　ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ．　上で利用できるＰＳＯＲＴであった。ＰＳＯＲＴは、マックジョーチ（ＭｃＧｅｏｃｈ，Ｄ．Ｊ．）（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．３：２７１（１９８５））およびフォン・ヘイユン（ｖｏｎ　Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．）（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３（１９８６））の方法によりシグナル配列の存在を予測し、クライン（Ｋｌｅｉｎ，Ｐ．）ら（クライン、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ８１５：４６８（１９８５））の方法により潜在的な膜貫通ドメインを検出する。検討された全部で２０１のＯＲＦにおいて９０の潜在的な膜タンパク質が認められた。それらのうちの１１がタイプＩシグナルペプチドを有し、５つがタイプＩＩシグナルペプチドを有していると予測されている。このアプローチを使用して、少なくとも５０の潜在的な膜タンパク質が既知の機能を持ったＯＲＦのリストから同定された。これにより、マイコプラズマ・ジェニタリウムにおける膜タンパク質の総数が約１４０であることがわかる。
【０１７７】
これらの推定膜タンパク質を管理するため、マイコプラズマ・ジェニタリウムは７つの機能からなるごく小さな分泌機構（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を自由に使用できるよう有している：３つの付随するＧｒｏＥＬ、ＤｎａＫおよびトリッガー因子（ｔｒｉｇｇｅｒ　ｆａｃｔｏｒ）Ｔｉｇ（パグスレイ（Ｐｕｇｓｌｅｙ，Ａ．Ｐ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：５０（１９９３）；グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ，Ｂ．）およびウィックナー（Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５５５５（１９９０）、ＡＴＰアーゼ案内タンパク質（ｐｉｌｏｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ＳｅｃＡ、１つの統合膜タンパク質トランスロカーゼ（ＳｅｃＹ）、シグナル認識粒子タンパク質（Ｆｆｈ）およびリポタンパク質−特異的シグナルペプチダーゼＬｓｐＡ（パグスレイ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：５０（１９９３））。おそらく、大腸菌およびヘモフィルス・インフルエンゼには存在している他の既知のＳｅｃＥ、ＳｅｃＤ、およびＳｅｃＦのようなトランスロカーゼの欠如は、マイコプラズマ・ジェニタリウムが１層の細胞エンベロープを有するという事実に関連している。また、ＳｅｃＢホモログ、大腸菌の分泌シャペロニン（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ）のマイコプラズマ・ジェニタリウムにおける欠如（それはバシラス・サチリスにおいても欠如している（コリエール、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４９３７（１９９４））は、一般的な分泌経路へ運命づけられた発生期のタンパク質を扱う上でのグラム陰性および細胞壁のない（ｗａｌｌ−ｌｅｓｓ）モリキュート（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）間の差異を反映しているかもしれない。タイプＩシグナルペプチドを含む幾つかの推定膜タンパク質の存在を考慮すると、シグナルペプチダーゼＩ（ｌｅｐＢ）の欠如は非常に驚くべきことである。疑問となっている大腸菌のｌｅｐＢおよびバシラス・サチリスのｓｉｐＳ（バン・ディジル（ｖａｎ　Ｄｉｊｉｌ，Ｊ．Ｍ．）ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１１：２８１９（１９９２））を使用してのマイコプラズマ・ジェニタリウムｌｅｐＢ遺伝子の直接電子検索は、有意の類似性は１つも明らかにしなかった。
【０１７８】
自己複製生物に必要不可欠であると考えられるタンパク質の幾つかをコードする遺伝子がなぜマイコプラズマ・ジェニタリウムにて欠如しているのかに関する幾つかの可能な説明がある。１つの可能性は、限られた数のタンパク質が他の機能を採用するのに適応してしまったのかもしれないということである。２番目の可能性としては、大腸菌の研究に基づいて生存に必須だと考えられているある種のタンパク質がマイコプラズマ・ジェニタリウムのようなより単純な原核生物においては必要ではないということである。最後に、マイコプラズマ・ジェニタリウムからの配列が、マッチが妥当な確信閾値を超えて検出できないほどに他の種からの既知の配列に対して低い類似性を有しているからかもしれない。
【０１７９】
マイコプラズマ・ジェニタリウムの完全なゲノム配列の決定は、この生物および関連した生物の生物学を理解するのに新たな開始点を提供する。単純な原核生物のマイコプラズマ・ジェニタリウムにおいて発現する遺伝子と、より複雑な生物体であるヘモフィルス・インフルエンゼにおいて発現する遺伝子の比較はこれらの種間の無数の差異を明らかにしている。マイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノムにある遺伝子の５６％はヘモフィルス・インフルエンゼにおける明らかな同系物を有し、このことはマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムのこの部分集合（ｓｕｂｓｅｔ）が自己複製生物体に真に必要不可欠である遺伝子をコードしているかもしれないことを示唆している。マイコプラズマ・ジェニタリウムおよびヘモフィルス・インフルエンゼ間で保存されている遺伝子の中で顕著なものは、ＤＮＡの複製および修復、転写および翻訳、細胞分裂、および解糖を介しての基本的なエネルギー代謝に関するものである。これらの遺伝子の同系物はまた真核生物においても同様に認められる。
【０１８０】
実施例２
マイコプラズマ・ジェニタリウムタンパク質に対する抗体の産生
実質的に純粋であるタンパク質またはポリペプチドは、当該技術分野において既知の方法の任意の１つを使用することによりトランスフェクションまたは形質転換された細胞から単離される。該タンパク質はまた、大腸菌のような原核生物の組換え発現システムにて産生し得るし、または化学的に合成することができる。最終調製物におけるタンパク質の濃度は、例えば、アミコンフィルター装置（Ａｍｉｃｏｎ　ｆｉｌｔｅｒ　ｄｅｖｉｃｅ）上で濃縮することによって数マイクログラム／ｍｌのレベルに調整される。ついで該タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は以下のように調製され得る：
【０１８１】
ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生
記載されたように同定および単離されたペプチドのエピトープに対するモノクローナル抗体は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．）Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）の古典的方法またはその改良された方法に従い、マウスのハイブリドーマから調製され得る。端的には、マウスは数週間の期間にわたり、選択された数マイクログラムのタンパク質を繰り返し接種される。ついで該マウスは屠殺され、脾臓の抗体産生細胞が単離される。該脾臓細胞はマウスのミエローマ細胞とポリエチレングリコールにより融合され、過剰の非融合細胞はアミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上で該系を増殖させることによって破壊される。うまく融合した細胞は希釈され、希釈アリコートはマイクロタイタープレートのウェルに播かれ、そこで培養液の増殖が続けられた。抗体−産生クローンは、ＥＬＩＺＡ、すなわちエングバール（Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９（１９８０）によって最初に記載された方法、およびその改良方法のようなイムノアッセイ法によってウェルの上澄み液中の抗体の検出によって同定される。選択された陽性クローンは拡張され、そのモノクローナル抗体産生物は使用するために回収され得る。モノクローナル抗体の産生に関する詳細な手順はデイビス（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．）らのベーシック・メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、エルセビア、ニューヨーク、２１−２章（１９８９）に記載されている。
【０１８２】
免疫によるポリクローナル抗体の産生
単一のタンパク質の異種のエピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、上記タンパク質（修飾しなくとも良いし、または免疫原性を高めるために修飾することもできる）で適当な動物を免疫することによって調製され得る。有効なポリクローナル抗体の産生は抗原および宿主の種の両方に関連した多くの要因によって影響される。例えば、小さい分子は他より免疫原性の低い傾向があり、担体およびアジュバントの使用が必要であるかもしれない。また、宿主動物は、接種および用量の部位に応じて変化し、抗原の不適切または過剰な用量は力価の低い血清という結果となる。皮膚内の複数の部位にての抗原の少ない用量（ｎｇレベル）の投与は最も信頼できるようである。ウサギの効果的な免疫法のプロトコールはバイツカイティス（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ，Ｊ．）らのＪ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９９１（１９７１）にみられる。
【０１８３】
ブースター注入が一定の間隔で与えられ、その抗体の力価が半定量的に、例えば、該抗原の既知の濃度に対してアガーにおける二重免疫拡散法によって決定されるように下がり始めたときに抗血清は回収される（オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｏ．）ら、第１９章：ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ワイエル（Ｗｉｅｒ，Ｄ．）編、ブラックウェル（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（１９７３）参照）。抗体のプラトー濃度は通常、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ血清（約１２μＭ）の範囲にある。抗原に対する抗血清の親和性は、例えば、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．）、４２章：マニュアル・オブ・クリニカル・イムノロジー（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２版、ローズ（Ｒｏｓｅ）およびフリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）、（編）、Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．、ワシントンＤ．Ｃ．（１９８０）によって記載されているように競合結合曲線の作成によって決定される。
【０１８４】
いずれかのプロトコールにより調製された抗体の調製物は、生物学的サンプルにおける抗体含有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用である；それらはまた、生物学的サンプルにおける抗原の存在を同定するために半定量的にまたは定性的に使用される。
【０１８５】
実施例３
ＰＣＲプライマーの調製およびＤＮＡの増幅
表１ａ、１ｂ、１ｃ、および２に開示されているようなマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの様々な断片は本発明に従って、様々な使用を目的とするＰＣＲプライマーの調製のために使用され得る。該ＰＣＲプライマーは、好ましくは少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基の長さである。プライマーの配列を選択する際、プライマー対は融解温度が殆ど同じであるように殆ど同じくらいのＧ／Ｃ比を有するのが好ましい。本実施例のＰＣＲプライマーおよび増幅されたＤＮＡは以下の実施例において使用される。
【０１８６】
実施例４
ＯＲＦに一致するＤＮＡ配列からの遺伝子発現
表１ａ、１ｂ、１ｃおよび２に提供されているマイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片は、従来技術（哺乳類、酵母菌、昆虫または細菌の発現系においてタンパク質の翻訳を指令する発現ベクターにクローニングされた配列をトランスファーする技術は当該技術分野においてよく知られている）を使用することによって発現ベクターに導入される。市販のベクターおよび発現系はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ラ・ジョラ、カリフォルニア）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マジソン、ウィスコンシン）、およびインビトロゲン（サン・ディエゴ、カリフォルニア）を含む様々な供給者から利用できる。所望なら、発現を促進し、適切なタンパク質の折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）を容易にするため、配列のコドン文脈およびコドン対は、ハートフィールド（Ｈａｒｔｆｉｅｌｄ）らの米国特許第５，０８２，７６７号によって説明されているように（参照のため本明細書に引用する）、ある特定の発現生物体のために最適化されていてもよい。
【０１８７】
以下は、マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノムの断片のクローニングされたＯＲＦからポリペプチドを産生する１つの例示的な方法として提供されている。該ＯＲＦは細菌由来のものであるためポリＡ配列が欠損しているので、この配列は、例えばｐＳＧ５（ストラタジーン）からポリＡ配列をＢｇｌＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を使用してスプライスし（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｕｔ）、真核生物の発現系において使用するため、哺乳類発現ベクターｐＸＴ１（ストラタジーン）中に組み入れることにより該構築物に加えられ得る。ｐＸＴ１はＬＴＲおよびモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）からのｇａｇ遺伝子の一部を含む。該構築物中の該ＬＴＲの位置は効率的で安定なトランスフェクションをできるようにする。該ベクターは、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ）チミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含んでいる。該マイコプラズマＤＮＡは、該マイコプラズマＤＮＡに相補的で、５’プライマーに組み入れられるＰｓｔＩおよび対応マイコプラズマＤＮＡ３’プライマーの５’端におけるＢｇｌＩＩの制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、ポリＡ配列が後に続くような位置にマイコプラズマＤＮＡが置かれることを確実にすることに注意して、該細菌ベクターからＰＣＲにより得られる。ＰＣＲ反応の結果得られた精製された断片はＰｓｔＩにて消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端にされ、ＢｇｌＩＩにて消化され、精製され、今度はポリＡ配列を含みＢｇｌＩＩで消化されたｐＸＴ１にライゲーションされる。
【０１８８】
ライゲーションされた産物は、該製品の特仕様書において略述される条件下でリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ライフ・テクノロジーズ、インコーポレーテッド、グランド・アイランド、ニューヨーク）を使用してマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションされる。陽性トランスフェクション体は、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ）中にてトランスフェクションされた細胞を成育させた後に選択される。該タンパク質は好ましくは上清に放出される。しかしながら、該タンパク質が膜結合ドメインを有するならば、該タンパク質は細胞内にさらに保持されるであろうし、また発現が細胞の表面に限定されるかもしれない。
トランスフェクションされた産物を精製し位置を探し出すことが必要であるかもしれないので、推定マイコプラズマＤＮＡ配列から合成された１５−マーの合成ペプチドは、該マイコプラズマＤＮＡによってコードされるポリペプチドに対する抗体を産生するためにマウスに注入される。
【０１８９】
抗体の産生が不可能な場合、マイコプラズマＤＮＡ配列はさらに真核生物の発現ベクターに組み入れられ、例えば、β−グロビンとのキメラとして発現される。β−グロビンに対する抗体は該キメラを精製するために使用される。β−グロビン遺伝子およびマイコプラズマＤＮＡ間で工作された対応プロテアーゼ裂開部位は、ついで翻訳後にこれら２つのポリペプチド断片を互いに分離するために使用される。β−グロビンキメラを生成するための１つの有用な発現ベクターはｐＳＧ５（ストラタジーン）である。このベクターはウサギβ−グロビンをコードする。ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩは発現された転写物のスプライシングを容易にし、構築物に組み入れられたポリアデニル化シグナルは発現のレベルを増加させる。記載されたこれらの技術は分子生物学の当業者にはよく知られている。標準的な方法は、デイビスらの方法テキストにおいて刊行されており、また多くの方法がストラタジーン、ライフ・テクノロジーズ、インコーポレーテッド、またはプロメガから技術補助的見本により利用可能である。ポリペプチドはさらに、イン・ビトロ・エクスプレス・トランスレーション・キット（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）（ストラタジーン）のようなイン・ビトロ翻訳系を使用することでいずれの構成物からも産生できる。
【０１９０】
本発明は明瞭さおよび理解のために相当詳細に記載されているので、当業者は本発明の本来の範囲から逸脱することなく形態および詳細において様々な変化をなし得るということを認識するであろう。
本明細書に列挙された全ての特許、特許出願および出版物は参照のため本明細書に引用されている。
【０１９１】
【表１】
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【０１９２】
【表２】
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【０１９３】
【表３】
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【０１９４】
【表４】
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【０１９５】
【表５】
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【０１９６】
【表６】
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【０１９７】
【表７】
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【０１９８】
【表８】
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【０１９９】
【表９】
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【０２００】
【表１０】
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【０２０１】
【表１１】
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【０２０２】
【表１２】
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【表１３】
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【０２０４】
【表１４】
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【０２０５】
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２３】
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【表２９】
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【０２３９】
【表４９】
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【表５４】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７７】
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【表７８】
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【０２６９】
【表７９】
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【表８０】
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【０２７１】
【表８１】
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【表８２】
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【０２７４】
【表８４】
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【０２７５】
連邦政府資金による研究および開発下になされた発明の権利に関する陳述
本発明を開発するうえでなされた仕事の一部は、米国政府の資金を利用してなされた。米国政府は発明−ＤＥ−ＦＣ０２−９５ＥＲ６１９６２．Ａ０００；ＮＰ−８３８Ｃ；ＮＩＨ−ＡＩ０８９９８、ＡＩ３３１６１、およびＨＬ１９１７１においてある権利を有する。
【０２７６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】マイコプラズマ・ジェニタリウムのＥｃｏＲＩ制限酵素地図。
【図２】本発明のコンピュータに基づいたシステムを行なうのに使用され得るコンピュータシステム１０２のブロックダイヤグラム。
【図３】マイコプラズマ・ジェニタリウムのシークエンシングプロジェクトの概要。
【図４】マイコプラズマ・ジェニタリウム染色体の環状表現図。外側の同心円：遺伝子同定がなされるプラス鎖上のコーディング領域。各コーディング領域の位置は図５Ａ〜図５Ｒ内にアルファベットによって役割に関して記されている。２番目の同心円：遺伝子同定がなされるマイナス鎖上のコーディング領域。３番目の同心円：染色体の各鎖上の転写の方向が推定の複製起点からの赤い矢印で記されている。４番目の同心円：コスミドおよびラムダクローン（青）による範囲。１９のコスミドクローンおよび１つのラムダクローンが該ゲノムの全構造を確認するために各末端からシークエンシングされた。５番目の同心円：該単一のリボソームオペロン（青）および３３のｔＲＮＡの位置。ｔＲＮＡの群（ｔｒｎＡ、ｔｒｎＢ、ｔｒｎＣ、ｔｒｎＤ、およびｔｒｎＥ）は、各群のｔＲＮＡの数を括弧内に付してＡ−Ｅの文字により示されている。６番目の同心円：ＭｇＰａオペロン（緑）およびＭｇＰａ繰り返し断片（茶）の位置。
【図５Ａ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｂ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｃ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｄ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｅ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｆ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｇ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｈ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｉ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｊ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｋ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｌ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｍ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｎ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｏ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｐ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｑ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図５Ｒ】マイコプラズマ・ジェニタリウムの遺伝子地図。各鎖上に予測されたコーディング領域を示す。図の記号表に記されているように機能範疇によって遺伝子はアルファベットで表示されている。遺伝子の同定番号は表６に記載のものに対応する。
【図６】マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム中のＭｇＰａ繰り返しの位置。マイコプラズマ・ジェニタリウムゲノム内のＭｇＰａオペロン（ＯＲＦ１−ＭｇＰａ遺伝子−ＯＲＦ３）の構造は最上段に示されている。完全なオペロンに加えてＭｇＰａオペロンの特定領域の混合物である９つの繰り返し要素が認められた。該ゲノムにおける各繰り返しの座標が各列の左および右の端に示されている。繰り返し要素は、配列類似性のあるオペロン中の領域の直下に位置する。該繰り返し要素と該ＭｇＰａ遺伝子との配列同一性のパーセントは７８％−９０％の範囲である。幾つかの繰り返しでは、ＭｇＰａ−関連配列は、様々な長さのＡ−Ｔに富んだスペーサー配列（図中、線で示され、該スペーサーの長さはｂｐによって示されている）によりゲノム内で分離されている。スペーサー配列が示されていない場合、該オペロンの混合物はゲノム内で同一線形順序に並ぶ（ｃｏ−ｌｉｎｅａｒ）。繰り返し７および９においては、該繰り返し中の配列の順序は該オペロンにあるものとは異なっている。これらの場合、該ゲノムにおける各繰り返し中の要素の順序は、要素１の次に要素２が続き、その次に要素３が続くというように数字で示されている。
【符号の説明】
Ａ：アミノ酸生合成
Ｂ：補因子、補欠分子族、担体の生合成
Ｃ：細胞エンベロープ
Ｄ：細胞プロセス
Ｅ：中心的な中間代謝
Ｆ：エネルギー代謝
Ｇ：脂肪酸／リン脂質代謝
Ｈ：プリン、ピリミジン、ヌクレオチドおよびヌクレオシド
Ｉ：制御機能
Ｊ：複製
Ｋ：輸送／結合タンパク質
Ｌ：翻訳
Ｍ：転写
Ｎ：他のカテゴリー
Ｏ：仮定
Ｐ：未知
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図５Ｍ】
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【図５Ｎ】
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【図５Ｏ】
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【図５Ｐ】
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【図５Ｑ】
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【図５Ｒ】
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【図６】
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