(57)【要約】【課題】原料の入手が容易であり、調製の操作が繁雑ではなく、多量に得ることが出来、原料費及び調製に掛かる費用が安価であり、不純物を含まないか又はごく少量であり、測定対象物質であるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１（ヒトＨＭＧ−１）と同じ反応性を示し、かつ継続的に同じ反応性のものを得ることが出来るヒトＨＭＧ−１測定用標準物質を提供する。また、質の高い校正及び精度管理を安価に行うことが出来、更に正確かつ精密な測定値を継続的に得ることが出来る試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法を提供する。【解決手段】遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなるヒトＨＭＧ−１測定用標準物質。また、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定において、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を標準物質として校正又は精度管理を行う、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１よりなるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１測定用標準物質。
【請求項２】
遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモヒリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加、又は修飾を施したものである、請求項１記載の測定用標準物質。
【請求項３】
遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子の一部よりなるものである、請求項１又は２記載の測定用標準物質。
【請求項４】
遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１が、試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の免疫学的測定の標準物質として用いられるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定用標準物質。
【請求項５】
試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定において、遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１を標準物質として校正又は精度管理を行うことを特徴とする、試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定方法。
【請求項６】
遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加、又は修飾を施したものである、請求項５記載の測定方法。
【請求項７】
遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子の一部よりなるものである、請求項５又は６記載の測定方法。
【請求項８】
試料中のヒト・ハイモビリティーグルーフプロテイン−１の測定が免疫学的測定法により行われるものである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定用標準物質に関するものであり、更にこの測定用標準物質を用いる試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
ハイモビリティーグルーフプロテイン（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（以下「ＨＭＧ」と略すことがある。）は、クロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。
また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。
生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧはＤＮＡと結合する際に二重螺旋構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
【０００３】
ＨＭＧには、いくつかの種類が存在する。例えば、ハイモビリティーグループプロテイン−１（ＨＭＧ−１）、ハイモビリティーグループプロテイン−２（ＨＭＧ−２）、ハイモビリティーグループプロテイン−３（ＨＭＧ−３）、ハイモビリティーグルーフプロテイン−８（ＨＭＧ−８）、ハイモビリティーグループプロテイン−１７（ＨＭＧ−１７）、ハイモビリティーグルーフプロテイン−Ｉ（ＨＭＧ−Ｉ）、ハイモビリティーグルーフプロテイン−Ｙ（ＨＭＧ−Ｙ）、ハイモビリティーグルーフプロテイン−Ｉ（Ｙ）（ＨＭＧ−Ｉ（Ｙ））、ハイモビリティーグループプロテイン  Ｉ−Ｃ（ＨＭＧ  Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
【０００４】
なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を使用してアミノ酸配列の相同性の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ウシのＨＭＧ−１の相同性は９８．６％であり、ブタのＨＭＧ−１の相同性は９９．１％であった。また、同様に、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ヒトのＨＭＧ−２の相同性は８１．２％であり、ウシのＨＭＧ−２の相同性は７２．３％であり、ブタのＨＭＧ−２の相同性は７９．４％であった。
【０００５】
ワングらは１９９９年に、ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧ−１の定量測定を行った。
その結果、ワングらは、ＨＭＧ−１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。
そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧ−１を測定することによって可能であることを示した。
即ち、ただ単に血液中でのＨＭＧ−１の存在を確認するだけではなく、精密に定量することの有用性が明らかにされた（非特許文献１参照）。
【０００６】
ところで、試料中に含まれる測定対象物質の定量測定を行うには、試料の測定値（吸光度等）を、濃度既知の標準物質の測定値と比較して、試料中の測定対象物質の定量値を算出すること〔校正（キャリブレーション）〕が必要である。
また、試料中に含まれる測定対象物質の定量測定を繰り返し行う際には、その測定が正確に、かつ精密に行われているか確かめるため、濃度既知の標準物質を測定し、その定量値を確認すること〔精度管理〕が行われる。
この校正、そして精度管理とも、標準物質を使用する。
【０００７】
従来の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定においては、ヒトの臓器等より抽出し、精製したＨＭＧ−１か、又は動物由来のＨＭＧ−１が、標準物質として用いられていた。
測定対象物質がヒトのＨＭＧ−１であるので、標準物質も同じヒトのＨＭＧ−１を使用することが、反応性に差異がなく、好ましいことは明らかである。
しかしながら、ヒトのＨＭＧ−１は、ヒトの臓器や細胞等の核の中より抽出し、精製しなければならないので、まず、ヒトの臓器等を入手することが困難であり、例え入手できたとしてもＨＭＧ−１の抽出及び精製が繁雑であった。そして、このような繁雑な操作にてヒトＨＭＧ−１を精製できたとしても、得られるヒトＨＭＧ−１はごく少量に過ぎなかった。
【０００８】
なお、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１は、既に知られている（非特許文献２参照）。しかしながら、これをヒトＨＭＧ−１測定時の標準物質として用いようとする発想は、未だかってなかった。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行。
【００１０】
【非特許文献２】
Ａ．Ｍｉｓｔｒｙら，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２巻，７１８〜７１９頁，１９９７年発行。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
前述したように、従来、試料中のヒトＨＭＧ−１を測定しようとする際に用いられる標準物質としてのＨＭＧ−１は、ヒトの臓器等より抽出し精製したＨＭＧ−１か、又は動物由来のＨＭＧ−１であった。
このうち、動物由来のＨＭＧ−１は、測定対象物質であるヒトのＨＭＧ−１とは反応性に差異がある可能性があり好ましくない。
【００１２】
また、ヒトの臓器等より抽出し精製したＨＭＧ−１は、ヒトの臓器や細胞等の核の中より抽出し、精製しなければならないので、まず、ヒトの臓器等を入手しなければならない。しかしながら、これは困難であり、例え入手できたとしてもＨＭＧ−１の抽出及び精製が繁雑であった。そして、このような繁雑な操作によりヒトＨＭＧ−１を精製できたとしても、得られるヒトＨＭＧ−１はごく少量に過ぎないものであった。
即ち、動物由来のＨＭＧ−１又はヒトの臓器等より抽出し精製したＨＭＧ−１を、ヒトＨＭＧ−１の測定における標準物質として用いることには、上記のような種々の問題点があった。
【００１３】
これに対して、本発明の第一の課題は、以下の特徴を有するヒトＨＭＧ−１測定用標準物質を提供することである。
・  原料の入手が容易である。
・  調製の操作が繁雑ではない。
・  多量に得ることが出来る。
・  原料費及び調製に掛かる費用が安価である。
・  不純物を含まないか又はごく少量である。
・  測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１と同じ反応性を示す。
・  継続的に同じ反応性のものを得ることが出来る。
【００１４】
また、本発明の第二の課題は、次の特徴を有する、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法を提供することである。
・  質の高い校正及び精度管理を安価に行うことが出来る。
・  正確かつ精密な測定値を継続的に得ることが出来る。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）  遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１よりなるヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１測定用標準物質。
（２）  遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加、又は修飾を施したものである、前記（１）の測定用標準物質。
（３）  遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子の一部よりなるものである、前記（１）又は（２）記載の測定用標準物質。
（４）  遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１が、試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の免疫学的測定の標準物質として用いられるものである、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の測定用標準物質。
（５）  試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定において、遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１を標準物質として校正又は精度管理を行うことを特徴とする、試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定方法。
（６）  遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１のアミノ酸配列が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加、又は修飾を施したものである、前記（５）記載の測定方法。
（７）  遺伝子組み換え法により調製したヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１が、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１分子の一部よりなるものである、前記（５）又は（６）記載の測定方法。
（８）  試料中のヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１の測定が免疫学的測定法により行われるものである、前記（５）〜（７）のいずれか１項に記載の測定方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
〔１〕ヒトＨＭＧ−１測定用標準物質
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１である。遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１であれば、いかなるものでもよい。
【００１７】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質である遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１は、ヒトＨＭＧ−１分子に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加、又は修飾を施したものであってもよい。
【００１８】
また、本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質である遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１は、ヒトＨＭＧ−１分子の一部よりなるものであってもよく、又はヒトＨＭＧ−１分子の全部よりなるものであってもよい。
【００１９】
本発明において、ヒトＨＭＧ−１を遺伝子組み換え法により調製する方法であるが、遺伝子組み換え法として知られている通常の方法等を用いればよい。
【００２０】
例えば、ヒトＨＭＧ−１の遺伝子をクローニングし、得られたヒトＨＭＧ−１遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。
この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することによりヒトＨＭＧ−１を発現させることが出来る。
ヒトＨＭＧ−１の遺伝子の塩基配列をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、リンカーライゲーション法等を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法を用いる場合には、ヒトＨＭＧ−１の遺伝子の塩基配列をプライマーを用いて増幅させることにより、ヒトＨＭＧ−１の遺伝子の塩基配列を得ることが出来る。
【００２１】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、試料中のヒトＨＭＧ−１を測定する際の標準物質として使用するものである。
【００２２】
例えば、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定時に、試料の測定値（吸光度等）を、濃度既知の標準物質の測定値と比較して、試料中のヒトＨＭＧ−１の定量値を算出する校正（キャリブレーション）の際に標準物質として使用する。
【００２３】
また、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定を行う際に、その測定が正確かつ精密に行われているか確かめるため、濃度既知の標準物質を測定し、この標準物質の測定値又はヒトＨＭＧ−１定量値を評価し、測定が正確かつ精密に行われているか確認を行う精度管理の際に標準物質として使用する。
【００２４】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定を、免疫学的測定により行う際の標準物質として、特に好適である。
【００２５】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を、蒸留水若しくは精製水などの水、ヒト若しくは動物の血清、ヒト若しくは動物の血漿、又は他の溶液等に添加、溶解したものであってもよい。
【００２６】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質には、必要に応じ、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１とともに、緩衝剤、有機溶媒、糖類、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、脂質、補酵素、金属イオンなどの無機物質、安定化剤、防腐剤、活性化剤、キレート剤、界面活性剤又は他の高分子物質等を含有させてもよい。
【００２７】
なお、緩衝剤としては、目的とするｐＨ範囲に緩衝能がある緩衝剤を適宜使用することができる。このような緩衝剤としては、例えば、トリス〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、リン酸緩衝液、イミダゾール、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、ＭＯＰＳＯ等を挙げることができる。
【００２８】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、液状形態や凍結形態でもよい。また、粉末形態、凍結乾燥形態又は固形形態等のいずれの形態でもよく、この場合には、使用時に水等の溶媒に溶解させて液体化して用いる。
【００２９】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、例えば、蒸留水若しくは精製水などの水、ヒト若しくは動物の血清、ヒト若しくは動物の血漿、又は他の溶液等の適当な溶媒に、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を添加、溶解させることにより製造することが出来る。
【００３０】
〔２〕ヒトＨＭＧ−１測定方法
１．総論
本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法（以下「本発明の測定方法」ということがある）は、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定において、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を標準物質として校正又は精度管理を行うことを特徴とするものである。
【００３１】
即ち、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定において、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を標準物質として使用し、この標準物質を用いて校正を行うことを特徴とするものである。
【００３２】
また、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定において、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を標準物質として使用し、この標準物質を用いて精度管理を行うことを特徴とするものである。
【００３３】
本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法において、校正又は精度管理に使用する標準物質は、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１であれば、いかなるものでもよい。
【００３４】
本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法において、標準物質として使用する遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１は、ヒトＨＭＧ−１分子に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入若しくは付加、又は修飾を施したものであってもよい。
【００３５】
また、本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法において、標準物質として使用する遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１は、ヒトＨＭＧ−１分子の一部よりなるものであってもよく、又はヒトＨＭＧ−１分子の全部よりなるものであってもよい。
【００３６】
なお、本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法において、標準物質として使用する遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１の詳細は、前記「〔１〕ヒトＨＭＧ−１測定用標準物質」の項に記載した通りである。
【００３７】
本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法においては、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定に際し、試料の測定とは別に、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定し、得られた試料の測定値（吸光度等）を、前記の濃度既知の標準物質の測定値（吸光度等）と比較して、試料中のヒトＨＭＧ−１の定量値を算出する。即ち、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質により校正（キャリブレーション）を行う。
【００３８】
なお、得られた試料の測定値を、前記の濃度既知の標準物質の測定値と比較して、試料中のヒトＨＭＧ−１の定量値を算出する方法であるが、例えば、標準物質の濃度を横軸に取り、その時の測定値を縦軸に取ったグラフ（検量線）を作成するか、又は、標準物質の濃度とその時の測定値との関係を表す数式を求める等を行う。次に、測定対象物質の測定値を前記のグラフ（検量線）又は数式に当てはめて、この測定対象物質の定量値を求める。
【００３９】
また、本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法においては、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定を行う際に、その測定が正確、かつ精密に行われているか確かめるため、試料の測定とは別に、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定し、前記の濃度既知の標準物質の測定値（又はこの測定値より算出したヒトＨＭＧ−１定量値）を評価して、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定が誤差が生じることなく正確かつ精密に行われているか確認する。即ち、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質により精度管理を行う。
【００４０】
なお、本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法におけるヒトＨＭＧ−１を測定するための原理としては、例えば、ヒトＨＭＧ−１に特異的に結合する抗体とヒトＨＭＧ−１との抗原抗体反応（免疫学的反応）、又はヒトＨＭＧ−１に特異的に結合するリガンドとヒトＨＭＧ−１との結合反応などの、ヒトＨＭＧ−１に特異的な親和性を有し結合する物質とヒトＨＭＧ−１との結合反応による測定法等を挙げることができる。
【００４１】
このうち、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定を免疫学的測定法により行う際に、本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法は、特に好適である。
【００４２】
２．免疫学的測定法
以下、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定を免疫学的測定法により行う場合を例にとって、本発明の測定方法を詳細に説明する。
【００４３】
（１）測定法
この免疫学的測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００４４】
そして、前記の免疫学的測定法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定方法を適用することができる。
また、本発明の測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００４５】
（２）測定試料
本発明の測定方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液；大便；血管もしくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便  、臓器、組織もしくは細胞などの抽出液等、ヒトＨＭＧ−１が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００４６】
（３）標識抗体を用いた免疫学的測定法
本発明の測定方法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができる。
【００４７】
前記測定方法に用いる固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いることができる。
固相化抗体は、抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００４８】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００４９】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００５０】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００５１】
抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００５２】
本発明の測定方法においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【００５３】
また、本発明の測定方法においては、前記の抗体を固相化した固相担体、又は前記の抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。そして、これらを共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００５４】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００５５】
例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１＝標識抗体」の複合体を形成させる。そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝ヒトＨＭＧ−１」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたＨＭＧ−１の量（濃度）のみを測定することができる。
【００５６】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００５７】
そして、得られた試料の測定値（吸光度等）を、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定して得られた測定値（吸光度等）と比較して、試料中のヒトＨＭＧ−１の定量値を算出する。〔校正〕
【００５８】
また、前記のようにして、試料の測定とは別に、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定し、前記の濃度既知の標準物質の測定値（又はこの測定値より算出したヒトＨＭＧ−１定量値）を評価して、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定が誤差が生じることなく正確かつ精密に行われているか確認する。〔精度管理〕
【００５９】
（４）凝集反応法による免疫学的測定法
本発明の測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００６０】
抗体を固相担体に感作させて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
抗体を固相担体に感作させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
【００６１】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００６２】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００６３】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ヒトＨＭＧ−１）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【００６４】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のヒトＨＭＧ−１の濃度、抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【００６５】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された抗体と試料に含まれていたヒトＨＭＧ−１との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、抗体を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【００６６】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００６７】
本発明の測定方法においては、抗体を感作した固相担体を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上と共存させてもよい。そして、これらを共存させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
【００６８】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【００６９】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光又は散乱光などの吸光度等を測定する。
そして、得られた試料の測定値（吸光度等）を、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定して得られた測定値（吸光度等）と比較して、試料中のヒトＨＭＧ−１の定量値を算出する。〔校正〕
【００７０】
また、前記のようにして、試料の測定とは別に、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定し、前記の濃度既知の標準物質の測定値（又はこの測定値より算出したヒトＨＭＧ−１定量値）を評価して、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定が誤差が生じることなく正確かつ精密に行われているか確認する。〔精度管理〕
【００７１】
なお、目視的に測定を行う場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【００７２】
次に、得られた試料の凝集状態を、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定して得られた凝集状態と比較して、試料中のヒトＨＭＧ−１の有無又はその濃度を判定する。〔校正〕
【００７３】
また、前記のようにして、試料の測定とは別に、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１よりなる標準物質（ヒトＨＭＧ−１濃度は既知）を測定し、前記の濃度既知の標準物質の判定結果を評価して、試料中のヒトＨＭＧ−１の測定が誤差が生じることなく正確かつ精密に行われているか確認する。〔精度管理〕
【００７４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７５】
〔実施例１〕（遺伝子組み換え法によるヒトＨＭＧ−１の調製）
ヒトＨＭＧ−１をヒト脳ｃＤＮＡからＤＮＡ増幅を行いクローン化した。
ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで修飾し、シークエンス・ベクターのｐＣＡＬ−ｎベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州、アメリカ合衆国）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにサブクローン化し、ＤＮＡ配列の確認を行った。
次に、このＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで修飾されたＰＣＲ産物をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として発現させるために、ｐＥＸ発現ベクターのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにサブクローン化した。
その後、この組み換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１に、トランスフォームした。
【００７６】
トランスフォームされた細胞を１Ｌ程で培養を行った後、ＩＰＴＧの誘導をかけ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１で発現させた。
この発現させたＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１を集菌後、３０ｍＬ程度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム及び５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）〕に分散させた。
【００７７】
そして、これを超音波処理により破砕し、遠心分離後、上澄み液を回収した。
この上澄み液中に含まれるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質をグルタチオン・カラム（ファルマシア社）により精製した。
次に、この精製したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質から、第Ｘａ因子を作用させて、ヒトＨＭＧ−１を切り出した。
以上の遺伝子組み換え操作により、ヒトＨＭＧ−１を取得、調製した。
【００７８】
〔実施例２〕（検量線の作成）
後述する参考例１で調製したパーオキシダーゼ標識抗体及び参考例２で調製したマイクロプレート固相化抗体を免疫学的測定試薬として使用し、実施例１の遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を標準物質として酵素免疫測定法（サンドイッチ法）により測定を行った。そして、この免疫学的測定方法における検量線を作成した。
【００７９】
１．測定試薬
▲１▼  パーオキシダーゼ標識抗体
参考例１で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを結合させたパーオキシダーゼ標識抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における酵素標識抗体として使用した。
【００８０】
▲２▼  マイクロプレート固相化抗体
参考例２で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をマイクロプレートの各ウェルに固相化したマイクロプレート固相化抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における固相化抗体として使用した。
【００８１】
▲３▼  洗浄液
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を調製し、洗浄液とした。
【００８２】
▲４▼  パーオキシダーゼ基質液
３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したものを調製して、標識としたパーオキシダーゼの基質、即ちパーオキシダーゼ基質液とした。
【００８３】
▲５▼  反応停止液
６Ｎ硫酸水溶液を調製して、反応停止液とした。
【００８４】
２．試料
▲１▼  遺伝子組み換えヒトＨＭＧ−１を含む試料（標準物質）
実施例１の遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。
この透析後の前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。
そして、この前記ヒトＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、前記ヒトＨＭＧ−１濃度が、９２ｎｇ／ｍＬ又は１８３ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
【００８５】
▲２▼  ０ｎｇ／ｍＬの試料
前記の０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を、ヒトＨＭＧ−１濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料とした。
【００８６】
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
▲１▼  前記２で調製した、前記遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を含む２種類の試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ、生理食塩水で２倍に希釈した。
【００８７】
▲２▼  前記▲１▼で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と、前記試料に含まれていた遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１との抗原抗体反応を行わせた。
【００８８】
▲３▼  次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
【００８９】
▲４▼  前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。次にこれを、前記▲３▼の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプレートに固相化している抗体に結合した遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１に、パーオキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。
【００９０】
▲５▼  その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルを前記１の洗浄液で洗浄した。
【００９１】
▲６▼  次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。そして、室温で反応させた。
【００９２】
▲７▼  前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の反応停止液を、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
【００９３】
▲８▼  次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）により測定した。
【００９４】
▲９▼  以上の操作により得られた、前記の試料中の遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１の濃度を横軸に取り、４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を縦軸に取った図、即ち検量線を作成した。（図１）
【００９５】
なお、吸光度の測定値は、０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値（吸光度）を試薬盲検値として差し引いたものであり、９２ｎｇ／ｍＬの試料の測定値（吸光度）は０．２０９であり、１８３ｎｇ／ｍＬの試料の測定値（吸光度）は０．４４７であった。
【００９６】
〔実施例３〕（血清試料中のヒトＨＭＧ−１の測定）
実施例２で作成した検量線を用いて、血清試料中のヒトＨＭＧ−１の測定値の校正を行い、定量値を求めた。
【００９７】
１．測定試薬
前記実施例２で使用した、「▲１▼パーオキシダーゼ標識抗体」、「▲２▼マイクロプレート固相化抗体」、「▲３▼洗浄液」、「▲４▼パーオキシダーゼ基質液」、及び「▲５▼反応停止液」を各々用いた。
【００９８】
２．試料
▲１▼  ヒト血清試料
５種類のヒト血清を試料として用いた。（ヒト血清試料−１、ヒト血清試料−２、ヒト血清試料−３、ヒト血清試料−４、及びヒト血清試料−５）
【００９９】
▲２▼  ０ｎｇ／ｍＬの試料
０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を、ヒトＨＭＧ−１濃度が０ｎｇ／ｍＬの試料とした。
【０１００】
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
▲１▼  前記２の５種類のヒト血清試料を、前記実施例２の「３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定」の項に記載された通りに操作を行い、各々の血清試料の測定値（吸光度）を得た。
【０１０１】
ヒト血清試料−１の測定値（吸光度）は０．１８０であり、ヒト血清試料−２の測定値（吸光度）は０．０７７であり、ヒト血清試料−３の測定値（吸光度）は０．０４０であり、ヒト血清試料−４の測定値（吸光度）は０．０２１であり、そしてヒト血清試料−５の測定値（吸光度）は０．０１４であった。
【０１０２】
なお、各々の測定値（吸光度）は、０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値（吸光度）を試薬盲検値として差し引いたものである。
【０１０３】
▲２▼  これらの測定値（吸光度）を前記実施例２で作成した検量線（図１）に当てはめ、校正を行い、各々の定量値を求めた。これらの定量値を以下示す。
【０１０４】
ヒト血清試料−１：  ７５ｎｇ／ｍＬ
ヒト血清試料−２：  ３２ｎｇ／ｍＬ
ヒト血清試料−３：  １７ｎｇ／ｍＬ
ヒト血清試料−４：    ９ｎｇ／ｍＬ
ヒト血清試料−５：    ６ｎｇ／ｍＬ
【０１０５】
以上のことにより、遺伝子組み換え法により調製したヒトＨＭＧ−１を標準物質として作成した検量線により校正を行い、血清試料中のヒトＨＭＧ−１の定量値を求めることができた。
【０１０６】
〔参考例１〕（パーオキシダーゼ標識抗体の調製）
ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを標識化して、パーオキシダーゼ標識抗体を調製した。
【０１０７】
（１）モノクローナル抗体の調製
「Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ」で表されたペプチドと担体（ＫＬＨ）との結合物を免疫原として、これをフロイント完全アジュバントと等量混合したものを８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に免疫注射した。
このマウスの血中の抗体価がプラトーに達した後、このマウスより脾臓を取得した。
【０１０８】
次に、この脾臓細胞と、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク  ９０８５）とを、ポリエチレングリコール１５００含有ＲＰＭＩ１６４０培地液中で混合し、細胞融合させた。
【０１０９】
その後、クローニングを行い、ヒトＨＭＧ−１には結合するがヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を産生するハイブリドーマ〔ＭＤ７７〕を取得した。
そして、このハイブリドーマを培養して、ヒトＨＭＧ−１には結合するがヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を調製した。
【０１１０】
（２）抗体へのチオール基の導入
前記（１）の、ヒトＨＭＧ−１には結合するがヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する０．１Ｍリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．５）の０．５ｍＬに、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸の０．６ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの１０μＬに溶解したものを添加して、室温で３０分間反応させた。
【０１１１】
その後これに、０．１ＭのＥＤＴＡの２０μＬ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ添加して、３０℃で５分間放置した。
【０１１２】
次にこれを、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５のカラムに通し、単純ケル濾過クロマトグラフィーを行い、過剰のＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸を取り除き、抗体画分を集めた。
【０１１３】
以上の操作により、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するがヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）に、チオール基を導入した。
【０１１４】
（３）パーオキシダーゼへのマレイミド基の導入
パーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．３ｍＬに溶解後、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の１．０ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの６０μＬに溶解したものを添加して、３０℃で６０分間反応させた。
その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一夜透析を行った。以上の操作により、前記のパーオキシダーゼに、マレイミド基を導入した。
【０１１５】
（４）標識抗体の調製
前記（３）で調製したマレイミド基を導入したパーオキシダーゼ及び前記（２）で調製したチオール基を導入した抗体を一対一で混合し、３０℃で２０時間反応させて、前記抗体へのパーオキシダーゼの導入（標識化）を行った。
【０１１６】
その後これを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４のカラムに通し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
このゲル濾過クロマトグラフィーの各画分を、１０％ポリアクリルアミド電気泳動にかけて確認を行い、未結合のパーオキシダーゼが混入しないように、パーオキシダーゼが結合した抗体の画分だけを集めた。
【０１１７】
このパーオキシダーゼが結合した抗体の画分を濃縮して、ヒトＨＭＧ−１には結合するがヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを結合させたもの、即ちパーオキシダーゼ標識抗体を得た。そして、このパーオキシダーゼ標識抗体を含む溶液のタンパク質濃度を測定した。
【０１１８】
〔参考例２〕（マイクロプレート固相化抗体）
ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をマイクロプレートに固相化して、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
【０１１９】
（１）モノクローナル抗体の調製
「Ｃｙｓ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ」で表されたペプチドと担体（ＢＳＡ）との結合物を免疫原として、これをフロイント完全アジュバントと等量混合したものを８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に免疫注射した。
【０１２０】
このマウスの血中の抗体価がプラトーに達した後、このマウスより脾臓を取得した。
次に、この脾臓細胞と、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク  ９０８５）とを、ポリエチレングリコール１５００含有ＲＰＭＩ１６４０培地液中で混合し、細胞融合させた。
【０１２１】
その後、クローニングを行い、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）を産生するハイブリドーマ〔ＭＤ７８〕を取得した。
そして、このハイブリドーマを培養して、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）を調製した。
【０１２２】
（２）  前記（１）で得た、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）を、リン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により１５μｇ／ｍＬとした後、９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記抗体を前記マイクロプレートの各ウェルに吸着させ、固相化した。
【０１２３】
（３）  この抗体が固相化されたマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）をマイクロプレートに固相化した、マイクロプレート固相化抗体を調製した。
【０１２４】
【発明の効果】
本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質は、原料の入手が容易であり、調製の操作が繁雑ではなく、多量に得ることが出来、原料費及び調製に掛かる費用が安価であり、不純物を含まないか又はごく少量であり、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１と同じ反応性を示し、かつ継続的に同じ反応性のものを得ることが出来る標準物質である。
【０１２５】
また、本発明の試料中のヒトＨＭＧ−１の測定方法は、質の高い校正及び精度管理を安価に行うことが出来、更に正確かつ精密な測定値を継続的に得ることが出来る測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヒトＨＭＧ−１測定用標準物質を用いて作成した検量線を示した図である。
【図１】
2004239880.tif 000003