(57)【要約】【課題】ヒトプロラクチン拮抗剤−血管新生阻害剤融合蛋白質を提供することを課題とする。【解決手段】本発明により、癌の治療に用いるためのヒトプロラクチン拮抗剤と血管新生阻害剤とを含む融合蛋白質を調製および使用する方法が提供された。例えば、アポトーシス遮断能および／または内分泌反応阻害能を特徴とする受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを含む新規融合蛋白質は、癌の治療において有用である。また、癌と闘うために、ヒトプロラクチン拮抗剤−エンドスタチン融合蛋白質をアポトーシス誘導と血管新生の阻害と組み合わせることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを有する蛋白質の有効量を患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項２】
受容体拮抗ドメインがプロラクチン拮抗剤ドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血管新生阻害ドメインがエンドスタチンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
蛋白質がプロラクチン拮抗剤−エンドスタチン融合蛋白質である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
血管新生阻害ドメインがアンジオスタチンである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
蛋白質がプロラクチン拮抗剤−アンジオスタチン融合蛋白質である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
血管新生阻害ドメインがＦｌｋ−１−ｂｐである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
蛋白質がプロラクチン拮抗剤−Ｆｌｋ−１−ｂｐ融合蛋白質である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、プロラクチン蛋白質の１２９位に対応する位置でグリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換を特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、配列番号：１（ｈＰＲＬＡ）に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種を有する蛋白質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、天然型プロラクチン配列またはその保存的変種の切断型を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
癌がプロラクチン受容体を発現することを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項１３】
受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
アポトーシス促進ドメインが標的細胞におけるＳＴＡＴ−５リン酸化を阻害することによって機能する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを含む蛋白質。
【請求項１６】
受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインである、請求項１５記載の蛋白質。
【請求項１７】
アポトーシス促進ドメインがプロラクチン拮抗剤ドメインである、請求項１５記載の蛋白質。
【請求項１８】
血管新生阻害ドメインがエンドスタチンである、請求項１６記載の蛋白質。
【請求項１９】
血管新生阻害ドメインがアンジオスタチンである、請求項１６記載の蛋白質。
【請求項２０】
血管新生阻害ドメインがＦＬＫ−１−ｂｐである、請求項１６記載の蛋白質。
【請求項２１】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、プロラクチンドメインの１２９位に対応する位置でグリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換を特徴とする、請求項１６記載の蛋白質。
【請求項２２】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、配列番号：１（ｈＰＲＬＡ）に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種を有する蛋白質を含む、請求項２１記載の蛋白質。
【請求項２３】
プロラクチン拮抗剤ドメインが、天然型プロラクチン配列またはその保存的変種の切断型を含む、請求項２２記載の蛋白質。
【請求項２４】
アポトーシス促進ドメインが、標的細胞におけるＳＴＡＴ−５リン酸化の阻害によって機能する、請求項２２記載の蛋白質。
【請求項２５】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種配列を含む第一のドメインと、正の免疫調節ドメインとを含む蛋白質。
【請求項２６】
請求項１５記載の蛋白質の治療的有効量と担体溶媒の適量とを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グリーンビル病院（Ｇｒｅｅｎｖｉｌｌｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ）寄付金システムおよび助成金（ＤＡＭＤ　１７−９９−１−９１２９、ＤＡＭＤ　１７−０１−１−０２０７、ＮＩＨ／ＮＣＩ　１Ｒ２１ＣＡ８７０９３）によって一部支援を受けた。
【０００２】
本発明は一般的に、癌の治療に用いるために、ヒトプロラクチン拮抗剤と血管新生阻害剤とを含む融合蛋白質を調製および使用する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
ヒト乳癌は、ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ）編の非特許文献１によって報告されるように、悪性度が高く、西欧社会の女性における癌による死因の第一位である。全米癌学会による最近の推定によれば、１９９８年にはアメリカ人女性８人に１人が乳癌を有し、その疾患のために女性４３，５００人が死亡するであろうと言われている。
【０００４】
プロラクチン（ＰＲＬ）が乳癌の発生に強く関連するいくつかの系列の証拠がある。プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）の発現レベルは、正常な乳房上皮細胞のみならず（非特許文献２）、手術によって摘出した乳癌組織と比較してヒト乳癌細胞では高いと報告されている（非特許文献３）。悪性乳房組織におけるＰＲＬＲレベルは、その周辺の正常組織に対して５倍高くなることがあり（上記非特許文献３を参照のこと）、そのためにこれらの悪性細胞は、ｈＰＲＬによる刺激に対して非常に感受性が高い。さらに、乳房におけるエストロゲンについての分裂作用の一つのメカニズムは、ＰＲＬＲ、エストロゲン受容体（ＥＲ）、またはプロゲステロン受容体レベルの間に正の相関が存在することから、ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）の産生および分泌に影響を及ぼす可能性があることが示唆されている（非特許文献４〜６参照）。これらのことを考慮すると、これらの知見は、ｈＰＲＬが、乳癌形成において重要な役割を有するオートクライン／パラクリン増殖因子としての役割を有するという仮説に至る（非特許文献７および８）。
【０００５】
ＰＲＬ発現と前立腺疾患との関連も同様に、ウェンボ（Ｗｅｎｎｂｏ）ら（非特許文献９）において提唱されている。ＰＲＬ受容体は、アラゴナ（Ａｒａｇｏｎａ）ら、（非特許文献１０）およびリーキ（Ｌｅａｋｅ）ら（非特許文献１１）に報告されているように、前立腺組織に認められる。さらに、ＰＲＬレベルは、前立腺過形成の発生と一致して年齢と共に増加しうることが認められた（非特許文献１２および１３）。ＰＲＬ遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、前立腺の劇的な肥大を起こした（上記の非特許文献９を参照のこと）。
【０００６】
乳癌と前立腺癌の双方に対するこの関連性を考慮すると、ＰＲＬシグナル伝達は治療的介入にとって興味深い標的となる。しかし、これまでのところ、この目的のために利用可能な適した薬剤はない。
【０００７】
腫瘍の血管新生の阻害はまた、癌の治療において非常に有望であることが示されている。血管新生は、内皮細胞の増殖、遊走、および分化、細胞外マトリクスの分解、管形成、ならびに新しい毛細管の発芽を含む複雑な多段階の工程である（非特許文献１４）。腫瘍はしばしば、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮増殖因子ファミリー（ＶＥＧＦ、非特許文献１５〜１７参照）のメンバーを含むいくつかの前血管新生分子を過剰発現する。血管密度と血管新生はいずれも転移の形成および予後に直接相関する（非特許文献１８および１９）。過剰な血管新生は、癌の病理の一部であり、腫瘍における血管新生を防止すれば、腫瘍細胞において休眠状態を有効に誘導しうると思われる（非特許文献２０および２１）。血管新生の遮断は、その血液供給を切断することによって、癌を治療、さらには根絶さえする治療方法として非常に有望であることが証明されている。癌に対する抗血管新生治療は、以下の理由により有効である：（１）腫瘍の増殖は血管新生に依存的である；（２）血管新生の程度は腫瘍の浸潤性に比例する；（３）腫瘍内皮細胞は、成体非新生物組織における内皮細胞とは定性的に異なる；（４）血管新生の内因性阻害剤および刺激剤が存在し、単離されている（非特許文献２２）。血管新生阻害剤は、以下の理由により興味をそそる抗癌剤となる：（１）薬物耐性を獲得する可能性は細胞障害剤の場合より低い；腫瘍の休眠は持続的な薬物投与によって得られる可能性がある；（２）化学療法においてしばしば認められる血液毒性が起こる可能性は低い；および（３）細胞障害剤との相乗作用の可能性がある、というような多くの独自の生物作用がある。
【０００８】
血管新生の阻害に対して最も有望な効果を有する２つの重要な分子は、可溶性の内因性因子であるアンジオスタチンとエンドスタチンである。コラーゲンＸＶＩＩＩの２０　ｋＤａ　Ｃ末端断片であるエンドスタチンは、オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）らによって初めて特徴が調べられ、血管新生および腫瘍退縮活性を示すことが報告されている（非特許文献２３および２４）。プラスミノーゲンの蛋白質分解断片であるアンジオスタチンも同様に、多様な腫瘍モデルにおいて強力な抗血管新生活性および抗腫瘍活性を示すと記述されている（非特許文献２５および２６）。エンドスタチンおよびアンジオスタチンが血管新生を阻害するメカニズムはわかっていない。エンドスタチンとアンジオスタチンはいずれも現在臨床試験の初期段階である（非特許文献２７のハーブスト（Ｈｅｒｂｓｔ）らによる総説を参照のこと）。
【０００９】
最も強力で特異的な血管新生因子の一つは、ＶＥＧＦ（非特許文献２８のフェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）らによる総説）である。ＶＥＧＦおよびその高親和性チロシンキナーゼ受容体Ｆｌｋ−１／ＫＤＲは、生理的血管新生および異常血管新生のいずれにとっても中心的な調節物質である。腫瘍内皮におけるＶＥＧＦおよびＦｌｋ−１の発現レベルが高いことは、このシグナル伝達系がパラクリンメカニズムによって腫瘍血管の増殖および生存を刺激することを示している（非特許文献１５、１６、および２８）。この仮説の直接的な証拠は、ＶＥＧＦ中和抗体を適用することによって（非特許文献１５および１６）、またはドミナントネガティブＦｌｋ−１受容体変異の遺伝子導入によって（非特許文献２９および３０）、動物モデルにおいて腫瘍の増殖が阻害されることから得られた。Ｆｌｋ−１発現は、成体内皮では抑制されているが、多様なヒト腫瘍において新たに形成された血管では高度に誘導されている。送達系としてアデノウイルスを用いて、エンドスタチン、アンジオスタチンの有効性と共に、ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ−１（Ｆｌｋ−１−ＢＰ）のリガンド結合外部ドメインを直接比較する最も最近の研究から、Ｆｌｋ−１−ＢＰが、エンドスタチンまたはアンジオスタチンのいずれかより良好な血管新生阻害剤であることが示されている（非特許文献３１）。
【００１０】
【非特許文献１】
ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ）編、「女性の癌の生物学（Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆｅｍａｌｅ　Ｃａｎｃｅｒｓ）」、ＣＲＣ出版、１９９７年、ｐ．３１−４２
【非特許文献２】
レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら、１９９７年
【非特許文献３】
ツーレイン、マルティニ（Ｔｏｕｒａｉｎｅ，　Ｍａｒｔｉｎｉ　Ｐ．）ら、ヒト乳房腫瘍と隣接する正常乳房組織におけるプロラクチン受容体遺伝子の発現増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｔｕｍｏｒｓ　Ｖｅｒｓｕｓ　Ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｔｉｓｓｕｅｓ）、「抄録、第７９回全米内分泌学会総会」、１９９７年、ｐ１１３
【非特許文献４】
サーバスク（Ｓｉｒｂａｓｋｕ）、１９７８年
【非特許文献５】
ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｐｍａｎ）、１９８６年
【非特許文献６】
リップマン（Ｌｉｐｐｍａｎ　）およびディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）、１９８９年
【非特許文献７】
クレベンガー（Ｃｌｅｖｅｎｇｅｒ）ら、「Ａｍ．　Ｊ．　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ」、１９９５年、　第１４６巻、ｐ．６９５〜７０５
【非特許文献８】
ギンスブルグ（Ｇｉｎｓｂｕｒｇ，　Ｅ．）ら、「Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．」、１９９５年、第５５巻、ｐ．２５９１〜２５９５
【非特許文献９】
ウェンボ（Ｗｅｎｎｂｏ）ら、「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」、１９９７年、第１３８巻、ｐ．４４１０〜４４１５
【非特許文献１０】
アラゴナ（Ａｒａｇｏｎａ）ら、「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」、１９７５年、第９７巻、ｐ．６７７〜６８４
【非特許文献１１】
リーキ（Ｌｅａｋｅ）ら、「Ｊ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」、１９８３年、第９９巻、ｐ．３２１〜３２８
【非特許文献１２】
ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ら、「Ｃｌｉｎ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」、１９７７年、第７巻、ｐ．１２９〜１３５
【非特許文献１３】
ベケマンス（Ｖｅｋｅｍａｎｓ）ら、「Ｂｒ．　Ｍｅｄ．　Ｊ．」、１９７５年、第４巻、ｐ．７３８〜７３９
【非特許文献１４】
タルイ（Ｔａｒｕｉ）ら、２００１年
【非特許文献１５】
キム（Ｋｉｍ）ら、１９９３年
【非特許文献１６】
チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、１９９６年
【非特許文献１７】
ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ）およびケシェト（Ｋｅｓｈｅｔ）、１９９７年
【非特許文献１８】
ビジャヤゴパル（Ｖｉｊａｙａｇｏｐａｌ）ら、１９９８年
【非特許文献１９】
グイディ（Ｇｕｉｄｉ）ら、２０００年
【非特許文献２０】
フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、１９９５年
【非特許文献２１】
ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）およびフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）、１９９６年
【非特許文献２２】
リャン（Ｒｙａｎ）およびウィルディング（Ｗｉｌｄｉｎｇ）、２０００年
【非特許文献２３】
オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら、１９９７年
【非特許文献２４】
ボーム（Ｂｏｅｈｍ）ら、１９９７年
【非特許文献２５】
オライリーら（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）、１９９４年
【非特許文献２６】
オライリーら（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）、１９９６年
【非特許文献２７】
ハーブスト（Ｈｅｒｂｓｔ）ら、２００１年
【非特許文献２８】
フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）、２００１年
【非特許文献２９】
ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら、１９９４年
【非特許文献３０】
ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）ら、１９９６年
【非特許文献３１】
クオ（Ｋｕｏ）ら、２００１年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、癌細胞におけるプロラクチンシグナル伝達メカニズムを妨害することができる薬剤を提供することである。
【００１２】
本発明のなおもう一つの目的は、腫瘍細胞株において血管新生を阻害する薬剤を提供することである。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの目的は、標的となる癌細胞に存在する受容体に拮抗すると同時に、腫瘍の血管新生を阻害することによって、癌に罹患した患者を治療する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、本明細書に記載の薬剤を用いることによって癌を治療する方法を提供することである。
【００１５】
以下の開示を読むことによって容易に明らかとなるこれらの目的および他の目的は、本発明によって達成されると考えられる。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
物質の組成の局面において、本発明は実質的に、受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを含む蛋白質に関する。本発明はさらに、受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインとなり得、血管新生阻害ドメインがエンドスタチンとなり得ることを提供する。受容体拮抗ドメインはまた、配列番号：１に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種であってもよい。
【００１７】
方法論の局面において、本発明は、受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを有する蛋白質の有効量を患者に投与することを含む、癌を治療する方法に関する。本方法はさらに、本明細書に記載の任意の蛋白質を患者に投与する方法を提供する。
【００１８】
本発明に係る方法においては、（１）受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを有する蛋白質の有効量を患者に投与することを含む、癌を治療する方法であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る方法においては、（２）受容体拮抗ドメインがプロラクチン拮抗剤ドメインである、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係る方法においては、（３）血管新生阻害ドメインがエンドスタチンである、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る方法においては、（４）蛋白質がプロラクチン拮抗剤−エンドスタチン融合蛋白質である、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る方法においては、（５）血管新生阻害ドメインがアンジオスタチンである、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る方法においては、（６）蛋白質がプロラクチン拮抗剤−アンジオスタチン融合蛋白質である、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る方法においては、（７）血管新生阻害ドメインがＦｌｋ−１−ｂｐである、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る方法においては、（８）蛋白質がプロラクチン拮抗剤−Ｆｌｋ−１−ｂｐ融合蛋白質である、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る方法においては、（９）プロラクチン拮抗剤ドメインが、プロラクチン蛋白質の１２９位に対応する位置でグリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換を特徴とする、上記（２）記載の方法であることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る方法においては、（１０）プロラクチン拮抗剤ドメインが、配列番号：１（ｈＰＲＬＡ）に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種を有する蛋白質を含む、上記（２）記載の方法であることを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る方法においては、（１１）プロラクチン拮抗剤ドメインが、天然型プロラクチン配列またはその保存的変種の切断型を含む、上記（２）記載の方法であることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る方法においては、（１２）癌がプロラクチン受容体を発現することを特徴とする、上記（３）記載の方法であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係る方法においては、（１３）受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインである、上記（１）記載の方法であることを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る方法においては、（１４）アポトーシス促進ドメインが標的細胞におけるＳＴＡＴ−５リン酸化を阻害することによって機能する、上記（１３）記載の方法であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る蛋白質においては、（１５）受容体拮抗ドメインと血管新生阻害ドメインとを含む蛋白質であることを特徴とする。
【００３３】
また、本発明に係る蛋白質においては、（１６）受容体拮抗ドメインがアポトーシス促進ドメインである、上記（１５）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００３４】
また、本発明に係る蛋白質においては、（１７）アポトーシス促進ドメインがプロラクチン拮抗剤ドメインである、上記（１５）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る蛋白質においては、（１８）血管新生阻害ドメインがエンドスタチンである、上記（１６）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る蛋白質においては、（１９）血管新生阻害ドメインがアンジオスタチンである、上記（１６）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明に係る蛋白質においては、（２０）血管新生阻害ドメインがＦＬＫ−１−ｂｐである、上記（１６）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明に係る蛋白質においては、（２１）プロラクチン拮抗剤ドメインが、プロラクチンドメインの１２９位に対応する位置でグリシンからアルギニンへの一アミノ酸置換を特徴とする、上記（１６）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００３９】
また、本発明に係る蛋白質においては、（２２）プロラクチン拮抗剤ドメインが、配列番号：１（ｈＰＲＬＡ）に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種を有する蛋白質を含む、上記（２１）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００４０】
また、本発明に係る蛋白質においては、（２３）プロラクチン拮抗剤ドメインが、天然型プロラクチン配列またはその保存的変種の切断型を含む、上記（２２）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００４１】
また、本発明に係る蛋白質においては、（２４）アポトーシス促進ドメインが、標的細胞におけるＳＴＡＴ−５リン酸化の阻害によって機能する、上記（２２）記載の蛋白質であることを特徴とする。
【００４２】
また、本発明に係る蛋白質においては、（２５）配列番号：１に記載のアミノ酸配列またはその保存的変種配列を含む第一のドメインと、正の免疫調節ドメインとを含む蛋白質であることを特徴とする。
【００４３】
また、本発明に係る薬学的組成物においては、（２６）上記（１５）記載の蛋白質の治療的有効量と担体溶媒の適量とを含む、薬学的組成物であることを特徴とする。
【００４４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、内分泌に基づく治療と標的化抗血管新生治療の併用作用が癌の治療を大きく増強させることを発見した。例えば、本明細書に開示の治療の産物および方法は、ＰＲＬＲを遮断することによって内因性ＰＲＬのオートクライン／パラクリン作用を阻害して、その結果、典型的にはアポトーシスを引き起こすように作用する。さらに、このアプローチは腫瘍の血管新生を阻害して、さらに腫瘍の増殖を阻害する。
【００４５】
本明細書において用いるように、「アポトーシス」とは、それによって発達または環境刺激が遺伝子プログラムを活性化して、最終的に死および細胞の効率的な処分に至る一連の特定の事象を実行する工程を意味する。細胞における形態学的変化には、小胞体の拡張および細胞質膜の回旋を伴う細胞容積の劇的な縮小が含まれる。次に、これによって細胞は、構造的に正常であるが、なおも圧縮されたオルガネラを含む一連の膜結合体へと切断される。核は不連続な染色質の濃縮を受け、ヌクレアーゼを介するＤＮＡ断片化が起こり、染色体ＤＮＡは小さいオリゴヌクレオソーム断片に分解される。核および細胞質は濃縮して、死につつある細胞は最終的に膜結合アポトーシス体に断片化され、これはマクロファージまたは隣接する細胞によって急速に貪食され、消化される。
【００４６】
本発明は、ＰＲＬＲの遮断に関連した恩典と血管新生の阻害に関連した恩典とを、各ドメインがこれらの機能の一つの実施能を有する多ドメイン分子を利用することによって組み合わせる。典型的な分子は、「血管新生阻害ドメイン」と組み合わせた「受容体拮抗ドメイン」または「アポトーシス促進ドメイン」を有する。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「受容体拮抗ドメイン」は、受容体に結合すると、受容体拮抗ドメインが一つまたはそれ以上の細胞工程を阻害するように作用して、それによって疾患の病因または維持を妨害する、癌のような障害に関連する受容体に特異的に結合するリガンドである。アポトーシスを誘導するそのようなドメインは、本明細書において、「アポトーシス促進ドメイン」と呼び、「血管新生阻害ドメイン」は、腫瘍の新生血管の形成を阻害するドメインである。
【００４８】
これらの特徴を有する融合蛋白質の恩典は非常に大きい。例えば、発癌組織はしばしば、一つまたはそれ以上の蛋白質受容体レベルの増加を特徴とする。これらの受容体の一つに特異的であるドメインを含む融合蛋白質は、癌組織を特異的に標的化することができると考えられる。受容体拮抗ドメインが、アポトーシス促進ドメインの場合のように、癌の病因を破壊する、または癌の維持を破壊する場合、分子の受容体拮抗部分は直接的な治療効果を有する。さらに、血管新生阻害ドメインの存在により、分子は、腫瘍の新生血管の形成を阻害し、それによって腫瘍の増殖にとって必要な血液供給および関連する栄養を腫瘍から枯渇させることによって二次的な治療効果を有する。
【００４９】
したがって、本発明に従って治療を受ける候補者には、腫瘍の維持または増殖に関連した少なくとも一つの受容体の存在を特徴とする悪性腫瘍を有する個体が含まれる。好ましい態様において、融合蛋白質の受容体拮抗ドメインは、標的化膜結合受容体に結合するアポトーシス促進ドメインである。そのような結合はアポトーシスを誘導し、同時に、血管新生阻害ドメインは腫瘍の新生血管の形成を阻害する。
【００５０】
本発明の二機能性蛋白質：
本発明に従って、悪性組織に対して独自の二重の治療効果、すなわち（ａ）受容体拮抗および／またはアポトーシス促進（全く同一であってもよい）および（ｂ）血管新生阻害の効果を有する二機能性蛋白質が考慮される。本発明はまた、本発明の二機能性蛋白質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を考慮する。
【００５１】
受容体拮抗ドメイン
本発明は、一つの局面において、受容体拮抗ドメインの効果を疾患組織に限定する第一のドメインを考慮する。例えば、発癌組織はしばしば、一つまたは複数の蛋白質受容体レベルの増加を特徴とする。これらの受容体の一つに対して特異的なドメインを含む融合蛋白質は、癌組織を特異的に標的化することができ、それによって局所腫瘍細胞障害反応を標的組織に誘導することができる。
【００５２】
一つの態様において、特定の受容体部位を標的化するドメインは、受容体拮抗ドメインであり、これはその名称が示唆するように、その同族受容体に結合して拮抗する。受容体拮抗ドメインが、癌細胞において高度に発現されている受容体を認識する限り、それは本発明の使用に適している。好ましい態様において、受容体拮抗ドメインは、アポトーシス促進ドメインである。
【００５３】
この二機能性分子のさらなる治療的恩典は、受容体拮抗ドメインが典型的に内分泌遮断活性を有する点である。このように、受容体拮抗ドメインが、例えばプロラクチン拮抗剤である場合、プロラクチンの正常な内分泌機能は破壊されると考えられる。この内分泌遮断の結果、プロラクチンおよび類似の分子の場合では、例えば、標的細胞のアポトーシスが起こりうる。その場合、受容体拮抗ドメインはまた、アポトーシス促進ドメインでもある。
【００５４】
アポトーシス促進ドメインの場合、そのようなドメインは一般的に、アポトーシスの予防に関係する細胞成分の正常な機能の拮抗剤を作製することによって設計される。乳癌と前立腺癌組織の双方において、例えば、発癌性と悪性細胞増殖は、少なくとも部分的にＰＲＬＲレベルの増加によって刺激される。ＰＲＬＲによるシグナル伝達は、プロラクチン受容体の二量体形成を介することが知られているが、二量体形成自身は受容体結合プロラクチン分子の二量体形成を介する。２つのＰＲＬＲに内因性ＰＲＬが結合すると、ＰＲＬＲの二量体が形成され、それによって癌細胞へのシグナル伝達が引き起こされる。したがって、本発明の一つの態様は、プロラクチン拮抗剤（ＰＲＬＡ）（すなわち、プロラクチン拮抗剤ドメイン）を用いてプロラクチンの正常なアポトーシス阻害機能に拮抗することを含む。
【００５５】
ＰＲＬＲシグナル伝達経路におけシグナル伝達は、ＳＴＡＴ（転写シグナル伝達物質および活性化物質（ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））のリン酸化を伴い、これはＰＲＬＲ拮抗の正常な作用であるアポトーシスの予防または阻害に関係する。このように、Ｇ１２９Ｒ拮抗剤は、ヒト乳癌細胞においてＳＴＡＴ　５リン酸化を阻害することによってアポトーシスを促進する。したがって、ＰＲＬＲを遮断することは、ＳＴＡＴ　５を含む内因性ＰＲＬのオートクライン／パラクリン作用を阻害し、その結果アポトーシスが生じる。このように、本発明によって考慮される一つのクラスのアポトーシス促進化合物は、ＳＴＡＴ　５リン酸化を阻害することができる化合物である。
【００５６】
本発明によって考慮される適したＰＲＬＡは、一般的に、ＰＲＬＲに対する特異的結合の特徴を保持しているが、なお正常なＰＲＬアポトーシス遮断メカニズムを破壊する何らかの構造的欠損を有すると思われる。そのような構造的欠損には、ＰＲＬ（従って、ＰＲＬＲ）の二量体形成を破壊する欠損が含まれる。
【００５７】
配列番号：１に示すように、一つの好ましい態様において、この構造的欠損は、ｈＰＲＬにおける１２９位に対応する位置でのグリシンからアルギニンへの置換である（ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒと称する）。図５に示すように、Ｇ１２９Ｒ変異を含む融合蛋白質は、抗ｈＰＲＬ抗体によって認識される。図６〜８に示すデータは、この変異ｈＰＲＬが真のｈＰＲＬＲ拮抗剤として作用することを証明する。したがって、ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒのような受容体拮抗ドメインは、特定のタイプの癌を治療するための治療的薬剤として作用しうる。
【００５８】
本発明の態様は、表１に示すＰＲＬの第三のαヘリックス領域内のアミノ酸配列の種間比較を開示する、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、（Ｃｌｉｎ．　Ｃａｎ．　Ｒｅｓ．　５：３５８３〜９３（１９９９））によって支持される。（記載された順序で、それぞれ配列番号：９から４０を示す）
【００５９】
【表１】
2004002276.tif 000002
＊表１：本表は、クック（Ｃｏｏｋｅ）ら、（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２５６：４００７〜４０１６（１９８１））から転載した。本発明者らは、本表において、ヒトプロラクチン配列の１２８位のアミノ酸がアルギニンであることに注目した。しかし、本発明者らのデータ（図１から３を参照）およびＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１５８５０、ＮＭ＿００９４８、Ｘ５４３９３、Ｖ００５６６、Ｍ２９３８６、Ｄ００４１１、およびＵ７５５８３は、ｈＰＲＬにおける１２８位のアミノ酸がグルタミン酸であることを示している。
【００６０】
表１より、ｈＰＲＬの１２９位のグリシンはＰＲＬの間で不変であることが明白であり、このことから、その機能に重要な役割を果たすことが示唆される。このように、１２９位のグリシンの代わりに、何らかのアミノ酸を置換すれば、これらの種のそれぞれにおいてＰＲＬＡが得られるはずである（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｍｏｌｅｃ．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９５））。一つの態様において、拮抗剤は、１２９位のグリシンの代わりにアルギニンのような比較的かさ高い側鎖アミノ酸を用いることによって作製される。したがって、本発明の一つの局面は、かさ高い側鎖アミノ酸の代わりに小さい側鎖アミノ酸を用いると蛋白質の拮抗剤型が得られるように、特定の位置で比較的小さい側鎖アミノ酸（すなわち、グリシン）が存在することを特徴とするＰＲＬの保存的変種を考慮する。好ましい態様において、受容体拮抗ドメインはｈＰＲＬ−Ｇ１２０Ｒ拮抗剤である。
【００６１】
本発明の受容体拮抗ドメインにはまた、本明細書において考察した受容体拮抗ドメインの保存的変種が含まれる。本発明のドメインの全体的な構造および組成は、それらが適当な機能的特徴、すなわち受容体の拮抗、アポトーシス誘導、正の免疫調節の特徴を付与する限りおいて、重要である。
【００６２】
本発明に係る保存的変種は、一般的に、蛋白質ドメインの全体的な分子構造を保存する。開示の蛋白質産物を含む個々のアミノ酸の特性を考慮すると、いくつかの合理的な置換が明白であると考えられる。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性における類似性に基づいて実施してもよい。
【００６３】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；ならびに（ｄ）陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には（ａ）〜（ｄ）群内で行うことができる。さらに、グリシンおよびプロリンは、αヘリックス破壊能に基づいて互いに置換してもよい。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、およびリジンのような特定のアミノ酸は、αヘリックスでより一般的に認められるが、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびトレオニンは、βプリーツシートで一般的に認められる。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンは、折り返し構造において一般的に認められる。以下の群の間でいくつかの好ましい置換を行うことができる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ、およびＩ。既知の遺伝子コード、ならびに組換え技術および合成ＤＮＡ技術があれば、当業者は保存的アミノ酸変種をコードするＤＮＡを容易に構築することができると思われる。
【００６４】
保存的変種では特に、本明細書に記載の受容体拮抗ドメインの切断型が考慮される。切断は、Ｎ末端またはＣ末端から作製してもよいが、一般的に天然型分子の約３０％より多くの欠失を含まない。天然型分子の欠失は、より好ましくは約２０％未満、最も好ましくは約１０％未満である。
【００６５】
一般的に、本発明のＤＮＡおよび蛋白質分子はいずれも、「配列同一性」を参照して定義することができる。いくつかの分子は、少なくとも約５０％、５５％、または６０％の同一性を有する。好ましい分子は少なくとも約６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性を有する分子である。他の好ましい分子は、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性を有する。最も好ましい分子は、少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。本明細書において用いられるように、二つの核酸分子または蛋白質は、二つが８５％より多くの配列（アミノ酸または核酸）の同一性を有する領域を含む場合、「有意な配列同一性を有する」と言われる。
【００６６】
「配列同一性」とは、本明細書において、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で入手可能なＢｌａｓｔ　２アルゴリズムを参照して、デフォルトパラメータを用いて定義される。このアルゴリズムに関する参考文献には、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ．ｈｔｍｌにおいて認められる文献；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．）、ギッシュ（Ｇｉｓｈ，　Ｗ．）、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｗ．）、マイヤース（Ｍｙｅｒｓ，　Ｅ．Ｗ．）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．Ｊ．）、（１９９０）「基本局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）」、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３〜４１０）；ギッシュ（Ｇｉｓｈ，　Ｗ．）およびステイツ（Ｓｔａｔｅｓ，　Ｄ．Ｊ．）、（１９９３）、「データベース類似性検索による蛋白質コード領域の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｂｙ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｓｅａｒｃｈ）」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．　３：２６６〜２７２）；マッデン（Ｍａｄｄｅｎ，　Ｔ．Ｌ．）、タツソフ（Ｔａｔｕｓｏｖ，　Ｒ．Ｌ．）およびザング（Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．）、（１９９６）、「ネットワークＢＬＡＳＴサーバーの応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ＢＬＡＳＴ　ｓｅｒｖｅｒ）」、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２６６：１３１〜１４１）；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｓ．Ｆ．）、マッデン（Ｍａｄｄｅｎ，　Ｔ．Ｌ．）、シェーファー（Ｓｃｈａｆｆｅｒ，　Ａ．Ａ．）、ザング（Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．）、ザング（Ｚｈａｎｇ，　Ｚ．）、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｗ．）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ，　Ｄ．Ｊ．）、（１９９７）、「ギャップＢＬＡＳＴとＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代の蛋白質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴ　ａｎｄ　ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ　ｎｅｗ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈ　ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９〜３４０２）；およびザング（Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．）およびマッデン（Ｍａｄｄｅｎ，　Ｔ．Ｌ．）、（１９９７）、「パワーＢＬＡＳＴ：相互または自動配列分析と注釈のための新しいネットワークＢＬＡＳＴ応用（Ｐｏｗｅｒ　ＢＬＡＳＴ：Ａ　ｎｅｗ　ｎｅｔｗｏｒｋ　ＢＬＡＳＴ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　ｏｒ　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）」、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．　７：６４９〜６５６）。したがって、表１に記載の配列を含む異なる種からのプロラクチンペプチド配列を、その本質的な機能を保存するプロラクチン由来受容体拮抗ドメインにおけるさらなる変異に関する情報を与えるために、ＢＬＡＳＴのような標準的なコンピュータープログラムを用いて配列化することができる。
【００６７】
本明細書に開示の蛋白質の保存的変種である蛋白質の他に、本発明はまた、アミノ酸置換によって蛋白質の増殖の誘導能が阻害される、腫瘍の増殖を誘導する際に役割を果たす蛋白質を用いることを考慮する。例えば、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）およびｈＧＨの１１９位のグリシンと１２０位のグリシンはそれぞれ、成長増強を刺激するＧＨの作用において重要な役割を有する。成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）の二量体形成は、ＨＧシグナル伝達にとって重要な段階であると考えられる。したがって、それぞれの位置での何らかのアミノ酸置換（アラニン以外）、特にアルギニンのようなかさ高い側鎖へのアミノ酸置換は、受容体の二量体形成を妨害し、その結果、成長ホルモン拮抗剤（ＧＨＡ）となる。このように、ＧＨＡのような拮抗剤が本発明によって考慮される。好ましい態様において、受容体拮抗ドメインは、ｈＧＨ−Ｇ１２０Ｒ拮抗剤である。
【００６８】
血管新生阻害ドメイン
本発明はまた、血管新生阻害剤として作用する、さらなる、しかし異なるドメインを考慮する。好ましい血管新生阻害ドメインにはエンドスタチンが含まれる。エンドスタチンの他に、本発明は、腫瘍の新生血管の形成を阻害することができる蛋白質を含む他の分子を考慮する。例えば、エンドスタチン、アンジオスタチン、およびＦｌｋ−１　ｂｐが本発明において考慮される。
【００６９】
Ｆｌｋ−１は、ＶＥＧＦに結合する完全長の受容体である。Ｆｌｋ−１　ｂｐは、ＶＥＧＦの結合に関与するＦｌｋ−１受容体の細胞外部分である。本発明では、細胞膜への付着を避けるためにＦｌｋ−１の代わりにＦｌｋ−１　ｂｐを用いる。
【００７０】
本発明はまた、上記の血管新生阻害ドメインの保存的変種（上記のような）を含む。
【００７１】
例示的な二機能性分子の調製：
本発明によって考慮される二機能性蛋白質は、先に述べたドメイン、すなわち受容体拮抗ドメイン（アポトーシス促進ドメインであってもよい）、および血管新生阻害ドメインのそれぞれを含む蛋白質であり、そのような融合の際に、双方のドメインが、互いに独立して実質的に関連する特徴を保持している。図１から３は、これらの特徴に従う本発明の一つの態様を開示する。融合蛋白質として典型的に産生されるが、ドメインはまた、例えば多官能性架橋剤を用いて、従来の化学的手段によって融合してもよい。融合蛋白質を作製する場合、いずれかのドメインをもう一方のＣ末端またはＮ末端に配置してもよい。
【００７２】
一つの態様において、融合蛋白質は、図１から３に示すようにｈＰＲＬＡ−エンドスタチン蛋白質である。この融合蛋白質は、実施例１および図４に示すように発現ベクターに組み入れることができる。次に、作製した発現ベクターを安定な細胞株にトランスフェクトして、その後、精製蛋白質を作製することができる。実施例２および実施例３は、ベクター形質転換および精製工程を実施するための非制限的な技法である。この融合蛋白質は、エンドスタチンのＮ末端と融合したＰＲＬＡのＣ末端を有し、これを図１から３に示す。しかし、本発明はまた、本明細書に記載のドメインを有する任意の融合蛋白質も考慮する。
【００７３】
融合蛋白質を作製する適した方法は、これらのドメインのいずれかの生物活性を実質的に変化させない方法でなければならない。例えば、ＩＬ−２のＮ末端と抗体のＣ末端との融合体は、ＩＬ−２の生物活性を変化させないことが証明されている。ライスフェルド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（１９９６）、上記。したがって、類似の方法を用いて、本発明に係る融合蛋白質を産生することができる。この工程には、正の免疫調節物質ドメインのＮ末端を受容体拮抗ドメインのＣ末端に結合させる融合蛋白質をコードするｃＤＮＡを設計することが含まれる。
【００７４】
その上、ｈＧＨのＣ末端（本発明者らは、アミノ酸１０個までを欠失させた）は、トランスジェニックマウスの成長促進活性にとって重要ではないという証拠があり（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９３）、構造的類似性に基づいて、正の調節物質とｈＰＲＬＡのような他の受容体拮抗ドメインのＣ末端との融合体は、これらのドメインの結合親和性を変化させないと考えられる。
【００７５】
本発明は、本明細書において考慮した所望の融合蛋白質を作製する如何なる特定の方法にも限定されることはない。しかし、考慮される組換え体の作製方法に従って、本発明は本発明に記載のドメインのヌクレオチド配列の一つまたは複数を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、中に典型的にはオープンリーディングフレームを含むＤＮＡまたはＤＮＡ断片がいずれかの方向に挿入される、プラスミドまたはウイルスベクターのようなベクターを含む。本発明はさらに、これらのベクターを含む細胞を考慮する。
【００７６】
組換え蛋白質の産生は当技術分野で周知であり、下記に概要を簡単に記載する。
【００７７】
細菌の発現
細菌に用いるために有用な細菌の発現ベクターは、所望の蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列を適した翻訳開始シグナルおよび終結シグナルと共に、機能的プロモーターと操作可能な読みとり枠で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にし、望ましい場合には、宿主内での増幅を提供するために、一つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製開始点を含むと思われる。形質転換のための適した原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．　Ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属内の様々な種が含まれるが、他の種も選択可能な材料として用いてもよい。好ましい態様において、原核生物宿主は大腸菌である。
【００７８】
細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドに基づくベクターであってもよい。これらのベクターは、選択マーカーと、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ　３７０１７）の要素を典型的に含む市販のプラスミドに由来する細菌の複製開始点とを含みうる。そのような市販のベクターには、例えば、ＧＥＭ　１（プロメガバイオテック社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ）、ｐＢｓ、フェージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ、ｐＢｓ　ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン社）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＫＫ２３２−８、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（ファルマシア社）が含まれる。本発明に係る好ましいベクターは、Ｐｔ７１発現ベクター（パリス（Ｐａｒｉｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１２：４３６〜４４９（１９９０））である。
【００７９】
これらの「骨格」部分を、適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と組み合わせる。細菌プロモーターには、ｌａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ラムダＰＲまたはＰＬ、ｔｒｐおよびａｒａが含まれる。Ｔ７が好ましい細菌プロモーターである。
【００８０】
適した宿主株を形質転換して、宿主株を適当な細胞密度に増殖させた後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制／誘導して、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的に、遠心分離によって回収して、物理的または化学的手段によって破砕し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。
【００８１】
真核細胞発現
様々な哺乳類細胞培養系もまた、組換え蛋白質を発現させるために用いることができる。哺乳類の発現系の例には、チミジンキナーゼ陰性（ＴＫ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ陰性（ＡＰＲＴ）細胞のような、選択されたマウスＬ細胞が含まれる。他の例には、グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ　２３：１７５（１９８１））によって記述されたサル腎繊維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合性のベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞株が含まれる。哺乳類の発現ベクターは、複製開始点、適したプロモーター、およびエンハンサーを含み、同様に、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’に隣接する非転写配列を含むと考えられる。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０開始点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を用いて必要な非転写遺伝子要素を提供してもよい。
【００８２】
哺乳類プロモーターには、ＣＭＶ極初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲｓ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが含まれる。例としての哺乳類ベクターには、ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、およびｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（ファルマシア社）が含まれる。好ましい態様において、哺乳類の発現ベクターはｐＵＣＩＧ−ＭＥＴである。選択マーカーには、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）が含まれる。
【００８３】
哺乳類の宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現系を利用してもよい。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、対象となるコード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ　ｌｅａｄｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲーションしてもよい。次に、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入してもよい。ウイルスゲノムの非必須領域への挿入（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）の結果、生存して、感染宿主において標的蛋白質を発現することができる組換えウイルスが得られると思われる（例えば、ローガン（Ｌｏｇａｎ）ら、１９８４、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８１：３６５５〜３６５９を参照のこと）。
【００８４】
治療的組成物：
本発明の蛋白質は、薬学的に有用な組成物を調製するために、既知の方法に従って製剤化することができ、それによって本発明の分子またはその機能的誘導体を薬学的に許容される担体溶媒との混合物として組み合わせる。他のヒト蛋白質、例えばヒト血清アルブミンを含む、適した溶媒およびその製剤化は、例えば「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、（第１６版、オソル（Ｏｓｏｌ，　Ａ．）編、マック、イーストン、ペンシルバニア州（１９８０））に記載されている。有効な投与のために適した薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は、本発明の一つまたは複数の蛋白質の有効量を担体溶媒の適量と共に含むと思われる。
【００８５】
本発明に従って用いられる薬学的組成物は、一つまたは複数の生理的に許容される担体または賦形剤を用いて従来の方法により製剤化してもよい。従って、二機能性分子、ならびにその生理的に許容される塩および溶媒和化合物は、吸入法もしくは通気法（口または鼻のいずれかを通して）、または経口、口腔内、非経口、もしくは直腸投与によって投与するために製剤化してもよい。
【００８６】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン処理したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸デンプンナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製された錠剤、またはカプセル剤の形状であってもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法に従ってコーティングしてもよい。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形状であってもよく、またはそれらは使用前に水または他の適した溶媒によって溶解するための乾燥製品の形状であってもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性溶媒（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、または精留食用油）；および保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段によって調製してもよい。調製物はまた、適当であれば、緩衝塩、着香料、着色料、および甘味料を含んでもよい。
【００８７】
経口投与のための調製物を、徐放性の活性化合物として適切に製剤化してもよい。口腔内適用の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤またはロゼンジの形状であってもよい。
【００８８】
吸入投与の場合、本発明に従って用いられる二機能性分子は、適した噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適した気体を用いて加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形状で都合よく送達される。加圧式エアロゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するための弁を提供することによって決定してもよい。化合物の粉末混合物と乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤とを含む吸入器または注入器に用いるためのゼラチンのようなカプセルおよびカートリッジに製剤化してもよい。
【００８９】
二機能性蛋白質は、注射、例えば、ボーラス注射または持続的注入による非経口投与のために製剤化してもよい。注射用製剤は、単位投与剤形、例えば保存剤を添加したアンプルまたは多用量容器であってもよい。組成物は、油性または水性溶媒中の懸濁剤、溶液、または乳剤の形状であってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような製剤化物質を含んでもよい。または、活性成分は、使用前に適した溶媒、例えば滅菌発熱物質不含水に溶解する粉末の剤形であってもよい。
【００９０】
化合物はまた、例えばカカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含む坐剤または浣腸のような直腸組成物に製剤化してもよい。
【００９１】
先に記述した製剤化の他に、二機能性分子は、デポー調製物として製剤化してもよい。そのような長時間持続型製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内）、または筋肉内注射によって投与してもよい。このように、例えば、化合物は適したポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中乳剤として）、またはイオン交換樹脂と共に、または例えばほとんど溶解しない塩などのほとんど溶解しない誘導体に製剤化してもよい。
【００９２】
組成物を、望ましければ活性成分を含む一つまたはそれ以上の単位用量剤形を含みうるパックまたはディスペンサー装置に提供してもよい。パックは例えば、ブリスタパックのような金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための説明書を添付してもよい。
【００９３】
組成物は、癌の治療において有用であるため、従来の化学療法剤と共に製剤化してもよい。従来の化学療法剤には、アルキル化剤、抗代謝剤、様々な天然産物（例えば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、およびアミノ酸枯渇酵素）、ホルモン、およびホルモン拮抗剤が含まれる。特定のクラスの物質には、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ複合体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、およびアンドロゲンが含まれる。いくつかの例示的な化合物には、シクロホスファミド、クロラムブシル、メソトレキセート、フルオロウラシル、シタラビン、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、シスプラチン、ヒドロキシウレア、プレドニゾン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、プロピオン酸テストステロン、およびフルオキシメステロンが含まれる。乳癌を治療する場合、例えば、タモキシフェンが特に好ましい。
【００９４】
発明の方法：
治療方法
本発明に従う本発明の治療方法は一般的に、先に同定した二機能性蛋白質を利用する。融合蛋白質のドメインは、特定の組織に特異的に標的化する能力および／または標的組織に対する免疫応答を増強する能力を共有する。したがって、典型的な方法は、融合蛋白質の受容体拮抗ドメインに対する標的細胞の受容体の結合および／または血管新生阻害ドメインによる腫瘍新生血管の形成の阻害を含む。
【００９５】
治療方法は、治療を必要とする被験者に融合蛋白質の治療的有効量を投与することを含む。「治療的に有効」とは、本明細書において、癌の増殖を阻害または逆転する（例えば、アポトーシスを誘導する）ために十分な量である融合蛋白質の量を意味するために用いられる。いくつかの方法は、既知の癌用薬剤または治療、例えば化学療法（好ましくは上記の種類の化合物を用いる）または放射線療法との併用療法を考慮する。患者はヒトまたはヒト以外の動物であってもよい。患者は典型的に、癌の維持または増殖を促進する受容体レベルの増加を特徴とする癌を有する場合に、治療を必要とすると思われる。
【００９６】
インビボ治療の際の投与は、非経口および経口を含む如何なる数の経路であってもよいが、好ましくは非経口投与である。嚢内、静脈内、髄腔内、および腹腔内投与経路を用いてもよいが、一般的に静脈内投与が好ましい。当業者は、治療すべき障害に応じて投与経路が変化することを認識すると思われる。
【００９７】
本発明に係る二機能性蛋白質の治療的有効量を決定することは、特定の患者の特徴、投与経路、および治療される障害の特性に大きく依存すると考えられる。一般的な手引きは、例えば国際ハーモナイゼーション会議の出版物および「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第２７章および第２８章、４８４〜５２８頁（マックパブリッシングカンパニー、１９９０）に見ることができる。
【００９８】
治療的有効量を明確に決定することは、薬剤の毒性および有効性のような要因に依存すると考えられる。毒性は、当技術分野で周知の方法を用いて決定してもよく、前述の参考文献に認められる。有効性は、以下の実施例において記載される方法と共に同じ手引きを利用して決定してもよい。したがって、薬学的有効量は、医師によって毒性学の見地から認容することができ、なおも有効であると思われる量である。例えば、有効性は、標的組織の塊の減少によって測定することができる。適した用量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜１０　ｍｇ／ｋｇの範囲となりうる。
【００９９】
融合蛋白質の生物活性を決定するためのスクリーニングアッセイ法
本発明はまた、受容体拮抗ドメインおよび血管新生阻害ドメインのそれぞれの生物活性、および／またはこれらのドメインのそれぞれを含む融合蛋白質の生物活性を比較するために用いることができる細胞に基づくアッセイ系を提供する。この目的のため、融合蛋白質の融合ドメインが確実に発現されるように抗体結合アッセイ法を用いる。融合蛋白質の各ドメインがその正常な受容体に確実に結合するように、競合的結合アッセイ法を用いてもよい。
【０１００】
細胞株に様々な濃度の特定のドメインをその拮抗型、非拮抗型、および融合型で導入することによって、当業者は、その非融合型の同じドメインと比較して融合蛋白質のアポトーシス促進ドメインの生物活性を決定することができると考えられる。アポトーシスを測定する方法は多数存在する。これらの方法には、以下の技術が含まれるがこれらに限定されることはない：（１）細胞生存率の喪失（生体色素の排除、またはＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）もしくはＭＴＳ−ＰＭＳの取り込みのいずれかをできないことにより特定する）；（２）ＤＮＡ断片化（アガロースゲル電気泳動、ＰＦＧ電気泳動、インサイチューターミナルトランスフェラーゼ標識（ＴＵＮＥＬ）によりアッセイする）；細胞および核の形態学（顕微鏡を用いて、染色質濃縮、ＤＮＡ構築、および細胞質の完全性を可視化する）；ならびにシステインプロテアーゼ活性化アッセイ法（比色もしくは蛍光読み出しと組み合わせたカスパーゼ活性化アッセイ法、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、またはウェスタンブロットもしくは免疫組織化学によるラミニン切断を利用する）。
【０１０１】
同様に、血管新生阻害ドメインの活性を測定することができる細胞株も同様に用いて、融合蛋白質のドメインの活性をモニターしなければならない。ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖および構築アッセイ法を用いる実施例７および実施例８は、融合蛋白質における血管新生阻害ドメインの生物活性を決定するために可能な方法であるが、これらに限定されることはない。
【０１０２】
以下の実施例は説明するためのものであり、制限的に解釈してはならない。
【０１０３】
【実施例】
実施例１．　ｈＰＲＬ−血管新生阻害発現のための発現ベクターのクローニングおよび構築
公表されたプロトコール（カタド（Ｃａｔａｄｏ）ら、２０００）に基づく２段階クローニング技法を用いて、エンドスタチン、アンジオスタチン、またはＦｌｋ−１−ｂｐと融合したｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒをコードする組換えＤＮＡ、すなわちＧ１２９Ｒ−エンドスタチン（Ｇ１２９Ｒ−ｅｎｄｏ）、Ｇ１２９Ｒ−アンジオスタチン、およびＧ１２９Ｒ−Ｆｌｋ−１−ｂｐ融合蛋白質をそれぞれ作製した。ヒトエンドスタチン、アンジオスタチン、またはＦｌｋ−１−ｂｐは、ユニバーサルクイッククローンｃＤＮＡ（クロンテック社、カリフォルニア州）からＰＣＲ増幅した。増幅したｃＤＮＡ断片のそれぞれを、まず、ｐＣＲ２．１　ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）に個々にクローニングして、それぞれの配列を決定した。
【０１０４】
次に、クローニングしたｃＤＮＡ断片を制限酵素切断によって再度単離し、精製して、ｐＥＴ２ｂ＋発現ベクターにライゲーションした（ノバゲン社、マディソン、ウィスコンシン州；図４）。３つのｃＤＮＡは全て、最初ｐＥＴ２２ｂ発現ベクターを用いて大腸菌発現に関して蛋白質の成熟型をコードする完全長のｃＤＮＡとしてクローニングした。次にｃＤＮＡを、翻訳開始コドンを欠損し、５’末端に（＋１部位の前、Ｇ１２９Ｒ　ＤＮＡとのインフレームライゲーションに関して）ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を有し、停止コドンの後にＸｈｏＩ部位を有する産物を生じるように設計された第二のプライマー対を用いてＰＣＲによって増幅した。次に、断片を制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ）によって処理して、Ｇ１２９Ｒ　ｃＤＮＡとライゲーションして、Ｇ１２９Ｒ−エンドスタチン、Ｇ１２９Ｒ−アンジオスタチン、およびＧ１２９Ｒ−Ｆｌｋ−１−ＢＰのためのｐＥＴ２２ｂ　Ｇ１２９Ｒ−融合プラスミドを作製した。
【０１０５】
実施例２．　安定な細胞株への発現プラスミドのトランスフェクト
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ノバゲン社、マディソン、ウィスコンシン州）のような大腸菌を、塩化カルシウム法を用いてＧ１２９Ｒ融合蛋白質をコードするプラスミドによって形質転換した。形質転換混合物をアンピシリンプレート上で広げて３７℃で一晩増殖させた。ＬＢシード培養物にコロニー６〜１０個を接種して一晩増殖させた。翌日、シード培養物５％を接種することによってＬＢ増殖培養物を作製し、３７℃で攪拌しながら〜２．５時間増殖させた。
【０１０６】
実施例３．　融合蛋白質の精製
細胞を形質転換して、実施例２に記載のように増殖させた。ＩＰＴＧ（フィッシャーサイエンティフィック）を培養物に加えて（最終濃度１ｍＭ）、Ｇ１２９Ｒ融合蛋白質の発現を誘導して、さらに４時間インキュベートした。細菌を沈降させて、０．２　ＭＮａＰＯ４　ｐＨ　８、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、および０．５％トライトンＸ−１００を含む溶液中に再懸濁させた。再懸濁させた細菌を５５０ソニックディスメンブレータ（フィッシャーサイエンティフィック）で溶解した。封入体の形態で存在する産物を１２，０００　ｇで１５分間沈降させて、再生させるために０．２　Ｍ　ＮａＰＯ４、ｐＨ　７、１％ｖ／ｖβメルカプトエタノール、および８　Ｍ尿素中に再懸濁させた。再生工程は、５０　ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ　８．０の存在下で尿素とβメルカプトエタノールの減少量に対して蛋白質を３日間連続して透析することを含む。試料をまず、０．２２　ミクロンのフィルター（ＶＷＲ）に通過させて、脱気した後、セファロースイオン交換カラムによって精製し、ＦＰＬＣ系（ファルマシア、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）を用いてセファクリルゲル濾過カラム（ファルマシア社、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）によって精製した。
【０１０７】
精製蛋白質の試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、クーマシーブルーによって染色した。図５に示すように、融合蛋白質は、双方のドメインの発現と一致する見かけの分子量を有する。さらに、図６に示すように、融合蛋白質の双方のドメインの発現は、特異的抗体（カルビオケム社、サンジエゴ、カリフォルニア州９２１２１；ヒトエンドスタチン、カタログ番号３２４７４６；ウサギ抗ヒトエンドスタチン、カタログ番号ＰＣ２６６；ヒトアンジオスタチン、カタログ番号１７６７００；抗アンジオスタチン、カタログ番号ＰＣ３７１；Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州５５４１３；ヒトＦｌｋ−１−ＢＰ、カタログ番号３５７−ＫＤ−０５０；抗ヒトＦｌｋ−１ＢＰポリクローナル抗体、カタログ番号ＡＦ３５７）を用いるウェスタン分析を用いて確認した。融合蛋白質の純度は、ＩＲＭＡの結果と標準的な蛋白質アッセイ法（バイオラド社、ハーキュルズ、カルフォルニア州）の結果とを比較することによって決定した。この方法によって産生されたＧ１２９Ｒ融合蛋白質は、野生型ＰＲＬと比較してＮ末端で余分のメチオニンを有する。
【０１０８】
本方法において用いた全ての蛋白質は、二カラム技法、すなわちイオン交換カラムの後にＦＰＬＣシステムを用いるサイズ排除カラムを用いることによって精製した。精製蛋白質は、ケープコップインクによってエンドトキシンレベルを調べた。エンドトキシンレベルは約５ＥＵ／ｍｇ蛋白質であり、これはマウス試験で許容されると見なされる。
【０１０９】
実施例４．　競合的放射レセプター結合アッセイ法による精製ｈＰＲＬおよびｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒの生物活性の試験
ラジオレセプター結合アッセイ法は、既に記述された通りに行った（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９１；別紙Ｂ）。簡単に説明すると、Ｔ−４７Ｄ細胞を６ウェル組織培養プレートにおいて９０％コンフルエント（〜１０５個／ウェル）になるまで増殖させる。細胞の単層を無血清ＲＰＭＩ　１６４０培地中で２時間飢餓状態に置いた。次に細胞を様々な濃度のｈＰＲＬ、ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ、エンドスタチン、またはＧＥＦＰの存在下または非存在下で、１２５Ｉ　ｈＰＲＬ（比活性＝３０　μＣｉ／μｇ；ＮＥＮデュポン社、ボストン、マサチューセッツ州）８×１０４　ｃｐｍを含む無血清ＲＰＭＩ　１６４０中で室温で２時間インキュベートした。次に、細胞を無血清ＲＰＭＩ　１６４０中で３回洗浄して、０．１　Ｎ　ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ　０．５　ｍｌ中で可溶化して、結合した放射活性をガンマカウンター（ＩＣＮバイオメディカル、モデル４／６００プラス；コスタメサ、カリフォルニア州）によって測定した。得られたデータを図７に示す。
【０１１０】
実施例５．　ＳＴＡＴ　５リン酸化／免疫沈降アッセイ法による精製ＧＥＦＰの生物活性試験Ｔ−４７Ｄ細胞を、１０％活性炭除去ウシ胎児血清（ＣＳＦＢＳ；増殖培地）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中で増殖させた。各実験に関して、細胞を増殖培地中で６ウェル培養プレートに移して、９０％コンフルエンシーになるまで培養した。実験当日、細胞を無血清培地中で１時間飢餓状態にして、ｈＰＲＬ、Ｇ１２９Ｒ、または両者の組み合わせと共に３０分間インキュベートした。処置後、Ｔ４７−Ｄ細胞を氷冷ＰＢＳによって１回洗浄して、氷冷溶解緩衝液［２０　ｍＭトリス塩酸（ｐＨ　７．４）、１００　ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０　μｇ／ｍｌアプロチニン、１０　μｇ／ｍｌロイペプチン］１ｍｌ中で軽く剥がして回収した。次に、溶解混合物を、２２ゲージ針の中を気泡ができないように数回上下させて、１２，０００×ｇで２０分間遠心した。上清を新しい微量遠心管に移した。ＳＴＡＴ５モノクローナル抗体５μｇを、それぞれの反応についてｄｄＨ２Ｏ　４００　μｌおよび２×ＩＰ緩衝液［１％トライトンＸ−１００、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１０　ｍＭトリスｐＨ　７．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、０．２　ｍＭバナジン酸ナトリウム、０．２　ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．５％ＮＰ−４０］５００　μｌと共に細胞溶解物１００　μｌ（総蛋白質２００〜５００　μｇ）に加える。４℃でゆっくり回転させながら一晩インキュベートした後、予め洗浄した（１×ＩＰ緩衝液）プロテインＡアガロースビーズ５０　μｌを各ＩＰ反応に加えて、インキュベーションを４℃でさらに２時間行った。アガロースビーズを１×ＩＰ緩衝液によって３回洗浄して、１×ＳＤＳ　ＰＡＧＥローディング緩衝液５０　μｌ中にプロテインＡアガロースビーズを再度懸濁させることによって、蛋白質を溶出する。次に、試料に４〜１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ホスホチロシン抗体ＰＹ２０およびＥＣＬ試薬キット（アマシャム社、イリノイ州）を用いてイムノブロット分析を行った。図８に示すように、ブロットをＸ線フィルムに感光させて、標準的な方法を用いて現像した（コダック社、ロチェスター、ニューヨーク州）。
【０１１１】
実施例６．　ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖アッセイ法を用いるＧＥＦＰの血管新生阻害作用の試験
ＨＵＶＥＣ細胞の細胞増殖アッセイ法は、バエ（Ｂａｅ）らが記述した方法に従った。簡単に説明すると、ＨＵＶＥＣ細胞をゼラチンコーティングした４８ウェルプレートに細胞１×１０５個／ウェルの密度で増殖培地３００　μｌに播種して、３７℃で２日間インキュベートした。プレートを暖かい無血清増殖培地中で３回洗浄してから、無血清増殖培地２００　μｌを陰性対照に加え、正常な増殖培地は、実験試料と共に陽性対照のために用いた。実験試料において、５００　ｎｇ／ｍｌの蛋白質を調べた。これらのプレートを３７℃で１日インキュベートした。次に、メチル−［３Ｈ］チミジン０．５　μＣｉ溶液２０　μｌを各ウェルに加えて、３７℃で１日インキュベートした。次にプレートを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳによって４回洗浄して、細胞を０．４　Ｎ　ＮａＯＨ　１５０　μｌによって室温で２０分可溶化した。この反応を中和するために、２Ｎ　ＨＣｌ　３０　μｌを各ウェルに加えて、内容物をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターで各試料の放射活性を測定した。ＨＵＶＥＣ細胞の細胞増殖アッセイ法は典型的に、バエ（Ｂａｅ）らが記述した方法に従う。簡単に説明すると、ＨＵＶＥＣ細胞をゼラチンコーティングした４８ウェルプレートに細胞１×１０５個／ウェルの密度で増殖培地３００　μｌに播種して、３７℃で２日間インキュベートする。プレートを暖かい無血清増殖培地中で３回洗浄してから、無血清増殖培地２００　μｌを陰性対照に加えて、正常な増殖培地は、実験試料と共に陽性対照のために用いる。実験試料において、５００　ｎｇ／ｍｌの蛋白質を調べる。これらのプレートを３７℃で１日インキュベートする。次に、メチル−［３Ｈ］チミジン０．５　μＣｉ溶液２０　μｌを各ウェルに加えて、３７℃で１日インキュベートする。次にプレートを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳによって４回洗浄して、細胞を０．４　Ｎ　ＮａＯＨ　１５０　μｌによって室温で２０分可溶化する。この反応を中和するために、２Ｎ　ＨＣｌ　３０　μｌを各ウェルに加えて、内容物をシンチレーションバイアルに移し、シンチレーションカウンターで各試料の放射活性を測定する。実験は全て、１試料あたり３個ずつ、少なくとも３回行う。本実験では１試料あたり３回ずつ行った。得られたデータを図９に示す。
【０１１２】
実施例７．　ＧＥＦＰのＨＵＶＥＣ構築阻害能の測定
本アッセイ法は一般的に既知の技法に従った（モラレス（Ｍｏｒａｌｅｓ）ら、１９９５）。ＨＵＶＥＣは、１０％ＦＢＳを含むライボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培地中で維持した。培養前に、マトリゲルによってウェルをコーティングすることによって（３７℃で３０分間の重合化）２４ウェル培養プレートを準備した。ライボビッツ培地１ｍｌに懸濁させたＨＵＶＥＣ（１×１０５個）をＧＥＦＰを含む条件または含まない条件下で対照と共に各ウェルに加えた。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。培養培地を除去した後、培養物をディフクイック（Ｄｉｆｆ　Ｑｕｉｃｋ）（ダーデベーリングインク、ネワーク、デラウェア州）によって固定した。各培養物における内皮血管ネットワーク領域は、オプトマックス−オリンパス（Ｏｐｔｏｍａｘ−Ｏｌｙｍｐｕｓ）顕微鏡によって顕微鏡下で調べた（図１０）。
【０１１３】
実施例８．　マウスにおけるヒト乳癌の阻害
無胸腺ヌードマウス８匹に、マトリゲルと混合したＴ−４７Ｄ細胞１×１０６個を皮下接種した。腫瘍を２１日間増殖させた。マウスを無作為化して、等しい２群に分けた。一群にはＧＥＦＰ（１０　ｍｇ／ｋｇ／マウス）を注射して；もう一方の群には滅菌生理食塩水（斑入り）１００　μｌを２５日間連続して注射した。処置後１２日および２５日目に以下の等式：［（短径２）×（長径）］／２を用いて計算した計算した腫瘍の容積を、図１１に示す。
【０１１４】
実施例９．　ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ−エンド融合蛋白質のインビボ試験
２つの乳癌細胞株、Ｔ−４７Ｄおよび４Ｔ１を用いて、ｈＰＲＬ−Ｇ１２９Ｒ−エンド融合蛋白質の抗腫瘍形成効果を調べた。ヌードマウスにＴ４７Ｄ腫瘍細胞（ｎ＝４）または４Ｔ１腫瘍細胞（ｎ＝４）を接種した後、対照動物８匹にＧ１２９Ｒ−エンドスタチン融合蛋白質を処置した。結果をそれぞれ、図１２および図１３に示す。
【０１１５】
図１２は、ヌードマウスにおけるＧＥＦＰのＴ−４７Ｄ誘導腫瘍増殖阻害能を示す。腫瘍を３週間確立させてから治療を行い、腫瘍容積を６日ごとに計算した。対照動物（ｎ＝４）にはＰＢＳ　１００　μｌを注射して、ＧＥＦＰ処置マウス（ｎ＝４）には総蛋白質２００　μｇの１００　μｌ容量を処置した（腹腔内注射による）。腫瘍の増殖速度はＧＥＦＰ処置動物では遅くなった。実験の終了時に、腫瘍を切除して重量を測定した。図１２の挿入図は対照マウスおよびＧＥＦＰ処置マウスからの腫瘍重量を表す。
【０１１６】
図１３は、ＧＥＦＰが、進行性マウス乳癌（４Ｔ１）の動物モデルにおける腫瘍の増殖の阻害において有効であることを示す。この細胞は、ＧＥＦＰ処置の１週間前に確立した。ＧＥＦＰ処置は毎日開始して３７日間行った（２００　μｇ／毎日、腹腔内注射）。対照マウスと処置マウスの間に、腫瘍増殖速度の有意な差を認識できる。図１３の挿入図は、対照マウスおよびＧＥＦＰ処置マウスからの腫瘍重量を表す。
【０１１７】
これらの実施例は、説明する目的のために提供され、本発明の範囲を如何なるようにも制限すると解釈されることはない。当業者は、本発明の範囲内の融合蛋白質は様々な手段によって作製してもよく、それらも本発明の精神または範囲内に含まれることを認識すると思われる。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明により、癌の治療に用いるためのヒトプロラクチン拮抗剤と血管新生阻害剤とを含む融合蛋白質を調製および使用する方法が提供された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ１２９Ｒの配列を示す図である。パネルＡは、Ｇ１２９ＲのＤＮＡの配列を示し（配列番号：２）、パネルＢは、蛋白質の配列を示す（配列番号：１）。開始コドンＡＴＧおよびメチオニンは、１２９位のアミノ酸での変異と共に配列において太字で示す。ＴＡＧは停止コドンである。
【図２】エンドスタチンの配列を示す図である。パネルＡは、エンドスタチンのＤＮＡの配列を示し（配列番号：３）、パネルＢは、蛋白質の配列を示す（配列番号：４）。開始コドンＡＴＧおよびメチオニンは、１２９位のアミノ酸での変異と共に配列において太字で示す。ＴＡＧは停止コドンである。
【図３】Ｇ１２９Ｒ−エンドスタチン融合蛋白質（ＧＥＦＰ）の配列を示す図である。パネルＡは、ＧＥＦＰのＤＮＡの配列を示し（配列番号：５）、パネルＢは、蛋白質の配列を示す（配列番号：６）。開始コドンＡＴＧおよびメチオニンは、１２９位のアミノ酸での変異と共に配列において太字で示す。Ｇ１２９Ｒとエンドスタチンの間にＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を加えることにより、２つの余分なアミノ酸残基（グリシンおよびセリン）が得られ、これを太字で示す。ＴＡＧは停止コドンである。
【図４】ＧＥＦＰ産生のための発現プラスミドのクローニングおよび構築を示す図である。エンドスタチンは、ＰＣＲを用いてヒト肝ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。これを、大腸菌発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）に、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位で、Ｇ１２９Ｒから増幅したＰＣＲ断片とライゲーションした。クローニングのために、ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位をＧ１２９Ｒとエンドスタチンの間に組み入れた。
【図５】融合蛋白質の大きさの決定を示す図である。精製Ｇ１２９Ｒ（レーン１）、エンドスタチン（レーン２）、およびＧＥＦＰ（レーン３）１μｇを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させて、クーマシーブルーによって染色した。レーンＭは蛋白質マーカーを表し、それぞれのサイズを示す。
【図６】ＧＥＦＰのイムノブロット分析を示す図である。全てのレーンに、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でＧ１２９Ｒ（レーン１〜４）、エンドスタチン（レーン２および５）、およびＧＥＦＰ（レーン３および６）１０　ｎｇを泳動させた。レーン１〜３は、ポリクローナルウサギ抗ｈＰＲＬ抗体と共にインキュベートし、レーン４〜６は、ポリクローナルウサギ抗エンドスタチン抗体と共にインキュベートした。ヤギ抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を二次抗体として用いて、ＥＣＬによって検出した。
【図７】競合的放射レセプター結合アッセイ法を示す図である。それぞれの処置の濃度は対数尺度で表す。値は、ヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄに対する各蛋白質の総結合の置換百分率として表す。データは１試料あたり３個ずつの実験から得て、平均値±ＳＤとして表記する。
【図８】ｈＰＲＬおよびＧＥＦＰによるＳＴＡＴ−５リン酸化の刺激／阻害を示す図である。ヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄを、表示の量のｈＰＲＬ、Ｇ１２９Ｒ、およびＧＥＦＰ（Ａ）、または用量依存的な併用処置（Ｂ）によって処置した。総蛋白質を抽出して、勾配４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した後、適当なパネルに示したように、ＳＴＡＴ−５−リン酸化またはＳＴＡＴ−５のいずれかに対する抗血清によるウェスタンブロッティングを行った。Ａ．ｈＰＲＬ（１００　ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ１２９Ｒ（５００　ｎｇ／ｍｌ）、エンドスタチン（５００　ｎｇ／ｍｌ）、およびＧＥＦＰ（５００　ｎｇ／ｍｌ）の単回処置を表す。対照細胞は０．１％血清培地と共にインキュベートした。Ｂ．ｈＰＲＬ＋Ｇ１２９ＲまたはｈＰＲＬ＋ＧＥＦＰのいずれかの併用治療によるＳＴＡＴ−５リン酸化の用量依存的な競合的阻害を表す。
【図９】内皮細胞増殖アッセイ法を示す図である。精製ヒトエンドスタチンおよびＧＥＦＰは、ＨＵＶＥＣ（Ａ）、Ｔ−４７Ｄ細胞（Ｂ）、およびマウスＬ−細胞（Ｃ）を用いてその抗増殖能の有無を試験した。実線はエンドスタチンを表し、破線はＧＥＦＰ処置を表す。細胞の生存率は、ＭＴＴアッセイ法によって決定した。値は、無処置の増殖細胞と比較して、エンドスタチンまたはＧＥＦＰのいずれかによる処置後の生存細胞の割合によって示す。Ａ．エンドスタチンおよびＧＥＦＰのｂＦＧＦ誘導内皮細胞増殖阻害能である。Ｂ．エンドスタチンおよびＧＥＦＰのヒト乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄの増殖阻害能を表す。Ｃ．この実験における陰性対照としての非内皮細胞増殖アッセイ法を表す。各実験は、１試料あたり３個ずつ行い、値は平均値±ＳＤとして表記する。
【図１０】内皮の管形成の分析を示す図である。抗生物質を加えないＥＧＭ−２培地中のＨＵＶＥＣ（細胞２５，０００個／ウェル）を、マトリゲル基底膜コーティングウェルに播種して、血管の管構造と類似の管構造を形成するか否かを評価した。パネルＡは、エンドスタチンが内皮細胞に作用を及ぼして管を形成することを表す。各実験について、低濃度（１００　ｎｇ／ｍｌ）および高濃度（１０００　ｎｇ／ｍｌ）を行った。パネルＢは、ＧＥＦＰ処置を表し、パネルＣはＧ１２９ＲがＨＵＶＥＣ管形成に及ぼす作用を表す。各ウェルは、１試料あたり３個ずつ用量依存的に行った。対照ウェルは、如何なる処置も含まない培地によって行った。ウェルを顕微鏡で調べ、４０倍で写真を撮影して、ディフクイック固定液によって染色した。
【図１１】インビボでのヒト乳癌阻害の予備的な分析を示す図である。無胸腺ヌードマウス８匹に、マトリゲルと混合したＴ−４７Ｄ細胞を皮下接種して、得られた腫瘍を２１日間増殖させた。腫瘍の容積を、処置後１２日および２５日に、式：［（短径）２×（長径）］／２を用いて計算した。値は、各群について平均値±ＳＤとして表す（ｎ＝３）。＊、処置後２５日で対照マウスに対してＰ＜０．０５。
【図１２】Ｇ１２９Ｒ−エンドスタチン融合蛋白質によるインビボでの腫瘍増殖阻害に関する予備試験を示す図である。ヌードマウス４匹にマトリゲルと混合したＴ−４７Ｄヒト乳癌細胞を皮下接種して、得られた腫瘍を２１日間増殖させた。腫瘍の容積は、以下の等式を用いてＧ１２９Ｒ−エンド融合蛋白質による処置後様々な時間に計算した：［（短径２）×（長径）］／２。
【図１３】Ｇ１２９Ｒ−エンドスタチン融合蛋白質によるインビボでの腫瘍増殖阻害に関する予備試験を示す図である。ヌードマウス４匹にマトリゲルと混合した４Ｔ１マウス乳癌細胞を皮下接種して、得られた腫瘍を７日間増殖させた。腫瘍の容積は、以下の等式を用いてＧ１２９Ｒ−エンド融合蛋白質による処置後様々な時間に計算した：［（短径２）×（長径）］／２。
【図１４】プロラクチン拮抗剤−血管新生阻害剤融合蛋白質の配列を示す図である。（Ａ）Ｇ１２９Ｒ−アンジオスタチンのアミノ酸配列（配列番号：７）、および（Ｂ）Ｇ１２９Ｒ−Ｆｌｋ１−ｂｐのアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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