(57)【要約】　　　（修正有）【課題】精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチド及び前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを供給、そして関連する組成物及び方法が開示される。【解決手段】（ａ）：Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして精巣由来の特定なクレオチド１〜ヌクレオチド564のヌクレオチド配列を含んで成るDNA分子；（ｂ）：前記（ａ）の対立遺伝子変異体；（ｃ）：前記（ａ）又は（ｂ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードするDNA分子；及び（ｄ）：前記（ａ）,(ｂ）又は（ｃ）の縮重ヌクレオチド配列；から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　（ａ）： Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして配列番号１に示されるヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564のヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子；
　（ｂ）：前記（ａ）の対立遺伝子変異体；
　（ｃ）：前記（ａ）又は（ｂ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする DNA分子；及び
　（ｄ）：前記（ａ）,(ｂ）又は（ｃ）の縮重ヌクレオチド配列；
　から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
　次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；
　（ａ）： Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして配列番号１に示されるヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564のヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子、
　（ｂ）：前記（ａ）の対立遺伝子変異体、及び
　（ｃ）：前記（ａ）又は（ｂ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする DNA分子、から成る群から選択された DNAセグメント；並びに転写ターミネーター；
　を含んで成る発現ベクター。
【請求項３】
　次の作用可能に連結された要素：
　転写プロモーター；
　（ａ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして配列番号１に示されるヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564のヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子、
　（ｂ）：前記（ａ）の対立遺伝子変異体、及び
　（ｃ）：前記（ａ）又は（ｂ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする DNA分子、から成る群から選択された DNAセグメント；並びに
　転写ターミネーター；
　を含んで成る発現ベクターが導入されている、前記 DNAセグメントによりコードされる精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項４】
　次の作用可能に連結された要素：
　転写プロモーター；
　（ａ）： Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして配列番号１に示されるヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564のヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子、
　（ｂ）：前記（ａ）の対立遺伝子変異体、及び
　（ｃ）：前記（ａ）又は（ｂ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする DNA分子から成る群から選択された DNAセグメント、及び転写ターミネーター；を含んで成る発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより、前記細胞が前記 DNAセグメントによりコードされる Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを発現し、そして前記 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体を回収することを含んで成る、 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを生成するための方法。
【請求項５】
　前記細胞が、次の作用可能に連結された要素：
　転写プロモーター；
　プロホルモンコンバーターゼをコードする DNA配列；及び
　転写ターミネーター、
を含んで成る第２発現ベクターをさらに含んで成る請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
　前記プロホルモンが、プロホルモンコンバーターゼ２、プロホルモンコンバーターゼ３、プロホルモンコンバーターゼ４、及びフリンから成る群から選択される請求の範囲第５項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
　多細胞生物内の細胞の増殖及び分化は、ホルモン及びポリペプチド成長因子により調節される。それらの拡散性分子は、細胞のお互いとの連絡を可能にし、そして器官を形成し、そして損傷を受けた組織を修復し、そして再生するために協力して作用する。ホルモン及び成長因子の例は、ステロイドホルモン（たとえばエストロゲン、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子(EGF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、エリトロポエチン(EPO) 、インシュリン及びカルシトニンを包含する。
【０００３】
　ホルモン及び成長因子は、受容体に結合することによって細胞代謝に影響を及ぼす。受容体は、細胞内のシグナル経路、たとえば第二メッセンジャー系と連係する一体性（integral) 膜タンパク質であり得る。他の種類の受容体は、可溶性分子、たとえば一定の転写因子である。
【０００４】
　インシュリンは、タンパク質／ポリペプチドホルモンのグループに属する。インシュリンは、グリコーゲン、脂肪酸、及びタンパク質の合成の速度を早め、そして解糖を刺激する。それはまた、グルコース、いくつかの他の糖及びアミノ酸の筋肉及び脂肪細胞中への輸送を促進する。インシュリンの成熟形は、プロペプチド形のＮ−末端に存在する30個のアミノ酸残基のＢ鎖、及びＣ−末端である21個のアミノ酸残基のＡ鎖から成る。プロインシュリンはまた、成熟インシュリンを形成するために分解されるＢ鎖とＡ鎖との間に連結ペプチド、すなわちＣ−ペプチドを含む。そのＢ鎖及びＡ鎖は、２つのジスルフィド結合により共有結合される。
【０００５】
　Ｂ−鎖、Ｃ−ペプチド、Ａ−鎖モチーフは、いくつかの他のタンパク質、たとえばリラキシン（アメリカ特許第 4,835,251号；引用により本明細書に組込まれる）、インシュリン様成長因子(IGF) Ｉ及びII（Bang and Hall, "Insulin-like Growth Factors", P.N.Schofield (eds.), 151-177, Oxford Univ.Press, Oxford; 引用により本明細書に組込まれる）、Leydig因子（Bullesbachなど.,　J.Biol.Chem.　270 : 16011-16015, 1995;　引用により本明細書に組込まれる）、及び初期胎盤インシュリン様因子(EPIL; Chassinなど.,　Genomics　29: 465-470, 1995;　引用により本明細書に組込まれる）に見出される。
【０００６】
　インシュリンスーパーファミリーの他のメンバーとは異なって、 IGFＩ及び IGFIIは、翻訳後に分解されるＤ及びＥドメインを有する。ジスルフィド結合に含まれるシステインは、ファミリーのすべてのメンバーに保存され、そして分子の三次構造において役割を演じる。
【０００７】
　精子形成は、生殖細胞が分化の複数段階を通して進行し、そしてユニークな機能を有する最終的に分化された細胞の形成において最高点に達する過程である。造血は精子形成を理解するための模範として使用され得、そして造血及び精子形成について知られていることの間に著しく相似することが存在するが、精原細胞（生殖細胞）の成熟は造血幹細胞の成熟よりも明確には理解されていない。精子形成における成熟過程を調節する因子の理解が特に不十分である。最近の出来事は、十分に分化された細胞への造血系の幹細胞の進行に関与するいくつかのサイトカインが、精子細胞成熟にも関与していることを示唆している。
【０００８】
　造血におけるサイトカイン作用に類似する態様において、それらのサイトカインは、生殖細胞の成熟において特定の段階で作用すると思われる。たとえば、幹細胞因子（また、スチール(Steel) 因子及びｃ−キットリガンドとしても知られている）mRNAが精原細胞に発現され（Manovaなど.,　Development 110 : 1057-1066, 1990)、そして成熟又は成熟前マウスへの幹細胞因子に対するモノクローナル抗体の投与は分化する精原細胞の消耗を引き起こすが、しかし非分化性精原細胞、又は精母細胞に対しては効果を有さない(Yoshinagaなど.,　Development　 113 : 689-699, 1991)。精子形成に関与する他のサイトカインは、IL-1, IL-6及びβ-TGFを包含する(Sharp, Regulartion of Spermatogenesis, in Knobil and Neil (ed.), Physiol.Reproduction, (2nd ed.), Raven, NY, 1994) 。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
　成長因子は代謝及び細胞障害の理解及びそれらの障害を治療する可能性に対して大きなインパクトを有しているので、新規因子の発見は重要である。精巣に見出される新規成長因子は、精子形成過程を解明し、そしてその過程の結果に潜在的に影響を及ぼすために特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
　本発明は、（ａ）：配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んでなるポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ) 又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された、単離された精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを提供する。
【００１１】
　もう１つの観点において、本発明は、（ａ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そしてヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；（ｄ）：（ａ), (ｂ) 、又は（ｃ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする DNA分子；並びに（ｅ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする縮重（degenerate) ヌクレオチド配列から成る群から選択された、単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００１２】
　もう１つの観点において、本発明は、次の作用可能に（operably) 連結された要素、すなわち転写プロモーター；（ａ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そしてヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である DNA分子から成る群から選択された DNAセグメント；並びに転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを供給する。
【００１３】
　もう１つの観点において、本発明は、次の作用可能に連結された要素、すなわち転写プロモーター；（ａ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そしてヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である DNA分子から成る群から選択された DNAセグメント；並びに転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターが導入されている培養された細胞を供給し、そしてここで前記細胞は、前記 DNAセグメントによりコードされる精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを発現する。
【００１４】
　もう１つの観点において、本発明は、次の作用可能に連結された要素、すなわち転写プロモーター；（ａ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そしてヌクレオチド１〜ヌクレオチド 564の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成る DNA分子；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）又は（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードし、そして（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対してヌクレオチド配列において少なくとも85％同一である DNA分子から成る群から選択された DNAセグメント；並びに転写ターミネーターを含んで成る第１発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより前記細胞が前記 DNAセグメントによりコードされる精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを発現せしめ、そして前記精巣−特異的インシュリン同族体を回収することを含んで成る、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを製造するための方法を提供する。
【００１５】
　１つの態様において、前記細胞が、次の作用可能に連結された要素、すなわち転写プロモーター；プロホルモンコンバーターゼ（prohormone convertase)をコードする DNA配列；及び転写ターミネーターを含んで成る第２発現ベクターをさらに含んで成る、 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを製造するための方法が提供される。関連する態様において、前記プロホルモンコンバーターゼは、プロホルモンコンバーターゼ２、プロホルモンコンバーターゼ３、プロホルモンコンバーターゼ４及びフリン（furin)から成る群から選択される。
【００１６】
　もう１つの観点においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基22〜アミノ酸残基52を含んで成るＢ鎖；及び配列番号２のアミノ酸残基 162〜アミノ酸残基 188を含んで成るＡ鎖を有する（ここで、前記Ｂ鎖及びＡ鎖が鎖間及び鎖中ジスルフィド結合により連結されている）、単離された成熟ラット Zins2精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質を供給する。関連する態様においては、配列番号２のアミノ酸残基23〜アミノ酸残基51のアミノ酸配列を有するＢ鎖；配列番号２のアミノ酸残基 163〜アミノ酸残基 188のアミノ酸配列を有するＡ鎖（ここで、前記Ｂ鎖及びＡ鎖は、鎖間及び鎖中ジスルフィド結合により連結されている）を有する、単離された成熟ラット Zins2精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質が提供される。
【００１７】
　本発明はまた、配列番号13のアミノ酸残基20〜アミノ酸残基54を含んで成るＢ鎖；配列番号13のアミノ酸残基 172〜アミノ酸残基 213を含んで成るＡ鎖を有する、単離された成熟ヒト Zins2精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質を供給し、ここで前記Ｂ鎖及びＡ鎖は鎖間及び鎖中ジスルフィド結合により連結されている。関連する態様においては、配列番号13のアミノ酸21〜アミノ酸残基53のアミノ酸配列を有するＢ鎖；配列番号13のアミノ酸残基 173〜アミノ酸残基 198のアミノ酸配列を有するＡ鎖を有する、単離された成熟ヒト Zins2精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質が提供され、ここで前記Ｂ鎖及びＡ鎖は鎖間及び鎖中ジスルフィド結合により連結されている。
【００１８】
　もう１つの観点において、本発明は、配列番号２のアミノ酸残基53〜アミノ酸残基 162のアミノ酸配列；配列番号13のアミノ酸残基55〜アミノ酸残基 172のアミノ酸配列；又は配列番号13のアミノ酸残基 201〜アミノ酸残基 213のアミノ酸配列を有する、翻訳後に修飾された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチド又はポリペプチドフラグメントを提供する。
【００１９】
　本発明はまた、医薬的に許容できるビークルと共に上記の単離された精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを含んで成る医薬組成物を提供する。
　上記のような単離された精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドのエピトープに対して特異的に結合する抗体もまた、本発明により提供される。
【００２０】
　本発明はさらに、上記のような単離された精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドのエピトープに対して特異的に結合する結合タンパク質も供給する。
　本発明はさらに、（ａ）：配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択されたポリペプチドのエピトープに対して特異的に結合する結合タンパク質を提供する。
【００２１】
　もう１つの観点において、本発明は、卵の受精への使用のための低温保存された精子の生存率を高めるための方法を提供し、ここで（ａ）：配列番号１又は配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドが、受精の前、精子、卵、卵−精子混合物に添加される。
【００２２】
　もう１つの観点においては、本発明は、精子の運動性を増強するための方法を提供し、
ここで（ａ）：配列番号１又は配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドが、受精の前、精子、卵、卵−精子混合物に添加される。関連する態様においては、 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体が低温保存に続いて精子に添加される、精子運動性を増強するための方法を提供する。
【００２３】
　もう１つの観点においては、本発明は、卵−精子相互作用を増強するための方法を提供し、
ここで（ａ）：配列番号１又は配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドが、受精の前、精子、卵、卵−精子混合物に添加される。
【００２４】
　もう１つの観点においては、本発明は、助力された生殖の間、受精を増強するための方法を提供し、
ここで（ａ）：配列番号１又は配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドが、受精の前、精子、卵、卵−精子混合物に添加される。
【００２５】
　関連する態様においては、前記助力された生殖がインビトロ受精である、受精を増強するための方法が提供される。
　（ａ）：配列番号１又は配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドのアンタゴニストが、卵の受精を妨げるために受容体に投与される避妊の方法がまた提供される。関連する態様においては、前記アンタゴニストが抗− Zins2結合タンパク質である避妊の方法が提供される。
【００２６】
　本発明はさらに、（ａ）：配列番号１又は配列番号12に示されるようなヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸の配列を含んで成るポリペプチド；（ｂ）：（ａ）の種同族体；（ｃ）：（ａ）及び（ｂ）の対立遺伝子変異体；及び（ｄ）：（ａ), (ｂ）又は（ｃ）に対して少なくとも85％同一である Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドから成る群から選択された Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを含むワクチンが、卵の受精を妨げるために受容体に投与される、免疫避妊の方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
　用語“対立遺伝子変異体”（allelic vaviant)とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の二者択一形のいづれかを示すために本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然で生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり（コードされたポリペプチドにおける変化がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００２８】
　用語“発現ベクター”は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結された注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状 DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含し、そしてまた、１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、等を包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルス DNAから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００２９】
　用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は不所望のコード配列を有さず、そして遺伝的に構築されたタンパク質生成系内での使用のために適切な形で存在することを示す。
【００３０】
　“作用可能に連結された”とは、 DNAセグメントに言及する場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、たとえば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
【００３１】
　“ポリヌクレオチド”は、５′末端から３′末端に読取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、 RNA及び DNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組合せから調製され得る。
【００３２】
　用語“プロモーター”は、 RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供する DNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の５′非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうとは限らない。
【００３３】
　用語“受容体”（receptor) は、生物活性分子（“リガンド”）に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示すために本明細書において使用される。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化（及び多くの場合、受容体多重化、すなわち同一の又は異なった受容体サブユニットの会合）をもたらす。それらの相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、サイクリック AMP生成の上昇、細胞カルシウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。用語“受容体ポリペプチド”は、単離された機能的ドメイン（たとえばリガンド−結合ドメイン）を含む、完全な受容体ポリペプチド鎖及びその一部を示すために使用される。
【００３４】
　“分泌シグナル配列”は、それが合成される細胞の分泌経路を通してより大きなポリペプチドを、そのポリペプチドの成分として方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードする DNA配列である。前記のより大きなポリペプチドは、分泌経路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００３５】
　本発明は、インシュリンファミリー（すなわち、インシュリン、リラキシン、Leydig因子、 INSL-4, IGFＩ及び IGFII）に対する同族性（homology) を有するポリペプチドをコードする新規 DNA配列の発現に一部、基づかれている。この新規 DNAに対応するmRNAの組織分布の分析は、発現が精巣に制限されたことを示した。現場（in situ)ハイブリダイゼーション分析は、mRNAが輸精管及び精巣上体に局在化していることを示し、このことは、精巣−特異的細胞型のための成長又は分化因子としての役割、及び精子活性化への関与を示唆する。
【００３６】
　精子形成は、連続的な過程であり、そして精子(sperm) として本明細書においては言及される、生殖細胞が究極的には精子に成熟する輸精管において生じる。成熟過程に影響を及ぼす精巣−特異的因子は、精子形成細胞と接触して存在する Sertoli細胞から直接的に由来し、又は傍分泌（paracrine)又は内分泌（endocrine)因子であり得る。輸精管外で生成される分子の多くは、輸精管内の Sertoli細胞により発現される輸送及び結合タンパク質により精子細胞微小環境中に輸送される。
【００３７】
　細胞バリヤーを横切り、そして精子細胞微小環境に侵入する傍分泌因子は、Leydig細胞から分泌される分子を包含する。Leydig細胞は、輸精管間に見出される間質空間に位置し、そして精子形成細胞成熟過程において重要な役割を演じると思われるいくつかの因子、たとえばテストステロン、Leydig因子、 IGF-1、インヒビン及びアクチビンを生成する。それらの及び他の因子の発現は、精子形成サイクルにおける定義された段階に対して特異的であり得る。次に、精子は精巣上体に輸送され、ここで精子運動性及び受精能力が高められる。精子は、開放されるまで、精巣上体尾に貯蔵される。
【００３８】
　卵母細胞又は卵に達し、そして卵−精子相互作用を開始する前、精子は活性化されるべきである。精子は徐々の受精能獲得を受け、インビトロで３〜４時間まで続き、この間、精子の頭部の形質膜及び外側の先体膜が融合し、先体酵素の開放を促進する小胞を形成する。先体膜は、精子頭部における核の先方端に位置する先体を取り囲む。
【００３９】
　精子が卵と相互作用するためには、精子は卵母細胞を貫通すべきである。この過程を可能にするためには、精子は、先体反応としても知られている先体エキソサイトーシスを受け、そして卵母細胞の付近に先体酵素を放すべきである。それらの酵素は、精子の種々の卵母細胞層（卵丘、放線冠及び透明帯）の貫通を可能にし、そして卵との相互作用を開始せしめる。開放される先体酵素は、プロテアーゼのような他の酵素の他に、ヒアルロニダーゼ及びプロアクロシンを包含する先体反応の間、プロアクロシンが結合のために必要とされ、そして結合の前に生ずべきである、酵素の活性形のアクロシンに転換され、そして透明帯の貫通が可能になる。
【００４０】
　先体溶菌酵素及び精子尾部運動の組合せが、精子に対して卵母細胞層を貫通する能力を提供する。多くの精子が卵に達し、そして卵が最終的に受精され得る前、それらの先体酵素を放すべきである。わずか１つの精子が卵にうまく結合し、そして貫通し、その後、他の精子が貫通し、そして卵の受精が生じないように、透明帯が硬化する（Zaneveld,in Male Infertility Chapter 11, Combaire (Ed.), Chapman & Hall, London 1996)。インシュリン同族体は、精子活性化及び卵−精子相互作用に関連している。たとえば、リラキシンと共にインキュベートされた、受精能を獲得した精子は、前進移動性精子の百分率の上昇、透明帯貫通速度の上昇、及び生存先体−反応精子の百分率上昇を示した(Carrellなど.,　Endocr.Res. 21: 697-707, 1995)。リラキシン Zina2タンパク質の同族性及び精巣への Zins2の局在化は、本明細書に記載される Zins2タンパク質がそれらの及び他の生殖過程において役割を演じることを示唆する。
【００４１】
　精巣−特異的インシュリン同族体をコードするラットcDNA（配列番号１）の分析は、推定上のシグナル配列及び成熟ポリペプチドを含んで成る、 188個のアミノ酸（配列番号２）をコードする読取り枠を示した。精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする代表的なヒトcDNA配列の分析は、配列番号13に示されるような 213個のアミノ酸の読取り枠との類似する同族性を示した。
【００４２】
　成熟ポリペプチドは、図１及び図２に示されるように、それぞれインシュリン、リラキシン１及び２、INSL-4並びにLeydig因子との同族性を有する。このファミリー内で、システインモチーフはＢ及びＡ鎖に高く保存され、ここで前記Ｂ鎖モチーフは、LCGX｛10｝C(ここでＸ｛　｝はシステインを除くいづれかのアミノ酸残基の数である）として表わされ得る。前記Ａ鎖モチーフは、 CCX｛３｝CX｛８｝C(ここで、Ｘ｛　｝はシステインを除くいづれかのアミノ酸残基の数である）である。
【００４３】
　精巣−特異的インシュリン同族体をコードするラットcDNA配列の単離は、予測されるアミノ酸配列がリラキシン及びインシュリンに見出されるＢ鎖−Ｃペプチド−Ａ鎖モチーフを含むことを示した。プレプロリラキシン及びプレプロインシュリンの両者は、シグナル配列、続いてＢ鎖、Ｃペプチド及びＡ鎖を有する。リラキシン及びインシュリンの両者の成熟分子は、除去されるシグナルペプチド及びＣペプチド、並びに鎖間及び鎖中ジスルフィド結合により連結されるＢ及びＡ鎖を有する(Jamesなど.,　Nature　267 : 544-546, 1977)。ヒトクローンの単離及び続く配列分析は、ヒト配列（配列番号13に示されるような）がそのファミリーの他のメンバーに構造的に等しいことを示す。
【００４４】
　成熟タンパク質分子のプロセッシングは、シグナルペプチドのＣ−末端での切断、及びインシュリンファミリーの他の成熟メンバーとの予測される構造的類似性に基づいて、Ｃ−ペプチドの除去をもたらす、Ｂ鎖のＣ−末端及びＡ鎖のＮ−末端での切断を包含する。インシュリンファミリーの他の既知メンバーと本発明のラット精巣−特異的インシュリン同族体の一列配列（図１及び図２に示されるような）は、配列番号２のアミノ酸残基22 (Glu)〜アミノ酸残基23 (Gln)の領域におけるシグナルペプチド切断部位を示唆する。Ｂ鎖のＣ−末端での切断は、アミノ酸52 (Arg)のＣ−末端で存在することが予測され、続いて、Ｃ−末端アミノ酸残基としてアミノ酸残基51 (Phe)を残すためにカルボキシペプチダーゼによる Arg残基の切断を伴う。
【００４５】
　Ａ鎖のＮ−末端をもたらす切断部位は、アミノ酸残基161 (Arg) 〜163 (Gly) の領域に示される。切断は、Ａ鎖のＮ−末端アミノ酸残基としてアミノ酸残基163(Gly)を残すように、アミノ酸残基162 (Arg) のＣ−末端の後に存在することが予測される。Ｃ−末端アミノ酸は、残基188 (Phe) である。Ｃ−ペプチドとＡ鎖との連結部での切断部位はよく保存されており、Arg-X-X-Arg(ここで、Ｘはいづれかのアミノ酸残基である）、 Arg-Arg又は Lys-Argの後に存在し；しかしながら、シグナル配列とＢ鎖との連結及びＢ鎖とＣ−ペプチドとの連結部での切断部位は、インシュリンファミリー内で同様に高度の保存性を維持しない。
【００４６】
　代表的なヒト精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの整列は、配列番号13のアミノ酸残基20 (Ser)〜残基21 (Arg)の領域におけるシグナルペプチド切断を示す。Ｂ鎖のＣ−末端での切断は、アミノ酸残基54 (Arg)のＣ−末端であることが予測され、続いて、Ｂ鎖のＣ−末端アミノ酸残基としてアミノ酸残基53 (Phe)を残すために、カルボキシペプチダーゼによる Arg残基の切断が伴う。Ａ鎖のＮ−末端をもらたす切断部位は、アミノ酸残基171 (Arg) 〜173(Gly) の領域に示される。切断は、Ａ鎖のＮ−末端アミノ酸残基としてアミノ酸残基173 (Gly) を残す、アミノ酸残基172 (Arg) のＣ−末端で存在することが予測される。
【００４７】
　予測されるヒト Zins2 A鎖配列のＣ−末端部分にいくつかの可能性ある切断部位が存在し、たとえばアミノ酸残基 200での ArgのＣ−末端又はアミノ酸残基 205での ArgのＣ−末端である。どの部位がＡ鎖Ｃ−末端切断部位であるか、又は切断が存在するか否かは、ヒト Zins2精巣−特異的インシュリン同族体のアミノ酸配列（配列番号13）のみに基づいて、又は他のインシュリン同族体（図１及び図２）に比較しても、明確ではない。 IGF-1は、フリン切断部位、及びＡ鎖のＣ−末端中の複数の可能性ある一塩基性切断部位及びコンセンサスフリン部位を有するが、インシュリン及びリラキシンは有さない。
【００４８】
　２つの可能な部位のどちらが実際の切断部位であるかの決定は、ヒト Zins2配列のみに基づいては、不可能である。ラット Zins2同族体のアミノ酸配列（配列番号２）の知識が、ヒトＡ鎖のＣ−末端切断部位の合理的な予測を可能にする。ヒト Zins2は２つの可能性ある切断部位を有し、そしてラット Zins2は有さない。ヒト配列Ｃ−末端のアミノ酸残基200 (Arg) に切断部位が存在する。この部位での切断、それに続く、カルボキシペプチダーゼによるArg(アミノ酸残基200)及びLys(アミノ酸残基199)の切断は、配列番号２に開示されるようなラット配列に対応するヒトＡ鎖のＣ−末端アミノ酸残基としてアミノ酸残基198 (Phe) を残す。従って、ヒト Zins2 A鎖のＣ−末端切断部位が配列番号13のアミノ酸残基200 (Arg) のＣ−末端であることは、ラット Zins2同族体に基づいて予測される。
【００４９】
　その予測される部位に基づけば、成熟ヒト Zins2精巣−特異的インシュリン同族体のアミノ酸配列は、配列番号13のアミノ酸残基21 (Arg)〜アミノ酸残基53 (Phe)の配列を有するＢ鎖、及び配列番号13のアミノ酸残基173 (Gly) 〜アミノ酸残基198 (Phe) の配列を有するＡ鎖を含む。成熟ラット Zins2精巣−特異的インシュリン同族体のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸残基23 (Gln)〜アミノ酸残基51 (Ser)の配列を有するＢ鎖、及び配列番号２のアミノ酸残基163 (Gly) 〜アミノ酸残基188(Phe)の配列を有するＡ鎖を含む。前記Ｂ及びＡ鎖は、鎖間及び鎖中ジスルフィド結合により連結される。
【００５０】
　プロインシュリン転換の酵素学が示すところによれば、プロホルモンコンバーターゼ３（PC３）又は他の同族体−塩基性有能コンバーターゼが主に、Ｂ鎖−Ｃ−ペプチド連結部で切断し、そしてプロホルモンコンバーターゼ２（PC２）又は類似するコンバーターゼがＣ−ペプチド−Ａ−鎖連結部で選択的に切断し、そして損なわれていないプロホルモンよりもPC３によりすでに処理されたプロインシュリンを好むことを示す。ヒト及びラットプロインシュリンにおいては、二塩基性残基が、Ｂ鎖とＣ−ペプチド、及びＣ−ペプチドとＡ鎖を連結する。
【００５１】
　さらに、切断部位側から４残基Ｎ−末端側の塩基性残基（“Ｐ４塩基性残基”）は、１つの又は両方の連結部で存在することができ；そしてフリン、又はフリンファミリーの類似するコンバーターゼ、たとえばプロホルモンコンバーターゼ４（PC４）及び PACE4の連結部位での切断能力に影響を及ぼすであろう。Vollenweiderなど.(Diabetes　44: 1075-80, 1995)により報告された研究において、PC３と、ヒトプロインシュリン、ラットプロインシュリンII又は変異体ヒトプロインシュリン Arg62のいづれかとによる COS細胞の同時トランスフェクションは、PC３が、Ｐ４塩基性残基の存在又は不在にかかわらず、両プロインシュリン連結部を切断したことを示した。
【００５２】
　リラキシンタンパク質内に、Ｂ鎖中のそれぞれアミノ酸残基35〜37及びアミノ酸残基47〜48での Cys-Gly-Arg及び Cys-Glyの高く保存された領域が存在し、それはまた、それぞれ、配列番号２のアミノ酸残基33〜35及びアミノ酸残基45〜46での本発明のラット精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質にも見出される。配列番号13に示されるヒト配列における同等の領域は、それぞれアミノ酸残基33〜35及び45〜46であり、そして図１及び図２に示される。リラキシンに見出されるような（そして図１及び図２に示されるような）残基35〜41(CGRELVR) がリラキシン受容体を結合するために重要である証拠が存在する（Bullesbachなど.,　J.Biol.Chem. 267:22957-22960, 1992)。
【００５３】
　 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体は、重要なアルギニン残基の１つを欠失し、ラット Zins2配列においては、第２アルギニンがバリンにより置換され（配列番号２のアミノ酸残基39）、そしてヒト Zins2配列においては、アルギニンがリシンにより置換されている（配列番号13のアミノ酸残基39）。この置換はリラキシンと Zins2とによる交差−反応性の可能性を排除しないが、しかし Zins2はリラキシンと交差−反応性ではないようである。
【００５４】
　配列番号２のアミノ酸残基53〜アミノ酸残基 162のアミノ酸配列；配列番号13のアミノ酸残基55〜アミノ酸残基 172のアミノ酸配列；及び配列番号13のアミノ酸残基 201〜アミノ酸残基 213のアミノ酸配列を有する、翻訳後修飾されたポリペプチド又はポリペプチドフラグメントもまた、本発明により提供される。翻訳後修飾の例は、タンパク質分解性切断、グリコシル化、ジスルフィド結合、及びヒドロキシル化を包含する。インシュリンからのＣペプチドは、糖尿病ラットに投与される場合、ニューロン又は血管に対する糖尿病により誘発される損傷を低め、又は妨げる(Idoなど.,　Science 277 : 563-66, 1997) 。
【００５５】
　染色体9p24に対するヒト Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの染色体局在性が、放射線ハイブリッドキメラを用いて決定された。 INSL4、すなわち生殖組織に関係するもう１つのインシュリン同族体もまた、染色体9p24に対してマッピングされた(Chassinなど.,　Genomics　29: 465-70, 1995) 。リラキシン１及び２が 9pter-q12に対してマッピングされた（Grawfordなど.,　EMBO J. ３: 2341-45, 1984)。性転換のいくつかの事例が、この領域及び精巣発育との関連性を示す、9p24を包含する新たなトランスロケーション又は欠失に関して報告されている(Hooなど.,　Am.J.Hum.Genet. 45(suppl.): A78, 1989; Bennettなど.,　J.Med.Genet.　30: 518-20, 1993) 。
【００５６】
　当業者は、配列番号１及び12に開示される配列がそれぞれラット及びヒト精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの単一の対立遺伝子を表わし、そして対立遺伝子変異、すなわち“対立遺伝子変異体”、及び他のスプライシング、すなわち“スプライス変異体”の発生が予測されることを認識するであろう。配列番号１及び12に示される DNA配列の対立遺伝子変異体、たとえばサイレント突然変異を含むそれらの変異体、及び突然変異がアミノ酸配列変化をもたらす変異体は、配列番号２及び13の対立遺伝子変異体であるタンパク質と同様に、本発明の範囲内にある。
【００５７】
　配列番号１及び12に示される DNA配列のスプライス変異体は、イントロン配列が除去され、そしてエキソン配列が連結される既知の真核 RNAスプライシング過程により創造される成熟 RNA分子に起因する DNA配列を含む。配列番号２及び13の Zins2精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質の性質を保持するタンパク質をコードするそのような DNA配列は、本発明の範囲内である。それらの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られている標準方法に従って、異なった個人又は組織からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００５８】
　本発明はさらに、他の種からの相当部ポリペプチド及びポリヌクレオチド（“種同族体”）を提供する。それらの種は、哺乳類、鳥類、両性類、爬虫類、魚類、昆虫、及び他の脊椎動物及び無脊椎動物種を包含するが、但しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、たとえばネズミ、ブタ、羊、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ及び他の霊長類のタンパク質からの精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドである。リラキシンの種同族体は、種から種のタンパク質間の機能的差異をたぶんもたらす、種間の相当な構造的変動が存在することにおいてユニークである。たとえば、ブタ、ラット及びヒトリラキシン間で、アミノ酸残基は、50％以上、変化することができる（アメリカ特許第 4,835,251号；引用により本明細書に組込まれる）。
【００５９】
　他の種の Zins2のポリペプチドは、治療的に重要であり得る。多くの場合、非生来のタンパク質、すなわち異なった種からのタンパク質の使用が、生来のタンパク質よりもより効果的であり得ることが示された。たとえば、サケカルシトニンは、ヒトカルシトニン形よりも骨吸収を阻止する上で相当により効果的であることが示されている。サケカルシトニンが骨粗鬆症の治療においてヒトカルシトニンよりもなぜより効果的であるかについてのいくつかの仮説が存在する。
【００６０】
　それらの仮説は、次のものを包含する：１）サケカルシトニンは分解に対してより耐性であり；２）サケカルシトニンはより低い代謝クリアランス速度(MCR) を有し；そして３）サケカルシトニンは骨受容体部位に対して高い親和性をもたらす、わずかに異なったコンホメーションを有することができる。もう１つの例は、β−エンドルフィンファミリーに見出される（Hoなど.,　Int.J.Peptide Protein Res.　29: 521-24, 1987) 。研究は、ラクダ、ウマ、七面鳥及びダチョウβ−エンドルフィンの末梢オピオイド活性が、摘出されたテンジクネズミ回腸が電気刺激され、そして収縮が測定される場合、ヒトβ−エンドルフィンの活性よりも高いことを示した。
【００６１】
　ラット、マウス及びウサギからの精管が同様にアッセイされた。ラット精管モデルにおいて、ラクダ及びウマβ−エンドルフィンは最高の相対的能力を示した。合成されたラットリラキシンは、マウス恥骨結合アッセイにおいて、ヒト及びブタリラキシンと同じほど活性であった（Bullesbach and Schwabe, Eur.J.Biochem.　241 : 533-7, 1996)。従って、本発明のラット Zins2分子は、ヒト細胞、組織及び受容体においてヒト内因性分子よりも高い能力を有することができる。
【００６２】
　ラット及びヒト精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの種同族体が、従来のクローニング技法と組み合わせて、本発明により提供される情報及び組成を用いてクローン化され得る。たとえば、cDNAが、タンパク質を発現する組織又は細胞型から得られるmRNAを用いてクローン化され得る。mRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることにより同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織細胞系のmRNAから調製される。
【００６３】
　次に、精巣−特異的インシュリン同族体−コードのcDNAが、種々の方法により、たとえば完全又は部分的ラットcDNAにより又は開示された配列に基づく１又は複数組の変性プローブによりプローブすることにより単離され得る。cDNAはまた、本明細書に開示される配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応又はPCR(Mullis、アメリカ特許第 4,683,202号）によりクローン化され得る。さらなる方法においては、cDNAライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され得、そして興味あるcDNAの発現が精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はポリペプチドに対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離にも適用され得る。
【００６４】
　本発明はまた、配列番号２, 13のポリペプチド及びそれらの種同族体に対して実質的に相同である単離された精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを供給する。“単離された”とは、たとえば血液及び動物組織は別として、その生来の環境以外の条件下に見出されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。高度に精製された形での、すなわち95％以上の純度、より好ましくは99％以上の純度のポリペプチドを供給することが好ましい。
【００６５】
　用語“実質的に同族である”とは、配列番号２, 13に示される配列又はそれらの種同族体に対して50％、好ましくは70％、より好ましくは少なくとも85％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、配列番号２, 13又はそれらの種同族体に対して、より好ましくは少なくとも90％同一であり、そして最とも好ましくは95％又はそれ以上同一であろう。
【００６６】
　たとえば、Altschulなど.,　Bull.Math.Bio.　48: 603-616, 1986 及び Henikoff and Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 　89: 10915-10919, 1992 を参照のこと。手短に言及すれば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペナルティー、及び表１（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff(前記）の"blosum 62" 評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。
【００６７】
【表１】
2004073205.tif 000002
【００６８】
　次に、最適な整合の％同一性が次のようにして計算される：
【数１】
2004073205.tif 000003
【００６９】
　ポリヌクレオチド分子の配列同一性が、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
　実質的に同族のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約30個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、たとえばアミノ−末端メチオニン残基、又は約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長、たとえばポリ−ヒスチジン部分、抗原性エピトープ又は結合ドメインの延長であるマイナーな性質のものである。一般的には、Fordなど.,　Protein Expression and Purification 　２: 95-107, 1991（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。
【００７０】
【表２】
2004073205.tif 000004
【００７１】
　本発明のタンパク質はまた、20個の標準アミノ酸の他に、非天然的に存在するアミノ酸残基を含んで成る。非天然アミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２，４−メタノプロリン、シス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−メチル−グリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチル−システイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリンを包含する。
【００７２】
　非天然アミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が、当業界において知られている。たとえば、ナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロシステムが使用され得る。アミノ酸を合成し、そしてtRNAをアミノアシル化するための方法は、当業界において知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、Ｅ．コリＳ30抽出物及び市販の酵素及び他の試薬を含んで成る細胞フリーシステムにおいて実施される。
【００７３】
　タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。たとえば、 Robertsonなど.,　J.Am.Chem.Soc.　113 : 2722, 1991; Ellmanなど.,　Meth.Enzymol. 202 : 301, 1991; Chungなど.,　Science　 259 : 806-09, 1993; 及び Chungなど.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA　 90: 10145-49, 1993を参照のこと。第２の方法においては、翻訳は、突然変異誘発されたmRNA及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞において行なわれる(Twcattiなど.,　J.Biol.Chem.　271 : 19991-98, 1996) 。
【００７４】
　第３の方法においては、Ｅ．コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸（たとえば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望する非天然アミノ酸（たとえば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。非天然アミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。 Koideなど.,　Biochem.　33: 7470-46, 1994 を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学的変性により非天然種に転換され得る。化学的変性は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組合され得る(Wynn and Richards, Protein Sci.　２: 395-403, 1993)。
【００７５】
　限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、非天然的に存在するアミノ酸、及び非天然のアミノ酸が、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残基のために置換され得る。“非天然のアミノ酸”は、タンパク質合成の後に修飾され、そして／又は、標準のアミノ酸の側鎖とは異なったそれらの側鎖での化学構造を有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３，３−ジメチルプロリンを包含する。
【００７６】
　本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得（Cunningham and Wells, Science　 244 , 1081-1085, 1989)。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体残基が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（たとえば、増殖又は分化）について試験される。
【００７７】
　複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、たとえばReidhaar-Olson and Saner (Science　 241 : 53-57, 1988)又はBowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci. USA　 86: 2152-2156, 1989)により開示される方法を用いて、行なわれ、そして試験され得る。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（たとえば、Lowmanなど.,　Biochem.　30: 10832-10837, 1991; Ladnerなど.,　アメリカ特許第 5,223,409号；Huse, WIPO公開 WO 92／06204)及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshireなど.,　Gene　46:145, 1986; Nerなど.,　DNA 　７: 127, 1988)を包含する。
【００７８】
　上記に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と組合され得る。活性ポリペプチド（たとえば精巣細胞の増殖又は分化の刺激）をコードする突然変異誘発された DNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおけ個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【００７９】
　上記で論ぜられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の残基１〜188 、配列番号13の残基１〜213 又はその対立遺伝子変異体に対して実質的に同族である種々のポリペプチドを調製することができる。
【００８０】
　十分な長さのタンパク質及びそのフラグメントを包含する、本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性 DNAにより形質転換され又はトランスフェクトされ、そして培養物において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化された DNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性 DNAを導入するための技法は、Sambrookなど.,　Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989（引用により本明細書に組込まれる）により開示される。
【００８１】
　一般的に、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドをコードする DNA配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝的要素、たとえば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに操作可能的に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び複製の１又は複数の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性 DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組込みにより供給され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常の事である。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。
【００８２】
　Ｂ及びＡ鎖の切断を確かにするために、精巣−特異的インシュリン同族体をコードする DNA配列を含む発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞が、適切なプロホルモンコンバーターゼ、たとえばフリン、PC４, PC２又はPC３をコードする発現ベクターにより同時トランスフェクトされる。そのような配列は、当業界において知られており、そして本明細書に記載されるようにして、発現ベクター中に挿入され、そして細胞中にトランスフェクトされ得る。
【００８３】
　精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを宿主細胞の分泌路中に方向づけるために、分泌シグナル配列（また、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（たとえばt-PA）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、精巣−特異的インシュリン同族体 DNA配列に、正しく読取り枠を整合して連結される。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードする DNA配列の５′側に位置するが、但し一定のシグナル配列は、興味ある DNA配列の他の場所に位置することもできる（たとえば、 Welchなど.,　アメリカ特許第 5,037,743号； Hollandなど.,　アメリカ特許第 5,143,830号を参照のこと）。
【００８４】
　培養された哺乳類細胞はまた、本発明内の好ましい宿主である。外因性 DNAを哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシウム−仲介トランスフェクション（Wiglerなど.,　Cell　14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics　 ７:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology　52: 456, 1973)、エレクトロポレーション(Neumannなど.,　EMBO J. １: 841-845, 1982)、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション(Ausubelなど., eds.,　Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)、及びリポソーム−仲介トランスフェクション(Hawley-Nelson, など.,　Focus　 15: 73, 1993; Ciccarone など.,　Focus　 15: 80, 1993) を包含する（それらの文献は引用により本明細書中に組込まれる）。
【００８５】
　培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、たとえばLevinsonなど.,　アメリカ特許第 4,713,339号； Hagenなど.,　アメリカ特許第 4,784,950号；Palmiterなど.,　アメリカ特許第 4,579,821号；及び Ringold、アメリカ特許第 4,656,134号（それらは引用により本明細書に組込まれる）により開示される。好ましい培養された哺乳類細胞は、BHK570細胞（ATCC受託番号10314)、COS-1(ATCC番号CRL 1650) 、COS-7(ATCC番号CRL 1651) 、293(ATCC番号CRL 1573；Grahamなど.,　J.Gen.Virol.　36: 59-72, 1977)、及びチャイニーズハムスター卵巣（たとえば、CHO-K1; ATCC番号CCL 61）細胞系を包含する。
【００８６】
　追加の適切な細胞系は、当業界において知られており、そして公共寄託機関、たとえば American Type Culture Collection, Rockville, Marylandから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、たとえば SV-40又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。たとえば、アメリカ特許第 4,956,288号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許第 4,579,821号及び第 4,601,978号；それらは引用により本明細書中に組込まれる）、及びアデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【００８７】
　薬物選択は一般的に、外来性 DNAが挿入されている培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、たとえば G-418又は同様のものの存在下で実施される。
【００８８】
　“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子（たとえば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）もまた、使用され得る。
【００８９】
　他の高等真核細胞、たとえば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、 Guarinoなど.,　アメリカ特許第 5,162,222号；Bangなど.,　アメリカ特許第 4,775,624号；及びWIPO公開 WO 94／06463(それらは引用により本明細書に組込まれる）により開示される。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム　リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の使用は、Sinkarなど.,　J.Biosci.(Bangalore)11: 47-58, 1987 により再考されている。
【００９０】
　菌類細胞、たとえば酵母細胞、及び特に、サッカロミセス(Saccharomyces) 属の細胞はまた、精巣−特異的インシュリン同族体フラグメント又はポリペプチド融合体を生成するために、本発明内で使用され得る。外因性 DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、たとえばKawasaki、アメリカ特許第 4,599,311号；Kawasakiなど.,　アメリカ特許第 4,931,373号； Brake、アメリカ特許第 4,870,008号； Welchなど.,　アメリカ特許第 5,037,743号；及びMurrayなど.,　アメリカ特許第 4,845,075号（それらは引用により本明細書中に組込まれる）により開示される。
【００９１】
　形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は特定の栄養物（たとえばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。酵母への使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasakiなど.(アメリカ特許第 4,931,373号）により開示されるPOT1ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（たとえば、Kawasaki、アメリカ特許第 4,599,311号；Kingsmanなど.,　アメリカ特許第 4,615,974号；及びBitter、アメリカ特許第 4,977,092号を参照のこと；それらは引用により本明細書に組込まれる）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。
【００９２】
　また、アメリカ特許第 4,990,446号；第 5,063,154号；第 5,139,936号；及び第 4,661,454号（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。他の酵母、たとえばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe) 、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイジス(Ustilago maydis) 、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris) 、ピヒア・グイレルモンジ（Pichia guillermondii）及びカンジダ・マルトサ(Candida maltosa) のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【００９３】
　たとえば、 Gleesonなど.,　J.Gen.Microbiol.　132 : 3459-3465, 1986 及び Cregg、アメリカ特許第 4,882,279号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、McKnightなど.,　アメリカ特許第 4,935,349号（引用により本明細書に組込まれる）の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Suminoなど.,　アメリカ特許第 5,162,228号（引用により本明細書に組込まれる）により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、 Lambowitz、アメリカ特許第 4,486,533号（引用により本明細書に組込まれる）により開示される。
【００９４】
　形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、たとえば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加された DNAを含む細胞を、たとえば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【００９５】
　精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドは、また、精巣−特異的インシュリン同族体エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに対して特異的に結合する抗体を調製するためにも使用され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良く知られている（たとえば、Sambrookなど.,　Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと；それらは引用により本明細書に組込まれる）。当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、たとえばウマ、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス及びラットから生成され得る。
【００９６】
　精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、たとえば、みょうばん（水酸化アルミニウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。免疫化のために有用なポリペプチドは、また融合ポリペプチド、たとえば精巣−特異的インシュリン同族体又はその一部と免疫グロブリンポリペプチドとの又はマルトース結合タンパク質との融合体を包含する。ポリペプチド部分が“ハプテン様”である場合、そのような部分は好都合には、高分子キャリヤー（たとえばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH) 、ウシ血清アルブミン(BSA) 又はテタヌストキシン）に対して免疫化のために結合され又は連結され得る。
【００９７】
　本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合フラグメント、たとえば Fabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、たとえばキメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒト CDRのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（cloaking）”ことによって、ここで結果物は“張り合された”抗体である）、ヒト適合化され得る。
【００９８】
　多くの場合、ヒト適合化された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。本発明において有用な抗体を生成し、又は選択するための他の技法は、精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はペプチドへのリンパ球のインビトロ暴露、及びファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーの選択（たとえば、固定された又はラベルされた精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はペプチドの使用により）を包含する。
【００９９】
　抗体は、それらが精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドに結合する場合、 106Ｍ-1又はそれ以上の、好ましくは 107Ｍ-1又はそれ以上の、より好ましくは 108Ｍ-1又はそれ以上の、及び最とも好ましくは 109Ｍ-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴って、特異的に結合するものとして定義される。抗体の結合親和性は、当業者により（たとえば Scatchard分析により）容易に決定され得る。
【０１００】
　当業者に知られている種々のアッセイが、精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Antibodies: A Laboratory Manual , Harlow and Lane(Eds.), Cold Spring HarborLaboratory Press, 1988に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ(ELISA) 、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体の精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０１０１】
　精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドに対する抗体は、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製により精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを単離するために；精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根元的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを検出し又は定量化するために；FACSを使用する分析方法において；発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗−イディオタイプ抗体を生成するために；及び中和抗体として使用され得る。
【０１０２】
　適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、螢光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本明細書における抗体はまたは、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。
【０１０３】
　本発明に従って調製される精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドは、当業界において一般的に知られている方法、たとえばタンパク質の大きさ、電荷、溶解性及び他の性質に基づく親和性精製及び分離を用いて精製される。タンパク質が培養された哺乳類細胞において生成される場合、汚染するタンパク質の量を制限するために、血清フリーの培養培地において細胞を培養することが好ましい。培地が収穫され、そして分別される。
【０１０４】
　分別の好ましい方法は、親和性クロマトグラフィー、 Q-Fast Flow Sepharose、Mono Q樹脂、FPLC、フェニル Sepharose、ヒドロキシアパタイト、Mono S及び／又は S-Sepharoseを包含する。タンパク質はまた、固定された親和性標識（たとえば、ポリヒスチジン、サブスタンスＰ又は抗体又は他の特定の結合剤が利用できる他のポリペプチド又はタンパク質）を用いても精製され得る。特異的切断部位は、興味あるタンパク質と親和性標識との間に供給され得る。好ましい親和性標識は、固定されたニッケル上での融合タンパク質の精製を可能にするポリヒスチジン末端を包含する（Houchuliなど.,　Bio/Technol.　６: 1321-1325, 1988)。
【０１０５】
　原核発現システムにおいては、マルトース結合タンパク質(MBP) 融合体が、親和性標識として都合良く使用され得る。タンパク質が宿主細胞の細胞質又はペリプラズムから回収される予定である場合、細胞はまず、破壊され、そしてタンパク質を含む粗抽出物が回収され、そして追加の精製段階にゆだねられる。分泌されたタンパク質は、好ましくは、ならし培地の濃縮の後、細胞ならし培地から回収される。特定の分別段階の選択及びそれらの段階の順序は、宿主細胞の型、及び選択される発現システムに一部、基づかれるであろう。そのような決定は、当業者のレベルの範囲内である。
【０１０６】
　ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製するための方法は、当業界において良く知られている（たとえば、Sambrookなど.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと；それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【０１０７】
　当業者にとって明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、たとえばウマ、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス及びラットから生成され得る。精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの免疫原性は、アジュバント、たとえばフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。
【０１０８】
　精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドに対する抗体は、単離のために、親和性精製のために、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの循環レベルの決定のための診断アッセイのために、及び精巣−特異的インシュリン同族体結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するためのアンタゴニストとして使用され得る。それらの抗体は、卵の受精を妨げるための避妊薬として有用である。
【０１０９】
　そのような抗体は、精子形成及び／又は精子活性化の成分を阻害することによってアンタゴニストとして作用する。そのような抗体“アンタゴニスト”は、動物及び特に、家畜動物及び家畜における避妊のために使用され得る。たとえば、抗− Zins2免疫化は、手術形の避妊（たとえば卵巣摘出及び去勢）の代わりに使用され、そして所望には、未来の繁殖の可能性を可能にするであろう。
【０１１０】
　可能性ある Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、たとえばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、たとえばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０１１１】
　それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、たとえばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。
【０１１２】
　そのようなランダムペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladnerなど.,アメリカ特許第 5,223,409号；Ladnerなど.,アメリカ特許第 4,946,778号；Ladnerなど.,アメリカ特許第 5,403,484号及びLadnerなど.,アメリカ特許第 5,571,698号）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、たとえばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA)及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) から市販されている。
【０１１３】
　ランダムペプチド表示ライブラリーは、 Zins2に結合するタンパク質を固定するために、本明細書に開示される Zins2精巣−特異的インシュリン同族体配列を用いてスクリーンされ得る。 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質”は、細胞を標識するために；親和性精製により同族体ポリペプチドを単離するために使用され得；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得る。それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、たとえば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る。
【０１１４】
　結合タンパク質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化するために診断アッセイにも使用され得る。それらの結合タンパク質はまた、精巣−特異的インシュリン同族体結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、 Zins2“アンタゴニス”としても作用することができる。
【０１１５】
　それらの抗− Zins2結合タンパク質は、精子形成及び精子活性化を阻害するために有用である。そのような抗− Zins2結合タンパク質は、ヒト及び動物、特に家畜動物における避妊のために使用され得、ここでそれらは卵の受精を妨げるよう作用する。そのような抗− Zins2結合タンパク質は、たとえば手術形の避妊（たとえば卵巣摘出及び去勢）の代わりに使用され、そして所望には、未来の繁殖の可能性を可能にする。
【０１１６】
　当業者に知られている種々のアッセイが、精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体又は結合タンパク質を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳細に記載されている。
【０１１７】
　そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する：同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈澱、酵素結合の免疫吸着アッセイ(ELISA）、ドットプロット又はウエスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサントイッチアッセイ．リガンド結合受容体フラグメントを用いる好ましいアッセイシステムは、市販のバイオセンサー装置(BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を使用し、ここで受容体フラグメントが受容体チップの表面上に固定されている。この装置の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991及びCunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-563, 1993により開示されている。
【０１１８】
　受容体フラグメントは、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは固定された受容体ポリペプチドに結合し、金フィルムの表面プラズマ共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され得、そして結合の化学量論の評価を可能にする。
【０１１９】
　本発明の分子は、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドのための受容体を同定し、そして単離するために使用され得る。たとえば、本発明のタンパク質及びペプチドがカラム上に固定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson など., eds., Academic Press, San Diego, CA, 1992, pp.195-202) 。
【０１２０】
　タンパク質及びペプチドはまた、放射性ラベルされ（Methods in Enzymol., vol.182, “Guideto Protein Purification ”, M. Deutscher, ed., Acad. Press,San Diego, 1990, 721-737）、又は光親和性ラベルされ(Brunnerなど., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993 及びFedan など., Biochem. Pharmacol. 33: 1167-1180, 1984）、そして特定の細胞−表面タンパク質が同定され得る。
【０１２１】
　本発明のポリペプチドは、精巣細胞の増殖又は分化を刺激するために使用される。増殖及び分化は、培養された精巣細胞を用いて、又は本発明の分子を適切な動物モデルにインビボ投与することによって測定され得る。培養された精巣細胞は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD から入手できる、イルカDB1. Tes細胞(CRL-6258); マウスGC-1 spg細胞(CRL-2053);　TM3細胞(CRL-1714);　TM4細胞(CRL-1715); 及びブタST細胞(CRL-1746)を包含する。
【０１２２】
　細胞増殖又は分化を測定するアッセイは、当業界において良く知られている。たとえば、増殖を測定するアッセイは、次のようなアッセイを包含する：中性赤色素に対する化学感受性（Caranaugh など., Investigational New Drags 8: 347-354, 1990;引用により本明細書に組込まれる）、放射性ラベルされたヌクレオチドの組込み（Cookなど., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989;引用により本明細書に組込まれる）、増殖する細胞の DNAへの５−ブロモ−２′−デオキシウリジン（BrdU）の組込み（Porstmann など., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985; 引用により本明細書に組込まれる）、及びテトラゾリウム塩の使用（Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley など., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshallなど., Growth Reg. 5: 69-84, 1995;及びScudieroなど., Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988; すべては引用により本明細書に組込まれる）。
【０１２３】
　分化を測定するアッセイは、たとえば組織の段階−特異的発現に関連する細胞表面マーカー、酵素活性、官能的活性、又は形態変化の測定を包含する（Watt, FASEB 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; すべては引用により本明細書に組込まれる）。
【０１２４】
　精巣に対する精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドの効果を評価するためのインビボアッセイは、当業界において良く知られている。たとえば、化合物が特定の期間、腹腔内注入され得る。その処理期間の後、動物は殺され、そして精巣が除去され、そして計量される。精巣が均質化され、そして精子頭部が計数される(Meistrichなど., EXP. Cell Res. 99: 72-78, 1976;引用により本明細書に組込まれる）。
【０１２５】
　他の活性、たとえば本発明のタンパク質に関連する走化性活性が分析され得る。たとえば精子形成における後期段階の因子は、卵−精子相互作用及び精子運動性に関与している。活性、たとえば低温保存された精子の生存率の増強、先体反応の刺激、精子運動性の増強、及び卵−精子相互作用の増強は、本発明のタンパク質に関与している。
【０１２６】
　そのような活性を評価するアッセイは知られている(Rosenberger, J. Androl. 11: 89-96, 1990; Fuchs, Zentralbl Gynakol 11: 117-120, 1993; Neurwingerなど., Andrologia 22: 335-9, 1990; Harris など., Human Reprod. 3: 856-60, 1988; 及びJockenhovel, Andrologia 22: 171-178, 1990; Lessingなど., Fertil. Steril. 44: 406-9 (1985); Zaneveld, In Male Infertility Chapter 11, Comhaire Ed., Chapman & Hall, London 1996; すべては引用により本明細書中に組込まれる）。それらの活性は、増強された受精能及び成功した生殖をもたらすことが予測される。
【０１２７】
　従って、本発明のタンパク質は、ヒト及び動物における助力された生殖の間、受精の増強に適用され得る。そのような助力された生殖方法は、当業界において知られており、そして人工受精、インビトロ受精、胚移行、及び配偶子卵管内移行を包含する。そのような方法は、自然の妊娠を妨げる生理学的又は代謝的障害を有する男性及び女性を助けることのために有用である。それらは、子供を所望する女性の子供の出産を可能にするが、しかしそれを所望しない女性に対しては、自然では妊娠できなくする。
【０１２８】
　そのような方法はまた、動物繁殖プログラム、たとえば家畜の繁殖にも使用され、そしてトランスジェニック動物の創造のための方法として使用され得る。本発明のタンパク質は、卵の受精の剤、精子、卵、又は卵−精子混合物と共に組合され得る。いくつかの種においては、精子はインビトロ受精工程の間、自発的に受精能を獲得するが、しかし通常、精子は、インビボ及びインビトロの両者において、延長された期間にわたって受精能を獲得する。成功した受精の傾向を高めるためには、そのような工程の間、精子活性化を高めることが好都合である。
【０１２９】
　そのような助力された生殖方法に使用される、洗浄された精子、又は精子血漿から除去された精子は、変更された生殖機能、特に、減じられた運動性及び透明帯相互作用を有することが示されている。助力された生殖方法の間、受精力を増強するために、精子は外部から添加される化合物を用いて、受精能を獲得する。
【０１３０】
　正常な対象からの精液血漿、又は精子を活性化することが知られている化合物、たとえばカフェイン、ジブチルサイクリックアデノシン−リン酸（dbcAMP）又はテオフィリンのカクテルを含む“受精能獲得媒体”における精子の懸濁は、精子の改良された生殖機能、特に精子運動性及び透明帯貫通性をもたらした（Parkなど., Am. J. Obstet. Gynecol. 158: 974-9, 1988; Vandevoort など., Mol. Repro. Develop. 37: 299-304, 1993; Vandevoort and Overstreet, J. Androl. 16: 327-33, 1995)。
【０１３１】
　インビボでの及び低温保存された精液に関しての免疫反応性クラキシンの存在は、精子運動性を有意に高めることが示された(Juangなど., Anim. Reprod. Sci. 20: 21-9, 1989; Juang など., Anim. Reprod. Sci. 22: 47-53, 1990)、ブタリラキシンは、低温保存されたヒト精子における精子運動性を刺激し(Colonなど., Fertil. Steril. 46: 1133-39, 1986; Lessing など., Fertil. Steril. 44: 406-9, 1985）、そして洗浄されたヒト精子のインビトロでの頸部粘液の貫通能力を保護した(Brennerなど., Fertil. Steril. 42: 92-6, 1984)。本発明のポリペプチドは、低温保存された精子の生存率を高め、精子の運動性を高め、そして受精力を高めるためのそのような方法、特に助力された生殖の方法に使用され得る。
【０１３２】
　妊娠を所望しない場合、 Zins2タンパク質又はタンパク質フラグメントは、ヒト及び動物における成功した生殖に対して決定的な工程又は複数の工程を選択的に阻害するための抗体及び／又は細胞仲介の免疫性の形成を誘発するために、“免疫避妊”又は“抗−受精能”ワクチンにおける成分としての使用のための生殖細胞特異的抗原として機能することができる。免疫避妊剤の開発への精子及び精巣抗原の使用は、記載されている（O'Hernなど., Biol. Reprod. 52: 311-39, 1995; Diekman and Herr, Am. J. Reprod. Immunol. 37: 111-17, 1997; Zhu and Haz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4704-9, 1997;それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【０１３３】
　ジフテリア又は破傷風キャリヤーに連結されるヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(HCG）に基づくワクチンが現在、臨床試験下にある（Talwarなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8532-36, 1994;引用により本明細書に組込まれる）。一回の注入が、ウサギにおいて一年近く持続する高い力価の抗体の生成をもたらした（Stevens, Am. J. Reprod. Immunol. 29: 176-88, 1993;引用により本明細書に組込まれる）。ワクチンを用いての免疫避妊のそのような方法は、 Zins2精巣−特異的インシュリン同族体タンパク質又はそのフラグメントを包含する。
【０１３４】
　 Zins2タンパク質又はフラグメントは、キャリヤータンパク質又はペプチド、たとえば破傷風又はジフテリアトキソイドに接合され得る。上記のようなアジュバントが含まれ得、そして前記タンパク質又はフラグメントが固有の免疫反応性を増強するために他の分子により非共有的に会合され得る。投与方法、及び投与回数を決定するための方法は当業界において知られている。そのような方法は、数週間にわたって多くの一次注射を包含し、続いて、適切な抗体力価の維持が必要とされる場合、追加二次免疫注射を伴う。
【０１３５】
　雄及び雌における生殖機能の調節は、血液−骨ホルモンによる視床下部及び下垂体前葉のフィードバック阻害により一部、制御される。精巣タンパク質、たとえばアクチビン及びインヒビンは、下垂体のための卵胞刺激ホルモン(FSH）を包含する活性分子の分泌を調節することが示されている（Ying, Endodcr. Rev. 9: 267-93, 1988; Plantなど., Hum. Reprod. 8: 41-44, 1993）。卵巣においてまた発現されるインヒビンはまた、卵巣機能を調節することが示された（Woodruffなど., Endocr. 132: 2332-42, 1993; Russellなど., J. Reprod. Fertil. 100: 115-22, 1994)。
【０１３６】
　リラキシンはまた、本発明のポリペプチドがまた、雌性配偶子及び生殖管に対して効果を有するように、卵胞及び子宮成長を調節する全射及び局部作用ホルモンであることも示されている(Bagnellなど., J. Reprod. Fertil. 48: 127-38, 1993）。それらの機能はまた、 Zins2タンパク質にも関係しており、そして精巣又は卵巣機能を調節するために使用され得る。
【０１３７】
　医薬使用のためには、本発明のポリペプチドは、従来の方法に従って、非経口、特に静脈内又は皮下供給のために配合される。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な時間にわたってのボーラス注射又は注入によるであろう。一般的に、医薬製剤は、医薬的に許容できるビークル、たとえば塩溶液、緩衝溶液、水中、５％デキストロース、又は同様のものと共に、精巣−特異的インシュリン同族体ポリペプチドを含むであろう。製剤はさらに、１又は複数の賦形剤、保存剤、溶解剤、緩衝剤、バイアル表上のタンパク質損失を阻止するためのアルブミン、等を含むことができる。
【０１３８】
　配合方法は当業界において良く知られており、そしてたとえば、Remington's Pharmaceutical Science, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA,1990（引用により本明細書に組込まれる）に開示される。治療用量は、一般的に、１日当たり 0.1〜100 pg／Kg患者の体重、好ましくは 0.5〜20μｇ／Kg・日の範囲であり、そして正確な用量は、処理されるべき患者の病状の性質及び重症度、患者の特性、等を考慮して、許容される標準に従って臨床医により決定される。用量の決定は、当業者のレベル内である。ポリペプチドは、１週間又はそれ以下の間、しばしば１〜３日間、急性処置のために投与され得、又は慢性処理のためには、数カ月〜数年の間、使用され得る。
【実施例】
【０１３９】
例１
　Ａ．インシュリンに対して構造的に相同の配列についてのcDNAデータベースの走査は、配列番号８のヌクレオチド１−189 に及ぶ相同性を伴って、リラキシンに対して相同であるヒト精巣cDNAライブラリーからの発現された配列標識(EST）を示した。このEST は、分泌シグナル配列、続いてインシュリン、すなわちファミリーＢ鎖モチーフをコードした。その配列の分析は、インシュリンＢ鎖同族体の追加の確認を提供する、推定上の両親媒性ヘリックスを示した。
【０１４０】
　Ｂ．ラット第１鎖cDNA反応は、 1.0μｇ／μｌの濃度でのラット精巣ポリｄ（Ｔ）−分泌されたポリ（Ａ）+ mRNA(Clontech, PoloAlto, CA) 10μｌ、及びXho Ｉ制限部位を含む、20ｐモル／μｌの第１鎖プライマーZC6091（配列番号３）２μｌを含んだ。その混合物を70℃で４分間、加熱し、そして氷上で急冷することによって冷却した。第１鎖cDNA合成を、８μｌの第１鎖緩衝液（５×SUPERSCRIPT TM緩衝液；Life Technologies, Gaithersbnrg, MD),　100mMのジチオトレイトール４μｌ、及びそれぞれ10mMのdATP, dGTP、及び５−メチル−dCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)２μｌを、 RNA−プライマー混合物に添加することによって開始せしめた。
【０１４１】
　その反応混合物を45℃で２分間インキュベートし、続いて、 200Ｕ／μｌのRNアーゼＨ−逆転写酵素（SUPERSCRIPT II（商標）；Life Technologies)10μｌを添加した。第１鎖合成の効率を、分析のための反応をラベルするためにその反応混合物の１つからの５μｌアリコートに10μCiの32Ｐ−αdCTPを添加することによって、平均した反応において分析した。前記反応物を45℃で１時間インキュベートし、続いて、50℃で10分間インキュベートした。
【０１４２】
　ラベルされた反応における組込まれなかった32Ｐ−αdCTPを、 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）上でのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされなかった第１鎖反応における組込まれなかったヌクレオチド及びプライマーを、 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）上でのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされた第１鎖cDNAの長さを、アガロースゲル電気泳動により決定した。
【０１４３】
　第２鎖反応は、 102μｌのラベルされていない第１鎖cDNA、30μｌの５×ポリメラーゼＩ緩衝液(125mMのトリス：HCl, pH7.5, 500mM の KCl, 25mMのMgCl2,　50mMの(NH4)2SO4),　100mMのジチオトレイドル２μｌ，10mMの個々のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む溶液３μｌ，５mMのβ−NAD ５μｌ，３Ｕ／μｌのＥ．コリ DNAリガーゼ（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA）２μｌ，10Ｕ／μｌのＥ．コリ DNAポリメラーゼＩ（New England Biolabs)５μｌ、及び２Ｕ／μｌのRNアーゼＨ（Life Technologies) 1.5μｌを含んだ。その第２鎖合成反応の１つからの10μｌアリコートを、第２鎖合成の効率をモニターするために、10μCiの32Ｐ−αdCTPの添加によりラベルした。
【０１４４】
　その反応物を16℃で２時間インキュベートし、続いて、10μｌのＴ４ DNAポリメラーゼ（10Ｕ／μｌ，Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を添加し、そして16℃でさらに５分間インキュベートした。そのラベルされた反応における組込まれなかった32Ｐ−αdCTPを、 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）を通してのクロマトグラフィー処理により除去し、その後、アガロースゲル電気泳動により分析した。ラベルされなかった反応を 0.5ＭのEDTA20μｌの添加により終結せしめ、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより抽出し、続いて、 2.5Ｍの酢酸アンモニウムの存在下でのエタノールにより沈澱せしめた。cDNAの収量は、10μｇのmRNA鋳型から開始して約２μｇであることが推定された。
【０１４５】
　Eco RIアダプターを上記cDNAの５′末端上に連結し、発現ベクター中へのクローニングを可能にした。cDNA（約２μｇ）の10.5μｌアリコート及び65ｐモル／μｌのEco RIアダプター（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）５μｌを、 2.5μｌの10×リガーゼ緩衝液（60mMのトリス−HCl, pH7.5, 10mMのMgCl2)，10mMのATP 2.5 μｌ、及び15Ｕ／μｌのＴ４ DNAリガーゼ（Promega Corp., Madison,WI）１μｌと共に混合した。その反応物を12℃で一晩（約12時間）インキュベートした。反応を、70℃での20分間のインキュベーションにより停止した。インキュベーションの後、反応物を37℃に冷却した。その反応に、10mMの ATP 2.5μｌ及び10Ｕ／μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Life Technologies）３μｌを添加し、連結されたEco RIアダプターをリン酸化した。
【０１４６】
　発現ベクター中へのcDNAの指向的クローニングを促進するために、cDNAをXho Ｉにより消化し、５′Eco RI付着端及び３′Xho Ｉ付着端を有するcDNAをもたらした。そのcDNAの３′末端でのXho Ｉ制限部位は、ZC6091プライマー（配列番号３）を用いて前もって導入されていた。制限酵素消化を、上記cDNA25μｌ，15μｌの10×Ｈ緩衝液(Boehringer Mannheim）、水 109μｌ及び40Ｕ／μｌのXho I(Boehringer Mannheim) 1.0μｌを含む反応混合物において行なった。消化を37℃で４分間、実施した。反応を、65℃での10分間のインキュベーションにより停止し、そして 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）を通してクロマトグラフィー処理した。
【０１４７】
　cDNAをエタノール沈澱せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして20μｌの１×ゲル負荷緩衝液（10mMのトリス：HCl, pH8.0, １mMのEDTA, ５％のグリセロール及び 0.125％のブロモフェノールブルー）に再懸濁した。その再懸濁されたcDNAを65℃に５分間、加熱し、氷上で冷却し、そして 0.8％低溶融アガロースゲル上で電気泳動した。汚染性アダプター、及び長さ 0.6Kb以下のcDNAをゲルから切り出した。電極を逆にし、そしてcDNAを、レーン起点近くに濃縮されるまで、電気泳動した。
【０１４８】
　濃縮されたcDNAを含むゲルの領域を切り出し、そして微小遠心分離管に入れ、そしてゲルスライスのおおよその体積を決定した。ゲルスライスの体積の約３倍の水(300μｌ）及び35μｌの10×β−アガロースＩ緩衝液(New England Biolabs）のアリコートを、前記管に添加し、そしてアガロースを、65℃に15分間、加熱することにより溶融した。サンプルを45℃に平衡化した後、３μｌの１Ｕ／μｌのβ−アガロースＩ(New England Biolabs）を添加し、そしてその混合物を45℃で60分間インキュベートし、アガロースを消化した。
【０１４９】
　インキュベーションの後、３Ｍの酢酸ナトリウム40μｌをサンプルに添加し、そしてその混合物を氷上で15分間インキュベートした。サンプルを室温で15分間、14,000xgで遠心分離し、消化されていないアガロースを除去した。cDNAをエタノール沈澱せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして10μｌの水に再懸濁した。
【０１５０】
　得られるcDNAを、Eco RI及びXho Ｉにより前もって消化され、そして脱リン酸化されたλファージベクターλZap（商標）II(StratagoneCloning Systems, La Jolla, CA)中にクローン化した。λZap（商標）IIベクターへのcDNAの連結を、 1.0μｌの調製されたベクター、 1.0μｌのラット精巣cDNA、 1.0μｌの10×リガーが緩衝液(Promega），10mMの ATP 1.0μｌ、水５μｌ及び15単位／mlでのＴ４ DNAリガーゼ(Promega） 1.0μｌを含む反応混合物において実施した。その連結混合物を、５℃〜15℃の温度グラジエント下で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、その連結混合物をGIGDACK（商標）III GOLDパッケージング抽出物（Stratagene Cloning Systems）を用いてファージ中にパッケージし、そして得られるライブラリーを、製造業者の規格に従って力価した。
【０１５１】
　Ｃ．ラット精巣λ ZapIIライブラリーを用いて、XLI Blue MRF'宿主細胞（Stratagene Cloning Systems）を感染せしめ、そして２×106 個のpfu を、45の 150−mm NZYプレート上にプレートした。接種されたプレートを37℃で一晩インキュベートした。フィルタープラークリフトを、製造業者により提供される工程に従って、HYBOND-Nナイロン膜(Amersham, Arlington Heights, IL）を用いて行なった。フィルターを、 1.5ＭのNaCl及び 0.5ＭのNaOHを含む溶液においての室温での変性により処理した。
【０１５２】
　フィルターを、フィルター紙上にすぐにブロットし、過剰の変性溶液を除去し、続いて、１Ｍのトリス−HCl, pH7.5及び 1.5ＭのNaCl溶液において５分間、中和した。ファージ DNAを、STRATALINKER（商標）UV Crosslinker (Stratagene Cloning Systems) を用いて、 1,200μジールのUVエネルギーによりフィルター上に固定した。固定した後、フィルターを、ハイブリダイゼーション溶液（５×SSC,５×Denhardt's溶液、 0.2％SDS及び１mMのEDTA）においてプレハイブリダイズした。加熱変性された、最終濃度 100μｇ／mlでの剪断されたサケ精子 DNAを添加した。フィルターを65℃で一晩、プレハイブリダイズした。
【０１５３】
　プローブを、ヒト精巣−特異的インシュリン同族体cDNAコード領域（例５を参照のこと）を増幅するために企画されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、 PCR生成物として調製した。 PCR反応混合物は、２μｌのZC10008(配列番号４）及び２μｌのZC10491(配列番号５）、 100フェントグラムのpSLHIT-10(例５に記載される）１μｌ，10mMのdNTP１μｌ，10μｌの10×KlenTaq 緩衝液（Clontech）、82μｌの水、及び２μｌのKlenTaq　DNAポリメラーゼ（Clontech）を含んだ。その PCR反応を次の通りに行なった：94℃で１分間、１サイクル；95℃で20秒間、60℃で20秒間、68℃で１分間、30サイクル；及び68℃で10分間、１サイクル。 PCR生成物を、 1.5％低溶融アガロースゲル上でゲル精製した。
【０１５４】
　50ナノグラムの PCR生成物を、MEGAPRIME TM DNA Labeling System (Amersham）を用いて、製造業者の規格に従って、ランダムプライミングによる32Ｐ−dCTPにより放射性ラベルした。
【０１５５】
　プレハイブリダイゼーション溶液を、 1.4×106cpm／mlのラベルされたプローブを含む新しいハイブリダイゼーション溶液により置換し、そして60℃で64時間、ハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションの後、そのハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてフィルターを、１×SSC,　0.25％ SDS及び１mMのEDTAを含む洗浄溶液により45℃ですすいだ。フィルターをオートラジオグラフフィルム上に配置し、そして−70℃で照射し、そして96時間、スクリーンを強めた。
【０１５６】
　オートラジオグラフの試験は、ラベルされたプローブによりハイブリダイズされた134 の領域を示した。寒天プラグを、精製のために73の領域から採取した。個々の寒天プラグを、１％（ｖ／ｖ）のクロロホルムを含むSM１mlにより一晩ソークした（Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ）。インキュベーションの後、個々のプラグからのファージを、SMによりに１：1000に希釈した。
【０１５７】
　12.5μｌのアリコートを、Ｅ．コリXL-1 Blue MRF 細胞上にプレートした。そのプレートを37℃で一晩インキュベートし、そして上記のようにして、フィルターリフトを調製し、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、洗浄し、そしてオートラジオグラフィー処理した。得られるオートラジオグラフの試験は、３つのフィルターリフト上で陽性シグナルを示した。
【０１５８】
　プラスミドを、IXASSIST／SOLRTMシステム（Stratagene Cloning Systems）を用いて、製造業者の規格に従って、切り出した。それらのプラスミドを、挿入体のサイズ決定及び配列決定のために PCRにより増殖した。pSLRatzins2-1 と称するクローンが、0.79Kbの挿入体を有することが示され、そして配列番号１に示される配列を含んだ：
【０１５９】
例２
　プローブを、 Zins2の十分な長さのコード配列から調製し、そしてHuman Maltiple Tissue Northern Blots (Clontech）をプローブするために使用した。そのノーザン分析は、精巣においてのみ存在する、約 1.2Kbでのバンドを示した。
【０１６０】
例３
　現場（in situ)ハイブリダイゼーションを、精巣内にZins2 ポリペプチドの発現を局在化するために行なった。
　Ａ．オリゴヌクレオチドプライマーを、ATG でプライミングを開始し、そしてSal Ｉクローニング部位を導入するよう企画し、そして停止コドン配列からすぐ下流でプライミンを開始し、３′非コード領域を排除し、そしてXba Ｉクローニング部位を導入するよう企画した（ZC10008;　配列番号４；及びZC10491:　配列番号５）。 PCRのための鋳型は、精巣cDNAであり、そして反応を次の通りに行なった：１μｌの鋳型 DNA：10μｌのKlenTaq 緩衝液（Clontech）；10mMのdNTP１μｌ；２μｌの個々のZC10008(配列番号４）及びZC10491(配列番号5); 87μｌの水；及び１μｌのKlenTaq ポリメラーゼ（Clontech）を混合し、そして95℃で30秒間、60℃で30秒間、及び68℃で２分間、20サイクル実施した。
【０１６１】
　得られる PCR生成物をフェノール−クロロホルム抽出し、そして DNAをエタノールにより沈澱せしめ、そして再懸濁した。その再懸濁された DNAをSal Ｉ及びXbaＩにより消化し、そしてpBluescript SK+（商標）phagemid ベクター（Stratagene）中に連結した。
【０１６２】
アンチセンスリボプローブを、ベクターのＴ７ポリメラーゼプロモーターを用いて調製した。30μｌのpSLHIT-7を 150単位のXba Ｉにより消化し、そしてフェノール−クロロホルム抽出し、エタノールにより沈澱せしめ、そして水に再懸濁した。センスリボプローブを、 200単位のXho Ｉにより30μｌのpSLHIT-7を消化することによって、Ｔ３ポリメラーゼプロモーターを用いて調製し、そして次に、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノールにより沈澱せしめ、そして水に再懸濁した。
【０１６３】
　 DNAのラベリングを次の反応で行なった：水20μｌ及び10×転写緩衝液（Ambion, Anstin, TX）２μｌ中、DNA １μｇ；10mMの個々のATP, CTP、及びGTP １μｌ；1000Ci／ｍモル(12,500mCi／ml）での35Ｓ UTP５μｌ（Amersham）及びＴ３又はＴ７ポリメラーゼ（Ambion）２μｌを混合し、そして37℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、その反応物を遠心分離し、そして50μｌのSET-DTT(10％のSDS 100 μｌ；１Ｍのトリス（pH7.5)10μｌ； 0.5ＭのEDTA (pH8.0)２μｌ；１ＭのDTT 10μｌ； 878μｌの水）を個々の管に添加し、そしてその反応物を65℃で５分間インキュベートした。
【０１６４】
　その反応混合物を遠心分離し、そして１μｌ／反応をcpmについて分析した。残り（69μｌ）の反応物をSephadex G-50 スピンカラム(Pharmacia）上で精製した。得られるプローブは、アンチセンスプローブに関して 1.8×106cpm／μｌであり、そしてセンスプローブに関して 8.9×106cpm／μｌであった。
【０１６５】
　Ｂ．精巣組織を、当業界において知られている技法を用いて、現場ハイブリダイゼーションのために調製した。たとえば、Simmonsなど., J. of Histotechnology 12: 169-181, 1989; 及びSylvester など., Biol. of Reproduction 45: 195-207, 1991を参照のこと。
　手短に言及すれば、Macaque モンキーの精巣組織を次の通りにして調製した：
　塩溶液及び固定剤による灌流の20分前、モンキーをペパリンにより灌流した。
　管系を塩溶液（９％NaCl）及び固定剤（表３及び４を参照のこと）により満たし、そして固定剤は氷上に及び塩溶液は室温で保持された。
【０１６６】
【表３】
2004073205.tif 000005
【０１６７】
【表４】
2004073205.tif 000006
【０１６８】
　10％スクロースを含む固定剤Ｃ
　50mlの円錐状遠心分離管に２ｇのスクロースを配置し、次に固定剤Ｂを添加し、20mlにした。
　時間ゼロで、モンキーにナトリウムペントバルビトールを注射し、そして動物が足の肉趾をつまんで、もはや反応しない場合、手術工程を開始した。
【０１６９】
　胸部腔を横隔膜まで開口し、作業部分を明確にした。短く太くされた18ｇ針（塩溶液により満たされた管に結合される）を、左心室中に挿入した。心臓が膨張したらすぐに、右心房をクリップで留めた。ポンプ設定を、40ml／分の速度に徐々に調節した。
　精巣を露出し、精巣の動脈及び静脈の漂白について観察し、そして血液が塩溶液により置換された徴候を観察した。
【０１７０】
　精巣を漂白した後、ポンプを、塩溶液から固定剤Ａに変換した。筋肉の単収縮又は収縮が、固定化が始まった徴候として用いられた。40ml／分での 250mlの固定剤Ａを、動物中に灌流した。固定剤による灌流が完結した後、ポンプを、40ml／分で５分間、固定剤Ｂに変換し、そして次に、 400〜450 mlの固定剤Ｂが灌流されるまで、20ml／分の速度に遅めた。
　精巣を切除し、そして固定剤Ｃ12，４℃で一晩、貯蔵した。
【０１７１】
　Ｃ．マカークザルの精巣の断面のスライドを、次の通りにしてハイブリダイゼーションのために調製した：
　スライドを、キシレンに２度、10分間、含浸することによって脱パラフィン化した。脱パラフィン化の後、スライドを、低下する濃度のエタノール溶液(100％，99％，95％，85％，70％，50％，30％）に、それぞれ２分間、含浸することによって再水和化した。
【０１７２】
　スライドを、予備加熱されたプロテイナーゼＫ溶液（20mg／mlのプロテイナーゼＫ20μｌ,0.5ＭのEDTA40ml，pH8.0, 320mlの殺菌された水）により37℃で30分間、処理した。スライドを、殺菌された水により２分間、すすぎ、そして次に、スライドを 0.1Ｍのトリエタノールアミン（pH8.0)により３分間すすいだ。スライドを、アセチル化溶液(500μｌの無水酢酸、 0.1Ｍのトリエタノールアミン 200ml）により10分間すすいだ。スライドを２×SSC により２分間すすいだ。
　組織を、上昇する濃度のエタノール溶液（上記に列挙される濃度の逆の順序）にスライドを含浸することによって脱水し、そして次に、乾燥剤により真空下で1.5 時間、乾燥せしめた。
【０１７３】
　Ｄ．用意されたマカークザル精巣フライドを、次の成分を含む溶液においてハイブリダイズした； 100％の脱イオン化されたホルムアミド（50％） 2.5ml，10％硫酸デキストラン、３ＭのNaCl, １×Denhardt's溶液、 100mMのトリス、pH8.0,10mg／mlのサケ精子 DNA（40μｇ／ml）20μｌ及び 100mMのDTT.プローブ（例３Ａに記載されるような）を、1.67×107cpm／mlの放射能の最終体積のために添加した。
　70μｌの合計プローブを添加し（約1.2 ×106cpm／スライド）、そしてパラフィンにより個々のスライドを被覆した。スライドを、湿性スライドチャンバーにおいて50℃で一晩ハイブリダイズした。
【０１７４】
　Ｅ．インキュベーションの後、スライドを、パラフィンを弱めるために、４×SSC に約30分間、配置した。
　パラフィンを除去し、そしてスライドを４×SSC により４度、それぞれ５分間、洗浄し、そして次に、RNアーゼ溶液（20μｇのRNアーゼＡ， 0.5ＭのNaCl, 10mMのトリス：HCl, pH8.0, １mMのEDTA,pH8.0)により処理した。
【０１７５】
　RNアーゼ溶液を37℃に予備加熱し、そしてスライドをRNアーゼ溶液において37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションの後、スライドを２×SSC ／10mMのDTT により２度、それぞれ10分間、RTで、１×SSC ／10mMのDTT により１度、10分間、RTで、及び 0.5×SSC ／10mMのDTT により１度、10分間、RTで洗浄した。スライドを、予備加熱された 0.1×SSC ／10mMのDTT により30分間、60〜65℃で洗浄した。
　組織サンプルを、30％，50％，70％，85％，95％，99％及び 100％の一連のエタノール溶液を用いて脱水した。脱水の後、スライドを十分に排水し、そして乾燥剤と共に真空下に１時間、配置した。
【０１７６】
　Ｆ．スライドを、溶融された（42℃）Kodak NTB2 Emulsion (Kodak, Rochester, NY)中に予備保温された（40℃）スライドを浸し、スライドを乾燥せしめ、次にそれらを光を通さない密封された容器において乾燥剤と共に４℃で貯蔵することによって、写真用感光乳剤により処理した。
　スライドを、室温に暖め、十分な強さのKodak D-19現像液(Kodak) に含浸し、水により8 度、すすぎ、Kodak 固定剤（kodaK)に10分間、含浸し、そして水に８度、浸すことによって、いくつかの間隔で現像した。
【０１７７】
　スライドを次の通りにして染色した：
　ヘマトキシリン溶液に 1.5時間、殺菌された水に５分間、95％エタノールによる５回の簡単なすすぎ、 0.1％エオシンケに１分間、殺菌された水に２分間、95％エタノールによる８回の簡単なすすぎ、95％メタノールに２分間、 100％エタノールによる８回の簡単なすすぎ、 100％エタノールに２分間、キシレンによる８回の簡単なすすぎ、キシレンに２分間。
【０１７８】
　スライドをキシレンに再び浸し、次に少量のPermount (Fisher SP15-100)により被覆し、そしてカバーガラスによりおおい、そして Zins2（アンチセンスプローブ）一対一負の対照（センスプローブ）の分布を示す銀色の粒状物について顕微鏡下で観察した。 Zins2 mRNA は、輸精管及び精巣上体に局在化されることが、現場ハイブリダイゼーションにより見出された。
【０１７９】
例４
　 Zins2を、Human/Rodont Somatic Cell Hybrid Mapping Panel Number2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of Medical Research, Camben, NJ)を用いて、 PCRによりヒト染色体９に対してマッピングした。パネルは、１つの特定のヒト染色体を個々に保持する24のヒト／ゲッ歯動物体細胞ハイブリッドから単離された DNA；及び親 DNAから成る。特定の Zins2オリゴヌクレオチドプライマー、センス ZC10684（配列番号６）及びアンチセンZC10685(配列番号７）を、 PCR増幅のために使用した。 PCR条件は次の通りであった：初期の１サイクル、95℃で５分間の変性、35サイクル、95℃で30秒間の変性、68℃で２分間のアニーリング及び72℃で30秒間の延長、続いて最終の１サイクル、72℃で８分間の延長。
【０１８０】
　それぞれ50μｌの PCR反応は、５μｌの10×KlenTaq　PCR反応緩衝液(CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), ４μl のdNTP混合物（それぞれ 2.5mM, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 2.5 μｌ（20ｐモル／μｌ）のZC10684(配列番号６）、 2.5μｌ（20ｐモル／μｌ）のZC10685(配列番号7)、 25μｌの PCR−品種の ddH2O，１μｌの50×Advantage KlenTaq ポリメラーゼ混合物(CLONTECH Laboratories, Inc.) 、及びそれぞれのヒト／ゲッ歯動物の体細胞ハイブリッド（10ng／μｌ）からの10μｌの DNAから成った。反応物を、３％ NuSieve GTGアガロースゲル（FMC Bioproducts, Rockland, ME)上での電気泳動により分離した。その結果は、 Zins2がヒト染色体９にマッピングしたことを示した。
【０１８１】
　 Zins2をさらに、Whitehead Institute/MIT Center for GenomeResearch's Gene Bridge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) の市販バージョンを用いて、染色体９ｐ24に対してマッピングした。GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel は、93の放射線ハイブリッドクローンの個々からのPCRable　DNA、及び２種類の対照 DNA(HFLドナー及びＡ23受容体）を含む。市販の wwwサーバー（attp: //www-genome. wi. mit. edu/cgi-bin/contig/rhmapper. pl) は、GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel により構成されたヒトゲノムのWhitehead Institute/MIT Center for Genome Research's放射線ハイブリッド地図（“WICGR ”放射線ハイブリッド地図）に関してのマッピングを可能にする。
【０１８２】
　GeneBridge 4 RH Panel による Zins2のマッピングのために、25μｌの反応物を、PCRable 96−ウェル　マイクロタイタープレート(Stratagone, La Jolla, (A)に設定し、そしてRobocycler Gradient 96　熱サイクラー（Stratagene）を使用した。95の PCR反応物の個々は、 2.5μｌの10×KlenTaq 反応緩衝液（Clontech）、２μｌのdNTP混合物（それぞれ 2.5mM, Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1.25μｌのセンスプライマー、ZC10,684（配列番号６）、1.25μｌのアンチセンスプライマー、ZC10,685（配列番号７）、 2.5μｌのRediLoad (Research Genetics)、 0.5μｌの50×Advantage KlenTaq Palymerase Mix (Clontech) 、個々のハイブリッドクローン又は対照からの25ngの DNA、及び25μｌの合計体積のためのddH2O から成った。
【０１８３】
　反応物を等量の鉱油により被覆し、そして密封した。 PCRサイクラー条件は次の通りであった：初期の１サイクル、95℃で５分間の変性、35サイクル、95℃で１分間の変性、70℃で１分間のアニーリング、及び72℃で１分間の延長、続いて最終の１サイクル、72℃で７分間の延長。反応物を、３％NuSieve GTG アガロースゲル（FMC Bioproducts, Rockland, ME)上での電気泳動により分離した。
【０１８４】
　その結果は、 Zins2がWICGR 放射線ハイブリッド地図に基づいて、ヒト染色体の連鎖群の上部から13.70cR 3000を位置づけることを示した。近位及び遠位骨格マーカーは、それぞれCHLC. GCT3G05 及び79S17gであった。周囲のマーカーの使用は、組込まれたLDB 染色体９地図上の9p24領域における Zins2を位置づける（The GeneticLocation Database, University of Southampton, www server: http: // cedar. gonetics. soton. ac. uk/public html1) 。
【０１８５】
例５
　オリゴヌクレオチドプライマーを、 EST配列の推定上の開始コドンでプライミングを開始するよう企画し、そしてその開始コドンの上流のKozak 翻訳コンセンサス配列、及びSal Ｉクローニング部位を含んだ。 PCRのための鋳型は、Marathon Readyヒト精巣cDNA（Clontech, Palo Alto, CA)であった。 PCRのための条件は次の通りであった：５μｌの鋳型cDNA；10μｌのKlenTaq 10×緩衝液；10mMのdNTP／μｌ；20ｐモル／μｌのZC10008(配列番号４）１μｌ；10ｐモル／μｌのAP-1プライマー（Clontech）２μｌ；水79μｌ；及び２μｌのKlonTaq ポリメラーゼ。反応は、95℃で30秒間、及び68℃で２分間、30サイクル実施された。
【０１８６】
　増幅された DNAを、低溶融アガロースにおいてゲル精製し、そして 700個の塩基対バンドが見出された。そのバンドの配列分析は、PCR 生成物が EST配列を重複し、そしてcDNA配列が、配列番号８に示されるような 202個の塩基対の３′側未翻訳配列を有する十分な長さの配列であることを決定した。そのcDNAを Zins2と命名した。PCR 生成物を、Sal Ｉ及びEco RIにより消化し、そしてSal Ｉ及びEco RIにより消化された発現ベクター pHZ-200により連結した。
【０１８７】
　 pHZ-200は、 pHZ-1と同じであるが、但しジヒドロ葉酸レダクターゼ配列が耐ネオマイシン性遺伝子により置換されている。プラスミド pHZ-1は、哺乳類細胞において、又はインビトロで転写されたmRNAからのカエル卵母細胞翻訳システムにおいてタンパク質を発現するために使用され得る発現ベクターである。 pHZ-1発現単位は、マウスメタロチオネイン−１プロモーター、コード配列の挿入のためのユニーク制限部位を含む複数のクローニングバンブを端に有するバクテリオファージＴ７プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター及びバクテリオファージＴ７ターミネーターを含んで成る。
【０１８８】
　さらに、 pHZ-1は、複製のＥ．コリ起点；細菌βラクタマーゼ遺伝子；SV40プロモーター及び起点を含んで成る哺乳類選択マーカー発現単位；ネオマイシン耐性遺伝子及びSV40転写ターミネーターを含む。連結反応に起因するプラスミドは、pSLHIT−１，２，３及び４と命名された。
【０１８９】
　オリゴヌクレオチドプライマーを、 Zins2のコード領域の５′及び３′末端にハイブリダイズするよう企画した(ZC10009、配列番号９及び ZC10537、配列番号10）。ヒト精巣cDNAライブラリーを鋳型として用いて、 PCRを次の通りに実施した：１μｌの鋳型 DNA（25ng），20ｐモル／μｌの ZC10009（配列番号９）及び ZC10532（配列番号10)(それぞれ２μｌ），10mMのdNTP１μｌ， 2.5Ｕ／μｌの活性 pfuポリメラーゼ（stratagene）１μｌ，10×活性 pfu緩衝液（stratagene）10μｌを含む同目的の反応混合物を組合した。反応を、95℃で30秒間、55℃又は50℃で30秒間、72℃で１分間、25サイクル行ない、そして次に、72℃で５分間インキュベートした。その同目的の反応からの PCR生成物を、ゲル精製し、そしてプールした。
【０１９０】
　プールされた PCR生成物を１：10及び１：100 に希釈し、そしてもう１つの PCR反応のために鋳型として使用し、ここでオリゴヌクレオチドは、 Zins2コード領域の５′及び３′末端で制限部位を組込むよう企画された。反応混合物は、１：10又は１：100 の鋳型１μｌ，20ｐモル／μｌの個々の ZC10008（配列番号４）又は ZC10538（配列番号11)(２μｌ），10mMのdNTP１μｌ，10μｌの10×活性 pfu緩衝液（stratagene）、 2.5Ｕ／μｌの活性 pfuポリメラーゼ（stratagene）１μｌ、及び83μｌの水を含んだ。反応を、95℃で30秒間、40℃で30秒間、72℃で１分間、３サイクル；95℃で30秒間、47℃で30秒間、72℃で１分間、20サイクル実施し；続いて、72℃で５分間インキュベートした。
【０１９１】
　 PCR生成物をプールし、そしてプロテイナーゼＫにより消化し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱せしめ、そして水に再懸濁した。 PCR生成物を、10％低溶融アガロース上でゲル精製した。 DNAをSal Ｉ及びEco RIにより消化し、そしてSal Ｉ／Eco RIにより消化された pHZ-200に連結した。得られるプラスミドをpSLHIT−10と命名し、そして配列分析した。
【０１９２】
例６
　十分な長さのヒト Zins2 cDNA を、λZAP（商標）IIヒト精巣cDNAをスクリーニングすることによって得た。精巣cDNAライブラリーの構成は次の通りであった：第１鎖cDNA反応は、 1.0μｇ／μｌの濃度でのヒト精巣poly d（Ｔ）−選択されたpoly（Ａ）+ mRNA（Clontech）15μｌ、及びXho Ｉ制限部位を含む20ｐモル／μｌの第１鎖プライマーZC6091（配列番号３）３μｌを含んだ。その混合物を70℃で４分間、加熱し、そして氷上で急冷することによって冷却した。
【０１９３】
　第１鎖cDNA合成を、 RNA−プライマー混合物に、12μｌの第１鎖緩衝液（５×SUPERSCRIPT TM緩衝液；Life Technologies, Gaithersburg, MD)， 100mMのジチオトレイトール６μｌ、及びそれぞれ10mMのdTTP, dATP, dGTP及び５−メチル−dCTPを含むデオキシヌクレオチド三リン酸溶液（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ)３μｌを添加することによって開始せしめた。その反応混合物を37℃で２分間インキュベートし、続いて、 200Ｕ／μｌのRNアーゼＨ- 逆転写酵素（SUPERSCRIPT II（商標）；Life Technologies)15μｌを添加した。第１鎖合成の効率を、分析のための反応をラベルするために反応混合物の１つからの５μｌのアリコートへの５μCiの32Ｐ−αdCTPの添加により平行した反応において分析した。
【０１９４】
　前記反応物を、37℃で10分間、45℃で１時間、次に50℃で10分間インキュベートした。ラベルされた反応における組込まれなかった32Ｐ−αdCTPを、 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）上でのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされなかった第１鎖反応における組込まれなかったヌクレオチド及びプライマーを、 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）上でのクロマトグラフィー処理により除去した。ラベルされた第１鎖cDNAの長さを、アガロースゲル電気泳動により決定した。
【０１９５】
　第２鎖反応は、 120μｌのラベルされていない第１鎖cDNA、36μｌの５×ポリメラーゼＩ緩衝液(125mMのトリス：HCl, pH7.5,500mMのKCl,25mMのMgCl2,50mMの(NH4)2SO4),100mMのジチオトレイドル 2.4μｌ，10mMの個々のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む溶液 3.6μｌ，５mMのβ−NAD ６μｌ，３Ｕ／μｌのＥ．コリ DNAリガーゼ（New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)3.6μｌ，10Ｕ／μｌのＥ．コリ DNAポリメラーゼＩ（New England Biolabs)９μｌ、及び２Ｕ／μｌのRNアーゼＨ（Life Technologies) 1.8μｌを含んだ。
【０１９６】
　その第２鎖合成反応の１つからの10μｌアリコートを、第２鎖合成の効率をモニターするために、10μCiの32Ｐ−αdCTPの添加によりラベルした。その反応物を16℃で２時間インキュベートし、続いて、15μｌのＴ４ DNAポリメラーゼ（10Ｕ／μｌ，Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を添加し、そして16℃でさらに５分間インキュベートした。
【０１９７】
　そのラベルされた反応における組込まれなかった32Ｐ−αdCTPを、 400孔サイズのゲル濾過カラム（Clontech）を通してのクロマトグラフィー処理により除去し、その後、アガロースゲル電気泳動により分析した。ラベルされなかった反応を 0.5ＭのEDTA20μｌの添加により終結せしめ、フェノール／クロロホルム及びクロロホルムにより抽出し、続いて、 2.5Ｍの酢酸アンモニウム及び４μｇのグリコーゲンキャリヤーの存在下でのエタノールにより沈澱せしめた。cDNAの収量は、15μｇのmRNA鋳型から開始して約３μｇであることが推定された。
【０１９８】
　Eco RIアダプターを上記cDNAの５′末端上に連結し、発現ベクター中へのクローニングを可能にした。cDNA（約 1.5μｇ）の10μｌアリコート及び65ｐモル／μｌのEco RIアダプター（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）５μｌを、２μｌの10×リガーゼ緩衝液(660mMのトリス−HCl, pH7.5,100mMのMgCl2), 10mMのATP ２μｌ、及び15Ｕ／μｌのＴ４ DNAリガーゼ（Promega Corp., Madison, WI）１μｌと共に混合した。その反応物を５℃で２時間、 7.5℃で２時間、10℃で２時間、そして12.5℃で10時間、インキュベートした。反応を、70℃で20分間のインキュベーションにより停止した。
【０１９９】
　発現ベクター中へのcDNAの指向的クローニングを促進するために、cDNAをXho Ｉにより消化し、５′Eco RI付着端及び３′Xho Ｉ付着端を有するcDNAをもたらした。そのcDNAの３′末端でのXho Ｉ制限部位は、ZC6091プライマー（配列番号３）を用いて前もって導入されていた。制限酵素消化を、上記cDNA20μｌ，10μｌの10×Ｈ緩衝液（Boehringer Mannheim)、水69／μｌ及び40Ｕ／μｌのXho Ｉ（Boehringer Mannheim) 1.0μｌを含む反応混合物において行なった。消化を37℃で40分間、実施した。反応を、70℃での10分間のインキュベーションにより停止し、そして 400孔サイズのゲル部品カラム（Clontech）を通してクロマトグラフィー処理した。
【０２００】
　cDNAをエタノール沈澱せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして14μｌの水、２μｌのリガーゼ緩衝液（Promega Corp., Madison WI), ２μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（10Ｕ／μｌ，Life Technologies)に再懸した。37℃で30分間のインキュベーションに続いて、cDNAを65℃に５分間、加熱し、氷上で冷却し、そして 0.8％低溶融アガロースゲル上で電気泳動した。汚染性アダプター、及び長さ 0.6Kb以下のcDNAをゲルから切り出した。電極を逆にし、そしてcDNAを、レーン起点近くに濃縮されるまで、電気泳動した。濃縮されたcDNAを含むゲルの領域を切り出し、そして微小遠心分離管に入れ、そしてゲルスライスのおおよその体積を決定した。
【０２０１】
　ゲルスライスの体積の約３倍の水(300μｌ）及び35μｌの10×β−アガロースＩ緩衝液(New England Biolabs）のアリコートを、前記管に添加し、そしてアガロースを、65℃に15分間、加熱することにより溶融した。サンプルを45℃に平衡化した後、３μｌの１Ｕ／μｌのβ−アガロースＩ(New England Biolabs）を添加し、そしてその混合物を45℃で60分間インキュベートし、アガロースを消化した。インキュベーションの後、３Ｍの酢酸ナトリウム40μｌをサンプルに添加し、そしてその混合物を氷上で15分間インキュベートした。サンプルを室温で15分間、14,000xgで遠心分離し、消化されていないアガロースを除去した。cDNAをエタノール沈澱せしめ、70％エタノールにより洗浄し、空気乾燥せしめ、そして10μｌの水に再懸濁した。
【０２０２】
　得られるcDNAを、Eco RI及びXho Ｉにより前もって消化され、そして脱リン酸化されたλファージベクターλZap（商標）II（stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）中にクローン化した。λZap（商標）IIベクターへのcDNAの連結を、 1.0μｌの調製されたベクター、 1.0μｌのヒト精巣cDNA、 1.0μｌの10×リガーゼ緩衝液(Promega）、10mMのATP1.0μｌ、水５μｌ及び15単位／mlでのＴ４ DNAリガーゼ(Promega） 1.0mlを含む反応混合物において実施した。その連結混合物を、５℃〜15℃の温度グラジエント下で一晩インキュベートした。インキュベーションの後、その連結混合物をGIGPACK（商標）III GOLDパッケージング抽出物（stratagene Cloning Systems）を用いてファージ中にパッケージし、そして得られるライブラリーを、製造業者の規格に従って力価した。
【０２０３】
　ヒト精巣λZaP IIライブラリーを用いて、Ｅ．コリ宿主細胞（XLI Blue MRF' 株；Stratagene Cloning Systems）を感染せしめ、そして 1.5×106 個の pfuを、約 40,000pfu／プレートの密度で150-mm NZYプレート上にプレートした。接種されたプレートを37℃で一晩インキュベートした。フィルタープラークリフトを、製造業者により提供される工程に従って、HYBOND-Nナイロン膜（Amersham, Arlington Heights, IL)を用いて行なった。フィルターを、 1.5ＭのNaCl及び 0.5ＭのNaOHを含む溶液においての室温での７分間の変性により処理した。
【０２０４】
　フィルターを、フィルター紙上にすぐにブロットし、過剰の変性溶液を除去し、続いて、１Ｍのトリス−HCl, pH7.5及び 1.5ＭのNaCl溶液において５分間、中和した。ファージ DNAを、STRATALINKER（商標）UV Crosslinker（stratagene Cloning systems)を用いて、 1,200μジールのUVエネルギーによりフィルター上に固定した。固定した後、フィルターを、ハイブリダイゼーション溶液（５×SSC,５×Denhardt's溶液、 0.2％SDS 及び１mMのEDTA）においてプレハイブリダイズした。加熱変性された、最終濃度 100μｇ／mlでの剪断されたサケ精子 DNAを添加した。フィルターを65℃で一晩、プレハイブリダイズした。
【０２０５】
　プローブを、配列番号12のヌクレオチド８〜ヌクレオチド 568に対応するヒト精巣−特異的インシュリン同族体cDNAコードを増幅するために企画されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、 PCR生成物として調製した。 PCR反応混合物は、２μｌの ZC10008（配列番号４）及び２μｌの ZC10491（配列番号５）、 100フェントグラムのpSLHIT-10(例５に記載される）１μｌ，10mMのdNTP１μｌ，10μｌの10× KlenTaq緩衝液（Clontech）、82μｌの水、及び２μｌの KlenTaq DNAポリメラーゼ（Clontech）を含んだ。その PCR反応を次の通りに行なった：94℃で１分間、１サイクル；95℃で20秒間、60℃で20秒間、68℃で１分間、30サイクル；及び68℃で10分間、１サイクル。 PCR生成物を、 1.5％低溶融アガロースゲル上でゲル精製した。
【０２０６】
　50ナノグラムの PCR生成物を、MEGAPRIME TM DNA Labeling System (Amersham）を用いて、製造業者の規格に従って、ランダムプライミングによる32Ｐ−dCTPにより放射性ラベルした。プレハイブリダイゼーション溶液を、 1.4×106cpm／mlのラベルされたプローブを含む新しいハイブリダイゼーション溶液により置換し、そして60℃で64時間、ハイブリダイズせしめた。ハイブリダイゼーションの後、そのハイブリダイゼーション溶液を除去し、そしてフィルターを、0.25％×SSC,0.25％SDS 及び１mMのEDTAを含む洗浄溶液により65℃ですすいだ。フィルターをオートラジオグラフフィルム上に配置し、そして−70℃で照射し、そして96時間、スクリーンを強めた。
【０２０７】
　オートラジオグラフの試験は、ラベルされたプローブによりハイブリダイズされた35の領域を示した。寒天プラグを、精製のために35の領域から採取した。個々の寒天プラグを、１％（ｖ／ｖ）のクロロホルムを含むSM１mlにより一晩ソークした（Sambrookなど., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。インキュベーションの後、個々のプラグからのファージを、SMにより１：1000に希釈した。12.5μｌのアリコートを、Ｅ．コリ XL-1 Blue MRF細胞上にプレートした。そのプレートを37℃で一晩インキュベートし、そして上記のようにして、フィルターリフトを調製し、プレハイブリダイズし、ハイブリダイズし、洗浄し、そしてオートラジオグラフィー処理した。得られるオートラジオグラフの試験は、３つのフィルターリフト上で陽性シグナルを示した。
【０２０８】
　プラスミドを、IXASSIST／SOLRTMシステム（Stratagene Cloning Systems）を用いて、製造業者の規格に従って、切り出した。それらのプラスミドを、挿入体のサイズ決定及び配列決定のために PCRにより増幅した。pSLZpin2と称するクローンが、 717bpの挿入体であることが示され、そして配列番号12に示される配列を含んだ。
　前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために本明細書に記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は添付される請求の範囲を除いては、限定されない。
【０２０９】
【表５】
2004073205.tif 000007
【０２１０】
【表６】
2004073205.tif 000008
【０２１１】
【表７】
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【０２１２】
【表８】
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【０２１３】
【表９】
2004073205.tif 000011
【０２１４】
【表１０】
2004073205.tif 000012
【０２１５】
【表１１】
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【０２１６】
【表１２】
2004073205.tif 000014
【０２１７】
【表１３】
2004073205.tif 000015
【０２１８】
【表１４】
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【０２１９】
【表１５】
2004073205.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】図１は、ヒト IGFＩ、ヒト IGFII、ヒトインシュリン、ヒトリラキシン２、ヒトリラキシン１、ヒトLeydig因子（HSLILH）、ヒトINSL4(初期胎盤インシュリン様因子又はEPIL）、ラット及びヒト Zins2の複数の整列を示す。
【図２】図２は、ヒト IGFＩ、ヒト IGFII、ヒトインシュリン、ヒトリラキシン２、ヒトリラキシン１、ヒトLeydig因子（HSLILH）、ヒトINSL4(初期胎盤インシュリン様因子又はEPIL）、ラット及びヒト Zins2の複数の整列を示す。
【図１】
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【図２】
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