(57)【要約】【課題】植物体として生長させられるケナフなど双子葉植物への遺伝子導入方法を提供する。【解決手段】ケナフの実生の腋芽細胞に、導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクターを有するアグロバクテリウムを感染させる工程を備えるケナフの遺伝子導入方法を提供する。腋芽細胞は、未分化状態では１つの腋芽発生部位に一つのみ存在する、と考えられている。このため、この腋芽細胞に遺伝子を導入することで、同じ形質を有するシュートを得やすく、カルス細胞に比べてキメラや突然変異の発生を抑制して、良好に遺伝子導入された植物体を入手しやすい。好ましくは、感染工程に先立って、ケナフの実生の胚軸であって、子葉の付根上端から３ｍｍ以内の部分を傷つけて、組織内部と外部との連通部を形成すると、より確実に腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させることができる。【選択図】図２
2004337043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
双子葉植物の実生の腋芽細胞に、導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクターを有するアグロバクテリウムを感染させる工程と、
前記感染工程に先立って、双子葉植物の実生の胚軸であって、子葉の付根上端から３ｍｍ以内の部分を傷つけて、組織内部と外部との連通部を形成する連通部形成工程を備える、双子葉植物の遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記感染工程に先立って、前記実生の頂芽と子葉とを除去し、子葉の付根上端を含む長さ５ｍｍ以内の胚軸片を形成する工程を備える、請求項１に記載の双子葉植物の遺伝子導入方法。
【請求項３】
双子葉植物はケナフである、請求項１又は２に記載の双子葉植物の遺伝子導入方法。
【請求項４】
遺伝子導入された双子葉植物を作出する方法であって、
双子葉植物の実生の腋芽細胞に導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクターを有するアグロバクテリウムを感染させる工程と、
前記アグロバクテリウムに感染させた実生であって、少なくとも頂芽が除去された胚軸片を、サイトカイニンを含有する培地に置床し培養して、腋芽細胞に由来するシュートを発現させる工程と、
前記腋芽細胞由来シュートの葉を除去してサイトカイニンを含有する培地に置床して培養し、多芽体を形成させる継代培養工程と
を備える、植物作出方法。
【請求項５】
前記感染工程に先立って、前記実生の子葉の付根上端から３ｍｍ以内の部分を傷つけて、組織内部と外部との連通部を形成する連通部形成工程を備える、請求項４に記載の植物作出方法。
【請求項６】
前記感染工程に先立って、前記実生の頂芽と子葉とを除去し、子葉の付根上端を含む長さ５ｍｍ以内の胚軸片を形成する工程を備える、請求項４または５に記載の植物作出方法。
【請求項７】
双子葉植物はケナフである、請求項４から６のいずれかに記載の植物作出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、双子葉植物、ケナフに好適な遺伝子を導入する技術に関し、また、遺伝子導入されたケナフ等の植物を作出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ケナフ、サイザルなどの栽培可能な草本類は、樹木と比較して生長が速く、畑などでの栽培が可能であるため、樹木に代替する天然繊維材料としての利用が推進されている。このうち、ケナフ（ハイビスカス  カナビナス、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ）は、生長が速く、靭皮組織などを種々の工業材料として利用できることから、近年注目されるようになった植物である。
ところで、ケナフにおいても他の植物、例えば、野菜や果樹におけるように遺伝子の組み換えによる改良が行えることが好ましい。このような観点から、ケナフのカルス細胞に遺伝子を導入することが提案されている。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅ１１（２），  １９９３，  １０１−１０４．
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ケナフではカルス細胞から再分化させる方法が確立されておらず、カルス細胞への遺伝子導入によっては、遺伝子が組み換えられた植物体が得られないのが現状である。
そこで、本発明では、植物体として生長させられるケナフなど双子葉植物への遺伝子導入方法、および遺伝子導入されたケナフなど双子葉植物の製造方法を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、本特許出願の出願時には未公開であるが、ケナフなどの双子葉植物を脱分化工程を経ずに増殖させる方法を見出した（特願２００１−３７１６１９号公報）。本方法では、まず、種子より得られるケナフ等の双子葉植物の実生から少なくとも茎頂部を除去した部分、好ましくは、茎頂部、子葉、及び子葉節より下方の部分を除去した胚軸片を作成する。そして、この胚軸片をサイトカイニンを含有する培地で培養し、子葉の付根に存在する腋芽細胞に由来するシュートを発現させる。その後、発現する各シュートの葉を除去してサイトカイニンを含有する培地で培養する工程を繰り返して継代培養し、多芽体（マルチプルシュート）を得る。本発明者らは、この増殖方法を用いて、遺伝子導入されたケナフなど双子葉植物を増殖するため、特に、マルチプルシュートを形成し得る腋芽細胞に遺伝子導入することに着目し、以下の発明を完成するに至った。
すなわち、本発明では、双子葉植物の実生の腋芽細胞に、導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクターを有するアグロバクテリウムを感染させる工程と、前記感染工程に先立って、双子葉植物の実生の胚軸であって、子葉の付根上端から３ｍｍ以内の部分を傷つけて、組織内部と外部との連通部を形成する連通部形成工程を備える、双子葉植物の遺伝子導入方法を提供する。
この方法によれば、腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させて、アグロバクテリウムのベクターに組み込まれた遺伝子を腋芽細胞に導入することができる。アグロバクテリウムの感染工程は、公知の条件、方法を用いることができる。腋芽細胞は、未分化状態では１つの腋芽発生部位に一つのみ存在する、と考えられている。このため、この腋芽細胞に遺伝子を導入することで、同じ形質を有するシュートを得やすく、カルス細胞の場合と比較してキメラや突然変異の発生を抑制して、良好に遺伝子導入された植物体を入手しやすい。また、腋芽細胞は、本来、生長することによって茎、葉などの各器官に分化する性質を備えているため、腋芽細胞を培養して分化させることがより容易である。
より確実に腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させるため、双子葉植物の実生において腋芽細胞のより近傍に、アグロバクテリウムが物理的に接触できるようにすることが好ましい。しかしながら、腋芽細胞のみを摘出することは、現段階では手間がかかり、また、腋芽細胞自体を損傷すると、目的とする形質転換体が得られない。そこで、腋芽細胞の損傷を回避して腋芽細胞近傍へアグロバクテリウムを接触させるために、前記感染工程に先立って、ケナフの実生の胚軸であって、子葉の付根上端から３ｍｍ以内の部分を傷つけて、組織内部と外部との連通部を形成する連通部形成工程を行う。連通部を形成することにより、腋芽細胞により近いケナフ組織中にアグロバクテリウムを外的に接触させることができる。したがって、腋芽細胞に至るまでの胚軸片などの組織内の移動を軽減でき、より確実に腋芽細胞をアグロバクテリウムに感染させて遺伝子導入することができる。
また、腋芽細胞のアグロバクテリウムの感染の確率を向上させるための試みとして、あるいは、アグロバクテリウム感染工程の効率化を図るための試みとして、前記感染工程に先立って、前記実生の頂芽と子葉とを除去し、子葉の付根上端を含む長さ５ｍｍ以内の胚軸部に整える剪定工程を備える方法も提供する。特に、頂芽を除くことにより、頂芽優勢の強いケナフなどの植物において、より容易に腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させることができる。また、植物体を形成する場合に、腋芽細胞を増殖（分化を含む）させることが容易となる。
【０００６】
本発明者らは、また、この脱分化工程を有しない遺伝子導入方法を見出すことにより、以下の遺伝子導入された植物の作出方法を発明するに至った。すなわち、本発明は、遺伝子導入された双子葉植物を作出する方法であって、双子葉植物の実生の腋芽細胞に導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクターを有するアグロバクテリウムを感染させる工程と、前記アグロバクテリウムに感染させた実生であって、少なくとも頂芽が除去された胚軸片を、サイトカイニンを含有する培地に置床し培養して、腋芽に由来するシュートを発現させる工程と、前記腋芽由来シュートの葉を除去してサイトカイニンを含有する培地に置床して培養し、多芽体を形成させる継代培養工程とを備える方法を提供する。
この方法では、上述のようにアグロバクテリウムによって遺伝子導入された腋芽細胞を選択して増殖させることができる。すなわち、アグロバクテリウムを感染させた実生について、頂芽を除去することにより、胚軸片において頂芽優勢を抑止して腋芽細胞の分化を促進することができる。したがって、効率良く、且つより確実に遺伝子導入されたシュートを得ることができる。
このような植物作出方法においても、前記感染工程に先立って、前記実生の子葉の付根上端から３ｍｍ以内の部分を傷つけて、組織内部と外部との連通部を形成する連通部形成工程を備えると、より確実に腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させることができる。
また、前記感染工程に先立って、前記実生の頂芽と子葉とを除去し、子葉の付根上端を含む長さ５ｍｍ以内の胚軸片を形成する工程を備えると、頂芽優勢を抑止して、より容易に腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させることができる。また、後に続く培養工程において腋芽細胞を増殖させることが容易となる。したがって、例えばケナフなど、頂芽優勢の強い双子葉植物の形質転換体の作出に有効である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本願の遺伝子導入方法の好適な実施形態について、図１〜３を参照して詳細に説明する。本実施形態の遺伝子導入方法は、外植片作成工程と、感染工程とを備える。
【０００８】
（外植片作成工程）
本発明に係る遺伝子導入方法を使用できる植物の種類は、腋芽細胞が存在する領域を特定でき、かつ以下に説明する方法によって植物体を得られる双子葉植物であれば特に限定されない。双子葉植物では、腋芽細胞が存在する領域を比較的容易に特定でき、これらの幼苗は、子葉の付根付近に腋芽細胞を有している。生長力が強いことや無菌状態の組織を得やすいことから、この子葉の付根付近の腋芽細胞を用いることが好ましい。また、特に子葉より根側に胚軸が伸長する種であると、腋芽細胞部分をより狭い範囲に特定しやすく、腋芽細胞近傍を効率的に摘出することができ、好ましい。
なお、本明細書において、腋芽細胞とは、分化前のものであり、単一細胞であることが好ましいが、複数個に増殖した状態であっても良いものとする。具体的には、目視において、腋芽の存在を確認できない状態の腋芽細胞である。
【０００９】
また、本発明に係る遺伝子導入方法は、カルス細胞からの再分化が困難な植物、あるいはカルス細胞からの再分化によって好ましい遺伝子組み換え体を得にくい種においても形質転換体を得ることができる。また、特に、頂芽優勢が強い植物においても、良好な形質転換体を得やすい方法である。したがって、カルス細胞からの分化が困難で、かつ頂芽優勢の強い植物により良好に遺伝子導入できる方法である。具体的には、マメ科の植物であるマングビーン（緑豆、Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）や、ケナフ等のアオイ科の植物の遺伝子導入に好適であり、特にケナフ（ハイビスカス  カナビナス，Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ）に好適である。ケナフとしては、例えば、ｅｖｅｒｇｒａｄｅｓ４１、Ｔａｉｎｕｎｇ２、ＳＦ４５９、ＨＣ−Ｇ４、青皮３号などを好適に用いることができるが、これらに限定されない。
【００１０】
外植片は、腋芽細胞を含む組織片である。腋芽細胞は、植物の茎において葉柄の付根部分（葉柄が落ちた後の付根部分を含む）またはその直上に対応する位置に存在する。好ましくは、頂芽の直下に位置する葉柄の付け根部分の茎（胚軸を含む）に存在する腋芽細胞を用い、より好ましくは、発芽させた種子の茎（胚軸）において子葉の付根部分またはその直上に対応する位置の腋芽細胞を用いる。
子葉の付根部分に位置する腋芽細胞を含む外植片を作成する場合、種子を発芽させて実生を得、所要の部分を摘出して外植片とする。例えば、ケナフ、マングビーンなどでは、この方法により、良好に遺伝子導入することができ、また良好に遺伝子導入された植物体を得ることができる。
【００１１】
種子から実生を得る場合、サイトカイニンを含有する培地で発芽、生育させることにより、後で腋芽細胞を分化させてシュートを発現させたり、多芽体（マルチプルシュートともいう）を形成したりするときの確率、効率を向上させることができ、好ましい。より好ましくは、種子にサイトカイニンを付与しておき、この種子をサイトカイニンを含有する培地で培養する。
【００１２】
ここで、サイトカイニンは、特に限定されず、例えば、６−ベンジルアミノプリン（６ＢＡ）、カイネチン、ゼアチン、６−（ｒ，ｒ−ジメチルアミノ）プリン（ＺｉＰ）、Ｎ−（２−クロロ−４−ピリド）−Ｎ’−フェニルウレア（ＣＰＰＵ）、１−フェニル−３−（１，２，３−ティアディアゾール−５−ＹＬ）ウレア（４ディアズロン：ＴＤＺ）等よりなる群の１種または２種以上を用いることができる。好ましくは、６ＢＡを用いることが好ましい。
【００１３】
また、これらのサイトカイニンとともに、オーキシンを加えても良い。オーキシンとしては、例えば、３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、３−インドール酪酸（ＩＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、４−クロロ−２−メチルフェノキシ酢酸、ｐ−クロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸等を挙げることができる。
【００１４】
種子にサイトカイニンを添加する場合、サイトカイニンの濃度が０．０００１ｍｇ／ｌ〜１ｍｇ／ｌの溶液を調製し、この溶液に種子を浸漬させたり、種子にこの溶液を吹き付けたりする。サイトカイニンの濃度は、より好ましくは、０．０００５ｍｇ／ｌ〜０．０１ｍｇ／ｌであり、例えば、ケナフの種子では、０．００１ｍｇ／ｌのサイトカイニン溶液に浸漬することで良好な効果が得られる。
【００１５】
また、培地にサイトカイニンを添加する場合、サイトカイニンの濃度は、０．１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌとすることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌである。さらに好ましくは、１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌである。また、オーキシンを添加する場合、例えばナフタレン酢酸の場合は、０．１ｍｇ／ｌ〜１ｍｇ／ｌの濃度とすることが好ましい。
【００１６】
種子の発芽および育成用の培地は、公知の植物の組織の培養に利用される培地を用いることができる。すなわち、無機成分と炭素源とを必須成分とし、適宜、他の植物生長調節物質、ビタミン、アミノ酸などを含有する固形培地とすることができる。無機成分としては、窒素、燐、カリウム、ナトリウム、カルシウム、硫黄、鉄、マンガン、亜鉛、沃素、硼素、モリブデン、塩素、コバルト等の元素を含む無機化合物が用いることができる。炭素源としては、炭水化物、例えばショ糖又はグルコースを用いることができ、好ましくはショ糖を用いる。ショ糖は、好ましくは、３ｗ／ｖ％含有する。
ビタミンとしては、例えばチアミン、ピリドキシン、ニコチン酸等を挙げることができる。アミノ酸としては、例えばグリシン、グルタミン酸、リジン等を挙げることができる。
なお、固形培地を調製する場合のゲル化剤としては、寒天、ジェランガム等を使用できる。これらの濃度は、通常寒天０．８ｗ／ｖ％、ジェランガム０．２５ｗ／ｖ％、及びゲルライト０．４ｗ／ｖ％で使用される。
【００１７】
図１に示すように、種子１から発芽させて育成する実生３は、増殖の点から、腋芽細胞の存在する領域に胚軸や子葉の付根、葉柄などを除く分化した細胞の種類が少ない状態で、かつできるだけ幼いことが好ましい。例えば、ケナフでは、体長２０ｃｍ以下であることが好ましく、１０ｃｍ以下であることがより好ましい。また、子葉が完全に開いた状態であると、外植片作成が容易であるため、少なくとも５ｃｍ程度に生長した実生であることが好ましい。
【００１８】
外植片１０は、植物組織の所望の部分をカットして摘出することによって得ることができる。腋芽細胞を後述するアグロバクテリウムにより確実に感染させるため、外植片１０は、腋芽細胞を損傷しない範囲で小さく、すなわち、腋芽細胞が外部との接触領域に近くなるように作成することが好ましい。
また、好ましくは、外植片作成工程において、図１（ｄ）に示すように、頂芽５を除去する。頂芽５を除去しておくことにより、腋芽細胞のより近傍に切断面を形成することができ、腋芽細胞へのアグロバクテリウムの接触を容易にすることができる。また、頂芽５を除去することによって、腋芽細胞をより優勢にすることができ、これによってもアグロバクテリウムの感染確率を向上できると考えられる。
【００１９】
具体的には、外植片１０は、図１（ｃ）、（ｄ）に示すように、腋芽細胞が存在する領域を長さ２．５〜６ｍｍ程度だけ切り出して作成することが好ましい。子葉７の付根に存在する腋芽細胞部分を使用する場合は、具体的には、子葉７の付根の上端から下方に２〜５ｍｍ、上方に０．５〜１ｍｍとなる部分を摘出することが好ましい。例えば、図１に示すように、子葉７を切除し（図１の（ｃ））、さらに、子葉７の付根の上端から伸長方向に約０．５ｍｍの部分より先端側の頂芽５を除去する（図１の（ｄ））ことが好ましい。このようにして得られる外植片１０を図２（ｅ）に示す。
なお、腋芽誘導を促進するため、また、外植片１０をより小さく形成させるため、あるいは、腋芽細胞近傍の流通をより促進させるために、図１の（ｄ）に示すように子葉７を除去することが好ましい。
なお、図１以降の各図において、胚軸中に図示した黒点は、腋芽細胞が存在すると推測されている領域を概念的に示したものである。
【００２０】
外植片作成工程では、好ましくは、腋芽細胞が存在すると推測されている領域の近傍に、外植片１０の外部と内部とを連通させる連通部１２を形成することが好ましい。連通部１２の形成は、本発明における連通部形成工程に相当する。連通部１２は、外植片の腋芽細胞の外皮組織を損傷することによって、内部組織を外部に露出させた部分である。具体的には、外皮組織に切込みを入れたり、抉ったり、穿孔したりすることによって形成することができる。穿孔であると、より小さい領域を狙うことが容易であり、腋芽細胞を損傷することを抑制して、且つより近い部分に連通部１２を形成することができる。
【００２１】
連通部１２は、具体的には、図２（ｅ），（ｆ）に示すように、腋芽細胞が存在すると想定される部分から半径０．５〜３ｍｍの領域に形成することが好ましい。連通部１２は腋芽細胞により近いほうが好ましく、腋芽細胞が存在すると想定される部分から半径０．５〜２ｍｍの領域に形成することがより好ましい。連通部１２は、好適には、注射針など先端が尖った部材を外皮側から内部に向かって穿孔して形成する。また、連結部１２は、腋芽細胞が存在すると想定される場所の下に形成しやすく、さらに、腋芽細胞が存在すると想定される位置から１ｍｍ以上離れた位置に形成すると、腋芽細胞を潰すおそれがなく、好ましい。
【００２２】
（感染工程）
感染工程は、公知のいわゆるアグロバクテリウム法で利用されるグラム陰性の土壌細菌であるアグロバクテリウムを腋芽細胞に感染させる工程である。
アグロバクテリウムは、典型的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いるが、同様の機能を備える、他の種でも良い。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの菌株は、特に限定されないが、例えば、ＥＨＡ１０５やＬＢＡ４４０１を好適に用いることができる（例えば、名古屋大学  生命農学研究科  植物遺伝育種研究室より入手可能）。これらの菌は、それぞれベクターとしてｐＩＧ１２１−Ｈｍを有しており、このベクターに腋芽に導入しようとする遺伝子をパッセンジャーとして組み込んだアグロバクテリウムを用いる。組み込まれる遺伝子は特に限定されず、例えば大腸菌由来のＧＵＳ遺伝子など、公知の、または適宜選択した遺伝子を組み込むことができる。
また、後で外植片にアグロバクテリウムが感染したものを選抜するために、カナマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子など、選抜用の遺伝子を組み込んでおくことが好ましい。
【００２３】
なお、アグロバクテリウムへのこれらの遺伝子の導入方法は、公知の方法を利用できるため、説明を省略する。また、遺伝子導入されたアグロバクテリウムは、公知の方法で増殖培養して用いることができる。典型的には、固形培地を用いて暗黒下で培養する。このときの培地は、特に限定されないが、感染工程で液体培地を用いる場合は、同種の培地で増殖することが好ましく、例えば、ＹＥＢを含む液体培地を用いる場合、アグロバクテリウムの培養にもＹＥＢを含む培地を用いることが好ましい。
【００２４】
アグロバクテリウムの外植片への接種方法は、特に限定されず、アグロバクテリウムを懸濁させた液に外植片を投入したり、アグロバクテリウムの懸濁液を外植片に振りかけたりすることができる。典型的には、図２（ｇ）に示すように、アグロバクテリウムが懸濁状態に分散する液体培地３１に外植片を含浸させる方法であると、外植片の表面全体にアグロバクテリウムを接触させることができ、アグロバクテリウムの接触面積が増大するため、好ましい。すなわち、外植片の各切断面（および連通部）にアグロバクテリウムを接種することにより、より高い確率で、効率よく外植片内部の腋芽細胞までアグロバクテリウムを侵入させることが可能となる。これにより、効率よく腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させられる。
【００２５】
アグロバクテリウムの液体培地３１は、例えば、ＹＥＢを含む培地を利用することができる。ここで、導入しようとする遺伝子が組み込まれたベクターを有するアグロバクテリウムのみを良好に増殖させるため、アグロバクテリウムに組み込んだ耐性遺伝子によって生存できる環境で、アグロバクテリウムを増殖させることが好ましい。例えば、カナマイシン耐性遺伝子を組み込んだ場合はカナマイシンを、ハイグロマイシン耐性遺伝子を組み込んだ場合はハイグロマイシンを含有する培地とすることが好ましい。
【００２６】
外植片１０へのアグロバクテリウムの接種は、具体的には、図２（ｇ）に示すように、アグロバクテリウムの液体培地３１を試験管などに入れておき、この中に外植片１０を投入して、数分間振盪することにより、外植片１０にまんべんなくアグロバクテリウムの培養液（液体培地３１）を付着させることができる。
【００２７】
感染工程では、外植片１０にアグロバクテリウムを接種した後、好ましくは、培養工程を行う。この培養工程は、典型的には外植片とアグロバクテリウムの両方が良好に培養できる環境で行う共存培養である。これにより、より確実に外植片に接種したアグロバクテリウムを腋芽細胞に感染させることができる。培養工程では、図３（ｈ）に示すように、アグロバクテリウムを接種した外植片を固形培地に置床して培養する。あるいは、共存倍地上に滅菌したろ紙を敷き、その上に外植片を載せて培養する。このとき、培地は、サイトカイニンを含有することが好ましい。サイトカイニンの濃度は、例えば、外植片がケナフの子葉の付根部分の場合、１ｍｇ／ｌ以上５ｍｇ／ｌ以下であることが好ましい。また、アセトシリンゴンを含有することが好ましく、例えば４０μｇ／ｌ添加されていることが好ましい。図３（ｈ）に示すように、アグロバクテリウムと外植片を暗所において数日間培養することにより、外植片１０とアグロバクテリウムの双方を良好に成長させることができる。このときの培養条件は、例えば、温度２３〜２５℃、暗黒下、７２時間である。
【００２８】
このようにして得られる外植片１０は、アグロバクテリウムによって良好に遺伝子が導入されている。特に、腋芽細胞が存在する領域部分を摘出してアグロバクテリウムを感染させることにより、腋芽細胞を周りの組織で保護した状態で扱うことができ、作業がより簡単である。また、腋芽細胞部分をより小さく取り出すことにより、腋芽細胞の周辺の組織に良好にアグロバクテリウムを接種することができる。このため、より確実に腋芽細胞の周辺にアグロバクテリウムを付与することができ、効率よく腋芽細胞にアグロバクテリウムを感染させて、遺伝子を導入することができる。特に、連通部１２を形成することにより、腋芽細胞の近傍の内部組織にアグロバクテリウムを接触させることができるため、腋芽細胞へのアグロバクテリウムの感染の確率をより向上させることができる。
【００２９】
腋芽細胞は未分化の細胞であり、自然界において活性化されると分化し、茎や葉を備えるシュートを発現する。したがって、外植片１０において、遺伝子導入された腋芽細胞を生長させることにより、良好に遺伝子導入されたシュートが得られる。ここで、腋芽細胞は、単一の細胞であると想定されているため、この一つの細胞に正常に遺伝子が導入されることで、シュートを形成する各部の細胞が同一の、正常に遺伝子が導入された細胞で構成される。また、腋芽細胞は、外植片１０において頂芽５（図１参照）を除去することによって活性化されて分裂を開始している可能性があるが、この場合においてもカルスなどを利用する場合に比較して、遺伝子導入されるべき細胞の数は非常に少ない。したがって、腋芽細胞に遺伝子導入する方法は、多数の細胞に遺伝子を導入して植物体を得る方法、例えば、カルスからの再分化させる方法などと比較して、突然変異やキメラの発生の確率を大幅に低減することができる。
【００３０】
腋芽細胞からシュートを発現させる方法は、特に限定されず、双子葉植物などの性質に合わせて種々に選択することができる。腋芽細胞からシュートを発現させた後（例えば、図４（ｋ）の状態）、発根させることにより、遺伝子導入された植物体を得ることができる。好ましくは、１つの腋芽細胞から複数のシュートを発現させ、株分け等することにより、同一の遺伝子が導入された複数の植物体を得ることができる。
【００３１】
以下、本発明にかかる一実施の形態として、図３，４を参照しながら外植片１０の腋芽細胞から複数のシュートを形成する方法について説明する。この方法は、ケナフ、マングビーンなど頂芽優勢の強い植物においても好適に実施できるが、頂芽優勢の強弱に関係なく種々の植物種に適用可能である。本方法は、上記感染工程の後、シュート発現工程（図３の（ｉ）および（ｊ））と、継代培養工程（図４）とを備える。
なお、上記外植片作成工程と感染工程とを含む一連の工程は、本発明の植物体の作出方法の一実施形態である。
【００３２】
（シュート発現工程）
シュート発現工程は、腋芽細胞からシュートを発現させる培養工程である。シュート発現工程は、遺伝子導入した外植片１０（茎あるいは胚軸）を、人工の固形培地に置床して腋芽を誘導し、腋芽由来シュート２１を発現させる。
【００３３】
本工程あるいは後で説明する継代培養工程で使用する人工培地としては、上述の外植片作成工程で述べたものと同様、公知の植物の組織の培養に用いられている培地とすることができる。すなわち、無機成分及び炭素源を必須成分として、その他必要に応じて植物成長調節物質、ビタミン、アミノ酸を含有する培地を用いる。各成分については、上述のとおりとすることができるが、これらに限定されず、種々の成分を含有させておくことができる。
【００３４】
具体的には、公知の植物組織培養に用いられる培地、例えばＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．（１９６２），  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．  １５：  ４７３  −  ４９７）、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇ，  Ｏ．Ｌ．  （１９６８），  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ．  Ｒｅｓ．  ５０：  １５１  −  １５８）、Ｎ６培地（Ｃｈｕ  （１９７５））、ＷＰ培地（Ｌｌｏｙｄ，  Ｇ．  （１９８１），  Ｉｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐ．  Ｓｏｃ．  ３０：  ４２１  −  ４２７）  、ＢＴＭ培地（Ｃｈａｌｕｐａ，  Ｖ．  （１９８４）  Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌｎｔ．  （ｐｒａｈａ）  ２６：  ３７４  −  ３７７）等を挙げることができる。特に、ＭＳ培地及びその改変培地（全培地成分を半分量〜１／３にしたＭＳ培地）が好ましく、より好ましくは、１／３ＭＳ培地である。
【００３５】
シュート発現工程は、植物成長調節物質として、サイトカイニンを含有する培地を用いることが好ましく、好ましくはサイトカイニンとして６ＢＡおよび／またはカイネチンを含み、より好ましくは６ＢＡを含む培地を用いる。サイトカイニンの培地における濃度は、例えば、外植片がケナフで、サイトカイニンとして６ＢＡを用いる場合、０．０１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌであることが好ましく、より好ましくは、０．５ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは、１ｍｇ／ｌ〜５ｍｇ／ｌである。
なお、サイトカイニンのみを培地に添加することが好ましいが、サイトカイニンが優勢に作用する範囲で適宜オーキシンを添加しても良い。例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸等を利用でき、サイトカイニン１ｍｇ／ｌに対して、オーキシンを０．１ｍｇ／ｌ程度であることが好ましい。
【００３６】
シュート発現工程における培養条件としては、温度は、２５〜３０℃、照度２０００〜２５００ｌｘ（２４時間／日）であると、腋芽由来シュートの効率的な形成の点で好ましい。
【００３７】
外植片１０をこのような培地に置床して、上記の条件で培養することにより、おおよそ２週間で腋芽細胞を誘導発現させて、図３（ｉ）に示すように、腋芽由来シュート２１を発現させることができる。
なお、本工程においては、腋芽が約１ｍｍ以上になった場合において、腋芽に由来するシュート，すなわち腋芽由来シュート２１が発現したものとする。腋芽由来シュート２１は少なくとも１本以上確認できればよい。特に、子葉節以高部位を用いた場合には、図３（ｉ）や図４（ｋ）に示すように、子葉節から２本の腋芽由来シュート２１が発現していることが好ましい。
【００３８】
シュート発現工程は、除菌工程や選抜工程と並行して行うことができる。除菌工程は、シュート発現工程における培養条件に、アグロバクテリウムが生存困難な条件を追加することにより、選抜工程は、シュート発現工程の培養条件に遺伝子導入されなかった外植片が生存困難な条件を追加することによって行うことができる。これにより、生長しつづける外植片１０において、腋芽細胞由来シュート２１の発現を誘導しながら、従来と同様の除菌および／または選抜をすることができ、好ましい。なお、シュート発現工程において、あるいは後述する継代培養工程において、除菌工程と選抜工程とを同時に進行させても良い。
【００３９】
除菌工程は、外植片が生存可能かつアグロバクテリウムは生存困難な環境での培養、すなわち除菌培養によって行うことができる。具体的には、シュート発現用の培地に殺菌剤を添加する。殺菌剤は、アグロバクテリウムを殺すことができ、且つ外植片を枯死させることがない公知の薬剤、抗生物質などを利用することができ、例えば、カルベニシュリンが好ましい。図３（ｉ）に示すように、殺菌剤を含む培地で、明るい場所で、数日から１週間程度培養することにより、アグロバクテリウムを死滅あるいは大幅に減少させることができる。除菌工程を兼ねるシュート発現工程の培養条件は、例えば、上述の培地にカルベニシュリン５００ｍｇ／ｌ添加した培地において、温度２５〜３０℃、照度２０００〜２５００ｌｘである。
【００４０】
また、除菌工程は、好ましくは、上述の培養工程後の外植片１０を、シュート発現工程の培養の前に殺菌剤を含む水で数回洗浄する工程を含むと、外植片１０の表面に付着するアグロバクテリウムを良好に除去することができ、好ましい。洗浄水は、例えば、カルベニシュリン５００ｍｇ／ｌ含有する水溶液とすることができる。
【００４１】
選抜工程は、アグロバクテリウムによって遺伝子導入された外植片１０は生存可能で、この遺伝子導入がなされなかった外植片１０は生存困難な環境での培養、すなわち選抜培養によって行う。選抜培養により、遺伝子導入されなかった外植片を除去することができる。この工程を行うためには、あらかじめ、アグロバクテリウムに組み込むベクターに、遺伝子導入前の外植片が耐性を有していない抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を導入しておく。
【００４２】
選抜工程の培地には、遺伝子導入される原種が耐性を有しない公知の抗生物質を選択して、培地に添加する。例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、リファンピシン、ジェネティシンなどを用いることができる。そして、アグロバクテリウムのベクターには、選抜工程で利用しようとする抗生物質に対する耐性遺伝子、すなわち、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、リファンピシン耐性遺伝子、またはジェネティシン耐性遺伝子をパッセンジャーとしてベクターに組み込んでおく。感染工程後の外植片を抗生物質を含むシュート発現用培地で所定期間培養することにより、図３（ｊ）に示すように、アグロバクテリウムによって遺伝子が導入された外植片１０ａは生き残り、遺伝子が導入されなかった外植片１０ｂの多くは枯死する。選抜工程を兼ねるシュート発現工程の培地は、例えば、上述のシュート発現工程の培地にカナマイシン５０ｍｇ／ｌを添加した培地において、明るい場所で１週間×２回、培地を取り替えて行う。この工程の培養条件は、例えば、温度２５〜３０℃で、照度２０００〜２５００ｌｘである。
【００４３】
なお、除菌工程および選抜工程は、シュート発現工程および／または継代培養工程において、培地を換えての複数の培養にまたがって行っても良い。特に、選抜工程、すなわち抗生物質を含む培地による培養を複数回繰り返すことによって、より確実に良好に遺伝子導入されたシュートを抽出することができ、好ましい。
【００４４】
（継代培養工程）
腋芽由来シュートの発現を確認できた外植片について継代培養工程を行う。継代培養工程の流れを図４に示す。継代培養工程では、腋芽由来シュート２１を有する外植片１０のトリミング（図４の（ｍ））とサイトカイニン含有培地における培養（図４の（ｎ），（ｏ），および（ｐ））を多芽体（マルチプルシュート）２８（図４（ｐ）参照）が発現するまで繰り返し行う。
【００４５】
トリミングでは、腋芽由来シュート２１が発現した外植片１０において、腋芽由来シュート２１の付根以外の部分を除去する。トリミングにより、外植片１０における頂芽優勢を阻害するとともに、腋芽由来シュート２１を優先させられることが推測される。また、トリミングによって多芽体２８の形成を促進できることが推測される。
トリミングによって切除する部位は、具体的には、腋芽由来シュート２１の付根部分より下方（子葉の付根部分に相当する位置より下方）の茎部分２３と、頂芽部分２５、あるいは、茎部等において発生したカルス、明らかに腋芽細胞に由来しないシュートなどである。また、腋芽由来シュート２１に形成された葉２１ａも切除する。なお、腋芽由来シュート２１が発現した段階で、外植片１０の子葉ないし葉を切除した際の残留部分（例えば、図４（ｍ）における葉柄７ａ）は、自然に落下していることが多い。そうでない場合にはこれらの部分も切除する。
【００４６】
次に、図４（ｎ）に示すように、トリミングした外植片１０をサイトカイニン含有培地に置床して培養する。継代培養工程の培地は、シュート発現工程の培地と同様であり、サイトカイニンを含有する人工倍地で外植片を培養する。サイトカイニンは、好ましくは，６ＢＡ、カイネチンであり、より好ましくは、６ＢＡである。６ＢＡを培地中に添加する場合、約０．０１ｍｇ／ｌ〜約１０ｍｇ／ｌであることが好ましく、より好ましくは、約０．５ｍｇ／ｌ〜約１０ｍｇ／ｌであり、さらに好ましくは、約１ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌである。もっとも好ましくは、約３ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌである。特に、外植片がケナフのＥｖｅｒｇｌａｄｅｓ４１及びＴａｉｎｕｎｇ２である場合、約３ｍｇ／ｌ〜約５ｍｇ／ｌであることが好ましい。サイトカイニンに加えてオーキシンを加えることもできるが、好ましくは、サイトカイニンのみとする。
【００４７】
その他の培養条件としては、温度は、２５〜３０℃、照度２０００〜２５００ｌｘの範囲が多芽体の効率的な発現のために好ましい。
なお、継代培養工程の培養においてもシュート発現工程の選抜工程と同様の抗生物質を添加した培地を用いることにより、選抜工程を行うことが可能である。また、シュート発現工程において選抜工程を行っても遺伝子導入されていない外植片が生き残る場合があるため、シュート発現工程から引き続いて継代培養工程でも選抜工程を行うことも好ましい。
【００４８】
継代培養工程における一つの培地における培養期間は、２〜４週間程度とする。好ましくは約３週間とする。培養期間を経過したら、再度、上記したトリミングを行い、外植片を再調整して、サイトカイニンによる培養を行う。すなわち、図４（ｏ）に示すように、培養期間経過後の外植片１０には、頂芽部分２５や腋芽由来シュート２１の葉２１ａなどが伸長するため、これらを図４（ｍ）に示すように切除し、図４（ｎ）に示すように、サイトカイニンを含む培地に置床して培養する。
このようにして外植片の培養を繰り返すことにより、培地に含まれるサイトカイニンによる刺激が繰り返し付与するとともに、トリミングによって腋芽以外の部分の生長を阻止する。これらの結果、頂芽優勢傾向の強い例えばケナフ等の双子葉植物においても、サイトカイニンによる成長促進の効果が腋芽部分に集中して多芽体２８の形成を促進すると考えられる。
【００４９】
継代培養工程は、図４（ｐ）に示すように、腋芽由来の多芽体２８が形成されるまで繰り返し行う。
例えば、ケナフにおいては、継代培養工程（培養期間は好ましくは各３週間とする）を少なくとも２回実施することにより、多芽体２８を発現させることができる。好ましくは３回以上実施する。
【００５０】
継代培養工程によって得られる多芽体２８は、公知の方法によって、さらに増殖することができ、さらに発根工程やシュート伸長工程を経て鉢挙げすることができる。継代培養工程以降の工程の実施形態について、簡単に説明する。
【００５１】
（増殖工程）
多芽体２８となった外植片を、適宜分割して、増殖用培地で培養することにより、さらに増殖させることができる。増殖用培地は、具体的には、前記した無機成分の他、ショ糖等の炭水化物、ビタミン等を含有し、６ＢＡを０．５ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ、好ましくは、１ｍｇ／ｌ〜１０ｍｇ／ｌ含有する増殖用の人工培地は、ＭＳ培地あるいはその改変培地（好ましくは１／３ＭＳ培地）を使用することが好ましい。
【００５２】
（シュート伸長工程）
次いで、多芽体となった外植片、または増殖工程を経た外植片は、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン等を含有するシュート伸長培地に移植することにより、効率よくシュートを伸長させることができる。
【００５３】
（発根工程）
次いで、伸長したシュートを分割、あるいは分割せずに発根培地に移植することにより、シュートを更に伸長させ、かつ発根させることができる。発根培地としては、前記の無機成分及び炭素源、ビタミン等を含有する。その後、水分を含ませたバーミキュライトなどの土壌資材に植え込む。
【００５４】
以上の工程から得られた発根したシュートを、馴化を経て鉢挙げ種苗を得ることができる。
【００５５】
以上説明したように、植物体の作出方法は、遺伝子導入された種子植物、特に双子葉植物の大量増殖を可能とする。特に、頂芽優勢の強い植物、例えばケナフなどにおいても良好に多芽体を誘導することができ、腋芽細胞に由来する、同一の遺伝子が導入された植物体を効率よく大量に得ることができる。
特に、遺伝子導入方法（外植片作成工程から感染工程（培養工程を含む））において、少なくとも実生の育成工程において、好ましくは、種子の段階から育成工程まで、より好ましくは、種子の段階から感染工程の培養工程まで一貫して、サイトカイニンを付与しておくことにより、さらに効率よく腋芽由来シュートを得ることができ、その後の、多芽体（マルチプルシュート）を効率よく得る事ができる。これにより、同一の遺伝子が導入された植物体を効率よく作出することができる。特に、培養において複数のシュートを発現するため、遺伝子導入から、より短期間での植物体の増殖が可能となる。
【００５６】
【実施例】
（実生の作成）
ケナフのＥｖｅｒｇｌａｄｅ４１、Ｔａｉｎｕｎｇ２、ＳＦ４５９、ＨＣ−Ｇ４及び青皮３号の種子を用意した。これらの種子を滅菌水で２〜３回洗浄し、次いで７０ｗ／ｖ％エタノールで種皮の色素が抽出されるくらいまでガラス棒ですすいだ。さらに、種子を、次亜塩素酸ナトリウム溶液（濃度５％）に浸漬した。この状態で、５分間超音波処理を行った。超音波処理後、次亜塩素酸ナトリウム溶液内の種子を、滅菌されたスパーテルで攪拌して種皮表面に付着した気泡を除去し、クリーンベンチ内で１０分間静置した。クリーンベンチ内で次亜塩素酸ナトリウム溶液のみを捨て、次亜塩素酸ナトリウム臭がなくなるまで種子を滅菌水で５回以上洗浄した。このとき、洗浄水中で沈降する種子を選択し、６ＢＡを０．００１ｍｇ／ｌ含有する滅菌水中に１時間浸漬して、滅菌された種子を得た。
【００５７】
滅菌後の各種類の種子を、それぞれ１００粒を滅菌したピンセットで採取し、種子ができるだけ重ならないように固形培地に播種した。種子は、植物培養試験管あたり３〜４粒とした。
なお、固形培地は、ハイポネックス液５−１０−５（窒素：リン酸：カリウム５：１０：５）を水で１０００倍希釈し、ＩＮＡ  Ａｇａｒ培地用寒天・ＢＡ−３０を最終濃度が２ｗ／ｖ％となるように添加して調製したものを滅菌して用いた。６ＢＡの濃度は、１ｍｇ／ｌとした。この培地を植物培養用試験管あたり２０ｍｌ注入して固化したのち、培地として用いた。なお、ハイポネックス液５−１０−５は、窒素全量５．００％（アンモニア性窒素１．９５％、硝酸性窒素０．９０％）、水溶性リン酸１０．０％、水溶性カリウム５．０％、水溶性マグネシウム０．０５％、水溶性マンガン０．００１％、水溶性ホウ素０．００５％の濃度で各成分を含有する、商業的に入手可能な液体肥料である。
培養は、２８℃、２５００ｌｘの連続照明下、静置して行った。おおよそ１０日間育苗すると、各種の種子から１５ｃｍ程度の実生が得られた。この段階の実生においては、いずれも、子葉の付根の上端部分に、腋芽は肉眼で観察されなかった。
【００５８】
（外植片の形成）
上記方法で得られた２５０本（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅ４１、Ｔａｉｎｕｎｇ２、ＳＦ４５９、ＨＣ−Ｇ４及び青皮３号について各５０本）の実生の子葉節から下部５ｍｍの部位から上部を無菌的に採取した。この子葉節以高部位から、さらに、上部１ｍｍの部位から上部を無菌的に切除し、さらに、子葉を根元から切除した胚軸を得、これを外植片とした。
【００５９】
（感染工程）
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＥＨＡ１０５であって、カナマイシン耐性遺伝子であるＮＰＴＩＩと、ハイグロマイシン耐性遺伝子であるＨＰＴと、ＧＵＳ遺伝子とが組み込まれたｐＩＧ１２１−Ｈｍプラスミドをベクターに有するものを用意した。アグロバクテリウムは、グリセロールストックとして名古屋大学  生命農学研究科  植物遺伝育種学研究室より入手した。
このアグロバクテリウムをグリセロールストックから滅菌した爪楊枝で採取し、ＹＥＢ培地に塗布して菌体を培地全体に広げた。ＹＥＢ培地としては、イースト抽出物１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ、アガー１５ｇ／ｌを含有し、ｐＨ７．２に調製された固形培地を用いた。この培地において温度２８℃、暗黒下で２日間培養した。
【００６０】
ＹＥＢ培地で増殖したアグロバクテリウムを滅菌した爪楊枝で掻き取り、３ｍｌの懸濁ＹＥＢ培地に懸濁させた。懸濁ＹＥＢ培地としては、イースト抽出物１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／ｌを含有し、ｐＨ７．２に調製された水の懸濁液体培地を用いた。この培地において、温度２８℃で２日間、振蕩状態で培養した。このとき、アグロバクテリウムの濃度は、波長６００ｎｍ透過度で０．８−１．３であった。
【００６１】
アグロバクテリウムを培養した懸濁ＹＥＢ培地に、アセトシリンゴンを添加して、あらかじめ作成しておいた外植片を投入した。３−１０分間、攪拌してアグロバクテリウムを接種した。その後、外植片を滅菌したろ紙において余分な水分を除去した。
次に、共存培地を用意し、外植片の根側を下側にして（正立状態で）置床し、３日間、温度２３〜２５℃暗所（０ｌｘ）で培養した。共存培地としては、１／３ＭＳ培地に、ショ糖３０ｇ／ｌ、アセトシリンゴン４０μｇ／ｌ、６ＢＡ５ｍｇ／ｌ、ゲルライト４ｇ／ｌを含有し、ｐＨ５．７に調製した固形培地を用いた。培養後、外植片下部付近にアグロバクテリウムの菌体がうっすらと綿状に増殖したのが観察された。
【００６２】
（シュート発現工程）
共存培養した外植片を、除菌培地に移植し、２５〜２８℃、２５００ｌｘ連続照明下で、７日間培養した。除菌培地としては、前記共存培地と同様の成分からアセトシリンゴンを除いた成分と、カルベニシュリン５００ｍｇ／ｌとを含み、ｐＨ５．７に調製した固形培地を用いた。綿状に増殖するアグロバクテリウムが観察されないことから、アグロバクテリウムの除去を確認した。
次に、除菌培地で培養した外植片を、第１の選択培地に移植し、２５〜２８℃、２５００ｌｘ連続照明下で、２１日間培養した。第１の選択培地としては、前記除菌培地と同様の成分にカナマイシン５０ｍｇ／ｌを加えた成分を含み、ｐＨ５．７に調製した固形培地を用いた。
培養開始後、約７日経過後には、腋芽が肉眼で観察されるようになり、１０〜１４日経過後には、ほとんどの外植片で、子葉節から発生する腋芽由来シュートまたは頂芽の伸長が観察された。胚軸から長さが１ｍｍ以上の腋芽由来シュートを確認できたものもあった。頂芽が伸長したものについては、頂芽を切除することで、腋芽の生長を促すことができた。これにより、ほとんどの外植片で胚軸の両側から伸びる２本の腋芽由来シュートを確認できた。また、培養期間が経過するにつれて、成長を続ける外植片と、茶色に変色して枯死する外植片とが現われた。枯死したものは、遺伝子導入されなかった外植片であると考え、廃棄した。
【００６３】
さらに、第１の選択培地で培養した外植片を、第２の選択培地に移植し、２５〜２８℃、２５００ｌｘ連続照明下で、２１日間培養した。第２の選択培地としては、カルベニシュリンを１００ｍｇ／ｌとした他は、第１の選抜培地と同一の成分を含み、ｐＨ５．７に調製した固形培地を用いた。
本実施例では、第２の選抜培地での培養が終了した時点で、腋芽細胞に由来すると考えられるシュートが、それぞれ各子葉の付根の上端部分から１本ずつ、１つの外植片に対して２本ずつ発現していた。腋芽由来シュートが確認できた外植片では、子葉の基部は枯れて自然に欠落しているか、あるいは軽くふれれば欠落するような状態であった。さらに、生長を続ける外植片と、茶色に変色して枯死する外植片とが現われた。また、胚軸の下部にはカルスが形成されている外植片もあった。
【００６４】
（継代培養工程１）
シュート発現工程終了時に２本の腋芽由来シュートの発現が観察された外植片２３４個（内訳；Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ  ４１＝５０個、Ｔａｉｎｕｎｇ  ２＝４９個、青皮３号＝４４個、ＳＦ４５９＝４１個、ＨＣ−Ｇ４＝５０個）について、葉やカルスおよび枯死部位を無菌的に切除して外植片をトリミングした。この外植片をシュート発現用培地と同組成の固体培地に挿し付けて、培養した。培養は２１日間とした。
培養期間経過後、外植片を観察したところ、腋芽由来シュート以外のシュートを有する外植片は見出されなかった。腋芽由来シュートには、葉が形成され、外植片の一部には、胚軸下部にカルスが形成されていた。
【００６５】
（継代培養工程２）
２１日経過後の外植片につき、腋芽由来シュートの葉の他、カルス、枯死部位を無菌的に切除して外植片を再調製した。この外植片を腋芽誘導用培地と同組成の固体培地に挿し付けて、再度培養した。培養は同じく２１日間とした。
培養期間経過後において、外植片を観察したところ、腋芽由来シュート以外のシュートを有する外植片を見出すことができた。腋芽由来シュートの発現部位である子葉節あるいは胚軸基部から１ｍｍ以上のシュートが複数発現した。
【００６６】
（継代培養工程３）
２１日経過後の外植片（外植片調製から５６日経過後）につき、腋芽由来シュートの葉、カルス、枯死部位を無菌的に切除した外植片を再調製した。この外植片をシュート発現用培地と同組成の固体培地に挿し付けて、再度培養した。培養は同じく２１日間とした。
培養期間経過後において、外植片を観察したところ、腋芽由来シュートの発現部位である子葉節あるいは胚軸基部から多くのシュートを発現していた。また、多くの外植片について腋芽由来シュート以外のシュートを有する外植片を見出すことができた。マルチプルシュートが形成された。腋芽由来のシュートから伸長したシュートの一部において、ＧＵＳ遺伝子に由来する青色が観察でき、遺伝子導入されたことが確認できた。
【００６７】
【発明の効果】
本発明によれば、植物体として生長させられるケナフなど双子葉植物への遺伝子導入方法、および遺伝子導入されたケナフなど双子葉植物の製造方法を提供することにより、双子葉植物、特にケナフについて所望の遺伝子が導入された植物体を良好に得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に係る種子から双子葉植物の実生を得て外植片を形成する工程を示す模式的な工程図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る外植片への連通部形成工程と、アグロバクテリウム接種工程とを模式的な工程図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る共存培養工程、除菌工程、および選抜工程を示す模式的な工程図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る継代培養工程を示す模式的な工程図である。
【符号の説明】
１  種子
３  実生
５  頂芽
７  子葉
７ａ  葉柄
１０，１０ａ，１０ｂ  外植片
１２  連通部
２１  腋芽由来シュート
２１ａ  葉
２３  茎部分
２５  頂芽部分
２８  多芽体
３１  液体培地
【図１】
2004337043.tif 000003
【図２】
2004337043.tif 000004
【図３】
2004337043.tif 000005
【図４】
2004337043.tif 000006