(57)【要約】【課題】検体を一回滴下するだけで複数の開口部に検体を導入することのできるフルースルー型リガンド検出装置及びリガンド検出方法を提供する。【解決手段】フィルター部材３と、このフィルター部材３を支持する下部デバイス１と、この下部デバイス１の上部に設けられ開口部４ａ，４ｂを備えた上部デバイス２とからなるフロースルー型リガンド検出装置において、開口部４ａ，４ｂの上部に開口部４ａ，４ｂに同時に検体を導入するための単一の上部アダプター１２を備えた。上部アダプター１２は上部が開口した有底容器形状であって、上部アダプター１２の底面１５に、開口部４ａ，４ｂの上部に連通するガイド１７ａ，１７ｂを設けた。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルター部材と、このフィルター部材を支持する下部デバイスと、この下部デバイスの上部に設けられ複数の開口部を備えた上部デバイスとからなるフロースルー型リガンド検出装置において、前記開口部の上部に検体を導入するための単一の導入開口部を備えたことを特徴とするフロースルー型リガンド検出装置。
【請求項２】
前記導入開口部は上部が開口した有底容器形状であって、その底部に前記開口部の上部に連通する複数の導入通路を設けたことを特徴とする請求項１記載のフロースルー型リガンド検出装置。
【請求項３】
請求項１又は２記載のフロースルー型リガンド検出装置の前記導入開口部に検体を滴下して前記開口部に検体を導入することを特徴とするリガンド検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フロースルー型リガンド検出装置及びリガンド検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、特殊な設備，器具や技術を用いることなく目標のリガンドを簡便かつ正確に検出するために、免疫測定法が利用されている。免疫測定法という用語は免疫反応の特異性を利用して試料中の分析対象物を免疫学的手法により検出または定量する分析方法の総称として用いられ、具体的には免疫拡散法，酵素免疫測定法などの種々の方法が実用化されている。このような免疫測定法の中で、フロースルー式アッセイ法はラテラルフロー式，タンジェンタルフロー式などと並ぶメンブランを使用したイムノクロマトグラフィー法の一種であり、操作が簡便であるため一般的な検査の場に普及している。
【０００３】
フロースルー式アッセイ法による免疫測定法についての詳細は、例えば“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｅｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｓａ  Ｖｉｃｋｅｒｓ，  ｐ６−８，特公平７−３４０１６号などに記載されている。
【０００４】
このフロースルー式アッセイ法に用いられるフルースルー型リガンド検出装置の例としては、特開平３−１１８４７３号公報に開示されているものが知られている。この装置は、底部と蓋とから構成される包囲体の内側にフィルタースタックを配置したものであり、目標のリガンドを含むと思われる検体を蓋に設けられた開口部を経てフィルタースタックに導入し、リガンドを結合剤へ結合させ発色させるなどの処理を行うことによって目標のリガンドを検出するものである。また、検体を導入する開口部を複数設け、同一の検体から複数のリガンドを検出できるように構成したものが登実第３０７９９６８号公報に開示されている。
【０００５】
ところで、検体を導入する開口部を複数設け、同一の検体から複数のリガンドを検出できるように構成した上記フルースルー型リガンド検出装置においては、複数のリガンドを検出するためには複数設けられた開口部にそれぞれ試薬や検体を滴下する必要があり、手間がかかるという問題があった。また、この手間を省くために１つの開口部で複数のリガンドの検出を行なおうとした場合は、異種の標識物が混ざり合うため非特異反応が出やすいという問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｅｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ”，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｓａ  Ｖｉｃｋｅｒｓ，  ｐ６−８
【特許文献１】
特公平７−３４０１６号公報
【特許文献２】
特開平３−１１８４７３号公報
【特許文献３】
登実第３０７９９６８号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明かかる課題に鑑みてなされたものであり、検体を一回滴下するだけで複数の開口部に検体を導入することのできるフルースルー型リガンド検出装置及びリガンド検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１記載のフロースルー型リガンド検出装置は、フィルター部材と、このフィルター部材を支持する下部デバイスと、この下部デバイスの上部に設けられ複数の開口部を備えた上部デバイスとからなるフロースルー型リガンド検出装置において、前記開口部の上部に検体を導入するための単一の導入開口部を備えたことを特徴とする。
【０００９】
この構成によれば、単一の導入開口部に検体を一回滴下するだけで複数の開口部に同時に検体を導入することができ、複数のリガンドの検出を簡便に行なうことができる。
【００１０】
本発明の請求項２記載のフロースルー型リガンド検出装置は、請求項１において、前記導入開口部は上部が開口した有底容器形状であって、その底部に前記開口部の上部に連通する複数の導入通路を設けたことを特徴とする。
【００１１】
この構成によれば、上部が開口した有底容器形状の導入開口部の上部から検体を滴下することで、導入開口部の底部に設けられた複数の導入通路を経由して複数の開口部に検体を導入することができ、簡単な構成で複数のリガンドの検出を行なうことができる。
【００１２】
本発明の請求項３記載のリガンド検出方法は、請求項１又は２記載のフロースルー型リガンド検出装置の前記導入開口部に検体を滴下して前記開口部に検体を導入することを特徴とする。
【００１３】
この構成によれば、複数のリガンドの検出を簡便に行なうことができる。
【００１４】
【発明の実施形態】
以下、本発明のフロースルー型リガンド検出装置及びリガンド検出方法の一実施例について添付した図１〜２を参照しながら説明する。１は装置の下部外郭をなす下部デバイスであり、２は装置の上部外郭をなす上部デバイスである。下部デバイス１は、略長方形の底面１ａとこの底面１ａの周縁部から略垂直に上方へ延設された側壁１ｂとを有する容器状に形成されている。この下部デバイス１の中には、フィルター部材３が収容，支持されている。このフィルター部材３は、メンブランフィルターからなる膜部材３ａと、この膜部材３ａの下部に配置されガラス孔フィルターからなるスペーサー３ｂと、このスペーサー３ｂの下部に配置され液体吸収能力に優れた吸収部材３ｃとから構成されている。なお、スペーサー３ｂは、吸収体３ｃからの色戻りをなくし膜部材３ａの着色による判定を正確に行うために設けられる。
【００１５】
一方、上部デバイス２は、下部デバイス１の形状に対応して上面２ａとこの上面２ａから略垂直に下方へ延設された側壁２ｂとを有する蓋状に形成されている。そして、上部デバイス２には水平方向の断面が略円形の２つの開口部４（４ａ，４ｂ）が設けられており、この２つの開口部４（４ａ，４ｂ）には検体を導入するための２つのアダプター開口部５（５ａ，５ｂ）と孔部６（６ａ，６ｂ）を有するアダプター７が載置されている。なお、２種類のリガンドを同時に検出することができるように、上部デバイス２は２つの開口部４（４ａ，４ｂ）を備えている。また、開口部４（４ａ，４ｂ）には上部デバイス２から下方に向けて徐々に直径が小さくなるように斜設された略円錐形状の内壁８（８ａ，８ｂ）が上部デバイス２と一体に形成されており、アダプター７はこの開口部４（４ａ，４ｂ）の形状に対応した形状に形成され、開口部４（４ａ，４ｂ）に取り外し自在に設けられている。また、アダプター７の底部９（９ａ，９ｂ）には、各アダプター開口部５（５ａ，５ｂ）について１つの孔部６（６ａ，６ｂ）が設けられている。また、各アダプター開口部５（５ａ，５ｂ）へ着脱自在に、フィルター１０を支持する固定リング１１が備えられている。
【００１６】
そして、下部デバイス１の側壁１ｂの上端と上部デバイス２の側壁２ｂの下端とを嵌合させることで、下部デバイス１と上部デバイス２とで装置の外郭をなすように構成されている。また、下部デバイス１と上部デバイス２とを組み合わせたときに開口部４がフィルター部材３のほぼ中央部に位置するように構成され、開口部４の内壁８の下端はフィルター部材３の上面を下方に向かって押さえ込むようになっており、アダプター７の下端はフィルター部材３の上面に接している。なお、上部デバイス２に検体名など記載するためのスペース２１を確保するために、開口部４は上部デバイス２の一端側にやや偏って配置されている。また、２２（２２ａ，２２ｂ）はリガンドの検出に用いられる金コロイドパッドであり、アダプター開口部５（５ａ，５ｂ）に設けられている。
【００１７】
複数の開口部４（４ａ，４ｂ）の上部に載置されたアダプター７の上部には、その複数の開口部４（４ａ，４ｂ）に同時に検体を導入するための単一の導入開口部たる上部アダプター１２が着脱自在に設けられている。この上部アダプター１２は、上部に略円形状に開口した開口端１３を有する有底容器形状であって、開口端１３から下方に向けて徐々に直径が小さくなるように斜設された略円錐形状の内壁１４を備えている。上部アダプター１２の底面１５は、その直径方向に形成された直線状の稜線部１６を最高部としてその両端へ向かって下がるように形成されており、断面が山形形状になっている。そして、底面１５の両端の最低部には、それぞれのアダプター開口部５（５ａ，５ｂ）の上部に連通する２つの導入通路たるガイド１７（１７ａ，１７ｂ）が設けられている。なお、このガイド１７（１７ａ，１７ｂ）は、上部アダプター１２の底面１５からアダプター開口部５（５ａ，５ｂ）に向けて下方に傾斜している。そして、上部アダプター１２に滴下された検体がガイド１７（１７ａ，１７ｂ）を経由して、開口部４（４ａ，４ｂ）に載置された２つのアダプター開口部５（５ａ，５ｂ）に同時に導入されるようになっている。
【００１８】
次に、上記フロースルー型リガンド検出装置を用いたリガンド検出方法について、免疫測定法を用いたインフルエンザウイルスの検出を例に取り説明する。
【００１９】
（１）金コロイド標識用抗Ａ型インンフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原を免疫し、一定期間維持したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．２５６，  ｐ４９５−４９７（１９７５））によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合する。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用いてインキュベーター中で３７℃に維持する。その後、ＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行う。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取する。得られた腹水からアフィニティクロマトグラフィー法によってＩｇＧを精製する（クローン名８Ｄ２）。
【００２０】
（２）金コロイド標識用抗Ｂ型インンフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
精製Ａ型インフルエンザウイルス抗原，Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートの代わりに、精製Ｂ型インフルエンザウイルス抗原，Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原固相プレートを用い、上記（１）の方法と同様にして作製する（クローン名９Ｄ１２）。
【００２１】
（３）固相用Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
上記（１）の方法と同様にして作製する（クローン名Ｂ４０）。
【００２２】
（４）固相用Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（マウス）の作製及び精製
上記（２）の方法と同様にして作製する（クローン名Ａ３）。
【００２３】
（５）金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
９ｍＬの金コロイド溶液（ＢＢＩ社、濃度０．０１（Ｗ／Ｖ）％の水溶液、ｐＨ７．１）に対して、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を１ｍＬ加えｐＨを８．５に合わせる。上記（１）で精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名８Ｄ２）を２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）で透析後、蒸留水で希釈し５０μｇ／ｍＬに調製する。この抗体１ｍＬを上記金コロイド溶液に撹拌しながら滴下し５分間静置し結合させる。その後１０％ＢＳＡを１ｍＬ加え１０時間穏やかに攪拌する。つぎに遠心管へ全量移し５０００ｇで３０分間遠心し上清を吸引廃棄する。沈渣を５％のシュークロースを含む２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．７）０．９ｍＬで浮遊させる。
【００２４】
（６）金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
上記（２）で精製した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名９Ｄ１２）を用い、上記（５）の方法と同様にして作製する。
【００２５】
（７）金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッド（金コロイドパッド２２ａ）の作製
上記（５）で作製した金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を５％シュークロースで５倍希釈し、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ガラスフィルター１６Ｓ（□１０×１０ｍｍにカット）に３０μＬ塗布し４５℃，６０分間乾燥機で乾燥させる。
【００２６】
（８）金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体パッド（金コロイドパッド２２ｂ）の作製
上記（６）で作製した金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体を用い、上記（７）の方法と同様にして作製する。
【００２７】
（９）フロースルー型リガンド検出装置の作製
吸収体３ｃとしてワットマン社製ＣＤ４２７−０７、吸収体３ｃからの色戻りを無くし、判定をし易くするためのスペーサー３ｂとしてミリポア社製ＧＦＣＰ２０３０００、膜部材３ａとしてＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製ニトロセルローストランスファーメンブラン（孔径０．４５μｍ）、を順に下部デバイス１へ入れ、上部デバイス２で閉じる。その後アダプター７を上部デバイス２に取りつける。
【００２８】
つぎにアダプター７の孔部６ａを通して（３）で作製・精製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名Ｂ４０）をクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）で希釈した液１２μＬを膜部材３ａに塗布する。また同様に（４）で作製・精製した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体（クローン名Ａ３）をクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７）で希釈した液１２μＬを、孔部６ｂを通して膜部材３ａに塗布し、４５℃、４０分間乾燥機で乾燥させる。
【００２９】
（１０）フロースルー型リガンド検出装置の最終作製
上記（９）で組立てたフロースルー型リガンド検出装置のアダプター７を一度取り外し、反応中に生じる凝集物を取りの除く為のフィルター１０を、固定リング１１を用いてアダプター７の２つのアダプター開口部５（５ａ，５ｂ）にそれぞれ固定し、再度上部デバイス２へ装着する。
【００３０】
（１１）金コロイド標識インフルエンザウイルスモノクローナル抗体パッドの取付け
上記（１０）で組立てたフロースルー型リガンド検出装置のアダプター開口部５ａへ金コロイド標識抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰウイルスモノクローナル抗体パッド（金コロイドパッド２２ａ）を１枚入れる。同様にアダプター開口部５ｂへ金コロイド標識抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰウイルスモノクローナル抗体パッド（金コロイドパッド２２ｂ）を１枚入れる。
【００３１】
（１２）検出方法
インフルエンザウイルスＡ型又はＢ型を含むと思われるサンプル（検体）を１％ＢＳＡ，５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，１５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）緩衝液１．０ｍＬに浮遊させ、０．２２μｍのフィルターで濾過した後、フロースルー型リガンド検出装置の上部アダプター１２へ全量滴下する。液がガイド１７（１７ａ，１７ｂ）を通り、アダプター開口部５ａ，アダプター開口部５ｂへ同時に供給される。サンプルが吸収体３ｃに全量吸収されたらアダプター７を上部デバイス２から外し膜部材３ａへの着色の有無を判定する。孔部６ａ下部の膜部材３ａが金コロイドの色（赤色）に着色していたら、サンプル中にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていた事になる。又は孔部６ｂ下部の膜部材３ａが金コロイドの色（赤色）に着色していたら、サンプル中にＢ型インフルエンザウイルスが含まれていた事になる。膜部材３ａの色が白色のままであれば、サンプル中にＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスが含まれていなかった事になる。
【００３２】
以上のように、本実施例のフロースルー型リガンド検出装置によれば、フィルター部材３と、このフィルター部材３を支持する下部デバイス１と、この下部デバイス１の上部に設けられ複数の開口部４（４ａ，４ｂ）を備えた上部デバイス２とからなるフロースルー型リガンド検出装置において、前記開口部４（４ａ，４ｂ）の上部に検体を導入するための単一の導入開口部たる上部アダプター１２を備えている。
【００３３】
この構成によれば、単一の上部アダプター１２に検体を一回滴下するだけで複数の開口部４（４ａ，４ｂ）に同時に検体を導入することができ、複数のリガンドの検出を簡便に行なうことができる。
【００３４】
また、前記上部アダプター１２は上部が開口した有底容器形状であって、その底部たる底面１５に、前記開口部４（４ａ，４ｂ）の上部に連通する複数の導入通路たるガイド１７（１７ａ，１７ｂ）を設けている。
【００３５】
この構成によれば、上部が開口した有底容器形状の上部アダプター１２の上部から検体を滴下することで、上部アダプター１２の底面１５に設けられた複数のガイド１７（１７ａ，１７ｂ）を経由して複数の開口部４（４ａ，４ｂ）に検体を導入することができ、簡単な構成で複数のリガンドの検出を行なうことができる。
【００３６】
さらに、本実施例のリガンド検出方法によれば、前記上部アダプター１２に検体を滴下して前記開口部４（４ａ，４ｂ）に検体を導入するので、複数のリガンドの検出を簡便に行なうことができる。
【００３７】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内において種々の変形実施が可能である。例えば、開口部４を３つ以上設け、その３つ以上の開口部に同時に検体を導入するように構成してもよい。また、上部アダプター１２の形状は、複数の開口部４に検体を同時に導入できる形状であれば、上記実施例に示したものに限らず、底面１５の断面形状は山形形状以外に中央部が高く形成された丸型形状などであってもよい。また、検出対象となるリガンドはインフルエンザウイルスに限らず、それ以外のリガンドの検出に用いてもよい。さらに、金コロイドパッド２２ａ，２２ｂを用いる代わりに、モノクローナル抗体を錠剤に加工したものを用いてもよいなど種々の変形が可能である。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の請求項１記載のフロースルー型リガンド検出装置は、フィルター部材と、このフィルター部材を支持する下部デバイスと、この下部デバイスの上部に設けられ複数の開口部を備えた上部デバイスとからなるフロースルー型リガンド検出装置において、前記開口部の上部に検体を導入するための単一の導入開口部を備えたので、単一の導入開口部に検体を一回滴下するだけで複数の開口部に同時に検体を導入することができ、複数のリガンドの検出を簡便に行なうことができる。
【００３９】
本発明の請求項２記載のフロースルー型リガンド検出装置は、請求項１において、前記導入開口部は上部が開口した有底容器形状であって、その底部に前記開口部の上部に連通する複数の導入通路を設けたので、上部が開口した有底容器形状の導入開口部の上部から検体を滴下することで、導入開口部の底部に設けられた複数の導入通路を経由して複数の開口部に検体を導入することができ、簡単な構成で複数のリガンドの検出を行なうことができる。
【００４０】
本発明の請求項３記載のリガンド検出方法は、請求項１又は２記載のフロースルー型リガンド検出装置の前記導入開口部に検体を滴下して前記開口部に検体を導入するので、複数のリガンドの検出を簡便に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のフロースルー型リガンド検出装置の一実施例を示す上面図である。
【図２】同上断面図である。
【符号の説明】
１  下部デバイス
２  上部デバイス
３  フィルター部材
４，４ａ，４ｂ  開口部
１２  上部アダプター（導入開口部）
１５  底面
１７，１７ａ，１７ｂ  ガイド（導入通路）
【図１】
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【図２】
2004279158.tif 000004