(57)【要約】【課題】簡便かつ正確、詳細に植物に由来する異物を同定するための方法及びツールを提供すること。【解決手段】（ａ）植物に特異的な塩基配列を有する非保存領域として、内部転写スペーサー領域１（ＩＴＳ１）又は内部転写スペーサー領域２（ＩＴＳ２）をターゲットとし、（ｂ）上記ＩＴＳ１又はＩＴＳ２の各々の両側に存在する２つの保存領域の塩基配列中の植物で保存されている配列に基づいて設計された２つの植物ユニバーサルプライマーを含み、これらのプライマーの少なくとも一方は、植物で保存されていて、かつカビ・コウボとは異なっている塩基配列を含んでいる、プライマーセットを構成し、（ｃ）上記プライマーセットを用いて、異物から調製したＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、（ｄ）増幅された上記非保存領域を含む核酸断片の塩基配列から異物を同定することを特徴とする植物に由来する異物の同定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）植物に特異的な塩基配列を有する非保存領域として、内部転写スペーサー領域１（ＩＴＳ１）又は内部転写スペーサー領域２（ＩＴＳ２）をターゲットとし、
（ｂ）上記ＩＴＳ１又はＩＴＳ２の各々の両側に存在する２つの保存領域の塩基配列中の植物で保存されている配列に基づいて設計された２つの植物ユニバーサルプライマーを含み、これらのプライマーの少なくとも一方は、植物で保存されていて、かつカビ・コウボとは異なっている塩基配列を含んでいる、プライマーセットを構成し、
（ｃ）上記プライマーセットを用いて、異物から調製したＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、
（ｄ）増幅された上記非保存領域を含む核酸断片の塩基配列から異物を同定することを特徴とする植物に由来する異物の同定方法。
【請求項２】
（ｄ）において、核酸断片の塩基配列決定を行うことにより異物を同定する請求項１記載の同定方法。
【請求項３】
非保存領域をＩＴＳ１とした請求項１又は２記載の同定方法。
【請求項４】
請求項１に記載の同定方法に用いるためのプライマーセット。
【請求項５】
２つの植物ユニバーサルプライマーが、ＩＴＳ１の両側に存在する２つの保存領域の塩基配列に基づいて設計された次の塩基配列を有するものである請求項４記載のプライマーセット。
５’−ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＹＴＧ−３’（配列番号１に示す塩基配列）
５’−ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  Ｇ−３’（配列番号２に示す塩基配列）
【請求項６】
配列番号１に示す塩基配列のうち、連続した１５塩基以上の塩基配列を含むプライマー、又は、そのプライマーに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡの逆相補鎖に相当する塩基配列を含むプライマー、
及び配列番号２に示す塩基配列のうち、連続した１５塩基以上の塩基配列を含むプライマー、又は、そのプライマーに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡの逆相補鎖に相当する塩基配列を含むプライマーを含む請求項４に記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物に由来する異物の同定方法及びこれに用いるためのプライマーセットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
食品等に混入した異物の同定や、警察の鑑識捜査においては、微量のサンプルをを同定する必要がある。微量のサンプルが植物や昆虫に由来する場合、形態的な特徴を指標にした同定方法が現在は主流であるが、こうした同定方法は、熟練された解析技術を必要とするため、簡便に正確で詳細な同定を行い難い問題がある。同時に、異物は極微量であったり、断片化及び変形していたり、加熱等で変性したりしている場合が多いため、これらを同定することは至極困難である。
【０００３】
一方、近年ＤＮＡの塩基配列情報を客観的な指標とする同定方法が提案されている。
（１）ＤＮＡの塩基配列情報を用いる同定方法として、特開平７−５９５６８号公報には、植物の遺伝子の可変領域のＤＮＡに隣接する不変領域を構成する塩基配列を有する任意のオリゴヌクレオチドの一種をプライマーとして用い、これを植物のＤＮＡにおける当該不変領域に結合させ、これを延長及び増幅させ１本鎖ＤＮＡを得ることを特徴とする、植物ＤＮＡの可変領域における塩基配列を有する１本鎖ＤＮＡプローブの製造方法及びこれを用いた植物の遺伝的同一性の検定方法が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
この方法では、上記特定の植物の可変領域における塩基配列を含む１本鎖ＤＮＡプローブを調製し、これを当該植物と同一の属若しくは種に含まれる他の植物のＤＮＡとハイブリダイズさせ、当該植物同士のバンドパターンを比較して、当該可変領域における塩基配列の差異を検定することで、植物の遺伝的同一性を検定する（段落番号００２５）。
【０００５】
この文献には、ｒＤＮＡを２個のプライマーを設定してＰＣＲ法で増幅することが至極困難であることが記載され（段落番号０００７及び０００８）、この方法は、ＰＣＲによる１本鎖ＤＮＡの増幅法であるため、２本鎖ＤＮＡの増幅法に比べて、増幅効率は低い（段落番号００２８）。この方法は、ある程度まで同定されている植物間の遺伝的同一性を検定するためのもので、如何なる植物のものであるか判らない異物等のサンプルについて増幅した可変領域を調べて、如何なる植物のものかを同定する方法ではない。なお、本明細書中で「非保存領域」と「可変領域」は同義であり、「保存領域」と「不変領域」は同義である。
【０００６】
（２）（１）に示した方法とは別に、ＰＣＲで特定の塩基配列を増幅させる方法が知られている。一例として、『日本食品衛生学会第７６回学術講演会  講演要旨集，第５２頁，塩基配列の解析による食品内生物系異物の同定』には、全ての昆虫において保存されているミトコンドリア１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域、及び植物において保存されているＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子領域を利用して、保存されている塩基配列からプライマーを設計し、生物の同定を行った研究が報告されている（非特許文献１）。
【０００７】
しかしながら、上記のプライマーセットにより増幅される領域は、多くの生物において保存され、類似している塩基配列を含むことから、例えば種又は属などの詳細なレベルまで正確に同定するのは難しい。したがって、より詳細な同定を行なうためには同定に用いる塩基配列の長さを長くする必要があるが、加熱等によって、ＤＮＡが損傷しているサンプルの場合には、ＰＣＲ産物が増幅されにくい。更に、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子は、色素体ゲノムにコードされた緑色植物特異的遺伝子であり、植物の同定に使いやすいという利点がある反面、サンプルが色素体含量が少ない植物の組織や部位である場合には、ＰＣＲ産物が得られ難いという問題がある。
【０００８】
（３）『Ｍｏｌ  Ｅｃｏｌ  ２０００  Ｏｃｔ；９（１０）：１５４９−１５５９』には、米国テキサス洲のエドワーズ高原の洞窟から採集した植物の根（重量２００ｍｇ）について、１８Ｓ  ｒＲＮＡとｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒＲＮＡ上に設計された植物ユニバーサルプライマーを用いて、ＩＴＳ１、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＩＴＳ２またがる長い領域をＰＣＲし、得られたＰＣＲ産物の塩基配列情報を、予め準備した洞窟の上の地上部から採取した植物組織の該当領域の塩基配列データベースと比較して、根を属・種レベルまで同定している。（非特許文献２）
【０００９】
ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、植物とカビ・コウボのような真菌類の間で強く保存されており、この文献で用いられている植物ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ産物を得た場合には、カビ・コウボ等（被検サンプル表面に付着した黴・酵母等のＤＮＡ）から得られるＰＣＲ産物と区別することができないことが危惧された。しかし、上記の危惧に拘らず、同方法では、結果的に植物のＰＣＲ産物を得ることに成功しているが、これは、サンプルが２００ｍｇという多くの量であり、また生きている植物根を冷凍したものであり、そこから抽出されたＤＮＡは、ほとんどがその植物由来のものであったために、純粋な植物のＰＣＲ産物を得ることができたものと考えられる。
【００１０】
しかしながら、前記のような異物の同定においては、サンプルが極微量であり、（食品に混入した異物の場合は通常数ｍｇ程度）、かつ、加熱によるＤＮＡの損傷も激しいため、その表面にカビ・コウボが付着した場合、サンプルから抽出されたＤＮＡ中のカビ・コウボ由来ＤＮＡの占める割合が高くなり、それらのＤＮＡの混入は無視できるものでないことが予想される。また、異物には、人に触れられる等で人や動物のＤＮＡが混入する場合もある。このため、繰り返しとなるが、非特許文献２に記載されたような方法では、カビ・コウボなどの他の生物由来ＤＮＡの混入への対処が行なわれていないので、植物異物を詳細かつ正確に同定することはできない。
以上のような理由から、詳細かつ正確に、熟練した技術を用いることなく異物を同定するための手段が望まれていた。
【００１１】
【特許文献１】
特開平７−５９５６８号公報
【非特許文献１】
日本食品衛生学会第７６回学術講演会  講演要旨集，第５２頁
【非特許文献２】
Ｍｏｌ  Ｅｃｏｌ  ２０００  Ｏｃｔ；９（１０）：１５４９−１５５９
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、簡便かつ正確、詳細に植物に由来する異物を同定するための方法及びツールを提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、次の知見を得た。
即ち、内部転写スペーサー領域１（ＩＴＳ１）及び内部転写スペーサー領域２（ＩＴＳ２）は、植物種ごとに特異的な非保存領域であり、比較的塩基長の短い塩基配列からなり、
これらの両側に隣接する塩基配列、つまりＩＴＳ１の場合は１８ＳｒＲＮＡ及び５．８ＳｒＲＮＡ、ＩＴＳ２の場合は５．８ＳｒＲＮＡ及びｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒＲＮＡ（２５Ｓ  ｒＲＮＡ或いは２８Ｓ  ｒＲＮＡ）は、広く植物全般において保存され、かつ、植物と他の生物種を画する塩基配列の領域を有しており、
したがって、各々の２つの保存領域に、植物全般に対するユニバーサルプライマーセットを構成し、これらより上記非保存領域を含む核酸断片を増幅すれば、上記非保存領域を含む核酸断片が得られる。
同時に、これらの両側に隣接する保存領域中のできるだけ非保存領域に近い領域の塩基配列には、植物とカビ・コウボ等とを明確に区別し得る塩基配列が含まれており、上記技術思想に沿って、核酸断片を増幅すれば、植物の非保存領域を含み、その両側に塩基長の短い配列を繋げた、全体として塩基長の短い核酸断片が得られる。
【００１４】
これにより、異物が微量であったり、変形や変性したものであっても、当該異物から調製したＤＮＡを使って、上記植物種ごとに特異的な非保存領域を含む核酸断片を確実に増幅でき、これより当該異物を構成する植物種を正確かつ詳細に同定することが可能となる。つまり、異物に含まれる植物種のＤＮＡがある程度損傷を受けていても、増幅されるＤＮＡ断片のサイズが小さいので、その異物中に残存するＤＮＡから、その植物種の非保存領域を確実に増幅でき、同定に供することができる。
【００１５】
更に、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２の塩基配列は、植物と哺乳類で塩基長が異なるため、増幅された核酸断片の塩基長から両者を正確に判別でき、植物のものと判別した核酸断片の塩基配列決定を行うことで、植物由来のものから正確、詳細に同定することが可能となる。そして、以上の同定は、ＤＮＡを操作する比較的簡便な方法によって達成される。
【００１６】
本発明者らは、以上の知見を得、これに基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（ａ）植物に特異的な塩基配列を有する非保存領域として、内部転写スペーサー領域１（ＩＴＳ１）又は内部転写スペーサー領域２（ＩＴＳ２）をターゲットとし、
（ｂ）上記ＩＴＳ１又はＩＴＳ２の各々の両側に存在する２つの保存領域の塩基配列中の植物で保存されている配列に基づいて設計された２つの植物ユニバーサルプライマーを含み、これらのプライマーの少なくとも一方は、植物で保存されていて、かつカビ・コウボとは異なっている塩基配列を含んでいる、プライマーセットを構成し、
（ｃ）上記プライマーセットを用いて、異物から調製したＤＮＡを鋳型とした増幅反応を行い、
（ｄ）増幅された上記非保存領域を含む核酸断片の塩基配列から異物を同定することを特徴とする植物に由来する異物の同定方法である。
また、本発明は、上記同定方法に用いるためのプライマーセットである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．定義
図１で示すように、植物細胞の染色体上にあるリボゾームＲＮＡ遺伝子クラスターは、保存領域である１８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ及びｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒＲＮＡ（２５Ｓ  ｒＲＮＡ或いは２８Ｓ  ｒＲＮＡ）がこの順で並び、各ｒＲＮＡの間に、非保存領域（内部転写スペーサー領域）であるＩＴＳ１及びＩＴＳ２が存在する構造となっている。
【００１８】
本発明において「保存領域」とは、生物の長い進化の過程でその領域の塩基配列が変化せずに、ほぼ保存されている配列を有するゲノム領域を指す。保存領域は、全ての生物において保存されている領域でもよいし、特定の生物集団において保存されているものでもよい。一方、「非保存領域」とは、生物の進化の過程でその領域内の塩基配列の変化が起こりやすく、特定の生物集団に特異的な配列を有するゲノム領域を指す。非保存領域は、特定の生物集団では共通する配列を有するが、他の生物集団のものとは異なるため、その生物集団に特異的なものであればよい。
なお、本発明では、図１において、１８ＳｒＲＮＡ側を上流、ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒＲＮＡ側を下流と定義する。
【００１９】
２．概要
本発明に係る異物の同定方法は、２つの保存領域の塩基配列に基づいて作製されたプライマーセットを用いて、この２つの保存領域に挟まれて存在する非保存領域を含む核酸断片を増幅し、得られる核酸断片から被検サンプルを同定することを特徴とするものである。プライマーセットを用いた被検サンプルの同定について、図２を参照しながら説明する。
【００２０】
図２では、２つの異なる生物集団のゲノム、例えば、種の異なる植物である「タマネギ」（図２Ａ）と「リンゴ」（図２Ｂ）において、上流から順に、保存領域１、非保存領域、及び保存領域２が配置されている場合について説明する。
図２Ａにおいては、ある特定の種の植物「タマネギ」のゲノムを示し、非保存領域の塩基配列は「タマネギ」に特異的な配列を有している。また図２Ｂにおいては、他の種の植物「リンゴ」のゲノムを示し、非保存領域の塩基配列は「リンゴ」に特異的な配列を有している。図２Ａ及びＢにおいては、非保存領域をドット（Ａ）と縦線（Ｂ）で区別して示している。
【００２１】
本発明において、「保存領域」は植物全般において保存されているものであり、「非保存領域」は、例えば、植物の属レベル又は種レベルで共通するが、他の属や種では異なり、その属や種の植物に特異的なものであればよい。
プライマーセットは、この非保存領域を含む核酸断片を増幅するために、非保存領域の両側に存在する保存領域１及び保存領域２の塩基配列に基づいて作製する。「保存領域の塩基配列に基づいて」とは、プライマーを設計する際に、保存領域をコードする塩基配列からなるＤＮＡを鋳型として、という意味であり、プライマーの種類、採用する増幅法などにより「基づく」という意味は異なる。例えばＰＣＲ法を採用して増幅反応を行う場合、設計するプライマーの配列は、鋳型ＤＮＡに対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合は鋳型ＤＮＡに対し相同配列となり、リバースプライマーの場合は鋳型ＤＮＡに対し相補配列となる。例えば、図２において、フォーワードプライマーＬ及びＭは、保存領域１の塩基配列に対し相同的になるよう設計し、リバースプライマーＮ及びＯは、保存領域２の塩基配列に対し相補的になるよう設計する。
【００２２】
プライマーは、保存領域１又は保存領域２の塩基配列内であればどの部分の塩基配列に基づいて設計してもよい。例えば、図２においては、フォーワードプライマー（Ｌ及びＭ）並びにリバースプライマー（Ｎ及びＯ）をそれぞれ２つの異なる部分の配列に基づいて設計している。好ましくは、増幅される核酸断片の長さが長くならないように、非保存領域からできる限り近い部分の塩基配列に基づいてプライマーを設計する。
【００２３】
このようにして設計したプライマーセットを用いて増幅反応を行った場合には、保存領域１及び保存領域２をゲノム上に有する全ての生物又は特定の生物集団から核酸断片を増幅することができる。また、増幅される核酸断片は、非保存領域を含むこととなる。従って、１組のプライマーセットにより、全ての生物又は特定の生物集団から核酸断片を増幅することができるため、対象とする生物ごとに種々のプライマーを用いて複数回増幅反応を行う必要はない。
【００２４】
例えば、図２Ａ及びＢに示すように、フォーワードプライマーＬ又はＭと、リバースプライマーＮ又はＯとが組み合わされたものを１つのプライマーセットとして使用する。フォーワードプライマーＬとリバースプライマーＮとを組み合わせた場合には核酸断片Ｌ−Ｎが増幅され、フォーワードプライマーＬとリバースプライマーＯとを組み合わせた場合には核酸断片Ｌ−Ｏが増幅され、フォーワードプライマーＭとリバースプライマーＮとを組み合わせた場合には核酸断片Ｍ−Ｎが増幅され、フォーワードプライマーＭとリバースプライマーＯとを組み合わせた場合には核酸断片Ｍ−Ｏが増幅される。図２Ａ及びＢに示す非保存領域の塩基配列はそれぞれ異なるが、同じプライマーセットを用いてそれぞれの非保存領域を含む核酸断片を増幅することができる。
【００２５】
このようにして増幅される核酸断片は、特定の生物集団に特異的な塩基配列を有する非保存領域を含むため、この非保存領域の塩基配列により、その生物を特定することが可能となる。以上、プライマーセットの設計及びプライマーセットを用いて増幅反応を行う場合の一般論について説明したが、プライマーセットの具体的な設計については後述する。
【００２６】
２．保存領域と非保存領域の決定
本発明において、増幅ターゲットとなる非保存領域と、プライマーを設計する際の鋳型とする２つの保存領域は、以下に記載するようにして決定する。
（１）非保存領域
非保存領域は、特定の生物集団に特異的な塩基配列を有するゲノム領域である。非保存領域は、更に、例えば、いずれの生物種のいずれの部位又は組織においてもコピー数が多いこと、種々の生物種に関してデータベースに登録されていること等の条件を満たすものが好ましい。
【００２７】
本発明においては、非保存領域は、特に内部転写スペーサー領域１（ＩＴＳ１）又は内部転写スペーサー領域２（ＩＴＳ２）とする。特に、非保存領域をＩＴＳ１とすることが望ましい。これは、ＩＴＳ１は、植物種ごとに特異的な塩基配列を有すると共に、これに隣接する保存領域中のＩＴＳ１に近い領域に、植物とカビ・コウボ等とを明確に区別し得る塩基配列を有し、核酸断片を増幅した場合に、植物のＩＴＳ１を含む塩基長の短い核酸断片が確実に得られ、これに基づいて正確で詳細な植物異物の同定を実施することが可能となるためである。また、ＩＴＳ１は、哺乳類においては配列が長く、植物においては短いことが知られているため、異物サンプル由来のＤＮＡにヒトＤＮＡが混入し、ヒト由来の増幅産物が得られた場合でも、増幅された核酸断片の長さから、被検サンプルが動物由来か植物由来かを判定することができるためである。
【００２８】
（２）保存領域
保存領域は、上記非保存領域に隣接して存在する２つの領域であり、特定の生物集団内において保存されている。このような保存領域は、更に、例えば、いずれの生物種のいずれの部位又は組織においてもコピー数が多いこと、種々の生物種に関してデータベースに登録されていることなどの条件を満たすものが好ましい。
本発明において、上記非保存領域に隣接して存在する２つの保存領域は、ＩＴＳ１に隣接する１８Ｓ  ｒＲＮＡ及び５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、又はＩＴＳ２に隣接する５．８Ｓ  ｒＲＮＡ及びｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｒＲＮＡ（２５Ｓ  ｒＲＮＡ或いは２８Ｓ  ｒＲＮＡ）とする。
【００２９】
３．プライマーの設計
本発明に係るプライマーセットは、上記「２．保存領域と非保存領域の決定」の項に記載のようにして決定された２つの保存領域の塩基配列に基づいて設計する。
プライマーセットは、ＩＴＳ１又はＩＴＳ２の各々の両側に存在する２つの保存領域の塩基配列中の植物で保存されている配列に基づいて設計された２つの植物ユニバーサルプライマーを含み、これらの内の少なくとも一方が、植物で保存されていて、かつカビ・コウボとは異なっている塩基配列を含むように設計する。
【００３０】
プライマーは、保存領域内であればいずれの部分に基づいて設計してもよいが、加熱等によってＤＮＡが損傷を受けているサンプルであっても、増幅産物が得られやすいように、できる限り非保存領域に近い部分に基づいて設計し、増幅産物のサイズ、即ち塩基数を出来る限り小さくすることが好ましい。
プライマーを設計する際の条件は、採用する増幅法に応じて異なる。例えば増幅法としてＰＣＲ法を採用する場合には、プライマー設計の条件としては、プライマーの長さ、プライマーセットに含まれる複数のプライマー間の相補性、ＧＣ含量、Ｔｍ値、プライマーの濃度などが挙げられる。
【００３１】
プライマーを設計する際の条件は当技術分野で公知であり、例えば、「ＰＣＲ法最前線−基礎技術から応用まで（蛋白質  核酸  酵素  臨時増刊号）」，関谷及び藤永編，共立出版株式会社，１９９６年、「バイオ実験イラストレイテッド３本当にふえるＰＣＲ（細胞工学別冊  目で見る実験ノートシリーズ）」，中山広樹著，株式会社秀潤社，１９９６年、並びにその他のプライマー設計に関する文献及びマニュアルなどを参照されたい。
【００３２】
設計するプライマーの長さは、採用する増幅反応により異なるが、例えばＰＣＲ法により増幅を行う場合には、約１５〜３５塩基長、好ましくは２０〜２５塩基長である。
設計するプライマーは、ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡのキメラ配列であってもよい。また、プライマーの配列中に、イノシンなどのリボヌクレオシドが含まれてもよい。
【００３３】
本発明において、プライマーの設計には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができ、このようなソフトウエアを利用することによって、容易に、プライマーとしての機能を有するプライマーを確認し、設計することができる。本発明で利用可能なプライマー設計用ソフトウエアとしては、例えばＯｌｉｇｏ  ５．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＨＹＢｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ４（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）などが挙げられる。
【００３４】
プライマーの合成法は当技術分野で周知である。例えば、ホスホロアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
上記「２．保存領域と非保存領域の決定」の項において、２つの保存領域を５．８Ｓ  ｒＲＮＡ及び１８Ｓ  ｒＲＮＡとした場合、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ及び１８Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列に基づいて作製したプライマーセットは、その保存領域に挟まれる非保存領域（ＩＴＳ１）を増幅することができるものである。
【００３５】
このようなプライマーセットを構成する２つの植物ユニバーサルプライマーとして、具体的には、次のものが挙げられる。
即ち、上流側のｆｏｒｗａｒｄプライマーとしては、塩基配列が５’−ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＹＴＧ−３’（配列番号１に示す）のもの、下流側のｒｅｖｅｒｓｅ  プライマーとしては、塩基配列が５’−ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  Ｇ−３’（配列番号２に示す）のものが挙げられる。
【００３６】
これらの植物ユニバーサルプライマーの設計の基礎となったデータの一例として、１４種の植物、コウボの１８Ｓ  ｒＲＮＡ内の下流域塩基配列のアライメント結果を図３に示し、また、１２種の植物、コウボの５．８Ｓ  ｒＲＮＡ内の上流域の塩基配列のアライメント結果を図４に示す。
また、ＩＴＳ１を増幅するためのｆｏｒｗａｒｄプライマーとして、配列番号１に示す塩基配列のうち、連続した１５塩基以上の塩基配列を含むプライマー、又は、そのプライマーに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡの逆相補鎖に相当する塩基配列を含むプライマーを採用することができる。また、ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマーとして、配列番号２に示す塩基配列のうち、連続した１５塩基以上の塩基配列を含むプライマー、又は、そのプライマーに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡの逆相補鎖に相当する塩基配列を含むプライマーを採用することができる。
【００３７】
なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、２つのＤＮＡ断片がＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊらによって記載されたような標準的なハイブリダイゼーション条件下で、相互にハイブリダイズすることを意味する（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．  ｃｏｌｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９））Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＵＳＡ，  ９．  ４７−９．  ６２及び１１．４５−１１．６１）。より具体的には、例えば３×ＳＳＣ、３７℃でハイブリダイズを行ない、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ  ３７℃で洗浄を行なう条件が挙げられる。ハイブリダイズする塩基配列等に応じて適宜ハイブリダイゼーション及び洗浄に適切な「ストリンジェントな条件」を選択することは、当技術分野では周知事項である。
【００３８】
以上の植物ユニバーサルプライマーを含むプライマーセットを用いることにより、カビ・コウボ等のＤＮＡに存在するＩＴＳ１領域が増幅されることを回避して、植物に特異的なＩＴＳ１領域のみを含む核酸断片を確実に増幅することが可能となる。つまり、図２に示すような、非保存領域の塩基配列がそれぞれ異なる植物の核酸断片（即ち、「タマネギ」（図１Ａ）や「リンゴ」（図１Ｂ）等の核酸断片）を増幅することができる。
【００３９】
４．異物からの核酸調製
本発明の同定方法は、異物（被検サンプル）から調製したＤＮＡを鋳型とし、上記「３．プライマーの設計」の項で記載のようにして設計したプライマーセットを用いて核酸断片を増幅し、その核酸断片から、被検サンプルを同定するものである。
ここで、異物とは、例えば、本来その製品中にあってはならないものが混入していたものを指し、食品等では、使用原料以外に当該食品中に混入した物質を指す。本発明において、同定の対象となる異物は、植物由来のサンプルであれば特に限定されず、例えば、食品に含まれる異物等、様々な製品に含まれる異物、犯罪捜査上の証拠品を例示することができる。
【００４０】
本発明の同定方法においては、微量サンプル、例えば１０ｍｇ以下程度のサンプル、更に１ｍｇ程度のサンプルであっても、被検サンプルとして用いることができる。本発明の同定方法によれば、植物の非保存領域を含む塩基長の短い核酸断片を確実に増幅できるためである。
被検サンプルからのＤＮＡの調製は、当技術分野で周知の方法を適宜使用して行うことができる。例えば、ＤＮＡを調製する場合には、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用することができる。
【００４１】
５．増幅反応
本発明の同定方法においては、次いで、上記「３．プライマーの設計」の項に記載のように設計したプライマーセットを用いて、非保存領域の塩基配列を含むＤＮＡ断片を増幅する。本発明において、ＤＮＡ断片を増幅する工程においては、当技術分野で周知のあらゆる増幅法を用いることができる。
核酸断片を増幅する手法としては、特に限定されないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の原理を利用した公知の方法を挙げることができる。ＰＣＲ法の原理は、まず、鋳型となるＤＮＡ２本鎖を加熱して変性させて１本鎖にし（変性）、次に、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両方の鎖に相補的な２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げて、プライマーとＤＮＡ鎖の相補的な部位とが２本鎖を形成するようにし（アニーリング）、そしてこの状態でＤＮＡ合成基質であるデオキシヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼとを作用させると、ポリメラーゼがプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく（伸長）という、３段階からなるＤＮＡ合成反応を繰り返して行うことにある。
【００４２】
ＤＮＡを鋳型として核酸断片を増幅する場合は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＲＣＡ法（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などを挙げることができる。
ＰＣＲ法では、被検サンプルから調製したＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーセットに含まれる一対のプライマー間の塩基配列を合成するものである。ＰＣＲ法によれば、変性、アニーリング及び合成からなるサイクルを繰り返すことによって、核酸断片を指数関数的に増幅させることができる。ＰＣＲの最適条件は、当業者であれば容易に決定することができる。
【００４３】
ＬＡＭＰ法では、被検サンプルから調製したＤＮＡを鋳型として、その鋳型の６カ所の領域に対して４種類のプライマーを設計して用い、鎖置換反応を利用して一定の温度で反応させることによって、核酸を１５分〜１時間で１０９〜１０１０倍に増幅することができる（栄研化学株式会社、Ｅｉｋｅｎ  ＧＥＮＯＭＥ  ＳＩＴＥホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｌｏｏｐａｍｐ．ｅｉｋｅｎ．ｃｏ．ｊｐ／参照）。
またＩＣＡＮ法では、被検サンプルから調製したＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡ（３´側）とＤＮＡ（５´側）からなるキメラプライマーを用い、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド部位を切断するリボヌクレアーゼにより、鎖伸長反応、鋳型交換反応及び切れ目導入反応を繰り返すことにより、キメラプライマーに挟まれた領域を特異的に増幅することができる（タカラバイオ株式会社ホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ−ｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ参照）。
【００４４】
ＲＣＡ法では、被検サンプルから調製したＤＮＡを環状の一本鎖ＤＮＡとして、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖ＤＮＡを合成することができる。この方法では、鋳型ＤＮＡを環状とすることによって、一本鎖ＤＮＡの合成が何周にもわたって起こり、９０分間で１０９倍程度に増幅することができる（ＳＮＰ遺伝子多型の戦略・ゲノムの多様性と２１世紀のオーダーメイド医療，松原謙一ら監修，中村祐輔編，中山書店，２０００年参照）。
ＬＣＲ法では、被検サンプルから調製したＤＮＡを鋳型として、その鋳型のセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれアニーリングする２種類の隣り合ったオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ＤＮＡリガーゼによりその隣り合うプローブを連結する反応を繰り返すことによって、核酸断片を指数関数的に増幅することができる（Ｂａｒａｎｙ，  Ｆ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８８：  １８９−１９３，  １９９１参照）。
【００４５】
ＳＤＡ法では、被検サンプルから調製したＤＮＡを、制限酵素が認識する塩基配列を有するプライマーを用いて、制限酵素とポリメラーゼとを組み合わせることにより、ＤＮＡ合成、制限酵素による切断、及び切断部位の修復のサイクルを繰り返すことにより核酸断片を増幅することができる（Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８９：  ３９２−３９６，  １９９２；Ｗａｌｋｅｒ，  Ｇ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２０：  １６９１−１６９６，  １９９２参照）。
上述したような公知の増幅反応により、上記「３．プライマーの設計」の項に記載のようにして設計したプライマーセットを用いて、非保存領域の塩基配列を含む核酸断片を、非常に効率よく増幅することができる。増幅は、その後、核酸断片を同定可能なレベルになるまで行う。
【００４６】
６．被検サンプルの同定
本発明の同定方法においては、次いで、上記「５．増幅反応」の項で増幅された核酸断片から被検サンプルを同定する。本発明において「同定」とは、被検サンプルとなる植物由来のサンプルにおいて、その植物がどの生物分類群に属するかを判定することを指す。本発明において「生物分類群」とは、一般的な生物分野において生物の分類に使用されている分類群を指し、例えば、岩波  生物学辞典  第４版，八杉龍一ら編，株式会社岩波書店，１９９６年などの文献には生物の分類に関して詳細な説明が記載されている。生物分類群としては、例えば界、門、綱、目、科、属、種、亜種等の群が挙げられ、科にはマメ科やウリ科、属にはダイズ属やカボチャ属が含まれる。本発明の同定方法は、植物がどの属又は種に属するかを判定する場合に特に有用である。
【００４７】
更に、本発明の同定方法において、上述した増幅工程において増幅された核酸断片は、植物の属又は種ごとに特異的な非保存領域のＩＴＳ１又はＩＴＳ２の塩基配列を有するため、その塩基配列から、被検サンプルが由来する植物の属又は種を判定することができる。増幅された核酸断片から被検サンプルを同定する方法としては、核酸断片の塩基配列決定を行い、その塩基配列から生物を特定する方法がある。しかしながら、増幅された核酸断片に基づいて生物を同定する方法であればこの方法に限定されるものではない。
【００４８】
核酸断片の塩基配列の決定は、ダイ・ターミネーター法などの周知の手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＡＢＩ製  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒなど）を用いて配列決定を行う。塩基配列決定反応を行うためのキットとしては、例えば  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）などが市販されている。
核酸断片の塩基配列を決定した後、その塩基配列を、例えば公知のデータベースで検索し、最も相同性の高い塩基配列を有する植物を特定することによって、被検サンプルを同定することができる。公知のデータベースとしては、特に限定されるものではないが、ＧｅｎＢａｎｋが挙げられる。
例えば、ＩＴＳ１の塩基配列は、多数の植物由来のものがＧｅｎＢａｎｋに登録されており、決定した塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬで検索することにより、最も同一性の高い塩基配列を有する植物種を特定することが可能である。
【００４９】
本発明に係る被検サンプルの同定方法は、あらゆる植物に由来する異物のサンプルから、同定に利用する核酸断片を増幅することが可能であるため、微量にしか存在しないサンプルであっても同定可能である。また、本方法の好ましい態様である、ＩＴＳ１領域を利用した場合には、その同定能が非常に高い。従って、食品に混入した異物の同定、警察の鑑識等において、微量なサンプルの同定及び特定に有用である。
【００５０】
７．同定用キット
本発明の同定方法は、同定用キットを用いて非常に容易に実施することができる。ここで、同定用キットは、少なくとも本発明のプライマーセットを含んでいる。また、同定用キットは、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類等を含んでもよい。
【００５１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕
［プライマーの設計］
（保存領域及び非保存領域の決定）
全ての植物由来の異物に対して、１種類のプライマーセットで対応できるようにするために、以下の条件を満たす塩基配列を検索した。
▲１▼  植物のどのような部位・組織でもコピー数が多い。
▲２▼  植物ユニバーサルプライマーが設計できる程度に保存された領域がある。
▲３▼  植物以外の生物のＤＮＡからはＰＣＲ産物が得られない。或いは、植物ＤＮＡ由来の産物と非植物ＤＮＡからの産物が容易に区別できる。
▲４▼  植物由来の異物の同定に使用できる程度に種々の植物の遺伝子配列がＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
これらの条件を満たす塩基配列として、植物の核ゲノムにコードされた１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＩＴＳ１−５．８Ｓ  ｒＲＮＡ領域をターゲットとして選択した。
【００５２】
すなわち、保存性の高い１８ＳｒＲＮＡ配列の３’末端と５．８ＳｒＲＮＡ配列の５’末端に、それぞれｆｏｒｗａｒｄプライマーとｒｅｖｅｒｓｅプライマーを設計し、１８ＳｒＲＮＡ遺伝子と５．８ＳｒＲＮＡ遺伝子に挟まれた保存性が極端に低いＩＴＳ１領域（約２１０ｂｐ）の配列情報を用いて、同定を行なうこととした。
（プライマーの設計）
決定した２つの各保存領域の塩基配列に基づいて、２つのプライマーを設計した。植物異物の同定を目的としているので、植物以外の生物からは増幅産物が得られないようにプライマーを設計した。
【００５３】
以下に具体的な手順を示した。
（１）植物ユニバーサル領域の検索
植物全般で保存されている配列を見つけるために、１２種類の植物（エンドウマメ（マメ科）、ダイズ（マメ科）、トマト（ナス科）、ジャガイモ（ナス科）、コメ（イネ科）、トウモロコシ（イネ科）、ココヤシ（ヤシ科）、ペポカボチャ（ウリ科）、アカナラ（ブナ科）、オレンジ（ミカン科）、ニンニク（ユリ科）、マツの一種）について、１８ＳｒＲＮＡ配列と５．８ＳｒＲＮＡ配列を入手し、それぞれから保存性の高い領域を抽出し、植物ユニバーサルプライマー候補領域とした。
【００５４】
（２）植物以外の生物由来ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ産物が得られないことのチェック
標的遺伝子は植物特異的な遺伝子ではないので、植物以外の生物から産物が得られないことを以下のように調べた。
被検サンプルとなる食品に混入した異物等は、人が触れていることが多く、サンプルから抽出したＤＮＡにヒトＤＮＡが混入することが懸念された。しかし、プライマー候補領域の塩基配列を用いたＢＬＡＳＴ検索の結果、（１）で選んだ植物ユニバーサルプライマー候補配列と相同性のある塩基配列は、ヒトＤＮＡ中にはないことがわかった。さらに、哺乳類のＩＴＳ１は植物に比べて数１００ｂｐ長く、ヒト由来ＤＮＡからＰＣＲ産物が得られたとしても、植物ＤＮＡからの産物（推定サイズ約３５０ｂｐ）と容易に区別がつくことが判明した。
また、バクテリアのような原核生物には５．８Ｓリボゾームが存在しないことから、異物由来のＤＮＡに原核生物のＤＮＡが混入していても原核生物ＤＮＡ由来の産物は得られないことが判明した。
更に、カビ・コウボＤＮＡについては、ｆｏｒｗａｒｄプライマーを（１）で選んだ１８Ｓ  ｒＲＮＡ３’末端領域中のプライマー候補領域から、カビ・コウボの配列とは異なる配列を含む領域から選び、産物が得られないことをコンピュータによるＰＣＲシミュレーション（Ａｍｐｌｉｆｙ  １．０）によって検証した。
【００５５】
（３）ＩＴＳ１領域に近い場所へのプライマーの設計
本同定法の対象とするサンプルでは加熱等により、ＤＮＡが損傷を受けていることも予想され、その場合でも増幅産物が得られやすいようにするためには、ＰＣＲによって得られる増幅産物のサイズを出来るだけ小さくする必要がある。このため、ｆｏｒｗａｒｄプライマーを１８ＳｒＲＮＡのできるだけ３’末端に近く、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを５．８ＳｒＲＮＡのできるだけ５’末端近くの配列から設計した。
以上のようにして、ＰＣＲプライマー配列を以下のように決定し、合成した。
＜植物核ＤＮＡ（１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＩＴＳ１−５．８Ｓ  ｒＲＮＡ領域）  プライマーセット＞
（ｆｏｒｗａｒｄ  プライマー）Ｐｌａ１８／ｆ１７３８        ５’−ＧＡＣ  ＧＴＣ  ＧＣＧ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＹＴＧ−３’（配列番号１に示す）
（ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマー）Ｐｌａ５８／ｒ４３    ５’−ＴＣＧ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＧＣＴ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  Ｇ−３’（配列番号２に示す）
【００５６】
〔実施例２〕
［異物サンプルの同定］
（食品に混入する可能性のあるモデル異物サンプルからのＤＮＡ抽出）
食品に混入する可能性のある異物のモデルサンプルとして、以下の植物サンプルを選択した。
（１）モデルサンプルとその選択基準
塩基配列による本同定方法と前記のプライマーが、食品中に混入した植物片の異物同定に適用可能であることを検証するために、異物のモデルサンプルを調製して、同定実験を行った。
モデルサンプルは、以下の要領で選択した。第一に、モデルサンプルとして、混入の報告のある植物を用い、その大きさを１ｍｇと１０ｍｇとした。この大きさは、食品中の異物として見つかる植物片の多くが数ｍｇ程度であることから決定した。第二に、以下の▲１▼〜▲３▼の基準に照らして調製した。
▲１▼  加工食品はレトルト加熱や炒煎処理を経ているものが多く、したがって、加熱を経た植物片をモデルサンプルとした。
▲２▼  加工食品の多くは、植物原料の混合物であるため、混入異物の表面には種々の植物組織が付着していると考えられるため、表面に種々の植物組織が付着した植物片をモデルサンプルとした。
▲３▼  本来、食品原料として用いられる植物の非可食部をモデルサンプルとした。これらは、植物由来原料加工時の選別工程が不充分であったり、調理時に誤って混入する場合を想定した。
上記の基準に照らして調製したモデルサンプルを以下に示す。
【００５７】
Ａ．焦げたタマネギの皮
１０５℃に調温した恒温槽中に１６ｈｒｓ置いた乾燥したタマネギの皮（それぞれ１ｍｇ、１０ｍｇ）をモデルサンプルとした（サンプルＡ）。１０５℃、１６ｈｒｓ処理後の乾燥タマネギ皮は、真っ黒に焦げた内部組織の外表面に白い皮をかぶった形態であった。このサンプルにより、炒煎等によって焦げた植物組織への検査法としての適用性を検証する。
Ｂ．表面に他の植物組織が付着したタマネギの皮
表面に種々の植物組織が付着しているモデルサンプルとして、カレーパウダー中に２ヶ月置き、表面が黄色く着色された乾燥したタマネギの皮（それぞれ１ｍｇ、１０ｍｇ）（サンプルＢ１）と、レトルトソース中の具材であるタマネギ（乾重量１ｍｇ、１０ｍｇに相当する湿重量１０ｍｇ、１００ｍｇ）（サンプルＢ２）を用いた。
Ｃ．原料や野菜の非可食部
リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）の果柄、カボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）のヘタ、及びラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）の種皮それぞれ１ｍｇと１０ｍｇを異物サンプルとして選んだ。［リンゴ（サンプルＣ１）、カボチャ（サンプルＣ２）、ラッカセイ（サンプルＣ３）］。
【００５８】
（２）ＤＮＡ抽出
（１）で選択したモデル異物サンプルのそれぞれについて、乾熱滅菌したメスとピンセットを使って、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。エッペンドルフチューブにＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ７４０９４５．５０）のＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＦ  ｂｕｆｆｅｒ）を所定量（５５０ｍｌ）加えてから、エッペンドルフチューブ用のホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｐｅｓｔｌｅｓ（エッペンドルフ  ００３０  １２０．９７３）を用いて、サンプルを粉砕した。
その後、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社）のＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒでのインキュベート時間以外はプロトコールに従って抽出を行なった。
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのプロトコールでは、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ＣＦ添加後、ただちにｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を加えてから３０ｍｉｎ（ａｔ  ６５℃）のインキュベーションとなっていた。今回は、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ添加後、６０ｍｉｎ（ａｔ  ６５℃）インキュベート後にｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加え、さらに３０ｍｉｎ（ａｔ  ６５℃）インキュベートするように改変し、組織の分解がより進むようにした。得られたＤＮＡ抽出液を使用まで４℃で冷蔵保管した。
【００５９】
（３）モデル異物サンプルから抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによるＩＴＳ領域の増幅とＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子領域の増幅
（２）で得られた植物異物モデルからのＤＮＡ抽出液は、そのＵＶスペクトルからＤＮＡ量を見積もることが出来ない場合があったので、ＤＮＡ抽出液の原液、１０倍希釈液（１／１０）、１００倍希釈液（１／１００）、１０００倍希釈液（１／１０００）をＰＣＲに供する鋳型とした。（希釈には滅菌超純水を用いた。）
ＰＣＲに用いるプライマーはＩＴＳ１領域を増幅するＰＣＲ（ＩＴＳ１  ＰＣＲ）では、実施例１に示したプライマーセットを用いた。
また、ＩＴＳ１領域を増幅するように実施例１で設計したプライマーセットとは別に、クロロプラストゲノムにコードされており、植物異物の同定に用いられた例もあるＲｕｂｉｓｃｏ（ｒｂｃＬ）遺伝子をターゲットとした植物ユニバーサルプライマーを設計し、ＩＴＳ１領域による同定との優位性を比較するためにＰＣＲ（ｒｂｃＬ  ＰＣＲ）を行なった。
なお、ｒｂｃＬ植物ユニバーサルプライマーの設計には、１７種類の植物（アカマツ（マツ科）、コナラ属（ブナ・ナラの仲間）（ブナ科）、アブラナ属（キャベツ・カリフラワーの仲間）（アブラナ科）、ズッキーニ（ウリ科）、カキ（カキ科）、ダイズ（マメ科）、エンドウ（マメ科）、グレープフルーツ（ミカン科）、ニンジン（セリ科）、ジャガイモ（ナス科）、トマト（ナス科）、コーヒー（アカネ科）、タマネギ（ユリ科）、ココヤシ（ヤシ科）、マダケ（イネ科）、イネ（イネ科）、トウモロコシ（イネ科））  ｒｂｃＬ遺伝子配列を用いた。ｒｂｃＬ遺伝子配列は植物の生存に必須なタンパク質をコードした構造遺伝子であるため、植物全般で塩基配列の保存性が高いため、その塩基配列から植物を同定するためには、増幅領域を長くする（塩基数を多くする）必要があった。その結果、設計したユニバーサルプライマーセットを用いた場合のＰＣＲ産物のサイズは約６００ｂｐとなった。用いたプライマー配列を以下に示した。
（ｆｏｒｗａｒｄ  プライマー）：ＲＢｆ１２４        ５’−ＣＴＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  ＣＣＧ  ＡＧＴ  ＡＡＣ−３’（配列番号３に示す）
（ｒｅｖｅｒｓｅ  プライマー）：  ＲＢｒ７５２      ５’−ＧＣＡ  ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＡＡＧ  ＴＡＡ  ＴＧＣ  ＣＣ−３’（配列番号４に示す）
【００６０】
ＩＴＳ１のＰＣＲ、ｒｂｃＬ  ＰＣＲのいずれも、以下の反応液組成とＰＣＲサイクルにより実施した。
＜ＰＣＲ反応液の組成＞
2004337069.tif 000002
＜ＰＣＲサイクル＞
▲１▼  ９４℃×９分
▲２▼  ９４℃×１分
▲３▼  ５８℃×１分
▲４▼  ７２℃×１分
▲５▼  ７２℃×５分
▲６▼  ４℃：保持          ▲２▼〜▲４▼を３５ｃｙｃｌｅｓ繰り返し
増幅反応後のそれぞれのＰＣＲ反応液の一部を２％アガロースゲル電気泳動に供した結果を以下に示す。
【００６１】
＜異物モデルサンプル由来のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲの結果＞
2004337069.tif 000003
注）レトルトソースからのサンプルだけは、湿重量で示した。タマネギは水分含量が９０％程度であり、約１０分の１の乾重量サンプルと同等のサンプルサイズとなる。
【００６２】
この結果より、本発明の方法に係るＩＴＳ１のＰＣＲによれば、混入した異物が焦げていても、その組織に、わずかでも焦げていない部分が残っていれば、サンプル重量１ｍｇからＰＣＲ産物を得ることが出来ることを示された。
また、レトルト具材のタマネギでは、ｒｂｃＬ  ＰＣＲでは産物が得られなかったが、本発明の方法に係るＩＴＳ１のＰＣＲでは産物が得られた。ＤＮＡ抽出からの実験を独立して２回実施したが、２回ともｒｂｃＬ  ＰＣＲ産物は得られなかった。このことから、レトルト処理によるＤＮＡの断片化のために、約６００ｂｐと産物サイズが大きいｒｂｃＬ  ＰＣＲの産物が得られなかったことが推測された。
（４）モデル異物サンプル由来のＰＣＲ産物の塩基配列解析
（３）において、予想された大きさの増幅産物が検出されたＰＣＲ反応液からキアゲン社のＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （５０）を用いてＰＣＲ産物を精製した。
得られたＰＣＲ産物を鋳型として、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  を用いて、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法による塩基配列解析のためのＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液の組成とＰＣＲサイクル条件はＫｉｔに付属のマニュアルに従った。
ＰＣＲ終了後の反応液からＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０を用いてＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物の全量をＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ  ３１０の専用サンプルチューブに移し、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ  ３１０を用いて塩基配列解析を行なった。
両プライマーから得られた塩基配列データをａｓｓｅｍｂｌｅして塩基の解析を行ない、ＰＣＲ産物全体のシークエンスを決定した。
【００６３】
（５）モデル異物サンプル由来のＰＣＲ産物の塩基配列を用いた相同性検索（ＩＴＳ１配列とｒｂｃＬ配列による同定能力の比較）
プライマー領域を除いたシークエンスデータをｑｕｅｒｙ配列として、ＢＬＡＳＴを使ってＧｅｎＢａｎｋから塩基配列の類似性の高い配列を検索した。
（ＵＲＬ：ＢＬＡＳＴ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）
得られた検索結果から、植物片の同定した。その内容を以下に示す。
［種々のタマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）由来サンプルについて］
焦げたタマネギ（サンプルＡ）、カレーパウダー中に置いたタマネギ（サンプルＢ１）、レトルト具材タマネギ（サンプルＢ２）の３つは、塩基配列が全て一致したので、そのうちの１つのデータを用いてＢＬＡＳＴ検索を行なった。
その結果、ｒｂｃＬ  ＰＣＲ産物のデータからは、最も近いデータはタマネギの属するＡｌｌｉｕｍ属だったが、２番目以下はＡｌｌｉｕｍ属のデータ（３種）とネギ科データ（２種）だけでなく、ネギ科に属さない植物のデータが混在した。これに対して、ＩＴＳ１のＰＣＲ産物のデータを用いた場合には、最も近いデータから７つがＡｌｌｉｕｍ属のデータとなった。
【００６４】
［カボチャのヘタ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｍｏｓｃｈａｔａ）（サンプルＣ１）］（図５を参照）
＜１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＩＴＳ１−５．８Ｓ  ｒＲＮＡＰＣＲ＞
カボチャ属に分類される植物のデータが並んだ。
＜ｒｂｃＬＰＣＲ＞
ウリ科内の複数の属に分類される植物のデータが並んだ。
［ラッカセイの種皮（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）（サンプルＣ２）］（図６を参照）
＜１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＩＴＳ１−５．８Ｓ  ｒＲＮＡＰＣＲ＞
Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａが最も近いデータとなり、２番目以下もＡｒａｃｈｉｓ属に分類される植物のデータが上位に並んだ。
＜ｒｂｃＬＰＣＲ＞
Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａが最も近いデータとなるが、２番目以下はマメ亜科に属する複数の属の植物のデータが並んだ。
［リンゴの果柄（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（サンプルＣ３）］（図７を参照）
＜１８Ｓ  ｒＲＮＡ−ＩＴＳ１−５．８Ｓ  ｒＲＮＡＰＣＲ＞
Ｍａｌｕｓ属に分類される植物のデータが上位に並んだ。
＜ｒｂｃＬＰＣＲ＞
リンゴ亜科に属する複数の属の植物のデータが上位に並んだ。
【００６５】
（６）実験の結果
今回の同定実験の結果から、ｒｂｃＬ遺伝子をターゲットに選んだ場合よりも、ＩＴＳ１領域を用いて同定を行った方が、より詳細に植物異物サンプルを同定することができることが明らかである。
なお、上記のようにカボチャのヘタ、ラッカセイの種皮、リンゴの果柄から得られたＩＴＳ１配列とｒｂｃＬ配列のそれぞれを用いて実施したＢＬＡＳＴ検索の結果を図５〜図７に示す。
【００６６】
【発明の効果】
本発明により、植物に由来する異物の同定方法及びこれに用いるプライマーセットが提供される。本発明の同定手段及びプライマーセットは、植物に由来する異物の被検サンプルが微量にしか存在しない場合であっても非常に高い同定能で被検サンプルを同定することができる。従って、食品に混入した異物の同定、警察の鑑識等に有用である。
【００６７】
【配列表】
2004337069.tif 000004
2004337069.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】植物細胞の染色体上にあるリボゾームＲＮＡ遺伝子クラスターを示す。
【図２】ゲノム中の非保存領域及び保存領域とプライマーの配置を示す。
【図３】１４種の植物、コウボの１８Ｓ  ｒＲＮＡ内の下流域塩基配列のアライメント結果を示す。
【図４】１２種の植物、コウボの５．８Ｓ  ｒＲＮＡ内の上流域の塩基配列のアライメント結果を示す。
【図５】カボチャのヘタから得られたＩＴＳ１配列とｒｂｃＬ配列を用いて実施したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す。
【図６】ラッカセイの種皮から得られたＩＴＳ１配列とｒｂｃＬ配列を用いて実施したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す。
【図７】リンゴの果柄から得られたＩＴＳ１配列とｒｂｃＬ配列を用いて実施したＢＬＡＳＴ検索の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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