(57)【要約】【課題】被検者の遺伝的因子や外因性化学発癌物質暴露の結果、気管支上皮内に発現するＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１を生物学的にモニタリングすることによって、各個人に適合する肺癌発症の危険性を判定する方法を提供すること。【解決手段】喀痰や気管支鏡検査による洗浄細胞診や生体組織診によって得られた気管支上皮内の芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）およびチトクローム解毒酵素Ｐ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の何れか一方または双方の発現量をＲＮＡレベル、蛋白質レベルで検出して被検者の肺癌感受性を検出する。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
喀痰や気管支鏡検査による洗浄細胞診や生検組織診によって得られた気管支上皮内の芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）およびチトクローム解毒酵素Ｐ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の何れか一方または双方の発現量をＲＮＡレベル、蛋白質レベルで検出して被検者の肺癌感受性を検出するようにしたことを特徴とする気管支上皮を用いた芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）及びチトクローム解毒酵素発現の検出による肺癌感受性の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、気管支上皮を用いた芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）及びチトクローム解毒酵素発現の検出による肺癌感受性の判定方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
ＣＹＰＩＡ１遺伝子にはアミノ酸がＩｌｅ（イソロイシン）からＶａｌ（バリン）に変わる遺伝子の多型が認められ、Ｖａｌ／Ｖａｌ型はそのアミノ酸配列が変わることで、ＣＹＰ１Ａ１酵素の活性が変化し肺癌発症のリスクが高くなることが知られている。また、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子のプロモーター領域にも遺伝子の多型が認められ、この遺伝子多型により約１０倍も酵素活性が変動すると考えられている。
さらに、ＣＹＰ２Ａ６遺伝子にも遺伝子の多型や欠損型が認められ、肺癌発症の危険性と関連することが報告されている。このように、ＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の多型は肺癌発症に密接に関わるとする多くの報告があるが、気管支上皮内の酵素の発現をメッセンジャーＲＮＡレベルや蛋白質レベルで検出し、被検者個人に則した肺癌発症に危険性を判定することは明らかにされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
肺癌発生の危険因子として、遺伝的因子が関与することについては多くの報告がある。しかしながら、遺伝的因子と、喫煙などに起因する外因性化学発癌物質による発癌の危険性の解析には、次のような問題がある。即ち、１）ヒトの遺伝子解析の研究は、個人のプライバシーのみならずその血縁者の遺伝的素因を明らかにするものであるため、倫理的、法的、社会的問題を招く可能性がある。
２）遺伝子多型の検出には時間やコストがかかり、十分な追試の後、最終的なコンセンサスが得られていない。
３）人種差や地域差があり、報告を比較検討することが困難な場合が多い。
４）外因性化学発癌物質暴露について、副流煙暴状況のように、把握することが困難なものが多い。
５）外因性化学発癌物質暴露は、たとえば喫煙に関することであればフィルター使用の有無やタール含有量などの細かい因子を考慮する必要がある。
６）生体内での酵素活性は、遺伝子の多型のみによっては必ずしも変動しておらず、喫煙のほかに食事やアルコール摂取など嗜好物で誘導される可能性があり、これらの摂取状況も把握する必要がある。
このように、遺伝的因子と外因性化学発癌物質によって得られる情報のみでは、個人に則した肺癌感受性の判定が困難である場合が多い。
【０００４】
本発明は、各被検者の遺伝的因子や外因性化学発癌物質暴露の結果、気管支上皮内に発現するＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１を生物学的にモニタリングすることによって、各個人に適合する肺癌発症の危険性を判定する方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、喀痰や気管支鏡検査による洗浄細胞診や生検組織診によって得られた気管支上皮内の芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）およびチトクローム解毒酵素Ｐ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の何れか一方または双方の発現量をＲＮＡレベル、蛋白質レベルで検出して被検者の肺癌感受性を検出するようにした気管支上皮を用いた芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）及びチトクローム解毒酵素発現の検出による肺癌感受性の判定方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をその好ましい実施形態に則して説明する。
大部分の肺癌が、気管支上皮を由来として発生する。喫煙者においては、常時、喫煙時の煙によって気管支上皮は暴露されている。図１に示すように、煙草の煙の中のアルキル側鎖の小さなニトロサミンはチトクロームＣＹＰ２Ｅ１によって、アルキル側鎖の大きなニトロサミンはＣＹＰ２Ａ６によって代謝活性化される。一方、煙草の煙の中の芳香族炭化水素（Ａｈ）であるベンツピレンは生体内でチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）１Ａ１によって代謝活性化される。暴露された芳香族炭化水素（Ａｈ）は、細胞質内の芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）と結合して核内に移行し、転写因子としてＣＹＰ１Ａ１遺伝子の転写を促進する。
【０００７】
ＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１によって代謝活性化された発癌物質はＤＮＡを障害し、ｐ５３などの癌遺伝子・癌抑制遺伝子の突然変異を励起して気管支上皮細胞が癌化すると考えられる。現在、ＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の多型は酵素の活性や肺癌の発生に関与することが知られているが、気管支上皮におけるＣＹＰ１Ａ１・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１の蛋白質レベルでの発現は明らかにされておらず、煙草の煙によるこれらの酵素誘導も詳細に検討されていなかった。
【０００８】
発明者は、ヒトの切除肺内の気管支上皮中の芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の発現を検出することが可能であることを確認した。図２に、気管支上皮におけるＣＹＰ２Ａ６の染色結果を示す。図２から明らかなように、ＨＥ染色では虚脱した気管支が認められる。ＣＹＰ２Ａ６染色により、気管支上皮に褐色に染まるＣＹＰ２Ａ６酵素の発現が認められる（矢印）。強拡大では繊毛を有する気管支上皮の細胞質内にＣＹＰ２Ａ６酵素の発現が認められる（矢印）。
【０００９】
さらに、図３に示すように、ヒトの喀痰細胞中の気管支上皮からも、ＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の発現を検出することが可能であることも確認した。図３に示すように、パパニコフ染色で喀痰中に繊毛を有する気管支上皮が認められる（矢印）。ＣＹＰ２Ａ６染色により、気管支上皮細胞に褐色に染まるＣＹＰ２Ａ６酵素の発現が認められる（矢印）。
【００１０】
本発明により、喀痰や気管支鏡検査による洗浄細胞診、生体組織診によって得られた気管支上皮内のＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１のＲＮＡレベル、蛋白質レベルの発現を検出し、被検者各個人の肺癌発症の危険性を明らかにすることが可能となった。
【００１１】
【実施例】
本発明においては、喀痰検査によって得られる気管支上皮や気管支鏡検査による洗浄細胞診、生体組織診によって非侵襲的に得られる気管支上皮を使用する。Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により喀痰中或いは洗浄細胞診や生体組織診中のＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１のメッセンジャーＲＮＡの発現を検出する。さらに、免疫組織化学染色によって気管支上皮内の芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の発現量を検出する。
【００１２】
先に述べたように、遺伝的因子の検出や各個人の主観的な外因性化学発癌物質の暴露状況の把握には、多くの問題がある。本発明においては、遺伝的素因や化学発癌物質暴露の結果、各個人の気管支上皮内に発現したＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１を、蛋白質レベルやメッセンジャーＲＮＡレベルで検出することにより、各個人に則した肺癌発症の危険性の検出を可能にする。
【００１３】
次の手順で、ＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１を、蛋白質レベルやメッセンジャーＲＮＡレベルで検出する。
▲１▼喀痰検査によって得られる気管支上皮や気管支鏡検査による洗浄細胞診、生体組織診によって非侵襲的に得られる気管支上皮を採取する。
▲２▼得られた検体の一部を用いて、メッセンジャーＲＮＡを抽出する（ＳＶ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製を使用）。
▲３▼Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法により、ＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１のメッセンジャーＲＮＡ発現量を検出する（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製を使用）。
▲４▼  ▲２▼で使用した残りの検体を直ちに１０ｍｌ−５０ｍｌの保存液中に入れ、気管支上皮懸濁液として固定と保存を行う（市販のＹＭ式液状検体用固定液を使用）。
▲５▼  ▲４▼で作成した気管支上皮懸濁液の一部をパパニコフ染色し、気管支上皮の有無を確認する。
免疫組織化学染色により気管支上皮内のＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１の蛋白質発現量を検出する（Ｇｅｎｔｅｓｔ社製やＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の抗体を使用）。
【００１４】
表１に、ＣＹＰ２Ａ６・ｐ５３発現と組織型・病期・喫煙指数（陽性率（％）の関係を示す。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
表２に、ＣＹＰ２Ａ６とｐ５３（陽性率％）の関係を示す。
【００１７】
【表２】
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【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、各個人の遺伝的素因や化学発癌物質暴露の結果、各個人の気管支上皮内に発現したＡｈＲ・ＣＹＰ２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１を、蛋白質レベルやメッセンジャーＲＮＡレベルで検出することによって、一人一人に視覚的に検出結果を示し、各個人が化学発癌物質暴露に注意（禁煙など）して検診などを積極的に受けるようになると予測され、肺癌予防に大きく貢献できる。さらに、客観的に各個人に則した肺癌の危険性の検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】芳香族炭化水素レセプター（ＡｈＲ）およびチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６・ＣＹＰ２Ｅ１・ＣＹＰ１Ａ１による肺癌発症のメカニズムを示す模式図
【図２】ヒトの切除肺標本による気管支上皮のシトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６染色結果を示す写真
【図３】ヒトの喀痰細胞による気管支上皮のシトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）２Ａ６染色結果を示す写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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