(57)【要約】【課題】あらゆる複数ターゲット分子（例えば、遺伝子）を同時に分離検出することができ、かつ比較的少量のプローブ分子（例えば、ＤＮＡコンジュゲート）を用いて遺伝子の同時分離検出が可能である方法の提供。【解決手段】１種または２種以上のプローブ分子（例えば、ＤＮＡコンジュゲート）と２種以上のターゲット分子（例えば、遺伝子）とを相互作用し得る条件下に置き、前記プローブ分子のいずれかと相互作用して複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子とを、複合体を形成したターゲット分子と複合体を形成しなかったターゲット分子との移動度の違いを利用して分離し、前記複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子を検出することを含む、ターゲット分子の検出方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または２種以上のプローブ分子と２種以上のターゲット分子とを相互作用し得る条件下に置き、
前記プローブ分子のいずれかと相互作用して複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子とを、複合体を形成したターゲット分子と複合体を形成しなかったターゲット分子との移動度の違いを利用して分離し、
前記複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子を検出することを含む
ターゲット分子の検出方法。
【請求項２】
前記プローブ分子が、ターゲット分子と相互作用し得る機能性部分とポリマーとのコンジュゲートである請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記機能性部分は核酸であり、前記ターゲット分子は核酸であり、前記相互作用はハイブリダイゼーションである請求項２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記機能性部分を構成する核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または人工核酸である請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
ターゲット分子が、疾病関連遺伝子及び病原菌の遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1種の核酸である請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
ハイブリダイズした二本鎖核酸をインターカレータを用いて検出する請求項３〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
前記機能性部分は抗体であり、前記ターゲット分子は抗原であり、前記相互作用は抗原抗体反応である請求項２に記載の検出方法。
【請求項８】
前記機能性部分は配位子であり、前記ターゲット分子は金属であり、前記相互作用は配位結合である請求項２に記載の検出方法。
【請求項９】
前記機能性部分はレセプターであり、前記ターゲット分子はホルモンであり、前記相互作用は、ホルモン−レセプター結合である請求項２に記載の検出方法。
【請求項１０】
前記コンジュゲートを構成するポリマーが、１種または２種以上のビニルモノマーの重合体である請求項２〜９のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１１】
ビニルモノマーが、アクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N,N'-ジメチルアクリルアミド及びN-ビニルピロリドンから成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
コンジュゲートを構成するポリマーの分子量が異なる少なくとも２種類のプローブ分子を用いる請求項２〜１１のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１３】
コンジュゲートを構成する機能性部分が、ポリマーの種類に応じて異なる請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記プローブ分子とターゲット分子の少なくとも一方を移動させることで、プローブ分子とターゲット分子とを相互作用し得る条件下に置く、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子との分離を電気泳動法により行う請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１６】
プローブ分子とターゲット分子とを相互作用させた後に電気泳動法に供する請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記プローブ分子とターゲット分子との相互作用、及び前記プローブ分子と複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子との分離を、前記プローブ分子を保持した電気泳動ゲルにターゲット分子を泳動させることで行う請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記プローブ分子の電気泳動ゲルへの保持を、プローブ分子を電気泳動ゲルに電気泳動させることで行う請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
前記複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を蛍光検出器、可視・紫外分光分析装置、有機質量分析装置、フーリエ変換赤外分光分析装置、飛行時間型質量分析装置、核磁気共鳴分析装置、ガスクロマトグラフ分析装置、ガスクロマトグラフ−質量分析装置、及び／又は液体クロマトグラフ分析装置によりにより行う請求項１〜１８のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲット分子の検出方法に関する。本発明の検出方法を核酸の検出方法として用いる場合、従来に無い原理に基づく遺伝子分離検出法であり、SNPを含めた遺伝子全般の特異的な同時分離検出が可能である。また、本願発明の方法は、核酸以外の種々のターゲット分子の検出方法としても有用である。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省の統計（http://www.mhlw.go.jp/topics/syokuchu/index.html）によると、2000件程度（被害者数としては30000人程度）の食中毒が毎年発生している。密閉性が向上した家屋の通気性の悪さ、性能が向上した冷蔵庫への過信、輸入産業の活発化に伴う汚染食材の流通、汚染食材の解凍による生活用水の汚染等の様々な要因によって、食中毒が一年中発生し易いためである。そして近年の食中毒の大きな特徴は、魚介類から感染する腸炎ビブリオに代わり、病原性大腸菌O157（O157:H7）を原因とする食中毒が増加した事である。O157は腸管出血性大腸菌に属する大腸菌であり、産生したベロ毒素によって下痢を引き起こす。現在、食中毒の原因細菌を特定する際には、患者の便をソルビトール添加寒天培地で培養する等、数日掛かる検査工程を必要とする。しかし、より迅速に原因細菌を特定するためには、ベロ毒素の遺伝子タイプを迅速かつ簡便に同定できれば良い。
【０００３】
一方、同じ症状を示す患者に同じ薬を投与しても、高い効果が発揮される場合がある一方で副作用が生じる場合もある、という「薬への感受性の個人差」が従来より、問題となっている。これは個人の遺伝子タイプによって薬への感受性が異なる事が原因である。しかし、患者がどの遺伝子タイプに分類されるかを医者が簡単に把握する事ができれば、副作用が強い薬の投与は避けられるはずである。この様な、個人ごとに最適な治療法を提供する「テイラーメイド医療」が実現するためには、遺伝子一塩基多型（single nucleotide polymorphisms、SNPs）に代表される遺伝子タイプの個体差を、迅速かつ簡便に同定する事ができる医療環境の整備が必要不可欠である。
【０００４】
この様に、遺伝子検査や遺伝子診断等の医療分野において、現在最も求められているのが「迅速かつ簡便に標的遺伝子を検出する技術」である。
【０００５】
現在、遺伝子検出法として最も脚光を浴びているのが、DNAチップあるいはDNAマイクロアレイと呼ばれる数cm角の基板による遺伝子の検出技術である。前者は、光リソグラフィー技術とDNA固相合成技術を融合させる事により、ガラス基板上においてプローブとなるDNA（DNA：遺伝子の本体）を一塩基ずつ合成する手法であり、後者は、あらかじめ調製した多数の異なるプローブDNAをDNAスポッターにより基板上の各スポットに固定化する技術である。蛍光標識した標的DNAをこの基板上に添加すると、固定化されたプローブDNAと二本鎖を形成する。二本鎖が形成された部分のみが蛍光を発するので、多数の遺伝子の発現がスポットパターンとして検出される。しかし現時点では、スポット上への試料の非特異的吸着が起こり易いという問題点がある。また、標的DNA（溶液中に溶解）とプローブDNA（固体上に固定化）間の反応が固液不均一反応になり、長時間のハイブリダイゼーション（二本鎖形成反応）が必要となる。これらはDNAチップあるいはDNAマイクロアレイの大きな原理的問題点である。
【０００６】
また、キャピラリー電気泳動を用いた遺伝子変異検出法としては、SSCP(一本鎖高次構造多型)法やRFLP(制限酵素断片長多型)法が知られている。前者は、正常体DNAと変異体DNAの一本鎖状態における高次構造が異なる事、後者は正常体DNAと変異体DNAの制限酵素切断部位が異なる事を利用し、それぞれの泳動挙動の変化を検出する手法である。しかし両者共に、高次構造が生じる部位や制限酵素が作用する部位に一塩基変異が無い限り、一般的なSNP検出法として利用するには限界がある。
【０００７】
本発明者らは、ＤＮＡコンジュゲートを用い、かつキャピラリー電気泳動を用いた遺伝子診断法について先に提案している(非特許文献１)。
【０００８】
この方法では、ポリアクリルアミドで内壁をコーティングしたキャピラリーにポリアクリルアミドとＤＮＡからなるＤＮＡコンジュゲート（ＤＮＡはターゲットである遺伝子と相補性である）を満たし、そこへターゲットである遺伝子を電気泳動させるものである。その結果、ターゲットである遺伝子に正常型と変異型（１塩基多型）とが共存する場合、両者を分離して検出することが可能である。
【０００９】
しかるに、この方法では、キャピラリー内を満たしたDNAコンジュゲートとハイブリダイズしやすい遺伝子と、その他の遺伝子という主に二つのグループへの分離検出しか出来なかった。さらには、ＤＮＡコンジュゲートをキャピラリーに満たす必要があり、多量のＤＮＡコンジュゲートを必要とした。
【非特許文献１】Electrophoresis, 23, 2267-2273 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明の目的は、遺伝子診断や遺伝子検査を始め、様々な生体成分の分析系に応用可能である簡便・正確な検出方法を新たに提供することである。特に、あらゆる複数遺伝子を同時に分離検出することができ、かつ比較的少量のＤＮＡコンジュゲートを用いて遺伝子の同時分離検出が可能である方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決する本発明は以下の通りである。
［請求項１］１種または２種以上のプローブ分子と２種以上のターゲット分子とを相互作用し得る条件下に置き、
前記プローブ分子のいずれかと相互作用して複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子とを、複合体を形成したターゲット分子と複合体を形成しなかったターゲット分子との移動度の違いを利用して分離し、
前記複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子を検出することを含む
ターゲット分子の検出方法。
［請求項２］前記プローブ分子が、ターゲット分子と相互作用し得る機能性部分とポリマーとのコンジュゲートである請求項１に記載の検出方法。
［請求項３］前記機能性部分は核酸であり、前記ターゲット分子は核酸であり、前記相互作用はハイブリダイゼーションである請求項２に記載の検出方法。
［請求項４］前記機能性部分を構成する核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または人工核酸である請求項３に記載の検出方法。
［請求項５］ターゲット分子が、疾病関連遺伝子及び病原菌の遺伝子から成る群から選ばれる少なくとも1種の核酸である請求項４に記載の検出方法。
［請求項６］ハイブリダイズした二本鎖核酸をインターカレータを用いて検出する請求項３〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
［請求項７］前記機能性部分は抗体であり、前記ターゲット分子は抗原であり、前記相互作用は抗原抗体反応である請求項２に記載の検出方法。
［請求項８］前記機能性部分は配位子であり、前記ターゲット分子は金属であり、前記相互作用は配位結合である請求項２に記載の検出方法。
［請求項９］前記機能性部分はレセプターであり、前記ターゲット分子はホルモンであり、前記相互作用は、ホルモン−レセプター結合である請求項２に記載の検出方法。
［請求項１０］前記コンジュゲートを構成するポリマーが、１種または２種以上のビニルモノマーの重合体である請求項２〜９のいずれか１項に記載の検出方法。
［請求項１１］ビニルモノマーが、アクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N,N'-ジメチルアクリルアミド及びN-ビニルピロリドンから成る群から選ばれる少なくとも1種である請求項１０に記載の検出方法。
［請求項１２］コンジュゲートを構成するポリマーの分子量が異なる少なくとも２種類のプローブ分子を用いる請求項２〜１１のいずれか１項に記載の検出方法。
［請求項１３］コンジュゲートを構成する機能性部分が、ポリマーの種類に応じて異なる請求項１２に記載の検出方法。
［請求項１４］前記プローブ分子とターゲット分子の少なくとも一方を移動させることで、プローブ分子とターゲット分子とを相互作用し得る条件下に置く、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出方法。
［請求項１５］前記複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子との分離を電気泳動法により行う請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出方法。
［請求項１６］プローブ分子とターゲット分子とを相互作用させた後に電気泳動法に供する請求項１５に記載の検出方法。
［請求項１７］前記プローブ分子とターゲット分子との相互作用、及び前記プローブ分子と複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子との分離を、前記プローブ分子を保持した電気泳動ゲルにターゲット分子を泳動させることで行う請求項１〜１３のいずれか１項に記載の検出方法。
［請求項１８］前記プローブ分子の電気泳動ゲルへの保持を、プローブ分子を電気泳動ゲルに電気泳動させることで行う請求項１７に記載の検出方法。
［請求項１９］前記複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を蛍光検出器、可視・紫外分光分析装置、有機質量分析装置、フーリエ変換赤外分光分析装置、飛行時間型質量分析装置、核磁気共鳴分析装置、ガスクロマトグラフ分析装置、ガスクロマトグラフ−質量分析装置、及び／又は液体クロマトグラフ分析装置によりにより行う請求項１〜１８のいずれか１項に記載の検出方法。
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成するために、種々検討し、プローブ分離同時制御法「PRESS（probe-regulated simultaneous separation）法」という新たな検出原理を見出し、本発明を完成させた。
【００１３】
特に、本発明では、試料必要量が少なく、分析所要時間も短いキャピラリー電気泳動法を応用し、迅速・簡便な遺伝子同時分離検出法の開発に成功した。
本発明に先立ち、キャピラリー管内において用いるDNA分離検出プローブとして、DNAとモノマーとをグラフト重合させて得られるバイオ複合材料であるDNAコンジュゲートを開発した。この物質は、DNAとモノマーを混合して重合することによって容易に得られる。そして、両者の混合比率を変化させることによって得られたDNAグラフト率の異なるDNAコンジュゲートは、キャピラリー管内において異なる速度で泳動することを発見した。このDNAコンジュゲートをバンド幅の狭いプローブ（プローブバンド）として用いることによって、遺伝子混合物の中から特定遺伝子を同時に分離検出する手法の開発に成功した。本発明は、複数の標的遺伝子を検出するための複数のプローブDNAコンジュゲートを合成し、電場を掛けたキャピラリー管内を泳動する標的遺伝子を泳動速度が異なるプローブによって特異的に補足し、各標的遺伝子-プローブ複合体が異なる時間に検出されるという従来に無い新規なアプローチに基づいている。
【００１４】
さらに本発明は、DNA以外の分子についても上記と同様にコンジュゲートを作成し、これをプローブとして用い、上記分子と相互作用を起こす分子をターゲットとして検出することを可能にする。
【発明の効果】
【００１５】
より一般性の高い遺伝子診断・検出技術
キャピラリー電気泳動を用いた遺伝子変異検出法としては、SSCP法やRFLP法が主流であるが、一般的なSNP検出法として利用するには限界がある。しかし本発明で示した手法は、塩基配列特異的に遺伝子の識別を実現するものであり、国内外で報告されているどの手法よりも正確かつ簡便に遺伝子全般を分離検出する事が出来るため、遺伝子分離・遺伝子診断・遺伝子解析分野におけるその高い応用可能性が今後期待される。
【００１６】
DNAチップやDNAマイクロアレイによる遺伝子検出法の問題点は、プローブであるDNAが固体基板上に固定化されている事に主に起因している。一方、キャピラリー電気泳動法による遺伝子検出法の問題点は、分析原理そのものに起因している。本発明で提案した原理を応用した遺伝子検出法においては、アレイ型DNAチップの個々のプローブスポットと同じ機能をDNAコンジュゲートが果たしている。しかも、「プローブ自身が泳動する」という従来とは異なる原理をキャピラリー管内に組み込む事によって、キャピラリー電気泳動法を利用した各種遺伝子検出法の問題点を解決するのみではなく、長時間の検出時間が必要であるというアレイ型DNAチップの問題点も解決している。すなわち、PRESS法の原理を利用した遺伝子検出法をチップ上に搭載すれば、従来とは全く異なる概念の「DNAチップ」の開発につながる。
【００１７】
チップ化による遺伝子診断の迅速化・簡易化の可能性
従来のDNA分子認識に関する報告は一般性に乏しく、情報レベルとしては不十分である。しかし発明では、DNAの相補性（四つの核酸塩基が構成する塩基配列の明確な識別性）に基づき正確に遺伝子が識別される点で、極めて高次の情報認識が行われている。この全く新しい情報認識型検出システムによって、遺伝子の塩基配列を一塩基のレベルで性格に識別し、その結果を明瞭な形で出力する事ができるナノ診断デバイスの開発が可能になる。キャピラリー電気泳動は、その分析所要時間が極めて短く、かつチップ上に簡単に搭載可能な技術である事は、既に近年報告されつつある。従って、本発明が示す成果は、遺伝子分離・遺伝子診断・遺伝子解析の迅速化・簡易化に大きく貢献する事が期待される。
【００１８】
フロー系遺伝子検出技術としての将来性
遺伝子診断に関連して、マイクロチップやマイクロアレイ等の微細加工技術が急速に発展している。DNAチップの問題点が見えてきた現状としては、フロー（流路）系で取り扱う事が出来るシステムが診断技術のブレークスルーをもたらす可能性が高い。本発明の方法は、従来の手法と比較して将来性が極めて高いフロー系遺伝子分離検出技術と考えられる。
【００１９】
「分析手法としての一般性」
標的物質とプローブの注入順番や、正負極の向き等を分離対象ごとに制御すれば、何らかの相互作用によって標的物質を検出する事ができるあらゆる分析系全般に本原理を応用する事が可能である。例えば、DNA-DNAのみではなく、抗原-抗体間の相互作用を利用する事が考えられ、遺伝子診断、免疫診断等の様々な医療分野への応用が可能になる。また金属-配位子間やホルモン-レセプター間の相互作用を利用する事によって、環境分析分野への応用も可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のターゲット分子の検出方法は、
(1)１種または２種以上のプローブ分子と２種以上のターゲット分子とを相互作用し得る条件下に置く工程、
(2)前記プローブ分子のいずれかと相互作用して複合体を形成したターゲット分子と、複合体を形成しなかったターゲット分子とを、複合体を形成したターゲット分子と複合体を形成しなかったターゲット分子との移動度の違いを利用して分離する工程、
(3)前記複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子を検出する工程
を含む。
【００２１】
本発明の方法で用いるプローブ分子は、ターゲット分子と相互作用し得る条件下に置かれた場合、ターゲット分子と相互作用し得る分子であれば、特に制限はない。そのようなプローブ分子は、例えば、ターゲット分子と相互作用し得る機能性部分とポリマーとのコンジュゲートであることができる。
また、ターゲット分子と相互作用し得る機能性部分とコンジュゲートされる分子の分子量が異なれば、検出挙動が異なるプローブ分子を得ることができるため、コンジュゲートを形成する分子の分子量は一切問わない。例えば、ターゲット分子と相互作用し得るプローブ部分とタンパク質のような高分子量物質とのコンジュゲートや、オリゴペプチドのような低分子量物質とのコンジュゲートが挙げられる。
【００２２】
図１に、本発明の方法の概念図を示す。
例えば、混合物（a・b・c）の中から標的物質（同a・b）を検出する場合を例として図に示す。各標的物質を何らかの相互作用によって捕捉するプローブ分子（同 A・B）をあらかじめ合成する。ここで、AとBを「流路の中で動きが異なる」ように分子設計する。そして、流路にあらかじめプローブ分子を注入し、後から標的物質を注入すると、標的物質-プローブ分子複合体（同 a-A・b-B）が形成される。例えば、複合体にのみ結合する試薬を流路内の溶液中に溶解させておくことによって、複合体（すなわち、プローブに捕捉された標的物質a・b）のみが検出される（例えば、DNAを検出する場合には、二本鎖DNAにのみ結合する臭化エチジウム等の蛍光試薬をあらかじめ溶解させておくことによって、複合体のみが蛍光検出される）。また、複合体にのみ結合する試薬を溶解させない場合は、a・b・cが全て分離されて検出する（例えば、DNAを検出する場合には、プローブ分子に捕捉されたDNAのみが異なる時間に検出されるが、捕捉されなかったその他のDNAも検出される）。この原理は、流路を用いるあらゆる検出方法と融合させる事が可能であり、その方法としては、キャピラリー電気泳動、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等が考えられる。
【００２３】
プローブ分子が、ターゲット分子と相互作用し得る機能性部分とポリマーとのコンジュゲートである場合、機能性部分、ターゲット分子、相互作用は、それぞれ以下の物であることができる。
(1)機能性部分は核酸であり、ターゲット分子は核酸であり、相互作用はハイブリダイゼーションである。(ターゲット分子：核酸)
(2)機能性部分は抗体であり、ターゲット分子は抗原であり、相互作用は抗原抗体反応である。（ターゲット分子：抗原）
(3)機能性部分は配位子であり、ターゲット分子は金属であり、相互作用は配位結合である。（ターゲット分子：金属）
(4)機能性部分はレセプターであり、ターゲット分子はホルモンであり、相互作用は、ホルモン−レセプター結合である。（ターゲット分子：ホルモン）
【００２４】
(1)の態様(ターゲット分子：核酸)
機能性部分は核酸であり、ターゲット分子は核酸であり、相互作用はハイブリダイゼーションである上記(A)の態様は、具体的には、ターゲット核酸の検出方法である。この方法は、
（１）核酸とポリマーとのコンジュゲートからなるプローブ分子（プローブ核酸）とターゲット核酸を含む試料とをハイブリダイズ条件下に置く工程、
（２）プローブ核酸とハイブリダイズしたターゲット核酸を、ハイブリダイズしなかった核酸と分離する工程、及び
（３）プローブ核酸とハイブリダイズしたターゲット核酸及び/又はプローブ核酸とハイブリダイズしなかったターゲット核酸を検出する工程
を含む。
【００２５】
［コンジュゲート（プローブ核酸）］
本発明の方法で使用するコンジュゲートは、構成する核酸が、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または人工核酸であることができる。ここで人工核酸は、核酸分子内の糖-リン酸ジエステル骨格を、エステル、アミド等のより安定な骨格に変換した核酸アナログ全般を意味し、例えば、ＰＮＡを挙げることができる。
【００２６】
また、コンジュゲートを構成するポリマーは、１種または２種以上のビニルモノマーの重合体であることができる。ビニルモノマーは、例えば、アクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N,N'-ジメチルアクリルアミド、N-ビニルピロリドン等であることができる。但し、ビニルモノマーであれば、ポリマーを構成する事が可能であり、いかなるモノマーでも良い。
【００２７】
DNAコンジュゲートの合成法としては、様々な方法が適用される。例えば、末端アミノ化一本鎖DNAとメタクリロイルオキシスクシンイミドをカップリングさせ、末端ビニル化一本鎖DNAとした後、これをアクリルアミドモノマーとラジカル共重合させる方法を挙げることができる。この際、カップリング反応や共重合反応における触媒はどのような物質でも良く、反応条件も特に限定されない。例えば、末端アミノ化一本鎖DNAとメタクリロイルオキシスクシンイミドを緩衝液中においてカップリングし、その生成物とアクリルアミドモノマーをTris-HCl緩衝液中においてN,N,N'N'-テトラメチルエチレンジアミンを開始剤としてラジカル重合させても良い。もちろん、これら以外の触媒を用いても、助触媒や添加剤を用いても良い。また、溶媒、緩衝液、反応温度等も限定されない。
【００２８】
コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、例えば、プローブとなる異なるコンジュゲートごとに数万から数十万の範囲である事が、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、好ましくは、３〜３０万の範囲である。
【００２９】
１分子のコンジュゲートに含まれる核酸の数は、例えば、1から数十本の範囲であることが、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。１分子のコンジュゲートに含まれる核酸の数は、好ましくは、１〜２０の範囲である。
【００３０】
本発明の方法では、コンジュゲートを構成するポリマーの分子量が異なる少なくとも２種類のプローブ分子を用いることもできる。その場合、コンジュゲートを構成する核酸が、ポリマーの種類に応じて異なることもできる。
このようにすることで、以下のことが可能になる。例えば、ターゲットとなる遺伝子が複数個ある場合、それぞれに対して相補的な遺伝子を結合した分子量が異なるコンジュゲートを合成し、プローブとして利用することによって、各ターゲット遺伝子-プローブコンジュゲートの泳動時間を制御することが可能となる。これにより、異なる時間にターゲット遺伝子が分離検出されるシステムを構築することが出来る。
【００３１】
ターゲット核酸は、例えば、ガンや糖尿病などのあらゆる疾病関連遺伝子、O157等の病原菌の遺伝子などのあらゆる核酸が考えられ、その鎖長、塩基配列は問わず本手法を適用可能である。
【００３２】
工程（１）では、プローブ分子とターゲット核酸を含む核酸試料とをハイブリダイズ条件下に置く。
具体的には、（ａ）プローブ分子とターゲット核酸を含む核酸試料とを同一溶液中に共存させてハイブリダイズさせるか、（ｂ）予めプローブ分子を保持している電気泳動用ゲルにターゲット核酸を含む核酸試料を泳動させることで、ハイブリダイズさせることもできる。プローブ分子の電気泳動ゲルへの保持は、例えば、プローブ分子を、ループに採取してからロータリーバルブを用いて分析用キャピラリー管内に導入する、吸引する、加圧する、電気泳動させる等の様々な手法によって行うことができる。
【００３３】
（ａ）のハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブ分子とターゲット核酸をあらかじめ混合する事によってハイブリダイゼーションを促進し、その混合溶液をキャピラリー管内に加圧法によって導入すれば良い。この時、キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）あるいは適当な二本鎖形成促進剤（塩化マグネシウム等）を添加した状態であることが望ましい。
【００３４】
（ｂ）のハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブ分子をキャピラリー管内に加圧法によって導入し、後からターゲット核酸を含む溶液を同じく加圧法によって導入すれば良い。この時キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）あるいは適当な二本鎖形成促進剤（塩化マグネシウム等）を添加した状態であることが望ましい。
【００３５】
工程（２）では、プローブ分子とハイブリダイズしたターゲット核酸を、ハイブリダイズしなかった核酸から分離する。この分離方法には特に制限はないが、電気泳動を用いることが好ましい。
プローブ分子とハイブリダイズしたターゲット核酸の、ハイブリダイズしなかった核酸からの分離を電気泳動法により行う場合、ハイブリダイゼーションを上記（ａ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲット核酸を含む核酸試料とをハイブリダイズさせた後に、試料を電気泳動法に供する。
また、ハイブリダイゼーションを上記（ｂ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲット核酸を含む核酸試料とのハイブリダイズ、及びプローブ分子とハイブリダイズしたターゲット核酸の、ハイブリダイズしなかった核酸との分離を、プローブ分子を保持した電気泳動ゲルにターゲット核酸を含む核酸試料を泳動させることで行うことができる。
【００３６】
電気泳動に関しては、負電荷のターゲット核酸及びプローブ分子を泳動させる必要があるため、陰極側から試料を導入し、陽極側に泳動させる。電気泳動は、キャピラリー電気泳動であることが好ましいが、スラブ型の電気泳動であってもよい。電気泳動の際には、例えば、キャピラリー管内は、Tris-ホウ酸緩衝液等によって満たされている事が望ましい。但し、これ以外の緩衝液を用いても良く、また純水、あるいは何らかの微量の有機溶媒を添加した純水（または緩衝液）を用いても問題がない。またこれらの泳動溶液は、適当な二本鎖形成促進剤（塩化マグネシウム等）を添加した状態であることが望ましい。また泳動温度はなるべく低温（0から30℃程度）である方が良い。
【００３７】
工程（３）では、プローブ分子とハイブリダイズしたターゲット核酸を検出する。
プローブ分子とハイブリダイズしたターゲット核酸の検出は、例えば、ハイブリダイゼーション及び／又は分離をインターカレータの共存下で行い、かつインターカレータが付着した二本鎖核酸を検出することにより行うことができる。
本発明の方法で使用するインターカレータは、特に制限されないが、例えば、エチジウムブロマイドや、Molecular Probe社製の各種核酸検出試薬（SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold）等を挙げることができる。
【００３８】
インターカレータが付着した二本鎖核酸の検出は、例えば、以下のように行うことができる。
例えば、あらかじめ緩衝液中にエチジウムブロマイド等の蛍光性インターカレータを溶解させておけば、プローブ分子とターゲット核酸が形成する複合体のみが蛍光標識され、蛍光検出器を用いる事によってターゲット核酸のみが分離検出される。
【００３９】
本発明の方法の1態様を、図２を用いてさらに具体的に説明する。
(A)では、泳動速度が異なるプローブＤＮＡコンジュゲートをキャピラリー管内に予め保持してある。そこへ、陰極側から標的ＤＮＡ混合物を注入する。この際、泳動溶液には二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光性インターカレータが溶解されている。
(B)では、標的ＤＮＡは、ＤＮＡコンジュゲートと異なり、ポリマーが結合していないため泳動速度が速く、そのため、ＤＮＡコンジュゲートに追いつき、ＤＮＡコンジュゲートと標的ＤＮＡとはハイブリダイズし得る状態になる。
(C)では、標的ＤＮＡが先に泳動し、その後、ＤＮＡコンジュゲートとハイブリダイズ(配列特異的に結合)した標的ＤＮＡは、蛍光性インターカレータの働きで検出される。
【００４０】
複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出は、複合体のみが蛍光標識される場合は、上述のように、蛍光検出器を用いて行うことが出来る。それに対し、蛍光標識を用いない場合は、蛍光検出器に代えて、例えば、可視・紫外分光分析装置、有機質量分析装置、フーリエ変換赤外分光分析装置、飛行時間型質量分析装置、核磁気共鳴分析装置、ガスクロマトグラフ分析装置、ガスクロマトグラフ−質量分析装置、及び／又は液体クロマトグラフ分析装置等を用いて、複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を行うことができる。複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出は、両者の違いを検知できる装置であれば、いずれの装置を用いて行うこともできる。
【００４１】
(2)の態様（ターゲット分子：抗原）
機能性部分が抗体であり、ターゲット分子が抗原であり、相互作用が抗原抗体反応である(2)の態様は、具体的には、ターゲット抗原の検出方法であり、
（１）抗体とポリマーとのコンジュゲートからなるプローブ分子とターゲット抗原を含む試料とを抗原抗体反応し得る条件下に置く工程、
（２）プローブ分子と反応したターゲット抗原を、反応しなかったターゲット抗原と分離する工程、及び
（３）プローブ分子と反応したターゲット抗原及び／又はプローブ分子と反応しなかったターゲット抗原を検出する工程
を含む。
【００４２】
本発明においては、抗原としては、あらゆる物質を対象とすることができ、例えば、タンパク質や、繰り返し構造を有する多糖類等の高分子量物質を挙げることができる。
また、抗体は、相手方となる抗原に対する抗体であれば良く、抗体はモノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。
抗原と抗体の例としては、例えば、コラーゲンと抗コラーゲン・モノクローナル抗体、ＨＣＶコアタンパク質と抗ＨＣＶコアタンパク質モノクローナル抗体、HBV(B型肝炎ウイルス)とHBV抗体、HIV(ヒト免疫不全ウイルス) とHIV抗体、HCV(C型肝炎ウイルス) とHCV抗体等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４３】
抗体を機能性部分とするコンジュゲートは、例えば、抗体を有するアミノ基をビニル基に変換し、その後、これをアクリルアミドモノマーとラジカル共重合させる方法により調製することができる。この際、アミノ基をビニル基に変換する反応や共重合反応における触媒はどのような物質でも良く、反応条件も特に限定されない。例えば、抗体が有するアミノ基をビニル基に変換して得た生成物とアクリルアミドモノマーをTris-HCl緩衝液中においてN,N,N'N'-テトラメチルエチレンジアミンを開始剤としてラジカル重合させても良い。もちろん、これら以外の触媒を用いても、助触媒や添加剤を用いても良い。また、溶媒、緩衝液、反応温度等も限定されない。
【００４４】
コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、例えば、プローブとなる異なるコンジュゲートごとに数万から数十万の範囲である事が、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、好ましくは、３〜３０万の範囲である。
【００４５】
１分子のコンジュゲートに含まれる抗体の数は、例えば、1から５０個の範囲であることが、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。１分子のコンジュゲートに含まれる抗体の数は、好ましくは、１〜２０の範囲である。
【００４６】
本発明の方法では、コンジュゲートを構成するポリマーの分子量が異なる少なくとも２種類のプローブ分子を用いることもできる。その場合、コンジュゲートを構成する抗体が、ポリマーの種類に応じて異なることもできる。
【００４７】
このようにすることで、以下のことが可能になる。例えば、ターゲットとなる抗原が複数個ある場合、それぞれに対する抗体を結合した分子量が異なるコンジュゲートを合成し、プローブとして利用することによって、各ターゲット抗原−プローブコンジュゲートの泳動時間を制御することが可能となるこれにより、異なる時間にターゲット抗原が分離検出されるシステムを構築することが出来る。
【００４８】
工程（１）では、プローブ抗体とターゲット抗原を含む試料とを抗原抗体反応し得る条件下に置く。具体的には、（ａ）プローブ抗体とターゲット抗原を含む試料とを同一溶液中に共存させて抗原抗体反応させるか、（ｂ）予めプローブ抗体を保持している電気泳動用ゲルにターゲット抗原を含む試料を泳動させることで、抗原抗体反応させることもできる。プローブ抗体の電気泳動ゲルへの保持は、例えば、プローブ抗体を、ループに採取してからロータリーバルブを用いて分析用キャピラリー管内に導入する、吸引する、加圧する、電気泳動させる等の様々な手法によって行うことができる。
【００４９】
（ａ）の抗原抗体反応は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブ抗体とターゲット抗原をあらかじめ混合する事によって抗原抗体反応を促進し、その混合溶液をキャピラリー管内に加圧法によって導入すれば良い。この時、キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）であることが望ましい。
【００５０】
（ｂ）の抗原抗体反応は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブ抗体をキャピラリー管内に加圧法によって導入し、後からターゲット抗原を含む溶液を同じく加圧法によって導入すれば良い。この時キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）であることが望ましい。
【００５１】
工程（２）では、プローブ分子と反応したターゲット抗原を、反応しなかったターゲット抗原と分離する。この分離方法には特に制限はないが、電気泳動を用いることが好ましい。
プローブ分子と反応したターゲット抗原の、反応しなかったターゲット抗原からの分離を電気泳動法により行う場合、反応を（ａ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲット抗原を含む試料とを反応させた後に、試料を電気泳動法に供する。
また、反応を（ｂ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲット抗原を含む試料との反応、及びプローブ分子と反応したターゲット抗原の、反応しなかったターゲット抗原との分離を、プローブ分子を保持した電気泳動ゲルにターゲット抗原を含む試料を泳動させることで行うことができる。
【００５２】
電気泳動に関しては、負電荷のターゲット及びプローブ分子を泳動させる必要があるため、陰極側から試料を導入してターゲット抗原を、陽極側に泳動させる。電気泳動は、キャピラリー電気泳動であることが好ましいが、スラブ型の電気泳動であってもよい。電気泳動の際には、例えば、キャピラリー管内は、Tris-ホウ酸緩衝液等によって満たされている事が望ましい。但し、これ以外の緩衝液を用いても良く、また純水、あるいは何らかの微量の有機溶媒を添加した純水（または緩衝液）を用いても問題がない。また泳動温度はなるべく低温（0から30℃程度）である方が良い。
【００５３】
工程（３）では、プローブ分子と反応したターゲット抗原及び／又はプローブ分子と反応しなかったターゲット抗原を検出する。
プローブ分子と反応したターゲット抗原の検出は、例えば、抗体に結合する二次抗体を蛍光標識して用い、かつ蛍光標識が付着した抗原抗体複合体を検出することにより行うことができる。
【００５４】
本発明の方法で使用する蛍光標識は、特に制限されないが、例えば、5'-カルボキシフルオレセイン（FAM）、5'-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、イソチオシアネートフルオレセイン（FITC）等を挙げることができる。
【００５５】
複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を蛍光標識を用いて行う場合は、上述のように、蛍光検出器を用いて行うことが出来る。それに対し、蛍光標識を用いない場合は、蛍光検出器に代えて、可視・紫外分光分析装置、有機質量分析装置、フーリエ変換赤外分光分析装置、飛行時間型質量分析装置、核磁気共鳴分析装置、ガスクロマトグラフ分析装置、ガスクロマトグラフ−質量分析装置、及び／又は液体クロマトグラフ分析装置等を用いて、複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を行うことができる。複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出は、両者の違いを検知できる装置であれば、いずれの装置を用いて行うこともできる。
【００５６】
(3)の態様（ターゲット分子：金属）
機能性部分が配位子であり、ターゲット分子が金属であり、相互作用が配位結合である(3)の態様は、具体的には、ターゲット金属の検出方法であり、
（１）配位子とポリマーとのコンジュゲートからなるプローブ分子とターゲット金属を含む試料とを配位結合し得る条件下に置く工程、
（２）プローブ分子と結合したターゲット金属を、結合しなかったターゲット金属と分離する工程、及び
（３）プローブ分子と結合したターゲット金属及び／又はプローブ分子と結合しなかったターゲット金属を検出する工程
を含む。
【００５７】
本発明においては、金属としては、配位結合するあらゆる金属を対象とすることができ、例えば、Cu、Cr、Mo、Rh、Ru、Zn等を挙げることができる。
また、配位子は、相手方となる金属に対して配位結合する物質であれば良く、例えば、(メチルスルフィニル)メタニド、ジヒドロナフタレニジル等の、有機金属化合物の骨格分子を挙げることができる。
【００５８】
配位結合した金属-配位子の例としては、カリウムと(メチルスルフィニル)メタニド、ナトリウムとジヒドロナフタレニジル、ナトリウムとナフタレンラジカルイオン、金属ハライドと2,2′-ビピリジン系配位子、ルテニウムと三核ルテニウムクラスター、各種金属とピリジニウムβジケトン配位子等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５９】
配位子を機能性部分とするコンジュゲートは、例えば、アミノ基にメタクリロイルオキシスクシンイミド等のビニル基導入試薬を作用させ、配位子が有するアミノ基をビニル基に変換し、その後、これをアクリルアミドモノマーとラジカル共重合させる方法により調製することができる。この際、アミノ基をビニル基に変換する反応や共重合反応における触媒はどのような物質でも良く、反応条件も特に限定されない。例えば、配位子が有するアミノ基をビニル基に変換して得た生成物とアクリルアミドモノマーをTris-HCl緩衝液中においてN,N,N'N'-テトラメチルエチレンジアミンを開始剤としてラジカル重合させても良い。もちろん、これら以外の触媒を用いても、助触媒や添加剤を用いても良い。また、溶媒、緩衝液、反応温度等も限定されない。
【００６０】
コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、例えば、プローブとなる異なるコンジュゲートごとに数万から数十万の範囲である事が、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、好ましくは、３〜３０万の範囲である。
【００６１】
１分子のコンジュゲートに含まれる配位子の数は、例えば、1から５０個の範囲であることが、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。１分子のコンジュゲートに含まれる配位子の数は、好ましくは、１〜２０の範囲である。
【００６２】
本発明の方法では、コンジュゲートを構成するポリマーの分子量が異なる少なくとも２種類のプローブ分子を用いることもできる。その場合、コンジュゲートを構成する配位子が、ポリマーの種類に応じて異なることもできる。
【００６３】
このようにすることで、以下のことが可能になる。例えば、ターゲットとなる金属が複数個ある場合、それぞれに対する配位子を結合した分子量が異なるコンジュゲートを合成し、プローブとして利用することによって、各ターゲット金属−プローブコンジュゲートの泳動時間を制御することが可能となるこれにより、異なる時間にターゲット金属が分離検出されるシステムを構築することが出来る。
【００６４】
工程（１）では、プローブ配位子とターゲット金属を含む試料とを配位結合し得る条件下に置く。
具体的には、（ａ）プローブ配位子とターゲット金属を含む試料とを同一溶液中に共存させて配位結合させるか、（ｂ）予めプローブ配位子を保持している電気泳動用ゲルにターゲット金属を含む試料を泳動させることで、配位結合させることもできる。プローブ配位子の電気泳動ゲルへの保持は、例えば、プローブ配位子をループに採取してからロータリーバルブを用いて分析用キャピラリー管内に導入する、吸引する、加圧する、電気泳動させる等の様々な手法によって行うことができる。
【００６５】
（ａ）の配位結合は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブ配位子とターゲット金属をあらかじめ混合する事によって配位結合を促進し、その混合溶液をキャピラリー管内に加圧法によって導入すれば良い。この時、キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）であることが望ましい。
【００６６】
（ｂ）の配位結合は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブ配位子をキャピラリー管内に加圧法によって導入し、後からターゲット金属を含む溶液を同じく加圧法によって導入すれば良い。この時キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）であることが望ましい。
【００６７】
工程（２）では、プローブ分子と結合したターゲット金属を、結合しなかったターゲット金属と分離する。この分離方法には特に制限はないが、電気泳動を用いることが好ましい。
プローブ分子と結合したターゲット金属の、結合しなかったターゲット金属からの分離を電気泳動法により行う場合、結合を（ａ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲット金属を含む試料とを結合させた後に、試料を電気泳動法に供する。
また、結合を（ｂ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲット金属を含む試料との結合、及びプローブ分子と結合したターゲット金属の、結合しなかったターゲット金属との分離を、プローブ分子を保持した電気泳動ゲルにターゲット金属を含む試料を泳動させることで行うことができる。
【００６８】
電気泳動に関しては、イオン化したターゲット及びプローブ分子を泳動させる必要がある。そのため、検出したいターゲット分子・プローブ分子複合体の電荷と反対の極性を示す電極側から金属を導入し、その反対電極側へと泳動させる。電気泳動は、キャピラリー電気泳動であることが好ましいが、スラブ型の電気泳動であってもよい。電気泳動の際には、例えば、キャピラリー管内は、Tris-ホウ酸緩衝液等によって満たされている事が望ましい。但し、これ以外の緩衝液を用いても良く、また純水、あるいは何らかの微量の有機溶媒を添加した純水（または緩衝液）を用いても問題がない。また泳動温度はなるべく低温（0から30℃程度）である方が良い。
【００６９】
工程（３）では、プローブ分子と結合したターゲット金属及び／又はプローブ分子と結合しなかったターゲット金属を検出する。
プローブ分子と結合したターゲット金属の検出は、例えば、プローブ分子にあらかじめ蛍光分子を結合させておき、プローブ分子・ターゲット金属複合体を検出することにより行うことができる。
本発明の方法で使用する、プローブ分子にあらかじめ結合する蛍光分子は、特に制限されないが、例えば、FAM、HEX、FITC等を挙げることができる。
【００７０】
複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を、蛍光標識を用いて行う場合は、上述のように、蛍光検出器を用いて行うことが出来る。それに対し、蛍光標識を用いない場合は、蛍光検出器に代えて、可視・紫外分光分析装置、有機質量分析装置、フーリエ変換赤外分光分析装置、飛行時間型質量分析装置、核磁気共鳴分析装置、ガスクロマトグラフ分析装置、ガスクロマトグラフ−質量分析装置、及び／又は液体クロマトグラフ分析装置等を用いて、複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を行うことができる。複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出は、両者の違いを検知できる装置であれば、いずれの装置を用いて行うこともできる。
【００７１】
(4)の態様（ターゲット分子：ホルモン）
機能性部分がレセプターであり、ターゲット分子がホルモンであり、相互作用がホルモン−レセプター結合である(4)の態様は、具体的には、ターゲットホルモンの検出方法であり、
（１）レセプターとポリマーとのコンジュゲートからなるプローブ分子とターゲットホルモンを含む試料とをレセプター−ホルモン結合し得る条件下に置く工程、
（２）プローブ分子と結合したターゲットホルモンを、結合しなかったターゲットホルモンと分離する工程、及び
（３）プローブ分子と結合したターゲットホルモン及び／又はプローブ分子と結合しなかったターゲットホルモンを検出する工程
を含む。
【００７２】
本発明においては、レセプターとしては、ホルモンと結合し得るあらゆる物質を対象とすることができ、例えば、細胞に存在して、物理・化学的な刺激を認識して細胞に応答を誘起する蛋白質（核内受容体や細胞膜（貫通型）受容体）を挙げることができる。
また、ホルモンは、相手方となるレセプターに対して結合するものであれば良い。
ホルモンとレセプターの例としては、例えば、エストラジオールとエストラジオールレセプター等の環境ホルモン分子とそのレセプターテストステロンやジヒドロテストステロン（DHT）とアンドロゲンレセプター、呈味性物質とそのレセプター等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７３】
ホルモンを機能性部分とするコンジュゲートは、例えば、ホルモンが有するアミノ基をビニル基に変換し、その後、これをアクリルアミドモノマーとラジカル共重合させる方法により調製することができる。この際、アミノ基をビニル基に変換する反応や共重合反応における触媒はどのような物質でも良く、反応条件も特に限定されない。例えば、ホルモンが有するアミノ基をビニル基に変換して得た生成物とアクリルアミドモノマーをTris-HCl緩衝液中においてN,N,N'N'-テトラメチルエチレンジアミンを開始剤としてラジカル重合させても良い。もちろん、これら以外の触媒を用いても、助触媒や添加剤を用いても良い。また、溶媒、緩衝液、反応温度等も限定されない。
【００７４】
コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、例えば、プローブとなる異なるコンジュゲートごとに数万から数十万の範囲である事が、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。コンジュゲートを構成するポリマーの分子量は、好ましくは、３〜３０万の範囲である。
【００７５】
１分子のコンジュゲートに含まれるレセプターの数は、例えば、1から５０個の範囲であることが、キャピラリー管内における泳動速度が異なるという観点から適当である。１分子のコンジュゲートに含まれるレセプターの数は、好ましくは、１〜２０の範囲である。
【００７６】
本発明の方法では、コンジュゲートを構成するポリマーの分子量が異なる少なくとも２種類のプローブ分子を用いることもできる。その場合、コンジュゲートを構成するレセプターが、ポリマーの種類に応じて異なることもできる。
【００７７】
このようにすることで、以下のことが可能になる。例えば、ターゲットとなるホルモンが複数個ある場合、それぞれに対するレセプターを結合した分子量が異なるコンジュゲートを合成し、プローブとして利用することによって、各ターゲットホルモン−プローブコンジュゲートの泳動時間を制御することが可能となるこれにより、異なる時間にターゲットホルモンが分離検出されるシステムを構築することが出来る。
【００７８】
工程（１）では、プローブレセプターとターゲットホルモンを含む試料とをレセプター−ホルモン結合し得る条件下に置く。
具体的には、（ａ）プローブレセプターとターゲットホルモンを含む試料とを同一溶液中に共存させてレセプター−ホルモン結合させるか、（ｂ）予めプローブレセプターを保持している電気泳動用ゲルにターゲットホルモンを含む試料を泳動させることで、レセプター−ホルモン結合させることもできる。プローブレセプターの電気泳動ゲルへの保持は、例えば、プローブレセプターをループに採取してからロータリーバルブを用いて分析用キャピラリー管内に導入する、吸引する、加圧する、電気泳動させる等の様々な手法によって行うことができる。
【００７９】
（ａ）のレセプター−ホルモン結合は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブレセプターとターゲットホルモンをあらかじめ混合する事によってレセプター−ホルモン結合を促進し、その混合溶液をキャピラリー管内に加圧法によって導入すれば良い。この時、キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）であることが望ましい。
【００８０】
（ｂ）のレセプター−ホルモン結合は、具体的には、以下の条件で行うことができる。
例えば、プローブレセプターをキャピラリー管内に加圧法によって導入し、後からターゲットホルモンを含む溶液を同じく加圧法によって導入すれば良い。この時キャピラリー管内は、低温（0から30℃程度）であることが望ましい。
【００８１】
工程（２）では、プローブ分子と結合したターゲットホルモンを、ハイブリダイズしなかった結合しなかったターゲットホルモンと分離する。この分離方法には特に制限はないが、電気泳動を用いることが好ましい。
プローブ分子と結合したターゲットホルモンの、結合しなかったターゲットホルモンからの分離を電気泳動法により行う場合、結合を（ａ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲットホルモンを含む試料とを結合させた後に、試料を電気泳動法に供する。
また、結合を（ｂ）の方法で行った場合には、プローブ分子とターゲットホルモンを含む試料との結合、及びプローブ分子と結合したターゲットホルモンの、結合しなかったターゲットホルモンとの分離を、プローブ分子を保持した電気泳動ゲルにターゲットホルモンを含む試料を泳動させることで行うことができる。
【００８２】
電気泳動に関しては、負電荷のターゲット及びプローブ分子を泳動させる必要があるため、陰極側から試料を導入してターゲットホルモンを、陽極側に泳動させる。電気泳動は、キャピラリー電気泳動であることが好ましいが、スラブ型の電気泳動であってもよい。電気泳動の際には、例えば、キャピラリー管内は、Tris-ホウ酸緩衝液等によって満たされている事が望ましい。但し、これ以外の緩衝液を用いても良く、また純水、あるいは何らかの微量の有機溶媒を添加した純水（または緩衝液）を用いても問題がない。また泳動温度はなるべく低温（0から30℃程度）である方が良い。
【００８３】
工程（３）では、プローブ分子と結合したターゲットホルモン及び／又はプローブ分子と結合しなかったターゲットホルモンを検出する。
プローブ分子と結合したターゲットホルモンの検出は、例えば、結合及び／又は分離をプローブ分子と結合したターゲットホルモンの検出は、例えば、プローブ分子にあらかじめ蛍光分子を結合させておき、プローブ分子・ターゲットホルモン複合体を検出することにより行うことができる。本発明の方法で使用する、プローブ分子にあらかじめ結合する蛍光分子は、特に制限されないが、例えば、FAM、HEX、FITC等を挙げることができる。
【００８４】
複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を蛍光標識を用いて行う場合は、上述のように、蛍光検出器を用いて行うことが出来る。それに対し、蛍光標識を用いない場合は、蛍光検出器に代えて、可視・紫外分光分析装置、有機質量分析装置、フーリエ変換赤外分光分析装置、飛行時間型質量分析装置、核磁気共鳴分析装置、ガスクロマトグラフ分析装置、ガスクロマトグラフ−質量分析装置、及び／又は液体クロマトグラフ分析装置等を用いて、複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出を行うことができる。複合体を形成したターゲット分子及び／又は複合体を形成しなかったターゲット分子の検出は、両者の違いを検知できる装置であれば、いずれの装置を用いて行うこともできる。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。
4-1) 使用試薬
オリゴヌクレオチド（5'-GCTGGTGGC-3'、5'-ACACACACA-3'、H2N-5'-GCCACCAGC-3'、H2N-5'-TGTGTGTGT-3'）はシグマジェノシスジャパン株式会社（北海道）よりHPLC精製グレード品として購入した。購入したオリゴヌクレオチドはまず滅菌水に溶解し、260nmにおける吸光度を測定した後、最近接塩基対法に基づいて算出した吸光係数より濃度を算出した。その他の試薬は全て市販の特級試薬を用いた。
【００８６】
4-2) メタクリルロイルオキシスクシンイミドの合成
1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド（14.5g）をジクロロメタン（40mL）に添加した混合溶液（溶液A）、及びメタクリル酸（4.03g）、N-ヒドロキシスクシンイミド（5.22g）、4-ジメチルアミノピリジン（2.80g）及びピリジン（10mL）をジクロロメタン（40mL）に溶解した混合溶液（溶液B）を調製した。氷浴下で溶液Bに溶液Aを滴下し、得られた白濁溶液を濾過した。その後濾液の脱水、酢酸エチル添加、濾過（濾液回収）、エバポレーションを3回繰り返す事によってメタクリルロイルオキシスクシンイミドを得た。
【００８７】
4-3) ビニル化DNAの合成
上記で得られたメタクリルロイルオキシスクシンイミド（32.5μmol）を溶解したジメチルスルホキシド（150μL）と、アミノ化オリゴヌクレオチド（0.65μmol）を溶解した炭酸二ナトリウム/炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5、650μL）を25℃で18時間混合した。得られた混合溶液をHPLC（逆相カラム、0.1Mトリエチルアミン-氷酢酸：100→73%、アセトニトリル：0→27%、30分）によって分取し、凍結乾燥する事によってビニル化オリゴヌクレオチドを得た。
【００８８】
4-4) DNAコンジュゲートの合成
所望の最終濃度になるようにビニル化オリゴヌクレオチド及びアクリルアミド（AAm）のストック溶液を混合し、10分間窒素を添加した。オリゴヌクレオチドの最終モル分率は、5.52×10-2mol%（CGACCACCG-AAm）及び5.52×10-1mol%（TGTGTGTGT-AAm）である。その後、過硫酸アンモニウム（APS、最終濃度：3mM）及びN,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED、最終濃度：6mM））を添加し、重合反応を開始した。反応温度は25℃、反応時間は18℃、攪拌速度は300rpmとした。反応終了後、重合溶液をゲル濾過し、DNAコンジュゲートが含まれる分取フラクションを透析し、凍結乾燥する事によってDNAコンジュゲートを得た。
【００８９】
4-5) キャピラリー電気泳動による複数遺伝子の同時分離検出の検討
まず初めにオリゴヌクレオチド及びDNAコンジュゲートの泳動挙動の検討を行った。各成分が単独で溶解している溶液を5秒間注入後、電圧（-30kV）を印加し、各成分の泳動時間を測定した。
次に、キャピラリー電気泳動による複数遺伝子の同時分離検出の検討を行った。DNAコンジュゲートを含む溶液（一種類の単独溶液、或いは二種類の混合溶液）をキャピラリー管内に5秒間注入した。そしてオリゴヌクレオチド混合溶液を5秒間注入した後、電圧（-30kV）を印加し、オリゴヌクレオチド-DNAコンジュゲート複合体の泳動時間を測定した。
試料注入は全て陰極側から加圧法（5psi）で行った。検出には、UV（各成分単独の泳動挙動の検討の場合。260nm）及び蛍光（複数遺伝子の同時分離検出の検討の場合。励起波長は488nm、蛍光波長は600nm）検出器を用いた。また泳動溶液は100mMのTris-ホウ酸緩衝液（pH7.4）であり、蛍光検出を行う場合のみ5mg/Lのエチジウムブロミド（蛍光性インターカレータ）を添加した。用いたキャピラリー電気泳動装置は、ベックマン社製のPACE MDQであり、キャピラリー管は内壁処理されている市販の管（Agilent社、CEPコートキャピラリー）を用いた（内径：75μm、試料導入〜検出部：50cm）。オリゴヌクレオチド濃度とDNAコンジュゲートの濃度は共に20μM（混合時は各10μM）である。
【００９０】
4-6) DNAコンジュゲート合成結果
本発明では、二種類のプローブDNAコンジュゲート（CGACCACCG-AAm及びTGTGTGTGT-AAm）を合成した。ゲル濾過カラムによって、重合溶液からDNAコンジュゲート、未反応ビニル化オリゴヌクレオチド、及び重合開始剤を分離する事が出来た。DNAコンジュゲートが含まれるフラクションを回収し、凍結乾燥することによってDNAコンジュゲート粉末を得た。粉末を滅菌水に溶解してUV測定を行い、DNAコンジュゲート中に含まれるオリゴヌクレオチド含有量を測定したところ、5.14×10-2mol%（CGACCACCG-AAm）及び1.45×10-1mol%（TGTGTGTGT-AAm）であった。
【００９１】
4-7) キャピラリー電気泳動における各種成分の泳動結果
次に、キャピラリー電気泳動による各成分（オリゴヌクレオチド及びDNAコンジュゲート）の泳動挙動の検討を行った。その結果、二種類のオリゴヌクレオチド及びその混合物の泳動時間はそれぞれほぼ同じ（3.5分）であったが、オリゴヌクレオチドのグラフト量が異なるDNAコンジュゲートの泳動時間は異なる事を見出した（CGACCACCG-AAm：29.5分、 TGTGTGTGT-AAm：28.5分）。これは、オリゴヌクレオチドのグラフトが3倍程度多いTGTGTGTGT-AAmコンジュゲートの方がより荷電/質量比が高くなり、CGACCACCG-AAmコンジュゲートよりも早く陰極側へ泳動したためであると考えられる。
【００９２】
4-8) キャピラリー電気泳動による複数遺伝子の同時分離検出結果
以上の結果に基づき、DNAコンジュゲートをプローブバンドとして用いたキャピラリー電気泳動による複数遺伝子の同時分離検出の検討を行った。その結果、二種類のオリゴヌクレオチドの混合溶液を分離検出する為に一種類のプローブDNAコンジュゲートを用いた場合には、DNAコンジュゲートの種類によって各オリゴヌクレオチドが特異的に分離検出された（図３ (a、b)）。これはオリゴヌクレオチドとDNAコンジュゲートが形成する複合体に、特異的に二本鎖DNA結合性インターカレータが結合して蛍光検出されている事を示している。そこで、二種類のオリゴヌクレオチドの混合溶液を分離検出する為に二種類のプローブDNAコンジュゲートを用いたところ、それぞれのオリゴヌクレオチドを特異的に分離検出する事に成功した（図３(c)）。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】本発明の方法（一般的）の概略説明図。
【図２】本発明の方法（核酸検出法）の概略説明図。
【図３】実施例における同時分離検出結果。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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