(57)【要約】【課題】胚（特に、ゼブラフィッシュ初期胚）を所定の方向を向かせることにより、胚に対する操作（物質の導入、或いは特定部位の抜き取り等）を容易とする方法を提供すること。【解決手段】固定電極である線状の第１電極１と、移動電極である点状の第２電極２との間に、比抵抗が２ｘ１０５Ω・ｃｍ以下の精製水Ｗにゼブラフィッシュ初期胚Ｅを浸漬した後に、両電極１，２間に交流電界を流して、初期胚Ｅに交番電界を負荷する。所定の条件の下で、初期胚Ｅは、細胞質が第２電極２の先端部２Ａを向くように回転させることができる。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
比抵抗が２ｘ１０５Ω・ｃｍ以下の精製水に胚を浸漬した後、対をなす第１電極と第２電極により該胚に不平等な交番電界を負荷して該胚が所定の方向を向くように回転させることにより位置決めし、該胚に所定の操作を行うことを特徴とする胚の操作方法。
【請求項２】
前記胚に不平等な交番電界を負荷して該胚を回転させるときに、その胚の卵膜表面と移動可能に構成された前記第２電極先端部との距離が１ｍｍ以下となるまで前記第２電極を近接させた後、対向する前記両電極間に電圧が２０ボルト以上で周波数が１０ヘルツ以上であって、且つ［電圧ｘ周波数≧４０ボルト・ヘルツ］となる条件で交番電界を負荷することを特徴とする請求項１に記載の胚の操作方法。
【請求項３】
前記胚が、ゼブラフィッシュ初期胚であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の胚の操作方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、胚（特に、ゼブラフィッシュ初期胚）の操作方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品等の化合物、または特定の遺伝子などが、ある生物の発生・成長に対してどのような影響を与えるか、或いは胚における特定の部位がその生物の発生・成長に対して如何なる影響を与えるか等を研究するための方法の一つとして、目的とする生物の胚（特に、初期胚）に所定の物質を導入する、或いは胚の特定の部位を抜き取るという方法がある。この方法を実施する場合には、胚に対して所定の操作を行わなければならない。
【０００３】
一般に、胚は非常に小さいものであることから、これらの操作は顕微鏡下で行われる。例えば、ウシ・ウマ等の動物の胚を操作するには、顕微鏡観察をしながら、マイクロマニピュレータを用い、マイクロピペットを操作して胚の位置及び方向を調整することが必要となる。この操作には、熟練した技術を要することから、全ての人が容易に行えるとは言い難い。このため、上記のような胚の操作を容易とするため、様々な研究機関で自動化装置の開発が進められている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
一方、電界を用いた細胞の操作方法に関して、理論面および応用面からの研究開発が行われている（特許文献１および非特許文献１）。しかしながら、容易に胚を操作できる方法については、未だ開発途中の段階である。
【０００５】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、その目的は、胚（特に、ゼブラフィッシュ初期胚）を所定の方向を向かせることにより、胚に対する操作（物質の導入、或いは特定部位の抜き取り等）を容易とする方法を提供することにある。
【特許文献１】特許第１９０８７４４号公報  「分極性微流体対の分割方法及び分割装置」
【非特許文献１】「新版  静電気ハンドブック」静電気学会編、平成１０年１１月２５日発行、オーム社、１８章、ｐ８４１−９１３
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
従来より、胚などの微粒子を交番電界下におくことにより、所定の方向に移動させるという誘電泳動現象は知られている。しかしながら、この現象は「移動」という観点のみについて知られたものであり、本発明者らの発明に示されるように「回転」については全く知られていなかった。
本発明者らは鋭意検討の結果、胚（特に、ゼブラフィッシュ初期胚）を適当な交番電界下におくことにより、驚くべきことに、その胚が所定の方向に整列するように回転することを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明に係る胚の操作方法は、胚を比抵抗が２ｘ１０５Ω・ｃｍ以下の精製水に浸漬した後、対をなす第１電極と第２電極により該胚に不平等な交番電界を負荷して該胚が所定の方向を向くように回転させることにより位置決めし、該胚に所定の操作を行うことを特徴とする。
【０００８】
「胚」とは、多細胞生物で、受精後に発生を開始した個体発生初期のものをいい、卵割中のもの、桑実胚、胞胚、原腸胚、神経胚などを含む。また、動物及び植物のいずれをも含む。これらの胚のうち、動物、脊椎動物、魚類、特にゼブラフィッシュの胚を用いることが好ましいが、これらに限られるものではない。また、端黄卵を用いることが好ましい。また、ゼブラフィッシュ胚の場合には、特に初期胚（卵割中の２細胞期〜１０２４細胞期まで）が交番電界によって、所定の方向に回転するので、好ましく用いることができる。
【０００９】
「精製水」とは、例えばイオン交換・蒸留等の処理を施された水のことを意味しており、その比抵抗は２ｘ１０５Ω・ｃｍ以下で用いることが好ましい。これ以上の比抵抗を備えた水（例えば、リン酸と塩化ナトリウムを含んだ人工海水）を用いると、発熱によって、その水の温度が４０℃以上まで上がってしまい、胚にダメージを与えるおそれがある。このため、交番電界を負荷する際には、比抵抗が２ｘ１０５Ω・ｃｍ以下の精製水を用いることが好ましい。
【００１０】
「交番電界」とは、交流電源により発生させた電界のことを意味し、「不平等な交番電界」とは、第１電極と第２電極とが平行な電界を発生させるように対向していないということを意味している。例えば、第１電極として線状または面状の電極を用い、第２電極として棒状（より詳細には、棒端部の点状）の電極を用いた場合には、第２電極から第１電極に拡がる不平等な交番電界がかけられることになる。また、両電極のうち、一方を固定電極とし、他方を移動電極とすることが好ましい。その場合に、第１電極として線状または面状の固定電極を設け、第２電極として棒状（或いは、点状）の移動電極とすることが好ましい。
【００１１】
「回転させる」とは、移動とは別に、胚が所定の方向に回る運動を意味している。例えば、ゼブラフィッシュ初期胚を用いた場合には、胚中の細胞質部分が不平等な交番電界のうち、電気力線がより混み合っている方向に向かって回転する（例えば上記の例、すなわち第１電極として線状または面状の電極を、第２電極として棒端部の点状電極を用いた場合には、細胞質部分が第２電極の方向を向くようにして回転する）。
【００１２】
「所定の操作」とは、胚に対して適当な行為を行うことを意味しており、例えば外来物質（医薬品などの化合物、遺伝子など）を導入すること、或いは胚の適当な部分を取り除くことを含む。
【００１３】
また、前記胚に不平等な交番電界を負荷して該胚を回転させるときに、その胚の卵膜表面と移動可能に構成された前記第２電極先端部との距離が１ｍｍ以下となるまで前記第２電極を近接させた後、対向する前記両電極間に電圧が２０ボルト以上で周波数が１０ヘルツ以上であって、且つ［電圧ｘ周波数≧４０ボルト・ヘルツ］となる条件で交番電界を負荷することが好ましい。卵膜表面と第２電極先端部との距離を１ｍｍ以下とすることにより、交番電界による静電気力を胚に及ぼし易くなり、胚を回転しやすくできる。
【００１４】
本発明によれば、胚を不平等な交番電界下に置くことにより、所定の方向を向くようにして回転させる。こうして、所定の方向を向いたところで、胚に所定の操作を行うので、その操作が容易となる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１６】
＜試験方法＞
１．胚についての条件
ゼブラフィッシュ初期胚（受精後、０時間〜３時間のもの、細胞数が２個〜１０２４個以下のもの）を精製水（蒸留・イオン交換処理水：比抵抗約２×１０５Ω・ｃｍ）に浸漬した後に、この胚に様々な交番電界を負荷して、胚が所定の方向を向くように回転するか否かを試した。
【００１７】
２．胚操作用装置
図１には、本試験に用いた胚操作用装置の概要を示した。図中の符号Ｅは、ゼブラフィッシュ初期胚（以下、単に「初期胚」という）である。初期胚Ｅは、精製水Ｗに浸漬された状態とされている。この精製水Ｗ中には、初期胚Ｅを挟んで、一対の電極１，２が設けられている。このうち、図示下方の第１電極１は、線状の固定電極である。また、上方の第２電極２は、移動可能な針状とされており、第１電極１に対して、ほぼ垂直方向をなして対向するようになっている。また、第２電極２の先端部２Ａが、第１電極１のほぼ中間位置となるようにして配置されている。先端部２Ａと初期胚Ｅとの間隔は、約１ｍｍとした。
また、両電極１，２間には、スイッチＳＷを介して、交流電源Ｖが接続されている。
【００１８】
３．操作手順
上記装置において、初期胚Ｅを精製水Ｗ中に浸漬した後、顕微鏡下で観察できるように配置し、スイッチＳＷをつないで初期胚Ｅに交番電界を付加し、経時的に初期胚Ｅの回転運動の有無を観察した。また、光学顕微鏡の接眼レンズ側に、ＣＣＤカメラを配置して、適当に静止画または動画を記録した。
【００１９】
４．試験条件
交流電源Ｖの条件として、周波数と電圧とを以下の四組に設定して、それぞれの場合について、胚の回転の有無を確認した。すなわち、周波数と電圧とを、（１）１ＭＨｚ、２０Ｖ、（２）１ＭＨｚ、１００Ｖ、（３）１００Ｈｚ、１００Ｖ、及び（４）１０Ｈｚ、１００Ｖの四組である。
【００２０】
＜試験結果＞
上記４（１）〜（４）の条件で初期胚に交番電界を負荷して、最大１０秒間の観察を行った。その結果、（２）１ＭＨｚ、１００Ｖ、及び（３）１００Ｈｚ、１００Ｖの条件では、初期胚が所定の方向（細胞質が第２電極２の先端部２Ａを向く方向）を向くように回転し、初期胚の電極方向への移動が確認できた。一方、（１）１ＭＨｚ、２０Ｖの条件では、１０秒間のうちには、初期胚の移動、及び回転運動は観察されなかった。また、（４）１０Ｈｚ、１００Ｖの条件では、回転運動は観察されたが電極への移動は見られなかった。
【００２１】
また、図２〜図５には、（３）１００Ｈｚ、１００Ｖの条件で交番電界を負荷したときの初期胚の回転運動の様子を示した。例えば、交番電界を負荷した直後（図２）と、５秒後（図４）との写真図を比較すると、初期胚が回転している様子と電極方向（第２電極）へ移動していることが分かる。
このように、本実施形態によれば、胚を所定の方向に回転させることができるので、胚に対する所定の操作を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施形態において、胚の操作用に用いた装置の概要図である。
【図２】１００Ｈｚ、１００Ｖの条件で、ゼブラフィッシュ初期胚に交番電界を負荷したときの初期胚の回転運動の様子を示す顕微鏡写真図−１である。この図は、交番電界を負荷した直後（０秒）のものである。
【図３】１００Ｈｚ、１００Ｖの条件で、ゼブラフィッシュ初期胚に交番電界を負荷したときの初期胚の回転運動の様子を示す顕微鏡写真図−２である。この図は、交番電界を負荷して３秒後のものである。
【図４】１００Ｈｚ、１００Ｖの条件で、ゼブラフィッシュ初期胚に交番電界を負荷したときの初期胚の回転運動の様子を示す顕微鏡写真図−３である。この図は、交番電界を負荷して５秒後のものである。
【図５】１００Ｈｚ、１００Ｖの条件で、ゼブラフィッシュ初期胚に交番電界を負荷したときの初期胚の回転運動の様子を示す顕微鏡写真図−４である。この図は、交番電界を負荷して７秒後のものである。
【符号の説明】
１…第１電極
２…第２電極
２Ａ…先端部
Ｅ…初期胚
Ｗ…精製水
Ｖ…交流電源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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