(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸の効率的かつ容易なトランスフェクションの方法を提供する。【解決手段】即ち、本発明は、核酸及び真核細胞の両方を受け取るための基質に関する。該基質は担体とカチオン性コーティングを含み、該カチオン性コーティングは、カチオン性脂質、リガンドと結合したカチオン性ポリマー、カチオン性ポリマーと生分解性バイオポリマーとの混合物、カチオン性ポリマーとリガンドと結合したカチオン性ポリマーとの混合物、又はリガンドと結合したカチオン性ポリマーと生分解性バイオポリマーとの混合物から調製される。カチオン性コーティングは溶液中で基質上にて核酸と真核細胞の両方を捕捉するとともにこれらの接着を促進する。さらに、カチオン性コーティングを用いて核酸を細胞中へトランスフェクションする方法も開示されている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と真核細胞とを受け取るための基質であって、前記基質は、
担体と、
カチオン性脂質、リガンドと結合したカチオン性ポリマー、カチオン性ポリマーと生分解性バイオポリマーとの混合物、カチオン性ポリマーとリガンドと結合したカチオン性ポリマーとの混合物、又はリガンドと結合したカチオン性ポリマーと生分解性バイオポリマーとの混合物、とを含み、
前記カチオン性脂質又はカチオン性ポリマーは溶液中において核酸及び真核細胞の両方を捕捉し、それにより基質上への接着が促進される基質。
【請求項２】
カチオン性脂質は前記担体の表面上に均一かつ非共有結合的に配置される請求項１に記載の基質。
【請求項３】
前記担体は金属又はセラミックである請求項２に記載の基質。
【請求項４】
前記カチオン性脂質はリガンドと結合している請求項２に記載の基質。
【請求項５】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項２に記載の基質。
【請求項６】
前記担体は金属又はセラミックである請求項５に記載の基質。
【請求項７】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項５に記載の基質。
【請求項８】
前記カチオン性脂質と結合する中性脂質を更に含む請求項２に記載の基質。
【請求項９】
前記中性脂質は、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン又はコレステロールである請求項８に記載の基質。
【請求項１０】
前記担体は金属又はセラミックである請求項９に記載の基質。
【請求項１１】
前記中性脂質はリガンドと結合している請求項９に記載の基質。
【請求項１２】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項９に記載の基質。
【請求項１３】
前記担体は金属又はセラミックである請求項１２に記載の基質。
【請求項１４】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項１２に記載の基質。
【請求項１５】
リガンドと結合したカチオン性ポリマーは担体の表面上に均一かつ非共有結合的に配置されている請求項１に記載の基質。
【請求項１６】
前記担体は金属又はセラミックである請求項１５に記載の基質。
【請求項１７】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項１６に記載の基質。
【請求項１８】
前記担体は金属又はセラミックである請求項１７に記載の基質。
【請求項１９】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項１７に記載の基質。
【請求項２０】
前記カチオン性ポリマーと生分解性バイオポリマーとの混合物は担体の表面上に均一かつ非共有結合的に配置されている請求項１に記載の基質。
【請求項２１】
前記担体は金属又はセラミックである請求項２０に記載の基質。
【請求項２２】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項２０に記載の基質。
【請求項２３】
前記担体は金属又はセラミックである請求項２２に記載の基質。
【請求項２４】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項２２に記載の基質。
【請求項２５】
前記カチオン性ポリマーとリガンドと結合したカチオン性ポリマーとの混合物は担体の表面上に均一かつ非共有結合的に配置されている請求項１に記載の基質。
【請求項２６】
前記担体は金属又はセラミックである請求項２５に記載の基質。
【請求項２７】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項２５に記載の基質。
【請求項２８】
前記担体は金属又はセラミックである請求項２５に記載の基質。
【請求項２９】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項２５に記載の基質。
【請求項３０】
前記リガンドと結合したカチオン性ポリマーと生分解性バイオポリマーとの混合物は担体の表面上に均一かつ非共有結合的に配置されている請求項１に記載の基質。
【請求項３１】
前記担体は金属又はセラミックである請求項３０に記載の基質。
【請求項３２】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項３０に記載の基質。
【請求項３３】
前記担体は金属又はセラミックである請求項３２に記載の基質。
【請求項３４】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項３２に記載の基質。
【請求項３５】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項１に記載の基質。
【請求項３６】
前記担体は金属又はセラミックである請求項３５に記載の基質。
【請求項３７】
前記担体は糸状又はテープ状の形状である請求項３５に記載の基質。
【請求項３８】
核酸を真核細胞に導入する方法であって、
前記方法は、
カチオン性脂質、カチオン性ポリマー及びリガンドと結合したカチオン性ポリマーから選択されるカチオン性分子を含む基質を提供する工程と、
前記カチオン性分子を核酸及び真核細胞と接触させ、それにより該核酸と該真核細胞とが基質上において前記該カチオン性分子に接着する工程とを含む方法。
【請求項３９】
前記カチオン性分子はカチオン性脂質であり、かつ前記基質は中性脂質を更に含み、前記中性脂質は前記カチオン性脂質と結合している請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記基質はリガンドを更に含み、前記リガンドは前記カチオン性脂質又は前記中性脂質と結合している請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記カチオン性分子は、カチオン性ポリマー又はリガンドと結合したカチオン性ポリマーであり、前記基質は生分解性バイオポリマーを更に含み、前記生分解性バイオポリマーは前記カチオン性ポリマーと結合している請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記担体は金属又はセラミックである請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞は哺乳動物の細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記担体は金属又はセラミックである請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記担体は糸状の形状である請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記担体はテープ状の形状である請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記接触工程は、インビトロにおいて前記カチオン性分子を核酸及び細胞と接触させることにより実施される請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記接触工程は、最初にインビトロにてカチオン性分子を核酸と接触させ、ついでインビボにて細胞と接触させることにより実施される請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の効率的かつ容易なトランスフェクションに関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸の効率的かつ容易なトランスフェクションは生物学的研究及び臨床的応用（例えば、遺伝子治療、組織工学、及びインビトロの免疫化）において役に立つものである。現在のトランスフェクション技術には、カチオン性脂質を介在した方法及びカチオン性ポリマーを介在した方法がある。これら二つの技術は他の技術にはない優れた利点を有している。しかしながら、それらの方法は、脂質（又はポリマー）中の窒素基の数と核酸中のリン酸基の数との比率を計算し、該核酸を該脂質（又はポリマー）と混合し、得られた混合物を細胞上に堆積させる必要がある。従って、より便利な方法が必要とされている。
【０００３】
【特許文献１】
米国特許第６０２５３３７号明細書
【特許文献２】
米国特許第６３１９７１５号明細書
【特許文献３】
米国特許第２００２／０００６６６４号明細書
【特許文献４】
米国特許第２００２／０００９８０７号明細書
【特許文献５】
米国特許第６３７６２４８号明細書
【非特許文献１】
ニコル  イー．バリラ（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｅ．  Ｂａｒｙｌａ）他、原子間力顕微鏡によるキャピラリー電気泳動における界面活性剤コーティングの特性（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｂｙ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、“Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．”、２００１年、第７３巻、ｐ．４５５８−４５６５
【非特許文献２】
アナ  ユー．ビエリンスカ（Ａｎｎａ  Ｕ．  Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ  ）他、インビトロ及びインビボにおける固相トランスフェクションのための膜ベースデンドリマー／ＤＮＡ複合体の応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ／ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）、“Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”、２０００年、第２１巻、ｐ．８７７−８８７
【非特許文献３】
リリー  チュ（Ｌｉｌｙ  Ｃｈｕ）他、大規模細胞培養によるたんぱく質産生のための工業的選択（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｃｈｏｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、２００１年、第１２巻、ｐ．１８０−１８７
【非特許文献４】
ダミエン  コノリー（Ｄａｍｉｅｎ  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ）他、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイドで永久的にコーティングした短いＯＤＳカラムにおける共通無機アニオンの迅速なイオンクロマトグラフィー（Ｆａｓｔ  ｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆｃｏｍｍｏｎ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  ｓｈｏｒｔ  ＯＤＳ  ｃｏｌｕｍｎ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｄｏｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ”、２００２年、第９５３巻、ｐ．２９９−３０３
【非特許文献５】
キミ  ホンマ（Ｋｉｍｉ  Ｈｏｎｍａ）他、アテロコラーゲンをベースとした細胞中への遺伝子導入は遺伝子機能のハイスループットスクリーニングを許容する（Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｌｌｏｗｓ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ”、２００１年、第２８９巻、ｐ．１０７５−１０８１
【非特許文献６】
ランス  カム（Ｌａｎｃｅ  Ｋａｍ  ）他、たんぱく質−マイクロパターン化された担体脂質二重膜への細胞接着（Ｃ  ｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｅｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、“Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．”、２００１年、第５５巻、ｐ．４８７−４９５
【非特許文献７】
ダン  ルオ（Ｄａｎ  Ｌｕｏ  ）他、細胞表面におけるＤＮＡの物理的集中化によるトランスフェクションの促進（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ）、“Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、２０００年８月、第１８巻、ｐ．８９３−８９５
【非特許文献８】
ウィリアム  エス．マヌエル（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｓ．  Ｍａｎｕｅｌ  ）他、ポリエチレンイミンでコーティングしたマイクロスフェアによるトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ”、２００１年、第９巻、第１号、ｐ．１５−２２
【非特許文献９】
ジェレミ  イー．メランソン（Ｊｅｒｅｍｙ  Ｅ．  Ｍｅｌａｎｓｏｎ）他、キャピラリー電気泳動における半永久壁コーティングのための二重鎖界面活性剤（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｃｈａｎｉｎｅｄ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｍｉｐｅｒｍａｎｅｎｔ  Ｗａｌｌ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、２０００年９月、第７２巻、第１７号、ｐ．４１１０−４１１４
【非特許文献１０】
トーマス  マーダン（Ｔｈｏｍａｓ  Ｍｅｒｄａｎ  ）他、癌に対する遺伝子オリゴヌクレオチド療法におけるカチオン性ポリマーの可能性（Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｔｉｏｎｉｃｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ”、２００２年、第５４巻、ｐ．７１５−７５８
【非特許文献１１】
タカヒロ  オチヤ（Ｔａｋａｈｉｒｏ  Ｏｃｈｉｙａ  ）他、キャリア材料としてアテロコラーゲンを用いたインビボにおけるプラスミドＤＮＡのための新規な送達系；ミニペレット（Ｎｅｗ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ；  ｔｈｅ  Ｍｉｎｉｐｅｌｌｅｔ）、“Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”，１９９９年６月、第５巻、第６号、ｐ．７０７−７１０
【非特許文献１２】
タチアナ  セグラ（Ｔａｔｉａｎａ  Ｓｅｇｕｒａ）他、遺伝子送達を促進するための表面に結合されたＤＮＡ複合体（Ｓｕｒ  ｆａｃｅ−Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．”、２００２年、第１３巻、ｐ．６２１−６２９
【非特許文献１３】
ロニー  ディ．シェア（Ｌｏｎｎｉｅ  Ｄ．  Ｓｈｅａ）他、組織工学のためのポリマーマトリックスからのＤＮＡ送達（ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、“Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、１９９９年６月、第１７巻、ｐ．５５１−５５４
【非特許文献１４】
ジ  チェン（Ｊｉ  Ｚｈｅｎｇ）他、表面に結合したポリエチレンイミンを備える生分解性ポリマー材料により介在された細胞のトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｂｏｕｎｄ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇ．”、２０００年、第１６巻、ｐ．２５４−２５７
【非特許文献１５】
ジュナルド  ズラウディン（Ｊｕｎａｌｄ  Ｚｌａｕｄｄｉｎ  ）他、定義されたｃＤＮＡを発現する細胞のマイクロアレイ（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃＤＮＡｓ）、“Ｎａｔｕｒｅ”、２００１年５月、第４１１巻、ｐ．１０７−１１０
【０００４】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明の一態様は、核酸と真核細胞の両方を受け取るための基質を特徴としている。従って、核酸の細胞へのトランスフェクションが促進される。この基質は、担体及び該担体の表面上に均一かつ非共有結合的にコーティングされるカチオン性分子を含んでいる。正電荷を有する表面は、負電荷を有する核酸を引き付ける。その結果、核酸は表面に接着した細胞の周りに集中し、細胞に高効率で導入される。
【０００５】
基質の担体は、細胞を受け取るのに適した種々の形状に形成され得る。この形状の例としては、テープ、膜、糸、スライド、マイクロビーズ、マイクロ粒子、細胞培養プレート、マルチウェルプレート及びバイオリアクタが挙げられ、これらのすべてが細胞を受け取ることが可能であるが、溶液を通過させることはできるが細胞を受け取ることはできないようにデザインされた円筒体は除外される。さらに、担体は、金属、ポリマー、織物、セラミック、プラスチック又はガラスから形成され得る。
【０００６】
担体上にコーティングされるカチオン性分子は、カチオン性脂質であり得る。該カチオン性脂質は、コーティングを安定化させるための中性脂質と選択的に結合している。そのような中性脂質の例としては、コレステロール、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルエタノールアミンが挙げられる。リガンドは、カチオン性脂質又は中性脂質のいずれか一方に結合され得る。カチオン性脂質（中性脂質）は、該脂質と共有結合したリガンドを備えることによりリガンドと結合しているか、又はリガンドと結合した中性脂質（リガンドと結合したカチオン性脂質）と非共有結合的に作用することによりリガンドと結合している。リガンドは、特殊な型の細胞と結合する分子であるか、又は細胞結合分子若しくは細胞結合分子複合体と結合する分子である。前者の例としては、細胞接着分子及び細胞表面マーカに対する抗体が含まれる。後者の例は、細胞表面マーカに対するビオチン化抗体と結合するアビジンである。従って、リガンドと結合したカチオン性脂質又は中性脂質は接着とトランスフェクションとを促進する。
【０００７】
コーティングされた担体のカチオン性分子はまた、カチオン性ポリマー（即ち、リガンドと結合していない）、リガンドと結合したカチオン性ポリマー又はその両者のいずれかであり得る。カチオン性ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリ（アミドアミン）及び含イミダゾールポリペプチドが挙げられる。そのようなカチオン性ポリマーは、担体にコーティングされる前にリガンドと結合したカチオン性ポリマーと混合され得る。カチオン性ポリマー又はリガンドと結合したカチオン性ポリマーのいずれか一方が、コラーゲン、ゼラチン及びキトサンのような生分解性バイオポリマーと混合され得る。生分解性バイオポリマーはカチオン性ポリマーのいかなる毒性をも弱め、カチオン性ポリマーの担体への付着を促進し、細胞の成長に対する良好な環境を提供する。
【０００８】
カチオン性コーティングは、導入されるべき核酸を吸引する機能を備えるとともに当該核酸から離れている、即ち、均一である。既に述べたように、カチオン性コーティングは、中性脂質（それが脂質コーティングである場合）、生分解性バイオポリマー（それがポリマーコーティングである場合）又はリガンドを含み得る。
【０００９】
本発明の別の態様は、上記基質の一つを用いる方法を特徴とする。即ち、基質を核酸及び真核細胞（例えば、哺乳動物の細胞）と接触させてカチオン性コーティング上に該核酸と該真核細胞とを接着させ、高効率でのトランスフェクションを行う方法である。カチオン性コーティングを最初にインビトロにて核酸と接触させ、次いでインビボにおけるトランスフェクションを行うためにインビボにて細胞と接触させる。これに代えて、インビトロにおけるトランスフェクションを行うために、カチオン性コーティングを核酸及び細胞の両方とインビトロにて接触させることもできる。
【００１０】
研究者及び臨床家は、従来の方法において必要とされていた核酸−脂質複合体又は核酸−ポリマー複合体を準備する必要もなく、本発明の基質のカチオン性コーティングに核酸と細胞を単に接触させるのみにてトランスフェクションを実施することができる。この簡便な方法が高効率なトランスフェクションを提供するということはこれまでには予測できなかった。さらに、本発明の基質及び方法は、真核細胞又は核酸を用いて容易に使用でき、かつ機能的ゲノム学、ハイスループットスクリーニング、組織工学、及びスケールアップした細胞培養の分野において使用され得る。
【００１１】
本発明のその他の利点、特徴及び目的は、以下に示す詳細な説明及び請求の範囲から明らかであろう。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、担体と、該担体上にコーティングされたカチオン性分子とを含む基質に関し、該カチオン性分子はカチオン性脂質（リガンドに結合していないか、又はリガンドと結合している）、カチオン性ポリマー又はリガンドと結合したカチオン性ポリマーである。基質は、単に、適切な溶液中にカチオン性分子を溶解し、該溶液を担体の表面上に適用し、かつ溶媒を乾燥することによって調製され得る。得られた基質は例えばオリゴヌクレオチドのような核酸を効果的に捕捉し（以下の実施例１を参照）、アンチセンス配列として細胞中に導入された場合、既存のたんぱく質の発現を阻止する。基質はまた、発現ベクターを効果的に捕捉し（以下の実施例２乃至５を参照）、細胞中に導入された場合、該細胞が外因性たんぱく質を生成することを可能にする。
【００１３】
担体は異なる適用目的に応じて種々の形状であり得る。例えば、テープ状の担体は、骨折の修復に使用され得る。より詳細には、テープ状担体のカチオン性コーティング上に間葉細胞（骨組織の前駆体）を接着し、例えば、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）又は骨形成因子（ＢＭＰ）のような骨の成長に重要な因子をコードする発現ベクターでトランスフェクトする。例えば、Ｓｉｋａｖｉｔｓａｓ  ＶＩ．他のＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００１年１０月、第２２巻、第１９号、ｐ．２５８１−２５９３、を参照されたい。被覆された担体はトランスフェクションされた細胞とともに骨折部位の周囲にて包まれるか、又は骨折部位内へ挿入される。成長因子の発現によって細胞は骨組織内にて成長し、骨折が治癒する。同様に、適切な成長因子をコードするベクターを含む糸状の担体で傷口を縫合することもできる。この適用において、縫合する前に担体上に細胞を接着させる必要はない。なぜならば、傷を受けた組織における細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞が生成した成長因子によって傷が治癒するからである。一方、スライド状、又は膜状の担体（例えば、セルロース、ＰＶＤＦ及びポリカーボネート）は種々の遺伝子にてトランスフェクションされた細胞を監視するために使用され得る。たとえば、カチオン性分子は、多数の分離されたコーティング領域を含む微細にパターン化された担体を形成するようにスライド又は膜にコーティングされる。そのような微細にパターン化された担体は、多数の細胞又は核酸を同時に処理するために使用され得る。マルチ−ウェルプレート状の担体は、同様の様式において使用され得る。加えて、バイオリアクタの形状を有する担体は、組換えたんぱく質の大量生産において細胞をトランスフェクション及び培養するために使用され得る。一実施例として、バイオリアクタの内面はカチオン性分子でコーティングされる。従って、細胞は発現ベクターでトランスフェクトされ、バイオリアクタ中にて培養されることにより組換えたんぱく質が生成される。更に、マイクロ粒子の形状をした担体は、粒子衝撃トランスフェクション法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）にて使用され得る。該方法では、核酸でコーティングされたマイクロ粒子が植物又は動物細胞中に発射され、トランスフェクションの効率が改善される。
【００１４】
担体は種々の材料から形成され得る。例えば、カチオン性コーティングを備えた金属の担体は、エレクトロポレーション−トランスフェクション法において使用され得る。核酸が金属担体に接着された細胞の周囲に集中していると、電気ショックを受けてより多くの核酸が細胞中にトランスフェクトされる。言い換えれば、該コーティングはエレクトロポレーションのトランスフェクション能を改善する。金属又は生分解性ポリマーのいずれかにて形成された担体は、骨の再構築のような組織工学にて使用され得る。そのような担体は、例えば、壁部に層状の足場を備えたカラムのように、骨構築後にかたどられる。該カラムは、間葉細胞と、ＴＧＦ−β又はＢＭＰをコードするベクターとを受け取るためにカチオン性分子でコーティングされる。ＴＧＦ−β又はＢＭＰの間葉細胞へのトランスフェクション後、カラム上のトランスフェクションを受けた細胞はインビトロにて培養されるか、又はカラムを骨に変換するために患者に移植される。
【００１５】
カチオン性コーティングは担体上にフィルム（即ち、薄い膜状の被覆）又はフォーム（即ち、微細な泡からなる軽量な泡状の塊）の形状にて形成され得る。例えばコラーゲン、ゼラチン及びキトサンのような担体上に堆積させた適切な分子を介しても担体に繋ぐことができる。以下の実施例６を参照されたい。すでに述べたように、コーティングは担体上にて微細にパターン化することも可能である。具体的には、担体の表面を例えばフィブロネクチン又はラミニンのような細胞外たんぱく質にて従来技術に記載したようなマイクロコンタクトプリンティングを用いて最初にパターン化する。例えば、Ｋａｍ  Ｌ．他のＪ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、第５５巻、ｐ．４８７−４９５、を参照されたい。得られた微細にパターン化された表面は、たんぱく質の線からなる格子状アレイを含む。たんぱく質は、担体のプリントされていない領域上のみにカチオン性コーティングの形成を割り当てる。各領域におけるカチオン性コーティングは他の領域と互いに分離される。例えばスライド状の担体はそのような領域を多数含む。従って、大量の細胞又は核酸を平行して処理するためのハイスループットシステムを提供する。
【００１６】
カチオン性分子は、例えば、１，２ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド、１，３−ジ−オレオイルオキシ−２−（６−カルボキシ−スペアミル）−プロピルアミド、Ｎ−［１，−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド、ドクタデシルアミドグリシルスペルミン、３．ベータ．［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、３ベータ−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、２’−（１”，２”−ジオレオイルオキシプロピルジメチル−アンモニウムブロマイド）−Ｎ−エチル−６−アミドスペルミンテトラトリフルオロ酢酸、ジパルミトイルフォスファチジルエタノルアミドスペルミン及び１−［２−（９−（Ｚ）−オクタデセノイルオキシ）エチル］−２−（８−（Ｚ）−ヘプタデセニル）−３−（ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロライドのようなカチオン性脂質であり得る。これらの脂質は、公知の方法を用いて合成され得る。例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  Ｓ．他のＰｒｏ．Ｉｎｄｉａｎ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００２年６月、第１１４巻、第３号、ｐ．１９７−２０１、を参照されたい。カチオン性脂質は、担体上にコーティングされる前に中性脂質と混合され得る。中性脂質はカチオン性脂質のコーティングを安定化させ、それにより、トランスフェクション能を高める。本発明における適切な中性脂質の例としては、フォスファチジルエタノールアミン、コレステロール、フォスファチジルコリンが挙げられる。中性脂質の量は、全脂質に対し０．０００１％乃至６０％（例えば、３０％）の範囲である。
【００１７】
カチオン性分子はまた、カチオン性ポリマーであり得る。適切なカチオン性ポリマーの分子量は、７００乃至８００，０００ダルトンの範囲である。一実施例において、カチオン性ポリマーは、コラーゲン、ゼラチン及びキトサンのような生分解性バイオポリマーとともにコーティングされる。生分解性バイオポリマーは水に溶解され、膜（例えば、０．４５マイクロメータの濾過膜）で濾過される。次いで、カチオン性ポリマーを濾過物中へ溶解し、濃度が１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲のコーティング液を得る。生分解性バイオポリマーの最終濃度は、０．０００１（ｗ／ｖ）％〜１（ｗ／ｖ）％の範囲（例えば、０．０２％）である。そのような濃度の範囲内において、生分解性バイオポリマーはカチオン性ポリマーの担体への付着を促進するとともに細胞が成長するのにより好ましい環境を提供し、結果としてカチオン性ポリマーにてコーティングされた担体のトランスフェクション能を高める。
【００１８】
カチオン分子は、本発明の基質上に、リガンドと共有結合的に結合され得る。リガンドは、特殊な型の細胞と結合するか、特殊な型の細胞と結合した分子（又は分子複合体）と結合するかのいずれかである。リガンドの例としては、細胞接着分子、抗体、アビジン、ビオチン、葉酸、炭水化物、ホルモン、薬物、プロテインＡ及びプロテインＧを含む。これらの分子は、一群の異なる型の細胞から特異的な型の細胞を捕捉し、該細胞を基質上に維持する。たとえば、カチオン性分子は、リンパ球の細胞表面マーカに対するビオチン化抗体のビオチン部分と結合するアビジンと共有結合にて結合し得る。従って、アビジンはビオチン化抗体でラベルされたリンパ球を選択的に捕捉できる。そのような基質は、例えばリンパ球のような、通常は担体に接着せず、従来の方法によってはトランスフェクションをすることが困難な懸濁状態の細胞を捕捉及びトランスフェクションするのに使用され得る。非特異的な細胞を洗い流すことによって捕捉されかつトランスフェクションされる懸濁細胞を豊富にすることが可能であることを明記したい。この一段階のトランスフェクション能を高める試みは、インビトロにてトランスフェクトされた細胞が豊富となり、かつ患者に再導入される生体外遺伝子療法においては有用である。リガンドを含む基質は、組織工学においても使用され得る。例えば、間葉細胞の表面マーカに対する抗体を含む基質上に、ＴＧＦ−β又はＢＭＰをコードする発現ベクターを加えることができる。基質を患者に移植した後、抗体は間葉細胞を基質に補充し、該基質において細胞はベクターによってトランスフェクトされ、骨組織を成長させる。リガンドとカチオン性分子とを共有結合的に結合させる方法は、当業者には公知である。例えば、Ｍｅｒｄａｎ  Ｔ．他のＡｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．、２００２年、第５４巻、第５号、ｐ．７１５、を参照されたい。リガンドはまた既に述べたように中性脂質と結合され得る。この目的のために、中性脂質は、総脂質重量の０．００１％〜６０％の量（例えば、１０％）にて含むことができる。
【００１９】
これに代えて、核酸の細胞への進入を促進する分子をカチオン性コーティング中に含むこともできる。そのような分子の例としては、ＨＩＶ−ｔａｔたんぱく質（ＴＡＴ）のフラグメント及びヘムアグルチニン（ＨＡ）のペプチド配列が含まれる。ＴＡＴは細胞膜に結合し、かつ細胞膜を横断し、ＨＡは膜融合を助けるとともにリソゾームからサイトゾルへと逃れる。従って、ＴＡＴ又はＨＡと結合したカチオン性脂質は核酸が細胞膜を横切ってリソゾームから逃れることを助ける。また、そのようなカチオン性脂質でコーティングされた担体及び該担体をトランスフェクションにおいて使用する方法も本発明の範囲内である。
【００２０】
細胞をトランスフェクションするためにカチオン性分子でコーティングされた担体を使用する場合、核酸及び細胞の両方を適切な時間（例えば、２４時間）の間、基質とともにインキュベートする。好ましくは、核酸を最初にカチオン性分子と接触させるか、又は核酸と細胞を同時にカチオン性分子と接触させる。
【００２１】
本発明の基質は、核酸及び細胞の両方をカチオン性コーティング上に引き付け、それにより核酸の細胞中へのトランスフェクションを促進するようにデザインされている。しかしながら、特異的な核酸を含んでいないような場合にも使用され得る。例えば、異なる種類の細胞に対する異なるリガンドを含む領域を備えた微細にパターン化された脂質コーティングを形成するとともにそれらの細胞をキャリアの核酸とともにコーティング上に配置して細胞アレイを形成する。種々の細胞を化合物と接触させた時の変化を監視することによって該化合物の細胞標的を同定する。
【００２２】
本発明の種々の実施形態をこれまでに述べてきた。にもかかわらず、本願発明の精神及び請求の範囲を逸脱することなく種々の改変がなされることは理解できるであろう。従って、その他の実施形態は以下に示す請求の範囲の範囲内である。
【００２３】
以下に示す実施例は単に例示の目的のみのものであり、いかなる様式においても開示の残りの部分を限定するものではないものと解釈すべきである。本明細書の記載に基づいて、当業者は更なる試行錯誤を繰り返すことなく本発明を完全に実施可能であると思われる。本明細書に引用されたすべての文献は、その全体が参照の目的にて援用される。
【００２４】
実施例１
標準９６ウェルプレートを、カチオン性脂質である１，２ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ；アラバマ州アラバスター所在のＡｖａｎｔｉ社から購入）でコーティングする。より詳細には、ＤＯＴＡＰの２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ及び８０ｎＭメタノール溶液を５０マイクロリットルに等分したものを６組の９６ウェルプレートにそれぞれ加えた。次いでプレートを一晩中真空乾燥器にて乾燥させ、使用時までデシケータ中に保存した。
【００２５】
一つの実験において、１００マイクロリットルの完全培地（即ち、１０％のウシ胎仔血清、５０ユニット／ｍｌのペニシリン及び５０マイクログラム／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地）を、コーティングされたプレートの各ウェルに加える。次いで、コーティングされた表面及び積層された培地を６時間毎に２４時間の間、顕微鏡にて調べた。全てのプレートに関して、２４時間の間表面の違いは見られなかった。さらに、コーティングされた表面上にも、培地中にもリポソーム様粒子は見出せなかった。
【００２６】
別の実験において、０．１マイクログラムの蛍光標識化されたオリゴヌクレオチドを、上記培地を１００マイクロリットル含むコーティングされたプレートの各ウェルへ加えた。次いで、プレートを蛍光顕微鏡にて観察した。蛍光は、コーティングされた表面のみにおいて検出され、培地中では検出されなかった。得られた結果は、ＤＯＴＡＰでコーティングされたプレートは核酸を効果的に捕捉することを示している。
【００２７】
実施例２
実施例１において調製されたコーティングされたプレートを使用して、増強された（Ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光たんぱく（ＥＧＦＰ；カリフォルニア州パロアルト所在のＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入）をコードする発現プラスミドをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションさせた。ＥＧＦＰプラスミドはキアゲン社（カリフォルニア州バレンシア所在）のＰｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔを用いて精製され、１．７より大きいＡ２６０／Ａ２８０比を示した。トランスフェクションする前に、１×１０６のＨｅＬａ細胞を培養し、実施例１に記載した５ミリリットルの完全培地にて再懸濁させた。１マイクログラムのＥＧＦＰプラスミドを細胞と混合した。次に混合物をコーティングしたプレート中に置いた（ウェル当たり約５０００個の細胞）。細胞をプレート上にて２４時間成長させたのち、蛍光顕微鏡写真を撮影した。細胞の蛍光顕微鏡の表面写真は、ＨｅＬａ細胞全体の８０％以上が高レベルの緑色蛍光たんぱく（ＧＦＰ）を発現していることを示した。更に、細胞は期待以上に繁殖していた。このことは、細胞が良好に繁殖しない従来の脂質介在型トランスフェクション法とは相反する結果である。
【００２８】
実施例３
標準９６ウェルプレートをカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）でコーティングした。より詳細には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス所在）からＰＥＩ（分子量２５０００ダルトン）を購入し、脱イオン水にて溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。各ＰＥＩ溶液は０．４５マイクロメートルの濾過膜を通過させた。濾過物をＰＥＩストック溶液として使用し、４℃にて保存した。プレートをコーティングするために、ストック溶液を滅菌脱イオン水にて希釈して２０ｍｇ／ｍｌとし、１０マイクロリットルに等分したものを９６ウェルプレートの各ウェルへ加えた。プレートを乾燥させ、実施例１に記載の方法にて保存した。
【００２９】
トランスフェクションを行うために、ＨｅＬａ細胞を実施例１に記載の完全培地中にてＥＧＦＰプラスミドと混合し、ＰＥＩでコーティングしたプレート上に置いた。２４時間後、細胞を検査し、蛍光顕微鏡写真を撮影した。蛍光顕微鏡写真は、全てのプレートにおいて細胞のほぼ６０％がトランスフェクションされていることを示しており、にもかかわらず細胞のほとんどが円形かつ収縮した形状、表現型の細胞接着不良又は細胞毒性と推定された。ＰＥＩの密度はこの実験において０．３マイクログラム／ｃｍ２より大きかった。期待に反して、０．３マイクログラム／ｃｍ２より小さいＰＥＩ密度の表面は低いトランスフェクション能であることがわかった。
【００３０】
実施例４
標準９６ウェルプレートをゼラチンを含んだＰＥＩ溶液でコーティングし、ＨｅＬａ細胞にＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションするために使用した。より詳細には、６０度の水浴中にて緩やかに攪拌しながらゼラチンを脱イオン水中に溶解し、２％（ｗ／ｖ）のゼラチン溶液を生成した。次いで、この溶液を室温まで徐々に冷却し、０．４５マイクロメートルの濾過膜を通過させた。濾過物をゼラチンストックとして使用し、４℃にて保存した。このストック溶液と上記ＰＥＩストック溶液とを混合し、滅菌脱イオン水にて希釈し、ＰＥＩとゼラチンの最終濃度をそれぞれ２０マイクログラム／ｍｌ及び０．０２％（ｗ／ｖ）とした。５０マイクロリットルのＰＥＩ／ゼラチン溶液をプレートの各ウェルに加えた。次いでプレートをデシケータ中にて乾燥及び保存した。
【００３１】
ＨｅＬａ細胞をＥＧＦＰプラスミドでトランスフェクションさせ、ＰＥＩ／ゼラチン溶液でコーティングしたプレートを用いて培養し、実施例２に記載の方法にて検査した。細胞の蛍光顕微鏡表面写真は、全ＨｅＬａ細胞の約８０％が高レベルのＧＦＰを発現していることを示していた。顕微鏡による表面写真は、ＰＥＩでコーティングしたプレートよりもＰＥＩ／ゼラチンでコーティングしたプレートの方がフィールド当たりの細胞数が多いことも示していた。更に、ＰＥＩ／ゼラチンでコーティングしたプレート上にて成長した細胞は、ＰＥＩでコーティングしたプレート上にて成長した細胞より良好に繁殖していた（実施例３）。
【００３２】
実施例５
実施例４にて調製されたコーティングされた９６ウェルプレートを、従来の脂質又はポリマーを介した方法を用いてはトランスフェクションさせることが非常に困難であるとされているヒト肝臓癌ＮＴＵ−ＢＷ細胞をトランスフェクションさせるために使用した。
【００３３】
細胞をＰＥＩ／ゼラチンでコーティングしたプレート上にてトランスフェクションさせ、培養し、実施例４に記載された方法にて検査した。蛍光顕微鏡表面写真は、全細胞の約５０％が高レベルにてＧＦＰを発現していることを示していた。
【００３４】
実施例６
ガラス製のスライドをＤＯＴＡＰ又はＰＥＩでつなぎ、ＨｅＬａ細胞のトランスフェクションに使用した。
より詳細には、ホウケイ酸ガラススライド（ペンシルバニア州メディア所在のＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）をＬｉｎｂｒｏ７Ｘ洗浄剤（オハイオ州オーロラ所在のＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）で洗浄し、脱イオン水中に１：３（ｖ／ｖ）に希釈し、４５０℃で４時間焼いた。次いで、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ；ミシガン州ミッドランド所在のＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製のＳｙｌｇａｒｄ１８４）エラストマー・スタンプを用いたマイクロコンタクトプリンティングによってスライドをゼラチン又はキトサンでプリントした。Ｋａｍ  Ｌ．他のＪ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年、第５５巻、ｐ．４８７−４９５、を参照されたい。１０ｎＭのＤＯＴＡＰ溶液１ミリリットルと２０マイクログラム／ｍｌのＰＥＩ溶液とをそれぞれ２組のスライド上に１分間被覆した。次に、使用する前に、スライドをダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ニューヨーク州グレートアイランド所在のＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）で簡単に洗浄した。
【００３５】
ＨｅＬａ細胞はＥＧＦＰプラスミドと混合し、上記完全培地を含む１００ｍｍの細胞培養皿中に置かれたスライド上に播種した。２４時間後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の８０％がＧＦＰを発現していることを見出した。
【００３６】
その他の実施形態
本明細書に記載された全ての構成要素は任意の組み合わせにて組み合わせることが可能である。本明細書に記載された各構成要素は同一、同等又は類似の目的に供される代替的な構成要素に置き換えることも可能である。従って、特別に記載されている場合を除き、開示された各構成要素は、一般的な一連の同等又は類似の構成要素の一例のみである。
【００３７】
上記記載から、当業者は本発明の本質的な特徴を容易に確かめることが可能であり、本発明の精神及び請求の範囲を逸脱しない限りにおいて、種々の用途及び条件に適合させるために本発明を多様に変更及び修正することが可能である。従って、その他の実施形態も以下に示す請求の範囲の範囲内に含まれる。
【外国語明細書】
2004159501.tif 000002
2004159501.tif 000003
2004159501.tif 000004
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