(57)【要約】【課題】哺乳動物の疲労回復状態を客観的に評価する方法の提供。【解決手段】哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量またはリン酸化ポテンシャルを指標とする疲労回復状態の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量を指標とする疲労回復状態の評価方法。
【請求項２】
哺乳動物の臓器中のリン酸化ポテンシャルを指標とする疲労回復状態の評価方法。
【請求項３】
哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量を指標とする被験化合物の疲労回復作用の評価方法。
【請求項４】
哺乳動物の臓器中のリン酸化ポテンシャルを指標とする被験化合物の疲労回復作用の評価方法。
【請求項５】
哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量を指標とする被験化合物の疲労回復促進作用の評価方法。
【請求項６】
哺乳動物の臓器中のリン酸化ポテンシャルを指標とする被験化合物の疲労回復促進作用の評価方法。
【請求項７】
臓器として肝臓を用いる請求項１〜６の何れか１項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疲労回復状態の評価方法並びに疲労回復作用及び疲労回復促進作用を有する化合物の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
哺乳動物の疲労回復状態を評価する方法としては、例えば、マウスの自発運動量の変化を測定する方法等が知られているが（非特許文献１参照）、個体間の差異が評価の客観性に影響することは否めない。
【０００３】
また、筋肉中のＡＴＰ量等を測定して疲労の回復具合を評価する方法もあるが（非特許文献２参照）、筋肉中のＡＴＰ等の回復時間が早いため、例えば、薬物投与の疲労回復に及ぼす影響等を観る上では好ましくない。
【０００４】
そこで、哺乳動物の疲労回復状態を客観的に評価できる方法が求められていた。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭６２−１８７４１０号公報（第５頁）
【非特許文献１】
只野  武ら  日本薬理学雑誌１００（５）、ｐ．４２３−４３１、１９９２年
【非特許文献２】
大地  陸男  著「生理学テキスト」（株）文光堂、１９９３年、ｐ．４１６−４１７
【非特許文献３】
Ｙａｓｕｏ  Ｅｎｄｏら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５０９．２、ｐ．５８７−５９８、１９９８年
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、哺乳動物の疲労回復状態及び被験化合物の疲労回復作用等を客観的に評価する方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、疲労回復作用を有する薬物を哺乳動物（例えば、マウス）に投与し、その肝臓中のＡＴＰ量、リン酸化ポテンシャルを測定することにより、薬物投与の影響と疲労回復状態の関係を客観的に明らかにできることを見出した。
【０００８】
かかる知見をもとに完成した本発明の態様の一つは、哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量を指標とする疲労回復状態の評価方法である。
【０００９】
本発明の他の態様は、哺乳動物の臓器中のリン酸化ポテンシャルを指標とする疲労回復状態の評価方法である。
【００１０】
本発明の他の態様は、哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量を指標とする被験化合物の疲労回復作用の評価方法である。
【００１１】
本発明の他の態様は、哺乳動物の臓器中のリン酸化ポテンシャルを指標とする被験化合物の疲労回復作用の評価方法である。
【００１２】
本発明の他の態様は、哺乳動物の臓器中のＡＴＰ量を指標とする被験化合物の疲労回復促進作用の評価方法である。
【００１３】
本発明の他の態様は、哺乳動物の臓器中のリン酸化ポテンシャルを指標とする被験化合物の疲労回復促進作用の評価方法である。
【００１４】
本発明の他の態様は、臓器として肝臓を用いる前記各評価方法である。
【００１５】
本発明に用いられる「哺乳動物」としては、例えば、マウス、ラット、モルモット等の実験動物が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられる「臓器」は、肝臓、腎臓、心臓、脳等のＡＴＰ量を測定可能な臓器であれば特に限定はないが、ＡＴＰの産生に関わる肝臓が好ましい。
【００１７】
本発明における「ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量」は、肝臓等の臓器中のＡＴＰ量を測定しうる方法であれば、いかなる方法によっても可能であるが、例えば、次のようにして測定することができる。
まず、マウスに被験化合物を投与し、運動負荷を与える（非特許文献３参照）。運動負荷直後、運動負荷直後から一定時間経過後の各マウス群に分け、それぞれのマウスから肝臓を摘出する。摘出した肝臓からＡＴＰを抽出し、ＡＴＰの含有量をＨＰＬＣ分析によって測定する。これによって、ＡＴＰ量の時間変化が測定できる。
【００１８】
また、「リン酸化ポテンシャル」は、ＡＴＰだけでなく、同時にＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＡＭＰ（アデノシン−５’−リン酸）も測定し、次の計算式から算出する（特許文献１参照）。
（１／２〔ＡＤＰ〕＋〔ＡＴＰ〕）／（〔ＡＭＰ〕＋〔ＡＤＰ〕＋〔ＡＴＰ〕）
ただし、〔  〕は濃度を示す。
これにより、リン酸化ポテンシャルの時間変化が測定できる。
【００１９】
本発明に用いられる「被験化合物」には、特に限定はないが、単独で投与すればその化合物が疲労回復作用をどれだけ有するかが評価でき、生薬類、ハーブ類、ビタミン類、アミノ酸類、ミネラル類等のＴＣＡサイクルにおいてＡＴＰ産生の素となるエネルギー源となる物質とともに投与すれば、その化合物が疲労回復をどれだけ促進するかが評価できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
【００２１】
【実施例】
以下に試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
（試験例１）
【００２２】
［実験動物］
ＢＡＬＢ／ｃ  ＣｒＳＩｃ  マウス，雄，７週齢
【００２３】
［運動負荷］
Ｙａｓｕｏ  Ｅｎｄｏらの方法（非特許文献３参照）を用い、かごの回転速度を６ｍ／ｍｉｎに設定し、強制的に４時間走行・歩行運動をさせる。
【００２４】
［被験物質投与］
運動負荷直後のマウスのうち、コントロール群は水のみ自由摂取とする。対照群には、エネルギー源としてショ糖溶液（ショ糖１５ｇ／精製水１００ｍＬ）を体重１０ｇにつき０．１ｍＬの割合で経口投与する。被験物質群にはショ糖溶液だけでなく、疲労回復促進作用を有する物質として表１に掲載した生薬配合の滋養強壮液を体重１０ｇにつき０．１ｍＬの割合で経口投与する。
【００２５】
なお、これに参考として運動負荷前の群を加え、運動負荷前５匹、運動負荷直後５匹、コントロール群１０匹、対照群１０匹、被験薬群１０匹のマウスで各群を構成する。
【００２６】
【表１】
2004251753.tif 000002
【００２７】
［サンプルの調製］
マウスから肝臓を摘出し、ドライアイスにて挟んで板状にし、凍結後、重量を測定する。肝臓は−８０℃にて直ちに保存する。
【００２８】
肝臓１ｇに対して冷蔵ＰＣＡ（過塩素酸）を十分量入れる。冷凍した肝臓を手早く試験管に入れ、氷上にてホモジナイズする。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１分間）後、上澄みをサンプルチューブに入れて冷却する。
【００２９】
無機リンの測定には、ホモジナイズ後１時間以内の上澄みを用いる。冷ＫＯＨ−Ｋ２ＨＰＯ４で中和する。混合後、超遠心分離を行う（１２０００ｒｐｍ：約１００００ｇ，４℃，５分間）。上澄みを０．２２ミクロンフィルターにて濾過する。遠心分離（３０００ｒｐｍ，４℃，１分間）、濾過後の上澄み液をサンプルとする。
【００３０】
［ＡＴＰ等の測定］
前記のように調製した運動負荷前、コントロール群（運動負荷後水のみ自由摂取）、対照群（ショ糖溶液投与）、被験物質群（ショ糖溶液及び滋養強壮液投与）の各サンプル中のＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰの各含量をＨＰＬＣ／ＵＶ（検出波長２５９ｎｍ）で定量する。
【００３１】
ＡＴＰ量の変化とリン酸化ポテンシャルの変化を図１〜６に示す。
【００３２】
図１及び２より、運動負荷により、肝臓中のＡＴＰ及びリン酸化ポテンシャルが減少し、図３及び４より、エネルギー源を与えなければ肝臓中のＡＴＰ量及びリン酸化ポテンシャルが回復しないことがわかる。
【００３３】
そして、図５及び６より、エネルギー源（ショ糖溶液）を投与すると肝臓中のＡＴＰ量及びリン酸化ポテンシャルともに回復するが、被験物質（滋養強壮作用を有する生薬液剤）を投与した方が回復が早いことがわかる。
【００３４】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物の疲労回復状態を客観的に評価することが可能となった。また、化合物の有する疲労回復作用や疲労回復促進作用を客観的に評価することが可能となった。
【００３５】
【図面の簡単な説明】
【図１】運動負荷時の肝臓中のＡＴＰ量の変化を示すグラフである。
【図２】運動負荷時の肝臓中のリン酸化ポテンシャルの変化を示すグラフである。
【図３】運動負荷後の肝臓中のＡＴＰ量の変化を示すグラフである。
【図４】運動負荷後の肝臓中のリン酸化ポテンシャルの変化を示すグラフである。
【図５】ショ糖溶液とさらに被験物質を投与した場合のＡＴＰ量の変化を示すグラフである。
【図６】ショ糖溶液とさらに被験物質を投与した場合のリン酸化ポテンシャルの変化を示すグラフである。
【図１】
2004251753.tif 000003
【図２】
2004251753.tif 000004
【図３】
2004251753.tif 000005
【図４】
2004251753.tif 000006
【図５】
2004251753.tif 000007
【図６】
2004251753.tif 000008