(57)【要約】【課題】試料液体の注入に用いる用具の洗浄が不要であり、また試料液体が極少量であっても、試料液体を定量的に流路に導入でき、更に、精度良く送液速度などを定めることができる試料導入方法を提供する。【解決手段】本発明のマイクロ流体素子への試料導入方法は、外部へ開口した導入口７と吐出口８が設けられた毛細管状の流路４を有するマイクロ流体素子Ｄａへの試料導入方法であって、流路４に導入用液体を充填した後に、導入口７において試料液体を導入用液体に接触させ、吐出口８から導入用液体を排出することで試料液体を流路４中に導入する構成とする。導入用液体を流路４に充填する際に、流路４内に気体が混入しないようにすることが好ましい。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部へ開口した導入口と吐出口が設けられた毛細管状の流路を有するマイクロ流体素子への試料導入方法であって、
流路に導入用液体を充填した後に、導入口において試料液体を導入用液体に接触させ、吐出口から導入用液体を排出することで試料液体を流路内に導入することを特徴とするマイクロ流体素子への試料導入方法。
【請求項２】
吐出口にポンプ又はシリンジを接続し、該ポンプ又はシリンジによって導入用液体を吸引して前記吐出口から排出する請求項１に記載のマイクロ流体素子への試料導入方法。
【請求項３】
マイクロ流体素子外に開口した開口部を有し液体を貯留する液溜め槽を導入口に設け、該液溜め槽に試料液体を注入することによって前記導入口にて試料液体を導入用液体に接触させる請求項１又は２に記載のマイクロ流体素子への試料導入方法。
【請求項４】
試料液体を流路内に導入した後、導入口において封止液体を前記試料液体に接触させて、前記試料液体に続いて前記封止液体を流路内に導入する請求項１乃至３のいずれかに記載のマイクロ流体素子への試料導入方法。
【請求項５】
複数の温調領域を有する流路内に試料液体を導入する請求項１乃至４のいずれかに記載のマイクロ流体素子への試料導入方法。
【請求項６】
前記複数の温調領域を有する流路が、ポリメラーゼ連鎖反応用流路である請求項５に記載のマイクロ流体素子への試料導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロ流体素子に形成された毛細管状の流路に所定量の試料液体を導入する方法に関し、特に極微少量の試料液体を流路に導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロ流体素子は、内部に毛細管状の流路（以下、「毛細管状の流路」を単に「流路」と称する場合がある。）を有し、流路内で試料液体の（生）化学反応、物理化学的処理、検出、定量などを行うものである。このマイクロ流体素子に設けられた毛細管状の流路に試料液体を導入する方法としていくつかの方法が知られている。
例えば、マイクロ流体素子の外部に開口した導入口から試料液体を注入した後、導入口に配管を接続し、配管を通じて加圧気体を送入し、この加圧気体によって試料液体を押圧して流路内に導入する方法（特許文献１）が挙げられる。
また、吐出口側から流路内を減圧し、試料液体を吐出口の方向へ吸引して流路内に導入する方法（特許文献２）も挙げられる。
更に、導入口から試料液体を注入した後、ポンプやマイクロシリンジなどを用いて、導入用液体を導入口から加圧して導入し、この加圧された導入用液体によって試料液体を押圧して流路内に導入する方法（特許文献３）や、流路の吐出口に多孔質体などの吸収体を設置し、この吸収体に試料液体を吸収させることによって、流路内に試料液体を導入する方法（特許文献４）も挙げられる。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００２−０１８２７１号公報
【特許文献２】
特開２００１−０８８０９６号公報
【特許文献３】
特開２００２−０９０３５７号公報
【特許文献４】
特開２００１−０８８０９８号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記した加圧又は減圧によって試料液体を導入する方法（特許文献１，２）は、試料液体が微量であっても適用できる。また、試料液体の計量にマイクロピペッターなどを使用できるため、チップを交換することによってマイクロピペッターの洗浄が不要となるという利点がある。
しかしながら、上記方法は、気体の圧力差で試料液体を押圧、または吸引することによって導入するため、例えば流路の途中に、多孔質膜のように大きな圧力損失を生じる機構が設けられている場合、試料液体がその機構を通過する前後で移動速度が大きく変化し、送液速度などを精度良く定めることができないという問題がある。また、流路が温度の異なる複数の領域を通るようになっている場合などには、気体の膨張・収縮が生じて圧力が変化し、送液速度が不正確になり、各温度領域を所定の滞留時間で送液できないなどの問題がある。
一方、導入用液体を導入口から加圧して導入し、この導入用液体によって試料液体を押圧して流路内に導入する方法（特許文献３）は、試料液体をマイクロピペッターなどで計量して導入口から注入し、その後、ポンプやマイクロシリンジなどを用いて、導入用液体を加圧して導入し、この導入用液体によって試料液体を押圧して流路内に導入し、送液する。この方法は、上記と同様に、試料液体の計量用具の洗浄が不要であり、また微少量の試料液体であっても所定量を導入できるという利点がある。
しかしながら、この方法では、前記した試料液体が導入用液体によって希釈されてしまいがちであった。また、試料液体と導入用液体との接触界面に気体が混入しやすく、導入用液体は該気体を介して試料液体を押圧して導入することになり、前記した加圧又は減圧を利用する方法と同様に、送液速度などを精度良く定めることができない問題が生じていた。
また、吸収体に試料液体を吸収させることによって、流路内に試料液体を導入する方法（特許文献４）は、試料液体がマイクロ流体素子内の流路の容積より少ない場合には、この方法を用いることができない。また、試料液体の送液を任意に停止させることができず、また送液速度などを精度良く定めることもできない。
【０００５】
試料液体を流路に導入する方法としては、液体クロマトグラフの試料注入方法を適用することもできる。この方法は、あらかじめ流路内に導入用液体を流通させておき、流路の途上に設けられたゴム質の隔壁を中空針で貫通した後、マイクロシリンジを用いて導入口より試料液体を流路に注入することによって、導入用液体を用い、かつ気体の圧力差を利用せずに試料液体を送液できる。このため、前記した加圧又は減圧を利用した方法のような送液速度などを精度良く定めることができない問題点を解消できる。
しかし、中空針より前記流路が細い場合や、試料液体が少ない場合には、この方法は困難であり、またマイクロシリンジが試料液体によって汚染されるため試料液体の注入毎に洗浄する必要があった。
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、試料液体の注入に用いる用具の洗浄が不要であり、また試料液体が極少量であっても、試料液体を定量的に流路に導入でき、更に、精度良く送液速度などを定めることができる試料導入方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、流路に導入用液体を充填した後に、導入口において試料液体を導入用液体に接触させ、その後、導入用液体を吸引して試料液体を流路に導入することによって、上記の諸問題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によるマイクロ流体素子への試料導入方法は、外部へ開口した導入口と吐出口が設けられた毛細管状の流路を有するマイクロ流体素子への試料導入方法であって、流路に導入用液体を充填した後に、導入口において試料液体を導入用液体に接触させ、吐出口から導入用液体を排出することで試料液体を流路内に導入することを特徴とする。
本発明によれば、流路に導入する容量の試料液体を導入口にて導入用液体と接触させ、この試料液体を全て流路に導入させることで、所定量の試料液体を流路に導入できる。
また、導入口にて導入用液体と接触させる試料液体の定量を洗浄不要のマイクロピペッターなどで行うことができる。このため、操作が簡略化されて作業効率が向上し、更に試料の汚染の恐れもない。
また、流路内に導入用液体を充填し、この導入用液体を吐出口より排出することによって、従来の気体の圧力差で試料液体を押圧、または吸引して送液する方法とは異なり、温度変化によって生じる気体と液体との熱膨張差や熱収縮差による影響がほとんど無く、所望の送液速度で精度良く試料液体を送液できる。
特に、流路内に大きな圧力損失を生じる機構や、流路が温度の異なる複数の領域を通るようになっているマイクロ流体素子であっても、精度良く送液速度などを定めることができる。
更に、試料液体が流路内の容積に比べて極少量であっても、流路に導入する容量の試料液体を導入口にて導入用液体と接触させて流路に導入させることによって、所定量の試料液体を流路に導入できる。また、気体が混入しないように流路内に導入用液体を充填し、この導入用液体を吐出口より排出して試料液体を導入するため、温度変化によって生じる気体と液体との熱膨張差や熱収縮差による影響がほとんど無く、試料液体が極少量であっても所望の送液速度で精度良く試料液体を送液できる。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において試料を導入するマイクロ流体素子は、内部に毛細管状の流路を有し、この流路に流体を導入できるようになっている。流体を導入し吐出するまでの流路内で、流体が温度変化をうける機構、化学反応をうける機構、電気的、化学的な測定をうける機構等が設けられている。このため、マイクロ流体素子の流路に試料液体を導入することによって、流路内で試料液体の（生）化学反応、物理化学的処理、検出、定量などを行うことができる。
【００１０】
このようなマイクロ流体素子は、微少流体デバイス、マイクロ・フルイディック・デバイス、マイクロ・ファブリケイテッド・デバイス、ラブ・オン・チップ、又はマイクロ・トータル・アナリティカル・システム（μ−ＴＡＳ）とも呼ばれるものであり、微小な流路、反応槽などの構造が形成された微小ケミカルデバイスである。
例えば、化学・生化学反応用微小デバイス（マイクロ・リアクター）；膜濾過デバイス、透析デバイス、脱気・吸気デバイス、抽出デバイスなどの化学的・物理化学的処理デバイス；ＤＮＡ分析デバイス、免疫分析デバイス、電気泳動デバイス、クロマトグラフィー、ガス分析デバイス、水質分析デバイスなどとして用いられる。
【００１１】
マイクロ流体素子の形状は任意であり、用途、目的に応じた形状とすることができる。例えば、塊状、板状、シート状（フィルム状、リボン状、ベルト状などを含む）、繊維状（中空繊維状）等であり得るし、これらの複合構造、例えば、板状の部材中の流路と、中空糸状の部材中の流路が接続された構造などであり得るが、板状又はシート状であることが好ましい。
このようなマイクロ流体素子は、例えば、流路となる溝部を有する部材の表面にカバーを貼付して形成することができる。或いは、少なくとも２つの部材に、流路となる線状の孔部が形成された層を挟んで固着することによって形成することができる。
【００１２】
前記流路は、その内部を試料液体が流通できる空洞を言い、単なる送液用の流路の他、反応流路、検出用流路、定量用流路、抽出その他の処理流路、バルブやポンプ部の空洞等であり得る。流路の断面寸法は任意であるが、幅と高さがそれぞれ好ましくは３μｍ〜３ｍｍ、更に好ましくは１０μｍ〜１ｍｍである。また、断面積は、好ましくは１０μｍ２〜１ｍｍ２、更に好ましくは３０μｍ２〜０．１ｍｍ２であり、最も好ましくは１００μｍ２〜０．０３ｍｍ２である。これらの寸法範囲とすることで、圧力損失が少なく試料液体の導入が容易であり、また、微小であることの特長が発揮できる。
【００１３】
また、前記流路には、マイクロ流体素子の外部に開口した導入口を形成することが好ましい。導入口は、流路に形成された孔でも良いが、この導入口には、内部に液体が貯留できる液溜め槽が設けられていることが好ましい。この液溜め槽は、特に限定されず使用でき、導入口の周囲に設けられた囲い枠でもよく、また導入口周辺のマイクロ流体素子表面に形成された凹状の窪みであっても良い。配管接続用のフィッティング（配管接続具）などを導入口に接続し、液溜め槽として使用することも好ましい。
【００１４】
マイクロ流体素子は、それぞれ導入口と吐出口が設けられ、かつ互いに独立した複数の流路を有するもの、又は、複数の流路が合流して１つの流路となるものであり、複数の流路のそれぞれに導入口が設けられ、合流した１つの流路に吐出口が設けられたものも好ましく用いることができる。このようなマイクロ流体素子を用いることによって、１台の導入機構で複数の試料液体について反応や処理を行うことができる。
【００１５】
本発明のマイクロ流体素子に試料液体を導入する方法では、まず、流路のうち少なくとも試料液体を送液する範囲全体に導入用液体を充填する。特に、導入用液体を排出する機構から導入口までの流路内においては、気体が混入しないように導入用液体を充填することが好ましい。
導入用液体を排出するための機構が内部ポンプのようにマイクロ流体素子内に設けられたものである場合、少なくとも導入口から内部ポンプまでの流路内においては、気体が混入しないように導入用液体を充填する。また、導入用液体を排出するための機構がマイクロ流体素子の外部に設けられた外部ポンプやシリンジである場合、流路の導入口から吐出口までの流路内において、気体が混入しないように導入用液体を充填する。この場合、外部ポンプやシリンジまでの接続配管内についても、気体が混入しないように導入用液体を充填することが好ましい。
【００１６】
また、導入用液体の液面が流路の導入口に達するように、導入用液体を流路内に充填することが好ましい。導入用液体が導入口から溢れた状態では、引き続いて導入口にて試料液体を導入用液体に接触させる際、流路外で試料液体と導入用液体との混合が生じるため、好ましくない。また、導入用液体の液面が導入口に達していない場合、引き続いて導入口に試料液体を導入用液体に接触させる際、流路内に気体が入りやすく、試料液体と導入用液体との間に気体が混入したり、流路が気体によって分断されることがあり、好ましくない。
【００１７】
導入用液体は、試料液体やマイクロ流体素子などに悪影響を及ぼすものでなければ任意である。例えば、水又は水溶液、アルコール類、脂肪酸エステル、ミネラルオイル、シリコンオイルなどが好ましく使用できる。試料液体が水系液体、即ち水溶液や、水を分散媒とする分散液である場合には、導入用液体は、水又は水溶液が好ましく、これにより導入用液体が、流路内での試料液体の（生）化学反応、物理化学的処理、検出、定量などに与える悪影響を少なくすることができる。
【００１８】
また、導入用液体は、試料液体とは混和性の液体であっても、また非混和性の液体であっても良い。導入用液体が試料液体とは混和性の液体の場合、導入用液体と試料液体とが、微細な毛細管状の流路内で接触している限り、互いに接触し混合する容積は、流路に導入される試料液体の容積に比べて微小である。例えば、流路断面が１００μｍ×１００μｍの矩形であるとき、１ｍｍ３の試料液体は経路長が１０ｃｍの流路を占める。よって、導入用液体が、試料液体とは混和性の液体であり、導入用液体と試料液体とが互いに接触して、例えば流路断面の２〜５倍（２００〜５００μｍ）の範囲の流路内で混合しても全体に対する影響は無視できる。
また、導入用液体は２種類以上を用いても良い。このとき、導入用液体同士の接触界面がマイクロ流体素子内にあるときは、この接触界面に気体を混入させないようにする。
【００１９】
前記した導入用液体を流路に充填した後、導入口における導入用液体を脱気し、この導入用液体の液面部分の気体の溶存濃度を不飽和とすることが好ましい。脱気は、例えば導入口付近を減圧雰囲気にすることで実施できる。これにより、導入口において試料液体を導入用液体に接触させる際、試料液体と導入用液体との接触界面となる導入用液体の液面に、微量の気体が気泡として混入しても、導入用液体に吸収されこの接触界面に気体を混入させないようにすることができる。
【００２０】
次に、導入口において所定量の試料液体を導入用液体に接触させる。即ち、試料液体と導入用液体が気体（流路断面を塞ぐ大きさの気泡）を介さずに直接接触するようにする。この際、試料液体と導入用液体との接触界面の間に、流路断面を塞がない大きさの気泡が混入しても大きな影響はないが、試料液体を所望の送液速度で精度良く移送するためには、このような小さな気泡も混入させないようにすることが好ましい。導入口に液溜め槽が設けられていない場合、外部へ開口した導入口を覆うように所定量の試料液体を滴下するか又は付着させることによって、試料液体と導入用液体との接触界面に気体が混入しないように試料液体と導入用液体とを接触させることができる。
導入口に液溜め槽が設けられた場合、マクロピペッターなどを用いて、この先端を液溜め槽の底に近づけて試料液体を吐出することで、試料液体と導入用液体との接触界面に気体が混入しないように試料液体と導入用液体とを接触させることができる。
【００２１】
試料液体の計量は、例えばマイクロピペッターやマイクロシリンジで行うことができる。特に、マイクロピペッターは、チップを交換することにより洗浄が不要であり、操作が簡略化されて作業効率が向上し、更に試料の汚染の恐れもないため、好ましく使用できる。
【００２２】
導入口において、所定量の試料液体を導入用液体に接触させた後、外部ポンプや内部ポンプなどによって導入用液体を吐出口から排出し、これにより試料液体を導入口から流路へ導入する。
導入用液体を吐出口から排出するための機構は任意であり、例えば、吐出口の減圧、外部ポンプによる吐出口の定量的吸引、内部ポンプによる定量的吸引、内部の減圧槽による減圧気体を用いた吸引、吸収体による導入用液体の吸収などが挙げられる。特に、定量ポンプによる定量的吸引が好ましく、外部ポンプによる定量的吸引が更に好ましい。
【００２３】
定量ポンプによる定量的吸引を用いる場合、あらかじめ試料液体から定量ポンプまでの流路及び接続配管においては、気体を混入させずに途切れることなく導入用液体が充填された状態とすることが好ましい。また、ポンプやシリンジの内部にも気体を混入させないことが好ましい。これにより、気温が変動する場合や、配管中の導入用液体が温度の異なる領域を通過する場合や、送液速度を変化させる場合にも該気体の体積変化がないため、定量ポンプによる定量的吸引の定量性の精度を向上させることができる。
但し、本発明においては、磁性流体で構成された導入用液体を磁力で駆動する場合は除く。
【００２４】
本発明においては、所望量の試料液体が流路内に導入され、この試料液体の後端が導入口に達した状態で、導入口において前記試料溶液を封止する液体（以下、「封止液体」という。）を試料液体に接触させて注入し、試料溶液を該封止液体とともに流路内に導入することが好ましい。このとき、試料液体と封止液体との接触界面に気体が混入しないようにすることが好ましい。
試料液体が流路内に導入され、試料液体の液面が導入口に達した状態とするためには、導入用液体の排出を一旦停止することが好ましく、優れた作業性で容易に試料液体の液面が導入口に達した状態とすることができる。
【００２５】
前記封止液体としては、例えば、試料液体と大気との接触を遮断し、試料液体の蒸発を防止できる液体や、流路内を送液する際、導入口や流路を洗浄できる液体などであり得る。このような封止液体を試料液体に続いて流路内に導入することによって、試料液体の蒸発を防いだり、流路内壁に付着した試料液体などを溶解し流路を洗浄することができる。このとき、試料液体と封止液体との接触界面に気体を混入させず、試料液体と封止液体とを接触させた状態で封止液体を流路内に導入することによって、蒸発防止などの効果を増すことができ、また、所望の送液速度で精度良く封止液体も送液できる。
例えば、封止用材料によって導入口や流路を洗浄する場合、封止液体の送液速度から洗浄に係る時間を推定することになる。このため、所望の送液速度で精度良く封止液体を送液することによって、洗浄に係る時間を正確に推定できる。以上により、試料液体と封止液体との接触界面に気体を混入させずに封止液体を流路内に導入することは、封止用材料によって導入口や流路を洗浄する場合において特に好ましい。
【００２６】
本発明は、導入口から吐出口までの経路には気体が混入しておらず、気体の体積変化によって試料液体の送液速度が変動することがない。このため、複数の温調領域を有する流路に該試料液体を導入する場合や、流路の温度を経時的に変化させる場合、また、流路の途中や吐出口に、圧力を印加することで開閉を行うチェックバルブや濾過膜などが設けられた場合のように、大きな圧力損失を生じる機構が流路に設けられている場合に、特に好ましく用いることができ、試料液体の送液速度などを精度良く定めることができる。
【００２７】
以下、本発明の実施例について添付図面により説明する。
図１及び図２は実施例によるマイクロ流体素子を示すもので、図１はその平面図、図２は図１のＡ−Ａ線縦断面図である。
図１及び図２に示すマイクロ流体素子Ｄａは化学反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ピー・シー・アール：ＰＣＲ）に用いるものである。このマイクロ流体素子Ｄａは、例えばアクリル樹脂製の基材１上に樹脂組成物からなる第一塗膜２と第二塗膜３を順次積層して部材Ｍを形成し、第二塗膜３には液体の流路４を形成するために、該塗膜を上下に貫通する孔を平面視で蛇行した形状に形成する。また、例えばアクリル樹脂製の保護板６に第三塗膜５を積層して部材Ｎを形成する。そして部材Ｍの第二塗膜３に部材Ｎの第三塗膜５を密着させて固着させることでこれらを一体化させ、第二塗膜３に設けた孔の上下を密閉させて毛細管状の流路４を形成する。
【００２８】
そしてマイクロ流体素子Ｄａの部材Ｎについて、保護板６と第三塗膜５を貫通する２つの孔部を形成してそれぞれ流路４の両端部に設けられた導入口７と吐出口８と連通させる。一方の孔部に配管接続用の円筒状フィッティング（配管接続具）を嵌挿して、液体を貯留する液溜め槽９とし、他方の孔部にも円筒状フィッティングを嵌挿して吐出側フィッティング１０とする。これによって、液溜め槽９の内側空間の底と吐出側フィッティング１０の内側空間の底に、それぞれ導入口７と吐出口８が開口し、流路４は大気に連通した構成となる。
図１に示すマイクロ流体素子Ｄａ内で蛇行して形成された流路４はポリメラーゼ連鎖反応用流路であり、略直線状の多数の流路部４ａが互いに平行に配列されると共に各流路部４ａは両端で湾曲または屈曲することで隣接する他の流路部４ａと接続されて全体で１本の流路を構成している。そして、流路４は流路部４ａの長さ方向に複数、例えば３つの温調領域部α、β、γを通るよう構成されている。各温調領域部α、β、γにおいて流路４はそれぞれ異なる温度に制御され、第一の温調領域部αでは二本鎖ポリヌクレオチドの熱変性温度、例えば９４〜９５℃、第二の温調領域部βではポリメラーゼ伸長反応温度、例えば７２〜７５℃、第三の温調領域部γではポリヌクレオチドの相補鎖形成温度、例えば４５〜６５℃に制御されている。
【００２９】
そのため、例えば、ＰＣＲ反応原液等の試料液体を液溜め槽９に注入して導入口７から流路４内に導入した場合、試料液体が流路４内を移動する過程で第一の温調領域部α、第二の温調領域部β、第三の温調領域部γを順次繰り返して通過することで温度が変化し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことになる。これらの温度調節を行う手段として、例えば表面温度を各温度に設定した温度調節ステージ（図示せず）をマイクロ流体素子Ｄａの基板１の下面に密着させて配置してもよく、各温度調節ステージはそれぞれ図１に示す第一の温調領域部α、第二の温調領域部β、第三の温調領域部γに相当する位置に設置するとよい。
【００３０】
次に、このマイクロ流体素子Ｄａへの試料導入方法について説明する。
まず、マイクロ流体素子Ｄａの吐出側フィッティング１０に、例えばシリンジポンプ（図示せず）に接続された接続配管１１の先端を吐出口８内に嵌挿して接続し、このシリンジポンプから導入用液体として例えば緩衝液を流路４に注入する。
このとき導入用液体の注入量は、吐出口８から注入された導入用液体が流路４全体に充填され、導入用液体の液面が導入口７に達する量である。即ち、導入用液体はマイクロ流体素子の導入口７からシリンジポンプまで、気体が混入せずに途切れず充填された状態となる。
【００３１】
次に、マイクロピペッター（図示せず）を用いて、液溜め槽９の筒状の内側空間に、ポリメラーゼ連鎖反応の原料溶液である試料液体を所定量注入する。このとき、マイクロピペッターの先端を液溜め槽９の内側空間の底に近づけて試料液体を吐出し、試料液体と、流路４内の導入用液体との接触界面に気体が混入しないように注入する。
【００３２】
次いで、シリンジポンプを駆動して導入用液体を一定速度で吸引し、吐出口８から排出すると、試料液体が導入口７から流路４に導入され、更に試料液体は流路４内を一定速度で送液され、３つの温調領域部α、β、γを順次通過することによって温度が変化する。これにより流路４を送液された試料液体は、ＤＮＡが増幅された反応溶液となり、吐出口８から吐出側フィッティング１０の筒状の内側空間に排出される。
【００３３】
上述のように本実施例によれば、流路４に導入する容量の試料液体を導入口７にて導入用液体と接触させ、この試料液体を全て流路４に導入させることによって、所定量の試料液体を流路４に導入できる。
また、導入口７にて導入用液体と接触させる試料液体の定量を洗浄不要のマイクロピペッターなどで行うことができる。このため、操作が簡略化されて作業効率が向上し、更に試料の汚染の恐れもない。
更に、微細な毛細管状の流路４内で接触している限り、試料液体と導入用液体とが互いに接触し混合する容積は、流路４に導入される試料液体の容積に比べて微小である。このため、試料液体と導入用液体とは実質的に混和することがない。
【００３４】
また気体が混入しないように流路４内に導入用液体を充填し、この導入用液体を吐出口８より排出して試料液体を導入するため、従来の気体の圧力差で試料液体を押圧、または吸引して送液する方法とは異なり、特に、流路４が温度の異なる複数の領域を通るようになっている場合や、流路４の温度を経時的に変化させる場合、温度変化によって生じる気体と液体との熱膨張差や熱収縮差による影響がほとんど無く、所望の送液速度で精度良く試料液体を送液でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応等の反応や処理を行うことができる。
また、流路４の途中や吐出口８に、圧力を印加することで開閉を行うチェックバルブや濾過膜などが設けられた場合のように、大きな圧力損失を生じる機構が流路４に設けられている場合であっても、流路４内に気体が混入しておらず、圧力変化によって生じる気体の体積変化による影響がほとんど無く、所定の送液速度で試料液体を流路４内に送液できる。
【００３５】
更に試料液体が流路４内の容積に比べて極少量であっても、同様に、流路４に導入する容量の試料液体を導入口７にて導入用液体と接触させて流路４に導入させることによって、所定量の試料液体を流路４に導入できる。また、気体が混入しないように流路４内に導入用液体を充填し、この導入用液体を吐出口８より排出して試料液体を導入するため、温度変化によって生じる気体と液体との熱膨張差や熱収縮差による影響がほとんど無く、試料液体が極少量であっても所望の送液速度で精度良く試料液体を送液できる。
【００３６】
また上述の実施例では、導入用液体の排出機構として外部ポンプを使用したが、マイクロ流体素子Ｄａ内に形成された内部ポンプを使用してもよい。この場合には予め流路４に導入用液体を充填する際に、少なくとも導入口７から内部ポンプまでの間に導入用液体を充填すればよい。その方法としては、前述の外部ポンプと同様にして、吐出口８から導入用液体を導入しても良いし、導入口７から導入用液体を導入しても良い。導入口７から導入する場合、液溜め槽９内に残留した導入用液体は、マイクロシリンジやマイクロピペッターで除去すればよい。
【００３７】
【実施例】
以下、本発明をより具体化した実施例１を用いて更に詳しく説明する。なお、以下の実施例１における「部」は「質量部」を表す。
また実施例の説明に先立って各部材の製作や試験に共通するエネルギー線照射装置と照射方法、エネルギー線硬化性組成物（ｉ）の調製方法、マイクロ流体デバイスＤａの製法、接続配管１１の製作手順について説明する。
［エネルギー線照射装置］
２００Ｗメタルハライドランプが組み込まれたウシオ電機株式会社製露光装置用光源ユニット「マルチライト２００型」を用い、３６５ｎｍにおける強度が５０ｍＷ／ｃｍ２の紫外線を窒素雰囲気下で照射した。
［製造例１］
〔エネルギー線硬化性組成物（ｉ）の調製〕
活性エネルギー線架橋重合性化合物として、大日本インキ化学工業株式会社製平均分子量約２０００の３官能ウレタンアクリレートオリゴマー「ユニディックＶ−４２６３」６０部、及び第一工業製薬株式会社製１，６−ヘキサンジオールジアクリレート「ニューフロンティアＨＤＤＡ」２０部、第一工業製薬株式会社製ノニルフェノキシポリエチレングリコール（ｎ＝１７）アクリレート「Ｎ−１７７Ｅ」（両親媒性の単量体）２０部、光重合開始剤としてチバガイギー社製１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン「イルガキュア１８４」５部、及び重合遅延剤として関東化学株式会社製２，４−ジフェニル−４−メチル−１−ペンテン０．１部を均一に混合して組成物（ｉ）を調製した。
【００３８】
〔マイクロ流体素子Ｄａの作製〕
基材１としてアクリル樹脂製の５ｃｍ×５ｃｍ×１ｍｍの板を用い、これに１２７μｍのバーコーターを用いて組成物（ｉ）を塗布し、紫外線を３秒間照射して、第一塗膜２を半硬化させた。
この半硬化の第一塗膜２に、１２７μｍのバーコーターを用いて組成物（ｉ）を塗布し、フォトマスクを使用して、図１に示された流路４となる部分以外に紫外線を３秒間照射して、照射部分の第二塗膜３を半硬化させた後、５０％エタノール水溶液にて第二塗膜３の未照射部の未硬化の組成物（ｉ）を洗浄除去し、流路４となる溝部が形成された部材Ｍを作製した。
一方、前記と同じアクリル樹脂製の５ｃｍ×５ｃｍ×１ｍｍの板６に１２７μｍのバーコーターを用いて組成物（ｉ）を塗布し、紫外線をフォトマスク無しで３秒間照射し、第三塗膜５を半硬化させ、部材Ｎとした。
次いで、部材Ｎの半硬化状態の第三塗膜５を部材Ｍの第二塗膜３と密着させて、紫外線を更に３０秒間照射し、部材Ｍの第二塗膜３に部材Ｎを接着して、溝部を密閉させて毛細管状の流路４とし、幅１５０μｍ、深さ１００μｍ、長さ１．５ｍ（流路断面積１５００μｍ２、流路の全容積２２．５ｍｍ３）の流路４を形成した。
【００３９】
〔導入口の形成〕
部材Ｎのうち、流路４の両端部に相当する位置に、３ｍｍのドリルにてそれぞれ孔を穿ち、流路４に導入口７と吐出口８を設けた。そして、この導入口７と吐出口８に内径２ｍｍ、外径３ｍｍ、高さ４ｍｍの軟質塩化ビニル製の円筒状フィッティングを嵌挿して接着し、液体を貯留する液溜め槽９と吐出側フィッティング１０を形成し、図１及び図２に示された形状のマイクロ流体素子［Ｄａ１］を得た。
この液溜め槽９と吐出側フィッティング１０の底にそれぞれ導入口７と吐出口８が開口している。そして液溜め槽９だけでなく、吐出側フィッティング１０の内側空間も円筒状の液溜めとして使用でき、例えば、流路４を送液した試料液体を溜めておくことができる。
〔接続配管の作製〕
内径２ｍｍ、外径３ｍｍの軟質塩化ビニルチューブの先端にテーパー状のホース口を取り付けて接続配管１１を作製した。
【００４０】
［実施例１］
〔反応溶液の調製〕
鋳型プラスミドＤＮＡ４．０ｍｍ３、宝酒造株式会社製ポリメラーゼ「TaKaRaEx Taq TM」２．０ｍｍ３、宝酒造株式会社製緩衝液「10X ExTaq TM Buffer」８．０ｍｍ３、宝酒造株式会社製基質「dNTP Mixture (2.5mM each)」６．４ｍｍ３、宝酒造株式会社製プライマー「Fluorescein-Labeled Primer M4 (1pmol/ｍｍ３)」２０ｍｍ３、宝酒造株式会社製プライマー「Fluorescein-Labeled Primer RV-M (1pmol/ｍｍ３)」２０ｍｍ３、及び滅菌蒸留水：１９．６ｍｍ３を混合して、ＰＣＲ用の反応溶液を調製した。
【００４１】
〔ＰＣＲ試験〕
製造例１で作製したマイクロ流体素子［Ｄａ１］を液溜め槽９と吐出側フィッティング１０を上にして、図１に示された第一の温調領域部α、第二の温調領域部β、第三の温調領域部γの底面に、それぞれ９５℃、７５℃、４５℃に温調した真鍮製の温調ステージ（図示せず）を密着させて載置した。そして、液溜め槽９と吐出側フィッティング１０の部分に、孔を開けた厚さ１ｍｍのアクリル樹脂板（図示せず）を、マイクロ流体素子［Ｄａ１］の上面に約１ｍｍの間隙をあけて載置した。
マイクロ流体素子［Ｄａ１］の吐出口８にマイクロシリンジポンプ（サイエンティフィック社製ＩＣ−３２１０Ｐ型）（図示せず）に接続された接続配管１１を嵌挿接続し、マイクロシリンジポンプを駆動して、導入用液体として宝酒造株式会社製緩衝液「10X ExTaq TM Buffer」８部及び滅菌蒸留水：２０部を混合した緩衝液を導入して、流路４に充填し、導入用液体の液面が導入口７に達したところでシリンジポンプを停止させた。
次いで、マイクロピペッターを用いて、マイクロ流体素子［Ｄａ１］の液溜め槽９の内部の底に、試料液体として上記で調製したＰＣＲ用の反応溶液１ｍｍ３（経路長６．７ｃｍの流路４に充填される量）の試料液体を注入した。
そして、シリンジポンプを吸引方向に駆動し、１ｍｍ３／分の一定速度で導入用液体を吐出口より排出したところ、排出された導入用液体と同一量の試料液体が一定速度で導入口７から流路４に導入され、更に流路４内を一定速度で送液され、前記の各温調領域部α、β、γを順次通過することによって温度履歴を受けた後、吐出口８から流出して、接続配管１１内に吸引された。そこでシリンジポンプを停止し、接続配管１１を外し、シリンジポンプを逆方向に駆動して接続配管１１内の試料液体を接続配管１１から吐出させて採取して、日立電子エンジニヤリング製電気泳動分析装置「ＳＶ１１００型」で分析したところ、ＤＮＡが増幅されていることが確認された。
【００４２】
【発明の効果】
上述のように本発明によるマイクロ流体素子への試料導入方法は、流路に導入する容量の試料液体を導入口にて導入用液体と接触させ、この試料液体を全て流路に導入させることによって、所定量の試料液体を流路に導入できる。
また、導入口にて導入用液体と接触させる試料液体の定量を洗浄不要のマイクロピペッターなどで行うことによって、操作が簡略化されて作業効率が向上し、更に試料の汚染の恐れもない。
更に、試料液体と導入用液体とが互いに接触し混合する容積は、流路に導入される試料液体の容積に比べて微小であるため、試料液体と導入用液体とは実質的に混和することがない。
また流路内に導入用液体を充填し、この導入用液体を吐出口より排出して試料液体を導入するため、従来の気体の圧力差で試料液体を押圧、または吸引して送液する方法とは異なり、温度変化によって生じる気体と液体との熱膨張差や熱収縮差による影響がほとんど無く、所望の送液速度で精度良く試料液体を送液できる。
特に、流路が温度の異なる複数の領域を通るようになっている場合や、流路の温度を経時的に変化させる場合、また、流路の途中や吐出口に、圧力を印加することで開閉を行うチェックバルブや濾過膜などが設けられた場合のように、大きな圧力損失を生じる機構が流路に設けられている場合であっても、所定の送液速度で試料液体を流路内に送液でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応等の反応や処理を行うことができる。
更に試料液体が極少量であっても、同様に、所定量の試料液体を流路に導入でき、また、所望の送液速度で精度良く試料液体を送液できる。
マイクロ流体素子の流路の導入口から吐出口までの間に加えて、外部ポンプとの接続配管内にも、気体を混入させずに導入溶液体を充填することによって、気温変動などの影響を受けにくくなり、流量を変化させる場合にも、所望の送液速度で高精度に送液できる。
また、試料液体を流路内に導入した後、導入口において封止液体を試料液体に接触させて、この封止液体を流路内に導入することによって、試料液体と大気との接触を遮断し、試料液体の蒸発を防いだり、流路内壁に付着した試料液体などを溶解し流路を洗浄することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例によるマイクロ流体素子の平面図である。
【図２】図１に示すマイクロ流体素子のＡ−Ａ線縦断面図である。
【符号の説明】
Ｄａ  マイクロ流体素子
４  流路
７  導入口
８  吐出口
９  液溜め槽
α  第一の温調領域部
β  第二の温調領域部
γ  第三の温調領域部
【図１】
2004191256.tif 000003
【図２】
2004191256.tif 000004