(57)【要約】      （修正有）【課題】カルシウムチャネルタンパク質をコードする遺伝子のコーディング領域の完全ヌクレオチド配列の決定。【解決手段】一次転写物のスプライス変異体として生じるサブユニットを含むヒトカルシウムチャンネルα１−、α２−、β−及びγ−サブユニットの各々をコードする単離ＤＮＡが提供される。特に、ヒトカルシウムチャンネルのα１Ａ−１、α１Ａ−２、α１Ｅ−１、α１Ｃ−２、α１Ｅ−３、β３−１、β２Ｃ、β２Ｄ、β２Ｅ及びβ４サブユニットの各々をコードするＤＮＡクローンが提供される。ＤＮＡを含む細胞及びベクター、サブユニット特異的抗体及び核酸プローブ並びにヒトカルシウムチャンネルの活性を変調する化合物の同定方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトカルシウムチャネルのβ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子であって、該サブユニットが配列番号26、配列番号３７または配列番号３８のいずれかに示すアミノ酸配列を含む前記DNA。
【請求項２】
前記サブユニットが配列番号３７に示すアミノ酸配列を含むβ２Cサブユニットである請求項１に記載のDNA分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３７に示すアミノ段配列をコードする配列番号３７に示すヌクレオチド配列を含む請求項１に記載のDNA分子。
【請求項４】
βサブユニットが配列番号２６に示すアミノ酸配列を含むβ２Dサブユニットである請求項１に記載のDNA分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２６に示すアミノ酸配列をコードする配列番号２６に示すヌクレオチド配列を含む請求項４に記載のDNA分子。
【請求項６】
βサブユニットが配列番号３８に示すアミノ酸配列を含むβ２Eサブユニットである請求項１に記載のDNA分子。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３８に示すアミノ酸配列をコードする配列番号３８に示すヌクレオチド配列を含む請求項６に記載のDNA分子。
【請求項８】
配列番号２６、配列番号３７または配列番号３８のいずれかに示すヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と、全配列にわたって少なくとも４０％の相同性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載のDNA分子によってコードされる実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２６、配列番号３７または配列番号３８のいずれかに示すアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号２７に示すアミノ酸配列を含むヒトカルシウムチャネルのβ４サブユニットをコードする単離されたDNA分子。
【請求項１２】
配列番号２７に示すアミノ酸配列をコードする配列番号２７に示すヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載のDNA分子。
【請求項１３】
配列番号２７に示すヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と、全配列にわたって少なくとも４０％の相同性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたDNA分子。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれかに記載のDNA分子によってコードされる実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項１６】
機能的な組換えカルシウムチャネルの発現に適した条件下で請求項１から８または１１から１３のいずれかに記載の単離されたDNA分子によってトランスフェクトまたは形質転換された真核細胞。
【請求項１７】
ヒトカルシウムチャネルのα１サブユニットをコードする異種DNAとヒトカルシウムチャネルのβサブユニットをコードする異種DNAを含む機能的な異種カルシウムチャネルを発現する真核細胞であって、該βサブユニットが配列番号２６、配列番号２７、配列番号３７または配列番号３８のいずれかに示すアミノ酸配列を含むβサブユニットから成る群より選択されることを特徴とする前記真核細胞。
【請求項１８】
前記異種核酸が、配列番号２６、配列番号３７または配列番号３８のいずれかに示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むDNA分子によってコードされるRNAである請求項１６または１７に記載の真核細胞。
【請求項１９】
ヒトカルシウムチャネルのα２サブユニットをコードする異種核酸を更に含む請求項１６乃至１８のいずれかに記載の真核細胞。
【請求項２０】
カルシウムチャネルの活性を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）機能的な異種カルシウムチャネルを有する真核細胞を、化合物およびカルシウムチャネル選択的イオンを含む溶液中に浮遊させる工程、
（ｂ）上記細胞の細胞膜を脱分極させる工程、および
（ｃ）細胞内に流入する電流を検出する工程から成り、
（ｉ）上記異種カルシウムチャネルは、該細胞に対して異種起源であるDNAまたはRNAにコードされるヒトカルシウムチャネルサブユニットを少なくとも１つ含み、
（ｉｉ）少なくとも１つのサブユニットは、β２およびβ４サブユニットから成る群より選択され、配列番号２６、２７、３７または３８に示すアミノ酸配列を含み、
（ｉｉｉ）検出される電流が、同一のカルシウムチャネル選択的イオンの存在下であるが該化合物の非存在下で同一または同様の細胞を脱分極させることによって発生する電流とは相違することを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
配列番号２６、２７、３７または３８のいずれかに示すヌクレオチド配列由来の少なくとも３０塩基から成る配列を含む少なくとも３０塩基の長さを有するRNAまたは一本鎖DNAプローブ。
【請求項２２】
配列番号２６、２７、３７または３８のいずれかに示すヌクレオチド配列由来の少なくとも１６塩基から成る配列を含む少なくとも１６塩基の長さを有するRNAまたは一本鎖DNAプローブ。
【請求項２３】
ヒトカルシウムチャネルサブユニットをコードする核酸を同定する方法であって、最も穏やかなストリンジェンシー条件下で請求項２１または請求項２２に記載のプローブを核酸分子のライブラリーとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした分子を選択することを含む方法。
【請求項２４】
β２およびβ４から成る群より選択されるヒトカルシウムチャネルサブユニットであって、配列番号２６、２７、３７または３８のいずれかに示すアミノ酸配列を含むサブユニット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子生物学及び薬理学に関する。特に、本発明は、カルシウムチャンネル組成物並びにその製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウムチャンネルは、Ｃａ２＋イオンを細胞外の流体から細胞内へ調節的に流入させ得る膜貫通型タンパク質であり、多数のサブユニットを有している。動物界のあらゆる細胞及び少なくともある種の細菌、菌類及び植物の細胞は１タイプ以上のカルシウムチャンネルを有している。
【０００３】
最も普遍的なタイプのカルシウムチャンネルは電圧依存性である。細胞内へＣａ２＋イオンを流入させるように電圧依存性チャンネルが「開く」ためには、チャンネル保有細胞の内部と細胞を浸漬させている細胞外媒体との間の電位差があるレベルになるまで脱分極する必要がある。細胞内へのＣａ２＋イオンの流入量はこの電位差に依存する。中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン、末梢神経細胞、並びに、骨格筋、心筋、静脈及び動脈の平滑筋などの筋細胞のような動物体内のすべての「興奮性」細胞は、電圧依存性カルシウムチャンネルを有している。
【０００４】
骨格筋、心筋、肺、平滑筋及び脳などの種々の組織に由来の哺乳類細胞中で多くのタイプのカルシウムチャンネルが同定されている［例えば、Ｂｅａｎ，Ｂ．Ｐ．（１９８９）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１：３６７−３８４及びＨｅｓｓ，Ｐ．（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５６：３３７参照］。種々のタイプのカルシウムチャンネルは、電流カイネティクス（kinetics）、静止電位（holding potential）感受性及びカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストに対する感受性に基づいて識別可能なＬ−、Ｔ−、Ｎ−及びＰ−型の４種類に大別される。
【０００５】
カルシウムチャンネルは、約１３０〜約２００キロダルトン（ｋＤ）の分子量をもちα１及びα２と呼ばれる２つの大サブユニットと、約６０ｋＤ未満の分子量をもつ１〜３個の異なる小サブユニットとから成るマルチサブユニットタンパク質である。大サブユニットの少なくとも１つ及び任意に小サブユニットのいくつかがグリコシル化されている。いくつかのサブユニットはリン酸化されることも可能である。α１サブユニットは、哺乳類筋組織から単離後にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分析すると分子量約１５０〜約１７０ｋＤを有し、種々の１，４−ジヒドロピリジン（ＤＨＰ）及びフェニルアルキルアミンに特異的に結合する部位を有している。α２サブユニットは、非還元性条件下（Ｎ−エチルマレイミドの存在下）のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分子量約１６０〜１９０ｋＤに対応するバンドとして泳動する。還元によって、大断片とより小さい断片とが遊離する。ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルのβサブユニットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による測定分子量５２〜６５ｋＤのリン酸化タンパク質である。このサブユニットは還元性条件に感受性でない。カルシウムチャンネルのγサブユニットは、精製されたすべての調製物中で観察されるとは限らないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による測定見掛け分子量３０〜３３ｋＤの糖タンパク質であると考えられる。
【０００６】
カルシウムチャンネルの構造及び機能を研究するためには、大量の純粋なチャンネルタンパク質が必要である。これらのマルチサブユニットタンパク質が複合体の性質を有すること、タンパク質が由来した組織中のカルシウムチャンネルの濃度が多様であること、組織中にカルシウムチャンネルの混合集団が存在すること、目的の組織を得ることが難しく、また単離手順中に天然型タンパク質の修飾が生じることから、高度に精製された完全にインタクトなカルシウムチャンネルタンパク質を大量に得ることは極めて難しい。
【０００７】
大多数の細胞中に種々のタイプのカルシウムチャンネルの混合集団が存在することが、全細胞の分析による特定タイプのカルシウムチャンネルのキャラクタリゼーションを極めて難しいものにしている。個々のカルシウムチャンネルを試験するために使用される単一チャンネル記録方法は、チャンネルの分子構造または生化学組成に関する情報を全く与えない。更に、この種の分析を行う場合には、天然機能及び薬理学的相互作用に重要であると考えられる他の細胞構成成分からチャンネルが単離される。
【０００８】
種々のタイプのカルシウムチャンネルの別のキャラクタリゼーション手段として、カルシウムチャンネルをコードする１つまたは複数の遺伝子のキャラクタリゼーションがある。カルシウムチャンネルタンパク質をコードする遺伝子のコーディング領域の完全ヌクレオチド配列から決定されたアミノ酸配列は、タンパク質の一次構造を示す。更に、一次構造の分析に基づいて、カルシウムチャンネルタンパク質の二次構造及び膜に対するタンパク質の関係を予測し得る。例えば、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルのα１サブユニットタンパク質のハイドロパシープロットは、α１サブユニットが、６個の推定トランスメンブラン領域を各々が含む４個の内部リピートを含むことを示す［Ｔａｎａｂｅ，Ｔ．ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２８：３１３］。
【０００９】
カルシウムチャンネルは種々の組織に存在し細胞内カルシウムイオン濃度の調節に中心的役割を果たすので、神経伝達物質放出、筋収縮、ペースメーカー活性、ホルモン及び他の物質の分泌などの動物体内の多数の生命プロセスに関与する。これらのプロセスは、ＣＮＳ及び心血管疾患のような多数のヒト疾患に関与すると考えられる。従ってカルシウムチャンネルもまた多数の疾患に関与する。ヒトを含めた動物の種々の心血管疾患の治療に有用な多数の化合物は、心臓及び／または血管の平滑筋に存在する電圧依存性カルシウムチャンネルの機能を変調することによってその有益な効果を作用させると考えられている。これらの化合物の多くはカルシウムチャンネルに結合し、細胞膜の脱分極に反応して細胞内へのＣａ２＋の流入を阻害したりまたは流入速度を減少させたりする。
【００１０】
ウサギのカルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするｃＤＮＡクローン及びｃＤＮＡクローンの転写物の組換え発現の研究結果は、α１サブユニットがカルシウムを細胞に流入させるポアを形成することを示す。これらの組換え細胞中で発生したバリウム電流と、夫々のα１サブユニットを１成分として含有するカルシウムチャンネルによってｉｎ ｖｉｖｏに発生した実効電流との関連は不明である。種々のカルシウムチャンネルのタイプを完全且つ正確に特性決定及び評価するためには、ｉｎ ｖｉｖｏに見出されるサブユニットを全て含有する組換えチャンネルの機能特性試験が必須である。
【００１１】
この試験を実施しカルシウムチャンネルの構造及び機能を完全に理解するために、できるだけ多数のカルシウムチャンネルサブユニットを同定し特性決定することが極めて重要である。また、カルシウムチャンネルと相互作用する化合物の同定に使用される組換え細胞を調製するために、所定のサブユニットを含有するカルシウムチャンネルの均一な集団を発現する細胞を産生することが必要である。
【００１２】
ＣＮＳのような他の器官系においてカルシウムチャンネルと相互作用する化合物の薬理学を理解することができれば、例えば神経変性疾患及び心血管疾患の治療において所望の治療効果を与えるようにヒトカルシウムチャンネルのサブタイプと特異的に相互作用する化合物の合理的な設計が促進されるであろう。しかしながら、特にＣＮＳ中ではヒトカルシウムチャンネルのタイプ及び個々のサブタイプの分子的性質を独立に決定できないこと、また、カルシウムチャンネル作動化合物（calcium channel−effecting compounds）の特異性を評価するために必要な特定チャンネルサブタイプの純粋な調製物を入手できないことが、このような理解及び治療有効化合物の合理的設計の妨げとなっていた。従って、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを同定し、カルシウムチャンネルサブユニット及び機能性カルシウムチャンネルを発現するためにこのようなＤＮＡを使用できれば、治療有効化合物のスクリーニング及び設計が促進されるであろう。
【００１３】
従って、本発明の１つの目的は、特定カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを提供し、組換え組織特異的または組換えサブタイプ特異的カルシウムチャンネルを保有する真核細胞を提供することである。本発明の目的は更に、カルシウムチャンネルのアンタゴニスト及びアゴニストとして作用する有望な治療用化合物の同定アッセイを提供することである。
【００１４】
発明の概要
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする単離及び精製された核酸フラグメントが提供される。ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードするＤＮＡ、及び、かかるＤＮＡの転写によって作製された上記サブユニットをコードするＲＮＡが提供される。特に、電圧依存性ヒトカルシウムチャンネル（ＶＤＣＣ）のα１サブユニットのタイプＡ、タイプＢ（ＶＤＣＣIVとも呼ぶ）、タイプＣ（ＶＤＣＣIIとも呼ぶ）、タイプＤ（ＶＤＣＣIIIとも呼ぶ）及びタイプＥをコードするＤＮＡフラグメントが提供される。
【００１５】
α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｃ、α１Ｄ及びα１ＥサブユニットをコードするＤＮＡが提供される。配列番号１の残基１０−２１６１として示すアミノ酸を実質的に含むα１ＤサブユニットをコードするＤＮＡが提供される。配列番号１のアミノ酸３７３−４０６に置換して配列番号２のアミノ酸１−３４として示すアミノ酸を実質的に含むα１ＤサブユニットをコードするＤＮＡが提供される。また、配列番号３または配列番号６として示すアミノ酸を実質的に含むα１ＣサブユニットをコードするＤＮＡ及び配列番号７または配列番号８として示すアミノ酸配列を実質的に含むα１ＢサブユニットをコードするＤＮＡも提供される。
【００１６】
α１ＡサブユニットをコードするＤＮＡも提供される。このようなＤＮＡは、配列番号２２もしくは２３で示すＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有しているα１ＡサブユニットをコードするＤＮＡ、または、配列番号２２もしくは２３で示す配列の全部もしくは一部を含むα１Ａの他のスプライス変異体をコードするＤＮＡを含む。配列番号２２で示す配列はα１Ａ−１と呼ばれるスプライス変異体であり、配列番号２３で示す配列はα１Ａ−２と呼ばれるスプライス変異体である。α１ＡサブユニットをコードするＤＮＡはまた、配列番号２１、２２もしくは２３を有するＤＮＡまたはブダペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ．に受託番号７５２９３で寄託されたα１ＡサブユニットをコードするＤＮＡを含む大腸菌宿主のファージ溶菌液から得られたＤＮＡの全部または一部を用いて単離され得るサブユニットをコードするＤＮＡを含む。このようなファージ中のＤＮＡは配列番号２１で示す配列を有するＤＮＡフラグメントを含む。このフラグメントは、高緊縮性条件下でα１ＡをコードするＤＮＡに選択的にハイブリダイズするが、α１ＢをコードするＤＮＡにハイブリダイズしないので、α１ＡサブユニットをコードするＤＮＡを単離するために使用され得る。
【００１７】
ヒトカルシウムチャンネルのα１ＥサブユニットをコードするＤＮＡも提供される。このＤＮＡは、配列番号２４で示すＤＮＡによってコードされたα１Ｅ−１と呼ばれるα１Ｅスプライス変異体をコードするＤＮＡ、及び、配列番号２５で示すＤＮＡによってコードされたα１Ｅ−３と呼ばれる変異体をコードするＤＮＡを含む。このＤＮＡはまた、配列番号２４及び２５に示すヌクレオチドの配列の全部または一部によってコードされたアミノ酸の配列をコードする他のスプライス変異体を含み、また、高緊縮性条件下で配列番号２４または２５のＤＮＡにハイブリダイズしα１Ｅスプライス変異体をコードするＤＮＡを含む。
【００１８】
ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするＤＮＡ及び該サブユニットをコードするＲＮＡも提供される。該ＲＮＡは該ＤＮＡの転写によって作製されたものである。組織特異的スプライス変異体のようなα２サブユニットのスプライス変異体をコードするＤＮＡも提供される。特に、サブユニットのα２ａ−α２ｅサブタイプをコードするＤＮＡが提供される。特に好ましい実施態様では、配列番号１１に示すアミノ酸をコードするＤＮＡと、配列番号１１のヌクレオチド１６２４と１６２５との間に挿入された配列番号１３のＤＮＡとを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるα２サブユニットをコードするＤＮＡが提供される。α２ａ−α２ｅのＤＮＡ及びアミノ酸を夫々配列番号１１及び２９〜３２に示す。
【００１９】
β１、β２、β３及びβ４サブユニット並びにβサブユニットのスプライス変異体をコードするＤＮＡのような、ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードする単離及び精製ＤＮＡフラグメントが提供される。ＤＮＡの転写によって作製されたβサブユニットをコードするＲＮＡも提供される。
【００２０】
また、配列番号９に示すアミノ酸をコードしているが配列番号９のヌクレオチド６１５−７８１に置換して配列番号１２の挿入ＤＮＡを含んでいるＤＮＡを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるβ１サブユニットをコードするＤＮＡも提供される。配列番号９に示す配列を有しており、配列番号９のヌクレオチド６１５−７８１に置換して配列番号１２の挿入ＤＮＡを含み、以下のヌクレオチド配列：配列番号１２のヌクレオチド１４−３４、配列番号１２のヌクレオチド１３−３４、配列番号１２のヌクレオチド３５−５５、配列番号１２のヌクレオチド５６−１９０、配列番号１２のヌクレオチド１９１−２７１、の１つ以上が欠失している転写物によってコードされるβ１サブユニットをコードするＤＮＡも提供される。特に、後述するようなβ１サブユニットスプライス変異体β１−１−β１−５（配列番号９、１０及び３３−３５参照）が提供される。
【００２１】
配列番号２６、２９及び３０の全部または一部分を含むβ２サブユニットスプライス変異体β２ｃ−β２ｅが提供される。配列番号１９及び２０に示す配列を有するβ３サブユニットスプライス変異体のようなβ３サブユニットスプライス変異体、配列番号２７に示す配列を有するＤＮＡを含むβ４サブユニットをコードするＤＮＡ、配列番号２８に示すアミノ酸配列が提供される。
【００２２】
また、β３をコードするＤＮＡを保有するプラスミドを内包する大腸菌（E．coli）宿主細胞は、ブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号６９０４８で寄託された。寄託されたクローンは、配列番号１９のヌクレオチド１２２−４５７及び配列番号２０の１０７−４４３を包含する。
【００２３】
配列番号９に示すアミノ酸をコードするＤＮＡを含む転写物またはＡＴＣＣ受託番号６９０４８で寄託されたβ３をコードする一次転写物のような、βサブユニットをコードし且つ任意に選択的エキソンを含む一次転写物の選択的プロセシングによって産生されるβサブユニットをコードするＤＮＡは、本発明で提供されるかまたは本発明で提供されるＤＮＡから構築され得る。
【００２４】
ヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードするＤＮＡも提供される。ＤＮＡの転写によって作製されたγサブユニットをコードするＲＮＡも提供される。特に、配列番号１４で示すヌクレオチドの配列を含むＤＮＡが提供される。
【００２５】
ヒトカルシウムチャンネルのα１Ａ、α１Ｄ、α１Ｂ、α１Ｃ及びα１Ｅなどのスプライス変異体を含むα１サブユニット、α２サブユニット並びにβ１−１−β１−５、β２Ｃ、β２Ｄ、β２Ｅ、β３−１及びβ４などのβサブユニットをコードする全長ＤＮＡクローン及び対応するＲＮＡ転写物が提供される。また、対応する全長サブユニットをコードする全長ＤＮＡクローンを調製するための、電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルのいくつかのα１Ｃサブタイプのサブユニット及びγサブユニットの実質的部分をコードするＤＮＡクローンも提供される。本文中に記載のように、開示されたＤＮＡをプローブとして用いると全長クローンが容易に得られる。
【００２６】
本発明では、α１Ａサブユニット、α１Ｃサブユニット、α１Ｅサブユニット及びそのスプライス変異体、β２Ｄ、β２Ｃ及びβ２Ｅサブユニット並びにβ４サブユニット、これらのサブユニットをコードする核酸が特に重要である。
【００２７】
１つ以上のカルシウムチャンネルサブユニット、特にヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする異種ＤＮＡを含むか、または、１つ以上のサブユニットをコードするＤＮＡクローンのＲＮＡ転写物を含む真核細胞が提供される。単一のα１サブユニットは１つのチャンネルを形成し得る。しかしながら、選択された細胞中で活性の有るチャンネルを形成するために必要なサブユニットの組み合わせは、本文中に記載の方法を用いて実験的に決定され得る。例えば、選択されたα１サブタイプまたは変異体が選択された細胞系中で活性の有るチャンネルを形成しないならば、活性の有るチャンネルが形成されるまで、１つまたは複数の追加のサブユニットを付加し得る。
【００２８】
好適実施態様において、細胞は、ヒトα１サブユニット、好ましくは少なくとも１つのα１Ｄ、α１Ｂ、α１Ａまたはα１ＥサブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む。より好ましい実施態様では、細胞が、少なくとも１つのβ、α２またはγサブユニットのような追加の異種サブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含む。このような実施態様においては、α１、α１＋β、α１＋β＋α２のいずれかをコードするＤＮＡのような１、２、３または４つのサブユニットをコードするＤＮＡクローンのいずれかの組み合わせによって安定にまたは一過的にトランスフェクトされた真核細胞が提供される。
【００２９】
本発明で提供される真核細胞は、α１サブユニットをコードする異種ＤＮＡを含むかまたはα１サブユニットをコードする異種ＤＮＡとβサブユニットをコードする異種ＤＮＡとを含む。少なくとも１つのサブユニットは、α１Ａ−１、α１Ａ−２、α１Ｃ−２、α１Ｅ−１、α１Ｅ−３、β２Ｃ、β２Ｄ、β２Ｆ、β３−１、β３−２サブユニットまたはβ４サブユニットから選択される。好適実施態様では、細胞がこのような異種カルシウムチャンネルサブユニットを発現し、膜貫通型異種カルシウムチャンネル中に１つまたはそれ以上のサブユニットを含む。より好ましい実施態様では、真核細胞が、生理的濃度で異種カルシウムチャンネルの活性を変調するカルシウムチャンネル選択イオン及び／または結合化合物の通過を制御する機能性異種カルシウムチャンネルを発現させる。いくつかの実施態様では、異種カルシウムチャンネルが少なくとも１つの異種カルシウムチャンネルサブユニットを含む。極めて好ましい実施態様では、真核細胞の表面で発現されるカルシウムチャンネルが実質的にまたは完全に、異種ＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされたサブユニットから構成される。好ましい実施態様において、このような細胞の異種カルシウムチャンネルは宿主細胞のいかなる内因性カルシウムチャンネルからも識別される。このような細胞は、カルシウムチャンネルの均質集団を得るための手段を提供する。典型的には、細胞は、選択されたカルシウムチャンネルを、細胞によって発現される唯一の異種イオンチャンネルとして含む。
【００３０】
いくつかの実施態様において、カルシウムチャンネルサブユニットをコードする異種ＤＮＡを含む組換え真核細胞は、１つ以上のサブユニットをコードするＤＮＡのトランスフェクションによって産生されるか、または１つ以上のカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡのＲＮＡ転写物の注入によって産生される。ＤＮＡは直鎖状ＤＮＡフラグメントとして導入されてもよく、または、サブユニットをコードするＤＮＡを安定にまたは一過的に発現させるための発現ベクター中に含まれてもよい。また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを保有するベクターも提供される。
【００３１】
異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞はカルシウムチャンネル機能アッセイで使用され得る。または、細胞が、機能性組換えヒトカルシウムチャンネルを構成するために必要な数よりも少数のサブユニットをコードする核酸で形質転換された場合には、このような細胞は、カルシウムチャンネル活性に対する追加サブユニットの効果を評価するために使用され得る。引き続いてこのような細胞をヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする１つ以上のＤＮＡクローンまたはＲＮＡ転写物でトランスフェクトすることによって追加サブユニットを提供し得る。
【００３２】
膜貫通型異種カルシウムチャンネルを発現する組換え真核細胞は、カルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定する方法に使用され得る。特に、細胞は、ヒトのカルシウムチャンネル活性のアゴニスト及びアンタゴニストを同定するアッセイ及び／またはカルシウムイオンの輸送及び輸送の調節に対する種々のカルシウムチャンネルサブユニットの寄与を評価するアッセイに使用される。細胞は、カルシウムチャンネルの均質集団を構成するので、このような集団の各々に特異的なカルシウムチャンネル活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する手段が提供される。
【００３３】
また、真核細胞を使用してカルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定するアッセイが提供される。これらのアッセイを実施するときには、本発明で提供されるＤＮＡによってコードされるサブユニットを少なくとも１つ含む異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞を、被検化合物とカルシウムチャンネル選択イオンとを含有する溶液中に導入し、細胞膜を脱分極させ、細胞に流入する電流を検出する。被検化合物がカルシウムチャンネル活性を変調する化合物である場合、検出される電流は、同じカルシウムチャンネル選択イオンが存在するが化合物の非存在下で同じまたは実質的に同じ細胞の脱分極によって生じる電流とは違っている。好適な実施態様においては、脱分極ステップ前の細胞を、細胞に内在するカルシウムチャンネルを実質的に不活化する静止電位に維持する。好適な実施態様においてはまた、細胞は哺乳類細胞、極めて好ましくはＨＥＫ細胞または両生類卵母細胞である。
【００３４】
α１Ｄ、α１Ｃ、α１Ｂ、α１Ａ及びα１Ｅ、α２、β１、β２、β３及びβ４などのβスプライス変異体並びにγサブユニットをコードするＤＮＡの連続ヌクレオチドを、少なくとも約１４、好ましくは１６、または所望の場合には２０もしくは３０以上含み、検出のために典型的に標識された核酸プローブが提供される。これらのプローブを使用したカルシウムチャンネルサブユニットコーディングＤＮＡの単離及びクローニング方法も提供される。これらのＤＮＡは組織内部のスプライス変異体及び組織間の変異体を包含する。
【００３５】
精製されたヒトカルシウムチャンネルサブユニット及び精製されたヒトカルシウムチャンネルが提供される。サブユニット及びチャンネルは、サブユニットをコードするＤＮＡをトランスフェクトした真核細胞から単離され得る。
【００３６】
別の実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネル、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットまたはヒトカルシウムサブユニットのエピトープ含有フラグメントの実質的に純粋な調製物で免疫した動物の血清から得られる免疫グロブリンまたは抗体が提供される。ヒトカルシウムチャンネル、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットまたはそのエピトープ含有フラグメントを免疫原として用いて産生されたモノクローナル抗体も提供される。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのフラグメントを含む大腸菌融合タンパク質も免疫原として使用され得る。このような融合タンパク質は、カルシウムチャンネルサブユニットペプチドに融合した大腸菌ＴｒｐＥタンパク質のような細菌性タンパク質またはその一部分を含み得る。カルシウムチャンネルサブユニットまたは精製カルシウムチャンネルを免疫原として用いて産生された免疫グロブリンは、他の特性のうちでも特に、生物サンプル中またはかかる生物サンプルに由来の溶液中に存在し得るヒトカルシウムチャンネルまたはそのサブユニットに特異的及び優先的に結合するか及び／またはその免疫沈降を惹起する能力を有している。このような抗体はまた、抗体の特異性の対象であるサブユニットを含有するカルシウムチャンネルを発現する細胞を選択的に単離するために使用され得る。
【００３７】
また、カルシウムチャンネルを有効量の上記抗体と接触させることによってイオンチャンネルの活性を変調させる方法が提供される。
【００３８】
また、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットに対するまたは組換えヒトカルシウムチャンネルもしくはそのサブユニットを発現する真核細胞に対するＬＥＳ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の免疫反応性に基づいてヒトのランベール・イートン症候群（Lambert Eaton Syndrome，ＬＥＳ）の存在を判定する診断方法が提供される。特に、個人の血清またはそのＩｇＧ画分（被検血清）とα及びβサブユニットのようなカルシウムチャンネルタンパク質とを結合させ、被検血清中の抗体が、罹患していないことが既知の個人または個人群から得られた対照血清中の抗体に比べて、１種以上のサブユニットまたは１種以上のサブユニットを発現する組換え細胞とより高度に反応することを確認することによって個人のランベール・イートン症候群を診断するイムノアッセイ方法が提供される。この方法には、血清中の所与の抗原に対する抗体を検出するために当業界で公知の任意のイムノアッセイ手順を使用し得る。
【００３９】
発明の詳細な説明
定義：
他に定義されない限り、本文中で使用したすべての技術用語及び科学用語は、本発明が所属する分野の当業者によって理解される慣用の意味と同義である。本文中で引用したすべての特許及び刊行物は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００４０】
言及されたカルシウムチャンネルサブユニットの各々は、本文中で詳細に開示されるサブユニット、及び、開示されたＤＮＡをプローブとして用い少なくとも低緊縮性下に適当なヒトｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得るＤＮＡによってコードされたヒトカルシウムチャンネルサブユニットを包含する。かかるＤＮＡはまた、本文中に記載されたサブユニットタンパク質のいずれかに約４０％の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、少なくとも低緊縮性条件下に本発明で提供されるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを包含し、かかるＤＮＡによってコードされているタンパク質は機能または分子量のような追加の識別特性値を示す。
【００４１】
開示されたサブユニットまたは他のこのようなサブユニットのスプライス変異体を示す転写物によってコードされるサブユニットは、任意の１つのサブユニットに対しては合計４０％未満の相同性を示すであろうが、１つ以上のサブユニットとの間でこのような相同領域を含むであろうことは理解されよう。また、４０％の相同性とは、約４０％またはそれよりもやや少ない程度のアミノ酸を共有し且つ保存的なアミノ酸置換を含み、タンパク質の活性が実質的に変化していないタンパク質を意味する。
【００４２】
本文中では、種々の遺伝子によってコードされるα１サブユニットのタイプは、タイプα１Ａ、α１Ｂ、α１Ｃ、α１Ｄ及びα１Ｅとして示されている。これらのタイプについて、α１ＢはＶＤＣＣIV、α１ＣはＶＤＣＣII、α１ＤはＶＤＣＣIIIとも呼ばれている。スプライス変異体であるサブユニットのサプタイプは例えば、α１Ｂ−１、α１Ｂ−２、α１Ｃ−１などと呼ばれる。
【００４３】
従って、本文中で使用された「α１サブユニットをコードするＤＮＡ」とは、少なくとも低緊縮性の条件下で本発明によって提供されるＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを意味するか、または、ヒトカルシウムのα１サブユニットをコードする本文中に開示されたＤＮＡによってコードされるタンパク質に少なくとも約４０％の相同性を有するサブユニットをコードするＤＮＡを意味する。α１サブユニットはカルシウムチャンネルを形成する能力によって同定され得る。典型的には、α１サブユニットは、少なくとも約１２０ｋＤよりも大きい分子量を有している。また、推定されたα１サブユニットアミノ酸配列のハイドロパシープロットは、α１サブユニットが、６個の推定されたトランスメンブランドメインを各々が含む４個の内部リピートを含むことを示す。
【００４４】
カルシウムチャンネルの活性は、電気生理学的方法及び本文中に記載の他の方法のような当業者に公知の方法によってｉｎ ｖｉｔｒｏで評価され得る。典型的には、α１サブユニットは、１，４−ＤＨＰまたはω−ＣｇＴｘのような１つ以上のカルシウムチャンネル活性モジュレーターと直接または間接に相互作用する領域を含む。α１サブユニットの種々のタイプは、結合特異性に基づく方法のような当業者に公知の任意の方法によって識別され得る。例えば、本文中では、α１Ｂサブユニットは従来Ｎ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの形成に関与し、α１Ｄサブユニットは従来Ｌ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの形成に関与することが知見され、α１Ａサブユニットは従来Ｐ−型チャンネルと呼ばれていたチャンネルの典型的な特徴を示すチャンネルの形成に関与すると考えられる。従って例えば、α１Ｂサブユニットを含むチャンネルの活性は１，４−ＤＨＰに感受性でないが、α１Ｄサブユニットを含むチャンネルの活性は１，４−ＤＨＰによって変調されるかまたは変化する。現在では、薬理学的特徴及び電流カイネティクスに基づいてカルシウムチャンネルを命名し、過去の呼称を避けるのが好ましい。α１サブユニットのタイプ及びサブタイプは、サブユニットまたはサブユニットを含むチャンネルに対するこのようなモジュレーターの効果並びにサブユニットを含むカルシウムチャンネルによって生じる電流及び電流カイネティクスの差異に基づいて特性決定し得る。
【００４５】
本文中で使用された「α２サブユニット」は、低緊縮性条件下で本発明で提供されるＤＮＡにハイブリダイズするかまたは本発明で開示されたタンパク質に少なくとも約４０％の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡによってコードされている。このようなＤＮＡは、典型的には約１２０ｋＤよりも大きい分子量を有するがα１サブユニットの非存在下にカルシウムチャンネルを形成しないタンパク質をコードしており、α１サブユニットを含むカルシウムチャンネルの活性を変化させ得る。スプライス変異体として生じるα２サブユニットのサブタイプは、α２ａ、．．．α２ｅのような下付き文字で示される。更に、α２サブユニット及びタンパク質を還元条件下で処理したときに産生される大フラグメントは、少なくともＮ−結合した糖によってグリコシル化されると考えられ、α１サブユニットに特異的に結合する１，４−ＤＨＰ及びフェニルアルキルアミンに特異的に結合しない。より小さいフラグメント、Ｃ−末端フラグメントは、δサブユニットと呼ばれており、約９４６（配列番号１１）からほぼＣ−末端までのアミノ酸を含む。このフラグメントは、α２サブユニットを還元性条件に暴露したときにα２の残りの部分から解離し得る。
【００４６】
本文中で使用された「βサブユニット」は、低緊縮性条件下で本発明で提供されるＤＮＡにハイブリダイズするかまたは本発明で開示されたタンパク質に少なくとも約４０％の相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡによってコードされており、これは、典型的にはαサブユニットよりも小さい約５０〜８０ｋＤのオーダーの分子量を有しており、α１サブユニットの非存在下に検出可能なカルシウムチャンネルを形成しないが、α１サブユニットまたはα１及びα２サブユニットを含むカルシウムチャンネルの活性を変化させ得るタンパク質である。
【００４７】
種々の遺伝子によってコードされているβサブユニットの種々のタイプはβ１、β２、β３及びβ４のような下付き文字で示される。特定タイプのスプライス変異体として生じるβサブユニットのサブタイプは、タイプ及び変異体に関する下付き数字で示される。β１スプライス変異体に関するこのようなサブタイプの例としてはこれに限定されないが、β１−１−β１−５があり、β２変異体に関するこのようなサブタイプの例としてはこれに限定されないが、β２ｃ−β２Ｅがある。
【００４８】
本文中で使用された「γサブユニット」は、γサブユニットをコードするＤＮＡとして本文中で開示されたＤＮＡによってコードされるサブユニットであり、本文中でプローブとして開示されたＤＮＡを使用し、ハイブリダイゼーションまたは当業者に公知の他の同様の方法によって単離及び同定され得る。従って、γサブユニットをコードしている全長クローンを単離または構築し得る。γサブユニットは低緊縮性条件下で本発明で提供されたＤＮＡにハイブリダイズするかまたは本文中に記載されたγサブユニットに少なくとも約４０％の相同性を有するタンパク質をコードすべく十分な配列相同性を示すＤＮＡによってコードされるであろう。
【００４９】
従って、当業者は、本発明の開示に基づいて、スプライス変異体を示す種々の遺伝子及びサブタイプによってコードされているタイプを含むカルシウムチャンネルのα１、α２、β、δ及びγサブユニットをコードするＤＮＡを同定し得る。例えば、本発明で開示されたＤＮＡに基づくＤＮＡプローブは、プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいてゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーのような適当なライブラリーをスクリーニングし、全タンパク質をコードする読み取りフラグメントを含む１つ以上のクローン中のＤＮＡを取得するために使用され得る。本発明に開示されたＤＮＡで適当なライブラリーをスクリーニングした後で、単離ＤＮＡについて、コードされたタンパク質の配列を与えたと推定される読み取り枠の存在を試験する。分子量の決定及び本発明の配列との比較によってサブユニットをα１、α２などのサブユニットとして同定し得る。必要な場合には、機能性アッセイを使用してサブユニットがα１、α２サブユニットであるかβサブユニットであるかを判断してもよい。
【００５０】
例えば、α１ＡサブユニットをコードするＤＮＡは、ヒトα１Ａサブユニットの全部または一部をコードするＤＮＡによって適当なライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。このようなＤＮＡとしては、ＡＴＣＣ受託番号７５２９３で寄託されたファージ中のα１サブユニットの一部分をコードしているＤＮＡがある。α１ＡサブユニットをコードするＤＮＡは、配列番号２１、２２及び／または２３に示す配列の全部もしくは一部分を有するオリゴヌクレオチドまたは寄託ファージ中のＤＮＡによって適当なライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。または、このようなＤＮＡが、配列番号２２または２３によってコードされているα１Ａサブユニットをコードする配列を有していてもよい。
【００５１】
同様に、β３をコードするＤＮＡは、ＡＴＣＣ受託番号６９０４８で寄託されたプラスミドβ１．４２から調製されたＤＮＡプローブによってヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離されることができ、または、配列番号１９及び／または２０に示された配列に従って調製された配列を有するプローブを用いて適当なライブラリーから得ることができる。更に、β４をコードするＤＮＡは、β４サブユニットをコードするクローンのＤＮＡ配列を示す配列番号２７に示すＤＮＡに従って調製されたＤＮＡプローブによってヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。そのアミノ酸配列を配列番号２８に示す。ＤＮＡの単離及び同定並びに全長ゲノムまたはｃＤＮＡクローンの調製のためには本文中に例示した方法を含む当業者に公知の任意の方法を使用し得る。
【００５２】
ＤＮＡコーディング
単離したＤＮＡによってコードされるサブユニットは、本発明で提供されるサブユニットのＤＮＡ及びアミノ酸の配列比較によって同定され得る。スプライス変異体は広い相同領域を共有しているが、非相同領域も含み、種々の遺伝子によってコードされたサブユニットが非相同配列の均一分布を共有している。
【００５３】
本文中で使用された「スプライス変異体」とは、２タイプ以上のｍＲＮＡを与えるゲノムＤＮＡの一次転写物の異なるプロセシングによって産生される変異体を意味する。スプライス変異体は、１つの組織内部または複数の組織で発生し得る（組織特異的変異体）。従って、等しいアミノ酸の領域及び異なるアミノ酸配列の領域を有するカルシウムチャンネルサブユニットのサブタイプをコードするｃＤＮＡクローンを本文中で「スプライス変異体」と呼ぶ。
【００５４】
本文中で使用された「カルシウムチャンネル選択イオン」とは、細胞膜を貫通するカルシウムチャンネルに対して、Ｃａ２＋の流れが許容または阻害されるときと実質的に同様の条件下でその流れが許容または阻害されるイオンを意味する。Ｂａ２＋はカルシウムチャンネル選択イオンの一例である。
【００５５】
本文中で使用された「カルシウムチャンネル活性を変調する化合物」とは、カルシウムチャンネル選択イオンを通過させるカルシウムチャンネルの能力に影響を与えるか、または、電流カイネティクスような他の検出可能なカルシウムチャンネルの特徴に影響を与える化合物を意味する。このような化合物としては、カルシウムチャンネルアンタゴニスト及びアゴニスト並びにカルシウムチャンネルの活性に直接及び間接に影響を与える化合物がある。
【００５６】
本文中で使用された「実質的に純粋な」サブユニットまたはタンパク質とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで均質に出現するようにまたは明確に配列決定されるように他の夾雑ポリペプチドが十分に除かれたサブユニットまたはタンパク質を意味する。
【００５７】
本文中で使用された「選択的にハイブリダイズする」とは、ＤＮＡフラグメントが、複数のフラグメントから第２のフラグメントを同定または単離し得るように、第２のフラグメントに対して十分な特異性でハイブリダイズすることを意味する。一般に、選択的ハイブリダイゼーションは高緊縮性条件下で生じる。
【００５８】
本文中では、異種または外来ＤＮＡ及びＲＮＡなる用語は互換的に使用されており、それらを存在させるゲノムの一部として天然に存在するものでないＤＮＡもしくはＲＮＡまたは天然に存在する場所とは異なるゲノム内の１つまたは複数の場所に見出されるＤＮＡもしくはＲＮＡを意味する。これは、細胞に内因性でなく、細胞内に人為的に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡである。異種ＤＮＡの例としては以下に限定されないが、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡ、転写、翻訳または他の調節可能な生化学プロセスに影響を与えることによって内因性ＤＮＡの発現を媒介または変化させるＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡがある。カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡのような異種ＤＮＡを発現する細胞は、同じまたは異なるカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含み得る。異種ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノムに取り込まれるかまたはエピソーム的に維持されるように導入されてもよい。
【００５９】
本文中で使用された「プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳の終止部位並びに他のシグナル配列のような調節ヌクレオチド配列及びエフェクターヌクレオチド配列に対する異種ＤＮＡの機能し得る結合」とは、このようなＤＮＡとこのようなヌクレオチド配列との間の機能的関係を意味する。例えば、プロモーターに対する異種ＤＮＡの機能し得る結合とは、ＤＮＡを特異的に認識し結合し読み取り枠に転写するＲＮＡポリメラーゼによってこのようなＤＮＡの転写がプロモーターから開始されるようなＤＮＡとプロモーターとの物理的及び機能的関係を意味する。
【００６０】
本文中で使用された「実質的に純粋な単離ＤＮＡ」とは、当業者によって使用される標準技術に従って精製されたＤＮＡフラグメントを意味する［例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照］。
【００６１】
本文中で使用された「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、適正な真核宿主細胞または生物が選択されるならば発現はｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００６２】
本文中で使用された「ベクターまたはプラスミド」とは、異種ＤＮＡを発現させるかまたはクローン化異種ＤＮＡを複製させるために細胞内に異種ＤＮＡを導入するために使用される個別要素（discrete elements）を意味する。このようなベクター及びプラスミドの選択及び使用は当業者の標準的な知識の範囲内である。
【００６３】
本文中で使用された「発現ベクター」とは、このようなＤＮＡフラグメントの発現を惹起し得るプロモーター領域のような調節配列と機能し得るように結合しているＤＮＡフラグメントを発現し得るベクターを包含する。従って、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入された時クローンＤＮＡを発現するプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターのような、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を意味する。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞及び／または原核細胞中で複製可能なベクター、並びにエピソームとして維持されるかもしくは宿主細胞ゲノムに取り込まれ得るベクターがある。
【００６４】
本文中で使用された「プロモーター領域」とは、機能し得るように結合したＤＮＡの転写を調節する遺伝子のＤＮＡ部分を意味する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始に十分なＤＮＡの特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分をプロモーターと呼ぶ。更に、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合及び転写開始活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作用因子でもよくまたはトランス作用因子に反応性でもよい。調節の性質次第でプロモーターは構成的または調節的である。
【００６５】
本文中で使用された「組換え真核細胞」とは異種ＤＮＡまたはＲＮＡを含む真核細胞を意味する。
【００６６】
本文中で使用された「組換えまたは異種カルシウムチャンネル」とは、組換えカルシウムチャンネルを発現する真核細胞に導入され該真核細胞中で発現する異種ＤＮＡによってコードされた１つ以上のサブユニットを含むカルシウムチャンネルを意味する。組換えカルシウムチャンネルはまた、細胞に内在するＤＮＡによって産生されるサブユニットも包含する。いくつかの実施態様において、組換えまたは異種カルシウムチャンネルは、異種ＤＮＡによってコードされたサブユニットだけを含んでいてもよい。
【００６７】
組換えまたは異種カルシウムチャンネルに関して本文中で使用された「機能性」なる用語は、チャンネルが、Ｃａ２＋またはＢａ２＋に限らないがＣａ２＋またはＢａ２＋などのカルシウムチャンネル選択イオンを刺激に反応して流入させるかまたは流入を調節するか及び／またはチャンネル親和性リガンドを結合させる能力を有することを意味する。好ましいことにはこのようなカルシウムチャンネル活性は、電気生理学的、薬理学的及び当業者に公知の他の手段によって宿主細胞中の内因性カルシウムチャンネル活性から識別可能である。
【００６８】
本文中で使用された「実質的に特定の配列番号で示されたアミノ酸配列を有するペプチド」とは、同じ機能を有するが僅かな配列変異、例えばペプチドの活性を変化させない保存性アミノ酸変異または小さい欠失もしくは挿入を含み得るペプチドを意味する。カルシウムチャンネルレセプターサブユニットペプチドの活性とは、他のこのようなサブユニットと共に機能性カルシウムチャンネルを形成する能力を意味する。
【００６９】
本文中で使用された「化合物の生理的濃度」とは、生物プロセスを惹起するために必要且つ十分な濃度を意味する。例えば、カルシウムチャンネル選択イオンの生理的濃度は、チャンネルが開いたときに内向きの電流を与えるために必要且つ十分なカルシウムチャンネル選択イオンの濃度である。
【００７０】
本文中で使用された「カルシウムチャンネルの活性」とは、カルシウムチャンネルを通るカルシウムチャンネル選択イオンの移動を意味する。このような活性は当業者に公知の任意の方法によって測定されることができ、例としては、刺激に反応して組換えチャンネルを流れる電流の量を測定する方法があるがこれに限定されない。
【００７１】
本文中で使用された「機能性アッセイ」なる用語は、機能性カルシウムチャンネルを同定するアッセイを意味する。従って、機能性アッセイは機能を評価するアッセイである。
【００７２】
当業者に理解されるであろうが、カルシウムチャンネル活性を変調するアンタゴニスト及びアゴニストのような化合物を同定するアッセイ方法では一般に、対照との比較が必要である。「対照」細胞または「対照」培養物の１つのタイプは、対照培養物を被検化合物に接触させない以外は被検化合物に接触した細胞または培養物と実質的に同様に処理した細胞または培養物である。別のタイプの「対照」細胞または「対照」培養物は、対照培養物に使用した細胞が機能性カルシウムチャンネルを発現しない以外はトランスフェクト細胞に等しい細胞または細胞培養物から成る。この場合には、アッセイの目的となる化合物の存在下で各タイプの細胞または細胞培養物を実質的に同じ反応条件に維持し、このときの被検化合物に対する被検細胞の反応と、被検化合物に対するカルシウムチャンネル陰性細胞の反応（または反応の欠如）とを比較する。例えば、パッチ固定（patch clamp）電気生理学的手順を用いる方法では、細胞を浸漬させる外部溶液を当業界で公知のように交換することによって被検化合物の存在下及び非存在下で同じ細胞を試験し得る。
【００７３】
また、本文中に開示されたサブユニットの各々は保存性アミノ酸置換を行うことによって修飾され、得られた修飾サブユニットも本発明の目的であることが理解されよう。適当な保存性アミノ酸置換は当業界で公知であり、通常は得られる分子の生物学的活性を変化させることなく行われるであろう。ポリペプチドの非必須領域の単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことは当業者の一般認識である（例えば、Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｊａｃｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．ｃｏ．，ｐ．２２４参照）。このような置換は好ましくは以下の表１に示す置換に従って行われるが、これらに限定はされない。
【００７４】
【表１】
2004180691.tif 000002
【００７５】
他の置換も可能であり、実験的にまたは既知の保存性置換に従って決定され得る。ポリペプチドのこのような修飾はいずれも、当業者に公知の任意の手段によって得られる。突然変異は、当業者に公知の任意の方法、例えばタンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発即ち特定部位の突然変異誘発及びＤＮＡ鋳型に変異を導入し増幅するためのプライマーを用いるＤＮＡ増幅方法の使用などを包含する。
【００７６】
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
ヒトカルシウムチャンネルのα１、α２、β及びγサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離方法が提供される。
【００７７】
かかるＤＮＡの同定及び単離は、所望のサブユニットをコードするＤＮＡが単離される少なくとも低緊縮性の適当な条件下で、制限酵素消化したヒトＤＮＡと、本文中に配列識別番号で示したヌクレオチド配列を有するＤＮＡの任意の連続部分に由来する少なくとも１４、好ましくは１６またはそれ以上のヌクレオチドを有する標識プローブとをハイブリダイズさせることによって行う。ハイブリダイゼーション反応でハイブリダイズするフラグメントを同定し、当業者に公知の標準クローニング技術を用いてクローニングし得る。完全読み取り枠の存在によって全長クローンを同定し、コードされたタンパク質の同一性を、本発明で提供されたサブユニットとの配列比較及びカルシウムチャンネル形成能力または他の機能を評価する機能性アッセイによって確認する。この方法は、サブユニットをコードするゲノムＤＮＡを同定するため、またはゲノムサブユニットＤＮＡの一次転写物の選択的スプライシングによって生じたヒトカルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体をコードするｃＤＮＡを同定するために使用され得る。例えば、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡは、ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによって同定され、制限マッピング、ＤＮＡ配列決定のような当業者に公知の方法によって特性決定され、ＤＮＡの配列中の異質性（heterogeneity）または異形性（divergence）を識別するために本発明で提供されたＤＮＡと比較される。このような配列の差異は、ｃＤＮＡの産生の出発材料となる転写物が、非相同領域及び相同領域がクラスターである場合には一次転写物の選択的スプライシングに由来し、非相同領域がクローン化したＤＮＡ全体に分布している場合には別の遺伝子に由来することを示す。
【００７８】
本発明で提供されたＤＮＡを用いて遺伝子を単離するために、適当な任意の方法を使用し得る。例えば、配列差異の領域に対応するオリゴヌクレオチドは、全長スプライス変異体をコードするＤＮＡをハイブリダイゼーションによって単離するために使用されているが、ゲノムクローンを単離するために使用することができる。組織特異的エキソンのようなヒトカルシウムチャンネルの１つのサブユニットの少なくとも一部分をコードする、本発明で開示されたヌクレオチド配列に基づくプローブは、近縁ＤＮＡをクローニングするため、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする全長ｃＤＮＡまたはゲノムクローンをクローニングするために、プローブとして使用され得る。
【００７９】
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットの少なくとも一部分をコードする核酸の少なくとも１４の実質的に連続の塩基、好ましくは１６以上、通常は少なくとも３０の連続塩基から成る標識されたＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡが提供される。標識の例としては放射性標識または酵素標識などがあるがそれに限定されない。該核酸の配列は本明細書で配列番号を付けて示した核酸配列のセグメントに対応する。このような核酸セグメントは、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡをクローニングするために本発明で提供される方法においてプローブとして使用され得る。一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照。
【００８０】
更に、当業界で公知の核酸増幅技術を用い、異なる配列プライマーを包囲するＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用してヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅することによって、カルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体の所在を検出し得る。増幅産物の大きさ及び配列の決定によってスプライス変異体を確認し得る。更に、ハイブリダイゼーションによるヒトゲノムＤＮＡ配列の単離は、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする転写物の種々のスプライス変異体に対応する多数のエキソンを介在イントロンと共に含むＤＮＡを与える。
【００８１】
電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルのα１、α２、β及びγサブユニットの各々のタイプ及びサブタイプをコードするＤＮＡは、本発明では、選択された組織に由来のｃＤＮＡの核酸増幅によって、または、かかるカルシウムチャンネルを有するヒト由来の細胞系または組織の単離ポリＡ＋ ｍＲＮＡから調製されたヒトｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって、クローニングされ得る。ｍＲＮＡを得るためのかかる細胞または組織のソースとしては、ヒト脳組織、または、神経芽腫細胞系のようなヒト神経起原の細胞系、ヒト骨格筋もしくは平滑筋細胞などがある。ｃＤＮＡライブラリーの調製方法は当業界で公知である［全般的にはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照］。
【００８２】
プローブ構築の出発点となる好ましい領域としては、５’及び／または３’コーディング配列、トランスメンブランドメインをコードすると予測される配列、細胞質ループをコードすると予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位、及び、他の機能的に有意な配列（後出の表参照）などがある。全長サブユニットをコードするＤＮＡまたはそのフラグメントを、好ましくは検出を容易にする適当なラベル手段によって標識してプローブとして使用し得る。フラグメントをプローブとして使用するとき、ＤＮＡ配列が典型的にはカルボキシル末端をコードするＤＮＡ部分に由来するのが好ましく、推定アミノ酸配列のハイドロパシー分析に基づいて予測されたトランスメンブランドメインをコードする部分を含むのが極めて好ましい［例えば、Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６７：１０５参照］。
【００８３】
ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのタイプまたはサブタイプに特異的なリボプローブを調製した。これらのプローブは選択された組織及び細胞中の特定サブユニットの発現を同定するために有用である。プローブ調製の出発点となった領域を、すべての既知のαまたはβサブユニットのサブタイプのＤＮＡ及びアミノ酸の配列と比較することによって同定した。相同の最も少ない領域、好ましくはヒト由来の配列、一般的にほぼ約２５０〜約６００ヌクレオチドを選択した。α及びβサブユニットの多数のリボプローブを調製した。これらのいくつかを以下の表にまとめる。
【００８４】
【表２】
2004180691.tif 000003
ｐＧＥＭシリーズはＰｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩより入手できる。米国特許第４，７６６，０７２号参照。
【００８５】
上記ヌクレオチド領域はまた、後述するように、サブユニット特異的抗体調製用タンパク質の領域を選択するためにも有用である。
【００８６】
従って、本発明で提供されるＤＮＡクローン及びそのフラグメントは、各サブユニットをコードするゲノムクローンを単離するため、及び、種々のヒト組織から調製されたライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによってスプライス変異体を単離するために使用され得る。当業界で公知の核酸増幅技術はまた、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットのスプライス変異体をコードするＤＮＡを検出するために使用され得る。これは、（１つまたは複数の）異なる配列を包囲するＤＮＡ配列に基づくオリゴヌクレオチドをヒトＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するためのプライマーとして使用することによって達成される。増幅産物の大きさ及び配列の決定によって、スプライス変異体の存在が確認され得る。更に、ハイブリダイゼーションによってヒトゲノムＤＮＡを単離すると、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードする転写物の種々のスプライス変異体に対応する多数のエキソンを介在イントロンと共に含むＤＮＡが得られる。
【００８７】
カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを単離した後、特定のカルシウムチャンネルサブユニットまたは変異体をコードするｍＲＮＡをどの組織が発現したかを決定するためにリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）保護アッセイを使用し得る。これらのアッセイは、全細胞性ＲＮＡの複合混合物中でＲＮＡ種を検出及び定量するための高感度の手段を提供する。サブユニットＤＮＡを標識し、細胞性ＲＮＡとハイブリダイズさせる。細胞性ＲＮＡ中に相補性ｍＲＮＡが存在するときは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが生じる。次に、ＲＮＡサンプルをＲＮアーゼで処理すると、一本鎖ＲＮＡが分解される。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドはＲＮアーゼ分解から保護されており、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーによって可視化され得る。また、特定のカルシウムチャンネルサブユニットをコードするｍＲＮＡをどの組織が発現したかを決定するために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術も使用され得る。サブユニットｍＲＮＡ発現を可視化するために標識サブユニットＤＮＡを種々の組織切片にハイブリダイズさせる。
【００８８】
ヒトカルシウムチャンネルのサブユニット（α１、α２、βまたはγ）の各々に関して、チャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを核酸スクリーニング方法によって同定し、単離されたクローンを使用して、オーバーラップするクローンを同定するために更にスクリーニングした。クローニングされたＤＮＡフラグメントのいくつかは、ｐＩＢＩ２４／２５（ＩＢＩ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、Ｍ１３ｍｐ１８／１９、ｐＧＥＭ４、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ７Ｚ、ｐＳＰ７２及び当業界で公知の他のこのようなベクターにサブクローニングでき、ＤＮＡ配列決定及び制限酵素マッピングによって特性決定した。従って逐次シリーズのオーバーラップクローンを、各サブユニットに関する全長クローンが調製されるまで、翻訳開始（start）コドン及び翻訳終止（stop）コドンの同定を含む当業界で公知の方法で作製し得る。クローン化したＤＮＡを発現させるために、このようなクローンの５’非コーディング領域並びに他の転写及び翻訳調節領域を、有効なリポソーム結合部位及び当業界で公知の他の調製領域によって置換し得る。翻訳及び／または転写効率を最適にするために必要な当業界で公知の他の５’端修飾を必要に応じて行ってもよい。
【００８９】
後出の実施例２〜８は、ヒトカルシウムチャンネルの種々のサブユニット、サブタイプ及び組織特異的変異体のようなスプライス変異体の各々のクローニングを詳細に記載している。サブユニットの部分配列が開示された少数の例においては、本文中の教示に基づいて、対応する全長クローン及びそのサブユニット、サブタイプまたはそのスプライス変異体をコードする配列を得ることは、上記に記載し後記に例示する方法を用いて当業者が容易に成し得ることである。
【００９０】
α１サブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
ヒトＣＮＳ及び他の組織中で発現される多数の電圧依存性カルシウムチャンネルα１サブユニット遺伝子を同定し、α１Ａ、α１Ｂ（またはＶＤＣＣIV）、α１Ｃ（またはＶＤＣＣII）、α１Ｄ（またはＶＤＣＣIII）及びα１Ｅと命名した。サブユニットの各タイプをコードするヒト神経ｃＤＮＡライブラリーから単離されたＤＮＡを単離した。スプライス変異体として生じるタイプの各々のサブタイプをコードするＤＮＡも提供される。本文中ではサブタイプを例えばα１Ｂ−１、α１Ｂ−２などとして示す。
【００９１】
電圧依存性カルシウムチャンネルのα１サブユニットのタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ、並びに、そのサブタイプは、ＤＨＰ、フェニルアルキルアミン、オメガコノトキシン（ω−ＣｇＴｘ）、クモ毒（funnel web spider toxin）ω−Ａｇａ−IV及びピラゾノイルグアニジンのような既知のカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストのクラスに対して異なる感受性を示す。これらのサブユニットタイプはまた、静止電位が違っており、且つ、α１サブユニットの種々のタイプを包含するカルシウムチャンネルを含む細胞膜の脱分極のときに発生する電流のカイネティクスも違っていると考えられる。
【００９２】
ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ω−ＣｇＴｘ、クモ毒成分、ピラゾノイルグアニジンなどから選択された少なくとも１つの化合物に結合するα１サブユニットをコードするＤＮＡが提供される。例えば、本発明で提供されるα１Ｂサブユニットは、Ｎ−型チャンネル内でω−ＣｇＴｘと特異的に相互作用すると考えられ、本発明で提供されるα１ＤサブユニットはＬ−型チャンネル内でＤＨＰと特異的に相互作用する。
【００９３】
ヒトカルシウムチャンネルα１ＤサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニットｃＤＮＡのフラグメントをヒト神経芽腫細胞系ＩＭＲ３２のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用い、α１ＤサブユニットｃＤＮＡを単離し、クローンα１．３６を作製した。このクローンをプローブとして用いて追加のＩＭＲ３２細胞ｃＮＤＡライブラリーをスクリーニングして、オーバーラップするクローンを作製し、このクローンを用いてスクリーニングして次のクローンを作製するという手順を、ヒトα１Ｄサブユニットをコードするヌクレオチド配列の全長に及ぶ十分なシリーズのクローンが得られるまで継続した。実施例２に記載のように部分的α１Ｄクローンの断片を結合することによってα１Ｄをコードする全長クローンを構築した。配列番号１はα１ＤサブユニットをコードするｃＤＮＡの７，６３５ヌクレオチドの配列を示す。２，１６１アミノ酸の配列をコードする６，４８３ヌクレオチドの配列の読み取り枠が存在する（配列番号１に示す）。
【００９４】
配列番号２はα１ＤサブユニットのＩＳ６トランスメンブランドメインをコードする選択的エキソンの配列を与える［トランスメンブランドメインなる用語の記載に関してはＴａｎａｂｅ，Ｔ．ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３１３−３１８参照］。
【００９５】
配列番号１はまた、ヒト神経細胞カルシウムチャンネルα１Ｄサブユニットから推定された２，１６１アミノ酸の配列を示す。アミノ酸配列に基づいて、α１Ｄタンパク質は計算分子量２４５，１６３を有している。カルシウムチャンネルのα１Ｄサブユニットは推定された４つの内部反復配列領域を含む。４つの内部反復領域は、２４の推定トランスメンブランセグメントを示し、アミノ−及びカルボキシル−末端が細胞内に伸びている。
【００９６】
α１Ｄサブユニットが、ＤＨＰ−感受性の、高電圧活性化される、長期持続カルシウムチャンネル活性を媒介することが判明した。このカルシウムチャンネル活性は、α１Ｄ及びβ１−２サブユニットをコードするＲＮＡ転写物、またはα１Ｄ、α２ｂ及びβ１−２サブユニットをコードするＲＮＡ転写物を同時注入した卵母細胞で検出された。この活性は、β１−２±α２ｂサブユニットをコードするＲＮＡ転写物を卵母細胞に注入したときに検出されるＢａ２＋電流とは違っていた。これらの電流は、非注入卵母細胞で報告されたＣａ２＋電流に薬理学的及び生物物理学的に類似していた。
【００９７】
ヒトカルシウムチャンネルα１ＡサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
α１Ａサブユニットの一部分をコードするＤＮＡを含有する生物材料は、特許手続き目的の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びこの条約に基づいて発布された条例の規約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託されている。寄託材料のサンプルは現在及び今後、上記の条約及び条例に基づいて、並びに、アメリカ合衆国の特許法及び条例あるいは本願もしくは本願を優先権主張する出願が出願されたかまたはかかる出願に対して許諾されるいかなる特許も許諾される他のすべての国家または国際機関の特許法及び条例に基づいて、特許事務所及び他の法的有資格者に入手可能であろう。
【００９８】
α１Ａサブユニットの一部分は、宿主大腸菌ＮＭ５１４株中のα１．２５４と命名されたλｇｔ１０ファージ中の約３ｋｂのインサートによってコードされている。この材料のファージ溶菌液は、上記のようにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｃｅｔｉｏｎにＡＴＣＣ受託番号７５２９３で寄託されている。α１ＡをコードするＤＮＡはまた、配列番号２１：
5’ CTCAGTACCATCTCTGATACCAGCCCCA 3’
を有するＤＮＡから調製されたプローブでスクリーニングすることによって同定され得る。
【００９９】
α１Ａスプライス変異体も作製した。２つのα１Ａスプライス変異体、α１ａ−１及びα１ａ−２の配列を配列番号２２及び２３に示す。上記のごときヒトライブラリーのスクリーニングまたは配列番号２２及び２３に示した配列の全部または一部分を用いることによって他のスクリーニング変異体を得ることができる。
【０１００】
ヒトカルシウムチャンネルα１ＢサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするｃＤＮＡのフラグメントでヒト脳幹神経節ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってα１ＢサブユニットをコードするＤＮＡを単離した。１つの陽性クローンの一部分を使用してＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。脳幹神経節ＤＮＡプローブにハイブリダイズしたクローンを使用してＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーを更にスクリーニングして、オーバーラップするクローンを同定し、このクローンを使用してヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。このようにして、ヒトα１Ｂサブユニットをコードするヌクレオチド配列のほぼ全長に及ぶ十分なシリーズのクローンを作製した。ＩＭＲ３２細胞のα１Ｂ ｍＲＮＡの特定領域の核酸増幅によって、α１Ｂをコードする配列の追加のセグメントが得られた。
【０１０１】
実施例２．Ｃに記載の部分的ｃＤＮＡクローンの断片を結合することによって全長α１Ｂ ＤＮＡクローンを構築した。配列番号７及び８は、α１ＢサブユニットをコードするＤＮＡクローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。配列番号７によってコードされたα１Ｂサブユニットをα１Ｂ−１サブユニットと呼ぶが、これは、α１Ｂサブユニット転写物の選択的スプライシングによって得られた配列番号８のヌクレオチド配列によってコードされた別のα１Ｂサブユニット即ちα１Ｂ−２と区別するためである。
【０１０２】
α１Ｂ−１をコードするＤＮＡ内部のヌクレオチド配列に従って設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＩＭＲ３２細胞ｍＲＮＡの核酸増幅によって、異なるコーディング配列を含むのでスプライス変異体であると考えられるα１Ｂ転写物の変異体を同定した。
【０１０３】
ヒトカルシウムチャンネルのα１ＣサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
多数のα１Ｃ特異的ＤＮＡクローンを単離した。配列のキャラクタリゼーションによって、α１Ｃコーディング配列、α１Ｃ翻訳開始配列及びα１Ｃの選択的スプライス領域が判明した。α１Ｃサブユニットの選択的スプライス変異体が同定された。配列番号３はα１Ｃサブユニットの実質的な部分をコードするＤＮＡを示す。配列番号４及び配列番号５に示すＤＮＡ配列は、α１Ｃタンパク質の可能な２つのアミノ末端をコードする。配列番号６はIVＳ３トランスメンブランドメインの選択的エキソンをコードする。α１Ｃ−１及びα１Ｃ−２と命名された２つのα１Ｃスプライス変異体の実質的な部分の配列を夫々、配列番号３及び３６に示す。
【０１０４】
α１Ｃサブユニットの部分をコードするＤＮＡクローンの単離及び同定を実施例２に詳細に記載する。
【０１０５】
ヒトカルシウムチャンネルのα１ＥサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
オリゴｄＴ−プライムしたヒト海馬ライブラリーからヒトカルシウムチャンネルα１ＥサブユニットをコードするＤＮＡを単離した。得られたクローンはスプライス変異体であり、これをα１Ｅ−１及びα１Ｅ−３と命名した。α１Ｅ−１と命名されたサブユニットは、配列番号２４に示すアミノ酸配列を有し、α１Ｅ−３と命名されたサブユニットは、配列番号２５に示すアミノ酸配列を有している。双方のスプライス変異体の違いは、配列番号２４のヌクレオチド２４０５と２４０６との間の５７塩基対のインサートに基づく。
【０１０６】
本文中で示したα１Ｅサブユニットは、高電圧活性化カルシウムチャンネル及び低電圧活性化チャンネルの特性を有するカルシウムチャンネルの形成に関与すると考えられる。これらのチャンネルは他の高電圧活性化カルシウムチャンネルに比較して迅速に不活性化される。更にこれらのチャンネルは、電圧活性化チャンネルに類似しているが、ある種の高電圧活性化チャンネルを遮断するＤＨＰ及びω−Ａｇａ−ＩＶＡに感受性である薬理学的プロフィルを示す。α１Ｅサブユニットを含むチャンネルの電気生理学及び薬理学に関しては実施例７のＦに更に詳細に記載する。
【０１０７】
追加のヒトカルシウムチャンネルα１サブユニットのタイプ及びサブタイプをコードするＤＮＡの同定及び単離
追加のα１サブユニットをコードするＤＮＡをα１Ａ、α１Ｂ、α１Ｃ、α１Ｄ及びα１Ｅサブユニットに関して本発明で提供されたＤＮＡを用いるかまたは当業者に公知の他の方法を用いて単離及び同定し得る。特に、近縁ＤＮＡを単離するための適当なライブラリーをスクリーニングするために本発明で提供されるＤＮＡを使用し得る。本文中に記載されたような方法を用いて全長クローンを構築でき、得られたサブユニットの配列並びに電気生理学的及び薬理学的特性を、本文中で例示したサブユニットのものと比較することによって特性決定した。
【０１０８】
ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
β１をコードするＤＮＡ
β１サブユニットをコードするＤＮＡを単離するために、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβサブユニットをコードするＤＮＡフラグメントに対するハイブリダイゼーションによってヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンを選択し、これを使用して、完全ヒトカルシウムチャンネルβサブユニットをコードするＤＮＡを包含するオーバーラップクローンが単離され配列決定されるまでオーバーラップクローンを単離した。
【０１０９】
ヒトカルシウムチャンネルβ１サブユニットの５つの選択的スプライス形態を同定し、多数の形態をコードするＤＮＡを単離した。これらの形態について、骨格筋で発現された形態をβ１−１と命名し、ＣＮＳで発現された形態をβ１−２と命名し、同じくＣＮＳで発現された形態をβ１−３と命名し、大動脈及びＨＥＫ２９３細胞で発現された形態をβ１−４と命名し、ＨＥＫ２９３細胞に発現された形態をβ１−５と命名した。β１−２及びβ１−３サブユニットをコードする全長ＤＮＡクローンを構築した。サブユニットβ１−１、β１−２、β１−４及びβ１−５をβサブユニットの選択的スプライス形態として核酸増幅分析によって同定した。β１スプライス変異体の配列を配列番号９、１０及び３３〜３５に示す。
【０１１０】
β２をコードするＤＮＡ
β２スプライス変異体をコードするＤＮＡが得られた。これらのスプライス変異体はβ２Ｃ−β２Ｅを包含する。スプライス変異体β２Ｃ−β２Ｅは、スプライス変異体間で違っている５’末端（ヌクレオチド１８２まで）の部分を除いて配列番号２６に示された配列全部を含む。配列番号２６に示す配列はβ２Ｄをコードしている。追加のスプライス変異体は、本文に記載の方法と配列番号２６に示すＤＮＡの全部もしくは一部分を含むオリゴヌクレオチドとを用いて単離でき、または、実施例に記載のごとく調製もしくは取得できる。β２スプライス変異体β２Ｃ及びβ２Ｅを夫々配列番号３７及び３８に示す。
【０１１１】
β３をコードするＤＮＡ
β３サブユニット及びその任意のスプライス変異体をコードするＤＮＡは、配列番号１９、２０に従って調製されたＤＮＡプローブを用いるかまたは寄託されたβ３クローンプラスミドβ１．４２（ＡＴＣＣ受託番号６９０４８）の全部もしくは一部分を用いてβ１サブユニットに関する上記の記載と同様にライブラリーをスクリーニングすることによって単離され得る。
【０１１２】
β３サブユニットをコードするＤＮＡを含むプラスミドβ１．４２を保有する大腸菌宿主は、特許手続き目的の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約及びこの条約に基づいて発布された条例の規約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２ Ｕ．Ｓ．Ａ．にＡＴＣＣ受託番号６９０４８で寄託した。寄託材料のサンプルは現在及び今後、上記の条約及び条例に基づいて、並びに、アメリカ合衆国の特許法及び条例あるいは本願もしくは本願を優先権主張する出願が出願されたかまたはかかる出願に対して許諾されるいかなる特許も許諾される他のすべての国家または国際機関の特許法及び条例に基づいて、特許事務所及び他の法的有資格者に入手可能であろう。
【０１１３】
β３をコードするプラスミドをβ１．４２と命名する。プラスミドはベクターｐＧｅｍ７ｚＦ（＋）に挿入されたβ３をコードする２．５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含有し、宿主大腸菌ＤＨ５α株中で寄託した。β３−１及びβ３−２と命名されたβ３スプライス変異体の配列を夫々配列番号１９及び２０に示す。
【０１１４】
ヒトカルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
ヒトゲノムＤＮＡライブラリーをウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするＤＮＡのフラグメントで低及び高緊縮性条件下にプローブする以外は、α１サブユニットをコードするＤＮＡを単離するために使用した方法と実質的に同様の方法で、ヒト神経細胞カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするＤＮＡを単離した。フラグメントは、ウサギ背骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡを含むヌクレオチド４３から２７２までのヌクレオチド配列に対応する配列を有するヌクレオチドを含んでいた。これはＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０９８３４に開示されており、これは米国出願０７／６２０，５２０（現在は許諾米国出願０７／９１４，２３１）に対応し、この米国出願は１９８８年４月４日出願の米国出願１７６，８９９の一部継続出願である。
【０１１５】
実施例４は、ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするＤＮＡクローンを単離するために、ゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって同定されたゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡクローンをプローブとして用いた方法を記載している。
【０１１６】
配列番号１１及び２９〜３２は、α２サブユニットをコードするＤＮＡの配列を示す。実施例５に記載したように、ヒト骨格筋、脳組織及び大動脈からのＲＮＡを、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットから分岐するヒト神経細胞α２サブユニットｃＤＮＡの領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて核酸増幅分析し、ヒトカルシウムチャンネルα２サブユニット転写体のスプライス変異体を同定した。
【０１１７】
ヒトカルシウムチャンネルγサブユニットをコードするＤＮＡの同定及び単離
ヒト神経細胞カルシウムチャンネルγサブユニットの一部分をコードするＤＮＡを実施例６に詳細に記載の手順で単離した。配列番号１４は、４３アミノ酸残基の配列をコードする読み取り枠を含むこのＤＮＡの３’端のヌクレオチド配列を示す。得られた部分は、許諾された同一出願人の米国出願０７／４８２，３８４に記載のウサギクローンに相同であるから、クローンの残りの部分は常用の方法によって得られる。
【０１１８】
抗体
カルシウムチャンネルサブユニットのサブタイプまたはカルシウムチャンネルのタイプに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、サブユニットタンパク質またはその部分を抗原として用いる当業者に公知の標準技術を用いて調製され得る。抗ペプチド抗体及び抗融合タンパク質抗体を使用し得る［例えば、Ｂａｈｏｕｔｈら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１２：３３８−３４３；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）］。免疫原として（合成ペプチドまたは組換え的に産生された細菌性融合タンパク質として）使用するためのカルシウムチャンネルサブユニットの部分を選択するときに考慮すべき要因としては、抗原性発揮の可能性（即ち、細胞外ドメイン及び細胞質ドメイン）、特定サブユニットに対する特異性（uniqueness）、及び当業者に公知の他の要因がある。
【０１１９】
サブユニット特異的抗体を入手できることにより、多様なサブユニットの分布及び発現密度をモニターするために免疫組織化学の技術を適用することが可能である（例えば、正常脳組織対疾患脳組織）。このような抗体はまた、ＬＥＳ診断のような診断目的、または、カルシウムチャンネルの活性を変調する抗体を用いる治療目的で使用され得る。
【０１２０】
抗体は、例えば、腹腔内、筋肉内、静脈内もしくは皮下注射、移植または経皮投与方式、などの標準方法を用いて患者に投与され得る。当業者は、使用される投与方式に従って投与形態、治療計画などを実験的に決定し得る。
【０１２１】
サブユニット特異的なモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を調製した。公知のすべてのα及びβサブユニットのサブタイプのＤＮＡ及びアミノ酸配列の比較によって抗原が由来した領域を同定した。最も相同性の小さい、好ましくはヒト由来の配列を選択した。選択領域または選択領域を保有する融合タンパク質を免疫原として使用する。また、選択したタンパク質領域及び融合タンパク質中の残基の疎水性分析を実施する。高疎水性の領域が回避される。また、より重要には、細菌宿主中で融合タンパク質を調製するときに微量コドンが回避される。特に、選択された宿主中の連続する３個以上の微量コドンの含有が回避される。αまたはβサブユニットのタイプまたはサブタイプに特異的な多数のモノクローナル及びポリクローナル抗体を調製した。これらのいくつかを以下の表に示す。代表的な抗体及び抗体の調製に使用したペプチド抗原を以下の表に示す。
【０１２２】
【表３】
2004180691.tif 000004
＊ＧＳＴ遺伝子融合系はＰｈａｒｍａｃｉａから入手できる。Ｓｍｉｔｈら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１参照。系は、遺伝子または遺伝子フラグメントをＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＧＳＴとの融合物として誘発可能な高レベル発現させるように設計されたｐＧＥＸプラスミドを与える。細菌宿主中で発現させ、得られた融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって細菌溶解液から精製する。
【０１２３】
ＧＳＴ融合タンパク質の各々は、同様の融合物及び坑血清の調製が可能なα１Ｃ及びα１Ｄを含むすべてのサブタイプにおいてサブタイプ相同性の小さい領域である細胞質ループ領域IIＳ６−IIＳ１に特異的である。
【０１２４】
異種カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含有する組換え真核細胞の調製
１つ以上のカルシウムチャンネルサブユニットまたは１つのカルシウムチャンネルサブユニットの一部分をコードするＤＮＡを、ＤＮＡを発現または複製する宿主細胞に導入し得る。これらのＤＮＡは、以下の実施例に記載の方法を用いるかまたは当業者に周知の他の手順で導入され得る。クローン化したＤＮＡを適当な発現ベクターに組込み、プラスミドベクターまたは各々が１つ以上の異なる遺伝子をコードするプラスミドベクターの組合わせまたは直鎖状ＤＮＡを用いて真核細胞をトランスフェクションし、トランスフェクト細胞を選択する手順も当業界で周知である［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ］。ヒトカルシウムチャンネルのサブユニットのいずれかをコードするクローン化した全長ＤＮＡをプラスミドベクターに組み込んで真核細胞中で発現させ得る。このようなＤＮＡはゲノムＤＮＡでもよくまたはｃＤＮＡでもよい。各々が少なくとも１つのカルシウムチャンネルサブユニットをコードする１つのプラスミドまたは組み合わせプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトし得る。あるいは、当業界で周知の方法を用い、直鎖状ＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトし得る。
【０１２５】
本発明で提供されるＤＮＡは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞を含む任意の真核細胞中で発現し得るが［例えば、Ｃｒｅｇｇら，（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：４７９参照］、本発明で提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの発現には哺乳類発現系が好ましい。
【０１２６】
異種ＤＮＡをコードするベクターによるトランスフェクションのような当業界で周知の任意の方法によって異種ＤＮＡを導入し得る。哺乳類細胞のトランスフェクションに特に好ましいベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化及びスプライス部位、ベクターを細菌中に維持するために必要な配列を含有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ発現ベクター、または、ｐＣＤＮＡ１もしくはｐｃＤＮＡ−ａｍｐのようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターベースのベクター、並びに、ＭＭＴＶプロモーターベースのベクターである。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡをＣＭＶプロモーターの直後の位置でベクターｐＣＤＮＡ１に挿入された。現在ではベクターｐＣＤＮＡ１が好ましい。
【０１２７】
安定にまたは一過的にトランスフェクトされた哺乳類細胞は、チミジンキナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシンに耐性の遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子を有する発現ベクターを細胞にトランスフェクトすることによって当業界に周知の方法で調製でき、一過的トランスフェクションの場合には、マーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下でトランスフェクト細胞を増殖させる。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含有するベクターｐＣＤＮＡ１の誘導体でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞中で機能性電圧依存性カルシウムチャンネルが産生された。
【０１２８】
異種ＤＮＡはエピソーム要素として細胞中に維持されてもよく、または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。次に、得られた組換え細胞を培養するか、または、このような培養物もしくはその継代培養物から継代培養する（哺乳類細胞の場合には継代させる）。組換え細胞のトランスフェクション、注入及び培養の方法は当業者に周知である。ＤＮＡまたはＲＮＡを導入する真核細胞は、このようなＤＮＡまたはＲＮＡによってトランスフェクト可能であるかまたはこのようなＤＡＮの注入が可能であるいかなる細胞でもよい。実質的にいかなる真核細胞も異種ＤＮＡのビヒクルとして有用であり得る。好ましい細胞は、更にＤＮＡ及びＲＮＡを発現し得る細胞であり、極めて好ましい細胞は異種ＤＮＡによってコードされた１つ以上のサブユニットを含む組換えまたは異種カルシウムチャンネルを形成し得る細胞である。このような細胞は実験的に同定されてもよくまたは容易にトランスフェクトまたは注入される既知の細胞から選択されてもよい。ＤＮＡ導入用の好ましい細胞は、一過的にまたは安定にトランスフェクトされ得る細胞であり、その例としては、ＣＯＳ細胞、マウスＬ細胞、ＣＨＯ細胞、ヒト胚性腎細胞、アフリカミドリザル細胞及び他の当業者に周知のこのような細胞などの哺乳類起原の細胞、アフリカツメガエル卵母細胞のような両生類細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅもしくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞があるがそれに限定されない。注入されたＲＮＡ転写物またはｃＤＮＡの発現に好ましい細胞はアフリカツメガエル卵母細胞である。ＤＮＡのトランスフェクションに好ましい細胞は容易にかつ効率的にトランスフェクトされる細胞である。このような細胞は当業者に周知であるかまたは実験的に同定され得る。好ましい細胞としては、ＤＧ４４細胞及びＨＥＫ２９３細胞があり、特に、液体窒素中で凍結でき次いで解凍させて増殖を再開させ得るＨＥＫ２９３細胞が好ましい。このようなＨＥＫ２９３細胞は例えばＧｏｒｍａｎの米国特許第５，０２４，９３９号に記載されている［Ｓｔｉｌｌｍａｎら，（１９８５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂiｏｌ．５：２０５１−２０６０も参照］。
【０１２９】
細胞は、その内部に導入された異種ＤＮＡを複製するかまたはその内部に導入された異種ＤＮＡを発現させるためのビヒクルとして使用され得る。いくつかの実施態様においては、細胞は、実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルサブユニットまたは異種カルシウムチャンネルを産生する手段として異種ＤＮＡを発現させるビヒクルとして使用される。異種ＤＮＡを含有する宿主細胞をカルシウムチャンネルが発現し得る条件下に培養するとよい。カルシウムチャンネルサブユニットを当業者に周知のタンパク質精製方法を用いて精製し得る。例えば、サブユニットまたはサブユニット含有カルシウムチャンネルをアフィニティ精製するために、本発明で提供される抗体のような１つ以上のサブユニットに特異的に結合し得る抗体を使用してもよい。
【０１３０】
ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及びヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットの実質的に純粋なヒトカルシウムチャンネルのサブユニットが提供される。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットの少なくとも１つを含む実質的に純粋な単離されたカルシウムチャンネルも提供される。また、宿主細胞によってコードされた１つ以上のサブユニットと細胞に導入された異種ＤＮＡもしくはＲＮＡによってコードされた１つ以上のサブユニットとの混合物を含有する実質的に純粋なカルシウムチャンネルも提供される。また、実質的に純粋なサブタイプ−または組織−型特異的カルシウムチャンネルも提供される。
【０１３１】
別の実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニット、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及びヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットの少なくとも１つをコードする異種ＤＮＡを含有する真核細胞が提供される。１つの好適実施態様においては、異種ＤＮＡが真核細胞中で発現され、好ましくはそれはヒトカルシウムチャンネルα１サブユニットをコードしている。
【０１３２】
異種カルシウムチャンネルの発現：電気生理学及び薬理学
カルシウムチャンネル活性を測定する電気生理学的方法は当業者に周知であり本文中に例示されている。機能性カルシウムチャンネルの形成を検出し、得られる電流のカイネティクス及び他の特徴を特性決定するために任意のこのような方法を使用し得る。カルシウムチャンネルを更に特性決定するために、薬理学的試験を電気生理学的測定と併用してもよい。
【０１３３】
機能性異種カルシウムチャンネルの活性の測定に関しては、測定される異種カルシウムチャンネル活性のＳ／Ｎ比を増加させるために、内因性イオンチャンネル活性及び所望の場合には所望のサブユニットを含有しないチャンネルの異種チャンネル活性をディファレンシャル静止電位差の使用のような化学的、薬理学的及び電気生理学的手段によって有意な程度に阻害し得る。
【０１３４】
従って、本発明で提供されるＤＮＡによってコードされるサブユニットの種々の組み合わせを真核細胞に導入する。得られた細胞を試験して、機能性チャンネルが発現されたか否かを確認しチャンネルの特性を決定し得る。特に好ましい様相では、異種ＤＮＡを含有する真核細胞が該ＤＮＡを発現し、組換え機能性カルシウムチャンネル活性を形成する。より好ましい様相では、組換えカルシウムチャンネル活性が、非トランスフェクト宿主細胞には欠如しているタイプの活性であるかまたは非トランスフェクト細胞中で示されない量及び／または薬理学的特性を有するかまたは生物物理学的特性を示すので、容易に検出され得る。
【０１３５】
真核細胞は本発明で提供されるサブユニットのサブタイプの種々の組み合わせによってトランスフェクトされ得る。得られる細胞は、カルシウムチャンネル活性を研究し本発明で提供される薬剤スクリーニングアッセイでの使用に適したカルシウムチャンネルの均一集団を提供するであろう。行った実験は、従来の分類図式が適当でないことを示した。
【０１３６】
トランスフェクト細胞のうちでも機能性異種カルシウムチャンネルを有する組換え真核細胞が好ましい。組換え細胞は、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードする異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物の導入及び発現、より好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする異種ＤＮＡ及び／またはヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードする異種ＤＮＡも発現する異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物の導入及び発現によって産生され得る。特に好ましくは、このような異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物によってコードされるα１、β及びα２サブユニットの各々、及び、任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードする異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写物をこのような組換え細胞中で発現させる。機能性カルシウムチャンネルは好ましくはヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニット及びβサブユニットを少なくとも含み得る。これらの２つのサブユニットを発現する真核細胞及び追加のサブユニットを発現する細胞を、ＤＮＡのトランスフェクション及びＲＮＡ転写物の注入によって調製した。このような細胞は、１つ以上の異種ヒトカルシウムチャンネルサブユニットを含有するカルシウムチャンネルに帰因する電圧依存性カルシウムチャンネル活性を示した。例えば、α１サブユニットとβサブユニットとに加えてα２サブユニットを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞は、脱分極に応じて細胞膜を透過するカルシウム選択イオン流量を増加させ、これは、α２サブユニットがカルシウムチャンネル機能を強めることを示す。漸増比のα２対α１によって細胞をコトランスフェクトし、得られたカルシウムチャンネルの活性を測定した。結果は、他のトランスフェクトされたサブユニットに対してα２をコードするＤＮＡの量を増加させるとカルシウムチャンネル活性が増加することを示す。
【０１３７】
ヒトα１サブユニット、ヒトβサブユニット及びヒトα２サブユニットを少なくとも含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞が好ましい。α１サブユニットだけをコードしているかまたはβ及び／またはα２サブユニットと組み合わせてコードしているｃＤＮＡまたはＲＮＡ転写物を含有する組成物で形質転換した真核細胞を、機能性カルシウムチャンネルを発現する細胞を産生するために使用し得る。異種ｃＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされたヒトサブユニットの全部を含有するヒトカルシウムチャンネルを発現する組換え細胞が特に好ましいので、異種ＤＮＡまたはＲＮＡによってコードされたヒトサブユニットを含有するカルシウムチャンネルを形成するために十分な濃度のサブユニットコーディング核酸をこのような宿主細胞に注入またはトランスフェクトするのが好ましい。サブユニットをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの正確な量及び比は実験的に決定でき、サブユニット、細胞及びアッセイ条件の個々の組み合わせ毎に最適化し得る。
【０１３８】
特に、哺乳類細胞は１つ以上のヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡで一過的及び安定にトランスフェクトされた。このような細胞は、ヒトカルシウムチャンネルに帰因し得る薬理学的及び電気生理学的特性を示す異種カルシウムチャンネルを発現する。しかしながら、このような細胞は均質集団を示し、薬理学的及び電気生理学的データは、ヒトカルシウムチャンネル活性の解明についてこれまでは得られなかった手掛かりを与える。例えば、ＨＥＫ細胞を、α１Ｅ−１、α２ｂ及びβ１−３サブユニットをコードするＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。得られた細胞はこれらのサブユニットを一過的に発現し、これらは、Ｌ−、Ｎ−、Ｔ−及びＰ−型のチャンネルとは異なる電圧活性化カルシウムチャンネルの薬理学的クラスであると考えられる特性を有するカルシウムチャンネルを形成する。観察されるα１Ｅ電流は、他のクラスの電圧活性化カルシウムチャンネルを定義するためにこれまで使用されてきた薬剤及び毒素に感受性でない。
【０１３９】
α１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２をコードするＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞は、ω−コノトキシンに対する感受性及びＮ−型チャンネルの典型的な電流を示す異種カルシウムチャンネルを発現する。均等なｍＲＮＡレベルを達成するために細胞に導入するα１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２のモル比を変更すると、細胞あたりのレセプターの数、電流密度が有意に増加し、ω−コノトキシンのＫｄに影響を与えた。
【０１４０】
α１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２から産生されたこれらのチャンネルの電気生理学的特性を、α１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−３をコードするＤＮＡでＨＥＫ細胞を一過的にトランスフェクトすることによって産生されるチャンネルの特性と比較した。チャンネルは、同様の電圧依存性活性化、実質的に等しい電圧依存性、同様の活性化のカイネティクス、単一指数によって調整され得るテール電流を示した。不活性化のカイネティクスの電圧依存性はすべての被検電圧において有意に違っていた。
【０１４１】
いくつかの実施態様においては、少なくとも１つのＲＮＡ転写物を含有する第１組成物を細胞に導入し、この転写物を細胞中でヒトカルシウムチャンネルのサブユニットとして翻訳することによって、異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞を産生する。好ましい実施態様においては、翻訳されるサブユニットが、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットを含む。より好ましくは、導入される組成物が、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードするＲＮＡ転写物を含有し、且つ、（１）ヒトカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードするＲＮＡ転写物及び／または（２）ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするＲＮＡ転写物を含有する。特に好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルのα１、β及びα２サブユニット及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードするＲＮＡを導入する。クローン化したＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の方法、及び、得られたＲＮＡの真核細胞内注入方法は当業界で周知である。ヒトカルシウムチャンネルのサブユニットのいずれかをコードする全長ＤＮＡのいずれかの転写物を、細胞中で発現させるために真核細胞中に単独で注入してもよくまたは他の転写物と組み合わせて注入してもよい。本発明で提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニットｃＤＮＡクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物の発現には両生類卵母細胞が特に好ましい。機能性異種カルシウムチャンネルを発現する両生類卵母細胞をこの方法によって産生した。
【０１４２】
細胞のアッセイ及び臨床使用並びにカルシウムチャンネルアッセイ
カルシウムチャンネル活性を変調する化合物の同定アッセイ
１つ以上のサブユニットを組換え的に発現する真核細胞の用途としては、被検化合物がカルシウムチャンネルアゴニスト活性を有するかアンタゴニスト活性を有するかを判定するアッセイがある。これらの真核細胞はまた、既知のカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストから特定のカルシウムチャンネルサブタイプ特異性を示すものを選択し、従って疾患特異的または組織特異的な治療薬として有効な化合物を選択するために使用され得る。
【０１４３】
異種ヒトカルシウムチャンネルを発現する真核細胞を使用して、カルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストのようなカルシウムチャンネルの活性変調（modulate）化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。
【０１４４】
アッセイでは特に、ヒトカルシウムチャンネルに特異的な有力なカルシウムチャンネルアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするため、特に特定のヒトカルシウムチャンネルサブタイプに特異的な化合物をスクリーニングするために、本発明で提供される異種ＤＮＡによってコードされた異種ヒトカルシウムチャンネルサブユニットを発現する真核細胞を使用する。このようなアッセイは、構造がいくらか異なるアゴニスト及びアンタゴニストからヒトカルシウムチャンネルの活性変調に特に有用なものを選択し、サブタイプ特異的または組織特異的カルシウムチャンネルアンタゴニスト及びアゴニスト活性を示す化合物を設計または選択するための合理的な薬剤設計の方法と組み合わせて使用され得る。これらのアッセイは、ある種のヒト疾患の治療に対する化合物の相対治療効果を正確に予想させる。更に、サブタイプ特異的及び組織特異的カルシウムチャンネルサブユニットが提供されるので、組織特異的またはサブタイプ特異的組換えカルシウムチャンネルを有する細胞を調製し、ヒトカルシウムチャンネル組織特異的またはサブタイプ特異的薬剤の同定アッセイに使用され得る。
【０１４５】
カルシウムチャンネルサブユニット発現用の宿主細胞は、リガンド結合アッセイにおける異種カルシウムチャンネルサブユニットの検出を実質的に妨害したりまたは機能性アッセイにおけるカルシウム電流の発生のような異種カルシウムチャンネル機能の検出を実質的に妨害したりするタイプまたは量の内因性カルシウムチャンネルサブユニットを産生しないのが望ましい。また、宿主細胞は、生理学的濃度で（一般にはナノモルまたはピコモルの濃度で）、本発明で提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニットの１つまたは全部を含有するカルシウムチャンネルに対する親和性を有する化合物の検出を妨害する内因性カルシウムチャンネルを産生しないのが好ましい。
【０１４６】
カルシウムチャンネルに対する親和性を有する化合物を同定するリガンド結合アッセイに関しては、少なくとも１つの異種α１サブユニットを発現する細胞を使用するのが好ましい。少なくとも１つのα１サブユニットを発現するトランスフェクト真核細胞は、例えばカルシウムチャンネルと特異的に相互作用することが分かっている標識化合物の相互作用を阻害する被検化合物の能力を評価することによって、異種カルシウムチャンネルに特異的に結合する被検化合物の能力を判断するために使用し得る。このようなリガンド結合アッセイはインタクトなトランスフェクト細胞または該細胞から調製された膜に対して実施し得る。
【０１４７】
異種カルシウムチャンネルまたはそのサブユニットを含有する膜に結合または他の方法で相互作用する被検化合物の能力は、任意の適当な方法、例えば、カルシウムチャンネルに対して既知の親和性を有する１種以上の濃度の化合物の存在下または非存在下でこのような膜の結合能力を測定するスキャッチャードプロットのような競合結合分析を用いて測定し得る。必要な場合、結果を、当業者に周知の方法に従って設計された対照実験に比較し得る。例えば、１つ以上のサブユニットをコードする核酸でトランスフェクトしない宿主細胞からの膜調製物を同様に処理したアッセイ結果を陰性対照とし、双方の結果を比較し得る。
【０１４８】
アッセイは、ヒトカルシウムチャンネルの少なくとも１つのサブユニット、好ましくはヒトカルシウムチャンネルの少なくとも１つのα１サブユニットを発現する組換え真核細胞の細胞膜を被検化合物と接触させ、膜に特異的に結合するかまたは膜の異種カルシウムチャンネルの活性を変化させるかもしくは変調する被検化合物の能力を測定する処理を含む。
【０１４９】
好ましい実施態様においては、ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをヒトカルシウムチャンネルのβサブユニット及び／またはヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットと組み合わせて含有するカルシウムチャンネルを有する組換え細胞をアッセイに使用する。このようなアッセイでは、ヒトα１、β及びα２サブユニットの各々を含有する、及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する組換え細胞の使用が特に好ましい。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、カルシウムチャンネル活性を変調する化合物を同定するアッセイは、被検化合物及びカルシウムチャンネル選択イオンを含有する溶液に細胞を接触させたときに異種機能性カルシウムチャンネルを有する真核細胞が示すカルシウムチャンネル活性を測定し、測定されたカルシウムチャンネル活性を被検化合物非含有の溶液中の同じ細胞または実質的に等しい対照細胞のカルシウムチャンネル活性に比較することによって行う。チャンネルが開いたときに内向きの電流を与えるために十分なカルシウムチャンネル選択イオンの濃度を有する溶液中に細胞を維持する。このようなアッセイでは、ヒトカルシウムチャンネルのα１、β及びα２サブユニットの各々及び任意にヒトカルシウムチャンネルのγサブユニットを含むカルシウムチャンネルを発現する組換え細胞の使用が特に好ましい。このようなアッセイの実施方法は当業者に公知である。例えば、アフリカツメガエル卵母細胞とアセチルコリン受容体とを用いる同様の方法［Ｍｉｓｈｉｎａら （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：３６４］及びこのような卵母細胞とナトリウムチャンネルとを用いる同様の方法［Ｎｏｄａら （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２：８２６−８２８］がある。アセチルコリン受容体を用いて行った同様の試験に関しては、例えばＣｌａｕｄｉｏら［（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１６８８−１６９４］を参照するとよい。
【０１５１】
機能性の組換えまたは異種カルシウムチャンネルは当業者に周知の任意の方法で同定され得る。例えば、細胞のイオン選択膜を透過する電流を測定する方法として公知の電気生理学的手順を使用し得る。本発明において提供される１つ以上のサブユニットをコードするＤＮＡを含有する組換え細胞の異種カルシウムチャンネルを透過するカルシウム選択イオン流の量及び時間を、２電極及び全細胞パッチ固定法を用いる電気生理学的記録法を用いて測定した。アッセイ感度を向上させるために、組換えチャンネルを通るカルシウム電流を測定するときに、非カルシウム電流及び内因性カルシウムチャンネルから生じるカルシウム電流を除去または減少させる公知の方法を使用し得る。
【０１５２】
例えば、ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４４は、チャンネルの開状態の持続時間を延長することによってＬ−型カルシウムチャンネル機能を特異的に増進させる［例えば、Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｂ．ら （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１１：５３８−５４４参照］。チャンネルの開時間が延長されると、その結果としてカルシウム電流の量が増加し持続時間が延長する。脱分極電圧コマンドによってイオンチャンネルを活性化した後で細胞膜を再分極するとテール電流を観察し得る。開いたチャンネルは、再分極されて閉鎖即ち「不活性化」するまでに有限時間を要し、この期間にチャンネルを流れる電流をテール電流と呼ぶ。Ｂａｙ Ｋ ８６４４はカルシウムチャンネルの開口事象を延長させるので、テール電流を延長し、より大きくする。
【０１５３】
実際には好ましくは、ヒトカルシウムチャンネルの１つ以上のサブユニットを含有する電圧依存性ヒトカルシウムチャンネルを発現する安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞または注入された細胞は、カルシウムチャンネル活性を変調するカルシウムチャンネルアゴニストまたはアンタゴニストのような物質を同定するアッセイで使用され得る。未知の活性を有する化合物から成る被検化合物がヒトカルシウムチャンネルを介してカルシウムイオンまたは他のイオンの流れを強化、阻害または他の方法で変更するか否かを判断するためのカルシウムチャンネルのアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関する被検化合物の機能性試験は、（ａ）カルシウムチャンネル選択イオンを含有する媒体中で細胞に流入するカルシウムチャンネル選択イオンの流量を調節し得る異種機能性カルシウムチャンネルを発現するようにトランスフェクトまたは注入された真核細胞を、被検化合物の（ｉ）存在下及び（ｉｉ）非存在下に維持し、（ｂ）異種カルシウムチャンネルが実質的に閉鎖され細胞の内因性カルシウムチャンネルが実質的に阻害される条件下に細胞を維持し、（ｃ）段階（ｂ）に維持された細胞の膜を、異種カルシウムチャンネル（好ましくは実質的に該チャンネルだけ）がカルシウムチャンネル選択イオンに透過性になるために十分な程度及び時間を要して脱分極し、（ｄ）被検化合物の存在下の電流の細胞流入量及び持続時間を、被検化合物の非存在下の電流の同一細胞または実質的に同じ細胞への流入量及び持続時間に比較することによって行う。
【０１５４】
従ってアッセイは、本発明で提供される異種機能性カルシウムチャンネルを発現する細胞を使用し、異種機能性チャンネルを介してＣａ++またはＢａ++のようなカルシウムチャンネル選択イオン流の量及び持続時間を強化、拮抗または他の方法で変調する被検化合物の能力を機能的、例えば電気生理学的に測定する。細胞の組換えカルシウムチャンネルを流れる電流の量は、例えば電気生理学的に直接測定されてもよく、または、カルシウム（または他の）イオンに依存的な影響を直接受けながら細胞内で生じる独立反応をモニターすることによって測定されてもよい。任意のカルシウムチャンネル活性評価方法を、本発明で提供される細胞及びアッセイと併用し得る。例えば、化合物のカルシウムチャンネル活性変調能力を試験する方法の１つの実施態様では、異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞を使用してカルシウムチャンネル選択イオン感受性反応の変調による電流量を測定する。該真核細胞は更に、指示（indicator）タンパク質をコードする構造遺伝子に機能し得るように結合された発現用の転写調節要素を含む。指示遺伝子の転写に使用される転写調節要素は、Ｃａ++及びＢａ++のようなカルシウムチャンネル選択イオンに細胞内で反応性である。このような転写に基づくアッセイの詳細は、１９９０年８月７日出願の同一出願人所有の許諾された米国出願０７／５６３，７５１を優先権主張した１９９１年８月７日出願の同一出願人所有のＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／５６２５に記載されている。また、係属中の米国出願０８／２２９，１５０及び０８／２４４，９８５に対応する同一出願人所有の公開ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１１０９０も参照されたい。
【０１５５】
ＬＥＳの診断アッセイ
ＬＥＳは、神経インパルスに正常に反応する運動神経末端からのアセチルコリン放出が不十分であることを特徴とする自己免疫疾患である。ＬＥＳ患者の免疫グロブリン（ＩｇＧ）は個々の電圧依存性カルシウムチャンネルをブロックし、従ってカルシウムチャンネル活性を阻害する［Ｋｉｍ ＆ Ｎｅｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４０５−４０８（１９８８）］。ランベルト−イートン症候群（ＬＥＳ）の診断アッセイが本発明で提供される。ＬＥＳの診断アッセイは、組換え細胞の表面で発現されたヒトカルシウムチャンネルまたは１つもしくは複数の特定サブユニットとＬＥＳ ＩｇＧとの免疫学的反応性に依存する。例えば、このようなアッセイは、本発明によって提供されるヒトカルシウムチャンネルサブユニット及びこのようなサブユニットを発現する細胞によるＬＥＳ ＩｇＧの免疫沈降に基づいてもよい。
【０１５６】
臨床応用
様々な疾病状態の治療に関しては、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡが入手可能になると、ある種の疾病状態の発生に相関関係を有し得る遺伝子の何らかの変異（例えば突然変異）を同定することが可能になる。更に、このような疾病状態の動物モデルを作製し、上記のごとき突然変異を合成ＤＮＡフラグメントに特異的に導入し、次に実験動物に導入するかまたはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系に導入することによっその効果を判定することが可能になる。
【０１５７】
また、ヌクレオチド配列をプローブとして使用して遺伝子スクリーニングを行うことが可能になる。従って、いずれか１つまたはそれ以上のカルシウムチャンネルサブユニットの変異／修飾が関与する疑いのある病理状態を有する患者の核酸サンプルを適当なプローブによってスクリーニングし、内因性カルシウムチャンネルのいずれかに関して何らかの異常が存在するか否かを判断し得る。同様に、カルシウムチャンネル機能不全に関連した疾病状態の家族歴を有する被検者をスクリーニングして、彼らもまたこのような疾病状態に対する素質があるか否かを判断し得る。
【０１５８】
実施例
以下の実施例は例示の目的で与えられており、本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例１】
【０１５９】
ヒト神経電圧依存性カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの単離に使用するライブラリーの調製
Ａ．ＲＮＡ単離
１．ＩＭＲ３２細胞
ＩＭＲ３２細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ．ＣＣＬ１２７，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、ＤＭＥＤ、１０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）と１．０ｍＭのジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）中で１０日間増殖させた。Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｍ［（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１４８７−１４９７］に記載された手順で全ＲＮＡを細胞から単離した。ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを標準手順に従って選択した［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ｐｇ．７．２６−７．２９］。
【０１６０】
２．ヒト視床組織
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｎｋ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡから入手し、−７０℃で冷凍保存しておいたヒト視床組織（２．３４ｇ）を液体窒素の存在下に乳鉢と乳棒とを用いて微粉砕し、細胞を１２ｍｌの溶解バッファ（５Ｍのイソチオシアン酸グアニジニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．４、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５％のβ−メルカプトエタノール）中で溶解した。その溶解液に溶解バッファを添加し、最終容量１７ｍｌとした。Ｎ−ラウリルサルコシン及びＣｓＣｌを、最終容量１８ｍｌ中の最終濃度が夫々４％及び０．０１ｇ／ｍｌになるまで混合物に添加した。
【０１６１】
Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローター内でサンプルを９，０００ｒｐｍで室温で１０分間遠心し、不溶物をペレットとして除去した。上清を等しい部分量に分け、各アリコートを、別の遠心管に収容した５．７ＭのＣｓＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡの溶液からなる２ｍｌのクッションに重層し、管あたり約９ｍｌとした。サンプルをＳＷ４１ローター内で３７，０００ｒｐｍで２０℃で２４時間遠心した。
【０１６２】
遠心後、各ＲＮＡペレットを３ｍｌのＥＴＳ（１０ｍＭのＴＲＩＳ，ｐＨ７．４、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＳＤＳ）中に再懸濁させ、１つの管に一緒に導入した。ＲＮＡを０．２５ＭのＮａＣｌ及び２倍容の９５％エタノールで沈殿させた。
【０１６３】
沈殿物を遠心によって収集し、４ｍｌのＰＫバッファ（０．０５ＭのＴＲＩＳ，ｐＨ８．４、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ）中に再懸濁させた。サンプルにプロテイナーゼＫを最終濃度２００μｇ／ｍｌまで添加した。サンプルを２２℃で１時間インキュベートし、次いで、等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（５０：４８：２）で２回抽出し、次いで等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で１回抽出した。ＲＮＡをエタノール及びＮａＣｌで沈殿させた。沈殿物を４００μｌのＥＴＳバッファに再懸濁させた。全ＲＮＡの収量は約１．０ｍｇであった。実施例１．Ａ．１に記載の標準方法に従ってポリＡ＋ＲＮＡ（３０μｇ）を全ＲＮＡから単離した。
【０１６４】
Ｂ．ライブラリー構築
標準方法に従って二重鎖ｃＤＮＡを合成した［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８参照］。（１）第１ストランドのｃＤＮＡをプライムするために使用したオリゴヌクレオチド、（２）二重鎖ＤＮＡに結合したアダプター、（３）遊離または非使用アダプターの除去に使用した方法、及び、（４）λファージベクターに結合した分画ｃＤＮＡの大きさ、が違う以外は、各ライブラリーを実質的に同様に調製した。
【０１６５】
１．ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１
ＩＭＲ３２ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（実施例１．Ａ．１）を鋳型として用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いてプライムした。一本鎖ｃＤＮＡを二重鎖ｃＤＮＡに変換すると、収量約２μｇが得られた。次に、ＳｎａＢＩ及びＸｈｏＩ制限部位も含むＥｃｏＩアダプター：
５’−ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＧＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣ−３’＝22-mer（配列番号15）
３’−        ＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＧ−５’＝18-mer（配列番号16）
を以下の手順で二重鎖ｃＤＮＡに付加した。
【０１６６】
ａ．１８−ｍｅｒのリン酸化
１０μｌの総量で１８−ｍｅｒ（２２５ピコモル）と［３２Ｐ］γ−ＡＴＰ（７０００Ｃｉ／ミリモル；１．０μｌ）及びキナーゼ（２Ｕ）とを一緒にし、３７℃で１５分間インキュベートする標準方法［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８参照］によって１８−ｍｅｒをリン酸化した。インキュベーション後、１μｌの１０ｍＭのＡＴＰと追加の２Ｕのキナーゼとを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。次に１０分間煮沸してキナーゼを失活させた。
【０１６７】
ｂ．２２−ｍｅｒのハイブリダイゼーション
２２５ピコモルの２２−ｍｅｒ（及び容量１５μｌを与える水）の添加及び６５℃で５分間のインキュベーションによって２２−ｍｅｒをリン酸化１８−ｍｅｒにハイブリダイズさせた。次に反応物を室温まで徐冷した。
【０１６８】
この場合アダプターは１５ピコモル／μｌの濃度で存在し、ｃＤＮＡ−アダプター結合の準備が整った。
【０１６９】
ｃ．ｃＤＮＡに対するアダプターの結合
標準プロトコル［例えばＳａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８参照］を用いてＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩアダプターを二重鎖ｃＤＮＡに結合した後で、混合物を７２℃で１５分間加熱してリガーゼを失活させた。ｃＤＮＡ結合反応物（２０μｌ）に、試薬すなわち水（２４μｌ）、１０×キナーゼバッファ（３μｌ）、１０ｍＭのＡＴＰ（１μｌ）及びキナーゼ（２Ｕ／μｌを２μｌ）を添加し、３７℃で３０分間加熱した。２μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、次いでフェノール／クロロホルムで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出した。
【０１７０】
ｄ．ｃＤＮＡの大きさ選択及びパッケージング
５ｍｌのセファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて遊離または非結合アダプターを除去することによって、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩアダプターと結合した二重鎖ｃＤＮＡを精製した。１００μｌの画分を収集し、放射能のモニターによってｃＤＮＡ含有と判定された画分をプールし、エタノール沈殿させ、ＴＥバッファに再懸濁させ、１％アガロースゲルにロードした。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色し、１〜３ｋｂの画分をゲルから切り出した。アガロースに封入されたｃＤＮＡを“Ｇｅｎｅｌｕｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて溶出させた。溶出したｃＤＮＡをエタノール沈殿によって収集し、０．１０ピコモル／μｌでＴＥバッファに再懸濁させた。ｃＤＮＡを５μｌの反応容量中で、１μｇのＥｃｏＲＩ消化し脱リン酸化したλｇｔ１１に、ｃＤＮＡがλｇｔ１１ベクターよりも２倍〜４倍のモル過剰比になる量で結合させた。ｃＤＮＡインサートを含む結合λｇｔ１１を、Ｇｉｇａｐａｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）キットを用いてλファージビリオンにｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージした。パッケージしたファージを大腸菌Ｙ１０８８の菌叢上で平板培養してスクリーニング用に調製した。
【０１７１】
２．ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃２
このライブラリーは、１〜３ｋｂのフラグメントでなく３〜９ｋｂのｃＤＮＡフラグメントをλｇｔ１１に結合させる以外は上記（実施例１．Ｂ．１）と同様に調製した。
【０１７２】
３．ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃３
ＩＭＲ３２細胞ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（実施例１．Ａ．１）を鋳型として使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。第１ストランドｃＤＮＡ合成のプライマーは、ランダムプライマー（ヘキサデオキシ−ヌクレオチド［ｐｄ（Ｎ）６］ Ｃａｔ ＃５０２０−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）であった。二重鎖ｃＤＮＡを合成し、ＥｃｏＲＩ、ＳｎａＢＩ、ＸｈｏＩアダプターをｃＤＮＡに付加し、未結合のアダプターを除去し、アダプターと結合した二重鎖ｃＤＮＡを実施例１．Ｂ．１の記載と同様にアガロースゲルで分画した。１．８ｋｂよりも大きいｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出させ、λgｔ１１に結合し、パッケージし、（実施例１．Ｂ．１に記載のように）Ｙ１０８８の菌叢に平板培養した。
【０１７３】
４．ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃４
ＩＭＲ３２細胞ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（実施例１．Ａ．１）を鋳型として使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。第１ストランドｃＤＮＡ合成のプライマーは、α１Ｄ（ＶＤＣＣIII）タイプのα１サブユニット（実施例２．Ａ参照）をコードする配列（配列番号１のヌクレオチド２９２７−２９５６の相補的配列）に特異的なオリゴヌクレオチド８９−３６５ａ、α１Ｃ（ＶＤＣＣII）タイプのα１サブユニット（実施例２．Ｂ参照）をコードする配列（配列番号３のヌクレオチド８５２−８７３の相補的配列）に特異的なオリゴヌクレオチド８９−４９５、α１Ｃサブユニットをコードする配列に特異的なオリゴヌクレオチド９０−１２（配列番号３のヌクレオチド２４９６−２５２０の相補的配列）であった。次に、１．８ｋｂでなく１．５ｋｂを上回る大きさのｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出させる以外は上記（実施例１．Ｂ．３）と同じ手順でｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１７４】
５．ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃５
１．８ｋｂでなく１．２ｋｂを上回る大きさのｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出させる以外は上記（実施例１．Ｂ．３）と同じ手順でｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【０１７５】
６．ヒト視床ｃＤＮＡライブラリー＃６
ヒト視床ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（実施例１．Ａ．２）を鋳型として使用して一本鎖ｃＤＮＡを合成した。第１ストランドの合成をプライムするためにオリゴ（ｄＴ）を使用した（実施例１．Ｂ．１）。二重鎖ｃＤＮＡを合成し（実施例１．Ｂ．１）、配列：
5’CCATGGTACCTTCGTTGACG3’＝20−mer（配列番号１７）
3’GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA5’＝24−mer（配列番号１８）
のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩアダプターを用い、上記（実施例１．Ｂ．１）の１８−ｍｅｒの代わりに２０−ｍｅｒ、２２−ｍｅｒの代わりに２４−ｍｅｒを二重鎖ｃＤＮＡに結合した。ｃＤＮＡ−アダプター混合物を１ｍｌのＢｉｏ Ｇｅｌ Ａ−５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）カラムに通すことによって未結合のアダプターを除去した。画分（３０μｌ）を収集し、放射能の第１ピークに存在する１μｌの各画分を１％アガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、ゲルを真空ゲルドライヤーで乾燥し、ｘ線フィルムに露光した。６００ｂｐよりも大きいｃＤＮＡフラグメントを含有する画分をプールし、エタノール沈殿させ、λｇｔ１１に結合させた（実施例１．Ｂ．１）。ｃＤＮＡライブラリーの構築を上記（実施例１．Ｂ．１）の手順で完了した。
【０１７６】
Ｃ．ハイブリダイゼーション及び洗浄条件
ｃＤＮＡライブラリー、ＤＮＡサザン転移物またはノーザン転移物をスクリーニングするために、定型化した方法で固定化ＤＮＡに対する放射性標識核酸のハイブリダイゼーションを標準ハイブリダイゼーション条件下で実施した［ハイブリダイゼーション：５０％脱イオン化ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの音波処理ニシン精子ＤＮＡ（Ｃａｔ ＃２２３６４５、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、４２℃；洗浄：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃］。ＳＳＰＥ及びＤｅｎｈａｒｄｔの配合比並びに脱イオン化ホルムアミドの調製は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８に記載されている。いくつかのハイブリダイゼーションにおいては、標準ハイブリダイゼーション条件の５０％脱イオン化ホルムアミドを１０％の脱イオン化ホルムアミドに代えることによってより低い緊縮性条件を使用した。
【０１７７】
フィルターから非特異的プローブを除去する洗浄条件は以下に記載のような高、中または低緊縮性条件を使用した。
【０１７８】
（１）高緊縮性:０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
（２）中緊縮性:０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
（３）低緊縮性:１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃
選択的バッファ、塩及び温度を用いて同様の緊縮性が得られることは理解されよう。
【実施例２】
【０１７９】
ヒト神経カルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするＤＮＡの単離
Ａ．α１ＤサブユニットをコードするＤＮＡの単離
１．部分的α１Ｄ ｃＤＮＡクローンの参照表
５’及び３’の非翻訳配列の部分を加えた完全α１Ｄコーディング配列を特性決定するために、多数のα１Ｄ特異的ｃＤＮＡクローンを単離した。配列番号１は、完全α１Ｄ ＤＮＡコーディング配列と、翻訳開始と推定されるアデニンヌクレオチドに隣接のグアニジンヌクレオチドで終結するα１Ｄ５’非翻訳配列の５１０ヌクレオチドと、３’非翻訳配列の６４２ヌクレオチドとを示す。配列番号１はまた、推定アミノ酸配列を示す。α１Ｄ配列と配列番号１に示された全長α１Ｄ ＤＮＡ配列に対する各クローンのヌクレオチド位置とを特性決定するために使用した部分的ｃＤＮＡクローンの表を以下に示す。これらのクローンの単離及びキャラクタリゼーションについては後述する（実施例２．Ａ．２）。
【０１８０】
【表４】
2004180691.tif 000005
＊ＩＭＲ３２ １．１３６の５’の１６２７ヌクレオチドは実施例２．Ａ．２．ｄに記載のイントロン及び追加エキソンをコードしている。
@ＩＭＲ３２ １．８０はヌクレオチド２９８４−３１３１及びヌクレオチド５３０３−５３４９（配列番号１）の２つの欠失を含む。１４８ヌクレオチドの欠失（ヌクレオチド２９８４−３１３１）を実施例２．Ａ．３．ｂに記載のポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって修正した。
#ＩＭＲ３２ １．３６は１３２ヌクレオチド（ヌクレオチド３０８１−３２１２）の欠失を含む。
【０１８１】
２．実施例２．Ａ．１に表示した個々のクローンの単離及びキャラクタリゼーション
ａ．ＩＭＲ３２ １．３６
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１（実施例１．Ｂ．１）の２×１０６の組換え体を、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１ ｃＤＮＡをコードする領域の放射性標識フラグメントの混合物を用いて１５０ｍｍのプレートあたり約２００，０００プラークの密度でスクリーニングする重複試験を行った［ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニットｃＤＮＡの配列に関してはＴａｎａｂｅら （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３１３−３１８参照］。
【０１８２】
フラグメント                  ヌクレオチド
ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ            −７８−１００６
ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ          １００６−２６５３
ＡｐａＩ−ＡｐａＩ            ３０９３−４１８２
ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ          ４４８７−５３１０
低緊縮性ハイブリダイゼーション条件（実施例１．Ｃ）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、フィルターを低緊縮性条件下（実施例１．Ｃ）で洗浄した。スクリーニングした２×１０６の組換え体のうちでα１Ｄ特異的組換え体（ＩＭＲ３２ １．３６）が１つだけ同定された。ＩＭＲ３２ １．３６を標準方法でプラーク精製し（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８）、ｐＧＥＭ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。
【０１８３】
ｂ．ＩＭＲ３２ １．８０
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃２（実施例１．Ｂ．２）の約１×１０６の組換え体を、ＩＭＲ３２ １．３６ ｃＤＮＡフラグメント（実施例２．Ａ．１）をプローブとして用いて１５０ｍｍのプレートあたり約１００，０００プラークの密度でスクリーニングする重複試験を実施した。標準ハイブリダイゼーション条件を使用し、フィルターを高緊縮性条件下（実施例１．Ｃ）で洗浄した。３つの陽性プラークが同定され、その１つがＩＭＲ３２ １．８０であった。ＩＭＲ３２ １．８０を標準方法によってプラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。
【０１８４】
ｃ．ＩＭＲ３２ １．１４４
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃３（実施例１．Ｂ．３）の約１×１０６の組換え体をＩＭＲ３２ １．８０のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド２０８３−２５１８）でスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例１．Ｃ）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮性条件下で（実施例１．Ｃ）フィルターを洗浄した。３つの陽性プラークを同定したが、その１つがＩＭＲ３２ １．１４４であった。ＩＭＲ３２ １．１４４をプラーク精製し、制限地図を作製し、ｃＤＮＡインサートをｐＧＥＭ７Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｏｓｎ，ＷＩ）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、ＩＭＲ３２ １．１４４が７つの開始可能メチオニン（配列番号１のヌクレオチド５１１−５３１）をコードする一連のＡＴＧコドンを有することが判明した。核酸増幅分析及びこれらの７つのＡＴＧコドンをコードするクローン化した核酸増幅分析産物のＤＮＡ配列決定によって、この配列がｄｂｃＡＭＰ誘発ＩＭＰ３２細胞中で発現されたα１Ｄ転写物中に存在することが確認された。
【０１８５】
ｄ．ＩＭＲ３２ １．１３６
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃４（実施例１．Ｂ．４）の約１×１０６の組換え体をＩＭＲ３２ １．８０（実施例２．Ａ．１）のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド２０８３−２５１８）でスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例１．Ｃ）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮性条件下（実施例１．Ｃ）でフィルターを洗浄した。６つの陽性プラークを同定したが、その１つがＩＭＲ３２ １．１３６であった。ＩＭＲ３２ １．１３６をプラーク精製し、制限地図を作製し、ｃＤＮＡインサートを標準プラスミドベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、ＩＭＲ３２ １．１３６が不完全にスプライスされたα１Ｄ転写物をコードしていることが判明した。クローンは約６４０ｂｐのイントロンに続く配列番号１のヌクレオチド１６２７−２９８８を含む。このイントロンの前に、α１ＤサブユニットのＩＳ６トランスメンブランドメインをコードしている代替エキソンである１０４ヌクレオチドのエキソン（配列番号２）が存在し、このエキソンは完全にスプライスされたα１Ｄ転写物を産生すべく配列番号１のヌクレオチド１６２７−１７３０に置換し得る［ＩＳ１−IVＳ６トランスメンブラン用語の記述に関しては、例えばＴａｎａｂｅら （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３１３−３１８を参照されたい］。
【０１８６】
ｅ．ＩＭＲ３２ １．１６３
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃３（実施例１．Ｂ．３）の約１×１０６の組換え体を、ヌクレオチド５８１１−６４６８（配列番号１）を含むＩＭＲ３２ １．８０（実施例２．Ａ．１）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩフラグメントでスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件（実施例１．Ｃ）を用いてハイブリダイゼーションを実施し、高緊縮性条件下（実施例１．Ｃ）でフィルターを洗浄した。３つの陽性プラークを同定したが、その１つがＩＭＲ３２ １．１６３であった。ＩＭＲ３２ １．１６３をプラーク精製し、制限地図を作製し、ｃＤＮＡインサートを標準プラスミドベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。このキャラクタリゼーションによって、ＩＭＲ３２ １．１６３がα１Ｄ末端コドン、ヌクレオチド６９９４−６９９６（配列番号１）を含むことが判明した。
【０１８７】
３．全長α１Ｄ ｃＤＮＡ［ｐＶＤＣＣIII（Ａ）］の構築
α１Ｄ ｃＤＮＡクローンＩＭＲ３２ １．１４４、ＩＭＲ３２ １．１３６、ＩＭＲ３２ １．８０及びＩＭＲ３２ １．１６３（実施例２．Ａ．２）はオーバーラップしており、ヌクレオチド２９８４−３１３１（配列番号１）の１４８ｂｐの欠失以外は全α１Ｄをコードする配列であるヌクレオチド５１１−６９９３（配列番号１）を含む。真核細胞発現ベクター中で全長α１Ｄ ｃＤＮＡを作製するためにこれらの部分的ｃＤＮＡクローン断片を結合した。得られたベクターをｐＶＤＣＣIII（Ａ）と呼ぶ。ｐＶＤＣＣIII（Ａ）の構築は以下に詳細に記載する４段階で行った。（１）ＩＭＲ３２ １．１４４、ＩＭＲ３２ １．１３６及びＩＭＲ３２ １．８０の断片を用いるｐＶＤＣＣIII／５’の構築、（２）ｐＶＤＣＣIII／５’のＩＭＲ３２ １．８０部分の１４８ヌクレオチドの欠失を修正するｐＶＤＣＣIII／５’．３の構築、（３）ＩＭＲ３２ １．８０部分及びＩＭＲ３２ １．１６３部分を用いるｐＶＤＣＣIII／３’．１の構築、及び、（４）ｐＶＤＣＣIII／５’．３インサートの一部分とｐＶＤＣＣIII／３’．１のインサートとｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）との結合によるｐＶＤＣＣIII（Ａ）の形成。ベクターｐｃＤＮＡ１は、哺乳類宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼIIによって認識される構成的プロモーターであるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する真核細胞発現ベクターである。
【０１８８】
全長構築物の調製に使用したＤＮＡフラグメントの各々を、ＤＥ８１フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ）に対するアガロースゲル電気泳動及び１．０ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴＲＩＳ，ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡを用いるフィルターペーパーからの溶出によって精製した。典型的には、１０μｌの反応容量中に等モル比のインサートフラグメントをベクターに対して２倍のモル過剰量のインサート総量で用いて結合させた。ＤＮＡの使用量は通常は約５０ｎｇ〜１００ｎｇであった。
【０１８９】
ａ．ｐＶＤＣＣIII／５’
ｐＶＤＣＣIII／５’を構築するために、ＩＭＲ３２ １．１４４（実施例２．Ａ．２．ｃ）をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ベクター（ｐＧＥＭ７Ｚ）、α１Ｄのヌクレオチド１−５１０（配列番号１）及びα１Ｄのヌクレオチド５１１−１７３２（配列番号１）を含有するフラグメントをゲル電気泳動によって単離した。ＩＭＲ３２ １．１３６（実施例２．Ａ．２．ｄ）のヌクレオチド１７３３−２６７１（配列番号１）のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩフラグメントを単離し、ＩＭＲ３２ １．８０（実施例２．Ａ．２．ｂ）のヌクレオチド２６７２−４４９２（配列番号１）のＡｐａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメントを単離した。３つのＤＮＡクローンを結合させて、ヌクレオチド１−５１０（配列番号１の５’非翻訳配列）とヌクレオチド５１１−４４９２（配列番号１）とを含有するｐＶＤＣＣIII／５’を形成した。
【０１９０】
ｂ．ｐＶＤＣＣIII／５’．３
ＩＭＲ３２ １．３６及びＩＭＲ３２ １．８０のＤＮＡ配列の比較から、これらの２つのｃＤＮＡクローンはヌクレオチド２９８４−３２１２のα１Ｄコーディング配列が違うことが判明した。ＩＭＲ３２ １．８０及びｄｂｃＡＭＰ誘発（１．０ｍＭ、１０日間）ＩＭＲ３２細胞質ＲＮＡ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（Ｅｄｓ） （１９８８） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに従って単離）の核酸増幅分析によれば、ＩＭＲ３２ １．８０がヌクレオチド２９８４−３１３１（配列番号１）の１４８ヌクレオチドの欠失を有し、ＩＭＲ３２ １．３６がヌクレオチド３０８１−３２１２の１３２ヌクレオチドの欠失を有することが判明した。核酸増幅分析を行うために、増幅反応をα１Ｄ特異的オリゴヌクレオチド１１２（配列番号１のヌクレオチド２５４８−２５７２）及び３１１（配列番号１のヌクレオチド３９２８−３９５７の相補的配列）によってプライムした。次に、これらの産物をα１Ｄ特異的オリゴヌクレオチド３１０（配列番号１のヌクレオチド２５８３−２６０８）及び３１２（ヌクレオチド３８８３−３９０９の相補的配列）を用いて再増幅した。ＡｃｃＩ及びＢｇｌII制限部位を含むこの再増幅産物をＡｃｃＩ及びＢｇｌIIによって消化し、ヌクレオチド２７６５−３８９０（配列番号１）のＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメントを、ＡｃｃＩ−ＢｇｌII消化したｐＶＤＣＣIII／５’にクローニングして、欠失を有するＡｃｃＩ−ＢｇｌII ｐＶＤＣＣIII／５’フラグメントに置換した。この新しい構築物をｐＶＤＣＣIII／５’．３と命名した。ｐＶＤＣＣIII／５’．３の増幅領域の配列決定によれば、ＩＭＲ３２ １．８０中の１４８ヌクレオチドの欠失が確認された。
【０１９１】
ｃ．ｐＶＤＣＣIII／３’．１
ｐＶＤＣＣIII／３’．１を構築するために、ＩＭＲ３２ １．１６３（実施例２．Ａ．２．ｅ）のｃＤＮＡインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にＸｈｏＩフラグメントとしてサブクローニングした。ｃＤＮＡフラグメントのＸｈｏＩ部位に、ｃＤＮＡライブラリーの構築に使用したアダプター（実施例１．Ｂ．３）を付加した。得られたプラスミドの制限酵素消化物の分析によって確認すると、インサートは、ＩＭＲ３２ １．１６３のインサートの翻訳方向がプラスミド中に存在するｌａｃＺ遺伝子の方向の逆になるように配向されていた。その理由は、このプラスミドによって形質転換されたＤＨ５α細胞中でｌａｃＺ遺伝子との融合によってα１Ｄ配列の発現の可能性が生じることを防止するためである。次に、このプラスミドをＨｉｎｄIII及びＢｇｌIIによって消化し、ＨｉｎｄIII−ＢｇｌIIフラグメント（ＨｉｎｄIII部位はベクターに由来し、ＢｇｌII部位は配列番号１のヌクレオチド６２２０にある）を除去し、このようにしてＩＭＲ３２ １．１６３クローンのヌクレオチド５２００−６２２０（配列番号１）を欠失させ、ヌクレオチド６２２１−７６３５（配列番号１）にあたる３’のＢｇｌII−ＸｈｏＩフラグメントを含むプラスミドの残部からこの配列を除去する。次に、ＩＭＲ３２ １．８０からのＨｉｎｄIII−ＰｖｕIIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド４４９３−５２９６）と、ＩＭＲ３２ １．１６３からのＰｖｕII−ＢｇｌIIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド５２９４−６２２０）と、ＩＭＲ３２ １．１６３の３’のＢｇｌII／ＸｈｏＩフラグメント（配列番号１のヌクレオチド６２２１−７６３５）を含むＨｉｎｄIII−ＢｇｌII消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドとを一緒にスプライシングすることによってｐＶＤＣＣIII／３’．１を作製した。
【０１９２】
ｄ．ｐＶＤＣＣIII（Ａ）：全長α１Ｄ構築物
ｐＶＤＣＣIII（Ａ）を構築するためにｐＶＤＣＣIII／５’．３（実施例２．Ａ．３．ｂ）のＤｒａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント（配列番号１のヌクレオチド３３０−５１０の５’非翻訳配列及び配列番号１のヌクレオチド５１１−４４９２のコーディング配列）を単離した。ｐＶＤＣＣIII／３’．１のＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩフラグメント（配列番号１のヌクレオチド４４９３−７６３５とアダプターのＸｈｏＩ部位とを含む）（実施例２．Ａ．３．ｃ）を単離した。プラスミドベクターｐｃＤＮＡ１をＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩによって消化し、アガロースゲルで単離した。３つのＤＮＡフラグメントを結合し、ＭＣ１０６１−Ｐ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を形質転換した。単離クローンを制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって分析し、互いに正確に結合したＤｒａＩ−ＨｉｎｄIII、ＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを含み、平滑末端ＤｒａＩ及びＥｃｏＲＶ部位が一緒に結合して環状プラスミドを形成したｐＶＤＣＣIII（Ａ）を同定した。
【０１９３】
α１Ｄサブユニットのアミノ末端は連続する７つの５’メチオニンコドン（配列番号１のヌクレオチド５１１−５３１）によってコードされている。この５’部分と２つのリシン残基をコードするヌクレオチド５３２−５３７とがｐＶＤＣＣIII（Ａ）から欠失し、有効なリボソーム結合部位（５’−ＡＣＣＡＣＣ−３’）によって置換されてｐＶＤＣＣIII．ＲＢＳ（Ａ）を形成していた。この構築物の転写物をアフリカツメガエル卵母細胞に注入した発現実験では、組換え電圧依存性カルシウムチャンネル発現レベルがｐＶＤＣＣIII（Ａ）の転写物を注入した卵母細胞の発現レベルに比べて向上していなかった。
Ｂ．α１ｃサブユニットをコードするＤＮＡの単離
１．部分的α１ｃ ｃＤＮＡクローンの参照表
α１ｃコーディング配列、α１ｃ翻訳開始及びα１ｃの代替スプライス領域を特性決定するために多数のα１ｃ特異的ｃＤＮＡクローンを単離した。配列番号３は１つのα１ｃコーディング配列(α１ｃ−１)と推定アミノ酸配列とを示す。配列番号３６はα１ｃ−２と命名した別のスプライス変異体を示す。配列番号４及び５は、α１ｃスプライス変異体の可能な２つのアミノ末端をコードしている。配列番号６はIV Ｓ３トランスメンブランドメインの代替エキソンをコードしている。他のα１ｃ変異体は配列番号３または３６の末端に代えて代替アミノ末端を選択し、及び／または、ヌクレオチド３９０４−３９８７に代えて例えば配列番号３の適当な位置に代替エキソン(配列番号６)を挿入することによって構築され得る。更に、別のα１ｃスプライス変異体を産生するために、７５ヌクレオチドの配列(配列番号３のヌクレオチド１３９１−１４６５)を欠失または挿入し得る。
【０１９４】
α１ｃ配列を特性決定するために使用したクローンと、特性決定したα１ｃ配列(配列番号３)に対する各クローンのヌクレオチド位置とを以下の表に示す。これらのｃＤＮＡクローンの単離及びキャラクタリゼーションに関しては後述する(実施例２．Ｂ．２)。
【０１９５】
【表５】
2004180691.tif 000006
＊ＩＭＲ３２ １．８６はウサギ心筋カルシウムチャンネルα１サブユニットｃＤＮＡ配列に比較して７３ヌクレオチドの欠失を有している。
＠１．１６Ｇはα１ｃゲノムクローンである。
【０１９６】
２．実施例２．Ｂ．１に記載のクローンの単離及びキャラクタリゼーション
ａ．ＣＮＳ１．３０
ヒト視床ｃＤＮＡライブラリーＮｏ．６(実施例１．Ｂ．６)の約１×１０６の組換え体を、実施例２．Ａ．２．ａに記載のウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα１ ｃＤＮＡのフラグメントによってスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下(実施例１．Ｃ)でフィルターを洗浄した。６つの陽性プラークを同定し、その１つがＣＮＳ１．３０であつた。ＣＮＳ１．３０をプラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＣＮＳ１．３０は、ヌクレオチド２１９９−３９０３(配列番号３)のα１ｃ特異的配列と、その直後に続く２つの同定された代替α１ｃエキソン(配列番号６)の一方のヌクレオチド１−８４とをコードしている。配列番号６の３’のＣＮＳ１．３０はイントロンを含み、従って、ＣＮＳ１．３０は部分的にスプライスされたα１ｃ転写物をコードしている。
【０１９７】
ｂ．１．１６Ｇ
ウサギ骨格筋ｃＤＮＡフラグメント(ヌクレオチド−７８〜１００６、実施例２．Ａ．２．ａ)を用いてλＥＭＢＬ３に基づくヒトゲノムＤＮＡライブラリー(Ｃａｔ＃ＨＬ１００６ｄ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)の約１×１０６の組換え体をスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下(実施例１．Ｃ)でフィルターを洗浄した。１４の陽性プラークを同定し、その１つが１．１６Ｇであつた。クローン１．１６Ｇをプラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、部分をＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＤＮＡ配列決定から、１．１６Ｇが実施例２．Ｂ．１に記載のようなα１ｃ特異的配列をコードしていることが判明した。
【０１９８】
ｃ．ＩＭＲ３２ １．６６及びＩＭＲ３２ １．６７
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃５(実施例１．Ｂ．５)の約１×１０６の組換え体を、α１ｃ配列(配列番号３のヌクレオチド７５８−８６７)をコードしている１．１６Ｇ(実施例２．Ｂ．２．ｂ)の１５１ｂｐのＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメントでスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを行った。次に、フィルターを６５℃の０．５×ＳＳＰＥで洗浄した。陽性プラークのうちで、ＩＭＲ３２ １．６６及びＩＭＲ３２ １．６７を同定した。ハイブリダイズするプラークを精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。これらのｃＤＮＡクローンの２つ、ＩＭＲ３２ １．６６及び１．６７は、記載したような(実施例２．Ｂ．１)α１ｃサブユニットをコードしている。更に、ＩＭＲ３２ １．６６は９１６ヌクレオチド(配列番号３)の３’のヌクレオチドで始まるＧＴスプライスドナージヌクレオチドによってマークされる部分的にスプライスされたα１ｃ転写物をコードしている。１．６６の内部のイントロン配列は１０１ヌクレオチドの長さである。ＩＭＲ３２ １．６６はヌクレオチド１−３(配列番号３)のα１ｃ翻訳開始をコードしており、５’非翻訳配列の１３２ヌクレオチド(配列番号４)がＩＭＲ３２ １．６６の開始コドンに先行して存在する。
【０１９９】
ｄ．ＩＭＲ３２ １．３７及びＩＭＲ３２ １．３８
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１(実施例１．Ｂ．１)の約２×１０６の組換え体をＣＮＳ １．３０ ｃＤＮＡフラグメント(実施例２．Ｂ．２．ａ)によってスクリーニングした。低緊縮性ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを行い、低緊縮性条件下(実施例１．Ｃ)でフィルターを洗浄した。４つの陽性プラークを同定し、プラーク精製し、制限地図を作製し、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。２つのクローンＩＭＲ３２ １．３７及びＩＭＲ３２ １．３８は実施例２．Ｂ．１に記載のようなα１ｃ特異的配列をコードしている。
【０２００】
ＩＭＲ３２ １．３７とＩＭＲ３２ １．３８とのＤＮＡ配列比較から、α１ｃ転写物がＩＶＳ３トランスメンブランドメインをコードする２つのエキソンを含むことが判明した。ＩＭＲ３２ １．３７はヌクレオチド３９０４−３９８７(配列番号３)の単一エキソンを有しており、ＩＭＲ３２ １．３８はヌクレオチド３９０４−３９８７(配列番号３)とそれに続くヌクレオチド１−８４(配列番号６)とから成る２つの並列エキソンを含むように変則的にスプライスされていると考えられる。ＩＶＳ３領域をコードする２つのエキソンのいずれかを含むようなα１ｃ転写物の代替スプライスは、ＣＮＳ１．３０配列とＩＭＲ３２ １．３７配列との比較によって確認された。ＣＮＳ１．３０は、ＩＭＲ３２ １．３７のヌクレオチド２１９９−３９０３(配列番号３)と同じ配列に先行されたヌクレオチド１−８４(配列番号６)を含んでいる。実施例２．Ｂ．２．ａに記載されているように、ヌクレオチド１−８４(配列番号６)の後にイントロンが続いている。２つの代替エキソンは、ＣＮＳ１．３０及びＩＭＲ３２ １．３７によって示されるヌクレオチド３９０３(配列番号３)に隣接してスプライスされている。
【０２０１】
ｅ．ＩＭＲ３２ １．８６
オリゴヌクレオチドプローブ９０−９(配列番号３のヌクレオチド１４６２−１４９１)及び９０−１２(配列番号３のヌクレオチド２４９６−２５２０)を用いた重複試験によってＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃１(実施例１．Ｂ．１)をスクリーニングした。ＩＭＲ３２ １．６７の３’端(配列番号３のヌクレオチド１７１７)とＣＮＳ１．３０の５’端(配列番号３のヌクレオチド２１９９)との間のα１ｃサブユニットをコードするクローンを単離するためにこれらのオリゴヌクレオチドプローブを選択した。ハイブリダイゼーション条件は、５０％脱イオン化ホルムアルデヒドを２０％に減らした以外は標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)であった。フィルターを低緊縮性条件下(実施例１．Ｃ)で洗浄した。３つの陽性プラークを同定し、その１つがＩＭＲ３２ １．８６であった。ＩＭＲ３２ １．８６をプラーク精製し、サブクローニングし、制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＩＭＲ３２ １．８６は実施例２．Ｂ．１に記載したようなα１ｃ配列をコードしている。ＤＮＡ配列決定によるキャラクタリゼーションから、ＩＭＲ３２ １．８６がウサギ心筋カルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするＤＮＡに比較してヌクレオチド２１９１−２２６３の７３ヌクレオチドの欠失を含むことが判明した[Ｍｉｋａｍｉら，(１９８９)Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２３０]。これらの欠失ヌクレオチドは配列番号３のヌクレオチド２１７６−２２４８に対応する。ＣＮＳ１．３０の５’端はＩＭＲ３２ １．８６の３’端にオーバーラップするので、これらの欠失ヌクレオチドのいくつか、即ち配列番号２２０５−２２４８はＣＮＳ１．３０によって占められている。ＩＭＲ３２ １．８６中の７３ヌクレオチドの欠失のうちの残りの欠失ヌクレオチド(即ち配列番号３のヌクレオチド２１７６−２２０４)は、ｄｂｃＡＭＰ誘発ＩＭＲ３２細胞ＲＮＡの核酸増幅分析によって決定された。７３ヌクレオチドの欠失は、フレームシフト突然変異であり、従って、修正される必要はない。この領域の正確なヒト配列(ＣＮＳ１．３０のＤＮＡ配列及びＩＭＲ３２細胞ＲＮＡの核酸増幅分析によって決定)を標準方法、例えば制限フラグメント置換または部位特異的突然変異誘発によってＩＭＲ３２ １．８６に挿入し得る。
【０２０２】
ｆ．ＩＭＲ３２ １．１５７
ＩＭＲ３２ ｃＤＮＡライブラリー＃４(実施例１．Ｂ．４)の１×１０６の組換え体を、α１ｃのヌクレオチド５０−７７４(配列番号３)をコードするＩＭＲ３２ １．６７のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントによってスクリーニングした。標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)を用いてハイブリダイゼーションを実施した。低緊縮性条件下(実施例１．Ｃ)でフィルターを洗浄した。陽性プラークの１つがＩＭＲ３２ １．１５７であると同定された。このプラークを精製し、インサートの制限地図を作製し、標準プラスミドベクターｐＧＥＭ７Ｚ(Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)にサブクローニングした。配列決定によってＤＮＡを特性決定した。ＩＭＲ３２ １．１５７は、ヌクレオチド１−８９(配列番号５)で始まりヌクレオチド１−８７３(配列番号３)が後続したα１ｃ配列の代替５’部分をコードすると考えられる。１．６６及び１．１５７の５’配列の分析を以下に示す(実施例２．Ｂ．３)。
【０２０３】
３．α１ｃ翻訳開始部位のキャラクタリゼーション
ＩＭＲ３２ １．１５７(配列番号５のヌクレオチド５７−８９、配列番号３のヌクレオチド１−６７)及びＩＭＲ３２ １．６６(配列番号４のヌクレオチド１００−１３２、配列番号３のヌクレオチド１−６７)の配列の部分をウサギ肺ＣａＣＢレセプターｃＤＮＡ配列、ヌクレオチド−３３−６７[Ｂｉｅｌら，(１９９０) ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２６９：４０９]と比較した。ヒト配列は翻訳開始領域をコードするα１ｃ転写物の可能な代替５’端である。ＩＭＲ３２ １．６６は、ＣａＣＢレセプターｃＤＮＡ配列に緊密に整合し、ＣａＣＢレセプターｃＤＮＡ配列からヌクレオチド１１２(配列番号４)で始まる５’方向に分岐する。ＣａＣＢレセプターｃＤＮＡ配列中で同定された開始コドンはα１ｃコーディング配列を記述するために使用したヌクレオチド１−３(配列番号３)の開始コドンと同じである。
【０２０４】
α１ｃ−１及びα１ｃ−２と命名したα１ｃスプライス変異体の配列を配列番号３及び３６に示す。
【０２０５】
Ｃ．α１Ｂサブユニットをコードする部分的ｃＤＮＡクローンの単離及び全長クローンの構築
ヒト脳幹神経節ｃＤＮＡライブラリーを、ウサギ骨格筋α１サブユニットｃＤＮＡフラグメント(フラグメントの記述に関しては実施例２．Ａ．２参照)によって低緊縮性条件下にスクリーニングした。ＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにハイブリダイズするクローンの１つを使用し、追加の部分的α１Ｂ ｃＤＮＡクローンを作製し、次にこれを使用してＩＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーを更にスクリーニングして追加の部分的ｃＤＮＡクローンを作製した。部分的ＩＭＲ３２ α１Ｂクローンの１つをヒト海馬ライブラリーのスクリーニングに使用してα１Ｂコーディング配列の３’端をコードする部分的α１Ｂクローンを作製した。ｃＤＮＡ配列の正確度を決定するために部分的ｃＤＮＡクローンの領域のいくつかの配列をＩＭＲ３２細胞ＲＮＡの核酸増幅分析産物の配列に比較した。
【０２０６】
α１ＢサブユニットをコードするＤＮＡの終結コドンの５’及び３’に位置する配列に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＩＭＲ３２細胞ＲＮＡとゲノムＤＮＡとの核酸増幅分析から、ＩＭＲ２細胞中の代替的にスプライスされたα１ＢをコードするｍＲＮＡが判明した。この第２のｍＲＮＡ産物は、最初に単離した他の３’ α１Ｂ ｃＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ中に存在しない別のエキソンを含むようにα１Ｂサブユニット転写物をディファレンシャルスプライシングした結果として得られる。α１Ｂサブユニットのこれらのスプライス変異体を識別するために、追加のエキソンを含む形態に対応するＤＮＡ配列によってコードされたサブユニットをα１Ｂ−１(配列番号７)と呼ぶ。他方、追加のエキソンが欠失した形態に対応するＤＮＡ配列によってコードされたサブユニットをα１Ｂ−２(配列番号８)と呼ぶ。α１Ｂ−１の配列は、ヌクレオチド６６３３(配列番号７)で始まるα１Ｂ−２の配列から分岐する。α１Ｂ−１中の追加エキソンの配列(配列番号７のヌクレオチド６６３３−６８１９)の後のα１Ｂ−１及びα１Ｂ−２の配列は等しい(即ち、配列番号７のヌクレオチド６８２０−７３６２及び配列番号８のヌクレオチド６６３３−７１７５)。配列番号７及び８は、α１Ｂ−１をコードするＤＮＡの５’非翻訳配列の１４３ヌクレオチド(ヌクレオチド１−１４３)と３’非翻訳配列の２０２ヌクレオチド(配列番号７のヌクレオチド７１６１−７３６２)及びα１Ｂ−２をコードするＤＮＡの３’非翻訳配列の３２１ヌクレオチド(配列番号８のヌクレオチド６８５５−７１７５)を示す。
【０２０７】
α１Ｂ転写物のＩＳ６領域の核酸増幅分析から、増幅反応の産物を含む臭化エチジウム染色アガロースゲルで観察された多様なフラグメントの大きさに基づく追加のスプライス変異体が存在するらしいことが判明した。
【０２０８】
ｐｃＤＮＡ−α１Ｂ−１と命名した全長α１Ｂ−１ ｃＤＮＡクローンを以下の８段階プロセスで調製した。
【０２０９】
段階１：ｐＧＥＭ３(Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)のＳａｃＩ制限部位をＳａｃＩ部位で消化することによって破壊し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって平滑端を作製し、再結合させた。新しいベクターをｐＧＥＭΔＳａｃと命名した。
【０２１０】
段階２：フラグメント１(ＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩ；配列番号７のヌクレオチド２３３７−４３０３)をＨｉｎｄIII／ＫｐｎＩ消化したｐＧＥＭ３ΔＳａｃに結合してｐα１．１７７ＨＫを産生した。
【０２１１】
段階３：フラグメント１は２つのヌクレオチド欠失(配列番号７のヌクレオチド３８５２及び３８５３)を有している。ＩＭＲ３２ ＲＮＡの増幅フラグメント(フラグメント２)をｐα１．１７７ＨＫに挿入することによって欠失を修復した。従って、フラグメント２(ＮａｒＩ／ＫｐｎＩ；配列番号７のヌクレオチド３８２８−４３０３)をＮａｒＩ／ＫｐｎＩ消化したｐα１．１７７ＨＫに挿入してフラグメント１のＮａｒＩ／ＫｐｎＩ部分に置換させ、ｐα１．１７７ＨＫ／ＰＣＲを作製した。
【０２１２】
段階４：フラグメント３(ＫｐｎＩ／ＫｐｎＩ；配列番号７のヌクレオチド４３０３−５６６３)をＫｐｎＩ消化したｐα１．１７７ＨＫ／ＰＣＲに結合してｐα１Ｂ５’Ｋを作製した。
【０２１３】
段階５：フラグメント４(ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII；ＥｃｏＲＩアダプターと配列番号７のヌクレオチド１−２３３７との連続)及びフラグメント５(ｐα１Ｂ５’ＫのＨｉｎｄIII／ＸｈｏＩフラグメント；配列番号７のヌクレオチド２３３７−５４４６)をＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化したｐｃＤＮＡ１(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)に結合してｐα１Ｂ５’を作製した。
【０２１４】
段階６：フラグメント６(ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ；両端にＥｃｏＲＩアダプターと配列番号７のヌクレオチド５７４９−７３６２とが付加されている)を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ II ＫＳ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ)に、フラグメントの５’端をポリリンカー中のＫｐｎＩ部位に近接させて結合して、ｐα１．２３０を作製した。
【０２１５】
段階７：フラグメント７(ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ；配列番号７のヌクレオチド４３０３−５４４６)及びフラグメント８(ＸｈｏＩ／ＣｓｐＩ；配列番号７のヌクレオチド５４４６−６２５９)を、ＫｐｎＩ／ＣｓｐＩ消化したｐα１．２３０に結合して(ｐα１．２３０にコードされた配列番号７のヌクレオチド５７４９−６２５９を除去し、配列番号７のヌクレオチド６２５９−７３６２を維持する)、ｐα１Ｂ３’を作製する。
【０２１６】
段階８：フラグメント９(ＳｐｈＩ／ＸｈｏＩ；配列番号７のヌクレオチド４９９３−５４４６)及びフラグメント１０(ｐα１Ｂ３’のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ；配列番号７のヌクレオチド５４４６−７３１９)を、ＳｐｈＩ／ＸｂａＩ消化したｐαＢ５’に結合して(ｐα１Ｂ５’にコードされた配列番号７のヌクレオチド４９９３−５４４６を除去し、配列番号７のヌクレオチド１−４８５０を維持する)、ｐｃＤＮＡα１Ｂ−１を作製する。
【０２１７】
得られた構築物ｐｃＤＮＡα１Ｂ−１はｐＣＤＮＡ１中に、５’非翻訳配列(配列番号７のヌクレオチド１−１４３)及び３’非翻訳配列(配列番号７のヌクレオチド７１６１−７３１９)を付加したα１Ｂ−１をコードする全長コーディング領域(配列番号７のヌクレオチド１４４−７３６２)を、ＣＭＶプロモーターの転写調節下で含んでいる。
【０２１８】
Ｄ．ヒトカルシウムチャンネルα１ＡサブユニットをコードするＤＮＡの単離
１．部分的クローンの単離
ヒトカルシウムチャンネルα１Ａサブユニットの部分をコードするＤＮＡクローンは、ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング及びヒト小脳ＲＮＡの核酸増幅によって得られた。ランダムにプライムした小脳ｃＤＮＡライブラリー(長さ２．８ｋｂよりも大きいインサートに関しては大きさ選択)の１×１０６の組換え体を、低緊縮性条件下(６×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、０．２％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの音波処理したニシン精子ＤＮＡ、４２℃)で、ラットα１Ａコーディング配列のヌクレオチド６１９０−６２１７を含むオリゴヌクレオチド７０４でスクリーニングすることによって、α１Ａコーディング配列の３’端に対応するクローンを単離した[Ｓｔａｒｒら，(１９９２) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８：５６２１−５６２５]。低緊縮性条件下で洗浄した。プローブにハイブリダイズした複数のクローン(クローンα１．２５１−α１．２５９及びα１．２４４)を精製し、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列分析によって特性決定した。少なくとも２つのクローンα１．２４４及びα１．２５４は翻訳終結コドンを含んでいた。クローンα１．２４４とα１．２５４とは異なる長さを有しているが、双方がα１Ａ転写物の末端の極限の３’端に対応するヌクレオチドの配列を含む。即ち、２つのクローンはオーバーラップしている。これらの２つのクローンは、クローンα１．２４４がα１．２５４に存在しない５ヌクレオチドの配列と１２ヌクレオチドの配列とを含む以外はオーバーラップ領域で等しい。
【０２１９】
追加のα１Ａをコードするクローンを得るために、ランダムにプライムした小脳ｃＤＮＡライブラリーの１×１０６組換え体(長さ１．０−２．８ｋｂの範囲のインサートに関して大きさで選択)を、３つのオリゴヌクレオチド、即ちオリゴヌクレオチド７０１(ラットα１Ａコーディング配列のヌクレオチド２２８８−２３１５を含む)、オリゴヌクレオチド７０２(ラットα１Ａコーディング配列のヌクレオチド３５５９−３５８５を含む)、及び、オリゴヌクレオチド７０３(ラットα１Ａコーディング配列のヌクレオチド４７９８−４８２７を含む)に対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングした。洗浄を４５℃で行う以外は最初のオリゴヌクレオチド７０４のスクリーニングに使用した条件と同じ条件を用いてハイブリダイゼーション及び洗浄を行った。２０のクローン(クローンα１．２６９−α１．２８８)がプローブにハイブリダイズした。数個のクローンをプラーク精製し、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列分析によって特性決定した。１つのクローンα１．２７９はコーディング配列の同じ領域に対応する他のクローンに存在しない約１７０のヌクレオチドの配列を含んでいた。この領域は他のスプライス変異体中に存在するかもしれない。どのクローンも翻訳開始コドンを含んでいなかった。
【０２２０】
ヒトα１Ａコーディング配列の５’端に対応するクローンを得るために、第１鎖のｃＤＮＡ合成を特異的にプライムするオリゴヌクレオチド７２０(配列番号２２のヌクレオチド２４８５−２５１０を含む)を用いて別の小脳ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ライブラリー(８×１０５組換え体)を、３つのオリゴヌクレオチド、即ちオリゴヌクレオチド７０１、オリゴヌクレオチド７２６(ラットα１Ａコーディング配列のヌクレオチド２３３３−２３６０を含む)、及び、オリゴヌクレオチド７００(ラットα１Ａコーディング配列のヌクレオチド７６７−７９６を含む)に対する低緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄条件に基づいてスクリーニングした。約５０のプラークがプローブにハイブリダイズした。ハイブリダイズするクローンα１．３８１−α１．３９０をプラーク精製し、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列分析によって特性決定した。少なくとも１つのクローンα１．３８１は翻訳開始コドンを含んでいた。
【０２２１】
精製クローンの配列を位置合わせすると、配列が完全α１Ａコーディング配列を含むようにオーバーラップすることが判明した。しかしながら、部分クローンのオーバーラップ配列は、全長α１Ａコーディング配列を構築するための部分クローンの結合に使用される適当な酵素制限部位を必ずしも含んではいなかった。全長α１Ａ ＤＮＡを構築するときに使用される適当な制限酵素部位を含むＤＮＡフラグメントを得るために、ヒト小脳組織から単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、核酸増幅処理した。プライマーとして使用したオリゴヌクレオチドは、選択された制限酵素部位の５’及び３’に位置するヒトα１Ａコーディング配列に対応した。従って、最初の増幅反応では、オリゴヌクレオチド７５３(配列番号２２のヌクレオチド２３６８−２３９１を含む)及び７２８(配列番号２２のヌクレオチド３１７９−３２０２を含む)をプライマー対として使用した。所望のＤＮＡフラグメントを十分な量で提供するために、この増幅の産物を、オリゴヌクレオチド７５３及び７５４(配列番号２２のヌクレオチド３１１２−３１３５を含む)をプライマー対として用いて再増幅した。得られた産物は長さ７６８ｂｐであった。第２の増幅反応では、オリゴヌクレオチド７１９(配列番号２２のヌクレオチド４９５０−４９７５を含む)及び７５２(配列番号２２のヌクレオチド５６４７−５６７０を含む)をプライマー対として使用した。所望の第２のＤＮＡフラグメントを十分な量で提供するために、この増幅の産物を、オリゴヌクレオチド７５６(配列番号２２のヌクレオチド５１１２−５１３５を含む)及び７５２をプライマー対として用いて再増幅した。得られた産物は長さ５５９ｂｐであった。
【０２２２】
２．全長α１Ａコーディング配列の構築
クローンα１．３８１と、７６８ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１．２７８と、５５９ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１．２４４とを、適当な制限部位で結合して、全長α１Ａコーディング配列を作製し、α１Ａ−１と命名した。
【０２２３】
クローンα１．２４４とα１．２５４との配列分析の結果を比較すると、α１Ａサブユニット遺伝子の一次転写物が代替的にスプライスされて、α１Ａサブユニットの異なる形態をコードする少なくとも２つの変異体ｍＲＮＡを生じることが判明した。１つの形態α１Ａ−１は配列番号２２に示す配列によってコードされている。第２の形態α１Ａ−２をコードする配列は、３’端がクローンα１．２４４に見出される５ヌクレオチド(配列番号２２のヌクレオチド７０３５−７０３９)が欠失している点でα１Ａ−１をコードする配列と違っている。この欠失は読み取り枠をシフトさせ、翻訳終結コドンを導入し、その結果として、α１Ａ−１スプライス変異体によってコードされるサブユニットよりも短いα１Ａサブユニットをコードするα１Ａ−２コーディング配列となる。従って、α１Ａ−１コーディング配列の３’端の一部分は実際はα１Ａ−２ ＤＮＡ中の３’非翻訳配列である。クローンα１．３８１と、７６８ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１．２７８と、５５９ｂｐの核酸増幅産物と、クローンα１．２５４とを結合することによって構築され得るα１Ａ−２の完全配列を配列番号２３に示す。
【０２２４】
Ｅ．α１ＥサブユニットをコードするＤＮＡの単離
ヒトカルシウムチャンネルのα１ＥサブユニットをコードするＤＮＡをヒト海馬ライブラリーから単離した。選択されたクローンを配列決定した。α１ＥサブユニットをコードするＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、同じα１Ｅサブユニット一次転写物の少なくとも２つの代替スプライス形態が発現されることを示した。１つの形態は配列番号２４に示す配列を有しており、α１Ｅ−１と命名し、他の形態は配列番号２４のヌクレオチド２４０５と２４０６との間に５７塩基対のフラグメントを挿入することによって得られる配列を有しており、α１Ｅ−３と命名した。得られた配列を配列番号２５に示す。
【０２２５】
α１Ｅ−１と命名されたサブユニットは計算分子量２５４，８３６を有しており、α１Ｅ−３と命名されたサブユニットは計算分子量２５７，３４８を有している。α１Ｅ−３はα１Ｅ−１に比べて、トランスメンブランドメインIIＳ６とIIIＳ１との間の細胞質ループであると考えられる領域に１９アミノ酸の挿入(配列番号２５によってコードされている)を有している。
【実施例３】
【０２２６】
ヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ａ．βサブユニットをコードする部分的ｃＤＮＡクローンの単離及びβ１サブユニットをコードする全長クローンの構築
ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニットｃＤＮＡフラグメント[ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニットｃＤＮＡの単離及び配列に関しては米国特許出願第４８２，３８４号またはＲｕｔｈら(１９８９)Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１１１５を参照]によって標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ．)を用いてスクリーニングした。追加のｃＤＮＡクローンを得るために、ハイブリダイズする１つのクローンの一部分を使用して海馬ライブラリーを再スクリニーングした。ハイブリダイズするクローンのｃＤＮＡインサートを制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によって特性決定し、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニットｃＤＮＡ配列に比較した。
【０２２７】
部分的β１サブユニットｃＤＮＡクローンの部分を結合して全β１サブユニットをコードする全長クローンを作製した。配列番号９はβ１サブユニットコーディング配列(ヌクレオチド１−１４３４)と３’非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド１４３５−１５４６)とを示す。推定アミノ酸配列も配列番号９に示す。発現実験を実施するために、全長β１サブユニットｃＤＮＡクローンを以下のごとく構築した。
【０２２８】
段階１：ＤＮＡフラグメント１(〜８００ｂｐの５’非翻訳配列に配列番号９のヌクレオチド１−２７７を付加)を、ＤＮＡフラグメント２(配列番号９のヌクレオチド２７７−１５４６に４４８ｂｐのイントロン配列を付加)に結合し、ｐＧＥＭ７Ｚにクローニングした。得られたプラスミドｐβ１−１．１８は、４４８ｂｐのイントロンを含む全長β１サブユニットｃＤＮＡクローンを含んでいた。
【０２２９】
段階２：ｐβ１−１．１８の５’非翻訳配列をリボソーム結合部位で置換するために、ＥｃｏＲＩ部位、リボソーム結合部位をコードする配列(５’−ＡＣＣＡＣＣ−３’)及び配列番号９のヌクレオチド１−２５を含む二重鎖アダプターを合成した。ＳｍａＩ消化したｐβ１−１．１８にアダプターを結合し、結合反応の産物をＥｃｏＲＩによって消化した。
【０２３０】
段階３：ＥｃｏＲＩアダプターと有効なリボソーム結合部位と配列番号９のヌクレオチド１−１５４６とイントロン配列とを含む段階２で得られたＥｃｏＲＩフラグメントを、プラスミドベクターにクローニングしてｐβ１−１．１８ＲＢＳと命名した。ｐβ１−１．１８ＲＢＳのＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤＮＡ１に、開始コドンをＣＭＶプロモーターに近接させてサブクローニングし、ｐＨＢＣａＣＨβ１ａＲＢＳ(Ａ)を作製した。
【０２３１】
段階４：イントロン配列の欠失したβ１サブユニットをコードする全長クローンを作製するために、ＤＮＡフラグメント３(配列番号９のヌクレオチド６６−１１４６に４４８ｂｐのイントロン配列とその配列に続く配列番号９のヌクレオチド１１４７−１５４６を付加したもの)の部位特異的突然変異を誘発してイントロン配列を欠失させ、これによってｐβ１(−)を作製した。ｐβ１−１．１８ＲＢＳのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント(リボソーム結合部位と配列番号９のヌクレオチド１−２７７を含む)を、ｐβ１(−)のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント(配列番号９のヌクレオチド２７７−１５４６を含む)に結合し、翻訳開始をＣＭＶプロモーターに近接させてｐｃＤＮＡ１にクローニングした。得られた発現プラスミドをｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)と命名した。
【０２３２】
Ｂ．スプライス変異体β１−３
β１サブユニットをコードするＤＮＡクローンのＤＮＡ配列分析は、ＣＮＳ中に同じヒトβ１サブユニット一次転写物の少なくとも２つの代替スプライス形態が発現されることを示した。１つの形態は配列番号９に示す配列を有し、β１−２と呼ぶ。β１−２の配列と代替形態β１−３の配列とはヌクレオチド１３３４(配列番号９)で分岐(diverge)する。３’非翻訳配列(ヌクレオチド１７９５−１８５１)を含む完全β１−３配列(ヌクレオチド１−１８５１)を配列番号１０に示す。
【実施例４】
【０２３３】
ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ａ．ｃＤＮＡクローンの単離
完全ヒト神経α２コーディング配列(ヌクレオチド３５−３３１０)と５’非翻訳配列(ヌクレオチド１−３４)と３’非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド３３１１−３６００)とを配列番号１１に示す。
【０２３４】
ヒト神経α２サブユニットをコードするＤＮＡを単離するために、ウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡフラグメント[ヌクレオチド４３−２７２、Ｅｌｌｉｓら (１９８８) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１６６１]を用いたヒトゲノムサザンブロットをプローブすることによって、ヒトα２ゲノムクローンを先ず単離した。ヒトゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、電気泳動にかけ、ブロットし、標準ハイブリダイゼーション条件(実施例１．Ｃ)及び低緊縮性洗浄条件(実施例１．Ｃ)を用いてウサギ骨格筋プローブによってプローブした。３．５ｋｂ及び３．０ｋｂの２つの制限フラグメントを同定した。これらのＥｃｏＲＩ制限フラグメントを、２．２ｋｂ〜４．３ｋｂの範囲のヒトゲノムＥｃｏＲＩフラグメントを含むλｇｔ１１ライブラリーを調製することによってクローニングした。ライブラリーをウサギα２プローブを用いて上記のようにスクリーニングし、ハイブリダイズするクローンを単離し、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。ＨＧＣａＣＨα２．２０は３．５ｋｂのフラグメントを含み、ＨＧＣａＣＨα２．９は３．０ｋｂのフラグメントを含んでいた。
【０２３５】
制限マッピング及びＤＮＡ配列決定によれば、ＨＧＣａＣＨα２．２０は６５０ｂｐのＰｓｔＩ−ＸｂａＩ制限フラグメント上に８２ｂｐのエキソン(配列番号１１のヒトα２コーディング配列のヌクレオチド１３０−２１１)を含み、ＨＧＣａＣＨα２．９は７５０ｂｐのＸｂａＩ−ＢｇｌII制限フラグメント上に１０５ｂｐのエキソン(配列番号１１のコーディング配列のヌクレオチド２１２−３１６)を含むことが判明した。これらの制限フラグメントを使用してヒト脳幹神経節ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした(実施例２．Ｃ．２．ａ)。ＨＢＣａＣＨα２．１を単離し(配列番号１１のヌクレオチド２９−１１６３)、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，２０８５２から得られたヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリー(ＡＴＣＣ受託番号３７４３２)をスクリーニングするために使用した。２つのクローン、ＨＢＣａＣＨα２．５(配列番号１１のヌクレオチド１−１１６２)及びＨＢＣａＣＨα２．８(配列番号１１のヌクレオチド７１４−１５６２とこれに続く１６００ヌクレオチドの介在配列)を単離した。ＨＢＣａＣＨα２．８の２４００ｂｐのフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド７５９で始まりイントロンのＳｍａＩ部位で終わる)を使用して、脳幹ライブラリーを再スクリーニングしＨＢＣａＣＨα２．１１(配列番号１１のヌクレオチド８７９−３６００)を単離した。クローンＨＢＣａＣＨα２．５とＨＢＣａＣＨα２．１１とはオーバーラップして完全ヒト脳α２タンパク質をコードする。
【０２３６】
Ｂ．ｐＨＢＣａＣＨα２Ａの構築
全長ヒトカルシウムチャンネルα１サブユニットをコードするＤＮＡを含むｐＨＢＣａＣＨα２Ａを構築するために、ＨＢＣａＣＨα２．５の(ＥｃｏＲＩ)−ＰｖｕIIフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド１−１０６１、ＥｃｏＲＩアダプター、ＰｖｕII部分消化物)と、ＨＢＣａＣＨα２．１１のＰｖｕII−ＰｓｔＩフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド１０６１−２４２４；ＰｖｕII部分消化物)とを、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ消化したｐＩＢＩ２４(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ)に結合した。次いで、(ＥｃｏＲＩ)−ＰｓｔＩフラグメント(配列番号１１のヌクレオチド１−２４２４)を単離し、ＥｃｏＲＩ消化したｐＩＢＩ２４中のＨＢＣａＣＨα２．１１のＰｓｔＩ−(ＥｃｏＲＩ)フラグメント(配列番号１１のヌクレオチド２４２４−３６００)に結合し、全長ヒト脳α２サブユニットをコードするＤＮＡ、ＨＢＣａＣＨα２を作製した。ＨＢＣａＣＨα２の３６００ｂｐのＥｃｏＲＩインサート(配列番号１１のヌクレオチド１−３６００)をｐｃＤＮＡ１(ｐＨＢＣａＣＨα２Ａ)に、メチオニン開始コドンをＣＭＶプロモーターに近接させてサブクローニングした。ＨＢＣａＣＨα２の３６００ｂｐのＥｃｏＲＩインサートを、ＳＶ４０初期プロモーター、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(ｄｈｆｒ)遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化部位及びスプライス部位、ベクターを細菌中に維持するために必要な配列を含むｐＳＶ２ｄＨＦＲ[Ｓｕｂｒａｍａｎｉら (１９８１) Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４]にサブクローニングした。
【実施例５】
【０２３７】
Ａ．ヒトβ１転写物及びヒトα２転写物のディファレンシャルプロセシング
骨格筋、大動脈、海馬と脳幹神経節、及び、ＨＥＫ２９３細胞中に存在するヒトβ２転写物の核酸増幅分析によれば、各組織中で配列番号９のヌクレオチド６１５−７８１に対応する領域のディファレンシャルプロセシングが判明した。この領域に異なるプロセシングを生じた５つのβ１転写物を与えた４つの異なる配列を同定した。異なる組織に由来のβ１転写物は、ＨＥＫ２９３細胞中で発現された１つのβ１転写物(β１−５)で４つの配列全部が欠失している以外は、４つの配列の異なる組み合わせを含んでいた。
【０２３８】
どのβ１転写物も４つの配列の各々を含んでいなかった。しかしながら、参照を容易にするために、４つの配列全部を末端同志をつないだ長い単一配列として配列番号１２に示す。ディファレンシャルプロセシングされた４つの配列は、配列１(配列番号１２のヌクレオチド１４−３４)、配列２(配列番号１２のヌクレオチド３５−５５)、配列３(配列番号１２のヌクレオチド５６−１９０)及び配列４(配列番号１２のヌクレオチド１９１−２７１)である。同定されたβ１転写物の形態は、(１)β１−１と呼ばれる配列１の欠失した形態(骨格筋で発現される)、(２)β１−２と呼ばれる配列２及び３の欠失した形態(ＣＮＳで発現される)、(３)β１−４と呼ばれる配列１、２及び３の欠失した形態(大動脈及びＨＥＫ細胞で発現される)、及び、(４)β１−５と呼ばれる配列１−４の欠失した形態(ＨＥＫ細胞で発現される)を含む。更に、β１−４及びβ１−５は、β１−１及びβ１−２の形態中に欠失しているグアニンヌクレオチド(配列番号１２のヌクレオチド１３)を含む。β１スプライス変異体の配列を配列番号９、１０及び３３−３５に示す。
【０２３９】
Ｂ．α２サブユニットをコードする転写物のディファレンシャルプロセシング
完全ヒト神経α２コーディング配列(ヌクレオチド３５−３３０７)と５’非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド１−３４)と３’非翻訳配列の一部分(ヌクレオチド３３０８−３６００)とを配列番号１１に示す。
【０２４０】
骨格筋、大動脈及びＣＮＳ中に存在するヒトα２転写物の核酸増幅分析によれば、各組織中で配列番号１１のヌクレオチド１５９５−１９４２に対応する領域のディファレンシャルプロセシングが判明した。
【０２４１】
分析は、ヌクレオチド１５９５−１９４２に対応するヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡの一次転写物が、配列番号１１のヌクレオチド１６２４と１６２５との間に挿入された追加の配列(配列番号１３：5’CCTATTGGTGTAGGTATACCAACAATTAATTTAAGAAAAAGGAGACCCAATATCCAG3’)を含むことを示した。配列番号１１のヌクレオチド１５９５−１９４２と、ヌクレオチド１６２４と１６２５との間に挿入された配列番号１３とを含む一次転写物の領域の１〜３個の異なる部分の有無に起因する差異を生じた５つの選択的スプライス変異体転写物が同定された。種々の組織に由来のα２をコードする５つの転写物は、大動脈中に発現する１つのα２転写物中で３つの配列全部が欠失している以外は、３つの配列の異なる組み合わせを含む。どのα２転写物も３つの配列の各々を含んでいなかった。ディファレンシャルプロセシングされた３つの領域の配列は配列１(配列番号１３)、配列２(配列番号１１のヌクレオチド１６２５−１６３９である5’AACCCCAAATCTCAG3’)及び配列３(配列番号１１のヌクレオチド１９０８−１９２８である5’CAAAAAAGGGCAAAATGAAGG3’)で示される。同定された５つのα２形態は、(１)α２ａと呼ばれる配列３の欠失した形態(骨格筋で発現される)、(２)α２ｂと呼ばれる配列１の欠失した形態(ＣＮＳで発現される)、(３)α２Ｃと呼ばれる配列１及び２の欠失した形態(大動脈で発現される)、(４)α２ｄと呼ばれる配列１、２及び３の欠失した形態(大動脈で発現される)、及び、(５)α２ｅと呼ばれる配列１及び３の欠失した形態(大動脈で発現される)である。
【０２４２】
α２ａ−α２ｅの配列を夫々配列番号２９−３２に示す。
【実施例６】
【０２４３】
ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからのカルシウムチャンネルγサブユニットをコードするＤＮＡの単離
Ａ．γサブユニットをコードするＤＮＡの単離
ベクターγＪ１０[Ｊａｙ，Ｓ．ら (１９９０) Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４９０−４９２]に含まれているウサギ骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニットｃＤＮＡの４８４ｂｐの配列(コーディング配列のヌクレオチド６２１−６２６に３’−非翻訳配列の４３８ヌクレオチドを付加したもの)に対するハイブリダイゼーションによって、λｇｔ１１に基づくヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｃａｔａｌｏｇ ＃ＨＬ１０８８ｂ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)に由来の約１×１０６の組換え体をスクリーニングした。中度の緊縮性条件(２０％の脱イオンホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、６×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ、４２℃)を用いてハイブリダイゼーションを実施し、低緊縮性条件下(実施例１．Ｃ参照)で洗浄した。このプローブにハイブリダイズしたプラークを精製し、インサートＤＮＡをｐＧＥＭ７Ｚにサブクローニングした。このｃＤＮＡインサートをγ１．４と命名した。
【０２４４】
Ｂ．γ１．４のキャラクタリゼーション
γ１．４をＤＮＡハイブリダイゼーションによって確認し、ＤＮＡ配列決定によって特性決定した。γ１．４の１５００ｂｐのＳｓｔＩフラグメントはサザンブロットでウサギ骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニットｃＤＮＡ γＪ１０にハイブリダイズした。このフラグメントの配列分析によれば、このフラグメントが約５００ヌクレオチドのヒトＤＮＡ配列及び〜１０００ヌクレオチドのλｇｔ１１配列を含むことが判明した(後者の配列が含まれる理由は、λｇｔ１１中のＥｃｏＲＩクローニング部位の１つの見掛けの破壊が生じるからである。)。ヒトＤＮＡ配列は、その直後に翻訳終結コドン及び３’非翻訳配列(配列番号１４)を有する１２９ヌクレオチドのコーディング配列を含む。
【０２４５】
ヒトλサブユニットｃＤＮＡの残りの５’配列を単離するためには、先ず、ヒトＣＮＳ ｃＤＮＡライブラリー及び／またはヒトＣＮＳ組織からのｍＲＮＡ調製物を、γ１．４のγ ｃＤＮＡ特異的配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅分析方法によって検定し得る。追加のヒト神経γサブユニットをコードするＤＮＡは、核酸増幅分析アッセイの結果に基づいて、γ特異的増幅可能ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。または、核酸増幅分析アッセイの結果に基づいて、γ特異的増幅可能転写物を含むｍＲＮＡ調製物からｃＤＮＡライブラリーを構築し得る。このようなライブラリーは、ポリＡ＋ ＲＮＡからの第１鎖のｃＤＮＡ合成をプライムするためにオリゴｄＴを用いる標準方法によって構築される(実施例１．Ｂ参照)。または、γ１．４中のヒトＤＮＡ配列に基づくγ ｃＤＮＡ特異的オリゴヌクレオチドによって第１鎖のｃＤＮＡをプライムすることによって第１鎖のｃＤＮＡを特定し得る。次にこの第１鎖の合成に基づいてｃＤＮＡライブラリーを構築し、γ１．４のγ特異的部分でスクリーニングし得る。
【実施例７】
【０２４６】
ヒト神経カルシウムチャンネルβ２サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離
ヒトカルシウムチャンネルβ２サブユニットをコードするＤＮＡの単離
実施例３に記載のごとく単離されたクローンの配列決定によって、ヒト神経カルシウムチャンネルβ２サブユニットをコードするクローンが判明した(β２０と命名、配列番号２６参照)。このクローンの５’端に基づくオリゴヌクレオチドを使用してヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをプライムした。低度から中度の緊縮性の条件下(５０℃、０．５×ＳＳＰＥで最終洗浄)でこのβ２クローンでライブラリーをスクリーニングした。複数のハイブリダイズするクローンを単離し配列決定した。これらのクローンとして、β２Ｃ、β２Ｄ及びβ２Ｅをコードしているクローンが存在した。例えば、β２Ｃの配列を配列番号３７に示し、β２Ｅの配列を配列番号３８に示す。
【０２４７】
次に、ランダムプライムした海馬ライブラリーを、β２ＤをコードするクローンとＡＴＣＣ受託番号６９０４８で寄託されたβ３クローンの一部分との組み合わせを用いてスクリーニングした。多数のハイブリダイズするクローンが単離された。これらのクローンをβ１０１、β１０２及びβ１０４と命名した。β１０１はβ２のスプライス変異体の５’端をコードすると考えられ、β２Ｅと命名した。β１０２及びβ１０４はβ２の３’端の部分をコードしている。
【０２４８】
β２スプライス変異体が配列番号２６のヌクレオチド１８２−２２９４を含み、開始コドンと配列番号２６の２１２に対応するヌクレオチドとの間だけが違っている。
【実施例８】
【０２４９】
ヒトカルシウムチャンネルβ４及びβ３サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ａ．ヒトβ４サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離
翻訳開始コドンとβ４コーディング配列の約６０％とを含むクローンがヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーから得られた(配列番号２７のヌクレオチド１−８９４参照)。β４コーディング配列の残りの３’部分をコードするＤＮＡを得るために、高緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で核酸増幅産物のハイブリダイゼーションに基づいてヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。β４サブユニットコーディング配列の３’端に対応する配列と終結コドンとを含むクローンを同定するために、ハイブリダイズするクローンを精製し、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列分析によって特性決定する。選択されたクローンをβ４コーディング配列の５’半鎖を含むクローンに適当な制限部位で結合し、β４サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡを作製する。全長β４クローンの配列を配列番号２７に示す。アミノ酸配列を配列番号２８に示す。
Ｂ．ヒトβ３サブユニットをコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例３に記載のごとく単離されたクローンの配列決定によって、ヒト神経カルシウムチャンネルβ３サブユニットをコードするクローンが判明した。このクローンはプラスミドβ１．４２(ＡＴＣＣ受託番号６９０４８)として寄託された。
【０２５０】
完全β３サブユニットをコードする全長ｃＤＮＡクローンを単離するために、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリー(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ)を、より低い緊縮性のハイブリダイゼーション条件(２０％の脱イオンホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの音波処理ニシン精子ＤＮＡ、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、４２℃)及び洗浄条件を用いて、β１−２をコードするｃＤＮＡの５’ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントに対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンの１つは、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドンの双方を含み、β３−１と命名された完全β３サブユニットをコードしている(配列番号１９)。ｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を調製し、実施例９．Ｄと同様の方法を用いてα１Ｂ−１ ｃＤＮＡ及びα２ｂ ｃＤＮＡの転写物と共にアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。卵母細胞を２電極電圧固定法で記録すると、卵母細胞が有意な電圧依存性の内向きのＢａ２＋電流を示した。
【０２５１】
β３−２と命名された別のβ３サブユニットをコードするクローンは、ヒト小脳ｃＤＮＡライブラリーを、より低い緊縮性の(２０％の脱イオンホルムアミド、２００μｇ／ｍｌの音波処理ニシン精子ＤＮＡ、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、４２℃)のハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、実施例８．Ａに記載の核酸増幅産物に対するハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングすることによって得られた。このクローン(配列番号２０、β３−２)とβ３−１(配列番号１９)と命名された第１β３サブユニットとは５’端に差異を有しており、β３遺伝子のスプライス変異体である。
【実施例９】
【０２５２】
ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするｃＤＮＡ及びＲＮＡ転写物の哺乳類細胞中での組換え発現
Ａ．ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡのＤＧ４４細胞中での組換え発現
１．ＤＧ４４細胞の安定なトランスフェクション
コロンビア大学のＬａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎから入手したＤＧ４４細胞[ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞：例えばＵｒｌａｕｂ，Ｇ．ら (１９８６) Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５−５６６参照]を、ＣａＰＯ４沈殿法[Ｗｉｇｌｅｒら (１９７９) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７１−１３７６]によって、トランスフェクト細胞中でポリシストロン性発現／選択を行わせるヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡ(実施例４参照)を含むｐＳＶ２ｄｈｆｒベクターで安定にトランスフェクトした。発現ベクターに取り込まれた細胞を選択するために、ヒポキサンチンまたはチミジン非含有の１０％ＤＭＥＭ培地でトランスフェクタントを増殖させた。この培地で生残能力を示した１２のトランスフェクタント細胞系を樹立細胞系とした。
【０２５３】
２．トランスフェクトＤＧ４４細胞中のα２サブユニットｃＤＮＡ発現の分析
ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡを含むｐＳＶ２ｄｈｆｒで安定にトランスフェクトした４つのＤＧ４４細胞系から、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ[(１９８８) Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１４８７−１４９７]の方法で全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ(レーンあたり〜１５μｇ)を１％アガロースホルムアルデヒドゲルで分離し、ニトロセルロースに移し、ランダムプライムしたヒト神経カルシウムチャンネルα２ ｃＤＮＡにハイブリダイズした(ハイブリダイゼーション：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、４２℃)；洗浄：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃)。ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡを含むｐＳＶ２ｄｈｆｒで安定にトランスフェクトした４つのＤＧ４４細胞系から得られた全ＲＮＡをノーザンブロット分析すると、４つの細胞系の１つが１０ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で２日間増殖させるとα２サブユニットｃＤＮＡの転写物に関して予測された大きさ(ｃＤＮＡの大きさに基づいて５０００ヌクレオチド)のハイブリダイズするｍＲＮＡを含むことが判明した。酪酸塩は転写を非特異的に誘発し、しばしばＳＶ４０初期プロモーターを誘発するために使用される[Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ ＆ Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．(１９８３)Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１６３１]。この細胞系４４α２−９はまた、α２ ｃＤＮＡに基づくプローブにハイブリダイズしたα２ ｃＤＮＡの転写物に関して予測された大きさ(５０００ヌクレオチド)よりも小さいｍＲＮＡ種(複数の種)及び大きい(６８００ヌクレオチド)ｍＲＮＡ種を産生した。このトランスフェクタントによって産生された５０００ヌクレオチド及び６８００ヌクレオチドの転写物は、完全α２サブユニットコーディング配列を含み、従って全長α２サブユニットタンパク質を産生する筈である。弱くハイブリダイズする８０００ヌクレオチドの転写物が非トランスフェクト及びトランスフェクトの双方のＤＧ４４細胞中に存在していた。明らかに、ＤＧ４４細胞は、カルシウムチャンネルα２サブユニットまたは同様の遺伝子を低レベルで転写する。この内因性α２サブユニット転写物の発現レベルは、ノーザン分析のためにＲＮＡを単離する前に細胞を酪酸塩に接触させた場合にも変わらないことが観察された。
【０２５４】
ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットｃＤＮＡを含むｐＳＶ２ｄｈｆｒで安定にトランスフェクトされた３つのＤＧ４４細胞系から全タンパク質を抽出した。約１０７個の細胞を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦを含む３００μｌの溶液中で音波処理した。等容量の２×のローディング色素[Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． (１９７０) Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０]をサンプルに添加し、タンパク質を８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、次いで、ニトロセルロースにエレクトロトランスファーした。ニトロセルロースをウサギ骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニット(Ｋ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａから入手)に対するモルモットのポリクローナル抗血清(希釈度１：２００)と共にインキュベートし、次いで[１２５Ｉ]−プロテインＡと共にインキュベートした。ブロットを−７０℃でＸ線フィルムに露光した。トランスフェクト及び非トランスフェクトの双方のＤＧ４４細胞から得られたタンパク質の少数のサンプルが、ヒト神経カルシウムチャンネルのα２サブユニットに関して予測された大きさ(１３０−１５０ｋＤａ)の免疫反応性タンパク質を含んでいた。この免疫反応性タンパク質のレベルは、酪酸ナトリウムの非存在下で増殖させた４４α２−９細胞中よりも１０ｍＭの酪酸ナトリウムの存在下で増殖させた４４α２−９細胞中で高かった。これらのデータは、４４α２−９及び非トランスフェクトＤＧ４４細胞の全ＲＮＡのノーザン分析で得られた結果と十分な相関関係を有している。４４α２−９細胞系はまた、１１０ｋＤの免疫反応性タンパク質を産生し、これは全長α２サブユニットのタンパク質分解産物であるか、または、α２サブユニットｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした細胞系中で産生された１つの短い(＜５０００ヌクレオチド)ｍＲＮＡの翻訳産物である。
【０２５５】
Ｂ．ヒト神経カルシウムチャンネルα１、α２及びβ１サブユニットをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞中の発現
ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡでヒト胚性腎細胞(ＨＥＫ２９３細胞)を一過的及び安定にトランスフェクトした。個々のトランスフェクタントについて、電圧活性化バリウム電流及び機能性組換え電圧依存性カルシウムチャンネルの存在を電気生理学的に分析した。
【０２５６】
１．ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
ヒト神経カルシウムチャンネルα１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードするＤＮＡを含む個別の発現ベクター、即ちプラスミドｐＶＤＣＣIII(Ａ)、ｐＨＢＣａＣＨα２Ａ及びｐＨＢＣａＣＨβ１ａＲＢＳ(Ａ)を夫々、実施例２．Ａ．３、４．Ｂ及び３．Ｂ．３に記載のように構築した。これらの３つのベクターを使用してＨＥＫ２９３細胞を一過的にコトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞の安定なトランスフェクションのためには、β１サブユニットをコードするＤＮＡを細胞に導入するためにｐＨＢＣａＣＨβ１ａＲＢＳ(Ａ)に代えてｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)(実施例３．Ｂ．３)を、ｐＶＤＣＣIII(Ａ)及びｐＨＢＣａＣＨα２Ａと共に使用した。
【０２５７】
ａ．一過的トランスフェクション
発現ベクターｐＶＤＣＣIII(Ａ)、ｐＨＢＣａＣＨα２Ａ及びｐＨＢＣａＣＨβ１ａＲＢＳ(Ａ)を、ＨＥＫ２９３細胞(ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３)の２組の一過的トランスフェクションに使用した。一方のトランスフェクション手順では、ＨＥＫ２９３細胞を、α１サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミド、α２サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミド、β１サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミド及びプラスミドｐＣＭＶβｇａｌ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)によって一過的にコトランスフェクトした。プラスミドｐＣＭＶβｇａｌはサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターに融合したｌａｃＺ遺伝子(大腸菌β−ガラクトシダーゼをコードする)を含んでおり、この遺伝子は、トランスフェクション効率をモニターするマーカー遺伝子としてトランスフェクションに参加した。他方のトランスフェクション手順では、ＨＥＫ２９３細胞を、α１サブユニットｃＤＮＡ発現プラスミドｐＶＤＣＣIII(Ａ)及びｐＣＭＶβｇａｌによって一過的にコトランスフェクトした。双方のトランスフェクションで、１０ｃｍの組織培養皿中で２〜４×１０６のＨＥＫ２９３細胞を、実験に使用した５μｇの各プラスミドによって、標準ＣａＰＯ４沈殿トランスフェクション手順に従って一過的にコトランスフェクトした(Ｗｉｇｌｅｒら (１９７９) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−１３７６)。β−ガラクトシダーゼとＸ−ｇａｌ基質とを用いる反応の産物の直接染色[Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｒ． (１９８６) ＥＭＢＯ  ５：３１３３−３１４２]及びβ−ガラクトシダーゼ活性の測定[Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ． (１９７２) Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ．３５２−３５５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ]によってトランスフェクタントのβ−ガラクトシダーゼ発現を分析した。これらのトランスフェクタント中のサブユニットｃＤＮＡの発現を評価するために、サブユニット転写物産生(ノーザン分析)、サブユニットタンパク質産生(細胞溶解液のイムノブロット分析)及び機能性カルシウムチャンネル発現(電気生理学的分析)について細胞を分析した。
【０２５８】
ｂ．安定なトランスフェクション
リン酸カルシウムトランスフェクション手順[Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ−Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １４，Ｕｎｉｔ ９．１．１−９．１．９(１９９０)]を用いてＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。各々が１〜２×１０６のＨＥＫ２９３細胞を収容した１０ｃｍの培養皿に、５μｇのｐＶＤＣＣIII(Ａ)、５μｇのｐＨＢＣａＣＨα２Ａ、５μｇのｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)、５μｇのｐＣＭＶＢｇａｌ及び１μｇのｐＳＶ２ｎｅｏ(選択マーカーとして)を含む１ｍｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム沈殿物をトランスフェクトした。５００μｇのＧ４１８を含む培地中で１０〜２０日間増殖させた後、コロニーが形成されたので、クローニングシリンダーを用いて単離した。
【０２５９】
２．ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の分析
ａ．β−ガラクトシダーゼ発現の分析
細胞溶解物(実施例７．Ａ．２に記載の手順で調製)のβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイ(Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．，(１９７２) Ｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｐｐ．３５２−３５５，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ)及び固定細胞の染色(Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．(１９８６) ＥＭＢＯ ５：３１３３−３１４２)によって、一過的トランスフェクタントのβ−ガラクトシダーゼの発現を検定した。これらのアッセイの結果は、ＨＥＫ２９３細胞の約３０％がトランスフェクトされたことを示した。
【０２６０】
ｂ．ノーザン分析
α１、α２及びβ１サブユニットの各々をコードするＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子を用いるかまたはα１サブユニットとｌａｃＺ遺伝子とを用いて一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｔｒａｋ Ｋｉｔ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ)を用いてポリＡ＋ ＲＮＡを単離した。ＲＮＡをアガロースゲルで電気泳動にかけ、ニトロセルロースに移した。次にニトロセルロースを以下の放射性標識プローブの１つ以上とハイブリダイズさせた：ｌａｃＺ遺伝子、ヒト神経カルシウムチャンネルα１ＤサブユニットをコードするｃＤＮＡ、ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニットをコードするｃＤＮＡまたはヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡ。α１サブユニットをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズした２つの転写物が、α１、α２及びβ１サブユニットの各々をコードするＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中及びα１サブユニットｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中で検出された。１つのｍＲＮＡ種はα１サブユニットｃＤＮＡの転写物に関して予測された大きさ(８０００ヌクレオチド)を有していた。第２のＲＮＡ種はこの転写物に関して予測された大きさよりも小さかった(４０００ヌクレオチド)。ｌａｃＺ遺伝子の転写物であると予測される大きさのＲＮＡは、α１、α２及びβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってトランスフェクトされた細胞中及びα１サブユニットｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってトランスフェクトされた細胞中で、ｌａｃＺ遺伝子配列に対するハイブリダイゼーションによって検出された。
【０２６１】
また、α１、α２及びβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってトランスフェクトされた細胞のＲＮＡはα２及びβ１サブユニットのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。２つのｍＲＮＡ種がα２サブユニットｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした。１つの種はα２サブユニットｃＤＮＡの転写物であると予測された大きさ(４０００ヌクレオチド)を有していた。他方の種はこの転写物に関して予測された大きさよりも大きかった(６０００ヌクレオチド)。α１、α２及びβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによってコトランスフェクトされた細胞中の多数のＲＮＡ種はβ１サブユニットｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした。βサブユニットｃＤＮＡ発現ベクターが２つのポリＡ＋付加可能部位を含むので、種々の大きさのβサブユニット転写物が多数産生された。
【０２６２】
ｃ．電気生理学的分析
パッチ固定法[Ｈａｍｉｌｌら (１９８１) Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．３９１：８５−１００]の全細胞変法を用い、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の各々について、電圧依存性バリウム電流を検定した。これらの実験の陰性対照として、ｐＣＭＶβｇａｌだけで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のバリウム電流を検定した。細胞を電流キャリアーとして作用するバリウムイオン含有の浴液に配置した。ナトリウムまたはカリウムチャンネルを流れる電流を除去するために浴液の主要塩成分としてＮａＣｌまたはＫＣｌの代わりに塩化コリンを使用した。浴液は１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳでｐＨ７．３に緩衝した(ｐＨを水酸化ナトリウムまたは水酸化テトラエチルアンモニウムで調整した)。１３５ｍＭのＣｓＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのグルコース、１０ｍＭのＥＧＴＡ、４ｍＭのＡＴＰ及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含む溶液(水酸化テトラエチルアンモニウムでｐＨを７．３に調整)をパッチピペットに充填した。セシウムイオン及びテトラエチルアンモニウムイオンは殆どの型のカリウムチャンネルを遮断する。ピペットはＳｙｌｇａｒｄ(Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ)でコートされ、１−４メガオームの抵抗を有していた。ＩＢＭ互換性ＰＣのＬａｂｍａｓｔｅｒ(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ)データ取得ボードとインタフェースしたＡｘｏｐａｔｃｈ ＩＣ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｄｉｔｙ，ＣＡ)増幅器によって５００メガオームのヘッドステージ抵抗器を通る電流を測定した。ｐＣｌａｍｐ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)を使用して電圧コマンドを発生させ、データを取得した。データをｐＣｌａｍｐまたはＱｕａｔｔｒｏ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ(Ｂｏｒｌａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｃｏｔｔｓ Ｖａｌｌｅｙ，ＣＡ)プログラムで分析した。
【０２６３】
薬剤を付加するために、試験中の細胞から数マイクロメーター以内に配置された「吹管(puffer)」ピペットを使用し圧力を加えて溶液を付加した。薬理学的キャラクタリゼーションに使用される薬剤を浴液と同じ溶液に溶解した。ＤＭＳＯ中で調製したＢａｙ Ｋ ８６４４(ＲＢＩ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ)の１０ｍＭのストック溶液のサンプルを付加する前に、１５ｍＭのＢａ＋２を含有する浴液で最終濃度１μＭに希釈した。
【０２６４】
２１の陰性対照ＨＥＫ２９３細胞(ｌａｃＺ遺伝子発現ベクターｐＣＭＶβｇａｌ単独で一過的にトランスフェクトした)を、電流を記録するパッチクランプ法の全細胞変法によって分析した。１つの細胞だけが識別可能な内向きのバリウム電流を示した。この電流は１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在によって影響されなかった。更に、Ｂａ２＋電流を示さなかった４つの細胞にＢａｙ Ｋ ８６４４を付加してもいかなる電流も出現しなかった。
【０２６５】
α１、α２及びβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによるＨＥＫ２９３細胞の一過的トランスフェクションの２日後に、個々のトランスフェクタントの電圧依存性バリウム電流を検定した。９つのトランスフェクタントで電流が記録された。１つの細胞のトランスフェクション効率は別の細胞のトランスフェクション効率とは異なっているので、個々のトランスフェクタント中の異種タンパク質の発現の程度は一様でなく、異種ＤＮＡを取り込まない細胞または発現しない細胞もある。これらの９個のトランスフェクタントのうちの２つで内向きのバリウム電流が検出された。これらのアッセイにおいて、膜の静止電位は−９０ｍＶであった。膜を一連の電圧段階で種々の試験電位に脱分極し、１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下及び非存在下の電流を記録した。内向きのバリウム電流の量はＢａｙ Ｋ ８６４４の付加によって有意に増加した。内向きのバリウム電流の最大値(〜１６０ｐＡ)は、１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下で膜を０ｍＶに脱分極したときに記録された。Ｂａｙ Ｋ ８６４４の非存在下及び存在下の夫々の場合の各脱分極後に記録された最大電流対脱分極電圧をプロットすることによってＩ−Ｖ曲線を作成し、双方の曲線を比較すると、Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下で電圧活性化電流が増加することが判明した。
【０２６６】
α１、α２及びβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡ及びｌａｃＺ遺伝子によってトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中のＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下に発生した電流の軌跡中に顕著なテール電流が検出されたが、これはこのトランスフェクタントで記録された電圧活性化バリウム電流の原因である組換えカルシウムチャンネルがＤＨＰ感受性であると考えられることを示す。
【０２６７】
内向きのバリウム電流を示した２つのトランスフェクト細胞のうちの第２の細胞は、膜を−９０ｍＶから脱分極したときに〜５０ｐＡの電流を示した。この電流は、確認されたカルシウムチャンネルブロッカーである２００μＭのカドミウムによってほぼ完全に遮断された。
【０２６８】
α１サブユニットをコードするＤＮＡとｌａｃＺ遺伝子とによって一過的にトランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの２日後に全細胞パッチ固定法によって分析した。これらの細胞の１つは３０ｐＡの内向きのバリウム電流を示した。この電流は１μＭのＢａｙ Ｋ ８６４４の存在下で２倍に増幅された。更に、Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下で小さいテール電流が検出された。これらのデータは、ＨＥＫ２９３細胞中のヒト神経カルシウムチャンネルα１ＤサブユニットをコードするｃＤＮＡの発現が機能性ＤＨＰ感受性カルシウムチャンネルを生じることを示す。
【０２６９】
３．ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の分析
一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の電気生理学的分析に関する記載(実施例７．Ｂ．２．ｃ)と同様にして、安定にトランスフェクトされた個々のＨＥＫ２９３細胞の電圧依存性バリウム電流の存在を電気生理学的に分析した。サイクリックＡＭＰ依存性キナーゼ媒介リン酸化[Ｐｅｒｚｅｒら (１９９０) Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １１４：１０７−２０７]を介してカルシウムチャンネル活性を最大にするために、ｃＡＭＰ(Ｎａ塩、２５０μＭ)をピペット溶液に添加し、いくつかの記録採取では浴液にフォルスコリン(１０μＭ)を添加した。これらの化合物の有無にかかわりなく定性的に同様の結果が得られた。
【０２７０】
Ｂａｙ Ｋ ８６４４(１μＭ)の非存在下及び存在下で安定にトランスフェクトされた細胞からバリウム電流が記録された。細胞をＢａｙ Ｋ ８６４４の非存在下で−９０ｍＶの静止電位から−１０ｍＶまで脱分極させると、急速に失活するテール電流を伴う約３５ｐＡの電流が記録された。Ｂａｙ Ｋ ８６４４を添加したときは、同様の脱分極プロトコルで、テール電流の上昇及び延長を伴う約７５ｐＡの電流が誘発された。この同じ細胞から記録された電流のピーク量を一連の脱分極電圧の関数として評価した。Ｂａｙ Ｋ ８６４４の存在下の応答が増加しただけでなく、電流−電圧関係全体が約−１０ｍＶシフトした。従って、Ｂａｙ Ｋ ８６４４の典型的な３つの特徴、即ち電流量の増加、テール電流の延長及び活性化電流の負シフトが観察され、これらは明らかに、安定にトランスフェクトされた細胞中のＤＨＰ感受性カルシウムチャンネルの発現をと示す。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中ではｃＡＭＰまたはフォルスコリンの有無にかかわりなく、Ｂａｙ Ｋ ８６４４のこのような効果は全く観察されなかった。
【０２７１】
Ｃ．ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを発現するためのｐＣＭＶに基づくベクター及びｐｃＤＮＡ１−に基づくベクターの使用
１．構築物の調製
ｐＣＭＶを用いて追加の発現ベクターを構築した。ｐＶＤＣＣIII(Ａ)からの全長α１Ｄ ｃＤＮＡ(実施例２．Ａ．３．ｄ)、ＨＢＣａＣＨα２からの３６００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントに含まれた全長α２ ｃＤＮＡ(実施例４．Ｂ)及びｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)からの全長β１サブユニットｃＤＮＡ(実施例３．Ｂ．３)を、プラスミドｐＣＭＶβｇａｌに個別にサブクローニングした。ｌａｃＺ遺伝子を除去するためにプラスミドｐＣＭＶβｇａｌをＮｏｔＩで消化した。ｐＣＭＶと呼ばれるプラスミドの残りのベクター部分のＮｏｔＩ部位に平滑末端を与えた。個別のＥｃｏＲＩフラグメントに含まれた全長α２をコードするＤＮＡ及びβ１をコードするＤＮＡを単離し、平滑末端を与え、ｐＣＭＶの平滑末端を有するベクターフラグメントに個別に結合させ、ｐＣＭＶ中のＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位との間にｃＤＮＡを配置した。α１ＤをコードするｃＤＮＡをｐＣＭＶと結合するために、ＣＭＶプロモーターの５’に直結するポリリンカー及びＳＶ４０ポリアデニル化部位の３’に直結するポリリンカー中の制限部位をｐＣＭＶから除去した。ＮｏｔＩ部位に１つのポリリンカーを付加した。このポリリンカーは制限酵素認識部位に以下の配列を有していた：
【０２７２】
【化１】
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【０２７３】
ｐＶＤＣＣIII(Ａ)からＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩとして単離されたα１ＤをコードするＤＮＡを次に、ＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位との間に配置するためにＸｂａII−ＳａｌＩ消化したｐＣＭＶに結合した。
【０２７４】
プラスミドｐＣＭＶはｐｃＤＮＡ１と同様にＣＭＶプロモーターを含んでいるが、挿入されたサブユニットをコードするＤＮＡに対するスプライスドナー／スプライスアクセプターの位置がｐｃＤＮＡ１とは違っている。スプライスドナー／スプライスレセプターの部位はＣＭＶプロモーターの３’及びサブユニットをコードするＤＮＡの開始コドンの５’に位置している。サブユニットをコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ１に挿入した後、スプライスドナー／スプライスアクセプターの部位はサブユニットｃＤＮＡ終結コドンの３’に位置している。
【０２７５】
２．ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
実施例７．Ｂ．１．ａに記載したように、ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＣＭＶ中のα１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードするＤＮＡまたはｐｃＤＮＡ１中のα１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードするＤＮＡ(夫々ベクターｐＶＤＣＣIII(Ａ)、ｐＨＢＣａＣＨα２Ａ及びｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ))によって一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクション効率の測定手段として各トランスフェクションにプラスミドｐＣＭＶβｇａｌを導入した。トランスフェクタントのβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果は(実施例７．Ｂ．２参照)、ＨＥＫ２９３細胞がｐＣＭＶ−及びｐｃＤＮＡ１−に基づくプラスミドによって等しい効率でトランスフェクトされたことを示した。しかしながら、現在では、カルシウムチャンネルレセプター発現のためにはｐｃＤＮＡ１に基づくプラスミドが好ましいとされている。
【０２７６】
Ｄ．ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＲＮＡのアフリカツメガエル卵母細胞中での発現
ｉｎ ｖｉｔｒｏ調製されたヒト神経α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードするＤＮＡの転写物の種々の組み合わせをアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。α１Ｄを含む組み合わせを注入した卵母細胞は電圧活性化バリウム電流を示した。
１．転写物の調製
ｍＣＡＰ ｍＲＮＡ ＣＡＰＰＩＮＧ ＫＩＴ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ｃａｔａｌｏｇ ＃２００３５０)の指示に従って、ヒト神経カルシウムチャンネルα１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を合成した。ｐｃＤＮＡ１とリボソーム結合部位で始まるα１Ｄ ｃＤＮＡとコーディング配列の８番目のＡＴＧコドンとを含むプラスミドｐＶＤＣＣIII．ＲＢＳ(Ａ)(実施例３．Ａ．３．ｄ参照)、ｐｃＤＮＡ１とα２サブユニットｃＤＮＡをと含むプラスミドｐＨＢＣａＣＨα１Ａ(実施例４参照)、及び、ｐｃＤＮＡ１とイントロン配列が欠失しリボソーム結合部位を含むβ１ ＤＮＡとを含むプラスミドｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)(実施例３参照)を、制限消化によって直鎖化した。α１Ｄ ｃＤＮＡ及びα２サブユニットをコードするプラスミドをＸｈｏＩで消化し、β１サブユニットをコードするプラスミドをＥｃｏＲＶで消化した。ＤＮＡインサートをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写した。
【０２７７】
２．卵母細胞の注入
アフリカツメガエル卵母細胞を単離し、コラゲナーゼ処理によって濾胞を除去し、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６、２０μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中に１９〜２５℃で注入後２〜５日間維持した後、記録採取した。卵母細胞に注入された各転写物に、細胞あたり６ｎｇの特異的ｍＲＮＡを注入し、総量５０ｎｌとした。
【０２７８】
３．細胞内電圧記録
注入卵母細胞の電圧依存性バリウム電流を、２電極電圧固定法[Ｄａｓｃａｌ，Ｎ． (１９８７) ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２：３１７]を用いて試験した。電圧コマンドを発生しデータを取得して分析するために、ｐＣｌａｍｐ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)ソフトウエアパッケージを、Ｌａｂｍａｓｔｅｒ １２５ｋＨｚのデータ取得インタフェースと共に使用した。この分析にはＱｕａｔｔｒｏ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌも使用した。電流信号を１−５ｋＨｚでディジタル化し、適宜濾過した。浴液は、４０ｍＭのＢａＣｌ２、３６ｍＭのテトラエチルアンモニウムクロリド(ＴＥＡ−Ｃｌ)、２ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭの４−アミノピリジン、０．１５ｍＭのニフルミン酸(niflumic acid)、５ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．６を含んでいた。
【０２７９】
ａ．ヒト神経カルシウムチャンネルα１、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の電気生理学的分析
非注入の卵母細胞を２電極電圧固定法によって試験すると、７つの分析細胞中の１つの細胞だけで極めて小さい(２５ｎＡ)内因性の内向きＢａ２＋電流が検出された。
【０２８０】
α１Ｄ、α２及びβ１サブユニット転写物を同時注入した卵母細胞は、−９０ｍＶまたは−５０ｍＶの静止電位から膜を脱分極させると、内向きのバリウム電流(１５４±１２９ｎＡ，ｎ＝２１)が持続した。これらの電流は典型的には、１４０〜７００ｍｓｅｃ．の試験パルスを投与したときに失活をほとんど示さなかった。一連の電圧に脱分極すると、電流は約−３０ｍＶで初めて出現し約０ｍＶでピークになることが判明した。
【０２８１】
ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４４を添加すると、電流量が増加し、細胞の脱分極のときに存在するテール電流の持続が延長し、電流活性化に超分極シフトが誘発された。Ｂａｙ Ｋ ８６４４をＤＭＳＯ中のストック溶液から新しく調製し、還流ポンプを停止させながら６０μｌの浴に１０×濃縮物として直接導入した。細胞と接触する最終希釈薬剤溶液のＤＭＳＯ濃度は０．１％を決して超過しなかった。対照実験は、０．１％のＤＭＳＯが膜電流に全く影響しないことを示した。
【０２８２】
ＤＨＰアンタゴニストであるニフェジピンの添加(ＤＭＳＯ中で調製しＢａｙ Ｋ ８６４４の添加に関して記載したように細胞に付加)は、α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットの転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流のかなりの部分(９１±６％，ｎ＝７)を遮断した。内向きのバリウム電流の残留失活成分は典型的にはニフェジピン添加後に残存していた。内向きのバリウム電流は、５０μＭのＣｄ２＋によって完全に遮断されたが、１００μＭのＮｉ２＋によれば約１５％遮断されただけであった。
【０２８３】
α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットの転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流に対するωＣｇＴＸの効果を試験した。キャリアータンパク質として作用させるために、ωＣｇＴＸ(Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ ＣＡ)を０．１％のシトクロムＣ(Ｓｉｇｍａ)を加えた１５ｍＭのＢａＣｌ２浴液中で調製した。対照実験は、シトクロムＣが電流に全く影響しないことを示した。−９０ｍＶの静止電位から０ｍＶまでの一連の電圧パルスを２０ｍｓｅｃ．間隔で記録した。二価カチオンによるωＣｇＴＸ結合の阻害を減少させるために、１５ｍＭのＢａＣｌ２、７３．５ｍＭのテトラエチルアンモニウムクロリドと４０ｍＭのＢａ２＋記録溶液に等しい残りの成分中で記録を採取した。テール電流の延長によって識別されるＤＨＰ感受性電流成分に対するωＣｇＴＸの効果を判定するために、ωＣｇＴＸの添加に先立ってＢａｙ Ｋ ８６４４を細胞に添加した。比較的高い濃度(１０−１５μＭ)のωＣｇＴＸによって内向きのバリウム電流は弱く(５４±２９％，ｎ＝７)且つ可逆的に遮断された。試験電流及び随伴するテール電流はωＣｇＴＸの添加後２〜３分以内に徐々に遮断されたが、ωＣｇＴＸを浴から洗浄除去すると双方が部分的に回復した。
【０２８４】
ｂ．ヒト神経カルシウムチャンネルα１Ｄをコードする転写物単独またはα１Ｄと他のサブユニットとをコードする転写物を注入した卵母細胞の分析
α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流に対するα２及びβ１サブユニットの貢献度を、α１Ｄサブユニット単独による発現及びβ１サブユニットまたはα２サブユニットとの併用による発現によって評価した。α１Ｄ ｃＤＮＡの転写物単独を注入した卵母細胞では、Ｂａ２＋電流が全く検出されなかった(ｎ＝３)。α１Ｄ及びβ１のｃＤＮＡの転写物を注入した卵母細胞では、−９０ｍＶの静止電位から膜を脱分極したときにα１Ｄ、α２及びβ１のｃＤＮＡの転写物を注入した細胞で観察される電流に類似の小さい(１０８±３９ｎＡ)Ｂａ２＋電流が検出されたが、電流量は少なかった。α１ＤをコードするＤＮＡ及びβ１をコードするＤＮＡの転写物を注入した４つの卵母細胞のうちの２つでは、Ｂａ２＋電流はＢａｙ Ｋ ８６４４に対して、α１Ｄ、α１−、α２−及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞で発現されたＢａ２＋電流のＢａｙ Ｋ ８６４４感度と同様の感度を示した。
【０２８５】
α１Ｄ及びα２サブユニットをコードする転写物を注入した５つの卵母細胞のうちの３つでは、−９０ｍＶの静止電位から膜を脱分極したときに極めて小さいＢａ２＋電流(１５−３０ｎＡ)を示した。これらのバリウム電流はＢａｙ Ｋ ８６４４に殆どまたは全く反応しなかった。
【０２８６】
ｃ．ヒト神経カルシウムチャンネルα２及び／またはβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の分析
α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中で検出された内向きのバリウム電流に対するα１Ｄ α１−サブユニットの貢献度を評価するために、ヒト神経カルシウムチャンネルα２及び／またはβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞のバリウム電流を検定した。α２サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は検出可能な内向きのバリウム電流を全く示さなかった(ｎ＝５)。β１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は脱分極されると測定可能な(５４±２３ｎＡ，ｎ＝５)内向きのバリウム電流を示したが、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞は、β１をコードするＤＮＡ単独の転写物を注入した卵母細胞で検出されたよりも約５０％大きい(８０±６１ｎＡ，ｎ＝１８)内向きのバリウム電流を示した。
【０２８７】
β１サブユニットをコードする転写物またはα２とβ１との双方のサブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流は典型的には、膜が−９０ｍＶの静止電位から−３０ｍＶまで脱分極したときに最初に観察され、膜が１０〜２０ｍＶに脱分極したときにピークを示した。巨視的には、α２とβ１との双方のサブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の電流とβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の電流とを識別することはできなかった。α１Ｄ、α２及びβ１サブユニット ｃＤＮＡの転写物を同時注入した卵母細胞中の電流と対比して、これらの電流は、試験パルス中に有意な失活を示し静止電位に対して強力な感度を示した。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流は通常は、１４０ｍｓｅｃのパルス中にピーク量の１０〜６０％まで失活し、α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中の電流よりも静止電位に対する感度が有意に増加していた。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞の膜の静止電位を−９０ｍＶから−５０ｍＶに変化させると、これらの細胞の内向きのバリウム電流の量が約８１％(ｎ＝１１)減少した。これに対比して、α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中で測定された内向きのバリウム電流は静止電位を−９０ｍＶから−５０ｍＶに変化させたときに約２４％(ｎ＝１１)減少した。
【０２８８】
α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中の内向きのバリウム電流はα１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した卵母細胞中で観察された内向きのバリウム電流とは薬理学的に違っていた。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞はＢａｙ Ｋ ８６４４に不感受性の内向きのバリウム電流を示した(ｎ＝１１)。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中でニフェジピンの静止電位感度及び電流が観察されたので、ニフェジピン感度の測定は難しい。しかしながら、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を同時注入した２つの卵母細胞は−５０ｍＶの静止電位から脱分極したときに測定可能な(２５〜４５ｎＡ)の内向きのバリウム電流を示した。これらの電流はニフェジピン(５〜１０μＭ)に感受性でなかった。α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞の内向きのバリウム電流は重金属に対して、α１Ｄ、α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中で検出された電流と同じ感度を示した。
【０２８９】
ヒト神経α２及びβ１サブユニットをコードする転写物を注入した卵母細胞中で検出された内向きのバリウム電流は、非注入のアフリカツメガエル卵母細胞中のカルシウム電流に類似する薬理学的及び生物物理学的特性を有していた。このヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットのアミノ酸はトランスメンブランドメインを形成し得る疎水性セグメントが欠失しているので、組換えβ１サブユニット単独でイオンチャンネルを形成し得るとは考え難い。むしろ、卵母細胞中に相同内因性α１サブユニットが存在し、このようなα１サブユニットによって媒介される活性がヒト神経β１サブユニットの発現によって強化される可能性が高い。
【０２９０】
Ｅ．ヒト神経カルシウムチャンネルα１Ｂ、α２Ｂ及びβ１−２サブユニットをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞中での発現
１．ＨＥＫ細胞のトランスフェクション
ヒト神経α１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２サブユニットの一過的発現をＨＥＫ２９３細胞中で試験した。５％の限定補充したウシ胎仔血清(Ｈｙｃｌｏｎｅ)とペニシリンＧ(１００Ｕ／ｍｌ)及び硫酸ストレプトマイシン(１００μｇ／ｍｌ)とを含むダルベッコの改質イーグル培地(Ｇｉｂｃｏ)中でＨＥＫ２９３細胞を単層培養物として増殖させた。ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを前述のようにリン酸カルシウムによって媒介した。トランスフェクトした細胞の電圧依存性Ｃａ２＋チャンネルによって媒介される内向きのバリウム電流(ＩＢａ)を試験した。
【０２９１】
ポリリシンをコートしたプレートあたり２×１０６の細胞をトランスフェクトした。標準トランスフェクション(１０ｃｍの皿)は、８μｇのｐｃＤＮＡα１Ｂ−１、５μｇのｐＨＢＣａＣＨα２Ａ、２μｇのｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)(実施例２．Ａ．３、４V．Ｂ及びIII参照)及び２μｇのＣＭＶβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド及び２０μｇ／ｍｌの一定質量を維持するためのｐＵＣ１８とを含んでいた。トランスフェクションの４８〜７２時間後に細胞を分析した。β−ガラクトシダーゼ活性に対するｉｎ ｓｉｔｕ組織化学染色(Ｓａｎｅｓら (１９８６) ＥＭＢＯ Ｊ．，５：３１３３)によって測定したトランスフェクション効率(±１０％)は概して５０％を上回っていた。
【０２９２】
２．トランスフェクタント電流の電気生理学的分析
ａ．材料及び方法
組換え発現されたＣａ２＋チャンネルの特性を全細胞パッチ固定法によって試験した。トランスフェクションの２〜３日後にトランスフェクトＨＫＥ２９３細胞において記録を採取した。記録採取の２４時間前に、ポリリシンをコートした３５ｍｍの組織培養皿(Ｆａｌｃｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，ＣＡ)あたり１００，０００〜３００，０００の細胞を平板培養した。水酸化テトラエチルアンモニウム(浴液)で調整した１０ｍＭのＢａＣｌ２、１２５ｍＭの塩化コリン、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓ(ｐＨ＝７．３)で細胞を潅流した。水酸化テトラエチルアンモニウムで調整した１３５ｍＭのＣｓＣｌ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、４ｍＭのＭｇ−アデノシン三リン酸(ｐＨ＝７．５)をピペットに充填した。Ｓｙｌｇａｒｄ(Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ)コートし、火炎研磨し、充填したピペットは、ｇｉｇｏｈｍのシールを細胞に設ける前には１〜２メガオームの抵抗を有していた。
【０２９３】
Ｂａｙ Ｋ ８６４４及びニフェジピン(Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ)をストック溶液(ジメチルスルホキシド中)から調製し、浴液に希釈した。細胞と接触する最終薬剤溶液中のジメチルスルホキシドの濃度が０．１％を超過することはなかった。対照実験は、０．１％のジメチルスルホキシドが膜電流に全く影響しないことを示した。ωＣｇＴＸ(Ｂａｃｈｅｍ，Ｉｎ  ｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ)を、キャリアータンパク質として作用する０．１％のシトクロムＣ(Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ)を加えた１５ｍＭのＢａＣｌ２浴液中で調製した。対照実験はシトクロムＣが電流に全く影響しないことを示した。これらの薬剤を浴液に溶解し、所与の実験の必要に応じた吹管ピペットによって連続的に添加した。室温で(２２℃〜２５℃)、記録採取を行った。典型的には２〜３．５メガオームのピペットアクセス抵抗に起因する電圧誤差を最小にするための直列抵抗補償(７０〜８５％)を使用した。０．５〜３ｋＨｚの範囲のサンプリング速度の１／４〜１／５の周波数で電流信号を濾過した(−３ｄＢ，４極Ｂｅｓｓｅｌ)。電圧コマンドを発生させ、データをＣＬＡＭＰＥＸ(ｐＣｌａｍｐ，Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ)で取得した。報告された全データを直線状リーク及び容量成分に対して補正した。ＣＬＡＭＰＦＩＴ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ)によって電流を指数調整(exponential fit)を行った。
【０２９４】
ｂ．結果
トランスフェクタントの流入Ｂａ２＋電流(ＩＢａ)を試験した。α１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２サブユニットをコードするＤＮＡでコトランスフェクトした細胞は高い電圧活性化Ｃａ２＋チャンネルを発現した。ＩＢａは膜が−９０ｍＶの静止電位から−２０ｍＶに脱分極したときに最初に出現し、１０ｍＶでピーク量に到達した。９５細胞中の３９の細胞が(１２の独立トランスフェクション)３０〜２７００ｐＡの範囲の平均４３３ｐＡのＩＢａを有していた。平均電流密度は２６ｐＡ／ｐＦであり、最大密度は１５０ｐＡ／ｐＦであった。典型的にはＩＢａは記録採取の最初の５分間で２〜２０倍に増加した。長期間の記録採取中には反復する脱分極によってＩＢａの減少が生じたが、この減少は通常は１０分以内で２０％を超過することはなかった。ＩＢａは典型的には１０分以内に活性化され、４６〜１０５ｍｓの範囲の高速時定数及び２９１〜４５３ｍｓ(ｎ＝３)の範囲の低速時定数の双方で失活した。失活は、複合的な電圧依存性を示し、≧２０ｍＶで誘発されたＩＢａは、より低い試験電圧で誘発されたＩＢａよりも遅く失活した。その理由は恐らく、高い試験電圧では高速失活成分に比べて低速失活成分の量が増加しているためであろう。
【０２９５】
組換えα１Ｂ−１α２ｂβ１−２チャンネルは静止電位に感受性であった。多様な静止電位における３０〜６０秒のコンディショニング後に測定したＩＢａの定常状態の失活は−６０ｍＶと−７０ｍＶの間の静止電位では約５０％であり、−４０ｍＶの静止電位では約９０％であった。失活したＩＢａの回復は通常は不完全であり、静止電位をより大きい負の電位に戻した後１分以内では初期量の５５〜７５％であった。これはある程度の減少が存在すること、即ち低速の回復が存在することを示す。
【０２９６】
組換えα１Ｂ−１α２ｂβ１−２チャンネルはまた、実験の時間規模中に０．５〜１０μＭの範囲の濃度のω−ＣｇＴｘによって不可逆的に遮断された。５μＭの毒素(ｎ＝７)を添加すると２分以内に活性が完全に遮断され、浴からω−ＣｇＴｘを洗浄した後も１５分間はＩＢａの回復が観察されなかった。ｄ２＋の遮断(５０μＭ)は速く完全で可逆的であった。ＤＨＰ Ｂａｙ Ｋ ８６４４(１μＭ；ｎ＝４)またはニフェジピン(５μＭ；ｎ＝３)は識別可能な影響を与えることはなかった。
【０２９７】
組換えα１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２サブユニットをコードするＤＮＡでコトランスフェクトした細胞は、主として単一クラスの飽和可能な高親和性ω−ＣｇＴｘ結合部位を示した。測定された解離定数(Ｋｄ)の値は５４．６±１４．５ｐＭ(ｎ＝４)であった。β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡまたはα２ｂβをコードするＤＮＡだけを含むベクターでトランスフェクトした細胞は特異的結合を全く示さなかった。α１Ｂ−１α２ｂβトランスフェクト細胞の結合容量(Ｂｍａｘ)は細胞あたり２８，７１０±１１，９５０部位(ｎ＝４)であった。
【０２９８】
これらの結果は、α１Ｂ−１α２ｂβ１−２トランスフェクト細胞が高電圧で活性化されるＣａ２＋チャンネル活性を発現し、この活性は失活する成分を含み、ω−ＣｇＴｘによって不可逆的に遮断され、ＤＨＰに不感受性で静止電位に感受性であることを示す。これらの細胞中に形成されたチャンネルの活性化及び不活性化のカイネティクス並びに電圧感受性は、神経細胞のＮ型Ｃａ２＋チャンネルの従来のキャラクタリゼーションとほぼ合致する。
【０２９９】
Ｆ．ヒト神経カルシウムチャンネルα１Ｂ−１、α１Ｂ−２、α２ｂ、β１−２及びβ１−３サブユニットをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞中での発現
非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中で有意なＢａ２＋電流は検出されなかった。更に、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞は検出可能なω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合部位を発現しない。
【０３００】
トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞中の三量体α１Ｂ、α２ｂ、β１タンパク質複合体の均質集団の発現の近似状態を得るために、α１Ｂ、α２ｂ、β１の発現レベルを変化させた。トランスフェクションに使用したα１Ｂ、α２ｂ、β１発現プラスミドのモル比を調節することによって細胞表面におけるチャンネル複合体の発現効率及び組立効率を最適にした。タンパク質発現を評価する免疫試薬の非存在下でほぼ最適のチャンネル発現を決定するために、トランスフェクタントのｍＲＮＡレベル、ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合及びＣａ２＋チャンネル電流密度を分析した。α２ｂのモル比が高いほどカルシウムチャンネル活性が増加するらしいと考えられた。
【０３０１】
１．トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ(Ｇｉｂｃｏ ＃３２０−１９６５ＡＪ)、５．５％限定／補充ウシ胎仔血清(Ｈｙｃｌｏｎｅ ＃Ａ−２１５１−Ｌ)、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中に維持した。Ｃａ２＋リン酸塩ベースの一過的トランスフェクションを行って前述のように分析した。細胞を、８μｇのｐｃＤＮＡ１α１Ｂ−１(実施例２．Ｃに記載)、５μｇのｐＨＢＣａＣＨα２Ａ(実施例４．Ｂ参照)、２μｇのｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)(β１−２発現プラスミド；実施例３．Ａ及び９．Ｅ参照)及び２μｇのｐＣＭＶβ−ｇａｌ[Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ](Ｃａ２＋チャンネルサブユニット発現プラスミドのモル比２：１．８：１)、または、３μｇのｐｃＤＮＡ１α１Ｂ−１もしくはｐｃＤＮＡ１α１Ｂ−２、１１．２５μｇのｐＨＢＣａＣＨα２Ａ、０．７５もしくは１．０μｇのｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢＳ(Ａ)もしくはｐｃＤＮＡ１β１−３及び２μｇのｐＣＭＶβ−ｇａｌ(Ｃａ２＋チャンネルサブユニット発現プラスミドのモル比２：１０．９：１)とコトランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドであるプラスミドｐＣＭＶβ−ｇａｌを組織化学的染色によってトランスフェクション効率を推定させ得るマーカーとしてトランスフェクションに導入した。３個未満のサブユニットが発現したときは、ｃＤＮＡインサートが欠失したｐＣＭＶプロモーター含有ベクターであるｐＣＭＶＰＬ２で置換してトランスフェクション中に等モルのｐＣＭＶベースのＤＮＡを維持するようにした。トランスフェクション中のＤＮＡの総量を２０μｇ／プレートに維持するためにｐＵＣ１８を使用した。
【０３０２】
トランスフェクト細胞のＲＮＡのカルシウムチャンネルサブユニットｍＲＮＡ発現を、ランダムプライムした３２Ｐ標識サブユニット特異的プローブを用いたノーザンブロットによって分析した。α１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２発現プラスミド(夫々８、５及び２μｇ；モル比＝２：１．８：１)でコトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞は、各Ｃａ２＋チャンネルサブユニットｍＲＮＡを等しいレベルで発現しなかった。α１Ｂ−１及びβ１−２のｍＲＮＡは比較的高いレベルで発現されたが、α２ｂのｍＲＮＡは有意に低いレベルで発現された。３つのｍＲＮＡの全部で等価の信号を生じるために必要なオートラジオグラフ露光に基づいて、α２ｂ転写物のレベルは、α１Ｂ−１及びβ１−２転写物のレベルよりも５〜１０分の１であると推定された。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞は検出可能なレベルのα１Ｂ−１、α２ｂまたはβ１−２ ｍＲＮＡを発現しなかった。
【０３０３】
等価のＣａ２＋チャンネルサブユニットｍＲＮＡ発現レベルを達成するために、種々の量のα１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２発現プラスミドを用いた一連のトランスフェクションを行った。α１Ｂ−１及びβ１−２のｍＲＮＡがα２ｂのｍＲＮＡに比べて極めて高いレベルで発現したので、トランスフェクション実験でα１Ｂ−１及びβ１−２プラスミドの量を減らし、α２ｂプラスミドの量を増やした。夫々３、１１．２５及び０．７５μｇのα１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２発現プラスミド(モル比＝２：１０．９：１)を用いたコトランスフェクションで、各Ｃａ２＋チャンネルサブユニットｍＲＮＡが均等な発現レベルに近づいた。α１Ｂ−１及びβ１−２発現プラスミドに対するα２ｂ発現プラスミドの相対的モル量を６倍に増やした。トランスフェクション中のα１Ｂ−１及びβ１−２プラスミドの量が２．６７倍減少し、α２ｂプラスミドの量が２．２５倍増加した。ほぼ等しい量のｍＲＮＡレベルを得るために必要なα２ｂのモル量がα１Ｂ−１及びβ１−２の６倍であったということは、α２ｂのｍＲＮＡの相対量が５〜１０分の１であるというこれまでの推定と合致する。種々の量の発現プラスミドでトランスフェクトした細胞に対するω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合は、夫々３、１１．２５及び０．７５μｇのα１Ｂ−１、α２ｂ及びβ１−２プラスミドがチャンネル複合体の細胞表面発現レベルを改良したことを示した。α１Ｂ−１を一定に維持してα２ｂ及びβ１−２発現プラスミドの量を更に増加させても、α２ｂ及びβ１−２を一定に維持してα１Ｂ−１発現プラスミドの量を変化させても、細胞あたりのω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合部位の細胞表面発現レベルがほぼ最適になることが判明した。その後のすべてのトランスフェクションは、夫々３、１１．２５及び０．７５μｇまたは１．０μｇのα１Ｂ−１もしくはα１Ｂ−２、α２ｂ及びβ１−２もしくはβ１−３発現プラスミドを用いて実施した。
【０３０４】
２．トランスフェクト細胞に対する１２５Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合
分散量の１方向分析(ＡＮＯＶＡ)及び多数を対合比較するＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒテスト(ｐ≦０．０５)を順次に用いてＫｄ及びＢｍａｘの統計的分析を行った。ヒト電圧依存性Ｃａ２＋チャンネルサブユニット、α１Ｂ−１、α１Ｂ−２、α２ｂ、β１−２、β１−３、の種々の組み合わせについて１２５Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡの飽和結合を試験した。アッセイあたり約２００，０００の細胞を使用したが、α１Ｂ−１、α１Ｂ−２、α１Ｂ−１α２ｂ、α１Ｂ−２α２ｂの組み合わせの場合は、管あたり１×１０６細胞を用いて検定した。トランスフェクト細胞は、単一クラスの飽和可能な高親和性結合部位を示した。種々の組み合わせについて解離定数(Ｋｄ)及び結合容量(Ｂｍａｘ)の値を測定した。結果を以下にまとめる。
【０３０５】
【表６】
2004180691.tif 000008
Ｎ．Ｄ．＝検出不能
【０３０６】
α１Ｂ−１またはα１Ｂ−２サブユニットが欠失したサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞は検出可能な１２５Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ結合を全く示さなかった(≦６００部位／細胞)。α１Ｂ−２単独またはα１Ｂ−２α２ｂをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に対する１２５Ｉ−ω−ＣｇＴｘ  ＧＶＩＡ結合は信頼できるＳｃａｔｃｈａｒｄデータ分析を得るためにはあまりにも低かった。Ｋｄ値及びＢｍａｘ値の比較から、サブユニットの特定の組み合わせとトランスフェクト細胞の結合親和性及び容量との間のいくつかの関係が判明した。３つのサブユニット全部でトランスフェクトした細胞(α１Ｂ−１α２ｂβ１−２、α１Ｂ−１α２ｂβ１−３、α１Ｂ−２α２ｂβ１−２またはα１Ｂ−２α２ｂβ１−３トランスフェクタント)中では、４４．３±８．１ｐＭ〜５４．９±１１．１ｐＭの範囲のＫｄ値が識別不可能であった(ｐ＞０．０５)。α２ｂサブユニットの欠失した２つのサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞(α１Ｂ−１β１−２、α１Ｂ−１β１−３、α１Ｂ−２β１−２またはα１Ｂ−２β１−３)中では、１６．４±１．２〜２２．２±５．８ｐＭの範囲のＫｄ値は３つのサブユニットの組み合わせよりも有意に低かった(ｐ＜０．０１)。α１Ｂ−１サブユニット単独でトランスフェクトした細胞は３１．７±４．２ｐＭのＫｄ値を有しており、この値は、α２ｂの欠失した２つのサブユニットの組み合わせと違っていなかった(ｐ＜０．０５)。α１Ｂα２ｂβ１対α１Ｂβ１の４つの組み合わせの比較と同様に、α１Ｂ−１がα２ｂと同時発現したとき、Ｋｄは３１．７±４．２から８４．６±５．３ｐＭまで有意に増加した(ｐ＜０．０５)。これらのデータは、α１Ｂ−１、α１Ｂ−１β１−２、α１Ｂ−１β１−３、α１Ｂ−２β１−２またはα１Ｂ−２β１−３などのサブユニットの組み合わせとα２ｂサブユニットとの同時発現が１２５Ｉ−ω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡに対する細胞表面レセプターの結合親和性を低下させることを示す。種々のサブユニットの組み合わせでトランスフェクトした細胞のＢｍａｘ値もかなり違っていた。α１Ｂ−１サブユニット単独でトランスフェクトした細胞は低いが検出可能な数の結合部位(約７５０結合部位／細胞)を発現した。α１Ｂ−１サブユニットをα２ｂサブユニットと同時発現させると、結合容量は約３倍に増加するが、β１−２またはβ１−３をα１Ｂ−１と同時発現させると表面結合の発現が８または１０倍に増加した。３つのサブユニット全部でトランスフェクトした細胞は最大数の細胞表面レセプターを発現した。α１Ｂ−１α２ｂβ１−３またはα１Ｂ−２α２ｂβ１−３の組み合わせでトランスフェクトした細胞の結合容量は、β１−２サブユニットを含む対応する組み合わせの約２倍であった。同様に、α１Ｂ−１α２ｂβ１−２またはα１Ｂ−１α２ｂβ１−３の組み合わせでトランスフェクトした細胞はα１Ｂ−２を含む対応する組み合わせの約２．５倍の結合部位を細胞あたりに含んでいた。すべての場合に、α２ｂサブユニットをα１Ｂ及びβ１と同時発現させたときの表面レセプター密度は、対応するα１Ｂ及びβ１の組み合わせだけでトランスフェクトした細胞に比べて増加していた。α１Ｂ−１α２ｂβ１−２では約８倍、α１Ｂ−１α２ｂβ１−３では１０倍、α１Ｂ−２α２ｂβ１−２では９倍及びα１Ｂ−２α２ｂβ１−３では１３倍であった。従って、Ｂｍａｘ値の比較は、毒素結合サブユニットα１Ｂ−１またはα１Ｂ−２は、α２ｂまたはβ１−２もしくはβ１−３サブユニットと同時発現されたときに細胞表面でより効率的に発現および組立られ、α２ｂまたはβ２サブユニットが存在するときに極めて効率的に発現される。
【０３０７】
３．電気生理学
全細胞記録法を用いてα１Ｂ−１α２ｂβ１−２及びα１Ｂ−１β１−２サブユニットの機能性発現を評価した。周囲細胞と非接触で簡単な形態を有しているトランスフェクト細胞をトランスフェクションの約４８時間後に記録採取に使用した。ピペット溶液は、(ｍＭで)１３５ＣｓＣｌ、１０ＥＧＴＡ、１ＭｇＣｌ２、１０ＨＥＰＥＳ及び４ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ(ｐＨ７．３、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。外部溶液は(ｍＭで)１５ＢａＣｌ２、１２５コリンＣｌ、１ＭｇＣｌ２及び１０ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７．３、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。キャリアーとして作用する０．１％のシトクロムＣ(Ｓｉｇｍａ)を含むω−ＣｇＴｘ ＧＶＩＡ(Ｂａｃｈｅｍ)の外部溶液を調製した。対照実験は、シトクロムＣがＢａ２＋電流に全く影響しないことを示した。
【０３０８】
α１Ｂ−１プラスミドとβ１−２プラスミドとの相対量を一定に維持して、種々の量のα２ｂ発現プラスミドでトランスフェクトした細胞中のＢａ２＋電流の巨視的電気生理学特性を試験した。これらのトランスフェクタントの全細胞から記録されたＢａ２＋電流(１５ｍＭのＢａＣｌ２)の振幅及び密度は劇的な違いを示した。３種類のトランスフェクション(α２ｂ非含有；[α１Ｂ−１：α２ｂ：β１−２]のモル比２：１．８：１；[α１Ｂ−１：α２ｂ：β１−２]のモル比２：１０．９：１)の７〜１１の細胞からの平均電流を測定した。トランスフェクションにα２ｂが含まれていないときに最小電流(範囲：１０〜２０５ｐＡ)が記録され、α１Ｂ−１α２ｂβ１−２プラスミドが比２：１０．９：１であるときの最大電流(範囲：５０〜８３００ｐＡ)が記録された。この比は、各サブユニット転写物のｍＲＮＡレベルがほぼ等価になった値である。α２ｂプラスミドの量を、ほぼ等しい量のサブユニットｍＲＮＡが生じるように調整すると、平均のピークＢａ２＋電流は４３３ｐＡから１，８２４ｐＡ(４．２倍)に増加し、対応する平均電流密度の増加は２６ｐＡ／ｐＦから１２７ｐＡ／ＰＦ(４．９倍)であった。この増加は、トランスフェクション中に１／２．７倍に減量したα１Ｂ−１及びβ１−２発現プラスミドの存在下で生じる。全部のトランスフェクション中で、Ｂａ２＋電流の量は正規分布に従っていなかった。
【０３０９】
サブユニットの組み合わせを比較しα２ｂの効果を判定するために、α１Ｂ−１β１−２または２：１．８：１(α１Ｂ−１：α２ｂ：β１−２)のモル比または２：１０．９：１(α１Ｂ−１：α２ｂ：β１−２)のモル比のα１Ｂ−１α２ｂβ１−２でトランスフェクトした細胞の電流−電圧特性を試験した。α２ｂ非含有及び１１．２５μｇのα２ｂ含有(モル比２：１０．９：１)の極限実施例は、０ｍＶ〜＋４０ｍＶの試験電位で電流電圧プロットの有意な違いを示さなかった(ｐ＜０．０５)。電流電圧プロットのピーク領域の両側で観察された僅かな差異は正規化に起因すると考えられる。α１Ｂ−１β１−２でトランスフェクトした細胞で観察された極めて小さい電流は、試験パルスによって活性化されたバリウム電流に比べてかなり高い残留リーク成分を有していた。電流電圧プロットを正規化すると、このリークはα１Ｂ−１α２ｂβ１−２でトランスフェクトした細胞中よりもはるかに大きい成分であり、その結果として、電流電圧プロットの幅が広くなったと考えられる。特に、α１Ｂ−１β１−２でトランスフェクトした細胞の電流−電圧プロットがピークの両側で開いていくという事実から考えると、これが電流電圧プロットの見掛けの差異の最も正しい説明であろうと考えられる。典型的には、電圧依存性活性化がシフトすると、電流−電圧プロット全体がシフトするが、これは観察されなかった。各々のカイネティクスを定性的に比較するために、−９０ｍＶ〜１０ｍＶの試験パルスの平均応答を正規化しプロットした。どの組み合わせに関しても、全細胞Ｂａ２＋電流の活性化または不活性化のカイネティクスの有意な差異は観察されなかった。
【０３１０】
Ｇ．ヒト神経カルシウムチャンネルα１Ｅ−３α２ｂβ１−３及びα１Ｅ−１α２ｂβ１−３サブユニットをコードするＤＮＡのＨＥＫ細胞中での発現
α１Ｅ−１α２ｂβ１−３及びα１Ｅ−３α２ｂβ１−３並びにα１Ｅ−３の機能性発現を全細胞記録法を用いて評価した。
【０３１１】
１．方法
周囲細胞と非接触で簡単な形態を有する一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の記録をトランスフェクションの２日後に採取した。
【０３１２】
トランスフェクトした組換えカルシウムチャンネルからのバリウム電流を記録するためにピペット充填に使用した内部溶液は、(ｍＭで)１３５ＣｓＣｌ、１０ＥＧＴＡ、１ＭｇＣｌ２、１０ＨＥＰＥＳ及び４ｍＭのＭｇ−ＡＴＰ(ｐＨ７．４−７．５、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。バリウム電流を記録するための外部溶液は、(ｍＭで)１５ＢａＣｌ２、１５０コリンＣｌ、１ＭｇＣｌ２及び１０ＨＥＰＥＳ及び５ＴＥＡ−ＯＨ(ｐＨ７．３、ＴＥＡ−ＯＨで調整)であった。Ｃａ２＋をＢａ２＋に置換した実験では、細胞外溶液を完全に交換しＢａ２＋とＣａ２＋との混合を完全に防止するために層流室を使用した。キャリァーとして作用する０．１％のシトクロムＣを含むω−ＣｇＴｘ  ＧＶＩＡの外部溶液を調製した。加圧した吹管ピペットによって毒素を添加した。直列抵抗を７０−８５％補償し、直列抵抗からの電圧誤差が５ｍＶ未満のときにだけ電流を分析した。リーク抵抗及びキャパシタンスは、ｐＣｌａｍｐ(Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ)によって作成されたＰ／−４プロトコルによって観察された標準化電流を減算することによって修正した。
【０３１３】
２．電気生理学的結果
α１Ｅ−１α２ｂβ１−３またはα１Ｅ−３α２ｂβ１−３は全細胞パッチ固定記録法によって強いバリウム電流を示した。α１Ｅ−３α２ｂβ１−３を発現する細胞は、α１Ｅ−１α２ｂβ１−３を発現する細胞よりも大きいピーク電流を有していた。更に、活性化及び不活性化のカイネティクスは、α１Ｅカルシウムチャンネルを発現する細胞中よりも明らかに実質的に速い。α１Ｅ−３単独を発現するＨＥＫ２９３細胞は有意な程度の機能性カルシウムチャンネルを含み、α１Ｅα２ｂβ１−３を発現する細胞と同様の特性を有するが実質的により小さいピークバリウム電流を有する。従って、α１Ｅの場合、α２及びβ１サブユニットはα１Ｅ媒介カルシウムチャンネルの機能性発現のためには不要であるが、機能性カルシウムチャンネルの数を実質的に増加させる。
【０３１４】
α１Ｅα２ｂβ１−３を発現する細胞の電流電圧特性の試験は、α１Ｅ−３α２ｂβ１−３が高電圧活性化カルシウムチャンネルであり、同じくα２ｂとβ１、及びα１Ｂとα１Ｄを発現する他の神経カルシウムチャンネルをやや下回る正の電位でピーク電流に達することを示す。α１Ｅ−１α２ｂβ１−３及びα１Ｅ−３α２ｂβ１−３の電流電圧特性はα１Ｂ−１α２ｂβ１−３の電流電圧特性とは統計的に違っている。α１Ｅ−１α２ｂβ１−３及びα１Ｅ−３α２ｂβ１−３の電流電圧曲線は、α１Ｅ−３単独の電流電圧曲線と同様に約＋５ｍＶでピークに達する。
【０３１５】
双方のプレパルス(２００ｍｓ)を用いる失活及び定常状態の失活のカイネティクス及び電圧依存性を試験した。α１Ｅ媒介カルシウムチャンネルは従来のクローン化されたカルシウムチャンネル及び他の電圧活性化カルシウムチャンネルに比べて速やかに失活する。α１Ｅ−１α２ｂβ１−３媒介カルシウムチャンネルは速やかに失活し、従って、比較的短い(２００ｍｓ)プレパルス及び長いプレパルス(＞２０ｓ定常状態失活)の双方に感受性であるが、定常状態失活から速やかに回復する。速やかな失活のカイネティクスは２つの成分を有しており、一方は約２５ｍｓの時定数をもち、他方は約４００ｍｓの時定数をもつ。
【０３１６】
α１Ｅ媒介カルシウムチャンネルが低電圧活性化カルシウムチャンネルの特性を有するか否かを判断するために、−６０〜＋９０ｍＶの範囲の試験パルスによって活性化されたテール電流を−６０ｍＶで詳細に測定した。−６０ｍＶで記録されたテール電流は、１５０〜３００μｓの単一指数によって十分に調整できた。この値は、低電圧活性化カルシウムチャンネルで典型的に観察された値よりも少なくとも１桁速い。
【０３１７】
α１Ｅ−３α２ｂβ１−３を発現するＨＥＫ２９３細胞は、荷電キャリヤーとＢａ２＋及びＣａ２＋によって搬送される電流とが異なる電流−電圧特性を有するときにＢａ２＋によってより多くの電流を流す。更に、不活性化の時間的進行はより緩徐であり、プレパルスの不活性化の量はＣａ２＋が荷電キャリヤーであるときにより少ない。
【０３１８】
本発明をある程度詳細に説明して来たが、通常の知識をもつ当業者に明らかな修正が本発明の範囲を逸脱することなく可能であろう。このような修正は当業者に明らかであるから、本発明は請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。
【配列表】
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