(57)【要約】【課題】セレノシステイン含有タンパク質を実用化可能な発現量で産生する遺伝子組換えシステムを構築する。【解決手段】動物個体内で動作可能な発現調節領域をコードする遺伝子配列、目的とするセレノシステイン含有タンパク質をコードする遺伝子配列、およびセレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ配列）をコードする遺伝子配列を有する遺伝子発現ユニットを動物細胞に導入し、ついで該動物細胞を哺乳動物または鳥類へ導入して、目的とするセレノシステイン含有タンパク質を発現可能な遺伝子組換え動物を作製する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物個体内で目的とするセレノシステイン含有タンパク質を発現させるために使用される遺伝子発現ユニットであって、当該動物個体内で動作可能な発現調節領域をコードする遺伝子配列、当該セレノシステイン含有タンパク質をコードする遺伝子配列、およびセレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ配列）をコードする遺伝子配列を有することを特徴とする遺伝子発現ユニット。
【請求項２】
当該セレノシステイン含有タンパク質が、セレノプロテイン類である請求項１に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項３】
当該セレノシステイン含有タンパク質が、セレノプロテインＰである請求項２に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項４】
当該セレノプロテインＰが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖よりなる、請求項３に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項５】
当該セレノシステイン含有タンパク質が、セレノシステイン非含有タンパク質を基本骨格とし、当該タンパク質の１以上のシステインがセレノシステインに置換されるかあるいは１以上のセレノシステインの挿入または置換によって形成されたものである、請求項１に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項６】
当該ＳＥＣＩＳ配列がセレノプロテインＰ遺伝子由来のものである、請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項７】
当該ＳＥＣＩＳ配列がセレノプロテインＰのコーディング配列の３’非翻訳領域に存在する配列である請求項６に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項８】
当該ＳＥＣＩＳ配列が、ＳＢＰ２とＳｅｃ−ｔＲＮＡＳｅｃを持ったｅＥＦｓｅｃとが複合体を形成できるものである請求項７に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項９】
当該発現調節領域が、動物細胞における発現を可能とするもので、各種分泌器官に対して特異的な発現調節領域である、請求項１から８のいずれかに記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項１０】
当該分泌器官が、ミルク、血液、尿、または精液を分泌する器官である請求項９に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項１１】
当該発現調節領域が、ミルク中に発現させる場合に、βカゼイン、βラクトグロブリン、乳清酸性タンパク等の転写調節領域、血中に発現させる場合に、種々の血液タンパク質、肝臓発現タンパク質などの転写調節領域、または尿中または精液中に発現させる場合に、各種分泌器官特異的な転写調節領域である、請求項１０に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項１２】
当該発現調節領域が、目的のタンパク質をミルク中に発現させることが可能な発現調節領域で、βカゼイン、βラクトグロブリン、乳清酸性タンパクから選択される発現調節領域である請求項１１に記載の遺伝子発現ユニット。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の遺伝子発現ユニットが組み込まれた動物細胞。
【請求項１４】
当該動物細胞が、卵子、胚、胚性幹（ＥＳ）細胞、始原生殖（ＰＧＣ）細胞、または体細胞から選択される請求項１３に記載の動物細胞。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の動物細胞が組み込まれたことを特徴とする、目的とするセレノシステイン含有タンパク質を発現可能な遺伝子組換え動物。
【請求項１６】
当該遺伝子組換え動物が、哺乳動物または鳥類から選択される請求項１５に記載の遺伝子組換え動物。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の遺伝子組換え動物を用い、当該動物及び／またはその子孫からセレノシステイン含有タンパク質を回収することを特徴とする、セレノシステイン含有タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
当該セレノシステイン含有タンパク質が、セレノプロテイン類である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
当該セレノシステイン含有タンパク質が、セレノプロテインＰである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
当該セレノプロテインＰが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖よりなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
当該セレノシステイン含有タンパク質が、セレノシステイン非含有タンパク質を基本骨格とし、当該タンパク質の１以上のシステインがセレノシステインに置換されるかあるいは１以上のセレノシステインの挿入または置換によって形成されたものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
目的とするセレノシステイン含有タンパク質を発現可能な遺伝子組換え動物の製造方法であって、
（ａ）動物個体内で目的とするセレノシステイン含有タンパク質を発現させるために使用される遺伝子発現ユニットであって、当該動物個体内で動作可能な発現調節領域をコードする遺伝子配列、当該セレノシステイン含有タンパク質をコードする遺伝子配列、及びセレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ配列）をコードする遺伝子配列を有することを特徴とする遺伝子発現ユニットを作製し、
（ｂ）上記（ａ）の遺伝子発現ユニットを動物細胞に導入し、ついで
（ｃ）上記（ｂ）の動物細胞を哺乳動物または鳥類へ導入して、目的とするセレノシステイン含有タンパク質を発現可能な遺伝子組換え動物を作製する
ことを含む方法。
【請求項２３】
請求項１５または１６に記載の遺伝子組換え動物により産生されるセレノシステイン含有タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、セレノシステイン含有タンパク質を産生する遺伝子組換え動物に関する。詳細には、動物個体内で動作可能な発現調節領域をコードする遺伝子配列、セレノシステイン含有タンパク質のコーディング配列、及びその３’側に位置するセレノシステイン挿入配列（以下、「ＳＥＣＩＳ配列」ともいう）を含む遺伝子発現ユニット、及び該遺伝子発現ユニットを導入された遺伝子組換え動物、及び該遺伝子組換え動物を用いたセレノシステイン含有タンパク質の製造方法に関する。好適には本発明の遺伝子組換え動物にはセレノプロテインＰ遺伝子が導入される。
【０００２】
【従来の技術】
セレノシステイン含有タンパク質とはシステインの硫黄がセレンに置き換ったアミノ酸、セレノシステイン（以下、「Ｓｅｃ」ともいう）を持つタンパク質で、このようなタンパク質を総称して「セレノプロテイン」と呼ばれている。哺乳動物には３０〜５０種類のセレノプロテインが存在しており（例えば、非特許文献１参照）、そのうちの約２０種類が同定されている。代表的なセレノプロテインとして、グルタチオン（ＧＳＨ）存在下に過酸化物を還元無毒化するグルタチオン・ペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）が挙げられる。ＧＰｘには、局在性と基質特異性の異なる４つのタイプが存在する。細胞質型ＧＰｘ（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＧＰｘ：ｃＧＰｘ）は細胞質に局在しており、過酸化水素を還元するが、過酸化脂質を還元する活性はない（例えば、非特許文献２参照）。リン脂質ヒドロペルオキシドＧＰｘ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ＧＰｘ；ＰＨ−ＧＰｘ）は細胞質、ミトコンドリアの両方に存在しており、過酸化水素だけでなく過酸化脂質も還元する（例えば、非特許文献３参照）。また、胃腸特異的に発現するタイプのＧＰｘである消化管型ＧＰｘ（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ＧＰｘ；ＧＩ−ＧＰｘ）も知られている（例えば、非特許文献４参照）。一方、細胞外には細胞外ＧＰｘ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＧＰｘ；ｅＧＰｘ）が存在し、ＰＨ−ＧＰｘと同様に過酸化水素と過酸化脂質の両方を還元する（例えば、非特許文献５参照）。
【０００３】
また、甲状腺ホルモン前駆体Ｔ４を活性型Ｔ３に変換するヨードチロニン脱ヨード酵素（例えば、非特許文献６参照）や、チオレドキシンを還元し細胞内レドックス制御に関与するチオレドキシン・レダクターゼ（例えば、非特許文献７参照）、Ｓｅｃの生合成のセレンドナーであるセレノフォスフェートを合成するセレノフォスフェート合成酵素（例えば、非特許文献８参照）がある。これらはいずれもレドックス制御に関わる酵素であり、Ｓｅｃはこれら酵素の活性部位を形成している。この他、血漿中に存在するセレノプロテインＰ（以下、「ＳｅＰ」ともいう）（例えば、非特許文献９参照）や骨格筋に発現するセレノプロテインＷ（例えば、非特許文献１０参照）、Ｔ細胞に発現する１５ｋＤａセレノプロテインなどが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。また最近、ＳＥＣＩＳの保存されている配列をモチーフとして相同性検索を行い、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＳＥＣＩＳを持つ新規のセレノプロテイン遺伝子が複数同定され、ｉｎ  ｖｉｖｏで７５Ｓｅ標識されたタンパク質の分析結果からも、さらに多くのセレノプロテインの存在が示唆されている（例えば、非特許文献１２参照）。
【０００４】
セレンは生体にとって非常に重要な微量元素であり、その欠乏に伴って様々な疾患や機能不全（肝壊死、心筋症、筋ジストロフィー、不妊、免疫不全など）を引き起こす。セレンは、生体内ではほとんどがＳｅｃとしてセレノプロテインに取り込まれており、セレン欠乏によるこれらの機能不全は前述の様々な生体内のセレノプロテインが低下した結果引き起こされる。すなわち、セレンはセレノプロテイン類を通して生体機能を発揮しており、セレンの作用の大部分はセレノプロテイン類の作用といえる。このように、セレノプロテイン類は生体にとって非常に重要なタンパク質であり、これらのセレノプロテイン類を用いれば、前述の様々な疾患に対する予防薬、治療薬の開発が可能になると考えられる。
【０００５】
しかし、このようなセレノプロテインの生合成には特殊な機構が必要である。Ｓｅｃは終止コドンのひとつＵＧＡによりコードされ、ｍＲＮＡからの翻訳時にタンパク質に組み込まれる。Ｓｅｃはタンパク質合成時に翻訳され得る２１番目のアミノ酸である。ＵＧＡが終止コドンとして認識されず、Ｓｅｃとして認識されるためには、翻訳時にＵＧＡの下流にＳｅｃ挿入配列（ＳＥＣＩＳ配列）と呼ばれるステム−ループ構造の存在が必須である。ごく最近、哺乳動物についてＳＥＣＩＳと特異的に結合する因子であるＳＥＣＩＳ結合タンパク質２（ＳＥＣＩＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２；以下、「ＳＢＰ２」という）とセレノステリル−ｔＲＮＡＳｅｃ（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｒｙｌ−ｔＲＮＡＳｅｃ；以下、「Ｓｅｃ−ｔＲＮＡＳｅｃ」という）に結合する特異な伸長因子ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｓｅｃ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（以下、「ｅＥＦｓｅｃ」という）の存在が報告された（例えば、非特許文献１３参照）。ＳＥＣＩＳにＳＢＰ２が結合し、ＳＢＰ２とＳｅｃ−ｔＲＮＡＳｅｃを持ったｅＥＦｓｅｃが結合することから、リボソーム上でＵＧＡコドンが現れたときＳｅｃとして翻訳されると考えられている。
【０００６】
このように、セレノプロテインの生合成は、この２つの核内因子を中心に複雑で特殊なメカニズムで行われるために、通常のタンパク質の場合と異なり、セレノプロテイン遺伝子の動物細胞への導入による遺伝子組換えセレノプロテインの産生は難しいと考えられている。実際、Ｔｕｊｅｂａｊｅｖａらは、セレノプロテイン類の一つであるラットセレノプロテインＰ遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に導入し発現を試みているが、その発現の程度は自発的にわずかなヒトセレノプロテインＰを発現しているＨｅｐＧ２肝細胞株と同程度しか達成できなかった（非特許文献１４参照）。すなわち、彼らの発現のレベルは、放射性同位元素である７５Ｓｅを用いて発現したセレノプロテインＰをラベルしなければ、検出することができないほどであった。
【０００７】
【非特許文献１】
コール（Ｊ．  Ｋｏｈｒｌ）ら、“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  ２０００，  ３８１，  ８４９
【非特許文献２】
ミルズ（Ｇ．  Ｃ．  Ｍｉｌｌｓ）、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  １９５７，  ２２９，  １８９
【非特許文献３】
ウアシニ（Ｆ．  Ｕｒｓｉｎｉ）ら、“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ”，  １９８５，  ８３９，  ６２
【非特許文献４】
チュー（Ｆ．  Ｆ．  Ｃｈｕ）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  １９９３，  ２６８，  ２５７１
【非特許文献５】
山本（Ｙ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら、“Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ”，  １９９３，  ３０５，  ５４１
【非特許文献６】
ベリー（Ｍ．  Ｊ．  Ｂｅｒｒｙ）ら、“Ｎａｔｕｒｅ”，  １９９１，  ３４９，  ４３８
【非特許文献７】
田村（Ｔ．  Ｔａｍｕｒａ）ら、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ”，  １９９６，  ９３，  １００６
【非特許文献８】
ギュイマレーズ（Ｍ．  Ｊ．  Ｇｕｉｍａｒａｅｓ）ら、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ”，  １９９６，  ９３，  １５０８６
【非特許文献９】
バーク（Ｒ．  Ｆ．  Ｂｕｒｋ）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ”，  １９９４，  １２４，  １８９１
【非特許文献１０】
バオ（Ｙ．  Ｂａｏ）ら、“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  １９９５，  ２２４，  ３９５
【非特許文献１１】
グラディシェフ（Ｖ．  Ｎ．  Ｇｌａｄｙｓｈｅｖ）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  １９９８，  ２７３，  ８９１０
【非特許文献１２】
レスキュア（Ａ．  Ｌｅｓｃｕｒｅ）ら、“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  １９９９，  ２７４，  ３８１４７
【非特許文献１３】
アトキンス（Ｊ．  Ｆ．  Ａｔｋｉｎｓ）ら、“Ｎａｔｕｒｅ”，  ２０００，  ４０７，  ４６３
【非特許文献１４】
“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  ２０００，  ２７５，  ６２８８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らもセレノプロテイン類を遺伝子組換え技術によって組換えタンパク質として得るために、通常の動物細胞培養系を試みた。図１に示すような現在知られている中では最も強力なＣＡＧプロモーターとヒトセレノプロテインＰ遺伝子を用いた遺伝子発現ユニットを構築し、ハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）に導入した。その結果、セレノプロテインＰ遺伝子導入細胞の培養上清に約３０ｎｇ／ｍｌ程度の発現を確認した。このように、従来の動物細胞培養系による組換えセレノプロテイン類の産生量は、最大でも数１０ｎｇ／ｍＬと推定され、現状の動物細胞を用いたセレノプロテイン類の発現系では実用化は困難といわざるを得ない。
【０００９】
近年、医薬品等の有用タンパク質が遺伝子組換え技術を用いて大腸菌、酵母、培養細胞や昆虫細胞で大量に生産され実用化されている。しかし上述のようにセレノプロテイン類においては、特殊な生合成メカニズムを持つために、特に動物細胞において産生量が十分ではなく、実用化には至っていない。従って、セレノプロテイン類を遺伝子組換えタンパク質として生産させる技術を開発することは、セレノプロテイン類を医薬品等で実用化するためには必須事項であるといえる。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、種々の検討を重ねた結果、セレノプロテイン類を、通常の遺伝子組換えタンパク質の生産系である大腸菌、酵母、培養細胞や昆虫細胞を用いる生体外生産系ではなく、動物個体を用いる生体内生産系を開発することによって実用化可能な発現量を確保するセレノプロテイン類の遺伝子組換えタンパク質生産システムを完成するに至った。さらに、動物個体を用いた生体内発現系であれば、目的のセレノプロテイン類を正常な形で発現できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
さらに詳細には、ミルク中にタンパク質を分泌させるために、ウシβカゼイン遺伝子プロモーターにヒトセレノプロテインＰ  ｃＤＮＡ遺伝子を連結した遺伝子発現ユニットを構築し、遺伝子組換えマウスを作製することで、組換えセレノプロテインＰタンパク質の動物生体内生産系について検討した。セレノプロテインＰのＮ末側認識抗体を用いて測定した結果、ミルク中に最高で約２．５μｇ／ｍＬの組換えセレノプロテインＰを分泌する遺伝子組換えマウスの系列の取得に成功した。この発現量は従来の体外生産系（ＣＨＯ細胞：約３０ｎｇ／ｍｌ）と比べて、約８３倍の発現量に相当する。一方、セレノプロテインＰのＣ末側認識のモノクローナル抗体を用いて測定したところ、ＣＨＯ細胞（５ｎｇ／ｍｌ）に対し、最大６４３ｎｇ／ｍｌの組換えマウスが得られ、約１２９倍の産生量を達成していることが示された。
【００１２】
Ｃ末側認識抗体とＮ末側認識抗体によって検出される産生量が異なることから、発現されたセレノプロテインＰのＣ末側領域が何らかの変化を起こしていることが示唆される。Ｎ末側認識抗体の反応したセレノプロテインＰ量に対するＣ末側認識抗体の反応したセレノプロテインＰ量の割合は、ＣＨＯ細胞の場合が約１７％であったのに対し、ミルク中のセレノプロテインＰでは最大で約７８％にも達した動物が得られている。このように、動物個体によって産生されたセレノプロテインＰの方がＣ末側領域が変化していないセレノプロテインＰであることが示された。前述のように、セレノプロテインＰはオープンリーディングフレーム内にＳｅｃをコードする終止コドンＵＧＡが１０個存在し、最も遺伝子組換え発現のしにくいセレノプロテインである。このようにセレノプロテインＰにおいて高発現が確認されたことから、その他のＳｅｃを１個しか持たないセレノプロテイン類の発現量はセレノプロテインＰ以上に高くなると期待できる。
【００１３】
このように遺伝子組換えセレノプロテイン類産生の課題解決のポイントは、従来の生体外生産系ではなく、特殊なタンパク質生産メカニズムにも対応できる動物個体を用いる生体内産生系を用いることである。これまで外来のセレノプロテイン類遺伝子を動物個体に導入し発現させた例はなく、ましてやＳｅｃを１０個持つ構造上最も発現の難しいと考えられるセレノプロテインＰの動物個体での発現に成功した例はない。すなわち、本発明者らによって初めてこの事実が確認され、実用化可能な組換えセレノプロテイン類の大量生産系が可能となった。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、実用化可能な発現量を確保するセレノプロテイン類の遺伝子組換えタンパク質を生産させるために動物個体を用いることを特徴とする。それゆえ、臓器、血液、ミルク及び尿、鳥類の場合卵など各種分泌物中にセレノプロテイン類を発現・生産させることが発明のポイントとなる。動物個体にセレノプロテインを生産させるため、目的セレノプロテイン遺伝子を発現させる適当な動物個体内で動作可能な発現調節領域（プロモーター、エンハンサーなど）＋目的セレノプロテイン遺伝子＋ＳＥＣＩＳ配列からなる遺伝子発現ユニットを構築し、該遺伝子発現ユニットを目的の動物に既存の方法を用いて導入し、遺伝子組換え動物を作製する。発現調節領域としては、動物細胞で発現可能なものであれば、種類は限定されず、どのようなものでも使用可能であるが、標的臓器への特異性及び高発現を確保するものが好ましい。例えば、ミルク中に発現させるならβカゼイン、βラクトグロブリン、乳清酸性タンパクなど、血中発現なら、種々の血液タンパク質、肝臓発現タンパク質などの転写調節領域が使用可能である。その他、尿中、精液中など、各種分泌器官特異的な転写調節領域を使用すれば、目的の分泌中への発現となり、回収が容易である。
【００１５】
また、目的セレノプロテイン類はセレノシステインを持っているものであれば、どのような種類のタンパク質でもかまわず、さらにセレノプロテイン類以外のタンパク質に人為的にセレノシステインを導入したタンパク質でも発現可能である。当該セレノプロテイン類がセレノプロテインＰである場合、そのポリペプチド鎖は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものである。また、挿入する遺伝子は、染色体遺伝子でもｃＤＮＡタイプでも、その組み合わせでもよく、最終的にｍＲＮＡ段階で目的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが形成できる遺伝子であればよい。
【００１６】
さらに、そのコーディング配列の３’非翻訳領域に存在するＳＥＣＩＳ配列も、ＳＢＰ２とＳｅｃ−ｔＲＮＡＳｅｃを持ったｅＥＦｓｅｃとが複合体を形成できるものであれば、その種類や数、位置に限定されない。
以上の構成要件の組み合わせの一つの望ましい態様として、ウシβカゼイン遺伝子プロモーターにヒトセレノプロテインＰ  ｃＤＮＡ遺伝子（３’非翻訳領域のＳＥＣＩＳ配列を含む）を連結した遺伝子発現ユニットが例示される。
【００１７】
このような遺伝子ユニットを導入される動物としては、マウスを始め、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギなど哺乳動物が挙げられるが、ニワトリなどの鳥類も可能である。鳥類に導入する場合には、使用するプロモーターを鳥類用に変更する必要がある。
また、遺伝子ユニットの導入方法にも限定されるものではなく、前核期の受精卵にマイクロインジェクションするなど、卵子や胚に直接遺伝子を導入する方法；胚性幹（ＥＳ）細胞、始原生殖（ＰＧＣ）細胞や体細胞に遺伝子を導入し、その後、ＥＳ細胞の場合のように桑実胚などに細胞を注入してキメラ動物を作成する方法、ＰＧＣ細胞の場合のように胎生期の血液に細胞を戻して生殖系細胞を通して動物個体を得る方法、あるいは体細胞の場合のように未受精卵への核移植を行ういわゆるクローン動物を作成する方法；並びにそれらを組み合わせた方法などが利用可能である。あるいは、遺伝子を電気穿孔法、細胞の食作用を利用した方法及び超音波法などによって直接、動物個体に導入する方法のいずれでもかまわないが、子孫に安定的にＳｅＰの発現が確保できる遺伝子組換え動物を得る方法の方が好ましい。用いる動物はセレノプロテイン類の発現が確保できる動物種であれば、いずれでもかまわないが、実用化を考えた場合、哺乳類、鳥類ともある程度大型で、飼育管理システムが確立している動物種が好ましい。
上述のようにして作製された遺伝子組換え動物及び／またはその子孫から所望とするセレノシステイン含有タンパク質を回収することが可能となる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ヒトセレノプロテインＰ遺伝子の動物細胞用発現ベクター構築》
北海道大学薬学部衛生化学講座の高橋和彦助教授より供与されたヒトセレノプロテインＰ  ｃＤＮＡ（配列番号２）を含むプラスミドＳｅＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐ２００）の５’末端に制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を、３’末端にＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ認識配列及びマウスセレノプロテインＰ  ｐｏｌｙ  Ａ付加シグナルを付加するため、これを鋳型として下記配列を用いてＰＣＲを実施した（図１）。
ＰＳ１：５’ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＧＣＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＣＡＡＣ（配列番号３）
ＰＳ２：５’ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＴＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＧＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＴＴＡＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＣＧＴＡＣ（配列番号４）
【００１９】
サーマルサイクラーにはｐｒｏｇｒａｍ  ｔｅｍｐ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ＰＣ−８００（アステック社）を、ＤＮＡポリメラーゼにはＬＡＴａｑ（タカラ社）を用い、試薬濃度はキット添付プロトコールに従い、温度条件９６℃  ２０秒、６８℃  ３分の２５サイクル、６８℃  ５分の１サイクルでＰＣＲを行った。増幅された約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の手法に従い、ｐＣＲ２．１  ｖｅｃｔｏｒにクローニングし、Ｍ１３  ｒｅｖｅｒｓｅおよびＴ７をプライマーとして、挿入断片の５’末端から約２００ｂｐのＰｖｕＩＩ認識配列までと、３’末端から約１００ｂｐのＢｓｍＩ認識配列までのＤＮＡ配列を解析した。
【００２０】
解析結果から正しい配列が付加されたＤＮＡクローンを選択し、ＸｈｏＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ヒトセレノプロテインＰ  ｃＤＮＡを含む約２．１ｋｂｐの断片をｐＳＰ７２ベクターに挿入した（ｐ２０１：図１）。ＳｅＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＰｖｕＩＩ／ＢｓｍＩ消化により得られる２つの内部断片のうち、３’側のＰｖｕＩＩ−ＢｓｍＩ断片（０．９ｋｂｐ）をｐ２０１のＰｖｕＩＩ／ＢｓｍＩ消化後のベクター側を含む断片に挿入した（ｐ２０３：図１）。さらにこのｐ２０３をＰｖｕＩＩで消化し、ここにＳｅＰ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＰｖｕＩＩ消化により得られた５’側のＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ断片（約８６０ｂｐ）を挿入して、ＰＣＲによるエラーのないヒトセレノプロテインＰ発現用ＤＮＡ断片を得た（ｐ２０４：図１）。このｐ２０４をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化し、得られた約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を同じ制限酵素で消化したｐＣＡＧ  ｍｃｓ（特願平８−１６５２４９）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し動物細胞での発現プラスミド（ｐ２０６：図１）を完成した。
【００２１】
《実施例２：ヒトＳｅＰ遺伝子の動物細胞での発現》
（１）発現プラスミドの細胞への導入
導入ＤＮＡは以下のようにして調製した。実施例１で構築した発現ベクターｐ２０６で大腸菌  ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換し、２５０ｍｌ  ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）中、３７℃で一晩振とう培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。得られた  プラスミドＤＮＡ溶液より２０μｇを採取し、ＰｖｕＩでベクター上の一カ所を消化し、アガロース電気泳動により完全消化を確認してフェノール（フェノール：ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）処理およびエタノール沈殿によりタンパク質を除去した。これを脱パイロジェン処理した蒸留水に溶解し、２μｇに相当する断片を動物細胞へのトランスフェクションに使用した。
【００２２】
導入する動物細胞は以下の手順で準備した。ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ細胞；大日本製薬社）をシャーレ（φ１００ｍｍ）上で６００ｎｇ／ｍｌのＳｅＰ断片（特願平１０−３４７８６３）を添加した１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ハイクローン社）含有ＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）培地中で培養した。シャーレに接着したＣＨＯ細胞をトリプシン処理により剥離し、上記培地で懸濁して細胞数を計算後、１．０ｘ１０５細胞／ｍｌに調製した。これを培養用６ウエルテストプレート（Ф３５ｍｍ）に２ｍｌ／ウエルで播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
【００２３】
ＣＨＯ細胞への遺伝子導入には、トランスフェクション用リポフェクチン溶液  Ｔｒａｎｓ−ＩＴ  ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  社）を使用した。４ｍｌポリスチレンチューブ中で無血清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）２００μｌとＬＴ１  １０μｌをゆるやかに混和して室温に５分間放置した。次に、導入するＤＮＡ断片２μｇに相当する溶液を添加し、ゆるやかに混和して室温で５分間放置した（ＤＮＡ／リポフェクチン複合体）。この間、６ウエルプレートに播いた細胞の培養上清を吸引除去し、新しく同じ無血清培地に交換した。ＤＮＡ／リポフェクチン複合体溶液全量を１ウエルの細胞に添加し、ゆるやかに混合した。６時間から８時間、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した後培養上清を除き、６００ｎｇ／ｍｌのＳｅＰ断片（特願平１０−３４７８６３）を添加した１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ハイクローン社）含有ＲＰＭＩ１６４０（シグマ社）培地を添加した。
【００２４】
（２）安定形質転換細胞の獲得
２〜３日間同条件で培養後、０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）、１０％ＦＢＳ、６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片含有ＲＰＭＩ１６４０培地に交換した。同培地での約１０日間のＧ４１８による選択の後、常法に従って、増殖した細胞を６ウエル  プレートの１ウエル  当たり１本のクライオチューブに入れ液体窒素中に保管した。
【００２５】
（３）発現産物の調製
各安定形質転換細胞を１５ｃｍ培養シャーレに１０％ＦＢＳ、６００ｎｇ／ｍｌ  ＳｅＰ断片含有ＲＰＭＩ１６４０に懸濁して播き込んだ。この細胞が８０％以上の密度まで増殖した後、培養上清を除き、ＰＢＳで洗浄して６００ｎｇ／ｍｌＳｅＰ断片含有ＡＳＦ培地に交換した。陰性コントロールとなる親株（ＣＨＯ細胞）以外は０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加した。３日間の培養後、上清を回収し、０．２２μｍフィルターで細胞を除きアッセイ用のサンプルとした。また、陰性コントロールの培養上清も同様の処理、濃縮を行った。
【００２６】
（４）免疫沈降／ウェスタンブロット
ヒトセレノプロテインＰ遺伝子導入細胞および陰性コントロールとした親株の培養上清２００μｌを、磁気ビーズを結合した抗ヒトセレノプロテインＰモノクローナル抗体（ＡＨ５，  ＢＤ１：ともにセレノプロテインＰのＣ末領域認識モノクローナル抗体、北海道大学薬学部衛生化学講座高橋和彦助教授より供与）とともに０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ中で４℃、一夜反応した。反応後、磁石を用いてセレノプロテインＰ抗体複合体を分離し、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳにて２回洗浄した。こうして得たセレノプロテインＰ−抗体複合体を２倍濃度のＳＤＳ電気泳動用サンプル処理バッファー１０μｌで回収し、ウェスタンブロットのサンプルとした。
【００２７】
ヒト血漿より精製したセレノプロテインＰについても同様に調製し、上記サンプル、分子量マーカー（Ｒａｉｎｂｏｗ  ｍａｒｋｅｒｓ；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  社）とともに０．１％  ＳＤＳ含有１２．５％ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳゲル）にアプライし、定電流下で電気泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング装置（ＡＴＴＯ社）を使用し、添付のプロトコールに従ってＳＤＳゲル上で分離した蛋白をＰＶＤＦ膜にトランスファーした。このＰＶＤＦ膜をブロックエース（大日本製薬）中で室温にて、１時間浸し、非特異的な蛋白の結合をブロックした。次に、ビオチン標識した抗ヒトセレノプロテインＰモノクローナル抗体（ＢＤ１，  Ｂ７８）および抗ヒトセレノプロテインＰウサギポリクローナル抗体をそれぞれ終濃度１μｇ／ｍｌおよび２μｇ／ｍｌに調製した１０％ブロックエースを含む０．０５％ｔｗｅｅｎ含有ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）中で、３７℃で１時間反応し、ＴＢＳＴで５回洗浄した。この後、ＡＢＣキット（ＶＥＣＴＯＲ社：ＳＡ−５００４）を用いて、添付のプロトコールに従ってパーオキシダーゼ標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎを反応させ、さらにＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）  を用いて添付のプロトコールに従い化学発光による検出を行った。
【００２８】
本ウェスタンブロットの結果を図２に示す。親株としたＣＨＯ細胞の培養上清（陰性コントロール；ｐＣＨＯ）にはシグナルは認められないが、発現プラスミドを導入した組換えＣＨＯ細胞の培養上清（ｒＣＨＯ）には、陽性コントロールとした精製ヒトセレノプロテインＰと同じ分子サイズのシグナルが認められた。この結果から、発現プラスミドを導入した組換えＣＨＯ細胞では培養上清中にヒトセレノプロテインＰが発現していることが確認できた。
【００２９】
（５）培養上清中のセレノプロテインＰ発現量の測定
発現プラスミドを導入した組換えＣＨＯ細胞の培養上清中に発現したセレノプロテインＰの発現量は、以下に示すＥＬＩＳＡ法により行った。
［測定用プレートの調製］
９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社）の各穴にヒトセレノプロテインＰのＮ末端側を認識するモノクローナル抗体ＢＤ１（５μｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を加え、４℃で一夜静置した。次に、抗体を含む溶液を除き、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で４倍希釈したブロックエースを加え、３７℃で１時間反応してヒトセレノプロテインＰ測定用プレートとした。
【００３０】
［認識抗体の調製］
０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０含むリン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）で５倍希釈したブロックエースに２％ラット血清を加え、これを用いてビオチン標識したヒトセレノプロテインＰのＮ末端側を認識するモノクローナル抗体（ＡＨ５）およびＣ末端側を認識するモノクローナル抗体（ＡＡ３）をそれぞれ１．０μｇ／ｍｌに調製した。
［サンプルの調製］
発現プラスミドを導入した組換え体および親株のＣＨＯ細胞の無血清培養により得られた上清を（原液からＰＢＳＴで５倍に希釈して）測定に使用した。
［標準ヒトセレノプロテインＰの調製］
ヒトセレノプロテインＰをＰＢＳＴで４０ｎｇ／ｍＬから０．１５６ｎｇ／ｍＬの濃度に倍々希釈し調製した。
【００３１】
［発色用酵素液の調製］
ＨＲＰ標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＶＥＣＴＯＲ社：ＳＡ−５００４）を５０倍希釈濃度のブロックエースを添加したＰＢＳＴで１００００倍に希釈して調製した。
［測定］
サンプルおよび標準ヒトセレノプロテインＰを調製した認識抗体で２倍希釈し、測定プレートに１穴あたり１００μＬ添加して３７℃で１．５時間反応した。次に、１穴あたり３７０μＬのＰＢＳＴで５回洗浄し、続いて酵素液を１穴あたり１００μＬ添加して３７℃で１時間反応した。その後、１穴あたり３７０μＬのＰＢＳＴで８回洗浄し、続いて酵素基質（ＴＭＢＺ：化血研）を１穴あたり１００μＬ添加して室温で１５分反応した。１Ｎの硫酸アンモニアを１穴あたり１００μＬ添加することで発色を停止し、ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＰＬＵＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて４５０−６５０ｎｍの吸光度を測定した。測定した標準ヒトセレノプロテインＰの値より標準曲線（吸光度とセレノプロテインＰ濃度の関係）を作成し、サンプル中のヒトセレノプロテインＰ濃度を算出した。
【００３２】
［測定結果］
結果を表１に示す。固相化および認識抗体のいずれにもＳｅＰのＮ末端側を認識する抗体を使用した場合、発現プラスミドを導入した組換えＣＨＯ細胞の培養上清中には約３０ｎｇ／ｍｌのＳｅＰが分泌発現されていることが確認できた。一方、認識抗体にＳｅＰのＣ末端側を認識する抗体を使用した場合、前述した組換えＣＨＯ細胞の培養上清中のＳｅＰ量は５ｎｇ／ｍｌ程度であった。Ｃ末側認識抗体とＮ末側認識抗体によって検出される産生量が異なることから、発現したＳｅＰのＣ末側領域が何らかの変化を起こしていることが示唆された。
【００３３】
表１：セレノプロテインＰの発現量
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【００３４】
《実施例３：ウシβカゼインプロモーターのクローニング》
（１）ＤＮＡ抽出
ホルスタイン雌の血液１０ｍｌで、リンフォプレップ（Ｓｉｇｍａ）でリンパ球を集め、１５０ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテナーゼＫ（ｓｉｇｍａ，  ｉｎ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ  ７．５）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  （ｐＨ  ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ）が１．５ｍｌ入ったチューブに入れ、一昼夜、５５℃で振揺保温した。サンプルに等量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノールを加え、３０分間、回転攪拌（２０回転／１分間）した。１２０００ｒｐｍで３分間、遠心（室温）し、上清にあるフェノール層をとり、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノール／クロロホルム（１：１）を等量加えた。１５分間、回転攪拌（２０回転／１分間）後、１２０００ｒｐｍで３分間、遠心（室温）し、フェノール／クロロホルム層を除き、イソプロパノールを等量加えた。ゆっくり混ぜ、ＤＮＡを沈澱させた。１２０００ｒｐｍで３分間、遠心（室温）し上清を捨て、８０％エタノールで洗浄した。エタノールをチップで完全に除去し、軽く風乾し、０．１ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）に溶解した。
【００３５】
（２）ウシβカゼインプロモーターのクローニング
Ｂｏｎｓｉｎｇ（１９８８）らの報告（Ａｕｓｔ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．，  １９８８，４１，ｐ５２７−５３７）を参考に、ウシβカゼインプロモーターをＰＣＲにて増幅・複製するためのプライマーをデザインした。センスプライマーとしてｃｇｃ  ｃｔｃ  ｇａｇ  ＴＣＧ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＡＡＴ  Ｇ（配列番号５）（ｃｇｃ＋ＸｈｏＩサイト（制限酵素）＋Ｂｏｎｓｉｎｇ（１９８８）らの報告の−１７２３番目から−１６９９番目の塩基配列（大文字で示した配列））、リバースプライマーとしてｃｔｃ  ａａｇ  ｃｔｔ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＴＡＧ  ＡＧＧ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＡＧＴ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号６）（ｃｔｃ＋ＨｉｎｄＩＩＩサイト＋１３番目から３７番目の塩基配列）を用いた。サンプル約１００ｎｇを用いて定法に従ってＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは９５℃  ９分、９４℃  １分→  ５８℃  １分→  ７２℃  ３分／４０サイクル（５０μｌスケール）の条件で実施した。ＰＣＲ反応産物を電気泳動した結果、予定された産物サイズの約１７７９ｂｐのバンドが認められた（ウシβカゼインプロモーター：Ｐｂｂｃａｓ）。このバンドを切り出し、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、マルチクローニングサイトにＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩサイトを持つプラスミド（ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ，  プロメガ社）にクローニングした（ｐＧＬ３ｂｂｃａｓ，  図３）。
【００３６】
《実施例４：ヒトＳｅＰ遺伝子の動物用発現ユニットの構築》
実施例１にて構築したｐ２０４のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ消化により得られた約２．１  ｋｂｐのＤＮＡ断片を、実施例３により得られたウシβカゼインプロモーターを有する発現プラスミドｐＧＬ３ｂｂｃａｓの同サイトに挿入し、ヒトＳｅＰｃＤＮＡが組み込まれた乳腺特異的発現プラスミド（ｐ２０５：図３）を構築した。
【００３７】
《実施例５：ヒトＳｅＰ遺伝子導入マウスの作出》
実施例４で構築した遺伝子発現ユニットをマウス受精卵に顕微注入することで遺伝子組換えマウスを作出した。マウス受精卵は、採卵用のＢＤＦ１系統の雌にＰＭＳＧ（セロトロピン、帝国臓器）を５ユニット／１匹の用量で投与し、４８時間後にｈＣＧ（プベローゲン、三共）を５ユニット／１匹の用量で投与したあと、ＣＤ−１系統の雄と交配させることで得、ｈＣＧ投与後１８〜２２時間目の前核期の卵子を顕微注入操作に用いた。顕微注入操作はナリシゲ製マイクロマニュピレータを装着したニコン製の倒立顕微鏡を用いて実施した。マイクロマニュピレータに装着したマイクロニードル（ガラス管を加工し作製）に約５ｍｇ／ｍＬに調製した遺伝子発現ユニットＤＮＡ液を充填し、ナリシゲ製のインジェクターを用いて卵子の前核内に約２ｐＬ注入した。４７０個の受精卵子の核に遺伝子発現ユニットＤＮＡ液を注入し、一晩培養して分割した２細胞期の卵子４０９個を精管結紮雄と交配させることによって得た代理親マウス（系統：ＣＤ−１）１４匹にそれぞれ２０〜３０個づつ移植した。
【００３８】
その結果、５１匹の産仔が得られた。これらの産子の３週齢の時期に尾を３ミリ程度採取し、ＤＮＡを抽出するために、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．４５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．４５％  ＮＰ４０および０．０１％ゼラチンを含む細胞溶解緩衝液に０．０５％のタンパク分解酵素を加えたもので５０℃で一晩おくことで完全に消化した。ヒトＳｅＰ遺伝子導入の有無をＰＣＲ法で調べるために、尾の消化液４μｌ、１０×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ２．５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ２．５μｌ、センスプライマー（ＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＴＡＴＧＴＡＡ；配列番号７）１μｌ、アンチセンスプライマー（ＡＡＴＡＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＧ；配列番号８）１μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ０．２μｌ、蒸留水１３．８μｌをよく混合し、９４℃３０秒、６０℃（５８〜６２℃）１分、７２℃１分で３０サイクルの条件で、ＰＥ  ａｐｐｌｙｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のサーマルサイクラー（ｇｅｎｅａｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍｓ９７００）にかけて調べた結果、得られた産仔のうち１７匹がヒトＳｅＰ遺伝子を導入したマウスであった。この１７匹をファウンダー（系統初代：Ｆ０）とし系統の樹立を行った結果、１３系列のヒトＳｅＰ遺伝子導入マウスを確立した。
【００３９】
《実施例６：ミルク中のヒトＳｅＰ濃度の解析》
解析は系統初代マウス（Ｆ０）、野生型マウス（非遺伝子導入マウス）や同系統内で交配を行うことで得られた第一世代（Ｆ１）、第二世代（Ｆ２）および第三世代（Ｆ３）等を用いて行った。解析に用いたミルクは産仔出産後５〜１５日目に、Ｓｉｇｍａ社製のオキシトシン（０．１８Ｕ／ｋｇ体重）を投与し、指でしぼりだすことにより採取した。ヒトＳｅＰ遺伝子導入マウスのミルク中のヒトＳｅＰ量を実施例２に示したＥＬＩＳＡ解析によって測定した。その結果、確立した１３系列のヒトＳｅＰ遺伝子導入うち、１１系列にヒトＳｅＰの発現が認められた。その中でＮｏ．４２系列のＦ１からＦ３の８個体のミルクを解析した結果を表２に示す。Ｎ末側認識モノクローナル抗体を用いた場合には８２４〜２５５７ｎｇ／ｍＬの濃度で、Ｃ末側認識モノクローナル抗体を用いた場合には２９２〜６４３ｎｇ／ｍＬの濃度のヒトＳｅＰの産生が認められた。
【００４０】
表２：セレノプロテインＰの発現量
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【００４１】
Ｎ末側認識抗体の反応したＳｅＰ量に対するＣ末側認識抗体の反応したＳｅＰ量の割合は、ＣＨＯ細胞の場合が約１７％（表１）であったのに対し、ミルク中のＳｅＰでは最大で約７８％にも達している動物が得られた。このように、動物個体によって産生されたＳｅＰの方が動物細胞による発現産物より、よりＣ末の変化の少ないＳｅＰを産生していることが示され、動物個体での発現系の有用性が示唆されている。
【００４２】
【発明の効果】
本発明は、従来の血液材料からの分離・精製に依らない安定なセレノプロテイン類の生産系としても有用である。また本発明は、セレノシステインを持つよう人為的にデザインされたタンパク質の生産方法として有用である。本発明の遺伝子組換え動物により産生されるセレノシステイン含有タンパク質は酸化ストレスに関連した各種疾病に対する病態悪化阻止、予防または治療剤等の医薬品を可能ならしめるものである。
【００４３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）に導入したヒトＳｅＰ遺伝子発現ユニットの構築を示す模式図である。
【図２】培養上清中に分泌された組換えＳｅＰの免疫沈降−ウエスタンブロット解析結果を示す（ｐＣＨＯ：非遺伝子組換えＣＨＯ細胞の培養上清、ＳｅＰ：ヒト血漿より分離したＳｅＰ、ｒＣＨＯ：遺伝子組換えＣＨＯ細胞の培養上清）。
【図３】遺伝子組換えマウス作出に用いた乳腺特異的なヒトＳｅＰ遺伝子発現ユニットの構築を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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