(57)【要約】      （修正有）【課題】新規糖代謝及び／または脂質代謝に関連する遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該ポリペチドの製造方法、該遺伝子および／またはポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって取得される物質、該スクリーニングに使用するキット、該遺伝子および／またはポリペプチドを利用した糖代謝及び／または脂質代謝異常を改善する物質の試験方法、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチド及び／または該抗体を含有する医薬組成物等を提供すること。【解決手段】特定の配列で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド等、該ポリヌクレオチドがコードするタンパク質等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の１）乃至６）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド：
１）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
５）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
６）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
下記の１）乃至４）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド：
１）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
下記の１）乃至５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
５）上記１）乃至４）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記の１）乃至４）のいずれか一つに記載のポリペプチド：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド。
【請求項５】
下記の１）乃至）４）のいずれか一つに記載のポリペプチド：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【請求項６】
下記の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）に記載の検体由来の全ＲＮＡと正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より抽出した全ＲＮＡにおける下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド３）上記２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記１）における被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【請求項７】
下記の工程１）および２）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）上記１）で測定されたポリペプチドの発現量と正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、上記１）における被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【請求項８】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）被験物質と上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドを接触する工程；
２）上記工程１）で選択されたポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質を選択する工程。
【請求項９】
下記の工程１）乃至５）を含む、下記のａ）乃至ｇ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドの発現を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｃ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｄ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｅ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｆ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｇ）上記ａ）乃至ｆ）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）上記１）により得られた全ＲＮＡにおける、上記ａ）乃至ｇ）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
４）上記２）により得られた全ＲＮＡおける、上記３）で測定されてポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
５）上記３）で測定されたポリヌクレオチドの発現量と上記４）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析する工程。
【請求項１０】
下記の工程１）乃至５）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）上記１）により得られた全ＲＮＡにおける、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
４）上記２）により得られた全ＲＮＡおける、上記３）の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
５）上記３）で測定されたポリヌクレオチドの発現量と上記４）で測定された該ポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、該被験物質の、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善効果を判定する工程。
【請求項１１】
下記の工程１）乃至３）を含む、下記のａ）乃至ｇ）の少なくとも一つの発現を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
ｃ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
ｄ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
ｅ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｆ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｇ）上記ａ）乃至ｆ）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した細胞由来全ＲＮＡにおける、上記ａ）乃至ｇ）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
３）上記２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析する工程。
【請求項１２】
下記の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した細胞由来全ＲＮＡにおける、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
３）上記２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善効果を判定する工程。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはランオン・アッセイであることを特徴とする、請求項６、９、１０、１１及び１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする、請求項６、９、１０、１１及び１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
下記の工程１）乃至３）を含む、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの少なくともいずれか一つの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
３）２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した細胞における該ポリペプチドの発現量の差を解析する工程。
【請求項１６】
下記の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
３）２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した細胞における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善効果を判定する工程。
【請求項１７】
ポリペプチドの発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、請求項７、８、１５及び１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
下記の工程１）および２）を含む、下記のａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドの少なくともいずれか一つの機能を促進するか抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）  非ヒト哺乳動物に、上記ａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドおよび試験しようとする物質を投与する工程；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／またはインスリン濃度を測定する工程。
【請求項１９】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドを発現する細胞と被験物質を脂肪分解促進物質を含む溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中の遊離脂肪酸濃度を測定する。
【請求項２０】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中のグルコース濃度を測定する。
【請求項２１】
下記の１）乃至５）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに被験物質を含む試料を接触させ、次いで、該ポリペプチドに結合した物質を分離することを特徴とする糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善物質の単離方法：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【請求項２２】
下記の工程１）および２）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の治療および／または予防物質の試験方法：
１）非ヒト哺乳動物に、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリペプチドおよび試験しようとする物質を投与する工程；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／または中性脂質濃度を測定する工程。
【請求項２３】
下記の工程１）および２）を含む、糖代謝異常及び／または脂質代謝異常の治療及び／または予防物質の試験方法：
１）非ヒト哺乳動物に、下記のａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドおよび試験しようとする物質を投与する工程；
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／または中性脂質濃度を測定する工程。
【請求項２４】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、糖代謝異常および／脂質代謝異常の治療および／または予防物質の試験方法：
１）下記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドを発現する細胞と被験物質を脂肪分解促進物質を含む溶液中で接触させる；
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）１）に記載の溶液中の遊離脂肪酸濃度を測定する。
【請求項２５】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の治療および／または予防物質の試験方法：
１）下記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を溶液中で接触させる；
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）１）に記載の溶液中のグルコース濃度を測定する、
【請求項２６】
脂肪分解促進物質がＴＮＦ−αであることを特徴とする、請求項１９または２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞が哺乳動物由来培養細胞であることを特徴とする、請求項９乃至２０、及び、請求項２４乃至２６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物由来培養細胞が霊長類またはげっ歯類動物由来であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物由来培養細胞がヒトまたはマウス由来であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物由来培養細胞が、マウス由来の繊維芽細胞、マウス、ラットもしくはヒト由来の脂肪細胞、マウス、ラットもしくはヒト由来の肝細胞であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
請求項８乃至２１、及び、請求項２６乃至２９のいずれか一つに記載の方法によって取得された物質。
【請求項３２】
下記の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも１以上を含むキット：
１）配列表の配列番号４または８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５から３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号４または８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）上記１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記２）に記載のポリヌクレオチドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）下記の▲１▼乃至▲５▼から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
５）上記４）に記載の抗体に結合する二次抗体。
【請求項３３】
請求項１乃至３から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項３４】
下記のａ）乃至ｅ）から選択される少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【請求項３５】
アデノウイルスベクターであることを特徴とする、請求項３３または３４に記載の組換えベクター。
【請求項３６】
組換えベクターｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０。
【請求項３７】
請求項３３乃至３６から選択される組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載の宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を生成せしめることを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。
【請求項３９】
組換えタンパク質が下記の１）乃至５）から選択されるタンパク質であることを特徴とする、請求項３８に記載の製造方法：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【請求項４０】
下記の１）乃至５）から選択されるポリペプチドまたはその部
分ポリペプチドの少なくともいずれか一つに特異的に結合する抗体；
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【請求項４１】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
ヒト型抗体であることを特徴とする、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
下記の１）乃至５）から選択されるポリペプチドのうち少なくとも一つを含有する医薬組成物：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【請求項４４】
請求項４０乃至４２に記載の抗体の少なくともいずれか一つを含有する医薬組成物。
【請求項４５】
耐糖能異常症及び／または糖尿病治療薬であることを特徴とする、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、ノックアウトされている非ヒト動物：
（ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）上記（ａ）乃至（ｆ）から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドのヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｈ）乃至（ｋ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明はインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する遺伝子として見出された新規糖代謝及び／または脂質代謝に関連する遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該ポリペチドの製造方法、該遺伝子および／またはポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって取得される物質、該スクリーニングに使用するキット、該遺伝子および／またはポリペプチドを利用した糖代謝及び／または脂質代謝異常を改善する物質の試験方法、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチド及び／または該抗体を含有する医薬組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病は近年その患者数が増加しており、成人病のひとつとして注目されている。２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）は日本人に多い糖尿病のタイプであり、早期発見、早期治療がその予後の点からも重要である。
【０００３】
しかし、２型糖尿病はその成因が多様であり、予想されうる原因についての知見は乏しい。２型糖尿病におけるインスリン作用不足の原因として、インスリン感受性機構の異常とインスリン分泌の低下が挙げられる。欧米では多くは前者、すなわちインスリン抵抗性が２型糖尿病の主な原因であるが、日本ではインスリン分泌不全を主な原因とする場合も少なくない。
【０００４】
近年、糖尿病治療薬として、インスリン抵抗性改善剤が開発されてきている。「インスリン抵抗性改善剤」は、インスリン受容体のシグナル伝達を増強することにより、インスリン作用の感受性を上げ、不足を補う作用メカニズムによりインスリン抵抗性を改善する薬剤である。そのようなインスリン抵抗性改善剤としては、例えば、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（例えば、特許文献１参照。）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（例えば、特許文献２参照。）、又はロシグリタゾン（例えば、特許文献３参照。）、ＧＩ−２６２５７０（例えば、特許文献４参照。）、ＪＴＴ−５０１（例えば、特許文献５参照。）、ＡＺ−２４２（例えば、特許文献６参照。）、ＭＣＣ−５５５（例えば、特許文献７参照。）、ＹＭ−４４０（例えば、特許文献８参照。）、ＫＲＰ−２９７（例えば、特許文献９参照。）、Ｔ−１７４（例えば、特許文献１０参照。）、ＮＣ−２１００（例えば、特許文献１１参照。）、ＮＮ−６２２（例えば、特許文献１２参照。）、ＢＭＳ−２９８５８５（例えば、特許文献１３参照。）、５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオン（例えば、特許文献１４参照。）のようなオキサゾール化合物、オキサジアゾリジン化合物、チアゾリジン化合物又はフェノキサジン化合物等を挙げることができる。
【０００５】
これらのインスリン抵抗性改善剤のうち、トログリタゾン、ロジグリタゾン、及びピオグリタゾンのようなチアゾリジン誘導体は臨床の場で用いられている（例えば、非特許文献１、２及び３参照）。これらの薬剤は、基本構造としてチアゾリジン環骨格を有することを特徴としており、核内レセプターであるＰＰＡＲγを標的分子とし、肝臓、筋肉、及び脂肪細胞における遺伝子発現を変化させることにより、２型糖尿病患者のインスリン抵抗性を改善すると考えられている。
【０００６】
ＰＰＡＲγの主要な発現臓器である脂肪組織では、インスリン抵抗性改善剤はＰＰＡＲγに直接作用し脂肪組織のインスリン感受性を亢進する（例えば、非特許文献４参照）。一方、ＰＰＡＲγを標的分子とするインスリン抵抗性改善剤の生体内での作用として、筋肉における糖利用の促進および肝臓における糖放出の抑制が挙げられるが、筋肉や肝臓におけるインスリン抵抗性改善が、筋肉や肝臓に発現しているＰＰＡＲγに対する直接の作用であるかに関しては今なお不明な点が多い（例えば、非特許文献５参照。）。近年では、チアゾリジン誘導体に代表されるインスリン抵抗性改善剤により、脂肪組織から分泌される因子の産生量が調節されることが、生体のインスリン感受性を調節し２型糖尿病を改善する一因として考えられている。
【０００７】
脂肪組織は単なる脂肪の貯蔵器官ではなく、多数の因子を分泌する内分泌器官であり、これら分泌因子の中には、節食およびエネルギー代謝を調節するレプチン  （ｌｅｐｔｉｎ）（例えば、非特許文献６及び７参照。）、インスリン感受性を低下させる作用を持つ腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ−α）（例えば、非特許文献８参照。））やレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）（例えば、非特許文献９参照。）、インスリン感受性を亢進させるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）（例えば、非特許文献１０及び１１参照）等、肥満やインスリン抵抗性、２型糖尿病と関連する多数の因子が含まれる。
【０００８】
例えばＴＮＦ−αは、肥満・糖尿病を呈するマウスの脂肪組織では発現が上昇しており、ＴＮＦ−αを中和することによりインスリン抵抗性が改善する（例えば、非特許文献１２参照。）。またピオグリタゾン投与によりインスリン抵抗性が改善した状態では、肥満・糖尿病モデルマウスで認められたＴＮＦ−αの発現亢進が抑制される（例えば、非特許文献１３参照。）。
【０００９】
逆にアディポネクチンは、肥満・糖尿病を呈するマウスやヒトでは発現が低下しており（例えば、非特許文献１４及び１５参照。）、インスリン抵抗性改善剤投与時には、アディポネクチンの発現が上昇する（例えば、非特許文献１０及び１１参照。）。
【００１０】
心臓血管疾患は、いまだ世界のほとんどの先進諸国における死亡の主原因である。アテローム性動脈硬化症は、急性冠症候群（不安定狭心症、急性心筋梗塞、虚血性突然死）、脳血栓および脳梗塞の主な病因であり、心臓血管疾患による死亡の大部分は、これらの梗塞により引き起こされる。米国では、毎年、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心筋梗塞により５５万人が死亡していると推定される。１９９１年の統計では、日本での死亡原因の第一位がアテローム性動脈硬化症による心臓血管疾患である。疫学研究により、アテローム性動脈硬化症は、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧症、喫煙などの多くの危険因子によって生じることが判明している。
【００１１】
血清脂質にはコレステロール（コレステロールエステル、遊離コレステロール）、リン脂質（レシチン、スフィンゴミエリン等）、トリグリセライド（中性脂肪）、遊離脂肪酸、その他のステロール類などがあるが、とくに臨床的に問題となるのは、中性脂肪およびコレステロールの増加である（例えば、非特許文献１６及び１７参照。）。したがって、血中脂質値の適切なコントロールは、虚血性心疾患、脳梗塞などに代表される動脈硬化に関連した諸疾患の予防または治療に極めて重要である（例えば、非特許文献１８参照。）
また、近年、中性脂肪が動脈硬化に関連した諸疾患のリスクとして再認識されてきている（例えば、非特許文献１９参照）。。血中の中性脂肪を低下せしめる薬剤としては、フィブリン酸系化合物、例えば、クロフィブレート、フェノフィブレート、ベザフィブレート、ゲムフィブロジルなどが医薬として供されており、血漿中の中性脂肪およびコレステロール値を低下させ、コレステロール値の高い個体における虚血性心疾患の予防に有用であることが知られている（例えば、非特許文献２０、２１及び２２参照。）。
【００１２】
一方、血中コレステロール値を低下させる薬剤としては、コレスチラミン、コレスチポール等の胆汁酸を捕捉してその吸収を阻害するもの（例えば、特許文献１５参照。）、メリナミド（例えば、特許文献第１６参照。）等のアシルコエンザイムＡコレステロールアシル転移酵素（ＡＣＡＴ）を阻害してコレステロールの腸管吸収を抑制するもの等の他、コレステロールの生合成を抑制する薬剤が注目されている。コレステロール生合成抑制薬剤として、特に３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）還元酵素を阻害するロバスタチン（例えば、特許文献１７参照。）、シンバスタチン（例えば、特許文献１８参照。）、プラバスタチン（例えば、特許文献１９参照））等が医薬として供されている。しかしながら、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害するとコレステロールの生合成以外に、ユビキノン、ドリコールやヘムＡの様な、その他の生体に必要な成分の生合成も阻害されるため、それらに起因する副作用が懸念される。また、最近では、糖尿病の前段階として耐糖能異常症（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：ＩＧＴ）が注目され始め（例えば、非特許文献２３参照）、糖代謝異常を初期段階から有効に治療する治療薬の開発が望まれている。
【００１３】
より安全で、かつより効果的な中性脂肪低下作用を示す脂質低下剤を得ることは、高脂血症の予防または治療あるいは動脈硬化の治療または予防に有用な、従って医薬としてより有用な薬剤を提供することになる。
【００１４】
【特許文献１】
特開昭６０−０５１１８９公報
【特許文献２】
特開昭６１−２６７５８０号公報
【特許文献３】
国際公開第９５／２１６０８号パンフレット
【特許文献４】
国際公開第００／８００２号パンフレット
【特許文献５】
国際公開第９５／１８１２５号パンフレット
【特許文献６参照】
国際公開第９９／６２８７２号パンフレット
【特許文献７】
欧州特許出願公開第６０４，９８３号明細書
【特許文献８】
国際公開第９４／２５４４８号パンフレット
【特許文献９】
米国特許第５，９４８，８０３号明細書
【特許文献１０】
欧州特許第２８３０３５号明細書
【特許文献１１】
欧州特許出願公開第７８７７２５号明細書
【特許文献１２】
国際公開第９９／１９３１３号パンフレット
【特許文献１３】
国際公開第０１／２１６０２号パンフレット
【特許文献１４】
欧州特許出願公開０７４５６００号明細書
【特許文献１５】
米国特許第４０２７００９号明細書
【特許文献１６】
仏国特許第１４７６５６９号明細書
【特許文献１７】
米国特許第４２３１９３８号明細書
【特許文献１８】
米国特許第４４４４７８４号明細書
【特許文献１９】
米国特許第４３４６２２７号明細書
【非特許文献１】
「ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｃｃｅ）」、２０００年、第６７巻、ｐ．２４０５−２４１６
【非特許文献２】
「日本臨床」、２０００年、第５８巻，ｐ．３８９−４０４
【非特許文献３】
「ファーマコセラピー（Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ）」、２００１年、第２１巻，ｐ．１０８２−１０９９
【非特許文献４】
「エンドクライノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、１９９６年、第１３７巻，１９８４−１９９０
【非特許文献５】
「エンドクライノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１３９巻，ｐ．５０３４−５０４１
【非特許文献６】
「ネイチャー  （Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９４年、第３７２巻、ｐ．４２５−４３２
【非特許文献７】
ネイチャー  （Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９８年、第３９５巻、ｐ．７６３−７７０）
【非特許文献８】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、１９９７年、第３８９巻、ｐ．６１０−６１４
【非特許文献９】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４０９巻、ｐ．３０７−３１２
【非特許文献１０】
「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００１年、  第７巻、ｐ．９４１−９４６
【非特許文献１１】
「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００１年、第７巻、ｐ．９４７−９５３
【非特許文献１２】
「サイエンス  （Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９３年、第２５９巻、ｐ．８７−９１
【非特許文献１３】
「エンドクライノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第１３４巻、ｐ．２６４−７０
【非特許文献１４】
「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｉｔｒｙ）」、１９９６年、第２７１巻、ｐ．１０６９７−１０７０３
【非特許文献１５】
「バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｉｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）」、１９９９年、第２５７巻、ｐ．７９−８３
【非特許文献１６】
中村治雄編集、「コモン・ディズィーズ・シリーズ（ＣＯＭＭＯＮ  ＤＩＳＥＡＳＥ  ＳＥＲＩＥＳ）  Ｎｏ．１９  高脂血症」、南江堂、１９９１年
【非特許文献１７】
「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」、２０００年、第１０１巻、ｐ．２７７７−２７８２
【非特許文献１８】
「アメリカン・ジャーナル・オブ・カルディオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第８３巻、３Ｆ−１２Ｆ
【非特許文献１９】
「ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９９年、第３４１巻、ｐ．４１０−４１８
【非特許文献２０】
「アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、１９７３年、１３巻、ｐ．２８７−３０８
【非特許文献２１】
「サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）」、２０００年、第１０２巻、ｐ．２１−２７
【非特許文献２２】
「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９８７年、第
３１７巻、ｐ．１２３７−１２４５
【非特許文献２３】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１４巻、ｐ．７８２−７８７
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】肥満・インスリン抵抗性・糖尿病モデル動物で発現が低下しており、ＰＰＡＲγを標的分子とするインスリン抵抗性改善剤により発現が誘導されてくる物質は、糖代謝の調節に関与する可能性を有する因子であると考えられる。また、インスリン抵抗性改善剤を投与すると血糖値の低下の他に血中の中性脂質濃度の低下も確認されるので、脂質代謝の調節に関与する可能性を有する因子であるとも考えられる。
【００１６】
本発明の目的はインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する遺伝子として見出された新規糖代謝及び／または脂質代謝に関連する遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該ポリペチドの製造方法、該遺伝子および／またはポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって取得される物質、該スクリーニングに使用するキット、該遺伝子および／またはポリペプチドを利用した糖代謝及び／または脂質代謝異常を改善する物質の試験方法、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチド及び／または該抗体を含有する医薬組成物等を提供することにある。
【００１７】
本発明者はＰＰＡＲγを標的分子とするインスリン抵抗性改善剤を投与することによって発現量が顕著に増加するポリヌクレオチドを見出し、該ポリヌクレオチドが糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善剤、例えば、インスリン抵抗性改善剤および／または血中中性脂質濃度低下剤の新規スクリーニング方法に使用でき、また、糖代謝異常改善剤および／または血中中性脂質濃度低下剤、例えば、インスリン抵抗性改善剤、高脂血症治療剤にもなり得ることを見出し、本発明を完成させた。
【００１８】
【発明を解決するための手段】
本発明は、
（１）下記の１）乃至６）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド：
１）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
５）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド。
６）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
（２）下記の１）乃至４）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド：
１）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
３）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（３）下記の１）乃至５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
５）上記１）乃至４）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（４）下記の１）乃至４）のいずれか一つに記載のポリペプチド：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
（５）下記の１）乃至）４）のいずれか一つに記載のポリペプチド：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド、
（６）下記の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）に記載の検体由来の全ＲＮＡと正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より抽出した全ＲＮＡにおける下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド３）上記２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記１）における被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程、
（７）下記の工程１）および２）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）上記１）で測定されたポリペプチドの発現量と正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、上記１）における被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程、
（８）下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）被験物質と上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドを接触する工程；
２）上記工程１）で選択されたポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質を選択する工程、
（９）下記の工程１）乃至５）を含む、下記のａ）乃至ｇ）の少なくとも一つのポリヌクレオチドの発現を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｃ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｄ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｅ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｆ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｇ）上記ａ）乃至ｆ）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）上記１）により得られた全ＲＮＡにおける、上記ａ）乃至ｇ）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
４）上記２）により得られた全ＲＮＡおける、上記３）で測定されてポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
５）上記３）で測定されたポリヌクレオチドの発現量と上記４）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析する工程。
（１０）下記の工程１）乃至５）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善する物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）上記１）により得られた全ＲＮＡにおける、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
４）上記２）により得られた全ＲＮＡおける、上記３）の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
５）上記３）で測定されたポリヌクレオチドの発現量と上記４）で測定された該ポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、該被験物質の、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善効果を判定する工程、
（１１）下記の工程１）乃至３）を含む、下記のａ）乃至ｇ）の少なくとも一つの発現を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｃ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｄ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
ｅ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｆ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
ｇ）上記ａ）乃至ｆ）から選択されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した細胞由来全ＲＮＡにおける、上記ａ）乃至ｇ）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
３）上記２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析する工程、
（１２）下記の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した細胞由来全ＲＮＡにおける、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの発現量を測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲２▼配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲３▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲４▼配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
３）上記２）で測定されたポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善効果を判定する工程、
（１３）ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはランオン・アッセイであることを特徴とする、（６）、（９）、（１０）、（１１）及び（１２）のいずれか一つに記載の方法、
（１４）ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法が動物組織または動物細胞由来の相補的ＤＮＡ群または該ＤＮＡ群の各ＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡで作製された遺伝子チップまたはアレイを用いることを特徴とする、（６）、（９）、（１０）、（１１）及び（１２）のいずれか一つに記載の方法、
（１５）下記の工程１）乃至３）を含む、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの少なくともいずれか一つの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、上記ａ）乃至ｅ）のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
３）２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した細胞における該ポリペプチドの発現量の差を解析する工程、
（１６）下記の工程１）乃至３）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善物質のスクリーニング方法：
１）被験物質を添加した培地で培養した細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
３）２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した細胞における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善効果を判定する工程、
（１７）ポリペプチドの発現量の測定方法が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法または固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）であることを特徴とする、（７）、（８）、（１５）及び（１６）のいずれか一つに記載の方法。
（１８）下記の工程１）および２）を含む、下記のａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドの少なくともいずれか一つの機能を促進するか抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）  非ヒト哺乳動物に、上記ａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドおよび試験しようとする物質を投与する工程；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／またはインスリン濃度を測定する工程、
（１９）下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドを発現する細胞と被験物質を脂肪分解促進物質を含む溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中の遊離脂肪酸濃度を測定する、
（２０）下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中のグルコース濃度を測定する、
（２１）下記の１）乃至５）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに被験物質を含む試料を接触させ、次いで、該ポリペプチドに結合した物質を分離することを特徴とする糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善物質の単離方法：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド、
（２２）下記の工程１）および２）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の治療および／または予防物質の試験方法：
１）非ヒト哺乳動物に、下記の▲１▼乃至▲５▼のいずれか一つに記載のポリペプチドおよび試験しようとする物質を投与する工程；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド、
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／または中性脂質濃度を測定する工程、
（２３）下記の工程１）および２）を含む、糖代謝異常及び／または脂質代謝異常の治療及び／または予防物質の試験方法：
１）非ヒト哺乳動物に、下記のａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドおよび試験しようとする物質を投与する工程；
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／または中性脂質濃度を測定する工程、
（２４）下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、糖代謝異常および／脂質代謝異常の治療および／または予防物質の試験方法：
１）下記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドを発現する細胞と被験物質を脂肪分解促進物質を含む溶液中で接触させる；
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）１）に記載の溶液中の遊離脂肪酸濃度を測定する、
（２５）下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の治療および／または予防物質の試験方法：
１）下記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を溶液中で接触させる；
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
２）１）に記載の溶液中のグルコース濃度を測定する、
（２６）脂肪分解促進物質がＴＮＦ−αであることを特徴とする、（１９）または（２４）に記載の方法、
（２７）細胞が哺乳動物由来培養細胞であることを特徴とする、（９）乃至（２０）、及び、（２４）乃至（２６）のいずれか一つに記載の方法、
（２８）哺乳動物由来培養細胞が霊長類またはげっ歯類動物由来であることを特徴とする（２７）に記載の方法、
（２９）哺乳動物由来培養細胞がヒトまたはマウス由来であることを特徴とする（２７）に記載の方法、
（３０）哺乳動物由来培養細胞が、マウス由来の繊維芽細胞、マウス、ラットもしくはヒト由来の脂肪細胞、マウス、ラットもしくはヒト由来の肝細胞であることを特徴とする（２７）に記載の方法。
（３１）  （８）乃至（２１）、及び、（２６）乃至（２９）のいずれか一つに記載の方法によって取得された物質、
（３２）下記の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも１以上を含むキット：
１）配列表の配列番号４または８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５から３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号４または８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）上記１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーまたは上記２）に記載のポリヌクレオチドプローブのいずれか一つのポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）下記の▲１▼乃至▲５▼から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
５）上記４）に記載の抗体に結合する二次抗体、
（３３）  １乃至３から選択される少なくともいずれか一つのポリヌクレオチドを含む組換えベクター、
（３４）下記のａ）乃至ｅ）から選択される少なくとも一つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクター：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド、
（３５）アデノウイルスベクターであることを特徴とする、３３または３４に記載の組換えベクター、
（３６）組換えベクターｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０、
（３７）  （３３）乃至（３６）から選択される組換えベクターで形質転換された宿主細胞、
（３８）  （３７）に記載の宿主細胞を培養し、組換えタンパク質を生成せしめることを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法、
（３９）組換えタンパク質が下記の１）乃至５）から選択されるタンパク質であることを特徴とする、（３８）に記載の製造方法：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
（４０）下記の１）乃至５）から選択されるポリペプチドまたはその部分ポリペプチドの少なくともいずれか一つに特異的に結合する抗体；
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
（４１）モノクローナル抗体であることを特徴とする、（４０）に記載の抗体。
（４２）ヒト型抗体であることを特徴とする、（４０）に記載の抗体、
（４３）下記の１）乃至５）から選択されるポリペプチドのうち少なくとも一つを含有する医薬組成物：
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド、
（４４）  （４０）乃至（４２）に記載の抗体の少なくともいずれか一つを含有する医薬組成物、
（４５）耐糖能異常症及び／または糖尿病治療薬であることを特徴とする、（４３）に記載の医薬組成物、
（４６）下記の（ａ）乃至（ｌ）のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む遺伝子が、ノックアウトされている非ヒト動物：
（ａ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）上記（ａ）乃至（ｆ）から選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドのヌクレオチド配列；
（ｈ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｊ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｋ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｌ）上記（ｈ）乃至（ｋ）に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
に関する。
【００１９】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、または、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行なった後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００２０】
本発明における、糖代謝異常には、耐糖能異常症、糖尿病を初めとする糖代謝の異常によって引き起こされる各種疾患が含まれ、インスリン感受性の異常によって引き起こされる２型糖尿病も糖代謝異常に含まれる。本発明における脂質代謝異常とは、体内での脂質の代謝に異常を来している状態をいい、脂質代謝異常によって引き起こされる疾患としては例えば、高コレステロール血症、高脂血症を挙げることができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
１．インスリン抵抗性改善剤によって発現が変動するポリヌクレオチド
本発明における「インスリン抵抗性改善剤によって発現が変動するポリヌクレオチド」とは、ヒトおよび／またはヒト以外の哺乳動物の、インスリン抵抗性改善剤添加によって発現が変動するポリヌクレオチドを意味する。
【００２２】
本発明におけるインスリン抵抗性改善剤とは、糖尿病の治療に使用される薬剤をいい、インスリン抵抗性改善剤としては有効成分としてインスリン抵抗性改善剤を有する医薬組成物を挙げることができる。「インスリン抵抗性改善剤」は、インスリン受容体のシグナル伝達を増強することにより、インスリン作用の感受性を上げ、不足を補う作用メカニズムによりインスリン抵抗性を改善する薬剤であり、糖尿病用剤として使用される。そのようなインスリン抵抗性改善剤としては、例えば、
特開昭６０−０５１１８９公報に記載されたトログリタゾン（５−［４−（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−イルメトキシ）ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
特開昭６１−２６７５８０号公報（ＥＰ特許第１９３，２５６号公報又は米国特許第４，６８７，７７７号公報）に記載されたピオグリタゾン（５−［４−［２−（５−エチル−ピリジン−２−イル）エトキシ］ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
特表平９−５１２２４９号公報（ＷＯ９５／２１６０８号公報又は米国特許第５，００２，９５３号公報）に記載されたロシグリタゾン（５−［４−［２−（Ｎ−メチル−Ｎ−２−ピリジルアミノ）エトキシ］ベンジル］−２，４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（マレイン酸塩等）、
ＷＯ００／８００２号公報に記載されたＧＩ−２６２５７０（化学名は、２（Ｓ）−（２−ベンゾイルフェニルアミノ）−３−［４−［２−（５−メチル−２−フェニルオキサゾール−４−イル）エトキシ］フェニル］プロピオン酸）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＷＯ９５／１８１２５号公報（ＥＰ公開第６８４，２４２号公報又は米国特許第５，７２８，７２０号公報）に記載されたＪＴＴ−５０１（４−［４−［２−（５−メチル−２−フェニル−オキサゾール−４−イル）エトキシ］ベンジル−３，５−イソオキサゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、ＷＯ９９／６２８７２号公報（ＥＰ公開第１，０８４，１０３号公報又は米国特許第６，２５８，８５０号公報）に記載されたＡＺ−２４２（２−エトキシ−３−［４−［２−（４−メチルスルホニルオキシフェニル）エトキシ］フェニル］プロパン酸）及び、その薬理上許容される塩（ナトリウム塩等）、
特開平６−２４７９４５号公報（ＥＰ公開第６０４，９８３号公報又は米国特許第５，５９４，０１６号公報）に記載されたＭＣＣ−５５５（５−［６−（２−フルオロベンジルオキシ）ナフタレン−２−イルメチル］チアソリジン−２，４−ジオン）及び、その薬理上許容される塩、
ＷＯ９４／２５４４８号公報（ＥＰ特許第６９６，５８５号公報又は米国特許第５，６４３，９３１号公報）に記載されたＹＭ−４４０（（Ｚ）−１，４−ビス［４−（３，５−ジオキソ−１，２，４−オキサジアゾリジン−２−イルメチル］フェノキシ］−２−ブテンで）及び、その薬理上許容される塩、
特開平１０−８７６４１号公報（米国特許５，９４８，８０３号公報）に記載されたＫＲＰ−２９７（５−（２，４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル）−２−メトキシ−Ｎ−（４−トリフルオロメチルベンジル）ベンズアミド）及び及びその薬理上許容される塩、
特開昭６４−５６６７５号公報（ＥＰ特許第２８３０３５号公報又は米国特許第４，８９７，３９３号公報）に記載されたＴ−１７４（５−［２−（２−ナフチルメチル）−５−ベンズオキサゾリルメチル］−２，４−チアゾリジンジオン）及び薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
特開平９−１００２８０号公報（ＥＰ公開第７８７７２５号公報又は米国特許第５，６９３，６５１号公報）に記載されたＮＣ−２１００（５−（７−ベンジルオキシ−３−キノイルメチル）−２，４−チアゾリジンジオン）及び、その薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＷＯ９９／１９３１３号公報（米国特許６，０５４，４５３号公報）に記載されたＮＮ−６２２（（Ｓ）−３−［４−［２−（フェノキサジン−１０−イル）エトキシ］フェニル］−２−エトキシプロパン酸）及び、その薬理上許容される塩（ナトリウム塩等）、
ＷＯ０１／２１６０２号公報に記載されたＢＭＳ−２９８５８５（Ｎ−（４−メトキシフェノキシカルボニル）−Ｎ−［４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）エトキシ］ベンジル］グリシン）であり、及びその薬理上許容される塩（塩酸塩等）、
ＥＰ公開第７４５６００号公報に記載された５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオン及びその薬理上許容される塩（塩酸塩等）（ここで、５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオンの塩酸塩を、以下、「化合物Ａ」という。）、
のようなオキサゾール化合物、オキサジアゾリジン化合物、チアゾリジン化合物又はフェノキサジン化合物を挙げることができ、好適には、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ＭＣＣ−５５５、ＫＲＰ−２９７、Ｔ−１７４、ＮＣ−２１００、化合物Ａであり、更に好適には、ピオグリタゾン、ロシグリダゾン又は化合物Ａであり、最も好適には、トログリタゾンまたは化合物Ａである。
【００２３】
本発明のインスリン抵抗性改善剤添加によって発現が変動するポリヌクレオチドは具体的には、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリペプチドが含まれる。
【００２４】
なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、天然型の、インスリン抵抗性改善剤添加によって発現が変動するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を他のヌクレオチドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などの改変により、天然型の、インスリン抵抗性改善剤添加によって発現が変動するポリヌクレオチドと同等に、インスリン抵抗性改善剤添加によって発現が変動するポリヌクレオチドを調製することが可能である。このように天然型のヌクレオチド配列においてヌクレオチドが置換、欠失、もしくは付加したヌクレオチド配列を有し、天然型の、インスリン抵抗性改善剤添加によって発現が変動するポリヌクレオチドと同等のインスリン抵抗性改善剤添加による発現の変動を示すポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含まれる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいはＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異ＤＮＡの直接導入などの方法により行うことができる。インスリン抵抗性改善剤添加によって発現量が変動するポリヌクレオチドの具体例としては、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５で示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドまたは、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドをその例としてあげることができるが、これらに限定されない。なお、本発明のおける「ポリヌクレオチド」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子やＥＳＴも含むものとする。
【００２５】
１．１  インスリン抵抗性改善剤投与によっては発現が変動するポリヌクレオチドの特定方法
本発明の、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が変動するポリヌクレオチドは、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現量が変動するポリヌクレオチドであり、哺乳動物にインスリン抵抗性改善剤を投与することによって、発現の上昇を確認することができる。具体的には糖尿病モデルマウスを用いて、Ａ）インスリン抵抗性改善剤化合物Ａを投与する場合、Ｂ）インスリン抵抗性改善剤トログリタゾンを投与する場合についてそれぞれ、以下の工程１）乃至２）を順次行なうことによって、特定することができる。
【００２６】
Ａ）インスリン抵抗性改善剤化合物Ａを投与する場合
１）化合物Ａを投与したＫＫマウス及び化合物Ａを投与しなかったＫＫマウスの皮下白色脂肪組織から全ＲＮＡを調製する工程；
２）上記１）に記載の各ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを利用して化合物Ａ投与と非投与で発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを特定する工程。
【００２７】
Ｂ）インスリン抵抗性改善剤トログリタゾンを投与する場合
１）トログリタゾンを投与したＫＫマウス及びトログリタゾンを投与しなかったＫＫマウスの皮下白色脂肪組織から全ＲＮＡを調製する工程；
２）上記１）に記載の各ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを利用してトログリタゾン投与と非投与で発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを特定する工程。
【００２８】
以下、各工程を順次説明する。
【００２９】
工程１）全ＲＮＡを調製する工程
本工程で用いられるＫＫマウスは肥満、高血糖および／または高インスリン血症を示す２型糖尿病のモデル動物であり、網膜の肥厚、細動脈瘤、腎糸球体の硬化、脂肪肝、心筋症、石灰沈着、膵島の肥大、膵β細胞の脱顆粒、グリコーゲン沈着、肝と末梢組織でのインスリン感受性の低下などの特長を有し、例えば日本クレアより購入することができる。
【００３０】
ＫＫマウスの白色脂肪組織から全ＲＮＡを抽出するに際しては、屠殺、採血後に他の組織が混入しないように注意しながら白色脂肪組織を切り出し、該組織をＲＮＡ抽出用の溶媒（例えばフェノール等、リボヌクレアーゼを不活性化する作用を有する成分を含むもの）で直接溶解するのが好ましい。または、該組織の細胞を破壊しないように、スクレーパーで慎重に掻きとるか、もしくはトリプシン等のタンパク質分解酵素を用いて穏やかに組織から細胞を抽出するなどの方法により、細胞を回収した後、速やかにＲＮＡ抽出工程に移行する。
【００３１】
ＲＮＡの抽出方法としては、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．  ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．、（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６２、１５６−１５９）などを採用しうるが、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法が好適である。また、市販のＲＮＡ抽出用試薬（例えば、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン（株）製）、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ギブコ・ビーアールエル社製））等を試薬に添付のプロトコールに従って用いることもできる。
【００３２】
得られた全ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いるのが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して例えばビオチン化したオリゴ（ｄＴ）プローブにｍＲＮＡを吸着させ、さらにストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子に、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用してｍＲＮＡを捕捉し洗浄操作の後、ｍＲＮＡを溶出することにより、ｍＲＮＡを精製することができる。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにｍＲＮＡを吸着させて、次にこれを溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、ｍＲＮＡをさらに分画することもできる。ただし、本発明の方法のためには、これらｍＲＮＡの精製工程は必須ではなく、上記１）に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの発現の検出が可能である限りにおいて、全ＲＮＡをその後の工程に用いることもできる。
【００３３】
対照として用いられる、化合物Ａまたはトログリダゾンを投与しなかったマウス白色脂肪細胞由来の全ＲＮＡは上記と同様に抽出、精製することができる。
【００３４】
工程２）  インスリン抵抗性改善剤投与と非投与で発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを特定する工程
ポリヌクレオチドの発現量は、工程１で得られた全ＲＮＡよりｃＲＮＡまたはｃＤＮＡを調製し、これを適当な標識でラベルすることにより、そのシグナル強度として検出することができる。
【００３５】
以下に、ポリヌクレオチド発現量の解析方法として、固相化試料を用いた解析方法と、その他のいくつかの解析方法について説明する。
【００３６】
（１）  固相化試料を用いた解析方法
ｉ）固相化試料
前記固相化試料としては、例えば以下のものが挙げられる。
ａ）遺伝子チップ：
データベース上のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）配列またはｍＲＮＡ配列をもとに合成したアンチセンスオリゴヌクレオチドが固相化された遺伝子チップを用いることができる。このような遺伝子チップとしてはアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製の遺伝子チップ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ、Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔ．２１、ｓｕｐｐｌｉｍｅｎｔ、２０−２４）を用いることができるが、これに限定されず、公知の方法に基づき作製してもよい。遺伝子チップ上に固相化するアンチセンスオリゴヌクレオチドの基となるＥＳＴ配列またはｍＲＮＡ配列は、解析対象の動物あるいは動物細胞と、同種の動物由来のものであることが最も好ましい。マウスやマウス由来培養細胞を用いるときはマウス由来のものが望ましく、ヒト検体やヒト由来培養細胞を用いるときはヒト由来のものが望ましい。ＫＫマウス由来のｍＲＮＡを解析する場合はマウス由来のものが最も好ましく、例えば、アフィメトリックス社製マウス１９Ｋセット（Ｍｕｒｉｎｅ  １９Ｋ  ＳＥＴ：１９ＫＡ、１９ＫＢ、１９ＫＣ）やマウス１１Ｋセット（Ｍｕｒｉｎｅ  １１Ｋ  ＳＥＴ：１１ＫＡ、１１ＫＢ）を用いることができる。ヒト白色脂肪細胞由来のｍＲＮＡを解析する場合には、ヒト由来のものが好ましく、例えば、アフィメトリックス社製ヒトＵ９５セットまたはＵ１３３セットを用いることができる。しかしながら、それらに限定されず、例えば近縁種の動物由来のものも使用可能である。近縁種としては、例えば哺乳類同士を挙げることができ、ヒトとマウス、ヒトとサル等組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００３７】
ｂ）マウスまたはヒト、全ＲＮＡあるいは特定の組織から得た全ＲＮＡより作製されたｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物が固相化された、アレイまたはメンブレンフィルター：
上記ｃＤＮＡまたはＲＴ−ＰＣＲ産物は、マウスまたはヒトのＥＳＴデータベース等の配列情報を基に作製されたプライマーで逆転写酵素反応やＰＣＲを実施することによりクローン化されたものである。このｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物は、あらかじめインスリン抵抗性改善剤を投与したマウスとインスリン抵抗性改善剤を投与しなかったマウスとの間で発現量の異なる全ＲＮＡを、サブトラクション法（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｉ、Ｌ、ｅｔ  ａｌ、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、６０２５−６０３０）、ディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇ、Ｐ．、ｅｔ  ａｌ、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３、３６８５−３６９０）等を利用して選択されたものであってもよい。また、アレイやフィルターは市販のもの（例えば、インテリジーン：タカラバイオ社製等）を使用してもよいし、上記ｃＤＮＡやＲＴ−ＰＣＲ産物を市販のスポッターで（例えば、ＧＭＳ４１７アレイヤー：タカラバイオ社製等）を用いて固相化することにより作製してもよい。
【００３８】
ｉｉ）プローブの作製と解析
標識プローブは、特定のｍＲＮＡクローンではなく、発現している全てのｍＲＮＡを標識したものを用いる。プローブ作製のための出発材料としては精製していないｍＲＮＡを用いてもよいが、前述の方法で精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いることが望ましい。以下に、各種固相化試料を用いた場合の、標識プローブの調製方法と検出、解析方法について説明する。
【００３９】
ａ）アフィメトリックス社製遺伝子チップ：
アフィメトリクス社製遺伝子チップに添付されたプロトコール（アフィメトリックス社発現解析技術マニュアル）に従ってビオチン標識したｃＲＮＡプローブを作製する。次いでアフィメトリックス社製遺伝子チップに添付のプロトコール（発現解析技術マニュアル）に従って、アフィメトリックス社製の解析装置（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４００）を用いてハイブリダイゼーションおよび解析を行い、アビジンによる発光を検出、解析を行なう。
【００４０】
ｂ）アレイ：
逆転写酵素反応でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、ｃＤＮＡの検出ができるようにｃＤＮＡを標識しておくことが必要であり、蛍光色素で標識する場合には、蛍光色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５など）で標識されたｄ−ＵＴＰなどを加えておくことによりｃＤＮＡを蛍光標識する。このとき、被験物質添加細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡと対照細胞由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡをそれぞれ異なる色素で標識しておけば、後のハイブリダイゼーション時には両者を混合して用いることができる。アレイとして例えば、タカラバイオ（株）社の市販アレイを用いる場合、同社のプロトコールに従いハイブリダイゼーションおよび洗浄を行って、蛍光シグナル検出機（例えばＧＭＳ４１８アレイスキャナー（タカラバイオ（株）社製）等）で蛍光シグナルを検出後、解析を行う。ただし、使用するアレイとしては市販のものに限定されず、自家製のもの、特別に作製したのもでもよい。
【００４１】
ｃ）メンブレンフィルター：
逆転写酵素でポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する際に、放射性同位元素（例えば、ｄ−ＣＴＰ等を加えることにより標識プローブを調製し、常法によりハイブリダイゼーションを行ない、例えば、市販のフィルター製マイクロアレーである、アトラスシステム（クロンテック社製）を用いてハイブリダイゼーションおよび洗浄を行なった後、解析装置（例えば、アトラスイメージ：クロンテック社製等）を用いて検出、解析を行なう。
【００４２】
前記ａ）乃至ｃ）のいずれに記載の方法も、同一ロットの固相化試料にインスリン抵抗性改善剤を投与したＫＫマウス白色脂肪細胞由来のプローブまたはヒトの白色脂肪細胞由来のプローブとインスリン抵抗性改善剤を投与しないＫＫマウス白色脂肪細胞由来のプローブまたはヒトの白色脂肪細胞由来のプローブをそれぞれハイブリダイズさせる。このとき、使用するプローブ以外のハイブリダイゼーション以外の条件は同じとする。蛍光標識プローブを用いる場合には、それぞれのプローブを異なる蛍光色素で標識しておけば一つの固相化試料に両プローブの混合物を一度にハイブリダイズさせて蛍光強度を読み取ることができる（Ｂｒｏｗｎ、Ｐ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔ、２１、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、３３−３７）。
【００４３】
（２）その他の解析方法
上記以外の解析方法として以下の方法等を挙げることができる。
ａ）サブトラクションクローニング法：
目的の細胞で特異的に発現する遺伝子のｃＤＮＡを取得する方法である。目的の細胞からｍＲＮＡを精製し、対照の細胞からもＲＮＡを抽出する。目的の細胞より精製したｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識することができる。標識されたｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡのハイブリッドをアルカリ処理し、ｍＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一本鎖ｃＤＮＡと対照細胞から抽出したＲＮＡを混合し、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させる。目的とした細胞にのみ発現しているｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。精製された一本鎖ｃＤＮＡをプローブとしてライブラリーをスクリーニングし、目的とする細胞で特異的に発現している遺伝子のクローンを取得することができる（実験医学別冊  新  遺伝子工学ハンドブック、羊土社（１９９６）Ｐ３２−３５参照）。
【００４４】
具体的にはインスリン抵抗性改善剤を投与したマウスまたはヒト白色脂肪細胞とインスリン抵抗性改善剤を投与しないマウスまたはヒト白色脂肪細胞のそれぞれからｍＲＮＡ（または全ＲＮＡ）を精製し、インスリン抵抗性改善剤を添加した培地で培養した細胞から精製したｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する。合成時に［α−３２Ｐ］ｄＮＴＰを加えることでｃＤＮＡを標識する。標識したｃＤＮＡと鋳型となったｍＲＮＡのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドをアルカリ高温処理しｍＲＮＡのみを分解し、一本鎖ｃＤＮＡを精製する。この一本鎖ｃＤＮＡとインスリン抵抗性改善剤を添加しないで培養した細胞から抽出したＲＮＡを混合し、二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させる。このときインスリン抵抗性改善剤を投与したマウスまたはヒト由来の細胞で特異的に発現するｍＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡは一本鎖のままである。ハイドロキシアパタイトカラムで二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一本鎖ｃＤＮＡとを分離し、一本鎖ｃＤＮＡのみを精製する。このステップを繰り返すことでインスリン抵抗性改善剤を投与したマウスまたはヒト由来の細胞で特異的なｃＤＮＡを濃縮することができる。濃縮された特異的ｃＤＮＡは放射性同位元素で標識されているので、ライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用できる。
【００４５】
ｂ）ディファレンシャルディスプレー法：
複数の細胞間あるいは同一細胞でも特定の誘導処理をしたものとしないものとの間で、特異的に発現している遺伝子を比較して同定する実験法である。例えば、以下のように実施できる。インスリン抵抗性改善剤を投与したＫＫマウスと投与しなかったＫＫマウスのそれぞれの白色脂肪細胞から全ＲＮＡを精製する。オリゴ（ｄＴ１２）の３’末端に更に２ヌクレオチド付加したプライマー（ｄＴ１２ＭＮ：Ｍ＝Ａ、ＧあるいはＣ、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣあるいはＴ）で逆転写し、新たに合成されたｃＤＮＡを基に、任意の配列を持ったプライマー（１０量体程度）を使用してＰＣＲを行なう。得られたＰＣＲ産物をゲル電気泳動し、ゲル上に展開（ディスプレー）される全ＲＮＡの発現パターン（フィンガープリント）を比較解析し、インスリン抵抗性改善剤添加細胞で特異的に発現している遺伝子を選択し、そのｃＤＮＡ断片を単離することができる（基礎生化学実験法４  核酸・遺伝子実験  ＩＩ．応用編、東京化学同人（２００１）、ｐ１２５−１２８）。
ｃ）レポーター遺伝子を使用した方法
インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのプロモーター支配下に、該プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子（以下「レポーター遺伝子」という。）を利用して、間接的にインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドやインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現を検出することもできる。以下、レポーター遺伝子を利用した検出方法について説明する。
【００４６】
ｃ−１）レポーター遺伝子
レポーター遺伝子は、宿主細胞が本試験方法の一連の過程において産生し得る他のいかなる蛋白質とも特異的に区別可能な、レポーター蛋白質をコードするものであればよい。好ましくは、形質転換前の細胞が該レポーター蛋白質と同一または類似の蛋白質をコードする遺伝子を持たないようなものがよい。例えば、レポーター蛋白質が該細胞に対して毒性を有するようなものや、該細胞が感受性を有する抗生物質の耐性を付与するものであるような場合でも、レポーター遺伝子の発現の有無は細胞の生存率で判定することが可能である。しかしながら、本発明で用いられるレポーター遺伝子としてより好ましいものは、発現量を特異的かつ定量的に検出することができる（例えば、該レポーター遺伝子にコードされる蛋白質に対する特異的抗体が取得されているような）構造遺伝子である。より好ましくは、外来の基質と特異的に反応することにより定量的測定が容易な代謝産物を生じるような酵素等をコードする遺伝子である。そのようなレポーター遺伝子としては、例えば、以下の蛋白質をコードする遺伝子を例示することができるが、本発明はそれらに限定されない。
【００４７】
ｃ−１−１）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：
クロラムフェニコールにアセチル基を付加する酵素で、いわゆるＣＡＴアッセイ等で検出することができる。プロモーターを組み込むだけでレポーターアッセイ用のベクターを調製できるベクターとして、ｐＣＡＴ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【００４８】
ｃ−１−２）ホタルルシフェラーゼ：
ルシフェリンを代謝した際に生じる生物発光を測定することにより定量できる。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）が市販されている。
【００４９】
ｃ−１−３）β−ガラクトシダーゼ：
呈色反応、蛍光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（プロメガ社製）が市販されている。
【００５０】
ｃ−１−４）分泌型アルカリホスファターゼ：
呈色反応、生物発光または化学発光でそれぞれ測定可能な基質がある。レポーターアッセイ用のベクターとしては、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ（クロンテック社製）が市販されている。
ｃ−１−５）緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）：
酵素ではないが、自らが蛍光を発するので直接定量できる。同じくレポーターアッセイ用のベクターとしてｐＥＧＦＰ−１（クロンテック社製）が市販されている。
【００５１】
ｃ−２）レポーター遺伝子の導入
公知の方法に従い、レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のＴＭＥＦＦ２遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを作製し、これらを細胞に同時トランスフェクションする。ベクターとしては、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製）等を好適に用いることができるが、これらに限定されない。
【００５２】
細胞に発現プラスミドを導入する方法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ．  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２、４５６−４５７）、電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１、８４１−８４５）、リポフェクション法（Ｌｏｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２、５７０７−５７１７、Ｓｕｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、１６４１−１６４３）等を挙げることができるが、これらに限定されず、本発明の属する技術分野において汎用される任意の方法を採用することができる。ただし、細胞がいわゆる浮遊細胞である場合は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法以外の方法を用いることが好ましい。いずれの方法においても、用いる細胞に応じて、至適化されたトランスフェクション条件を用いることが必要である。
【００５３】
ｃ−３）評価
かくして、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現ベクターと、レポーター発現ベクターを同時トランスフェクションした細胞を培養すると、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現依存的にレポーター遺伝子の転写が促進される。したがって、レポーター遺伝子の発現が可能な条件下において、培地中に任意の被検物質を添加した場合と添加しない場合でのレポーター遺伝子の発現量変化をみれば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量が評価できる。ここで、「レポーター遺伝子の発現が可能な条件」とは、レポーター発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞が生存して、レポーター遺伝子の転写産物（レポーター蛋白質）の生産が可能な条件であればよい。好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）で、４から６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６から３８℃（最も好適には３７℃）で２から３日間（最も好適には２日間）培養する。
【００５４】
（３）評価・判定
上記解析の結果、インスリン抵抗性改善剤を投与したＫＫマウス由来白色脂肪細胞とインスリン抵抗性改善剤を投与しないＫＫマウス由来白色脂肪細胞または、インスリン抵抗性改善剤を投与したヒト白色脂肪細胞とインスリン抵抗性改善剤を投与しなかったヒト白色脂肪細胞で、発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドとして特定することができる。そしてこの特定されたポリヌクレオチドを以下、「インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチド」とする。ここで、「著しく異なる」とは、例えば、アフィメトリックス社の遺伝子チップを用いて、アフィメトリックス社のｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒ．３．０を用いて解析した場合、インスリン抵抗性改善剤を添加して培養した細胞由来のポリヌクレオチドのＡｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ値がインスリン抵抗性改善剤無添加の場合に比べて２倍以上増加している場合をいう。
【００５５】
こうして特定されたインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドとしては具体的には配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドおよび配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０からなるポリヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドを挙げることができる。配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０からなるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０は独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１）に平成１４年（２００２年）４月５日付で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００５で国際寄託されており、またＧｅｎＢａｎｋにＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ２３−１７９Ｃ３  ｍａｐ  １１（アクセッション番号：ＡＣ０２２７８０、バージョン：ＡＣ０２２７８０．１７）内の２箇所（１３８６６−１３００９，１０７４９−１０２２４）に分かれて、ＯＲＦに相当するヌクレオチド配列の全長と一致する配列が存在する。また、２００２年１１月１４日付で、ＧｅｎＢａｎｋにＭｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  １３００００７Ｆ０４  ｇｅｎｅ  （１３００００７Ｆ０４Ｒｉｋ），  ｍＲＮＡ  （アクセッション番号：ＸＭ＿１８１２９４、バージョン：ＸＭ＿１８１２９４．１）として、登録されている。
【００５６】
１．２  相同性ポリヌクレオチドの検索
１．１の方法によって見出されたポリヌクレオチドについては、公知のデータベースとの間で相同性検索を行うことにより、同様の機能を有すると推定できるポリヌクレオチドを同定することができる。相同性検索によって同定されたポリヌクレオチドについても上記方法により、インスリン抵抗性改善剤投与による特異的発現を調べることでポリヌクレオチドの機能を解明することができる。相同性ポリヌクレオチドは同種生物間に限らず、他種生物間でも検索することができる。相同性ポリヌクレオチドの検索はＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されているデータに対してＢＬＡＳＴ等の検索プログラムを用いて行なうことができるが、その他、市販の検索ソフトを用いても検索することができる。このようなポリヌクレオチドとして、例えば、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドまたは配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチドを挙げることができる。配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４からなるヌクレオチド配列はｃＤＮＡの配列を示し、このうち、配列番号５９から１４６２からなるヌクレオチド配列はアミノ酸配列をコードしている領域を示す。この配列を有するポリヌクレオチドはヒト全長ｃＤＮＡライブラリーを用いて適当なＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ反応を行なうことにより取得することができる。
【００５７】
１．３  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチド
上記１．１および上記１．２において特定されたポリヌクレオチドの他に、それぞれのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン抵抗性改善剤によって発現が上昇するポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含めることができる。このようにして特定されたポリヌクレオチドを「インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチド」という。すなわち、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドは、以下の１）乃至５）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドである。
１）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
２）配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
３）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
４）配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるポリヌクレオチド；
５）上記１）乃至４）に記載のポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００５８】
なお、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドについてシグナルペプチド切断部位予測プログラムＳＰＳｃａｎを用いて解析すると、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドについてはアミノ酸番号１から２０までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２０と２１のアミノ酸の間でシグナルペプチドが切断されと推定され、配列番号９に示されるアミノ酸配列についてはアミノ酸番号１から２６までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２６番目と２７番目のアミノ酸の間でシグナルペプチドが切断されると推定される。また、シグナル配列予測プログラムＳｉｇｎａｌＩＰ（ｖｅｒ．２）を用いてｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＮ）およびｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）の２種類のアルゴリズムを用いて解析すると、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドについてはアミノ酸番号１から２８までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２８と２９のアミノ酸の間でシグナルペプチドが切断されと推定され、配列番号９に示されるアミノ酸配列についてはアミノ酸番号１から２６までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２６番目と２７番目のアミノ酸配列の間でシグナルペプチドが切断されると推定される。すなわち、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列および、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列が成熟体タンパク質をコードするヌクレオチド配列と推定される。
【００５９】
なお、本明細書中においてはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドのことをＲ１０と呼ぶこともあり、ヒト由来のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドにコードされているポリペプチドのことをＨｕＲ１０と呼ぶこともある。
【００６０】
１．４  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの検定
上記のようにして特定されたインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドは、ＫＫマウス由来白色脂肪細胞においてインスリン抵抗性改善剤投与によって、投与しない場合に比べ発現量が著しく増加しており、インスリン抵抗性改善剤によって引き起こされる糖代謝および／または脂質代謝の変化に影響を与えるポリヌクレオチドであり、インスリン抵抗性改善剤を始めとした糖代謝および／または脂質代謝に影響を及ぼす物質のスクリーニングに有効である。
【００６１】
まず、特定されたポリヌクレオチド断片をプローブとして、ＫＫマウスまたはヒトｃＤＮＡライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法等、公知の方法に従い、完全長ｃＤＮＡを取得する。この完全長ｃＤＮＡをマウスまたはヒト細胞に導入して高発現させ、糖代謝および／または脂質代謝に影響が生じるか否かを検討する。
【００６２】
ｃＤＮＡを動物個体内で発現させるためには、得られた完全長ｃＤＮＡをウイルスベクターに組み込み、動物に投与する方法が挙げられる。ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス等のＤＮＡウイルス、またはＲＮＡウイルスにｃＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。なかでも、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が好ましい。
【００６３】
非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、なかでも、ＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００６４】
また、培養細胞に対して、完全長ｃＤＮＡをヒト、マウス、ラット等由来の筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、あるいは筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞に分化する細胞等のインスリン感受性を有する細胞へ導入し、高発現させ、各標的細胞の有する機能、具体的には、糖や脂質の産生や取り込み、あるいはグリコーゲンの蓄積等の糖脂質代謝を調節する機能にどの様な影響が現れるかを検討することができる。逆に、試験する遺伝子の全ＲＮＡに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各標的細胞の機能にどの様な影響が出るかを調べることもできる。また、遺伝子の発現を抑制する他の方法としては二本鎖の単鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いる方法を挙げることもできる（「ジーンズ・アンド・デヴェロップメンツ（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ）」）、２００１年１月１５日、第１５巻、第２号、ｐ．１８８−２００）。例えば、ｓｉＲＮＡを文献記載の方法に従って導入し、ｓｉＲＮＡの対象となる遺伝子の発現量及びグルコース濃度を調べることができる。
【００６５】
完全長ｃＤＮＡを動物または細胞に導入するにあたっては、適当なプロモーターおよび形質発現に関わる配列を含むベクターに該ｃＤＮＡを組み込み、該ベクターで宿主細胞を形質転換させる。脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｓ．    ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１、８５４−８６４）、レトロウイルスベクターｐＬＮＣＸ、ｐＬＮＳＸ、ｐＬＸＩＮ、ｐＳＩＲ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社製）、コスミドベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製）等が挙げられるが、これに限定されない。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２、４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１、８４１−８４５）などによりサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３、１７５−１８２、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ、Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、４１２６−４２２０）、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１５７３）等に取り込ませることができるが、これらに限定されない。かくして所望の形質転換体を得ることができる．
また、遺伝子操作により、正常動物において対象とする遺伝子を破壊したノックアウト動物を作製し、糖脂質代謝を調節する機能にどの様な影響が現れるかを検討することも可能である。逆に、肥満や糖尿病といった症状を呈する動物において、目的とする遺伝子が高発現するようにトランスジェニック動物を作製し、その病態が改善・治療されるか否かを検討することも可能である。前記トランスジェニック動物は、動物から受精卵を取得し、遺伝子導入の後、偽妊娠動物に移植し、発生させることにより得ることができ、その手順は公知の方法（発生工学実験マニュアル（野村達次  監修、勝木元也  編、１９８７年刊）、特開平５−４８０９３号等参照）に従えばよい。具体的には、例えば、マウスの場合にはまずメスマウスに排卵誘起剤を投与後、同系統のオスと交配し、翌日メスマウスの卵管より前核受精卵を採取する。次いで、導入するＤＮＡ断片溶液を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に注入する。なお、導入する遺伝子を動物細胞内で発現させるためのプロモーターやエンハンサー等の調節遺伝子は、導入された動物の細胞内で機能するものであれば特に限定されない。ＤＮＡを注入した受精卵は、偽妊娠仮親メスマウス（Ｓｌｃ：ＩＣＲ等）の卵管に移植し、約２０日後に自然分娩または帝王切開により出生させる。
【００６６】
こうして得られた動物が、導入遺伝子を保持していることを確認する方法としては、例えば、前記動物の尾等からＤＮＡを抽出し、該ＤＮＡをこれに特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅する方法、該ＤＮＡを制限酵素で消化後、ゲル電気泳動し、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜等にブロッティングした後、標識した導入遺伝子の全部または一部をプローブとしてサザンブロット解析を行なう方法等を挙げることができる。
【００６７】
１．５  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドによる血中グルコース濃度及び／または血中インスリン濃度低下作用
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現させた動物では血中の、グルコース濃度及び／またはインスリン濃度の低下が観察される。例えば、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ又は配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをアデノウイルスベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製のアデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに付属。）に組み込んで、アデノウイルスを作製し、糖尿病モデルマウス（例えば、ＫＫ／Ｔａマウス（日本クレア社より購入））に接種し、該ＤＮＡをマウスで発現させると該ＤＮＡを発現させなかったマウスに比べて、血中のグルコース濃度及びインスリン濃度が、有意に低下する。すなわち、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現産物である、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは血中のグルコース濃度及び／またはインスリン濃度を低下させる機能を有し、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは糖代謝異常及び／または脂質代謝異常の治療剤となり得る。
【００６８】
１．６  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドによる脂肪分解抑制作用本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現させた細胞では腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  α：ＴＮＦ−α）が有する脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能を有する。本明細書中において脂肪細胞において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能とは、脂肪細胞において遊離脂肪酸の放出量を減少させる機能をいう。
【００６９】
例えば、マウス繊維芽細胞由来細胞株３Ｔ３−Ｌ１細胞に、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ又は配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドををコードするＤＮＡをアデノウイルスベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製のアデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに付属。）に組み込んだアデノウイルスを作製し、このアデノウイルスを３Ｔ３−Ｌ１細胞に感染させる。インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現する細胞をＴＮＦ−α存在下で培養すると、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現しない細胞に比べて、培養上清中の遊離脂肪酸濃度が有意に低下していることが確認される。このことから、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現産物であるポリペプチドは脂肪組織において、インスリン抵抗性および糖尿病発症原因の一つとして報告されているＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を減弱させることにより、糖代謝改善に寄与する。
【００７０】
１．７  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドによる糖産生量調節
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現させた細胞では糖産生量が減少することが確認される。
【００７１】
本明細書中において、肝臓において糖産生を抑制する機能とは、肝臓や肝臓由来の培養細胞において糖新生等によって産生される糖の量を減少させる機能をいう。例えば、ラット肝癌細胞Ｈ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３に、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列を含むことからなるＤＮＡ、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ又は配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをアデノウイルスベクターｐＡｘＣｗ（タカラバイオ社製のアデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに付属。）に組み込んだ、アデノウイルスを作製し、このアデノウイルスをＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞に感染させる。このインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現する細胞を培養し、培地中のグルコース濃度を測定すると、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現しない細胞に比べて、インスリンの添加、無添加に関わらず、糖産生量が減少していることが確認できる。このことから、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現産物であるポリペプチドは肝臓において糖産生量を負に調節をする機能、すなわち、糖産生を抑制する機能を有する。
【００７２】
２．インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド
本発明における「インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド」は、糖代謝および／または脂質代謝に影響する、本発明によって得られたポリペプチドを意味する。「インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを含有する組成物」とは上記ポリペプチドを含んでいる物質を意味する。本発明におけるインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドはＫＫマウス由来白色脂肪細胞において、インスリン抵抗性改善剤を投与すると投与しない場合に比べ発現量が著しく増加しており、糖代謝および／または脂質代謝に影響を与える遺伝子を検出するために有効であり、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
【００７３】
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは、上記１．５から１．７に示したような、血中のグルコース濃度及び／またはインスリン濃度を低下させる機能、脂肪組織において、インスリン抵抗性および糖尿病発症原因の一つとして報告されているＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能を有する。
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは具体的には、以下の１）乃至５）のいずれか一つに記載のポリペプチドである。
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
４）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
５）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
６）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
７）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド：
８）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド。
【００７４】
なお、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドについてシグナルペプチド切断部位予測プログラムＳＰＳｃａｎを用いて解析すると、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドについてはアミノ酸番号１から２０までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２０と２１のアミノ酸の間でシグナルペプチドが切断されと推定され、配列番号９に示されるアミノ酸配列についてはアミノ酸番号１から２６までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２６番目と２７番目のアミノ酸配列の間でシグナルペプチドが切断されると推定される。また、シグナル配列予測プログラムＳｉｇｎａｌＩＰ（ｖｅｒ．２）を用いてｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＮ）およびｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）の２種類のアルゴリズムを用いて解析すると、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドについてはアミノ酸番号１から２８までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２８と２９のアミノ酸の間でシグナルペプチドが切断されと推定され、配列番号９に示されるアミノ酸配列についてはアミノ酸番号１から２６までのアミノ酸配列からなるペプチドがシグナル配列であり、アミノ酸番号２６番目と２７番目のアミノ酸配列の間でシグナルペプチドが切断されると推定される。すなわち、ＳｉｇｎａｌＩＰの解析結果に従えば、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１６３から１４５５に示されるヌクレオチド配列および、配列表の配列番号８のヌクレオチド番号１３７から１４６２に示されるヌクレオチド配列が成熟体タンパク質をコードするヌクレオチド配列と推定される。
【００７５】
なお、本明細書中において「ポリペプチド」という言葉には、タンパク質、これに糖鎖が付加されたもの、塩も含むものとする。
【００７６】
３．インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生産
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって生産することができる。具体的には、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによって該ポリヌクレオチドを発現させることにより、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを得ることが出来る。
【００７７】
ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）が挙げられるが、これに限定されない。ＲＴＳを用いる場合を例に挙げると、目的の遺伝子をＴ７プロモーターにより制御される発現ベクターにクローニングし、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応系に添加すると、最初に鋳型ＤＮＡよりＴ７ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡが転写され、その後大腸菌溶解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、目的のポリペプチドが反応液中に合成される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、１、２０−２３（２００１）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、２、２８−２９（２００１）。
【００７８】
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
【００７９】
例えば、大腸菌としてはＫ１２株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般にｐＢＲ３２２やｐＵＣ系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知の各種菌株、およびベクターがいずれも使用できる。
【００８０】
プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ラクトース（ｌａｃ）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（ｔａｃ）プロモーター、リポプロテイン（ｌｐｐ）プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子Ｔｕ（ｔｕｆＢ）プロモーター等が挙げられ、どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
【００８１】
枯草菌としては、例えば２０７−２５株が好ましく、ベクターとしてはｐＴＵＢ２２８（Ｏｈｍｕｒａ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５、８７−９３）などが用いられるが、これに限定されるものではない。枯草菌のα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
【００８２】
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ、Ｙ．（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３、１７５−１８２、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ、Ｇ．  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
【００８３】
脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するｐＣＲ３．１（インビトロジェン社製）、ＳＶ４０の初期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１、８５４−８６４）等が挙げられるが、これに限定されない。
【００８４】
宿主細胞として、ＣＯＳ細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、ＳＶ４０複製起点を有し、ＣＯＳ細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびＲＮＡスプライス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ、Ｈ．  ａｎｄ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、Ｇ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１、１２９５−１３０８）、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ａ．Ｊ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２、４５６−４５７）、および電気パルス穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１、８４１−８４５）などによりＣＯＳ細胞に取り込ませることができ、かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現し得るベクター、例えばｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ）やｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｐ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ、Ｐ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７−３４１）などをコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
【００８５】
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞由来株化細胞（Ｓｆ−９またはＳｆ−２１）やＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵細胞由来Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（Ｗｉｃｋｈａｍ、Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ、（１９９２）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．  Ｉ：  ３９１−３９６）などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用したｐＶＬ１３９２／１３９３がよく用いられる（Ｋｉｄｄ、Ｉ．Ｍ．ａｎｄ  Ｖ．Ｃ．Ｅｍｅｒｙ（１９９３）Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４２、１３７−１５９）。この他にも、バキュロウイルスのＰ１０や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、ＡｃＮＰＶのエンベロープ表面タンパク質ＧＰ６７の分泌シグナル配列を目的タンパク質のＮ末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Ｚｈｅ−ｍｅｉ  Ｗａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３７９、１６７−１７４）。
【００８６】
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや石油酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｂ．ｄ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７、３０１８−３０２５）や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０、１−５）などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位をＮ末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリンプロテアーゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、Ｎ末端側に酵母のαファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つＫＥＸ２プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されることが知られている（Ａｎｄｒｅｗ、Ｌ．Ｎｉｌｅｓ、ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８、１２５−１３１）。
【００８７】
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば、上記ＣＯＳ細胞であれば、ＲＰＭＩ１６４０培地やダルベッコ変法イーグル培地（以下「ＤＭＥＭ」という）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清などの血清成分を添加したものを使用できる。
【００８８】
上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換えタンパク質は、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に６残基からなるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発明のポリペプチドを大量に製造できる。また、精製したポリペプチドの分子量は質量分析器、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等通常の方法で決定することができる。なお、配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９からならポリペプチドはシグナル配列予測プログラムＳｉｇｎａｌＩＰを用いて検索すると、アミノ酸番号１から２８がシグナル配列と推定されるので、成熟体ポリペプチドとしてはアミノ酸番号２９から４５９からなるポリペプチドとして発現している可能性がある。また配列番号９に示されるアミノ酸配列についてはアミノ酸番号１から２６番目がシグナル配列と推定されるので、成熟体ポリペプチドとしてはアミノ酸番号２７から４６８からなるポリペプチドとして発現している可能性がある。そのほか、スプライシングバリアントが存在する可能性もあるが、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと同一の機能（生物活性）（血中グルコース濃度の低下作用）を有する限りにおいてこららのポリペプチドも本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに含まれる。
【００８９】
このようにして得られた本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは血中のグルコース濃度及びインスリン濃度を低下させる機能を有するので、糖代謝異常及び／または脂質代謝異常の治療剤となり得る。
４．糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドおよびインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは、血中グルコース濃度が正常動物に比べて高くなる糖代謝異常および／または脂質代謝異常を有する動物では、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を有さない動物に比較して発現量が有意に低下している。また、糖尿病モデル動物にインスリン抵抗性改善剤を投与すると血中グルコース濃度とともに血中中性脂質濃度も低下し、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドおよびインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量はインスリン抵抗性改善剤を投与しない場合に比べ有意に上昇している。したがって、検体中の該インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドまたはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量を定量することにより、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を判定し、インスリン抵抗性異常で引き起こされる２型糖尿病等の疾患の診断に利用することが可能である。
【００９０】
また、糖尿病モデル動物にインスリン抵抗性改善剤を投与すると、血中の中性脂質濃度も低下するので、脂質代謝異常の診断にも利用することができる。
なお、「検体」とは、被験者や臨床検体、被験動物等から得られた、血液、体液、肝臓、筋肉、脂肪組織等の組織または排泄物等の試料を意味するが、本発明においては血液、肝臓または脂肪組織が好ましい。
【００９１】
例えば、被験者から採取した検体中でのインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドまたはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量が正常人から採取した検体に比べ低い場合、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を有するか、糖代謝異常および／または脂質代謝異常になる可能性が高いと判定される。また、個々の患者について、該インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドやインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現変動を経時的に観察すれば、該患者の予後を予測することもできる。
【００９２】
本発明において、正常人および正常動物とは、糖代謝異常および脂質代謝異常を有さない人および動物を意味する。正常人あるいは正常動物であるか否かは、血糖値および血中中性脂質（トリグリセライド）濃度を測定し、あらかじめ正常人の値として決められている数値範囲に入るか否かで判定することができる。血糖値および血中中性脂質濃度は通常の方法によって測定できるが、例えば、血糖値はグルコローダーＧＸＴ（Ａ＆Ｔ社製）、トリグリセライド濃度はトリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定することができる。本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドまたはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量と、正常人または正常動物の血糖値および血中中性脂質濃度の相関をあらかじめ調べておくことによって、被験者または被験動物から採取した検体における本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドまたはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量を測定することによって被験者または被験動物が、正常人または正常動物であるか否かを判定することができる。
【００９３】
４．１  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを利用した糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを利用した糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法は、具体的には、４．１．１または４．１．２に記載したとおりである。
【００９４】
４．１．１  以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）上記１）に記載の検体由来の全ＲＮＡと正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より抽出した全ＲＮＡの間における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
３）上記２）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記１）に記載の被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【００９５】
４．１．２  以下の工程１）乃至４）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）上記１）に記載の全ＲＮＡと上記２）に記載の全ＲＮＡの間における本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
４）上記３）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、上記１）に記載の被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【００９６】
４．１．３  ここで、４．１．１の工程１）および４．１．２の工程１）および工程２）における全ＲＮＡの抽出は上記、「１．１  インスリン抵抗性改善剤投与によって変動するポリヌクレオチドの特定方法」の項中「工程１」全ＲＮＡを調製する工程」の項に示した方法にしたがって実施することができ、抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが望ましい。また、４．１．１の工程２）および４．１．２の工程３）におけるインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量の測定も上記、「１．１  インスリン抵抗性改善剤投与によって変動するポリヌクレオチドの特定方法」の項中「工程２」  インスリン抵抗性改善剤投与と非投与で発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを特定する工程」の項に記載の方法や、下記の４．１．４に示すＲＴ−ＰＣＲ法、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、ランオン・アッセイに従って実施することができるが、特に遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲを用いて実施することが望ましい。
【００９７】
４．１．４  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量を測定するためのその他の方法
４．１．４．１  ＲＴ−ＰＣＲ
まず本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのｍＲＮＡを鋳型とする逆転写酵素反応を行ってから、ＰＣＲを実施して特異的にＤＮＡ断片を増幅する。この方法において、目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するためには、目的のｍＲＮＡの特定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから逆転写酵素により生成されるｃＤＮＡの配列中の特定の部分配列に相補的なセンスプライマーが用いられる。ＲＴ−ＰＣＲは市販のキット（例えば、ＲＮＡ  ＰＣＲキット  ＡＭＶ  ｖｅｒ２．１：タカラバイオ社製等）を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行なうことができるが、以下の方法でもできる。
【００９８】
逆転写酵素反応およびＰＣＲの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質的に本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列のアンチセンス配列中の、連続した１５ヌクレオチドから４０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチドから３０ヌクレオチド、更に好ましくは２３ヌクレオチドから３０ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。
【００９９】
一方、ＰＣＲにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列において、上記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も５’末端側の位置よりもさらに５’末端側領域に存在する配列中の連続した１５から４０ヌクレオチド、好ましくは１８から３５ヌクレオチド、更に好ましくは２１から３０ヌクレオチドの任意の部分配列からなる。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを避けたプライマーの設計を行うことが好ましい。
【０１００】
これらアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーには、いずれも上記で規定したそれらヌクレオチド配列の５’末端に、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げとならないよう、該リンカーは反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こさないようなものであることが好ましい。
ＲＴ−ＰＣＲの反応は常法により行なうことができる。なお、ＲＴ−ＰＣＲによる検出のための試料は、通常ポリ（Ａ）＋ＲＮＡにまで精製されている必要はない。
【０１０１】
ＰＣＲ終了後、反応液を電気泳動し、目的の大きさのバンドが増幅されているか否かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈したｃＤＮＡクローンを標準の鋳型ＤＮＡとして同条件でＰＣＲを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数を定めておくか、または、例えば５サイクル毎に一部反応液をサンプリングしてそれぞれ電気泳動を行う。また例えばＰＣＲ反応時に放射標識ｄＣＴＰを用いることにより、バンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。ポリヌクレオチド定量の信頼性を高めた方法として、上記ＲＴ−ＰＣＲ法を改良した競合ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｓｏｕａｚｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２１、２８０−２８５）や、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法（Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｇｅｎｏｍ．Ｒｅｓ．６、９８６−９９４）なども利用可能である。
【０１０２】
４．１．４．２  リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）：  ＲＮＡ試料中の、上記１）乃至５）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ（ただし配列中のｔはｕに読み替える）のみに標識プローブをハイブリダイズさせ、二本鎖ポリヌクレオチドを形成させておいてから、試料にリボヌクレアーゼを添加してインキュベーションすると、プローブがハイブリダイズしたｍＲＮＡは二本鎖を形成していることによってリボヌクレアーゼによる消化を免れ、それ以外のＲＮＡは消化されるので、該二本鎖ポリヌクレオチドのみが残る（検出されるｍＲＮＡよりプローブが短ければ、プローブの鎖長に相当する二本鎖ポリヌクレオチドが残る）。この二本鎖ポリヌクレオチドを定量することにより、目的のポリヌクレオチドの発現量を測定する。具体的には、例えば以下に記載する方法に従う。
【０１０３】
二本鎖を形成せずに余った標識プローブを二本鎖ポリヌクレオチドと確実に分離して定量を容易にするために、余った標識プローブはリボヌクレアーゼに消化されることが好ましいが、リボヌクレアーゼとして一本鎖ＤＮＡも消化できるようなものを使用すれば、標識プローブはＤＮＡでもＲＮＡでもよい。標識プローブの調製方法は上記常法に従って行なうことができるが、リボヌクレアーゼアッセイにおいて用いられるプローブの長さは５０から５００ヌクレオチド程度が好ましい。また、二本鎖ＤＮＡを直接標識して熱変性したのみのプローブ等、相補鎖が混在するようなプローブは本法には好適ではない。
【０１０４】
ＲＮＡプローブは、例えば下記の方法に従って調製される。まず鋳型ＤＮＡをバクテリオファージのプロモーター（Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３プロモーター等）を有するプラスミドベクター（例えばｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）など）に挿入する。次にこの組換えプラスミドベクターを、制限酵素で、挿入断片のすぐ下流で一ヶ所だけ切断されるように消化する。得られた直鎖ＤＮＡを鋳型として、放射能標識されたリボヌクレオチド存在下で、インビトロ転写反応を行う。この反応には、ベクター中のプロモーターに合わせてＴ７、ＳＰ６またはＴ３ポリメラーゼ等の酵素を用いる。以上の操作は例えばリボプローブシステム−Ｔ７、同−ＳＰ６または同−Ｔ３（いずれもプロメガ社製）を用いて行うことができる。
【０１０５】
ＲＮＡ試料を調製するまでの工程は「１．１  インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が変動するポリヌクレオチドの特定方法」の項中「工程１）全ＲＮＡを調製する工程」の項に示した方法にしたがって実施することができ、抽出された全ＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが望ましい。調製された全ＲＮＡ試料１０から２０μｇ相当分と、５×１０５ｃｐｍ相当の過剰量の標識プローブとを用いてリボヌクレアーゼ保護アッセイを行う。この操作は市販のキット（ＨｙｂＳｐｅｅｄ  ＲＰＡ  Ｋｉｔ、アンビオン社製）を用いて行うことができる。得られたリボヌクレアーゼ消化後の試料を、８Ｍ  尿素を含む４から１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムでオートラジオグラフィーを行う。以上の操作により、リボヌクレアーゼ消化を免れた二本鎖ポリヌクレオチドのバンドを検出することができ、またその定量は常法に従って実施することができる。さらに、各試料間のＲＮＡ量の差等に起因するばらつきを補正する目的で、β−アクチン遺伝子の発現量を同時に測定しておけば、より精密な評価を行うことができる。
【０１０６】
４．１．４．３  ランオン・アッセイ（Ｒｕｎ−ｏｎ  ａｓｓａｙ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｍ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｚｉｆｆ、Ｅ．Ｂ．Ｂ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１１、４３３−４３８、Ｇｒｏｕｄｉｎｅ、  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．    １、２８１−２８８参照）：  本方法は、細胞から核を単離して目的の遺伝子の転写活性を測定する方法であり、細胞内のｍＲＮＡを検出する方法ではないが、本発明においては「ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法」に包含される。単離された細胞核を用いて、試験管内で転写反応を行わせると、核を単離する前に既に転写が開始されｍＲＮＡ鎖が生成されている途中のものが伸長していく反応のみが進行する。この反応時に放射標識したリボヌクレオチドを添加して、伸長していくｍＲＮＡを標識しておき、その中に含まれる、非標識プローブにハイブリダイズするｍＲＮＡを検出することにより、核を単離した時点における目的のポリヌクレオチドの転写活性を測定することができる。なお具体的操作方法は、標識しないプローブを調製する他は、上記参照文献の記載に準ずる。被験者または被験動物から採取した検体由来の試料と、正常人または正常動物由来の試料との間で測定結果を比較し、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの転写活性が正常人または正常動物より低い場合、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を有すると判断することができる。
【０１０７】
４．１．５  判定
４．１．１の工程３）および４．１．２の工程４）におけるインスリン感受性異常の病態の判定は、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドが複数ある場合は、その発現量の差を総合的に評価して行なうことが望ましい。なお、「発現量の差」は、被験者または被験動物由来の検体と、正常人または正常動物由来の検体におけるインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量を定量的に比較できる限り、発現量差であっても発現量比であってもよい。
【０１０８】
上記分析の結果、被験者または被験動物から採取した検体由来の試料と、正常人または正常動物由来の試料との間で測定結果を比較し、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量が正常人または正常動物より低い場合、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を有すると判断することができる。
【０１０９】
４．２  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを利用した糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを利用した糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法は、具体的には以下の４．２．１、４．２．２、４．２．３または４．２．４からなる。
４．２．１  以下の工程１）乃至２）を含む：
１）被験者または被験動物から採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程：
２）上記１）で検出されたポリペプチドの発現量と正常人または正常動物から採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、上記１）における被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【０１１０】
４．２．２  以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程：
２）正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における、上記１）に記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程：
３）上記１）に記載のポリペプチドの発現量と上記２）に記載のポリペプチドの発現量の差を解析し、上記１）に記載の被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【０１１１】
４．２．３  以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）上記２）で検出されたポリペプチドの発現量と正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より得た全ポリペプチにおける該ポリペプチドの発現量の差を解析し、上記１）における被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【０１１２】
４．２．４  以下の工程１）乃至５）を含む、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法：
１）被験者または被験動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）正常人または正常動物より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体より得た全ポリペプチドを固相化する工程；
３）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのうちのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程：
４）上記２）に記載の固相化ポリペプチドにおける、上記３）で発現量を測定したポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
５）上記３）で検出したポリペプチドの発現量と上記４）で検出したポリペプチドの発現量の差を解析し、上記１）に記載の被験者または被験動物の糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態を判定する工程。
【０１１３】
以下、上記４．２．１乃至４．２．４に記載の検出方法について説明する。
【０１１４】
糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態の検出方法の好適な態様として、抗体を利用した方法について説明する。まず、試料中のポリペプチドを９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートのウエル内底面やメンブレン等に固相化しておいてから、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、９６穴プレートや３８４穴プレート等のマルチウエルプレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）や放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリペプチドを転写する方法（ウエスタンブロット法）か、または直接メンブレンに試料またはその希釈液を染み込ませる、いわゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられる。
【０１１５】
（１）試料の調製
試料としては、ヒト全血、血清、肝臓または脂肪組織抽出液が好ましい。該全血、肝臓または脂肪組織抽出液は、必要に応じて高速遠心を行うことにより、不溶性の物質を除去した後、以下のようにＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
【０１１６】
ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料としては、例えば回収した血清、肝臓や脂肪組織抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、例えば血清、肝臓や脂肪組織抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈して、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の２−メルカトルエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合する。ドット／スロットブロットの場合は、例えば回収した血清、肝臓や脂肪組織抽出液そのもの、または緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッティング装置を使用するなどして、直接メンブレンへ吸着させる。
【０１１７】
（２）試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するためには、試料を免疫沈降法、リガントの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せずに検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。ポリペプチドを固相化する場合において、ウエスタンブロット法、ドットブロット法またはスロットブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、バイオラッド社製等）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社製）等）、コットンメンブレン（例えば、ブロットアブソーベントフィルター（バイオラッド社製）等）またはポリビニリデン・ジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（例えば、バイオラッド社製等）等が挙げられる。
【０１１８】
電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッティング方法としては、ウエット式ブロッティング法（ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ｖｏｌｕｍｅ  ２  ｅｄ  ｂｙ  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ）、セミドライ式ブロッティング法（上記ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  ｖｏｌｕｍｅ  ２  参照）等を挙げることができる。ドットブロット法やスロットブロット法のための器材も市販されている（例えば、バイオ・ドット（バイオラッド）等）。
【０１１９】
一方、ＥＬＩＳＡ法／ＲＩＡ法で検出・定量を行うためには、専用の９６穴プレート（例えば、イムノプレート・マキシソープ（ヌンク社製）等）に試料またはその希釈液（例えば０．０５％  アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「ＰＢＳ」という）で希釈したもの）を入れて４℃から室温で一晩、または３７℃で１から３時間静置することにより、ウエル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
【０１２０】
（３）抗体
用いられる抗体は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例えば、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれにも結合するが、他のいかなるマウスまたはヒト由来のタンパク質とも結合しないような抗体を挙げることができる。
【０１２１】
前記抗体は、常法を用いて（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質１、ｐ．３８９−３９７，１９９２）、抗原となるタンパク質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５−４９７、１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ、Ｒ．ｅｄ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐ．３６５−３６７、１９８０、Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．）に従って、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
【０１２２】
抗体を作製するための抗原としては、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドまたはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
【０１２３】
前記抗原ポリペプチドは本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによって該ポリヌクレオチドを発現させることにより、該ポリヌクレオチドを得ることが出来る。
【０１２４】
抗原となるポリペプチドは上記、「３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生産」の項に記載した方法によって製造することができる。
【０１２５】
上記のようにして得られる抗体は、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法などの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いることができる。
【０１２６】
インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと特異的に結合する抗体の例として、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
【０１２７】
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、またはハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、およびその認識特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
【０１２８】
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使用することもできる。
【０１２９】
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製した本発明の蛋白質またはその一部を使用することができる。さらに、本発明により本発明の蛋白質の一次構造が明らかにされたので、当業者に周知の方法を用いて、本発明の蛋白質の部分ペプチドを化学合成し、これを抗原として使用することもできる。
【０１３０】
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物としては、マウスが最も好適に用いられるが、これに限定されない。
【０１３１】
マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
【０１３２】
免疫は、一回、または、適当な間隔で（好ましくは１週間から５週間間隔で）複数回繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ましい。
【０１３３】
ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法（以下「ＲＩＡ法」という）、固相酵素免疫定量法（以下「ＥＬＩＳＡ法」という）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、および操作の自動化の可能性などの観点から、ＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法がより好適である。
【０１３４】
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係なタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
【０１３５】
（ｃ）ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）ミエローマ株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｙｅｌｔｏｎ，  Ｄ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８１，  １−７（１９７８）］、Ｐ３／ＮＳＩ  ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）  ［Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ５１１−５１９  （１９７６）  ］、Ｓｐ２  ／Ｏ−Ａｇ１４  （ＳＰ−２）  ［Ｓｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７６，  ２６９−２７０  （１９７８）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３  （６５３）  ［Ｋｅａｒｎｅｙ，  Ｊ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １２３，  １５４８−１５５０  （１９７９）］、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）  ［Ｈｏｒｉｂａｔａ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，  Ａ．  Ｗ．  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  ４９５−４９７  （１９７５）］などを用いることが好ましい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、およびウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］  、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  ；以下「ＩＭＤＭ」という）、またはダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３から４日前に正常培地［例えば、１０％  ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
【０１３６】
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から得てもよく、一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを適宜組み合わせたもの等から得ることができるが、脾細胞が最も一般的に用いられる。
【０１３７】
最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウスから抗体産生細胞が存在する部位、例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程（ｃ）で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法である。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
【０１３８】
脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えばＲＰＭＩ１６４０）、またはリン酸緩衝生理食塩液（以下「ＰＢＳ」という）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が５：１〜１０：１程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら１ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（分子量１０００〜４０００）を含む無血清培地を滴下する。その後、１０ｍｌの無血清培地をゆっくりと加えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（以下「ＨＡＴ」という）液およびマウスインターロイキン−２（以下「ＩＬ−２」という）を含む正常培地（以下「ＨＡＴ培地」という）中に懸濁して培養用プレート（以下「プレート」という）の各ウェルに分注し、５％  炭酸ガス存在下、３７℃で２週間程度培養する。途中適宜ＨＡＴ培地を補う。
【０１３９】
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、８−アザグアニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株である場合、融合しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、ＨＡＴ含有培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマは生存することができるが、抗体産生細胞どうしの融合細胞には寿命がある。従って、ＨＡＴ含有培地中での培養を続けることによって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマのみが生き残り、結果的にハイブリドーマを選択することができる。
【０１４０】
コロニー状に生育してきたハイブリドーマについて、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地（以下「ＨＴ培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を採取し、例えば、ＥＬＩＳＡ法により抗体価を測定する。
【０１４１】
以上、８−アザグアニン耐性の細胞株を用いる方法を例示したが、その他の細胞株もハイブリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組成も変化する。
【０１４２】
（ｆ）クローニング
工程（ｂ）の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生することが判明したハイブリドーマを、別のプレートに移しクローニングを行う。このクローニング法としては、プレートの１ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈して培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイクロマニュピレーターによって１個づつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーターによって１個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が簡便でありよく用いられる。
【０１４３】
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
【０１４４】
（ｇ）ハイブリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ  ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
【０１４５】
かくして得られるモノクローナル抗体は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対して高い抗原特異性を有する。
【０１４６】
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定は以下のように行うことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、またはＲＩＡ法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
【０１４７】
さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
【０１４８】
このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、その特異性を利用した本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの検出や分離精製に用いることができる。
【０１４９】
（４）検出
上記（３）記載の方法で得られる抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
【０１５０】
標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（または標識ストレプトアビジン）を使用する方法のための、予め標識された抗体（またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。ＲＩＡの場合はＩ１２５等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
【０１５１】
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、それら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
【０１５２】
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法においては、好ましくは市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウエルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定することにより定量する。また好ましくは上記（３）において抗体作製のために使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することが可能である。
【０１５３】
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においてはＸ線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。また、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
【０１５４】
（５）測定操作
ｉ）ウエスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合
まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的吸着を阻害する物質（スキムミルク、カゼイン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作（ブロッキング）を行う。ブロッキング溶液の組成は、例えば５％  スキムミルク、０．０５から０．１％  ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）が用いられる。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、１から１０％のウシ血清アルブミン、０．５から３％のゼラチンまたは１％のポリビニルピロリドン等を用いてもよい。ブロッキングの時間は、４℃で１６から２４時間、または室温で１から３時間である。
【０１５５】
次に、メンブレンを０．０５から０．１％  ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウエスタンブロッティング実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で２時間行う。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合はブロッキング溶液で２０００から２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で４５分から１時間浸し、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずメンブレンを洗浄液中で１５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１５６】
ｉｉ）ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ
まず、上記（２）の方法で試料を固相化させたプレートのウェル内底面への抗体の非特異的吸着を阻止するため、ウエスタンブロットの場合と同様、予めブロッキングを行っておく。ブロッキングの条件については、ウエスタンブロットの項に記載した通りである。
【０１５７】
次に、ウェル内を０．０５から０．１％  ツイーン２０を含むＰＢＳまたはＴＢＳ（以下「洗浄液」という）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（３）記載の方法で作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーションし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記（３）記載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のＥＬＩＳＡ実験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で１時間程度行う。抗体反応操作終了後、ウェル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場合は洗浄液で２０００から２００００倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のウェルに二次抗体溶液を分注して室温で１から３時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずウェル内に洗浄液を分注して５分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して５分間振盪した後、再度洗浄液を交換して５分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄液を交換して洗浄してもよい。
【０１５８】
また本発明において、いわゆるサンドイッチ法のＥＬＩＳＡは例えば以下に記載する方法により実施することができる。まず、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を２箇所選んで、それぞれの領域中のアミノ酸６残基以上からなる部分ペプチドを合成し、該部分ペプチドを抗原とした２種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記（４）記載のように標識しておく。標識しなかった方の抗体は、上記（２）記載の方法に準じて９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートのウェル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をウェル内に入れて常温で１時間インキュベーションする。ウェル内を洗浄後、標識した方の抗体希釈液を各ウェルに分注してインキュベーションする。再びウェル内を洗浄後、標識方法に合わせた検出操作を行う。
【０１５９】
（６）リガンド
抗体の他に、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに特異的に結合する基質、補酵素、調節因子等のリガンドを用いることによってもインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを定量することができる。
【０１６０】
（７）判定
以上に記載した方法で、被験者または被験動物から採取した検体と、正常人または正常動物から採取した検体との間で検出結果を比較し、その結果上記（３）記載の方法で作製された抗体またはリガンドが特異的に結合するポリペプチドの量を各インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量として、正常個体に比べインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量が低下している場合に糖代謝異常および／または脂質代謝異常があるか、糖代謝異常および／または脂質代謝異常になる可能性が高いと判定することができる。
【０１６１】
５．インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドおよび／またはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド検出用キット
インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドおよび／またはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは、以下の１）乃至５）からなる群から選択される少なくとも一つ以上を含むキットを用いて検出することができる。
１）配列表の配列番号４または８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部乃至全部を特異的に増幅するための１５から３０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドプライマー；
２）配列表の配列番号４または８に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、該ポリヌクレオチドを検出するための１５ヌクレオチド以上の連続したポリヌクレオチドプローブ；
３）上記  ）に記載のポリヌクレオチドが固定された固相化試料；
４）下記の▲１▼乃至▲５▼から選択されるポリペプチドに特異的に結合し、該タンパク質を検出するための抗体；
▲１▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲２▼配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲３▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
▲４▼配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド。
▲５▼上記▲１▼乃至▲４▼に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
５）上記４）に記載の抗体に結合する二次抗体。
【０１６２】
前記１）記載のプライマーは、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列表の配列番号４または８に示されるヌクレオチド配列）に基づき市販のプライマー設計ソフト（たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ  ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．２）を用いる等、常法により容易に設計し、増幅することができる。このようなプライマーとしては例えば、配列表の配列番号６に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号７に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせまたは配列表の配列番号２０に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号２１に示されるヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用することができる。また、前記２）に記載のプローブは、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリペプチドであって、１００から１５００塩基長、好ましくは３００から６００塩基長である。これらのプライマーやプローブは、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよく、また、リンカーを付加していてもよい。
【０１６３】
上記３）に記載の固相化試料は、上記２）に記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料の作成方法については、既に「１．１  インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が変動するポリヌクレオチドの特定方法」の項中、「工程２」インスリン抵抗性改善剤投与と非投与で発現量が著しく異なるポリヌクレオチドを特定する工程」の項中、「（１）固相化試料を用いた解析方法」の項で説明した通りであり、例えば、遺伝子チップ、ｃＤＮＡアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
【０１６４】
本発明のキットには、更に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）および緩衝液を含めることもできる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＬＡ  ＴａｑＤＡＮ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどが例示できる。緩衝液は使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて選ばれ、必要に応じてＭｇ２＋等が添加されている。
【０１６５】
前記、４）および５）に記載の抗体は「４．糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法」の項に記載した方法により作製することができる。該抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよい。
【０１６６】
本発明のキットはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドおよび／またはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの検出に用いることができ、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の病態の判定や、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善する物質のスクリーニングにも用いることができる。
【０１６７】
６．インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドはインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇したポリペプチドがコードするポリペプチドとして見出されたタンパク質であり、糖代謝および／または脂質代謝に関連するタンパク質であり、上記１．５乃至１．７に記載したように、血中のグルコース濃度及びインスリン濃度を低下させる機能、脂肪組織において、インスリン抵抗性および糖尿病発症原因の一つとして報告されているＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能を有する。
【０１６８】
したがって、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進又は抑制する物質は糖代謝および脂質代謝に関連する物質として、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善する物質ともなる得る。
【０１６９】
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドまたはインスリン抵抗性改善間感受性ポリペプチドの少なくとも一つの発現量を測定することによって糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善する物質のスクリーニングをすることができる。
【０１７０】
なお、「被験物質」とは、本発明のスクリーニング方法で本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進又は抑制する効果を調べる対象となる物質をいう。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量を増加するように設計された核酸またはその誘導体（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ等を含む）を、被験物質として使用することも可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよく、個体、液体等適当な状態で投与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えてもよい。培養細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる。培地に添加する場合には培養開始時から添加してもよいし、培養途中で添加しても良く、また、添加の回数も１回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜設定してよいが、好ましくは３０分から４８時間である。哺乳動物個体に被験物質を投与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、投与から、検体を得るまでの時間は適当に選択することができる。
【０１７１】
本発明における「糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善する物質」とは、インスリン抵抗性を改善する効果を有する物質および／または脂質代謝異常を改善する物質を意味する。
【０１７２】
本発明のスクリーニング方法において用いられる培養細胞は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つまたはその一部のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを発現する哺乳動物細胞であればよく、肝臓または脂肪組織由来の培養細胞あるいは肝臓や脂肪組織に分化する培養細胞であるが、例えば本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つをそのプロモーター領域とともに導入した細胞など、人為的に形質転換された細胞も使用することが可能である。このような培養細胞としては、例えば、マウス繊維芽細胞由来細胞株３Ｔ３−Ｌ１細胞、ラット肝臓癌細胞株Ｈ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３、マウス、ラットおよびヒト遊離脂肪細胞、マウス、ラットおよびヒト初代肝細胞等を挙げることができる。哺乳動物種としては、ヒト、マウスまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましいが、これらに限定されない。
【０１７３】
本発明のスクリーニング方法には、培養細胞を用いず、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から摘出されたその臓器または組織細胞における本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つの発現を検出する方法も含まれる。ポリヌクレオチド発現の検出対象となる臓器または組織は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれかを発現するものであればよいが、好ましくは白色脂肪細胞、肝臓、筋肉である。哺乳動物種としてはヒト、マウスまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。なお、糖尿病のモデル動物であるＫＫマウスを用いることもできる。
【０１７４】
本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合には本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つを発現可能な条件であれば、いかなる条件で培養してもよい。例えば、該培養細胞について確立された培養条件が知られており、該条件下において該細胞が本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現する場合は、該条件で培養してよい。また、哺乳動物個体から摘出した臓器または組織における本ポリヌクレオチド発現を検出する場合における、該動物の飼育条件も、被験物質を添加しない場合にインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを発現可能な条件であればよい。
【０１７５】
インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを検出する実施態様において用いられる培養細胞の種類に関する条件は、上記したインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現を検出する実施態様の場合と同様である。また、何らかの事情により培養細胞を用いるよりも好適と判断される場合には、哺乳動物個体に被験物質を投与して、その後該動物個体から採取された臓器または組織等を試料として用いる方法も採用し得る。ヒトの場合は生体より採取された脂肪組織や肝臓を用いることもできる。
【０１７６】
哺乳動物種としてはヒト、マウスまたはハムスターが好ましく、ヒトまたはマウスがより好ましい。培養細胞の培養条件、動物の飼育条件、被験物質の投与方法についても、ポリヌクレオチド発現を検出する実施態様の場合と同様である。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。
【０１７７】
本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液または核抽出画分が用いられ得るが、全細胞抽出液が好適である。全細胞抽出液は、必要により高速遠心することにより不溶性の物質を除去した後、ＥＬＩＳＡ／ＲＩＡ用試料やウエスタンブロット用試料の調製工程に供される。
【０１７８】
なお、被験物質の、糖代謝および／又は脂質代謝に対する影響を調べるためには、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量を測定する方法、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの転写産物である、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量を測定する方法及びインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を利用した方法がある。
【０１７９】
培養細胞からの、全ＲＮＡの抽出、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量の測定、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量の測定については、上記１．１に既に記載した方法に従って行うことができる。
【０１８０】
６．１  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドを用いる方法
本発明のスクリーニング方法としては例えば、哺乳動物由来培養細胞を用いる場合、哺乳動物個体を用いる場合についてそれぞれ以下のようになる。
【０１８１】
Ａ）哺乳動物由来培養細胞を用いる場合
Ａ−１）以下の工程１）乃至３）を含む。
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）１）由来の全ＲＮＡと被験物質を添加しないで培養した哺乳動物培養細胞由来全ＲＮＡの間における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
３）ポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１８２】
Ａ−２）以下の工程１）乃至４）を含む。
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）１）由来の全ＲＮＡと２）由来の全ＲＮＡの間における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
４）３）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１８３】
Ｂ）哺乳動物個体を用いる場合
Ｂ−１）以下の工程１）乃至３）を含む。
１）被験物質を投与した動物より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）１）由来の全ＲＮＡと被験物質を投与しなかった動物より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体より得た全ＲＮＡの間における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つ発現量の差を検出する工程；
３）２）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、被験物質の糖代謝異常および／または脂質代謝異常改善効果を判定する工程。
【０１８４】
Ｂ−２）以下の工程１）乃至４）を含む。
１）被験物質を投与した動物より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
２）被験物質を投与しなかった動物より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体より、全ＲＮＡを抽出する工程；
３）１）由来の全ＲＮＡと２）由来の全ＲＮＡの間における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドのいずれか一つの発現量の差を検出する工程；
４）３）に記載のポリヌクレオチドの発現量の差を解析し、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１８５】
６．２  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを用いる場合
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量を測定することを利用したスクリーニング方法については哺乳動物培養細胞を用いた場合と動物固体を用いた場合についてそれぞれ以下の工程を含む。
【０１８６】
Ａ）哺乳動物由来培養細胞を用いる場合
Ａ−１）以下の工程１）および２）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
２）１）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１８７】
Ａ−２）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞における、上記１）に記載のポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）上記１）で検出されたポリペプチドの発現量と、２）で検出されたポリペプチドの発現量の差を検出し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１８８】
Ａ−３）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記固相化ポリペプチドにおける、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）上記２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全ポリペプチドにおける該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１８９】
Ａ−４）以下の工程１）乃至５）を含む：
１）被験物質を添加した培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
２）被験物質を添加しない培地で培養した哺乳動物由来培養細胞から得た全ポリペプチドを固相化する工程；
３）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
４）上記２）に記載の固相化ポリペプチドにおける上記３）で測定したポリペプチドと同じポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて測定する工程；
５）３）で測定されたポリペプチドの発現量と、４）で測定されたポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進または抑制効果を判定する工程。
【０１９０】
Ｂ）哺乳動物個体を用いる場合
Ｂ−１）以下の工程１）および２）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
２）１）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体から採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１９１】
Ｂ−２）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取された血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体における、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取された血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体における、該ポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）１）で検出されたポリペプチドの発現量と、２）で検出されたポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１９２】
Ｂ−３）以下の工程１）乃至３）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体中の全ポリペプチドを固相化する工程；
２）上記固相化ポリペプチドにおける、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
３）２）で検出されたポリペプチドの発現量と、被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体中における該ポリペプチドの発現量の差を解析し、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１９３】
Ｂ−４）以下の工程１）乃至５）を含む：
１）被験物質を投与された哺乳動物個体より採取した血液、肝臓および／または脂肪組織を含む検体中の全ポリペプチドを固相化する工程；
２）被験物質を投与されなかった哺乳動物個体より採取した血液、肝臓または脂肪組織を含む検体中の全ポリペプチドを固相化する工程；
３）上記１）に記載の固相化ポリペプチドにおける、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのいずれか一つの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
４）上記２）に記載の固相化ポリペプチドにおける、上記３）で発現量を測定したのポリペプチドと同じポリペプチドの発現量を該ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて検出する工程；
５）上記３）で検出されたポリペプチドの発現量と、上記４）で検出されたポリペプチドの発現量の差を解析し、被験物質の、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の促進または抑制効果を判定する工程。
【０１９４】
６．３  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量の測定
インスリン抵抗性改善剤感受性ポリヌクレオチドの発現量は１．１の項で記載した方法によって行なうことができる。
【０１９５】
６．４  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの検出
次に、本発明の方法の別の実施態様としては、上記のポリヌクレオチドの発現を検出する実施態様において検出対象となった遺伝子（ポリヌクレオチド）がコードするポリペプチド（タンパク質）を検出する方法がある。「４．糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法」の項中、「４．２  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを利用した糖代謝異常および／または脂質代謝異常の検出方法」の項に記載した方法に従って、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量を測定することができる。
【０１９６】
被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの産生量を増加させた被験物質は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する物質であり、糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善させる機能を有し、インスリン抵抗性を改善させる機能を有し、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善剤、２型糖尿病の治療または予防剤および／または高脂血症治療または予防剤となり得る。
【０１９７】
インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの産生量を低下させた被験物質は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を抑制する物質であり、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの発現量増加に起因する糖代謝異常および／または脂質代謝異常を改善させる機能を糖代謝異常の治療または予防剤および／または高脂血症治療または予防剤となり得る。
【０１９８】
６．５  インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を利用した方法
Ａ．血中のグルコース濃度及び／またはインスリン濃度を低下させる機能を利用したスクリーニング方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは血中グルコース濃度及び／または血中インスリン濃度を低下させる機能を有する。したがって、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する物質は血糖値および／または血中インスリン濃度を上昇させる機能を有する物質であり、一方、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を抑制する物質は血糖値および／または血中インスリン濃度を低下させる機能を有する物質である。こららの物質は具体的には以下の、Ａ−１またはＡ−２の工程によって取得することができる。
【０１９９】
Ａ−１．下記の工程１）および２）を含む、下記のａ）乃至ｃ）から選択される少なくともいずれか一つのポリペプチドの機能を促進する物質または抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）  非ヒト哺乳動物に、上記ａ）乃至ｅ）から選択されるポリペプチドおよび被験物質を投与する工程；
２）上記１）に記載の動物の血中のグルコース濃度および／またはインスリン濃度を測定する工程。
【０２００】
Ａ−２．  下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中のグルコース濃度を測定する。
【０２０１】
血中グルコース濃度（血糖値）は、当業者が通常用いる方法によって測定することができるが、例えば、グルコース測定用キット（グルコースＣＩＩ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて測定することができる。また、血中のインスリン濃度も当業者が通常用いる方法によって測定することができるが、例えば、インスリン測定キット（森永生化学研究所製）を用いて血中インスリン値を測定することができる。その結果、コントロールに比べてグルコース濃度および／またはインスリン濃度を低下させた被験物質は本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する物質であると判定することができる。また、コントロールに比べてグルコース濃度および／またはインスリン濃度を増加させた被験物質は本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を抑制する物質であると判定することができる。
【０２０２】
Ｂ．ＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能を利用したスクリーニング方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは脂肪組織において、インスリン抵抗性および糖尿病発症原因の一つとして報告されているＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能を有する。したがって、ＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能を阻害する物質及び／または促進する物質は、糖代謝異常及び／または脂質代謝異常の改善剤となり得る。具体的には以下のようなスクリーニング方法によってこのような物質を入手することができる。
【０２０３】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載の機能を促進又は抑制する機能を有する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を脂肪分解促進物質を含む溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中の遊離脂肪酸濃度を測定する。
【０２０４】
本スクリーニング方法に用いられる細胞としては、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを発現している細胞で、脂肪分解アッセイに使用することができる細胞であれば、特に制限されず、脂肪細胞を用いることができ、例えば、３Ｔ３Ｌ１細胞を脂肪細胞に分化させた細胞を用いることができる。脂肪分解促進物質としては、脂肪の分解を促進する機能を有する物質であれば特に制限されないが、例えば、ＴＮＦ−αを挙げることができる。
【０２０５】
具体的には、上記工程１）においてはインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを発現する３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を脂肪分解アッセイ培地（フェノールレッド不含、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：シグマ社製）を含む低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）にＴＮＦ−α（シグマ社製）を適当な濃度（例えば、終濃度０．５ｎｇ／ｍｌ）で添加し、被験物質の存在下で適当な時間培養する。
【０２０６】
上記工程２）においては、培養後の培地上清中の遊離脂肪酸濃度を測定する。遊離脂肪酸の濃度は当業者が通常行う方法によって行うことができるが、例えば、遊離脂肪酸測定用のキット（ＮＥＦＡ−Ｃテストワコー：和光純薬社製）をそのマニュアルにしたがって用いて測定することができる。同時に、コントロールとして本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを発現しない細胞についても同様に培養を行い遊離脂肪酸濃度を測定する。その結果、コントロールと比較して、遊離脂肪酸濃度が低くなっている場合には被験物質は本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する物質であると判定することができ、逆に遊離脂肪酸濃度が高くなっている場合には、被験物質は本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を抑制するする物質であると判定することができる。
【０２０７】
Ｃ．肝臓において糖産生を抑制する機能を利用したスクリーニング方法
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドは肝臓において糖産生を抑制する機能を有する。したがって、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを発現する細胞においてコントロールに比べて、糖産生量を有意に変化させる物質は糖代謝異常及び／または脂質代謝異常の治療剤となり得る。このような物質は具体的には以下の工程によって取得することができる。
【０２０８】
下記の工程１）乃至２）を含むことを特徴とする、下記のａ）乃至ｅ）に記載のポリペプチドの機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法：
ａ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｂ）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｃ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｄ）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
ｅ）上記ａ）乃至ｄ）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
１）上記ａ）乃至ｅ）から選択される少なくともいずれか一つを発現する細胞と被験物質を溶液中で接触させる；
２）１）に記載の溶液中のグルコース濃度を測定する。
【０２０９】
上記工程１）において用いる細胞としては、上記ａ）乃至ｅ）から選択される本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを発現する細胞であり、糖産生量を測定することができる限り特に制限はなく、培地についても、糖産生量を測定することができる限りにおいて制限はない。例えば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを発現するＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３肝癌細胞を糖新生アッセイ培地（［フェノールレッドを含まず、グルコースを含まず、Ｌ−グルタミンを含まず、ピルビン酸を含まないＤＭＥ−ｂａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製）に終濃度２ｍＭでＬ−グルタミンを添加したもの］にて２回細胞を洗浄後、各ウエルに５００μｌの糖新生アッセイ培地及び被験物質を添加し、さらに必要なウエルには外因性基質としてピルビン酸／乳酸をそれぞれ終濃度２０ｍＭ／２ｍＭになるように添加して、インキュベートする。インキュベート時間は糖産生量を測定することができる限りにおいて得に制限はないが、例えば、１分から１０時間、好ましくは、３０分から５時間、より好ましくは３時間である。
工程２）においては上記工程１）の上清を用いてグルコース濃度を測定する。グルコース濃度の測定は当業者が通常用いる方法で行うことができるが、例えば、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット（モレキュラープローブ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより測定することができる。その結果本発明の被験物質を添加することによってコントロールに比べ、糖産生量が低下している被験物質は本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する物質であると判定することができ、糖産生量の増加に起因する疾患の治療剤となり得る。また、コントロールに比べ糖産生量が増加している被験物質は本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を阻害する物質であり、糖産生量の低下に起因する疾患の治療剤となり得る。
【０２１０】
６．６  その他
なお、上記本発明のスクリーニング方法は被験物質の代わりに本発明のインスリン抵抗性改善剤の機能に影響することが明らかな物質を用いた検定試験に用いることもできる。
【０２１１】
７．直接相互作用する物質の探索
本発明の他の一つの態様としては、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの活動を抑制するような物質を得ることを目的とした、該蛋白質の立体構造をベースとしたドラッグデザインの手法を含む。このような手法は、ラショナルドラッグデザイン法として知られており、酵素活性などの機能や、リガンド、コファクター、またはＤＮＡへの結合などを効率よく阻害もしくは活性化させるような化合物の探索に利用されている。この例として、すでに上市されている抗ＨＩＶ剤であるプロテアーゼの阻害剤がよく知られている。本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの三次元構造解析においても、Ｘ―線結晶解析や核磁気共鳴法といった一般的によく知られている手法が利用できると考えられる。さらに、本発明のスクリーニングポリペプチドの機能を抑制する物質の探索には、コンピュータードラッグデザイン（ＣＡＤＤ）を活用した設計も可能である。この例としては、慢性関節リウマチ治療の新たなゲノム新薬として期待されているＡＰ−１の働きを阻害する低分子化合物（国際特許出願公開ＷＯ９９／５８５１５号）などが知られている。このような方法により、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに直接結合したり、あるいは本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと他の因子との相互作用を阻害することにより、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を抑制するような物質を得ることができる。
【０２１２】
さらに、他の一つの態様は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドが会合するポリペプチド、すなわち本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドのパートナータンパク質に関する。すなわち、本発明は、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの活性を調節するパートナータンパク質のスクリーニング方法に関する。
【０２１３】
このスクリーニング方法の一つの態様は、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに被験タンパク質試料を接触させ、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに結合するタンパク質を選択する工程を含む。このような方法としては、例えば、精製したインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを用いて、これに結合するタンパク質のアフィニティー精製を行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドにヒスチジン６個よりなる配列をアフィニティータグとして融合したものを作製して、これを細胞の抽出液（予めニッケル−アガロースカラムにチャージして、このカラムを素通りした画分）と４℃で１２時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途ニッケル−アガロース担体を加えて４℃で１時間インキュベートする。ニッケル−アガロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、１００ｍＭイミダゾールを加えることにより、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと特異的に結合する細胞抽出液中のタンパク質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと直接結合するタンパク質、およびインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドとの結合活性は持たないが、サブユニットとしてインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに直接結合するタンパク質と複合体を形成することにより間接的にインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに結合するタンパク質が精製できる［実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ５「転写因子研究法」ｐｐ２１５−２１９（羊土社刊）］。
【０２１４】
別の方法としては、ファーウエスタンブロット法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ７６−８１（羊土社刊）］や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイブリッドシステム法［実験医学別冊、「新遺伝子工学ハンドブック」ｐｐ６６−７５（羊土社刊）、「チェックメイト・マンマリアン・ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製）］によるクローニングも可能であるが、これらの方法に限定されない。
【０２１５】
このようにして、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと直接もしくは間接的に相互作用するパートナータンパク質のｃＤＮＡが得られれば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドと該パートナータンパク質との相互作用を阻害する物質の機能的スクリーニングに利用することができる。具体的には、例えば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドとグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質を調製して、抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させた後、ビオチン化した該パートナータンパク質をこの融合タンパク質と接触させ、該融合タンパク質との結合をストレプトアビジン化アルカリフォスファターゼで検出する。ビオチン化した該パートナータンパク質添加の際、被験物質も添加し、融合タンパク質と該パートナータンパク質との結合を促進あるいは阻害する物質を選択する。この方法では、融合タンパク質に直接作用する物質または該パートナータンパク質に直接作用する物質が得られる。
【０２１６】
融合タンパク質と該パートナータンパク質との結合が間接的であり、何らかの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液存在下で、同様に上記アッセイを行う。この場合には、該因子に対して作用するような物質も選択される可能性がある。
【０２１７】
また、得られたパートナータンパク質が、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する活性を有している場合には、既に記載したインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド遺伝子の発現ベクターを応用した試験方法に従って、糖代謝異常および／または脂質代謝異常の改善剤または予防剤、例えば、インスリン抵抗性改善効果を有する２型糖尿病や高脂血症のの治療または予防剤として有用な候補物質のスクリーニングを行うことができる。また、得られたパートナータンパク質が、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能を促進する活性を有している場合には、このような促進因子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、糖代謝異常や脂質代謝異常、例えば、２型糖尿病や高脂血症の遺伝子治療に用いることができる。
【０２１８】
そのようなポリヌクレオチドは、例えば同定された阻害因子のアミノ酸配列を解析し、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドプローブを合成してｃＤＮＡライブラリーやゲノムライブラリーのスクリーニングを行うことにより取得できる。また、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの機能の阻害活性を有するぺプチドが、ランダムに合成された人工ペプチドライブラリー由来である場合は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを化学合成する。
【０２１９】
遺伝子治療においては、そのようにして得られた阻害因子をコードする遺伝子を、例えばウイルスベクターに組み込んで、該組換えウイルスベクターを有するウイルス（無毒化されたもの）を患者に感染させる。患者体内ではインスリン抵抗性改善因子が産生され、インスリン抵抗性が改善する機能を有するので、糖代謝異常や脂質代謝異常、例えば、２型糖尿病や高脂血症のの治療が可能となる。
【０２２０】
遺伝子治療剤を細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、あるいは非ウイルス性の遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））のいずれの方法も適用することができる。
【０２２１】
ウイルスベクターによる遺伝子導入方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ＴＲ４あるいは変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法が挙げられる。このうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルスを用いた方法が、特に好ましい。非ウイルス性の遺伝子導入方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【０２２２】
また遺伝子治療剤を実際に医薬として作用させるには、ＤＮＡを直接体内に導入するインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）法およびヒトからある種の細胞を取り出し体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）法がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，  １２  （１５）（１９９４））。
【０２２３】
例えば、該遺伝子治療剤がインビボ法により投与される場合は、疾患、症状等に応じ、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等、適当な投与経路により投与される。またインビボ法により投与する場合は、該遺伝子治療剤は一般的には注射剤等とされるが、必要に応じて慣用の担体を加えてもよい。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス−リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
【０２２４】
配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１−２９５０に示されるヌクレオチド配列または配列番号８のヌクレオチド番号１−３３５４に示されるヌクレオチド配列または部分配列に相補的なヌクレオチド配列は、いわゆるアンチセンス治療に用いることができる。アンチセンス分子は、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列または配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列の一部に相補的な、通常１５から３０ｍｅｒからなるＤＮＡ、もしくはそのホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはモルフォリノ誘導体などの安定なＤＮＡ誘導体、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡ誘導体として用いられ得る。そのようなアンチセンス分子を、微量注入、リポソームカプセル化により、あるいはアンチセンス配列を有するベクターを利用して発現させるなど、本発明の技術分野において周知の方法で、細胞に導入することができる。このようなアンチセンス療法は、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列または配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列がコードするタンパク質の活性が増加しすぎることによって引き起こされる病気の治療または予防に有用である。
【０２２５】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬として有用な組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造され得る。このような担体と製造方法の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）に記載されている。そして、配列番号４のヌクレオチド番号１から２９５０に示されるヌクレオチド配列または配列番号８のヌクレオチド番号１から３３５４に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現やその遺伝子産物の活性に異常の認められる患者の治療に十分な量を各人に投与される。その有効量は、各人の状態、体重、性別、および年齢などの種々の因子や、皮下、局所、経口、および筋肉内といった投与方法の違いによって変化し得る。例えば、静脈注射する場合には、０．０２から０．２ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間、また、皮下投与の場合には、１から２００ｍｇ／ｍ２／日のように変化し得る。
【０２２６】
８．本発明のポリペプチドを含有する医薬
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
２）配列表の配列番号５のアミノ酸番号２９から４５９に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
３）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
４）配列表の配列番号９のアミノ酸番号２７から４６８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるポリペプチド；
４）上記１）乃至２）に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド；
は医薬として用いることができ、糖代謝と関連する疾患、例えば、糖尿病、高脂血症等の糖代謝異常の治療剤として用いることができ、それ自体あるいは適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等により経口的に、又は、注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは、外用剤等により非経口的に投与することができる。
【０２２７】
これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤；及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウムのような陽イオン界面活性剤；及び、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【０２２８】
本発明の化合物を患者へ導入する方法については、上記に加えてコロイド分散系を用いることができる。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果が期待される。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば限定しないが、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系を挙げる事ができ、好ましくは、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果のある、複数のリポソーム、人工膜の小胞である（Ｍａｎｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８，６，６８２；Ｂｌｕｍｅ  ａｎｄ  Ｃｅｖｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，１９９４，２３，１１９；Ｃｈｏｎｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９５，６，６９８  ）。
０  ．２−０  ．４  μｍ  のサイズ範囲をとる単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化し得、化合物はこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８１，６，７７  ）。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質、とりわけ相転移温度の高いリン脂質を１種又はそれ以上のステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソーム生産に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を包含する。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでは脂質部分が１４−１８  の炭素原子、特に１６  −１８  の炭素原子を含有し、飽和している（１４  −１８  の炭素原子鎖の内部に二重結合を欠いている）。代表的なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを包含する。
【０２２９】
リポソームを包含するコロイド分散系の標的化は、受動的又は能動的のいずれかであってもよい。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含有する臓器の網内系細胞へ分布しようとするリポソーム本来の傾向を利用することによって達成される。一方、能動的な標的化は、例えば、ウイルスのタンパク質コート（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．），１９９３，９０，８４７４  ）、モノクローナル抗体（又はその適切な結合部分）、糖、糖脂質又はタンパク質（又はその適切なオリゴペプチドフラグメント）のような特定のリガンドをリポソームへ結合させること、又は天然に存在する局在部位以外の臓器及び細胞型への分布を達成するためにリポソームの組成を変えることによってリポソームを修飾する手法等を挙げる事ができる。標的化されたコロイド分散系の表面は様々なやり方で修飾され得る。リポソームで標的したデリバリーシステムでは、脂質二重層との緊密な会合において標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層へ脂質基が取込まれ得る。脂質鎖を標的リガンドと結びつけるために様々な連結基が使用され得る。本発明のオリゴヌクレオチドのデリバリーが所望される細胞の上に支配的に見出される特定の細胞表面分子に結合する標的リガンドは、例えば、（１  ）デリバリーが所望される細胞によって支配的に発現される特定の細胞受容体と結合している、ホルモン、成長因子又はその適切なオリゴペプチドフラグメント、又は（２  ）標的細胞上で支配的に見出される抗原性エピトープと特異的に結合する、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、又はその適切なフラグメント（例えば、Ｆａｂ  ；Ｆ  （ａｂ’）２  ）、であり得る。２種又はそれ以上の生物活性剤（例えば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドとその他の薬剤）は、単一のリポソーム内部で複合し、投与することもできる。内容物の細胞内安定性及び／又は標的化を高める薬剤をコロイド分散系へ追加することも可能である。
【０２３０】
その使用量は症状、年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１ｍｇ（好適には、３０ｍｇ）、上限２０００ｍｇ（好適には、１５００ｍｇ）を、注射の場合には、１回当り下限０．１ｍｇ（好適には、５ｍｇ）、上限１０００ｍｇ（好適には、５００ｍｇ）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。
【０２３１】
９．本発明のポリペプチドに対する抗体を含有する医薬
本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを過剰に発現させた糖尿病モデルマウスでは、血糖値、血中インスリン濃度の低下が認められることから、本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対する抗体は、糖代謝異常により血糖値及び血中インスリン濃度が正常値より低下している動物及び／またはヒトにおいて、血糖値及び／または血中インスリン濃度を上昇させ、低血糖症の治療薬となり得る。本発明のインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対する抗体をヒトに対する医薬として用いる場合、抗原性の問題からヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド抗体を作製することが望ましい。ヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド抗体の作製は、次に述べるような手法により得ることができる。即ち、▲１▼ヒト末梢血あるいは脾臓から採取したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−４存在下、抗原であるヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドで感作し、感作したヒトリンパ球をマウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１８２３）と細胞融合させることにより目的の抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする。得られた抗体産生ハイブリドーマが生産する抗体は、ヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体である。これらの抗体の中からヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの活性を中和する抗体を選別する。しかしながら、このようにヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作する方法では、一般的に抗原に対して高親和性の抗体を得るのは困難である。従って、ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに高親和性のモノクローナル抗体を得るには、上記のようにして得られた低親和性のヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体を抗親和化する必要がある。それには、上記のようにして得られ、中和抗体であるものの低親和性であるヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体のＣＤＲ領域（特にＣＤＲ−３）にランダム変異を導入し、これをファージで発現させてヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを固相化したプレートを用いてファージディスプレー法により、抗原であるヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに強力に結合するファージを選択し、そのファージを大腸菌で増やし、その塩基配列から高親和性を有するＣＤＲのアミノ酸配列を決定すればよい。このようにして得られたヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体をコードする遺伝子を一般的に使用されている哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込んで、発現させることによりヒト型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体が得られる。これらの中から、ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生物活性を中和し、かつ高親和性である目的のヒト型抗インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体を選別することができる。また、▲２▼Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、本発明と同じように常法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ｐ．４９５−４９７，  １９７５）によりマウス型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体を作製し、ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生物活性を中和し、かつ高親和性を有するモノクローナル抗体を選択する。この高親和性マウス型抗ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体のＣＤＲ−領域（ＣＤＲ−１、２および３）をヒトＩｇＧのＣＤＲ領域に移植するＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ：  Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，  ｐ２９３−２９９，  １９９１）の手法を駆使することによりヒト型化が可能である。上記に加え、さらに▲３▼ヒト抹消血リンパ球をＳｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに移植し、この移植されたＳＣＩＤマウスはヒト型抗体を生産する（Ｍｏｓｉｅｒ  Ｄ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  ｐ２５６−２５９，  １９８８；  Ｄｕｃｈｏｓａｌ  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．：  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５，  ｐ２５８−２６２，  １９９２）ので、抗原としてヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを抗原として感作し、スクリーニングすることにより、ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに特異的なヒト型モノクローナル抗体を生産するリンパ球をそのマウスから採取することができる。得られたリンパ球を前述のヒト型抗体の作製法▲１▼と同様に、マウスとヒトとのヘテロハイブリドーマであるＫ６Ｈ６／Ｂ５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１８２３）と細胞融合させ、得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。このようにして得られたハイブリドーマを培養することにより、目的のヒト型モノクローナル抗体を大量に製造でき、該タンパク質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。また、目的のヒト型モノクローナル抗体をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）をクローニングし、この遺伝子を遺伝子工学的手法により適当なベクターに組み込み、各種動物細胞、混注細胞、あるいは大腸菌などを宿主として発現させることにより、遺伝子組換えヒト型モノクローナル抗体を大量に製造することができる。得られた培養液から上述と同様の方法により精製することにより、精製されたヒト型モノクローナル抗体を大量に得ることができる。更に、上述の方法で得られた抗インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドモノクローナル抗体の中から、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生物活性を中和する抗体は、生体内でのインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生物活性、即ち、血糖値を低下する作用を阻害することから、医薬として、特に糖代謝異常および／または脂質代謝異常の治療剤として期待される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド抗体の低血糖及び／または低インスリン症状に対する治療及び／または予防効果は、例えば、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを過剰に発現しているトランスジェニック動物に同インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド抗体を投与し、血糖値の変化を測定することで確認することができる。
【０２３２】
このようにして得られたインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドの生物活性を中和する抗体は、医薬として特に血糖値及び／または血中インスリン濃度が低い症状の治療及び／または予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。本発明の抗体は製剤化して経口的あるいは非経口的に投与することができる。本発明抗体を含む製剤は、インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドを認識する抗体を有効成分として含有する医薬組成物として、ヒトあるいは動物に対し安全に投与されるものである。医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などが挙げられる。モノクローナル抗体は高分子蛋白質であることから、バイアル瓶などのガラス容器や注射筒などへの吸着が著しい上に不安定であり、種々の物理化学的因子、例えば、熱、ｐＨ及び湿度とうにより容易に失活する。従って、安定な形で製剤化するために、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤などを添加する。安定化剤としてはグリシン、アラニン等のアミノ酸類、デキストラン４０及びマンノース等の糖類、ソルビトール、マンニトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられ、またこれらの二種以上を併用してもよい。これらの安定化剤の添加量は、抗体の重量にたいして０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。これら安定化剤を加えることにより、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の保存安定性を向上することができる。緩衝剤としては、例えばリン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。緩衝剤は、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水溶液のｐＨを調製し、抗体の安定性、溶解性に寄与する。緩衝剤の添加量としては、例えば液状製剤あるいは凍結乾燥製剤を採用解した後の水量に対し、１〜１０ｍＭとするのが好ましい。界面活性剤としては、好ましくはポリソルベート２０、プルロニックＦ−６８、ポリエチレングリコール等、特に好ましくはポリソルベート８０が挙げられ、またこれらの２種以上を併用してもよい。抗体のような高分子蛋白質は容器の材質であるガラスや樹脂などに吸着しやすい。従って、界面活性剤を添加することによって、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の抗体の、容器への吸着を防止することができる。界面活性剤の添加量としては、液状製剤あるいは凍結乾燥製剤の再溶解後の水重量に対して０．００１〜１．０％添加することが好ましい。以上のような安定化剤、緩衝剤、あるいは吸着防止剤を加えて本発明抗体の製剤を調製することができるが、特に医療用または動物用注射剤として用いる場合は、浸透圧として許容される浸透圧比は１〜２が好ましい。浸透圧比は、製剤化に際して塩化ナトリウムの増減により調製することができる。製剤中の抗体含量は、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜調整することができ、ヒトに対するヒト型抗体の投与量は、抗体のヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対する親和性、即ち、ヒトインスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチドに対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なく薬効を発揮することができる。ヒト型抗インスリン抵抗性改善剤感受性ポリペプチド抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜３０日間に１回投与すればよい。
【０２３３】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、下記実施例において、遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【０２３４】
実施例１．ＫＫマウスへの薬剤投与および血液生化学値測定
１）ＫＫマウスの準備
通常の食餌（Ｆ２：船橋農場製）で飼育した１８週齢の雄性ＫＫマウス（高脂血症マウス：日本クレアより購入）の体重を測定し、次いで尾静脈から採血し、遠心分離により血漿を分離し、血糖値を測定した。血糖値が３．５ｇ／Ｌ以上の個体を選抜し、体重および血糖値が群毎にほぼ等しくなるように３匹ずつ群分けし、実験に供した（表１）。本実験に用いた化合物Ａ（５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオンの塩酸塩）は粉末の餌（Ｆ２：船橋農場製）に０．００３％（薬剤重量／餌重量）の濃度で添加することによって食餌と一緒に投与した（混餌投与）。なお、コントロール群では化合物Ａを添加しない食餌を与えた。
【０２３５】
【表１】
2004180669.tif 000002
２）薬剤投与及び皮下白色脂肪組織の採取
群分けの日を０日とし、化合物Ａの投与を開始した。化合物Ａの投与開始日を０日とし、１日後、３日後、８日後の午前中に体重を測定し、尾静脈よりヘパリン処理済みヘマトクリット管２本分およびＥＤＴＡ処理したヘマトクリット管１本分を採血し、遠心により血漿を分離し、血漿中の血糖値、インスリン濃度、トリグリセライド濃度および遊離脂肪酸濃度を測定した。血糖値はグルコローダーＧＸＴ（Ａ＆Ｔ社製）、インスリン濃度はＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＲＩＡ  キット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．  （米国）製）、トリグリセライド濃度はトリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬社製）そして遊離脂肪酸濃度はＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定を行なった。同じ日の午後に断頭によってと殺し、皮下白色脂肪組織（ｓｕｂｃｕｔａｎｉｏｕｓ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ）を採取し、液体窒素により凍結した。なお、採血日の前日から当日にかけて体重と摂餌量を測定し、各個体における薬物投与量を計算した。化合物Ａを投与しなかった群についても同様に行なった（表２）。
【０２３６】
表中、“ｐｒｅ”で示す値は、群分けの日（０日）における血漿中の血糖値、インスリン濃度およびトリグリセライド濃度を表し、“Ｄａｙ１”、“Ｄａｙ３”、“Ｄａｙ８”で示す値は、それぞれ実験開始から１日、３日、８日後の血漿中の血糖値、インスリン濃度、トリグリセライド濃度および遊離脂肪酸濃度を表す。
【０２３７】
表２に示すように、化合物Ａ非投与群では、実験開始１日後、３日後、８日後を通じて血漿中の血糖値、インスリン濃度、トリグリセライド濃度および遊離脂肪酸濃度の変動はほとんど無く、いずれも高値を示していた。これに対し化合物Ａ投与群では、血糖値および血漿中トリグリセライド濃度は非投与群と比較して投与１日後では有意な差は認められなかったが、投与３日後、８日後ではいずれも有意に低下していた。また血漿中インスリン濃度および遊離脂肪酸濃度は、非投与群と比較して投与１日後から低下傾向が認められ、投与３日後、８日後ではいずれも非投与群と比較して有意に低下していた。
【０２３８】
【表２】
2004180669.tif 000003
【０２３９】
実施例２．マウス脂肪組織からの全ＲＮＡの抽出
ＫＫマウスの皮下白色脂肪組織から全ＲＮＡの抽出を行った。実施例１で得た皮下白色脂肪組織を、速やかに液体窒素内に入れ急速冷凍した後、使用時まで−８０℃に保存した。皮下白色脂肪組織０．２ｇに対し約２ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン：キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛６で１分間）。ホモジナイズした皮下白色脂肪組織を１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した後、水層を新たなチューブに移し、０．２容量のクロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。室温で３分間静置してから、１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。遠心後、上層を回収し、０．８容量のリボヌクレアーゼ含まないイソプロピルアルコールを加えて混和した。室温で１０分間静置後、１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼを含まない７０％エタノールを加え、１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を除去して、沈殿を乾燥させることにより、全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡ試料は、使用時まで−８０℃に保存した。
【０２４０】
実施例３．遺伝子チップ解析
遺伝子チップ解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）に従って、以下に記載した方法により行った。
【０２４１】
ａ）ｃＤＮＡの合成
上記実施例２記載の方法で得られた全ＲＮＡ各５μｇから、ｍＲＮＡ精製キット（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ＭＡＧ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ、タカラバイオ社製）を用いて添付のプロトコールに従ってｍＲＮＡを精製した。ｍＲＮＡの出発材料として、上記アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアルの記載に従ってｃＤＮＡの合成および精製を行った（ファーストストランド合成の反応条件は、４２℃、１時間とした）。
【０２４２】
ｂ）ｃＲＮＡの合成
ａ）で得られたｃＤＮＡを鋳型として、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアルの記載に従ってｃＲＮＡの合成を行った（反応条件は３７℃、４．５時間とした）。合成されたｃＲＮＡは各群▲１▼〜▲６▼ごと（３匹分）に等量ずつ混合した。この操作で得られた１０μｇのｃＲＮＡを４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ８．１）、１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  酢酸マグネシウム存在下９４℃で３５分間断片化し、プローブ溶液に加えた。
【０２４３】
ｃ）プローブ溶液の作製
プローブ溶液に加える各種コントロールｃＲＮＡ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ）はアマシャム・ファルマシア社から購入した。
【０２４４】
ｄ）ハイブリダイゼーション
上記のようにして得られたプローブとハイブリダイズさせる遺伝子チップとして、アフィメトリクス社製マウスゲノムＵ７４セット（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ７４  ｖｅｒ．２  Ｓｅｔ：ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２、ＭＧ−Ｕ７４Ｂｖ２、ＭＧ−Ｕ７４Ｃｖ２）を用いた。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄操作は上記マニュアル記載に従って行った（ハイブリダイゼーション条件は、４５℃、１６−２０時間とした。）。
【０２４５】
ｅ）解析
上記ｄ）でハイブリダイゼーション操作を行った遺伝子チップのデータ解析は、上記マニュアルの記載に従って、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  ５．０  （アフィメトリックス社）にて行った。化合物Ａ非投与マウスのデータを基準にして、化合物Ａ投与マウスより得られたデータと比較検討した。その結果、ＭＧ−Ｕ７４Ｂｖ２遺伝子チップにおいて下記の表３に示すように、１０７９４８＿ａｔというＥＳＴのＳｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ値が、化合物Ａ投与マウスでは化合物Ａ非投与マウスと比較して投与後１日、３日、８日のいずれにおいても上昇していた。また、Ｃｈａｎｇｅも投与後１日、３日、８日のいずれにおいてもＩ  （Ｉｎｃｒｅａｓｅ）を示していた。ここで示す“Ｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ”値は化合物Ａ非投与マウスを基準とした化合物Ａ投与マウスの相対的発現量を２を底とするＬｏｇで表し、例えばある遺伝子のＳｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ値が３のとき、その遺伝子は化合物Ａ投与マウスにおいて化合物Ａ非投与マウスの２の３乗、つまり８倍多く発現していることを示す。また“Ｃｈａｎｇｅ”は、化合物Ａ非投与マウスと比較して、化合物Ａ投与マウスにおける発現量が有意に変動しているかどうかを表しており、例えばある遺伝子のＣｈａｎｇｅがＩ（Ｉｎｃｒｅａｓｅ）のとき、その遺伝子は化合物Ａ投与マウスにおいて化合物Ａ非投与マウスより有意に発現が亢進していることを示す。表３では、投与後１日、３日、８日後のｓｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏ値及びＣｈａｎｇｅを示す。
【０２４６】
１０７９４８＿ａｔのヌクレオチド配列は配列表の配列番号１のヌクレオチド番号１から５２７に示す。
【０２４７】
【表３】
2004180669.tif 000004
実施例４．  ５’ＲＡＣＥによるｃＤＮＡ配列の決定
ａ）５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応
実施例３のａ）で得られたｃＤＮＡを用いて、ＭＧ−Ｕ７４Ｂの１０７９４８＿ａｔというＥＳＴの５’ｃＤＮＡ配列を決定するため、以下のヌクレオチド配列：
５’−  ｔｇｔｔｃｔｔｇｇｇ  ｃｃｔｔｃａｇｃａｔ  ｔｃｔｔｃｃｔｃ  −３’（Ｒ１０Ｌ２５５：配列表の配列番号２）
５’−ｃｔａｇｔｇａｇｔｇ  ａｇｇｃｃｃａｇｇｃ  ａｃｃａｔｇａａ  −３’（Ｒ１０Ｌ４１９：配列表の配列番号３）
からなるオリゴヌクレオチドを合成し、５’ＲＡＣＥを行なった。
【０２４８】
５’ＲＡＣＥは、クロンテック社のＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用い、添付のマニュアルに従って行った。
【０２４９】
ＰＣＲ反応は、まず９４℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で５秒、７２℃で３分の温度サイクルを５回繰り返し、次に９４℃で５秒、７０℃で１０秒、７２℃で３分の温度サイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温してから、４℃に保存した。反応には、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を使用した。反応物は１．２％のアガロースゲルで電気泳動して、特異的断片の増幅を解析した。特異的断片の増幅が確認された反応物は、再度１．２％のアガロースゲルで電気泳動し、電気泳動後のゲルをＳＹＢＲＧｏｌｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色した後、紫外線照射下で特異的断片部分のゲル片を剃刀刃で切り出した。アガロースゲルより切り出した断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。
【０２５０】
ｂ）ＴＡクローニング
上記ａ）により増幅・精製された特異的断片を含む溶液３０μｌ中４μｌをとり、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（インビトロジェン社製）をその添付プロトコールに従って用い、増幅されたＤＮＡ断片をプラスミドベクターにクローニングした。この組換えプラスミドベクターで大腸菌を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、１．２ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＴＢＧ培地で３７℃で一晩培養し、Ｂｉｏ  Ｒｏｂｏｔ  ９６００  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることによりプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．０（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製）をその添付プロトコールに従って用いることによりシーケンス反応を行った。反応にはＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（アプライド・バイオシステムズ社製）を使用した。シーケンス反応物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）によりヌクレオチド配列解析を行い、１０７９４８＿ａｔの５’側上流のヌクレオチド配列を決定した（配列表の配列番号４）。ｃＤＮＡは、２９５０塩基から成り、メチオニンで始まる４５９個のアミノ酸から成るオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を持つことが明らかとなった。また、ＯＲＦにコードされているアミノ酸配列について、ＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸データベース、ＴｒＥＭＢＬ、およびＧｅｎｅＳｅｑプロテインデータベースを検索したところ、新規なポリペプチドをコードすることが明らかとなった。
【０２５１】
また、ＯＲＦに相当するヌクレオチド配列について、ＧｅｎＢａｎｋのマウスｄｒａｆｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベースを検索したところ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１  ｃｌｏｎｅ  ＲＰ２３−１７９Ｃ３  マップ  １１（登録番号ＡＣ０２２７８０．１７）内の２箇所（１３８６６−１３００９、１０７４９−１０２２４）に分かれて、ＯＲＦに相当するヌクレオチド配列の全長と一致する配列が存在した。
【０２５２】
実施例５．  マウスｃＤＮＡのクローニング
「実施例２．マウス脂肪組織からの全ＲＮＡの抽出」の項に記載の方法で得られた全ＲＮＡを出発材料として、下記の方法に従って「実施例４．  ５’  ＲＡＣＥによるｃＤＮＡ配列の決定」の項で同定された、配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡを取得した。
【０２５３】
ａ）  ファーストストランドｃＤＮＡ合成
ファーストストランドｃＤＮＡは、先に示したようにして調製した全ＲＮＡ６μｇを基にして、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社）をその添付プロトコールに従って用いることにより合成した。反応は４０μｌの容量で行なった。反応後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  １００  Ｃｏｌｕｍｎｓ（クロンテック社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。
【０２５４】
ｂ）  ＰＣＲ反応
以下のヌクレオチド配列：
５’−ｇｇａｃｔｇｔｃｃｔｇｃｃａｇｇｃｃａｔ−３’（Ｒ１０Ｆ：配列表の配列番号６）、
５’−ｇｃｃｔｃａｃｃｔｇｇｔｇｔａｔｇａａｃｇｃｔ−３’（Ｒ１０Ｂ２：配列表の配列番号７）を有するオリゴヌクレオチドを合成した。ヌクレオチド配列は、実施例３で得られたヌクレオチド配列の結果をもとにして決定した。
【０２５５】
ＰＣＲ反応はＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従って用いることにより行った。具体的に以下に示す。得られたファーストストランドｃＤＮＡ  １μｌに、上記の合成プライマーＲ１０Ｆと合成プライマーＲ１０Ｂ２それぞれ０．３μＭ、１０Ｘ  Ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＡＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＧＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＣＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＴＴＰ  ０．３ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １ｍＭ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕｎｉｔｓ（全てキットに添付）を添加し、５０μｌのＰＣＲ溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，  ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（エムジェイジャパン（株）社製）により行った。まず９４℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の温度サイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温してから、４℃に保存した。目的ｃＤＮＡは、反応物を１％のアガロースゲルで電気泳動し、目的ｃＤＮＡ（１４０２ｂｐ）の増幅を確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。目的ｃＤＮＡの濃度は、吸光光度計（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃ  Ｉ：日立計測器サービス（株））により測定した。
【０２５６】
ｃ）  ＴＡクローニング
ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより増幅したｃＤＮＡ断片は平滑末端であるので、ＴＡクローニングするために、上記ｂ）にて精製したｃＤＮＡの３’末端にｄＡＴＰの付加を行なった。精製したｃＤＮＡ  １８０ｎｇに、１０Ｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μｌ、ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕｎｉｔｓ（全てインビトロジェン社製、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付）、ｄＡＴＰ  ０．２Ｍを添加し、１０μｌの反応液を作製した。反応液をＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，  ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（エムジェイジャパン（株）社製）にて、７０℃で３０分反応させた後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  １００  Ｃｏｌｕｍｎｓ（クロンテック社製）を添付のプロトコールに従って用いることによりｃＤＮＡを精製した。精製したｃＤＮＡを、ｐＴＡＲＧＥＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）をその添付プロトコールに従って用いて、ｐＴＡＲＧＥＴ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）にクローニングした。この組換えプラスミドベクターで大腸菌（ＪＭ１０９：タカラバイオ（株）社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、常法に準じてプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）によりヌクレオチド配列解析を行ない、上記実施例４で同定された配列表の配列番号４に示されるヌクレオチド配列のＯＲＦを有するｃＤＮＡがｐＴＡＲＧＥＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒに組み込まれていることを確認した。このプラスミドをｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０と命名した。ｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年（２００２年）４月５日付で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８００５で国際寄託されている。
【０２５７】
実施例６．  ヒトホモログの探索
配列表の配列番号５に示されるマウスポリペプチドに対応するヒトｃＤＮＡを取得するため、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列について、ＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸データベース、ＴｒＥＭＢＬ、およびＧｅｎｅＳｅｑプロテインデータベースを検索したところ、ＧｅｎＢａｎｋアミノ酸データベース上のｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  Ｕｎｋｎｏｗｎ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ＩＭＡＧＥ：４５３７１２４）（アクセッション番号：ＸＰ＿０５７６７４、バージョン：ＸＰ＿０５７６７４．２）と８６％のホモロジーを有していることがわかった（図１）。ヒトホモログのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列表の配列番号８に示されており、また、アミノ酸配列は配列表の配列番号９に示されている。
【０２５８】
実施例７．  ｄｂ／ｄｂマウスへのｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ投与時の遺伝子チップ解析
ａ）  ｄｂ／ｄｂマウスへの薬剤投与および血液生化学値測定
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／Ｋｓｊ−ｄｂ／ｄｂ  Ｊｃｌマウス（以下、「ｄｂ／ｄｂマウス」とする。）およびＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍ  Ｊｃｌマウス（以下、「ｄｂ／＋ｍマウス」とする。）（日本クレア社より購入）を、温度２３±３℃、湿度５５±１５％に設定された動物室に搬入し、マウス用ブラケットケージ（有限会社新東洋製作所製）に個体収容した。マウスには粉末飼料（Ｆ２：株式会社船橋農場）と水道水を自由に摂取させ、５日間環境に馴化させた後、トログリタゾン（三共製）の投与を開始した。トログリタゾンを１％の濃度で粉末飼料（Ｆ２：株式会社船橋農場）に添加し、３箇月間自由に摂取させた。なお、対照群にはトログリタゾン非添加の粉末飼料を与えた。
【０２５９】
なお、ｄｂ／ｄｂマウスは、投与前日に尿検査試験紙（マルティスティックス：バイエルメディカル株式会社）により尿糖を検査し、糖尿病を誘発（±〜３＋）していることを確認した。群分けは投与前日に実施し、ｄｂ／ｄｂマウスは、群間で体重値および尿糖グレードの平均が近似するよう振り分けた。また、ｄｂ／＋ｍマウスは、群間で体重値の平均が近似するよう振り分けた。各群５匹で実験を行った。以下に群構成を示す（表４）
【０２６０】
【表４】
2004180669.tif 000005
ｂ）血液化学的検査
３箇月間の投与後に、エーテル麻酔下で大静脈より採血した。採取した血液は、ヘパリンリチウム入りの血漿分離用サンプル管（マイクロテイナ：日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に注入した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）後、血漿を分取し、自動分析装置（ＴＢＡ−２００ＦＲ：東芝メディカル株式会社）で酵素法によりグルコース濃度を測定した（表５）。また、トリグリセライド濃度はトリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。
【０２６１】
表５に示すように、トログリタゾン非投与ｄｂ／ｄｂ群では、正常コントロールマウスであるｄｂ／＋ｍ群と比較して、血糖値および血漿中トリグリセライド濃度の著しい上昇がみられ明らかに高血糖、高脂血症を呈する。これに対し、トログリタゾン投与ｄｂ／ｄｂ群では、トログリタゾン非投与のｄｂ／ｄｂ群に認められた血糖値および血漿中トリグリセライド濃度の顕著な上昇が抑制され、ほぼｄｂ／＋ｍ群と同等の血糖値および血漿中トリグリセライド濃度を示した。
【０２６２】
【表５】
2004180669.tif 000006
【０２６３】
ｃ）マウス脂肪組織からの全ＲＮＡの抽出
上記ｂ）で採血したマウスより、精巣周囲の脂肪組織を採取し、液体窒素により速やかに凍結し、使用時まで−８０℃に保存した。各群５匹の脂肪組織を群ごとに一つにまとめ、臓器１ｇに対し約１０ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社製）を加え、超高速ホモジナイザー（ポリトロン、キネマティカ社製）を用いて氷上でホモジナイズを行った（目盛６で１分間）。１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、水層を新たなチューブに移し、０．２容量のクロロホルムを加え、１５秒間激しく転倒混和した。室温で３分間静置してから、１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心後、上層を回収し、０．８容量のリボヌクレアーゼを含有しないイソプロピルアルコールを加えて混和した。これを室温で１０分間静置後、１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上清を除去してリボヌクレアーゼを含まない７０％エタノールを加えた。これを１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿を乾燥させることにより、全ＲＮＡを得た。この全ＲＮＡ試料は、使用時まで−８０℃に保存した。
【０２６４】
ｄ）  遺伝子チップ解析
遺伝子チップ解析は、アフィメトリクス社の発現解析技術マニュアル（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ）に従って、以下に記載した方法により行った。
【０２６５】
１．ｃＤＮＡの合成
上記実施例ｂ）記載の方法で得られた各５μｇの全ＲＮＡを出発材料として、上記マニュアル記載に従ってｃＤＮＡの合成および精製を行った（ファーストストランド合成の反応条件は、４２℃、１時間とした）。
【０２６６】
２．ｃＲＮＡの合成
上記のようにして得られたｃＤＮＡを鋳型として、上記マニュアルの記載に従ってｃＲＮＡの合成を行った。得られたｃＲＮＡを各群ごとに１０μｇ断片化してプローブ溶液に加えた。
【０２６７】
３．プローブ溶液の作製
プローブ溶液に加える各種コントロールｃＲＮＡ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ）はアマシャム・ファルマシア社から購入した。
【０２６８】
４．ハイブリダイゼーション
上記のようにして得られたプローブとハイブリダイズさせる遺伝子チップとして、アフィメトリクス社製マウスゲノムＵ７４セット（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ７４  ｖｅｒ．２  Ｓｅｔ：ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２、ＭＧ−Ｕ７４Ｂｖ２、ＭＧ−Ｕ７４Ｃｖ２）を用いた。ハイブリダイゼーションとその後の洗浄操作は上記マニュアル記載に従って行った（ハイブリダイゼーション条件は、４５℃、１６−２０時間とした）。
【０２６９】
５．解析
上記４．でハイブリダイゼーション操作を行った遺伝子チップのデータ解析も、上記マニュアルの記載に従って、Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  ＭｉｃｒｏａｒｒａｙＳｕｉｔｅ  ４．０（アフィメトリックス社）にて行った。まず、ｄｂ／＋ｍマウスのデータを基準にして、ｄｂ／ｄｂマウスより得られたデータと比較検討したところ、ＭＧ−Ｕ７４Ｂ遺伝子チップの１０７９４８＿ａｔが示すヌクレオチド配列（配列表の配列番号１）のＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ値は−２．６であった。ここで示す「Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ」値はｄｂ／＋ｍマウスを基準としたｄｂ／ｄｂマウスの相対的発現量を表し、例えばＡ遺伝子およびＢ遺伝子のＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ値がそれぞれ−３および３のとき、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるＡ遺伝子およびＢ遺伝子の発現はそれぞれ、ｄｂ／＋ｍマウスの３分の１および３倍となっていることを示す。従って、ＭＧ−Ｕ７４Ｂ遺伝子チップの１０７９４８＿ａｔが示す配列は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいてｄｂ／＋ｍマウスの２．６分の１に発現が抑制されていた。次にトログリタゾン非投与ｄｂ／ｄｂマウスのデータを基準にして、トログリタゾン投与ｄｂ／ｄｂマウスより得られたデータと比較検討した。その結果、ＭＧ−Ｕ７４Ｂ遺伝子チップの１０７９４８＿ａｔが示す配列（配列表の配列番号１）のＦｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ値は３．５であった。従って、ＭＧ−Ｕ７４Ｂ遺伝子チップの１０７９４８＿ａｔが示す配列は、トログリタゾン投与ｄｂ／ｄｂマウスにおいてトログリタゾン非投与ｄｂ／ｄｂマウスの３．５倍発現が増加していた。
【０２７０】
実施例８．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法によるマウスポリペプチドの発現および精製
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ法によるマウスポリペプチドの発現は、ラピッド・トランスレーション・システム（Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＲＴＳ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて行った。発現プラスミド、ｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０より当該遺伝子のＯＲＦをコードするｃＤＮＡ配列を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ（いずれもタカラバイオ社製）による消化で切り出して末端をＴ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製）を用いて平滑化した。このＤＮＡ断片をＲＴＳ専用発現ベクター、ｐＩＶＥＸ−２．４ｃ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）のＳｍａＩサイトへ読み枠が一致するように組み込み、ＲＴＳ用発現ベクターとした。得られたプラスミドＤＮＡについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライド・バイオシステムズ社製）によりヌクレオチド配列解析を行ない、上記実施例４で同定された配列表の配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるＯＲＦを有するｃＤＮＡが、その５’上流側のベクター配列中に存在するポリヒスチジンタグ配列と同じ読み枠でｐＩＶＥＸ−２．４ｃに組み込まれていることを確認した。作製したプラスミドを用いて大腸菌、ＪＭ１０９（タカラバイオ製）を形質転換し、得られた形質転換体を大量培養した後、Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｕｒｅｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  システム（プロメガ社製）を用いてプラスミドを大量調製した。
【０２７１】
発現はＲＴＳ５００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  キット  （ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用い、添付のマニュアルに従って行った。反応槽中には、精製した上記プラスミドＤＮＡを１５μｇ、１ｍｇ／ｍｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅを１００μｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＧｒｏＥＳを５０μｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ＧｒｏＥＬを１０μｌ（以上、タカラバイオ製）、１００ｍＭ  還元型グルタチオンを２０μｌ、１００ｍＭ  酸化型グルタチオンを２μｌ（いずれもＳｉｇｍａ社製）加え、全量を１ｍｌとした。供給槽中には、１００ｍＭ  還元型グルタチオンを２００ｕｌ、１００ｍＭ  酸化型グルタチオンを２０μｌ（いずれもＳｉｇｍａ社製）加え、全量を１０ｍｌとした。反応は３０℃、付属のマグネット式スターラーの回転数１２０ｒｐｍの条件で２０時間行った。
【０２７２】
発現させたタンパク質はマウスポリペプチドに融合させたポリヒスチジンタグを利用し、Ｍａｇ−Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｈｉｓ−タグ（東洋紡製）を用いて精製した。反応槽より反応液を回収し、１２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心にて不溶物を除去し、回収された上清に４００ｕｌの磁性ビーズを加え、室温で３０分間振盪し、タンパク質を吸着させた。磁性ビーズを磁石を用いて回収し、３００ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、０．１％  ３−（（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ）−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  （ＣＨＡＰＳ）を含む溶出液５ｍｌで２回洗浄した。洗浄したビーズに２００ｍＭイミダゾール、０．１％  ＣＨＡＰＳを含む溶出液２ｍｌを加えて室温で１０分間振盪した後、磁石を用いてビーズを回収し、目的のポリペプチドを含む上清を得た。得られたポリペプチドはＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開した後、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いた染色により精製度を確認した。その後ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ  ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて５０００ｘｇ、  １．５時間の遠心操作で濃縮し、１ｍｇ／ｍｌ程度の目的とするマウスポリペプチド溶液を得た。
【０２７３】
実施例９．組換えアデノウイルスの作製
配列表の配列番号４のヌクレオチド番号７９から１４５５に示されるヌクレオチド配列からなるマウス由来のｃＤＮＡ（以下、「マウスＲ１０  ｃＤＮＡ」とする。）を強制発現させるための組換えアデノウイルスは、市販のキット（アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット、タカラバイオ社製）を用いて作製した。すなわち、上記実施例５で得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、クローニングしたプラスミドベクター、ｐＴＡＲＧＥＴのＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナル配列とともにマウスＲ１０  ｃＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマーとして下記のヌクレオチド配列
５’−ａｔｃｃｔｔｇｃｔａｇｃｃｔｃｇａｇａｃ−３’  （Ｒ１０ｇｒａｆｔＦ    ：配列表の配列番号１１）及び
５’−ｔｃｃｇｇａａｔｃｇａｔｃｃｔｔａｔｃｇ−３’  （ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ３’：配列表の配列番号１０）
を有するオリゴヌクレオチドを合成し、アデノウイルスベクターへのマウスＲ１０  ｃＤＮＡクローニング用プライマーとした。ＰＣＲ反応にはＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製）を添付のプロトコールに従って用い、反応条件は実施例５に準じた。ＰＣＲ反応によって得られた約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ社製）を用いてリン酸化したものを挿入ＤＮＡ断片として以下の操作に用いた。
【０２７４】
アデノウイルスベクターにおいて、ヒトエロンゲーションファクター１αプロモーターにより挿入ＤＮＡが発現されるように、キット付属のコスミドベクター、ｐＡｘＣｗのＳｗａＩサイトにヒトエロンゲーションファクター１αプロモーター配列を導入した。具体的には、ヒトエロンゲーションファクター１αプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を、ｐＥＦ４／Ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（インビトロジェン社製）を鋳型とし、ＰＣＲ増幅用プライマーとして以下の配列、
５’−ｃｔａｇｇｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｔｇｃ−３’  （ＥＦ１ａ５’：配列表の配列番号１２）
及び
５’−ｇｃｃａｔｔｔａａａｔｃｃｔｃａｃｇａｃａｃｃｔｇａａａｔｇｇａａｇ−３’  （ＥＦ１ａ３’Ｓｗａ：配列表の配列番号１３）
を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これらプライマー及びＰＬＡＴＩＮＵＭＰｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、プライマー配列により導入されたＳｗａＩサイトを含む目的のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ製）を用いてコスミドベクターｐＡｘＣｗのＳｗａＩサイトに導入し、コスミドベクターｐＡｘＥＦを作成した。ｐＡｘＥＦの制限酵素ＳｗａＩ認識部位（プライマー配列由来）に上記プライマー（Ｒ１０ｇｒａｆｔＦとＳＶ４０ｐｏｌｙＡ３’）を用いてＰＣＲ反応により増幅したマウスＲ１０ｃＤＮＡのＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．１（タカラバイオ製）を用いて挿入し、コスミドｐＡｘＥＦ−Ｒ１０を作製した。ｐＡｘＣＡ−Ｒ１０  ＤＮＡ若しくは対照用として発現遺伝子を導入していないｐＡｘＥＦ  ＤＮＡおよび末端タンパク質結合ウイルスＤＮＡ（ＤＮＡ−ＴＰＣ、アデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キットに添付）をリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（アマシャム・ファルマシア社製）を用いて、ヒト胎児腎臓由来２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ１５７３）にコ・トランスフェクションして組換えアデノウイルスを単離し、さらに２９３細胞中で増幅させた。増幅させたウイルスの２９３細胞からの回収は、まずウイルス感染２９３細胞に３０秒×４回の超音波処理（ブランソン社製Ｂ−１２００を使用）を行い、次いで４Ｍ塩化セシウム／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌを下層、２．２Ｍ塩化セシウム／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）５ｍｌを上層とした溶液をクッションとし、細胞破砕液２０ｍｌを重層し、スイング式ローターＳＷ２８（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）社製）を用いて密度勾配遠心分離を２５，０００ｒｐｍ、４℃、２時間の条件で行い、塩化セシウム溶液の２層の中間に現れるウイルス由来のバンドを回収した。この粗精製ウイルス液に等量の飽和塩化セシウム溶液を加え、この混合液を最下層として４Ｍ塩化セシウム／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍｌ、２．２Ｍ塩化セシウム／１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）４ｍｌの順に重層し、スイング式ローターＳＷ４１Ｔｉ（ベックマン社製）を用いて密度勾配遠心分離を３５，０００ｒｐｍ、４℃、３時間の条件で行い、４Ｍ−２．２Ｍ塩化セシウム溶液の中間に現れるウイルス由来のバンドを回収した。得られたウイルス液を、１０％グリセロールを添加したＰＢＳに対して４℃で２回透析した後、使用するまで−７０℃以下で凍結保存した。本実験で得られたマウスＲ−１０  ｃＤＮＡを保持する組換えアデノウイルスをＡｄ−Ｒ１０と命名した。また、マウスＲ−１０ｃＤＮＡを保持しないコントロールのアデノウイルスをＡｄ／ｅｍｐｔｙと命名した。
【０２７５】
実施例１０．組換えアデノウイルスを用いたイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での発現
上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒ１０またはＡｄ／ｅｍｐｔｙを、５×１０８ｐｆｕ／ｂｏｄｙとなるように生理食塩水で希釈し、それぞれ４匹の２０週齢の雄ＫＫ／Ｔａマウス（日本クレア社より購入）に２００μｌずつ尾静脈注射により接種した。接種３、７、１４、２１日後に各マウスの尾静脈よりへパリン処理ヘマトクリット管で採血して、卓上遠心機で５２００ｒｐｍで１５分、２回遠心して血漿を分離し、グルコース測定用キット（グルコースＣＩＩ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて血糖値を、インスリン測定キット（森永生化学研究所製）を用いて血中インスリン値を、トランスアミナーゼ測定用キット（トランスアミナーゼＣＩＩ−テストワコー、和光純薬社製）を用いて血中ＡＬＴ値（アラニン・アミノ・トランスフェラーゼ値）をそれぞれ測定した。その結果、Ａｄ／ｅｍｐｔｙ接種マウス群では血中の各測定値にコントロールと比較して有意な差が認められなかったのに対し、Ａｄ／Ｒ１０接種マウス群には血糖値、血中インスリン値に低下傾向が認められた。その際、体重変化は群間に大きな差を認めず、肝機能障害の指標となる血中ＡＬＴ値は全く上昇を示さなかったことから、マウスＲ１０  ｃＤＮＡ発現によるＫＫ／Ｔａマウスの血糖値、血中インスリン値の低下は毒性によるものではない事が明らかとなり、Ｒ１０ポリペプチドは血中グルコース濃度低下作用及び血中インスリン濃度低下作用を有することが明らかとなった。（図２）。
【０２７６】
実施例１１．  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるｍＲＮＡ発現量の定量
「実施例２．マウス脂肪組織からの全ＲＮＡの抽出」の項に記載の方法で得られた全ＲＮＡを出発材料として、配列表の配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ（以後Ｒ１０  ｍＲＮＡという）の発現量の変化を、下記の方法に従ってＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて解析した。
【０２７７】
ファーストストランドｃＤＮＡは、先に示したようにして調製した全ＲＮＡ  ５μｇをもとにして、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アマシャム・ファルマシア社）をその添付プロトコールに従って用いることにより合成した。反応は４０μｌの容量で行なった。反応後、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ  １００  Ｃｏｌｕｍｎｓ（クロンテック社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。各精製溶液を２０μｌずつに分け、一方はそのまま全てのサンプルを混合し検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液の原液とし、もう一方は各サンプルに純水１８０μｌを加えて５倍希釈を行い発現定量用サンプルとした。
【０２７８】
Ｒ１０  ｍＲＮＡ発現定量用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲの反応に用いるプライマーとして、以下の配列：
５’−ａｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｃｔｔｃａｇ−３’  （配列表の配列番号１４）
及び、
５’−ａａｃｔｃｔｔｇｇｔｇｔｇａｃａｇａａｃａｇｇ−３’（配列表の配列番号１５）
を有するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏＥｘｐｒｅｓｓ，  アマシャム・ファルマシア社製）を、プローブとして、配列：
５’−ａｇｔｇｇｃｔｃｃｃｔｇｃｇａｇａｇｔｔｔｇａｇｇ−３’（配列表の配列番号１６）
を有し、その５’末端にレポーター色素Ｆａｍ，  ３’末端にレポーター消光体のＴＡＭＲＡを結合したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ，  アプライドバイオシステムズジャパン社製）を合成した。また発現量の補正のためにマウスβ−アクチンの定量を行うこととし、同様にプライマーとして、配列：
５’−ｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇａｃｔｃａｇｇａｔｔｔ−３’（配列表の配列番号１７）
及び、
５’−ｇｇａｔｇｔｔｔｇｃｔｃｃａａｃｃａａｃｔ−３’（配列表の配列番号１８）
を有するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏＥｘｐｒｅｓｓ，  アマシャム・ファルマシア社製）を、プローブとして、配列：
５’−ａａａａｃｔｇｇａａｃｇｇｔｇａａｇｇｃｇａｃａｇ−３’（配列表の配列番号１９）
を有し、その５’末端にレポーター色素Ｆａｍ，  ３’末端にレポーター消光体のＴＡＭＲＡを結合したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅ，  アプライドバイオシステムズジャパン社製）を合成した。
【０２７９】
これら調製した試料を用いてＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法によるＲ１０  ｍＲＮＡ発現量の定量を行った。ＰＣＲ反応はＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  （アプライドバイオシステムズジャパン社製）上で行った。反応溶液の組成は１ウェル中、調製したＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ用ファーストストランドｃＤＮＡ溶液５μｌ，  ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プライマー（５０ｐｍｏｌ／μｌ）を正方向側、逆方向側ともに０．１μｌ（最終濃度１００ｎＭ），ＴａｑＭａｎＰＣＲ用プローブ  （７．８μＭ）  １．５μｌ  （最終濃度２３４ｎＭ），  ＰＣＲ増幅用混合液（ＴａｑＭａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ  ：  アプライドバイオシステムズジャパン社製）２５μｌ、超純水１８．３μｌとした。この際、検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液は原液濃度を便宜的に６２５とし、以降５倍希釈を繰り返して濃度６２５，１２５，２５，５，１の５段階の希釈系列を作製した。ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ＡＢＩ  ７７００  ：  アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いて行った。反応は、５０℃で２分間、９５℃で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の反応を４０回繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。各サイクル毎のレポーター色素の発光量からβ−アクチンおよびＲ１０の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ｃＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸にサイクル数をとった検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期において任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。Ｒ１０  ｍＲＮＡの発現量は同一サンプルにおけるβ−アクチンの発現量の値で補正を行った。
【０２８０】
その結果、化合物Ａを混餌投与されたＫＫマウスの脂肪組織では、コントロール群と比較し投与後１日目よりＲ１０  ｍＲＮＡ発現量が亢進し、その傾向は投与後７日目まで継続した（図３）。ＫＫマウスの血糖値は化合物Ａ投与後１日目ではコントロール群と比較して差は無く、３日目より有意な低下が確認されることから、Ｒ１０  ｍＲＮＡ発現はＫＫマウスの糖尿病改善に先行する形で誘導されていることが示された。
【０２８１】
実施例１２．  ヒトホモログｃＤＮＡのクローニング
ヒト脂肪組織の全ＲＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を出発材料として、下記の方法に従って「実施例６．  ヒトホモログの探索」の項で同定された、配列表の配列番号８に示されるヌクレオチド配列のＯＲＦ（配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列）を有するｃＤＮＡを取得した。
ａ）  ファーストストランドｃＤＮＡ合成
ファーストストランドｃＤＮＡは、ＳＵＰＥＲ  ＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＲＮａｓｅＨ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社）を添付のプロトコールに従って用いることにより合成した。すなわち、先に示した全ＲＮＡ１．２５μｇをもとにしてプライマ−ｐ（ｄＴ）１５  ｃＤＮＡ合成用（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社製）１μｇを、ＤＮａｓｅ  ａｎｄ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ社製）に溶解し１５μｌとして７０℃で１０分インキュベートする。その後氷上に移して急冷し、５分間静置した後に５ｘ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｕｆｆｅｒ（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩに添付）  ５μｌ、１００ｍＭ  ＤＴＴ（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩに添付）  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ  （２５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  １μｌ、４０  ｕｎｉｔｓ／μｌ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）  ０．５μｌ、２００  ｕｎｉｔｓ／μｌ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  １μｌを加え２５μｌの反応溶液を作製した。４２℃で９０分、７０℃で１０分インキュベートした後、ＤＮａｓｅ  ａｎｄ  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを加え全量を５０μｌとし、これをｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ溶液とした。
【０２８２】
ｂ）  ＰＣＲ反応
以下のヌクレオチド配列：
５’−ｃｔｃｔｃｃａｇｃｔｔｃｇｃｃａｔｇｃｃ−３’（Ｈｕｍａｎ  Ｒ１０−１：配列表の配列番号２０）、
５’−ｃｔｃａｇｇｃｃａｇｇｔｃｔｃｔｃａｃｃｔｔ−３’（Ｈｕｍａｎ  Ｒ１０−２：配列表の配列番号２１）
を有する５’末端がリン酸化されているオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、実施例６で得られたヌクレオチド配列の結果をもとにして決定した。
【０２８３】
ＰＣＲ反応はＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより行った。具体的に以下に示す。得られたファーストストランドｃＤＮＡ  ０．５μｌに、１０Ｘ  Ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＡＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＧＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＣＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＴＴＰ  ０．３ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １ｍＭ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕｎｉｔｓ（全てキットに添付）および上記の合成プライマー２種類をそれぞれ０．３ｍＭになるように添加し、５０μｌのＰＣＲ溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，  ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（エムジェイジャパン（株）社製）により行った。まず９４℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、７０℃で３分の温度サイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温してから、４℃に保存した。目的ｃＤＮＡは、反応物を１％のアガロースゲルで電気泳動し目的ｃＤＮＡ（１４３６ｂｐ）の増幅を確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。目的ｃＤＮＡの濃度は、吸光光度計（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃ  Ｉ：日立計測器サービス（株））により測定した。
【０２８４】
ｃ）  クローニング
ベクターにはセルフライゲーションさせたｐＴＡＲＧＥＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより増幅し精製したｃＤＮＡ断片を、制限酵素Ｓｍａ  Ｉで消化し脱リン酸化したベクターＤＮＡ（ｐＴＡＲＧＥＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ）と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）をその添付プロトコールに従って用いることによりクローニングした。この組換えプラスミドベクターで大腸菌（ＪＭ１０９：宝酒造（株）社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、常法に準じてプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりヌクレオチド配列解析を行ない、上記実施例６で示された配列表の配列番号８に示されるヌクレオチド配列のＯＲＦを有するｃＤＮＡがｐＴＡＲＧＥＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒに組み込まれていることを確認した（以後、ｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０と呼ぶ）。
【０２８５】
実施例１３．  ヒトホモログポリペプチドの発現
ａ）ＦＬＡＧタグ付加型ヒトホモログｃＤＮＡのクローニング
Ｒ１０のヒトホモログの発現をタンパク質レベルで確認するために、検出用タグとしてＦＬＡＧタグをＲ１０のヒトホモログＯＲＦ（配列表の配列番号８のヌクレオチド番号５９から１４６２に示されるヌクレオチド配列）のＣ末端に付加したｃＤＮＡをクローニングした。クローニングは実施例１２で得られたヒトホモログＯＲＦ全長のうち、Ｃ末端からＮ末端に向かい約０．５ｋｂｐのところにあるＢｓｔ  ＸＩ部位からＣ末端側のベクター配列内にあるＫｐｎ  Ｉ部位を、ＰＣＲで増幅後Ｂｓｔ  ＸＩで消化したＦＬＡＧタグ付き断片と置き換えることにより行なった。詳細を以下に示す。
【０２８６】
ａ）ＦＬＡＧタグ付きＣ末端側断片の取得
以下のヌクレオチド配列：
５’−ｇｔｇｇｔａｇｇａｃｃｔｔｇｔｇｔｔｃｇ−３’（Ｈｕｍａｎ  Ｒ１０−３：配列表の配列番号２２）、
５’−ｔｃａｔｃａｃｔｔａｔｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃｔｔｇｔａａｔｃｃｃｔｔｇｔｇｔａｔｇａｔｃｇｃｔｔｃｃａｇｔｔａａａｇａｔ−３’（Ｈｕｍａｎ  Ｒ１０ＦＬＡＧ：配列表の配列番号２３）
を有するオリゴヌクレオチドを合成した。このうちＨｕｍａｎ  Ｒ１０ＦＬＡＧオリゴヌクレオチドは５’末端がリン酸化されているオリゴヌクレオチドである。
【０２８７】
ＰＣＲ反応はＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより行った。実施例１２で得られたｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０プラスミドＤＮＡ７５ｎｇに、１０Ｘ  Ｐｆｘ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＡＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＧＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＣＴＰ  ０．３ｍＭ、ｄＴＴＰ  ０．３ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １ｍＭ、ＰＬＡＴＩＮＵＭ  Ｐｆｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５Ｕｎｉｔｓ（全てキットに添付）および上記の合成プライマー２種類をそれぞれ０．３ｍＭになるように添加し、５０μｌのＰＣＲ溶液を作製した。ＰＣＲ反応は、Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，  ＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（エムジェイジャパン（株）社製）により行った。まず９４℃で５分加熱した後、引き続き９４℃で１５秒、５８℃で３０秒、７０℃で１分３０秒の温度サイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で７分間保温してから、４℃に保存した。反応物を１％のアガロースゲルで電気泳動することにより目的ｃＤＮＡが増幅されていることを確認後、目的ｃＤＮＡ（１０１７ｂｐ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。精製したｃＤＮＡをＢｓｔ  ＸＩにて消化した後、３％のアガロースゲルにて電気泳動し、目的ｃＤＮＡ（５３０ｂｐ）のみゲルより切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。目的ｃＤＮＡの濃度は、吸光光度計（Ｇｅｎｅ  Ｓｐｅｃ  Ｉ：日立計測器サービス（株））により測定した。
【０２８８】
ｂ）ベクターの調製およびライゲーション
実施例１２で得られたｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０プラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化後、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ社製）をその添付プロトコールに従い用いることにより消化部位を平滑化した。次に制限酵素ＢｓｔＸＩで部分消化を行い、０．６％アガロースゲルにて電気泳動後、目的とするｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０プラスミドＤＮＡからヒトホモログＯＲＦのＣ末端側約０．５ｋｂｐを欠失した断片（約６．６ｋｂｐ）のバンドのみ切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより精製した。
【０２８９】
精製したベクターｃＤＮＡを脱リン酸化処理後、上記「ａ」ＦＬＡＧタグ付きＣ末端側断片の取得」で得られた、ＰＣＲで増幅後ＢｓｔＸＩで消化したＦＬＡＧタグ付き断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）をその添付プロトコールに従って用いることによりヒトホモログＯＲＦのＣ末端にＦＬＡＧタグを付加したｃＤＮＡをクローニングした。この組換えプラスミドベクターで大腸菌（ＪＭ１０９：宝酒造（株）社製）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で培養した。その結果アンピシリン耐性を示して生育してきた大腸菌コロニーを選択して、２ｍｌの５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で３７℃で一晩培養し、常法に準じてプラスミドＤＮＡを回収した。得られたプラスミドＤＮＡについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりヌクレオチド配列解析を行ない、上記実施例６で示された配列表の配列番号８に示されるヌクレオチド配列のＯＲＦのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有するｃＤＮＡがｐＴＡＲＧＥＴ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒに組み込まれていることを確認した（以後、本プラスミドを「ｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０ＦＬＡＧ」と呼ぶ）。
【０２９０】
実施例１４．ＨＥＫ２９３細胞での発現およびウエスタンブロット解析
プラスミドＤＮＡのＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションはインビトロジェン（株）の遺伝子導入試薬“リポフェクトアミン２０００”を用いて行なった。ＨＥＫ２９３細胞は、コラーゲンコートされた９ｃｍシャーレにて１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ６ｍｌ中で培養した。まず精製したｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０ＦＬＡＧプラスミドＤＮＡ９．６μｇを溶解した０．６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＩＲｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン（株）社製）と、３６μｌのリポフェクトアミン２０００を溶解した０．６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍとを混合した。２０分後、セミコンフルエントになるまで増殖したＨＥＫ２９３細胞の入ったシャーレに、先に混合したプラスミド−リポフェクトアミン２０００混合液を添加し、そのまま３７℃、５％ＣＯ２下で２日間培養した。
【０２９１】
このようにして得られた細胞をＰＢＳ（−）緩衝液２ｍｌで洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ４０，０．５％  デオキシコレートナトリウム塩、０．１％  ＳＤＳ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））５００μｌを加えスクレイパーで溶解し回収した。この溶液を４℃で１０分間保持した後、遠心分離により上清のみ回収し、これを細胞溶解液とした。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、ニューページゲルシステム（インビトロジェン（株）社製）をその添付のプロトコールに従って用いることにより行った。
【０２９２】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからバンドをニューページトランスファーバッファー（インビトロジェン（株）社製）中でゲルメンブレン転写装置（トランスブロットＳＤ  セミドライゲルトランスファーセル、バイオラッド社製）を用いて６０分、２ｍＡ／ｃｍ２の条件でイミュン−ブロットＰＶＤＦメンブレン（バイオラッド社製）に転写した。
【０２９３】
転写後のＰＶＤＦメンブレンをタイトボックス（（株）池田理化社製）に入れ、５％  スキムミルク（雪印乳業（株）社製）を含む０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ５０ｍｌ中で４℃、一晩静置した。翌日メンブレンを取り出し、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ中で、１０分間×３回洗浄した。洗浄後、パラフィルム上でメンブレンを、ペルオキシダーゼ結合抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（１０００倍希釈）、１％  スキムミルクを含む０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ  ３ｍｌに浸し１時間反応させた。１時間後、メンブレンを取り出し０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ溶液で１０分間×３回洗浄した。洗浄後、メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出溶液（アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、抗ＦＬＡＧ抗体が結合するバンドの検出を行った（メンブレンをラップフィルム上に置き、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出溶液に５分間浸した後、Ｘ線フィルムを感光させた（２０秒間））。その結果、コントロールである緑色蛍光色素（ＧＦＰ）発現プラスミドｐＱＢＩ２５（タカラバイオ（株）社製）ＤＮＡを導入して得られたＨＥＫ２９３細胞溶解液では認められない約５０ＫＤａのバンド（ＦＬＡＧタグ付きＲ１０ヒトホモログの予想サイズは５２．７ＫＤａである）が、ｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０プラスミドＤＮＡを導入して得られたＨＥＫ２９３細胞溶解液にのみ検出された（図４）。以下、Ｒ１０ヒトホモログを「ＨｕＲ１０」という。
【０２９４】
実施例１５．３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を用いた脂肪分解作用を指標とした機能解析
ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞の培養および脂肪細胞への分化
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＬ−１７３）は、１０％  ＦＣＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製：以下すべてこのＦＣＳを使用）を含むＤＭＥＭ基本培地［ＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）、１ｘ  抗生物質−抗真菌剤（インビトロジェン社製）、３３μＭ  ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ（シグマ社製）、２００μＭ  アスコルビン酸（シグマ社製）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ］にて維持培養した。培養は維持・分化ともに３７℃、１０％ＣＯ２インキュベーターにて行なった。
【０２９５】
トリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン社製）にて細胞をフラスコより剥離し、１０％  ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ基本培地に懸濁後、０．４％  トリパンブルー染色液（インビトロジェン社製）にて生細胞数の計測を行い、２．５  ｘ  １０４細胞／ｍｌになるように調整した。コラーゲンタイプＩコートの２４穴プレート（スミロン社製）に１ウエル当たり１ｍｌ（２．５ｘ１０４細胞）ずつプレーティングし、１週間培養した。脂肪細胞への分化は、分化誘導培地［５％ＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌ  インスリン（ＳＩＧＭＡ社製）、５００ｎＭ  ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ：ＳＩＧＭＡ社製）、１μＭＤｅｘａｍｅｔｈａｚｏｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を含むＤＭＥＭ基本培地］にて２４時間ごとに２回培地交換し、その後インスリン培地［５％ＦＣＳ、１００ｎｇ／ｍｌ  インスリンを含むＤＭＥＭ基本培地］に交換し、６〜７日後に実験に使用した。
【０２９６】
ｂ）組換えアデノウイルスの作製
マウスＲ１０  ｃＤＮＡおよび緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ＧＦＰ  ｃＤＮＡ）を強制発現させるための組換えアデノウイルスは、上記実施例９「組換えアデノウイルスの作製」に記載した方法と同様にアデノウイルス・エクスプレッション・ベクター・キット（タカラバイオ社製）を用いて作製された。簡単に以下に記す。
【０２９７】
Ｒ１０  ｃＤＮＡ断片として、上記実施例５で得られたプラスミドＤＮＡ「ｐＴＡＲＧＥＴ−Ｒ１０」を制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩにて消化したものを、またＧＦＰ  ｃＤＮＡ断片としてプラスミドｐＱＢＩ２５（タカラバイオ社製）をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩにて消化したものを使用した。これらのｃＤＮＡ断片を、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて、キット付随のコスミドベクター、ｐＡｘＣＡｗｔのＳｗａＩ部位へ導入し、コスミドｐＡｘＣＡ−Ｒ１０およびｐＡｘＣＡ−ＧＦＰを作製した。作製したコスミドｐＡｘＣＡ−Ｒ１０およびｐＡｘＣＡ−ＧＦＰを用いた組換えアデノウイルスの単離、増幅および精製は、上記実施例９に準じて行なった。本実験で得られたマウスＲ１０  ｃＤＮＡを保持する組換えアデノウイルスをＡｄ−Ｒ１０と、また、ＧＦＰ  ｃＤＮＡを保持するコントロールアデノウイルスをＡｄ−ＧＦＰと命名した。
【０２９８】
ｃ）  ＴＮＦ−α誘導性脂肪分解に対する作用解析
炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  α：ＴＮＦ−α）誘導性の脂肪分解に対するマウスＲ１０遺伝子の作用を、上記ｂ−１）記載のアデノウイルスを用いて、上記ａ）に記載した方法にて分化させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞にて検討した。詳細を以下に示す。
【０２９９】
ｃ−１）組換えアデノウイルス感染
上記のようにして精製された組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒ１０またはＡｄ−ＧＦＰを、１．６×１０９ｐｆｕ／ｍｌおよび４×１０８ｐｆｕ／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで希釈した。それぞれｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：重複感染率）が８００と２００に相当する。脂肪細胞に分化させた３Ｔ３−Ｌ１細胞を２回洗浄後、各ウエルにウイルス液を１００μｌずつ添加し３７℃、１０％ＣＯ２インキュベーター内で２０分後毎に振り混ぜながら１時間感染させた。感染後各ウエルに０．９ｍｌのインスリン培地を添加し、その後２日間培養した。
【０３００】
ｃ−２）組換えアデノウイルス感染によるＲ１０  ｍＲＮＡ発現のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによる検討
組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒ１０およびＡｄ−ＧＦＰ感染２日後の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からの全ＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより行なった。得られた全ＲＮＡを出発材料として、実施例１１に記載の方法に準じてＲ１０  ｍＲＮＡ発現についてのＴａｑＭａｎ  ＰＣＲを行なった。発現量の補正のため、実施例１１と同様にマウスβ−アクチンの定量もおこなった。その結果、コントロールであるＡｄ−ＧＦＰ感染群と比較して、Ａｄ−Ｒ１０感染群ではウイルス量依存的にＲ１０  ｍＲＮＡ発現の増加が認められた（図５）。
【０３０１】
ｃ−３）組換えアデノウイルス感染によるＲ１０ポリペプチド発現のウエスタンブロッティングによる検討
細胞溶解液の抽出およびウエスタンブロット解析は実施例１４に記載の方法に準じて行なった。変更点のみ以下に示す。
【０３０２】
組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒ１０およびＡｄ−ＧＦＰ感染２日後の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞からの細胞溶解液の抽出はＲＩＰＡ緩衝液４０μｌを用いて行なった。ウエスタンブロット解析には、１次抗体としてイオン交換カラムにて精製したウサギ抗Ｒ１０Ｂペプチド：
Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ（配列表の配列番号２４）
ポリクローナル抗体（（株）スクラムに依頼して作製、１０００倍希釈で使用）を、２次抗体としてペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（１０００倍希釈で使用）を用いた。その結果、コントロールであるＡｄ−ＧＦＰ感染細胞溶解液では認められない約５０ＫＤａのバンドが、Ａｄ−Ｒ１０感染細胞溶解液ではウイルス量依存的に検出された（図６）。
【０３０３】
ｃ−４）ＴＮＦ−α誘導性脂肪分解に対する作用解析
脂肪分解アッセイは脂肪分解アッセイ培地［フェノールレッド不含、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ＳＩＧＭＡ社製）を含む低グルコースＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）］を用いて行い、ＴＮＦ−α（ＳＩＧＭＡ社製）は終濃度２．５ｎｇ／ｍｌで用いた。先ず分化させた３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を脂肪分解アッセイ培地にて２回洗浄し、その後ＴＮＦ−αを含むかあるいは含まない、脂肪分解アッセイ培地を５００μｌ／ウエルで加え、２４時間培養した。培養後、上清中の遊離脂肪酸濃度をＮＥＦＡ−Ｃテストワコー（和光純薬社製）を用いてプロトコールに従って測定した。反応は、培養上清４０μｌに対し発色試液Ａ：８０μｌ、発色試液Ｂ：１６０μｌを用いて行った。測定の結果、組換えアデノウイルス感染によりＲ１０を発現した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞では、コントロールであるＧＦＰを発現した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞と比較して、ＴＮＦ−α誘導性の脂肪分解作用（遊離脂肪酸放出）が有意に抑制されていた（図７）。従って、Ｒ１０遺伝子は、インスリン抵抗性および糖尿病発症原因の一つとして報告されている、脂肪組織におけるＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を抑制することが明らかになり、遊離脂肪酸放出作用の抑制によって糖代謝の改善に寄与することが明らかになった。
【０３０４】
実施例１６．  Ｈ４ＩＩＥＣ３肝細胞を用いた糖新生を指標とした機能解析
ａ）Ｈ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３肝癌細胞の培養
Ｈ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１６００）は、１０％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）および１ｘ  抗生物質−抗真菌剤（インビトロジェン社製）を含む低グルコースＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）にて維持培養した。培養は維持・分化ともに３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて行なった。
【０３０５】
トリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン社製）にて細胞をフラスコより剥離し、１０％  ＦＣＳを加えたＤＭＥＭ培地に懸濁後、０．４％  トリパンブルー染色液（インビトロジェン社製）にて生細胞数の計測を行い、１．５  ｘ  １０５細胞／ｍｌになるように調整した。２４穴プレート（スミロン社製）に１ウエル当たり１ｍｌ（１．５ｘ１０５細胞）ずつプレーティングし、３〜４日してコンフルエントな状態になったところで以下の実験に使用した。
【０３０６】
ｂ）外因性基質依存的糖新生およびインスリンによる糖新生抑制を指標とした機能解析
組換えアデノウイルス、Ａｄ−Ｒ１０をＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞に感染させることにより、外因性基質依存的な糖新生およびインスリンによる糖新生抑制に対するＲ１０の機能について解析した。用いた組換えアデノウイルスは、実施例１５．ｂ−１）記載のものと同一である。具体的に以下に示す。
【０３０７】
ｂ−１）組換えアデノウイルス感染
精製された組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒ１０またはＡｄ−ＧＦＰを、２×１０８ｐｆｕ／ｍｌとなるように１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで希釈した。ｍｏｉ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：重複感染率）は１０に相当する。コンフルエントになるまで培養したＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞を２回洗浄後、各ウエルにウイルス液を１００μｌずつ添加し３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０分毎に振り混ぜながら１時間感染させた。感染後各ウエルに０．９ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地を添加し、その後２日間培養した。
【０３０８】
ｂ−２）組換えアデノウイルス感染によるＲ１０  ｍＲＮＡ発現のＴａｑＭａｎ  ＰＣＲによる検討
組換えアデノウイルスＡｄ−Ｒ１０およびＡｄ−ＧＦＰ感染２日後のＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞からの全ＲＮＡ抽出およびＴａｑＭａｎ  ＰＣＲは、実施例１５に記載の方法と全て同様に行なわれた。その結果、コントロールであるＡｄ−ＧＦＰ感染群と比較して、Ａｄ−Ｒ１０感染群ではＲ１０  ｍＲＮＡ発現の増加が認められた（図８）。
【０３０９】
ｂ−３）組換えアデノウイルス感染によるＲ１０ポリペプチド発現のウエスタンブロッティングによる検討
細胞溶解液の抽出からウエスタンブロット解析まで、実施例１５に記載の方法と全て同様に行なった。その結果、コントロールであるＡｄ−ＧＦＰ感染細胞溶解液では認められない約５０ＫＤａのバンドが、Ａｄ−Ｒ１０感染細胞溶解液のみで検出された（図９）。
【０３１０】
ｂ−４）外因性基質依存的糖新生およびインスリンによる糖新生抑制を指標とした機能解析
コンフルエントにまで培養したＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞を０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭにて洗浄し、０．１ｎＭインスリンを含むかあるいは含まない、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭにて１８時間培養した。翌日、糖新生アッセイ培地［フェノールレッドを含まず、グルコースを含まず、Ｌ−グルタミンを含まず、ピルビン酸を含まないＤＭＥ−ｂａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社製）に終濃度２ｍＭでＬ−グルタミンを添加したもの］にて２回細胞を洗浄後、各ウエルに５００μｌの糖新生アッセイ培地を添加し、さらに必要なウエルには外因性基質としてピルビン酸／乳酸をそれぞれ終濃度２０ｍＭ／２ｍＭになるように添加した。３時間後、上清５０μｌを用いて、培養上清中のグルコース濃度をＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄキット（モレキュラープローブ社製）をその添付プロトコールに従って用いることにより測定した。測定の際、全ての培養上清サンプルに乳酸／ピルビン酸を終濃度４０ｍＭ／４ｍＭになるように加えた。測定の結果、組換えアデノウイルス感染によりＲ１０を発現したＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞では、コントロールであるＧＦＰを発現したＨ４−ＩＩ−Ｅ−Ｃ３細胞と比較して、インスリン添加時、非添加時ともに基質依存的糖新生量が減少していることが示された（図１０）。従って、Ｒ１０遺伝子は肝臓において糖産生量を抑制することが明らかになり、糖産生量を抑制することで糖代謝改善に寄与することが明らかになった。
【０３１１】
実施例１７．ヒトＲ１０ホモログのイン・ビボでの発現及び生物活性
ａ）ヒトＲ１０ホモログのｃＤＮＡを保持するアデノウイルスの取得
ヒトＲ１０ホモログを強制発現させための組換えアデノウイルスは実施例９に記載したのと同様の方法によって取得することができる。すなわち、実施例１１で得られたｐＴＡＲＧＥＴ−ＨｕＲ１０を鋳型として適当なプライマーを設計してヒトＲ１０ホモログのｃＤＮＡを増幅する。このｃＤＮＡを実施例９に記載と同様の方法によってアデノウイルスに組み込み、ヒトＲ１０ホモログのｃＤＮＡを保持するアデノウイルスＡｄ−ＨｕＲ１０が取得できる。
【０３１２】
ｂ）ヒトＲ１０ホモログのｃＤＮＡのマウスでの発現
上記Ａｄ−ＨｕＲ１０を実施例１０に記載の方法と同様の方法によってマウスに尾静脈注射により接種し、接種３、７、１４、２１日後に尾静脈より採血し血糖値を測定するとコントロールに比べて、血糖値、血中インスリン濃度に低下傾向が認められる。このことから、ＨｕＲ１０ポリペプチドは血中グルコース濃度低下作用及び血中インスリン濃度低下作用を有することが明らかとなる。
【０３１３】
実施例１８．３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を用いた脂肪分解作用を指標としたＨｕＲ１０の機能解析
実施例１５に記載したのと同様の方法により、ヒト由来のＨｕＲ１０のｃＤＮＡを含むアデノウイルスＡｄ−ＨｕＲ１０に感染した細胞についてＴＮＦ−α誘導性脂肪分解に対する作用を解析するとＨｕＲ１０はＴＮＦ−αの脂肪分解促進による遊離脂肪酸放出作用を減弱させることが確認される。
【０３１４】
実施例１９．Ｈ４−ＩＩ−ＥＣ３肝細胞を用いた糖新生を指標としたＨｕＲ１０の機能解析
実施例１６に記載したのと同様の方法により、ヒト由来のＨｕＲ１０のｃＤＮＡを含むアデノウイルスＡｄ−ＨｕＲ１０に感染した細胞について糖産生量を測定すると、基質依存的糖新生量の減少が観察される。
【０３１５】
製剤例
本発明の医薬組成物の例として、
１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド、
または、
２）配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する機能、２型糖尿病モデルマウスに投与すると血中のグルコース濃度を低下させる機能、脂肪組織において遊離脂肪酸放出作用を抑制する機能、肝臓において糖産生を抑制する機能から選択される少なくとも一つの機能を有するポリペプチド、
を有する化合物とを水またはそれ以外の薬理学的に許容し得る溶液に溶解した無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に供される。具体的には例えば、配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド０．５ｍｇを１リットルの注射用水に溶解し、無菌的にアンプルに分注、封入する。
【０３１６】
また、無菌粉末製剤（（１）配列表の配列番号５のアミノ酸番号１から４５９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号９のアミノ酸番号１から４６８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを凍結乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、使用時に薬理学的に許容し得る溶液で希釈してもよい。
【０３１７】
【参考例】５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオン塩酸塩の製造
欧州特許出願公開第７４５６００号に記載の方法によって合成した、５−［４−（６−メトキシ−１−メチルベンズイミダゾール−２−イルメトキシ）ベンジル］チアゾリジン−２，４−ジオン１０．６ｇ及び４規定塩酸−１，４−ジオキサン１００ｍｌの混合物を濃縮後、酢酸エチルを加え、析出した成績体を濾取し、酢酸エチルで洗浄して、融点２７５−２７７℃を有する目的化合物１１．０ｇを得た。
１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル：δ（ｐｐｍ）：重ジメチルスルホキシド中、内部標準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を使用して測定した１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ）：δ（ｐｐｍ）は次の通りである。
【０３１８】
３．１１  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝１４Ｈｚ及び９Ｈｚ），  ３．３４  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝１４Ｈｚ及び４Ｈｚ），３．８９  （３Ｈ，  ｓ），  ３．９８  （３Ｈ，  ｓ），  ４．９１  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ＝９Ｈｚ及び４Ｈｚ），５．６４  （２Ｈ，  ｓ），  ７．１４  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝９Ｈｚ），  ７．１５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝９Ｈｚ）７．２５  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ＝９Ｈｚ），  ７．５０  （１Ｈ，  ｓ），  ７．７０  （１Ｈ，  ｄ，  ９Ｈｚ），１２．０４  （１Ｈ，  ｓ，  Ｄ２Ｏ添加により消失）。
【０３１９】
【発明の効果】
本発明によりインスリン抵抗性改善剤投与によって発現が上昇する遺伝子として見出された新規糖代謝及び／または脂質代謝に関連する遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、該ポリペチドの製造方法、該遺伝子および／またはポリペプチドの機能を促進するかまたは抑制する物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法によって取得される物質、該スクリーニングに使用するキット、該遺伝子および／またはポリペプチドを利用した糖代謝及び／または脂質代謝異常を改善する物質の試験方法、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチド及び／または該抗体を含有する医薬組成物等が提供された。
【０３２０】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１０：ＰＣＲプライマー
配列番号１１：ＰＣＲプライマー
配列番号１２：ＰＣＲセンスプライマー
配列番号１３：ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号１４：Ｒ１０  ｍＲＮＡ用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプライマー
配列番号１５：Ｒ１０  ｍＲＮＡ用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプライマー
配列番号１６：Ｒ１０  ｍＲＮＡ用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプローブ
配列番号１７：βアクチン用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプライマー
配列番号１８：βアクチン用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプライマー
配列番号１９：βアクチン用ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲプローブ
配列番号２０：ヒトＲ１０用ＰＣＲセンスプライマー
配列番号２１：ヒトＲ１０用ＰＣＲアンチセンスプライマー
配列番号２２：ヒトＲ１０用ＰＣＲプライマー
配列番号２３：ヒトＲ１０ｆｌａｇ用ＰＣＲプライマー
配列番号２４：Ｒ１０Ｂペプチド
【０３２１】
【配列表】
2004180669.tif 000007
2004180669.tif 000008
2004180669.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウス（ｍｏｕｓｅ）とヒト（ｈｕｍａｎ）のホモロジー検索の図。＊は同じアミノ酸を示す。番号はアミノ酸番号を示す。
【図２】Ａｄ−Ｒ１０、Ａｄ／ｅｍｐｔｙまたは生理食塩水投与のマウスの体重、血中グルコース値、血中インスリン値及び血中ＡＬＴ値に及ぼす影響を示す。
【図３】化合物Ａ投与の有無による、ＫＫマウス脂肪組織におけるＲ１０  ｍＲＮＡ発現量の比較を示す。ｃｔｒｌはコントロールを示す。
【図４】ＨＥＫ２９３細胞におけるＨｕＲ１０の発現を示す。
【図５】アデノウイルス感染による３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＲ１０  ｍＲＮＡ発現を示す。
【図６】Ａｄ−Ｒ１０感染細胞溶解液ではウイルス量依存的に検出されたＲ１０を示す。
【図７】３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＴＮＦ−α誘導性脂肪分解に対するＲ１０発現の効果を示す。
【図８】アデノウイルス感染によるＨ４‐ＩＩ‐Ｅ‐Ｃ３肝細胞におけるＲ１０  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図９】Ａｄ−Ｒ１０感染細胞溶解液で検出されたＲ１０を示す。
【図１０】Ｈ４‐ＩＩ‐Ｅ‐Ｃ３肝細胞における基質依存性糖新生に対するＲ１０発現の効果を示す。
【図１】
2004180669.tif 000036
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2004180669.tif 000041
【図７】
2004180669.tif 000042
【図８】
2004180669.tif 000043
【図９】
2004180669.tif 000044
【図１０】
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