(57)【要約】【課題】従来とは異なる機構でカリウムイオンチャンネルタンパク質のイオン透過性を制御する抗痴呆薬及び抗てんかん薬を効率的に選抜することができる。【解決手段】ムスカリン受容体とＡ−キナーゼアンカータンパク質とカリウムイオンチャンネルタンパク質とが発現している細胞に、ムスカリン受容体アゴニストと被検物質とを投与する工程と、上記細胞に生ずる電流強度を測定する工程と、測定された上記細胞の電流強度と、被検物質非投与時の細胞の電流強度とを比較して、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型プロテインキナーゼＣによるカリウムイオンチャンネルタンパク質のリン酸化を阻害又は促進する物質を選抜する工程とを有する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムスカリン受容体とＡ−キナーゼアンカータンパク質とカリウムイオンチャンネルタンパク質とが発現している細胞に、ムスカリン受容体アゴニストと被検物質とを投与する工程と、
上記細胞に生ずる電流強度を測定する工程と、
測定された上記細胞の電流強度と、被検物質非投与時の細胞の電流強度とを比較して、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型プロテインキナーゼＣによるカリウムイオンチャンネルタンパク質のリン酸化を阻害又は促進する物質を選抜する工程とを有することを特徴とする神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
上記ムスカリン受容体アゴニストは、オキソトレモリン−Ｍであることを特徴とする請求項１記載の神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
上記細胞は、ＳＣＧ細胞、又はＡ−キナーゼアンカータンパク質遺伝子及びカリウムイオンチャンネルタンパク質遺伝子で形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞であることを特徴とする請求項１記載の神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
ムスカリン受容体とＡ−キナーゼアンカータンパク質とカリウムイオンチャンネルタンパク質とが発現している細胞に、ムスカリン受容体アゴニストと放射性標識リン酸と被検物質とを投与する工程と、
上記カリウムイオンチャンネルタンパク質に結合した上記放射性標識リン酸の放射活性を測定する工程と、
測定された放射活性と、被検物質非投与時の放射活性とを比較して、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型プロテインキナーゼＣによるカリウムイオンチャンネルタンパク質のリン酸化を阻害又は促進する物質を選抜する工程とを有することを特徴とする神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
上記ムスカリン受容体アゴニストは、オキソトレモリン−Ｍであることを特徴とする請求項４記載の神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
上記細胞は、ＳＣＧ細胞、又はＡ−キナーゼアンカータンパク質遺伝子及びカリウムイオンチャンネルタンパク質遺伝子で形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞であることを特徴とする請求項４記載の神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
Ａ−キナーゼアンカータンパク質とプロテインキナーゼＣとが結合しており、
上記Ａ−キナーゼアンカータンパク質と上記プロテインキナーゼＣとの結合性を調節する化合物によって上記プロテインキナーゼＣを解離しうることを特徴とするＡ−キナーゼアンカータンパク質とプロテインキナーゼＣとの複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗痴呆薬や抗てんかん薬等の神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経伝達物質であるアセチルコリンがムスカリン受容体を活性化すると、交感神経節や中枢神経細胞では、緩徐興奮性シナプシス後興奮（以下ｓＥＰＳＰと称する。）と数秒から数分続く活動電位頻度の上昇が生じる。このｓＥＰＳＰは、ムスカリン受容体が活性化されることによって、Ｍと呼ばれるカリウムイオンチャンネル（以下、ＫＣＮＱと称する。）タンパク質のイオン透過性が減少し、Ｍ電流が抑制されて引き起こされる。この一連のシグナル伝達機構は、いくつか不明な点を残している。
【０００３】
これまでに、アセチルコリンによるこの神経興奮の上昇におけるセカンドメッセンジャーとしての役割を担う物質の候補として、ホスホリパーゼＣの生成物であるジアシルグリセロールやイノシトール三リン酸等のいくつかの化合物が挙がってはいたものの確定はされていない。また、脳神経での神経興奮の機構自体に幾つかの仮説が存在していた（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
ところで、脳神経系の障害による痴呆症であるアルツハイマー病は、コリン作動性神経の変性脱落により生じるために、脳内アセチルコリン濃度を高めるため、分解酵素（アセチルコリンエステラーゼ）の阻害剤が抗痴呆剤として臨床的に使用されている。また、近年、遺伝性脳疾患である良性家族性てんかんとＫＣＮＱタンパク質との関係が示されている（非特許文献２）。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｎ．Ｖ．  Ｍａｒｒｉｏｎ，  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｍ−ｃｕｒｒｅｎｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ５９，  ４８３−５０４  （１９９７）
【０００６】
【非特許文献２】
Ｔ．Ｊ．Ｊｅｎｔｓｃｈ，  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ＫＣＮＱ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌｓ：  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉｄｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｕｒｏｓｃｉ．  １，  ２１−３０（２０００）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＫＣＮＱは、その遺伝子異常によって様々な疾患を引き起こすと考えられることから、注目が集まっているが、ムスカリン受容体からＫＣＮＱ抑制に至るシグナル伝達経路は依然として不明点を残していた。また、神経疾患の治療に関する研究が日々進められているものの、アルツハイマー病等の痴呆症状や、てんかん等に対する根本的な治療法や治療薬の開発には至っておらず、既存の手法とは異なる新しい治療法の開発が望まれていた。
【０００８】
本発明はこのような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、従来とは異なる機構でカリウムイオンチャンネルタンパク質のイオン透過性を制御する抗痴呆薬及び抗てんかん薬を効率的に選抜することができる神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
ところで本発明者らは、アセチルコリンに起因する神経細胞興奮機構の解明をするために、長年にわたる検討を行った結果、最近ムスカリン受容体からＫＣＮＱに至るシグナル伝達機構に、ＡＫＡＰ及びこれに結合したプロテインキナーゼが関与することを初めて解明することに成功した。そして、この機構を新規薬剤の開発に応用できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係る神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法は、ムスカリン受容体とＡ−キナーゼアンカータンパク質とカリウムイオンチャンネルタンパク質とが発現している細胞に、ムスカリン受容体アゴニストと被検物質とを投与する工程と、上記細胞に生ずる電流強度を測定する工程と、測定された上記細胞の電流強度と、被検物質非投与時の細胞の電流強度とを比較して、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型プロテインキナーゼＣによるカリウムイオンチャンネルタンパク質のリン酸化を阻害又は促進する物質を選抜する工程とを有することを特徴とする。
【００１１】
また、本発明に係る神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法は、ムスカリン受容体とＡ−キナーゼアンカータンパク質とカリウムイオンチャンネルタンパク質とが発現している細胞に、ムスカリン受容体アゴニストと放射性標識リン酸と被検物質とを投与する工程と、上記カリウムイオンチャンネルタンパク質に結合した上記放射性標識リン酸の放射活性を測定する工程と、測定された放射活性と、被検物質非投与時の放射活性とを比較して、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型プロテインキナーゼＣによるカリウムイオンチャンネルタンパク質のリン酸化を阻害又は促進する物質を選抜する工程とを有することを特徴とする。
【００１２】
正常神経組織においては、ムスカリン受容体→ホスホリパーゼＣ→イノシトール−３リン酸／カルシウムイオン→Ａ−キナーゼアンカータンパク質、プロテインキナーゼＣの機序で活性化が生じカリウムイオンチャンネル（ＫＣＮＱ）タンパク質がリン酸化され、その結果、細胞膜系にＭ電流抑制が起り、神経細胞膜の興奮上昇となることが明らかとなった。
【００１３】
既に、ＫＣＮＱイオンチャネルに直接作用し、ＫＣＮＱのイオン透過性を抑制することによる抗痴呆薬や、逆にＫＣＮＱのイオン透過性を上昇させる抗てんかん薬が開発されている。
【００１４】
これに対して本発明は、本来生体の持つムスカリン受容体からＫＣＮＱへ至るシグナル伝達機構に関与するプロテインキナーゼＣをターゲットとし、プロテインキナーゼＣの活性を阻害又は促進することによって、ＫＣＮＱのイオン透過性を間接的に調節する物質をスクリーニングすることができる。最も特徴的なことは、細胞内に遊離して存在するプロテインキナーゼＣの活性ではなく、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型のプロテインキナーゼＣの活性のみを有効に測定できることである。
【００１５】
また、本発明に係るＡ−キナーゼアンカータンパク質とプロテインキナーゼＣとの複合体は、Ａ−キナーゼアンカータンパク質を介してＫＣＮＱと結合しており、上記Ａ−キナーゼアンカータンパク質と上記プロテインキナーゼＣとの結合性を調節する化合物やペプチドによって上記プロテインキナーゼＣを解離しうることを特徴とする。
【００１６】
例えばカリウムイオンチャンネルタンパク質が発現している細胞内に、上記Ａ−キナーゼアンカータンパク質と上記プロテインキナーゼＣとの結合性を弱める化合物とともに存在させると、プロテインキナーゼＣが遊離され、カリウムイオンチャンネルタンパク質をリン酸化してＭ電流を抑制し、ｓｌｏｗ  ＥＰＳＰを生じる。また、２回目以降のアセチルコリンに対する反応が失われる。すなわち、この複合体は、アセチルコリンがムスカリン受容体を活性化するときに絶対必要なものである。このため、複合体を細胞中に積極的に存在させかつ解離が弱い刺激でも生じる状態を作り出せれば抗痴呆作用を持ち、他方、複合体をなくすか解離が起こらないようにすると反応が停止し抗てんかん薬として利用することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法について、詳細に説明する。
【００１８】
本発明者らは、長年にわたる鋭意検討の結果、図１に示すような、神経伝達物質であるアセチルコリンがムスカリン受容体を活性化して、カリウムイオンチャンネル（以下、ＫＣＮＱと称する。）タンパク質のイオン透過性を減少させるという神経細胞でのイオンチャンネル制御機構の全容を解明することに成功した。特に、図１中、Ａ−キナーゼアンカータンパク質（以下、ＡＫＡＰと称することがある。）に結合したプロテインキナーゼＣ（以下、ＰＫＣと称することがある。）が、カルシウムイオン濃度やイノシトール三リン酸の上昇等によりＡＫＡＰから解離され、この解離されたＰＫＣがセカンドメッセンジャーとなってＫＣＮＱをリン酸化してイオン透過性を減少させるという機構を新たに解明した。すなわち、ムスカリン受容体→ホスホリパーゼＣ→イノシトール−３リン酸／カルシウムイオン→ＡＫＡＰ→ＰＫＣの機序での活性化によりＫＣＮＱタンパク質がリン酸化され、その結果、細胞膜系にＭ電流抑制が起り、ｓＥＰＳＰの上昇、神経細胞膜の興奮上昇を引き起こすことが明らかとなった。
【００１９】
ところで、ＫＣＮＱ遺伝子の異常は良性家族性てんかんや難聴に関与していることが知られている。また、ＫＣＮＱのイオン透過性を制御することで、痴呆をともなうアルツハイマー病を含む神経変性疾患や、てんかん等の遺伝性脳疾患を制御可能であることが実験的に示されている。すなわち、ＫＣＮＱに直接作用し、ＫＣＮＱのイオン透過性を抑制することによる抗痴呆薬や、逆にＫＣＮＱのイオン透過性を上昇させることによる抗てんかん薬の開発の努力がされている。
【００２０】
上述したように、本発明者らは、ＫＣＮＱに結合したＡＫＡＰとＰＫＣとの三重複合体（以下、単に複合体と称することがある）から解離したＰＫＣが、ＫＣＮＱのイオン透過性を制御するという、新たな知見を見出した。ここで重要なのは、細胞質内に広く存在するＰＫＣではなく、ＫＣＮＱと接している複合体から解離したＰＫＣがすぐ近傍のＫＣＮＱに作用することを見出したという点である。このことから、複合体から解離したＰＫＣの活性を阻害又は促進することによって、ＫＣＮＱのイオン透過性を調節することが大事と考えられる。
【００２１】
すなわち、複合体から解離したＰＫＣを標的とした薬剤は上述したようなＫＣＮＱに直接作用するタイプの抗痴呆薬とは異なるメカニズムではあるが、ＫＣＮＱに直接作用するタイプの抗痴呆薬と同様のＫＣＮＱのイオン透過性減少が可能であると考えられる。また同様に、複合体から解離したＰＫＣを標的としたＰＫＣの不活性剤は、上述したようなＫＣＮＱに直接作用するタイプの抗てんかん薬とは異なるメカニズムによってではあるが、ＫＣＮＱに直接作用するタイプの抗てんかん薬と同様のＫＣＮＱのイオン透過性上昇が可能であると考えられる。
【００２２】
そこで、本発明者らは、複合体からの解離そのものを調節したり、解離した後はそのＰＫＣを標的とする制御物質をスクリーニングする方法を提案した。最初に、本発明に係る神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法の第１の例について説明する。
【００２３】
第１の例では、先ず、ムスカリン受容体とＡＫＡＰとＫＣＮＱとが発現している細胞の存在下で、ムスカリン受容体アゴニストと被検物質とを投与する。
【００２４】
ムスカリン受容体としては、例えばムスカリンｍ１受容体等が挙げられるが、特に限定されない。
【００２５】
ＡＫＡＰは、本来プロテインキナーゼＡのみと結合するタンパク質と機能的に定義される一群のタンパク質であるが、さらにカルモジュリン、ＰＫＣ及びカルシニューリンの足場となるＡＫＡＰが存在する。神経細胞での後シナプス部位でこれら複数の酵素を統合するＡＫＡＰとしては、例えば配列番号１で示されるラット由来のＡＫＡＰ１５０や、ヒトＡＫＡＰ７９等が挙げられる。
【００２６】
ＫＣＮＱタンパク質は、神経細胞におけるイオン透過性に関与するイオンチャンネルタンパク質である。具体的なＫＣＮＱタンパク質としては、配列番号２で示されるＫＣＮＱ２や、配列番号３で示されるＫＣＮＱ３等が挙げられる。
【００２７】
ここで用いるムスカリン受容体と、ＡＫＡＰと、ＫＣＮＱタンパク質とが発現している細胞としては、例えばこれらのタンパク質を本来発現している上頚神経節細胞や中枢神経細胞等の神経細胞等を使用することができる。より具体的には、ラットのＳＣＧ（ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ）細胞を使用することができる。また、上述のＡＫＡＰ、ＫＣＮＱ等のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築し、この発現ベクターを導入して形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞等も使用することができる。
【００２８】
ムスカリン受容体アゴニストとしては、例えばアセチルコリン、ムスカリン、オキソトレモリン−Ｍ等のムスカリン受容体を活性化できる化合物を使用できる。
【００２９】
次に、例えば電気生理学的手法を用いて、Ｍ電流抑制の電流値を測定し、その強度変化を観察する。これにより、細胞膜でのＫＣＮＱの動作状況を観察することができる。
【００３０】
そして、測定された細胞の電流強度と、対照である被検物質非投与時の細胞の電流強度とを比較する。
【００３１】
ここで、ＡＫＡＰとＰＫＣとの相互作用について詳細に説明する。ＰＫＣは、図２ａに示すように、触媒活性部位と制御部位との主に２つの部分から構成され、触媒活性部位においてＡＫＡＰのＮ末端近傍と結合することによって複合体を形成しているものと考えられる。また、ＡＫＡＰは、そのＮ末端近傍において、ＫＣＮＱと三重に複合していると考えられる。なお、複合体を形成した状態のＰＫＣは、その酵素活性が隠（マスク）されていて、ＫＣＮＱをリン酸化することがない。
【００３２】
そして、ムスカリン受容体アゴニストがムスカリン受容体を活性化すると、例えばイノシトール三リン酸やカルシウムイオン等による解離促進作用によって、図２ｂに示すように、ＡＫＡＰからＰＫＣの触媒活性部位が解離する。複合体から解離することによって、このＰＫＣの酵素活性は表に現れかつ、活性化の影響を受け活性化され、直近に存在するＫＣＮＱをリン酸化する。この結果、ＫＣＮＱのイオン透過性を減少させ、Ｍ電流の抑制を引き起こす。
【００３３】
ところでＰＫＣ阻害剤は、ＰＫＣの触媒活性部位又は制御部位のいずれに作用するかによって、活性部位標的阻害剤と制御部位標的阻害剤との２種類に大まかに分類される。そして、ＰＫＣ阻害剤のうち、活性部位標的阻害剤はＰＫＣに到達する前にリン酸化してしまうため受容体反応を阻害できない。一方、制御部位標的阻害剤は複合体形成時において、あらかじめ活性抑制の準備が整った状態であるため、受容体刺激でＰＫＣが遊離されてもＰＫＣの活性は抑制されているので、受容体反応が阻害される、つまり、ＰＫＣの制御部位標的阻害剤は、ＫＣＮＱのリン酸化を阻害し、イオン透過性を変化させないので、Ｍ電流抑制を妨げると考えられる。このＰＫＣの制御部位標的阻害剤は、ＫＣＮＱのイオン透過性を低下させＭ電流抑制を妨げるという従来の抗痴呆薬と同様の作用を、細胞に対して引き起こす。
【００３４】
このため、Ｍ電流抑制の程度を調べることによって、被検物質がＰＫＣの制御部位阻害剤であるか否か、すなわち、被検物質がＡＫＡＰ結合型ＰＫＣに特異的な阻害剤であるか否かを判別することができる。そして、ＡＫＡＰ結合型ＰＫＣに特異的な阻害剤を選抜することによって、神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬をスクリーニングすることができる。具体的には、Ｍ電流抑制を相対的に妨げた被検物質は、抗てんかん薬の候補化合物となる可能性があり、逆にＭ電流抑制を期待できる被検物質は、抗痴呆薬薬の候補化合物となる可能性がある。
【００３５】
以上のように、本発明の第１の例のスクリーニング方法によれば、細胞内に自由に存在するＰＫＣの活性ではなく、ＡＫＡＰ結合型から遊離する分だけのＰＫＣ活性を有効に測定できるので、ＫＣＮＱのイオン透過性を間接的に調節する物質、すなわち新規な抗痴呆薬又は抗てんかん薬の候補化合物を効率的に選抜することができる。
【００３６】
また、本発明に係る神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬のスクリーニング方法の第２の例について説明する。
【００３７】
先ず、ムスカリン受容体とＡＫＡＰとＫＣＮＱタンパク質とが発現している細胞を用意し、この細胞に、ムスカリン受容体アゴニストと放射性標識リン酸と、被検物質とを投与し、所定の時間インキュベートする。
【００３８】
ここで用いるムスカリン受容体と、ＡＫＡＰと、ＫＣＮＱタンパク質とが発現している細胞としては、例えばこれらのタンパク質を本来発現している上頚神経節細胞や中枢神経細胞等の神経細胞等を使用することができる。より具体的には、ラットのＳＣＧ（ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｇａｎｇｌｉｏｎ）細胞を使用することができる。また、上述のＡＫＡＰ、ＫＣＮＱ等のタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを構築し、この発現ベクターを導入して形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞等も使用することができる。
【００３９】
また、ムスカリン受容体とＡＫＡＰとＫＣＮＱタンパク質としては、第１の例で列挙したものと同様のものを使用することができる。
【００４０】
放射性標識リン酸としては、［３２Ｐ］−Ｈ３ＰＯ４等の通常の放射性標識リン酸を使用することができる。
【００４１】
次に、カリウムイオンチャンネルタンパク質に結合した放射性標識リン酸の放射活性を測定する。具体的には、細胞を可溶化し、免疫沈降及び電気泳動法によってＫＣＮＱを分離し、分離後の放射活性をオートラジオグラフィー等で測定する。これによってＫＣＮＱのリン酸化量が求められる。
【００４２】
ところで、ＫＣＮＱのリン酸化も、Ｍ電流抑制と同様に、複合体から解離したＰＫＣによって引き起こされる現象である。
【００４３】
したがって、ＫＣＮＱのリン酸化の程度を調べることによって、被検物質がＰＫＣの制御部位阻害剤であるか否か、すなわち、被検物質が複合体の解離の程度を変えるかもしくは、ＡＫＡＰ結合型ＰＫＣに特異的な阻害剤であるか否かを判別することができる。そして、ＡＫＡＰ結合型ＰＫＣに特異的な阻害剤を選抜することによって、神経変性疾患治療薬又は遺伝性脳疾患治療薬をスクリーニングすることができる。具体的には、リン酸化量を相対的に増加した被検物質は、抗痴呆薬の候補化合物となる可能性があり、逆にＫＣＮＱのリン酸化量が小さい被検物質は、抗てんかん薬の候補化合物となる可能性がある。
【００４４】
以上のように、本発明の第２の例のスクリーニング方法によれば、細胞内に遊離して存在するＰＫＣの活性ではなく、Ａ−キナーゼアンカータンパク質結合型のＰＫＣの活性のみを有効に測定できるので、ＫＣＮＱのイオン透過性を間接的に調節する物質やペプチド、すなわち新規な抗痴呆薬又は抗てんかん薬の候補化合物を効率的に選抜することができる。
【００４５】
また、本発明に係るＡ−キナーゼアンカータンパク質とプロテインキナーゼＣとの複合体は、図２に示すように、ＫＣＮＱとＡ−キナーゼアンカータンパク質とプロテインキナーゼＣとが結合してなる複合体である。この複合体は、Ａ−キナーゼアンカータンパク質と上記プロテインキナーゼＣとの結合性を調節する化合物によって上記プロテインキナーゼＣを解離しうる。Ａ−キナーゼアンカータンパク質と上記プロテインキナーゼＣとの結合性を調節する物質としては、イノシトール三リン酸やカルシウムイオン等が挙げられる。
【００４６】
例えばカリウムイオンチャンネルタンパク質が発現している細胞内に、上記Ａ−キナーゼアンカータンパク質と上記プロテインキナーゼＣとの結合性を弱める化合物とともに存在させると、プロテインキナーゼＣが遊離され、カリウムイオンチャンネルタンパク質をリン酸化してＭ電流を抑制し、ｓｌｏｗ  ＥＰＳＰを生じる。また、２回目以降のアセチルコリンに対する反応が失われる。すなわち、この複合体は、アセチルコリンがムスカリン受容体を活性化するときに絶対必要なものである。このため、複合体を細胞中に積極的に存在させかつ解離が弱い刺激でも生じる状態を作り出せれば抗痴呆作用を持ち、他方、複合体をなくすか解離が起こらないようにすると反応が停止し抗てんかん薬として利用することができる。
【００４７】
【実施例】
次に、本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
実験１．（ＫＣＮＱ２及びＡＫＡＰ１５０の発現プラスミドの作製）
ＫＣＮＱ２及びＡＫＡＰ１５０のｃＤＮＡは、ＬＡ−ｔａｑ−ＤＮＡ合成酵素（タカラ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋから得たそれぞれの遺伝子データ（それぞれ配列番号２，配列番号１）を基にプライマ−をデザインして、ラット脳ＲＮＡをテンプレートとした逆転写酵素反応とＤＮＡ合成酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）とにより作製した。また、組み換えＤＮＡ合成酵素連鎖反応により変異ｃＤＮＡを作製した。ＫＣＮＱ２のｃＤＮＡをプラスミドｐＺｅｏＳＶに挿入して発現ベクターとした。ＡＫＡＰのｃＤＮＡをプラスミドｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０に挿入して、ＡＫＡＰ１５０の発現ベクターとした。グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）融合ＡＫＡＰ１５０タンパクは、その遺伝子ＤＮＡをｐＧＥＸベクターに組み込み調製した。
【００４９】
実験２．（細胞培養、ｃＤＮＡの導入及び形質転換）
神経細胞は２−３週齢のラットから単離し、既報（Ｄｅｌｍａｓ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０６，  ３１９−３２９  （１９９８））に従い培養した。次に、前記のＤＮＡを組み込んだプラスミドを１００μｇ／ｍｌとなるように稀釈し、ＳＣＧ神経細胞の核中に空気圧注入した。形質転換した細胞は培養状態にして保存した。ｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０にコードしたＧＦＰ−Ｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子融合タンパクはパッチクランプ法のために、その蛍光で検出した。ヒト−ムスカリンサブタイプｍ１受容体発現チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯｈｍ１細胞と称することがある。）は、１％子牛血清を加えたα−イーグル培養液で培養した。細胞は、リポフェクタミンプラス導入剤（インビトロゲン社製）またはフュジーン６導入剤（ロッシ  モレキュラー  バイオケミカル社製）を用いて培養液に植付け、後１日目に形質転換した。実験に使用したプラスミドはＡＫＡＰ１５０−ＤＮＡを挿入したｐＴｒａｃｅ、又は無処理ｐＴｒａｃｅｒを用いて重複形質転換した。形質転換後２日目に、転換した細胞を選択した。ＰＫＣ阻害剤の効果を調べるために、細胞に酵素阻害剤を下記の濃度で加えて１晩培養した。具体的には、１００ｎＭ  ビスインドリルマレイミドＩ（カルバイオケム社製）処理ＳＣＧ神経細胞、１００ｎＭ  カルフォスチンＣ（カルバイオケム社製）処理ＳＣＧ神経細胞、１．２μＭ  ケレリスリン（カルバイオケム社製）処理ＳＣＧ神経細胞、又は１０μＭ  サフィゴール（シグマ）処理ＳＣＧ神経細胞である。
【００５０】
実験３（神経細胞膜の電気生理学的測定）
分離細胞でのｓＥＰＳＰの測定はアクソパッチ２００Ｂパッチクランプ増幅器（アクソンインストラメント社製）を用いて行った。細胞からのシグナルは２ｋＨｚで取り出し、１ｋＨｚでフィルターした。電流の解析と測定はピークランプソフトウエアで行った。膜穿孔式パッチ法を使用して、既報（Ｓｅｌｙａｎｋｏ，  Ａ．Ａ．，  Ｓｔａｎｓｆｅｌｄ，  Ｃ．Ｅ．  ＆  Ｂｒｏｗｎ，  Ｄ．Ａ．  ，  Ｐｒｏｃ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ２５０，  １１９−１２５  （１９９２））にしたがって、ＳＣＧ神経細胞からの微細電流を測定した。アムホテリシンＢ（０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌ）を次の細胞外溶液に溶かした。細胞外溶液は１３０ｍＭ  酢酸カリウム、１５ｍＭ  塩化カリウム、３ｍＭ  塩化マグネシウム、６ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３）を含んでいる。細胞内溶液をピペットに満たした時の抵抗値は２〜３ＭΩであった。内部溶液は１２０ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、２．５ｍＭ塩化カルシウム、１１ｍＭグルコース、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を含んでいる。Ｍ電流強度は、−２０ｍＶの保持電流から−５０ｍＶまでの５００ミリ秒間のテスト刺激で生じる不活化電流として測定した。
【００５１】
ＣＨＯｈｍ１細胞におけるＭ電流はパッチ固定法の全細胞膜電位固定様式で測定した。パッチピペット電極の内部抵抗は４〜８ＭΩで、次の溶液を満たした。すなわち、９０ｍＭクエン酸カリウム、２０ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウム、３ｍＭ  ＥＧＴＡ、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）よりなる溶液である。外部溶液は１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、５ｍＭ  塩化カリウム、２ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  塩化カルシウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）である。また、接続抵抗（９０〜９５％）と全細胞容量補正を用いた。形質変換したＣＨＯｈｍ１細胞のほとんどはこの測定条件下では比較的小さな減衰を示した。
【００５２】
実験４．（ＰＫＣ阻害剤によるＳＣＧ神経細胞でのＭ電流抑制の濃度依存性）
先ず、各種の神経細胞を段階的に異なる濃度のムスカリン性アセチルコリン受容体刺激剤（アゴニスト）であるオキソトレモリンーＭ（以下、Ｏｘｏ−Ｍと称する。）で還流して、Ｍ電流を測定した。その結果を標準化した後に、各実験値を平均し、その値の変化をＯｘｏ−Ｍ濃度を段階的増加した時の時間変化に対して図式化した。結果を図３ａに示す。細胞標品は無処理ＳＣＧ神経細胞（対照細胞標品）、ＡＫＡＰ（ΔＡ）（１−１４３）で形質転換したＳＣＧ神経細胞、１００ｎＭ  ビスインドリルマレイミドＩ（カルバイオケム）（以下ｂｉｓと記す。）処理ＳＣＧ神経細胞、１００ｎＭ  カルフォスチンＣ（カルバイオケム）（以下ｃａｌと記す。）処理ＳＣＧ神経細胞、１．２μＭ  ケレリスリン（カルバイオケム）（以下ｃｈｅと記す。）処理神経細胞、又は１０μＭ  サフィゴール（シグマ）（以下ｓａｆと記す。）処理ＳＣＧ神経細胞である。
【００５３】
実験５．
それぞれの神経細胞標品で得られたＭ−電流値のＯｘｏ−Ｍの濃度依存阻害のＨｉｌｌ−プロットの結果を図３ｂに示す。使用した細胞は、無処理ＳＣＧ神経細胞（対照細胞標品）、ＡＫＡＰ（ΔＡ）（１−１４３）で形質転換したＳＣＧ神経細胞、１００ｎＭ  ｂｉｓ  処理ＳＣＧ神経細胞、１００ｎＭ  ｃａｌ処理ＳＣＧ神経細胞、１．２μＭ  ｃｈｅ処理神経細胞、又は、１０μＭ  ｓａｆ処理ＳＣＧ神経細胞である。その結果、ＡＫＡＰ（ΔＡ）及びＰＫＣ−制御部位標的阻害剤である、Ｓａｆ又はＣａｌ処理細胞では、ＰＫＣ−活性部位標的阻害剤であるＢｉｓ又はＣｈｅ処理細胞及び無処理細胞の場合とはＭ−電流抑制のＯｘｏ−Ｍ投与依存カーブの形が変り、高濃度側にずれて５０％阻害濃度が増大する（抑制されにくい）ことが明らかとなった。
【００５４】
実験６．（Ｏｘｏ−Ｍ処理細胞でのカリウムチャンネルＫＣＮＱ２タンパク質のＰＫＣによるリン酸化反応に対する各種の市販ＰＫＣ阻害剤の影響）
ＣＨＯｈｍ１細胞をＦＬＡＧ−標識化ＫＣＮＱ２で形質転換して４８時間後に、無リン酸溶液に０．５  Ｃｉ／ｍｌの放射性リン酸塩［３２Ｐ］−Ｈ３ＰＯ４（アマーシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を加えて４時間放置した。そのいくつかには実験５で使用したＰＫＣ阻害剤を加えた。その後に、１０μＭのＯｘｏ−Ｍで３分間の処理を行った。次に細胞をかき取り、７００μｌの氷冷したＴＮＥ溶液に移した。ＴＮＥ溶液は１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ノニデットＰ−４０（ナカライ社製）、５０ｍＭ  フッ化ナトリウム、１ｍＭ  ヴァナジン酸ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、タンパク分解酵素阻害剤混合物よりなる。
【００５５】
細胞の可溶化はＴＮＥ溶液中で２０分間、４℃で緩やかに振盪して行った。可溶化細胞液を遠心分離して上清液を取り、３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  セファローズ４  （アマーシャム  ファルマシア  バイオテク社製）に通して精製して使用した。上清液は２時間、４μｇのＭ２−抗ＦＬＡＧ抗体と反応し、次にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  結合ビーズを加えて４℃で１時間処理した。免疫反応した沈殿物は６回ＴＮＥ緩衝液で洗浄した。６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後に、［３２Ｐ］−Ｈ３ＰＯ４で標識したＫＣＮＱ２を、富士フィルム社製のＢＡＳ１０００を用いたリン酸イメージ法で検出した。一方、免疫沈降したタンパク質のうち、リン酸化されたタンパク質はＫＣＮＱ２タンパク質である事を抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスターンブロット法により確認した（図４ａ）。
【００５６】
実験７．（リン酸化ＫＣＮＱ２タンパク質の３２Ｐ−標識されたアミノ酸の分析）
【００５７】
リン酸化アミノ酸の分析はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の試料タンパクをＰＤＶＦ膜にブロッティングして、タンパク質が結合した部分の膜を切り取り、６Ｎ−塩酸中で１１０℃で９０分間処理して加水分解し、それをセルローズ（支持体の）薄層クロマト紙を用いて電気泳動して分離し、［３２Ｐ］−リン酸で標識されたアミノ酸を検出した。その結果、［３２Ｐ］標識アミノ酸の泳動位置からリン酸化セリンと同定された（図４ｂ）。
【００５８】
実験８．（ＫＣＮＱ２タンパク質のリン酸化に対するＯｘｏ−Ｍの促進効果）ＣＨＯｈｍ１細胞をＦＬＡＧ−標識化ＫＣＮＱ２タンパク質とＡＫＡＰ１５０タンパク質又はＡＫＡＰ（ΔＡ）タンパク質で同時に形質転換した。４８時間後に無リン酸−溶液に０．５  Ｃｉ／ｍｌの放射性リン酸塩［３２Ｐ］−Ｈ３ＰＯ４（アマーシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を加えて４時間放置した。その後に、１０μＭのＯｘｏ−Ｍで３分間の処理を行った。その後、ＫＣＮＱ２タンパク質のリン酸化を実験６の方法で分析した。
【００５９】
この結果、ＡＫＡＰ１５０タンパク質を発現した細胞ではムスカリン刺激でリン酸化されたが、ＡＫＡＰ（ΔＡ）変異タンパク質を発現した細胞ではＯｘｏ−Ｍによるリン酸化効果が抑制された。これはＡＫＡＰ１５０タンパク質とＰＫＣとの複合体の形成をＡＫＡＰ（ΔＡ）変異タンパク質が阻止した結果、Ｏｘｏ−Ｍのリン酸化の作用が抑えられたためである。（図４ｃ）
【００６０】
実験９．（ＫＣＮＱ２タンパク質のＯｘｏ−Ｍによるリン酸化の促進に対するＰＫＣ阻害剤の効果）
ＦＬＡＧ−標識化ＫＣＮＱ２タンパク質で形質転換したＣＨＯｈｍ１細胞を実験５で使用した各種の市販ＰＫＣ阻害剤で処理した後、ＫＣＮＱ２タンパク質のリン酸化を調べた。処理した細胞を破壊後、免疫沈降及び電気泳動法で分離したＫＣＮＱ２タンパク質のリン酸イメージ法で分析を行ってリン酸化量を求めた。結果を図４ｄに示す。図４ｄに示す様に、対照細胞標品にＯｘｏ−Ｍを加えるとリン酸化は１．５倍の増加を示す。これに対しＢｉｓとＣｈｅの存在下ではリン酸化量は僅かに下がるのみであるが、ＣａｌとＳａｆではリン酸化促進に対して強い阻害効果を示す。先の実験５の結果とともに、４種の市販ＰＫＣ阻害剤は２群に分けられること、すなわち、阻害剤の作用機構が異なったものであることを示している。制御部位標的阻害剤と言われるＣａｌ及びＳａｆはＡＫＡＰ結合状態ですでにＰＫＣを阻害している状態にあり、したがって遊離されて酵素活性部位が露出してもＰＫＣが作用せず、ＫＣＮＱ２タンパク質のリン酸化が生じない一方、活性部位標的阻害剤とされるＢｉｓ及びＣｈｅはＯｘｏ−Ｍの作用をわずかに抑制するに過ぎない。
【００６１】
ここで、実験１〜実験９の結果について、以下に概要を述べる。先ず、ＫＣＮＱ２、ＡＫＡＰ１５０、ＡＫＡＰのＫＣＮＱ２結合領域のみの欠損タンパク質（ＡＫＡＰ（ΔＡ）（１−１４３））のｃＤＮＡ、又はＡＫＡＰ変異タンパクのｃＤＮＡを挿入した発現ベクターを構築し、次いでラットＳＣＧ細胞へ発現ベクターを注入して形質転換細胞を調製した。また、ＣＨＯｈｍ１細胞にＡＫＡＰ１５０−ＤＮＡを挿入したプラスミドを導入して形質転換した。
【００６２】
次に、ＳＣＧ細胞を用いた電気生理学的手法によって、ムスカリン受容体に対するＯｘｏ−Ｍの作用によるＭ電流の強度変化を測定して、神経細胞膜でのカリウムイオンチャンネルの動作状況を観察した。Ｍ電流はＯｘｏ−Ｍに濃度依存した変化を示す。また、ＡＫＡＰ（ΔＡ）（１−１４３）の遺伝子ＤＮＡで形質変換した細胞を用いた場合には、Ｍ電流のＯｘｏ−Ｍの濃度依存性を変化させる。ＰＫＣ阻害剤をＳＣＧ神経細胞に添加後、Ｏｘｏ−ＭのＭ電流抑制を測定したところ、ＡＫＡＰ様に作用するものと、ＡＫＡＰ（ΔＡ）（１−１４３）様に作用するものとの２種のグループに分けられた。前者はＰＫＣ活性部位標的阻害剤と言われる阻害剤であり、後者はＰＫＣ制御部位標的阻害剤と言われる阻害剤である。前者は、Ｏｘｏ−Ｍ濃度に対するＨｉｌｌプロットでは低濃度のＯｘｏ−ＭでＭ電流の５０％阻害が見られるが、後者では高濃度で５０％阻害が認められ、これらの阻害剤は、ＰＫＣの阻害様式が異なることが示された。したがって、Ｏｘｏ−Ｍ濃度に対するＭ電流抑制を測定することにより、薬剤の神経細胞の対する作用（結合型か否か）を判別することが可能である。
【００６３】
ところで、ＣＨＯｈｍ１細胞をＫＣＮＱ２で形質転換した細胞を反応系にしたとき、ＫＣＮＱ２のリン酸化はＯｘｏ−Ｍにより促進する。また、ｍ１受容体阻害剤であるピレンゼピンによりＯｘｏ−Ｍの効果は拮抗される。ＡＫＡＰ（ΔＡ）を同時に形質転換した細胞ではＯｘｏ−Ｍによる促進は相殺され、リン酸化反応にＡＫＡＰが関与していることを示している。ＫＣＮＱ２のリン酸化されたアミノ酸を分析した結果、セリンのリン酸化が明らかになり、ＰＫＣの触媒作用によりリン酸化反応が進行したことを示唆している。
【００６４】
また、ＫＣＮＱ２で形質転換したＣＨＯｈｍ１細胞にＰＫＣ阻害剤を加えた後に、リン酸のＫＣＮＱ２への取り込み量はＯｘｏ−Ｍの添加効果により、対照では１．５倍増加するが、ＰＫＣの制御部位標的阻害剤ではリン酸の取り込みが減少する。一方、活性部位標的阻害剤ではＯｘｏ−Ｍの効果は変化していない。このことは、リン酸化反応に結合型のＰＫＣのみが関与している事を示唆している。ＡＫＡＰ結合型のＰＫＣによるＫＣＮＱ２のイオン透過性の抑制がまさにアセチルコリンの作用であり、神経活動を活発化（興奮）する。この阻害剤の結果に基づき、アセチルコリンの細胞内作用と同等の作用薬は抗痴呆薬として使え、ＰＫＣの制御部位標的活性化剤やリン酸化促進剤と位置付けられる。一方、ＰＫＣの制御部位標的阻害剤は抗てんかん剤とされ、本方法でスクリーニングが可能である。
【００６５】
以上の実験結果から、Ｍ電流抑制効果の薬剤濃度又はＫＣＮＱ２タンパク質のリン酸化に対する薬剤の阻害又は促進作用を調べることにより、ＫＣＮＱのイオン透過性を間接的に調節する物質をスクリーニングすることができる。神経細胞でのカリウムイオンチャンネルＫＣＮＱ２又はＫＣＮＱ３の働きを促進しカリウムイオンの透過量を上昇させる薬剤は抗てんかん薬となり、逆に透過量の低下に働く薬剤は抗痴呆薬となることが期待される。このようなＰＫＣ阻害薬剤の開発は、痴呆症状及びてんかんの新規な治療方法を開発するうえで極めて重要である。
【００６６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、これまでの抗痴呆薬や抗てんかん薬とは異なる機構でカリウムイオンチャンネルタンパク質のイオン透過性を制御可能な化合物を効率的に選抜できるので、新規な抗痴呆薬や抗てんかん薬の開発に貢献することができる。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ムスカリン受容体刺激によりＫＣＮＱタンパク質がリン酸化のため抑制されて、神経細胞膜興奮の上昇に至るまでのシグナル伝達機構を説明する模式図である。
【図２】ＫＣＮＱとＡＫＡＰとＰＫＣとの存在状態を説明するために、ＫＣＮＱのＣ末端側を抜き出した模式図である。図２ａは、ＫＣＮＱに結合するＡＫＡＰがさらにＰＫＣとが複合体を形成している状態であり、図２ｂは、そのＡＫＡＰからＰＫＣが解離した状態である。
【図３】図３ａは、Ｏｘｏ−Ｍ濃度の段階的な増加に伴うＭ電流強度の標準化平均値の時間変化を示す図である。（白丸）はＰＫＣ阻害剤未添加のＳＣＧ神経細胞、（黒丸）はＰＫＣ阻害剤未添加のＡＫＡＰ（ΔＡ）（１−１４３）で形質転換したＳＣＧ神経細胞、（菱形）は１．２μＭケレリスリン添加ＳＣＧ神経細胞、（黒四角）は１００ｎＭビスインドリルマレイミド添加ＳＣＧ神経細胞、（白三角）は１００ｎＭカルフォスチンＣ添加ＳＣＧ神経細胞、（黒逆三角）は１０μＭサフィゴール添加ＳＣＧ神経細胞を示す。図３ｂは、ＰＫＣ阻害剤添加又は未添加のＳＣＧ細胞における、Ｍ電流抑制に対するＯｘｏ−Ｍの阻害の濃度依存性を示す図である。
【図４】図４ａは、Ｏｘｏ−Ｍの添加又は非添加でのＦＬＡＧ標識ＫＣＮＱ２チャンネルのリン酸化を調べた実験結果である。図４ｂは、ＫＣＮＱのセリン残基がリン酸化されることを示す実験結果である。図４ｃ上は、ＫＣＮＱへの放射性標識リン酸の取り込みをオートラジオグラフィーによって分析した結果であり、図４ｃ下は、ＫＣＮＱチャンネルのリン酸化は、ムスカリン阻害剤のピレンゼピンによってブロックされることを示す図である。図４ｃ中、＊は標準誤差を表し、Ｐ＜０．０５である。図４ｄは、Ｏｘｏ−Ｍによるリン酸化の促進に対するＰＫＣ阻害剤の抑制効果を示す図である。＊，  ＊＊は標準誤差を表し、それぞれＰ＜０．０５  及びＰ＜０．０１である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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