(57)【要約】【課題】化学発光法を用い、活性酸素および脂質過酸化ラジカルの消去活性を同時測定することにより、検体抗酸化能を総合評価するための方法、装置、および抗酸化能の表示法を提供する。【解決手段】所定の過酸化物および鉄化合物の混液に検体、化学発光試薬を添加し、化学発光阻害を測定して検体の抗酸化力を求め、検体ｇ当たりのユニット数として表示する。操作が簡易かつ迅速で感度が高く、食品、医薬品、化粧品および血液、尿、唾液等の生体組織にも応用でき、健康維持、病気予防等に向けた技術開発に広く寄与する。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の化学発光をおこすための反応液の調整法と、化学発光を再現性よく測定するための装置および方法。
【請求項２】
食品、医薬品、化粧品、生体組織等の広範囲の検体から界面活性剤などを用いた試料測定液の作成法。
【請求項３】
測定結果から抗酸化ユニット数を算出し、試料の総合的抗酸化能を数値化表現する方法。
【請求項４】
抗酸化ユニットの定義ならびに抗酸化力レベルの規定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検体の総合的抗酸化能を測定する方法、装置および抗酸化能の定量的数値表現に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フリーラジカルなどによる無差別な生体内酸化が多くの病気の原因になることが明らかにされ、摂取食品の抗酸化能ならびに摂取食品の生体内抗酸化力に与える影響が注目されている。
【０００３】
食品および生体組織の抗酸化力を評価する方法として、従来は検体中の個々の抗酸化成分を測定してきた。しかし、食品および生体は一般に複数の抗酸化成分を含有し、これらが相乗的に働いている。したがって、抗酸化力全体の評価は複雑であり、全体的な評価は不十分なものにならざるをえなかった。
【０００４】
最近、血液中に蓄積する過酸化脂質を定量する方法、核酸および脂質の酸化生成物の尿への排泄量を測定する方法等が提出されている。これらの方法は生体内の生理状態を推測する有用な方法であるが、生体内の現在の抗酸化力を直接評価することはできない、他方、ＸＹＺ系微弱発光による抗酸化能の評価法が提案されているが、抗酸化能の評価範囲および測定値の抗酸化力レベルと既方法との関係が明確でない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料の個々の抗酸化成分の活性を測定するのではなく、一種の測定法で、主要抗酸化能を総合評価するための方法、装置および総抗酸化能の数値化表現を目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
生体内では、まずスーパーオキシドが過剰に発生し、これが各種活性酸素（過酸化水素、ヒドロキシラジカル、パーオキシナイトライトなど）に変わり、生体構成成分（脂質、蛋白質、核酸等）を無差別に攻撃して、がん等の病気を誘発する。とくに脂質は、活性酸素で容易に酸化され、脂質過酸化ラジカルとなって連鎖的反応を起こし、酸素障害の中心的役割を演ずる。すなわち、スーパーオキシドおよび脂質過酸化ラジカルは酸素障害を通して起こる病気の主要因を形成する。
【０００７】
したがって、本発明においては、このスーパーオキシドならびに脂質過酸化ラジカルの消去活性を同時測定することにより、抗酸化能の総合評価を試みた。生体内に存在する各種抗酸化成分（ビタミンＥ、アスコルビン酸、カロテン、ポリフェノール、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシターゼ等）は、ほとんどが活性酸素を消去するか、脂質過酸化ラジカルを消去するか、あるいは両者を同時消去するかによって抗酸化活性を示し、大部分の抗酸化成分が本測定法の対象になるからである。
【０００８】
本発明では、スパーオキシド消去活性と脂質過酸化ラジカル消去活性とを同時評価する方法として化学発光反応を利用した。すなわち、過酸化脂質に鉄（ＩＩ）化合物および化学発光試薬（イソルミノール）を加えると、次の反応を経て化学反応を示す。
ＬＯＯＨ（過酸化物質）＋鉄（ＩＩ）化合物→ＬＯ・
ＬＯ・＋イソルミノール（ＱＨ−）→ＬＯＨ＋セミキノンラジカル（Ｑ−・）
Ｑ−・＋Ｑ−・→キノン（Ｑ）＋Ｏ２−・
Ｑ  ・＋Ｏ２  ・→イソルミノールエンドペルオキシド→発光
この反応系に抗酸化成分を添加すると、過酸化脂質ラジカルおよびＯ２−・（スーパーオキシド）の消去力に依存して化学発光が阻害される。したがって、化学発光の阻害率を測定すれば試料中の抗酸化能を総合的に評価することができる。
【０００９】
化学発光を測定する装置としてはアロカ株式会社製化学発光検出器（ルミネッセンスリーダー、ＢＬＲ−２０１）を用いた。具体的測定手順は次のとおりである。
【００１０】
測定用バイアルに過酸化物質溶液（反応基準液）の一定量（８００μＬ）および試料液（１０〜２００μＬ）を入れ、これを測定室にセットする。つぎに、化学発光試薬１５０μＬを加えて反応をスタートさせ、化学発光量を３分間測定する。反応基準液としては、０．２Ｍホウ酸バッファー（Ｐｈ９．４、５０％メタノールを含む）に２５０μＭのクメンヒドロペルオキシド（ＣｕｍＯＯＨ）を溶かした溶液を用い、化学発光試薬としては、１０ｍＬの１ｍＭイソルミノール／メタノール液に０．５ｍｇのミクロペルオキシダーゼを溶かした溶液を使用した
【００１１】
コントロール（試料無添加）の発光量（基準発光量、Ａ）および５０ｎｍｏｌＴｒｏｌｏｘ添加時の発光量（Ｂ）を求め、５０ｎｍｏｌ  Ｔｒｏｌｏｘが示す発光阻害量（Ａ−Ｂ）を抗酸化活性１ユニット（Ｕ）と定義した。試料溶量を変えた数点の測定値から試料液の化学発光阻害曲線を作成し、これから１Ｕ阻害を示す試料液量（Ｕ阻害量）を求め、試料の抗酸化能ををＵ／ｇ新鮮重あるいはＵ／ｇ乾燥重で示した。
【００１２】
上記測定において、基準発光量を常に一定にすることが重要であり、そのためつぎの方法をとった。▲１▼過酸化物質としては比較的安定なＣｕｍＯＯＨを用いた。▲２▼５ｍＭ  ＣｕｍＯＯＨ／エタノール溶液（ＣｕｍＯＯＨ標準液）を調整し、これを随時０．２Ｍホウ酸バッファーで希釈して反応基準液（２５０μＭ  ＣｕｍＯＯＨ液）を作成した。ＣｕｍＯＯＨ標準液および反応基準液には０．１ｍＭのジエチレントリアミンペンタ酢酸を含ませてＣｕｍＯＯＨ濃度の安定化をはかった。▲３▼ＣｕｍＯＯＨ濃度は常時ロダン鉄法で確認した。
【００１３】
上記化学発光の測定操作において、化学発光試薬を注入するとき、通常のマイクロシリンジを用いると、機器に装備してあるゴムパッキングをとおして注入するにもかかわらず、なお光が中に漏れ、誤差、ばらつきの原因となった。そこで、本発明では、マイクロシリンジの針部の根元にさらにゴムパッキングを装備し、液注入後も針を挿入したまま発光測定を行うことにより（図１）、光漏れを完全に防ぐことができた。
【００１４】
試料測定液はつぎのように調整した。試料に３０倍容（Ｗ／Ｖ）の抽出溶媒を加え、ブレンダーついでガラスホモジナイザーで十分磨砕し、ホモジネートを調整する。全ホモジネートを集め一定容にしたのち、超音波処理、ついで遠心し得られる上清を測定液とした。抽出溶媒は、動物性食品に対しては、トライトン溶液（０．１％トライトンＸ−１００および１％ＮａＦを含む２０ｍＭホウ酸バッファー（Ｐｈ９．４））を用い、植物性食品に対しては、トライトン溶液／メタノール（４：１、Ｖ／Ｖ）を使用した。また、必要に応じて測定液を随時希釈した。希釈用溶媒としては０．０５％トライトンＸ−１００を含む０．２Ｍホウ酸バッファー（Ｐｈ９．４）を用いた。
【００１５】
血液の抗酸化活性の測定はつぎの簡易法によった。三共マイクロレットを用いて指頭から採血し（５０〜１００ｍｇ）、脱脂綿に吸収させてバイアルに入れる。これに０．９％ＮａＣｌ溶液（１％ＮａＦを含む）を０．６ｍＬ加えて振盪遠心し、得られる上清を血漿測定液として用いた。血漿の活性を測定後、残る上清および沈殿に上記トライトン溶液４ｍＬを加え振盪、溶血させ、全血液の測定液として使用した。
【００１６】
【実施例】
以下実施例を示して本発明を説明する。ただし本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００１７】
先ず、本測定法の特徴を明らかにした実験結果を示す。本法が脂質過酸化ラジカルおよびスーパーオキシドの両消去活性を同時評価していることを確認するため、α−トコフェロールおよびスーパーオキシドジスムターゼならびにこれらの混合物の化学発光阻害効果を調べた。図２に示すようにα−トコフェロール（図２ａ）およびスーパーオキシドジスムターゼ（図２ｂ）はともに添加量に依存して化学発光を強く阻害した。また、両者を混合するとほぼ相加的に化学発光を阻害した（図２ｃ）。すなわち、これは、本測定法が脂質過酸化ラジカルおよびスーパーオキシドの両消去活性を同時評価していることを示す。
【００１８】
食品中には化学構造の異なる他種類の抗酸化成分が存在するので、これらの混合状態および単独状態における発光阻害効果を調べた。すなわち、アスコルビン酸、カテキン、スペルミン、タウリンのそれぞれ単独の場合およびα−トコフェロールとペア混合した場合の化学発光阻害を測定し、それぞれ単独測定値の和と混合測定値とを比較した。図３に示すように、各ペアの単独測定値の和と混合測定値とは大まかに類似し、各抗酸化成分は単独状態でも混合状態でも類似した阻害効果を示し、混合状態では両者がほぼ相加的に活性を発揮し、そして評価されることが分かる。
【００１９】
本発明による植物性食品の抗酸化能の測定値を示す。ホウレンソウをトライトン溶液／メタノール（４：１、Ｖ／Ｖ）とともにホモジナイズし、適宜希釈して試料液を調整した。試料液量を変えて化学発光阻害を測定し、発光阻害曲線を作成した（図４）。この阻害曲線ならびに５０ｎｍｏｌ  ＴｒｏｌｏＸの阻害値から試料液のＵ阻害量を求めると７６μＬとなり、次式から抗酸化ユニット数を算出した。
Ｕ／ｇ新鮮重＝試料液量（ｍＬ）×希釈倍率／Ｕ阻害量（ｍＬ）／試料（ｇ）
ホウレンソウの抗酸化能は、９０１Ｕ／ｇ新鮮重を示した。
【００２０】
つぎに、動物性食品の抗酸化能の測定例を示す。まぐろ（大とろ）をトライトン溶液とともにホモジナイズし、化学発光の阻害曲線を作成した（図５）。この阻害曲線および５０ｎｍｏｌ  ＴｒｏｌｏＸ阻害値からＵ阻害量（４７．６μＬ）を求め、抗酸化ユニット数を算出した。まぐろ（大とろ）の抗酸化能は、３４３Ｕ／ｇ新鮮重を示した。
【００２１】
本測定法は多種類の食材を広範囲に測定することができる。表１にはその測定値ならびに測定値のばらつきを示した。同一試料液を３〜５回測定し、測定値を平均値±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示し、変動係数（ＣＶ）を求めた。変動係数は５％以下で測定値のばらつきは比較的小さい。一般に、植物性食品は動物性食品に比較して抗酸化能が高く、とくに、コーヒー、お茶類は群をぬいていた。
【表１】
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【００２２】
本発明の測定法は、また各種調理食品の抗酸化能を測定することができる。表２にサンドウィッチ（ハム、卵）および和食弁当の測定例を示す。測定においては、必要に応じ、各食材もしくは料理ごとに分別しホモジナイズして測定した。１食分のサンドウィッチ（１８５．８ｇ）の総抗酸化能は２２，４６０Ｕ／新鮮重であった。また、和食弁当の総抗酸化能は３９，６００Ｕ／新鮮重であった。
【表２】
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【００２３】
本測定法は血液、唾液、尿等の生体組織ならびに分泌物についても広く測定することができる。
【００２４】
血液についての測定例を図６に示す。３０才の男性から血液５９ｍｇを採血し、これに０．９％食塩（１％ＮａＦを含む）を加える。振盪遠心し、得られる上清を血漿の試料溶液として化学発光阻害を測定した。つぎに、残余の上清および沈殿に、トライトン溶液を加え、振盪溶血した液を全血液の試料液として測定した。それぞれの阻害曲線および５０ｎｍｏｌ  ＴｒｏｌｏＸの阻害値から血漿および全血液のＵ阻害量（血漿、５７μＬ：全血液、２４μＬ）を求め、抗酸化能を算出した。血漿は３１５Ｕ／ｇ血液、全血液は３５００Ｕ／ｇ血液を示した。
【００２５】
唾液、尿は３０才男性から採取し、唾液はトライトン溶液、尿は０．２Ｍホウ酸バッファーで希釈し、発光阻害曲線を作成した（図７）。阻害曲線および５０ｎｍｏｌ  ＴｒｏｌｏＸの阻害値からＵ阻害量を求め、抗酸化能を算出した。唾液は３１１Ｕ／ｇ、尿は４７３Ｕ／ｍＬを示した。
【００２６】
本測定法は健康食品、栄養補助食品、医薬品等の抗酸化能の測定が容易にできる。測定例を図８および図９に示す。「Ａｓａｈｉ粉末ビール酵母」および「すっぽん成分抽出製剤（すっぽん球）」はトライトン溶液で、そして麦若葉青汁はトライトン溶液／メタノール（４：１、Ｖ／Ｖ）で抽出し、試料液を調整した。Ａｓａｈｉ粉末ビール酵母およびすっぽん球の発光阻害曲線をそれぞれ図８（ａ）および図８（ｂ）に示す。また、麦若葉青汁の阻害曲線を図９に示す。上記方法に従ってＵ阻害量を求め抗酸化能を算出した。結果はつぎのとおりである。Ａｓａｈｉ粉末ビール酵母、７０４Ｕ／ｇ；すっぽん球、４４Ｕ／ｇ；麦若葉青汁、１４４５Ｕ／ｇ。
【００２７】
本測定法は化粧品、化粧品原料の測定も容易にできる。図１０、図１１、図１２、図１３に測定例を示す。各製品は直接もしくは希釈溶媒で希釈して試料液とした。図１０（ａ）、図１０（ｂ）に表３の組成のスキンローションａおよびｂの発光阻害曲線を示す。また図１１（ａ）、図１１（ｂ）にオウゴンエキス、オタネニンジンエキスの阻害曲線を示す。図１２（ａ）、図１２（ｂ）に表４の組成の美白ゲル、表５の組成の美容エッセンスの阻害曲線を示す。そして図１３に鉱石浸水液の阻害曲線を示す。各製品の抗酸化能はつぎのとおりであった。
スキンローションａ、１８．５Ｕ／ｍＬ、スキンローションｂ、２６Ｕ／ｍＬ、オウゴンエキス、１３７５Ｕ／ｍＬ、オタネニンジンエキス、１０８Ｕ／ｍＬ、美白ゲル、７５９Ｕ／ｇ、美容エッセンス、２３４０Ｕ／ｇ、鉱石浸水液、０．５Ｕ／ｍＬ
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【００２８】
【発明の効果】
本発明によれば、各種食材、調理食品、健康食品、栄養補助食品、医薬品、化粧品、化粧品原料等の抗酸化能を総合的に定量評価することができる。さらに血液、尿、唾液等生体組織関連の抗酸化能も容易に測定することができる。したがって、本発明は、広範囲の検体について同一スケールでの抗酸化力値が得られるばかりでなく、食品、健康食品、医薬品、化粧品等が生体内抗酸化能に与える影響、効果をも直接的に調べることができる。これは、さらに、抗酸化能からみた健康維持、病気予防そして病気治療のための適切な食品、健康食品、医薬品、化粧品等の開発を可能にし、同時に食品摂取のありかた、医薬品、化粧品使用のありかた等の領域においても新しい技術展開を可能とさせ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本測定における化学発光試薬の注入装置の図面である。
【図２】本測定法が脂質過酸化ラジカルおよびスーパーオキシドの両消去活性を同時評価していることを示す図面である。
【図３】各種抗酸化成分の単独ならびに混合状態における化学発光抑制効果を示す図面である。
【図４】植物性食品の測定例を示す図面である。
【図５】動物性食品の測定例を示す図面である。
【図６】血液の測定例を示す図面である。
【図７】唾液および尿の測定例を示す図面である。
【図８】Ａｓａｈｉ粉末ビール酵母およびすっぽん球の測定例を示す図面である。
【図９】麦若葉青汁の測定例を示す図面である。
【図１０】スキンローションの測定例を示す図面である。
【図１１】オウゴンエキス、オタネニンジンエキスの測定例を示す図面である。
【図１２】美白化粧水、美容液の測定例を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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