(57)【要約】【課題】軟骨型フィブロネクチンの検出方法、該方法を用いた軟骨腫瘍の検出方法、前記検出方法に使用することができる軟骨型フィブロネクチンに特異的な結合性を有する抗体及びかかる抗体を産生するハイブリドーマを提供する。【解決手段】少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」、ヒト軟骨型ＦＮに特異的に結合性を有するとともにＣ領域を有するフィブロネクチンには結合性を実質的に有しないモノクローナル抗体、かかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系５Ｂ８。（１）検体中の軟骨型フィブロネクチンと軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質とを接触させる工程；（２）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンと軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質との複合体」を検出する工程。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記（１）及び（２）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（１）検体中の軟骨型フィブロネクチンと軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質とを接触させる工程；
（２）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンと軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質との複合体」を検出する工程。
【請求項２】
「軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質」が、固相に結合していることを特徴とする請求項１記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
【請求項３】
「軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質」が抗体又はそのフラグメントであることを特徴とする請求項１又は２記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
【請求項４】
検体中の軟骨型フィブロネクチンを、軟骨型フィブロネクチンに特異的な結合性を有する抗体又はそのフラグメントを用いて検出し、該検出結果と軟骨腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」。
【請求項５】
検体が生体から取り出した軟骨組織であって、該軟骨組織を組織染色することで軟骨型フィブロネクチンの検出を行うことを特徴とする請求項４記載の「軟骨腫瘍の検出方法」。
【請求項６】
ヒト軟骨型フィブロネクチンに特異的に結合性を有するとともにＣ領域を有するフィブロネクチンには結合性を実質的に有しないモノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項６に記載されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系５Ｂ８。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、軟骨型フィブロネクチンの検出方法、軟骨型フィブロネクチンを検出して軟骨腫瘍を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
本明細書中においては、「フィブロネクチン」を「ＦＮ」と略記する。
ＦＮは細胞接着を促進する因子の一つであり、血漿型ＦＮ、細胞型ＦＮ、軟骨型ＦＮなど数種類のＦＮが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。これらの構造的相違は、スプライシングの相違によることも知られている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
一般にＦＮはヘパリンやヒアルロン酸などのＧＡＧ、コラーゲンなどに接着性を有することが知られていた。また軟骨型ＦＮがプロテオグリカンの１種であるデコリンに結合性を有することも知られていた（非特許文献５）。接着性において他の型のＦＮには特異性が低く、軟骨型ＦＮのみに高い特異性を示す物質はこれまでは知られていなかった。
【０００４】
ＦＮは５’末端から３’末端に向かって順にＩ−１（配列番号１５）、Ｉ−２（配列番号１７）、Ｉ−３（配列番号１９）、Ｉ−４（配列番号２１）、Ｉ−５（配列番号２３）、Ｉ−６（配列番号２５）、ＩＩ−１（配列番号２７）、ＩＩ−２（配列番号２９）、Ｉ−７（配列番号３１）、Ｉ−８（配列番号３３）、Ｉ−９（配列番号３５）、ＩＩＩ−１（配列番号３７）、ＩＩＩ−２（配列番号３９）、ＩＩＩ−３（配列番号４１）、ＩＩＩ−４（配列番号４３）、ＩＩＩ−５（配列番号４５）、ＩＩＩ−６（配列番号４７）、ＩＩＩ−７（配列番号４９）、ＥＤＢ（配列番号５１）、ＩＩＩ−８（配列番号５３）、ＩＩＩ−９（配列番号５５）、ＩＩＩ−１０（配列番号５７）、ＩＩＩ−１１（配列番号５９）、ＥＤＡ（配列番号６１）、ＩＩＩ−１２（配列番号６３）、ＩＩＩ−１３（配列番号６５）、ＩＩＩ−１４（配列番号６７）、ＩＩＩＣＳ（Ｖ領域：配列番号６９）、ＩＩＩ−１５（配列番号７１）、Ｉ−１０（配列番号７３）、Ｉ−１１（配列番号７５）、Ｉ−１２（配列番号７７）の各ドメインからなることが知られている（非特許文献６）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５９，  ３９６２−３９７０  （１９８４）
【非特許文献２】Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８０（２），  ４９２−４９８  （１９７９）
【非特許文献３】Ｎｉｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２（１４），  ５８５３−５８６８  （１９８４）
【非特許文献４】ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ４（７），  １７５５−１７５９  （１９８５）
【非特許文献５】Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８，  １１１７５−１１１８１  （２００３）
【非特許文献６】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ８，  ３１５−３２５
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
特に軟骨において存在する軟骨型ＦＮは、他のＦＮと比して繊維形成能などの点で異なる性質を有しており、軟骨型ＦＮのみを検出し、その局在を調べたり、或いはその発現量を測定することで、軟骨型ＦＮの機能の解明を進めることができると考えられる。しかし、軟骨型ＦＮのみに特異的に結合性を有する抗体は知られておらず、そのような抗体の探索が必要とされていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、軟骨型ＦＮに特異的に結合性を有する物質を鋭意探索した結果、驚くべきことにＧＡＧの１種であるＣＳＥが軟骨型ＦＮに特異的な結合性を示すこと、及び軟骨型ＦＮに特異的に結合性を有するモノクローナル抗体の作成に成功し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明は以下の通りである。
（１）  少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（ａ）検体中の軟骨型フィブロネクチンと軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質とを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「軟骨型フィブロネクチンと軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質との複合体」を検出する工程。
（２）  「軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質」が、固相に結合していることを特徴とする請求項１記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（３）  「軟骨型フィブロネクチン結合性タンパク質」が抗体又はそのフラグメントであることを特徴とする（１）又は（２）記載の「軟骨型フィブロネクチンの検出方法」。
（４）  検体中の軟骨型フィブロネクチンを、軟骨型フィブロネクチンに特異的な結合性を有する抗体又はそのフラグメントを用いて検出し、該検出結果と軟骨腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」。
（５）  検体が生体から取り出した軟骨組織であって、該軟骨組織を組織染色することで軟骨型フィブロネクチンの検出を行うことを特徴とする（４）記載の「軟骨腫瘍の検出方法」。
（６）  ヒト軟骨型フィブロネクチンに特異的に結合性を有するとともにＣ領域を有するフィブロネクチンには結合性を実質的に有しないモノクローナル抗体。
（７）  （６）に記載されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系５Ｂ８。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を発明の実施の形態により詳説する。
【００１０】
（１）本発明軟骨型ＦＮ検出方法
本発明軟骨型ＦＮ検出方法は、少なくとも下記（ａ）及び（ｂ）の工程を有する。
（ａ）検体中の軟骨型ＦＮと軟骨型ＦＮ結合性タンパク質とを接触させる工程；
（ｂ）前記接触により生じた「軟骨型ＦＮと軟骨型ＦＮ結合性物質との複合体」を検出する工程。
【００１１】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「検体」は、「軟骨抽出液」、生検によって得られる「軟骨組織」、医薬品、医療用具等を目的とする軟骨型ＦＮの製造の工程管理における「試作品又はサンプル」、「医薬品」等が例示され、特に「軟骨抽出液」が好ましい。ここで軟骨抽出液とは、軟骨を破砕した後、該破砕物から有機溶媒又は水性溶媒に溶解性を有する成分を抽出した溶液を指称する。
【００１２】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮ」とは、その遺伝子構造と血漿型ＦＮ、細胞型ＦＮなどの構造との対比によって知られている可変領域（ＥＤＡ、ＥＤＢ、及びＶ）の他、更にＩＩＩ−１５及びＩ−１０モジュールを欠失したＦＮであり、正常軟骨組織で発現しているＦＮを指す。かかる「軟骨型ＦＮ」は配列番号２記載のアミノ酸配列からなる。例えばこれを遺伝子組換的手法により発現させるためには配列番号１記載の塩基配列を含む核酸を、常法に従って発現ベクターなどに組み込んで組換えベクターを調製し、これを適当な宿主細胞に導入して組換体を得てそれを成育させることで行うことができる。
【００１３】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」としては、「抗体」又はその「抗原結合フラグメント」が例示される。かかる「抗体」としては抗軟骨型ＦＮ抗体であることが好ましく、モノクローナル抗体が好ましい。かかる抗体はヒト化抗体、ヒト抗体であってもよい。ヒト化抗体は例えばキメラ抗体を含む。このような「抗体」の具体例としてはハイブリドーマ細胞系５Ｂ８によって産生される抗体が例示される。
【００１４】
このような「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」は何にも結合していない可溶性の状態で本発明軟骨型ＦＮ検出方法に用いることも可能であるが、固相に結合していることが好ましい。かかる「固相」としては例えばプレート、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲルなどが例示される。その中でも特にプレート及びビーズが好ましくは例示され、殊にプレートが取扱の簡便性から好ましい。
【００１５】
上述の「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」と「固相」との結合は、共有結合、イオン結合、物理的吸着などが挙げられ特に限定はされないが、その中でも単なる物理的吸着で十分な結合の強度を得られるため好ましい。
【００１６】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」と検体中の軟骨型ＦＮとの接触は、検体が液体の場合には、反応容器中において検体と「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」を混合し、軟骨型ＦＮと軟骨型ＦＮ結合性タンパク質が相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法は限定されない。例えば反応容器に入れた「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」又は「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」が固相化されたプレートに検体を添加、或いは反応容器に「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」及び検体を同時に添加してなされる。また検体が固体の場合には、固相に固着していない「軟骨型ＦＮ結合性タンパク質」を検体に加えて接触がなされることが好ましい。なお、かかる接触を保つ時間は、前記軟骨型ＦＮ結合性タンパク質と検体中の軟骨型ＦＮとが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定はされないが、数秒〜数時間、好ましくは５分以上１０時間以内であり、最も好ましくは３０分〜８時間である。また、接触を行う温度条件は、０〜４０℃、４〜３８℃が好ましく、２０℃〜３７℃が最も好ましい。更に、反応を行うｐＨ条件は、６．０〜８．０が好ましく、特に６．５〜７．５が好ましい。
【００１７】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法における「軟骨型ＦＮと軟骨型ＦＮ結合性タンパク質との複合体」の検出方法は、複合体に含まれる軟骨型ＦＮ結合性タンパク質又は軟骨型ＦＮを特異的に検出することによりなされる。例えば、軟骨型ＦＮ結合性タンパク質を特異的に検出するためには、予め軟骨型ＦＮ結合性タンパク質を標識物質（例えば放射能、蛍光物質など）でラベルしておき、かかる標識物質を検出することによって行うことも可能であり、また軟骨型ＦＮ結合性タンパク質を特異的に認識して結合する物質（例えば抗体が挙げられる）を用いることができる。軟骨型ＦＮ結合性タンパク質として軟骨型ＦＮに特異的な結合性を有する「抗体」を用いる場合には、例えばかかる抗体に特異的に結合する二次抗体を使用して常法により検出を行うことも可能である。また、例えば複合体に含まれる軟骨型ＦＮを特異的に検出することで複合体を検出する場合には、標識物質で予め標識してあり、ＦＮを認識する抗体などを用いて検出を行うと、容易に検出を行うことが可能となる。かかる抗体としては、後述の本発明抗体のみならず、広く一般的なＦＮとも結合性を有する抗体（例えばマウス由来の抗ヒトＦＮ抗体１３６Ｈなど）を用いることが可能である。このような抗体を使用する場合には、標識物質を結合した二次抗体（上記一次抗体に結合性を有する抗体）を使用することも可能である。二次抗体を使用した場合には、例えば予め二次抗体にペルオキシダーゼなどの標識物質を結合しておき、その酵素反応を用いて基質（３，３’−ジアミノベンチジン（以下「ＤＡＢ」と略記する）やｏ−フェニレンジアミンなど）を分解して発色基質を生じさせて検出を行うことも可能である。かかる二次抗体を使用する検出方法が簡便で且つ常法に従って行うことができるため好ましい。
【００１８】
本発明軟骨型ＦＮ検出方法の具体的な例としては、例えば下記が挙げられる。
組織染色の手法を用いる場合には、検体として生検によって得られた軟骨組織を用いる。かかる軟骨組織を公知の手法を用いてパラフィン切片などとし、かかる切片にマウス抗軟骨型ＦＮＩｇＧ抗体（一次抗体）を用いてパラフィン切片上に存在する軟骨型ＦＮと反応させる。その後、切片を洗浄した後、かかる切片を西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（二次抗体）などにより処理を行って、二次抗体を一次抗体に結合させる。そして切片を洗浄して一次抗体に結合した二次抗体を例えばＤＡＢ溶液などの発色基質溶液と反応させて検出することができる。すなわちＤＡＢ溶液での反応後に発色が認められた切片は、軟骨型ＦＮが存在している切片であると判断される。ＤＡＢ溶液による反応後の発色度合いを対比することで、軟骨型ＦＮの定量を行うことも可能である。
【００１９】
また、ＥＬＩＳＡ的手法を用いる場合には、検体として生検によって得られた軟骨組織からの抽出液を用いることができる。例えばＣＳＥ−脂質結合体を固着させたマイクロプレートに、検体を分注し、一定時間インキュベートする。その後マイクロプレートを洗浄し、マウス抗軟骨型ＦｎＩｇＧ抗体とインキュベートし、更にプレートを洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたウサギ抗マウスＩｇＧ抗体などをプレートに分注して反応させる。プレートを洗浄した後、ＤＡＢ溶液などの発色基質溶液と反応させて検出を行う。すなわちＤＡＢ溶液での反応後に発色が認められた検体には、軟骨型ＦＮが存在していたと判断される。ＤＡＢ溶液による反応後の発色度合いを対比することで、軟骨型ＦＮの定量を行うことも可能である。
【００２０】
（２）本発明腫瘍検出方法
本発明腫瘍検出方法は、検体中の軟骨型ＦＮを、軟骨型ＦＮ結合性タンパク質を用いて検出し、その結果と腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする「軟骨腫瘍の検出方法」である。
【００２１】
本発明腫瘍検出方法は、軟骨の腫瘍化に伴い軟骨性ＦＮの量が減少することに基づく発明である。本発明腫瘍検出方法における「軟骨型ＦＮの検出」は、上述の本発明軟骨型ＦＮ検出方法を用いて行うことができる。したがって本発明腫瘍検出方法で用いる検体は、軟骨由来の検体であることが好ましい。軟骨由来の検体とは、例えば生検によって得られた軟骨組織、かかる軟骨組織からの抽出液などが挙げられ、いずれも本発明腫瘍検出方法に使用することが可能である。本発明腫瘍検出方法においては、操作の簡便性の観点から、生検によって得られる軟骨組織を検体として用い、免疫染色の手法を用いて検出を行うことが好ましい。
【００２２】
本発明腫瘍検出方法における腫瘍の有無と上記検出結果の関連づけは、検出結果が健常軟骨組織における軟骨型ＦＮ量と比して検体における軟骨型ＦＮ量が減少していることを示した場合に、かかる検体には腫瘍が存在するとして関連づけることが好ましく、より好ましくは、検体において実質的に軟骨型ＦＮが検出されなかった場合に、かかる検体には腫瘍が存在するとして関連づけを行う。
【００２３】
（３）本発明抗体及び本発明ハイブリドーマ
本発明抗体は、ヒト軟骨型ＦＮに特異的に結合性を有するとともにＣ領域を有するＦＮには結合性を実質的に有しないモノクローナル抗体である。
【００２４】
上記ＦＮの「Ｃ領域」とは、血漿型ＦＮや細胞型ＦＮに存在する領域であって、フィブリン２結合領域のＮ末側に隣接して存在する領域でＦＮのＩＩＩ−１５モジュール（塩基：配列番号７１，アミノ酸：配列番号７２）とＩ−１０モジュール（塩基：配列番号７３、アミノ酸：配列番号７４）とが組み合わさった領域である。Ｃ領域はより具体的には配列番号８に示す全長ＦＮのアミノ酸配列においてアミノ酸番号２１９７〜２３３３からなる領域である。本発明抗体はかかるＣ領域を有するＦＮには結合性を実質的に示しない。
【００２５】
本発明抗体は、具体的には本発明ハイブリドーマであるハイブリドーマ細胞系５Ｂ８によって産生されるモノクローナル抗体が例示される。
【００２６】
本発明ハイブリドーマは、公知の細胞融合法により作製することができる。即ち、例えば軟骨型ＦＮを免疫原としてヒト以外の動物を免疫し、その脾細胞又はリンパ節細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中から軟骨型ＦＮを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより本発明ハイブリドーマを得ることができる。
【００２７】
上記免疫原としては、軟骨型ＦＮを含有するものであれば特に限定されず、例えば、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸を常法に従って組み込んだ組換体を生育させて得られる生育物（組換体破砕物、培地、排泄物、分泌物など）、或いはそれらから軟骨型ＦＮ結合性タンパク質などを用いるアフィニティークロマトグラフィーで部分精製又は精製して得た軟骨型ＦＮ等を挙げることができるが、特に精製して得た軟骨型ＦＮであることが好ましい。
【００２８】
本発明ハイブリドーマを作製するために用いる被免疫動物としては特に限定されず、例えば、ヤギ、ヒツジ、モルモット、マウス、ラット、ウサギ等を挙げることができるが、なかでもマウスが好ましい。
【００２９】
上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、マウスを免疫する場合、１回に１〜１００μｇ、好ましくは５０〜１００μｇの免疫用抗原を等容量（０．１ｍＬ）の生理食塩水及びフロイントの完全アジュバント、不完全アジュバント、又はＲＩＢＩアジュバントシステムで乳化して、上記被免疫動物の背部、腹部の皮下又は腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法等を挙げることができる。
【００３０】
本発明においては、上記被免疫動物を免疫後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、融合促進剤の存在下で、これらの組織に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。
【００３１】
上記融合促進剤としては特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」とも記載する）や、センダイウイルス等を挙げることができるが、ＰＥＧを用いることが好ましい。
【００３２】
上記骨髄腫細胞としては特に限定されず、例えば、Ｐ３Ｕ１、ＮＳ−１、Ｐ３ｘ６３．Ａｇ８．６５３等のマウス由来の細胞；ＡＧ１、ＡＧ２等のラット由来の細胞等を挙げることができる。
【００３３】
上記細胞融合法としては特に限定されず、例えば、脾細胞と骨髄腫細胞とを１：１〜１０：１の比率で混合し、これに分子量１，０００〜６，０００のＰＥＧを１０〜８０％の濃度で添加し、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜１０分間インキュベートする方法等を挙げることができる。
【００３４】
本発明において、軟骨型ＦＮを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、例えば、ハイブリドーマのみが生育できるＨＡＴ培地等の選択培地で培養し、ハイブリドーマ培養上清中の抗体活性を上述の本発明測定法等の方法を用いて測定することにより行うことができる。更に、本発明において、軟骨型ＦＮを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの樹立は、例えば、軟骨型ＦＮを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに対し、限界希釈等の方法によりクローニングを繰り返すことにより行うことができる。
【００３５】
本発明ハイブリドーマとしては、例えば、５Ｂ８を挙げることができる。このハイブリドーマは、平成１５年６月２日に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３８０として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６）に寄託されたものである。
【００３６】
本発明抗体を大量に調製する方法としては特に限定されず、例えば、あらかじめプリスタンを投与したマウスの腹腔に本発明ハイブリドーマを移植して、回収した腹水から得る方法等を挙げることができる。腹水中の本発明抗体は、プロテインＡやプロテインＧカラム等を使用する公知の方法等により容易に精製することができる。
【００３７】
（４）本発明製造方法
本発明製造方法は、軟骨型ＦＮを含む試料を、固相上に固着した軟骨型ＦＮ結合性物質と接触させて、固相上に固着した「軟骨型ＦＮと軟骨型ＦＮ結合性物質との複合体」を形成させ、かかる複合体を形成して固相を分離し、その後複合体から軟骨型ＦＮを単離することを特徴とする軟骨型ＦＮの製造方法である。
【００３８】
本発明製造方法における「試料」とは、軟骨型ＦＮを含むものである液体である限りにおいて特に限定はされない。かかる「試料」の例としては、例えば軟骨抽出液、組換軟骨ＦＮを発現する組換体の生育物（組換体の培養上清、組換体の抽出液、組換体の排泄物など）などが例示される。その中でも特に組換体の生育物が好ましい。
【００３９】
上述の組換体は例えば次のようにして調製することができる。
すなわち、配列番号１３及び配列番号１４記載のプライマー配列を用いて、ヒト由来の軟骨細胞から常法に従って調製した全ＲＮＡを鋳型として逆転写ポリメラーゼ  チェイン  リアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ法）により軟骨型ＦＮの部分配列を増幅し、かかる増幅産物を例えばＴＡクローニングなどでクローン化することができる。そしてこのクローンを適当な制限酵素で消化して切り出した後、例えばＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １３９（１９９７），  ２９５−３０７に記載されたｐＡ１ＦＮＣ（血漿型ＦＮをコードする発現ベクター）の相同領域と常法で置換し、軟骨型ＦＮを発現する発現ベクターを調製する。そして、かかる組換ベクターをベクターが適当に働く宿主細胞に感染、組み込み、組換体を調製することができる。
【００４０】
上記「宿主細胞」として真核細胞（ほ乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。宿主細胞として真核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「真核細胞用の発現ベクター」を選択し、宿主細胞として原核細胞を使用する場合には基本ベクターとして「原核細胞用の発現ベクター」を選択する。
【００４１】
本発明製造方法における「固相」とは、本発明軟骨型ＦＮ検出方法で記載した固相と同様であるが、本発明製造方法をバッチ法（静的吸着）で行う場合にはプレート及びビーズが例示され、またカラム法（動的吸着）で行うためにはゲルが挙げられる。これらの固相を利用することが軟骨型ＦＮの大量製造が容易となるため好ましい。
【００４２】
本発明製造方法における「軟骨型ＦＮ結合性物質」も、本発明軟骨型ＦＮ検出方法で記載した物質（軟骨型ＦＮ結合性タンパク質及び軟骨型ＦＮ結合性脂質結合ＧＡＧ）が例示されいずれも使用することが可能である。
【００４３】
本発明製造方法における「軟骨型ＦＮ結合性物質の固相上への固着」は、製造工程における軟骨型ＦＮの損失を最小限とするために、より強力な固着手段で固着されていることが好ましい。このような固着手段としては化学結合、その中でも特に共有結合が挙げられる。
【００４４】
本発明製造方法における「軟骨型ＦＮ結合性物質と軟骨型ＦＮとの接触」は例えば下記が挙げられる。すなわちバッチ法において、例えばプレートを固相として使用した場合には、軟骨型ＦＮ結合性物質が固着したプレートに上記試料を添加する方法が挙げられる。また、ビーズを固相として使用した場合には、軟骨型ＦＮ結合性物質が固着したビーズを、反応容器に予め添加しておき、かかる容器に上記試料を添加して接触させる方法、反応容器に予め上記試料を添加しておき、かかる容器に軟骨型ＦＮ結合性物質が固着したビーズを添加する方法、及び反応容器に軟骨型ＦＮ結合性物質が固着したビーズと上記試料とを同時に添加する方法が例示される。このような方法で接触がなされた場合には、軟骨型ＦＮ結合性物質に軟骨型ＦＮが結合して複合体を形成するのに十分な時間、接触状態を保つ必要がある。かかる時間としては例えば３０秒以上１２時間以下、好ましくは１０分〜１０時間、より好ましくは３０分〜８時間が例示される。また、接触を行う温度条件は、０〜４０℃、１〜２４℃が好ましく、４℃〜２０℃が最も好ましい。更に、反応を行うｐＨ条件は、６．０〜８．０が好ましく、特に６．５〜７．５が好ましい。なお、かかるバッチ法を用いる場合には、上記複合体を形成させた後、既存の固液分離手段を用いて固相を単離する必要がある。
【００４５】
一方、カラム法においては、軟骨型ＦＮ結合性物質が固着したゲル又はビーズをカラムに充填し、かかるカラムに試料を通筒することで、試料中の軟骨型ＦＮを固相に結合させて複合体をすることができる。
【００４６】
上記手法により形成された複合体から軟骨型ＦＮを溶出させる方法としては、複合体を高濃度の塩の水溶液（例えば４ｍｏｌ／ｌの尿素を含むリン酸緩衝液など）などに浸漬し、十分に撹拌し、液相を回収することで軟骨型ＦＮのみを容易に単離することが可能となる。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
（調製１）軟骨型ＦＮを含む検体の調製
ヒト肋軟骨から全ＲＮＡを常法に従って抽出し、これを鋳型としてプライマーとして配列番号１３及び１４の塩基配列を使用した逆転写ポリメラーゼチェインリアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ法）によってＦＮのＩＩＩ−１２からＩ−１２モジュールをコードするｃＤＮＡ（ＩＩＩＣＳ領域とＣ領域を欠失している）を調製した。ついで、ＴＡクローニングにてこれをクローン化した（ｒＦＮ／Ｏ）。このクローンを制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩ及びＮｄｅ  Ｉで処理したあと、血漿型ＦＮ発現ベクターｐＡｌＦＮＣ（Ｍａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７  １３９  ２９５−３０７）の相同領域と常法に従って置換し、軟骨型ＦＮ発現ベクターを調製した。
上記ｒＦＮ／Ｏと同様の手法で以下のクローンを含むベクターを調製した。
【００４８】
【表１】
2004359555.tif 000002
【００４９】
注：ｒＦＮ／Ｃｍの合成にはＪ．  Ｃ．  Ｓ．，  １０８，  ９０７−９１５記載のプライマーを使用した。
【００５０】
各ＦＮ発現ベクター（４μｇ）と、ジヒドロ葉酸還元酵素発現ベクター（０．４μｇ）を、αＭＥＭ（ギブコ社製、核酸含有）中で６センチ培養皿を用いて培養したハムスター卵巣上皮由来培養細胞株ＣＨＯＤＧ４４細胞に、リン酸カルシウム法を利用して導入し、３５℃、二酸化炭素濃度３．５％で１２時間培養した。次いで、培地を交換し、３７℃、二酸化炭素濃度５％で２４時間培養した。さらに、核酸非含有で、１０ｎｍｏｌ／ｌメソトレキセートを添加した培地に交換し、適宜培養系を拡大しつつ２週間培養した。
【００５１】
次に、形成されたコロニーをピックアップし、最も多くＦＮを発現しているものを選択し、１週間、血清濃度１％で大量培養した。回収した培養上清は、４℃、１０，０００ｒｐｍで遠心して不溶物を除き、ＴＦＴシステム（ファルマシア社製）で２０分の１の体積に濃縮後、マウス抗ハムスターＦＮ抗体３Ｃ１２カラムに通して内在性のハムスターＦＮを除去した。さらに、マウス抗ヒトＦＮ抗体１１９Ａカラムによって各ＦＮをアフィニティー精製した。
【００５２】
（調製２）生検により得られた軟骨組織の処理
生検により得られた軟骨組織は、１０％緩衝ホルマリン（和光純薬工業株式会社製）に２４時間浸して組織を固定した後、組織脱水溶液（和光純薬工業株式会社製）に２時間ずつ、７回浸して脱脂脱水した。次いで、キシレン（和光純薬工業株式会社製）に２時間ずつ３回浸した後、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）に７２時間ずつ３回浸して脱灰し、ティッシュプレップＴ５８０（フィッシャーサイエンティフィック社製）に２時間ずつ４回浸透し、パラフィン包埋した。
脱灰を除く全ての操作は、全てティッシュティックＶＩＰ−Ｍ１５００（サクラ社製）により行った。
【００５３】
実施例１：本発明抗体の調製
調製１で調製したｒＦＮ／Ｏをマウス（日本クレア社、６週齢雌）に１匹当たり４０μｇずつＦＲＥＵＮＤ’Ｓ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  （ｃｏｍｐｌｅｔｅ）（シグマ社製）と共に、１週間に１回、計２回腹腔内投与した。抗体価が上昇したことを確認し、さらに１週間後、調製１で調製したｒＦＮ／Ｏ（３０μｇ）を尾静脈に投与した。４日後、マウス脾臓を摘出し、調製した脾細胞とミエローマ細胞Ｓｐ２を１０：１の割合で混合し、ＰＥＧ１５００（ベーリンガーマンハイム社製）存在下にて細胞融合を行った。融合した細胞は、ＨＡＴ（ＩＣＮ  バイオメディカル社製）を含むエスクロン培地に懸濁して３日間培養し、次いで、ＨＴ（ＩＣＮバイオメディカル社製）、２０％胎児血清、ＯＰＩ（シグマ社製）、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（ギブコ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に置換して選択をかけた。
【００５４】
細胞融合から７日後、形成されたコロニーの培養上清を回収し、抗原であるｒＦＮ／Ｏ、或いはｒＦＮ／Ｃ、ｒＦＮ／Ｃｍ、ｒＦＮ／ＡＣ、ｒＦＮ／ＢＣ、ｒＦＮ／ＡＢＣを固層化した９６穴マルチプレートに一穴当たり５０μｌで添加し、室温で１時間静置した。その後、溶液を廃棄し、洗浄液で洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体を１μｇ／ｍｌで含むＰＢＳを一穴当たり５０μｌで添加して、室温で１時間静置した。その後さらに洗浄液で３回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミンを２００μｇ／ｍｌで含む過酸化水素水で発色を行い、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５５】
その結果、ｒＦＮ／Ｏに結合性を有し、その他のＦＮに結合性を有しない（すなわちＣ領域を有するＦＮには結合性を有しない）クローンを数個選択し、限外希釈法による２次スクリーニングを同様の方法にて行った。そして、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法に使用できる、マウス抗軟骨型ＦＮ抗体５Ｂ８を得た。
【００５６】
実施例２：腫瘍における軟骨型ＦＮ量の変化
パラフィン包埋した各軟骨組織は、４μｍの厚さで切片を作成した。作成した切片は、キシレン（和光純薬工業株式会社製）に１０分ずつ３回浸し、次いで１００％エタノールに３回、９０％、８０％、７０％エタノールに１回ずつ各２分浸し、脱パラフィンを行った。
【００５７】
蒸留水で洗浄後、５００μｇ／ｍｌで牛睾丸由来ヒアルロニダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．０、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウムを含む）を室温で３０分各切片に対して反応させ、ヒアルロン酸の分解を行った後、ＰＢＳで３回洗浄、ついで５００μｇ／ｍｌでプロテアーゼ（シグマ社製）を含むＰＢＳを室温で３０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、０．３％でヤギ血清（ベクタステイン社製）を含むＰＢＳで室温下１時間ブロッキングし、適宜希釈したマウス抗軟骨型ＦＮ抗体５Ｂ８、マウス抗ヒトＦＮ抗体１３６Ｈを添加し、４℃、１２時間反応させた。さらにＰＢＳで洗浄後、１％過酸化水素水に室温下２０分反応させて内因性ペルオキシダーゼ処理を行い、さらに洗浄後、ビオチン結合抗マウスＩｇＧ抗体（ベクタステイン社製）、ヤギ血清をそれぞれ１μｇ／ｍｌ、０．３％で含むＰＢＳを室温下１時間反応させた。洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ベクタステイン社製）を適量含むＰＢＳにて室温、３０分反応させ、洗浄後、２００μｇ／ｍｌでジアミノベンジジン（ナカライテスク社製）を含む３７℃、５０ｍｍｏｌ／ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．６）に浸し、かかる水溶液に過酸化水素水を添加し、反応させた。約１０分後、蒸留水で洗浄して反応を停止し、次いで、７０％、８０％、９０％エタノールに２分ずつ各１回浸し、１００％エタノールに２分ずつ３回浸して脱水、さらにキシレンに１０分ずつ３回浸し、ＥＵＫＩＴＴ液（Ｏ．ＫＩＮＤＬＡＲ社製）でマウントし、スライドガラスを作成、顕微鏡で観察した。
【００５８】
その結果、正常軟骨組織では５Ｂ８による染色が認められたが、軟骨腫瘍ではその染色が全く認められなかった。一方、１３６Ｈによる染色では、共に広範囲に染色が認められ、特に軟骨腫瘍では、より強い染色像が認められた。
【００５９】
実施例３
生検によって得られた正常、あるいは各種疾患を持つヒト軟骨を、４ｍｏｌ／ｌ尿素及び各種プロテアーゼインヒビターを含む５０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液に軟骨湿重量１０ｍｇあたり０．１ｍｌの割合で、４８時間ごとに３回浸すことで軟骨からＦＮを抽出した。次に、かかる緩衝液をＰＢＳに対して透析し、ゼラチンカラムに添着して洗浄した後、４ｍｏｌ／ｌ尿素で溶出、得られたフラクションを再度ＰＢＳに対して透析することで各軟骨組織中のＦＮをアフィニティー精製した。
【００６０】
次に、ゼラチンを２．５ｎｇ／ｗｅｌｌでコートした９６穴マルチプレートに各軟骨から抽出したＦＮを１０ｎｍｏｌ／ｌの濃度で５０μｌずつ添加し、４℃で１２時間反応させた。次いで、マウス抗軟骨型ＦＮ抗体５Ｂ８、或いはマウス抗ヒトＦＮ抗体１３６Ｈを１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して室温下、１時間反応させ、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄後、さらに西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇＧ抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ｗｅｌｌで添加して室温下、１時間反応させ、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、洗浄液で３回洗浄し、ｏ−フェニレンジアミンを２００μｇ／ｍｌで含む過酸化水素水で発色を行い、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６１】
その結果、正常軟骨から精製したＦＮは５Ｂ８抗体に強い反応が認められたが、各種軟骨疾患から抽出したＦＮは、５Ｂ８抗体に全く反応しなかった。
【００６２】
【配列表】
2004359555.tif 000003
2004359555.tif 000004
2004359555.tif 000005
2004359555.tif 000006
2004359555.tif 000007
2004359555.tif 000008
2004359555.tif 000009
2004359555.tif 000010
2004359555.tif 000011
2004359555.tif 000012
2004359555.tif 000013
2004359555.tif 000014
2004359555.tif 000015
2004359555.tif 000016
2004359555.tif 000017
2004359555.tif 000018
2004359555.tif 000019
2004359555.tif 000020
2004359555.tif 000021
2004359555.tif 000022
2004359555.tif 000023
2004359555.tif 000024
2004359555.tif 000025
2004359555.tif 000026
2004359555.tif 000027
2004359555.tif 000028
2004359555.tif 000029
2004359555.tif 000030
2004359555.tif 000031
2004359555.tif 000032
2004359555.tif 000033
2004359555.tif 000034
2004359555.tif 000035
2004359555.tif 000036
2004359555.tif 000037
2004359555.tif 000038
2004359555.tif 000039
2004359555.tif 000040
2004359555.tif 000041
2004359555.tif 000042
2004359555.tif 000043
2004359555.tif 000044
2004359555.tif 000045
2004359555.tif 000046
2004359555.tif 000047
2004359555.tif 000048
2004359555.tif 000049
2004359555.tif 000050
2004359555.tif 000051
2004359555.tif 000052
2004359555.tif 000053
2004359555.tif 000054
2004359555.tif 000055
2004359555.tif 000056
2004359555.tif 000057
2004359555.tif 000058
2004359555.tif 000059
2004359555.tif 000060
2004359555.tif 000061
2004359555.tif 000062
2004359555.tif 000063
2004359555.tif 000064
2004359555.tif 000065
2004359555.tif 000066
2004359555.tif 000067
2004359555.tif 000068
2004359555.tif 000069
2004359555.tif 000070
2004359555.tif 000071
2004359555.tif 000072
2004359555.tif 000073
2004359555.tif 000074
2004359555.tif 000075
2004359555.tif 000076
2004359555.tif 000077
2004359555.tif 000078
2004359555.tif 000079
2004359555.tif 000080
2004359555.tif 000081
2004359555.tif 000082
2004359555.tif 000083
2004359555.tif 000084
2004359555.tif 000085
2004359555.tif 000086
2004359555.tif 000087
2004359555.tif 000088
2004359555.tif 000089
2004359555.tif 000090
2004359555.tif 000091
2004359555.tif 000092
2004359555.tif 000093
2004359555.tif 000094
2004359555.tif 000095
2004359555.tif 000096
2004359555.tif 000097
2004359555.tif 000098
2004359555.tif 000099
2004359555.tif 000100
2004359555.tif 000101
2004359555.tif 000102
2004359555.tif 000103
2004359555.tif 000104
2004359555.tif 000105
2004359555.tif 000106
2004359555.tif 000107
2004359555.tif 000108
2004359555.tif 000109
2004359555.tif 000110
2004359555.tif 000111
2004359555.tif 000112
2004359555.tif 000113
2004359555.tif 000114
2004359555.tif 000115
2004359555.tif 000116
2004359555.tif 000117
2004359555.tif 000118
2004359555.tif 000119
2004359555.tif 000120
2004359555.tif 000121
2004359555.tif 000122
2004359555.tif 000123
2004359555.tif 000124
2004359555.tif 000125
2004359555.tif 000126
2004359555.tif 000127
2004359555.tif 000128
2004359555.tif 000129
2004359555.tif 000130
2004359555.tif 000131
2004359555.tif 000132
2004359555.tif 000133
2004359555.tif 000134
2004359555.tif 000135
2004359555.tif 000136
2004359555.tif 000137
2004359555.tif 000138
2004359555.tif 000139
2004359555.tif 000140
2004359555.tif 000141
2004359555.tif 000142
2004359555.tif 000143
2004359555.tif 000144
2004359555.tif 000145
2004359555.tif 000146
2004359555.tif 000147
2004359555.tif 000148
2004359555.tif 000149
2004359555.tif 000150
2004359555.tif 000151
2004359555.tif 000152
2004359555.tif 000153
2004359555.tif 000154
2004359555.tif 000155
2004359555.tif 000156
2004359555.tif 000157
2004359555.tif 000158
2004359555.tif 000159
2004359555.tif 000160
2004359555.tif 000161
2004359555.tif 000162
2004359555.tif 000163
2004359555.tif 000164
2004359555.tif 000165
2004359555.tif 000166
2004359555.tif 000167
2004359555.tif 000168
2004359555.tif 000169
2004359555.tif 000170
2004359555.tif 000171
2004359555.tif 000172
2004359555.tif 000173
2004359555.tif 000174
2004359555.tif 000175
2004359555.tif 000176
2004359555.tif 000177
2004359555.tif 000178
2004359555.tif 000179
2004359555.tif 000180
2004359555.tif 000181
2004359555.tif 000182
2004359555.tif 000183
2004359555.tif 000184
2004359555.tif 000185
2004359555.tif 000186
2004359555.tif 000187
2004359555.tif 000188
2004359555.tif 000189
2004359555.tif 000190
2004359555.tif 000191
2004359555.tif 000192
2004359555.tif 000193
2004359555.tif 000194
2004359555.tif 000195
2004359555.tif 000196
2004359555.tif 000197
2004359555.tif 000198
2004359555.tif 000199
2004359555.tif 000200
2004359555.tif 000201
2004359555.tif 000202
2004359555.tif 000203
2004359555.tif 000204
2004359555.tif 000205
2004359555.tif 000206
2004359555.tif 000207
2004359555.tif 000208
2004359555.tif 000209
2004359555.tif 000210
2004359555.tif 000211
2004359555.tif 000212
2004359555.tif 000213
2004359555.tif 000214
2004359555.tif 000215
2004359555.tif 000216
2004359555.tif 000217
2004359555.tif 000218
2004359555.tif 000219
2004359555.tif 000220
2004359555.tif 000221
2004359555.tif 000222
2004359555.tif 000223
2004359555.tif 000224
2004359555.tif 000225
2004359555.tif 000226
2004359555.tif 000227
2004359555.tif 000228
2004359555.tif 000229
2004359555.tif 000230
2004359555.tif 000231
2004359555.tif 000232
2004359555.tif 000233
2004359555.tif 000234
2004359555.tif 000235
2004359555.tif 000236
2004359555.tif 000237
2004359555.tif 000238
2004359555.tif 000239
2004359555.tif 000240
2004359555.tif 000241
2004359555.tif 000242
2004359555.tif 000243
2004359555.tif 000244
2004359555.tif 000245
2004359555.tif 000246
2004359555.tif 000247
2004359555.tif 000248
2004359555.tif 000249
2004359555.tif 000250
2004359555.tif 000251
2004359555.tif 000252
2004359555.tif 000253
2004359555.tif 000254
2004359555.tif 000255
2004359555.tif 000256
2004359555.tif 000257
2004359555.tif 000258
2004359555.tif 000259
2004359555.tif 000260
2004359555.tif 000261
2004359555.tif 000262
2004359555.tif 000263
2004359555.tif 000264
2004359555.tif 000265
2004359555.tif 000266
2004359555.tif 000267
2004359555.tif 000268
2004359555.tif 000269
2004359555.tif 000270
2004359555.tif 000271
2004359555.tif 000272
2004359555.tif 000273
2004359555.tif 000274
2004359555.tif 000275
2004359555.tif 000276
2004359555.tif 000277
2004359555.tif 000278
2004359555.tif 000279
2004359555.tif 000280
2004359555.tif 000281
2004359555.tif 000282
2004359555.tif 000283
2004359555.tif 000284
2004359555.tif 000285
2004359555.tif 000286
2004359555.tif 000287
2004359555.tif 000288
2004359555.tif 000289
2004359555.tif 000290
2004359555.tif 000291
2004359555.tif 000292
2004359555.tif 000293
2004359555.tif 000294
2004359555.tif 000295
2004359555.tif 000296
2004359555.tif 000297
2004359555.tif 000298
2004359555.tif 000299
2004359555.tif 000300
2004359555.tif 000301
2004359555.tif 000302
2004359555.tif 000303
2004359555.tif 000304
2004359555.tif 000305
2004359555.tif 000306
2004359555.tif 000307
2004359555.tif 000308
2004359555.tif 000309
2004359555.tif 000310
2004359555.tif 000311
2004359555.tif 000312
2004359555.tif 000313
2004359555.tif 000314
2004359555.tif 000315
2004359555.tif 000316
2004359555.tif 000317
2004359555.tif 000318
2004359555.tif 000319
2004359555.tif 000320
2004359555.tif 000321
2004359555.tif 000322
2004359555.tif 000323
2004359555.tif 000324
【００６３】
【発明の効果】
本発明により軟骨型フィブロネクチンの検出方法が提供されると共に、軟骨型フィブロネクチンに特異的な結合性を有するモノクローナル抗体、及びかかるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞が提供される。