(57)【要約】【課題】タンデム型質量分析装置における測定スループットの向上と試料同定精度の向上。【解決手段】測定対象となるイオン種の選択と解離および測定をｎ段階繰り返すタンデム型質量分析装置を用いた質量分析スペクトル解析システムにおいて、ＭＳｎ−１（ｎ≧２）のスペクトル解析結果の質量電荷比（ｍ／ｚ値）に基づき、ＭＳｎで測定すべきイオン種を選定し、これを必要とする数のアミノ酸配列が決定するまで繰り返す。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析装置の測定対象となる物質をイオン化し、生成したイオン種の中から特定の質量数のイオン種を選択して解離させ、更に、測定対象となるイオン種の選択と解離および測定をｎ段階繰り返すタンデム型質量分析装置を用いた質量分析スペクトル解析システムにおいて、
ｎ段階目のタンデム質量分析を実施するか否かを、ｎ−１段階目のスペクトル測定により得られた全ての質量対電荷比（ｍ／ｚ）のピークに基づき決定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システム。
【請求項２】
ｎ段階目のタンデム質量分析する際、ｎ−１段階目のスペクトル測定により得られた全ての質量対電荷比（ｍ／ｚ）のピークに基づき、装置に内蔵もしくは外部接続された選択手段によってイオン種を選択する請求項１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項３】
ｎ段階目にタンデム質量分析で得たマススペクトルを、データベースと比較して合致する場合には測定を終了し、合致しない場合にはｎ＋１段階目のスペクトル測定を実施する請求項１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項４】
ｎ段階目にタンデム質量分析して得たマススペクトルを、データベースと比較して合致する場合には測定を終了し、合致しない場合にはデータベースと合致するまでｎ＋１段階目のスペクトル測定を実施する請求項１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の質量分析スペクトル解析システムにおいて、イオン種の選択とスペクトルの測定を繰り返すことを特徴とする質量分析スペクトル解析システム。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の質量分析スペクトル解析システムにおいて、測定対象が蛋白質，ポリペプチド，糖，リン酸，酸素，水素，アルキル基，有機酸に類する化合物またはその他の化合物のいずれかであるか、前記化合物により化学修飾された蛋白質，ポリペプチドまたは糖であることを特徴とする質量分析スペクトル解析システム。
【請求項７】
蛋白質，ポリペプチド，化学修飾された蛋白質，化学修飾されたポリペプチドについて解離イオン種の候補構造を予測し、予測結果から前駆イオンを構成するアミノ酸残基の配列あるいは配列の数を予測し、ペプチド鎖中に含まれるＭ残基以上の配列を明らかにできなかった場合には、配列が不明なアミノ酸残基を最も多く含む解離イオン種を選択して解離させ、ペプチド鎖中のＭ残基以上の配列が明らかになるまでイオン種の選定と解離の測定を繰り返す請求項６に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項８】
前記Ｍの値が４，５，６または７である請求項７に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項９】
前記Ｍの値を測定時または測定前の段階で測定者が指定する請求項８に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１０】
請求項１〜４，６のいずれかにおいて、２段階目からｎ段階目までのマススペクトルを加算または加重した上で加算し、左記加算スペクトルを用いて測定対象の構造を予測することを特徴とする質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１１】
前記加算スペクトルのピーク群のうちアミノ酸由来のピーク群の数がトータルでＪ以上となるまで、以降の解離，測定を実行する請求項１０に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１２】
前記Ｊの値が４，５，６または７である請求項１１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１３】
前記Ｊの値を測定時または測定前の段階で測定者が指定する請求項１１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１４】
前記化学修飾された蛋白質または化学修飾されたポリペプチドについて、ｎ段階目の解離において修飾化合物を脱離させ、ｎ＋１段階目の解離で修飾化合物が脱離したポリペプチドまたは糖を解離させる請求項６に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１５】
前記化学修飾された蛋白質または化学修飾されたポリペプチドについて、ｎ段階目の解離において修飾化合物を脱離させ、ｎ＋１段階目の解離で修飾化合物を解離させる請求項６に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１６】
ｎ段階のタンデム質量分析により得られたスペクトルデータから予測される前駆イオンの構成アミノ酸うち、一つのアミノ酸残基の質量数と他の種類の二つのアミノ酸残基の質量数の和を比較した時、両者の値が近いために、一つのアミノ酸残基であるか二つのアミノ酸残基であるか判別が困難な場合、左記判別が困難なアミノ酸を含むイオン種を選択して解離させる請求項６に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１７】
イオン種の候補構造中にトリプトファン（Ｔｒｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）のいずれかを含むと予測された場合、左記アミノ酸残基を含むと予測されたイオン種を選択して解離させる請求項６に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１８】
糖、および、化学修飾された糖について解離イオン種の候補構造を予測し、予測結果から前駆イオンを構成する単糖の配列または配列の数を予測し、糖鎖中のＭａ個以上の配列を明らかにできなかった場合には、配列が不明な単糖を最も多く含む解離イオン種を選択して解離させ、糖鎖中のＭａ個以上の配列が明らかになるまでイオン種の選定と解離，測定を繰り返す請求項６に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項１９】
Ｍａの値が４，５，６または７である請求項１８に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項２０】
Ｍａの値を測定時もしくは測定前の段階で測定者が指定する請求項１８に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項２１】
加算スペクトルのピーク群のうち糖に由来するピーク群の数がトータルでＪａ以上となるまで、以降の解離，測定を実行する請求項１０に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項２２】
前記Ｊａの値が４，５，６または７である請求項２１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【請求項２３】
前記Ｊａの値を測定時または測定前の段階で測定者が指定する請求項２１に記載の質量分析スペクトル解析システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、質量分析装置を用いた質量分析スペクトルの解析システムに係り、ポリペプチド，糖などの生体高分子の化学構造を高精度で同定する質量分析スペクトル解析システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
（１）  一般的な質量分析法では、測定対象をイオン化した後、質量分析装置に送り込んで解離生成物の質量数を測定する。多段解離が可能なタンデム型質量分析装置では、解離反応により生成したイオン種の内、ある質量数のイオン種だけを選定して、更に、ガス分子と衝突させる。
【０００３】
これにより２段階目，３段階目，…，ｎ段階目の解離反応を誘発させ、各段階で生成したイオン種の質量数を分析する。この場合、２段階目以降で解離させるイオン種は、測定者の知見に基づいて選択するのが一般的であった。
【０００４】
（２）  測定すべきイオン種の選定に関する公知例としては、特許文献１が挙げられる。
【０００５】
本特許文献１では、最もスペクトル強度の高いイオン種を選定する方法について述べられている。また、一般にとられている方法として、スペクトル強度が高いものを幾つか選定、または、ｋ番目（ｋは測定者が指定）にスペクトル強度が高いものを選定すると云った方法がとられることもある。
【０００６】
（３）  一般的には予め測定された構造既知のポリペプチドのスペクトルデータをデータベースに蓄えておき、測定したスペクトルとマッチングし、スペクトル同定する方法が用いられている。また、蛋白質以外にも特許文献２にデータベースを利用した構造同定に関するものがある。
【０００７】
【特許文献１】
特開２０００−１７１４４２号公報
【特許文献２】
特開平０５−１６４７５１号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
（１）  従来法ではｎ段階目の解離（以降ＭＳｎと呼ぶ）を実施する際に、ｎ−１段階目（ＭＳｎ−１）の解離スペクトルから、測定者の知見に基づいてイオン種を選定していた。このため、ＭＳｎ測定には手間がかかり、通常は、ｎ＝２の段階までのスペクトル解析しか実施しないことが多かった。ｎ＝２の段階では、同定上必要なスペクトル情報が十分得られないことがある。
【０００９】
（２）  前記の特許文献１は、最適な分析条件の決定に関するものであり、生体高分子、特に、ポリペプチドの同定精度を上げると云う観点からは必ずしも最適とは云えない。
【００１０】
また、強度情報に基づきイオンの選定を実施した場合には、構造情報を得る上で最適なイオンを選定できない可能性がある。生成したイオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）の値を有効に利用する必要がある。
【００１１】
（３）  ペプチド鎖を構成するアミノ酸残基数をＫとし、アミノ酸の種類を２０とすると、可能なアミノ酸配列の数はＫ２０にもなる。これに、アミノ酸側鎖の化学修飾を考えると、その数は更に増大する。
【００１２】
このため、化学修飾を考えた場合のデータベースを作成し、実用的な時間内で検索することは不可能に近い。
【００１３】
一方、化学修飾を外すためには化学的な前処理が必要であり、測定スループットの低下を招く恐れがある。また、現在市販されているデータベースに基づくマッチングソフトでは、ＭＳ２までの測定にしか対応していないと云う問題がある。
【００１４】
上記の課題を解決するためには、ＭＳｎ（ｎ≧３）の各段階において最適なイオン種の選定を実施し、ＭＳｎスペクトルに含まれる情報を有効に活用する必要がある。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
前記の課題を解決するため、本発明では、質量分析装置のうち測定対象となる物質をイオン化し、生成したイオン種の中から特定の質量数のイオン種を選択して解離させ、更に、測定対象となるイオン種の選択と解離および測定をｎ段階繰り返すタンデム型質量分析装置において、
ｎ段階目のタンデム質量分析を実施するか否かを、ｎ−１段階目のスペクトル測定により得られた全ての質量対電荷比（ｍ／ｚ）のピークに基づき、決定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、必要最低限の測定回数で、測定対象の構造情報を得ることが可能となる。
【００１６】
上記手段において、好ましくはｎ段階目のタンデム質量分析する際、ｎ−１段階目のスペクトル測定により得られた全ての質量対電荷比（ｍ／ｚ）のピークに基づき、装置に内蔵または外部接続された選択手段によって、イオン種を選択することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、多段階の解離を効率よく実施させ、より詳細に測定対象の構造情報を得ることが可能となる。
【００１７】
上記手段において、好ましくはｎ段階目にタンデム質量分析して得たマススペクトルを、データベースと比較して合致する場合には測定を終了し、合致しない場合にはｎ＋１段目のスペクトル測定を実施することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、必要最小限の測定回数で構造同定ができ、また、データベースに登録された構造がない場合には、詳細なスペクトル測定を実施することができる。
【００１８】
上記手段において、好ましくはｎ段階目にタンデム質量分析して得たマススペクトルを、データベースと比較して合致する場合には測定を終了し、合致しない場合にはデータベースと合致するまで、ｎ＋１段階目のスペクトル測定を実施することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、データベースとの照合による構造同定を確実に実行可能となる。
【００１９】
上記質量分析スペクトル解析システムにおいて、好ましくはイオン種の選択とスペクトルの測定を自動的に繰り返すことを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、測定者がスペクトルを見て、測定すべきイオンを選定する手順を省略することができ、測定ターンアラウンドタイムの短縮が可能となる。
【００２０】
好ましくは、上記の測定対象が蛋白質，ポリペプチド，糖，リン酸，酸素，水素，アルキル基，有機酸に類する化合物、または、その他の化合物のいずれかであるか、前記化合物により化学修飾された蛋白質もしくはポリペプチドであることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、タンデム型質量分析装置を用いた生体関連高分子の精度よい構造決定が可能となる。
【００２１】
好ましくは、上記における蛋白質，ポリペプチド，化学修飾された蛋白質、および、化学修飾されたポリペプチドについて解離イオン種の候補構造を予測し、その予測結果からペプチド鎖を構成するアミノ酸残基の配列を予測する。これによりペプチド鎖中に含まれるＭ残基以上の配列を明らかにできなかった場合には、配列が不明なアミノ酸残基を最も多く含む解離イオン種を選択して解離させ、ペプチド鎖中のＭ残基以上の配列が、明らかになるまでイオン種の選定と解離，測定を繰り返すことを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。
【００２２】
これにより、蛋白質，ポリペプチド，化学修飾された蛋白質，および、化学修飾されたポリペプチドの構造を、望む範囲で高精度に同定することが可能となる。
【００２３】
また、更に好ましくは、上記におけるＭの値が４，５，６または７のいずれかであることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、確定したアミノ酸配列を含む蛋白質またはポリペプチドをデータベース検索することで、全体のアミノ酸配列を類推できる。
【００２４】
また、更に好ましくは上記におけるＭの値を測定時、もしくは、測定前の段階で、測定者が指定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、測定対象中の任意の個数のアミノ酸残基を、同定することが可能となる。
【００２５】
上記において、好ましくは２段階目からｎ段階目までのマススペクトルを、加算もしくは加重した上で加算し、該加算スペクトルを用いて測定対象の構造を予測することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、多段階の解離スペクトルに対応したデータベースを用意しなくても、２段階目までの解離スペクトルデータと比較することで、構造同定が可能となる。
【００２６】
また、上記手段において、更に、好ましくは加算スペクトルのピーク群のうちアミノ酸由来のピーク群の数がトータルでＪ以上となるまで、以降の解離，測定を実行することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、必要最低限の解離と測定を実施すればよいので、測定スループットを向上させることができる。
【００２７】
また、上記手段において、好ましくはＪの値が４，５，６または７のいずれかであることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、確定したアミノ酸配列を含む蛋白質またはポリペプチドをデータベース検索することで、全体のアミノ酸配列を類推できる。
【００２８】
また、更に好ましくは、上記におけるＪの値を、測定時または測定前の段階で、測定者が指定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、測定対象中の任意の個数のアミノ酸残基を、同定することが可能となる。
【００２９】
好ましくは、上記の化学修飾された蛋白質または化学修飾されたポリペプチドについて、ｎ段階目の解離において修飾化合物を脱離させ、ｎ＋１段階目の解離で修飾化合物が脱離したポリペプチドまたは糖を解離させることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、化学修飾されていない構造でのマススペクトルを得ることができる。
【００３０】
データベースと実測スペクトルデータの比較の際、化学修飾されていない構造のデータベースを使用することができ、また、このため高速な構造検索が可能となる。
【００３１】
これにより、蛋白質またはポリペプチドを修飾している化合物を同定することが可能となる。また、化学修飾を外すための化学的な前処理が不要となり、測定スループットを向上させることができる。
【００３２】
上記解決手段において、好ましくは脱離した修飾化合物の構造を同定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより蛋白質またはポリペプチドを修飾している化合物を、同定することが可能となる。
【００３３】
上記の解決手段において、好ましくは蛋白質，ポリペプチドもしくは化学修飾された蛋白質、または、化学修飾されたポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、質量数が近いために一つのアミノ酸残基であるか、二つのアミノ酸残基であるか判別が困難な場合、判別が困難なアミノ酸を含むイオン種を選択して解離させることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、アミノ酸残基配列の候補対象を限定することができ、構造同定精度の向上が可能となる。
【００３４】
上記手段において、好ましくはイオン種の候補構造中にトリプトファン（Ｔｒｐ），アスパラギン（Ａｓｎ），グルタミン（Ｇｌｎ），グルタミン酸（Ｇｌｕ），アルギニン（Ａｒｇ）のいずれかを含むと予測された場合、左記アミノ酸残基を含むと予測されたイオン種を選択して、解離させることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、アミノ酸残基配列の同定精度を向上させることが可能となる。
【００３５】
上記の手段おいて、好ましくは糖および化学修飾された糖について解離イオン種の候補構造を予測し、該予測結果から前駆イオンを構成する単糖の配列あるいは配列の数を予測する。これにより糖鎖中のＭａ個以上の配列を明らかにできなかった場合には、配列が不明な単糖を最も多く含む解離イオン種を選択して解離させ、糖鎖中のＭａ個以上の配列が明らかになるまでイオン種の選定と解離，測定を繰り返すことを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、糖鎖構造を構成する単糖を同定することが可能となる。
【００３６】
更に、好ましくは、上記解決手段におけるＭａの値が４，５，６または７のいずれかであることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、明らかになった４〜７個の糖鎖配列をデータベースと比較し、全体の糖鎖を類推することが可能となる。
【００３７】
また、更に好ましくは、上記解決手段におけるＭａの値を測定時もしくは測定前の段階で測定者が指定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、糖鎖を構成する単糖を、任意の数だけ明らかにすることが可能となる。
【００３８】
上記解決手段において、好ましくは加算スペクトルのピーク群のうち、糖に由来するピーク群の数がトータルでＪａ以上となるまで、以降の解離，測定を実行することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、糖鎖構造を構成する単糖を同定することが可能となる。
【００３９】
また、更に好ましくは、上記解決手段におけるＪａの値が４，５，６または７のいずれかであることを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、明らかになった４〜７個の糖鎖配列を、データベースと比較し全体の糖鎖を類推することが可能となる。
【００４０】
また、更に好ましくは、Ｊａの値を測定時または測定前の段階で、測定者が指定することを特徴とする質量分析スペクトル解析システムにある。これにより、糖鎖を構成する単糖を任意の数だけ明らかにすることが可能となる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
〔実施例  １〕
図１は、本発明の質量分析スペクトルの解析システムのフロー図である。ここでは、アミノ酸残基数３０のポリペプチドを、消化酵素によって残基数５〜７程度のポリペプチド混合物としたものを試料とする。
【００４２】
まず最初に試料が注入され、前処理（ＬＣ：液体クロマトグラフィー）により分離された後、イオン化される。ここでのイオン化の方式は、穏和なイオン化方式として知られるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法である。
【００４３】
イオン化した試料は、トラップ型質量分析によって質量検出される。検出したイオンの質量数とスペクトル強度の情報は、データ処理装置に転送され、マススペクトルデータ（ＭＳ１と呼ぶ。以降、ｎ回目に測定されたマススペクトルをＭＳｎと呼ぶ）として、ストレージに蓄積される。
【００４４】
この測定されたマススペクトル（ＭＳ１）は、図２に示すようなスペクトルであり、ほぼ試料がイオン化したもののみが観測されている。
【００４５】
データ処理装置に内蔵されたソフトウエアは、検出したイオンの質量数から可能なアミノ酸配列の候補と、構成アミノ酸の個数を列挙して入出力デバイスに表示する。また、各イオンの質量数とアミノ酸配列の候補も、入出力デバイスに表示する。
【００４６】
ＭＳ１のスペクトルに複数のピークが存在する場合、測定者はアミノ酸候補の情報を参考に、構造を同定したいイオンを選定し、入出力デバイスを介してイオン選定部に指示する。本実施例では、図２のスペクトルにおけるピークａのイオンを選定する。
【００４７】
次に、再度試料をイオン化させて、ＭＳ２スペクトルを測定する。トラップ型質量分析装置は、ＭＳ１スペクトルの指定された質量数のイオンを選定して、ガス分子と衝突させ解離させる。生成した複数のイオン種は、トラップ型質量分析装置に導入され、図３に示すようなマススペクトル（ＭＳ２）が得られる。
【００４８】
図３のスペクトルデータは、データ処理装置に内蔵されたソフトウエアにより解析される。また、アミノ酸配列の候補とアミノ酸の構成個数が列挙され入出力デバイスに表示される。この時、ａ，ｂ，ｃおよびｚは、それぞれのピーク群に対応するアミノ酸配列とアミノ酸個数も同時に表示する。
【００４９】
この情報から、ｂおよびｃを構成するアミノ酸配列は、候補数が１０種以上となり不確定であることが分かった。そこで、ｂ、ｃのうち、ｃのピーク群に属するイオン種を選定して更に解離と測定を実施した。こうして得られたマススペクトル（ＭＳ３）を図４に示す。
【００５０】
図４のスペクトルをデータ処理装置で解析することにより、ｃのピーク群のアミノ酸配列を決定でき、更に、ａを構成するアミノ酸配列を決定することができる。
【００５１】
このように測定者はＭＳｎ−１（ｎ≧２）のスペクトル解析結果を参考に、ＭＳｎで測定すべきイオン種を選定する。これを候補構造が絞られるまで繰り返す。更に、全アミノ酸配列が決定した段階で測定終了する。この際、次の試料を測定する場合には、再び試料を導入し、以上の操作を実施する。
【００５２】
以上のように本実施例により、ＭＳ３以降の測定において、最適なイオン種を選定することで同定精度の向上が可能となる。
【００５３】
〔実施例  ２〕
本発明にかかる質量分析スペクトルの解析システムについて図５を用いて以下に説明する。
【００５４】
図５は本発明の質量分析スペクトル解析システムのフロー図で、ここでは糖鎖を試料とする。
【００５５】
最初に試料が注入され、前処理（ＬＣ：液体クロマトグラフィー）により分離処理された後、イオン化される。ここで、イオン化の方式は、穏和なイオン化方式として知られるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法である。イオン化した試料は質量分析装置によって測定され、ＭＳ１スペクトルが得られる。
【００５６】
次に、ＭＳ１で得られたイオンの質量数およびＬＣの保持時間を、図６に示すようなデータベースと比較する。データベースは保持時間とＭＳ１で得られるイオンの質量数、糖鎖の種類の情報で構成されている。図６の場合、Ａ〜Ｆまでの６種類の糖鎖が登録されている。
【００５７】
本実施例で測定した糖鎖は、ＬＣの保持時間が約２０秒、ＭＳ１で得られたイオン種の質量が１７００Ｄａであったので、測定対象とした糖鎖は“Ｂ”であることが分かる。データベースとの一致で、得られ糖鎖が特定できたのでこの段階で測定を終了する。もしデータベースとの比較で、一致が見られない場合には更に、ＭＳ２以降のスペクトル測定を実施し、測定者が構造同定に必要な情報を十分得るまでＭＳｎ測定を繰り返す。
【００５８】
上記の本実施例により、データベースを利用することで、最低限の測定回数で構造決定ができ、また、データベースで構造決定できない場合には、構造同定に必要な回数の測定を実施する。
【００５９】
〔実施例  ３〕
実施例２では、ＭＳ１スペクトルをデータベースと比較して以降の測定を実施するかどうか判定していたが、全ての段階の測定において（ＭＳｎ，ｎ≧１）データベースとの比較を実施しても同様の効果を奏する。但し、この場合、ＭＳｎ測定に対応したデータベースが必要となる。
【００６０】
〔実施例  ４〕
実施例１では、イオン種の選定を測定者が実施していたが、データ処理装置にイオン種の選定作業を実行させることにより、自動的に測定および測定対象の同定を繰り返すことができる。
【００６１】
本実施例により、測定者が測定すべきイオンを選定する手順を省略することができ、測定ターンアラウンドタイムの短縮が可能となる。
【００６２】
〔実施例  ５〕
前記実施例ではポリペプチドおよび糖を測定対象としたが、糖，リン酸，酸素，水素，アルキル基，有機酸に類する化合物もしくはその他の化合物のいずれかであるか、前記化合物により化学修飾された蛋白質またはポリペプチドであっても同様の効果を奏する。
【００６３】
〔実施例  ６〕
本発明の質量分析スペクトルの解析システムについて、図５のフロー図を用いて以下に説明する。
【００６４】
図７は実施例１において測定したＭＳ１〜ＭＳ３スペクトルにおけるアミノ酸配列の確定の様子を示す図である。図７において、ＭＳ１スペクトルでは、親イオン（ａ）の構造は不確定であり、その質量数だけが明らかである。
【００６５】
次に、ＭＳ２スペクトルでは、親イオンから一つのアミノ酸残基が脱離したイオン（ｂ）、二つ脱離したイオン（ｃ）、および、親イオンのＣ末端側二つのアミノ酸から構成されるイオン（ｚ）が観測される。
【００６６】
質量数を比較することにより、Ａ４およびＡ５のアミノ酸残基が確定される。その一方で、Ａ１〜Ａ３の部分は不確定である。そこで、測定すべきイオンとしてＡ１〜Ａ３の残基を含むｂまたはｃを選び、更に、解離させＭＳ３スペクトルを測定する。ここで、ｂは既に確定されたＡ４の残基を含んでいるため、得られるスペクトルはｃよりも複雑になる。これを回避するため、より質量数が小さく残基数が少ないｃのイオンを選定する。
【００６７】
ＭＳ３スペクトルではｃが解離してｄおよびｅのイオンが生成される。それぞれの質量数を比較することにより、Ａ２およびＡ３の残基が確定される。また、親イオン（ａ）の質量数も既に明らかなので、Ａ１の残基を決定することができる。
【００６８】
本実施例においては、ＭＳｎ−１（ｎ≧３）のスペクトル解析により、不確定なアミノ酸残基の数が最も多いピーク群、また、好ましくはこの中で最も質量数が小さいピーク群を選定し、ＭＳｎ（ｎ≧３）スペクトルを測定する。
【００６９】
また、この選定作業を自動的に実行し、Ｍ個以上（本実施例ではＭ＝５）のアミノ酸配列が明らかになるまで測定を繰り返す。本実施例では、ＭＳ３で５残基の配列が決定でき、また、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基も５残基であるので、ＭＳ３で測定を終了する。
【００７０】
以上のように、本実施例によりポリペプチドの構造を、望む範囲で精度良く同定することが可能となる。
【００７１】
〔実施例  ７〕
本実施例では、確定すべきアミノ酸残基の数Ｍを４〜７とした場合について説明する。
【００７２】
既知の蛋白質のアミノ酸配列情報は、ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）などのデータベースに蓄積されている。これらの配列情報データベースと測定したアミノ酸配列を比較することにより、酵素消化する以前の試料蛋白全体の配列構造を類推することが可能である。このためには、５残基程度のアミノ酸配列が明らかであればよい。
【００７３】
また、試料とした蛋白質の構成残基数が少ない場合、もしくは、特殊なアミノ酸配列である場合には、４残基としても同様に全アミノ酸配列を類推できる。
【００７４】
また、試料が様々な蛋白質に共通なアミノ酸配列を含むと予想される場合には、決定すべき残基数を６または７残基とすることにより、全アミノ酸配列を類推できる。
【００７５】
以上のように本実施例により、試料中のアミノ酸配列を４〜７残基明らかにすることで、全アミノ酸配列を類推することができる。
【００７６】
〔実施例  ８〕
実施例６，７において、Ｍの値を与えることにより、測定対象中の任意の数のアミノ酸配列を明らかにすることができる。
【００７７】
〔実施例  ９〕
本実施例を図８を用いて説明する。図８はポリペプチドを測定して得たＭＳ２、ＭＳ３スペクトルを加算したものである。また、点線で示すものは、左記スペクトルを隣接平均して平滑化処理したものである。
【００７８】
ここでは、隣接平均する質量範囲を１８Ｄａとしている。これは水（質量数１８Ｄａ）、または、アンモニア（質量数１７Ｄａ）の脱離によって生成する派生スペクトルを、一つのアミノ酸残基から派生したスペクトルとして考慮するためである。
【００７９】
図８における点線は５つの極大値を持ち、スペクトルを５個のピーク群に分類できることが分かる。また、測定対象がポリペプチドであることから、いずれのピーク群もアミノ酸由来であると考えられる。従って、測定対象には少なくとも５残基以上のアミノ酸残基が含まれていることが分かる。
【００８０】
これらのピーク群の質量数を解析することにより、５つのアミノ酸残基を特定し得る。特定すべきアミノ酸残基数Ｊを５としている場合には、上記のスペクトルを得た段階で測定を終了しても構わない。
【００８１】
以上のように本実施例により測定回数を限定し、測定ターンアラウンドタイムを最小限にすることが可能となる。
【００８２】
〔実施例  １０〕
Ｊの値が４〜７のうち、いずれかである場合について説明する。既知の蛋白質のアミノ酸配列情報はＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）などのデータベースに蓄積されている。これらの配列情報データベースと、測定したアミノ酸配列を比較することにより、酵素消化する以前の試料蛋白全体の配列構造を類推することが可能である。このためには、５残基程度のアミノ酸配列が明らかであればよい。
【００８３】
また、試料とした蛋白質の構成残基数が少ない場合、または、特殊なアミノ酸配列である場合には、４残基としても同様に全アミノ酸配列を類推できる。
【００８４】
また、試料が様々な蛋白質に共通なアミノ酸配列を含むと予想される場合には、決定すべき残基数を６または７残基とすることにより、全アミノ酸配列を類推できる。
【００８５】
以上のように本実施例により、試料中のアミノ酸配列を４〜７残基明らかにすることで、全アミノ酸配列を類推できる。
【００８６】
〔実施例  １１〕
本発明に係り、化学修飾されたポリペプチドの修飾部分を外して測定を実施する方法について説明する。
【００８７】
図９は、化学修飾されたポリペプチドのＭＳ２スペクトルである。図９におけるスペクトルはピーク１００，１０１および１０２の主として３本のピークから構成される。
【００８８】
ピーク１００とピーク１０１の差、Δｍは８０．０Ｄａであり、またピーク１０２の質量数も同様に８０．０Ｄａである。このことから、ピーク１００は化学修飾されたポリペプチドに由来し、ピーク１０１は化学修飾が外れたポリペプチドに由来し、ピーク１０２は修飾化合物であるリン酸に由来すると考えられる。従って、ピーク１０１のイオンを選定してＭＳ２以降の測定を実施すれば、リン酸化されていないポリペプチドと、同様のスペクトルが得られる。
【００８９】
リン酸化以外に考えられる化学修飾と、Δｍの値は表１のようになる。
【００９０】
【表１】
2004257922.tif 000002
【００９１】
表１に示した化学修飾を受けたポリペプチドは、いずれも上記に述べたように最大質量数のピークからΔｍだけ低い質量数にピークを持ち、更に、低質量数側にはΔｍの質量を持つピークが現れる。最大質量数のピークからΔｍだけ低い質量数のイオンを測定することにより、化学修飾されていないペプチドを測定することが可能である。
【００９２】
以上のように本実施例により、化学修飾を外されたため、化学処理や修飾構造を考慮したデータベースを用いなくても、化学修飾された測定対象の構造同定が可能となる。
【００９３】
〔実施例  １２〕
実施例１１において、修飾化合物を同定する方法について以下に説明する。
【００９４】
まず、修飾された測定対象のＭＳ１スペクトルを測定し、図７のようなスペクトルを得る。
【００９５】
実施例９で述べたように、図７におけるピーク１０２は質量数８０．０Ｄａであり、またピーク１０１と１００の質量数の差も８０．０Ｄａである。従ってピーク１０２はピーク１００から質量数８０．０Ｄａの修飾化合物（リン酸に相当）が脱離してイオン化したものと考えられる。
【００９６】
修飾化合物がリン酸以外の場合、Δｍの値は表２のようになる。
【００９７】
【表２】
2004257922.tif 000003
【００９８】
Δｍの値が大きくなると（Δｍ＞５０Ｄａ）、ＭＳ１スペクトルだけでは同定が困難になるので、ピーク１０２を解離させてＭＳ２以降のスペクトルを測定し、データベース検索して構造を同定する。以上のように本実施例により修飾化合物の同定が可能となる。
【００９９】
〔実施例  １３〕
本発明に係る実施例を表１を用いて説明する。表１は、一つのアミノ酸残基の質量数と、それに近い二つのアミノ酸残基の質量数の和を比較したものである。表１より、例えばリジン（Ｌｙｓ）の質量数とグリシン（Ｇｌｙ）とアラニン（Ａｌａ）の質量数の和はほぼ同一であり、分解能の低い装置では区別できない。従って、イオン種の候補構造中にＬｙｓが現れた場合、実際のイオン種にはＧｌｙとＡｌａが同時に含まれている場合もあり得る。
【０１００】
このような場合、対応する図１０を用いて次に説明する。図１０ではＭＳ２の段階で測定されたイオン種について、スペクトルデータ解析システムは候補構造１と候補構造２を与えた。これは上記に述べたようにＬｙｓの質量と、Ｇｌｙ，Ａｌａの質量の和が近いため、両者を区別できなかったことによる。
【０１０１】
このような場合、スペクトルデータ解析システムは、更に、ＭＳ３測定を実施する。
【０１０２】
本実施例では、ＭＳ３測定の段階でもＬｙｓもしくはＧｌｙ−Ａｌａを区別できないため、更にＬｙｓ（もしくはＧｌｙ−Ａｌａ）を含むと考えられるイオン種を選定しＭＳ４測定を実施する。
【０１０３】
ＭＳ４ではＧｌｙ−Ａｌａの結合が切れて、Ｇｌｙ単独のイオンが観測されるため、候補構造２（もしくは候補構造２’）が実際の構造であることが分かった。
【０１０４】
このように、質量数が近く判別が困難と考えられるアミノ酸（もしくはアミノ酸ペア）を候補構造中に含む場合には、前記のアミノ酸を含むイオン種を選定することにより、構造を同定することができる。
【０１０５】
以上のように本実施例により、アミノ酸残基配列の候補対象を限定することができ、構造同定精度の向上が可能となる。
【０１０６】
〔実施例  １４〕
実施例１３において、特に、トリプトファンに注目してイオン選定する方法について以下に述べる。
【０１０７】
トリプトファン（Ｔｒｐ）の質量数は１８６．２Ｄａであり、表２に示すように、多くの二つのアミノ酸の組合せとほぼ同一、もしくは、全く同一の質量数を持つ。従って、ある特定の質量を持つイオン種の中にトリプトファンが含まれるか、あるいは、上記に挙げた様な、その他の二つのアミノ酸が含まれるか決定するには、Ｔｒｐ、または、Ｔｒｐに近い質量数を持つと予測されるイオン種を、更に解離させて測定する必要がある。
【０１０８】
本実施例により、アミノ酸残基配列の候補対象を限定することができ、構造同定精度の向上が可能となる。
【０１０９】
〔実施例  １５〕
本発明の実施例のうち、ＭＳ２以降に測定した全てのスペクトルを加算する方法について説明する。
【０１１０】
図１１は、ポリペプチドのＭＳ１〜ＭＳ３までのスペクトルである。一般的なデータベースとのマッチングにより、構造解析するソフトではＭＳ３以降のスペクトル解析に対応していないことが多い。
【０１１１】
そこで、このような解析ソフトによるアミノ酸配列決定を可能とするため、ＭＳ２およびＭＳ３のスペクトルを加算して一つのスペクトルを作成する。本実施例ではＭＳ３のスペクトル最大強度がＭＳ２に比較して１／３程度である。もし、ＭＳ３のスペクトル最大強度がＭＳ２に比較して１／１０以下になる場合にはＭＳ３のスペクトル値に一定の値を乗じ、加重処理してもよい。こうして作成した加算スペクトルを、解析ソフトで処理することにより、アミノ酸配列決定が可能となる。
【０１１２】
〔実施例  １６〕
前記実施例６〜１０において、測定対象が糖または化学修飾された糖であっても同様の効果を奏する。
【０１１３】
糖の場合、構成単位はアミノ酸ではなく単糖であるので、糖鎖中における単糖の配列を明らかにすることができる。
【０１１４】
〔実施例  １７〕
前記実施例１１〜１２において、測定対象を糖または化学修飾された糖であっても同様の効果を奏する。
【０１１５】
糖の場合、構成単位はアミノ酸ではなく単糖であるので、化学修飾を脱離させることによって、修飾されていない糖鎖構造を明らかにできる。また、脱離した修飾化合物を計測することで、修飾化合物の構造を同定することができる。
【０１１６】
【発明の効果】
本発明によれば、より少ない測定時間でＭＳｎ（ｎ＞２）スペクトルの測定とスペクトル同定が可能となる。特に、蛋白質，ポリペプチド，糖および化学修飾された蛋白質，ポリペプチドの高精度の同定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る質量分析スペクトル解析システムのフロー図である。
【図２】本発明の実施例１に係る質量分析スペクトル図である。
【図３】本発明の実施例１に係る質量分析スペクトル図である。
【図４】本発明の実施例１に係る質量分析スペクトル図である。
【図５】本発明の実施例２に係る質量分析スペクトルの解析システム図である。
【図６】本発明の実施例に係る糖鎖データベース図である。
【図７】本発明の実施例１に係る質量分析スペクトル解析図である。
【図８】本発明の実施例９に係る質量分析スペクトル解析図である。
【図９】本発明の実施例１１に係る質量分析スペクトル解析図である。
【図１０】本発明の実施例１３に係る質量分析スペクトル解析図である。
【図１１】本発明の実施例１５に係る質量分析スペクトル解析図である。
【符号の説明】
１００…化学修飾されたポリペプチドに由来するマスピーク、１０１…化学修飾がはずれたポリペプチドに由来するマスピーク、１０２…リン酸に由来するマスピーク。
【図１】
2004257922.tif 000004
【図２】
2004257922.tif 000005
【図３】
2004257922.tif 000006
【図４】
2004257922.tif 000007
【図５】
2004257922.tif 000008
【図６】
2004257922.tif 000009
【図７】
2004257922.tif 000010
【図８】
2004257922.tif 000011
【図９】
2004257922.tif 000012
【図１０】
2004257922.tif 000013
【図１１】
2004257922.tif 000014