(57)【要約】【課題】  試料中の蛋白質分解物質および／または核酸分解物質に阻害効果を引き起こす組成物に対して試料を曝露することによって試料中の細胞および核酸を保存するための方法を提供すること。【解決手段】  本発明の方法に有用な組成物は、試料中の蛋白質分解物質の蛋白質分解活性および／または核酸分解物質の核酸分解活性に必要な微量金属に結合する、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびＥＤＴＡのようなキレート剤を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の細胞の核酸の完全性を保存する方法であって、前記試料中の蛋白質分解物質の阻害を引き起こす組成物に対して前記試料を曝露することを含み、前記組成物は有効濃度のキレート剤強化成分は含まないことを特徴とする方法。
【請求項２】
蛋白質分解物質の阻害を引き起こす前記組成物は、前記蛋白質分解物質の活性に必要な少なくとも１種の補因子に結合する組成物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料中の細胞の核酸の完全性を保存する方法であって、前記試料中の核酸分解物質の阻害を引き起こす組成物に対して前記試料を曝露することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
核酸分解物質の阻害を引き起こす前記組成物は、前記核酸分解物質の活性に必要な少なくとも１種の補因子に結合する組成物であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記補因子は微量金属であることを特徴とする請求項２または４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分解物質の活性に必要な少なくとも１種の補因子に結合する前記組成物は、キレート化合物であることを特徴とする請求項２または４に記載の方法。
【請求項７】
前記キレート化合物はクエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびＥＤＴＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項８】
核酸の完全性を保存するための反応混合物であって、細胞を含む試料と蛋白質分解物質または核酸分解物質の活性に必要な少なくとも１種の補因子に結合する組成物とを含み、前記組成物は有効濃度のキレート剤強化成分は含まないことを特徴とする反応混合物。
【請求項９】
蛋白質分解物質または核酸分解物質の活性に必要な少なくとも１種の補因子に結合する前記組成物は、キレート化合物であることを特徴とする請求項８に記載の反応混合物。
【請求項１０】
前記キレート化合物はクエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびＥＤＴＡからなる群から選択されたことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、概して、核酸をハイブリダイゼーションおよび増幅などのある種の診断方法に適するものとするために、このような核酸の完全性を維持することに関する。より詳細には、本発明は蛋白質分解物質および／または核酸分解物質に対して阻害効果を引き起こす組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分子を利用する診断方法には、標的核酸の存在および／または量を測定する核酸プローブハイブリダイゼーション、核酸増幅法および核酸伸長を含む酵素活性のための核酸プライマーハイブリダイゼーション、ニッキングおよび／または開裂が含まれる。ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）などの核酸増幅法を使用して、試料中に存在するコピー数が少ない特定の関心のある核酸配列（標的配列）のコピー数を増す。
【０００３】
ＤＮＡ分解酵素および蛋白質分解酵素を不活性化する公知の方法は、試料を１００℃で１５分間加熱する方法である（たとえば、非特許文献１参照）。蛋白質分解酵素を不活性化するその他の方法では、チオシアン酸グアニジニウムまたはチオシアン酸ナトリウムのようなカオトロピック剤を使用して、これらの酵素蛋白質を変性させる（たとえば、参照により本明細書の一部をなすものとする特許文献１参照）。ヌクレアーゼおよび蛋白質分解酵素の不活性化に加えて、カオトロピック剤はまた、広範囲な生物材料の細胞壁の溶解を促進することが知られている（参照により本明細書の一部をなすものとする特許文献２参照）。したがって、細胞壁の保存も所望するときには、プロテアーゼまたはヌクレアーゼの不活性化を促進するカオトロピック剤の使用は避けるべきである。
【０００４】
核酸を保存する方法のより一般的な説明は、Exact Laboratoriesに対する特許文献３よって提供されており、糞便試料中の剥離したヒト上皮細胞からＤＮＡを抽出する方法においてヌクレアーゼ阻害剤としてＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを使用することが開示されている（特許文献３参照）。また、京都医科学研究所、ＫＫは、尿中の細胞の保存方法に関する２つの日本特許の開示を所有する。抗菌剤としてのＥＤＴＡに加えて緩衝剤としてクエン酸を使用することが開示されており（特許文献４参照）、およびクエン酸およびＥＤＴＡに加えてフッ素化合物としてフッ化ナトリウムを使用することが開示されている（特許文献５参照）。Sierra Diagnosticsはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）またそれらの塩と共に、少なくとも一種の「キレート剤強化成分」（塩化リチウム、グアニジン、サリチル酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウムまたはチオシアン酸ナトリウム）を使用することを開示している（特許文献６）。塩化リチウム、グアニジンおよびチオシアン酸ナトリウムは当業者に公知のカオトロピック剤である。キレート剤強化成分の効果的な濃度の範囲は、約０．１Ｍから約２．０Ｍである。
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４，８４３，１５５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２３４，８０９号明細書
【特許文献３】国際公開００／５０６４０号パンフレット
【特許文献４】特開平０４−１１８５５７号公報
【特許文献５】特開平０５−２４９１０４号公報
【特許文献６】国際公開９９／２９９０４号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開第０，９１５，１７１号明細書
【特許文献８】米国特許第５，９７３，１３８号明細書
【非特許文献１】Sambrook, J., Fritsh, E.F., and Maniatis, T.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これらの方法の多くは、時間がかかり、労働集約的であり、および／またはそれに関連する煩雑な安全に関する要件を有する。比較的厳しい処理工程または条件を使用する方法の他の問題点は、ある標的核酸配列の損失である。核酸増幅方法は非常に少ないオリジナルの標的から標的配列（アンプリコン）の複数のコピーを作製する能力を有するにもかかわらず、オリジナルの標的が試料中に大量にある場合に、増幅効率および検出能力が向上する。抗酸性バチルス属（Bacillus）（ＡＦＢ）、塗抹陰性の結核菌（Mycobacterium tuberculosis）試料のような検出することが特に困難な試料を処理するときに、より高い検出能が非常に重要でありうる。
【０００７】
分子診断法を実施する試料に関する別の共通の問題点は、時間に関する試料の安定性である。ある場所で試料を採取し、次に分子診断法の集中試験所のような他の場所に輸送するとき、試料の安定性がより重要となる。
【０００８】
たとえば、多くの臨床的に重要な生物は、尿試料および膣および頸部スワブ中では、室温で約２４時間より長くにわたっては、それらの完全性を維持しない。したがって、このような試料は、集中試験所に輸送中および／または保存中に、冷蔵することが必要となる。尿試料およびスワブから通常試験され、室温で保存された試料中では不安定なことが周知な１つの被検体は、淋菌（Nisseria gonorrhoeae）である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
標的核酸の完全性の維持および試料安定性の維持に関連した問題を解決し、したがって標的核酸配列の検出改善の利益を実現するために、本発明は、試料中の蛋白質分解物質および／または核酸分解物質に対する阻害効果を引き起こす組成物に対して試料を曝露することによって、試料中の細胞および核酸を保存する方法を提供する。本発明の方法に有用なこのような組成物には、試料中の蛋白質分解物質の蛋白質分解活性および／または核酸分解物質のヌクレアーゼ活性に必要な微量金属に結合するキレート剤、たとえばクエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびＥＤＴＡが含まれる。本発明の組成物は、有効濃度の「キレート剤強化成分」もカオトロピック剤も含まない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
前述のように、本発明は、有効濃度の「キレート強化剤」またはカオトロピック剤は含まないが、それにもかかわらず試料中の蛋白質分解物質および／または核酸分解物質に対する阻害効果を引き起こす組成物に試料を曝露することによって、試料中の細胞および核酸を保存する方法に関する。この方法では、細胞溶解前にこのような組成物に試料を曝露して、核酸を含有する細胞を試料中に安定に維持するようにする。
【００１１】
本発明の方法を実施することができる試料の種類には、喀痰試料、血液試料、尿試料、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）試料、膣および頸部スワブその他のような、実質的にすべてのヒトおよび家畜の臨床試料、水、空気および土壌試料のような環境試料、および食品試料が含まれる。本発明の方法を実施できる試料は、直接プローブハイブリダイゼーションまたは増幅方法の開始のためのプライマーハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーションを含むことができる診断方法を実施する標的核酸配列を有する細胞を含有することが推測される。
【００１２】
このような試料に一般的に見いだされる蛋白質分解物質には、蛋白質分解酵素、たとえばレニンのようなエンドペプチダーゼ、トリプシンおよびキモトリプシンのようなエキソペプチダーゼ、およびカテプシンを含むプロテアーゼが含まれる。試料中に存在するとき、蛋白質分解物質は細胞壁の分解を引き起こし、したがって診断する標的核酸を含む核酸を放出させる。次にこのように放出された核酸は、診断方法に悪影響を及ぼす他の作用物質の作用を受ける。該作用物質は、分解酵素（ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素のようなもの）、および核酸ハイブリダイゼーションおよび／または増幅方法を阻害する物質（ヘムおよびヘマチンから得られたポルフィリン化合物のようなもの）、血清酵素（アプロチニン、ロイペプチンＰＭＳＦおよびペプスタチンのようなもの）、および尿素のようなものである。核酸、特に標的核酸をこのような作用物質に曝露すると、核酸について実施される診断方法のいずれにも悪影響が及ぶ。したがって、細胞壁の早期の溶解を阻害することによって核酸とこのような作用物質との接触を防止することによって、診断方法を試料に実施できるまでの長期間にわたって安定な試料を維持することが可能となる。
【００１３】
本発明の方法には、有効濃度のキレート強化剤またはカオトロピック剤は含まないが試料中の蛋白質分解物質および／または核酸分解物質に対する阻害効果を引き起こす組成物に試料を曝露することを伴う。この曝露は、細胞が溶解して標的核酸が放出される前のいかなる時点でも行うことができる。この曝露によって、細胞試料と、蛋白質分解物質および／または核酸分解物質の活性に必要な少なくとも一種の補因子に結合する組成物とを含有する反応混合物が得られる。
【００１４】
多くのこのような組成物は、本発明の方法に有用である。このように有用な組成物の例には、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、フッ化ナトリウムおよびＥＤＴＡなどのキレート剤が含まれる。このようなキレート剤は、試料中の蛋白質分解物質の蛋白質分解活性に必要な微量金属に結合する。したがって、蛋白質分解物質は、細胞壁を分解するために効果的に、またはまったく作用することができない。これによって細胞壁は無傷のまま維持され、そして細胞内の核酸分子の完全性が維持される。なぜなら、該核酸分子が分解を引き起こす作用物質に曝露されないからである。
【００１５】
蛋白質分解物質の阻害を引き起こす組成物は、あらゆる形態または状態で使用することができる。たとえば、このような組成物は乾燥顆粒形態、圧縮錠剤、この組成物を含有する溶解可能なカプセル、またはこの組成物を含有する袋のような透過性賦形剤中の固体または液体として、試料に曝露することができる。また、この組成物（任意の形態）を、試料を保持する容器に添加するか、または試料を添加する容器に組み込むことができる。
【００１６】
本発明の方法に有用なこのような組成物の濃度は、約２．５ｍＭから約３５０ｍＭの範囲内で変動し、好ましい範囲は約５ｍＭから約１００ｍＭである。本発明の方法が効果的な温度の範囲は、約５℃から約６０℃の範囲内で変動である。
【００１７】
本発明の方法に有用なその他の組成物は、このような組成物の最適特性（たとえば蛋白質分解物質の阻害を引き起こすこと）を指向する通常のスクリーニング試験を実施することによって、成功の合理的予測を、当業者が確認することができる。
【００１８】
本明細書で示した実施例は、当業者が特定の組成物が本発明の方法に有用であるらしいかどうかを迅速に決定することができる、簡単かつ直接的な通常のスクリーニング試験を提供する。
【００１９】
組成物と試料を互いに曝露させるとき、蛋白質分解酵素のような蛋白質分解物質ならびにＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素のような核酸分解酵素に必要な補因子である、マグネシウム、カルシウム、亜鉛およびマンガンなどの微量金属が組成物に結合する。このような結合状態では、微量元素は、それら補因子の機能を利用できない。したがって、細胞壁に対する蛋白質分解物質および核酸に対する核酸分解酵素の分解作用が阻害される。
【００２０】
本発明の方法のために組成物と試料との互いに対する曝露有効であるための時間の長さは、一般的に最小限で、最大限の時間はない。微量金属の結合は、組成物と試料を互いに曝露させるとほぼ直ちに開始され、そして、このような結合は、時間が経っても測定できるほどに消失しない。概して、本発明の方法が有効であるためには、組成物と試料との互いの曝露は、３０分以上であるべきである。
【００２１】
任意選択で、このような曝露の後に、組成物と試料を分離してもよい。このような分離は遠心分離、濾過などのさまざまな手段によって実施することができ、透過性賦形剤を使用した場合は、透過性賦形剤を物理的に試料から除去するか、または処理した試料を単純にピペッティングによって取り出すことができる。
【００２２】
現在では、さまざまな方法を使用してハイブリダイゼーションまたは増幅のために試料中の標的核酸が調製されている。たとえば、マイコバクテリアの核酸配列を増幅するために処理される喀痰試料は、一般的にＮＡＬＣ／ＮａＯＨ方法にかけられる。同様に、別の種類の臨床試料は、別の周知の標準的方法（たとえば血液および尿などの大量試料に関しては遠心分離）にかけられる。本発明の方法は、このような標準的方法の前に、標準的方法の一部として、あるいは標準的方法の後に使用することができる。
【００２３】
細胞壁の完全性および核酸の完全性を維持することに関する本発明の方法の有用性に加えて、該方法は、同様に室温で輸送するために試料を安定化させる。本発明の方法によって生じる蛋白質分解物質および／または核酸分解物質の阻害は、慣用の試料保存方法を使用する現在利用できる方法よりも長時間室温での試料の保存および試料の輸送を可能にする。たとえば、特許文献７に開示されるような混合床イオン交換樹脂を使用すると、４日間ほどの長さにわたる尿試料の室温保存を可能とするが、一方、以下の実施例で示される本発明の方法では、少なくとも１４日間の尿試料の室温保存を可能とする。
【００２４】
以下の実施例では本明細書に記載された本発明の特定の実施形態を例示する。当業者に明らかなように、さまざまな変化および変更が可能で、それらの変化および変更は、記載された本発明の範囲内であると考えられる。
【実施例１】
【００２５】
尿中における淋菌(N. gonorrhoeae)ＤＮＡ分解の防止
本実施例の目的は、本発明の方法がヒト尿中で淋菌プラスミドＤＮＡの分解を排除するかどうかを判定することであった。
【００２６】
材料：
BDProbeTec（商標） ET 淋菌プライミングマイクロウェル（ＢＤ）
BDProbeTec（商標） ET 淋菌増幅マイクロウェル（ＢＤ）
BDProbeTec（商標） ET 淋菌プラスミドＤＮＡ（ＢＤ）
BDProbeTec（商標） ET 器具および器具プレート
BDProbeTec（商標） ET 溶解ヒーター
BDProbeTec（商標） ET プライミングおよび加熱ヒーター
BDProbeTec（商標） ET ピペッターおよびピペットチップ
クエン酸ナトリウム、三ナトリウム塩（Sigma）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「ＥＤＴＡ」（Sigma）
陰性のプールされた尿
グリシンＨＣｌ（Sigma）
四三酸化鉄（Pea Ridge Iron Ore）
ジメチルスルホキシド「ＤＭＳＯ」（Sigma）
ビシン（Sigma）
グリセロール（Sigma）
水酸化カリウム「ＫＯＨ」（Sigma）
【００２７】
方法：
１０、４０および１００ｍＭ（最終濃度）のクエン酸ナトリウム、１０、２０および４０ｍＭ（最終濃度）のＥＤＴＡを用い、および化学的添加物を用いずに、体積２０ｍｌの陰性のプールされた尿を調製した。さらに、体積２０ｍｌの陰性のプールされた尿を３０分間にわたって加熱した（加熱処理尿）。この試料を室温で６０分間にわたってインキュベートした。インキュベーション工程の後に、試料を淋菌プラスミドＤＮＡ（２５００ＤＮＡコピー／ｍｌ）を加えた。試料に室温で６０分間にわたってインキュベートした。インキュベーション工程の後に、それぞれの試料に由来する２ｍｌ体積（各試料について８回繰り返し(eight replicates)）を３０分間にわたって１１４℃に加熱して、ＤＮＡを変性させた。
【００２８】
加熱変性したＤＮＡを、特許文献８に記載されるように酸性環境で常磁性粒子を用いて、試料から単離した。前述の各試料について８回繰り返しの１ｍｌ量を四三酸化鉄に添加した。体積１００μｌの６ＭグリシンＨＣｌを、各試料に添加した。ＤＮＡ−四三酸化鉄複合体を磁石で分離し、９００μｌの１ｍＭグリシンＨＣｌで２回洗浄して、イオン強度を下げ、非特異的に結合した物質を除去した。体積４８０μｌの溶出緩衝液（８８．３ｍＭのＫＯＨ、１７７．８ｍＭのビシン、１２．１％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび１１．０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（最終濃度））を用いて、ＤＮＡを四三酸化鉄から放出させた。
【００２９】
製造元（BDProbeTec（商標）ET  トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）および淋菌増幅DNA Assay Package Insert L-000203（１９９９年１１月））の指示に従って、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）を実施した。体積１５０μｌのそれぞれの試料をプライミングマイクロウェルに添加した。プライミングマイクロウェルプレートを室温で２０分間にわたりインキュベートし、その後プレートを７２．５℃でインキュベートした。増幅マイクロウェルプレートを５４℃でインキュベートした。１０分後、各プライミングマイクロウェルの１００μｌ量を、対応する増幅マイクロウェルに添加した。増幅マイクロウェルプレートをBDProbeTec ET器具に入れた。データはＭＯＴＡ値（metric other than acceleration）として記録した。
【００３０】
結果
結果は、以下の表に各処理試料の平均増幅ＭＯＴＡ値（各試料について８回繰り返し）として示す。
【００３１】
【表１】
2004159648.tif 000002
【００３２】
結論
この実施例のデータは、１０、２０および４０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび１０、４０および１００ｍＭのＥＤＴＡが、ヒト尿中の淋菌プラスミドＤＮＡを、内在性ヌクレアーゼによる分解から保護したことを示す。また、このデータは、加熱処理尿では淋菌プラスミドＤＮＡの分解が防御されていることを示す。
【実施例２】
【００３３】
クエン酸ナトリウムによる尿中の淋菌細胞の安定性
この実施例の目的は、ヒト尿中において室温で１４日間の淋菌の無傷細胞の安定性を決定することであった。
【００３４】
材料
実施例１に記載されるのと同一の増幅試薬および器具
クエン酸ナトリウム（Sigma）
ＢＳＡ／ＰＢＳ（０．２％牛血清アルブミン、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭ塩化ナトリウム）
陰性のプールされた尿
ＣＴ／ＧＣ希釈剤（ＢＤ）
淋菌  ATCC 19424
Dynac II  遠心分離機（ＢＤ）
【００３５】
方法
１００ｍＭ（最終濃度）クエン酸ナトリウムを用いて、および用いずに、体積８０ｍｌの陰性のプールされた尿を調製した。試料に、最終濃度２５００細胞／ｍｌにおいて、淋菌細胞を加えた。それぞれの試料を室温で１４日間にわたりインキュベートした。特定の時点で（０、６および１４日目）、それぞれの試料の２．０ｍｌ（各試料について８回繰り返し）を、室温で３０分間にわたり２０００×ｇで遠心分離した。上清を傾瀉し、細胞ペレットをＢＳＡ／ＰＢＳ２．０ｍｌに再懸濁させ、次に室温で３０分間にわたり２０００×ｇで遠心分離した。再度上清を傾瀉し、細胞ペレットをＣＴ／ＧＣ希釈剤２．０ｍｌに再懸濁させた。各試料を１１４℃で３０分間加熱し、細胞を溶解させた。実施例１に記載されるように、細胞溶解物についてＳＤＡを実施した。
【００３６】
結果
結果は、以下の表に１４日間処理した各試料の平均増幅ＭＯＴＡ値（各試料について８回繰り返し）として示す。
【００３７】
【表２】
2004159648.tif 000003
【００３８】
結論
この実施例のデータは、ヒト尿に対する１００ｍＭクエン酸ナトリウムの添加が、淋菌の無傷細胞の溶解を阻害し、室温で最低１４日間にわたってその安定性を維持したことを示す。対照的に、クエン酸ナトリウムのない尿中では、細胞は安定ではなく、０日目に比較してＭＯＴＡ値が減少したことによって示されるように遠心分離前に溶解を受ける傾向があった。
【実施例３】
【００３９】
その他の化学添加剤による尿中の淋菌細胞の安定性
この実施例の目的は、その他の化学添加剤がヒト尿中における淋菌の無傷細胞の安定性を維持できるかどうかを決定することであった。
【００４０】
材料
実施例１に記載されるのと同一の増幅試薬および器具
ＢＳＡ／ＰＢＳ（０．２％牛血清アルブミン、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭ塩化ナトリウム）
陰性のプールされた尿
ＣＴ／ＧＣ希釈剤（ＢＤ）
淋菌  ATCC 19424
クエン酸ナトリウム（Sigma）
スクロース（Sigma）
ポリビニルピロリドン「ＰＶＰ」（平均分子量４００００）（Sigma）
塩化マグネシウム「ＭｇＣｌ２」
フッ化ナトリウム（Sigma）
蟻酸ナトリウム（Sigma）
ホウ酸ナトリウム（Sigma）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「ＥＤＴＡ」（Sigma）
エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸「ＥＧＴＡ」（Sigma）
Dynac II遠心分離機（ＢＤ）
【００４１】
方法
１００ｍＭクエン酸ナトリウム（最終濃度）、５、１０および１５％（ｖ／ｖ）スクロース（最終濃度）、５、１０および１５％（ｖ／ｖ）ＰＶＰ（最終濃度）、５、１０および１５ｍＭ塩化マグネシウム（最終濃度）、１０および１００ｍＭフッ化ナトリウム（最終濃度）、１０および１００ｍＭ蟻酸ナトリウム（最終濃度）、１０および１００ｍＭホウ酸ナトリウム（最終濃度）、０．５および５ｍＭのＥＤＴＡ（最終濃度）、０．５および５ｍＭのＥＧＴＡ（最終濃度）を用い、および化学添加剤を用いずに、体積４０ｍｌの陰性尿を調製した。試料に、最終濃度２５００細胞／ｍｌで淋菌細胞を加えた。各試料を室温で６日間インキュベートした。特定の時点で（０および６日目）、試料を実施例２に記載されるように２０００×ｇで遠心分離することによって処理した。各試料を１１４℃で３０分間加熱して細胞を溶解させた。実施例１に記載されるように細胞溶解物についてＳＤＡを実施した。
【００４２】
結果
結果は、以下の表に６日間処理した各試料の平均増幅ＭＯＴＡ値（各試料について８回繰り返し）として示す。
【００４３】
【表３】
2004159648.tif 000004
【００４４】
結論
本実施例のデータは、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１００ｍＭホウ酸ナトリウム、および５ｍＭのＥＤＴＡについては、０日目と６日目において、淋菌細胞の平均増幅ＭＯＴＡ値に有意な差がないことを示す。これらの結果は、淋菌の無傷細胞の安定性は、これらの化学安定化剤によってヒト尿中で維持されることを示す。さらに、これらの結果は、これらの化学安定化剤が、クエン酸ナトリウムと同様の方法で、淋菌の無傷細胞の溶解を防止する機能を果たしたことを示す。
【実施例４】
【００４５】
異なる温度での尿中における淋菌の細胞の安定性
この実施例の目的は、実施例３に記載されるクエン酸ナトリウムおよびその他の化学安定化剤を入れた尿中、５、２５、３５および４５℃において、６日間にわたり淋菌の無傷細胞の安定性を維持できるかどうかを決定することであった。
【００４６】
材料
実施例１に記載されるのと同一の増幅試薬および器具
ＢＳＡ／ＰＢＳ（０．２％牛血清アルブミン、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭ塩化ナトリウム）
陰性のプールされた尿
ＣＴ／ＧＣ希釈剤（ＢＤ）
淋菌  ATCC 19424
クエン酸ナトリウム（Sigma）
フッ化ナトリウム（Sigma）
ホウ酸ナトリウム（Sigma）
エチレンジアミン四酢酸「ＥＤＴＡ」（Sigma）
Dynac II遠心分離機
【００４７】
方法
１００ｍＭクエン酸ナトリウム（最終濃度）、１００ｍＭフッ化ナトリウム（最終濃度）、１００ｍＭホウ酸ナトリウム（最終濃度）、５ｍＭのＥＤＴＡ（最終濃度）を用いて、および化学添加剤を用いないで、体積７０ｍｌの陰性のプールされた尿を調製した。この試料に、最終濃度２５００細胞／ｍｌで淋菌細胞を加えた。各試料を５、２５、３５および４５℃で６日間インキュベートした。特定の時点（０および６日目）で、試料を実施例２に記載されるように２０００×ｇで遠心分離することによって処理した。各試料を１１４℃で３０分間加熱して細胞を溶解させた。実施例１に記載されるようにこの細胞溶解物にＳＤＡを実施した。
【００４８】
結果
データは、以下の表に５、２５、３５および４５℃における６日間の各試料の平均ＭＯＴＡ値（各試料について８回繰り返し）として示した。
【００４９】
【表４】
2004159648.tif 000005
【００５０】
結論
この実施例のデータは、５、２５、３５および４５℃における０日目と６日目に関して、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１００ｍＭホウ酸ナトリウムおよび５ｍＭのＥＤＴＡを有するヒト尿中において、淋菌の無傷細胞の平均ＭＯＴＡ値に有意な差がないことを示す。これらの結果は、これらの化学安定化剤が尿中の淋菌の無傷細胞に良好な安定性を与え、最小限６日間にわたって細胞溶解を防止することを示す。対照的に、細胞は化学化合物のない尿中では安定でなく、０日目に比較してＭＯＴＡ値が減少することによって示されるように、温度５、２５、３５および４５℃では６日間以内に、遠心分離する前に細胞溶解を受ける傾向があることが示された。
【実施例５】
【００５１】
尿中における淋菌ＤＮＡの安定性
この実施例の目的は、室温で３日間にわたって実施例３に記載される化学添加剤を有するヒト尿中において淋菌プラスミドＤＮＡを維持できるかどうかを測定することであった。
【００５２】
材料
実施例１に記載されるのと同一の増幅試薬および器具
BDProbeTec ET 淋菌プラスミドＤＮＡ（ＢＤ）
エチレンジアミン四酢酸、二ナトリウム塩「ＥＤＴＡ」（Sigma）
陰性のプールされた尿
四三酸化鉄（Pea Ridge Iron Ore）
ジメチルスルホキシド「ＤＭＳＯ」（Sigma）
ビシン（Sigma）
グリセロール（Sigma）
水酸化カリウム「ＫＯＨ」（Sigma）
【００５３】
方法
１００ｍＭクエン酸ナトリウム（最終濃度）、１００ｍＭフッ化ナトリウム（最終濃度）、１００ｍＭホウ酸ナトリウム（最終濃度）、１０および２０ｍＭのＥＤＴＡ（最終濃度）を用い、および化学添加剤を用いずに、体積６０ｍｌの陰性のプールされた尿を調製した。この試料を室温で６０分間インキュベートした。インキュベーション段階後、この試料に、最終濃度５０００ＤＮＡコピー／ｍｌで淋菌プラスミドＤＮＡを加えた。この試料を室温で３日間インキュベートした。特定の時点（０および３日目）で、体積２ｍｌの各試料（各試料について８回繰り返し）を３０分間にわたり１１４℃に加熱して、ＤＮＡを変性させた。実施例１に記載されるように、酸性環境下で常磁性粒子を用いて、試料から加熱変性ＤＮＡを単離した。実施例１に記載されるようにこの単離ＤＮＡにＳＤＡを実施した。
【００５４】
結果
結果は、以下の表に室温で３日間インキュベートした後の各試料の平均ＭＯＴＡ値（各試料について８回繰り返し）として示した。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
結論
この実施例のデータは、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１００ｍＭホウ酸ナトリウムおよび１０ｍＭのＥＤＴＡおよび２０ｍＭのＥＤＴＡが、尿中において室温で最小限３日間にわたって、内在性ヌクレアーゼによる淋菌プラスミドＤＮＡの分解を防止することを示す。尿中に化学添加剤を入れない場合、淋菌プラスミドＤＮＡは迅速に分解された。
【実施例６】
【００５７】
異なる温度におけるＥＤＴＡを入れた尿中の淋菌細胞の長期にわたる安定性および市販の尿保存剤とＥＤＴＡとの比較
この実施例の目的は、ＥＤＴＡを有する尿中で、５、２７、３３、４５および６０℃において６および１４日間にわたって淋菌の無傷細胞の安定性が維持できるかどうかを決定し、市販の尿保存剤、ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（商標、Sierra Diagnostics, LLC製）に対してＥＤＴＡの有効性を比較することである。
【００５８】
材料
実施例１に記載されるのと同一の増幅試薬および器具
エチレンジアミン四酢酸、二カリウム塩「ＥＤＴＡ」（Sigma）
ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（商標）（Sierra Diagnostics）
ＢＳＡ／ＰＢＳ（０．２％牛血清アルブミン、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）および１５０ｍＭ塩化ナトリウム）
陰性のプールされた尿
ＣＴ／ＧＣ希釈液（ＢＤ）
淋菌  ATCC 19424
Dynac II遠心分離機
【００５９】
方法
ｉ）ＥＤＴＡカリウム：１０ｍＭのＥＤＴＡカリウム（最終濃度）を用いて、体積７０ｍｌのプールされた陰性の尿を調製した。この試料に、最終濃度２０００細胞／ｍｌで淋菌細胞を加えた。各試料を５、２５、３３、４５および６０℃で１４日間インキュベートした。特定の時点（０、６および１４日目）で、この試料を実施例３に記載されるように２０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離することによって処理した。各試料を１１４℃で３０分間加熱して細胞を溶解させた。実施例１に記載されるようにこの細胞溶解物にＳＤＡを実施した。
【００６０】
ｉｉ）収集した陰性尿７０ミリリットルに１０％（ｖ／ｖ）のＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（商標）（最終濃度）を用いて、体積７０ｍｌのプールされた陰性の尿を調製した。この試料に、最終濃度２０００細胞／ｍｌで淋菌細胞を加えた。各試料を５、２５、３３、４５および６０℃で１４日間インキュベートした。特定の時点（０、６および１４日目）で、この試料を実施例３に記載されるように２０００×ｇで３０分間にわたり遠心分離することによって処理した。各試料を３０分間にわたり１１４℃に加熱して細胞を溶解させた。実施例１に記載されるようにこの細胞溶解物にＳＤＡを実施した。
【００６１】
結果
データは、以下の表に５、２７、３３、４５および６０℃で６日後および１４日後の各試料（８回繰り返し）の平均ＭＯＴＡ値として示した。
【００６２】
【表６】
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【００６３】
結論
この実施例のデータは、ヒト尿に対する１０ｍＭのＥＤＴＡの添加が淋菌の無傷細胞の溶解を阻害し、５、２７、３３、４５および６０℃で最小限１４日間にわたり、それらの安定性が維持されることを示す。対照的に、この細胞は、２７℃においてＥＤＴＡのない尿では安定ではなく、０日目に比較してＭＯＴＡ値が減少したことによって示されるように、遠心分離する前に溶解を受ける傾向があった。また、ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｐｒｏｔｅｃｔ（商標）処理ヒト尿において、細胞は２７および３３℃では６日後、５および６０℃では１４日後に安定ではなくなった。
【００６４】
本発明はいくつかの特定例について説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく当業者にとって明らかな変更を行うことができる。本発明のさまざまな特性は添付の特許請求の範囲で述べた。
【外国語明細書】
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