(57)【要約】　　　（修正有）【課題】イムノアッセイにおいて有用であるゼラチンおよびアミノデキストランで被覆したコロイド粒子を提供する。【解決手段】粒子が：（ａ）表面アミン反応性官能基を有するまたは有しない重合体物質から成る群から選択された重合体、非ゼラチン、非アミノデキストラン核；（ｂ）（ｉ）ゼラチン被膜が架橋されているかまたは（ｉｉ）アミノデキストラン被膜が、（１）表面アミン反応性基を有しない核物質を被覆する際には常に架橋されているかまたは（２）被膜がアミノデキストランの共有結合により核の表面にアミノ反応性基とアミノデキストランアミノ基との間の反応により結合している際には架橋されていないかまたはまたはされているＡ型、ブルーム数６０〜３００の酸硬化ゼラチンおよびアミノデキストランから成る群から選択された被膜；（ｃ）ゼラチンおよびアミノデキストラン被膜に共有結合した官能基を有する別個のコロイド粒子をつくる。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の側官能基を有する表面被膜を有する別個のコロイド粒子において、
上記粒子が：
（ａ）表面アミン反応性官能基を有する重合体物質および表面アミン反応性基を有しない重合体物質から成る群から選択された重合体、非ゼラチン、非アミノデキストラン核；
（ｂ）（ｉ）ゼラチン被膜が化学架橋剤により架橋されているかまたは
（ｉｉ）アミノデキストラン被膜が、
（１）上記アミノデキストランが、表面アミン反応性基を有しない核物質を被覆する際には化学架橋剤により常に架橋されているかまたは
（２）上記アミノデキストランが、表面アミン反応性基を有する核物質の表面を被覆し、上記被膜が上記アミノデキストランの共有結合により上記核の表面に、上記アミン反応性基とアミノデキストランアミノ基との間の反応により結合している際には、化学架橋剤により架橋されていないかまたはまたはされている
Ａ型、ブルーム数６０〜３００の酸硬化ゼラチンおよびアミノデキストランから成る群から選択された上記被膜；
（ｃ）上記ゼラチンおよびアミノデキストラン被膜に共有結合した官能基
を有することを特徴とする別個のコロイド粒子。
【請求項２】
上記核が０．１〜約５．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項１記載の粒子。
【請求項３】
上記核が約０．１〜約１．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項１記載の粒子。
【請求項４】
上記核が磁性であることを特徴とする請求項１記載の粒子。
【請求項５】
上記重合体物質がポリスチレンラテックスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つの項記載の粒子。
【請求項６】
上記核表面が、アルデヒド、カルボン酸およびエステル並びにトシル基から成る群から選択されたアミン反応性官能基を有することを特徴とする請求項５記載の粒子。
【請求項７】
上記アミノデキストランが１Ｘ，２Ｘ，３Ｘおよび５Ｘ−アミノデキストランから成る群から選択されていることを特徴とする請求項５記載の粒子。
【請求項８】
上記被膜が５Ｘ−アミノデキストランであることを特徴とする請求項５記載の粒子。
【請求項９】
上記粒子からの側官能基が、アミノ基、マレイミジル基、スルフヒドリル基、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および生物細胞から成る群から選択されていることを特徴とする請求項５記載の粒子。
【請求項１０】
（Ａ）Ａ型、ブルーム数６０〜３０の酸硬化ゼラチンおよびアミノデキストランから成る群から選択された物質で被覆された疎水性、非ゼラチン、非アミノデキストラン重合体核および（Ｂ）上記ゼラチンまたはアミノデキストラン被膜からの複数の側官能基を有するコロイド粒子を製造するにあたり：
（ａ）上記ゼラチンまたはアミノデキストランを、アミン反応性官能基を有する重合体物質およびアミン反応性官能基を有しない重合体核から成る群から選択された重合体核の表面上に被覆し、上記被覆を：
（ｉ）上記ゼラチンまたはアミノデキストランを上記核の表面上に吸着させるかまたは
（ｉｉ）上記アミノデキストランを上記核に、アミノデキストランアミン基と上記核上に存在する上記アミン反応性基との反応により共有結合させることにより行い；
（ｂ）（ｉ）段階（ａ）（ｉ）のゼラチンまたはアミノデキストラン被膜を、上記被膜と化学架橋剤との反応により架橋させるかまたは
（ｉｉ）段階（ａ）（ｉｉ）のアミノデキストラン被膜を選択的に架橋させるかまたは架橋させず、上記架橋は上記被膜と化学架橋剤との反応により行い；
（ｃ）すべての段階（ｂ）の架橋した生成物の表面上に存在する遊離、未反応架橋剤官能基を、上記基とポリアミンとの反応により、少なくとも１つのポリアミン−ＮＨ２基が未反応架橋剤官能基と反応し、少なくとも１つのポリアミン−ＮＨ２基が未反応のままであるように遮断し；
（ｄ）段階（ｃ）の粒子または段階（ｂ）（ｉｉ）の未架橋粒子を洗浄して、ゼラチンまたはアミノデキストランで被覆されており、側アミノ基を有する固体重合体核を有するコロイド粒子を得る
ことを特徴とするコロイド粒子の製造方法。
【請求項１１】
上記核が約０．１〜５．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
上記核が約０．１〜１．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
重合体核が磁性であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
上記重合体物質がポリスチレンラテックスであることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１つの項記載の粒子。
【請求項１５】
上記被膜を１Ｘ，２Ｘ，３Ｘおよび５Ｘ−アミノデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
上記被膜が５Ｘ−アミノデキストランであることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
段階（ｄ）の生成物を、マレイミジル基、スルフヒドリル基、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および生物細胞から成る群から選択された側官能基を有するように誘導体化することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
上記ポリアミンを、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−シクロヘキサンジアミン、１，４−シクロヘキセンジアミン、１，４−フェニレンジアミン、ジエチレントリアミンおよびアミノデキストランから成る群から選択することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）重合体のみの物質、磁性粒子を包埋した重合体物質および磁性核を被覆する重合体物質から成る群から選択された非ゼラチン、非アミノデキストラン重合体物質の核；
（ｂ）Ａ型、ブルーム数６０〜３００の酸硬化ゼラチンおよびアミノデキストランから成る群から選択された（ａ）の核の表面上の被膜；
（ｃ）ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および生物細胞から成る群から選択された物質；および
（ｄ）上記ゼラチンまたはアミノデキストラン被膜の両方に共有結合し、段階（ｃ）の物質から選択された架橋基
を有することを特徴とするコロイド粒子。
【請求項２０】
上記核が約０．１〜５．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項１９記載の粒子。
【請求項２１】
上記核が約０．１〜１．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項１９記載の粒子。
【請求項２２】
上記重合体物質がポリスチレンラテックスであることを特徴とする請求項１９，２０または２１記載の粒子。
【請求項２３】
上記アミノデキストランが１Ｘ，２Ｘ，３Ｘおよび５Ｘ−アミノデキストランから成る群から選択されていることを特徴とする請求項２２記載の粒子。
【請求項２４】
上記アミノデキストランが５Ｘ−アミノデキストランであることを特徴とする請求項２２記載の粒子。
【請求項２５】
上記架橋基が、アミノ基、マレイミジル基、スルフヒドリル基、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体から成る群から選択されていることを特徴とする請求項２２記載の粒子。
【請求項２６】
ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体が共有結合した粒子において、上記粒子のそれぞれが：
（ａ）コロイドの大きさの固体重合体核物質；
（ｂ）（ｉ）上記核物質の表面上に化学架橋剤により架橋した第１ゼラチン被膜および第２アミノデキストラン被膜または
（ｉｉ）上記固体核の表面上に吸着した第１ゼラチン被膜および上記ゼラチン被膜上に縮合反応により結合した第２アミノデキストラン被膜（ここで上記ゼラチン被膜はＢ型、ブルーム数６０〜２２５のアルカリ硬化ゼラチンから成る）；
（ｃ）抗体；および
（ｄ）一方の末端が上記アミノデキストランに共有結合し、他の末端が上記抗体に共有結合した架橋基
を有することを特徴とする粒子。
【請求項２７】
上記固体核が、疎水性表面を有する磁性粒子から成ることを特徴とする請求項２６記載の粒子。
【請求項２８】
上記固体核材料が約０．１〜５．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項２６記載の粒子。
【請求項２９】
上記固体核材料が０．１〜１．０ミクロンの範囲の大きさであることを特徴とする請求項２６記載の粒子。
【請求項３０】
上記架橋剤がグルタルアルデヒドであることを特徴とする請求項２６または２７記載の粒子。
【請求項３１】
上記架橋基が、上記架橋したゼラチンの表面に結合したアミノ基および反応性マレイミジルまたはスルフヒドリル基を有する部分に結合した他のアミノ基を有するポリアミンを有し、上記ポリアミンが、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロパン、１，４−シクロヘキサンジアミン、１，４−シクロヘキセンジアミン、１，４−フェニレンジアミンおよびジエチレントリアミンおよびアミノデキストランから成る群から選択されていることを特徴とする請求項２６または２７記載の粒子。
【請求項３２】
上記ポリアミンがエチレンジアミンおよびアミノデキストランであることを特徴とする請求項２６または２７記載の粒子。
【請求項３３】
上記抗体が、スルフヒドリル置換基およびマレイミジル置換基から成る群から選択された反応性置換基を有し、上記スルフヒドリル置換基が上記抗体上に本来的に存在するかあるいは上記抗体上に本来的に存在するアミノ基の２−イミノチオラン塩酸塩での変性により形成したものであり、上記マレイミジル置換基が、上記抗体上のアミノ基のマレイミジル含有試薬での変性により存在していることを特徴とする請求項２６または２７記載の粒子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は一般に、側官能基が結合した架橋ゼラチンまたはアミノデキストラン被膜を有するコロイドの大きさの粒子に関する。特に本発明は、官能化されて側タンパク質、例えば抗体に結合する架橋ゼラチンまたはアミノデキストラン被膜を有する重合体コロイド粒子、このような粒子を製造する方法およびこのような粒子のバイオアッセイにおける使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
重合体粒子および磁性粒子を用いて化合物を結合させることは長く知られており、工業的および実験的方法において用いられている。例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂、架橋スチレン−ジビニルベンゼン回転楕円状ビーズは、最も早く、最も広く用いられる現代的な支持粒子（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）の一つである。これらは有機合成において均質な触媒を不均質化するために、および生物学的反応において用いられた。メリフィールド樹脂はかなり大きかったので、これらを濾過により容易に分離することができた。しかし、若干の分野において、コロイドの大きさの粒子を用いるのが望ましい。その理由は、結合する物質が少量であるか、高価であるかまたは比較的大きい粒子を用いるのが望ましくない方法において用いられるためである。これは特に、生化学分野においてあてはまる。
しかし、粒子がコロイドの大きさである場合には、濾過によりこれらを液体媒体から分離することは、長時間を要するかまたは困難になりうる。特に、コロイド粒子はフィルターの表面を被覆し、濾過工程を遅延させる傾向がある。磁性粒子、特に重合体被膜を有する磁性粒子を用いることは、大いに有用であることが見いだされた。その理由は、このような粒子は反応器の一方の側に磁気的に集まり、反応媒体の大部分を単にデカンテーションすることができるからである。ここで用いる「粒子」という用語は、球形、回転楕円状、ビーズおよび他の形状を同様に含み、他に特定しない限り、このような用語と交換可能に用いるものとする。
被覆した磁性粒子を用いることは、生物学的用途、特に抗体が粒子の表面被膜に結合する場合に特に有用であることが見いだされた。結合した抗体を用いて、多くの生体試料（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅ）を含む試験試料から特定の生体物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）を補集するかまたは所望の種を試料中に残して、不所望な種を試験試料から補集することができる。
また磁性球またはビーズとして知られている被覆した磁性粒子の種類を、４種の一般的な組に分けることができる。
【０００３】
１．磁性核および重合した単量体またはシラン処理剤の硬質殻被覆を有する核および殻ビーズ。Ｒｅｍｂａｕｍの米国特許第４，２６７，２３４号（強磁性流体核粒子の周辺のポリグルタルアルデヒド殻）；Ｃｚｅｒｌｉｎｓｋｉの同第４，４５４，２３４号（サブミクロン磁性粒子の周辺の懸濁液または乳化重合被膜）；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ等の同第４，５５４，０８８、４，６９５，３９２および４，６９５，３９３号（多分散の大きさおよび形状のシラン処理した磁性酸化物粒子）；Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎの同第４，６７２，０４０号（ポリシランで被覆した磁性粒子）；Ｍａｒｇｅｌ等の同第４，７８３，３３６号（強磁性流体粒子の周辺の懸濁液重合ポリアクロレイン）；Ｏｗｅｎ等の同第４，７９５，６９８号（ウシ血清アルブミン被膜）；およびＹｕｄｅｌｓｏｎの同第４，９６４，００７号（ゼラチン−アラビアゴム−界面活性剤被膜）各明細書参照。
２．磁性核および架橋しているかまたは架橋していないランダムコイルまたは球形重合体のゆるい（ｌｏｏｓｅ）殻を有する核および殻ビーズ。Ｍｏｌｄａｙの米国特許第４，４５２，７７３号（強磁性流体粒子の周辺のデキストラン被膜）；およびＯｗｅｎ等の同第４，７９５，６９８号（強磁性流体粒子の周辺のタンパク質例えばウシ血清アルブミン）各明細書参照。
３．ポリスチレンラテックス粒子中に均一に包埋された強磁性流体粒子により形成した磁性ラテックス材料。Ｄａｎｉｅｌ等の米国特許第４　，３５８，３８８号明細書参照。
４．磁性材料、例えば重合体−フェライトまたは重合体磁赤鉄鉱複合系を充填した多孔質重合体粒子。Ｋ．　Ｎｕｓｔａｄ等、「Ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　Ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　Ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」、Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａ．　ＲｅｍｂａｕｍおよびＺ．　Ｔ６ｋ　ｓ編（Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　Ｆｌａ．：　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８８）第５３〜７５頁；　Ｃ．Ｄ．　Ｐｌａｔｓｏｕｃａｓ等、「Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　Ｏｆ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｍｏｎｏｓｉｚｅｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐａｒｔｉｃｌｓ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｏｆ　Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　Ｆｒｏｍ　Ｈｕｍａｎ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｃｅｌｌ　Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ」、ｉｂｉｄ．第８９〜９９頁；およびＵｇｈｅｌｓｔａｄ等の国際特許出願公開第ＷＯ　８３／０３９２０号明細書（圧縮または多孔質粒子を鉄塩の溶液で処理することにより調製した重合体被覆磁性粒子およびこのような粒子の医学、診断または他の目的への使用）参照。
【０００４】
医学および生物学的用途におけるほとんどの重合体被覆磁性ビーズの有用性は、実際の考慮、例えば粒子の大きさおよび形状が均一であること、生体試薬が粒子に強力に結合することが必要であること、疎水性被膜より親水性重合体被膜が好ましいことおよび被膜が生物分解性であるか否かにより制限されていた。生体試薬がインビボで投与される場合には生物分解性は特に重要である一方、これはまた、種々の細胞の分類、分離およびアッセイ工程においても重要である。最も望ましい被覆した磁性粒子は以下の特徴を有する。
１．粒子は、生体試薬が被覆される表面積が最大になるように可能な限り小さくなければならないが、粒子はなお小さい磁石により容易に分離することができなければならない。大きさが小さく、表面積が大きいことは、可能な最小量の粒子を用いて目的とする物質を分離する；例えば、１つの段階において試料あたり１０６程度の細胞と相互作用し、これにより連続的添加および精密検査を回避するために望ましい。
２．抗体被覆粒子の細胞表面への非特異的結合が低くなければならない。粒子表面は親水性であるかまたは抗体が結合する親水性物質の被膜により覆われていなければならない。
３．粒子上の重合体および抗体層は互いに共有結合して解離およびコンホーメーションの変化を低減しなければならない。
４．磁性粒子上の被膜および抗体を重合体表面に結合させる任意の分子鎖は代謝可能でなければならない。
５．細胞の陽性選択において、生存可能な細胞を磁性粒子から迅速かつ容易に回収する機構を利用して、回収した細胞を培養することができるようにしなければならない。
６．細胞の陰性選択において、抗体被覆粒子は無菌であって、残りの細胞を培養することができるようにしなければならない。
７．細胞と他の生体物質とを磁気的に分離し、分類するために、好ましい磁性粒子は「柔軟な」磁性粒子である。即ち、硬質または永久磁性とは逆に、容易に磁化し、消磁することができる粒子である。粒子は強磁性、フェリ磁性または超常磁性（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）であることができる。強磁性およびフェリ磁性粒子は大きさに制限はない一方、超常磁性粒子は、通常約４０ナノメートルより小さい寸法を有する単一ドメイン構造（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に限定される。（Ｃ．Ｋｉｔｔｅｌ等、Ｓｏｌｉｄ　Ｓｔａｔｅ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　３：　第４３７〜４６４頁（１９５６）。
【０００５】
それぞれの磁性複合粒子を上記の群のそれぞれから細胞分離工程において用いる際に問題が存在する。遭遇した問題のいくつかの例は、以下のものである：
１．強磁性流体核および通常の重合体の外殻粒子は磁気モーメントが小さすぎて、手で支えた永久磁石を用いて磁性粒子を採集し、分離する細胞分離に用いるのに実用的でない。このような粒子は、加工することができる物質の容量を厳しく制限するハイフィールド（ｈｉｇｈ−ｆｉｅｌｄ）分離技術が必要であり、従ってスケールアップが制限される。
２．乳化重合により製造された強磁性流体−ポリスチレン粒子は、大きさを厳しく調整することができず、直径は約０．１〜４μｍの範囲内である。従って、このようなビーズに結合した抗体を用いて細胞を分離する際には、本質的に最も小さい磁気モーメントを有する極めて小さい、動的に可動である磁性粒子が、細胞表面上の抗原部位を優先的に占める傾向がある。この結果、形成した細胞−ビーズ結合体は分離を容易にするのに十分な非磁性モーメント（ｎｏｔ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｍｏｍｅｎｔ）を有しない。
それぞれＢおよびＡ型のゼラチンの第１および第２層を有し、本明細書および係属中の優先権を伴う出願番号第０７／６０７，２５３号明細書に教示されたように製造した磁性粒子を用いることにより、これらの問題が克服される。しかし、ゼラチンで被覆した粒子は、ある細胞、特に血小板および食細胞、例えば単球との非特異的相互作用に関する若干の問題を有することが見いだされた。ゼラチンのアミノ酸配列が（ラットおよび子牛皮膚コラーゲンのα−１鎖により例示されたように）、フィブロネクチンのＲＧＤ結合配列を複製するトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む３つの領域、細胞の付着を特異的に促進する細胞外マトリックスの成分を含むため、問題が発生した。これらの表面上に表された、フィブロネクチンを含むこれらの生物細胞は、架橋ゼラチンと同等であるコラーゲンに対して特異的な親和性を有する。例えば、白血球のサブセットの分離において用いられるゼラチンで被覆した磁性フェライト粒子を含む抗体もまた、血小板および単球の表面上のフィブロネクチンに結合する。この結果、単球および血小板が粒子および抗体特異性抗原を有するこれらの細胞と結合するため、非特異的な除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）が発生する。細胞の非特異的除去は、被覆した粒子上の最外被覆層としてアミノデキストランを用いることにより回避することができる。デキストラン誘導体を担体として用いることは、Ｕ．　Ｍａｎａｂｅ等、Ｊ．Ｌａｂ．　Ｃｌｉｎ．　Ｍｅｄ．　１０４：第４４５〜４５４頁（１９８４）（抗体−ポリアルデヒドデキストラン−メトトレキセート）；Ｌ．Ｂ．　Ｓｈｉｎ等、Ｉｎｔｌ．　Ｊ．　Ｃａｎｃｅｒ　４１：第８３２〜８３９頁（１９８８）（抗体−アミノデキストラン−メトトレキセート）；Ａ．Ｒ．　Ｏｓｅｒｏｆｆ等、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８３：　第８７４４〜８７４８頁（１９８６）（抗体−アミノデキストラン−塩素　６）；Ｓ．　Ｒａｋｅｓｔｒａｗ等、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：　第４２１７〜４２２１頁（１９９０）（抗体−デキストランヒドラジド−Ｓｎ（ＩＶ）塩素　６）；Ｒ．Ｊ．　Ｍｒｓｎａｙ等、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４５：第２００〜２０８頁（１９８７）（ウアバイン−アミノデキストラン−金粒子）；Ｊ．Ｗ．Ｍ．　Ｂｕｌｔｅ等、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓ．　２５：第１４８〜１５７頁（１９９２）（抗粒子（ａｎｔｉ　ｐａｒｔｉｃｌｅ））により討議されており；他のものはＳ．Ｓ．　Ｗｏｎｇ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ」（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，アメリカ合衆国フロリダ州、１９９１）に記載されている。
【０００６】
磁性粒子に加えて、親水性重合体被膜で被覆し、これにその後抗体が結合することができる、ポリスチレンラテックス（ＰＳＬ）粒子が必要とされている。ここで、重合体を被覆したＰＳＬ粒子を、ビーズに基づく細胞集団分析およびイムノアッセイに用いることができる。しかし、製造された非磁性ＰＳＬ粒子は通常、比較的低い密度の種々の官能基、例えばカルボキシルまたはアミノ基を有する。従って、被覆物質、例えばデキストランまたはゼラチンのＰＳＬ粒子の表面への共有結合は満足されない。
【０００７】
上記した種々の粒子は、生物学的技術において、種々の生体物質、特に抗体を固定するのに用いられている。このような粒子を用いるにあたり、共有結合による抗体の固定が、ｐＨおよび用いられる各モノクローナル抗体に関する抗体濃度の注意深い個別の調整を必要とする抗体吸着による固定より好ましい。Ｐ．　Ｂａｇｃｈｉ等、Ｊ．　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．，　８３：　第４６０〜４７８頁（１９８１）；　Ｊ．　Ｌｙｋｌｅｍａ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　ａｎｄ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ，　１０：　第３３〜４２頁（１９８４）；　Ｍ．Ｄ．　Ｂａｌｅ等、Ｊ．　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．，　１２５：　第５１６〜５２５頁（１９８８）；　Ｃ．Ｃ．　Ｈｏ等、ｉｂｉｄ．，　１２１：第５６４〜５７０頁（１９８８）；「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｔ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ：　Ｐｈｙｓｅｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｔｕｄｉｅｓ」、ＡＣＳ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ，　Ｎｏ．　３４３，　Ｊ．Ｌ．　ＢｒａｓｈおよびＴ．Ａ．　Ｈｏｒｂｅｔｔ編（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：　Ａｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，　１９８７）；　Ｗ．　Ｎｏｒｄｅ，　Ａｄｖ．　Ｃｏｌｌ．　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．，　２５：　第２６７〜３４０頁（１９８６）；　Ａ．Ｖ．　Ｅｌｇｅｒｓｍａ等、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１９８ｔｈ　Ａｍｅｒ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　Ｍｅｅｔｉｎｇ，　アメリカ合衆国フロリダ州マイアミビーチ、１９８９年９月１０〜１５日、ＣＯＬＬ　０１３１；　およびＤ．Ｅ．　Ｂｒｏｏｋｓ，　Ａｎｎｅｎｂｅｒｇ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｈ．Ｂ．　Ｗａｌｌｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ　ａｔ　Ｅｉｓｅｎｈｏｗｅｒ　Ｌａｔｅｘ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，　アメリカ合衆国フロリダ州オーランド、１９８９年１２月　４〜　５日。しかし、ｐＨおよび抗体を注意深く調整した際にも、吸着された抗体の配向が、活性な吸着された抗体が形成するようになることはほとんど確実でない。また、吸着された抗体は、抗体の粒子の表面からの脱着から生じる長期間貯蔵の問題を有する。さらに、タンパク質、例えば抗体は、タンパク質のｐＩまたはこの付近において疎水性表面上の最大吸着を達成する傾向がある。しかし、帯電基間の静電気的相互作用が重要である場合には、吸着表面および吸着質は最終的に反対の電荷を有しなければならない。一方、共有結合方法は、これらの条件ほど感受性が高くない。
【０００８】
共有結合方法は、その後アミノデキストランで被覆され［Ｒ．Ｓ．　Ｍｏｌｄａｙ等、ＦＥＢＳ．　Ｌｅｔｔ．，　１７０：第２３２〜２３８頁（１９８４）］、ここに参照として包含する係属中の出願番号第０７／９７７，４６７号および０７／２５５，７４３号明細書に記載されたように多くの抗体で誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）されるカルボキシ変性ラテックス中に包埋された磁鉄鉱の粒子に用いられている。抗体がＩｇＧイソタイプである場合には、共有結合方法により、抗体と粒子との間の結合が抗体Ｆｃまたはヒンジ部において発生し、抗体のＦａｂ部において発生しないことが確実になる。抗体が、Ｆａｂ部のみが露出しているペンタメリック（ｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ）ＩｇＭイソタイプである場合には、１つのＦａｂ部の粒子への結合はなお露出している４つのＦａｂ部を残し、反応に有効である。本発明は、側生体物質、例えばモノクローナル抗体が結合することができる、生物分解性を有する磁性および非磁性粒子の製造方法を提供する。本発明の粒子を種々の細胞分離およびアッセイ方法において用いることができる。磁性またはラテックス核材料上で用いられる被膜における生物分解性は、細胞分離技術において重要である。例えば、抗体は、ゼラチン／アミノデキストラン被覆磁性粒子、例えばマンガンフェライト粒子に結合することができる。従って、これらの粒子はタンパク質性被膜およびマンガン−鉄酸化物核を有し、これらのすべては生物分解性である。このような粒子を用いる陽性細胞選択工程において、所望の細胞が他の細胞から単離された後、粒子および被膜を放置して、細胞を生存可能に保持し、さらなる使用のために培養することができるような方法で分解させることができる。あるいはまた、酵素コラゲナーゼを第１に用いて、ゼラチン被膜の消化により核材料（磁性またはラテックス）を放出させることができる。次に、核材料を、細胞を培養する前に細胞懸濁液から除去することができる。このような生物分解性ビーズを用いる細胞の陰性選択において、ビーズを細胞懸濁液中に残し、ここから残りの細胞の生存可能性を損なうことなく目的の細胞を除去することができる。例えば、生物分解性磁性ビーズを用いる骨髄除去操作において、若干のビーズを患者に移植される除去した髄中に置き去りにする心配はほとんどない。現在、Ｕｇｈｅｌｓｔａｄ等、国際特許出願公開第ＷＯ　８３／０３９２０号明細書により製造され、抗体と結合したた合成重合体−磁鉄鉱粒子は骨髄除去に用いられている。重合体は生物分解性ではなく、これらのビーズに疎水性表面を与える。本発明のゼラチン被覆粒子には存在しないこの疎水性は、ビーズと細胞との間に非特異的相互作用を発生させることができる。この非特異的相互作用の結果、選択性は乏しく、所望のレベルの処理を達成するために一層多くのビーズを用いなければならない。本発明はこれらの問題を回避する。
【０００９】
ゼラチン被覆粒子は、ある細胞、特に血小板［Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，　第　８編、Ｍ．Ｍ．　Ｗｉｎｔｒｏｂｅ等編（Ｌｅａ　＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ，アメリカ合衆国ペンシルバニア州フィラデルフィア、１９８１）、第１６章］および食細胞、例えば単球［Ｂａｓｉｃ　＆　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　第　６編、Ｄ．Ｐ．　Ｓｔｉｔｅｓ等編（Ａｐｐｌｅｔｏｎ　＆　Ｌａｎｇｅ，　コネティカット、イースト　ノーウォーク、１９８７）、第　９章］との非特異的相互作用に関して若干の問題があることが見いだされた。ゼラチンのアミノ酸配列が（ラットおよび子牛皮膚コラーゲンのα−１鎖により例示されたように）、フィブロネクチンのＲＧＤ結合配列を複製するトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）［Ｔｈｅ　ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓ，第　４編、Ｔ．Ｈ．　Ｊａｍｅｓ編（Ｍａｃ　Ｍｉｌｌｉａｎ，ニューヨーク、１９７７）第　２章、第５４頁］を含む３つの領域、細胞の付着を特異的に促進する細胞外マトリックスの成分［Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍ　１７０：第１２３６頁（１９９０）］を含むため、問題が発生した。これらの表面上に表された、フィブロネクチンを含むこれらの生物細胞は、架橋ゼラチンと同等であるコラーゲンに対して特異的な親和性を有する。例えば、結合した抗体、白血球のサブセットの分離において用いられるゼラチンで被覆した磁性フェライト粒子もまた、血小板および単球の表面上に存在するフィブロネクチンに結合する。この結果、単球および血小板並びに抗体特異性抗原を含む細胞がゼラチン被覆粒子と結合するため、細胞の試料からの非特異的な除去が発生する。細胞の非特異的除去は、最外被覆層としてアミノデキストランを用いることにより実質的に回避することができる。
【００１０】
【本発明の開示】
本発明は、水溶性ゼラチンまたはアミノデキストランで被覆した疎水性表面を有する重合体物質の核を有する別個のコロイド粒子を提供する。重合体核は、表面アミン反応性基が共有結合した重合体物質および表面アミン反応性基を有しない重合体物質から成る群から選択された非ゼラチン系、非アミノデキストラン系核である。複数の側官能基が被覆した粒子に結合している。側官能基は、末端アルデヒドまたはカルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基またはマレイミジル基、並びにポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるかまたはこれらの構造内にこれらを含むことができる。
また、本発明は、任意の物質製の固体核を有し、水溶性ゼラチンの第１層およびアミノデキストランの第２層で被覆され、上記被膜が化学的架橋剤の作用により架橋されているかまたは固定されており、複数の側官能基を有する、別個のコロイド粒子を提供する。側官能基は、末端アルデヒドまたはカルボキシル基、アミノ基、スルフヒドリル基またはマレイミジル基、並びにポリクローナルまたはモノクローナル抗体であるかまたはこれらを有することができる。核は、ゼラチン溶液中に形成した金属粒子であるかまたは次にゼラチンで被覆した予備形成した粒子とすることができる。
【００１１】
本発明は、側生物学的官能基、例えばポリクローナルおよびモノクローナル抗体が架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン被膜に、ヘテロ二官能価（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）剤、例えば短鎖ジアミンまたはポリアミン鎖により共有結合して、上記抗体官能化粒子を生物学的分離およびアッセイに好都合に用いることができるようにした、別個のコロイド粒子を提供する。ヘテロ二官能価剤は、生体物質または官能基と、架橋したゼラチンまたはアミノデキストランとの間の架橋基として作用する。
【００１２】
本発明はさらに、それぞれが複数の官能基を有する、水溶性ゼラチンまたはアミノデキストランで被覆した疎水性表面を有する重合体物質の固体核を有するコロイド粒子の製造方法を提供する。一般に、この方法は、疎水性表面を有する固体核重合体材料をゼラチンまたはアミノデキストランで、ゼラチンまたはアミノデキストランと重合体材料との間に共有結合を形成することなく被覆するかまたはアミノデキストランのアミノ基を重合体材料の表面上の反応性基（例えばアルデヒドまたはカルボン酸またはポリスチレン粒子上の酸エステル基）と結合させ、吸着されたゼラチンまたはアミノデキストランまたは結合したアミノデキストランを架橋させ、架橋したゼラチンまたはアミノデキストランを誘導体化して、所望の反応性種が上記架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン表面に共有結合した生成物を得ることを含む。重合体ビーズの表面に結合したアミノデキストランを架橋させることが好ましいが、このような架橋はすべての状態において必要であるとは限らない。例えばアッセイ中の生体物質またはアッセイに用いられる試薬は重合体物質と相互作用せず、架橋は必要でない。本発明はさらに、ゼラチンおよびアミノデキストランで被覆した粒子からポリクローナルおよびモノクーナル抗体が結合した粒子を製造する方法およびこのような粒子を生物学的アッセイ、特に免疫学的アッセイにおいて用いる方法を提供する。
【００１３】
本発明は、任意の物質製の固体核を有し、架橋したゼラチンの生物分解性第１層および側官能基を有するアミノデキストランの生物分解性第２層で被覆された、別個のコロイド粒子の製造方法を提供する。この方法は、第１ゼラチン層および第２アミノデキストラン層を有する疎水性表面を有する固体核材料を被覆し、吸着した外部被膜を架橋させ、架橋した被膜を誘導体化して所望の反応性種が上記架橋した被膜表面に共有結合した生成物を得ることを含む。さらに、本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が結合した粒子を製造する方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、生体物質の陽性または陰性分離および分析方法を提供する。この方法は、生体物質を含む溶液を、架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン被覆核粒子の表面に共有結合した抗体と接触させ、形成した混合物を、上記抗体と上記物質との間に複合体を形成するのに十分な温度および時間でインキュベーションし、溶液を含む形成した粒子を分析して、粒子によりシフトした光散乱または他の粒子によりシフトした特性を測定することを含む。所要に応じて、粒子を溶液から分離し、いずれかまたは両方を実施する分析により独立して分析する。
以下の発明の詳細な説明および好適例において、本出願人は、反応性マレイミジル基を架橋したゼラチンまたはアミノデキストラン被覆粒子上に配置し、反応性スルフヒドリル基を抗体上に配置した。これらは、マレイミジル基が抗体に結合し、スルフヒドリル基が架橋ゼラチンに結合するように入れ換えることができる。本出願人はまた、スルフヒドリル試薬のモデルとして２−イミノチオラン塩酸塩を用い、マレイミジル試薬のモデルとしてスルホ−ＳＭＣＣ（以下に記載する）を用いることを選択した。列挙した他の試薬または類似した性質および結果を有する試薬もまた用いることができる。
【００１５】
ここで用いるアルデヒド／硫酸塩ポリスチレンラテックスおよび硫酸化ポリスチレンラテックス粒子は２種の異なるタイプの粒子を示す。前者は、物質、例えばアミノデキストランと結合することができる反応性アルデヒド基を有し、共有結合を形成する。後者は、このような反応性基を有しない。被膜物質は、硫酸化ポリスチレン粒子の表面上に、吸着された物質と粒子表面との間に共有結合を形成することなく吸着される。ポリスチレンラテックスに加えて、他の重合体物質を核粒子として用いることができる。例えば、特に、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエステルおよびポリフィレンオキシド（ｐｏｌｙｐｈｙｌｅｎｅ　ｏｘｉｄｅ）粒子をゼラチンまたはアミノデキストランで被覆し、ここに記載したように誘導体化することができる。しかし、これらの他の重合体粒子の入手可能性および費用は、ポリスチレン粒子の使用を好ましくする。ポリスチレンを好ましくする他の考慮事項は、被覆される粒子の大きさおよび形状が均一であることである。重合体粒子の大きさは、約０．１〜約５．０ミクロンの範囲内である。好ましい粒子の大きさは、約０．１〜１．０ミクロンの範囲内である。
【００１６】
最後に、アミノデキストラン被膜を架橋させるか否かの選択は２つの要因に依存する。第１には、アミノデキストランが、例えばカルボン酸化ビーズ上に被覆されたかのように重合体粒子表面と結合するか否かである。アミノデキストランが結合していない場合には、被膜を架橋させなければならない。第２の要因は、従業者の選択である。アミノデキストランが結合している場合には、従業者は、被膜を架橋させるか否かは自由である。一般に、「比較的厚い」アミノデキストラン被膜が好ましい場合には、重合体表面に結合したアミノデキストラン層を架橋させ、付加的なアミノデキストランを用いて未反応架橋剤反応性基を遮断する。その後の反応を、ここに記載したように実施する。アミノデキストラン／架橋剤反応は、所要に応じて複数回実施することができる。１つのアミノデキストラン層のみが望ましい場合には、ここに記載したように、表面と結合した層をさらに架橋させることなく誘導体化するかまたは層を架橋させ、未反応架橋剤反応性基をポリアミン、例えば特にエチレンジアミンおよびトリエチレンジアミンとの反応により遮断することができる。次に、これらの粒子を、ここに記載したようにさらに誘導体化することができる。
【００１７】
生体試薬の用語解説
ここで用いるモノクローナル抗体（ｍＡｂまたはＡｂ）に対するすべての参照は、アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクールター　コーポレーションにより、同社により製造されているモノクローナル抗体に関して用いられる識別表示による。以下の情報はさらに、ここで用いる抗体を同定する。これらのモノクローナル抗体の使用は例示のためのみであり、本発明を制限するものと考えるべきではない。「ＣＤ」という用語は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ　ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ａｎｔｉｇｅｎｓにより採用されている「クラスター表示」を示す。Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル所在）である。
【００１８】
2004003991.tif 000002
ここで用いられ、クールター　コーポレーションから市場で入手できる他の試薬は以下のものである：
ＭｓＩｇＧ１−ＲＤ１／ＭｓＩｇＧ１−ＦＩＴＣ：マウス　ＩｇＧ１−フィコエリトリン［ＲＤ１］／マウスＩｇＧ１−フルオレセインイソチオシアネート［ＦＩＴＣ］
Ｔ１１−ＲＤ１／Ｂ４−ＦＩＴＣ：　Ａｂ　Ｔ１１−フィコエリトリン／Ａｂ　Ｂ４−ＦＩＴＣ
Ｔ４−ＲＤ１／Ｔ８−ＦＩＴＣ：　Ａｂ　Ｔ４−フィコエリトリン／Ａｂ　Ｔ８−ＦＩＴＣ
１Ｘ　ＰＢＳ：５３．８ｇのＫ２ＨＰＯ４を１．６リットルの蒸留水に溶解した。１２．８ｇのＫＨ２ＰＯ４を加え、溶解するまでかきまぜた。次に、３４０ｇのＮａＣｌを溶液に溶解した。すべての塩が溶解した後に、蒸留水を加えて容積を２リットルとし、０．２μｍフィルターで濾過した。生成した溶液は２０Ｘ　ＰＢＳであった。１部の２０Ｘ　ＰＢＳを１９部の蒸留水で希釈することにより、１ＸＰＢＳを調製した。この１Ｘ　ＰＢＳ溶液は７．１〜７．３の範囲内、代表的に７．２のｐＨを有し、ＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍであった。
【００１９】
本発明の方法を用いるにあたり、大きさの範囲が０．１〜５．０ミクロンである均一な粒子（核材料）をゼラチンまたはゼラチンおよびアミノデキストランで被覆し、被膜を化学固定剤で固定するかまたは化学的に粒子表面に結合させる。被覆されていない粒子は疎水性または部分的に疎水性である表面を有する。粒子の好ましい大きさは０．１〜１．０ミクロンの範囲内である。
【００２０】
本発明において用いる磁性粒子は、ゼラチン溶液中に分散可能である予備成形された磁性粒子であるかまたは、上記磁性粒子の製造におけるゼラチンのその場での使用により製造される磁性粒子とすることができる。マンガン、亜鉛、混合マンガン−亜鉛、鉄、バリウム、コバルトおよびニッケルのフェライトの単分散コロイド粒子のその場での製造方法は、第１に第１鉄塩と他の金属塩を、水酸化カリウムまたはナトリウムおよび硝酸カリウムまたはナトリウム溶液を含む水性ゼラチン溶液中で混合し、すべての溶液に窒素ガスをパージすることにより形成した水性金属水酸化物ゲルを用いることを含む。ゲルの金属酸化物ゾルへの転化は、９０℃（低い温度）において４〜７２時間温和に熱処理し、この間第１鉄の硝酸酸化を実施することにより達成される。次にヒドロゾル中の磁性粒子を洗浄し、ここに記載したようにさらに処理する前に以下に記載したタイプのゼラチンの１％水溶液中に再懸濁させる。ここに記載したように、その場でのゼラチンを用いる磁性粒子を製造するにあたり、１種のタイプのゼラチンのみがこのような使用に最適であることが見いだされた。これは、ｐＩ範囲が４．７５〜５．０であるＢ型またはアルカリ硬化ゼラチンである。その場でのゼラチンを用いて磁性粒子を製造する方法は、係属中の出願番号第０７／５３２，４３２号、１９９０年６月４日出願、現在の米国特許第５，０６２，９９１号明細書に十分に記載し、この教示をここに参照として包含し、ここに記載する。本発明に従って架橋したゼラチンを以下に示す。
【００２１】
ゼラチンは、酸またはアルカリ硬化し、次に３９℃またはこれより高い温度で熱分解した、繊維状組織、例えば皮膚または骨中の高度に架橋したコラーゲンから得られる。コラーゲン分子は、α型タンパク質のらせん構造と、β型タンパク質の鎖間水素結合との組み合わせである。それぞれか左巻きらせんである３つのコラーゲンペプチド鎖は、互いに関してねじれており、超らせんを形成する。処理する際には、超らせんの３つのペプチドストランドを、鎖間水素結合を切断し、これらを水分子への水素結合で置き換えることにより分離する。分離されたペプチドはランダムコイル配置を有する。「Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓ」，　Ｔ．Ｈ．　Ｊａｍｅｓ編、（ニューヨーク：　ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ　Ｐｒｅｓｓ，　１９７７）。α−１ペプチド鎖は配列され、１０００以上の残基を有することが見いだされている。Ｄ．Ｊ．Ｓ．　Ｈｕｌｍｅｓ等、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，　７９：　第　１３７頁（１９７３）。これらは、主に非極性残基の長い部分を含み；存在する極性残基は、酸性または塩基性領域に局在していない。さらに、親水性残基を表面上に露出し、疎水性残基を構造中に埋める傾向がある球状タンパク質とは対照的に｛Ｒ．Ｅ．　Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ等、「Ｔｈｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ：　Ｂｅｎｊａｍｉｎ，　１９６９）参照。｝、ランダムコイルゼラチンは、疎水性粒子、例えばポリスチレンラテックス粒子または磁鉄鉱およびフェライト粒子の表面に容易に吸着することができる疎水性残基が露出している。水性ゼラチンが粒子の表面上に吸着される際には、この親水性側鎖（アスパルチル、グルタミルおよびリシル残基）は、水性媒体の外部を向く傾向がある。コラーゲンにおける分子内架橋点として作用するリシル基は、吸着したゼラチン中の架橋に近づきやすい。グルタルアルデヒドはしばしば架橋剤として用いられる。Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｍｅｒｗｅ等、米国特許第４，４７８，９４６号明細書およびＳ．Ｂ．　Ｓａｔｏ等、Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１００：第１４８１〜１４９２頁（１９８６）。
【００２２】
通常二官能価である、多くの異なる架橋剤、例えばビス［２−（コハク酸イミドオキシカルボニルオキシ）−エチル］スルホン、酒石酸二コハク酸イミジル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｔａｒｔａｒａｔｅ）、エチレングリコールビス（コハク酸イミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｓｕｃｃｉｎａｔｅ））、スベリン酸二コハク酸イミジルおよびグルタルアルデヒトを本発明において用いることができる。好ましいゼラチンまたはアミノデキストラン架橋剤であり、市場で入手できるグルタルアルデヒドは、主に２８０ｎｍにおいて単量体吸収を有する。しかし、市販の製品中には、２３５ｎｍにおいて吸収を発生させる顕著な量の重合体物質が存在する。場合により三量体または直鎖状オリゴマーである重合体種は、吸着されたゼラチン上に存在するアミノ基の間の分子内または分子間架橋を形成するのに十分な長さである。吸着されたゼラチンまたはアミノデキストランとグルタルアルデヒドとの間の反応時間を賢明に選択することにより、ゼラチンを核粒子上に適切に固定することができ、従ってこれはその後の分離、反応および洗浄工程の間に除去されない。これにより、遊離ゼラチンの過剰の架橋により形成した大きな凝集塊を回避することができ、粒子間架橋が解消される。
【００２３】
若干のタイプのゼラチン、例えばＡ型、酸硬化、等電点ｐＨ８．３〜８．５およびＢ型、アルカリ硬化、等電点ｐＨ４．７５〜５．０が、本発明において用いるのに有用である。各タイプが、ゲル強度を示す種々のブルーム数（Ｂｌｏｏｍ　Ｎｕｍｂｅｒ）において有用である。本発明において用いるのに有用であるＡ型ゼラチンのブルーム数は、６０〜３００の範囲内である。本発明において用いるのに有用であるＢ型ゼラチンのブルーム数は、６０〜２２５の範囲内である。本発明の好適例において用いられるＡ型のブルーム数１７５のゼラチンが好ましく、ゼラチン分子の間の分子間相互作用を最小にするために、比較的多数のリシル残基およびその一層低いブルーム数のために選択された。磁鉄鉱およびフェライト粒子への最適な吸着のために、これを、等電点の範囲の中心であるｐＨ８．４に緩衝し、このｐＨではこれは最も水溶性が高く、最小粘度の溶液が得られる。グルタルアルデヒドを加えた際に発生する、フェライト粒子上に吸着したゼラチンの不安定さは、本発明により、一層希薄な粒子およびゼラチン濃度（０．１％重量／容量（ｗ／ｖ））を、ここでグルタルアルデヒドと反応しない不活性重合体安定剤、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）と共に他の反応に用いられた２．５％ｗ／ｖ固体懸濁液の代わりに用いることにより克服された。安定剤および２５倍低いゼラチン濃度を用いることにより、グルタルアルデヒド固定反応中の粒子間架橋が回避される。重合体脱着が、グルタルアルデヒド固定反応の時間、約６分に対して極めて遅い工程であるため、核粒子の周辺の安定なゼラチン被膜が形成した。
【００２４】
生物学的および医学的技術において有用であるためには、固定された（架橋した）ゼラチンのみ（２層）またはゼラチン／アミノデキストラン被膜は、生物学的に活性な物質、例えば抗体と結合して、粒子表面に結合した固定された生物学的に活性な物質を生成することができる官能基を含んでいなければならない。生体物質の粒子表面への共有結合は、単なる吸着より好ましい。ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体の、架橋したゼラチン表面への結合は、「短鎖」ジアミンまたはポリアミンおよびヘテロ二官能価試薬を用いることにより達成される。（以下用語「ポリアミン」にはジアミンが含まれる。）ポリアミンは、本来的に存在するかまたは本発明の段階により存在し、架橋ゼラチン表面上に存在する残留アルデヒドまたはカルボキシル基と反応する。ポリアミンを用いることは、アルデヒド／カルボキシル基を遮断する役目を有するのみならず、架橋工程中に減少したゼラチンアミノ基、例えばリシルアミノ基を補充する役目を有する。この方法は一般に２段階で達成される。第１段階において、未反応末端アルデヒド基はポリアミンと反応し、続いて形成したシッフ塩基が水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）により還元されて、安定な飽和Ｃ−Ｎ結合が形成する。第２段階において、ゼラチンの露出したカルボン酸残基（グルタミン、アスパラギン）は、水溶性カルボジイミド、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）の存在下でポリアミンに結合する。
【００２５】
ジアミンを含む短鎖ポリアミンは、同一粒子上の隣接するアルデヒドまたはカルボン酸基の架橋を回避するかまたは異なる粒子上のこのような基の結合を回避するために好ましい。１つのポリアミンのアミノ基はゼラチン表面と反応し、他のものは未反応のままであり、生体物質に直接または間接的に結合するのに有用である。「短鎖」ポリアミンの例には、エチレンジアミン、フェニレンジアミン、プロピレンジアミン、１，４−シクロヘキサンジアミン、シクロヘキセンジアミン、テトラメチレンジアミン、ジエチレントリアミン、１，５−ジアミノ−３−（２−アミノエチル）ペンタン［（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２）３Ｃ］および一般式Ｈ２ＮＣＨ２−（ＣＨ２）ｘ−ＣＨｙ（ＣＨ３）ｚ−ＮＨ２およびＣ６Ｈ４＋ａ（ＮＨ２）２１（ここでｘ＝０〜３，ｙ＝１または２およびｙ＝１のときｚ＝１またはｙ＝２のときｚ＝０およびａ＝０または６である）で表される他のポリアミンが含まれる。エチレンジアミンが好ましい。
【００２６】
生体物質の粒子への結合は、被覆された架橋した粒子の遊離アミノ基の、水溶性ヘテロ二官能価試薬、例えば２−イミノチオラン塩酸塩（ＩＴ）、スルホサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、サクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−サクシニミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエートでの活性化を含み、上記に列挙した試薬はグルタルアルデヒド等の置換基である。２−イミノチオラン塩酸塩およびマレイミジル／サクシニミジル試薬が好ましい。Ｅ．Ｉｓｈｉｋａｗａ，　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｓｕｐｐ．，　１：第１〜１６頁（１９８０）およびＪ．　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，　４：　第２０９〜２２７頁（１９８３）；　Ｍ．　Ｉｍａｇａｗａ等、Ｊ．　Ａｐｐｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　４：　第４１〜５７頁（１９８２）；およびＭ．Ｄ．　Ｐａｒｔｉｓ，　Ｊ．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ．，　２：第２６３〜２７７頁（１９８３）。スルホ−ＳＭＣＣを用いる際には、スルホ−ＳＭＣＣの活性スルホサクシニミジルエステル末端はｐＨ７．０〜７．５においてアミンと反応してペプチド結合を形成する。形成したスルホ−ＳＭＣＣ／ジアミン架橋単位は長さが約１６オングストロームである。
【００２７】
ポリアミンとスルホ−ＳＭＣＣとの反応を実施する際には、粒子の凝集を顕微鏡試験（１０００倍拡大）およびクールター　Ｎ４ＭＤサブミクロン粒子サイズアナライザー（アメリカ合衆国フロリダ州マイアミ所在のクールター　コーポレーション）または同様の装置を用いた光散乱分析により監視した。
スルホ−ＳＭＣＣのマレイミジル基はｐＨ６．５〜７．５で遊離スルフヒドリル基と反応して安定な共有チオエーテル結合を形成する。しかし、スルホ−ＳＭＣＣと反応する被覆した粒子が、スルホ−ＳＭＣＣのマレイミジル末端と反応しうる遊離スルフヒドリル基を含まないことが必須である。スルフヒドリル基は、ゼラチンがほとんど有しないシステインおよびシステインアミノ酸残基上に見いだされるかまたはこれから発生する。従って、本発明の架橋したゼラチン粒子は、スルホ−ＳＭＣＣと反応する前に遊離スルフヒドリル基を遮断するタンパク質変性剤を必要としない。
【００２８】
生体物質、特にモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、スルホ−ＳＭＣＣ官能化粒子のマレイミジル末端に、本来的にまたは誘導体化により上記生体物質上に存在するスルフヒドリル基により共有結合することができる。システイン残基を有する生体物質は、本質的にスルフヒドリル基を含む。付加的なスルフヒドリル基を導入するために、生体物質のアミノ基を、トラウトの試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）、２−イミノチオラン塩酸塩（ＩＴ）により、７〜１０の範囲内のｐＨで活性化する。Ｍ．　Ｅｒｅｃｉｎｓｋａ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．，　７６：第４９５〜５００頁（１９７７）；　Ｊ．Ｍ．　Ｌａｍｂｅｒｔ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　１７：第５４０６〜５４１６頁（１９７８）；およびＭ．Ｅ．　Ｂｉｒｎｂａｕｍｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．，　１８１：　第２０１〜２１３頁（１９７９）。生体物質が抗体である際には、抗体のリシルおよび末端アミノ基をＩＴにより活性化する。本発明において、反応条件および反応体の濃度を変化させて最適な結合を決定し、従って、基材粒子と結合した際に、生体物質、特に抗体は最大官能活性を保持する。マレイミドはスルフヒドリル基と溶液中で極めて急速に反応するが、粒子上で固定された同一の基は、タンパク質と反応するための反応時間が長かった。特にＩｇＭ抗体を用いた際には、抗体結合中の粒子および抗体濃度を最適化して凝集を回避した。ＩｇＭ抗体を最適化する手順を、等電点が約５．０〜約９．０の範囲内であるすべてのモノクローナル抗体に用いることができる。一般に、単なる吸着に必要であるより約３０倍少ない抗体が、共有結合を達成するために必要であった；抗体を得るのが高価であるかまたは困難である際の重要性の結果が含まれる。
【００２９】
マレイミジルにより活性化された粒子との結合反応において用いられるイミノチオランにより活性化された抗体の最適濃度を、活性化抗体結合曲線（表面抗体対全抗体濃度）を用いることにより決定した。代表的な結合時間の後、試料を採取し、０．２μｍ低タンパク質結合フィルターで濾過した。濾液を分光光度分析し、表面抗体を、初期溶液中の全抗体と濾液中の抗体との間の差異（全抗体−濾液抗体）により決定した。抗体（Ａｂ）濃度依存性実施例における結合データは、ラングミュア等温型特性を示す；即ち、全抗体対表面抗体濃度に関して線型低濃度領域であり、高濃度における粒子表面において飽和を示す平滑な変曲点および安定水準である。実際に用いられる抗体濃度は、変曲点におけるものまたは変曲点よりわずかに高い濃度におけるものであった。直線に関して双曲線の方程式を１つに計算し直すことにより、結合定数を図式的に得た。１／ｎ２　ｓ対１／Ｃ２の２つの相互のプロットを作図し、ここでｎ２　ｓは粒子のグラムあたり結合したＩＴ−Ａｂのモル数であり、Ｃ２は平衡における遊離ＩＴ−Ａｂのモル濃度である。線型のプロットは、ラングミュア型結合の挙動を示す。ＩＴ−Ａｂのスルホ−ＳＭＣＣにより活性化されたフェライト粒子に対する結合定数Ｋ１＝ｎｓＫを、方程式１／ｎ２　ｓ＝１／（ｎｓＫＣ２）＋１／ｎｓ（式中Ｋは固有結合定数であり、ｎｓはフェライト粒子のグラムあたりの結合部位のモル数である）を用いて計算した。種々のモノクローナル抗体に関するプロットの線型回帰分析により、以下の結果が得られた：
【００３０】
Ａｂ　Ｔ１１：　　Ｋ＝１．３×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝５．９×１０−８モル／ｇ
Ａｂ　ＫＣ１６：　Ｋ＝６．４×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝５．１×１０−７モル／ｇ
Ａｂ　１Ｄ３：　　Ｋ＝２．７×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝２．０×１０−７モル／ｇ
Ａｂ　ＭＯ２：　　Ｋ＝１．８×１０７Ｍ−１　ｎｓ＝７．１×１０−７モル／ｇ
フェライト粒子に関する結果を、アミノデキストランで共有結合被覆し、モノクローナル抗体およびタンパク質と結合した市場で入手できるカルボキシ変性ラテックスビーズ（磁鉄鉱２３％，直径０．９８０μｍ、Ｒｈ　ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃから得られる）に関する類似するデータと好ましく比較した。結果は以下の通りである：Ａｂ　Ｔ１１：　　Ｋ＝６．５×１０５Ｍ−１　ｎｓ＝１．１×１０−７モル／ｇ
Ａｂ　ＫＣ１６：　Ｋ＝３．２×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝６．９×１０−８モル／ｇ
Ａｂ　１Ｄ３：　　Ｋ＝３．２×１０５Ｍ−１　ｎｓ＝１．７×１０−７モル／ｇ
Ａｂ　ＭＯ２：　　Ｋ＝２．０×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝１．６×１０−７モル／ｇ
Ａｂ　ＫＣ４８：　Ｋ＝２．５×１０５Ｍ−１　ｎｓ＝７．６×１０−８モル／ｇ
Ａｂ　ＰＬＴ−１：Ｋ＝２．８×１０５Ｍ−１　ｎｓ＝２．２×１０−７モル／ｇ
ストレプタビジン：Ｋ＝１．３×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝９．５×１０−８モル／ｇ
フェライト核ビーズに加えて、本発明を、架橋したゼラチンで被覆したポリスチレンビーズに結合したモノクローナル抗体を用いて評価した。これらの抗体に関する結合定数は、上記した両方の評価と好ましく比較し、以下の通りであった：
Ａｂ　Ｔ８：　　　Ｋ＝１．７×１０６Ｍ−１　ｎｓ＝９．５×１０−８モル／ｇ
Ａｂ　Ｔ４：　　　Ｋ＝２．５×１０７Ｍ−１　ｎｓ＝３．５×１０−８モル／ｇ
ポリスチレンビーズを用いた結果は、本発明の方法は磁性球に限定されず、疎水性表面を有する任意のコロイド粒子を用いて用いることができることを示す。
【００３１】
【磁性ビーズを用いた好適例の記載】
Ｉ．第１および第２ゼラチン層を有する磁性粒子の製造
磁鉄鉱および他の磁性粒子のゼラチン溶液中での製造
１０ミリモル（５ミリリットル）の２Ｍ　ＫＮＯ３溶液、１２．５ミリモル（２．５ミリリットル）の５Ｍ　ＫＯＨ溶液および１１．２５ミリリットルの二回蒸留水（ＤＤＷ）を混合し、Ｎ２ガスを１０分間パージした（溶液Ａ）。次に、６．２５ミリモル（６．２５ミリリットル）の１Ｍ　ＦｅＳＯ４溶液および２５ミリリットルの新たに調製した、Ｎ２をパージした２％のＢ型、ブルーム数２２５のウシ皮膚ゼラチン溶液［有用なゼラチン溶液の範囲は約０．８〜約２．０％である］をパイレックス（登録商標）ビン中の溶液Ａに加え、混合し、Ｎ２ガスで掃引し、きつくふたをし、オーブン中に９０℃で４時間平静に置いた。黒色磁鉄鉱粒子の懸濁液が室温に到達した後、これらを１／２時間超音波処理し、１％のＢ型、ブルーム数２２５のゼラチン溶液で洗浄し、次に次の段階のように大過剰量の１％ｗ／ｖゼラチンと接触させた。
また、ゼラチンをこれらの調製物中でその場で用いて、金属フェライトを調製した。他の金属、即ちＭｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋および（Ｍ２＋）を用いた実施例において、Ｍ２＋：Ｆｅ２＋のモル比を１：２に保持したが、Ｃｏ２＋およびＮｉ２＋に関しては硝酸塩を硫酸塩の代わりに用いた。合計の金属対水酸化物のモル比を１：２に保持した；しかし、関連するＫＮＯ３対全金属およびＫＮＯ３対ＫＯＨのモル比を変化させた。混合Ｍｎ／Ｚｎフェライトを製造するにあたり、１：１のモル比の硫酸マンガン対硫酸亜鉛および同一の合計モル量の非鉄金属イオンを用いた。以下に例を示す。
１０ミリモル（５ミリリットル）の２Ｍ　ＫＮＯ３溶液、１８．７５ミリモル（３．７５ミリリットル）の５Ｍ　ＫＯＨ溶液および６．８７５ミリリットルのＤＤＷを混合し、Ｎ２ガスを１０分間パージした（溶液Ｃ）。次に、６．２５ミリモル（６．２５ミリリットル）の１Ｍ　ＦｅＳＯ４溶液、３．１２５ミリモル（３．１２５ミリリットル）の１Ｍ　Ｃｏ（ＮＯ３）溶液および２５ミリリットルのＢ型、ブルーム数２２５のウシ皮膚ゼラチン溶液を混合し、Ｎ２ガスを１０分間パージした（溶液Ｄ）。溶液Ｄをパイレックス（登録商標）ビン中の溶液Ｃに加え、混合し、Ｎ２ガスで掃引し、きつくふたをし、オーブン中に９０℃で５時間平静に置いた。茶色粒子の懸濁液が室温に到達した後、これらを１／２時間超音波処理し、１％のＢ型、ブルーム数２２５のゼラチン溶液で洗浄し、次に次の段階のように大過剰量の１％ｗ／ｖゼラチンと接触させた。
【００３２】
上記の方法を用いて、直径が約０．１および０．２μｍであり、球形形状のコバルトおよびニッケルフェライト粒子を、大きい、ゆるく保持された茶色の凝集体に形成した。亜鉛は、７２時間の熱処理の後にもなお低い収率の直径が約０．２μｍより小さい淡い茶色の磁性材料を生成した。均一な球形形状であり、直径が０．３μｍである濃い茶色のマンガンフェライト粒子が単一粒子として８３〜８８％の収率で得られた。同様の淡い茶色のマンガン−亜鉛フェライト粒子が９０℃で７２時間熱処理した後に４９〜５５％の収率で得られた。バリウムに関しては、ＢａＳＯ４は水に不溶であるため、方法を変更した。（バリウムが存在する場合を除いて、２価の金属をこれらの塩化物または硫酸塩として硝酸塩と同様に用いることができる。）従って、６．２５ミリモル（６．２５ミリリットル）の１Ｍ　ＦｅＣｌ２溶液、０．５ミリモル（５．０ミリリットル）の０．１　Ｂａ（ＮＯ３）２溶液および２５ミリリットルの２％ゼラチンを混合し、Ｎ２ガスを１０分間パージした（溶液Ｄ）。１０ミリモルのＫＯＨ溶液（２ミリリットル）を用い、熱処理を２０時間続けた以外は、溶液Ｃおよびフェライト製造工程の残りは不変とした。直径が０．２μｍであり、均一な非球形形状の黒色のバリウムフェライト粒子が形成した。
【００３３】
ゼラチン被覆した磁性粒子の製造
均一な大きさ（０．３μｍ）および球形形状を有し、上記の方法によりその場でゼラチンを用いて製造した若干量の磁性粒子、例えばマンガンフェライト粒子を、大過剰量の１％ｗ／ｖのＢ型、ブルーム数２２５のゼラチン水溶液と接触させた。あるいはまた、均一な大きさ（０．３μｍ）および球形形状を有する、予備成形した（即ち、ゼラチンのその場での使用以外の方法により製造した）分散性磁性粒子、例えばマンガンフェライト粒子を、大過剰量の１％ｗ／ｖのＢ型、ブルーム数２２５のゼラチン溶液と、周囲温度で約６０分間接触させた。次に、粒子（上記のいずれか）を磁気的に分離し、０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液中の、２％ｗ／ｖのＡ型、ブルーム数１７５のゼラチン溶液、ｐＨ８．４で５回洗浄した。洗浄後、粒子を、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１％ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含む、２％ｗ／ｖのＡ型、Ａ型ゼラチンの水溶液中の２．５％ｗ／ｖ（重量／容量）固体懸濁液としてｐＨ８．４で周囲温度で数カ月以内貯蔵した。貯蔵溶液のアジ化物含有物が保持されている場合には、懸濁液は、約３か月まで貯蔵することができる。
【００３４】
吸着したゼラチンの架橋
６２．５マイクロリットルの２５％グルタルアルデヒド水溶液（０．１５６ミリモル）を、１２０ミリリットルの、０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液中の１％ポリビニルピロリドン（分子量＝４０，０００）、ｐＨ７．２に加えた。これに、上記で製造した５ミリリットルの２．５％固体懸濁液をグルタルアルデヒド溶液に加え、形成した懸濁液を周囲温度で３〜１５分間、好ましくは約６分間混合した。
【００３５】
未反応アルデヒド基の遮断
０．１０５ミリリットルの９９％エチレンジアミン（１．５６ミリモル）を、１％ＰＶＰ溶液、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２中の１２５ミリリットルの固定した、ゼラチンで被覆した磁性粒子（０．１％ｗ／ｖ固体）に加えた。形成した懸濁液を、約１〜４時間、好ましくは約２時間、２５０ミリリットルの組織培養フラスコ中で混合した。混合時間の終了時に、１．２５ミリリットルの０．１ｍＭ　ＫＯＨ中の水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）の１０ｍｇ／ミリリットル溶液を磁性粒子に加え、形成した懸濁液をさらに１５分間混合した。次に、粒子を磁気的に分離し、複数回、好ましくは３回、０．２Ｍ塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。
【００３６】
安定剤としてポリビニルピロリドンを用いない吸着したゼラチンの架橋
上記のようにして製造した０．１Ｍ　リン酸緩衝液中の、２％ｗ／ｖのＡ型、ブルーム数１７５のゼラチン、ｐＨ８．４に懸濁させた５ミリリットルの２．５％ｗ／ｖ固体マンガンフェライト粒子を磁気的に分離した。透明な上澄み液を廃棄し、磁性粒子の残留物を、５６マイクロリットルの２５％グルタルアルデヒド水溶液と１ｍＭ水酸化カリウム溶液、ｐＨ１０．００とを混合することにより調製した５ミリリットルの３ｍｇ／ミリリットルのグルタルアルデヒド水溶液に再懸濁させた。形成した磁性粒子の懸濁液を約３０分間混合し、好ましくはローラー混合した。グルタルアルデヒドの添加および混合が完了した後、約３４マイクロリットルのエチレンジアミン（ジアミン対グルタルアルデヒドのモル比が１０：１）を反応混合物に加え、次にこれをさらに２〜３時間かきまぜた。次に、１ｍＭ　ＫＯＨ中の水素化ホウ素ナトリウムの４０ｍｇ／ミリリットル溶液約０．３１３ミリリットルを反応混合物に加え、形成した混合物を約１０〜３０分間かきまぜた。次に、架橋した粒子を３回磁気的分離を用いて洗浄し、５ミリリットルの１ｍＭ水酸化カリウム水溶液中に再懸濁させた。
【００３７】
元素分析にあたり、マンガンフェライト粒子上の架橋したゼラチンの懸濁液５ミリリットルをさらに１５回蒸留水で洗浄し、磁気的に分離した残留物をオーブン中で１００℃で乾燥した。重量百分率分析は以下の通りであった：Ｍｎ，１９．０５％；Ｆｅ，４９．４９％；Ｃ，０．５４％；Ｈ＜０．５％；Ｏ，３０．９２％（差分）。炭素のゼラチン中の重量百分率は、このアミノ酸含量から得られ、これは以下の通りであった：Ｃ，５０．４６％；Ｈ．６．７６５％；Ｎ，１８．２７％；Ｏ，２４．２９％およびＳ，０．２１％。［「Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓ」，第４編、Ｔ．Ｈ．　Ｊａｍｅｓ編、（ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ、ニューヨーク，１９７７）、第２章、第５２頁参照］。このようにして、１ｇのフェライト−ゼラチン粒子に関して、１ｇ×０．００５４／０．５０５６＝０．０１０７０ｇのゼラチンおよび０．９８９３ｇのフェライトが存在する。球形であり、直径が０．２９μｍであるマンガンフェライト粒子の粒子あたりの容積は、１．２７７×１０−１４ｃｍ３である。４．２４ｇ／ｃｍ３の粒子密度を用いて、粒子あたりの質量は、５．４１４×１０−１４ｇであり、０．９８９３ｇのフェライト中の粒子の数は１．８２７×１０１３である。従って、粒子あたりのゼラチンの質量は５．８５６×１０−１６ｇである。グルタルアルデヒドで架橋させる前の２％ｗ／ｖのゼラチンから０．０２ｇ／ｃｍ３のゼラチン被膜の密度を仮定すると、粒子あたりのゼラチンの容量は、２．９２×１０−５ｃｍ３である。従って、粒子あたりの合計容積（フェライトおよびゼラチン）は、４．２０５×１０−１４ｃｍ３であり、フェライトおよびゼラチンから成る球の半径は、２．１５７×１０−５ｃｍ、即ち０．２１５７μｍである。次に、ゼラチン被膜の厚さは、０．２１５７μｍ−０．１４５μｍ（フェライト粒子の平均半径）＝０．０７０７μｍ（即ち約７１ｎｍ）である。ゼラチン被膜の厚さに関するこの値は、以下の刊行物から得られるようなゼラチンの種々の表面への以下の吸着データと良好に整合する。
１．Ａ．Ｔ．　Ｋｕｄｉｓｈ等、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｔ　Ｉｎｔｅｒｇａｃｅｓ，　ＡＣＳ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　３４３，　Ｔ．Ｌ．　ＢｒａｓｈおよびＴ．Ａ．　Ｈｏｒｂｅｔｔ編（ワシントン，　Ｄ．Ｃ．；　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　１９８７）、第１７章、第２６１〜２７７頁：ガラス上のＡ型ブタ皮膚ゼラチンは、７５０Å（０．０７５μｍ）の被膜の厚さを与え、ガラス上のＢ型子牛皮膚ゼラチンは、５００Å（０．０５０μｍ）の被膜の厚さを与えた。
２．Ｎ．　Ｋａｗａｎｉｓｋｉ等、Ｊ．　Ｐｈｙｓ．　Ｃｈｅｍ．　９４：　第４６１１〜４６１７頁（１９７０）：マイカ上のＢ型ゼラチン、ブルーム数２５９は、７５ｎｍ（７５０Å）において、力対距離（マイカ表面間）の引力最小（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ　ｍｉｎｉｍｕｍ）を与えた。
３．Ｈ．　Ｍｅｌｔｇｅｒ等、Ｊ．　Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｇａｃｅ　Ｓｃｉ．　１２６：　第　２９２〜　３０３頁（１９８８）：ガラス上の変性可溶性子牛皮膚コラーゲン（即ちゼラチン）は、６００〜７００Å（０．０６０００〜０．０７００μｍ）の被膜の厚さを与えた。
粒子が分析にのみならず、さらに用いられる際には、グルタルアルデヒドからの残留アルデヒド基を、ジアミンとの反応により除去する。
【００３８】
固定したゼラチンのカルボン酸残基との反応
２．１１ミリリットルの９９％エチレンジアミンを、０．２Ｍ　ＮａＣｌ水溶液中のアルデヒドで遮断したビーズの懸濁液、０．１％ｗ／ｖ固体１１８ミリリットルに加えた。形成した懸濁液を、約１５分間物理的および超音波的に混合した。この混合の後、０．２Ｍ　ＮａＣｌ中の１０ｍｇ／ミリリットルのＥＤＡＣ４．５ミリリットルを加え、懸濁液を第１に、約１５分間物理的および超音波的に混合し、最後に物理的に約８〜１６時間混合した。次に、フラスコの内容物を磁気的に分離し、１Ｘ　ＰＢＳで複数回洗浄し、１Ｘ　ＰＢＳ中で約３０分間超音波的に混合し、最後に５ミリリットルの１Ｘ　ＰＢＳ中の２．５％ｗ／ｖ固体に濃縮した。大規模（１００ｘ）製造にあたり、前のアルデヒド遮断工程およびＥＤＡＣ結合工程を組み合わせて、複数回の分離および洗浄を回避した。工程の組み合わせの結果、最終的な抗体結合ビーズの活性の損失はなかった。
ジアミンで処理した粒子のスルホ−ＳＭＣＣによる活性化
【００３９】
一般に、新たに調製した１Ｘ　ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ミリリットルのスルホ−ＳＭＣＣ２７マイクロリットルを、２．５％ｗ／ｖ磁性粒子懸濁液１ミリリットルあたり用いた。代表的な調製において、１３５マイクロリットルのスルホ−ＳＭＣＣ溶液を、５ミリリットルの２．５％ｗ／ｖ粒子に加えた。次に、混合物を、１５ミリリットルのプラスチック製遠心管中で約１時間ローラー混合し、約５分間超音波的に混合し、磁気的に分離し、１Ｘ　ＰＢＳで複数回洗浄した。
上記の一連の工程により形成した、官能化された架橋したゼラチン被覆粒子は側マレイミジル基を有し、種々の医学的および／または生物学的使用に適する。粒子に結合することが望ましい物質が十分な活性スルフヒドリル基を有する場合には、この物質の活性化は不必要であり、以下の段階を省略することができる。
【００４０】
２−イミノチオラン塩酸塩での抗体の活性化
０．１％のＮａＮ３を含む１Ｘ　ＰＢＳ中の５１．２４ｍｇ／ミリリットルの濃度のＴ１１モノクローナル抗体を調製した。結合中の１０ｍｇのＴ１１抗体および１５ｍｇ／ミリリットルの抗体濃度に関して、合計の反応容積は０．６６７ミリリットルでなければならない。１５：１：：ＩＴ：Ｔ１１の活性化比率を用いて、１Ｘ　ＰＢＳ中の０．９３７５マイクロモル（０．１２９ｍｇ）のＩＴ（６５マイクロリットルの２ｍｇ／ミリリットルＩＴ）が必要である。従って、０．４０７ミリリットルの１Ｘ　ＰＢＳ溶液を０．１９５ミリリットルのＴ１１濃縮物に加え、これにより形成した溶液に、さらに６５マイクロリットルの２ｍｇ／ミリリットルＩＴ溶液を加えた。最終的に形成した溶液を管反応器中で１時間ローラー混合した。次に、反応管の内容物を、２０ミリリットルのＧ−５０セファデックスカラムの最上部に加え、平衡にし、１００ミリリットルの１Ｘ　ＰＢＳで洗浄した。誘導体化した抗体を、１Ｘ　ＰＢＳを用いて溶出し、複数の２．５ミリリットルフラクションをＵＶモニターで補助しながら採集した。２８０ｎｍにおける帯吸収の中央のフラクションを保存し、Ａ２８０値を用いてＴ１１／ＩＴ抗体濃度を決定した。代表的に、Ｔ１１／ＩＴ濃度は約３．０ｍｇ／ミリリットルであった。Ｔ１１／ＩＴ溶液を、溶媒を除去することにより濃縮することができる。
【００４１】
Ｔ１１／ＩＴのスルホ−ＳＭＣＣ誘導体化粒子との結合
実験室規模結合において、合計容積は５ミリリットルであり、粒子の濃度は２．５％ｗ／ｖ固体であり、Ｔ１１／ＩＴ濃度は０．９ｍｇ／ミリリットルであった。１つの試料において、精製したＴ１１／ＩＴ溶液の濃度が１．８５０ｍｇ／ミリリットルである際には、１Ｘ　ＰＢＳ中のＴ１１／ＩＴ抗体溶液２．３９２ミリリットルを、２．４３２ミリリットルの上澄み液を除去することにより予め濃縮した２．５％ｗ／ｖ固体のスルホ−ＳＭＣＣ活性化粒子５ミリリットルに加えた。Ｔ１１／ＩＴ溶液を粒子に０．５ミリリットルずつ、添加の間に超音波的および物理的に混合しながら加えた。次に、形成した溶液を１５ミリリットルの管中で約２時間ローラー混合した。次に１ミリリットルの試験試料を採取し、低タンパク質結合０．２μｍフィルターで濾過し、濾液をＴ１１抗体に関して、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより分光光度分析した；Ａ２８０＝ｃ（上澄み液）＝０．３９８６ｍｇ／ミリリットル。［差分による測定、ｃ（表面）＝ｃ（合計）−ｃ（上澄み液）］。従って、ｃ（表面）＝０．９ｍｇ／ミリリットル−０．３９８６ｍｇ／ミリリットル＝０．５０１ｍｇ／ミリリットル。これは、粒子１ｇあたり２０ｍｇＴ１１のＴ１１表面負荷に言い換えられるかまたは、マンガンフェライト粒子に関しては、４．８９ｍ２／ｇの比表面積に関して、４．１ｍｇ　Ｔ１１／ｍ２粒子表面積であった。粒子濃度の２倍および３倍希釈を用いたが、結合中の同一の合計抗体濃度を用いた同様の方法により、一層高い表面抗体負荷が得られた。しかし、粒子濃度の４倍希釈が一層高い抗体の表面被覆を与えなかった際に、限界に到達した。
【００４２】
未反応マレイミジルおよびスルフヒドリル基の遮断
スルホ−ＳＭＣＣ活性化粒子上の未反応マレイミジル基を、抗体結合の後にＬ−システインで遮断した。代表的に、１Ｘ　ＰＢＳ中の５ｍｇ／ミリリットルのＬ−システイン０．４８０ミリリットルを、前の工程の結合混合物の残りの４ミリリットルに加え、形成した溶液を１５分間ローラー混合した。未反応スルフヒドリル基を、１Ｘ　ＰＢＳ中の２０ｍｇ／ミリリットルのヨードアセトアミド０．５３４ミリリットルを加え、続いて０．１００ミリリットルの１Ｍ、ｐＨ９．８のホウ酸ナトリウム緩衝液を加えることにより遮断した。形成した溶液を３０分間ローラー混合し、遮断した結合混合物を磁気的に分離し、粒子を１％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、熱ショック）および０．１％ＮａＮ３（ＢＳＡ緩衝液）を含む１Ｘ　ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、４ミリリットルの前記のＢＳＡ溶液を粒子に加え、粒子を約１時間ローラー混合し、４℃に約８〜１６時間貯蔵し、磁気的に分離し、ＢＳＡ緩衝液でさらに３回洗浄した。
本明細書に記載した方法により製造した粒子を含む抗体は、種々の細胞分離アッセイにおいて有用であることが見いだされた。生体物質が、抗体に結合することができる抗原決定基を含む場合には、本発明を用いるアッセイにおいて用いられる生体物質は、正常または異常Ｔ細胞、Ｂ細胞、白血球、ウィルス、赤血球、胸部、子宮、結腸、腎臓、肝臓、肺、精巣、腹部、甲状腺および上皮小体の細胞等から成る群から選択することができる。
【００４３】
上記の磁性粒子の例と同等の本発明の例において、マレイミジル基とスルフヒドリル基とを入替えることができる。即ち、架橋したゼラチンで被覆した粒子を、上記したマレイミジル基の代わりに反応性スルフヒドリル基で終了する側基を有するように誘導体化し、抗体を、上記したスルフヒドリル基の代わりに反応性マレイミジル基を有するように誘導体化する。この同等の例を製造するのに用いられる方法は，上記と同一である。両方の場合において、抗体をゼラチン表面に、上記のようにして製造した分子架橋により結合させる。
以下の実施例は、本発明の有用性を例示するために示すものであり、本発明を限定するものと解釈するべきではない。
【００４４】
【実施例１】
Ｔ細胞およびＢ細胞集団の磁性ビーズ除去に対するプロトコール。
フィコール−ハイパ−ク（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）勾配の密度単離により全血試料から単核細胞（ＭＮＣ）を得て、ＰＢＳで洗浄した。試験する磁性粒子懸濁液（２．５％Ｗ／Ｖ）と結合した５，１０，２５，５０および１００マイクロリットルのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む一連の管に１ミリリットルの１×ＰＢＳ中の１×１０６ＭＮＣを添加した。２本の管を除去および非除去の各コントロール用にした。その後、得られた懸濁液を多重管渦巻器あるいは単一管回転器で３分間回転した。培養の終期に、細胞懸濁液を単一管磁性ラックにより供された磁界中に合計２分間置いた。磁性分離の終期に、非結合細胞をパストゥールピペットを用いて管の中央から透明な液体を全部抜き出すことによって抽出した。
Ｔ細胞あるいはＢ細胞（Ｔ１１，Ｔ３，Ｔ４，Ｔ８，Ｂ１，Ｂ４）では、除去後集めた細胞懸濁液を元の細胞懸濁液と直接比較し、その後粒子除去した。元のおよび除去した試料を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みをデカントし、各管中に残っている約１００マイクロリットルの１×ＰＢＳを残した。その後室温にて１０分間除去管の各組の一方の管を１０マイクロリットルのＣＹＴＯ−ＳＴＡＴ（商標）ＭｓＩｇＧ１−ＲＤ１／ＭｓＩｇＧ１−ＦＩＴＣコントロール試薬（ＭＳ）を用いて染色し（ｓｔａｉｎ）、他の管を１０マイクロリットルのＣＹＴＯ−ＳＴＡＴ（商標）Ｔ１１−ＲＤ／Ｂ４−ＦＩＴＣ試薬（Ｔ１１，Ｔ３，Ｂ１あるいはＢ４除去に対して）あるいは１０マイクロリットルのＴ４−ＲＤ１／Ｔ８−ＦＩＴＣ試薬（Ｔ４あるいはＴ８除去に対して）を用いて染色した。培養の終期に、５００マイクロリットルのＰＢＳを各試料に添加し、試料をフローサイトメトリーにより分析した。試料をＭビーズ２−カラープログラムを使用してＥＰＩＣＳ（商標）プロフィルで分析した。（ＥＰＩＣＳ（商標）およびＣＹＴＯ−ＳＴＡＴ（商標）はクールター　コーポレーションの登録商標である）。Ｍｓコントロール試薬で染色した元の試料を操作し、検査してリンパ球集団がビットマップ１に完全に組み込まれたか否かを決定し、必要な場合は調整した。弁別器２の左側を＜１％の陽性染色を与えるチャンネルの各蛍光ヒストグラムに対してセットした。このことはＭｓコントロール試薬を用いて染色した各試料に対して行われ、その後特異的な抗体を用いて染色した対応する管を分析した。データを集め、赤および緑のヒストグラム（ＴおよびＢすなわちＴ４およびＴ８）の陽性染色細胞の、陽性のパーセントではなくて、絶対数として記録した。以下に試験結果をまとめる。
【００４５】
【実施例２】
赤血球（ＲＢＣ）の磁性ビーズ除去に対するプロトコール。
１００マイクロリットルのＮａ４ＥＤＴＡ抗凝固全血を一連の反応管中に置いた。各管に、磁性粒子懸濁液（２．５％Ｗ／Ｖ）と結合した２５〜１５０マイクロリットルのＫＣ−１６を添加し、ＰＢＳを使用して合計体積を２５０マイクロリットルに調整した。懸濁液を３〜５分間多重管渦巻器あるいは単一管回転器で低混合速度にて回転した。回転完了後、１ｍｌのＰＢＳを各試料管に添加し、その後管を２〜５分間磁性ラックに置いた。パストゥールピペットを使用して各管から全上澄みを除去し、標識化管中に蓄えた。試料をクールター　Ｓ−ｐｌｕｓ（商標）ＩＶあるいは類似のｒｂｃカウンターで全ｒｂｃ数／ｍｌ全血として分析した。陽性コントロールは１００マイクロリットルの全血プラス１．１５０ミリリットルの１×ＰＢＳであり、１００％ｒｂｃカウントを与え、陰性コントロールは１００マイクロリットルの全血プラス１．１５０ミリリットルのバッチ溶解剤あるいは類似の溶解剤であり、０％ｒｂｃカウントを与えた。除去ｒｂｃの百分率は１００％である〔（試料管中のｒｂｃカウント）／（１００％ｒｂｃカウント）〕。
【００４６】
【実施例３】
白血球の磁性ビーズ除去に対するプロトコール
１００ミリリットルのＮａ４ＥＤＴＡ−抗凝固全血を集め、多数の遠心分離管に分離し、１０分間５００ｇにて遠心分離した。大部分の血漿を除去し、各管から細胞のバフ（ｂｕｆｆ）着色層を除去し、一緒に溜めて、更に１０分間５００ｇにて遠心分離した。バフ着色細胞および血漿は、ｒｂｃカウントが８．０×１０９／ｍｌ以下であり、白血球（ｗｂｃ）が２〜４×１０７／ｍｌである白血球リッチ全血を構成する。
１００マイクロリットルの白血球リッチ全血を多数の反応管中にピペットで入れた。その後１０〜１６０マイクロリットル量の磁性ビーズ懸濁液（２．５％Ｗ／Ｖ）を各管にピペットで入れ、その後２００マイクロリットルの１×ＰＢＳを加えた。（１０〜４０マイクロリットルのビーズを用いたＮ．Ｂ．Ｌｏｗｅｒ滴定点を最初に操作すべきである。終点除去が４０マイクロリットルで得られない場合のみ付加的なビーズを加えた）。各管を３〜５分間低速度で回転した。その後２ミリリットルの１×ＰＢＳを加え、管の内容物を混合し、その後２分間磁性的に分離した。全上澄み液を除去し、二重管中に置き、その後５分間４００ｇにて遠心分離した。その後得られた上澄みをヒペットで注意深く除去し、分析した。
白血球リッチあるいは白血球除去全血試料を細胞の混合物から特異的な細胞の除去に対して弁別するために設計した１０マイクロリットルの単一のあるいは２つのカラー抗体調製物を添加することより分析した。例えば、Ｔ１１結合磁性ビーズを除去に使用した場合、Ｔ１１−Ｂ４２つのカラーを使用して実際のＴ１１細胞除去とＴ１１細胞の非特異的除去（即ちＢ細胞）を弁別した。混合物を渦で混合し、暗中で室温にて１０分間培養した。コントロールは非除去細胞を用いた抗体コントロールおよびアイソタイプコントロールであった。その後試験管をクールターＥＰＩＣＳ（商標）Ｑ−プレップあるいは類似の装置に置き、３５秒溶解モードで操作した。ｒｂｃを溶解し、試料を固定した（Ｑ−プレップ）後、全試料をクールターＥＰＩＣＳ（商標）プロフィルフローサイトメーターあるいは類似の装置で分析した。この手順は試料の体積あたりの実際の細胞数としてデータを得るために必要である。プロフィルで利用できるプログラムをリンパ球および単球−骨髄集団の分析に使用した。
【００４７】
実施例１〜３のプロトコールを使用した試験結果の概要
１．Ｔ１１／Ｂ４免疫細胞アッセイでは、非除去コントロールは９７，２０９Ｔ１１＋、１８，２４０Ｂ４＋、１９，７１７単球および２５，３８１顆粒球カウントを与えた。Ｔ１１抗体に結合した１０マイクロリットルの２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズを用いた除去の後、カウントはそれぞれ１５，８２６、２０，１８１、１９，９５４および３０，９７２であった。２０マイクロリットルのＴ１１抗体結合ビーズを用いた除去は２，２５６、２０，９８９、２０，８７４および３１，９６５カウントを与えた；３０マイクロリットルでは１，１５０、２１，４２８、２０，６９７および３５，３６２カウントを与えた；および４０マイクロリットルでは６４４、２１，２３２、１９，８１７および３３，９３５カウントをそれぞれ与えた。
２．Ｔ４／Ｔ８免疫細胞アッセイでは、４．１×１０５Ｔ８および７．９×１０５Ｔ４細胞を含有する非除去コントロールは５４，４１５Ｔ４および２７，９０６Ｔ８カウントを与えた。Ｔ８抗体に結合した２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズの１０、２０および３０マイクロリットルを用いた除去の後、カウントはそれぞれ５７，０３０および１２、５９，５３８および６、および６０，９０５および５であった。
３．赤血球／血小板アッセイでは、非除去コントロールは４．５×１０６ｗｂｃ、４．４×１０８ｒｂｃおよび４．７×１０７血小板を含有した。除去実験はＫＣ−１６抗体に結合した２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズの２０、４０、６０および８０マイクロリットルを使用して行った。除去の後残留するｗｂｃ、ｒｂｃおよび血小板は、２０マイクロリットルでは４．４×１０６のｗｂｃ、１．６×１０８のｒｂｃおよび４．３×１０７の血小板であり；４０マイクロリットルでは４．６×１０６のｗｂｃ、１×１０７のｒｂｃおよび４．５×１０７の血小板であり；６０マイクロリットルでは４．５×１０６のｗｂｃ、１×１０７のｒｂｃおよび４．３×１０７の血小板であり；８０マイクロリットルでは４．５×１０６のｗｂｃ、１×１０７のｒｂｃおよび４．３×１０７の血小板であった。結果は１．８５×１０１０粒子を含有する４０マイクロリットルの２．５％固体ビーズは４．３×１０８ｒｂｃを除去し、こうして４３の粒子対ｒｂｃ比を与えた。
４．骨髄細胞アッセイでは、非除去コントロールは７３，８２１のリンパ球、１３，４２６の単球および５５，６６１の顆粒球カウントを与えた。除去研究はＫＣ−４８抗体に結合した２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズの１０、２０、３０おび４０マイクロリットルを使用して行った。結果はそれぞれ１０マイクロリットルでは７０，３３０、９，３０９および３４０カウント、２０マイクロリットルでは６８，４１４、２，００６および１，３３２カウント、３０マイクロリットルでは６２，９６６、１，５９７および９２２カウント、および４０マイクロリットルでは５９，３４０、１，５４６および８９９カウントであった。
類似の除去研究は１Ｄ３抗体に結合した２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズの１０、２０、３０および４０マイクロリットルを使用して行った。結果はそれぞれ１０マイクロリットルでは７６，４０５、１３，８３９および１，５９７カウント、２０マイクロリットルでは７３，１９８、８，６５３および１，２１６カウント、３０マイクロリットルでは６５，６６７、２，５９０および２，１３０カウント、および４０マイクロリットルでは６６，２７６、１，９０６および１，６８６カウントであった。
更なる除去研究はＭＯ２抗体に結合した２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズの１０、２０、３０および４０マイクロリットルを使用して行った。結果はそれぞれ１０マイクロリットルでは７２，５６３、３，１０７および５６，５２０カウント、２０マイクロリットルでは７２，９０５、３，６１６および３４，５３３カウント、３０マイクロリットルでは６９，６４４、１，６１８および３２，３１３カウント、および４０マイクロリットルでは６９，４７７、１，２１０および３０，８９９カウントであった。
５．赤血球／血小板アッセイでは、非除去コントロールは７×１０６ｗｂｃ、４．９×１０１０ｒｂｃおよび３．０×１０７血小板を含有した。除去研究はＰＬＴ−１抗体に結合した２．５％Ｗ／Ｖ固体磁性ビーズの２０、４０、６０および８０マイクロリットルを使用して行った。除去の後結果は２０マイクロリットルでは１０×１０６のｗｂｃ、５．４×１０１０のｒｂｃおよび１×１０６の血小板であり；４０マイクロリットルでは１０×１０６のｗｂｃ、５．８×１０１０のｒｂｃおよび１×１０６の血小板であり；６０マイクロリットルでは７×１０６のｗｂｃ、５．１×１０１０のｒｂｃおよび１×１０６の血小板であり；８０マイクロリットルでは１０×１０６のｗｂｃ、５．６×１０１０のｒｂｃおよび０の血小板であった。
【００４８】
ＩＩ．第１ゼラチン層および第２アミノデキストラン層を有する磁性粒子の調製
アミノデキストランの調製
方法Ａ．小規模なアミノデキストランの調製
デキストラン中でグリコピラノース環を部分的に分裂し、アルデヒド基に酸化し、アルデヒド基と１，３−ジアミノプロパンの結合によりシッフ塩基結合を形成し、シッフ塩基結合の還元により安定な炭素−窒素結合を形成することによってアミノデキストランを調製した。典型的な手順では、２０ｇのデキストランを１５０ミリリットルの５０ｍＭ酢酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．５に溶解した。２５ミリリットルの蒸留水中の２．１４ｇの過ヨウ素酸ナトリウムの溶液を激しく磁性混合しつつ約１０分にわたりデキストランに滴下した。得られた溶液を室温すなわち１５〜２７℃で約１．５時間攪拌し、その後蒸留水に対して透析した。２０ミリリットルの１，３−ジアミノプロパンを２０ミリリットルの蒸留水で混合し、氷浴中で冷却し、激しく攪拌し、氷酢酸の添加により約１５分にわたり約１１．５から約８．７にｐＨを調整した。典型的には１５〜２０ミリリットルの氷酢酸を使用した。透析したデキストラン溶液を冷却したジアミン溶液に約１５〜２０分にわたり滴下した。添加完了後、得られた溶液を室温で約２．２５時間攪拌した。１０ミリリットルの０．１ｍＭ水酸化ナトリウム中の０．８ｇの水素化ホウ素ナトリウムの還元溶液を約１５分にわたり室温でデキストラン反応混合物に添加した。発泡のほとんどを排出するために水素化ホウ素添加の間反応混合物を攪拌した。流出液の電導率が３〜４μｍｈｏ／ｃｍになるまで粗アミノデキストラン溶液を蒸留水に対して徹底的に透析した。その後透析溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過し、モデルＴＤＳ−０００３０−Ａ、Ｄｕｒａ−Ｄｒｙマイクロプロセッサー制御凍結乾燥器（ＦＴＳシステムインコーポレイテッド）中で２４時間凍結乾燥し、２１％の収率で４．２５の薄片状の薄黄色の結晶を得た。
【００４９】
方法Ｂ．アミノデキストランの大規模な調製
方法Ａの手順をアミノデキストランの大規模調製のためおよびデキストランに導入されたアミノ基の数を増加するために改良した。より低分子量断片に糖ポリマーの更なる分裂を避けるために、中空繊維膜濾過が透析に置き代わり、より小さいジアミン−過ヨウ化物モル比を使用した。中空繊維カートリッジ（ポリスルホン、膜表面積３ｆｔ３、繊維直径１ｍｍ、５，０００ＭＷに切断）をリテンテイト（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）ラインで５〜１０ｐｓｉに相当する１５〜２０ｐｓｉを分配するインプットパワーポンプ（２つのポンプヘッド、最大流速約４．５６リットル／分、Ｎｏ．１８Ｎｏｒｐｒｅｎｅ（商標）食品用銘柄管材料使用）に縦に据えつけた。濾液を５０〜１００ミリリットル／分で集めた。約６〜８時間にわたって２０〜３０リットルの蒸留水を使用して洗浄を行った。導電率は約３〜４μｍｈｏ／ｃｍに減少し、ｐＨは６．０〜６．５であった。脱塩中供給材料体積を２リットルに維持し、その後酸化デキストランの第１洗浄で８００ミリリットルに濃縮し、アミノデキストランの第２洗浄で４００ミリリットルに濃縮した。
【００５０】
標準規模の調製では、８０ｇのデキストランを６００ミリリットルの蒸留水を含有する１クォート（リットル）ガラスブレンダーボールに移した。固形物を約２〜５分間中速でブレンドし、全デキストランを溶解した。８．５６ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを１００ミリリットルの蒸留水に溶解し、得られた溶液を激しく磁性攪拌して約１０分にわたりデキストラン溶液に滴下した。添加完了後、得られた混合物を室温で更に３時間攪拌した。その後得られた粘性の反応混合物を蒸留水で２リットルに希釈し、中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。初期導電率は１．５ｍｍｈｏ／ｃｍあるいはこれより高く、初期ｐＨは４．０であった。約１８〜２２リットルの蒸留水を使用して終期ｐＨ６．０〜６．５を有する溶液を得た。洗浄した酸化デキストラン溶液の終期体積は８００ミリリットルであった。
【００５１】
洗浄した酸化デキストラン溶液に、８０ミリリットルの無色の液体１，３−ジアミノプロパンをゆっくりと約１０分にわたって室温で添加した。その後得られた混合物を室温で更に３時間攪拌した。攪拌終了後、４０ミリリットルの１ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液に溶解した３．２ｇの水素化ホウ素ナトリウムを室温でアミノデキストラン反応混合物に約５分にわたって磁性攪拌しつつ添加した。水素化ホウ素ナトリウムの添加終了後、得られた混合物を更に１時間攪拌し、その後中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。初期導電率は５．０ｍｍｈｏ／ｃｍあるいはそれより高く、初期ｐＨは約１２．０であった。導電率を約３〜４μｍｈｏ／ｃｍおよびｐＨを６．０〜６．５に減ずるために約２０〜２５リットルの蒸留水を必要とした。アミノデキストラン溶液の終期体積は４００ミリリットルであった。この溶液を０．２μｍの無菌酢酸セルロースフィルターユニットに通し、その後４８時間にわたって凍結乾燥して、収率５２％で４８ｇの薄片状の薄黄色の結晶を得た。
【００５２】
上記方法によりデキストランＴ−２Ｍから調製したアミノデキストランの２つの試料に対して元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ）を得た。分析は以下の通りであった。
試料１．２０ｇのデキストラン規模、透析による脱塩。
測定値：Ｃ　４３．０４
Ｈ　　６．６０
Ｎ　　１．０９
０　４９．２７　（差より）
試料２．８０ｇのデキストラン規模、膜濾過による脱塩。
測定値：Ｃ　４２．５３
Ｈ　　６．５２
Ｎ　　１．０１
０　４９．９４　（差より）
Ｃ４６Ｈ７９ＮＯ３７・３Ｈ２Ｏに対する計算値：
Ｃ　４２．７６
Ｈ　　６．６３
Ｎ　　１．０８
０　４９．５３
２つの調製物におけるアミノデキストランに対する分析は非常に類似しており、こうして脱塩を透析あるいは膜濾過でしても同じ生成物を得たことを示した。試料１に対して得た実験式Ｃ４６Ｈ８４ＮＯ４０は２９単位のグルコース（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）、１単位の完全にジアミン置換した糖環（Ｃ１２Ｈ２８Ｎ４Ｏ３）および１２単位の水に基づく式Ｃ４６Ｈ７９ＮＯ３７・３Ｈ２Ｏに非常に類似する。従って、デキストランにおけるジアミン置換の程度は１００％過ヨウ素酸塩分裂およびジアミン置換に基づく１／１２の理論値と比較して試料１では１／３０であった。試料２に対して得た実験式Ｃ４９Ｈ９０ＮＯ４３は３１単位のグルコース、１単位の完全にジアミン置換した糖環および１２単位の水に基づく式Ｃ４９Ｈ８４ＮＯ４０・３Ｈ２Ｏに非常に類似する。デキストランにおけるジアミンによる置換の程度は試料２に対しては１／３２であった。
【００５３】
アミノデキストラン被膜粒子の調製では、類似の結果を、１×（１×＝３．３％の糖残基の置換）、２×（６．６％）、３×（９．９％）および５×（１６．５％）のアミノ基のモル量を有する平均分子量が１０，０００、４０，０００および２，０００，０００であるアミノデキストラン（Ｔ−１０、Ｔ−４０およびＴ−２Ｍ）を使用して得た。全アミノデキストランをデキストランの１×酸化において使用した過ヨウ素酸ナトリウムの２倍および３倍量を使用して方法ＡおよびＢに従って初期に調製した。シッフ塩基形成で使用した１，３−ジアミノプロパンの量を一定に維持した。
【００５４】
出願番号０７／８２７，３４７において最初に開示したアミノデキストランを調製する方法ＡおよびＢに対して改良を行った。これらの改良は過ヨウ素酸アニオン、ジアミン添加およびシッフ塩基の水素化ホウ素ナトリウム還元を用いたデキストラングルコース環の酸化および分裂を含む。改良によりアミノデキストラン、特に５×アミノデキストランの収量が増加した。一般に、第１の改良は以前に開示した化学量論的な２：１ジアミン：過ヨウ素酸塩モル比に対してほんの１０％過剰のジアミンを使用することであった。第２はジアミン添加反応を約５〜１０℃の範囲の温度で行った。第３はジアミン添加反応をシッフ塩基形成に対して近紫外（ＵＶ）領域で分光器でモニターした。連続した分光分析が安定期に達したことを示したときシッフ塩基の形成は完了したと考える。その後反応を止めた。これらの改良によりより低分子量断片への重合性糖基のアミノリシスを減じ、こうして中空繊維膜濾過による精製および濃縮の後より高い収量の生成物を得た。中空繊維濾過は３ｆｔ２の膜表面積、１ｍｍの繊維直径、５０００分子量に切断したポリスルホンカートリッジを使用して行った。カートリッジをＮｏ．１８Ｎｏｒｐｒｅｎｅ（商標）食品用銘柄管材料を使用した場合最大流速４．５６リットル／分を有し１５〜２０ｐｓｉを分配する２つのポンプヘッドを備えたインプットパワーポンプ中に縦に据えつけた。この形状では、リテネイト（ｒｅｔｅｎａｔｅ）ラインにおける圧力は約５〜１０ｐｓｉであった。濾液を５０〜１００ミリリットル／分で集めた。約６〜８時間にわたって２０〜３０リットルの蒸留水を使用して洗浄を行った。５×−アミノデキストランを調製するための以下の方法を全アミノデキストランの調製に応用できる改良した手順を説明するために示す。
【００５５】
方法Ｃ．５×−アミノデキストランの調製
Ｔ−２Ｍデキストラン（５０ｇ、０．３０８モル、シグマあるいはファルマシアから得た）を３００ミリリットルの蒸留水を含有した１クォートあるいは１リットルのガラスブレンダーボールに添加した。混合物を全デキストランが溶解するまで、典型的には約３〜５分間、最大速度でブレンドした。３００ミリリットルの蒸留水中の２６．７５ｇ（０．１２５モル）のＮａＩＯ４の溶液を激しく磁性攪拌して約１０分間にわたってデキストラン溶液に添加した。過ヨウ素酸塩の添加完了後、反応混合物を室温にて更に約３時間攪拌した。３時間後、６００ミリリットルの反応体積は初期導電率９．７ｍｍｈｏ／ｃｍおよび初期ｐＨ２．５を有した。反応混合物を蒸留水で２リットルに希釈し、中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。１５〜１８リットルの蒸留水を使用して洗浄を行い、６００ミリリットルの導電率１０ｍｍｈｏ／ｃｍおよびｐＨ６．７を有する洗浄した酸化デキストラン溶液を得た。
【００５６】
酸化デキストランの溶液を氷浴を使用して約８℃に冷却し、２３．２ミリリットル（０．２７５モル）の１，３−ジアミノプロパンを約１０分にわって酸化デキストラン溶液に添加した。得られた反応混合物を攪拌し、氷浴温度に維持した。黄色のシッフ塩基の形成を抽出試料の３３５ｎｍ近ＵＶ吸収を測定することにより１０〜１５分にわたってモニターした。典型的な実験では、１ｍｍの通路長さのセルを使用した３３５ｎｍでの測定値は以下の通りであった。
【００５７】
2004003991.tif 000003
吸収値が安定期に達した後、１９．３ミリリットルの１ｍＭ水酸化カリウム水溶液中の１９．３ｇ（０．５００モル）の水素化ホウ素ナトリウムを約１０分にわたって周囲温度で磁性攪拌しつつ反応混合物に添加した。水素化ホウ素ナトリウムの添加完了後、反応混合物を周囲温度で更に約２時間攪拌した。攪拌完了後、１ｃｍの通路長さのセルを使用して３３５ｎｍでの分光器による測定値はシッフ塩基化合物が本質的に消失したことを示す０．０６７単位の吸収値を示した。その後約１０００ミリリットル体積の反応混合物を中空繊維カートリッジを使用して脱塩した。初期導電率は４３ｍｍｈｏ／ｃｍであり、初期ｐＨは１１．０であった。約１８〜２０リットルの蒸留水を洗浄の液体として使用し、導電率約４〜６μｍｈｏ／ｃｍおよびｐＨ６．５〜７．０を有する約３００ミリリットルの５×−アミノデキストラン溶液を得た。５×−アミノデキストラン溶液を０．２μｍの硝酸セルロース繊維を通して濾過し、モデルＴＤＳ−０００３０−Ａ、Ｄｕｒａ−Ｄｒｙ（商標）マイクロプロセッサー制御凍結乾燥器（ＦＴＳシステムインコーポレイテッド）中で４８時間凍結乾燥し、４８％の収率で２４ｇの薄片状の薄黄色の結晶を得た。元素分析によると、Ｃ＝４５．８３％、Ｈ＝７．００％、Ｎ＝４．４９％、Ｏ（差より）＝４２．６８％であった。Ｃ１２Ｈ２２Ｏ８．２５Ｎ
に対する計算分析では、Ｃ＝４６．１５％、Ｈ＝７．１０％、Ｎ＝４．４８％、Ｏ＝４２．２６％であった。
【００５８】
実際の分析に基づく実験式はＣ１２Ｈ２２Ｏ８．３Ｎであり、これは完全にジアミン置換した糖環（Ｃ１２Ｈ２８Ｎ４Ｏ３）の１単位あたり６単位のグルコースに基づく式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ８．２５Ｎに非常に類似している。従って、デキストラン中のジアミン置換の程度は１００％過ヨウ素酸塩分裂およびジアミン置換に基づく１／２．５の理論値に比べて１／７であった。１００ｇおよび３００ｇのデキストラン規模での繰り返し実験では同程度の置換を有する生成物を得た。
【００５９】
ゼラチン溶液における磁鉄鉱および他の磁性粒子の調製
磁鉄鉱を含有する金属フェライト（ＭＦｅ２Ｏ４、ここでＭ＝Ｆｅ２　＋，Ｍｎ２　＋，Ｚｎ２　＋，Ｃｏ２　＋，Ｎｉ２　＋およびＢａ２　＋である。）を上記Ｉで記載したようにタイプＢのゼラチンにおけるそのままの状態で（ｉｎ　ｓｉｔｕ）で調製した。更に、本発明を説明するために、マンガンフェライトを以下のように調製した。
６２．５ｍｍｏｌ（６２．５ｍｌ）の１ＭのＦｅ２ＳＯ４溶液、１００ｍｍｏｌ（５０ｍｌ）の２ＭのＫＮＯ３溶液、３１．２５ｍｍｏｌ（３１．２５ｍｌ）の１ＭのＭｎＳＯ４溶液および７２．９２ｍｌの蒸留水を１リットルの（登録商標）ボトル中で一緒に混合し、１０分間Ｎ２ガスでパージした（溶液Ａ）。その後１６６．６ｍｍｏｌ（３３．３３ｍｌ）の５ＭのＫＯＨを溶液Ａに添加し、Ｎ２ガスを吹き付け、約５〜１０分の範囲の時間室温（１８〜２７℃）で音波処理して、滑らかな、暗い緑色のＦｅ（ＯＨ）２ゲルのスラリーを得た。音波処理の後、２５０ミリリットルの２％のタイプＢ、アルカリ硬化した、２２５ブルーム（Ｂｌｏｏｍ）ウシ皮膚ゼラチン溶液をＦｅ（ＯＨ）２ゲルに添加し、混合し、Ｎ２ガスを吹き付け、固く蓋をし、約５〜１０分音波処理し、約２４時間９０℃オーブン中に静置した。オーブン加熱の後、パイレックス（登録商標）ボトルおよび内容物をオーブンから除去し、室温に冷却するために放置した。冷却完了後、ボトル中の茶色の粒子の懸濁液を混合し、２つの２５０ミリリットルの組織培養フラスコにデカントした。洗浄の間磁性分離を使用して、各フラスコのフラクションを約５回１％Ｗ／ＶのタイプＢゼラチンあるいは１％１×アミノデキストラン溶液を用いて洗浄した。洗浄後、磁性粒子を再び一緒にして、十分な量の１％の１×アミノデキストラン溶液中に懸濁して５００ミリリットルの合計体積にし、約０．５時間音波処理した。粒子を約５〜１０℃の冷蔵温度で８時間から少なくとも６か月まで貯蔵した。０．１％Ｗ／Ｖのアジ化ナトリウムを含有する１×アミノデキストラン溶液中で２．５％Ｗ／Ｖ固体懸濁液として貯蔵した。また、タイプＢゼラチンにおける調製および１×アミノデキストランを用いた洗浄の後、直ちに粒子を使用してもよい。
【００６０】
５×−アミノデキストラン被膜磁性粒子の調製
方法１．揃った寸法０．３μｍで球形の、上記手順により調製した多量の貯蔵マンガンフェライト粒子を蒸留水で多数回洗浄し、１０５℃で乾燥し、懸濁液中のＷ／Ｖ固体を決定した。０．５６％Ｗ／Ｖ固体を有する分析した試料を使用した。
１００ミリリットルの０．５６％Ｗ／Ｖ固体のゼラチン調製したアミノデキストラン貯蔵マンガンフェライト粒子を磁性的に分離し、同体積の２％Ｗ／Ｖの５×−アミノデキストラン溶液中に再び懸濁した。１００ミリリットルの茶色の粒子の懸濁液を約１０分間音波処理し、その後夜中（約８〜１６時間）２５０ミリリットル組織培養フラスコ中でオービタルシェーカーにより混合した。混合完了後、約２０マイクロリットルの５Ｍ水酸化カリウム水溶液を用いてｐＨを１０．０に調整した。吸着した５×−アミノデキストランを１．１７３ミリリットルの２５％のグルタルアルデヒド水溶液（３．１１ｍｍｏｌ）をｐＨ調整粒子懸濁液に添加することにより架橋し、得られた懸濁液を１〜４時間の範囲の時間、好ましくは１時間、オービタルシェーカーを使用して混合した。架橋粒子を磁性的に分離し、上澄みを測定して廃棄し、未反応アルデヒド基を遮断し安定化するために、廃棄した上澄みの体積と等しい１％の５×−アミノデキストラン溶液の体積中に粒子を再び懸濁した。また、エチレンジアミンあるいは１，３−ジアミノプロパン溶液のようなポリアミン溶液を未反応アルデヒド基を遮断するために使用してもよい。ポリアミンのモル量は使用したグルタルアルデヒドの量の約１０倍である。再懸濁した粒子を振盪し、音波処理してそれらを分散し、得られた懸濁液をオービタルシェーカーを使用して夜中混合した。その後１ｍＭの水酸化カリウム水溶液中の１０ｍｇ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（６．２２ｍｍｏｌＮａＢＨ４）の２３．５ｍｌの試料を懸濁液に添加し、得られた混合物を更に０．５時間軌道的に混合した。その後粒子を磁性的に分離し、１×ＰＢＳで多数回（最低３回）洗浄し、２２．４ｍｌ体積に濃縮し、２．５％Ｗ／Ｖ固体懸濁液を得た。
【００６１】
方法２．０．１％アジ化ナトリウムを含有する１％Ｗ／Ｖ１×−アミノデキストラン溶液中に懸濁した０．８３％Ｗ／Ｖ固体マンガンフェライト粒子の６０．２ミリリットルの試料を磁性的に分離し、０．２Ｍの塩化ナトリウム水溶液の２０ミリリットル部で多数回洗浄した。洗浄後、粒子を０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液（約２０ミリリットル）中の十分な量の３．７５ｍｇ／ｍｌの５×−アミノデキストラン中に再懸濁し、２．５％Ｗ／Ｖ固体懸濁液を得た。次に、２．５％Ｗ／Ｖ固体懸濁液のミリリットル毎に対して、０．２Ｍの塩化ナトリウム溶液中の９マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍｌのＥＤＡＣ・ＨＣｌを懸濁液に添加した（合計１８０マイクロリットル）。得られた混合物を５０ミリリットルの組織培養フラスコ中で約１２〜１６時間の範囲の時間軌道的に振盪した。粒子を磁性的に分離し、蒸留水で多数回洗浄し、１×ＰＢＳ中に再懸濁して、ゼラチンとアミノデキストラン間の縮合反応により形成された被膜を有する磁性粒子の２．５％Ｗ／Ｖ固体懸濁液を２０ミリリットル得た。この縮合反応はアミノデキストランのアミン基とゼラチン上に存在するカルボキシレート基間で起こる。ＥＤＡＣは尿素として縮合反応の間に形成した水を除去した。グルタルアルデヒドのような架橋剤を使用することは必要ない。得られた粒子は、第１ゼラチン層、第２アミノデキストラン層および化学架橋剤による架橋を有する粒子と等価であるとして規定する。
【００６２】
架橋したゼラチン層および５×−アミノデキストラン層の厚さの決定
Ａ．ゼラチンの厚さ
グルタルアルデヒド架橋溶液を５６マイクロリットルの２５％グルタルアルデヒド水溶液と５ミリリットルの１ｍＭ水酸化カリウム水溶液を混合することにより調製した。上記のようにタイプＢにおいて調製した、および０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．４）中の２％Ｗ／ＶのタイプＡの１７５ブルームゼラチン中に懸濁した、マンガンフェライト粒子の２．５％Ｗ／Ｖ固体懸濁液の５ミリリットルから、粒子を磁性的に分離し、上澄み液を廃棄した。分離した粒子を５ミリリットルのグルタルアルデヒド溶液に再懸濁し、約３０分好ましくはローラーミキサーを使用して混合した。粒子を再び磁性的に分離し、５ミリリットルの１ｍＭ水酸化カリウム水溶液で３回洗浄し、５ミリリットルの１ｍＭ水酸化カリウム水溶液に再懸濁した。
【００６３】
蒸留水で１５回洗浄し１１０℃で一定の重量になるまで乾燥した、５ミリリットルの架橋したゼラチン被膜マンガンフェライト粒子を使用して元素分析を行った。分析結果は、Ｍｎ＝１９．０５％、Ｆｅ＝４９．４９％、Ｃ＝０．５４％、Ｈ＜０．５％、Ｎ＜０．５％およびＯ（差による）＝３０．９２％であった。ゼラチン中の重量による炭素の百分率はそのアミノ酸成分から得ることができる（「Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓ」４編、ティー．エイチ．ジェイムズ、（マクミラン、ニューヨーク　１９７６７）、２章、５２頁）。ここで使用したタイプＡゼラチンはＣ＝５０．４６％、Ｈ＝６．７６５％、Ｎ＝１８．２７％、Ｏ＝２４．２９％およびＳ＝０．２１％を与える。この情報を使用して、ゼラチン層の厚さを計算することができる。
【００６４】
１ｇのゼラチン被膜フェライト粒子を使用すると、１ｇ×０．００５４／０．５４０６＝０．０１０７０ｇのゼラチンと０．９８９３ｇのフェライトがある。直径０．２９μｍのマンガンフェライト球の粒子体積は１．２７７×１０−１４ｃｍ３であり、０．９８９３ｇのマンガンフェライト中の粒子数は１．８２７×１０１３である。従って、フェライト粒子あたりのゼラチン質量は５．８５６×１０−　１６ｇである。
【００６５】
グルタルアルデヒドで架橋する前の２％Ｗ／Ｖゼラチンからゼラチン被膜の密度を０．０２ｇ／ｃｍ３と仮定すると、粒子あたりのゼラチン体積は２．９２×１０−１４ｃｍ３である。結果として、粒子あたりの合計体積、すなわちゼラチンプラスフェライトは４．２０５×１０−１４ｃｍ３であり、ゼラチン−フェライト球の半径は２．１５７×１０−　５ｃｍ（０．２１５７μｍ）である。こうしてマンガンフェライト球上のゼラチン被膜の厚さは０．２１５７μｍ−０．１４５μｍ（フェライト球の平均半径）＝０．０７０７μｍ（７１ｎｍ）である。これは、エイ．ティー．クディッシュ氏等による、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｔ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ」、エイシーエスシンポジウムシリーズ３４３、ジェイ．エル．ブラッシュ氏等による、（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ワシントン、ディー．シー．１９８７）出版、２６１〜２７７頁により与えられたガラス上の７５０オングストロームの値；エヌ．カワニシ氏等による、「Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．」、９４巻、４６１１〜４６１７頁（１９９０）により与えられた雲母上の７５ｎｍの値、およびエイチ．メッツァー氏等による、「Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ　Ｉｎｔｅｆａｃｅ　Ｓｃｉ．」、１２６巻、２９２〜３０３頁（１９８８）により与えられたガラス上の６００〜７００オングストロームの値と良く一致する。
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）安定化剤を使用してゼラチン層を架橋したマンガンフェライト粒子に対してゼラチン層の厚さを同様にして計算した。元素分析によると、Ｍｎ＝１８．８４％、Ｆｅ＝４７．８２％、Ｃ＝１．６７％、Ｈ＜０．５％、Ｎ＜０．５％およびＯ（差による）＝３１．６７％であった。ゼラチン被膜の計算した厚さは１４８ｎｍであった。ＰＶＰを使用したより厚い被膜は手順の相違から生じたと考える。フェライト−ゼラチン溶液を元の手順において２％から０．０８％に希釈し、１％ＰＶＰを添加した場合、より厚い被膜を得た。ゼラチン−フェライト粒子を２％ゼラチン溶液から分離し、架橋媒体中に再懸濁した場合、より薄い被膜を得た。結果として、過剰のポリマーがなく、ゼラチンあるいはＰＶＰのいずれかが存在した。
【００６６】
Ｂ．アミノデキストランの厚さ
マンガンフェライト粒子を、順次、架橋され、遮断され、安定化される５×−アミノデキストラン（方法１）で被膜した。得られた粒子を蒸留水で多数回洗浄し、磁性的に分離し、１１０℃で乾燥した。元素分析の結果は、Ｍｎ＝１４．０４％、Ｆｅ＝４４．３６％、Ｃ＝２．９７％およびＯ（差による）＝３８．６３％であった。４５．８３％のＣを含むとして分析された５×−アミノデキストランおよび２％Ｗ／Ｖの５×−アミノデキストラン被膜に対して、推定したアミノデキストラン層の厚さは２１８ｎｍである。
【００６７】
スルホ−ＳＭＣＣを用いたジアミン処理粒子の活性化
５倍の活性化量のスルホ−ＳＭＣＣを使用した他は、スルホ−ＳＭＣＣを用いてゼラチン被膜粒子を活性化するために説明した同じ手順を使用して５×−アミノデキストラン被膜粒子を活性化する。磁性粒子を１×−、２×−あるいは３×−アミノデキストランで被膜する場合、１、２あるいは３倍量のスルホ−ＳＭＣＣをそれぞれ使用する。
【００６８】
２−イミノチオラン塩酸塩を用いた抗体活性化
前述した手順により２−イミノチオラン塩酸塩を用いて抗体を活性化した。活性化粒子に結合すべき抗体あるいは他の物質が反応性スルフィドリル基を十分に有する場合、２−イミノチオラン塩酸塩による活性化は必要ないかもしれない。また、当業者には、マレイミジル基を含むことによる粒子の活性化、および抗体あるいは他の物質の活性化がスイッチとなり得ることが認識できる。すなわち、反応性スルフィドリル基の導入により粒子を活性化でき、反応性マレイミジル基を含んで抗体あるいは他の物質を活性化できる。
【００６９】
本発明の利用性を説明するために以下の例を示すが、本発明を限定するものではない。別の方法が示されない限り、方法１を５×−アミノデキストランを用いて粒子を被膜するのに使用した。この例では、白血球リッチの全血試料中の好中球を数えるための２つの方法を説明する。５×−アミノデキストラン被膜ビーズに結合したモノクローナル抗体１Ｄ３およびフローサイトメトリーを両方法において使用する。
【００７０】
第１の方法では、磁性ビーズタイターを含有する一連の１Ｄ３を調製し、白血球リッチ血液試料と混合し、その後磁性的に試料から分離した。その後好中球を除去した上澄みをフローサイトメトリーで分析し、好中球除去が完了した点を決定した。試料を最低タイターから最高タイターのオーダーで分析し、除去を一定のサイトメーターカウントにより確認した。
【００７１】
第２の方法では、全血試料を同じタイターの１Ｄ３結合磁性ビーズと混合したが、磁性分離は行わなかった。好中球細胞の表面に磁性ビーズが付着したことにより細胞の寸法、形状あるいは屈折率が変化するので、この混合物を前方対側方（直交）散乱ヒストグラムにおける正常顆粒球領域から変化した好中球に対してフローサイトメトリーで分析した。変化した好中球集団あるいはカウントが安定な値に達した場合、光散乱ヒストグラムにおけるカウントあるいはビットマップ領域における蛍光発生カウントを好中球の相対数を得るために全白血球細胞（リンパ球、単球および顆粒球）に対するそれぞれのカウントと比較した。
【００７２】
均一な寸法、均一な球形および均一な屈折率性状を有する良好に規定されたフェライト粒子を使用することは、ここで説明した粒子のような粒子の表面に結合した生体細胞から光散乱において認識できる明確な変化を得るには本質的なことである。化学物質から生じる電気双極子散乱に加えて、フェライト粒子から生じる磁性双極子散乱が細胞粒子結合から生じる光分散の強度に実質的に寄与できる〔ジェイ．エイ．ストラトン、「Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｔｈｅｏｒｙ」（マグローヒル、ニューヨーク１９４１）、４３７頁およびシー．エフ．ボーレンおよびディー．アー．ホフマン、「Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　ｂｙ　Ｓｍａｌｌ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、（ウィリー、ニューヨーク１９８３）、１４１頁〕。ジェイ．ジェイ．マリー、「Ｏｐｔｉｃｓ」、４巻、１０１１頁（１９６５）では、磁鉄鉱のような磁性粒子により低角光散乱を測定する。
【００７３】
ここで使用したマンガンフェライト粒子の直径は０．２９±０．０８μｍであった。この直径は、国際特許出願公開ＷＯ９０／１３０１３（発明の名称：ＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ　ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＣＥＬＬＳ　ＯＲ　ＦＯＲＭＥＤ　ＢＯＤＩＥＳ　ＷＩＴＨ　ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ　ＳＥＬＥＣＴＥＤ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳＵＴＩＬＩＺＩＮＧ　ＡＴ　ＬＥＡＳＴ　ＯＮＥ　ＳＥＮＳＩＮＧ　ＰＡＲＡＭＥＴＥＲ）およびＰＣＴ出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ／０８５９０（出願人クールター　コーポレイション）（発明の名称：ＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ　ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＩＣ　ＣＥＬＬＳＵＴＩＬＩＺＩＮＧ　ＬＩＧＨＴ　ＳＣＡＴＴＥＲ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）で使用されたポリスチレンラテックスおよび磁性ラテックス粒子に対する０．６５〜３．０μｍの平均直径範囲から外れている。この研究で使用されたポリスチレンラテックス粒子は均一な寸法および形状であった。しかし、乳化重合の間にラテックスの内側に寸法および形状が変わるフェロ流体（ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ）粒子を埋め込むことにより形成された磁性ラテックス粒子は球形であるが（米国特許４，３５８，３８８号明細書、ダニエル等）、寸法が広範に変わる。例えば、平均粒子直径は０．７μｍであったが、個々の粒子は０．２から１．０μｍに変わった。（ポリスチレンラテックスに埋め込んだフェロ流体粒子の構造が規定されないという事実から更なる問題が生じる）。重量％により測定した場合には低レベルであったが、直径の小さい粒子は非常に多かった。結果として、より大きい粒子の移動度に対してより小さい粒子の移動度がより高いために、より小さい粒子抗体結合は細胞表面の抗原部位を優先的に専有するであろう。しかし、これらの小さい粒子は細胞の光分散の変化への寄与が小さく、目的の変化した細胞集団の本当の数あるいはカウントを得るには、これらの磁性粒子を使用することは信頼性がない。合計においてラテックス粒子中に異なる空間的な方向を有する磁性粒子を多く有する場合に、このことは、幾分、得られる正味の磁性双極子が低レベルであるためかも知れない。
【００７４】
【実施例１０】
５Ｘ−アミノデキストランで被覆した粒子に結合した抗体に関する試験結果の要約
実施例１〜３に記載したプロトコルを用いて、以下のアッセイ結果を得た。
Ａ．赤血球／胸腺リンパ球アッセイ
０〜２５０マイクロリットルの０．８３３３％ｗ／ｖ固体、ＫＣ−１６結合磁性ビーズを用いて赤血球／胸腺リンパ球アッセイを実施した。結果を表１３に示す。結果は、１００マイクロリットルの０．８３３％ｗ／ｖビーズが、４．９×１０７個の赤血球をアッセイ試料から除去する１．３２×１０９個のビーズを含み、従って２７のビーズ対細胞比率が得られることを示す。
【００７５】
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Ｂ．Ｔ４／Ｔ８リンパ球アッセイ
０〜２５０マイクロリットルの０．０２５％ｗ／ｖ固体、Ｔ４モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、Ｔ４／Ｔ８リンパ球除去アッセイを実施した。結果を表１４に示す。クールター　エス−プラス（Ｓ−Ｐｌｕｓ）（登録商標）カウンターにおいて測定したリンパ球の数に対する合計のリンパ球蛍光結果を評価した後、各除去後に残存するＴ４細胞の数を評価し、これらのデータを用いて、１５０マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体ビーズが、６．０×１０５個のＴ４細胞をアッセイ試料から除去する６．０×１０７個の粒子を含み、従って１００のビーズ対細胞比率が得られることが示される。
【００７６】
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Ｃ．赤血球／血小板アッセイ
０〜２５０マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体、ＰＬＴ−１モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、赤血球／血小板アッセイを実施した。結果を表１５に示す。結果は、２００マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体ビーズが、９．２×１０６個の血小板を除去する７．９２×１０８個の粒子を含み、従って８．６のビーズ対血小板比率が得られることを示す。
【００７７】
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Ｄ．骨髄細胞アッセイ
０〜２５０マイクロリットルの０．１２５％ｗ／ｖ、Ｍ０２モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、骨髄細胞アッセイを実施した。結果を表１６に示す。結果は、２００マイクロリットルの０．１２５％ｗ／ｖ固体ビーズが、４．８×１０４個の単球を除去すると評価された４．０×１０８個の粒子を含み、従って８．３×１０３のビーズ対単球比率が得られることを示す。
【００７８】
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Ｅ．骨髄細胞アッセイ
０〜２５０マイクロリットルの０．１％ｗ／ｖ固体、ＫＣ−４８モノクローナル抗体結合ビーズを用いて、骨髄細胞アッセイを実施した。結果を表１７に示す。結果は、１５０マイクロリットルの０．１％ｗ／ｖ固体ビーズが、１．６×１０６個の顆粒球を除去すると評価された２．４×１０８個の粒子を含み、従って１４９のビーズ対顆粒球比率が得られることを示す。
【００７９】
2004003991.tif 000008
同様の除去試験を、表１７と同一の対照試料および０〜２５０マイクロリットルの０．５％ｗ／ｖ固体、１Ｄ３モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて実施した。これらの結果を表１８に示す。結果は、５０マイクロリットルの０．５％ｗ／ｖ固体ビーズが、１．５４×１０６個の好中球を除去すると評価された４．０×１０８個の粒子を含み、従って２６０のビーズ対好中球比率が得られることを示す。
【００８０】
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Ｆ．Ｔ１１／Ｂ４リンパ球アッセイ
０〜６０マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体、Ｔ１１モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、Ｔ１１／Ｂ４リンパ球アッセイを実施した。結果を表１９に示す。結果は、２０マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体ビーズが、６．４６×１０５個のＴ１１＋細胞を除去すると評価された８．０×１０７個の粒子を含み、従って１２４のビーズ対Ｔ１１＋細胞比率が得られることを示す。
【００８１】
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第２の除去試験を、表１９で用いたものと同一の対照試料および５〜６０マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体、Ｂ４モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて実施した。これらの結果を表２０に示す。結果は、４０マイクロリットルの０．２５％ｗ／ｖ固体ビーズが、１．２３×１０５個のＢ４＋細胞を除去すると評価された１．６×１０８個の粒子を含み、従って１３００のビーズ対Ｂ４＋細胞比率が得られることを示す。
【００８２】
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Ｇ．磁性ビーズを用いた骨髄細胞アッセイ
０〜２５０マイクロリットルの０．５％ｗ／ｖ固体、ＫＣ−５６モノクローナル抗体結合磁性ビーズを用いて、赤血球の骨髄細胞除去アッセイを実施した。結果を表２１に示す。結果は、２５０マイクロリットルのビーズが、１．３５×１０６個の赤血球を除去すると評価された１．９８×１０９個の粒子を含み、従って１４７０のビーズ対赤血球比率が得られることを示す。
【００８３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての好中球除去のプロットである。
【図２】Ａ〜Ｌは、一層高い滴定量の磁性ビーズを細胞試料に加えるに従って、正常の顆粒球領域において、一層後方への散乱（ＦＳ）または一層小さい大きさおよび一層側面方向への散乱（ＬＳＳ）または一層大きい粒度へ明瞭に連続してシフトすることを例示する一連のヒストグラムである。
【図３】除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての真血細胞除去のプロットである。
【図４】除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての血小板除去のプロットである。
【図５】除去工程において用いられるビーズ対細胞比率の関数としての白血球除去のプロットである。
【図６】実施例５において実施したＴ４抗体、アミノデキストラン被覆ポリスチレンビーズによるＴ４集団シフト分析を示す図である。
本発明を実施する最良の態様
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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