(57)【要約】　　　（修正有）【課題】体内動態が改善された、腫瘍壊死因子活性を有する生理活性物質を提供する。【解決手段】腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子部分とからなる生理活性複合体は、高分子部分を有しないものと比較して、安定で、生体における滞留時間が有意に長く、その結果として、少用量を投与しても、初期血中レベルがより長く持続することが判明した。即ち、腫瘍壊死活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子、ポリエチレングリコールの単独重合体若しくは共重合体またはそれらの誘導体部分とからなる生理活性複合体と、斯かる生理活性複合体を有効成分とする感受性疾患剤。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子部分とからなる生理活性複合体。
【請求項２】
蛋白質部分が配列表における配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の生理活性複合体。
（配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｘａａはアスパラギン、アラニン、アルギニン、セリン、トレオニン、プロリン、メチオニン又はロイシンのいずれかであるものとする。）
【請求項３】
高分子部分がポリエチレングリコールの単独重合体若しくは共重合体又はそれらの誘導体である請求項１又は２に記載の生理活性複合体。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載の生理活性複合体を有効成分とする感受性疾患剤。
【請求項５】
抗腫瘍剤としての請求項４に記載の感受性疾患剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は生理活性物質に関するものであり、とりわけ、腫瘍壊死因子活性を有する生理活性複合体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
アンガス・トムソン編集『ザ・サイトカイン・ハンドブック』、１９９４年、アカデミック・プレス社発行、２８９乃至３０４頁などに記載されているように、腫瘍壊死因子は、１９７５年、エル・ジェー・オールドらによって、ＢＣＧ及び細菌内毒素を逐次投与したウサギやマウスなどの動物の血清中に分泌される細胞障害性因子として見出された。その後の研究により、現在では、腫瘍壊死因子は分子量約１７，０００ダルトン、等電点５．６の蛋白質であり、主としてマクロファージによって産生されることが知られている。
【０００３】
腫瘍壊死因子は、発見当初から、腫瘍細胞に対してかなり選択的に細胞障害作用をおよぼすことから、例えば、特公昭６２−４５２０８号公報や特公平４−４６９２８号公報などに見られるように、悪性腫瘍に対する治療剤として注目され、開発が進められてきた。しかし、腫瘍壊死因子は生体における滞留時間が短く、例えば、静脈経路などにより生体へ投与すると、血液中のプロテアーゼによって速やかに分解されたり、ごく短時間で尿中に排泄されてしまい、所期の血中レベルを長く維持することができない。さりとて、血中レベルを高めるべく投与量を上げると、腫瘍壊死因子による細胞障害作用が正常細胞にまでおよぶこととなる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
斯かる状況に鑑み、この発明は、体内動態が改善された、腫瘍壊死因子活性を有する安定な生理活性物質を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者が鋭意研究し、検索したところ、本質的に、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子部分とからなる生理活性複合体は、高分子部分を有しないものと比較して、安定で、生体における滞留時間が有意に長く、その結果として、少用量を投与しても、所期の血中レベルがより長く持続することが判明した。
【０００６】
すなわち、この発明は、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子部分とからなる生理活性複合体を提供することによって前記課題を解決するものである。
【０００７】
さらに、この発明は、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子部分とからなる生理活性複合体を有効成分とする感受性疾患剤を提供することによって前記課題を解決するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施の形態について説明すると、既述のとおり、この発明でいう生理活性複合体とは、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子部分とからなるものである。この発明の生理活性複合体を構成する蛋白質は、例えば、蛋白質工学の手法により、腫瘍壊死因子におけるアミノ酸配列の大半を変更することなく、腫瘍壊死因子活性が実質的に消失しない範囲で、腫瘍壊死因子を構成するアミノ酸のうちの、遊離のアミノ基を有するリジンなどのアミノ酸につき、蛋白質のＮ末端に位置するものを除いて、それ以外を遊離のアミノ基を有しないもの、好ましくは、アスパラギン、アラニン、アルギニン、セリン、トレオニン、プロリン、メチオニン又はロイシンのいずれかに置換することによって得ることができる。
【０００９】
周知のとおり、腫瘍壊死因子は起源によってアミノ酸配列が若干異なり、例えば、人の腫瘍壊死因子は１５７個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する。後述する感受性疾患剤へ配合する生理活性複合体の具体例としては、蛋白質部分として、例えば、配列表における配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するもの、好ましくは、配列表における配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。斯かる蛋白質は、アミノ酸配列における第１１番目、第６５番目、第９０番目、第９８番目、第１１２番目及び第１２８番目のリジンがすべてアスパラギン、アラニン、アルギニン、セリン、トレオニン、プロリン、メチオニン又はロイシンのいずれかで置換されている点で従来公知の人の腫瘍壊死因子とは相違するけれども、腫瘍一般に対して人の腫瘍壊死因子と同等以上の細胞障害作用をおよぼす。
【００１０】
斯かる蛋白質は、既述のとおり、蛋白質を構成するアミノ酸の１又は複数を所望のアミノ酸で置換する蛋白質工学の手法により得ることができる。例えば、腫瘍壊死因子をコードするＤＮＡにおける遊離のアミノ基を有するアミノ酸をコードするコドンをＮＮＳ配列で置換したオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応させ、得られたＰＣＲ産物の存在下で、腫瘍壊死因子をコードするＤＮＡをＰＣＲ反応させることによって、腫瘍壊死因子における遊離のアミノ基を有するアミノ酸がランダムなアミノ酸で置換された蛋白質をコードするＤＮＡのライブラリーを得る。その後、「ファージディスプレー法」などにより、このライブラリーのＤＮＡをしてそれぞれ蛋白質を発現させた後、通常のシーケンス解析とともに、例えば、腫瘍壊死因子に対する抗体を用いる固相酵素免疫法、腫瘍壊死因子に対する抗体若しくは受容体蛋白質を用いるパニング法、さらには、腫瘍壊死因子の標的細胞を用いるバイオアッセイなどを組み合わせて適用することによって、腫瘍壊死因子活性を保持しつつ、腫瘍壊死因子における遊離のアミノ基を有するアミノ酸のうち、Ｎ末端のアミノ酸を除いて、それ以外が遊離のアミノ基を有しないアミノ酸で置換された蛋白質をコードするＤＮＡを得る。斯かるＤＮＡの選別に当たって、ファージディスプレー法は極めて有用であり、この方法と上述のごとき方法の１又は複数を併用するときには、腫瘍壊死因子における遊離のアミノ基を有するアミノ酸のうち、Ｎ末端に位置するものを除いて、それ以外が遊離のアミノ基を有しない他のアミノ酸で置換され、かつ、腫瘍壊死因子の望ましい生理活性を高レベルで保持する一群の蛋白質を迅速にして網羅的に選別できることとなる。
【００１１】
この発明の生理活性複合体を構成する蛋白質は、斯くして得られたＤＮＡを、必要に応じて、ＰＣＲ反応によって増幅した後、プラスミドベクターなどを介して大腸菌などの宿主へ導入して形質転換し、生成した形質転換体から目的とする蛋白質を産生するクローンを採取し、培養することによって所望量得ることができる。形質転換体の培養物から蛋白質を採取するには、培養物へ、例えば、透析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの蛋白質を精製するための汎用の方法を適用すればよく、必要に応じて、これらの方法は適宜組み合わせて適用される。
【００１２】
この発明の生理活性複合体は、斯くして得られた腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質のＮ末端へ高分子を人為的に結合せしめることによって得ることができる。この発明で用いる高分子は、実質的に水溶性であって、生体にとって無害なもの、とりわけ、生体にとって抗原となり難い非蛋白質性のものが好ましい。個々の高分子としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの単独重合体、エチレングリコールとビニルアルコール、プロピレングリコールなどとの共重合体又はそれらの誘導体などの合成高分子や、エルシナン、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、プルラン、メチルセルロースなどの天然高分子が挙げられ、このうち、分子量が揃った調製物を入手し易い点で、ポリエチレングリコールの単独重合体、共重合体及びそれらの誘導体が好ましい。なお、高分子の分子量は、平均分子量として、通常、５００乃至５０，０００ダルトン、好ましくは、１，０００乃至１０，０００ダルトンの範囲で加減し、分子量が不均一である場合には、反応に先だって、例えば、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの汎用の方法によって分画する。高分子の種類や生理活性複合体の最終用途にもよるけれども、分子量がこの範囲を下回ると体内動態を改善し難くなり、反対に、この範囲を上回ると、複合体の水溶性が低下し、医薬品として安全に使用できなくなることがある。
【００１３】
腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質のＮ末端へ斯かる高分子を結合せしめるには、遊離のアミノ基へ特異的に反応して共有結合を形成する試薬により別途活性化させておいた高分子を蛋白質に反応させるか、あるいは、遊離のアミノ基へ特異的に反応する官能基を有する多官能試薬により、蛋白質と高分子とを架橋すればよい。個々の反応方法としては、斯界において汎用される方法、例えば、特開昭６２−２８９５２２号公報などに記載されたエステル結合法、アミド結合法などが挙げられ、このうち、蛋白質と高分子との間に形成される共有結合の安定性の点で、アミド結合法が好ましい。
【００１４】
反応方法にもよるけれども、反応開始時における蛋白質と高分子との割合は、モル比で１：０．１乃至１：１００、好ましくは、１：０．５乃至１：５０の範囲で加減する。一般に、この範囲を下回ると蛋白質同士の結合が顕著となり、反対に、この範囲を上回ると高分子同士の結合が顕著となる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率を低下させることとなり、通常、上記の範囲で加減するのが望ましい。反応の際の温度、ｐＨ及び反応時間は、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質が失活したり分解し難く、かつ、望ましくない副反応が最小になるように設定され、具体的には、反応温度を０乃至１００℃、好ましくは、２０乃至４０℃、ｐＨを０．１乃至１２、好ましくは、ｐＨ５乃至９とし、０．１乃至５０時間、好ましくは、１０時間以内に反応を完結させる。斯くして得られた生理活性複合体は、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質を精製する場合と同様の方法によって精製することができ、最終使用形態に応じて、例えば、濃縮、塩析、遠心分離、凍結乾燥などの方法により液状又は固状とする。
【００１５】
この発明の生理活性複合体は、感受性疾患を治療及び／又は予防するための薬剤として極めて有用である。この発明でいう感受性疾患とは、生理活性複合体を単独で投与するか、あるいは、他の薬剤とともに投与することによって治療及び／又は予防し得る疾患全般を意味し、個々の疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、副腎腫、甲状腺腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症などの固形腫瘍、白血病、リンパ腫などの血液系腫瘍、さらには、ウイルス性疾患、細菌感染症、免疫疾患などが挙げられる。したがって、この発明の感受性疾患剤は、斯かる疾患を治療・予防するための、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様な用途を有することとなる。
【００１６】
適用対象となる感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、この発明による感受性疾患剤は、投与経路に応じて、生理活性複合体を０．１ｎｇ／ｋｇ体重／回以上、好ましくは、１乃至１，０００ｎｇ／ｋｇ体重／回含有せしめ、用途に応じて、エキス剤、エリキシル剤、下気道吸入剤、カプセル剤、顆粒剤、眼科用徐放剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シロップ剤、浸漬剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などに調製される。
【００１７】
この発明の感受性疾患剤は、いわゆる、投薬単位形態の薬剤をも包含するものとし、その投薬単位形態の薬剤とは、生理活性複合体を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくは約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、例えば、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、座剤、散剤、錠剤、注射剤、パップ剤などが挙げられる。
【００１８】
この発明の感受性疾患剤は、有効成分としての生理活性複合体以外の、例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤などの薬剤一般に汎用される適宜の調剤用薬を配合することを妨げない。また、この発明の目的を逸脱しない範囲で、生理活性複合体とともに、他の有効成分として、例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、消炎剤などの外皮用薬、ビタミンＡ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤などのビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤などの滋養強壮薬、クロロフィル製剤、色素製剤などの細胞賦活用薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤などの抗腫瘍薬、抗ヒスタミン剤などのアレルギー用薬、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウイルス剤などの化学療法剤、さらには、ホルモン剤、抗生物質製剤、生物学的製剤などの生理活性複合体以外の薬剤を１又は複数配合してもよい。
【００１９】
さらに、この発明の生理活性複合体は、免疫助成剤として、例えば、アクチノマイシンＤ、アセグラトン、イホスファミド、ウベニメクス、エトポシド、エノシタビン、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸エピルビシン、塩酸ゲムシタビン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、塩酸ニムスチン、塩酸ピラルビシン、塩酸ファドゾール水和物、塩酸ブレオマイシン、塩酸ブロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、クレスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ジノスタンチンスチマラマー、酒石酸ビノレルビン、ソブゾキサン、ダカルバジン、チオテパ、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム、ドキシフルリジン、ドセタキセル水和物、トレチノイン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バクリタキセル、ビカルタミド、ピシバニール、ヒドロキシカルバミド、ブスルファン、フルオロウラシル、フルタミド、ベントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシンＣ、ミトブリニトール、メトトレキセート、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ペプロマイシン、レンチナンなどの抗腫瘍薬と組み合わせて用いると、いずれか一方のみでは容易に達成できない、相乗的に高い抗腫瘍効果が得られる。しかも、斯かる併用は、抗腫瘍薬の用量を低減でき、その結果として、抗腫瘍薬による副作用を著明に軽減し得る実益がある。
【００２０】
この発明の感受性疾患剤は、経口経路で適用しても非経口経路で適用しても感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、具体的には、例えば、患者の症状や適用後の経過を観察しながら、体重１ｋｇ当たり０．１乃至１，０００ｎｇ／日、好ましくは、１乃至１００ｎｇ／日の生理活性複合体を、必要に応じて、複数回に分けて１乃至７回／週の頻度で１週間乃至半年間に亙って経口経路で適用するか、あるいは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、直腸内、腹腔内などの非経口経路により適用する。この発明の生理活性複合体は、安定であって、血液中のプロテアーゼなどによって分解され難く、しかも、生体における滞留時間が腫瘍壊死因子より有意に長く、投与経路によっては２倍以上にも達することから、同一の感受性疾患に対して同一の経路で適用する場合、投与量を有意に小さくすることができ、その結果として、正常細胞に対する細胞障害性などに起因する副作用をより小さくできる実益がある。
【００２１】
以下、この発明の実施の形態につき、実施例に基づいて説明する。
【００２２】
【実施例１】
〈腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質の調製〉
常法にしたがって、配列表における配列番号４及び配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、Ｔａｑポリメラーゼにより６０℃でＰＣＲ反応させた後、反応混合物を精製して、配列表における配列番号１で表される人の腫瘍壊死因子の第６５番目、第９０番目及び第９８番目のリジンがランダムなアミノ酸で置換された１６２塩基対のＰＣＲ産物を採取した。引き続いて、配列表における配列番号６及び配列番号７で表されるプライマーとしてのオリゴヌクレオチドの存在下、上記で得られたＰＣＲ産物をＴａｑポリメラーゼにより６０℃でさらにＰＣＲ反応させた後、反応混合物を精製して、配列表における配列番号１で表される人の腫瘍壊死因子の第６５番目、第９０番目、第９８番目、第１１２番目及び第１２８番目のリジンがすべてランダムなアミノ酸で置換された２５１塩基対のＰＣＲ産物を採取した。
【００２３】
別途、常法にしたがって、ファージミドベクター（商品名『ｐＣａｎｔａｂ５ｅ』、アマシャム・ファルマシア社製造）へ配列表における配列番号１で表される人の腫瘍壊死因子をコードするＤＮＡを導入し、これを鋳型として、上記で得たプライマーとしての２５１塩基対のＰＣＲ産物とともに、配列表における配列番号８及び配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドの存在下、ＡｃｃｕｔａｑＤＮＡポリメラーゼにより増幅して、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列における第１１番目、第６５番目、第９０番目、第９８番目、第１１２番目及び第１２８番目のリジンがすべてランダムなアミノ酸で置換された４６３塩基対のＰＣＲ断片を得た。その後、汎用のファージディスプレー法により、このＰＣＲ断片をファージミドベクターへ導入し、６個のリジンの一部又は全部がランダムなアミノ酸で置換された人の腫瘍壊死因子の変異体を発現したファージライブラリーを得た。このライブラリーに対して、腫瘍壊死因子に対する抗体をセンサーチップに固定化した市販の表面プラズモン共鳴装置（商品名『ＢＩＡＣＯＲＥ　２０００』、ビアコア株式会社販売）を用いるパニング法を繰り返し適用することによって抗体に結合するクローンを検索し、さらに、斯くして検索されたクローンに対して、標的細胞としてマウス結合組織由来の細胞であるＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１．２）を用いて細胞障害性を測定するバイオアッセイを適用することによって腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質をコードするクローンを選別したところ、配列表における配列番号１で表されるアミノ酸配列において、第１１番目、第６５番目、第９０番目、第９８番目、第１１２番目及び第１２８番目のリジンがアスパラギン、アルギニン、アラニン、セリン、トレオニン、プロリン、メチオニン又はロイシンのいずれかで置換された蛋白質が高い腫瘍壊死因子活性を保持していることが判明した。
【００２４】
そこで、斯かる蛋白質をコードするクローンの一つにつき、最も高い腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの部分をプライマーとしての配列表における配列番号１０及び配列番号１１で表されるオリゴヌクレオチドの存在下で増幅した後、得られた配列表における配列番号１２で表される塩基配列を有するＤＮＡをプラスミドベクター（商品名『ｐＵＣ１８』、宝酒造株式会社製造）へ導入した。その後、常法にしたがって、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株へ導入し、得られた形質転換体を培養し、培養物をイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを用いる方法により精製して配列表における配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質を採取した。
【００２５】
斯くして得られた蛋白質の一部をとり、２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥしたところ、分子量１７，０００ダルトン付近に主たるバンドが観察された。通常のフルオレスカミン法により遊離のアミノ基を測定したところ、本例の蛋白質は、１分子当たり、遊離のアミノ基を１残基有していた。また、常法にしたがって、Ｌ−Ｍ細胞を標的細胞とするバイオアッセイにより細胞障害性を調べたところ、対照としての人の組換え型腫瘍壊死因子のＩＣ５０（標的細胞の生存を５０％阻害する試料の濃度）が０．２２ｎｇ／ｍｌであったのに対して、本例の蛋白質はそれとほぼ同等の０．２３ｎｇ／ｍｌであった。これらの結果は、本例の蛋白質においては、腫瘍壊死因子における遊離のアミノ基を有する７箇所のアミノ酸のうち、Ｎ末端に位置するアミノ酸を除いて、６箇所のリジンすべてが遊離のアミノ基を有しない他のアミノ酸で置換されていること、そして、斯くして創出された、腫瘍壊死因子とは構成アミノ酸のいくつかが相違する本例の蛋白質が、標的細胞に対して腫瘍壊死因子と同等の細胞障害作用をおよぼすことを物語っている。
【００２６】
【実施例２】
〈生理活性複合体の調製〉
実施例１の方法により得た腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質を燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ８．５）に濃度０．１乃至１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、高分子としてモノメトキシポリエチレングリコールＮ−サクシンイミジルプロピオネートにより活性化させたメトキシポリエチレングリコール（平均分子量５，０００ダルトン）をモル比で蛋白質の５倍になるように加え、３７℃で３０分間反応させた。次いで、反応混合物へε−アミノカプロン酸をモル比で高分子の１０倍加え、暫時静置して反応を停止させた後、反応混合物をゲル濾過クロマトグラフィーを用いる汎用の方法により精製して、蛋白質部分のＮ末端部分へのみポリエチレングリコールが結合してなる、分子レベルの不均一性を有しない均質な生理活性複合体を得た。
【００２７】
斯くして得られた複合体は、２−メルカプトエタノール存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２４，０００ダルトン付近に主たるピークを示した。標的細胞としてＬ−Ｍ細胞を用いる前述の方法により細胞障害活性を測定したところ、本例の複合体も対照としての人の組換え型腫瘍壊死因子も、ＩＣ５０はともに０．３４ｎｇ／ｍｌであり、両者は同等の活性を保持していた。ちなみに、ポリエチレングリコールの平均分子量を４０，０００ダルトンに変更して調製した別の生理活性複合体につき、上記と同様にしてＬ−Ｍ細胞に対する細胞障害性を試験したところ、そのＩＣ５０は０．４３ｎｇ／ｍｌであり、対照の腫瘍壊死因子の活性を略７０％保持していた。
【００２８】
【実施例３】
〈抗腫瘍作用〉
常法にしたがって、マウス肉腫細胞の一種であるｍｅｔｈＡ（ＡＴＣＣ６３１８１）を移植した一群のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、４週齢、体重２０ｇ、３匹／群）に対して、移植から７日後に、尾静脈へ実施例２の方法により得た生理活性複合体、実施例１の方法により得た腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質又は人の組換え型腫瘍壊死因子のいずれかの生理食塩水溶液を表１に示す投与量で注射投与した。投与から２４時間後に出血壊死と突然死の有無を調べるとともに、引き続いて腫瘍径を経時的に測定し、ケイスケ・ハラナカら『インターナショナル・ジャーナル・オブ・メディスン』、第３４巻、２６３乃至２６７頁（１９８４年）に記載された方法にしたがって腫瘍体積を計算した。そして、腫瘍移植後２０日目の腫瘍体積を生理食塩水のみを注射投与する対照の系と比較することによって抗腫瘍効果（％）を算出した。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表１の結果に見られるとおり、実施例１の方法により得た蛋白質又は人の組換え型腫瘍壊死因子のいずれかを投与した群は、いずれも、１０μｇ／匹投与すると、投与から２４時間以内に出血壊死を招来し、全例が突然死した。投与量を段階的に下げたところ、突然死こそ回避できたものの、腫瘍の完全縮退は認められず、多くが４０日以内に死亡した。一方、この発明による生理活性複合体を投与した群では、１０μｇ／匹投与しても突然死は全く認められず、また、３μｇ／匹の投与によっても、顕著な抗腫瘍効果が確認された。このことは、この発明の生理活性複合体が、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質の抗腫瘍効果を効果的に引き出しつつ、その副作用を著明に低減することを物語っている。
【００３１】
【実施例４】
〈体内動態〉
ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した血清と、生理食塩水により３．３μｇ／ｍｌに希釈した実施例２の方法により得た生理活性複合体とを体積比３：１の割合で混合し、一定間隔を置いてサンプリングしながら、３７℃で９時間インキュベートした。採取したサンプルは、直ちにＬ−Ｍ細胞を標的細胞とする細胞障害性活性の測定に供し、残存する細胞障害活性を判定することにより安定性の目安とした。併行して、生理活性複合体に代えて人の組換え型腫瘍壊死因子又は実施例１の方法により得た蛋白質を投与する系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を図１に示す。なお、図１において、生理活性複合体、人の組換え型腫瘍壊死因子及び実施例１の方法により得た蛋白質を投与した系を、それぞれ、「●」、「○」及び「△」を付して表示した。
【００３２】
図１に見られるとおり、対照においては、腫瘍壊死因子及び蛋白質が容易に分解され、９時間インキュベートすると、細胞障害性活性が３％前後にまで低下した。これに対して、この発明の生理活性複合体は、同様に９時間インキュベートしても、なお２０％以上の細胞障害活性を保持していた。このことは、この発明の生理活性複合体が血液中のプロテアーゼなどによって分解され難く、安定であることを物語っている。
【００３３】
さらに、実施例２の方法により得た生理活性複合体を濃度５μｇ／ｍｌになるように生理食塩水で希釈し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に２００μｌ／匹の用量で注射投与した。その後、３時間に亙ってマウスから一定間隔を置いて血液を採取し、中和抗体を用いて複合体の血清レベルを測定した。併行して、生理活性複合体に代えて人の組換え型腫瘍壊死因子又は実施例１の方法により得た蛋白質を投与する系を設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を図２に示す。なお、図２において、生理活性複合体、人の組換え型腫瘍壊死因子及び実施例１の方法により得た蛋白質を投与した系を、それぞれ、「●」、「○」及び「△」を付して表示した。
【００３４】
図２の結果に見られるとおり、対照においては、投与直後から腫瘍壊死因子及び蛋白質の血清レベルが急激に低下し、３時間経過した時点で当初の１０％以下にまで低下していたのに対して、この発明の生理活性複合体は、当初の血清レベルの５０％強を保持していた。このことは、この発明の生理活性複合体が、従来公知の腫瘍壊死因子やＮ末端に高分子部分を有しない腫瘍壊死因子の変異体と比較して、体内動態が有意に優れ、注射投与しても、生体により長く滞留し得るものであることを物語っている。
【００３５】
【実施例５】
〈急性毒性〉
常法にしたがって、８週齢のマウスに実施例２の方法により得た生理活性複合体を経皮、経口又は腹腔経路で注射投与したところ、生理活性複合体のＬＤ５０は、いずれの投与経路によっても１ｍｇ／ｋｇ体重以上であった。このことは、この発明の生理活性複合体が人への投与を前提とする医薬品に配合して安全であることを物語っている。
【００３６】
【実施例６】
〈液剤〉
安定剤として１％（ｗ／ｗ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例２の方法により得た生理活性複合体を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌して液剤を得た。
【００３７】
安定な本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。
【００３８】
【実施例７】
〈乾燥注射剤〉
安定剤として１％（ｗ／ｗ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実施例２の方法により得た生理活性複合体を１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥させた後、密栓して乾燥注射剤を得た。
【００３９】
安定な本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するため乾燥注射剤として有用である。
【００４０】
【実施例８】
〈軟膏剤〉
滅菌蒸留水にカルボキシビニルポリマー（商品名『ハイビスワコー』、株式会社和光純薬工業製造）と、パイロジェンを除去した高純度トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原製造）とをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解した後、実施例２の方法により得た生理活性複合体の適量を均一に混合し、ｐＨ７．２に調製して、１ｇ当り生理活性複合体を約５μｇ含むペースト状物を得た。
【００４１】
延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するための軟膏剤として有用である。
【００４２】
【実施例９】
〈錠剤〉
無水結晶性α−マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原製造）に実施例２の方法により得た生理活性複合体の適量を均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当り生理活性複合体を約１μｇ含む錠剤を得た。
【００４３】
摂取性、安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。
【００４４】
【発明の効果】
以上説明したとおり、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質部分と、その蛋白質のＮ末端へ人為的に結合せしめた高分子とからなるこの発明の生理活性複合体は、体内動態に優れ、注射投与しても、当初の血清レベルが長時間持続する。したがって、斯かる生理活性複合体を有効成分とするこの発明の感受性疾患剤は、医薬品の分野において、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス疾患剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様の用途を有する。
【００４５】
しかも、この発明の生理活性複合体は、腫瘍壊死因子活性を有する蛋白質のＮ末端へのみ高分子が結合してなるものであることから、原理上、リンホカイン活性を有する従来公知の複合体において懸念されたような、分子レベルの不均一性を有しないという特徴がある。また、この発明の生理活性複合体を構成する蛋白質として、腫瘍壊死因子における遊離のアミノ基を有するアミノ酸のうち、Ｎ末端に位置するものを除いて、それ以外が遊離のアミノ基を有しない他のアミノ酸で置換された蛋白質を用いるときには、Ｎ末端へのみ高分子が結合した生理活性複合体を極めて高収率で得ることができる。その際、遊離のアミノ基を有しないアミノ酸として、例えば、アスパラギン、アラニン、アルギニン、セリン、トレオニン、プロリン、メチオニン、ロイシンなどを採用するときには、腫瘍壊死因子の望ましい生理作用をそっくりそのまま保持するか、極めて高レベルで保持する生理活性複合体をほぼ理論どおりの収率で得ることができる。
【００４６】
斯くも顕著な効果を奏するこの発明は、斯界に貢献すること誠に多大な、意義のある発明であると言える。
【００４７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】この発明による生理活性複合体と対照の物質の血液における安定性を示す図である。
【図２】この発明による生理活性複合体と対照の物質の体内動態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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