(57)【要約】      （修正有）【解決手段】（１）特定のアミノ酸配列において、４２位のアミノ酸がシステインに、または２４６位のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。（２）上記配列に示されるアミノ酸配列において、４２位のアミノ酸がシステインに、または２４６位のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子。（３）（２）記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。（４）形質転換体または形質導入体。（５）熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法。【効果】本発明によれば、熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼが提供され、診断用酵素等として測定用キットに有利に利用されることにより、産業上有用である。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸が置換されたＤ−アミノ酸オキシダーゼであって、熱安定性がｐＨ６．０において５５℃，  １５分の熱処理で３０％以上の残存活性を示すものであることを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項２】
アミノ酸が置換されたＤ−アミノ酸オキシダーゼであって、熱安定性がｐＨ６．０において５５℃，  １５分の熱処理で５０％以上の残存活性を示すものであることを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、４２位のアミノ酸がシステインに、または２４６位のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の４２位と同等位置のアミノ酸がシステインに、または配列番号１の２４６位と同等位置のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
【請求項５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において、４２位のアミノ酸がシステインに、または２４６位のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の４２位と同等位置のアミノ酸がシステインに、または配列番号１の２４６位と同等位置のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子。
【請求項７】
請求項５または請求項６記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物よりＤ−アミノ酸オキシダーゼを採取することを特徴とする熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼ、その遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及び熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、Ｄ−アミノ酸を酸化し、イミノ酸及び過酸化水素に変換する酵素であり、生成するイミノ酸は、非酵素的に加水分解されて対応するケト酸とアンモニアとなる。本酵素は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、昆虫、微生物等天然に広く存在することが知られている
【非特許文献１参照】。
例えば、哺乳類由来のものとしては、ブタ腎臓由来
【非特許文献２参照】，ヒト由来
【非特許文献３参照】，ウサギ由来、ラット由来、マウス由来、モルモット由来等の報告がある。
また微生物由来としては、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属
【特許文献１参照】，Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属
【特許文献２参照】，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属
【特許文献３参照】，Ｃａｎｄｉｄａ属
【特許文献４参照】，
【非特許文献４参照】，Ｆｕｓａｒｉｕｍ属
【特許文献５参照】，
【特許文献６参照】，
【特許文献７参照】，Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ属
【特許文献８参照】，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属
【特許文献９参照】，Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属
【特許文献１０参照】，Ｒｏｂｉｌｌａｒｄａ属
【特許文献１０参照】，Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ属
【特許文献１０参照】，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属
【特許文献１１参照】，Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属等が知られている。
【０００３】
なかでも哺乳類由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼについては、ブタ腎臓由来，ヒト由来，ウサギ由来，ラット由来、マウス由来のアミノ酸配列が互いに高い相同性を有していることが知られている。例えば、ブタ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼに対して、ヒト由来は８４％、ウサギ由来は８０％、ラット由来は７８％、マウス由来は７６％の相同性がある。
【非特許文献５参照】
これらの酵素のなかにはすでに遺伝子のクローニングに成功し、組み換え体によって生産されている例もある
【非特許文献６参照】，
【特許文献１２参照】。
本酵素は、産業上広く利用されており、例えば、Ｄ−アミノ酸の測定、ＤＬ−アミノ酸からのＬ−アミノ酸の製造
【特許文献１１参照】、２−オキソ酸の製造、抗生物質前駆体の製造
【特許文献１３参照】等に用いられる。なかでも近年、Ｄ−アミノ酸の測定については臨床診断における重要性が高まっている。例えば、腎疾患患者では血中Ｄ−アミノ酸量が高値であるという報告がある
【非特許文献７参照】。
【０００４】
また老化に伴い、レンズタンパク質あるいは脳中のＤ−アミノ酸が増加蓄積することが知られている
【非特許文献８参照】，
【非特許文献９参照】。
すでに、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを用いて酵素的にＤ−アミノ酸を測定する方法について検討されている
【非特許文献７参照】。
しかしここで用いられている酵素は、ブタ腎臓由来であり、この酵素は、液状化した状態では不安定であるという欠点があった。そこで、体外診断薬あるいは測定試薬として処方するために、さらに熱安定性の優れた酵素の開発が強く求められていた。
酵素を安定化する技術としては、酵素タンパクをコードする遺伝子に変異を導入し、アミノ酸を１もしくは複数欠失、置換もしくは付加する遺伝子工学的手法が広く知られており、例えば、ホタルルシフェラーゼの耐熱性がアミノ酸変異により向上することが報告されている
【特許文献１４参照】，
【特許文献１５参照】。
しかしながら、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子改変によるアミノ酸置換については、酵素の触媒機構の解明等を目的として行われた報告があるものの
【非特許文献１０参照】，
【非特許文献１１参照】，
【非特許文献１２参照】，
【非特許文献１３参照】，
【非特許文献１４参照】、耐熱性等の機能が向上したという例はなかった。
【０００５】
【特許文献１】
特開平５−２１１８９０号公報
【特許文献２】
特公昭５９−１５６３５号公報
【特許文献３】
特開平９−７５０７８号公報
【特許文献４】
特開昭５５−２３９６６号公報
【特許文献５】
特開平２−２００１８１号公報
【特許文献６】
特開平１０−５２２６５号公報
【特許文献７】
特開平１１−３１８４３９号公報
【特許文献８】
特開平１１−３１８４４０号公報
【特許文献９】
特開平１１−５６３６２号公報
【特許文献１０】
特開平７−２７４９５７号公報
【特許文献１１】
特開平６３−６３３７７号公報
【特許文献１２】
特開平６−９０７４４号公報
【特許文献１３】
特表２００１−５０６８６８号公報
【特許文献１４】
特開平５−２４４９４２号公報
【特許文献１５】
特開２０００−１９７４８７号公報
【非特許文献１】
Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ４７，３４５７（１９９９）
【非特許文献２】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４８，１（１９６１）
【非特許文献３】
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３８，１８０（１９８８）
【非特許文献４】
Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５，６２７（２００１）
【非特許文献５】
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３９５，１６５（１９９８）
【非特許文献６】
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１９，１１１４（１９９６）
【非特許文献７】
Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．７３，１０５（１９８７）
【非特許文献８】
ファルマシア  ３２，１２１４（１９９６）
【非特許文献９】
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４８，５１０（１９８７）
【非特許文献１０】
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１，５９（２００２）
【非特許文献１１】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１６６６（１９９４）
【非特許文献１２】
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９，１７１（１９９１）
【非特許文献１３】
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，１０２４（１９８９）
【非特許文献１４】
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３８，２６９（１９８８）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、種々の用途、特に臨床診断に用いることのできる、水溶液中で熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、ブタ腎臓由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）アミノ酸が置換されたＤ−アミノ酸オキシダーゼであって、熱安定性がｐＨ６．０において５５℃，  １５分の熱処理で３０％以上の残存活性を示すものであることを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
（２）アミノ酸が置換されたＤ−アミノ酸オキシダーゼであって、熱安定性がｐＨ６．０において５５℃，  １５分の熱処理で５０％以上の残存活性を示すものであることを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、４２位のアミノ酸がシステインに、または２４６位のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
（４）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の４２位と同等位置のアミノ酸がシステインに、または配列番号１の２４６位と同等位置のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列を有することを特徴とするＤ−アミノ酸オキシダーゼ。
（５）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、４２位のアミノ酸がシステインに、または２４６位のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子。
（６）配列番号１に示されるアミノ酸配列の６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の４２位と同等位置のアミノ酸がシステインに、または配列番号１の２４６位と同等位置のアミノ酸がチロシンに置換されているアミノ酸配列をコードするＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子。
（７）（５）または（６）記載のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
（８）（７）記載の組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体。
（９）（８）記載の形質転換体または形質導入体を培地に培養し、培養物よりＤ−アミノ酸オキシダーゼを採取することを特徴とする熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼの製造法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとは、Ｄ−アミノ酸酸化酵素ともいい、酸素の存在下、Ｄ−アミノ酸を酸化して、過酸化水素、２−オキソ酸及びアンモニアを生成する作用を有するオキシダーゼをいう。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、自然界に広く分布しており、種々の動物、例えば、タコ、イカ、昆虫等の無脊椎動物あるいは脊椎動物の組織、例えば、腎臓、肝臓、脳、白血球等、また各種微生物、例えば、糸状菌、酵母、細菌等に存在する。
本発明で述べられるＤ−アミノ酸オキシダーゼは、例えば、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するブタ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ等であり、また、配列番号１と高い相同性を有するアミノ酸配列を有するＤ−アミノ酸オキシダーゼでもよく、例えば、哺乳類由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ、好ましくはヒト由来、ウサギ由来、ラット由来、マウス由来、モルモット由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼである。さらに、配列番号１のアミノ酸で１から複数個が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列を有するＤ−アミノ酸オキシダーゼである。
本発明で用いられるＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子は、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするブタ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子であり、また、配列番号１と高い相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子でもよく、例えば、哺乳類由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子、好ましくはヒト由来、マウス由来、モルモット由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を用いてもよい。さらに、配列番号１のアミノ酸で１から数個が欠失、置換、付加及び／または挿入されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いてもよい。
【０００９】
これらの遺伝子等は、既に公知の方法に従って調製される。例えば、野生型ブタ由来Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子のｃＤＮＡは、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６，３６１２（１９８７）記載の方法により調製可能である。その組み換え体ＤＮＡは、例えば、ｐＫＫ２２３−３，ｐＵＣ１９，ｐＥＴ−１１ｄベクターに挿入されたものとして、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，  １６５，１４２２（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１１４（１９９６）に記載の方法により調製することが可能である。
本発明において、「Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの４２位と同等位置のアミノ酸」とは、確定したＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるブタ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のＤ−アミノ酸オキシダーゼの４２位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。また、「Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの２４６位と同等位置のアミノ酸」とは、確定したＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるブタ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のＤ−アミノ酸オキシダーゼの２４６位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味するものである。
具体的には、既製のアミノ酸の相同性の解析用ソフト、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）により、配列番号１に示されるブタ由来のＤ−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列との相同性を比較することにより決定される。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた通常公知の方法で行い得る。
すなわち、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組み換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００１０】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、５−ブロモウラシル等を挙げることができる。この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。
紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従うことができる（現代化学，ｐｐ２４〜３０，１９８９年６月号）。
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：  Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５）〕，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １４，９６７９（１９８６）〕，Ｋｕｎｋｅｌ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７）〕等が挙げられる。
【００１１】
また、一般的にポリメラーゼ  チェイン  リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる〔Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９）〕  。
なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を合成し得ることはもちろんである。上記方法により得られる所望のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列の決定・確認は、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行い得る。
上述の如くして得られたＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。
例えば、宿主として、エッシェリア属に属する微生物、例えば得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡績社製）、ＤＨ５α（宝酒造社製）等を形質転換またはそれらに形質導入して夫々の菌株を得る。
【００１２】
そして、上記菌株より変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する菌株をスクリーニングすることにより、変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する菌株を得ることができる。
このようにして得られた菌株より純化された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、Ｇｕｅｒｒｙの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１１６，１０６４（１９７３）〕、Ｃｌｅｗｅｌｌの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１１０，  ６６７（１９７２）〕等により得ることができる。
そして、このようにして得られた組み換え体ＤＮＡより変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を含有するＤＮＡを得るには、例えば、該プラスミドＤＮＡに制限酵素を温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で１〜２４時間、好ましくは２時間程度作用させて、反応終了液をアガロースゲル電気泳動法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，１５０，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）〕で処理することにより得ることができる。
【００１３】
上記のようにして得られた変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを含み、変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ生産能を有する菌株を用いて変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。また培養は、２０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、好ましくは４〜８時間で、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培養終了後、該培養物より変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。
例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、または、リゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪もしくは放置して自己消化を行わせ本酵素を菌体外に排出させることができる。
そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
【００１４】
上記粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲルもしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマト法；分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製された酵素標品を得ることができる。
このようにして、所望の変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを得ることができる。
また、本発明の「熱安定性の優れた」とは、以下に述べる活性測定方法及び熱安定性測定方法に記載した反応条件下で、ｐＨ６．０において５５℃、１５分間熱処理した後の残存活性比が熱処理前の活性に対して３０％以上、好ましくは５０％以上残存していることをいう。熱安定性の優れた変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酵素含有製品等の保存性が著しく向上するため、産業上非常に有利である。
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの活性の測定方法、基質親和性測定方法及び熱安定性測定方法は、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるＤ−アミノ酸オキシダーゼ活性の測定方法及び熱安定性測定方法について説明する。
【００１５】
（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性の測定方法）
０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）２．５５ｍｌ、０．５６ＭＤ−アラニン溶液  ０．２ｍｌ、６％フェノール溶液  ０．１ｍｌ、１５０Ｕ／ｍｌぺルオキシダーゼ溶液  ０．１ｍｌ、１．７６％  ４−アミノアンチピリン溶液  ０．０５ｍｌの混合液を２５℃で５分間インキュベートし、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼサンプルを０．１ｍｌ添加、混合した。全容３．１ｍｌを３７℃で３分間反応させ、反応開始から３分間の、反応溶液の５００ｎｍにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。酵素１Ｕは、上記測定条件下において、１分間あたり１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量とした。
（熱安定性測定方法）
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼサンプルを約０．５Ｕ／ｍｌとなるように０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、５５℃にて１５分間加温した。加熱前と加熱後のサンプルの酵素活性を測定し、残存活性比を求めることで安定性を評価した。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１（変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの作製）
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼｃＤＮＡを、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，３６１２（１９８７）記載の方法で取得した。またＤ−アミノ酸オキシダーゼ発現プラスミドｐＤＡＯは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５，１４２２（１９８９）記載の方法で取得した。Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，ｐ．３２６−３３１，１９７９）に従い、組み換え体プラスミド  ｐＤＡＯを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株を得た。
この形質転換株を、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ），  酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ），  ＮａＣｌ  ０．５％（Ｗ／Ｖ），アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）及び１．４％（Ｗ／Ｖ）寒天〕に接種し、３７℃で培養した。
１２時間後、出現してきたコロニーを、ＬＢ−ＩＰＴＧ−ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（Ｗ／Ｖ），  酵母エキス０．５％（Ｗ／Ｖ），  ＮａＣｌ  ０．５％（Ｗ／Ｖ），イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド  （１ｍＭ）及びアンピシリン  （５０μｇ／ｍｌ）〕１００ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養を行った。この培養物を、８０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組み換え体プラスミドｐＤＡＯを抽出して精製し、組み換え体プラスミドｐＤＡＯを１００μｇ得た。
【００１７】
この組み換え体プラスミドｐＤＡＯを鋳型とし、センスプライマーとして５’−ＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡ−３’（２５  ｍｅｒ）、アンチセンスプライマーとして５’−ＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴ−３’（２５ｍｅｒ）を用い、Ａｒｎｏｌｄの方法〔ｉｎ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｎ，  ５９７（１９９９）〕でＥｒｒｏｒ−Ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲを行った。
増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルで電気泳動を行い、ゲルからＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  ＭＩＮＵＳ  ＥｔＢｒ  ＳＰＩＮ  ＣＯＬＵＭＮ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて回収し、ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ処理した。これを、組み換え体プラスミドｐＤＡＯをＳａｃＩ，ＳｐｈＩ処理したものとライゲーションさせ、Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，ｐ．３２６−３３１，１９７９）に従い、変異が導入された組み換え体プラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株を得た。この形質転換株をＬＢ−ａｍｐ寒天培地に接種し、３７℃で培養した。
１２時間後、出現してきた各コロニーをＬＢ−ＩＰＴＧ−ａｍｐ培地２０ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養を行った。この培養液を８０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間の遠心分離を行い、上清を廃棄した。沈殿に０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を０．５ｍｌ添加し、超音波破砕処理を行い粗酵素液を得た。
【００１８】
実施例２（熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼの探索）
実施例１で調製した変異導入酵素及び変異前の酵素（以下、未変異酵素という）を夫々約０．５Ｕ／ｍｌとなるように０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈し、５５℃にて１５分間加温した。加熱前と加熱後の各サンプルを前記Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ活性の測定方法及び熱安定性測定方法で測定し、残存活性比を求めることで安定性を評価した。未変異酵素は、残存活性が５％であったが、変異を導入した酵素生産株のうち、活性が５６％残存する酵素を生産する候補株Ａと３２％残存する酵素を生産する候補株Ｂが選択された。候補株Ａと候補株ＢをＬＢ−ａｍｐ培地２ｍｌ中、３７℃で１８時間振盪培養を行い、この培養液からＧＦＸ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてプラスミドを単離し、該プラスミド中のＤ−アミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定した。その結果、候補株Ａは、４２番目のフェニルアラニンがシステインに、候補株Ｂは２４６番目のアスパラギンがチロシンに置換されていることが判った。
なお、このようにして得られた４２位のフェニルアラニンがシステインに置換された変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードするプラスミドｐＤＡＯ−Ｆ４２Ｃ及び２４６位のアスパラギンがチロシンに置換された変異型Ｄ−アミノ酸オキシダーゼをコードするプラスミドｐＤＡＯ−Ｎ２４６Ｙは、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに夫々ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２５２及びＦＥＲＭ  ＢＰ−８２５１として寄託されている。
【００１９】
【発明の効果】
本発明によれば、熱安定性の優れたＤ−アミノ酸オキシダーゼが提供され、診断用酵素等として測定用キットに有利に利用されることにより、産業上有用である。
【００２０】
【配列表】
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