(57)【要約】【課題】タンパク質を含有する水溶液の新規な滅菌方法及びこれを利用した細胞培養方法を提供すること。【解決手段】タンパク質を含有する水溶液、例えば、培養上清水溶液、より好ましくはリン酸基を含まない培養上清水溶液に対してグリセリンを添加した後でオートクレーブ処理するように工夫したタンパク質含有水溶液の加熱滅菌方法、並びにグリセリンを添加した後でオートクレーブ処理して得られた培養上清を用いる細胞培養方法を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質を含有する水溶液にグリセリンを添加し、オートクレーブ処理することを特徴とするタンパク質含有水溶液の加熱滅菌方法。
【請求項２】
グリセリンを添加した上でオートクレーブ処理した培養上清を用いることを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質含有水溶液の加熱滅菌方法及び細胞培養方法に関する。詳しくは、タンパク質の加熱変性させることなく滅菌することが可能な加熱滅菌方法と該方法によって処理された培養上清を用いる細胞培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は熱に弱く、熱変性するため、タンパク質の滅菌を行う場合には、微生物を濾別できる濾材（フィルター）を用いる、いわゆる「濾過滅菌（濾過法）」を行うことが常識である。即ち、タンパク質の滅菌には加熱滅菌を採用することができないということが従来の技術常識である。特に、高分子量のタンパク質は、熱変性し易く、例えばコラーゲン等は構造が崩れて固形のゼラチンになることが古くから知られている
【０００３】
前記濾過滅菌は、タンパク質を含有する水溶液が濾過される際に、該水溶液に混入している微生物を濾材の細孔壁に吸着捕集して、無菌の濾液を得るという原理に基づいている。濾過滅菌が施されたタンパク質は、変性が起きていないので、本来の生理機能を保持したままで、除菌された濾液中に回収されるという利点がある。
【０００４】
微生物、細菌、真菌等は、０．２０μｍ程度のフィルターで濾別でき、更に近年、細孔サイズがより小さな濾材が開発されたことによって、レトロウイルス程度のサイズのウイルスまで濾別することも可能となった。
【０００５】
一方、熱に弱い蛋白質等の生体由来材料に対して、γ線滅菌する研究も進んでいる（非特許文献１参照）。
【０００６】
【非特許文献１】
伊佐間ら、ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ  １９，（７）：２１−２９，２００２。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記濾過滅菌技術では、滅菌対象であるタンパク質が高分子量である場合には、濾材の細孔を大きくする必要があるため、ウイルスを濾別することは困難になるという問題があった。また、仮に細孔の口径が小さな濾材を使用して濾過滅菌を行うことができる場合であっても、パルボウイルス程度の極小のウイルスまで濾別できているという保証はないという問題があった。
【０００８】
また、γ線滅菌技術では、γ線照射のための施設や装置が必要であり、固体でない水溶液中の蛋白質のγ線滅菌については、いまだ研究報告もない状況である。
【０００９】
一方、医療材料や医薬にタンパク質が使われることが多くなり、特に、再生医療等においては、生体由来材料の利用が著しく増大することが予想される。特に、組織や器官を形成する際には、細胞間に存在する細胞外マトリックスを有効に利用することが重要である。例えば、細胞を移植して、組織や臓器を作る際には、細胞増殖の足場となる細胞外マトリックスごと生体に埋め込む必要が生じる。
【００１０】
この細胞外マトリックスは、コラーゲン等の高分子量のタンパク質やヒアルロン酸等の多糖、プロテオグリカン類の集合体であるから、これを医用材料等に利用する場合、感染症を防止するために、どのような方法で滅菌処理するかが課題であった。
【００１１】
そこで、本発明では、タンパク質を含有する水溶液の新規な滅菌方法及びこれを利用した細胞培養方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、熱変性の問題があるために、従来不可能と考えられていた加熱処理によるタンパク質の滅菌法について鋭意検討を試みる内に、タンパク質に変性が発生しても、加熱前の構造に戻れれば、タンパク質本来の機能を維持させることができるのではないかとの発想の転換を行った。
【００１３】
その結果、タンパク質を含有する水溶液にグリセリンを添加し、オートクレーブ処理するタンパク質含有水溶液の加熱滅菌方法、並びにグリセリンを添加した上でオートクレーブ処理した培養上清を用いる細胞培養方法を案出した。
【００１４】
本発明では、オートクレーブによる加熱滅菌の作用によって、微生物、真菌、細菌やウイルスを完全に滅菌、不活化できるとともに、グリセリン存在下でタンパク質の不溶化、断片化、機能の不活化を阻止することができるという好ましい結果を得ることができる。また、グリセリンは必須の生体物質であるため生体内の代謝サイクルで処理され、非毒性であるので、グリセリンを含む蛋白質や前記培養上清で培養された細胞をそのまま体内に移入しても生体への影響はないという利点を得ることができる。
【００１５】
即ち、本発明は、ウイルスの濾別が保証できないという問題を解決できなかった濾過殺菌や特殊な施設や装置が必要になる等の問題を抱えていたγ線殺菌とは全く異なる、タンパク質の加熱殺菌という新技術を提供するという技術的意義、加熱滅菌処理した培養上清を用いる新規細胞培養方法を再生医療等の関連産業界に提供するという技術的意義を有している。
【００１６】
【実施例】
本発明に係る、グリセリンを用いるタンパク質の加熱殺菌方法の有効性を検証すべく、以下の実験を行った。
【００１７】
まず、タンパク質に熱変性が生じると、不溶化、断片化、機能の不活化となって現れることから、グリセリンを添加したタンパク質水溶液（培養上清）をオートクレーブ処理した時に、含まれているタンパク質が不溶化するか否か、断片化が起こるか否か、タンパク質の機能が不活化していないか否かについて検証することにした。
【００１８】
まず、以下の実験で使用する無血清培養による培養上清の調製は、次の手法で行った。ヒト初代培養、繊維芽細胞を２２５ｃｍ２の培養フラスコを用いて、１０％ウシ胎児血清溶液（ＦＢＳ）、抗生物質を含むＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで培養を行った。
【００１９】
３０ｍｌのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）（−）で少なくとも３回細胞を洗浄した後、ＦＢＳを添加していないＤＭＥＭ培地を３５ｍｌ添加して培養した。５日後に無血清培地の培養上清を回収して、１０〜３０μｍのフィルターで細胞残渣を除去した後、日本ミリポア製の分画フィルター（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＥＬ、１００Ｋ）を用いて、濃縮を行った。培養上清中のフェノール・レッド（色素）を除くために、更に水で濃縮を行った。濃縮の過程で沈殿が生じた場合には、遠心にて上清分画を試料とした。
【００２０】
実験例１（グリセリンのタンパク質不溶化防止機能の確認実験）。
【００２１】
０．５％濃度の蛋白質を含む培養上清水溶液に、２０％濃度になるようにグリセリンを添加した実施例１と、前記培養上清水溶液にグリセリンを添加しない比較例１を作製した。また、１．０％濃度の蛋白質を含む培養上清水溶液に、２０％濃度になるようにグリセリンを添加した実施例２と、前記培養上清水溶液にグリセリンを添加しない比較例２を作製した。
【００２２】
作製された各実施例、各比較例の試料は、ポリプロピレン製マイクロチューブに入れて、キャップをしてオートクレーブ（以下、「Ａ／Ｃ」と略称。）で、１２１℃、２０分の条件で滅菌処理し、４℃の冷蔵庫で保管し、経時的に沈殿や混濁の発生を観察した。その結果を、次の表１に示した。なお、表１において、「＋」は、沈殿や混濁が観察されたこと、「−」は、沈殿や混濁が観察されなかったことを示している。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
前掲した表１からわかるように、０．５％以上のタンパク質濃度の培養上清水溶液（即ち、可溶性細胞外マトリックス水溶液）では、Ａ／Ｃ処理によって、タンパク質の沈殿が生じるが、２０％のグリセリンを添加すると沈殿や混濁が生じなくなる。これは、可塑性を備えるグリセリンが、熱変性する蛋白質の構造を元に戻す作用を発揮し、タンパク質の不溶化を防止したからと考えられる。
【００２５】
実験例２（グリセリンのタンパク質断片化防止機能の確認実験）。
【００２６】
次の表２に示す内容の各試料（培養上清水溶液）に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、その結果を図（図面代用写真）１に示す。なお、図１のレーン番号と表２の試料番号は対応している。
【００２７】
【表２】
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【００２８】
添付した図１からわかるように、培養上清蛋白質（水溶液）は、グリセリンを添加しても、試料の培養上清水溶液に含まれるタンパク質のバンドに大きな変化はない。このことから、タンパク質の切断はほとんど生じていないことが明らかである。
【００２９】
しかし、ＰＢＳ溶液中では、タンパク質のバンドに大きな変化が見られた。バンド消失の原因としては、タンパク質が沈殿を起こしたか、切断されたと考えるのが妥当であり、これは、ＰＢＳのリン酸基とタンパク質とが反応した結果と考えることができる。従って、本発明に係る方法では、培養上清ＰＢＳ溶液ではなく、リン酸基を含まない培養上清水溶液を採用するのが好ましい。
【００３０】
実験例３（オートクレーブ処理したタンパク質の細胞の足場機能の検証実験）。
【００３１】
オートクレーブ処理又は未処理の培養上清（可溶性細胞外マトリックス）をフラスコに入れ、該フラスコ底面に結合させてから、細胞を培養した。細胞の足場に用いたタンパク質（可溶化細胞外マトリックス）は、０．２％タンパク質濃度の無血清培養の培養上清０．５ｍｌで、予め６−ウエルプレートのウエルに、次の表３に番号▲１▼〜▲４▼で示された培養上清試料水溶液を添加して表面を被覆し、そのまま１時間放置し、そこにヒト初代培養の線維芽細胞を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地で培養して、細胞の増殖速度を比較した。その結果を以下の表４に示す。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
【表４】
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注）表４の▲１▼〜▲４▼は、表３の▲１▼〜▲４▼に対応している。
【００３４】
▲１▼〜▲４▼の培養上清に含まれるタンパク質の細胞の足場としての機能を、細胞の増殖速度により比較すると、培養上清は、グリセリンを添加しないでＡ／Ｃ処理すると（表４、▲２▼参照）、増殖速度が４２％（３．４／８．０）まで低下するが、グリセリンを添加してＡ／Ｃ処理することによって（表４、▲４▼参照）、増殖速度を６６％（５．３／８．０）の低下に留めることができる。
【００３５】
このことから、グリセリンを添加した後にＡ／Ｃ処理することによって、培養上清水溶液中のタンパク質の機能（細胞の足場機能）の低下を抑制することができることがわかる。
【００３６】
以上の実験例から、従来タンパク質をオートクレーブ処理（加熱滅菌）すると、熱変性による沈殿や混濁を生じ、特に、コラーゲン等の高分子量蛋白質は、熱による変性の度合いが大きかったことから、タンパク質の滅菌処理は、専ら濾過滅菌に限られていたところ、従来不可能と考えられていたコラーゲン等を含む高分子量のタンパク質（細胞外マトリックス）に対して、グリセリンを添加した上でオートクレーブ処理（加熱滅菌）することによって、沈殿や混濁を生じさせることなく、タンパク質の断片化もなく、更には機能低下を抑制できることがわかった。即ち、タンパク質含有水溶液の新規な加熱滅菌方法並びに該方法によって処理された培養上清を用いる細胞培養方法を提供することができる。
【００３７】
【発明の効果】
本発明に係る加熱滅菌方法によれば、オートクレーブによる加熱滅菌の作用によって、微生物、真菌、細菌やウイルスを完全に滅菌、不活化できるとともに、グリセリンによってタンパク質の不溶化、断片化、機能の不活化を阻止することができる。また、前記加熱殺菌方法によって得られた培養上清を用いて細胞培養を行なうことによって、感染症の確実に防ぐことができ、更には、グリセリンは必須の生体物質であるため生体内の代謝サイクルで処理され、非毒性であることから、グリセリンを含む蛋白質や前記培養上清で培養された細胞をそのまま体内に移入しても生体への影響はいという優れた効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】表２に示す内容の各試料（培養上清水溶液）に含まれるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果を示す図面代用写真）。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月11日(2002.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
３０ｍｌのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ（−））で少なくとも３回細胞を洗浄した後、ＦＢＳを添加していないＤＭＥＭ培地を３５ｍｌ添加して培養した。５日後に無血清培地の培養上清を回収して、１０〜３０μｍのフィルターで細胞残渣を除去した後、日本ミリポア製の分画フィルター（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＥＬ、１００Ｋ）を用いて、濃縮を行った。培養上清中のフェノール・レッド（色素）を除くために、更に水で濃縮を行った。濃縮の過程で沈殿が生じた場合には、遠心にて上清分画を試料とした。