(57)【要約】【課題】オーファンレセプターのリガンドの決定方法の提供。【解決手段】リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法。【選択図】  なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法。
【請求項２】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質を用いることを特徴とする請求項１記載のリガンドの決定方法。
【請求項３】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分と、試験化合物とを接触させることを特徴とする請求項１記載のリガンドの決定方法。
【請求項４】
（１）アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化またはｐＨの低下を促進する活性または抑制する活性、（２）ＭＡＰキナーゼの活性化、（３）転写因子の活性化、（４）ジアシルグリセロール産生、（５）細胞膜上のイオンチャンネルの開閉、（６）アポトーシスの誘導、（７）形態変化、（８）該融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移行、（９）低分子量Ｇタンパク質の活性化、（１０）細胞分裂促進活性または（１１）ＤＮＡ合成促進活性を測定することを特徴とする請求項１記載のリガンドの決定方法。
【請求項５】
該融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移行を測定することを特徴とする請求項１記載のリガンドの決定方法。
【請求項６】
ＧＦＰ蛍光を観察することにより該融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移行を測定する請求項５記載のリガンドの決定方法。
【請求項７】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞と試験化合物とを接触させて、レポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項１記載のリガンドの決定方法。
【請求項８】
（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物と接触させてレポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞と試験化合物とを接触させて、レポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項２記載のリガンドの決定方法。
【請求項１０】
（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物と接触させてレポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
レセプタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＧＦＰが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
プロモーターがＴＡＴＡ様配列である請求項７記載の方法。
【請求項１４】
レポータータンパク質がルシフェラーゼである請求項７記載の方法。
【請求項１５】
プラスミドがｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結したものである請求項７記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、リガンドが決定されていない２種類以上のレセプタータンパク質を発現している請求項７記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉをコードする遺伝子を含有するプラスミドを更に含有する請求項７記載の方法。
【請求項１８】
さらにフォルスコリンを添加する請求項７記載の方法。
【請求項１９】
２種類以上のレセプタータンパク質が類似の特徴を有することを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
類似の特徴がレポータータンパク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
予め２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の基礎発現量および／またはフォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を測定し、該レポータータンパク質の発現量が同程度である２種類以上のレセプタータンパク質を組み合わせて発現させることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質またはその塩。
【請求項２３】
蛍光タンパク質がＧＦＰである請求項２２記載の融合タンパク質またはその塩。
【請求項２４】
請求項２２記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項２５】
請求項２２記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項２６】
請求項２５記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項２７】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質に対するリガンドを決定するための蛍光タンパク質の使用。
【請求項２８】
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質に対するリガンドを決定するためのＧＦＰの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞膜に存在するレセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法、特にリガンドが全く未知である、いわゆるオーファンレセプターのリガンドの決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプタータンパク質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプタータンパク質のうち多くは共役しているｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、Ｇタンパク質と略称する）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また、７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質あるいは７回膜貫通型レセプタータンパク質（７ＴＭＲ）と総称される。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えば、ホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の機能を調節する物質と、その特異的レセプタータンパク質、特にはＧタンパク質共役型レセプタータンパク質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】
従来、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質と生理活性物質（すなわち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（すなわち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。
しかし、現時点でもなお、対応するリガンドが同定されていない、いわゆるオーファンレセプターが多数存在しており、そのリガンドの決定および機能解明が切望されている。
Ｇタンパク質共役型レセプターのシグナル伝達作用を指標とする、新たな生理活性物質（すなわち、リガンド）の探索、また、該レセプターに対するアゴニストまたはアンタゴニストの探索は有用である。これら該レセプターに対するリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、Ｇタンパク質共役型レセプターの機能不全に関連する疾患の予防および／または治療薬や診断薬として活用することが期待できる。
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は中生動物のオワンクラゲに由来する発光タンパク質の一種である（特許文献１〜５）。
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  レスポンスエレメント（ＭＲＥ）およびｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）とレポーター活性とを組み合わせて、Ｇｉ、ＧｓまたはＧｑ共役型オーファン受容体のリガンドを決定する方法が報告されている（非特許文献１）。
ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）とレポーター活性とを組み合わせて、ＧｓまたはＧｑ共役型オーファン受容体と相互作用する分子をスクリーニングする方法が報告されている（非特許文献２）。
ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）とレポーター活性とを組み合わせて、リガンドが知られているＧｉまたはＧｓ共役型受容体の特徴を調べる方法が報告されている（非特許文献３）。
Ｇ蛋白質共役型レセプターとの共役関係の曖昧さを増大させたキメラＧ蛋白質αサブユニット、キメラＧタンパク質を発現させた細胞を用いてＧ蛋白質共役型レセプターの反応を検出する方法が報告されている（特許文献６）。
組換え型酵母発現ライブラリーを用いたオーファンＧ蛋白質共役型レセプターのリガンドの同定方法が報告されている（特許文献７）。
受容体と試験ペプチドの両方を含有する細胞からなり、オーファン受容体の同定あるいはスクリーニングに有用な細胞の受容体活性修飾物質の同定方法が報告されている（特許文献８）。
オーファン受容体のリガンドを同定するためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ有性生殖系を利用した発現システムが報告されている（特許文献９）。
【特許文献１】
ＷＯ９６／２３８１０
【特許文献２】
ＷＯ９６／２７６７５
【特許文献３】
ＷＯ９７／２６３３３
【特許文献４】
ＷＯ９７／２８２６１
【特許文献５】
ＷＯ９７／４２３２０
【特許文献６】
ＷＯ  ０１／３６４８１
【特許文献７】
ＵＳＰ６，２５５，０５９
【特許文献８】
ＵＳ２００１／００２６９２６
【特許文献９】
ＷＯ  ００／０３１２６１
【非特許文献１】
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５，５４−６１、１９９９
【非特許文献２】
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２６，３４９−３５４、１９９５
【非特許文献３】
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９５，６：  ５７４−５８１
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来のリガンドの探索・決定方法では、例えば真核生物由来の細胞を用いて、リガンドをスクリーニングする場合、該レセプターを安定的に発現する、いわゆる安定細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を樹立しなければならず、この細胞株の樹立には特別な細胞を必要とした。またスクリーニングには複数の測定の組合せが必要であり、試験化合物が複数存在すると、時間がかかるためにその実施が困難であった。つまり、従来のリガンド等の探索・決定方法には、（１）使用可能な細胞系が限定される、（２）該細胞系の樹立に時間がかかる、（３）複数の測定法を組み合わせるために、検体数が多くなるとその実施が困難になる等の問題があった。これらの問題を解決するための、各種の細胞系が使用でき、かつ短時間で実施できるリガンドの決定方法が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰ等の蛍光タンパク質との融合タンパク質を安定的にあるいは一過性に発現させた細胞を作製することにより、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質の蛍光またはＧＦＰ抗体等の蛍光タンパク質抗体を利用した免疫染色法やウエスタンブロット法など用いて、
（１）タンパク質レベルでレセプタータンパク質が発現していることを確認でき、
（２）細胞膜にレセプタータンパク質が発現していることを確認でき、
（３）レセプタータンパク質の発現量を見積もることができ、
（４）レセプタータンパク質の高発現細胞を選択でき、そして
（５）リガンドによるレセプターの特異的反応を、レセプターと蛍光タンパク質との融合タンパク質の細胞内へのインターナリゼーションとして検出できること等を見出し、これらの特徴を利用することにより、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質（以下、オーファンレセプターと略記する場合がある）のリガンドを効率よく決定できることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする該レセプタータンパク質に対するリガンドの決定方法、
［２］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質を用いることを特徴とする上記［１］記載のリガンドの決定方法、
［３］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分と、試験化合物とを接触させることを特徴とする上記［１］記載のリガンドの決定方法、
［４］（１）アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化またはｐＨの低下を促進する活性または抑制する活性、（２）ＭＡＰキナーゼの活性化、（３）転写因子の活性化、（４）ジアシルグリセロール産生、（５）細胞膜上のイオンチャンネルの開閉、（６）アポトーシスの誘導、（７）形態変化、（８）該融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移行、（９）低分子量Ｇタンパク質の活性化、（１０）細胞分裂促進活性または（１１）ＤＮＡ合成促進活性を測定することを特徴とする上記［１］記載のリガンドの決定方法、
［５］該融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移行を測定することを特徴とする上記［１］記載のリガンドの決定方法、
［６］ＧＦＰ蛍光を観察することにより該融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移行を測定する上記［５］記載のリガンドの決定方法、
［７］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞と試験化合物とを接触させて、レポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする上記［１］記載のリガンドの決定方法、
［８］（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物と接触させてレポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする上記［７］記載の方法、
［９］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質を発現し、かつ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞と試験化合物とを接触させて、レポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする上記［２］記載のリガンドの決定方法、
［１０］（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（２）ｃＡＭＰレスポンスエレメント／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物と接触させてレポータータンパク質の活性を測定することを特徴とする上記［９］記載の方法、
［１１］レセプタータンパク質がＧタンパク質共役型レセプタータンパク質である上記［１］記載の方法、
［１２］ＧＦＰが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である上記［１］記載の方法、
［１３］プロモーターがＴＡＴＡ様配列である上記［７］記載の方法、
［１４］レポータータンパク質がルシフェラーゼである上記［７］記載の方法、
［１５］プラスミドがｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質をコードする遺伝子を連結したものである上記［７］記載の方法、
［１６］細胞が、リガンドが決定されていない２種類以上のレセプタータンパク質を発現している上記［７］記載の方法、
［１７］細胞が、抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉをコードする遺伝子を含有するプラスミドを更に含有する上記［７］記載の方法、
［１８］さらにフォルスコリンを添加する上記［７］記載の方法、
［１９］２種類以上のレセプタータンパク質が類似の特徴を有することを特徴とする上記［１６］記載の方法、
［２０］類似の特徴がレポータータンパク質の基礎発現量および（または）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量である上記［１９］記載の方法、
［２１］予め２種類以上のレセプタータンパク質をそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の基礎発現量および／またはフォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を測定し、該レポータータンパク質の発現量が同程度である２種類以上のレセプタータンパク質を組み合わせて発現させることを特徴とする上記［１６］記載の方法、
［２２］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質またはその塩、
［２３］蛍光タンパク質がＧＦＰである上記［２２］記載の融合タンパク質またはその塩、
［２４］上記［２２］記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するＤＮＡ、
［２５］上記［２２］記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
［２６］上記［２５］記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
［２７］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質に対するリガンドを決定するための蛍光タンパク質の使用、
［２８］リガンドが決定されていないレセプタータンパク質に対するリガンドを決定するためのＧＦＰの使用に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のリガンド決定方法は、（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする方法であり、具体的には、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分と、試験化合物とを接触させることを特徴とする方法である（リガンド決定方法Ａ）。
さらには、本発明のリガンドの決定方法は、（１）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質を発現し、かつエンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞と試験化合物とを接触させて、発現誘導されるレポータータンパク質の活性を測定する方法、（２）（ｉ）リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドおよび（ｉｉ）エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを連結したプラスミドを含有する細胞を培養し、試験化合物と接触させて、発現誘導されるレポータータンパク質の活性を測定する方法である（以上、リガンド決定法Ｂ）。
【０００８】
本発明に用いられるオーファンレセプターとしては、例えばＧタンパク質共役型レセプタータンパク質などが用いられる。具体例としては、配列番号：９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するＧタンパク質共役型レセプタータンパク質や、ＷＯ９６／０５３０２、ＥＰ−Ａ−７１１８３１、ＥＰ−Ａ−７８９０７６、ＥＰ−Ａ−１１０３５６３、ＥＰ−Ａ−１１０３５６２、特開平８−１５４６８２号公報、特開平８−２８３２９５号公報、特開平８−１９６２７８号公報、特開平８−２４５６９７号公報、特開平８−２６６２８０号公報、特開平９−５１７９５号公報、特開平９−１２１８６５号公報、特開平９−２３８８６８６号公報、特開平１０−１４６１９２号公報に記載のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質などが挙げられる。
【０００９】
蛍光タンパク質としては、視覚によって認識し得るタンパク質であれば特に限定されることはなく、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｔａｇ配列、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＤｓＲＥＤ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＢＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などが用いられる。
ＧＦＰは、中生動物のオワンクラゲに由来する発光タンパク質の一種であり、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質などである。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
ＧＦＰの活性としては、例えば、励起光照射による発光などが挙げられる。実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、それらの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
ＧＦＰにおける励起光照射による発光などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。
【００１０】
また、ＧＦＰとしては、（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加または挿入したアミノ酸配列、（３）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられ、なかでも（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基が欠失しているアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基が欠失し、さらに次のアラニン残基がスレオニン残基またはセリン残基に置換されたアミノ酸配列を含有するタンパク質などが好ましく用いられる。
具体的には、例えば、（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるＧＦＰ、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表わされるアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基が欠失しているアミノ酸配列からなるＧＦＰ、（ｉｉｉ）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基が欠失し、さらに次のアラニン残基がスレオニン残基またはセリン残基に置換されたアミノ酸配列からなるＧＦＰなどが用いられる。
【００１１】
Ｔａｇ配列としては、例えば、以下の公知配列が用いられる。
（１）Ｈｉｓ−ｔａｇ（ＰＣＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ  Ａ）
Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ（配列番号：１７）
（２）Ｖ５−ｔａｇ（ＰＣＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ）
Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ（配列番号：１８）
（３）ｍｙｃ−ｔａｇ（ｐＣＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ）
Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ（配列番号：１９）
（４）Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ（ＰＣＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ  Ａ）
Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ（配列番号：２０）
（５）ＨＡ−ｔａｇ（ＰＣｌｕｚＨＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）
Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ（配列番号：２１）
【００１２】
ＥＧＦＰとしては、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が用いられる。
ＥＣＦＰとしては、配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が用いられる。
ＥＹＦＰとしては、配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が用いられる。
ＤｓＲＥＤとしては、配列番号：２６で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が用いられる。
ＥＢＦＰとしては、配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質が用いられる。
これらＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲＥＤ、ＥＢＦＰは、励起光照射による発光などの活性を有する限り、（１）上記したアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）上記したアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加または挿入しているアミノ酸配列、（３）上記したアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているアミノ酸配列、または（４）それらの欠失・付加・置換を組み合わせたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００１３】
ＧＦＰをコードするＤＮＡとしては、具体的には、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列の相補的塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつ配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：７で表されるアミノ酸配列からなるＧＦＰと実質的に同質の活性（例、励起光照射による発光など）を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１４】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のハイブリダイゼーション用試薬を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列からなるＧＦＰをコードするＤＮＡは、配列番号：２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ（ＷＯ９７／４２３２０）などであり、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列からなるＧＦＰをコードするＤＮＡは、配列番号：４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ（ＷＯ９６／２３８１０）などであり、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列からなるＧＦＰ（ＧＦＰｕｖ）をコードするＤＮＡは、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ（ＷＯ９７／２６３３３）などであり、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるＧＦＰ（ＥＧＦＰ）をコードするＤＮＡは、配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ０５７２）などである。
【００１５】
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるＥＧＦＰをコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列からなＥＣＦＰをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列からなＥＹＦＰをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２６で表わされるアミノ酸配列からなＤｓＲＥＤをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２８で表わされるアミノ酸配列からなるＥＢＦＰをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡなどが用いられる。
【００１６】
オーファンレセプターと蛍光タンパク質との融合タンパク質は、オーファンレセプタータンパク質をコードするＤＮＡとＧＦＰをコードするＤＮＡとを連結したＤＮＡを用いて製造することができる。
該連結ＤＮＡは、オーファンレセプターをコードするＤＮＡの塩基配列の３’末端に、インフレームでＧＦＰをコードするＤＮＡの５’末端を連結して構築する。
なお、両ＤＮＡの間にＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒなど分子量の小さいアミノ酸残基から選ばれる１〜５個程度のリンカーと呼ばれるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入してもよい。
オーファンレセプターと蛍光タンパク質との融合タンパク質（以下、融合タンパク質と略記する場合がある）の発現ベクターは、例えば、（１）融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を調製し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
リガンドが決定されていないレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質としては、例えば、配列番号：３０〜配列番号：１３１のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなる、リガンドが決定されていない１０２種類の各レセプタータンパク質と配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるＧＦＰとの融合タンパク質が好ましく用いられる。これら配列番号：３０〜配列番号：１３１のいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列においては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端のメチオニン残基が欠失しており、場合によっては、さらに次のアラニン残基がスレオニン残基またはセリン残基に置換されている。
この融合タンパク質をコードするＤＮＡは、リガンドが決定されていない１０２種類の各レセプタータンパク質をコードする部分の下流に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるＧＦＰをコードするＤＮＡ（配列番号：２）を連結することによって調製でき、具体的には配列番号１３２〜配列番号：２３３のいずれかの配列番号で表される塩基配列からなるＤＮＡが用いられる。これら配列番号：１３２〜配列番号：２３３のいずれかの配列番号で表される塩基配列においては、配列番号：２で表される塩基配列の５’末端のメチオニン残基コドンが欠失しており、場合によっては、さらに次のアラニン残基コドンがスレオニン残基コドンまたはセリン残基コドンに置換されている。
【００１７】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
該ベクターで用いられるプロモーターは、遺伝子発現に用いる宿主内で機能する適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
また、各種組織において発現させる場合、インスリンＩＩ・プロモーター（膵臓）、Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−αサブユニット・プロモーター（下垂体）、トランスサイレチン・プロモーター（肝臓）、レニン・プロモーター（腎臓）、ＰＳＥ・プロモーター（前立腺）、ＣＤ２・プロモーター（Ｔ細胞）、ＩｇＧ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ・プロモーター（Ｂ細胞）、スカベンジャ−レセプターＡ・プロモーター（マクロファージ）などが用いられる。
宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００１８】
該発現ベクターは、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しうる。選択マーカーとして、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のレセプタータンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築されたレセプタータンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００１９】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６０，  １６０  （１９６８））、ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９，  ３０９  （１９８１））、ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １２０，  ５１７  （１９７８））、ＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４１，  ４５９  （１９６９））、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ３９，  ４４０  （１９５４））、ＤＨ５α（Ｉｎｏｕｅ，  Ｈ．，  Ｎｏｊｉｍａ，  Ｈ．ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，  Ｇｅｎｅ，  ９６，  ２３−２８  （１９９０））、ＤＨ１０Ｂ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７，  ４６４５−４６４９  （１９９０））などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，  ２４，  ２５５  （１９８３））、２０７−２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ９５，  ８７  （１９８４））などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００２０】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ  細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，  １３，  ２１３−２１７  （１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３１５，  ５９２  （１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、膵臓由来細胞（ＲＩＮｍ５Ｆ、ＨＩＴ−Ｔ１５など）、下垂体由来細胞（ＧＨ３、ＧＨ１、ＲＣ４／ＢＣなど）、胎盤由来細胞（ＢｅＷｏ，ＪＡＲ，ＪＥＧ−３など）、肝臓由来細胞（ＨｅｐＧ２など）、腎臓由来細胞（ＡＣＨＮなど）、血球細胞由来細胞（Ｈ９，ＴＨＰ−１，Ｕ−９３７など）、ＨｅＬａ細胞などが用いられる。
【００２１】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，  ２１１０  （１９７２）や、Ｇｅｎｅ，  １７，  １０７  （１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，  １１１  （１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １９４，  １８２−１８７  （１９９１）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７５，  １９２９  （１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２，  ４５６  （１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、上記融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
【００２２】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２３】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ４３１−４３３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７２）〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７，  ４５０５  （１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｇ．  Ａ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１，  ５３３０  （１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２４】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９５，  ７８８  （１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １２２，  ５０１  （１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ８，  ３９６  （１９５９）〕、ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  １９９，  ５１９  （１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ７３，  １  （１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
各種宿主について適当な培地、培養条件などについては公知である（特に、ＷＯ  ００／１４２２７号公報第２４頁第２４行〜第２６頁第８行、ＥＰ１１１１０４７Ａ２号公報段落［００９０］〜［００９６］参照）。
以上のようにして、形質転換体の細胞膜に融合タンパク質を発現させることができる。
【００２５】
上記培養物から融合タンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
融合タンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により融合タンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にレセプタータンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる融合タンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる融合タンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する融合タンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する融合タンパク質またはその塩の活性または存在は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００２６】
本発明のリガンドの決定方法に用いられる試験化合物としては、公知のリガンド（例えば、アンギオテンシン、ボンベシン、カナビノイド、コレシストキニン、グルタミン、セロトニン、メラトニン、ニューロペプチドＹ、オピオイド、プリン、バソプレッシン、オキシトシン、ＰＡＣＡＰ（例、ＰＡＣＡＰ２７，ＰＡＣＡＰ３８）、セクレチン、グルカゴン、カルシトニン、アドレノメジュリン、ソマトスタチン、ＧＨＲＨ、ＣＲＦ、ＡＣＴＨ、ＧＲＰ、ＰＴＨ、ＶＩＰ（バソアクティブ・インテスティナル・アンド・リレイテッド・ポリペプチド）、ソマトスタチン、ドーパミン、モチリン、アミリン、ブラジキニン、ＣＧＲＰ（カルシトニンジーンリレーティッドペプチド）、ロイコトリエン、パンクレアスタチン、プロスタグランジン、トロンボキサン、アデノシン、アドレナリン、ケモカインスーパーファミリー（例、ＩＬ−８，ＧＲＯα，ＧＲＯβ，ＧＲＯγ，ＮＡＰ−２，ＥＮＡ−７８，ＧＣＰ−２，ＰＦ４，ＩＰ−１０，Ｍｉｇ，ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１などのＣＸＣケモカインサブファミリー；ＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１，ＭＣＰ−２，ＭＣＰ−３，ＭＣＰ−４，ｅｏｔａｘｉｎ，ＲＡＮＴＥＳ，ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β，ＨＣＣ−１，ＭＩＰ−３α／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３β／ＥＬＣ，Ｉ−３０９，ＴＡＲＣ，ＭＩＰＦ−１，ＭＩＰＦ−２／ｅｏｔａｘｉｎ−２，ＭＤＣ，ＤＣ−ＣＫ１／ＰＡＲＣ，ＳＬＣなどのＣＣケモカインサブファミリー；ｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎなどのＣケモカインサブファミリー；ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅなどのＣＸ３Ｃケモカインサブファミリー等）、エンドセリン、エンテロガストリン、ヒスタミン、ニューロテンシン、ＴＲＨ、パンクレアティックポリペプタイド、ガラニン、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸，リゾホスファチジルセリン、スフィンゴシルホスホリルコリン、リゾホスファチジルコリン、ステロイド類、胆汁酸類、イソプレノイド、アラキドン酸代謝物、アミン類、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸など）の他に、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。例えば、該組織抽出物、細胞培養上清などを、オーファンレセプターとＧＦＰとの融合タンパク質を発現させた細胞に添加し、その細胞刺激活性などを測定しながらスクリーニングを行い、最終的に単一のリガンドを決定することができる。
【００２７】
本発明のリガンド決定方法Ａは、具体的には、該融合タンパク質の発現細胞を構築し、該発現細胞やその細胞膜画分を用いて細胞刺激活性アッセイやレセプター結合アッセイを行うことによって、オーファンレセプターに結合して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性）、ＭＡＰキナーゼの活性化、転写因子（例、ＣＲＥ、ＡＰ１、ＮＦｋＢなど）の活性化、ジアシルグリセロール産生、細胞膜上のイオンチャンネル（例、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−など）の開閉、アポトーシスの誘導、細胞の形態変化、レセプター（融合タンパク質）の細胞膜から細胞質への移行、低分子量Ｇタンパク質（例、Ｒａｓ、Ｒａｐ、Ｒｈｏ、Ｒａｂなど）の活性化、細胞分裂促進活性、ＤＮＡ合成促進活性などを有する化合物、すなわちリガンド（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）を決定する方法である。
本発明のリガンド決定方法は、融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分と試験化合物とを接触させた場合の、例えば、該オーファンレセプターに対する試験化合物の結合量や細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
【００２８】
より具体的には、本発明は、次のようなリガンド決定方法を提供する。
（１）標識した試験化合物を、融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、標識した試験化合物の該細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定することを特徴とするオーファンレセプターに対するリガンドの決定方法、
（２）標識した試験化合物を、融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した融合タンパク質に接触させた場合における、標識した試験化合物のオーファンレセプターに対する結合量を測定することを特徴とするオーファンレセプターに対するリガンドの決定方法、
（３）試験化合物を、融合タンパク質を発現している細胞に接触させた場合における、オーファンレセプターを介した前記細胞刺激活性、ＭＡＰキナーゼの活性化、転写因子（例、ＣＲＥ、ＡＰ１、ＮＦｋＢなど）の活性化、ジアシルグリセロール産生、細胞膜上のイオンチャンネル（例、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−など）の開閉、アポトーシスの誘導、細胞の形態変化、レセプター（融合タンパク質）の細胞膜から細胞質への移行、低分子量Ｇタンパク質（例、Ｒａｓ、Ｒａｐ、Ｒｈｏ、Ｒａｂなど）の活性化、細胞分裂促進活性、ＤＮＡ合成促進活性などを測定することを特徴とするオーファンレセプターに対するリガンドの決定方法、および
（４）試験化合物を、融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した融合タンパク質に接触させた場合における、オーファンレセプターを介する前記細胞刺激活性、ＭＡＰキナーゼの活性化、転写因子（例、ＣＲＥ、ＡＰ１、ＮＦｋＢなど）の活性化、ジアシルグリセロール産生、細胞膜上のイオンチャンネル（例、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−など）の開閉、アポトーシスの誘導、細胞の形態変化、レセプター（融合タンパク質）の細胞膜から細胞質への移行、低分子量Ｇタンパク質（例、Ｒａｓ、Ｒａｐ、Ｒｈｏ、Ｒａｂなど）の活性化、細胞分裂促進活性、ＤＮＡ合成促進活性などを測定することを特徴とするオーファンレセプターに対するリガンドの決定方法を提供する。
特に、上記（１）〜（２）の試験を行ない、試験化合物がオーファンレセプターに結合することを確認した後に、上記（３）〜（４）の試験を行なうことが好ましい。
【００２９】
場合によっては、上記発現細胞から融合タンパク質を単離精製し、それを用いてレセプター結合アッセイ等を行うこともできる。リガンド決定方法に用いる融合タンパク質としては、前記細胞を用いて大量発現させた融合タンパク質が適している。
融合タンパク質を製造するには、上記の発現方法が用いられるが、該融合タンパク質をコードするＤＮＡを哺乳動物細胞や昆虫細胞などで発現させることが好ましい。融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片をバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現した融合タンパク質の量と質の検査は公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Ｎａｍｂｉ，Ｐ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７，  １９５５５−１９５５９  （１９９２）〕に記載の方法に従って行うことができる。
【００３０】
本発明のリガンド決定方法において、融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分を用いるのが好ましい。
本発明のリガンド決定方法において、融合タンパク質を発現している細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行なうことができる。
融合タンパク質を発現している細胞とは、融合タンパク質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した融合タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
【００３１】
該融合タンパク質を発現している細胞やその膜画分中の融合タンパク質の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。この融合タンパク質の発現量を、蛍光顕微鏡や蛍光光度計を用いて、細胞や細胞膜におけるＧＦＰ発光量から概算することができる。
オーファンレセプターに対するリガンドを決定する上記の（１）〜（２）の方法を実施するためには、融合タンパク質を含有する適当な細胞または細胞膜画分および標識した試験化合物が必要である。融合タンパク質画分としては、天然型のオーファンレセプターと同等の活性を有する組換え型融合レセプターを含有するものが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験化合物として、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した、前述のリガンド化合物群から選ばれる化合物が用いられる。
【００３２】
具体的には、本発明のリガンドの決定方法を行なうには、まず融合タンパク質を発現している細胞またはその細胞膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁することにより融合タンパク質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとオーファンレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチンなどの各種タンパク質をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるリセプターやリガンドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。そして、例えば０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター標品に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃〜５０℃、望ましくは約４℃〜３７℃で、約２０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターあるいはγ−カウンターで計測する。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物をオーファンレセプターに対するリガンド（アゴニストを含む）として選択することができる。
【００３３】
本発明のリガンドを決定する上記の（３）〜（４）の方法を実施するためには、オーファンレセプターを介する前記細胞刺激活性、例えばＭＡＰキナーゼの活性化、転写因子（例、ＣＲＥ、ＡＰ１、ＮＦκＢなど）の活性化、ジアシルグリセロール産生、細胞膜上のイオンチャンネル（例、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｃｌ−など）の開閉、アポトーシスの誘導、細胞の形態変化、レセプター（融合タンパク質）の細胞膜から細胞質への移行、低分子量Ｇタンパク質（例、Ｒａｓ、Ｒａｐ、Ｒｈｏ、Ｒａｂなど）の活性化、細胞分裂促進活性、ＤＮＡ合成促進活性などを公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、融合タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレート等に培養する。リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した代謝産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００３４】
上記細胞刺激活性のうち「レセプターの細胞質内への移行」の測定では、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質の蛍光を測定することで、融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移動を観察することができる。融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移動の観察するためには、前記した融合タンパク質を安定的にまたは一過性に発現している動物細胞を用いるのが適している。適当な培養器に通常の培地を用いて培養した当該細胞に、適当な濃度に希釈した試験化合物を添加する。その際培地に直接希釈した試験化合物溶液を添加しても良いが、細胞をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、ＢＳＡを０から１０％、好ましくは０．１から１％添加しても良い）で洗浄した後、試験化合物を含有する同液を添加しても良い。該細胞はリガンド添加後、４℃から３７℃、好ましくは２０℃から３７℃で１分から６時間、好ましくは１０分から２時間放置後に、融合タンパク質の細胞膜から細胞質への移動を観察する。該細胞はそのままでも観察可能であるが、グルタルアルデヒドやホルマリンで固定してもよい。固定方法は公知の方法に従って行うことができる。
観察は通常の蛍光顕微鏡や共焦点レーザー顕微鏡を用いればよいが、励起光を照射できる機能と蛍光像を取り込む機能を備えたプレートリーダーなども使用できる。その際、レセプターと、配列番号：３または配列番号：５で示した野生型ＧＦＰまたはＧＦＰｕｖとの融合タンパク質を検出するためには紫外光、好ましくは３９５ｎｍで励起し、フルオレセイン・イソチアネート（ＦＩＴＣ）や一般に市販されるＧＦＰ検出用のフィルターを用いて観察できる。また、配列番号：１または配列番号：７で示したＧＦＰとの融合タンパク質を検出するためには４６０〜５００ｎｍ、好ましくは４８８ｎｍの励起光で励起し、ＦＩＴＣや一般に市販されるＧＦＰ検出用のフィルターを用いて観察すればよい。
レセプター（融合タンパク質）の細胞質内への移行の他に、レセプターの凝集、レセプターの局在化、あるいはレセプターの発現の低下または増加など、顕微鏡的に観察できるレセプターの形態学的な変化を観察することもできる。
【００３５】
本発明のリガンド決定法Ｂを実施する場合、融合タンパク質の発現ベクター以外に、特定のエンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドを、細胞、好ましくは真核生物由来の細胞に組み込むことが必要である。このプラスミドは、細胞、好ましくは真核生物由来の細胞内で該レポータータンパク質を発現させることのできるプロモーターを含有し、更に原核生物内で増殖させる場合の選択マーカーとして薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）などを含有してもよい。
エンハンサー／プロモーターの下流にレポータータンパク質をコードするＤＮＡを含有するプラスミドは、そのエンハンサーの制御下に細胞内でレポータータンパク質を発現することでき、かつ細胞内に導入できるプラスミドであれば、市販のプラスミドなどのいかなるプラスミドでもよい。
エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０、パピローマウイルス等のウイルス由来のエンハンサー、レトロウイルスのＬＴＲ、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ｃＡＭＰ応答配列）（ＣＲＥ）、あるいはＴＰＡレスポンスエレメント（ＴＰＡ応答配列）（ＴＲＥ）等が用いられ、好ましくはｃＡＭＰレスポンスエレメントである。該細胞が発現するオーファンレセプターによって仲介されうる上記細胞刺激活性によって活性化されるエンハンサーが適当である。
【００３６】
プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶのチミジンキナーゼ遺伝子のＴＡＴＡ様プロモーター等が用いられ、好ましくはＴＡＴＡ様プロモーターである。
レポータータンパク質遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子等が用いられる。公知の方法にて酵素活性を検出できるような酵素遺伝子であれば、レポータータンパク質として用いうる。
かかるプラスミドの具体例として、ｃＡＭＰレスポンスエレメントの下流にＴＡＴＡ様プロモーターおよびレポータータンパク質（例、ルシフェラーゼ遺伝子）をコードする遺伝子を連結したプラスミド、例えばｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）などがある。
リガンド決定方法Ｂで用いられる細胞としては、前記した宿主細胞が用いられ、好ましくは真核生物由来の細胞、より好ましくは動物細胞（例、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞など）などが用いられる。
【００３７】
該細胞は、２種以上（好ましくは２〜３種）の融合タンパク質を発現していてもよい。
２種類以上の融合タンパク質を発現させる場合は、類似の生物学的特徴を有する２種類以上のオーファンレセプターを用いるのが良い。
類似の特徴としては、例えば、使用する２種類以上のオーファンレセプターをそれぞれ単独で発現させた時のレポータータンパク質の発現量などが挙げられる。具体的には、２種類以上のオーファンレセプターをそれぞれ単独で発現させた場合における（１）レポータータンパク質の基礎発現量および／または（２）フォルスコリン添加時のレポータータンパク質の発現量を指標として、各レセプタータンパク質の特徴を区別することができる。
従って、２種類以上のオーファンレセプターを発現させてリガンドを決定する場合、あらかじめレポータータンパク質の基礎発現量が低いもの、中程度のもの、明らかに高いものなどに区分けをしたり、あるいはフォルスコリン添加によってレポータータンパク質の発現量が上昇しにくいレセプタータンパク質を明らかにしておくことが望ましい。なぜならば、例えばレポータータンパク質の基礎発現量が高いレセプタータンパク質とレポータータンパク質の基礎発現量が低いレセプターの２種類のレセプタータンパク質を発現させた場合、後者にリガンドが結合した場合にレポータータンパク質発現量の上昇が検出しにくくなるからである。すなわち：
（１）レポータータンパク質の基礎発現量が高いオーファンレセプターと低いレセプタータンパク質の混合は避けるのが好ましい、
（２）フォルスコリン添加によるレポータータンパク質の発現量の上昇が顕著なレセプタータンパク質とそうでないオーファンレセプターは混合しないほうが好ましい、
（３）レポータータンパク質の基礎発現量が同程度であるオーファンレセプター同士を組み合わせて発現させるのが好ましい。
このように類似の特徴を有するオーファンレセプターの組合わせとしては、例えば、ＡＰＪ（アペリンレセプター；Ｇｅｎｅ，  １３６，  ３５５  （１９９３））とＴＧＲ−１（特開２００２−０７８４９２号）との組み合わせが挙げられる。
【００３８】
リガンドの決定方法Ｂの具体例を以下に記載する。
細胞を９６ウェルプレートに播種し、例えば１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで一晩培養する。ここで、例えば市販のトランスフェクションキットを用いて、融合タンパク質の発現プラスミドおよびレポータープラスミドを同時に細胞に導入し、細胞をさらに一晩培養することにより、細胞内でオーファンレセプターを一過性に発現させる。細胞を洗浄し、さらに培地を無血清化した後、試験化合物を添加する。エンハンサーがＣＲＥである場合、試験化合物と同時にフォルスコリンを添加してもよい。一定時間インキュベーションを行った後、細胞を溶解し、レポータータンパク質の活性を測定する。
前記の決定方法において、レポータータンパク質活性のベースラインが高く、試験化合物による活性の変化の検出が困難な場合には、ベースラインを低下させる手段を講じるとよい。例えばオーファンレセプターがＧタンパク質共役型レセプタータンパク質（ＧＰＣＲ）の場合、Ｇタンパク質のαサブユニットのうち、ｃＡＭＰ抑制効果を示すＧｉタンパク質を加えることにより、活性変化の検出が容易となる。Ｇｉタンパク質を発現させるために、Ｇｉタンパク質をコードするＤＮＡを発現するプラスミドを、オーファンレセプタープラスミドおよびレポータープラスミドと共に細胞に導入することができる。この場合、３種のプラスミド（オーファンレセプタープラスミド：レポータープラスミド：Ｇｉプラスミド）の混合比は、好ましくは５〜１５：１：１〜６程度、さらに好ましくは７：１：３程度である。
本発明のリガンド決定方法Ｂにおいて、試験化合物を添加した場合に、レポータータンパク質の活性が約２０％以上、好ましくは約５０％以上、上昇または減少した時、当該試験化合物をリガンドとして同定することができる。
本発明のリガンド決定方法Ｂにおいて用いられる試験化合物は、前述の試験化合物などから選択される化合物である。
【００３９】
更に、本発明のリガンド決定用キットは、本発明の融合タンパク質を発現し得る細胞またはその細胞膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．リガンド決定用試薬
（１）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（２）融合タンパク質標品
融合タンパク質を発現しているＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（３）標識試験化合物
市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した化合物、または適当な方法で標識化したもの。
水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。水に難溶性を示す試験化合物については、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ、メタノール等に溶解する。
（４）非標識試験化合物
標識化合物と同じものを１００〜１０００倍濃い濃度に調製する。
【００４０】
２．測定法
（１）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプタータンパク質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（２）標識試験化合物を５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには非標識試験化合物を５μｌ加えておく。
（３）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識試験化合物を０．２Ｎ  ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（４）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定する。
【００４１】
この様に、本発明のリガンド決定方法（Ａ及びＢ）によれば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質の蛍光またはＧＦＰ抗体などの蛍光タンパク質抗体を利用した免疫染色法やウエスタンブロット法など用いて、
（１）タンパク質レベルでレセプタータンパク質が発現していることを確認でき、
（２）細胞膜にレセプタータンパク質が発現していることを確認でき、
（３）レセプタータンパク質の発現量を見積もることができ、
（４）レセプタータンパク質の高発現細胞を選択でき、そして
（５）リガンドによるレセプターの特異的反応を、レセプターと蛍光タンパク質との融合タンパク質の細胞内へのインターナリゼーションとして検出できる。これらの特徴を利用することにより、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質（オーファンレセプター）のリガンドを効率よく決定できる。
このようにして決定されたリガンドは、そのレセプタータンパク質に結合して、その生理的機能を調節するので、そのレセプタータンパク質の機能に関連する疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。さらには、リガンドとそのレセプタータンパク質を用いて、該レセプターのアゴニスト／アンタゴニストのスクリーニングを行うことができる。
【００４２】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００４３】
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
配列番号：１
実施例１で使用したＧＦＰ（以下、ＧＦＰ−１と略記する）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：２
実施例１で使用したＧＦＰをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３
野生型ＧＦＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号：４
野生型ＧＦＰをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：５
ＧＦＰｕｖのアミノ酸配列を示す。
配列番号：６
ＧＦＰｕｖをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：７
ＥＧＦＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号：８
ＥＧＦＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：９
実施例１で用いるヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ５のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１０
実施例１で用いるヒト由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ５をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１１
参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
配列番号：１２
参考例１におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
配列番号：１３
ヒト由来副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ−Ｒ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１４
ヒト由来副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ−Ｒ）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１５
ヒト由来ＧＰＲ４０のアミノ酸配列を示す。
配列番号：１６
ヒト由来ＧＰＲ４０をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１７
Ｈｉｓ−Ｔａｇのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１８
Ｖ５−ｔａｇのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１９
ｍｙｃ−ｔａｇのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２０
Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２１
ＨＡ−ｔａｇのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２２
ＥＣＦＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２３
ＥＣＦＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：２４
ＥＹＦＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２５
ＥＹＦＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：２６
ＤｓＲＥＤのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２７
ＤｓＲＥＤをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：２８
ＥＢＦＰのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２９
ＥＢＦＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：３０
オーファンレセプターｈＢＬ５とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３１
オーファンレセプターｈ７ＴＢＡ６２とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３２
オーファンレセプター１４２７３とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３３
オーファンレセプターＥＭＲ３とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３４
オーファンレセプターＧＰＲ１５とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３５
オーファンレセプターＧＰＲ３１とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３６
オーファンレセプターＧＰＲＣ５ＢとＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３７
オーファンレセプターＰＳＥＣ０１４２とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３８
オーファンレセプターＨＥ６とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：３９
オーファンレセプターＧＰＲ６１とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４０
オーファンレセプターＴＧＲ９とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４１
オーファンレセプターＴＧＲ２４とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４２
オーファンレセプターＺＧＰＲ１とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４３
オーファンレセプターＥＭＲ１とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４４
オーファンレセプターＧＰＲ２５とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４５
オーファンレセプターＧＰＲ５５とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４６
オーファンレセプターＡＸＯＲ１４とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４７
オーファンレセプターＴＭ７ＳＦ１とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４８
オーファンレセプターＰＳＰ２４ＢとＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：４９
オーファンレセプターＳＲＥＢ３とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５０
オーファンレセプターＴＧＲ３７とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５１
オーファンレセプターＨ９６３とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５２
オーファンレセプターＧＰＲ８７とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５３
オーファンレセプターＧＰＲ９１とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５４
オーファンレセプターＰＮＲとＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５５
オーファンレセプターＴＧＲ２９とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５６
オーファンレセプターＴＧＲ３６とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５７
オーファンレセプターＨ９とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５８
オーファンレセプターＴＧＲ１８とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：５９
オーファンレセプターＴＧＲ１９とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６０
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配列番号：６１
オーファンレセプターＧＰＲ１９とＧＦＰ−１との融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。
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配列番号：１８２
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配列番号：１８５
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配列番号：１８６
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配列番号：１８８
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オーファンレセプターＧＰＲ３２とＧＦＰ−１との融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
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配列番号：２３２
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配列番号：２３３
オーファンレセプターＴＧＲ３４とＧＦＰ−１との融合タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
【００４４】
参考例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５は、平成１２（２０００）年４月３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（旧  通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１４として、また平成１２（２０００）年３月２３日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６４１０として寄託されている。
【００４５】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
【００４６】
参考例１  ヒト脾臓のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型とし、２個のプライマー、プライマー１（配列番号：１１）およびプライマー２（配列番号：１２）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記鋳型ｃＤＮＡ１／１０量、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１／５０量、プライマー１（配列番号：１１）およびプライマー２（配列番号：１２）各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、および該酵素製品に添付のバッファー１／５量、ＧＣ  Ｍｅｌｔ１／５量からなり、最終量を２０μｌとした。ＰＣＲ反応では、９４℃・５分の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、６８℃・２分のサイクルを３０回繰り返し、最後に６８℃・５分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応産物をＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングした。これを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、該ＰＣＲ産物のｃＤＮＡを持つクローンをアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１０）を得た。このｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号：９）を有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ５と命名した。また配列番号：１０で表わされるＤＮＡを含有する形質転換体を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＣＲ４−ｈＴＧＲ５と命名した。
【００４７】
参考例２  ＴＧＲ５を一過性に発現させたヒトＨＥＫ２９３細胞における、コレステロール代謝関連物質によるレポーター活性化の検出
コレステロール代謝関連物質によるＴＧＲ５特異的な刺激活性の検出は、ＣＲＥプロモーターの発現誘導によって産生されるレポーター遺伝子産物（ルシフェラーゼ）の発現量を指標に行った。
ヒト由来のＨＥＫ２９３細胞を増殖培地（ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に１０％ウシ胎児血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加したもの）に懸濁し、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度にてコラーゲンでコートされたＢｌａｃｋ  ｗｅｌｌ  ９６ウェルプレート（ベクトンディッキンソン社）にまいた。３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した後、レポーター遺伝子を含有するプラスミドｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に、公知の方法により動物細胞用発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  Ｈｉｎｕｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  １２１９，  ２５１−２５９，  １９９４記載のｐＡＫＫＯ−１．１１１Ｈと同一のプラスミドベクター）にＴＧＲ５遺伝子を挿入して作製したＴＧＲ５発現ベクタープラスミド、または、ＴＧＲ５遺伝子を含まない元のｐＡＫＫＯ−１１１Ｈを該細胞に以下の通りにトランスフェクションした。
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を２４：１にて混合することにより、リポフェクトアミン希釈液を調製した。また、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ、ＴＧＲ５発現ベクタープラスミドまたは元のベクタープラスミド（２４０ｎｇ／μｌ）およびｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（２４０ｎｇ／μｌ）を２４：０．９：０．１にて混合することによりＤＮＡ希釈液を調製した。リポフェクトアミン希釈液とＤＮＡ希釈液を等量混合し、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた後、その溶液２５μｌを上記のＨＥＫ２９３細胞を培養したプレートに添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をアッセイ用培地（ＤＭＥＭに０．１％ウシ血清アルブミンを添加したもの）にて洗浄した後、アッセイ用培地にて希釈したリトコール酸（和光純薬）およびプロゲステロン（和光純薬）を２×１０−５Ｍとなるようプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間培養した。培養上清を捨てて、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ製造株式会社）を５０μｌ添加し、プレートリーダー（ＡＲＶＯ  ｓｘマルチラベルカウンター、Ｗａｌｌａｃ社）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。
その結果、配列番号：１０で表される塩基配列を有するＴＧＲ５遺伝子を導入したＨＥＫ２９３細胞特異的に、リトコール酸およびプロゲステロンによるルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（図１）。
【００４８】
参考例３  Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドの宿主細胞への導入
公知の方法によって作製した各種Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡ、すなわち甲状腺ホルモン刺激因子レセプター（ＴＲＨＲ）、ニューロメジンＵレセプター（ＦＭ−３およびＴＧＲ−１）、プロラクチン放出因子レセプター（ｈＧＲ３）、アペリンレセプター（ＡＰＪ）などを挿入した動物細胞用発現プラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたコロニーを単離・培養後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドの調製を行なった。また、ｃＡＭＰレスポンスエレメント（ＣＲＥ）の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結されたｐＣＲＥ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のレポータープラスミドを同様にして調製した。
Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドを導入する宿主細胞として、ヒトＨＥＫ２９３細胞をＩ型コラーゲンでコートした９６ウエル黒色プレート（ベクトンディッキンソン社）に１００，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。同じくＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞をｐＡＫＫＯ−１１１Ｈで形質転換したＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞をコスター社の９６ウエル黒色プレートに４０，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培養液量１００μｌで播種し、一晩培養した。いずれの細胞についても、プレート培養するための培地としてＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）に１０％のウシ胎児血清のみを添加したものを用いた。
上記各プラスミドを２４０ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質の発現プラスミド９μｌとレポータープラスミド１μｌの割合で２４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）に添加した。これを、同じく２４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに１０μｌのリポフェクトアミン２０００（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社）を添加したものと等量混合して、リポフェクトアミン２０００に添付の説明書の方法に従ってリポソームとプラスミドとの複合体を形成させた。また、効率的なスクリーニングの実施のためには、２４０ｎｇ／μｌの濃度で３種類のレセプター発現プラスミドを５μｌずつ添加し、他の試薬の比率は前出と同じものを調製した。これらを２５μｌ／ｗｅｌｌずつＨＥＫ２９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞の培養液に添加し、３７℃で一晩培養してプラスミドの導入を行った。ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞については、プラスミド添加後４時間以降に培養液をアッセイバッファー（０．１％のウシ血清アルブミンを添加したＤＭＥＭ）に交換し、無血清化をおこなった。
【００４９】
参考例４  レポーターアッセイによるリガンド活性の検出
ＨＥＫ２９３細胞についてはアッセイの１時間前に培養液を、参考例３に記載のアッセイバッファーに交換し、プレインキュベーションを行なった。アッセイバッファーにリガンドあるいはリガンド候補化合物を溶解したものを用意し、参考例３で準備したＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞に添加した。また、アッセイバッファーに終濃度２μＭのフォルスコリンを添加した条件でのアッセイも同様にして実施した。リガンドまたは試験化合物の添加後４時間のインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのアゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写・翻訳の促進あるいは抑制を誘導した。インキュベーション終了後に各ウェルのアッセイバッファーを除去し、ピッカジーンＬＴ２．０（東洋インキ社）発光基質を５０μｌずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各ウェルのレポーター遺伝子の発現誘導量に相当する発光量を参考例２記載のプレートリーダーにて測定した。
参考例３および４に記載の方法に従って各種のＧタンパク質共役型レセプタータンパク質ｃＤＮＡを挿入した発現プラスミドを用い、ＨＥＫ２９３細胞においてリガンド刺激によるレポーター遺伝子の発現誘導を測定した。細胞内へシグナルを伝達するＧタンパク質のαサブユニットとしてＧｓに共役するＣＲＦＲについては、フォルスコリン非添加、添加のいずれの条件においてもリガンド添加によるレポーター遺伝子の活性化が検出された。また、抑制性であるＧｉに共役するＡＰＪについては、フォルスコリン添加条件において、リガンド添加によるレポーター遺伝子発現の抑制が検出された。また、Ｇｑに共役するレセプターＴＲＨＲ、ＦＭ−３、ＴＧＲ−１については、フォルスコリン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された。ＧｑおよびＧｉの両方に共役するレセプターｈＧＲ３についても、同様にフォルスコリン添加条件においてレポーター遺伝子の発現の促進が検出された（図２）。
【００５０】
参考例５  抑制性Ｇタンパク質αサブユニットＧｉ発現プラスミドを用いたレポーターアッセイ
参考例３に示したＧタンパク質レセプター発現プラスミドと同様の方法によって、抑制性Ｇタンパク質αサブユニット（Ｇｉ）の発現プラスミドを調製した（ここで、Ｇｉついては、動物種を問わない）。これを３μｌ、レセプター発現プラスミドを７μｌ、レポータープラスミドを１μｌの割合で２４０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉに添加し、その他の条件は実施例２と同様の方法でＨＥＫ２９３あるいはＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞にＤＮＡを導入した。これら３種のプラスミドの混合比は全体の量を１１μｌとした場合、Ｇｉが１から６μｌ、好ましくは１から３μｌが適当である。これらを実施例３の方法に従ってアッセイを行いリガンド活性を検出した。
すなわち、Ｇｉ共存下でのＴＧＲ５のリトコール酸に対する反応を検出した結果、ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞を用いたＧタンパク質レセプターＴＧＲ５のアッセイにおいて、ＧｉをＴＧＲ５と同時に発現させることにより、リガンド非添加時（リガンド（−））のルシフェラーゼ活性を大幅に低下させることができ、その結果リガンド（リトコール酸、２×１０−５Ｍ、リガンド（＋））による活性の上昇を検出することが可能となった（図３）。
【００５１】
実施例１  ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質のタウロリトコール酸添加による細胞内移行
ＴＧＲ５のＣ末端にオワンクラゲより単離されたＧｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）をつないだ融合タンパク質を発現させるための発現プラスミドを構築した。その際ＧＦＰのｃＤＮＡ（配列番号：２）としてＧＦＰの発現ベクターｐＱＢＩ２５（宝酒造）から切り出した断片を用いた。ＴＧＲ５のｃＤＮＡはＰＣＲ法によりその終止コドンを制限酵素ＮｈｅＩの認識配列に修正し、ここにＧＦＰのｃＤＮＡ断片を連結して、実施例１に記載の発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入した。このようにして得たＴＧＲ５とＧＦＰとの融合タンパク質（以下、ＴＧＲ５−ＧＦＰ）の発現ベクタープラスミドを以下の方法でＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞にトランスフェクションした。ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞は増殖培地［ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）に１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を添加したもの］に懸濁し、０．６×１０５ｃｅｌｌｓ／チャンバーの濃度にてチェンバー数４つのＬａｂ−ＴｅｋＩＩカバーグラスチェンバー（Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ社）にまき、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した後にトランスフェクションした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いた。まず、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  試薬  ２μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）５０μｌを混合し、５分間放置後、これを０．４８μｇのＤＮＡとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ  ５０μｌの混合液と混ぜ合わせ、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた。この混合液を上記のＣＨＯ細胞を培養したチェンバーに１００μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。培地を共焦点顕微鏡観察用培地［Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）に０．１％ウシ  アルブミン（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｆｒｅｅ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社））を懸濁したもの］に置き換え、共焦点顕微鏡（ライカ社）でＧＦＰの蛍光像を観察した。その際、ＧＦＰの励起は４８８ｎｍで行った。
その結果ＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質は細胞膜に観察された（図４）。この細胞にタウロリトコール酸を１０−５Ｍとなるように培地に添加した３０分後には、ＧＦＰの蛍光が細胞膜ではなく、細胞質に移動していることが見出された（図５）。このことはＴＧＲ５が細胞膜に発現するＧタンパク質共役型のレセプターであるとともに、ＴＧＲ５がタウロリトコール酸に反応して細胞質へ移行、すなわちインタナリゼーションしたことを示す。
【００５２】
実施例２  膵臓β細胞株ＲＩＮｍ５Ｆに一過性発現による副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ−Ｒ）とＧＦＰ融合タンパク質の発現
実施例１と同様の方法でヒトＰＴＨ−Ｒ（配列番号：１３）のＣ末端にＧＦＰをつないだ融合タンパク質を発現させるための発現プラスミドを参考例２に記載の発現ベクターｐＡＫＫＯ−１１１Ｈに挿入した発現ベクターを作製した。このようにして得たＰＴＨ−ＲとＧＦＰとの融合タンパク質（以下、ＰＴＨ−ＧＦＰ）の発現ベクタープラスミドを以下の方法でＲＩＮｍ５Ｆ細胞にトランスフェクションした。ＲＩＮｍ５Ｆ細胞は増殖培地［ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）にＣｈａｒｃｏａｌ／Ｄｅｘｔｒａｎ処理済のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）を１０％添加したもの］に懸濁し、０．３×１０５ｃｅｌｌｓ／チャンバーの濃度にてチェンバー数８つのＬａｂ−ＴｅｋＩＩカバーグラスチェンバー（Ｎａｌｇｅｎ  Ｎｕｎｃ社）にまき、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した後にトランスフェクションした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）を用いた。まずＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  試薬  ３．３μｌとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社）８０μｌを混合し、５分間放置後、これを０．７２μｇのＤＮＡとＯＰＴＩ−ＭＥＭ−Ｉ  ８０μｌの混合液と混ぜ合わせ、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた。この混合液を上記のＲＩＮｍ５Ｆ細胞を培養したチェンバーに１６０μｌ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。共焦点顕微鏡での観察は実施例１と同様の方法で行った。
その結果ＰＴＨ−ＧＦＰ融合タンパク質の細胞膜での発現が観察された。
【００５３】
実施例３  インスリンＩＩプロモーターを用いたＧＰＣＲとＧＦＰ融合タンパク質の発現
実施例１と同様の方法で、マウスゲノムからクロ−ニングしたマウスインスリンＩＩプロモーターの下流に、ヒトＧＰＲ４０（配列番号：１５）のＣ末端にＧＦＰをつないだ断片を挿入し、ＧＰＲ４０とＧＦＰとの融合タンパク質（以下、ＧＰＲ４０−ＧＦＰ）を発現させるための発現ベクターを作製した。このようにして得たＧＰＲ４０−ＧＦＰの発現ベクタープラスミドを以下の方法でＭＩＮ６細胞にトランスフェクションした。ＭＩＮ６細胞は増殖培地［ＤＭＥＭ（４．５ｇ／ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ含有）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に最終濃度ウシ胎児血清（Ｔｒａｃｅ社）を１５％、５５μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（大日本製薬  社）をそれぞれ添加したもの］に懸濁し、１．２×１０５ｃｅｌｌｓ／チャンバーの濃度にてチェンバー数４つのＬａｂ  Ｔｅｋ  ＩＩカバーグラスチェンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ社）にまき、３７℃、５％ＣＯ２条件下で二晩培養した後にトランスフェクションした。トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。まずＬｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  試薬４μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１００μｌを混合し、５分間放置後、これを２μｇのＤＮＡとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μｌの混合液と混ぜ合わせ、２０分間室温で静置することによりＤＮＡとリポフェクトアミンの複合体を形成させた。この混合液を上記のＭＩＮ６細胞を培養したチェンバーに１００μｌ添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間培養後、新たな増殖培地４００μｌに交換し、さらに一晩培養した。共焦点顕微鏡での観察は実施例１と同様の方法で行った。
その結果、ＧＰＲ４０−ＧＦＰ融合タンパク質がＭＩＮ６細胞の細胞膜で発現しているのが観察された。
【００５４】
実施例４  １０２種類の融合タンパク質をそれぞれ発現し得る形質転換体の製造
実施例１の方法に準じて、リガンドが決定されていない１０２種類の各レセプタータンパク質と配列番号：１で表されるアミノ酸配列またはその改変アミノ酸配列からなるＧＦＰとの融合タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１３２〜配列番号：２３３）をそれぞれ含有する１０２種類の発現ベクタープラスミドを調製し、ＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞にトランスフェクションした。これらのＣＨＯ細胞を実施例１と同様に培養したところ、融合タンパク質の発現がＣＨＯ−ｍｏｃｋ細胞に観察された。
【００５５】
【発明の効果】
本発明の、リガンドが決定されていないレセプタータンパク質のリガンドの決定方法は、各種の細胞系を使用できるため簡便であり、かつ短時間で実施することができる。
【００５６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＧＲ５発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（Ａ）および元のベクターのみを導入したＨＥＫ２９３細胞（Ｂ）における、コレステロール代謝関連物質によるレポーター活性化の検出（ｎ＝２）の結果を示す。
【図２】ＨＥＫ２９３細胞におけるリガンド刺激に対するレポーター遺伝子の発現誘導の結果を示す。
【図３】Ｇｉ共存下でのＴＧＲ５のリトコール酸に対する反応の結果を示す。
【図４】リガンド非存在下における、ＣＨＯ細胞に発現させたＴＧＲ５−ＧＦＰ融合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示す。
【図５】ＴＧＲ５−ＧＦＰを発現させたＣＨＯ細胞にＴＬＣＡを添加して３０分後の融合タンパク質の局在を示す。図中の白線は４μｍを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月3日(2003.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【配列表】
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