(57)【要約】      （修正有）【課題】各種臓器に普遍的に増殖・分化やその機能保全に関わる、あるいは癌や自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖・分化やその機能保全あるいは老化に関わる予防薬、治療薬、または検査薬のスクリーニング等に有用な新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、新規ポリペプチドに対する抗体を提供すること。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）特定のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部又は全部から成るポリペプチド、（ｂ）特定のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。【選択図】図１
2004337122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の一部又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のＤＮＡがコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子。
【請求項４】
請求項３記載の哺乳動物が齧歯類である齧歯類由来遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の齧歯類がマウスであるマウス遺伝子。
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部または全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列の一部または全部から成り、（ａ）のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
【請求項７】
請求項１若しくは２記載のＤＮＡ、又は請求項３ないし５のいずれか一項に記載の遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質である、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１若しくは２記載のＤＮＡ、又は請求項３ないし５のいずれか一項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項６又は７記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ及び膜アンカー領域を有し、精巣、心臓で特に強い発現が、また各種臓器に普遍的な発現が認められる新規ＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、並びに、新規ポリペプチドに対する抗体等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年のヒトゲノムプロジェクト及びヒトｃＤＮＡプロジェクトの成功により、多くのヒト疾患関連遺伝子が同定あるいは推定されるにいたった。しかしながらその一方で倫理上の問題からヒト遺伝子を用いた研究には制約があり、新たな研究の方向性が模索されている。このような観点からモデル生物における相同遺伝子を同定することは、研究を進展させる意味できわめて重要なステップと考えられる。特にマウスは最も研究が進んでいるモデル生物で、ゲノム情報や変異種の情報も比較的多く蓄積されているが、蓄積されたゲノム情報はまだ十分なものではない。一方、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究がなされ、得られたｃＤＮＡの断片配列がＥｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ（ＥＳＴ）としてデータベースに登録、公開がなされた。しかし、多くのＥＳＴは１００塩基長から５００塩基長といった短い塩基配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００３】
各種臓器においては、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。また、各種臓器における機能の調節には、機能を受け持つ特異的な細胞の増殖あるいは同細胞の活性化が関係している。従って、精巣、心臓で特に強い発現が、また各種臓器に普遍的な発現が認められる新規な遺伝子を取得して、その遺伝子にコードされる各種臓器に普遍的でかつ複雑な機能を調節する蛋白質を得ることは、医薬品開発に有用である。また、得られた蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現している該蛋白質の遺伝子の機能をホモロジー検索から推定し、その情報を基にして該蛋白質を適当な発現系で発現させて組換え蛋白質を得、更にして該蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることが必要であった。
【０００４】
長鎖ヒトｃＤＮＡプロジェクトにて、ヒト脳由来のヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子  （Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．，  Ｋｉｋｕｎｏ，Ｒ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，Ｍ．，  Ｈｉｒｏｓａｗａ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｏｈａｒａ，Ｏ．，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ７  （４），  ２７３−２８１  （２０００）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｕｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｓ．  ＸＶＩＩＩ．  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  １００  ｎｅｗ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｒａｉｎｗｈｉｃｈ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．）が報告されているが、その機能については不明であった。ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子は染色体３ｐ２１．２−ｐ１４．３に存在し、更に、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子のＳＮＰｓも複数箇所報告されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｃｍｄ＝Ｄｉｓｐｌａｙ＆ｄｏｐｔ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝１００４７２７６）、ヒト疾患の大部分が単なる遺伝子の欠失によって引き起こされるのではなくて、アミノ酸置換によって蛋白質の機能や活性が一部分だけ変化することにより引き起こされることを鑑みると、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子は各種臓器の分化やその機能保全に関わる、あるいは癌、自己免疫疾患、及びアレルギーといった細胞の増殖・分化に関わる疾患に関与している可能性が考えられる。ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子にコードされるポリペプチドには、トロポミオシン様ドメイン、Ｐｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメイン、膜アンカー領域が認められる６９０アミノ酸長であった。
【０００５】
【非特許文献１】
１．  Ｗｉｇｇｌｅｓ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｄｅｍｃｈｙｓｈｙｎ，  Ｌ．，  Ｐｒａｔｔ，  Ｍ．Ａ．，  Ｓｔａｉｎｅｓ，  Ｗ．Ａ．，  Ｓａｌｉｈ，  Ｍ．，  Ｔｕａｎａ，  Ｂ．Ｓ．，  １９９７，    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：３２３８４−９４，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｃｉｄｉｃ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．
【非特許文献２】
２．  Ｗｉｅｌｏｗｉｅｙｓｋｉ，  Ｐ．Ａ．，  Ｓｅｖｉｎｃ，  Ｓ．，  Ｇｕｚｚｏ，  Ｒ．，  Ｓａｌｉｈ，  Ｍ．，  Ｗｉｇｌｅ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｔｕａｎａ，  Ｂ．Ｓ．，    ２０００，    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３８４７４−８１，
Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ，  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （ＳＬＡＰｓ）  ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｔａｉｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
【非特許文献３】
３．  Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｄ．  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，  ２００２，  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  ５１３：５８−６６，
Ｔｈｅ  ＦＨＡ  ｄｏｍａｉｎ．
【非特許文献４】
４．  Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｋ．    ａｎｄ  Ｂｕｃｈｅｒ，  Ｐ．，    １９９５，    Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．，  ２０：３４７−３４９，
Ｔｈｅ  ＦＨＡ  ｄｏｍａｉｎ：  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．
【非特許文献５】
５．  Ｓｕｎ，  Ｚ．，  Ｈｓｉａｏ，  Ｊ．，  Ｆａｙ，  Ｄ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，  Ｄ．Ｆ．，  １９９８，    Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８１：２７２−２７４，
Ｒａｄ５３  ＦＨＡ  ｄｏｍａｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｒａｄ９  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．
【非特許文献６】
６．  Ｗｏｏｄｓｉｄｅ，  Ｄ．Ｇ．，  Ｓｈａｔｔｉｌ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｍ．Ｈ．，    ２００１，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２：９０４−９０５，
Ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＳＬＡＰｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ．
【非特許文献７】
７．  Ｈａｍｍｅｔ．  Ａ．，  Ｐｉｋｅ，  Ｂ．．Ｌ，  ＭｃＮｅｅｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｃｏｎｌａｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ｔｅｎｉｓ，  Ｎ．，  Ｈｅｉｅｒｈｏｒｓｔ，  Ｊ．，  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ．，  ２００３，  ５５：２３２−７．，
Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅｓ，  Ｌｉｎｋｓ  ＦＨＡ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｓ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅｓ
ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．
【非特許文献８】
８．  Ｐｅｎｇ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．Ｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００３，  ２７８：８８７３−８８７６．，
Ｉｓ  ａｎ  Ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｃｈｋ２  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ．
【非特許文献９】
９．  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｇ．Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｂ．，  Ｂｉｇｎｅｌｌ，  Ｃ．Ｒ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ａ．Ｍ．，  Ｅｌｌｅｄｇｅ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００３，  ４２１：９６１−９６６．
ＭＤＣ１  ｉｓ  ａ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．
【非特許文献１０】
１０．  Ａｌｉ，  Ｉ．  Ｕ．，  Ｌｉｄｅｒｅａｕ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  １９８９，  ８１：１８１５−１８２０，
Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｃ−ｅｒｂＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  （ｃ−ｅｒｂＡ  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｃ−ｅｒｂＡ２）  ｉｎ  ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ３ｐ２１−
ｐ２５  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．
【非特許文献１１】
１１．  Ｈｉｂｉ，  Ｋ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｙａｍａｋａｗａ，  Ｋ．，  Ｕｅｄａ，  Ｒ．，  Ｓｅｋｉｄｏ，  Ｙ．，  Ａｒｉｙｏｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｓｕｙａｍａ，  Ｍ．，  Ｔａｋａｇｉ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９９２，  ７：４４５−４４９，
Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ３ｐ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．
【非特許文献１２】
１２．  Ｈａ，  Ｈ．，  Ａｂｅ，  Ｋ．，  Ａｒｔｚｔ，  Ｋ．，  Ｇｅｎｅ，  １９９１，  １０７：３４５−３４６
Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ＫＥ２  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｈ−２Ｋ  ｒｅｇｉｏｎ．
【非特許文献１３】
１３．  Ｓｈａｎ，ｇ  Ｈ．Ｓ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｔａｎ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｗｕ，  Ｍ．，  Ｇｅｎｅ，  １９９４，  １５１：１９７−２０１，ＹＫＥ２，  ａ  ｙｅａｓｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｈｏｗｉｎｇ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ＫＥ２  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｚｉｐｐｅｒ  ｍｏｔｉｆ．
【０００６】
【本発明が解決しようとする課題】
従来、ヒト長鎖ｃＤＮＡプロジェクトでヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子が取得されていたが、遺伝子情報が完全でなく、その機能に関する情報も不完全であった。一方、各種臓器に普遍的に発現する新規遺伝子を取得し、該遺伝子、該遺伝子がコードする蛋白質あるいはその蛋白質に特異的に結合する抗体を得ることは、細胞内で該蛋白質が他の蛋白質との結合を阻害する化合物を、あるいはシグナル伝達等に影響及ぼす化合物をスクリーニングするのに重要である。
【０００７】
従って、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子に関連する新規遺伝子を取得し、新規モチ−フを取得し、同遺伝子の組織特異的発現パターンを得て、本発明の新規遺伝子がコードする蛋白質の機能に関する情報を得ることは、本発明のポリペプチドの特異的結合蛋白質や、アゴニスト、アンタゴニストを検索する際の非常に重要な手段となる。上記のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質が見出されなくても、本発明のポリペプチドの不活化実験（例えばノックアウト動物の作製）からそのポリペプチドの生理作用を解析することにより、本発明のポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストを作製することが可能であり、本発明のポリペプチドに対する特異的結合蛋白質、アゴニストまたはアンタゴニストなどは、各種臓器に関わる疾患の患者の機能不全に関連する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬として活用することが可能となる。
生体での本発明のポリペプチドの機能の低下または昂進が、各種臓器に関わる疾患の原因となっている場合が考えられる場合がある。この場合には、そのポリペプチド該蛋白質に対するアンタゴニストやアゴニストの投与だけでなく、そのポリペプチドの各種臓器をターゲットとした本発明のポリペプチド投与や、そのポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸の投与、あるいは該遺伝子を用いた遺伝子治療に応用することもできる。この場合には本発明のポリペプチドをコードする塩基配列は、本発明のポリペプチドの各種臓器に関わる疾患の患者の遺伝子欠失や変異の有無を調べるために必要な情報であり、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明のポリペプチドの機能不全に関与する疾患の予防あるいは治療薬や診断薬に応用することができる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、マウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、その遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側にヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子になかった全く新しい１６７アミノ酸長の配列が付加していること、また、得られた遺伝子が精巣において高く、心臓に於いてやや高く、子宮と眼において少し高く、脳に於いてやや弱く、調べた限りの全ての臓器で発現が認められること、また、発生の全過程に於いて発現していることを見出した。更に、得られた遺伝子情報を解析することにより、本発明のその遺伝子がコードするポリペプチドには、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子と同様にＣ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＰｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメインが存在するのみならず、その近辺にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が存在すること、Ｎ−末端側に１６７アミノ酸伸張しているポリペプチド配列には、ＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが存在することを発見し、それらのドメインが細胞内の重要な機能に係わっていることを示し、更にその遺伝子情報をもとに新規ポリペプチドとそれに特異的な抗体を得て、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は第一の態様として、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする塩基配列から成るＤＮＡ：（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部（例えば、以下に示すＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ及び膜アンカー領域に特徴的な配列の少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において３６番目（メチオニン）〜８５６番目（トリプトファン）の８２１個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部から成るポリペプチド；又は（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド、に係る。
本発明の第二の態様として、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列（配列番号：２の塩基対第１１１〜２，６７８番目の２，５６８塩基対長）及びその一部（例えば、以下に示すＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ及び膜アンカー領域  を有する配列の少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において３６番目（メチオニン）〜８５６番目（トリプトファン）の８２１個のアミノ酸から成るポリペプチド）又は全部をコードするＤＮＡ；（ｂ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；又は（ｃ）（ａ）のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、（ａ）のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに係る。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるＤＮＡをまとめて、以下、「本発明のＤＮＡ」ともいう。本発明のＤＮＡは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、哺乳動物が齧歯類である齧歯類由来遺伝子、特に齧歯類がマウスであるマウス遺伝子にも係る。特に、マウス遺伝子は「マウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のＤＮＡ又は遺伝子（以下、「ＫＩＡＡ１６０１遺伝子」ともいう。）にコードされるポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。）、例えば、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド（以下、「ＫＩＡＡ１６０１蛋白質」ともいう）に係る。
また、本発明は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。
【００１０】
また、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされる新規ポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、該ポリペプチドに対する抗体を用いることによって、該蛋白質の発現量を変化させる化合物、該蛋白質に結合する蛋白質との結合性を変化させる化合物（アンタゴニスト、アゴニスト）のスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法などを提供する。更に、本発明ポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩を用いることを特徴とする、それら物質と特異的に結合する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング用キット等も提供する。
【００１１】
更に、本発明は、本発明のＤＮＡ、本発明のＤＮＡを含有する組換えベクター又は発現ベクター、該ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体を培養し、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、本発明のポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又はその塩の製造方法、及び、こうして得られる本発明のポリペプチドの一部あるいは全長のポリペプチドを含む組換え蛋白質またはその塩を提供する。又、本発明は、本発明のＤＮＡを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質をコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスヌクレオチド又はそれらを含有してなる医薬、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を含有してなる医薬を提供する。
更に、本発明は、本発明ＤＮＡ、本発明ポリペプチド、その部分ポリペプチド若しくは該ポリペプチドを含む組換え蛋白質、又は、本発明のＤＮＡ又は遺伝子に対する抗体を網羅的に作成し、それらを集積させて得られる、所謂、ＤＮＡチップ（アレイ）、プロテインチップにも係る。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＮＡは、本発明者により採取されたマウス胎児尾芽由来ｍＲＮＡを出発材料として、本発明者が調製したｃＤＮＡライブラリーから、ｃＤＮＡ断片として単離した後に、塩基配列を決定し同定したものである。即ち、具体的には、小原他の方法（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，９：４７−５７）に従って調製したマウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、約１６，６０８個の組換え体を選択し、その全ての３’末端ＤＮＡ配列を決定し、その中から、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子に高い相同性を有するクローンを選択し全塩基配列の決定を行なった。次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（ＧＣＧ，  Ｆａｓｔａ＆  Ｂｌａｓｔ）を用いてホモロジー検索を行なった
すなわち、マウス胎児尾芽由来ｃＤＮＡライブラリーに対し、ヒト長鎖ｃＤＮＡ（ＫＩＡＡ１６０１）にホモロジーを有する遺伝子取得を試みたところ、驚くべきことにヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側に対し１６７アミノ酸長の新規アミノ酸配列が付加した構成のより長い新規アミノ酸配列（全長が８５６アミノ酸長）を有する新規ポリペプチドをコードする新規遺伝子が取得することに成功した。
その結果、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子がコードするアミノ酸配列（６９０アミノ酸長）のほぼ全長（１−６８１番目までの６８１アミノ酸長）と本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列  （８５６アミノ酸長）の１５７番目から８４９番目までのアミノ酸配列（６９３アミノ酸長）とで、約８９．１２％という有意な相同性を有する、配列番号：２に示される塩基配列を有するクローンを取得した（クローン名：ｍｐｍ０３１７５）。
【００１３】
取得したｍｐｍ０３１７５にコードされるポリペプチド（本発明のポリペプチド）のアミノ酸配列は８５６アミノ酸長であり、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０００，  ７，  ２７３−２８１，  ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ０４６８２１）にコードされている蛋白のアミノ酸配列（６９０アミノ酸長）に比較し相同部分を除外すると、Ｎ−末端側に１５６アミノ酸長分の伸長が認められた。得られた「本発明のポリペプチド」のアミノ酸配列について、以下の実施例に記載したようにホモロジー検索を行った結果、今までに出願された配列に対して「本発明のポリペプチド」では、４１１アミノ酸長、  ３５９アミノ酸長、  ２６３アミノ酸長、あるいは２２１アミノ酸長について比較的高いホモロジーが認められた。しかし、それらは本発明の「本発明のポリペプチド」（８５６アミノ酸長）  の全長をカバーするものでなく、部分的な短い配列にホモロジーが認められるのみで、本発明による「本発明のポリペプチド」配列の解明により、ようやく新規配列蛋白とその機能を述べること可能となった。そこで、次にマウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子にコードされているポリペプチドの全長アミノ酸に対し、公共のデータベースを用いてホモロジー検索を行った。
その結果、国際公開番号ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２（発明の名称：  Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２，    Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＨＹＳＥＱ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  １１，  Ｏｃｔ．  ２００１）のＮｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２（４６３アミノ酸長）の２−４１２番目の４１１アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号３７４−８３８番目  （４６５アミノ酸長）とで、比較的高いホモロジーが認められた  （約７７．８５％）。本発明の８５６アミノ酸配列は、公開されたＮｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２  （４６３アミノ酸長）配列に対し、Ｎ−末端側に３７３アミノ酸長の新規配列が付加されている。ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２の  Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列について診断用アミノ酸配列として記載しているのみで、その機能については不明である。４６３アミノ酸長のうちホモロジーの認められる４１１アミノ酸長のアミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチドの８５６アミノ酸配列は長大であり、後に述べるようにその機能についても推定可能で有用である。
また、国際公開番号ＷＯ２０００６５０５４−Ａ２（発明の名称：  Ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６，  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＩＮＣＹＴＥ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：２，  Ｎｏｖ．  ２０００）のＨｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６，  （３５９アミノ酸長）の１−３５９番目の配列（３５９アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号４９８−８５６（３５９アミノ酸長）とで、比較的高いホモロジーが認められた（約９０．８１％）。ＷＯ２０００６５０５４−Ａ２のＨｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６  の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列を用いた各種疾病処置用組成物として記載しているのみで、その機能については不明である。３５９アミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明の８５６アミノ酸配列は，  Ｎ−末端側に４９７アミノ酸長の付加があり長大であり、また、機能についても記載可能で有用である。
また、国際公開番号ＷＯ２００１４０４６６−Ａ２  （発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  ７，  Ｊｕｎ．  ２００１）の  Ｈｕｍａｎ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（２９６アミノ酸長）の１−２６３番目の配列（２６３アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号１６８−４３０（２６３アミノ酸長）の配列とで高いホモロジーが認められた（約９９．２４％）。ＷＯ２００１４０４６６−Ａ２の  Ｈｕｍａｎ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅの出願では、単に分泌蛋白や膜貫通に関係するポリペプチド断片のアミノ酸配列について各種疾病処置用蛋白質として記載しているのみで、その機能については不明である。２９６アミノ酸長のうちホモロジーの認められる２６３アミノ酸長のアミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチドの８５６アミノ酸配列は、Ｎ−末端側に１６７アミノ酸長の付加、及びＣ−末端側に４２６アミノ酸長の付加があり、長大であり、後に述べるようにその機能についても推定可能で有用である。
さらに、米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３２７５３−Ａ１のＨｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＃３１４  （Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  Ｒｏｓｅｎ  ＣＡ，  Ｒｕｂｅｎ，  ＳＭ，  Ｂａｒａｓｈ，  ＳＣ，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  １９，  Ｓｅｐ．  ２００２）の  Ｈｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＃３１４，  ２４４アミノ酸長）の２４−２４４番目の配列（２２１アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号３１−２５１（２２１アミノ酸長）の配列とで高いホモロジーが認められた（約９７．７４％）。ＵＳ２００２１３２７５３−Ａ１のＨｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＃３１４の出願では、単にポリペプチド断片のアミノ酸配列について類似ペプチドの検出やＴＮＦの放出刺激等の生理活性作用の可能性がある蛋白質として記載しているのみで、その機能について詳しく述べられていない。２４４アミノ酸長のうちホモロジーの認められる２２１アミノ酸長のアミノ酸長のアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチドの８５６アミノ酸配列は、Ｎ−末端側に３０アミノ酸長の付加、及びＣ−末端側に６０５アミノ酸長の付加があり、長大であり、後に述べるようにその機能についても推定可能で有用である。
本発明のｍｐｍ０３１７５蛋白質アミノ酸配列（８５６アミノ酸長）について、上記に示したように、今までに出願された配列に対して４１１アミノ酸長、３５９アミノ酸長、２６３アミノ酸長、及び２２１アミノ酸長について比較的高いホモロジーが認められたが、それらは本発明のｍｐｍ０３１７５蛋白質アミノ酸配列  （８５６アミノ酸長）  の全長をカバーするものでなく、一部のより短い配列に関連があるのみで、本発明の長鎖配列の解明により、ようやく新規配列蛋白とその機能を述べること可能となった。
尚、配列番号：２に示される塩基配列を有する本発明のＤＮＡを含むプラスミド（プラスミド表示名：  ｍｐｍ０３１７５）は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１５年４月２８日付けで寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３３１が付されている。
【００１４】
ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子の配列は３，８５１塩基対長であり、コードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは６９０アミノ酸である（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：２７３−２８１，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ１６０１／，  ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ０４６８２１）。ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子ホモログを詳細に研究することにより、Ｎ−末端側にはさらにポリペプチドがコードされている可能性について検証される可能性がある。本発明のＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列の長さは８５６アミノ酸であるが、本発明のＤＮＡに対するホモログについて更に詳細に研究することにより、Ｎ−末端側に更に伸張してポリペプチドがコードされていることを見つける可能性がある。
【００１５】
尚、当業者であれば、本明細書によって初めて開示された配列番号：２に示した塩基配列に基づいてクローンの５’側に適当なプライマー（例えば、配列番号：２の塩基対第６１〜８０番目５’−ＡＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＣＡＣＴＧＧＴ−３に対応させて合成した配列５’−ＡＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴ−３’  ）を調製し、該プライマーと市販されている哺乳動物由来のｍＲＮＡ、あるいは哺乳動物由来組織から調製した哺乳動物由来のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションを行なった後に逆転写反応を行なうことにより本発明のＤＮＡの上流側（遺伝子の５’側）の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片を特異的に合成することができる。合成した５’側の領域を含む新たなｃＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した後、配列番号２の一部分をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来ＫＩＡＡ１６０１遺伝子の全領域を調製することが可能である。あるいは他の方法、例えば、本発明のＤＮＡをプローブとして用いれば、コロニーハイブリダイゼーションのような相同性クローニングによって、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１６０１遺伝子の５’末端領域を調製することができる。
更に、本発明のＤＮＡ配列及び本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている以上、当業者であれば、これらの情報に基づき、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１６０１遺伝子の５’末端領域を容易に取得することができる。又、短い断片や得られた配列に人工的な間違いが起こらないように十分な注意を払いながら、ＲＡＣＥ等のＰＣＲ法を使用することによっても、ヒトを含めた各種哺乳動物由来ＫＩＡＡ１６０１遺伝子の全領域を調製することが可能である。
【００１６】
本発明のＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列から成るものであればいかなるものであってもよい。各種哺乳動物由来の各種臓器、例えば、脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、胸腺、筋肉、骨髄等、あるいは発生の各段階の各種組織・細胞に由来するｃＤＮＡライブラリー等から同定・単離されたｃＤＮＡ、又は、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリー作成に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織、あるいはそれらの細胞質よりｔｏｔａｌＲＮＡ画分またはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって増幅することもできる。
【００１７】
配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：１で示される全アミノ酸配列との相同性の程度が、全体の平均で約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であるアミノ酸配列を意味する。従って、本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列から成るポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１で示されるアミノ酸配列に対して上記の相同性を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを挙げることができる。ここで、実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。又、本発明のポリペプチドには、例えば、配列番号：１で示されるアミノ酸配列中の一部（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１〜３５番目のアミノ酸）のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列、或いはそれらを組み合わせたアミノ酸配列から成り、配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドも含まれる。
【００１８】
更に、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は、該ＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、好ましくは更に配列番号：１で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドと同質の生物学的活性を有するポリペプチド（蛋白質）をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。かかる条件下で、配列番号：２で示される塩基配列において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、約６０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  （ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．  １１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ  Ｎｏ．  １６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、４０℃の０．１ｘＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンブロットハイブリダイゼーションで本発明ヒトＤＮＡプローブにハイブリダイズする程度の条件である。
【００１９】
本発明のＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分等の適当な塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素キット（ギブコＢＲＬ社）等を用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２０】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、当該技術分野で公知の方法に従って作成することができる。例えば、（１）本発明のＤＮＡ又は本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有するＤＮＡ断片を切り出し、（２）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、あるいはＳＶ４０、ＣＭＶウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ウシパピローマウイルスなどの動物ウイルス由来配列を使用した発現ベクター等を利用することができる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、あるいはそれらプロモーターを組み合わせまたは複合させたプロモーターなどが、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＨＳＰプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどが挙げられる。
【００２１】
発現ベクターには、以上の他に、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされた蛋白質を他の蛋白質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、カルモデュリンバインディング蛋白質、及びプロテインＡ等）との融合蛋白質として発現させることも可能である。このような融合蛋白質は、適当なプロテアーゼを使用して切断し、それぞれの蛋白質に分離することができる。
【００２２】
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２由来のＤＨ１（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）），ＪＭ１０３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）），ＪＡ２２１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）），及びＨＢ１０１（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９））、あるいはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｂ株等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４（Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）），２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等が用いられる。動物細胞としては、例えば、サル腎臓細胞由来ＣＯＳ−１，ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞，チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３細胞，ヒトＦＬ細胞、ヒトＨｅｌａ細胞あるいはヒトミエローマ細胞などが用いられる。
【００２３】
これら宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献を参照することができる。Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）；  Ｇｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）；細胞工学別冊８  新  細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及びＶｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）。
【００２４】
このようにして得られた、本発明のＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体は、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常、約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培養は通常、ｐＨ約５〜８に調整された培地を用いて約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、ｐＨは約６〜８に調整された培地を用いて、通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。
【００２５】
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により蛋白質の粗抽出液を得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に蛋白質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こうして得られた本発明のポリペプチド（蛋白質）は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。更に、組換え体が産生する蛋白質を、精製前または精製後に、メチオニンアミノペプチダーゼを用いてＮ−末端メチオニンを除去したり、ミリストイル転移酵素を用いてＮ−末端アミノ酸のミリストイル化を行ったり、アセチルトランスフェラーゼを用いてＮ−末端アミノ酸のアセチル化を行ったり、或いはその他の修飾酵素を用いることにより任意にアミノ酸の修飾を行うことができる。又、Ｃ−末端を修飾するプロセシングカルボキシルペプチダーゼ、Ｃ−末端アミド化酵素等を作用させてＣ−末端アミノ酸を修飾することもできる。更に、トリプシン、キモトリプシン、ＦａｃｔｏｒＸａ、トロンビン、又は、ＫＥＸ２プロテアーゼのような適当な蛋白限定分解酵素を作用させることにより、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド（蛋白質）又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
【００２６】
本発明のポリペプチド（蛋白質）は、Ｃ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ−末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルエステルなどが用いられる。
【００２７】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）がＣ−末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ−末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明の蛋白質には、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ−末端のグルタミン酸残基がピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上にある、例えばＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、ＳＨなどが適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの一部からなるペプチドとしては、前記した本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）の部分ペプチドであって、実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有し、例えば、本発明の組換え蛋白質と実質的に同質の生物学的活性を有するペプチドなどが用いられる。このような部分ペプチドの具体例としては、配列番号：１で示されるアミノ酸配列の中の、Ｎ−末端側にＦＨＡドメイン、ややＣ−末端側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ、及びＣ−末端に膜アンカー領域を有する配列の少なくとも一つの配列を有するもの、又は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において３６番目（メチオニン）〜８５６番目（トリプトファン）の８２１個のアミノ酸から成るポリペプチドを挙げることができる。  又、本発明の部分ペプチドはＣ−末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明の蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２  ）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明の蛋白質と同様に、Ｎ−末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ−末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
【００２９】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）又はその一部からなるペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００３０】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体は、当該技術分野で公知の化学合成方法を用いて調製することもできる。例えば、通常市販されている蛋白質合成用樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、当業界において自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、例えば、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドのようなカルボジイミド類に代表される蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，  ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対照とする酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００３１】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、酸アミド類、ハロゲン化炭化水素類、アルコール類、スルオキシド類、及びエーテル類等、当業界において蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。原料の各アミノ基、カルボキシル基、及びセリン水酸基等の保護基としても、当該技術分野において、通常使用される基を使用することができる。原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００３２】
本発明の一部からなるペプチドまたはそれらの塩は、当該技術分野において自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明の蛋白質を適当な蛋白質限定分解酵素で切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（１）〜（３）に記載された方法が挙げられる。
（１）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、  丸善（株）  （１９７５年）
（２）矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座１、  蛋白質の化学ＩＶ、  ２０５、（１９７７年）（３）矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店。又は、一部からなるペプチドは、例えば、Ｃ−末端から十数残基の配列或いは配列番号：１で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することができる。更に、このような部分ぺプチドは例えば約５０から５００アミノ酸長までの長さの適当な部位のポリペプチド、または約５００アミノ酸長から全長までの長さの適当な場部位のポリペプチドを選択して、組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。
反応後の精製も自体公知の方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００３３】
本発明のポリペプチド（その存在状態は蛋白質である）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩と特異的に結合する抗体は、それらを特異的に認識し得るものであれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のポリペプチド（蛋白質）、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその部分ペプチドを抗原として用い、当業者に公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。このように免疫原として使用できる部分ぺプチドの例として、配列番号１に示される本発明ポリペプチドのＣ末端における十数個〜１００個程度の連続したアミノ酸から成るペプチドを挙げることができる。
例えば、ポリクローナル抗体の場合には、上記抗原を単独、又は、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の適当な担体に結合させて、アジュバントの存在又は非存在下で、例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの適当な動物に対して免疫誘導することによって容易に得ることができる。ポリクローナル抗体は免疫された動物の血清から公知の様々な方法によって回収及び精製することができる。
一方、モノクローナル抗体を製造するためには、例えば、上記の免疫された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、公知の不死化増殖細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等の骨髄腫細胞株）との細胞融合により、ハイブリドーマを作成する。これを更にクローニングし、本発明のポリペプチド等に特異的に認識する抗体を生産しているハイブリドーマのクローンを選別し、該ハイブリドーマの培養液からモノクローナル抗体を回収し精製することによって容易に得ることができる。
尚、合成ペプチドに対する抗体の作製と抗体の精製に関する参考文献として、例えば、新細胞工学実験プロトコル、東大医科学研究所制癌研究部編、秀潤社、１９９３年、２−２−２，合成ペプチドに対する抗体の作製、ｐ２１０−２１７を挙げることができる。
更に、当業者には公知である様々な遺伝子工学的手法により、こうして得られた抗体の抗原決定基等を含む、ヒト化抗体等の各種キメラ抗体も容易に製造することができる。  本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチド（蛋白質）等を検出するために使用することができる。また、これらを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチド（蛋白質）の検出、被検細胞内における本発明のポリペプチド（蛋白質）の挙動の分析などのために使用することができる。
【００３４】
更に、本発明の抗体は、公知の方法による被検液中の本発明のポリペプチド（蛋白質）等の定量、特に、モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ免疫測定法による定量、及び組織染色等による検出などに使用することができる。それによって、例えば、本発明のポリペプチド（蛋白質）等が関与する疾病の診断を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２  、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる本発明の蛋白質等の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、蛋白質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、当該技術分野で公知の、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などを用いることができる。
【００３５】
これらの測定・検出方法に関する一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．  ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、  同書Ｖｏｌ．  ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＰａｒｔＢ））、同書Ｖｏｌ．  ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、  同書Ｖｏｌ．  ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、  同書Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、  同書Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチド（蛋白質）又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡとしては、当該ＤＮＡの塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列の全塩基配列または部分塩基配列と約９５％以上、最も好ましくは１００％の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。又、これらアンチセンスＤＮＡと同様の作用を有する核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡの修飾体）も本発明でいうアンチセンスＤＮＡに含まれる。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００３７】
更に、本発明のポリペプチド（蛋白質）等は、これら物質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、本発明のポリペプチド（蛋白質）、その一部からなるペプチドまたはそれらの塩を用いることを特徴とする、該物質又はそれらの塩の活性を阻害する化合物（以下、「阻害剤」ともいう）のスクリーニング方法、及びその為のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物である。該化合物またはその塩は、本発明の蛋白質等の活性を直接阻害するものであってもよいし、本発明のポリペプチド（蛋白質）等の発現を阻害することによって間接的に本発明のポリペプチド（蛋白質）等の活性を阻害するものであってもよい。該化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。本発明のポリペプチド（蛋白質）等の生物学的活性を阻害する化合物も上記各種疾病に対する治療・予防剤などの医薬として使用できる可能性がある。
【００３８】
本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子をプローブとして使用することにより、ヒトにおける本発明のポリペプチド又はその一部分からなるペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。更に、本発明のＫＩＡＡ１６０１遺伝子に異常があったり、欠損している場合あるいは発現量が減少している場合、生体内において正常な機能を発揮できない患者に対しては、公知手段に従って（１）レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターをベヒクルとして使用する遺伝子治療によって、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を該患者体内に導入し、発現させるか、又は（２）本発明のポリペプチド（蛋白質）等を該患者に注入すること等によって、該患者において本発明の蛋白質等の機能を発揮させることができるものと考えられる。前者の場合、本発明のＤＮＡ又は哺乳動物由来遺伝子を適当なベクターをベヒクルとして使用し、ベクターにのせた形の該ＤＮＡを単独、又は、摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することも可能である。
【００３９】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＣｏｍｍｉｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００４０】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（アミノ酸数：８５６）を示す。
〔配列番号：２〕配列番号：１で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を含む、クローンｍｐｍ０３１７５の全塩基配列（４，５０１塩基対）を示す。
【００４１】
【実施例】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載されている方法に従った。
【００４２】
（１）マウス胎児尾芽由来ｃＤＮＡライブラリーの構築
ａｔｔＢ１部位を有するオリゴヌクレオチド：５’−ＦｇｃＧＣＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣ（Ｔ）１８−３’（Ｆ、ｇおよびｃは、それぞれフルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾Ｇ、フォスフォロチオエイト修飾Ｃ残基を表す）をプライマーとして、マウス胎児尾芽（ＩＣＲマウス受精１１．５日目のＳ１，  Ｓ０，  Ｓ−１，  及びＳ−２に関わる前体節中胚葉及び体節中胚葉）由来ｍＲＮＡを鋳型にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素キット（インビトロジェン社製）で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。これにａｔｔＢ１部位を有するアダプターをｃＤＮＡにライゲーションした。その後、アガロースゲルで１ｋｂ−２ｋｂ、２ｋｂ−３ｋｂ、３ｋｂ−４ｋｂ、４ｋｂ−５ｋｂ、と５ｋｂ−７ｋｂにｃＤＮＡをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたａｔｔＰ  ｐＳＰＯＲＴ−１エントリーベクター（インビトロジェン社製）にＢＰ反応により移し換えた後、大腸菌ＥｌｅｃｔｏｒｏＭａｘ  ＤＨ１０Ｂ株（インビトロジェン社製）にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した１０６個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、３７℃で２−３時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、ＬＲ反応によりａｔｔＲ  ｐＢＣデスティネーションベクター（インビトロジェン社製）にｃＤＮＡを移し換えた。このプラスミドを精製後、ＤＨ１０Ｂ株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を２−３回繰り返した。最後に各分画ごとにＤＨ１０Ｂ株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法  （Ｎｕｃｒｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９，  ｅ２２  （２００１）およびＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．９，  ４７−５７（２００２））に従った。
次に、全ての画分に含まれる約１６，６０８個のクローンの３’末端ＤＮＡ配列を決定した。この中から、ヒトＫＩＡＡ１６０１に相同性が高いクローンのｃＤＮＡに関して全塩基配列の決定を行なった。配列決定には、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００）と同社製反応キットを使用した。大部分の配列はショットガンクローンをダイターミネーター法を用いて決定した。一部の塩基配列については、決定した塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、プライマーウォーキング法で決定した。
【００４３】
（２）ホモロジー検索による本発明ＤＮＡを含むクローンの決定
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、ＤＮＡ解析プログラム（Ｆａｓｔａ  ＆  Ｂｌａｓｔ）を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンｍｐｍ０３１７５が見出された。更に、別のＤＮＡ解析プログラム（ＢＥＳＴＦＩＴ）を用いて、このクローンｍｐｍ０３１７５とヒトＫＩＡＡ１６０１のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、アミノ酸配列のレベルでは、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子がコードするアミノ酸配列（６９０アミノ酸長）のほぼ全長（１−６８１番目，６８１アミノ酸長）と本発明の配列番号：１で示されるアミノ酸配列  （８５６アミノ酸長）の１５７番目から８４９番目までの６９３アミノ酸長の配列について、約８９．１２％のホモロジーを示すことが判明した。
公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に関するデータベースを検索すると、複数の報告があったが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全体をカバーする報告はなかった。詳しくには、次に示す公開されたポリペプチドのアミノ酸配列に対し、本発明のポリペプチド８５６アミノ酸長のポリペプチドアミノ酸配列塩基配列は長く、新規配列の付加が認められた。
１）国際公開番号ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２（発明の名称：  Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２，    Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＨＹＳＥＱ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  １１，  Ｏｃｔ．  ２００１）のＮｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２（４６３アミノ酸長）の２−４１２番目の４１１アミノ酸長のアミノ酸配列と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号３７４−８３８（４６５アミノ酸長）とで、比較的高いホモロジーが認められた  （約７７．８５％）。
２）国際公開番号ＷＯ２０００６５０５４−Ａ２（発明の名称：  Ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６，  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＩＮＣＹＴＥ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：２，  Ｎｏｖ．  ２０００）のＨｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６，  （３５９ａアミノ酸長）の１−３５９番目の配列（３５９アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号４９８−８５６（３５９アミノ酸長）とで、比較的高いホモロジーが認められた（約９０．８１％）
３）国際公開番号ＷＯ２００１４０４６６−Ａ２  （発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  ７，  Ｊｕｎ．  ２００１）の  Ｈｕｍａｎ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  （  ２９６アミノ酸長）の１−２６３番目の配列（２６３アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号１６８−４３０（２６３アミノ酸長）の配列とで高いホモロジーが認められた（約９９．２４％）
４）米国特許出願公開番号ＵＳ２００２１３２７５３−Ａ１のＨｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＃３１４  （Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  Ｒｏｓｅｎ  ＣＡ，  Ｒｕｂｅｎ，  ＳＭ，  Ｂａｒａｓｈ，  ＳＣ，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  １９，  Ｓｅｐ．  ２００２）の  Ｈｕｍａｎ  ｎｏｖｅｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＃３１４，  ２４４アミノ酸長）の２４−２４４番目の配列（２２１アミノ酸長）と、本発明のポリペプチド（８５６アミノ酸長）の一部のアミノ酸配列、すなわち配列番号３１−２５１（２２１アミノ酸長）の配列とで高いホモロジーが認められた（約９７．７４％）。
本発明のｍｐｍ０３１７５蛋白質アミノ酸配列（８５６アミノ酸長）について、上記に示したように、今までに出願された配列に対して４１１アミノ酸長、３５９アミノ酸長、２６３アミノ酸長、あるいは２２１アミノ酸長について比較的高いホモロジーが認められたが、それらは本発明のポリペプチドアミノ酸配列  （８５６アミノ酸長）  の全長をカバーするものでなく、一部のより短い配列に関連があるのみであった。
【００４４】
公開された遺伝子の塩基酸配列に関するデータベースを検索すると、本発明のｍｐｍ０３１７５塩基配列（４，５０１塩基長）の一部の配列とホモロジーを有する部分配列について複数の報告があったが、配列全体をカバーする報告はなかった。詳しくには、次に示す公開された塩基配列に対し、本発明の４，５０１塩基長の塩基配列は長く、新規配列の付加が認められた。
１）国際公開番号ＷＯ２００１４０４６６−Ａ２  （発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  ７，  Ｊｕｎ．  ２００１）  のＨｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ＰＲＯ  ３５７７  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（２，６９８塩基長）の配列番号１４６−１，５３５（１，３９０塩基長）と本発明の塩基配列（４，５０１塩基長）  の一部（配列番号８−１，３９９，  １，３９２塩基長）とで、約９２．５４％という比較的高いホモロジーが認められた。
２）国際公開番号ＷＯ２０００６５０５４−Ａ２  （発明の名称：Ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６  ｃＤＮＡ，  Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＩＮＣＹＴＥ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：２，  Ｎｏｖ．  ２０００）のＨｕｍａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＵＭＡＰ−１６  ｃＤＮＡ  （１，９２３塩基長）  の配列番号２０−１，５４５（１，５２６塩基長），及び１，５７２−１，９１３番目の配列（３４２塩基長）と、本発明の塩基配列（４，５０１塩基長）の一部の配列、すなわち配列番号１，４５１−２，９７５（１，５２５塩基長）と配列番号２，９７８−３，３２３（３４６塩基長）とで、それぞれ約９０．０４％、約９０．２６％という比較的高いホモロジーが認められた。
３）国際公開番号ＷＯ２００１７５０６７−Ａ２  （発明の名称：  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２  （Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：    ＨＹＳＥＱ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：  １１，  Ｏｃｔ．  ２００１）の  Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＃３６６２（１，３９６塩基長）の１２４−１，３９６番目の配列（１，２７３塩基長），及び２４−１１９番目の配列（９６塩基長）と、本発明の塩基配列（４，５０１塩基長）の一部の配列、すなわち配列番号１，５１０−２，７８０（１，２７１塩基長）と配列番号１，２４８−１，３４３（９６塩基長）とで、それぞれ約８８．３８％、９３．７５％というやや高いホモロジーが認められた。
４）国際公開番号ＷＯ２０００２１９９１−Ａ１（発明の名称：  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３３  （Ａｐｐｌｉｃａｎｔ：  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＩＮＳＴ  ＩＮＣ．，  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄａｔｅ：２０，  Ａｐｒ．  ２０００）の  Ｈｕｍａｎ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３３  （４４２塩基長）  の配列番号２２−４３５（４１４塩基長）と本発明の塩基配列（４，５０１塩基長）の一部列番号１，１８４−１，５９７，  ４１４塩基長）とで、約９２．５１％という比較的高いホモロジーが認められた。
１）、２）、３）及び４）については、ｍｐｍ０３１７５塩基配列（４，５０１塩基長）と比較すると、上記に示すように、１，３９０塩基長、１，８６８塩基長（１，５２６塩基長と３４２塩基長を関連させて計算）、１，３６９塩基長（１，２７３塩基長と９６塩基長を関連させて計算）、及び４１４塩基長について比較的高いホモロジーが認められた。しかし、それらの配列はいずれも本発明のｍｐｍ０３１７５遺伝子配列  （４，５０１塩基長）  の全長をカバーするものでなく、全長の長さが違うが、部分的に相同配列を含む関係にあり、１）、２）、３）及び４）の配列と本発明の遺伝子の配列は、断片的に比較的高いホモロジーが認められるものの全く異なる新規な配列と判断される。
【００４５】
以上のホモロジー検索の結果から、候補クローンｍｐｍ０３１７５はヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子と高いホモロジーを示し、かつヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子に対し新規配列が付加された構成となっていること、また、部分的には類似遺伝子が存在するが全長については既知配列の例がない、全く新規遺伝子であることが判明した。
【００４６】
（３）モチ−フ検索
本発明のＤＮＡに関して、ＰＲＯＳＩＴＥ  ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムであるｐｆｔｏｏｌｓ  （Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ，  Ｂｕｃｈｅｒ  Ｐ，  Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｋ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ＡｃｉｄｓＲｅｓ．  １９９７  Ｊａｎ  １；２５（１）：２１７−２１）、及びＰｆａｍ  ｄａｔａｂａｓｅを検索するための蛋白質解析プログラムｈｍｍｅｒ  ２．１（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，  Ｅ．  Ｌ．  Ｌ．，  Ｅｄｄｙ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｂｉｒｎｅｙ，  Ｅ．，  Ｂａｔｅｍａｎ，Ａ．，  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，  Ｒ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９８；  ２６，  ３２０−３２２）を用いてモチ−フ検索を行なった  （Ｓｕｙａｍａ  ｅｔ．  ａｌ．  １９９９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２７：  ３３８−３３９）。
Ｃ−末端に認められる膜アンカー領域についてはＳＯＳＵＩ（Ｈｉｒｏｋａｗａ，  Ｔ．，  Ｂｏｏｎ−Ｃｈｉｅｎｇ，  Ｓ．，  Ｍｉｔａｋｕ，  Ｓ．，    Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．，  １９９８，  １４：  ３７８−９，  ＳＯＳＵＩ：  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）という汎用ｔｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅ（ＴＭ）ｓｅｇｍｅｎｔ検索用プログラムにより検索して得られた、配列番号：１に示されるアミノ酸配列におけるＣ−末端の８３２−８５４番目のＩＬＱＰＶＰＡＶＦＩＧＬＦＬＡＦＬＦＷＣＦＧＰをいう。この配列は、ヒトＫＩＡＡ１６０１蛋白質のＣ−末端に認められる膜アンカー領域及び、ウサギ心臓由来ＳＬＡＰ（Ｗｉｇｌｅ  ＪＴ，  Ｄｅｍｃｈｙｓｈｙｎ  Ｌ，  Ｐｒａｔｔ  ＭＡ，  Ｓｔａｉｎｅｓ  ＷＡ，  Ｓａｌｉｈ  Ｍ，  Ｔｕａｎａ  ＢＳ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２：３２３８４−３２３９４）  のＣ−末端に認められる膜アンカー領域の各々の配列について調べたところアミノ酸レベルのホモロジーは認められなかった。すなわち、これら類似する３つのポリペプチドのＣ−末端配列は、ホモロジーは認められないが、それら全ての配列は疎水性が高く膜結合領域となっていることに重要な意味があると考えられた。
本発明の遺伝子に関連するヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は６９０アミノ酸長であり、Ｃ−末端側に膜アンカー領域を有し、その内側にトロポミオシン様ドメイン、Ｐｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメイン（Ｈａ，  Ｈ．，  Ａｂｅ，  Ｋ．，  Ａｒｔｚｔ，  Ｋ．，    Ｇｅｎｅ，  １９９１，  １０７：３４５−３４６，    Ｓｈａｎ，ｇ  Ｈ．Ｓ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｔａｎ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｗｕ，  Ｍ．，  Ｇｅｎｅ，  １９９４，  １５１：１９７−２０１）が認められた。本発明のポリペプチドで認められたＰｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメインでは、いわゆるＫＥ２ファミリーに特徴的な配列に比較すると重要な部分に数個アミノ酸配列欠失の繰り返しがみられ少々異なる構造をとっていたが、近辺にＫＥ２ファミリーに特徴的であるＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフが存在することが確認出来た。本発明のＤＮＡは、４，５０１塩基対あり、８５６個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしている。本発明のＤＮＡがコードするポリペプチドのアミノ酸配列には、８５６アミノ酸長とヒトＫＩＡＡ１６０１と比較し１６７アミノ酸長く、Ｃ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＰｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメインが認められるのみならず、下記に示すようにそれらのドメイン近辺にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が存在すること、Ｎ−末端側に１６７アミノ酸伸張しているポリペプチド配列には、ＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する、今までにない構成であることを新たに見出した（図１）。
詳しくは、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から６２−１２０番目にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが、更にＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＮ−末端側から６３−１２０番目にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが、また、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によっても、配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうち６３−１４１番目にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインが見出された。
また、ＨＭＭＰｆａｍ検索法によると配列番号：１に示されるアミノ酸配列のうちＣ−末端側に５７６−６６９番目に  Ｐｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎ配列が見出された。
更に、配列番号：１に示されるアミノ酸配列の６８６−７１４番目にＬＱＧＥＬＥＫＬＫＫＥＷＤＶＬＥＴＥＣＨＳＬＫＫＥＮＶＬＬというＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフを含む配列（Ｔｈｅ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｍｏｔｉｅｆ  ｗｈｅｒｅ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｉｓ  ｆｏｕｎｄ  ｅｖｅｒｙ  ｓｅｖｅｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，  Ｗｉｇｌｅ，Ｊ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２：３２３８４−３２３９４）、及び７３５−７５６番目にも  ＬＴＳＤＬＳＩＬＱＭＴＲＫＥＬＥＫＱＶＧＳＬというＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフを含む配列（Ｔｈｅ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｍｏｔｉｅｆ  ｗｈｅｒｅ  ａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｉｓ  ｆｏｕｎｄ  ｅｖｅｒｙ  ｓｅｖｅｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，  Ｗｉｇｌｅ，Ｊ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２：３２３８４−３２３９４）が、今回の配列検索の結果により合計２ヶ所で見出された。
本発明のｍｐｍ０３１７５遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｃ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＰｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメインが認められるのみならず、その近辺にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が２ヶ所存在すること、Ｎ−末端側に１６７アミノ酸伸張しているポリペプチド配列には、ＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する、今までにない構成であることを見出し、このことにより補強された強力な機能を推定することが可能となった。
【００４７】
（４）ｍＲＮＡレベルでの発現頻度
ｍＲＮＡレベルでのヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子の発現頻度については、心臓において高く、脳においてやや高く、腎臓において少し高い発現量が認められた。さらに、調べた限り全ての臓器、組織において普遍的に発現が認められた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ１６０１／、ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：２７３−２８１）。これらの知見をもとに、本発明の遺伝子の一つであるマウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現頻度について、ＲＴ−ＰＣＲ法によりマウスにおける同遺伝子の組織特異的及び発生段階特異的発現を解析した。マウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子の転写産物をＰＣＲ法で増幅して検出するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を５’−  ＣＡＧＴＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡ−３’（配列番号：３）、リバースプライマーの配列を５’−  ＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡ  −３’（配列番号：４）とし、それらのプライマーを用いてマウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子の転写産物をＲＴ−ＰＣＲ法で増幅すると、約５３７ｂｐＤＮＡ断片が得られる設計にした。マウス各組織から調製されたｍＲＮＡを材料とし、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）により１ｓｔストランドｃＤＮＡ  まで調製が終了しているＣｌｏｎｔｅｃｈ社製のＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＃Ｋ１４２３−１，  ＃Ｋ１４３０−１）を用い、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社が示す方法により以下のようにして解析を行った。すなわち、各マウス組織１ｓｔストランドｃＤＮＡと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてＰＣＲを行い、マウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子の転写産物のうち約５３７ｂｐＤＮＡ長のＤＮＡ断片の増幅を図った。ＰＣＲは、ＴａｑポリメラーゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝酒造，  ＃ＲＰ００１Ａ）を用い、上述のＤＮＡ混合液を９５°Ｃ（２．５分）で加熱した後、９５°Ｃ（３０秒）／５７°Ｃ（３０秒）／７２°Ｃ（３０秒）のサイクルを３５回繰り返して行った。コントロールとしてＣｌｏｎｔｅｃｈ社が提供するＧ３ＰＤＨプライマー（＃５４０６−１）を使用したＧ３ＰＤＨ転写産物由来約９３８ｂｐＤＮＡ断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたＰＣＲ産物を、サイズマーカーとともに２％  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製、＃５００７０）を用いて電気泳動で分画し、分画したＰＣＲ産物の量を半定量的に比較した（図２）。その結果、マウスＫＩＡＡ１６０１遺伝子に由来する約５３７ｂｐＤＮＡ断片が特異的に増幅され、調べた限りの全ての臓器、全ての発生過程にて発現していることが確認された。より詳しくには、精巣において強い、心臓に於いてやや強い濃さの、子宮と眼に於いて少し濃い、脳に於いてやや薄いバンドとして、また、調べたその他の臓器、組織について、すなわち脾臓、肺、骨格筋、肝臓、腎臓、骨髄、リンパ節、平滑筋、前立腺、胸腺においては全て中程度の濃さのバンドとして検出された。また、発生の過程では７日目、１１日目、１５日目、１７日目の全過程において中程度の濃さのバンドとして検出された。
尚、図２において、下段のＧ３ＰＤＨはコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現パターンを示す。従って、以上の結果から、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドは精巣、心臓、子宮、眼をはじめ各種臓器に普遍的に、あるいは発生の全過程に発現が認められ、これにより関連する臓器、組織の発生・分化や機能保全に関わっているといえる。
【００４８】
（５）本発明遺伝子の機能推定
本発明のポリペプチド（全長が８５６アミノ酸長）は、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子がコードするポリペプチドのＮ−末端側に対し１６７アミノ酸長の新規アミノ酸配列が付加した、より長い新規なアミノ酸配列といえる。ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子にコードされるポリペプチドには、トロポミオシン様ドメイン、Ｐｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメイン、膜アンカー領域が見出されていた。
一方、膜結合型の酸性・両親媒性α−ヘリックス蛋白質のファミリーに分類されるＳａｒｃｏｌｅｍｍａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （ＳＬＡＰｓ）について、ウサギ心臓由来ＳＬＡＰ遺伝子の解析がなされ、同ＳＬＡＰ遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列上には、膜アンカー領域に加えてＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  の存在が確認され、同遺伝子を用いた実験結果から、ＳＬＡＰｓは筋肉等の細胞膜上で脱分極、あるいは膜チャンネルによる情報伝達、膜輸送に関わる可能性について報告がなされていた（Ｗｉｇｌｅ  ＪＴ，  Ｄｅｍｃｈｙｓｈｙｎ  Ｌ，  Ｐｒａｔｔ  ＭＡ，  Ｓｔａｉｎｅｓ  ＷＡ，  Ｓａｌｉｈ  Ｍ，  Ｔｕａｎａ  ＢＳ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２：３２３８４−３２３９４）。ウサギＳＬＡＰ蛋白（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＡ６５５９７，６３９アミノ酸長）と本発明のマウスｍｐｍ０３１７５遺伝子コードされるポリペプチドのアミノ酸レベルのホモロジーはやや高い（約８１．８７％）。しかし、ウサギＳＬＡＰ蛋白とマウスｍｐｍ０３１７５遺伝子コードされるポリペプチドを比較すると、ウサギＳＬＡＰが６３９アミノ酸長であるのに対し、８５６アミノ酸長とＮ−末端部分で１６７アミノ酸長分だけ長いことが明らかとなった。更に、ウサギ心臓由来ＳＬＡＰ遺伝子がＣ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が配置された構成であるのに比較し、マウスｍｐｍ０３１７５遺伝子コードされるポリペプチドは、Ｃ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が配置されているのみならず、Ｎ−末端側に１６７アミノ酸伸張しているポリペプチド配列にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有する、今までにない構成であることが判明した。ウサギ心臓由来ＳＬＡＰ遺伝子にコードされる蛋白質の研究から、ＳＬＡＰ蛋白質は、Ｃ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が配置された構成で、ＳＬＡＰ遺伝子転写産物は複数の類似したｍＲＮＡｓとして検出されること、また、ＳＬＡＰ蛋白質はニワトリの視覚神経のＴＯＰ−ＡＰ  （Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ  ｇｒａｄｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）にアミノ酸レベルで７６％のホモロジーを有し、ＴＯＰ−ＡＰが神経のガイダンスあるいは網膜蓋のマップ形成に関与するとされていることから（Ｗｉｅｌｏｗｉｅｙｓｋｉ  ＰＡ，  Ｓｅｖｉｎｃ  Ｓ，  Ｇｕｚｚｏ  Ｒ，  Ｓａｌｉｈ  Ｍ，  Ｗｉｇｌｅ  ＪＴ，  Ｔｕａｎａ  ＢＳ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０００，  ２７５：３８４７４−３８４８１  ）、ＳＬＡＰ蛋白質のみならず、マウスｍｐｍ０３１７５遺伝子コードされるポリペプチドについても、細胞膜にＣ−末端で結合して神経、筋肉等の細胞膜上で脱分極、あるいは膜チャンンネルによる情報伝達、膜輸送、あるいは神経のガイダンス等に関わる可能性が高いと推察された。
本発明のｍｐｍ０３１７５遺伝子にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列には、そのＮ−末端側にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）を有する。ＦＨＡドメインは、リン酸化ペプチド認識領域であり複数の制御蛋白で認められ、近年になってようやくリン酸化に依存した蛋白−蛋白相互作用に関わる重要なドメインであることが解明された（Ｈａｍｍｅｔ．  Ａ．，  Ｐｉｋｅ，  Ｂ．．Ｌ，  ＭｃＮｅｅｓ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｃｏｎｌａｎ，  Ｌ．Ａ．，  Ｔｅｎｉｓ，  Ｎ．，  Ｈｅｉｅｒｈｏｒｓｔ，  Ｊ．，  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ．，  ２００３，  ５５：２３２−７）。ＦＨＡドメインは、８つのβ−ｓｈｅｅｔが折れたたまれたサンドイッチ構造に特徴的があり、その構造はリン酸化スレオニン含有ペプチド部位（ｐ−Ｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を認識する。また、リン酸化チロシンに対しても比較的高いアフィニティを有する。活性化蛋白質でリン酸化スレオニンエピトープを有する状態が存在するものとして、キナーゼ、ホスファターゼ、キネシン転写因子、ＲＮＡ−結合蛋白、及び代謝酵素といった生体内の調節に関わる蛋白質が知られている。それら重要蛋白質がリン酸化され活性化されている状態になっていることを、検知する役目としてＦＨＡドメインが関わっている（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｄ．  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｓ．Ｐ．，  ２００２，  ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ，  ５１３：５８−６６）。更に、ＦＨＡドメインはリン酸化ペプチドと結合しシグナル伝達等に関与することから、本発明のポリペプチドはシグナル伝達、小胞膜輸送、細胞内蛋白質分解といった細胞膜上の重要な機能に係わっていることは明らかである。本発明のマウスｍｐｍ０３１７５遺伝子コードされるポリペプチドのアミノ酸配列には、ＳＬＡＰ蛋白質に認められるＣ−末端部分に膜アンカー領域とその内側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が配置された構成だけでなく、更に、Ｎ−末端側にＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有することにより、それら機能を互いに強化していると推定される。
また、ＳＬＡＰｓやＫＩＡＡ１６０１の組織特異的発現パターンから、発現本発明のｍｐｍ０３１７５遺伝子にコードされるポリペプチドは、心臓血管、神経、精巣、子宮、眼等における細胞の重要な機能に係わっていると類推される。これらから、本発明のＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒモチーフ  及び膜アンカー領域を有するポリペプチドは、主に細胞膜上にあって心臓血管、神経、眼、筋肉等の細胞膜上で脱分極、あるいは膜チャンンチャネルによる情報伝達、膜輸送、あるいは神経のガイダンス等に関わる、例えば神経細胞の軸索突起の伸張作用を調節することができる蛋白質と推定された。これらを総合すると、本発明のポリペプチドは小胞による分泌、細胞の突起伸張、細胞の接着及び機能の発現、あるいは細胞の運動や移動といった細胞の重要なプロセスを担う新規蛋白質であり、それら重要機能に関わる各種臓器における生体内の複合蛋白質の中心をなしているといえる。
【００４９】
これまでに、膜アンカー領域とその内側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が存在し、Ｎ−末端側には、ＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有するポリペプチドについては報告がない。また、これら膜アンカー領域とその内側にＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  が存在し、Ｎ−末端側には、ＦＨＡ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ドメインを有するアミノ酸配列をコードする本発明の遺伝子配列は、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析の結果精巣において高く、心臓に於いてやや高く、子宮と眼において少し高いが脳に於いてやや弱く、調べた限りの全ての臓器、組織で発現が認められること、また、発生の全過程に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードする蛋白質が全組織に於いて細胞の増殖・分化を制御する重要な働きに関わっている可能性が示された。
本発明の新規ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に精巣、心臓において強く、子宮、眼においてやや強く発現していることを特徴とする、新規なＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  及び膜アンカー領域  を有する蛋白質であり、それら組織に於いて発育、機能保全、あるいは全身の臓器に関わる病態  （例えば癌化・老化・機能不全）  解明、それによる予防薬、治療薬、検査薬の開発に有用であることが明らかで、それが本発明の優れた点である。また、本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる点が優れている。
【００５０】
ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現について調べられ、心臓において高く、脳においてやや高く、腎臓において少し高い発現量が認められること、また、発生の全過程に於いて発現していることが認められた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｈｕｇｅ／ｇｆｐａｇｅ／ＫＩＡＡ１６０１／、ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，７：２７３−２８１）。しかし、本発明のｍｐｍ０３１７５遺伝子は、精巣、心臓において強く、子宮、眼においてやや強く発現していること、また各種臓器、組織に普遍的に発現量していること、発生の各段階全てにおいて発現量していることから、特に精巣、心臓、子宮、眼において、また、各種臓器において、発育、機能保全、あるいは各種臓器における癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や老化あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療薬、検査薬の開発に有用である。本発明の組換え蛋白質、あるいは組換え蛋白質を発現する組換え体を利用することにより、アゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングあるいはドラッグデザイン研究に利用できる。
【００５１】
このように細胞の増殖・分化や老化に極めて重要なＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  、及び膜アンカー領域を有するポリペプチドをコードする遺伝子は、それ自身も直接疾患原因遺伝子となりうる。
本発明のポリペプチドにはＮ−末端に付加されたＦＨＡドメインが特徴となっているが、このＦＨＡドメインについては、以下の疾患原因となりうることが知られている。例えば、ＣＨＫ２という細胞周期のチェックポイントに重要な蛋白質については、ＦＨＡドメインの配列中に変異が入ることで、癌が生じることが報告された（Ｐｅｎｇ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．Ｌ．，    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００３，  ２７８：８８７３−８８７６）。更に、ＦＨＡドメインを有するＮＦＢＤ１  （ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ＢＲＣＴ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）やＭＤＣ１  （ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）といった蛋白質についても、これらの分子の機能喪失によりやはり細胞周期に異常をきたしたりＤＮＡ  ダメージのチェックポイントが損なわれたりすることも判明した（Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｇ．Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｂ．，  Ｂｉｇｎｅｌｌ，  Ｃ．Ｒ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ａ．Ｍ．，  Ｅｌｌｅｄｇｅ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００３，  ４２１：９６１−９６６）。これらのことからＦＨＡドメインを有する分子は特に精巣、心臓、子宮、眼において、また、各種臓器において、細胞周期を通して細胞の生存にとって極めて重要な役割をする分子と言え、この分子の変異、機能不全、機能低下は各種臓器における癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や老化あるいは先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患に関わると容易に推察できる。
Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  及び膜アンカー領域を有するヒトＳＬＡＰ遺伝子及びヒトＫＩＡＡ遺伝子の染色体上のローカスは３ｐ２１．２−１４．３であった（Ｗｉｇｇｌｅｓ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｄｅｍｃｈｙｓｈｙｎ，  Ｌ．，  Ｐｒａｔｔ，  Ｍ．Ａ．，  Ｓｔａｉｎｅｓ，  Ｗ．Ａ．，  Ｓａｌｉｈ，  Ｍ．，  Ｔｕａｎａ，  Ｂ．Ｓ．，  １９９７，    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：３２３８４−９４，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｃｍｄ＝Ｄｉｓｐｌａｙ＆ｄｏｐｔ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝１００４７２７６）。３ｐ２１．２−１４．３を含む３番染色体短腕上には、乳癌、肺癌を含む各種癌の原因遺伝子がマップされている（Ａｌｉ，  Ｉ．  Ｕ．，  Ｌｉｄｅｒｅａｕ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｃａｌｌａｈａｎ，  Ｒ．，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  １９８９，  ８１：１８１５−１８２０，    Ｈｉｂｉ，  Ｋ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｙａｍａｋａｗａ，  Ｋ．，  Ｕｅｄａ，  Ｒ．，  Ｓｅｋｉｄｏ，  Ｙ．，  Ａｒｉｙｏｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｓｕｙａｍａ，  Ｍ．，  Ｔａｋａｇｉ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｔ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １９９２，  ７：４４５−４４９）。これにより、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  及び膜アンカー領域を有する本発明のポリペプチドは、乳癌、肺癌を含む各種癌の原因となる可能性が高い。
これらの知見から、本発明のＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ及び膜アンカー領域を有するポリペプチドに関わるＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む遺伝子、該ＤＮＡにコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドを含む組換え蛋白質については、それらが各種臓器に普遍的に細胞の増殖あるいは分化の調節などに、また、それら臓器の機能保全や老化に関わる病態の解明に関わることが強く示唆される。
【００５２】
【発明の効果】
ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子にコードされているポリペプチドは６９０アミノ酸長と短く、その機能を類推するモチ−フ構造が限られているため、その機能の推定も限られたものであった。今回、本発明者はマウス胎児尾芽由来のｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＫＩＡＡ１６０１遺伝子に高いホモロジーを示す遺伝子（ＤＮＡ）をクローニングし、Ｎ−末端側に新たにＤＮＡ配列が付加されている新規ＤＮＡ配列を取得することに成功した。その新規ＤＮＡ配列にコードされるポリペプチドは８５６アミノ酸長と長く、また、そのポリペプチドは、ややＣ−末端側に認められるＬｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ  をはさんで、Ｎ−末端側にＦＨＡドメイン、Ｃ−末端に及び膜アンカー領域を有する従来にはない構成で、細胞の突起伸張、細胞の接着と機能の発現、あるいは細胞の運動や移動といった細胞の重要なプロセスに関係すると推定された。更に本発明の遺伝子配列は、脳においては発現量が比較的低いこと、また、発生の全過程に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードする蛋白質が全組織に於いて細胞の増殖・分化を制御する重要な働きに関わっている可能性が示された。
【００５３】
これまでに記載したことから、本発明のＤＮＡ、本発明のポリペプチドあるいは本発明の抗体は、癌・自己免疫疾患・アレルギーのような細胞の増殖に関わる疾患や先天奇形など分化異常を含めたヒト疾患の機序解明及び診断・治療上、また、各種臓器の機能保全や老化の防止に必要不可欠な役割を果たすと考えられる。また、ｍＲＮＡレベルでの発現頻度解析のよる各組織及び発生段階での発現のパターン情報は、各種臓器に普遍的に発現していること、及び各発生過程に於いて普遍的に発現していることを明らかとし、本発明の遺伝子が各種臓器の発生・分化やその機能保全また老化において重要性であること明らかにした。
従って、本発明のＤＮＡ及び該ＤＮＡを含む哺乳動物由来遺伝子、それらがコードするポリペプチドの一部又は全長、該ポリペプチドの一部又は全長に対する抗体、アンチセンスＤＮＡ等は、癌や先天奇形を含めたヒト疾患を治療する為のモデル動物であるマウスを用いた各種治療・予防方法開発において、医薬として使用することが可能である。
【００５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドに新規に認められたＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ及び膜アンカー領域を有する新規ポリペプチドを示す（ａａ：  アミノ酸配列で数字はアミノ酸数、ボックス：上から、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、ＨＭＭＳｍａｒｔ検索法、またＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法、Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ｍｏｔｉｆ検索法、ＳＯＳＵＩ検索法といった異なった検索法にて同定したＦＨＡドメイン、Ｐｒｅｆｏｌｄｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＫＥ２  ｐｒｏｔｅｉｎドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒモチーフ及び膜アンカー領域を示す）。
これらの結果から、ＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎ検索法、ＨＭＭＰｆａｍ検索法、及びＨＭＭＳｍａｒｔ検索法Ｌｅｕｃｉｎｅ  Ｚｉｐｐｅｒ  Ｍｏｔｉｆ検索法、ＳＯＳＵＩ検索法により、ＦＨＡドメイン、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  モチーフ  及び膜アンカー領域  を有するドメインを、それぞれ新たに同定した。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ法によるｍｐｍ０３１７５（マウスＫＩＡＡ１６０１）遺伝子のマウス各組織、及び各発生段階における発現強度の比較。上段の２つの写真はｍｐｍ０３１７５遺伝子の発現強度、下段はコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子（Ｇ３ＰＤＨ）の発現強度を、アガロース電気泳動で分画した後のエチジウムブロミド染色パターンについての写真で示す。
【図１】
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【図２】
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