(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｂ型肝炎やＣ型肝炎等のウイルス感染症等の予防・治療、腫瘍の治療等に有効なＩ型インターフェロンの産生を制御する、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に結合する性質を持つ新規アダプタータンパク質およびその遺伝子を提供する。【解決手段】新規アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、ヒト由来の特定のアミノ酸配列からなり、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質と、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質とを併せ持つ。上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体は、ＴＩＲドメインを有していれば、同様の性質を持つ。また、遺伝子は、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１をコードする遺伝子である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち３９４〜５３２番目のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち３９６〜５３４番目のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質と、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質とを併せ持つタンパク質。
【請求項５】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を持つ一方、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質に異常を持つタンパク質。
【請求項６】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質を持つ一方、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも４３４番目のアミノ酸が置換又は欠失され、かつ、３９４〜５３２番目のアミノ酸配列の少なくとも一部を保持している請求項６記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
ｃＤＮＡであって、配列番号１に示される塩基配列のうち、６３〜２１９８番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項８記載の遺伝子。
【請求項１０】
ｃＤＮＡであって、配列番号３に示される塩基配列のうち、６６〜２２６１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項８記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質に対して特異的に結合する抗体。
【請求項１３】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含むウイルス感染症の予防・治療剤。
【請求項１４】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含む腫瘍の治療剤。
【請求項１５】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを有効成分として含むウイルス感染症の予防・治療剤。
【請求項１６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを有効成分として含む腫瘍の治療剤。
【請求項１７】
請求項６または７に記載のタンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患の治療剤。
【請求項１８】
請求項６または７に記載のタンパク質を有効成分として含むアトピー性疾患の治療剤。
【請求項１９】
請求項６または７に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを有効成分として含む自己免疫疾患の治療剤。
【請求項２０】
請求項６または７に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを有効成分として含むアトピー性疾患の治療剤。
【請求項２１】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を有効成分として含む自己免疫疾患の治療剤。
【請求項２２】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を有効成分として含むアトピー性疾患の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に結合してＩ型インターフェロンの産生を誘導しうる性質を持つ新規アダプタータンパク質およびその変異体、並びにそれをコードする遺伝子、その用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
インターフェロンは、ウイルスに対する適応免疫応答において重要な役割を果たすタンパク質である。
【０００３】
前述したように、インターフェロンは、適応免疫系において重要な役割を果たしており、適応免疫系におけるインターフェロンの役割については詳細な研究がなされている。しかしながら、病原体に対する免疫応答の際に、生体内でインターフェロンがどのようなシグナル伝達経路を介して産生されるかについてはほとんど解明されていなかった。
【０００４】
最近、哺乳動物の自然免疫系において病原体を認識する受容体としてＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、適宜「ＴＬＲ」と略記する）が発見され、このＴＬＲに関する研究により、自然免疫系における病原体の認識に係わるシグナル伝達経路が明らかにされつつある。
【０００５】
哺乳動物のＴＬＲファミリーは、ショウジョウバエとヒトとの種の違いを越えて保存されていると考えられる主要な組織であり、様々な微生物構成成分を認識し、核因子κＢ（以下、「ＮＦ−κＢ」と略記する）の活性化および他のシグナル伝達経路を媒介する。
【０００６】
現在、ヒトでは、ＴＬＲファミリーに属する１０種の受容体（ヒトＴＬＲ１〜１０）が確認されており、これらのマウス相同体（マウスＴＬＲ１〜１０）も確認されている。ＴＬＲファミリータンパク質は、複数のロイシン・リッチ・リピート（ＬＲＲ）およびそれとカルボキシル末端（Ｃ末端）隣接領域を含む細胞外領域と、Ｔｏｌｌ／インターロイキン１受容体相同ドメイン（ＴＩＲ）と呼ばれる細胞質の（細胞内の）シグナル伝達領域とから構成されている。各ＴＬＲは、特有の１種または複数種のリガンドを細胞外領域で認識し、細胞内のＴＩＲを媒介すると推測される免疫応答を誘発する。各ＴＬＲによって誘発される免疫応答は、互いに異なっており、一部が重複していることもある。
【０００７】
ほとんどのＴＬＲファミリーのタンパク質に共通する細胞質領域のＴＩＲドメインは、シグナル伝達およびアダプター分子ＭｙＤ８８またはＭａｌ／ＴＩＲＡＰの相互作用を引き起こすと考えられている。すなわち、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９は、アゴニスト刺激の下でアダプター分子ＭｙＤ８８によってシグナルを伝達してＮＦ−κＢを活性化する。
【０００８】
一方、最近、ＴＬＲ４を介するシグナル伝達経路においては、ＴＬＲ４と会合するアダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰ（ＭｙＤ８８−ａｄａｐｔｅｒ−ｌｉｋｅあるいはＴＩＲＡＰと呼ばれているアダプター分子）が関与していることが報告されている（非特許文献２〜４参照）。
【０００９】
上記の報告によれば、ＴＬＲ４は、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ、およびインターフェロンβプロモータの活性化に関与している。このインターフェロンβプロモータの活性化を誘導するＴＬＲ４の特有の能力は、「アダプター分子ＭｙＤ８８に非依存的なシグナル伝達経路」と呼ばれている、ＴＬＲ４と会合するアダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰによって媒介されるシグナル伝達経路に起因している。すなわち、ＴＬＲ４を介するシグナル伝達では、アダプター分子ＭｙＤ８８と異なる第２のアダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰとＴＬＲ４との協働によって、ＮＦ−κＢおよびＩ型インターフェロンプロモータの活性化が制御される。
マクロファージ（Ｍｆ）においては、ＴＬＲ２刺激ではなくＴＬＲ４刺激の結果として、インターフェロンβのプロモータ活性化がＳＴＡＴ１によるα／βリン酸化を誘導する。その後、インターフェロンβをコードしている遺伝子の発現は、ＭＣＰ（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）−５、ＩＰ（インターフェロン誘導タンパク質）−１０、およびｉＮＯＳ（誘導型ＮＯ合成酵素）の産生を誘導する。これは、再びアダプター分子ＭｙＤ８８に非依存的な経路を介して起こり、ＭｙＤ８８−／−細胞（アダプター分子ＭｙＤ８８を欠損させた細胞）でさえ起こる。
【００１０】
現在まで最も可能性が高いと思われていた概念は、アダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰがアダプター分子ＭｙＤ８８に非依存的な経路をカバーするということである。
【００１１】
これに対して、本願発明者等は、二本鎖ＲＮＡによって誘導されヒトＴＬＲ３を介した免疫応答を研究し、ヒトの線維芽細胞において、ヒトＴＬＲ３が、細胞表面上での二本鎖ＲＮＡの認識に関与し、インターフェロンβ産生を誘導する下流のシグナル伝達を引き起こすことを見出した（非特許文献１参照）。すなわち、インターフェロンβプロモータの活性化およびインターフェロンβの産生が、二本鎖ＲＮＡに応答したヒトＴＬＲ３によって強くかつ急速に誘導されることを示した（非特許文献１参照）。ヒトＴＬＲ３は、二本鎖ＲＮＡの類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ）にも応答してＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモーターを活性化させる（非特許文献１参照）。リポーター遺伝子分析により、ヒトＴＬＲ３は、インターフェロンβプロモータの活性化を媒介するが、ＮＦ−κＢの活性化はそれより低いレベルでしか媒介しないことが明らかになった（非特許文献１参照）。この結果は、他のＴＬＲ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ９が、それらに特有のリガンドを認識したのに続いて、アダプター分子ＭｙＤ８８を介してＮＦ−κＢおよびｐ３８  ＭＡＰＫ（ＭＡＰキナーゼ）を活性化したのと著しく異なっている。
【００１２】
ところで、ＴＬＲ３によって誘導されるＩ型インターフェロン（インターフェロンαおよびインターフェロンβ）は、抗ウイルス作用や抗がん作用を示すことが知られている。詳細には、Ｉ型インターフェロンは、以下のような作用を持つことが知られている。
【００１３】
Ｉ型インターフェロンは、以下のような複数の作用機序により抗ウイルス作用を奏することが知られている。
【００１４】
▲１▼ウイルスのｍＲＮＡを不安定化し、宿主のタンパク翻訳を抑制する細胞内遺伝子を活性化する。これにより、ウイルスの複製を抑制し、ウイルスの増殖を抑制する。
【００１５】
▲２▼ＭＨＣクラスＩ分子の発現を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対する抵抗性を誘導する。細胞障害性ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する感受性を亢進させる。さらに、Ｔ細胞の活性化の抑制およびＴ細胞サプレッサー活性の増強にも関与する。
【００１６】
▲３▼ウイルス感染細胞を選択的に障害するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるアポトーシスをウイルスに誘導する。
【００１７】
また、Ｉ型インターフェロンは、以下のような複数の作用機序により抗腫瘍作用を奏することが知られている。
【００１８】
１）腫瘍細胞内のｍＲＮＡを不安定化し、宿主のタンパク翻訳を抑制する細胞内遺伝子を活性化する。これにより、腫瘍細胞内のタンパク質の合成を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制する。
【００１９】
２）マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞等の抗腫瘍エフェクターを活性化し、これらの抗腫瘍エフェクターにより腫瘍細胞を障害することで、腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する。
【００２０】
３）ウイルス感染細胞を選択的に障害するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるアポトーシスを腫瘍細胞に誘導する。
【００２１】
さらに、Ｉ型インターフェロンは、前述したようにＴ細胞の活性化の抑制、Ｔ細胞サプレッサー活性の増強にも関与することから、ある種の自己免疫疾患を改善できると考えられる。
【００２２】
Ｉ型インターフェロンは、以上のような抗ウイルス作用および抗腫瘍作用を持つことから、従来より、インターフェロンα製剤やインターフェロンβ製剤が、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｃ型肝炎から誘発される肝がん、腎臓がん等の治療剤として使用されている。例えば、天然型インターフェロンα製剤である住友製薬株式会社製の「スミフェロン（登録商標）」などが、臨床応用において好成績を挙げている。
【００２３】
【非特許文献１】
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｋｉｋｋａｗａ，  Ｓ．，  Ｋｏｈａｓｅ，  Ｍ．，  Ｍｉｙａｋｅ，  Ｋ．，  ＆  Ｓｅｙａ，  Ｔ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２９３：  １３６４−１３６９（２００２年５月３１日電子発行）
【００２４】
【非特許文献２】
Ｋａｗａｉ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａ．  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ＭｙＤ８８−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：  ５８８７−５８９４  （２００１）
【００２５】
【非特許文献３】
Ｈｏｒｎｇ，  Ｔ．，  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｇ．  Ｍ．，  ＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｒ．  ＴＩＲＡＰ：  ａｎ  ａｄａｐｔｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：  ８３５−８４１  （２００１）
【００２６】
【非特許文献４】
Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  Ｋ．  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｌ  （ＭｙＤ８８−ａｄａｐｔｅｒ−ｌｉｋｅ）  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：  ７８−８３  （２００１）
【００２７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これまでのＴＬＲに関する研究では、二本鎖ＲＮＡを認識したＴＬＲ３によりＩ型インターフェロンの産生が誘導されるシグナル伝達経路が、他のＴＬＲを介したシグナル伝達経路とは異なることが示唆されているものの、このシグナル伝達経路に関与するタンパク質は解明されていない。
【００２８】
もしＴＬＲ３と特異的に結合して下流のＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達を誘導するタンパク質の存在が明らかにされれば、ウイルスに対する自然免疫応答における重要なシグナル伝達経路およびその調節機構の解明が進むこととなり、自然免疫系に係わる種々の病気の病態解析や、自然免疫応答の調節による治療薬の開発等に有効利用できると考えられる。
【００２９】
また、前述したウイルス感染症や腫瘍の治療に用いられているインターフェロン製剤は、全身投与なので、治療効果の得られる濃度では、精神・神経症状（うつ病等）、自己免疫疾患（甲状腺機能異常、自己免疫性肝炎、溶血性貧血、潰瘍性大腸炎、慢性関節リウマチ等）が悪化する等の副作用が強い。インターフェロン製剤による副作用は、本来はインターフェロンを産生しない正常な宿主細胞にまでインターフェロンが導入されてしまうために、本来は外部抗原に対する免疫応答時に行われるべきＴ細胞に対する自己抗原の提示が、インターフェロンの導入部位全体で誘導され、自己免疫現象が起こり易くなるためであると考えられる。
【００３０】
このように、インターフェロン製剤は、治療効果の得られる濃度では副作用が強いため、全身投与では十分な抗がん作用を維持するのが難しい。また、インターフェロン製剤を局所投与したとしても、副作用を完全に避けることは難しいと考えられる。
【００３１】
もしＴＬＲ３と特異的に結合して下流のＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達を誘導する新規なタンパク質を見出せば、生体内で局所的なＩ型インターフェロンの産生を亢進することによりウイルス感染症や腫瘍等を治療する新たな治療剤を開発することができると考えられる。また、この新規なタンパク質の機能解析を通じて生体内でＩ型インターフェロンの産生を阻害するタンパク質を提供し、このタンパク質により生体内でＩ型インターフェロンの産生を阻害することにより自己免疫疾患やアトピー性疾患等を治療する新たな治療剤を提供することができると考えられる。
【００３２】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に特異的に結合する性質を持つ新規アダプタータンパク質およびその変異体、上記タンパク質の遺伝子、上記遺伝子を含む組換え発現ベクター、上記タンパク質に対する抗体、並びにこれらを用いたウイルス感染症の予防・治療剤、腫瘍の治療剤、自己免疫疾患の治療剤、およびアトピー性疾患の治療剤を提供することにある。
【００３３】
【課題を解決するための手段】
本願発明者等は、最近、ヒトＴＬＲ３が、現在知られているＴＬＲファミリー全般のシグナル伝達に必須と考えられているアダプター分子ＭｙＤ８８、およびＴＬＲ４に会合するアダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰに依存することなく、二本鎖ＲＮＡ（リボ核酸）の存在を示すシグナルを伝達してインターフェロン（ＩＦＮ）βの産生を誘導することを見出した。
【００３４】
本願発明者は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に特異的に結合する性質を持つ新規なアダプタータンパク質について鋭意検討した結果、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に特異的に結合する性質を持つ新規アダプタータンパク質を同定するとともに、その全長遺伝子配列を決定し、さらに、この新規タンパク質が、核因子を活性化しインターフェロンβの産生を誘導する機能を持つことを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００３５】
本発明に係るタンパク質は、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその変異体である。
【００３６】
上記タンパク質は、後述するように、本願発明者等が初めて同定し、その全長アミノ酸配列を明らかにした新規のアダプタータンパク質（本願発明者等はこれを「ＴＩＣＡＭ−１」と命名した；以下、適宜「アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１」と記す）であり、配列番号２にはヒト由来のアミノ酸配列を、配列番号４にはマウス由来のアミノ酸配列をそれぞれ示す。このアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、後述するように、他のＴＬＲやＴＬＲ３変異体等とは結合せずＴＬＲ３と特異的に結合し、哺乳動物の核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）およびインターフェロンβプロモータを活性化し、インターフェロンβの産生を誘導する機能を持つことが確認された。
【００３７】
したがって、上記タンパク質は、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を亢進することができる。それゆえ、前述したＩ型インターフェロンの抗ウイルス作用や抗腫瘍作用を利用して、Ｂ型肝炎やＣ型肝炎等のウイルス感染症等の予防・治療（予防または治療）、腫瘍（がん）の自然免疫治療等が可能となる。
【００３８】
すなわち、ウイルス感染症の殆どでウイルスの二本鎖ＲＮＡが関与することが証明されており、この二本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ３によって認識され、ＴＩＣＡＭ−１を介したシグナル伝達経路によりＩ型インターフェロンの産生を誘導する。したがって、ウイルス感染症に対してアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を投与すれば、ウイルス感染症に対する自然免疫系の免疫応答を増強し、ウイルス感染部位において選択的にＩ型インターフェロンを大量に産生させることができる。それゆえ、ウイルス非感染部位に対するＩ型インターフェロンの導入によって引き起こされる自己免疫疾患等の副作用を回避しながら、Ｉ型インターフェロンの抗ウイルス作用によりウイルス感染症を予防または治療することができる。
【００３９】
また、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、後述するように、ＴＬＲ３と会合しなくとも、単独でＩ型インターフェロンの産生を誘導することが確認された。したがって、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、ウイルス感染時以外にもＩ型インターフェロンの産生を誘導でき、Ｉ型インターフェロンの産生により改善される各種の疾患に有効である。例えば、腫瘍に対してアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を投与すれば、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導することができるので、Ｉ型インターフェロンの抗腫瘍作用を利用して腫瘍の治療が可能となる。
【００４０】
また、上記タンパク質は、アダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰに非依存的なＴＬＲ３を介する新たなシグナル伝達経路が存在することを明らかにするものであり、この新たなシグナル伝達経路により、ＴＬＲファミリーからインターフェロンβプロモーターの活性化に至るシグナル伝達のミッシングリンクが説明可能となる。そのため、タンパク質は、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析に有効利用できる可能性がある。
【００４１】
なお、上記タンパク質が、インターフェロンαの産生を誘導する機能を持つかは検証されていないが、これまでの研究によりインターフェロンαおよびインターフェロンβの産生に係るシグナル伝達経路が共通していることが確認されていることから、上記タンパク質は、インターフェロンαの産生を誘導する機能も持っていると推定される。
【００４２】
ここで、上記「タンパク質」は、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＦｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
【００４３】
本発明に係る配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体は、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち３９４〜５３２番目のアミノ酸配列（ＴＩＲドメイン）を有するもの、（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列のうち３９６〜５３４番目のアミノ酸配列（ＴＩＲドメイン）を有するもの、（ｃ）哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質と、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質とを併せ持つもの、（ｄ）哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を持つ一方、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質に異常（低下あるいは欠失）を持つもの、または（ｅ）哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質を持つ一方、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つものである。上記（ｅ）のタンパク質の具体例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも４３４番目のアミノ酸が置換又は欠失され、かつ、３９４〜５３２番目のアミノ酸配列（ＴＩＲドメイン）の少なくとも一部を保持しているヒト由来のタンパク質が挙げられる。
【００４４】
上記タンパク質の変異体は、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析に有効利用できる可能性がある。
【００４５】
さらに、上記（ａ）〜（ｃ）の変異タンパク質は、上記配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同様に、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を亢進することができる。それゆえ、前述したＩ型インターフェロンの抗ウイルス作用や抗腫瘍作用を利用して、Ｂ型肝炎やＣ型肝炎等のウイルス感染症等の予防・治療（予防または治療）、腫瘍（がん）の自然免疫治療等が可能となる。
【００４６】
上記（ｄ）の変異タンパク質は、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を亢進することができるので、Ｉ型インターフェロンの産生を亢進することによって改善される疾患（がんやウイルス感染症等）の予防または治療のための治療剤として使用することができる。
【００４７】
上記（ｅ）の変異タンパク質は、ＴＬＲ３に結合してＴＬＲ３からＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達を阻害するので、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を抑制することができる。それゆえ、それゆえ、Ｉ型インターフェロンの産生によって引き起こされる自己免疫疾患やアトピー性疾患等の疾患の予防または治療に使用できると考えられる。
【００４８】
また、上記（ａ）〜（ｅ）の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析においても有用である。
【００４９】
なお、上記「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意義する。換言すれば、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるものとは、配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を変異した変異体（変異タンパク質）である。ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００５０】
本発明に係る遺伝子は、上記タンパク質のいずれかをコードする遺伝子である。
【００５１】
上記遺伝子は、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析に有効利用できる可能性がある。
【００５２】
なお、上記「遺伝子」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味であり、本発明に係る遺伝子としては、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、６３〜２１９８番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するヒト由来のｃＤＮＡ、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、６６〜２２６１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するマウス由来のｃＤＮＡ、▲３▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例として挙げられる。
【００５３】
また、上記「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「遺伝子」は、オープンリーディングフレーム以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、タンパク質をコードする配列をベクター配列につないで本発明の遺伝子を構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明の遺伝子を所望に増幅させることができる。また、本発明の遺伝子の一部配列をプローブに用いてもよい。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップを構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００５４】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記遺伝子を含むものである。
【００５５】
この組換え発現ベクターを用いると、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により標的細胞を形質転換して標的細胞に上記遺伝子を導入することができる。
【００５６】
上記形質転換により得られる形質転換体は、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析に有効利用できる可能性がある。
【００５７】
また、上記形質転換によって、この組換え発現ベクターに含まれる遺伝子を哺乳動物の標的細胞（宿主細胞）内に導入し、その細胞内で発現させることで、哺乳動物のＩ型インターフェロンの産生を制御することができる。それゆえ、上記組換え発現ベクターは、Ｉ型インターフェロンの産生を亢進することによって改善される疾患（ウイルス感染症や腫瘍等）、あるいはＩ型インターフェロンの産生によって引き起こされる疾患の遺伝子治療が可能となる。
【００５８】
本発明に係る抗体は、上記タンパク質に特異的に結合する抗体である。
【００５９】
上記抗体は、宿主細胞におけるアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の発現の検出、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の製造・精製等に有用であると考えられる。
【００６０】
また、上記抗体は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合する性質を持つタンパク質に対して特異的に結合する抗体は、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３を介した免疫応答によるＩ型インターフェロンの産生を阻害することができる。Ｉ型インターフェロンの産生を亢進することによって改善される疾患（ウイルス感染症や腫瘍等）の予防・治療剤として有効である。
【００６１】
【発明の実施の形態】
（１）本発明に係るアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１、及びその遺伝子の配列、構造等
本願発明者等は、〔実施例〕で述べるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクトの実験によって、二本鎖ＲＮＡによって誘導されるヒトＴＬＲ３を介したＴＬＲ３シグナル伝達は、その細胞質の末端であるＴＩＲドメインを通して行われ、主としてアダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰに非依存的であることを見出した。
【００６２】
そこで、本願発明者等は、少なくともＴＬＲ３を介するＩ型インターフェロンプロモータの活性化には別のアダプター分子が優先的に関与していると考えた。。
【００６３】
本願発明者等は、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導するシグナル伝達を優先的に媒介する、既知のアダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰとは異なる別のアダプター分子が存在するはずと考え、この未知のアダプター分子の同定を試みた。
【００６４】
その結果、本願発明者等は、物理的にはヒトＴＬＲ３のＴｏｌｌ／インターロイキン１受容体相同ドメイン（以下、「ＴＩＲドメイン」と略記する）と結合し、機能的にはポリイノシン酸−シチジル酸（以下、「ポリ（Ｉ：Ｃ）」と略記する）に応答してＩ型インターフェロンプロモーターの活性化を誘導する代替のアダプター分子を同定することに成功した。このアダプター分子は、ＴＩＲドメインを含有することから、本願発明者等は、「ＴＩＲドメイン含有アダプター分子」（以下、「ＴＩＣＡＭ−１」と略記する）と命名した。
【００６５】
本発明に係るアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１のアミノ酸配列を、配列番号２および４に示す。配列番号２にはヒト由来のアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１（以下、「ヒトＴＩＣＡＭ−１」と略記する）のアミノ酸配列を、配列番号４にはマウス由来のアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１（以下、「マウスＴＩＣＡＭ−１」と略記する）をそれぞれ示す。
【００６６】
また、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１をコードする完全長ｃＤＮＡ配列の塩基配列を、配列番号１および３に示す。配列番号１にはヒトＴＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を、配列番号３にはマウスＴＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列をそれぞれ示す。
【００６７】
なお、配列番号１の塩基配列中、６３〜２１９８番目の塩基配列が、ヒトＴＩＣＡＭ−１をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当する。また、配列番号３の塩基配列中、６６〜２２６１番目の塩基配列が、上記マウスＴＩＣＡＭ−１をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に相当する。配列番号１および３に示される各ｃＤＮＡ配列は、このＯＲＦ領域のほか５’側及び３’側にそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものであった。
【００６８】
ヒトＴＩＣＡＭ−１は、Ｎ末端のプロリン・リッチ・ドメイン（１〜３９３番目のアミノ酸配列）、ＴＩＲドメイン（３９４〜５３２番目のアミノ酸配列）、およびＣ末端のプロリン・リッチ・ドメイン（５３３〜７１２番目のアミノ酸配列）から構成されていることが判明した（図５）。
【００６９】
ヒトＴＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡ配列のＴＩＲドメインは、既知のアダプター分子、ヒトＭａｌ／ＴＩＲＡＰ（非特許文献３・４参照）およびヒトＭｙＤ８８のＴＩＲドメイン（図６の「Ｍａｌ（ＴＩＲ）．ｈｕ」および「ＭｙＤ８８（ＴＩＲ）．ｈｕ」）に対する類似性が低く、他のＴＩＲドメイン含有タンパク質のＴＩＲドメイン中における保存配列である、Ｂｏｘ１の（Ｆ／Ｙ）Ｄ、Ｂｏｘ２のＲＤ、およびＢｏｘ３のＦＷ（Ｘｕ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：  １１１−１１５  （２０００）参照）が全て欠失している点で特異的である（図６）。
【００７０】
対照的に、ヒトＴＩＣＡＭ−１では、ＴＩＲ−ＭｙＤ８８を介するシグナル伝達に必須であり、既知のアダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰで保存されている、いわゆるＢＢループ（Ｘｕ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：  １１１−１１５  （２０００）参照）内のプロリンが良く保存されていた。
【００７１】
このヒトＴＩＣＡＭ−１と既知のアダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰとの間のもう１つの重要な相違点は、ヒトＴＩＣＡＭ−１は、Ｄｅａｔｈ領域（細胞死誘導領域）、あるいはより短いＭａｌに類似したＮ末端ドメインが欠失しており、その代わりに、プロリン・リッチな長いＮ末端領域およびＣ末端領域を含んでいる点である。
【００７２】
また、上記ヒトＴＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡ配列を用いて、ヒトゲノムドラフトシークエンスのデータベース検索を行った。その結果、ヒトＴＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡ配列は、染色体１９ｐ１３．３（遺伝子座）上に存在することが判明した。
【００７３】
なお、上記タンパク質や遺伝子は、診断にも利用できる可能性がある。すなわち、診断対象の個体から採取した細胞においてアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１または同様の機能を持つ変異体の発現の有無を検出すれば、この結果に基づいて個体がアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の欠損や変異に起因する免疫不全症にかかっているか否かを診断することができると考えられる。アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１または同様の機能を持つ変異体の発現の有無を検出する方法としては、ＤＮＡチップを用いてアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の遺伝子を検出する方法、個体のアダプタータンパク質の遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰｓ）を調べる方法等が考えられる。
【００７４】
（２）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係るタンパク質および遺伝子の取得方法について説明する。
【００７５】
上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１をコードする遺伝子を取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトまたはマウスのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００７６】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００７７】
また、上記プローブの配列を、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の機能上重要と考えられるＴＩＲドメインの中から選択し、ヒト・マウスやその他の哺乳動物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる。
【００７８】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００７９】
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れ、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記タンパク質アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモータを組み入れた組換え発現ベクター及び宿主には様々なものがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等により比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。
【００８０】
（３）アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１及びその遺伝子等の有用性
アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、以下の２種類の作用機序により、Ｉ型インターフェロンの産生を亢進することができる。
【００８１】
（ａ）ウイルスに感染した、ＴＬＲ３を発現している宿主細胞内で、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１が、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡを認識したＴＬＲ３と結合して、下流のＩ型インターフェロンの産生誘導に至るシグナル伝達を誘導し、Ｉ型インターフェロンの産生を強く亢進する。したがって、ウイルスに感染した宿主細胞において細胞特異的（局所的）にＩ型インターフェロンの産生を強く亢進することができる。すなわち、ウイルスに対する免疫応答を亢進できる。
【００８２】
（ｂ）ウイルスに感染していない宿主細胞内で、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１が単独で発現して、下流のＩ型インターフェロンの産生誘導に至るシグナル伝達を誘導し、Ｉ型インターフェロンの産生を亢進する。このようなアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の単独発現でも高いＩ型インターフェロン誘導活性がある。ただし、これによるＩ型インターフェロンの産生量は（ａ）によるものと比較すると少ない。
【００８３】
これらの結果として、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、以下のような有用性を持つ。
【００８４】
▲１▼アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１あるいはアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を有効成分として含む混合物は、ウイルス感染症の予防・治療剤として極めて有用である。すなわち、主として（ａ）の作用機序によるＩ型インターフェロンの産生亢進の結果として、ウイルス感染時に、前述したＩ型インターフェロンによる抗ウイルス効果を、ウイルスに感染した宿主細胞において細胞特異的（局所的）に亢進できる。すなわち、ウイルス感染に対するＩ型インターフェロンによる生体防御機能を強化できる。したがって、Ｉ型インターフェロンの過剰な産生による自己免疫疾患等の副作用を最小限に抑制しながらウイルス感染症を予防または治療できる。適用されるウイルス感染症としては、現時点でＩ型インターフェロンの有効性が確認されている疾患、すなわち、ウイルス性のＢ型肝炎およびＣ型肝炎（特に遺伝子型がＩＩａのものに有効）等が挙げられる。また、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ；免疫不応答感染症）にも適用できると考えられる。また、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、ウイルスの潜伏感染が予想される部位にアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を発現させることにより、ウイルス感染の予防が可能である。また、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、単独発現（（ｂ）の作用機序）でも高いＩ型インターフェロン誘導活性があるので、ＴＬＲ３が発現しない場合（（ａ）の作用機序が有効でない場合）にも十分な抗ウイルス作用を奏する。
【００８５】
▲２▼アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１あるいはアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を有効成分として含む混合物は、腫瘍の治療剤としても有用である。すなわち、上記（ｂ）の作用機序によるＩ型インターフェロンの産生亢進の結果として、前述したＩ型インターフェロンによる抗腫瘍効果を亢進できるので、自然免疫療法による腫瘍（癌）の治療が可能となる。適用される腫瘍としては、現時点でＩ型インターフェロンの有効性が確認されている悪性腫瘍（肝がん、腎臓がん、若年性咽頭乳頭腫、悪性リンパ腫、脳腫瘍、膠芽腫、髄芽腫、星細胞腫、皮膚悪性黒色腫等）が挙げられる。
【００８６】
なお、本発明に係る治療剤の標的となる細胞としては、ウイルスの二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３をその表面上で発現するものであることが望ましいが、本発明に係るタンパク質は単独でＩ型インターフェロンの産生を誘導することができるので、ＴＬＲ３をその表面上で発現しない細胞にも適用可能である。ただし、ウイルス感染症に適用する場合には、ウイルスの二本鎖ＲＮＡを認識するＴＬＲ３をその表面上で発現する細胞に導入する方が好ましい。これにより、ウイルス感染部位において局所的にＩ型インターフェロンの産生を誘導することができ、Ｉ型インターフェロンの産生量の増大による副作用を最小限に抑えながら、Ｉ型インターフェロンの産生量の増大によるウイルス感染症の治療を効果的に行うことができる。
【００８７】
本願発明者等の研究によれば、ヒトＴＬＲ３は、様々な樹状細胞（ＤＣ）サブセットの中で発現される。また、ヒトＴＬＲ３は、ヒト腸上皮細胞やヒト線維芽細胞の中で発現されることが報告されている（Ｍ．Ｍｕｚｉｏ，  Ｄ．Ｂｏｓｉｓｉｏ，  Ｎ．Ｐｏｌｅｎｔａｒｕｔｔｉ，  Ｇ．Ｄ’ａｍｉｃｏ，  Ａ．Ｓｔｏｐｐａｃｃｉｒｏ，  Ｒ．Ｍａｎｃｉｎｅｌｌｉ  Ｃ．ｖａｎ’ｔ  Ｖｅｅｒ，  Ｇ．Ｐｅｎｔｏｎ−Ｒｏｌ，Ｌ．Ｐ．Ｒｕｃｏ，  Ｐ．Ａｌｌａｖｅｎａ，  Ａ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４  （２０００）  ５９９８−６００４およびＥ．Ｃａｒｉｏ，  Ｄ．Ｋ．Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６８  （２０００）  ７０１０−７０１７）。このことは、その機能が、自然免疫系における微生物核酸成分に対する応答と密接に関連していることを示唆している。したがって、本発明に係るウイルス感染症の治療剤は、ヒトＴＬＲ３を発現してタイプＩインターフェロンを産生する細胞、特に、ヒトＴＬＲ３をその表面上で発現すると共に、ＲＮＡウイルスを認識したときにＩ型インターフェロンを産生する細胞に対して効果的である。このような細胞としては、例えば、ヒト肺線維芽細胞やヒト包皮線維芽細胞等のヒト線維芽細胞、ヒト樹状細胞、ヒト腸上皮細胞等が挙げられる。特に、線維芽細胞は、ＲＮＡウイルス感染または二本鎖ＲＮＡによる処理の際に、異なる複数のシグナル伝達経路を経てＩ型インターフェロンを産生することが知られており、大きな効果が期待できる。また、マウスＴＬＲ３を発現してＩ型インターフェロンを産生する細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞等の細胞が挙げられる。
【００８８】
また、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を含む予防・治療剤の投与方法としては、静脈注射、皮下注射などが好ましいが、舌下錠や直腸投与などの非経口投与でもよい。また、投与形態として、通常の蛋白質の製剤化法により製剤化されたものを使用できる。また、リポソーム製剤などの乳化剤として使用することもできる。
【００８９】
アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、上述した有用性に加えて、以下のような有用性を持つと考えられる。
【００９０】
すなわち、上記（ｂ）の作用機序によるＩ型インターフェロンの産生亢進の結果として、前述したＩ型インターフェロンによる免疫調節効果を亢進できるので、ある種の自己免疫疾患の治療が可能になると考えられる。
【００９１】
また、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、ＴＬＲ３とアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１との結合、あるいはアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１から下流のＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達を亢進する化合物や、このシグナル伝達を阻害する化合物（阻害剤）のスクリーニング等にも利用できると考えられる。
【００９２】
また、後述の実施例において詳述するように、上記アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１は、ＴＬＲ３と結合し、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する分子であり、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系において極めて重要な役割を果たす分子と考えられる。それゆえ、本発明に係る遺伝子およびタンパク質は、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析にも有効利用できる可能性がある。
【００９３】
（４）アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体
タンパク質の変異体が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られている。そのため、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と同様にＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を併せ持つアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異体を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて作製することができる。また、変異体の作製には、市販の突然変異誘発キット（例えば、ストラタジーン社製の位置指定突然変異誘発キット”ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ”）を利用してもよい。この場合、位置を、ＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を持つ領域と考えられるＴＩＲドメイン以外に変異を導入すれば、ＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を併せ持つアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体を確実に作製することができると考えられる。
【００９４】
すなわち、後段の実施例で述べるように、ヒトＴＩＣＡＭ−１を構成するアミノ酸配列のうちほぼＴｏｌｌ／インターロイキン１受容体に対して相同性を持つ領域（ＴＩＲドメイン）のみからなる、３８７〜５５６番目のアミノ酸配列からなる変異タンパク質が、ヒトＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を併せ持っていたことから、ＴＩＲドメイン（ヒトＴＩＣＡＭ−１を構成するアミノ酸配列のうちの３９４〜５３２番目のアミノ酸配列あるいはマウスＴＩＣＡＭ−１を構成するアミノ酸配列のうちの３９６〜５３４番目のアミノ酸配列）を少なくとも有する変異体であれば、ＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を併せ持つと考えられる。
【００９５】
ＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質を併せ持つアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体は、前述したアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と同様の有用性、すなわち、▲１▼ウイルス感染症としての有用性、▲２▼腫瘍の治療剤としての有用性等を持つ。
【００９６】
一方、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１において、ＴＬＲ３と特異的に結合する性質およびＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質に重要な領域と考えられるＴＩＲドメインに変異を生じさせれば、ＴＬＲ３と特異的に結合する性質、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質のいずれか一方に異常を持つ変異タンパク質を作製できると考えられる。
【００９７】
そして、後段の実施例で述べるように、ヒトＴＩＣＡＭ−１を構成するアミノ酸配列のうちのほぼＴＩＲドメイン（３８７〜５５６番目のアミノ酸配列）のみからなる変異タンパク質に対してさらに４３４番目（完全長のヒトＴＩＣＡＭ−１での位置）のアミノ酸（プロリン）をヒスチジンに置換する点変異を導入した変異タンパク質が、ＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質を保持する一方、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質を失ったことから、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１あるいはＴＩＲドメインを少なくとも有するその変異体に対して、ＴＩＲドメインのうち、少なくとも４３４番目のアミノ酸（プロリン）を含む一部領域に変異を導入すれば、ヒトＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つ変異タンパク質を作製できると考えられる。
【００９８】
このようなＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体は、ＴＬＲ３から下流のＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達を阻害して、Ｉ型インターフェロンの産生を抑制することができる。その結果、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の制御を介したＴＬＲ３から下流のＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達経路に起因した自己免疫疾患やアトピー性疾患等を治療できると考えられる。すなわち、上記変異タンパク質は、以下の有用性を有すると考えられる。
【００９９】
（ア）上記変異タンパク質またはそれを有効成分として含む混合物は、自己免疫疾患の治療剤として有用である。
【０１００】
（イ）上記変異タンパク質またはそれを有効成分として含む混合物は、アトピー性疾患の治療剤として有用である。
【０１０１】
一方、ヒトＴＩＣＡＭ−１あるいはＴＩＲドメインを少なくとも有するヒトＴＩＣＡＭ−１の変異体に対して、ヒトＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質が失われるように、４３４番目のアミノ酸（プロリン）以外のＴＩＲドメインの一部に変異を導入すれば、ヒトＴＬＲに対して特異的に結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つ変異タンパク質を作製できると考えられる。
【０１０２】
このようなＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質を持つ一方、Ｉ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つ変異タンパク質は、前述したアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と同様に、ウイルス感染症の予防・治療剤としての有用性、腫瘍の治療剤としての有用性等を持つと考えられる。ただし、この場合、ウイルス感染症の予防・治療剤としての有用性は、前述した（ａ）の作用機序（ウイルス免疫応答）によるＩ型インターフェロンの産生亢進の結果ではなく前述した（ｂ）の作用機序（アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の単独発現）によるＩ型インターフェロンの産生亢進の結果である。したがって、この変異体は、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と比較すると、自己免疫疾患等の副作用を抑制する効果やウイルス抑制効果は低い。
【０１０３】
（５）組換え発現ベクター
本発明に係る組換え発現ベクターは、前述したアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１またはその変異体をコードする遺伝子を含むものである。
【０１０４】
この組換え発現ベクターは、種々の細胞に上記遺伝子を導入してその細胞内でアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を産生させることにより、種々の細胞内におけるＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析に有効利用できる可能性がある。
【０１０５】
また、公知の哺乳動物の標的細胞（宿主細胞）内に対して、この組換え発現ベクターに含まれる遺伝子を遺伝子導入法により導入し、その細胞内で発現させることで、前述したアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１またはその変異体を生体内で産生させることができる。それゆえ、上記組換え発現ベクターは、含有する遺伝子がコードするタンパク質と同様の有用性を有する。すなわち、上記組換え発現ベクターは、含▲１▼ウイルス感染症の予防・治療剤としての有用性、▲２▼腫瘍の治療剤としての有用性、（ア）自己免疫疾患の治療剤としての有用性、（イ）アトピー性疾患の治療剤としての有用性等を持つ。
【０１０６】
なお、この組換え発現ベクターを用いて哺乳動物の標的細胞内に遺伝子を導入する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（１）哺乳動物の疾患部位から標的細胞を採取し、採取した標的細胞に組換え発現ベクターを導入した後、、哺乳動物の体内に戻す方法、（２）哺乳動物の局所の臓器や癌部にカチオン性リポソームと共に組換え発現ベクターを導入する方法、（３）組換え発現ベクターとしてレトロウイルスベクターやアデノウイルス等のウイルスベクターを用い、ウイルスベクターの感染力を利用して標的細胞内に遺伝子を導入する方法、（４）哺乳動物の局所の臓器や癌部に組換え発現ベクターを導入した後、電極で一定の電場を与えるエレクトロポレーション法等が挙げられる。
【０１０７】
腫瘍に対しアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１を全身投与した場合、腫瘍部位以外でも副作用の強いＩ型インターフェロンの産生が亢進されるので、副作用を回避しながら十分な抗腫瘍作用を維持するのが難しいことも考えられる。これに対し、上述した遺伝子導入法などの方法でアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の局所濃度を挙げれば、腫瘍に対してより適応した治療法を実現できる。したがって、上記組換え発現ベクターは、腫瘍の治療剤として非常に有用である。
【０１０８】
（６）アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１に対する抗体
本発明に係る抗体は、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１または変異体と特異的に結合する抗体である。
【０１０９】
上記抗体は、宿主細胞におけるアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の発現の検出、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の製造・精製等に有用であると考えられる。
【０１１０】
さらに、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と特異的に結合する抗体、またはＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質とＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質とを併せ持つアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の変異体と特異的に結合する抗体は、ＴＬＲ３から下流のＩ型インターフェロンの産生に至るシグナル伝達を遮断して、Ｉ型インターフェロンの産生を抑制することができると考えられるので、前述したＴＬＲ３に対して特異的に結合する性質を持つ一方でＩ型インターフェロンの産生を誘導する性質に異常を持つ変異タンパク質と同様に、（ア）自己免疫疾患の治療剤としての有用性、（イ）アトピー性疾患の治療剤としての有用性を持つと考えられる。また、上記抗体を用いてＩ型インターフェロンの産生を阻害した状態で、目的遺伝子を挿入したウイルスベクターを宿主細胞に感染させれば、ウイルスベクターによる宿主細胞への目的遺伝子の導入効率を高められると考えられる。
【０１１１】
また、上記抗体は、診断薬としても使用できる可能性がある。すなわち、上記抗体を用いて診断対象の個体から採取した細胞におけるアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１（または同様の機能を持つ変異体）の発現の有無を検出すれば、この結果に基づいて個体がアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１の欠損や変異に起因する免疫不全症にかかっているか否かを診断することができると考えられる。
【０１１２】
上記抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。これは、性質が均一で供給しやすい、将来的にヒト型抗体に変えうる、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの理由による。
【０１１３】
上記モノクローナル抗体は、次の方法により作製することができる。すなわち、まず、アダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１、そのフラグメントまたはその他の誘導体、あるいはそれらのアナログ、もしくはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてマウス脾臓リンパ球を免疫し、免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生させる。なお、免疫操作は、公知の各種方法、例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４，  ７２（１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））などにより行うことができる。
【０１１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例の記載に限定されるものではなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
【０１１５】
〔細胞株・細胞培養〕
ヒト肺線維芽細胞株ＭＲＣ−５は、理化学研究所（茨城県つくば市高野台３−１−１）の”Ｒｉｋｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ”に寄託されているものから取得した。また、ヒトの上皮細胞株ＨｅＬａは、藤田尚志博士（東京都臨床医学研究所）から提供して頂いたものである。また、実施例で使用したＨＥＫ（ヒト胚腎臓）２９３細胞株は、ヒトＴＬＲ３は発現せず、ヒトＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡは極めて低いレベルで発現した（図示しない）。
【０１１６】
細胞株ＭＲＣ−５および細胞株ＨｅＬａは、それぞれ５重量％（ＨｅＬａ）または１０重量％（ＭＲＣ−５）の熱不活性化ＦＣＳ（ＪＲＨバイオサイエンス社）と、抗生物質とを添加したＭＥＭ（改変イーグル培地）中で培養した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０重量％のＦＣＳおよび抗生物質を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養した。
【０１１７】
〔試薬〕
ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ）Ｂ、抗原型０１１１：Ｂ４の大腸菌由来のＬＰＳ（リポ多糖；ヒトＴＬＲ４によって認識されるグラム陰性細菌の細胞壁成分；以下、「ＬＰＳ」と略記する）、およびマウスＩｇＧ１は、Ｓｉｇｍａ社から購入した。マイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２は、Ｍ．Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｔ．Ｔａｋａｏ，  Ｍ．Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｙ．Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ，  Ｓ．Ｔｓｕｊｉ，  Ｎ．Ａ．Ｂｅｇｕｍ，  Ｏ．Ｔａｋｕｃｈｉ，  Ｓ．Ａｋｉｒａ，  Ｋ．Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，  Ｔ．Ｓｅｙａ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６  （２００１）  ２６１０−２６１６に記載の方法で調製した。これらの試薬は、ＬＰＳを除いて、細胞刺激の前にポリミキシンＢ（１０μｇ／ｍｌ）によって３７℃で１時間処理した。
【０１１８】
〔ヒトＴＬＲに対するモノクローナル抗体〕
ヒトＴＬＲ３に対するモノクローナル抗体（ＴＬＲ３．７）およびヒトＴＬＲ２に対するモノクローナル抗体（ＴＬＲ２．４５）は、非特許文献１に記載されている方法（Ｘｕ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｏｌｌ／ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：  １１１−１１５  （２０００）も参照）で作製した。ヒトＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体は、三宅健介博士（東京大学医化学研究所）から提供して頂いたものである（作製法については、Ｒ．Ｓｈｉｍａｚｕ，  Ｓ．Ａｋａｓｈｉ，  Ｈ．Ｏｇａｔａ，  Ｙ．Ｎａｇａｉ，  Ｋ．Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，  Ｋ．Ｍｉｙａｋｅ，  Ｍ．Ｋｉｍｏｔｏ，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １８９  （１９９９）  １７７７−１７８２参照）。
【０１１９】
〔ｃＤＮＡ発現ベクター〕
ヒトＴＬＲ２、ヒトＴＬＲ３、ＭｙＤ８８、およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰのｃＤＮＡを、組換え体ヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）と共に９日間培養したヒトの単核細胞から得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって生成し、哺乳動物の発現ベクターｐＥＦＢＯＳ中にクローニングすることで、ヒトＴＬＲ２発現ベクター、ヒトＴＬＲ３、ＭｙＤ８８発現ベクター、およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰ発現ベクターとした。なお、発現ベクターｐＥＦＢＯＳは、大阪大学の長田重一教授から提供して頂いたプラスミドベクターである。
【０１２０】
ヒトＴＬＲ４発現ベクターおよびＭＤ−２発現ベクターは、三宅健介博士（東京大学医化学研究所）から提供して頂いたものである（Ｓｈｉｍａｚｕ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｔ．  ＭＤ−２，  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｎ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８９：  １７７７−１７８２  （１９９９）参照）。
【０１２１】
Ｎ末端にＦｌａｇタグ（Ｆｌａｇ標識）を付けたヒトＴＬＲ４発現ベクターおよびＮ末端にＦｌａｇタグを付けたヒトＴＬＲ２発現ベクターはそれぞれ、ヒトＴＬＲ４およびヒトＴＬＲ２をコードするｃＤＮＡを、Ｎ末端にＦｌａｇタグを付けたプラスミドベクターｐＣＭＶ−Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ社製）に組み込むことにより作成した。
【０１２２】
ヒトＣＤ１４発現ベクター（ｐＭＥ１８Ｓ／ＣＤ１４）は、西村仁博士（筑波大学）から提供して頂いたものである。
【０１２３】
ＴＩＲドメインを欠失させたヒトＴＬＲ３の変異体（ＴＬＲ３を構成するアミノ酸配列のうち１〜７２９番目のアミノ酸配列からなるタンパク質；以下、「ヒトＴＬＲ３ｄｅＩＣＹＴ」と記す；）をコードするｃＤＮＡは、ヒトＴＬＲ３のｃＤＮＡからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によって作製し、発現ベクターｐＥＦＢＯＳ中にクローニングしてヒトＴＬＲ３ｄｅＩＣＹＴ発現ベクターとした。
【０１２４】
ヒトＭｙＤ８８の顕性不活性（ドミナントネガティブ）な変異体（ヒト由来のアダプタータンパク質ＭｙＤ８８を構成するアミノ酸配列のうち５２〜２９６番目のアミノ酸配列からなるタンパク質；以下、「ＴＩＲＭｙＤ８８」と記す）をコードするｃＤＮＡは、骨髄細胞株Ｐ３９のｃＤＮＡからＰＣＲによって作製し、発現ベクターｐＥＦＢＯＳ中に組み込んでＴＩＲＭｙＤ８８発現ベクターとした。
【０１２５】
ヒトＴＬＲ３における７９５番目のアミノ酸（アラニン）をヒスチジンに置換した変異体（Ａｌａ７９５Ｈｉｓ；以下、「ヒトＴＬＲ３  Ａ７９５Ｈ」と記す）をコードする発現ベクター、およびアダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰの顕性不活性な変異体（アダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰにおける１２５番目のアミノ酸（プロリン）をヒスチジンに置換した顕性不活性な変異体；Ｍａｌ  Ｐｒｏ１２５Ｈｉｓ；以下、「ＭａｌＰ１２５Ｈ」と記す）をコードするｃＤＮＡは、それぞれヒトＴＬＲ３およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰから「Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ」位置指定突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて生成した。そして、ヒトＴＬＲ３  Ａ７９５ＨをコードするｃＤＮＡ、およびＭａｌＰ１２５ＨをコードするｃＤＮＡをそれぞれプラスミドベクターｐＥＦＢＯＳに組み込むことにより、ヒトＴＬＲ３  Ａ７９５Ｈ発現ベクターおよびＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクターを得た。
【０１２６】
〔実施例１；リポーター遺伝子発現アッセイ〕
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションにより、ヒトＴＬＲ３が、二本鎖ＲＮＡの類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ）の存在をアダプター分子ＭｙＤ８８またはＭａｌ／ＴＩＲＡＰを介してシグナル伝達するかどうか調べた。
【０１２７】
まず、リポーター遺伝子発現アッセイによりＮＦ−κＢの活性化の度合いを分析した。
【０１２８】
２４ウェルのプレート上のＨＥＫ（ヒト胚腎臓）２９３細胞（１ウェル当たり２×１０５個）を、遺伝子導入用カチオン性脂質「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」試薬（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、０．１μｇ）と、（１）空ベクター、（２）ＴＩＲＭｙＤ８８発現ベクター（０．２μｇ）、（３）ＴＩＲＭｙＤ８８発現ベクター（０、０．０５μｇ、０．２μｇ、または０．６μｇ）およびヒトＴＬＲ２発現ベクター（０．１μｇ）、（４）空ベクター、（５）ＴＩＲＭｙＤ８８発現ベクター（０．２μｇ）、（６）ＴＩＲＭｙＤ８８発現ベクター（０、０．０５μｇ、０．２μｇ、または０．６μｇ）およびヒトＴＬＲ３発現ベクター（０．１μｇ）、（７）空ベクター、（８）ＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクター（０．２μｇ）、（９）ＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクター（０、０．２μｇ、または０．６μｇ）およびヒトＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２発現ベクター（０．３μｇ）、（１０）空ベクター、（１１）ＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクター（０．２μｇ）、または（１２）ＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクター（０、０．２μｇ、または０．６μｇ）およびヒトＴＬＲ３発現ベクター（０．１μｇ）とによって、過渡的にトランスフェクトした。空ベクターを添加することによって、トランスフェクトされるＤＮＡの総量（０．８〜１．０μｇ）を調整した。また、内部コントロールとして、プラスミドベクターｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；５ｎｇ）を用いた。
【０１２９】
なお、「空ベクター」はｃＤＮＡを組み込んでいないプラスミドベクターｐＥＦＢＯＳである。また、「ヒトＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２発現ベクター」とは、ヒトＴＬＲ４発現ベクターとヒトＣＤ１４発現ベクターとＭＤ−２発現ベクターとの組み合わせを指す。
【０１３０】
トランスフェクトの２４時間後に、（１）〜（３）のトランフェクト後の細胞を培地のみまたはポリミキシンＢで処理したＭＡＬＰ−２（１００ｎＭ）で、（４）〜（６）および（１０）〜（１２）のトランフェクト後の細胞を培地のみまたはポリミキシンＢで処理したポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍｌ）で、（７）〜（９）のトランフェクト後の細胞を培地のみまたはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で、それぞれ６時間刺激した。続いて、細胞を溶出バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶出した。この溶出液について、トランスフェクト後の刺激によるＮＦ−κＢの活性化の度合いを表すルシフェラーゼの活性を、製造業者の使用説明書に従って測定した。また、計３回の実験を行い、それらの代表値を測定値とした。
【０１３１】
トランスフェクト後に刺激を与えた細胞のルシフェラーゼ活性の測定値を、図１（ａ）〜（ｄ）に灰色または黒色で示し、トランスフェクト後に刺激を与えなかった（培地のみで刺激した）細胞のルシフェラーゼ活性の測定値を、図１（ａ）〜（ｄ）に白色で示す。ルシフェラーゼ活性の測定値は、トランスフェクト後に刺激を与えなかった細胞のルシフェラーゼ活性を１とした相対値（相対刺激）で表している。
【０１３２】
次に、ｐ−１２５  ｌｕｃリポータープラスミドを用いたリポーター遺伝子発現アッセイによりインターフェロンβプロモータの活性化の度合いを分析した。
【０１３３】
この「ｐ−１２５  ｌｕｃレポータプラスミド」は、東京大学大学院医学系研究科の谷口維紹教授から供与して頂いたものである（Ｔ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｋ．Ｏｇａｓａｗａｒａ，  Ａ．Ｔａｋａｏｋａ，  Ｎ．Ｔａｎａｋａ，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９  （２００１）  ６２３−６５５参照）。ｐ−１２５  ｌｕｃレポータプラスミドは、レポータ遺伝子発現ベクターとしての「ピッカジーン（Ｐｉｃａｇｅｎｅ）」ルシフェラーゼレポータプラスミド（東洋インキ株式会社製）に対して、ヒトインターフェロンβプロモータをコードする領域（−１２５〜＋１９）を挿入したものである。
【０１３４】
ｐ−１２５  ｌｕｃリポータープラスミドを用いたリポーター遺伝子発現アッセイでは、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子に代えてｐ−１２５  ｌｕｃリポータープラスミド（０．１μｇ）を用いる点と、（１）〜（３）のベクターに代えて、（１’）空ベクター、（２’）ＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクター（０．２μｇ）、または（３’）ＭａｌＰ１２５Ｈ発現ベクター（０、０．２μｇ、または０．６μｇ）およびヒトＴＬＲ４／ＣＤ１４／ＭＤ−２発現ベクター（０．３μｇ）を用いる点と、（１）〜（３）のベクターを用いてトランスフェクトした細胞を培地のみまたはＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激する点とを除いて、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子を用いたリポーター遺伝子発現アッセイと同様の操作を行った。
【０１３５】
そして、トランスフェクト後の刺激によるインターフェロンβプロモータの活性化の度合いを表すルシフェラーゼの活性を測定した。得られた測定値を、図２（ａ）〜（ｄ）に図１（ａ）〜（ｄ）と同様の形態で示す。
【０１３６】
本実施例では、以下の結果が得られた。
【０１３７】
まず、アダプター分子ＭｙＤ８８の顕性不活性な変異体ＴＩＲＭｙＤ８８の発現は、その量に応じてヒトＴＬＲ２を介したヒトＴＬＲ２のリガンドＭＡＬＰ−２によるＮＦ−κＢの活性化を著しく阻害した（図１（ａ））。これに対して、アダプター分子ＭｙＤ８８の顕性不活性な変異体ＴＩＲＭｙＤ８８の発現は、ヒトＴＬＲ３を介したポリ（Ｉ：Ｃ）によるＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモーターの活性化にはほとんど影響を与えなかった（図１（ｂ）および図２（ｂ））。
【０１３８】
アダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰの顕性不活性な変異体ＭａｌＰ１２５Ｈを用いた類似の実験において、アダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰがヒトＴＬＲ３を介するシグナル伝達に寄与しないことも示された（図１（ｄ）および図２（ｄ））。
【０１３９】
それとは対照的に、ヒトＴＬＲ４を介するＬＰＳによるＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモーターの活性化は、アダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰの顕性不活性な変異体ＭａｌＰ１２５Ｈによってその量に応じて阻害された（図１（ｃ）、図２（ｃ））。
【０１４０】
以上の結果から、ヒトＴＬＲ３によって媒介されたインターフェロンβの産生を誘導するシグナル伝達は、既知のアダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰに依存しないことが分かった。
【０１４１】
〔実施例２；リポーター遺伝子発現アッセイ〕
２４ウェルのプレート上のＨＥＫ（ヒト胚腎臓）２９３細胞（１ウェル当たり２×１０５個）を、遺伝子導入用カチオン性脂質「リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）  ２０００」試薬（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、０．１μｇ）またはｐ−１２５  ｌｕｃリポータープラスミド（０．１μｇ）と、空ベクター、ヒトＴＬＲ３発現ベクター（０．１μｇ）、ヒトＴＬＲ３ｄｅｌＣＹＴ発現ベクター（０．１μｇ）、またはヒトＴＬＲ３  Ａ７９５Ｈ発現ベクター（０．１μｇ）とによって、過渡的にトランスフェクトした。
【０１４２】
トランスフェクトの２４時間後に、（１）〜（３）のトランフェクト後の細胞を培地のみまたはポリミキシンＢで処理したポリ（Ｉ：Ｃ）で６時間刺激した。続いて、細胞を溶出バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶出した。この溶出液について、ルシフェラーゼの活性を測定した。また、計３回の実験を行い、それらの代表値を測定値とした。
【０１４３】
トランスフェクト後に刺激を与えた細胞のルシフェラーゼ活性の測定値を、図３（ａ）（ｂ）に黒色で示し、トランスフェクト後に刺激を与えなかった（培地のみで刺激した）細胞のルシフェラーゼ活性の測定値を、図３（ａ）（ｂ）に白色で示す。ルシフェラーゼ活性の測定値は、トランスフェクト後に刺激を与えなかった細胞のルシフェラーゼ活性を１とした相対値（相対刺激）で表している。
【０１４４】
本実施例では、以下の結果が得られた。
【０１４５】
ヒトＴＬＲ３からＴＩＲドメインを削除したタンパク質であるヒトＴＬＲ３ｄｅｌＣＹＴをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、同様に、ポリ（Ｉ：Ｃ）に応答しなかった（図３）。
【０１４６】
ヒトＴＬＲ３の突然変異体ヒトＴＬＲ３  Ａ７９５ＨをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞は、ＴＬＲ３ｄｅｌＣＹＴと同様に、ポリ（Ｉ：Ｃ）に対する応答性を失った。この結果は、ヒトＴＬＲ３における７９５番目のアミノ酸（アラニン）の点突然変異が、ＮＦ−κＢへの下流のシグナル伝達にとっても、インターフェロンプロモーターβの活性化にとっても、極めて重大であることを示唆している。
【０１４７】
これに対して、ＴＩＲドメインを含むヒトＴＬＲ３を発現している細胞は、ポリ（Ｉ：Ｃ）による刺激の下でインターフェロンβプロモーターを活性化した（図３（ｂ））。
【０１４８】
〔実施例３；新規アダプター分子のスクリーニングおよび同定〕
まず、酵母ツー・ハイブリッド・システムから、ヒトＴＬＲ３の末端は、あるタンパク質と特異的に会合することが確認された（図４）。
【０１４９】
次に、ヒトＴＬＲ３のシグナル伝達に関与するアダプター分子を同定するために、酵母ツー・ハイブリッド・システムを用いてスクリーニングを行った。
【０１５０】
すなわち、ヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインに対して特異的に結合する新規アダプター分子のスクリーニングは、酵母ツー・ハイブリッド・システム「マッチメーカー（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ）ツー・ハイブリッド・システム３」（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーの中からヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインと相互作用するタンパク質を探索する方法で行った。
【０１５１】
すなわち、まず、転写因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインの融合ベクターであるプラスミドベクターｐＧＢＫＴ７（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）のマルチクローニング・サイトに対し、ヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメイン（ヒトＴＬＲ３を構成するアミノ酸配列のうち７４５〜９０４番目のアミノ酸配列）およびヒトＴＬＲ４のＴＩＲドメイン（ヒトＴＬＲ３を構成するアミノ酸配列のうち６２５〜７９９番目のアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ挿入することにより、いわゆる餌（ｂａｉｔ）プラスミドベクターとして、プラスミドベクターｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ３およびプラスミドベクターｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ４を作製した。また、転写因子ＧＡＬ４の活性化ドメインの融合ベクターであるプラスミドベクターｐＧＡＤＴ７（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に対し、ヒトの肺由来の「マッチメーカー」ｃＤＮＡライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を組み込んで、いわゆる獲物プラスミドベクター群を作製した。
【０１５２】
そして、酵母培地において、酵母細胞株ＡＨ１０９（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を、餌プラスミドベクターｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ３と、「マッチメーカー」ｃＤＮＡライブラリーより作製した獲物プラスミドベクター群とで形質転換した。酵母培地としては、Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｆ．，  Ｆｉｎｋ，  Ｇ．  Ｒ．，  ＆  Ｈｉｃｋｓ，  Ｊ．  Ｂ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｈｏｒ，  ＮＹ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｈｏｒ  ｐｒｅｓｓ．  （１９８６）に記載されたものを用いた。
【０１５３】
酵母ツー・ハイブリッド・システムでは、獲物プラスミドベクターと餌プラスミドベクターとが相互作用する場合にのみ、酵母細胞がプレート上で増殖できる。この場合、スクリーニング対象の１，０００，０００の形質転換体から、５つのクローンがＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｄｅプレート（トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン、およびアデニンのないＳＤ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｒｏｐｏｕｔ）培地プレート）上で成長した。
【０１５４】
これらのクローンからプラスミドを回収し、プラスミド内の挿入部位の配列を解析した。
【０１５５】
ＢＬＡＳＴ検索解析により、クローン２．３Ａ１−１がＮＣＢＩのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）配列から推定されたヒトの仮定的なｍＲＮＡ配列ＣＬ２４７５１を含むことが明らかとなった。挿入部位の５’領域内の１２塩基対が、仮定のｍＲＮＡ「ＬＯＣ１４８０２２」の３’末端と重なった。
【０１５６】
ＣＬ２４７５１は、ヒトのゲノムにおいてＬＯＣ１４８０２２からたった７５ｂｐしか離れていなかったという事、およびＬＯＣ１４８０２２の３´末端がポリアデニル酸末端を持たないという事は、これら２つの注釈付きのｍＲＮＡが１つの転写から得られたことを示唆している。
【０１５７】
これを確認するために、ＬＯＣ１４８０２２中に位置している５’プライマーおよびＣＬ２４７５１中の３’プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。種々の細胞および組織のｍＲＮＡから、予想されたＤＮＡ断片を増幅することに成功した。これにより、本願発明者等は、ＬＯＣ１４８０２２およびＣＬ２４７５１がそれぞれ、新規アダプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの５’断片および３’断片であると結論した。ＰＣＲによって得られた２つのｃＤＮＡ断片を連結することによって、完全長のｃＤＮＡが得られた。
【０１５８】
本願発明者等は、このタンパク質を「ＴＩＣＡＭ−１（ＴＩＲ含有アダプター分子−１）」と命名した。
【０１５９】
また、本願発明者等は、以下の方法でヒトＴＩＣＡＭ−１に対して相同性を持つマウス由来のタンパク質ＴＩＣＡＭ−１（マウスＴＩＣＡＭ−１）を見いだした。
【０１６０】
まず、ＥＳＴに登録されているマウスのｃＤＮＡの塩基配列からヒトＴＩＣＡＭ−１に相同性を有する配列を探索したところ、ヒトＴＩＣＡＭ−１に相同性を有するマウスＬＯＣ２２４８９９が見つかり、この塩基配列がヒトＴＩＣＡＭ−１のマウス相同体をコードするｃＤＮＡの塩基配列であるものと推定された。
【０１６１】
そこで、ヒトＴＩＣＡＭ−１のマウス相同体をコードするものと推定されたマウスＬＯＣ２２４８９９のアミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴプログラムにより、ヒトＴＩＣＡＭ−１のアミノ酸配列との相同性検索解析を行った。解析結果を図５に示す。なお、ヒトＴＩＣＡＭ−１タンパク質およびマウスＴＩＣＡＭ−１タンパク質のアミノ酸配列は、ｃＤＮＡの塩基配列から推定した。また、これらタンパク質のアミノ酸配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアラインメントした。
【０１６２】
図５において、ヒトＴＩＣＡＭ−１のアミノ酸配列を「ＴＩＣＡＭ−１．ｈｕ」、マウスＬＯＣ２２４８９９のアミノ酸配列を「ＴＩＣＡＭ−１．ｍｕ」と表している。図５において、アスタリスク（＊）は同一の残基を示し、２点（：）は保存された置換を示し、１点（・）は準保存された置換を示す。
【０１６３】
図５の結果から、ＥＳＴから推定したマウスＬＯＣ２２４８９９のアミノ酸配列が、ヒトＴＩＣＡＭ−１のアミノ酸配列と非常に類似しており、それゆえ、マウスＬＯＣ２２４８９９が、ヒトＴＩＣＡＭ−１のマウス相同体である可能性が高いことが明らかとなった。このことから、マウスＬＯＣ２２４８９９を、ヒトＴＩＣＡＭ−１のマウス相同体「マウスＴＩＣＡＭ−１」と同定した。
【０１６４】
また、ヒトＴＩＣＡＭ−１およびマウスＴＩＣＡＭ−１は、図５中に上線で示すＴＩＲに類似したモチーフ（ＴＩＲドメイン）を持っており、その領域はヒトＴＩＣＡＭ−１では３９４〜５３２番目のアミノ酸配列であり、マウスＴＩＣＡＭ−１では３９６〜５３４番目のアミノ酸配列であった。
【０１６５】
このマウスＴＩＣＡＭ−１は、ヒトＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲドメイン中のＮ末端領域およびＣ末端領域にあるプロリン・リッチな領域が部分的に欠失していた（図５参照）。マウスＴＩＣＡＭ−１は、ヒトＴＩＣＡＭ−１に対して５４％の同一性を持っていた。
【０１６６】
なお、ヒトＴＩＣＡＭ−１およびマウスＴＩＣＡＭ−１のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、ＤＤＢＪデータベースに登録済（本願出願時には未公表）であり、それらのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はそれぞれＡＢ０８６３８０およびＡＢ０９１０５３である。
【０１６７】
〔実施例４；酵母ツー・ハイブリッド・システムによる相互作用の解析〕
酵母ツー・ハイブリッド・システムにより、ヒトＴＬＲ３とヒトＴＩＣＡＭ−１との間の相互作用を解析した。
【０１６８】
すなわち、まず、プラスミドベクターｐＧＡＤＴ７（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に対し、ＴＩＣＡＭ−１遺伝子の部分的な断片を含むと推定されたｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＧＡＤＴ７のマルチクローニングサイトに組み込んで、いわゆる獲物ベクターとしてのプラスミドベクターｐＧＡＤＴ７−ＴＩＣＡＭ−１を作製した。また、獲物ベクターとしては、このプラスミドベクターｐＧＡＤＴ７−ＴＩＣＡＭ−１と、コントロールとしてのプラスミドベクターｐＧＡＤＴ７とを用いた。
【０１６９】
一方、餌ベクターとしては、前述したプラスミドベクターｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ３およびｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ４と、コントロールとしてのプラスミドベクターｐＧＢＫＴ７（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）とを用いた。
【０１７０】
そして、実施例４で用いたの同じ酵母培地において、酵母細胞株ＡＨ１０９（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を、２種類の獲物プラスミドベクターのいずれか（プラスミドベクターｐＧＡＤＴ７またはｐＧＡＤＴ７−ＴＩＣＡＭ−１）と、３種類の餌プラスミドベクターのいずれか（プラスミドベクターｐＧＢＫＴ７、ｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ３、またはｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ４）とで形質転換し、ＳＤ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｄｅプレート上で画線培養した。結果を図４に示す。
【０１７１】
この場合、上記の全ての組み合わせのうち、獲物プラスミドベクターｐＧＡＤＴ７−ＴＩＣＡＭ−１と餌プラスミドベクターｐＧＢＫＴ７−ＴＬＲ３との組合せだけが、細胞を増殖することができた。また、酵母ツー・ハイブリッド・システムにおいて、ヒトＴＬＲ３に代えてヒトＴＬＲ２を用いた場合にも、酵母中でＴＩＣＡＭ−１がクローニングされなかった（図示しない）。
【０１７２】
これにより、酵母ツー・ハイブリッド・システムによるスクリーニングによって同定されたｐＧＡＤＴ７−ＴＩＣＡＭ−１が、ヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインに対して特異的に結合するアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１（ヒトＴＩＣＡＭ−１）をコードする遺伝子の部分的な断片を含んでいることが確認された。
【０１７３】
〔実施例５；ＴＩＲドメインの比較〕
ヒトおよびマウスのＴＩＣＡＭ−１、Ｍａｌ（ＴＩＲＡＰ）、およびＭｙＤ８８のＴＩＲドメインのアラインメントを行い、これらを比較した。
【０１７４】
ヒトＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲドメイン（３９４〜５３２番目のアミノ酸配列）、マウスＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲドメイン（３９６〜５３４番目のアミノ酸配列）、ヒトＭｙＤ８８（アクセッション番号Ｕ７０４５１）のＴＩＲドメイン（１６０〜２９６番目のアミノ酸配列）、およびヒトＭａｌ／ＴＩＲＡＰ（アクセッション番号ＡＦ４０６６５２）のＴＩＲドメイン（８５〜２１６番目のアミノ酸配列）を、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてアラインメントした。ＴＩＲドメインの位置は、ＳＭＡＲＴプログラムを用いて推定した。アラインメントした結果を図６に示す。
【０１７５】
図６中においても、「ＴＩＣＡＭ−１．ｈｕ」および「ＴＩＣＡＭ−１．ｍｕ」はそれぞれ、「ヒトＴＩＣＡＭ−１」および「マウスＴＩＣＡＭ−１」を表す。また、アステリスク（＊）は同一の残基を示し、２点（：）は保存された置換を示し、１点（・）は準保存された置換を示す。Ｂｏｘ１〜３の詳細については、前述した文献を参照。
【０１７６】
〔実施例６；ＴＩＣＡＭ−１の検出〕
ヒトの多数の組織中におけるＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロットキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いたノーザンブロット法で解析した。すなわち、ヒトの１２レーンの「Ｈｕｍａｎ  ＭＴＮ  Ｂｌｏｔ」メンブレンおよび「Ｂｌｏｔ  Ｉｔ」メンブレン（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて、ヒトの多数の組織から抽出したｍＲＮＡを変性条件下で電気泳動した。電気泳動のパターンをフィルターにトランスファーし、Ｃ末端ＴＩＣＡＭ−１プローブ（ヒトＴＩＣＡＭ−１をコードするｃＤＮＡの１４０６〜２１９３番目の塩基配列を３２Ｐで標識したもの）を用いて厳しい条件でハイブリダイズした。「ＢＡＳ２０００」画像解析装置（富士フィルム株式会社製）を用いて１日間露出を行うことによりフィルター上のパターンを撮像した。結果を図７の上段に示す。
【０１７７】
コントロールとして標識したβ−アクチンプローブを用いて同様の操作を行い、４時間露出でフィルター上のパターンを撮像した。結果を図７の下段に示す。
【０１７８】
図７に示すように、末梢血白血球（ＰＢＬ）、脳（ｂｒａｉｎ）、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）、胸腺（ｔｈｙｍｕｓ）、肝臓（ｌｉｖｅｒ）、肺（ｌｕｎｇ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、骨格筋（ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ）、心臓（ｈｅａｒｔ）、および胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）を含むたいていの組織において、２．６キロベース（ｋｂ）のヒトＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡが検出された。
【０１７９】
〔実施例７；ＲＴ−ＰＣＲによるＴＩＣＡＭ−１の検出〕
図８に示す複数種のヒト細胞およびヒト細胞株からトータルのＲＮＡを単離し、ヒトＴＩＣＡＭ−１のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲサイクルは３５サイクル実行した。
【０１８０】
図８において、ＭｆおよびｉＤＣはそれぞれ、マクロファージおよび未熟樹状細胞を表す。「−」は、鋳型なしのコントロールを示す。また、β−アクチンプライマーをコントロールとして用いてＰＣＲサイクルを２０サイクル実行した。
【０１８１】
ヒト末梢血から用意した、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）、マクロファージ（ＭΦ）、およびＮＫ（ナチュラルキラー）細胞は全て、ヒトＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡを発現した（図８）。また、リンパ系の細胞株（Ｔ細胞ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｔ細胞Ｍｏｌｔ−４、Ｂ細胞Ｎａｍａｌｗａ）および線維芽細胞の細胞株（ＭＲＣ５）も、ヒトＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡが陽性であった（図８）。
【０１８２】
これらの結果を総合すれば、ヒトＴＩＣＡＭ−１の発現がβ−アクチンの発現と比較して遍在しており、かつ、弱いと推論される。
【０１８３】
〔実施例８；免疫沈降法によるＴＩＣＡＭ−１とＴＬＲ３の相互作用解析〕
ヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインとＴＩＣＡＭ−１との会合は、ヒトＴＬＲ３（Ｆｌａｇ標識付）およびヒトＴＩＣＡＭ−１（ＨＡ標識付）を発現しているＨＥＫ２９３細胞の免疫沈降法（イムノプレシピテーション）によって確認した。
【０１８４】
まず、６ウェルのプレートで、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬（Ｇｉｂｃｏ社製）を用い、ヒトＴＬＲ３−Ｆｌａｇ発現ベクター（Ｆｌａｇタグ付きＴＩＣＡＭ−１発現ベクター）３μｇおよびＴＩＣＡＭ−１−ＨＡ発現ベクター（ＨＡタグ付きＴＩＣＡＭ−１発現ベクター）０．５μｇで過渡的にトランスフェクトした。このとき、空ベクターを加えることによって、ＤＮＡの総量を一定（４μｇ）に保った。
【０１８５】
トランスフェクトの２４時間後、細胞を、培地のみ（図９のレーン１およびレーン３）、あるいはポリ（Ｉ：Ｃ）１０μｇ／ｍｌ（図９のレーン２およびレーン４）で１５分間刺激し、溶出バッファ（ｐＨ７．５；２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１重量％のＮＰ４０、２ｍＭのＰＭＳＥ、２５ｍＭのインドアセトアミド、および１０ｍＭのＥＤＴＡを含む）中に溶出させた。
【０１８６】
遠心分離後に、細胞溶出液を、免疫沈降プローブ（ＩＰ）としてマウスＩｇＧ１（図９のレーン１およびレーン２）または抗ＦｌａｇＭ２抗体（図９のレーン３およびレーン４；Ｓｉｇｍａ社製）と共に４℃で２時間かけてインキュベートし、免疫沈降させた。コントロール反応のために、マウスＩｇＧ１を用いた。免疫複合体を、プロテインＧ−セファロースにより沈降させ、沈降物を良く洗浄した。
【０１８７】
そして、１重量％のＳＤＳ、０．２重量％のＮＰ−４０、および５重量％の２−メルカプトエタノールを含むＤＰＢＳを加えて煮沸することによって、免疫沈降したタンパク質を抽出した。次に、抽出物を抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。溶出液も、トランスフェクトされたＴＩＣＡＭ−１−ＨＡの発現を調べるために免疫ブロットした。
【０１８８】
得られた結果（ウエスタンブロット；ＷＢ）を図９に示す。なお、表中の、＋はそれでトランスフェクションあるいは刺激をしたことを、−はそれでトランスフェクションあるいは刺激をしなかったことを示す。また、中央パネルは細胞溶出液の一部のウエスタンブロット（免疫ブロット）であり、下パネルは細胞溶出液全体のウエスタンブロットである。
【０１８９】
図９に示すように、ヒトＴＬＲ３およびヒトＴＩＣＡＭ−１との両方を含む分子複合体が、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫沈降によって検出された（図９のレーン３およびレーン４；上パネルの矢印で指す位置）。したがって、ヒトＴＩＣＡＭ−１が、ヒトＴＬＲ３と会合することが確認された。
【０１９０】
また、ヒトＴＬＲ３に対する特定のモノクローナル抗体ＴＬＲ３．７（非特許文献１参照）の存在下においても、類似のヒトＴＬＲ３とヒトＴＩＣＡＭ−１との会合が確認された（図示しない）。また、ヒトＴＬＲ３を発現した細胞のポリ（Ｉ：Ｃ）による刺激は、この分子会合にほとんど影響を与えなかった（図９）。
【０１９１】
細胞溶出液全体のウエスタンブロット（ＷＢ）は、ＴＩＣＡＭ−１−ＨＡ（中央パネルの矢印で指している位置）の発現を示した。細胞溶出液全体のウエスタンブロットでは、ヒトＴＩＣＡＭ−１のメジャーバンドの上の高分子量型も検出された（図９の上パネル）。これは、リン酸化型を表すと考えられる。
【０１９２】
次に、同じ条件の下で、他のＴＬＲおよびＴＬＲ３変異体に対してＴＩＣＡＭ−１が結合するかを調べた（図１０）。
【０１９３】
まず、ＨＥＫ２９３細胞は、ヒトＴＩＣＡＭ−１−ＨＡ（０．０５μｇ）と共に、空ベクター（４μｇ）あるいはヒトＴＬＲ３−Ｆｌａｇ発現ベクター（３μｇ）、ＴＬＲ３Ａ７９５Ｈ−Ｆｌａｇ発現ベクター（３μｇ）、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ２発現ベクター（２μｇ）、Ｆｌａｇ−ＴＬＲ４発現ベクター（２μｇ）、あるいはＭＤ−２発現ベクター（１μｇ）で過渡的にトランスフェクトした。このとき、空ベクターを加えることによって、ＤＮＡの総量を一定（４μｇ）に保った。トランスフェクトの２４時間後に、細胞を溶出バッファで溶出した。
【０１９４】
溶出液をマウスＩｇＧ１（図示しない）または抗ＦｌａｇＭ２抗体（レーン１〜５）で免疫沈降した。そして、１重量％のＳＤＳ、０．２重量％のＮＰ−４０、および５重量％の２−メルカプトエタノールを含むＤＰＢＳを加えて煮沸することによって、免疫沈降したタンパク質を抽出した。次に、抽出物を抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。溶出液も、トランスフェクトされたＴＩＣＡＭ−１−ＨＡの発現を調べるために免疫ブロットした。抗Ｆｌａｇ抗体または抗ＨＡ抗体を用いて免疫ブロットを行った。
【０１９５】
得られた結果を図１０に示す。なお、表中の、＋はそれでトランスフェクションをしたことを、−はそれでトランスフェクションをしなかったことを示す。図１０の上パネルは、免疫沈降されたＦｌａｇタグ付きＴＬＲタンパク質を示す。図１０の中パネルは、（レーン２だけ示す）野生型のＴＬＲ３（カッコあるいは矢印）と相互作用するＴＩＣＡＭ−１を示す。図１０の下パネルは、トランスフェクトされたＴＩＣＡＭ−１−ＨＡ（矢印）の発現を示す。
【０１９６】
図１０に示すように、ヒトＴＬＲ３は、ヒトＴＩＣＡＭ−１と共沈したが、ＴＬＲ３変異体Ａ７９５Ｈ、ＴＬＲ２、およびＴＬＲ４とは共沈しなかった。すなわち、Ａ７９５Ｈ  ＴＬＲ３変異体は、ＴＩＣＡＭ−１と結合する能力を失った（図１０）。ＴＬＲ２およびＴＬＲ４は、ＭＤ−２と共発現した場合でさえ、ＴＩＣＡＭ−１を共沈できなかった（図１０）。これらの結果は、ＴＬＲ２に対するモノクローナル抗体およびＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体を用いた場合にも、確認された（図示しない）。
【０１９７】
これらの結果から、ヒトＴＩＣＡＭ−１がヒトＴＬＲ３に対して特異的に結合することが確認された。
【０１９８】
また、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体を用いた実験における、イースト・ツー・ハイブリッド分析および特異性確認の結果を総合すれば、ヒト細胞中において、ヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインはアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と会合できることができる一方、ＴＬＲ２やＴＬＲ４はアダプタータンパク質ＴＩＣＡＭ−１と会合できないと結論できる。
【０１９９】
〔実施例９；ヒトＴＩＣＡＭ−１およびその変異体の発現ベクター作製〕
図１１に示すように、ヒトＴＩＣＡＭ−１と、その３種類の変異体、すなわちヒトＴＩＣＡＭ−１の１〜２８８番目のアミノ酸配列を欠失させた変異体（以下、「ヒトＴＩＣＡＭ−１（ΔＮ２８８）」と表記する）、ヒトＴＩＣＡＭ−１の１〜３８６番目のアミノ酸配列を欠失させた変異体（以下、「ヒトＴＩＣＡＭ−１（ΔＮ３８６）」と表記する）、およびほぼヒトＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲドメインのみからなる変異体（以下、「ヒトＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲ」と表記する）をそれぞれコードする３種類の発現ベクターを作製した。上記のほぼヒトＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲドメインのみからなる変異体（ヒトＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲ）は、より詳細には、ヒトＴＩＣＡＭ−１の１〜３８６番目のアミノ酸配列と５５７〜７１２番目のアミノ酸配列とを欠失させた変異体、すなわちヒトＴＩＣＡＭ−１を構成するアミノ酸配列のうち３８７〜５５６番目のアミノ酸配列からなる変異タンパク質を作製した。
【０２００】
ＴＩＣＡＭ−１をコードする完全長のｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＥＦＢＯＳのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイトに組み込んでヒトＴＩＣＡＭ−１発現ベクターとした。ｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−１（ΔＮ２８８）、ｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−１（ΔＮ３８６）、およびｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−１（ＴＩＲ）は、それぞれ、Ｋｏｚａｃｋ配列および第１のＡＴＧの後に続いているＴＩＣＡＭ−１の２８９−７１２番目のアミノ酸配列、３８７−７１２番目のアミノ酸配列、および３８７−５５６番目のアミノ酸配列をコードする配列をプラスミドベクターｐＥＦＢＯＳのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩサイト中に挿入することによって作製した。これらプラスミドベクターは、内毒素を含まない「Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ」キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）で調製した。
【０２０１】
〔実施例１０；ヒトＴＩＣＡＭ−１の変異による機能解析〕
ヒトＴＩＣＡＭ−１の機能解析を行うために、ヒトＴＩＣＡＭ−１およびその変異体について、ＮＦ−κＢおよびインターフェロンβの活性化度を測定するリポーター遺伝子発現アッセイを行った。すなわち、インターフェロンβプロモーター等に対するＴＩＣＡＭ−１の機能的な結合をＨＥＫ２９３細胞中で調べた。
【０２０２】
２４ウェルのプレート上のＨＥＫ２９３細胞（１ウェル当たり２×１０５個）を、遺伝子導入用カチオン性脂質「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」試薬（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）０．１μｇ（図１２（ｂ））またはｐ１２５  ｌｕｃリポータープラスミド０．１μｇ（図１２（ａ））と、空ベクター、ヒトＴＩＣＡＭ−１ＴＩＲ、ヒトＴＩＣＡＭ−１（ΔＮ３８６）、ヒトＴＩＣＡＭ−１（ΔＮ２８８）、または完全長のヒトＴＩＣＡＭ−１を発現するベクター（それぞれ１０ｎｇまたは１００ｎｇ）とでトランスフェクトした。空ベクターを添加することによって、トランスフェクトされるＤＮＡの総量（０．８〜１．０μｇ）を調整した。また、内部コントロールとして、プラスミドベクターｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；５ｎｇ）を用いた。
【０２０３】
トランスフェクトの２４時間後に、細胞を溶出バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶出した。この溶出液について、トランスフェクト後の刺激によるＮＦ−κＢの活性化の度合いを表すルシフェラーゼの活性を、製造業者の使用説明書に従って測定した。また、計３回の実験を行い、それらの代表値を測定値とした。インターフェロンβの活性化度を図１２（ａ）に、ＮＦ−κＢの活性化度を図１２（ｂ）にそれぞれ示す。
【０２０４】
結果として、インターフェロンβプロモーター活性化の顕著な亢進が、少量（０．１μｇ）の完全長ヒトＴＩＣＡＭ−１を発現しているＨＥＫ２９３細胞において観察された（図１２（ａ））。図１２の染色体欠失分析は、ヒトＴＩＣＡＭ−１由来のＴＩＲドメインが、顕性不活性体として作用するＭｙＤ８８のＴＩＲとは異なり、上記機能を担っていることを示唆している。ＴＩＲドメインに対するＮ末端領域およびＣ末端領域の連結反応は、インターフェロンβプロモーターの活性化度を高めた（図１２（ａ））。それゆえ、ヒトＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲドメインは、ヒトＴＬＲ３の末端を下流の分子と結合させてインターフェロンβプロモーターを活性化するのに十分な最小の必須成分と考えられる。
【０２０５】
また、図１２（ｂ）に示すヒトＴＩＣＡＭ−１によるＮＦ−κＢを活性化する能力を類似のトランスフェクト実験で調べた結果から、完全長のＴＩＣＡＭ−１は、インターフェロンβプロモーターと比較して弱くＮＦ−κＢプロモーターを活性化することが分かった。ＮＦ−κＢの活性化能は、ＴＩＲドメインあるいは完全長のＴＩＣＡＭ−１を持つ細胞よりも、Ｎ末端ドメインのない変異体の方が高かった（図１２）。それゆえ、Ｎ末端配列は、トランスフェクタント上でのインターフェロンβ産生に対して強い優先性を誘導し、同時にＮＦ−κＢの活性化を比較的抑制すると思われる。また、Ｃ末端領域は、インターフェロンβおよびＮＦ−κＢ活性化の両方を少し増強した（図１２）。
【０２０６】
さらに、完全長のヒトＴＩＣＡＭ−１を発現している細胞においては、ＴＬＲ３のトランスフェクトなしにインターフェロンβプロモーターの活性化が誘発されることがあった（図１２）。
【０２０７】
このことから、ヒトＴＩＣＡＭ−１は、自発的に、インターフェロンβプロモーターを活性化し、インターフェロンβの産生を誘導すると考えられる。この自発的なインターフェロンβの産生誘導は、ヒトＴＩＣＡＭ−１が、未知の分子とのホモ二量化あるいは錯体形成を起こすことに起因すると考えられる。この研究結果は、自動二量化する傾向があるアダプター分子Ｍａｌに関する研究、および同じく自動二量化する傾向があるアダプター分子ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの構造解析結果と整合している。
【０２０８】
〔実施例１１；ＴＬＲ３によって媒介されるシグナル伝達の解析〕
次に、ヒトＴＬＲ３によって媒介されるシグナル伝達を解析するためのリポーター遺伝子発現アッセイを行った。すなわち、ＴＩＣＡＭ−１の最小の必須成分であるＴＩＲドメインをＨＥＫ２９３細胞に用い、インターフェロンβプロモーターの活性化に対するＴＬＲ３および／またはポリ（Ｉ：Ｃ）の効果が相加的なものであるかどうかを調べた。
【０２０９】
まず、ヒトＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲ発現ベクター（ｐＥＦＢＯＳ−ＴＩＣＡＭ−１（ＴＩＲ））に対して、４３４番目のアミノ酸（プロリン）をヒスチジンに置換する点突然変異を挿入することによって、ヒトＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲの顕性不活性な変異体を作製した。作製した変異体は、「ＴＩＲ  Ｐ４３４Ｈ」と命名した。
【０２１０】
２４ウェルのプレート上のＨＥＫ２９３細胞（１ウェル当たり２×１０５個）を、遺伝子導入用カチオン性脂質「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」試薬（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）０．１μｇ（図１３（ｂ））またはｐ１２５  ｌｕｃリポータープラスミド０．１μｇ（図１３（ａ））と、ＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲ（０．１ｎｇおよび１０ｎｇ）またはＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲの顕性不活性な変異体ＴＩＲ  Ｐ４３４Ｈをコードしているプラスミド（０、０．２μｇ、０．６μｇ）と、空ベクター、ＴＬＲ２（０．１μｇ）、またはＴＬＲ３（０．１μｇ）とでトランスフェクトした。空ベクターを添加することによって、トランスフェクトされるＤＮＡの総量（０．８〜１．０μｇ）を調整した。また、内部コントロールとして、プラスミドベクターｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；５ｎｇ）を用いた。
【０２１１】
トランスフェクトの２４時間後に、細胞を１００ｎＭのＭＡＬＰ−２（ＴＬＲ２刺激）あるいは１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３刺激）で６時間刺激し、細胞を溶出バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶出した。この溶出液について、トランスフェクト後の刺激によるインターフェロンβの活性またはＮＦ−κＢの活性を表すルシフェラーゼの活性を、製造業者の使用説明書に従って測定した。また、計３回の実験を行い、それらの代表値を測定値とした。インターフェロンβの活性化度を図１３（ａ）に、ＮＦ−κＢの活性化度を図１３（ｂ）にそれぞれ示す。
【０２１２】
ＴＬＲ３およびＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲの両方をトランスフェクトした結果、インターフェロンβプロモーターが強く活性化された（図１３）。また、低い導入量のＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲトランスフェクタント（図１３）の結果から非常に明確に示されているように、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるこトランスフェクタントの刺激は、ＴＩＣＡＭ−１を介するインターフェロンβプロモーターの活性化を亢進した。ヒトＴＩＣＡＭ−１を発現している細胞に対してヒトＴＬＲ３コトランスフェクションおよびポリ（Ｉ：Ｃ）刺激を行ったことによるＮＦ−κＢ活性化の亢進がみられた（図１３）。一方、ヒトＴＬＲ２を発現する細胞に対してＴＩＣＡＭ−１による追加のトランスフェクションを行っても、ヒトＴＬＲ２刺激に応答したＮＦ−κＢの活性化が起こらなかった（図１３）。これらから、ヒトＴＩＣＡＭ−１がヒトＴＬＲ３に対して特異性を有していると考えられる。また、ＨＥＫ２９３細胞中でＴＩＣＡＭ−１のＴＩＲと共にＴＬＲ２を発現させたところ、ヒトＴＬＲ２のリガンドであるマイコプラズマリポペプチドＭＡＬＰ−２で刺激された細胞中でさえ、インターフェロンβプロモーターの発現を活性化しなかった（図１３）。
【０２１３】
以上のことから、ヒトＴＩＣＡＭ−１に対するヒトＴＬＲ３の機能的な会合は、ポリ（Ｉ：Ｃ）によって媒介されるインターフェロンβプロモーターの活性化に関与すると考えられる。
【０２１４】
また、興味深いことに、活性なＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲの代わりにＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲの顕性不活性な変異体Ｐ４３４Ｈをトランスフェクトした場合、ポリ（Ｉ：Ｃ）−ＴＬＲ３によって媒介されるインターフェロンβプロモーターおよびＮＦ−κＢの活性化が完全にキャンセルされた（図１３）。これは、ＴＩＣＡＭ−１  ＴＩＲの顕性不活性な変異体Ｐ４３４Ｈは、ヒトＴＬＲ３に結合する能力を持つ一方、インターフェロンβの産生を誘導する能力を失っているためと考えられる。したがって、この変異体は、むしろヒトＴＬＲ３を介するシグナル伝達を遮断してインターフェロンβの産生を阻害するものと考えられる。
【０２１５】
〔実施例１２；アダプター分子の機能解析〕
次に、ヒトＴＩＣＡＭ−１と既知のアダプター分子ＭｙＤ８８およびＭａｌ／ＴＩＲＡＰとの間でインターフェロンβおよびＮＦ−κＢの活性化度を比較するためのリポーター遺伝子発現アッセイを行った。
【０２１６】
２４ウェルのプレート上のＨＥＫ２９３細胞（１ウェル当たり２×１０５個）を、遺伝子導入用カチオン性脂質「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００」試薬（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて、ルシフェラーゼを連結したＮＦ−κＢレポータ遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）０．１μｇ（図１４（ｂ））またはｐ１２５  ｌｕｃリポータープラスミド０．１μｇ（図１４（ａ））と、空ベクター、ＭｙＤ８８、Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰ、または完全長のＴＩＣＡＭ−１（それぞれ１０、１００、または２００ｎｇ）とでトランスフェクトした。空ベクターを添加することによって、トランスフェクトされるＤＮＡの総量（０．８〜１．０μｇ）を調整した。また、内部コントロールとして、プラスミドベクターｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製；５ｎｇ）を用いた。
【０２１７】
トランスフェクトの２４時間後に、細胞を溶出バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で溶出した。この溶出液について、インターフェロンβの活性またはＮＦ−κＢの活性を表すルシフェラーゼの活性を、製造業者の使用説明書に従って測定した。また、計３回の実験を行い、それらの代表値を測定値とした。インターフェロンβの活性化度を図１４（ａ）に、ＮＦ−κＢの活性化度を図１４（ｂ）にそれぞれ示す。
【０２１８】
インターフェロンβプロモーターおよびＮＦ−κＢの活性化プロフィールを比較（図１４）すると、これらの３つのアダプター分子は、ＮＦ−κＢに対して類似レベルの活性化を誘導した（図１４）のに対し、ＴＬＲ３および／またはポリ（Ｉ：Ｃ）のようないかなる刺激もない条件において、完全長のヒトＴＩＣＡＭ−１によるインターフェロンβプロモーター誘発活性は、アダプター分子Ｍａｌ／ＴＩＲＡＰまたはＭｙＤ８８によるインターフェロンβプロモーター誘発活性と比較して１００倍以上高かった（図１４）。したがって、ヒトＴＩＣＡＭ−１は、インターフェロンβプロモーターに対してより直接的に作用し、インターフェロンβの産生を顕著に亢進することができると考えられる。
【０２１９】
〔実施例１３；ウエスタンブロット〕
ＨＥＫ２９３細胞を、アダプター分子Ｍａｌ−ＨＡ、ＭｙＤ８８−ＨＡ、あるいはＴＩＣＡＭ−１−ＨＡをそれぞれコードするプラスミド（１００ｎｇ）で過渡的にトランスフェクトした。トランスフェクトから２４時間後に、細胞を溶解し、発現されたタンパク質を抗ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロット法により解析した。
【０２２０】
得られたウエスタンブロットを図１５に示す。左側の黒い矢印はＭａｌ−ＨＡの発現を示し、中央の白抜きの矢印はＭｙＤ８８−ＨＡを示し、右側の矢印はＴＩＣＡＭ−１−ＨＡの発現を示す。図１５の結果から、これらのアダプター分子は、妥当なタンパク質発現レベルを持つことが確認された。
【０２２１】
〔実施例１４；ＴＩＣＡＭ−１ノックダウン〕
次に、ＴＩＣＡＭ−１を介するインターフェロンβの産生誘導へのシグナル伝達を確認するために、一本鎖ＲＮＡのトランスフェクションによってヒトＴＩＣＡＭ−１ノックダウン細胞を生成した。
【０２２２】
ヒトＴＩＣＡＭ−１の一本鎖ＲＮＡの配列は、図１６に示すように、センスがｒ［ＧＡＣＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＵＣＣＡＡＣ］ｄ［ＴＴ］であり、アンチセンスがｒ［ＧＵＵＧＧＡＧＵＧＧＣＧＵＣＵＧＧＵＣ］ｄ［ＴＴ］（ＴＩＣＡＭ−１）である。「ｒ」および「ｄ」はそれぞれ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを表す。ＴＩＣＡＭ−１のメッセージ中における一本鎖ＲＮＡ領域を、一本鎖ＲＮＡ配列の下に示す。
【０２２３】
遺伝子をサイレントにするのに有効なヒトＴＩＣＡＭ−１メッセージ中における一本鎖ＲＮＡのトランスフェクションの位置は、図１６に示すように、９８６〜１００８番目の塩基配列（ｂｐ）である。
【０２２４】
ＨｅＬａ細胞およびＭＲＣ−５細胞は、細胞表面上でＴＬＲ３を発現し、外因的に付加的なポリ（Ｉ：Ｃ）に応答してインターフェロンβを産生した。これらは両方とも、ＴＩＣＡＭ−１およびＴＬＲ３のｍＲＮＡを含んでいた（データは示していない）。一本鎖ＲＮＡを上記の位置に導入した細胞内ではインターフェロンβの産生が部分的に減少していた。
【０２２５】
〔実施例１５；ＲＴ−ＰＣＲ〕
ヒトＴＩＣＡＭ−１のプライマーまたはβ−アクチンのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。結果を図１７に示す。図１７（ａ）はＨｅＬａ細胞であり、図１７（ｂ）はＭＲＣ−５細胞である。
【０２２６】
用いたヒトＴＩＣＡＭ−１のプライマーの配列は、５’ＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＧ３’（５’プライマー）および５’ＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＣ３’（３’プライマー）である。
【０２２７】
ヒトＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルは、ＨｅＬａ細胞およびＭＲＣ−５細胞中においてＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）法によって約８０％抑制された（図１７）。
【０２２８】
したがって、これらの実験によって、ＴＩＣＡＭ−１が、二本鎖ＲＮＡによって媒介されたＴＬＲ３の活性化とインターフェロンβの産生とをつなぐアダプター分子であるという直接的な証拠が得られた。
【０２２９】
〔実施例１６；ＲＮＡｉ〕
ＲＮＡｉにより二本鎖ＲＮＡの補充が、ヒトＴＩＣＡＭ−１が減少されたＨｅＬａ細胞およびＭＲＣ−５細胞中におけるインターフェロンβタンパク質の産生を誘発するかどうかを調べた。
【０２３０】
ＨｅＬａ細胞またはＭＲＣ−５細胞を、「Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；最終濃度２００ｎＭ）を用い、バッファだけ、ラミン（Ｌａｍｉｎ）Ａ／Ｃの一本鎖ＲＮＡ（コントロール；最終濃度２００ｎＭ）、またはヒトＴＩＣＡＭ−１の一本鎖ＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクトから４８時間後に、ＨｅＬａ細胞およびＭＲＣ−５細胞をそれぞれ、５０μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）で刺激した。２４時間の刺激の前（０時間刺激後）および２４時間の刺激の後における上清のインターフェロンβの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。ＨｅＬａ細胞の測定結果を図１８（ａ）に、ＭＲＣ−５細胞の測定結果を図１８（ｂ）に示す。
【０２３１】
ＲＮＡｉの基本的な方法は、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｈａｒｂｏｒｔｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，  Ｗ．，  Ｙａｌｃｉｎ，  Ａ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｋ．，  ＆  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  Ｄｕｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＲＮＡｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：  ４９４−４９８  （２００１）に記載されている。また、詳細な手順および条件はＯｓｈｉｕｍｉ，  Ｈ．，  Ｂｒｇｕｍ，  Ｎ．  Ａ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｍ．，  ＆  Ｓｅｙａ，  Ｔ．  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍｅ，  Ｊｐｎ．  １２０：  ９１−９５  （２００２）に記載されている。
【０２３２】
ヒトＴＩＣＡＭ−１の一本鎖ＲＮＡの配列は、センスがｒ［ＧＡＣＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＵＣＣＡＡＣ］ｄ［ＴＴ］であり、アンチセンスがｒ［ＧＵＵＧＧＡＧＵＧＧＣＧＵＣＵＧＧＵＣ］ｄ［ＴＴ］（ＴＩＣＡＭ−１）である。また、ｌａｍｉｎＡ／Ｃの一本鎖ＲＮＡの配列は、センスがｒ［ＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡ］ｄ［ＴＴ］、アンチセンスがｒ［ＵＧＵＵＣＵＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＣＡＧ］ｄ［ＴＴ］である。ここで、「ｒ」および「ｄ」はそれぞれ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを表す。これらの一本鎖ＲＮＡは、Ｘｅｒａｇｏｎ社（ＵＳＡ）から購入した。
【０２３３】
ポリ（Ｉ：Ｃ）（１０μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬ）で刺激した細胞（ＨｅＬａ細胞またはＭＲＣ−５細胞）を２４時間（２４ｈ）培養し、上清を採取した。培養液の上清中におけるヒトインターフェロンβの濃度は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着定量法；ＴＥＢ社製）によって測定した。結果を図１８に示す。
【０２３４】
これらの細胞中においては、インターフェロンβ産生のレベルは、一本鎖ＲＮＡによって約５０％まで特異的に阻害された（図１８）。
【０２３５】
したがって、これらの実験によって、ＴＩＣＡＭ−１が、二本鎖ＲＮＡによって媒介されたＴＬＲ３の活性化とインターフェロンβの産生とをつなぐアダプター分子であるという直接的な証拠が得られた。
【０２３６】
【発明の効果】
本発明は、以上のように、哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体３に対して特異的に結合してＩ型インターフェロンの産生を誘導する新規アダプタータンパク質およびその変異体、上記タンパク質の遺伝子、上記遺伝子を含む組換え発現ベクター、上記タンパク質に対する抗体を提供できる。
【０２３７】
これらは、〔発明の実施の形態〕の欄で詳述したように、上記ＴＬＲ３を介したシグナル伝達系ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料、当該シグナル伝達系やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析、Ｂ型肝炎やＣ型肝炎等のウイルス感染症の予防・治療、腫瘍の治療、自己免疫疾患の治療、アトピー性疾患の治療等に有用である。
【０２３８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＴＬＲによるＮＦ−κＢの活性化をリポーター遺伝子発現アッセイにより解析した結果を示す図である。
【図２】ヒトＴＬＲによるインターフェロンβプロモーターの活性化をリポーター遺伝子発現アッセイにより解析した結果を示す図である。
【図３】ヒトＴＬＲ３およびその変異体によるＮＦ−κＢおよびインターフェロンβプロモーターの活性化をリポーター遺伝子発現アッセイにより解析した結果を示す図である。
【図４】酵母ツー・ハイブリッド・システムによるタンパク間の相互作用を調べた結果を示す図である。
【図５】ヒトＴＩＣＡＭ−１とマウスＴＩＣＡＭ−１との相同性検索の結果を示す図である。
【図６】ヒトＴＩＣＡＭ−１およびマウスＴＩＣＡＭ−１と、既知のアダプター分子ＭａｌおよびＭｙＤ８８のＴＩＲドメインを示す図である。
【図７】ヒトの多数の組織中におけるＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡの発現を示すノーザンブロットである。
【図８】ＲＴ−ＰＣＲにより複数種のヒト細胞およびヒト細胞株におけるＴＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡを検出した結果を示す図である。
【図９】ヒトＴＩＣＡＭ−１とヒトＴＬＲ３の相互作用を解析するための免疫沈降法の結果を示す図である。
【図１０】ヒトＴＩＣＡＭ−１と、ヒトＴＬＲ３以外のヒトＴＬＲやヒトＴＬＲ３変異体との相互作用を解析するための免疫沈降法の結果を示す図である。
【図１１】ヒトＴＩＣＡＭ−１の変異体を示す図である。
【図１２】ヒトＴＩＣＡＭ−１およびその変異体について、ＮＦ−κＢ活性およびインターフェロンβプロモーター活性の測定結果を示す図である。
【図１３】ＴＬＲ３によって媒介されるシグナル伝達を解析するためのリポーター遺伝子発現アッセイによるＮＦ−κＢ活性およびインターフェロンβ活性の測定結果を示す図である。
【図１４】ヒトＴＩＣＡＭ−１および既知のアダプター分子についてでインターフェロンβ活性およびＮＦ−κＢ活性を測定した結果を示す図である。
比較するためのリポーター遺伝子発現アッセイを行った。
【図１５】ＨＥＫ２９３細胞中におけるヒトＴＩＣＡＭ−１および既知のアダプター分子の発現を示すウエスタンブロットである。
【図１６】ヒトＴＩＣＡＭ−１の一本鎖ＲＮＡの配列を示す図である。
【図１７】ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図１８】ＲＮＡｉによる解析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2004180540.tif 000039
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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