(57)【要約】【課題】結晶化探索プレートに多数形成したウェルの各混合ドロップを高能率に観察でき、更に結晶生成の有無や結晶の大きさ等を正確且つ確実に検出できるようにする。【解決手段】ウェル２ａが縦横に複数形成された結晶化探索プレート２を略水平且つ上下複数段に収容するプレート支持枠６を有するプレート収容本体１と、ウェル２ａに照明を当てる照明装置と、照明によるウェル２ａからの光の変化を検出するための撮影装置とを有する光検出装置７と、光検出装置７をプレート収容本体１に対して前後・左右・上下に移動して全てのウェル２ａを検出する移動駆動装置８Ｙ，８Ｘ，８Ｚと、撮影装置からの信号を画像処理して各ウェル２ａにおける結晶の生成が検出できる画像信号を出力する画像処理装置と、移動駆動装置８Ｙ，８Ｘ，８Ｚによる光検出装置７の移動を制御する制御装置とを備える。【選択図】　　　　図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化剤溶液と混合ドロップとを内部に収容して蒸気拡散を行うウェルが縦横に複数形成された結晶化探索プレートを略水平且つ上下に複数段に配置し、前記ウェルの混合ドロップに照明を当てて光の変化を検出できるようにした光検出装置を設け、該光検出装置を左右・前後に移動することにより結晶化探索プレートの各ウェルに対する検出を行い、続いて光検出装置を上下方向に移動した後再び前後・左右に移動することにより別の結晶化探索プレートの各ウェルに対する検出を行い、前記光検出装置の検出結果から各ウェルにおける結晶の生成を観察することを特徴とする結晶観察方法。
【請求項２】
前記光検出装置の照明が透過明視野照明であることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法。
【請求項３】
前記光検出装置の照明が透過直交ニコル照明であることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法。
【請求項４】
前記ウェルの混合ドロップがハンギングドロップであるとき、アッパーガラスから照明を当てることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法。
【請求項５】
前記ウェルの混合ドロップがシッティングドロップであるとき、ロワーガラスから照明を当てることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法。
【請求項６】
結晶化剤溶液と混合ドロップとを内部に収容するウェルが縦横に複数形成された結晶化探索プレートを略水平且つ上下複数段に収容するプレート支持枠を有するプレート収容本体と、
ウェルの混合ドロップに照明を当てる照明装置と、照明による混合ドロップからの光の変化を検出するための撮影装置とを有する光検出装置と、
該光検出装置を前記プレート収容本体に対して前後・左右・上下に移動可能に支持し全てのウェルの混合ドロップを観察するようにした移動駆動装置と、
移動駆動装置による光検出装置の移動を制御する制御装置と、
を備えたことを特徴とする結晶観察装置。
【請求項７】
照明装置の照明投射側と撮影装置の受光側に、偏光を揃えた方向を互いに直交させ得る偏向フィルタを備えたことを特徴とする請求項６記載の結晶観察装置。
【請求項８】
前記偏光を揃えた方向が互いに直交した偏向フィルタを、直交を保持したまま同時に回転させる回転駆動装置を備えていることを特徴とする請求項７記載の結晶観察装置。
【請求項９】
撮影装置からの信号を画像処理して各ウェルにおける結晶の生成を検出する画像信号を出力するようにした画像処理装置を備えていることを特徴とする請求項６記載の結晶観察装置。
【請求項１０】
前記画像処理装置の画像信号から結晶が生成したことを表示する表示装置を備えたことを特徴とする請求項９記載の結晶観察装置。
【請求項１１】
前記光検出装置の検出結果を記録する画像記録装置を備えたことを特徴とする請求項６又は９記載の結晶観察装置。
【請求項１２】
前記略コの字状の光検出装置の上部突部と下部突部の一方に撮影装置を備え、上部突部と下部突部の他方に前記撮影装置に対応する位置に移動して切換えが可能な面式照明装置と挿入式照明装置とを備えたことを特徴とする請求項６記載の結晶観察装置。
【請求項１３】
前記面式照明装置が光拡散板を備えたことを特徴とする請求項１２記載の結晶観察装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、構造ゲノム科学等で結晶の生成を観察するのに用いられる結晶観察方法及び装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、構造生物学、特にタンパク質の立体構造を明らかにして物理化学的に生体の全機能を解明しようとする構造ゲノム科学が盛んに進められている。
【０００３】
タンパク質の立体構造を明らかにするには、まずタンパク質を結晶化させる試験を実施し、その後、得られたタンパク質結晶をＸ線構造解析することによってその立体構造を測定する。
【０００４】
従って、タンパク質の立体構造を明らかにするには、まずそのタンパク質の結晶を造る必要があり、タンパク質を結晶化させる方法としては、良質な結晶が得られ易い蒸気拡散法が知られている。この蒸気拡散法には、図３０に示すハンギングドロップ蒸気拡散方式、図３１に示すシッティングドロップ蒸気拡散方式、図３２に示すサンドイッチドロップ蒸気拡散方式等が知られている。
【０００５】
ハンギングドロップ蒸気拡散方式は、図３０に示すように、結晶化探索のための容器１００（以下ウェルと言う）に所定量の結晶化剤溶液１０１を収容し、ウェル１００の上部にはグリース１０２を介してウェル１００を密閉するアッパーガラス１０３を備える。アッパーガラス１０３の下面には、タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液とを混合した混合ドロップ１０４をぶら下げる。これにより、気相で隔てられた混合ドロップ１０４と結晶化剤溶液１０１との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、緩やかに混合ドロップ１０４内でタンパク質の過飽和状態がつくり出されて結晶化が実現される。
【０００６】
シッティングドロップ蒸気拡散方式は、図３１に示すように、ウェル１００に結晶化剤溶液１０１を収容し、ウェル１００の上部にはグリース１０２を介してウェル１００を密閉するアッパーガラス１０３を備える。タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液１０１を混合した混合ドロップ１０４は、ウェル１００内に備えたガラス製等の透光性のドロップ台１０５上に形成する方式である。
【０００７】
又、サンドイッチドロップ蒸気拡散方式は、図３２に示すように、ウェル１００に結晶化剤溶液１０１を収容し、ウェル１００の上部にはグリース１０２を介してウェル１００を密閉するアッパーガラス１０３を備える。タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液１０１を混合した混合ドロップ１０４は、ウェル１００の内部に備えたインナーガラス１０６と前記アッパーガラス１０３との間に挾持されるように形成する方式である。
【０００８】
上記した蒸気拡散法では、タンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液１０１（ｐＨを合わせ、適当な濃度の沈殿剤や添加剤等を含んだ溶液）を混合することにより混合ドロップ１０４を形成し、この混合ドロップ１０４を結晶化剤溶液１０１が収容されて密閉したウェル１００内に設置することにより、混合ドロップ１０４を結晶化剤溶液１０１に対して蒸気平衡させる。最初は、混合ドロップ１０４中の沈殿剤濃度のほうが低いので混合ドロップ１０４から結晶化剤溶液１０１へ水が少しずつ蒸発して移動する。その結果、混合ドロップ１０４中のタンパク質と沈殿剤の濃度が徐々に上昇してタンパク質の過飽和溶液ができる。この時、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度等が適切であれば、混合ドロップ１０４に結晶が析出する。
【０００９】
蒸気拡散法によってタンパク質が結晶化する条件を探索するためには、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度等の条件を細かく変え、更にその条件を組合わせた非常に多くの試験を実施する必要がある。従って、この結晶化条件の探索作業を単独の容器を用いて行っていたのでは膨大な時間と手間を要してしまう。
【００１０】
このため、結晶化条件の探索作業の能率を高める方法として、図３３に示すようにプレート本体１０７に対して図３０、図３１、図３２に示したようなハンギングドロップ、或いはシッティングドロップ、或いはサンドイッチドロップを形成するためのウェル１００を縦横に多数形成した透光性を有する合成樹脂製の結晶化探索プレート１０８（結晶化条件探索用キット）が用いられている。この結晶化探索プレート１０８によれば、多数備えられている各ウェル１００におけるｐＨや沈殿剤の種類・濃度等の条件を少しずつ変えることにより、多数の結晶化条件の探索試験を一つの結晶化探索プレート１０８で効率的に行える。
【００１１】
一方、上記したようなタンパク質の結晶化条件を探索する試験においては、各混合ドロップ１０４においていつ結晶が析出するかは分からないために、各ウェル１００の混合ドロップ１０４に対して長い時間に亘って結晶生成の有無を観察する必要があり、又、Ｘ線解析に必要なある程度大きな結晶を得るために結晶の成長も観察する必要がある。又、種々の条件によって一旦生成した結晶が消失してしまうことがあるため、こうした動向も観察する必要がある。
【００１２】
混合ドロップ１０４に結晶が生成したか否かを観察したり或いは生成した結晶の成長等を観察する手法としては、結晶化探索プレート１０８の各ウェル１００に対して上下方向から照明を当てることにより、透過光が結晶の存在によって偏光することを利用して、結晶の生成の有無や結晶の大きさ等を観察する方法がある。
【００１３】
一般には図３０、図３１、図３２に矢印で示すように、ウェル１００の下方から透過照明１０９を混合ドロップ１０４に当て、ウェル１００の上部において混合ドロップ１０４に当てた照明の透過光を検出することにより、結晶の生成を検出するようにしている。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、従来においては、結晶化探索プレート１０８の各ウェル１００に対し、透過照明１０９を当てて混合ドロップ１０４における結晶生成の有無や結晶の大きさ等を検出する作業を作業者が手作業で行っており、しかもこの作業は規定の時間間隔ごとに繰り返して行う必要があり、このために、従来の検出作業は非常に繁雑で時間が掛り、作業能率が非常に低いという問題を有していた。
【００１５】
更に、検出作業を作業者が手作業で行っているために、検出忘れや検出精度にバラツキが生じ易く、よって結晶生成や結晶の大きさ等を正確に検出することができない問題を有していた。
【００１６】
本発明は、かかる従来方式のもつ問題点を解決すべくなしたもので、結晶化探索プレートに多数形成したウェルの各混合ドロップを高能率に観察でき、更に結晶生成の有無や結晶の大きさ等を正確且つ確実に検出できるようにした結晶観察方法及び装置を提供することを目的としている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、結晶化剤溶液と混合ドロップとを内部に収容して蒸気拡散を行うウェルが縦横に複数形成された結晶化探索プレートを略水平且つ上下に複数段に配置し、前記ウェルの混合ドロップに照明を当てて光の変化を検出できるようにした光検出装置を設け、該光検出装置を左右・前後に移動することにより結晶化探索プレートの各ウェルに対する検出を行い、続いて光検出装置を上下方向に移動した後再び前後・左右に移動することにより別の結晶化探索プレートの各ウェルに対する検出を行い、前記光検出装置の検出結果から各ウェルにおける結晶の生成を観察することを特徴とする結晶観察方法、に係るものである。
【００１８】
請求項２記載の発明は、前記光検出装置の照明が透過明視野照明であることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法、に係るものである。
【００１９】
請求項３記載の発明は、前記光検出装置の照明が透過直交ニコル照明であることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法、に係るものである。
【００２０】
請求項４記載の発明は、前記ウェルの混合ドロップがハンギングドロップであるとき、アッパーガラスから照明を当てることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法、に係るものである。
【００２１】
請求項５記載の発明は、前記ウェルの混合ドロップがシッティングドロップであるとき、ロワーガラスから照明を当てることを特徴とする請求項１記載の結晶観察方法、に係るものである。
【００２２】
請求項６記載の発明は、結晶化剤溶液と混合ドロップとを内部に収容するウェルが縦横に複数形成された結晶化探索プレートを略水平且つ上下複数段に収容するプレート支持枠を有するプレート収容本体と、
ウェルの混合ドロップに照明を当てる照明装置と、照明による混合ドロップからの光の変化を検出するための撮影装置とを有する光検出装置と、
該光検出装置を前記プレート収容本体に対して前後・左右・上下に移動可能に支持し全てのウェルの混合ドロップを観察するようにした移動駆動装置と、
移動駆動装置による光検出装置の移動を制御する制御装置と、
を備えたことを特徴とする結晶観察装置、に係るものである。
【００２３】
請求項７記載の発明は、照明装置の照明投射側と撮影装置の受光側に、偏光を揃えた方向を互いに直交させ得る偏向フィルタを備えたことを特徴とする請求項６記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００２４】
請求項８記載の発明は、前記偏光を揃えた方向が互いに直交した偏向フィルタを、直交を保持したまま同時に回転させる回転駆動装置を備えていることを特徴とする請求項７記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００２５】
請求項９記載の発明は、撮影装置からの信号を画像処理して各ウェルにおける結晶の生成を検出する画像信号を出力するようにした画像処理装置を備えていることを特徴とする請求項６記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００２６】
請求項１０記載の発明は、前記画像処理装置の画像信号から結晶が生成したことを表示する表示装置を備えたことを特徴とする請求項９記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００２７】
請求項１１記載の発明は、前記光検出装置の検出結果を記録する画像記録装置を備えたことを特徴とする請求項６又は９記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００２８】
請求項１２記載の発明は、前記略コの字状の光検出装置の上部突部と下部突部の一方に撮影装置を備え、上部突部と下部突部の他方に前記撮影装置に対応する位置に移動して切換えが可能な面式照明装置と挿入式照明装置とを備えたことを特徴とする請求項６記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００２９】
請求項１３記載の発明は、前記面式照明装置が光拡散板を備えたことを特徴とする請求項１２記載の結晶観察装置、に係るものである。
【００３０】
上記手段によれば、以下のように作用する。
【００３１】
光検出装置は上下・左右・前後に移動可能にしているので、光検出装置をプレート収容本体に収容した複数の結晶化探索プレートの全てのウェルに対応させて各ウェルの混合ドロップの結晶生成を検出することができ、よって多数の結晶化探索プレートのウェルを自動で高能率に観測することができる。
【００３２】
光検出装置により透過明視野照明で観察すると、混合ドロップの状況を概略的に掴むことができる。
【００３３】
観察光路上に偏光を揃えた方向が互いに直交する偏向フィルタを、直交を保持したまま同時に回転させるように備えた透過直交ニコル照明で観察すると、結晶の個々をより鮮明に観察して確実な検出ができる。
【００３４】
撮影装置からの信号を画像処理して各ウェルにおける結晶の生成を検出する画像信号を出力する画像処理装置を備え、更に、前記画像処理装置の画像信号から結晶が生成したことを表示する表示装置を備えているので、結晶の生成を直ちに知ることができる。
【００３５】
光検出装置が略コの字状を有し、ウェルの混合ドロップに照明を当てる照明装置が結晶化探索プレートの上下一側に対応し、ウェルの混合ドロップに当てた照明の透過光を撮影する撮影装置が結晶化探索プレートの上下他側に対応するように備えられているので、コンパクトな構成の光検出装置によって結晶化探索プレートの各ウェルの検出が行える。
【００３６】
光検出装置の照明装置が結晶化探索プレートの上側に対応し撮影装置が結晶化探索プレートの下側に対応するように備えられているので、通常ウェル内部の上部に形成される混合ドロップに照明装置を近付けることができ、よって混合ドロップへの有効光量を増大することができ、更に観察画像における混合ドロップ外周部の観察不可帯を大幅に減少させることができる。又、照明装置における結晶化探索プレートに対応する位置に照明拡散板を備えているので、混合ドロップへの有効光量を更に増大できる。
【００３７】
光検出装置の検出結果、即ち生画像の信号或いは画像処理した画像信号を記録する画像記録装置を備えているので、後でその画像データを用いて結晶の生成条件等の管理が有効にできる。
【００３８】
略コの字状を有する光検出装置の上部突部と下部突部の一方に撮影装置を備え、上部突部と下部突部の他方に、前記撮影装置に対応する位置に移動して切換えが可能な面式照明装置と挿入式照明装置とを備えているので、混合ドロップがハンギングドロップであるときは、面式照明装置によりアッパーガラスから照明を当て、又、混合ドロップがシッティングドロップであるときは、挿入式照明装置によりロワーガラスから照明を当てるように切換えることができ、よって鮮明な画像による検出が容易且つ能率的に可能になる。
【００３９】
又、面式照明装置に光拡散板を備えることにより、ドロップに当てる有効光量を増大することができる。
【００４０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００４１】
図１は、結晶化探索プレートに多数備えられるウェルに形成した混合ドロップを観察する結晶観察装置の一例を示す正面図、図２は図１のＩＩ−ＩＩ方向矢視図、図３は図１のＩＩＩ−ＩＩＩ方向矢視図、図４は結晶観察装置の主要構成部の斜視図である。
【００４２】
図１〜図４において、１は結晶化探索プレート２を略水平且つ上下に複数段に収容するようにしたプレート収容本体である。プレート収容本体１は、下部に備えた棚３の上部に底板４を設けており、該底板４上の前面の左右側と中間位置とに鉛直な支持部材５ａ，５ｂ，５ｃを設けている。該支持部材５ａ，５ｂ，５ｃの後面には、片持ち式で結晶化探索プレート２を支持するようにしたプレート支持枠６を上下に多段（図示例では５段）に固定している。このプレート支持枠６は、前記結晶化探索プレート２を左右２列で上下多段に支持するようになっている。
【００４３】
前記底板４上におけるプレート支持枠６の後方位置には、光検出装置７を前後・左右・上下に移動するための移動駆動装置が設けられている。
【００４４】
移動駆動装置は、前後移動装置８Ｙと上下移動装置８Ｚと左右移動装置８Ｘとにより構成されている。
【００４５】
図１〜図４に示す例では、前後移動装置８Ｙは、底板４上の左右側に設けた前後案内台９ａ，９ｂと、図２に示すようにＬ字状に曲げられた下端が前後案内台９ａ，９ｂの夫々の上部を前後（Ｙ方向）に移動できるようにした上下案内台１０ａ，１０ｂと、右側の前後案内台９ｂの前部内側に備えられて右側の上下案内台１０ｂを前後に移動させるようにした前後駆動モータ１１Ｙとを備えている。１０は前記上下案内台１０ａ，１０ｂの下端同士を連結する連結プレートである。
【００４６】
又、上下移動装置８Ｚは、前記左右の上下案内台１０ａ，１０ｂ間に渡して設置されて上下案内台１０ａ，１０ｂに沿って上下（Ｚ方向）に移動が可能な左右案内台１２と、右側の上下案内台１０ｂ下部内側に備えられて左右案内台１２の右端を上下に移動させるようにした上下駆動モータ１１Ｚとを備えている。
【００４７】
又、左右移動装置８Ｘは、前記左右案内台１２に沿って左右（Ｘ方向）に移動が可能な前記光検出装置７と、前記左右案内台１２の左側下部に備えられて前記光検出装置７を左右に移動させるようにした左右駆動モータ１１Ｘとを備えている。
【００４８】
前記した前後移動装置８Ｙ、上下移動装置８Ｚ及び左右移動装置８Ｘは、例えばその一例を示す図５、図６のような装置で構成されている。即ち、案内台９ｂ，１０ｂ，１２の長手方向に沿ってスクリュー軸１３を設けると共に、案内台９ｂ，１０ｂ，１２に沿って移動可能な取付台１４を設け、且つ前記スクリュー軸１３に螺合したナット１５を取付台１４に固定し、前記スクリュー軸１３の回転を駆動する駆動モータ１１Ｙ，１１Ｚ，１１Ｘを設けている。従って、駆動モータ１１Ｙ，１１Ｚ，１１Ｘを駆動してスクリュー軸１３を回転すると、ナット１５を介して取付台１４が案内台９ｂ，１０ｂ，１２の長手方向に沿って移動するようになっている。
【００４９】
従って、図１〜図４の前後移動装置８Ｙの駆動モータ１１Ｙを駆動すると、前記取付台１４に取り付けた右側の上下案内台１０ｂが前後に移動する。この時、左側の上下案内台１０ａは連結プレート１０にて右側の上下案内台１０ｂに連結されているので、左側の上下案内台１０ａは右側の上下案内台１０ｂと同期して前後する。
【００５０】
又、上下移動装置８Ｚの上下駆動モータ１１Ｚを駆動すると、前記取付台１４に取り付けた左右案内台１２の右端部が右側の上下案内台１０ｂに沿って上下に移動し、これと同期して左右案内台１２の左端部も左側の上下案内台１０ａに沿って上下動する。
【００５１】
又、左右移動装置８Ｘの駆動モータ１１Ｘを駆動すると、前記取付台１４に取り付けた光検出装置７が左右案内台１２に沿って左右に移動する。
【００５２】
次に、前記光検出装置７を図７〜図９について説明する。
【００５３】
光検出装置７は、前記プレート収容本体１に収容保持された結晶化探索プレート２を、上下から小さな間隔を有して挟むように略コの字状に形成した検出本体１６を備えている。略コの字状を有する検出本体１６の上部突部１７と下部突部１８は、図７に示すように前記結晶化探索プレート２の前後幅をカバーできる長さを有している。
【００５４】
前記検出本体１６の下部突部１８には、結晶化探索プレート２の各ウェル２ａの下方から混合ドロップに照明を当てる照明装置１９が備えられており、又、上部突部１７には混合ドロップに当てた照明の透過光が変化する状態を撮影して検出するための撮影装置２０が設けられている。
【００５５】
前記照明装置１９は、下部突部１８の後方に、発熱がない白色ＬＥＤを複数備えた光源２１と、該光源２１の各白色ＬＥＤからの照明光を光ファイバ２２を介して集める集光部２３と、該集光部２３に集めた照明光を下部突部１８の前端部において上方に向けるミラー２４と、ミラー２４からの光を平行光にするレンズ２５と、該レンズ２５からの平行光を絞って前記ウェル２ａの混合ドロップに当てる投射レンズ２６とを備えている。更に、前記レンズ２５と投射レンズ２６との間には、偏光の向きを揃えるようにした偏光フィルタ２７を設けている。
【００５６】
又、上記照明装置１９は、光ファイバ２２の中心部分に相当する光源２１のみを点灯すると、図１０に示すように中心光４６ａにより透過明視野照明を行うことができ、又、光ファイバ２２の外周部分に相当する光源２１のみを点灯すると、図１１に示すように外周光４６ｂにより透過暗視野照明を行えるようになっている。
【００５７】
前記撮影装置２０は、前記投射レンズ２６による照明光の光軸上に設けて混合ドロップに当てた照明の透過光を後方に曲げるミラー２８と、該ミラー２８からの透過光を撮影するＣＣＤカメラ等のカメラレンズ２９を備えたカメラ３０とを備えている。更に、ミラー２８とカメラレンズ２９との間には偏光の向きを揃えるようにした偏光フィルタ３１を設けている。図中３２は、前記カメラ３０を前後（図９では左右）に移動するためのカメラ駆動モータである。
【００５８】
又、前記偏光フィルタ２７，３１は、ステッピングモータ等の回転駆動装置３３，３４によりギヤ３５等を介して別個に回転できるようになっており、更に、偏光フィルタ２７，３１の回転の原点位置を原点リミットスイッチ３６により検出するようになっている。
【００５９】
上記偏光フィルタ２７，３１は、偏光の向きを揃えた方向が一致するように回転位置を設定すると、照明装置１９からの照明光を透過させて透過明視野照明を行うことができる。又、上記偏光フィルタ２７，３１を、偏光の向きを揃えた方向が互いに直交するように回転位置を設定すると、透過直交ニコル照明とすることができる。更に、前記回転駆動装置３３，３４を同時に駆動することにより、上記透過直交ニコル照明を保持したまま、偏光フィルタ２７，３１を同時に回転できるようにしている。
【００６０】
図１０は、前記図７〜図９に示した光検出装置７の作用と、結晶化探索プレート２に形成されるウェル２ａの形状例を示している。
【００６１】
このウェル２ａは、上端がプレート本体３７の上面から突出し下端がプレート本体３７の下側に延長された環状の外壁３８と、該外壁３８の内側に所要の間隔を有して配置され下端が環状の底壁３９により前記外壁３８の下端に固定された環状の内壁４０とを備えて環状溶液室４１を形成している。内壁４０の上端は前記外壁３８の上端よりも低い高さに形成されており、又、内壁４０の内部空間は観察用照明穴４２となっている。
【００６２】
更に、前記外壁３８の上端は、グリースを介してアッパーガラス４３により密閉できるようになっており、又、内壁４０の上端はグリースを介してロワーガラス４４により密閉できるようになっている。
【００６３】
従って、上記図１０に示したウェル２ａにおいては、アッパーガラス４３の下面に混合ドロップ４５を形成することによりハンギングドロップ蒸気拡散方式とすることができ、又、ロワーガラス４４の上面に混合ドロップ４５を形成することによりシッティングドロップ蒸気拡散方式とすることができるので、両方式に共用できる。
【００６４】
更に、混合ドロップ４５の観察光路には、光学的な外乱が殆ど無いアッパーガラス４３とロワーガラス４４しか存在しないため、従来のように観察光路上にウェルの樹脂底壁と結晶化剤溶液が存在することによる光学的な外乱を生じるようなことがなく、よって混合ドロップ４５に殆ど直接的に照明を当てることができて理想的な観察状態を得ることができる。
【００６５】
又、前記したように光ファイバ２２の中心部分に相当する光源２１のみを点灯すると、図１０のように中心光４６ａによる透過明視野照明によって混合ドロップ４５を観察することができ、又、光ファイバ２２の外周部分に相当する光源２１のみを点灯すると、図１１のように外周光４６ｂによる透過暗視野照明によって混合ドロップ４５を観察することができる。
【００６６】
更に、図１０、図１１においては、前記撮影装置２０のミラー２８の受光側前面に、ウェル２ａの混合ドロップ４５に傾斜した照明を当てるリング照明装置４７を設けており、これにより反射暗視野照明にて混合ドロップ４５を観察できるようにしている。
【００６７】
尚、図７、図１０では、環状溶液室４１を有する形状のウェル２ａを備えた結晶化探索プレート２を観察する場合について示しているが、図３０、図３１、図３２に示したようなウェル１００に形成した混合ドロップ１０４の観察にも勿論適用することができる。
【００６８】
図１０に示す光検出装置７においては、照明装置１９による中心光４６ａを投射レンズ２６により混合ドロップ４５に集光させ、その透過光を撮影装置２０で撮影する状態を示しており、この時、前記偏光フィルタ２７と偏光フィルタ３１の偏光の向きを揃えた方向を一致させておくと、透過明視野照明とすることができ、又、偏光フィルタ２７と偏光フィルタ３１の偏光の向きを揃えた方向を互いに直交させておくと、透過直交ニコル照明とすることができる。
【００６９】
又、図１１に示すように、照明装置１９により外周光４６ｂによる照明を行うと透過暗視野照明を行うことができ、又、撮影装置２０側に設けたリング照明装置４７による照明を行うと、反射暗視野照明を行うことができる。この透過暗視野照明と反射暗視野照明は、前記透過明視野照明及び透過直交ニコル照明に比して撮影画像が暗くなる問題があるが、結晶における異なる方向への偏光が捕らえられる可能性があるので、前記透過明視野照明及び透過直交ニコル照明と組み合わせて用いることもできる。
【００７０】
図１２は、前記光検出装置７の他の形態を示したものであり、図１２では照明装置１９の照明光を、前記ウェル２ａの観察用照明穴４２内に挿入・抜き出しするようにした光ファイバ５２から投射するようにした挿入式照明装置１９ａの場合を示している。こうした構成の場合、観察用照明穴４２内に対する光ファイバ５２の挿入・抜き出しの動作が必要であるために、この動作分の時間が必要となり、よって図７〜図９の形態に比して作業能率が低くなる。
【００７１】
図７に示した撮影装置２０のカメラ３０にて撮影した信号は、画像処理装置４８に送られて画像処理が行われるようになっており、又、画像処理装置４８には、画像信号４９を入力して結晶が生成したことを音声、或いは点灯、点滅、画像等により表示するようにした表示装置５０が接続されている。更に、光検出装置７の検出結果、即ち前記画像処理装置４８からの画像信号４９、或いは前記カメラ３０からの生画像の信号を入力して記録するようにした画像記録装置５１が設けられている。
【００７２】
更に、前記光検出装置７を駆動する光学系コントローラ５３が図１に示すようにプレート収容本体１の棚３上に設けられており、又、移動駆動装置における前後移動装置８Ｙ、上下移動装置８Ｚ及び左右移動装置８Ｘを駆動するアクチュエータコントローラ５４が前記棚３上に設けられている。
【００７３】
図１３は結晶観察装置の全体を制御する制御系のブロック図であり、パソコン等からなる制御装置５５は、光学系コントローラ５３を介して光検出装置７を制御するようになっている。光学系コントローラ５３にはカメラコントローラ５６、モータドライバ５７、照明電源５８等が設けられている。又、前記制御装置５５は、前記画像処理装置４８、表示装置５０、画像記録装置５１の機能を備えていてもよい。
【００７４】
更に、制御装置５５は、アクチュエータコントローラ５４を介して移動駆動装置の前後移動装置８Ｙ、上下移動装置８Ｚ及び左右移動装置８Ｘを駆動するようになっている。５９は非常停止ペンダントである。
【００７５】
以下に、上記した結晶観察装置の作用を説明する。
【００７６】
図１０に示した結晶化探索プレート２は、図示とは別の場所において各ウェル２ａの環状溶液室４１に所要量の結晶化剤溶液を注入し、内壁４０の上端をグリースを介しロワーガラス４４により密閉する作業を行う。更に、アッパーガラス４３上でタンパク質溶液のサンプルと結晶化剤溶液（ｐＨを合わせ、適当な濃度の沈殿剤や添加剤を含む溶液）を混合して混合ドロップ４５を形成し、混合ドロップ４５を形成したアッパーガラス４３を上下反転してグリースを介し外壁３８の上端に設置することによりウェル２ａを密閉する。これにより混合ドロップ４５はウェル２ａ内においてアッパーガラス４３に吊り下げられるようになる。又、混合ドロップ４５をアッパーガラス４３に吊り下げる方法に変えて、混合ドロップ４５をロワーガラス４４上に形成するようにしてもよい。
【００７７】
上記したように、各ウェル２ａに対する結晶化剤溶液の注入と混合ドロップ４５の形成とを行った結晶化探索プレート２は、アッパーガラス４３が上側に向くようにして、図１〜図４に示すようにプレート収容本体１の左右において上下に多段に設けられた各プレート支持枠６に載置して収容する。
【００７８】
前記結晶化探索プレート２の各ウェル２ａにおいては、アッパーガラス４３に吊り下げた混合ドロップ４５と気相で隔てられている環状溶液室４１の結晶化剤溶液との間の結晶化剤濃度の平衡化が進められ、混合ドロップ４５中のタンパク質と沈殿剤の濃度が徐々に上昇し、緩やかに混合ドロップ４５内でタンパク質の過飽和状態がつくり出され、ｐＨや沈殿剤の種類・濃度或いは温度条件等が適切であると、混合ドロップ４５内に結晶が析出する。
【００７９】
しかし、混合ドロップ４５内にはいつ結晶が生成するか分からないので、各ウェル２ａについて結晶の生成を所定時間ごとに観察する必要がある。
【００８０】
このため、図１３の制御装置５５は、アクチュエータコントローラ５４を指令することにより移動駆動装置における前後移動装置８Ｙ、上下移動装置８Ｚ及び左右移動装置８Ｘを駆動して、光検出装置７を例えば図１〜図３に実線で示すように左側上端部の後方に移動し、先ず左側最上部の結晶化探索プレート２における左側最後部（図３では最上部）のウェル２ａの中心軸と撮影装置２０の観察光路が、図７のように一致するよう位置を調整する。
【００８１】
続いて、照明装置１９により図１０に示すように投射レンズ２６を介してウェル２ａの混合ドロップ４５に照明光を当て、この時の透過光をミラー２８を介して撮影装置２０により撮影する。この時、回転駆動装置３３，３４を駆動して前記偏光フィルタ２７と偏光フィルタ３１の偏光の向きを揃えた方向を一致させておくと、透過明視野照明が行われれる。即ち、前記混合ドロップ４５に結晶が存在すると、撮影装置２０により図１４に示すように明るい画面の中に結晶ａが黒く撮影される。
【００８２】
一方、回転駆動装置３３，３４を駆動して偏光フィルタ２７，３１の偏光の向きを揃えた方向が互いに直交した状態になるようにすると、透過直交ニコル照明が行われる。即ち、透過直交ニコル照明においては、前記混合ドロップ４５に結晶が存在すると、撮影装置２０により図１５に示すように暗い画面の中に結晶ａが白く撮影される。この透過直交ニコル照明では暗い画面の中に結晶ａが高輝度で表示されるため、この画像の結晶ａとその周辺とのコントラストが鮮明であり、よってエッジ検出画像を得る等のその後の画像処理に有効であり、結晶の大きさ（長さ、面積）等を容易に計測することができる。
【００８３】
図１６は混合ドロップ４５に沈殿が生じた場合の透過明視野照明による撮影画像の一例を示している。又、図１７は沈殿の中に結晶が生成している可能性を示す透過明視野照明による撮影画像の一例を示している。又、図１８は混合ドロップ４５に種類が異なるタンパク質の結晶を存在させた場合の透過明視野照明による撮影画像の一例を示している。
【００８４】
従って、上記透過明視野照明によれば、混合ドロップ４５の状況を概略的に掴むことができる。
【００８５】
一方、図１６に示すように混合ドロップ４５に沈殿が検出された場合には、沈殿の中に結晶が生成している場合があるので更に詳細な検出が要求される場合があり、又図１７のように沈殿の中に結晶が生成している可能性を高い撮影画像や、又、図１８のようにタンパク質の結晶が存在している撮影画像の場合には、結晶を更に高い精度で検出する要求がある。
【００８６】
このような場合には、前記したように透過直交ニコル照明により撮影する。すると、前記図１６の撮影画像の場合には図１９に示すように沈殿の中に一点の結晶が存在していることが検出され、又前記図１７の撮影画像の場合には図２０に示すように結晶が析出し始めていることが検出され、又、前記図１８の撮影画像の場合には図２１に示すように結晶の個々が鮮明に検出される。
【００８７】
又、混合ドロップ４５内に生成する結晶は、その種類及び結晶の向き等によって照明に対する偏光の方向が異なることがあり、このため、前記回転駆動装置３３，３４によって、偏光フィルタ２７，３１の偏光の向きを揃えた方向が互いに直交した状態のまま同時に１８０゜回転させる。すると、あらゆる方向に偏光する全ての結晶を検出することができる。
【００８８】
上記したように、混合ドロップ４５における結晶の観察には、少なくとも透過明視野照明と透過直交ニコル照明の両方を行うようにする。この時、光ファイバ２２の外周部分に相当する光源２１のみを点灯して図１１のように外周光４６ｂによる透過暗視野照明を行ったり、又、リング照明装置４７を設けて反射暗視野照明を行うことによって結晶の観察が更に高い精度で行える場合には、前記透過暗視野照明、反射暗視野照明を組み合わせて実施するようにしてもよい。
【００８９】
前記した光検出装置７の検出結果から結晶の生成を観察することができる。即ち、撮影装置２０により撮影した信号（画像）から結晶の生成を検出することができ、更に、撮影した信号を図７に示す画像処理装置４８に送って画像処理することにより、この処理画像から結晶の生成を更に精度良く検出することができる。この時、画像処理装置４８からの画像信号４９を表示装置５０に入力して、結晶が生成したことを音声、或いは点灯、点滅、画像等により表示させるようにすると、結晶の生成を直ちに知ることができる。
【００９０】
更に、前記画像処理装置４８からの画像信号４９或いはカメラ３０からの生画像の信号を、画像記録装置５１に入力して記録しておくと、後でその画像データを有効に利用することができる。
【００９１】
図３の左側最上部の結晶化探索プレート２における左側最後部のウェル２ａに対する観察が終了すると、左右移動装置８Ｘを駆動して光検出装置７を前記観察が終了したウェル２ａの右隣のウェル２ａに移動させ、前記と同様にして観察を行う。このように光検出装置７を順次右側に移動して最上部左右の結晶化探索プレート２における最後部一列のウェル２ａの観測を終了する。続いて、前後移動装置８Ｙを駆動して、光検出装置７を最後部より一列前の列のウェル２ａに移動した後、再び左右方向に移動することによりこの列の観測を行う。このように光検出装置７を前後・左右に移動させることにより、最上部の結晶化探索プレート２における全てのウェル２ａの観測を終了する。
【００９２】
次に、上下移動装置８Ｚを駆動して光検出装置７を最上段の結晶化探索プレート２より一つ下段の結晶化探索プレート２に移動させ、前記と同様に光検出装置７を前後・左右に移動させることにより、この段の結晶化探索プレート２における全てのウェル２ａの観測を終了する。更に、光検出装置７を別の段の結晶化探索プレート２に移動して上記操作を行うことにより、プレート収容本体１に収容した全ての結晶化探索プレート２のウェル２ａを観測することができる。
【００９３】
上記において、前後移動装置８Ｙ、上下移動装置８Ｚ及び左右移動装置８Ｘの駆動、及び光検出装置７の操作は全て制御装置５５で行うので、結晶化探索プレート２の全てのウェル２ａに対する観察を非常に高能率に行うことができる。
【００９４】
更に、所定時間ごとに全ての結晶化探索プレート２のウェル２ａを観測する作業も、制御装置５５に設定したスケジュールによって自動的に繰り返して行えるので、観測作業を容易且つ高能率に行うことができる。
【００９５】
次に、前記光検出装置７の他の形態例を図２２、図２３について説明する。
【００９６】
図２２、図２３に示す光検出装置７は、前記プレート収容本体１に収容保持された結晶化探索プレート２を、上下から小さな間隔を有して挟むように略コの字状に形成した検出本体１６を、左右移動装置８Ｘの左右案内台１２（図１、図２参照）に対し回転駆動装置６０により上部突部１７と下部突部１８が上下反転できるよう回転可能に取り付ける。下部突部１８における図２２の左右略中心位置には撮影装置２０’を設け、又、上部突部１７には、図７と同様の面式照明装置１９’と、図１２と同様の挿入式照明装置１９ａ’を並べて設け、該面式照明装置１９’と挿入式照明装置１９ａ’は、スライド駆動装置６１により一緒に左右に移動して前記撮影装置２０’に対応する位置に切換えられるようにしている。
【００９７】
又、前記挿入式照明装置１９ａ’は、図示しない昇降装置により上下に移動してウェル２ａの観察用照明穴４２に対して光ファイバ５２を挿入・引出しできるようにしている。
【００９８】
更に前記面式照明装置１９’の結晶化探索プレート２に対向する位置には、光拡散板６２を備えている。このとき、面式照明装置１９’及び挿入式照明装置１９ａ’には図７に示した偏光フィルタ２７，３１を備えていてもよい。
【００９９】
図２２、図２３では、図２４に示すようにウェル２ａのアッパーガラス４３にハンギングドロップ４５ａによる混合ドロップ４５が形成されているときに有効であり、アッパーガラス４３側から直接混合ドロップ４５へ光を当てることができるので、鮮明な撮影画像を得ることができる。更に、アッパーガラス４３側から広い視野で照明できるので混合ドロップ４５への有効光量を増大することができる。更にこのとのき、面式照明装置１９’に光拡散板６２を備えていることにより、混合ドロップ４５全体に照明を均一に当てることができる。
【０１００】
従って、図７に示した光検出装置７では、図２４のハンギングドロップ４５ａによる混合ドロップ４５の場合でも観察用照明穴４２を通してロワーガラス４４側から照明を当てているために、透過明視野照明で結晶を撮影した撮影画像では例えば図２５に示すように混合ドロップ外周部に観察不可帯６３（画像としては黒い帯になる）が大きく撮影されてしまうのに対し、図２２の光検出装置７により透過明視野照明にて結晶を撮影した場合の撮影画像では、図２６に示すように観察不可帯６３が大幅に減少して僅かとなり、従って結晶ａの見落しが減る。更に結晶ａの画像が鮮明となる。従って、画像の処理が容易になる。
【０１０１】
又、図２７に示すようにウェル２ａのロワーガラス４４にシッティングドロップ４５ｂによる混合ドロップ４５が形成されているときには、図２２、図２３に示した光検出装置７を回転駆動装置６０を駆動することにより上下反転して図２８、図２９の状態とする。更にスライド駆動装置６１を駆動して、挿入式照明装置１９ａが撮影装置２０に対応する位置になるように位置決めした後、挿入式照明装置１９ａを図示しない昇降装置により上昇させて、光ファイバ５２をウェル２ａの観察用照明穴４２に挿入することによりシッティングドロップ４５ｂを撮影する。
【０１０２】
このようにロワーガラス４４側から直接シッティングドロップ４５ｂへ光を当てて撮影できるので、鮮明な撮影画像を得ることができる。
【０１０３】
上記したように、光検出装置７の上部突部１７と下部突部１８の一方に撮影装置２０’を備え、上部突部１７と下部突部１８の他方に、前記撮影装置２０’に対応する位置に移動して切換えが可能な面式照明装置１９’と挿入式照明装置１９ａ’とを備えているので、混合ドロップ４５がハンギングドロップ４５ａであるときは、面式照明装置１９’によりアッパーガラス４３から照明を当て、又、混合ドロップ４５がシッティングドロップ４５ｂであるときは、挿入式照明装置１９ａ’によりロワーガラス４４から照明を当てるように切換えることができ、よってハンギングドロップ４５ａとシッティングドロップ４５ｂを備え結晶化探索プレート２に対して、１台の観察装置で高能率に観察を行うことができる。
【０１０４】
尚、本発明は上記形態例にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明によれば、光検出装置が上下・左右・前後に移動可能にしてあるので、光検出装置をプレート収容本体に収容した複数の結晶化探索プレートの全てのウェルに対応させて各ウェルの混合ドロップの結晶生成を検出することができ、よって多数の結晶化探索プレートのウェルを自動で高能率に観測することができる。
【０１０６】
光検出装置により透過明視野照明で観察すると、混合ドロップの状況を概略的に掴むことができる。
【０１０７】
観察光路上に偏光を揃えた方向が互いに直交する偏向フィルタを、直交を保持したまま同時に回転させるように備えた透過直交ニコル照明で観察すると、結晶の個々をより鮮明に観察して確実な検出ができる。
【０１０８】
撮影装置からの信号を画像処理して各ウェルにおける結晶の生成を検出する画像信号を出力する画像処理装置を備え、更に、前記画像処理装置の画像信号から結晶が生成したことを表示する表示装置を備えているので、結晶の生成を直ちに知ることができる。
【０１０９】
光検出装置が略コの字状を有し、ウェルの混合ドロップに照明を当てる照明装置が結晶化探索プレートの上下一側に対応し、ウェルの混合ドロップに当てた照明の透過光を撮影する撮影装置が結晶化探索プレートの上下他側に対応するように備えられているので、コンパクトな構成の光検出装置によって結晶化探索プレートの各ウェルの検出が行える。
【０１１０】
光検出装置の照明装置が結晶化探索プレートの上側に対応し撮影装置が結晶化探索プレートの下側に対応するように備えられているので、通常ウェル内部の上部に形成される混合ドロップに照明装置を近付けることができ、よって混合ドロップへの有効光量を増大することができ、更に観察画像における混合ドロップ外周部の観察不可帯を大幅に減少させることができる。又、照明装置における結晶化探索プレートに対応する位置に照明拡散板を備えているので、混合ドロップへの有効光量を更に増大できる。
【０１１１】
光検出装置の検出結果、即ち生画像の信号或いは画像処理した画像信号を記録する画像記録装置を備えているので、後でその画像データを用いて結晶の生成条件等の管理が有効にできる。
【０１１２】
略コの字状を有する光検出装置の上部突部と下部突部の一方に撮影装置を備え、上部突部と下部突部の他方に、前記撮影装置に対応する位置に移動して切換えが可能な面式照明装置と挿入式照明装置とを備えているので、混合ドロップがハンギングドロップであるときは、面式照明装置によりアッパーガラスから照明を当て、又、混合ドロップがシッティングドロップであるときは、挿入式照明装置によりロワーガラスから照明を当てるように切換えることができ、よって鮮明な画像による検出が容易且つ能率的に可能になる効果がある。
【０１１３】
又、面式照明装置に光拡散板を備えることにより、ドロップに当てる有効光量を増大させられる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の結晶観察装置の一例を示す正面図である。
【図２】図１をＩＩ−ＩＩ方向から見た側面図である。
【図３】図１をＩＩＩ−ＩＩＩ方向から見た平面図である。
【図４】本発明の結晶観察装置の一部の斜視図である。
【図５】光検出装置を前後・左右・上下に移動させるための移動装置の一例を示す正面図である。
【図６】図５のＶＩ−ＶＩ方向矢視図である。
【図７】光検出装置の形態の一例を示す側面図である。
【図８】図７をＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ方向から見た正面図である。
【図９】図７をＩＸ−ＩＸ方向から見た平面図である。
【図１０】光検出装置の作用の一例を示す正面図である。
【図１１】図１０の他の作用状態を示す正面図である。
【図１２】光検出装置の他の形態を示す側面図である。
【図１３】結晶観察装置の全体を制御する制御系の一例を示すブロック図である。
【図１４】透過明視野照明による結晶の撮影画像例を示す図である。
【図１５】透過直交ニコル照明による結晶の撮影画像例を示す図である。
【図１６】透過明視野照明による沈殿の撮影画像例を示す図である。
【図１７】透過明視野照明による沈殿の中に結晶が生成している可能性を示す撮影画像例を示す図である。
【図１８】透過明視野照明による種類の異なるタンパク質の結晶が存在している場合の撮影画像例を示す図である。
【図１９】図１６の状態を透過直交ニコル照明により撮影した場合の撮影画像例を示す図である。
【図２０】図１７の状態を透過直交ニコル照明により撮影した場合の撮影画像例を示す図である。
【図２１】図１８の状態を透過直交ニコル照明により撮影した場合の撮影画像例を示す図である。
【図２２】光検出装置の形態の他の例を示す正面図である。
【図２３】図２２の側面図である。
【図２４】ハンギングドロップを撮影する状態を示す模式図である。
【図２５】図７の光検出装置によりハンギングドロップを撮影した撮影画像の説明図である。
【図２６】図２２の光検出装置によりハンギングドロップを撮影した場合の撮影画像の説明図である。
【図２７】シッティングドロップを撮影する状態を示す模式図である。
【図２８】光検出装置を図２２の状態から上下反転した状態を示す正面図である。
【図２９】図２８の側面図である。
【図３０】従来のハンギングドロップ蒸気拡散方式を説明するためのウェルの切断側面図である。
【図３１】従来のシッティングドロップ蒸気拡散方式を説明するためのウェルの切断側面図である。
【図３２】従来のサンドイッチドロップ蒸気拡散方式を説明するためのウェルの切断側面図である。
【図３３】図３０、図３１、図３２に示すウェルを備えるようにした従来の結晶化探索プレートの一例を示す斜視図である。
【符号の説明】
１　プレート収容本体
２　結晶化探索プレート
２ａ　　　　　　　ウェル
６　プレート支持枠
７　光検出装置
８Ｘ　　　　　　　左右移動装置（移動駆動装置）
８Ｙ　　　　　　　前後移動装置（移動駆動装置）
８Ｚ　　　　　　　上下移動装置（移動駆動装置）
１７　上部突部
１８　下部突部
１９　照明装置
１９’面式照明装置
１９ａ’　挿入式照明装置
２０，２０’　撮影装置
２７　偏光フィルタ
３１　偏光フィルタ
３３，３４　　　回転駆動装置
４３　アッパーガラス
４４　ロワーガラス
４５　混合ドロップ
４８　画像処理装置
４９　画像信号
５０　表示装置
５１　画像記録装置
５５　制御装置
６０　回転駆動装置
６１　スライド駆動装置
６２　光拡散板
【図１】
2004003917.tif 000003
【図２】
2004003917.tif 000004
【図３】
2004003917.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2004003917.tif 000008
【図７】
2004003917.tif 000009
【図８】
2004003917.tif 000010
【図９】
2004003917.tif 000011
【図１０】
2004003917.tif 000012
【図１１】
2004003917.tif 000013
【図１２】
2004003917.tif 000014
【図１３】
2004003917.tif 000015
【図１４】
2004003917.tif 000016
【図１５】
2004003917.tif 000017
【図１６】
2004003917.tif 000018
【図１７】
2004003917.tif 000019
【図１８】
2004003917.tif 000020
【図１９】
2004003917.tif 000021
【図２０】
2004003917.tif 000022
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2004003917.tif 000029
【図２８】
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【図２９】
2004003917.tif 000031
【図３０】
2004003917.tif 000032
【図３１】
2004003917.tif 000033
【図３２】
2004003917.tif 000034
【図３３】
2004003917.tif 000035