(57)【要約】【課題】発癌予防効果に優れ安全性が高い発癌予防剤を提供する。【解決手段】脂肪酸又は脂肪酸メチルエステルを発癌予防剤に含有させた。脂肪酸としてはドコサヘキサエン酸が特に好ましく、脂肪酸メチルエステルとしては、エイコサペンタエン酸メチルエステル，ドコサペンタエン酸メチルエステル，及びドコサヘキサエン酸メチルエステル等の高度不飽和脂肪酸メチルエステルが特に好ましい。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとの少なくとも一方を含有することを特徴とする発癌予防剤。
【請求項２】
前記脂肪酸が不飽和脂肪酸であることを特徴とする請求項１に記載の発癌予防剤。
【請求項３】
前記不飽和脂肪酸が非共役不飽和脂肪酸であることを特徴とする請求項２に記載の発癌予防剤。
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸が、炭素−炭素二重結合を３個以上有する高度不飽和脂肪酸であることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の発癌予防剤。
【請求項５】
前記高度不飽和脂肪酸が、オクタデカテトラエン酸，エイコサペンタエン酸，ドコサテトラエン酸，ドコサペンタエン酸，及びドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種であることを特徴とする請求項４に記載の発癌予防剤。
【請求項６】
前記脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとは、魚油，魚肝油，及び海獣油の少なくとも１種を処理することにより製造されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の発癌予防剤。
【請求項７】
エプスタイン・バール・ウィルス活性化抑制効果を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の発癌予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の発生を予防する発癌予防剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、生活環境の悪化や食生活の変化などに伴って生活習慣病が大きな問題となってきており、そのなかでも癌は最も大きな問題となっている。癌の治療法は年々進歩しており、種々の方法や抗癌剤等が知られている。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−３９９９８号公報
【特許文献２】
特開２０００−３００２１０号公報
【特許文献３】
特開２０００−３８３４７号公報
【非特許文献１】
古江尚著、「抗癌剤投与の実際−腫瘍別・抗腫瘍剤別投与法」、医薬ジャーナル社、２０００年４月１日
【非特許文献２】
大澤俊彦，大東肇，吉川敏一監修、「がん予防食品」、シーエムシー社、１９９８年１２月２６日
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、癌の発生を予防する効果を有する発癌予防剤については多くは知られておらず、しかも、十分な発癌予防効果を有するものはほとんどなかった。このようなことから、発癌予防効果に優れ、且つ副作用等のない安全性の高い発癌予防剤が求められていた。
そこで、本発明は、上記のような従来技術が有する問題点を解決し、発癌予防効果に優れ安全性が高い発癌予防剤を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、本発明は次のような構成からなる。すなわち、本発明の発癌予防剤は、脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとの少なくとも一方を含有することを特徴とする。
このような発癌予防剤は、種々の癌に対する発癌予防効果に優れ、且つ安全性が高い（副作用等がほとんどない）。
【０００６】
前記脂肪酸は不飽和脂肪酸であることが好ましい。また、不飽和脂肪酸は非共役不飽和脂肪酸であることが好ましい。
さらに、この不飽和脂肪酸は、炭素−炭素二重結合を３個以上有する高度不飽和脂肪酸であることがより好ましい。さらにまた、この高度不飽和脂肪酸は、オクタデカテトラエン酸，エイコサペンタエン酸，ドコサテトラエン酸，ドコサペンタエン酸，及びドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種であることがさらに好ましい。
【０００７】
また、これらの脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとは、魚油，魚肝油，及び海獣油の少なくとも１種を処理することにより製造されたものであることが好ましい。このような発癌予防剤は、脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとが安全な天然物である魚油，魚肝油，又は海獣油から製造されているので、安全性がより高い。
さらに、これらの脂肪酸と該脂肪酸のメチルエステルとは、エプスタイン・バール・ウィルス活性化抑制効果を有することが好ましい。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明に係る発癌予防剤の実施の形態を詳細に説明する。なお、本実施形態は本発明の一例を示したものであって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
まず、魚肝油から種々の脂肪酸メチルエステル（飽和脂肪酸メチルエステル及び不飽和脂肪酸メチルエステル）を得る方法について説明する。ここでは、一例としてマンボウ肝油を原料とした場合について説明する。マンボウは世界中の温帯海域や熱帯海域に広く生息しており、しかも、他の魚油や魚肝油と比較してドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）が多く含まれているという特徴がある。
【０００９】
ただし、マンボウ肝油以外の魚油，魚肝油，海獣油からも脂肪酸メチルエステルを得ることができる。例えば、アイザメ肝油，スケトウダラ肝油，ウルメイワシ油，ギンダラ油，クロマグロ油，サケ油，サンマ油，ニシン油，マサバ油，竪琴アザラシ油等があげられる。
以下に、マンボウ肝油から脂肪酸メチルエステルを製造する操作手順を、図１のフロー図を参照しながら説明する。
【００１０】
▲１▼マンボウ肝油３．２ｇにＫＯＨのメタノール溶液（濃度は２ｍｏｌ／Ｌ）６５ｍＬを加え、１分間エステル交換反応を行って、脂肪酸メチルエステルを生成させた。
▲２▼そこに水を加えることにより反応を停止させ、ｎ−ヘキサンで脂肪酸メチルエステルを抽出した。脂肪酸メチルエステルを含むｎ−ヘキサンを無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて脂肪酸メチルエステルを回収した。
【００１１】
▲３▼脂肪酸メチルエステル２．９ｇとメタノール４８ｍＬと撹拌子とを三角フラスコに入れ、ウォーターバスで約５０℃に保ちながらマグネチックスターラーで撹拌し溶解させた。
▲４▼加熱と撹拌を続けながら、尿素粉末９．６ｇを徐々に加えた。三角フラスコに栓をして５０℃で３０分間撹拌した後、三角フラスコをウォーターバスから取り出して室温になるまで放冷した。
【００１２】
▲５▼室温に冷却されると脂肪酸メチルエステルの尿素付加体の結晶が析出するので、これを残留した尿素とともに濾取し、漏斗上の結晶をｎ−ヘキサンで洗浄した。なお、濾液には脂肪酸メチルエステルの尿素非付加体が含まれている。また、前記洗浄の際に生じた洗液は濾液に加えた。
▲６▼得られた結晶を別の三角フラスコに入れ、温水を加えて尿素付加体の分解と尿素の溶解とを行った。そして、室温になるまで放冷した（水等で冷却してもよい）。
【００１３】
▲７▼尿素付加体が分解されて生じた脂肪酸メチルエステルをｎ−ヘキサンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて回収した。
▲８▼前記▲５▼の工程で得られた脂肪酸メチルエステルの尿素非付加体を含んでいる濾液に対して、前記▲４▼〜▲６▼の工程を再度行った（使用した尿素粉末は５．６ｇ）。そして、得られた濾液（脂肪酸メチルエステルの尿素非付加体を含む）をｎ−ヘキサンで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターを用いて脂肪酸メチルエステルを回収した。
【００１４】
▲９▼前記▲７▼の工程で得られた脂肪酸メチルエステルを、オクタデシル基結合シリカゲルカラム（ＯＤＳカラム）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、各成分に単離した。また、前記▲８▼の工程で得られた脂肪酸メチルエステルについても、同様にして各成分に単離した。
このような操作により、図１の下部に記した種々の脂肪酸メチルエステルが得られた。
【００１５】
すなわち、尿素付加体画分からは、５種の飽和脂肪酸メチルエステルと５種の不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は１個）が単離された。具体的には、飽和脂肪酸メチルエステルとしては、ミリスチン酸メチルエステル（Ｃ１４：０）、ペンタデカン酸メチルエステル（Ｃ１５：０）、パルミチン酸メチルエステル（Ｃ１６：０）、ヘプタデカン酸メチルエステル（Ｃ１７：０）、ステアリン酸メチルエステル（Ｃ１８：０）が得られ、不飽和脂肪酸メチルエステルとしては、９−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ１６：１，ｎ−７）、７−メチル−７−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ１７：１）、オレイン酸メチルエステル（Ｃ１８：１，ｎ−９）、９−エイコセン酸メチルエステル（Ｃ２０：１，ｎ−１１）、１０−ドコセン酸メチルエステル（Ｃ２２：１，ｎ−１１）が得られた。
【００１６】
また、尿素非付加体画分からは、２種の不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は２個）と６種の高度不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は３個以上）が単離された。具体的には、不飽和脂肪酸メチルエステルとしては、リノール酸メチルエステル（Ｃ１８：２，ｎ−６）、１１，１４−エイコサジエン酸メチルエステル（Ｃ２０：２，ｎ−６）が得られ、高度不飽和脂肪酸メチルエステルとしては、α−リノレン酸メチルエステル（Ｃ１８：３，ｎ−３）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸メチルエステル（Ｃ１８：４，ｎ−３）、アラキドン酸メチルエステル（Ｃ２０：４，ｎ−６）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ２０：５，ｎ−３）、ドコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ２２：５，ｎ−３）、ドコサヘキサエン酸メチルエステル（Ｃ２２：６，ｎ−３）が得られた。
【００１７】
次に、上記のようにして得られた脂肪酸メチルエステルをはじめとする種々の化合物について、その発癌予防効果を評価した。
評価した飽和脂肪酸メチルエステルは、カプリン酸メチルエステル（Ｃ１０：０）、ラウリン酸メチルエステル（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸メチルエステル（Ｃ１４：０）、ペンタデカン酸メチルエステル（Ｃ１５：０）、パルミチン酸メチルエステル（Ｃ１６：０）、ヘプタデカン酸メチルエステル（Ｃ１７：０）、ステアリン酸メチルエステル（Ｃ１８：０）の７種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
【化２】
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【００２０】
【化３】
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【００２１】
【化４】
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【００２２】
【化５】
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【００２３】
【化６】
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【００２４】
【化７】
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【００２５】
また、評価した不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は１個又は２個）は、９−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ１６：１，ｎ−７）、７−メチル−７−ヘキサデセン酸メチルエステル（Ｃ１７：１）、オレイン酸メチルエステル（Ｃ１８：１，ｎ−９）、９−エイコセン酸メチルエステル（Ｃ２０：１，ｎ−１１）、１０−ドコセン酸メチルエステル（Ｃ２２：１，ｎ−１１）、リノール酸メチルエステル（Ｃ１８：２，ｎ−６）、１１，１４−エイコサジエン酸メチルエステル（Ｃ２０：２，ｎ−６）の７種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００２６】
【化８】
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【００２７】
【化９】
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【００２８】
【化１０】
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【００２９】
【化１１】
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【００３０】
【化１２】
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【００３１】
【化１３】
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【００３２】
【化１４】
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【００３３】
さらに、評価した高度不飽和脂肪酸メチルエステル（炭素−炭素二重結合の数は３個以上）は、α−リノレン酸メチルエステル（Ｃ１８：３，ｎ−３）、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸メチルエステル（Ｃ１８：４，ｎ−３）、アラキドン酸メチルエステル（Ｃ２０：４，ｎ−６）、エイコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ２０：５，ｎ−３）、ドコサペンタエン酸メチルエステル（Ｃ２２：５，ｎ−３）、ドコサヘキサエン酸メチルエステル（Ｃ２２：６，ｎ−３）の６種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００３４】
【化１５】
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【００３５】
【化１６】
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【００３６】
【化１７】
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【００３７】
【化１８】
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【００３８】
【化１９】
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【００３９】
【化２０】
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【００４０】
さらに、評価した共役不飽和脂肪酸メチルエステルは、共役リノール酸（Ｃ１８：２）及び共役リノレン酸（Ｃ１８：３）の２種であり、その化学構造式は以下に示す通りである。
【００４１】
【化２１】
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【００４２】
【化２２】
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【００４３】
さらに、リファレンス化合物として、以下に示すような化学構造を有するオレアノール酸及びβ−カロチンの評価も行った。
【００４４】
【化２３】
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【００４５】
【化２４】
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【００４６】
発癌予防効果は、抗発癌プロモーター活性を評価することにより行った。そして、抗発癌プロモーター活性は、エプスタイン・バール・ウィルス（ＥＢＶ）活性化抑制効果検定法を用いて評価した。ＥＢＶのゲノムを内蔵するバーキット・リンパ腫由来の培養細胞であるラジ（Ｒａｊｉ）株においてＥＢＶのゲノムの発現を阻害する化合物の多くが、マウス皮膚二段階発癌実験において抗発癌プロモーターとして作用するので、ＥＢＶ活性化抑制効果検定法は抗発癌プロモーター活性評価の１次スクリーニング法として有用である。
【００４７】
ＥＢＶのゲノムの発現を阻害する作用に着目したこの検定法は、発癌プロモーターであるテトラデカノイルホルボールアセテート（ＴＰＡ）と抗発癌プロモーター活性発現に相乗的に作用するｎ−酪酸と被検物質とをラジ株培養系に加えて培養し、ＴＰＡにより活性化された細胞に由来する抗体を間接蛍光抗体法で検出する方法である。この方法は、迅速且つ定量性に優れ、微量活性成分の検出が可能である点で優れた方法である。
【００４８】
以下に、ＥＢＶ活性化抑制効果検定法の操作手順を、図２のフロー図を参照しながら詳細に説明する。なお、本手順は、徳田らの方法（Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，４０巻，３０９頁（１９８８））に準拠している。
▲１▼１×１０６　／ｍＬのラジ細胞に２０ｎｇ／ｍＬ（３２ｐｍｏｌ）の濃度のＴＰＡを加え、さらにｎ−酪酸を加えた。
【００４９】
▲２▼そこに、水，エタノール，又はジメチルスルホキシドに溶解した所定量の被検物質（脂肪酸メチルエステル及びリファレンス化合物）を添加して、３７℃で４８時間培養した。
▲３▼培養終了後、上咽頭癌患者の血清を用いた間接蛍光抗体法によりＥＢＶ早期抗原の発現を検出した。
【００５０】
ＴＰＡのみを加えた群（コントロール）のＥＢＶ早期抗原の発現率を１００％として、被検物質添加群のＥＢＶ早期抗原の発現率を求め、下記式により被検物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を算出した。
（ＥＢＶ早期抗原の発現阻害率）＝１００−（ＥＢＶ早期抗原の発現率）
各被検物質のＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を表１及び表２に示す。なお、被検物質の濃度が１０００の欄の括弧内の数値は、ラジ細胞の生存率（％）を示す。この数値が高い方が正常細胞に対する悪影響が小さい、すなわち安全性が高いと言える。
【００５１】
【表１】
2004002269.tif 000026
【００５２】
【表２】
2004002269.tif 000027
【００５３】
表１及び表２から分かるように、脂肪酸メチルエステルにはＥＢＶ早期抗原の発現を阻害する効果が認められた。そして、不飽和度が高くなるにしたがって該効果が高くなる傾向があり、特に、高度不飽和脂肪酸メチルエステルであるエイコサペンタエン酸メチルエステル，ドコサペンタエン酸メチルエステル，及びドコサヘキサエン酸メチルエステルは、１０００倍モル濃度においてＴＰＡによる早期抗原の発現を完全に阻害した。
【００５４】
なお、飽和脂肪酸メチルエステルにおいては、カプリン酸メチルエステルとラウリン酸メチルエステルを除いては、分子量が小さくなるにしたがってＥＢＶ早期抗原の発現阻害率が高くなるという傾向が見られた。また、共役不飽和脂肪酸メチルエステル（表２に記載の共役リノール酸及び共役リノレン酸）と非共役不飽和脂肪酸メチルエステル（表１に記載のリノール酸及び表２に記載のα−リノレン酸）とを比較すると、２つの異性体のうち非共役不飽和脂肪酸メチルエステルの方がＥＢＶ早期抗原の発現阻害率が若干高かった。
【００５５】
また、脂肪酸メチルエステルをＴＰＡに対して１０００倍モル濃度使用しても、ラジ細胞の生存率は６０％又は７０％であった。脂肪酸メチルエステルを使用しないコントロールにおいても生存率は８０％程度であることから、脂肪酸メチルエステルは正常細胞に対する悪影響が小さいと言える。
次に、ドコサヘキサエン酸メチルエステルの発癌予防効果を評価するために行ったマウス皮膚二段階発癌実験について説明する。
【００５６】
試験群として６週齢のＩＣＲ雌性マウスを１５匹用意し、各マウスの背部皮膚に３９０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度の７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）を塗布して、イニシエーションを行った。そして、その１週間後から２０週間にわたって、週２回の割合で同一部位に被検物質であるドコサヘキサエン酸メチルエステル（濃度は８５ｎｍｏｌ／Ｌ）とＴＰＡ（濃度は１．７ｎｍｏｌ／Ｌ）を塗布した。なお、ＴＰＡは、ドコサヘキサエン酸メチルエステルを塗布してから６０分後に塗布した。
【００５７】
対照群として前述と同種のマウスを１５匹用意し、ドコサヘキサエン酸メチルエステルを塗布しないことを除いては前述と同様に、ＤＭＢＡの塗布とＴＰＡの塗布とを行った。
両群のマウスについて、腫瘍が発生したマウスの数と形成した腫瘍数とを調べた。そして、各群における腫瘍発生率（腫瘍が発生したマウスの率）とマウス１匹当りの平均腫瘍個数とを算出した。その結果を表３に示す。
【００５８】
【表３】
2004002269.tif 000028
【００５９】
対照群においては１０週間後には全てのマウスに腫瘍の発生が認められ、２０週間後には１匹当たり約９個の腫瘍が認められた。それに対して、ドコサヘキサエン酸メチルエステルを塗布した試験群は、対照群と比較して腫瘍の発生が明らかに遅延しており、２０週間後でも腫瘍数は約５個で、対照群の約５０％の数であった。このことから、ドコサヘキサエン酸メチルエステルの塗布により、腫瘍の発生が約５０％に抑制されることが分かる。
【００６０】
このように、脂肪酸メチルエステル、特に高度不飽和脂肪酸メチルエステルは発癌予防効果に優れ且つ安全性が高いので、発癌予防剤として好適に使用可能である。また、マンボウ肝油のような高度不飽和脂肪酸類を含む油脂類は、発癌予防の観点から、機能性食品として期待できる。
なお、本実施形態においては脂肪酸メチルエステルについて説明したが、同様の脂肪酸の他のエステル（例えば、プロピルエステル，ブチルエステル等）も発癌予防効果を有している。よって、これらの脂肪酸エステルも発癌予防剤として使用可能である。
【００６１】
次に、脂肪酸の発癌予防効果ついて説明する。脂肪酸の種類は特に限定されるものではなく、前述した全ての脂肪酸メチルエステルの遊離脂肪酸が発癌予防効果を有している。
一例として、ドコサヘキサエン酸の発癌予防効果の評価結果を表４に示す。なお、発癌予防効果の評価方法は、前述の脂肪酸メチルエステルの場合と同様に、抗発癌プロモーター活性を評価することにより行った。また、表４中の数値は表１，２と同様にＥＢＶ早期抗原の発現阻害率（％）を示し、被検物質の濃度が１０００の欄の括弧内の数値はラジ細胞の生存率（％）を示す。
【００６２】
【表４】
2004002269.tif 000029
【００６３】
表４から分かるように、ドコサヘキサエン酸はドコサヘキサエン酸メチルエステルよりも、ＥＢＶ早期抗原の発現を阻害する効果が優れていた。また、ドコサヘキサエン酸及びドコサヘキサエン酸メチルエステルは、比較のため試験したドコサヘキサエン酸エチルエステルよりもＥＢＶ早期抗原の発現を阻害する効果が優れていた。ラジ細胞の生存率については前記３者は同程度であり、正常細胞に対する悪影響は小さかった。
このように、遊離の脂肪酸についても脂肪酸メチルエステルと同様に発癌予防効果に優れ且つ安全性が高いので、発癌予防剤として好適に使用可能である。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の発癌予防剤は、発癌予防効果が優れていることに加えて、副作用等がほとんどなく安全性が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】マンボウ肝油から脂肪酸メチルエステルを製造する操作手順を示すフロー図である。
【図２】ＥＢＶ活性化抑制効果検定法の操作手順を示すフロー図である。
【図１】
2004002269.tif 000030
【図２】
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