(57)【要約】      （修正有）【課題】フミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンスにおけるタンパク質の大量生産を可能にする発現系、とりわけ宿主−ベクター系およびそれを利用したタンパク質の製造方法を提供する。【解決手段】フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ１遺伝子またはＮＣＥ２遺伝子の制御配列、すなわちプロモーター、シグナル配列、およびターミネーターを含んだ発現ベクターを構築し、それを利用する。【効果】この発現ベクターにより、例えばセルラーゼＮＣＥ４を、フミコーラ・インソレンスにおいて、培養液１リットルあたり約４．５ｇ以上と極めて効率よく生産することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ１遺伝子またはＮＣＥ２遺伝子の制御配列を含んでなる、発現ベクター。
【請求項２】
フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ１遺伝子またはＮＣＥ２遺伝子の制御配列が、プラスミドｐＭ３−１またはプラスミドｐＭ１４−１内にあるＮＣＥ１および２の制御配列である、請求項１記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記制御配列が、プロモーター、シグナル配列、およびターミネーターからなる群から選ばれる少なくとも一つである、請求項１または２記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記プロモーター配列が、プラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列または高プロモーター活性を保持するその改変配列である、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項５】
ＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列が、プラスミドｐＭ３−１中のＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流のＢｇｌIIサイトまでの配列である、請求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記プロモーター配列が、プラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列または高プロモーター活性を保持するその改変配列である、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項７】
ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列が、プラスミドｐＭ１４−１中のＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流のＥｃｏＲＩサイトまでの配列である、請求項６記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記シグナル配列が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の−２２から−１までの配列をコードする塩基配列もしくは配列番号２に記載のアミノ酸配列の−２３から−１までの配列をコードする塩基配列、またはこれら塩基配列の改変配列であって、シグナル配列活性を保持するアミノ酸配列をコードする塩基配列である、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記ターミネーター配列が、プラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流の約１４００ｂｐまでの領域中に存在する配列またはターミネーター機能を保持するその改変配列である、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流の約１４００ｂｐまでの領域中に存在する配列が、ＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流のＢｇｌIIサイトまでの配列である、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記ターミネーター配列が、プラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＣ末端から下流の約５００ｂｐまでの領域中に存在する配列またはターミネーター機能を保持するその改変配列である、請求項３記載の発現ベクター。
【請求項１２】
ＮＣＥ２遺伝子のＣ末端から下流の約５００ｂｐまでの領域中に存在する配列が、ＮＣＥ２遺伝子のＣ末端から下流のＢｇｌIIサイトまでの配列である、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記制御配列に作動可能に連結された目的タンパク質をコードする塩基配列を更に含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記目的タンパク質が、セルラーゼＮＣＥ４またはそれらの改変タンパク質である、請求項１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
遺伝子マーカーを更に含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
遺伝子マーカーが薬剤耐性遺伝子である、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
遺伝子マーカーがStreptomyces rimofaciens由来のデストマイシン耐性遺伝子である、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
発現ベクターｐＭＫＤ０１、ｐＥＧＤ０１、またはｐＩＥＤ０２。
【請求項１９】
請求項１０〜１８のいずれか一項に記載のベクターによって形質転換された、フミコーラ属に属する微生物。
【請求項２０】
フミコーラ属に属する微生物がフミコーラ・インソレンスである、請求項１８記載の微生物。
【請求項２１】
フミコーラ属に属する微生物において目的タンパク質を発現させる方法であって、請求項１９または２０に記載の微生物を培養し、培養物から前記目的タンパク質またはペプチドを採取する工程を含んでなる、方法。
【請求項２２】
微生物がフミコーラ・インソレンスであり、その培養液１リットルあたり４．５ｇ以上のタンパク質を生産する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法によって生産されたタンパク質もしくはペプチドまたはそれを含んでなる組成物。
【請求項２４】
請求項２１または２２に記載の方法によって、発現ベクターとして発現ベクターｐＭＫＤ０１を用いた場合に得られる、Ｎ末端に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、タンパク質。
【請求項２５】
請求項２０または２１に記載の方法によって、発現ベクターとして発現ベクターｐＥＧＤ０１を用いた場合に得られる、Ｎ末端に配列番号５または６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２６】
請求項２１または２２に記載の方法によって、発現ベクターとして発現ベクターｐＩＥＤ０２を用いた場合に得られる、Ｎ末端に配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する、タンパク質。
【請求項２７】
プラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列または高プロモーター活性を保持するその改変配列を含んでなる、プロモーター配列。
【請求項２８】
ＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列が、プラスミドｐＭ３−１中のＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流のＢｇｌIIサイトまでの配列である、請求項２７記載のプロモーター配列。
【請求項２９】
プラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列または高プロモーター活性を保持するその改変配列を含んでなる、プロモーター配列。
【請求項３０】
ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列が、プラスミドｐＭ１４−１中のＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流のＥｃｏＲＩサイトまでの配列である、請求項２９記載のプロモーター配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンス（Humicola insoiens ）において、タンパク質またはペプチドを大量発現または大量分泌させる生産系に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌は、タンパク質を菌体外に分泌することが知られている。よって、糸状菌について、タンパク質を効率よく生産させるための高生産細胞や培養方法等が検討され、開発されてきた。
【０００３】
その主要なものとしては、ＵＶ照射、変異誘導剤等により、人工突然変異株を作出し、それらの中から目的とするタンパク質を多量に生産する株を選抜するという手法が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしこの手法は、複数のタンパク質の協調作用により活性が発現される様な酵素の発現およびその特性を向上させたい場合には利用が難しくなる。更に、生育に悪影響を及ぼす例えば致死性のタンパク質等を生産する場合には、目的タンパク質を生産する細胞にいかなる変異処理を用いても生産性の向上が図れないことが多く見受けられる。
【０００５】
一方、最近になって遺伝子組み換えの技術を用いて目的タンパク質を生産させる方法が検討され、一部の糸状菌においては、異種由来のタンパク質、または、同種において微量発現しているタンパク質を大量に生産することが可能となった。例えば、Aspergillus nidulans(G.L.Gray,et al.,Gene,48,41,1986)、Aspergillus oryzae(T.Christensen,et al.,Bio/Technology，6，1419,1988 )、Trichoderma reesei(Taina Karhunen,et al.,Mol.Gen.Genet.241,515-522,1993)、Trichoderma viride（C.Cheng,et al.,Agric.Biol.Chem.，55,1817,1991 ）等において成功しており、その生産量は、培養液１Ｌ当たり１．０〜３．３ｇ程度である。
【０００６】
好温性糸状菌フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens ）も優れたタンパク質分泌能を有する。また、フミコーラ・インソレンスは、種々の産業上有用なセルラーゼを産生することも知られている（ＷＯ９１／１７２４３号公報（特表平５−５０９２２３号公報））。
【０００７】
しかしながら、フミコーラ・インソレンスの全分泌タンパク質における有用成分はわずか数％程度である。これら微量有用成分を大量発現、大量分泌させる方法を確立すれば、最終産物の能力は飛躍的に向上する。また、フミコーラ・インソレンスにおいて異種由来の遺伝子を大量発現する方法を確立すれば、種々の酵素および有用タンパク質を単一の方法で生産でき、より安価な提供が可能となる。さらに、有用タンパク質の生産宿主としてフミコーラ・インソレンスは、好温性糸状菌であることから、至適培養温度が３７℃付近であり、培養の際、他の雑菌の汚染を受けにくいという利点がある。
【０００８】
一方、フミコーラ・インソレンスにおいても、本発明者等の一部によって、特開平８−５６６６３号公報に記載されているように、形質転換系が確立され、遺伝子組み換えの技術の使用が可能となった。
【０００９】
しかし、フミコーラ・インソレンスに関し、目的タンパク質を高レベルで発現、分泌できるような有効な発現ベクター系の開発が依然として求められていたといえる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、今般、フミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンスにおける目的タンパク質の大量生産方法を確立した。
【００１１】
従って、本発明はフミコーラ属に属する微生物、とりわけフミコーラ・インソレンスにおけるタンパク質の大量生産を可能にする発現系、とりわけ宿主−ベクター系およびそれを利用したタンパク質の製造方法の提供をその目的としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、目的タンパク質の生産性は親株の１０〜１６倍となり、またその生産量は培養液１リットルあたり約４．５ｇに達する極めて効率のよいタンパク質の生産系が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
微生物の寄託
図１に記載の地図で表されるプラスミドｐＭ３−１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１４４５９、原寄託日：１９９４年８月３日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１−１−３）に寄託されている。
【００１４】
図２に記載の地図で表されるプラスミドｐＭ１４−１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１４５８５，原寄託日：１９９４年１０月１８日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１５】
本発明による発現ベクターｐＭＫＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７４（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３０、現寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１６】
本発明による発現ベクターｐＥＧＤ０１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７３（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７２９、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１７】
本発明による発現ベクターｐＩＥＤ０２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７５（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３１、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１８】
本発明による発現ベクターｐＮＣＥ４Ｓａｌで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７６（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３２、原寄託日：１９９６年７月１２日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００１９】
本発明による発現ベクターの宿主となりうるフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７７（原寄託：ＦＥＲＭ Ｐ−１５７３６、原寄託日：１９９６年７月１５日）の受託番号のもと通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【００２０】
定  義
本明細書において、タンパク質およびペプチドは特に断らない限り、同義に用いることとする。また、本明細書において、改変配列とは、塩基配列またはアミノ酸配列において、一〜数個の塩基またはアミノ酸の挿入、置換または欠失、もしくはその一方または両末端への付加がなされたものを意味する。
【００２１】
フミコーラ・インソレンスにおける制御配列
本発明におけるフミコーラ属に属する微生物における発現系にあっては、フミコーラ・インソレンス由来の制御配列を用いる。本発明において制御配列とは、プロモーター、シグナル配列、およびターミネーターからなる群から選ばれる少なくとも一つを意味する。
【００２２】
本発明による制御配列とは、好ましくは特開平８−５６６６３号公報に記載のフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ１遺伝子の制御配列、さらに特開平８−１２６４９２号公報に記載のフミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ２遺伝子の制御配列である。より具体的には、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２のもと寄託されている菌株中のプラスミドｐＭ３−１およびプラスミドｐＭ１４−１内にある、ＮＣＥ１および２の制御配列である。
【００２３】
本発明において好ましいプロモーター配列の例としては、図１の地図で表されるプラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えば図中のＮＣＥ１遺伝子のＮ末端から上流のＢｇｌIIサイトまでの配列が挙げられる。
【００２４】
また、本発明において好ましいプロモーター配列の別の例としては、図２の地図で表されるプラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流の約１５００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えば図中のＮＣＥ２遺伝子のＮ末端から上流のＥｃｏＲＩサイトまでの配列が挙げられる。
【００２５】
さらに、本発明によるプロモーター配列には、これら領域の全配列のみならず、高プロモーター活性を保持するその改変配列も含まれる。本発明において、高プロモーター活性とは、後記するＮＣＥ４遺伝子の発現において、高発現を実現する強いプロモーター活性を意味し、より具体的には、培地１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは４．５ｇのＮＣＥ４の発現を実現するプロモーター活性を意味するものとする。後記する実施例に記載の知見、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２のもと寄託されている菌株、および図１または２の地図が与えられた当業者であれば、そのような改変配列が存在することは容易に予測でき、また容易に製造することが可能であることは明らかである。
【００２６】
また、本発明において好ましいシグナル配列の例としては、セルラーゼＮＣＥ１または２のシグナル配列が挙げられる。より具体的には配列番号１に記載のアミノ酸配列の−２２から−１までの配列をコードする塩基配列、および配列番号２に記載のアミノ酸配列の−２３から−１までの配列をコードする塩基配列が挙げられる。更に本発明には、その改変配列であって、依然としてシグナル配列活性を保持するアミノ酸配列をコードするものも包含される。このような改変配列についても、後記する実施例に記載の知見、ＦＥＲＭ ＢＰ−５９７１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５９７２のもと寄託されている菌株、および図１または２の地図が与えられた当業者であれば、そのような改変配列が存在することは容易に予測でき、また容易に製造することが可能であることは明らかである。
【００２７】
なお、これら配列の実際の利用にあたり上記のシグナル配列に加えてさらにＮＣＥ１または２のＮ末端側のいくつかのアミノ酸が付加されてもよいことは当業者に明らかである。すなわち、これらシグナル配列の利用にあたり、目的タンパク質が、ＮＣＥ１または２のＮ末端側のいくつかのアミノ酸からなるペプチドとの融合タンパク質、さらにはＮＣＥ１またはＮＣＥ２との融合タンパク質として得られてもよい。
【００２８】
さらに、本発明において好ましいターミネーター配列としては、図１の地図で表されるプラスミドｐＭ３−１中の、ＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流の約１４００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えばＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流のＢｇｌIIサイトまでの配列が挙げられる。また、別の例としては、図２の地図で表されるプラスミドｐＭ１４−１中の、ＮＣＥ２遺伝子のＣ末端から下流の約５００ｂｐまでの領域中に存在する配列、例えば例えばＮＣＥ１遺伝子のＣ末端から下流のＢｇｌIIサイトまでの配列が挙げられる。
【００２９】
さらに、本発明によるターミネーター配列には、これら領域の全配列のみならず、そのターミネーター活性を保持する改変配列も含まれる。
【００３０】
これら制御配列、とりわけＮＣＥ１またはＮＣＥ２のプロモーター配列は、ＮＣＥ４遺伝子を極めて高効率で発現させる。従って、本発明の好ましい態様によれば、ＮＣＥ４遺伝子の発現に好ましく用いられる制御配列、とりわけＮＣＥ４遺伝子の発現に好ましく用いられるプロモーター配列が提供される。本発明の好ましい態様によれば、セルラーゼＮＣＥ４の生産性は、この酵素の由来である親株における生産性の１０〜１６倍となり、またその生産量は培養液１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは約４．５ｇに達する。
【００３１】
発現ベクターおよび宿主
本発明によれば、上記制御配列を用いて目的タンパク質を発現するための発現ベクターが提供される。
本発明による発現ベクターは、その第一の態様によれば、上記制御配列と、場合によって遺伝子マーカーとを含んでなるものである。さらに、本発明による発現ベクターは、第一の態様の発現ベクターに、さらにその制御配列に作動可能に連結された目的タンパク質をコードする塩基配列を含んでなるものである。従って、上記した本発明によるプロモーター、シグナル配列、およびターミネーターからなる群から選ばれる少なくとも一つを含んでなる発現ベクターは本発明の範囲に包含されるものである。
【００３２】
前記したように、本発明によるプロモーター配列は極めて有用性の高いものであることから、本発明の好ましい態様によれば、本発明によるプロモーター配列を少なくとも含んでなる発現ベクターが提供される。この発現ベクターにあって、シグナル配列、ターミネーター配列は本発明によるシグナル配列およびターミネーター配列以外のものであってもよいが、上記した上記本発明によるシグナル配列およびターミネーター配列の利用が好ましい。これらベクターの具体例としては、後記する実施例において構築された発現ベクターｐＭＫＤ０１、ｐＥＧＤ０１、およびｐ１ＥＤ０２からＮＥＣ３およびＮＣＥ４遺伝子を除いた形態のベクターが挙げられる。
【００３３】
本発明による発現ベクターは、宿主細胞において複製可能なベクター、例えばプラスミドを基本に構築されるのが好ましい。そのようなベクターとして、大腸菌で複製可能なベクターである、pUC Vector、pTV Vector、pBluescript 、pBR322などが挙げられる。本発明によるベクターの構築に必要な手法は、遺伝子組み替えの分野において慣用されている方法を用いることができる。
【００３４】
また遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の手法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。本発明に用いる薬剤耐性遺伝子は、宿主細胞が感受性を示す薬剤に関するものならば限定されないが、例えば、宿主としてフミコーラ・インソレンスを用いる場合、Streptomyces rimofaciens由来のデストマイシン耐性遺伝子、Escherichia coli由来のハイグロマイシンB 耐性遺伝子、Streptococcus hindustanus 由来のブレオマイシン耐性遺伝子、Streptomyces hygroscopicus由来のビアラフォス耐性遺伝子を好ましく用いることができる。
【００３５】
本発明の好ましい態様によれば、公知の方法により、Aspergillus nidulans由来trp C 遺伝子のプロモーターとターミネーター(Mullaney，E.J．et al.，Mol．Gen．Genet． 199:37-45,1985)が得られ、これを用いて、デストマイシン耐性遺伝子（特開昭59-175889 ）を発現可能にしたカセットを利用するのが好ましい。
【００３６】
本発明による発現ベクターは、種々の目的タンパク質またはペプチドの発現生産に利用することができる。本発明において目的タンパク質またはペプチドとは、フミコーラ・インソレンスに存在しないいわゆる外来タンパク質のみならず、フミコーラ・インソレンスにおいて発現してはいるがその量が微量であるタンパク質をも意味するものとする。例えば、本発明による発現ベクターにおける目的タンパク質をコードする遺伝子としては、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ等産業上有用なタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。また、これらを人為的に改良した遺伝子についても同様に目的タンパク質とすることができる。
【００３７】
本発明による発現ベクターは、宿主としてフミコーラ属に属する微生物と組み合わされて発現系とされる。本発明の好ましい態様によれば、フミコーラ属に属する微生物としてフミコーラ・インソレンスを利用する。
【００３８】
ＮＣＥ４遺伝子
本発明の好ましい態様によれば、本発明による発現系は、フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ４またはそれらの改変タンパク質を目的タンバク質として、その生産のために好ましく用いることができる。ここで、フミコーラ・インソレンス由来のセルラーゼＮＣＥ４とは、配列番号３に記載のタンパク質を意味する。これは後記する実施例に記載の通り、今般、本発明者等によって単離されたセルラーゼ酵素である。なおここで、改変タンパク質とは、上記タンパク質のアミノ酸配列において、アミノ酸の付加、挿入、削除、欠失、または置換などの改変が生じたタンパク質であって、依然としてセルラーゼＮＣＥ４と同様のセルラーゼ活性、とりわけエンドグルカナーゼ活性を保持するものを意味するものとする。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、これらセルラーゼＮＣＥ４の発現系として好ましいベクターの具体例としては、後記する実施例によって構築された発現ベクターｐＭＫＤ０１、ｐＥＧＤ０１、またはｐＩＥＤ０２が挙げられる。
【００４０】
本発明による発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子組み替えの分野で慣用されている手法を用いることができ、例えば、特開平８−５６６６３号公報に記載の方法に準じて実施することができる。また、エレクトロポレーションによって実施されてもよい。
【００４１】
目的タンパク質の生産
本発明による目的タンパク質の生産は、上記した本発明による発現ベクターで形質転換された宿主細胞を適当な培地中で培養し、培養物から目的タンパク質またはペプチドを採取することによって実施される。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、目的タンパク質の生産性は親株の１０〜１６倍となり、またその生産量は培養液１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは約４．５ｇに達する極めて効率のよいタンパク質の生産系が提供される。例えば、宿主細胞がフミコーラ・インソレンスである場合、その培養液１リットルあたり２．０ｇ、好ましくは４．０ｇ、より好ましくは４．５ｇ以上の目的タンパク質を生産することができる。この量は、従来知られたタンパク質の発現系と比較して、極めて多量である。このことは、本発明による目的タンパク質の発現系が極めて高い有用性を有していることを示している。
【００４３】
例えば、目的タンパク質がセルラーゼＮＣＥ３またはＮＣＥ４である場合、これら酵素は本来的に高活性であるが、それを更に大量に生産することができる。その結果、セルロース含有繊維の毛羽除去、減量加工、およびデニム染めセルロース含有繊維の脱色加工などに有用なセルラーゼ調製物を効率よく生産することが可能となるとの利点が得られる。
【００４４】
本発明による目的タンパク質の生産法において、形質転換体の培養は、慣用の成分、例えば炭素原、窒素原、無機塩、増殖因子成分などを含む液体培地で、好気的条件での培養法、振盪培養法、電気撹拌培養法または深部培養法により行うことができる。培地のｐＨは例えば７〜８程度である。培養は宿主細胞がフミコーラ・インソレンスである場合、フミコーラ・インソレンスの培養に慣用される通常の条件、例えば１５℃〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０℃、培養時間は２４〜２４０時間程度の条件で行うことができる。
【００４５】
本発明によって得られるタンパク質あるいはペプチドの培養物からの回収にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法等を単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
【実施例】
【００４６】
本発明を以下の実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
実施例Ａ１：フミコーラ・インソレンスからのテンセル毛羽除去に活性を有する成分の単離精製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を、（Ｎ）培地（５．０％アビセル、２．０％酵母エキス、０．１％ポリペプトン、０．０３％塩化カルシウム、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）中、３７℃で培養した。７日間培養の後、得られた培養液を７０００ｒｐｍで２０分間遠心することにより菌体を除き、培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。
【００４８】
この粗精製セルラーゼ調製液を疎水クロマトグラフィー（Phenyl-SepharoseHigh Performance16/100、ファルマシアバイオテク社製）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分画した。このうち、０．１−０Ｍの濃度勾配のときに得られた画分にテンセル毛羽除去活性が強く認められたので、その画分を再び、疎水クロマトグラフィー（Phenyl-Sepharose High Performance16/100 ）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、０．４−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、活性画分を分取した。
【００４９】
次に、その画分を逆相クロマトグラフィー（Source15 ISO、ファルマシアバイオテク社製）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、分画した。このうち、０Ｍの濃度のときに得られた画分にテンセル毛羽除去活性が強く認められたので、その画分を逆相クロマトグラフィー（Source 15 PHE 、ファルマシアバイオテク社製）に供し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１−０Ｍの濃度勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、テンセル毛羽除去活性の強い画分を精製酵素ＮＣＥ４として単離した。このＮＣＥ４はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分子量４３ｋＤａの単一なバンドを示した。
【００５０】
実施例Ａ２：セルラーゼＮＣＥ４の部分アミノ酸配列
（１）Ｎ末端アミノ酸残基の同定
実施例１において精製したタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定するため、ＦＰＬＣシステム（ファルマシアバイオテク社製）でカラムクロマトグラフィーを行い（カラム：ＲＥＳＯＵＲＣＥ（商品名）ＲＰＣ ３ｍｌ、０．１％のＴＦＡを含む５％〜６０％アセトニトリルグラジェント）、主要なピークを分取した。
【００５１】
これを凍結乾燥した後、少量の水に溶解し、８％Gel SDS-PAGE mini（テフコ社製）を用いて電気泳動した。マルチフォーII電気泳動装置（ファルマシアバイオテク社製）を用いて、これをＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に、タンパク質を電気的にうつしとり、コマジーブリリアントブルーR-250（ナカライテスク社製）で染色した後、脱色し、水で洗浄し、風乾した。ここから分子量４３KDa のタンパク質がブロットされた部分を切り出し、これをプロテインシーケンサーModel 492（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端側アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は以下の通りであった。
【００５２】
N 末端アミノ酸配列：Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-
Pro-Ser(15残基)
【００５３】
（２）ペプチドマッピング
前記（１）のＦＰＬＣによって精製されたタンパク質を凍結乾燥後、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解した。タンパク質に対し約１／２０モル量のトリプシン（プロメガ社製）を添加し、３７℃で、４８時間反応させた。この分解産物をModel 172 μプレパラティブHPLCシステム（パーキンエルマ社製）でカラムクロマトグラフィーを行い（カラム：Ｃ８ ２２０×２．１ｍｍ、０．１％ＴＦＡ、０％アセトニトリル〜−０．０８５％ＴＦＡ、３５％アセトニトリルグラジェント）、３種のペプチドを分取した。得られたペプチド断片のアミノ酸配列を前述のプロテインシーケンサーにより決定した。その結果は、以下の通りであった。
【００５４】
TP-1:Tyr-Gly-Gly-Ile-Ser-Ser(6残基)
TP-2:Phe-Pro-Asp-Ala-Leu-Lys(6残基)
TP-3:Phe-Asp-Trp-Phe-Lys-Asn-Ala-Asp-Asn-Pro-Ser-Phe-Ser-Phe-Arg
*******(15残基)
【００５５】
これらＮ末端アミノ酸配列およびペプチドマッピングによって得られたアミノ酸配列は、ＷＯ９１／１７２４３号公報（特表平５−５０９２２３号公報）に記載されているフミコーラ・インソレンスＤＳＭ１８００から得られた４３ＫＤａエンドグルカナーゼのアミノ酸配列と相同性を示すことから、同タンパク質はセルラーゼの一種であることが強く示唆された。
【００５６】
また、上記配列をProtein Identification Resource（PIR）R44.0，March，1995、またはSWISS-PROT R31.0,March 1995 に登録されている配列と比較したところ、相同性を示す配列はあるものの、同一ではなく、新規なタンパク質であることが明らかとなった。
【００５７】
実施例Ａ３：ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
ゲノムＤＮＡの単離はHoriuchiらの方法（Hiroyuki Horiuchi et al.，J．Bacteriol.，170:272-278,1988 ）に従った。
【００５８】
まず、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を前述（Ｎ）培地中、３７℃で培養した。２日間培養の後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。得られた菌体をフェノール処理、プロテイナーゼＫ、およびリボヌクレアーゼＡ処理、さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿化によりゲノムＤＮＡを得た。
【００５９】
つぎに、フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡをSau3A I により消化し、アガロースゲル電気泳動によって、９〜２３ｋｂｐの範囲で部分的に分解されたことを確認した後、これをエタノール沈殿によって回収した。このＤＮＡ断片をファージベクター、EMBL3 クローニングキット（ストラタジーン社製）のBamH IアームにT4リガーゼ（東洋紡績社製）を用いて連結させた。これをエタノール沈殿後、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。
【００６０】
連結混合物の全量をHohn，B.の方法（ Hohn，B．Methods Enzymol.，68:299-309,1979 ）に記載されている様に凍結したパッケージ成分およびギガパックIIパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、ラムダヘッドにパッケージし、得られたファージを大腸菌ＬＥ３９２株に感染させた。この方法により得られた５×１０4個のファージライブラリーを用いて目的遺伝子のクローニングを行った。
【００６１】
実施例Ａ４：ＰＣＲ法による長鎖プローブの作製
ＤＮＡプローブとして、フミコーラ・インソレンスの全ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ法により増幅されたロングプローブを作製し、これを用いた。
【００６２】
各プライマーは、Ｎ末端およびペプチドTP-3において＊で示したアミノ酸に対応するＤＮＡを合成した。作製した合成オリゴヌクレオチドの配列は以下に示される通りであった。
【００６３】
NCE4N1:5’-GCXGA(CT)GGXAA(AG)TC(AGCT)AC-3’(17mer)
NCE4N2:5’-GCXGA(CT)GGXAA(AG)AG(CT)AC-3’(17mer)
NCE4C:5’-CXGC(AG)TT(CT)TT(AG)AACCA(AG)TC-3’(19mer)
(X:イノシン)
【００６４】
ＰＣＲ反応は以下の条件で行った。まず、フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーとしてNCE4N1、NCE4C 各１μＭ加えたもの、NCE4N2、NCE4C 各１μＭ加えたものの２組のチューブを作製し、これらを、ｄＮＴＰ存在下、９５℃、５分間熱変性を行った。その後、Taq ポリメラーゼ（リコンビナントTaq 、宝酒造社製）を加え、９４℃１分間、４５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を２５回繰り返すことにより増幅した。その結果、プライマーとしてNCE4N1、NCE4C を用いた場合のみ、約７５０ｂｐのＤＮＡが増幅された。これを以降のスクリーニングのプローブとして用いた。
【００６５】
実施例Ａ５：セルラーゼ成分ＮＣＥ４遺伝子のクローニング
（１）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
ＰＣＲ法により増幅させた約７５０ｂｐのＤＮＡ断片１００ｎｇを、あらかじめECL ダイレクトDNA/RNA ラベリング検出システム（アマシャム社製）により、標識化しておいた。
【００６６】
実施例２に記載の方法に準じて作製したファージプラークは、ハイボンドN+ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）にうつしとり、０．４Ｎ水酸化ナトリウムで変性した後、5 倍濃度ＳＳＣ（１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットの方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、４時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。ラベルの洗浄は前述キットの方法に従った。まず、０．４％ＳＤＳ、６Ｍ尿素添加０．５倍濃度ＳＳＣにより４２℃で２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に２倍濃度ＳＳＣにより室温で５分間の洗浄を２回行った。
【００６７】
プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、添付されている検出溶液に１分間浸したあと、ハイパーフィルム―ECL（アマシャム社製）に感光させ、４個の陽性クローンを得た。
【００６８】
（２）ファージＤＮＡの調製
E．coli ＬＥ３９２にファージを感染させ、８時間後ファージ粒子を集め、Grossberger の方法（Grossberger,D.,Nucleic Acids．Res．15 6737,1987 ）により、プロテイナーゼＫおよびフェノール処理後、エタノール沈殿により、ファージＤＮＡを分離した。
【００６９】
（３）目的遺伝子のサブクローニング
４種のファージＤＮＡをSal I で切断し、アガロース電気泳動に供した。
ＤＮＡをSouthernの方法（Southern,E.M.,J.Mol.Biol．98:503-517，1975）により、ナイロンメンブランにうつしとり、前記（１）のプラークハイブリダイゼーションと同一の条件で、約７５０ｂｐのプローブを用いハイブリダイズさせ、５．２ｋｂｐの目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を検出した。その結果、４種のファージＤＮＡが同一サイズのSal I 断片を有していた。
【００７０】
この５．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をセファグラスバンドプレップキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて分離し、E．coli ＪＭ１０９を用いプラスミドｐＵＣ１１９のSal I サイトにサブクローニングを行った。得られたプラスミドをｐＮＣＥ４Ｓａｌとした。
【００７１】
実施例Ａ６：塩基配列の決定
（１）ゲノムＤＮＡの塩基配列解析
塩基配列決定は以下の様に実施した。
塩基配列解析装置は、A.L.F．DNAシーケンサーII（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。シーケンシングゲルとしては、レディミックスゲル（ファルマシアバイオテク社製）または、ハイドロリンクロングレンジャー（ＦＭＣ社製）として入手可能なアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（N，N，N'，N'- テトラメチルエチレンジアミン、尿素、過硫酸アンモニウム）としては、A.L.F グレードの試薬（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。塩基配列解読反応は、オートリードシーケンシングキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いた。ゲル作製条件、反応条件と泳動条件の各々は、各説明書の詳細を参照し、設定した。
【００７２】
テンペレートＤＮＡであるｐＮＣＥ４Ｓａｌを、１０μｇの２Ｍ水酸化ナトリウムでアルカリ変性した後、オートリードシーケンシングキット添付のユニバーサルプライマーとアニーリングさせ、伸長反応を行った。反応産物をシーケンサーで解読したところ、５４６ｂｐの塩基配列が判明した。この結果から、MNEG01なるFITC標識シーケンシングプライマーを作製し、ｐＮＣＥ４Ｓａｌに対して反応させ、さらに解読を進めた。得られた結果から、さらに次のプライマーを作製してゆき、解読を進めた結果、ＮＣＥ４の全長が解読された。作製したFITC標識シーケンシングプライマーは以下に示される通りであった。
【００７３】
MNEG-01:5’-GTGATGAGGGCTGGCGACAGGCC-3’(23mer)
MNEG-02:5’-CTGCCACCTCTATTGCCGGCAGC-3’(23mer)
MNEG-03:5’-CCCGACGCCCTCAAGCCCGGCTG-3’(23mer)
MNEG-04:5’-GGCTGGAGCGGCTGCACCACCTG-3’(23mer)
【００７４】
（２）塩基配列決定
上記（１）の結果をもとに、MNEG-05 〜MNEG-08 なるFITC標識シーケンシングプライマーＤＮＡを合成した。作製したFITC標識シーケンシングプライマーは以下に示される通りであった。
【００７５】
MNEG-05:5’-GACCTGACGGAAGCTGAAGCTCG-3’(23mer)
MNEG-06:5’-AGCAGTGCAGCCGCTGGGAGTCG-3’(23mer)
MNEG-07:5’-TGGCAGATGAGGACGTGGTGTTG-3’(23mer)
MNEG-08:5’-CGCAGCCGGACTTGGCGTCGAAG-3’(23mer)
【００７６】
これらプライマーとｐＮＣＥ４Ｓａｌとのオートリードシーケンシングキットによる反応を行った。まず、１０μｇのプラスミドをアルカリ変性し、これを各々のプライマーとアニーリングし、Ｔ７ポリメラーゼで反応させた。その結果、SalI断片の内、１２５７ｂｐの塩基配列が決定できた。その配列は配列番号３に示される通りであった。
【００７７】
実施例Ａ７：イントロンの決定
イントロンの決定には、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１からｍＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これとゲノムの塩基配列を比較し同領域を判定した。
【００７８】
（１）全ＲＮＡの調製
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１をセルラーゼ誘導培地、好ましくは前述（N ）培地において２日間培養し、菌体を遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）により回収した。そのうち２ｇの菌体を滅菌水で洗浄し、液体窒素で凍結したままブレンダー（日本精機社製ホモジナイザーAM-3）で粉砕した。これを４Ｍグアニジンチオシアン酸塩を含む変性溶液１０ｍｌ（４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍメルカプトエタノール）に懸濁した。室温で数分間撹拌の後、１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で中和し、１０ｍｌのＴＥ飽和フェノールを加えさらに撹拌した。これに２ｍｌのクロロホルム―イソアミルアルコール（２４：１）を加え、よく撹拌した後、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によりフェノールで変性した菌体成分を除去した。上層（水層）を吸い取り、１０ｍｌのイソプロパノールで核酸を沈殿化した。同沈殿を遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）して核酸として回収し、７０％エタノール―水で再遠心分離により沈殿を洗った。
【００７９】
この沈殿を３．５ｍｌのＴＥに溶解の後、溶液に８８０μｌの１０Ｍ塩化リチウム溶液を加え、５℃で２時間冷蔵の後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分）により沈殿を回収した。同沈殿は７０％エタノールで洗い、これを全ＲＮＡ画分とした。収量は２．７ｍｇ、 収率は０．１４％であった。
【００８０】
（２）ポリＡテイル+ＲＮＡ（＝ｍＲＮＡ）の調製
ｍＲＮＡの調製は、ｍＲＮＡピュアリフィケーションキット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。
【００８１】
まず上記（１）で調製した全ＲＮＡのうち、１ｍｇを１ｍｌのエリューションバッファーに溶解し、これに６５℃、１０分間の熱変性処理を加えた。氷中で急冷の後、０．２ｍｌのサンプルバッファーを加えた。この全量のＲＮＡ溶液をオリゴ（dT）セルロースカラムにチャージし、ハイソルトバッファーで３回、ロウソルトバッファーで３回カラムを洗浄の後、６５℃に加温したエリューションバッファーで溶出した。このカラム操作を２回繰り返し、ｍＲＮＡ画分とした。収量は１９．２μｇ、収率は２％であった。
【００８２】
（３）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡ合成は、タイムセーバーcDNA合成キット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて行った。
【００８３】
まず、５μｇのｍＲＮＡを２０μｌのサンプルバッファーに溶解した。６５℃、１０分間の熱処理の後、ファーストストランド合成ミックスにジチオスレイトール溶液およびオリゴ（dT）プライマーと共に添加し、３７℃で１時間反応させた。次に、この全量をセカンドストランドミックスに加え、１２℃、３０分間、次いで２２℃、１時間反応させ、これをｃＤＮＡとした。
【００８４】
（４）セルラーゼＮＣＥ４ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
合成したｃＤＮＡのうち１μｇを鋳型とし、目的のｃＤＮＡのみをＰＣＲ法により増幅した。Ｎ末端およびＣ末端のプライマーとして以下の様な配列のオリゴヌクレオチドプライマーを作製した。
【００８５】
NCE4-CN:5’-ATGCGTTCCTCCCCTCTCCTCCGCTCCGCC-3’(30mer)
NCE4-CC:5’-TACAGGCACTGATGGTACCAGTCATTAATC-3’(30mer)
【００８６】
ＰＣＲ反応は、以下の条件で行った。まず、フミコーラ・インソレンスｃＤＮＡ１μｇに対し、プライマーを各１μＭ加え、dNTP存在下、９４℃、１０分間熱変性を行った。その後、Taq ポリメラーゼ（リコンビナントTaq 、宝酒造社製）を加え、９４℃１分間、５０℃２分間、７２℃３分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動の結果、０．９ｋｂｐの大きさであった。これをエタノール沈殿化により濃縮し、pT7 ブル−T ―ベクターキット（ノバジェン社製）によりクローン化した。このプラスミドをｐＣＮＣＥ４とした。
【００８７】
（５）ｃＤＮＡの塩基配列解析
シーケンシング反応は前述同様オートリードシーケンシングキットを用いた。
プラスミドｐＣＮＣＥ４を２Ｍ水酸化ナトリウムでアルカリ変性し、エタノールで沈殿化した。この一本鎖プラスミドをテンペレートとし、Ｔ７ポリメラーゼで反応させた。前記合成プライマーMNEG01、MNEG02、MNEG03、MNEG04、MNEG05、MNEG06、MNEG07、およびMNEG08ならびにキット添付のユニバーサルプライマー、リバースプライマーを用いて反応を行い、配列を解読した。
【００８８】
その結果、５６ｂｐの一つのイントロンが存在した。配列番号３の配列において、非翻訳開始配列およびその終了配列、イントロン内部の調整配列は下記の通りである（数字は配列番号３の配列位置番号である）。
Introne ：４５３〜４５８、５０６〜５０８、４９１〜４９７
【００８９】
実施例Ｂ１：プラスミドｐＭＫＤ０１の作製
（１）プラスミドｐＵＣ１１８ＢＮの作製
ｐＵＣ１１８ ＤＮＡ １μｇをBamH Iによって切断後、フェノール処理によって制限酵素を失活させた。これをエタノール沈殿し、少量のＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解した。このＤＮＡをDNA ブランチング キット( 宝酒造社製)によって末端を平滑化した。これをさらにDNA ライゲイション キット（宝酒造社製）によって連結し、自己閉環させた。得られた連結混合物をE．coli competent cells ＪＭ１０９（宝酒造社製）に形質転換した。形質転換体について、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭ ＩＰＴＧ、０．００４％ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で生育可能で、かつ白色のコロニーを呈するものを選抜し、これを更に、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）において一晩、３７℃で培養した。得られた培養液から、アルカリ−ＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをBamH Iによって切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、ｐＵＣ１１８ ＤＮＡのBamH I部位を破壊したプラスミドＤＮＡを選択した。このプラスミドＤＮＡをｐＵＣ１１８ＢＮとした。
【００９０】
（２）プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮの作製
ｐＵＣ１１８ＢＮ ＤＮＡ １μｇをSph I によって切断し、前述と同様の方法により、ｐＵＣ１１８ＢＮ のSph I 部位を破壊したプラスミドＤＮＡを得た。このプラスミドＤＮＡをｐＵＣ１１８ＢＳＮとした。
【００９１】
（３）プラスミドｐＭ２１の作製
（Ａ）セルラーゼＮＣＥ２遺伝子の単離
フミコーラ・インソレンスから、特開平８−１２６４９２号公報に記載の方法によって得られる、セルラーゼＮＣＥ２遺伝子、ならびにそのプロモーターおよびターミネーター領域として上流に１．４Ｋｂ、下流に０．５ＫｂのＤＮＡ配列を有する全長３．４ＫｂｐのPst I 〜Xba I 断片を、先のｐＵＣ１１８ＢＳＮのPst I 〜Xba I 部位に連結した。得られたラスミドＤＮＡをｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸとした。
【００９２】
（Ｂ）プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸの部位指定変異処理
ＮＣＥ２遺伝子のＮ末端の下流および終止コドンのすぐ下流に、BamH I部位を以下のように部位指定変異により導入した。プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸによりE．coli ＪＭ１０９株を形質転換し、さらにヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させた後、アンピシリン、カナマイシンをそれぞれ１５０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌの濃度で含む３０ｍｌの、２×ＹＴ液体培地（１．６％バクトトリプトン、０．８％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）において、３７℃で、１６〜２０時間培養した。培養上清よりＭ１３の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を回収した。このｓｓＤＮＡと２種の合成オリゴヌクレオチドを用い、スカルプタ−インビトロミュータジェネシスシステム（アマシャム社製）を使用して、部位指定変異処理を行った。作製した合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列は以下に示されるとおりであった。
【００９３】
MNC-02 5’-GAGCGCCAGAACTGTGGATCCACTTGGTGAGCAATG-3’(36mer)
MNC-03 5’-TCCGCCGTTCTGAGCGGATCCAGGCGTTTGGCGCG-3’(36mer)
【００９４】
部位指定変異処理したＤＮＡ混合液を、E．coli ＴＧ１に導入し、得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）にて培養し、プラスミドＤＮＡを回収した。このプラスミドＤＮＡをBamH Iによって切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドｐＵＣ１１８ＢＳＮ−ＰＸに二箇所BamH I部位の導入されたプラスミドＤＮＡを選択した。このプラスミドＤＮＡをｐＭ２１とした。
【００９５】
（４）セルラーゼＮＣＥ３遺伝子の単離
公知のHumicola grisea 由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子（de Oliviera Alzevedo,M.et al.,J.General Microbiol.,136:2569-2576,1990 ）の配列をもとに、フミコーラ・インソレンス由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子（ＮＣＥ３）をＰＣＲ法により単離した。
【００９６】
（Ａ）ゲノムＤＮＡの単離
前記実施例Ａ３の方法によりフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１のゲノムＤＮＡを得た。
【００９７】
（Ｂ）セルラーゼＮＣＥ３遺伝子のＰＣＲ法による増幅 Humicola grisea 由来のセロビオハイドロラーゼ遺伝子の配列をもとに、フミコーラ・インソレンスのＮＣＥ３遺伝子をＰＣＲ法により単離した。このＮＣＥ３を含むＰＣＲ産物が、プラスミドｐＭ２１のBamH I部位にフレームを合わせて連結できるように、各プライマーにはあらかじめBamH I部位を含む形で設計した。プライマーとして以下のような配列の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
【００９８】
MKA-05:5’-GCCGCCCAGCAGGCGGGATCCCTCACCACCGAGAGG-3’(36mer)
MKA-06:5’-TGATCGTCGAGTCAGGGATCCAGAATTTACAGGCAC-3’(36mer)
【００９９】
ＰＣＲ反応はLA PCR Kit Ver.2（宝酒造社製）に従い、以下の方法で行った。まず、前述の方法によって得られるフミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーを各１μＭ、４００μＭ dNTP 、LA Taqポリメラーゼ２．５Ｕを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を３０回繰り返すことにより増幅した。０．８％アガロースゲル電気泳動の結果、１．６ＫｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。この１．６ＫｂｐのＤＮＡ断片をセファグラスバンドプレップ キット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて回収し、これをpT7 ブルーT-ベクター キット（ノバジェン社製）に連結した。このプラスミドＤＮＡをｐＫ２１とした。
【０１００】
（５）プラスミドｐＫＭ０４の作製
プラスミドｐＫ２１ＤＮＡをBamH Iによって消化し、１．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、プラスミドｐＭ２１ＤＮＡをBamH Iによって消化し、さらに７０℃で１０分間処理し、制限酵素を失活させた。これを子牛由来のアルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）によって脱リン酸化し、さらに、これを０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、５．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＫ２１由来の１．６ＫｂｐのＤＮＡ断片とｐＭ２１由来の５．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＫＭ０４を得た。
【０１０１】
（６）プラスミドｐＭＫＤ０１の作製
まず、公知の方法により得られるAspergillus nidulans由来trp C 遺伝子のプロモーターおよびターミネーター（Mullaney，E.J． et al.，Mol．Gen．Genet．199:37-45,1985 ）を用いて、特開昭５９−１７５８８９号公報に記載されているデストマイシン耐性遺伝子をフミコーラ・インソレンスで発現可能にした遺伝子を作製した。これを、プラスミドｐＫＭ０４のXba I 部位に導入し、プラスミドｐＭＫＤ０１を作製した。
【０１０２】
実施例Ｂ２：プラスミドｐＭＫＤ０１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
（１）プラスミドｐＭＫＤ０１の高濃度精製標品の調製
プラスミドｐＭＫＤ０１をフミコーラ・インソレンスに導入するために、まずｐＭＫＤ０１の高濃度精製標品を調製した。ｐＭＫＤ０１をE．coli ＪＭ１０９に導入し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌ ＬＢ培地において一晩、３７℃で培養した。得られた培養液をフレキシプレップ キット（ファルマシアバイオテク社製）を用いて精製し、１μｇ／μｌのｐＭＫＤ０１プラスミドＤＮＡを得た。
【０１０３】
（２）フミコーラ・インソレンスの形質転換
フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を（Ｓ）培地中３７℃で培養し、２４時間後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離により集菌した。ここで、（Ｓ）培地の組成は、前述（Ｎ）培地にグルコース（３．０％）を加え、かつアビセルを除いたものである。得られた菌体を０．５Ｍシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍｌ Novozyme 234（ＮＬＩ社製）、５ｍｇ／ｍｌ Cellulase Onozuka R-10（ヤクルト社製）、０．５Ｍ シュークロース）１０ｍｌに懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。この懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣ緩衝液（０．５Ｍシュークロース、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））で洗浄した。
【０１０４】
以上のように調製したプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁し、この１００μｌに対し１０μｇのＤＮＡ（ＴＥ）溶液（１０μｌ）を加え、氷中に５分間静置した。つぎに、４００μｌのＰＥＧ溶液（６０％ ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液を加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。集めたプロトプラストを１ｍｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、最終的に１００μｌのＳＵＴＣ緩衝液に懸濁した。
【０１０５】
以上の処理を加えたプロトプラストを、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＹＭＧ培地（１％グルコース、０．４％酵母エキス、０．２％モルトエキス、１％寒天（ｐＨ６．８））上に、ＹＭＧ軟寒天とともに重層し、３７℃で５日間培養した後、形成したコロニーを形質転換体とした。
【０１０６】
（３）ｐＭＫＤ０１による形質転換株の培養およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる評価
前記のようにプラスミドｐＭＫＤ０１をフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１に導入し、ハイグロマイシン耐性を示す株を５０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｐＭＫＤ０１による形質転換株のうち５クローンにおいて、ＮＣＥ３と推定されるタンパク質バンドが、親株より３〜４倍増加していた。
【０１０７】
（４）組み換えＮＣＥ３のＮ末端アミノ酸残基の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、大量発現したタンパク質バンドがＮＣＥ３遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、親株とＮＣＥ３高発現株から得られた培養上澄について、前記実施例Ａ２の方法に従いFPLCシステムを用いたカラムクロマトグラフィーを行い、主要なピークを比較した。ＮＣＥ３高発現株において特に増加しているピークを分取し、凍結乾燥した。これを少量の水に溶解し、8 ％Gel SDS-PAGE mini（テフコ社製）を用いて電気泳動した。これを前記実施例Ａ２の方法に従ってPVDF膜に、タンパク質を電気的にうつしとり、コマジーブリリアントブルーR-250 で染色した後、脱色し、水で洗浄した。ここから、分子量６６ＫＤのタンパク質がブロットされた部分を切り出し、ブロットされたタンパク質を、Podell，D．N．らの方法（Podell，D．N．et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun．,81:176,1978 ）に従い、修飾Ｎ末端残基を除去した。まず、目的タンパク質を切り出し、少量の０．５％ポリビニルピロリドン（分子量４０，０００、シグマ社製）／１００ｍＭ酢酸溶液中で、３７℃で３０分間保温した後、水でよく洗浄した。次に、Pfu ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ（宝酒造社製）により修飾Ｎ末端残基を除去し、水で洗浄、風乾した。これをプロテインシーケンサーModel 492 に供し、Ｎ末端側アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は以下に示される通りであった。
【０１０８】
N末端アミノ酸配列：Asn-Cys-Gly-Ser-Leu-Thr-Thr-Glu-Arg-His-Pro-Ser-Leu-Ser-Trp
(15残基)
【０１０９】
このＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＭＫＤ０１の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ２、ＮＣＥ３融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。
【０１１０】
（５）ｐＭＫＤ０１による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
前述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥでＮＣＥ３の大量発現が確認された５クローンの培養上澄をさらに定量するために、ＦＰＬＣシステムによりカラムクロマトグラフィーを行った。その条件は前記（４）と同一とした。ＮＣＥ３のピークを分取し、これを凍結乾燥し、重量を測定して高発現株と親株の生産性を比較した。その結果は、次の表に示されるとおりであった。
【０１１１】
【表１】
2004337173.tif 000002
【０１１２】
実施例Ｂ３：プラスミドｐＥＧＤ０１の作製
プラスミドｐＭＫＤ０１をBamH Iによって消化し、さらに７０℃の熱処理によって制限酵素を失活させ、脱リン酸化処理し、８．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【０１１３】
次に、上記実施例Ａ１〜７で得られたフミコーラ・インソレンス由来のＮＣＥ４遺伝子の配列をもとに、ＰＣＲ法によりＮＣＥ４遺伝子を増幅した。このＮＣＥ４を含むＰＣＲ産物は、前述プラスミドｐＭＫＤ０１の８．２ＫｂｐのBamH I断片にフレームを合わせて連結できるように、各プライマーにはあらかじめBamH I部位を含む形で設計した。プライマーとして以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
【０１１４】
NCE4-N:5’-CCGGTGTTGGCCGGATCCGCTGATGGCAAG-3’(30mer)
NCE4-C:5’-TAAGGCCCTCAAGGATCCCTGCGTCTACAG-3’(30mer)
【０１１５】
ＰＣＲ反応は、以下のように行った。フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇに対し、プライマーを各１μＭ、４００μＭ dNTP 、Pfu DNA ポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５Ｕを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃３分間の反応条件を２５回繰り返すことにより０．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。この０．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収し、これを前述ｐＭＫＤ０１の８．２Ｋｂｐ BamH I 断片に連結した。このプラスミドＤＮＡをｐＥＧＤ０１とした。
【０１１６】
実施例Ｂ４：プラスミドｐＥＧＤ０１の発現
（１）プラスミドｐＥＧＤ０１によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
プラスミドｐＥＧＤ０１によるフミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１の形質転換は、実施例Ｂ２の方法に従って行った。まず、ｐＥＧＤ０１の高濃度精製標品を調製し、１μｇ／μｌのｐＥＧＤ０１プラスミドＤＮＡを得た。このｐＥＧＤ０１溶液を１０μｌ使用して、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を形質転換し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株を５０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｐＥＧＤ０１による形質転換株のうち１０クローンにおいて、ＮＣＥ４と推定されるタンパク質バンドが、親株より１０〜１６倍増加していた。
【０１１７】
（２）組み換えＮＣＥ４のＮ末端アミノ酸残基の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、大量発現したタンパク質バンドがＮＣＥ４遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、親株、ＮＣＥ４高発現株から得られた培養上澄をＦＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い、主要なピークを比較した。条件は上記実施例Ｂ２と同一とした。ＮＣＥ４高発現株において特に増加しているピークを分取し、凍結乾燥した。これを少量の水に溶解した。実施例Ｂ２の方法に従って修飾Ｎ末端残基を除去した後、前述のプロテインシーケンサーによって、Ｎ末端側アミノ酸配列を決定した。その結果、２種類のＮ末端側アミノ酸配列がおよそ７：３の割合で得られた。得られた配列は以下に示される通りであった。次に、修飾Ｎ末端を除去せずに前述のプロテインシーケンサーによって、Ｎ末端側アミノ酸配列を決定した。その結果、以下に示されるアミノ酸配列１のみが得られた。
【０１１８】
N末端アミノ酸配列1：Val-Val-Glu-Glu-Arg-Gln-Asn-Cys-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp(20残基)
N末端アミノ酸配列2：Asn-(Cys)-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)-(Cys)-Lys-Pro-Ser-(Cys)(20残基)
【０１１９】
これらのＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＥＧＤ０１の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ２およびＮＣＥ４融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。Ｎ末端側アミノ酸配列が２種類得られたことで、本融合タンパク質のシグナル配列が切断される際、複数の位置でプロセスされることが明らかとなった。
【０１２０】
（３）ｐＥＧＤ０１による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
前述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥでＮＣＥ４の大量発現が確認された５クローンの培養上澄をさらに定量するために、ＦＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い、ＮＣＥ４のピークを分取した。これを凍結乾燥し、重量を測定し、高発現株と親株の生産性を比較した。その結果は、次の表に示される通りであった。
【０１２１】
【表２】
2004337173.tif 000003
【０１２２】
実施例Ｂ５：プラスミドｐＩＥＤ０２の作製
（１）プラスミドｐＩＤ０１の作製
プラスミドｐＥＧＤ０１をHind IIIおよびBamH Iによって消化し、７．２ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
次に、特開平８−５６６３号公報に記載の方法で得られるフミコーラ・インソレンス由来のＮＣＥ１遺伝子の配列をもとに、ＰＣＲ法によりＮＣＥ１遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列をコードする部分のＤＮＡを増幅した。このＮＣＥ１プロモーターおよびシグナル配列を含むＰＣＲ産物は、前述プラスミドｐＥＧＤ０１の７．２ＫｂｐのHind III〜BamH I断片に連結できるように、各プライマーにはあらかじめHind III、BamH I部位を含む形で設計した。プライマーとして以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
【０１２３】
PNCE1-N:5’-GTCATGAAGCTTCATTAAGGTACGTATGCAAC-3' (32mer)
PNCE1-C:5’-GGTGATGGATCCGGCCTGCTGGGCAGCGACGC-3' (32mer)
【０１２４】
ＰＣＲ反応は、実施例３と同様に行った。フミコーラ・インソレンスゲノムＤＮＡ１μｇ対し、プライマー各１μＭ、４００μＭ dNTP 、Pfu DNA ポリメラーゼ２．５Ｕを加え、９４℃１分間、５５℃２分間、７２℃４分間の反応条件を２３回繰り返すことにより１．５ＫｂのＤＮＡ断片を増幅した。このＰＣＲ産物をHind IIIおよびBamH Iによって消化し、１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これを前述ｐＥＧＤ０１の７．２ＫｂｐのHind III〜BamH I断片に連結した。このプラスミドＤＮＡをｐＩＤ０１とした。
【０１２５】
（２）プラスミドｐＩＥＤ０２の作製
プラスミドｐＩＤ０１をBamH Iによって消化し、７０℃の熱処理で制限酵素を失活させ、さらに脱リン酸化処理した後、８．６ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。次に、プラスミドｐＥＧＤ０１をBamH Iによって消化した後、ＮＣＥ４遺伝子を含む０．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を回収した。２つの断片を連結し、プラスミドｐＩＥＤ０２を得た。
【０１２６】
実施例Ｂ６：プラスミドｐＩＥＤ０２の発現
（１）プラスミドｐＩＥＤ０２によるフミコーラ・インソレンスの形質転換
プラスミドｐＩＥＤ０２によるフミコーラ・インソレンスのＭＮ２００−１形質転換は、実施例Ｂ２の方法に従って行った。まず、ｐＩＥＤ０２の高濃度精製標品を調製し、１μｇ／μｌのｐＩＥＤ０２プラスミドＤＮＡを得た。このｐＩＥＤ０２溶液を１０μｌ使用して、フミコーラ・インソレンスＭＮ２００−１を形質転換し、ハイグロマイシン耐性を示す形質転換株を５０株選抜した。これらを（Ｎ）培地で３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、ｐＩＥＤ０２による形質転換株のうち５クローンにおいて、ＮＣＥ４と推定されるタンパク質バンドが、親株より５〜１０倍増加していた。
【０１２７】
（２）組み換えＮＣＥ４のＮ末端アミノ酸残基の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、大量発現したタンパク質バンドがＮＣＥ４遺伝子由来であることを確認するために、このタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、実施例Ｂ２と同様の方法によって、親株およびＮＣＥ４高発現株から得られた培養上澄についてＦＰＬＣシステムを用いたカラムクロマトグラフィーを行い、ＮＣＥ４のピークを分取し、凍結乾燥した。これを少量の水に溶解した。実施例Ｂ２の方法に従って修飾Ｎ末端残基を除去した後、前述のプロテインシーケンサーによって、Ｎ末端側アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は以下に示される通りであった。
【０１２８】
N末端アミノ酸配列:Gln-Ala-Gly-Ser-Ala-Asp-Gly-Lys-Ser-Thr-Arg-Tyr-Trp-Asp-(Cys)
(15残基)
【０１２９】
このＮ末端側アミノ酸配列は、プラスミドｐＩＥＤ０２の塩基配列から推定されるセルラーゼＮＣＥ１、ＮＣＥ４融合タンパク質のアミノ酸配列と一致した。
【０１３０】
（３）ｐＥＧＤ０２による形質転換株のＦＰＬＣよる評価
前述の様にＳＤＳ−ＰＡＧＥでＮＣＥ４の大量発現が確認された５クローンの培養上澄をさらに定量するために、ＦＰＬＣシステムでカラムクロマトグラフィーを行い、ＮＣＥ４のピークを分取した。これを凍結乾燥し、重量を測定し、高発現株と親株の生産性を比較した。その結果は、次の表に示されるとおりであった。
【０１３１】
【表３】
2004337173.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、プラスミドｐＭ３−１の制限酵素地図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＭ１４−１の制限酵素地図である。
【図３】図３は、プラスミドベクターｐＭＫＤ０１の制限酵素地図である。
【図４】図４は、プラスミドベクターｐＥＧＤ０１の制限酵素地図である。
【図５】図５は、プラスミドベクターｐＩＥＤ０２の制限酵素地図である。
【図１】
2004337173.tif 000005
【図２】
2004337173.tif 000006
【図３】
2004337173.tif 000007
【図４】
2004337173.tif 000008
【図５】
2004337173.tif 000009
【配列表】
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