(57)【要約】【解決手段】酵母Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　Ｓ−２が生産するリパーゼＣＳ２のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子のＤＮＡ配列が新たに決定され、アミノ酸配列の結果から、本酵素は植物表層を保護する高分子エステルであるクチンを分解できるクチナーゼであることも確認された。【効果】本遺伝子を含む組換えベクターも創製されたので、組換えＤＮＡ技術を利用することにより、リパーゼＣＳ２（クチナーゼ）の工業生産が可能となり、薬品、飲食品、洗剤のほか、バイオディーゼル燃料、ポリ乳酸等生分解性プラスチックの分解剤等の用途に広く本酵素を利用することができる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
タンパク質がリパーゼＣＳ２活性を有することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２の塩基配列で示される、請求項１又は２に記載のタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくともコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
【請求項５】
組換えベクターＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の組換えベクターを微生物に導入し、得られた形質転換体を利用すること、を特徴とするリパーゼＣＳ２活性を有するタンパク質を生産する方法。
【請求項７】
微生物が酵母であること、を特徴とする請求項６に記載のリパーゼＣＳ２活性を有するタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵母由来のリパーゼＣＳ２遺伝子に関するものである。更に詳細には、本発明は、リパーゼＣＳ２のアミノ酸配列、それをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列の決定にも成功したものである。これらの配列は、いずれも従来未知の新規配列であり、本発明は、これらの配列が明らかにされたことによって、組み換えＤＮＡ技術の利用が可能となり、その結果、脂質分解だけではなく、バイオディーゼル燃料の生産、ポリ乳酸等プラスチックの分解といった各種のしかも新規な工業用途を有するリパーゼＣＳ２の大量生産を可能とするものである。
【０００２】
【従来の技術】
本発明者らは、酵母、クリプトコッカス　エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２）の培養物から新規リパーゼＣＳ２を製造する技術を先に開発したところである（特開２００１−２５２０７２）。
【０００３】
本酵素は、油脂分解能が高いだけでなく有機溶媒に安定であるという特性を有しているため、薬品、飲食品、化粧品、洗剤等従来からのリパーゼの用途に加え、有機溶媒存在下でのエステル交換やエステル合成といった分解の逆反応である合成反応への利用も可能であって、例えば、植物油など天然の再生産可能な原料から作られ、しかもクリーンな燃料であるバイオディーゼル燃料の生産に用いることも本発明者らによって提案されている。
【０００４】
更にまた、本酵素はすぐれたプラスチック分解能を有し、例えば、農業用フィルムや包装フィルムその他各種用途に広く利用されているポリ乳酸（ＰＬＡ）を効率的に分解することができ、環境汚染防止にきわめて有効であることも、本発明者らによって新たに見出された。
しかしながら、本酵素をコードする遺伝子については、従来何も報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記したように数多くのしかも非常にすぐれた用途を有するリパーゼＣＳ２について、組換えＤＮＡ技術による工業的大量生産等に資するため、その遺伝子を解明する目的でなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
リパーゼＣＳ２は、本発明者らによって開発された新規酵素であって、下記の理化学的性質を有し、クリプトコッカス属に属する酵母、例えばクリプトコッカス　エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　Ｓ−２）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５）の培養物から分離、採取することができる（特開２００１−２５２０７２）。
【０００７】
本酵素の理化学的性質は、次のとおりである。
【０００８】
（１）作用
油脂分解性を有し、トリグリセリドに作用して、グリセリンと脂肪酸に加水分解する。
【０００９】
（２）基質特異性
トリプチリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリオレインをよく分解する。トリアセチン、トリカプリン、トリラウリンは中程度に分解する。トリミリスチン、トリステアリンに対する分解力は弱い。
【００１０】
（３）位置特異性
トリオレインに作用せしめると、オレイン酸と少量の１，２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオレインとモノオレインは検出されない。
【００１１】
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
至適ｐＨ：７．０
安定ｐＨ範囲：５〜９
【００１２】
（５）反応最適温度及び温度による失活の条件
反応最適温度：３７℃
温度による失活の条件：温度上昇による活性の失活は緩やかであり、６０℃、３０分の熱処理においても活性を維持している。
【００１３】
（６）有機溶媒に対する安定性、活性化
有機溶媒に安定であり、更に、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテルによって活性が上昇する。
【００１４】
（７）分子量
２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１５】
本発明は、前記目的を達成するためになされたものであって、鋭意研究の結果、上記したリパーゼＣＳ２をコードする遺伝子のクローニング及びその塩基配列の決定にも成功し、本発明の完成に至ったものである。
以下、本発明について詳述する。
【００１６】
精製したリパーゼＣＳ２をタンパク質分解酵素（リシルエンドペプチダーゼ）で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきアミノ酸配列を決定した。そのいくつかの断片につきアミノ酸配列を決定したその部分配列をもとにＤＮＡプライマー（混合プライマー）を設計し、リパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列の決定に用いた。
【００１７】
リパーゼＣＳ２遺伝子をクローニングするために、先ず、液体培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２の菌体よりｍＲＮＡを調整し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。このｃＤＮＡをテンプレートに、上記プライマーを用いてリパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列（約１８０塩基）をまず決定した。その決定した内部配列を利用し新たなプライマーを設計し、それを用いて３’−及び５’−ＲＡＣＥ法によりリパーゼＣＳ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した。このようにして決定したリパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列を配列番号２（図１）に示し、この塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に示す。
【００１８】
上記のように、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２より本酵素のｃＤＮＡを取得後、クローニングを行った。そのＤＮＡ配列から推定アミノ酸配列が決定できた。なお、上記に取得したｃＤＮＡをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用発現ベクターｐＧ−１（ＧＰＤプロモータ、ＰＧＫターミネータ、ＴＲＰ１マーカー）のＢａｍＨＩクローニングサイトに挿入して組換えベクターを作製した。得られた組換えベクターは、ＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１と命名し、これを独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３９として寄託した。
【００１９】
上記に取得した組換えプラスミドＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３９）を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９株に形質転換したところ、トリブチレンを１％濃度で懸濁させたＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）プレート上で、形質転換株はトリブチレン分解により生じるハローを形成した。このことで取得したｃＤＮＡが確かに目的のリパーゼＣＳ２をコードするものであり、しかもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより活性のあるものとして発現、分泌されることを確認した。
【００２０】
本発明に係るクリプトコッカス属由来のリパーゼＣＳ２は、油脂分解に利用できることはもちろんのこと、試薬、医薬成分、特定保健用飲食品成分、洗剤、化粧品その他広範囲な用途に利用することができ、また、特に有機溶媒に安定であるという特質から、エステル交換反応やエステル合成にも利用でき、バイオディーゼル燃料の合成も可能とするものであり、そして更に、本発明者らの最近の研究により、プラスチック、特にポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等の生分解性プラスチックを効率的に分解することがはじめて見出され、このような有益な用途に各種利用することができるものであるが、今回、本酵素遺伝子、アミノ酸配列が明らかになったことにより、これらを利用した組換えＤＮＡ技術によって、本酵素を効率的に工業生産することができる。
【００２１】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００２２】
【実施例１】
（１）酵母エキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４　１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、トリオレイン１％、ラクトース０．５％を含む液体培地に前培養した酵母Ｓ−２菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５）を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃、１００ｒｐｍの振とう培養を行った。得られた菌体からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００２３】
（２）なお、酵素の精製は次のようにして行った。上記により液体培養した培養物から酵母菌体を除いて培養液を得た。このようにして得た培養液を８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離し、０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過後、限外濾過により濃縮した。陽イオン交換樹脂ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷカラムによる高速液体クロマトグラフ（ｐＨ７．０リン酸バッファ、およびそれに０．５％ＮａＣｌ添加したものによるグラジエント溶出）によってリパーゼを精製した。活性は１７．１倍、収量は１１．４％であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単バンドとなり、分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２２ｋダルトンであることが判明した。
【００２４】
（３）精製したリパーゼＣＳ２をタンパク質分解酵素（リシルエンドペプチダーゼ）で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきそのアミノ酸配列を決定した。その部分配列をもとにＤＮＡプライマー（混合プライマー）を設計し、リパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列の決定に用いた。
【００２５】
（４）リパーゼＣＳ２遺伝子をクローニングするために、先ず、液体培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２の菌体よりｍＲＮＡを調整し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。上記プライマーを用いてリパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列（約１８０塩基）をまず決定した。その決定した内部配列を利用し新たなプライマーを設計し、それを用いて３’−及び５’−ＲＡＣＥ法によりリパーゼＣＳ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した。このようにして決定したリパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列を配列番号２（図１）に示し、この塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に示す。
【００２６】
（５）上記に取得したｃＤＮＡをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用発現ベクターｐＧ−１（ＧＰＤプロモータ、ＰＧＫターミネータ、ＴＲＰ１マーカー）のＢａｍＨＩクローニングサイトに挿入して、組換えプラスミドＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３９）を作成した。
【００２７】
（６）上記に取得した組換えプラスミドを用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９株を形質転換した。得られた形質転換株は、トリブチレンを１％濃度で懸濁させたＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）プレート上で、トリブチレン分解により生じるハローを形成した。このことで取得したｃＤＮＡが確かに目的のリパーゼＣＳ２をコードするものであり、しかもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにより活性のあるものとして発現、分泌されることを確認した。
【００２８】
（７）上記のとおり、リパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列（１の位置（ＡＴＧ）〜７２０の位置（ＴＡＡ）まで）を決定した（配列番号２：図１）。また、この塩基配列から推定されるタンパク質は、２３９残基であることが明らかとなった。
【００２９】
（８）このようにして、ＤＮＡ配列からリパーゼＣＳ２の推定アミノ酸配列（配列番号１：図１）が決定された。このアミノ酸配列より計算される分子量は、本精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による結果と矛盾しないものであった。本酵素のアミノ酸配列と既知のタンパク質配列データベースとの相同性をＢＬＡＳＴを用いて解析した結果、脂質分解酵素であるリパーゼの１種であるクチナーゼとの類似性が確認され、本発明に係るリパーゼＣＳ２は、既述の理化学的性質を有し、また、アミノ酸配列より、クチナーゼであることも確認された。また、今回決定された本発明酵素のアミノ酸配列及び塩基配列は、従来知られておらず、全く新規であることも判明した。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によって、リパーゼＣＳ２について、遺伝子レベルでの解析が行われ、そのアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子のＤＮＡ配列がはじめて明らかにされた。これらの配列はいずれも新規であるが、そのアミノ酸配列を解析したところ、本酵素は、クチナーゼとの類似性が確認され、クチナーゼの１種であることが判った。
【００３１】
また、本発明に係るリパーゼＣＳ２（すなわち、クチナーゼ）遺伝子のＤＮＡは、その酵素のアミノ酸配列及び／又はその理化学的性質（作用も包含する）が変化しないようにその塩基配列の塩基を置換することも可能であるし、その塩基配列の一部について、塩基の置換、削除、挿入、転移の少なくともひとつを行ってもよい。
【００３２】
本発明によってリパーゼＣＳ２（クチナーゼ）について、遺伝子の解析、それを含む組換えベクター及び形質転換体の作成にはじめて成功したので、組換えＤＮＡ技術による本酵素の効率的工業生産に途が拓け、その結果、薬品、飲食品、洗剤といった油脂分解能に基づく従来からのリパーゼとしての用途のほか、エステル交換やエステル合成作用に基づくバイオディーゼル燃料の工業的製造、更には、本発明者らがはじめて発見したクチナーゼとしての作用に基づくポリ乳酸等のプラスチック、特に従来リパーゼでは分解できなかった生分解性プラスチックの分解剤への用途といった数多くの有用な用途に広く利用することができる。
【００３３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】リパーゼＣＳ２のアミノ酸配列（下段）及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（上段）を示す。
【図１】
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