(57)【要約】【課題】十分な軟骨および／または硬骨形成誘導能力を有する物質を見出し、それを用いて硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復等を有効に行なう。【解決手段】ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６またはＢＭＰ-７の特性を示す蛋白質、それらの製造方法、ならびにそれらを含有する、硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復等のための医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
　下記の（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡ配列によりコードされる、ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６またはＢＭＰ-７の特性を示す蛋白質：
(ａ)ＢＭＰ-５をコードするＤＮＡ配列であって、
(i) 第ＩＩＩ表のヌクレオチド位置＃６９９〜＃２０６０を含むか、
(ii) 第ＩＩＩ表のヌクレオチド位置＃１６６５〜＃２０６０を含むか、
(iii) 厳密なハイブリダイゼーション条件下、(i)の配列にハイブリダイズし、かつＢＭＰ-５の生物学的特性を持つ蛋白質をコードする配列を含むか、
(iv) (i)〜(iii)のいずれか１つの配列に関して、同義性（degenerate)であるかまたは対立性(allelic)である配列を含むか、または
(v) 第ＩＩＩ表のアミノ酸＃３２３〜＃４５４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を持つもの；
(ｂ)ＢＭＰ-６をコードするＤＮＡ配列であって、
(i) 第ＩＶ表のヌクレオチド位置＃１６０〜＃１６９８を含むか、
(ii) 第ＩＶ表のヌクレオチド位置＃１３０３〜＃１６９８を含むか、
(iii) 厳密なハイブリダイゼーション条件下、(i)の配列にハイブリダイズし、かつＢＭＰ-６の生物学的特性を持つ蛋白質をコードする配列を含むか、
(iv) (i)〜(iii)のいずれか１つの配列に関して、同義性であるかまたは対立性である配列を含むか、または
(v) 第ＩＶ表のアミノ酸＃３８２〜＃５１３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を持つもの；
および
(ｃ)ＢＭＰ-７をコードするＤＮＡ配列であって、
(i) 第Ｖ表のヌクレオチド位置＃９９４〜＃１３８９を含むか、
(ii) 厳密なハイブリダイゼーション条件下、(i)の配列にハイブリダイズし、ヌクレオチド位置＃９９４で始まるコドンによりコードされるアミノ酸位置に対応するＮ-末端位置のアミノ酸配列をコードし、かつＢＭＰ-７の生物学的特性を持つ蛋白質をコードする配列を含むか、
(iii) (i)〜(ii)のいずれか１つの配列に関して、同義性であるかまたは対立性である配列を含むか、または
(iv) 第Ｖ表のアミノ酸＃３００〜＃４３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を持つもの。
【請求項２】
　ＢＭＰ-５、ＢＭＰ-６またはＢＭＰ-７の特性を示す蛋白質であって、次の工程を含む方法により得られるもの：
　(ａ) 適切な培養培地で請求項１の（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡを含むベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、ついで
　(ｂ)当該培養培地から、前記蛋白質を回収し、単離し、精製する。
【請求項３】
　さらに、軟骨および／または硬骨形成誘導能力を示す、請求項１または２記載の蛋白質。
【請求項４】
　ＢＭＰ蛋白質の製法であって、次の工程を含む方法：
　(ａ) 適切な培養培地で請求項１の（ａ）〜（ｃ）に記載のＤＮＡを含むベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し、ついで
　(ｂ)当該培養培地から、前記蛋白質を回収し、単離し、精製する。
【請求項５】
　ＢＭＰ−７の特性を示す蛋白質であって、次の工程を含む方法により得られるもの：
(ａ)適切な培養培地で第Ｖ表のアミノ酸＃１〜＃４３１をコードするＤＮＡ配列または第Ｖ表のヌクレオチド＃９７〜＃１３８９を含むＤＮＡ配列により形質転換されたＣＨＯ細胞を培養し、
(ｂ)当該培養培地から、前記ＢＭＰ-７蛋白質を回収し、単離し、精製する。
【請求項６】
　ＢＭＰ-７蛋白質の製法であって、次の工程を含む方法：
(ａ)適切な培養培地で第Ｖ表のアミノ酸＃１〜＃４３１をコードするＤＮＡ配列または第Ｖ表のヌクレオチド＃９７〜＃１３８９を含むＤＮＡ配列により形質転換されたＣＨＯ細胞を培養し、
(ｂ)当該培養物から、前記ＢＭＰ-７蛋白質を回収し、単離し、精製する。
【請求項７】
　請求項１〜３または５のいずれか１項記載の蛋白質を有効成分とする軟骨および／または硬骨形成を必要とする患者の処置用医薬組成物。
【請求項８】
　さらに医薬的に許容し得るマトリックスを含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
　マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸および燐酸三カルシウムを含む、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
　請求項１〜３または５のいずれか１項に記載の蛋白質を有効成分とする、創傷治癒および組織修復用医薬組成物。
【請求項１１】
　ＡＴＣＣ受託番号６８０２０のＢＭＰ-７ ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　この発明は、硬骨および／または軟骨の形成に有用な蛋白質に関するものである。特に、この発明は、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質群（ここで、ＢＭＰとは、骨形成蛋白質である）と呼ばれる若干の群の精製蛋白質並びにそれらを得る方法に関するものである。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成誘導能力を呈し得る。それらは、硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復に使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
　骨や軟骨の損傷を治療するために、以前から種々の物質や治療方法が提案されてきた。しかしながら、これらの物質は軟骨および／または硬骨形成誘導能力が十分とはいえないものもあり、それらを用いた硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復等の治療も不十分な場合が多かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
　したがって、本発明は、十分な軟骨および／または硬骨形成誘導能力を有する物質を見出し、それを用いて硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復等を有効に行なうことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
　上記課題に鑑みて本発明者らは鋭意研究を重ね、硬骨および／または軟骨の形成に有用な蛋白質を見出し、本発明を完成するに至った。特に、本発明は、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質群（ここで、ＢＭＰとは、骨形成蛋白質である）と呼ばれる若干の群の精製蛋白質並びにそれらを得る方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
　本発明の蛋白およびそれを含む医薬組成物により、硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復を効果的に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
　この発明は、一群のＢＭＰ−５蛋白質を提供する。精製ひとＢＭＰ−５蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質を実質的に含まず、また第ＩＩＩ表に示されたアミノ酸＃３２３〜アミノ酸＃４５４を含むアミノ酸配列を特徴とする。
【０００７】
　このアミノ酸配列＃３２３〜＃４５４は、第ＩＩＩ表のヌクレオチド＃１６６５〜ヌクレオチド＃２０６０を含むＤＮＡ配列によりコードされる。さらにＢＭＰ−５蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された２８０００〜３００００ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下では、前記蛋白質は、約１４０００〜２００００ダルトンの分子量により電気泳動する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を刺激、促進または他の形で誘導することができると考えられる。
【０００８】
　さらにこの発明は、第I表に記載されたアミノ酸＃９〜アミノ酸＃１４０を含むうしＢＭＰ−５蛋白質を提供する。アミノ酸配列＃９〜＃１４０は、第I表のヌクレオチド＃３２〜＃４２７を含むＤＮＡ配列によりコードされる。さらに、これらの蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された２８０００〜３００００ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下では、前記蛋白質は、約１４０００〜２００００ダルトンの分子量により電気泳動する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を誘導し得ると考えられる。
【０００９】
　この発明のひとＢＭＰ−５蛋白質は、ヌクレオチド＃６９９〜ヌクレオチド＃２０６０を含む第ＩＩＩ表に示されたヌクレオチド配列と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列により形質転換された細胞を培養することにより製造され得る。アミノ酸＃３２３〜アミノ酸＃４５４までの第ＩＩＩ表に示された配列と同一または実質的に同じアミノ酸配列を含むＢＭＰ−５蛋白質を培養培地から回収し、分離し、精製する。
【００１０】
　うしＢＭＰ−５蛋白質は、ヌクレオチド＃８〜ヌクレオチド＃４２７を含む第I表に示された配列と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列により形質転換された細胞を培養し、アミノ酸＃９〜アミノ酸＃１４０を含む第Ｉ表に示されたアミノ酸配列またはその一部分を含む蛋白質を、培養培地から回収および精製することにより製造され得る。
【００１１】
　この発明は、一群のＢＭＰ−６蛋白質を提供する。精製ひとＢＭＰ−６蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質を実質的に含まず、また第ＩＶ表に示されたアミノ酸＃３８２〜アミノ酸＃５１３を含むアミノ酸配列を特徴とする。アミノ酸＃３８２〜＃５１３を含むアミノ酸配列は、第ＩＶ表のヌクレオチド＃１３０３〜ヌクレオチド＃１６９８までのＤＮＡ配列によりコードされる。さらにこれらの蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された２８０００〜３００００ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下では、前記蛋白質は、約１４０００〜２００００ダルトンの分子量により電気泳動する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を刺激、促進または他の形で誘導することができると考えられる。
【００１２】
　さらに、この発明は、第ＩＩ表に示されたアミノ酸＃１２１〜アミノ酸＃２２２を含むアミノ酸配列を特徴とするうしＢＭＰ−６蛋白質を提供する。＃１２１から＃２２２までのアミノ酸配列は、第ＩＩ表のヌクレオチド＃３６１〜ヌクレオチド＃６６６までの第ＩＩ表のＤＮＡ配列によりコードされる。さらにこれらの蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された２８０００〜３００００ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＲにおける還元条件下では、前記蛋白質は、約１４０００〜２００００ダルトンの分子量により電気泳動する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を誘導し得ると考えられる。
【００１３】
　この発明のひとＢＭＰ−６蛋白質は、第ＩＩＩ表に示されたヌクレオチド＃１６０〜ヌクレオチド＃１６９８を含むＤＮＡ配列または実質的に似た配列により形質転換された細胞を培養することにより製造され得る。アミノ酸＃３８２〜アミノ酸＃５１３または実質的に似た配列を含むＢＭＰ−６蛋白質を培養培地から回収し、分離し、精製する。
【００１４】
　うしＢＭＰ−６蛋白質は、第II表に示されたヌクレオチド＃３６１ないしヌクレオチド＃６６６を含む第I表に示された配列と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたは実質的に似た配列により形質転換された細胞を培養し、第ＩＩ表に示されたアミノ酸＃１２１〜アミノ酸＃２２２を含む蛋白質を、培養培地から回収および精製することにより製造され得る。
【００１５】
　この発明は、一群のＢＭＰ−７蛋白質を提供する。精製ひとＢＭＰ−７蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質を実質的に含まない。ひとＢＭＰ−７蛋白質は、第V表に示されたアミノ酸＃３００〜アミノ酸＃４３１を含むアミノ酸配列を特徴とする。このアミノ酸配列＃３００〜＃４３１は、第V表のヌクレオチド＃９９４〜ヌクレオチド＃１３８９までのＤＮＡ配列によりコードされる。さらにＢＭＰ−７蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された２８０００〜３００００ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下では、前記蛋白質は、約１４０００−２００００ダルトンの分子量により電気泳動する。これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を刺激、促進または他の形で誘導することができると考えられる。
【００１６】
　この発明のひとＢＭＰ−７蛋白質は、ヌクレオチド＃９７〜ヌクレオチド＃１３８９を含む第Ｖ表に示されたヌクレオチド配列と同一または実質的に同じヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列により形質転換された細胞を培養することにより製造され得る。アミノ酸＃３００〜アミノ酸＃４３１の第V表に示された配列と同一または実質的に同じアミノ酸配列を含むＢＭＰ−７蛋白質を、培養培地から回収し、分離し、精製する。
【００１７】
　さらにこの発明は、上記蛋白質を利用することにより、関連ひと蛋白質（複数も可）または他のほ乳類軟骨および／または硬骨形成蛋白質（複数も可）を得る方法を提供する。上記方法は、遺伝子工学技術分野における熟練者には周知である。上記蛋白質を得るための一方法では、ひとＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７暗号化配列またはその一部分を利用して、ひとゲノムおよび／またはｃＤＮＡライブラリ−をスクリー二ングするためのプロ−ブを設計することにより、ひとゲノムおよび／またはｃＤＮＡ配列を分離する。当技術分野の範囲内に含まれる別の方法では、この発明のうしおよびひとＢＭＰ蛋白質を用いることにより、他のほ乳類ＢＭＰ軟骨および／または硬骨形成蛋白質を得ることができる。
【００１８】
　ヌクレオチド配列を同定した後、上記ヌクレオチド配列により形質転換した細胞を培養することにより蛋白質を製造する。この配列またはその一部分は、厳密な条件下でＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７蛋白質のヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションし、軟骨および／または硬骨形成活性を呈する蛋白質をコードする。発現された蛋白質を培養培地から回収および精製する。精製ＢＭＰ蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。
【００１９】
　ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を促進、刺激または他の方法で誘導する能力を特徴とし得る。さらに、これらの蛋白質の軟骨および／または硬骨形成誘導能力は、後記ラット骨形成検定で軟骨および／または硬骨形成活性を立証し得ることにより示され得ると考えられる。さらに、この発明の蛋白質は、このラット骨形成検定において形成された骨１グラム当たり１０μｇ〜５００μｇの濃度で活性を示すと考えられる。さらに具体的には、これらの蛋白質は、原型または修正得点方法を用いた後記ラット骨形成検定において蛋白質１μｇで少なくとも＋２のスコアが得られることを特徴とし得ると考えられる。
【００２０】
　この発明の別の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤または担体中に治療有効量のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７蛋白質を含む医薬組成物を提供する。さらに別の組成物は、少なくとも１種のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またＢＭＰ−７蛋白質を含む。従って、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質は互いに協調または恐らくは相乗的に作用し得るため、上記組成物はこの発明の複数のＢＭＰ蛋白質を含み得ると考えられる。この発明の組成物は、硬骨および／または軟骨形成の誘導に使用される。これらの組成物はまた、創傷治癒および組織修復に使用され得る。
【００２１】
　この発明のさらに別の組成物は、この発明のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７蛋白質の加えて、少なくとも１種の他の治療上有用な薬剤、例えば共同所有の１９８８年１月１４日公開の国際公開ＷＯ８８／００２０５および１９８９年１１月２日公開の国際公開ＷＯ８９／１０４０９に開示されたＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２（これらはまた、過去にＢＭＰ−２Ａ、ＢＭＰ−２ Ｉ類と命名されている）とＢＭＰ−３およびＢＭＰ−４（これらはまた、過去にＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−２ ＩＩ類と命名されている）と呼ばれる蛋白質を含み得る。他の治療上有用な薬剤としては、成長因子、例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、腫よう増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）がある。
【００２２】
　この発明の組成物はまた、例えば組成物の送達および／または支持を目的とし、および／または硬骨および／または軟骨形成用表面を提供する適当なマトリックスを含み得る。上記マトリックスは、ＢＭＰ蛋白質の緩慢な放出および／またはこの発明のＢＭＰ蛋白質を呈するのに適当な環境を提供し得る。
【００２３】
　この発明の組成物は、若干の硬骨および／または軟骨欠損および歯周病の処置方法で使用され得る。それらはまた、様々なタイプの創傷の処置および組織修復方法において使用され得る。この発明によると、これらの方法は、上述の硬骨および／または軟骨形成、創傷治癒または組織修復を要する患者にこの発明の組成物を投与することを必要とする。従って、この方法は、この発明の蛋白質の治療有効量の投与を含む。また、これらの方法は、この発明の蛋白質を上記共同所有出願で開示された「ＢＭＰ」蛋白質の少なくとも１種と連係的に投与することを含み得る。さらに、これらの方法はまた、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦを含む他の成長因子と共にこの発明の蛋白質を投与することを含み得る。
【００２４】
　また、この発明のさらに別の態様は、この発明の蛋白質の発現を暗号化するＤＮＡ配列である。上記配列は、第I−Ｖ表に示された５’−３’方向のヌクレオチド配列、または厳密な条件下で第Ｉ−Ｖ表のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を含み、軟骨および／または硬骨形成誘導能力を示す蛋白質をコードする。上記軟骨および／または硬骨形成は、後記ラット骨形成検定で立証され得る。これらの蛋白質は、この検定において形成される骨１グラム当たり１０μｇ〜５００μｇの濃度で活性を示し得ると考えられる。さらに詳しくは、これらの蛋白質は、ラフト骨形成検定において蛋白質１μｇで少なくとも＋２のスコアを得る能力を示すと考えられる。最後に、第Ｉ−Ｖ表の配列の対立遺伝子または他の変異型もまた、上記ヌクレオチド改変の結果ペプチド配列が変化しようと否とに拘わらず、この発明に包含される。
【００２５】
　この発明の別の態様は、発現制御配列と機能し得るように結合された上記ＤＮＡ配列を含むベクターを提供する。これらのベクターは、この発明の蛋白質の新規製造方法であって、発現制御配列と機能し得るように結合されたこの発明の蛋白質の発現を指図するＤＮＡ配列により形質転換されたセルラインを、適当な培養培地で培養し、そこからこの発明の蛋白質を回収および精製する方法において使用され得る。この主張されている方法は、ポリペプチド発現用宿主細胞として、若干の原核生物および真核生物の両既知細胞を使用し得る。回収されたＢＭＰ蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質からそれらを分離することにより精製される。
【００２６】
　下記の詳細な記載およびその好ましい実施態様を熟考すれば、この発明の別の態様および利点は明白である。
【００２７】
　発明の詳細な記載
　精製ひとＢＭＰ−５蛋白質は、第ＩＩＩ表のＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を培養することにより製造され得る。発現されたＢＭＰ−５蛋白質は、培養培地から分離および精製される。精製ひとＢＭＰ−５蛋白質は、第ＩＩＩ表に示されたアミノ酸＃３２３〜＃４５４を含むアミノ酸配列を特徴とすることが予想される。従って、この発明の精製ＢＭＰ−５ひと軟骨および／または硬骨蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合された、第ＩＩＩ表に示されたヌクレオチド＃６９９〜ヌクレオチド＃２０６０を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第ＩＩＩ表に示されたアミノ酸＃３２３からアミノ酸＃４５４までのアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収および精製することにより製造される。
【００２８】
　別の実施態様では、ＤＮＡ配列は、アミノ酸＃３２３〜＃４５４をコードするヌクレオチドを含む。従って、ＢＭＰ−５蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合された、第ＩＩＩ表に示されたヌクレオチド＃１６６５〜ヌクレオチド＃２０６０を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第ＩＩＩ表に示されたアミノ酸＃３２３からアミノ酸＃４５４を含むアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収および精製することにより製造される。精製ひとＢＭＰ−５蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。
【００２９】
　この発明の精製ＢＭＰ−５うし軟骨および／または硬骨蛋白質は、第I表に示されたヌクレオチド＃８〜ヌクレオチド＃５７８までのＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第I表に示されたアミノ酸＃９からアミノ酸＃１４０を含むアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収および精製することにより製造される。精製ＢＭＰ−５うし蛋白質およびこの発明のＢＭＰ蛋白質は全て、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。
【００３０】
　精製ひとＢＭＰ−６蛋白質は、第ＩＶ表のＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を培養することにより製造され得る。発現された蛋白質は、培養培地から分離および精製される。この発明の精製ひとＢＭＰ−６蛋白質は、第ＩＶ表に示されたアミノ酸＃３８２〜＃５１３を含むアミノ酸配列を特徴とすることが予想される。従って、この発明のこれらの精製ＢＭＰ−６ひと軟骨／硬骨蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合された、第ＩＶ表に示されたヌクレオチド＃１６０〜ヌクレオチド＃１６９８を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第ＩＶ表に示されたアミノ酸＃３８２からアミノ酸＃５１３までのアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収、分離および精製することにより製造される。
【００３１】
　別の実施態様は、アミノ酸＃３８２〜＃５１３をコードするヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を利用し得る。従って、精製ひとＢＭＰ−６蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合された、第ＩＶ表に示されたヌクレオチド＃１３０３〜ヌクレオチド＃１６９８を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第ＩＶ表に示されたアミノ酸＃３８２からアミノ酸＃５１３を含むアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収および精製することにより製造され得る。精製ひとＢＭＰ−６蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。
【００３２】
　この発明の精製ＢＭＰ−６うし軟骨／硬骨蛋白質は、第ＩＩ表に示されたヌクレオチド＃３６１〜ヌクレオチド＃６６６を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第ＩＩ表に示されたアミノ酸＃１２１からアミノ酸＃２２２を含むアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収することにより製造される。別の実施態様では、うし蛋白質は、第ＩＩ表のヌクレオチド＃２８９〜＃６６６を含む配列により形質転換された宿主細胞を培養し、アミノ酸＃９７〜アミノ酸＃２２２を含む蛋白質を回収および精製することにより製造される。精製ＢＭＰ−６うし蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。
【００３３】
　精製ひとＢＭＰ−７蛋白質は、第V表のＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞を培養することにより製造され得る。発現された蛋白質は、培養培地から分離および精製される。精製ひとＢＭＰ−７蛋白質は、第V表に示されたアミノ酸＃３００〜＃４３１を含むアミノ酸配列を特徴とすることが予想される。従って、この発明のこれらの精製ＢＭＰ−７ひと軟骨／硬骨蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合された、第V表に示されたヌクレオチド＃９７〜ヌクレオチド＃１３８９を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第V表に示されたアミノ酸＃３００からアミノ酸＃４３１までのアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収、分離および精製することにより製造される。
【００３４】
　別の実施態様は、アミノ酸＃３００〜＃４３１をコードするヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を利用し得る。精製ＢＭＰ−７蛋白質は、異種調節制御配列と機能し得るように結合された、第V表に示されたヌクレオチド＃９９４〜＃１３８９を含むＤＮＡ配列または実質的に相同性の配列により形質転換された宿主細胞を培養し、第V表に示されたアミノ酸＃３００からアミノ酸＃４３１を含むアミノ酸配列または実質的に相同性の配列を含む蛋白質を培養培地から回収および精製することにより製造され得る。精製ひとＢＭＰ−７蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。
【００３５】
　さらにＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成活性を示す能力を特徴とし得る。この活性は、例えば実施例３記載のラット骨形成検定において立証され得る。さらに、これらの蛋白質は、検定において形成される骨１グラム当たり１０μｇ〜５００μｇの濃度で活性を示すと考えられる。さらにこれらの蛋白質は、さらに詳しく後述されている原型または修正得点方法を用いたこの検定において１μｇで少なくとも＋２のスコアを得る能力を特徴とし得る。
【００３６】
　さらにＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された２８０００〜３００００ダルトンの見かけ上の分子量を特徴とし得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける還元条件下では、上記蛋白質は約１４０００〜２００００ダルトンの分子量により電気泳動する。
【００３７】
　また、この明細書で規定する蛋白質は、第Ｉ−Ｖ表の配列と似ているが、天然になされて（例、ポリペプチドにおいてアミノ酸変化を生じさせ得るヌクレオチド配列の対立遺伝子変異型）または故意に操作されて修飾が加えられた配列によりコードされる因子を含む。同様に、第Ｉ−Ｖ表のアミノ酸残基の連続配列を全体的または部分的に複製する合成ポリペプチドもこの発明に包含される。これらの配列は、この発明の他の軟骨／硬骨蛋白質と１次、２次または３次構造および立体配座特性を共有することにより、それらと共通した硬骨および／または軟骨成長因子生物特性を有し得る。すなわち、それらは、治療プロセスにおいて天然蛋白質に代わる生物活性代用物として使用され得る。
【００３８】
　この明細書に記載されているこの発明の蛋白質の配列の他の特異的突然変異としては、グリコシル化部位の修飾がある。これらの修飾は、Ｏ−結合またはＮ−結合グリコシル化部位を含み得る。例えば、グリコシル化の非存在または一部のみのグリコシル化は、第Ｉ−Ｖ表に示された通り、この発明の蛋白質の配列に存在するアスパラギン結合ゲリコシル化認識部位におけるアミノ酸置換または欠失によるものである。アスパラギン−結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞性グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ただし、Ｘは通常任意のアミノ酸である）である。ゲリコシル化認識部位の第１または第３アミノ酸位置の一方または両方における様々なアミノ酸置換または欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失の結果、修飾されたトリペプチド配列が非グリコシル化される。その改変されたヌクレオチド配列の発現により、その部位かグリコシル化されていない変異体が生成される。
【００３９】
　この発明はまた、他の蛋白質性物質をコードするＤＮＡ配列の随伴がなく、この発明の蛋白質の発現をコードする新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、第Ｉ−Ｖ表において５’−３’方向に描かれた配列を含む。さらに、厳密なハイブリダイゼーション条件下「Ｔ．マニアチス等、「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）］、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８２）３８７−３８９頁参照］、第Ｉ−Ｖ表のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションし、ラット骨形成検定において軟骨および／または硬骨形成活性を立証する配列が含まれる。上記の厳密な一ハイブリダイゼーション条件の一例は、６〜４×ＳＣＣ中６５℃でのハイブリダイゼーションであり、次いで０．１×ＳＣＣ中６５℃で１時間洗浄を行う。別法として、典型的な厳密なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド中、４×ＳＣＣ、４２℃である。
【００４０】
　同様に、第Ｉ−Ｖ表の配列によりコードされる蛋白質に似た蛋白質をコードするが、遺伝子コードの同義性または対立遺伝子変異（アミノ酸変化を生じる場合も生じない場合もあり得る種集団における天然塩基改変）故にコドン配列が異なるＤＮＡ配列もまた、この明細書に記載されているこの発明の蛋白質をコードする。活性、半減期またはコードされるポリペプチドの生産性を高めるための点突然変異または誘導性修飾（挿入、欠失および置換を含む）に起因する第Ｉ−Ｖ表のＤＮＡ配列における変異型もまた、この発明に包含される。
【００４１】
　別の態様において、この発明は、関連ひと蛋白質または他のほ乳類ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質を得る方法を提供する。上記蛋白質を得る一方法では、例えば、この明細書で開示されているひとＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７暗号化配列を利用することにより、ひと遺伝子またはそのフラグメントに関して標準技術を用いてひとゲノム・ライブラリーを厳密に調べる。また、こうして同定された配列をプローブとして使用することにより、類似軟骨／硬骨蛋白質を合成するひとセルラインまたは組織を同定することができる。ｃＤＮＡライブラリーを合成し、ひとまたはうし暗号化配列から誘導されたプローブによりスクリーニングする。こうして同定されたひと配列を宿主細胞に形質転換し、宿主細胞を培養し、培養培地から蛋白質を回収、分離および精製する。精製蛋白質は、実施例３のラット骨形成検定において軟骨および／または硬骨形成活性を呈することが予想される。
【００４２】
　この発明の別の態様は、この発明のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質の新規製造方法を提供する。この発明の方法は、既知調節配列の制御下、この発明の蛋白質の発現をコードする上記ＤＮＡ配列により形質転換された適当な細胞またはセルラインを培養することを含む。調節配列は、プロモーター・フラグメント、ターミネーター・フラグメントおよび適当な宿主細胞において蛋白質の発現を指示する他の適当な配列を含む。適当なセルラインを培養する方法は、当業界の技術範囲内に含まれる。形質転換細胞を培養し、それにより発現されたＢＭＰ蛋白質を、当業界の熟練者に周知の精製技術を用いて培養培地から回収し、分離し、精製する。精製ＢＭＰ蛋白質は、それらと共に生成される他の蛋白質性物質および他の汚染物質を実質的に含まない。この発明の精製ＢＭＰ蛋白質は、この発明の蛋白質と天然で共存する物質を実質的に含まない。
【００４３】
　適当な細胞またはセルラインは、ほ乳類細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であり得る。適当なほ乳類宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の製造および精製の方法は、当業界において公知である。例えば、ゲシングおよびサムブルック、「ネイチャー、２９３：６２０−６２５（１９８１）または別法として、カウフマン等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５（７）：１７５０−１７５９（１９８５）またはハウリー等、アメリカ合衆国特許４４１９４４６号参照。他の適当なほ乳類セルラインには、さるＣＯＳ−１セルラインおよびＣＶ−１セルラインがあるが、これらに限定はされない。
【００４４】
　細菌細胞もまた適当な宿主であり得る。例えば、エシェリヒア・コリの様々な株（例、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジー分野における宿主細胞としてよく知られている。また、バチルス・スブチリス、シュードモナス、他の細菌などの様々な株もこの方法で使用され得る。
【００４５】
　当業界の熟練者に周知の酵母細胞の多くの株もまた、この発明のポリペプチド発現用宿主細胞として利用可能であり得る。さらに、所望ならば、昆虫細胞が、この発明の方法における宿主細胞として利用され得る。例えば、ミラー等、「ジェネティック・エンジニアリングム　８：２７７−２９８（プレナム・プレス１９８６）およびそこに引用されている参考文献参照。
【００４６】
　この発明の別の態様は、この発明の蛋白質発現方法で使用されるベクターを提供する。前記ベクターは、この発明のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質をコードする新規ＤＮＡ配列を含む。さらに、前記ベクターは、また、蛋白質配列の発現を可能にする適当な発現制御配列を含む。別法として、上述の末端切断または修飾配列が組み込まれたベクターはまた、この発明の実施態様であり、この発明の蛋白質の製造に有用である。前記ベクターは、セルラインを形質転換する方法で使用され得、選択された宿主細胞における複製および発現を指示し得るこの発明のＤＮＡ暗号化配列を機能し得るように随伴した選択された調節配列を含み得る。前記ベクターに有用な調節配列は、当業界の熟練者に周知であり、選ばれた宿主細胞により選択され得る。前記選択は常用の手順で行なわれ、この発明の一部を形成するものではない。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白質の製造に使用される前記ベクターにより形質転換された宿主細胞およびその子孫もまた、この発明により提供される。
【００４７】
　当業界に精通しておれば、この発明のＤＮＡ配列および既知ベクター、例えばｐＣＤｒ[岡山等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２：１６１−１７０（１９８２）］およびｐＪＬ３、ｐＪＬ４［ガフ等、ＥＭＢＯジャーナル、４：６４５−６５３（１９８５）］の使用によるほ乳類発現ベクターの構築は可能である。同様に、当業界の熟練者であれば、暗号化配列に近接するほ乳類調節配列を削除または細菌配列と置き換えてこの発明の配列を操作することにより、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用細菌ベクターを作成することができる。例えば、前記暗号化配列はさらに操作され得る（例、他の既知リンカーに結合または非暗号化配列をそこから欠失させるか、または他の既知技術によりそこに存在するヌクレオチドを改変することによる修飾）。次いで、修飾された暗号化配列は、例えばＴ．谷口等、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・エス・エーム　７７：５２３０−５２３３（１９８０）に記載された方法を用いて既知細菌ベクターに挿入され得る。次いで、この例証的細菌ベクターは、細菌宿主細胞に形質転換され、それによりこの発明の蛋白質が発現され得る。細菌細胞におけるこの発明の軟骨および／または硬骨蛋白質の細胞外発現を行うための戦略については、例えばヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１７７３４３参照。
【００４８】
　同様の操作は、昆虫細胞での発現を目的とする昆虫ベクター［例えば公開されたヨーロッパ特許出願１５５４７６号に記載された方法参照］の構築についても実施され得る。また、酵母ベクターは、酵母細胞によるこの発明の因子の細胞内または細胞外発現用酵母調節配列を用いて構築され得る。［例、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰＡ１２３２８９に記載された方法参照］。
【００４９】
　ほ乳類細胞からこの発明の蛋白質を高レベルで製造する方法は、この発明の蛋白質をコードする異種遺伝子の多数のコピーを含む細胞の構築を必要とする。異種遺伝子は、カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１５９：６０１−６２９（１９８２）の方法に従い、増幅可能なマーカー、例えば、それによって多数の遺伝子コピーを含む細胞が増加濃度のメトトレキセイト（ＭＴＸ）における伸長用に選択され得るジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＨ）遺伝子に結合され得る。この方法は、若干の異なる細胞タイプにより使用され得る。
【００５０】
　例えば、発現を可能にする他のプラスミド配列を機能し得るように随伴したこの発明の蛋白質のＤＮＡ配列を含むプラスミドおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３「カウフマンおよびシヤープ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２：１３０４（１９８２）］は、燐酸カルシウム共沈澱およびトランスフェクション、電気操作またはプロトプラスト融合により、ＤＨＦＲ欠失ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩへ共に導入され得る。カウフマン等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１７５０（１９８３）の記載に従い、ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析した胎児牛血清を含むアルファ培地における生長について選択し、続いて増加濃度のＭＴＸ（０．０２、０．２、１．０および５μＭＭＴＸにおける一連の段階）中での生長による増幅について選択する。蛋白質発現は、ＭＴＸ耐性のレベル増加に従い増すべきである。
【００５１】
　形質転換体をクローン化し、培養培地からこの発明の蛋白質を回収し、分離し、精製する。発現された蛋白質の特性検定は、標準技術を用いて実施され得る。例えば、特性検定には、「３５Ｓ］メチオニンまたはシステインによるパルス標識、またはポリアクリルアミド・ゲル電気泳動が含まれ得る。実施例３における上記ローゼン−修飾サンパスーレディ・ラット骨形成検定により生物活性蛋白質発現をモニターする。似た方法に従うことにより、他の関連蛋白質も製造され得る。
【００５２】
　この発明の蛋白質は、硬骨および／または軟骨が正常に形成されていない環境において軟骨および／または硬骨形成を誘導するため、ひとおよび他の動物における骨折および軟骨欠航の治療適用性を有する。この発明の蛋白質を用いた製剤は、閉鎮および複雑骨折の縮小並びに人工関節の固定改良における予防的用途を有し得る。骨形成剤により誘導される新たな骨形成は、先天的、外傷誘発性または腫よう切除による頭蓋および顔面欠損の修復に貢献し、また美容形成手術にも有用である。この発明の蛋白質は、歯周病の処置および他の歯科修復方法において使用され得る。上記薬剤は、骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の生長を刺激し、または骨形成細胞の原種の分化を誘導するための環境を提供し得る。これまでに様々な骨形成、軟骨誘導および硬骨誘導因子が記載されている。それらの検討については、例えば、ヨーロッパ特許出願１４８１５５および１６９０１６参照。
【００５３】
　この発明の蛋白質はまた、創傷治癒および関連組織修復において使用され得る。創傷のタイプには、火傷、切り傷および潰ようがあるが、これらに限定されない。創傷治癒および関連組織修復の検討については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照。
【００５４】
　この発明の別の態様は、骨折および硬骨および／または軟骨欠撮または歯周病に関連した他の状態を修復するための治療方法および組成物を含む。さらに、この発明は、創傷治癒および組織修復を目的とする治療方法および組成物を含む。上記組成物は、この発明のＢＭＰ蛋白質、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７の少なくとも１種の治療有効量を、医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはマトリックスと混合した形で含む。
【００５５】
　この発明の蛋白質は、互いにまたは他の関連蛋白質および成長因子と協調して、または恐らくは相乗的に作用し得ると予想される。従って、この発明の治療方法および組成物は、この発明の蛋白質の１種またはそれ以上を含む。従って、この発明のさらに別の治療方法および組成物は、この発明の少なくとも１種の蛋白質の治療有効量を、上述した共同所有の公開国際出願ＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９に開示された他の「ＢＭＰ」蛋白質ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−４の少なくとも１種の治療有効量と共に含む。この発明の上記方法および組成物は、上述の「ＢＭＰ口蛋白質またはその一部分と組み合わせた形でこの発明の蛋白質またはその一部分を含み得る。
【００５６】
　上記組み合わせ剤は、蛋白質の個々の独立した分子またはヘテロ分子、例えば各蛋白質の一部分により形成されたヘテロダイマーを含み得る。例えば、この発明の方法および組成物は、この発明のＢＭＰ蛋白質またはその一部分が別の「ＢＭＰ」蛋白質の一部分と結合して形成されたヘテロ分子を含み得る。
【００５７】
　この発明のさらに別の治療方法および組成物は、この発明の蛋白質またはその一部分を、問題の硬骨および／または軟骨欠損、創傷または組織の処置に有益な他の薬剤と組み合わせた形で含む。これらの薬剤には、様々な成長因子、例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板出来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫よう増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、Ｋ−線維芽細胞成長因子（ＫＦＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＤＩＡ）およびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）が含まれる。これらの薬剤の一部分もまた、この発明の組成物中で使用され得る。
【００５８】
　ｐＨ、等張性、安定性などを充分考慮した上で生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製品および製剤は、当業界の技術範囲内に含まれる。また、上記治療用組成物は、軟骨および硬骨成長因子蛋白質における種特異性が見たところ欠如しているため、目下駄医学的適用についても貴重である。ひとに加えて家畜および純血馬は、この発明の蛋白質による上記処置に望ましい患者である。
【００５９】
　上記治療方法は、組成物を局所的、全身的またはインプラントもしくは装置として局部的に投与することを含む。投与時、この発明で使用される治療組成物は、勿論、発熱物質を含まず、生理学的に許容し得る形態である。さらに、上記組成物は、望ましくは軟骨および／まだは硬骨または組織傷害部位への送達に適した粘ちゅう性形態で封入または注射され得る。局所投与は、創傷治癒および組織修復に好適であり得る。
【００６０】
　好ましくは、硬骨および／または軟骨形成を目的とする場合、上記組成物は、この発明のＢＭＰ蛋白質を硬骨および／または軟骨損傷部位に送達し、硬骨および軟骨発生用の構造を提供し得、また最適には体内へ吸収され得るマトリックスを含み得る。上記マトリックスは、ＢＭＰ蛋白質または組成物を含む他の因子をゆっくりと放出させ得る。上記マトリックスは、他の内植による医学適用法において現在使用されている材料で形成され得る。
【００６１】
　マトリックス材料は、生物学的適合性、生物分解性、機械的特性、外見上の体裁および界面特性に基づいて選択される。この発明の組成物の特別な適用性により、適当な製剤が規定される。組成物に使用可能なマトリックスは、生物分解性で化学的に規定された硫酸カルシウム、燐酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ酪酸およびポリ無水物であり得る。他の可能な材料は、生物分解性で生物学的に充分定義された、例えば骨または皮膚コラーゲンである。さらに別のマトリックスは、純粋な蛋白質または細胞外マトリックス成分により構成される。他の可能なマトリックスは、非生物分解性で化学的に定義された、例えば焼結ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラミックである。マトリックスは、上記タイプの材料のいずれかの組み合わせ、例えばポリ酪酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよび燐酸三カルシウムにより構成され得る。生体セラミックは、組成物、例えばカルシウム‐アルミナート−ホスフェートにおいて改変され得、そして加工処理によって孔のサイズ、粒子サイズ、粒子形状および生物分解性が改変され得る。
【００６２】
　投与体制は、この発明の蛋白質の作用を修飾する様々な因子を考慮した上で担当医により決定される。この発明の蛋白質の作用を修飾し得る因子には、形成が望まれる骨の重量、骨損傷の部位、損傷骨の状態、傷のサイズ、損傷組織のタイプ、患者の年齢、性別および食餌療法、感染がある場合にはその重さ、投与の時間および他の臨床的因子がある。用量は、再構成で使用されるマトリックスのタイプおよび組成物中に存在する硬骨および／または軟骨蛋白質のタイプにより変動し得る。また、最終組成物への他の既知成長因子、例えばＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β並びにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの添加も、用量に影響を与え得る。
【００６３】
　軟骨および／または硬骨の成長および／または修復の定期的評価により、進行状況をモニターすることができる。例えば、Ｘ−線、組織形態計測測定法およびテトラサイクリン標識を用いて推移をモニターすることができる。
【００６４】
　以下、実施例により、この発明のうし軟骨および／または硬骨蛋白質の回収および特性検定およびこれらの蛋白質の使用による対応するひと蛋白質（複数も可）の回収並びに組換え技術による前記蛋白質の発現におけるこの発明の実践方法を説明する。
【００６５】
　実施例Ｉ
　牛の軟骨／骨誘導蛋白の単離
　Ｍ．Ｒ．ウリスト等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユーエスエイ第７０巻：３５１１頁（１９７３）の方法に従い、下記のように幾つかの抽出工程を割愛して、粉砕牛骨粉末（２０〜１２０メッシュ、ヘリトレックス）を調製する。この粉砕した粉末１０ｋｇを、激しく撹拌しながら４℃で４８時間０．６Ｎ ＨＣｌの連続的変化に付して脱ミネラル化する。得られた懸濁液を４Ｃで５０ｌの２Ｍ ＣａＣｌ２およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０ｍＭで１６時間抽出し、次いで０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５０ ｌ中で４時間抽出する。残留物を蒸留水で３回洗浄した後、クリニカル・オーソペディックス・アンド・リレイテッド・リサーチ第１７１巻：２１３頁（１９８２）に記載のように、４Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＣｌ）２０ ｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、１ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルに再懸濁する。１６〜２０時間後に上清を取り除き、さらに、１０ ｌのＧｕＣｌ緩衡液中に移す。残留物をさらに２４時間抽出する。
【００６６】
　粗ＧｕＣｌ抽出物を合し、１００００分子量遮断膜を付けたペリコン装置でおよそ２０倍に濃縮し、次いで５０ｍＭトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ７．２）、最初のカラムの始発緩衡液で透析する。長時間の透析の後、蛋白を４ｌ ＤＥＡＥセルロースカラムにロードし、非結合分画を集める。
　非結合分画を濃縮し、６Ｍ尿素中の５０ｍＭ ＮａＡＣ、５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４．６）に対して透析する。この非結合分画をカルボキシメチルセルローカラムに適用する。カラムに結合しなかった蛋白を始発緩衡液でよく洗浄することにより除去し、ローゼン改良サンパス−レディ検定（下の実施例ＩＩＩに記載）により測定される骨および／または軟骨形成活性を有する蛋白をふくむ物質を、５０ｍＭ ＮａＡｃ、０．２５ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ４．６）によりカラムから脱着する。この段階的溶出から得られた蛋白を２０〜４０倍に濃縮し、次いで８０ｍＭ ＫＰＯ４、６Ｍ尿素（ｐＨ６．０）で５倍に希釈する。この溶液のｐＨを５００ｍＭ Ｋ２ＰＯ４で６．０に調節する。この試料を８０ｍＭ ＫＰＯ４、６Ｍ尿素（ｐＨ６．０）で平衡に達したヒドロキシアパタイトカラム（ＬＫＢ）に適用し、同緩衡液でカラムを洗浄することにより全ての非結合蛋白を除去する。骨および／または軟骨形成活性を有する蛋白を１００ｍＭ ＫＰＯ４（ｐＨ７．４）および６Ｍ尿素で溶出する。
【００６７】
　この蛋白をおよそ１０倍に濃縮し、固体ＮａＣｌを最終濃度０．１５Ｍとなるまで加える。この物質を、５０ｍＭ ＫＰＯ４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ７．４）で平衡に達したヘパリン−セファロースカラムに適用する。カラムを始発緩衡液で良く洗浄した後、骨および／または軟骨誘導活性を有する蛋白を５０ｍＭ ＫＰＯ４、７００ｍＭ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ７．４）によって溶出する。この分画を最小容量まで濃縮し、０．４ｍｌの等分試料を、４Ｍ ＧｕＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．２）で平衡させたスーパーローズ６およびスーパーローズ１２カラムを連続接続したものに適用し、カラムを流速０．２５ｍｌ／分で展開する。骨および／または軟骨誘導活性を示す蛋白はおよそ３００００ダルトンの蛋白に相当する。
【００６８】
　スーパーローズカラムからの上記分画をプールし、５０ｍＭ ＮａＡｃ、６Ｍ尿素（ｐＨ４．６）に対して透析し、ファーマシア・モノＳ ＨＲカラムに適用する。このカラムを１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＡｃ、６Ｍ尿素（ｐＨ４．６）への勾配にて展開する。活性な骨および／または軟骨形成分画をプールする。この物質を０．１％ＴＦＡ中で０．４６×２５ｃｍのヴィダックＣ４カラムに適用し、９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡへの勾配によってカラムを展開する（１ｍｌ／分で６０分間のうちに３１．５％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡから４９．５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに至る）。活性物質はおよそ４０〜４４％アセトニトリルの時点で溶出する。分画を軟骨および／または骨形成活性について検定する。活性物質をモノＱカラムでさらに分画する。この蛋白を６Ｍ尿素、２５ｍＭジエタノールアミン（ｐＨ８．６）に対して透析し、次に０．５×５ｃｍモノＱカラム（ファーマシア）に適用し、６Ｍ尿素、２５ｍＭジエタノールアミン（ｐＨ８．６）および０．５Ｍ ＮａＣｌ、６Ｍ尿素、２５ｍＭジエタノールアミン（ｐＨ８．６）の勾配にて展開する。画分を１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ３．０にする。適当な分画の等分試料を以下の方法のうちの１つによってヨウ素化する：Ｐ．Ｊ．マコーネイ等インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー第２９巻：１８５〜１８９頁（１９６６）；Ａ．Ｅ．ボルトン等、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ．第１３３巻：５２９頁（１９７３）；およびＤ．Ｆ．ボーエン−ポープ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２３７巻：５１６１頁（１９８２）。これらの分画に存在するヨウ素化された蛋白をＳＤＳゲル電気泳動により分析する。
【００６９】
　実施例ＩＩ
　牛の軟骨／骨誘導因子の特性決定
　Ａ．分子量
　６Ｍ尿素、２５ｍＭジエタノールアミン（ｐＨ８．６）、およそ０．３ＭのＮａＣｌ中の実施例Ｉ由来の蛋白およそ５μｇをＳＤＳに関して０．１％とし、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ　０．１％ ＳＤＳ（ｐＨ７．５）に対して１６時間透析する。次いで透析した物質を、少量の１２５Ｉ標識対応物とともに透析膜で電気泳動的に濃縮する〔フンカピラー等、メソッズ・イン・エンチモロジー第９１巻：２２７〜２３６頁（１９８３）〕。この物質（容量はおよそ１００μｌ）を１２％ポリアクリルアミドゲルにロードしジチオトレイトールで試料を還元することなくＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す〔ラムリ、Ｕ．Ｋ．ネイチュア、第２２７巻：６８０〜６８５頁（１９７０）〕。予め染色した分子量標準（ベセスダ・リサーチ・ラブズ）に比較した分子量を決定する。固定していないゲルのオートラジオグラフィーの後、およそ２８０００〜３００００ダルトンのバンドを削り取り、蛋白を電気泳動的にゲルから溶出する（フンカピラー等、上記）。骨および／または軟骨活性が２８０００〜３００００の領域に見いだされるとする、上記同時出願の「ＢＭＰ」出願に記載の類似の精製骨分画を根拠とすると、このバンドが骨および／または軟骨誘導分画を含むことが推論される。
【００７０】
　Ｂ．サブユニットの特性決定
　単離された牛骨蛋白のサブユニットの組成もまた決定される。上記の溶出した蛋白を完全に還元し、ヨウドアセタートおよび標準的方法を用いて２％ ＳＤＳ中でアルキル化し、電気泳動パッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）により再濃縮する。次に、完全に還元されアルキル化された試料をさらに１２％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、二重線の様相を有する得られたおよそ１４０００〜２００００ダルトンの領域を、非固定ゲルのオートラジオグラフィーにより位置決定する。したがって、この２８０００〜３００００領域に残る。微弱なバンドが２８０００〜３００００領域に入る。したがって、この２８０００〜３００００ダルトンの蛋白が１４０００〜２００００の広い領域を生成するか、さもなければこれはおよそ１４０００〜１６０００および１６０００〜２００００ダルトンの２個の広いバンドを含むというふうに解釈および表現をすることもできる。
【００７１】
　実施例ＩＩＩ
　ローゼン改良サンパス−レディ検定
　サンパスおよびレディ、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ユーエスエイ第８０巻：６５９１〜６５９５頁（１９８３）に記載のラット骨形成検定の改良法を、本発明に係る蛋白の骨および／または軟骨活性の評価に使用する。この改良検定を本明細書中ローゼン改良サンパス−レディ検定と称する。サンパス−レディ法のエタノール沈殿工程を、検定されるべき分画の水に対する透析（組成物が溶液の場合）または透析濾過（組成物が懸濁液の場合）に置き換える。溶液または懸濁液を次いで０．１％ ＴＦＡに再溶解し、得られる溶液をラットのマトリックス２０ｍｇに添加する。この蛋白で処理していない偽のラットマトリックス試料を対照として用いる。この物質を凍結し凍結乾燥して得られる粉末を＃５のゼラチンカプセルに封入する。カプセルを、２１〜４９日令の雄ロングエヴァンズラットの腹胸部位の皮下に植え付ける。移植物は７〜１４日後に除去する。各移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析［Ａ．Ｈ．レディ等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ第６９巻：１６０１頁（１９７２）参照］に使用する。
【００７２】
　各移植物の他の半分は固定し、組織学的分析用に加工する。グリコールメタアクリレート切片（１μｍ）をフォン・コッサおよび酸フスチンまたはトルイジン・ブルーで染色し、各移植物中に存在する誘導された骨および軟骨の形成量を評点付ける。＋１から＋５までの語は、移植物の各組織学的切片の領域が新しい骨および／または軟骨細胞ならびに新しく形成された骨およびマトリックスで占められていたことを表わす。２種類の評点法をここに記載する。第１の評点法の場合、評点＋５は移植物の５０％以上がこの移植物内の蛋白の直接結果として生成された新しい骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１は各々移植物の４０％、３０％、２０％および１０％以上が新しい軟骨および／または骨を含んでいることを示す。第２の評点法（これ以降、改良評点法と称する）は以下の通りである：各移植物からの隣接していない３個の切片を評価し平均する。「＋／−」は軟骨または骨の不確かな固定を示し、「＋１」は各切片の＞１０％が新しい軟骨または骨であることを示し、「＋２」は＞２５％、「＋３」は＞５０％、「＋４」は〜７５％、「＋５」は＞８０％を示す。個々の移植物の評点を、検定の変化性を表わすために表にする。
【００７３】
　マトリックス試料中の試料を含む軟骨および／または骨誘導性蛋白の用量反応特性は、形成される骨および／または軟骨の量は、試料中の軟骨／骨誘導性蛋白の量と共に増加することを示すという事が考えられる。対照試料は骨および／または軟骨形成を全くもたらさないということが考えられる。
　上記「ＢＭＰ」蛋白のような他の軟骨および／または骨誘導性蛋白と同様に、形成された骨および／または軟骨は、マトリックスの占める空間に物理的に閉じ込められると予想される。試料はさらにＳＤＳゲル電気泳動および等電点電気泳動、引き続きオートラジオグラフィーによる分析も行なう。活性は蛋白のバンド行うｐＩと相関がある。特定の分画における蛋白の純度を評価するため、吸光係数１ＯＤ／ｍｇ−ｃｍを蛋白の評価基準として使用し、この蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、引き続き銀染色または放射ヨウ素化行うオートラジオグラフィーにかける。
【００７４】
　実施例ＩＶ
　Ａ．牛の蛋白組成
　実施例ＩＩＢに記載したおよそ１４０００〜２００００ダルトン領域のゲル薄片を標準的方法を用いてメタノール−酢酸−水で固定し、水で短時間すすぎ、次いで０．１Ｍ重炭酸アンモニウムで中和する。このゲル薄片をかみそりの刃でさいの目に切った後、ＴＰＣＫ処理トリプシン（ワーシングトン）０．２μｇを加えゲルを摂氏３７度で１６時間インキュベートすることにより、蛋白をゲルマトリックスから消化する。次いで、得られた消化物をＣ４ヴィダックＲＰＨＰＬＣカラムおよび０．１％ ＴＦＡ−水、０．１％ ＴＦＡ、水−アセトニトリルの勾配を用いるＲＰＨＰＬＣに付す。得られたペプチドのピークを２１４および２８０ｎｍのＵＶ吸収により監視し、アプライド・バイオシステムズの気相シークエネーター（モデル４７０Ａ）を用いる直接アミノ末端アミノ酸配列解析に付す。標準的な３文字記号によってアミノ酸を表現するとき以下のようなアミノ酸配列を有する１個のトリプシン分解によるフラグメントを標準的方法によって単離する。この配列中、「Ｘａａ」は未知のアミノ酸であり、かっこ内のアミノ酸はその配列における不確実性を示す：
　Ｘａａ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−（Ｓｅｒ）
　以下の４個のオリゴヌクレオチドプローブを上で固定されたトリプシン分解によるフラグメントのアミノ酸配列に基づいて設計し、自動ＤＮＡ合成機で合成する。
　プローブ♯１：ＧＴＲＣＴＹＧＡＮＡＴＲＣＡＮＴＣ
　プローブ♯２：ＧＴＲＣＴＹＧＡＮＡＴＲＣＡＮＡＧ
　プローブ♯３：ＧＴＲＣＴＹＡＡＹＡＴＲＣＡＮＴＣ
　プローブ♯４：ＧＴＲＣＴＹＡＡＹＡＴＲＣＡＮＡＧ
　上に規定されたプローブにおいて標準的ヌクレオチド記号は以下の通りである：Ａ、アデノシン；Ｃ、シトシン；Ｇ、グアニン；Ｔ、チミン；Ｎ、アデノシンまたはシトシンまたはグアニンまたはチミン；Ｒ、アデノシンまたはグアニン；そしてＹ、シトシンまたはチミン。
　このプローブの各々がオリゴヌクレオチドの集まりから成っている。遺伝暗号は同義性を有する（１以上のコドンが同一のアミノ酸をコードし得る）ので、トリプシン分解されたアミノ酸配列をコードする全ての可能なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドの混合物を合成する。これらのプローブを放射活性標識し、下記の牛ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用する。
【００７５】
　Ｂ．牛のＢＭＰ−５
　ゲーロン−ロベイ等の方法［カレント・アドバンシズ・イン・スケルトジェネシス、エルセヴィア・サイエンス・パブリシャーズ（１９８５）］によって牛胎児骨細胞から単離された全ＤＮＡから、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーにより、ポリ（Ａ）含有ＲＮＡを単離する。この全ＲＮＡはマリオン・ヤング博士（ナショナル・インスティテュート・オブ・デンタル・リサーチ、ナショナル・インスティテューツ・オブ・ヘルス）から入手した。ラムダｇｔ１０（トゥール等、上記）においてｃＤＮＡライブラリーを作成し、１平板に付き８０００組替え体の割合で５０枚の平板に蒔く。これらの組替え体（４０００００個）を、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）ハイブリダイゼーション法［ウズニイ等、サイエンス、第２４２巻：１５２８〜１５３４頁（１９８８）を参照］を用いて、プローブ１、２、３および４の組み合わせを使用した二重のニトロセルロースフィルター上でスクリーニングする。陽性物質が２８個得られ、これらを第２回目のために再び蒔く。再び二重ニトロセルロースレプリカ（写し）を作成する。１組のフィルターはプローブ♯１および♯２について、他方はプローブ♯３および♯４についてスクリーニングする。前者に関して６個、後者では２１個の陽性物質が得られる。６個のうちＨＥＬ５と呼ばれる１個から病原菌を除いてファージ平板ストックを作成し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、Ｍ１３およびｐＳＰ６５中にサブクローニングする（プロメガ・バイオテク、マジソン、ウィスコンシン）［メルトン等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第１２巻：７０３５〜７０５６頁（１９８４）］。このフラグメントのＤＮＡ配列および導き出されたアミノ酸配列を表Ｉに示す。
【００７６】
　Ｍ１３におけるこのフラグメントのＤＮＡ配列解析は、これが上に開示した所望のトリプシン分解ペプチド配列をコードしており、かつこの導き出されるアミノ酸配列は、トリプシンの特異性により予想される通り塩基性残基（Ｌｙｓ）が先行するということを示すものである。表Ｉの配列中、下線を付したアミノ酸＃４２〜＃４８の部分は上で同定されたトリプシン分解フラグメントに相当し、これからオリゴヌクレオチドプローブを設計する。表Ｉに開示されているアミノ酸＃１５〜＃２３の誘導されるアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇは、上に述べた「ＢＭＰ」公開第ＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９号に記載された２８０００〜３００００ダルトンの精製骨調製物中に見出されるトリプシン分解フラグメント配列Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇに類似していることが注目される。表Ｉに開示されるこのフラグメントは牛のＢＭＰ−５蛋白をコードしているＤＮＡ配列の一部である。表Ｉに示したＤＮＡ配列は、１４０アミノ酸残基からなる部分的ペプチドをコードしている（最初の７個のヌクレオチドはクローニング過程で使用されるアダプターのものである）４２０塩基対のクローンの５′未満からの開放読み取り枠を示す。枠内の停止コドン（ＴＡＡ）は、このクローンが牛ＢＭＰ−５のカルボキシ末端部分をコードしていることを示している。
【００７７】
【表１】
2004073208.tif 000002
【００７８】
　Ｃ．牛のＢＭＰ−６
　上記プローブ＃１、＃２、＃３および＃４によって単離された残りの陽性クローン（２１個の陽性物質を含む第２の群）をＨＥＬ５によりスクリーニングし、還元ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするさらにもう１個のクローンを同定する［５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５×デンハート、６５℃で１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ標準ハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＨＢ）、２×ＳＳＣ ０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄］。このクローンの病原菌を除き、ファージ平板ストックを作成し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。ＤＮＡ配列およびこのクローンの一部から導かれたアミノ酸配列を表ＩＩに示す。この配列は、本発明に係る牛のＢＭＰ−６軟骨／骨蛋白をコードしているＤＮＡ配列の一部を表わしている。
　表ＩＩの配列中、最初に下線を付したアミノ酸＃９７〜アミノ酸＃１０５の部分は、上に述べた「ＢＭＰ」公開第ＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９号に記載された２８０００〜３００００ダルトンの精製牛骨調製物（およびおよそ１８０００〜２００００ダルトン還元型におけるその還元型）中に見出されるトリプシン分解フラグメントに相当する。表ＩＩにおいて第２に下線を付したアミノ酸＃１２４〜アミノ酸＃１３０の配列は、上で同定されたトリプシン分解フラグメントに相当し、ここからオリゴヌクレオチドプローブを設計する。
　表ＩＩのＤＮＡ配列は、２２２アミノ酸残基からなる部分的ペプチドをコードしている表ＩＩの配列の５′末端から始まる６６６塩基対の開放読み取り枠を示す。枠内の停止コドン（ＴＧＡ）は、このクローンが牛のＢＭＰ−６蛋白のカルボキシ末端部分をコードしていることを示している。他のＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β科の蛋白についての知識に基づくと、前駆体ポリペプチドは３個の塩基性残基の箇所（ＡｒｇＡｒｇＡｒｇ）で開裂して表ＩＩの配列の残基９０または９１で始まる成熟ペプチドを生成することが予想される。
【００７９】
【表２】
2004073208.tif 000003
【表３】
2004073208.tif 000004
【００８０】
　実施例Ｖ
　Ａ．ヒトの蛋白組成
　ＢＭＰ−５および／またはＢＭＰ−６のｍＲＮＡを合成するヒトのセルラインを以下の方法で同定する。ＲＮＡを種々のヒトセルラインから単離し、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーによりポリＡ含有ＲＮＡを選択し、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で電気泳動し、ニトロセルロースに移す。このゲルのニトロセルロースレプリカを、表Ｉの配列のヌクレオチド１〜４６５を含む上記ＢＭＰ−５ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントに対応する一本鎖Ｍ１３３２Ｐ標識プローブにハイブリダイズする。強くハイブリダイズしているバンドがヒトの骨肉腫セルラインＵ−２０ＳＲＮＡに相当するレーンに検出される。もう１個のニトロセルロースレプリカを、牛ＢＭＰ−６のＰｓｔＩ−ＳｍａＩフラグメントを含む一本鎖Ｍ１３３２Ｐ標識プローブ（表ＩＩのヌクレオチド１０６〜２６１に対応）にハイブリダイズする。Ｕ−２０Ｓ ＲＮＡに対応するレーン中の幾つかのＲＮＡ種がこのプローブとハイブリダイズすることがわかる。
　確立されている技術（トゥール等）を用いてＵ−２０ＳポリＡ含有ＲＮＡからベクターラムダＺＡＰ（ストラタジーン）にｃＤＮＡライブラリーを作成する。このライブラリーの組替え体７５００００個を平板に蒔き、二重のニトロセルロースレプリカを作成する。表ＩＩのヌクレオチド２５９〜７５１に相当する牛ＢＭＰ−６のＳｍａＩフラグメントをニック翻訳によって標識し、ＳＨＢ中６５℃で両方の組のフィルターにハイブリダイズする。一方の組のフィルターは緊縮（ストリンジェント）条件下（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で、他方は緊縮性の低い条件下（１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃）で洗浄する。多くの写しが組替え体とハイブリダイズしている（およそ１６２個）のに注目できる。２４個を選んで第２回目のために再播種する。各平板につき３個のニトロセルロースレプリカを作成する。１個はＢＭＰ−６ＳｍａＩプローブにハイブリダイズし、１個はニック翻訳されたＢＭＰ−６ＰｓｔＩ−ＳａｃＩフラグメント（表ＩＩのヌクレオチド１０６〜３７８）に、そして第３番目はニック翻訳されたＢＭＰ−５ ＸｂａＩフラグメント（表Ｉのヌクレオチド１〜７６）にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は緊縮条件下で行なう。
【００８１】
　Ｂ．ヒトのＢＭＰ−５蛋白
　第２のプロ−ブより強く第３のプロ−ブにハイブリダイズしている１７個のクローンの斑を除く。これらのうちの１個、Ｕ２−１６のＤＮＡ配列解析は、これがヒトＢＭＰ−５をコードしていることを示す。Ｕ２−１６はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビル、メリーランド）に１９８９年６月２２日、入手番号ＡＴＣＣ６８１０９のもとで寄託された。この寄託および本明細書中に記載されている他の寄託は、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定に基づいて行なわれる。Ｕ２−１６はおよそ２．１Ｋｂの挿入部を含む。Ｕ２−１６のＤＮＡ配列および誘導されるアミノ酸配列を以下の表ＩＩＩに示す。このクローンは、ヒトのＢＭＰ−５蛋白をコードするのに必要な全ヌクレオチド配列を含んでいると予想される。表ＩＩＩのｃＤＮＡ配列は、アミノ酸４５４個の蛋白をコードし、全ての枠において停止コドンを伴う７００ｂｐの５′非翻訳領域が先行する、１３６２ｂｐの転写解読枠、および枠内停止コドン（ＴＡＡ）に続く９０ｂｐの３′非翻訳領域を含んでいる。
【００８２】
　アミノ酸４５４個のこの蛋白はそのアミノ酸配列によって予言できるようにおよそ５２０００ダルトンの分子量を有し、主要な翻訳生成物であると考えられる。他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−β科内の他の蛋白についての知識に基づくと、この前駆体ポリペプチドは３塩基性ペプチドＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓにおいて開裂し、アミノ酸＃３２３「Ａｓｎ」で始まる１３２アミノ酸成熟ペプチドを生成するであろうと予測される。ＢＭＰ−５の成熟型へのプロセシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセシングと類似の方法による二量重合およびＮ末端領域の脱離を含んでいると予想される［Ｌ．Ｅ．ジェントリー等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー８：４１６２（１９８８）；Ｒ．ダーニック等、ネイチャー３１６：７０１（１９８５）］。
【００８３】
　したがって、ＢＭＰ−５の成熟活性種は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体を含み、各サブユニットが予想分子量およそ１５０００ダルトンのアミノ酸＃３２３〜＃４５４からなるという事が考えられる。さらに活性ＢＭＰ−５種は例えば成熟サブユニットに結合したプロ蛋白サブユニットまたはプロ蛋白二量体が考えられる。また別の活性種は、アミノ酸＃３２９〜＃４５４を含むことができ、かかる種は牛の精製した材料中に見出される相同性のトリプシン分解配列を含んでいる。さらにまた考えられるのは、アミノ酸＃３５３〜＃４５４からなり、故に最初の保存されたシステイン残基を含む、ＢＭＰ−５蛋白である。
【００８４】
　表ＩＩＩの下線を付したアミノ酸＃３２９〜＃３３７の配列Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇは、上記実施例ＩＶで述べた表Ｉのアミノ酸＃１５〜＃２３の牛の配列と相同性を分かち合っている。これら各々の配列は、上記の「ＢＭＰ」公開出願第ＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９号に記載のように、２８０００〜３００００ダルトンの精製された骨の調製物中に見出されるトリプシン分解フラグメント配列Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（およびおよそ１８０００〜２００００ダルトンにおけるその還元型）と相同性を分かち合っている。
【００８５】
　表ＩＩＩの下線を付したアミノ酸＃３５６〜＃３６２の配列Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅは上で述べた牛骨調製物中に同定されるトリプシン分解フラグメントに相当し、これよりオリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【００８６】
【表４】
2004073208.tif 000005
【表５】
2004073208.tif 000006
【表６】
2004073208.tif 000007
【表７】
2004073208.tif 000008
【００８７】
　上記トリプシン分解配列Ｈｉｓ−Ｇｕｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−（Ｓｅｒ）は、例えば公開第ＷＯ８８／００２０５号に記載されるように牛およびヒトの軟骨／骨蛋白ＢＭＰ−２Ａ配列中に見出される配列Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒと類似することが注目される。ヒトのＢＭＰ−５は、他のＢＭＰ分子およびＴＧＦ−β分子の超科の他の構成員と相同性を分かち合っている。ヒトＢＭＰ−５システインに富むカルボキシ末端１０２アミノ酸残基は、本明細書ならびに上記公開第ＷＯ８８／００２０５号およびＷＯ８９／１０４０９号中に開示されるＢＭＰ蛋白と、以下の相同性を分かち合っている：ＢＭＰ−２と６１％の一致；ＢＭＰ−３と４３％の一致；ＢＭＰ−４と５９％の一致；ＢＭＰ−６と９１％の一致；そしてＢＭＰ−７と８８％の一致。ヒトＢＭＰ−５はさらに以下の相同性を分かち合っている：ＴＧＦ−β３と３８％の一致；ＴＧＦ−β２と３７％の一致；ＴＧＦ−β１と３６％の一致；ミュラー阻害物質（ＭＩＳ）、即ち雄の胚の発達中ミュラー管の退行をもたらす精巣の糖蛋白と２５％の一致；インヒビンαと２５％の一致；インヒビンβＢ３８％の一致；インヒビンβＡと４５％の一致；Ｖｇｌ、即ち胚発生初期における中胚葉の誘導に関与し得るツメガエルの因子［ウィークスおよびメルトン、セル第５１巻８６１〜８６７頁（１９８７）］と５６％の一致；胚発生初期における背腹の特定に必要であり、発達後期において他の様々な発達過程に関与している、ショウジョウバエのドロソフイラ・デカペンタプレジック・ローカスの産物であるＤｐｐと５７％の一致［パジェット等、ネイチャー第３２５巻８１から８４頁（１９８７）］。
【００８８】
　Ｃ．ヒトのＢＭＰ−６蛋白
　実施例ＶＡに記載の第２のプローブに対し第３のプローブに対するより強くハイブリダイズする６個のクローンを取り、プラスミド中に導入する。これらのプラスミドの制限地図作成、サザンブロット分析およびＤＮＡ配列分析は、２種類のクローンがあることを示す。クローンＵ２−７およびＵ２−１０は、他の４個のクローンよりも第２のプローブにより強くハイブリダイズし、かつ表ＩＩの牛ＲＭＰ−６に対しより近接したＤＮＡ相同性を持つという事に基づくと、ヒトのＢＭＰ−６をコードする配列を含んでいる。これらのクローンから導かれるＤＮＡ配列のデータは、それらがヒトのＢＭＰ−６蛋白のカルボキシ末端を含む１３２のアミノ酸から成る部分的ポリペプチドをコードしていることを示す。Ｕ２−７は、ブタペスト条約の規定のもとで、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ロックビル、メリーラント］に１９８９年６月２３日、入手番号６８０２１のもとで寄託された。
【００８９】
　プライマー延長ｃＤＮＡライブラリーを、その配列がクローンＵ２−１０由来のヒトＢＭＰ−６の３’非翻訳配列に基づいているオリゴヌクレオチドＧＧＡＡＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＡＡＴＧＴＧを用いてＵ−２０Ｓから作成する。このライブラリーを、Ｕ２−７およびＵ２−１０のＢＭＰ−６をコードしている配列から誘導される配列ＣＡＧＡＧＴＣＧＴＡＡＴＣＧＣのオリゴヌクレオチドによりスクリーニングする。ハイプリダイゼーションは標準ハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＨＢ）中、摂氏４２度で、洗浄条件として摂氏４２度、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのもとで行う。明確にハイブリダイズしているク口ーンを単離する。これらのクローンのうち１個のＤＮＡ挿入部ＰＥＨ６−２は、これがＵ２−７やＵ２−１０よりもさらに５’方向へ伸長することを示す。上記のＵ−２０ＳｍＲＮＡから組み立てられたプライマー伸長ｃＤＮＡライブラリーを、ＰＥＨ６−２の５’末端付近の配列から誘導された配列ＧＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣＧＴのオリゴヌクレオチドによりスクリーニングする。ハイブリダイゼーションはＳＨＢ中摂氏６５度で、洗浄は２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中摂氏６５度で行なう。明確にハイブリダイズしている組替え体を単離し、制限地図の作成およびＤＮＡ配列解析によって分析する。
【００９０】
　この明確にハイプリダイズしている組替え体のうちの１個ＰＥ５８３４＃７の挿入物の５’配列を、配列ＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＧＣのオリゴヌクレオチドの設計に使用する。任意のプライマーを使用したＣＤＮＡライブラリー［（ｄＮ）６をプライマーとして用いる外はオリゴ（ｄＴ）をプライマーとするライブラリーとして合成］を、このオリゴヌクレオチドを用いて、ＳＨＢ中摂氏６５度でハイプリダイゼーションし、１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中摂氏６５度で洗浄することによりスクリーニングする。明確にハイプリダイズしているクローンＲＰ１０を同定し、単離し、その挿入部の５’末端からのＤＮＡ配列を決定する。この配列は、配列ＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡを有するオリゴヌクレオチドの設計に使用する。ヒト胎盤のｃＤＮＡライブラリー（ストラタジーンのカタログ＃９３６２０３）を、このオリゴヌクレオチドを用いて、ＳＨＢ中摂氏６５度でハイプリダイゼーションし、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにて摂氏６５度で洗浄することによりスクリーニングする。ＢＭＰ６Ｃ３５と命名された明確にハイブリダイズする組替え体を単離する。この組替え体の挿入部のＤＮＡ配列分析は、これが完全なヒトＢＭＰ−６蛋白をコードしていることを示す。
【００９１】
　ＢＭＰ６Ｃ３５は、ブタペスト条約の規定のもとにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１２３０：パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡ）に１９９０年３月１日、入手番号６８２４５のもとで寄託された。ＢＭＰ６Ｃ３５の挿入部の大部分のＤＮＡ配列およびここから誘導されるアミノ酸配列を表ＩＶに示す。このＤＮＡ配列は、５１３個のアミノ酸を持つヒトＢＭＰ−６蛋白前駆体をコードしている、１５３９塩基対の開放読み取り枠を含む。考え得るイニシエーターであるメチオニンコドンには、３個全ての読み取り枠において停止コドンを伴う１５９塩基対の５’非翻訳配列が先行する。ヌクレオチド１６９９〜１７０１における停止コドンには少なくとも１２２２塩基対の３’非翻訳配列が続く。Ｕ２−７は、ＳＭＰ６Ｃ３５の１２２１位において、Ｔ基に相当する位置にＣ基があり、Ｕ２−７もまた、ＢＭＰ６Ｃ３５Ｋ１２５３位において、Ｇ基を有するということに留意されたい。これらはコードされている蛋白にアミノ酸の相違を招く訳ではなく、恐らくは対立遺伝子による変異を意味するものである。
【００９２】
　オリゴヌクレオチドＴＣＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＧＡＧＡＴＧＣＡを使用して、１×１０６の組替え体のニトロセルロースレプリカをＳＨＢ中摂氏６５度でこのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで摂氏６５度で洗浄することにより、ヒトのゲノムライブラリー（トゥール等、上記）をスクリーニングする。明確にハイブリダイズするクローンを精製する。オリゴヌクレオチドのハイブリダイズする領域はおよそ１．５ｋｂＰｓｔフラグメントに位置する。このフラグメントのＤＮＡ配列解析により、表ＩＶに示される５’配列が確認される。
【００９３】
　表ＩＶにおいて最初に下線を付した部分であるアミノ酸＃３８８から＃３９６の配列Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｒｇは、上に記載した表ＩＩに開示された牛の配列中の類似配列Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｒｇに対応する。表ＩＶにおいて第２に下線を付したアミノ酸＃４１５から＃４２１の配列Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅは、上で同定されたトリプシン分解フラグメントに対応し、ここからオリゴヌクレオチドプローブを設計する。トリプシン分解配列Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−（Ｓｅｒ）は、他のＢＭＰ蛋白中に見出される配列、例えば牛に見出される配列Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒおよび公開第ＷＯ８８／００２０５号に記載されているヒトの軟骨／骨蛋白ＢＭＰ−２に類似していることが注目される。故にＢＭＰ−６はＴＣＦ−β様分子のＢＭＰ亜科の新しい構成員をなし、これは公開第ＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９号に記載されている分子ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ならびに本明細書中に記載されるＢＭＰ−５およびＤＭＰ−７を含む。
【００９４】
　他のＢＭＰ他のおよびＴＣＦ−β科の他の蛋白についての知識に基づくと、ＲＭＰ−６は前駆体分子として合成され、この前駆体ポリペプチト］まアミノ酸＃３８１およびアミノ酸＃３８２の間で開裂して理論的分子量およそ１５ｋｄを有する１３２個のアミノ酸からなる成熟ポリペプチドを生成すると予想される。ＤＭＰ−６の成熱型はＢＭＰ−５と同様、ポリペプチド鎖１個当たり考え得るＮ結合糖蛋白化部位３個を含む。
【００９５】
　成熱型へのＢＭＰ−６のプロセシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセシングと類似の方法の二量体形成およびＮ末端領域の脱離を含んでいると予想される［Ｌ．Ｅ．ジェントリー等、（１９８８）；Ｒ．ダーニック等、（１９８５）、上記］。活性ＢＭＰ−６蛋白分子は二量体であると考えられる。さらに、ＢＭＰ−５の成熟活性種は、蛋白分子が２個のポリペプチドサブユニットからなるホモ二量体であって各サブユニットが表ＩＶに開示されるアミノ酸＃３８２〜＃５１３を含んでいるということが考えられる。この他のＢＭＰ−５の活性種は、例えばフォ蛋白（phoprotein）二量体またはプロ蛋白（proprotein）サブユニットおよび成熟サブユニットであると考えられる。もう一つの活性ＢＭＰ−５蛋白はアミノ酸＃３８８〜＃５１３から成り、よって精製した牛の材料に見出さオ１るトリプシン分解フラグメントを含み得る。本発明に係る別のＢＭＰ−５蛋白はアミノ酸＃４１２〜＃５１３からなり、よって最初の保存されたシステイン残基を含む。
【００９６】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【００９７】
ネズミのＶｇｒ−１の配列［リヨンズ等、ＰＮＡＳ第８６巻４５５４頁（１９８９）］をヒトのＢＭＰ−６と比較することにより、アミノ酸配列の一致の程度は９２％以上であることが示される。ネズミのＶｇｒ−１はＢＭＰ−６のネズミにおける相同体のようである。ヒトのＢＭＰ−６は、他のＢＭＰ分子およびＴＧＦ−β超科分子の他の構成員と相同性を分かち合っている。ヒトＲＭＰ−６のシステインに富むカルボキシ末端の１０２個のアミノ酸残基は、本明細書中ならびに公開第ＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９号中に開示されるＢＭＰ蛋白と、以下の相同性を分かち合っている：ＢＭＰ−２と６１％の一致；ＢＭＰ−３と４４％の一致；ＢＭＰ−４と６０％の一致；ＢＭＰ−５と９１％の一致；そしてＢＭＰ−７と８７％の一致。ヒトのＲＭＰ−６はさらに以下の相同性を分かち合っている：ＴＧＦ−β３と４１％の一致；ＴＧＦ−β２と３９％の一致；ＴＧＦ−β１と３７％の一致；ミュラー阻害物質（ＭＩＳ）、即ち雄の胚の発達中ミュラー管の退行をもたらす精巣の糖蛋白と２６％の一致；インヒビンαと２５％の一致；インヒビンβBと４３％の一致；インヒビンβAと４９％の一致；Ｖｇｌ、即ち胚発生初期における中胚葉の誘導に関与し得るツメガエルの因子［ウィークスおよびメルトン（１９８７）、上記］と５８％の一致；そして胚発生初期における背腹の特定に必要であり、発達後期において他の様々な発達過程に関する、ショウジョウバエのドロソフイラ・デカペンタプレジック・ローカスの産物であるＤｐｐと５７％の一致［パジェット等、（１９８７）、上記］。
【００９８】
Ｄ．ひとＢＭＰ−７蛋白
　クローンの第２群を代表する上記実施例ＶＣの残る４種のクローンはＢＭＰ−７として示す新規ポリペプチドをコード化している。これらのクローンの１つであるＵ２−５は、ブダペスト条約規定に基づいて受託番号ＡＴＣＣ６８０２０号として１９８９年６月２２日にＡＴＣＣに受託された。本クローンはＢＭＰ−７の全コード化配列を含むものではないことが決定された。配列ＧＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧ（Ｕ２−５の３’非コード化配列に基づいて示した）のオリゴをＵ−２　ＯＳ　ｍＲＮＡからプライマー延長ｃＤＮＡライブラリーを作るのに使用した（トール等）。本ライブラリーの５００，０００組換え体を４２℃ ＳＨＢでハイブリッド化し、４２℃ ５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で洗浄することによりオリゴヌクレオチドＧＡＴＣＴＣＧＣＧＣＴＧＣＡＴ（ＢＭＰ−７コード化配列に基づいて示した）で選別した。数種のハイブリッド化クローンを得た。これらのクローンであるＰＥＨ７−９の１つのＤＮＡ配列分析および誘導アミノ酸配列を第Ｖ表に示す。ＰＥＨ７−９をブダペスト条約規定に基づいて受託番号ＡＴＣＣ６８１８２として１９８９年１１月１７日にメリーランド、ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）で寄託した。ＰＥＨ７−９には１４４８塩基対の挿入を含む。本クローンであるＰＥＨ７−９はＢＭＰ−７蛋白をコード化するのに必要なヌクレオチド配列全てを含むことが予期された。第Ｖ表のｃＤＮＡ配列は、４３１アミノ酸の蛋白をコード化している１２９２塩基対の転写解読枠を含み、その前に全枠の停止コドンと共に９６塩基対の５’未翻訳領域があり、枠内停止コドンＴＡＧの後に６０塩基対の３’未翻訳領域を含む。
【００９９】
　４３１アミノ酸のこの蛋白は、そのアミノ酸配列により予測されるように分子量４９，０００ダルトンであり、最初の翻訳生成物を表すことが予測される。他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−βファミリー内の他の蛋白の知識に基づくと、プレカーサーポリペプチドがアミノ酸＃２９９と＃３００の間で開裂して１３２アミノ酸成熟ペプチドを生じると予想される。
【０１００】
　ＢＭＰ−７の成熟形にするプロセシングは、関連性のある蛋白ＴＧＦ−Ｂのプロセシングに類似した方法でのプロプロテインの二量体化およびＮ末端領域の除去を含むことが予想される（Ｌ．Ｅ．ジェントリー等、（１９８８年）前掲およびＲ．デルニック等、（１９８５年）前掲）。それ故、ＢＭＰ−７の成熟活性種は各サブユニットが計算重量１５，０００ダルトンである第Ｖ表に示すようなアミノ酸＃３００〜４３１からなる２ポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなることが予想される。他の活性ＢＭＰ−７種は例えば蛋白二量体または成熟サブユニットに結合したプロプロテインサブユニットと予測される。付加的な活性種は第Ｖ表の上記種のアミノ酸＃３０９〜＃４３１を含み精製うし材料中に見られるトリプチック配列を含む可能性がある。またＢＭＰ−７蛋白がアミノ酸＃３３０−＃４３１を含みそれにより第１保護システイン残基を含むことが予想される。
【０１０１】
　アミノ酸＃３０９〜＃３１４のＡｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇの第Ｖ表の下線した配列は、上記の「ＢＭＰ」公開ＷＯ８８／００２０５号およびＷＯ８９／１０４０９に記載したような２８，０００〜３０，０００ダルトンの精製骨製品中に見られるトリプチックフラグメント＃５のアミノ酸と同じ配列である。アミノ酸＃３３３〜＃３３９ Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅの第Ｖ表の下線した配列は、そこからオリゴヌクレオチドプローブを指定した上記記載のようなうし骨髄製品で同定したトリプチックフラグメントに相当する。
【０１０２】
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０１０３】
　ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６と同様に、ひとＢＭＰ−７は他のＢＭＰ分子および分子のＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーを相同性を有する。ひとＢＭＰ−７のシステイン豊富カルボキシ末端１０２アミノ酸残基は、本書に記載され上記記載のＷＯ８８／００２０５およびＷＯ８９／１０４０９のＢＭＰ蛋白と次のような相同性を有する、ＢＭＰ−２に６０％相同、ＢＭＰ−３に４３％相同、ＢＭＰ−４に５８％相同、ＢＭＰ−６に８７％相同およびＢＭＰ−５に８８％相同である。ひとＢＭＰ−７はさらに次の相同性を有する。ＴＧＦ−β３に４０％相同、ＴＧＦ−β２に４０％相同、ＴＧＦ−β１に３６％相同、雄性胚が発達する間にミューラー管の退化をひきおこす精巣性糖蛋白であるミューラー阻害物質（ＭＩＳ）に２９％相同、インヒビン−αに２５％相同、インヒビン−βＢに４４％相同、インヒビン−βＡに４５％相同、早期胚形成の中胚葉誘導に関することができるアフリカツメガエル因子であるＶｇｌに５７％相同（ウイークス・アンド・メルトン、（１９８７年）前掲）および早期胚形成の背−腹部明確化に必要とし、発生の後の段階での様々な他の発生段階に関与するドロソフイラ・デカペンタプレジック座の生産物であるＤｐｐに５８％相同（パジェット等（１９８７年）、前掲）である。
【０１０４】
　本発明はＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７のゲノム配列を包含する。これらの配列を得るためには、ここに記載したｃＤＮＡ配列を当業者によく知られた技術を利用してゲノムライブラリーを選別するプローブとして利用する。
【０１０５】
　上記製法および当業者によく知られた付加的な方法を、プローブ源としてうしまたはひと蛋白を利用することにより興味がある他の関連蛋白を単離するのに使用することができる。上記他の蛋白はとりわけ破損修復、傷治療および組織修復において同様に利用することができる。
【０１０６】
実施例ＶＩ
　ＢＭＰタンパクの発現
　本発明のウシ、ヒトまたはその他の哺乳動物のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６もしくはＢＭＰ−７タンパクを産生するために、通常の遺伝子操作技術により、それをコード化したＤＮＡを適当な発現ベクターにトランスフェクトし、哺乳動物細胞またはその他の好ましい真核生物もしくは原核生物の宿主に導入する。本発明の生物学的に有効なヒト組み換えタンパクのための好ましい発現系は、安定した状態で形質転換された哺乳動物細胞であろうと考えられる。一時的な発現のために、ＳＶ４０形質転換アフリカン・グリーン・モンキー腎ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７を選択し、通常プラスミド内でコード化タンパクを１−４日間、適度な量産生させる。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７を安定して高量発現させるために、チャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）のセルラインが好ましい。従って、好ましい哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞であると考えられる。
【０１０７】
　形質転換した宿主細胞を培養し、それにより発現した本発明のＢＭＰタンパクは、回収し、単離し、精製する。発現タンパクは、標準的な手法を用いて確認する。例えば、確認には、［３５Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベル化、およびポリアクリルアミド電気泳動による分析が含まれる。組み換えて発現したＢＭＰタンパクには、共産し天然では通常共存しているタンパク様物質がなく、培養液中に見出される物質のようなその他の狹雑物も含まれない。
【０１０８】
Ａ．ベクターの構築
　上述のとおり、当業界で既知の、多数の発現ベクターが、本発明のＢＭＰタンパクの発現に利用することができる。以下の実施例に用いるベクターは、ｐＭＴ２の誘導体であるｐＭＴ２１であるが、その他のベクターも、本発明の実施に適している。
【０１０９】
　ｐＭＴ２は、ブダペスト条約の規定に従って、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、ＭＤ（米国）に、受け入れ番号ＡＴＣＣ６７１２２で寄託していたｐＭＴ２−ＶＷＦから誘導する。ＥｃｏＲＩ消化して、ｐＭＴ−ＶＷＦに存在する相補的ＤＮＡ挿入部位を切除し、直線状のｐＭＴ２を産生するが、これは連結でき、エシェリキア・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５に通常アンピシリン抵抗性を形質転換できる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、常法により調製することができる。
【０１１０】
　ｐＭＴ２１は、ループアウト／イン突然変異誘発を用いて構築する［モリナガら、バイオテクノロジー８４巻６３６頁（１９８４年）］。これにより、塩基１０７５〜１１７０（全部）が除去される。さらに、以下の配列を挿入する：５′ＴＣＧＡ３′。この配列は、新しい制限部位、ＸｈｏＩを完備する。このプラスミドは、３個の特異なクローニング部位、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを含有することになる。
【０１１１】
　さらに、ｐＭＴ２１は、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、消化したＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、ＣｌａＩリンカー（ＮＥバイオ・ラブズ、ＣＡＴＣＧＡＴＧ）を連結する。このようにして、ＳＶ４０複製起点近くのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびｐＭＴ２のエンハンサー配列から出発して、塩基２１７１〜２４２０を除去し、唯一のＣｌａＩ部位を導入するが、アデノウィルスＶＡＩ遺伝子は無傷のままにしておく。
【０１１２】
Ｂ．ＢＭＰ−５ベクターの構築
　第III表に示したＢＭＰ−５相補的ＤＮＡ配列の誘導体は、ヌクレオチドＮｏ．６９９〜Ｎｏ．２０７０のヌクレオチド配列から成り、特異的に増幅される。オリゴヌクレオチドＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡおよびＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧＣは、プライマーとして使用され、第ＩＩＩ表のヌクレオチド配列Ｎｏ．６９９〜Ｎｏ．２０７０を、実施例Ｖで記載されたクローンＵ２−１６の挿入部位から増幅させる。この方法により、ヌクレオチド配列ＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣをヌクレオチドＮｏ．６９９のすぐ前に、そしてヌクレオチド配列ＣＴＧＣＡＧＧＣＡをヌクレオチドＮｏ．２０７０のすぐ後に導入する。これらの配列を付加することにより、増幅されたＤＮＡ断片の両末端で、ＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作り出すことになる。この方法により増幅されたＤＮＡ産生物は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、上述のｐＭＴ２誘導ｐＭＴ２１のＰｓｔＩ部位にサブクローン化する。得られたクローンは、Ｈ５／５／ｐＭＴと称する。
【０１１３】
　Ｈ５／５／ｐＭＴの挿入部位は、ＰｓｔＩ消化により切除し、ＰｓｔＩ部位でプラスミドベクターｐＳＰ６５にサブクローン化し、その結果、ＢＭＰ５／ＳＰ６が得られる。ＢＭＰ５／ＳＰ６およびＵ２−１６は、制限エンドヌクレアーゼＮｓｉＩとＮｄｅＩで消化し、第ＩＩＩ表のヌクレオチドＮｏ．７０４〜Ｎｏ．１８７６に対応する挿入部位を切除する。その結果得られるクローンＵ２−１６の１１７３ヌクレオチドＮｓｉＩ−ＮｄｅＩ断片は、対応する１１７３ヌクレオチドＮｓｉＩ−ＮｄｅＩ断片が除去された、ＢＭＰ５／ＳＰ６のＮｓｉＩ−ＮｄｅＩ部位に連結する。得られたクローンは、ＢＭＰ５ｍｉｘ／ＳＰ６４と称する。
【０１１４】
　ＢＭＰ５ｍｉｘ／ＳＰ６４の直接的なＤＮＡ配列分析を行い、増幅により産生したヌクレオチド配列が、第ＩＩＩ表に示されたものと同一であることを確認する。クローンＢＭＰ５ｍｉｘ／ＳＰ６４は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、第ＩＩＩ表のヌクレオチドＮｏ．６９９〜Ｎｏ．２０７０および上述のＰｓｔＩ認識部位を含有する付加配列から成る挿入部位を切除する。その結果、１３８２ヌクレオチドＰｓｔＩ断片は、ｐＭＴ２誘導ｐＭＴ２１のＰｓｔＩ部位にサブクローン化される。このクローンは、ＢＭＰ５ｍｉｘ／ｐＭＴ２１Ｎｏ．２と称する。
【０１１５】
Ｃ．ＢＭＰ−６ベクターの構築
　ヌクレオチドＮｏ．１６０〜Ｎｏ．１７０６のヌクレオチド配列から成る、第ＩＶ表に示したＢＭＰ−６相補的ＤＮＡ配列の誘導体は、当業者に既知である一連の技術により産生される。実施例Ｖに記載されたクローンＢＭＰ６Ｃ３５は、制限エンドヌクレアーゼＡｐａＩおよびＴａｑＩで消化し、第ＩＶ表に示した配列の、ヌクレオチドＮｏ．２３１〜Ｎｏ．１７０３から成る挿入部位の１４７６ヌクレオチド部分を切除する。ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位コンバーターを有する合成オリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６相補的ＤＮＡ配列の１４７６ＡｐａＩ−ＴａｑＩ断片に含まれないＮｏ．１６０−Ｎｏ．２３０およびＮｏ．１７０４〜Ｎｏ．１７０６に対応するヌクレオチドと置換するように計画する。喪失した５’
　（ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＣＴＧＴＧ　　ＣＴＧＧＴＧＧＴ　　ＧＧＧＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＣおよび
　　ＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣ　　ＣＴＣＣＧＣＣＣＣＡＧ　　ＣＣＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＧ）
および３’（ＴＣＧＡＣＴＧＧＴＴＴおよびＣＧＡＡＡＣＣＡＧ）配列を置換するためのオリゴヌクレオチド／ＳａｌＩコンバーターは、互いに独立してアニーリングする。次いでアニーリングした５’および３’コンバーターは、上述の１４７６ヌクレオチドＡｐａＩ−ＴａｑＩに連結し、第ＩＶ表のＮｏ．１６０〜１７０６のヌクレオチド配列および両末端にＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を作るように企てた付加配列から成る１５６３ヌクレオチド断片を作り出す。得られた１５６３ヌクレオチド断片は、ｐＳＰ６４のＳａｌＩ部位にサブクローン化する。このクローンは、ＢＭＰ６／ＳＰ６４Ｎｏ．１５と称する。
【０１１６】
　ＢＭＰ６／ＳＰ６４Ｎｏ．１５のＤＮＡ配列分析を行い、コンバーターにより置換された５’および３’配列が第ＩＶ表に示した配列と同一であることを確認する。ＢＭＰ６／ＳＰ６４Ｎｏ．１５の挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化して切除する。得られた１５６３ヌクレオチドＳａｌＩ断片は、ｐＭＴ２誘導ｐＭＴ２１のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にサブクローン化し、本明細書ではＢＭＰ６／ｐＭＴ２１と称する。
【０１１７】
Ｄ．ＢＭＰ−７ベクターの構築
　ヌクレオチドＮｏ．９７〜Ｎｏ．１４０２のヌクレオチド配列からなる、第Ｖ表に示したＢＭＰ−７配列の誘導体は、特異的に増幅される。オリゴヌクレオチドＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＧＣＧＣＴＣＡおよびＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣは、プライマーとして、上述のクローンＰＥＨ７−９の挿入部位から、第Ｖ表のヌクレオチド配列Ｎｏ．９７〜Ｎｏ．１４０２を増幅させるのに使用する。この方法により、ヌクレオチド配列ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣを、ヌクレオチドＮｏ．９７のすぐ前に、そしてヌクレオチド配列ＧＴＣＧＡＣＡＧＡをヌクレオチドＮｏ．１４０２のすぐ後に挿入することになる。これらの配列を付加することにより、増幅したＤＮＡ断片の各末端に、ＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作り出す。この方法により得られる増幅したＤＮＡ産生物は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化し、プラスミドベクターｐＳＰ６４のＳａｌＩ部位にサブクローン化し、その結果、ＢＭＰ−７／ＳＰ６Ｎｏ．２が得られる。
【０１１８】
　クローンＢＭＰ−７／ＳＰ６Ｎｏ．２およびＰＥＨ７−９は、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＳｔｕＩで消化し、第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．３６３〜Ｎｏ．１０８１に対応する挿入部位を切除する。得られるクローンＰＥＨ７−９の７１９ヌクレオチドＮｃｏＩ−ＳｔｕＩ断片は、対応する７１９ヌクレオチド断片が除去されるＢＭＰ７／ＳＰ６Ｎｏ．２のＮｃｏＩ−ＳｔｕＩ部位に連結する。得られるクローンは、ＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６と称する。
【０１１９】
　ＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６の直接的なＤＮＡ配列分析を行い、３’部分が第Ｖ表のＮｏ．１０８２〜Ｎｏ．１４０２のヌクレオチド配列と同一であることを確認するが、５’部分には、誤って挿入された１個のヌクレオチドを含有する。
【０１２０】
　ＰＥＨ７−９を鋳型として用いるヌクレオチド配列（第Ｖ表のＮｏ．９７〜Ｎｏ．１４０２）の増幅は、上述のように繰り返し行う。この方法により得られた増幅したＤＮＡ産生物は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＰｓｔＩで消化する。この消化により、第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．９７〜Ｎｏ．８３３から成る７４７ヌクレオチド断片、および前述のＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を作り出した５’プライミングオリゴヌクレオチドの付加配列を切除する。この７４７ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ断片は、ＳａｌＩ−ＰｓｔＩ消化ｐＳＰ６５ベクターにサブクローン化し、その結果、５’ＢＭＰ７／ＳＰ６５が得られる。ＤＮＡ配列分析により、５’ＢＭＰ７／ＳＰ６５Ｎｏ．１の挿入部位は、第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．９７〜Ｎｏ．３６２と同一の配列から成ることが示される。
【０１２１】
　クローンＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６および５’ＢＭＰ７／ＳＰ６５は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＮｃｏＩで消化する。得られた第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．３６３〜Ｎｏ．１０４２から成るＢＭＰ７ｍｉｘ／ＳＰ６５の３’ＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片、および第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．９７〜Ｎｏ．３６２から成る５’ＢＭＰ７／ＳＰ６５の５’ＳａｌＩ−ＮｃｏＩ断片は、ＮｃｏＩ制限部位で一緒に連結し、第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．９７〜Ｎｏ．１４０２から成る１３１７ヌクレオチド断片およびこの断片の両末端でＳａｌＩ制限部位を作り出す５’および３’オリゴヌクレオチドプライマーから誘導した付加配列を産生する。この１３１７ヌクレオチドＳａｌＩ断片は、ｐＭＴ２誘導ｐＭＴ２Ｃｌａ−２のＳａｌＩ部位に連結する。このクローンは、ＢＭＰ７／ｐＭＴ２と称する。
【０１２２】
　ＢＭＰ７／ｐＭＴ２の挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩで消化して切除する。得られた１３１７ヌクレオチドＳａｌＩ断片は、ベクターｐＳＰ６４のＳａｌＩ制限部位にサブクローン化する。このクローンはＢＭＰ７／ＳＰ６４Ｎｏ．２ｄと称する。ＢＭＰ７／ＳＰ６４Ｎｏ．２ｄの挿入部位は、ＳａｌＩで消化して切除し、得られる第Ｖ表のヌクレオチドＮｏ．９７〜Ｎｏ．１４０２から成るＳａｌＩ断片は、上述のｐＭＴ２誘導ｐＭＴ２１のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位にサブクローン化する。
【０１２３】
実施例ＶＩＩ
　一過性ＣＯＳ細胞発現
　ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白の一過性発現を得るために、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７のｃＤＮＡを含むベクターの一種である各ＢＭＰ５ｍｉｘ／ｐＭＴ２１＃２、ＢＭＰ６／ｐＭＴ２１＃２、またはＢＭＰ７／ｐＭＴをエレクトロポレーション法を用いてＣＯＳ−１細胞中に形質導入する。その他の適当な形質導入法にはＤＥＡＥ−デキストランおよびリポフェクションがある。約４８時間後、細胞について、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７蛋白の細胞内および分泌発現の両方を、［３５Ｓ］メチオニンによる代謝標識およびポリアクリルアミドゲル電気泳動により検討した。細胞内ＢＭＰは、Ｎ−結合糖付加阻害剤であるチュニカマイシンで処理した細胞につき検討した。チュニカマイシン処理細胞内で、非糖付加第一次翻訳生成物は予測のつく大きさの均一なバンドとして移動し、ポリアクリルアミドゲルで、蛋白質の糖付加体よりしばしば容易に判別し得る。各場合において、チュニカマイシン処理細胞内の蛋白は、形質導入されてはいるが、未処理ＣＯＳ細胞の二重プレート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　ｐｌａｔｅ）と比較する。
【０１２４】
Ａ．ＢＭＰ−５　ＣＯＳ発現
　結果は約５２Ｋｄおよび５７ＫｄのＢＭＰ−５の細胞内形がＣＯＳ細胞により生成していることを示している。５２Ｋｄ蛋白質はＢＭＰ−５　ｃＤＮＡクローンの第一次配列から予想し得る大きさである。チュニカマイシンでの細胞処理後、ＢＭＰ−５の５２Ｋｄ体のみが生成し、このことは５７Ｋｄ蛋白は５２Ｋｄ第一次翻訳生成物の糖付加誘導体であることを示している。５７Ｋｄ蛋白は調節培地中に分泌され、明らかＣＯＳ細胞により効果的にプロペプチドおよび成熟ペプチドにプロセッシングされていない。
【０１２５】
Ｂ．ＢＭＰ−６　ＣＯＳ発現
　細胞内ＢＭＰ−６は未処理ＣＯＳ−１細胞内に約６１Ｋｄおよび６５Ｋｄのダブレットとして存在する。チュニカマイシンの存在下で、６１Ｋｄ蛋白のみが観察され、これは６５Ｋｄ蛋白が６１Ｋｄ第一次翻訳生成物の糖付加誘導体であることを示している。これはＢＭＰ−６のｃＤＮＡクローンにから予想される分子量に近似している。チュニカマイシンの不存在下では、ＣＯＳ−１細胞から分泌される主要成分蛋白はＢＭＰ−６の６５Ｋｄの糖付加、未プロセッシング切断体である。さらに６５Ｋｄより少量で４６Ｋｄおよび２０Ｋｄペプチドも存在し、これは各々プロセッシングされたプロペプチドおよび成熟ペプチドを示している可能性がある。
【０１２６】
Ｃ．ＢＭＰ−７　ＣＯＳ発現
　チュニカマイシン処理ＣＯＳ−１細胞内のＢＭＰ−７蛋白は４４Ｋｄおよび４６Ｋｄのとダブレットして現われる。チュニカマイシンの不存在下では、４６Ｋｄおよびおそらく４８Ｋｄの蛋白が生産される。これらはおそらくＢＭＰ−７第一次翻訳生成物の糖付加誘導体の可能性を示している。４８Ｋｄ蛋白はＣＯＳ−１細胞から分泌される主要ＢＭＰ成分であり、このことはプロペプチド二塩基性切断部位における非能率的なＢＭＰ−７の切断を示している。
【０１２７】
実施例ＶＩＩＩ
　ＣＨＯ細胞発現
　ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞（ＤＵＫＸ　Ｂｌｌ）に、上記のＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７発現ベクターの一種をエレクトロポレーションにより形質導入し、ヌクレオチド無含有培地中での発育によりＤＨＥＲ発現を選択する。形質導入の他の方法として、ＣａＰＯ４沈澱法、プロトプラスト融合法、マイクロインジェクション法およびリポフェクションなどを用いることができるがこれらに限定されない。より便宜的に高い発現を得るために、細胞は５ｎＭ、２０ｎＭまたは１００ｎＭ　ＭＴＸを補足したヌクレオチド無含有培地中で選択することができる。ＤＨＦＲ選択可能マーカーはビシストロンコードづけ領域の第二遺伝子としてＢＭＰ　ｃＤＮＡに物理的に結合しているから、ＤＨＦＲを発現する細胞は上流シストロン内にコード化されたＢＭＰも発現するはずである。単一のクローン、または合併クローンの集合のいずれもＢＭＰ蛋白の発現につき増殖および分析する。細胞はＭＴＸ濃度の増大（５ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭ）とともに段階的に選択され、遺伝子増幅による発現ベクターＤＮＡの多数複写を含み、従って多量のＢＭＰ蛋白を分泌する細胞株を得る。
【０１２８】
　標準的技術を用いて、ＢＭＰのＲＮＡおよび蛋白の発現または活性につき選別し、高発現細胞株を、適当な選択水準でクローニングまたは再クローニングして細胞のより均一な集団のものを得る。ついで得られた細胞株のＢＭＰ　ＤＮＡ配列、ＢＭＰのＲＮＡおよび蛋白の発現につき検討する。ついで、適当な細胞株を組換えＢＭＰ蛋白の生産に用いることができる。
【０１２９】
Ａ．ＢＭＰ−５のＣＨＯ発現
　上記のＢＭＰ−５ベクターＢＭＰ５ｍｉｘ／ＰＭＴ２１＃２をエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞中に形態導入し、ＤＨＦＲ発現のための細胞を選択する。クローナル細胞株はＭＴＸ耐性につき段階的に選択された個々のコロニーから得、ＢＭＰ−５蛋白分泌につき検討する。ある種の場合には、細胞株を集団として保持し、ＭＴＸ選択のより遅い段階でクローニングすることができる。
【０１３０】
　実施例Ｖ．Ｂ．に記載のように、ＢＭＰ−５のｃ　ＤＮＡは約５２Ｋｄの蛋白をコード化している。プロペプチド切断、糖付加、および二量体または多量体生成を含むがこれに限定されない細胞内プロセッシングの後、多数のＢＭＰ−５ペプチドが生成する。還元条件下で、ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより判別可能なＢＭＰ−５蛋白のプロセッシング形として少なくとも４種のペプチド候補が存在する：６５Ｋｄペプチド、３５Ｋｄペプチドおよび約２２Ｋｄ分子量のダブレットである。他により少量のＢＭＰ−５ペプチド類が存在し得る。他の同類のＢＭＰ分子および同類の蛋白ＴＧＦ−ベータのプロセッシグと比較すると、６５Ｋｄ蛋白は未プロセッシングＢＭＰ−５に相当し、３５Ｋｄ体はプロペプチドに相当し、２２Ｋｄダブレットは成熟ペプチドに相当する可能性がある。
　ＢＭＰ−５細胞株からの物質は２次元ゲル系により分析する。第一次元で、蛋白を非還元条件下で電気泳動する。ついで還元し、第二のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。ジスルフィド結合した二量体または多量体は第二の還元ゲルを横切る対角線の下を通過する。ＢＭＰ−５蛋白の分析結果は、大量の成熟ＢＭＰ−５ペプチドが、一次元還元ゲルで観察される２２Ｋｄダブレットに変形する約３０〜３５Ｋｄのホモ二量体を生成し得ることを示している。成熟ペプチドの画分は明らかにプロペプチドとのジスルフィド結合複合体中にある。この複合体の量は成熟ホモ二量体と比較するとより少量である。さらに、未プロセッシング蛋白のうちあるものは明らかにホモ二量体またはホモ多量体を生成し得る。
【０１３１】
Ｂ．ＢＭＰ−６のＣＨＯ発現
　上記のＢＭＰ−６発現ベクターＢＭＰ６／ｐＭＴ２１をＣＨＯ細胞中に形質導入し、上記ＢＭＰ−５に関するＡ部に記載したと同様の方法でのＤＨＦＲ発現を経て安定な形質転換体を選択する。ＢＭＰ−６の成熟活性体は、第ＩＶ表のアミノ酸＃３８２〜＃５１３を含むものと予測される。分泌ＢＭＰ−６蛋白は、ＢＭＰ−５、他の同類のＢＭＰ分子および同類の蛋白ＴＧＦ−βに関して上記に記載したと同様の方法でプロセッシグされると予測される［ジェントリーら；デルニックら、上掲］。
Ｃ．ＢＭＰ−７のＣＨＯ発現
　上記のＢＭＰ−７発現ベクターＢＭＰ７／ｐＭＴ２１をＣＨＯ細胞中に形質導入し、ＢＭＰ−５に関し、上記と同様の方法でのＤＨＦＲ発現を経て安定な形質転換体を選択する。ＢＭＰ−７の成熟活性体は、第Ｖ表のアミノ酸＃３００〜＃４３１を含むものと予測される。分泌ＢＭＰ−７蛋白は、ＢＭＰ−５、他の同類のＢＭＰ分子および同類の蛋白ＴＧＦ−βに関して上記に記載したと同様の方法でプロセッシグされると予測される［ジェントリーら；デルニックら、上掲］。
【０１３２】
実施例ＩＸ
　発現ＢＭＰ蛋白の生物学的活性
　上記の実施例ＶＩＩおよびＶＩＩＩで得た発現ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７蛋白の生物学的活性測定のために、ＢＭＰ蛋白を培養培地から回収し、共産生した蛋白質性物質および他の汚染物質からＢＭＰ蛋白を分離精製する。蛋白はヘパリンセファローズカラム上で一部精製し、当業者に公知の標準的精製技術を用いてさらに精製する。
【０１３３】
　例えば、培養物から集めた形質導入後調整培地上清を、ＹＭ１０膜上限外濾過により約１０倍に濃縮しついで、２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（出発緩衝液）に対して透析する。ついでこの物質を出発緩衝液中ヘパリンセファローズカラムにかける。非吸着蛋白を出発緩衝液で洗浄して除去し、吸着蛋白は、本発明の蛋白を含んでおり、２０ｍＭトリス、２．０Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄して脱着する。ヘパリンカラムにより吸着された蛋白は、例えば、セントリコン１０で約１０倍に濃縮し、および例えば０．１％トリフルオロ酢酸による透析濾過により塩を減少させる。得られた溶液の適当量をラットマトリックス２０ｍｇと混合し、ついでインビボの骨および／または軟骨形成活性につき、ローゼン修正サムパス−レッジ測定法により測定する。模擬形質導入上清画分を対照として使用する。
【０１３４】
　調製用ＮａＤｏｄＳＯ４／ＰＡＧＥによりさらに精製を行うことができる［エムリ、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）第２２７巻第６８０−６８５頁（１９７０年）］。例えば蛋白約３００μｇを厚さ１．５ｍｍ、１５％ゲルに適用し、上記と同様にヘパリン−セファローズ上で精製したＬ−［３５Ｓ］メチオニン−標識ＢＭＰ蛋白を添加することにより回収が可能である。蛋白は隣接するレーンの銅染色により可視化できる［リーら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）第１６６巻第３０８−３１２頁（１９８７年）］。適当なバンドを削り取り、０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４／２０ｍＭ　トリス、ｐＨ８．０にて抽出する。上清を１０％ＣＦ３ＣＯＯＨを用いてｐＨ３に酸性化することができ、蛋白は５．０ｘ０．４６ｃｍ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ４　カラム上で脱塩し（ザ・セパレーション・グループ、ヘスペリア、カリホルニア）、０．１％ＣＦ３ＣＯＯＨから９０％アセトニトリル／０．１％ＣＦ３ＣＯＯＨの傾斜溶媒にて展開する。
【０１３５】
　本発明のひとＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７の特定量を付加したラットマトリックスを含む移植組織をおよそ７日後除去し、発生学的評価を行う。各移植組織からの代表的切片について、ホン・コサおよび酸性フクシンを用いて新しい骨ミネラル部分を染色し、トルイジンブルーを用いて軟骨に該当するマトリックス形成の部分を染色する。切片内に存在する細胞の型およびこれらの細胞が表現型を示す程度につき評価し、実施例ＩＩＩ中に記載と同様に数字で示した。
【０１３６】
　活性度は宿主細胞抽出物により試験することもできる。精製はすべての緩衝液に尿素６Ｍを含ませる以外は上記と同様の方法で行う。
【０１３７】
　前記の説明は本発明の好ましい具体例を詳細に述べたものである。実際には、これらの記載を検討することにより当業者に多くの修正および変更が想起されることが予測される。これらの修正および変更はここに付した請求の範囲内に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３８】
　本発明の蛋白質およびそれを含む医薬組成物は、優れた軟骨および／または硬骨形成誘導能力を有するので、硬骨および／または軟骨形成の誘導、創傷治癒および組織修復等に使用され得る。本発明の蛋白質およびそれを含む医薬組成物は特に再生医療の分野に有用である。