(57)【要約】【課題】本発明は、Ｓ．タイフィ菌の無毒性は生物よりなる脊椎動物又は無脊椎動物の免疫化するための免疫原性組成を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、Ｓ．タイフィ菌の無毒性は生物よりなる脊椎動物又は無脊椎動物の免疫化するための免疫原性組成を提供する。その派生物はｃｙａ及び／又はｃｒｐ及び／又はｃｄｔ遺伝子を有する。本発明は病原に対する免疫応答を誘発することができる高原を生産する脊椎動物又は無脊椎動物の該病原から派生される組換え遺伝子を発現することができる上記種類の無毒性派生物よりなる該脊椎動物又は無脊椎動物の免疫化のための免疫原性組成を提供する。本発明の他の実施例は免疫原性組成をこれらの菌株から精製する方法、及び免疫原性組成の適用によるＳ．タイフィの免疫原性抗原に応答する免疫系を刺激する方法だけではなく、免疫原性組成の精製に役に立つ菌株を含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルモネラの毒性を制御し、菌株の深い組織に定着する能力を減ずる、ｃｄｔ遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの分離された無毒性菌株であって、該菌株は個体の免疫化に有用で、それによって、該菌株は該個体に対する病原性因子から派生された組換え遺伝子を発現可能であり、該組換え遺伝子の産物は、該病原体に対して該個体である脊椎動物において免疫反応を誘発することができる抗原であることを特徴とする無毒性菌株。
【請求項２】
該サルモネラは、致死の染色体遺伝子の突然変異を有し、さらに染色体遺伝子の突然変異は、平衡型で致死の宿主ベクター系を構成するために致死遺伝子の突然変異を補って完全にする、ベクターが生成する遺伝子によって平衡化される染色体遺伝子の突然変異であることを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
該菌株の細胞は：
ａ）ベータ−アスパーテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｅｔａ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ａｓｄ）をコード化し、機能する本来から固有の染色体遺伝子を欠き；
ｂ）染色体のａｓｄ遺伝子の突然変異を補って完全にするが、組換えによって欠陥性の染色体遺伝子の置換を成し得ない、機能的なＡｓｄのポリペプチドをコード化する組換え遺伝子を現に有し；
ｃ）機能的なＡｓｄのポリペプチドをコード化する組換え遺伝子と免疫原性抗原との間の物理的連鎖を有し、機能的なＡｓｄのポリペプチドの欠乏が、前記菌株の細胞を溶解させる環境に該細胞がある場合に、機能的なＡｓｄのポリペプチドをコード化する組換え遺伝子の欠損は、該細胞を溶解させる、
ことを特徴とする請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
Ｓ．タイフィの菌株、χ４０７３、χ４３４６及びχ４４１７並びにその派生物の菌株から構成されるグループから選択された分離されたＳ．タイフィの菌株。
【請求項５】
サルモネラの毒性を制御し、サルモネラの無毒性派生物の深い組織に定着する能力を減ずる、ｃｄｔ遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの無毒性派生物からなる個体を免疫化する免疫原性因子。
【請求項６】
該無毒性派生物は、前記病原体に対して前記個体である脊椎動物において免疫反応を誘発することができる抗原を生産するために、前記個体に対する病原性因子から派生された組換え遺伝子を発現できることを特徴とする請求項５に記載の個体を免疫化する免疫原性因子。
【請求項７】
該無毒性派生物はｃｒｐ遺伝子における突然変異を有することを特徴とする請求項５に記載の免疫原性因子。
【請求項８】
該無毒性派生物はｃｙａ遺伝子における突然変異を有することを特徴とする請求項５に記載の免疫原性因子。
【請求項９】
該無毒性派生物はｃｙａ遺伝子における突然変異をも有することを特徴とする請求項７に記載の免疫原性因子。
【請求項１０】
ワクチンが個体に投与された際に病原体の免疫原性抗原に反応するために該個体の免疫系を刺激することが可能なワクチンの生産のための請求項５に記載の免疫原性因子の使用。
【請求項１１】
ワクチンが個体に投与された際にＳ．タイフィの免疫原性抗原に反応するために該個体の免疫系を刺激することが可能なワクチンの生産のための請求項５に記載の免疫原性因子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は無毒性微生物、それらの精製方法及びそれらのワクチンにおける使用に関する。特に、これは無毒性Ｓ．タイフィに関する。
【背景技術】
【０００２】
チフス菌によって引き起こされる腸チフスは、低開発国の住民、工業国から風土性地域を訪れた旅行者、及び熟達試験を実行する研究所の臨床微生物学者に対する重要な大衆健康問題として残っている。現在認可されている腸管外で殺された全ての細胞の腸チフスのワクチンは防御するが許容させ得ない高い頻度でマークされた全身系のそして局所副作用を引き起こす（プロットキンＳＡ，モーティマーＥＡ  Ｊｒ．（ｅｄｓ）におけるレビン、腸チフスワクチン：ワクチン。フィラデルフィフ、ＷＢサウンダース、１９８８年、３３３乃至３６１頁）。代替ワクチンには最近認可された経口的生ワクチン菌株Ｔｙ２１ａ及び実験に基づく腸管外のＶｉ多糖ワクチンが含まれている。
【０００３】
経口的ワクチンの利点は局所応答が最大に刺激される粘膜免疫系への複製生体の導出である。更に、弱毒性腸チフス菌が外来性抗体を発現するキャリアワクチンとして作用しそれらを人間免疫系に導出する誘因候補である。しかし、このアプローチを人間を免疫化するために成功するように使用するための臨界前要件は免疫系へ外来性タンパク質及び多糖抗原を導出するために高度に免疫原性であり未だ安全な腸チフス菌の弱毒性菌株を存在せしめることである。
【０００４】
Ｔｙ２１ａに基づく最近の経口的ワクチンは種々の欠点を有する。Ｔｙ２１ａは比較的低い免疫原性のものであり免疫化のために多数回の経口的投与が必要となる。成育可能な生体の産出はそれが大規模に発酵し凍結乾燥されたときに低い。更に、Ｔｙ２１ａは不確定なままのｑａ１Ｅ及びｖｉａに加えて多数回の突然変異を有する。（ホーン他、（１９８７），Ｊ．インフェクト．ディス．１５６：１６７−１７４；ホーン他、（１９８８），Ｊ．インフェクト．イミュン．５６：１３２６−１３３３）。
【０００５】
ソネ赤痢菌（フォーマル他、（１９８１），インフェクト．ニミュン．３４：７６４−７５０）のＯ抗原又はコレラ菌０１抗原型イナバ（フォレスト他、（１９８９），Ｊ．インフェクト．ディス．１５９：１４５−１４６）のＯ抗原をイクスプレッシングするＴｙ２１ａの構成物は人間における臨床試験を受けている。北米ボランティアにおいて試験されたＴｙ２１ａ／Ｓ．ソネ構成物の２ロットが病原性のＳ．ソネを用いた実験による挑戦に対する有意な防御を提供し、そこにはロットからロットへの変化があり他のロットは防御的であった（ブラック他、Ｊ．インフェクト．ディス．（１９８７），１５５：１２６０−１６２７；ヘリングトン他（１９９０），ワクチン８：３５３−３５７）。Ｔｙ２１ａ／イナバ構成物はワクチンの少数のみで及び低力価で血清イナバビブリオサイダル抗体及び腸ＳＩｇＡ抗イナバＯ抗体を誘発した（タケット他、（１９９０），インフェクト．ニミュン．１６２０−１６２７）。病原性Ｖ．コレラエ０１を用いた実験による挑戦研究において、構成物の宿主は下痢に対して全体に渡って有意的に防御されなかったが、穏やかな下痢を有し、より少ない野性Ｖ．コレラエ細胞（タケット他，Ｉｄ．）をシェドした。
【０００６】
候補キュリア菌株としてのＴｙ２１ａの使用の欠点はその制限された免疫原性、そのアテニュエイションの分子ベース上での正確な情報の欠如及びその菌株（例えば、トランスフォーメーション、エレクトロポレーション、及び組み換え頻度において）の細菌遺伝子手技における実施上の困難さを含む。それは又凍結乾燥培養の再構成の後の非常に乏しい生存度を示している。
【０００７】
本出願人は無毒性に通ずる障害が食餌によって又は動物宿主によって供給されるあらゆるものによっても回復され得ない毒性因子のトランスポゾン誘発された無毒性突然変異株を使用したワクチンを用いた有毒感染に対する防御の新たな方法を開示した。ネズミチフス菌のアデニル酸シクラーゼ遺伝子（ｃｙａ）及び環状ＡＭＰ受容タンパク質遺伝子（ｃｒｐ）における遺伝子欠失突然変異の導入による無毒性微生物を製造する方法を含む出願人の最初の研究の内のいくつかがＥＰＯ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．３１５，６８２（１９８９年５月１７日に公表された）、及びＰＣＴ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．８８／０９６６９（１９８８年１２月１５日に公表された）に述べられている。出願人は又、組み換え抗原の発現のためのキャリア細胞として所望される無毒性突然変異型細胞の他の種類の生産の方法を提供した。これらの細胞は酵素が本質的な細胞壁構造成分の生合成における過程に触媒作用を及ぼす細胞生存のために本質的な酵素を符号化する機能擦る自生遺伝子の欠如及び最初の組み換え遺伝子が欠損染色体遺伝子を置換することができない自生酵素のための機能置換である酵素を符号化する最初の組み換え遺伝子の存在によって特徴付けられる。これらの細胞に最初の組み換え遺伝子は構造的に所望の産物を符号化する２番目の組み換え遺伝子に連鎖されている。最初の組み換え遺伝子の損失は細胞を溶解させる。これらの方法は特許文献１に記載されている。上記の特許出願の開示は、あらゆる対応する国家特許出願と同様に、引用によってここで合体される。
【特許文献１】ＷＯ  ８９／０３４２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、幾分、ＥＰＯ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．３１５，６８２に開示されていない新たな無毒性Ｓ．タイフィ派生物に基づく。本発明にはこれらの新たなＳ．タイフィ派生物の出願が、特に、商業ワクチン、Ｓ．タイフィの免疫原性抗原に応答する免疫系を刺激する方法、及び病原の免疫原性抗原に応答する免疫系を刺激する方法において、含まれる。ここで提供される菌株はＳ．タイフィによって引き起こされる病気を防止するための商業ワクチン、及びその抗体を用いてＳ．タイフィが交叉反応する他の腸の細菌の生産に直接的及び関節的に適当である。これらの菌株は又細菌細胞において組み換え遺伝子上で符号化された発現産物の生産のためのキャリア微生物として役に立つ。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明の一実施例は生理学的に許容される賦形剤において、ｃｙａ遺伝子における突然変異を用いたチフス菌（Ｓ．タイフィ）の無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。
【００１０】
本発明の他の実施例はｃｙａ遺伝子における突然変異を用いた分離されたＳ．タイフィの無毒性菌株である。
【００１１】
本発明の更に他の実施例はｃｒｐ遺伝子における突然変異を用いたＳ．タイフィの無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。
【００１２】
本発明の更に他の実施例はｃｒｐ遺伝子における突然変異を用いたＳ．タイフィの分離された無毒性菌株である。
【００１３】
本発明のその他の実施例はＳ．タイフィの無毒性派生物、ｃｙａ遺伝子における突然変異及びｃｒｐ遺伝子における突然変異を用いた該派生物である。
【００１４】
本発明の更に他の実施例はｃｙａ遺伝子及びｃｒｐ遺伝子における突然変異を用いたＳ．タイフィの分離された無毒性菌株である。
【００１５】
本発明の更に他の実施例はｃｄｔ遺伝子における突然変異を用いたサルモネラの無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。
【００１６】
本発明のその他の実施例はｃｄｔ遺伝子における突然変異を含むサルモネラの分離された無毒性派生物である。
【００１７】
本発明の更に他の実施例は菌株χ３９５８，χ４３２３，χ３９２６，χ３９２７，χ４２９７，χ４３４６，χ３９４０，χ４０７３及びその派生物のグループから選択された分離された菌株である。
【００１８】
本発明のその他の実施例はｃｙａ遺伝子における突然変異よりなる無毒性のＳ．タイフィの菌株を利用する方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。
【００１９】
本発明の更に他の実施例はｃｒｐ遺伝子における突然変異よりなる無毒性Ｓ．タイフィの菌株の利用方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。
【００２０】
本発明の更に他の実施例はｃｄｔ遺伝子における突然変異よりなる無毒性サルモネラの菌株の利用方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。
【００２１】
本発明の他の実施例はｃｄｔ突然変異株であるＳ．タイフィの分離された菌株である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
まず、図面を簡単に説明する。
【００２３】
図１Ａはχ３６３３（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の９ｘ１０8ＣＦＵ、χ３７３７（ｐＳＤ１１０+／Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の１ｘ１０9及びχ３３３９（自生型）の１ｘ１０9ＣＦＵを用いた経口接種の後スペシファイされた回数の生後８周間ＢＡＬＢ／ｃマウスのペヤーズパッチからのＣＦＵの回復を示すグラフである。３匹のマウスが各時点で犠牲になった。幾何平均±標準偏差として与えられる。
【００２４】
図１Ｂはχ３６３３（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の９ｘ１０8ＣＦＵ、χ３７３７（ｐＳＤ１１０+／Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の１ｘ１０9及びχ３３３９（自生型）の１ｘ１０9ＣＦＵを用いた経口接種の後スペシファイされた回数の生後８周間ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの脾臓からのＣＦＵの回復を示すグラフである。３匹のマウスが各時点で犠牲になった。幾何平均±標準偏差として与えられる。
【００２５】
図２はｐＹＡ１０７７部分限定マップである。λｇｔ１１クローンＬ１４からの１．０ｋｂ  Ｍ．レプラエ挿入ＤＮＡ片がｐＹＡ２９２内のＥｃｏＲＩ部位にサブクローンされた。Ｍ．ラプラエ挿入ＤＮＡ内に単一非対照ＳａｌＩ部位がある。下記のエンドヌクレアーゼ：ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，及びＸｂａＩに関するＭ．ラプラエ挿入ＤＮＡ内には部位がない。
【００２６】
図３はＳ．タイフィ、Ｓ．タイフィムリウム及びｐＹＡ１０７７及びｐＹＡ１０７８をハーバーするＥ．コリ菌株によって生産されるタンパク質のウェスタンブロットを示すハーフトーン再生である。ニトロセルロースフィルタ上のそのタンパク質は２１らい腫らい患者からのプールされた血清を用いて反応された。レーン１，分子サイズマーカー（サイズはブロットの左へ示されている）；レーン２，ｐＹＡ２９２を用いてＳ．タイフィχ４２９７によってスペシファイされたタンパク質；レーン３乃至５，各々がｐＹＡ１０７８を含む３つの独立Ｓ．タイフィχ４２９７隔離集団によってスペシファイされたタンパク質；レーン６乃至８，各々がｐＹＡ１０７７を含むＳ．タイフィχ４２９７隔離集団の３つの独立隔離集団によってスペシファイされたタンパク質；レーン９，ｐＹＡ１０７７を用いてＳ．タイフィムリウムχ４０７２によってスペシファイされたタンパク質；レーン１０，ｐＹＡ１０７５（それがｐＹＡ１０７７においてそうであるようにラクＺプロモータの血縁である同じ指向におけるλｇｔ１１クローンＬ１４からの１．０ｋｂ  Ｍ．ラプラエＤＮＡ挿入を含むｐＵＣ８−２派生物）を用いてＳ．タイフィムリウムによってスペシファイされたタンパク質。注：それがβガラクトシダーゼのアルファー領域を用いた融合タンパク質であるためｐＹＡ１０７５によってスペシファイされた免疫反応性タンパク質はｐＹＡ１０７７によってスペシファイされたものよりも僅かに大きい。
【００２７】
図４はλｇｔ１１：：Ｍ．ラプラエクローンＬ１４及びＳ．タイフィ、ｐＹＡ２９２，ｐＹＡ１０７７及びｐＹＡ１０７８をハーバーしているＳ．タイフィムリウム及びＥ．コリ菌株によって生産されたウェスタンブロットを示すハーフトーン再生である。
【００２８】
図５は人間血清における３７°ＣでのＳ．タイフィＴｙ２及びＩＳＰ１８２０の自生及び野性菌株の成長を示すグラフである。
【００２９】
本発明はある突然変異が実質的にその免疫原性に影響を及ぼさずに微生物を無毒性にし得るという発見に基づいている。特に、この発明は微生物が夫々アデニル酸シクラーゼ（ＡＴＰピロフォスフェートリアーゼ（環化する）ＥＣ４．６．１．１）及び環状ＡＭＰ受容タンパク質（ＣＲＰ）を合成する能力を除去する遺伝子欠失（オープントライアングル又はデルタ）突然変異Δｃｙａ及び／又はΔｃｒｐをキャリーする微生物ワクチンに関する。
【００３０】
環状−３’５’−ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）及び環状ＡＭＰ受容タンパク質は大量のカタボリティーの輸送及び衰弱に関する大量の遺伝子及びオペロンの転写に必要である。燃料／炭素源を輸送するために使用される系が全て、いくつかのアミノ酸透過酵素であることから、ｃＡＭＰろによる正制御の下にあるということを示す証拠が提供された。異化におけるその非常に重要な役割に加えて、細胞におけるｃＡＭＰ濃縮は又温度ファージ、フィムブリエの合成、べん毛の合成及び少なくとも一つの外膜タンパク質の合成による溶原化に影響を及ぼす。ｃＡＭＰは哺乳類細胞内に存するが、大食細胞及びサルモネラが侵入及び増殖し得る他の細胞内に存するその濃縮は野性型表現型インビトロを表すΔｃｙａ突然変異株を許容するのに必要な０．１乃至１．０ｍＭ  ｃＡＭＰの濃縮以下である。更に、Δｃｒｐ突然変異の包含は、本質的にそのようなΔｃｙａ突然変異株によるｃＡＭＰインビトロ又はインビボの理解から生ずるであろういかなる恩恵をも廃止するであろう。
【００３１】
突然変異のＳ．タイフィのｃｙａ及びｃｒｐへの導入は、他のサルモネラ菌株からＳ．タイフィへの突然変異の移入のために、トランスポゾンの使用によって完成され得る。トランスポゾンは細菌染色体へ多くの点において付加され得る。トランスポゾン挿入及び遺伝子欠失の特徴はクロックナー他（１９７７）、モル．ボイル．１１６：１２５において再調査された。例えば、テトラサイクリンへ耐性（及びフザリク酸に感受性を）与えるトランスポゾンＴｎ１０はΔｃｙａ及びΔｃｒｐ突然変異を、例えばＥ．コリ及びＳ．タイフィムリウムを含む様々な細菌種において製造するのに使用され得る。Ｓ．タイフィムリウムにおいてこれらの突然変異株を製造及び検出する方法はＥＰＯ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．３１５，６８２に記載されており、方法は又後にＴｎ１０を使用する例にて提供する、これらの突然変異は好ましくは高度に病原性であるＳ．タイフィの様々な隔離集団へ転位され得る。Ｓ．タイフィムリウムから野性型Ｓ．タイフィ菌株へのΔｃｙａ及びΔｃｒｐ突然変異の転移の例は後に例にて示す。
【００３２】
Δｃｙａ及び／又はΔｃｒｐ突然変異の導入によって一旦無毒性となったら、その微生物はその微生物に対する免疫を誘発するワクチンの免疫原性成分として役に立つ。
【００３３】
本発明の他の実施例において、ｃｙａ突然変異株及び／又はｃｒｐ突然変異株であるＳ．タイフィは、好ましくは遺伝子欠失によって、サルモネラの毒性を調節する、ｃｒｐ遺伝子の付近の遺伝子において、突然変異される。この遺伝子，ｃｄｔ遺伝子における突然変異は、例えば脾臓のような深い組織に効果的に定着する細菌の能力を減少させる。ｃｒｐ+遺伝子を有する核外遺伝子がΔ（ｃｒｐ−ｃｄｔ）を用いて菌株内に配置された際、それはその無毒性及び免疫原性を保有しよってｃｙａ及びｃｒｐ突然変異株と同様の表現型を有する。核外遺伝子上にｃｒｐ+遺伝子を含むΔ（ｃｒｐ−ｃｄｔ）突然変異を用いた突然変異株は腸道及びＧＡＬＴに定着する通常の能力を保有するが、より深い組織に定着する減少された能力を有する。その例においては、元のΔ（ｃｒｐ−ｃｄｔ）突然変異はχ３６２２において分離されアルギニン及びシステインの成長のための要求を課するａｒｇＤ及びｃｙｓＧ遺伝子を削除した；この突然変異株対立遺伝子はΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−１０と名付けられた。アルギニン要求を課さなかったより短い遺伝子欠失を含む第２の突然変異株が分離された；これはχ３９３１内に存しΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−１４と名付けられた。Ｓ．タイフィにおけるｃｄｔにおける突然変異は直接製造され得るとともに例に示されたようなＳ．タイフィムリウム菌株からの転位を介して導入され得る。更に、ｃｄｔ突然変異は知られた技術、及びここに記載された特徴を使用した表現型選択を使用してサルモネラの他の菌株において製造され得る；代わりに、Δｃｄｔ突然変異が例に記載されたＳ．タイフィムリウムから他のサルモネラの菌株へ知られた技術であるトランスポゾン突然変異誘発の技術を使用して転位され得る。
【００３４】
本発明の更に他の実施例において病原性Ｓ．タイフィの無毒性派生物がＧＡＬＴ，例えば回腸のペヤーズパッチへ選択された抗原を送出するキャリア細菌として使用され得る。サルモネラはペヤーズパッチ（カーター、Ｐ．Ｂ．及びＦ．Ｍ．コリンズ、Ｊ．イクスプ．メド．１３９：１１８９（１９７４））へ帰ることが知られている。Ｓ．タイフィムリウム−Ｅ．コリ雑種が又マウスにおいてペヤーズパッチを定着させることが示された（ハーマン、Ａ．Ｗ．他、インフェクト．及びイミュン．２２：７６３（１９７８））。もしこれらのキャリア細菌が病原性生体からの組み換え遺伝子を含み発現すると、その病原から説明生産された抗原遺伝子産物に対する抗原が誘発される。組み換えＤＮＡ遺伝子技術の出現によって、特異性抗原が生産されるユニークワクチンを総合的に発生させることが、病因因子によってではなく、その抗原に関して遺伝子を発現することができる細菌の他の宿主菌株によって、今可能となっている。抗原が哺乳類の宿主の抗原を用いて交叉反応しよって自己免疫の誘発を相乗作用する可能性があるとき、その遺伝子を変更する組み換え遺伝子技術を使用することが又可能でありその結果影響を及ぼす交叉反応抗原決定郡は生産されない。よって、組み換えＤＮＡ技術は脊椎動物宿主を用いた交叉反応をなし得る又は自己免疫状態を誘発し得るいかなる物質も有しないワクチンの発生のために使用され得る。
【００３５】
生体、特にキャリア細菌として機能し得るサルモネラを準備する方法は、ＷＯ  ８９／０３４２７（１９８９年４月２０日発行）にて記載され、米国シリアルナンバー０７／２５１，３０４において、１９８８年１０月３日に出願され、それは共通に所有されている。これらの引例の双方はここで引用によって合体される。一般に、サルモネラは、その酵素が重要な細胞壁構造成分の生合成において過程に触媒作用を及ぼす、細胞生存に重要な酵素を符号化する染色体遺伝子において突然変異を引き起こすとみなされている。染色体外の遺伝的要素、例えば組み換えベクターは突然変異株細胞に導入される。この遺伝的要素は自生酵素に関する機能的な置換である酵素を符号かする第１の組み換え遺伝子を含むが、その第１の組み換え遺伝子は欠損染色体遺伝子を置換し得ない。第１の組み換え遺伝子は構造的に所望の産物を符号化する第２の組み換え遺伝子に連鎖されており、それはキャリア微生物において発現されるべきものである。第１の組み換え遺伝子の喪失はその細胞が第１の組み換え遺伝子の発現による産物が欠けている環境にあるときその細胞を溶解させる。
【００３６】
重要な細胞壁構造成分の生合成において過程に触媒作用を及ぼす、細胞生存に重要な酵素を符号化する遺伝子の数は、例えばａｓｄ遺伝子によって符号化されるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（Ａｓｄ）に関する技術において知られている。Ｓ．タイフィ利用トランスポゾン突然変異生成のａｓｄ遺伝子において遺伝子欠損突然変異を導入する方法が例に示されている。無毒性キャリアＳ．タイフィにおいて発現されるべき抗原を符号化する遺伝子に連鎖された、ａｓｄ遺伝子に関する機能的置換をキャリーする遺伝的要素の構造が又例に示されている。
【００３７】
本発明が局所免疫が重要でありかつ防御の第１線となる可能性のある細菌、菌類、寄生生物、又はウイルス病因子に対する効果的なワクチンの開発に広く適用できることは明らかである。いくつかの例はトラコーナクラミジアによって引き起こされる眼の伝染病のみではなくペスト菌によって引き起こされる肺ペスト、淋菌によって引き起こされる淋病、梅毒トリポネーマによって引き起こされる梅毒、及び性病の制御に関するワクチンである。咽喉炎又は心臓病を引き起こす種のような、グループＡ及びグループＢの双方からの連鎖状球菌、骨膜炎菌、肺炎マイコプラスマ、インフルエンザ菌、百日咳菌、ヒト型結核菌、らい菌、ボルデテラアビウム、大腸菌、連鎖球菌エキ、肺炎球菌、ウシ流産菌、パスツレラヘモリティカ、コレラ菌、赤痢菌種、及びレジュネラニューモフィラ菌がそれらから遺伝子から得られる本発明の範囲内の細菌の更なる例である。インフルエンザウイルスに対して生産されているようなウイルスワクチンは又本発明によって包含される。ウイルスワクチンは又、例えばパポウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、ミクソウイルス、パラミクソウイルス、又はレトロウイルス綱からの他のウイルス、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスの夫々に対しても製造され得る。病原性菌類、原生動物、及び寄生生物による伝染病に対して防御するワクチンは又本発明によって熟慮される。
【００３８】
更なる実施例において、ワクチンの免疫原性成分が宿主のアレルゲンであるときそのようなワクチンはアレルギーの宿主を特別に知覚鈍麻させるように設計されたエクスポージャー養生において使用され得る。
【００３９】
その実施例の一つにおいて、本発明は病原性微生物の生無毒性派生物を含む脊椎動物又は無脊椎動物の免疫化のためのワクチンとして説明し得、該派生物は機能的なアデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰ受容タンパク質を生産し得ず該動物の病原である又は該動物のアレルゲンを生産する生体から派生される組み換え遺伝子を発現し得る。
【００４０】
更に他の実施例において本発明の無毒性微生物は様々な宿主タンパク質の合成のためのベクターとして使用し得る。本発明の無毒性微生物は宿主への導入の後にＧＡＬＴ，腸管膜リンパ腺及び脾臓を含む様々な免疫担当構造をトラバースし得るため、そのような細菌は様々な免疫抑制産物をターゲットするために使用され得る。よって、免疫抑制タンパク質又はペプチドを符号化する一又はそれ以上の遺伝子がその微生物がテイクアップしたときに適当な免疫担当組織における滞留が宿主における免疫応答を抑圧、促進又は一時的変位させる組み換え産物をイクスプレッシングし得るような無毒性微生物へ組み換えで導入し得る。免疫抑制分子の例は、コロニー刺激因子（大食細胞、顆粒細胞、又は混合された），マクロファージケモトキシン、マクロファージ抑制因子、白血球抑制因子、リンフォトキシン、芽球化因子、インターフェロン、及びインターロイキンを含むがしかしそれに限定されない。
【００４１】
本発明の更に他の実施例はここで熟慮された無毒性微生物の様々な生理学上の機能（即ち、成長率、血圧、他）を刺激又は抑制する可能性のある薬物学的活動性産物の送出及び生産のための使用である。
【００４２】
上記の全てを熟慮する実施例において、本発明の主題はｃｙａ及び／又はｃｒｐ遺伝子における突然変異をキャリーするＳ．タイフィの無毒性菌株である。
【００４３】
ｃｄｔにおける突然変異株、及び／又はキャリア微生物における突然変異株をも含むＳ．タイフィのｃｙａ及び／又はｃｒｐ突然変異株の製造は他の知られた技術を使用して又完成され得る。これらの技術は例えば突然変異生成の標準技術及び／又は組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。所望の突然変異株が表現型特徴に基づいて選択され、それらのいくつかは例において後に述べ、それらは表８に示される。本発明のこれらの実施例における各々の用語は下記の記載によって分析される。
【００４４】
免疫原性因子によって、免疫系の一又はそれ以上の機能が増加され免疫原性因子に差し向けられるように、生きた生体の免疫系を刺激するために使用される因子が意味される。免疫原性因子はワクチンを含む。免疫原性因子は、知られた技術を使用して、分離された多クローン性抗体及び単クローン性抗体の夫々の抗体の生産に使用され得る。
【００４５】
ワクチンによって将来の害に対する防御が提供されるように生きた生体の免疫系を刺激するために使用される因子が意味される。免疫化はＴリンパ球を殺しかつ又他の細胞（例えば食細胞）を生体内でそうさせるように活性化し得、生体がそれまでに作用を受けた病原又は抗原に対して差し向けられる連続したハイレベルの抗体及び／又は細胞性免疫応答を誘発する過程を呼ぶ。「免疫系」という語は異物の存在への単細胞生体の反応、例えばインターフェロン生産を包含し得るが、本出願においてはその語はそれによって多細胞が生体の細胞又は生体の細胞外液に侵入する抗原物質に対する抗体を生産する解剖学的特徴及び機構に限定される。そのように生産される抗体は、免疫グロブリンＡ，Ｄ，Ｅ，Ｇ，又はＭのような免疫綱のどれにでも属し得る。個別の興味のものであるのは、本発明のワクチンはＩｇＡ生産を刺激するものに限定されないが、これが温血動物の分泌系によって生産される免疫グロブリンの原理であることから免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の生産を刺激するワクチンである。例えば、ここで説明される自然のワクチンはＩｇＡ：〕形成、例えば細胞及び体液性免疫に加えて広い範囲の多の免疫応答を生産するようである。抗原に対する免疫応答は良く研究され広く報告されている。免疫学の調査はバレット、ジェイムス、Ｔ．免疫学の教科  書：第４版、Ｃ．Ｖ．モスビー会社、セントロウイス、ＭＯ（１９８３）において与えられ、その全ては引用によって合体される。
【００４６】
脊椎動物は脊椎動物亜門、魚類動物、両生類動物、爬虫類動物、鳥類動物、及び哺乳類動物を含むせき索動物門の一次門のどれでものメンバーであり、それらの全ては分節骨又は軟骨性脊柱によって特徴付けられる。全ての脊椎動物は機能的な免疫系を有し抗体の生産によって抗原に応答する。よって全の脊椎動物はワクチンに応答し得る。ワクチンは人間又は犬（狂犬病ワクチン）等の哺乳動物に非常に一般的に与えられているが、魚類動物及び鳥類動物等の商業的に飼養されている他の綱の脊椎動物に関するワクチンも、その種がここで説明されていれば、本発明の範囲内にある。
【００４７】
その脊椎動物を除いた動物界のどのようなメンバーも無脊椎動物である。そのような動物は無脊椎動物門を構成し背骨又は脊柱を有しない。この分類は魚類動物、両生類動物、爬虫類動物、鳥類動物及び哺乳類動物を除く全ての動物を含む。多くの無脊椎動物が抗原刺激への原子免疫応答をイリサイティングし得哺乳動物に感染させ本発明によってここで開示されている同じ微生物によって影響されやすい。そのような無脊椎動物の典型は甲殻類及びモルーセス及び他の関連動物である。無脊椎動物の防御におけるワクチンの使用はここまで良くは記載されていないが、等業者は本発明がそれらの原子免疫系の使用によって無脊椎動物にも適用可能であることを理解するであろう。例えば、及び本発明によって、甲殻類のサルモネラによる感染症に対する影響されやすさはサルモネラ種の無毒性菌株の導入を許容しそれらよって原子免疫系が応答するためのポテンシャルを提供するであろう。よって、無脊椎動物を感染させることができる病原性微生物の無毒性派生物の病原に対する該無脊椎動物に存する免疫系からの応答を刺激する使用は本発明の範囲内にある。
【００４８】
本発明のワクチンを用いて取り扱われる「個体」はここで全ての脊椎動物、例えば在来鳥類動物、特に農業的重要性のものを含む哺乳動物を含むものとして定義される。更に、軟体類及びある他の無脊椎動物が原子免疫系を有し「個体」に含まれる。
【００４９】
本発明の一実施例は病原又はアレルゲンに対する抗体応答に使用される遺伝子産物キャリアとしてのＧＡＬＴ又はＢＡＬＴに付着し、そこに侵入し、そこで生存する病原微生物の無毒性派生物の使用である。無毒性はその属又は種の微生物が病原としてもう機能し得ないということを意味するのではなく、使用されている個々の微生物が取り扱われている個々の動物に関して無毒であるということを意味する。その微生物は通常病原性であるが無毒性である菌株に属しているべきである属又は種にまで属している可能性がある。病原性によって病気を引き起こす又は通常の生理学的機能を損ない得る能力が意味される。無毒性菌株は通常その毒性病原性カウンターパートと組み合わされた病気の全組を含むことが出来ない。ここで使用されている微生物は細菌、原生動物、及び単細胞菌類を含む。
【００５０】
遺伝物質を第１の生体から通常遺伝物質を第１の生体を用いて交換しない第２の生体に転移する技術が急激に膨張する組み換えＤＮＡ技術の結果最近広く得られるようになった。本出願において、一生体から第２へ第２の生体の再生産が同じ遺伝物質を含むディセンデントを起こすように転移された遺伝物質が組み換え遺伝子と呼ばれる。用語遺伝子はここでどんな遺伝の生物単位をも表現するその最も広い意味において使用されている。組み換え遺伝子は親生体に存するような完全な遺伝子である必要はなく、それは高分子、例えば機能するポリペプチドの生産を生産し又は抑制することができた。その遺伝子は単に抗原産物の生産におけるガイドとして使用されるテンプレートとして役に立つことが必要である。その産物はその親生体におけるその正確な形において見出されなかったものの一つであってもよい。例えば、１００アミノ酸残基よりなるポリペプチド抗原に関して暗号づけする機能的遺伝子は７５のみ又は１００ものアミノ酸よりなるペプチドが宿主細胞の細胞機構によって生産されるように部分的にキャリア微生物に転移されてもよい。しかし、もしこの遺伝子産物が親生体に存する同様な抗原に対する抗体の形成を引き起こすであろう抗原である場合、その遺伝子は本発明において定義された用語遺伝子の範囲内にあると考えられる。その代わりに、もし個々の抗原のアミノ酸配列又はその破片が知られている場合、そのＤＮＡ片又はそのアナログをオートメイテッド遺伝子シンセサイザー又は同様のものによって化学的に合成し該ＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに導入することが可能である。そのスペクトルの他端においていくつかの遺伝子産物に関して暗号づけするＤＮＡの長い節があり、その一つ又は全てが抗原性である得る。よって、ここで定義され請求されているような遺伝子は抗原を生産し得る遺伝のどんな単位でもある。その遺伝子は染色体、核外遺伝子、又はウイルスオリジンのものである得る。
【００５１】
遺伝子を免疫応答の誘発において効果的にするために、その遺伝子は発現されなければならない。遺伝子の発現はその遺伝子の構造（ＤＮＡベースの配列）において固有の情報がＲＮＡ分子、ポリペプチド又は他の生物分子の形における物理的産物にその遺伝子が位置する細胞の生化学的機構によって形質転換するということを意味する。そのように生産された生物分子は遺伝子産物と称される。ここで使用されている用語遺伝子産物は遺伝子の制御の下で起きる生化学反応の結果生産されるどんな生物産物をも呼ぶ。遺伝子産物は、例えばＲＮＡ分子、ペプチド、又は酵素の制御の下で生産される産物又はその遺伝子の最初の産物、即ち代謝産物である他の分子であってもよい。例えば、遺伝子はその遺伝子が見出された元の細胞の外側の環境においてグリカンの形成を制御する酵素へリボソームの動作によって翻訳されるＲＮＡ分子の合成を最初に制御してもよい。そのＲＮＡ分子、酵素、及びグリカンはここで使用されている用語としての全ての遺伝子産物である。糖タンパク質及び多糖のような、多くの他種の遺伝子産物ばかりではなくこれらのどれも動物の免疫系に導入されたら抗原として作用する。糖タンパク質及びリポタンパク質を含むタンパク質遺伝子産物はワクチンにおける抗原として使用するのに好ましい遺伝子産物である。
【００５２】
ワクチンを抗原の生産において効果的にするために、抗原物質がワクチン接種された動物の抗原生産機能が活動し始めるように放出されなければならない。よって、その遺伝子産物の微生物キャリアはその動物に導入されなければならない。前述の如くＧＡＬＴ又はＢＡＬＴ細胞の好ましい応答を刺激するめたに、その微生物又は遺伝子産物の導入は、静脈、筋肉、皮下注射又は乳房内又は陰茎内又は膣内投与のようなワクチン投与の他の方法が可能であるが、経口投与、胃挿管法によって又はエアロゾルの形でのようにその腸又は気管支に直接導入されることが好ましい。
【００５３】
無毒性微生物がキャリア微生物として使用されととき、そして一旦そのキャリア微生物が動物内に存したとき、その抗原はその動物の免疫系で役に立つようになる必要がある。これはそのキャリア微生物がその抗原分子が放出されるように死ぬことによって完成される。もちろん、溶解無しにその周辺質の内容物を放出する「漏出」無毒性突然変異株の使用が又可能である。その代わりに、その細胞の死の前に外部環境へのそのキャリア細胞によって得ることができるようにされるであろう抗原の生産を制御する遺伝子が選択されてもよい。この方法においては、ワクチン接種された動物において、例えばそのペヤーズパッチにおいて生存しそして抗原を生産し続け、それによって連続的に抗体形成を誘発する生存可能な微生物を使用することが可能である。これらの環境の下の好ましい遺伝子産物は細胞膜を介して外部環境へ転移される産物又はその遺伝子産物の全てまたは部分がその環境に曝されるように外膜に付着又は埋設される産物である。この後者種の遺伝子産物の典型は通常それに対して防御が所望される生体の表面上で見出される抗原である。もしこれらの抗原が通常の方法で細胞表面に輸送された場合、その抗原に対する抗体形成が強化される。
【００５４】
抗原を他の病原からＧＡＬＴ又はＢＡＬＴへ送出するという病原の使用はもしそれが仮にそのような病原がペヤーズパッチ又はＢＡＬＴを定着させる能力の保有の間に無毒性とされ得るというような事実に関するものでは無い場合不適当となるであろう。
【００５５】
そこから組み換え遺伝子が派生する生体はワクチン接種されている動物のどんな病原であってもよく又その動物のアレルゲン又は他の抗原を生産した生体であってもよい。アレルゲンはアレルギー性反応を引き起こす物質であり、この場合それらに対してワクチン接種される動物におけるものである。動物のふけ及び花粉等の多数の異なる物質がアレルゲンとなり得、個々の動物のアレルギー性反応はどのような個々のアレルゲンに対するかによって異なる。通常アレルギー性反応を示す動物においてアレルゲンに対する寛容を誘発することが可能である。寛容を誘発する方法は良く知られておりそして一般に増加する供与量におけるその動物へのアレルゲンの投与よりなる。寛容誘発の更なる記載は前に引用したバレット教科書において与えられる。最後に宿主生体それ自体は他の薬物学的な活動物質に関する免疫抑制遺伝子がそのベクターによって発現されているときに遺伝物質の源として役に立つ。
【００５６】
上に開示された種の生ワクチンの動物への投与はどのような知られた又は標準の技術によってもよい。これらは経口摂取、胃挿管法、又は気管支−鼻−眼噴霧を含む。これらの全ての方法は生ワクチンがＧＡＬＴ又はＢＡＬＴ細胞に容易に到達し抗体形成を誘発することを許容し投与の好ましい方法である。静脈注射等のそのキャリア微生物がその動物の血流に到達することを許容する他の投与方法も許容され得る。静脈、筋肉、又は乳房内注射は本発明の他の実施例を用いて、後述する如くに又許容され得る。
【００５７】
投与の好ましい方法が経口摂取、エアロゾル噴霧及び胃挿管法であることから、好ましいキャリア微生物はワクチン接種されている動物の腸又はブロンキーのリンパ上皮構造のどれにでも付着し、侵入しそこで生存する種に属するものである。これらの菌株は腸病原性菌株の遺伝的操作によって生産される腸病原性菌株の無毒性派生物とするのに好ましい。ペヤーズパッチに付着し、侵入しそこで生存し、よって直接ＩｇＡの生産を刺激する菌株が最も好ましい。動物においてこれらはサルモネラの特定な菌株、及びペヤーズパッチへ帰るサルモネラ−Ｅ．コリ雑種を含む。
【００５８】
組み換えＤＮＡ技術は今十分に良く知られており日常の手順として考えられるように広く広まった。非常に一般的で広い用語において、この方法は、遺伝物質か又はより通常には遺伝物質の部分の、その転移された遺伝物質がそれが転移された先の生体の遺伝物質の一部となるように一生体から第２の生体への転移よりなる。これは通常最初の核外遺伝子又は親染色体のいずれかからの親生体からのＤＮＡの小さい破片の獲得よりなる。核外遺伝子（又は染色体外要素と称される）はその細胞の染色体から物理的に分離された遺伝単位である。ＤＮＡはどのようなサイズのものでもよくしばしば特定のベースペア部位においてＤＮＡ分子を分割するように作用する制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用によって得られる。組み換え分子を形成するための核外遺伝子、ファージ又はコスミッドベクターへの結さつに続きその組み換え分子はエレクトロポレーションを含む形質転換（外部環境からの裸のＤＮＡの取込みであり、それはカルシウムイオンのような様々な因子の存在によって人為的になされ得る）のような様々な手段によって宿主細胞に転移され得る。組み換えＤＮＡが形質導入ファージのようなファージ又はコスミッドベクター内でパッケージされる形質導入等の他の方法も又適用可能である。一旦組み換えＤＮＡがキャリア細胞内にあると、それは分離された破片（一般に完全な伝達された核外遺伝子の真）として存在し続け得るか又はそれは宿主細胞染色体へ挿入され細胞分裂の間のその染色体を用いて再生されて得る。
【００５９】
転移遺伝物質は相対的にまっすぐであるが、結果的にどの転移が発現された遺伝子に到るのかを予測することは未だに可能ではない。この選択過程は、しかし、本発明に対してどのような困難も与えない。宿主微生物が転移された遺伝子を発現しそれによって抗原を生産しなければならないことから、「ショットガン」アプローチがうまくゆく。抗体は所望の抗原、例えば病原微生物からの細胞膜の破片に対して標準の技術によって最初に生産される。その抗原の源である生体からのＤＮＡはエンドヌクレアーゼによって多数破片へ分割され、そしてその破片はランダムに病原抗原に対する抗体を用いたそれらの反応によって容易に確認し得病原から抗原を発現するキャリア微生物に挿入される。抗原イクスプレッシング微生物は選択され所望の組み換え生体を与えるためにクローンされ得る。ショットガンクローニングは良く知られており、マニチアティス、Ｔ．、他、分子クローニング、第２版、コールドスプリングハーバー研究所（１９８９）において詳述されており、それはここで引用によって合体される。遺伝子転移の技術は本発明の部分として考慮されず、無毒性微生物において発現される生体からの遺伝子よりなる組み換え生体を生産し得るどのような方法も十分である。
【００６０】
その種が通常遺伝情報を交換する場合接合、形質転換又は形質導入等の遺伝子転移のより古典的方法が使用され得る。
【００６１】
無毒性微生物の派生物は又本発明の範囲内にあると熟慮される。派生によって性的、無性的に派生される後代及び単一又は多数ベース置換、遺伝子欠失、挿入又は機能的アデニル酸シクラーゼ及び／又はｃＡＭＰ受容タンパク質及び／又はｃｄｔ遺伝子の発現の自然に発生する毒性核外遺伝子を用いた又は用いない生産に対する無能性を保有する逆位を含む無毒性菌株の突然変異株が意味される。例えば４０６２及び４０６４のような菌株はここで菌株をが従う経口接種を介して菌株に追随するための便利な標識として使用されてきたナリジクス酸耐性を与えるｇｙｒＡ突然変異をキャリーする。しかし、薬剤耐性はワクチンとして素養される菌株にとって望まれる属性ではない。よってｇｙｒＡ突然変異は野性型ｇｙｒＡ＋（ナリジクス酸に対する感受性を与える）の菌株への近接して連鎖されているＴｎ１０の遺伝に関する選択による形質導入そしてフザリク酸耐性に関する選択を用いてｇｙｒＡ-対立遺伝子をキャリーする親菌株上に増殖されたファージ溶解産物を用いた形質導入によるＴｎ１０の除去によって容易に除去され得る。
【００６２】
必要な供与量はその遺伝子産物の抗原性によって異なるであろうし単に存在するワクチンの免疫応答典型を誘発するのに十分な量であることが必要とされるであろう。日常の実験はその必要な量を容易に確立するであろう。多数倍の供与量が所望レベルの防御の提供に必要なように使用される。
【００６３】
製薬のキャリア又はそこでそのワクチンが懸濁又は溶解する賦形剤がどのような溶剤又は個体であり得又は接種された動物に対して無害でありキャリア生態又は抗原性遺伝子産物と適合する物質において包囲され得る。適当な製薬のキャリアが技術において知られており、例えば通常塩類液及び生理的濃度における又はそれに近い濃度における他の無害塩等の液体キャリア、及び滑石又はショ糖等のそして飼養又は農場動物へ又合体され得る個体キャリアを含む。望ましければアジュバントを抗原性の増強のために付加され得る。気管支を介した投与に使用されるとき、ワクチンはエアロゾルの形であることが望ましい。適当な製薬キャリア及びアジュバント及び供与様式の準備が、例えばレミングトンの製薬化学、第１７版、（ゲナロ、Ｅｄ．，マック出版会社、イーストン、ペンシルバニア、１９８５）に説明されている。
【００６４】
病原派生遺伝子産物を用いた免疫化は又は病原からの組み換え遺伝子によってスペシファイされた遺伝子産物を発現するキャリアとして作用する病原微生物の無毒性派生物を用いた前の免疫化に関連して使用され得る。そのような腸管外免疫化はその病原派生遺伝子産物に対する分泌免疫系がＧＡＬＴ又はＢＡＬＴのリンパ系細胞を刺激するためのその病原派生遺伝子産物をイクスプレッシングするキャリア細胞を用いた免疫化によってプライムされるやいなや分泌免疫応答の発現を増強するブースターとして役に立ち得る。その増強された応答は第２の、ブースター、又は既住応答として知られその結果宿主の延長された免疫防御がなされる。ブースター免疫化は有益な結果と共に多数回繰り返され得る。
【００６５】
上記の開示は本発明の概略を説明する。引き続くここに単に例証の目的で提供され特記されない限り限定が意図されない特定例の参照によってより完全な理解が得られ得る。
【実施例】
【００６６】
例１
本例はｃＡＭＰ合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入による無毒性細菌の分離及び利用及び表現型の安定、完全無毒性及び高免疫原性を与える突然変異を用いた菌株の確認を説明する。
【００６７】
細菌菌株。大腸菌及びネズミチフス菌菌株が表１．Ａ．及びＢ．に記載される。それらは５％グリセロールを含む１％バクト−ペプトン内に懸濁され−７０°Ｃでデュープリケートにおいて貯蔵のためにドライアイス−エタノールで高速凍結され更に又通常使用のために−２０°Ｃて貯蔵するために５０％グリセノールを含む１％バクト−ペプトン内で懸濁される凍結培養として保存された。
【００６８】
培地。通常培養のための複合培地はＬ肉汁（レノックス、ウイルス学  １：１９０−２０６，（１９６５））及びルリア肉汁（ルリア及びブロウス、Ｊ．バクテリオル．７４：４６１−４７６，（１９５７））であった。ディフコ寒天がルリア肉汁にベース寒天に関して１．２％及び軟寒天に関して０．６５％付加された。ペナセイ寒天が細菌の通常のエニュメレーションのために使用された。醗酵が適当な炭水化物の１％最終濃度を用いてマッコンキーベース寒天又はエオシンメチレンブルー寒天（カーティス、遺伝学  ５８：９−５４，（１９６８））の補足によって評価された。
【００６９】
合成培地は最小液体（ＭＬ）及び前述（カーティス、バクテリオル  ８９：２８−４０，（１９６５））の如くの適正レベルでの栄養素を用いて補足された最小寒天（ＭＡ）であった。ゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）（カーティス、１９６５  前に）が通常希釈液として使用された。
【００７０】
形質導入。細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔが通常標準方法（ダビス他、「人．ゲネットに関して．Ｅｎｇ．Ａｄｖ．細菌遺伝学」。コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ＮＹ，（１９７９））を使用した形質導入に関して使用された。供与菌菌株の夜通しの培養は予め温められたルリア肉汁に１：２０で希釈され、３７°Ｃでの振とうを用いて６０分間成長させられそして０．０１の多重度でＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて感染させられた。その感染交合は略１５時間夜通し振とうされ、クロロホルムが３７°Ｃで更に１０分間の振とうを増して許容し、懸濁がセントリ  フュージ（ソルバル  ＲＣ５Ｃ，ＳＳ−３４ローター、７，０００ｒｐｍ，１０分間）し細菌デブリを除去した。ファージ（ｃａ．１０10／ｍｌ）を含む上澄みが４°Ｃでクロロホルム上に貯蔵された。１２．５μｇ／ｍｌの濃度に対するテトラサイクリンがＴｎ１０挿入及びＴｎ１０- 誘発突然変異の形質導入の選択に使用された。
【００７１】
Ｔｎ１０の喪失に関するフザリク酸選択。マロイ及びヌン（Ｊ．バクテリオル．１４５：１１１０−１１１２，（１９８１））によって説明された培地及び方法が使用された。Ｔｎ１０誘発突然変異は３７°Ｃで１２．５ｍｇテトラサイクリン／ｍｌを含むＬ肉汁内で略５ｘ１０8ＣＦＬ／ｍｌまで夜通し成長した。培養はそこで略２ｘ１０9力価までテトラサイクリン無しの予め温められたＬ肉汁に１：４０希釈され３７°Ｃで通気された。ＢＳＧで希釈された適当多数の細胞（即ち、１０7乃至１０8）がフザリク酸含入培地上に載置され４８時間３７°Ｃでインキュベートされた。フザリク酸耐性隔離集団が同じ選択培地上で精製された。単一隔離集団が採集され成長させられそして１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌを用いて及び用いずペナッセイ上でテトラサイクリン感受性に関して試験された。
【００７２】
マウス。雌ＢＡＬＢ／ｃ  マウス（生後６乃至８週間）（サクソ、オマハ、ＮＢ）が感染性及び／又は免疫化実験に関して使用された。動物は実験に使用される前に１週間隔離室に置かれる。実験マウスはワイヤフロアを用いたナルゲネフィルターカバードケージに置かれた。食料と水は不断で与えられた。動物室は２２乃至２３°Ｃで１２時間照明で保持された。
【００７３】
動物感染性。Ｓ．タイフィムリウム菌株の毒力は経口（ｐ．ｏ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ．）接種に従って決定された。マウスにおける接種に関する細菌はＬ肉腫内で３７°Ｃでスタンディングカルチャーとして夜通し成長させられた。これらの培養は予め温められたＬ肉腫に１：５０希釈され略０．８乃至１．０のＯＤ600まで３７°Ｃで略４時間通気された。その細胞はＢＳＧにおける懸濁に続くソルバルＲＣＴＣ遠心器において４°Ｃで１０分間、７，０００ｒｐｍ、ＧＳＡローターでの遠心沈澱法によって５０フォルド濃縮された。力価決定に関してペナッセイ寒天上にそしてＣｙａ／Ｃｒｐ表現型を確かめるために１％マルトースを用いたマッコンキー寒天上に適当な希釈溶液が置かれた。Ｓ．タイフィムリウムを用いた全てのｐ．ｏ．接種に関して、マウスは感染の前に４時間食料と水が与えられなかった。それらはそして３０ｍｌピペットマンＰ２０を使用したＢＳＧ内に懸濁された２０μｌのＳ．タイフィムリウムのｐ．ｏ．フィーディグの１０乃至１５分前にピベットマンＰ２００を使用して１０％（ｗ／ｖ）重炭酸塩ナトリウム３０ｍｌが与えられた。食料と水は経口接種の３０分後に戻された。マウスの罹患率及び死亡率が３０日の間観察された。アンファステッドＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内接種が２６ゲージ３／８"ニードルを使用してＢＳＧに希釈された１００μｌのＳ．タイフィムリウム細菌懸濁を送出するために実行された。マウスの罹患率及び死亡率は３０日の間観察された。
【００７４】
防御免疫の評価。最初の実験において、どのようなＳ．タイフィムリウム突然変異株菌株にによる感染にもかかわらず３０日間生存したどのようなマウスも野性型マウス−毒性Ｓ．タイフィムリウム親菌株を用いた１０3乃至１０4倍ＬＤ50供与量をｐ．ｏ．経路にて３１日に挑戦させられた。その後、マウスのグループは様々な毒性突然変異株の供与量によって経口的に免疫化されそして最初の免疫化の後に様々な倍数で様々な供与量の毒性野性型親細胞に挑戦させられた。罹患率及び死亡率は実験の間通して及び野性型親による挑戦の後少なくとも３０日の間観察された。
【００７５】
Ｓ．タイフィムリウム菌株のΔｃｙａ−１２及びΔｃｒｐ−１１突然変異を用いた分離。野性型、マウスパッセージド毒性Ｓ．タイフィムリウムＳＬ１３４４菌株は遺伝的に下記の如くにカーティス及びケリー（１９８７）によって説明されたものと同様に古典的遺伝的方法を使用してモディファイされた。手順は００１０３７からの元のｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０突然変異及びＰＰ１００２からの元のｃｙａ：：Ｔｎ１０突然変異の高度に毒性及びインベイシブなＳ．タイフィムリウムＳＬ１３４４菌株χ３３３９への形質導入そして最も大きい遺伝子型安定ばかりでなくマウスにおける完全な無毒性及び最も高度な免疫原性のための多数の独立フザイク酸耐性、テトラサイクリン感受性遺伝子欠失突然変異株のスクリーニングよりなる。
【００７６】
ｃｒｐ及びｃｙａ遺伝子におけるＴｎ１０挿入の形質導入はｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株ＰＰ１０３７上での高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物及びｃｙａ：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株ＰＰ１００２上での他の溶解産物の最初の製造によって促進される。結果として得られるＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はその後宿主Ｓ．タイフィムリウムχ３３３９に０．３の多重度で感染させそれをマルトースネガティブ表現型に関するスクリーニングを用いてテトラサイクリン耐性へ形質導入するのに使用される。そのファージ細菌感染混合は１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフロ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃでの略２６時間インキュベーションの後、Ｐ２２ＨＴｉｎｔ（ＰＰ１０３７）・χ３３３９感染の結果得られたテトラサイクリン耐性、マルトースネガティブコロニー及びＰ２２ＨＴｉｎｔ（ＰＰ１００２）・χ３３３９感染の結果得られたテトラサイクリン耐性、マルトースネガティブコロニーが０．５ｍｌＢＳＧへ採集され同じ選択培地上に線条接種された。結果的に得られたχ３３３９派生物はχ３６０４（ｃｙａ：：Ｔｎ１０）及びχ３６０５（ｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０）と称された（表１．Ａ．）。
【００７７】
【表１】
2004337175.tif 000003
【００７８】
【表２】
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【００７９】
【表３】
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【００８０】
【表４】
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【００８１】
【表５】
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【００８２】
【表６】
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【００８３】
【表７】
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【００８４】
【表８】
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【００８５】
【表９】
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【００８６】
【表１０】
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【００８７】
【表１１】
2004337175.tif 000013
【００８８】
【表１２】
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【００８９】
【表１３】
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【００９０】
【表１４】
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【００９１】
【表１５】
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【００９２】
【表１６】
2004337175.tif 000018
菌株χ３６０４及びχ３６０５はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサンクリン／ｍｌで成長され緩衝生理食塩水にゼラチン（ＢＳＧ）を用いて１：１０希釈され菌株の１００μｌサンプルはフザリク酸含入（ＦＡ）培地（マロイ及びヌン、１９８１）のプレート１０枚上に塗布された。そのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各プレートからの５つのフザリク酸耐性コロニーが０．５ｍｌＢＳＧに採集されＦＡ培地上で精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され３７°Ｃで混濁へ成長されＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失に関してチェックされた。一つのテトラサイクリン感受性派生物が１０枚のＦＡ培地のプレーティングから選択され完全ＬＰＳ（Ｐ２２ＨＴｉｎｔ感受性によって）、栄養素要求性又は原栄養菌性、遺伝子欠失の安定性、及びテトラサイクリン耐性のリバージョンに関して特徴付けられた。これらの過程の結果１０の独立して分離されたχ３６０４からのΔｃｙａ突然変異株及び１０の独立して分離されたχ３６０５からのΔｃｒｐ突然変異株及が得られた。
【００９３】
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。
【００９４】
生ワクチンとして経口投与されるべき菌株はそれらの無毒性及びそれらの免疫原性属性に関する完全な安定性を有しなければならない。１０の独立したΔｃｙａ突然変異株及び１０の独立したΔｃｒｐ突然変異株の各々の５０フォルド濃縮された培養及び様々な希釈（略１０9，１０7，１０5，１０3ＣＦＵ／プレート）が０．５％のそれらの成長を支えることのないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを含む（２２μｇシステイン／ｍｌ及び２２μｇアルギニン／ｍｌを用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされ、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。一双プレートの内の１セットが紫外線照射（５ジュール／ｍ2／秒）され暗がりで３７°Ｃでインキュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて３７°Ｃでインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は４８時間成長期間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がテトラサイクリン感受性野性型親菌株に関して観察され得たよりも高頻度でフザリク酸耐性Δｃｙａ及びΔｃｒｐ突然変異株から回復され得たかどうかに関して研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
【００９５】
Δｃｒｐ及びΔｃｙａ突然変異株の毒性及び免疫原性。結果として得られた１０のΔｃｒｐ及び１０のΔｃｙａ突然変異は最低の毒性及び外皮（スクラフィ対円滑）の外観、食欲、活動性（高低）によって示される如くの病気症候学を決定するために経口的接種によってＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてスクリーニングされた。グループ当たり５匹のマウスが独立したΔｃｙａ又はｃｒｐ遺伝子欠失突然変異株の各々の略１０9 ＣＦＵを用いてｐ．ｏ．接種された。動物は上記判断基準で採点され３０日の実験で生存者は野性型毒性親菌株χ３３３９の１０8 ＣＦＵを用いて挑戦させられた。ｃｙａ又はｃｒｐ遺伝子欠失突然変異株によって感染された２０グループの内の３つにおいて、５匹のマウスの内の５匹がΔｃｙａ−１２，Δｃｒｐ−１１及びΔｃｒｐ−１０突然変異株による感染にもかかわらず生存し又野性型挑戦の１０4ＬＤ50に対して完全に防護された。特に一グループ、Δｃｒｐ−１０突然変異株、は無毒性、免疫原性及び安定性において匹敵するものがなかった。これらの実験の後、マウスはΔｃｒｐ−１０突然変異株（例３，表６参照）のｐ．ｏ．又はｉ．ｐ．を与えられたどのような供与量によっても全く影響を及ぼされていないようであった。
【００９６】
選択された突然変異株菌株の特性。Δｃｙａ−１２，Δｃｒｐ−１０及びΔｃｒｐ−１１の夫々のχ３６１５，χ３６２２及びχ３６２３は少なくとも毒性、高免疫原性及び極度に安定な表現型及び遺伝子型であると判断された。３つの菌株の表現型特性上のデータは表２に示される。表３は毒性野性型親χ３３３９及び夫々ｃｙａ：：Ｔｎ１０及びｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０突然変異を用いたχ３６０４及びχ３６０５菌株を用いた結果の比較におけるこれらの菌株の無毒性及び免疫原性上のデータを示す。親χ３３３９におけるｈｉｓＧ突然変異による要求されるヒスチジンに加えて、Δｃｒｐ−１０突然変異がアミノ酸アルギニン及びシステインに関するχ３６２２要求上で課された。この観察に関するベース及びΔｃｒｐ−１０突然変異の特性の他の分析は例３で与えられる。
【００９７】
【表１７】
2004337175.tif 000019
【００９８】
【表１８】
2004337175.tif 000020
例２
本例は無毒性細菌の構造を遺伝子欠失突然変異影響ｃＡＭＰ合成の導入及び表現型の安定性、完全無毒性及び高免疫原性に関する二つの遺伝子欠失突然変異を用いた菌株の利用と特徴付けによって説明する。
【００９９】
細菌菌株。使用されている大腸菌及びネズミチフス菌菌株は表１．Ａ．及びＢ．に記載されている。これらの菌株の維持と貯蔵は例１に記載されている如くである。
【０１００】
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認に関する複合培地は例１に説明されている如くである。
【０１０１】
Ｔｎ１０の損失に関する形質導入及びフザリク酸選択。培地及び方法は例１に述べた如くである。
【０１０２】
動物感染及び防護免疫の評価。Ｓ．タイフィムリウム菌株の毒性及び免疫原性は例１にて説明された如く決定された。
【０１０３】
Δｃｙａ−１２及びΔｃｒｐ−１１遺伝子欠失突然変異を用いたＳ．タイフィムリウムの構造。効験の見地からの最良のワクチン菌株は意味のある定着能力及び侵入性を示す高毒性菌株の弱毒化によって得られるようである。ＳＬ１３４４（χ３３３９）、ＵＫ−１（χ３７６１）及び７９８のようなこれらの高病原性Ｓ．タイフィムリウム野性型菌株の選択に関する判断基準はマウス毒性アッセイ、抗生物質感受性、毒性核外遺伝子の保有、遺伝的操作（細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ又はＰ１感受性、形質転換能力及び動員された核外遺伝子を受け取る容易性）の容易性、及びコリシン感受性において低ＬＤ50値（表４参照）を含んだ。
【０１０４】
野性型毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株ＳＬ１３４４（χ３３３９），７９３及びＵＫ−１（χ３７６１）はカーティス及びケリー（１９８７）において記載されたものと同様の古典的遺伝的方法を使用して遺伝的に下記の如くに一時的変異された。手順はＳ．タイフィムリウムＳＬ１３４４（例１にて説明した如く）においてΔｃｙａ−１２又はΔｃｒｐ−１１突然変異の近くでトランスポゾンＴｎ１０（テトラサイクリン耐性を符号化する）の載置によって分離され特徴付けられたｃｒｐ及びｃｙａ遺伝子の動員遺伝子欠失及び連鎖された形質の高毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株ＵＫ−１  χ３７６１，７９８及びＳＬ１３４４  χ３３３９へのテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いたＰ２２ＨＴｉｎｔ媒介形質導入を介した形質導入よりなる。何れの挿入も単独ではＳ．タイフィムリウムの毒性に影響を与えない。
【０１０５】
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の遺伝子導入はΔｃｒｐ−１１及びｚｉｃ−１４３１：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７７３上の高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物及びΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１１上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ３３３９，７９８及びχ３７６１へ形質導入するために使用された。
【０１０６】
Ｓ．タイフィムリウムχ３７７３（Δｃｒｐ−１１  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０）上で増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔはＭａｌ-に関するスクリーニングを用いて毒性菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｌサンプルが１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃで略２６時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Ｍａｌ-形質導入体が同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られた７９８派生物はχ３８２５と称されＵＫ−１派生物はχ３８２８と称された。菌株χ３７７３，χ３８２５及びχ３８２８は遺伝子型Δｃｒｐ−１１  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０（表１．Ｂ．）を有する。これらの菌株はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１：１０希釈され、各々の１００μｌはフザリク酸含入（ＦＡ）培地（マロイ及びヌン、１９８１）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは０．５ｍｌ  ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃで成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳの存在及び栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は双方が遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕の遺伝子型を有するχ３８７６（７９８）及びχ３９５４（ＵＫ−１）及びχ３６２３（ＳＬ１３４４  Δｃｒｐ−１１は元々例１にて説明した如くに分離された）（表１．Ｂ．）と称された。
【０１０７】
Ｃｙａ-及びＣｒｐ-突然変異株の表現型は同じ（Ｍａｌ-，Ｓｔｌ-，Ｍｔｌ-，他）であるので、クローンされたｃｒｐ+遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル  １６７：６１６−６２２（１９８６））を与える、核外遺伝子、ｐＳＤ１１０，がΔｃｙａ突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔｃｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３６２３，χ３８７６及びχ３９５４のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む（表１．Ｂ．）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ+コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上に精製され双方が遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+を有するχ３９３８（７９８）及びχ３９６１（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δｃｒｐ−１１  ｐＳＤ１１０+を有するχ３７７４（ＳＬ１３４４）と称された。
【０１０８】
菌株χ３７７４，χ３９３８及びχ３９６１はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌにおいて成長させられ連鎖されたΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を導入するために各々は独立してχ３７１１上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に載置された。アンピシリン耐性（ｐＳＤ１１０+）、テトラサイクリン耐性（ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０）、Ｍａｌ-（Δｃｙａ）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は双方が遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を有するχ３９７８（７９８）及びχ３９６２（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δｃｒｐ−１１  ｐＳＤ１１０+Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を有するχ３９３６（ＳＬ１３４４）と称された。χ３９３６，χ３９７８及びχ３９６２の培養はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１：１０希釈され、そして各培養の１００μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたＦＡ耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関してチェックされた。ｐＳＤ１１０核外遺伝子はｐＳＤ１１０を消去するために二つの過程を必要とするＳＬ１３４４派生物を除いてその結果アンピシリン感受性を得るこの過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は双方が遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕を有するχ４０３９（７９８）及びχ３９８５（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕を有するχ３９３９（ＳＬ１３４４）と称された（表１．Ｂ．）。
【０１０９】
無毒性突然変異株の遺伝子型及び表現型安定性。遺伝的形質の安定性を決定する方法は例１に説明した如くである。Δｃｙａ  Δｃｒｐ突然変異による全ての遺伝子型及び表現型形質は運動性を除いて完全に安定である。機能的べん毛の合成及び運動性の表出が野性型ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子機能に依存しているとはいえ、ｃｆｓ（構成性べん毛合成）遺伝子における抑圧遺伝子突然変異がべん毛合成及び運動性がｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子機能から独立するように容易に選択され得る。Ｓ．タイフィムリウムΔｃｙａ  Δｃｒｐ菌株において、運動型突然変異株は菌株構成過程間ですでに選択された。べん毛抗原への免疫は防護的であり得るので全てのワクチン菌株の運動型突然変異株が選択された。
【０１１０】
Ｓ．タイフィムリウムグループＢ  Ｏ−抗原合成は抗血清を用いたスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるＰ２２ＨＴｉｎｔ細菌ウイルスによって確認された。
【０１１１】
二つの突然変異株菌株の様々な炭素源上での砂糖の醗酵及び成長は表２に記載された如くのΔｃｒｐ又はΔｃｙａ単独を用いた菌株に対して等しい。表現型は環状ＡＭＰに関する要求及びカタボリック活性に関する環状ＡＭＰ受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものであった。
【０１１２】
フザリク酸耐性テトラサイクリン感受性派生物の選択に続く構成における核過程において、テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株が親テトラサイクリン感受性野性型菌株に関して観察され得たより高頻度で回復され得たかに関する研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
【０１１３】
マウスに関する突然変異株菌株の毒性。Ｓ．タイフィムリウムの毒性上の予備情報は個体マウスを１０8突然変異株細胞を用いて経口的に感染させ罹患率及び死亡率を記録培地することによって得られた。表４はＳ．タイフィムリウム野性型親菌株、及びΔｃｙａ−１２  Δｃｒｐ−１１派生物χ３９８５及びχ４０３９を用いて経口的に感染させられたマウスの罹患率及び死亡率のデータを示す。
【０１１４】
【表１９】
2004337175.tif 000021
無毒性突然変異株を用いた免疫化の有効性。表５はＳ．タイフィムリウムΔｃｙａ  Δｃｒｐ突然変異株χ３９８５及びχ４０３９のその後の完全毒性野性型Ｓ．タイフィムリウム細胞のＬＤ50供与量１０4倍を用いた経口挑戦に対する免疫を誘発する能力上のデータを示す。これらの高供与量挑戦の下で、健康を維持し食し正常に成長したχ４０３９を用いて免疫化されたマウスを除いて多くのマウスが減少した食料消費と共にかなりの病気であることを示している。
【０１１５】
【表２０】
2004337175.tif 000022
例３
本例はｃｒｐ遺伝子及びサルモネラの毒性を又制御する付近の遺伝子を包含する遺伝子欠失突然変異を所有する無毒性細菌の分離を示す。
【０１１６】
細菌菌株。使用される大腸菌及びネズミチフス菌菌株は表１．Ａ．及びＢ．に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１にて説明した如くである。
【０１１７】
培地。通常の細菌の培養、エニュメレーション及び確認に関する複合培地は例１にて説明した如くである。
【０１１８】
形質導入及びＴｎ１０の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
【０１１９】
動物感染及び防護的免疫の評価。Ｓ．タイフィムリウム菌株の毒性及び免疫原性は例１にて説明した如くに決定された。
【０１２０】
Δｃｒｐ−１０突然変異を用いたＳ．タイフィムリウムの分離。例１にて説明した如く、１０のΔｃｒｐ突然変異の内の一が（ａｒｇＤの遺伝子欠失による）アルギニン及び（ｃｙｓＧの遺伝子欠失による）システインに関する栄養素要求性を与えるχ３６０５において分離された。Ｓ．タイフィムリウムＳＬ１３４４菌株χ３６２２における突然変異は元々Δｃｒｐ−１０として参照されていたが、システインに関する栄養素要求性のために今はΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０と称される。１０9 χ３６２２細胞を用いて経口的に感染された５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループは健康を維持し総合的に影響を及ぼされなかった（表３）。更に、これらのマウスは１０8 親χ３３３９細胞を用いた経口挑戦に対する高レベルの免疫原性を得た（表３）。
【０１２１】
菌株の系列はχ３６２２の表現型特徴の各々を独立して評価するように構成された。クローンされたｃｒｐ+ 遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドゴロゴッツ、Ｊ．バクテリオル．１６７：６１６−６２２（１９８６））を与える核外遺伝子、ｐＳＤ１１０が染色体においてΔｃｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３６２２のＬ肉汁培養がＳ．タイフィムリウム上に増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、アクピシリン耐性、Ｍａｌ+コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上で精製されχ３７０６と称された。χ３７０６は経口的にマウスに接種され脾臓から再分離された。その動物通過菌株はχ３７３７と称された。Ａｒｇ-又はＣｙｓ-栄養素要求形質を与えない二つの他のｃｒｐ突然変異株、χ３６０５（ｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０）及びχ３６２３（Δｃｒｐ−１１）が又、夫々、形質導入によってｐＳＤ１１０核外遺伝子を用いて補足されχ３７３１及びχ３７７４と称された。独立してｃｙｓＧ及びａｒｇ突然変異をキャリーするＳ．タイフィムリウム菌株が構成されχ３９１０（ｃｙｓＧ：：Ｔｎ１０），χ４０６３及びχ４０７１（ａｒｇ：：Ｔｎ１０）と称された。
【０１２２】
二つの他の高病原性Ｓ．タイフィムリウム菌株がΔｃｒｐ−１０突然変異の導入による弱毒化に関して選択された。χ３７６１（ＵＫ−１）及び７９８は瀕死の馬及びブタから、夫々略１ｘ１０5ＣＦＵのマウスにおけるＬＤ50を用いて分離された毒性、侵入性菌株である。連鎖されたトランスポゾンｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０を用いたΔｃｒｐ−１０の形質導入がＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１２（表１．Ｂ．参照）上の高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物の最初の製造によって促進された。そのファージ溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ３７６１及び７９８へ形質導入するのに使用された。テトラサイクリン耐性コロニーがＭａｌ-，Ａｒｇ-及びＣｙｓ-表現型に関して選択されスクリーンされ結果的に得られた７９８派生物はχ４２４６と称されχ３７６１（ＵＫ−１）派生物はχ４２４８（表１）と称された。
【０１２３】
ｃｒｐ突然変異はｃｒｐ+野性型対立遺伝子をキャリーするｐＳＤ１１０のχ４２４６及びχ４２４８への導入によって補足された。χ４２４６及びχ４２４８のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む（表１）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン、Ｍａｌ+コロニーが同じ培地上に採集され精製されそして双方共が遺伝子型ｐＳＤ１１０+ ／Δｃｒｐ−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０を有するχ４２４７（７９８）及びχ４２６２（ＵＫ−１）と称された。
【０１２４】
Ｓ．タイフィムリウムχ３６２２，χ３７３１，χ３７３７、χ３７７４，χχ３９１０，χ４０６３及びχ４０７１の毒性。表６はＳ．タイフィムリウム菌株χ３６２２，χ３７３１，χ３７３７，χ３９１０，χ４０６３及びχ４０７１によって経口的に感染させられたマウスの罹患率及び死亡率上のデータを示す。菌株χ３７３７は野性型χ３３３９親菌株に関するＬＤ50供与量の１０4倍を受けたマウスに関して完全に無毒性であった。３０日観察期間を通してマウスは全く病気となってはいないようであった。この実験に関する制御として、χ３６０５におけるｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０突然変異が野性型Ｃｒｐ+ 表現型（χ３７３１）へのｐＳＤ１１０による補足がなされそしてマウスは感染し死んだ。略１ｘ１０5ＣＦＵ供与量はχ３７３１及びχ３７７４（ｐＳＤ１１０+／ΔＣｒｐ−１１）によってｐ．ｏ．接種された５匹のマウスの内４匹を殺した。Ｃｙｓ-及びＡｒｇ-表現型を用いた菌株の毒性を独立して試験するために菌株χ３９１０（ｃｙｓＧ：：Ｔｎ１０），χ４０６３（ａｒｇ：：Ｔｎ１０）及びχ４０７１（ａｒｇ：：Ｔｎ１０）がＢＡＬＢ／ｃマウスにｐ．ｏ．接種された。χ３９１０，χ４０６３及びχ４０７１が同様の又はより低い供与量がｐ．ｏ．接種されたときに殺した。よってΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異に関する無毒性は単にｃｒｐ遺伝子の遺伝子欠失によるものではなくａｒｇＤ又はｃｙｓＧ座の何れかの遺伝子欠失によって与えられるものではなかった。むしろ、Ｓ．タイフィムリウム毒性に関する他の遺伝子がｃｒｐ遺伝子に近い染色体の領域に局在しなければならない。
【０１２５】
【表２１】
2004337175.tif 000023
【０１２６】
【表２２】
2004337175.tif 000024
χ３６２２，χ３７３７、χ４２４７及びχ４２６２を用いた免疫化の有効性。完全毒性野性型Ｓ．タイフィムリウム細胞のＬＤ50供与の１０4倍を用いたその後のｐ．ｏ．又はｉ．ｐ．挑戦に対する免疫を誘発するχ３６２２，χ３７３７、χ４２４７及びχ４２６２の能力上のデータが表７に示されている。野性型親菌株の過度の供与量が与えられた全てのマウスは実験の３０日間を通して全く病気にはなっていないようであった。よってΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異は双方がＳ．タイフィムリウムを完全に無毒性とし高免疫原性とする少なくとも二つの遺伝子を欠失させる。
【０１２７】
【表２３】
2004337175.tif 000025
【０１２８】
【表２４】
2004337175.tif 000026
Δｃｒｐ−１４突然変異を用いたＳ．タイフィムリウム菌株の分離。ｃｒｐ−７７３：：Ｔｎ１０の不正確な削除結果がａｒｇＤからｃｙｓＧに及ぶ遺伝子の欠失を発生させたため、他の手順は無毒性を与える遺伝子の位置をｃｒｐの付近の領域に配置するよう設計された。χ３９１０（ｃｙｓＧ：：Ｔｎ１０）の突然変異株の２０の独立した欠失がフザリク酸含入培地上で選択されテトラサイクリン感受性及びマルトース負表現型に関してスクリーンされた。χ３９１０の２０のフザリク酸耐性派生敷設の内の一は遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１４を有し、アルギニンではなくヒスチジン及びシステインに関する栄養素要求性を与えた。χ３９３１と称されたこの菌株は野性型ｃｒｐ+遺伝子をキャリーするｐＳＤ１１０を導入するためにχ３６７０上で成長させられたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物を用いて形質導入された。アンピシリン耐性、マルトース正形質導入体は同じ培地上に採集され精製され結果的に得られた菌株はχ３９５５と称された。
【０１２９】
Ｓ．タイフィムリウムｐＳＤ１１０+／Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１４  χ３９５５の毒性。表７は経口的にＳ．タイフィムリウムχ３９５５によって感染させられたマウスの罹患率及び死亡率を示す。菌株χ３９５５は略１０9 ＣＦＵを受けたマウスに関して完全に無毒であった。３０日間を通してマウスは全く病気ではなかったようだ。
【０１３０】
χ３９５５を用いて免疫化の有効性。表７はその後のχ３９５５の完全毒性野性型Ｓ．タイフィムリウム細胞のＬＤ50供与量の１０4倍によるｐ．ｏ．挑戦に対する免疫を誘発する能力を示す。親菌株の過度の供与量が与えられたマウスは実験の間の３０日を通して全く病気ではなかったようだ。
【０１３１】
野性型菌株χ３３３９に関するχ３６３３（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）及びχ３７３７（ｐＳＤ１１０+Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）による腸道、ＧＡＬＴ及び脾臓への定着。Ｓ．タイフィムリウムχ３６２２及びχ３７３７は成長させられ例１で説明した如く生後８週間雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの経口接種のために準備された。９．４ｘ１０8ＣＦＵ（χ３６２２）、１．２ｘ１０9ＣＦＵ（χ３７３７）又は１．１ｘ１０9ＣＦＵ（χ３３３９）によるｐ．ｏ．接種の野他１，３，５及び７日経過後に犠牲となった。グループ毎に３匹のマウスがランダムに選択され、安楽死させられそして組織サンプルが収集された。各マウスからの脾臓、ペヤーズパッチ、回腸の１０−ｃｍ切片及び小さい腸内容物がＢＳＧを用いてポリプロピレンチューブ内に載置され、ブ連鎖マン組織ホモジナイザーによって均質化されそして氷上に載置された。希釈されない又は希釈されたサンプル（１００μｇ）は直接マッコンキー寒天＋１％ラクトース＋５０μｇストレプトマイシン／ｍｌ（χ３３３９及びχ３７３７）上に及びマッコンキー寒天＋１％マルトース＋５０μｇストレプトマイシン／ｍｌ（χ３６２２）上に載置されそのプレートは３７°Ｃで２６時間インキュベートされた。そのパースペクティブ組織における力価は各時間間隔及びサンプリングの各時間におけるグループ毎３匹のマウスに関して計算された幾何平均に関して決定された。
【０１３２】
この分析の結果は図１に示される。χ３６２２において付加的に弱毒化する突然変異、それは依然としてＣｒｐ+（ｐＳＤ１１０+）派生物χ３７３７において発現しているが、効果的に深い組織に定着する能力を非常に減少させることが明らかである。Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異によって欠失させられた責任のある遺伝子がそれ故ｃｄｔと称されている。χ３６３３及びχ３７３７のＣｄｔ-表現型はΔｃｒｐ−１１突然変異を有するＳ．タイフィムリウムによる又は組み合わせられたΔｃｒｐ及びΔｃｙａ突然変異（カーティス及びケリー、１９８７年）によるマウスのｐ．ｏ．接種に引き続いて観察されるどのような脾種の不在によっても又発現させられる。菌株χ３７３７はχ３６２２よりも速く成長した。χ３６２２における付加的弱毒化突然変異はｃｒｐ突然変異がそうであるごとくには成長率を減少させない。
【０１３３】
与えられる表現型に関する突然変異の分離及び分析に基づいてＳ．タイフィムリウム染色体における遺伝子順序がａｒｇＤ  ｃｒｐ  ｃｄｔ  ｃｙｓＧであるべき推論される。
【０１３４】
ｃｄｔ突然変異でもあるΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０又はΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１４突然変異の含有が生弱毒化サルモネラワクチン菌株の安全性を増強しながらその免疫原性を減少させないであろうことは明らかである。これは非宿主種、Ｓ．タイフィムリウム及びＳ．エンテリティディス等の侵入性サルモネラ種ばかりではなく、Ｓ．タイフィ、Ｓ．パラタイフィ  Ａ（Ｓ．ショットムエレリ），Ｓ．パラタイフィ  Ｂ（Ｓ．ヒルシュフェルディー），Ｓ．パラタイフィ  Ｃ（全ての感染人），Ｓ．コレラエスイス（感染  豚），Ｓ．デュブリン（感染牛），Ｓ．ガリナルム、及びＳ．プロルム（双方とも感染家禽）等の宿主適応侵入性サルモネラ種に関して特に重要である可能性がある。
【０１３５】
例４
本例はｃＡＭＰ合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入及び利用及びサルモネラの毒性を深い組織の定着に影響を及ぼすことによって又制御する付近の遺伝子及び表現型の安定性、完全無毒性及び高免疫原性に関する二つの遺伝子欠失突然変異を用いた菌株の特徴によって無毒性細菌の構造を説明する。
【０１３６】
細菌菌株。使用される大腸菌及びネズミチフス菌菌株は表１．Ａ．及びＢ．に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
【０１３７】
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
【０１３８】
形質導入及びＴｎ１０の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
【０１３９】
Δｃｙａ−１２及びΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０遺伝子欠失突然変異によるＳ．タイフィムリウム菌株の構造。効験の見地での最良ワクチン菌株は意味ある定着能力及び侵入性を示す高毒性菌株の弱毒化によって得られるようである。ＳＬ１３４４（χ３３３９）、ＵＫ−１（χ３７６１）及び７９８等のこれらの高病原性Ｓ．タイフィムリウム野性型菌株の選択の基準は例２にて説明した。
【０１４０】
野性型、毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株ＳＬ１３４４，７９８及びＵＫ−１は遺伝的に下記の如くに、カーティス及びケリー（１９８７年）にて説明されているものと同様な古典的遺伝的方法を使用して一時的変異された。手順は（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンＴｎ１０をΔｃｙａ−１２又はΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異の近くに載置し連鎖された形質をテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いてＰ２２ＨＴｉｎｔ媒介形質導入を介して高毒性Ｓ．タイフィムリウム菌株ＵＫ−１  χ３７６１，７９８及びＳＬ１３４４  χ３３３９へ形質導入することによってＳ．タイフィムリウムＳＬ１３４４（例１にて説明した如くに）において分離され特徴付けられたｃｒｐ及びｃｙａ遺伝子の動員遺伝子欠失よりなる。Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０に連鎖されたｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０及びΔｃｙａ−１２に連鎖されたｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０がこの目的のために使用された。いずれの挿入も単独ではＳ．タイフィムリウムの毒性に影響を及ぼさない。
【０１４１】
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０及びｚｉｃ−１４３１：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１２上の高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物及びΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１１上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ３３３９，７９８及びχ３７６１へ形質導入するために使用された。
【０１４２】
Ｓ．タイフィムリウムχ３７１２（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０）上で増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔはＭａｌ-に関するスクリーニングを用いて毒性菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｌサンプルが１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃで略２６時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Ｍａｌ-形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られた７９８派生物はχ３７７７と称されＵＫ−１派生物はχ３７７９と称された。菌株χ３７１２，χ３７７７及びχ３７７９は全て遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０（表１．Ｂ．）を有する。χ３７７７及びχ３７７９はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１：１０希釈され、各々の１００μｌはフザリク酸含入（ＦＡ）培地（マロイ及びヌン、１９８１）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは０．５ｍｌ  ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃで成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳの存在及び栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は双方が遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕の遺伝子型を有するχ３７８４（ＵＫ−１）及びχ３８０６（７９８）と称された。χ３６２２（ＳＬ１３４４  Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）は元々例１にて説明した如くに分離された）（表１．Ｂ．）。
【０１４３】
Ｃｙａ-及びＣｒｐ-突然変異株の表現型は同じ（Ｍａｌ-，Ｓｔｌ-，Ｍｔｌ-，他）であるので、クローンされたｃｒｐ+遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル  １６７：６１６−６２２（１９８６））を与える、核外遺伝子、ｐＳＤ１１０，がΔｃｙａ突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔｃｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３６２２，χ３８７４及びχ３８０６のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む（表１）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ+ コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上に精製され双方が遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+を有するχ３９０１（７９８）及びχ３９４５（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  ｐＳＤ１１０+を有するχ３７０６（ＳＬ１３４４）と称された。
【０１４４】
菌株χ３７０６，χ３９０１及びχ３９４５はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌにおいて成長させられ連鎖されたΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を導入するために各々はχ３７１１上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて独立して形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に載置された。アンピシリン耐性（ｐＳＤ１１０+）、テトラサイクリン耐性（ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０）、Ｍａｌ-（Δｃｙａ）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は双方が遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を有するχ３９０２（７９８）及びχ３９５６（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  ｐＳＤ１１０+Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を有するχ３７２２（ＳＬ１３４４）と称された。χ３７２２，χ３９０２及びχ３９５６の培養はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１：１０希釈され、そして各培養の１００μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたＦＡ耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関してチェックされた。ｐＳＤ１１０核外遺伝子はｐＳＤ１１０を消去するために二つの過程を必要とするＳＬ１３４４及びＵＫ−１派生物を除いてこのその結果アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は双方が遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕を有するχ４０３８（７９８）及びχ３９５８（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕を有するχ３７２４（ＳＬ１３４４）と称された（表１．Ｂ．）。
【０１４５】
無毒性突然変異株の遺伝子型及び表現型安定性。遺伝的形質の安定性を決定する方法は例１に説明した如くである。Δｃｙａ  Δｃｒｐ突然変異による全ての遺伝子型及び表現型形質は運動性を除いて完全に安定である。機能的べん毛の合成及び運動性の表出が野性型ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子機能に依存しているとはいえ、ｃｆｓ（構成性べん毛合成）遺伝子における抑圧遺伝子突然変異がべん毛合成及び運動性がｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子機能から独立するように容易に選択され得る。Ｓ．タイフィムリウムΔｃｙａ  Δｃｒｐ菌株において、運動型突然変異株は菌株構成過程間ですでに選択された。べん毛抗原への免疫は防護的であり得るので全てのワクチン菌株の運動型突然変異株が選択された。
【０１４６】
Ｓ．タイフィムリウムグループＢ  Ｏ−抗原合成は抗血清を用いたスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるＰ２２ＨＴｉｎｔ細菌ウイルス感受性によって確認された。
【０１４７】
二つの突然変異株菌株の様々な炭素源上での砂糖の醗酵及び成長は表２に記載された如くのΔｃｒｐ又はΔｃｙａ単独を用いた菌株に対して等しい。表現型は環状ＡＭＰに関する要求及びカタボリック活性に関する環状ＡＭＰ受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものであった。
【０１４８】
フザリク酸耐性テトラサイクリン感受性派生物の選択に続く構成における核過程において、テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がテトラサイクリン感受性野性型親菌株に関して観察され得たより高頻度で回復され得たかに関する研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
【０１４９】
例５
本例は無毒性細菌の構造を表現型の安定性及び完全無毒性に関して二つの遺伝子欠失突然変異を用いてｃＡＭＰ合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異及び利用及び特徴付けによって説明する。
【０１５０】
細菌菌株。使用されるネズミチフス菌及びＳ．タイフィ菌株は表１．Ｂ．及びＣ．に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
【０１５１】
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
【０１５２】
形質導入及びＴｎ１０の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
【０１５３】
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。遺伝的形質の安定性の決定に関する方法は例１にて説明した如くである。
【０１５４】
マウス。雌ＣＦＷ−１  マウス（１８−２０ｇ）（チャールズリバー、ウィルミングトン、ＭＡ）が全ての感染実験に使用された。動物は実験に使用される前に１週間隔離室に置かれる。実験マウスはワイヤフロアを用いたナルゲネフィルターカバードケージに置かれた。食料と水は不断で与えられた。動物室は２２乃至２３°Ｃで１２時間照明で保持された。
【０１５５】
動物感染性。Ｓ．タイフィ菌株の毒力は去勢豚の胃粘素を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）接種に従って決定された。マウスにおける接種に関する細菌はＬ肉腫内で３７°Ｃでスタンディングカルチャーとして夜通し成長させられた。その培養は予め温められたＬ肉腫に１：５０希釈され略０．８乃至１．０のＯＤ600まで３７°Ｃで略４時間通気された。力価決定に関してペナッセイ寒天上にそしてＣｙａ／Ｃｒｐ表現型を確かめるために１％マルトースを用いたマッコンキー寒天上に適当な希釈溶液が置かれた。
【０１５６】
アンファステッドＣＦＷ−１マウスの腹腔内接種が２６ゲージ３／８"ニードルを使用して１５％去勢豚の胃粘素（ウィルソン  ロット  ＃０３４７Ａ００１）において懸濁されたＳ．タイフィの５００μｌを送出するために実行された。その粘液懸濁はＳ．タイフィ細胞の付加に先立って１０分間１２１°Ｆ（１５ｐ．ｓ．ｉ．）オートクレービング、ｐＨ７への中性化及びｍｌ当たり３μｇのフェリックアンモニウムシトレート（シグマ、Ｓｔ．ロウイス、ＭＯ）の付加によって準備された。野性型親のＬＤ50値及びΔｃｒｐ−１１  Δｃｒｐ−１２派生物の毒性は１０日間の罹患率及び死亡率の記録の後に決定された。
【０１５７】
ｃｙａ及びｃｒｐ突然変異を用いたＳ．タイフィ菌株の構造。野性型、毒性Ｓ．タイフィＴｙ２（Ｅ１型）、ＩＳＰ１８２０（４６型）及びＩＳＰ２８２２（Ｅ１型）菌株は下記の如くにカーティス及びケリー（１９８７）によって説明されたものと同様の古典的遺伝的方法を用いて遺伝的に一時的変異された。ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２は最近チリにおける腸チフス流行の間に分離されＳ．タイフィの標準実験室Ｔｙ２菌株より侵入的であるようである。それらの弱毒化はよってＴｙ２から派生されるものより効能があるであろうワクチン菌株を生成する可能性がある。その構成手順はΔｃｙａ又はΔｃｒｐ突然変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンの載置によってＳ．タイフィムリウムＳＬ１３４４において分離され特徴付けられたｃｒｐ及びｃｙａ遺伝子の動員遺伝子欠失及びテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いたＰ２２ＨＴｉｎｔ媒介形質導入を介した高毒性Ｓ．タイフィＴｙ２，ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２菌株へ連鎖された形質の形質導入よりなる。ｃｒｐに連鎖されたｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０及びｃｙａに連鎖されたｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０がこの目的のために使用された。いずれの挿入も単独ではＳ．タイフィムリウムの毒性に影響を及ぼさない。
【０１５８】
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔｃｒｐ−１１及びｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７７３上の高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物及びΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１１上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はそこで遺伝形質を宿主Ｓ．タイフィＴｙ２，ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２菌株へ形質導入するために１０の感染多重によって感染させるために使用された。
【０１５９】
Ｓ．タイフィムリウムχ３７７３（Δｃｒｐ−１１  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０）上で増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔはＭａｌ-に関するスクリーニングを用いて毒性Ｓ．タイフィＴｙ２，ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｌサンプルが１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃで略２６時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Ｍａｌ- 形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られたＴｙ２派生物はχ３８５３と称されＩＳＰ１８２０派生物はχ４２９８と称されＩＳＰ２８２２派生物はχ３８５２と称された。全てのこれらの菌株は遺伝子型Δｃｒｐ−１１  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０（表１．Ｃ．）を有する。菌株χ３８５２，χ３８５３及びχ４２９８はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１：１０希釈され、各々の１００μｌはフザリク酸含入（ＦＡ）培地（マロイ及びヌン、１９８１）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは０．５ｍｌ  ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃで成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ及びＶｉ抗原の存在及びシステイン及びトリプトファン（全てのその親菌株によって要求される二つのアミノ酸）に関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は全てが遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕の遺伝子型を有しχ３８７７（ＩＳＰ２８２２），χ３８７８（Ｔｙ２）及びχ４２９９（ＩＳＰ１８２０）と称された（表１．Ｃ．）。
【０１６０】
Ｃｙａ-及びＣｒｐ-突然変異株の表現型は同じ（Ｍａｌ-，Ｓｔｌ-，Ｍｔｌ-，他）であるので、クローンされたｃｒｐ+遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル  １６７：６１６−６２２（１９８６））を与える、核外遺伝子、ｐＳＤ１１０，がΔｃｙａ突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔｃｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３８７７，χ３８７８及びχ４２９９のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む（表１．Ｂ．）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ+コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上に精製され全てが遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+を有するχ３８７９（ＩＳＰ２８２２）、χ３８８０（Ｔｙ２）及びχ４３００（ＩＳＰ１８２０）と称された。
【０１６１】
菌株χ３８７９，χ３８８０及びχ４３００はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌにおいて成長させられ連鎖されたΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を導入するために各々はχ３７１１上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて独立して形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に載置された。アンピシリン耐性（ｐＳＤ１１０+）、テトラサイクリン耐性（ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０）、Ｍａｌ-（Δｃｙａ）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は全てが遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+ Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０（表１．Ｃ．）を有するχ３９２１（ＩＰＳ２８２２）、χ３９２２（Ｔｙ２）及びχ４３１６（ＩＳＰ１８２０）と称された。χ３９２１，χ３９２２及びχ４３１６の培養はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１：１０希釈され、そして各培養の１００μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたＦＡ耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。ｐＳＤ１１０核外遺伝子はその結果アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は全てが遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕（表１．Ｃ．）を有しχ３９２６（ＩＳＰ２８２２），χ３９２７（Ｔｙ２）及びχ４３２２（ＩＳＰ１８２０）と称された。Ｓ．タイフィＶｉ抗原合成は抗血清を用いたＶｉへのスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるＶｉＩＩ細菌ウイルス感受性によって確認された。ベン毛の合成は機能的ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に依存する。しかし、ベン毛がポテンシャリーに重要な抗原であるので、Δｃｙａ  Δｃｒｐ  Ｓ．タイフィ菌株の運動型派生物は、ｃｆｓ（構成性ベン毛合成）遺伝子（シルバーマン及びシモン、Ｊ．バクテリオル．１２０：１１９６−１２０３（１９７４）における突然変異の故に、運動性寒天において選択された。χ３９２６及びχ３９２７は有ベン毛及び運動型として分離されたが菌株χ４３２３はχ４２２２のベン毛正運動型派生物として選択された。
【０１６２】
表８には砂糖の醗酵及び様々な炭素源上での成長、ＬＰＳプロフィール、Ｖｉ抗原及び平均世代時間に関して全ての突然変異株菌株の表現型特性及びそれらの親が記載されている。表現型は環状ＡＭＰに関する要求及びカタボリック活性に関する環状ＡＭＰ受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものである。
【０１６３】
【表２５】
2004337175.tif 000027
【０１６４】
【表２６】
2004337175.tif 000028
【０１６５】
【表２７】
2004337175.tif 000029
【０１６６】
【表２８】
2004337175.tif 000030
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与されるべき菌株はそれらの無毒性及びそれらの免疫原性属性に関する完全な安定性を有しなければならない。Δｃｙａ  Δｃｒｐ  Ｓ．タイフィ菌株の５０フォルド濃縮された培養及び様々な希釈（略１０9，１０7，１０5，１０3ＣＦＵ／プレート）が０．５％のそれらの成長を支えるベきでないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを含む（要求されるアミノ酸を用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされたとき、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。一双プレートの内の１セットが紫外線照射（５ジュール／ｍ2／秒）され暗がりで３７°Ｃでインキュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて３７°Ｃでインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は４８時間成長期間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がその親菌株に関して観察され得たよりも高頻度で回復され得たかどうかに関して研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
【０１６７】
マウスに関する突然変異菌株の毒性。表９はマウスχ３９２６又はχ３９２７の何れかの略５０倍ＬＤ50供与量の感染にもかかわらずマウスは生存するということを示しているデータを含む。Ｓ．タイフィの自然の宿主は人である。よって去勢豚胃粘素がマウスにおけるＳ．タイフィ細胞の毒性エンハンサーとして使用され、よってこのモデルシステムにおいてＳ．タイフィワクチン候補の毒性を最大限にする。
【０１６８】
【表２９】
2004337175.tif 000031
例６
本例はｃＡＭＰ合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入及び利用による無毒性細菌及び深い組織の定着に影響を及ぼすことによってサルモネラの毒性を制御する付近の遺伝子の構造を示す。
【０１６９】
細菌菌株。使用されるネズミチフス菌及びＳ．タイフィ菌株は表１．Ｂ．及びＣ．に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
【０１７０】
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
【０１７１】
形質導入及びＴｎ１０の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
【０１７２】
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。遺伝的形質の安定性の決定に関する方法は例１に説明した如くである。
【０１７３】
Δｃｙａ−１２及びΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異によるＳ．タイフィ菌株の構造。Ｓ．タイフィ菌株は人に関して高侵入性である。Δｃｙａ−１２及びΔｃｒｐ−１１突然変異を用いたＳ．タイフィ菌株は無毒性に見えるが、免疫原性を妥協することなく更に安全性を増強させることは付加的弱毒化突然変異を付加することを考えることは慎重であると見えるであろう。Ｓ．タイフィムリウム菌株（例１，３及び４）におけるΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異の特性はＳ．タイフィを無毒性及び免疫原性とするためにそれを使用することを正当化した。この突然変異は又腸道及びＧＡＬＴへの定着の意味ある減少無くネズミチフス菌による深い組織への定着を制御するｃｄｔ遺伝子を欠失させる。
【０１７４】
野性型、毒性Ｔｙ２（Ｅ１型），ＩＳＰ１８２０（４６型）及びＩＳＰ２８２２（Ｅ１型）菌株遺伝的に下記の如くに、カーティス及びケリー（１９８７年）にて説明されているものと同様な古典的遺伝的方法を使用して一時的変異された。ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２は最近チリにおける腸チフス流行の間に分離されＳ．タイフィの標準実験室Ｔｙ２菌株より侵入的であるようである。それらの弱毒化はよってＴｙ２から派生されるものより効能があるであろうワクチン菌株を生成する可能性がある。その構成手順はΔｃｙａ又はΔｃｒｐ突然変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンの載置によって（例１に説明された如く）Ｓ．タイフィムリウムＳＬ１３４４において分離され特徴付けられたｃｒｐ及びｃｙａ遺伝子の動員遺伝子欠失及びテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いたＰ２２ＨＴｉｎｔ媒介形質導入を介したＳ．タイフィＴｙ２及び高毒性Ｓ．タイフィＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２菌株への連鎖された形質の形質導入よりなる。〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０に連鎖されたｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０及びｃｙａに連鎖されたｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０がこの目的のために使用された。いずれの挿入も単独ではＳ．タイフィムリウムの毒性に影響を及ぼさない。
【０１７５】
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０及びｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１２上の高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物及びΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１１上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はそこで遺伝形質を宿主Ｓ．タイフィＴｙ２，ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２菌株へ形質導入するために使用された。
【０１７６】
Ｓ．タイフィムリウムχ３７１２（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０）上で増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔはＭａｌ- に関するスクリーニングを用いて毒性Ｓ．タイフィＴｙ２，ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｌサンプルが１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃで略２６時間インキュベートの後、テトラサイクリン耐性Ｍａｌ-形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られたＩＳＰ２８２２派生物はχ３７９１と称され、Ｔｙ２派生物はχ３７９２と称されＩＳＰ１８２０派生物はχ４３２４と称された。全てのこれらの菌株は遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０（表１．Ｃ．）を有しシステイン、トリプトファン及びアルギニン（表１．Ｃ．）に関する栄養素要求性を有した。菌株χ３７９１，χ３７９２及びχ４３２４はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて成長させられた。各培養はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１：１０希釈され、各々の１００μｌはフザリク酸含入（ＦＡ）培地（マロイ及びヌン、１９８１）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは０．５ｍｌ  ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃで成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ及びＶｉ抗原の存在及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は全てが遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕（表１．Ｃ．）を有しχ３８０２（ＩＳＰ２８２２），χ３８０３（Ｔｙ２）及びχ４３２５（ＩＳＰ１８２０）と称された。
【０１７７】
Ｃｙａ-及びＣｒｐ-／Ｃｄｔ-突然変異株の表現型は同じ（Ｍａｌ-，Ｓｔｌ-，Ｍｔｌ-，他）であるので、クローンされたｃｒｐ+遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性（シュローダー及びドブロゴッツ、Ｊ．バクテリオル  １６７：６１６−６２２（１９８６））を与える、核外遺伝子、ｐＳＤ１１０，がΔｃｙａ突然変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔｃｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３８０２，χ３８０３及びχ４３２５のＬ肉汁成長培養はＳ．タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む（表１．Ｂ．）。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ+ コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上に精製され全てが遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+ を有しχ３８２４（Ｔｙ２）、χ３８４５（ＩＰＳ２８２２）及びχ４３３１（ＩＳＰ１８２０）と称された。
【０１７８】
菌株χ３８２４，χ３８４５及びχ４３３１はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌにおいて成長させられ各々は連鎖されたΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を導入するためにχ３７１１上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて独立して形質導入された。その形質導入混合はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に載置された。アンピシリン耐性（ｐＳＤ１１０+）、テトラサイクリン耐性（ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０）、Ｍａｌ-（Δｃｙａ）コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は全てが遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を有しχ３９１９（Ｔｙ２）、χ３９２０（ＩＳＰ２８２２）及びχ４３４０（ＩＳＰ１８２０）と称された。χ３９１９，χ３９２０及びχ４３４０の培養はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１：１０希釈され、そして各培養の１００μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたＦＡ耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。ｐＳＤ１１０核外遺伝子はその結果アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌株は全てが遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕（表１．Ｃ．）を有しχ３９２４（Ｔｙ２），χ３９２５（ＩＳＰ２８２２）及びχ４３４５（ＩＳＰ１８２０）と称された。Ｓ．タイフィＶｉ抗原合成は抗血清を用いたＶｉへのスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）によって及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるＶｉＩＩ細菌ウイルス感受性によって確認された。ベン毛の合成は機能的ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に依存する。しかし、ベン毛がポテンシャリーに重要な抗原であるので、Δｃｙａ  Δｃｒｐ  Ｓ．タイフィ菌株の運動型派生物は、ｃｆｓ（構成性ベン毛合成）遺伝子（シルバーマン及びシモン、Ｊ．バクテリオル．１２０：１１９６−１２０３（１９７４）における突然変異の故に、運動性寒天において選択された。χ３９４０（ＩＳＰ２８２２），χ４０７２（Ｔｙ２）及びχ４３４６（ＩＳＰ１８２０）は夫々χ３９２５，χ３９２４及びχ４２４５のベン毛正運動型派生物として選択された。
【０１７９】
Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異株菌株の砂糖の醗酵及び様々な炭素源上での成長はΔｃｒｐ−１１突然変異株菌株に関して観察されものと同様であった。表現型は環状ＡＭＰに関する要求及びカタボリック活性に関する環状ＡＭＰ受容タンパク質の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものである。
【０１８０】
無毒性突然変異株の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与されるべき菌株はそれらの無毒性属性に関する完全な安定性を有しなければならない。Δｃｙａ  Δｃｒｐ  Ｓ．タイフィ菌株の５０フォルド濃縮された培養及び様々な希釈（略１０9，１０7，１０5，１０3ＣＦＵ／プレート）が０．５％のそれらの成長を支えるべきでないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを含む（要求されるアミノ酸を用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされたとき、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。一双プレートの内の１セットが紫外線照射（５ジュール／ｍ2／秒）され暗がりで３７°Ｃでインキュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて３７°Ｃでインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は４８時間成長期間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がその親菌株に関して観察され得たよりも高頻度で回復され得たかどうかに関して又研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。
【０１８１】
例７
本例は様々な感染症に対して免疫原性するための経口ワクチンとして使用するための外来の抗原をイクスプレッシングする組み換え無毒性Ｓ．タイフィ菌株の構造を説明する。
【０１８２】
細菌菌株。使用されるＥ．コリ、Ｓ．タイフィムリウム及びＳ．タイフィ菌株は表１に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１で説明した如くである。
【０１８３】
培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くである。
【０１８４】
形質導入及びＴｎ１０の損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて説明した如くである。
【０１８５】
ΔａｓｄＡ１突然変異を用いたＳ．タイフィ菌株の構造。野性型、毒性Ｓ．タイフィＴｙ２（Ｅ１型）は下記の如くにカーティス及びケリー（１９８７）及びナカザワ、ケリー及びカーティス（１９８７）によって説明されたものと同様の古典的遺伝的方法を用いて遺伝的に一時的変異された。Δｃｙａ−１２  Δｃｒｐ−１１突然変異を含むχ３９２７及び菌株χ４３２３の構造は例５に説明された。Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０突然変異を含む菌株χ４３４６の構造は例６で説明された。無毒性サルモネラ菌株における組み換え核外遺伝子上のクローンされた遺伝子の安定な維持及びハイレベルな発現は平衡致死宿主ベクター系の使用に依存する。これに関し、アスパーテイトβセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを符号化するａｓｄ遺伝子の染色体突然変異は細菌細胞壁の硬い層の重要な成分であり動物において合成されないジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）に関する真正要求を課するためにΔｃｙａ  Δｃｒｐ突然変異株へ導入される。染色体Δａｓｄ突然変異はそこで野性型ａｓｄ+遺伝子をプロセッシングする核外遺伝子クローニングベクターによって補足それる。核外遺伝子の損失の結果ＤＡＰ無し死及び細胞溶解が生ずる。このような平衡宿主ベクター組み合わせは免疫化された動物宿主において数週間安定でありサルモネラのみではなくクローンされた遺伝子産物に対しても強い免疫応答を引き出す。
【０１８６】
構成手順はＳ．タイフィムリウムＬＴ２−Ｚ（χ３５２０）において分離され特徴付けられたΔａｓｄＡ１突然変異のΔｃｙａ  Δｃｙａ  Ｓ．タイフィ菌株への動員よりなる。これはΔａｓｄＡ１突然変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンＴｎ１０の載置及び連鎖された形質のＳ．タイフィ  Ｔｙ２  Δｃｙａ−１２  Δｃｒｐ−１１  菌株χ３９２７，Ｓ．タイフィ  ＩＰＳ１８２０  Δｃｙａ−１２  Δｃｒｐ−１１  菌株χ４３２３，及びＳ．タイフィ  Ｔｙ２  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  菌株χ４３４６へのＰ２２ＨＴｉｎｔ形質導入を介したテトラサイクリン耐性に関する選択及びジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）負表現型に関するスクリーニングを用いた形質導入によって完成された。ΔａｓｄＡ１へ連鎖されたｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０がこの目的のために使用された。
【０１８７】
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠損の形質導入はΔａｓｄＡ１及びｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム上の高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物の最初の製造によって促進された。結果的に得られたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はそこで１０の多重感染における感染及び遺伝子形質を宿主Ｓ．タイフィ  Ｔｙ２菌株χ３９２７，ＩＳＰ１８２０菌株χ４３２３及びχ４３４６へ形質導入するために使用された。
【０１８８】
ファージ−細菌感染混合は１００μｌサンプルが５０μｇ  ＤＡＰ／ｍｌを含むペナッセイ寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで略２０分間インキュベートされ１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された。３７°Ｃでの略２６時間インキュベーションの後、形質導入体は同じ培地に採集され精製された。５つのテトラサイクリン耐性コロニーのスクリーニングはＤＡＰ要求で又ある５つの形質導入体の内の略４を産する。結果として得られたＴｙ２派生物はχ４２９６と称され遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕  ΔａｓｄＡ１  ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０を有する。結果として得られたＩＳＰ１８２０派生物はχ４４１６と称され遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕  Δｃｙａ−１２Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕  ΔａｓｄＡ１  ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０を有し、χ４４３４と称され遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕  ΔａｓｄＡ１  ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０を有する。菌株χ４２９６，χ４４１６及びχ４４３４はＬ肉汁＋５０μｇ  ＤＡＰ／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上で成長させられゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）に１：１０希釈されフザリク酸含入（ＦＡ）＋５０μｇ  ＤＡＰ  ／ｍｌ  培地（マロイ及びヌン、１９８１）上に塗布されそのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。フザリク酸耐性コロニーは０．５ｍｌ  ＢＳＧへ採集されＦＡ＋５０μｇ  ＤＡＰ  ／ｍｌ培地上に精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはＬ肉汁＋５０μｂ  ＤＡＰ／ｍｌに採集され３７°Ｃで混濁に成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全ＬＰＳ及びＶｉ抗原の存在及びシステイン、トリプトファン、メチオニン、スレオニン及び最小培地上のＤＡＰに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株はχ４２９７（Ｔｙ２）と称され、遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕  ΔａｓｄＡ１  Δ〔ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０〕を有し；χ４４１７（ＩＳＰ１８２０），遺伝子型Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕  ΔａｓｄＡ１  〔ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０〕を有し；χ４４３５，遺伝子型Δｃｒｐ−１１  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕  ΔａｓｄＡ１  〔ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０〕を有する。
【０１８９】
野性型親菌株のＡｓｄ-派生物がＣｒｐ+Ｃｙａ+バックグラウンド対Ｃｒｐ-Ｃｙａ-バックグラウンドによる発現される組み換え抗原の生産の比較の目的のために構成された。Ｔｙ２ΔａｓｄＡ１菌株がＰ２２ＨＴｉｎｔ（Ｘ３５２０）を用いたＳ．タイフィＴｙ２菌株Ｘ３７６９及びＳ．タイフィＩＳＰ１８２０菌株Δ３７４４の同時形質導入、テトラサイクリン耐性の選択及びジアミノピメリン酸負表現型に関するスクリーニングによって構成された。結果的に得られたＴｙ２派生物はＸ４４５６と称されＩＳＰ１８２０派生物はＸ４４５４と称され双方は遺伝子型ΔａｓｄＡ１  ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０を有する。菌株Ｘ４４５６及びＸ４４５４はＬ肉汁＋５０μｇ  ＤＡＰ／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌで成長させられゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１：１０希釈され１００μｌサンプルはフザリク酸含入＋５０μｇ  ＤＡＰ／ｍｌ培地（マロイ及びヌン，１９８１年）上に塗布されそのプレートは３７°Ｃで略３５時間インキュベートされた。フザリク酸耐性コロニーがＬ肉汁＋５０μｇ  ＤＡＰ／ｍｌに採集され３７°Ｃで混濁に成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全ＬＰＳ及びＶｉ抗原の存在、及びシステイン、トリプトファン、メチオニン、スレオニン及び最小培地上のＤＡＰに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株はＸ４４５７（Ｔｙ２）及びＸ４４５５と称されΔａｓｄＡ１  Δ〔ｚｈｆ−４：：Ｔｎ１０〕を有する。
【０１９０】
ミコバクテリウムラプラエ抗原の無毒性組み換えＳ．タイフィにおける発現。λｇｔ１１：：ミコバクテリウムラプラエクローンＬ１４（又クローン７．８とも称される）が２１らい種（ＬＬ）らい患者（サシッシュ、エッセル、ソール及びクラーク−カーティス、インフェクト、イミュン、５８，１３２７−１３３６（１９９０））からのプールされた血清を用いてλｇｔ１１：：Ｍ．ラプラエの遺伝学的スクリーニングによって確認され。クローンＬ１４は略１５８及び１５３ｋＤａの二つのタンパク質をスベシファイし、双方はプールされたＬＬ患者の血清（サシッシュ他、１９９０年）において非常に強く反応する。これらのタンパク質は又血清が独立して試験（クラーク−カーティス、ソール、サシッシュ、ボゼッカー、セラ、デカルバルホ及びエッセル、微生物学におけるレス．印刷中）されるとき２１のＬＬ患者の血清の内の１４における抗原を用いて反応する。
【０１９１】
１．０ｋｂ  Ｍ．ラプラエ挿入ＤＮＡ破片が、アガロースゲル電気泳動法による消化破片の分離によって従われる、ＥｃｏＲＩを用いた組み換えファージＤＮＡの消化によってλｇｔ１１クローンＬ１４から除去された。Ｍ．ラプラエ破片はゲルから精製されＡｓｄ+ベクターｐＹＡ２９２（ガラン、ナカザワ及びカーティス、遺伝子（１９９０年），９４：２９）のＥｃｏＲＩ部位にクローンされた。２種類の組み換え核外遺伝子が生成された：それがｌａｃＺプロモータと関連するのと同じｔｒｃプロモータと関連する指向においてＭ．ラプラエ挿入ＤＮＡがｐＹＡ２９２へクローンされたｐＹＡ１０７７、及びＭ．ラプラエ破片がｔｒｃプロモータに関する対向する指向においてクローンされたｐＹＡ１０７８。ｐＹＡ１０７７の部分的限定マップが図２に示されている。双方の組み換え核外遺伝子が大腸菌Ｋ−１２菌株χ６０６０及びＳ．タイフィムリウム菌株χ３７３０へ形質転換されその形質転換体によってスペシファイされたタンパク質がウェスタンブロッティングによって分析された。クローンｐＹＡ１０７７は略３０ｋＤａの単一融合タンパク質をスペシファイし、それはプールされたＬＬ患者の血清において抗体に強く反応する。クローンｐＹＡ１０７８は患者の血清を用いて反応するいかなるタンパク質をもスペシファイしない。
【０１９２】
細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物がＳ．タイフィムリウムχ３７３０＋ｐＹＡ１０７７及びχ３７３０＋ｐＹＡ１０７８上に準備された；これらの溶解産物はＳ．タイフィχ４２９７，χ４４１７，χ４４３５，χ４４５５及びχ４４５７を形質導入するために使用された。３つのランダムに選ばれたｐＹＡ１０７７を用いたχ４２９７の各形質導入体によって生産されたタンパク質のウェスタンブロット分析は各形質導入体はプールされたＬＬ患者の血清を用いて反応する３０ｋＤａのタンパク質をスペシファイしたがｐＹＡ１０７８をハーバーリングする３つの独立χ４２９７形質同流体は遺伝学的反応性タンパク質をスペシファイしなかった（図３）。
【０１９３】
更に、ｐＹＡ１０７７からの遺伝学的反応性タンパク質の発現はχ４４１７，χ４４３５，χ４４５５，及びχ４４５７において又示された。図４はλｇｔ１１：Ｍ．ラプラエクローンＬ１４及びＳ．タイフィによって生産されたタンパク質のウェスタンブロットを示し、Ｓ．タイフィムリウム及びＥ．コリ菌株がｐＹＡ２９２，ｐＹＡ１０７７及びｐＹＡ１０７８をハーバーリングしている。ニトロセルロースフィルター上のタンパク質は２１のらい種らい患者からのプールされた血清を用いて反応させられた。正抗原抗体がサシッシュ、エッセル、ソール及びクラーク−カーティス（１９９０年）５８：１３２７によって説明された技術によって検出された。更に個別には、第２の抗体はアルカリフォスファターゼコンジュゲーティド抗ポリスペシフィック抗体であり色素産生の基質はニトロブルーテトラゾリウム及び５ブロモ４クロロ３インドリルリン酸塩、ｐトルイジン塩であった。図のレーンは下記の通りである：（レーン１）分子サイズ標識；（レーン２）ｐＹＡ１０７７を用いたＳ．タイフィχ４２９７；（レーン３）ｐＹＡ１０７７を用いたＳ．タイフィχ４４１７；（レーン４）ｐＹＡ１０７７を用いたＳ．タイフィχ４４３５；（レーン５）ｐＹＡ１０７７を用いたＳ．タイフィχ４４５５；（レーン６）ｐＹＡ１０７７を用いたＳ．タイフィχ４４５７；（レーン７）ｐＹＡ２９２を用いたＳ．タイフィχ４２９７；（レーン８）ｐＹＡ２９２を用いたＳ．タイフィχ４４３５；（レーン９）ｐＹＡ２９２を用いたＳ．タイフィχ４４５５；（レーン１０）ｐＹＡ２９２を用いたＳ．タイフィχ４４５７；（レーン１１）ｐＹＡ２９２を用いたＳ．タイフィχ４４１７；（レーン１２）ｐＹＡ１０７７を用いたＥ．コリχ６０９７；（レーン１３）λｇｔ１１：：Ｍ．ラプラエクローンＬ１４からのタンパク質；（レーン１４）ｐＹＡ１０７８を用いたＳ．タイフィムリウムχ４０７２。λｇｔ１１：：Ｍ．ラプラエクローンＬ１４によってスペシファイされた遺伝学的反応正タンパク質はβガラクトシダーゼを用いた融合タンパク質であるためサイズにおいてより大きい。
【０１９４】
ｐＹＡ１０７７組み換えベクターを用いたＳ．タイフィ菌株χ４２９７，χ４４１７及びχ４４３５は腸チフス及びらい病に対して防護するために人を免疫価する候補である。それらのワクチンの効験は防護免疫応答を引き出すであろういくつかのＭ．ラプラエ抗原につき一の確認及びそこで人免疫化試験において使用され得たであろうＳ．タイフィΔｃｙａΔｃｒｐΔｃｄｔΔａｓｄ菌株においてＡｓｄ+ベクターにおいてクローンされた遺伝子によってそれらをスペシファイさせることに依存するであろう。
【０１９５】
例８
本例はＳ．タイフィのΔｃｙａΔｃｒｐ突然変異株の生経口ワクチンの安全性、免疫原性、及び効験を試験する過程を提供する。試験される菌株はＴｙ２，ＩＳＰ１８２０及びＩＳＰ２８２２のΔｃｙａΔｃｒｐ派生物である。
【０１９６】
研究された個体。研究された個体は１８乃至３９才の健康な大人であるボランティアである。防護的ボランティアは研究前にスクリーンされる。スクリーニング過程は：
１．医学的経歴
２．物理的検査
３．心電図
４．検尿
５．完全血球算定
６．血液化学（ＢＵＮ，クレアチニン、空腹時血グルコース
７．血清Ｎａ+ 、Ｃｌ- 、Ｋ+ 、ＨＣＯ3 - 
８．ＶＤＲＬ
９．Ｂ型肝炎表面抗原
１０．ＥＬＩＳＡによるＨＩＶ抗原
１１．妊娠テスト（女性）
１２．肝機能テスト（ＳＰＧＴ）
１３．心理学的検査及びインタビュー。
研究に参加するボランティアは一般的良好な健康を基準として選択され更に：
１．胆嚢の病気、免疫不全、心臓血管の病気、呼吸器系統の病気、内分泌の病気、肝炎、腎臓及び膀胱の病気の病歴を含む肝臓の病気、前立腺肥大、緑内障、消化器系統の病気、細網内皮系の病気、神経弛緩の病気、入院を要する精神医学の病気、薬物又はアルコール乱用の臨床的に実質的な経歴が無く；
２．正規母集団に関して定義された限界内にある通常そして規則正しい腸習性を持ち即ち：下剤又は下痢止め薬のしばしばの使用なしに少なくとも週に３回の便通及び日に３回未満の便通があり；
３．アモキシリン又はシプロキサシンに対するアレルギーが無く；
４．ワクチン接種の前７日間に抗生物質治療の経歴が無く；
５．陰性妊娠テスト（女性）を受け；
６．陰性ＨＩＶ抗体テストを受ける。
【０１９７】
ボランティアは隔離病室に入室を許可され、そして情報提供され、立会われ、記載された承諾が得られる。
【０１９８】
研究設計。２２人のボランティアが研究される。基線血液及び腸液体標本が収集される。その室での２日間の環境順化の後、空腹のボランティアがランダムにＴｙ２，ＩＳＰ１８２０又はＩＳＰ２８２２のΔｃｙａΔｃｒｐ派生物のいずれかの５ｘ１０5を含む重炭酸緩衝一経口供与量を用いて摂取することが許容される。ボランティアは次の１５日間副作用に関して観察される（発熱、不快感、悪寒、嘔吐、下痢）（腸チフスの通常のインキュベーション期間は８乃至１２日である）。連続した血液及び大便培養が得られる。更に温度の高さが１００．８°Ｆあるボランティアはだれでも観察がなされる際に血液サンプルが採られる；温度が１２時間このレベルに高められたままである場合、経口アモキシリン（各６時間毎に１．０グラム）及び経口シプロフロクサシン（１０日間、各１２時間毎に７５０ｍｇ）を用いた療法が開始される。十二指腸液培養が７，１０及び１３日での観察の期間に又得られる。
【０１９９】
動物試験。アジュバンドとしての豚胃粘素を用いた腹腔内接種によるマウスにおける親菌株に関するＬＤ50及び弱毒化された派生物が又決定された。
【０２００】
ワクチン接種物の準備。Ｓ．タイフィ候補ワクチン菌株の保存培養が、必要となるまで−７０°Ｃで、１５％グリセロールによって補足され、トリプチケース大豆肉汁培地（ＴＳＢ）において細胞懸濁として貯蔵された。各菌株の接種物を製造するためにその懸濁は挑戦の二日前に解かされ羊赤血球寒天（ＴＳＡにおける５％ｓｒｂｃ）上に載置される。夜通しの３７°Ｃでのインキュベーションの後、略２０乃至３０典型的なコロニーが採集され塩類液において懸濁された。この懸濁はトリプチケース大豆肉汁培地上に接種され、適当に補足され、そしてそのプレートは３７°Ｃで夜通しインキュベートされる。ボランティアに経口的にワクチン接種するための準備において、これらのプレート上の成長は各プレート毎に略３ｍｌ無菌通常塩類液を用いて収穫される。結果的に得られた懸濁は濁り分析的に標準化される。要求されるサルモネラの濃縮を近似させるために塩類液において希釈がなされた。ワクチン接種物は氷上の隔離室に移動させられた。顕微鏡的検査及びスライド凝集が使用前にＳ．タイフィＯ及びＨ抗血清を用いて実行された。レプリカ塗布プレート定量培養が生存度及び接種物サイズの確認のためにワクチン接種の前後にその接種物から製造された。
【０２０１】
ボランティアの接種。そのワクチンは経口経路によってＮａＨＣＯ3を用いて投与される。ボランティアはワクチン接種前に９０分間ＮＰＯである。２グラムのＮａＨＣＯ3が５オンスの蒸留水において解かされる。ボランティアは４オンスの重炭酸イオン水を飲み；１分後ボランティアは残った１オンスの重炭酸イオン水に懸濁されたワクチンを接種する。ボランティアは接種後９０分間食事と水を採らない。
【０２０２】
標本収集に関する過程。
【０２０３】
大便標本。ボランティアを通過させられた全ての大便の数、コンシステンシー、及び説明の記録が採られる。各大便（又は大便が通過させられない場合直腸綿棒）の標本が培養に関して収集された。標本の体積が計測された。５点システムでグレード分けされた：
グレード１−硬い大便（通常）
グレード２−柔らかい大便（通常）
グレード３−濃い液体（異常）
グレード４−不透明な水のような（異常）
グレード５−米磨ぎ汁様（異常）。
【０２０４】
静脈切開。抗体決定に関する血清がワクチン接種前及び８，２１，２８，６０，及び１８０日後に得られる。抗体スクリーニング細胞アッセイに関するリンパ球分離に関するヘパリン化血は０，４，７，及び１０日に収集された。０，２８，６０、及び１８０日に収集された単核細胞はサルモネラに対するリンパ球増殖性応答を査定し抗原を制御するために使用される。最後に０，２８，６０及び１８０日からの単核細胞は又、Ｓ．タイフィに対する抗体依存細胞毒性アッセイ及び生体の制御において使用される。血液（５ｍｌ）が後ワクチン接種観察期間の３，４，７，８，１０，１２，及び１５日に培養に関してワクチン生体の検出のために得られる。更なる血清の標本及び単核細胞が一次ワクチン接種後１８０日に得られた。
【０２０５】
空腸液吸引。経口ワクチン接種前及び放出の直ぐ前（１５日），ボランティアは局所ＳＩｇＡ抗体の測定のために腸液を収集するために口から１３０ｃｍの距離へポリ塩化ビニル腸チューブをのみ下す。１０ｍｇのメトクロプラミドがチューブの摂取の後にその胃から幽門を通して小腸への通過を促進するために傾向的に与えられる。チューブの空腸への載置は距離（１３０ｃｍ）、吸引された液体の色（黄色−緑），及びｐＨ（６）によって証明される。略１００ｍｌの空腸液体が各挿管毎に取り去られる。
【０２０６】
ゼラチンストリングカプセル。各ワクチン菌株を用いた腸定着率の決定のため、ゼラチンストリングカプセル（エンテロテスト）がボランティアによって入院の期間に３回摂取された。
【０２０７】
ボランティアはＡＭ６時からＮＰＯである。水の飲み下しは口及び喉を湿らすためになされた。引き出されたストリングの位置を用いたカプセルはナイロンストリングのループを保持しながら水で飲み下される。その線は顔に向かって確保され、決められた場所で４時間置かれる。ボランティアは任意に水を飲むことを許されるが、他の食料又は飲物を採ることは許されない。４時間後その線は引き抜かれ、胆汁で染められた粘液で浸された末端部が切り取られ無菌ペトリ皿に載置され、それは確認のためにラベルが付けられる。そのストリングはそこで微生物に関して大便標本を用い場合と同じ方法で培養される。
【０２０８】
扁桃培養。扁桃リンパ組織のワクチン接種後の可能な侵入を検出するために連続的な扁桃培養が３，４，７，８，１０，１２及び１５日に得られる。
【０２０９】
細菌学的分析。大便、直腸綿棒、及び接種されたゼラチンカプセルからの胆汁に染められた十二指腸ストリングの末端１５ｃｍがセレナイトＦ豊富肉汁に接種される。扁桃綿棒がＧＮ肉汁に接種される。夜通しの３７°Ｃでのインキュベーションの後、副次培養が、双方共ワクチン菌株の栄養素要求性に関して適当に補足されたＳＳ（サルモネラ−シゲラ）寒天培地及びＸＬＤ寒天培地上に作られた。疑わしいコロニーが補足されたトリプルシュガーアイアンスラント及びＳ．タイフィＶｉを用いた凝集によってなされる確認に移動させられる。これらの隔離集団は（例えば核外遺伝子の存在に関する又はクローン遺伝子に関する特異遺伝子プローブを用いたサザンブロッティングに関する）更なる分析のためにグリタロールにおいて−７０°Ｃで保管される。
【０２１０】
血液培養（５ｍｌ）は補足されたブレインハートインフュージョン肉汁の５０ｍｌに接種される。
【０２１１】
免疫学的分析。血清及び空腸液標本はレビン他、（１９８７年）、Ｊ．クリン．インベスト．７９：８８８−９０２によって説明された過程を使用してＥＬＩＳＡによって測定されたＳ．タイフィＯ，Ｈ，及びＶｉ抗原に対するＩｇＡ，ＩｇＭ，及びＩｇＧ抗体に関して試験される。Ｈ抗体は又抗原Ｓ．バージニア（Ｓ．バージニアはＳ．タイフィと同一のベン毛抗原を分担する）を使用してウィダルチューブ凝集によって測定される。
【０２１２】
周辺血液単核細胞が収集されサルモネラ抗原に対する特異な応答の研究に関して分割される。これらは下記のものを含む。
【０２１３】
１．抗体分泌細胞：Ｓ．タイフィＯ，Ｖｉ又はＨ抗原に対するＩｇＧ，ＩｇＡ又はＩｇＭ抗体を分泌するトラフィッキングリンパ球はカンテーレ他の方法によって測定される。
【０２１４】
２．複製リンパ球：周辺血液単核細胞は抗原駆動リンパ球複製を検出するために、上述のレビン他によって説明された如くに、ヒートフェノール不活性Ｓ．タイフィ、Ｓ．タイフィムリウム、Ｓ．ソンプソン、及びＥ．コリと混合される。
【０２１５】
３．ＡＤＣＣ：Ｓ．タイフィのプラズマ媒介単核細胞抑制が前述のレビン他で説明された如くの抗体依存細胞様細胞毒性アッセイにおいて測定される。
【０２１６】
ワクチン菌株の排出。ワクチン菌株の排出がワクチンの供与量の後１週間以内で終わるであろうということが予測される。排出が７又はそれ以上の日数続いた場合、排出を続けているボランティアはシプロフロクサシン（各１２時間毎に７５０ｍｇ）供与量が与えられる。≧２連続日数間の陰性培養が放出のために要求される。
【０２１７】
例９
本例は野性型親菌株、Ｔｙ２から準備されたΔｃｙａΔｃｒｐ  Ｓ．タイフィ菌株χ３９２７の安全性及び免疫原性を示す。この菌株のマウスに於けるＬＤ50は（去勢豚胃粘素を用いた腹腔内注射を使用して）１．８ｘ１０4である。
【０２１８】
引き続く過程は本質的に前述の例８にて説明したものであった。ボランティアの二つの同齢集団が異なる供与量のワクチンが与えられた研究に使用された。その第１の研究において、１７人のボランティアが二重盲検法にてランダマイズされた；６人のボランティアは５ｘ１０5ｃｆｕのχ３９２７を受け、残りの人は他のＳ．タイフィ菌株の同じ供与量を受けた。第２の研究では、１９人のボランティアが二重盲検法にてランダマイズされた；６人のボランティアは５ｘ１０4ｃｆｕのχ３９２７を受け、残りの人は他のＳ．タイフィ菌株の同じ供与量を受けた。ボランティアは１５日間（第１の研究）又は２４日間（第２の研究）隔離室で厳密に監視された。生存兆候が観察期間中各６時間毎に測定された。各ボランティアからの全ての大便はプラスチック容器に収集され、検査され、５点スケールでグレード分けされ、そして大便がゆるい場合には体積が測定された。ボランティアは医師によって毎日インタビューされ症候について尋ねられた。発熱は口腔の温度≧３８．２°Ｃとして定義された。下痢は４８時間以内の２又はそれ以上のゆるい大便が合計して少なくとも２００ｍｌの体積あるか又は一回のゆるい大便≧３００ｍｌであるとして定義された。抗生物質療法が発熱又は陽性血液培養を発するボランティアに与えられた。
【０２１９】
ワクチンを準備するために−７０°Ｃで１５％グリセロールを用いたトリプチケース大豆肉汁上で維持されてきたχ３９２７の貯蔵培養が解かされ補足されたアロ寒天上で成長させられた。３７°Ｃでインキュベートされた後、２０乃至３０のワクチン菌株の典型的なコロニーがアロ寒天から採集され、塩類液において懸濁され、そして再びアロ寒天上に接種された。３７°Ｃで夜通しインキュベートされた後、その細菌は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の３ｍｌを用いて収穫され細菌の濃度が濁り分析的に標準化された。その懸濁の希釈がミリメーター毎の生存可能な生体の所望の濃度を達成するためにＰＢＳにおいてなされた。接種物の同一性は顕微鏡的検査によって及びＳ．タイフィＯ，Ｈ，及びＶｉ抗血清を用いたサイド凝集によって確認された。複製塗布プレート定量培養が生存可能性及び接種物のサイズの確認のためにワクチン接種の前後にその接種物より作られた。
【０２２０】
ワクチン菌株はソディウムバイカーボネートを用いて経口経路によって投与された。ソディウムバイカーボネート（２ｇｍ）は１５０ｍｌの蒸留水において解かされボランティアは胃酸を中和するために１２０ｍｌ飲んだ。一分後、バイカーボネート溶液の残りの３０ｍｌに懸濁されているワクチンを飲んだ。ボランティアはワクチン接種の前後の９０分間飲まず食わずであった。
【０２２１】
ボランティアによって通過させられた各大便（及び大便が通過させられなかった場合には直腸綿棒）がワクチン菌株のために毎日培養された。大便は０．１％ＰＡＢＡ及び０．１％ＰＨＢによって補足されたグラム陰性肉汁（ＢＢＬ，コッキースビル、ＭＤ）へ及び補足を用いてＳ−Ｓ寒天上に直接接種された。３７°Ｃでの夜通しのインキュベーションの後、１ｇの大便が連続的に塩類液において１０フォルド希釈され各希釈は上記の如くに補足されたＳ−Ｓ寒天上に載置された。疑わしいコロニーがトリプルシュガーアイアンアガースラントに移動させられ同一性がＳ．タイフィＯ，Ｈ，及びＶｉ抗血清を用いた凝集によって確認された。
【０２２２】
ワクチン接種の後７，１０，及び１３日に絶食しているボランティアは胆汁に染められた十二指腸液のサンプルを収集するためにストリングデバイスを含むゼラチンカプセルを飲み下した。４時間後、そのストリングは除去され末端１５ｃｍの色とｐＨが記録された。十二指腸液はストリングの端から絞られ上記の如く培養された。
【０２２３】
ワクチン生体の培養のための血液はワクチン接種の４，５，７，８，１０，１２及び１５日後に及び発熱が発生した場合には再び系統的に収集された。血液の５ｍｌが補足されたアロ肉汁の５０ｍｌに接種された。
【０２２４】
更に、扁桃培養がそのワクチン菌株の検出のために１，２，４，５，７，８，１０，１２及び１５日に得られた。扁桃に当てられた綿棒は補足を用いたグラム陰性肉汁に２４時間及びそこで補足されたサルモネラ−シゲラ寒天に接種された。
【０２２５】
免疫が九滴応答を決定するために、下記の過程が続けられた。血清サンプルがワクチン接種の前及び７，２１，２８及び６０日後に得られた。空腸液が例８にて説明した如くに、ワクチン接種の前及び１４日後に収集された。その液体の合計のＩｇＡ含有量はＥＬＩＳＡによって測定され各標本は１００当たり２０ｍｇのＩｇＡを含むように標準化された。Ｓ．タイフィリポ多糖（ＬＰＳ）、Ｈ，及びＶｉ抗原が血清及び空腸において測定された。
【０２２６】
ＬＰＳ  Ｏ  抗原に対するＩｇＡ抗体がＥＬＩＳＡによって検出された。１：１００希釈において試験された前及び後ワクチン接種血清間のネット光学濃度≧０．２０における上昇は意味のある上昇と考えられた。各マイクロタイタープレートと共に使用された正制御血清はハイレベルのＬＰＳ  Ｏ抗体を含み、Ｔｙ２１ａワクチンによる免疫化の後に強いＩｇＧ  ＬＰＳ  Ｏ抗体応答を有した健康な１２人のチリ人からの血清のプールを表示した。ＬＰＳ  Ｏ抗原に対するＩｇＡ抗体が血清の１：２５希釈から開始した２フォルド希釈を使用して測定された。ＩｇＡ力価は４フォルド上昇が前及び後ワクチン接種過程に発生した場合意味があると考えられた。
【０２２７】
Ｓ．タイフィＬＰＳ  Ｏ抗原に対する腸分泌ＩｇＡ抗体が又ＥＬＩＳＡによって測定された。４フォルド上昇は意味があると考えられた。
【０２２８】
Ｈ抗体を測定するために、Ｈ−ｄベン毛抗原がＳ．タイフィ菌株５４１Ｔｙから準備された。Ｈ−ｄ抗体に関する血清及び空腸液がＥＬＩＳＡによって測定された。力価における４フォルド上昇は意味があると考えられた。
【０２２９】
Ｈ抗体に関するウィダールチューブ凝集テストがＳ．タイフィと他の抗原ではなくベン毛抗原ｄを分担するサルモネラバージニアを使用して実行された。
【０２３０】
Ｖｉ抗原がＥＬＩＳＡによって血清及び空腸液において測定され；４フォルド上昇が意味があると考えられた。
【０２３１】
ＩｇＧ，ＩｇＡ，又はＩｇＭ抗体をＳ．タイフィＯ，Ｈ，又はＶｉ抗原に対して分泌するガットデライブド、トラフィッキング抗体分泌細胞がフォレスト他（（１９８８年），ランセット１：８１）の方法の変更によってＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＰＯＴアッセイの双方を使用して測定された。ヘパリン化血がワクチン接種の前及び７及び１０日後に引き抜かれた。簡単に、フィコーグラディエント（オルガノンテクニカ、デュルハム、ＮＣ）によって分離された周辺血リンパ球が抗原塗布プレートに付加された。ＥＬＩＳＡにおいて、リンパ球によって分泌された抗体の結束が結束された抗ＩｇＡコンジュゲートを用いた基質の反応によって生産された光学濃度における変化によって測定された。ＬＰＳ、Ｈ，及びＶｉ抗原に対するに対する意味のある応答がこれらの研究において参加しているボランティアから取られた免疫化前及び４日細胞から生成されたＯ．Ｄ．プラス３  Ｓ．Ｄ．における差異を使用して決定された。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、個々のリンパ球によって分泌された特異なＩｇＡが各ウェルへのアガロースオーバーレイの付加及び結束された抗人ＩｇＡコンジュゲートを用いた基質の反応によって生産された色付きスポットの計数によって検出された。ワクチン接種後のウェル毎に≧４スポットの検出は正反応として定義され；この数はワクチン接種前に計数されたスポットの平均数プラス２  Ｓ．Ｄ．に基づいている。
【０２３２】
その結果得られたものは下記の通りである。
【０２３３】
ワクチン接種後のボランティアの臨床的兆候は二重盲検法において評価された。菌株χ３９２７を受けた１２人のボランティアの内の一人が発熱した。このボランティアはワクチン接種後２２日に最高温度４０．１°Ｃまで熱が上がった。このボランティアは４乃至１３日に深刻な急激な腹痛、不快感、食欲不振、頭痛、及び嘔吐にみまわれたが、彼の発熱は２２日までには始まらなかった。彼の兆候はそこでめまい、筋肉及び身体痛、便秘、不眠症、及び茶色の痰を生産するせきを含んだ。このグループの他のボランティアの一人は入院患者監視期間に不快感、急激な腹痛、頭痛、及び吐き気にみまわれた。
【０２３４】
細菌学的研究は５ｘ１０4を受けた６人のボランティア中の一人及びχ３９２７の５ｘ１０5ｃｆｕを受けた６人のボランティア中の一人が陽性血培養を有することを示した。これらは１５日及び８及び１２日に夫々発生した。これらのボランティアの何れもどのような兆候も有していなかった。χ３９２７を受けた１２人のボランティアの内の一人は１日の大便において検出されたワクチン生体の一コロニーを有した。これらのボランティアはだれも陽性扁桃又は十二指腸ストリング培養を有しなかった。ボランティアの血及び大便から回復されたχ３９２７隔離集団は全てΔｃｙａΔｃｒｐ突然変異の存在に関連する予測される表現型を保有した。
【０２３５】
免疫学的研究はχ３９２７を受けた１２ワクチン中の６（５０％）がＩｇＧ抗Ｓ．タイフィＬＰＳ応答を発現させることを示した。Ｈ抗原又はＶｉに対する抗体は１２人のボランティアの何れにも検出されなかった。１２人のボランティア中の一人のみが空腸液におけるＬＰＳに対する分泌ＩｇＡを発現した。Ｈ抗体に対する分泌ＩｇＡ抗体応答がたった一人のボランティアに発生しワクチン接種後分泌抗Ｖｉ抗体を持つボランティアは一人もいなかった。１２人のボランティア中の５人がＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＡＳＰＯＴアッセイによって検出されたＬＰＳに対するＩｇＡを分泌する循環細胞を発現された。環状ＡＭＰ調節経路における遺伝子欠失によって与えられる弱毒化の度合いは突然変異株及び親菌株を用いたボランティアの同時挑戦無しには厳密には測定され得なかった。しかし、野性型菌株の同様な供与量が与えられたボランティアを用いた歴史的経験に基づくと、その遺伝子欠失がＳ．タイフィの弱毒化を与えるようである。野性型Ｓ．タイフィ菌株Ｔｙ２が重炭酸イオン無しに１ｘ１０7の供与量で６人のボランティアに与えられたとき、８３％が（＞３６時間１０３°Ｆの温度として定義される）腸チフス又は（＞５日間の低グレード発熱、意味のある血清学的応答、陽性血培養又はＳ．タイフィの排泄として定義される）感染を発現した。対照的に、Ｔｙ２から派生されたχ３９２７ワクチンを重炭酸イオンを用いて（重炭酸イオン無しの余程高い供与量と同等）１０4又は１０5ｃｆｕ供与量で受けたここで報告された１２人のボランティア中、たった一人のボランティアが発熱を発生したった二人のボランティアが陽性血培養を発生した。その上、熱病にみまわれたボランティアは、発熱時に付加的に収集された血培養であるにもかかわらず彼らの血液においてワクチン細菌が検出されなかった。発熱はワクチンによる腸の感染によって刺激されたシトキネスの放出に対する応答において発生したようである。
【０２３６】
例１０
本例はΔｃｄｔ突然変異を含むΔｃｒｐ−１０  Δｃｙａ−１２  Ｓ．タイフィ構造物の構造及び特徴を説明する。我々はＳ．タイフィＴｙ２（Ｅ１型）及びＳ．タイフィＩＳＰ１８２０（チリ人伝染病４６型隔離集団）へΔｃｙａΔｃｒｐ突然変異を導入した。Δｃｙａ−１２及びΔｃｒｐ−１１突然変異による前者の菌株は既に例９に説明した如くに人ボランティアにおいて評価された。５ｘ１０4ｃｆｕを受けた６人のボランティアの内の一人及び５ｘ１０5 ｃｆｕのΔｃｒｐ−１０  Δｃｙａ−１２  Ｓ．タイフィ菌株、χ３９２７、を受けた６人のボランティアの内の一人が陽性血培養を有した。これらは夫々１５日及び８及び１２日に発生した。しかし、これらのボランティアはだれもどのような兆候も示さなかった。更に、必ずしも全ての免疫化された個体がＳ．タイフィ抗原に対する高力価抗体応答を発現しなかった。免疫化されたこれらの大多数における防護的免疫の誘発に関するより高い経口供与量を許容するであろう更なる弱毒する突然変異が所望される。我々は減少させられた毒性を結果的に生じよってより高い供与量を許容するはずであるΔｃｒｐ−１０  Δｃｙａ−１２  Ｓ．タイフィ菌株へ導入された更なる遺伝子欠損を確認した。この欠損は深い組織への定着（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｅｐ  ｔｉｓｓｕｒｅ）に関してｃｄｔと称された遺伝子における遺伝子欠失である。Δｃｙａ及びΔｃｄｔ突然変異に加えてΔｃｄｔ突然変異を用いた菌株は又ΔｃｙａΔｃｙａ突然変異のみによる菌株の場合よりも人の血清においてより生存できない。それらはよってよりたやすく取り除かれるはずであり血中にワクチンを有する状態を誘発できないようである。
【０２３７】
菌株構造。野性型、毒性Ｓ．タイフィＴｙ２（Ｅ２型）及びＩＳＰ１８２０（４６型）菌株がカーティス及びケリー（（１９８７年）、インフェクト．イミュン．５５：：３０３５−３０４３）で説明され、例１に説明した方法と同様の方法による古典的遺伝学を使用して遺伝的に一時的変異された。アデニレートシクラーゼ及び環状ＡＭＰ受容タンパク質が損なわれたネズミチフス菌遺伝子欠失突然変異株は無毒性であり免疫原性である。インフェクト．イミュン．５５：：３０３５−３０４３．（１）。その手順はトランスポゾンＴｎ１０（テトラサイクリン耐性を符号化する）のｃｙａ又はｃｒｐ遺伝子欠失の近くへの載置によってＳ．タイフィムリウムＳＬ１３４４において分離され特徴付けられたｃｒｐ−ｃｄｔ（Δｃｄｔ−１０と称された）及びｃｙａ遺伝子の遺伝子欠失の形質導入を促進することよりなる。よって我々は夫々Δｃｒｐ−１０に連鎖されたｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０及びΔｃｙａ−１２に連鎖されたｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を使用し、テトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスクリーニングを用いてＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて連鎖された形質を高毒性Ｓ．タイフィＴｙ２及びＩＳＰ１８２０菌株へ同時形質導入した。
【０２３８】
連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔｃｒｐ−１０ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１２上へ高力価細菌ウイルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物を及びΔｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を含むＳ．タイフィムリウム菌株χ３７１１上へ別の溶解産物を最初に製造することによって促進された。結果的に得られたＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物はそこで遺伝的形質を宿主Ｓ．タイフィＴｙ２（χ３７６９）及びＩＳＰ１８２０（χ３７４４）菌株へ１０の多重感染で感染させ形質導入するのに使用された。
【０２３９】
Ｓ．タイフィムリウムχ３７１２（Δｃｒｐ−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０）上で増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔは毒性Ｓ．タイフィＴｙ２及びＩＳＰ１８２０菌株をＭａｌ-Ｔｅｔrに形質導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｌサンプルが１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマッコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布される前に３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃで略３６時間インキュベートの後、形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結果的に得られたＴｙ２派生物はχ３７９２と称されＩＳＰ１８２０派生物はχ４３２４と称された。双方の菌株は遺伝子型Δｃｒｐ−１０  ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０を有する。菌株χ３７９２及びχ４３２４はルリア肉汁1＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１：１０希釈された。（1ルリア肉汁はリッター当たり１０ｇのＮａＣｌを含み他方レノックス肉汁はリッター当たり５ｇのＮａＣｌを含む。高容量オスモル濃度培地において成長させられたサルモネラ細胞は組織培養細胞に侵入する増加された能力を示す（ガラン及び  カーティス、インフェクト．イミュン．（１９９０）５８：１８７９−１８８５；侵入のために要求されるサルモネラ遺伝子の発現はＤＮＡスーパーコイリングにおける変化によって調整される）。よって、ルリア肉汁における増加されたＮａＣｌレベルはワクチン菌株の最適有効性を確実にする。）各々の菌株の１００μｌのサンプルはフザリク酸含入（ＦＡ）培地（マロン及びヌン（１９８１年），Ｊ．バクトリアル．１４５：１１１０−１１１２）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーは０．５ｍｌ  ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に線条接種によって精製された。精製されたフザリク酸耐性コロニーはルリア肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃで成長させられＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株はχ３８０３（Ｔｙ２）及びχ４３２５（ＩＳＰ１８２０）と称され、それらは遺伝子型Δｃｒｐ−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕を有する。
【０２４０】
Ｃｙａ-及びＣｒｐ-／Ｃｄｔ-突然変異株の表現型は同じ（Ｍａｌ-，Ｓｔｌ-，Ｍｔｌ-，他）であるので、クローンされた野性型ｃｒｐ+遺伝子をそのプロモーターを用いてキャリーする（シュローダー及びドブロゴッツ（１９８６）、Ｊ．バクテリオル  １６７：６１６−６２２）、核外遺伝子、ｐＳＤ１１０，が染色体において（よってその菌株を野性型表現型に回復させる）一時的にΔｃｒｐ突然変異を補足しΔｃｙａ突然変異を用いた菌株の確認を形質導入後に可能とするために使用された。χ３８０３及びχ４３２５のルリア肉汁培養はＳ．タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐＳＤ１１０を含む。選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ+ コロニーが採集されマッコンキー寒天＋１％マルトース寒天上に精製されχ３８２４（Ｔｙ２）及びχ４３３１（ＩＳＰ１８２０）と称されそれらは遺伝子型Δｃｒｐ−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+を有する。
【０２４１】
菌株χ３８２４及びχ４３３１はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はΔｃｙａ−１２及び連鎖されたｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０突然変異を導入するためにχ３７１２上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて独立して形質導入された。マルトース負、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性表現型に関する選択はマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上でなされた。アンピシリン耐性（ｐＳＤ１１０+），テトラサイクリン耐性（ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０），Ｍａｌ-（Δｃｙａ）コロニーはマッコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に採集され精製された。精製されたコロニーはルリア肉汁に採集され混濁へ成長させられその菌株は完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。正しい表現型の隔離集団はχ３９１９（Ｔｙ２）及びχ４３４０（ＩＳＰ１８２０）と称され、それらは遺伝子型Δｃｒｐ−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕ｐＳＤ１１０+Δｃｙａ−１２  ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０を有する。χ３９１９及びχ４３４０の培養はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１：１０希釈され、そして各培養の１００μｌサンプルがフザリク酸含入培地上に塗布され３７°Ｃで略３６時間インキュベートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーが採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたＦＡ耐性コロニーはルリア肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ１０（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシステイン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。ｐＳＤ１１０核外遺伝子はアンピシリンの不在における菌株の成長の間自然に失われた。アンピシリン感受性及び核外遺伝子無しの最後の菌株はχ３９２４（Ｔｙ２）及びχ４３４５（ＩＳＰ１８２０）と称されそれらは遺伝子型Δｃｒｐ−１０  Δ〔ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ１０〕Δｃｙａ−１２  Δ〔ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ１０〕を有する。ベン毛の運動性の表示を用いた合成は機能的ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子に部分的に依存しベン毛が重要な抗原であるので、我々はベン毛合成及びｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子機能から独立する機能を許容する抑圧遺伝子突然変異（ｃｆｓ）を所有するχ３９２４及びχ４３４６の派生物を選択した。χ４０７３はχ３９２４のベン毛正派生物として選択されχ４３２６はχ４３４５のベン毛正派生物として選択された。図１０は野性型親菌株及びそれらのΔｃｙａΔｃｒｐ派生物が記載されている。
【０２４２】
菌株χ４０７３及びχ４３４６は下記の表現型特徴によって容易にそれらの野性型親と区別され得る：炭素源マルトース、マンニ  トール、ソルビット、メルビオース及びキシロースを醗酵又は成長させる能力が無いこと、Ｈ2Ｓを生産する能力が無いこと、増加させられた世代時間、及び意味のある程度に増加させられたマウスＬＤ50値。
【０２４３】
【表３０】
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χ３７４４，χ３７６９，χ４０７３，及びχ４３４６に関する成長条件
各菌株の細胞は寒天培地から２ｍｌルリア肉汁に採集された。培養は３７°Ｃで略１４時間静止培養としてインキュベートされた。その培養が視覚的に混濁（ＯＤ600 ≧０．５）のとき、白金耳量の各培養がいくつかの表現型特性を実証するために表１１に記載された培地上の分離された培養に関して線条接種させられた。培養は又ファージ、抗生物質罹病性、野性型ＬＰＳを生産する能力、栄養素要求性、運動性、コリシンを生産する能力が無いこと、核外遺伝子ＤＮＡの不在、平均世代時間、及び抗血清によるＳ．タイフィ（図１１参照）のＯ，Ｈ，及びＶｉ抗原を確認するための凝集に関して試験された。全ての菌株の表現型特性がそれらの野性型親よりも意味がある程度遅く成長するΔｃｙａΔｃｒｐ菌株χ４３４６及びχ４０７３を用いて予測された如くであった。
【０２４４】
【表３１】
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【０２４５】
【表３２】
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【０２４６】
【表３３】
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【０２４７】
【表３４】
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寒天培地上の成長特徴
菌株は３７°Ｃでのスタンディングオーバーナイト培養としてのルイア肉汁において成長させられ、ゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）において希釈され、そして分離されたコロニー形成単位（ｃｆｕ）を達成するために１％マルトースを含むマッコンキー寒天上に載置された。与えられた菌株の全てのコロニーはサイズ及び色において均一に見える。Δｃｙａ  ｃｒｐ菌株のそれらの野性型親に比較して遅い成長率によって、マッコンキー寒天上の成長はχ４０７３及びχ４３４６のコロニーが容易に目視できる前に３７°Ｃで略３７＋  時間かかる。
【０２４８】
突然変異株表現型の安定性
χ４０７３及びχ４３４６の５０フォルド濃縮培養及び様々な希釈（略  １０9，１０7，１０5，１０3ｃｆｕ／プレート）がそれらの成長を保持すべきでない０．５％マルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースの何れかを含む（２２μｇ  Ｌアルギニン／ｍｌ、２２μｇ  Ｌシステイン及び２０μｇ  Ｌトリプトファン／ｍｌにしよって補足された）最小寒天培地上にプレートされた。１対のプレートの内の１セットは紫外線照射（５ジュール／ｍ2／秒）され暗がりで３７°Ｃでインキュベートされた。他の１セットは証明を用いて３７°Ｃでインキュベートされた。復帰突然変異体及び／又は突然変異株は４８時間の成長期間の後に検出されらかった。
菌株の貯蔵
各菌株は１％ペプトン−５％グリセロール懸濁において維持され−７０°Ｃで貯蔵された。
【０２４９】
動物実験に関する接種物の準備
下記はマウスの腹腔内の（ｉ．ｐ．）接種に関する各ワクチン菌株とその親の成長及び懸濁に関する標準化されたプロトコルである。
【０２５０】
雌ＣＦＷマウス（１８乃至２０ｇ）（チャールズリバー、ウィルミンク゛トン、ＭＡ）が野性型Ｓ．タイフィのＬＤ50値及びΔｃｒｐ−１０Δｃｙａ−１２派生物の毒性の決定のために使用された。静止夜通し培養（３７°Ｃ）が予め温められたルリア肉汁に１：２０希釈されＯＤ600≦０．０８に達するまで３７°Ｃ（１５０ｒｐｍ）で通気された。野性型及びΔｃｒｐ−１０  Δｃｙａ−１２  Ｓ．タイフィ細胞が１５％（重さ／体積）去勢豚胃粘素（アメリカン研究所、オマハ、ＮＢ）において懸濁された。その１５％粘素懸濁はｐＨ７への中性化、１５ｐ．ｓ．ｉで１２１°Ｆで１０分間のオートクレービングによって準備され、新鮮に準備された無菌第２鉄アンモニウムシトレート／ｍｌ（シゲラ、Ｓｔ．ロウイス、ＭＯ）の３μｇが適当に希釈されたＳ．タイフィ細胞の付加に先立ち付加された。その細胞懸濁はそこで５００μｌ体積において２３ゲージニードルを使用してＣＦＷマウスにｉ．ｐ．投与された。野性型親及びΔｃｒｐ−１０  Δｃｙａ−１２派生物のＬＤ50が７２時間の死亡率データの記録の後に決定された。野性型親に関するＳ．タイフィ突然変異株の毒性に関する結果に関して表１２を参照されたし。
【０２５１】
【表３５】
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哺乳類細胞培養粘着性及び侵入性アッセイ
Δｃｒｐ−１０  Δｃｙａ−１２及びΔｃｒｐ−１１  Δｃｙａ−１２菌株のＣＨＯ細胞へ粘着及び侵入する能力に関する野性型親菌株と比較したデータが表１３に示されている。Ｓ．タイフィ突然変異株は、３７°Ｃで、夫々２時間及び４時間を通してＣＨＯ細胞の単層に粘着及び／又は侵入する野性型親菌株に比較して減少された能力を示している。
【０２５２】
【表３６】
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通常人の血清における突然変異株の野性型親に比較した成長及び残存
成長カーブは先に野性型Ｓ．タイフィを用いて吸収された通常人において実行された。略１０6ｃｆｕのＳ．タイフィ  Δｃｙａ  Δｃｒｐ及び野性型菌株が５％ＣＯ2室において３７°ＣでＨＥＰＥＳを用いて平衡化された各ｍｌの血清に付加された。補体媒介された溶菌活動性が１０分間６０°Ｃでの血清の不活性化及び６０分後のＥ．コリＫ−１２の成長のチェックによって実証された。通常の血清において、Ｅ．コリＫ−１２細胞は６０分後血清において殺された。
【０２５３】
特に、χ３７４４（ＩＳＰ１８２０，野性型）、χ３７６９（Ｔｙ２，野性型）、χ４０７３（Ｔｙ２  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）、χ４３４６（ＩＳＰ１８２９  Δｃｙａ−１２  Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）、及びχ２８９（Ｅ．コリ  Ｋ−１２）かルリア肉汁で３７°Ｃでスタンディング夜通し培養として成長させられた。人血清は相同野性型Ｓ．タイフィＴｙ２及びＩＳＰ１８２０菌株χ３７６９及びχ３７４４の夫々を用いて吸収され、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを用いて緩衝されそしてアッセイに関して５ＣＯ2 大気においてインキュベートされた。Ｅ．コリ  Ｋ−１２  χ２８９菌株は補体媒介された溶菌に関して正の制御を示し同じ菌株は熱不活性化された血清における成長の際にネット成長によって実証された如く負の制御として作用した。
【０２５４】
図５は３７°Ｃで２４時間を通した各菌株のネット成長及び／又は残存を示す。
菌株の寄託
下記に記載された材料は、米国型培養収集（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１  パークローンドライブ、ロックビレ、メリーランド、をもちいた、ブタペスト条約の条件の下の寄託に関する。示されているアクセッション番号は成功した生存度試験の後に割り当てられ、必要料金が支払わられた。該培養へのアクセスは本特許出願が３７  ＣＦＲ  １．１４及び３５  ＵＳＣ  １２２の下でそれに与えられるべきである長官によって決定されるものへ未決定の間可能であろう。公衆に対する該培養の取得可能性に関する全ての制限は本出願に基づいた特許の許可に関して取り消されること無いように除去されるであろう。更に、指名された寄託は寄託の期日から３０年間、又は最後の寄託要求から５年間、又は米国特許の実施可能期間の内の長い期間維持される。万一培養が生存不可能となったり又は不注意に破壊され又は、核外遺伝子含有菌株がその核外遺伝子を失った場合、それは同じ分類の種類の生存可能な培養によって取り替えられる。ここで述べられる寄託された材料は便宜を意図しており、本発明をこのここでの説明の観点で実行することを要求されず、そして更に、これらの材料は引用によって合体される。
【０２５５】
【表３７】
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【産業上の利用可能性】
【０２５６】
ここで提供される菌株は直接及び間接に、Ｓ．タイフィによって引き起こされる病気を防止する、ワクチンを含む免疫原性成分、及びそれによってに対する抗体が交叉反応する他の腸の細菌の生産に適する。これらの菌株は又細菌細胞において組み換え遺伝子上で符号化される発現産物の生産のためのキャリア微生物として有用である。更に、増給された安全性を用いて使用され得るその菌株は、Ｓ．タイフィに対する、及び無毒性Ｓ．タイフィにおいて発現される抗原に対する単一クローン及び多クローンの双方の抗体の生産のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０２５７】
【図１Ａ】χ３６３３（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の９ｘ１０8ＣＦＵ、χ３７３７（ｐＳＤ１１０+／Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の１ｘ１０9及びχ３３３９（自生型）の１ｘ１０9ＣＦＵを用いた経口接種の後スペシファイされた回数の生後８周間ＢＡＬＢ／ｃマウスのペヤーズパッチからのＣＦＵの回復を示すグラフである。
【図１Ｂ】χ３６３３（Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の９ｘ１０8ＣＦＵ、χ３７３７（ｐＳＤ１１０+／Δ〔ｃｒｐ−ｃｙｓＧ〕−１０）の１ｘ１０9及びχ３３３９（自生型）の１ｘ１０9ＣＦＵを用いた経口接種の後スペシファイされた回数の生後８周間ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの脾臓からのＣＦＵの回復を示すグラフである。
【図２】ｐＹＡ１０７７部分限定マップである。
【図３】Ｓ．タイフィ、Ｓ．タイフィムリウム及びｐＹＡ１０７７及びｐＹＡ１０７８をハーバーするＥ．コリ菌株によって生産されるタンパク質のウェスタンブロットを示すハーフトーン再生である。
【図４】λｇｔ１１：：Ｍ．ラプラエクローンＬ１４及びＳ．タイフィ、ｐＹＡ２９２，ｐＹＡ１０７７及びｐＹＡ１０７８をハーバーしているＳ．タイフィムリウム及びＥ．コリ菌株によって生産されたウェスタンブロットを示すハーフトーン再生である。
【図５】人間血清における３７°ＣでのＳ．タイフィＴｙ２及びＩＳＰ１８２０の自生及び野性菌株の成長を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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