(57)【要約】【課題】培養液の蒸発を防止すると共に細胞に負担をかけることなく、試薬添加等の液体試料の吐出やインキュベーション等を行う。【解決手段】細胞を含んだ液滴状の培養液を保持する基板２と、該基板２を培養温度に設定された内部空間に収納する保持チャンバ１０と、該保持チャンバ１０の内部空間に培養温度近傍の霧状液滴Ｂを供給する液滴供給手段２０とを備えている細胞培養装置１を提供する。【選択図】    図１
2004337091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含んだ液滴状の培養液を保持する基板と、
該基板を培養温度に設定された内部空間に収納する保持チャンバと、
該保持チャンバの内部空間に培養温度近傍の霧状液滴を供給する液滴供給手段とを備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養装置において、
前記液滴供給手段は、液体を保持する液体保持容器と、
該液体保持容器に保持された前記液体に超音波振動を与えて霧状液滴を発生させる液滴発生手段と、
前記液体保持容器内で発生した前記霧状液滴を前記保持チャンバに送り込むための気流を発生させる気流発生手段とを備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項２に記載の細胞培養装置において、
前記気流発生手段により発生される前記気流の流量を調整する流量調整手段を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の細胞培養装置において、
前記気流発生手段から前記保持チャンバに送り込まれる気体の温度を調整する気体温度調整手段を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
請求項２から４のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記保持容器に保持された前記液体の温度を調整する液温調整手段を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記保持チャンバ内部を培養温度近傍に保つための温度保持手段を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞培養装置において、
前記温度保持手段は、前記保持チャンバ内部に保持された前記基板の近傍に配設された温度センサと、
前記基板又はその近傍を加熱するヒータと、
前記温度センサの検出値に基づいて前記ヒータの出力を制御する制御手段とを備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記基板に向けて液体を吐出する液体吐出手段を備え、
前記保持チャンバが、前記液体吐出手段を内部に挿入する開口部と、
該開口部の開閉を行う開閉手段とを備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞培養装置において、
前記液体吐出手段が、前記開口部との隙間を閉じる遮蔽手段を備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、
前記保持チャンバ内の前記培養液の液量を検出する液量検出手段と、
該液量検出手段の検出値に基づいて、前記液滴供給手段によって供給される前記霧状液滴の液量を調整する液量調整手段とを備えていることを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の細胞培養装置において、
前記液量検出手段が、前記培養液の液滴の径を計測する画像処理により前記液量を検出することを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞を含んだ液滴状の培養液を培養する細胞培養装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
周知のように、数ｃｍの基板上に完全に独立し、且つ規則正しく整列した微小な培地を高密度に配置すると共に、この培地内で生細胞を培養するものとして、細胞アレイが知られている。この細胞アレイは、薬剤等のスクリーニングに用いられ、薬物に対する細胞の応答性評価を高スループットに処理することを可能にしている。この種のスクリーニングは、様々な方法が知られているが、その１つとして、相対疎水性領域の内側に相対親水性領域（ドメイン）を配置することにより形成される仮想ウェルを含むマイクロタイター様プレートを用いたスクリーニングが知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
このマイクロタイター様プレートは、カバーであるトップ部材とボトム部材とを微小な隙間を有して重ね合わせた構造をしている。また、ボトム部材の表面には、疎水性領域と親水性領域とが形成されており、親水性領域が、その周囲を疎水性領域に囲まれた状態で複数個設けられている。この親水性領域は、互いに独立して形成されているので、複数の親水性領域で異なる種類の液体試料等を同時に保持することが可能である。
このマイクロタイター様プレートを用いた細胞の薬剤スクリーニングを行う場合には、まず細胞を含む培養液をプレートに導入する。この際、培養液は、仮想ウェルの親水性領域に優先的に接着する。次に、培養液をプレート上から除去すると、親水性領域に細胞を含んだ培養液が保持された状態となる。その後、試薬等を細胞へ添加することにより化合物に暴露し、インキュベーション後に細胞を溶解させ、その成分を分析して薬剤の効果を測定している。
【０００４】
【特許文献１】
特表２００２−５０２９５５号公報（段落番号００１１−０１４０、図５、図６）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記特許文献１記載のマイクロタイター様プレートでは、親水性領域で保持する細胞を含んだ培養液が微小量であるため、通常の温度環境ではすぐに蒸発してしまうといった不都合があった。このため、プレートを露点近傍まで冷却することで、培養液の蒸発を防止していた。この露点温度は、室温及び湿度によって決定する温度であり、例えば、室温２０℃、湿度４０％における露点温度は６℃である。ところが、この温度は、細胞が通常存在している温度環境と比較するとかなり低い温度であり、細胞にとって最適な環境ではなかった。特に、試薬の添加とインキュベーションとを一定時間の間隔で繰り返して行うスクリーニングでは、露点と常温（例えば、インキュベーション時の温度は、約３７℃）とを繰り返すことになり、細胞に負担がかかり細胞に対する薬剤の効果を正確に測定できない恐れがあった。
【０００６】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、培養液の蒸発を防止すると共に細胞に負担をかけることなく、試薬添加等の液体試料の吐出やインキュベーション等を行うことができる細胞培養装置を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、細胞を含んだ液滴状の培養液を保持する基板と、該基板を培養温度に設定された内部空間に収納する保持チャンバと、該保持チャンバの内部空間に培養温度近傍の霧状液滴を供給する液滴供給手段とを備えている細胞培養装置を提供する。
【０００８】
この発明に係る細胞培養装置においては、保持チャンバの内部空間に培養温度近傍の霧状液滴を供給する液滴供給手段を備えているので、保持チャンバの内部空間に霧状液滴を充満させることが可能になる。即ち、保持チャンバの内部空間に収納されている基板に対して霧状液滴を供給することが可能である。これにより、基板に保持されている細胞を含んだ液滴状の培養液の周囲には、霧状液滴が存在している状態となるので、培養液に霧状液滴が付着し易くなる。つまり、保持チャンバの内部空間は、培養温度に設定されているので液滴状の培養液が蒸発しやすい状態であるが、上述したように該培養液に霧状液滴が容易に付着する。従って、液滴状の培養液は、蒸発による水分の減少量を、霧状液滴の吸収による水分増加量で補うことができるので、蒸発を防止することができる。また、霧状液滴は、例えば、約３７℃の培養温度近傍の温度に維持されているので、培養液に付着した際に培養液の温度を低下させず、細胞に負担をかけることはない。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の細胞培養装置において、前記液滴供給手段は、液体を保持する液体保持容器と、該液体保持容器に保持された前記液体に超音波振動を与えて霧状液滴を発生させる液滴発生手段と、前記液体保持容器内で発生した前記霧状液滴を前記保持チャンバに送り込むための気流を発生させる気流発生手段とを備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、液滴発生手段による超音波振動によって発生した霧状液滴が、気流発生器によって発生した気流と共に保持チャンバ内に送られる。このように、霧状液滴は、気流を利用して保持チャンバ内に送り込まれるので、確実に霧状態を保った霧状液滴として送り込むことができる。また、保持チャンバに達した際に、霧状液滴は、気流によって広範囲に拡散されるので、基板上に細胞を含んだ培養液が多数保持されていたとしても、各々に均等に付着することが可能となる。
【００１０】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の細胞培養装置において、前記気流発生手段により発生される前記気流の流量を調整する流量調整手段を備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、流量発生手段により、気流と共に保持チャンバ内に供給される霧状液滴の量を調整することが可能である。これにより、基板上に保持されている培養液の数や大きさ等に応じて最適な量の霧状液滴を供給できるので、より確実に培養液の蒸発を防止することができる。
【００１１】
請求項４に係る発明は、請求項２又は３に記載の細胞培養装置において、前記気流発生手段から前記保持チャンバに送り込まれる気体の温度を調整する気体温度調整手段を備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、気体温度調整手段により、保持チャンバに送り込まれる気体温度を、例えば、約３７℃の培養温度近傍に調整することが可能である。従って、保持容器内に収納されている細胞への影響を低減させることができる。即ち、温度変化による負担を低減することができる。また、気流発生手段と保持チャンバとの距離が離れている場合でも、気体の温度を一定の温度に保つことができる。
【００１２】
請求項５に係る発明は、請求項２から４のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、前記保持容器に保持された前記液体の温度を調整する液温調整手段を備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、液温調整手段により、例えば、約３７℃の培養温度近傍の状態で液体を保持可能である。従って、液滴発生手段により、培養温度近傍の霧状液滴を確実に発生することができる。
【００１３】
請求項６に係る発明は、請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、前記保持チャンバ内部を培養温度近傍に保つための温度保持手段を備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、温度保持手段により、保持チャンバ内を、例えば、約３７℃の培養温度近傍の状態に設定することが可能である。従って、細胞を含む培養液を最適な環境の状態で収納することができ、細胞の温度変化による負担をより低減することができる。
【００１４】
請求項７に係る発明は、請求項６に記載の細胞培養装置において、前記温度保持手段は、前記保持チャンバ内部に保持された前記基板の近傍に配設された温度センサと、前記基板又はその近傍を加熱するヒータと、前記温度センサの検出値に基づいて前記ヒータの出力を制御する制御手段とを備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、制御手段が、温度センサの検出値に基づいて基板又はその近傍を加熱するヒータの出力を制御するので、基板の温度を例えば、約３７℃の培養温度近傍に維持することが可能である。特に、温度センサは、基板の近傍に配設されているので、高精度に基板の温度を一定温度に維持することができる。従って、基板に保持されている細胞を含んだ培養液は、基板を介して直接的に最適な温度に維持されるので、温度変化による細胞の負担を低減することができる。
【００１５】
請求項８に係る発明は、請求項１から７のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、前記基板に向けて液体を吐出する液体吐出手段を備え、前記保持チャンバが、前記液体吐出手段を内部に挿入する開口部と、該開口部の開閉を行う開閉手段とを備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、液体吐出手段により、基板に保持されている細胞を含んだ培養液に対して、例えば、試薬等の液体を必要に応じて吐出して添加することができる。また、保持チャンバは、開閉手段を備えているので、培養液に液体を添加する必要時以外は、細胞を最適な環境に維持されている保持チャンバ内に外部とは隔離して収納することができる。従って、細胞の温度変化による負担をより低減すると共に蒸発の可能性を低減することができる。
【００１６】
請求項９に係る発明は、請求項８に記載の細胞培養装置において、前記液体吐出手段が、前記開口部との隙間を閉じる遮蔽手段を備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、遮蔽手段により培養液に対して液体を吐出している間においても、保持チャンバ内から外部に向けて、例えば、培養温度近傍に設定された温度や霧状液滴等が排出することが低減される。従って、細胞への負担や培養液の蒸発の可能性を更に低減することができる。
【００１７】
請求項１０に係る発明は、請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞培養装置において、前記保持チャンバ内の前記培養液の液量を検出する液量検出手段と、該液量検出手段の検出値に基づいて、前記液滴供給手段によって供給される前記霧状液滴の液量を調整する液量調整手段とを備えている細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、液量調整手段が、液量検出手段によって検出された培養液の液量の検出値に基づいて、霧状液滴の液量を調整する
ので、培養液の液量を常に一定量に維持することが可能になる。これにより、供給される霧状液滴の量が少ないことで培養液に含まれる細胞が乾燥したり、霧状液滴の量が多いことで培養液が液状になることが防止される。特に、培養液が隣接して多数存在している場合には、培養液同士が結合することを防止可能である。従って、培養液の大きさを初期状態の最適な大きさのまま維持することができ、蒸発の可能性を更に低減することができる。
【００１８】
請求項１１に係る発明は、請求項１０に記載の細胞培養装置において、前記液量検出手段が、前記培養液の液滴の径を計測する画像処理により前記液量を検出する細胞培養装置を提供する。
この発明に係る細胞培養装置においては、液量検出手段が、培養液の液滴の径を計測する画像処理により液量を検出するので、確実に液滴の径を検出することができ、液量検出を高精度に行うことができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る細胞培養装置１の第１実施形態について図１から図７を参照して説明する。
本実施形態の細胞培養装置１は、図１及び図４に示すように細胞を含んだ液滴状の培養液Ａを保持する細胞アレイ基板（基板）２と、該細胞アレイ基板２を培養温度に設定された内部空間に収納する細胞アレイ保持チャンバ（保持チャンバ）１０と、該細胞アレイ保持チャンバ１０の内部空間に培養温度近傍の霧状液滴Ｂを供給する液滴供給部（液滴供給手段）２０と、細胞アレイ基板２に向けて細胞懸濁液Ｃ、即ち、細胞を含んだ培養液や薬剤等の液体を吐出する細胞分注装置（液体吐出手段）３０とを備えている。
【００２０】
図２に示すように、上記細胞アレイ基板２は、例えば、幅２ｃｍ、奥行き２ｃｍ、厚さ０．５ｍｍの大きさに形成されており、上面に複数の液滴状の培養液Ａを保持することが可能である。この細胞アレイ基板２は、上記細胞アレイ保持チャンバ１０内に収納されている。
細胞アレイ保持チャンバ１０は、例えば、幅１０ｃｍ、奥行き７ｃｍ、高さ５ｃｍの蓋１１を有する箱状に形成されており、内部を培養温度近傍、即ち、３７℃±０．５℃に保つための温度保持機構（温度保持手段）４０を備えている。
【００２１】
該温度保持機構４０は、細胞アレイ保持チャンバ１０の内部に保持された細胞アレイ基板２の近傍に配設された温度センサ４１と、細胞アレイ基板２又はその近傍を加熱するヒータ４２と、温度センサ４１の検出値に基づいてヒータ４２の出力を制御する温度制御ユニット（制御手段）４３を有している。
温度センサ４１は、例えば熱電対であり、図２に示すように細胞アレイ基板２の周囲に複数個配設されている。また、ヒータ４２は、細胞アレイ保持チャンバ１０内の下面、側面及び上面等に複数個配設されている。なお、温度センサ４１も、ヒータ４２同様に細胞アレイ保持チャンバ１０内に複数個配設されていても構わない。
【００２２】
また、細胞アレイ保持チャンバ１０の蓋１１には、上記細胞分注装置３０の後述する流路部５２を内部に挿入する開口部１２が形成されている。この開口部１２の両側には、一対のリニアガイド１３が設けられている。この該リニアガイド１３上には、開口部１２を塞ぐ大きさに形成された一対のシャッタ１４が移動可能に配設されている。また、シャッタ１４の一端側には、エアシリンダ１５が連結されており、該エアシリンダ１５によってシャッタ１４を移動させることにより（紙面に対して左右方向）、開口部１２の開閉を可能にしている。即ち、これらリニアガイド１３、シャッタ１４及びエアシリンダ１５は、開口部１２の開閉を行なう開閉手段１７を構成している。
なお、シャッタ１４は、開口部１２を完全に塞ぐものではなく、若干の隙間を開けた状態で閉状態となるように設定されている。また、開口部１２は、細胞アレイ基板２の真上に位置するように形成されている。
【００２３】
更に、細胞アレイ保持チャンバ１０の両側壁には、それぞれ液滴供給部２０から供給されてくる霧状液滴Ｂを内部に導入するための噴霧導入口１６が形成されている。また、細胞アレイ保持チャンバ１０の下面は、透明ガラス等の透明材料で形成されており、図示しない倒立顕微鏡によって下方から細胞アレイ基板２を観察可能とされている。
【００２４】
上記液滴供給部２０は、純水（液体）Ｄを保持する加湿器容器（液体保持容器）２１と、該加湿器容器２１に保持された純水Ｄに超音波振動を与えて霧状液滴Ｂを発生させる超音波加湿器（液滴発生手段）２２と、加湿器容器２１で発生した霧状液滴Ｂを細胞アレイ保持チャンバ１０に送り込むための気流を発生させる気流発生部（気流発生手段）２３とを有している。
【００２５】
超音波加湿器２２は、加湿器容器２１に蓋を被せた箱上に形成されており、加湿器容器２１の下部には、超音波振動可能な振動子２４が設けられている。これにより、超音波加湿器２２は、該振動子２４の振動を純水Ｄに伝達して水面から霧状液滴Ｂを発生させる機能を有している。
また、超音波加湿器２２は、加湿器容器２１に保持された純水Ｄの温度を調整する温調ヒータ（液温調整手段）２５を有している。即ち、温調ヒータ２５は
、純水Ｄの温度を、例えば培養温度近傍である３７℃±０．５℃になるように温度調整している。これにより、純水Ｄから発生した霧状液滴Ｂは、培養温度近傍である３７℃±０．５℃に調整されている。
更に、超音波加湿器２２には、気流発生部２３から送られてくる気流を導入するためのエア導入口２２ａ及び送られてきた気流を排出するためのエア排出口２２ｂが設けられている。
なお、加湿器容器２１内に蓄えられている純水Ｄの水面を超音波の収束点の近傍に位置するように制御することで、霧状液滴Ｂの発生効率を向上させることができる。
【００２６】
気流発生部２３は、例えば、二酸化炭素濃度５％の空気が１５０ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で充填された圧縮ボンベ２６を有しており、配管２７ａを介して超音波加湿器２２のエア導入口２２ａに接続されている。また、超音波加湿器２２のエア排出口２２ｂは、配管２７ｂを介して細胞アレイ保持チャンバ１０の噴霧導入口１６に接続されている。この際、配管２７ｂは、途中で２分岐しており、両噴霧導入口１６に接続されている。これにより、圧縮ボンベ２６内の空気（気体）が、超音波加湿器２２で発生した霧状液滴Ｂを含んだ状態で細胞アレイ保持チャンバ１０内に導入されている。
【００２７】
また、気流発生部２３は、圧縮ボンベ２６により発生される気流の圧力を調整する圧力調整レギュレータ２８ａ、流量を調整する流量調整バルブ（流量調整手段）２８ｂ、及び細胞アレイ保持チャンバ１０に送り込まれる空気の温度を調整する配管温調器（気体温度調整手段）２９ａを備えている。即ち、配管２７ａには、圧縮ボンベ２６の出口側から順に圧力調整レギュレータ２８ａ、流量調整バルブ２８ｂ及び配管温調器２９ａが順に介在されている。これにより、圧縮ボンベ２６内の空気は、圧力及び流量が調整されると共に気体温度を、例えば、培養温度近傍の３７℃±０．５℃に調整された状態で超音波加湿器２２に送ることが可能である。更に、配管２７ｂの周囲には、シリコンラバーヒータ２９ｂが取り付けられており、配管２７ｂを例えば、培養温度近傍の３７℃±０．５℃に温度になるように加温している。即ち、シリコンラバーヒータ２９ｂは、配管温調器２９ａと同様に細胞アレイ保持チャンバ１０に送り込まれる空気の温度を調整する気体温度調整手段の一部である。
【００２８】
上記細胞分注装置３０は、図３に示すように、吐出ヘッド部５０及びシリンジポンプ部６０を備えており、図示しない搬送手段によりＸＹＺ方向に移動可能とされている。これにより、図１に示すように細胞懸濁液保管容器３１や後述するマイクロタイタープレート７１等と細胞アレイ保持チャンバ１０との間を移動すると共に、細胞アレイ保持チャンバ１０の各位置に移動可能とされている。なお、細胞懸濁液保管容器３１は、図示しない温調ヒータを有しており、内部の細胞懸濁液Ｃを例えば、培養温度近傍の３７℃±０．５℃に調整している。
【００２９】
吐出ヘッド部５０は、図３に示すように、円筒圧電素子５１及び流路部５２を有している。この円筒圧電素子５１は、シリンジポンプ部６０のシリンジブロック６１の一端側に固定されている。また、円筒圧電素子５１の他端側には、継手部材５３を介して流路部５２が脱着可能に固定されている。更に、円筒圧電素子５１の中心は、中空部５１ａとされており、内周面及び外周面には、電極が形成されている。この電極は、内周電極をマイナス極（グラウンド）、外周電極をプラス極として分極されており、各電極に対して図示しない駆動回路から電圧を印加可能とされている。これにより、円筒圧電素子５１に電圧が印加された場合には、軸方向に伸縮することが可能とされており、この円筒圧電素子５１の動きに伴って流路部５２も軸方向に移動可能とされている。
【００３０】
流路部５２は、内部に流路５４を有すると共に先端部に直径７５μｍのノズル口５５を有している。この流路５４は、継手部材５３の流路を介して円筒圧電素子５１の中空部５１ａと連通している。
また、流路部５２は、図５に示すように細胞アレイ保持チャンバ１０の開口部１２と細胞分注装置３０との隙間を閉じるフランジ部（遮蔽手段）５６を有している。即ち、流路部５２の外周には、流路部５２を細胞アレイ保持チャンバ１０内に挿入した際に、開口部１２の隙間を閉じるためのフランジ部５６が形成されている。このフランジ部５６は、ノズル口５５から、細胞アレイ保持チャンバ１０の底面から蓋１１までの距離と略同一の長さ離間した位置に形成されており、その直径は開口部１２の大きさの約２倍とされている。
更に、流路部５２の先端部外周には、円筒ヒータ５７が設けられており、図示しない温調器と共に流路部５２を、例えば培養温度近傍の３７℃±０．５℃になるように加温している。
【００３１】
シリンジポンプ部６０は、図３に示すように、上述したシリンジブロック６１に加え、ピストン６２、ラックピニオン機構６３及びモータ６４を備えている
。シリンジブロック６１は、内部に流路６１ａを有しており、円筒圧電素子５１の中空部５１ａに連通している。これにより、シリンジブロック６１は、各流路を介してノズル口５５に連通している。また、この流路６１ａ内には、ピストン６２が配されており、該ピストン６２の一端は、ラックピニオン機構６３を介してモータ６４に連結されている。これにより、モータ６４を駆動させることで、ピストン６２は、流路６１ａに沿って往復移動可能（紙面に対して上下方向）とされている。
【００３２】
また、細胞分注装置３０は、図１及び図３に示すように、薬剤分注装置７０を備えている。この薬剤分注装置７０は、複数の薬剤を保持するマイクロタイタープレート７１と、細胞分注装置３０の内部及び外部を洗浄するための洗浄槽７２、電磁弁７３、洗浄水ポンプ７４及び洗浄水タンク７５を有している。上記電磁弁７３、洗浄水ポンプ７４及び洗浄水タンク７５は、シリンジポンプ部６０に設けられている。
即ち、シリンジブロック６１の流路６１ａには、配管７６を介して洗浄水タンク７５が接続されており、この配管７６の途中に洗浄水タンク７５側から順に洗浄水ポンプ７４、電磁弁７３が介在されている。これにより、電磁弁７３を開状態に作動させた後、洗浄水ポンプ７４を駆動することで洗浄水タンク７５内の洗浄水を、シリンジブロック６１の流路６１ａに導入し、細胞分注装置３０の流路を洗浄することが可能である。
また、洗浄槽７２は、図示しない洗浄液搬送手段から導入口７２ａに洗浄液が供給されており、供給された洗浄液は、排出口７２ｂから排出されている。即ち、洗浄槽７２内部は、導入口７２ａから排出口７２ｂに向かう洗浄液の流れが形成されている。これにより、搬送手段により細胞分注装置３０を移動させて、流路部５２を洗浄槽７２内に浸漬することで、流路部５２の外周面を洗浄することが可能である。
【００３３】
このように構成された細胞培養装置１により、細胞を培養する場合について以下に説明する。
まず細胞アレイ基板２に細胞を含んだ培養液Ａを保持させる前に、細胞培養装置１を初期状態に設定する。即ち、図１から図３に示すように、温度保持機構４０により細胞アレイ保持チャンバ１０内及び細胞アレイ基板２の温度を、培養温度近傍、例えば、３７℃±０．５℃になるように調整する。つまり、温度制御ユニット４３は、温度センサ４１からの検出値に基づいて各ヒータ４２を所望する培養温度近傍の温度になるように温度制御する。
また、超音波加湿器２２の温調ヒータ２５を作動させて、加湿器容器２１の純水Ｄの温度を予め培養温度近傍、例えば、３７℃±０．５℃になるように設定しておく。更に、温調ヒータ２５と同様に、配管温調器２９ａ、シリコンラバーヒータ２９ｂ、円筒ヒータ５７及び細胞懸濁液保管容器３１についても、予め培養温度近傍、例えば、３７℃±０．５℃の温度になるように加温しておく。
【００３４】
次に、圧力調整レギュレータ２８ａ及び流量調整バルブ２８ｂにより圧縮ボンベ２６の空気を、例えば、圧力０．０５ｋｇｆ／ｃｍ２〜０．２ｋｇｆ／ｃｍ２流量０．１ｌ／ｍｉｎ〜１．０ｌ／ｍｉｎの範囲になるよう調整して、超音波加湿器２２に供給する。この空気の供給と同時に、超音波加湿器２２の振動子２４を超音波振動させて加湿器容器２１内に霧状液滴Ｂを発生させる。なお、発生する霧状液滴Ｂの粒径は、超音波振動数等によって決定され、本実施形態では、例えば、直径２μｍ〜１０μｍの粒径である。
【００３５】
加湿器容器２１内に発生した霧状液滴Ｂは、圧縮ボンベ２６から供給された空気によって運ばれ、配管２７ｂを介して２箇所の噴霧導入口１６から細胞アレイ保持チャンバ１０内に導入される。この際、霧状液滴Ｂ及び空気は、温調ヒータ２５、配管温調器２９ａ及びシリコンラバーヒータ２９ｂにより、培養温度近傍、例えば、３７℃±０．５℃に調整されている。また、霧状液滴Ｂは、圧縮ボンベ２６の空気によって細胞アレイ保持チャンバ１０内に次々と供給される。この際、流入した霧状液滴Ｂの一部は、空気と共に開口部１２とシャッタ１４との若干の隙間から外部に放出され、細胞アレイ保持チャンバ１０内の圧力が増大するのを防止している。これにより、細胞アレイ保持チャンバ１０内部は、霧状液滴Ｂが充満された状態となっていると共に３７℃±０．５℃の培養温度近傍の温度に維持された状態となっている。
【００３６】
上述した初期状態となった後、搬送手段によって細胞分注装置３０を移動させ、流路部５２を細胞懸濁液容器３１に浸漬する。浸漬させた後、モータ６４を駆動してピストン６２を動かすことにより、ノズル口５５から流路５４内に細胞懸濁液Ｃを、例えば、５μｌ吸引する。この際、流路５４は、円筒ヒータ５７によって加温されているので、吸引された細胞懸濁液Ｃは、３７℃±０．５℃の培養温度近傍の温度に維持された状態となっている。
【００３７】
細胞懸濁液Ｃを吸引後、搬送手段によって細胞分注装置３０を細胞アレイ保持チャンバ１０のシャッタ１４、即ち、開口部１２の真上に移動させる。そして、エアシリンダ１５によりシャッタ１４を移動させて、開口部１２を開状態にすると共に搬送手段により細胞分注装置３０を下降させて、流路部５２を細胞アレイ保持チャンバ１０内に挿入する。この際、図５に示すように、フランジ部５６の下面と、細胞アレイ保持チャンバ１０の蓋１１の上面との距離が約１ｍｍになるまで、流路部５２を挿入する。なお、この状態は、流路部５２先端のノズル口５５と細胞アレイ基板２の上面との距離が、約０．５ｍｍの状態である。
【００３８】
次に、ノズル口５５より細胞懸濁液Ｃを、細胞アレイ基板上に液滴状の培養液Ａとして吐出する。
即ち、図６（ａ）に示すように、細胞懸濁液Ｃを吸引した後の流路５４の状態は、先端に細胞懸濁液Ｃが存在し、その後方に空気が存在している状態となっている。ここで、図７に示すように、駆動回路により円筒圧電素子５１の両電極に正のパルス電圧を印加する。電圧が印加されると、円筒圧電素子５１は、図６（ｂ）に示すように軸方向（紙面に対して上方向）に収縮する。この円筒圧電素子５１の動きに伴って、流路部５２も同時に移動する。このとき、流路部５２の流路５４内に保持されている細胞混濁液Ｃは、流路部５２の急激な移動に追従できず流路部５２の移動方向とは逆方向、即ち、細胞アレイ基板２の方向に向けて慣性力が作用する。これにより、流路５４先端の圧力が上昇して、ノズル口５５から細胞懸濁液Ｃが液滴状となって吐出する。つまり、細胞を含んだ液滴状の培養液Ａが吐出される。
【００３９】
なお、円筒圧電素子５１の移動量は、２μｍ等の僅かな量であり、円筒圧電素子５１の移動に伴う流路５４内の圧力変化は、空気の膨張、圧縮で吸収されている。また、吐出される液滴状の培養液Ａの量は、液体試料の物性、駆動電圧値及び細胞数等によって決定されるものであり、本実施形態では、４０Ｖ、１００μｓｅｃの矩形波を印加することにより、０．１ｎｌ〜１０．０ｎｌの培養液Ａが吐出されている。
【００４０】
上述したように、１つの液滴状の培養液Ａを吐出した後、ノズル口５５と細胞アレイ基板２との距離を一定に保ったまま、搬送手段により細胞分注装置３０をＸＹ方向（平面方向）に微小移動する。移動後、ノズル口５５より液滴状の培養液Ａを吐出する。このように、培養液Ａの吐出とノズル口５５の微小移動とを繰り返して、図４に示すように細胞アレイ基板２に培養液Ａを順次吐出させて保持する。なお、全ての培養液Ａを吐出するのに要する時間は、約１００秒から５００秒程度である。この間、細胞アレイ保持チャンバ１０の開口部１２は、フランジ部５６によって、若干の隙間を空けて閉じられているので、細胞アレイ保持チャンバ１０内の霧状液滴Ｂが大量に外部に排出されることはない。そして、搬送手段により細胞分注装置３０を上昇させ、細胞アレイ保持チャンバ１０から退避させると共に、エアシリンダ１５を作動させてシャッタ１４を閉状態にする。
【００４１】
一方、細胞アレイ基板２上に保持された液滴状の培養液Ａは、細胞アレイ保持チャンバ１０の内部が、培養温度近傍に維持されているため、表面から水分が蒸発し液適量が減少し始める。ところが、細胞アレイ保持チャンバ１０内には、圧縮ボンベ２６からの空気によって広範囲に均等に拡散した霧状液滴Ｂが、浮遊して充満した状態となっている。そのため、霧状液滴Ｂが、培養液Ａに付着して吸収され、培養液Ａの液適量が増加する。従って、培養液Ａの蒸発による水分減少量と、霧状液滴Ｂを吸収することによる水分増加量とが平衡状態となり、培養液Ａの液適量が一定に保たれる。また、霧状液滴Ｂの温度は、培養温度近傍に調整されているので、培養液Ａに吸収された際、温度による負担を細胞に与えることはない。
なお、本実施形態においては、霧状液滴Ｂの流量を１０μｌ／ｍｉｎ〜１００μｌ／ｍｉｎの範囲に設定することで、細胞アレイ基板２上の培養液Ａを３時間以上保持させることが可能である。
【００４２】
上述したように、細胞アレイ基板２上に液滴状の培養液Ａを吐出して細胞培地を形成した後、細胞培地に薬剤を添加する。即ち、まず搬送手段により細胞分注装置３０を移動させて、流路部５２を洗浄槽７２内に浸漬する。これにより
、流路部５２の外周面を洗浄する。また、この状態で、電磁弁７３を開状態にして洗浄水ポンプ７４を駆動させ、洗浄水タンク７５から洗浄水を流路５４に導入し流路５４内を洗浄する。洗浄終了後、搬送手段により流路部５２を上昇させると共に、モータ６４によりシリンダ６３を動かして流路５４内に、例えば、１０μｌの空気を吸引する。空気の吸引後、搬送手段により流路部５２をマイクロタイタープレート７１内に保持されている薬剤のうち、所望する薬剤内に挿入し、空気吸引と同様にシリンダ６３を動かして流路５４内に、例えば、５μｌの薬剤を吸引する。
【００４３】
そして、上述した細胞アレイ基板２上に培養液Ａを吐出した方法と同様の手順にて、細胞培地、即ち、各培養液Ａに薬剤を添加する。また、異なる種類の薬剤を添加させる場合には、再度洗浄槽７２で流路部５２の外周面を洗浄すると共に、洗浄水により流路５４内を洗浄した後に、マイクロタイタープレート７１から所望する薬剤を吸引して各培養液Ａに添加する。
【００４４】
薬剤の添加が終了した後、細胞のインキュベーションを行う。即ち、細胞アレイ保持チャンバ１０内には、常に５％の二酸化炭素を含んだ空気が供給されていると共に、培養温度近傍の温度に調整されているので、細胞アレイ保持チャンバ１０内でそのまま細胞をインキュベーションすることが可能である。また、所定時間のインキュベーションを行った後、細胞アレイ基板２上の細胞を、蛍光顕微鏡等で観察することにより、細胞の生死判別や活性レベル測定を行い、薬剤の効果を測定することも可能である。
【００４５】
上述したように、この細胞培養装置１においては、細胞アレイ保持チャンバ１０内に培養温度近傍の霧状液滴Ｂを供給する液滴供給部２０を備えているので、細胞アレイ基板２上に保持されている細胞を含んだ液滴状の培養液Ａの周囲には、霧状液滴Ｂが存在している状態となっている。即ち、培養液Ａに霧状液滴Ｂが付着し易い状態となっている。従って、液滴状の培養液Ａは、蒸発による水分減少量を、霧状液滴Ｂの吸収による水分増加量で補うことができ、蒸発を防止することができる。また、霧状液滴Ｂは、培養温度近傍の温度の維持されているので、培養液Ａに付着した際に細胞に負担をかけることはない。
また、霧状液滴Ｂは、圧縮ボンベ２６による気流を利用して細胞アレイ保持チャンバ１０内に送り込まれるので、確実に霧状態を保った霧状液滴Ｂとして送り込むことができる。これにより、細胞アレイ保持チャンバ１０に達した際に、霧状液滴Ｂは、気流によって広範囲に拡散されるので、細胞アレイ基板２上の各培養液Ａに均等に付着することが可能なる。
【００４６】
また、液滴供給部２０は、気流発生部２３により発生される空気の流量を調整する流量調整バルブ２８ｂを備えているので、空気と共に細胞アレイ保持チャンバ１０内に供給される霧状液滴Ｂの量を調整することが可能である。これにより、細胞アレイ基板２上に保持されている培養液Ａの数や大きさ等に応じて最適な量の霧状液滴Ｂを供給できるので、より確実に培養液Ａの蒸発を防止することができる。
また、圧縮ボンベ２６から細胞アレイ保持チャンバ１０に送り込まれる空気の温度を調整する配管温調器２９ａ、シリコンラバーヒータ２９ｂを備えているので、細胞アレイ保持チャンバ１０に送り込まれる空気温度を、培養温度近傍に調整することが可能である。従って、細胞への温度変化による負担を低減させることができる。
【００４７】
更に、超音波加湿器２２は、純水Ｄの温度を調整する温調ヒータ２４を備えているので、純水Ｄの温度を培養温度近傍に加温でき、培養温度近傍の霧状液滴Ｂを確実に発生させることができる。
また、細胞アレイ保持チャンバ１０は、温度保持機構４０を備えているので、内部を培養温度近傍の状態に維持することが可能である。従って、細胞を含む培養液Ａを最適な環境の状態で収納することができ、細胞の温度変化による負担を低減させることができる。特に、温度制御ユニット４３が、温度センサ４１の検出値に基づいて細胞アレイ基板２又はその近傍を加熱する各ヒータ４２を調整するので、高精度に細胞アレイ基板２の周囲温度を培養温度近傍の状態に維持することが可能である。
【００４８】
更には、細胞分注装置３０を備えているので、培養液Ａに対して、薬剤等の液体を必要に応じて吐出して添加させることができる。また、細胞アレイ保持チャンバ１０は、開口部１２の開閉を行う開閉手段１７を備えているので、培養液Ａに薬剤等を添加させる必要時以外は、細胞を最適な環境に維持されている細胞アレイ保持チャンバ１０内に外部とは隔離して収納することができ、温度変化による負担が低減されると共に蒸発の可能性を低減することができる。
加えて、細胞分注装置３０は、フランジ部５６を備えているので、培養液Ａに薬剤等を吐出している間においても、細胞アレイ保持チャンバ１０内から外部に向けて、霧状液滴Ｂ等が大量に排出することを低減することができる。
【００４９】
次に、本発明の第２実施形態を、図８から図１０を参照して説明する。なお、この第２実施形態においては、第１実施形態における構成要素と同一の部分については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第２実施形態と第１実施形態との異なる点は、第１実施形態では、細胞アレイ保持チャンバ１０内に収納されている培養液Ａの液量に関係なく、霧状液滴Ｂを供給したが、第２実施形態の細胞培養装置１００では、培養液Ａの液量を検出すると共に、検出値に応じて霧状液滴Ｂの供給量を調整する点である。
【００５０】
即ち、本実施形態の細胞培養装置１００は、図８及び図９に示すように細胞アレイ保持チャンバ（保持チャンバ）１１０内の細胞アレイ基板２に保持された培養液Ａの液量を検出する液量検出機構（液量検出手段）１２０と、該液量検出部１２０の検出値に基づいて、液滴供給部２０によって供給される霧状液滴Ｂの液量を調整する液量調整機構（液量調整手段）１３０とを備えている。
【００５１】
上記細胞アレイ保持チャンバ１１０は、図９に示すように本体１１１に超音波加湿器（液滴発生手段）１１２が組み込まれた一体構造とされている。本体１１１は、蓋１１を有する箱状に形成されており、内部に細胞アレイ基板２を収納可能であると共に温度センサ４１及びヒータ４２が配設されている。また、本実施形態では、パーソナルコンピュータ（以下ＰＣ）１０１が、温度センサ４１の検出値に基づいてヒータ４２の出力を調整している。即ち、温度センサ４１、ヒータ４２及びＰＣ１０１は、本体１１１内部を培養温度近傍、例えば３７℃±０．５℃に保つための温度保持機構（温度保持手段）１４０を構成している。また、本実施形態の細胞アレイ基板２は、例えば、厚さ１ｍｍの透明なポリプロピレン板の表面全体に、細胞が接着し易いようにフィプロネクチンコートがなされている。
【００５２】
また、本体１１１には、分注ヘッドユニット１７０を内部に挿入する開口部１２が形成されている。この開口部の両側には、一対のリニアガイド１３が配設されており、該リニアガイド１３上にシャッタ１４が移動可能に配設されている。このシャッタ１４は、図示しないスプリングによって開口部１２を閉状態とするように付勢されている。また、シャッタ１４は、スプリングに対向する側において、ワイヤ１１１ａが接続されており、滑車１１１ｂを介してロータリーアクチュエータ１１１ｃに連結されている。つまり、該ロータリーアクチュエータ１１１ｃが作動することにより、シャッタ１４は、スプリングのバネ力に抗する力で引っ張られるので、開口部１２を開状態にすることが可能である。また、シャッタ１４は、ロータリーアクチュエータ１１１ｃを停止することで、スプリングのバネ力により引っ張られ、開口部１２を開状態とすることが可能である。
即ち、これらリニアガイド１３、シャッタ１４、スプリング、ワイヤ１１１ａ、滑車１１１ｂ及びロータリーアクチュエータ１１１ｃは、開口部１２の開閉を行なう開閉手段１１３を構成している。
なお、本体１１１の蓋１１及びシャッタ１４は、透明プラスチック等の透明材料で形成されている。また、ロータリーアクチュエータ１１１ｃは、ＰＣ１０１によって作動が制御されている。
【００５３】
超音波加湿器１１２の振動子２４は、図示しない駆動回路から駆動電圧が印加されるようになっており、該駆動回路は、インターフェースを介してＰＣ１０１に接続されており、可変制御可能とされている。即ち、超音波加湿器１１２で発生される霧状液滴Ｂの発生量は、ＰＣ１０１によって制御可能とされている。
つまり、超音波加湿器１１２及びＰＣ１０１は、上記液量調整機構１３０を構成している。
また、超音波加湿器１１２内には、純水Ｄの温度を培養温度近傍に調整する温調ヒータが配設されている。また、発生した霧状液滴Ｂは、エア導入口２２ａを介して気流発生部２３から送られてきた空気と共に、エア排出口２２ｂを通って本体１１１内部に供給される。
【００５４】
上述した細胞アレイ保持チャンバ１１０は、図８に示すように、倒立顕微鏡１６０のＸＹステージ１６１上に載置されている。この倒立顕微鏡１６０は、ＸＹステージ１６１を移動可能（紙面に対して左右及び垂直方向）に支持する主架台１６２、細胞アレイ保持チャンバ１１０内の細胞アレイ基板２を下方から観察するための対物レンズ１６３、観察するための光を照射する光源１６４、対物レンズ１６３で観察された画像を撮像する撮像部１６５を備えている。この撮像部１６５により撮像された観察画像は、ＰＣ１０１に取り込まれて記憶されるようになっている。更に、ＰＣ１０１は、撮像部１６５、ＸＹステージ１６１の作動を制御する機能を有している。
即ち、これら倒立顕微鏡１６０及びＰＣ１０１は、上述したように培養液Ａの液量を検出する液量検出機構１２０とを構成している。つまり、液量検出機構１２０は、撮像部１６５により培養液Ａの液滴の径を計測する画像処理により培養液Ａの液量を検出する機能を有している。また、ＰＣ１０１は、検出値に基づいて超音波加湿器１１２の振動子２４を可変制御している。
【００５５】
また、主架台１６２は、ＺＹステージ１６６を移動可能に支持している。該ＺＹステージ１６６には、細胞アレイ基板２に向けて細胞懸濁液Ｃや薬剤等の液体を吐出する分注ヘッドユニット（液体吐出手段）１７０が設けられている。即ち、分注ヘッドユニット１７０は、ＺＹステージ１６６によりＺＹ方向（紙面に対して上下及び垂直方向）に移動可能とされている。
【００５６】
分注ヘッドユニット１７０は、図１０に示すように、シリンジポンプ部６０及び吐出ヘッド部１７１を備えている。
該吐出ヘッド部１７１は、円筒圧電素子５１、流路部着脱継手１７２及び流路部１７３を有している。流路部着脱継手１７２は、円筒圧電素子５１の一端側に固定されており、他端側に流路部１７３を着脱可能に固定している。即ち、流路部着脱継手１７２は、内部に中空状の流路部挿入口１７２ａを有しており、その周囲に電磁コイル１７２ｂが配設されている。この電磁コイル１７２ｂは、図示しない回路から電流が流れるようになされている。つまり、電磁力を利用して流路部１７３を着脱することが可能である。なお、流路部挿入口１７２ａの中心には、流路１７２ｃが形成されており、円筒電圧素子５１の中空部５１ａに連通されている。
【００５７】
流路部１７３は、直径の異なる後方部１７３ａ、先端部１７３ｂを有している。即ち、後方部１７３ａは、磁性体材料、例えば、ＳＵＳ（ステンレス）４３０により、流路部挿入口１７２ａに挿入可能な直径に形成されている。また、先端部１７３ｂは、ルビーにより後方部１７３ａより小さい直径で形成されており、先端部に直径７５μｍのノズル口１７４を有している。また、流路部１７３は、内部に流路１７５が形成されており、ノズル口１７４と流路部着脱継手１７２の流路との間を連通している。なお、流路部１７３は、Ｏリングを介在して流路部挿入口１７２ａ内に挿入される。
【００５８】
また、図８に示すように、ＸＹステージ１６１上には、上記細胞アレイ保持チャンバ１１０と共に、細胞懸濁液保管容器３１、マイクロタイタープレート７１及び分注ヘッドユニット１７０の複数の流路部１７３を保管する流路部保管容器１７６が載置されている。この流路部保管容器１７６は、細胞懸濁液保管容器３１及びマイクロタイタープレート７１と同様に、図示しない温調ヒータ等により複数の流路部１７３を培養温度近傍に加温することが可能である。
【００５９】
このように構成された細胞培養装置１００により、細胞を培養する場合について以下に説明する。
まず、細胞アレイ保持チャンバ１１０の本体１１１内に培養温度近傍、即ち３７℃±０．５℃の霧状液滴Ｂを充満させると共にヒータ４２等により内部を３７℃±０．５℃の状態に維持させる。また、流路部保管容器１７６、細胞懸濁液保管容器３１、マイクロタイタープレート７１についても、３７℃±０．５℃の温度に加温する。
【００６０】
このように細胞培養装置１００を初期状態にした後、ＰＣ１０１によりＸＹステージ１６１及びＺＹステージ１６６を作動させて、分注ヘッドユニット１７０を、流路部保管容器１７６内の所望する流路部１７３の上方に位置させる。そして、分注ヘッドユニット１７０を下降させて、流路挿入口１７２ａ内に流路部１７３の後方部１７３ａを挿入する。この状態において、電磁コイル１７２ｂに電流を流して電磁力を発生させ、流路部着脱継手１７２に流路部１７３を固定する。
【００６１】
流路部１７３の固定終了後、ＸＹステージ１６１及びＺＹステージ１６６を作動させて、分注ヘッドユニット１７０の流路部１７３を細胞懸濁液容器３１の内部に挿入する。そして、シリンジポンプ部６０を作動させてノズル口１７４から流路１７５内に細胞懸濁液Ｃを吸引する。吸引後、分注ヘッドユニット１７０を細胞アレイ保持チャンバ１１０の開口部１２上方に位置させる。そして、ロータリーアクチュエータ１１１ｃを駆動させて、シャッタ１４を開状態にすると共に、分注ヘッドユニット１７０下降させる。即ち、流路部１７３を細胞アレイ保持チャンバ１１０内に挿入する。この際、ＰＣ１０１は、ノズル口１７４が細胞アレイ基板２の直上約０．５ｍｍの位置となったときに、分注ヘッドユニット１７０の下降を停止させる。
【００６２】
次に、ノズル口１７４と細胞アレイ基板２との距離を一定に保ったまま、ＸＹステージ１６１及びＺＹステージ１６６を微小移動させ、細胞懸濁液Ｃを細胞アレイ基板２上に液滴状の培養液Ａとして順次吐出する。吐出終了後、分注ヘッドユニット１７０を細胞アレイ保持チャンバ１１０から退避させると共に、シャッタ１４を閉状態にする。また、電磁コイル１７２ｂによる保持を解いて、流路部１７３を流路部保管容器１７６に収納する。
【００６３】
一方、細胞アレイ基板２上に液滴状の培養液Ａを吐出して保持した後、対物レンズ１６３により培養液Ａの液滴を観察すると共に、撮像部１６５により液滴の観察画像を撮像してＰＣ１０１に記憶させる。ＰＣ１０１は、取得した液滴画像を画像処理プログラム等のプラグラミングにより解析し、液滴の直径を測定する。このように培養液Ａの観察から直径の計測を、例えば、１０秒間隔で連続して行なう。これにより、例えば、液滴の直径が吐出された初期状態の直径から１０％以上減少した場合には、水分の蒸発量が霧状液滴Ｂの吸収量を上回っていると判断して、霧状液滴Ｂの噴霧量を増加させる。
即ち、ＰＣ１０１は、超音波加湿器１１２の振動子２４に印加する電圧を増加させることにより、霧状液滴Ｂの発生量を増加させる。これにより、細胞アレイ保持チャンバ１１０内に供給される霧状液滴Ｂの量が増加するので、液滴状の培養液Ａがより霧状液滴Ｂを吸収し易くなる。
【００６４】
また、逆に液滴の直径が吐出された初期状態の直径から１０％以上増加した場合には、水分の蒸発量より霧状液滴Ｂの吸収量が上回っていると判断して、霧状液滴Ｂの噴霧量を低下させる。即ち、ＰＣ１０１は、超音波加湿器１１２の振動子２４に印加する電圧を低下させることにより、細胞アレイ保持チャンバ１１０内に供給される霧状液滴Ｂの量を低下させる。
上述した制御を行なうことで、液滴状の培養液Ａの蒸発量と霧状液滴Ｂの吸収量との平衡状態が崩れた場合でも、培養液Ａの液適量を最初に吐出された最適な量に維持することができる。なお、ＰＣ１０１は、予め代表的な温湿度環境における振動子２４の印加電圧と、液滴直径の増減率のデータが格納されており、このデータに基づいて振動子２４の印加電圧が決定される。
【００６５】
また、細胞アレイ基板２上に保持された細胞培地に対する薬剤の添加も上述した方法と同様に行なわれる。即ち、分注ヘッドユニット１７０に流路部１７３を固定した後、マイクロタイタープレート７１から所望する薬剤を吸引する。その後、シャッタ１４を開けて、細胞培地に薬剤を添加する。また、異なる薬剤を添加する場合には、別の流路部１７３を流路部保持容器１７６から取り出して使用する。
【００６６】
上述したように、この細胞培養装置１００においては、液量調整機構１３０が、液量検出機構１２０によって検出された培養液Ａの液量の検出値に基づいて、霧状液滴Ｂの液量を調整するので、培養液Ａの液量を常に一定量に維持することが可能になる。即ち、供給される霧状液滴Ｂの液量が少ないことにより培養液Ａが蒸発して細胞が乾燥したり、霧状液滴Ｂの液量が多いことにより培養液Ａが液状となって隣接する培養液Ａ同士が結合することが防止される。従って、培養液Ａの大きさを初期状態の最適な大きさのまま維持することができ、蒸発の可能性を更に低減することができる。
また、液量検出機構１２０は、培養液Ａの液滴の径を計測すると共に、画像処理により液量を検出するので、確実に液滴の径を検出することができ、液量検出を高精度に行うことができる。
【００６７】
【実施例】
次に、上記第１実施形態に基づいて、実際に生細胞を細胞アレイ基板２上に吐出した場合の実施例について図１１を参照して説明する。
この実施例では、細胞としてチャイニーズハムスターの肺細胞を使用し、培養液として１０％のウシ胎児血清を含有したＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（シグマ社製））を使用した。また、細胞懸濁液Ｃは、細胞濃度を２．０×１０７／ｍｌに調整して使用した。また、細胞アレイ基板２は、フィブロネクチンコートを施した基板を使用した。
上述した条件により、細胞アレイ基板２に細胞を含んだ液滴状の培養液Ａを吐出させると、図１１に示すように、培養液Ａの周囲に直径５μｍ〜１５μｍ程度の霧状液滴Ｂが存在していることが確認された。また、このように霧状液滴Ｂによって培養液Ａの蒸発を防止しながら１時間程度保持させると、細胞は、自ら細胞接着性の蛋白質を分泌して、細胞アレイ基板２上に接着することが確認された。
【００６８】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
例えば、上記第１実施形態では、細胞アレイ保持チャンバ内に収納されている培養液の液量に関係なく、霧状液滴を供給したが、第２実施形態の液量検出機構や液量調整機構を備えた構成にしても構わない。
また、第２実施形態における倒立顕微鏡に、蛍光キューブや位相差リング等を付加した構成にしても構わない。この場合では、細胞の蛍光観察や位相差観察を行なうことができ、細胞の生死の判断や活性レベルの測定を行なうことができる。即ち、薬剤に対する細胞の応答性の評価を行なうことも可能になる。また、細胞アレイ基板上の細胞培地に薬剤を添加する際に、予め倒立顕微鏡で細胞の位置を測定し、この測定結果に基づいて分注ヘッドユニットを移動配置することで、細胞に向かって確実に薬剤を添加することができる。
【００６９】
更に、細胞アレイ基板は、全面に細胞接着蛋白質をコーティングしたものを用いたが、これに限られず、従来のように疎水性領域の中に複数の親水性領域が独立して形成されている基板や、細胞非接着性の領域の中に複数の細胞接着性の領域が独立して形成されている基板を用いても構わない。このような基板を用いる場合には、細胞懸濁液を基板に吐出する前に倒立顕微鏡で吐出対象の領域、即ち、親水性領域や細胞接着性の位置を測定し、この測定位置に基づいて分注ヘッドユニットを移動配置することで所望の領域に確実に細胞懸濁液を吐出することができる。
更には、細胞に対する汚染を防止するには、少なくとも倒立顕微鏡のステージより上部の部分をクリーンボックスで覆い、非使用時にはクリーンボックス内に殺菌灯を灯すことが望ましい。
【００７０】
また、上記各実施形態では、流路部の流路は、ノズル口の先端に向かって径が細くなるテーパ状に形成されているが、これに限られるものではなく、例えば、図１２に示すように、ストレート状の流路でも構わない。特に、高濃度の細胞懸濁液を吐出する場合には、ストレート状の流路のほうが好ましい。即ち、テーパ状の流路では、流路内の細胞懸濁液が時間と共に細胞が沈降して先端部に堆積するので、先端部付近の流路では、細胞濃度が上昇してしまう。極端な場合には、ノズル口に目詰まりが発生する可能性がある。これに対してストレート状の流路では、テーパ状の流路よりも細胞沈降によるノズル口の目詰まりが発生しにくいので、上述したように高濃度の細胞懸濁液を吐出するのに好適である。
【００７１】
また、図１３に示すように、流路を傾けることで流路内の細胞沈降を制限しても構わない。この場合では、例えば、傾斜角度を３０°以上にして目詰まりに至る時間を遅くしたり、傾斜角度を６０°以上にして目詰まりをほぼ解消することが可能である。また、細胞懸濁液の培養液の比重を、細胞の比重に近づけることも、細胞沈降を遅くさせる効果がある。
【００７２】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る細胞培養装置によれば、液滴供給手段により、基板に保持されている細胞を含んだ液滴状の培養液の周囲に、霧状液滴を存在させることができる。従って、培養液は、蒸発による水分の減少量を霧状液滴の吸収による水分増加量で補うことができるので、蒸発を防止することができる。この際、霧状液滴は、培養温度近傍の温度であるので、培養液の温度低下を防止でき、細胞に負担をかけることはない。
また、保持チャンバは、培養温度近傍に維持した状態で基板を内部に保持可能であるので、この状態で、例えば、細胞懸濁液の吐出や、試薬及び薬剤等の添加や細胞のインキュベーション等を行なうことができ、低温化による細胞の負担をなくして薬剤等のスクリーニングを行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る細胞培養装置の第１実施形態を示す構成図である。
【図２】図１に示す細胞培養装置の細胞アレイ保持チャンバ及び液滴供給部を示す断面図である。
【図３】図１に示す細胞培養装置の細胞分注装置を示す断面図である。
【図４】細胞アレイ基板に細胞を含む液滴状の培養液を吐出させた状態を示す図である。
【図５】細胞分注装置の流路部を細胞アレイ保持チャンバ内に挿入させた状態を示す断面図である。
【図６】細胞分注装置の流路部を拡大した断面図であって、（ａ）は円筒圧電素子に電圧を印加させる前の状態を示す図であり、（ｂ）は円筒圧電素子に電圧を印加した状態を示す図である。
【図７】円筒圧電素子に印加する駆動電圧波形を示す図である。
【図８】本発明に係る細胞培養装置の第２実施形態を示す構成図である。
【図９】図８に示す細胞培養装置の細胞アレイ保持チャンバを示す断面図である。
【図１０】図８に示す細胞培養装置の分注ヘッドユニットを示す断面図である。
【図１１】図１に示す細胞培養装置によって、細胞アレイ基板上に吐出された液滴状の培養液の周囲に霧状液滴が存在している状態を示す拡大図である。
【図１２】細胞分注装置及び分注ヘッドユニットの流路の変形例を示す断面図である。
【図１３】細胞分注装置及び分注ヘッドユニットの変形例を示す断面図である。
【符号の説明】
Ａ    培養液
Ｂ    霧状液滴
１、１００    細胞培養装置
２    細胞アレイ基板（基板）
１０、１１０    細胞アレイ保持チャンバ（保持チャンバ）
１２    開口部
１７、１１３    開閉手段
２０    液滴供給部（液滴供給手段）
２１    加湿器容器（液体保持容器）
２２、１１２    超音波加湿器（液滴発生手段）
２３    気流発生部（気流発生手段）
２５    温調ヒータ（液温調整手段）
２８ｂ    流量調整バルブ（流量調整手段）
２９ａ    配管温調器（気体温度調整手段）
２９ｂ    シリコンラバーヒータ（気体温度調整手段）
３０    細胞分注装置（液体吐出手段）
４０、１４０    温度保持機構（温度保持手段）
４１    温度センサ
４２    ヒータ
４３    温度制御ユニット（制御手段）
５６    フランジ部（遮蔽手段）
１２０    液量調整機構（液量検出手段）
１３０    液量調整機構（液量調整手段）
１７０    分注ヘッドユニット（液体吐出手段）
【図１】
2004337091.tif 000003
【図２】
2004337091.tif 000004
【図３】
2004337091.tif 000005
【図４】
2004337091.tif 000006
【図５】
2004337091.tif 000007
【図６】
2004337091.tif 000008
【図７】
2004337091.tif 000009
【図８】
2004337091.tif 000010
【図９】
2004337091.tif 000011
【図１０】
2004337091.tif 000012
【図１１】
2004337091.tif 000013
【図１２】
2004337091.tif 000014
【図１３】
2004337091.tif 000015