(57)【要約】      （修正有）【課題】実質的に少なくとも６０％〜９０％のソラマージン(solamargine)およびソラソニン(solasonine)からなる植物由来の水溶性抽出物及びその製法及びそれを含む腫瘍／ガン細胞阻害組成物を提供する。【解決手段】Solanum属の植物由来の水溶性抽出物は、ソラマージン(solamargine)およびソラソニン(solasonine)からなる。Solanum属の植物由来の水溶性抽出物を調製する方法は、酸を用いる加水分解、塩基を用いる沈殿、ならびにクロロホルム、アルコールおよび水を抽出溶媒として使用する分離処理の工程を包含する。該方法から調製される水溶性抽出物は、純水または中性ｐＨ水に直接的に溶解され得、２〜２０ｍｇ／ｍｌあるいはそれ以上の範囲の水溶性を有する帯黄色の澄んだ透明水溶液を形成する。水溶性抽出物は、腫瘍／ガン細胞、特に、肝臓ガン細胞、肺ガン細胞および乳ガン細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物における有効成分として使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に少なくとも６０％〜９０％のソラマージン(solamargine)およびソラソニン(solasonine)からなるSolanum属の植物由来の水溶性抽出物。
【請求項２】
【表１】
2004359661.tif 000006
およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるSolanum属の植物から抽出される、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項３】
Solanum incanum Lから抽出される、請求項２に記載の水溶性抽出物。
【請求項４】
Solanum nigrumから抽出される、請求項２に記載の水溶性抽出物。
【請求項５】
（a）Solanum属の植物の植物原料（plant material）を３〜５のｐH値を有する酸性水溶液を用いる抽出処理にかけ、水溶液を得る工程；
（b）工程（a）において得られた水溶液のｐH値を塩基でｐH８〜１０に調整し、沈殿物を形成させる工程；
（c）工程（b）において形成された沈殿物を水で洗浄し、その後乾燥し、乾燥生成物を得る工程；
（d）工程(c)において得られた乾燥生成物をクロロホルムと混合し、その後適量の１００％アルコールを添加し、クロロホルム−アルコール混合物を形成させる工程；
（e）工程(d)において形成されたクロロホルム−アルコール混合物を、予め決められた水：アルコール比を有する水／アルコール溶液と混合し、クロロホルム−ベース（chloroform-based）層および非−クロロホルム−ベース（non-chloroform-based）層を含む混合物を得る工程；
（f）工程（e）において得られた混合物からクロロホルム−ベース層を取り除き、適量の水を添加する工程；および
（g）工程（f）の結果生じる混合物から上清を得、その後その上清を乾燥する工程（ここで、結果生じた乾燥生成物は水に直接的に溶解され得、帯黄色の澄んだ透明の水溶液を形成する）
を包含する方法から調製される、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項６】
前記方法の工程（a）において、使用される植物原料が、前記Solanum属の植物の果実、根、茎および葉の少なくとも１種である、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項７】
前記方法の工程(a)において、使用される植物原料が前記Solanum属の植物の果実である、請求項６に記載の水溶性抽出物。
【請求項８】
前記方法の工程(a)において、植物原料が前記Solanum属の植物の植物全体である、請求項６に記載の水溶性抽出物。
【請求項９】
前記方法の工程（a）において、前記Solanum属の植物の植物原料が予備処理において切り刻まれている（chopped）、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１０】
前記方法の工程(a)において、水溶液が、抽出処理に続いて遠心を行うことによって得られる、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１１】
前記方法の工程(a)において、抽出処理における酸性水溶液が、蟻酸、酢酸、または塩酸を含む水溶液である、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１２】
前記方法の工程（b）において、塩基が、アルカリ水酸化物（alkali hydroxides）および水酸化アンモニウムからなる群より選択される化合物を含むアルカリ性水溶液である、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１３】
前記方法の工程（b）において、塩基が、水酸化アンモニウムを含むアルカリ性水溶液である、請求項１２に記載の水溶性抽出物。
【請求項１４】
前記方法の工程（b）において、塩基が、水酸化ナトリウムを含むアルカリ性水溶液である、請求項１２に記載の水溶性抽出物。
【請求項１５】
前記方法の工程（b）において、沈殿物が、ｐＨ値の調整に続いて遠心を行うことによって得られる、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１６】
前記方法の工程（c）において、乾燥処理が、凍結乾燥（lyophilization）、噴霧乾燥（spray-drying）、エバポレーション（evaporation）、加熱乾燥（heat-drying）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１７】
前記方法の工程(c)において、乾燥生成物が、工程(b)において形成される沈殿を水で洗浄し、該洗浄された沈殿物を水に懸濁し、次いで凍結乾燥を行うことによって得られる、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１８】
前記方法の工程(d)および(e)において、アルコールが、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項１９】
前記方法の工程(f)において、クロロホルム−ベース層の除去が遠心によって行われる、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項２０】
前記方法の工程(g)において、乾燥処理が、凍結乾燥（lyophilization）、噴霧乾燥（spray-drying）、エバポレーション（evaporation）、加熱乾燥（heat-drying）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の水溶性抽出物。
【請求項２１】
ナノ粒子サイズ（nanoparticle size）を有する水溶性粒子の形態である、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項２２】
１μｍより小さい粒子サイズを有する水溶性粒子の形態である、請求項２０に記載の水溶性抽出物。
【請求項２３】
７５％を超えるソラソニン(solasonine)およびソラマージン（solamargine）から構成される、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項２４】
０．３：１．０から１．０：０．６までの範囲のソラソニン対ソラマージン比を有する、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項２５】
０．４：１．０から０．９：１．０までの範囲のソラソニン対ソラマージン比を有する、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項２６】
約０．７：１．０のソラソニン対ソラマージン比を有する、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項２７】
２から２０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の範囲の水溶性（water solubility）を有する、請求項１に記載の水溶性抽出物。
【請求項２８】
腫瘍／ガン細胞の増殖を阻害することにおいて有効な医薬品の製造において使用され得る、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の水溶性抽出物。
【請求項２９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の水溶性抽出物、および必要に応じて薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の水溶性抽出物、および必要に応じて薬学的に許容される担体を含む、腫瘍／ガン細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項３１】
（a）Solanum属の植物の植物原料（plant material）を３〜５のｐH値を有する酸性水溶液を用いる抽出処理にかけ、水溶液を得る工程；
（b）工程（a）において得られた水溶液のｐH値を塩基でｐH８〜１０に調整し、沈殿物を形成させる工程；
（c）工程（b）において形成された沈殿物を水で洗浄し、その後乾燥し、乾燥生成物を得る工程；
（d）工程(c)において得られる乾燥生成物をクロロホルムと混合し、その後適量の１００％アルコールを添加し、クロロホルム−アルコール混合物を形成させる工程；
（e）工程(d)において形成されるクロロホルム−アルコール混合物を、予め決められた水：アルコール比を有する水／アルコール溶液と混合し、クロロホルム−ベース（chloroform-based）層および非−クロロホルム−ベース（non-chloroform-based）層を含む混合物を得る工程；
（f）工程（e）において得られる混合物からクロロホルム−ベース層を取り除き、次いで適量の水を添加する工程；および
（g）工程（f）の結果生じる混合物から上清を得、その後その上清を乾燥する工程；（ここで、結果生じた乾燥生成物は水に直接的に溶解され得、帯黄色の澄んだ透明の水溶液を形成する）
を包含する、Solanum属の植物から水溶性抽出物を調製するための方法。
【請求項３２】
工程（a）において、前記Solanum属の植物の植物原料が予備処理において切り刻まれている（chopped）、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
工程（a）において、植物原料が、前記Solanum属の植物の果実、根、茎、および葉の少なくとも１種である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
工程（a）において、植物原料が前記Solanum属の植物の果実である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
工程（a）において、植物原料が前記Solanum属の植物の植物全体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
工程（a）において、植物原料が、
【表２】
2004359661.tif 000007
およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるSolanum属の植物に由来する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
工程（a）において、植物原料がSolanum incanum L.由来である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（a）において、植物原料がSolanum nigrum由来である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
工程（a）において、水溶液が、抽出処理に続いて遠心を行うことによって得られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
工程（a）において、抽出処理における酸性水溶液が、蟻酸、酢酸、または塩酸を含む水溶液である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
工程(b)において、塩基が、アルカリ水酸化物（alkali hydroxides）および水酸化アンモニウムからなる群より選択される化合物を含むアルカリ性水溶液である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
工程（b）において、塩基が、水酸化アンモニウムを含むアルカリ性水溶液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
工程（b）において、塩基が、水酸化ナトリウムを含むアルカリ性水溶液である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
工程（b）において、沈殿物が、ｐＨ値調整に続いて遠心を行うことによって得られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
工程（c）において、乾燥処理が、凍結乾燥（lyophilization）、噴霧乾燥（spray-drying）、エバポレーション（evaporation）、加熱乾燥（heat-drying）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
工程(c)において、乾燥生成物が、工程(b)において形成される沈殿を水で洗浄し、該洗浄された沈殿物を水に懸濁し、次いで凍結乾燥を行うことによって得られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
工程(d)および(e)において、アルコールが、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
工程(f)において、クロロホルム−ベース層の除去が遠心によって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
工程（g）において、乾燥処理が、凍結乾燥（lyophilization）、噴霧乾燥（spray-drying）、エバポレーション（evaporation）、加熱乾燥（heat-drying）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
工程（g）から結果生じる生成物が、ナノ粒子サイズ（nanoparticle size）を有する水溶性粒子の形態である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５１】
工程（g）から結果生じる生成物が、１μｍより小さい粒子サイズを有する水溶性粒子の形態である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
工程（g）から結果生じる生成物が、実質的に少なくとも６０％〜９０％のソラソニン(solasonine)およびソラマージン(solamargine)からなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項５３】
工程（g）から結果生じる生成物が、７５％を超えるソラソニン(solasonine)およびソラマージン（solamargine）から構成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
工程（g）から結果生じる生成物が、０．３：１．０から１．０：０．６までの範囲のソラソニン対ソラマージン比を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５５】
工程（g）から結果生じる生成物が０．４：１．０から０．９：１．０までの範囲のソラソニン対ソラマージン比を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５６】
工程（g）から結果生じる生成物が、約０．７：１．０のソラソニン対ソラマージン比を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５７】
工程（g）から結果生じる生成物が、２から２０ｍｇ／ｍｌ、またはそれ以上の範囲の水溶性（water solubility）を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項５８】
請求項３１〜５７のいずれか１項に記載の方法によって調製される水溶性抽出物、および必要に応じて薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項５９】
請求項３１〜５７のいずれか１項に記載の方法によって調製される水溶性抽出物、および必要に応じて薬学的に許容される担体を含む、腫瘍／ガン細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１）発明の分野
本発明は、Solanum属の植物由来の水溶性抽出物、それらの調製方法、および前記を含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２）関連技術の開示
癌は、世界的にヒトの主な死亡原因の１つであり、肺癌、肝癌、および乳癌は最も代表的である。癌の発生機構は、いまだ完全には理解されていないが、被験者での癌の開始（onset）は、前記被験者において生じる、異常なおよび制御できない細胞分裂によって引き起こされると考えられている（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。
【０００３】
一般に、ヒトまたは動物体内の細胞の成長および分化は、ヒトまたは動物体内に存在する成長ホルモンによって厳密に制御されている。細胞が、内因性および／または外因性要因によって引き起こされた遺伝子突然変異を細胞内に蓄積した場合、前記細胞は、次に細胞の制御できない成長および分裂を導く、間違ったシグナル伝達を生じ、そのため結果として徐々にガン細胞の形成を生じる（非特許文献４）。
【０００４】
近年、世界中の研究者らは、癌の働きを研究するために努力してきた。しかし、現在開発され、また用いられている癌治療は、満足な治療効果を提供することができない。患者の個人的な要因に加え、抗ガン薬物の重篤な副作用および該薬物に対するガン細胞の抵抗性は、臨床治療において直面する主な問題である。
【０００５】
病院で用いられる公知の西洋医学が、癌疾患に対する現在の治療を効果的に改良することに失敗したという事実を考慮し、ある研究者らは、癌疾患の開始機構の研究結果に基づいて、癌症状の治療または緩和のために使用され得る、漢方薬（TCM）または薬草由来の活性成分を見いだすことを試みた。
【０００６】
アポトーシスは、動物細胞の成長を調節する生得（natural）機構であり（非特許文献５）、動物の成長過程において生じる自然な組織収縮および吸収などの自然な細胞死の調節において重要な役割を果たすと考えられている。加えて、ヒト細胞が損傷され、修復され得ない場合、癌細胞の形成を防止するためにアポトーシスが開始される。
【０００７】
アポトーシスの主要な形態学的特徴は：アポトーシス小体の形成、染色体の凝縮、およびＤＮＡの断片化を含む（非特許文献６、非特許文献７および非特許文献８）。アポトーシスの間、死亡した細胞の残骸は、炎症反応を誘導することなく食作用を介して近隣の細胞およびマクロファージにより、速やかに摂取される（非特許文献９）。加えて、フローサイトメトリーによって細胞周期の変化を検出した場合、sub-G1ピークの存在を観察することができる（非特許文献１０および非特許文献１１）。したがって、sub-G1ピークは、アポトーシスを受けている細胞を識別する典型的なマーカーであると考えられている。
【０００８】
細胞は、その細胞のアポトーシス機構が制御不能であれば、癌細胞になるということが文献に報告されている（非特許文献１２および非特許文献１３）。したがって、アポトーシスは、腫瘍研究の主題になっている。加えて、アポトーシスは、特定の抗癌薬によって誘導される事が報告されている（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、および非特許文献１７）。したがって、アポトーシスは、抗癌薬の世界的な開発において、重要な方向を示す。
【０００９】
疾患の処置のための漢方薬または薬用植物（herbal medicine）の使用には、長い歴史がある。現在、かなり多くの研究者らが、漢方薬または薬用植物由来の有効な抗癌薬物を見いだそうと努力している。しかし、漢方薬または薬用植物の適用は、いまだに経験論に基づいており、また十分な科学的証拠によって支えられていない。加えて、漢方薬または薬用植物の活性成分の抽出、および用量ならびに品質管理が科学的に扱われていないため、該医薬によって現れる治療効果が首尾一貫しない。
【００１０】
さらに、漢方薬または薬用植物由来の活性成分のほとんどは、水不溶性である。水不溶性材料を動物の体内に経口的に投与または注射した場合、これらの意図された治療効果は、吸収困難性（difficulty in absorption）のために達成されない事がある。これらは、漢方薬および薬用植物の開発および適用を妨害する主な制限である。
【００１１】
医薬として使用され得る植物は、非常に多い。植物原料から抽出された多くのタンパク質阻害物質（inhibitor）は、抗癌療法において使用されている事が周知である。抗癌可能性を有するこれらのタンパク質阻害物質のうち、Solanum属の植物由来のステロイドアルカロイドは、潜在的な抗癌薬物ということが見いだされている。
【００１２】
Solanum incanum L.（Solanum incanum Ruiz. & Pav.、ラテン語でSolanum coagulans Forsskalおよび英語でbitter appleとしても知られる。）は、ステロイドグリコアルカロイドを含む事が公知である（非特許文献１８）。加えて、多くのSolanum属の植物、例えば中国語でLong Kuiおよび英語でblack nightshadeとしても知られる、Solanum indicum、Solanum nigrum（非特許文献１９）、Solanum capsicastrum（英語でfalse Jerusalem cherryとして知られる ）、Solanum xanthocarpum、Solanum melongena（非特許文献２０）、Solanum coagulans、Solanum tuberosum(非特許文献２１)、Solanum sodomeum（オーストラリアにおいてapple of Sodomとして知られる）、Solanum tuburosum、Solanum aculeastrum(非特許文献２２)、Solanum lycocarpum(非特許文献２３)、Solanum khasianum(非特許文献２４)、Solanum suaveolens(非特許文献２５)、Solanum uporo(非特許文献２６)、Solanum  abutiloides(非特許文献２７)、Solanum coccineum(非特許文献２８)、Solanum  unguiculatum(非特許文献２９)、Solanum robustum(非特許文献３０)、Solanum anguivi(非特許文献３１)、Solanum platanifolium(非特許文献３２)、Solanum mammosum(非特許文献３３)、などは、ステロイドグリコアルカロイドを含む事が報告されている。
【００１３】
今日まで、Solanum属の前述の植物から得ることができるステロイドアルカロイドは、例えばソラマージン（solamargine）、ソラソニン（solasonine）、カーシアニン（khasianine）およびソラソジン（solasodine）を含む（非特許文献３４、および非特許文献３５）。ソラニンンおよびソラマージンの構造は、以下の通りである：
【００１４】
【化１】
2004359661.tif 000002
【００１５】
【化２】
2004359661.tif 000003
加えて、研究は、様々な植物原料から得られたソラマージンは、以下の生物の成長を阻害し得る事を示した：Trypanosoma cruziなどの寄生虫；Tribolium castaneum（red flour beetleとして知られる）、Manduca sexta（tobacco hornwormとして知られる）などの昆虫；Phoma medicaginisおよびRhizoctomia solaniなど糸状菌(mold)；ならびにLymnaea cubensisおよびBiomphalaria grabrataなどの軟体動物（非特許文献３６、非特許文献３７、非特許文献３８）。
【００１６】
さらに、Chun-Nan Linらは、ソラマージンはSolanum incanumの果実から得られること、およびその構造はステロイドアルカロイドグリコシドに属することを報告した。該化合物は、CCl4-誘導性損傷から肝臓を保護し、ならびにJTC-26およびヒトPLC/PRF/5肝癌細胞の成長を阻害することが見いだされた（非特許文献３９）。
【００１７】
Shu-Hui Hsuらは、ソラマージンの細胞毒性の機構を研究し、Hep3Bおよび正常な皮膚線維芽細胞などの細胞死を、アポトーシスの経路を介して促進する事を見いだした。特に、細胞のアポトーシスのプロセスに関与するTNF受容体Ｉの遺伝子発現が、ソラマージンによってアップレギュレートされる事を見いだした（非特許文献４０）。
【００１８】
Katsuya Fukuhara およびIsao Kubohasは、非特許文献４１において、熟したSolanum incanumの果実を、室温においてメタノールで抽出したことを報告した。その後、減圧下において溶媒を除去し、そして残留物を凍結乾燥して暗褐色の抽出物を得た。次に、該抽出物を、メタノール（１％）を含む水に懸濁した。不水溶性部分を除去した後、該懸濁液を、n-ヘキサン、クロロフォルム、エチルアセテート、および水で分配し、そして生物活性を有する水層を得た。この様にして得られた生物活性を有する該水層を、その後２つの主要な化合物、ソラマージンおよびソラニンを得るように、回転式多段向流クロマトグラフィー（rotation locular countercurrent cromatography）および液滴向流クロマトグラフィー（droplet countercurrent cromatography）にかけた。
【００１９】
Ke Huらは、乾燥したSolanum nigrumの全草（whole herb）を、７５％エタノールで還流（reflux）したことを、非特許文献４２において開示した。真空中で溶媒を除去して褐色の残留物を得、これを石油エーテルで脱脂して抽出物を得た。得られた抽出物を水に懸濁し、マクロレジン（macroresin）カラム上でクロマトグラフィーにかけた。６０％エタノール溶離液中に、活性化合物が存在した。その後、６０％エタノール溶離液をH2Oで分配し、そしてn-BuOHで抽出し、それからこの様にして得られた該n-BuOH抽出物を、β2-ソラマージン、ソラマージンおよびデガラクトチゴニン（degalactotigonin）を生じるために、溶離液としてCHCl3-MeOH-H2Oを使用するシリカゲル上、および溶離液としてMeOH-H2O(60:40)を使用するSephadex LH-20上でカラムクロマトグラフィーにかけた。しかし、この論文は、どのようにして水溶性生物活性抽出物をSolanum nigrumから得る事ができるのかを教えていない。
【００２０】
特許文献１は、オーストラリアにおいてapple of Sodomとして知られるSolanum sodomeumの植物原料を、２％または３％の酢酸などの希釈した酸性溶液で抽出して第１の酸性抽出物（上清部分）を得、その後、第１の酸性抽出物から分離した後、該固形残留物を他の容積の希釈酸溶液で抽出して第２の酸性抽出物（上清部分）をえた。第１および第２の酸性抽出物を混合した後、沈殿物を得るために塩基を加えた。該沈殿物を、沸騰したエタノール中に溶解した。エタノール除去後、微粉末抽出物（BEC001として呼ばれる（referred to））を得た。BEC001抽出物を、更に分離し、そしてソラマージン、ソラソニンならびにソラドジン（soladodine）のモノおよびジ-グリコシドを含む様々なグリコアルカロイドを生じるために精製した。
【００２１】
特許文献１は、H2OをBEC001抽出物の担体として使用できる事を述べているが、該抽出物は、前記特許の実施例において、本質的にジメチルスルホキシド溶液（DMSO）、パラフィン、亜鉛軟膏、亜鉛クリーム、およびセトマクロゴール（界面活性剤）と共に処方される。
【００２２】
さらに、特許文献２によると、in vitroにおける細胞毒性実験で使用されるソラソジン(solasodine)グリコシドを、５％DMSO溶液を生じるために最初にDMSOに溶解し、そしてその後希釈した。加えて、該実験に使用したソラソジングリコシドは、ソラマージン（３３％）、ソラソニン（３３％）、ならびにジ−およびモノ−グリコシド（３４％）を含む混合物（BECとして呼ばれる）の形態、または別々の成分の形態（ソラマージン、ソラニン、ジ−およびモノ−グリコシドの混合物、ならびにソラソジンのアグリコン）のいずれかである。
【００２３】
前述のステロイドアルカロイドが水不溶性であることから、前述の特許および文献においてアルコール蒸留が一般的な抽出方法であり、通常、抽出部分を解析のために有機溶媒、すなわちDMSOに溶解する。水不溶性材料は、動物の体内に直接注射するには適当でなく、また経口投与の間に消化管によって吸収されない事もないことから、ステロイドアルカロイドの治療効果は達成され得ず、それによってステロイドアルカロイドの薬学的な利用および開発が制限されている。
【００２４】
本出願人は、ソラマージンおよび／またはソラニンの乾燥粉末は、DMSOの前処理なしには、水に全く溶解せず、またDMSOで処理した後でさえも完全には水に溶解しないということを見いだした。特に、特許文献１に開示される方法を使用して抽出されたステロイドアルカロイドを、蒸留水中に溶解する事はできなかった。ソラマージンまたはソラソニンを、最初にDMSOに溶解した後は水に溶解する事ができるが、その濃度が高すぎれば（5mg/mlより大きい）沈殿する。加えて、DMSO（>1%）それ自体が細胞に対して強い細胞毒性を有し、したがって、その濃度は、５％未満に調製されなければならない。そのような事実は、Solanum属の植物から抽出されたステロイドアルカロイドを溶解するためのDMSO有機溶媒の使用には、限界があるということを明確に示している。
【００２５】
前述の事を考慮すると、現在、ステロイドアルカロイドは、主に限られた、また小規模な方法で、かつ単独の（single）バッチ（batch）において化学的に製造されており、そして商業使用のための大規模なSolanum属の植物から水溶性ステロイドアルカロイドを抽出するための効率的なプロセスがない。それ自体、薬剤および薬物の製造にステロイドアルカロイドを利用することが制限されている。
【特許文献１】EP 0 020 029 A1
【特許文献２】US 5,958,770
【非特許文献１】Chen, P.L., et al. (1990), Science, 250, 1576-1580
【非特許文献２】Finlay, C.A., et al. (1989), Cell, 57, 1083-1093
【非特許文献３】Baker, S.J., et al. (1990) Science, 249, 912-915
【非特許文献４】Kerr, J.F.R. (1971) J. Pathol., 105, 13-20
【非特許文献５】Martin, S.J. and Green, D.R. (1995), Crit. Rev. Oncol. Hemat., 18, 137-153
【非特許文献６】Arends, M.J. and Wyllie, A.H. (1991) Int. Rev. Exp. Pathol., 32, 223-254
【非特許文献７】Dive, C., et al. (1992) Biochim. Biophys. Acta 1133, 275-285
【非特許文献８】Darzynkiewicz, Z., et al. (1992) Cytometry, 13, 795-808
【非特許文献９】Sarraf, F.E. and Bowen, I.D. (1988) Cell Tissue Res. 21, 45-49
【非特許文献１０】Alzerreca, A. and Hart, G. (1982) Toxicology Lett. 12, 151-155
【非特許文献１１】Lin, C.N., et al. (1986) J. Taiwan Pharm. Assoc. 38, 166
【非特許文献１２】Carson, D.A. and Ribeiro, J.M. (1993) Lancet 341, 1251-1254
【非特許文献１３】Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49, 5870-5878
【非特許文献１４】Wyllie, A.H., et al. (1980) Int. Rev. Cytol. 68, 251-306
【非特許文献１５】Wyllie, A.H., et al. (1984) J Pathol. 142, 67-77
【非特許文献１６】Barry, M.A., et al. (1990) Biochem. Pharmacol., 40, 2353-2362
【非特許文献１７】Hickman, J.A. (1992) Cancer Metast. Rev., 11, 121-139
【非特許文献１８】Kuo, K.W., et al. (2000), Biochemical Pharmacology, 60 (12): 1865-73
【非特許文献１９】Hu, K., et al. (1999), Planta Medica, 65 (1): 35-8
【非特許文献２０】Blankemeyer, J.T., et al. (1998), Food & Chemical Toxicology, 36 (5): 383-9
【非特許文献２１】Friedman, M., et al. (1996), Journal of Nutrition, 126 (4): 989-99
【非特許文献２２】Wanyonyi, A.W., et al. (2002), Phytochemistry, 59 (1): 79-84
【非特許文献２３】Peters, V.M., et al. (2001), Contraception, 63 (1):53-5
【非特許文献２４】Putalun, W., et al. (2000), Biological & Pharmaceutical Bulletin, 23 (1): 72-5
【非特許文献２５】Ripperger, H., et al. (1997), Phytochemistry, 46 (7): 1279-82
【非特許文献２６】Ripperger, H., et al. (1997), Phytochemistry, 44,(4): 731-4
【非特許文献２７】Tian, R.H., et al. (1997), Phytochemistry, 44 (4): 723-6
【非特許文献２８】Lorey, S., et al. (1996), Phytochemistry, 41 (6): 1633-5
【非特許文献２９】Sarg, T.M., et al. (1995), Pharmacy World & Science, 17 (6): 191-4
【非特許文献３０】Ripperger, H. (1995), Phytochemistry 39 (6): 1475-7
【非特許文献３１】Ripperger, H., et al. (1994), Phytochemistry, 37 (6): 1725-7
【非特許文献３２】Puri, R., et al. (1994), Journal of Natural Products 57 (5): 587-96
【非特許文献３３】Alzerreca, A., et al. (1982), Toxicology Letters, 12 (2-3): 151-5
【非特許文献３４】Chataing, B., et al. (1998), Planta Medica 64, 31-36
【非特許文献３５】Weissenberg, M., et al. (1998), Phytochemistry 47, 203-209
【非特許文献３６】Chataing, B., et al. (1998), Planta Medica, 64, 31-36
【非特許文献３７】Fewell, A.M., et al. (1994), Phytochemistry, 37, 1007-1011
【非特許文献３８】Lin, C.N., et al. (1990), J. Nat. Prod., 53, 513-516
【非特許文献３９】Lin, C. N. et al. (1986), J. Natural Prod., 53, 513-516
【非特許文献４０】Hsu, S. H. et al. (1996), Biochem. Biophys. Res. Comm., 229, 1-5
【非特許文献４１】Fukuhara K. and Kubohas I. (1991), Phytochemistry, 30 (2): 685-687
【非特許文献４２】Ke Hu et al. (1999) , Planta Medica., 65, 35-38
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
発明の要約
従って、第１の局面において、Solanum属の植物由来の水溶性ステロイドアルカロイドをラージスケールで生産するために、本発明は、Solanum属の植物由来の水溶性抽出物を提供する（ここで、この抽出物は、実質的に、少なくとも６０〜９０％のソラマージン（solamargine）およびソラソニン（solasonine）からなり、そしていかなる他の溶媒および／または溶媒アジュバントの添加を伴わずに、純水または中性のｐＨ値を有する水に直接溶解され得、その結果２から２０ｍｇ／ｍｌ、あるいはそれ以上の範囲の水溶性を有する帯黄色の澄んだ透明の水溶液が形成される）。
【００２７】
第２の局面において、本発明は、腫瘍／ガン細胞（特に、肝ガン細胞、肺ガン細胞、および乳ガン細胞）の増殖を抑制するための有効成分として、水溶性抽出物を含む薬学的組成物を提供する。
【００２８】
第３の局面において、本発明は、以下：
（a）Solanum属の植物の植物原料（plant material）を３〜５のｐH値を有する酸性水溶液を用いる抽出処理にかけ、水溶液を得る工程；
（b）工程（a）において得られた水溶液のｐH値を塩基でｐH８〜１０に調整し、沈殿物を形成させる工程；
（c）工程（b）において形成された沈殿物を水で洗浄し、その後乾燥し、乾燥生成物を得る工程；
（d）工程(c)において得られた乾燥生成物をクロロホルムと混合し、その後適量の１００％アルコールを添加し、クロロホルム−アルコール混合物を形成させる工程；
（e）工程(d)において形成されるクロロホルム−アルコール混合物を、予め決められた水：アルコール比を有する水／アルコール溶液と混合し、クロロホルム−ベース（chloroform-based）層および非−クロロホルム−ベース（non-chloroform-based）層を含む混合物を得る工程；
（f）工程（e）において得られた混合物からクロロホルム−ベース層を取り除き、その後適量の水を添加する工程；および
（g）工程（f）の結果生じる混合物から上清を得、その後その上清を乾燥する工程（ここで、結果生じた乾燥生成物は水に直接的に溶解され得、帯黄色の澄んだ透明の水溶液を形成する）
を包含する、Solanum属の植物から水溶性抽出物を調製するための方法を提供する。
【００２９】
本発明の上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面と共に、以下の詳細な説明および好ましい実施形態への参照によって、明らかになるであろう。
発明の詳細な説明
本発明は、水に直接溶解して、澄んだ透明水溶液を形成することができ、そしてそれゆえ医薬品および薬物の製造に適する、ステロイドアルカロイドを含むSolanum属の植物から得られた水溶性抽出物を提供する。
【００３０】
特に、本発明は、Solanum属の植物から得られた水溶性抽出物を提供する（これは、実質的に、少なくとも６０〜９０％のソラマージン（solamargine）およびソラソニン（solasonine）からなり、そしていかなる他の溶媒および／または溶媒アジュバントの添加を伴わずに、純水または中性のｐH値を有する水に直接溶解し得、その結果２から２０ｍｇ／ｍｌの範囲、あるいはそれ以上の水溶性を有する帯黄色の澄んだ透明の水溶液が形成される）。
【００３１】
本発明は、以下：
（a）Solanum属の植物の植物原料（plant material）を３〜５のｐH値を有する酸性水溶液を用いる抽出処理にかけ、水溶液を得る工程；
（b）工程（a）において得られる水溶液のｐH値を塩基でｐH８〜１０に調整し、沈殿物を形成させる工程；
（c）工程（b）において形成される沈殿物を水で洗浄し、その後乾燥し、乾燥生成物を得る工程；
（d）工程(c)において得られる乾燥生成物をクロロホルムと混合し、その後適量の１００％アルコールを添加し、クロロホルム−アルコール混合物を形成させる工程；
（e）工程(d)において形成されるクロロホルム−アルコール混合物を、予め決められた水：アルコール比を有する水／アルコール溶液と混合し、クロロホルム−ベース（chloroform-based）層および非−クロロホルム−ベース（non-chloroform-based）層を含む混合物を得る工程；
（f）工程（e）において得られる混合物からクロロホルム−ベース層を取り除き、次いで適量の水を添加する工程；および
（g）工程（f）の結果生じる混合物から上清を得、その後その上清を乾燥する工程（ここで、結果生じた乾燥生成物は水に直接的に溶解され得、帯黄色の澄んだ透明の水溶液を形成する）
を包含する、水溶性抽出物を調製するための方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、工程（a）において、Solanum属の植物の植物原料は、予備処理において切り刻まれている（chopped）。
【００３３】
好ましくは、工程（a）において、植物原料は、Solanum属の植物の果実、根、茎、および葉の少なくとも１つである。本発明の好ましい実施形態において、工程(a)において使用される植物原料は、Solanum属の植物の果実である。本発明のさらに好ましい実施形態において、工程(a)において使用される植物原料は、Solanum属の植物の植物全体である。
【００３４】
好ましくは、水溶性抽出物は、
【００３５】
【表３】
2004359661.tif 000004
からなる群より選択されるSolanum属の植物から得られる。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態において、水溶性抽出物は、Solanum incanum L. から得られる。本発明のさらに好ましい実施形態において、水溶性抽出物は、Solanum nigrumから得られる。
【００３７】
好ましくは、該方法の工程(a)において、水溶液は、抽出処理に続いて遠心または濾過を行うことによって得られる。
【００３８】
好ましくは、工程(a)において、抽出処理において使用される酸性水溶液は、蟻酸、酢酸、または塩酸を含む水溶液である。
【００３９】
好ましくは、工程（b）において、塩基は、好ましくは、アルカリ水酸化物（alkali hydroxides）および水酸化アンモニウムからなる群より選択される化合物を含むアルカリ性水溶液である。本発明の好ましい実施形態において、アルカリ性水溶液は水酸化アンモニウムを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、アルカリ性水溶液は、水酸化ナトリウムを含む。
【００４０】
好ましくは、該方法の工程(b)において、沈殿物は、ｐＨ値調整に続いて遠心または濾過を行うことによって得られる。
【００４１】
好ましくは、該方法の工程(c)において、乾燥処理は、凍結乾燥、噴霧乾燥、エバポレーション、加熱乾燥、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。本発明の１つの好ましい実施形態において、乾燥処理は、低温処理によって有効成分の安定性および活性を改善するために使用される凍結乾燥によって行われる。
【００４２】
好ましくは、該方法の工程(c)において、工程(b)において形成される沈殿物が水で洗浄され、過剰な塩基を取り除くために遠心され、そして蒸留水中に懸濁され、次いで乾燥処理が行われる。
【００４３】
該方法の工程(d)において、クロロホルムおよびアルコールの量は、工程(c)から得られる乾燥生成物がそれらに溶解することができさえすれば、特に重要ではない。本発明の好ましい実施形態において、アルコールの量は、工程(d)において使用されるクロロホルムの量より多くない。
【００４４】
好ましくは、該方法の工程(d)および（e）において、アルコールは、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、工程(d)および（e）において使用されるアルコールは、メタノールである。
【００４５】
好ましくは、工程（e）において使用される水／アルコール溶液において、水の含有量がアルコールの含有量以上である。より好ましくは、水対アルコール比は、１：１である。
【００４６】
好ましくは、該方法の工程（ｆ）において、工程（e）から得られた混合物中のクロロホルム−ベース層は、遠心または濾過を行うことによって取り除かれる。
【００４７】
好ましくは、該方法の工程（ｇ）において、上清は、工程（ｆ）において結果的に生じる混合物を遠心または濾過することによって得られる。
【００４８】
好ましくは、該方法の工程（ｇ）において、乾燥処理は、凍結乾燥、噴霧乾燥、エバポレーション、減圧下における濃縮、加熱乾燥、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましい実施形態において、工程（ｇ）において行われる乾燥処理は、減圧下における濃縮および凍結乾燥を包含する。
【００４９】
所望されるならば、工程（ｇ）において得られる乾燥生成物は、水に再溶解され得（re-dissolved）、次いで遠心および乾燥処理が行われる。
【００５０】
本発明に従う抽出物は、飲料水または滅菌水に直接的に溶解され得、帯黄色の澄んだ透明の水溶液を形成する。従って、本発明によって得られる抽出物は、真に水溶性抽出物である。
【００５１】
本発明の方法から調製される水溶性抽出物は、実質的に、少なくとも６０％−９０％のソラマージンおよびソラソニンからなる。さらに、本出願人は、ある因子が、本発明の方法を用いて得られる水溶性抽出物におけるソラソニンおよびソラマージンの含有量および比率に影響を与えるかもしれないことを見出した。
【００５２】
これらの因子として、Solanum属の植物の種(species)およびこの抽出方法において使用される植物の部位（単数／複数）、ならびに使用されるアルコールおよび塩基の型が挙げられる。
【００５３】
例えば、Solanum incanum L.の熟した果実から生産される水溶性抽出物において、ＨＰＬＣ分析に従うと、ソラマージンの含有率はソラソニンの含有率よりも高い。さらに、３３％の塩基性ＮＨ4ＯＨ溶液と比較すると、工程（ｂ）における塩基として１０Ｍ  ＮａＯＨ  塩基性溶液を用いることによって得られる水溶性抽出物において、ソラマージン含有率はソラソニン含有率よりも低い。加えて、工程（ｄ）においてエタノールを用いることによって得られる水溶性抽出物におけるソラソニンおよびソラマージンの含有率は、メタノールを用いることによって得られるものの約５０％である。さらに、Solanum  nigrumの熟していない（unripe）果実（暗緑色）から得られる抽出物は、ソラソニンおよびソラマージンのより高い含有率を有し、一方熟した果実（暗紫色）および植物の他の部分は、より低い含有率を有する。Solanum  nigrumからの抽出物におけるソラソニンおよびソラマージンの含有率は、Solanum incanum L.から得られる抽出物におけるものと異なる。それゆえ、当業者は、適切な操作条件と共に、Solanum属の植物の適切な種（species）を選択すること、および植物の適切な部分（単数または複数）を用いることによって、所望の水溶性抽出物を調製することができる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態において、抽出処理を行うための工程（a）において使用される水溶液は酢酸を含み、沈殿物を形成するための工程（ｂ）において使用される塩基性溶液は水酸化アンモニウムを含み、そして工程（ｄ）および（e）において使用されるアルコールはメタノールである。
【００５５】
好ましくは、水溶性抽出物は７５％以上のソラマージンおよびソラソニンからなる。
【００５６】
水溶性抽出物におけるソラソニン対ソラマージン比は、好ましくは、０．３：１．０から１．０：０．６までの範囲であり、より好ましくは０．４：１．０から０．９：１．０までの範囲である。本発明の好ましい実施形態において、水溶性抽出物におけるソラソニン対ソラマージン比は、約０．７：１．０である。
【００５７】
好ましくは、抽出物は、ナノ粒子サイズ（nanoparticle size）を有する水溶性粒子の形態をとる。より好ましくは、抽出物は、１μｍより小さい粒子サイズを有する水溶性粒子の形態をとる。
【００５８】
本発明に従う水溶性抽出物は、腫瘍／ガン細胞（特に、肝ガン細胞、肺ガン細胞、および乳ガン細胞）の増殖に抑制効果を有することが証明された。さらに、本発明に従う水溶性抽出物から得られるソラソニンおよびソラマージンもまた、このような抑制効果が実証された。それゆえ、本発明に従って調製される水溶性抽出物、ならびにそれらの中に含まれるソラソニンおよびソラマージンが、抗−腫瘍または抗−ガン組成物の調製において用途を見出し得ることが期待される。
【００５９】
従って、本発明はまた、本発明に従う水溶性抽出物、またはその水溶性抽出物から得られるソラソニンおよびソラマージンを含む薬学的組成物を提供する。水溶性抽出物から精製されるソラソニンおよびソラマージンはまた、水に直接的に溶解し得る。
【００６０】
必要に応じて、本発明に従う薬学的組成物は、さらに、薬剤−製造技術において広く使用される薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、崩壊剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、および吸収遅延剤（absorption retardant）を含む１つ以上の試薬を含む。
【００６１】
本発明に従う薬学的組成物は、非経口または経口経路によって、滅菌水溶液または懸濁液、滅菌粉末、錠剤、カプセル剤、クリーム、軟膏剤などを含む適切な製剤において、投与され得る。本発明に従う薬学的組成物は、好ましくは、水性注射、粉末注射、注射用凍結乾燥生成物などの注射剤として適するよう処方される。
【００６２】
必要に応じて、本発明の薬学的組成物は、単独にか、またはさらなる抗−腫瘍／抗−ガン剤（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン、アクチノマイシン、シス−プラチン(cis-platin)など）と共に、投与され得る。
【００６３】
本発明に従う薬学的組成物の投薬量および間隔（interval）は、以下の因子に依存する：処置される疾患の重篤度、投与経路、および処置される被験体の体重、年齢、健康状態、および応答（response）に依存する。概して、本発明に従う薬学的組成物は、経口的にか、または腹腔的に、２−６ｍｇ／ｋｇの日用量で、単一の投与形態または異なる複数−投与形態（multi-dosage form）において、投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明は、例示のみの目的のために与えられ且つ本発明の範囲を制限することを意図されない以下の実施例への参照を用いて、詳細に説明されるであろう。
【００６５】
実施例１．水溶性抽出物の調製
Solanum incanum L. の熟した果実５００ｇを、１０００ｍｌの純水の添加に引き続いて粉砕した。得られた水性混合物へ、９９．５％の酢酸を滴下して、ｐＨ値を４．０へ調整し、続いて室温で１２時間振盪した。水性混合物を遠心分離することによって上清みを得、そして３３％ＮＨ4ＯＨ塩基性溶液をそこへ滴下して、上清みのｐＨ値を９．０へ調整し、そして沈殿物が形成された。４，５００ｒｐｍでの遠心分離（Beckman Coulter, Avanti J-25, JA-14 Rotor）を行うことによって沈殿物を得、そしてその中に存在する残余の塩基性溶液を、沈殿物を水で洗浄し続いて４，５００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。このようにして得た沈殿物を蒸留水中に懸濁させ、そして凍結乾燥（Virtis, Freezemobile 12ES）へ供して、５ｇの乾燥粉末を得た。乾燥粉末は、大部分が水性溶液中に懸濁され、そして水中に直接溶解し得ず、またはそのうちの非常に少量のみが直接溶解し得る。
【００６６】
水中に直接溶解し得る抽出物の調製のために、２ｇの乾燥粉末を試薬等級のクロロホルム５０ｍｌに溶解させ、続いて４０ｍｌの１００％メタノールを添加しそして振盪して、均質な懸濁液を形成させた。上清みを、４，５００ｒｐｍでの遠心分離または濾過によって得た。７０ｍｌのメタノール：水溶液（１：１）を上清みへ添加し、そして十分に混合した。得られた混合物を、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた上清みを取り出し、そして１２０ｍｌの蒸留水をそこへ添加し、そして十分に振盪した。その間に、上清みが薄黒く（murky）なった。上清みを更に１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、沈殿物を除去した。得られた上清みを減圧下５５℃での濃縮に供して、メタノールを除去し、続いて凍結乾燥を行って乾燥粉末を得た。
【００６７】
この段階で得られた乾燥粉末は、蒸留水中に直接溶解して、クリアかつ透明で黄色がかった溶液が形成され得る。依然としていくらかの沈殿物が存在する場合、それは、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって除去され得、そして得られる上清みは、凍結乾燥へ直接供されて、減圧下での濃縮の工程なしに水溶性乾燥粉末が得られ得る。
【００６８】
一般的に、８００ｍｇの水溶性乾燥粉末が、Solanum incanum L.の果実５００ｇから抽出され得る。ＨＰＬＣ分析において、該水溶性乾燥粉末の主成分は、ソラマージン（solamargine）およびソラソニン（solasonine）であると観察され、ここで、ソラマージンの含有量は、ソラソニンのそれよりも高かった（実施例２および図１Ａを参照のこと）。
【００６９】
あるいは、上述の調製プロセスにおいて、該果実は、３％または５％の１０００ｍｌ酢酸水溶液中に浸漬されそして切断され得る。更に、室温で１２時間水性混合物を振盪する工程を行う代わりに、形成される水性混合物は、５０℃で５時間、または８０℃で２時間振盪され得る。あるいは、水酸化ナトリウム水溶液が、ＮＨ4ＯＨ水溶液の代替物として使用され得る。
【００７０】
実施例２．水溶性抽出物の成分の同定
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、本発明の方法から得られる水溶性抽出物の主成分を決定した。
【００７１】
方法：
この実施例において、使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ  ２５０−４  Ｌｉｃｈｒｏｐｈｅｒ  １００  ＲＰ−１８ｅのカラム（５μｍ）、および２５０ｍｍ ｘ ４ｍｍの寸法を有する、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｅｓ（Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製の１１００モデルであり；６０％アセトニトリル／４０％再蒸留水（ｐＨ＝２．８）を移動相として使用し；そして流速は１ｍｌ／分であった。この実験において使用したソラソニンおよびソラマージンの標準試料は、Kaohsiung Medical大学薬学部のChun-Nan Lin教授から提供され、そしてこの２つの標準試料は、Gan, K.H., Lin, C.N. and Won, S.J. (1993), Journal of Natural Products 56, 15-21において開示される精製方法に従って得られた。
【００７２】
実施例１の方法に従うSolanum incanum L.およびSolanum nigrumの果実から調製された好適な量の水溶性抽出物を、純水に溶解させ、そして以下の条件に従うＨＰＬＣ分析に供した：
１．Solanum incanum L.の水溶性抽出物（２５μｇ）、ソラソニン（５μｇ）と混合したSolanum incanum L.の水溶性抽出物（２５μｇ）、およびソラマージン （５μｇ）と混合したSolanum incanum L.の水溶性抽出物（２５μｇ）：
２．Solanum nigrumの水溶性抽出物（２５μｇ）、ソラソニン （１０μｇ）と混合したSolanum nigrumの水溶性抽出物（２５μｇ）、およびソラマージン（１０μｇ）と混合したSolanum nigrumの水溶性抽出物（２５μｇ）：ならびに
３．それぞれ、５０μｇ、４０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、１０μｇおよび５μｇの量のSolanum incanum L.の水溶性抽出物。
【００７３】
結果：
図１Ａは、Solanum incanum L.の果実由来の水溶性抽出物のＨＰＬＣスペクトルを示す。図１Ｂおよび１Ｃに示される保持時間と比較すると、図１Ａにおける第１ピークはソラソニンに対応しそして第２のそれはソラマージンに対応し、そしてソラマージンの含有量はソラソニンのそれよりも多いことが判る。
【００７４】
図２Ａ−２Ｃを参照すると、ＨＰＬＣスペクトルは、Solanum nigrumの果実由来の水溶性抽出物はまた、ソラソニンおよびソラマージンに対応する２つのピークを提供することを示した。しかし、Solanum nigrumの果実由来の水溶性抽出物とSolanum incanumのそれとの差異は、Solanum nigrumにおいてソラソニンの含有量はソラマージンのそれよりも多いという点にある。
【００７５】
更に、図１Ａ−１Ｃおよび図２Ａ−２Ｃに示されるように、本発明に従う水溶性抽出物は、ソラソジン（solasodine）を含まず、そしてEP 0 020 029 A1に開示される抽出物とは明らかに異なっていた。
【００７６】
図３Ａ−３Ｆは、それぞれ、７５μｇ、５０μｇ、４０μｇ、３０μｇ、２０μｇ、および１０μｇの量のSolanum incanum L.由来の水溶性抽出物のＨＰＬＣスペクトルである。Solanum incanum L.の水溶性抽出物の２つの主成分のピーク値は水溶性抽出物の濃度に比例して変動することがわかる。
【００７７】
ソラソニンおよびソラマージンの比率について、それは、ＨＰＬＣ溶出スペクトル（HPLC eluting spectrum）に従ってコンピュータプログラム（Agilent ChemStation Integrator Algorithm）を使用して自動化積分（automated integration）によって評価され得る。鋭いまたは丸いピーク形状がスペクトルに現れる場合、このような変化は、果実の熟度および季節の因子に起因し得る。２６の反復実験に基づいて、Solanum incanum L.の水溶性抽出物は、約０．３：１．０から約１．０：１．０までの範囲内、そして主に０．４：１．０から０．９：１．０までの範囲内のソラソニン対ソラマージン比を有することがわかった。
【００７８】
実験結果から、本出願人は、本発明に従う水溶性抽出物は、実質的に、少なくとも６０〜９５％（好ましくは、７５％を超える）のソラソニンおよびソラマージンからなることを見出した。
【００７９】
本出願人はまた、ソラソニンおよびソラマージンの含有量および比率は、線形関係で、ＨＰＬＣ分析において使用される水溶性抽出物の濃度に伴って変化することを見出した。図４は、線形回帰を使用してプロットされた検量線を示す図であり、ここで、７の濃度のSolanum incanum L.水溶性抽出物を、三重でＨＰＬＣ分析に供し、そして値（平均±ＳＤ）を、２つの主要成分のＨＰＬＣピーク面積の積分から算出した。図４に示される結果は、ソラソニンおよびソラマージンのピーク値が、水溶性抽出物の濃度に伴って線形関係で上昇および下降することを明確に示した。従って、２つの成分、ソラソニンおよびソラマージンは、本発明に従う水溶性抽出物の品質管理についての指標成分（index component）として使用され得る。
【００８０】
更に、水に直接溶解され得るソラマージンおよびソラソニンは、前述のＨＰＬＣ条件を使用して、本発明の水溶性抽出物から更に精製され得る。
【００８１】
実施例３．水溶性抽出物の溶出に対するｐＨの効果
【００８２】
方法：
水溶性抽出物の溶出に対するｐＨの影響を測定するために、実施例１の方法を使用して調製したSolanum incanum L.の水溶性抽出物（４０μｇ）を、以下のＨＰＬＣ条件下で、実施例２において使用したのと同一の装置を使用してのＨＰＬＣ分析に供した：
１．カラム：LiChroCART 250-4 Lichropher 100 RP-18e（５μｍ）、２５０ｍｍ×４ｍｍ；および
２．移動相：６０％アセトニトリル／４０％再蒸留水［２．３、２．５、２．８、３．０および３．２へｐＨ調整した］。
【００８３】
結果：
図５Ａ−５Ｅは、種々のｐＨ値でのSolanum incanum L.由来の水溶性抽出物のＨＰＬＣスペクトルを示す。示されるように、水溶性抽出物の主成分の保持時間は、移動相のｐＨ値の上昇によって、遅延した。溶出プロフィールは僅かに変化したが、２成分ピークプロフィールは依然として維持された。
【００８４】
実施例４．水溶性抽出物の粒度の比較
この実施例を、本発明の方法を使用して調製されたSolanum incanum L.由来の水溶性抽出物と、EP 0 020 029 A1の実施例２に開示される方法を使用して得られるものとの間の、粒度における差異を比較するために行った。
【００８５】
方法：
本発明に従ってSolanum incanum L.から調製された水溶性抽出物５０ｍｇ、およびEP 0 020 029 A1の実施例２に開示される方法に従ってSolanum incanum L.から調製された抽出物５０ｍｇを、それぞれ、５０ｍｌの蒸留水に溶解させ、そして粒度分析器（Beckman Coulter LS 230, Coulter Corporation, Miami, USA）を使用して粒度分析に供した。
【００８６】
結果：
図６を参照して、EP 0 020 029 A1の実施例２に開示される方法に従ってSolanum incanum L.から調製された抽出物の平均粒度は２３８．２μｍであり、そして粒度分布（particle size distribution）は１．８μｍ〜１５００μｍの範囲内であり、そして多量の不溶性沈殿物が水溶液中に存在した（図６Ａを参照のこと）。これに対して、本発明に従ってSolanum incanum L.から調製した水溶性抽出物の平均粒度は、０．４１８μｍであり、そして粒度分布は０．２８μｍ〜０．６５μｍの範囲内であった（図６Ｂを参照のこと）。本発明に従う抽出物は、水に完全に溶解され得る。
【００８７】
実施例５．水溶性抽出物の溶解性の比較
この例示的実験は、本発明の方法を使用して調製したSolanum incanum L.由来の水溶性抽出物とEP 0 020 029 A1の実施例２に開示される方法を使用して得たものとの間の水溶性（water-solubility）における差異を比較するために行った。
【００８８】
方法：
本発明に従ってSolanum incanum L.から調製された水溶性抽出物５ｍｇ、およびEP 0 020 029 A1の実施例２に開示される方法に従ってSolanum incanum L.から調製された抽出物５ｍｇを、それぞれ、２ｍｌの蒸留水に溶解させ、そして１２，０００ｒｐｍで遠心分離して、上清みを得た。２０μｌの上清みを取り出し、そして本発明の実施例２に開示される手順に従ってＨＰＬＣ分析に供した。
【００８９】
結果：
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、EP 0 020 029 A1の実施例２に開示される方法に従ってSolanum incanum L.から調製した抽出物（図７Ａ）および本発明に従ってSolanum incanum L.から調製した水溶性抽出物（図７Ｂ）の水溶性を示すグラフである。示されるように、本発明に従ってSolanum incanum L.から調製した水溶性抽出物は、より良好な水溶性を有する。
【００９０】
上記実施例および図から、慣用方法を使用して調製された抽出物と比較した場合、本発明に従ってSolanum属の植物から調製された水溶性抽出物は、実際に、水に溶解してクリアかつ透明な水溶液を形成し得ることが明らかである。これは、本発明に従ってSolanum属の植物から調製された水溶性抽出物は、ナノ粒度、特に１μｍ未満を有するという事実に起因し得る。従って、本発明に従ってSolanum属の植物から調製された水溶性抽出物は、ステロイドアルカロイドを含む医薬、特に癌治療のための医薬の製造における使用に好適であることが予想される。
【００９１】
従って、本発明に従ってSolanum属の植物から調製された水溶性抽出物の生物活性（bio-activity）を証明するために、本発明の実施例１において調製したSolanum incanum L.の水溶性抽出物を、薬理学的効果について試験した。
【００９２】
薬理学的実験１．
インビトロでの水溶性抽出物の抗癌活性
本発明に従ってSolanum属の植物から得られた水溶性抽出物が抗癌活性を有するかどうかを測定するために、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ４４１、およびＭＣＦ−７の主要な癌細胞を分析標的（analytic targets）として使用した。ここで、Ｈｅｐ３ＢおよびＨ４４１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 USA）から購入し、そしてＭＣＦ−７は、Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（331 Shih-Pin Road, Hsinchu, 300 Taiwan R.O.C.）から購入した。
【００９３】
方法：
Ｈｅｐ３Ｂをダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）においてインキュベートし、一方、Ｈ４４１およびＭＣＦ−７をＲＰＭＩ−１６４０においてインキュベートした（培地は両方とも、１０％ウシ胎仔血清および４０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有した）。
【００９４】
癌細胞の細胞傷害性を、テトラゾリウム塩アッセイ（tetrazolium salt assay）（MTS, Mosmann. T., 1983, Immmunol. Meth., 65, 55-63）を使用して測定し、これは、製造者の手順に従って細胞生存度（cell viability）の比色分析測定について行った（CellTiter 96TM AQ, Promega, Madison, USA）。
【００９５】
細胞を、９６−ウェルプレートに１×１０4細胞／ウェルで接種し、そして少なくとも１６時間、３７℃で、５％ＣＯ2インキュベータにおいてインキュベートした。Solanum incanum L.由来の水溶性抽出物を、滅菌注射用水（sterile injection water）に溶解させて種々の試験濃度を得、これを、ウェル中の各癌細胞をインキュベートしている培地へ添加し、そして１２時間反応させた。次いで、２０μｌのＭＴＳを各ウェルへ添加し、そしてこの溶液を３時間反応させた。反応完了時に、各ウェルにおける吸光度を、ELISA reader 312e, Bio-TEKを使用することによって、４９０ｎｍで測定した。各値を、３つの実験からの平均±ＳＤとして表現した。
【００９６】
結果：
図８Ａ〜８Ｃは、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ４４１、およびＭＣＦ−７の増殖を阻害することに対する、本発明に従ってSolanum incanum L.から調製した水溶性抽出物の効果を示すグラフである。本発明に従ってSolanum incanum L.から調製した水溶性抽出物は、これらの癌細胞の増殖を有効に阻害することが観察された。
【００９７】
薬理学的実験２
遺伝子チップを使用することによる、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製した水溶性抽出物の肺癌細胞中の遺伝子調節機構に対する効果の測定
癌処置に関する開発および研究における進路をはっきりと示すように、そして発癌性因子に関する研究および効果的な抗癌医薬の開発において補助するように、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物の癌細胞における遺伝子調節に対する効果を理解するために本実験を行い、遺伝子チップ技術によって本発明の水溶性抽出物の調節効果を決定した。
【００９８】
本実験において、市販の遺伝子チップアレイ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調節された水溶性抽出物のＨ４４１癌細胞における遺伝子調節に対する効果を測定した。
【００９９】
最初にＲＮＡサンプルを、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調節した水溶性抽出物（１００μｇ/ｍｌ）で２時間処理した癌細胞から、および抽出物で処理していない癌細胞（コントロールグループ）から単離した。標識したｃＤＮＡを［32Ｐ］−ｄＣＴＰを使用して逆転写を行うことによって作製し、これを遺伝子チップアレイ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）上でのＤＮＡフラグメントでのハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用し得た。反応した遺伝子チップアレイを、オートラジオグラフィーを使用してｘ線フィルムに暴露した。
【０１００】
結果：
図９を参照すると、Ｈ４４１を本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製した水溶性抽出物で２時間処理した後、癌細胞の死と正に関連する腫瘍壊死因子レセプターＩ（ＴＮＦＲ−Ｉ）およびＴＮＦレセプター関連因子−１（ＴＲＡＦ−１）の遺伝子発現はアップレギュレートされるが、一方アポトーシスタンパク質２（ＩＡＰ−２）のインヒビターおよびアポトーシスインビヒター４（ＡＰＩ−４）（これは細胞死を阻害する）の遺伝子発現は、抽出物の影響に起因してダウンレギュレートされた。従って、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物は、ＴＮＦＲ−ＩおよびＴＲＡＦ−１の遺伝子発現を開始し得ることが理解され得る。
【０１０１】
薬理学的実験３
本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物の癌細胞の細胞周期に対する効果
フローサイトメトリー（「ＦＡＣＳｃａｎ」；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、細胞を本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物で処理する前および後に、癌細胞の細胞周期の変化を測定した。
【０１０２】
方法：
最初に、３５ｍｍプレート中で１×１０6癌細胞を１６時間インキュベートした後、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物（３０μｇ/ｍｌ）を各プレートに添加して、０、１、３、５、および８時間反応させた。各反応時間が終了したときに、細胞を１×トリプシンでトリプシン処理し、そして上清および培地を回収した。細胞含有上清を１５ｍｌ遠心分離チューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離してペレットを得た。３００μｌの１×ＰＢＳを添加しそして十分に混合した後、３００μｌ細胞懸濁液をマイクロチューブに移し、そして７００μｌ無水アルコール中で固定した。固定された細胞を少なくとも３０分間、４℃の冷蔵庫で静置し、１２００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、上清を得て十分に混合した。４４５μｌの１×ＰＢＳ溶液を上清に添加しそして十分に混合し、その後５μｌのＲＮａｓｅ（１０ｍｇ/ｍｌ）を添加してＲＮＡを消化した。細胞を５０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で浸透し、そして３７℃で１時間、インキュベーター中でインキュベートし、その後遠心分離した。上清を取り出し、そして４９５μｌのＰＢＳ溶液と十分に混合した。細胞を４℃で１５〜３０分間、暗所中で５μｌのヨウ化プロピジウム（５ｍｇ/ｍｌ）で染色し、その後濾過および分析した。
【０１０３】
細胞周期の測定
フィルターに接着した細胞を１×ＰＢＳ溶液中に十分に懸濁し、そして１００細胞/秒でフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＡＣＳｃａｎ）に導入した。１０，０００細胞を一度に分析した。細胞を半径７５μｍを有する孔を通過させ、細胞容量に比例して電流パルスシグナルを生成した。細胞を４８８ｍｍでアルゴンイオンのレーザービームによって励起させて蛍光を発生させた。得られたデータを使用して、細胞周期を測定するためにＷｉｎｍｄｉソフトウェアと組み合わせてＤＮＡ含量を分析した。
【０１０４】
結果：
表１は、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物で処理したＨｅｐ３Ｂ、Ｈ４４１およびＭＣＦ−７の細胞周期の変化を示し、ここで、ｓｕｂ−Ｇ１ピークの上昇によって、癌細胞が水溶性抽出物によって誘導されたアポトーシスを起こすことが示された。
【０１０５】
表１に示されるように、癌細胞における細胞周期のｓｕｂ−Ｇ１ピークは１時間以内に劇的に増加し、そしてこれは反応時間の増加と共に増加した。癌細胞は、高投薬量の抽出物の結果として、細胞膜の破損によって死んだ。本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物は３種類の癌細胞のアポトーシス機構を開始し得ることが示されている。
【０１０６】
【表４】
2004359661.tif 000005
【０１０７】
薬理学的実験４
本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物の癌細胞形態に対する効果
本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物によって誘導される癌細胞の形態学的変化を詳細に調べるために、ヘマトキシリンで染色した癌細胞の形態を、光学顕微鏡を使用して検査した。
【０１０８】
方法：
最初に、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物（３０μｇ/ｍｌ）で１、３、５、および８時間処理した適切な量の肝癌細胞、肺癌細胞、および乳癌細胞を、８００ｒｐｍで１０分間、サイトスピン中で遠心分離して細胞スライド（ｃｙｔｏｓｌｉｄｅ）を得た。細胞を、４％のパラホルムアルデヒド中で３０分間固定し、そしてヘマトキシリンで染色し、その後７０％、８０％、９０％、９５％、および１００％無水アルコールによって過剰の染料を除去した。細胞スライドを脱水処理のためにキシレン中に配置し、そしてカバースライドおよびマウンティング媒体によってカバーした。細胞形態の変化を、光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＸ−４０）を使用して４００Ｘで観察しそして記録した。
【０１０９】
結果：
図１０は、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物（３０μｇ/ｍｌ）で、細胞を１、３、５、および８時間処理する前および後のヒト癌細胞の形態学的変化を示し、ここで、ラインＡはＨｅｐ３Ｂを示し、ラインＢはＨ４４１を示し、そしてラインＣはＭＣＦ−７を示す。抽出物で処理されていない細胞をコントロールグループとして使用し、そして矢印は、細胞の典型的な形態学的変化を示した。
【０１１０】
図１０において示されるように、核（ｎｕｃｌｅｕｓｅｓ）の減少、クロマチン凝縮、およびアポトーシス小体の存在が、癌細胞が本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物で１時間処理された後、癌細胞中で観察された。同時に、癌細胞の形態学的変化が、細胞膜が最終的に破壊するまで、反応時間の進行と共にますます明らかとなった。
【０１１１】
ｓｕｂ−Ｇ１ピーク、クロマチン凝縮、およびアポトーシス小体の存在はアポトーシスに特徴的であるので、このアッセイおよび薬理学的実験３において示される結果は、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物が細胞死を誘導するために癌細胞においてアポトーシスの機構を開始し得ることを明確に示す。
【０１１２】
薬理学的実験５
本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から調製された水溶性抽出物のインビボでの抗癌効果
本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．由来の水溶性抽出物のインビボでの抗癌効果を確認するために、ヌードマウスをインビボ動物モデルとして使用した。
【０１１３】
方法：
最初に、２×１０7Ｈ４４１細胞を、ヌードマウスＢＡＢＬ／ｃ−ｎｕ−ｎｕ（８週齢、約２０〜２５ｇ）の後部側腹に皮下注射によって移植した。腫瘍が形成してこれが増殖し始めた後（約１０日）、腫瘍を有するヌードマウスを６〜７匹のマウスのグループに無作為に配置した。
【０１１４】
注射グループにおけるヌードマウスは、一日に一回、０．８ｍｍ針を使用して、水中に溶解した２２０μｇ水溶性抽出物で腹腔内投与した。注射を３日間続け、そして４日間中断した。マウスを２日毎に計量し、そして腫瘍サイズをマイクロメーターを使用して測定した。次の処置過程を進め、そして観察を２ヶ月にわたって続けた。腫瘍体積を、長さ×幅×（高さ/２）の積として計算した。
【０１１５】
経口投与グループマウスにおける各ヌードマウスは、１日に一回、フィーダーによって水溶性抽出物（６００μｇ）を経口投与した。フィーディングは５日連続し、そして２日間中断した。ヌードマウスの体重および腫瘍サイズを上記様式で記録した。投与および観察を２ヶ月にわたって続けた。腫瘍体積もまた上記様式で計算した。
【０１１６】
結果：
図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃはそれぞれ、ヌードマウスにおける腫瘍サイズの変化を示し、ここで、図１１Ａは、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から得られた水溶性抽出物を投与されていないコントロールグループのマウス（６匹のヌードマウス）における腫瘍サイズにおけるサイズの変化を示した；図１１Ｂは、経口投与グループ（７匹のヌードマウス）における腫瘍サイズにおける変化を示した；そして図１１Ｃは、注射グループ（７匹のヌードマウス）における腫瘍サイズにおける変化を示した。
【０１１７】
図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃにおいて示されるように、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から得られた水溶性抽出物を投与されていないコントロールグループのマウスにおける腫瘍のサイズは、速やかに増加することが見出された（１ヶ月後には本来のサイズの約６倍）。しかし、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から得られた水溶性抽出物を経口投与されたヌードマウスにおける腫瘍は、大きく萎縮したかまたは消滅した。いくつかにおける腫瘍はサイズにおいてわずかに増加したが、増殖速度はコントロールグループと比較してはるかに遅かった。本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から得られた水溶性抽出物を腹腔内投与されたヌードマウスに関しては、全てのマウスにおける腫瘍が萎縮したかまたは消滅した。これらの結果によって、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．から得られた水溶性抽出物の経口または腹腔内投与は、ヌードマウスに移植された腫瘍の増殖を遅延させること、そのサイズを減少させること、およびこれを除去さえすることにおいて効果的であり、そして経口投与グループにおけるよりも腹腔内投与グループにおいて効果が優れていたことが示された。
【０１１８】
薬理学的実験６
本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物からさらに精製されたソラソニン（ｓｏｌａｓｏｎｉｎｅ）およびソラマージン（ｓｏｌａｍａｒｇｉｎｅ）のインビボでの抗癌効果
本実験を使用して、ＨＰＬＣを使用して本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物から精製されたソラソニンおよびソラマージンの生物活性を、研究した。
【０１１９】
方法：
実施例２において記載されたＨＰＬＣ手順に従って、２つの化合物（ソラソニンおよびソラマージン（これらは同様に水中に直接溶解され得る））を、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物からさらに分離および精製した。
【０１２０】
細胞毒性を、薬理学的試験１において開示されるＭＴＳテトラゾリウム塩アッセイによって決定した。Ｈ４４１細胞を、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物から精製された種々の投薬量のソラソニンおよびソラマージンで１２時間処理し、その後製造業者の手順に従って細胞生存度の比色定量測定を行った（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６TM  ＡＱ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）。データを３回の実験から平均値±ＳＤとして表した。
【０１２１】
結果：
図１２は、ヒト肺癌細胞の増殖が、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物から精製したソラソニンおよびソラマージンによって効果的に阻害され得ることを示す。示されるように、本発明に従うＳｏｌａｎｕｍ  ｉｎｃａｎｕｍ  Ｌ．の水溶性抽出物から精製されたソラソニンおよびソラマージンは、顕著な抗癌活性を有する。
【０１２２】
要約すると、本出願人は、Ｓｏｌａｎｕｍ属の植物由来の水溶性抽出物を首尾よく得、水溶性抽出物の抽出の間に科学的分析のための条件を確立し、そして効果的な品質管理が可能となるようにその活性化合物を得た。さらに、本発明に従う水溶性抽出物は、癌細胞の増殖を阻害しそして癌細胞のアポトーシス機構を開始する活性を有することが証明された。これらの事実によって、本発明の水溶性抽出物は癌細胞の増殖を阻害することおよび癌細胞を検出することにおいて潜在能力を有することが示される。
【０１２３】
本明細書中に引用される全ての特許および参考文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。対立する場合には、本発明の記載（定義を含む）が優先する。
【０１２４】
本発明は上記の特定の実施形態を参照して記載されているが、多数の改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われ得ることが明らかである。従って、本発明は添付の特許請求の範囲に示される場合にのみ制限されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１Ａ】図１Ａは、Solanum incanum L.から得られた水溶性抽出物（２５μｇ）のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ソラソニン（５μｇ）を混合したSolanum incanum L.から得られた水溶性抽出物（２５μｇ）のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ソラマージン（５μｇ）を混合したSolanum incanum L.から得られた水溶性抽出物（２５μｇ）のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Solanum nigrum から得られた水溶性抽出物（２５μｇ）のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ソラソニン（５μｇ）を混合したSolanum nigrumから得られた水溶性抽出物（２５μｇ）のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ソラマージン（５μｇ）を混合したSolanum nigrumから得られた水溶性抽出物（２５μｇ）のＨＰＬＣスペクトルを示す。
【図３Ａ−３Ｆ】図３Ａ−３Ｆは、種々の濃度を有するSolanum incanum L. から得られた水溶性抽出物のＨＰＬＣスペクトルである。
【図４】図４は、図３Ａ−３ＦのHPLCスペクトルから推定されるSolanum incanum L. の水溶性抽出物における主成分の量的基準（quantitative standards）を示すグラフである。
【図５Ａ−５Ｆ】図５Ａ−５Ｆは、種々のｐＨ値におけるSolanum incanum L. から得られた水溶性抽出物のＨＰＬＣスペクトルである。
【図６】図６は、それぞれ、本発明に従うSolanum incanum L. から、あるいはＥＰ  ０  ０２０  ０２９  Ａ１の方法から得られる水溶性抽出物の粒子サイズにおける比較結果を示す。
【図７Ａ．７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、本発明に従うSolanum incanum L. から、あるいはＥＰ  ０  ０２０  ０２９  Ａ１の方法から得られた水溶性抽出物のHPLCスペクトルであり、ここで、この２つの方法から得られた５０μｇの水溶性抽出物は水に溶解され、その後ＨＰＬＣ分析される。
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ−８Ｃは、本発明に従うSolanum incanum L. から得られる一連の投与量の水溶性抽出物のヒト肝ガン、肺ガンおよび乳ガン細胞の増殖に及ぼす抑制効果を示すグラフである。
【図９】図９は、遺伝子チップ上のオートラジオグラフィー結果（本発明に従うSolanum incanum L. から得られる水溶性抽出物の肺ガン細胞の遺伝子調節に及ぼす影響を示す）を示す１セットのグラフである（ここで、ＲＮＡサンプルは、Solanum incanum L. から得られた水溶性抽出物（１００μｇ／ｍｌ）で２時間処理された肺ガン細胞から単離され、そして標識ｃＤＮＡを生成する[32Ｐ]−ｄＣＴＰを用いる逆転写にかけられ、そしてこのように得られる標識ｃＤＮＡは、遺伝子チップアレイ上のＤＮＡフラグメントへハイブリダイズされ、その後Ｘ−線フィルムへのオートラジオグラフィーが行われる）；
【図１０】図１０は、本発明に従うSolanum incanum L. から得られる水溶性抽出物で処理される肝ガン細胞（ラインＡ）、肺ガン細胞（ラインＢ）、および乳ガン細胞（ラインＣ）の形態学的変化を示す１セットの写真である。
【図１１Ａ．１１Ｂ．１１Ｃ】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、本発明に従うSolanum incanum L. から得られた水溶性抽出物を投与されていないヌードマウス、該抽出物を経口投与されたヌードマウス、および該抽出物を腹腔内に投与されたヌードマウスにおける腫瘍の大きさにおける変化を示すグラフであり、ここで、各曲線は、１匹のヌードマウスにおける腫瘍の大きさにおける変化を表す。
【図１２】図１２は、本発明に従うSolanum incanum L. から得られたソラソニンおよびソラマージンのヒト肺ガン細胞の増殖に及ぼす抑制効果を示すグラフである。
【図１Ａ】
2004359661.tif 000008
【図１Ｂ】
2004359661.tif 000009
【図１Ｃ】
2004359661.tif 000010
【図２Ａ】
2004359661.tif 000011
【図２Ｂ】
2004359661.tif 000012
【図２Ｃ】
2004359661.tif 000013
【図３Ａ】
2004359661.tif 000014
【図３Ｂ】
2004359661.tif 000015
【図３Ｃ】
2004359661.tif 000016
【図３Ｄ】
2004359661.tif 000017
【図３Ｅ】
2004359661.tif 000018
【図３Ｆ】
2004359661.tif 000019
【図４】
2004359661.tif 000020
【図５Ａ】
2004359661.tif 000021
【図５Ｂ】
2004359661.tif 000022
【図５Ｃ】
2004359661.tif 000023
【図５Ｄ】
2004359661.tif 000024
【図５Ｅ】
2004359661.tif 000025
【図６】
2004359661.tif 000026
【図７Ａ】
2004359661.tif 000027
【図７Ｂ】
2004359661.tif 000028
【図８Ａ】
2004359661.tif 000029
【図８Ｂ】
2004359661.tif 000030
【図８Ｃ】
2004359661.tif 000031
【図１１Ａ】
2004359661.tif 000032
【図１１Ｂ】
2004359661.tif 000033
【図１１Ｃ】
2004359661.tif 000034
【図１２】
2004359661.tif 000035
【図９】
2004359661.tif 000036
【図１０】
2004359661.tif 000037