(57)【要約】【課題】プロスタグランジンＤ２により媒介される疾病状態の治療に有用な化合物の同定方法、並びにＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２関連障害の診断方法及び診断キットを提供する。【解決手段】同定方法は、ＣＲＴＨ２のサンプルとＰＧＤ２とを接触させ、ＣＲＴＨ２に対するＰＧＤ２の結合を測定し；ＣＲＴＨ２の同種サンプルと、ＰＧＤ２及び適当な量の試験化合物の両方とを接触させ、ＣＲＴＨ２に対するＰＧＤ２の結合を測定し；そして前記結果を比較して、ＰＧＤ２の結合がＰＧＤ２の存在により影響されているかを決定することを含む。診断方法は、患者サンプル中のＣＲＴＨ２遺伝子発現又はＰＧＤ２依存性のＣＲＴＨ２の活性のレベルを測定し、健康な個体の測定値と比較すること含む。診断キットは、ＰＧＤ２又はそのアナログ、及びＣＲＴＨ２ポリペプチド、ＣＲＴＨ２ポリペプチドをコードする核酸、又はＣＲＴＨ２を発現する細胞を容器中に含む。【選択図】　図２
2004004109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＲＴＨ２のサンプルとＰＧＤ２とを接触させて、ＣＲＴＨ２に対するＰＧＤ２の結合を測定し；
（ｂ）ＣＲＴＨ２の同種サンプルと、ＰＧＤ２及び適当な量の試験化合物の両方とを接触させて、前記ＣＲＴＨ２に対するＰＧＤ２の結合を測定し；そして
（ｃ）前記（ａ）の結果と（ｂ）の結果とを比較して、ＰＧＤ２の結合がＰＧＤ２の存在により影響されているか否かを決定すること
を含む、ＣＲＴＨ２レセプターに対するＰＧＤ２の結合を変化させる化合物の同定方法。
【請求項２】
（ａ）ＣＲＴＨ２のサンプルとＰＧＤ２とを接触させて、その結果生じる前記ＣＲＴＨ２の活性を測定する工程；
（ｂ）適当な量の試験化合物の存在下で、ＣＲＴＨ２の同種サンプルとＰＧＤ２とを接触させて、その結果生じるＣＲＴＨ２の活性を測定する工程；及び
（ｃ）前記（ａ）の結果と（ｂ）の結果とを比較して、ＣＲＴＨ２のＰＧＤ２依存性活性が前記試験化合物の存在により影響されているか否かを決定する工程
を含む、ＣＲＴＨ２レセプターの活性（通常、ＣＲＴＨ２レセプターに対するＰＧＤ２の結合に依存する）を変化させる化合物の同定方法。
【請求項３】
試験化合物を、前記ＣＲＴＨ２のＰＧＤ２依存性活性を妨害するアンタゴニストとして同定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物が、ＣＲＴＨ２に特異的な抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物が、ＰＧＤ２に特異的な抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
試験化合物を、前記ＣＲＴＨ２のＰＧＤ２依存性活性を向上するアゴニストとして同定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ＣＲＴＨ２のＰＧＤ２依存性活性が、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、自己免疫疾患、再灌流損傷、及び炎症性疾患からなる群から選択した疾病状態に関係する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ；変形性関節症；炎症性腸疾患；乾癬、湿疹、紅斑、かゆみ症、及びニキビから選択した皮膚の障害；発作；及び移植片拒絶反応からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
測定されるＣＲＴＨ２活性が、ＰＧＤ２に対して結合する能力である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＲＴＨ２が、哺乳動物細胞の表面、哺乳動物細胞の膜断片の表面又は脂質小胞の表面に存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＲＴＨ２が哺乳動物細胞の表面に存在し、そして前記ＣＲＴＨ２のＰＧＤ２依存性活性がＰＤＧ２に対する前記細胞の走化性応答である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＲＴＨ２が哺乳動物細胞の表面に存在し、そしてＣＲＴＨ２のＰＧＤ２依存性活性が、
（ａ）細胞内Ｃａ２＋濃度、
（ｂ）反応性酸素種の放出、又は
（ｃ）アクチン重合への効果、
に対する影響である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＲＴＨ２を固体表面に固定する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記固体表面がマイクロタイター皿である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
容器中に収容された、ＰＧＤ２又はそのアナログ、及びＣＲＴＨ２ポリペプチド、ＣＲＴＨ２ポリペプチドをコードする核酸、又はＣＲＴＨ２を発現する細胞を含む、診断キット。
【請求項１６】
患者においてＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２に関連する障害を検出又は治療することに使用するための指示書を更に含む、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）により媒介される疾病状態の治療及び予防に有用な化合物の同定に関する。
【０００２】
プロスタグランジンは、局所活性ホルモン様化学的メディエイタとして作用し、アラキドン酸の炭素原子数２０の脂肪酸骨格から誘導される一群の化合物である。プロスタグランジンは、炭素原子数２０のポリ不飽和脂肪酸から誘導され、エイコサノイドの或る主要な区分（化学的メディエイタの大きなファミリー）を規定し、また、リポキシン、トロンボキサン、ヒドロペルオキシ脂肪酸、及びロイコトリエンも含まれる。
【０００３】
エイコサノイドの合成は、一般的に、局所的組織損傷、ホルモンによる刺激、又は細胞性活性化経路（例えば、免疫グロブリンＩｇＥの細胞表面レセプターに対する結合）を介することによって刺激される。貯蔵され、予め形成された化学的メディエイタと異なり、エイコサノイド脂質メディエイタは、典型的に、活性化イベントの後でのみ細胞内に現れる。ついで、エイコサノイドは、特異的な細胞表面レセプターに結合することにより、多くの組織において多様な種々の効果を媒介する。プロスタグランジンは、多くの炎症性応答、並びに免疫系の機能を媒介することが知られている。アンタゴニスト化合物は、エイコサノイドレセプター結合の正常な作用を妨げるように作用するエイコサノイドの種々の群について開発されてきた。
【０００４】
一般的に言えば、前記炎症性応答は、局所的損傷に対する応答を促進する保護的な機構である。例えば、悪影響を受けている領域への組織液の漏洩は、抗体との接触を促進し、また、任意の有害薬剤と直接戦うように白血球を移動させる。残念ながら、炎症性応答は不適切なことがある。すなわち、炎症性応答は、長すぎる時間継続することがあるか、又は残念ながら身体にダメージを与える作用を有する炎症系成分による関与を含み、それによって、疾病状態に貢献するか、又は、疾病状態を規定することさえある。従って、炎症の進行を妨げることが医学的に適当である多くの状況が存在する。アレルギー及び喘息は、複雑で、典型的には慢性の炎症性疾患の主要な群の代表である。多くの炎症性疾患状態において典型的であるように、アレルギー疾病状態は、免疫系の異常な、あるいはそうでなければ望ましくない活性も含まれる。
【０００５】
本発明は、特に、アレルギー性疾患、例えば、アレルギー喘息、アトピー性皮膚炎、及びアレルギー性鼻炎の予防及び治療に有用な化合物の同定に関する。また、本発明は、全般的に、炎症性成分を含む疾病状態、例えば、以下に限定されるものではないが、炎症性障害、例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患；皮膚の障害、例えば、乾癬、湿疹、紅斑、かゆみ症、及びニキビ；発作、及び再灌流損傷により特徴づけられる任意の疾病、移植片拒絶反応、及び自己免疫疾患の予防及び治療に有用な化合物の同定に関する。
【０００６】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
アレルギー性喘息及びアレルギー性鼻炎は、現在、人口の約１０％が罹病している疾病であり、この数字は増加しつつあるように考えられている（Ｂｕｓｈ，Ｒ．Ｋ．ａ．Ｇ．，Ｊｈｏｎ　Ｗ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ａｓｔｈｍａ　ａｎｄ　ｒｈｉｎｉｔｉｓ，第１版，１９９７，Ａｂｉｎｇｄｏｎ：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０）。現在、多くの群の薬剤、例えば、抗ヒスタミン剤、うっ血除去剤、β２アゴニスト、抗コリン作用剤、メチルキサンシネス（ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅｓ）、クロモリン、コルチコステロイド、及びロイコトリエンモジュレーターが、これらの疾病の治療に広く使用されている。しかしながら、一般的に、副作用及び低有効性から、これらの薬剤の有用性は限られている。従って、これらの疾病状態及び他の炎症性状態に寄与する炎症性及び免疫学的プロセスの鍵となる段階を妨害する薬剤学的に活性な化合物を同定することに対して、大きな医学的要求が存在する。
【０００７】
ＰＧＤ２は、血小板により生成されることが知られている。また、ＰＧＤ２は、マスト細胞、マクロファージ、並びに炎症性プロセス及び免疫系プロセスに関与する他の細胞によって生成される。ＰＧＤ２の機能として報告されているものとしては、血小板凝集の阻害、平滑筋の弛緩及び収縮、神経におけるシグナル伝達の変化、睡眠誘導、並びに炎症性応答を媒介する細胞の走化性応答の促進を挙げることができる。マスト細胞は、長い間、免疫グロブリンタイプＩｇＥ依存性アレルギー性疾患、例えば、アレルギー性鼻炎及びアレルギー性喘息に関連づけられてきた。マスト細胞−誘導メディエイタ、例えば、ＰＧＤ２、ロイコトリエンＣ４、ヒスタミン、プロテアーゼ、サイトカイン、及びケモカインが、即時過敏反応に関与することについては、明確な証拠がある〔例えば、Ｒｏｓｓｉ　ａｎｄ　Ｏｌｉｖｉｅｒｉ，Ｃｈｅｓｔ，１１２（２），ｐｐ．５２３−５２９，１９９７を参照されたい〕。
【０００８】
マスト細胞の他に、Ｔｈ２タイプの免疫系ヘルパーＴ細胞も、アレルギー性応答の潜在的オーケストレーター（ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｏｒ）として認められている（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，１９９９，Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１７：２５５−８１）。アトピー患者においては、疾病の重篤度は、Ｔｈ２−生成サイトカインのレベルに相関し、そしてＴｈ２細胞は、気管支肺胞洗浄及び気管支生検標本において同定されてきた〔Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，１９９２，Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３２６（５）：２９８−３０４；Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ　１４６（１）：１０９−１５〕。コルチコステロイドによる徴候の救済は、Ｔｈ２サイトカインの減少と良好に相関する〔例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら，１９９１，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　＆　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９４（１−４）：２２０−１を参照されたい〕。更に、ＩＬ−４ノックアウトマウスへＴｈ２細胞を養子移植（ａｄｏｐｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）することにより、Ｔｈ２細胞が気道過敏の病原に関与する証拠が得られている〔Ｌｉら，１９９６，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１５７（８）：３２１６−９；Ｂｒｕｓｓｅｌｌｅら，１９９５，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｃｅｌｌ　＆　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１２（３）：２５４−９〕。
【０００９】
しかしながら、炎症状態に対するより特異的で効果的な治療方法を提供するためには、細胞レセプターについて関連する各化学的メディエイタの特異性及び得られる下流シグナル伝達イベントの本質をより良く理解することが求められることになろう。プロスタグランジンに対して多くのレセプター（例えば、ＤＰ、ＦＰ、及びＥＰ）が同定されてきたが、ＤＰレセプターだけがＰＧＤ２に対する特異性を有することが示されている。生物学的応答の複雑性を考慮すると、ＰＧＤ２に対する別の細胞レセプタータイプが存在する可能性が高いが、これに関連する最近の単離努力は失敗している〔Ｎａｒｕｍｉｙａら，１９９９，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　７９（４）：１９９３−２２６〕。
【００１０】
最近、ＰＧＤ２がヒトＴｈ２細胞により生成されていることが決定された〔Ｔａｎａｋａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６４（５）ｐｐ．２２７７−８０，２０００〕。また、Ｔｈ２細胞が或る特定のＧ−タンパク質共役型レセプター（これは、当初はヒトＴｈ２セルラインからクローン化された）を発現することも決定された〔Ｎａｇａｔａら，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１６２（３）：１２７８−８６；及びＵＳＰ６０４０４２６を参照されたい〕。このレセプターは、ＣＲＴＨ２（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｓ：Ｔｈ２細胞上で発現した化学誘引物質レセプターホモログ）と称されている。また、Ｇｅｎｅ　Ｂａｎｋ受託番号ＡＢ００８５３５も参照されたい。
【００１１】
前記ＣＲＴＨ２レセプターは、多様な種々の組織、例えば、脳、肺、及びリンパ系器官からも、選択的に発現している〔Ａｂｅら，１９９９，Ｇｅｎｅ２２７（１）：７１−７〕。免疫系細胞からの発現に関して、ＣＲＴＨ２レセプターがＴｈ２細胞（好酸球及び好塩基球）上に選択的に発現し、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞上で発現しないことが報告されている〔Ｎａｇａｔａら，１９９９，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　４５９（２）：１９５−９〕。更に、ＣＲＴＨ２と他のすべての公知の細胞表面タンパク質との間には、ＦＭＬＰレセプターとの低い相同性（〜３０％）を除いて、有意な配列相同性が存在しない。更に、ＣＲＴＨ２に対する天然リガンドは、報告されていない。
本発明は、ＣＲＴＨ２に対する天然リガンドが、実際は、ＰＧＤ２であるという発見に基づくものであり、これらの相互作用が特異的抗炎症性医薬の開発において重要であることは、直ちに認識されるであろう。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ＰＧＤ２関連障害、例えば、アレルギー、喘息、及び炎症の治療に有用な治療化合物のスクリーニング方法に関する。本発明は、部分的に、本明細書に記載の発見、すなわち、ＰＧＤ２がＣＲＴＨ２に対する天然リガンドであること、及びアレルギー性及び炎症性応答におけるこの相互作用の役割に基づいている。本発明は、種々の態様において、ＰＧＤ２−ＣＲＴＨ２相互作用のモジュレータ（すなわち、アンタゴニスト及び／又はアゴニストである化合物）を同定する１次スクリーニングアッセイを提供する。これらの１次アッセイは、高スループットスクリーニングに適応することができる。
【００１３】
別の態様では、本発明は、前記モジュレータ（例えば、アゴニスト又はアンタゴニスト）の生物学的活性及び得られるそれらの有用性を更に特徴づける２次アッセイを提供する。或る同定された化合物は、ＰＧＤ２が関与する障害及び状態、例えば、アレルギー、喘息、及び全般的に炎症性状態の治療及び予防に有用であろう。或る同定された化合物は、ＰＧＤ２とＣＲＴＨ２との相互作用を向上させることが有利な障害又は状態の治療又は予防に有用であろう。
【００１４】
本発明は、（ａ）ＰＧＤ２の存在下又は不在下で、ＣＲＴＨ２と試験化合物とを接触させ；そして（ｂ）その生物学的効果を決定することを含む、ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２−媒介プロセスを変化させる化合物の同定方法を提供する。典型的アッセイにおいては、ＰＧＤ２が通常は結合する部位と同じＣＲＴＨ上の部位に、試験化合物が結合し、そして効果を有するが、当業者であれば、いつでも必ずしもそうなる必要がないことに気づくであろう、すなわち、本発明の方法論は、ＰＧＤ２結合部位と距離の離れたＣＲＴＨ２上の部位において作用する化合物の同定にも用いることができる。
【００１５】
或る態様においては、同定される化合物は、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用又はその正常な結果を妨害するアンタゴニストである。更に別の態様においては、同定される化合物は、ＣＲＴＨ２上にＰＧＤ２が結合する正常な効果を高いレベルで模倣するアゴニストである。典型的な態様では、測定されるＣＲＴＨ２活性が、ＰＧＤ２と相互作用する能力である。本発明の更に別の態様においては、試験化合物は、ＣＲＴＨ２に特異的な抗体であるか、又はＰＧＤ２により部分的にもたらされるエピトープに特異的な抗体である。
【００１６】
更に、本発明は、（ａ）ＣＲＴＨ２発現性細胞と試験化合物とを接触させ；そして（ｂ）得られたＣＲＴＨ２活性のレベル又は前記細胞内におけるＣＲＴＨ２の発現のレベルを測定し、そして測定した前記の活性又は発現レベルが試験化合物の不在下で測定したものと異なっている場合には、ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２−媒介プロセスを変化させる化合物を同定することを含む、ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２−媒介プロセスを変化させる化合物の同定方法を提供する。或る態様では、測定されるＣＲＴＨ２活性が、ＰＧＤ２と相互作用する能力である。別の態様では、測定されるＣＲＴＨ２活性が、その細胞のＰＧＤ２に対する走化性応答である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、更に、（ａ）ＣＲＴＨ２を発現する第二細胞と、同定された化合物とを接触させ；そして（ｂ）前記化合物が第二のＣＲＴＨ２活性を変化させるか否かを決定することを含む。別の態様においては、測定される前記第一の又は第二のＣＲＴＨ２活性のいずれかが、ＰＧＤ２と相互作用する能力である。更に別の態様においては、測定される前記第一の又は第二のＣＲＴＨ２活性のいずれかが、その細胞のＰＧＤ２に対する走化性応答である。別の態様においては、前記第二のＣＲＴＨ２活性は、細胞内Ｃａ２＋濃度、反応性酸素種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の放出、又はアクチン重合である。
【００１８】
本発明に包含される別の態様は、（ａ）試験化合物の存在下で、ＣＲＴＨ２とＰＧＤ２（又はそのアナログ）とを接触させ；そして（ｂ）ＣＲＴＨ２と結合するＰＧＤ２（又はそのアナログ）の量を測定し、そして（ｂ）で測定した結合ＰＧＤ２の量が、試験化合物不在下で測定した結合ＰＧＤ２の量と異なる場合に、ＣＲＴＨ２に対するＰＧＤ２の結合を変化させる化合物を同定することを含む、ＣＲＴＨ２に対するＰＧＤ２の結合を変化させる化合物の同定方法である。或る態様においては、工程（ａ）で接触させるＣＲＴＨ２が、細胞表面上に存在する。別の態様では、前記ＣＲＴＨ２が固体表面上に固定されている。別の態様では、前記固体表面が、マイクロタイター皿である。更に別の態様においては、前記細胞とＰＧＤ２特異的抗体とを接触させることにより、ＰＧＤ２の結合量を測定する。
更に別の態様では、前記ＰＧＤ２を標識し、そして前記標識を検出することによってＰＧＤ２の結合量を測定する。この方法の或る態様では、ＰＧＤ２を蛍光標識により標識する。
【００１９】
更に、本発明は、患者サンプルにおいてＣＲＴＨ２遺伝子発現レベル又はＣＲＴＨ２レセプターレベルのいずれかを測定し、そして測定されたレベルが、臨床的に正常な個体において見られるレベルと異なる場合に、ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２関連障害を検出することを含む、哺乳動物におけるＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２関連障害の検出方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、キットも包含する。提供されるキットは、容器中に収容された、（ａ）ＰＧＤ２若しくはそのアナログ、又は（ｂ）ＣＲＴＨ２ポリペプチド、又は（ｃ）ＣＲＴＨ２ポリペプチドをコードする核酸、又は例えば、（ｄ）ＣＲＴＨ２を発現する細胞、並びに好ましくは、指示書及び他の試薬を含む。或る態様では、前記キットは、更に、患者におけるＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２関連障害の存在の検出に使用するための指示書を含む。
【００２１】
本明細書において、用語「ＰＧＤ２媒介」は、ＰＧＤ２の発現、合成、及び／又は活性のレベルに、直接又は間接的に、依存及び／又は応答するプロセスを含む。前記プロセスとしては、以下に限定されるものでなく、アレルギープロセス、喘息プロセス、及び炎症プロセス、例えば、炎症性細胞の走化性、血小板凝集の阻害、平滑筋の弛緩及び収縮、並びに神経学的調節（例えば、睡眠、体温、及び痛み応答調節）を挙げることができる。
【００２２】
本明細書において、用語「ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２−関連障害」及び「ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２−関連状態」は、ＰＧＤ２が関与するか、あるいは、患者内のＰＧＤ２の濃度によって有益に又は不利に作用することのある障害又は状態を意味する。前記障害及び状態は、例えば、正常で、悪影響を受けておらず、悪化していない個体において見られるレベルと比較して、異常なレベルでのＰＧＤ２の発現、合成、及び／又は活性の結果として生じることがある。前記障害としては、以下に限定されるものでなく、アレルギー性障害、喘息性障害、及び炎症性障害、例えば、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、気管支収縮；及び神経学的障害、例えば、睡眠障害；並びに体温の調節又は痛み応答における障害を挙げることができる。
【００２３】
本発明の目的に関して、ＰＧＤ２の「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」とは、全体的に構造がＰＧＤ２に類似であり、少なくとも一つのアッセイの条件下において全体的にＰＧＤ２と同じ生物学的効果を有する化合物である。すなわち、或るアッセイにおいて有効なＰＧＤ２アゴニスト又はＰＧＤ２アンタゴニスト化合物の活性が測定されれば、そのアナログは、前記アッセイにおいて使用される限り、任意のＰＧＤ２自体と置換することができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
ＰＧＤ２関連障害、例えば、アレルギー性障害、喘息、及び炎症性応答障害の検出及び治療に有用な治療用化合物の同定のためのスクリーニングアッセイに関して以下に説明する。また、前記アッセイは、ＰＧＤ２自体と比較して、高いＰＧＤ２−ＣＲＴＨ２結合及び活性を示す化合物の検出にも適用することができる。前記スクリーニングアッセイには、第一に、高スループット・スクリーニングフォーマットに適用することができる１次スクリーニングアッセイ、及び第二に、１次選別において同定されたリード化合物を更に特徴づけするために使用することができる２次スクリーニングアッセイが含まれる。更に、本明細書は、前記ＰＧＤ２関連障害の治療において、同定された化合物を使用する診断及び治療方法も開示する。
【００２５】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイは、例えば、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用を変化させる、有機化合物、ペプチド、及びタンパク質（抗体を含む）の同定に使用することができる。
前記の同定された化合物などは、ＰＧＤ２によるＣＲＴＨ２の走化性誘発のアゴニスト又はアンタゴニストとして用いることができる。例えば、ＣＲＴＨ２活性に影響する化合物としては、以下に限定されるものでなく、ＣＲＴＨ２に結合し、このことにより、ＰＧＤ２の結合を阻害する化合物、及び走化性誘発を妨害（アンタゴニスト）又は走化性誘発を向上（アゴニスト）する化合物を挙げることができる。
また、本発明の方法論は、ＰＧＤ２に結合し、そのことによってＰＧＤ２のＣＲＴＨ２への結合を妨げるか又は向上させる化合物の検出（又は、活性の確認）にも有用である。
【００２６】
ＣＲＴＨ２遺伝子活性に影響する化合物（ＣＲＴＨ２遺伝子発現に影響することによる；例えば、転写に影響を与えるか又はスプライシングイベントを妨害して、ＣＲＴＨ２の完全長又は切断された形態の発現を変化させることができるタンパク質又は小型有機分子などの分子を含む）も、本発明のスクリーニングにおいて同定することができる。
更に、前記アッセイが、ＣＲＴＨ２シグナル変換を変化させる化合物（例えば、下流シグナリングイベントに影響を与える化合物、例えば、ＰＧＤ２により活性化されたシグナルの変換に関与することができるＧ−タンパク質活性の阻害剤又は増強剤又はＣＲＴＨ２へ結合する別のリガンドも同定することができることにも注意されたい。ＣＲＴＨ２の下流のシグナリングイベントに影響し、そしてアレルギー性又は炎症性応答におけるＣＴＲＴＨ２の効果を変化させる化合物の同定又は使用も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
本明細書に記載の１次スクリーニングアッセイは、ＰＧＤ２−ＣＲＴＨ２相互作用を変化させる化合物、すなわち、ＣＲＴＨ２レセプターにおけるＰＧＤ２の位置において（ＰＧＤ２と比較して反作用的に又は作用的に）作用する試験化合物、あるいはＰＧＤ２と結合するか又はＰＧＤ２を変化させ、それによりＣＲＴＨ２レセプターにおいてＰＧＤ２がどのように作用するかに影響を与える試験化合物を検出することを意図している。
【００２８】
以下に詳しく記載するように、前記アッセイは、高スループットスクリーニング方法に適用することができる機能的アッセイ（例えば、結合アッセイ）である。
結合アッセイを用いて、ＰＧＤ２とＣＲＴＨ２との間の相互作用を変化させる化合物を同定することができる。本発明の或る観点によると、前記選別は、ＣＲＴＨ２とＰＧＤ２との間の正常な相互作用を妨害する化合物、例えば、他の天然プロスタグランジン若しくはそのアナログ、又は別の化合物を同定することを意図することができる。前記化合物は、アレルギー性応答、喘息、及び炎症性応答に対するリード化合物として有用となろう。本発明の別の観点では、前記選別を、ＣＲＴＨ２とＰＧＤ２の間の正常な相互作用を模倣するが、向上した効果を有する化合物（例えば、他のプロスタグランジン若しくはそのアナログ、又は他の化合物）を同定するように設計することができる。前記化合物は、ＣＲＴＨ２−ＰＧＤ２相互作用のアゴニストに対するリード化合物として有用であろう。
【００２９】
結合アッセイは、直接結合アッセイ又は競合結合アッセイとして実施することができる。直接結合アッセイにおいては、試験化合物を、ＣＲＴＨ２レセプター又はＰＧＤ２リガンドに結合させることによって試験する。次いで、第二工程において、ＰＧＤ２−ＣＲＴＨ２相互作用を変化させる能力に関して試験化合物を試験する。一方、競合結合アッセイでは、ＣＲＴＨ２との結合に関してＰＧＤ２と競合する試験化合物の能力を評価する。
【００３０】
直接結合アッセイでは、ＰＧＤ２及び／又はＣＲＴＨ２を、前記リガンド又はレセプターに前記試験化合物が結合可能な条件下で、試験化合物に接触させる。前記結合は、溶液中で又は固体表面上で実施することができる。好ましくは、前記試験化合物を、検出のために予め標識しておく。標識には、任意の検出可能な基、例えば、以下に限定されるものでなく、発光性、蛍光性、若しくは放射性の同位体又は前記のものを含有する基、あるいは非同位体標識、例えば、酵素又は染料を用いることができる。結合を実施するのに充分な時間インキュベーションをした後に、その反応物を、過剰な又は非特異的に結合した試験化合物を除去する条件及び操作にさらす。典型的には、適当な緩衝液で洗浄することを挙げることができる。最後に、ＰＧＤ２−試験化合物複合体又はＣＲＴＨ２−試験化合物複合体の存在を検出する。
【００３１】
競合結合アッセイでは、試験化合物を、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２に対する結合を分裂させるか又は向上させるそれらの能力に関してアッセイする。標識したＰＧＤ２を、ＣＲＴＨ２又はその断片若しくは誘導体と混合し、そして試験化合物を添加するか又は添加せずに、それらの間の相互作用が正常に発生する条件下におくことができる。ＣＲＴＨ２に結合する標識化ＰＧＤ２の量を、試験化合物の存在下又は不在下における結合量と比較することができる。
【００３２】
好ましい態様においては、複合体形成及び検出を促進するために、１又は複数の成分を固体表面上に固定して前記結合アッセイを実施する。種々の態様において、前記固体支持体は、以下に限定されるものでなく、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミド、及びアガロースであることができる。前記支持体の形状としては、ビーズ、膜、微細粒子、反応容器（例えば、マイクロタイタープレート）の内部表面、試験管、又は他の反応容器を挙げることができる。ＣＲＴＨ２又は他の成分の固定は、共有結合又は非共有結合を介して達成することができる。或る態様では、前記結合が間接的、すなわち、結合した抗体を介することができる。別の態様では、ＣＲＴＨ２及びネガティブコントロールを、エピトープ、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と組み合わせることにより、前記固体表面への結合を、市販の抗体、例えば抗ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって媒介させることができる。
【００３３】
例えば、或る固体支持体に固定したＣＲＴＨ２を用いて、親和性結合アッセイを実施することができる。典型的には、結合反応の固定成分（この場合、ＰＧＤ２又は試験化合物）を、標識して検出可能にする。種々の標識化方法が実施可能であり、例えば、発光性、発色性、蛍光性、又は放射性の同位体又は基の検出、あるいは非同位体標識、例えば、酵素又は染料の検出を用いることができる。或る好ましい態様では、試験化合物を発蛍光団、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手可能）で標識する。
【００３４】
次に、標識した試験化合物又はＰＧＤ２及び試験化合物を、特異的結合が起こることが可能な条件下で、前記固体支持体と接触させる。前記結合反応を実施した後に、前記表面を洗浄することによって、結合していない試験化合物及び非特異的に結合した試験化合物を分離する。結合パートナーの前記固相への結合は、当業者に公知の種々の方法で実施することができ、例えば、以下に限定されるものでなく、化学的架橋、プラスチック表面への非特異的接着、固相へ結合した抗体との相互作用、結合パートナー（例えば、ビオチン）に結合したリガンドと固相に結合したリガンド−結合タンパク質（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）との間の相互作用などを挙げることができる。
最後に、前記固体表面に残っている標識を、当業者に公知の任意の方法により検出することができる。例えば、発蛍光団で標識した場合には、蛍光計を用いて複合体を検出することができる。
【００３５】
好ましい態様においては、結合アッセイを以下の通りに実施することができる：
（ａ）一時的にＣＲＴＨ２を発現する３００−１９細胞（後出）をペレット化し、そして室温でアッセイ緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含み、ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウムを補足したハンクスの平衡塩類溶液）で２回洗浄する。前記細胞を、２×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。９６ウェルＵ底マイクロタイター皿を用いて、下記の通りに（体積１５０μＬで）アッセイを準備する：
（ｂ）ベヒクル５０μＬ（アッセイ緩衝液中０．３％ＤＭＳＯ、合計ウェル）；又は最終アッセイ濃度が１０μＭになる３０μＭ冷ＰＧＤ２５０μＬ〔冷却したＰＧＤ２の原液を、貯蔵濃度１０ｍＭでＤＭＳＯ中に溶解し、そして−２０℃で貯蔵し、次いで、使用に際して３：１０００に希釈して最終貯蔵濃度３０μＭにした〕；
細胞５０μＬ（２×１０７／ｍＬ；１０６／ウェル）；
６ｎＭ［３Ｈ］−ＰＧＤ２５０μＬを加えて、最終濃度を２ｎＭとする〔Ａｍｅｒｓｈａｍ；１６２Ｃｉ／ｍｍｏｌ，メタノール：水：アセトニトリル（３：２：１）中０．１Ｃｉ／ｍＬ，６１７ｎＭをアッセイ緩衝液１ｍＬ当たり１０μＬに希釈して濃度を６ｎＭとした〕。
（ｃ）前記プレートを室温で２０分間放置することによりインキュベートし、その後で遠心分離（２８００ｒｐｍ，Ｓｏｒｖａｌ　ＲＴ６０００，５分間，４℃）する。その上清を捨てて、非特異的結合を減らす。冷却アッセイ緩衝液を用いて、ウェル１個の洗浄につき緩衝液１５０μＬで６回洗浄することにより、前記プレート（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ　ｐｌａｔｅ　ＧＦ／Ｃ，予め少なくとも１時間３％ＰＥＩ中に浸積したもの）から集菌する。前記フィルタープレートを一晩乾燥させる。シンチレーション液５０μＬを加えた後に、前記プレートをシンチレーション計数器中で計数（ウェル１個当たり１分間）する。好ましくは、ＣＲＴＨ２を発現するインタクト細胞の形態か、又はＣＲＴＨ２を含む単離された細胞膜として、ＣＲＴＨ２を結合アッセイに加える。こうして、ＣＲＴＨ２への直接結合又はＰＧＤ２−ＣＲＴＨ２複合体を変化させる試験化合物の能力を、培養物中のインタクト細胞又は動物モデル中で、試験化合物の存在下又は不在下で、アッセイすることができる。
【００３６】
標識したＰＧＤ２は、ＣＲＴＨ２を発現する細胞又は前記細胞から得られる粗抽出物と混合することができ、また、前記試験化合物を加えることができる。ＣＲＴＨ２と相互作用する化合物の同定に、単離した膜を使用することができる。例えば、単離した膜を用いる典型的実験においては、細胞を遺伝子工学的に処理してＣＲＴＨ２を発現させることができる。膜は、標準的技術によって回収し、そしてイン・ビトロ結合アッセイに用いることができる。標識したリガンド（例えば、１２５Ｉで標識したＰＧＤ２）を前記膜に結合させ、そして特異的活性についてアッセイし；そして過剰量の標識していない（冷却）リガンドの存在下で実施した結合アッセイと比較することによって特異的結合を決定する。あるいは、可溶性ＣＲＴＨ２を、組換え的に（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）発現させ、そして細胞に基づかないアッセイに利用してＣＲＴＨ２に結合する化合物を同定する。組換え的に発現したＣＲＴＨ２ポリペプチド又はＣＲＴＨ２のＥＣＤ１つ以上を含有する融合タンパク質を、前記の細胞に基づかないスクリーニングアッセイに用いることができる。あるいは、ＣＲＴＨ２のＣＤ１つ以上に相当するペプチド又はＣＲＴＨ２のＣＤ１つ以上を含有する融合タンパク質を、前記の細胞に基づかないアッセイ系に用いて、前記ＣＴＲＴＨ２の細胞質部分に結合する化合物を同定することができる。前記化合物は、ＣＲＴＨ２のシグナル変換経路を変化させるのに有用でありえる。細胞に基づかないアッセイでは、当業者に公知の方法によって、前記の組換え的に発現したＣＲＴＨ２を、固体基質、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、又はカラムに結合させる（前出のＡｕｓｕｂｅｌらを参照されたい）。次に、前記試験化合物を、ＣＲＴＨ２に結合するそれらの能力に関してアッセイする。
【００３７】
あるいは、前記結合反応を、溶液中で実施することができる。このアッセイにおいては、標識した成分を放置して、溶液中のその結合パートナーと相互作用させる。標識した成分とその結合パートナーとの間の大きさの違いによって分離が可能な場合は、例えば、結合していない標識成分は通過可能だが、その結合パートナー又はパートナーに結合した標識成分は通過することができない孔を有するウルトラフィルターを通して、結合反応の生成物を通過させることにより分離を達成することができる。また、分離は、前記標識成分の結合パートナーを溶液から捕獲することができる任意の試薬（例えば、前記結合パートナーに対する抗体、前記結合パートナーと結合する前にリガンドと相互作用することができるリガンド結合タンパク質など）を用いることによっても達成することができる。
【００３８】
或る態様では、例えば、固相（例えば、プラスチックビーズ）に結合した精製ＣＲＴＨ２又はその誘導体、アナログ、断片、若しくはドメインを含有するカラムに、連続的ファージディスプレイライブラリーからのファージを通過させることにより、ファージライブラリーをスクリーニングすることができる。洗浄緩衝液のストリンジェンシーを変化させることにより、ＣＲＴＨ２に対して高い親和性を有するペプチドを発現するファージを増加させることができる。前記カラムから単離されたファージは、クローニングすることができ、また、その短いペプチドの親和性は直接測定することができる。オリゴヌクレオチド１種以上に対する配列を、ＣＲＴＨ２に結合する更に高い親和性に関する試験と組み合わせることができる。どのアミノ酸配列がＣＲＴＨ２に対して最も強力な結合をもたらすかを知る上で、コンピュータモデルを用いて、ＣＲＴＨ２と試験化合物との間の分子接触（ｃｏｎｔａｃｔ）を同定することができる。これにより、これらの連絡を模倣する非タンパク質化合物を設計することができよう。このような化合物は、前記ペプチドの活性と同じ活性を有することができ、そして製造するのに低コストで効果的であるという利点を有しつつ、治療上に使用することができる。
【００３９】
この観点の本発明の別の特定の態様では、前記固体支持体が、マイクロタイター皿に結合しているＣＲＴＨ２含有膜である。試験化合物と、例えば、ライブラリーメンバーを発現する細胞とを、前記マイクロタイター皿中で、前記ライブラリーメンバーを発現することができる条件下で培養する。前記タンパク質（又は核酸若しくは誘導体）に結合するライブラリーメンバーを回収する。その方法は、Ｐａｒｍｌｙ　＆　Ｓｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ　７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓら，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１８３１８；及び本明細書で引用する他の参考文献中に、例として記載されている。
【００４０】
本発明の別の態様では、ＣＲＴＨ２又はＰＧＤ２と試験化合物との間の相互作用を、イン・ビトロでアッセイすることができる。既知の又は未知の分子について、結合を行わせる条件下で、ＣＲＴＨ２核酸、タンパク質、又は誘導体への特異的結合に関してアッセイし、続いて、ＣＲＴＨ２に特異的に結合する分子を同定する。前記の２種類の成分は、種々の方法で測定することができる。一つの方法は、前記成分の一方を容易に検出可能な標識で標識し、それを試験化合物と一緒に結合が起こりうる条件下におき、結合標識成分を非結合標識成分から分離する分離工程を実施し、次に結合成分の量を測定する。或る態様では、ＣＲＴＨ２を標識し、そして、結合が発生可能な条件を用いて、試験薬剤に加えることができる。前記試験薬剤の結合は、ポリアクリルアミドゲル分析を用いて前記試験薬剤の存在下又は不在下で形成された複合体を比較することによって決定することができる。
【００４１】
更に別の態様では、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２に対する結合を、動物モデル中のインタクト細胞内でアッセイすることができる。標識したＰＧＤ２を、試験化合物と共に及び試験化合物を伴わずに、動物に直接投与することができる。ＰＧＤ２の取り込みを、試験化合物の存在下又は不在下で測定することができる。これらのアッセイに関して、試験化合物を添加しておいた宿主細胞を遺伝子工学的に処理してＣＲＴＨ２及び／又はＰＧＤ２を発現させることができる（これは、一時的、誘発的若しくは構成的、又は安定的であることができる）。本発明のスクリーニング方法の目的には、多様な種々の宿主細胞を用いることができ、例えば、以下に限定されるものでなく、組織培養細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、及び細菌を挙げることができる。どのタイプの細胞も、それぞれ長所を有する。本発明のアッセイを実施する上で、好ましいタイプの細胞としては、哺乳動物細胞、例えば、Ｔ細胞又はＣＲＴＨ２を発現する他の細胞、すなわち、脳、胸腺、筋肉、脾臓、皮膚、及び他の組織を挙げることができる。細菌及び酵母は、比較的容易に培養することができるが、哺乳類細胞と異なるタンパク質を処理する。
【００４２】
或る場合には、機能的ＣＲＴＨ２リガンドが、ＣＲＴＨ２と一緒に、熱力学的に安定な複合体を形成せず、従って、安定な２量体複合体の形成が要求される１次アッセイによって検出できないことがある。しかしながら、前記リガンドは、複合体形成の動態学的測定により検出可能にすることができる。例えば、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２への結合及びＤＰへの結合は、温度並びにＣａ２＋及びＭｇ２＋イオンの存在によって、別々に調節されていることが知られている。前記方法としては、例えば、レセプターへ結合するリガンドのオン・レート及びオフ・レートの動態学的測定を挙げることができる。従って、本発明の結合アッセイには、動態学的な研究及び測定も含まれる。
【００４３】
更に、或る場合には、Ｇタンパク質共役型レセプターの応答が、リガンドへの長時間の露出により低下するか又は脱感受性化されることが観察されている。本発明の更に別の態様では、アッセイを利用して、ＣＲＴＨ２レセプターの前記脱感受性化をブロックする化合物を同定することができ、前記化合物を用いて、ＣＲＴＨ２の活性を維持することができる。前記化合物は、ＰＧＤ２関連障害、例えば、アレルギー性及び炎症性応答障害、例えば喘息の治療に対する治療方法の一部として用いることができる。
【００４４】
本発明の或る態様において、例えば、熱力学的に安定な複合体の形成への依存性を低くしたアッセイは、シンチレーション近接アッセイ（ＵＳＰ４５６８６４９に記載されている）である。精製した又は部分的に精製したＣＲＴＨ２又はＣＲＴＨ２膜を、シンチラント−積載固相（例えば、ビーズ）の表面にコートし、そして前記固相を遮断剤、例えば、アルブミン又は血清で処理する。次に、放射能標識（例えば、３３Ｐ標識）した試験化合物を、特異的結合の候補試験化合物が、前記固相上のＣＲＴＨ２へ特異的に結合することが可能になる条件下で、ＣＲＴＨ２コートしたビーズと混合する。洗浄して過剰の又は非特異的な結合を除去した後で、標識した試験化合物とＣＲＴＨ２との特異的結合が行われていた場合には、前記放射性標識をシンチラントに密接に近接させて光を放出させ、それをシンチレーション計数器で検出することができる。
【００４５】
別の態様では、親和性捕獲シンチレーション近接アッセイを使用して、結合を溶液中で実施することができる。このアッセイでは、ＣＲＴＨ２を精製し、そして親和性標識、例えばビオチンで標識する。次に、ビオチニル化したＣＲＴＨ２を、溶液結合（ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ）が発生可能な条件下で、放射能標識した試験化合物と混合する。ＣＲＴＨ２と試験化合物との複合体を含むビオチニル化ＣＲＴＨ２を、ストレプトアビジンでコートしたシンチラント−積載ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）上に捕獲し、そして前記のようにシンチレーション計数器中で計数する。
【００４６】
走化性アッセイも、１次アッセイとして使用することができる。ＣＲＴＨ２タイプのプロスタグランジンレセプターと誘引物質との間の相互作用の１つの生物学的効果は、走化性として知られる工程、すなわち、前記レセプターを発現している細胞の前記の特定の誘引物質への指向的移動の誘発である。本明細書に記載するように走化性アッセイを使用して、前記ＣＲＴＨ２レセプターと前記誘引物質ＰＧＤ２との間の相互作用を妨害する化合物を選別することができる。前記走化性アッセイは、高スループットスクリーニング法に適用することができ、従って、１次アッセイとして用いて、ＣＲＴＨ２アンタゴニストを同定することができる。走化性による移動をアッセイするための多くの技術が開発されている〔例えば、Ｌｅｏｎａｒｄら，１９９５，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　α　ａｎｄ　β　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ”，　ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６．１２．１−６．１２．２８，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｊｏｈｎ　Ｗｌｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　ｌｎｃ．１９９５を参照されたい〕。
【００４７】
或る態様では、例えば、マルチウェル・ボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）走化性容器内の化学誘引物質勾配を用いて、ＣＲＴＨ２を発現する細胞の移動を誘発するＰＧＤ２の能力を変化させる能力について、化合物を試験することができる。この装置は、典型的には、Ｕ字型底部のウェル４８個を有する容器を含み、これに、前記化学誘引物質又は化学誘引物質活性に関して試験する化合物を入れる。密閉ガスケットで覆われたポリカーボネート膜によって、底部容器と４８孔容器の蓋とを分離し、前記膜と前記容器の蓋とにより形成されたウェルに、細胞懸濁液を加える。
【００４８】
この方法の或る具体例では、ＣＲＴＨ２細胞のＰＧＤ２への誘引を妨げる試験化合物の能力に関して、前記試験化合物に対して競合アッセイを実施する。この方法では、前記ボイデン走化性容器の底部ウェル中に試験化合物を希釈して入れる。この希釈シリーズに、ＣＲＴＨ２細胞に対して走化性効果を有することが知られている濃度で、或る一定量のＰＧＤ２も加える。対照としての少なくとものアリコートは、ＰＧＤ２のみを含む。ＣＲＴＨ２を発現している細胞を、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ及び１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）を補足したＲＰＭＩ１６４０中に３〜３．５×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、そして前記容器の上部ウェルに入れる。前記容器を、加湿ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で９０〜１２０分間インキュベートする。インキュベーション時間が終了した後に、光学顕微鏡検査によって前記膜フィルターの下方表面上の移動細胞の数を計数する。ＰＧＤ２の走化性活性に対する試験化合物の貢献は、ＰＧＤ２のみを含むアリコートの走化性活性と、試験化合物及びＰＧＤ２を含むアリコートの走化性活性とを比較することによって測定する。ＰＧＤ２溶液へ試験化合物を添加した結果、前記膜の下方表面上で検出される細胞数が、ＰＧＤ２のみを含む溶液を用いて検出される細胞数と比較して減少している場合には、ＣＲＴＨ２を発現している細胞の走化性活性のＰＧＤ２誘発のアンタゴニストが同定される。反対に、ＰＧＤ２溶液へ試験化合物を添加した結果、前記膜の下方表面上で検出される細胞数が（ＰＧＤ２のみを含む溶液を用いて検出される細胞数と比較して）減少している場合には、ＣＲＴＨ２を発現している細胞の走化性活性のＰＧＤ２誘発のアゴニストが同定される。
【００４９】
本発明の方法は、多数の試験化合物の迅速なスクリーニングに対する高スループット様式で、常法どおりに実施することができる。特に、前記方法で用いられる細胞系は、当業者に公知の任意のマルチプルコピーフォーマット（例えば、以下に限定されるものでなく、マイクロタイタープレート、寒天板上のスポッティング、寒天ウェル、チップ上のスポッティングなど）で発現及びアッセイすることができる。同様に、標準的なマルチプル操作技術（例えば、以下に限定されるものではないが、ロボット操縦技術）も、細胞及び／又は試験化合物の多数配置に用いることができる。
【００５０】
ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用を変化させる試験化合物の同定の後に、更に２次スクリーニングアッセイを用いて、ＰＧＤ２、ＣＲＴＨ２、及びＰＧＤ２−ＣＲＴＨ２シグナリング経路の生物学的活性における試験化合物の効果について、試験化合物を更に特徴づけることができる。種々のアッセイを、２次選択として適用することができる。前記方法としては、例えば、以下に限定されるものでなく、結合アッセイ、走化性アッセイ、接着アッセイ、細胞内カルシウム移動アッセイ、酸素放出アッセイ、及びアクチン重合アッセイを挙げることができる。前記アッセイの実例を、以下に詳細に示す。
【００５１】
１次結合アッセイの代わりに又は１次結合アッセイに加えて、結合アッセイを２次アッセイとして実施することができる。或る態様では、１次選別として直接結合アッセイが用いられた場合に、２次選別として競合アッセイを用いることができる。別の態様では、機能的１次選別（例えば、高スループット走化性スクリーニングアッセイ）により同定された化合物に対して、結合アッセイを用いることができる。別の態様では、結合アッセイを用いる１次選別で同定された化合物を、第二タイプの結合アッセイを用いる２次選別において更に分析することができる。例えば、ＣＲＴＨ２親和性カラムアッセイを用いて同定された化合物を、その結合相互作用の動態学的分析によって２次選別において試験することができる。
【００５２】
走化性アッセイを、２次アッセイとして使用することができる。ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２に対する結合を妨害すること又はＰＧＤ２のＣＲＴＨ２に対する結合を向上することが１次スクリーニングアッセイにより同定された試験化合物は、走化性アッセイを用いて、生物学的活性について試験することができる。前記のように、ケモカインは、細胞タイプ特異的ケモカインレセプターとのそれらの相互作用を介して、細胞の指向的移動を誘発することができ、そしてこの走化性移動を試験するための技術が数多く開発されてきた（例えば、Ｌｅｏｎａｒｄら，１９９５，“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　α　ａｎｄ　β　Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ”，ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６．１２．１−６．１２．２８，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ｌｎｃ．１９９５を参照されたい）。従って、或る態様では、例えば、マルチウェルボイデン走化性容器中のケモカイン勾配を用いて、或る化合物を、ＣＲＴＨ２を発現する細胞移動を誘発するＰＧＤ２の能力を変化させる能力について試験することができる。
【００５３】
この方法の或る具体例では、１次選別で同定されたＰＧＤ２／ＣＲＴＨ２アンタゴニスト又はアゴニスト試験化合物の希釈シリーズを、前記ボイデン走化性容器の底部ウェル中に入れる。この希釈シリーズに、或る一定量のＰＧＤ２も加える。対照としての少なくとも１つのアリコートは、ＰＧＤ２のみを含む。この方法及びアッセイ条件は、前記１次スクリーニングアッセイに記載されているとおりであり、そして光学顕微鏡検査によって前記膜フィルターの下方表面上の移動細胞の数を計数する。ＰＧＤ２の走化性活性に対する前記アンタゴニスト又はアゴニスト化合物の貢献は、ＰＧＤ２のみを含むアリコートの走化性活性と、試験化合物及びＰＧＤ２を含むアリコートの走化性活性とを比較することによって測定する。ＰＧＤ２溶液へ試験化合物を添加した結果、前記膜の下方表面上で検出される細胞数が、ＰＧＤ２のみを含む溶液を用いて検出される細胞数と比較して減少している場合には、ＣＲＴＨ２を発現している細胞の走化性活性のＰＧＤ２誘発のアンタゴニストが同定される。反対に、ＰＧＤ２溶液へ試験化合物を添加した結果、前記膜の下方表面上で検出される細胞数が（ＰＧＤ２のみを含む溶液を用いて検出される細胞数と比較して）減少している場合には、ＣＲＴＨ２を発現している細胞の走化性活性のＰＧＤ２誘発のアゴニストが同定される。
【００５４】
他の２次アッセイは、反応性酸素種放出アッセイである。ＣＲＴＨ２細胞（例えば、好酸球）のＰＧＤ２誘発活性化の一つの測定基準は、反応性酸素種の細胞内放出である。これは、ルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）依存化学発光を用いて反応性酸素種放出を測定する反応性酸素種放出アッセイ（又はＲＯＳ）で試験することができる。この方法では、新鮮な単離好酸球を標準的方法によって調製し、そしてＲＰＭＩ（１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ；１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ；０．５％ＦＢＳ）中２〜４×１０６細胞／ｍＬの濃度で、室温で再懸濁する。使用する直前に、細胞懸濁液１ｍＬを緩衝液９ｍＬに加え、３７℃で１５分間予め加熱し、そして２００ｍＭルシゲニン０．５ｍＬを加える。
【００５５】
ＤＭＳＯを含む緩衝液（ＤＭＳＯ／２．５ｍＬ緩衝液；１．５μＬ）中に試験化合物（１０，０００×ＤＭＳＯ原液として製造）を希釈し、そして２５μＬ／ウェルの量で白色９６ウェル培養プレートに加えて３７℃インキュベーター中に放置する。単離した細胞（室温に維持）を、室温の緩衝液で２〜４×１０６細胞／ｍＬに希釈し、そして水浴中で３７℃で１５分間インキュベートする。１５分の時点で、前記細胞懸濁液の１０ｍＬに、２００ｍＭルシゲニン０．５ｍＬ〔ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州〕を加えて混合し、そして１００μＬ／ウェルの量で、予め加熱したマイクロタイタープレートに加える。前記プレートを５分間３７℃に戻し、その時点で刺激物２５μＬを加える。前記プレートを、ルミノメーター中で８周期に亘って読みとる。試験化合物の発光は、ＰＧＤ２のみを含む対照サンプルと比較して、ＰＧＤ２の存在下で試験することができる。ＰＧＤ２の能力を妨害して、ＣＲＴＨ２細胞内において細胞内反応性酸素種放出をもたらす化合物は、ＣＲＴＨ２アンタゴニストに対する候補である。
【００５６】
別の２次スクリーニングアッセイは、カルシウム移動アッセイである。細胞内イオン化カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の上昇は、走化性活性の初期の指標である。実際、後出のカルシウム流動研究において、低レベルのＰＧＤ２でさえ、ＣＲＴＨ２を発現する細胞中で［Ｃａ２＋］ｉの移動を増加させることが示されている。前記カルシウム流出アッセイを２次選別として用いて、ＰＧＤ２／ＣＲＴＨ２相互作用のモジュレータを更に特徴づけることができる。細胞内のカルシウムイオン濃度は、ＰＧＤ２の存在下で、及び／又は試験化合物の存在下及び不在下で、ＣＲＴＨ２を発現する細胞中で測定することができる。
【００５７】
カルシウム移動は、フローサイトメトリーによって、及び細胞内にトラップされる蛍光染料で標識することによって検出及び測定することができる。例えば、Ｉｎｄｏ−１という染料は、カルシウムが結合することにより発光スペクトルに変化が表れる。カルシウムが結合した染料により生成する蛍光の、結合していない染料により生成する蛍光に対する割合を用いて、細胞内カルシウム濃度を推定する。或る態様では、例えば、下記の方法を用いることができる。ＣＲＴＨ２を発現する細胞を収集し、そしてカルシウム流出アッセイを実施する前日に、新鮮な培地中に２×１０５／ｍＬ以下で再懸濁する。細胞を３７℃で２０〜３０分を超えない時間インキュベートし、次いで、回転分離（ｓｐｉｎ　ｄｏｗｎ）し、そしてＩｎｄｏ−１ＡＭを含む新鮮なＰＴＩ緩衝液５０ｍＬ〔ハンクス緩衝液，ｐＨ７．２〜７．４；１０ｍＭ−Ｈｅｐｅｓ；１．６ｍＭＣａＣｌ２〕（３７℃に予備加熱）中に、１ｍＬ当たり１千万の濃度で再懸濁する。細胞を励起させ、そして蛍光計（Ｐｈｏｔｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて蛍光を測定する。前記読み出しが安定化した後に、時間軸をリセットし、そして特定の時点（例えば２０秒）でＰＧＤ２を添加する。応答後、以下の試薬を以下の順序で、キュベット中に入れて、全カルシウムを放出及びキレートする：１８％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２０μＬ）、３Ｍトリス（ｐＨ８．５，２０μＬ）、及び０．５Ｍ−ＥＧＴＡ（ｐＨ８．５，２０μＬ）。試験化合物の存在下及び不在下で、この実験を繰り返す。試験化合物の不在下では、ＰＧＤ２により、１５ｎＭのＥＣ５０で、ＣＲＴＨ２を発現する細胞中で［Ｃａ２＋］ｉが増加する。従って、アゴニスト試験化合物の存在下では、ＥＣ５０がこの価よりも高くなることが予測されるのに対して、アゴニスト試験化合物の存在下では、ＥＣ５０が減少することが予測される。
【００５８】
更に別の２次スクリーニングアッセイは、アクチン重合アッセイである。ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用の別の生物学的効果が、アクチン重合である。従って、アクチン重合アッセイは、本発明の１次スクリーニングアッセイで単離された化合物の活性を特徴づけるための２次選別として用いることができる。或る態様では、アクチン特異的蛍光標識であって、重合化アクチン繊維に結合するニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）−ファラシジン（ｐｈａｌｌａｃｉｄｉｎ）を用いて、アクチン重合をアッセイすることができる。或る具体的態様では、アッセイを以下の通りに実施することができる：細胞調製物を、１０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、１００／１０Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び０．５％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ１６４０中に５〜１０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。その細胞懸濁物を、９６ウェルＵ字底ポリプロピレンマイクロタイタープレート中にアリコート（ウェル毎に１００μＬ）する。適当な刺激物５０μＬ（ＰＧＤ２若しくは試験化合物、又はＰＧＤ２及び試験化合物の両方）を、８チャンネルピペットを用いて加え、続いて、正確に２５秒後に、リソフォスファチジルコリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）、ハンクスの平衡塩類溶液（１００μＬ，１０×）、１６％ホルムアルデヒド（８００μＬ）、及びＭＥＯＨ中の６．６μＭ−ＮＢＤ−ファラシジン（１００μＬ）を含む停止溶液５０μＬを加える。前記プレートを室温で１５分間放置する。次に、前記プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を払い落とし、そして細胞ペレットを、２％ＦＣＳ及び０．２％アジ化ナトリウムを加えたＰＢＳ２５０μＬ中に再懸濁する。次に、ＦＡＣＳ特質装置（Ｃａｌｉｂｅｒ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）上で各サンプルを読み取る。前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｃａｔｔｅｒ）／側方散乱（ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ）データを用いて細胞をリンパ球領域にゲート（ｇａｔｅ）する。応答は、ベヒクル処理細胞と刺激物処理細胞との間におけるＦＬ−１蛍光の中間値の変化によって測定する。試験化合物は、ＰＧＤ２の存在下及び不在下でアッセイして、ＰＧＤ２のみを含むサンプルと比較することができる。ＣＲＴＨ２細胞のＰＧＤ２誘発アクチン重合を減少する化合物は、ＣＲＴＨ２アンタゴニストの候補として同定される
【００５９】
本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用して、有機化合物、又はペプチド若しくはタンパク質、例えば、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用を変化させるものを同定することができる。従って、本発明に従って選別することができる物質には、抗体及び断片も含まれる。例えば、ＣＲＴＨ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合し、そして天然リガンドによって誘発される活性を阻害するペプチド模倣有機化合物（すなわち、アンタゴニスト）又は天然リガンドにより誘発される活性を模倣するペプチド模倣有機化合物（すなわち、アゴニスト）も選別することができる。更に、ＣＲＴＨ２のＥＣＤ（又はその一部）が共有結合する有機化合物、ペプチド、抗体、又はそれらの断片も、前記天然ＣＲＴＨ２リガンドと別の方法でＰＧＤ２と結合し、従って、ＰＧＤ２を“中和”することができる。
【００６０】
スクリーニングに用いることができる化合物としては、以下に限定されるものでなく、ペプチド、例えば、可溶性ペプチド〔例えば、以下に限定されるものでなく、ランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Ｌａｍら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８４−８６を参照されたい）〕、及びＤ−及び／又はＬ−配置アミノ酸から造られたコンビナトリアルケミストリー誘導分子ライブラリー、ホスホペプチド（例えば、以下に限定されるものでなく、ランダム又は部分的に分解した，誘導された［ｄｉｒｅｃｔｅｄ］ホスホペプチドライブラリー；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら，１９９３，Ｃｅｌｌ　７２：７６７−７７８を参照）、抗体（例えば、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、又は一本鎖抗体、並びにそれらのＦＡｂ，Ｆ（ａｂ’）２及びＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、及びエピトープ結合性フラグメント）、並びに小型の有機又は無機分子を挙げることができる。
【００６１】
本発明の或る態様では、ＨＳＰＲ相互作用のモジュレータに関する選別に用いることができる試験化合物の源として、ペプチドライブラリーを用いることができる。多様性ライブラリー、例えば、ランダムの又はコンビナトリアルのペプチド又は非ペプチドのライブラリーを、前記ＨＳＰレセプターに特異的に結合する分子に関して選別することができる。多くの使用可能なライブラリーが当業者に知られており、例えば、化学合成ライブラリー、組換えライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、及びイン・ビトロ翻訳系ライブラリーを挙げることができる。
【００６２】
化学合成ライブラリーは、例えば、以下の文献に記載されている：Ｆｏｄｏｒら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４−８６；Ｌａｍら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７（９）：１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２０２４２；並びにＢｒｅｎｎｅｒ及びＬｅｒｎｅｒ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３８１−５３８３。
【００６３】
ファージディスプレイライブラリーは、例えば、以下の文献に記載されている：Ｓｃｏｔｔ　＆　Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，ら，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−１５７；Ｋａｙら，１９９３，Ｇｅｎｅ１２８：５９−６５；及び１９９４年８月１８日付ＰＣＴ公報ＷＯ９４／１８３１８。
【００６４】
非ペプチドのライブラリーの例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、ｂｕｎｉｎら，１９９４，ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．ａｃａｄ．ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：４７０８−４７１２を参照されたい）を使用に供することができる。ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）ライブラリー（Ｓｉｍｏｎら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７−９３７１）も用いることができる。ペプチド中のアミド官能基を過メチル化して化学的に変形されたコンビナトリアルライブラリーを生成している使用可能な他のライブラリーの例は、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１１３８−１１１４２）により記載されている。
【００６５】
前記ライブラリーのスクリーニングは、多様な任意の公知方法によって実施することができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示した以下の参考文献を参照されたい：Ｐａｒｍｌｅｙ　＆　Ｓｍｉｔｈ，１９８９，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ　＆　Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら，１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら，１９９４，Ｃｅｌｌ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，．５７７−５８０；Ｂｏｃｋら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５５：８５０−８５２；ＵＳＰ５０９６８１５，ＵＳＰ５２２３４０９，及びＵＳＰ５１９８３４６，ａｌｌｔｏ　Ｌａｄｎｅｒら；　Ｒｅｂａｒ　＆　Ｐａｂｏ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：６７１−６７３；及びＰＣＴ公報ＷＯ９４／１８３１８。
【００６６】
本発明の別の態様では、標識したＰＧＤ２をイン・ビトロ翻訳システム、例えば、ウサギ網状赤血球ライセート（ＲＲＬ）システムに加え、更に、イン・ビトロ初期（ｐｒｉｍｉｎｇ）反応を進行させることによって前記スクリーニングを実施することができる。イン・ビトロ翻訳系ライブラリーとしては、以下に限定されるものでなく、１９９１年４月１８日付のＰＣＴ公報ＷＯ９１／０５０５８；及びＭａｔｔｈｅａｋｉｓら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９０２２−９０２６に記載のものを挙げることができる。
【００６７】
本発明の方法で試験及び同定することができる化合物としては、以下に限定されるものでなく、任意の市販元、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ（１００１　ＷｅｓｔＳｔ．Ｐａｕｌ　Ａｖｅ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ウイスコンシン州５３２３３）、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐ．０．Ｂｏｘ１４５０８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州６３１７８）、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｅ　ＡＧ（ｌｎｄｕｓｔｒｉｅｓｔｒａｓｓｅ２５，ＣＨ−９４７１　Ｂｕｃｈｓ，スイス連邦共和国（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ．９８０　Ｓｏｕｔｈ　２ｎｄ　Ｓｔｒｅｅｔ，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ニューヨーク州１１７７９））、Ｅａｓｔｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐ．０　Ｂｏｘ４３１，Ｋｉｎｇｓｐｏｒｔ，テネシー州３７６６２）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ（Ｓａｎｄｈｏｆｅｒ　Ｓｔｒａｓｓｅ　１１６，Ｄ−６８２９８　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、Ｔａｋａｓａｇｏ（４Ｖｏｌｖｏ　Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ，ニュージャージー州０７６４７）、ＳＳＴ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（６３５　Ｂｒｉｇｈｔｏｎ　Ｒｏａｄ，Ｃｌｉｆｔｏｎ，ニュージャージー州０７０１２）、Ｆｅｒｒｏ（１１１Ｗｅｓｔ　Ｉｒｅｎｅ　Ｒｏａｄ，Ｚａｃｈａｒｙ，ルイジアナ州７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ　Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ　Ｄ−３０９１８，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＰＧ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　ｌｎｃ．，Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏｎｅ　ＰＰＧ　Ｐｌａｃｅ．３４階，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ペンシルバニア州１５２７２）から得る化合物を挙げることができる。更に、あらゆる種類の天然生成物も本発明の方法を用いて選別することができ、例えば、細菌、真菌、植物、又は動物の抽出物を挙げることができる。
【００６８】
更に、小型分子試験化合物を含む試験化合物の多様なライブラリーを用いることができる。ライブラリーは、例えば、Ｓｐｅｃｓ　ａｎｄ　ＢｉｏＳｐｅｃｓＢ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｏｌｇｏｐｒｕｄｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ　Ｒｅｇｉｏｎ，ロシア連邦共和国）、ＣｏｍｇｅｎｅｘＵＳＡ　Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ニュージャージー州）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ　ＰＬ３４　０ＨＷ，英国）、及びＡｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，ロシア連邦共和国）から購入することができる。
【００６９】
また、更に、当業者に公知のコンビナトリアルライブラリー法も利用することができ、例えば、以下に限定されるものでなく、生物学的ライブラリー；空間的なアドレスが可能な平行固相又は液相ライブラリー；脱コンボルーション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）が必要な合成ライブラリー法；“１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ　ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）”ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を挙げることができる。前記生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるのに対し、他の４種のアプローチが、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は低分子化合物のライブラリーに適用することができる（Ｌａｍ，１９９７，　Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２：１４５）。試験化合物のコンビナトリアルライブラリー（低分子試験化合物を含む）を用いることができ、これは、例えば、Ｅｉｃｈｌｅｒ　＆　Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ　１：１７４−１８０；Ｄｏｌｌｅ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ，２：２２３−２３６；及びＬａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２：１４５−１６７に記載のとおりに生成することができる。
【００７０】
分子ライブラリーの合成法の例は、当業界内で、例えば、ＤｅＷｉｔｔら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９；Ｅｒｂら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ｌｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ｌｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐら，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３中で見つけることができる。
【００７１】
化合物のライブラリーは、溶液中に（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１）、あるいはビーズ（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５−５５６）、細菌（ＵＳＰ５２２３４０９）、胞子（ＵＳＰ５，５７１，６９８；５，４０３，４８４；及び５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６３７８−６３８２；及びＦｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）上に存在させることができる。
【００７２】
前記ライブラリーのスクリーニングは、多様な任意の公知方法によって実施することができる。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを記載した以下の参考文献を参照されたい：Ｐａｒｍｌｅｙ　＆　Ｓｍｉｔｈ，１９８９，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；Ｓｃｏｔｔ　＆　Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０；Ｆｏｗｌｋｅｓら，１９９２；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４２２−４２７；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５３９３−５３９７；Ｙｕら，１９９４，Ｃｅｌｌ７６：９３３−９４５；Ｓｔａｕｄｔら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１，．５７７−５８０；Ｂｏｃｋら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５５：５６４−５６６；Ｔｕｅｒｋら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６９８８−６９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ３５５：８５０−８５２；ＵＳＰ５０９６８１５，ＵＳＰ５２２３４０９，及びＵＳＰ５１９８３４６，ａｌｌｔｏ　Ｌａｄｎｅｒら；　Ｒｅｂａｒ　＆　Ｐａｂｏ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：６７１−６７３；及びＰＣＴ公報ＷＯ９４／１８３１８。
【００７３】
前記試験化合物の中で、試験することができる化合物には、プロスタグランジン阻害剤として作用することが当業者に公知の小型有機分子も含まれる。
ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用を変化させる化合物の同定においては、その化合物を、アレルギー性又は炎症性応答を変更する能力に関する試験に対して更に調査することができる。例えば、特に、本発明の方法を経て同定された化合物を、ＰＧＤ２関連障害（例えば、アレルギー、喘息、及び炎症）を受けた動物モデル中で、イン・ビボで更に試験することができる。
【００７４】
コンピュータモデリング及び検索技術によって、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２との相互作用を変化させることができる化合物を同定するか、又は既に同定された化合物を改良することができる。同定されたこのような化合物又は組成物は、その活性部位又は領域を同定する。前記活性部位は、典型的には、リガンド結合部位であろう。前記活性部位は、当業者に公知の方法を用いて同定することができ、例えば、ペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、又は関連する化合物又は組成物とその天然リガンドとの複合体の研究から同定することができる。後者の場合には、化学的方法又はＸ線結晶画像法（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、因子上のどの位置に複合体化したリガンドが発見されるかを発見することによって、活性部位を発見することができる。
【００７５】
次に、前記活性部位（典型的には結合部位）の三次元的幾何学構造を決定する。これは、公知の方法（例えば、完全な分子構造を決定することができるＸ線結晶画像化）によって実施することができる。一方、固相又は液相ＮＭＲを用いて、ある程度の分子内距離を決定することができる。他の任意の構造決定方法も、部分的な又は完全な幾何学構造を得るために用いることができる。幾何学的構造は、複合体化した（天然又は合成）リガンドを用いて測定することができ、これは、決定した活性部位構造の正確性を上げることができる。
【００７６】
正確さが不完全又は不十分な構造が決定された場合は、コンピュータに基づく数値的モデリングの方法を用いて構造を完全にするか又は精度を改良することができる。認められている任意のモデリング方法を用いることができ、例えば、特定のバイオポリマー（例えば、タンパク質又は核酸）に特異的なパラメーター化モデル、コンピュータによる分子動作の計算に基づく分子力学モデル、熱のアンサンブルに基づく統計学的力学モデル、又は組み合わせたモデルを挙げることができる。ほとんどのタイプのモデルに対して、標準的分子力場（構成する原子及び基の間の力を意味する）が必要であり、物理化学において知られている力場（ｆｏｒｃｅ　ｆｉｅｌｄ）から選択することができる。不完全な又は正確さに欠けた実験的構造は、これらのモデリング法によって完全な又はより正確な構造をコンピュータによって計算する上の制約として役立てることができる。
【００７７】
最後に、実験的にモデリングによるか又は組み合わせにより、活性（結合）部位の構造が決定された後で、化合物を変化させる候補を、それらの分子構造に関する情報に沿って、化合物を含むデータベースを検索することによって同定することができる。前記検索は、決定した活性（結合）部位の構造と一致する構造を有し、そして前記活性部位を規定する基と相互作用をする化合物を探す。前記検索は、手動であることができるが、コンピュータを援用することが好ましい。この検索により発見される化合物は、有効なＣＲＴＨ２を変化させる化合物である。
【００７８】
あるいは、これらの方法を、変化させる既知の化合物又はリガンドから、変化させるより向上した化合物を同定するために用いることができる。新しい構成（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）に適用した前記の実験的及びコンピュータによるモデリング方法を用いて、公知化合物の構成を修正させることができ、また、修正の構造的効果を決定することができる。次に、変更した構造を、前記化合物の活性（結合）部位の構造と比較して、改良された適合性又は相互作用が得られるか否かを決定する。この方法において、構成における体系的な変化（例えば、側鎖の変化によるもの）は、迅速に評価して、特異性又は活性が向上した修正された変化させる化合物又はリガンドを得ることができる。
【００７９】
ＣＲＴＨ２又はＰＧＤ２の活性（結合）部位並びに関連するプロスタグランジン及びそれらのアナログの同定に基づく変化させる化合物の同定に有用な更なる実験的及びコンピュータモデリング方法が、当業者に明らかになるであろう。
分子モデリングシステムとしては、例えば、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，マサチュ−セッツ州）を挙げることができる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギーの最小化及び分子力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、作図（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、グラフィックモデリング、及び分子構造の分析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、インタラクティブな作図、修正、ビジュアル化、及び分子相互の動作の分析をすることができる。
【００８０】
特定のタンパク質にインタラクティブな医薬のコンピュータモデリングに関する多くの技術文献が存在する。例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら，（１９８８，　Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｆｅｎｎｉｃａ９７：１５９−１６６）；Ｒｉｐｋａ（１９８８，Ｎｅｗ　Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ５４−５７）；ＭｃＫｉｎａｌｙ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓｍａｎｎ（１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１−１２２）；Ｐｅｒｒｙ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｐ．１８９−１９３，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９；Ｌｅｗｉｓ　ａｎｄ　Ｄｅａｎ（１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５−１４０及び１４１−１６２）；及び、核酸成分に対するモデルレセプターに関して：Ａｓｋｅｗら．（１９８９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０）。化学薬品を選別及び描画する他のプログラムも、市販元、例えば、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，カリフォルニア州）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ）、及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，ｌｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から入手することができる。これらは、特定のタンパク質に特異的な医薬への適用を第一に意図しているが、それらは、一度同定されたＤＮＡ又はＲＮＡの領域に特異的な医薬の設計に適用することができる。
【００８１】
ＣＲＴＨ２タンパク質、ＣＲＴＨ２の変異、一部欠失（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、若しくは欠失（ｄｅｌｅｔｅｄ）型のポリペプチド及びペプチド断片、及び／又はＣＲＴＨ２融合タンパク質は、特に限定されるものではないが、抗体の産生、診断アッセイにおける試薬として、ＰＧＤ２関連障害の調節に関連する他の細胞遺伝子産物の同定、ＰＧＤ２関連障害の治療における薬剤として使用可能な化合物のスクリーニング用アッセイにおける試薬として、種々の用途のために調製することができる。加えて、ＣＲＴＨ２及びＰＧＤ２の相互作用から得られる情報に基づいて、ＣＲＴＨ２受容体分子への循環性（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ＰＧＤ２の正常な結合を阻害するＣＲＴＨ２のペプチド断片が、インビボ治療用として得られる。
【００８２】
ＣＲＴＨ２ペプチド、ポリペプチド、及び融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。例えば、蛇行した（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）ＣＲＴＨ２のＥＣＤの４つのドメイン１又はそれ以上をコードするヌクレオチド配列を合成又はクローニングし、一緒に連結することにより、ＣＲＴＨ２の可溶性ＥＣＤをコードすることができる。４つのＥＣＤ１又はそれ以上をコードするＤＮＡ配列は、直接的に、あるいは、ペプチドスペーサーをコードするリンカーオリゴヌクレオチドを介して、一緒に連結することができる。前記リンカーは、柔軟で、且つグリシンの割合が高いアミノ酸配列をコードし、そのため、連結されたドメインが、ＣＲＴＨ２リガンドと結合可能なコンフォメーションをとることができる。あるいは、ＥＣＤ内の個々のドメインをコードするヌクレオチド配列を、ＣＲＴＨ２ペプチドを発現するのに用いることができる。
【００８３】
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、ＣＲＴＨ２の適当な領域をコードするヌクレオチド配列を発現させ、前記ポリペプチドを産生することができる。得られるペプチド又はポリペプチドが可溶性誘導体（例えば、ＥＣＤに相当するペプチド；ＴＭ及びＣＤが欠失した一部欠失体又は欠失体）である場合には、前記ペプチド又はポリペプチドは、培養培地から回収することができる。ポリペプチド又はタンパク質が分泌されない場合には、ＣＲＴＨ２産物は、宿主細胞それ自体から回収することができる。
【００８４】
宿主−発現ベクター系には、その場で（ｉｎ　ｓｉｔｕ；すなわち、細胞膜に固定されて）ＣＲＴＨ２又は機能的等価物を発現するように作られた宿主細胞も含まれる。前記発現系からのＣＲＴＨ２の精製又は濃縮は、当業者に周知の方法並びに適当な界面活性剤及び脂質ミセルを用いて達成することができる。しかし、ＣＲＴＨ２の構造的及び機能的特性を維持するだけでなく、生物学的活性を評価すること（例えば、薬剤スクリーニングアッセイ）が重要である場合には、前記作出宿主細胞それ自体を用いることができる。
【００８５】
本発明の目的のために用いることのできる宿主−発現ベクター系には、特に限定されるものではないが、微生物、例えば、ＣＲＴＨ２ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ＣＲＴＨ２ヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；ＣＲＴＨ２配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＣＲＴＨ２ヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター［例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）］を感染させたか、あるいは、組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を担持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が含まれる。
【００８６】
細菌系においては、発現させるＣＲＴＨ２遺伝子産物の使用意図に基づいて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、ＣＲＴＨ２タンパク質の医薬組成物の調製用に、あるいは、ＣＲＴＨ２タンパク質に対する抗体の調製用に、前記タンパク質を大量に製造する必要がある場合には、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物を高レベルで発現させるベクターが望ましい。このようなベクターには、特に限定されるものではないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら，１９８３，ＥＭＢＯ　Ｊ．，２：１７９１）（ＣＲＴＨ２のコード配列を、ｌａｃＺコード領域とインフレームで、ベクターに個別に連結し、融合タンパク質製造することができる）；及びｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ及びｌｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ及びＳｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３−５５０９）等が含まれる。また、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するのに、ｐＧＥＸベクターを用いることができる。一般に、前記融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、グルタチオン−アガロースゲルビーズに吸着させ、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン又はＸａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計されており、クローニングされた標的遺伝子産物は、ＧＳＴ部分から切り離すことができる。
【００８７】
また、任意の融合タンパク質を、発現させる融合タンパク質に特異的な抗体を利用することにより、容易に精製することができる。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらにより記載された系を用いると、ヒトセルライン中で発現させた非変性融合タンパク質を、容易に精製することができる（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８９７２−８９７６）。この系では、目的遺伝子のオープンリーディングフレームが、ヒスチジン残基６個からなるアミノ末端タグに、翻訳可能に融合するように、前記遺伝子をワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞由来の抽出物を、Ｎｉ２＋・ニトリロ酢酸−アガロースカラムにロードした後、イミダゾール含有バッファーにより、ヒスチジンタグ付加タンパク質を選択的に溶出する。
【００８８】
昆虫系においては、外来遺伝子を発現するためのベクターとして、ＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｌｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス）が用いられる。前記ウイルスは、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する。ＣＲＴＨ２コード配列を、ウイルスの非本質的領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。ＣＲＴＨ２遺伝子コード配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子の不活化と、非閉塞性組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質コートを欠失したウイルス）の産生とが生じる。続いて、前記組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子を発現させる細胞に感染させる（例えば、Ｓｍｉｔｈら，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４；Ｓｍｉｔｈ，米国特許第４，２１５，０５１号明細書参照）。
【００８９】
哺乳動物宿主細胞においては、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合には、目的のＣＲＴＨ２ヌクレオチド配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体［例えば、後期プロモーター及び３部からなる（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列］に連結させることができる。続いて、インビトロ又はインビボ組換えにより、キメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムを非本質的領域（例えば、Ｅ１又はＥ３領域）へ挿入することにより、感染宿主中でＣＲＴＨ２遺伝子産物を発現可能で、発現しうる組換えウイルスが得られるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３６５５−３６５９参照）。また、挿入したＣＲＴＨ２ヌクレオチド配列の効率的翻訳のために、特異的な開始シグナルを必要とすることができる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が含まれる。完全なＣＲＴＨ２遺伝子又はｃＤＮＡ（それ自身の開始コドン及び隣接配列を含む）を適当な発現ベクターに挿入する場合には、追加の翻訳制御シグナルを必要としないことができる。しかし、ＣＲＴＨ２Ｅコード配列の一部のみを挿入する場合には、外来性の翻訳制御シグナル（おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む）が提供されることが必要である。更に、挿入物全体の翻訳を保証するためには、前記開始コドンは、目的のコード配列のリーディングフレームとインフレームであることが必要である。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、種々の起源（天然物及び合成物の両方）であることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサー因子、転写ターミネーター等を含むことにより、向上させることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１６−５４４参照）。
【００９０】
更には、所望の特定な方法で、遺伝子産物を修飾及びプロセシングしたり、あるいは、挿入した配列の発現を調節する宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物の前記修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であることができる。種々の宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に関して、特徴的且つ特定の機構を有する。発現させる外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを保証するために、適当なセルライン又は宿主系を選択することができる。従って、一次転写産物の正確なプロセシング、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を用いることができる。前記哺乳動物宿主細胞には、特に限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、及びＷｌ３８の各セルラインが含まれる。
【００９１】
組換えタンパク質の長期間且つ高収率の製造のためには、安定（ｓｔａｂｌｅ）発現が好ましい。例えば、先述のＣＲＴＨ２配列を安定的に発現するセルラインを作出することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、選択マーカー、及び適当な発現制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入の後、作出細胞を富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地で１〜２日間増殖させ、続いて、選択培地に転換することができる。組換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する耐性を与える。前記選択マーカーは、細胞の染色体中にプラスミドが安定的に組み込まれ、細胞が増殖してフォーカス（ｆｏｃｕｓ）を形成する（前記フォーカスは、次に、クローニングし、セルラインまで拡張可能である）のを可能にする。この方法は、ＣＲＴＨ２遺伝子産物を発現するセルラインを作出するのに、有利に使用することができる。前記作出セルラインは、ＣＲＴＨ２遺伝子産物の内在性活性に影響を与える化合物のスクリーニング及び評価において、特に有用であることができる。
【００９２】
特に限定されるものではないが、いくつかの選択系を用いることができる。例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９７７，Ｃｅｌｌ，１１：２２３），ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２６），及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２：８１７）の各遺伝子を、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−の各細胞において使用することができる。また、以下の各遺伝子に関する選択に基づいて、抗代謝剤（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）耐性を用いることもできる：
メトトレキセートへの耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５６７；０’Ｈａｒｅら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７）；
ミコフェノール酸への耐性を与えるｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１）；及び
ハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，１９８４，Ｇｅｎｅ，３０：１４７）。
【００９３】
ＣＲＴＨ２のエピトープ又はＣＲＴＨ２の保存された変異体若しくはＣＲＴＨ２のペプチド断片のエピトープの１又はそれ以上を特異的に認識する抗体も、本発明に含まれる。前記抗体には、特に限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化若しくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより製造される断片、抗イデオタイプ（ａｎｔｉ−Ｉｄ）抗体、及びこれらのいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。
【００９４】
本発明の抗体は、例えば、生物学的試料中のＣＲＴＨ２の検出に用いることができ、従って、診断又は予後技術の一部として利用することができ、それによって、異常量のＣＲＴＨ２に関して患者を検査することができる。ＣＲＴＨ２の変異型を特異的に認識する抗体は、診断又は予後技術の一部として、特に有用であることができる。前記抗体は、例えば、先述の化合物スクリーニング計画に関連して、ＣＲＴＨ２遺伝子産物の活性及び／又は発現における試験化合物の効果を評価するためにも、利用することができる。更に、前記抗体は、後述の遺伝子治療技術に関連して、例えば、正常及び／又は作出したＣＲＴＨ２発現細胞の評価（患者に導入する前の評価）のために用いることができる。前記抗体は、更に、異常なＣＲＴＨ２活性の阻害方法として用いることができる。従って、前記抗体は、ＰＧＤ２関連障害の治療方法の一部として利用可能である。
【００９５】
抗体を製造するために、ＣＲＴＨ２、ＣＲＴＨ２ペプチド［例えば、受容体の機能的ドメイン（例えば、ＥＣＤ、ＴＭ、又はＣＤ）に相当するペプチド］、一部欠失したＣＲＴＨ２ポリペプチド［ドメイン（例えば、ＴＭ又はＣＤ）１又はそれ以上が欠失したＣＲＴＨ２］、ＣＲＴＨ２の機能的等価物、又はＣＲＴＨ２の変異体を注射することにより、種々の宿主動物を免疫することができる。前記宿主動物には、特に限定されるものではないが、少し例を挙げれば、ウサギ、マウス、ハムスター、及びラットが含まれる。免疫応答を向上させるために、宿主の種に依存して、種々のアジュバンドを用いることができる。前記アジュバントには、特に限定されるものではないが、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ジニトロフェノール、及び潜在的に使用可能なヒトアジュバント［ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ］が含まれる。ポリクローナル抗体は、免疫した動物の血清から得られる抗体分子の不均一な集団である。
【００９６】
特定抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、継代セルラインの培養による抗体分子の製造に関して提供される任意の技術によって得ることができる。これらの技術には、特に限定されるものではないが、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７及び米国特許第４，３７６，１１０号明細書）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，１９８３，ｌｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ，４：７２；Ｃｏｌｅら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２０２６−２０３０）、及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｌｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が含まれる。前記抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びそれらの任意のサブクラスを含む）であることができる。本発明のｍＡｂを製造するハイブリドーマは、インビトロ又はインビボで培養することができる。高力価のｍＡｂの製造のためには、現在のところ、インビボが好適な製造方法である。
【００９７】
更に、「キメラ抗体」の製造のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８；　Ｔａｋｅｄａら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：４５２−４５４）を用いることができる。前記技術では、適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることにより、キメラ抗体が製造される。キメラ抗体は、種々の部分が種々の動物種に由来する分子（例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子）である。
【００９８】
また、単鎖抗体の製造に関して記載の方法（米国特許第４，９４６，７７８号明細書；Ｂｉｒｄ，１９８８．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３；及びＷａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５４４−５４６）を、ＣＲＴＨ２遺伝子産物に対する単鎖抗体を製造するために、適合させることができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖及び軽鎖を、アミノ酸ブリッジを介して連結することにより形成され、その結果、単鎖ポリペプチドが得られる。
【００９９】
特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知技術により製造することができる。例えば、前記断片には、特に限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により製造することのできるＦ（ａｂ’）２断片、及び前記Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元することにより製造することのできるＦａｂ断片が含まれる。また、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定を行なうことができる。
【０１００】
ＣＲＴＨ２に対する抗体は、次に、当業者に周知の技術（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ及びＢｏｎａ，１９９３，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．，７（５）：４３７−４４４；及びＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．，１４７（８）：２４２９−２４３８参照）により、ＣＲＴＨ２に「よく似た（ｍｉｍｉｃ）」抗イディオタイプ抗体を製造するのに利用することができる。例えば、ＣＲＴＨ２のＥＣＤに結合し、且つＣＲＴＨ２へのメラノコルチンの結合を完全に阻害する抗体を、ＥＣＤに「よく似た」抗イディオタイプ（従って、メラノコルチンに結合し、メラノコルチンを中和する）の製造に用いることができる。前記中和性抗イディオタイプ、又はこの抗イディオタイプのＦａｂ断片は、治療的養生法において、天然のリガンドを中和し、ＰＧＤ２関連障害（例えば、アレルギー性障害及び喘息）を治療するのに用いることができる。
【０１０１】
また、ＣＲＴＨ２活性のアゴニストとして作用することのできる抗ＣＲＴＨ２抗体を製造することができる。前記抗体は、ＣＲＴＨ２に結合し、受容体のシグナル伝達活性を活性化するであろう。更に、ＣＲＴＨ２活性のアンタゴニストとして作用する（すなわち、ＣＲＴＨ２受容体の活性化を阻害する）抗体は、ＰＧＤ２関連障害（例えば、アレルギー性障害、喘息、及び炎症性障害）の治療に、特に有用であろう。
【０１０２】
可溶性のＣＲＴＨ２のＥＣＤ又は融合タンパク質（例えば、融合Ｉｇ分子）を発現する、遺伝子工学的に作出された細胞は、インビボに投与することが可能であり、そこで、可溶性分子の供給を担う「バイオリアクター」として機能することができる。前記可溶性ＣＲＴＨ２ポリペプチド及び融合タンパク質は、適当な濃度で発現された場合、ＣＲＴＨ２の天然リガンドを中和又は「掃討（ｍｏｐ　ｕｐ）」するはずである。従って、ＣＲＴＨ２活性の阻害剤として作用し、従って、ＰＧＤ２関連障害（例えば、アレルギー性障害、喘息、及び炎症性障害）を治療するのに用いることができる。
【０１０３】
ＣＲＴＨ２は、或るＴ細胞、脳、胸腺、筋肉、脾臓、皮膚、及びおそらく他の細胞タイプに存在する細胞表面タンパク質であり、マスト細胞及びおそらく他の細胞タイプから放出されるＰＧＤ２に応答するらしい（ＰＧＤ２関連障害に関連するシグナルにおける重要な初期段階）。このように、ＣＲＴＨ２は、アレルギー性及び炎症性応答における重要な初期段階であることができる。従って、ＣＲＴＨ２タンパク質、類似化合物、誘導体、及びその断片、並びに、核酸（及びそれに相捕的な配列）及び抗ＣＲＴＨ２抗体は、前記ＰＧＤ２関連障害の検出及び診断における用途を有する。
【０１０４】
ＣＲＴＨ２及びＣＲＴＨ２核酸を、慢性、急性、又は異常なアレルギー性及び炎症性応答（例えば、喘息）を引き起こすことのあるＰＧＤ２関連障害の検出、予後、又は診断のアッセイに使用することができる。
【０１０５】
本発明の分子は、アッセイ（例えば、イムノアッセイ）に用いたり、あるいは、ＣＲＴＨ２発現に影響を与える種々の症状、疾病、及び障害を検出、予後、診断、又はモニターするのに、あるいは、それらの治療をモニターするのに用いることができる。特には、前記イムノアッセイは、免疫特異的な結合が可能な条件下で、患者由来の試料と抗ＣＲＴＨ２抗体とを接触させ、前記抗体により免疫特異的な結合量を検出又は測定することを含む方法により、実施される。特定の観点では、組織切片における前記抗体の結合は、異常なＣＲＴＨ２局在化又はＣＲＴＨ２の異常な（例えば、低いか、あるいは、存在しない）レベルの検出に用いることができる。特定の態様では、ＣＲＴＨ２に対する抗体は、ＣＲＴＨ２の存在に関する患者組織又は血清試料のアッセイ（ＣＲＴＨ２の異常レベルは、疾病症状の指標である）に使用することができる。「異常なレベル」とは、障害を有していない個体若しくは体の一部由来の類似試料における存在レベル（あるいは、それを代表する標準レベル）に対して、増加又は減少したレベルを意味する。
【０１０６】
使用可能なイムノアッセイには、特に限定されるものではないが、少し例を挙げれば、例えば、ウエスタンブロット、免疫組織化学ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ　ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫ラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、又はプロテインＡイムノアッセイなどの技術を用いる競合及び非競合アッセイ系が含まれる。
【０１０７】
ＣＲＴＨ２遺伝子並びに関連する核酸配列及び部分配列（相捕的配列を含む）は、ハイブリダイゼーションアッセイにも使用することができる。ＣＲＴＨ２核酸配列又はその部分配列（ヌクレオチド少なくとも約８個を含む）は、ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションアッセイは、先述のｈｓｐｒ発現及び／又は活性における異常な変化に関連する症状、障害、又は疾病状態の検出、予後、診断、又はモニターに用いることができる。特には、前記ハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、核酸を含有する試料と、ＣＲＴＨ２ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズ可能な核酸プローブとを接触させ、得られるハイブリダイゼーションを検出又は測定することを含む方法により、実施される。
【０１０８】
具体的態様では、ＣＲＴＨ２タンパク質、ＣＲＴＨ２ＲＮＡ、又はＣＲＴＨ２機能的活性（例えば、ＰＧＤ２への結合、抗ＣＲＴＨ２抗体結合活性など）レベルの低下を検出することによるか、あるいはＣＲＴＨ２のＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＣＲＴＨ２タンパク質において、ＣＲＴＨ２の発現又は活性の低下を起こす突然変異（例えば、ＣＲＴＨ２核酸における転座、ＣＲＴＨ２遺伝子又はタンパク質における切断、野生型ＣＲＴＨ２に対する核酸又はアミノ酸配列の変化）を検出することにより、感染又は悪化障害の間に免疫応答性の減少を伴う疾病及び障害を診断することができるか、又は疑われるそれらの存在を選別することができるか、又は前記障害が発病しやすい素質を検出することができる。前記疾病及び障害としては、以下に限定されるものでなく、アレルギー性及び喘息性障害（例えば、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、気管支収縮）、神経学的障害（例えば、睡眠障害、及び体温又は痛み応答の調整における障害）、及び炎症性障害（例えば、慢性関節リウマチ；変形性関節症；炎症性腸疾患；皮膚の障害、例えば、乾癬、湿疹、紅斑、かゆみ症、及びニキビ；発作；並びに再灌流損傷、移植片拒絶、及び自己免疫疾患によって特徴づけられる任意の障害）を挙げることができる。
【０１０９】
例えば、ＣＲＴＨ２のレベルは、免疫アッセイによって検出することができ、ＣＲＴＨ２ＲＮＡのレベルは、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロット、インザイチューハイブリダイゼーション）によって検出することができ、そしてＣＲＴＨ２活性は、イン・ビボ又はイン・ビトロで結合活性を測定することによってアッセイすることができる。ＣＲＴＨ２核酸における転座、欠失、及び点変異は、サザンブロッティング、ＦＩＳＨ、ＲＦＬＰ分析、ＳＳＣＰ、プライマー（好ましくは、ＣＲＴＨ２遺伝子の少なくとも大部分に及ぶ断片を生成するプライマー）を用いるＰＣＲ、ＣＲＴＨ２ゲノムＤＮＡ又は患者から得られたｃＤＮＡの配列などによって検出することができる。
【０１１０】
好ましい態様では、患者サンプル中のＣＲＴＨ２ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、ＰＧＤ２関連障害（例えば、アレルギー性障害、喘息、又は炎症性障害）を持たない対象由来の類似のサンプル中に存在するレベルと比較して検出又は測定することができる。減少したレベルは、その対象が、アレルギー性障害、喘息、又は炎症性障害を、発病するか又は発病しやすい素質を有することを現している。
或る具体的態様では、患者サンプル中のｈｓｒｐのｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、前記障害を持たない対象由来の類似のサンプル中に存在するレベルとと比較して検出又は測定する。前記検出又は測定において、増加したレベルは、その対象が、自己免疫障害を有するか又は自己免疫障害に罹病しやすい素質を有することを現している。
【０１１１】
また、容器１個以上、抗ＣＲＴＨ２抗体、及び、場合により、前記抗体に対する標識化結合パートナーを含む、診断用途用のキットも提供する。あるいは、抗ＣＲＴＨ２抗体を（検出可能なマーカー、例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分、又は放射能部分で）標識することもできる。また、１又は複数個の容器中に、ＣＲＴＨ２ＲＮＡとハイブリダイズ可能な核酸プローブを含むキットも提供する。或る具体的態様では、キットは、１個又は複数個の容器中に、ＣＲＴＨ２核酸の少なくとも一部に適当な反応条件下でプライマーによる増幅［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Ｉｎｎｉｓら，１９９０，ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，カリフォルニア州を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ３２０，３０８を参照されたい）Ｑβレプリカーゼの使用、環状プローブ反応、又は当業者に公知の他の方法による増幅］をすることが可能な一組のプライマー（例えば、それぞれ、ヌクレオチド数６〜３０個のもの）を含むことができる。キットは、場合により、容器中に、精製したＰＧＤ２又はＣＲＴＨ２核酸、タンパク質、それらの誘導体、アナログ、又は断片、あるいは標準又は対照として用いるためのものを更に含むことができる。
【０１１２】
本発明は、ＰＧＤ２とＣＲＴＨ２との相互作用を変化させるための、及びＰＧＤ２関連障害（例えば、以下に限定されるものでなく、アレルギー、喘息、及び炎症）を治療するための方法及び組成物も包含する。正常ＣＲＴＨ２遺伝子生成物の機能が欠損するとＰＧＤ２関連障害表現型が発生することがあるので、ＣＲＴＨ２遺伝子生成物活性の増加又はＣＲＴＨ２経路の活性化（例えば、下流活性化）は、ＣＲＴＨ２遺伝子発現及び／又はＣＲＴＨ２活性の不完全なレベルを示す個体において、正常ＰＧＤ２関連状態への進行を促進する。
【０１１３】
あるいは、或るＰＧＤ２関連障害の症状は、ＣＲＴＨ２遺伝子の発現及び／又はＣＲＴＨ２遺伝子活性、及び／又はＣＲＴＨ２経路のダウンレギュレーション活性のレベルを減少することによって（例えば、下流シグナリングイベントを標的とすることによって）改善することができる。別のアプローチを以下に記載する。
或るＣＲＴＨ２アンタゴニストは、喘息又は炎症などの状態の治療に用いることができる。ＣＲＴＨ２のアゴニストは、前記治療が必要な哺乳動物において、ＣＲＴＨ２活性を刺激するために用いることができる。
【０１１４】
前記化合物の毒性及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物における標準的製剤学的手順、例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％が致死する投与量）及びＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な投与量）によって決定することができる。毒性と治療効果との間の投与量率（ｄｏｓｅ　ｒａｔｉｏ）は、治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いることができることもあるが、影響を被っていない細胞に対する潜在的損傷を最小化するように、影響を被っている組織の部位に前記化合物を狙うデリバリーシステムを設計することに注意し、そのことによって副作用を減らすことが好ましい。
【０１１５】
前記細胞培養アッセイ及び動物実験から得たデータは、製剤化する上で、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲に用いることができる。前記化合物の投与量は、好ましくは、僅かな毒性又は無毒で、前記ＥＤ５０を含む循環性濃度の範囲内である。前記投与量は、この範囲内で、使用する投与形態及び利用する投与経路に応じて変化することができる。本発明の方法で使用する全ての化合物について、治療有効量は、細胞培養アッセイから最初に確立することができる。投与量は、動物モデル中で、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環性血しょう濃度範囲を達成するように製剤化することができる。前記情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために用いることができる。血しょう中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１１６】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、生理学的に許容することができる担体又は賦形剤１種以上を用いて、従来の方法で形成することができる。
従って、前記化合物及びそれらの生理学的に許容することのできる塩及び溶媒化物を、（口経由又は鼻経由の）吸入又はガス注入、あるいは経口、頬、非経口、又は直腸投与によって投与する目的で製剤化することができる。
【０１１７】
経口投与用に、前記医薬組成物を、例えば、薬剤学的に許容することのできる賦形剤、例えば、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、タルク、又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ポテトデンプン又はナトリウムデンプングリコレート）；又は浸潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて、従来の方法によって製造された錠剤又はカプセルの形態にすることができる。前記錠剤は、当業者に周知の方法でコートすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態にすることができるか、あるいはそれらを、使用前に水又は他の適当なベヒクルと構成する乾燥生成物とすることができる。前記液体調製物は、薬剤学的に許容することのできる添加剤、例えば、懸濁剤（例えば、ソルビトール、シロップ、セルロース誘導体、又は水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）；非水性ベヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、又は精留した植物油）；及び防腐剤（例えば、メチル若しくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）を用いて、従来の方法によって調整することができる。可能であれば、前記調製物は、緩衝液塩、香料、着色料、及び甘味料も含んでいることができる。
【０１１８】
経口投与用の調製物は、前記活性化合物の放出を制御するように、適当に製剤化することができる。
頬投与用に、前記組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤又はロゼンジの形態にすることができる。
吸入による投与用に、本発明に従って使用する化合物を、適当な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適当なガスを用いて、圧縮パック又はネブライザからのエーロゾルスプレー供給という形態で便利に配達する。圧縮エーロゾルの場合には、計測された量を配達するためのバルブを備えることにより、単位投与量を決定することができる。吸入器又は注入器中で使用するための（例えばゼラチンの）カプセル又はカートリッジを、前記化合物と適当な粉末ベース（例えば、ラクトース又はデンプン）との粉末混合物を含んで製剤化することができる。
【０１１９】
前記化合物は、注射による（例えば、ボーラス注射又は継続的注入による）非経口投与用に製剤化することもできる。注射用調製物は、防腐剤を加えて、単位投与形態で、例えば、アンプル又はマルチ投与容器中に存在させることができる。前記組成物は、油性又は水性ベヒクル中で、例えば、懸濁液、溶液、又は乳液の形態であることができ、また、製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ　ａｇｅｎｔ）、例えば、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤を含むことができる。あるいは、前記活性成分は、使用前に適当なベヒクル、例えば、無菌のパイロジェン不含水で構成する粉末形態であることができる。
【０１２０】
前記化合物は、直腸組成物、例えば、座剤又は保留浣腸剤（例えば、従来の座剤基剤、例えば、ココアバター又は他のグリセリドを含む）に製剤化することができる。
前記化合物は、前記の製剤に加えて、蓄積（ｄｅｐｏｔ）調製物として製剤化することもできる。このような長期活性製剤は、移植（例えば、皮下移植又は筋肉内移植）又は筋肉内注入により投与することができる。従って、前記化合物は、例えば、適当な重合体の又は疎水性の材料（例えば、許容することのできるオイル中のエマルジョンとして）、又はイオン交換樹脂を用いて製剤化するか、あるいは、弱可溶性誘導体、例えば、弱可溶性塩として製剤化することができる。
【０１２１】
前記組成物は、所望により、パック又は投薬器（これは、活性成分を含む単位投与形態を含むことができる）中に存在させることができる。前記パックは、例えば、金属又はプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを挙げることができる。前記パック又は投薬器は、投与に対する指示書を伴うことができる。
【０１２２】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
本実施例に記載のインビボ及びインビトロアッセイは、ＣＲＴＨ２に対するキーの内在性リガンドとしてＰＧＤ２を同定する、ＰＧＤ２／ＣＲＴＨ２相互作用を特徴付けるものである。
ＣＲＴＨ２を発現する３００−１９細胞（トランスフォームされたプレ−Ｂリンパ球）を用いて、多数のマスト細胞及び非マスト細胞由来のメディエーターを［Ｃａ２＋］ｉ可動性（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）アッセイにおいてスクリーニングした（３００−１９細胞は、Ｍ．Ｇ．Ｒｅｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３１７（６０３５）、３５３−３６５頁、１９８５年に開示されている）。本明細書に記載の実験について、ＣＲＴＨ２は、アンピシリン及びネオマイシン耐性マーカーを含み、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるプラスミド「ｐ３．１プロラックフラッグ（ｐｒｏｌａｃｆｌａｇ）」から発現させた。プロラックシグナルペプチドが、遺伝子挿入物の膜発現を可能にする。また、発現された分子の好都合な検出を可能とするＮ末端のＦｌａｇペプチドタグを有する。好ましいＣＲＴＨ２の発現量は、約４０，０００分子／細胞表面である。
【０１２３】
カルシウム流出（ｆｌｕｘ）の研究は、ＰＧＤ２がＣＲＴＨ２安定セルラインの［Ｃａ２＋］ｉ可動性を１５ｎＭのＥＣ５０で増加させることを示した。それに比して、ＰＧＪ２はこの試験において２００ｎＭのＥＣ５０を有しているのに対し、他のプロスタグランジン及びそれらの類似化合物［ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、ＢＷ−２４５Ｃ、及びトロンボキサン擬似物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）］及びロイコトレン（ｌｅｕｋｏｔｒｅｎｅｓ）は不活性である（３００ｎＭを越えるＥＣ５０を有する）ことが見出された。
【０１２４】
ＰＧＤ２に対するＣＲＴＨ２の結合親和性を直接測定するために、以下の結合アッセイを用いた。トランスフェクションされた３００−１９細胞及び親の３００−１９細胞を、室温においてアッセイバッファーで２回洗浄し、２×１０７細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。９６ウェルのＵ字底ポリプロピレンプレート［Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｉｎｃ．；米国マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ）］を用いて、アッセイを次のように組み立てた：ビヒクル（アッセイバッファ中０．３％ＤＭＳＯ、全部のウェル）又は３０ｍＭ冷ＰＧＤ２（ＮＳウェル）５０μＬ；細胞（ウェル当たり１０６細胞として２×１０７細胞／ｍＬ）５０μＬ；６ｎＭ［３Ｈ］−ＰＧＤ２５０μＬ。プレートを、遠心処理（２８００ｒｐｍ、Ｓｏｒｖａｌ　ＲＴ６０００、５分間、４℃）前、室温で２０分間のインキュベーションに付した。プレートを、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ウェル当たり６ｘ１５０μＬのバッファー洗浄）を用いて、冷アッセイバッファーにより集めた（Ｐａｃｋａｒｄ　ＵｎｉｆｉｌｔｅｒプレートＧＦ／Ｃ、予め少なくとも１時間３％ＰＥＩ中に浸漬）。フィルタープレートを一晩乾燥した。シンチレーション流体（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ　０）５０μＬを添加した後、プレートをＰａｃｋａｒｄＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターで計数した（ウェル当たり１分間）。この結合のＩＣ５０値は１８ｎＭであると測定された。ラベルされたＰＧＤ２及びラベルされていない「コールドの（ｃｏｌｄ）」ＰＧＤ２の溶液を以下のように調製した：アッセイバッファ−１ｍＬ当たり［３Ｈ］−ＰＧＤ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｌｏｔ＃ＴＲＫ７３４、１６２Ｃｉ／ｍｍｏｌ、メタノール：水：アセトニトリル（３：２：１）中０．１Ｃｉ／ｍＬ、６１７ｎＭ）１０μＬを用いて、６ｎＭの濃度の［３Ｈ］−ＰＧＤ２の溶液（２ｎＭの最終濃度に対して５０μＬ／ウェル）を調製し；コールドＰＧＤ２（Ｂｉｏｍｏｌ＃ＰＧ−００５、ｌｏｔ＃Ｐ４６５３）を１０ｍＭのストックとしてＤＭＳＯ中に溶かした（−２０℃で保存）。この１０ｍＭストックを３：１０００に希釈し、３０ｍＭの最終濃度を得た（１０ｍＭの最終濃度に対して５０μＬ／ウェル）。アッセイバッファ−：ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウムを補充したハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）：１０×のハンクス液（Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２を含む）１００ｍＬ；１ＭのＨＥＰＥＳ１０ｍＬ／Ｌ；７．５％炭酸水素ナトリウム４．７ｍＬ／Ｌ。
【０１２５】
図１は、［３Ｈ］−ＰＧＤ２結合のスキャッチャードプロット分析を示している。このデータは、リガンドが、均一集団受容体を有するトランスフェクタントに、Ｋｄ＝１８．１ｎＭで結合したことを示した。受容体濃度は、７９，５５４部位／細胞であると計算された。
【０１２６】
ＣＲＴＨ２に結合し、且つＣＲＴＨ２を発現する細胞におけるＰＧＤ２反応を刺激するＰＧＤ２の能力を、他のプロスタグランジン及びプロスタグランジン類似化合物の能力と比較した。最初に、プロスタグランジン及び類似化合物を、競合結合研究を用いて、ＣＲＴＨ２への結合に対しＰＧＤ２と競合するそれらの能力について試験した。これらの研究は、試験したプロスタグランジン及び類似化合物の間のアゴニスト能力について次のランクを示した：ＰＧＤ２＞＞ＰＧＪ２＞ＰＧＦ２＝ＰＧＥ２＞＞ＢＷ２４５Ｃ。次いで、相対的なカルシウム放出アッセイを実施した。図２は、トランスフェクタントにおける［Ｃａ２＋］ｉ可動性へのＰＧＤ２、ＰＧＪ２、ＰＧＦ２、ＰＧＥ２、及びＢＷ２４５Ｃの効果を示している。［Ｃａ２＋］ｉ可動性の順序は、図２に示したように、それらの結合親和性の順序に類似している（すなわち、ＰＧＤ２＞ＰＧＦ２ａ＞＞ＢＷ２４５Ｃ）。
【０１２７】
図２に示すように、ヒト好酸球の［３Ｈ］−ＰＧＤ２結合部位及び好酸球の機能的応答へのプロスタグランジン及び類似化合物の効果は、同じ順序の能力を有している（すなわち、ＰＧＤ２＞ＰＧＦ２ａ＞＞ＢＷ２４５Ｃ）。このアゴニストの能力のランク順序は、如何なる公知のプロスタノイド受容体のものとも有意に異なっており、ＣＲＴＨ２とのそれらの相互作用と一致している（表１参照）。
【０１２８】
ヒトＣＲＴＨ２と、他のプロスタグランジン受容体、ＤＰ、ＥＰ１−４、ＴＰ、ＦＰ、及びＩＰとのアミノ酸配列アラインメントは、出版物を元にして決定することができる。ＣＲＴＨ２は、ＤＰ、ＥＰ１−４、ＴＰ、ＦＰ、及びＩＰ各受容体と３０％未満の配列相同性を示す。
【０１２９】
ヒトＴリンパ球のＰＧＤ２、マウスＭＤＣ、及びマウスｍＳＤＦに対する走化性反応もアッセイした。走化性は、４８−ウェルＢｏｙｄｅｎチャンバー［Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、米国メリーランド州キャビンジョン（Ｃａｂｉｎ　Ｊｏｈｎ）］、及び３．０μｍポリカーボネートフィルターを用いて測定した。細胞を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を補充したＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁（３〜３．５ｘ１０６細胞／ｍＬ）させ、チャンバーの上方のウェルに入れた。試験すべき化合物は、下方のウェルに入れた。このチャンバーを、給湿したＣＯ２インキュベーター中で３７℃において９０〜１２０分間インキュベートした。インキュベーション時間の終わりに、フィルター上の移動細胞の数［高倍率範囲（ｈｉｇｈ　ｐｏｗｅｒ　ｆｉｅｌｄ）当たりで発現される］を顕微鏡で計数した。図４及び図５に示すように、抗−ＣＤ３刺激Ｔ細胞（図４）及び抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８−刺激Ｔ細胞（図５）は、いずれもＰＧＤ２に特異的に応答する。図６において、ヒト好塩基球のＰＧＤ２及びＣ５ａに対する走化性応答を示している。
【０１３０】
《表１》
ＰＧＤ２及び他のプロスタグランジンの、単離されたヒト好酸球におけるＬ３ＨＩＰＧＤ２結合及び機能的応答への効果
リガンド　ＰＧＤ２結合　ＲＯＳ＊放出　走化性　アクチン−重合体＊　［ＣＡ２＋］ｉ可動性
　　　　　　　　　　ＩＣ５０（μＭ）　　　ＥＣ５０（μＭ）　　ＥＣ５０（μＭ）　　　　　ＥＣ５０（μＭ）　　　　　　　　　ＥＣ５０（μＭ）　　　　
ＰＧＤ２　　　　　　０．０２５（４）　　０．００２（６）　　０．００３（１）　　　　　０．００４（４）　　　　　　　　０．０３（４）
ＰＧＪ２　　　　　　　　　ＯＴ　　　　　０．０７５（１）　　　＞０．１（１）　　　　　１．８（１）　　　　　　　　　　０．１３（２）
ＰＧＦ２α　　　　１．５（１）　　　　　＞１（３）　　　　　＞０．１（１）　　　　　１．９（１）　　　　　　　　　　　＞１（１）
ＢＷ−２４５Ｃ　　　　＞１００（３）　　　＞１（１）　　　　　＞１（１）？？　　　　　　＞１（１）？？　　　　　　　　　＞１（１）
Ｐａ，１１ｂ−ＰＧＦ２　　ＯＴ　　　　　＞０．１（２）　　　　＞０．１（１）　　　　　　＞１（２）　　　　　　　　　　　　ＯＴ
ＰＧＥ１　　　　　　　　　ＯＴ　　　　　＞０．１（１）　　　　＞０．１（１）　　　　　＞１００（１）　　　　　　　　　　＞１（１）
ＰＧＥ２　　　　　　３．３（１）＊＊　　　＞０．１（１）＊＊　　＞０．１（１）＊＊　　　　＞３００（２）＊＊　　　　　　　　　＞１（２）＊＊
ＰＧ１２　　　　　　　　　ＯＴ　　　　　＞１（２）　　　　　＞０．１（１）　　　　　　＞１００（１）　　　　　　　　　　＞１（１）
Ｕ−４６６１９　　　　　　ＯＴ　　　　　＞０．１（２）　　　　　　ＯＴ　　　　　　　　　　　ＯＴ　　　　　　　　　　　　＞１（１）　　　　　
＊ＲＯＳ：活性酸素種；アクチン−重合体：ヒト全血好酸球アクチン−重合応答＊そのＣＲＴＨ２への結合にもかかわらず、ＰＧＥ２は好酸球応答（すなわち、アクチン重合）を誘導できない。ＰＧＥ２は、そのＥＰ２受容体への結合（ｃＡＭＰで媒介される）により、ＣＲＴＨ２で媒介される好酸球反応を鈍らせることができると推定される。
【０１３１】
本発明の実施に従ってスクリーニングを行うことに関して、ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２への特異的な結合は、４０℃より室温の方が高いことに留意されたい。それとは対照的に、ＰＧＤ２のＤＰ受容体への特異的反応は、室温より４０℃の方が高い。低濃度のマグネシウムイオン及びカルシウムイオンはＰＧＤ２のＣＲＴＨ２への結合を高めるが、それのＤＰ受容体への結合をわずかに阻害することにも留意されたい。ＰＧＤ２のＣＲＴＨ２受容体との反応を高めることに関して、５ｍＭのカルシウムイオン又はマグネシウムイオンは、有用な濃度であり、一般には、１〜５０ｍＭであり、好ましくは５〜２０ｍＭが好都合であろう。
【０１３２】
【実施例２】
以下の実験を行い、さらにＣＲＴＨ２を特徴付けし、ＰＧＤ２で媒介される炎症応答におけるＣＲＴＨ２の役割を決定した。
ＣＲＴＨ２は、７回膜貫通Ｇタンパク質共役型の受容体の一員である。Ｇタンパク質共役型受容体として、ＣＲＴＨ２はＧタンパク質を介して細胞質媒介事象に共役する。興味深いことに、百日咳毒素は、ＰＧＤ２で媒介される好酸球走化性を阻害し、このことは、ＣＲＴＨ２がおそらくＧｉと結合していることを示唆した。研究により、ＣＲＴＨ２が、セカンドメッセンジャーとしてｃＡＭＰでなくカルシウムを利用することも示された。
【０１３３】
ヒトにおいて、ＣＲＴＨ２は広範な組織分布を有しており、それは脳、胸腺、筋肉、脾臓、皮膚、及び他の組織で発現される。従って、ＣＲＴＨ２は、異なる組織において異なる効果を有する可能性がある。すなわち、或る細胞型では、特定の遺伝子産物及び活性を活性化し、別の組織では、同一又は別の遺伝子産物又は活性をダウンレギュレートする（その特定の細胞型において活性化されるシグナル伝達経路に依存して）可能性がある。
【０１３４】
モルモットの眼に局所的に与えられたＰＧＤ２は、６時間後の攻撃（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の時に、眼圧低下及び微小血管漏れとそれに続く結膜炎（好酸球浸潤、粘液分泌）を引き起こす（Ｗｏｏｄｗａｒｄら、１９９０年、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓｕ．Ｓｃｉ．３１：３８−１４６）。眼圧低下反応は、ＢＷ−２４５Ｃによって擬似されたが、一方、微小血管漏れとそれに続く結膜炎は、ＢＷ−２４５Ｃでは無反応であった。このことは、炎症性応答が別の受容体、おそらくＣＲＴＨ２によって媒介されることを示した。
【０１３５】
脈管（ｖａｓｃｕｌａｒ）透過性におけるＣＲＴＨ２で媒介される増加は、細胞性の炎症のキー要素であることができ、この作用は、走化性因子に対するインビボの走化性応答を大いに促進することができる。イヌにおいて、気管注入（ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）は、１〜４時間後の攻撃においてそれらの気管の管腔に好酸球蓄積を引き起こし（Ｅｍｅｒｙら、１９８９年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＡｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　６７（３）：９５９−６２）、ＩＶ注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）は、循環性好酸球の顕著かつ迅速な減少を引き起こす。これらの全研究において、後ＰＧＤ２攻撃で好中球応答に変化はなく、観察は、好中球におけるＣＲＴＨ２発現の欠如、及びラジオリガンド受容体結合アッセイが精製されたヒト好中球中に２ｎＭ［３Ｈ］−ＰＧＤ２に対する特異的な結合部位を同定できなかった事実と一致する。
【０１３６】
単離されたヒト好酸球に関するインビトロ研究は、［Ｃａ２＋］ｉ可動性の活性化、ＲＯＳ放出、アクチン重合反応、及び走化性が、これらの研究におけるアゴニスト能力のランク順序がＣＲＴＨ２トランスフェクタントに関する［３Ｈ］−ＰＧＤ２結合研究からインビトロで得られたものと比較して似ている（実施例１参照）ことから、ほぼ確実にＣＲＴＨ２を介して媒介されることを証明した。しかしながら、ＰＧＤ２による好酸球活性化は、明らかにＦＰ又はＴＰ受容体を介して媒介されるものではない。なぜならば、ＰＧＦ２ｃｔ又は公知のトロンボキサン擬似物Ｕ４６６１９は、これらのアッセイにおいて何らの活性も示さないからである。好酸球の他に、ヒトの活性化されたＴ−リンパ球及び好塩基球も、走化性アッセイにおいて、ＰＧＤ２に対して応答性があり、他のプロスタノイド又はＢＷ−２４５Ｃには応答性がない（図６及び図７参照）。
【０１３７】
ヒト活性化Ｔ細胞はＰＧＤ２に応答すること、及びＰＧＤ２に対する応答にはＣＤ３及びＣＤ２８によるＴ細胞の活性化が必要であることが示された。この反応がＴｈ２細胞にのみ限定されているか否かはまだわからない。ＣＲＴＨ２はヒトにおけるＴｈ２に特異的な受容体であることがもともと報告されているが、マウスの研究では、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１細胞のいずれもがＣＲＴＨ２を発現し、ＰＧＤ２に応答することが示された。これらの研究は、ＣＲＴＨ２発現のパターンに一定の種差がある可能性を示唆している。
【０１３８】
ＰＧＤ２は、アレルギー、喘息、及び炎症に関係した他の多くの生物学的効果を有している。例えば、吸入されたＰＧＤ２は、喘息患者に気管支収縮を引き起こさせ、その効果は、ＰＧＦ２ｃｔ及びヒスタミンより、それぞれ３．５倍及び３０倍強力である（Ｈａｒｄｙら、１９８４年、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３１１（４）：２０９−１３）。この効果は、中枢の気道よりむしろ末梢の気道に優先的である（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、１９７７年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　１３（２）：２５５−６９）。吸入されたＰＧＤ２も咳を引き起こし、喘息患者におけるメタコリン及びヒスタミン気道の過剰反応性を強める。ヒトの皮膚に皮内的に投与されたＰＧＤ２は、２時間までの間に強い紅斑形成を引き起こし（Ｓｏｔｅｒら、１９８３年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　８０（２）：１１５−９）、これは細静脈の透過性の増加を反映している。ＰＧＤ２によるアトピー性及び非アトピー性の被験者の鼻内攻撃は、投与量に依存した鼻開存性の減少、及びアレルギー症状（とりわけ、鼻のうっ血、咳、及びのどの痛み）の増大を引き起こし、このようにアレルギー性鼻炎に関連した症状及び病態生理学に擬似する（Ｓｏｔｅｒら、１９８３年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ　８０（２）：１１５−９）。Ｃ５７／ＢＬマウスにおいて、抗原−及び化合物４８／８０−誘導された皮膚のかゆみは、ＰＧＤ２アンタゴニストにより遮断される。しかしながら、これらの応答の完全な薬理学的特徴付けが欠如しているため、どのプラスタノイド受容体が関与しているか明らかでない。インビボ及びインビトロ研究により、ＰＧＤ２による気管支収縮応答は、部分的に、気道平滑筋ＴＰ受容体の直接的活性化による（Ｂｅａｓｌｅｙら、１９８９年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　６６（４）：１６８５−９３）か、あるいは、気道副交感神経からのアセチルコリンの前結合的（ｐｒｅｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ）放出の間接的刺激による（Ｔａｍａｏｋｉら、１９８７年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　６３（４）：１３９６−４００）ことがあり得ることが示唆されている。前者は、ＰＧＤ２が低い親和性（Ｋｉ＝７５μＭ）でＴＰ受容体に結合するので、ありそうもないことと思われ；後者は、どのプロスタノイド受容体が関与しているかについての情報を提供していない。
【０１３９】
モジュレーター、すなわち、ＰＧＤ２及びＣＲＴＨ２の相互作用のアンタゴニスト及びアゴニストも、肺性疾患の治療において重要であることができる。ＰＧＤ２は、アレルギー、喘息、及び炎症におけるキーとなる媒介物質として機能することができ、マスト細胞によって生産される最も豊富な媒介物質の一つ［ヒスタミン及びペプチドロイコトリエン（ｐｅｐｔｉｄｏｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｎｓ）の他に］であり、そしてアトピー性の喘息患者のＢＡＬ及びアレルギー性鼻炎からの鼻洗浄から回収される（Ｋｎａｎｉら、１９９２年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　＆　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　９０（６Ｐｔ１）：８８０−９）。さらに、アレルギー性鼻炎及び喘息を持った患者は、商品名ＺＹＲＴＥＣ及びＳＩＧＵＬＡＩＲのもとに販売されている薬剤を用いた場合でさえ、鼻のうっ血及び肺性の機能不全の効果的な軽減を得られず、このことは、ヒスタミン及びロイコトレン以外の媒介物質（一種又はそれ以上）が関与していることを示している。抗原誘導され、マスト細胞由来のＰＧＤ２の早期の放出は、アレルギー性の症状に寄与すること、並びに、肺中に好酸球、リンパ球、及び好塩基球を補充することにより炎症性の応答を開始することに役割を担うことができる。ＢＡＬ、及び尿中のＰＧＤ２及びその代謝産物の量も、１２時間後の抗原攻撃の後、有意に高められると思われる。従って、ＰＧＤ２も、より多量の炎症性の細胞を引き付けることによって、免疫性の反応を維持し及び潜在的に増強することに関与していることができる。
【０１４０】
さらに、速度論的（ｋｉｎｅｔｉｃ）研究により、抗ＩｇＥがＰＧＤ２の早期（２〜３０分間）及び後期（４〜６時間）の生産を引き起こし、そのとき前者はＣＯＸ−１により制御され及び後者は誘導性ＣＯＸ−２により調節されることが示された（Ｒｅｄｄｙら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　＆　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２６５（１）：２０５−１０）。事実、最近になって、ヒトＴｈ２細胞及び活性化された肺胞マクロファージは、ＣＯＸ−２依存性経路によりＰＧＤ２を合成することが示された（Ｔａｍａｏｋｉら、１９８７年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　６３（４）：１３９６−４００；ＭａｃＤｅｒｍｏｔら、１９８４年、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　２７（２）：１６３−７９）。免疫組織化学的研究は、喘息患者における、ＣＯＸ−１でなくＣＯＸ−２の気管支上皮及び粘膜下組織の細胞性発現の有意な増加を示している（Ｓｏｕｓａら、１９９７年、Ｔｈｏｒａｘ　５２（１１）：９４０−５）。ＰＧＤ２生産の速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、抗原攻撃された喘息患者に見られる早期相及び後期相の応答により一時的に修正されるので、マスト細胞、Ｔｈ２細胞、及び活性化された肺胞マクロファージが、後期相においてＰＧＤ２の量を高騰させるのに寄与する細胞種であると考えられる。
【０１４１】
【実施例３】
図３は、ＰＧＤ２に近い類似化合物についてのカルシウム流出アッセイ（再度、３００−１９ＣＲＴＨ２トランスフェクタントを用いて）の結果を示している。
【０１４２】
【実施例４】
《ＰＧＤ２アゴニスト及びアンタゴニストのＣＲＴＨ２への結合を測定するための追加のアッセイ》
ＰＧＤ２アゴニスト及びアンタゴニスト化合物の結合も、ＣＲＴＨ２−発現Ｌ１．２細胞から調製した膜を用いて測定した。膜調製物を作成するために、細胞ペレット１０ｇを冷５０ｍＭ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．７）２０ｍＬ中に再懸濁させ、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーを用いて氷上で３回（各１０秒間）ホモジナイズする。次いで、この懸濁液を同じバッファーで８０ｍＬまで希釈し、４０，０００ｘｇで３０分間遠心分離する。上澄みを廃棄した後、ペレットを、前記の再懸濁、ホモジナイズ、及び遠心分離を繰り返すことにより、冷８０ｍＭ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．７）で一回洗浄する。最後に、ペレットを冷５０ｍＭ−ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．７）２０ｍＬ中に再懸濁させ、アリコートし、−８０℃で保存する。アッセイの当日に、膜を氷上で解凍し、２５μＬを、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。次いで、０．５Ｍ−ＭｇＣｌ２５μＬ及びＰＶＴ−ＷＧＡシンチレーションプロキシミティー（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）アッセイ（ＳＰＡ）ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１０μＬを各ウェルに入れ、充分に混合する。次いで、試験すべき化合物５μＬを添加し、続いて３０ｎＭ３Ｈ−ＰＧＤ２（１：１７希釈されたＮＥＮから２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）５μＬを添加して、結合反応を開始する。次いで、プレートを密閉し、室温で少なくとも１時間インキュベートした後、Ｗａｌｌａｃ　ＭｉｃｒｏｂｅｔａＴｒｉｌｕｘシンチレーションカウンターで計数する。非特異的な結合を、１００μＭのラベルされていないＰＧＤ２を含有するウェルで測定する。活性な化合物は、ＣＲＴＨ２への結合に対して３Ｈ−ＰＧＤ２と競合することができ、結合したｃｐｍの数の減少により確認される。
【０１４３】
【実施例５】
《ＣＲＴＨ２における化合物の機能的活性（アゴニスト対アンタゴニスト）を測定するための追加のアッセイ》
化合物の機能的活性は、ＣＲＴＨ２を発現するＬ１．２細胞中でＰＧＤ２により誘導された一時的なＣａ２＋流出を遮断することができる能力により測定した。Ｃａ２＋流出は、ＦＬＩＰＲカルシウムアッセイキット（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いることによりＦＬＩＰＲで測定する。最初に、リージェントバッファー（Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂｕｆｆｅｒ）の１Ｘ溶液を、キットからのコンポーネント（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）Ｂを１：１０に希釈し、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整することにより調製する。次に、Ｃａ２＋センシングダイ（Ｓｅｎｓｉｎｇ　Ｄｙｅ）を、キットからのコンポーネントＡの１ビン（ｖｉａｌ）を１Ｘリージェントバッファー１０ｍＬ中に溶かすことにより調製する。アッセイの当日に、１Ｘリージェントバッファー２０ｍＬを、ダルベッコの修正イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉａ）（ＤＭＥＭ）２０ｍＬ、２５０ｍＭプロベネシド４００μＬ、及びＣａ２＋センシングダイ溶液１ｍＬと混合して、アッセイバッファー（Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ）を調製する。次いで、細胞を１０００ｘｇで５分間遠心分離することによりペレット化し、約９０％の冷培地を吸引により除去する。次いで、細胞をアッセイバッファー中に３．３ｘ１０３細胞／μＬの濃度に再懸濁し、この懸濁液６０μＬを３８４−ウェルプレートの各ウェルに入れる。この細胞プレートを５％ＣＯ２中に３７℃で１時間インキュベートし、次いで、試験すべき化合物５μＬを添加する。次いで、この細胞プレートを、１．４μＭＰＧＤ２を含有するプレートと共にＦＬＩＰＲ中に入れる。ＦＬＩＰＲは、自動的に細胞プレートにＰＧＤ２（最終濃度は１００ｎＭである）５μＬを添加し、２分間にわたって直後のＣａ２＋流出を測定する。このＣａ２＋流出の生産を阻害することができる化合物はアンタゴニストである。
【０１４４】
【実施例６】
ＰＧＤ環に基づいて、図９及び図１０に示した化合物を、ＣＲＴＨ２受容体に対する選択性（ＤＰと比較して）について試験した。
アッセイにおいて、各Ｄ環化合物の３Ｈ−ＰＧＤ２の結合と競合する能力を、ＣＲＴＨ２及びＤＰ受容体の両方で測定し、ＩＣ５０値（μＭ）を測定した。対照として、３Ｈ−ＰＧＤ２と競合するコールドＰＧＤ２を用いて、ＣＲＴＨ２で０．０１０７のＩＣ５０値を測定し（８回の実験値）、そしてＤＰ受容体で０．０２３４の値を測定した（７回の実験値）。実施例１の結合アッセイ手順を用いた。好ましくは、ＤＰでのＩＣ５０に対するＣＲＴＨ２でのＩＣ５０の比は、約２０より小さく、さらに好ましくは約２００より小さい。
【０１４５】
化合物１３，１４−ジヒドロ−１５−ケトＰＧＤ２；１５（Ｒ）１５−メチルＰＧＤ２；及び１５−デオキシ−デルタ１２，１４，ＰＧＤ２は、とりわけＣＲＴＨ２に対して選択的であった。図９及び図１０に示した化合物は、別のアッセイにおいてＰＧＤ２アゴニストであることが決定された。
【０１４６】
【実施例７】
ＰＧＦ環に基づいて、図１１に示した化合物を同様に試験し、ＣＲＴＨ２受容体に選択的（ＤＰと比較して）であることが示された。図１１に示した化合物は、別のアッセイにおいてＰＧＤ２アゴニストであることが決定された。
【０１４７】
【実施例８】
ＰＧＪ環に基づいて、図１２に示した化合物を同様に、ＣＲＴＨ２受容体に対する選択性（ＤＰと比較して）について試験した。図１２に示した化合物は、別のアッセイにおいてＰＧＤ２アゴニストであることが決定された。
【０１４８】
【実施例９】
図１３〜図１６に示した、４種の化合物（ａ）〜（ｄ）は同様に、ＣＲＴＨ２受容体に対する選択性（ＤＰと比較して）について試験した。これらの化合物は、別のアッセイ（実施例５参照）においてＰＧＤ２アンタゴニストであることが決定された。
【０１４９】
本実施例の化合物の合成に関して、最初の化合物である図１３の化合物（ａ）は、化学文献（Ｓｉｎｄｅｌａｒ，Ｋ．ら；Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４０、３５３０−３５４４頁、１９７５年）に報告されており、その合成は容易である。
図１４のステロイド化合物のメチルエステル（ｂ）は、調製されている（Ｉ．Ｇ．Ｒｅｓｈｅｔｏｖａら、Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＳＲ　Ｄｉｖ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（英訳）、３９；３．２；６０７−６０９頁、１９９０年；及びＩｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ　ＳＳＳＲ　Ｓｅｒ．Ｋｈｉｍ．；ＲＵ；３；６８７−６９０頁、１９９０年を参照されたい）。
図１５の化合物（ｃ）は、Ｃ．Ｍｅｎｃｉｕら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；４２（４）、６３８−６４８頁、１９９９年に記載と類似の経路を介して合成することができる。
図１６の化合物（ｄ）は、Ｂ．Ｌ．Ｍｙｌａｒｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．；３４；１０８−１２２頁、１９９１年に記載のように合成する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＲＴＨ２でトランスフェクトした細胞への［３Ｈ］−ＰＧＤ２結合のスキャッチャードプロット分析の結果を示すグラフである。
【図２】ヒト好酸球の［３Ｈ］−ＰＧＤ２結合部位におけるプロスタグランジン及びアナログの効果を示す表である。
【図３】ＰＧＤ２誘導体の構造を示す説明図である。
【図４】ヒトＴリンパ球におけるＰＧＤ２、ｍＭＤＣ、及びｍＳＤＦの走化性応答の結果を示すグラフである。
【図５】ヒトＴリンパ球におけるＰＧＤ２、ｍＭＤＣ、及びｍＳＤＦの走化性応答の結果を示すグラフである。
【図６】ＰＧＤ２及びＣ５ａに対するヒト好塩基球の走化性応答の結果を示すグラフである。
【図７】ＰＧＤ２アンタゴニストＩＡａ−１１及びＢＷ−Ａ８６８Ｃの構造式を示す説明図である。
【図８】プロスタグランジン及びアナログの構造を示す説明図である。
【図９】ＰＧＤ環に基づくＰＧＤ２アゴニストの構造を示す説明図である。
【図１０】ＰＧＤ環に基づくＰＧＤ２アゴニストの構造を示す説明図である。
【図１１】ＰＧＦ環に基づくＰＧＤ２アゴニストの構造を示す説明図である。
【図１２】ＰＧＪ環に基づくＰＧＤ２アゴニストの構造を示す説明図である。
【図１３】ＰＧＤ２アンタゴニストの構造を示す説明図である。
【図１４】ＰＧＤ２アンタゴニストの構造を示す説明図である。
【図１５】ＰＧＤ２アンタゴニストの構造を示す説明図である。
【図１６】ＰＧＤ２アンタゴニストの構造を示す説明図である。
【図１】
2004004109.tif 000003
【図２】
2004004109.tif 000004
【図３】
2004004109.tif 000005
【図４】
2004004109.tif 000006
【図５】
2004004109.tif 000007
【図６】
2004004109.tif 000008
【図７】
2004004109.tif 000009
【図８】
2004004109.tif 000010
【図９】
2004004109.tif 000011
【図１０】
2004004109.tif 000012
【図１１】
2004004109.tif 000013
【図１２】
2004004109.tif 000014
【図１３】
2004004109.tif 000015
【図１４】
2004004109.tif 000016
【図１５】
2004004109.tif 000017
【図１６】
2004004109.tif 000018