(57)【要約】      （修正有）【課題】ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質を分解できる腸内微生物の取得、及び本菌株のプロバイオティクス食品、又は、環境修復剤としての利用。【解決手段】上記化合物又はそれらの構造類縁体を唯一の炭素源とした無機栄養塩培地に、健康なヒトの糞便等腸内試料（又は乳酸菌株バンク）を添加し、集積培養によって単離した菌株を、安全性確認後に、乳飲料、ヨーグルト等に添加するか、又は腸溶カプセル等を用いた経口剤や座薬として生体内における内分泌撹乱物質又は発ガン性物質量の低減を試みるプロバイオティクス食品、又は（下水処理等における）環境修復剤として用いる。本方法を用いてビスフェノールＡを分解できる新規アクロモバクター属細菌株（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８７３）を単離した。この腸内細菌株はプロバイオティクス及び環境浄化の双方に利用できる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質（若しくはそれらの構造類縁体）を唯一の炭素源とした無機栄養塩培地に、健康なヒトから採取した糞便等腸内試料（若しくは乳酸菌株バンク）を添加し集積培養する事によって単離した菌株（若しくはその菌株から得られた分解酵素）を、安全性確認後に、乳飲料、ヨーグルト等に添加するか、若しくは腸溶カプセル等を用いた経口剤や座薬等として腸内生態系に添加し、生体内における内分泌撹乱物質又は発ガン性物質量を低減させる事を試みるプロバイオティクス食品、医薬の製造方法。
【請求項２】
請求項１で示した方法で得られた微生物株を用いた環境修復法。
【請求項３】
請求項１で示した方法で分離された、ビスフェノールＡを分解可能で、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８７３として寄託されている新規アクロモバクター属細菌株（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株）。
【請求項４】
請求項３で示した微生物株を用いて、ダイオキシン等の（ビスフェノールＡ以外の）有害芳香族炭化水素を分解する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腸内等の生体内で、ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質を分解可能なプロバイオティクス商品、及び環境修復剤を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ピロリ菌抑制効果を有する乳酸菌株ＬＧ２１を商品化したプロビオヨーグルトＬＧ２１（明治乳業）、腸内通過物の時間を短縮し発ガン性物質のリスク低減効果を有するビフィズス菌株ＢＥ８０株を商品化したダノンビオ（カルピス味の素ダノン）、腸に定着しやすい乳酸菌株を商品化したＬＣ１（ネスレ）、ナチュレＰＲＯ  ＧＢ（雪印乳業）等の様々なプロバイオティクス商品が開発され、商品によっては年１００億円を超える売り上げに成長している。しかしながら、これらの機能性食品は、現時点では（１）胃、口腔、腸内における有害微生物抑制、（２）腸内フローラ改善、（３）腸内通過物の時間短縮、（４）抗変異原性活性、（５）免疫力向上等の機能に留まっており、腸をはじめとする生体内に存在する各種有害物質を分解する事によって疾病リスクを低減できる商品は開発されていない。本発明は、この点に着目してなされたものであり、ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質を分解できる腸内微生物をプロバイオティクス食品、若しくは環境修復剤として利用する方法、及び該目的に利用可能な腸内微生物株を提供する事を目的としている。
【０００３】
なお、従来、ビスフェノールＡやダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質を分解できる微生物株は国内外で多数分離されており、実際、特許出願例も多い（例：特開２００２−１４２７５７、特開２００２−２６２、特開２００２−２５３２０８、特開２００１−８６９８０）が、いずれも環境修復剤として用いる事のみを目的としているため、「食品としての安全性」と「腸への定着性」の両面で危険性が大きい活性汚泥や土壌、底泥等から分離培養された株に限定されている。それに対し、本発明は、環境修復剤としての利用方法も捨ててはいないが、あくまでも食品利用を第一目的としているため、分離源を健康なヒト糞便等腸内試料、若しくは既に一定の安全性が担保されている乳酸菌株バンクに特定する事によって、「食品利用に対する安全性及び腸内定着性の配慮」がなされている点を特徴としている。
【０００４】
ところで、本発明で提供した株が分解対象としているビスフェノールＡ（ＢＰＡ）は、世界中で約１７０万ｔ、国内では約３５万ｔが生産され、ポリカーボネイト樹脂として自動車部品、ＣＤ等のディスク、シート、窓ガラスに、そしてエボキシ樹脂として、コーティング、接着剤等に使用されている物質であるが、１９９５年に米国ミズーリ大学のフレデリック・フォン・サール教授がＮＯＡＥＬよりも低濃度のＢＰＡを、妊娠した雌マウスに食べさせた結果、生まれた雄仔マウスの前立腺と精子数に変化を確認したと言う、所謂「低用量効果」を報告し、商業本「奪われし未来」でも紹介されたため、日本でも１９９７年には環境庁による内分泌攪乱作用を有すると疑われる６７種の化学物質の中にリストアップされるに至った。しかしながら、これらの一連の騒ぎに対して、日米欧のＢＰＡ関連業界は、この低用量効果に関する大規模な追試を行った結果、低用量効果は認められず、今まで所謂、「低用量効果」と考えられていた現象は、「マウスの使用数が少ないための統計誤差」と「食餌等に含まれるエストロゲン類」の双方によるアーティファクトの可能性が高いと言う推論を相次いで報告した。
【０００５】
しかし、その一方で、米国国立保健科学研究所（ＮＩＥＨＳ）の国家毒性プログラム（ＮＴＰ）が米国環境保護庁（ＥＰＡ）の要請で行ったピアレビュー（精査）では、低用量作用の有無のどちらが正しいのかの結論を容易には出せないと言う現状認識を示すに留まっており、日本でも、東大医学部堤教授らが、ＢＰＡが極微量存在しただけで、卵子の成熟が阻害され受精できなくなる可能性があると言う報告を２００２年に行っている。また、岡山大学医学部工藤教授らも、同じく２００２年に子宮内膜症の患者腹水に高濃度にＢＰＡが含まれている事を報告している。また、更に、先天異常の尿道下裂の男児を持つ母親のＢＰＡ血中濃度が、一般の妊婦より約２倍高い事が、横浜市立大と神奈川県立こども医療センターが同じく２００２年に報告しており、これらの報告を併せて考えれば、現時点でもヒトの健康に対するＢＰＡの各種悪影響を無視する事はできず、そのリスクを低減する事ができるプロバイオティクス食品を開発する事は十分に価値（市場性）があるものと考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質を分解できる腸内微生物をプロバイオティクス食品、若しくは環境修復剤として利用する方法、及び該目的に利用可能な腸内微生物株を提供する事を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため、ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質（若しくはそれらの構造類縁体）を唯一の炭素源とした無機栄養塩培地に、健康なヒトから採取した糞便を添加し集積培養する事によって単離した菌株を、安全性確認後に、乳飲料、ヨーグルト等に添加するか、若しくは腸溶カプセル等を用いた経口剤や座薬として腸内生態系に添加し、生体内における内分泌撹乱物質又は発ガン性物質量を低減させる事を試みるプロバイオティクス食品、若しくは（下水処理等における）環境修復剤として用いればよい。本発明では、単に方法論を示すだけでなく、本方法を用いてビスフェノールＡを分解できる新規アクロモバクター属細菌株（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８７３）を単離した。この腸内細菌株はプロバイオティクス及び環境浄化の双方に利用することができる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を更に詳細に説明する。まず、ビスフェノールＡ、ダイオキシン等の内分泌撹乱物質又は発ガン性物質（若しくはそれらのアナログ）を唯一の炭素源とした無機栄養塩培地に、健康なヒトから採取した糞便等腸内試料（若しくは乳酸菌株バンク）を添加し集積培養する事によって、これらを資化できる微生物株を単離する。この際、留意すべき点は、単離した微生物株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の分子進化学的解析と生理試験を行う事によって、病原菌（日和見感染菌を含む）でない事をまず確認する事である。もしこの段階で病原菌である事が推定される場合は、いかに有害物質分解能が強くとも、生菌をそのまま食品として用いる事は避ける必要がある。実際、発明者らは、無塩化ダイオキシンを唯一の炭素源とした無機栄養塩培地に、健常なヒト糞便を添加して、集積培養を繰り返した結果、２株の分離に成功したが、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の分子進化学的解析と生理試験を行った結果、いずれもバイオセーフティレベル２（ＢＬ２）に属する細菌種である事が推測されたため、食品としての利用を断念した経験も有する。
【０００９】
次に、この単離した微生物株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の分子進化学的解析と生理試験において、病原性が疑われなかった場合は、マウスを用いた急性毒性試験（ＬＤ５０試験）等の動物試験に供し、動物においては安全性が確保されているか確認した上で、はじめて（食品としての）臨床試験にまわす事が肝要である。その上で十分な安全性が確認できれば、その菌株（若しくはその菌株から得られた分解酵素）を、乳飲料、ヨーグルト等に添加するか、若しくは腸溶カプセル等を用いた経口剤や座薬等に加えて腸内生態系に添加し、生体内における内分泌撹乱物質又は発ガン性物質量を低減させる事を試みるプロバイオティクス食品あるいは予防医薬として活用できる可能性が高まる。なお、その際、投与した動物、若しくはヒトの血清等に含まれる有害物質量が実際に低減できている事を統計的に確認できるなら、もちろんそれにこした事はないが、実質的な低減率が数％の範囲に留まる場合は、検体間の個体差もあるので統計的に意味のあるデータを出すのは難しい。しかし、仮にその場合でも、数％の潜在的低減効果が疾病率低減に無関係とは言い切れない限り、（医薬としての扱いは難しくとも）予防食品としての価値は残されているものと考えられる。
【００１０】
さて、本発明において
【請求項３】に示した新規アクロモバクター属細菌株（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株：ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８７３）は、以上の試験において、いずれも問題が認められず、一定の安全性が確保されたものである。本株は、健常なヒト糞便を分離源とし、第一集積培養段階ではカルバゾール（ダイオキシンのアナログ）を、第二集積培養段階ではビスフェノールＡを、それぞれ唯一の炭素源とした無機栄養塩培地を用いて、集積培養を繰り返す事によって単離されたものであり、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の分子進化学的解析と生理試験では既存病原菌との類縁性は認められなかった。また、マウスを用いた急性毒性試験でも最大摂取量で特に異常は認められなかった。よって、（今後、臨床試験に移す必要はあるが）、食品として利用する上で一定の安全性が確保されているものと考えられ、糞便提供／実験者の名前からＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株（ＦＥＲＭＰ−１８８７３）と命名した。本株は、培養にあたって培地へのビスフェノールＡの添加が必須であり、標準寒天培地だけでは生育しないという特徴的な栄養要求性を持つ。従って、例えば腸内でビスフェノールＡ等が多い状況でのみ増殖し、（有害物質除去という）役目が終わると菌の活動が自ずと抑制される効果が期待され、プロバイオティクス食品として特に有用である事が期待される。
【００１１】
なお、このＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８８７３）を単離するにあたって、第一集積培養ステップにヘテロ環式芳香族化合物であるカルバゾールを用いたが、本物質はダイオキシンの構造類縁体として知られている。興味深い事に、カルバゾール等のヘテロ環式芳香族化合物又は多環芳香族化合物を資化できる微生物はダイオキシンをも分解できる例が知られている（特開２００２−１３０２、「活性汚泥を用いたダイオキシン分解処理方法」；特開２００２−７５３、「ダイオキシン分解処理方法」）。そういった意味で本株もダイオキシン分解能を有する可能性も考えられ、実際、本株の培養液をダイオキシン汚染土壌（国内の化学工場敷地から採取）に添加し３ケ月インキュベートしたところ、ＣＡＬＵＸ法（株式会社日吉、Ｃｌａｒｋ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ＃５，８５４，０１０）にて２３％の分解（ＴＥＱ）が確認できた。従って、本株は、ヒト腸内生態系において、ビスフェノールＡだけでなくダイオキシンもある程度は分解できる事が期待できるプロバイオティクス食品として利用できる可能性があるだけでなく、ダイオキシン等汚染土壌・排水に対する環境修復剤（バイオレメディエーション剤）としても利用できる可能性も同時に考えられる。
【００１２】
なお、本発明と前記の特開２００２−１３０２、特開２００２−７５３との関係については、まず、この２つの特許の請求項が「活性汚泥」もしくは「環境」のみに限定され、食品利用を考えていないため、少なくともプロバイオティクス食品としての利用の面では、前記特許願に何ら抵触しないものと考えられる。また、環境修復剤としての利用に関しても、特開２００２−７５３において請求項が、「単離された特定微生物から前記ヘテロ環式芳香族化合物又は多環芳香族化合物を資化するための分解酵素を誘導するとともに該分解酵素をダイオキシン汚染物質に添加することを特徴とするダイオキシン分解処理方法」に限定されているのに対し、本発明では（１）特に分解酵素の誘導処置を行っていない点、（２）集積培養段階でカルバゾールのみを用いるのではなく、第二集積培養段階でビスフェノールＡも唯一の炭素源として用いている点の２点が異なるため、やはり抵触しないものと考えられる。
【００１３】
ところで、従来、ビスフェノールＡやダイオキシンを分解可能な微生物株は特開２００２−１３０２、特開２００２−７５３に限らず、国内外で多数、分離されている。しかしながら、いずれも、環境修復剤としての利用のみを目的とされたものであり、食品利用という発想自体が現時点では考えられていない。本発明の独自性、新規性はこの点にあり、食品利用を目的とするため、菌の分離源を、従来の活性汚泥、土壌、底泥等から、より安全性、及び腸内への定着性が高い事が期待される健常なヒト糞便等の腸内試料及び乳酸菌株バンクに限定している。なお、ここで言う乳酸菌株バンクとは、旧醸造試験場や食品メーカー等で微生物バンク化されている乳酸菌保存株群を指し、こういった安全性が既に確保されている食品微生物群から有害物質分解機能を有する菌株をスクリーニングする方法も有効と考えられる。
【００１４】
次に、実施例にて本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記の例のみに限定されるものではない。
【００１５】
【実施例１】
健康な成人男性（２１才）から糞便１０ｇを採取し、滅菌水９０ｍｌで懸濁後、０．４％のカルバゾール（ＤＭＳＯの最終濃度は５％）のみを炭素源として含んだ５０ｍｌ田代無機液体培地（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ３４．４ｍｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＮＨ４ＮＯ３１０ｇ、ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １００μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１１４μｇ、Ｈ３ＢＯ３  １０ｐｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １００μｇ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ  １０μｌ、０．３３Ｍリン酸緩衝液１０ｍｌ：１Ｌ）に１ｍｌ接種した。３０度で１週間、振とう培養を行った結果、液体培地の白濁が見られた。顕微鏡でこの白濁が増殖した細菌群によるものである事を確認した後、１ｍｌを無菌的にとり、今度は炭素源を０．４％ビスフェノールＡのみとした新たな田代無機液体培地（ＤＭＳＯは無添加）に接種する事を計３回、計４週間、繰り返し集積培養を行った。得られた集積培養液を、ビスフェノールＡを０．４％加え白濁させた標準寒天培地に塗布し、３０度で３日間培養した。その結果、コロニーの周辺に、はっきりとした透明なゾーン（ハロー）が確認できた。これは分離株が培地中のビスフェノールＡを分解している事を意味している。次に純粋分離作業を繰り返し単離した菌体からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の部分断片約５００ｂｐを増幅後、塩基配列をシーケングし、近隣結合法を用い分子系統解析した結果、既存ＤＮＡデータベースには登録がない新規のアクロモバクター属細菌株である事が推定できたため、糞便提供／実験者の名前からＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株と命名し、該微生物を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１４年６月６日に寄託（寄託番号ＦＥＲＭＰ−１８８７３）した。なお、本株はビスフェノールＡを含まない標準寒天培地では増殖できない「特異な栄養要求性」を有していた。
【００１６】
【実施例２】
次に、国内の某化学工場で採取したダイオキシン汚染土壌（２６００ｐｇＴＥＱ／ｇ）を篩にかけ十分混合後、５０ｇ採取し、２００ｍｌの三角フラスコに添加した。次に、ビスフェノールＡを０．４％含む標準液体培地１００ｍｌにＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｓｈｉｂａｔａ−９株を接種し２日間、３０度で振とう培養し得た培養液をそのまま前記ダイオキシン汚染土壌に添加攪拌後、そのまま３ケ月、３０度で静置培養した。３ケ月後にドライングオーブン（４０℃）で２日間乾燥させ、乳鉢で十分、粉砕混和させた上で、ダイオキシン量をＣＡＬＵＸ法（株式会社日吉、Ｃｌａｒｋ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｕ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ＃５，８５４，０１０）で測定した。その結果、菌無添加区は、ＰＣＤＤｓ／ＰＣＤＦｓが２６００ｐｇＴＥＱ／ｇ、ｃｏ−ＰＣＢｓが３．０ｐｇＴＥＱ／ｇだったのに対して、菌添加区は、ＰＣＤＤｓ／ＰＣＤＦｓが２０００ｐｇＴＥＱ／ｇ、ｃｏ−ＰＣＢｓが３．２ｐｇＴＥＱ／ｇまで分解できている事が確認できた。これは高濃度ダイオキシン汚染土壌を３ケ月で２３％分解できている事を示唆しており、本株を食品だけでなく、バイオレメディエーション（バイオオーギュメンテーション）にも用いる事ができる可能性が考えられる。
【００１７】
【発明の効果】
実施例で示したように、発明者らは本方法を用いて既に、健康な成人男性糞便から、ビスフェノールＡを分解可能な細菌株の分離に成功した。本菌株、あるいは本菌株を分離した方法論を用いて分離できるビスフェノールＡ分解菌群を、プロバイオティクス製品、健康補助食品、もしくは医薬として用いれば、ビスフェノールＡの影響が疑われている子宮内膜症、先天異常（男児尿道下裂）、不妊症、行動異常（子育て、攻撃性）のリスクを減少させる事ができる可能性がある。また、下水処理、廃水処理等で用いれば生態系攪乱リスク等を減少させる事ができる可能性もある。以上、まとめると、本発明は、予防医学、機能性食品、環境保全の３つの側面から社会貢献できる可能性があるものと結論付けられる。