(57)【要約】【課題】変形性関節症を簡便かつ特異的に検定するための方法、及び、それを実施するための検定キットを提供する。【解決手段】検体ドナーから採取した血液検体中における抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度を測定する変形性関節症の検定方法、及び、上記検定方法を行うための変形性関節症検定キット。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体ドナーから採取した血液検体中における抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度を測定することを特徴とする変形性関節症の検定方法。
【請求項２】
ＥＬＩＳＡ法を用いて、検体ドナーから採取した血液検体中における抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度を測定することを特徴とする変形性関節症の検定方法。
【請求項３】
検体ドナーがヒトであることを特徴とする請求項１又は２記載の変形性関節症の検定方法。
【請求項４】
抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体は抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載の変形性関節炎の検定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の変形性関節症の検定方法を行うための変形性関節症検定キット。
【請求項６】
検体ドナーから採取した血液検体をｆｉｂｕｌｉｎと反応させることを特徴とする抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定方法。
【請求項７】
ｆｉｂｕｌｉｎを固相に結合させる工程を含む請求項６記載の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定方法。
【請求項８】
ｆｉｂｕｌｉｎが組み換えｆｉｂｕｌｉｎである請求項６又は７記載の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡便かつ特異性に優れた変形性関節症の検定方法、及び、この方法を行うための検定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、症状として関節炎が観察される疾患には、変形性関節症（以下、ＯＡともいう）、関節リウマチ（以下、ＲＡともいう）、全身性エリテマトーデス等があるが、これらのうち、変形性関節症は、主として加齢とともに発生する変形関節疾患であって、関節軟骨の変性、骨辺縁の肥厚及び滑膜の変化を特徴とする。変形性関節症は、一般に加齢や荷重、又は、遺伝的素因による軟骨の変性としてとらえられている。しかし、組織学的には滑膜炎を有し、滑膜表層細胞の増生が観察される等、炎症、即ち、免疫反応も関与している可能性も示唆されている。しかしながら、血液を用いた有用な免疫学的検査はこれまで存在しなかった。
そのため、変形性関節症をより簡便にかつ特異的に測定することのできる検定方法が望まれていた。
【０００３】
ｆｉｂｕｌｉｎは、インテグリンのβ１の細胞質ドメインの合成ペプチドに結合するタンパク質であり（非特許文献１）、細胞外マトリックスと血漿中に存在するタンパク質である（非特許文献２）。ｆｉｂｕｌｉｎには６つの種類が存在することが知られており、それぞれｆｉｂｕｌｉｎ１〜６と呼ばれている。
【０００４】
特許文献１には、ｆｉｂｕｌｉｎ４（ヒトＳ１−５  ＥＣＭＰ様タンパク質）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが開示されている。非特許文献３には、ｆｉｂｕｌｉｎ４が癌組織や免疫関連組織で発現すること、及び、ｆｉｂｕｌｉｎ４のアンタゴニストが、エイズ、ＯＡ、ＲＡ等の免疫疾患の治療薬になる可能性があることが開示されている。非特許文献４には、大腸癌患者ではｆｉｂｕｌｉｎ１の発現が増加していることが開示されている。しかしながら上記のいずれの文献においても、ＯＡ患者血液中における抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の増加についてはまったく記載されていない。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許６，００４，７５３
【非特許文献１】
Ｃｅｌｌ、１９８９年、５８巻、６２３〜６２９頁
【非特許文献２】
Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９０年、１１１巻、３１５５〜３１６４頁
【非特許文献３】
ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００１年、４８９巻、５９〜６６頁
【非特許文献４】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９９年、２７４巻、２９号、２０４４４〜２０４４９頁
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述の現状に鑑みて、変形性関節症を簡便かつ特異的に検定するための方法、及び、それを実施するための検定キットを提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、自己抗原としてｆｉｂｕｌｉｎに着目し、これと変形性関節症との関連性を鋭意研究した結果、驚くべきことに、血液中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度と変形性関節症とのあいだに相関性があることを見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、検体ドナーから採取した血液検体中における抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度を測定することからなる変形性関節症の検定方法である。
また本発明は、上記検定方法を行うための変形性関節症検定キットでもある。
更に本発明は、検体ドナーから採取した血液検体をｆｉｂｕｌｉｎと反応させることからなる抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定方法でもある。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】
本発明においては、血液検体中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度を測定することによって、変形性関節症を検定することができる。すなわち、血液を注射器等によって採取し、この血液検体を用いて抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度を測定することによって変形性関節症を検定する。
【０００９】
本発明における抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体は、抗ｆｉｂｕｌｉｎ１自己抗体、抗ｆｉｂｕｌｉｎ２自己抗体、抗ｆｉｂｕｌｉｎ３自己抗体、抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体、抗ｆｉｂｕｌｉｎ５自己抗体、抗ｆｉｂｕｌｉｎ６自己抗体のいずれであってもよい。本発明を実施するにあたっては、これらのうち１種類のみの濃度を測定してもよいし、２種類以上の濃度を測定してもよい。
【００１０】
上記血液検体としては、血液から遠心分離操作等を行い分離した血清を用いてもよい。血清を用いることにより非特異的な反応を抑制し、より精度良く検定を行うことができる。
【００１１】
本発明の検定方法においては、検体ドナーから採取した血液検体中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定した後、これを、健常な血液中の標準的な抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度、又は、変形性関節症を患っている患者の血液中の特異的な抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度と比較することにより、上記血液検体を提供した検体ドナーが変形性関節症を患っている可能性が高いか否かを検定することができる。
抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度によって変形性関節症を検定するにあたっては、抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体の濃度が高いほど変形性関節症の可能性が高い。
【００１２】
抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定するための手段としては特に限定されないが、抗原抗体反応を利用して抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体を検出する方法を挙げることができる。この場合、血液中に存在する抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体と特異的に結合するｆｉｂｕｌｉｎを使用することができる。すなわち抗ｆｉｂｕｌｉｎ１自己抗体濃度を測定する場合にはｆｉｂｕｌｉｎ１を使用すればよい。抗ｆｉｂｕｌｉｎ２自己抗体濃度を測定する場合にはｆｉｂｕｌｉｎ２を使用すればよい。抗ｆｉｂｕｌｉｎ３自己抗体濃度を測定する場合にはｆｉｂｕｌｉｎ３を使用すればよい。抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体濃度を測定する場合にはｆｉｂｕｌｉｎ４を使用すればよい。抗ｆｉｂｕｌｉｎ５自己抗体濃度を測定する場合にはｆｉｂｕｌｉｎ５を使用すればよい。抗ｆｉｂｕｌｉｎ６自己抗体濃度を測定する場合にはｆｉｂｕｌｉｎ６を使用すればよい。
【００１３】
上記ｆｉｂｕｌｉｎとしては、組み換えｆｉｂｕｌｉｎを使用してもよい。上記組み換えｆｉｂｕｌｉｎとしては、例えば、固相との結合能を有するものが好適に使用でき、このようなものとしては、固相との結合能を有する蛋白質とｆｉｂｕｌｉｎとの融合蛋白質等を挙げることができる。
【００１４】
本発明において抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定する手段としては、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
ＥＬＩＳＡ法を用いて抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定する場合には、公知のＥＬＩＳＡ法を用いることができる。ＥＬＩＳＡ法では、ポリスチレン等の固相にｆｉｂｕｌｉｎを結合させ、そこに血液検体を添加し、酵素標識抗体を反応させて可視化することにより、検体中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定することができる。
【００１５】
本発明の変形性関節症の検定方法の適用範囲としては特に限定されず、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス等の哺乳動物を挙げることができるが、特にヒトに対して好ましく適用される。
【００１６】
本発明は、上記検定方法を実施するための検定キットでもある。
本発明の検定キットの態様は、本発明の検定方法を簡便に実施するための検定キットであれば特に限定されない。具体的には、血液中に含まれる抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体と特異的に結合するｆｉｂｕｌｉｎを含有し、抗原抗体反応を利用して血液中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定できる検定キットが好ましい。上記検定キットとしては、血液中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度を測定することを可能にするｆｉｂｕｌｉｎや器材等を少なくとも１種含んでいればよく、例えば、抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定にあたってＥＬＩＳＡ法を利用する場合には、ｆｉｂｕｌｉｎを固定化した担体等が挙げられる。
【００１７】
また、本発明は、検体ドナーから採取した血液検体をｆｉｂｕｌｉｎと反応させることからなる、抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定方法でもある。上記反応にあたっては、上述のように、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
【００１８】
抗ｆｉｂｕｌｉｎ自己抗体濃度の測定にあたっては、ｆｉｂｕｌｉｎを固相に結合させる工程を含むことが好ましい。ｆｉｂｕｌｉｎを固相に結合させるには、上記固相との結合能を有する蛋白質とｆｉｂｕｌｉｎとの融合蛋白質を使用することが好ましい。
【００１９】
【実施例】
以下に試験例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら試験例のみに限定されるものではない。
【００２０】
（試験例１）血液中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体濃度の測定
（１）ｆｉｂｕｌｉｎ４融合蛋白質の作成
ｆｉｂｕｌｉｎ４の遺伝子を、軟骨細胞由来のｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。ｆｉｂｕｌｉｎ４の遺伝子増幅に使用したプライマーの配列は配列番号４に示すとおりである。増幅した遺伝子は大腸菌用の蛋白質発現ベクターｐＭＡＬ−ｃ（ＮＥＢ社製）にヒスチジンタグをコードする遺伝子と共に挿入し、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）との融合蛋白質（ＭＢＰ−ｆｉｂｕｌｉｎ４融合蛋白質）としてＤＨ５α大腸菌で発現させた。精製はＮｉ−ＮＴＡをキレートしたカラム（Ｈｉ−Ｔｒａｐキレーティングカラム、アマシャム社製）を用い、ヒスチジンタグとの親和性を利用して行った。これによって融合蛋白質が３種類得られた。各融合蛋白質を、それぞれｆｉｂｕｌｉｎ４ａ、ｆｉｂｕｌｉｎ４ｂ及びｆｉｂｕｌｉｎ４ｃとする。
【００２１】
（２）ＥＬＩＳＡ法による抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体の検出
９６穴プレートを、上記で精製したＭＢＰ−ｆｉｂｕｌｉｎ４融合蛋白質（ｆｉｂｕｌｉｎ４ａ、ｆｉｂｕｌｉｎ４ｂ若しくはｆｉｂｕｌｉｎ４ｃ）、又は、コントロールとして同様に精製したＭＢＰ単独蛋白質１０μｇ／ウェルでコートし、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングした後、５００倍に希釈した血清サンプルを反応させた。洗浄後、ｆｉｂｕｌｉｎ４に反応した抗体を抗ペルオキシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（ザイメット社製）と反応させた後、ｏ−フェニレンジアミンを基質として加え発色させた。ＭＢＰ−ｆｉｂｕｌｉｎ４融合蛋白質に対するＯＤ値からＭＢＰ単独蛋白質に対するＯＤ値を差し引いたものをｆｉｂｕｌｉｎ４に対するＯＤ値とし、以下の式に従い、ユニット表示し、健常人の平均ＯＤ値に標準偏差の３倍を加えたＯＤ値（１００ユニット）以上を陽性とした。
結合ユニット＝［検体のＯＤ値／（健常人の平均ＯＤ値＋健常人のＯＤ値の標準偏差の３倍）］×１００
【００２２】
上記のＥＬＩＳＡ法による検定は、ＯＡ９２検体、ＨＣ（健常コントロール）５４検体に対して行った。結果を図１に示した。
この検定結果から、陽性となった者は、変形性関節症を患う患者の２４％であった。このことから、血清中の抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体濃度を測定することにより変形性関節症を検定できることが明らかとなった。
【００２３】
（試験例２）軟骨細胞のｆｉｂｕｌｉｎ１〜６含有量
以下に示す手順で、リアルタイムＰＣＲを用い、正常軟骨細胞及び変形性関節症軟骨細胞のｆｉｂｕｌｉｎ１〜６含有量を測定した。
まずｆｉｂｕｌｉｎ１の遺伝子を、軟骨細胞由来のｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅した。ｆｉｂｕｌｉｎ１の遺伝子増幅に使用したプライマーの配列は配列番号１に示すとおりである。増幅した遺伝子をベクターｐＣＲ（商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（商標）に挿入した。このプラスミドから遺伝子を当該プライマーで増幅し、各増幅サイクルごとに増幅産物量を測定して、初期量と増幅産物量との関係について標準曲線を作成した。各検体をテンプレートとして同様の増幅を行い、上記標準曲線を用いて各テンプレートのｆｉｂｕｌｉｎ１含有量を算出した。検体としては、３種類の正常軟骨細胞及び８種類の変形性関節症軟骨細胞を用いた。
【００２４】
同様に、ｆｉｂｕｌｉｎ２〜６の遺伝子についてもリアルタイムＰＣＲを行い、各軟骨細胞のｆｉｂｕｌｉｎ２〜６含有量を算出した。ｆｉｂｕｌｉｎ２〜６に関して使用したプライマーの配列は配列番号２〜６に示すとおりである。
【００２５】
得られた結果から、正常軟骨細胞の場合の平均値、及び、変形性関節症軟骨細胞の場合の平均値を求め、その結果を図２に示した。この結果から、変形性関節症軟骨細胞においてｆｉｂｕｌｉｎ１〜６それぞれの含有量が増加していることが明らかとなった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明は、上述のような構成を有するので、血液検体を用いて簡便かつ特異的に変形性関節症を検定することができる検定方法及び検定キットを提供することができる。
【００２７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１におけるＥＬＩＳＡ法による抗ｆｉｂｕｌｉｎ４自己抗体の検定結果を示す図である。
【図２】試験例２で得られた軟骨細胞のｆｉｂｕｌｉｎ１〜６含有量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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