(57)【要約】【課題】本発明は、５’末端を含む領域の塩基配列が未知なポリヌクレオチドの合成方法の提供を課題とする。【解決手段】１種類のプライマーを用いて目的とするポリヌクレオチドの５’末端と３’末端に互いに相補的な塩基配列を付加し、標的とするポリヌクレオチドを合成する。必要な塩基配列は、プライマーと２本鎖ＤＮＡと鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼとのインキュベートにより、容易に付加することができる。本発明を５’ＲＡＣＥに応用し、既知の方法では取得できなかった発現レベルの低い遺伝子も効率的に取得することができた。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成方法。
ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程
ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程、および
ｃ）工程ｂ）で得られた相補鎖を鋳型とし、工程ａ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成する工程、
【請求項２】
工程ｂ）が、次の要素を相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートする工程からなる請求項１に記載の方法。
（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（２）工程ａ）で合成したポリヌクレオチド、および
（３）ヌクレオチド基質
【請求項３】
５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡの第２鎖である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｃＤＮＡが５’末端に前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を含むポリヌクレオチドを付加したｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを、次の要素を相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートすることによって合成する工程を含む請求項３に記載の方法。
（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖
（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、および
（ｉｖ）ヌクレオチド基質
【請求項６】
（ｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、逆転写酵素活性を有する酵素を用いる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インキュベートに先だって、ｃＤＮＡの第１鎖の３’にパリンドローム構造を有するオリゴヌクレオチドを付加する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡの第１鎖である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであり、このｃＤＮＡが５’に任意の塩基配列を付加したオリゴｄＴプライマーによって合成されたｃＤＮＡである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項３または請求項９に記載の方法に基づいて合成された５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドをクローン化する工程を含む、末端塩基配列が未知のポリヌクレオチドの単離方法。
【請求項１２】
ｃＤＮＡの第１鎖、および／または第２鎖の３’末端にパリンドローム構造を有するｃＤＮＡからなるｃＤＮＡライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリヌクレオチドの増幅方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリヌクレオチドの単離において、ポリヌクレオチドの増幅方法は重要なステップの一つである。ポリヌクレオチドの増幅方法として最も一般的な手法は、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲ法によるＤＮＡの合成反応は、プライマーから３’方向への相補鎖合成反応の繰り返しで構成されている。ＰＣＲ法においては、新たに合成されたＤＮＡが、変性の後に鋳型として利用されるため、反応生成物は指数的に増加する。ＰＣＲ法に用いられるプライマーは、目的とする塩基配列の５’側の領域に相補的な塩基配列を有する。したがって、少なくともプライマーがアニールする部分の塩基配列は、予めわかっていなければならない。言いかえれば、塩基配列が不明なＤＮＡをＰＣＲ法によって選択的に増幅することはできない。
【０００３】
しかし、塩基配列が不明なＤＮＡについても、選択的な増幅は必要である。たとえば、部分的な塩基配列に基づく遺伝子の全長の取得が、しばしば試みられる。具体的には、ｍＲＮＡの５’側の領域は、ｃＤＮＡとして合成されにくい。そのため、しばしば５’側の塩基配列が不完全なｃＤＮＡがクローニングされる。５’側の塩基配列を欠失した不完全なｃＤＮＡの全長塩基配列を明らかにするためには、未知の塩基配列からなる５’側の塩基配列を含むＤＮＡを選択的に増幅する必要がある。
【０００４】
また、特定の機能を有する遺伝子の取得方法であるディファレンシャルディスプレー法においては、結果として遺伝子の断片塩基配列が得られる。得られた塩基配列が既知の遺伝子に一致しない場合には、その遺伝子の全長塩基配列を明らかにしなければならない。このとき、断片塩基配列に基づく遺伝子の全長の取得が試みられる。
【０００５】
遺伝子を構成する塩基配列の一部のみが明らかな場合に、この部分的な塩基配列に基づいて、遺伝子の全長を取得する方法が知られている。その代表的な方法がＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）法である。ＲＡＣＥ法は、末端の塩基配列が未知の遺伝子を鋳型として、ＰＣＲを利用して未知の塩基配列を含む領域を増幅する方法である。ＰＣＲのためのプライマーは、塩基配列が明らかな部分を利用してデザインされる。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定すれば、未知の塩基配列は明らかになる。ＲＡＣＥ法には、プライマーがアニールするための領域を付加する方法などが異なるいくつかのバリエーションが知られている。
【０００６】
たとえば、ＳＭＡＲＴ（Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　Ａｔ　５’　ｅｎｄ　ｏｆ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）法としてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社が商業的に供給しているＲＡＣＥ法のためのキットは、次のような原理に基づいて、塩基配列が未知の領域を含むｃＤＮＡの合成を実現している（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７／６，１５５８−１５６０，　１９９９）。ＳＭＡＲＴ法は、ｃＤＮＡの第１鎖（ｆｉｒｓｔ　ｓｔｒａｎｄ）の合成に用いる逆転写酵素の特殊な酵素活性を利用している。ＳＭＡＲＴ法では、ＭＭＬＶＲＴ（Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と呼ばれる逆転写酵素の変異体が用いられる。
【０００７】
この逆転写酵素は、相補鎖合成が鋳型となるＲＮＡの５’末端に達した後に、合成したｃＤＮＡの３’末端に同じ塩基を連続して付加する。付加される塩基は、多くの場合ｃである。したがってｃの連鎖（ｃ　ｓｔｒｅｔｃｈ）に相補的な塩基配列であるｇが連続した塩基配列を３’末端に有するオリゴヌクレオチドは、ＭＭＬＶＲＴが合成したｃＤＮＡの３’末端にアニールするプライマーとなる。
【０００８】
ＳＭＡＲＴ法は、ｃＤＮＡ第２鎖（ｓｅｃｏｎｄ　ｓｔｒａｎｄ）合成用のプライマーとして、３’末端にｇの連鎖を備え、５’末端側にはＳＭＡＲＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる特殊な塩基配列を付加したオリゴヌクレオチド「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」を使用する。「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の３’末端に配置されたｇの連鎖がｃＤＮＡのｃの連鎖にアニールすると、逆転写酵素は「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の５’側のＳＭＡＲＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ部分についても相補鎖を合成する。こうして、ｃＤＮＡの末端には、「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の塩基配列が完全な２本鎖として付加される。
【０００９】
一方、「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」そのものは、ｃＤＮＡ第１鎖を鋳型とする相補鎖合成のプライマーとして機能する結果、ｃＤＮＡの第２鎖も合成されて、２本鎖のｃＤＮＡを得ることができる。このｃＤＮＡは、「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」の５’側に配置されたＳＭＡＲＴ　ｓｅｑｕｅｎｃｅと、ｃＤＮＡの合成に用いた遺伝子特異プライマーを利用したＰＣＲによって増幅することができる。「ＳＭＡＲＴ　ｏｌｉｇｏ」として、２つのプライマーを設定できる長さを有するオリゴヌクレオチドを用いた場合には、ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを応用することも可能である。
【００１０】
ＲＡＣＥ法には、ＳＭＡＲＴ法以外にもいくつかのバリエーションが存在する。たとえばＣｌｏｎｔｅｃｈ社が商業的に供給しているＲＡＣＥ法用キットであるＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴ法とは異なる原理によって末端への既知塩基配列の付加を実現している。Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」と呼ばれる２本鎖オリゴヌクレオチドを利用する。「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」は、３’末端をブロックされたプライマーとならない短いオリゴヌクレオチドと、このオリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を３’末端に有する長いオリゴヌクレオチドで構成されている。
【００１１】
「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」における短いオリゴヌクレオチドの５’側は平滑末端である。「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」の平滑末端をｃＤＮＡの末端にライゲーションすることによって、未知の塩基配列に塩基配列がわかっているＤＮＡが付加される。ライゲーション産物を鋳型として、次のようなプライマーセットを用いてＰＣＲを行えば、未知の塩基配列を含むＤＮＡを増幅することができる。
−塩基配列が既知の領域にアニールする遺伝子特異プライマー
−「Ｍａｒａｔｈｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ」を構成する長いオリゴヌクレオチドの５’側塩基配列（短いオリゴヌクレオチドには重ならない領域）に相補的な塩基配列を有するプライマー
【００１２】
ＳＭＡＲＴ法やＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡの原理においては、ｃＤＮＡの両端に同じ塩基配列が付加されてしまう場合がある。これらの方法においては、抑制ＰＣＲ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＰＣＲ；　Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ　Ｌ，　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ　１９９６　Ｊｕｎ，　１１；９３（１２）：６０２５−３０）を利用することによって、両端に同じ塩基配列が付加されたｃＤＮＡの合成を抑制している。
【００１３】
抑制ＰＣＲとは、両端に同じ塩基配列を付加されたｃＤＮＡが、ＰＣＲ法においては合成されにくくなる現象を利用している。同じ塩基配列を付加されたｃＤＮＡは、各鎖の５’末端と３’末端が互いに相補的な塩基配列で構成されている（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）。その結果、１本鎖に変性されて鋳型となるステップにおいて、両端の相補的な塩基配列が互いにハイブリダイズして、フライパン状の構造を取る。同一鎖内のハイブリダイズは、プライマーとのハイブリダイズよりも優先的に起きるため、けっきょく、このような構造を有する鋳型は、ＰＣＲのための鋳型とはなり得ないことになる。これが、抑制ＰＣＲの原理である。
【００１４】
その他にも、ＲＡＣＥ法のバリエーションは知られている。たとえば、末端部分に未知の塩基配列を有するＤＮＡであっても、両端を連結して環化すれば、塩基配列がわかっている部分を利用してＰＣＲのためのプライマーをデザインすることができる。この方法は、ｍＲＮＡの５’末端に対する特異性が無い。そのため、特に５’側が未知の遺伝子の全長を取得しようとする場合には、不向きである。
ｃＤＮＡの第１鎖の３’末端に、塩基配列がわかっているオリゴヌクレオチドを連結する方法も公知である。この方法は、第１鎖を合成後に精製する工程を要する。
したがって、ＳＭＡＲＴ法やＭａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡの５’末端に対する特異性が期待できる有利な方法であると言うことができる。特にＳＭＡＲＴ法は、利用する酵素が少ない上、反応工程も他の方法に比べるとシンプルである。
【００１５】
しかし、ｍＲＮＡの５’末端に対する特性が期待できるとはいえ、転写量が低い遺伝子については、依然として、その全長を取得することは困難であることは事実である。したがって、わずかなｍＲＮＡをもとに、その全長を取得することができる新たなＲＡＣＥ法が提供されれば有用である。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成するための新たな原理の提供を課題とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
ＲＡＣＥ法においては、最終的にはＰＣＲのようなプライマー依存性の相補鎖合成反応を利用して、目的とする遺伝子が合成される。一般に、プライマー依存性の相補鎖合成反応は、合成すべきポリヌクレオチドの塩基配列に基づいてプライマーの塩基配列をデザインしなければならない。一方で、ＲＡＣＥ法の目的は、塩基配列が未知の領域を合成することにある。したがって、プライマーがアニールすべき塩基配列としてどのような塩基配列を選択し、またその塩基配列をどのようにして導入するのかが、ＲＡＣＥ法のパフォーマンスを決定する大きな要因となる。しかし既知のＲＡＣＥ法においては、どのような塩基配列を導入すれば、望ましい結果を得ることができるのかは、十分に検討されていない。また塩基配列の導入方法についても、なお改善の余地があると言える。
【００１８】
これに対して本発明者らは、５’側に未知の塩基配列を含む鋳型ポリヌクレオチドの相補鎖合成において、合成された相補鎖における３’末端に特定の塩基配列を付加することによって、ＲＡＣＥ法のパフォーマンスの向上が期待できることを見出した。更に、この目的のために好適な反応条件を明らかにして本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成方法。
ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程
ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程、および
ｃ）工程ｂ）で得られた相補鎖を鋳型とし、工程ａ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成する工程、
〔２〕工程ｂ）が、次の要素を相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートする工程からなる〔１〕に記載の方法。
（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（２）工程ａ）で合成したポリヌクレオチド、および
（３）ヌクレオチド基質
〔３〕５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡの第２鎖である〔１〕に記載の方法。
〔４〕ｃＤＮＡが５’末端に前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を含むポリヌクレオチドを付加したｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡである〔３〕に記載の方法。
〔５〕５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを、次の要素を相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートすることによって合成する工程を含む〔３〕に記載の方法。
（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖
（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、および
（ｉｖ）ヌクレオチド基質
〔６〕（ｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いる〔５〕に記載の方法。
〔７〕（ｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、逆転写酵素活性を有する酵素を用いる〔５〕に記載の方法。
〔８〕インキュベートに先だって、ｃＤＮＡの第１鎖の３’にパリンドローム構造を有するオリゴヌクレオチドを付加する工程を含む、〔５〕に記載の方法。
〔９〕５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡの第１鎖である〔１〕に記載の方法。
〔１０〕ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであり、このｃＤＮＡが５’に任意の塩基配列を付加したオリゴｄＴプライマーによって合成されたｃＤＮＡである〔９〕に記載の方法。
〔１１〕〔３〕または〔９〕に記載の方法に基づいて合成された５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドをクローン化する工程を含む、末端塩基配列が未知のポリヌクレオチドの単離方法。
〔１２〕ｃＤＮＡの第１鎖、および／または第２鎖の３’末端にパリンドローム構造を有するｃＤＮＡからなるｃＤＮＡライブラリー。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の工程を含む、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成方法を提供する。
ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程
ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程、および
ｃ）工程ｂ）で得られた相補鎖を鋳型とし、工程ａ）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドを合成する工程、
【００２０】
本発明において、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドとは、相補鎖合成の鋳型とすることが可能なあらゆるポリヌクレオチドが含まれる。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはそれらのハイブリッドポリヌクレオチド、そして各種のヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオチドを示すことができる。ポリヌクレオチドは、天然由来のみならず、人工的に製造されたポリヌクレオチドであってもよい。あるいは、天然由来のポリヌクレオチドに人為的な変異を導入したポリヌクレオチドを利用することもできる。
本発明において、特に重要なポリヌクレオチドはｍＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡである。ここでいうｃＤＮＡは、第１鎖並びに第２鎖のいずれをも含む。ｍＲＮＡ、ならびにｍＲＮＡを鋳型として合成されるｃＤＮＡの５’末端を含む領域は、しばしば塩基配列の決定が必要となる重要なポリヌクレオチドである。
【００２１】
本発明において、５’末端を含む領域の塩基配列が未知とは、前記工程ａ）における相補鎖合成の鋳型となるポリヌクレオチドの５’末端を含む領域の塩基配列が未知であることを言う。したがって、もしも当該ポリヌクレオチドが、他のポリヌクレオチドＸを鋳型として生成された場合には、ポリヌクレオチドＸの３’側の塩基配列が未知である。
さてポリヌクレオチドＸがｍＲＮＡの場合、通常その３’末端はポリ（Ａ）である。本発明においてｍＲＮＡの３’末端を含む領域が未知であるとは、３’末端のポリ（Ａ）ｔａｉｌを除く領域の塩基配列が未知である場合を言う。更に、ｍＲＮＡの３’末端を含む領域を鋳型として合成されたｃＤＮＡにおいては、その５’末端に配置されたｔの連鎖（ｔ　ｓｔｒｅｔｃｈ）の有無に関わらず、５’末端を含む領域のｔの連鎖を除いた塩基配列が未知である場合、当該ポリヌクレオチドの５’末端の塩基配列は未知であると言う。
ただし、工程ｂ）において、所定の塩基配列を付加すべき３’末端とは、ｔの連鎖を鋳型として生成した相補鎖の３’末端であってよい。つまり、未知かどうかの判断においてはポリ（Ａ）が考慮されない。他方、３’末端へ塩基配列を付加する場合には、もしも３’末端にａの連鎖が存在する場合には、ａの連鎖の３’末端に塩基配列を付加することができる。
【００２２】
本発明において、工程ａ）前記ポリヌクレオチドの、任意の領域にアニールするオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖を合成する工程は、プライマー依存性の相補鎖合成反応を触媒する任意の酵素によって実施することができる。このような酵素として、たとえばＴａｑ　ポリメラーゼを示すことができる。
【００２３】
一方、工程ａ）においてプライマーとするオリゴヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの任意の領域にアニールして相補鎖合成をプライムし、前記ポリヌクレオチドの５’末端に至る領域に対する相補鎖の合成を可能とするものであれば、その塩基配列や長さは制限されない。一般に、ある程度の特異性を維持して相補鎖合成反応を開始するには、少なくとも１５塩基以上、通常２０〜４０塩基、たとえば２０〜３０塩基からなるオリゴヌクレオチドがプライマーとして利用される。このようなオリゴヌクレオチドの調製方法は公知である。
【００２４】
次にオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列は、前記ポリヌクレオチドの任意の領域に相補的な塩基配列で構成される。本発明において相補的とは、ワトソン−クリックのルールにしたがってベースペア（相補鎖結合）を形成することができる塩基配列を言う。なお本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、完全に相補的でなくてもよい。すなわち、特異性を維持できるストリンジェンシーのもとで、相補鎖合成を開始することができるオリゴヌクレオチドは、その塩基配列が完全に相補的でなくても本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる。たとえばプライマーの３’末端の塩基は、鋳型に対して相補的であることが重要な条件である。しかし、プライマーの中間部分や５’末端は、必ずしも完全に相補的である必要はない。
【００２５】
本発明においては、前記ポリヌクレオチドの５’末端を含む領域は塩基配列が未知である。しかしその他の領域については塩基配列が明らかな部分もある。したがって本発明のオリゴヌクレオチドは、この、塩基配列が明らかな部分に対して相補的な塩基配列を含むようにデザインすることができる。前記ポリヌクレオチドがｃＤＮＡであれば、遺伝子を構成する塩基配列中、塩基配列が明らかな部分にアニールし、塩基配列が未知の領域に向かう相補鎖合成反応をプライムできるようにデザインする。
【００２６】
本発明は、工程ａ）に続いて工程ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程を含む。工程ｂ）は、任意の方法によって実施することができる。本発明における工程ｂ）として、たとえば次の方法を示すことができる。すなわち、次の要素を相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートすることによって、工程ｂ）を実施することができる。
（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（２）工程ａ）で合成したポリヌクレオチド、および
（３）ヌクレオチド基質
【００２７】
前記（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いれば、単一の酵素によって前記要素（１）と（２）を兼ねることができるので望ましい。このような酵素として、Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム製）ＥｘＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴＡＫＡＲＡ　Ｔａｑ（いずれも宝酒造製）、ＡｍｐｌｉＴａｑ（アプライドバイオシステムズ製）、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ（いずれもプロメガ製）などを示すことができる。
【００２８】
あるいは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメラーゼを用いる場合は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する他の酵素を付加的に加えることができる。たとえばλｅｘｏ（λｐｈａｇｅ）は２本鎖特異的５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持っている。上記工程には、鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素が基質として用いることができるヌクレオチド基質が添加される。具体的には、一般にＰＣＲ法や、ｃＤＮＡの合成において利用されているヌクレオチド基質を用いることができる。通常、ａｔｃあるいはｇの天然のデオキシヌクレオチドが用いられる。その他、必要に応じて蛍光分子、放射性同位元素、あるいはビオチン等によって修飾されたヌクレオチド誘導体を用いることもできる。
【００２９】
これらの要素を（３）工程ａ）で合成したポリヌクレオチドとともに、相補鎖合成反応が可能な条件下でインキュベートすることにより、工程ａ）で合成したポリヌクレオチドの３’末端に、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を付加することができる。上記要素のインキュベートによって、ＤＮＡの３’末端に目的とする塩基配列を付加する反応は、これまでに報告されていない。本発明者らは、前記のような特定の条件で、ポリヌクレオチドの末端に目的とする塩基配列を付加することができ、更に付加された塩基配列を利用して、末端の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの合成が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００３０】
要素（１）−（３）のインキュベーションによる前記ポリヌクレオチドの３’末端への塩基配列の付加は、次のようなメカニズム（図４）によって説明することができる。（３）工程ａ）で合成したポリヌクレオチドは、鋳型となったポリヌクレオチドと２本鎖を形成している。線状の２本鎖ＤＮＡは、特に低濃度においては環状となり、両末端が接近する（Ｈｅｆｆｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ．　７５：６０１２−６０１６，１９７８）。溶液中のＤＮＡは、環状の形態を取ることによって物理的に安定化すると考えられている。
【００３１】
ＤＮＡが十分に安定な温度にあれば、２本鎖は安定化される。しかし、たとえば耐熱性のＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成反応を行う条件下では、かなりの高温条件下におかれることになる。たとえばＥｘ−Ｔａｑ（宝酒造製）による相補鎖合成反応は、７０℃前後の高温が利用される。このような高温の条件下では、２本鎖ＤＮＡの末端部分は２本鎖構造を安定に維持できない。その結果、３’末端が本来ベースペアリングすべき鎖（ｓｔｒａｎｄ）以外の鎖に接近し、更にその鎖を鋳型として相補鎖合成を開始してしまう反応が起こり得る。本発明においては、この現象を、ＤＮＡポリメラーゼの鋳型の乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）と呼ぶ。
【００３２】
このとき、もっとも鎖の乗換えが起こりやすいのが、環状構造を取ることによって接近している、線状ＤＮＡの両末端である。より具体的には、３’末端が同じ鎖の５’末端に接近し、その塩基配列に相補的な塩基配列を合成してしまう。その結果、３’末端には、自身の５’末端に相補的な塩基配列が付加される。自身の５’末端とは、もともとプライマーである前記オリゴヌクレオチドの塩基配列であるから、結果として３’末端には、前記オリゴヌクレオチドの相補配列が付加される。
【００３３】
本発明において、ポリヌクレオチドの３’末端に目的とする塩基配列を付加するメカニズムは、ここで説明したメカニズムに限定されない。いずれにせよ、ここに述べた条件でインキュベートすることにより、工程ｂ）は達成される。このことは、実施例の結果からも裏付けられている。
【００３４】
本発明において、前記ポリヌクレオチドとして、ｃＤＮＡを用いる場合、ｃＤＮＡは第２鎖あるいは第１鎖のいずれをも、利用することができる。ｃＤＮＡの第１鎖は、ｍＲＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡである。また第２鎖は、ｃＤＮＡの第１鎖を鋳型として合成されたＤＮＡを言う。第２鎖をテンプレートにする場合はｍＲＮＡの５’方向へとＤＮＡ合成が進行するので５’ＲＡＣＥを実現できる。逆に第１鎖をテンプレートにする場合はｍＲＮＡの３’側へとＤＮＡ合成が進行するので、３’ＲＡＣＥを行うことができる。第２鎖をテンプレートにするためには、第２鎖に相補的な塩基配列を有するプライマーをデザインする。また第１鎖がテンプレートであれば、プライマーの塩基配列は第１鎖に相補的な塩基配列とする。ｃＤＮＡ第２鎖の５’側（すなわちｍＲＮＡの５’側）は、翻訳開始コドンを含む。したがって、第２鎖の５’側の領域は、ｃＤＮＡの塩基配列に基づいて翻訳アミノ酸配列を推定する上で重要である。そのためこの領域の塩基配列を決定することは、遺伝子の単離や機能解析において、しばしば重要な課題となる。
【００３５】
ｃＤＮＡの第２鎖を本発明における前記ポリヌクレオチドとして用いる場合、第２鎖は次の要素（ｉ）−（ｉｖ）を相補鎖合成が可能な条件でインキュベートすることによって合成することができる。
（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖
（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素
（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、および
（ｉｖ）ヌクレオチド基質
【００３６】
本発明において、（ｉ）ｃＤＮＡの第１鎖は、ｍＲＮＡの任意の領域に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、逆転写酵素活性を有する酵素により合成することができる。第１鎖を合成するためのプライマーは、前記工程ａ）で用いるオリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであるのが望ましい。一般的なｃＤＮＡの合成方法においては、第１鎖を合成した後に鋳型となったｍＲＮＡは分解される。ｍＲＮＡは、アルカリ変性やＲＮＡｓｅＨなどの酵素作用によって容易に分解できる。ｍＲＮＡが分解されると、ｃＤＮＡの第１鎖は１本鎖となる。本発明において、第１鎖の合成のための逆転写酵素として、第２鎖の合成や工程ｂ）に用いる鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素を用いることもできる。Ｔｆｌ、あるいはＴｔｈのように、逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが公知である。これらのＤＮＡポリメラーゼは、市販されている（プロメガ）。このような酵素を用いることにより、反応系を構成する酵素の数を減らすことができる。
【００３７】
ｃＤＮＡの第２鎖は、こうして合成された第１鎖を鋳型として合成されたＤＮＡである。鋳型依存性の相補鎖合成反応は、通常はプライマーの３’末端からの相補鎖合成反応が利用される。プライマーの塩基配列特異的なアニールにより、合成すべき塩基配列を特異的に合成することができる。しかしプライマーは、相補鎖合成のための必須の条件ではない。たとえば上記要素（ｉ）−（ｉｖ）を相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートするとき、ｃＤＮＡの第１鎖を鋳型とする相補鎖合成反応が達成される。ここで言う相補鎖合成が可能な条件とは、上記要素（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素がその活性を維持できる条件を言う。用いる酵素に応じた酵素活性の維持に必要な条件は、当業者が適宜設定することができる。
【００３８】
上記要素（ｉ）−（ｉｖ）のインキュベートによるｃＤＮＡ第２鎖の合成メカニズムは、例えば次のように説明することができる。まず、ｃＤＮＡの第１鎖の３’末端が、自身に接近して、自身を鋳型とする相補鎖合成反応を開始する。第１鎖の３’末端には、必ずしも自己相補的な塩基配列を有しているとは限らない。しかし、数塩基であっても自身を鋳型とする相補鎖合成反応が起きれば、３’末端は自己相補的な塩基配列を獲得する。その結果、自身へのベースペアリングがより安定化され、やがて３’末端は完全なステムループ構造を取る。ステムループ構造が実現できれば、自身を鋳型とする相補鎖合成反応が進行してｃＤＮＡの第２鎖の合成は完成する。
【００３９】
３’末端の自身への接近によって、自身を鋳型とする相補鎖合成反応を開始する現象はたとえばテトラヒメナにおいても観察されている。あるいは第１鎖の３’末端からの自身を鋳型とする相補鎖合成反応は、ｃＤＮＡの合成においても利用されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．　”Ｅｎｚｙｍｉｃ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅｓ”　Ｃｅｌｌ　７：２７９−２８８，　１９７６）。
したがって、上記要素（ｉ）−（ｉｖ）のインキュベートによって、自身を鋳型とする相補鎖合成反応開始することは可能である。実際にこの条件によってｃＤＮＡの第２鎖を合成する反応を実施例に記載した。
【００４０】
さて、このようなメカニズムに基づけば、第２鎖の完成によって、第１鎖と第２鎖が同一の鎖上に連続したｃＤＮＡが合成されることになる。このようなｃＤＮＡは、両者がアニールした２本鎖部分と、ステムループを構成するヒンジ部分とを有する。ここで上記要素（ｉｉｉ）５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ｃＤＮＡの２本鎖部分を構成している第１鎖を５’末端から消化する。ｃＤＮＡの消化は２本鎖のＤＮＡに作用するので、けっきょく第１鎖はヒンジ部分に至るその全長を消化されることになる。こうして、最終的に、１本鎖の第２鎖を生成する。生成した第２鎖は、５’末端を含む塩基配列が未知であり、かつその３’末端に第１鎖の合成に用いたプライマーに相補的な塩基配列を有するから、上記工程ａ）におけるポリヌクレオチドとして利用することができる。
【００４１】
本発明における工程ｂ）工程ａ）で合成された相補鎖の３’末端に工程ａ）のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を付加する工程として、次のような方法を示すこともできる。すなわち、５’末端に前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を含むポリヌクレオチドを付加したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ第１鎖を合成するのである。こうして合成された第１鎖３’末端には、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に相補的な塩基配列が配置される。つまりこのｃＤＮＡ第１鎖は、工程ｂ）の目的とするポリヌクレオチドに他ならない。
【００４２】
ｍＲＮＡの５’末端に任意のオリゴヌクレオチドを連結する方法は公知である。たとえば、全長ｃＤＮＡの合成方法であるオリゴキャップ法は、オリゴキャップリンカーと呼ばれるオリゴヌクレオチドを、ｍＲＮＡの５’末端に特異的に結合するための方法である（Ｍｕｒａｙａｍａ，　Ｋ．　ａｎｄ　Ｓｕｇａｎｏ，　Ｓ．　（１９９４）　Ｏｌｉｇｏ−ｃａｐｐｉｎｇ：　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄｔｏ　ｒｅｐｌａｃｅ　ｔｈｅ　ｃａｐ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ　ｍＲＮＡｓ　ｗｉｔｈ　ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．　Ｇｅｎｅ　１３８，　１７１−１７４．）。オリゴキャップ法は、真核細胞生物のｍＲＮＡの５’末端にあるキャッピング構造をターゲットにリンカーを結合する。したがって、５’末端のキャッピング構造を持たない不完全なｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの混入を防ぐことができる。
【００４３】
オリゴキャップ法を本発明に応用するには、オリゴキャップリンカーの塩基配列を、前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列とすればよい。通常、オリゴキャップ法では、全長ｃＤＮＡが特異的に増幅されるように、オリゴキャップリンカーの塩基配列は、遺伝子中に見出しにくい塩基配列の利用が有利である。遺伝子中に見出される塩基配列を用いた場合は、全長ｃＤＮＡではなく遺伝子の断片が増幅される可能性を否定できないためである。一方本発明においては、３’’末端には前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を導入するため、リンカーの塩基配列はむしろ遺伝子中に見出される塩基配列となる。本発明においては、リンカーの塩基配列が異なるほかは、オリゴキャップ法と同様の操作により、ｍＲＮＡの５’末端へオリゴヌクレオチドが付加される。
【００４４】
本発明において、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡの第１鎖を用いることもできる。ｃＤＮＡの第１鎖は通常、オリゴｄＴプライマーを用いて合成される。次に、遺伝子中の塩基配列が明らかな領域に対するオリゴヌクレオチドを用いて第１鎖を鋳型として第２鎖を合成する。その結果、第２鎖の３’末端は、ａの連続した塩基配列で構成されることになる。同じ塩基の連続は、前記要素（１）−（３）のインキュベートによる工程ｂ）には不向きである。第２鎖の５’末端を構成する前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、通常ｔの連鎖のような単調な塩基配列とはならない。そのため、先に説明した前記要素（１）−（３）のインキュベートによる工程ｂ）が起こりにくくなる。このような不都合は、第２鎖の３’末端の塩基配列に適当な塩基配列を付加することによって避けることができる。
【００４５】
たとえばオリゴｄＴプライマーの５’末端に適当な塩基配列を付加しておくことによって、第２鎖の３’末端に任意の塩基配列を与えることができる。たとえば、６〜８塩基の制限酵素の認識配列をオリゴｄＴプライマーの５’末端に付加することができる。このようなオリゴｄＴプライマーは、その３’末端への適当な塩基配列の付加を可能とするとともに、クローニング用ベクターへのｃＤＮＡのライゲーションにおいても有用である。あるいは、オリゴｄＴプライマーの５’末端に、前記オリゴヌクレオチドと実質的に同じ塩基配列を付加することによって、前記工程ｂ）を実施することもできる。
【００４６】
本発明において、上記要素（ｉ）−（ｉｖ）のインキュベートに先だって、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にパリンドローム構造を有するオリゴヌクレオチドを付加することができる。パリンドローム構造とは、末端においてヘアピンループを構成しうる自己相補配列を含む塩基配列を言う。自己相補配列を構成する塩基の数は、制限されない。より具体的には２−２０塩基、たとえば２−４塩基の自己相補配列を示すことができる。具体的には、５’−ａａｇｃｔｔ−３’は、本発明のパリンドローム構造として利用することができる。
【００４７】
このような付加的な塩基配列は、たとえば前記オリゴヌクレオチドの５’末端への自己相補配列の付加によって実現することもできる。このとき、自己相補配列の付加とプライマーの５’末端への制限酵素サイトの付加を兼ねることもできる。たとえば先に例示した塩基配列５’−ａａｇｃｔｔ−３’も、制限酵素認識配列の一つである。パリンドローム構造は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に付加することもできる。たとえば、前記ポリヌクレオチドの合成にあたり、鋳型となるポリヌクレオチドの５’末端に付加すべき塩基配列の相補配列を付加しておけばよいのである。たとえば、先に述べたオリゴキャップ法のように、ｍＲＮＡの５’末端に人為的な塩基配列を付加する反応は公知である。この反応を利用すれば、パリンドローム構造に必要な自己相補配列をｍＲＮＡの５’末端に付加することができる。そして目的とする塩基配列を導入されたｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡは、その３’末端にパリンドローム構造を有する。
【００４８】
第２鎖であれ、第１鎖であれ、いずれにせよ上記のような反応によって、塩基配列が未知である領域の３’末端に、前記オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列が付加されたポリヌクレオチドとすることができる。
このようにして得られた末端にパリンドローム構造を付加されたポリヌクレオチドの集合体は、本発明によるポリヌクレオチドの合成方法のためのｃＤＮＡライブラリーとして有用である。このｃＤＮＡライブラリーを用いることにより、単一の遺伝子特異的プライマーを使って５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥのいずれをも実施することができる。つまり、ｃＤＮＡの第２鎖にアニールするプライマーによって５’ＲＡＣＥが、第１鎖にアニールするプライマーによって３’ＲＡＣＥが可能となる。パリンドローム構造を末端に配置されたｃＤＮＡからなるｃＤＮＡライブラリーが構築されれば、同じライブラリーを用いて、本発明に基づいて、様々な遺伝子の未知塩基配列を容易に取得することができる。本発明のポリヌクレオチドの合成方法において、３’末端へのパリンドローム構造の付加は必須ではない。しかし遺伝子特異プライマーの伸長産物の、自己を鋳型とする相補鎖合成（セルフプライム）を促進するためには、パリンドローム配列の付加は有効である。
【００４９】
本発明のｃＤＮＡライブラリーを用いれば、ゲノムプロジェクトによって同定された未知の遺伝子の塩基配列をもとにしてｃＤＮＡを単離することができる。一旦ｃＤＮＡがクローニングされれば、ｃＤＮＡに基づいてタンパク質の解析も可能となる。また本発明のｃＤＮＡライブラリーは、既知の遺伝子の、発現量の少ないスプライシングバリアントの単離に利用することができる。本発明に基づいて、いろいろな組織由来のｃＤＮＡライブラリーを合成しておけば、遺伝子やスプライシングバリアントの単離において利用価値は高い。
【００５０】
末端にパリンドローム構造を付加されたポリヌクレオチドは、工程ｃ）において前記オリゴヌクレオチドをプライマーとするポリヌクレオチドの合成方法によって増幅することができる。増幅すべき塩基配列の末端領域に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、目的とする塩基配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法は公知である。
【００５１】
本発明において、工程ｃ）は、たとえばＰＣＲ法によって実施することができる。具体的には、まず工程ｂ）で得たポリヌクレオチドを変性して１本鎖とする。ＰＣＲ法においては、鋳型ポリヌクレオチドは、一般に加熱によって変性される。変性されたポリヌクレオチドは、プライマーとなるオリゴヌクレオチドとともに、このプライマーからの相補鎖合成が可能な条件下でインキュベートされる。当業者は、プライマーの塩基配列や反応液の組成に応じて、相補鎖合成が可能な条件を設定することができる。変性と相補鎖合成反応とを繰り返すことにより、ＰＣＲ法に基づいて目的とするポリヌクレオチドを連続的に生成することができる。
【００５２】
相補鎖合成を触媒するＤＮＡポリメラーゼには、ポリヌクレオチドの変性温度においても活性を失わない耐熱性の酵素を利用するのが有利である。先に用いた（１）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素、あるいは（ｉｉ）鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒する酵素として用いたＤＮＡポリメラーゼが耐熱性を有していれば、そのまま工程ｃ）に利用することもできる。
工程ｃ）において合成されたポリヌクレオチドは、エタノール沈殿などの公知の方法によって分離することができる。あるいは、電気泳動などの手法を用いて、目的とするサイズのポリヌクレオチドを分取することもできる。
【００５３】
既知のＲＡＣＥ法のうち、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡという商品名で実用化されているＲＡＣＥ法においては、抑制ＰＣＲ（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ＰＣＲ）と呼ばれる方法が応用されていることは既に述べた。一方、本発明に基づくＲＡＣＥ法においては、ｃＤＮＡの両端に相互に相補的な塩基配列が配置されることになる。つまり本発明に基づくＲＡＣＥにおいて最終的に鋳型となるｃＤＮＡは、逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）を有する。ｃＤＮＡのこのような構造は、Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡにおいては抑制ＰＣＲの原理によって合成が抑制されるべき構造であると言える。ところが実際には、本発明に基づくＲＡＣＥ法は可能であり、目的とするｃＤＮＡの合成が効率的に行われることは実施例に示したとおりである。
【００５４】
本発明において、ｃＤＮＡが逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）を有するのにもかかわらず、目的とするｃＤＮＡの合成が可能な理由として、たとえば次のようなメカニズムが考えられる。
既に述べたように、抑制ＰＣＲにおいて、逆位反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）が鋳型として利用されにくい理由は、同一鎖上の相補配列のハイブリダイズが、プライマーのアニールと競合するためである。ところが、遺伝子に由来する塩基配列が十分に長い場合には、同一鎖内のハイブリダイズが起きにくくなる場合が考えられる。その結果、プライマーのアニールを十分に阻害できない、つまり抑制ＰＣＲが作用しない状況が生じる。ＲＡＣＥにおいては、遺伝子部分の塩基配列が長いものが、取得すべきｃＤＮＡである可能性が高い。したがって、逆位反復配列を有するｃＤＮＡを鋳型とすることによって、より長い塩基配列を選択的に合成するメカニズムが実現できたことになる。
【００５５】
また、鋳型となるｃＤＮＡとプライマーの比も重要な要素である。つまり、プライマーをｃＤＮＡに対して大過剰で用いることにより、同一ＤＮＡ分子（ｉｎｔｒａ　ＤＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）上の相補鎖のハイブリダイズよりも、プライマーとのアニールの機会を大きくすることができる。具体的には、予測される鋳型の量に対してモル比で、約５倍〜２０倍、好ましくは１０倍以上のプライマーを用いるのが有利である。たとえば、長さ１ｋｂ　の２本鎖ｃＤＮＡ１μｇ（約９．１２ｘ１０１１　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に対して１０ｐｍｏｌ　（約７８ｎｇ：約５．９ｘ１０１２　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）から２０ｐｍｏｌの２４ｍｅｒプライマーを用いることができる。
【００５６】
本発明によるポリヌクレオチドの合成方法は、５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドのクローン化に有用である。すなわち本発明は、本発明の記載の方法に基づいて合成された５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドをクローン化する工程を含む、末端塩基配列が未知のポリヌクレオチドの単離方法に関する。
合成されたポリヌクレオチドをクローン化する方法は、公知である。一般的には、適当なクローニングベクターに合成されたポリヌクレオチドを組み込んで、クローン化することができる。ポリヌクレオチドの合成に用いられるプライマーにクローニング用の制限酵素認識配列を付加しておくと、合成されたポリヌクレオチドを容易にクローニングベクターへ挿入することができる。あるいは、合成されたポリヌクレオチドを平滑末端のままクローニングベクターにライゲーションすることもできる。
【００５７】
クローニングされたポリヌクレオチドは、その塩基配列を決定することができる。挿入されたポリヌクレオチドの塩基配列は、ベクターの塩基配列等に相補的な塩基配列を有するプライマーを利用して決定される。以上の工程により、たとえば第２鎖の５’末端を含む領域の塩基配列が未知である場合には５’ＲＡＣＥが、また第１鎖の５’末端を含む領域の塩基配列が未知である場合には３’ＲＡＣＥが可能となる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドの合成方法の用途は、ＲＡＣＥに限定されない。たとえば本発明の方法に基づいて、テロメラーゼ活性を測定することができる。テロメラーゼは、特定の塩基配列を有するＤＮＡを基質として、その３’末端にテロメアリピートと呼ばれる特定の塩基配列の繰り返しからなる塩基配列を付加する。テロメアリピートは、種ごとに決まった塩基配列で構成されている。たとえばヒトのテロメアリピートは（ＴＴＡＧＧＧ）　ｎである。付加されたテロメアリピートの長さに基づいてテロメラーゼの活性を評価することができる。本発明に基づいてテロメラーゼの活性を測定するには、基質ＤＮＡにテロメラーゼを作用させた後、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを作用させる。先に述べたメカニズムに基づいて、基質ＤＮＡの３’末端は自身にアニールして相補鎖が合成され、更に鋳型となった基質ＤＮＡの伸長産物自身は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって消化される。
【００５９】
ここで合成された相補鎖は基質ＤＮＡに相補的な塩基配列を有するので、基質ＤＮＡと同じ塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして相補鎖合成が可能である（工程ａ））。反応液中に残った基質ＤＮＡをそのままプライマーとして用いることもできる。相補鎖合成が５’末端に達すると２本鎖ＤＮＡの環状化と鋳型乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ａｃｔｉｏｎ）によって、３’末端に基質ＤＮＡに相補的な塩基配列が付加される（工程ｂ））。最終的に、基質ＤＮＡと同じ塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、テロメラーゼの作用によって伸長した基質ＤＮＡの３’末端側の未知塩基配列を増幅することができる。
【００６０】
なおテロメラーゼの作用によって付加される塩基配列がテロメアリピートであることは明らかである。しかしその長さや末端のテロメアリピートが繰り返し単位のどこまでを有しているかは不明である。したがって、テロメラーゼの作用によって伸長した基質ＤＮＡを鋳型として合成されたＤＮＡは、本発明における５’末端を含む領域の塩基配列が未知のポリヌクレオチドに含まれる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドの合成方法に必要な要素を組み合わせて、未知の塩基配列を含むポリヌクレオチドの合成用キットとすることができる。本発明に基づくキットは、たとえば次の要素で構成することができる。
−５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ
−前記ＤＮＡポリメラーゼの活性を維持することができる緩衝液、および
−相補鎖合成のためのヌクレオチド基質
【００６２】
本発明における各要素の具体的な構成は、既に述べたとおりである。本発明のキットには、上記要素の他に、更に付加的な要素を追加することができる。たとえば、ｃＤＮＡ第１鎖を合成するための逆転写酵素や３’ＲＡＣＥを実施するためのオリゴｄＴプライマーを組み合わせることができる。あるいは、目的とするポリヌクレオチドの塩基配列が明らかな領域に対してデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを予め添付することもできる
【００６３】
また、ｍＲＮＡの５’末端にリンカーを導入する場合には、リンカーとするオリゴヌクレオチドやＲＮＡリガーゼを組み合せることができる。更に、ｍＲＮＡの５’末端へのリンカーの結合にオリゴキャップ法を応用する場合には、オリゴキャップ法に必要な各種の酵素が組み合せられる。たとえば、アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）やタバコ酸性ピロフォスファターゼ（ＴＡＰ）を組み合せることができる。
【００６４】
本発明のキットには、実験材料や操作が適切であったかどうかを判定するためにコントロールを組み合せることができる。本発明におけるコントロールには、たとえば、どのようなｃＤＮＡライブラリーであっても、一定の大きさのｃＤＮＡの合成が期待できるプライマーを用いることができる。このようなｃＤＮＡを与えるプライマーとして、たとえばβアクチン遺伝子の合成を可能とするプライマーを示すことができる。
以下に実施例に基づいて更に具体的に本発明を説明する。
【００６５】
【実施例】
比較例．公知のＲＡＣＥ法と本発明のＲＡＣＥ法
公知のＲＡＣＥ法として、Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（クロンテク社製）を利用し、遺伝子の５’側の未知塩基配列の単離を試みた。遺伝子にはマウスＭｓｈ４を選択した。Ｍｓｈ４は、ＭｕｔＳミスマッチ修復遺伝子ファミリーの一員であり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、マウス及びヒトで同定されている（Ｒｏｓｓ−Ｍａｃｄｏｎａｌｄ　ａｎｄ　Ｒｏｅｄｅｒ，　Ｃｅｌｌ　７９：　１０６９−８０　（１９９４）；　Ｚａｌｅｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１５３：　１２７１−８３　（１９９９）；　Ｋｎｅｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１４：　１０８５−９７　（２０００）；　Ｐａｑｕｉｓ−Ｆｌｕｃｋｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４４：　１８８−９４　（１９９７））Ｍｓｈ４の塩基配列は既に公知だが、今回はそのスプライシングバリアントの取得を目的とした。マウス（８週齢）の睾丸からｍＲＮＡを抽出し、常法にしたがってｃＤＮＡを合成した。次にｃＤＮＡの両端にアダプターをライゲーションした。以上の工程は、クロンテク社のマニュアルにしたがった。得られたアダプター付加ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＭｓｈ４のスプライシングバリアントγ（Ｍｓｈ４−γ）およびβアクチンに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った。反応シーケンスと反応液の組成を次に示す。
［９４℃／３０秒→６０℃／１分→６８℃／３分］×３５サイクル
２μＬ　　　　１０ｘ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ
１μＬ　　　　２．５ｍＭ　４ｄＮＴＰｓ
１μＬ　　　　睾丸ｃＤＮＡ（アダプター付加済み）
０．２μＬ　　Ｅｘ−Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼ
０．４μＬ　　各遺伝子特異プライマー（１０μＭ）
０．４μＬ　　アダプタープライマー（１０μＭ）
１５μＬ　　蒸留水（ｔｏｔａｌ　２０μＬ）
実験に用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。＃１８と＃２０がマウスＭｓｈ４の塩基配列に基づいてデザインされた遺伝子特異プライマー（ＧＳＰ）である。
＃１８：５’−ＧＧＣＡＴＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：１）
＃２０：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号：２）
β−ａｃｔｉｎ　１：　５’−ＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：３）
β−ａｃｔｉｎ　２：　５’−ＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号：４）
反応後の反応液の一部を取り、アガロースゲルで電気泳動した。エチジウムブロマイド染色により、アガロースゲル中のＤＮＡを検出した。Ｍｓｈ４の結果を図２に、βアクチンの結果を図３に示した。
【００６６】
Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔでは、図１に示すようにアダプタープライマーがアダプターの５’オーバーハングした１本鎖部分と同じ配列を持つようにデザインされている。アダプターを構成するオリゴヌクレオチドの３’末端はＮＨ２基でブロッキングされているので、これを起点とする相補鎖合成は抑止されている。したがって、原理上は、遺伝子特異プライマー（ｇｅｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ；ＧＳＰ）からの相補鎖合成が起きない限り、アダプタープライマーからの相補鎖合成は起きない。
【００６７】
しかし実際には、非特異的な産物が合成されてスメアなバックグランドが出現した（図２、図２、レーン１）。非特異的な反応の産物と思われるこれらのスメアなバンドは、アダプタープライマーの塩基配列やその他の現象が原因によって生成されたと考えられた。クロンテク社のマニュアルには、次のような非特異反応が生じる可能性が指摘されている。たとえばｃＤＮＡに連結したアダプターのオーバーハング部分に相補鎖が合成されてしまい、遺伝子特異プライマーからの相補鎖合成無しでもｃＤＮＡが増幅される場合があることが記載されている。
【００６８】
そこで、上記のような非特異反応に起因する産物の合成を抑制するために、アダプタープライマーの量を制限してＰＣＲを試みた。すなわちｃＤＮＡとの連結に用いるアダプタープライマーの量を、１／１０〜１／１０００、およびアダプタープライマー無しの条件で、ＰＣＲを実施した。その結果、１／１０ではバックグランドが見られた（図２および図３のレーン２）。１／１００〜１／１０００に制限した場合には非特異的な産物の合成はほとんど見られなくなった（（図２および図３のレーン３−４）。更にアダプタープライマーを加えない場合にも、増幅産物が観察された（図３のレーン５）。すなわち遺伝子特異プライマーのみによるＰＣＲにおいても、増幅産物が検出された。
【００６９】
合成されたＰＣＲ産物の塩基配列を解析した結果、１つを除いていずれも目的とするＤＮＡが合成されていることが確認された。これらの結果に基づいて、アダプタープライマーを使わず、遺伝子特異プライマーのみで増幅することが可能な未知の構造を有するｃＤＮＡが合成されていることが示された。
【００７０】
たとえば図４に示すメカニズムによって、アダプタープライマーを用いないＤＮＡの合成が可能となると考えられた。
サイクル１：
通常のＰＣＲと同じように、遺伝子特異プライマー（ｇｅｎｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ）から２本鎖ＤＮＡが合成される。
サイクル２：
ある頻度で１本鎖の３’末端付近がヘアピン構造を形成し、この部分をプライマーとして自身を鋳型として２本鎖ＤＮＡが合成される。ヘアピン構造をプライマーとするＤＮＡの複製は、テトラヒメナのｒＤＮＡの合成においても観察されている現象である。合成された２本鎖ＤＮＡのほとんどは、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの２本鎖ＤＮＡ特異的な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によって１本鎖に分解される。このとき、もしも５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の作用を受けない場合には、サイクル３−ｎｏ　ｅｘｏ　ａｔｔａｃｋｅｄで示した構造のＤＮＡを生成する。ただし、このような構造を有するＤＮＡが合成される可能性は低いと考えられる。
【００７１】
サイクル３：
サイクル２で生成した１本鎖ＤＮＡを鋳型にして２本鎖ＤＮＡが合成される。ＤＮＡ合成は６８℃という高温で行われるので、先に合成された２本鎖の末端は一部が２本鎖構造を維持できなくなっている。その結果、鋳型の５’末端まで合成を終えたＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは、自身が合成した新しい相補鎖を鋳型として更に合成を続け、プライマーの塩基配列に相補的なＤＮＡをも合成する。このような反応を、鋳型乗り換え（ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ａｃｔｉｏｎ）と呼ぶことは既に述べた。プライマーの塩基配列に相補的な塩基配列は、新たに合成された相補鎖の３’末端に位置する。
サイクル４：
以降のサイクルでは、通常のＰＣＲと同様にＤＮＡが増幅される。ただし、ＤＮＡの３’末端には常にプライマーの相補配列が位置するので、ＰＣＲに必要なプライマーは１種類である。
【００７２】
実施例
図４に示したように、アダプターを用いず未知の塩基配列の増幅が可能であることを確認するために、次の実験を行った。すなわち、上記比較例と同じｃＤＮＡ、またはＥ１２．５マウス胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーを対象として、遺伝子特異プライマーのみを用いて５’ＲＡＣＥを行った。ｃＤＮＡへのアダプターのライゲーションの工程を省き、ＰＣＲにおいてアダプタープライマーを加えない他は、上記比較例と同じ条件でＤＮＡを合成した。実験に用いた遺伝子特異プライマーの塩基配列を以下に示す。
＃６　：５’−ＧＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＧＧＴ−３’（配列番号：５）
＃１８：５’−ＧＧＣＡＴＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧ−３’（配列番号：１）
＃２０：５’−ＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＴＣ−３’（配列番号：２）
＃２１：　５’−ＧＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧＡＴＴＧＣ−３’（配列番号：６）
＃２６：　５’−ＡＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＧ−３’（配列番号：７）
＃２７：　５’−ＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡ−３’（配列番号：８）
β−ａｃｔｉｎ　１：　５’−ＧＴＧＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：３）
β−ａｃｔｉｎ　２：　５’−ＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣ−３’（配列番号：４）
上記プライマーのうち、＃６、＃２０、＃２１はＭｓｈ４−γの塩基配列に基づいてデザインされたプライマーである。各プライマーがアニールする領域は、それぞれＭｓｈ４−γのｃＤＮＡの３’側から、＃６、＃２０、＃２１の順に並んでいる。一方＃２６と＃２７は、Ｍｓｈ４のスプライシングバリアントε（Ｍｓｈ４−ε）の塩基配列に基づいてデザインされたプライマーである。各プライマーがアニールする領域は、それぞれＭｓｈ４−εのｃＤＮＡの３’側から＃２６、および＃２７の順に並んでいる。したがって、これらのプライマーを組み合せることによってｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行うことができる。
【００７３】
遺伝子特異プライマーとして＃２６、＃２７、または＃１８を用いた結果の一部を図５に示す。図５は、各プライマーについて３連、または６連で反応させた結果を示している。鋳型には、マウス胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリーを用いた。１種類のプライマーによって、目的とする増幅産物が増幅されていることが確認された。
【００７４】
更に増幅されたＤＮＡの塩基配列の末端部分の塩基配列を決定し、その３’末端にプライマーに相補的な塩基配列が付加されていることを確認した。決定された末端部分の構造を図６および図７に示した。図中、四角で囲んだ塩基配列はプライマー由来の塩基配列、アンダーラインを付けた部分がプライマー以外の相補的な塩基配列を示す。アンダーラインを付けた部分の塩基配列が相補的であることは、ｔｅｍｐｌａｔｅ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇによって相補的な配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ）が合成されたことを裏付けている。
【００７５】
この実験によって、Ｍｓｈ４の各スプライシングバリアントについて、以下のようなサイズのｃＤＮＡの増幅が確認された。本発明によって、未知の塩基配列を含む領域を単一のプライマーによって十分な長さにわたって増幅することができることが示された。なお実験にはバリアントγとεのプライマーしか用いていない。この実験で合成されたバリアントは、いずれもバリアントγまたはεと同じエキソンを含んでいる。そのため、バリアントγとεのためのプライマーによって、各種のバリアントが合成された。たとえばバリアントαβθおよびιは、いずれも＃２０、＃２１のプライマーがアニールする塩基配列を含んでいる。
α：約２ｋｂ
β：約２ｋｂおよび約１．５ｋｂ
δ：約１ｋｂ
ε：約２ｋｂ
θ：約１．５ｋｂ
ι：約１．５ｋｂ
【００７６】
図２および図３のゲルの写真から明らかなように、ｔａｒｇｅｔが存在していてＰＣＲの条件が至適であれば、本発明の方法によって非常にきれいな一本のバンドとしてｃＤＮＡが増幅される。本発明によるポリヌクレオチドの合成方法は、非常にユニークな方法でしかも信頼性も高い。本発明の方法が高い信頼性を有することは、全てのＭｓｈ４バリアントについてゲノムＤＮＡのｓｅｑｕｅｎｃｅと比較したところ、末端の塩基配列に特に異常は認められなかった、という事実によって裏付けられている。本発明の方法によれば、αδεのようにｃＤＮＡライブラリーに極めて僅かしか含まれていないｕｎｕｓｕａｌな構造を持つものも単離することが可能である。本発明の方法を利用して、ゲノムプロジェクトの情報をもとにして、ｕｎｕｓｕａｌ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙなるものの構築ができるかもしれない。
【００７７】
【発明の効果】
本発明によって、５’末端を含む領域の塩基配列が未知なポリヌクレオチドの合成方法が提供された。本発明の方法を、ｃＤＮＡの第２鎖に適用した場合には、５’ＲＡＣＥを実現できる。本発明に基づく５’ＲＡＣＥは、既知の方法では取得できなかった、より５’側に長いｃＤＮＡの取得を可能とした。また本発明の方法は、ｃＤＮＡの第１鎖に適用した場合に３’ＲＡＣＥを可能とする。本発明においては、同様の原理を、５’ＲＡＣＥと３’ＲＡＣＥのいずれにも応用することができる。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドの合成方法によれば、逆転写酵素、１つのプライマー、そして特定のＤＮＡポリメラーゼの利用によって、簡単な操作で５’末端を含む領域の塩基配列が未知なポリヌクレオチドの合成方法を可能とする。つまり本発明によって、安価で簡便な手法によって目的とするポリヌクレオチドの合成が可能となった。一方、既知の方法は、特殊なプライマーの利用を必須とし、更に複数の酵素を組み合せた複雑な反応に基づいて実施されていた。
【００７９】
本発明の方法は、目的とするポリヌクレオチドを効率的に合成することができる。効率的とは、次のような特徴を期待できることを言う。
−未知の塩基配列部分がより長い状態で取得できること
−非特異反応が抑制されること
ここで言う非特異反応は、目的とするポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを合成する反応を言う。具体的には、プライマーダイマーや、複数のｃＤＮＡ断片が連結された構造を有するポリヌクレオチドなどを生成する反応が非特異反応に含まれる。
この特徴により、本発明に基づく５’ＲＡＣＥや３’ＲＡＣＥは、目的とするｃＤＮＡの確実な取得を可能とする。
【００８０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例に用いたＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔの反応原理を示す図である。図中、１はアダプタープライマーのアニール位置、２はｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲのためのアダプタープライマーがアニールする位置を示した。ｄｓ　ｃＤＮＡは２本鎖ｃＤＮＡを示し、またＮＮＴ３０は、ｃＤＮＡの合成に用いられたプライマーを示す。
【図２】マウスＭｓｈ４遺伝子に５’ＲＡＣＥ法を応用して得られたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。１ｓｔは５’側のプライマーを用いた場合の結果を、２ｎｄａｒｙは３’側のプライマーを用いた場合の結果を示す。
【図３】マウスβアクチン遺伝子に５’ＲＡＣＥ法を応用して得られたＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図４】アダプタープライマーを用いないＤＮＡ合成のメカニズムを示す図。
【図５】アダプタープライマーを用いないＰＣＲ産物の電気泳動結果を示す写真である。
【図６】本発明によって増幅されたＤＮＡの末端部分の塩基配列を決定した結果を示す図である。図中、プライマーの塩基配列を四角で囲んで示した。また末端部分に付加されたプライマーに由来しに相補的な塩基配列にアンダーラインを付けた。各塩基配列はスプライシングバリアントごとに記載され、上が５’末端の、下が３’末端の塩基配列を示す。各塩基配列の左側にスプライシングバリアントの名前と、増幅産物の長さを示した。
【図７】本発明によって増幅されたＤＮＡの末端部分の塩基配列を決定した結果を示す図である（図６の続き）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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