(57)【要約】【課題】精巣細胞に関する研究を高感度かつ簡便に行うための、精巣細胞の分類、及び精巣細胞分画の分取方法の提供。【解決手段】以下の工程：（ａ）精巣細胞を単離する工程、（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、及び（ｃ）ＤＮＡ含量に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体又は四倍体の細胞分画に分類する工程、を含む、精巣細胞の分類方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）精巣細胞を単離する工程、
（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、及び
（ｃ）ＤＮＡ含量に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体又は四倍体の細胞分画に分類する工程、
を含む、精巣細胞の分類方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、精巣細胞を０．１〜０．５％コラゲナーゼ処理することを含むものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、精巣細胞を４０〜１００μｍのメッシュに通すことを含むものである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
セルソーター解析により細胞の大きさを測定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
細胞の大きさに基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体、二倍体又は四倍体に分類されたそれぞれの細胞分画を、さらに細胞の大きさが小さい分画と大きい分画とに分類するものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
以下の工程：
（ａ）精巣細胞を単離する工程、
（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、並びに
（ｃ）ＤＮＡ含量に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体及び／又は四倍体の細胞分画を分取する工程、
を含む、精巣細胞分画の分取方法。
【請求項７】
セルソーター解析により細胞の大きさを測定する工程をさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
細胞の大きさに基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体、二倍体及び／又は四倍体のぞれぞれの細胞分画から、さらに細胞の大きさが小さい分画及び／又は大きい分画を分取するものである請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により分取された精巣細胞分画。
【請求項１０】
以下の工程：
（ａ）精巣細胞を単離する工程、
（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）の測定結果に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体、及び／又は四倍体の細胞分画を定量する工程、
を含む、精巣細胞分画の定量方法。
【請求項１１】
セルソーター解析により細胞の大きさを測定する工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
細胞の大きさに基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体、二倍体及び／又は四倍体のぞれぞれの細胞分画について、さらに細胞の大きさが小さい分画及び／又は大きい分画を定量するものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
（ａ）被験体を被検要因に暴露する工程、
（ｂ）上記被験体から精巣を採取する工程、及び
（ｃ）請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により精巣細胞を定量する工程、
を含む、精巣障害性要因の同定方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）の後に、さらに、被検要因が、精巣細胞分画のうちいずれの分画に対し精巣障害性であるかどうかを判定する工程を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
精巣障害性要因が精巣障害性物質である、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
以下の工程：
（ａ）被験体を被検要因に暴露する工程、
（ｂ）上記被験体から精巣を採取する工程、並びに
（ｃ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により精巣細胞を分類、分取及び／又は定量する工程、
を含む、被検要因が精巣細胞に及ぼす影響を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精巣細胞の分類方法、並びに精巣細胞分画の分取及び定量方法に関する。また本発明は、精巣障害性要因の同定方法、並びに精巣障害性要因が精巣細胞に及ぼす影響を判定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
精子形成過程の状態を正確に把握することは、ダイオキシンをはじめ、環境中の内分泌障害性物質などの暴露による精巣障害を鋭敏に検出することとなり、また医薬品の開発においても、精巣細胞の分化又は増殖に対する有効性及び安全性の評価に役立つこととなる。
【０００３】
哺乳動物の精子形成過程を大別すると、１）精祖細胞の増殖分化、２）精母細胞の減数分裂、３）精子細胞の形態変化があり、ラットでは１４のステージに、マウスでは１２のステージに分けられる。現在、哺乳動物の精子形成過程の全般にわたる培養系は確立されていないが、この理由として、精細管におけるサイトカイン等によるパラクリン形式の分化増殖調節機構が未知であることが挙げられる。他方、その機構を解明するために重要な精子形成過程の把握は、主として複雑な形態学的観察に基づいているため、時間がかかり、経験も必要であった。
以上のような理由から、精巣細胞を研究するための高感度かつ簡便な方法が望まれていた。
【０００４】
【特許文献１】
特表２００２−５００００６号公報
【非特許文献１】
Ｋａｔｏｈ，  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（日本国），２００２年，第２７巻，ｐ．８７−９６
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、精巣細胞に関する研究を高感度かつ簡便に行うための、精巣細胞の分類及び精巣細胞分画の分取方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、精巣細胞をセルソーター解析に適した状態で単離する手法を開発し、単離した精巣細胞を、セルソーター解析によりＤＮＡ含量及び細胞の大きさの２つのパラメータで分画したところ、各分画に含まれる細胞の種類に共通性がみとめられたため、この手法により精巣細胞を分類できるという知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）である。
（１）以下の工程を含む精巣細胞の分類方法。
（ａ）精巣細胞を単離する工程、
（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、及び
（ｃ）ＤＮＡ含量に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体又は四倍体の細胞分画に分類する工程
上記分類方法において、工程（ａ）は、例えば、精巣細胞を０．１〜０．５％コラゲナーゼ処理すること、及び／又は精巣細胞を４０〜１００μｍのメッシュに通すことを含むものである。
また上記分類方法は、セルソーター解析により細胞の大きさを測定する工程をさらに含むものであってもよい。この場合には、上記分類方法は、細胞の大きさに基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体、二倍体又は四倍体に分類されたそれぞれの細胞分画を、さらに細胞の大きさが小さい分画と大きい分画とに分類するものである。
【０００８】
（２）以下の工程を含む精巣細胞分画の分取方法。
（ａ）精巣細胞を単離する工程、
（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、並びに
（ｃ）ＤＮＡ含量に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体及び／又は四倍体の細胞分画を分取する工程
上記分取方法は、セルソーター解析により細胞の大きさを測定する工程をさらに含むものであってもよい。この場合には、上記分取方法は、細胞の大きさに基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体、二倍体及び／又は四倍体のそれぞれの細胞分画から、さらに細胞の大きさが小さい分画及び／又は大きい分画を分取するものである。
【０００９】
（３）上記分取方法により分取された精巣細胞分画。
（４）以下の工程を含む精巣細胞分画の定量方法。
（ａ）精巣細胞を単離する工程、
（ｂ）上記精巣細胞をセルソーター解析に供して、該精巣細胞のＤＮＡ含量を測定する工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）の測定結果に基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎ、一倍体、二倍体、及び／又は四倍体の細胞分画を定量する工程
上記定量方法は、セルソーター解析により細胞の大きさを測定する工程をさらに含むものであってもよい。この場合には、上記定量方法は、細胞の大きさに基づいて、倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、一倍体、二倍体及び／又は四倍体のそれぞれの細胞分画について、さらに細胞の大きさが小さい分画及び／又は大きい分画を定量するものである。
【００１０】
（５）以下の工程を含む精巣障害性要因の同定方法。
（ａ）被験体を被検要因に暴露する工程、
（ｂ）上記被験体から精巣を採取する工程、及び
（ｃ）上記定量方法により精巣細胞を定量する工程
上記同定方法は、工程（ｃ）の後に、さらに、被検要因が、精巣細胞分画のうちいずれの分画に対し精巣障害性であるかどうかを判定する工程を含んでもよい。また上記精巣障害性要因としては、例えば精巣障害性物質が挙げられる。
【００１１】
（６）以下の工程を含む被検要因が精巣細胞に及ぼす影響を判定する方法。
（ａ）被験体を被検要因に暴露する工程、
（ｂ）上記被験体から精巣を採取する工程、並びに
（ｃ）上記分類、分取及び／又は定量方法により精巣細胞を分類、分取又は定量する工程
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、精巣細胞を分類及び定量する方法に係るものであり、セルソーター解析を利用して、ＤＮＡ含量及び／又は細胞の大きさの２つのパラメータを測定することにより精巣細胞をいくつかの分画（サブタイプ）に分類し、各分画の精巣細胞を定量することを特徴とする。この分類及び定量結果を利用することによって、精巣障害性要因を明らかにし、またそれらの要因が精巣細胞に及ぼす影響を判定することができる。
【００１３】
１．精巣細胞の単離
本発明においては、精巣細胞を分類、分取及び／又は定量する。本発明において「精巣細胞」とは、精巣中に含まれる細胞を指す。精巣の精細管では、発生過程において、精原細胞（２ｎ）から精母細胞（４ｎ）を経て精子細胞（ｎ）となり、この精子細胞が形態変化した精子細胞（ｓｕｂ−ｎ）に形態変化（精子形成）することが知られている。ここで、「ｓｕｂ−ｎ」とは、形態変化した精子細胞の倍数性を表す。形態変化した精子細胞と精子細胞は、いずれも一組の染色体を含み、同量のＤＮＡを含有するが、形態変化した精子細胞の染色体は、精子細胞のものと比較して濃縮して存在している点で両者の存在形態が相違するため、形態変化した精子細胞の倍数性をｓｕｂ−ｎと表し、精子細胞の倍数性をｎと表す。また「倍数性」とは、細胞当たりの染色体の組の数に関し、染色体組の数に応じて、一倍体、二倍体などと呼ぶ。
【００１４】
従って、精巣には、以下の細胞が含まれる。
・二倍体の精原細胞（Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｏｎｉａ）
・四倍体の精母細胞、すなわち、レプトテン期精母細胞（Ｌｅｐｔｏｔｅｎｅ）、ザイゴテン期精母細胞（Ｚｙｇｏｔｅｎｅ）、パキテン期精母細胞（Ｐａｃｈｙｔｅｎｅ）
・一倍体の精子細胞、すなわち、エロンゲイティング精子細胞（Ｅｌｏｎｇａｔｉｎｇ  ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）、円形精子細胞（Ｒｏｕｎｄ  ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）
・倍数性がｓｕｂ−ｎのエロンゲイティッド精子細胞（Ｅｌｏｎｇａｔｅｄ  ｓｐｅｒｍａｔｉｄ）
・二倍体の体細胞、すなわち、セルトリ細胞（Ｓｅｒｔｏｌｉ）、ライディヒ細胞（Ｌｅｙｄｉｇ）、筋様細胞（Ｍｙｏｉｄ）
本発明においては、上記精巣細胞を、好ましくは４〜７つの分画、例えば７つ又は４つの分画に分類、分取及び／又は定量する。
【００１５】
精巣細胞は、精巣から単離して得る。被験体からの精巣の採取は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば、哺乳動物を麻酔下にて放血致死させ、ハサミなどを用いて精巣を摘出し、脂肪除去の後、精巣白膜及び血管系を除去する。
【００１６】
続いて、精巣から精巣細胞を単離する。本発明において細胞の「単離」とは、精巣から主として精巣細胞が優位に含まれている細胞画分のみを取り出し、かつ個々の細胞を分離させることを指す。「優位に」とは、単離細胞画分中の精巣細胞の割合が少なくとも９０％であることを意味する。この際、精巣細胞をセルソーター解析に耐えることができるように単離することが重要である。そのため、本発明者は、以下に記載する酵素的分離及び機械的分離を組み合わせて行うことによって、セルソーター解析に適した状態で精巣細胞を単離する手法を開発した。
【００１７】
本発明において酵素的分離は、コラゲナーゼを用いて行う。例えば、０．１〜０．５％コラゲナーゼ、好ましくは０．２５％コラゲナーゼ中に精巣を入れる。処理条件は、３０〜３８℃、好ましくは３２．５℃にて、１５〜６０分間、好ましくは２０〜３０分間行う。この際、１００〜２００ｃｙｃｌｅ／ｍｉｎ、好ましくは１５０〜１６０ｃｙｃｌｅ／ｍｉｎにて水浴にて振とうさせる。
【００１８】
機械的分離は、精巣を段階的に小さくしたメッシュに通すか、又は段階的に細い注射針に通すか、あるいはこれらを組み合わせて行う。メッシュは、４０μｍ〜１００μｍの範囲内、例えば、４０μｍ又は７０μｍのものを用いることができる。注射針は、１８Ｇ〜２７Ｇの範囲内、例えば、２４Ｇ、２６Ｇ又は２７Ｇのものを用いることができる。
【００１９】
本発明においては、上記酵素的分離を０．２５％コラゲナーゼを用いて行い、上記機械的分離をメッシュ上でピペッティングして、精巣細胞を単離することが好ましい。
【００２０】
続いて、単離した精巣細胞を、セルソーターで解析するために、細胞懸濁液として調製する。懸濁溶液は、精巣細胞を破壊せず、精巣細胞に一般的に使用されている溶液であれば特に限定されない。例えば懸濁溶液としては、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含のリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ−）、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加ＰＢＳ（−）などが挙げられる。セルソーター解析に最適な細胞懸濁濃度は、５×１０５〜５×１０７個／ｍｌであり、好ましくは１×１０６〜３×１０６個／ｍｌである。
上述したような操作により、精巣細胞を、セルソーター解析に十分耐えられるように、また、解析後も細胞の形態を維持可能なように単離することができる。
【００２１】
２．精巣細胞ＤＮＡの染色
精巣細胞を単離した後、セルソーター解析により精巣細胞のＤＮＡ含量を測定するために、精巣細胞のＤＮＡを蛍光色素で染色する。
【００２２】
精巣細胞は、染色を行う前に固定化しておくことが好ましい。固定化により、ＤＮＡと結合する蛍光色素がはじめて細胞膜を通過し、細胞とＤＮＡとが結合することが可能となる。
細胞の固定化は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば、メタノールを用いる固定、エタノールを用いる固定などが挙げられる。
【００２３】
具体的に説明すると、例えばメタノールを用いて精巣細胞を固定する場合には、６０〜８０％メタノール、好ましくは７０％メタノールに細胞懸濁液を一滴ずつ撹拌しながら滴下して加え（細胞：メタノールが約１：３０となるように加える）、４℃にて１時間維持する。細胞は、このアルコール固定液を遠心分離後、ＰＢＳ（−）に置換することにより、この状態のまま保存することができる。
【００２４】
細胞固定後、アルコールをＰＢＳ（−）に置換した後、ＲＮＡによる蛍光色素のＤＮＡ結合性への干渉を阻止するために、ＲＮａｓｅ処理を行うことが好ましい。ＲＮａｓｅは、０．１〜０．５％、好ましくは０．２５％のものを使用し、３６〜３８℃、好ましくは３７℃のもとで、１０〜３０分間、好ましくは２０分間にわたり細胞をインキュベートする。
【００２５】
ＲＮａｓｅ処理後、精巣細胞のＤＮＡを染色する。ＤＮＡを染色するための蛍光色素は、当技術分野で一般的に用いられているものであれば特に限定されない。例えば、ヨードプロピディウム（ＰＩ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ヘキスト３３３４２などが挙げられる。ＰＩ及びＥｔＢｒは、核酸の二重らせん内に挿入され、蛍光強度を増強させることが知られている。またヘキスト３３３４２は、生細胞のＤＮＡ染色に有効であることが知られている。
【００２６】
例えば細胞をＰＩにより染色する場合には、遮光下で、精巣細胞に１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０μｇ／ｍｌのＰＩを加え、１０〜１℃、好ましくは４℃にて、１０〜６０分間、好ましくは３０分間かけて染色を行う。
【００２７】
また例えば細胞をヘキスト３３３４２により染色する場合には、精巣細胞に５〜１０μＭの濃度でヘキスト３３３４２を加え、１０〜３０℃、好ましくは室温にて、１０〜６０分間、好ましくは２０分間かけて染色を行う。
【００２８】
３．セルソーター解析
本発明においては、上述のようにして調製した精巣細胞をセルソーター解析に供する。セルソーターとは、細胞の有する各種パラメータに基づいて細胞を選別・分取する装置を指す。
【００２９】
（１）セルソーターの原理
セルソーターの原理は、サンプル中の細胞を１個ずつレーザー光の中心を通過させ、細胞がレーザー光中を通過するときに発する蛍光及び散乱光を検出し、それらの光を各種の電気パルス、続いてシグナル情報に変換し、目的とする細胞に関するヒストグラム解析とリストモードデータ解析を行って、その結果に基づいて細胞の分取を行う、というものである。そのため、セルソーターは、フローサイトメーターと細胞分取装置とを備えており、蛍光や散乱光のシグナル情報の測定結果を、例えばドットプロットとして表示する機能を有しており、また特定のシグナル情報を発する細胞を細胞分取装置により分取することができる。なお、このような方法はフローサイトメトリーと呼ばれている。
【００３０】
セルソーターは、生細胞を高い生存率でかつ無菌的に分取することができるため、当技術分野で広く利用されている。セルソーター解析についての詳細な説明に関しては、例えば、「動物細胞培養の実際」（１９９０年，三井洋司監訳，丸善株式会社）、「フローサイトメトリーの原理入門」（ベックマン・コールター株式会社，サイトメトリーグループホームページ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｃ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ｃｏｍ／ａｄｄ＿ｐａｇｅ／ｆｃｍｐｒｉｎ．ｈｔｍｌ）を参照されたい。
【００３１】
本発明において利用可能なセルソーターは、上述したようなフローサイトメーターと細胞分取装置とを備えるものであれば特に限定されず、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）、ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ製）などが挙げられる。セルソーターは、製造業者の取扱説明書に従って取り扱い、解析を行う。
【００３２】
（２）パラメータによる分取
本発明においては、精巣細胞がレーザー光を照射されて発する蛍光及び前方散乱光を利用して、精巣細胞のＤＮＡ含量及び／又は細胞の大きさの２つのパラメータを測定する。
【００３３】
蛍光は、細胞が蛍光色素を含有する場合に、レーザー光のエネルギーによってこの蛍光色素が励起され、細胞が蛍光と呼ばれる光をあらゆる方向に発することにより生じる。この蛍光を測定することにより、細胞の特徴を知ることができる。例えば本発明においては、精巣細胞のＤＮＡを蛍光色素で染色しているため、蛍光強度は、精巣細胞のＤＮＡ量に比例することになる。
【００３４】
蛍光は、蛍光色素によりその波長が異なる。従って、ＤＮＡの染色に使用した蛍光色素に応じて、照射する励起光を変更する必要がある。例えば蛍光色素ＰＩは、４８８ｎｍで励起し、最大放射スペクトルは約６１５ｎｍである。また蛍光色素ヘキスト３３３４２は、３５０〜３６３ｎｍで励起し、４５０ｎｍ以上で回復する。
【００３５】
蛍光によるセルソーター解析を行った場合の一例として、図１Ｂに、精巣細胞のＤＮＡ量（ＰＩ量）と細胞数のプロットを示す。精巣細胞のＤＮＡ量は染色体の倍数性と関連している。従って、ＤＮＡ量（ＰＩ）が異なる場合は、細胞数のピークが異なることとなる。例えば、図１Ｂに示すＩ〜ＩＶは、それぞれｓｕｂ−ｎ、ｎ（一倍体）、２ｎ（二倍体）及び４ｎ（四倍体）に対応する。ここで、ｓｕｂ−ｎ及びｎの精巣細胞は、いずれも一組の染色体を含み、同量のＤＮＡを含有するが、ｓｕｂ−ｎの精巣細胞の染色体は、ｎのものと比較して濃縮して存在している点で両者の存在形態が相違する。そのため、図１Ｂに示すように、ｓｕｂ−ｎとｎが区別可能なピークとして現れると考えられる。このように蛍光を利用することによって、精巣細胞を倍数性で分類することができる。
【００３６】
前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ；ＦＳＣ）は、主に細胞表面で生じるレーザー光の散乱であり、細胞表面積に比例する。すなわち、細胞が大きくなるほど、生じるＦＳＣは強くなる。従って、ＦＳＣを用いて精巣細胞の大きさを測定することができる。
【００３７】
ＦＳＣによるセルソーター解析を行った場合の一例として、図１Ａに精巣細胞のＦＳＣと細胞数のプロットを示す。図１Ａに示すように、精巣細胞の大きさ（ＦＳＣ）と細胞数との関連性はみとめられず、ピークがない。そのため、精巣細胞の大きさの測定のみでは精巣細胞を分類することはできない。
【００３８】
一方、蛍光とＦＳＣとを組み合わせた場合には、精巣細胞のＤＮＡ量と細胞の大きさの２つのパラメータに基づいて細胞を分類することができる。例えば、図１Ｄに示すように、ＤＮＡ量（ＰＩ）−ＦＳＣのプロットを作成した場合には、精巣細胞を次の７つの分画に分類することができる。すなわち、（１）倍数性がｓｕｂ−ｎの分画、（２）一倍体であって、細胞の大きさが小さい分画、（３）一倍体であって、細胞の大きさが大きい分画、（４）二倍体であって、細胞の大きさが小さい分画、（５）二倍体であって、細胞の大きさが大きい分画、（６）四倍体であって、細胞の大きさが小さい分画、及び／又は（７）四倍体であって、細胞の大きさが大きい分画、に分類することができ、セルソーターは、これらの情報に基づいて、精巣細胞分画を分取することとなる。
【００３９】
また、セルソーター解析に一般的に利用される側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ；ＳＳＣ）は、照射されるレーザー光の軸に対して９０°の方向の角度で散乱する光であり、主に細胞内顆粒などの細胞内部構造の複雑さを表す。すなわち、細胞内部の構造が複雑になるほど、生じるＳＳＣは強くなる。従って、ＳＳＣを用いて精巣細胞の内部構造の複雑性を測定することができる。ＳＳＣによるセルソーター解析を行った場合の一例として、図１Ｃに精巣細胞のＦＳＣとＳＳＣのプロットを示す。図１Ｃに示すように、精巣細胞の大きさ（ＦＳＣ）と細胞内部構造の複雑性（ＳＳＣ）との関連性はみとめられず、ピークがない。そのため、細胞の内部構造の複雑性をパラメータとして精巣細胞を分類することはできない。
【００４０】
（３）精巣細胞の種類と７つの分画との関係
本発明においては、上述したように、ＤＮＡ含量と大きさに基づいて、精巣細胞を７つの分画に分類することができる。４つ及び７つの精巣細胞分画について以下の表１にまとめる。４つの分画は、表１のＤＮＡ含量（倍数性）が同じものである。
【００４１】
【表１】
2004159554.tif 000002
【００４２】
表１において、「分画」の欄に記載の数字は、本明細書及び図面に示す数字に対応し、「大きさ」の欄に記載のＬ及びＲは、同じ倍数性を有する細胞を大きさに基づいて２つの分画に分けた場合の、小さい分画（Ｌ）と大きい分画（Ｒ）を指す。本発明においては、図１Ｄに示すように、ｓｕｂ−ｎの細胞以外は、同じ倍数性を有する精巣細胞を、その大きさに基づいて２つの分画に分けることができる。ここで、「大きい」とは、細胞の体積が他のものよりも上回っていることを指す。また「小さい」とは、細胞の体積が他のものよりも少ないことを指す。本発明において「大きい」と「小さい」の境界は、ＤＮＡ（ＰＩ）−ＦＳＣのプロットの各分画における曲線の変曲点部位にて規定した。
【００４３】
また、図２に、各精巣細胞分画に含まれる細胞を示す。写真の枠内に示す細胞は、各分画の代表的な細胞を示す。
本発明により、精巣細胞を分類し、各精巣細胞分画を分取することができる。この方法は、精巣細胞の膜障害性の操作を取り入れず、細胞膜をインタクトな状態で分取することが可能であり、分取された精巣細胞をさらなる用途に用いることができる。
【００４４】
４．定量
本発明により、上記「３．セルソーター解析」の項に記載のようにして分類された精巣細胞を分取し、その各々の精巣細胞分画を定量することができる。
精巣細胞分画の定量は、血球計算盤などを用いて算出した、セルソーター解析に供した全精巣細胞数の割合から算出して行うことができる。あるいは、既知濃度で標識したビーズをセルソーター解析に供し、ビーズの標識に対する割合から精巣細胞画分を定量することもできる。ビーズとしては、フローサイトメトリーに適した当技術分野で公知のあらゆる粒子を用いることができ、例えば、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ等が挙げられる。本発明において好適なビーズとしては、例えば、ＥＰＩＣＳ社のＦｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔなどが挙げられる。ビーズの標識は、蛍光標識が好ましく、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、Ｃｙ５などによりビーズを標識する。
【００４５】
５．分取した精巣細胞分画
上述のようにして分取した精巣細胞分画は、均質であり、かつ細胞が破壊されずに分取されているため、様々な用途に用いることができる。本発明において、「分取された精巣細胞分画」とは、その細胞集団に含まれる全成分のうちの８０〜１００％、好ましくは９０〜１００％、さらに好ましくは９５％以上を、当該分画に属する精巣細胞が占有することを指す。
【００４６】
例えば、上記精巣細胞分画は、特定の精巣細胞分画に特異的な抗体を作製するための抗原として用いることができる。また、特定の精巣細胞分画におけるタンパク質やＤＮＡを採取することができる。
【００４７】
６．精巣障害性要因の同定、並びにその影響の検討
上述した精巣細胞分画の定量方法を利用して、精巣障害性要因を同定し、その影響を検討することができる。本発明において「精巣障害性」とは、特定の精巣細胞分画の全精巣細胞に占める割合が変化すること、又は全精巣細胞数が変化すること、あるいは、特定の精巣細胞分画又は全精巣細胞の形態、機能などが変化することを指す。また、「精巣障害性」とは、精巣の発育過程における障害性及び成熟過程における障害性のいずれも意味する。
【００４８】
（１）被検要因
被検要因は、精巣障害性を有すると推測される要因、又は精巣障害性を有することが知られているが、その障害性を検討しようとする要因であれば特に限定されず、未知及び既知の要因とすることができる。例えば、物質的要因（医薬品、食品など）、環境要因（圧力、気候、放射線など）、精神的要因（ストレスなど）、疾病（感染症、遺伝性疾患など）、加齢が挙げられる。
【００４９】
例えば、被検要因としては、未知及び既知の精巣障害性物質を用いることができる。未知の精巣障害性物質としては、天然に存在するものであってもよいし、又は人工的に合成されたものでもよく、例えば、医薬品、食品、農薬、食品添加物、化粧品、家庭用品に含まれるような種々の化学物質、動物体内の分泌物（ホルモンなど）、植物体内のアルカロイド等の物質、重金属イオンなどが挙げられる。また既知の精巣障害性物質としては、例えば、ニトロベンゼン、フタル酸エステル、アドリアマイシン、スピロノラクトン、レセルピン、カドミウムなどが挙げられる。
【００５０】
また、被検要因の精巣障害性を、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、例えば、被検要因に暴露する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。さらに、複数の要因の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被検要因を組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
（２）被験体
被験体は、精巣を有する動物であれば特に限定されず、例えば、精巣障害を受けるかどうかを検討すべき動物（例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類など）、精巣障害を受けるかどうかを検討すべき動物と近縁の動物（例えば、ヒトと近縁の実験動物など）が挙げられる。
【００５２】
被験体の状態、例えば年齢（又は週齢、月齢）、飼育条件などは特に限定されない。本発明では、複数の状態の被験体を用いて比較検討することにより、精巣障害がどの状態の被験体に現れるかを判定することもできる。
【００５３】
（３）精巣細胞の分取と定量
精巣障害性要因の同定及び検討では、まず被験体を上記被検要因に暴露する。被検要因の暴露条件は、その要因の種類、被験体の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。また被検要因として、被検サンプルを被験体に投与する場合には、その投与量、投与期間、投与経路などの投与条件は、被検サンプルの種類、被験体の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。また、さらに、これらの条件を変更し、特定の投与又は暴露条件と精巣障害性との関連性を検討することもできる。
【００５４】
続いて、上記１〜３の項の記載に従って、被験体から精巣を採取し、精巣細胞を単離して、ＤＮＡを染色し、セルソーター解析に供する。セルソーター解析により、精巣細胞が、ＤＮＡ含量及び／又は細胞の大きさに基づいて、上記「３．セルソーター解析」の項に記載の４〜７つの分画に分類及び分取され、各分画に含まれる細胞数が定量される。
【００５５】
（４）精巣障害性要因の同定及び検討
上述の操作によって定量された精巣細胞分画の細胞数について、被検要因に暴露した群（試験群）と、被検要因に暴露していない群（対照群）とを比較する。ここで、試験群のいずれかの分画の細胞数が、対照群の細胞数よりも低減している場合に、被検要因は精巣障害性要因と同定されることとなる。
【００５６】
また、対照群の精巣細胞数と比較して、特定の精巣細胞分画の細胞数が低減しているかどうかを検討することにより、被検要因がどの分画の精巣細胞に対し精巣障害性の影響を及ぼすかを判定することができる。
【００５７】
さらには、各分画の精巣細胞を詳細に研究することによって、精巣障害性要因が、精巣細胞分画に対し、どのような影響を及ぼすのかを判定することもできる。例えば、精子形成過程は、上述した分画で表した場合、２ｎ→４ｎ→ｎ→ｓｕｂ−ｎと進行するものと考えられる。従って、精巣障害性要因による各分画の変化は、精子形成過程のどの部分で精巣細胞が障害されているかを示唆するものである。
【００５８】
本発明の精巣障害性要因の同定方法は、種々のサンプル又は要因の精巣障害性を判定することができるため、医薬品及び食品の開発における安全性評価、精巣障害の機構解明などに有用である。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００６０】
〔実施例１〕精巣細胞の調製
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（１３週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ，  Ｉｎｃ．）の両精巣を摘出し、０．２５％コラゲナーゼ処理を３２．５℃にて３０分行うことにより単離精巣細胞を得た。
【００６１】
コラゲナーゼ処理後、まずピペッティングしながら７０μｍメッシュを通して濾過し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ−：Ｃａ２＋，Ｍｇ２＋不含）に懸濁する。遠心洗浄後、ピペッティングしながら４０μｍメッシュを通してろ過し、ＰＢＳ（−）に懸濁する。
【００６２】
ＤＮＡの染色に際しては、７０％冷メタノール（４℃）で１時間かけて固定した後、０．２５％ＲＮａｓｅ処理を３７℃にて２０分間施し、５０μｇ／ｍｌヨードプロピディウム（ＰＩ）を２×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液に添加した。
【００６３】
〔実施例２〕セルソーターを用いた精巣細胞の分取
実施例１で調製した精巣細胞を、セルソーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて解析し、細胞分取をおこなった。
【００６４】
ＦＳＣ−ＤＮＡプロットによる解析の結果、精巣摘出後約４時間で、少なくとも７つの精巣細胞分画が検出でき、またその定量もできた。各倍数性（ｓｕｂ−ｎ，ｎ，２ｎ，４ｎ）に該当する精巣細胞の、精巣細胞総数に対する相対的な割合は、それぞれ２９％、４１％、１８％及び８％であった。また、ＦＳＣ−ＤＮＡプロット上の７つの分画での精巣細胞の相対的な割合は、図３及び下記表２に示す通りである。図３は、全精巣細胞数を１００％とした場合の各分画の細胞数の相対値を示す（平均値±標準偏差、ｎ＝２２）。表２においては、ＤＮＡ含量に対応する倍数性を、ｓｕｂ−ｎ、ｎ、２ｎ及び４ｎで表し、同じ倍数性の細胞のうち、細胞が大きい分画をＲ、小さい分画をＬと表す。
【００６５】
さらに、セルソーティング後の観察により、各分画に含まれる精巣細胞の種類は共通しており、各分画に含まれる精巣細胞の種類を判定することができた（図２及び表２）。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
〔実施例３〕セルソーターを用いた精巣障害モデルラットの精巣細胞の分類
３種の精巣障害性化学物質、すなわちシクロホスファミド（０，２０ｍｇ／ｋｇ）、エチニルエストラジオール（０，３，１０ｍｇ／ｋｇ）、及びハロペリドール（０，３０，６０ｍｇ／ｋｇ）を、各々９週齢、９週齢及び６週齢の雄性ＳＤラットに、各々２週間、４週間及び４週間経口投与した。これらの精巣障害性化学物質は、精巣細胞を減少させることが知られている。本実施例では、精巣細胞のいずれの細胞分画の細胞数が減少するかを検討することによって、精巣障害性物質がどの精巣細胞分画に影響を及ぼすのかを判定する。精子形成過程は、各分画と対応しているため、精巣障害により各分画に変化がみとめられた場合には、どの精子形成過程に障害があらわれたのかを判定することができる。
【００６８】
実施例１及び２と同様の手法で、ラットから精巣を採取し、精巣細胞を単離した後、ＤＮＡ量と細胞の大きさに基づき、単離精巣細胞を７つの分画に分類、定量した。また、回収した全単離精巣細胞数は、添加した既知濃度の蛍光標識ビーズ（Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔ，  Ｅｐｉｃｓ）との比により求め、薬剤投与による精巣毒性を各分画の細胞数の変化として捉え、評価した。
【００６９】
結果を図４に示す。図４に示す結果は、細胞数の平均値±標準偏差（ｎ＝５）を表し、＊印はｐ＜０．０５で有意差があるもの、＊＊はＰ＜０．０１で有意差があるものを示す。シクロホスファミド投与実験では、本発明の方法の場合は２ｎ−Ｌ及び４ｎ−Ｌの有意な減少が認められ（図４Ａ）、各倍数体の細胞の変化を検出することができた。一方、従来の倍数性のみによる分類では、２ｎ−Ｌと２ｎ−Ｒ、４ｎ−Ｌと４ｎ−Ｒとを区別することができないため、これらの分画において有意な変化を検出することはできないことがわかる。
【００７０】
また、エチニルエストラジオール投与実験では、投与群で精巣重量の有意な減少が認められ、２ｎ−Ｌ以外の全ての分画で著しい細胞数の減少が認められた（図４Ｂ）。さらに、ハロペリドール投与実験では、いずれの分画においても統計学的な有意差は認められなかったが、４ｎ−Ｌと４ｎ−Ｒの軽度な減少が各用量群とも数例で認められた（図４Ｃ）。精巣重量も６０ｍｇ／ｋｇ群で明らかな減少が認められたが、有意な差は認められなかった。
【００７１】
３種の精巣障害性化学物質をラットに投与した単離精巣細胞を用いて、セルソーター解析により得られた結果は、報告されている組織学的検査結果ともよく一致しており、また、精子形成障害の状態と程度を迅速に、感度よく、的確に評価できることが示唆された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、精巣細胞の分類及び精巣細胞分画の定量方法が提供される。この方法を利用することにより、特定の精巣細胞分画のみを分取することができ、また、精巣障害性物質及び要因を同定し、その影響を検討することができるため、精巣細胞の研究に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ラットから単離した精巣細胞を用いたセルソーター解析を示す図である。
Ａ：前方散乱光（ＦＳＣ）のヒストグラムを示す。
Ｂ：ＰＩ蛍光に基づくＤＮＡ含量のヒストグラムを示す。ピークＩは倍数性ｓｕｂ−ｎの精巣細胞を表し、ピークＩＩは一倍体（ｎ）の精巣細胞を表し、ピークＩＩＩは二倍体（２ｎ）の精巣細胞を表し、ピークＩＶは四倍体（４ｎ）の精巣細胞を表す。
Ｃ：前方散乱光−側方散乱光（ＦＳＣ−ＳＳＣ）のプロットを示す。
Ｄ：ＦＳＣ−ＤＮＡ含量のプロットを示す。１〜７は、精巣細胞分画を表す。
【図２】ＦＳＣ−ＤＮＡ含量プロットによる各精巣細胞分画のセルソーティングを示す図である。１〜７は、それぞれ図１Ｄの各分画に対応する。写真は、各分画で分取された細胞（ギムザ染色）を示し、枠で囲った部分は、各分画の代表的な細胞の拡大写真である。
【図３】ＦＳＣ−ＤＮＡ含量プロット各分画における細胞数の定量を示す図である。棒グラフの１〜７で表される数字は、図１Ｄ及び図２におけるＦＳＣ−ＤＮＡ含量プロットにおける各分画の数字と対応する。
【図４】精巣障害性化学物質を投与したラットを用いた各精巣細胞分画の細胞数を示す図である。Ａはシクロホスファミドを２週間経口投与したもの、Ｂはエチニルエストラジオールを４週間経口投与したもの、Ｃはハロペリドールを４週間経口投与したものを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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