(57)【要約】【課題】遺伝子操作にて得られるＨＳＡにおいて、培地中の夾雑物質、産生宿主の含有物、分泌・産生物などのＨＳＡ含有画分中に存在する夾雑物質を除去する。【解決手段】遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をｐＨ２〜５、塩濃度０．４〜１Ｍの条件下でアルキル基型の疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．３Ｍの条件下で溶出する工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法。得られたＨＳＡは極めて高純度であり、特にフェノール硫酸法により検出可能な遊離の夾雑物質に由来する各種副作用を回避することができる。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンであって、フェノール硫酸法により検出可能な遊離の夾雑物質の含有量が、ヒト血清アルブミン２５０ｍｇ当たり１μｇ以下であることを特徴とするヒト血清アルブミン。
【請求項２】
遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンをｐＨ２〜５、塩濃度０．４〜１Ｍの条件下でアルキル基型の疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．３Ｍの条件下で溶出する工程を含むことを特徴とする請求項１記載のヒト血清アルブミンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子操作により得られる、新規な性状を有するヒト血清アルブミンおよびそのヒト血清アルブミンを得るための一手法であるヒト血清アルブミンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルブミン、特にヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持する責を負う。また、種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持っている。
【０００３】
ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に関連するいくつかの症状を改善させる。低蛋白血症や胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とすることがある。
【０００４】
したがって、ＨＳＡを投与する基本的な治療上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を治療する点に存する。
【０００５】
現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の分画からの産物として製造されている。この製造法の欠点は不経済であることと、血液の供給が困難であるということである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質を含んでいることがある。したがって、ＨＳＡの代替の原料を開発することが有益となろう。
【０００６】
ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によって、多種のポリペプチドの微生物による生産が可能となった。ＨＳＡにおいても、遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製する技術が確立されつつある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、遺伝子操作においては、産生宿主の培養時、ＨＳＡの精製時などに、培地中の或種の成分、微生物の分泌・産生物などが遊離状態または他の成分との結合状態で、ＨＳＡ含有画分中に夾雑物質として存在することになる。これらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡには夾雑してこなかった成分であり、かかる成分の除去は遺伝子操作により得られるＨＳＡに独特の問題点であり、これに対応するための新たな精製手段が要求される。
【０００８】
したがって、本発明が解決すべき課題は、遺伝子操作により得られ、かつ産生宿主関連あるいはその他の夾雑物質を除去したＨＳＡを提供することにある。本発明が解決すべき他の課題は、上記ＨＳＡの製造方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる実情下に鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得られるＨＳＡを回収するに際して、当該ＨＳＡの精製工程において、特定の条件下で疎水性クロマト処理を行うことにより、フェノール硫酸法で検出可能な遊離の夾雑物質が充分に除去された高純度のＨＳＡを提供できることを見出し、本発明を完成した。なお、遺伝子操作により得られる高純度ＨＳＡは新規物質である。また、フェノール硫酸法で検出可能な遊離の夾雑物質が充分に除去されることは、これら夾雑物質に起因する各種副作用を回避し、安全なＨＳＡ製剤を提供することに意義を有するものである。
【００１０】
本発明は、下記の要旨を有するものである。
▲１▼　遺伝子操作により得られるＨＳＡであって、フェノール硫酸法により検出可能な遊離の夾雑物質の含有量が、ＨＳＡ２５０ｍｇ当たり１μｇ以下であることを特徴とするＨＳＡ。
▲２▼　遺伝子操作により得られるＨＳＡをｐＨ２〜５、塩濃度０．４〜１Ｍの条件下でアルキル基型の疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．３Ｍの条件下で溶出する工程を含むことを特徴とするＨＳＡの製造方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ
本発明において用いられる遺伝子操作により得られるＨＳＡは、遺伝子操作によって得られるのであれば、その由来に特に制限はない。したがって、当該ＨＳＡを産生させるためのＨＳＡ産生宿主は、遺伝子操作を経て調製されたものであれば特に限定されず、公知文献記載のものの他、今後開発されるものであっても適宜利用することができる。当該宿主としては、具体的には遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性とされた菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌など）、動物細胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主として、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）〕を使用して得られたＨＳＡが好ましい。また、栄養要求性株や抗生物質感受性株を使用して得られたＨＳＡであってもよい。さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株（ａ，　ｈｉｓ　４，　ｌｅｕ　２，　ｃａｎ　１）、ピキア・パストリスＧＴＳ１１５株　（ｈｉｓ　４）などを使用して得られたＨＳＡが好適に用いられる。
【００１２】
本発明において、ＨＳＡ産生宿主の調製方法およびその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳＡの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法としては、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭５８−５６６８４号、同５８−９０５１５号、同５８−１５０５１７号の各公報）、新規なヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５号、特開平１−９８４８６号の各公報）、合成シグナル配列を用いる方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させる方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ２プロモーターを用いる方法（特願平３−６３５９８号、同３−６３５９９号の各公報）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特開昭６０−４１４８７号、同６３−３９５７６号、同６３−７４４９３号の各公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現（特開平２−１０４２９０号公報）などが例示される。
【００１３】
このうち、メタノール含有培地中で変異を起こさせる方法は、具体的には以下のように行われる。すなわち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的にはＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）のＡＯＸ１遺伝子領域に常法によりＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラスミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度としては、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。
【００１４】
また、ＨＳＡ産生宿主の培養方法（すなわち、ＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対する高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る方法（特願平１−２１９５６１号公報）、培地中に脂肪酸を添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１７１９号公報）などが例示される。
【００１５】
さらにＨＳＡの分離採取方法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを用いてＨＳＡと着色成分とを分離することによる着色抑制方法（特開平４−５４１９８号公報）などが例示される。
【００１６】
形質転換宿主の培養に用いられる培地は、通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸またはその塩を添加したものが好適に使用され、培養条件は一般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕなどが使用される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イーストナイトロジエンのベース（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース〕などが挙げられる。また、天然培地としては、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％グルコース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基性、弱酸性でよい。また、メタノール資化性宿主の場合は、メタノール含有培地を用いることができる。この場合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。
【００１７】
培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では３７℃程度が好ましい。
【００１８】
培養終了後、ＨＳＡは培養濾液、菌体、細胞などからそれぞれ公知の分離手段により採取される。
【００１９】
（２）ＨＳＡの精製
本発明のＨＳＡの精製工程としては、各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度勾配遠心分離法、透析などの公知の方法が採用される。
当該精製工程としては、例えば以下の▲１▼〜▲７▼を含む工程が好適に挙げられる。
▲１▼　ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分子量１０万〜５０万、および１０００〜５万の限外濾過膜を用いて処理する。
▲２▼　５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。
▲３▼　ｐＨ３〜５で酸処理する。
▲４▼　分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処理する。
▲５▼　ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で陽イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ８〜１０、塩濃度０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。
▲６▼　ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収する。そして
▲７▼　ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。
【００２０】
また、前記工程▲６▼の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で溶出する工程、または前記工程▲７▼の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出する工程、さらには前記工程▲５▼と▲６▼の間、▲６▼と▲７▼の間、または▲７▼の後に、ｐＨ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱画分を回収する工程をさらに含むものであってもよい。
【００２１】
（３）ＨＳＡの脱色
ＨＳＡの脱色工程は、上記精製工程において、特に好ましくはその最後に組み込まれ、特定のリガンド部を有するキレート樹脂とＨＳＡを接触させることにより行われる。
【００２２】
キレート樹脂の担体部分は疎水性を有する担体であることが好ましく、例えばスチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体などが挙げられる。
【００２３】
一方、リガンド部は、Ｎ−メチルグルカミン基などのポリオール基、イミノ基、アミノ基、エチレンイミノ基などを分子内に複数個有するポリアミン基（この中にはポリエチレンポリアミンなどのポリアルキレンポリアミン基も含まれる）、およびチオ尿素基が挙げられる。上記担体部分とリガンド部を有するキレート樹脂の市販品としては、担体部分がいずれもスチレンとジビニルベンゼンの共重合体であるＤＩＡＩＯＮ　ＣＲＢ０２（リガンド部；Ｎ−メチルグルカミン基、三菱化成製）、ＤＩＡＩＯＮ　ＣＲ２０（リガンド部；−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＨ、三菱化成製）、ＬＥＷＡＴＩＴ　ＴＰ２１４（リガンド部；−ＮＨＣＳＮＨ２、バイエル製）、アンバライトＣＧ４０００が好適に使用される。
【００２４】
当該キレート樹脂による処理条件は、好適には次の通りである。
ｐＨ条件：酸性または中性（ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜７）
時間：１時間以上、好ましくは６時間以上
イオン強度：５０ｍｍｈｏ以下、好ましくは１〜１０ｍｍｈｏ
混合比：ＨＳＡ２５０ｍｇに対して樹脂０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ（湿重量）
【００２５】
（４）本発明における疎水性クロマト処理
上記工程（▲１▼〜▲７▼およびキレート樹脂処理を含む）を経て得られたＨＳＡにおいては、フェノール硫酸法で検出可能な遊離の夾雑物質が充分に除去されていない。
【００２６】
そこで、これらの処理終了後に得られるＨＳＡを、ｐＨ２〜５（好ましくは、ｐＨ３〜４）、塩濃度０．４〜１Ｍ（好ましくは、０．４〜０．７Ｍ）の条件下で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜８（好ましくは、ｐＨ６．５〜７）、塩濃度０．０１〜０．３Ｍ（好ましくは、０．０５〜０．２Ｍ）の条件下で溶出する工程を組み合わせる。または、前記の工程▲６▼の代わりに当該疎水性クロマト処理工程を組み合わせる。こうして、フェノール硫酸法で検出可能な遊離の夾雑物質が充分に除去されたＨＳＡを回収することができる。
【００２７】
ここにフェノール硫酸法とは、一般的には糖質の比色定量法の一つであり、検体である糖水溶液にフェノール水溶液を添加し、次いで濃硫酸を添加して振盪することにより生ずる溶解熱を利用して糖から形成されるフルフラール誘導体とフェノールとの反応呈色物を比色測定する方法である。また、フェノール硫酸法で検出可能な夾雑物質としては、例えば中性糖（ペントース、ヘキソースなど）、単糖グリコシド（オリゴ糖、複合糖質、ウロン酸など）、メチル化糖などの、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体反応を起こさない非抗原性の夾雑物質が例示される。
【００２８】
疎水性クロマト用担体としては、炭素数４〜１８のアルキル基型（例：ブチル基型、オクチル基型、オクチルデシル基型など）、フェニル基型などが例示される。ブチル基型としては、ブチル−アガロース、ブチル−ポリビニル（商品名ブチル−トヨパール、東ソー社製）などが、オクチル基型としては、オクチル−アガロースなどが、オクチルデシル基型としては、オクチルデシル−アガロースなどが、フェニル基型としては、フェニル−セルロース（商品名フェニルセロファイン、生化学工業社製）などが例示される。
【００２９】
また、上記の疎水性クロマト処理を行わずとも、固定化ＣｏｎＡ処理（例えば、ＣｏｎＡ−セファロースなど）によっても、本発明のＨＳＡ、すなわちフェノール硫酸法で検出可能な遊離の夾雑物質が充分に除去されたＨＳＡを得ることができる。
【００３０】
（５）精製された遺伝子操作由来のＨＳＡの性状
本発明のＨＳＡは、分子量約６万７千、等電点４．６〜５．０の単一物質である。当該ＨＳＡは、単量体のみからなり、二量体、重合体または分解物を実質的に含まない。具体的には、二量体、重合体および分解物の全含有量は０．０１％以下程度である。また、産生宿主に由来する夾雑成分（例えば、蛋白質、多糖成分など）を実質的に含まない。より詳細には（正確には）産生宿主由来の夾雑成分のうち、抗原性を有するものを実質的に含まない。具体的には、本発明のＨＳＡとしては、ＨＳＡ２５％溶液の場合で、夾雑成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下のものが例示される。また、本発明のＨＳＡとしては、多糖成分が１ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以下のものが例示される。結果的にＨＳＡの純度としては９９．９９９９９９％以上、好ましくは９９．９９９９９９９％以上のものが例示される。当該ＨＳＡの着色度としてはＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ３５０／Ａ２８０が０．０１〜０．０５、Ａ４５０／Ａ２８０が０．００１〜０．０２、Ａ５００／Ａ２８０が０．００１〜０．００５程度が例示される。また、ＨＳＡに結合している脂肪酸量がＨＳＡ１分子当たり１分子以下、好ましくは０．１分子以下のものが例示される。
【００３１】
特に本発明のＨＳＡは、フェノール硫酸法により検出可能な遊離の夾雑物質をＨＳＡ２５０ｍｇ当たり１μｇ以下しか含有しないことを特徴とする。当該夾雑物質のうち非抗原性のものは、産生宿主由来成分に対する抗体とは抗原抗体反応を起こさない。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のＨＳＡは、フェノール硫酸法により検出可能な遊離の夾雑物質に由来する各種副作用を回避することができる。したがって、安全なＨＳＡ製剤を提供することができる。また、本発明の方法によれば、遺伝子操作により得られるＨＳＡにおいて、培地中の或種の夾雑物質、微生物（産生宿主）が含有または分泌する物質などのＨＳＡ含有画分中に存在する夾雑物質、特にフェノール硫酸法により検出可能な遊離の夾雑物質を充分に除去することができる。したがって、本発明方法により得られるＨＳＡは極めて高純度であり、本発明のＨＳＡを得ることができる。
【００３３】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３４】
参考例１
（１）使用菌株：Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　ＧＣＰ１０１株
特開平２−１０４２９０号公報に記載の方法により、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ１遺伝子領域に、ＡＯＸ１プロモーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つプラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換して、ＰＣ４１３０が得られる。この株はＡＯＸ１遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。
【００３５】
ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコース）３ｍｌに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ５４０＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。３日間３０℃で培養後に初期ＯＤ５４０＝０．１となるようにＹＰＤ培地５０ｍｌに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰り返した。継代毎に菌体を１０７ｃｅｌｌｓ／ｐｌａｔｅになるように滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ（メタノール）−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベースウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株はほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわち、このプレートではコロニーが生じるということはメタノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートに拡げ、シングルコロニーに単離した。その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。
【００３６】
（２）菌株の培養
（前々培養）
グリセロール凍結ストック菌株１ｍｌを２００ｍｌのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００ｍｌ容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養した。
【００３７】
【表１】
2004002449.tif 000002
【００３８】
（前培養）
ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施しなかった。
【００３９】
（本培養）
バッチ培養用培地（表２）２５０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンターを用いて通気攪拌培養した。槽内圧を０．５ｋｇ／ｃｍ２、最大通気量を８００Ｎ−Ｌ／ｍｉｎとして溶存酸素濃度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持するように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。回分培養において培地中のグリセロールが消費された時点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中にメタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加することにより、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤（Ａｄｅｃａｎｏｌ、旭電化工業製）を回分培養開始時に０．３０ｍｌ／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加することで実施した。
【００４０】
【表２】
2004002449.tif 000003
【００４１】
【表３】
2004002449.tif 000004
【００４２】
参考例２
参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモーター　［変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（ＴＥＡＳＴ，　５，　１６７−１７７　（１９８８）またはＭｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　Ｂｉｏｌ．，　９，　１３１６−１３２３　（１９８９））中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴからＣに変異したもの］を用いてＨＳＡ発現用プラスミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号公報）。参考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産生させた。
【００４３】
参考例３
［ｉ］培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ）
参考例１ないしは参考例２で得られた培養液約８００Ｌを圧搾することにより培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分画（Ｉ）〕。
【００４４】
続いて、６０℃、３時間の加熱処理を行った。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、１０ｍＭシステイン、１００ｍＭアミノグアニジンの共存下にｐＨ７．５で行った。加熱処理液を急速に約１５℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いてアルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換した。
【００４５】
［ｉｉ］陽イオン交換体処理
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにアルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。
【００４６】
［ｉｉｉ］疎水性クロマト処理
Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファインを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミンはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮するとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。
【００４７】
［ｉｖ］陰イオン交換体処理
疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったアルブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロースに吸着することなく、カラムを通過した。
【００４８】
［ｖ］ＨＳＡの塩析処理
５％濃度のＨＳＡに塩化ナトリウムを添加して最終濃度１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡを沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不純物を除去した。
【００４９】
［ｖｉ］脱色処理
２５％濃度の精製ＨＳＡ１ｍｌにＤＩＡＩＯＮ　ＣＲＢ０２（担体部分はスチレン−ジビニルベンゼン共重合体、リガンド部分はＮ−メチルグルカミン基からなるキレート樹脂，三菱化成製）１ｇを加え、ｐＨ６．８、イオン強度５ｍｍｈｏの条件下、室温で２４時間攪拌した。樹脂を蒸留水で洗浄し、非吸着画分をＨＳＡとして回収した。
【００５０】
実施例１
参考例１（または参考例２）および参考例３（但し、［ｖ］のＨＳＡの塩析処理を除く）を経て調製された酵母由来ＨＳＡ含有水溶液に塩化ナトリウムを最終濃度０．５Ｍとなるように添加し、ｐＨを３．５に調整してフェニルセルロファイン充填カラムにアプライした。０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ３．５）で洗浄後に０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。
【００５１】
実験例１
参考例３の各精製工程のうち表４の例１〜６に示される工程を経て得られたＨＳＡについて、下記の項目の測定を行った。なお例６において、固定化ＣｏｎＡ処理は、ＣｏｎＡ−セファロース（ファルマシア社製）を用いて処理した。
▲１▼　フェノール硫酸法による遊離の夾雑物質量の測定
各ＨＳＡ中の遊離の夾雑物質量を、公知の手法に従ってフェノール硫酸法で測定した。まず、各ＨＳＡを直接フェノール硫酸法で測定して、夾雑物質の総量（すなわち、遊離状態のものおよび非遊離状態のものの合計量）を算出した。一方、同じく各ＨＳＡをＣｏｎＡ−セファロース（ファルマシア社製）で処理して、パス画分であるＨＳＡをフェノール硫酸法で測定し、夾雑物質量（非遊離状態のもの）を算出した。両者の測定量の差が、遊離状態の夾雑物質量を意味する。標準曲線はマンナンを標準品として用いて作成した。以上の結果を表４に示す。
【００５２】
▲２▼　非抗原性であることの確認
ＨＳＡ非産生酵母の培養上清を本発明方法と同様の方法で粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて精製ＨＳＡ溶液中に存在する酵母由来成分の検出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で行った。検体はＨＳＡ濃度として２５％（２５０ｍｇ／ｍｌ）に調整したものを用いて測定した。本発明の疎水クロマト処理前後におけるＨＳＡは、ともに０．１ｎｇ／ｍｌの検出限界において酵母由来成分が検出されなかった。
【００５３】
【表４】
2004002449.tif 000005