(57)【要約】【課題】ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の用途を提供することを課題とする。【解決手段】新規なヒトＡＭＰＫファミリーのメンバーを同定し、それをＡＲＫ５（ＡＭＰＫ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｋｉｎａｓｅ　５：ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５）と名付けた。栄養飢餓中、ＡＲＫ５は、Ａｋｔ依存に細胞の生存を支持した。また、ヒト膵臓癌細胞系ＰＡＮＣ−１と比較して、ＰＡＮＣ−１に対しＡＲＫ５が安定的にトランスフェクトされたＰＡＮＣ−１細胞系（Ｐ／ＡＲＫ細胞系）は、インビトロ転移活性の２倍超の増加を示した。ヌードマウスにおいて、Ｐ／ＡＲＫ細胞系は、移植から１２週間後に腫瘍増殖の１０倍超の増加を示し、移植された腫瘍巣内の壊死区域が、Ｐ／ＡＲＫ細胞系においては親ＰＡＮＣ−１細胞と比較して有意に減少していた。さらに、Ｐ／ＡＲＫ細胞系を移植されたヌードマウスには、筋肉浸潤及び腸管膜転移が顕著に観察された。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡ
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５およびドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡを含むベクター
【請求項２】
ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現を抑制するためのヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または、それらを含むベクターを有効成分として含有する、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを治療または予防するための薬剤。
【請求項３】
ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞。
【請求項４】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞にストレスを与え、細胞死を誘導する工程、
（ｄ）細胞死が誘導された細胞数を測定する工程、
を含み、上記細胞死が誘導された細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定され、減少する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
【請求項５】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）請求項３に記載の細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）移動した細胞数を測定する工程、
を含み、上記移動した細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
【請求項６】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程、
を含み、上記ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
【請求項７】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ
ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
【請求項８】
被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験試料の存在下で、ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとを接触させる工程、
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとの結合を検出する工程、
を含み、上記結合が、被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、抑制される場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
【請求項９】
以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制する試料のスクリーニング方法。（ａ）請求項４〜８のいずれかに記載の評価方法により、複数の被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する工程（ｂ）複数の被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料を選択する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制する試料のスクリーニング方法。（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）請求項４〜８のいずれかに記載の評価方法により、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料を選択する工程
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の工程に、さらに細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１２】
ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１２に記載の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を対照と比較する工程
【請求項１４】
ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５、または、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１４に記載の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を対照と比較する工程
【請求項１６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１４に記載の検査方法。
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
【請求項１７】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１４に記載の検査方法。
（ａ）被検者からｃＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ｃＤＮＡ試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするｃＤＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する工程
【請求項１８】
ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査薬。
【請求項１９】
ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に結合する抗体を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞ホメオスタシスは、細胞増殖と細胞死と細胞生存との間の絶妙のバランスを示し、従って、腫瘍形成は、細胞ホメオスタシスのバランス崩壊の所産であると考えられる（Ｗｙｌｌｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｔ．　Ｒｅｖ．　Ｃｙｔｏｌ．　１９８０，　６８，　２５１−３０６）。腫瘍の細胞増殖及び細胞生存はいずれも、基本的には、血中から供給される栄養、特にグルコースと、酸素とによって維持されており、従って、アンバランスな栄養供給及び無秩序な腫瘍細胞増殖により、腫瘍組織の中心では壊死性の細胞死が誘発される（Ｄａｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｍｅｎｚａ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１９９９，２４，　６８−７１；Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１９９７，　３，　１７７−１８２；Ｓｏｕｔｈｅｒｌａｎｄ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９８８，　２４０，　１７８−１８４）。最近、本発明者らは、ヒト肝癌細胞系及びヒト正常繊維芽細胞系を含む大部分の細胞系が、グルコース飢餓条件下で細胞死を起こすことを証明した（Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７；Ｅｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。興味深いことに、膵臓癌細胞系ＰＡＮＣ−１のようないくつかの腫瘍細胞が、臨床的血管造影における低血管（ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒ）所見と一致して、グルコース飢餓に対する高い抵抗性を示すことが証明され（Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７）、そしてその抵抗性はＡＭＰＫ活性に依存していることが見出された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。さらに、抵抗性は低酸素条件によっても開始し、それもＡＭＰＫ活性に依存している（Ｅｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。
【０００３】
ＡＭＰＫは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼファミリーに属するＳＮＦ−１（ｓｕｃｒｏｓｅ−ｎｏｎ−ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）のヒトホモログであり、代謝ストレス、低酸素、熱ショック、及び虚血の下にある細胞において活性化されることが、よく証明されている（Ｃａｒｌｓｏｎ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９９９，　２，　２０２−２０７；Ｈａｒｄｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９８，　６７，　８２１−８５５）。ＳＮＦ−１／ＡＭＰＫファミリーは、哺乳動物を含むいくつかの種において高度に保存されており（Ｂｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９６，　２３５，　７３６−７４３；Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　　２０００，　６３，　４６−５９；Ｈｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｄｅｖ．　１９９７，　４７，　１４８−１５６；Ｉｎｇｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍａｍｍ．　Ｇｅｎｏｍｅ　１９９３，　４，　４０１−４０３；Ｒｕｉｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｃｈ．　Ｄｅｖｅｌ．　１９９４，　４８，　１５３−１６４；Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　１９９９，　４５３，　１３５−１３９）、ＡＭＰＫのαサブユニットが触媒サブユニットであることが既知である（Ｈａｒｄｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９８，　６７，　８２１−８５５）。現在までに、４種のタンパク質、ＡＭＰＫ−α１及びα２（Ａｇｕａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅ　　１９９４，　１４９，　３４５−３５０；Ｃａｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９８９，　１８６，　１２９−１３６；Ｄａｖｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９８９，　１８６，　１２３−１２８；Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９６，　６１１−６１４）、ＭＥＬＫ（マウスタンパク質／Ｈｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｒｅｐｒｏｄ．　Ｄｅｖ．　１９９７，　４７，　１４８−１５６）、及びＳＮＡＲＫ（ラットタンパク質／Ｌｅｆｅｂｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２００１，　３５５，　２９７−３０５）がＡＭＰＫファミリーの触媒サブユニットとして同定されている。ＡＭＰＫ活性化はＴｈｒ１７２のリン酸化により開始することが報告されているが（Ｈａｗｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９６，　２７１，　２７８７９−２７８８７）、いかにしてリン酸化が開始するかは、未だ不明である。
【０００４】
癌抑制遺伝子ＡＴＭは、神経学的変性及び癌素因を伴うヒト遺伝性疾患、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ（毛細血管拡張性運動失調）の研究中に単離された（Ｌａｖｉｎ，　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２０００，　２，　２１５−２１７；Ｌａｖｉｎ　ａｎｄ　Ｓｈｉｌｏｈ，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９７，　１５，　１７７−２０２；Ｓａｖｉｔｓｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９５，　２６８，　１７４９−１７５３）。ＡＴＭは、ホスファチジルイノシトールキナーゼファミリーに属し、ＤＮＡ二本鎖切断に対する細胞応答中に、そのＳｅｒ１５及びＳｅｒ２０におけるリン酸化を介して癌抑制遺伝子ｐ５３を活性化するという特徴を有する（Ｂａｎｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８，　２８１，　１６７４−１６７７；Ｃａｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８；Ｓｈｅｉｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１９９７，　９１，　３２５−３３４）。いくつかの研究が、ＤＮＡ損傷による細胞応答にＡＴＭ／ｐ５３経路が密接に関与していることを報告しているが、ＡＴＭ／ｐ５３経路の制御の分子的メカニズムは解明されていない。例えばＡＴＭ活性化は、遺伝学的損傷及び非遺伝学的損傷の両方による細胞応答に関与しているが、いかなる因子がＡＴＭリン酸化を刺激するのかは不明である。
【０００５】
細胞生存も、腫瘍細胞維持に不可欠の系の一つもあり、セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔが、細胞生存因子として同定されている（Ｄａｔｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１９９９，　１３，　２９０５−２９２７）。細胞生存シグナル伝達において、ＰＩ−３Ｋにより活性化が開始するＡｋｔは、Ｂａｄ（Ｄａｔｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１９９７，　９１，　２３１−２４１；Ｐｅｓｏｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９７，　２７８，　６８７−６８９）、カスパーゼ９（Ｃａｒｄｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８，　２８２，　１３１８−１３２１）、Ｆｏｒｋｈｅａｄ（Ｂｒｕｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１９９９，　９６，　８５７−８６８）、及びＭｄｍ２（Ｍａｙｏ　ａｎｄ　Ｄｏｎｎｅｒ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００１，　９８，　１１５９８−１１６０３）をリン酸化することが知られている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＡＭＰＫファミリーに属するタンパク質およびその機能を同定し、該タンパク質の利用方法を提供することにある。より詳細には、ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の用途を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、推定分子量７４ｋＤａの６６１アミノ酸をコードする新規なヒトＡＭＰＫファミリーのメンバーを同定し、それをＡＲＫ５（ＡＭＰＫ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｋｉｎａｓｅ　５：ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５）と名付けた。ＡＲＫ５は、５９５〜６００ａａに推定Ａｋｔリン酸化モチーフを有し、Ｓｅｒ６００が活性型Ａｋｔによりリン酸化され、それにより共通のＡＭＰＫ　基質であるＳＡＭＳ−ペプチドに対するキナーゼ活性が活性化されることが見出された。さらに、Ａｋｔ１により活性化されたＡＲＫ５が、ＡＴＭをリン酸化することも判明した。また、栄養飢餓中、ＡＲＫ５は、Ａｋｔ依存に細胞の生存を支持することが判明した。一方、ヒト膵臓癌細胞系ＰＡＮＣ−１と比較して、ＰＡＮＣ−１に対しＡＲＫ５が安定的にトランスフェクトされたＰＡＮＣ−１細胞系（Ｐ／ＡＲＫ細胞系）は、インビトロ転移活性の２倍超の増加を示した。また、該インビトロ転移活性は、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ経路に依存していることが見出された。Ｐ／ＡＲＫ細胞系においては、有意に高い栄養飢餓に対する抵抗性、並びに活性型のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の培地中への分泌の増加が観察されたが、ＰＡＮＣ−１細胞系においては観察されなかった。さらに、Ｐ／ＡＲＫ細胞系は、ＭＴ１−ＭＭＰの発現を示し、それにより、浸潤におけるＭＭＰの重要な役割が示された。ヌードマウスにおいて、Ｐ／ＡＲＫ細胞系は、移植から１２週間後に腫瘍増殖の１０倍超の増加を示し、移植された腫瘍巣内の壊死区域が、Ｐ／ＡＲＫ細胞系においては親ＰＡＮＣ−１細胞と比較して有意に減少していた。さらに、Ｐ／ＡＲＫ細胞系を移植されたヌードマウスには、筋肉浸潤及び腸管膜転移が顕著に観察された。
【０００８】
以上の結果から、ＡＲＫ５は、栄養飢餓などの細胞死を導くストレスから細胞を保護する薬剤として利用できることが判明した。また、ＡＲＫ５阻害剤は、腫瘍などの疾患の治療や予防に使用できることが判明した。さらに、ＡＲＫ５を指標とすることで、腫瘍などの疾患の検査が可能になることが判明した。
【０００９】
即ち、本発明は、ＡＲＫ５の用途に関し、以下の〔１〕〜〔１９〕を提供するものである。
〔１〕　以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分として含有する、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡ
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５およびドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡを含むベクター
〔２〕　ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現を抑制するためのヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または、それらを含むベクターを有効成分として含有する、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを治療または予防するための薬剤。
〔３〕　ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞。
〔４〕　被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔３〕に記載の細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞にストレスを与え、細胞死を誘導する工程、
（ｄ）細胞死が誘導された細胞数を測定する工程、
を含み、上記細胞死が誘導された細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定され、減少する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される方法。
〔５〕　被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）〔３〕に記載の細胞を提供する工程、
（ｂ）該細胞に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）移動した細胞数を測定する工程、
を含み、上記移動した細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
〔６〕　被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に被験試料を接触させる工程、
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程、
を含み、上記ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
〔７〕　被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５遺伝子のプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する工程、
（ｂ）該細胞または該細胞抽出液に被験試料を接触させる工程、
（ｃ）該細胞または該細胞抽出液における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、
を含み、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ
ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
〔８〕　被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法であって、
（ａ）被験試料の存在下で、ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとを接触させる工程、
（ｂ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５とＡｋｔとの結合を検出する工程、
を含み、上記結合が、被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、抑制される場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される方法。
〔９〕　以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制する試料のスクリーニング方法。
（ａ）〔４〕〜〔８〕のいずれかに記載の評価方法により、複数の被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する工程
（ｂ）複数の被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料を選択する工程
〔１０〕　以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制する試料のスクリーニング方法。
（ａ）ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に複数の被験試料を接触させる工程
（ｂ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と被験試料との結合を検出する工程
（ｃ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料を選択する工程
（ｄ）〔４〕〜〔８〕のいずれかに記載の評価方法により、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する工程
（ｅ）該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５と結合する被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料を選択する工程
〔１１〕　〔９〕または〔１０〕に記載の工程に、さらに細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
〔１２〕　ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法。
〔１３〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１２〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の活性または活性型ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を対照と比較する工程
〔１４〕　ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５、または、該ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法。
〔１５〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１４〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からタンパク質試料を調製する工程
（ｂ）該タンパク質試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を測定する工程
（ｃ）測定されたＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５の量を対照と比較する工程
〔１６〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１４〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からＲＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ＲＮＡ試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＲＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたＲＮＡの量を対照と比較する工程
〔１７〕　以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、〔１４〕に記載の検査方法。
（ａ）被検者からｃＤＮＡ試料を調製する工程
（ｂ）該ｃＤＮＡ試料に含まれるＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするｃＤＮＡの量を測定する工程
（ｃ）測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する工程
〔１８〕　ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査薬。
〔１９〕　ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５に結合する抗体を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、ＡＭＰ活性化タンパク質リン酸化酵素（ＡＭＰＫ）ファミリーに属するＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５（ＡＲＫ５）を単離し、該ＡＲＫ５の機能を同定した。本発明は、この知見に基づくものである。
【００１１】
本発明は、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ、ＡＲＫ５およびドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡ、または、それらＤＮＡを含むベクターを有効成分として含有する、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤を提供する。
【００１２】
上記ストレスとしては、好ましくは、細胞死を誘導するストレスである。このような細胞死を誘導するストレスとしては、特に制限はなく、低酸素ストレス、低栄養ストレス、代謝ストレス、熱ストレス、または、虚血ストレスなどが例示できる。
【００１３】
本発明の細胞にストレス耐性を賦与する薬剤が適用可能な疾患としては、例えば低酸素ストレス、低栄養ストレス、代謝ストレス、熱ストレス、または、虚血ストレスなどが関与している疾患が挙げられる。より具体的には、心筋梗塞、脳血栓等による虚血性脳疾患などが例示できるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の細胞にストレス耐性を賦与する薬剤は、移植用臓器の庇護剤としても使用しうる。
【００１４】
本発明における細胞にストレス耐性を賦与する薬剤に含有されるＡＲＫ５が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられる。
【００１５】
ヒトＡＲＫ５のｃＤＮＡの塩基配列および該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例を、それぞれ、配列番号：１および配列番号：２に示す。
【００１６】
本発明におけるＡＲＫ５をコードするＤＮＡには、ＡＲＫ５（例えば配列番号：２）と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、ＡＲＫ５の変異体、アレル、バリアント、ホモログ等をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるＤＮＡが、ＡＲＫ５（例えば配列番号：２）と同等の生物学的機能や生化学的機能（活性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることを意味する。例えば、ＡＲＫ５（例えば配列番号：２）と同等なストレス耐性能やリン酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のＡＲＫ５をコードするＤＮＡに含まれる。
【００１７】
対象となるＤＮＡがＡＲＫ５（例えば配列番号：２）と同等なストレス耐性能を有するか否かは、例えば、該ＤＮＡが導入された細胞のグルコース飢餓への耐性度を評価することで判定することができる。また、対象となるＤＮＡがＡＲＫ５（例えば配列番号：２）と同等なリン酸化活性を有するか否かは、例えば、該ＤＮＡからコードされるタンパク質によるＡＴＭに対するリン酸化活性、または、ＳＡＭＳペプチドに対するリン酸化活性を評価することで判定することができる。
【００１８】
あるＤＮＡからコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｇｅｎｅ　１５２，　２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，　ＭＪ，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｍ．（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１００，　４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９８４）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ　Ｗ，　ａｎｄ　Ｆｒｉｔｚ　ＨＪ（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４，　３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　８２，　４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ　（１９８８）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　８５，　２７６３−２７６６）などを用いて、ＡＲＫ５（例えば配列番号：２）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製することができる。
【００１９】
また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ＡＲＫ５（例えば配列番号：２）のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなり、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＡＲＫ５をコードするＤＮＡに含まれる。
【００２０】
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
【００２１】
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，　Ｄ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　（１９８４）　８１，　５６６２−５６６６　、Ｚｏｌｌｅｒ，　Ｍ．　Ｊ．　＆　Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　（１９８２）　１０，　６４８７−６５００　、Ｗａｎｇ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４，　１４３１−１４３３　、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　（１９８２）　７９，　６４０９−６４１３）。
【００２２】
ＡＲＫ５のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質には、これらタンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これらタンパク質と他のペプチドやポリペプチドとが融合したものである。
【００２３】
また、あるＤＮＡからコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ．，　９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　ｐｒｅｓｓ，　１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者においては、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ配列（例えば配列番号：１）もしくはその一部を利用して、これと相同性の高いＤＮＡを単離することは、周知の技術である。
【００２４】
また、本発明におけるＡＲＫ５コードするＤＮＡには、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：１）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＡＲＫ５と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。
【００２５】
ＡＲＫ５と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ　、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２６】
また、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡの配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、ＡＲＫ５と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離することも可能である。
【００２７】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードする、ＡＲＫ５と機能的に同等なタンパク質は、通常、ＡＲＫ５とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のＡＲＫ５をコードするＤＮＡには、ＡＲＫ５（例えば配列番号：２）と機能的に同等であり、かつ該タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。
【００２８】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３−５８７７，　１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，　１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ　＝　１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ　＝　１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ　＝　５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ　＝　３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００２９】
また、本発明におけるＡｋｔとは、セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡｋｔを意味する。ＡｋｔのｃＤＮＡの塩基配列および該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例を、それぞれ、配列番号：３および配列番号：４に示す。
【００３０】
本発明において、ドミナントアクティブ型のＡｋｔは、例えば、文献（Ｃｒｏｓｓ，　Ｄ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　　３７８：　７８５−７８９　（１９９５）；　Ｋｏｈｎ，　Ａ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．２７１：　３１３７２−３１３７８　（１９９６））等に記載の方法に従って作製できる。ドミナントアクティブ型のＡｋｔのｃＤＮＡの塩基配列および該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例を、それぞれ、配列番号：５および配列番号：６に示す。
【００３１】
本発明において、ＡＲＫ５またはドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡを、生体内で該ＤＮＡの発現を保証するベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入することができる。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ＡＲＫ５またはドミナントアクティブ型のＡｋｔをコードするＤＮＡをベクターへ挿入する操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ　ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ　ｖｉｖｏ法であってもよい。本発明においては、上記の方法により、細胞にストレス耐性を賦与するための遺伝子治療を行うことが可能である。
【００３２】
また、本発明は、ＡＲＫ５の発現を抑制するためのヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または、それらを含むベクターを有効成分として含有する、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ（毛細血管拡張性運動失調）を治療または予防するための薬剤を提供する。ここで、腫瘍としては、好ましくは転移性腫瘍が挙げられるが、これに限定されるものではない。腫瘍が転移性腫瘍の場合、上記薬剤は、該転移性腫瘍の浸潤または転移を抑制するために使用される。
【００３３】
本発明において、ＡＲＫ５の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体としては、特に制限はなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体が挙げられる。
【００３４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ配列（例えば配列番号：１）中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくはＡＲＫ５のＤＮＡ配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの一例を、配列番号：７に示すが、これに限定されるものではない。
【００３５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとがＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１　又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在しているものも含まれる。
【００３７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、ＡＲＫ５の産生細胞に作用して、該ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、ＡＲＫ５の発現を抑制することにより、結果的にＡＲＫ５の作用を抑制する効果を有する。
【００３８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
【００３９】
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
【００４０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
【００４１】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドやその誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調製し、好ましい量を用いることができる。
【００４２】
本発明は、ＡＲＫ５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する。
このような細胞としては、実施例に記載のＨ／ＡＲＫ５（ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ　が導入されたＨｅｐＧ２細胞）やＰ／ＡＲＫ５（ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ　が導入されたＰＡＮＣ−１細胞）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明におけるＡＲＫ５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞は、被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法、および、該評価方法を利用したスクリーニング方法に使用することができる有用な細胞である。
【００４３】
本発明におけるＡＲＫ５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞は、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡを細胞に導入することで作製することができる。また、内因性のＡＲＫ５をコードする遺伝子のプロモーター領域に変異を導入することで作製することも可能である。細胞や該細胞に導入されるＡＲＫ５が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。
【００４４】
ＡＲＫ５をコードするＤＮＡを細胞に導入する場合、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡは、発現ベクターに組み込むことが好ましい。例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＰＣ−１０細胞、Ａ５４９細胞、ＡＳＰＣ−１細胞、ＨＬＦ細胞、ＨＦ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２７７，　１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　（１９９０）　１８，　５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ　Ｉ、ｐＣＤ８などが挙げられる。
【００４５】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０　Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００４６】
本発明は、被験試料が、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する方法を提供する。
【００４７】
本発明の評価方法の一つの態様としては、まず、ＡＲＫ５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する。次いで、該細胞に被験試料を接触させる。
本発明における「被検試料」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。
【００４８】
本発明において、細胞と被験試料との接触は、例えば、細胞の培養液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＡＲＫ５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞へ導入することも可能である。
【００４９】
本発明の評価方法の一つの態様では、次いで、該細胞にストレスを与え、細胞死を誘導する。このような細胞死を誘導するストレスとしては、特に制限はなく、低酸素ストレス、低栄養ストレス、代謝ストレス、熱ストレス、または、虚血ストレスなどが例示できる。
【００５０】
本発明の評価方法の一つの態様では、次いで、細胞死が誘導された細胞数を測定する。本発明において、細胞死が誘導された細胞数を測定する方法としては、当業者に周知の方法を使用することが可能である。例えば、実施例に記載のＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２／ＰＩ染色などで評価することが可能であるが、この方法に限定されるものではない。
【００５１】
本発明の評価方法の一つの態様では、上記細胞死が誘導された細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定され、減少する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定される。
【００５２】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、ＡＲＫ５の発現が上昇するように人為的に改変された細胞を提供する。次いで、該細胞に被験試料を接触させる。
次いで、移動した細胞数を測定する。本発明において、移動した細胞数は、当業者に周知の方法で測定することが可能である。例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ−Ｃｏａｔｅｄ　Ｉｎｖａｔｉｏｎ　Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において、マトリゲル層を通り下方のチャンバーの底へ移動する細胞数を、位相差顕微鏡を用いて計測することが可能であるが、この方法に制限されるものではない。
【００５３】
本発明の評価方法の別の態様では、上記移動した細胞数が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される。
【００５４】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、ＡＲＫ５に被験試料を接触させる。用いられるＡＲＫ５の状態としては、特に制限はなく、例えば、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【００５５】
また、本発明の評価方法に用いられるＡＲＫ５が由来する生物種としては、特定の生物種に限定されるものではなく、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどが挙げられる。ＡＲＫ５が発現している細胞としては、内在性のＡＲＫ５を発現している細胞、または外来性のＡＲＫ５を発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＡＲＫ５を発現している細胞としては、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、上記外来性のＡＲＫ５を発現している細胞は、例えば、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、当業者に一般的な方法によって実施することができる。また、上記外来性のＡＲＫ５を有する細胞は、例えば、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡを、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＡＲＫ５が導入される細胞が由来する生物種としては、特に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【００５６】
また、ＡＲＫ５が発現している細胞抽出液は、例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【００５７】
また、本発明において「接触」は、ＡＲＫ５の状態に応じて行う。例えば、ＡＲＫ５が精製された状態であれば、精製標品に被験試料を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験試料を添加することにより行うことができる。被験試料がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを、ＡＲＫ５が発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＡＲＫ５が発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【００５８】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、ＡＲＫ５の活性または活性型ＡＲＫ５の量を測定する。ＡＲＫ５の活性およびその測定方法は、既述している。
【００５９】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、上記ＡＲＫ５の活性または活性型ＡＲＫ５の量が、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される。
【００６０】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、ＡＲＫ５遺伝子のプロモータ―領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
【００６１】
本発明において、「機能的に結合した」とは、ＡＲＫ５遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、ＡＲＫ５遺伝子のプロモータ―領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、ＡＲＫ５遺伝子のプロモータ―領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【００６２】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡもまた含まれる。
【００６３】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、上記細胞または上記細胞抽出液に被験試料を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【００６４】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００６５】
また、ＡＲＫ５遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【００６６】
また、該遺伝子からコードされるＡＲＫ５を含む画分を定法に従って回収し、該ＡＲＫ５の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、ＡＲＫ５に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法などを実施し、該ＡＲＫ５の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。
【００６７】
本発明の評価方法の別の態様では、上記レポーター遺伝子の発現レベルが、被験試料を接触させないときに比べ上昇する場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、減少する場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される。
【００６８】
本発明の評価方法の別の態様においては、まず、被験試料の存在下で、ＡＲＫ５とＡｋｔとを接触させる。用いられるＡＲＫ５とＡｋｔは、精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。Ａｋｔの精製は、当業者に周知の方法で行うことができる。
【００６９】
本発明の評価方法の別の態様では、次いで、ＡＲＫ５とＡｋｔとの結合を検出する。
例えば、被検試料の存在下で、ＡＲＫ５とＡｋｔとを発現する細胞を培養し、細胞を回収後、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の結合を評価することができる。また、例えば被検試料の存在下で、ＡＲＫ５とＡｋｔとを試験管内でインキュベートし、一方のタンパク質に対する抗体、またはこれらのタンパク質に融合させたタグに対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体または該タンパク質に付加したタグに対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の結合を評価することができる。また、一方のタンパク質を支持体に結合させておき、他方のタンパク質を結合させ、そこに被検試料を適用する。結合していたタンパク質が解離するか否かを検出することにより被検試料の効果を評価することもできる。
【００７０】
本発明の評価方法の別の態様では、上記結合が、被験試料を接触させないときに比べ促進される場合に、被験試料が細胞にストレス耐性を賦与すると判定され、抑制される場合に、被験試料が腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると判定される。
【００７１】
さらに、本発明は、細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制する試料を効率的にスクリーニングする方法を提供する。本発明の細胞にストレス耐性を賦与する試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制する試料のスクリーニング方法の一つの態様においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価し、複数の被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料を選択する。
【００７２】
上記スクリーニング方法の他の態様においては、まず、ＡＲＫ５に複数の被験試料を接触させる。次いで、ＡＲＫ５と被験試料との結合を検出する。次いで、ＡＲＫ５と結合する被験試料を選択する。
【００７３】
ＡＲＫ５を用いて、これに結合するポリペプチドをスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。ＡＲＫ５をコードするＤＮＡを、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ　Ｉ、ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしては一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。
【００７４】
動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法　（Ｃｈｕ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．　１５，　１３１１−１３２６　（１９８７））、リン酸カルシウム法　（Ｃｈｅｎ，　Ｃ　ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ，　Ｈ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　７，　２７４５−２７５２　（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法　（Ｌｏｐａｔａ，　Ｍ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　５７０７−５７１７　（１９８４）；　Ｓｕｓｓｍａｎ，　Ｄ．　Ｊ．　ａｎｄ　Ｍｉｌｍａｎ，　Ｇ．　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　４，　１６４２−１６４３　（１９８５））、リポフェクチン法　（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，　Ｂ．　Ｃｅｌｌ　７，　１０２５−１０３７　（１９９４）；　Ｌａｍｂ，　Ｂ．　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５，　２２−３０　（１９９３）；　Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，　Ｓ．　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９，　２３０−２３４　（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。
【００７５】
特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をＡＲＫ５のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合ポリペプチドとしてＡＲＫ５を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学　１３，　８５−９０　（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合ポリペプチドを発現することができるベクターが市販されている。また、融合ポリペプチドにすることによりＡＲＫ５の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合ポリペプチドを調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素　ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７　ｇｅｎｅ１０　タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、ＡＲＫ５に結合するポリペプチドのスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学　１３，　８５−９０　（１９９５））。
【００７６】
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体はＡＲＫ５、それと結合能を有するポリペプチド、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、ＡＲＫ５に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。ＡＲＫ５に対する抗体は、例えば、ＡＲＫ５をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたポリペプチドを精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成したＡＲＫ５の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
【００７７】
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ　抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、ＡＲＫ５を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合ポリペプチドとして調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、ＡＲＫ５の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
【００７８】
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．　ａｎｄ　Ｌａｎｅ，　Ｄ．：　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，　ｐｐ．５１１−５５２，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８）　）記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
【００７９】
免疫沈降されたポリペプチドの解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでポリペプチドの分子量により結合していたポリペプチドを解析することができる。また、この際、一般的にはＡＲＫ５に結合したポリペプチドは、クマシー染色や銀染色といったポリペプチドの通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である３５Ｓ−メチオニンや３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のポリペプチドを標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。ポリペプチドの分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のポリペプチドを精製し、その配列を決定することもできる。
【００８０】
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステムを用いて行う方法が挙げられる。
【００８１】
２−ハイブリッドシステムにおいては、ＡＲＫ５またはその部分ペプチドをＳＲＦ　ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４　ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、ＡＲＫ５と結合するポリペプチドを発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内でＡＲＫ５と結合するポリペプチドが発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させることにより、該ｃＤＮＡがコードするポリペプチドを得ることができる。これによりＡＲＫ５に結合するポリペプチドまたはその遺伝子を調製することが可能である。
【００８２】
２−ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｔｙｐｅ１）遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
【００８３】
ＡＲＫ５と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、ＡＲＫ５をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここにＡＲＫ５と結合するポリペプチドを発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、ＡＲＫ５に結合したポリペプチドを調製することができる。
【００８４】
得られたポリペプチドは、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００８５】
また、ポリペプチドに限らず、ＡＲＫ５に結合する化合物を単離する方法としては、例えば、固定したＡＲＫ５に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、ＡＲＫ５に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ　ＮＣ；　Ｆａｒｒｅｌｌ　ＦＸ；　Ｃｈａｎｇ　Ｒ；　Ｋａｓｈｙａｐ　ＡＫ；　Ｂａｒｂｏｎｅ　ＦＰ；　Ｍｕｌｃａｈｙ　ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＤＬ；　Ｂａｒｒｅｔｔ　ＲＷ；　Ｊｏｌｌｉｆｆｅ　ＬＫ；　Ｄｏｗｅｒ　ＷＪ．，　Ｓｍａｌｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　ｐｏｔｅｎｔ　ｍｉｍｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　（ＵＮＩＴＥＤ　ＳＴＡＴＥＳ）　Ｊｕｌ　２６　１９９６，　２７３　ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ　ＧＬ．，　Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｎａｔｕｒｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　（ＥＮＧＬＡＮＤ）　Ｎｏｖ　７　１９９６，　３８４　ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ　ＪＣ　Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　Ｎａｔｕｒｅ　（ＥＮＧＬＡＮＤ）　Ｎｏｖ
７　１９９６，　３８４　ｐ１７−９）が当業者に公知である。
【００８６】
本発明において、結合した試料を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、ＡＲＫ５と被験試料との間の相互作用を微量のポリペプチドを用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。
したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりＡＲＫ５と被験試料との結合を評価することが可能である。また、結合した試料を検出又は測定する手段としては、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法においては、上記方法により得られたＡＲＫ５と結合する被験試料について、本発明の評価方法により、細胞にストレス耐性を賦与するか否か、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制するか否かを評価する。次いで、ＡＲＫ５と結合する被験試料から、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料を選択する。
【００８８】
さらに、本発明においては、医薬組成物の製造方法を提供する。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって、細胞にストレス耐性を賦与すると評価された試料、または、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを抑制すると評価された試料と医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【００８９】
また、本発明は、ＡＲＫ５の活性もしくは活性型ＡＲＫ５の量、または、ＡＲＫ５もしくは該ＡＲＫ５をコードするＤＮＡの発現量を測定する工程を含む、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法を提供する。このような検査方法によって、腫瘍の悪性度（例えば転移能など）の判定、抗腫瘍剤による化学療法や放射線治療に対しての腫瘍耐性能の判定、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの確定診断が可能になるものと考えられる。
【００９０】
以下に本発明の検査方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定されるものではない。なお、本発明の検査において、対照とは、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの非罹患者を意味する。
【００９１】
本発明のＡＲＫ５の活性または活性型ＡＲＫ５の量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、まず、被検者からタンパク質試料を調製する。本発明において、被検者からのタンパク質試料は、例えば、被検者の腫瘍、筋肉、神経などの病変部と、リンパ球、白血球などの血球成分などを含む試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。
【００９２】
本発明の方法においては、次いで、該タンパク質試料に含まれるＡＲＫ５の活性または活性型ＡＲＫ５の量を測定する。次いで、測定されたＡＲＫ５の活性または活性型ＡＲＫ５の量を対照と比較する。
【００９３】
また、本発明のＡＲＫ５または該ＡＲＫ５をコードするＤＮＡの発現量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、まず被検者からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれるＡＲＫ５の量を測定する。次いで、測定されたＡＲＫ５の量を対照と比較する。
【００９４】
このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法（Ｗｉｄｅら、Ｋｉｒｋｈａｍ及びＨｕｎｔｅｒ編集、「ラジオイムノアッセイ法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｅ．　ａｎｄ　Ｓ．　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、エジンバラ、（１９７０））、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４７　Ｎｏ．５（２００２）、蛋白質　核酸　酵素　Ｖｏｌ．４７　Ｎｏ．８（２００２））、２次元電気泳動法、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられるが、上記検査方法は、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれるＡＲＫ５をコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。その他の態様としては、まず、被検者からｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれるＡＲＫ５をコードするｃＤＮＡの量を測定する。次いで、測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。被検者からのＲＮＡ試料やｃＤＮＡ試料は、例えば、被検者の被検者の腫瘍、筋肉、神経などの病変部と、リンパ球、白血球などの血球成分などを含む試料から、当業者に周知の方法で調製することができる。
【００９６】
このような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。
【００９７】
本発明はまた、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法に使用される検査薬を提供する。このような検査薬としては、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検査薬、または、ＡＲＫ５に結合する抗体を含む検査薬が挙げられる。ここで、該抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はないが、例えば本実施例において記載されている抗ＳＮＡＲＫ抗体が挙げられる。抗体は必要に応じて標識される。
【００９８】
また、上記オリゴヌクレオチドは、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡ（たとえば配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするものである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００９９】
上記オリゴヌクレオチドを含む検査薬としては、上記本発明の検査方法に使用しうるプローブ（該プローブが固定された基板の形態であってもよい）やプライマーが挙げられる。上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１００】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、ＡＲＫ５をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【０１０３】
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
【０１０４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
（１）ＦＬＡＦ−ＴＡＧ　ＡＲＫ５の調製
ＦＬＡＧタグを有するＡＲＫ５は、ＬＡ　ＰＣＲ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）；上流プライマー：５’−ＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧ−３’（配列番号：８）；下流プライマー：５’−ＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：９）を用いて、かずさＤＮＡ研究所より提供された全長ＫＩＡＡ０５３７がライゲートしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ＋ベクターより調製した。ＰＣＲ産物をサブクローニングのためｐＴ７−Ｂｌｕｅ　Ｔベクターへとライゲートさせ、次いでＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩにより消化された挿入ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターへと再ライゲートさせた。アンチセンスベクターの調製のため、ｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクターへも挿入ｃＤＮＡをライゲートさせた。
【０１０５】
（２）細胞系及びトランスフェクション
ヒト肝癌細胞系ＨｅｐＧ２は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，ＭＯ）が補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持した。トランスフェクションのため、細胞を２．５×１０５／ウェルで６穴プレートに播き、次いである程度修飾されたＴｒａｎｓＦａｓｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（５μｇ　ＤＮＡ／ウェル：Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＷＩ）を使用してトランスフェクションを実施した。４８時間後、ヒトＡＲＫ５発現クローンの調製のため、Ｇ４１８選択を１ｍｇ／ｍｌで実施した。
【０１０６】
（３）抗体及び組換えタンパク質
ＦＬＡＧに対するモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ結合アガロース、組換え活性型Ａｋｔ１、並びにドミナントネガティブ及びドミナントアクティブＡｋｔ１発現ベクターは、Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）より購入した。
【０１０７】
（４）細胞死誘導アッセイ
細胞死誘導は、以前に記載されたようなＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２／ＰＩ染色法（Ｈａｓｅｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９９６，　５６，　１７１３−１７１８；Ｓｈｉｍｉｚｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９９６，　１２，　２０４５−２０５０）により評価した。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＰＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓより購入した。処理後、細胞を収集し、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２及びＰＩで染色し、次いで蛍光顕微鏡により観察した。ＰＩで染色された核を保持する細胞の、全細胞（約１０００個）に対する比により、細胞誘導比を示した。
【０１０８】
（５）Ａｋｔ１インビトロリン酸化アッセイ
ＦＬＡＧタグを有するタンパク質を、抗ＦＬＡＧ結合アガロースにより細胞溶解物から単離し、２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、２ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有するキナーゼ緩衝液に懸濁させた。続いて、１００μＭ　［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（２０μＣｉ）及び組換え活性型Ａｋｔ１を、組換えタンパク質を含有するキナーゼ緩衝液に添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、アガロースを０．１％　ＮＰ−４０を含有するＰＢＳで６回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、放射性同位体活性をシンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）で測定した。さらに、測定された試料を、オートラジオグラフィーのため７．５％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。
【０１０９】
（６）細胞系及び細胞培養
ヒト膵臓癌細胞系ＰＡＮＣ−１に対しＡＲＫ５が安定的にトランスフェクトされたＰＡＮＣ−１細胞系（Ｐ／ＡＲＫ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において維持した。
【０１１０】
（７）インビトロ腫瘍転移アッセイ
インビトロ腫瘍転移アッセイは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ−Ｃｏａｔｅｄ　Ｉｎｖａｔｉｏｎ　Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いて実施した。細胞（５×１０４個／チャンバー）を培養培地を含む各チャンバーに播き、次いで内側チャンバー及び外側チャンバーの培地を６週間後に交換した。４８時間後、浸潤した細胞を、位相差顕微鏡下で計数した。
【０１１１】
（８）ＭＭＰ発現に関するウェスタンブロッティング分析
ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系を２．５×１０５個／ウェルで６穴培養プレート上に播いた。２４時間後、培地を無血清ＤＭＥＭに交換し、無血清培養を４８時間実施した。培養後、培地を収集し、ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）により濃縮し、細胞をＰＢＳ−１％　ＮＰ−４０により溶解させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した濃縮培地及び細胞抽出物を、半乾燥ブロッティングシステムによりニトロセルロース膜へと転写した。膜を、室温で１時間、５％（ｗ／ｖ）スキムミルク（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃｏ．）を含有するＰＢＳでブロッキングし、ＰＢＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０との混合物（Ｓｉｇｍａ，Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ）で洗浄し、次いでＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、又はＭＴ１−　ＭＭＰに対する抗体（Ｆｕｊｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｙａｍａ，Ｊａｐａｎ）のＰＢＳ希釈物と共に室温で一夜インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、膜を、２０００倍希釈のＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）と共にインキュベートした。膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、次いでＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｋ．Ｋ．，ＵＫ）により可視化した。
【０１１２】
（９）インビボ腫瘍形成性アッセイ
ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系の腫瘍形成性は、５×１０６個の細胞を、６週齢雄ＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウスの背部へ皮下移植することにより調査した。１２週間にわたり、各腫瘍の長さ（Ｌ）及び幅（Ｗ）の直径を測定し、腫瘍容積を次式により計算した。腫瘍容積＝（Ｌ／２）×（Ｗ／２）２×π×（４／３）。移植後１２週間後に、マウスを屠殺し、組織をホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋し、８μｍの連続切片を調製した。切片を、Ｄｅｌａｆｉｅｌｄのヘマトキシリン／エオシンで染色した。
【０１１３】
［実施例１］　ＡＲＫ５の同定
本発明者らは、ヒト精巣一本鎖ＤＮＡから、ＡＭＰＫファミリー遺伝子ＳＮＡＲＫをコードするヒトｃＤＮＡを単離し、このタンパク質に対するポリクローナル抗体を調製した。その抗体を使用して、いくつかのヒト細胞系、肺癌ＰＣ−１０及びＡ５４９、膵臓癌ＰＡＮＣ−１及びＡＳＰＣ−１、肝癌ＨｅｐＧ２及びＨＬＥ、並びに繊維芽細胞ＨＦにおけるＳＮＡＲＫの内因性の発現を調査した。図１に示されるように、イムノブロッティングにより、試験された細胞系のうちのいくつかにおいて、７４ｋＤａの未知の交差反応性タンパク質の発現が明らかとなった（強：ＰＣ−１０、ＰＡＮＣ−１、ＡＳＰＣ−１、及びＨＬＥ；弱：Ａ５４９及びＨＦ；無：ＨｅｐＧ２）。
【０１１４】
本発明者らは、ヒトＳＮＡＲＫアミノ酸配列、又は抗ヒトＳＮＡＲＫ抗体を調製するために使用したペプチド配列、及びＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（米国）のヒトタンパク質データベースを使用したＢＬＡＳＴ検索分析により、この７４ｋＤａの未知のタンパク質を同定することを試み、ＫＩＡＡ０５３７　ｃＤＮＡクローン（Ｎａｇａｓｅ　ｅｔ　ａｌ．　ＤＮＡ　Ｒｅｓ　１９９８，　２８，　３１−３９）によりコードされる推定タンパク質を見出した。図２に示されるように、ＳＮＡＲＫ及びＫＩＡＡ０５３７タンパク質の推定触媒ドメインは、８４％の類似性を示し、抗ヒトＳＮＡＲＫ抗体の調製に使用したペプチド配列も、ＫＩＡＡ０５３７タンパク質との高い類似性を示した。
【０１１５】
このＫＩＡＡ０５３７　ｃＤＮＡクローンがＳＮＡＲＫ抗体により検出された未知の７４ｋＤａタンパク質をコードしているか否かを調査するため、本発明者らは、ＦＬＡＧタグを有するＫＩＡＡ０５３７　ｃＤＮＡを調製した。そのｃＤＮＡをＨｅｐＧ２において発現させると、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体及び抗ＳＮＡＲＫポリクローナル抗体を使用したイムノブロッティングが、共通の７４ｋＤａのバンドを与え、そのことにより、ＫＩＡＡ０５３７　ｃＤＮＡが、前述の未知の７４ｋＤａタンパク質をコードしていることが示唆された（図３Ａ）。
【０１１６】
４種の因子、ＡＭＰＫ−α１、ＡＭＰＫ−α２、ＭＥＬＫ、及びＳＮＡＲＫがＡＭＰＫファミリーの触媒サブユニットとして同定されているため（図３Ｂ）、本発明者らは、ＫＩＡＡ０５３７をＡＲＫ５（ＡＭＰＫ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｋｉｎａｓｅ　５：ＡＭＰＫ関連リン酸化酵素５）と名付けた。ＡＲＫ５アミノ酸配列（配列番号：２）の相同性検索分析により、ＡＲＫ５がヒトＳＮＡＲＫと５５．０％の全体相同性を有することが明らかとなった（図３Ｂ）。ＡＲＫ５は、ＡＭＰＫ−α１、ＡＭＰＫ−α２、ＭＥＬＫとも、それぞれ４７％、４５．８％、４２．４％の相同性を示した（図３Ｂ）。これらのデータは、ＡＲＫ５がＡＭＰにより活性化されるセリン／トレオニンプロテインキナーゼであることを強く示唆している。
【０１１７】
７４ｋＤａ　のバンドに関する抗ＳＮＡＲＫとの交差反応を示さないＨｅｐＧ２細胞に、ＡＲＫ５発現ベクターをトランスフェクト（Ｈ／ＡＲＫ）することにより、直接、この可能性を検討した（図１及び図４Ａ）。図４Ａに示されるように、Ｈ／ＡＲＫは、抗ＳＮＡＲＫ抗血清を使用したウェスタンブロット上に７４ｋＤａの明瞭なバンドを示した。これは、免疫沈降法によりさらに確認された。まず、親ＨｅｐＧ２細胞系及びＨ／ＡＲＫ系からの細胞抽出物を、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させ、上清及び免疫沈降物の両方を抗ＳＮＡＲＫ抗血清を使用したウェスタンブロット分析にかけた。Ｈ／ＡＲＫ細胞由来の免疫沈降物のみが、強い反応性を与えた（図４Ａ）。基質としてＧＳＴ−ＳＡＭＳペプチドを使用したインビトロのキナーゼ活性は、トランスフェクション後、明らかな増加を示した。その活性は、２００μＭ　ＡＭＰ（図４Ｂ）の存在下でさらに刺激され、従って、ＡＲＫ５がヒトＡＭＰＫファミリーの新規メンバーであることが強く示された。
【０１１８】
［実施例２］　ＡＲＫ５はグルコース飢餓に対する抵抗性を媒介する
本発明者らは、栄養飢餓に対する抵抗性が腫瘍悪性度の決定因子の一つであること（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７；Ｅｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）、グルコース飢餓に対する抵抗性がＡＭＰＫの活性化（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）又は低酸素条件（Ｅｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）により誘導されうることを提唱した。これに関して、グルコース飢餓に対する抵抗性のメカニズムにおけるＡＲＫ５の関与を調査した。ヒト肝癌細胞系ＨｅｐＧ２に定常状態酸素圧（２１％Ｏ２）下でグルコース飢餓を施した場合、２４時間の処理中、細胞の９０％超が壊死性の細胞死を起こしたが、同様の処理中に細胞死を示したＨ／ＡＲＫ細胞は４０％のみであった（図５Ａ）。１％酸素圧において細胞にグルコース飢餓を施した場合、ＨｅｐＧ２の９０％超が生存したが、ＡＲＫ５に対するアンチセンスＲＮＡ発現ベクターをＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトした場合には約５０％の細胞が死滅した（図５Ｂ）。これらの結果は、ＡＲＫ５が、グルコース飢餓に対する抵抗性に関与していることを明白に示している。
【０１１９】
［実施例３］　ＡＲＫ５はＡｋｔによるＳｅｒ６００のリン酸化により活性化される
ＧＳＴ−ＳＡＭＳリン酸化として測定される全ＡＭＰＫ活性は、ＨｅｐＧ２においては、１ｈｒのグルコース飢餓中わずかに増加したが、Ｈ／ＡＲＫ細胞においては、同様の１ｈｒのグルコース飢餓中、劇的に増加した（図６Ａ）。ＡＲＫ５発現ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターにより駆動されるため、ＡＲＫ５のｍＲＮＡレベルは、１ｈｒのグルコース飢餓中、変化せず、ＡＲＫ５タンパク質も変化を示さなかった（図６Ａ）。
【０１２０】
本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞において、もう一つのプロテインキナーゼＡｋｔが栄養飢餓の直後に活性化されることを以前に見出した（Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７）。図６Ｂより明らかなように、Ａｋｔは、迅速にリン酸化された（図６Ｂ）。従って、本発明者らは、ＡｋｔとＡＲＫ５との間に、ＡＲＫ５の活性化をもたらす何らかの相互作用が存在するか否かを決定した。
【０１２１】
ＡＲＫ５のアミノ酸配列分析より、図７に示されるように、完全に保存された推定Ａｋｔリン酸化部位がＣ末端部分に存在することが明らかとなった。これらの観察は、ＡＲＫ５がＡｋｔによるＳｅｒ６００のリン酸化により活性化されることを示唆している。この可能性をインビトロで直接検討した。ＳｅｒをＡｌａに置換することにより、ＡＲＫ５のＳｅｒ６００点突然変異を構築し、ＦＬＡＧタグを有する発現ベクターを構築した（ＡＲＫ５／ＳＡ）。野生型及びＡＲＫ５／ＳＡの両方をＨｅｐＧ２細胞へとトランスフェクトし、ＦＬＡＧタグを有するＡＲＫ５及びＡＲＫ５／ＳＡを、抗ＦＬＡＧ抗体結合アガロースによる免疫沈降により精製した。ＧＳＴ−ＳＡＭＳリン酸化活性及びＡＲＫ５リン酸化の両方を、ＰＤＫ１により活性化されたＡｋｔ１の存在下又は非存在下でのインビトロでのインキュベーションの後、調査した。図８の結果は、ＡＲＫ５のみがＡｋｔにより活性化され、同時にリン酸化されることを明白に示した。
【０１２２】
ＡｋｔによるＡＲＫ５の活性化をさらに調査するため、インビボでのこれらの成分の生理学的相互作用を調査した。ＡＲＫ５及びリン酸化Ａｋｔの細胞内局在の免疫蛍光実験により、これらの２個の成分が主に細胞質に局在していることが明らかとなった（図９Ａ）。Ａｋｔは、ＨｅｐＧ２細胞において、グルコース飢餓又はインスリン処理のいずれかにより活性化される。これらの条件下で、ＡＲＫ５及びＡｋｔの共免疫沈降を調査した。その結果、ＡＲＫ５及びＡｋｔは相互に会合しているが、グルコース飢餓又はインスリン処理のいずれかによるＡｋｔ活性化の直後に解離することが明白に示された（図９Ｂ）。これらの結果より、ＡＲＫ５は細胞質においてＡｋｔと会合しているが、Ａｋｔが何らかの刺激により活性化されると、ＡＲＫ５がＳｅｒ６００においてリン酸化され、酵素的活性化及びＡｋｔからの解離がもたらされることが示された。
【０１２３】
前述のように、ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＲＫ５の過剰発現は、グルコース飢餓に対する抵抗性をもたらす。ＡＲＫ５の酵素的活性化がグルコース飢餓に対する抵抗性にとって実際に必要であるか否かを決定するため、グルコース飢餓中のＨｅｐＧ２生存に対する、ＡＲＫ５変異体、並びにドミナントアクティブ型及びドミナントネガティブ型のＡｋｔのトランスフェクション、そしてＡｋｔ活性化の化学的阻害剤の効果を、調査した。図１０Ａに示されるように、２４時間のグルコース飢餓中、ＨｅｐＧ２細胞の９０％超が壊死性細胞死を起こした。野生型ＡＲＫ５をトランスフェクトすることにより壊死性細胞死は約４０％にまで抑制されたが、ＡＲＫ５／ＳＡ又はＡｋｔリン酸化部位を含むＣ末端領域の６６アミノ酸を欠くＡＲＫ５のトランスフェクションによっては抑制されなかった。ドミナントアクティブＡｋｔをＨｅｐＧ２細胞へとトランスフェクトした場合にも、細胞死誘導が有意に抑制されたが、ドミナントネガティブＡｋｔでは抑制されなかった。ＡＲＫ５とドミナントアクティブＡｋｔとの組み合わせ発現は、さらに約２０％にまで細胞死を抑制したが、ドミナントネガティブＡｋｔ及び／又はＡＲＫ５変異体は、抑制することができなかった（図１０Ａ）。これらの結果は、活性型Ａｋｔにより活性化されるＡＲＫ５が、ＨｅｐＧ２細胞におけるグルコース飢餓に対する抵抗性にとって不可欠であることを明白に示している。
【０１２４】
これらの観察は、Ｈ／ＡＲＫ細胞を使用することによりさらに確認された（図１０Ｂ）。ドミナントアクティブＡｋｔをＨ／ＡＲＫ細胞へと導入した場合、細胞死は顕著に抑制された。しかしながら、ドミナントネガティブＡｋｔを使用した場合には、より大きく細胞死の誘導が起こった（図１０Ｂ）。ＰＩ−３Ｋの阻害剤、ＬＹ２９４００２を含めた場合、Ａｋｔの活性化は明白に阻害され、同時に細胞死が増加した。これらの結果は、一過性トランスフェクションの結果と一致している。さらに、グルコース飢餓によるＡｋｔ活性化は、ＬＹ２９４００２に対する感受性を有することが既知である（Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７）。
【０１２５】
［実施例４］　ＡＴＭはＡＲＫ５標的候補である
本発明者らは、ＨｅｐＧ２細胞系において、グルコース飢餓中のｐ５３リン酸化により、細胞周期の進行が、Ｇ１期で遅れること、及びＡＴＭ遺伝子産物がこの過程に関与していることを見出した（Ｋｕｓａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．，発表予定）。細胞生存及び細胞周期進行が、グルコース飢餓中、ＡＭＰＫにより調節されることが見出されたため（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；Ｉｍａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｕｎ．　２００１，　２８７，　５６２−５６７）、本発明者らは、ＡＴＭがＡＭＰＫの標的であると推測した。図１１Ａに示されるように、アミノ酸配列分析により、ＡＴＭが、Ａｋｔ（２部位：ＲＸＲＸＸＳ／Ｔ（配列番号：１０）；Ｍａｙｏ　ａｎｄ　Ｄｏｎｎｅｒ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００１，　９８，　１１５９８−１１６０３）及びＡＭＰＫ（２３部位：ＸＭ／Ｉ／Ｌ／Ｆ／ＶＸＸＸＸＳ／ＴＸＸＸＬ／Ｍ／Ｉ／Ｆ／Ｖ（配列番号：１１）；Ｈａｒｄｉｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｌｉｎｇ，　Ｅｕｒ．Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９７，　２４６，　２５９−２７３）のためのいくつかの推定リン酸化部位を含有することが明らかとなった。
【０１２６】
Ｈｉｓタグを有するＡＴＭ（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１９９７，　９４，８０２１−８０２６）が安定的に発現されているＰＡＮＣ−１細胞（Ｐ／ＡＴＭ）を使用して、３２Ｐインビボ標識実験を実施した。通常の培地中で培養されたＰ／ＡＴＭ細胞において、Ｈｉｓ−ＡＴＭへの３２Ｐ取り込みが検出され、Ｐ／ＡＴＭ細胞にグルコース飢餓を施すと、ＡＴＭリン酸化の増加が検出された（図１１Ｂ）。興味深いことに、ＡＲＫ５に対するアンチセンスＲＮＡ発現ベクターの一過性発現によりＡＴＭリン酸化は完全に抑制され、ＡＲＫ５を一過性発現する細胞においてはＡＴＭのリン酸化の増加が検出された（図１１Ｂ）。このことは、ＡＲＫ５が、グルコース飢餓中ＡＴＭをリン酸化することを示唆している。この可能性をさらに確認するため、インビトロリン酸化を調査した。図１１Ｃに示されるように、ＡＲＫ５、又はＰＤＫ１により活性化されたＡｋｔ１は、単独では、ＡＴＭをリン酸化しなかったが、ＡＲＫ５及び活性型Ａｋｔ１の両方の存在下ではＡＴＭリン酸化が検出され（図１１Ｃ）、従って、ＡＲＫ５がＡＴＭをリン酸化することが直接示された。
【０１２７】
セリン／トレオニンプロテインキナーゼＡＭＰＫは、酵母ＳＮＦ−１の哺乳動物ホモログであり（Ｈａｒｄｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９８，　６７，　８２１−８５５；Ｍｉｔｃｈｅｌｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９４，　２６９，　２３６１−２３６４；Ｗｏｏｄｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　１９９４，　２６９，　１９５０９−１９５１５）、酵素活性化は、代謝ストレス、低酸素、熱ショック、及び虚血の下にある細胞においてＡＭＰ：ＡＴＰ比の上昇により誘発される（Ｃａｒｌｓｏｎ，　Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１９９９，　２，　２０２−２０７；Ｈａｒｄｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１９９８，　６７，　８２１−８５５）。最近、本発明者らは、ＡＭＰＫ活性化が、栄養飢餓中の細胞死に対する腫瘍の抵抗性に関与していることを証明した（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。従って、ＡＭＰＫは、腫瘍細胞生存因子である可能性がある。最近、新規ＡＭＰＫファミリー遺伝子ＳＮＡＲＫがラットｃＤＮＡライブラリーより同定され（Ｌｅｆｅｂｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　２００１，　３５５，　２９７−３０５）、本発明者らは、そのヒトホモログを同定した（Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。
【０１２８】
ＳＮＡＲＫに関する研究中、いくつかの組織に由来する腫瘍細胞系において未知の免疫交差反応性の７４ｋＤａタンパク質が観察され、本発明者らは、それがＡＲＫ５であることを見出した。ＡＭＰＫのα１及びα２サブユニット、並びにＳＮＡＲＫを含む他のＡＭＰＫファミリーのメンバーと同様に、ＡＲＫ５は、ＳＡＭＳペプチドに対するリン酸化活性を示した。さらに、ＡＲＫ５のリン酸化活性は、ＡＭＰの存在下で促進され、従って、本発明者らは、ＡＲＫ５がＡＭＰＫファミリーの新規メンバーであることを提唱する。ＡＭＰＫファミリーの中で、ＡＲＫ５はＳＮＡＲＫに対して最も高い類似性を示し、ＡＲＫ５の推定触媒ドメインは、ＳＮＡＲＫのそれと８４％の類似性を示した。
【０１２９】
酸素及び栄養、特にグルコースの供給は、腫瘍細胞の増殖及び生存にとって不可欠であり、これらの成分の欠乏は、腫瘍細胞の重大な損傷を引き起こす（Ｄａｎｇａｎｄ　Ｓｅｍｅｎｚａ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１９９９，　２４，　６８−７１；Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１９９７，　３，　１７７−１８２；Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７；Ｓｏｕｔｈｅｒｌａｎｄ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８８，　２４０，　１７８−１８４）。栄養飢餓は、腫瘍細胞の過剰増殖により引き起こされた供給−需要バランスの崩壊により、いくつかの腫瘍領域において病態生理学的に引き起こされ、そのような領域内の細胞は壊死性の細胞死を起こす（Ｄａｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｍｅｎｚａ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１９９９，　２４，　６８−７１；Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１９９７，　３，　１７７−１８２；Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７；Ｓｏｕｔｈｅｒｌａｎｄ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８８，　２４０，　１７８−１８４）。従って、血液供給の増加、即ち腫瘍血管形成は、腫瘍の進展にとっての中枢であると考えられており、実際、腫瘍悪性度は、多くの場合に腫瘍血管形成と高度に相関していることが見出されている（Ｆｏｒｋｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００１，９８，　３９８−４００；Ｆｏｌｋｍａｎ，　Ａｄｖ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９７４，　１９，　３３１−３５８）。しかしながら、本発明者らは、最近、栄養飢餓に対する抵抗性が様々な癌細胞系の間で大きく異なっており、臨床的に低血管（ｈｙｐｏｖａｓｃｕｌａｒ）であることが既知の膵臓癌には、強い抵抗性が観察されることを見出した（Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７）。これらの観察から、本発明者らは、栄養飢餓に対する抵抗性が、腫瘍進展のためのもう一つの決定因子であるという仮説を立てた。Ａｋｔ及びＡＭＰＫが、抵抗性メカニズムに関与していることが見出された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；Ｉｚｕｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　２０００，　６０，　６２０１−６２０７；Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。さらに、元来はグルコース飢餓に対する感受性が極めて高い正常ヒト繊維芽細胞及びヒト肝癌細胞系ＨｅｐＧ２において、低酸素により、グルコース飢餓に対する抵抗性が誘導されうる。Ａｋｔ及びＡＭＰＫは、低酸素により誘導される抵抗性に密接に関与していると考えられる（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２００２，
ｉｎ　ｐｒｅｓｓ；Ｅｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。
【０１３０】
これらの所見を考え合わせ、本発明者らは、Ａｋｔシグナル伝達経路とＡＭＰＫシグナル伝達経路、特にＡＲＫ５との間に関連が存在すると推測した。いくつかの種において観察されるＡｋｔリン酸化モチーフのコンセンサス配列は、ＲＸＲＸＸＳ／Ｔ（配列番号：５）（Ｍａｙｏ　ａｎｄ　Ｄｏｎｎｅｒ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　２００１，　９８，　１１５９８−１１６０３）であることが確立されている。興味深いことに、ＡＲＫ５は、５９５〜６００アミノ酸にそのコンセンサス配列を含有しており、Ａｋｔにより直接活性化されることが本実施例におけるインビトロリン酸化により証明された。この観察は、ＡＲＫ５がＡｋｔの新規標的であることを強く示している。本実施例において、ドミナントアクティブＡｋｔ１も、細胞をグルコース飢餓から救済したが、ＡＲＫ５発現はＨｅｐＧ２細胞においてイムノブロッティングレベルでは検出されなかった。ＡＲＫ５に対するアンチセンスＲＮＡ発現ベクターは、グルコース飢餓中の細胞死をわずかに促進した。ＨｅｐＧ２細胞においてはＡＲＫ５が低レベルに発現しているのかもしれず、この量のＡＲＫ５がドミナントアクティブＡｋｔ１に応答したのかもしれない。この概念と一致して、細胞生存活性は、ＡＲＫ５により促進され、ＡＲＫ５変異体は、ドミナントアクティブＡｋｔ１により誘導される細胞生存を取り消した。ＡＲＫ５は、ＨｅｐＧ２においてＡｋｔの下流の腫瘍細胞生存因子として作用する。以前の研究において、本発明者らは、ＡＭＰＫ−α１及びα２サブユニットに対するアンチセンスＲＮＡ発現ベクターが、ＨｅｐＧ２細胞における低酸素により誘導されるグルコース飢餓に対する抵抗性（Ｅｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）及びＰＡＮＣ−１細胞における構成性の抵抗性（Ｋａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）を抑制することを見出した。ＡＲＫ５と、ＡＭＰＫ−α１及びα２とが相互作用するか否かは現在のところ明らかでないが、ＡＲＫ５がＡＭＰＫ−キナーゼとして機能する可能性はある。これらの結果に基づき、本発明者らは、ＡＲＫ５が、Ａｋｔの新規基質であること、Ａｋｔにより活性化されたＡＲＫ５が栄養飢餓に対する腫瘍の抵抗性と密接に関与していることを提唱する。
【０１３１】
最近、本発明者らは、ＡＭＰＫファミリーが、ｐ５３蓄積を介した細胞周期停止に関与していることを証明した（Ｉｍａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｕｎ．　２００１，　２８７，　５６２−５６７）。本実施例において、本発明者らは、ＡｋｔがＡＲＫ５の上流エフェクターであることを証明し、従って、グルコース飢餓中のＡＲＫ５の標的因子を同定することを試みた。ヒト遺伝性疾患であるａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａは、神経学的変性及び癌素因により特徴付けられるが、ＡＴＭはこの症候群において欠損している遺伝子である（Ｌａｖｉｎ，　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２０００，　２，　２１５−２１７；Ｌａｖｉｎ　ａｎｄ　Ｓｈｉｌｏｈ，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９７，　１５，　１７７−２０２；Ｓａｖｉｔｓｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９５，　２６８，　１７４９−１７５３）。ＡＴＭは、ホスファチジルイノシトールキナーゼファミリーのメンバーであり（Ｌａｖｉｎ，　Ｎａｔ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２０００，　２，　２１５−２１７；Ｌａｖｉｎ　ａｎｄＳｈｉｌｏｈ，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１９９７，　１５，　１７７−２０２；Ｓａｖｉｔｓｌｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，　２６８，　１７４９−１７５３）、放射線曝露に応答して、ｐ５３リン酸化を介してＧ１／Ｓチェックポイントを活性化する（Ｂａｎｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８，　２８１，　１６７４−１６７７；Ｃａｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８）。ＤＮＡ損傷に応答して、活性化されたＡＴＭは、ｐ５３をＳｅｒ１５においては直接的に、Ｓｅｒ２０においてはＣｈｋ２により間接的にリン酸化し、細胞周期停止又は細胞死を引き起こす（Ｂａｎｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８，　２８１，　１６７４−１６７７；Ｃａｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８；Ｓｈｅｉｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１９９７，　９１，　３２５−３３４）。ＤＮＡ損傷のセンサーとしての機能に加え、ＡＴＭは酸化ストレスのセンサーでもあることが示唆されている（Ｒｏｔｍａｎ　ａｎｄ　Ｓｈｉｌｏｈ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｕｒｖ．　１９９７，　２９，　２８５−３０４；Ｐｅａｒｃｅ　ａｎｄ　Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２００１，　１１，　４２６−４３３）。Ａ−Ｔ細胞及びＡｔｍ遺伝子破壊マウスにおける増加した酸化ストレスの証拠がこれを支持している（Ｂａｒｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１９９９，　９６，　９９１５−９９１９；Ｇａｔｅｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．　２００１，　２０，　２８９−２９４）。ＡＲＫ５がグルコース飢餓に応答してインビトロ及びインビボでＡＴＭをリン酸化するという本発明者らの観察は、グルコース欠乏中の細胞生存の維持におけるＡＴＭ／ｐ５３経路の関与（Ｋｕｓａｋａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）と共に、細胞内シグナル伝達におけるＡＴＭのより全般的な役割をさらに支持する。アミノ酸配列分析より、ＡＴＭが、ＡＭＰＫ（２３部位）及びＡｋｔ（２部位）によるリン酸化のためのコンセンサス配列を含有していることが明らかとなった。Ａｋｔ１により活性化されたＡＲＫ５は、ＡＴＭをリン酸化したが、活性型Ａｋｔ１は単独ではリン酸化しなかった。それは、おそらく、コンフォメーションの拘束又はＡＴＭと複合体を形成する他のタンパク質の存在のためであろう。非損傷シグナル伝達におけるＡＴＭの役割のその他の証拠は、インスリンにより活性化されたＡＴＭキナーゼが、タンパク質合成の制御因子４Ｅ−ＢＰＩ（ＰＨＡＳ−１）をリン酸化することを示したＹａｎｇ　ａｎｄ　Ｋａｓｔａｎ，２００１により提供されている。本明細書に記載された結果は、その報告と適合しており、本発明者らは、インスリン処理がＡｋｔを活性化し、次にＡｋｔがＡＲＫ５を活性化し、それにより、ＡＴＭの活性化がもたらされうることを証明した。ＡＴＭがグルコース飢餓条件におけるＡＲＫ５の下流エフェクターであることも、本発明者らは示した。この経路によるＡＴＭの活性化は、提唱されているインスリン処理後スキームに付加的な経路を追加するであろう（Ｙａｎｇ　ａｎｄ　Ｋａｓｔａｎ，　Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２００１，　２，　８９３−８９８；Ｌａｖｉｎ，　Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２０００，　２，　２１５−２１７）。
【０１３２】
本実施例において、本発明者らは、ヒトＡＭＰＫファミリーの新規メンバーとしてＡＲＫ５を同定した。ＡＲＫ５活性化は、Ａｋｔにより制御され、活性化されたＡＲＫ５は、次に、グルコース飢餓中、ＡＴＭをリン酸化した。リン酸化されたＡＴＭは、ｐ５３のリン酸化及び蓄積を介して細胞周期のＧ１期における停止を誘導するため（Ｂａｎｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８，　２８１，　１６７４−１６７７；Ｃａｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　　１９９８；Ｓｈｅｉｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　１９９７，　９１，　３２５−３３４）、本所見は、ＡＭＰＫファミリーがグルコース飢餓中のｐ５３蓄積に関与しているという本発明者らの以前の概念と一致している（Ｉｍａｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｕｎ．　２００１，　２８７，　５６２−５６７）。Ａｋｔ活性化はインスリン又はインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）に対する感受性を有する細胞において証明されており、インスリン及びＩＧＦは細胞増殖に不可欠である（Ｌａｗｌｏｒ　ａｎｄ　Ａｌｅｓｓｉ，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ．　２００１，　１１４，　２９０３−２９１０）。興味深いことに、ヒト膵臓癌細胞系は、ＡＲＫ５の発現を示すが、ヒト正常膵臓細胞は示さない（かずさＤＮＡ研究所ホームページ上のＫＩＡＡ０５３７の公式データ）。従って、この矛盾は、ＡＲＫ５細胞の分布によると考えられる。本実施例の結果に基づき、本発明者らは、ＡＲＫ５が腫瘍悪性度と関連した栄養飢餓に対する腫瘍の抵抗性において重大な役割を果たしていることを提唱する。従って、ＡＲＫ５は癌治療のための新規の標的になりうる。
【０１３３】
［実施例５］　ＡＲＫ５はインビトロで腫瘍転移を誘導した
腫瘍転移においては、腫瘍移動活性が必須要件の一つであり、最近、腫瘍移動がＡｋｔ活性化の結果として引き起こされることが報告されたが（Ｋｉｍ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．，　ＦＡＳＥＢ　Ｊ　２００１，　１５，　１９５３−１９６２；Ｈｉｇｕｃｈｉ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒ　Ｂｉｏｌ　２００１，　１１，　１９５８−１９６２）、Ａｋｔが腫瘍移動を誘導する分子メカニズムは未だ不明である。ＡＲＫ５は栄養飢餓中のＡｋｔの基質であるため、本発明者らは、ＡＲＫ５が腫瘍移動を誘導するか否かを調査した。
【０１３４】
ＰＡＮＣ−１細胞系をマトリゲルコーティングを施された浸潤チャンバーに播くと、４８時間で約１５０個の細胞が、マトリゲル層を通り下方チャンバーの底へと転移した（図１２Ａ）。しかしながら、転移した細胞の大部分がチャンバーの底に付着することができず、図１２Ｂに示されるように重度の損傷を示した。対照的に、Ｐ／ＡＲＫ細胞系は４００個超が転移を示し、大部分がチャンバーの底に付着し生存可能であった（図１２Ａ及びＢ）。従って、ＡＲＫ５が腫瘍細胞の移動を刺激し、転移細胞の生存を支持することが示された。しかしながら、Ｐ／ＡＲＫ細胞系において検出された腫瘍細胞転移は、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ経路の強力かつ特異的な阻害剤ＬＹ２９４００２（Ｖｌａｈｏｓ　ＣＪ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　１９９４，　２６９，　５２４１−５２４８．）の添加により、完全に抑制された。これらの所見は、ＡＲＫ５がＡｋｔの刺激の下で腫瘍転移を誘導することを強く示唆している。
【０１３５】
［実施例６］　ＡＲＫ５により誘導されたマトリックスメタロプロテイナーゼ産生
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、細胞−細胞マトリックス及び基底膜マトリックスの分解による腫瘍転移に密接に関与しているため（Ｌｉｏｔｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　１９８０，　２８４，　６７−６８）、本発明者らは、２つの細胞系のＭＭＰ産生を比較した。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、Ｐ／ＡＲＫ細胞系においては、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）及びＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）のｍＲＮＡレベルが顕著に増加しているが、ＭＭＰ−３（ストロメライシン−１）（データは示していない）は増加していないことが明らかとなり、ウェスタンブロッティング分析によってもこれらの酵素の明白な増加が示された（図１３）。これは、これらの酵素の不活型について特に当てはまり、従って、ＡＲＫ５がＭＭＰの分泌及び活性化に密接に関与していることが示された。膜結合型マトリックスメタロプロテイナーゼとして同定されたＭＴ１−ＭＭＰは、膜固定ドメインのタンパク質分解によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の活性化に関与している（Ｏｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　１９９５，　９２，　２７３０−２７３４；Ｋｏｓｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２０００，　１４８，　６１５−６２４）。ＭＴ１−ＭＭＰ発現はＰＡＮＣ−１細胞系においてはほぼ検出不可能であったが、Ｐ／ＡＲＫにおいては劇的に増加していた（図１３）。従って、ＡＲＫ５がＭＴ１−ＭＭＰ産生を介してＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌及び活性化を誘導することが示唆された。さらに、これらのＭＭＰ産生は、Ｐ／ＡＲＫ細胞をマトリゲル上で培養した場合、より強くなった（図１３）。
【０１３６】
［実施例７］　　ＡＲＫ５による腫瘍形成増加及び壊死抑制
インビトロ実験より、ＡＲＫ５が腫瘍形成、浸潤、及び転移を刺激しうることが強く示唆された。そこで、ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系をヌードマウスに移植した。図１４に示されるように、移植から１２週間後、Ｐ／ＡＲＫ細胞系は、ＰＡＮＣ−１細胞系と比較して１０倍の腫瘍容積の増加を示した（表１）。
【０１３７】
【表１】
2004083494.tif 000002
【０１３８】
移植から１２週間後、ＰＡＮＣ−１により形成された腫瘍巣の全てが、中心の壊死を示した（図１５Ａ）。対照的に、Ｐ／ＡＲＫ細胞系は、小型腫瘍巣（１／５）及び大型腫瘍巣（４／５）という２つの型の腫瘍巣を形成した。小型Ｐ／ＡＲＫ腫瘍巣においては、壊死領域は観察されず、中心領域の腫瘍細胞は生存していた（図１５Ａ）。興味深いことに、大型Ｐ／ＡＲＫ腫瘍巣は、断片的（ｐｉｅｃｅ　ｍｅａｌ−ｌｉｋｅ）壊死を示したが、大規模な中心壊死は示さなかった（図１５Ｂ）。これらの所見より、Ｐ／ＡＲＫにより形成された腫瘍巣が壊死誘導に対して抵抗性を有することが推測された。一方、ＡＲＫ５はグルコース飢餓により引き起こされる細胞死に対する抵抗性を示す所見が得られている。従って、本実施例における所見は、上記所見とよく一致している。そこで、本発明者らは、ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系により形成された腫瘍巣内の壊死領域を測定した。図１５Ｃに示されるように、Ｐ／ＡＲＫ腫瘍は、わずか約２０％の壊死領域を含有していたが、ＰＡＮＣ−１の腫瘍では約６０％の領域が壊死を示した。腫瘍壊死は、酸素・栄養供給とエネルギー需要とのバランス、及び内因的な飢餓に対する腫瘍の抵抗性により決定される。血液供給は、腫瘍微小血管密度により仮定された。これらの結果は、ＡＲＫ５を高レベルに発現している細胞が、腫瘍巣内の壊死に対する高い抵抗性を保持していることを強く示唆している。
【０１３９】
［実施例８］　ＡＲＫ５により誘導された筋肉浸潤及び腸管膜転移
ＡＲＫ５のインビボ効果をさらに解明するため、病理学的観察を実施した。図１６Ａ及び表２に示されるように、Ｐ／ＡＲＫ由来の腫瘍巣（３／５）は筋肉層への浸潤を示したが、ＰＡＮＣ−１由来の腫瘍巣（０／５）は示さなかった。ＰＡＮＣ−１細胞系（１／５）及びＰ／ＡＲＫ細胞系（１／５）の両方が、肝臓転移を示した（表２）。
【０１４０】
【表２】
―――――――――――――――――――――
所見　　　　　　　　　ＰＡＮＣ−１　　　Ｐ／ＡＲＫ
―――――――――――――――――――――
筋肉層への浸潤　　　　０／５　　　　　３／５
肝臓転移　　　　　　　１／５　　　　　１／５
腸間膜転移　　　　　　０／５　　　　　１／５
―――――――――――――――――――――
【０１４１】
しかしながら、興味深いことに、Ｐ／ＡＲＫ細胞系（１／５）を移植されたヌードマウスにおいては、転移が観察された。図１６Ｂに示されるように、転移巣が腸管膜に観察され、腫瘍細胞が筋肉層及び腸管上皮層へと浸潤していた。
【０１４２】
本実施例において、ＡＲＫ５は、インビトロ実験において腫瘍細胞転移を刺激した。Ｐ／ＡＲＫ細胞系は、ＰＡＮＣ−１細胞と比べて２倍の転移活性の増加を示し、そして活性はＡｋｔに依存していた。さらに、ＡＲＫ５は、腫瘍転移の中心的因子であるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の活性化も示した。最近、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を分泌する因子（活性化因子）が同定され、ＭＴ１−ＭＭＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｔｙｐｅ−１　ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ／参照（Ｏｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９９５，　９２，　２７３０−２７３４））と名付けられた。そして、本発明者らの結果は、ＡＲＫ５がＭＴ１−ＭＭＰの発現を新たに誘導することを証明した。これらの結果に基づき、本発明者らは、インビトロで観察された腫瘍細胞転移が以下のようにして起こったと提唱する。ＡＲＫ５がＡｋｔ活性化の刺激によりＭＴ１−ＭＭＰ発現を誘導する。新たに誘導されたＭＴ１−ＭＭＰが、続いて、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の膜結合ドメインをタンパク質分解し、それらを培地中へ分泌する。放出されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９がマトリゲルを溶解させ、Ｐ／ＡＲＫ細胞が孔を通って下方チャンバーの底へと転移する。
【０１４３】
ＡＲＫ５により誘導された腫瘍の進展及び転移は、インビボでも証明された。ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系をヌードマウスに移植すると、Ｐ／ＡＲＫ細胞系が移植されたマウスにおいては、腫瘍容積の１０倍超の増加が観察された。さらに、Ｐ／ＡＲＫ細胞系により形成された腫瘍巣においては、進行中の壊死性細胞死が有意に抑制されていた。腫瘍巣内の細胞の生存及び増殖は、栄養及び酸素により維持されており、従って、腫瘍巣の中心の細胞は、グルコース及び酸素の不足により、壊死性細胞死を起こす（Ｄａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１９９９，　２４，　６８−７１；Ｓｏｕｔｈｅｒｌａｎｄ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８８，　２４０，　１７８−１８４；Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　１９９７，　３，　１７７−１８２）。ＡＲＫ５は、インビトロで、栄養飢餓により誘導される細胞死に対する抵抗性を示した。従って、ここでのインビボ所見は、インビトロ観察と相関している。
【０１４４】
さらに、本実施例において、Ｐ／ＡＲＫ細胞系により形成された腫瘍巣においては、独特の壊死パターンが観察された。一般的には、大部分の腫瘍巣が、中心壊死パターンを示し、本実施例においてＰＡＮＣ−１細胞系により形成された腫瘍巣も、その一般的なパターンを示した。しかしながら、興味深いことに、Ｐ／ＡＲＫ由来腫瘍巣内の壊死領域は、いくつかの部分に分離されており、それは、「島」ではなく「群島」のようであった。本実施例において、本発明者らは、それを「虫食い状壊死（ｐｉｅｃｅ−ｍｅａｌ　ｌｉｋｅ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ）」として評価した。各断片的壊死領域は、ＰＡＮＣ−１細胞系により形成された腫瘍巣内の壊死領域よりも有意に小さく、領域を全て合わせたとしても、有意に小さかった。従って、本発明者らは、この独特の壊死パターンも、ＡＲＫ５により誘導された抵抗性によるものと推測する。
【０１４５】
本実施例においては、ＡＲＫ５による腫瘍転移が、インビトロ及びインビボの両方で証明された。腫瘍巣の中心領域に存在する大部分の細胞は、腫瘍過剰増殖の結果としての栄養飢餓により壊死を起こしている。しかしながら、膵臓癌細胞のようないくつかの腫瘍細胞は、栄養飢餓に対する高い抵抗性を示し、その抵抗性はＡｋｔ及びＡＭＰＫの活性による。本発明者らは、腫瘍転移は、不都合な微小環境から、より好都合な環境への腫瘍細胞の逃避行為であると推測している。その推測に基づき、本発明者らは、Ａｋｔ及びＡＭＰＫファミリーの両方による膵臓癌転移を以下のように仮定した。腫瘍過剰増殖の結果として、中心領域の腫瘍細胞が栄養減少による細胞ストレスを受ける。この栄養飢餓がまずＡｋｔ活性化を引き起こし、活性化されたＡｋｔが続いてＡＲＫ５をリン酸化する。活性型Ａｋｔの刺激により、活性化されたＡＲＫ５が、ＭＴ１−ＭＭＰ発現を誘導し、誘導されたＭＴ１−ＭＭＰが、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を活性化する。このようにして、ＡＲＫ５を高レベルに発現している腫瘍細胞は、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を使用して、他の組織へと転移する。
【０１４６】
【発明の効果】
本発明によって、細胞にストレス耐性を賦与する薬剤、および、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、もしくは、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａを治療または予防するための薬剤の提供が可能になった。さらに、腫瘍、神経変性疾患、筋肉変性疾患、または、ａｔａｘｉａ　ｔｅｌｅａｎｇｉｅｃｔａｓｉａの検査方法および該検査方法に使用可能な検査薬の提供が可能になった。
【０１４７】
【配列表】
2004083494.tif 000003
2004083494.tif 000004
2004083494.tif 000005
2004083494.tif 000006
2004083494.tif 000007
2004083494.tif 000008
2004083494.tif 000009
2004083494.tif 000010
2004083494.tif 000011
2004083494.tif 000012
2004083494.tif 000013
2004083494.tif 000014
2004083494.tif 000015
2004083494.tif 000016
2004083494.tif 000017
2004083494.tif 000018
2004083494.tif 000019
2004083494.tif 000020
2004083494.tif 000021
2004083494.tif 000022
2004083494.tif 000023
2004083494.tif 000024
2004083494.tif 000025
2004083494.tif 000026
2004083494.tif 000027
2004083494.tif 000028
2004083494.tif 000029
2004083494.tif 000030
2004083494.tif 000031
2004083494.tif 000032
2004083494.tif 000033
2004083494.tif 000034
2004083494.tif 000035
2004083494.tif 000036
2004083494.tif 000037
2004083494.tif 000038
2004083494.tif 000039
2004083494.tif 000040
2004083494.tif 000041
2004083494.tif 000042
2004083494.tif 000043
2004083494.tif 000044
2004083494.tif 000045
2004083494.tif 000046
2004083494.tif 000047
2004083494.tif 000048
2004083494.tif 000049
2004083494.tif 000050
2004083494.tif 000051
2004083494.tif 000052
2004083494.tif 000053
2004083494.tif 000054
【図面の簡単な説明】
【図１】未知タンパク質の抗ＳＮＡＲＫ抗体との交差反応を示す写真である。いくつかの細胞系（肺：肺癌ＰＣ−１０及びＡ５４９、膵臓：膵臓癌ＰＡＮＣ−１及びＡＳＰＣ−１；肝臓：肝癌ＨｅｐＧ２及びＨＬＥ；並びに繊維芽細胞：ＨＦ）からの細胞抽出物を、ヒトＳＮＡＲＫに対するポリクローナル抗体によりイムノブロットした。アステリスクは、未知の７４ｋＤａのタンパク質の位置を示す。
【図２】ＫＩＡＡ０５３７（上）及びヒトＳＮＡＲＫ（下）の推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号：２および１２に記載）を示す図である。ボックスＡ：推定触媒ドメインの領域を、ボックスＢはヒトＳＮＡＲＫに対するポリクローナル抗体の調製に使用したアミノ酸配列を示している。
【図３】新規ＡＭＰＫ関連プロテインキナーゼを示す写真および図である。
（Ａ）　ＦＬＡＧ−　ＫＩＡＡ０５３７の発現ベクターでトランスフェクトされた（＋）又はトランスフェクトされていない（−）ＨｅｐＧ２細胞からの細胞抽出物を、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体又は抗ＳＮＡＲＫポリクローナル抗体によりイムノブロットした。
（Ｂ）　ＡＭＰＫファミリーに属する分子の進化系統樹及び概略モデルを示している。
【図４】ＡＲＫ５のＳＡＭＳペプチドリン酸化活性を示す写真および図である。
（Ａ）　ヒトＳＮＡＲＫに対するポリクローナル抗体によるイムノブロッティング分析を、ＨｅｐＧ２細胞又はＨ／ＡＲＫ細胞に由来する細胞抽出物又は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体による免疫沈降物に対して実施した。
（Ｂ）　２００μＭ　ＡＭＰの存在下（＋）又は非存在下（−）において、細胞抽出物（ＨｅｐＧ２及びＨ／ＡＲＫ）又は組換えＦＬＡＧ−ＡＲＫ５（ｒＡＲＫ５）によるＳＡＭＳリン酸化を測定した。酵素活性は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。アステリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１（ｔ検定）を示す。
【図５】グルコース飢餓に対する抵抗性におけるＡＲＫ５の関与を示す図である。
（Ａ）　グルコースを含む（＋）又は含まない（−）培地を２４時間施したＨｅｐＧ２細胞又はＨ／ＡＲＫ細胞において、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。アステリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１（ｔ検定）を示す。
（Ｂ）　ＡＲＫ５に対するアンチセンスＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトされた（黒）又はトランスフェクトされていない（白）ＨｅｐＧ２細胞に、正常酸素（２１％）又は低酸素（１％）の酸素圧下で、２４時間、グルコースを含む（＋）又は含まない（−）培地を施した。インキュベーション後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。アステリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１（ｔ検定）を示す。
【図６】ＡｋｔによるＡＲＫ５の活性化を示す図および写真である。
（Ａ）　グルコースを含む（＋）又は含まない（−）培地中で１時間培養されたＨｅｐＧ２細胞又はＨ／ＡＲＫ細胞に由来する細胞抽出物のＳＡＭＳリン酸化活性を測定した。酵素活性は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している（上グラフ）。酵素活性の測定に使用された細胞抽出物におけるＡＲＫ５発現も、調査した（下パネル）。
（Ｂ）　示された時間、グルコース飢餓を施されたＨｅｐＧ２細胞又はＨ／ＡＲＫ細胞に由来する細胞抽出物を、Ｓｅｒ４７３においてリン酸化されたＡｋｔ又は全Ａｋｔに対するポリクローナル抗体によりイムノブロットした。
【図７】ＡＲＫ５及び他の既知のＡｋｔ基質の推定Ａｋｔリン酸化部位のアミノ酸配列の比較を示す図である。ＡＲＫ５タンパク質の概略モデル中の影付きのボックス及び黒塗りボックスは、それぞれ、推定触媒ドメイン領域及びＡｋｔリン酸化モチーフ領域である。図中のアミノ酸配列は、配列番号：１３〜２０に記載している。
【図８】ＡＲＫ５のＡｋｔリン酸化部位の突然変異分析を示す図である。ＡＲＫ５及びＡＲＫ５／ＳＡを、インビトロで活性型Ａｋｔ１の存在下（＋）又は非存在下（−）でインキュベートした。インキュベーション後、シンチレーション計数により、ＡＲＫ５（上）又はＳＡＭＳ（下）のリン酸化を測定した。３２Ｐ取り込みは、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。アステリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１（ｔ検定）を示す。
【図９】ＡｋｔとＡＲＫ５との相互作用を示す写真である。
（Ａ）　Ｈ／ＡＲＫ細胞を、グルコースを含む（Ｇ＋）又は含まない（Ｇ−）培地中で１時間培養し、次いで抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ＡＲＫ）、又はＳｅｒ４７３においてリン酸化されたＡｋｔに対するポリクローナル抗体（ｐＡｋｔ）による免疫蛍光実験を実施した。
（Ｂ）　Ｈ／ＡＲＫ細胞に、０〜６０分間、グルコース飢餓又はインスリン刺激を施し、全細胞抽出物又はＦＬＡＧ又はＡｋｔに対する抗体による免疫沈降物を、全Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ、又はＦＬＡＧに対する抗体によりブロットした。
【図１０】（Ａ）　ＡＲＫ５、ドミナントアクティブＡｋｔ、ドミナントネガティブＡｋｔ、ＡＲＫ５欠失変異体、及び／又はＡＲＫ−ＳＡ変異体で一過性トランスフェクトされた、又はトランスフェクトされていないＨｅｐＧ２細胞に、グルコース飢餓を２４時間施したことを示す図である。インキュベーション後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。
（Ｂ）　ドミナントアクティブＡｋｔ又はドミナントネガティブＡｋｔで一過性トランスフェクトされた、又はされていないＨ／ＡＲＫ細胞に、ＬＹ２９４００２（２０μＭ）の存在下又は非存在下で、２４時間グルコース飢餓を施したことを示す図である。インキュベーション後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２／ＰＩ染色分析を使用して、細胞死誘導を測定した。細胞死誘導比は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。
【図１１】ＡＲＫ５によるＡＴＭのリン酸化を示す図および写真である。
（Ａ）　各コンセンサス配列がボックス内に示されている。ＡＭＰＫ（上）又はＡｋｔ（下）によるリン酸化部位の概略モデルが、ＡＴＭ配列上に矢印により示されている。各コンセンサス配列が、それぞれボックス内に示されている。
（Ｂ）　５μＭ　ＣｄＣｌ２の添加により１６時間ＡＴＭ発現が誘導されたＰ／ＡＴＭ細胞（Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）に、ＡＲＫ５又はＡＲＫ５／ＡＳを２４時間トランスフェクトした、又はトランスフェクトしなかった。トランスフェクション後、３２Ｐのインビボ標識を実施し、細胞をグルコースを含む又は含まない培地中で１時間インキュベートした。Ｈｉｓ−ＡＴＭへの３２Ｐ取り込みを、Ｎｉ−アガロース収集により検出し、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化した。
（Ｃ）　ＰＤＫ１により活性化されたＡｋｔ１（２μｇ）の存在下又は非存在下で、Ｈｉｓ−ＡＴＭ（２μｇ）をＡＲＫ５と反応させた、又は反応させなかった。Ｈｉｓ−ＡＴＭへの３２Ｐ取り込みを、Ｎｉ−アガロース収集により検出し、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化した。
【図１２】マトリゲルコーティングが施された浸潤チャンバーを使用したインビトロ腫瘍転移アッセイを示す図および写真である。
（Ａ）　ＰＡＮＣ−１細胞系（ＡＲＫ５−）及びＰ／ＡＲＫ細胞系（ＡＲＫ５＋）を上方チャンバーに播き、２０μＭ　ＬＹ２９４００２の存在下（＋）又は非存在下（−）で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、下方チャンバーの底へと転移した細胞を計数した。転移細胞の数は、３回の実験の平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。
（Ｂ）　ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系を浸潤チャンバーで４８時間培養し、次いで、４８時間後、下方チャンバーの底へと転移した細胞を位相差顕微鏡で観察した。
【図１３】ＭＭＰの分泌及び発現を示す写真である。ＰＡＮＣ−１細胞系（ＡＲＫ５−）及びＰ／ＡＲＫ細胞系（ＡＲＫ５＋）を、マトリゲルコーティングが施された（＋）又は施されていない（−）６穴プレートにおいて、無血清培地で４８時間培養した。培養後、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の分泌の検出のため培養培地を濃縮し、ＭＴ１−ＭＭＰ発現の調査のため細胞抽出物を収集した。
【図１４】ヌードマウスにおけるＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系の腫瘍形成性を示す図である。ＰＡＮＣ−１細胞系（白）及びＰ／ＡＲＫ細胞系（黒）をヌードマウス（各５匹）へと移植し、腫瘍容積を１２週間にわたり測定した。腫瘍容積は、５個のデータの平均として示されており、バーはＳＥ値を表している。
【図１５】ヌードマウスにおいてＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系により形成された腫瘍の組織学的観察を示す写真および図である。移植から１２週間後、ＰＡＮＣ−１細胞系及びＰ／ＡＲＫ細胞系により形成された小型（Ａ）及び大型（Ｂ）腫瘍巣を抽出し、ＨＥ染色した。壊死領域は「Ｎ」として示されている。さらに、各腫瘍巣の中心領域が、それぞれ３００倍に拡大されている。
（Ｃ）　各腫瘍巣内の壊死領域を測定し、壊死領域の比率を５個のデータの平均として示した。バーはＳＥ値を表している。
【図１６】筋肉浸潤（Ａ）及び腸管膜転移（Ｂ）を示す写真である。Ｍ：筋肉；Ｔ：腫瘍；ＭＬ：筋肉層；Ｉｎｔ．：腸管。
【図１】
2004083494.tif 000055
【図２】
2004083494.tif 000056
【図３】
2004083494.tif 000057
【図４】
2004083494.tif 000058
【図５】
2004083494.tif 000059
【図６】
2004083494.tif 000060
【図７】
2004083494.tif 000061
【図８】
2004083494.tif 000062
【図９】
2004083494.tif 000063
【図１０】
2004083494.tif 000064
【図１１】
2004083494.tif 000065
【図１２】
2004083494.tif 000066
【図１３】
2004083494.tif 000067
【図１４】
2004083494.tif 000068
【図１５】
2004083494.tif 000069
【図１６】
2004083494.tif 000070