(57)【要約】【課題】技術者の技量、熟練度やカエル体内のホルモンバランスに関わりなく、一定量の良質な卵母細胞を入手可能にすることを目的とする。【解決手段】メスアフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを２回注射した後、該メスアフリカツメガエルから卵母細胞を摘出する。【効果】アフリカツメガエルから効率的に良質な卵母細胞を大量に入手することができ、コストも１／２から１／３に低減させることができる。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メスアフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを２回注射し、該メスアフリカツメガエルから卵母細胞を摘出することを含む、卵母細胞の入手方法。
【請求項２】
１回目の注射から２回目の注射までの間隔が２５日から３５日であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２回目の注射から卵母細胞の摘出までの期間が１日から２０日であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
メスアフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを２回注射して販売または譲渡することを特徴とする、アフリカツメガエルを販売または譲渡する方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法によって得られた複数の卵母細胞を容器に入れ、性腺刺激ホルモンを２回注射したことを表示して販売または譲渡を行うことを特徴とする卵母細胞の販売または譲渡方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アフリカツメガエルから良質な卵母細胞を大量に効率的に入手する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、アフリカツメガエルから卵母細胞を採取する際には、良質の卵母細胞をより多く、効率的に得るために、カエルの外観、年齢、体重などから良質の卵母細胞を保有していそうな個体を判断している。また、カエルに一度排卵させ、その卵細胞の形状から卵母細胞の良否を判定する方法もある。従来実験用として使用されているアフリカツメガエルは、年齢１年から１０年、体重５０ｇから３５０ｇのものがほとんどである。
【０００３】
なお、カエル卵母細胞は遺伝子、色素、蛋白質、ぺプチド、薬物などの試料を導入し、卵母細胞への色素、蛋白質、ぺプチド、薬物などの作用を確認する、遺伝子機能を解析する、遺伝子産物としての蛋白質を生産するなどの目的で広く使用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記の従来の方法は、技術者個人の技量、熟練度により、良質の卵母細胞を保有する個体を引き当てる確率が変動するという問題があった。これは良質のカエルを見分ける客観的な基準がとぼしいことが原因の一つである。また、一般の飼育環境では、水温、照明時間などを一定にしていても、カエル個体のホルモンバランスの年周期などにより、卵母細胞の良否の年内変動は避けられなかった。本発明は技術者の技量、熟練度やカエル体内のホルモンバランスに関わりなく、一定量の良質な卵母細胞を入手可能にすることを目的としている。
【０００５】
また上記の従来技術では一定量の良質な卵母細胞を保有するカエルを見極めることが困難なため、実験などに必要な数以上のカエルを使用し、実験などを成立させることが多い。本発明は最低数のカエルを用いて実験を成立させることを目的としている。
【０００６】
また本発明の他の目的は、高確率で良質の卵母細胞を大量に保有することを保証したアフリカツメガエルを、生産・販売または譲渡することにある。
更に本発明の他の目的は、上記の方法によって得られる良質の卵母細胞を販売または譲渡することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために、メスアフリカツメガエルに性腺刺激ホルモン注射を行なう方法を提供するものである。この方法の原理を下記に示す。
尚、本発明において、「良質」の卵母細胞とは、発生段階の識別において通常用いられるｓｔａｇｅにおけるｓｔａｇｅ５〜６の卵母細胞であって、好ましくは直径が約１ｍｍ、黒白がはっきりし、更には真球に近いもの、摘出から使用までの時間が経過しすぎていないものをいう。ｓｔａｇｅ１〜４の卵母細胞は、サイズが小さく、また細胞の性質がｓｔａｇｅ５〜６のものとは異なり、遺伝子等の試料の注入には適さず、遺伝子導入をしたことによる死亡率も高い。またｓｔａｇｅ６を越えたいわゆる過熟の卵母細胞は、死亡率が高く、実験用の用途のための供給には適さない。卵母細胞がいずれのｓｔａｇｅにあるかは、当業者であれば容易に識別することができる。
【０００８】
本発明において用いるアフリカツメガエルの年齢は、１年から１０年、好ましくは１年から５年、更に好ましくは１年から３年である。３年までのものを用いれば、過熟卵がそれ程多くないため好ましいが、性腺刺激ホルモンの注射前に予め人工的に排卵させておけば、過熟卵がなくなるため、１年から１０年のものでも好適な結果を得ることができる。また体重は８０ｇから３５０ｇ、好ましくは８０ｇから１３０ｇである。年齢が上がるにつれて体重が重くなるためであるが、上記排卵処理を行うことで、体重が重いものであっても好適に使用できる。
【０００９】
まず、メスアフリカツメガエルの背部皮下に５０〜１００ユニットの性腺刺激ホルモンを注射する。注射後、２５〜３５日目のカエルの背部皮下に５０〜１００ユニットの性腺刺激ホルモンを再度注射する。性腺刺激ホルモン（ゴナドトロピン）としては、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン及びこれらの混合物等が挙げられ、各種動物の下垂体から単離・精製されて市販されており、ウマ等の哺乳動物由来のものを好適に使用することができる。
【００１０】
２回目の注射から１日〜２０日後に卵母細胞を摘出する。なお、２回目の注射から１５日を過ぎると過熟卵が多くなりすぎるため、好ましくは５〜１５日目、より好ましくは７〜１３日のカエルが最も良質の卵母細胞を大量に保有している可能性が高い。
【００１１】
また、これらのカエルを輸送する際には、２回目の注射後、１〜２日経たものを通常の方法で輸送する。輸送後１週間以上経たカエルから卵母細胞を摘出することが好ましい。性腺刺激ホルモンを２回注射して販売または譲渡することにより、従来販売されているカエルと比較して卵母細胞の質が高く量の多いものが供給できることになり、コストを低減することができると共に、カエルの使用者にとっても無駄が少なく、効率的に実験を進めることができる。尚、本発明の方法を用いない場合の採取卵母細胞数は平均約３００個以下である。カエルから実験用の卵母細胞を摘出する場合、ｓｔａｇｅ５〜６の卵母細胞の割合が卵母細胞総数の７割未満であると、個々の卵母細胞の単離等の操作の負担が過大であり、廃棄してしまうことが多い。本発明の方法を用いることにより、ｓｔａｇｅ５〜６の卵母細胞を７割以上保有するカエルの割合を顕著に上げることが可能である。更に、遺伝子導入等の実験に使用する場合、卵母細胞を摘出した翌日には導入することが好ましいため、上記操作を施したカエルを提供することは、使用者に好都合である。
【００１２】
尚、性腺刺激ホルモンの投与を行ったアフリカツメガエルは、総排泄口が赤くなってくると共に、下腹部がはってくるという形態的な変化を示すようになる。従来実験用として販売されているアフリカツメガエルにおいては、総排泄口が赤くなった状態で販売されているものはない。
【００１３】
更に本発明は、上記方法によって得られた複数の卵母細胞を容器に入れ、性腺刺激ホルモンを２回注射したことを表示して販売または譲渡を行うことを提供する。上記したように卵母細胞の摘出後、実験までの期間が長すぎると好ましくないため、上記表示の他に、卵母細胞の摘出日時等を表示することも好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
実施例１
以下、本発明の実施例について、図１を用いて詳細に説明する。本実施例では第１回目の注射から２回目の注射までの期間を３０日間とするが、この期間は必ずしも３０日間には限定されるものではない。またここでは２回目の注射から摘出までの期間を１２日間とするが、この期間も必ずしも１２日間に限定されない。またここでは性腺刺激ホルモン量を１００ユニットとするが、この量も限定されるものではない。
【００１５】
年齢２年、体重１００ｇのメスアフリカツメガエル１を氷麻酔２し、背部側線器官内側３の皮下に性腺刺激ホルモン（ピーメックス）１００ユニットを注射する。３０日間の肥育後、再びメスアフリカツメガエル１を氷麻酔２し、背部側線器官内側３の皮下に性腺刺激ホルモン１００ユニットを注射する。更に１２日間の肥育後アフリカツメガエル１を氷麻酔し、腹部４より卵母細胞５を摘出する。
【００１６】
実施例２
以下、本発明の実施例について、図２を用いて詳細に説明する。本実施例では、実施例１で記述した方法を用いて、メスアフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを注射する。
２回目の性腺刺激ホルモンを注射してから、１日、６日、１３日、２０日、２７日経過した複数のアフリカツメガエルから卵母細胞を摘出する。それぞれの日において使用したアフリカツメガエルの匹数に対する、ｓｔａｇｅ５〜６の卵母細胞を概数として７割以上保有していたアフリカツメガエルの割合を計算したものを図２に示す。１日目では、良質の卵母細胞を保有していた割合が１０．０％であったが、６日目では２４．１％、１３日目では１８．８％であった。すなわち、性腺刺激ホルモンを注射してから、一定の時間が経過することによりアフリカツメガエルが良質の卵母細胞を有する確率が２倍になる。良質の卵母細胞を保有するカエルの割合が最も高くなったのは２回目の注射から６日後であった。
【００１７】
実施例３
以下、本発明の実施例について、図３を用いて詳細に説明する。本実施例では、実施例１で記述した方法を用いて、メスアフリカツメガエルに性腺刺激ホルモンを注射する。
２回目の性腺刺激ホルモンを注射してから、１日、６日、１３日、２０日、２７日経過した複数のアフリカツメガエルから卵母細胞を摘出する。それぞれのアフリカツメガエルから採取した卵母細胞数の平均値を示したものが図３である。１日目では平均３６２個であったが、６日目では８５３．１個、１３日目では９０８．８個であった。すなわち、性腺刺激ホルモンを注射してから、一定の時間が経過することによりアフリカツメガエルが保有する良質の卵母細胞数が２〜２．５倍になる。卵母細胞数の平均値が最大になるのは２回目の注射から６〜１３日後であった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によりアフリカツメガエルから効率的に良質な卵母細胞を大量に入手することができ、コストも１／２から１／３に低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】アフリカツメガエル注射及び卵母細胞の摘出方法を示す。
【図２】性腺刺激ホルモン注射後の経過日数と良質卵母細胞を保有するカエルの割合の関係を示す。
【図３】性腺刺激ホルモン注射後の経過日数とカエル１匹からの採取卵母細胞数の平均値の関係を示す。
【符号の説明】
１：メスアフリカツメガエル
２：氷
３：背部側線器官内側
４：アフリカツメガエル腹部
５：卵母細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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