(57)【要約】【課題】抗体安定化効果の高い抗体固定化技術と、これを利用した免疫反応法及び免疫反応装置を提供する。【解決手段】構造安定性を有する構造ユニットにおける、抗体等の直径とほぼ同等乃至やや大きい孔径の細孔中に、抗体又は抗体フラグメントを固定化する。構造ユニットは、好ましくは多数の均一な孔径のメソポアを有するメソポーラスシリカ多孔体である。このように固定化した安定化抗体の、抗原との特異的結合反応を利用した、免疫反応法及び免疫反応装置。【選択図】　　　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造安定性を有する構造ユニットにおける、抗体又は抗体フラグメントの直径に対してほぼ同等乃至やや大きい孔径の細孔中に、前記抗体又は抗体フラグメントを固定化したことを特徴とする安定化抗体。
【請求項２】
前記構造ユニットが、粉状の形態、粒状の基体材料の表面に膜状に形成された形態、又は任意形状の抗体固定床の表面に膜状に形成された形態のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の安定化抗体。
【請求項３】
前記構造ユニットが、界面活性剤のミセルのまわりに一定のシリカ質材料を用いて無機の骨格を形成した後、界面活性剤のミセルを除去して多数の均一な孔径を有するメソポアを形成したメソポーラスシリカ多孔体であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の安定化抗体。
【請求項４】
抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して目的物質の検出、測定又は精製を行う免疫反応法であって、その抗体として請求項１〜請求項３のいずれかに記載の安定化抗体を用いることを特徴とする免疫反応法。
【請求項５】
抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して目的物質の検出、測定又は精製を行うための免疫反応装置であって、該免疫反応装置における抗体を用いる部材、部位又はプロセスにおいて請求項１〜請求項３のいずれかに記載の安定化抗体を用いることを特徴とする免疫反応装置。
【請求項６】
前記免疫反応装置が、イムノアッセイ装置、イムノクロマトグラフィー装置、イムノバイオセンサー、水晶振動子センサー又は表面プラズモン共鳴センサーであることを特徴とする請求項５に記載の免疫反応装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、構造安定性を有する構造ユニットにおける特定の孔径の細孔中に抗体又は抗体フラグメントを固定化した安定化抗体と、この安定化抗体を利用した免疫反応法及び免疫反応装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗体（免疫グロブリン）は、抗原に対して特異的かつ鋭敏に免疫反応を起こすことから、単に医療目的での人体等への投与だけでなく、近年はむしろ、抗原あるいは抗原と結合した一定の目的物質に対するセンシング手段、測定手段、精製手段等としての利用が注目されている。そして、機能性タンパク質である抗体は温度、ｐＨ又は酵素作用等の環境要因により失活（即ち抗原との結合能を喪失）し易いため、その保存時や使用時において安定化を図ることが望ましい。
【０００３】
抗体が医薬として人体等に投与される場合には、生物体に対する安全の考慮から、抗体の安定化手段の種類はかなり限定される。しかし、上記のようなセンシング手段等として抗体を利用する場合には、医療になじまないような任意の手段で抗体を安定化したり、利用目的に合致した任意の形態で抗体を固定化することができる。以上の事情を踏まえ、従来より、抗体の安定化技術や固定化技術が種々に提案されている。
【０００４】
抗体の安定化技術としては、特公昭６２−２０９６５号公報に開示された方法が例示される。この方法は、免疫グロブリンを注射用に製剤化する際、生体内での抗体活性の持続時間を長くする目的でこれをスルホン化し、更に製造工程における凝集白濁化（抗体の失活）を抑制するために血清アルブミン、グリシン、マンニトール等を添加するものである。
【０００５】
次に、特開昭６３−８８１９７号公報に開示された方法では、溶液状態のモノクローナル抗体に対してグリセロール等の多価アルコールを添加することにより、保存期間中の抗体活性の低下を防ごうとする。又、特開昭６３−２２５３２０号公報に開示された方法では、抗体溶液にデキストランを添加して、抗体のオリゴマー化、分解又は析出による活性低下の防止を図っている。更に、特許第２９６６５９２号公報に開示された方法ではヒトモノクローナル抗体製剤の凍結乾燥後の再溶解時における安定化のためマンニトールを添加し、特公平６−９９３２５号公報に開示された方法では卵アルブミン加水分解物の添加により抗体の溶液状態の安定化を図っている。
【０００６】
一方、抗体の固定化技術、即ち、抗体を一定の形態を持った材料又は部材に固定化する事は、免疫測定法や免疫センサー等においては日常的に行われている。抗体の固定化担体としては、ラテックスやポリスチレンチューブ等が一般的であるが、その他にも、例えば特公平７−１２２６２２号公報に開示されたフィブロインフィルム、特許第２６４２３４２号公報に開示された不溶性多孔質シート、ＵＳＰ４０７１４０９号公報に開示された多孔質ガラス等が例示される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記した従来の抗体の安定化技術は、いずれも抗体の溶液状態での安定化又は析出防止を目的とし、抗体溶液中に安定化剤を共存させる点において共通する。しかし、単に安定化剤を共存させる方式では、仮に抗体溶液を低温下や凍結乾燥状態で保存しても、その安定化効果は限定されたものである。通常、このような方式による有効な保存期間は数ケ月程度以下であり、実用的要求に必ずしも応えていなかった。しかも、種々の理由により抗体溶液のｐＨが大きく変化したり、抗体溶液に有機溶媒を混入させたりした場合には、ほとんど安定化効果を期待できない。
【０００８】
一方、上記した従来の抗体の固定化技術については、当該技術分野の常識からして、十分な固定化効果を得ることがまず優先され、安定化効果については必ずしも十分に考慮されていない。実際、上記従来の抗体固定化技術においては、固定化が抗体活性に与える影響について言及も評価もしていない。
【０００９】
以上のように、抗体活性を安定化するために抗体を固定化する、と言う技術目的を明示した従来技術は存在しない。更には、抗体安定化のために必要又は有益な固定化の形態を具体的に提示した従来技術は存在しない。本願発明は、従来の抗体固定化技術とは異なるアプローチで、抗体の固定化を抗体の安定化技術として捉え直し、抗体安定化効果の高い抗体固定化技術を開発すること、及び、その技術的メリットを享受できる免疫反応法及び免疫反応装置を提供することを、解決すべき課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明（請求項１に記載の発明）の構成は、構造安定性を有する構造ユニットにおける、抗体又は抗体フラグメントの直径に対してほぼ同等乃至やや大きい孔径の細孔中に、前記抗体又は抗体フラグメントを固定化した、安定化抗体である。
【００１１】
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明（請求項２に記載の発明）の構成は、前記第１発明に係る構造ユニットが、粉状の形態、粒状の基体材料の表面に膜状に形成された形態、又は任意形状の抗体固定床の表面に膜状に形成された形態のいずれかである、安定化抗体である。
【００１２】
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明（請求項３に記載の発明）の構成は、前記第１発明又は第２発明に係る構造ユニットが、界面活性剤のミセルのまわりに一定のシリカ質材料を用いて無機の骨格を形成した後、界面活性剤のミセルを除去して多数の均一な孔径を有するメソポアを形成したメソポーラスシリカ多孔体である、安定化抗体である。
【００１３】
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明（請求項４に記載の発明）の構成は、抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して目的物質の検出、測定又は精製を行う免疫反応法であって、その抗体として第１発明〜第３発明のいずれかに係る安定化抗体を用いる、免疫反応法である。
【００１４】
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明（請求項５に記載の発明）の構成は、抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して目的物質の検出、測定又は精製を行うための免疫反応装置であって、該免疫反応装置における抗体を用いる部材、部位又はプロセスにおいて第１発明〜第３発明のいずれかに係る安定化抗体を用いる、免疫反応装置である。
【００１５】
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明（請求項６に記載の発明）の構成は、前記第５発明に係る免疫反応装置が、イムノアッセイ装置、イムノクロマトグラフィー装置、イムノバイオセンサー、水晶振動子センサー又は表面プラズモン共鳴センサーである、免疫反応装置である。
【００１６】
【発明の作用・効果】
（第１発明の作用・効果）
第１発明の安定化抗体では、構造安定性を有する構造ユニットにおいて、抗体又は抗体フラグメント（以下、単に「抗体等」と言うときは、抗体及び抗体フラグメントを意味する）の直径とほぼ同等か、これよりやや大きい孔径の細孔中に抗体等を固定化している。そのため、細孔中において抗体等の分子レベルでの大きな変形が物理的に規制され、抗体の活性な立体的コンフォメーションが安定的に維持される。即ち、前記従来の抗体安定化技術に比較して、抗体等の失活が著しく起こり難い。
【００１７】
構造ユニットに構造安定性がない場合は、十分な安定化効果を期待できない。、構造ユニットの細孔が抗体等に比較して過大であると、抗体等が固定化された細孔内に大きな隙間が残る恐れがあり、抗体の活性な立体的コンフォメーションが十分に保護されない。構造ユニットの細孔が抗体等に比較して過小であると、抗体等の分子全体が十分に細孔内に入り込めないので、やはり抗体活性が有効に保護されない。
【００１８】
第１発明のように、抗体の立体的コンフォメーションを３次元の物理的な空間規制によって安定化させると言う試みは、溶液状態の抗体に安定化剤を添加する従来技術に比較して、新規かつ斬新である。又、専ら固定化を目的として抗体を担体に結合させる従来技術の場合、抗体を担体表面へ固定化する技術においては、抗体の立体的コンフォメーションがほとんど保護されないから、安定化効果が極めて乏しいと考えられる。抗体を多孔質材料に固定化する従来技術も存在するが、抗体の立体的コンフォメーションの３次元的空間規制に不可欠な細孔−抗体間のサイズの関係が考慮されていないため、その安定化効果は限定的であると考えられる。
【００１９】
第１発明の安定化抗体における抗体の安定化効果は、安定化抗体が保存上の要求や使用上の要求から、乾燥状態や水溶液等の液体中での分散状態にあっても、十分に維持される。
【００２０】
一方、従来の抗体安定化技術において、有機溶媒やｐＨ変化に対する抗体の安定化は未解決の問題の一例である。例えば、水に難溶性の環境ホルモン、薬物等を対象とする測定に抗体を用いる場合、測定系に有機溶媒を使用又は添加したい場合がある。水晶振動子センサーや表面プラズモン共鳴センサー等においては、抗体が繰り返し使用され、一旦は結合した抗原と抗体を酸処理、アルカリ処理等により解離させる必要がある。第１発明の安定化抗体は、これらの場合においても安定であることが確認された。
【００２１】
（第２発明の作用・効果）
上記第１発明に係る安定化抗体の担体たる構造ユニットは任意の材料形態を備えることができるが、抗体の保存目的又は使用目的に対応して、より好ましくは粉状の形態、粒状の基体材料の表面に膜状に形成された形態、又は任意形状の抗体固定床の表面に膜状に形成された形態のいずれかとすることができる。
【００２２】
構造ユニットが粉状の形態をとる場合には、抗体の分散液状態での保存又は使用、凍結乾燥状態での保存等に有利である。構造ユニットが粒状の基体材料の表面に膜状に形成された形態をとる場合には、クロマトグラフィー用カラムへの充填、イムノクロマトグラフィーにおける固定化等に有利である。構造ユニットが任意形状の抗体固定床の表面に膜状に形成された形態をとる場合には、水晶振動子イムノセンサー、表面プラズモン共鳴センサー等に有利である。
【００２３】
（第３発明の作用・効果）
上記第２発明に係る安定化抗体において、構造ユニットがメソポーラスシリカ多孔体である場合、製造プロセス上も有利であり、抗体の特に高い安定化効果が得られ、しかも抗体を高単位に固定化できる。
【００２４】
その第１の理由は、後述のようにメソポーラスシリカ多孔体の製造プロセスを選択することにより、粉状の形態の構造ユニットや、任意形状の基体表面に膜状に形成された形態の構造ユニットとを自由に造り分けることができる点である。第２の理由は、界面活性剤の種類の選択により、ミセルのサイズの制御を通じて、構造ユニットにおける最適な細孔径を正確に決定できることである。第３の理由は、単一種類の界面活性剤を用いることにより、構造ユニットにおける多数の細孔を均一な孔径に揃えることができる点である。第４の理由は、上記のような細孔を高密度に備えた多孔体が得られるので、抗体の高単位固定化が容易となる点である。
【００２５】
（第４発明の作用・効果）
第４発明の免疫反応法においては、第１発明〜第３発明に係る安定化抗体を用いるので、その実施に当たり第１発明〜第３発明の上記作用・効果を十分に享受することができる。
【００２６】
（第５発明の作用・効果）
第５発明の免疫反応装置においては、抗体を用いる部材、部位又はプロセスにおいて第１発明〜第３発明に係る安定化抗体を用いるので、その実施に当たり第１発明〜第３発明の上記作用・効果を十分に享受することができる。
【００２７】
（第６発明の作用・効果）
上記第５発明に係る免疫反応装置としては、イムノアッセイ装置、イムノクロマトグラフィー装置、イムノバイオセンサー、水晶振動子センサー又は表面プラズモン共鳴センサーを好ましく例示することができる。
【００２８】
【発明の実施の形態】
次に、第１発明〜第６発明の実施の形態について説明する。以下において単に「本発明」と言うときは、第１発明〜第６発明を一括して指している。
【００２９】
〔抗体等〕
本発明において対象となる抗体又は抗体フラグメント（抗体等）の種類は限定されない。抗体フラグメントとは、完全な抗体に比較してアミノ酸配列又は立体構造において部分的に欠失しているが、抗原との特異的な結合能力を実質的に保持しているポリペプチドを言う。
【００３０】
対象となる抗体としては、具体的には、抗体のＦｃ部分を欠失させた　（Ｆａｂ）２　もしくは　Ｆａｂ型抗体、あるいは遺伝子組換え技術によって作製した　ＳｃＦＶ　型抗体等を例示することができる。
【００３１】
〔安定化抗体〕
本発明に係る安定化抗体は、構造安定性を有する構造ユニットにおける、抗体等の直径に対してほぼ同等乃至やや大きい孔径の細孔中に、抗体等を固定化したものである。「ほぼ同等乃至やや大きい」とは、例えば、構造ユニットの細孔の径が抗体等の直径とほぼ同等以上であり、かつ、抗体等の直径の１．５倍以下、より好ましくは１．２倍以下であることを言う。
【００３２】
構造ユニットの細孔と抗体等の直径が上記の関係にあるとき、抗体が十分に安定化され、かつ、固定化された抗体等が抗原と反応するために必要な僅かな立体的コンフォメーションの変化や、抗原との結合・解離が効率的に行われる。
【００３３】
安定化抗体の構造の一例を図１に概念化して示す。図１は、基体材料の表面に膜状に形成された構造ユニットと、該構造ユニットに固定化された抗体との概念図である。基体材料である固定床１上には構造ユニット２が膜状に形成されている。構造ユニット２はｐＨ，熱，流体の流動等の環境条件に対して構造安定性を有する中空の構造体である。構造ユニット２の細孔３には略「Ｙ」字形に図示する抗体４が収容・固定化されている。この抗体４は、抗原５に対する特異的な結合能力を発現するものであり、通常の抗体や、抗体フラグメント即ち抗体活性部位を含有する抗体断片等により構成される。抗体４は、構造ユニット２の細孔３中に固定化されることにより、立体構造の大きな変化による失活が抑制されると共に、抗原５との特異的結合に必要な活性部位の比較的小さな構造変化は許容する程度の自由度を与えられる。
【００３４】
抗体４は、構造ユニット２に対して　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａａｌｓ力等により結合している。構造ユニット２の細孔３の空間形状は、抗体４の立体形状とほぼ合致していることが、特に好ましい。この場合の蜂の巣形状の構造ユニット２は、例えば後述のように、層状シリケートと界面活性剤を利用して形成されるメソポーラスシリカ多孔体等であり得る。
【００３５】
〔構造ユニット〕
上記図１に示す構造ユニット２は、無機材料から構成されても良く、有機ポリマー等の有機材料から構成されても良い。有機材料からなる構造ユニット２においては、抗体の周りを、場合によっては構造ユニットと抗体とを連結する要素であるアンカーユニットを介して、被覆するためのポリマー形成反応が必要である。上記ポリマーの種類や、これを構成すべきモノマーの種類は、発明の目的を阻害しない限りにおいて特段に限定されない。
【００３６】
無機材料からなる構造ユニットとしては、例えばケイ酸（ＳｉＯ２　）やアルミナ等の各種金属酸化物、ＳｉＯ２　−ＭＯ２／ｎ　（ＭはＡｌ等の金属）で表される複合酸化物等によって構成することができる。例えば、ケイ酸からなる構造ユニットの形成方法として、カネマイトのような層状シリケート，アルコキシシラン，シリカゲル，水ガラス，ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
【００３７】
無機材料から構造ユニットを作製するには、無機材料を界面活性剤（テンプレート物質）と混合反応させ、界面活性剤のミセルのまわりに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば４００°Ｃ〜６００°Ｃでの焼成や、有機溶剤抽出等により界面活性剤を除去して、界面活性剤のミセルと同じサイズ及び形状のメソポア細孔を無機骨格中に形成することができる（メソポーラスシリカ多孔体）。従って、メソポーラスシリカ多孔体においては、抗体等とほぼ対応したサイズの多数の細孔を均一な孔径を以て形成できる点に大きな特徴がある。
【００３８】
上記構造ユニットの作製方法において、ケイ素含有化合物例えばケイ酸を出発材料とする場合には、カネマイトの如き層状シリケートをまず形成し、この層間にミセルを挿入し、ミセルが存在しない層間をシリケート分子で繋ぎ、その後ミセルを除去して細孔を形成することができる。この方法は、粉状の形態を持つ構造ユニットを作製するのに適している。
【００３９】
又、上記構造ユニットの作製方法において、ケイ素含有モノマー（例えば水ガラス、アルコキシシラン）を出発材料とし、界面活性剤のミセルの周囲にケイ素含有モノマーを集合させて重合させることによりシリカを形成し、次いでミセル分子を取り除いて細孔を形成することもできる。この方法は、ケイ素含有モノマーを含む反応液を、例えば粒状の基体材料や一定の形状又は形態を持った抗体固定床等のベース材の表面に塗布したり、スピンコートしたりした後、ケイ素含有モノマーを重合させることにより、ベース材の表面膜の形態を持つ構造ユニットを作製するのに適している。
【００４０】
カネマイトの如き層状シリケートの形成を介して構造ユニットを形成する方法においては、細孔表面は疎水性であり、かつアニオン性を有する。疎水性表面は水和していない抗体の安定な固定化のために好ましく、アニオン性表面は表面にカチオンを有する抗体の固定化のために好ましい。
【００４１】
上記ミセルは、適当な媒体中に各種の界面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤や、例えばアルキルスルホン酸塩のような陰イオン界面活性剤や、例えばポリエチレングリコール系等の非イオン界面活性剤、を分散させることにより形成される。ミセル形状としては、球状，シリンダー状，層状等があり、又、それらが規則的に配列してヘキサゴナル，キュービック構造を持つ、液晶構造が形成される。
【００４２】
界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えることによりミセルの径を変化させ、形成される細孔の径を制御することができる。又、界面活性剤と併せ、トリメチルベンゼン，トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することにより、ミセルを膨潤させ、結果的に更に大きな細孔を形成することもできる。
【００４３】
構造ユニットの形態としては粉末状，顆粒状，バルク状，膜状等がある。構造ユニットを構成する多孔性細孔の好ましい細孔径（直径）は、その中に固定される抗体の直径との対応で規定されるが、一般的には、１ｎｍより大きく、好ましくは２ｎｍより大きい。又、一般的に３０ｎｍより小さい。
【００４４】
前記アンカーユニットを構成する分子としては構造ユニットと基本的には同じ構造が望ましく、特に酵素が活性ユニットである場合に、これに結合するために、水酸基，アミド基，アミノ基，ピリジン基，ウレア基，ウレタン基，カルボン酸基，フェノール基，アゾ基，ヒドロキシル基，シラン誘導体，アミノアルキレン基等の官能基が結合していることが必要である。
【００４５】
本発明の安定化抗体を組み立てるに当たり、まず抗体に直接連結させる分子を介してポリマー反応を行い、抗体を収容した状態で構造ユニットを形成しても良く、又、構造ユニットを先に形成しておき、これに、場合によっては抗体自身が有するリジンのアミノ基等を介して抗体を導入しても良い。抗体と構造ユニットとの結合は、前記　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａａｌｓ力による結合や共有結合のみならず、イオン結合，水素結合，疎水結合等であっても良い。
【００４６】
〔免疫反応法〕
本発明に係る免疫反応法は、上記安定化抗体を用いることにより、抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して目的物質の検出、測定又は精製を行うものである限りにおいて、限定されない。
【００４７】
本発明に係る免疫反応法として、より好ましくは、ラジオイムノアッセイ法、酵素免疫測定法、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフィー法等を例示できる。
【００４８】
〔免疫反応装置〕
本発明に係る免疫反応装置は、抗原−抗体間の特異的結合反応を利用して目的物質の検出、測定又は精製を行うための免疫反応装置であって、該免疫反応装置における抗体を用いる部材、部位又はプロセスにおいて上記安定化抗体を用いる限りにおいて、その種類や構成を限定されない。
【００４９】
本発明に係る免疫反応装置として、より好ましくは、イムノアッセイ装置、イムノクロマトグラフィー装置、イムノバイオセンサー、水晶振動子センサー又は表面プラズモン共鳴センサーを例示できる。
【００５０】
図２に、本発明に係る免疫反応装置の一種であるイムノクロマトグラフィー装置の簡略化した構成例を示す。図２において、抗体を固定化した担体が充填されているアフィニティカラム６に対して、抗原を含む水溶液がポンプ７から送液される。そしてカラム中では抗原のみが吸着され、それ以外の物質は素通りする。その後、バルブ８の切り替えによりポンプ９から送液された酸性の溶出液によって、抗原がアフィニティカラム６から分離され、フラクションコレクター部１０の試験管等に回収される。なお、この装置の場合、アフィニティカラム６のｐＨを元の状態に戻すことにより再使用でき、繰り返し使用の可能な回数が多いほど好ましいものである。
【００５１】
図３に、本発明に係る免疫反応装置の一種である水晶振動子センサーの簡略化した構成例を示す。図３（ａ）において、公知の構成を持つ水晶振動子１１が設置された容器１２において、表面に抗体１３を固定化したラテックス粒子１４が水溶液中に懸濁されている。この容器１２に抗原１５を投入すると、図３（ｂ）のように抗原−抗体反応を通じて水晶振動子１１上での免疫ラテックス凝集反応が起こり、水晶振動子１１の振動周波数が変化する。その変化量を読み取って抗原を定量するのである。この装置の場合、抗体を固定化したラテックス粒子は使い捨てとなるため、抗体の保存期間が長いことが好ましい。
【００５２】
【実施例】
〔実施例１：メソポーラスシリカ多孔体の合成−１〕
ＴＥＯＳ（テトラエトキシシラン）、塩酸でｐＨ２に調整した水、及びエタノールを、１：５：３．８の重量割合に混合し、２５度Ｃで攪拌した後、４０〜６０°Ｃで適当な時間放置してゾル化させた。この放置時間は通常、０．５〜２３時間の範囲内である。次いで、エタノールで希釈したＣＡＴＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を、超音波攪拌下で添加した。ＣＡＴＢの添加量は、１モルのＳｉに対してＣＡＴＢが０．１モルとなる割合とした。
【００５３】
次に、上記の反応液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後、ベース材としての金膜上で２０００　ｒ．ｐ．ｍ．　の条件でスピンコートし、薄膜を形成させた。この金膜は、予め界面活性剤中で超音波洗浄し、十分に水洗して窒素気流中で乾燥しておいたものである。上記の薄膜を形成させた金膜は、室温で１日乾燥させた後、４００°Ｃにて１２時間加熱することにより、ＣＡＴＢ等の有機成分を完全に除去した。これにより、多孔体薄膜（本例に係る、薄膜状に形成されたメソポーラスシリカ多孔体を伴う金膜を言う。以下同様）を得た。
【００５４】
〔実施例２：安定化抗体の作製−１〕
上記の多孔体薄膜を収容した容器に、マウスモノクローナル抗体（抗原はコルチゾール）を脱イオン水にて１０ｍｇ／ｍｌに希釈した液１００ｍｌを注加して、４°Ｃで４時間以上緩やかに混和することにより、多孔体薄膜における薄膜状メソポーラスシリカ多孔体の細孔に抗体を固定化した。その後、安定化抗体薄膜（本例に係る、抗体固定化薄膜状メソポーラスシリカ多孔体を伴う金膜を言う。以下同様。）を脱イオン水で３回洗浄した。
【００５５】
〔実施例３：結合活性の測定〕
上記の安定化抗体薄膜をシャーレの底に置き、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したコルチゾールと室温で２時間反応させた。次に安定化抗体薄膜を十分に水洗した後、ペルオキシダーゼの基質であるｏ−フェニレンジアミン溶液を用いて発色反応を行った。そして基質溶液の４９０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、抗体のコルチゾールに対する結合活性（以下、単に「結合活性」とも言う。）を求めた。
【００５６】
なお、この場合のネガティブコントロールとしては、前記多孔体薄膜に対してコルチゾール抗体でない非特異的なマウスイムノグロブリンを実施例２と同様にして固定化したものを用い、両者の吸光度の差より結合活性を求めた。その結果を表１に示すが、コントロールに比較して本実施例は吸光度が明らかに高く、抗体が有効に固定化され、かつ固定化後も有効に抗原抗体反応が起きていることが分かった。
【００５７】
【表１】
2004083501.tif 000003
〔実施例４：乾燥状態での安定化効果〕
実施例２で得た安定化抗体薄膜を乾燥状態で３７°Ｃにて長期に（具体的には、表２に示す日数）保存し、抗体の結合活性の経時変化を調べた。対照として、ベース材としての金膜上に、公知の手段により実施例２と同じコルチゾール抗体を同じ量的割合で非共有結合により固定化させたもの（以下、単に「抗体固定化金膜」と言う。）を用いた。
【００５８】
これらの測定結果を、固定化直後の結合活性を１００とした場合の相対活性値で表２に示すが、対照例に比較して、本実施例は乾燥状態での経時的安定性が格段に高かった。
【００５９】
【表２】
2004083501.tif 000004
〔実施例５：溶液状態での安定化効果〕
実施例４で用いたものと同じ安定化抗体薄膜及び対照例の抗体固定化金膜について、この両者を３７°ＣにてｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に長期に（具体的には、表３に示す日数）保存し、抗体の結合活性の経時変化を調べた。
【００６０】
これらの測定結果を、固定化直後の結合活性を１００とした場合の相対活性値で表３に示すが、対照例に比較して、本実施例は溶液中での経時的安定性が格段に高かった。
【００６１】
【表３】
2004083501.tif 000005
〔実施例６：有機溶媒存在下での安定化効果〕
実施例４で用いたものと同じ安定化抗体薄膜及び対照例の抗体固定化金膜について、この両者を２０％エタノールを含むリン酸緩衝液中で、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したコルチゾールと室温下０．５〜３時間（具体的には、表４に示す時間数）反応させた。反応後、安定化抗体薄膜及び抗体固定化金膜を洗浄し、ペルオキシダーゼの基質であるｏ−フェニレンジアミン溶液を用いて発色反応を行った。
【００６２】
そして実施例３の場合と同様にして抗体の結合活性を測定した。その結果を表４に示すが、本実施例においては抗体反応時間を長くすることで結合活性が増大し、２時間でほぼプラトーに達した。一方、対照例の抗体固定化金膜では、恐らくはエタノールによる抗体の変性のため、抗体反応時間を長くすることで結合活性が低下した。
【００６３】
【表４】
2004083501.tif 000006
〔実施例７：繰り返し使用における安定化効果〕
ヒトアルブミンに対する抗体を、実施例２と同じ要領で多孔体薄膜に固定化した。一方、対照として、実施例４に係る抗体固定化金膜と同じ要領でヒトアルブミンに対する抗体を金膜上に固定化した。これらの膜体について、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）センサーを用いて繰り返し使用における抗体の安定化効果を調べた。
【００６４】
即ち、これらの膜体をＳＰＲセンサーの抗体固定化チップ部として組み込み、ヒトアルブミン溶液を送液して、ＲＵ（レゾナンスユニット）で抗体との結合活性を求めた。その後、０．１Ｍの塩酸溶液を流してアルブミンと抗体との結合を解離させ、更にアルブミン溶液を送液して抗体との結合活性を求めた。このような操作の繰り返しを合計５回行い、その都度の抗体との結合活性を測定した。
【００６５】
その結果を表５に示すが、本実施例に係る安定化抗体薄膜では、塩酸による抗原と抗体との解離を伴う操作の繰り返しによっても、結合活性（ＲＵ）はほとんど低下しなかった。対照例では、上記操作の繰り返しに伴い結合活性の大きな低下が認められた。
【００６６】
【表５】
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〔実施例８：メソポーラスシリカ多孔体の合成−２〕
１００ｍｌのビーカーに５．０ｇ（０．０２８ｍｏｌ）のδ−Ｎａ２　Ｓｉ２　Ｏ５　（カネマイト）及び５０ｍｌのイオン交換水を入れ、室温で３時間攪拌した後、濾過してδ−Ｎａ１．６　Ｈ０．４　Ｓｉ２　Ｏ５　の沈殿物を得た。この沈殿物に５０ｍｌのイオン交換水を加え、均一な分散液になるまで攪拌した。これをＡ液とする。
【００６７】
１００ｍｌの三角フラスコに４．０ｇ（０．０１　ｍｏｌ）のドコシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＭＡ−Ｂｒ）及び５０ｍｌのイオン交換水を入れて６０°Ｃで攪拌し、完全に透明液になってから、８．０ｇ（　０．０４ｍｏｌ）のトリイソプロピルベンゼン（ＴＩＰＢ）を添加して激しく１０分間攪拌した後、６０°Ｃで保持した。これをＢ液とする。
【００６８】
上記Ａ液を２５０ｍｌ容の三口丸形フラスコに移して激しく攪拌しながら、それに６０°Ｃに保ったＢ液を徐々に添加し８０°Ｃまで昇温させ、続けて同温度で３時間恒温反応させた。次に塩酸を用いて反応液のｐＨを８．５±０．１まで調整し、続けて３時間攪拌した。反応終了後すぐに反応物を濾過捕集し、十分に水洗した後、４５°Ｃで２４時間風乾させた。次いで風乾物を５５０°Ｃで６時間焼成することにより有機成分を除き、白色粉末を約４．５ｇ得た。
【００６９】
この白色粉末（以下、ＦＳＭと言う）の構造をＸ線回折装置（理学社製ＲＡＤ−Ｂ）で確認し、その細孔径や表面積及び細孔総容積をＮ２　吸着装置（Ａｕｔｏｓｏｒｂ）で測定した結果、ＦＳＭが前記構造ユニット（平均細孔径約７０Åのほぼ均一な細孔）を備えるメソポーラスシリカ多孔体であることを確認した。
【００７０】
〔実施例９：安定化抗体の作製−２〕
上記のＦＳＭ３ｇを収容した容器に、前記マウスモノクローナル抗体を脱イオン水にて１０ｍｇ／ｍｌに希釈した液１００ｍｌを注加して、室温で緩やかに攪拌することにより、ＦＳＭの細孔に抗体を固定化した。こうして得られた安定化抗体ＦＳＭ（本例に係る、抗体を固定化したＦＳＭ）を濾過・水洗し、室温で乾燥させた。
【００７１】
〔実施例１０：安定化抗体ＦＳＭの溶液状態での安定化効果〕
実施例９で得られた安定化抗体ＦＳＭを用い、これを３７°ＣにてｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に２週間以内の所定の日数（具体的には、表６に示す日数）保存し、前記実施例３に準ずる方法で結合活性を測定した。対照としては可溶性の抗コルチゾール抗体を用い、抗マウスＩｇＧ　抗体をプレートに固定したものを用いて結合活性を測定した。
【００７２】
測定結果を表６に示すが、安定化抗体ＦＳＭは、可溶性の抗体に比較して良好な安定性を示した。
【００７３】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】安定化抗体の一例を示す図である。
【図２】免疫反応装置の一例を示す図である。
【図３】免疫反応装置の他の一例を示す図である。
【符号の説明】
１　　　　　　　固定床
２　　　　　　　構造ユニット
３　　　　　　　細孔
４　　　　　　　抗体
５　　　　　　　抗原
６　　　　　　　アフィニティカラム
１１　　　　　　水晶振動子
１２　　　　　　容器
１３　　　　　　抗体
１４　　　　　　ラテックス粒子
１５　　　　　　抗原
【図１】
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【図２】
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【図３】
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