(57)【要約】【課題】溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイを別々のウェル中で行うことなく、１つのウェル中で行うことができ、アッセイの再現性を改善することができる、アッセイ方法および製造物品を提供することである。【解決手段】溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：（ａ）強酸、強塩基、および水で順次洗浄することにより該ポリスチレン表面を清浄化する工程；（ｂ）該清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程；および（ｃ）該核酸プローブを、該第一官能基および該第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、該吸着したポリマーに共有結合させる工程。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）強酸、強塩基、および水で順次洗浄することにより該ポリスチレン表面を清浄化する工程；
（ｂ）該清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程；および
（ｃ）該核酸プローブを、該第一官能基および該第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、該吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイの分野に属する。より詳細には、本発明は、分析される核酸を溶液から取り出す目的のために、ポリスチレン表面上に核酸プローブを固定するための改良方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
同一人に譲渡された米国特許第４，８６８，１０５号には、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイが開示されている。このアッセイでは、分析される核酸は、まず第一の容器中で、溶液中で、標識化プローブのセットとハイブリダイズされ、そして捕獲プローブのセットとハイブリダイズされる。次いで、プローブ−分析物複合体は、捕獲プローブのセグメントに相補的である固相固定化プローブを含む第二の容器に移される。このセグメントは固定化プローブにハイブリダイズするので、溶液から複合体は除去される。固定化複合体の形態で分析物を有することにより、アッセイにおける続く分離工程が容易になる。最終的に、標識化プローブのセットの一本鎖セグメントは標識プローブにハイブリダイズされるので、分析物含有複合体は、標識から直接または間接的に生じたシグナルによって検出され得る。
【０００３】
同一人に譲渡された欧州特許出願（ＥＰ）第３１７０７７号には、米国特許第４，８６８，１０５号に記載のアッセイの変形が開示されており、ここでは、標識プローブにより生じるシグナルが増幅される。この増幅は、核酸マルチマーの使用を包含する。これらのマルチマーは、分枝ポリヌクレオチドであって、分析される核酸にまたは分析物に結合した核酸（分枝または直鎖状）に特異的にハイブリダイズするセグメント、ならびに、標識プローブに特異的にハイブリダイズする第二のセグメントの反復を有するように構築されている。マルチマーを用いるアッセイでは、分析物を、標識または増幅プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと、第一の容器内でハイブリダイズさせ、そして複合体を、捕獲プローブのセグメントとハイブリダイズする固定化核酸を含む他の容器に移すという開始工程が行われる。次いで、マルチマーは固定化複合体にハイブリダイズされ、さらに、標識プローブはマルチマーの第二のセグメントの反復にハイブリダイズされる。マルチマーは、標識プローブが付着する多数の部位を提供するので、シグナルが増幅される。
【０００４】
１９９０年７月２７日に出願された同一人に譲渡された同時係属出願米国特許出願第５５８，８９７号（ＰＣＴ　ＷＯ９２／０２５２６）には、上記溶液相アッセイに用いられる、大きなコーム型分枝ポリヌクレオチドマルチマーの調製が記載されている。このコームは、より小さいマルチマーよりも強くシグナルを増強する。
【０００５】
ＥＰ３１７０７７に記載のように、２つの型の溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ形式が使用される：それはビーズアッセイ手順、およびマイクロタイタープレートアッセイ手順である。実際には、マイクロタイタープレートアッセイが、好ましい。ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル中の捕獲プローブを固定する手順は、以下に示すとおりであった。ポリ−（フェニルアラニル−リシン）を、プレートのウェル表面上に受動的に吸着させた。固定化されるべきオリゴヌクレオチドを、固相法によって５’改変シチジン（シチジンのＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル誘導体）を有するように合成した。このオリゴヌクレオチドを、改変シチジンと二価性架橋剤のエチレングリコールビス−（スクシンイミジルスクシネート）との反応によって活性化し、そして、活性化オリゴヌクレオチドを、ウェルに添加し、室温でインキュベートした。インキュベーションの間、架橋剤の他の官能基は、吸着したポリ−（フェニルアラニル−リシン）の一級アミノ基と反応し、このためオリゴヌクレオチドを固定する。次いで、ウェルをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄（ｗａｓｈｅｄ）し、ＨＭ緩衝液（０．１％　ＳＤＳ、４×ＳＳＣ、１ｍｇ／ｍＬ　音波処理サケ精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍＬ　ポリ−Ａ、１０ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン）でコートし、ＰＢＳで再び洗浄し、そして使用のために保存した。示されるように、捕獲プローブセットおよび増幅プローブセットに対する、分析物の初期ハイブリダイゼーションを、塩基条件下で別のウェル中で行った。ハイブリダイゼーション後、溶液を中和した。そして、中和溶液を固定化プローブを含むウェル中に移した。初期ハイブリダイゼーションは、固定化捕獲プローブを含んだウェル中では行われ得なかった。なぜなら、固定化複合体は、ハイブリダイゼーション条件下で不安定であるからである。
【０００６】
本発明は、上記の従来の手順よりも優れるいくつかの利点を提供する。第一に、本発明によれば、初期ハイブリダイゼーションを包含する全体のアッセイが、１っのウェル中で行われ得る。第二に、本発明は、アッセイの再現性を改良する。最後に、大きなコーム型マルチマーを用いるその好ましい実施態様において、バックグラウンドシグナルを減少させる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の１つの局面は、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、この方法は以下の工程を包含する：
（ａ）強酸、強塩基および水で順次洗浄することによりポリスチレン表面を清浄化する（ｃｌｅａｎｓｉｎｇ）工程；
（ｂ）ポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程；および
（ｃ）核酸プローブを、塩基安定性の連結を通じて、吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【０００８】
本発明の別の局面は、ポリスチレン表面上に吸着したポリマーおよび塩基安定性の連結を通じてポリマーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を包含する、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための製造物品である。
【０００９】
本発明のさらに別の局面は、試料中において分析される一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイの改善であり、ここで、アッセイが、以下の工程：
（ａ）試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびＤＮＡマルチマーのセグメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相補的な第二セグメントを有する、工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリスチレン表面に固定化した該オリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、該マルチマーと接触させる工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、該マルチマーにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、そして改良点は、工程（ｂ）において、吸着したポリマーを通じてポリスチレン表面に固定化したオリゴヌクレオチドであって、塩基安定性の連結を通じて該吸着したポリマーに共有結合したオリゴヌクレオチドを使用することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
（項目１）　溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いるための、第一官能基を有する核酸プローブをポリスチレン表面上に固定化するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）強酸、強塩基、および水で順次洗浄することによりこのポリスチレン表面を清浄化する工程；
（ｂ）この清浄化されたポリスチレン表面上へ第二官能基を有するポリマーを受動的に吸着させる工程；および
（ｃ）この核酸プローブを、この第一官能基およびこの第二官能基を包含する塩基安定性の連結を通じて、この吸着したポリマーに共有結合させる工程。
【００１１】
（項目２）　上記結合が、二価性架橋剤を通じてつくられる、項目１に記載の方法。
【００１２】
（項目３）　上記ポリマーがポリペプチドであり、そして上記第二官能基が一級アミノ基である、項目１に記載の方法。
【００１３】
（項目４）　（ｄ）少なくとも、上記溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用される条件と同程度のストリンジェントな条件に、上記ポリマー−核酸プローブでコートされた表面をさらす工程を包含する、項目１に記載の方法。
【００１４】
（項目５）　上記ポリマー−核酸プローブでコートされた表面を、２５〜６５℃で１０〜１８０分間、低濃度のデタージェントを含有する弱塩基溶液と接触させる、項目２に記載の方法。
【００１５】
（項目６）　上記溶液が、０．０１〜２重量％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．１〜０．５Ｎ　ＮａＯＨである、項目３に記載の方法。
【００１６】
（項目７）　上記強酸が１〜１０Ｎ　ＨＣｌであり、そして上記強塩基が１〜１０Ｎアルカリ金属水酸化物である、項目１に記載の方法。
【００１７】
（項目８）　最初に上記核酸プローブが、上記架橋剤に、このプローブ上の第一官能基とこの架橋剤の官能基の１つとの間の反応を通じて共有結合して、活性化した核酸プローブを形成し、そして次いで、この活性化核酸プローブが、上記吸着したポリマーに、上記第二官能基の１つとこの架橋剤の他の官能基との間の反応を通じて共有結合する、項目２に記載の方法。
【００１８】
（項目９）　上記核酸プローブが、このプローブ上の上記官能基を提供するために、Ｎ４−位が改変されているシチジンを有する、項目８に記載の方法。
【００１９】
（項目１０）　上記ポリマーがポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸ブローブが、
【００２０】
【化１】
2004004087.tif 000002
からなる群より選択され、ここでＸがシチジンのＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を表す、項目２に記載の方法。
【００２１】
（項目１１）　ポリスチレン表面上に吸着したポリマー、および塩基安定性二価性架橋剤を通じて、このポリマーに共有結合した核酸プローブを有する、ポリスチレン表面を含む、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイで使用するための製造物品。
【００２２】
（項目１２）　上記物品が、マイクロタイタープレートのウェルである、項目１１に記載の製造物品。
【００２３】
（項目１３）　上記物品が、ビーズである、項目１１に記載の製造物品。
【００２４】
（項目１４）　上記表面上に上記プローブが、約０．１〜１０ピコモル存在する、項目１１に記載の製造物品。
【００２５】
（項目１５）　上記ウェル表面上に上記プローブが、約０．４〜０．７ピコモル存在する、項目１２に記載の製造物品。
【００２６】
（項目１６）　上記ポリマーがポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸プローブが、
【００２７】
【化２】
2004004087.tif 000003
からなる群より選択され、ここでＸがシチジンのＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を表す、項目１１に記載の製造物品。
【００２８】
（項目１７）　試料中において分析される一本鎖核酸の存在を検出するための溶液相核酸サンドイッチハイブリダィゼーションアッセイであって、ここでこのアッセイが以下の工程：
（ａ）この試料を、ハイブリダイゼーション条件下で、標識プローブのセットおよび捕獲プローブのセットと接触させる工程であって、ここで、各標識プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびＤＨＡマルチマーのセグメントに相補的な第二セグメントを有し、そして各捕獲プローブが、分析物に相補的な第一セグメントおよびポリスチレン表面上に固定化したオリゴヌクレオチドに相補的な第二セグメントを有する、工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、ポリスチレン表面に固定化した、このオリゴヌクレオチドと接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、このマルチマーと接触させる工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の生成物を、ハイブリダイゼーション条件下で、このマルチマーにハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドと接触させる工程、を包含し、
そして改良点は、このオリゴヌクレオチドが、表面に吸着したポリマーを通じてこのポリスチレン表面に固定化され、塩基安定性の連結を通じてこのポリマーに共有結合していることである、アッセイ。
【００２９】
（項目１８）　上記結合が、二価性架橋剤を通じてつくられる、項目１７に記載のアッセイ。
【００３０】
（項目１９）　上記ポリスチレン表面がマイクロタイタープレートのウェルであり、工程（ａ）〜（ｄ）がこのウェル内で行われる、項目１７に記載のアッセイ。
【００３１】
（項目２０）　上記表面が、工程（ａ）を行う前に、オリゴヌクレオチドをその中に固定化してそして洗浄した後、工程（ａ）のハイブリダイゼーション条件にさらされる、項目１７に記載のアッセイ。
【００３２】
（項目２１）　上記ポリマーがポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）であり、上記架橋剤がジスクシンイミジルスベレートであり、そして上記核酸プローブが、
【００３３】
【化３】
2004004087.tif 000004
からなる群より選択され、ここでＸがシチジンのＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を表す、項目１８に記載のアッセイ。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明において用いられる共有結合を特徴付けるのに使用される用語「塩基安定性」とは、４〜７０℃の範囲の温度で１Ｎ　ＮａＯＨと接触したとき、または少なくとも溶液相ハイブリダイゼーションアッセイにおける分析物に対するプローブのハイブリダイゼーションにおいて使用される程度にストリンジェントな（例えば、模擬またはよりストリンジェントな）条件下で、実質的な分解（例えば、加水分解による共有結合の切断）が起こらない結合を意味する。
【００３５】
用語「二価性架橋剤」は、２つの官能基を有する有機分子を意図しており、ここで、官能基の内の１つは、試薬とポリマーとの間に共有結合を形成するために、本発明中で使用されているポリマーの官能基と反応し得、そして、もう１つの官能基は、試薬とプローブとの間に第二の共有結合を形成するために、固定化される核酸プローブ上の官能基と反応し得る。得られた３成分の複合体は、試薬の２っの官能基とポリマー上の官能基およびプローブ上の官能基との間の反応を通じて、ポリマーおよびプローブの両方に共有結合する架橋剤を含む。好ましくは、ポリマーおよびプローブ上の官能基は、一級アミノ基であり、そして試薬上の官能基は、一級アミノ基と反応する官能基から選択される（例えば、カルボキシル基、塩化スルホニル基、またはアルデヒド基）。
【００３６】
用語「溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ」は、同一人に譲渡された米国特許第４，８６９，１０５号およびＥＰ３１７０７７に記載およびクレームされているアッセイ法を意味する。
【００３７】
「改変ヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドに安定して取り込まれ得て、そして架橋剤の官能基と反応する付加的な官能基を有するヌクレオチドモノマーを意味する。
【００３８】
「マルチマー」とは、分析される核酸および多数の標識プローブに、同時に直接または間接的にハイブリダイズし得る分枝ポリヌクレオチドを意味する。マルチマーの分枝は、共有結合によりつくられ、そしてマルチマーは、それぞれ、分析される核酸または分析される核酸にハイブリダイズする核酸に対して、および多数の標識プローブに対してハイブリダイズし得る、２つの型のオリゴヌクレオチド単位で構成される。このようなマルチマーの組成物および調製は、ＥＰ３１７０７７およびＷＯ９２／０２５２６に記載されており、これらの開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。
【００３９】
（ポリスチレン表面上のプローブの固定）
以下の記載は、従来のポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル表面上にプローブを固定することを述べているが、本発明の方法が、核酸サンドイッチハイブリダイゼーションにおいて用いられる他のポリスチレン表面（例えば、粒子（ビーズ）、チューブ、フィルター、カラムなど）に、プローブを固定するのに用いられ得ることは、認識される。
【００４０】
最初に、ポリスチレン表面を、強酸、強塩基、および水性緩衝液で、連続して洗浄することにより清浄化する。酸は通常、０．１〜５Ｎの濃度での、塩酸、硝酸、または硫酸のような鉱酸である。塩酸（ＩＮ）が好ましい。表面を、通常４〜３７℃の範囲の温度で１〜６０分間（好ましくは約１５〜２０分間）、酸と接触させる。次いで、酸処理をしたウェルを、リン酸緩衝化生理食塩水のような中性の水性緩衝液で洗浄する。強塩基は、通常０．１〜５Ｎの濃度のアルカリ金属水酸化物（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ）である。水酸化ナトリウム（１Ｎ）が好ましい。表面と塩基との間の接触時間は、通常１〜６０分間であるが、好ましくは約１５〜２０分間である。接触温度は、典型的には、再度４〜３７℃である。塩基処理に続いて、表面を中性の水性緩衝液で再び洗浄する。
【００４１】
表面を、ポリマーでコートする。このポリマーは、好ましくは多数の反応性の一級アミノ基を有するポリペプチドであって、そしてポリスチレン上で受動的に吸着されるポリペプチドである。ポリペプチドは、典型的には、１分子当り平均して約１０％〜１００％の、一級アミン含有アミノ酸残基を有する。ポリペプチドは、天然産生タンパク質または合成ポリペプチドであり得る。合成ポリペプチドは、ホモポリマー（同じアミノ酸で構成されている）またはコポリマー（２種またはそれ以上のアミノ酸で構成されている）であり得る。天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかにある、スルフヒドリルまたはカルボキシレートのような、他の反応性官能基が用いられ得る。その分子量は、厳密ではなく、通常５，０００〜５０，０００ダルトンの範囲内である。この資格内で使用され得るポリペプチドの例は、ポリリシン、ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）、ポリ（Ａｌａ−Ｇｌｕ）、カゼイン、およびウシ血清アルブミンである。３０，０００〜６０，０００の範囲の分子量を有するポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（ｐｈｅ：ｌｙｓが１：１モル比）が、好ましい。清浄化したポリスチレンを、ポリペプチドの中性（ｐＨ６〜８）水性緩衝溶液と接触させることにより、コーティングを行う。溶液中のポリペプチド濃度は、通常０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌであるが、０．１〜１．５ｍｇ／ｍＬが、より通例である。溶液は、必要に応じて約５Ｍまでの濃度の塩を含有し得る。ポリペプチドコーティング工程は、通常２０℃〜６５℃で０．５〜３６時間、好ましくは２５〜３５℃で１５〜２０時間行われる。この処理に続き、表面を、中性の水性緩衝液で繰り返し洗浄し、吸着していないあらゆるポリペプチドを取り除く。必要に応じて、表面を、アッセイの初期ハイブリダイゼーションの工程で用いられる条件を模擬した条件か、またはよりストリンジェントな条件（ｐＨ、イオン強度、デタージェント、プロテイナーゼ）にさらして、初期ハイブリダイゼーションの間に脱落し得る吸着したポリペプチドを脱落させ得る。
【００４２】
吸着したポリペプチドと共有結合する一本鎖のオリゴヌクレオチドプローブは、Ｗａｒｎｅｒら、ＤＮＡ（１９８４）３：４０１に記載の自動化ホスホルアミデート法によって調製され得、そしてＳａｎｃｈｅｚ−ＰｅｓｃａｄｏｒおよびＵｒｄｅａ，ＤＮＡ（１９８４）３：３３９に従って精製され得る。それらは、５’改変ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを包含する。そしてこれらは、反応部位を提供する官能基を含有しており、この反応部位により架橋剤にオリゴヌクレオチドをカップリングさせる。好ましい改変ヌクレオチドは、５−メチル−シチジンのＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体であり、それは米国特許第４，８６８，１０５号に記載されている。他の改変ヌクレオチドは、米国特許第４，９４８，８８２号に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブの長さおよび塩基組成は、それがハイブリダイズすべき核酸配列の長さおよび塩基組成に依存する。その長さは通常１５〜１００ヌクレオチド、より通例では２０〜３０ヌクレオチドである。２１塩基のオリゴヌクレオチド５’−ＸＣＡＣＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧ−３’（ＥＰ３１７０７７に記載）、および５’−ＸＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＡＧＡＧ−３’（ここでＸはシチジンのＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）誘導体を表す）が、標準プローブ配列として選択された。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’改変ヌクレオチドの官能基と架橋剤の官能基の１つとの間の反応を経て、塩基安定性の二価性架橋剤とカップリングする。オリゴヌクレオチドが架橋剤の両方の官能基とカップリングするのを避けるために、試薬は非常に過剰で使用される（例えば、５０倍〜１０００倍過剰）。塩基安定性、および、オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドのアミノ基との反応性の機能的基準が満たされる限り、種々の架橋剤が使用され得る。適切な架橋剤の例は、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｔａｌｏｇ中に見られ得る。カップリング反応の条件は、使用した特定の試薬により変更する。現在において、好ましい架橋剤は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートである。架橋剤は、通常極性溶媒または水性緩衝液に溶解され、そしてこの溶液は、水性緩衝液および極性溶媒中のオリゴヌクレオチド溶液に添加される。カップリングは、通常は中性（６−８）ｐＨ、および４℃〜２５℃の範囲の温度で約１０分間〜１８時間行われる。得られたオリゴヌクレオチド−架橋剤複合体（本明細書中では、時に「活性化オリゴヌクレオチド」と呼ばれる）は、従来のクロマトグラフィー手順を用いて、未反応の開始物質および不要の反応生成物から精製され得る。
【００４４】
次いで、架橋剤の残存官能基が、吸着したポリペプチドのアミノ基と反応し得る条件下で、ポリペプチドでコートした表面を、精製した活性化オリゴヌクレオチドの中性水性緩衝化溶液と接触させる。典型的に、このカップリング反応は、０℃〜２５℃で０．５〜１８時間、好ましくは２℃〜８℃で８〜１８時間、過剰な活性化オリゴヌクレオチド（１０倍〜１００倍過剰が好ましい）を用いて行われる。この反応が完了した後、表面を水性緩衝液で洗浄し、表面から未反応の活性化オリゴヌクレオチドを除去する。本方法のこの段階で、表面は、核酸プローブが架橋剤を通じて共有結合した吸着したポリペプチドでコートされる。標準的なマイクロタイターウェルの場合、１ウェル当りの固定化核酸プローブは、典型的に０．１〜１０ｐｍｏｌ、好ましくは０．４〜０．７ｐｍｏｌである。この時点で、必要に応じて、表面に二価性架橋剤をさらに添加し、プレート表面上に残存するあらゆる反応基と反応させることによって、プレートを「過カップリング（ｏｖｅｒｃｏｕｐｌｅ）」し得る。
【００４５】
表面が増幅アッセイ手順で使用されるとき、特に、ＷＯ９２／０２５２６の大きなコーム型マルチマーを使用するアッセイでは、アッセイの溶液相ハイブリダイゼーション工程における主要な条件（ｐＨ、イオン強度、温度、デタージェント）を模擬した条件に表面を置くのが好ましい。このような処理は、溶液相ハイブリダイゼーション中で脱落し得る、あらゆるポリペプチド−オリゴヌクレオチド複合体を脱落させるのに役立つ。従って、このような場合では、表面を、低濃度のデタージェント（例えば、０．０１〜２．０重量％　ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む０．１〜０．５Ｎ　ＮａＯＨ）を含有する弱塩基溶液と２５〜８５℃で１０〜１８０分間接触させる。この最終処理の後、表面をアスピレートする。次いで、表面を水性緩衝液で洗浄する。それは、使用するまで、湿度を制御した環境で０℃〜１０℃で貯蔵され得る。
【００４６】
（溶液相ハイブリダイゼーションアッセイでのコートしたポリスチレン表面の使用）
コートしたポリスチレン表面は、以下の溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションで用いられる。コートした表面が、マイクロタイタープレートのウェルの内側の表面である場合、分析される核酸を、過剰量の以下に示す２つの一本鎖核酸プローブセットを入れたウェル中に入れる：（１）捕獲プローブのセット、それぞれ、分析物に相補的な第一結合配列、および、ウェル表面に結合した核酸に相補的な第二結合配列を有する、および（２）増幅プローブ（分枝または直鎖状）のセット、それぞれ、分析物に特異的に結合し得る第一結合配列、および、マルチマーのセグメントに特異的に結合し得る第二結合配列を有する。増幅プローブを用いることにより、マルチマーは「万能」試薬にするべく設計され得、そして各分析物に対して異なるマルチマーをつくる必要はない。得られた生成物は、それぞれの第一結合配列により分析物にハイブリダイズした２つのプローブからなる３成分の核酸複合体である。プローブの第二結合配列は、分析物と相補的ではないので、一本鎖セグメントのままで残っている。この複合体は、ウェル表面上の固定化プローブに、第二結合配列によってハイブリダイズする。得られた生成物は、ウェル表面に結合したオリゴヌクレオチドと、捕獲プローブの第二結合配列とにより形成された二重鎖によって、ウェル表面に結合した複合体を含む。次いで、非結合物質を、例えば洗浄により表面から除去する。
【００４７】
次いで、増幅マルチマーを、ハイブリダイゼーション条件下で結合複合体に加え、マルチマーを複合体の増幅プローブの結合可能な第二結合配列にハイブリダイズさせる。次いで、得られた複合体を、洗浄によりいずれの非結合マルチマーからも分離する。次いで、標識オリゴヌクレオチドを、マルチマーの相補的なオリゴヌクレオチド単位にハイブリダイズさせるような条件下で加える。次いで、得られた固定化標識核酸複合体を洗浄して、非結合標識オリゴヌクレオチドを除去し、読み取る。
【００４８】
分析される核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体、食料品、環境物質など）由来であり得、種々の手段（例えば、プロテイナーゼＫ／ＳＤＳ、カオトロピック塩など）によりハイブリダイゼーション分析のために調製され得る。また、酵素的、物理的、または化学的手段（例えば、制限酵素、音波処理、化学分解（例えば、金属イオン）など）によって、分析される核酸の平均サイズを小さくすることが有利であり得る。フラグメントは、０．１Ｋｂ程に小さくあり得、通常少なくとも約０．５Ｋｂであり、そして１Ｋｂまたはそれ以上であり得る。分析される配列は、分析のため一本鎖形態で提供される。配列が天然に一本鎖形態で存在する場合、変性は必要とされない。しかし、配列が二本鎖形態で存在し得る場合、配列を変性する。変性は種々の技法（例えば、アルカリ、一般的には約０．０５〜０．２Ｍの水酸化物、ホルムアミド、塩類、熱、またはそれらの組合せ）により行われ得る。
【００４９】
分析される配列に相補的である、捕獲プローブおよび増幅プローブの第一結合配列は、それぞれ少なくとも１５ヌクレオチド、通常少なくとも２５ヌクレオチド、そして約５Ｋｂ以下、通常約１Ｋｂ以下、好ましくは約１００ヌクレオチド以下のヌクレオチドからなる。それらは、典型的には約３０ヌクレオチドである。それらは、通例、分析物の異なる配列に結合するように選択される。第一結合配列は、種々の考察に基づいて選択され得る。分析物の性質に依存して、コンセンサス配列、多型性に関連した配列、特定の表現型または遺伝子型、特定の株などに関連し得る。
【００５０】
増幅プローブおよび捕獲プローブの第一結合配列を適切に選択することによって、それらは、特定の遺伝子を含む特異的な核酸分子、または異なる複数の核酸分子の一部として存在する、他の配列を同定するのに使用され得る。目的とする核酸分子を、同じ特定の配列を含む他の分子から識別するためには、プローブの１つを、特定の配列に相補的に形成し、一方、他のプローブを、その分子に特有である（すなわち、特定の配列を含む他の分子には存在しない）その分子のもうひとつの配列に相補的に形成する。
【００５１】
捕獲プローブおよび増幅プローブの第二結合配列は、それぞれ、ポリスチレン表面に分枝した（ｂｒａｎｃｈ）オリゴヌクレオチドに、およびマルチマーのセグメントに、相補的であるように、そして試料／分析物の内在性配列に遭遇することのないように選択される。第二結合配列は、第一結合配列に連続し得るか、または中間の非相補的配列によってそこから一定の間隔をとって配置され得る。プローブは、所望であれば他の非相補的配列を含み得る。これらの非相補的配列は、結合配列の結合を妨げないか、または非特異的結合を生じさせないものでなければならない。
【００５２】
捕獲プローブおよび増幅プローブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングにより調製され得るが、前者が好ましい。
【００５３】
結合配列は、完全に相補的であって、ホモ二本鎖を提供する必要はない。多くの場合では、５個またはそれ以上のヌクレオチドのループを無視して、約１０％未満の塩基がミスマッチであるヘテロ二本鎖で十分である。従って、本明細書中で用いられる用語「相補的」とは、安定した二重構造を提供するのに十分な相補性の程度を意味する。
【００５４】
標識オリゴヌクレオチドは、マルチマーの繰り返しオリゴヌクレオチド単位に相補的な配列を含む。標識オリゴヌクレオチドは、１つまたはそれ以上の分子（「標識」）を含み、これは検出し得るシグナルを直接または間接的に提供する。標識は、相補的な配列の個々のメンバーに結合され得るか、または複数の標識を有する末端メンバーまたは末端テイルとして存在し得る。配列に結合した標識を提供するための種々の手段が、文献に報告されている。例えば、Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８３）８０：４０４５；ＲｅｎｚおよびＫｕｒｚ、Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８４）１２：３４３５；ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＧｕｍｐｏｒｔ、Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８３）１１：６１６７；Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８５）１３：２３９９；ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、Ａｎａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１３８：２６７を参照のこと。標識は、相補的な配列に、共有結合または非共有結合で結合され得る。用いられ得る標識には、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、酵素サブユニット、金属イオンなどが包含される。例示の特定の標識には、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　ｒｅｄ）、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどが包含される。
【００５５】
分析物の予測モルに対する捕獲プローブおよび増幅プローブの割合は、それぞれ少なくとも化学量論であり、好ましくは過剰量である。この割合は、好ましくは少なくとも約１．５：１であり、より好ましくは少なくとも２：１である。通例、２：１から１０，０００：１の範囲内である。各プローブの濃度は、一般的に約１０−１０〜１０−６Ｍの範囲であり、試料の核酸濃度は、１０−２１〜１０−１２Ｍまでの種々の範囲をとる。アッセイのハイブリダイゼーション工程は、一般的に約１０分から２時間までを要し、多くは約１時間で完了する。ハイブリダイゼーションは、やや高めの温度で、一般的には約２０℃から８０℃の範囲で、より通常には約３５℃から７０℃までで、特に６５℃で行われ得る。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応は、水性媒体中で、特に緩衝化水性媒体中で、通常行われる。媒体は種々の添加剤を合有し得る。用いられ得る添加剤には、低濃度のデタージェント（０．１〜１％）、塩類（例えば、クエン酸ナトリウム（０．０１７〜０．１７Ｍ））、フィコール、ポリビニルピロリドン、担体核酸、担体タンパク質などが包含される。非水性溶媒は、水性媒体に添加され得る。これは、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アルコール、およびホルムアミドである。これらの他の溶媒は、２〜５０％の範囲内の量で存在する。
【００５７】
ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、溶媒系などにより制御され得る。従って、目的とする配列の長さおよび性質に依存して、ストリンジェンシーを変化させる。
【００５８】
標識の存在を検出するためには、標識の性質に依存して、種々の技法が用いられ得る。蛍光物質に対しては、多くの種々の蛍光光度計が有用である。化学発光物質に対しては、ルミノメーターまたはフィルムが有用である。酵素を用いる場合は、蛍光産物、化学発光産物、または着色産物が提供され得、そして蛍光光度計、ルミノメーター、分光光度計により、または視覚的に測定され得る。イムノアッセイに用いられる種々の標識およびイムノアッセイに適用され得る方法が、本アッセイに用いられ得る。
【００５９】
以下の実施例は、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明をどのようにも限定することを意図しない。
【００６０】
【実施例】
（実施例１）
Ｗｈｉｔｅ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　１　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、９６ウェル／プレート）を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．から購入した。
【００６１】
（予備洗浄）
各ウェルに２００μＬの６Ｎ　ＨＣｌを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。次いで、このプレートを１×ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。次いでウェルに２００μＬの６Ｎ　ＮａＯＨを満たし、室温で１５〜２０分間インキュベートした。プレートを再び１×ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【００６２】
（ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）コーティング）
ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）をＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入した。このポリペプチドは、ｐｈｅ：ｌｙｓを１：１のモル比で有しており、平均分子量は４７，９００ｇｍ／ｍｏｌである。平均長さは３０９アミノ酸であり、１５５アミン／ｍｏｌを含む。ポリペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液３０ｍＬを、２Ｍ　ＮａＣｌ／０．５×ＰＢＳと混合し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ６．０）にした。各ウェルに、この溶液を１００μＬずつ加えた。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、３０℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【００６３】
（最初のストリッピング）
０．５重量％　ＳＤＳを含有する２００μＬの０．２Ｎ　ＮａＯＨをポリペプチドでコートしたウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、６５℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。
【００６４】
（オリゴヌクレオチドの活性化）
ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）の５０ｍｇアリコートを、それぞれ５００μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。
【００６５】
１×ＰＢＳ中の上記２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（ＸＴ１＊と呼ぶ）の２６　ＯＤ２６０単位を、ＤＳＳ−ＤＭＦの各アリコートに添加した。混合物をボルテックスにかけ、室温で３０分間インキュベートした。２本のＮＡＰ２５カラム（２６　ＯＤ２６０当り１，５０μＬアリコート）を、１×ＰＢＳで平衡化し、ＤＳＳ−ＤＭＦ−オリゴヌクレオチド混合物を１×ＰＢＳ　２ｍＬで希釈し、そして希釈混合物をカラム上に即座に載せた。カラムから流出させ、そして溶離剤を廃棄した。活性化オリゴヌクレオチドを、各カラムから１×ＰＢＳ　３．５ｍＬで溶出し、全部のカラムを集めて１×ＰＢＳ　１００ｍＬに入れた。
【００６６】
（ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）でコートしたプレートヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング）
各ウェルに、活性化オリゴヌクレオチド含有溶離剤を５０μＬずつ加え、ウェルを室温で１２０分間インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートして液体を除去した。
【００６７】
（最終ストリッピング）
０．５重量％　ＳＤＳを含有する２００μＬの０．２Ｎ　ＮａＯＨを各ウェルに加えた。プレートをプラスチックで包み、６５℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで４回洗浄し、ウェルをアスピレートし液体を除去した。ストリッピングしたプレートを、２〜８℃で乾燥剤ビーズと共に貯蔵した。
【００６８】
（実施例２）
（予備洗浄）
Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　１　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌポリスチレンマイクロタイタープレートを、１Ｎ　ＨＣｌおよび１Ｎ　ＮａＯＨを使用した以外は、実施例１のように予備洗浄した。
【００６９】
（ポリペプチドコーティング）
ウェルを実施例１のようにコートした。最初のストリッピング工程を省いた。
【００７０】
（オリゴヌクレオチドの活性化）
ＸＴ１＊オリゴヌクレオチドを、以下のことを除いて、実施例１のように活性化した：ＸＴ１＊に対するＤＳＳのモル比を、１０００：１の代わりに４００：１にした；活性化中に用いた緩衝液およびｐＨは、ｐＨ７．８でのリン酸ナトリウムであった；活性化を停止させるために使用した緩衝液およびｐＨは、ｐＨ６．５のリン酸ナトリウムであった；そして、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに用いた温度および緩衝液は、ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム、４℃であった。
【００７１】
（コートしたウェルヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング）
カップリングを、緩衝液をリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）とし、そしてインキュベーションを一晩行った以外は、実施例１のように行った。
【００７２】
（ストリッピング）
ウェルを、０．２Ｎ　ＮａＯＨ／０．５重量％　ＳＤＳで、実施例１のようにストリッピングした。
【００７３】
（実施例３）
実施例１および２の固定化手順を、カップリング工程で使用した活性化オリゴヌクレオチドの量をいろいろと変えて用いて繰り返した。ウェル表面に結合したオリゴヌクレオチドの量を、これらの各実験において測定した。図１は、これらの実験結果を示すグラフである。示したように、実施例２の手順により、ウェルに添加した所定の量の活性化オリゴヌクレオチドで、約１０倍以上のオリゴヌクレオチドが表面に結合した。
【００７４】
（実施例４）
本実施例は、ＨＣＶ　ＲＮＡアッセイにおける本発明の使用を例示し、そして、プレート上に固定化されたプローブの量に対するアッセイ感度に関する。
【００７５】
（アッセイで使用するマルチマーの合成）
「１５×３」増幅溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを、この実施例で用いた。「１５×３」の呼称は、形式が、増幅プローブにハイブリダイズする第一セグメント、および、３つの標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする第二セグメントの１５個の反復を有するコーム型マルチマーを用いることに由来する。
【００７６】
１５個の分枝部位、および、３つのオリゴヌクレオチド結合部位を有する側鎖伸長を有する１５×３コーム型分枝オリゴヌクレオチドを、以下のように合成した。
【００７７】
オリゴヌクレオチドの全ての化学的合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，（ＡＢＩ）モデル３８０Ｂ）で行った。βシアノエチル型のホスホルアミダイト化学を用いた。これには、ＰｈｏｓｔｅｌＴＭ試薬（ＡＢＮ）を用いる５’リン酸化が包含される。示したこと以外は、標準的なＡＢＩプロトコルを用いた。複数のサイクルを用いた（例えば、１．２サイクル）と示されている場合、ＡＢＩにより推奨された複数の標準量のアミダイトが、特定のサイクルに用いられた。Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機で行われる、サイクル１．２および６．４を実施するためのプログラムを本明細書中に添付する。
【００７８】
以下の構造のコーム体を最初に調製した：
【００７９】
【化４】
2004004087.tif 000005
ここで、Ｘ’は分枝モノマーであり、そしてＲは過ヨウ素酸切断可能リンカーである。
【００８０】
１５個の（ＴＴＸ’）繰り返しによるコーム体の部分を、３３．８ｍｇのアミノプロピル誘導体化チミジンの調整孔ガラス（ＣＰＧ）（２０００Å、支持体１グラム当り７．４マイクロモルチミジン）を用いて、１．２サイクルプロトコルで、最初に合成する。分枝部位ヌクレオチドは、下式であった：
【００８１】
【化５】
2004004087.tif 000006
ここでＲ２は
【００８２】
【化６】
2004004087.tif 000007
を表す。
【００８３】
コーム体（側鎖を含まない）の合成に関して、βシアノエチルホスホルアミダイトモノマーの濃度は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴが０．１Ｍ、分枝部位モノマーＥが０．１５Ｍ、およびＰｈｏｓｔｅｌＴＭ試薬が０．２Ｍであった。脱トリチル化は、脱保護期間中に階段フロースルー（ｓｔｅｐｐｅｄ　ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｈ）を用いて、塩化メチレン中の３％トリクロロ酢酸で行った。最終的に、５’ＤＭＴをアセチル基で置換した。
【００８４】
切断可能リンカーＲおよび式３’−ＲＧＴＣＡＧＴｐの６塩基の側鎖伸長は、以下のようにして各分枝モノマー部位で合成した。塩基保護基（上式のＲ２）の除去は、コーム体の合成に用いたのと同じカラム中にＣＰＧ支持体を保持している間に、手動的に行った。Ｒ２がレブリニルである場合、０．５Ｍヒドラジン水和物のピリジン／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）溶液を加え、１５分ごとに液体を取り替えながら９０分間ＣＰＧ支持体と接触させておき、続いてピリジン／氷酢酸（１：１　ｖ／ｖ）で、次いでアセトニトリルで十分に洗浄した。脱保護を行った後、切断可能リンカーＲおよび６塩基側鎖伸長を、６．４サイクルを用いて加えた。
【００８５】
これらの合成において、ホスホルアミダイトの濃度は、０．１Ｍであった（０．２ＭのＲおよびＰｈｏｓｔｅｌＴＭ試薬を除く；Ｒは、２−（４−（４−（２−ジメトキシトリチルオキシ）エチル）−フェノキシ２，３−ジ（ベンゾイルオキシ）−ブタンオキシ）フェニル）エチル−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトであった）。
【００８６】
脱トリチル化は、３％トリクロロ酢酸の塩化メチレン溶液で連続フロースルーを用いて行い、次いでトルエン／クロロメタン（１：１　ｖ／ｖ）の溶液でリンスする。分枝ポリヌクレオチド鎖は、固体支持体から、サイクル「ＣＥ　ＮＨ３」を用いて３８０Ｂで自動的に除去した。水酸化アンモニウム溶液を４ｍＬのスクリューキャップＷｈｅａｔｏｎバイアルに集め、６０℃で１２時間加熱して全ての塩基保護基を除去した。室温まで冷却した後、溶媒をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃエバポレーターで除去し、残渣を１００μＬの水に溶解した。以下の構造の３’バックボーン伸長（セグメントＡ）、側鎖伸長、および連結反応テンプレート／リンカーもまた、自動合成機を用いて作成した。
【００８７】
【化７】
2004004087.tif 000008
粗製のコーム体を標準ポリアクリルアミドゲル法（７％、７Ｍ尿素および１×ＴＢＥランニング緩衝液を含む）により精製した。
【００８８】
３’バックボーン伸長および側鎖伸長を、以下のようにしてコーム体に連結した。コーム体（４ｐｍｏｌ／μＬ）、３’バックボーン伸長（６．２５ｐｍｏｌ／μＬ）、側鎖伸長（９３．７５ｐｍｏｌ／μＬ）、側鎖連結テンプレート（９３．７５ｐｍｏｌ／μＬ）、およびバックボーン連結テンプレート（５ｐｍｏｌ／μＬ）を、１ｍＭ　ＡＴＰ／５ｍＭ　ＤＴＴ／５０ｍＭ　トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０／１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２／２ｍＭ　スペルミジン中で、０．５単位／μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼと合わせた。この混合物を３７℃で２時間インキュベートし、次いで水浴中で９５℃に加熱し、次いで１時間かけて３５℃未満までゆっくりと冷却した。２ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリコール、および０．２１単位／μＬ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。ＤＮＡをＮａＣｌ／エタノール中で沈澱させ、水中に再懸濁し、そして以下のような２回目の連結反応にかけた。混合物を調整して、１ｍＭ　ＡＴＰ、５ｍＭ　ＤＴＴ、１４％ポリエチレングリコール、５０ｍＭ　トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　スペルミジン、０．５単位／μＬ　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および０．２１単位／μＬ　Ｔ４リガーゼを加え、そして混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。次いで、連結反応産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。
【００８９】
（使用した標識プローブおよび捕獲プローブ）
本アッセイで使用した、増幅（標識）プローブＨＣＶ−特異的セグメントおよび捕獲プローブＨＣＶ−特異的セグメントは、以下の通りである：
ウイルス単離物第Ｉ群の、ＨＣＶ　Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブ（図２Ａを参照）：
【００９０】
【表１】
2004004087.tif 000009
ウイルス単離物第ＩＩ群の、ＨＣＶ　Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なプローブ（図２Ｂを参照）：
【００９１】
【表２】
2004004087.tif 000010
Ｃ遺伝子および５’−末翻訳領域のヌクレオチド配列に相補的なプローブ（図３参照）：
【００９２】
【表３】
2004004087.tif 000011
上のセットでは、それぞれの捕獲プローブは、ＨＣＶ配列に相補的な配列に加えて、ＸＴ１＊に相補的な下流配列を含む。
【００９３】
（アッセイ形式）
以下の範囲の抽出用緩衝液を調製した。
【００９４】
【表４】
2004004087.tif 000012
トリス、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、音波処理サケ精子ＤＮＡおよびＳＳＣを、２５ｍＬの脱イオン水に添加し、そして脱イオン水で体積を９３ｍＬに調整した。溶液を穏やかに混合し、そしてｐＨを７．５に調整した。プロテイナーゼＫを溶液に添加し、そして溶解するまで混合する。溶液を水浴中で、３７℃で３時間インキュベートした。溶液を室温まで冷却し、そしてホルムアミドを添加した。
【００９５】
含有物と、溶液を形成する残りのものとを混合することにより、以下に示す処方のハイブリダイゼーション緩衝液を調製した。
【００９６】
【表５】
2004004087.tif 000013
捕獲プローブおよび標識プローブの各２５μＬを、ＰＫ緩衝液（プロテイナーゼＫ１２ｍｇを、抽出緩衝液６ｍＬ中に溶解）３，０００μＬを添加した。この混合物の５０μＬを、実施例２のように調製したマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、ＨＣＶ核酸を含有すると思われる試料５０μＬを添加した。プレートを、Ｍｙｌａｒで覆い、そして６５℃で１６時間インキュベートした。次いで、プレートを冷却し、Ｍｙｌａｒを除去し、ウェルをアスピレートし、１×洗浄緩衝液（０．１％　ＳＤＳ／０．０１５Ｍ　ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ　クエン酸ナトリウム）で洗浄し、そして再度アスピレートした。
【００９７】
ハイブリダイゼーション緩衝液中のマルチマーの溶液（２５ｆｍｏｌ／５０μＬ）を調製し、５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを、Ｍｙｌａｒで覆い、３０秒間攪拌し、そして５５℃で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを冷却し、Ｍｙｌａｒを除去し、１×洗浄緩衝液で洗浄し、そしてアスピレートした。
【００９８】
アッセイを、ＨＣＶ　ＲＮＡを５、５０、および５００チポモル（ｔｉｐｏｍｏｌ）（ｔｍ、チポモル＝６０２分子、または１０−２１モル）のそれぞれを含む標本について、１ウェル当り種々の量の固定化（捕獲）ＤＮＡで実施例２のように調製したマイクロタイタープレートを用いて行った。感度は、デルタ値＝（平均値−２倍標準偏差）−（ゼロ＋２倍標準偏差）として特徴付けた。図４に、これらのアッセイの結果を示す。示されるように、本アッセイにおいて最適な感度は、１ウェル当り０．１〜１．１ｐｍｏｌの固定化ＤＮＡで生じる。
【００９９】
（実施例５）
ＨＢＶ　ＤＮＡのアッセイを、上記の実施例４に記載した形式、および種々のポリペプチドコーティングを使用した以外は、上記の実施例２のようにコートしたマイクロタイタープレートを用いて行った。これらのアッセイでは、ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）、カゼイン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ「ブロッキング試薬」（＃１０９６１７６）Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｃａｔａｌｏｇ）、ポリ（Ａｌａ−Ｇｌｕ）およびポリ（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）でコートしたプレートは、アッセイにおいて類似の成果を示した。
【０１００】
（実施例６）
改変した手順を、以下に示す：
（予備洗浄）
Ｗｈｉｔｅ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　１　Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（ポリスチレンマイクロタイタープレート、９６ウェル／プレート）を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．から入手した。各ウェルを２５０μＬの１Ｎ　ＨＣｌで満たし、そして室温で１５〜２０分間インキュベートした。次いで、プレートを２５０μＬの１Ｎ　ＮａＯＨで満たし、そして室温で１５〜２０分間インキュベートした。次いでプレートを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体を除去した。
【０１０１】
（ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）コーティング）
ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（上記）を、２Ｍ　ＮａＣｌ／１×ＰＢＳと混合し、最終濃度を０．１ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ６．０）にして、そして得られた溶液の２００μＬをそれぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチックで包んで乾燥を防ぎ、そして３０℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてウェルをアスピレートして液体を除去した。
【０１０２】
（オリゴヌクレオチドの活性化）
５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）中に含まれる、
【０１０３】
【化８】
2004004087.tif 000014
ここでＸがＮ４−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）−５−メチルシチジンである）の２５０ＯＤ２６０単位に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（「ＢＳ３」、１８０ｍｇ）を添加した。混合物をボルテックスし、そして室温で３０分間インキュベートした。１０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化したゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、活性化オリゴヌクレオチドを精製するのに使用した。活性化オリゴヌクレオチド反応混合物を、カラムに加え、濾過した。溶出物を集め、次の工程に用いるまで保存した。溶出物の濃度を、５０ｍＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）で希釈して、３．７×１０−２ＯＤ２６０／ｍＬに調整した。
【０１０４】
（ポリ（Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）でコートしたプレートヘの活性化オリゴヌクレオチドのカップリング）
活性化オリゴヌクレオチド含有溶離液（１００μＬ）をそれぞれのウェルに添加し、ウェルを４℃で１２〜１８時間インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで２回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去した。
【０１０５】
（最終ストリッピング）
０．１重量％　ＳＤＳを含有するＮａＯＨ（０．２Ｎ、２５０μＬ）を、それぞれのウェルに添加した。プレートをプラスチックで包み、そして６５℃で６０分間インキュベートした。次いで、プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄し、そしてウェルをアスピレートし、液体を除去した。
【０１０６】
（過カップリング）
０．４ｍｇ／ｍＬ　ＢＳ３を含有するリン酸ナトリウム（５０ｍＭ、１００μＬ、ｐＨ７．８）を、各ウェルに添加し、そしてプレートで１２〜１８時間インキュベートさせた。次いで、プレートを１×ＰＢＳで２回、そして水で１回洗浄した。次いで、洗浄し終わったプレートを、４℃で小袋内で貯蔵した。
【０１０７】
上記の本発明を実施するための態様について、生化学、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、および関連分野における当業者に明らかな改変は、以下の請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０８】
核酸プローブは、溶液相核酸サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、特に大きな分枝ＤＮＡ増幅マルチマーを用いたアッセイで用いるためのマイクロタイタープレートのウェルのようなポリスチレン表面に以下の工程によって固定化される：（ａ）強酸、強塩基、および水で順次して洗浄することにより、表面を清浄化する工程；（ｂ）清浄化された表面上へ一級アミノ基を有するポリペプチドを受動的に吸着させる工程；および（ｃ）プローブを、塩基安定性の二価性架橋剤を通じて、吸着したポリペプチドに共有結合させる工程；および（ｄ）アッセイで用いられるハイブリダイゼーション条件を模擬した条件に表面をさらす工程。
【０１０９】
【発明の効果】
第１に、本発明の方法および物品により、初期ハイブリダイゼーションを包含する全体の溶液相核酸ハイブリダイゼーションアッセイを、１つのウェル中で行うことができる。第２に、アッセイの再現性が改良される。最後に、大きなコーム型マルチマーを用いるその好ましい実施形態において、バックグラウンドシグナルを減少させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例３に記載した実験結果のグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例４に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例４に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図３Ａ】図２Ａは、実施例４に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例４に記載したプローブの部分配列を載せている。
【図４】図４は、実施例４に記載した試験結果のグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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