(57)【要約】【課題】副作用がなく安全で、且つ強いプロスタグランジンＥ２遊離抑制活性を示すプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤を提供する。【解決手段】キンシバイの組織培養により得られるカルスから水及び／又は有機溶媒で抽出して得られるキンシバイ抽出物並びにそれを分離精製して得られるパツロン及びガルシノンＢを有効成分とするプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤。【選択図】  図１
2004359565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キンシバイの組織培養により得られるカルスから水及び／又は有機溶媒で抽出して得られるキンシバイ抽出物を有効成分とすることを特徴とするプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤。
【請求項２】
式：
【化１】
2004359565.tif 000008
で表されるパツロンを有効成分とすることを特徴とするプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤。
【請求項３】
式：
【化２】
2004359565.tif 000009
で表されるガルシノンＢを有効成分とすることを特徴とするプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キンシバイカルスを抽出して得られるキンシバイ抽出物からなるプロスタグランジンＥ２（ＰＧ  Ｅ２）遊離抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジンＥ２が遊離されるとその部位で血管拡張が生じ、血管の透過性が亢進し、血管から組織への血漿タンパク質の滲出が起こり、浮腫や発熱がもたらされ、炎症が進行する。それ故、プロスタグランジンＥ２の遊離を抑制することによりこのような炎症を抑えることが可能となることから、シクロオキシゲナーゼ阻害によりプロスタグランジンＥ２の生合成を抑制するアスピリン、インドメタシン、ジクロフェナクなどの非ステロイド系抗炎症剤は、炎症の治療薬として現在汎用されている。しかし、このような非ステロイド系抗炎症剤は消化管障害などの副作用を有するために、より安全性の高い抗炎症剤が望まれている。
【０００３】
キンシバイ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ  Ｔｈｕｎｂ）は、オトギリソウ科の半落葉小低木で植え込みの樹木や庭木として広く植栽されており、その全草が食薬区分の食品素材として認められている。キンシバイの利用例としては、特開平７−２７８００３にテストステロン−５α−レダクターゼ阻害剤、特開２００１−２２６２４９に乾燥肌改善剤が開示されているが、組織培養により得られるカルスから抽出したプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤に関するものはない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、副作用がなく安全で、且つ強いプロスタグランジンＥ２遊離抑制活性を示すプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究を行い、キンシバイの組織培養により得られるカルスを種々の溶媒で抽出し、その抽出物を分離精製して数種の成分を単離し、それらの抽出物及び成分についてプロスタグランジンＥ２遊離抑制作用を調べた結果、水及び／又は有機溶媒で抽出して得られるキンシバイ抽出物並びに次式
【０００６】
【化３】
2004359565.tif 000003
で表されるパツロン及び次式
【０００７】
【化４】
2004359565.tif 000004
で表されるガルシノンＢに優れたプロスタグランジンＥ２遊離抑制作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、キンシバイの組織培養により得られるカルスから水及び／又は有機溶媒で抽出して得られるキンシバイ抽出物並びにそれを分離精製して得られるパツロン及びガルシノンＢを有効成分とするプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤である。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の組織培養に使用するキンシバイは、学名がＨｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ  Ｔｈｕｎｂであり、漢方では芒種花と呼ばれ、煎じて肝炎などの治療に処方されており、使用するのは全草の何れの部位でもよいが、花が好ましい。
【００１０】
本発明で実施する組織培養とは、キンシバイ組織の一部（移植片）をＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地、Ｗｈｉｔｅ培地などの一般的培地中、カイネチン、ゼアチン、６−ベンジルアデニン（６−ＢＡ）、イソペンテニルアデニンなどのサイトカイニン及びインドール酢酸（ＩＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸、２，３，６−トリクロロフェノキシ安息香酸などのオーキシンの存在下、ｐＨ５〜６、２０〜３０℃、暗所で静置培養又は振とう培養することである。
【００１１】
本発明においてキンシバイ抽出物の抽出に用いるカルスとは、上記培養により細胞分裂を繰返して生じた無定形の組織塊のことである。使用するカルスは、生及び乾燥のいずれでも好適であり、そのままでもよく、破砕機で破砕してもよく、粉砕機で粉砕してもよい。
【００１２】
本発明で抽出に用いる溶媒は、水及び有機溶媒であり、有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類、ヘキサン、ベンゼンなどの炭化水素類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、酢酸、氷酢酸、プロピオン酸などの常温で液体の有機酸などであり、単一又は混合して用いる。
【００１３】
本発明の有効成分であるキンシバイ抽出物は次のようにして製造することができる。
【００１４】
キンシバイカルス１部（重量）に上記抽出溶媒１〜５０部を加えて常温でときどきかき混ぜながら、必要ならば攪拌及び加温して成分を溶出させ、濾過して不溶物を除去し、濾液を減圧濃縮（溶媒を完全に留去の意味）してキンシバイ抽出物を得ることができる。抽出溶媒に水を使用した場合は、水と混ざらない有機溶媒、例えばヘキサン、ベンゼン、エーテル、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、ブタノールなどで抽出後、有機層を濃縮してもキンシバイ抽出物を得ることができる。
【００１５】
また、濃縮して得られた上記濃縮物に水を加え、水と混ざらない上記有機溶媒で分配し、有機層を減圧濃縮して精製キンシバイ抽出物を得ることができる。更に、精製キンシバイ抽出物をカラムクロマトグラフィーなどの常法により分離精製してパツロン及びガルシノンＢを得ることができる。カラムクロマトグラフィーの溶出溶媒は吸着剤によって異なり、シリカゲル及びアルミナの場合は上記有機溶媒を混合して用い、アルキルシリル化シリカゲル（逆相クロマト用充填剤、例えばＯＤＳなど）及びポーラスポリマーの（例えば、スチレン系、ヒドロキシメタクリレート系、レジン系）場合は含水アルコール（メタノール又はエタノール）を用い、架橋デキストランなどのゲル濾過材（例えば、Ｓｈｅｐｈａｄｅｘ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）の場合は水及び上記有機溶媒を用いることができる。
【００１６】
以上のようにして製造した本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤は、プロスタグランジンＥ２が関与する疾病の治療及び予防に有効である。即ち、気管支炎、咽頭炎、扁桃炎、関節炎、肝炎、腎炎、潰瘍性大腸炎、骨膜炎、歯肉炎、歯周炎、歯槽骨炎、紫外線皮膚炎、眼炎、咽頭痛、歯痛、神経痛、筋肉痛、捻挫、挫傷、痛風、月経困難症、やけどなどによる痛み・発熱・炎症、外科的及び歯科的処置後の炎症、インフルエンザなどのウイルスや細菌感染による症状、慢性間接リュウマチ、変形性関節症、高カルシウム血症を伴う悪性腫瘍などの治療及び予防に有用である。
【００１７】
本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤は、キンシバイ抽出物並びにパツロン及びガルシノンＢを単独又は他の医薬と併用することができ、製剤添加物を配合することにより任意の剤形にして医薬として利用することができる。剤形としては、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤）、外用剤（軟膏剤、パップ剤、粘着テープ、点鼻剤、点耳剤、噴霧剤など）、注射剤、眼科用剤（点眼剤、眼軟膏剤）、坐剤などが挙げられる。更に、食品添加物を配合することにより健康食品及び菓子、冷菓、乳製品、卵製品、肉製品、清涼飲料、酒類などの飲食品に利用することができる。
【００１８】
本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤の有効成分であるキンシバイ抽出物並びにパツロン及びガルシノンＢの投与量は、投与形態及び治療によって変わるが、キンシバイ抽出物では５〜３０００ｍｇ／日、好ましくは１０〜１０００ｍｇ／日、パツロン及びガルシノンＢでは１〜１０００ｍｇ／日、好ましくは５〜５００ｍｇ／日である。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例及び試験例により詳細に説明する。
実施例１
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及びカイネチン含有Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地（蒸留水１ｋｇに対し、ショ糖３０ｇ、硝酸アンモニア１．６５ｇ、硝酸カリウム１．９ｇ、塩化カルシウム０．４４ｇ、硫酸マグネシウム０．３７ｇ、りん酸二水素カリウム０．１７ｇ、硫酸第一鉄２７．８ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム３７．３ｍｇ、硫酸マンガン２２．３ｍｇ、硫酸亜鉛８．６ｍｇ、塩化コバルト０．０２５ｍｇ、硫酸銅０．０２５ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０．２５ｍｇ、ヨウ化カリウム０．８３ｍｇ、ホウ酸６．２ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩０．５ｍｇ、チアミン塩酸塩０．１ｍｇ、イノシット０．１ｇ、グリシン２ｍｇ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸２．２１ｍｇ、カイネチン０．０２１５ｍｇ；ｐＨ５．５）に予めキンシバイの花の組織を培養して得た細胞懸濁液を接種して２５℃で遮光下、回分培養した。培養液を濾布濾過してカルスを回収し、凍結乾燥した。この乾燥カルス５２５．８ｇをメタノール６．４ｋｇに５日間浸漬後、濾紙濾過し、濾液を減圧濃縮して濃縮物１８５．７ｇを得た。この濃縮物に酢酸エチル１０００ｍｌと水１０００ｍｌを加えて分配し、酢酸エチル層を減圧濃縮して本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤であるキンシバイ抽出物１１．６ｇを得た。
【００２０】
この抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム・メタノール系及びベンゼン・酢酸エチル系）により繰返し分離後、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０（溶離液：メタノール）で精製してガルシノンＢを２．２ｍｇ得た。
【００２１】
実施例２
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸及びカイネチン含有Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ培地（蒸留水１ｋｇに対し、ショ糖３０ｇ、硝酸アンモニア１．６５ｇ、硝酸カリウム１．９ｇ、塩化カルシウム０．４４ｇ、硫酸マグネシウム０．３７ｇ、りん酸二水素カリウム０．１７ｇ、硫酸第一鉄２７．８ｍｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム３７．３ｍｇ、硫酸マンガン２２．３ｍｇ、硫酸亜鉛８．６ｍｇ、塩化コバルト０．０２５ｍｇ、硫酸銅０．０２５ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム０．２５ｍｇ、ヨウ化カリウム０．８３ｍｇ、ホウ酸６．２ｍｇ、イノシット０．１ｇ、グリシン２ｍｇ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸２．２１ｍｇ、カイネチン０．０２１５ｍｇ；ｐＨ５．５）に予めキンシバイの花の組織を培養して得た細胞懸濁液を接種して２５℃で遮光下、連続培養した。培養液を濾布濾過してカルスを回収し、６０℃で乾燥した。この乾燥カルス１．２ｋｇをクロロホルム１６ｋｇに５日間浸漬後、濾紙濾過し、濾液を減圧濃縮して本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤であるキンシバイ抽出物２７ｇを得た。
【００２２】
この抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム・メタノール系）により分離後、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０（溶離液：メタノール）で精製してパツロンを２１ｍｇ得た。
【００２３】
実施例３
ナフタレン酢酸及びカイネチン含有Ｗｈｉｔｅ培地（蒸留水１ｋｇに対し、ショ糖３０ｇ、硝酸カリウム８０ｍｇ、塩化カリウム６５ｍｇ、硝酸カルシウム０．３ｇ、硫酸マグネシウム０．７２ｇ、硫酸ナトリウム０．２ｇ、りん酸二水素ナトリウム１６．５ｍｇ、硫酸第二鉄２．５ｇ、硫酸マンガン７ｍｇ、硫酸亜鉛３ｍｇ、ヨウ化カリウム０．７５ｍｇ、ホウ酸１．５ｍｇ、ニコチン酸０．５ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩０．１ｍｇ、チアミン塩酸塩０．１ｍｇ、グリシン３ｍｇ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸１ｍｇ、カイネチン０．５ｍｇ；ｐＨ５．５）に予めキンシバイの花の組織を培養して得た細胞懸濁液を接種して２５℃で遮光下、静置培養した。培養液を濾布濾過してカルスを回収した。このカルス２．１ｋｇを８０％エタノール１０ｋｇに加えて８０℃で５時間浸漬し、濾紙濾過後、濾液からエタノールを減圧留去して濃縮液を得た。この濃縮液にクロロホルム１０００ｍｌを加えて分配し、クロロホルム層を減圧濃縮して本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤であるキンシバイ抽出物９．１ｇを得た。
【００２４】
この抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム・メタノール系及びベンゼン）及びＯＤＳカラムクロマトグラフィー（溶離液：水・メタノール系）により繰返し分離後、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０（溶離液：メタノール）で精製してパツロンを５７ｍｇ及びガルシノンＢを１８ｍｇ得た。
【００２５】
実施例４
本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤を使用する場合、例えば次の様な処方によって用いることができる。
【００２６】
2004359565.tif 000005
（１）、（２）、（３）、（４）の２／３及び（５）の１／２を混合後、顆粒化する。残りの（４）及び（５）をこの顆粒に加えて錠剤に加圧成型する。
【００２７】
2004359565.tif 000006
（１）、（２）、（３）及び（４）の１／２を混合後、顆粒化する。しかる後残りの（４）を顆粒に加え、全体をゼラチンカプセルに封入する。
【００２８】
2004359565.tif 000007
（１）、（２）、（３）、（４）を全量２ｍｌになるように注射用蒸留水に溶解してアンプルに注入する。全工程は無菌状態で行う。
【００２９】
試験例１
Ｃ６ラットグリオーマ細胞は、１×１０５細胞／ウエルの細胞密度で播き、３日間培養後、試験に使用した。これらの細胞を本発明のプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤（１０μＭ）で１０分間前処理した後、メディウムにＡ２３１８７カルシウムイオノフォア（１０μＭ）を加えて１０分間インキュベートし、メディウム中に遊離してきたプロスタグランジンＥ２量をラジオイムノアッセイ法で定量した。その結果、図１に示すとおりキンシバイ抽出物、パツロン及びガルシノンＢにプロスタグランジンＥ２遊離抑制活性が認められた。
【００３０】
試験例２
試験例１同様に培養した細胞を本発明のパツロン（０〜１０μＭ）で１０分間前処理した後、メディウムにＡ２３１８７カルシウムイオノフォア（１０μＭ）を加えて１０分間インキュベートし、メディウム中に遊離してきたプロスタグランジンＥ２量をラジオイムノアッセイ法で定量した。その結果、図２に示すとおりパツロンは無刺激時のプロスタグランジンＥ２遊離に対して作用を示さなかったが、Ａ２３１８７誘導性のプロスタグランジンＥ２遊離は濃度依存的に抑制した。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によると、キンシバイ抽出物、パツロン及びガルシノンＢを有効成分とするプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤は、優れたプロスタグランジンＥ２遊離抑制作用を有し、天然物である食品素材から製造される故に副作用がなく安全なので、プロスタグランジンＥ２が関与する疾病の治療及び予防に有効である。
【００３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｃ６ラットグリオーマ細胞におけるＡ２３１８７刺激によるプロスタグランジンＥ２遊離に対する本発明のキンシバイ抽出物（Ａ）、パツロン（Ｂ）及びガルシノンＢ（Ｃ）の作用を示すグラフである。なお、グラフ中のＣｏｎｔｒｏｌはプロスタグランジンＥ２遊離抑制剤で処理していない対照のことである。それぞれの量は３つの独立した実験により、平均±標準誤差で示している。
【図２】Ｃ６ラットグリオーマ細胞におけるＡ２３１８７誘導性プロスタグランジンＥ２遊離に対する本発明のパツロンの作用を示すグラフである。それぞれの量は３つの独立した実験により、平均±標準誤差で示している。ｔ−検定において有意差のあったものにアスタリスクを表示している（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【図１】
2004359565.tif 000010
【図２】
2004359565.tif 000011