(57)【要約】【課題】フラクトサミンの濃度を分析するために必要な最小の化合物のみを含む簡単な乾燥相試験デバイス。【解決手段】液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析する多層試験デバイスであって：少なくとも９であるｐＨ値を有する緩衝液を含む、不透明でない、液体透過緩衝液層と；フラクトサミンによって還元され得る指示薬を含む、指示薬層と；そして、検出孔を必要に応じて有する支持部材とを備える；ここで、その緩衝液層が該指示薬層上に重ねられる、デバイス。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析する多層試験デバイスであって：
少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む、不透明でない、液体透過緩衝液層；
フラクトサミンにより還元され得る指示薬を含む、指示薬層；および
検出孔を必要に応じて有する支持部材を備え；ここで該緩衝液層が該指示薬層上に重ねられる、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多層試験デバイスに関し、より詳細には、フラクトサミンの濃度について液体試料を分析することに関する。
【０００２】
【従来の技術】
（発明の背景）
（背景情報）
（真性）糖尿病の個体は、膵臓が、炭水化物代謝を調節するに十分な量の活性ホルモンインスリンを血流中に分泌しないので、異常に高い血糖レベルを有している。過血糖状態として知られる異常に高い血糖レベルが長期間継続させると、個体は、網膜症、腎症、神経障害およびアテローム硬化症を含む糖尿病の慢性合併症となる。
【０００３】
血清およびその他の生物学的流体中に存在するタンパク質のようなタンパク質が、非酵素的条件下でグルコースと反応し、フラクトサミン（ｆｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ）またはケトアミン（ｋｅｔｏａｍｉｎｅ）としてまた知られている糖化（ｇｌｙｃａｔｅｄ）タンパク質を生成することが知られている。反応の進行は、血液中のグルコース濃度に直接依存する。その結果、糖尿病の個体は、通常、健康な個体と比較して上昇したフラクトサミン濃度を有している。従って、糖化血清タンパク質の濃度は、過血糖状態の指標として用いられている。糖尿病の検出、モニタリングおよび処置を補助するために、血糖濃度は、フラクトサミンについて分析することにより間接的に測定され得る。特に、フラクトサミンレベルの測定は、フラクトサミン濃度が約半月にわたる期間の血清グルコースレベルの平均を反映するので、糖尿病のコントロールをモニターするために有用である。
【０００４】
フラクトサミンは以下のように形成される。血液タンパク質は、インビボで、グルコースと血液タンパク質の利用可能なアミノ基との間の非酵素的反応により糖化タンパク質となる。グルコースは、タンパク質のアミノ基に結合してシッフ塩基、即ち、分子再配置を行い安定なケトアミンを形成するアルジミン（ａｌｄｉｍｉｎｅ）を形成する。当該技術分野では、このようなケトアミンは、一般に、「フラクトサミン」として知られている。タンパク質糖化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）およびフラクトサミン形成の程度は、血液グルコース濃度に直接比例する。
【０００５】
糖尿病のコントロールの程度を測定する現存する方法の多くは信頼性に乏しい。例えば、血漿グルコースを直接測定する試験は、血液グルコースレベルが一日の間に、食事、活動度、および処置により影響されて有意に変動するので、不適切または誤らせることさえ見出された。
【０００６】
直接グルコース測定の欠点のため、血液グルコースレベルの長期間の指標となる試験が開発された。このような試験の１つは、糖化ヘモグロビンを測定した。糖化ヘモグロビンを測定することに伴う、高価、訓練された技術者の必要性および再現性の欠如のため、血清フラクトサミンを測定するためのより信頼性のある試験が開発された。フラクトサミンのアッセイは、糖化ヘモグロビンのアッセイのいくつかを克服する。何故なら、フラクトサミンの測定は、実施するのが技術的により簡単で、そして糖化ヘモグロビン（２〜３ケ月）に比較してより短期間（１／２月）の血糖症コントロールを反映する。
【０００７】
Ｂａｋｅｒは、米国特許第４，６４２，２９５号および第４，６４５，７４２号において、フラクトサミンレベルを測定する方法を開示している。しかし、開示される方法は、溶液アッセイを用い、これは、溶液アッセイに伴う不便さ、および比較的大量の液体試料を必要とするなどいくつかの実施上の制限を有する。このような方法は、例えば、Ｉｓｍａｉｌらにより、米国特許第４，９５６，３０１号に開示されるように、乾燥相の化合物に適合されてきた。しかし、Ｉｓｍａｉｌの乾燥相アッセイは、試験片デバイスであり、これは反応促進剤化合物の使用を必要とし、そしてそれは、フラクトサミンアッセイで特に有用である特定の試薬、即ち、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）および炭酸塩緩衝液を用いて実施し得ない。
【０００８】
多層試験デバイスが一般に、当該技術分野で知られいる。しかし、当該技術分野の多くの特許、例えば、Ｇｏｆｆｅらの米国特許第４，０５０，８９８号は、拡散層の必要性を記載している。拡散層の使用を克服するため、いくつかの多層デバイスは、公開された欧州特許出願第０　３８８　７８２号に示されるように、第１の支持部材と多層分析フィルムとの間に空気間隙を有している。
【０００９】
Ｓａｋａｍｏｔｏは、公開された欧州特許出願第０　４７３　１８９号において、フラクトサミンをアッセイするための多層の分析部材を記載している。しかし、多層の配置、および用いられる材料は、本発明と異なっている。結果として、Ｓａｋａｍｏｔｏらの部材は、バインダーの使用を必要とし、そして全血中のフラクトサミンを分析し得ない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
従って、フラクトサミンの濃度を分析するために必要な最小の化合物のみを含む簡単な乾燥相試験デバイスの必要性がなお当該技術分野に存在する。そして特に、拡散層または空気間隙を必要とせず、そして全血中のフラクトサミン濃度を分析し得る簡単な多層試験デバイスにこの化合物を採用するための必要性がなお存在している。本発明は、これらの必要性を満足し、そして同様に関連する利点を提供する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
１つの局面において、本発明のデバイスは、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析する多層試験デバイスであって：
少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む、不透明でない、液体透過緩衝液層；
フラクトサミンにより還元され得る指示薬を含む、指示薬層；および
検出孔を必要に応じて有する支持部材を備え；ここでその緩衝液層がその指示薬層上に重ねられる、デバイスである。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明のデバイスは、試料孔を有する別の支持部材をさらに備え、そして上記緩衝液層および上記指示薬層が両支持部材間に挟まれている、多層試験デバイスである。
【００１３】
他の実施形態において、本発明のデバイスは、上記支持部材が実質的に平面状の支持部材である、多層試験デバイスである。
【００１４】
別の実施形態において、本発明のデバイスは、１つ以上の別の層をさらに備える、多層試験デバイスである。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記別の層が、分離層、放射線ブロッキング層、妨害除去層、汚染防止層、透析層、濾過層、および支持体層からなる群から選択される、多層試験デバイスである。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記緩衝液が、約１０と約１２との間のｐＨ値を有する、多層試験デバイスである。
【００１７】
さらに別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記指示薬が、発色性色素および蛍光試薬からなる群から選択される、多層試験デバイスである。
【００１８】
さらに別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記指示薬がテトラゾリウム色素である、多層試験デバイスである。
【００１９】
他の局面において、本発明のデバイスは、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析する多層試験デバイスであって：
少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む、緩衝液層；
フラクトサミンにより還元され得る指示薬を含む、指示薬層；および
検出孔を必要に応じて有する支持部材を備え；ここでその緩衝液層およびその指示薬層が並置される、デバイスである。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明のデバイスは、試料孔を有する別の支持部材をさらに備え、そして上記緩衝液層および上記指示薬層が両支持部材間に挟まれている、多層試験デバイスである。
【００２１】
他の実施形態において、本発明のデバイスは、上記支持部材が実質的に平面状の支持部材である、多層試験デバイスである。
【００２２】
別の実施形態において、本発明のデバイスは、１つ以上の別の層をさらに備える、多層試験デバイスである。
【００２３】
別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記別の層が、分離層、放射線ブロッキング層、妨害除去層、汚染防止層、透析層、濾過層、および支持体層からなる群から選択される、多層試験デバイスである。
【００２４】
別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記緩衝液が、約１０と約１２との間のｐＨ値を有する、多層試験デバイスである。
【００２５】
別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記指示薬が、発色性色素および蛍光試薬からなる群から選択される、多層試験デバイスである。
【００２６】
別の実施形態において、本発明のデバイスは、上記指示薬がテトラゾリウム色素である、多層試験デバイスである。
【００２７】
別の局面において、本発明のデバイスは、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析する多層試験デバイスであって：
試料孔を有する実質的に平面状の第１のプラスチック支持部材；
検出孔を有する実質的に平面状の第２のプラスチック支持部材；
約１０と約１２との間のｐＨ値を有する緩衝液を含む、不透明でない、液体透過緩衝液層；および
ニトロブルーテトラゾリウムクロライド色素を含む、指示薬層、を備え、ここでその緩衝液層がその指示薬層の上に重ねられ、そしてここでその緩衝液層および指示薬層がその第１の支持部材と第２の支持部材との間に挟まれる、デバイスである。
【００２８】
別の局面において、本発明の方法は、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための方法であって：
（ａ）　少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む不透明でない液体透過緩衝液層、フラクトサミンにより還元され得る指示薬を含む指示薬層、および検出孔を必要に応じて有する支持部材を備え、ここでその緩衝液層がその指示薬層上に重ねられる試験デバイスを提供する工程；
（ｂ）　その試験デバイスに液体試料を付与する工程；および
（ｃ）　その液体試料中に存在するフラクトサミンの濃度についてその指示薬層を分析する工程、を包含する方法である。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の方法は、上記工程（ａ）の試験デバイスが試験孔を有する別の支持部材をさらに備え、そしてここで上記緩衝液層および上記指示薬層が両支持部材間に挟まれる、方法である。
【００３０】
別の実施形態において、本発明の方法は、上記フラクトサミンの濃度が、上記指示薬層に関して、発色変化若しくは蛍光の強度若しくは程度を、肉眼により若しくは機器を用いて測定することにより分析される、方法である。
【００３１】
別の実施形態において、本発明の方法は、上記工程（ｃ）の分析が周囲温度で実施される、方法である。
【００３２】
さらに別の局面において、本発明の方法は、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための方法であって：
（ａ）　少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む緩衝液層、フラクトサミンにより還元され得る指示薬を含む指示薬層、および検出孔を必要に応じて有する支持部材を備え、ここでその緩衝液層およびその指示薬層が並置される試験デバイスを提供する工程；
（ｂ）　その試験デバイスに液体試料を付与する工程；および
（ｃ）　その液体試料中に存在するフラクトサミンの濃度についてその指示薬層を分析する工程、を包含する方法である。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の方法は、上記工程（ａ）の試験デバイスが試験孔を有する別の支持部材をさらに備え、そしてここで上記緩衝液層および上記指示薬層が両支持部材間に挟まれる、方法である。
【００３４】
他の実施形態において、本発明の方法は、上記フラクトサミンの濃度が、上記指示薬層に関して、発色変化若しくは蛍光の強度若しくは程度を、肉眼により若しくは機器を用いて測定することにより分析される、方法である。
【００３５】
別の実施形態において、本発明の方法は、上記工程（ｃ）の分析が周囲温度で実施される、方法である。
【００３６】
（発明の要旨）
本発明は、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための新規な多層試験デバイスおよび方法に関する。簡単でしかも正確な多層試験デバイスは、フラクトサミンにより還元され得る指示薬を含む指示薬層上に重ねられるまたは並置され、少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む緩衝液層を有する。緩衝液層を支持して、指示薬層および多層デバイス中の任意の層が、フラクトサミンの濃度を分析するための検出孔を必要に応じて有する少なくとも１つの支持部材である。試料孔を有するさらなる支持部材が使用され得る。２つの支持部材が用いられる場合、多層は、試料孔を有する第１の支持部材と、必要に応じて検出孔を有する第２の支持部材との間に挟まれる。
【００３７】
【発明の実施の形態】
（発明の詳細な説明）
本発明は、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための、簡単ではあるが正確な多層試験デバイスおよび方法を提供する。本発明は、フラクトサミン技術における他の乾燥相試験デバイスに対して明確な利点を提供する。驚くべきことにおよび予期せぬことに、本発明は、全血を含む任意のタイプの液体試料を、周囲温度で反応促進剤を用いることなく分析し得る。さらに、拡散層または空気間隙は、フラクトサミンの正確な測定に必要ではない。
【００３８】
一般に、血液中のフラクトサミン濃度は、約半月の期間にわたる血液中の平均グルコース濃度を反映する。フラクトサミン形成は、グルコース濃度に直接依存するので、糖尿病の個体は、糖尿病でない個体と比較したとき、より高い血液中のフラクトサミン濃度を有する。アルカリ条件では、血液中で形成されるフラクトサミンは、エネアミノール（ｅｎｅａｍｉｎｏｌ）に変換される。フラクトサミンのエネアミノール形態は、フラクトサミンにより還元され得る適切な指示薬と反応する化学的に活性な還元性物質である。例えば、この反応から生じる発色色素の色変化または蛍光試薬の蛍光が測定され得、そして標準と比較され、先の半月にわたる血液試料中の平均グルコース濃度の指標を与える。グルコース濃度に対するこの相関関係は、たとえグルコースが血液中でタンパク質と結合したままであっても可能で、フラクトサミンを形成する分子再配列を行う。
【００３９】
フラクトサミン濃度について分析されるべき液体試料は、天然に存在し得またはフラクトサミンを含むと考えられる人工的に形成された液体であり得、そして通常は、生物学的液体試料、またはその希釈物である。フラクトサミン濃度が測定され得る生物学的液体試料は、全血、血清、血漿、尿、および唾液を含む。本発明は、他の先行技術の多層デバイスを用いては可能でない、全血中に見出されるフラクトサミンを分析するために特に有用である。
【００４０】
本発明を用いるフラクトサミンの分析は、周囲温度または室温（約３０℃）で実施され得る。先行技術は、反応促進剤または高温のいずれかを用いる。Ｉｓｍａｉｌの米国特許第４，９５６，３０１号に記載された乾燥相アッセイは、周囲温度でフラクトサミンのレベルを分析もするために反応促進剤化合物の使用を必要とする。公開された欧州特許出願第０　４７３　１０９号に記載されたＳａｋａｍｏｔｏの多層分析部材は、４０℃のオーダーの高温を必要とする。驚くべきことに、そして予期せぬことに、本発明の多層試験デバイスは、反応促進のために別の化合物または高温のいずれも必要としない。
【００４１】
（多層）
本発明によれば、多層試験デバイスの層が互いに隣接して配置され、その結果それらは流体伝達を提供する。隣接する層間の流体流れは、縦方向また側面方向のいずれかであり得る。従って、多層デバイスの層は重ねられ得（図１および３に示されるように）または並置され得る（図２および４に示されるように）。
【００４２】
試験デバイスの種々の多層は、緩衝液または指示薬のような目的のアッセイ試薬を含む。目的の試薬は、層中に含浸され得るか、または層中若しくは層上にコートされ得るか、または層に共有結合し得る。
【００４３】
本明細書で記載される、緩衝液層、指示薬層、および任意の別の層を含む、種々の層のための材料は、目的のアッセイ試薬を含有し得るが、フラクトサミン分析物および他の重要なアッセイ試薬および液体に対して透過可能である多孔性マトリックスを含み得る。透過性は、一般に、多孔度、膨潤する能力または任意の他の特性から生じる。試験デバイス層は、セルロース、紙、羊毛、フェルト、織物などのような種々の多孔性の繊維状材料を含み得る（例えば、米国特許第３，８０２，８４２号；第３，８０９，６０５号；および第３，８９７，２１４号を参照のこと。これらすべては参考として本明細書に援用される）。あるいは、試験デバイス層は、微細孔性ポリマーのような、多孔性の、非繊維性材料を含み得る（例えば、本明細書で参考として援用される米国特許第３，５５２，９２９号を参照のこと）。これらの層について用いられ得る適切な材料の特定の例は、３ｍｍ濾紙のような濾紙、レーヨン、ＣｙｔｏｓｅｐＲ膜（Ａｈｌｓｔｒｏｍ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｔ．Ｈｏｌｌｙ　Ｓｐｒｉｎｇ，ＰＡ）、ガラス繊維、およびＢｉｏｄｙｎｅ　Ａ　ナイロン膜を含む。
【００４４】
本発明によれば、緩衝液または指示薬のようなアッセイ試薬を含む多層は、同時にまたは連続的にアセンブルされ得る。所定の層の多孔性材料が、最初に緩衝液または指示薬溶液のようなアッセイ試薬の溶液中に置かれる。乾燥後、層は、それが多層試験デバイス中で使用されるまで、デシケーターキャビネット中に保存され得る。
【００４５】
多層は、一般に、以下により完全に説明されるように、１つの支持部材上にマウントされ、または２つの支持部材の間に挟まれる試薬パッド（ｐａｄ）の形態である。多層パッドは、環状または矩形のような任意の幾何学的形状であり得、そして周囲がほぼ０．５〜２０ｍｍ、好ましくは１〜１０ｍｍであり、そして互いに重ねられまたは並置されるいずれかで配置される。
【００４６】
多層の配置に拘わらず、本発明により具現化される試験デバイスは、基礎部材として、緩衝液層、指示薬層を備え、そして以下に記載するように、さらなる層を備え得る。
【００４７】
（緩衝液層）
緩衝液層１４は、少なくとも９のｐＨ値を有する緩衝液を含む。種々の公知のタイプの緩衝液は、その緩衝液がフラクトサミンがそれらのエネアミノール形態に転換されるような十分に高いｐＨを提供する限り緩衝液層中に含まれ得る。これを達成するために、緩衝液のｐＨは、約９と１３との間のｐＨ値であるべきであり、そして最適結果のためには、ｐＨは、１０と１２との間のｐＨ値である。このような緩衝液の例は、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、グアニジウム塩、特定のアミノ酸、および当該技術分野で周知の他の好適な緩衝液、またはそれらの組み合わせを含む。緩衝液層が指示薬層の上に重ねられる場合、それは一般に、不透明でない（ｎｏｎ−ｏｐａｑｕｅ）材料でなる。
【００４８】
（指示薬層）
指示薬層１５は、発色性色素、または蛍光試薬を含む特定の色素のような、フラクトサミンにより還元され得る任意の指示薬を含む。液体試料中に存在するフラクトサミンの量に基づく色を変化させる適切な発色性色素の例は、ネオテトラゾリウムクロライド（ＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリユウムクロライド（ＴＮＢＴ）、ブルーテトラゾリウムクロライド（ＢＴ）、インドニトロテトラゾリウムクロライド、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、ニトロブルーモノテトラゾリウムクロライド、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）、テトラゾリウムバイオレット、２，３，５−トリフェニル−２−Ｈ−テトロゾリウムクロライド、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＴＣＮＢＴ）、テトラゾリウムＸＴＴ（ＸＴＴ）、２−２’−ベンゾチアゾリル−５−スチリル−３−（４’−フタルヒドラジジル）テトラゾリウムクロライド（ＢＳＰＴ）、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＤＳＮＢＴ）のようなテトラゾリウム染料を含む。適切な蛍光試薬の例は、５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロライド（ＣＴＣ）である。
【００４９】
（付加的な層）
本発明では、緩衝液層および指示薬層に加えて別の層が、本発明に従って用いられ得る。例えば、多層試験デバイスは、緩衝液層パッドの前に赤血球細胞（ＲＢＣ）分離層を、ＲＢＣ成分を分離する目的で備え得る。その他の有用な層は、限定されないが、本明細書に参考として援用される米国特許第４，０５０，８９８号および第４，０４２，３３５号に記載されるような、放射線ブロッキング層、界面活性剤、キレーター、抗酸化剤、または正確な結果を妨害し得る他の物質を含み得る妨害除去層、汚染防止層、透析層、濾過層、支持層などを含む。
【００５０】
（多層の支持）
本発明における支持部材（単数または複数）は、光またはその他のエネルギーに対して不透過性、反射性、または透明であり得る。支持部材は、意図される分析モードおよび用いられる指示薬（発色性または蛍光指示薬）に適合する。支持部材に用いられ得る材料は、種々のプラスチック、およびセルロース、アセテート、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、およびポリスチレンのようなポリマーを含む。一般に、このような材料が用いられる場合、支持部材は実質的に平面状である。これら層はまた、層をそれらを適正な向きに保持するプラスチックコンテナー中に収容され得、またはそれらは、ＩＣＯＮデバイス（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような、当該技術分野で公知の他の材料中に収容され得る。
【００５１】
（１つの支持部材デバイス）
本発明は、必要に応じて検出孔を有する少なくと１つの支持部材を有する。本明細書で用いる語句「必要に応じて検出孔を有する」は、１つの支持部材が透明である場合検出孔の必要がなく、その一方不透明支持部材を備える場合検出孔が必要でありそして存在することを意味する。検出孔は、指示薬層上の色変化または蛍光を観察するための穴である。孔のサイズは、多層のサイズより小さく、そしてそのサイズは層または層パッドのサイズに依存する。孔のサイズは、ほぼ０．５ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１ｍｍと１０ｍｍとの間である。底部支持部材上の検出孔の位置は、多層が重ねられるかまたは並置されるか（例えば図１対図２にで示されるように）に依存する。多層が重ねられる場合、検出孔はすべての多層の下である（例えば図１を参照のこと）。多層が並置される場合、検出孔は指示薬層または他の最終層の直ぐ下にある（例えば図２を参照のこと）。
【００５２】
１つの支持のみが用いられる場合、液体試料は、多層の第１の層に、例えば、フィンガースティック、ピペット、ドロッパーにより、またはデバイスを試料中に浸すことにより直接付与される。液体試料は、自由に浸透し、そして緩衝液層および存在する任意の付加的な層中に拡散および流れ込み、そしてフラクトサミンの濃度が分析され得るように指示薬層に移動する。フラクトサミン濃度は、指示薬の変化を、発色性色素の色変化若しくは蛍光試薬中の蛍光の強度若しくは程度を測定するなど、肉眼若しくは機器を用いて調べることにより分析され得る。フラクトサミンレベルは、反射率計および蛍光光度計を含む、分光光度計のような適切な機器の使用により測定され得る。
【００５３】
（２つの支持部材デバイス）
本発明は、上記のように１つの支持部材のみを用いて実施され得るが、さらなる支持体が用いられる得る。２つの支持体が用いられる場合、多層は、試料孔を有する第１の支持部材と、必要に応じて検出孔を有する第２の支持部材との間に挟まれる。検出孔のように、試料孔は、多層のサイズより小さいサイズであり、そしてそのサイズは、層または層パッドのサイズに大部分依存する。孔サイズは、ほぼ０．５ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１ｍｍと１０ｍｍとの間である。
【００５４】
２つの支持体は、接着剤のような固定手段により一緒に保持される。用いられ得る接着剤の例は、ゼラチン、ゴム、シリコーン、およびアクリレートベース接着剤を含む。さらに、ブラスチックのハウジングが、当該技術水準で一般的であるように、超音波溶接またはスナップ止めで一緒にはめ込まれ得る。
【００５５】
２つの支持部材試験デバイスを用いる場合、１滴の液体試料が試料孔に多層の第１のパッドへと、例えば、フィンガースティック、ドロッパー、ピペットの使用により、またはデバイスを試料中に浸すことにより付与される。液体試料は、自由に透過し、そして緩衝液層および存在する任意の別の層中またはそれらを通じて拡散し、そしてフラクトサミンの濃度が分析され得るように、指示薬層に移動する。フラクトサミン濃度は、指示薬の変化を、発色性色素の色変化若しくは蛍光試薬中の蛍光の強度若しくは程度を測定するなど、肉眼若しくは機器を用いて調べることにより分析され得る。フラクトサミンレベルは、反射率計および蛍光光度計を含む、分光光度計のような適切な機器の使用により測定され得る。
【００５６】
本発明の別の実施態様は、上記の図面を参照して記載される。好ましい実施態様である図１ａおよび１ｂについて言えば、液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための多層試験デバイス１０は、試料孔１３を有する実質的に平面状の第１の支持部材１２、および検出孔１７を有する実質的に平面状の第２の支持部材１６の、２つの支持部材を有する。２つの支持体は、接着剤のような取り付け手段１８により一緒に保持される。重ねられそして２つの支持体の間に挟まれて、少なくとも緩衝液層パッド１４および指示薬層パッド１５を、緩衝液層１４が指示薬層１５の上に重ねられて備える多層がある。
【００５７】
図２ａおよび２ｂについて言えば、別の実施態様の多層試験デバイス２０は、多層が並置されそしてそのために検出孔２３が配置されることを除いて上記のデバイスと同じである。液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための多層試験デバイス２０のこの実施態様は、試料孔１３を有する実質的に平面状の第１の支持部材１２、および検出孔２３を有する実質的に平面状の第２の支持部材２２の、２つの実質的に平面状の支持部材を有する。２つの支持体は、接着剤のような取り付け手段２４により一緒に保持される。流体を伝達するように並置されそして２つの支持体の間に挟まれて、少なくとも緩衝液層パッド１４および指示薬層パッド１５を備える多層がある。
【００５８】
図３ａおよび３ｂについて言えば、さらに別の実施態様の多層試験デバイス３０は、唯一の実質的に平面状の支持部材を有する。液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための多層試験デバイス３０のこの実施態様は、指示薬層パッド１５上に流体を伝達するように重ねられた緩衝液層１４を支持し、検出孔３３を備えた唯一の実質的に平面状の支持部材３２を有する。
【００５９】
図４ａおよび４ｂについて言えば、さらに別の実施態様の多層試験デバイス４０は、多層が並置されることを除いて上記のデバイスと同じである。液体試料中のフラクトサミンの濃度を分析するための多層試験デバイス４０のこの実施態様は、検出孔４３を有し、指示薬層パッド１５と液体を伝達するように並置される緩衝液層パッド１４を支持する１つの実質的に平面状の支持部材４２を有する。
【００６０】
以下の実施例は本発明を例示し、制限する意図はない。
【００６１】
【実施例】
（実施例Ｉ）
（変化する濃度の指示薬を有する２層フラクトサミン試験デバイスの調製および試験）
緩衝液層パッド：　ＣｙｔｏｓｅｐＲ膜　＃１６６１（Ａｈｌｓｔｒｏｍ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｔ．　Ｈｏｌｌｙ　Ｓｐｒｉｎｇ，ＰＡ）を１１．７のｐＨを有するグアニジニウムカーボネート緩衝液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１．２５モル溶液中に１分間置いた。過剰の緩衝液を取り除き、そして膜を６０℃で３０分間乾燥した。乾燥後、緩衝液層が多層試験デバイス中で使用されるまで、緩衝液層パッドをデシケーターキャビネット中に保存した。使用時には、７ｍｍの円形の緩衝液層パッドを調製した。
【００６２】
指示薬層パッド：　５μｍポアサイズのＢｉｏｄｙｎｅ　Ａ　ナイロン膜（Ｐａｌｌ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔ　Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）を、水中で１〜３０ミリモルの変化する濃度のニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む溶液中に１分間置いた。過剰のＮＢＴを除去し、そして膜を６０℃で３０分間乾燥した。乾燥後、含浸した膜を周囲光の非存在下で保存した。使用時には、７ｍｍの円形の円形のＮＢＴ指示薬層パッドを調製した。
【００６３】
支持部材：　２つの白色のプラスチック製の実質的に平面状の細片を用いた（パーツ番号Ｄｉａｇ　０００１，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）。試料孔を備えた上部プラスチック細片および検出孔を備えた底部細片の、プラスチック細片の各々は７ｍｍより小さいサイズの穴を有していた。接着剤テープが、ブラスチック細片の内側にある穴を取り囲んでいる。
【００６４】
多層試験デバイス：　上記の緩衝液層パッドの１つが、上記のＮＢＴ指示薬層パッドの１つの上に重ねられた。２つのプラスチック細片の間に、試料孔が緩衝液層パッドに曝されるように、そして検出検出孔がＮＢＴ指示薬層パッドに曝されるように、２つの重ねたパッドが挟まれる。
【００６５】
多層試験デバイス分析：　水中の１ミリモルのデオキシモルホリノフラクトース（ＤＭＦ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液１０μｌを、緩衝液層パッドへと試料孔に付与した。ＤＭＦ液体試料は、緩衝液パッドを通じてＮＢＴ緩衝液層パッドに流れ、そこでアルカリ性ＤＭＦはＮＢＴ色素と反応し発色産物を形成した。マゼンタ色を、Ｇｒｅｔａｇ　Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを用いて２、４、６、８、および１０分後に測定した。同じプロトコールを、１〜３０ミリモルＮＢＴの濃度について繰り返した。図５は、異なる濃度のＮＢＴを用いて調製された多層試験デバイスにＤＭＦを添加した１０分後までに生成された色を示す。
【００６６】
（実施例ＩＩ）
（２層フラクトサミン試験デバイスの調製および血清ベースのフラクトサミン校正剤の試験）
試験デバイスを、緩衝液層パッドに用いられる材料が不織布レーヨンＳ−５（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）であり、そして指示薬層パッドがＮＢＴの１５ミリモル濃度の溶液に含浸したＬｏｐｒｏｄｙｎｅ膜（Ｐａｌｌ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔ　Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）であったことを除いて、上記の実施例Ｉのように調製した。
【００６７】
多層試験デバイス分析：　１０μｌの血清ベースのフラクトサミン校正剤試料（ブランク、普通、中間、および高濃度）（Ｉｓｏｌａｂ，Ｉｎｃ．，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）を、緩衝液層パッドへと試料孔を直接付与した。血清ベースのＦ液体試料は、緩衝液パッドを通じてＮＢＴ緩衝液層パッドに流れ、そこでアルカリ性ＤＭＦはＮＢＴ色素と反応し発色産物を形成した。マゼンタ色を、ＧｒｅｔａｇＲｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて２、４、６、８、および１０分後に測定した。多層試験デバイスは、以下に示す結果により示されるように、血清をベースにした異なるフラクトサミン試料間を正確に区別し得た。
【００６８】
2004004106.tif 000002
【００６９】
本発明を開示した実施態様を参照して記載したが、本発明の思想を逸脱することなく種々の改変がなされ得ることを理解すべきである。従って、本発明は、以下の請求項によりのみ制限される。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によって、フラクトサミンの濃度を分析するために必要な最小の化合物のみを含む簡単な乾燥相試験デバイスが提供される。そして特に、本発明によって、拡散層または空気間隙を必要とせず、そして全血中のフラクトサミン濃度を分析し得る簡単な多層試験デバイスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１ａは、多層試験デバイスが指示薬層上に重ねられた緩衝液層を例示する２つの支持部材の概略図である。
【図１Ｂ】図１ｂは、図１ａの多層試験デバイスの２つの支持部材の概略図であり、ここでは２つの支持部材は重ねられた多層を挟んでいる。
【図２Ａ】図２ａは、多層試験デバイスが互いに対して並置される場合を例示する２つの支持部材の概略図である。
【図２Ｂ】図２ｂは、図２ａの多層試験デバイスの２つの支持部材の概略図であり、ここでは２つの支持部材は並置された多層を挟んでいる。
【図３Ａ】図３ａは、多層試験デバイスが色素層の上に重ねられた緩衝液層を例示する１つの支持部材の概略図である。
【図３Ｂ】図３ｂは、図３ａの多層デバイスの１つの支持部材の概略図であり、ここでは緩衝液層が支持体上の色素層の上に重ねられている。
【図４Ａ】図４ａは、多層試験デバイスが互いに対して並置される場合を例示する１つの支持部材の概略図である。
【図４Ｂ】図４ｂは、図４ａの多層デバイスの１つの支持部材の概略図であり、ここでは多層が支持体上に並置されている。
【図５】図５は、変化する濃度のＮＢＴを用いて調製された多層試験デバイスに添加されたデオキシモルホリノフラクトース（ＤＭＦ）の試験結果をグラフ化した図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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