(57)【要約】      （修正有）【課題】ウシＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法を提供すること、具体的には対象遺伝子の周辺の領域を特異的に増幅せしめ、ＤＮＡ  欠損を検知することにより診断を行う方法及びそのためのキットを提供すること。【解決手段】下記の工程を含むウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法であって、変異部位を含む領域がウシＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列の１９９７〜１１０３０  位を含む領域であることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法。（ａ）ウシの核酸試料を得る工程、（ｂ）工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、（ｃ）工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含むウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法であって、変異部位を含む領域がウシＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列中、配列表の配列番号１に示される塩基配列の１９９７〜１１０３０  位を含む領域であることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法。
（ａ）ウシの核酸試料を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
【請求項２】
遺伝子増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応法によって行われる請求項１に記載の遺伝子診断法。
【請求項３】
変異の存在をポリメラーゼ連鎖反応法による遺伝子増幅産物を調べることにより行う請求項１または２に記載の遺伝子診断法。
【請求項４】
核酸試料がゲノミックＤＮＡ  、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む試料である請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子診断法。
【請求項５】
被検ウシからゲノム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法を用いてウシＨｓｐ７０  遺伝子を単離し、常法により該遺伝子の塩基配列を決定し、該塩基配列を配列表の配列番号１に記載の正常ウシのＨｓｐ７０  をコードするｃＤＮＡの塩基配列と比較して変異の有無を調べることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法。
【請求項６】
ウシのＨｓｐ７０  欠損症を検出するためのキットであって、ウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも該オリゴヌクレオチドプライマーが、
（１）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの５’  末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び
（２）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの３’  末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
からなる群から選ばれたものであることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症を検出するためのキット。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３５個のヌクレオチドからなるものである請求項６記載のキット。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の配列番号２〜８に示された群から選ばれた１対（ただし、配列番号２と４、３と５および６と７の組み合わせを除く）のものであることを特徴とする請求項６記載のウシのＨｓｐ７０  欠損症を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法（又は検出方法）に関する。
【０００２】
本明細書において、「Ｈｓｐ７０  」はＨｓｐ７０  遺伝子が転写され翻訳されて生成したタンパク質を意味し、「Ｈｓｐ７０  遺伝子」はＨｓｐ７０  をコードしている翻訳領域のエクソン部分、隣接している非翻訳領域のエクソン部分、それらのイントロン部分、該遺伝子の発現の制御に関わる領域に加え、本疾患に関連する変異部分が含まれるＤＮＡ  の領域を意味する。
【０００３】
【従来の技術】
Ｈｓｐ７０  欠損症は、横隔膜筋症を主徴とする常染色体性劣性遺伝病であり、臨床的には鼓張症、呼吸不全などを呈し、病理組織学的特徴としては横隔膜筋に筋繊維変性およびコア様構造が認められる疾患である。本疾患は、ホルスタイン牛においては１９９４年以降発生が認められているが、ヒトにおいて同様な疾患の報告はない。
Ｈｓｐ７０  欠損症を発症したウシは、鼓張症を繰り返すため、発見することができる。しかし、一方の染色体上にのみ異常に関連した遺伝子を有するヘテロ接合体であるウシ、すなわち遺伝的にＨｓｐ７０  欠損症のキャリアーであるウシについては、その異常を知ることが難しい。
したがって、見かけ上は異常の認められないウシ同士を交配させた場合でも、生まれてくる子牛に異常が現れることがあり、本疾患の発生を未然に防ぐ上では問題を有している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ウシのＨｓｐ７０  欠損症を予防する手段の１つとして、ヘテロ接合体同士の交配を避けるという方法が考えられる。しかし、この方法を可能にするためには、ウシのＨｓｐ７０  欠損症の診断を遺伝子レベルで行い、疾患遺伝子のキャリアーを特定する必要がある。異常を持つウシの疾患遺伝子が、正常なものに比べてどのように変異しているかを明らかにし、様々な遺伝子工学的手法により、変異遺伝子を迅速に検出できる手段を得ることができれば、このような遺伝子診断法を確立することができる。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、ウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法（遺伝子検出法）を提供することである。これにより、Ｈｓｐ７０  欠損症のキャリアーをスクリーニングすることによって、今後の本疾患の発生を未然に防ぐことができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記目的を達成するために研究を重ねた結果、本疾患と密接に関連する約１１ｋｂに及ぶＤＮＡ  の欠損を見出すことに成功した。この欠損領域には、既にウシで報告されているＨｓｐ７０  遺伝子（Ｍ．  Ｄ．  Ｇｒｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  １４，  ８６３−８６８  （１９９２）；  Ｊ．  Ａ．  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３０５，  １９７−２０３  （１９９５））を含んでいた。
さらに、本発明者らは、ＤＮＡ  の欠損という変異によりＨｓｐ７０  が発現していないことが本疾患の原因であることを見出し、該遺伝子上に設定した特定のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、オリゴヌクレオチドプライマーを用いる  ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により、かかる変異が検出されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明並びにその態様を以下に示す。
（１）下記の工程を含むウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法であって、変異部位を含む領域がウシＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列中、配列表の配列番号１に示される塩基配列の１９９７〜１１０３０  位を含む領域であることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法。
（ａ）ウシの核酸試料を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
（２）遺伝子増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応法によって行われる請求項１に記載の遺伝子診断法。
（３）変異の存在をポリメラーゼ連鎖反応法による遺伝子増幅産物を調べることにより行う請求項１又は２に記載の遺伝子診断法。
（４）核酸試料がゲノミックＤＮＡ  、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを含む試料である請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子診断法。
【０００８】
（５）被検ウシからゲノム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法を用いてウシＨｓｐ７０  遺伝子を単離し、常法により該遺伝子の塩基配列を決定し、該塩基配列を配列表の配列番号１に記載の正常ウシのＨｓｐ７０  をコードするｃＤＮＡの塩基配列と比較して変異の有無を調べることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法。
（６）ウシのＨｓｐ７０  欠損症を検出するためのキットであって、ウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅反応により増幅するのに利用されるオリゴヌクレオチドプライマーを含有しており、しかも該オリゴヌクレオチドプライマーが、
（１）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの５’  末端の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び
（２）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの３’  末端の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれたものであることを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症を検出するためのキット。
（７）オリゴヌクレオチドプライマーが、１５〜３５個のヌクレオチドからなるものである請求項６記載のキット。
（８）オリゴヌクレオチドプライマーが、配列表の配列番号２〜８に示された群から選ばれた１対（ただし、配列番号２と４、３と５および６と７の組み合わせを除く）のものであることを特徴とする上記（６）記載のウシのＨｓｐ７０  欠損症を検出するためのキット。
【０００９】
（９）ウシＨｓｐ７０  遺伝子及びウシＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子に対応する塩基配列又はその相補鎖の全体又はその一部であって、
（ａ）  配列表の配列番号１で示された塩基配列又はその相補鎖の全体又はその一部、
（ｂ）  前記配列（ａ）  とハイブリッド形成し、ＰＣＲ  によりウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域を遺伝子増幅するのに利用できるすべての配列、
（ｃ）  遺伝子コードの縮退のために前記配列（ａ）  及び（ｂ）  から派生した配列
よりなる群から選ばれたものであることを特徴とする塩基配列。
（１０）ゲノミック  ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、  ＲＮＡ配列、ハイブリッド配列、合成配列、及び半合成配列からなる群から選ばれたものであることを特徴とする上記（９）に記載の塩基配列。
【００１０】
（１１）上記（９）と（１０）のいずれかに記載の塩基配列又は対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成できることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
（１２）上記（１１）に記載のヌクレオチドプローブを用いてウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む配列を明らかにし、及び／又は単離する工程を有することを特徴とするウシＨｓｐ７０  欠損症の検出方法。
（１３）上記（６）〜（８）のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
（１４）上記（１３）記載のオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とするウシのＨｓｐ７０  欠損症用遺伝子診断試薬。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下において、本発明を詳細に説明する。
請求項１記載の本発明は、ウシＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法（検出方法）である。
後述するように、ウシＨｓｐ７０  欠損症の原因となる遺伝子上の変異が解明された（図１（ａ））ことにより、この変異を利用して該疾患の検出を行うことができる。具体的なウシＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法（検出方法）としては、次のような工程を含む態様が例示される。すなわち、
（ａ）ウシの核酸試料を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、ウシのＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変異部位を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、
（ｃ）工程（ｂ）の核酸断片について変異の存在を調べる工程、
である。
【００１２】
第１に、工程（ａ）について述べる。本発明に用いられるウシの核酸試料としては、Ｈｓｐ７０  をコードする塩基配列を有するものであれば特に限定されるものではなく、適当な細胞又は組織由来の核酸（全ゲノムＤＮＡ  及び細胞の全ＲＮＡ  から転写されたｃＤＮＡを包含する）、例えば、ゲノミックＤＮＡ  、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等が挙げられる。ウシの核酸試料の調製は、公知の方法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９））に記載の方法により行うことができる。
【００１３】
第２に、工程（ｂ）について述べる。工程（ａ）で得られた核酸試料および適当なプライマーを用いて、ウシＨｓｐ７０  遺伝子に存在しうる変位部位を含む領域が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。
本工程で用いられる遺伝子増幅反応の方法としては、該領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、ＰＣＲ  法、ＲＮＡ  ポリメラーゼを利用した核酸増幅法や鎖置換増幅法のような核酸増幅法を利用することができる。なかでもＰＣＲ  法が好ましく用いられる。
増幅の対象となる、変異部位を含む領域としては、ウシＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列のうち、ウシＨｓｐ７０  欠損症の原因となる変異を含んでいる領域であれば特に限定されず、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列の中の１９９７〜１１０３０  位を含む領域が挙げられる。
【００１４】
本明細書中、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ  」とは、一般的に米国特許第４６８３１９５  号明細書に記載されている方法を指し、例えば、所望の塩基配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。
一般に、ＰＣＲ  法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うところのサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、ＰＣＲ  法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増殖されるべき塩基配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべき塩基配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべき塩基配列に隣接しているものが好ましく使用され得る。
【００１５】
ＰＣＲ  法は、Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｅｌｆａｕｄ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｓｎｉｎｄｋｙ，  ＆  Ｔ．  Ｊ．  Ｗｈｉｔｅ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）；  Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ＆  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）；  Ｒ．  Ｋ．  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９，  ４８７−４９１  （１９８８）；  Ｍ．  Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５，  ８９９８−９００２  （１９８８）  などに記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行うことができる。
また、ＰＣＲ  法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコールに従って実施することもできる。
【００１６】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドで、好ましくはポリデオキシヌクレオチドが挙げられ、Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  Ｖｏｌ．  ２８，  ｐ．  ７１６−７３４  （１９８９）  に記載されているような既知の方法、例えば、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホアミダイト法、ホスホネート法などの方法により化学合成することができる。通常、合成は修飾された固体支持体上で便利に行うことができることが知られており、例えば、自動化された合成装置を用いて行うことができ、該装置は市販されている。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上の修飾された塩基を含有していてよく、例えば、イノシンなどの天然においては普通でない塩基あるいはトリチル化された塩基などを含有していてもよい。
【００１７】
ＰＣＲ  法で用いるプライマーとしては、上記の変異部位を含むＤＮＡ  断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。代表的には、プライマーは（ａ）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（ｂ）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、より好ましくは（１）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの５’  端側の任意の領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び（２）  配列表の配列番号１に示された塩基配列のうちの３’  端側の任意の領域に対する相補塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができ、例えば、３〜１００個、好ましくは１０〜５０個、さらに好ましくは１５〜３５個のヌクレオチドを含有するものが挙げられる。
また、ＰＣＲ  条件についても特に限定されず、通常行われる公知の条件でよく、例えば、上記した文献の記載を参考に選択することができる。ＰＣＲ  においては、ＤＮＡ  鎖の熱変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる相補鎖の合成からなる一つのサイクルが、例えば、１０〜５０回、好ましくは２０〜３５回、より好ましくは２５〜３０回繰り返して行われる。
【００１８】
第３に、工程（ｃ）について述べる。本工程において、工程（ｂ）で得られる核酸断片について変異の存在を調べる。変異の存在の検出方法としては、特に限定されないが、ＰＣＲ  法により得られたＤＮＡ  断片長を調べることにより検出する。ＤＮＡ  断片長を調べる方法は特に限定されないが、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル上の電気泳動によりＤＮＡ  断片を分離し、例えば、既知分子量のマーカーＤＮＡ  フラグメントの移動度に対してのそれの移動度に基づいて、目的のＤＮＡ  断片を同定する方法が好ましい。
【００１９】
上記以外の検出法としては、前記に例示された態様の工程（ｃ）をその他の変異検出方法に変更した方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む適当なＤＮＡ  断片をプローブに用いるハイブリダイゼーション法のような公知の変異検出方法が使用できる。さらに、増幅されたＤＮＡ  を適当なベクターにクローニングして塩基配列を決定する方法や、あるいは増幅断片そのものを鋳型としてその塩基配列を決定する方法によっても変異の検出を行うことができる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドやプローブなどは、検出を容易にするためのラベル成分により標識されていることが好ましい。該ラベル成分は、分光学的手段、光学的手段、生化学的手段、免疫学的手段、酵素化学的手段、放射化学的手段などにより検出できるものであることができる。ラベル成分の例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、３２Ｐなどの放射性ラベル、アイソトープ、ビオチン、蛍光色素、発光物質、発色物質などが挙げられる。
【００２１】
本発明のウシＨｓｐ７０  欠損症の遺伝子診断法（検出方法）により、Ｈｓｐ７０  欠損症を発病しているウシのみならず、Ｈｓｐ７０  欠損症のキャリアーのウシについても検出し、診断することができる。
したがって、本発明でいうウシＨｓｐ７０  欠損症とは、遺伝子的に異常であることを意味し、症状の有無を問わず、またキャリアーを含めて広義に解釈するものとする。
【００２２】
正常ウシ及びＨｓｐ７０  欠損症発症ウシのＨｓｐ７０  遺伝子の解析：
遺伝子上の変異と本疾患との関連を調べるために、まず正常なウシのＨｓｐ７０  をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を単離し、その塩基配列を明らかにする。該遺伝子が単離された例はこれまで報告されていないが、本発明者らは、本疾患牛を含む家系のゲノム連鎖解析を行い、ポジショナルクローニング法と云われる手法を用いてウシＨｓｐ７０  遺伝子を単離した。すなわち、連鎖地図上に原因遺伝子座のマッピングを行ったのち、その染色体領域より原因遺伝子を単離する方法（「動物遺伝育種学事典」、社団法人畜産技術協会発行）により実施した。
【００２３】
本発明により解明された正常ウシのＨｓｐ７０  をコードするｃＤＮＡの全塩基配列を配列表の配列番号１に示す。ＤＮＡ  断片の塩基配列の決定（シークエンシング）は、化学分解法（Ｍａｘａｍ  ＆  Ｇｉｌｂｅｒｔ  法）、チェーンターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒジデオキシ法）などにより行うことができる。
【００２４】
Ｈｓｐ７０  欠損症の原因となる遺伝子上の変異は、正常ウシ及び発症ウシのＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列を比較することによって明らかにすることができる。すなわち、前記の正常ウシの場合と同様に発症ウシのＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列を調べ、これを正常ウシ遺伝子の塩基配列と比較することにより、該疾患の原因である変異を確認することができる。
【００２５】
本発明ではＨｓｐ７０  欠損症ウシのＨｓｐ７０  遺伝子上では配列表の配列番号１に示される正常ウシのＨｓｐ７０  遺伝子上のＨｓｐ７０  をコードする翻訳領域の塩基配列のうち１９９７〜１１０３０  位の部分が欠損する変異を見出した（図１（ａ））。
図１（ａ）  において、ＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂは、いずれもＨｓｐ７０  遺伝子である。このＨｓｐ７０  遺伝子は、ほとんど同じ配列の２つの遺伝子が染色体上に横並びしているものから成る。また１１ｋｂの欠損部位は、ＨＳＰＡ１Ａの３’側の非翻訳領域から始まり、ＨＳＰＡ１Ｂの翻訳領域の３’側末端で終わる。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例をもってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。以下の記載では、特に説明がない場合には、Ｄ．  Ｍ．  Ｇｌｏｖｅｒ  ＆  Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  （Ｅｄ．），  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １，  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９５）；  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （Ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８９）；  Ｍ．  Ａ．  Ｉｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇｅｌｆａｕｄ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｓｎｉｎｄｋｙ  ＆  Ｔ．  Ｊ．  Ｗｈｉｔｅ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）；  Ｍ．  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  Ｑｕｉｒｋｅ  ＆  Ｇ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  （Ｅｄ．），  ＰＣＲ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９１）  に記載の方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法により行われている。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明がない場合、それらに添付のプロトコールの指示に従って行っている。
【００２７】
実施例１
（１）  正常ウシＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列の決定
Ｈｓｐ７０  欠損症の疾患牛（１２頭）及びそれらの両親／娘牛からなる家系について、多型性ＤＮＡ  マーカーを用いてＨｓｐ７０  欠損症と連鎖するウシ染色体の領域を決定した。すなわち、連鎖地図上にあるＤＮＡ  マーカーのうち疾患と最も強く連鎖するマーカーを選抜した。ウシの人工大腸菌染色体（ＢＡＣ）  ライブラリー［ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ  ＨＯＳＰＩＴＡＬ  ＯＡＫＬＡＮＤ  −  ＢＡＣＰＡＣ  ＲＥＳＯＵＲＣＥＳ製］からこの領域に存在するＢＡＣ  クローンを分離した。
このＢＡＣ  のクローンを材料にショットガン塩基配列決定法を行った。まず、ネブライザーで物理的にＢＡＣ  クローンのＤＮＡ  を約７００  ｂｐの大きさに細断し、両端をＤＮＡ  ポリメラーゼで平滑にし、プラスミドにクローニングした。これらのプラスミドクローンから無作為に選び、それぞれ両端からＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ試薬（ＰＥ  バイオシステムズ社製）  により、３７００蛍光ＤＮＡ  シークエンサー（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いてその塩基配列を決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号１に示す。この塩基配列を他の既知の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  のデータベースに登録されており、塩基配列が決定されている遺伝子）  と比較したところ、Ｈｓｐ７０  遺伝子であることが判明した。
【００２８】
（２）  Ｈｓｐ７０  の発現
筋肉を磨り潰したものを遠心することによって得られる上清である可溶画分を該疾患牛の横隔膜筋から調製し、Ｈｓｐ７０  の発現について常法に従って調べた。すなわち、可溶画分を、ＳＤＳ  を含む１０％  ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、Ｈｓｐ７０  に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）をプローブにしてＨｓｐ７０  の発現を調べるウェスタンブロットを行ったところ、正常ウシに比べ該疾患牛ではほとんど発現していないことが明らかとなった。
【００２９】
（３）  Ｈｓｐ７０  欠損症ウシＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列の決定
実施例１（２）  に述べたように、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシでのＨｓｐ７０  の発現が認められないことから、該疾患牛のＨｓｐ７０  遺伝子の塩基配列を決定した。すなわち、配列表の配列番号１の配列を参照しつつＰＣＲ  を行い、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシにおけるＨｓｐ７０  遺伝子のＤＮＡ  塩基配列を決定した。
このようにして決定された塩基配列を、前記の正常ウシについて決定されたものと比較した結果、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシのＨｓｐ７０  遺伝子では、配列表の配列番号１に示された塩基配列中、１９９７〜１１０３０  位を含む約１１  ｋｂ  の欠損が認められた。このため、該疾患牛ではＨｓｐ７０  の発現が見られないと考えられる。
【００３０】
実施例２
Ｈｓｐ７０  正常型の検出：
ウシのゲノミックＤＮＡ  上のＨｓｐ７０  の正常型を確認するため、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシに認められた欠損部位を含むＤＮＡ  断片を増幅するためのプライマーＦ１、Ｒ１、Ｆ２、Ｒ２（配列表の配列番号２−５）を配列表の配列番号１の塩基配列を基にして合成した。これらプライマーの塩基配列上の位置を図１（ｂ）  に示す。
【００３１】
正常ウシの血液、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシの筋肉、及びその母牛又は娘牛の血液（抗擬固剤としてＥＤＴＡ、ヘパリンを含む）より、ＱＩＡａｍｐ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ又はＱＩＡａｍｐ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノミックＤＮＡ  を調製した。
これらのゲノミックＤＮＡ  を鋳型とし、プライマーＦ１とＲ１及びＦ２とＲ２を用いたＰＣＲ  （Ａｎｉｍａｌ  Ｔａｑ  を使用、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクル反応）を行い、反応液を１．５％ゲル（１ｘ  ＴＢＥ）を用いた電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増幅ＤＮＡ  断片を確認した。
正常ウシとＨｓｐ７０  欠損症ウシの母牛又は娘牛のゲノミックＤＮＡ  を鋳型とした場合、図２（ａ）  に示すように、４２２  ｂｐ及び１９８  ｂｐのＤＮＡ  断片の増幅が見られた。しかし、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシのゲノミックＤＮＡ  を鋳型にした場合は、増幅が認められなかった。
【００３２】
実施例３
Ｈｓｐ７０  変異型の検出：
ウシのゲノミックＤＮＡ  上のＨｓｐ７０  遺伝子の変異型が有ることを確認するため、実施例１（３）  に記載の約１１  ｋｂ  の欠損部分の両端にプライマーＦ３、Ｆ４、Ｒ３（配列表の配列番号６−８）を合成し（図１（ｂ））、実験に供した。
【００３３】
正常ウシ、Ｈｓｐ７０  欠損症ウシ、及びその母牛又は娘牛のゲノミックＤＮＡ  を鋳型とし、プライマーＦ３とＲ３及びＦ４とＲ３を用いたＰＣＲ  （Ａｎｉｍａｌ  Ｔａｑ  を使用、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分間からなる工程を１サイクルとした３５サイクル反応）を行い、反応液を１．５％ゲル（１ｘ  ＴＢＥ  ）を用いた電気泳動に供し、泳動後のゲルをエチジムブロマイド染色して増幅ＤＮＡ  断片を確認した。
Ｈｓｐ７０  欠損症ウシ、及びその母牛又は娘牛のゲノミックＤＮＡ  を鋳型とした場合、図２（ｂ）  に示すように、２０２８  ｂｐ  及び２００８  ｂｐ  のＤＮＡ  断片の増幅が見られた。しかし、正常ウシのゲノミックＤＮＡ  を鋳型にした場合は、増幅が認められなかった。
【００３４】
これらの結果より、Ｈｓｐ７０  遺伝子の翻訳領域を含む約１１  ｋｂ  の欠損について、発症ウシの母牛又は娘牛はこの変異に関してヘテロ接合体であり、Ｈｓｐ７０  欠損症が染色体性劣性遺伝をする遺伝性疾患であることが確認された。
【００３５】
【発明の効果】
本発明によれば、遺伝子工学的手法により、ウシのＨｓｐ７０  欠損症及びそのキヤリアーを簡便、かつ迅速に検出し、診断することが可能である。また、そのために使用するキットが提供される。
【００３６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）Ｈｓｐ７０  欠損症ウシ由来のウシＨｓｐ７０  遺伝子の欠損部分を示す図である。
（ｂ）欠損部分を検出するためのＰＣＲ  プライマーの位置を示す。
【図２】（ａ）Ｈｓｐ７０  正常型の検出：Ｈｓｐ７０  遺伝子の変異のないゲノミックＤＮＡ  を鋳型とすれば、ＰＣＲ  で増幅することを示す電気泳動パターン図である。
（ｂ）Ｈｓｐ７０  変異型の検出：Ｈｓｐ７０  遺伝子の変異のあるゲノミックＤＮＡ  を鋳型とすれば、ＰＣＲ  で増幅することを示す電気泳動パターン図である。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月3日(2003.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【配列表】
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