(57)【要約】【課題】  ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物、好ましくは、そのＬＬ−Ｆ２８２４９α代謝産物の産生を担う蛋白質をコードする全ヌクレオチド配列を単離および特徴付けし、次いで、生合成蛋白質を含むアミノ酸配列を単離し、その機能を決定すること。また、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナスの生物工学処理された株の発酵ブロスからの天然および半合成の誘導体を直接的に単離する新しい製法、ならびにより少ない工程の効率的なプロセスにおいてモキシデクチンの新しい製法を提供すること。【解決手段】  ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するための全生合成経路に関連した蛋白質をコードする新しい、精製され単離された核酸分子の提供。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス（Streptomyces）から単離され、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生する生合成経路の少なくとも１つの蛋白質をコードする精製および単離された核酸分子。
【請求項２】
核酸分子が抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナス（Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus）から単離された請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物がＬＬ−Ｆ２８２４９αである請求項１記載の核酸分子。
【請求項４】
分子が配列番号：１に記載のヌクレオチド配列またはその相補鎖である請求項１記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項４の核酸分子の配列にハイブリダイズし、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生する生合成経路の蛋白質をコードする核酸配列。
【請求項６】
配列番号：１のヌクレオチド７６９７−１０４６５よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号：１のヌクレオチド１０７９１−１１５７０よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号：１のヌクレオチド１１６５９−１２４６２よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号：１のヌクレオチド１２８５０−１９８７５よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号：１のヌクレオチド１９８７６−３１０３６よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１１】
配列番号：１のヌクレオチド３１１１５−４９２４６よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号：１のヌクレオチド５０４４９−５１３０３よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号：１のヌクレオチド５１３００−５２７０６よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１４】
配列番号：１のヌクレオチド５２８０９−６９８３３よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１５】
配列番号：１のヌクレオチド６９９２９−８５４２９よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１６】
配列番号：１のヌクレオチド８５５７４−８６３３８よりなる請求項４記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１記載の核酸分子を含む生物学的に機能的なプラスミドまたはベクター。
【請求項１８】
ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９２であるＣｏｓ１１、ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９３であるＣｏｓ３６またはＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９４であるＣｏｓ４０を含む請求項１７記載のプラスミドまたはベクター。
【請求項１９】
請求項１７記載のプラスミドまたはベクターにより安定して形質転換またはトランスフェクトされた適当な宿主細胞。
【請求項２０】
エシェリキア（Escherichia）、アクチノマイセターレス（Actinomycetales）、バシラス（Bacillus）、コリネバクテリア（Corynebacteria）またはテルモアクチノマイセス（Thermoactinomyces）である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２１】
大腸菌（Escherichia coli）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）である請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１記載の核酸分子によりコード化された生合成蛋白質。
【請求項２３】
オープン・リーティング・フレームのアミノ酸配列が、配列番号：２ないし配列番号：１２のうちのいずれか１つで表されるか、あるいはその生物活性変異体である請求項２２記載の蛋白質。
【請求項２４】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の生合成に関与する蛋白質の産生方法であって、適当な栄養条件下で、蛋白質生成物の発現を可能とするように請求項１記載の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた原核または真核宿主細胞を増殖させ、次いで、該核酸分子発現の所望の蛋白質生成物を単離すること含むことを特徴とする該産生方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の原核または真核宿主細胞における核酸分子発現の蛋白質生成物。
【請求項２６】
全生合成遺伝クラスターにわたり、かつＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するのを担うＩ型ポリケチド合成酵素をコードする核酸分子を含む、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の生合成経路の蛋白質をコードする核酸分子をクローニングするためのプラスミドまたは２もしくは３個のプラスミドの組合せ。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９２であるＣｏｓ１１、ＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９３であるＣｏｓ３６およびＡＴＣＣ指定番号ＰＴＡ−４３９４であるＣｏｓ４０を含む請求項２６記載の組合せ。
【請求項２８】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス株を、突然変異させた核酸分子で形質転換またはトランスフェクトして、元来のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異したモジュール３ケト還元酵素ドメインと置き換え；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の産生を可能とするように適当な栄養培地中で形質転換またはトランスフェクトしたストレプトマイセス株を培養し；次いで
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収することを含むことを特徴とする該製法。
【請求項２９】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αである請求項２８記載の製法。
【請求項３０】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）適当な原核または真核宿主細胞を、突然変異させた核酸分子で形質転換またはトランスフェクトし；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の発現を可能とするように適当な栄養条件下で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を増殖させ；次いで、
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収することを含むことを特徴とする該製法。
【請求項３１】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αであることを特徴とする請求項３０記載の製法。
【請求項３２】
２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセス株を形質転換またはトランスフェクトさせて、元来のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異したモジュール３ケト還元酵素ドメインと置き換え；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の産生を可能とするように適当な栄養培地中で形質転換またはトランスフェクトしたストレプトマイセス株を培養し； 
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収し；
（ｅ）適当な反応条件下、２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物に変換し；次いで
（ｆ）２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を単離する
ことを含むことを特徴とする該製法。
【請求項３３】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αであって、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α化合物を製造することを特徴とする請求項３２記載の製法。
【請求項３４】
２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の製法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１の核酸分子のモジュール３ケト還元酵素ドメインを突然変異させて、突然変異させた核酸分子を構築し、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とし；
（ｂ）適当な原核または真核宿主細胞を、突然変異させた核酸分子で形質転換またはトランスフェクトさせ；
（ｃ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の発現を可能とするように適当な栄養条件下で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を増殖させ； 
（ｄ）２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を回収し；
（ｅ）適当な反応条件下、２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物に変換し；次いで
（ｆ）２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を単離する
ことを含むことを特徴とする該製法。
【請求項３５】
２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物が２３−オキソ−ＬＬ−Ｆ２８２４９αであって、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α化合物を製造することを特徴とする請求項３４記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するのを担う蛋白質をコードする新規な生合成遺伝子ならびにストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナス（Streptomyces cyaneogriseus subsp. noncyanogenus）からの活性代謝産物を調製するためのその使用に関する。さらに、本発明は、天然の代謝産物の半合成誘導体を調製する生合成経路の遺伝子操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書に引用された全ての特許および刊行物を出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす。
【０００３】
ストレプトマイセス（Streptomyces）は、β−ラクタムおよびその大環状ラクトン化合物またはマクロライドのごとき知られた大部分の活性な抗生物質を含めた非常に様々な商業的に重要な二次代謝産物の産生株である。ストレプトマイセスにより産生された二次的な代謝産物の商業上の重要性のために、ストレプトマイセスの分子遺伝子操作のための方法の開発において、最近のかなりの投資が存在している。手順は、ポリエチレングリコール媒介形質転換および大腸菌（Escherichia coli）からの接合伝達により遺伝物質の導入につき開発されてきた。ベクターは、高および低コピー数のベクター、組込みベクターおよびイー・コリ（E. coli）−ストレプトマイセスシャトルベクターを含めて開発されている。ストレプトマイセスの分子遺伝子操作についてのこれらの方法は、D. A. Hopwoodら, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation Press, Norwich, UK （1985）に要約されている。多くの場合、二次的代謝産物の産生のための遺伝子は、ストレプトマイセス中でクラスター形成されている。かくして、生合成遺伝子クラスター中の単一遺伝子の同定は、その代謝産物の生合成を担う全ての遺伝子の同定に容易に導く。この観察は、大いに価値があることが証明され、二次的代謝産物遺伝子クラスターは、逆遺伝学、ブロックされた変異体の相補性、耐性、異種プローブの使用におりクローニングされたきた。これらの方法を用いて、ヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列データが、エリスロマイシン（S. Donadioら, Science 252:675−679 （1991）およびS. F. Haydockら, Molecular and General Genetics 230:120−128 （1991）参照）；ラパマイシン（T. Schweckeら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:7839−7843 （1995）およびX. Ruanら, Gene 203:1−9 （1997）参照）；ＦＫ５０６（H. MotamediおよびA. Shafiee, European Journal of Biochemistry 256:528−534 （1998））；オレアンドマイシン（D. G. Swanら, Molecular and General Genetics 242:358−362 （1994））およびリファマイシン（P. R. Augustら, Chemistry & Biology 5:69−79 （1998）参照）の合成を指令するものを含めた多数のマクロライド生合成遺伝子クラスターにつき獲得されてきた。しかしながら、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物として知られる大環状ラクトン化合物についての完全な生合成遺伝子クラスターはまだ当該技術分野において言及されていない。
【０００４】
分子遺伝子操作がポリケチド生合成の経過を変更するように用いることができるという多数の報告が存在する（S. Donadioら, Science 252:675−679 （1991）およびS. Donadioら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 7119−7123 （1993）参照）。これらの試験において、エリスロマイシン関連ラクトンは、モジュール４エノイル還元酵素、またはより重要なことには、本明細書に記載された試みでは、モジュール５ケト還元酵素のドメインのいずれかを非機能性とするような６−デオキシエリスロノライドＢ合成酵素（「ＤＥＢＳ」）遺伝子クラスター（エリスロマイシン生合成を担うコアポリケチド合成酵素遺伝子クラスター）の操作後に産生される。これらの変異体ＤＥＢＳ遺伝子クラスターを含む株は、予期されたエリスロマイシン関連ラクトンを産生した。これらの先駆的試験は、それ以来繰り返され、展開され、多数のかかる試験の結果は文献に概説されている（例えば、L. KatzおよびS. Donadio, Annual Reviews of Microbiology 47:875−912 （1993）; C.R. HutchinsonおよびI. Fujii, Annual Reviews of Microbiology 49:201−238 （1995）; D.A. Hopwood, Chemical Reviews 97:2465−2497 （1997）;ならびにC.W. CarrerasおよびD.V. Santi, Current Opinions in Biotechnology 9: 403−411 （1998）参照）。
【０００５】
文献に要約されたデータは、Ｉ型ポリケチド合成酵素（「ＰＫＳ」）モジュール中の触媒ドメインの機構が保存され、多数の高度に保存されたアミノ酸配列モチーフもそれらの生合成遺伝子クラスターにおいて記載されていることを示唆する。例えば、エス・アベルミチリス（S. avermitilis）により産生されるアベルメクチン（avermectin）の生合成遺伝子クラスターの機構が報告され（D. J. MacNeilら, Gene 115:119−125 （1992）およびD. J. MacNeilら, Annals of the New York Academy of Sciences 721:1２３−132 （1994）参照）；その生合成遺伝子クラスターの部分的なヌクレオチド配列が報告されているか、さもなければ入手可能である。また、MacNeilおよび共同研究者は、モジュラー機構を予測し、野生型エス・シアネオグリセウス（NRRL 15773）ネマデクチン（nemadectin）生合成遺伝子クラスターの限定されたエンドヌクレアーゼの制限酵素地図を報告した（D. J. MacNeilら, Annals of the New York Academy of Sciences 721:1２３−132 （1994）参照）が、それらの制限酵素地図は不完全であった。それらの分析は、ＰＫＳ機能の９個のモジュラー・リピートの存在を単に示し、エス・シアネオグリセウスゲノムの７５ｋｂ領域を規定するのに６個のオバーラップクローンを必要とした。MacNeilらは、全ての生合成遺伝子クラスターのＤＮＡシークエンシングを完了しなかった。それどころか、その著者らは、選択されたコスミドの末端だけを配列決定した。限定的な配列情報から、彼らは非常に概略的なエンドヌクレアーゼ制限酵素地図だけを生成できた。さらに、Ｃ−１３標識試験を行い、その構成アシルユニットからのＬＬ−Ｆ２８２４９α化合物の合成についての機序を提案した（H. R. Tsouら, Journal of Antibiotics （Tokyo） 42:398−406 （1989））。
【０００６】
寄生虫、節足動物外寄生生物およびダニ感染のコントロールまたは予防を含めた線虫および節足動物寄生虫の処置に広範囲に用いる天然の殺寄生虫剤である高度に活性なＬＬ−Ｆ２８２４９化合物をストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナス（以下、「エス・シアネオグリセウス（S. cyaneogriseus）」という）の発酵ブロスから単離する。エス・シアネオグリセウスから産生された抗寄生虫のＬＬ−Ｆ２８２４９化合物のシリーズは、よく特徴付けされたアベルメクチンに特許上は区別されるが、構造上類似する。米国特許第５,１０６,９９４号およびその継続出願の米国特許第５,１６９,９５６号は、主要および微量の成分、ＬＬ−Ｆ２８２４９α−λの調製を記載する。そのＬＬ−Ｆ２８２４９α−λファミリーの化合物は、限定されるものではないが、ＬＬ−Ｆ２８２４９α−λの半合成の２３−オキソ誘導体および２３−イミノ誘導体をさらに含み、それらは米国特許第４，９１６，１５４号に示されている。２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９αとして化学的に知られているモキシデクチンは、特に強力な２３−イミノ誘導体である。ＬＬ−Ｆ２８２４９誘導体の他の例には、限定されるものではないが、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−５−（フェノキシアセトキシ）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α、２３−（セミカルバゾン）−ＬＬ−Ｆ２８２４９αおよび２３−（チオセミカルバゾン）−ＬＬ−Ｆ２８２４９αが含まれる。
【０００７】
主要なネマデクチン代謝産物の１つのＬＬ−Ｆ２８２４９α（以下、「Ｆα」という）は、４工程化学プロセスを用いて商業上重要な化合物のモキシデクチンに変換される。これまで知られていなかったＦαの生合成遺伝子クラスターの決定は、商業上非常に重要であろう。活性なＦα化合物およびＬＬ−Ｆ２８２４９ファミリーの化合物の他の天然のメンバーを調製する遺伝子の単離が高度に望ましいだけではなく、モキシデクチンのごとき商業上強力な半合成誘導体をより迅速でかつ効率的に調製することも高度に望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物、好ましくは、そのＬＬ−Ｆ２８２４９α代謝産物の産生を担う蛋白質をコードする全ヌクレオチド配列を単離および特徴付けし、次いで、生合成蛋白質を含むアミノ酸配列を単離し、その機能を決定することが本発明の重要な目的である。
【０００９】
もう一つの目的は、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナスの生物工学処理された株の発酵ブロスからの天然および半合成の誘導体を直接的に単離する新しい製法を提供することにある。
【００１０】
さらなる目的は、これまで達成されたよりもより少ない工程の効率的なプロセスにおいてモキシデクチンの新しい製法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらなる趣旨および目的は、本明細書を先に進むにつれ明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記の目的は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するための全生合成経路に関連した蛋白質をコードする新しい、精製され単離された核酸分子を提供することにより達成される。
【００１３】
本発明は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物、最も重要なことには、高度に活性な主要成分ＬＬ−Ｆ２８２４９αの形成のためのユニークなクローニングおよび完全な生合成経路の特徴付けに関する。全ＤＮＡ遺伝子クラスターおよび適当な宿主におけるその発現は、高度に活性な天然の代謝産物および半合成誘導体の効率的な産生を可能とする。顕著には、全生合成経路は、効率的に、コスミド番号１１、３６および４０（以下、各々、Ｃｏｓ１１、Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０という）と識別されるわずか３種のプラスミドに含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の背景および当該技術分野からのその逸脱は、添付図面を参照して後記にさらに記載されるであろう。
【００１５】
本発明により、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するための全生合成経路の蛋白質をコードする新規に精製され単離された核酸分子が提供される。本発明の核酸分子は、抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセスから単離される。驚くべきことには、全ての本質的な生合成蛋白質をコードする完全なＤＮＡはわずか３種のコスミド中に効率的に詰め込まれている。本発明により核酸分子を含有するように構築されたこれらの３種のコスミド、Ｃｏｓ１１、Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生するための全生合成経路を調節するのに十分である。かくして、本発明は、好ましい具体例として、従前に検討されたより少ない工程にて、活性な抗寄生性ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物、特にモキシデクチンを調製するための実質的により効率的な手段とできる３種のコスミド中の全生合成遺伝子クラスターをユニークに提供する。本発明の成功は、全生合成遺伝子を単離する他者により先行された失敗した試みを克服し、長期の永続的な要求を満足させる。
【００１６】
（配列番号：１に対応する）この完全なＤＮＡ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、図６に十分に記載されている。また、本発明の範囲は、その相補鎖、すなわち、相補性ヌクレオチド（例えば、Ｔに代えたＡ、Ｇに代えたＣおよびそれらの逆）および／または逆方向のヌクレオチド配列（すなわち、例えば、リーディング５‘から３’末端へか、あるいはリーディング３‘から５’末端への方向へ変化する順方向または昇順鎖に代えた降順）であるそれらのヌクレオチドを含む。
【００１７】
本発明は、さらに、微生物源から単離された請求項４の核酸分子の配列にハイブリダイズし、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生する生合成経路の蛋白質をコードする核酸配列を含む。当業者によく知られている典型的なハイブリダイゼーション手順および条件は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に示されている。標準的またはストリンジェントな条件が相同プローブに使用されているが、標的核酸配列と１００％未満の相同性を有する部分的な相同プローブにつき用いることができるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は少ない。後者の場合の部分的な相同プローブにおいて、一連のサザンおよびノーザンハイブリダイゼージョンは、異なるストリンジェンシーで容易に行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーションがホルムアミド含有溶媒中で行われる場合、好ましい条件には、一定の約４２℃にて、６×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド強度の温度およびイオン強度を使用する。約４５％ないし０％の範囲のアニーリング緩衝液中の小量または低量のホルムアミドを除いて、同一の温度およびイオン強度を用いることができるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は少ない。あるいは、ハイブリダイゼーションは、ホルムアミドを全く含有しない水溶液中で行うことができる。通常、水性ハイブリダイゼーションでは、その溶液のイオン強度は、アニーリング温度を約６８℃から４２℃に低下させつつ、同一の、しばしば、約１Ｍ Ｎａ＋に保つ。
【００１８】
一般的には、適当な宿主細胞からのゲノムＤＮＡおよびそのクローニングした組換えＤＮＡの単離および特徴付けは、適当なライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして全てまたは一部分のヌクレオチド配列を利用して標準的またはストリンジェントなハイブリダイゼーション手法を介してなすことができる。別法のアプローチとして、他の関連する公知のＤＮＡおよび蛋白質配列に基づき構築されるオリゴヌクレオチド・プライマーを他の同一または関連する配列を増幅および同定するためのポリメラーゼ連鎖反応に用いることができる。本明細書に記載されたヌクレオチドおよび蛋白質は、種々のルーチン方法により単離および精製される。好ましくは、蛋白質は、実質的に純粋な形態で得られるが、約８０％ないし約９０％の低い範囲が許容される。本発明の範囲には、抗生物質を産生する野生型または変異株のストレプトマイセスから直接的に誘導されるものと同一構造同一または実質的に同一の構造を有する化学合成により調製され、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の生合成経路に関連するルーチン試験または標準的アッセイ方法により確認されたＤＮＡおよび蛋白質も含まれると考えられる。
【００１９】
加えて、本発明は、限定されるものではないが、ＯＲＦ１遺伝子によりコード化された（配列番号：２に対応する）調節蛋白質、ＯＲＦ２遺伝子によりコード化された（配列番号：３に対応する）チオエステラーゼ蛋白質、ＯＲＦ３遺伝子によりコード化された（配列番号：４に対応する）調節蛋白質、ＯＲＦ４遺伝子によりコード化されたＭｏｄ１についての（配列番号：５に対応する）ローディング・ドメイン蛋白質、ＯＲＦ５遺伝子によりコード化されたMod2−Mod3についての（配列番号：６に対応する）ローディング・ドメイン蛋白質、ＯＲＦ６遺伝子によりコード化されたＭｏｄ４−Ｍｏｄ７についての（配列番号：７に対応する）ローディング・ドメイン蛋白質、ＯＲＦ７遺伝子によりコード化された（配列番号：８に対応する）メチル転位酵素蛋白質、ＯＲＦ８遺伝子によりコード化された（配列番号：９に対応する）p450蛋白質、ＯＲＦ９遺伝子によりコード化されたＭｏｄ８−Ｍｏｄ１０についての（配列番号：１０に対応する）ローディング・ドメイン蛋白質、ＯＲＦ１０遺伝子によりコード化されたＭｏｄ１１−Ｍｏｄ１３についての（配列番号：１１に対応する）ローディング・ドメイン蛋白質、ＯＲＦ１１遺伝子によりコード化された（配列番号：１２に対応する）オキシド還元酵素蛋白質を含むアミノ酸配列よりなる単離された生合成蛋白質を含みかつ十分に記載する。
【００２０】
生合成蛋白質をコードするゲノムＤＮＡクラスターのオープン・リーディング・フレームは、種々の技術認識手法（art−recognized technique）を用いて同定できる。その手法には、限定されるものではないが、公知の開始および停止コドン、コドン頻度に基づく推定リーディングフレーム位置、他の公知のストレプトマイセス株等で発現した遺伝子に類似する整列を位置決定するコンピューター解析が含まれる。このように、本発明の蛋白質を本発明のヌクレオチド配列を用いて同定し、次いで、オープン・リーディング・フレームまたはコード化された蛋白質を単離または精製できるか、あるいは、化学的手段により合成できる。オープン・リーディング・フレームおよび適当なプロモーター、イニシエータ、ターミネーター等の基づき発現可能なゲノム構築体を設計し、オープン・リーディング・フレームによりコード化された蛋白質を発現するように適当な宿主細胞に導入できる。
【００２１】
本明細書に用いた「蛋白質」なる用語は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を産生する生合成経路を含む核酸分子によりコードされ、当該技術分野において通常用いられるポリペプチド、酵素等を意味する。本発明の蛋白質は、アミノ酸残基がペプチド共有結合により連結される全長を含めた変化する長さのアミノ酸の鎖、ならびにその生物学的に活性な変異体を含む。その蛋白質は、天然、組み換えまたは合成であり得る。例えば、生合成蛋白質は、蛋白質をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクターに挿入し、次いで、適当な宿主において蛋白質を発現させることによる通常の組換え技術を介して、あるいはアミノ酸配列がアミノ酸鎖に別々および順次結合されるMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149−2154 （1963）に記載されたMerrifield固相合成法による標準的な化学合成を介して調製できる。別法として、最新の装置が蛋白質の自動合成用のPerkin−Elmer, Inc. （Wellesley, MA）のごとき種々の製造者から商業的に入手可能である。
【００２２】
本発明の範囲内に含まれる生物学的に活性な変異体は、少なくとも、本発明の核酸分子によりコード化されるアミノ酸配列の生物学的に機能的な部分を含む。本明細書に記載された「生物学的に機能的な部分」とは、その蛋白質の活性な機能を依然として保持する一部分の蛋白質構造、例えば、同一または実質的に同一の活性および／または結合特性、すなわち、少なくとも約９０％、より好ましくは約９５％の類似性または効力を有するＯＲＦ１遺伝子によりコード化された調節蛋白質分子の一部分である。その蛋白質の生物学的に活性な変異体には、欠失、置換または付加されたアミノ酸残基、天然に発生した対立遺伝子等を有する活性なアミノ酸構造が含まれる。生物学的に機能的な部分は、全長蛋白質を断片を調製するために化学的または酵素的な消化に付し、次いで、それらの断片を標準的アッセイ方法においてテストして、どの部分のアミノ酸構造が、全長蛋白質と同一または実質的に同一の生物学的活性を保持するかを分析することにより容易に同定し得る。
【００２３】
従来知られていなかったＦαの全生合成遺伝子クラスターの決定は、商業上非常に重要である。本方法により遺伝子の単離および完全な記載は、活性なＦα化合物およびＬＬ−Ｆ２８２４９ファミリーの化合物の他の天然のメンバーの生成の増大を可能とする。さらに、その遺伝子についての情報は、従来の化学プロセスの製造よりも迅速でかつ効率的な方法でモキシデクチンのごとき商業的に有効な半合成の誘導体を調製するための改良方法を可能とする。本明細書に記載された新規なＦα生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび特徴付けの直接的および有利な成果として、エス・シアネオグリセウスの生物工学で設計された株を用いるモキシデクチンおよび他の重要なＬＬ−Ｆ２８２４９誘導体の直接的な発酵生成のためのユニークなプロセスが今や得られる。
【００２４】
本発明の一つの有利さは、エス・シアネオグリセウスの発酵ブロスからの高度に活性なＦαの産生を増強する能力である。 Ｃｏｓ１１は、ＰＫＳクラスター用の推定転写アクチベーター遺伝子（ＯＲＦ１）を含む。そのアクチベーターの発現レベルの増大の結果、Ｆαの高い収率を生じる。これは、公知の技術により遺伝子のコピー数を増加させるか、またはこの遺伝子につき調節配列エレメントを増強することにより達成される（例えば、Perez−Llarenaら, Journal of Bacteriology 179:2053−2059 （1997）参照）。
【００２５】
本発明の全生合成遺伝子クラスターを獲得することから由来する他の利益は、例えば、ＬＬ−Ｆ２８２４９α、ＬＬ−Ｆ２８２４９β、ＬＬ−Ｆ２８２４９γ、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α （モキシデクチン）、２３−（Ｏ−メチルオキシム）−５−（フェノキシアセトキシ）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α、２３−（セミカルバゾン）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α、２３−（チオセミカルバゾン）−ＬＬ−Ｆ２８２４９α等のごとき、ＬＬ−Ｆ２８２４９ファミリーの化合物の天然および半合成の誘導体の効率的な醗酵産生および製造を可能とすることである。ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物、望ましくは主要産物としてのそのＦα代謝産物の産生を担う蛋白質をコードする生合成遺伝子の同定を介して、その経路のさらなるクローニングおよび突然変異生成がその発酵プロセスの副生成物として他の代謝産物を容易に生成する。その生合成遺伝子は、特に、そのファミリーの他の半合成メンバーを調製する化学反応の工程数を最小化するのに有用である。
【００２６】
本発明の高度に好ましい有用性は、公知の化学プロセスを介して従前に行われたものより少ない工程で商業上重要な化合物のモキシデクチンの製造を含む。モキシデクチンは、現在は、まず、ストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナスの発酵により得られるＦαからの４工程の化学プロセスにより生成されている。その天然の代謝産物Ｆαのモキシデクチンへの変換は、以下の化学反応：（１） ５−ヒドロキシル基の保護；（２） ２３−ヒドロキシル基のケト官能への酸化；（３） ２３−ケトの２３−Ｏ−メチルオキシム基への変換；および（４）５−ヒドロキシル基の脱保護を含む。本発明の効率的な方法は、今や、単一工程で達成される２３ケトＦαのモキシデクチンへの化学変換を可能とする。
【００２７】
生合成遺伝子クラスターの変異体の生成によれば、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物構造の２３位のケト機能の還元を担う特定の活性が消失し、化学合成は１工程まで減少する。驚くべきことには、モジュラーポリケチド合成酵素の残留物は、機能性のままであり、そのポリケチド合成酵素の機能的な残留物は非天然のポリケチド中間体を認識する。次いで、そのユニークな生物工学の株は、２３−ケトＦαの直接的な発酵生成のために用い、クローニングし、再生し、さらに通常のプロセッシング時間を減少できる。
【００２８】
後記の例において、選択的な突然変異生成が、本方法に従い、Ｆα生合成を修飾し、所望の代謝産物を得る方法を示す。基本的には、エス・シアネオグリセウスＦα生合成遺伝子クラスターのモジュール３ケト還元酵素ドメインの変異体は、部位特異的な突然変異生成により生成される。これらのケト還元酵素変異体は、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの推定アミノ酸配列を多数の生物学的に活性なケト還元酵素ドメインおよびいくつかの「隠蔽（cryptic）」ケト還元酵素ドメインからのケト還元酵素ドメインと比較することにより設計される。次いで、エス・シアネオグリセウスＦα生合成遺伝子クラスターのモジュール３ケト還元酵素ドメインは、Ｆα生合成を変更し、所望の代謝産物を得るための相同性組換えによりこれらの変異体ドメインで置き換えられる。
【００２９】
一般的に言及すれば、その部位特異的な突然変異生成は、２３−ケト（オキソ）還元酵素遺伝子（２３−ＫＲ遺伝子）中の小さな欠失または点突然変異を導入して、２３−ケト還元酵素ドメインを非機能性とするが、それはポリケチド合成酵素の他のドメインの機能を保持する。２３−ＫＲ遺伝子中の突然変異は、標準的な方法により、野生型ストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナス株または変異株のＦα産生株１４２に導入され、その結果、２３−ケト（オキソ）Ｆαを直接的に発酵生成する。加えて、２３−ＫＲ遺伝子中の全ＦαＰＫＳ遺伝子クラスターを運ぶ突然変異は、エス・リビダンス（S. lividans）、エス・コエリコロル（S. coelicolor）、イー・コリ等のごとき適当な宿主細胞へ導入し、２３−ケトＦαを生成できる。形質転換した宿主細胞は、２３−ケトＦαのさらなる発酵生成のために本明細書に記載された方法を用いて、エス・シアネオグリセウスへの接合伝達のためのＤＮＡ源として用いられる。
【００３０】
次いで、２３−オキソ化合物のイミノ誘導体（２３−オキシム）は、S. M. McElvain, The Characterization of Organic Compounds, published by MacMillian Company, New York, 1953, pages 204−205（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された手順のごとき標準的な手法により容易に調製される。典型的には、酢酸および過剰な塩酸ヒドロキシルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩、塩酸セミカルバゾール等のごときアミノ誘導体化剤の存在下、等量の酢酸ナトリウムと共に、室温ないし約５０℃にて、２３−オキソ化合物メタノールまたはエタノールのごときアルコールあるいはジオキサン中で撹拌する。その反応は、通常、室温にて数時間ないし数日で完了するが、加熱により容易に急ぐこともできる。２３−ケトＦα化合物を介するモキシデクチンへのこの引き続いての変換は、驚くべきことにはかつ有益なことには、開始するための必要な化学反応だけである。
【００３１】
さらに、３種のコスミド、Ｃｏｓ１１、Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０内に含まれた遺伝子材料は、当業者に知られた遺伝子操作を介して２つのプラスミドまたは単一のプラスミドへフィットするように縮小することができると考えられる。例えば、本発明の方法により調製されたＣｏｓ１１、Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０内に存在するクローン化されたＦα生合成遺伝子を用いて、全ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）遺伝子クラスターを２つのプラスミドまたは単一プラスミド上に組み立てられるであろう。その組立は、クローニング、ＰＣＲまたは合成遺伝子、あるいはそれらの技術認識手法のいずれかの組合せの使用により達成できる。その組み立てられたＦαＰＫＳ遺伝子クラスターは、Ｆαを産生するためのエス・リビダンス、エス・コエリコロル、イー・コリ等のごとき適当な宿主細胞へ導入できる。従って、その組み立てられたＰＫＳ遺伝子クラスターを、例えば、Olsthoorn−Tielemanら, Eur. J. Biochem. 268:3807−3815 （2001）により記載された無細胞発現系のごとき無細胞発現系にて用いて、さらなる量のＦαおよび関連生成物を生成できる。
【００３２】
コアＬＬ−Ｆ２８２４９αポリケチド合成酵素のモジュラー機構およびそれらのモジュール内の機能的ドメインを用いて、本明細書に記載された生合成遺伝子クラスターはクローニングされ、十分に特徴付けされる。一般的には、生合成遺伝子の単離では、エス・シアネオグリセウスゲノムＤＮＡのコスミドライブラリーは、商業的に入手可能なベクターpSuperCos （Stratagene, La Jolla, CA）中で調製される。このコスミドライブラリーは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてエス・アベルミチリスゲノムＤＮＡから増幅されたアベルメクチン モジュール1 ケトアシル合成酵素に対応するＤＮＡの断片で探索される。続いて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて従前に特徴付けされたコスミドから増幅されたＦα生合成遺伝子クラスターのいくつかの領域をプローブとして用いて、さらなるコスミドを単離する。これらの方法を用いて、集合的に１００ＫｂｐのゲノムＤＮＡにわたる一連のコスミドを単離する。完全なエンドヌクレアーゼ制限酵素マッピングおよびヌクレオチドアラインメント分析を介して、コスミドを同定し、その結果、ほぼ８８ｋｂｐにわたる決定的で、明白な隣接ヌクレオチド配列を生じる。このヌクレオチド配列の分析は、Ｆαの生合成または生合成の調節に関与する少なくとも６種のさらなる遺伝子と一緒に、モジュラーポリケチド合成酵素の１３個の完全なモジュールの存在を明らかにする。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明の核酸分子を含有する生物学的に機能的なプラスミドまたはベクターを含む。本発明の特定のプラスミドは、大きなＤＮＡ遺伝子クラスターを組み込む能力につき選択されるが、それらは通常であり、商業的に入手可能なベクター、例えば、pKR0.9、pFDmod3/5.2 シリーズ、pFDmod3/4.2シリーズ等から誘導される。
【００３４】
イー・コリは例において異種宿主として用いるが、抗生物質生合成遺伝子の異種発現は、それらが本明細書に記載された比較的大きなプラスミド構築体で形質転換できる限りは、幅広い数のアクチノマイセターレス、バシラス、コリネバクテリア、テルモアクチノマイセス等で期待される。形質転換されるものには、限定されるものではないが、比較的非制限であることが知られているストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）およびストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）が含まれる。好ましくは、プラスミドまたはベクターにより安定的に形質転換またはトランスフェクトされる適当な宿主細胞は、ストレプトマイセス・コエリコロルまたは大腸菌−ストレプトマイセス・コスミド・ビヒクルである。その蛋白質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現は、所望ならば、標準的な技術方法を用いて行うことができる。
【００３５】
以下のセクションは、本発明の全ての大きな生合成経路を順調にクローニングし、特徴付けするために用いた当業者に有用な一般的な方法および材料を強調する。
【００３６】
一般的な方法および材料
Ａ．材料、プラスミドおよび菌株
アプラマイシン、pKC1132で選択するための抗生物質耐性マーカーを含めたイー・コリおよびストレプトマイセス中で複製および選択するのに必要なエレメントを含むイー・コリ−ストレプトマイセスシャトルベクターをこの仕事を通して用いる（Biermanら, Gene 116:43−49 （1992）参照）。pKC1132に加えて、商業的に入手可能なクローニングベクターを本明細書に示すごとく用いる。当業者は、標準的な技術を用いて、例示されたベクターに代えて容易に置換できる他のよく知られたクローニングベクターを選択でき、古くからある株のコスミドを宿すイー・コリで遭遇した不安定性問題を回避または最小化できるであろう。
【００３７】
プラスミドＤＮＡは、他のプラスミドに対する研究により確立されたものと類似する手順を用いて操作できる。典型的な手順は、Sambrookら, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に示されている。ストレプトマイセスについての典型的な手順は、D. A. Hopwoodら, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation Press, Norwich, UK （1985）に示されている。この仕事において用いた特定の方法は、上記に引用した実験マニュアルに示された方法と同一でない場合には、本明細書に記載される。
【００３８】
この仕事を通して用いた一般的な実験株のイー・コリ JM109およびDH5αは、多数の商業源から容易に入手可能である（例えば、Stratagene, La Jolla, CA）。イー・コリ XL1−Blue MRF'株はStratagene （La Jolla, CA）から得られる。イー・コリ ETS12567 （pUZ8002）は、 ワシントン大学の化学部門（Seattle, WA）のHeinz Floss教授から得られる。イー・コリ VCS257は、Stratagene （La Jolla, CA）から得られる。エス・アベルミチリスは、ＡＴＣＣ寄託受付番号第３１,２６７号下、American Type Culture Collectionから得られるが、ＮＲＲＬ８１６５下、Agricultural Research Culture Collection （NRRL）, 1815 N. University Street, Peoria, IL 61604からも得られる。「野生型」ストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナス ＬＬ−Ｆ２８２４９ （NRRL 15773）および「エス・シアネオグリセウス株142」と指定されたエス・シアネオグリセウス変異株Ｆα産生株は、本発明の開示を通して別々に用いるが、それらは置き換え可能であり、開示されたいずれかの所与の工程において相互に置換可能である。野性型株から誘導された株１４２は、古典的な遺伝子操作を受けて、抗生物質産生を増強するが、それは野生型株と同一のポリケチド合成酵素ＤＮＡ配列を保持する。それらのポリケチド合成酵素配列を同定するために、限定されるものではないが、Ｃｏｓ１１、Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０を含めた本明細書に記載された全てのプラスミドを同一の結果を持つ野生型ストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナスまたはエス・シアネオグリセウス株１４２から誘導できる。
【００３９】
Ｂ．プラスミドＤＮＡの制限分析
プラスミドＤＮＡの制限分析用の手順、アガロースゲル電気泳動用の手順および組換えＤＮＡ技術の他の標準的な手法は、Sambrookら, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に記載されている。プラスミドＤＮＡは、製造者の手順に従い制限エンドヌクレアーゼで消化される。酵素は、New England Biolabs （Beverly, MA）、Life Technologies （Rockville, MD）またはPromega （Madison, WI）から得られる。制限消化は、緩衝液としての４０ｍＭトリス−酢酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡを用いる０.８％w/vアガロース中の電気泳動により分析される。その断片のサイズは、公知の分子量のＤＮＡ断片（１Ｋｂラダー, Life Technologies, Rockville, MD）に比較することにより決定される。
【００４０】
Ｃ．ハイブリダイゼーション・プローブの調製
ハイブリダイゼーション・プローブは、本明細書に記載のごとく、以下の制限消化に続いてプラスミドから単離されるか、またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成される。プローブは、その製造者により提供された手順に従い、New England Nuclear （Boston, MA）からのEasyTidesTM α32P−dCTP （3000 Ci/ミリモル）およびAmersham Pharmacia Biotech （Piscataway, NJ）からのrediprimeTM IIランダムプライム標識システムを用いて高い比放射能で放射標識される。
【００４１】
ハイブリダイゼーション・プローブを用いて、（エス・シアネオグリセウス株１４２および野生型エス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーの双方から）Ｆα生合成遺伝子クラスターを含有するコスミドを同定し、トランス接合個体（transconjugant）およびイクシザント（excisant）を確認および特徴付けし、次いで、遺伝子の同定を確認するＦα生合成遺伝子クラスターの正確な制限酵素地図の作製を促す。これらのハイブリダイゼーション・プローブは、ＰＣＲ増幅により生成されるか、あるいはそのプローブを以下の表１にまとめたクローンから切り取られるのいずれかである。
【００４２】
【表１】
2004337169.tif 000002
【００４３】
プラスミドの単離、維持および増殖
Ａ．プラスミド単離
本明細書に記載されたベクターで形質転換されていないイー・コリ株および形質転換されているイー・コリ株の双方をSambrookら, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に記載されたものと類似する良好に確立された方法を用いて増殖させる。
【００４４】
プラスミドＤＮＡをQIAGEN （Valencia, CA）から得られた試薬および材料を用いてイー・コリ 培養物から単離する。分析される株数に依存して、用いたミニプレップ・プラスミド単離システムには、（比較的少数の株からのプラスミド単離用の）QIAprepＲ Spin Miniprep Kits；（いくらか多数の株からの高処理量プラスミド単離用の）QIAprepＲ 8 Turbo Miniprep Kits；または（９６ウェルブロック中の株からのプラスミドの部分的自動化単離用の）QIAprepＲ 96 Turbo Miniprep Kitsが含まれた。イー・コリからのより多量のプラスミドＤＮＡの単離では、QIAGEN Plasmid Midi （１００μｇまで）およびMaxi （500μｇまで）キットに含まれた試薬および材料、あるいはClontech （Palo Alto, CA）からのNucleobond AX−１００ （１００μｇまで）キットに含まれた試薬および材料を用いる。
【００４５】
Ｂ．プラスミドＤＮＡによる大腸菌の形質転換
プラスミドＤＮＡを、Sambrookら, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に記載されたものと類似する良好に確立された手順を用いて、エレクトロポレーションにより電気成分（electrocompetent）イー・コリへ、あるいは熱ショックにより化学的に成分イー・コリ株に形質転換する。形質転換体は、再度、Sambrookら, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に記載された良好に確立された方法を用いて、適当な抗生物質を用いて選択され、プラスミドが本明細書に記載された方法を用いて単離した後、それらを制限エンドヌクレアーゼでの消化に続いて、特徴付けする。
【００４６】
Ｃ．大腸菌からストレプトマイセス・シアネオグリセウスへのプラスミドＤＮＡの接合伝達
全ての場合に、注目するプラスミドを、まず、本明細書に記載されたエレクトロポーレーションによりETS12567 （pUZ8002）と指定されたイー・コリ株に形質転換する。この株は、cmｒ、tetｒ、dam−およびdcm−である。さらに、oriT−バージョンのプラスミドpRK2であるpUZ8002（R. Meyerら, Science 190:1226−1228 （1975）参照）はkanrを与える。形質転換された細胞を、5μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１００μｇ／ｍｌアプラマイシンを含めた適当な抗生物質選択の存在下に維持する。イー・コリ形質転換体からエス・シアネオグリセウスへのプラスミドＤＮＡの接合伝達は、以下の手順を用いて達成され、その双方の手順は、M. Biermanら, Gene 116: 43−49 （1992）により記載された手順から修飾されている。
【００４７】
コンジューゲーション方法１：５μｇ／ｍｌカナマイシン、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアプラマイシンで補足された３ｍｌ ＬＢ培地を単一の確立された形質転換されたイー・コリコロニーで接種し、培養物を２２０ｒｐｍで浸透しつつ３７℃で１６時間インキュベートする。１０ｍｌＴＳＢ （２７.５ｇ／Ｌ トリプシンソイブロス（tryptic soy broth）、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.０、１００ｍｌ／Ｌのオートクレーブ後に添加した２０％（ｗ／ｖ）グルコースの滅菌溶液）培地をエス・シアネオグリセウス菌糸体断片の１００μｌの凍結ストックで接種し、培養物を２２０ｒｐｍで浸透しつつ３１℃で１６時間インキュベートする。翌日、５０μｇ／ｍｌ アプラマイシンを補足した１０ｍｌ ＬＢ培地を一晩のイー・コリ培養物の１００μｌアリコートで接種する。同時に、エス・シアネオグリセウスの一晩の培養物の２ｍｌアリコートを滅菌ガラスビーズを含む試験管中で２分間ボルテックスする。その懸濁液を音波処理（３×、１００％出力にて５分間のバースト）し；菌糸体断片のこの懸濁液の１ｍｌを９ｍｌのＴＳＢ （２７.５ｇ／Ｌトリプシンソイブロス、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.０、１００ｍｌ／Ｌ オートクレーブ後に添加した２０％（ｗ／ｖ）グルコースの滅菌溶液）に移す。双方の培養物が、そのイー・コリ培養物の６００ｎｍでの吸光度が０.４〜０.６に達するまで、２２０ｒｐｍで振盪させつつ３７℃にてインキュベートする。各培養物中の細胞を遠心により採取し、ＬＢで２×洗浄し、次いで、５００μｌ 2XYT（16ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０）中に懸濁させる。２つつの調製物のアリコート（１００μｌ）を合わせ；その混合物を５０℃にて５分間インキュベートし；次いで、その細胞を遠心により採取する。その上清を除去し、細胞ペレットを１００ｍｌの2XYT （１６ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０）に懸濁させ、SFM （２５ｇ／Ｌ 大豆粉ニュトリソイ（soybean flour nutrisoy）、２５ｇ／Ｌ マンニトール、２０ｇ／Ｌ 寒天、０.４６２ｇ／Ｌ Ｌ−システイン、０.４６２ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.４６２ｇ／Ｌ Ｌ−プロリン）プレートに蒔く。これらのプレートを３７℃にて１６時間インキュベートし、次いで、０.５ｍｇのナリジクス酸および１ｍｇのアプラマイシン（各々、最終濃度  ２０μｇ／ｍｌおよび４０μｇ／ｍｌ）を含有する１ｍｌの滅菌水で過負荷する。そのプレートは、コロニーが良好に確立されるまで３７℃にてインキュベートする。
【００４８】
コンジュゲーション方法２：５μｇ／ｍｌカナマイシン、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌアプラマイシンで補足された３ｍｌ ＬＢ培地を単一の良好に確立された形質転換されたイー・コリコロニーで接種し、培養物を２２０ｒｐｍで浸透しつつ３７℃で１６時間インキュベートする。２５ｍｌＫＢ３培地（１０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１.５ｇ／Ｌ Difco 寒天、ｐＨ６.８、および ３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する０.５ｍｌ／Ｌの微量元素溶液）をエス・シアネオグリセウス菌糸体断片の１ｍｌの凍結ストックで接種し、培養物を２２０ｒｐｍで浸透しつつ３１℃で１６時間インキュベートする。翌日、５０μｇ／ｍｌ アプラマイシンを補足した９ｍｌのＬＢ培地を１ｍｌの一晩のイー・コリ培養物と合わせる。同時に、エス・シアネオグリセウスの一晩の培養物の５ｍｌアリコートを滅菌ガラスビーズを含む試験管中で２分間ボルテックスする。そのホモジナイズした培養物の２.５ｍｌのアリコートを２５ｍｌのＫＢ３培地（１０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１.５ｇ／Ｌ Difco寒天、ｐＨ６.８、および３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する０.５ｍｌ／Ｌの微量元素溶液）に接種し、双方の培養物を３７℃にて３時間インキュベートする。各培養物中および細胞を遠心により採取し、ＬＢで２×洗浄する。イー・コリおよびエス・シアネオグリセウス細胞ペレットを各々、１ｍｌおよび２ｍｌのＴＳＢ（２７.５ｇ／Ｌトリプシンソイブロス、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.０、１００ｍｌ／Ｌのオートクレーブ後に添加した２０％（ｗ／ｖ）グルコースの滅菌溶液）に懸濁する。１０μｌのエス・シアネオグリセウス懸濁液および１００μｌのイー・コリ懸濁液を８９０ｍｌのＴＳＢ（２７.５ｇ／Ｌトリプシンソイブロス、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.０、１００ｍｌ／Ｌのオートクレーブ後に添加した２０％（ｗ／ｖ）グルコースの滅菌溶液）と合わせ、１００μｌの混合物を10ｍＭ MgCl2で補足した１０ｍＭ ＡＳ−１プレート（1ｇ／Ｌ 酵母エキス、０.２ｇ／Ｌ Ｌ−アラニン、0.2ｇ／Ｌ Ｌ−アルギニン、０.５ｇ／Ｌ Ｌ−アスパラギン、５ｇ／Ｌ 可溶性デンプン、2.５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ Ｎａ2ＳＯ4、２０ｇ／Ｌ 寒天、ｐＨ７.５）に蒔く。これらのプレートを３７℃にて１６時間インキュベートし、次いで、３ｍｌのＲ２寒天（１００ｇ／Ｌ スクロース、１０ｇ／Ｌ グルコース、１０ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ2、０.２５ｇ／Ｌ Ｋ2ＳＯ4、0.1ｇ／Ｌ カザミノ酸、２５ｇ／Ｌ 寒天）を過負荷する。用時に、以下の溶液をＲ２寒天：1ｍｌの０.５％ Ｋ２ＨＰＯ４；８ｍｌの３.６８％ ＣａＣｌ２.２Ｈ２Ｏ；１.５ｍｌの20% Ｌ−プロリン；１０ｍｌの５.７３％ TES、ｐＨ７.２；０.５ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨ；および４０ｍｇ��Ｌ  ＺｎＣｌ2、２００ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ3.６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２.２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ2.４Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７.１０Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24.４Ｈ２Ｏを含有する１ｍｌの微量元素溶液）の各８０ｍｌフラスコに添加する。また、その溶液を１００μｇ／ｍｌアプラマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのナリジクス酸（最終濃度）まで補足する。そのプレートは、コロニーが良好に確立されるまで３７℃にてインキュベートする。
【００４９】
いずれかの方法を用いて、推定トランス接合個体を、プラスミド源として用いたイー・コリ株による可視的な混入が直るまで１００μｇ／ｍｌアプラマイシンおよび１００μｇ／ｍｌのナリジクス酸の存在下で新たなプレート上で各々選定する。
【００５０】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物の産生についての完全な生合成経路をコードするストレプトマイセス・シアネオグリセウス亜種ノンシアノジーナスから誘導された精製されたＤＮＡは、American Type Culture Collection （ATCC）, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110−2209, U.S.Aにおいて、37 C.F.R. § 1.808により命じられた条件下の本願特許出願と連結して寄託され、ブタペスト条約に従って維持されている。より詳細には、本明細書に十分記載され、かつＣｏｓ１１、Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０として同定される精製されたコスミドＤＮＡを、ＡＴＣＣに２００２年５月２４日に寄託され、各々、ＡＴＣＣ特許寄託識別番号ＰＴＡ−４３９２、ＰＴＡ−４３９３およびＰＴＡ−４３９４と指定された。部位特異的な突然変異生成および本明細書に記載された方法を用いて容易に構築できる関連する精製されたＤＮＡ、関連するヌクレオチド配列を含む他のコスミドまたはプラスミドも本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。
【００５１】
以下の実施例は、本発明のある種の態様を示す。しかしながら、これらの実施例は単に例示であり、本発明の条件および範囲に関して全てが確定的であることを意図しないと理解されるべきである。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が与えられた場合に、その特定の範囲の上下の双方の条件を一般的に少ない利便性であるが用いることができる。その実施例は、室温（約２３℃ないし約２８℃）、および雰囲気圧にて行なわれる。本明細書に参照された全ての割合およびパーセントは重量ベースであり、全温度は特記しない限りは摂氏温度で表される。
【００５２】
本発明のさらなる理解は、以下の非限定例から得られる。
【実施例１】
【００５３】
ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を作成するための生合成遺伝子クラスターの特徴付け
Ａ．Ｆα生合成遺伝子クラスターを含有するコスミドの単離および特徴付け
１．ストレプトマイセス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーの構築
ゲノムＤＮＡをD. A. Hopwoodら, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation Press, Norwich, UK （1985） （「Isolation of Streptomyces 「Total」 DNA: Procedure 3）に示された方法を用いてエス・シアネオグリセウス（野生型および１４２と指定されたＦα産生株）から単離する。そのエス・シアネオグリセウスのゲノムＤＮＡ調製物を以下のごとく、Sau3AIでの部分的な制限酵素エンドヌクレアーゼ消化に付した。Sau3AIおよびゲノムＤＮＡを含有する反応混合物を調製し、（０、５、１０、１５、２０、３０および４５分間の）時点にて、アリコートを取り出し、反応物を最終濃度が１０ｍＭのＥＤＴＡの添加によりクエンチした。各クエンチした各反応時点の一部を、０.３％ ｗ／ｖアガロースを介する電気泳動により２５ボルトにて１６時間分離した。優勢に２３Ｋｂｐおよび５０Ｋｂｐの間にあるＤＮＡ断片を含有する反応時点をコスミドライブラリーについて選択した。同時に、pSuperCos 1 （Stratagene, La Jolla, CA）を制限エンドヌクレアーゼXbaIで消化し；ウシ小腸アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し；次いで、エタノール沈殿後に、その直線ベクターを一つのCosサイトを取り出すために制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化した。エス・シアネオグリセウスゲノムＤＮＡのそのSau3AI断片を、製造者により提供された手順に従い直線化したBamHIで処理したpSuperCos 1に連結した。得られた組換えコスミドＤＮＡ調製物をGigapackＲ III XL Packaging Extractを用いて詰め、得られたラムダファージ粒子のクロロホルムでの溶解後、そのコスミドＤＮＡライブラリーをイー・コリ VCS257に形質転換させた。これらの操作は、製造者（Stratagene, La Jolla, CA）により提供された試薬、材料および手順を用いて全て行った。
【００５４】
２．Ｆα生合成遺伝子クラスターを含有するコスミドの単離
ゲノムＤＮＡをD. A. Hopwoodら, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation Press, Norwich, UK （1985） （「Isolation of Streptomyces 「Total」 DNA: Procedure 3）に示された方法を用いてエス・アベルミチリスから単離した。このゲノムＤＮＡ調製物をポリメラーゼ連鎖反応を用いるアベルメクチンの生合成遺伝子クラスターのモジュール１ケトアシル合成酵素ドメインの領域の増幅のためのテンプレートとして用いた。用いたオリゴヌクレオチドプライマーを公的なデータベースへ寄託されたアベルメクチン生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列に基づき設計した。エス・シアネオグリセウス株１４２コスミドライブラリーのコロニーリフト（lifts）をアベルメクチン ケトアシル合成酵素プローブに対するハイブリダイゼーションにつきスクリーニングし、より詳細には、Ｉ型ポリケチド合成酵素ＤＮＡを潜在的に含有する３０種を超えるコスミドを単離した。最初に、これらのコスミドをBamHIでの消化に続いて、アガロースゲル電気泳動、アベルメクチンモジュール1 ケトアシル合成酵素プローブを用いたサザンブロット、および限定されたヌクレオチド分析により分析した。MacNeilおよび共同研究者（D. J. MacNeilら, Gene 115:119−125 （1992）およびD. J. MacNeilら, Annals of the New York Academy of Sciences 721:1２３−132 （1994）参照）により報告されたデータに対するこれらのデータの比較は、これらのコスミドのうちの２つは、大部分のＦα生合成遺伝子クラスターにわたるようであることを示唆した。また、MacNeilおよび彼の共同研究者により示された限定的なデータは、大部分のモジュール３を含むこの５.７Ｋｂｐ NotI−EcoRIの断片の単離を支持するために初期のベースとして用いた。この5.7Ｋｂｐ NotI−EcoR断片の（pNE57と指定された）クローンを調製した。この５.７Ｋｂｐ断片のヌクレオチド配列をその全体において決定した。次いで、（Ｆα産生株から単離されたゲノムＤＮＡからの）Ｆα生合成遺伝子クラスターのこの断片を野生型エス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーでスクリーニングするためのプローブとして用い、Ｉ型ポリケチド合成酵素ＤＮＡを潜在的に含有する４５個のコスミドを単離した。これらのコスミドは、本明細書に記載された方法を用いて、BamHI, NotIおよびEcoRIで広範囲にマッピングし、MacNeilおよび彼の共同研究者により示された不完全なデータに対するこれらの制限酵素地図の比較に基づいて、主要なＦα生合成遺伝子クラスターにわたるようである（野生型株からのＣｏｓ３６およびＣｏｓ４０と指定された）２つのコスミドを同定した。
【００５５】
Ｆα生合成遺伝子クラスターの「末端」にわたるが、コアポリケチド合成酵素ＤＮＡの重要なストレッチを含有しないコスミドを同定するために、以下の戦略を使用した。（エス・シアネオグリセウス株１４２からの）Ｃｏｓ１１から単離された５.５Ｋｂｐ BamHI断片を用いて、そのクラスターを「左」に伸長するであろうさらなるコスミドを同定するために従前に選択された野生型エス・シアネオグリセウス・コスミドを再探索した。そのプローブにハイブリダイズした多数のコスミドを同定し、制限酵素マッピング後、これらのうちの１つの、左に最も遠くクラスターを伸長するのを支持するであろうCos14を同定した。Ｃｏｓ３６の３’末端から単離された５００ｂｐ NotI断片を用いて、「右」へクラスターが伸びるであろうさらなるコスミドを同定するために野生型エス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーを再探索した。そのプローブにハイブリダイズした多数のコスミドを同定し、制限酵素マッピング後、これらのうちの１つの、「右」に最も遠くクラスターを伸長するのを支持するであろうＣｏｓ５０を同定した。
【００５６】
３．Ｆα生合成遺伝子クラスターを含有する制限酵素マッピングコスミド
最初に、アベルメクチン ケトアシル合成酵素プローブにハイブリダイズするエス・シアネオグリセウス株１４２コスミドライブラリーからの３０を超えるコスミド、およびＦα モジュール３プローブ（pNE57）にハイブリダイズする野生型エス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーからの４５個のコスミドをBamHI、NotIおよびEcoRIでの消化に続いてマッピングした。この予備的分析に基づき、かつMacNeilおよび彼の共同研究者により示された不完全なデータ（D. J. MacNeilら, Gene 115:119−125 （1992） and D. J. MacNeilら, Annals of the New York Academy of Sciences 721:1２３−132 （1994）参照）に対するその制限酵素地図の比較に基づいて、いくらかのコスミドをより包括的な分析のために選択した。（エス・シアネオグリセウス株１４２からＣｏｓ７およびＣｏｓ１１と指定；および野生型エス・シアネオグリセウスからＣｏｓ１２、Ｃｏｓ１４、Ｃｏｓ３６、Ｃｏｓ４０およびＣｏｓ５０と指定された）これらのコスミドをBamHI、NotIおよびEcoRIでの消化、およびBamHI/MluI、NotI/EcoRI、BamHI/EcoRI、SacI/EcoRIおよびNotI/MluIでのダブル消化に続いて注意深くマッピングした。観察された制限酵素地図における曖昧さを解消するために、これらコスミドのサブクローンを以下の表２にまとめ、これらのサブクローンを後記のごとく広範囲にマッピングした。
【００５７】
【表２】
2004337169.tif 000003
【００５８】
Ｂ．Ｆα生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列
１．シークエンシングの戦略
圧倒的に大部分のヌクレオチド配列データは、本明細書に記載されたごとく調製されたコスミドＤＮＡの末端−シークエンシングランダムの、サイズ選択されたサブライブラリーにより得られた。ランダムサブライブラリーを、十分な被覆（８〜１０％重複性（redundancy））がＤＮＡの全断片にわたり存在するまで、配列決定した。ランダムサブライブラリーにおいて不十分に表示されたか、または他の理由で配列決定が難しい生合成遺伝子クラスターの領域についてのヌクレオチド配列を得るために、２つの他のシークエンシングの戦略を用いた。最初に、生成物を遺伝子クラスターの注目する領域にわたるようにポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成した。これらのＰＣＲ産物は、シークエンシングプライマーとしてＰＣＲプライマーを用いて直接的に配列決定するか、あるいはその産物を商業的に入手可能なＰＣＲ産物クローニングベクターpTOPO TA （Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングし、次いで、ユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。別法として、コスミドまたはコスミドから調製されたサブクローンの注目する領域を介する「ウォーキング（walking）」によりヌクレオチド配列を得るのを促すシークエンシングプライマーを合成した。全体的に、ヌクレオチド配列を製造者（Applied Biosystems, a Division of Perkin Elmer, Foster City, CA）により提供された詳細な手順に従うABI PRISMＲ BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionの試薬および材料を用いて、Applied Biosystems Model 377 Automated シークエンサーで得た。ヌクレオチド配列データを標準的な「収集」および「シークエンシング分析」アルゴリズム（Applied Biosystems, Perkin Elmer部門, Foster City, CA）を用いて収集および分析した。ヌクレオチド配列組立ては、DNASTAR （Madison, WI）から商業的に入手可能であるSeqManTM II配列分析パッケージを用いて、かつGeospiza （Seattle, WA）により発明者らのために開発されたカスタムFinchTM−300 Assembly Serverを用いて生成した。
【００５９】
Ｆα生合成遺伝子クラスターの大部分にわたる広範囲の制限酵素マッピングに基づいて表された（Ｃｏｓ３６およびＣｏｓ４０と指定された）２つのコスミドを野生型エス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーから単離した。これらのコスミドを本明細書に記載のごとく調製された末端−シークエンシングランダムのサイズ選択されたサブライブラリーによりそれらの全体において配列決定した。加えて、いくつかのサブクローンから調製されたランダムのサイズ選択されたサブライブラリー（以下の表３にまとめた）も配列決定した。最後に、Ｆα生合成遺伝子クラスターの包括的な制限酵素マッピングを支持するために生成された大部分のサブクローンをユニバーサルプライマーを用いて末端を配列決定した。
【００６０】
【表３】
2004337169.tif 000004
【００６１】
２．ヌクレオチドアラインメント分析のためのサブライブラリーの構築
コスミドおよびそれらのコスミドから誘導されたサブクローン中に存在する大量のインサートを生成するために、大量のプラスミドＤＮＡを必要とした。培地（典型的には、１Ｌ）を注目するクローンで接種し、次いで、３７℃にて一晩インキュベートした。プラスミド（コスミド）ＤＮＡをQIAGEN Plasmid Midi （１００μｇまで）およびMaxi （５００μｇまで）キットに含まれた材料および試薬、あるいはClontech （Palo Alto, CA）からのNucleobond AX−１００ （１００μｇまで）キットに含まれた試薬および材料を用いてこれらの培養物から単離した。これらのプラスミド（コスミド）に存在するインサートを適当な制限エンドヌクレアーゼで消化することにより切り取り、その断片を０.８％ ｗ／ｖ アガロースを介する電気泳動により分離した。その所望の断片をこれらのゲルから切り取り、次いで、これらのバンド中に含有したＤＮＡを、QIAGEN （Valencia, CA）からの（１０ｋｂｐを超える断片用の）QIAEX IIＲまたは（１０ｋｂｐ未満の断片用の）QIAquick II Gel Extraction Systemsに含まれた試薬、材料および手順を用いて単離した。次いで、そのＤＮＡを１０％出力のMicroson細胞攪乱器（cell disruptor）を用いて音波処理してランダムに剪断した。音波処理時間は、所望のサイズの断片を生成するために最適化された（典型的には、コスミドから単離した大きなインサートでは約１８秒、これらのコスミドのプラスミドサブクローンから単離した小さな断片では約８秒）。エタノール沈殿後、そのＤＮＡ断片を2.5μｌの１０×  Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液、１μｌの２５μｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび1.5μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを含有する２５μｌの反応容積中のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いて「鈍く（blunted）」した。反応混合物を１６℃にて２０分間インキュベートし、０.８％w/vアガロースを介する電気泳動により分離した。（公知の分子量のＤＮＡ断片に対する比較による）１.５Ｋｂｐおよび２.５Ｋｂｐ間のＤＮＡを含有するゲルの領域を切り取り、そのＤＮＡをQIAGEN （Valencia, CA）からのQIAquick II Gel Extraction Systemに含まれた試薬、材料および手順を用いてアガロースから抽出した。精製されたＤＮＡをエタノール沈殿により採取し、次いで８μｌの水に再懸濁した。次いで、これらのＤＮＡ断片をpCRＲ−Bluntにクローニングし、その連結生成物を製造者（Invitrogen, Carlsbad, CA）により提供された試薬、材料および手順を用いて化学的に形質転換受容性のイー・コリ TOP10に形質転換した。コロニーを選定し、それを用いて、９６ウェルの深いウェルブロック中の５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補足した２ｍｌのＬＢ培地を接種した。プラスミドＤＮＡをQIAprepＲ 96 Turbo Miniprep Kitsに含まれた試薬、材料および手順を用いてこれらの各培養物から精製した。インサートを持つクローンの頻度は９０％を超えたが、所望のサイズのインサートが存在するかを決定するために各プラスミドをEcoRIで消化し、次いで、その断片を０.８％ ｗ／ｖアガロースを介する電気泳動により分離した。所望のインサートを含有したクローンを本明細書に記載されたユニバーサルプライマーを用いて配列決定した。
【００６２】
３．生合成モジュールおよびモジュール内ドメインの同定
多数のモジュラーポリケチド生合成遺伝子クラスターを特徴付けし、操作した。加えて、多数のモジュラーポリケチド生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列を公的データベースに寄託した。一般的には、モジュラーポリケチド生合成遺伝子クラスターのモジュールおよびこれらのモジュール内ドメインは、公的データベースに対するＢＬＡＳＴ検索を行うことにより同定でき、それらの公的データベースの広範な使用は、Ｆα生合成遺伝子クラスターの本分析を促すようになされた（S. F. Altschulら, Nucleic Acids Research 25:3389−3402 （1997）参照）。加えて、モジュラーポリケチド合成酵素ドメインの同定のための方法を要約した、特に、メチルマロニル−クラスアシル基転移酵素ドメインからのマロニルクラスの区分を記載する最近の文献の使用を使用した（S. J. Kakavasら, Journal of Bacteriology 179:7515−7522 （1997））。Leadlayおよび共同研究者は、メチルマロニル−クラスアシルトランスゲラーゼドメインからのマロニルクラスの分化についての方法を最初に記載した（T. Schweckeら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92:7839−7843 （1995）参照）。
【００６３】
ポリケチド合成酵素のローディング・ドメインおよび１３個のモジュールを一緒にコード化する５つのオープン・リーディング・フレームの記載は、以下の表４に示す。各オープン・リーディング・フレームについて、（ヌクレオチド内の）Ｆα生合成遺伝子クラスター中の位置、および予測遺伝子産物の（アミノ酸内の）長さを示した。加えて、（再度、アミノ酸における）その予測遺伝子産物内の各生合成ドメインの適当な位置も示した。用いた略語は以下の通りである：ＡＣＰ、アシル担体蛋白質；ＡＴｍ、マロニル−クラスのアシル基転移酵素；ＡＴｍｍ、メチルマロニルクラスのアシル基転移酵素；ＤＨ、脱水酵素；ＥＲ、エノイル還元酵素；ＫＲ、ケト還元酵素；ＫＳ、ケトアシル合成酵素；ＬＤ、ローディング・ドメイン；ＴＥ、チオエステラーゼ。
【００６４】
【表４】
2004337169.tif 000005
【００６５】
４．他の生合成経路遺伝子の同定
コアモジュラーポリケチド合成酵素遺伝子でクラスター形成することが判明した他のオープン・リーディング・フレームが、Ｆα生合成において役割を演じたかどうか、そうでなるならば、いかなる役割が、公的なデータベースクラスター中で寄託された配列に対してこれらのオープン・リーディング・フレームのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列のＢＬＡＳＴ比較に基づき得たか（S. F. Altschulら, Nucleic Acids Research 25:3389−3402 （1997）参照）。それらの方法を用いて、Ｆα生合成に関与できる少なくとも６個の他の遺伝子の仮の同定がなされた。
【００６６】
Ｆα生合成に関与できる遺伝子をコード化する６個のさらなるオープン・リーディング・フレームの記載を以下の表５に示した。各オープン・リーディング・フレームについて、推定遺伝子産物の（ヌクレオチドにおける）Ｆα生合成遺伝子クラスターの位置および（アミノ酸における）長さを示した。加えて、Ｆα生合成における予測された機能性の役割を指定するのに用いたＢＬＡＳＴ結果の簡単な記載も、各オープン・リーディング・フレームについてここに含まれる。
【００６７】
【表５】
2004337169.tif 000006
【００６８】
ＯＲＦＡ及びＯＲＦＢ: ＢＬＡＳＴ結果は、各々、ＯＲＦＡ及びＯＲＦＢ間のかなりの相同性ならびにK+−転位ATPaseサブユニットＢおよびＡ、特に、マイコバクテリウム・チュベルクロシス（Mycobacterium tuberculosis）遺伝子（そのヌクレオチド配列は公的データベースに直接提出された）を示す。これらの遺伝子は、Ｆα生合成遺伝子クラスターに関連しない。
【００６９】
ＯＲＦ１: ＢＬＡＳＴ結果は、ヌクレオチドレベルにて、ＯＲＦ１がエス・ベネズエラエ（S. venezuelae）（Y. Xueら, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95:12111−12116 （1998）参照）からのマクロライド生合成遺伝子クラスターのpikCDオペロン中の推定転写アクチベーター、およびラパマイシン産生微生物エス・ヒグロスコピカス（S. hygroscopicus）（X. Ruanら, Gene 203: 1−9 （1997）参照）からのＩ型ポリケチド合成酵素生合成遺伝子クラスター内の推定調節蛋白質に関連することを示唆する。その予測アミノ酸配列レベルにて、遺伝子産物は、イー・コリ narL遺伝子産物に関連する仮定上の転写アクチベーターのファミリーに限定的な相同性を示す。これらのＢＬＡＳＴ結果に基づき、ＯＲＦ１は、転写アクチベーターをコードするようである。
【００７０】
ＯＲＦ２: ＢＬＡＳＴ結果は、アミコラトプシス・メディテラネイ（Amycolatopsis mediterranei）リファマイシン生合成遺伝子クラスター（P. R. Augustら, Chemistry & Biology 5:69−79 （1998）参照）およびエス・グリセウス（S. griseus）カンジシジン（candicidin）生合成遺伝子クラスター（L. M. Criadoら, Gene 126:135−139 （1993）参照）におけるチオエステラーゼを含めたヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列レベルの双方でのＯＲＦ２およびチオエステラーゼの間のかなりの相同性を明らかにする。これらのＢＬＡＳＴ結果に基づき、ＯＲＦ２は、チオエステラーゼをコードするようである。
【００７１】
ＯＲＦ３: ＢＬＡＳＴ結果の分析は、エス・シアノジーナス（S. cyanogenus） S136 ランドマイシン（landomycin）生合成遺伝子クラスター（L. Westrichら, FEMS Microbiological Letters 170:381−387 （1999）参照）における還元酵素に相同性であることを示唆する。予測アミノ酸配列レベルにて、ＢＬＡＳＴ結果は、ＯＲＦ３遺伝子産物、およびアスペルギラス・パラシチカス（Aspergillus parasiticus）アフロトキシン（aflatoxin）生合成経路（C. D. Skoryら, Applied and Environmental Microbiology 58:3527−3537 （1992）参照）におけるバーシドロインＡ（versicolorin A）のステリグマトシスチン（sterigmatocystin）への変換を担うオキシド還元酵素間の相同性を明らかにする。これらのＢＬＡＳＴ結果に基づき、ＯＲＦ３は、還元酵素をコードするようである。
【００７２】
ＯＲＦ７: ＢＬＡＳＴ結果は、エス・ラベンデュラエ（S. lavendulae）マイトマイシンＣ生合成遺伝子クラスター（Y. Q. Maoら, Chemistry & Biology 6:251−263 （1999）参照）およびサッカロポリスポラエ・エリトラエ（Saccharopolyspora erythraea）エリストマイシン生合成遺伝子クラスター（S. F. Haydockら, Molecular and General Genetics 230:120−128 （1991）参照）におけるメチル基転移酵素を含めたヌクレオチドレベルでのＯＲＦ７およびメチル基転移酵素の間のかなりの相同性を明らかにする。これらのＢＬＡＳＴ結果に基づき、ＯＲＦ７は、メチル基転移酵素をコードするようである。
【００７３】
ＯＲＦ８: ＢＬＡＳＴ結果は、エス・ロセオフルビウス（S. roseofulvus）フレノリシン（frenolicin）生合成遺伝子クラスター（C.D. Reeves and C.L. Soliday, 直接提出参照）およびエス・プリスチナエスピラリス（S. pristinaespiralis） プリスチナマイシン（pristinamycin）生合成遺伝子クラスター（V. de Crecy−Lagardら, Journal of Bacteriology 179:705−713 （1997）参照）におけるP450を含めたＯＲＦ８および推定チトクロームP450間の限定的な相同性を明らかにする。これらのＢＬＡＳＴ結果に基づき、ＯＲＦ８は、チトクロームP450をコードするようである。
【００７４】
ＯＲＦ１１: ＢＬＡＳＴ結果は、エス・ビオラセオルべル（S. violaceoruber） グラナチシン（granaticin）生合成遺伝子クラスター（D. H. Shermanら, EMBO Journal 8:2717−2725, （1989）参照）およびエス・シンナモネンシス（S. cinnamonensis） モネンシン（monensin）生合成遺伝子クラスター（T. J. Arrowsmithら, Molecular and General genetics 234:254−264 （1992）参照）におけるオキシド還元酵素を含めたヌクレオチドおよび予測アミノ酸配列レベルの双方でのＯＲＦ１１およびオキシド還元酵素間のかなりの相同性を明らかにする。これらのＢＬＡＳＴ結果に基づき、ＯＲＦ１１は、オキシド還元酵素をコードするようである。
【００７５】
ＯＲＦＸ: ＢＬＡＳＴ結果は、ＯＲＦＸおよびオエルスコビア・キサンチネオリチカ（Oerskovia xanthineolytica）（S. H. Shenら, Journal of Biological Chemistry 266:1058−1063 （1991）参照）からのグルカン  エンド−１,３−β−グルコシダーゼの間の相同性を明らかにする。この遺伝子は、Ｆα生合成遺伝子クラスターに関連しない。
【００７６】
ヌクレオチド配列特徴付け（Ｇ＋Ｃ含量、潜在的リボソーム結合サイト）に基づき、蛋白質をコード化するようである特徴付けされたＯＲＦＢおよびＯＲＦ１間の３.５Ｋｂｐ領域内にいくつかのオープン・リーディング・フレームが存在する。しかしながら、ＢＬＡＳＴ分析は、これらの仮定上の蛋白質の予測アミノ酸配列および公的なデータベースに寄託された蛋白質の配列間にかなりの相同性を明らかにしない。結果的には、Ｆαの生合成におけるこれらの仮定上の蛋白質に対する機能的役割に帰することはそれらのヌクレオチド（または予測アミノ酸）配列単独に基づいて可能ではない。加えて、特徴付けされたＯＲＦＸおよび今や得られたヌクレオチド配列の末端間の７.８Ｋｂｐ領域内に多数のオープン・リーディング・フレームが存在する。ＯＲＦＸがＦα生合成において役割を演じないようである遺伝子をコードし、マクロライド生合成遺伝子が典型的にはクラスター形成するので、ＯＲＦＸを超えたオープン・リーディング・フレームによりコード化された仮定上の蛋白質は、Ｆα生合成において参画しない。
【実施例２】
【００７７】
遺伝子置換、インテグラント（Integrant）およびエキシザント（Excisant）の特徴付け
Ａ．遺伝子置換
２３−ケト−Ｆαの直接的発酵生成ができるエス・シアネオグリセウスを開発するために、モジュール３ケト還元酵素ドメインを非機能性の変異体で置換したＦα産生株の誘導体の生成を探求した。ポリケチド合成酵素の休止に最低限で影響しつつケト還元酵素活性を崩壊するように各々が設計された一連の指令されたアミノ酸置換を以下のごとく設計した。エス・シアネオグリセウスＦα生合成遺伝子クラスターからのモジュール３ケト還元酵素ドメインの予測アミノ酸配列が多数の生物学的に活性なケト還元酵素ドメインの予測アミノ酸配列と整列させた複数のアミノ酸配列整列化を生成した。これらのケト還元酵素ドメイン配列は、エス・アベルミチリス アベルメクチン生合成遺伝子クラスター、サッカロポリスポラ・エリトレアエ（Saccharopolyspora erythreae）エリスロマイシン生合成遺伝子クラスター、エス・ヒグロスコピカス ラパマイシン生合成遺伝子クラスター、エス・カエレスチス（S. caelestis） ニダマイシン生合成遺伝子クラスターおよびアミコラトプシス・メジテラネイ（Amycolatopsis mediterranei） リファマイシン生合成遺伝子クラスターからのものであった。また、非機能性であることが知られている３つのケト還元酵素ドメイン（Saccharopolyspora erythreae エリスロマイシン生合成遺伝子クラスターのモジュール３、エス・カエレスチス ニダマイシン生合成遺伝子クラスターのモジュール４およびアミコラトプシス・メジテラネイ リファマイシン生合成遺伝子クラスターのモジュール３からのいわゆる「潜在性の」ケト還元酵素ドメイン）が配列整列化に含まれた。この複数のアミノ酸配列整列化は、大部分の生物学的に活性なケト還元酵素ドメインに共通するが、非機能性のケト還元酵素ドメインから欠いた（またはそのドメインにおいて変化した）比較的不変のアミノ酸配列の同定を容易に支持した。
【００７８】
また、Ｆα生合成遺伝子クラスターからのモジュール３ケト還元酵素ドメインの所望の変異体が本明細書に記載されたごとくモジュール３ケト還元酵素ドメインの改変変異体で置き換えることができるように、相同性組換えによるエス・シアネオグリセウスにおける遺伝子組み換えのための方法を開発した。
【００７９】
１．部位特異的な突然変異生成のためのプラスミドの構築
QuikChangeTM部位特異的な突然変異生成手順は、ＤＮＡの二本鎖領域の各鎖に対応する２つの変異原性オリゴヌクレオチドを必要するポリメラーゼ連鎖反応に基づく２本鎖方法である。この方法は、大きなプラスミド、特に高Ｇ＋Ｃ含量ＤＮＡを含有する大きなプラスミドを用いる場合に少し有効である。結果的に、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの部位特異的な突然変異生成は、pSL301 （Invitrogen, Carlsbad, CA）のBstEII−AatIIサイトにおけるpNE57の９００ｂｐ BstEII−AatII断片である（また、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの所望の領域を含有する）pKR0.9（図３参照）と表示されたベクター中で行った。
【００８０】
２．部位特異的な突然変異生成
Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの５種の変異体をQuikChangeTM Site−Directed Mutagenesis kit （Stratagene, La Jolla, CA）により提供された試薬、材料および手順を用いて部位特異的な突然変異生成により生成した。以下のアミノ酸置換を後記の変異原性オリゴヌクレオチドを用いてpKR0.9において生成した：
【００８１】
「179」 GGTGTLG （配列番号：13）からGAASTLG （配列番号：14）へ
5´−CTGGTGACGGGCGCTGCAAGCACTCTGGGGGCG  （配列番号：15）
3´−GACCACTGCCCGCGACGTTCGTGAGACCCCCGC  （配列番号：16）
【００８２】
「204」 LVSRRGM （配列番号：17）からLVAAAGM （配列番号：18）へ
5´−GCGGCATCTGCTGCTGGTGGCAGCGGCAGGCATGGCCGCCGCCGGTG  （配列番号：19）
3´−CGCCGTAGACGACGACCACCGTCGCCGTCCGTACCGGCGGCGGCCAC  （配列番号：20）
【００８３】
「260」 HTAGVLD （配列番号：21）からHTPPLLD （配列番号：22）へ
5´−GACCGCTGTGGTGCACACGCCACCTCTCCTGGACGACGCCACCGTG  （配列番号：23）
3´−CTGGCGACACCACGTGTGCGGTGGAGAGGACCTGCTGCGGTGGCAC  （配列番号：24）
【００８４】
「283」 GAKVD （配列番号：25）からGAAVD （配列番号：26）へ
5´−GATGCGGTGCTCGGGGCGGCTGTGGACGGTGCCCTGCAC  （配列番号：27）
3´−CTACGCCACGAGCCCCGCCGACACCTGCCACGGGACGTG  （配列番号：28）
【００８５】
「306」 VLFSSAA （配列番号：29）からVLFAAAA （配列番号：30）へ
5´−GTCGGCGTTCGTGCTGTTCGCAGCGGCCGCCGGGGTCCTGG  （配列番号：31）
3´−CAGCCGCAAGCACGACAAGCGTCGCCGGCGGCCCCAGGACC  （配列番号：32）
【００８６】
QuickChangeTM突然変異生成反応物には、最終反応容積の５０μｌ中に１２５ｎｇの各変異原性オリゴヌクレオチド、５０ｎｇのpKR0.9、0.7μｌのPfuＤＮＡポリメラーゼおよび2.5% ＤＭＳＯが含まれた。その反応物を２２サイクルの増幅（４５秒間９５℃、１分間６３℃および１０分間７０℃）に付し、増幅産物を製造者により提供された詳細な手順に従いクローニングした。部位特異的な突然変異生成手順を完了した後、コロニーを選定し、それを用いて１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足した２ｍｌ ＬＢ培地を接種した。プラスミドＤＮＡをQIAprepＲ 8 Turbo Miniprep Kitsに含まれた試薬、材料および手順を用いてこれらの各培養物から生成し、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインのその変異した９００ｂｐ BstEII−AatII領域を所望の変更がさなれたことを確認するためにその全体を配列決定した。
【００８７】
３．統合のためのプラスミドの構築
３元連結（three−way ligation）を用いて、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの５つの部位特異的な変異体とフランキングＤＮＡとを合わせて、pKC1132バックボーンを用いて相同性統合を促進した。その３つの成分には以下のもの：（突然変異誘発させた領域に隣接する大部分のＦα モジュール３を含む）pNE57の４.３Ｋｂｐ NotI−BstEII断片；（Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインおよび野生型Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの５つの部位特異的な変異体を含む）６つのpKR0.9構築体の１.１Ｋｂｐ BstEII−PstI断片；および（イー・コリおよびストレプトマイセス中で得られたプラスミドの選択および複製に必要な全エレメントを含む）pKC1132の３.６Ｋｂｐ PstI−NotI断片が含まれた。これらの操作の結果、pFDmod3/5.2プラスミドシリーズを生成した。次いで、これらのプラスミドを用いて、約１ＫｂｐのフランキングＤＮＡを取り出した統合用プラスミドのバージョンを構築した。これらのプラスミドは、各pFDmod3/5.2プラスミドをEcoRIで消化することにより構築した。このEcoRIサイトは、（大部分のＦα モジュール３を含有する）pNE57の４.３Ｋｂｐ NotI−BstEII断片を導入するために用いたKC1132中のNotIサイトに直接隣接する。その３’オーバーハングは、標準的反応条件下でT4ＤＮＡポリメラーゼを用いて満たし、その直線化プラスミドをMscIで消化した。その消化物は、０.８％ ｗ／ｖアガロースを介する電気泳動により分離し、所望の断片をゲルから切り取り、そのＤＮＡをQIAGEN （Valencia, CA）からのQIAquick II Gel Extraction Systemに含まれた試薬、材料および手順を用いてそのアガロースから抽出した。精製したＤＮＡをエタノール沈殿により採取し、連結して、pFDmod3/4.2プラスミドシリーズを生成した（図５参照）。
【００８８】
pFDmod3/5.2シリーズ（図４参照）およびpFDmod3/4.2シリーズ（図５参照）を本明細書に記載された方法を用いてイー・コリ ETS12567 （pUZ8002）に形質転換した。次いで、これらの形質転換されたイー・コリ株を本明細書に記載された方法を用いてエス・シアネオグリセウスへの接合伝達のためのＤＮＡ源として用いた。
【００８９】
４．エス・シアネオグリセウストランス接合個体およびイクシザントからのゲノムＤＮＡの単離および分析
D. A. Hopwoodら, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation Press, Norwich, UK （1985） （「Isolation of Streptomyces 「Total」 DNA」: Procedure 4）に記載された方法から修飾した方法をエス・シアネオグリセウスからの少量のゲノムＤＮＡの単離のために用いた。推定エス・シアネオグリセウスのトランス接合個体およびイクシザントを選定し、それを用いて、３ｍｌ ＫＢ３培地（１０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１.５ｇ／Ｌ Difco寒天、ｐＨ６.８、および３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する０.５ｍｌ／Ｌの微量金属溶液）を接種した。培養物を２２０ｒｐｍで振盪しつつ３１℃にて２４〜２８時間インキュベートした。これらの培養物の５００μｌアリコート中の細胞を微量遠心管内で１３,０００ｒｐｍにて５分間遠心することにより採取し、その上清を廃棄した。細胞ペレットを水で洗浄後、それらを４５０μｌのSET （４ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび５０μｇ／ｍｌ RNaseAを含有する ０.３Ｍ スクロース、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス、ｐＨ８.０）に懸濁させ、その懸濁物を３７℃にて２〜４時間インキュベートした。２５０μｌのＳＤＳの２％溶液を添加し、その試料を１分間ボルテックスした。試料を２５０μｌのフェノール:ＣＨＣｌ３ （１：１）で抽出し、その相を微量遠心管内での１３,０００ｒｐｍの５分間の遠心により分離させた。水層を新しい試験管に移し、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加後、そのＤＮＡを等量のイソプロパノールを添加することにより沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１３,０００ｒｐｍの５分間の遠心により採取し、−２０℃の７０％エタノールで洗浄し、１００μｌの水に懸濁した。
【００９０】
エス・シアネオグリセウス株からの多量のゲノムＤＮＡの単離については、２５ｍｌ ＫＢ３培地（１０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１.５ｇ／Ｌ Difco寒天、ｐＨ６.８、および３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する０.５ｍｌ／Ｌの微量金属溶液）を注目する株の菌糸体断片で接種した。培養物を２２０ｒｐｍで振盪しつつ３１℃にて２４〜２８時間インキュベートした。これらの培養物の３ｍｌアリコート中の細胞を微量遠心管内で１３,０００ｒｐｍの５分間の遠心し、上清を廃棄した。水でその細胞ペレットを洗浄した後、ゲノムＤＮＡをQIAGEN （Valencia, CA）からの総（植物）ＤＮＡの単離用のDNAeasyTMシステムに含まれた試薬、材料および手順を用いて単離した。
【００９１】
５．トランス接合個体の特徴付け
推定上のトランス接合個体を、１００μｇ／ｍｌアプラマイシン、３０μｇ／ｍｌナリジクス酸、５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミドおよび５０μｇ／ｍｌニスタチンＡを含有するＣＭ寒天（５ｇ／Ｌコーンスティープリカー（corn steep liquor）、５ｇ／Ｌ Bacto−ペプトン、１０ｇ／Ｌ 可溶性デンプン、０.５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２.２Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌ Bacto−寒天）プレートに蒔く。これらのプレートをコロニーが良好に確立されるまで３１℃にてインキュベートする。次いで、ゲノムＤＮＡを、サザンブロットによる分析および以下のヌクレオチドアラインメント分析のための本明細書に記載された方法を用いて推定上のトランス接合個体から単離した。ゲノムＤＮＡ調製物のアリコートをHindIII/StuIおよびSalIで消化した。その断片を、０.８％ ｗ／ｖアガロースを介する電気泳動により分離し、Sambrookら, Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）に記載されたものと類似する良好に確立された手順に従いサザン分析用のNytranTM膜（商業的にはSchleicher & Schuell BioScience, Inc. USA, Keene, NHから入手できる）にブロットした。典型的には、これらのサザンブロットは、本明細書に記載されたごとく生成されたmod3−特異的なプローブでプローブされた。その期待されたサイズの断片は以下のもの：
【００９２】
【表６】
2004337169.tif 000007
【００９３】
であった。
【００９４】
サザン分析に基づいて修正されたようであるトランス接合個体の注目する領域は、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、そのＰＣＲ産物を所望の配列が得られたことを確認するために配列決定した。２つのプライマーセットを用いて、そのトランス接合個体を特徴付けした。各対は、一つのmod3−特異的プライマーおよびベクター由来の配列に特異的である一つのプライマーよりなった。加えて、そのプライマー対は、一方の対が「そのカセットの右側」からの産生物を増幅し、他方の対が「そのカセットの左側」からの産生物を増幅するであろう。用いたプライマー対は、以下のもの：
【００９５】
【表７】
2004337169.tif 000008
【００９６】
であった。
【００９７】
テンプレートとしての「正確な」トランス接合個体から単離されたゲノムＤＮＡを用いて、これらのプライマーは、各々、６.４Ｋｂｐおよび５.７Ｋｂｐ産物の増幅を指令するであろう。ケト還元酵素ドメインを含有するこれらのＰＣＲ産物の領域は、以下のオリゴヌクレオチド配列プライマー：
【００９８】
【表８】
2004337169.tif 000009
【００９９】
を用いて得られた。
【０１００】
６．イクシザントの切り取りおよび特徴付け
サザン分析および本明細書に記載されたＰＣＲ産物のヌクレオチドアラインメント分析により確認されたトランス接合個体を用いて、２５ｍｌのＫＢ３培地（１０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１.５ｇ／Ｌ Difco寒天、ｐＨ６.８、および３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する０.５ｍｌ／Ｌの微量金属溶液）を接種し、培養物を２２０ｒｐｍにて振盪しつつ、３１℃にて４８時間インキュベートした。その培養物の５００μｌアリコートを新たな２５ｍｌのＫＢ３培地にクロスさせた。このプロセスは、切り取り事象が生じるのを可能とするために、選択の不存在下、多数のかかるラウンドの間継続した。ラウンド３〜６の後、１０−１ないし１０−５の連続希釈の培養物を調製し、その１０−３ないし１０−５の希釈物の２５０μｌアリコートを１４０ｍｍ直径のＣＭ寒天プレート（５ｇ／Ｌコーンスティープリカー、５ｇ／Ｌ Bacto−ペプトン、１０ｇ／Ｌ可溶性デンプン、０.５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０.５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２.２Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌ Bacto−寒天）に蒔いた。これらのプレートを、コロニーが良好に確立されるまで、３１℃にて４８〜９６時間インキュベートした。次いで、個々のコロニーを選択し、ＣＭプレート上に反復してパッチし、ＣＭプレートを１００ｍｇ／ｍｌアプラマイシンで補足した。これらのプレートを３１℃にて５日間までインキュベートし、その時点にて、アブラマイシンに感受性であるが、選択の不存在下、通常増殖できるコロニーを同定した。次いで、ゲノムＤＮＡを本明細書に記載された方法を用いて推定上のこれらのイクシザントから単離した。テンプレートとして、これらのゲノムＤＮＡ調製物を用いて、注目する領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、そのＰＣＲ産物を配列決定して、所望の配列が得られたことを確認した。増幅のために用いたプライマー対は以下のもの：
【０１０１】
【表９】
2004337169.tif 000010
【０１０２】
であった。
【０１０３】
テンプレートとして「正確な」イクシザントから単離されたゲノムＤＮＡを用いて、これらのＰＣＲプライマーは、６.６Ｋｂｐ産物の増幅を指令するであろう。ケト還元酵素ドメインを含有するこれらのＰＣＲ産物の領域を、以下のオリゴヌクレオチド配列決定プライマー：
【０１０４】
【表１０】
2004337169.tif 000011
【０１０５】
を用いて、本明細書中で配列決定して、所望の配列が得られたことを確認した。
【０１０６】
Ｂ．発酵および発酵生成物の分析
２５ｍｌのＫＢ３培地（１０ｇ／Ｌ Bacto−トリプトン、５ｇ／Ｌ 酵母エキス、３ｇ／Ｌ ビーフエキス、１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１.５ｇ／Ｌ Difco寒天、ｐＨ６.８、および３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する０.５ｍｌ／Ｌの微量金属溶液）を含む種フラスコ（seed flask）をエス・シアネオグリセウス菌糸体断片の５００ｍｌの懸濁物（新たなまたは凍結したもののいずれか）で接種し、次いで、その培養物を２２０ｒｐｍにて振盪しつつ３１℃にて４８時間インキュベートした。その種培養物の５００μｌアリコートを２５ｍｌのＳＤ２生成培地（８５.５ｇ／Ｌ グルコース、０.３６ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０.７２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、7.2ｇ／Ｌ ＣａＣＯ３、４.８６ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０.７２ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、７.２ｇ／Ｌ ファルマメディア（pharmamedia）、および３０ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４、３０ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４.７Ｈ２Ｏ、４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４、４ｇ／Ｌ ＣｕＣｌ２.５Ｈ２Ｏ、０.４ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ２.６Ｈ２Ｏを含有する１.８ｍｌ／Ｌの微量金属溶液）を含有する生成フラスコにクロスさせ、次いで、培養物を３１℃にて１０日間インキュベートした。（典型的には）１２０時間にて開始し、発酵の終わりを通して継続し、産生物の１００μｌのアリコートを取り出し、９００μｌのメタノールと合わせた。その懸濁物を１分間ボルテックスし、微量遠心管内の１３,０００ｒｐｍでの１０分間の遠心により澄ませ、その抽出の１０μｌのアリコートを逆相ＨＰＬＣにより分析した。
【０１０７】
逆相ＨＰＬＣによる分析では、試料をWaters Model 996 Photodiode Array Detector、Waters Model 717 AutosamplerおよびWaters Nova−Pak C18カラム（８ｍｍ×１００ｍｍ）を装備したWaters Model 625 Liquid Chromatography Stationでのクロマトグラフィーに付した。カラムを流速２ｍｌ／分間にてｐＨ４.５の６０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび４０％ （ｖ／ｖ） １００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する移動相に平衡化し、その移動相で溶出した。注目する化合物のＦαおよび２３−ケトＦα（モキシデクチンの前身）を２４２ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより検出し、保持時間を真正試料のものと比較した。
【０１０８】
前記において、限定ではなく例示の目的のために本発明の特定の具体例の詳細な記載が提供された。この開示に基づいて当業者に明確である全ての他の修飾、分岐および等価物は、特許請求された発明の範囲内に含まれることを意図するものであると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、本発明により作成されたコスミド内に含まれた遺伝子セグメントを介するＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を調製するための生合成遺伝子クラスターの構築を示す。エス・シアネオグリセウスコスミドライブラリーは、コスミドベクターpSuperCos 1のBamH1サイト内へのエス・シアネオグリセウスゲノムＤＮＡのSal3A断片の連結により構築される。得られたコスミドライブラリーは、イー・コリ VCS257へ形質転換される。種々のコスミドは、本明細書に記載されたアベルメクチンケトアシル合成酵素プローブを用いたハイブリダイゼーション手法または「ウォーキング（walking）」手法により同定される。そのコスミドは、エンドヌクレアーゼ制限酵素マッピングおよびＤＮＡシークエンシングにより特徴付けられる。Ｆα遺伝子クラスターのBamH1 制限酵素地図は、オバーラップコスミドの分析から得られ、ＤＮＡシークエンシングにより確認される。ＢはBamH1サイトを示す。
【図２】図２は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を調製するためのクローニングされた生合成遺伝子クラスターによりコード化された生合成蛋白質およびそれらの位置を示す。全てのＦαポリケチド合成酵素遺伝子クラスターを含有する約８８Ｋｂｐの連続ヌクレオチド配列は、コスミドおよびそのサブクローンを配列決定することにより得られる。その１３モジュールおよび各ドメインは、ＢＬＡＳＴアラインメント分析（alignment analysis）を用いて同定される。他の生合成遺伝子は、同一方法により同定される。以下の略語：ＡＣＰ、アシル担体蛋白質；ＤＨ、脱水酵素；ＥＲｍ、エノイル還元酵素；ＫＲ、ケト還元酵素；ＫＳ、ケトアシル合成酵素；ＬＤ、ローディング・ドメイン；ＴＥ、チオエステラーゼ；ＭＴ、メチル基転移酵素；ＡＴ、アシル基転移酵素を図中で用いる。
【図３】図３は、pSL301 （Invitrogen, Carlsbad, CA）のBstEII−AatIIサイト中のpNE57の９００ｂｐ BstEII−AatII断片である（さらに、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメインの所望の領域を含む）pKR0.9と指定されたベクターの成分の構造を示す。以下の略語：mod3 KR、Ｆα モジュール３ケト還元酵素ドメイン；amp、アンピシリン耐性マーカーを図中で用いる。
【図４】図４は、pFDmod3/5.2シリーズのプラスミド成分の構造を示す。これらのプラスミドは、フランキングＤＮＡを持つＦαモジュール３ケト還元酵素ドメインの部位特異的なの変異体を結合させ、相同性組込み（homologous integration）を促すように構築される。バックボーンベクターは、イー・コリ−ストレプトマイシン シャトルベクターpKC1132である。以下の略号： mod3 KS、モジュール３ケトアシル合成酵素ドメイン；mod3 AT、モジュール３アシル基転移酵素；mod3 DH、モジュール３脱水酵素；mod 3 ER, モジュール３エノイル還元酵素；mod3 KR、モジュール３ケト還元酵素ドメイン；apra、アプラマイシン（apramycin）耐性マーカーを図中で用いる。
【図５】図５は、pFDmod3/4.2シリーズのプラスミド成分の構造を示す。そのプラスミドは、異常な組込み（aberrant integration）を最小化するように約１ＫｂｐのフランキングＤＮＡを除去することによりpFDmod3/4.2から誘導される。以下の略語：mod3 AT、モジュール３アシル基転移酵素；mod3 DH、モジュール３脱水酵素；mod 3 ER、モジュール３エノイル還元酵素；mod3 KR、モジュール３ケト還元酵素ドメイン；apra、アプラマイシン耐性マーカーを図中で用いる。
【図６】図６は、ＬＬ−Ｆ２８２４９化合物を調製するための生合成遺伝子の（配列番号：１に対応する）全長ヌクレオチド配列（８８４００ｂｐ）を示す。
【図７】図７は、ＯＲＦ１遺伝子によりコード化された調節蛋白質の（配列番号：２に対応する）推定アミノ酸配列（９２２ａａ）を表す。
【図８】図８は、ＯＲＦ２遺伝子によりコード化されたチオエステラーゼ蛋白質の（配列番号：３に対応する）推定アミノ酸配列（２５９ａａ）を表す。
【図９】図９は、ＯＲＦ３遺伝子によりコード化された還元酵素蛋白質の（配列番号：４に対応する）推定アミノ酸配列（２６７ａａ）を表す。
【図１０】図１０は、ＯＲＦ４遺伝子によりコード化されたＭｏｄ１についてのローディング・ドメイン蛋白質の（配列番号：５に対応する）推定アミノ酸配列（２３４１ａａ）を表す。
【図１１】図１１は、ＯＲＦ５遺伝子によりコード化されたＭｏｄ２−Ｍｏｄ３についてのローディング・ドメイン蛋白質の（配列番号：６に対応する）推定アミノ酸配列（３７２３ａａ）を表す。
【図１２】図１２は、ＯＲＦ６遺伝子によりコード化されたＭｏｄ４−Ｍｏｄ７についてのローディング・ドメイン蛋白質の（配列番号：７に対応する）推定アミノ酸配列（３７２３ａａ）を表す。
【図１３】図１３は、ＯＲＦ７遺伝子によりコード化されたエチル基転移酵素蛋白質の（配列番号：８に対応する）推定アミノ酸配列（２８４ａａ）を表す。
【図１４】図１４は、ＯＲＦ８遺伝子によりコード化されたp450蛋白質の（配列番号：９に対応する）推定アミノ酸配列（４６８ａａ）を表す。
【図１５】図１５は、ＯＲＦ９遺伝子によりコード化されたＭｏｄ８−Ｍｏｄ１０についてのローディング・ドメイン蛋白質の（配列番号：１０に対応する）推定アミノ酸配列（５６７４ａａ）を表す。
【図１６】図１６は、ＯＲＦ１０遺伝子によりコード化されたＭｏｄ１１−Ｍｏｄ１３についてのローディング・ドメイン蛋白質の（配列番号：１１に対応する）推定アミノ酸配列（５１６６ａａ）を表す。
【図１７】図１７は、ＯＲＦ１１遺伝子によりコード化されたＭｏｄ１１−Ｍｏｄ１３についてのオキシドレダクダーゼ蛋白質の（配列番号：１２に対応する）推定アミノ酸配列（２５４ａａ）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【図６−１４】
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【図６−１５】
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【図６−１６】
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【図６−１７】
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【図６−１８】
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【図６−１９】
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【図６−２０】
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【図６−２１】
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【図６−２２】
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【図６−２３】
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【図６−２４】
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【図６−２５】
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【図６−２６】
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【図６−２７】
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【図６−２８】
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【図６−２９】
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【図６−３０】
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【図６−３１】
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【図６−３２】
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【図６−３３】
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【図６−３４】
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【図６−３５】
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【図６−３６】
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【図６−３７】
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【図６−３８】
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【図６−３９】
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【図６−４０】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【配列表】
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