(57)【要約】  【課題】  微生物を宿主とした異種の発現システムを利用することにより、ウサギ肝臓由来のエステラーゼを効率よくかつ大量に生産する方法を提供すること。  【解決手段】  ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を含有する組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体、およびそれを用いたエステラーゼの製造方法が開示されている。好ましくは、本発明の形質転換体は、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）を宿主とする。本発明の形質転換体を培養することにより、ウサギ肝臓由来のエステラーゼを効率的に製造することができる。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を含有する、組換えベクター。
【請求項２】
前記ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子が、以下の（１）から（４）よりなる群から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１に記載の組換えベクター：
（１）配列番号２の１位から５４６位のアミノ酸配列、または該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）配列番号４の１位から５６４位のアミノ酸配列、または該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（３）配列番号１の１位から１６３８位の塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（４）配列番号３の１位から１６９２位の塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
前記ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子が、小胞体保持シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含まないか、または該小胞体保持シグナルペプチド配列が改変されて小胞体保持機能を有しない遺伝子である、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記小胞体保持シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号２の５４３位から５４６位のアミノ酸配列または配列番号４の５６１位から５６４位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、あるいは配列番号１の１６２７位から１６３８位の塩基配列または配列番号３の１６８１位から１６９２位の塩基配列からなるＤＮＡである、請求項３に記載の組換えベクター。
【請求項５】
真核微生物で機能し得る、請求項１から４のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記真核微生物が、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）である、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の組換えベクターを含む、形質転換体。
【請求項８】
宿主が真核微生物である、請求項７に記載の形質転換体。
【請求項９】
前記真核微生物がピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）である、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程、および得られた培養物からウサギ肝臓由来のエステラーゼを精製する工程を包含する、ウサギ肝臓由来のエステラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウサギ肝臓由来のエステラーゼを発現する微生物およびそれを用いたウサギ肝臓由来エステラーゼの製造方法に関する。より詳細には、ウサギ肝臓由来のエステラーゼを微生物で効率的に発現させるための組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体およびそれを用いたウサギ肝臓由来のエステラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）は、エステルを加水分解し、アルコールとカルボン酸とに遊離させる典型的なエステル加水分解酵素である。例えば、ウサギ肝臓由来のエステラーゼは、分子量６０ｋＤａ、至適ｐＨ７．５であり、その基質特異性については、一般的なエステル基質だけではなく、現在知られている他の加水分解酵素では加水分解が難しいとされるα，α−２置換マロン酸誘導体エステルを光学選択的に加水分解する。そのため、医薬品および液晶中間体の合成に有用な酵素であり、このような中間体を工業的に生産する観点からもウサギ肝臓由来のエステラーゼは興味深い。
【０００３】
しかし、この酵素は、ウサギの肝臓から精製酵素として得る場合は動物愛護などの点で問題があり、さらに、動物由来の酵素であるため、微生物を用いて工業的に生産することも困難であり、これまで工業化されていなかった。
【０００４】
これまで、カルボキシルエステラーゼを含むタンパク質全般を微生物を用いて発現させるために、細菌をはじめとして酵母またはカビを宿主とする種々の発現系が開発されている。そのうち、真核細胞の発現系として、例えば、メチロトローフ酵母であるピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を宿主とする方法が開発されている。具体的には、アルコールオキシダーゼのプロモーターを含む発現ベクターの下流に目的とするタンパク質をコードする遺伝子を挿入し、これをピチア・パストリスに導入後、該遺伝子を相同組換えにより染色体上のアルコールオキシダーゼ遺伝子と入れ替え、メタノール存在下で培養することにより目的の遺伝子の発現を行い、目的とするタンパク質を高レベルで発現させる方法が開発されている（例えば、非特許文献１）。
【０００５】
他方、動物の肝臓由来のエステラーゼを微生物において発現させた例としては、ブタの肝臓由来のエステラーゼをピチア・パストリスを宿主として発現させる方法が知られている（例えば、非特許文献２）。
【０００６】
しかし、上記いずれの方法においても、発現したエステラーゼの量は、酵素タンパク質量に換算して１ｍｇ／Ｌにも及ばず、依然、効率よく大量生産できるものとは言い難い。
【非特許文献１】ホシダ（Ｈｏｓｈｉｄａ）ら，「ジャーナルオブバイオサイエンスアンドバイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」,２００１年，第９２巻，ｐ．３７２−３８０
【非特許文献２】ランゲ（Ｌａｎｇｅ）ら，「ケムバイオケム（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）」，２００１年，第２巻，ｐ．５７６−５８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を、微生物を宿主とした異種の発現システムを利用して発現させることにより、エステラーゼを効率よくかつ大量に生産できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を含有する、組換えベクターを提供する。
【０００９】
好適な実施態様では、上記ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子は、以下の（１）から（４）よりなる群から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である：
（１）配列番号２の１位から５４６位のアミノ酸配列、または該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）配列番号４の１位から５６４位のアミノ酸配列、または該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（３）配列番号１の１位から１６３８位の塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（４）配列番号３の１位から１６９２位の塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１０】
より好適な実施態様では、上記ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子は、小胞体保持シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含まないか、または該小胞体保持シグナルペプチド配列が改変されて小胞体保持機能を有しない遺伝子である。
【００１１】
さらに好適な実施態様では、上記小胞体保持シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号２の５４３位から５４６位のアミノ酸配列または配列番号４の５６１位から５６４位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、あるいは配列番号１の１６２７位から１６３８位の塩基配列または配列番号３の１６８１位から１６９２位の塩基配列からなるＤＮＡである。
【００１２】
好適な実施態様では、上記組換えベクターは、真核微生物で機能し得る。
【００１３】
より好適な実施態様では、上記真核微生物は、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）である。
【００１４】
本発明はまた、上記のいずれかの組換えベクターを含む、形質転換体を提供する。
【００１５】
好適な実施態様では、上記形質転換体の宿主は真核微生物である。
【００１６】
より好適な実施態様では、上記真核微生物はピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）である。
【００１７】
本発明はさらに、上記のいずれかの形質転換体を培養する工程、および得られた培養物からウサギ肝臓由来のエステラーゼを精製する工程を包含する、ウサギ肝臓由来のエステラーゼの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、微生物を用いてウサギ肝臓由来のエステラーゼを効率よくかつ大量に生産することができる。本発明により得られたウサギ肝臓由来のエステラーゼは、微生物宿主を用いて発現させた既報のブタ肝臓由来のエステラーゼと比較して、より高い発現量を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
＜ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子＞
本発明の組換えベクターには、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子が含有されている。このエステラーゼ遺伝子の起源となるウサギの種類は特に限定されないが、通常は、当業者が実験に用いるウサギであり得る。このエステラーゼ遺伝子は、上記のようなエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであれば、特に限定されない。このウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子の好ましい例としては、以下の（１）から（４）よりなる群から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である：
（１）配列番号２の１位から５４６位のアミノ酸配列、または該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（２）配列番号４の１位から５６４位のアミノ酸配列、または該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（３）配列番号１の１位から１６３８位の塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；および
（４）配列番号３の１位から１６９２位の塩基配列からなるＤＮＡ、または該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２０】
ここで、上記（１）および（２）で表されるタンパク質をコードするＤＮＡにおいて、アミノ酸配列に対する欠失、置換または付加されるアミノ酸の位置および数は、このタンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより得られるタンパク質が、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有する限りにおいて適切に決定され得る。また、このようなウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性は後述の方法を用いて測定され得る。
【００２１】
なお、上記（３）および（４）において、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドＤＮＡが形成され、非特異的なハイブリッドＤＮＡが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化して表現することは困難であるが、例えば、相同性の高いＤＮＡ同士、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、一般的なサザンハイブリダイゼーションの処理条件（例えば、ハイブリダイゼーション溶液が、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．０２％ＳＤＳ、０．５％スキムミルク溶液、および１００μｇ／ｍＬサケ変性精子ＤＮＡを含む）よりも強い条件であり、例えば、この組成よりもハイブリダイゼーション溶液の構成成分の濃度が高いか、ハイブリダイゼーション温度が５５℃以上であるか、膜洗浄溶液が０．１％ＳＤＳおよび０．５×ＳＳＣの組成より低い濃度の溶液であるか、あるいは膜洗浄温度が５０℃以上であるかのいずれかの場合であり得る。
【００２２】
本発明に用いられるウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子は、上記（１）〜（４）から選択されるＤＮＡのうち、（１）および（２）に記載される「該配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ活性を有するタンパク質」をコードする遺伝子であることが好ましい。特に、小胞体保持シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含まないＤＮＡからなる遺伝子であることがより好ましい。ここで、小胞体保持シグナルペプチドとは、エステラーゼのＣ末端に存在する数個のアミノ酸からなるモチーフであり、発現したタンパク質を小胞体に残留させるために働く。ここで、小胞体保持シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は、例えば、配列番号２の５４３位〜５４６位のアミノ酸配列または配列番号４の５６１位〜５６４位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、あるいは配列番号１の１６２７位〜１６３８位の塩基配列または配列番号３の１６８１位〜１６９２位の塩基配列からなるＤＮＡである。このような特定のＤＮＡを除くことにより、あるいは、発現した場合に小胞体保持機能を有さないようにこれらの配列を改変することにより、本発明の組換えベクターは、酵母においてエステラーゼ遺伝子をより一層効果的に発現させることができる。小胞体保持シグナルペプチドを含まないエステラーゼ遺伝子は、具体的には、配列番号２の１位〜５４２位のアミノ酸配列または配列番号４の１位〜５６０位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、あるいは配列番号１の１位〜１６２６位の塩基配列または配列番号３の１位〜１６８０位の塩基配列からなるＤＮＡでなる遺伝子である。
【００２３】
このようなエステラーゼ遺伝子は、当業者が通常用いる方法によって、ウサギ肝臓のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡから例えばＲＴ−ＰＣＲ法を用いてクローニングされ、必要に応じて、上記のように適切に改変（欠失、置換、または付加）されることによって得られる。
【００２４】
＜組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、上記のウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を含む。
【００２５】
本発明の組換えベクターに用いられるベクターは、自己複製型であっても、あるいは相同組換えを起こす組込み型であってもよく、特に限定されない。遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列、ならびに選択マーカーを含んでいることが望ましい。さらに、ベクターは、形質転換する宿主に応じて適切に選択され得る。例えば、宿主として酵母を用いる場合は、酵母で機能し得るベクターが選択される。宿主としては、どのような微生物を用いてもよく、好ましくは真核微生物であり、例えば、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属）などの酵母が挙げられる。ピチア属で機能するベクターの具体的な例としては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）については、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺαなどが挙げられ、そしてピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）については、ｐＭＥＴ、ｐＭＥＴαなどが挙げられる。このようなピチア属で機能するベクターは、例えば、インビトロジェン社より市販されている。ｐＰＩＣＺおよびｐＰＩＣＺαの制限酵素地図をそれぞれ図１および図２に示す。シゾサッカロマイセス属で機能するベクターの例としては、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）については、ｐＴＩ１Ｍ５、ｐＳＩ１Ｐ４Ｍ５などが挙げられる。これらの制限酵素地図をそれぞれ図３および図４に示す。
【００２６】
他の酵母で機能するベクターの例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）については、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＹＥＸ−ＢＸなどが挙げられ、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）については、ｐＮＯｔａ１などが挙げられる。
【００２７】
本発明の組換えベクターは、例えば、上記エステラーゼ遺伝子を適切なプライマーを用いて増幅してその両端に制限酵素部位を設け、これを該制限酵素で切断した上記適切に選択されたベクターに挿入することによって得られる。例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ３３株、ＧＳ１１５株またはＫＭ７１株を宿主として用いる場合、例えば、ｐＰＩＣＺα中のメタノールオキシダーゼのプロモーターの下流にウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を挿入する。
【００２８】
＜ウサギの肝臓由来のエステラーゼを発現し得る形質転換体＞
本発明の形質転換体は、上記本発明の組換えベクターを宿主微生物に導入することにより得られる。ベクターに挿入される遺伝子が真核生物であるウサギ由来の遺伝子であるため、本発明の形質転換体に用いられる宿主としては、真核微生物を用いることが好ましく、ピチア属、シゾサッカロマイセス属、カンジダ属、サッカロマイセス属などが挙げられる。その中でも特に入手が容易であるという理由から、ピチア属が好ましい。ピチア属の例としては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）が挙げられる。特に、さらに入手が容易であるという理由から、ピチア・パストリスＸ３３株、ＧＳ１１５株またはＫＭ７１株が好ましい。このようなピチア属の微生物は、例えば、インビトロジェン社より市販されている。また、シゾサッカロマイセス属については、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好適に用いられる。
【００２９】
宿主微生物に上記組換えベクターを導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法があり、具体的には、例えば、酵母の場合は、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。
【００３０】
上記組換えベクターが導入された宿主（形質転換体）は、選択マーカー（例えば、ゼオシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）で選択され、エステラーゼの発現を測定することにより選択される。エステラーゼの発現は、エステラーゼ活性を測定することにより確認し得る。
【００３１】
ウサギ肝臓由来のエステラーゼは、当業者が通常行う任意のエステラーゼ活性測定方法によって測定され得る。具体的には、例えば以下のようにしてその活性を測定し得る。
【００３２】
まず、形質転換体を破砕して得られる酵素溶液０．１ｍＬと０．４ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）との混合溶液に、０．５％のエタノールを含む０．５ｍＭのｐ−ニトロフェニルブチレート（１．５ｍＬ）を基質として添加し、生成するｐ−ニトロフェノールの定量を行う。酵素単位は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニルブチレートを加水分解する酵素量を１単位とする。酵素のタンパク質量は、ウサギ肝臓から精製されたエステラーゼ試薬（例えば、ＳＩＧＭＡ社により市販されている）との比較から算出される。
【００３３】
＜エステラーゼの製造方法＞
次に、本発明のエステラーゼの製造方法について説明する。
【００３４】
本発明の製造方法では、まず上記形質転換体を培養する。このような形質転換体の培養条件は、宿主の種類等を考慮して、当業者によって適切に選択され得る。次いで、培養物から当業者が通常用いる方法によってウサギ肝臓由来のエステラーゼを精製する。具体的には以下のように行うことができる。
【００３５】
例えば、形質転換された酵母を、適切な培地中で振とう培養を行い、酵母菌体が目的の密度に達した後、培地をメタノール含有培地に変更し、さらに培養を継続することによりウサギ肝臓由来のエステラーゼを誘導する。なお、メタノールは、例えば、所定の時間ごとに終濃度０．１〜４．０％(v/v)となるように添加してもよい。得られた培養液中の菌体を破砕または溶菌した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、限外ろ過などによって精製し、ウサギ肝臓由来の精製エステラーゼを得ることができる。精製は、タンパク質量あるいは上記のエステラーゼの活性測定法によって測定されるエステラーゼ活性を指標として行われ得る。
【００３６】
本発明の製造方法により得られるウサギ肝臓由来のエステラーゼは、約６０ｋＤａの分子量であり、これは、ウサギの肝臓から精製された市販のエステラーゼ試薬（ＳＩＧＭＡ製）の分子量とほぼ一致する。さらに、エステラーゼの発現量は、既報のブタ肝臓由来のエステラーゼと同等あるいはそれ以上であり、条件によっては３０倍以上の発現量が達成され得る。
【実施例】
【００３７】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
＜実施例１：ピチア・パストリス用発現プラスミドの構築＞
ウサギ肝臓由来のエステラーゼをシャトルプラスミドｐＰＩＣＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込むために、センスプライマーＮＲＬＥ／ＥｃｏＲＩ（配列番号５）およびアンチセンスプライマーＣＲＬＥ／ＥｃｏＲＩ（配列番号６）を合成した。これらは、５’および３’末端にそれぞれ制限酵素部位ＥｃｏＲＩを有する。
【００３９】
ウサギ肝臓ポリＡ＋  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製）からウサギ肝臓ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてマニュアルの手順に従って調製した。このウサギ肝臓ｃＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型として、上記センスプライマーＮＲＬＥ／ＥｃｏＲＩ（配列番号５）およびアンチセンスプライマーＣＲＬＥ／ＥｃｏＲＩ（配列番号６）を各２５ｐｍｏｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μＬ、２．５ｍＭのｄＮＴＰ（４μＬ）、および１．２５単位のＥｘ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を滅菌水で５０μＬにした緩衝液中でＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲは、９４℃にて３０秒間、５２℃にて３０秒間、および７２℃にて１分３０秒間のインキュベートを１サイクルとして、合計３０サイクル行った。ＰＣＲで増幅された約１７００ｂｐの断片をエタノール沈殿した後、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し、ＥｃｏＲＩで処理したｐＰＩＣＺαＡのクローニングサイトへ挿入した（図５を参照のこと）。挿入されたＤＮＡ配列は、配列番号１の１位から１６２６位の塩基配列を有し、これはエステラーゼのシグナル配列、小胞体保持シグナル配列、ならびにエステラーゼの成熟タンパク質の最初のＧｌｙをコードするＤＮＡ配列を含まない。本プラスミドをｐＰＩＣＺα／ＲＬＥと命名した。このプラスミドは、ゼオシン耐性遺伝子（Ｚｅｏｃｉｎｒ）を有する。
【００４０】
＜実施例２：ピチア・パストリスの形質転換＞
プラスミドｐＰＩＣＺα／ＲＬＥ（１０μｇ）を制限酵素ＰｍｅＩで処理して直鎖状にした後、フェノール−クロロホルム処理し、次いでエタノール沈殿を行って、１０μＬに濃縮した。次いで、これを８０μＬのピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に加え、氷中に５分間静置した。これを０．２ｍＬのキュベットに入れ、３５μＦ、１．５ｋＶ、および２８５Ωの条件下で、島津遺伝子導入装置ＧＴＥ−１０システム（島津製作所製）を用い、エレクトロポレーションを行った。その後、１ｍＬの１Ｍソルビトールを加え、３７℃で１時間静置した。これをゼオシンを含むＹＰＤＳ固体培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％、ソルビトール１Ｍ、および寒天２％）に塗布し、３０℃にて４日間培養した。得られたコロニーを、再度ゼオシンを含むＹＰＤＳ固体培地で３０℃にて２日間培養し、形質転換体を含むマスタープレートを作製した。
【００４１】
得られたマスタープレートから形質転換体をＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、およびグルコース２％）に植菌し、３０℃にて２日間振とう培養した。この菌体から、ゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくんＴＭ（宝酒造社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｐＰＩＣＺαＡ由来の５’ＡＯＸプライマーおよびウサギ肝臓由来ｃＤＮＡ内部のプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅断片を確認することにより、目的の形質転換体の選択をした。これにより、ウサギ肝臓由来のエステラーゼ遺伝子を含む形質転換体ＰＩＣＺα／ＲＬＥを得た。
【００４２】
＜実施例３：形質転換体の培養およびウサギ肝臓由来のエステラーゼの生成＞
実施例２で得られた形質転換体ＰＩＣＺα／ＲＬＥを、２５ｍＬのＢＭＧＹ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、リン酸カリウム緩衝液１００ｍＭ  ｐＨ６．０、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  １．３４％、ビオチン４×１０−５％、およびグリセロール１％）に接種し、６００ｎｍの吸光度が４になるまで３０℃にて振とう培養した。菌体を２５℃にて、１０分間かけて３０００ｒｐｍで遠心分離して回収した。回収した菌体を１００ｍＬのＢＭＭＹ培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、リン酸カリウム緩衝液１００ｍＭ  ｐＨ６．０、Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  １．３４％、ビオチン４×１０−５％、およびメタノール０．５％）に６００ｎｍの吸光度が１となるように懸濁し、３０℃にて９４時間振とう培養した。なお、培養中は、２４時間おきにメタノールを０．５ｍＬずつ加えた。この培養液中の菌体をアストラソン超音波細胞破砕機（和研薬製）用いて、破砕した。
【００４３】
次いで、菌体破砕液の一部を試験管に採り、上記ＢＭＭＹ培地で希釈して０．１ｍＬとした。この０．１ｍＬの希釈された菌体破砕液に０．４ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２５℃にて３分間保持した。これに０．５％のエタノールを含む１．５ｍＬの０．５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルブチレート（ＰＮＰＢ）を基質として添加することにより反応を開始した。一定時間経過後、０．１ｍＬの５％トリクロロ酢酸水溶液を加え反応を停止した。これに２．８ｍＬの２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し、撹拌後、速やかに波長４００ｎｍにおける吸光度を測定し、生成するｐ−ニトロフェノール量を検量線により定量した。なお、酵素単位は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェニルブチレートを加水分解する酵素量を１単位（Ｕ）とした。この結果、菌体破砕液には、１ｍＬあたり１．７単位（Ｕ）の加水分解活性を確認した。
【００４４】
また、酵素タンパク質の量を、ウサギ肝臓から精製されたエステラーゼ試薬（ＳＩＧＭＡ社製；１Ｕ／ｍＬ＝１５．３μｇ／ｍＬ）を指標として用いて、上記の活性測定を行い、その酵素単位の比較から算出した。その結果、上記菌体破砕液には、酵素タンパク質が２６μｇ／ｍＬ含まれていることが確認された。
【００４５】
次いで、この菌体破砕液を、遠心分離（３，０００×ｇ、１０分間）および限外ろ過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ０．５ｍＬ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ５０００  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製））により部分精製して、ウサギ肝臓由来の精製エステラーゼを得た。このエステラーゼを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して分子量を測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＬＭＷ  ＥＬＥＣＴＲＯＰＨＯＲＥＳＩＳ  ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ｐｈａｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）をサイズマーカーとして用い、ゲルはＰｈａｓｔＧｅｌＴＭ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ８−２５（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いて、Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）により行った。その結果、単一バンドが見られ、その分子量は、６０ｋＤａであることが確認された。
【００４６】
＜実施例４：シゾサッカロマイセス・ポンベ用発現プラスミドの構築＞
エステラーゼを分泌発現させるために、ウサギ肝臓由来のエステラーゼのシグナル配列を利用する場合およびシゾサッカロマイセス・ポンベ由来の分泌シグナル配列を利用する場合の２種類の発現プラスミドを構築した。
【００４７】
（１）ウサギ肝臓由来のエステラーゼのシグナル配列を利用する場合
シグナル配列を含むウサギ肝臓由来のエステラーゼを発現ベクターｐＴＩ１Ｍ５を用いて発現させた。この発現ベクターには、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のインベルターゼプロモーター（Ｉｎｖ１Ｐ）が存在するため、グルコースの存在下では抑制され、培地中のグルコースがなくなることにより働く。さらにＳＶ４０プロモーターの下流にはネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｍｒ）を有するため、培地中の抗生物質Ｇ４１８の濃度に依存してベクターのコピー数が増加する。
【００４８】
発現ベクターｐＴＩ１Ｍ５に挿入するためのプライマーとして、センスプライマーＲＬＥＦＷ１（配列番号７）およびアンチセンスプライマーＲＬＥＲＶ１（配列番号８）を合成した。これらのプライマーは、それぞれ制限酵素部位ＡｆｌＩＩＩおよびＫｐｎＩを有する。上記実施例１に記載のウサギ肝臓由来のｃＤＮＡを鋳型として、このプライマーＲＬＥＦＷ１およびＲＬＥＲＶ１ならびにＫＯＤポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲで増幅された約１７００ｂｐ断片をエタノール沈殿した後、制限酵素ＡｆｌＩＩＩおよびＫｐｎＩで処理し、ＢｓｐＬＵ１１ＩおよびＫｐｎＩで処理したｐＴＩ１Ｍ５ベクターに挿入した（図６を参照のこと）。挿入されたＤＮＡ配列は、配列番号３の１位から１６８０位の塩基配列を有し、エステラーゼの小胞体保持シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含まない。このプラスミドをｐＴＩ１ＯＳＲＬＥと命名した。ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の解析を行って、ＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
【００４９】
（２）シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の分泌シグナル配列を利用する場合
シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の分泌シグナル配列Ｐ４を利用してエステラーゼを発現させるために、発現ベクターｐＳＩ１Ｐ４Ｍ５を用いた。この発現ベクターは、上記（１）で用いたｐＴＩ１Ｍ５と同様、Ｉｎｖ１ＰおよびＮｍｒを有する。
【００５０】
まず、上記（１）で得た発現プラスミドｐＴＩ１ＯＳＲＬＥをＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩで処理して、約１４００ｂｐ断片を切り出し、これを、同様にＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩで処理したｐＳＩ１Ｐ４Ｍ５に挿入した。このベクターを、ｐＴＩ１Ｐ４ＲＬＥ−１と命名した。
【００５１】
次いで、分泌シグナル配列を含まないエステラーゼ遺伝子とＰ４シグナルとを連結するために、センスプライマーＲＬＥＦＷ２（配列番号９）およびアンチセンスプライマーＲＬＥＲＶ２（配列番号１０）を合成した。これらのプライマーは、上記それぞれ制限酵素部位ＡｆｌＩＩを有し、得られるＤＮＡにＡｆｌＩＩ部位を生じさせる。他方で、上記実施例１に記載のウサギ肝臓由来のｃＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、上記プライマーＲＬＥＦＷ２およびＲＬＥＲＶ２ならびにＫＯＤポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩで処理し、同様にＡｆｌＩＩで処理したｐＴＩ１Ｐ４ＲＬＥ−１ベクターに挿入した（図７を参照のこと）。このプラスミドをｐＴＩ１Ｐ４ＲＬＥと命名した。ＤＮＡシークエンサーで塩基配列の解析を行って、挿入の向きおよびＰＣＲによるエラーがないことを確認した。挿入されたＤＮＡ配列は、配列番号１の１位から１６２６位の塩基配列を有し、ウサギ肝臓由来のエステラーゼのシグナル配列、小胞体保持シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含まず、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来の分泌シグナル配列Ｐ４のＣ末端をコードするＤＮＡとエステラーゼ成熟タンパク質のＮ末端から１番目に位置するＨｉｓをコードするＤＮＡとが連結されている。
【００５２】
＜実施例５：シゾサッカロマイセス・ポンベの形質転換＞
上記実施例４で作製した２種の発現ベクターを、酢酸リチウム法により宿主酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）［ｌｅｕ１−３２ｈ−］にそれぞれ導入し、ロイシン欠失最小栄養培地プレート（ＭＭＡプレート）に塗布した。３２℃にて静置培養し、得られたコロニーを最終濃度１０μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＹＥＬ（０．５％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、３％グルコース）液体培地に接種し、目的の形質転換体をそれぞれ選択した。得られた形質転換体を、それぞれＴＩ１ＯＳ／ＲＬＥおよびＴＩ１Ｐ４／ＲＬＥと命名した。
【００５３】
＜実施例６：形質転換体の培養およびウサギ肝臓由来のエステラーゼの生成＞
上記実施例５で得られた２種の組換え酵母を、最終濃度１００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＹＰＤ（１％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ペプトン、２％グルコース）液体培地５ｍＬにそれぞれ植菌し、３２℃にて３日間培養した後、遠心分離により培養液を培養上清液と菌体とに分離した。菌体を、５ｍＬの滅菌水で２回洗浄した後、４倍容量のＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁した。次いで、０．６倍容量のガラスビーズを添加し、ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ（ＢＩＯＳＰＥＣ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ製）で３，８００ｒｐｍにて３０秒間の条件で３回菌体破砕し、ＴＢＳ緩衝液で５００μＬに調整して、菌体破砕液を得た。菌体破砕液の一部を、１２，０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離を行って菌体破砕上清液を得た。
【００５４】
得られた培養上清液および菌体破砕上清液について、上記実施例３に記載のようにしてエステラーゼ活性を測定した。なお、コントロールとして、ウサギ肝臓から精製されたエステラーゼ試薬（ＳＩＧＭＡ社製；１Ｕ／ｍＬ＝１５．３μｇ／ｍＬ）を用い、酵素タンパク質量をこの値より換算した。
【００５５】
ウサギ肝臓由来のエステラーゼの分泌配列を有するＴＩ１ＯＳ／ＲＬＥの培養上清液における活性は０．０７４Ｕ／ｍＬであり、そして培養上清液あたりの酵素タンパク質量は１．１μｇ／ｍＬであった。一方、Ｐ４分泌シグナル配列を有するＴＩ１Ｐ４／ＲＬＥでは、培養上清中でエステラーゼ活性は見られなかった。また、ＴＩ１ＯＳ／ＲＬＥおよびＴＩ１Ｐ４／ＲＬＥの菌体破砕上清液における活性は、培養液あたりに換算してそれぞれ１．２６Ｕ／ｍＬおよび０．２６Ｕ／ｍＬであり、培養液あたりの酵素タンパク質量は、それぞれ１９．３μｇ／ｍＬおよび４．０μｇ／ｍＬであった。いずれも分泌シグナル配列を有するにもかかわらず、培養上清液よりも菌体破砕上清液の方がタンパク質量が多く、エステラーゼは細胞内に多く残存していた。全体としてのタンパク質の発現量は、既報のピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させたブタ肝臓由来のエステラーゼ（１μｇ／ｍＬ未満）よりもはるかに多かった。
【００５６】
＜実施例７：培養条件の検討＞
ウサギ肝臓由来のエステラーゼのシグナル配列を有するＴＩ１ＯＳ／ＲＬＥを、上記実施例３に記載のエステラーゼ活性測定手順における抗生物質Ｇ４１８の濃度を１００〜８００μｇ／ｍＬおよび培養日数を３日または６日として培養した。上記実施例６と同様の手順で培養上清液および菌体破砕上清液を得て、エステラーゼ活性およびタンパク質量を測定し、培養液１ｍＬあたりに換算した。結果を表１に示す。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
Ｇ４１８の濃度を２００μｇ／ｍＬとした場合、６日間の培養によって酵素タンパク質の分泌量が約４μｇ／ｍＬにまで到達した。菌体内に存在する酵素タンパク質量は大きな差は見られなかった。
【００５９】
次いで、培養上清液の一部をメンブランフィルター（１０Ｋ；ミリポア製）を用いて２５０μＬまで濃縮し、培養上清濃縮液を得た。この濃縮液について、上記実施例３と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、６０ｋＤａ付近にバンドが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、微生物を用いてウサギ肝臓由来のエステラーゼを効率よくかつ大量に生産することができる。例えば、微生物宿主を用いてブタ肝臓由来のエステラーゼを発現させた場合よりも高い発現量を示す。また、本発明の方法により得られるエステラーゼは、医薬品および液晶中間体の合成に有用な酵素である。したがって、本発明の方法は、従来のようなウサギの肝臓から精製して得る方法と比較して、動物愛護の観点から好適な方法であり、特に、医薬品の製造に用いられる場合は、宗教上の理由でブタ由来の酵素を受け入れることのできない人たちにも適用可能である点で非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ピチア属で機能するベクターの制限酵素地図である。
【図２】ピチア属で機能するベクターの制限酵素地図である。
【図３】シゾサッカロマイセス属で機能するベクターの制限酵素地図である。
【図４】シゾサッカロマイセス属で機能するベクターの制限酵素地図である。
【図５】ピチア・パストリス用発現プラスミドｐＰＩＣＺα／ＲＬＥの構築を示す模式図である。
【図６】シゾサッカロマイセス・ポンベ用発現プラスミドｐＴＩ１ＯＳＲＬＥの構築を示す模式図である。
【図７】シゾサッカロマイセス・ポンベ用発現プラスミドｐＴＩ１Ｐ４ＲＬＥの構築を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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