(57)【要約】【課題】簡便な操作による、転写因子の活性化状態を効率よく、高感度かつ網羅的に検出するための方法の提供。【解決手段】検体中の転写因子の活性化の程度を解析するための方法であって、検体ごとに異なる標識物質によって標識されたプローブを各検体に添加する工程、転写因子と結合したプローブのみを回収する工程、前記回収されたプローブを、単一のプレート上でハイブリダイゼーションした後に、前記各標識物質を検出する工程を含む、前記方法。【選択図】    図２
2004159609.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の転写因子の活性化の程度を解析するための方法であって、検体ごとに異なる標識物質によって標識されたプローブを各検体に添加する工程、転写因子と結合したプローブのみを回収する工程、前記回収されたプローブを、単一のプレート上でハイブリダイゼーションした後に、前記各標識物質を検出する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
プローブを標識する物質が、蛍光物質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
蛍光物質が、Ｃｙａｎｉｎｅ３、Ｃｙａｎｉｎｅ５、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、Ｃｙａｎｉｎｅ７およびフルオレセイン−４−イソチオシアネートからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
検体が２種であり、各検体に対する標識物質の一方がＣｙａｎｉｎｅ３であり、他方がＣｙａｎｉｎｅ５である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
転写因子と結合したプローブを回収する工程が、ゲルシフトアッセイを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
各標識物質を検出する工程が、競合的ハイブリダイゼーションである、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
競合的ハイブリダイゼーションが、オリゴマイクロアレイプレート上において行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
オリゴマイクロアレイプレート上のオリゴマーが、ＤＮＡおよび／またはＰＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プローブが、ｄｓＤＮＡである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
プローブが、ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
２種以上の標識物質、転写因子と結合したプローブのみを回収するための手段および標識物質を検出するための手段を含む、検体中の転写因子の活性化の程度を解析するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な転写因子解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年ヒトゲノムの完全解読がほぼ完了し、体系的な遺伝子機能解析が可能になった。さらに、新規遺伝子に対応したタンパク質発現ライブラリー化の試みもなされていることから、今後はタンパク質の機能解明のための材料供給の問題は次第に解決され、プロテオーム解析の重要性が一層高まるものと考えられる。
【０００３】
タンパク質−タンパク質間の結合解析は各タンパク質の機能を探る上で多くの有益な情報を与えるものである一方、各タンパク質の発現制御を見る方法としては、現在はｍＲＮＡの存在を調べるＤＮＡチップ技術があるにすぎない。また、遺伝子やタンパク質の発現を網羅的に解析することを目指したＤＮＡ−タンパク質結合解析は行われていないに等しい。したがって、実際の生体内でのタンパク質発現制御解析を進める上で、ｍＲＮＡの転写の引き金となるＤＮＡとタンパク質結合解析の技術開発が必要とされている。すなわち、転写活性を制御する転写因子の活性化状態を見る転写因子（ＴＦ）解析が考案されている。
【０００４】
転写因子とは、遺伝子のプロモーター内にある、特定のＤＮＡ結合部位と相互作用することによって遺伝子の発現を制御しているタンパク質である。一般的なヒトの細胞には２０００種類を超える転写因子が存在すると考えられているが、現在までに判明している転写因子は、そのうちのわずか１０〜２０％にすぎない。
【０００５】
転写因子解析は、転写因子と結合したプローブＤＮＡを定量することによって行われる。これらの転写因子解析に使われるプローブＤＮＡを検出する方法として、ＤＮＡ−ＤＮＡの結合を調べる種々の方法が存在するが、将来的に解析の数が増えた場合においても、最近確立されたマイクロアレイ技術（例えば非特許文献１〜３参照）を用いることで多検体解析が可能となると考えられている。
【０００６】
また、転写因子解析には、転写因子とプローブとの結合量をもとに算出される数値データより、最終的には転写因子の活性化状態を解析することが必須である。この網羅的な転写因子の活性化状態の解析技術の例として、ゲルシフトアッセイとメンブレンアレイを組み合わせた方法が既に存在する（例えば非特許文献４〜６参照）。
【０００７】
この方法は、ビオチンラベルを行ったプローブＤＮＡの混合物（種々の転写因子に対する特異プローブの混合物）と検体細胞の核抽出物とをあらかじめ混合し、転写因子と結合したプローブＤＮＡをゲルシフトアッセイにより非結合のプローブと選り分け、その後にあらかじめ各プローブＤＮＡに対応する合成オリゴ（ターゲットという）が張り付いたメンブレンフィルターとハイブリダイズし、最終的に存在するビオチン量を化学発光体をラベルしたアビジンと結合することにより間接的に測定し定量するものである（図１）。最終的に得られたスポットのシグナル強度は、ビオチンラベルＤＮＡプローブの存在量に比例するので、比較したい別々の検体のデータ（２枚のメンブレン）のシグナル強度を比較することによって、転写因子の活性化状態の比較が行われる。
【０００８】
しかし、ビオチンを用いたこの方法は、メンブレン上のターゲットとプローブとの反応のために最低１日のハイブリダイゼーションが必要であったり、その後のプローブ末端に存在するビオチンの量を定量するためにアビジンとの反応を行い、さらに発色反応を行わなくてはならない、など煩雑な操作を経るため解析結果を得るまでに約３日を要する。
【０００９】
また、当該従来法においては、一発光物質のみを用いて検出を行うため、結果のアウトプットが別々のメンブレンになされ、異種細胞からの検体などの二者を最終的に比較したい場合に誤差が生じやすいという欠点もある。
【００１０】
生体内における転写因子の活性化状態を測定する上で非常に重要となる点は、微細な変化をいかにモニタリングできるかにある。したがって、誤差による影響が大きいビオチンのみを用いる方法は、かかる点において、転写因子の活性化状態を詳細にモニタリングするには、必ずしも十分な検出感度を有しているとは言い難い。
【００１１】
なお、生体内における転写因子の解析のための別法として、抗体を用いる方法も考案されている（例えば非特許文献７および８参照）。しかし、この方法では、単に転写因子の量の相対的な比較が行われるのみであって、網羅的な転写因子の活性化状態の解析は不可能である。すなわち、この方法は、最終的な遺伝子発現のみの解析と軌を一にするものにすぎない。
【００１２】
【非特許文献１】「マイリア（登録商標）」（”ＭｙｒｉａＴＭ”）、商品カタログ、（米国）、パノミクス社（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、２００１年、ｐ．１〜１５
【非特許文献２】クルビラ・エフ・ジーら（Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ  ＦＧ  ｅｔ  ａｌ．）  「多様性を志向した合成によるグルコースシグナリングの遮断および小分子マイクロアレイ」”Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．”  「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）  ２００２年  ４月１１日；第４１６巻（第６８８１号）：ｐ．６５３〜７。
【非特許文献３】デボー・エフら（Ｄｅｖａｕｘ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．）  「トランスクリプトーム、転写活性化因子およびマイクロアレイ」”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ，  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ”  「エフ・イー・ビー・エス・レット（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ）」  ２００１年６月８日；第４９８巻（第２〜３号）：ｐ．１４０〜４。
【００１３】
【非特許文献４】「トランスシグナル（登録商標）」（”ＴｒａｎｓＳｉｇｎａｌＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  Ａｒｒａｙ”）、商品カタログ、（米国）、パノミクス社（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）、２００１年、ｐ．１〜２
【非特許文献５】ビンギ・リン（Ｂｉｎｇｈｕｉ  Ｌｉｎ）「ヒト組み換えＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）を用いたゲルシフト解析：ポリｄ（Ｉ−Ｃ）の特異的複合体形成に対する影響」（”Ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＰ１（ｃ−ｊｕｎ）：  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｏｌｙ  ｄ（Ｉ−Ｃ）  ｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”）［ｏｎｌｉｎｅ］、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、［平成１４年９月２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｐｈｏｎｏｔｅｓ／３７／３７＿１４／３７＿１４．ｈｔｍ＞
【非特許文献６】「ゲルシフトアッセイシステム」（”Ｇｅｌ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ”）［ｏｎｌｉｎｅ］、プロメガ株式会社  テクニカルサービス部、［平成１４年９月２日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏ．ｊｐ＞
【００１４】
【非特許文献７】「マーキュリ（登録商標）トランスファクタキット」（”ＭｅｒｃｕｒｙＴＭ  ＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ”）、商品カタログ、（米国）、クローンテク社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ．）、２００１年４月、ｐ．１〜２
【非特許文献８】「マーキュリ（登録商標）トランスファクタキットユーザーマニュアル」（”ＭｅｒｃｕｒｙＴＭ  ＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ”）、商品カタログ、（米国）、クローンテク社（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、２００２年４月、ｐ．１〜１８
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、簡便な操作によって、転写因子の活性化状態を効率よく、高感度かつ網羅的に検出するための方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、驚くべきことに、プローブの標識物質を改変することによって上記課題が解決されることを見出し、さらに研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、検体中の転写因子の活性化の程度を解析するための方法であって、検体ごとに異なる標識物質によって標識されたプローブを各検体に添加する工程、転写因子と結合したプローブのみを回収する工程、前記回収されたプローブを、単一のプレート上でハイブリダイゼーションした後に、前記各標識物質を検出する工程を含む、前記方法に関する。
【００１７】
また、本発明は、プローブを標識する物質が、蛍光物質である、前記方法に関する。
さらに、本発明は、蛍光物質が、Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）、Ｃｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５（Ｃｙ５．５）、Ｃｙａｎｉｎｅ７（Ｃｙ７）およびフルオレセイン−４−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される、前記方法に関する。
また、本発明は、検体が２種であり、各検体に対する標識物質の一方がＣｙ３であり、他方がＣｙ５である、前記方法に関する。
【００１８】
また、さらに本発明は、転写因子と結合したプローブを回収する工程が、ゲルシフトアッセイを含む、前記方法に関する。
【００１９】
さらにまた、本発明は、各標識物質を検出する工程が、競合的ハイブリダイゼーションである、前記方法に関する。
また、本発明は、競合的ハイブリダイゼーションが、オリゴマイクロアレイプレート上において行われる、前記方法に関する。
さらに、本発明は、オリゴマイクロアレイプレート上のオリゴマーが、ＤＮＡおよび／またはＰＮＡを含む、前記方法に関する。
【００２０】
また、本発明は、プローブが、ｄｓＤＮＡである、前記方法に関する。
さらに、本発明は、プローブが、ＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドである、前記方法に関する。
そして、本発明は、２種以上の標識物質、転写因子と結合したプローブのみを回収するための手段および標識物質を検出するための手段を含む、検体中の転写因子の活性化の程度を解析するためのキットに関する。
【００２１】
本発明においては、個別に検出可能な標識物質を単一のプレートにおいて検出することによって、転写因子と結合したプローブの解析を行えるため、複数検体を対象として、測定誤差が小さく、かつ検出感度が高い解析を効率的に行うことができる。
【００２２】
また、本発明の方法において、標識物質として相互に異なる蛍光波長を有する蛍光物質を用いれば、転写因子と結合したプローブの解析をより高感度で行うことができる。
【００２３】
また、本発明の方法においては、転写因子に結合したプローブのみの回収を、ゲルシフトアッセイのような簡便な従来法によって行うことができる。
さらに、本発明の方法においては、競合的ハイブリダイゼーションを用いることによって、転写因子の活性化状態を測定することが容易になる。
本発明においては、競合的ハイブリダイゼーションをオリゴマイクロアレイプレート上において行うことができるため、多検体の同時アッセイを容易に行うことができる。また、オリゴマイクロアレイプレートに固定化するオリゴマーとして、ＤＮＡのみならずＰＮＡも用いることによって、より正確なアッセイを行うことができる。
【００２４】
また、本発明の方法において、プローブとしてＤＮＡ／ＰＮＡハイブリッドを用いれば、転写因子と核酸オリゴマーとの特異的結合のみの検出をより高感度で行うことが容易になるため、転写因子の活性化状態の測定をより高感度で行うことが可能になる。
さらに、本発明のキットを用いれば、検体中の転写因子の活性化の程度の解析を、極めて簡便かつ効率的に、しかも高感度で行うことができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の方法は、
ａ）プローブの標識物質によるラベリング、
ｂ）前記ラベルプローブの検体への添加、
ｃ）結合プローブの回収、および
ｄ）転写因子の活性化の程度の測定
の各工程を含む。
【００２６】
本発明において用いられる標識物質は、各検体ごとに検出可能なものであれば特に制限されない。例えば、ビオチン−アビジンに感作した化学発光体（ジゴキシゲニンＤＩＧなど）および蛍光物質などが含まれる。Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７およびＦＩＴＣなどの相互に異なる蛍光波長を有する蛍光物質を用いれば、検体中の転写因子の活性化の程度の測定を競合的ハイブリダイゼーションなどの手法を用いて、１枚のプレートによって行うことが容易になるため好適である。Ｃｙ３およびＣｙ５は、ラベリングが容易であるため特に好適である。ラベリングの方法は特に限定されず、例えば、プライマー合成時にあらかじめ５’−端に導入する場合や、ＰＣＲ反応を行う時にＣｙ３−ｄＮＴＰ、Ｃｙ５−ｄＮＴＰを用いて導入する場合などによって行われる。
【００２７】
なお、プローブとして、従来法のようにｄｓＤＮＡを用いることもできるが、ＤＮＡ／ＰＮＡのハイブリッドを用いれば、細胞内タンパク質中に含まれる種々の修飾酵素による切断および熱や溶媒に対する耐性を高めることができ、安定的な転写因子の結合解析が容易になるため好適である。
【００２８】
ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ペプチド核酸）とは、アミノ酸誘導体のＮ‐（２−アミノエチル）グリシンがペプチド結合することにより、糖リン酸バックボーンをポリアミドに置換した核酸類似体である。すなわち、ＰＮＡは、ＤＮＡやＲＮＡが塩基・五炭糖・リン酸という成分で構成され、五炭糖とリン酸がリン酸ジエステル結合により連結されて背骨構造（糖リン酸バックボーン）を形成するのに対して、前記Ｎ‐（２−アミノエチル）グリシン分子が、核酸と同様にらせん構造をとり、さらに塩基と骨格構造との立体的距離や結合している各塩基間の距離がＤＮＡやＲＮＡと同じになるように設計されている分子である。
【００２９】
前記のような構造を有するため、ＰＮＡはＤＮＡやＲＮＡと相補的に結合することができる。また、オリゴＰＮＡと同様に、アミノ酸がペプチド結合により連なるタンパク質を分解する生体内ヌクレアーゼに対して、ＰＮＡは完全耐性を有するという特性も併せ持っている。したがって、プローブとしてＤＮＡ／ＰＮＡのハイブリッドを用いれば、転写因子の活性化状態を、高感度で、かつ高精度で検出することが容易になる。
【００３０】
ラベルプローブを検体に添加、混合し、適切な条件下にてインキュベーションすることによって、前記プローブと転写因子との結合を行わせる（工程ｂ））。その後、前記ｄ）転写因子の活性化の程度の測定を行うが、その前に転写因子と結合したプローブのみの回収を行うことによって、活性化された転写因子のみの定量が可能になる（工程ｃ））。
該転写因子と結合したプローブの回収のための方法は特に限定されないが、例としてゲルシフトアッセイが挙げられる。また、スピンカラム（ゲルろ過カラム等）を用いたタンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡ分離方法などによる回収方法も可能である。
【００３１】
ゲルシフトアッセイとは、転写因子の活性化状態、つまり転写因子が特定の塩基配列に結合することを見る方法として、従来から行われている方法である。具体的には、寒天ゲル内またはアクリルアミドゲル内を転写因子とプローブＤＮＡの結合体が泳動されるときに、転写因子の結合していないＤＮＡよりも転写因子と結合したＤＮＡ分子の泳動距離が短くなることを利用した方法で、転写因子とＤＮＡの結合状態を観察する場合に簡易的に行える方法である。
【００３２】
従来ゲルシフトが確認されていたのは、ビオチンラベルを行ったプローブＤＮＡのみであった。しかし、本発明の方法においては、蛍光物質によってラベルしたプローブＤＮＡにおいてもゲルシフトの確認が可能であるという新たな事実に基づき、プローブＤＮＡの蛍光物質によるラベリングが行われる。
【００３３】
転写因子の活性化の程度は、前記回収されたプローブを単一のプレートにハイブリダイゼーションした後に、転写因子に結合したプローブの量を、それに結合せしめた標識物質の量を定量することによって測定される。この目的には、従来の転写因子解析に使われるプローブＤＮＡを検出する方法である、ＤＮＡ−ＤＮＡの結合を見る種々の方法を用いることができる（例えば、ゲルシフトアッセイ、表面プラズモン共鳴を用いた分子間結合解析など）。これらの検出は、各検体ごとに非競合的に行ってもよいが、競合的ハイブリッドなどのマイクロアレイ技術は、多検体を同時にアッセイできるため好適である。オリゴマイクロアレイプレートを用いれば、競合的ハイブリッドを簡便に行うことができるため、特に好適である。
【００３４】
なお、オリゴマイクロアレイプレートに用いるオリゴマーとしては、ＤＮＡが用いられるが、結合のミスマッチの低減、より高感度の解析等の観点から、ＰＮＡまたはＰＮＡを含むもの等を適宜用いることもできる。
【００３５】
本発明の一態様を、図２に模式化して示した。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明につき、実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を説明するものであって、いかなる意味においても限定するものではない。
【００３７】
（実施例１）
（１）蛍光標識プローブの作製
転写因子であるＮｆｋａｐｐａＢが結合しうる蛍光標識ｄｓＤＮＡプローブを以下のように作製した。
2004159609.tif 000003
上記プライマーをＣｙ３−ＮｆｋａｐｐａＢとＮｆｋａｐｐａＢ−ｒまたはＣｙ５−ＮｆｋａｐｐａＢとＮｆｋａｐｐａＢ−ｒとで等量（等モル数）ずつ混合し、９５℃  １０ｍｉｎ、９０℃  ５ｍｉｎ、８５℃  ５ｍｉｎ、８０℃  ５ｍｉｎ、７５℃  ５ｍｉｎ、７０℃  ５ｍｉｎ、６５℃  ５ｍｉｎ、６０℃  ５ｍｉｎ、５５℃  ５ｍｉｎ、５０℃  ５ｍｉｎ、４５℃  ５ｍｉｎ、４０℃  ５ｍｉｎ、３５℃  ５ｍｉｎ、３０℃  ５ｍｉｎ、２５℃  ５ｍｉｎ、４℃  ３０  ｍｉｎの反応を行うことによって、ｄｓＤＮＡプローブを作製した。
【００３８】
（２）Ｃｙ３ラベルおよびＣｙ５ラベルの転写因子結合プローブを用いたゲルシフトアッセイ
Ｃｙ３−ＮｆｋａｐｐａＢとＮｆｋａｐｐａＢ−ｒまたはＣｙ５−ＮｆｋａｐｐａＢとＮｆｋａｐｐａＢ−ｒのｄｓＤＮＡをＮｆｋａｐｐａＢタンパク質と結合反応を行った後、アクリルアミドゲル電気泳動を行いゲルシフトすることを確認した（図３）。この結果、Ｃｙ３またはＣｙ５ラベルのプローブＤＮＡであっても、従来通りゲルシフトの確認は可能であることが明らかになった。ゲルは３％アクリルアミドゲル（０．５×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ）を用いた。また泳動用ｂｕｆｆｅｒは０．５×ＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒを用いて行った。
【００３９】
（３）マイクロアレイの作製
各転写因子に対応する（結合する）シスエレメントの配列は以下の通りであった。
2004159609.tif 000004
【００４０】
2004159609.tif 000005
【００４１】
2004159609.tif 000006
【００４２】
2004159609.tif 000007
【００４３】
（４）マイクロアレイによる転写因子結合性プローブの検出
各転写因子結合性配列の蛍光標識ｄｓＤＮＡプローブは、Ｃｙ３ラベルのプローブとその相補鎖配列を持つＲｅｖｅｒｓｅオリゴないしは、Ｃｙ５ラベルのプローブとその相補鎖配列を持つＲｅｖｅｒｓｅオリゴとを、前記の方法により結合することで行った。一方、オリゴアレイ（スライドガラス上へのオリゴのスポッテイング）は、各転写因子結合性配列のＲｅｖｅｒｓｅオリゴおよび、Ｍｕｔａｔｉｏｎオリゴを以下の方法でスポッテイングすることで行った。すなわち、各オリゴ溶液の濃度を６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ（３×ＳＳＣ緩衝液となるようにした）となるように調整し、市販のオリゴアレイ用スライドガラス（コーニング社）にＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ４１７ｓｌｉｄｅ  ａｒｒａｙｅｒを用いてスポッテイングした。スポット後のスライドガラスに紫外線を当てることでオリゴの固定化を行った。Ｃｙ３ラベルのプローブとＣｙ５ラベルのプローブは図４に示す混合比でハイブリダイゼーション溶液（３×ＳＳＣ、０．６％  ＳＤＳ）に加え、オリゴのスポットされたスライドガラスとカバーガラスの間に流し込み、湿室状態に保ちながら、４２℃にて一晩反応させた。その後スライドガラスを洗浄し、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  （Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ）で各スポット上の蛍光強度を読み取ることで、プローブの存在量を計測した。
【００４４】
その結果、下記表１および図４に示す結果が得られた。すなわち、Ｃｙ３ラベルのＥＢＮＡプローブとＣｙ５ラベルのＥＢＮＡプローブとを等量混合した場合のＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度比を同一にした場合には、例えばＣｙ３ラベルのｐ５３は蛍光が確認できるが、プローブを添加していないＣｙ５ラベルの蛍光は全く確認できなかった（Ｃｙ５／Ｃｙ３＝０．０４４０）。逆にＡＰ−１では、プローブを添加していないＣｙ３ラベルの蛍光は確認できないが、Ｃｙ５ラベルの蛍光は確認できた（Ｃｙ５／Ｃｙ３＝１５．６）。さらに、ＮＦｋＢではＣｙ３：Ｃｙ５の比を１：３になるように混合しているので、その蛍光強度も３倍になるように検出可能であった（Ｃｙ５／Ｃｙ３＝３．００）。
また、用いるプローブ量が高い濃度であるとそれぞれの蛍光強度も強まるため、Ｍｕｔａｔｉｏｎオリゴとの反応も検出されるが、適宜プローブ量を減少させることによって、Ｍｕｔａｔｉｏｎオリゴとの非特異的結合も除外できることが判明した（図４）。
【００４５】
【表１】
2004159609.tif 000008
【００４６】
以上の結果から、用いるプローブの存在量に依存した競合的ハイブリダイゼーションが各転写因子において確認され、よって本方法により転写因子に結合するオリゴの存在比を検出し得ることが明らかになった。
【００４７】
（実施例２）マイクロアレイを用いた細胞内転写因子の活性比較
前記の方法により、実際に細胞から回収した２種類の核抽出液中に存在する転写因子の活性化状態の比較を行った。すなわち、Ｓａｏｓ２細胞中のｐ５３タンパク質はＨＬ６０細胞中のｐ５３に比べて、転写因子としての活性化状態が低いことが知られている。そこでＳａｏｓ２細胞およびＨＬ６０細胞よりそれぞれ核抽出物を回収し、Ｓａｏｓ２の核抽出物はＣｙ３ラベルのプローブ混合物と、ＨＬ６０の核抽出物はＣｙ５ラベルのプローブ混合物と混合することで反応させ、それぞれゲルシフト法によりシフトしたプローブを回収した。この時あらかじめそれぞれの核抽出物にＥＢＮＡタンパク質を同量加えコントロールとした。回収されたＣｙ３ラベルのプローブとＣｙ５ラベルのプローブとを混合し、前記と同様にガラススライドを用いて検出を行った（図５参照）。
【００４８】
ＥＢＮＡの蛍光強度を一定となるようにして解析を行った結果、予想通りＳａｏｓ２細胞のｐ５３、ＡＰ−１、ＮＦｋＢの転写活性がＨＬ６０よりも低いことが判明した（図５および図６）。このことから、本方法により多検体の転写因子の活性化状態を競合的ハイブリダイゼーションによりモニタリングできることが示された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明のよれば、従来法より簡便な操作によって、転写因子の活性化状態を効率よく、高感度かつ網羅的に検出することが可能になる。したがって、本発明は、遺伝子病の診断および治療、ならびに新規医薬活性化合物の安全性評価に利用することができ、関連産業に資するところ大である。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来の転写因子解析法の模式図である。
【図２】本発明の転写因子解析法の一態様の模式図である。
【図３】Ｃｙ３ラベルおよびＣｙ５ラベルの転写因子結合プローブを用いたゲルシフトアッセイの結果を示す写真図である。
【図４】マイクロアレイによる転写因子結合性プローブの検出を示す写真図である。
【図５】マイクロアレイを用いた細胞内転写因子の活性比較を示す写真図である。
【図６】マイクロアレイを用いた細胞内転写因子の活性比較を、蛍光強度の数値化によって示す図である。
【図１】
2004159609.tif 000009
【図２】
2004159609.tif 000010
【図３】
2004159609.tif 000011
【図４】
2004159609.tif 000012
【図５】
2004159609.tif 000013
【図６】
2004159609.tif 000014