(57)【要約】【課題】従来の技術で知られていない新たな物質を有効成分とした臓器の移植・手術などに幅広く応用できる動物細胞の新規な保護剤およびその保護方法を提供すること。【解決手段】本発明の細胞保護剤は、メチル化カテキン誘導体を有効成分としたこれまでにない全く新しい細胞保護剤であり、動物細胞の培養培地にメチル化カテキン誘導体を添加させることにより、保存後の細胞生存率を向上でき、さらには臓器の移植・手術などに幅広く応用できるものである。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表されるメチル化カテキン誘導体を有効成分とする動物細胞保護剤。
【化１】
2004337110.tif 000013
2004337110.tif 000014
［式中Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはメチル基を、他は水素を示す］
【請求項２】
一般式（２）で表されるメチル化カテキン誘導体を有効成分とする動物細胞保護剤。
【化２】
2004337110.tif 000015
2004337110.tif 000016
［式中Ｒ３はメチル基を示す］
【請求項３】
有効成分として一般式（１）あるいは一般式（２）で表されるメチル化カテキン誘導体を含む細胞保護剤を使用する動物細胞の保護方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、メチル化カテキン誘導体を有効成分とする動物細胞保護剤およびその保護方法に関する。より詳しくは、本発明は、人または動物の組織から単離した細胞に対し、有効成分として一般式（１）［式中Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはメチル基、他は水素を示す］で表されるメチル化カテキン誘導体、なかでも一般式（２）［式中Ｒ３はメチル基を示す］で表されるメチル化カテキン誘導体を添加することにより、細胞障害を抑制することができ、再生医学の進歩に大きく貢献できるものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年の外科的術式や免疫抑制剤などの進歩に伴って移植手術の症例が増加しているが、その一方で様々な問題が残されているのが現状である。その問題の一つに移植臓器の機能障害があげられ、これは、移植をおこなう際に虚血および血流再開時に生ずるフリーラジカルが引き金となり、生体膜の脂質過酸化が促進され、生体膜障害が起こることが原因とされている。よって、このような障害を防ぎ、安定した状態で臓器を保存させるために、細胞の生存率を維持することができる細胞保護剤が必要不可欠となる。
【０００３】
このような事情から、従来より細胞を保存する方法が種々提案されており、現在、低温保存法による細胞保存がさかんに行われている。しかしながらこの低温保存をおこなうと、ナトリウムイオンまたはカルシウムイオンの平衡維持能の破壊、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生、ミトコンドリアの機能不全などが引き起こされ、問題とされている。
【０００４】
従来の細胞を保存する技術として、カテキン類を有効成分として利用した細胞や臓器を保存する技術が開示されている（下記の特許文献１を参照）。
【０００５】
一方、近年、花粉症の劇的な増加が大きな社会問題となっているが、メチル化カテキン誘導体は花粉症などに対し優れた抗アレルギー作用をもつことが知られている（下記の特許文献２を参照）。このようにメチル化カテキン誘導体には上記のような優れた作用をもつことが知られるようになってきている。
【０００６】
【特許文献１】
特開２０００−３４４６０２号公報
【特許文献２】
特開２０００−１５９６７０号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらメチル化カテキン誘導体を用いて細胞を保護しようとする技術はこれまでまったく示唆されていない。そこで本発明は、動物細胞の培養培地にメチル化カテキン誘導体を添加させることにより、保存後の細胞生存率を向上できる動物細胞保護剤およびその保護方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち請求項１記載の本発明は、一般式（１）で表されるメチル化カテキン誘導体を有効成分とする動物細胞保護剤である。
【０００９】
【化３】
2004337110.tif 000002
2004337110.tif 000003
［式中Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも一つはメチル基、他は水素を示す］
【００１０】
請求項２記載の本発明は、一般式（２）で表されるメチル化カテキン誘導体を有効成分とする動物細胞保護剤である。
【００１１】
【化４】
2004337110.tif 000004
2004337110.tif 000005
［式中Ｒ３はメチル基を示す］
【００１２】
請求項３記載の本発明は、有効成分として一般式（１）あるいは一般式（２）で表されるメチル化カテキン誘導体を含む細胞保護剤を使用する動物細胞の保護に適用する方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるカテキンの基本骨格は下記の一般式（３）で表される。
【００１４】
【化５】
2004337110.tif 000006
2004337110.tif 000007
【００１５】
これらカテキンの立体配置に関して、ベンゾピラン環の２位と３位はそれぞれＲ配置またはＳ配置のいずれであってもよい。本発明に用いるカテキンとしては（＋）あるいは（−）−カテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−エピカテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−ガロカテキン３−Ｏ−ガレート、（＋）あるいは（−）−エピガロカテキン３−Ｏ−ガレートがあげられる。
【００１６】
本発明の動物細胞保護剤は、一般式（１）あるいは一般式（２）で表されるメチル化カテキン誘導体を有効成分とするものである。
【００１７】
【化６】
2004337110.tif 000008
2004337110.tif 000009
【００１８】
【化７】
2004337110.tif 000010
2004337110.tif 000011
【００１９】
本発明のメチル化カテキン誘導体は一般式（１）の中のＲ１〜Ｒ４の少なくとも一つがメチル基で他は水素であり、好ましいのはＲ３およびＲ４の少なくとも一つがメチル基で他は水素であり、さらに好ましいのは一般式（２）の中のＲ３がメチル基である。これらメチル化カテキン誘導体を単独で用いても、あるいはそれらの混合物として用いても、いずれであってもよい。
【００２０】
本発明のメチル化カテキン誘導体は、茶葉、例えば‘青心大ぱん’、‘べにほまれ’、‘べにふじ’、‘べにふうき’などの茶葉、好ましくは乾燥茶葉を水系溶剤で抽出して得られるポリフェノール画分から分離、採取することができる。また、本発明のメチル化カテキン誘導体は化学合成的手法によっても得ることができ、カテキン類を原料としてトリメチルシリルジアゾメタン、ジアゾメタン、ヨウ化メチルなどのハロゲン化メチル、硫酸ジメチル、炭酸ジメチルなどのメチル化試薬と反応させることにより大量調製が可能である。
【００２１】
本発明の好ましい態様としては、本発明のメチル化カテキン誘導体を有効成分として用いる保護剤を、通常細胞培養として用いられている種々の培養液に添加する。本発明に使用される培養液は公知のものが使用され、例えばＨｏｒｍｏｎ−Ｆｒｅｅ−Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ（ＨＦＳＦ）培地、Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｅｒ（ＣＢ）培地、Ｈｏｒｍｏｎ−Ｆｒｅｅ−Ｓｅｒｕｍ−Ａｄｄｅｄ（ＨＦＳＡ）培地などが使用可能であるが、カテキンの細胞内取り込みを考慮するとＨＦＳＡ培地を使用するのが好ましい。
【００２２】
本発明の保護剤の有効成分とは、カテキン誘導体の純度に関係なくすべてが包含されるが、高純度であればより効果的である。
【００２３】
本発明の保護剤を動物細胞の保護に使用する場合、これまで種々の細胞培養に用いられている各種培養液に、カテキン誘導体を通常は０．０１〜１００ｍＭ添加、好ましくは０．０５〜１０ｍＭ、さらに好ましくは０．１〜５ｍＭ添加する。
【００２４】
これらの培養液に、さらに他の抗酸化剤であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ビタミンＥ、ビタミンＣ、グルタチオン、カロチノイド、フラボノイド、糖類、鉄キレート剤、尿酸、アルブミンなど、さらには凍結防止剤であるジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコールなども併用することができる。
【００２５】
本発明の保護剤を使用する条件として、適用温度は０〜３７℃であることが好ましい。
【００２６】
本発明における動物細胞には、人または動物の組織から単離した幹細胞、皮膚細胞、粘膜細胞、肝細胞、膵島細胞、神経細胞、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨細胞、筋細胞などが含まれる。
【００２７】
本発明では細胞生存率を向上できる物質を見出したことで、従来の細胞保護液にこの物質を添加することにより、細胞障害を抑制することができ、ひいては臓器の移植・手術に利用することができ、再生医学の進歩に大きく貢献することができる。
【００２８】
以下に実施例をあげ、本発明をさらに詳しく説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２９】
【実施例】
（実施例１）雄性ＳＤラットの肝細胞をコラゲナーゼ潅流法により単離し、ポリスチレンプレート（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で細胞を播種し、５％ＣＯ２・３７℃の条件下においてＢ培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、ペニシリンＧ１００Ｕ／ｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢ５０ｎｇ／ｍｌ、アプロチニン１００ｎｇ／ｍｌ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）、１０％のウシ胎児血清（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、インシュリン１ｎＭ、デキサメタソン１ｎＭ）で６時間培養し、Ｂ培地からＡ培地（Ｂ培地からインシュリン、デキサメタソンを除いたもの）に置き換えさらに６時間培養を続けた。
【００３０】
この細胞を一晩初代培養した後、１０％（ｖ／ｖ）の３”−Ｏ−メチル−エピガロカテキンガレート（３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇ）溶液（純度９５％）を含むＡ培地に置き換え、前培養を４時間おこなった。コントロールとして３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇの代わりに１０％（ｖ／ｖ）の水を添加し同様に前培養した。
【００３１】
前培養した肝細胞を遠心分離にかけ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄した（１２００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）。３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇを各濃度添加したＡ培地およびコントロールのＡ培地中に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で細胞を懸濁させ、チューブを氷上（４℃）で２４時間低温保存させた。
【００３２】
低温保存後このチューブを取り出し、３７℃の恒温槽で１時間培養後、培養した肝細胞を遠心分離にかけ、ＰＢＳで洗浄した（１２００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）。そして細胞をプレートに播種し、細胞生存率の測定をおこなった。また、低温保存した肝細胞を３７℃の恒温槽でさらに２４時間培養し、同様に細胞生存率の測定をおこなった。細胞生存率の測定はＭＴＴアッセイ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）によりおこなった。低温保存前のコントロールの細胞生存率を１００％として表し、低温保存から１時間後および２４時間後の各保存液による細胞生存率を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2004337110.tif 000012
【００３４】
表１より、３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇを添加させた場合の細胞生存率は、保存操作後のコントロールと比較して高い値を示した。また、３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇの濃度に依存して細胞生存率も高くなり、３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇの濃度が高いほど効果も高くなることがわかった。
【００３５】
また２４時間培養後の細胞生存率は全体的に若干低下するものの、３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇを０．４ｍＭ添加した場合の細胞生存率は保存操作前のコントロールより高く維持されていた。
【００３６】
この結果より、培養培地に３”−ＯＭｅ−ＥＧＣｇを添加させることにより、細胞生存率を向上できることが示唆される。
【００３７】
【発明の効果】
本発明の細胞保護剤は、メチル化カテキン誘導体を有効成分としたこれまでにない全く新しい細胞保護剤であり、臓器の移植・手術などに幅広く応用でき、再生医科学の進歩に大きく貢献できるものである。