(57)【要約】【課題】リボフラビンを生産し、プロリン類似体に対して耐性を有するバチラス・サブチリス及び前記微生物を用いてリボフラビンを生産する方法を提供する。【解決手段】バチラス・サブチリスは、プロリン類似体に対して耐性を有するために菌体内のプロリン合成が増加して浸透圧耐性が強化されることによってリボフラビンを高濃度及び高収率で生産できる。したがって、本発明は前記微生物を培養し、その培養物からリボフラビンを大量で収得できる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボフラビンを生産し、プロリン類似体に対して耐性を有する、バチラス・サブチリス(Bacillus subtilis)。
【請求項２】
CJKB0001(KCCM-10445)である請求項１に記載のバチラス・サブチリス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のバチラス・サブチリスを培養する工程、およびその培養物よりリボフラビンを回収する工程を含む、リボフラビンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリボフラビンを生産する微生物及びこれを用いたリボフラビンの生産方法に係り、より詳細には母菌株に比べてリボフラビン生産能が向上したバチラス・サブチリス(Bacillus subtilis)変異株及び前記微生物を用いてリボフラビンを生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リボフラビン(ビタミンB2)は多種の微生物と全ての植物で生合成される水溶性ビタミンの一種である。しかし、人間を含む脊椎動物では生合成されない特性がある。リボフラビンは、全ての有機細胞体の酸化-還元反応に必要な粗酵素であるフラビンアデニンジヌクレオチド(flavin adenine dinucleotide、FAD)とフラビンモノヌクレオチド(flavin mononucleotide、FMN)の前駆物質であって人間を含む動物に必須栄養素である。リボフラビンが欠乏されれば口腔及び咽頭粘膜の炎症、皮膚炎症及びその他の皮膚損傷、結膜炎、視力減退、成長阻害及び体重減少などが誘発されうる。したがって、リボフラビンは前述したようなビタミン欠乏と関連した疾病の予防または治療のためのビタミン製剤及び家畜の成長のための飼料添加物として使われてきた。特に、濃縮状態のリボフラビンはそれ自体が飼料として使われてきた。現在リボフラビンの生産量は全世界的に年間3000トン規模であり、そのうち約75%が飼料添加剤として使われ、残りが食品及び医薬用として使われている。
【０００３】
現在、リボフラビンの生産方法としては、化学的合成法と微生物を用いた発酵法とが併用されている。通常、化学的合成法は、D-リボースのような前駆物質を用いて多段階の工程を経て高純度のリボフラビンを生産する方法である。前記化学的合成法は、その出発物質が高価であるために、コスト高となる短所があって微生物を用いた発酵法が開発された。微生物を用いた発酵法は、自然からリボフラビンを生産する微生物を分離するか、またはリボフラビンが過生産さるべく遺伝工学的方法または化学的・物理的方法で微生物の変異を誘導して適切な条件で培養した後、前記培養物からリボフラビンを分離する方法である。
【０００４】
前記リボフラビンを生産する微生物としては、サッカロマイセス(Saccharomyces)属とカンジダ(Candida)属に属する酵母、クロストリジウム(Clostridium)属、バチラス(Bacillus)属及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)属に属する細菌、並びにエレモテシウム(Eremothecium)属及びアシュビア(Ashbya)属に属する真菌などが知られている。
【０００５】
特許文献１には、酵母であるカンジダ・ファマタ(Candida famata)を用いたリボフラビンの製造方法が開示されており、また非特許文献１には、リボフラビン生合成関連酵素遺伝子が過発現さるべく操作されたバチラス・サブチリスとコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Coryebacterium ammoniagenes)を用いて各々4.5g/lと17.4g/lのリボフラビンを生産した例を報告したことがある。また、特許文献２には、組換えバチラス・サブチリスを用いたリボフラビンの生産方法が開示されたことがあり、特許文献３には、組換え技術を用いてバチラス・サブチリスにリブオペロンを有するベクターを導入することによって、リボフラビンの生産性を増加させた組換え菌株が開示されている。また、非特許文献2には、リボフラビンを生産する子嚢菌類であるエレモテシウム・アシュビー(Eremothecium ashbyii)及びアシュビア・ゴシピー(Ashbya gossypii)を報告し、非特許文献３には、糖蜜や植物油を主要炭素源とする栄養培地で子嚢菌類の変異株を培養して発酵液1リットル当り15gのリボフラビンを生産したことがある。その他、特許文献４には、前記アシュビア・ゴシピーを用いたリボフラビン生産と関連して開示されたことがある。
【０００６】
しかし、依然として産業的にリボフラビンを量産するにはリボフラビンの生産能が向上された微生物を開発する必要性がある。
【０００７】
一方、微生物を用いた発酵法において高濃度及び高収率で培養産物を収得するために浸透圧耐性を有する菌株が開発されている。前記浸透圧耐性を有する菌株は高濃度の炭素源が供給されるか、培養産物が蓄積されて菌体外部の浸透圧が増加しても菌体の生育と代謝が阻害されないために、さらに高収率の産物を生産できる特徴がある。かかる点に着眼して、本発明者らは、プロリン類似体耐性菌株を開発し、菌株のプロリン合成能を増加させて浸透圧耐性形質を強化することによって、高濃度及び高収率の5'-イノシン酸を生産する菌株を開発したことがある（特許文献５参照）。
【０００８】
【特許文献１】
米国特許第5,231,007号明細書
【特許文献２】
欧州特許第0821063号明細書
【特許文献３】
米国特許第5,837,528号明細書
【特許文献４】
国際公開第95/26406号パンフレット
【特許文献５】
大韓民国特許第330712号明細書
【非特許文献１】
Perkins et al.,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,22:8-18,1999
【非特許文献２】
Windholzet al.,The Merck Index, Merck & Co.,p1183,1983
【非特許文献３】
Bigelis,Biotechnology,vol.7b, p243,1989
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、リボフラビンを生産し、プロリン類似体に対して耐性を有することを特徴とするバチラス・サブチリスを提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記微生物を用いたリボフラビンの生産方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の一側面において本発明は、リボフラビンを生産し、プロリン類似体に対して耐性を有することを特徴とするバチラス・サブチリスを提供し、具体的には、本発明は、前記バチラス・サブチリスがバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)であることを特徴とする微生物を提供する。
【００１２】
本発明の他の側面において本発明は、前記微生物を培養し、その培養物からリボフラビンを生産する方法を提供する。
【００１３】
本発明者らは、リボフラビンの生産能が向上した微生物の研究中にバチラス・サブチリスにプロリン類似体に対して耐性を与えることによって、浸透圧に対する耐性を有し、リボフラビンを高濃度及び高収率で生産する変異株を選別し、これを用いてリボフラビンを高濃度で生産することによって本発明を完成した。
【００１４】
本発明に係るバチラス・サブチリス(Bacillus subtilis)においては、（１）リボフラビンを生産し、プロリン類似体に対して耐性を有する、バチラス・サブチリスであることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明に係るバチラス・サブチリスにおいては、（２）CJKB0001(KCCM-10445)である前記(1)に記載のバチラス・サブチリスであることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明に係る方法においては、（３）前記(1)または(2)に記載のバチラス・サブチリスを培養する工程、およびその培養物よりリボフラビンを回収する工程を含む、リボフラビンを生産する方法であることを特徴とする。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明に係るバチラス・サブチリスは、リボフラビンを生産するバチラス・サブチリスAS5の変異株であって、プロリン類似体に対して耐性を有するために菌体内プロリン合成が増加されて浸透圧耐性が強化されることによって、リボフラビンを高濃度及び高収率で生産する特徴がある。
【００１９】
大部分の細菌は、菌体外部の浸透圧が増加すれば、カルシウムイオンとオスモライトという有機性溶質を蓄積することによって、菌体内部の浸透圧を増加させて菌体の浸透的脱水現象を防止する。このようなオスモライトとしては、プロリン(L-proline)、グルタミン酸、糖及びN-メチル化アミノ酸誘導体などが知られている。その中、プロリンは浸透圧調節の重要な因子として知られている。文献にはブレビバクテリウムラクトフェルメンタム菌体外部の浸透圧が増加すれば、プロリン生合成経路の重要な酵素であるピロリン-5-カルボキシレート還元酵素の活性が増加して菌体内部にプロリンが蓄積されると報告されたことがある(Agr, Bio,Chem.,53(9):2475-2479,1989)。以外にも菌体外部の浸透圧により大腸菌、サルモネラ・チフィムリウム及びセラチア菌等でも菌体内部にプロリンが蓄積されたことが報告されたことがある(J.Bacteriol.,163:296,1985)。
【００２０】
したがって、本発明者らはバチラス・サブチリスAS5に浸透圧耐性を与えるために変異を誘導した後、高濃度のプロリン類似体が含まれている培地で生育可能なプロリン類似体に対して耐性を有する菌株を選別し、このうちリボフラビン生成能に最も優れた菌株を選別した。
【００２１】
前記プロリン類似体としては、3，4-ジヒドロプロリン、アゼチジンカルボン酸、チアプロリン、(S)-2，2-ジメチル-4-オキサゾリデカルボン酸、(S)-5，5-ジメチル-チアゾリドカルボン酸、(4S，2RS)-2-エチル-4-チアゾリジン-カルボン酸、(2S，4S)-4-ヒドロキシ-2-ピロリン-カルボン酸、2-ピペリジンカルボン酸及び2、5-ピロリジンジオンがある。本発明ではプロリン類似体としてチアプロリンを使用した。
【００２２】
前記母菌株として使用したバチラス・サブチリスAS5は、ロシアのバイオノム-エス社(BIONOM-S，LTD.ロシア、モスクワ、オボレンスク)から購入して使用した。
【００２３】
母菌株に変異を誘導する方法としては、当業界で公知された物理的または化学的方法を使用できる。例えば、物理的方法としては、X線または紫外線を使用でき、化学的方法としてはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)、ジエチルサルフェート及びエチルアミンなどの化学変異剤を使用できる。
【００２４】
本発明者らは、前記と同じ方法で変異が誘導された菌株をプロリン類似体が濃度別に含まれている培地で培養して高濃度のプロリン類似体の存在下で生育が可能な変異株を選別し、このうちリボフラビン生成能に最も優れた変異株1株を選別した。これをバチラス・サブチリスCJKB0001と命名し、韓国微生物保存センター(Korean Federation of Culture Collections)に2002年11月18日寄託番号KCCM-10445として寄託した。
【００２５】
本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)は、チアプロリンが70mg/lまで含まれた培地でも生育が可能な特性がある。これに対し、母菌株として使用したバチラス・サブチリスAS5はチアプロリンが40mg/l以下に含まれた培地で生育可能で、それ以上の濃度では生育不可能な特性がある。
【００２６】
したがって、本発明のバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)はプロリン類似体に対して耐性が与えられた菌株であって菌体外部に高濃度の溶質が蓄積されても菌体内部にプロリンを高濃度で蓄積して母菌株に比べてさらに効率よく浸透圧による菌体の生育及び代謝阻害を抑制することによって、高濃度のリボフラビンを培養液中に直接蓄積させうる特徴がある。
【００２７】
本発明者らは本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)をフラスコで培養した結果、母菌株であるバチラス・サブチリスAS5菌株に比べて約11%高い濃度の8.0g/lのリボフラビンを培地内に蓄積することを確認した。また、本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)を5リットル発酵槽で培養した結果、母菌株に比べて約19.6%高い26.8g/lの濃度を有するリボフラビンを培地内に蓄積することを確認した。
【００２８】
したがって、本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)は、母菌株に比べてプロリン類似体に対して耐性が向上した菌株であって浸透圧耐性が与えられることによってリボフラビン生産能が顕著に向上した菌株である。
【００２９】
リボフラビンの生産のために本発明のバチラス・サブチリスを適した条件下で培養する。
【００３０】
すなわち、本発明のバチラス・サブチリスを適当な炭素源、窒素源、及び無機化合物などが含まれた通常の培地内に接種し、好気条件下で所定の温度及びpHで培養する。前記炭素源としては、葡萄糖、糖蜜、ラクトース、サッカロース、マルトース、デキストリン、澱粉、マンニトール、ソルビトールまたはグリセロールを使用できる。望ましくは、葡萄糖または糖蜜とを使用する。前記窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種の無機窒素源やペプトン、NZ-アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、コーンスティープリカー（corn steep liquor）、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物のような有機窒素源を使用しうる。望ましくは、酵母抽出物及びコーンスティープリカーを使用する。前記無機化合物としては、燐酸1水素カリウム、燐酸2水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンまたは炭酸カルシウムなどを使用でき、その他に必要に応じてビタミン及び栄養要求性塩基などをさらに添加しうる。培養は好気的条件下で、例えば振とう培養または通気攪拌培養により30〜45℃の温度、望ましくは37〜40℃の温度で行う。培地のpHは培養する間に中性近くで保持することが望ましく、培養は2〜6日間行う。
【００３１】
本発明に係る一実施例では本発明のバチラス・サブチリス変異株CJKB0001を種培地に接種して空気を1vvmに供給しつつ37℃、800rpmで20時間培養した後、発酵培地に前記種培養液を接種して空気を1vvmに供給し、40℃、800rpm、pH7.0で60〜70時間振とう培養しつつ、培養液内の残存糖濃度が0.5〜1%になるように葡萄糖が添加された追加培地を供給して培養液内の総糖含量が20%になるように添加して培養することによって、母菌株に比べて濃度が約19.6%向上したリボフラビンを収得した。
【００３２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
【００３３】
但し、下記実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されることはない。
【００３４】
【実施例】
実施例1．本発明に係るバチラス・サブチリスCJKBOOO1の選別
本発明のバチラス・サブチリスCJKBOOO1は、母菌株であるバチラス・サブチリスAS5に変異を誘導した後、チアプロリンが含まれている培地で培養して生育可能なコロニーを収得した後、リボフラビン生成能に最も優れた変異株のうちから選別した。
【００３５】
母菌株として使用したバチラス・サブチリスAS5はロシアのバイオノム-エス社(BIONOM-S，LTD.，ロシア.モスクワ.オボレンスク)から購入した。前記バチラス・サブチリスAS5を燐酸緩衝液(phosphate buffer，pH7.0)またはクエン酸緩衝(citrate buffer，pH5.5)に107〜108細胞/mlの濃度で懸濁した。前記懸濁液に変異誘発剤であるN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジンを最終濃度が10〜50μg/mlになるように添加した。これを室温または30℃で30〜60分間処理して突然変異を誘発させた。これを0.85%食塩水で3回洗浄した後、適切に希釈した後、1.8%の寒天が含まれている最小培地にチアプロリンを濃度別に添加して培地を製造した後、前記チアプロリンを添加した培地に塗抹した後、37℃で5日間培養してコロニーを収得した。この際、チアプロリンの濃度は0mg/l〜100mg/lになるようにした。多様な濃度のチアプロリンを含有した最小培地で生長したコロニーを各々栄養寒天培地に接種して37℃で24時間培養した後、これを発酵培地に接種して37℃で4〜5日間培養して発酵培養液に蓄積されるリボフラビンの生成量が最も優秀な菌株を選別した。実験に使われたそれぞれの培地組成は表1に示したようである。
【００３６】
【表１】本発明に係るバチラス・サブチリス変異株CJKBOOO1の選別のための培地組成
2004180672.tif 000002
【００３７】
リボフラビンの生成量は、HPLCを用いて分析した。HPLC分析はクロマシルC18(5μm)が充填されたカラム(内径4.6mm、長さ250mm)が装着されたウォータース510(Waters 510)を使用して行った。この際、移動相としては5mMソジウムヘキサンスルホネートと20mMのH3PO4とが混合された溶媒とアセトニトリルとを89:1の体積比で混合して使用した。移動相の流速は1ml/分であり、検出器はUV検出器(TSPUV2000、UV260nm)を使用した。試料注入量は15μlであり、試料を希釈するために溶媒としては蒸溜水を使用した。
【００３８】
実験の結果、チアプロリン70mg/lを含有した培地で生育する変異株らのリボフラビン生成能が優秀であった。このうちリボフラビン生成能が最も優秀な変異株1株を選別し、これをバチラス・サブチリス変異株CJKBOOO1と命名した。このように選別されたバチラス・サブチリスCJKBOOO1は韓国微生物保存センターに2002年11月18日寄託番号KCCM-10445として寄託した。
【００３９】
実施例2．本発明に係るバチラス・サブチリスCJKBOOO1と母菌株として使用したバチラス・サブチリスAS5とのチアプロリンに対する耐性比較
本実施例では、前記実施例1で選別したバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)と母菌株として使用したバチラス・サブチリスAS5とをチアプロリンが濃度別に添加された培地で培養してチアプロリンに対する耐性を比較した。すなわち、それぞれの菌株を前記実施例1の表1に示したようなチアプロリン添加培地に接種して37℃で5日間培養した。
【００４０】
実験の結果、表2に示したように母菌株として使用したバチラス・サブチリスAS5菌株はチアプロリンが40mg/l添加された培地では生育できたが、それ以上の濃度では生育できなかった。これに対し、本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB00O1はチアプロリン70mg/lが含まれた培地でも生育できた。
【００４１】
【表２】バチラス・サブチリスCJKB0001とバチラス・サブチリスAS5とのチアプロリンに対する耐性比較
2004180672.tif 000003
+:生育可能、-:生育不可能
【００４２】
実施例3．本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001のフラスコ発酵力価
本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)のフラスコ発酵力価を母菌株であるバチラス・サブチリスAS5の発酵力価と比較して調べた。
【００４３】
前記本発明に係る変異株と母菌株とを各々種培地に接種して種培養した後、種培養液をフラスコ発酵培地に接種して発酵した。
【００４４】
種培地は直径18mmの試験管に5mlずつ分注した後、これを121℃で15分間加圧殺菌して製造した。ここに本発明に係る変異株と母菌株とを各々接種して200rpm、37℃で20時間振とう培養した。培養が完了すれば種培養液1mlをフラスコ発酵培地に接種して200rpm、37℃で90時間振とう培養した。前記フラスコ発酵培地は本培地と別に殺菌した培地を前記種培地と同じ方法で加圧殺菌した後、あらかじめ加圧殺菌した250ml容量のフラスコに各々15mlと5mlずつ分注して製造した。
【００４５】
培養が完了すれば培地内に蓄積されたリボフラビンの量を前記実施例1と同じ方法で分析した。実験に使用した種培地と発酵培地の組成は表3に示したようである。
【００４６】
【表３】フラスコ発酵のための培地組成
2004180672.tif 000004
【００４７】
実験の結果、母菌株であるバチラス・サブチリスAS5の培地内のリボフラビン蓄積量は7.2g/lであり、本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001の培地内のリボフラビン蓄積量は母菌株に比べて11%が向上した8.0g/lであった。
【００４８】
実施例4．本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001の5リットル発酵槽での発酵力価
本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001(KCCM-10445)の5リットル発酵槽での発酵力価を母菌株であるバチラス・サブチリスAS5の発酵力価と比較して調べた。前記本発明に係る変異株と母菌株とを各々種培地に接種して種培養した後、種培養液を発酵培地に接種して流加式発酵(fed-batch fermentation)を行った。まず、種培地を2.5リットル容量の実験用発酵槽に1リットルずつ分注した後、121℃で10分間加圧殺菌して製造した。これを冷却した後、本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0OO1と母菌株とを各々食塩水に懸濁して10mlずつ接種した後、除菌された空気を1vvmに供給して37℃で800rpmで攪拌しつつ20時間培養した。培養中にpHは調節しなかった。種培養が完了すれば、前記種培養液を発酵培地に接種して流加式発酵を行った。前記発酵培地は5リットル容量の実験用発酵槽に1.4lずつ分注した後、121℃で20分間加圧殺菌して製造した。これを冷却した後、上記の種培養液200mlずつを接種して除菌された空気を1vvmに供給しつつ800rpm、40℃で培養した。この際、培養中に残存糖濃度が0.5〜1%になるように調節しつつ追加培地を供給して発酵培地に添加された総糖濃度を20%にした。培養中、pHはアンモニア水を用いて7.0に調節しつつ60〜70時間培養した。培養が完了した後、リボフラビンの培地内の蓄積量を前記実施例1と同じ方法で分析した。本発明において使用した培地の組成は表4に示したようである。
【００４９】
【表４】5リットル発酵槽培養のための培地組成
2004180672.tif 000005
【００５０】
実験の結果、リボフラビンの培養液内の蓄積量は母菌株であるバチラス・サブチリスAS5が22.4g/lであり、本発明に係るバチラス・サブチリスCJKB0001の場合には母菌株に比べて約19.6%が向上した26.8g/lであった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明に係るバチラス・サブチリスは、プロリン類似体に対して耐性を有するために菌体内のプロリン合成が増加して浸透圧耐性が強化されることによってリボフラビンを高濃度及び高収率で生産できる。本発明によれば、前記微生物を培養し、その培養物からリボフラビンを大量で収得できる。