(57)【要約】【課題】乾式充填法において、安価で簡易な設備で、簡便に充填でき、低耐圧のカラム容器が使用でき、使用時の取り扱いが簡易であって、しかも高密度かつ均一な充填を行うことができ、さらに、繰り返し安定性の高い液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を提供すること。【構成】粉体供給フィーダーによって充填剤粉体をカラム内に連続的に充填する際にカラム中に充填する前に充填剤粉体を除電することにより、上記目的を達成する（流通充填法）。また、この構成に、バルブを介してカラムに接続された粉体供給部に供給された粉体を、カラム内を真空状態にした後に、バルブを開放して急速にカラム内に充填する（分割真空充填法）ための構成を付加して、充填剤粉体を除電した後に、分割真空充填法による充填を行うように構成することも可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
充填剤粉体を除電した後にカラム中に充填することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項２】
前記充填剤粉体の除電はイオン風によって行うことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項３】
前記カラム内の空気を前記カラムの他端から吸引することを特徴とする請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項４】
前記充填は、恒温室内で行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項５】
前記充填剤粉体は、充填剤粉体基材表面に超微粒子粉末を担持してなることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項６】
一端に開閉可能なバルブを有する粉体供給部に閉止した前記バルブを介してカラムの一端を接続し、
所定量の充填剤粉体を前記粉体供給部に仕込み、
前記カラムの他端から吸引して前記カラム内を所定真空圧まで減圧し、
また、前記粉体供給部とカラムとの間に設けられた除電部を作動させた後、
前記バルブを瞬時に開放して、前記除電部により、前記粉体供給部から前記所定量の充填剤粉体を除電しつつ前記カラム内に充填する第１のステップと、
所定回数のタッピングを行う第２のステップとを
繰り返すことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項７】
前記第１のステップと第２のステップとを繰り返す回数が８回以上であることを特徴とする請求項６に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項８】
前記真空圧は、１０ｋＰａ以下であることを特徴とする請求項６または７に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項９】
前記所定量、すなわち充填剤粉体の１回あたりの充填量は、繰り返される充填回数に応じて決定されることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項１０】
前記充填は、恒温室内で行われることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【請求項１１】
前記充填剤粉体は、充填剤粉体基材表面に超微粒子粉末を担持してなることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィーの分離カラムに乾式で充填剤を充填する方法に関し、詳しくは簡易な操作で、均一でよく圧密化された固定相を実現し、高い繰り返し安定性で、高理論段数を得ることができる液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
混合物からの純粋な物質の単離や混合物の分離手段として、クロマトグラフィーを用いた、いわゆる分取クロマトグラフィーが各種適用されており、中でも比較的分解しやすい物質の分離が可能である点で、液体クロマトグラフィー、特に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が工業用途を始めとする各種の用途に適用されている。
【０００３】
このような液体クロマトグラフィーにおいて、混合物からの優れた単体の分離に際し、より高い理論段数（良好な理論段相当高さ＝ＨＥＴＰ）を実現するためには、カラムに充填される充填剤を、均一に、かつよく圧密化された状態とする必要がある。
【０００４】
カラムは、使用者自らが充填剤を充填するか、あるいは市場に供給されるプレパックドカラムを購入することにより利用することができる。
しかし、使用者が充填する場合には、特有のノウハウや付帯設備を必要とし、再現性のよいカラムを得ることは難しい。また、使用者が充填を簡便に行えるように作成された自己充填機能付きカラムがあるが、これは非常に高価であり、工業的な使用は著しく制限される。
他方、市場に供給されるプレパックドカラムも非常に高価である。
【０００５】
カラムに充填剤を充填する方法としては、主に、充填剤を適当な溶媒に分散させスラリー状態でカラムに充填した後、ポンプ等を用いて前記溶媒を更に加圧送液することにより充填剤を圧密化する湿式充填法と、充填剤をカラムに小量づつ入れながらタッピング等を行う乾式充填法とが行われている。
【０００６】
乾式充填法は、一般に、作業性，安全性には優れているものの、得られる理論段数は低いために、高理論段数が要求される場合には、湿式充填法が用いられている。
しかしながら、湿式充填法は高理論段数は得られやすいが、高圧ポンプ等の大がかりな設備が必要であり、多量の分散溶剤（分散媒），洗浄溶剤も必要で使用時に溶剤，分散媒の置換，除去等が大変であり、その取り扱いが面倒であり、また、充填の際に５０〜２００ｋｇ／ｃｍ２程度の高圧が必要となるため、高耐圧構造のカラム容器が必要となり、その結果高価なものとなってしまうという問題点がある。
【０００７】
そのため、使用者自らであっても簡便に高理論段数のカラムの充填を行うことができる液体クロマトグラフィー用カラムの開発が望まれている。
【０００８】
このため、本出願人は、特開平５‐１０７２３７号公報において、シリカゲル等の基材の表面に超微粒子粉末を、好ましくは基材１００重量部に対して０．０１〜４重量部担持してなる液体クロマトグラフィー用充填剤およびこの充填剤を乾式充填法により充填してなる液体クロマトグラフィー用カラムを提案している。ここに開示された充填剤を用いることにより、流動性が良好で、乾式充填法によるカラムへの高密度かつ均一な充填を容易かつ良好に行うことができ、得られたカラムは高理論段数を実現できる。
【０００９】
しかしながら、ここに開示されたカラムは充填剤自体の改良によって高い性能、例えば高充填率，高理論段数を得ているが、その充填方法自体は、従来の乾式充填法であって、カラムに充填剤を少量づつ入れながらタッピングを行うものにすぎず、充填方法自体の改善が強く求められている。
また、上述したように湿式充填法に比べると、乾式充填法は、一般に得られる性能（特に、理論段数）が低いため、従来の充填剤を用いる場合であっても湿式充填法と同等あるいは同等以上の性能（特に、理論段数）が得られる乾式充填法の開発が強く望まれている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前記従来技術の問題点を解消し、乾式充填法において、安価で簡易な設備で、簡便に充填でき、低耐圧のカラム容器が使用でき、使用時の取り扱いが簡易であって、しかも高密度かつ均一な充填を行うことができ、かつ高性能、特に湿式充填法によって得られる性能と同等あるいは同等以上の性能（特に、理論段数）を得ることができ、しかも繰り返し安定性の高い液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法は、充填剤粉体を除電した後にカラム中に充填することを特徴とするものである。
【００１２】
ここで、前記充填剤粉体の除電は、イオン風によって行うことが好ましい。また、前記カラム内の空気を前記カラムの他端から吸引することが好ましい。また、前記充填は、恒温室内で行われることが好ましい。また、前記充填剤粉体を充填する速度は、充填高さで１〜１０ｃｍ／ｍｉｎであることが好ましい。また、前記充填剤粉体は、充填剤粉体基材表面に超微粒子粉末を担持してなるものであることが好ましい。
【００１３】
【作用】
本発明に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法は、カラムの一端からフィーダーを用いて、好ましくはカラムの他端から空気などのガスを吸引しつつ、充填剤粉体を、カラム直前でイオン風によって除電した後、カラム中に、好ましくは充填高さで１〜１０ｃｍ／ｍｉｎの充填速度で完全かつ十分に充填する方法（流通充填法）である。本充填法においては、恒温室内で充填剤粉体の充填を行うことが好ましい。
また、充填剤粉体は、充填剤粉体基材表面に超微粒子粉末を、より好ましくは、基材１００重量部に対して超微粒子粉末０．０１〜４重量部担持してなるものであることが好ましい。
【００１４】
従って、本発明によれば、カラムに充填する前に充填剤粉体をイオン風によって除電して、粉体の電荷を緩和除去することにより、高密度かつ均一な充填が可能となり、簡便な乾式充填にもかかわらず、湿式充填法と同等または同等以上の性能、特に高理論段数を得ることができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を添付の図面を参照して詳細に説明する。
図１（ａ）は本発明の一実施例に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を実施するカラム充填装置の正面模式図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）に示すカラム充填装置のイオン風送入部のＢ−Ｂ線切断断面図である。
【００１６】
なお、図１（ａ）に示すカラム充填装置１０は、本発明の一実施例に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を実施するための装置であって、本装置は、分割真空充填法および流通充填法による液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を実施可能に構成した装置である。この装置は、粉体供給部１２と、バルブ１４と、粉体供給部ジョイント１６と、イオン風送入部１８と、カラム２２の両端に取り付けられるカラムジョイント２０，２０と、ポンプジョイント２４とからなり、ポンプジョイント２４は真空ポンプ２６に接続され、イオン風送入部１８はイオナイザー２８およびフィーダー３０に接続され、イオナイザー２８は送風機３２に接続される。
【００１７】
粉体供給部１２の上端には拡径した逆円錐状の開口部１２ａが設けられ、その下側にはバルブ１４が組み込まれる。粉体供給部１２の下端部が粉体供給部ジョイント１６によって気密に締め付けられ、カラム２２の上端部が粉体供給部ジョイント１６とユニット化されたカラムジョイント２０によって気密に締め付けられることにより、粉体供給部１２とカラム２２とが気密に接続される。
【００１８】
一方、カラム２２の下端部はポンプジョイント２４とユニット化されたもう１つのカラムジョイント２０によって締め付けられ、気密に接続される。ポンプジョイント２４は真空ポンプ２６に接続するためのものである。また、粉体供給部ジョイント１６の外側にはイオン風送入部１８が取り付けられる。イオン風送入部１８は、図１（ｂ）に示すように円環状をなし、接線方向に逆向きに平行な送入路を有し、その先端にイオン風送入口１８ａ，１８ａを有し、これらの送入口１８ａ，１８ａはイオン風を生成するイオナイザー２８の送出口に輸送管によって接続される。イオナイザー２８の送出口とイオン風送入部１８の送入口１８ａ，１８ａとの間の輸送管には粉体供給フィーダー３０の送出管が接続される。さらにイオナイザー２８には送風機３２が接続され、所定風量の空気が送風機３２によってイオナイザー２８に送風される。
【００１９】
なお、イオナイザー２８としては、空気をイオン化できればどのようなものでもよく、市販のイオン化エアーガン，イオン化エアーノズルなどを用いることができる。例えば、イオン化エアーガンＭＯＤＥＬ−３００，ＭＯＤＥＬ−３０１，ＭＯＤＥＬ−３１２（いずれも、ヒューグルエレクトロニクス（株）製），パルスガンＰＧ−５（大坪電気（株）製），トップガンＩＩ（ＥＳ型，ＨＢＡ型、シムコジャパン（株）製）などを挙げることができる。また、粉体供給フィーダー３０としては、特に制限はなく市販の粉体供給フィーダーを用いることができるが、例えば、フィードコンミュー（ＦＣμ−０３０Ｆ，ＦＣμ−２００Ｆ、日清エンジニアリング（株）製）などを挙げることができる。
【００２０】
本実施形態において用いられる液体クロマトグラフィー用充填剤粉体（以下、充填剤という）は、シリカゲル等の充填剤粉体基材のみから構成されるものでもよいが、本出願人が特開平５‐１０７２３７号公報に提案したように、充填剤粉体基材の表面に超微粒子シリカ等の超微粒子粉末を担持してなる構成を有することが好ましい。
【００２１】
基材としては、シリカゲル等、通常の液体クロマトグラフィー用の充填剤として用いられるものがいずれも適用可能であるが、好ましくは平均粒径２０〜１００μｍ程度、より好ましくは平均粒径２０〜６０μｍ程度のものが好適に適用される。なお、形状は球形であってもよく、あるいは破砕形であってもよい。このような基材としては、具体的には、シリカゲルとしてのマイクロビーズシリカ，ＢＷシリカ（以上、富士デビソン化学（株）製），Ｓ−５０シリカ（ヤマムラ化学社製），ＭＳ−ＧＥＬ（洞海化学社製）等が好適に例示される。
【００２２】
本発明に使用される充填剤は、好ましくはこのような基材の表面に、超微粒子粉末、特に超微粒子シリカを、好ましくは均一にコーティングした状態に担持してなるものである。なお、本発明において、超微粒子とは粒径が１００ｎｍ以下であることを示す。本発明においては、このような構成の充填剤を用い、本発明の充填方法と組み合わせることにより、カラム中の充填剤の充填密度を容易に均一で高密度化することを可能とし、それにより、高い理論段数を得られる液体クロマトグラフィー用カラムを実現可能としたものである。
【００２３】
適用される超微粒子シリカの粒径は、上記条件を満たすものであれば特に限定はないが、好ましくは、５〜６０ｎｍ程度、より好ましくは１０〜６０ｎｍ程度である。上記粒径を有する超微粒子シリカを適用することにより、充填剤の流動性が良好になり、充填密度が増し、カラム内部の粒子充填密度が均一化する。また、高理論段数を実現するためには、適用する超微粒子シリカは高純度であるものが好ましく、少なくとも９０％以上、好ましくは９９．８％以上の純度を有するものであるのが良い。このような超微粒子シリカとしては、具体的には、ＡＥＲＯＳＩＬ　１３０，ＡＥＲＯＳＩＬ　２００，ＡＥＲＯＳＩＬ　３００，ＡＥＲＯＳＩＬ　３８０，ＲＹ２００，Ｒ９７２，Ｒ２０等が好適に例示される。
【００２４】
なお、本発明においては、このような超微粒子シリカ以外にも、超微粒子チタン，超微粒子アルミニウム等も好適に適用可能である。このような超微粒子チタンとしては、具体的には、Ｔｉｔａｎｉｕｍ　Ｏｘｉｄｅ　Ｐ２５（日本アエロジル社製）、超微粒子アルミニウムとしては、Ａｌｕｍｉｎｕｍ　Ｏｘｉｄｅ　Ｃ（日本アエロジル社製）等が例示される。
【００２５】
超微粒子シリカの担持量にも特に限定はなく、シリカゲルの表面全体に均一に超微粒子シリカをコーティングした状態とできればよいが、好ましくは、シリカゲル１００重量部に対して０．０１〜４重量部程度、より好ましくは０．０５〜２重量部程度である。
【００２６】
シリカゲル表面に超微粒子シリカを担持させる方法には特に限定はなく、適用するシリカゲルや超微粒子シリカに応じた公知の方法を適用すればよいが、一例として、適当量の両者を傾斜式球形ミキサーに充填し、このミキサーを２０００〜４０００ｒｐｍ程度の速度で、５分程度回転させる方法等が例示される。
【００２７】
本発明に使用される液体クロマトグラフィー用カラム容器（以下、単にカラムという）２２は、上述した充填剤を充填するためのもので、円筒状等の形状を有する。
カラムの形状は通常円筒状であるが、特に制限はなく、そのサイズも用途に応じて適宜設定すればよく、特に限定はない。また、材質もステンレス，硬質ガラス等、通常のＨＰＬＣ用カラムに用いられる物がいずれも適用可能である。
【００２８】
本発明に用いられるカラム充填装置，カラムおよび充填剤は、基本的に以上のように構成されるが、その作用および本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法（いわゆる、流通充填法）について詳細に説明する。
【００２９】
（１）まず、粉体供給部１２を粉体供給部ジョイント１６で気密に取り付け、このジョイント１６にはイオン風送入部１８を取り付け、カラム２２を除いて図１（ａ）に示すカラム充填装置１０を組み立てる。ここで十分に洗浄乾燥させたカラム２２の上端をカラムジョイント２０，２０で気密に締め付けることによりカラム２２をカラム充填装置１０に組み込む。なお、カラム充填装置１０への組み込み前に、図示しないフィルターを含むカラムエンドアッセンブリとカラム２２との組立体の空重量を電子天秤で測定しておくのがよい。
【００３０】
（２）次に、組み終えたカラム充填装置１０を図示しない恒温室内に入れ、図１（ｂ）に示すように、イオン風送入部１８の送入口１８ａ，１８ａに送風機３２が接続されたイオナイザー２８および粉体供給フィーダー３０を接続し、ポンプジョイント２４に真空ポンプ２６を接続する。この後、真空ポンプ２６でカラム２２の下端から吸引するとともに送風機３２から送風された空気流をイオナイザー２８でイオン化させて発生させたイオン風をフィーダー３０によって供給された、図示しない恒温室内で十分調整した試料充填剤粉体に混合し、この混合物を送入口１８ａ，１８ａからイオン風送入部１８に連続的に導入し、カラム２２中に混合物を供給し、充填剤粉体を粉体供給量（充填速度）充填高さで１〜１０ｃｍ／ｍｉｎ、例えば重量で１．３ｇ／ｍｉｎで充填する。
【００３１】
（３）なお、イオン風は主にカラム２２の下端から真空ポンプ２６によって吸引されるが、イオン風の風量が多い場合には、バルブ１４を開放し、イオン風送入部１８の上部の粉体供給部１２の開口１２ａから排出させてもよい。このようして、カラム２２には、イオン風によって除電された直後の充填剤粉体が充填される。
【００３２】
（４）このようにして充填剤粉体をカラム２２の上部まで充填させた後、カラム２２のタッピングを所定回数行う。例えば、タッピングは、２ｃｍの高さで約２０回繰り返すのが好ましい。
（５）この後、片方ずつカラムジョイント２０，２０を外し、カラム２２の両端にフィルターを含むカラムエンドアッセンブリを取り付け、再度、電子天秤で重量を測定し、（１）で測定した空重量を引き、充填された充填剤粉末の重量とカラム容積から、充填カラム２２の充填率を算出する。
【００３３】
（６）さらに、充填したカラム２２を高速液体クロマトグラフィーに取り付け、その応答波形から理論段数を算出する。
こうして、高性能、特に理論段数および充填率の高いカラムを得ることができる。
【００３４】
このような本実施態様に係る流通充填法によって充填剤粉体が充填されたカラムが高い性能、特に高い理論数段を示すのは、イオン風を導入することによって、充填剤粉体の電荷を緩和でき、均一な充填を可能とし、高い充填率を得ることができるからである。
【００３５】
ここで、イオン風の供給量は２０〜１００ｌ／ｍｉｎであるのがよいが、より好ましくは少ない方が良い。その理由は真空ポンプ２６により吸引できる風量に規定されるからである。また、カラム２２への充填剤粉体の充填速度は特に制限的ではないが、カラム２２への充填高さで１０〜１００ｍｍ／ｍｉｎであることが好ましい。その理由は粒子が十分に除電される程度の量であれば良いからである。また、上述した例では、カラム２２への粉体充填に際し、カラム２２の下端から真空ポンプ２６で吸引しているけれども、本発明はこれに限定されず、必ずしも吸引を行う必要はない。また、上述した例では、恒温室を使用し、恒温恒湿雰囲気で充填を行っているが、本発明はこれに限定されるわけではない。
【００３６】
ところで、上述した例では、イオン風送入部１８にイオナイザー２８からのイオン風と粉体供給フィーダー３０から供給される充填剤粉体との混合物を供給しているが、本発明はこれに限定されず、粉体供給部１２に粉体供給フィーダー３０を接続し、充填剤粉体は粉体供給部１２から供給し、イオン風送入部１８にはイオナイザー２８からのイオン風のみを導入し、両者を粉体供給部ジョイント１６および／または上部カラムジョイント２０において混合して、カラム２２中に供給するようにしてもよい。
【００３７】
以下に、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を実施例に基づいて具体的に説明する。
【００３８】
〔実施例１〕
図１（ａ）に示すカラム充填装置１０を用いて、本発明の一実施態様に係る流通充填法によって前述した手順でカラム２２に試料充填剤粉体を充填した。ここで、イオナイザー２８によるイオン風の風量は２０ｌ／ｍｉｎであった。カラム２２の末端から真空ポンプ２６による吸引を行った。フィーダーによる粉体供給部１２からカラム２２への充填剤粉体の充填速度は１．３ｇ／ｍｉｎであった。カラム２２は、直径１０ｍｍ，高さ１００ｍｍのものを用い、充填後のタッピングは、２ｃｍの高さで約２０回行った。ここで、試料充填剤粉体は、微粉で表面処理したシリカゲル（ＳｉＯ２）を調整したが、混合比を０．２５〜２．０％重量比の範囲で変えた数種の充填剤粉体を用いた。恒温恒湿室内の雰囲気は、温度２５℃，相対湿度５０ＲＨ％とした。
【００３９】
こうして得られた充填カラムを液体クロマトグラフィー装置（Ｌ−６０００，Ｌ−４２００、日立製作所製）に設置し、移動相としての酢酸エチル（１５％），ヘキサン（８５％）の溶液中に、フタル酸ジメチル３％，ベンゼン３％，ヘキサン９４％の溶液を１００μｌ注入し、図２に示すようなクロマトグラムを得、滞留時間ｔＲおよび半値幅Ｗｈを実測して、理論段数Ｎを下記式の半値幅法により求めた。
理論段数Ｎ＝（ｔＲ／σ）２＝５．５４×（ｔＲ／Ｗｈ）２
ここで、σは正規分布による標準偏差である。
【００４０】
得られた結果を各混合比に対する理論段数として図３に示す。
同図から明らかなように、イオナイザーを使用してイオン風で除電した場合も、イオナイザーを用いないで除電しなかった場合も混合比０．５％でピークを持つが、イオン風を導入した場合はイオン風を導入しなかった場合に比べ理論段数が高く、混合比が増加するにつれてより高くなることが分かる。この結果、イオン風を導入することにより、粉体の電荷を緩和でき、充填率を向上させ、理論段数を向上させることができることが分かる。
【００４１】
ところで、本発明に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法は、前述のように、図１（ａ）に示したような構成を有する装置を用いて、その粉体供給部１２に粉体供給フィーダー３０を接続し、充填剤粉体はこの粉体供給部１２から供給し、イオン風送入部１８にはイオナイザー２８からのイオン風のみを導入して、両者を粉体供給部ジョイント１６と上部カラムジョイント２０のいずれか一方または両方において混合して、カラム２２中に供給する方法としても実施することができる。
すなわち、本装置を以下のように操作することにより、分割真空充填法による充填方法を実施することも可能である。
【００４２】
（１’）実施例１に示した手順と同様にして、カラム２２を除いて図１（ａ）に示すカラム充填装置１０を組み立て、カラム２２をカラム充填装置１０に組み込む。なお、この時、バルブ１４は閉めた状態にしておく。なお、カラム充填装置１０に組み込む前に、カラム２２とフィルターを含むカラムエンドアッセンブリとを組み立て、この組み立てカラム２２の空重量を電子天秤で測定しておくのがよいことは実施例１の場合と同様である。
【００４３】
（２’）組み終えたカラム充填装置１０を恒温室（図示せず）内に入れ、ポンプジョイント２４に真空ポンプ２６を接続する。試料充填剤粉体は、図示しない恒温室内において十分調整したものを分割回数に合わせて１回の粉体充填量を決め、粉体供給部１２に仕込んだ後、真空ポンプ２６でカラム２２内を所定時間、例えば１〜３分、真空ポンプ２６の能力や真空圧によっては３０分間吸引する。ここで、真空ポンプ２６による吸引は、カラム２２内の圧力が所定真空圧、好ましくは、１０ｋＰａ以下になるまで行うことが好ましい。その理由は、空気の粘性を十分に小さくするためである。
【００４４】
また、１回の充填量は、全充填量を分割回数に応じて分割した量であれば良く、毎回均一であっても、不均一であってもよいが、１回の充填量は、カラム２２の大きさによって決めるのが好ましく、より好ましくは、充填高さ５〜２０ｍｍに相当する量が適量である。分割数を多くすれば、理論数段は向上するが、操作性は悪くなるからである。従って、カラム２２の大きさから１回の充填量を決め、全充填量を充填する分割回数を定めるのがよい。
【００４５】
（３’）カラム２２内の圧力が所定真空圧になっていることを、例えばインジケータ（圧力計）や真空ゲージ等で確認後、イオナイザー２８でイオン化させて発生させたイオン風を供給しつつ素早くバルブ１４を開放し、充填剤粉体をカラム２２内に急速に充填する。なお、真空圧に達していないあるいは達しない場合には、再度、カラム充填装置１０を組み直して、漏れがないことを確認し、再び真空ポンプ２６でカラム２２内を吸引する。
【００４６】
（４’）この後、真空ポンプを取り外し、カラム２２のタッピング所定回数を行う。例えば、タッピングは、２ｃｍの高さで約２０回繰り返すのが好ましい。これは、適度な衝撃を与えるために２ｃｍ程度の高さが適当であることと、２０回程度のタッピングで、充填密度がほぼ最大定常に漸近するという理由による。
【００４７】
（５’）この分割充填（上記（２’）〜（４’））を所定回数だけ繰り返す。所定分割回数の分割充填を行って、カラム２２の上部まで充填剤粉体が充填された後、粉体供給部ジョイント１６とユニット化された上部のカラムジョイント２０を外し、カラム２２の上部を例えばカッターナイフ等で擦り切り、平らにならした後、図示しないフィルターを含むカラムエンドアッセンブリを取り付ける。この後、カラム２２を逆にし、ポンプジョイント２６とユニット化されたカラムジョイント２０を取り外し、同様に擦り切った後、図示しないフィルターを含むカラムエンドアッセンブリを取り付ける。なお、この時、カラム２２とフィルターとの間に充填剤粉体が挟まらないように気を付けるのがよい。
【００４８】
ところで、下側のカラムジョイント２０の代わりにフィルターを内蔵するカラムエンドアッセンブリをカラム２２に取り付けたまま用いてもよい。この場合には、取り外し可能なポンプジョイント２４をカラムエンドアッセンブリの配管接続口に直接接すればよい。この場合には、充填剤粉体をカラム２２の上部まで充填後、上側のカラムジョイント２０を外してカラム２２の上部を平らにした後、カラム２２の上部のみにフィルター付カラムエンドアッセンブリを取り付ければよい。こうすることで、カラム充填（カラム製造）操作を簡略化できる。
【００４９】
（６’）充填し終えたカラム２２は、実施例１の場合と同様に、再度、電子天秤で重量を測定し、（１’）で測定した空重量を引き、充填された充填剤粉体の重量とカラム容積から充填率を算出する。
（７’）充填したカラムを高速液体クロマトグラフィーに取り付け、その応答波形から理論段数を算出する。
このようにして、高性能、特に理論段数および充填率の高いカラムを得ることができる。
【００５０】
このような、本実施態様に係る分割真空充填法によって充填剤粉体が充填されたカラムが高い性能、特に高い理論段数を示すのは、以下の理由によるものと考えられる。一般に、高い理論段数を得るには粒子径の小さい充填剤粉体を用いる必要があるが、従来の乾式充填法では、充填剤粉体が空気を抱き込んでしまい、高密度の充填を行うことができなかったが、本発明の分割真空充填法では、充填を真空中で行うことにより、空気の粘性の影響を排除できるためであると考えられる。また、多数回に分割して充填することにより、充填率がカラム内部でより均一になるため理論段数が向上するものと考えられる。
【００５１】
上述した例では、恒温室を使用し、恒温恒湿雰囲気で充填しているが、本発明はこれに限定されるわけではない。また、分割真空充填１回当たりの充填量，真空引きの時間などは、上述した例に限定されず、カラムの大きさや分割回数および真空ポンプ２６の能力や達成すべき真空圧に応じて、さらにはその他の必要に応じて適宜選択すればよい。
【００５２】
次に、この構成における動作例を示す。
図１（ａ）に示すカラム充填装置１０を用いて、前述した（１’）〜（５’）の工程を行って分割回数を１回，２回，３回，４回，８回，１２回および１６回に変えてカラム２２に試料充填剤粉体を充填した。本動作例では、真空ポンプ２６による真空引きの時間は３０分、真空ケージによる真空圧のチェックは１０ｋＰａであることを確認することで行った。また、タッピングは２ｃｍの高さで、約２０回繰り返した。さらに、充填に際して温度，湿度の影響をなくすために用いた恒温恒湿室内の雰囲気は温度２５℃，相対湿度５０ＲＨ％とした。
【００５３】
ここで用いたカラム２２は、（株）ＹＭＣ製カラムで、その直径は１０ｍｍ，高さは１００ｍｍであった。
ここで、試料充填剤粉体は、シリカゲル（ＳｉＯ２）で質量中位径４７．５μｍ（ＭＢ４Ｂ、富士デビソン化学（株）製）と質量中位径０．１５μｍ（Ａｅｒｏｓｉｌ２００、日本アエロジル（株）製）の両者を混合機を用いて混合比０．５％の重量比（微粉質量／粗粉質量）で混合撹拌し、表面処理したものを用いた。混合機（日清エンジニアリング社製、Ｈｉ−Ｘ２００）の操作条件は、インペラー回転数４０００ｒｐｍ，混合槽傾斜角４５ｄｅｇ，混合時間２０ｍｉｎとした。
【００５４】
こうして得られた充填カラムを液体クロマトグラフィー装置（Ｌ−６０００，Ｌ−４２００、日立社製）に設置し、移動相としての酢酸エチル（１５％），ヘキサン（８５％）の溶液中に、タル酸ジメチル３％，ベンゼン３％，ヘキサン９４％の溶液を１００μｌ注入し、図２に示すようなクロマトグラムを得、滞留時間ｔＲおよび半値幅Ｗｈを実測して、理論段数Ｎを下記式の半値幅法により求めた。
理論段数Ｎ＝（ｔＲ／σ）２＝５．５４×（ｔＲ／Ｗｈ）２
ここで、σは正規分布による標準偏差である。
【００５５】
こうして得られた結果を図４に示す。この図から明らかなように、分割回数が増加するにつれて、理論段数も増加してきているのが分かる。この結果より、多数回に分割して充填することにより、充填率がカラム内部でより均一になるため理論段数が向上したことが分かる。
【００５６】
次に、他の動作例を示す。
図１（ａ）に示すカラム充填装置１０を用い、前述の動作例と同様に分割真空充填法によって試料粉体をカラムに充填し、測定して理論段数を求めた。分割回数は８回および１２回とした。また、用いたカラムは直径１０ｍｍ，高さ１００ｍｍのものと、直径１０ｍｍ，高さ１５０ｍｍのものを用いた。ここでは、試料充填剤粉体として、平均粒径Ｄ５０＝４０μｍのシリカゲル（ＭＢ４Ｂ、富士デビソン化学（株）製）を微粉による表面処理をせずにそのまま用いた。また、比較のため、従来の乾式タッピング充填法によって充填した市販の直径１０ｍｍ，高さ１５０ｍｍの充填カラムの理論段数を測定した。
これらの結果を、表１に示す。
【００５７】
【表１】
2004004093.tif 000002
【００５８】
表１から明らかなように、従来の大気圧充填およびタッピングを行う乾式充填法による市販カラムは、理論段数のばらつきが大きく、相対的に低い理論段数を示しているのに対し、本発明の８回分割真空充填法による同一寸法の充填カラムは高い理論段数を示し、そのばらつきも小さいことがわかる。また、本発明の分割真空充填法による充填カラムは、分割回数が多いほど、より高い理論段数を示し、カラムの高さが変わっても、単位長さ当りの理論段数は高くなり、かつそのばらつきも小さくなることがわかる。
【００５９】
以上、一実施例に係る液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法について詳細に説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、充填の際に、充填剤の表面にアルコール等を噴霧して充填剤の流動性を向上する等、公知の各種の操作を行ってもよいなど、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、各種の変更および改良を行ってもよいのはもちろんである。
【００６０】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、湿式充填のように大がかりで複雑な設備が不要で、安価で簡易な設備で簡便に充填でき、低耐圧のカラム容器を使用でき、溶剤を使用しないので使用時の取り扱いが容易であるにもかかわらず、従来の乾式充填に比べて高く、湿式充填と同等もしくは同等以上の性能（特に、理論段数，充填率など）を得ることができ、得られた性能（特に、理論段数）のばらつきも小さく繰り返し安定性が高いという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法を実施するカラム充填装置の一実施例の正面図であり、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ線断面図である。
【図２】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法の実施例の流通充填法における混合比と理論段数の関係を示すグラフである。
【図３】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法の他の実施例において理論段数を求めるのに用いられるクロマトグラムの一例である。
【図４】本発明の液体クロマトグラフィー用カラムの充填方法の他の実施例における分割回数と理論段数の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
１０　カラム充填装置
１２　粉体供給部
１２ａ　供給口
１４　バルブ
１６　粉体供給部ジョイント
１８　イオン風送入部
１８ａ　送入口
２０　カラムジョイント
２２　カラム
２４　ポンプジョイント
２６　真空ポンプ
２８　イオナイザー
３０　粉体供給フィーダー
３２　送風機
【図１】
2004004093.tif 000003
【図２】
2004004093.tif 000004
【図３】
2004004093.tif 000005
【図４】
2004004093.tif 000006