(57)【要約】【課題】本発明は、細胞の走化性又はランダムムーブメントを利用する毒性物質の試験方法に関わり、物質の毒性を検出するに当たり、少量の細胞試料を用いて、細胞の自力に基づく動きを正確にしかも容易に検出しうる方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、他方のウエルＢには細胞走化性因子を含有する試料を入れるか又は入れることなく、細胞のウエルＢの方向への移動又はランダムムーブメントの有無を検出することによる検体の毒性試験方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、他方のウエルＢには細胞走化性因子を含有する試料を入れるか又は入れることなく、細胞のウエルＢの方向への移動又はランダムムーブメントの有無を検出することによる検体の毒性試験方法。
【請求項２】
液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、他方のウエルＢに細胞走化性因子を含有する試料を入れ、次いで細胞の走化性有無を検出することによる検体の毒性試験方法。
【請求項３】
液体試料を静止した状態で収納できる３個のウエルＡ、Ｂ及びＣが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して直列に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一端のウエルＡに細胞懸濁液を入れ、他端のウエルＣに細胞走化性因子を含有する試料を入れ、任意の段階において中央のウエルＢに検体を入れ、次いで細胞の走化性有無を検出することによる検体の毒性試験方法。
【請求項４】
液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、更に任意の段階において血清を加え又は加えずに、流路におけるランダムムーブメントの有無を検出することによる検体の毒性試験方法。
【請求項５】
細胞走化性検出装置が、夫々のウエルにおいて試料を注入・吸出するための管と共に、注入・吸出時の圧力の変化を緩和するための管を備えていることを特徴とする請求項１乃至４記載の検体の毒性試験方法。
【請求項６】
細胞走化性検出装置が、夫々のウエルにおける試料を注入・吸出するための管の総て、又は夫々のウエルにおける試料を注入・吸出するための管及び注入・吸出時の圧力の変化を緩和するための管の総てが、それ等の上端部において液体を収納できる空間を共有していることを特徴とする請求項１乃至４記載の検体の毒性試験方法。
【請求項７】
細胞走化性検出装置が、ウエルはガラス基板と密着するように形成されていること、流路に土手が設けられていること、土手の上部には細胞の径又はその変形能に合わせた幅及び／又は深さの溝を１乃至複数本構成する障壁が設けられているか、又は平面が設けられており、該平面はガラス基板との間で細胞の径又はその変形能に合わせた隙間を形成するべく設けられていることを特徴とする請求項１乃至４記載の検体の毒性試験方法。
【請求項８】
検体と細胞を接触させ、該検体により細胞走化性又はランダムムーブメントが消失するか否かにより該検体が該細胞に対する毒性を有するか否かを判定することを特徴とする検体の毒性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、物質の毒性試験方法に関わる。より詳細には、細胞の生物学的動態、特に走化性又はランダムムーブメントを指標として物質の毒性有無を検出・判定する方法に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
生物に対して毒性を含む種々の重大な影響（以下、単に「毒性」という）を及ぼす物質には、人工的に合成された化学物質を始めとして生物由来の物質まで、様々な種類があり、これ等の物質の毒性試験が様々な分野で行われている。例えば、薬物や薬剤候補物質の毒性試験、食品・飲料を始めとする食用品の毒性試験、工場廃水の毒性試験、環境汚染のチェック、その他多数のケースが挙げられる。
【０００３】
環境汚染を例に取れば、ダイオキシン、環境ホルモン、大気汚染物質等による汚染が社会問題になっており、更には微量であるが多数の化学物質による複合的な汚染が問題となる場合があり、人為的に生成された産物としての化学物質のみでなく、その副産物や、更にはそれ等が環境中で分解乃至変換された二次的産物も原因となり得る。化学物質として登録されているもので１０００万種近くの物が知られており、しかも、それは年々増加している。かくして環境汚染の原因物質として、人を含む生物に影響を与える可能性のある物質は無数に存在することが考えられるが、その内、毒性に関する情報が得られているのは１割程度であると言われている。
【０００４】
従来、環境汚染の原因物質を検出するためには、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、核磁気共鳴、質量分析等の技術に基づく物理的分析、或いは化学呈色反応を利用した化学的分析が主として行われてきたが、上記するように多数存在する環境汚染物質の総てを検出・同定・定量し、また毒性の評価を行うことは事実上不可能であり、極めて重大な影響を与える可能性のある物質であっても見過ごされる可能性があり、複数の化学物質の組合せが生物に重大な影響を与えていることを見落とす可能性も否定できない。
【０００５】
環境中の毒性物質を的確に検出できる試験系として、バイオアッセイによる毒性評価試験技術が、その簡便さ、高感度の故に注目されている。ここに、「バイオアッセイ」とは、生物を用いた化学物質の評価のことで、化学物質の毒性等に関する情報を生物学的な応答反応により評価する方法のことである。従来実用化されている生体細胞を用いるバイオアッセイ技術は、主に細胞数の変化や代謝活性、ＤＮＡ合成、タンパク合成等を指標としたものであり、これ等は何れも個々の細胞の内部での生化学的反応に対する化学物質の影響を検出・測定し、或いは判定するものであるが、細胞を数日間にわたり培養する必要がある等、一般的に測定時間が長い等の問題がある。また、上記した従来のバイオアッセイ技術では、化学物質の生体免疫系に対する影響を評価するための細胞間の相互作用や外部環境に対する細胞応答性、細胞走化性反応等を評価することはできない。
【０００６】
本発明は、後述するように、細胞の走化性又はランダムムーブメントを指標とする種々の物質の毒性試験方法であるが、細胞の走化性又はランダムムーブメントを検出する手段として充分な性能を備えたものは存在しない。例えば、　細胞の走化性をｉｎ　ｖｉｔｒｏ　で検出する装置としてボイデンチェンバーが使用されてきた（非特許文献１参照）。これは、細胞が通過できる大きさの穴（直径３〜８μｍ）があいているフィルターで上室と下室とに２分された構造を有し、上室に細胞浮遊液を、下室に走化性因子を含む検体溶液を入れ、走化性因子に向かって移動する細胞がフィルターを通過し又はフィルターの裏面に現れた数を観察する装置である。今日最も普通に使用されている装置であるが、細胞浮遊液の量として、１×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度の浮遊液を１／４ｍｌ〜１／２０ｍｌ要する。これは、細胞数にして、少なくとも５×１０４個を必要とすることを意味する。多量に得られる細胞を対象とする場合はさしたる問題はないが、例えば、好酸球は抹消血白血球に占める割合が１〜５％程度、好塩基球は同じく１％以下、単球は同じく１〜２％程度であり、この様な少量のみ存在する細胞を対象とする場合は、必要量を手に入れるために多くの労力を要する。また、マウスのような小動物を用いる場合、採血可能な量は限られており、一頭あたりせいぜい１．０ｍｌ程度であり、その性質を調べるには使用量が少ないことが望まれる。また、ボイデンチェンバーにおいては、移動する過程にある細胞の状態の観察や数の計数をすることができないこと、細胞のランダムムーブメントによるフィルターの通過現象と細胞の走化性によるフィルターの通過現象との区別がつきにくく、往々にして判定を誤る可能性を否定できない。
【０００７】
細胞の走化性を数個のレベルで観察できる定性用スライドグラスが市販されている（ニューロプローブ社製、商品名ジグモンドチェンバー／非特許文献２参照）。これは、横縦２５×７５ｍｍ、厚さ２ｍｍの顕微鏡ガラススライド上に、１ｍｍ幅のブリッジ（流路）を挟んで横方向の長さ２５ｍｍ、幅４ｍｍ、深さ１ｍｍの溝（ウエル）が２個設けられている。即ち、二つのウエルが流路を挟んで連通した形を有している。一方のウエルに細胞浮遊液を入れ、他方のウエルに走化性因子を含有する検体溶液を入れ、カバーグラスを被せて、一方のウエルから流路を越えて他方のウエルへ移動する細胞を顕微鏡で観察する。然し、ブリッジが細胞の径又は変形能に合わせた空間を形成することは想定されていない。また、流路に細胞が通過する溝は設けられていない。更に、一個のウエルの容積が１００μｌであり、少なくとも１／１０　ｍｌの細胞浮遊液を要する。
【０００８】
また、同様な構造のものとして、スライドグラス上に、同心円状に二つの溝（ウエル）を設け、その間をブリッジ（流路）で隔てたケモタキシスチャンバーが市販されている（ウェーバーサイエンティフィック社製、商品名　ダンケモタキシスチャンバー）。これは、内側のウエルに細胞浮遊液を、外側のウエルに検体を夫々入れ、カバーグラスを被せて、流路を通過する細胞を顕微鏡で観察するものである。流路はカバーグラスより２０μｍ低く設定されており、細胞はその隙間を通過する構造である。ここで、流路の平面とカバーグラスとの間で形成される距離は細胞の径又は変形能とは無関係に設定されており、また、流路には細胞が通過する溝が設けられていない。そして、これ等、上述のスライドグラスタイプのものは、何れもウエル内における細胞の移動を精密に制御することができず、また、細胞をウエル内に注入する際の不測の移動を排除することができないため、判定に誤差を生じる可能性が高い。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｂｏｙｄｅｎ，　Ｓ．，　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．，　１１５：４５３（１９６２）
【非特許文献２】
Ｚｉｇｍｏｎｄ　Ｓ．Ｈ．，　Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　７５：６０６‐６１６（１９７７）
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞の走化性又はランダムムーブメントを指標として物質の毒性試験を行う方法に関わり、少量の細胞を用いて、細胞や試料注入時における細胞の不測の移動等の測定かく乱要因を排除して正確に、且つ、高感度で毒性評価を行う方法を提供することを目的とする。
【００１１】
即ち、本発明は、（１）液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、他方のウエルＢには細胞走化性因子を含有する試料を入れるか又は入れることなく、細胞のウエルＢの方向への移動又はランダムムーブメントの有無を検出することによる検体の毒性試験方法である。
【００１２】
また、本発明は、（２）液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、他方のウエルＢに細胞走化性因子を含有する試料を入れ、次いで細胞の走化性有無を検出することによる検体の毒性試験方法であり、或いは、（３）液体試料を静止した状態で収納できる３個のウエルＡ、Ｂ及びＣが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して直列に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一端のウエルＡに細胞懸濁液を入れ、他端のウエルＣに細胞走化性因子を含有する試料を入れ、任意の段階において中央のウエルＢに検体を入れ、次いで細胞の走化性有無を検出することによる検体の毒性試験方法である。
【００１３】
また、本発明は、（４）液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルＡ及びＢが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置の一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、更に任意の段階において血清を加え又は加えずに、流路における細胞のランダムムーブメントの有無を検出することによる検体の毒性試験方法である。
【００１４】
ここで、（５）本発明で使用される細胞走化性検出装置は、夫々のウエルにおいて試料を注入・吸出するための管と共に、注入・吸出時の圧力の変化を緩和するための管を備えていることが好ましい。更に、（６）該細胞走化性検出装置は、夫々のウエルにおける試料を注入・吸出するための管の総て、又は夫々のウエルにおける試料を注入・吸出するための管及び注入・吸出時の圧力の変化を緩和するための管の総てが、それ等の上端部において液体を収納できる空間を共有していることが好ましい。また、（７）該細胞走化性検出装置は、ウエルはガラス基板と密着するように形成されていること、流路に土手が設けられていること、土手の上部には細胞の径又はその変形能に合わせた幅及び／又は深さの溝を１乃至複数本構成する障壁が設けられているか、又は平面が設けられており、該平面はガラス基板との間で細胞の径又はその変形能に合わせた隙間を形成するべく設けられていることが好ましい。
【００１５】
更に本発明は、（８）検体と細胞を接触させ、該検体により細胞走化性又はランダムムーブメントが消失するか否かにより該検体が該細胞に対する毒性を有するか否かを判定することを特徴とする検体の毒性試験方法に関わる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、第１義的にはケモカインによる細胞の走化性に着目した物質の毒性評価を行う方法に関わり、第２義的には細胞のランダムムーブメントに着目した物質の毒性評価を行う方法に関わる。
【００１７】
ここで、本発明において毒性試験の指標とする「細胞走化性」とは、細胞が特定の化学物質を認識し、その濃度勾配に応じて移動する性質のことで、走化性因子とはその化学物質のことを云う。走化性は細胞の最も鋭敏な反応の一つであり、典型的な走化性因子であるケモカインの類には１０−９モルという極めて微量な濃度でも反応する。これ等の物質は、一般的には、高濃度になると細胞を活性化することが知られている。しかし、細胞が他の物質により重大な影響を受けた場合は走化性因子の作用に対して反応を示さなくなる。本発明は、この現象を利用して物質の毒性試験を行うものであり、そのために細胞の自力による移動を正確に捉える装置を用いるものである。
【００１８】
細胞が走化性を示す時は、細胞の一部が進行方向に伸展（糸状仮足、葉状仮足）し、接着班を形成した後、そこへ細胞質が進行方向に移動するステップが必要である。ケモカインによる細胞走化性においても、細胞は運動方向側にアクチンフィラメントを再重合させ、平行に走ったアクチンフィラメントの束を含む糸状仮足や、網状に枝分かれしたアクチンフィラメントを含む葉状仮足といった形態が観察される。これまでの細胞走化性の研究から、アクチンフィラメントの再重合へのシグナルは、ＦＲＬ又はＤＯＣＫ２→Ｒａｃ→ＩＲＳｐ５３→ＷＡＶＥ→Ａｒｐ２／３→アクチン重合→葉状仮足、または、Ｃｄｃ４２→Ｎ−ＷＡＶＥ→Ａｒｐ２／３→アクチン重合→糸状仮足といったモデルが考えられている。このモデルがケモカインにおいても当てはまることを示唆する事実が幾つも見出され、報告されている（灰野　誠、松島網治、分子細胞治療　第２巻６号　５６７〜５７６（２００１））。従って、細胞に対する毒性物質はこれ等の経路の何れかを遮断するものと考えられ、その結果として、走化性が消失することになる。更に、細胞の走化性は、喘息、リュウマチ等のアレルギー性疾患、感染症や通風等の各種炎症性疾患のように、様々な疾病の成立と密接に関わっており、この機構に影響を及ぼす物質は、所謂、毒性物質として、ヒトを始めとする生物系に重大な影響を及ぼすものと考えられる。
【００１９】
細胞に対して重大な影響を及ぼす物質としては、解糖系に対して影響を及ぼす物質、アクチン／ミヨシン相互作用に影響を及ぼす物質、細胞接着に影響を及ぼす物質等、種々多様な機作を通じて影響を及ぼす物質が存在し、無機化合物やイオン、有機化合物等、多岐にわたる。本発明は、これら種々の物質について、これ等が細胞の生命現象の一つである走化性を停止させるか否かを指標として、毒性試験を行う方法に関わる。
【００２０】
試験に用いる細胞は、目的に応じて任意に選ぶことができるが、血液細胞、例えば、好中球、好酸球、リンパ球等の白血球、マクロファージ等から選ぶことができる。中でも、好中球は比較的入手し易く、取り扱いも容易であり、好ましい例である。細胞は、試験の目的に応じ、ヒト、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、イヌ等から適宜選択して使用することができる。
【００２１】
細胞に対する走化性因子は、ケモカインファミリーとして細胞毎に明らかにされており、例えば、好中球に対しては、ＩＬ−８、Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ等が知られている。好酸球に対しては、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧｌｕやＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、ガレクチン９（エカレクチン／Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｖｏｌ．　２７３（２７），　１６９７６−１６９８４（１９９８）），　　エオタキシン（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　Ｖｏｌ．　２７１（１３），　７７２５−７７３０（１９９６））等のペプチド性因子が知られている。マクロファージ・単球に対してはＭＣＰ−１が知られている。かくして、細胞の種類と走化性因子の組合せを選ぶことにより、物質が細胞に及ぼす影響の違いを知ることができる。
【００２２】
細胞は走化性因子に対する走化性以外に、走化性因子が存在しない状態においても無方向に移動する現象（ランダムムーブメント又はランダムマイグレーションと呼ばれている）を示すことが知られている。かかるランダムムーブメントも細胞の生命現象の一つであり、その動きの有無を指標として、物質の細胞への影響の有無を判定することができる。本発明によれば、精密な細胞の動きを追跡し、検出することができるため、ランダムムーブメントを指標とする毒性試験方法も提供される。ランダムムーブメントを指標とすれば、高価な走化性因子を使用しないで済むというメリットがある。また、本発明者が得た知見によれば、ランダムムーブメントは血清の存在により増進する。例えば、好中球懸濁液を３７℃で３０分間維持するとランダムムーブメントは消失するが、これに終濃度にして約１０％の血清を添加するとランダムムーブメントが復活することが観察された。
この現象を利用して、後述するようにランダムムーブメントの消失をより正確に確認することができる。
【００２３】
本発明で細胞の走化性又はランダムムーブメントの有無を判定乃至検出するための装置は、液体試料を静止した状態で収納できる２個のウエルが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して相互に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置であり、その一つのウエルＡに細胞懸濁液及び検体含有液を入れ、又は予め検体で処理した細胞の懸濁液を入れ、細胞のウエルＢの方向への移動又は流路におけるランダムムーブメントの有無を検出することにより検体の毒性試験を行うことができる。
この場合において、細胞を血清で処理するとランダムムーブメントが増進される状況を設定することができ、その状況においてなおランダムムーブメントが抑制されるか否かを判定することにより、より正確に検体（毒性物質）の細胞に対する影響を調べることができる。細胞を処理する際の血清の濃度は、終濃度で１０％程度でよいが、これに限らず、適宜の濃度を選択できる。
【００２４】
本発明において使用することができる装置の他の好ましい態様としては、液体試料を静止した状態で収納できる３個のウエルＡ、Ｂ及びＣが細胞の移動に対して抵抗性を有する流路を介して直列に連通しており、且つ、夫々のウエルが試料を注入・吸出するための管を備えている細胞走化性検出装置であり、その一端のウエルＡに細胞懸濁液を入れ、他端のウエルＣに細胞走化性因子を含有する試料を入れ、任意の段階において中央のウエルＢに検体を入れ、次いで細胞の走化性有無を検出することにより、検体の毒性試験を行うことができる。
【００２５】
更に、上述の細胞検出装置は、夫々のウエルにおいて試料を注入・吸出するための管と共に、注入・吸出時の圧力の変化を緩和するための管を備えていることが好ましく、また、これ等、試料を注入・吸出するための管の総て、又は、試料を注入・吸出するための管及び注入・吸出時の圧力の変化を緩和するための管の総てが、それ等の上端部において液体を収納できる空間を共有していることが好ましい。かかる構造を採用することにより、試料をウエル内に注入する際の液圧で試料が他方のウエルに移動し、判定を誤らせることを防止することができる。
【００２６】
本発明において用いられる細胞走化性検出装置の好ましい態様は、ウエルはガラス基板と密着するように形成されていること、流路に土手が設けられていること、土手の上部には細胞の径又はその変形能に合わせた幅及び／又は深さの溝を１乃至複数本構成する障壁が設けられているか、又は平面が設けられており、該平面はガラス基板との間で細胞の径又はその変形能に合わせた隙間を形成するべく設けられていることである。
【００２７】
ウエルが流路を介して互いに連通している一組の構造体（以下、ウエルユニットと呼ぶ）の複数を集積させることにより、多数の検体を同時に処理することが可能となる。
【００２８】
複数のウエルユニットを集積させ、これ等のウエルに試料・検体を供給するための自動ピペットの操作をコンピュータープログラムで制御することにより、試料・検体の供給操作を自動化することができる。
【００２９】
以下において、本発明をより具体的に説明するが、これ等は代表例を述べているものであり、本発明を限定するものではない。
【００３０】
図１は、本発明で用いられる装置の一例を示すもので、ウエル２Ａに、管３Ａを通して細胞懸濁液が注入される。ウエル２Ｂには走化性因子を含む溶液が管３Ｂを通して注入され、細胞が正常な状態である場合は、細胞がウエル２Ａからウエル２Ｂに向かって移動しようとして、流路１を通過する。図１の場合、流路１は、基板５に設けられた土手８と透明なガラス基板６との間で、細胞の大きさに相当する隙間が形成されているが、１個の細胞が通過できる細い溝を複数本構成する障壁が形成されていても良い（例えば、図１７参照）。流路１を通過する細胞の状況は、ガラス基板６を通して、例えば顕微鏡９で観察される。図２は基板５の下面図である。なお、図１及び図２で例示する装置は、各ウエルにおいて管３Ａと４Ａ、３Ｂと４Ｂが相互に連通した構造であり、連通管を通して圧力を分散させる構造である。この装置において、ウエル２Ａに細胞懸濁液と検体含有溶液をいれ、ウエル２Ｂに走化性因子含有溶液を入れ、細胞が流路１を通過するかどうかを検出器９で観察する。細胞の移動が検出されなければ、細胞は走化性を失っており、検体は細胞に対して重大な影響を及ぼす物質であると判断される。以下に述べる装置も同様に使用される。
【００３１】
図３は、本発明で使用される装置の他の例を示すもので、基板５、ブロック７及びガラス基板６から構成されるユニットを示している。図３において、１０で示す空間が、各ウエルに設けられた管３Ａ、３Ｂの上端部３Ａｂ、３Ｂｂにより共有される空間であり、装置全体は、細胞走化性に影響を与えない液体、例えば緩衝液等で満たされている。その液体の量は該空間１０の少なくとも一部を満たす量である。この液体により、装置全体が同一の圧力下に置かれ、且つ、液体の抵抗により、試料の注入圧及びウエルの水平が崩れた場合による試料の急激な移動が抑制される。かくして、走化性因子の濃度勾配が水平方向に形成されると共に長時間にわたり維持される。
【００３２】
図４は、更に他の例を示すもので、各ウエルが試料注入のための管３Ａ、３Ｂ以外に、それと連通する関係にある管４Ａ、４Ｂを有し、それ等総ての管の上端部３Ａｂ、４Ａｂ、３Ｂｂ、４Ｂｂが空間１０を共有するユニットの構造を示す。
【００３３】
図５は、各ウエルにピペットで試料を注入する作業を容易にするために、夫々の注入管の上端部の周りを、注入管の径よりも大きくローと状に掘り窪めた例である。図５（１）は装置の断面図であり、（２）は上面図である。
【００３４】
上記構造の変形として、試料、例えば、細胞懸濁液を収納するためのウエルに設けられた管の上端部が、流路を介して相対するウエルに設けられた管の上端部よりも高く設定されている構造を有していても良い。例えば、図６において、管が設けられているブロック７は、ウエル２Ｂに設けられた管３Ｂの上端部３Ｂｂの周辺で掘り下げられており、ウエル２Ａの管３Ａの上端部３Ａｂが管３Ｂの上端部３Ｂｂより高く形成されている。装置全体を満たす液体は、当初は、その液面が、管３Ａの上端部３Ａｂより上に来るよう、図中、矢印Ｉで示される位置に来るよう液量を調節する。その状態で、管３Ａを通じて細胞懸濁液及び検体含有溶液をウエル２Ａに注入する。細胞は、装置全体の均一な圧力と液体の抵抗により、急激な移動が抑制され、管３Ａ内及びウエル２Ａ内に散在している。次に、空間１０から液体を吸引除去して液面を矢印ＩＩの位置、即ち、管３Ａの上端部３Ａｂが露出する位置まで下げ、更に、適量の液体を吸引することにより、管３Ａ内及びウエル２Ａ内に散在していた細胞を、ウエル２Ａ内の流路の近傍に集めることができる。吸引する液量は、管３Ａ及びウエル２Ａの容積に基づき算出でき、通常は、該容積の３分の１乃至１０分の１で目的が達せられる。なお、ウエル２Ｂへの走化性因子含有溶液の注入も、液面を再び矢印Ｉの位置に戻した状態で行うことにより、注入時の急激な圧力変化が緩和される。
【００３５】
液面を再び矢印Ｉの位置にまで戻す場合に使用する液体として、予め装置内に存在する液体（緩衝液等の水溶液）より比重が軽い液体を用いると、各ウエルの管の上部が軽い液体により蓋がされた形になり、遮断効果により、試料の無用の拡散が防止される。かかる液体としては、試料に対して不活性であり、水に不溶で、比重が１．０未満であれば適宜選択して使用できる。そのような液体の例として、ミネラルオイル（比重０．８４／シグマ社製Ｍ３５１６）、流動パラフィン等が挙げられる。
【００３６】
図７は、各ウエルが試料を注入するための管３Ａ、３Ｂと共に、これと連通する関係にある管４Ａ、４Ｂを備えている場合において、ウエル２Ａの管の上端部３Ａｂ、４Ａｂがウエル２Ｂの管の上端部３Ｂｂ、４Ｂｂより高く設定されている場合を示す。図８は、ブロック７に斜面を形成させることによりウエル２Ａの管の上端部を高く設定した場合を示す。これらは、一方の管の上端部を他方のそれより高く設定する場合の例示であり、同一の目的を達するために、他にも種々の変形がありうる。
【００３７】
本発明で使用される装置のウエルユニットは目的に応じて種々のウエルの連通様式を採用することができる。即ち、流路を介したウエルの連通様式として、図２に例示する如き２連式の他に、必要に応じて更に結合させ、連通させることもでき、例えば、図９に例示する３連式が考えられる。図９において、例えば、ウエル２Ａに細胞を、ウエル２Ｃに走化性因子を入れ、ウエル２Ｂに検体含有溶液を入れることにより、検体溶液が細胞に影響を与えるか否かを調べることができる。
【００３８】
図１０に例示するように、一つのウエルの周りに流路を介して複数のウエルを連通させた、所謂、同心状の形式をとることもできる。更には、図９のタイプの変形として、図１４の如く、同心円状にすることもできる。図１４は、３連式を同心円状にした例であるが、２連式でもこのタイプを採用することができる。図１０のウエルユニットの場合、図１１に例示するように、貫通孔３Ａａ上に管３Ａが設けられており、貫通孔３Ｂ１〜４ａ上には管３Ｂ１〜４が、貫通孔４Ｂ１〜４ａ上には管４Ｂ１〜４が夫々設けられる。ウエル２Ａに管３Ａを通して細胞浮遊液と検体溶液を入れ、ウエル２Ｂ１〜４に種々の走化性因子含有溶液を入れることにより、複数の走化性因子に対する検体の関係を同時に調べることができる。検体が、所謂、毒性物質ではなく、走化性因子阻害剤であった場合にも走化性が見られないために誤って毒性物質と判定される恐れがあるが、複数の走化性因子について検体の作用を調べることにより判定の誤りを回避することができる。図１０に例示するウエルユニットはかかる目的に使用する場合において便利である。
【００３９】
なお、ウエル内における細胞の位置を調整し易くするために、流路を介して互いに連通しているウエルの何れか一方、例えば細胞を収納するウエル、又は双方において、流路の近傍における液体又は細胞懸濁液の量を制限するべく、流路に直交して壁を設けてもよい（図１２）。図１２は、流路１を介してウエル２Ａ、２Ｂが連通しており、夫々のウエルに、流路１に直交して壁２４Ａ及び２４Ｂが設けられている場合を示す。壁２４と流路１との間隔は任意に設定できる。図１３は、流路に直交して壁を設けたウエルと流路の変形例を示しており、（１）はウエルの幅の一部に流路が設けられている場合を、（２）は流路が中央で二分され、流路を挟んで一個のウエル（２Ａ）に対し二個のウエル（２Ｂ、２Ｃ）が設けられていると共にウエル２Ａ側にのみ壁２４が設けられている場合を、（３）は流路において障壁の列がテラス１１を挟んで二列設けられている場合を、夫々示している。このような変形は例示として挙げたもので、これ等に限られないことは云うまでもない。また、必要に応じ、流路に直交して設けた壁と土手の間をテラスにしてもよい。
【００４０】
ウエルは、細胞懸濁液、走化性因子含有液、検体溶液を静止した状態で収容するための容器であり、その容積は、特に制限は無く、必要最小限の液量を収納できればよい。例えば、深さ０．０５〜０．１ｍｍ程度、幅１．２ｍｍ程度、長さ２．５ｍｍ程度あれば充分である。
【００４１】
流路１は、両端のウエル２Ａとウエル２Ｂを隔てる土手８（基板５上の突出部）及びガラス基板６により構成される（図１５）。土手８は、流路１の両端にあるウエル２Ａ、２Ｂを隔てるもので、土手８のサイズは、特に限定されるものではないが、例えば、高さ０．００３〜０．１　ｍｍ程度、相対するウエルに向かう方向における長さとして０．０１〜０．５　ｍｍ程度、相対するウエルに向かう方向に直交する方向における長さとして１．２　ｍｍ程度あればよい。
【００４２】
好ましい態様としては、土手８の上に、図１７〜図１９に例示されるような複数の障壁１２が設けられ、細胞が通過する溝１３が形成される。溝の幅は細胞の径又は細胞の変形能に合わせて設定される。ここに、細胞の変形能とは、細胞が弾力性を有するものであるとき、その弾力性のために容易に形を変え、扁平状やひも状などの形態をとり、通常、細胞が自由空間でとる形状（球状）において有する径よりも狭い間隔の溝を通り抜けることを言う。かかる溝を設けることにより、溝を通過する細胞を個々のレベルで観察することが可能となる。土手の上部に溝を構成する障壁を設けない場合は、土手の上面がガラス基板との間で細胞の径又は細胞の変形能に合わせた深さ乃至隙間であるテラスを形成する。この場合の幅／深さは、細胞の種類に合わせて、通常３〜５０μｍから選ばれる。好中球、好酸球、好塩基球、単球・マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の場合は３〜１０μｍ、例えば４、５、８又は１０μｍから選ばれ、がん細胞や組織に存在する細胞の場合は８〜２０μｍの幅が選ばれる。
【００４３】
土手の上面に、障壁を挟んで、平面であるテラス１１（例えば図１７参照）を設けると細胞の通過が観察しやすくなる。テラス１１を設ける場合、その相対するウエルに向かう方向の長さは約０．０１　ｍｍ乃至約０．５ｍｍから適宜選ばれる。なお、障壁を挟んで、一方のテラス１１−１を他方１１−２より長く設定することもできる（図２６参照）。
【００４４】
なお、図１６に例示するように、テラス１１を多段式に形成することにより、ウエル内で細胞の位置を調整するために、他方のウエル側から吸引するとき、細胞が土手８の近傍に集まり易くなる。例えば、試料が好中球、好酸球、好塩基球等である場合、テラス１１−２　及び１１−３のガラス基板６からの距離（図１６においては障壁１２の高さ）を３μｍ、テラス１１−１及び１１−４のガラス基板６からの距離を４．５μｍとし、ウエル２Ａに細胞を入れ、ウエル２Ｂ側から吸引すると、これらの細胞はテラス１１−１で一度止まった後、テラス１１−２とガラス基板６との間に集まり易くなる。各テラス１１−１〜４のガラス基板６からの距離は、取扱う試料に応じて適宜設定することができ、概ね３乃至５μｍの範囲で設定され得るが、これに限定されるわけではない。ここで、細胞を収納するウエルの反対側のテラス（１１−３）の長さを、細胞を収納するウエルの側のテラス（テラス１１−２）より約１．５乃至５倍長くすると、溝を通り抜けた細胞の観察や計数をより容易に行うことができる。なお、図１６は障壁１２が設けられている場合を示しているが、テラス１１−２　及び１１−３のガラス基板６からの距離が細胞の径又は変形能に相当する場合は、障壁は必ずしも必要ではない。
【００４５】
土手の上面に障壁１２（図１７、図１９他参照）を設ける場合、障壁１２により構成される溝１３の断面は、Ｖ字型断面、凹型断面、半円型断面等、任意の形状とすることができる。溝１３の数は、流路の幅に対する障壁の幅と溝の幅で決定される。例えば、流路の幅１ｍｍ、障壁の幅１０μｍ、溝の幅５μｍの場合、溝の数は最大で６６本となる。検出・観察に適した溝５の数は、１乃至約１００本、好ましくは好ましくは約１０乃至約７０本である。
【００４６】
障壁１２の長さは、約５〜約４００μｍから選ばれ、例えば、５、１５、２０、３０、４０、６０、１００、２００、３００又は４００μｍのものが用いられる。障壁１２自体の幅は適宜選ぶことができる。また、後述する図２２の場合は、縦横の長さがほぼ等しい方が効果的である。
【００４７】
流路１を形成する溝１３は、図１９に例示するごとく、相対するウエルに向かう方向に直交する１乃至複数本の溝１４で互いに連通していてもよい。かくすることにより、一方のウエルに入れた物質が他方のウエルに向かって拡散するのを均一化させ、或いは、、細胞が通過する様子をより正確に把握することができる。その場合、　溝１３の幅を、相対するウエルに向かう方向でこれに直交する溝１４を横切る度に段階的に変化させてもよい（図２０、図２１参照）。
【００４８】
或いは、流路を挟んで相対するウエルに向かう方向の溝が、これに直交する溝を横切るごとに相互の位置関係を変えてもよい（図２２参照）。図２２では、２分の１ピッチ、直行する方向にシフトしている場合を示す。この構造は、細胞の走化性を指標として毒性試験を行う際に支障となる細胞のランダムムーブメントの影響を少なくするのに適している。即ち、細胞がランダムムーブメントにより溝１３ａを通過することがあっても、溝１３ａを遮る形で存在する障壁１２にぶつかって元のウエルの方向に戻ることが期待される。細胞のランダムムーブメントによる溝の通過を防ぐ構造として、これ以外にも、例えば図３４（１）〜（３）に示す構造が考えられる。即ち、図３４（１）及び（２）は、細胞の進行方向（矢印）に溝１３を遮る形で細胞の進行の折り返しをさせる障壁２５を設けた例を示す。細胞は細胞膜で障壁に接して移動するので、折り返し障壁２５で進行方向を反転し、再び障壁１２の壁面に沿って元の方向に戻ることになる。図３４（３）は、障壁１２を円形にした例を示し、ランダムムーブメントの細胞が障壁の壁面に沿って戻ることになる。なお、走化性に基づく移動においては、矢印の方向に自力で移動するので、元に戻ることはない。
【００４９】
更には、障壁が相対するウエルに向かう方向に繋がっていてもよい（図２３参照）。また、土手の中央にテラスを設け、テラスをはさんで　障壁の列を２箇所に形成することもできき（図１３（３）、図２４、図２５参照）、かかる構造とすることにより、溝を通過した後の細胞の観察・計数が容易に行われる。なお、中央のテラスの大きさは、顕微鏡の視野でカバーできる大きさであることが望ましい。図２４、図２５において、（１）は上面図、（２）は断面図である。
【００５０】
障壁１２の高さ（溝の深さ）は、細胞の移動を観察する際の顕微鏡やＣＣＤカメラ等の対物レンズの焦点深度内に収まる深さであると便利であり、例えば、１０〜４０倍の対物レンズの焦点深度に合わせると３〜４．５μｍ程度が好ましいが、これに限定される必要はない。
【００５１】
流路を通過する細胞の状態を検出するに当たり、検出器９が一定時間経過毎に所定の流路上に戻り、繰返し検出を行う場合がある。例えば、後述するように、複数のウエルユニットを集積させた装置において、各ウエルユニットの流路を通過する細胞の状態を検出するために、検出器９をスキャンさせ、経時的に検出を行う場合である。このような場合、所定の流路においては検出画面の範囲が毎回同じになるよう、画面の位置決めを容易にするために、流路上の何れかの位置に印１５を設けると便利である。印１５は位置決めを容易にするために役立てば、如何なる形状でも良い。また、印１５を設ける箇所は、土手８の上部、例えば後述のテラス１１の何れかの箇所、或いは、何れかの障壁１２の上部であっても良い。また、設ける印１５の数は、１個に限らず、複数個であっても良い（図２５（１）、図２６、図２７（２）、（３）、（４）参照）。
【００５２】
走化性因子を用いる場合は、走化性因子を入れる前に、他方のウエルにおいて細胞が同じ条件で、細胞の進行方向に向かってスタートラインに並ぶようにすることは、細胞のランダムムーブメントによる混乱を抑えるために重要である。そのための構造の一つとして、流路に細胞の移動を制限するための障害物を設けることが提案される。ここに云う障害物とは、細胞の移動を完全には遮断することなく、その移動を制限するもので、例えば、一連の突起の並び、一連の三角柱や四角柱の並びを挙げることができるが、この目的を達成し得るならば如何なる形状でも採用し得る。障害物が設けられる位置は、土手の上部であることが好ましいが、目的を達成するのであれば、土手の上部に限られない。土手の上面に障壁が設けられておらず、全面がテラスである場合はその一端付近に設けられる（図２７（１）の１６）。土手の上面に障壁とテラスが設けられている場合は、障壁の列に並行して、テラスのウエル側に設けられる（図２７（２）〜（４）の１６）。なお、図２７において、（１）、（２）及び（４）は障害物として突起の並びが採用された場合の例示であり、（３）は三角柱の並びが採用された場合の例示である。障害物１６の高さは、細胞の径又は変形能に合わせた長さと同等かそれの２分の１乃至４分の１あればよい。障害物１６の間隔は、通常は、細胞の径又は変形能に合わせた長さと同等に設定されるが、高さが低く設定されている場合は、それより短く設定されていてもよい。
【００５３】
流路を介して連通した複数のウエルよりなるウエルユニットの複数個を１枚の基板上に配置乃至集積して多数検体を同時に処理する装置とすることができる。同じタイプのユニットを並列に配置し、又は、異種のユニットを配列することが可能である。以下に各図に基づいて配置乃至集積の様式を説明するが、もとよりこれ等は例示であり、これ等に限定されるものではなく、目的に応じて種々の組み合わせを採ることができる。図２８は、図２に示すタイプの、２つのウエルが流路を介して連通してなるウエルユニットが、１辺が１６ｍｍの正方形である一枚の基板５上に１２個設けられた例を示す。この例では、１つのウエルユニットの大きさは長辺が５．７ｍｍ、短辺が１．２ｍｍであり、各ウエルユニットは０．８ｍｍの間隔で配置されている。図２９は、図１２に示すタイプのウエルユニットが１２個集積配置された場合を示す。
【００５４】
図３０は、図２８に示される多数ユニットの集積を更に集積させた場合の一例を示す。即ち、図３０においてＡ１〜４、Ｂ１〜４、Ｃ１〜４で表される四辺形の夫々が図２８で示される集積である。ここで、Ａ行、Ｂ行及びＣ行は互いに異なったタイプのユニットの集積であってもよい。
【００５５】
図３１は、２連式の独立したユニットが円形に集積されている例を示す。図３１の一点破線においける断面を図３２に示す。大きさの一例を示せば、ウエル２Ａ及び２Ｂは半径方向の幅が１．５ｍｍ、流路１の半径方向の幅は０．５ｍｍであり、流路１には１０μｍ幅の溝１３が設けられている。この場合、ユニット全体としての円の半径は５．０ｍｍとなる。
【００５６】
これら、多数のユニットを集積させる場合において、ブロック７やガラス基板６は、ユニット全体をカバーするように１個又は１枚とすることができる（図３３参照）。
【００５７】
図３３は、多数ユニットを集積させた細胞走化性検出及び細胞分離装置を組立てる場合の一例を示す。カバーキャップ１７と中間支持体２１の間に多数ユニットを集積させた基板５、パッキング５’とそれをカバーする１個のブロック７をおき、中間支持体２１と底支持体２２の間に１枚のガラス基板６をおき、ネジで締め付ける。ブロック７と基板５との位置関係は中間支持体２１で規定され、中間支持体２１に設けられたガイドピン２０とブロック７の底面に設けられたガイドピン受孔１９によって固定される。なお、基板５とブロック７とは直接圧着させても良い。
【００５８】
なお、図３３において、集積ユニットの代わりに、１つのウエルユニット、即ち、１対のウエルと流路を設けた基板５を用い、全体を組み立てたユニットを、一定の間隔で複数個配置することも可能である。この場合、ユニット毎に逐次交換することができる。
【００５９】
本発明で使用される細胞走化性検出装置においては、細胞懸濁液、走化性因子含有溶液及び検体溶液をウエルユニットに供給する際、或いは、液面を調節するために空間１０において液体を吸引・排出する際、例えば、コンピュータープログラムで制御されるオートピペットを用いて自動制御することが可能である。この目的に使用できるオートピペットは既に知られており、容易に自動制御機構を備えた検出装置を組み立てることができる（例えば、特願２００１−３４３７１３号参照）。
【００６０】
本発明において用いられる検出手段は、流路を移動する細胞又は移動した後の細胞を検出できる手段であればよく、必要に応じ検出結果を記録するための手段を含む。細胞を検出・記録するために知られている手段であれば何れも使用可能であり、例えば、顕微鏡、顕微鏡とビデオカメラの組合せ等である。対物レンズにＣＣＤカメラを取り付けた構造を採用することもできる。集積ユニットの検出においては、対物レンズが各ユニットの流路を順次スキャンする構造を採用することが好ましい。
【００６１】
検出手段は、通常は、図１や図４に示すように、ウエルユニットの流路に設定されるが、多数のウエルユニットを集積させた自動装置においては、所定の位置に設置された検出部に各ウエルユニットの列が順次移動し、検出・記録を行う構造を採ることもできる。検出は、直線上に並んでいる各ウエルユニットの流路を検出器がスキャンすることにより行われる。スキャンする検出器は１個でも良いし、複数個でもよい。かくすることにより、比較的少ない数の検出装置で多数の集積ユニットに対応することが可能となる。
【００６２】
流路上を通過する細胞の検出・計数は、細胞を直接顕微鏡で捉えることにより行うこともできるが、常法に従い、予め細胞を発光・蛍光物質でマーキングしておき、その発光・蛍光を捕捉することにより容易に検出・計数することができる。
【００６３】
以上説明した装置を用いて検体に毒性物質が存在するか否かを試験する方法の一例を述べれば次の通りである。まず、細胞とその走化性因子の組合せを選択する。次いで、ウエルの一つに細胞懸濁液を注入し、検体溶液を注入する。或いは、細胞を検体溶液で処理した後ウエルに注入しても良い。その後、他方のウエルに走化性因子含有溶液を注入し、細胞の走化性有無を検出する。検体に毒性物質が含まれていれば、細胞は走化性を示さない。
【００６４】
他の試験方法としては、ウエルの一方に細胞懸濁液を入れ、他方のウエルに走化性因子含有溶液を入れる。細胞の走化性を確認した後、細胞の入っているウエル又は走化性因子が入っているウエルと細胞が入っているウエルとの間にあるウエル（例えば図９のウエル２Ｂ）に検体溶液を注入する。細胞が走化性を示さなくなれば、その検体には毒性物質が存在することがわかる。本発明で用いる装置は、ウエルへの試料の注入が細胞の動きに影響を及ぼさない、或いは、影響を最小限に抑えることができるので、細胞の移動が走化性の故であるのか、液体の注入圧によるのかの判定に混乱することがない。
【００６５】
細胞のランダムムーブメントを指標とする場合は、ウエルの一方に細胞懸濁液を入れ、次いで検体を入れるか、或いは、予め検体で処理した細胞をウエルに入れ、流路に現れる細胞の有無を検出することにより、検体の細胞への影響、即ち、毒性の有無を判定することができる。ランダムムーブメントを増進させるために細胞懸濁液に血清を添加することにより、測定の精度を上げることができる。
【００６６】
多数集積型の装置を用いれば、検体を入れない対照群と検体を入れた測定対象群とを同時に検出し、比較することができる。しかも、同時に多数の検体を処理することが可能である。
【００６７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、これ等はもとより例示であり、本発明を限定するものではない。
【００６８】
【実施例１】
これまでに走化性が確認されている細胞と走化性因子の組合せのとして、ヒト好中球とＩＬ−８の組合せを用いて、ヒト好中球の走化性に影響を与える化学物質を加えることによりその影響を観測し、毒性の評価が可能であることを確認した。
【００６９】
１）実験に用いた検出装置、細胞、および試薬
１−１）検出装置
使用した検出装置は、断面が図４に示す構造を有し、管３Ａ、Ｂ及び４Ａ、Ｂの断面は円形であり、ウエルユニットは図２のタイプであるが、貫通孔は何れも円形であり、また、土手８に設けられた障壁はは図２５の構造を有する。テラスの相対するウエルに向かう方向の長さは２６０μｍ、横幅は１２００μｍであり、障壁の高さは５μｍである。図２におけるウエル２Ａに細胞懸濁液を入れ、ウエル２Ｂに走化性因子含有溶液を入れ、ウエル２Ａ側の障壁の列（細胞のスタートライン）からウエル２Ｂの方向に１３０〜２６０μｍの領域の細胞をカウントした。該装置は予め緩衝液ＲＰＭＩ１６４０　（ＳＩＧＭＡ　Ｒ７３８８）で空間部（図４の１０）まで満たされている。
【００７０】
１−２）細胞
好中球は健常人よりヘパリンナトリウム（１２．５ＩＵ／ｍｌ）真空採血管を用いて採血した。モノポリ分離溶液（大日本製薬）を用いて得られた顆粒球層を分取し混在した赤血球をｏｓｍｏｔｉｃ　ｓｈｏｃｋにより除去しＨＢＳＳ溶液（ギブコ）で洗浄した細胞を好中球とした。好中球を０．１％ＢＳＡ　ＲＰＭＩ１６４０　（ＳＩＧＭＡ　Ｒ７３８８）に浮遊さ４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、０．６μｌずつ使用した。検出装置の１ｗｅｌｌに２４００個の細胞が注入されたことになる。通常、上記検出装置を使用する時は１００個から５００個の細胞数で使用可能だが、このように過剰の好中球を注入することにより被験細胞数が増え、走化性因子を添加しなくても画像検出部分に移動する、いわゆるｒａｎｄｏｍ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎの数も相対的に増えるため、通常数個程度のｒａｎｄｏｍ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ数が過剰の細胞を注入すると数十個になり、走化性因子を加えなくても細胞は画像検出部分に遊走するのを観察することが出来、薬剤が細胞に与える影響をより生体内に近い状態での細胞の動きを観察することが可能である。
【００７１】
１−３）走化性因子
ＩＬ−８（コスモバイオ社製）は０．１％ＢＳＡ　ＰＢＳで溶解した後、ＲＰＭＩ１６４０で希釈して１０−７Ｍ　とし、１回当たり１μｌずつ添加した。
【００７２】
１−４）毒性物質
日常、汎用されている薬品のうち、エタノール、アジ化ナトリウム、ホルムアルデヒドを選び、これらの好中球の運動能に与える影響を調べた。エタノールは手指の消毒、また、癌スクリーニングに欠かせない細胞診の標本の固定液として用いられている。消毒剤として用いる場合７０％で最も殺菌力が強く、細菌、結核菌、ウイルスを不活化する作用がある。細胞診の固定液として用いる場合は７０〜１００％で、組織の脱水と蛋白質の沈澱作用を有する。アジ化ナトリウムは臨床検査検体や、種々の試薬における防腐剤として繁用されており、使用濃度は通常０．１％である。ホルムアルデヒドは病理学的標本の固定液として細胞のタンパク質を凝固させる作用を有する。ホルマリン原液（３５．０〜３７．０％）が用いられている。固定液として使用する場合の濃度は１０〜２０％である。近年、建築機材などに用いられていることからシックハウス症候群の原因のひとつとも考えられている。
【００７３】
２）毒性試験
２−１）細胞をウエルに注入した直後に毒性物質を作用させる方法
細胞懸濁液をウエル２Ａに注入し、空間部（図４の１０）から液体を吸引することにより細胞を所定の位置に並べ、その直後にウエル２Ｂに１０−７Ｍ　のＩＬ−８を１μｌ注入した。更に、種々の濃度に希釈したエタノール、アジ化ナトリウム、ホルマリンの各々１μｌをウエル２Ｂに注入し、３０分後における細胞の数をカウントした。結果を図３５に示す。図において、（１）はエタノール、（２）はアジ化ナトリウム、（３）はホルマリンで処理した場合の結果を示す。各図から明らかな様に、添加した薬剤の濃度に従って、走化性を示す好中球の数が減少した。
【００７４】
この方法は、主に即時型の毒性を検出するために利用できると考えられる。しかしながらこの方法では、薬剤が細胞に作用したために走化性が抑制されたのではなく、薬剤が走化性因子の活性そのものを失わせた可能性も否定できず、結果の評価には注意が必要である。
【００７５】
２−２）　細胞を薬剤とプレインキュベートした後に走化性因子を作用させる方法
２−２−１）　エタノール曝露が遊走細胞数に与える影響
各濃度のエタノールによる細胞のプレインキュベートが細胞の走化性に与える影響を調べた。
【００７６】
エタノールは純エタノール（９９．５％）を滅菌蒸留水で１０％、１％及び０．０１％に希釈したものを用いた。これを好中球が含まれる培養液に終濃度が１％、０．０１％及び０．００１％となるように添加して、室温で３０分間インキュベートした。なお３０分後の好中球の生存率は９６〜９８％であった。この細胞を洗浄した後に所定量をウエル２Ａに注入し、次いでウエル２Ｂに１０−７Ｍ　のＩＬ−８を１μｌ注入して細胞の走化性を観察した。ＩＬ−８注入後、画像検出部分を遊走した細胞数を５分おきにカウントした。下記に示すように、遊走細胞数はエタノールの濃度に依存して抑制されることが明確に示された。
2004003965.tif 000003
【００７７】
同様にして、ホルマリン、アジ化ナトリウムの濃度を変えて好中球を処理して、ＩＬ−８との作用を調べた結果を下記に示す。細胞数はＩＬ−８注入２０分後における画像検出部分を遊走した数である。この場合も遊走細胞数が毒性物質により抑制されることが明確に示された。
2004003965.tif 000004
【００７８】
【実施例２】
実施例１で使用したと同一の装置、細胞及び毒性物質を用いて、細胞のランダムムーブメントを指標とする毒性試験の可能性を検証した。即ち、各濃度の毒性物質と共にプレインキュベートした細胞懸濁液をウエル２Ａに１μｌずつ注入した場合（１）と、更にこれにヒト血清を終濃度が１０％になる様に加えた場合（２）とについて、ウエル２Ａ側の障壁の列（細胞のスタートライン）からウエル２Ｂの方向に０〜２６０μｍの領域の細胞をカウントした。結果を下記に示す。細胞数は、細胞注入２０分後における画像検出部分を遊走した数である。細胞のランダムムーブメントが毒性物質により抑制されることが対照との比較から明らかであり、ランダムムーブメントが毒性試験における指標となり得ることが示された。
【００７９】
2004003965.tif 000005
【００８０】
【発明の効果】
本発明による毒性試験方法はバイオアッセイ系であるため、未知の毒性物質や複合的に影響するもの等も検出可能であり、また、細胞走化性という極めて鋭敏な生体反応を利用し、或いは細胞のランダムムーブメントを指標とすることができるため、微量の毒性物質でも高感度、且つ短時間で検出・測定することが可能である。
【００８１】
本発明は、環境中に存在する物質の毒性試験の他に、新規な薬剤の開発過程において薬剤候補物質の毒性試験等に利用することができ、その他、食品、飲料を始めとする生活関連物質の生体への影響を調査するためにも応用することができる。特に、新薬開発においては、新規物質の安全性を動物実験により間接的に確認しているが、本発明によれば、その物質が与える影響を、ヒト細胞を用いて直接的に検証することができる。
【００８２】
即ち、本発明によれば、様々な疾病と密接な関わりを有する免疫システム等に対して影響を及ぼす物質の評価が可能である。即ち、好酸球等の細胞の走化性はアレルギー等の免疫反応と密接な関係があると考えられていることから、これ等の細胞の走化性に着目した毒性物質の検出は、アレルギー等を含む免疫反応の異常を引起す毒性物質の検出を迅速に行うことを可能にすると期待される。
【００８３】
本発明において使用する装置は、細胞を個々のレベルで直接観察することができ、その容積が小さくてすみ、細胞使用量が少ない。これは、多数の検体について試験を行うとき、細胞の入手の問題が少なく、メリットが高い。例えば、末梢血からごく少量しか得ることが出来ないために研究が進んでこなかった好酸球、好塩基球、単球等についてもアッセイを容易に行うことができる。
【００８４】
本発明において使用する装置によれば、走化性を指標とする場合においては、細胞のランダムムーブメントの影響を少なくすることができるため、測定のバックグラウンドが低く、正確な判定が可能である。また、ランダムムーブメントを指標とすることもでき、その場合は、高価な走化性因子を使用しないで済むというメリットがある。
【００８５】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の毒性試験で用いられる細胞走化性検出のための装置の一例を示す概念図。
【図２】図１の装置のウエルユニットの下面図。
【図３】本発明の毒性試験で用いられる細胞走化性検出装置の他の例を示す。矢印は、装置を満たす液体の液面の位置を示す。
【図４】本発明の毒性試験で用いられる細胞走化性検出装置の他の例であって、ウエルに試料を注入・採取するための管３と試料の注入・採取時における昇圧・減圧を回避するための管４が設けられている装置の構造を示す概念図。矢印は、装置を満たす液体の液面の位置を示す。
【図５】試料注入管の上部にピペット先端部の導入口を設けた装置の例を示す。（１）は断面図であり、（２）は上面図である。
【図６】本発明の毒性試験で用いられる細胞走化性検出装置の他の例であって、細胞を入れるウエル２Ａの管３Ａの上端部３Ａｂが、他のウエル２Ｂの管３Ｂの上端部３Ｂｂより高く設定されている構造を示す概念図。矢印Ｉ及び矢印ＩＩは、装置を満たす液体の液面の位置を示す。
【図７】本発明の毒性試験で用いられる細胞走化性検出装置の他の例であって、ウエルに試料を注入・採取するための管３と試料の注入・採取時における昇圧・減圧を回避するための管４が設けられている装置において、細胞を入れるウエル２Ａの管３Ａ、４Ａの上端部３Ａｂ、４Ａｂが他のウエル２Ｂの管３Ｂ、４Ｂの上端部３Ｂｂ、４Ｂｂより高く設定されている構造を示す概念図。矢印Ｉ及び矢印ＩＩは、装置を満たす液体の液面の位置を示す。
【図８】図７の構造の変形例を示す。矢印Ｉ及び矢印ＩＩは、装置を満たす液体の液面の位置を示す。
【図９】ウエルが流路を介して３連式に連通する場合の基板の上面図を示す。
【図１０】複数のウエル２Ｂ１〜４が流路１を介して１つのウエル２Ａに連通している場合の基板の上面図を示す。
【図１１】図１０の基板を備えた装置であって、図１０の一点破線における断面図を示す。矢印Ｉ及び矢印ＩＩは、装置を満たす液体の液面の位置を示す。
【図１２】流路に沿って壁が設けられたウエルの例を示す図である。
【図１３】流路に沿って壁が設けられたウエルの他の例を示す図である。
【図１４】図１０の連通様式が円形に構成された場合の上面図を示す。
【図１５】流路１の構造の一例を示す。
【図１６】流路１における土手８が多段式のテラス１１−１〜４を有する場合を示す。
【図１７】流路１における障壁１２と溝１３の配列例を示す。矢印は、相対するウエルに向かう方向を示す。
【図１８】図１７の流路１の断面図を示す。
【図１９】流路１を挟んで相対するウエルに向かう方向の溝１３が、これに直交する２本の溝１４で連通している場合を示す。矢印は、相対するウエルに向かう方向を示す。
【図２０】流路を挟んで相対するウエルに向かう方向の溝が、これに直交する２本の溝で連通していると共に、相対するウエルに向かう方向の溝の幅が直交する溝を横切るごとに段階的に変化する場合を示す。図中矢印は相対するウエルに向かう方向を示す。図は、障壁自体の幅が変化する場合を示す。
【図２１】図２０の変形例で、障壁の大きさは同じであるが、その数が増減する場合を示す。図中矢印は相対するウエルに向かう方向を示す。
【図２２】流路を挟んで相対するウエルに向かう方向の溝が、これに直交する３本の溝で連通していると共に、相対するウエルに向かう方向の溝が、これに直交する溝を横切るごとに相互の位置関係を変えている場合を示す。図では、２分の１ピッチ、直行する方向にシフトしている場合を示す。図中矢印は相対するウエルに向かう方向を示す。
【図２３】障壁が相対するウエルに向かう方向に繋がっている場合を示す。
図中矢印は相対するウエルに向かう方向を示す。
【図２４】土手の中央にテラスを設け、テラスをはさんで　障壁の列を２箇所に形成した例を示す。（１）は上面図、（２）は断面図である。
【図２５】図２４に示す流路において画面の位置決めのための印１５を二箇所に設けた例を示す。（１）は上面図、（２）は断面図を示す。
【図２６】流路において画面の位置決めのための印１５を一箇所に設けた例を示す。
【図２７】土手に、細胞の移動を制限するための障害物１６を設けた場合の例を示す。
【図２８】多数ユニットの集積例であり、同一タイプのユニットの集積例を示す。
【図２９】図１２のウエルが集積配置された例を示す図である。
【図３０】複数種のユニットを多数集積させた例を示す説明図である。
【図３１】多数のユニットを円形に集積させた例を示す。
【図３２】図３１の一点破線における断面図である。
【図３３】細胞走化性検出装置の組立例を示す図であり、（１）は部品毎の斜視図、（２）は対応する断面図である。
【図３４】細胞のランダムムーブメントによる溝の通過を制限するための流路の構造の例を示す。矢印は細胞が走化性により進行する方向を示す。
【図３５】細胞をウエルに注入した直後に毒性物質を作用させる方法で試験を行った場合の結果を示す。（１）はエタノール、（２）はアジ化ナトリウム、（３）はホルマリンを作用させた場合の結果を示す。
【符号の説明】
１：流路
２：ウエル。添字のＡ、Ｂ、Ｂ１〜ｎ、Ｃはウエルの区別を意味する。
３：試料注入・採取用管。添字のＡ、Ｂ、Ｂ１〜ｎ、Ｃはウエルの区別を、ａは管３に対応する基板５の貫通孔を、ｂは管３の上端部を夫々意味する。
４：試料の注入・採取時における昇圧・減圧を回避するための管。添字のＡ　　　　、Ｂ、Ｂ１〜ｎ、Ｃはウエルの区別を、ａは管４に対応する基板５の貫通孔を、ｂは管４の上端部を夫々意味する。
５：基板
５’：パッキング
６：ガラス基板
７：管を穿ったブロック
８：土手
９：検出器
１０：管の上端部により共有される空間
１１、１１−１〜４：テラス
１２：流路１における障壁
１３：流路を挟んで相対するウエルに向かう方向の溝
１４：溝１３に直交する溝
１５：画像の位置決めのための印
１６：障害物
１７：カバーキャップ
１８：０−リング
１９：ガイドピン受孔
２０：ガイドピン
２１：中間支持体
２２：底支持体
２３：底部基板
２４：流路に沿って設けられた壁
２５：折り返し障害物
←　：装置を満たす液体の液面の位置
←Ｉ：上位にある管の上端部が覆われる液面の位置
←ＩＩ：上位にある管の上端部が露出する液面の位置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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