(57)【要約】  【課題】  抗凝固剤を加えない血液を用いて抗血栓性を有する食品およびその品種を選別することを特徴とする抗血栓性食品の評価方法を確立し、ならびにその評価方法に基づく、食品またはその加工食品、そのための加工方法などを提供すること。  【解決手段】  抗血栓性の評価方法として、抗凝固血を用いないGorog Thrombosis Testによるin vitro評価、次いで実施されるHe-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるin vivo評価を組み合わせることが好ましい。この評価方法による結果は、抗血栓性などの機能性を有する食品および加工食品などの選別に優れており、これらの方法で選別された抗血栓性食品を供給することができる。【選択図】  なし 【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固剤を含まない血液と食品抽出液とを用いて、Gorog Thrombosis Testによるin vi
tro評価、次いでHe-Neレーザー惹起血栓形成システムによるin vivo評価を行うことによ
り、抗血栓性を有する食品およびその品種を選別することを特徴とする抗血栓性食品の評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法による評価に基づいて造られたことを特徴とする食品またはその加工食品。
【請求項３】
請求項１に記載の方法を用いて評価される抗血栓性を有する食品が穀物、野菜または果物であることを特徴とする食品またはその加工食品。
【請求項４】
請求項１に記載の方法を用いて選定された抗血栓性を有する食品を原料として用意する工程と、この食品から抗血栓性を有する抽出液を作製する工程と、この抽出液をさらに分画して抗血栓性を有する画分を得る工程とを少なくとも備えたことを特徴とする食品加工方法。
【請求項５】
請求項４に記載の食品加工方法において、前記原料が、穀類、野菜または果物であることを特徴とする食品加工方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血栓形成性を有する食品および食品加工方法に関する。詳しくは、抗凝固剤を含まない血液を用いてGorog Thrombosis Testによるイン・ビトロ（in vitro）の評
価、次いでHe-Neレーザー惹起全血血栓形成システムによるイン・ビボ（in vivo）の評価を行うことにより、血栓形成阻害と血栓溶解促進の両活性を測定して得られる抗血栓形成性食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
食事の西欧化（具体的には動物性食品摂取や脂肪摂取の増加など）や高齢化社会の到来などにより、心筋梗塞、糖尿病や高血圧症、高脂血症などの生活習慣病対策が大きな社会問題となっている。そうした生活習慣病の発症には、多くの場合、動脈血栓が深く関与している。また、いわゆるロング・フライト（またはエコノミークラス）症候群においては、静脈血栓が深く関与している。さらに、抗血栓薬の投与がある種の癌や血管性痴呆、アルツハイマー痴呆の症状を改善することも報告されている。
【０００３】
したがって、血栓形成の予防は、現代における多くの疾患の予防と治療に大いに役立つことが期待される。このような血栓に対する抗血栓形成性、血栓溶解性などの生理活性を有する医薬品としてはアスピリン等が知られている。
【０００４】
食品についても魚類や野菜・果実類のいくつかが、血栓予防性のある食品として供されているものの、その効果は謳われているほど確実なものでもない。その理由として、以下のことが挙げられる。血栓に関する評価においては、血栓自体が血栓形成と血栓溶解および血栓に係わる酵素系とその阻害系との間のバランスで規定されるところから全体としての活性を測定する必要があるにもかかわらず、これまでその目的に適った方法が開発され、そして汎用されてきたとは言い難いからである。さらに別の理由として、このような血栓に関する評価方法が適切に確定しないなかで、一般的に抗血栓性があると言われている食品および加工食品における実状は、その効能が有効成分の含有量から選別されることが多く、血栓形成阻害と血栓溶解促進および血栓に係わる酵素系とその阻害系との総和としての抗血栓活性の定量的把握が、現実にはおこなわれていないことも指摘できる。
【０００５】
一般的に、食品素材には有効成分だけでなくその反対の生理活性を示す成分が含まれることが多い。また、一般に抗血栓性があるとされる食品において、そうした生理的機能の表示と管理が適切な評価方法で行われず、単に定性的な特性に基づいて行われていることも多い。実際、ポリフェノールを含有するブドウ果実の抗血栓性（赤ワイン）を見ても、抗血栓性発現のランダム性が認められており、すべてのブドウ果実がほぼ同程度の抗血栓活性を普遍的に有するものでもない。その点については、他の穀物・野菜・果物についても然りである。
【０００６】
血栓亢進状態の評価には、in vivoの血小板反応性（血小板粘着性と血小板凝集能）を
的確に反映する測定方法が必要である。血液凝固や血小板機能の分析装置としてはソノクロット（サイエンコ社製、米国）やその他血液凝固測定装置（例えばシスメックス社製、日本）など、数多くの機器が市販されている。しかしながら、線溶の測定に適った測定装置として十分なものはほとんどみられず、ましてや、抗血栓性食品の選別方法として適切なスクリーニング方法なども見当たらない。
【０００７】
従来、アゴニスト惹起血小板凝集法が直接的かつ現実的な方法として汎用されてきたが、アゴニスト惹起血小板凝集法の結果が、in vivoの血小板反応性をどの程度定量的に反
映しているかについては問題があった。また、キットを使用した凝固・線溶・血小板系の因子定量法も多く用いられてきたが、凝固・線溶・血小板系の因子の定量結果とin vivo
の血小板反応性との相関が明瞭ではない。これは、血小板反応性系が亢進しても、同時に阻害系も亢進した場合には、系全体の状態を正確に判定することが難しいことを示す。
【０００８】
これらの方法と違って、血栓形成傾向（血栓亢進状態）を測定する方法のなかで、in v
itroのズリ惹起（shear-induced）血小板凝集法は、in vivoにおける動脈血栓形成傾向を反映しているとされている。（(1)Ratnatunga CP, et al;"High-dose aspirin inhibits
shear-induced platelet reaction involving thrombin generation.": Circulation 85:
1077-1082, 1992 （非特許文献１）、(2)Cattaneo M,et al;"Platelet aggregation at
high shear is impaired in patients with congenital defects of platelet secretion
and is corrected by DDAVP − Correlation with the bleeding time.": J Lab Clin 
Ｍed 125: 540-547, 1995 （非特許文献２）、(3)Gorog DA, et al;"Thrombotic status
analyser. Measurement of platelet-rich thrombus formation and lysis in native bl
ood.": Thromb Haemost 73: 514-520, 1995 （非特許文献３）、(4)Tokuue J,et al; "En
hanced platelet aggregability under high shear stress after treadmill exercise i
n patients with effort angina.": Thromb Haemost 75: 833-837, 1996 （非特許文献４））
しかしながら、ズリ惹起血小板凝集法のなかで本発明で用いられるHaemostatometryとG
orog Thrombosis Test以外では、検体として多血小板血漿、抗凝固剤添加血液等にみられるように抗凝固薬剤が用いられるのが一般である。しかし、動脈血栓は単に血小板だけの反応ではなく、白血球、赤血球、血流などの相互作用の結果形成されるものであること（(1)Hamburger SA, McEver RP; "GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets t
o neutrophils": Blood 75: 550-554, 1990 （非特許文献５）、(2)Santos MT, et al;"E
nhancement of platelet reactivity and modula- tion of eicosanoid production by i
ntact erythrocytes. A new approach to platelet activation and requirement.": J C
lin Invest 87: 571-580, 1991 （非特許文献６）、(3)Maugeri N, et al; "Polymorphon
uclear leukocyte-platelet interaction. Role of P-selection in thromboxane B2 and
leukotriene C4 cooperative synthesis": Thromb Haemost 72: 450-456, 1994 （非特
許文献７））、生理的濃度のカルシウムイオンやトロンビンなども重要な役割を果たしていること（(1)Chow TW, et al; "Shear stress-induced von Willebrand factor binding
to platelet glycoprotein Ib initiates calcium influx associated with aggregatio
n.": Blood 80: 113-120, 1992 （非特許文献８）、(2)Ikeda Y, et al；"Transmembrane
calcium influx associated with von Willebrand factor binding to GP Ib in the in
itiation of shear-induced platelet aggregation.": Thromb Haemoast 69: 496-502, 1
993 （非特許文献９）、(3)Yamashita T, et al；"The antithrombotic effect of low m
olecular weight synthetic thrombin inhibitors, argatroban and PPACK on He-Ne las
er-induced thrombosis in rat mesenteric microvessels.": Thromb Res 69: 93-100, 1
993 （非特許文献１０）、(4)Harker LA, et al;"Thrombin hypothesis of thrombus gen
eration and vascular lesion formation": Am J Cardiol 75: 12B-17B, 1995 （非特許
文献１１））などから、それらのズリ惹起血小板凝集法測定による評価にも限界があることが予測された。
【０００９】
一方、in vivoの血小板反応性測定（動脈血栓の動物モデル）では、用いる血管の種類
やその大小、血栓惹起方法の違い等により幾つかのモデルが使われてきた。その一つは、冠動脈モデルや中大脳動脈モデルであり、例えば前者の冠動脈モデルでは狭窄と内皮の機械的な損傷を与えて血栓を形成させるものである。狭窄により大きなズリ力が生じ、ズリ惹起血小板凝集が起こり、損傷部位に壁在性血栓が形成される。その際血流量はゼロ近くになるが、血栓は血流により流され血流量が回復する。このモデルでは血栓の成長と消失が繰り返され、血流が増減（cyclic flow reduction）する。他方、中大脳動脈モデルに
おいては、ローズベンガルが静脈注入され、血管はキセノンランプで照射される。赤い色素は緑の光を吸収して活性酸素を発生する。活性酸素は内皮の剥離をもたらし、血小板血栓による完全閉塞がおこり、完全閉塞が起こるまでの時間が測定される。
【００１０】
また微小血管に血栓を形成させる方法として、小さな血管をピンポイントに照射できるバイオルビーレーザー、He-Neレーザー、アルゴンレーザーなどを用いたレーザー技術が
利用されるようになり、腸間膜微小血管や脳軟膜微小血管等の微小血栓モデルも確立されている。あるいはやや照射範囲は広いものの蛍光色素と紫外線（UV）照射を組み合わせたモデルも適用することが可能である。これらの方法により細動脈と細静脈のいずれに形成された血栓も血小板血栓であるが、血栓惹起の機序はレーザーの種類によっても異なっている。
【００１１】
例えば、バイオルビーレーザー惹起血栓形成は、照射により赤血球が破壊され、赤血球より放出されるADPが血小板血栓を惹起し、内皮の剥離は認められない特徴を有する。こ
れに対して、He-Neレーザー惹起血栓形成やUV惹起血栓形成では赤血球の破壊や内皮の剥
離はみられず、血管内皮の機能的損傷によりその抗血栓性が失われる。また、アルゴンレーザー惹起血栓形成では内皮のわずかな損傷と血漿タン白質凝固塊の生成が血栓を惹起することが推定されている。このような血栓惹起の機序の違いによるin vivoの評価で抗血
栓性を評価することは、生理的な条件下での抗血栓性を考えるうえで限界があるといえる。そうは言っても、抗血栓性の証明はin vivoの系で行われなければならず、上記のin vi
vo測定系は問題点があるものの用いざるを得ないのが現状である。
【非特許文献１】Ratnatunga CP, et al;"High-dose aspirin inhibits shear-induced platelet reaction involving thrombin generation.": Circulation 85: 1077-1082, 1992
【非特許文献２】Cattaneo M,et al;"Platelet aggregation at high shear is impaired in patients with congenital defects of platelet secretion and is corrected by DDAVP − Correlation with the bleeding time.": J Lab Clin Ｍed 125: 540-547, 1995
【非特許文献３】Gorog DA, et al;"Thrombotic status analyser. Measurement of platelet-rich thrombus formation and lysis in native blood.": Thromb Haemost 73: 514-520, 1995
【非特許文献４】Tokuue J,et al; "Enhanced platelet aggregability under high shear stress after treadmill exercise in patients with effort angina.": Thromb Haemost 75: 833-837, 1996
【非特許文献５】Hamburger SA, McEver RP; "GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils": Blood 75: 550-554, 1990
【非特許文献６】Santos MT, et al;"Enhancement of platelet reactivity and modula- tion of eicosanoid production by intact erythrocytes. A new approach to platelet activation and requirement.": J Clin Invest 87: 571-580, 1991
【非特許文献７】Maugeri N, et al; "Polymorphonuclear leukocyte-platelet interaction. Role of P-selection in thromboxane B2 and leukotriene C4 cooperative synthesis": Thromb Haemost 72: 450-456, 1994
【非特許文献８】Chow TW, et al; "Shear stress-induced von Willebrand factor binding to platelet glycoprotein Ib initiates calcium influx associated with aggregation.": Blood 80: 113-120, 1992
【非特許文献９】Ikeda Y, et al；"Transmembrane calcium influx associated with von Willebrand factor binding to GP Ib in the initiation of shear-induced platelet aggregation.": Thromb Haemoast 69: 496-502, 1993
【非特許文献１０】Yamashita T, et al；"The antithrombotic effect of low molecular weight synthetic thrombin inhibitors, argatroban and PPACK on He-Ne laser-induced thrombosis in rat mesenteric microvessels.": Thromb Res 69: 93-100, 1993
【非特許文献１１】Harker LA, et al;"Thrombin hypothesis of thrombus generation and vascular lesion formation": Am J Cardiol 75: 12B-17B, 1995
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以上より、従来の抗凝固血を用いたin vitroのズリ惹起血小板凝集測定法またはin viv
oの惹起血栓形成だけでは必ずしも生理的条件下で抗血栓性を評価しているとは言い難い
。したがって生理的な血栓形成とその抑制を実証する評価方法の確立に基づく、抗血栓性食品のより確実な選択が望まれている。
【００１３】
本発明者は、上記の状況に鑑み、抗凝固剤を加えない本来の血液凝固と血小板反応過程を検出することができるin vitroの方法とin vivoの評価法を組み合わせることにより、
要諦部分として抗血栓形成能を測定するための新しいシステムを開発し、食材の抗血栓形成能を品種間の差異のレベルまで判別することができ、高い抗血栓形成性食品を提供することを可能とする本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、抗凝固剤を加えない血液と食品抽出液とを用いて抗血栓性を有する食品またはその品種を選別することを特徴とする抗血栓性食品の評価方法を確立すること、ならびにその評価方法に基づく、食品またはその加工食品、そのための加工方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
(1)本発明は、抗凝固剤を含まない血液と食品抽出液とを用いて、Gorog Thrombosis Te
stによるin vitro評価、次いでHe-Neレーザー惹起血栓形成システム によるin vivo評価
を行うことにより、抗血栓性を有する食品およびその品種を選別することを特徴とする抗血栓性食品の評価方法である。
【００１６】
(2)本発明の食品またはその加工食品は、上記（1）に記載の方法による評価に基づいて造られたことを特徴としている。
【００１７】
(3) 上記食品またはその加工食品は、穀物、野菜または果物が好ましい。
【００１８】
(4) 本発明の食品加工方法は、上記（１）に記載の方法を用いて選定された抗血栓性を有する食品を原料として用意する工程と、この食品から抗血栓性を有する抽出液を作製する工程と、この抽出液をさらに分画して抗血栓性を有する画分を得る工程とを少なくとも備えたことを特徴とする。
【００１９】
(5) 上記食品加工方法において、前記原料は穀類、野菜または果物であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の方法に基づいて、血栓形成系と血栓溶解系の両活性の測定を行うことのできるGorog Thrombosis Testによるin vitro評価、次いでHe-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるin vivo評価を行うことにより、食材・食品の抗血栓・血栓溶解能に関
する評価を正確に行うことができる。
【００２１】
その評価は、抗凝固剤を含まない新鮮全血を用いて、血栓形成の中心的な役割を果たす血小板活性に対する作用を直接検出することに基づくため、抗血栓形成性を有する食品および加工食品などの選別に優れている。本発明の方法で選別された抗血栓性食品が供給さ
れることは、そうした食品の多様な用途、利用の途が開かれているため、産業利用上、極めて意義深い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
循環系疾患は、動脈硬化および血栓形成が関わっていることが多い。血栓形成を未然に防ぐには、まず血小板活性の異常な亢進を早期に発見することが有効と言われる。このため抗血栓性の機能には、血栓形成に中心的役割を果たす血小板への生理作用が含まれる。
【００２３】
本発明は、多数の食品の中から真に抗血栓性を有する食品を選別するためには、前提として、使用する評価方法の適格性ならびに方式の適正さを厳密に検証しなければならないという本発明者の認識から出発している。そのため本発明者は、抗血栓性の証明には、必ず最後はin vivoの系で行われなければならないこと、in vitroの方法においても抗凝血
剤を含まない新鮮全血を使用してなるべく自然な状態で測定すること、ならびに血栓形成において中心的な役割を演ずる血小板が作用する局面での測定を可能とする評価方法を確立することなどを課題として研究を積み重ねてきた。
【００２４】
種々の方法を用いていろいろな食品についてその血栓に対する生理的な効果を検討する過程で、本発明の組み合わせによる方法が食品の抗血栓性に関する評価法として最も有用であることを見出した。本方法により極めて安定的な抗血栓性の活性を有する食品を選別することができ、血栓予防効果のある食材・食品や加工食品を血栓予防食として供することができる。
【００２５】
なお、本明細書における「食品」とは、通念的な一般的飲食物に必ずしも限定されるものではなく、食材、さらには治療・予防に使用される食品をも含み、人間のみならず動物も摂取するものとして幅広い意味に解されるべきものである。同様に「加工食品」についても、生産もしくは採取された食材を加工したもの全般をいい、嗜好食品、健康食品、機能性食品、栄養機能食品、特定保健用食品、栄養強化食品、サプリメントなども包含される。
【００２６】
＜抗血栓性の評価方法＞
血液のハンドリング上、抗凝固剤を用いざるを得えなかった従来技術の問題点を解決し、その限界を克服するためには、抗凝固剤を加えない血液を用いるズリ惹起血小板反応性のin vitro測定法、次いで血管内に血小板を主体とする血栓を形成するin vivo測定法を
用いることによって抗血栓性を実証する必要がある。
【００２７】
この観点から検討したところ、本発明者は、血栓形成阻害と血栓溶解促進の両活性の測定を行うために、上記HaemostatometryまたはGorog Thrombosis Testによる抗凝固剤を用いないin vitro評価、次いで上記He-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるi
n vivo評価を行うことによる評価方法が、両活性のバランスの基に成立する血栓に関する評価を適切に反映しているとの確証を得た。
【００２８】
本発明者は、Haemostatometer（自作）を用いたHaemostatometryとGorog Thrombosis T
estの手法とを用いて鋭意研究を行なった結果、両測定方法がズリ惹起血小板反応性、血
栓溶解能の評価において極めて有用であることを見出した。Dr.Iren B.KovacsとDr. P. G
orogにより開発されたヘモスタトメーター（Haemostatometer）およびGorog Thrombosis
Testは、上記「発明の技術的背景」に示された経験的現象に考察が加えられ、また臨床に
適用すべく開発されたin vitro評価のための装置である。これらの抗血栓形成性の評価方法において、抗凝固剤を加えない血液が使用されることから採血後直ちに測定が可能であり、しかも従来の方法で指摘されていた試料調整の過程で反応性の高い血小板が失われている可能性もない。
【００２９】
これらin vitro評価の測定原理は、前述したように抗凝固血を用いない全血にズリ応力を与えて血小板を活性化して、プラスチックの部品内に血小板を主体とする止血栓を人工的に形成させて、血小板反応性と血栓溶解能を測定するものである。本発明者は、食品の抗血栓性に関して、両評価方法とも同一対象の食品に対し同じ評価結果を与えることも確認している。よってin vitroの評価法として、HaemostatometryまたはGorog Thrombosis
Testのいずれを用いてもよい。しかしながら、後述するように装置および測定の簡便さならびに良好な再現性からは、Gorog Thrombosis Testがより便利であり、しかも優れてい
るという結論に達している。
【００３０】
また、in vivo評価方法の候補として開発したHe-Neレーザー惹起血栓形成法においては、種々の血管が血栓形成の対象となり得る。血栓を形成する血管として、より好ましくはマウスの頚動脈が選択される。この方法において、マウスにエバンスブルー（Evans blue
）を静脈注入した後、頚動脈をHe-Neレーザーで照射し血栓を作成する。この場合、血栓
による完全閉塞には至らずにcyclic flow reductionがみられ、血栓の形成と消失は、画
像処理法により測定される。
【００３１】
以上のまとめとして、抗血栓性食品の適正な選別法のためには、(1)動脈血栓で中心的
な働きをしている血小板の働き（血小板凝集能＋血小板粘着能）が測定できること (2)血栓溶解能が測定できることである。その目的からするとGorog Thrombosis Test、Haemost
atometer（Clot Signature Analyzer）を用いるHaemostatometryおよびThrombotic Statu
s Analyser等が適合する装置であり、その再現性や操作性等からGorog Thrombosis Test
がより最適であることがわかった。本発明の研究過程で得られた血小板反応性・凝固能・血栓溶解能測定法の特徴の知見を表１に要約した。
【００３２】
【表１】
2004279399.tif 000002
【００３３】
【表２】
2004279399.tif 000003
【００３４】
＜抗血栓性の評価方式＞
次に述べる抗血栓形成性の評価プロセスは、穀物・野菜・果実等の食品素材を含め、どんな食品素材または食品にも適用でき、その結果に基づき抗血栓性食品を供することができる。
【００３５】
抗血栓性の評価方式として、生体内で実際に抗血栓形成性が実現されているかを確認するために必ず最後の段階にin vivoの評価方法を組み入れる必要がある。さらに上述のよ
うに、本発明者による研究の結果、in vitroでの測定方法、2種類のうち、その再現性や
操作性等からGorog Thrombosis Testがより好適であることがわかった。したがって本発
明では、抗血栓性などの機能性を有する食品および加工食品などの選別のための抗血栓性の評価方式として、抗凝固血を用いないGorog Thrombosis Testによるin vitro評価、次
いで実施するHe-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるin vivo評価の方法を採用する。
【００３６】
具体的には、まず抗凝固剤を含まない全血にズリ応力を与えて血小板を活性化し、プラスチックの部品内で血小板を主体とする止血栓を人工的に形成させ、血栓形成系と血栓溶解系の両活性の測定を行うことのできるGorog Thrombosis Test によるin vitroの評価方法（代わりにHaemostatometryを使用することもできるが、再現性および操作性などからG
orog Thrombosis Testの方が好ましい）を用いていろいろな食品の抽出液についてその血小板反応性および血栓溶解に対する効果を検討する。
【００３７】
有効な食品については、次にHe-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるin
vivo評価方法を用いて有用な食品の抗血栓性・血栓溶解能に関する評価を行う。なお、in
vitro測定法が不要あるいは実施不可能なものについては直ちにin vivo評価法を実施し
てもよい。また、in vivo法の採用に際して、食品が固体あるいは粉体の場合には、経口
投与後１週間〜数ヵ月後に測定を行うことが望ましい。
【００３８】
食品の抗血栓性に関する検索、同一食品材料における品種間におけるその検索は、あらゆる食品、食品材料が対象となる。とりわけ、穀類、野菜、果物などの植物性起源のものは日常的に多く摂取されており、栄養または生理機能などについて関心がもたれることが多いことから、そうしたスクリーニングの対象として好適である。今回の研究では、穀類、野菜、果物に絞って検索したが、その他の起源の食品、例えば動物性起源の食品材料をスクリーニングの対象から排除するものではない。
【００３９】
＜上記評価方法に基づく食品およびその加工＞
上記の本発明の評価方法によって抗血栓性を有することが判明した食品素材（穀物・野菜・果実等）の品種を直接、食品として食用することもできるし、それを用いて可食部分を前記のようにすりつぶし、ジュースとして食用することもできる。また有効成分を抽出し分画して活性の高い画分を得ることができる。また、これらの画分を加工することにより錠剤やカプセル等の形態による加工食品を得ることができる。
【００４０】
したがって、Gorog Thrombosis Testによるin vitro評価、次いでHe-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるin vivo評価を行うことにより抗血栓性を有すると評価
された食品（その品種も含まれる）およびその加工食品は、その提供の形態、方法を問わず、本発明に含まれる。上記食品またはその加工食品には穀物、野菜または果物が含まれる。
【００４１】
抗血栓性を有すると評価された食品（その品種も含まれる）を原料とする、本発明の食品加工方法は、上記Gorog Thrombosis Test によるin vitro評価、次いで実施されるHe-N
eレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによるin vivo評価に基づいて評価された、抗血栓性を有する食品を原料として用意する工程と、この食品から抗血栓性を有する抽出液を作製する工程と、この抽出液をさらに分画して抗血栓性を有する画分を得る工程とを少なくとも備えている。
【００４２】
上記の抗血栓性を有する食品を原料として用意する工程は、夾雑物もしくは共存物を除去し、精選するためのもので、当業界で通常用いられている技術、例えば、洗浄、粉砕、剥皮、研磨、圧搾、篩別などの方法を使用することができる。
【００４３】
次いで、この食品から抗血栓性を有する抽出液を作製する工程は、水、塩類を含有する
溶液、あるいはアルコール系、エーテル系、ケトン系、エステル系などの適当な抽出溶剤を用いて行うことができる。
【００４４】
上記工程で得られた抽出液をさらに分画して抗血栓性を有する画分を得る工程においては、通常利用されている分画方法、例えば、遠心分離、限外ろ過、塩析、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種方法、あるいはそれら分離方法の組み合わせにより行うことができる。
【００４５】
上記食品加工方法において、前記原料は特に穀類、野菜または果物であることが好ましい。
【００４６】
これらの食品加工方法において、抗血栓形成性を有する画分の分画の程度は任意であり、加工食品側からの必要性に応じて行われる。当該画分から、抗血栓性を生理作用として発揮する成分を単離同定するには、従来用いられている天然物化学または生化学的手法を利用して行うことができる。
【実施例１】
【００４７】
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００４８】
本発明は、血栓形成阻害と血栓溶解促進の両活性の測定を指標として穀物・野菜・果実等の食品素材の抗血栓性スクリーニングを行うものであり、in vitroの評価にはHaemosta
tometerを自作するとともに、Gorog Thrombosis Test（Montrose Diagnostics Limited社、英国）を入手して用いた。次いでHe-Neレーザー惹起全血血栓形成・溶解システムによ
るin vivoの評価には、He-Neレーザー（Model NEO-50MS；日本科学エンジニアリング（株）製）、CCDカメラ（Model TMC-７；竹中機器システム（株）製）、ビデオ（Model SR-17
50；日本ビクター（株）製）等を備えたシステムを用いた。
【００４９】
評価のための材料として用いた動物は、例えば10週齢の雄性Wistar/STラット（SLC Co.
Ltd., 日本）または10週齢の雄性C57BL/６マウス（SLC Co. Ltd., 日本）であり、日本
生理学会の定める「生理学領域における動物実験に関する基本方針」に従ってこれらの動物を取り扱い、in vitroおよびin vivoの動物モデルの評価を行った。動物モデルのin vi
tro評価では抗凝固剤を用いないで採血した血液を用いて行ったが、もちろんヒトの採血
した血液を用いて評価することができる。
【００５０】
検体としての穀物・野菜・果実などの食品抽出液としての試料は、個体による活性の偏りを避けるため、一品種ごとに数個体を用い全体を試料とし、可食部分を乳鉢と乳棒を用いて室温ですりつぶした搾汁液をミリポアフィルター（ニューステラディスク（R）0.45
μm，クラボウ（株），日本）で濾過し、濾液を測定まで−80℃で冷凍保存し、測定時に
解凍し使用した。
【００５１】
本発明において動物材料を用いたHaemostatometryまたはGorog Thrombosis TestならびにHe-Neレーザー惹起血栓形成・溶解システムよる評価技術操作の概要は、以下の表２に
例示したとおりである。
【００５２】
【表３】
2004279399.tif 000004
【００５３】
統計処理には、通常利用されている手法、例えば、2群間の平均値の差の検定には、in
vitro実験では、スチューデントのｔ-検定（対応あり）を、ex vivoおよびin vivo実験の検定ではｔ-検定（対応なし）を用いて行うことができる。また、3群間以上の平均値の差の検定にはANOVAを用いる。
【００５４】
＜Haemostatometryによる評価＞
例えば、Haemostatometryによる評価の場合には３チャンネルのHaemostatometer装置が工夫され、抗凝固処理しない血液が用いられ、ズリ力によって活性化される血小板の反応性と流動下の凝固能が同時に測定される（図１；装置の機構図を参照）。測定に必要な血
液量が比較的少ないのも特徴である。
【００５５】
採血後シリンジをAにセットし、２本のポリエチレンチューブのひとつより流動パラフ
ィン（Liquid paraffin）がシリンジ内に流入され、その結果、他方のチューブから血液
（Native Blood）が流出し、血液は37℃の生食（Saline）中Bを通った後、血液溜Cに流入する（図１の上図）。血液は60mmHg下、一定の速度で流され、採血２分30秒後にBにおい
てチューブを針（Needle）で窄刺すると窄刺により出血が起こるが、穴はズリ力によって活性化され形成された血小板血栓により塞がれ、やがて血液凝固により血流は停止する。これらの現象はPressure Transducerの圧センサーにより圧変化として測定され、窄刺に
よる最大の圧降下から圧が30％回復するまでの面積をH１、90％回復までの面積をH２とし血小板反応性の指標とする（図１の下図）。また採血から血液凝固により10mmHgの圧降下が起こるまでの時間をCT１、10mmHgになるまでの時間をCT２とし血液凝固能の指標とする（図１の下図）。予めシリンジ内に食品から調製した液を入れておくと食品の血小板反応性と血液凝固能への影響を検討できるし、本方法により血栓溶解能も測定可能である。
【００５６】
Haemostatometryによる抗血栓性の評価は、次の表３に示す評価基準に従う。
【００５７】
【表４】
2004279399.tif 000005
【００５８】
＜Gorog Thrombosis Testによる評価＞
Gorog Thrombosis Testの測定装置（図２）は、Montrose Diagnostics Limited社（英
国）から入手可能であり、具体的な測定の手順および操作は操作指示書に従って行えばよい。その測定原理を、図３に示す。
【００５９】
本法においても抗凝固処理しない血液が用いられ、ズリ力によって活性化される血小板の反応性と血栓溶解能が流動下で同時に測定される。採血後、所定量の血液および試料溶
液を含むシリンジを用いて、装置の上面（図２）にある試料注入用の穴からディスポーザブルチューブに血液を注入する。このディスポーザブルチューブは、プラスチック製であり、２種のタイプが用意されている。いずれも先細りの円錐形となっており、筒断面の形状が図３に示すように異なっている。このチューブ内に大小各1個の鉄ボールが入ってお
り、ボールとチューブ管壁の間に小さな隙間が形成されている。血液を含む試料液がシリンジからディスポーザブルチューブ内に入れられると、血液は重力に従って下に流れ、ボールとチューブ管壁の間の隙間を流れる。この隙間を流れるときに大きなズリ力が発生し、これにより血小板の活性化が始まる。ディスポーザブルチューブ下端から落下してくる試料液滴を、フォトセンサーにより光学的に検出し、液滴の落下間隔を測定する。活性化され生じた血小板凝集塊が、ボールと管壁の隙間につまり、隙間が狭くなると液滴の落下間隔は長くなる。
【００６０】
Gorog Thrombosis Testによる評価では、図４に示すように、測定時間内（X-軸）にお
ける、液滴が次々に落下する間隔の変化（d（秒）,Y-軸）をプロットすることにより、閉塞時間（occlusion time;ＯＴ）と血栓溶解時間（thrombolysis time;ＬＴ）が求められ
、これらの値の変化から試料の効果の強さが示される。すなわち、ＯＴは、血小板反応性（血小板粘着能+血小板凝集能）の指標となり、ＬＴは、血栓溶解能の指標となる（図４
）。
【００６１】
本法では、上記のように測定の操作自体が極めて簡単であり、しかもHaemostatometry
のように複雑かつ間接的な検出手段ではないため、再現性がより高くなっている。
【００６２】
＜マウス頚動脈を用いたin vivoの実験＞
・He-Neレーザー惹起血栓形成法による抗血栓活性の測定
ネンブタール（R）（Sodium pentobarbital, Abbott Lab., USA）をマウス殿筋に注射
し麻酔した（65mg/kg body weight）。20分後に、左大腿動脈にポリエチレンチューブ（P
E10, Becton Dickinson and Company, USA）を留置した。次いでマウス頸部を切開し、左総頚動脈を露出させ、乾燥防止のため随時、生理食塩水（37℃）を滴下した。施術後のマウスを、37℃に保温してある顕微鏡載物台上に固定した（Model CH-2またはBH-2, オリンパス（株）、日本）。石英ファイバーを用いて鏡筒内に導入され、ダイクロイックミラー（dichroic mirror）で反射、対物レンズ（x4）により集光（200μm at focal plane）されたHe-Neレーザー（Model NEO-50MS；日本科学エンジニアリング（株））をマウス頚動
脈（径450〜500μm）に照射した（図５）。血栓形成はカニューレよりEvans blue(Merck
Co. Ltd.,ドイツ)を動脈に注入して開始させた。血栓形成過程は頚動脈を落射照明装置で照明し（Model LG-PS2, オリンパス（株）、日本）、鏡筒上部に設置したCCDカメラを介
して（Model TMC-７；竹中機器システム（株）製）、ビデオ（Model SR-1750；日本ビク
ター（株）製）経由でパソコンに取り込んだ（Macintosh Power Mac（R）、G3）（図５および６）。
【００６３】
Evans blueを動脈に注入する直前および注入してから、10秒間隔で600秒間、合計61枚
の画像を取り込んだ。
【００６４】
・血栓体積解析法と血栓形成傾向の評価
記録された血栓画像をパソコンに取り込み、画像解析ソフト「Image Analyst」（R）（Automatix Inc., USA）を用いて、血栓面積の算出を行った。すなわち、画像に一定の輝
度閾値を与えて血栓の輪郭を求め、輪郭内の面積を計測した（図６Ａ）。この値に輝度値を乗じて積分光学濃度を求めて血栓の３次元画像を作成し、これを血栓体積の近似値とした（図６Ｂ）。
【００６５】
血栓形成開始から600秒間にわたる血栓体積の経時的変化を、図７に示す。成長した血
栓は飛翔血栓として血流により流された。そして血栓の成長は増減を繰り返した。Evans
blueを動脈に注入してから600秒間、合計61枚の画像の血栓体積を計測し合算したものを
、血栓形成傾向の指標Ｔとした（図８）。これらの詳細は、Ijiri Y, Miura M, Hashimot
o M, Fukunaga C, Watanabe S, Kubota A, Oiwa K, Okuda T, Yamamoto J: A new model
to evaluate the diet-induced prothrombotic state, using He-Ne laser-induced thro
mbogenesis in the carotid artery of apolipoprotein E-deficient and low-density l
ipoprotein receptor-  deficient mice.: Blood Coagul Fibrinolysis. 13: 1-8, 2002
に記載されている。
【００６６】
このHe-Neレーザー惹起血栓形成法による抗血栓活性の測定例を図１０（ｂ）に示した
。ここでは、先天的動脈硬化マウス（apoE-/-・LDLR-/-のDKマウス）を用いて、血栓形成傾向の比較実験を行った。図１０（ａ）に示す組成の基本食を調製し、一方、この基本食の組成における炭水化物源として同年に同一圃場で収穫された４品種「ホクシン」、「タイセツコムギ」、「きたもえ」、「北海257号」の国産の原穀小麦をそのまま製粉した全
粒粉を用いるとともに、これに伴い他の成分量を若干変更して実験食を調製した。そして、それぞれをDKマウスに与えて血栓形成傾向を測定した。
【００６７】
図１０（ｂ）の結果に示されるように、同じ種である小麦でも品種の違いにより血栓形成傾向に及ぼす影響について有意な差が認められた。
【００６８】
[実施例１]
前記のような評価方法および評価基準に従い、下記の表４に示すような穀類・野菜・果実についていくつかの品種について評価したところ、前記のように食品には抗血栓性成分だけでなくその反対の生理活性を示す成分が含まれることに由来するものと思われる品種差がみられることを見出し、どのような品種に高い抗血栓性がみられるかを明らかにすることができた。
【００６９】
もちろん、抗血栓性を有する食品は、このような銘柄の穀類・野菜・果実の食品素材に限定されるものではなく、それ以外の銘柄の穀類・野菜・果実であってもよいし、穀物・野菜・果実以外の有用な他の食品素材であってもよい。
【００７０】
以下の表５に、本発明により得られた抗血栓性の野菜、果実の品種差の結果を、表３に表示されている抗血栓作用の評価基準に基づいて示す。なお上述したように、これらの結果は、Gorog Thrombosis Testの測定装置を使って測定しても、あるいはHaemostatometry
によって測定しても、いずれも同じ結果を得ることができる。
【００７１】
表５の結果から、品種差によりその効力が異なることがわかる。（品種は便宜的にコード番号で表示している。）
【００７２】
【表５】
2004279399.tif 000006
【００７３】
【表６】
2004279399.tif 000007
【００７４】
【表７】
2004279399.tif 000008
【００７５】
上記の結果については、それぞれ次にHe-Neレーザー惹起血栓形成・溶解システムによ
るin vivoの評価方法を行って比較した。このin vivoの評価においても、その抗血栓性は上記のin vitro結果と同様であることが確認された。in vivoの評価の一例として、図９
にトマトの一品種（KG99-4）とタマネギの一品種（北01-1）の結果を示す。
【００７６】
[実施例２]
食品原料としてのトマトは、個体による活性の偏りを避けるため、一品種（KG99-4）ごとに数個を用いて以下の食品加工用材料とした。可食部分を乳鉢と乳棒を用いて室温ですりつぶした搾汁液をミリポアフィルター（ニューステラディスク（R）0.45μm，クラボウ（株），日本）で濾過し、得られた濾液を使用した。この搾汁液について、限外濾過膜（モルカットII（R）、ＮＭＷＬ10,000、日本ミリポア（株）、日本）を使用して濾過する
ことにより以下の画分を得た。限外濾過は、搾汁液がはじめの1/4容量になるまで行った
。残った濾過前液を生理食塩水で４倍に希釈し、再度限外濾過を行った。同様の操作を反復し、分子量1万以下の画分および1万を超える画分を調製することができた。
【００７７】
両画分について、上記の評価方法により血小板反応性阻害作用を調べたところ、分子量１万以下の画分で認められ、分子量１万を超える画分では認められなかった。
【００７８】
抗血栓形成性を有する上記分子量1万以下の画分を、ジュースなどに添加して当該食品
に抗血栓形成性を付与することができた。
【００７９】
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、ヘモスタトメーター（Haemostatometer）装置の機構（上図）ならびにヘモスタトグラムの解析（下図）を示す。下図において、横軸は、採血後の時間（分）、縦軸は圧力（mmHg）を表す。
【図２】図２は、Gorog Thrombosis  Testの装置の写真を示す。装置に示された装置名称は、Gorogの原語で表示されている。
【図３】図３は、Gorog Thrombosis  Testの測定原理を示す。
【図４】図４は、Gorog Thrombosis Testにおける解析の方法を示す。
【図５】図５は、He-Neレーザー惹起全血血栓形成法を示す。
【図６】図６は、画像処理によりマウス頚動脈に形成された血栓の体積測定法を示す。
【図７】図７は、血栓体積の経時的変化を示す。
【図８】図８は、血栓形成傾向の指標Ｔの算出法を示す。
【図９】図９は、小麦ＫＧ９９−４およびタマネギ北０１−１の血栓形成に対する作用を示す。
【図１０】図１０は、品種の異なる小麦の血栓形成に対する作用を示す。
【図１】
2004279399.tif 000009
【図２】
2004279399.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004279399.tif 000017
【図１０】
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