(57)【要約】【課題】ＤＮＡチップなどの検査コスト削減の一環として、チップの高密度化が進められている。従来の分析装置では、通常のレーザーが励起光源として使用され、蛍光のピークねらいの測定方法が用いられている。この技術では、ドットサイズが高密度化し、１ミクロン以下になったときの分解能低下が避けらず、高密度化に対応した光源および高感度蛍光検出システムの実現が望まれている。【解決方法】蛍光スペクトルが異なり、かつ、蛍光のピーク位置ではなく裾野によった波長で蛍光スペクトルが交差する２種類の蛍光を利用し、光源として、その交差位置を中心に波長が周期的に変化するフェムト秒パルスレーザー光を励起光に用い、検出Ｓ／Ｎ比の高い測定系を実現し、さらに、２光子あるいは多光子吸収過程を利用して高分解能の観測を可能にし、課題を解決した。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を生体分子試料に照射することにより、前記生体分子試料あるいは前記生体分子試料に標識として付加されている蛍光体から発せられる蛍光の強度やスペクトルを検出することにより生体分子試料の成分を判定する蛍光分析方法において、前記蛍光体として、励起光に対する吸収スペクトルと定義する縦軸に蛍光体の励起光吸収強度をとり横軸に蛍光体の励起光吸収波長をとってグラフとして表した励起光吸収強度−波長曲線が異なる少なくとも２種類の蛍光体が用いられ、前記２種類の蛍光体は、その吸収スペクトルが各吸収スペクトルのピーク位置でない位置で、一方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が正であり他方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が負であるように交差している蛍光体であり、前記励起光は、前記試料に照射されている間の少なくとも一部の時間にわたって波長が周期的に変化するように波長変調されている励起光であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の蛍光分析方法において、前記蛍光分析方法は、前記蛍光標識からの蛍光を波長分離した後、波長分離されたそれぞれの蛍光を光検出器により各蛍光に対応する電気信号に変換し、前記各電気信号を差動増幅器に導いて、同相ノイズを除去する蛍光検出手段を用いることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の蛍光分析方法において、前記励起光は、λ１とλ２を正の数としたとき、前記２種類の蛍光体の吸収スペクトルの各ピーク値を与える各波長λ３とλ４の間にある特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けた励起光であり、前記波長λ０＋λ１とλ０−λ２は、いずれも、前記波長λ３とλ４のうちの短い方の波長よりも長く、かつ、前記波長λ３とλ４のうちの長い方の波長よりも短い波長であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記励起光は前記試料に照射されている間の全時間帯において、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けていることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記励起光の波長の変化が特定波長λ０を中心波長とする正弦波であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記検出される蛍光は、生体分子試料における多光子吸収効果による蛍光発光を計測する方法であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記試料は、多光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として付加された生体分子を含む試料であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項８】
請求項７に記載の蛍光分析方法において、前記試料は、多光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として複数付加されており、複数の成分分析が可能であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記多光子吸収が２光子吸収であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記蛍光の検出に蛍光色素あるいは蛍光タンパク質からの蛍光信号を前記励起光の前記波長変調の周波数と同期した位相検出を行うことを利用していることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記試料からの蛍光検出に空間ビーム光学系により構成された蛍光波長の分離機能を有する光学装置を用いることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記試料からの蛍光検出に、前記試料からの蛍光を光ファイバ内を前記励起光と逆方向に進行させるように構成されているとともに、光ファイバカプラおよび光ファイバフィルタモジュールにより構成された蛍光波長の分離機能を有している光学装置を用いることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の蛍光分析方法において、前記光学装置が試料の平面全体をスキャンできる円盤型レンズアレイを有していることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記差動増幅器に入力される前記２種類の蛍光に基づく信号が、差動増幅を受ける前のいずれかの段階において、振幅が同じで位相が互いに逆位相の関係にある信号になるように制御手段によって制御されることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の蛍光分析方法において、前記制御手段が、電気的手段によって電気的抵抗素子の抵抗値を変える手段であることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の蛍光分析方法において、前記試料の励起に用いられる励起光の光源の分散補償に、斜め蒸着技術を用いて製造された多層膜を用いた分散補償素子が用いられていることを特徴とする蛍光分析方法。
【請求項１７】
励起光を生体分子試料に照射することにより、前記生体分子試料あるいは前記生体分子試料に標識として付加されている蛍光体から発せられる蛍光の強度やスペクトルを検出することにより生体分子試料の成分を判定することができる蛍光分析装置において、前記装置は、前記蛍光体として、励起光に対する吸収スペクトルと定義する縦軸に蛍光体の励起光吸収強度をとり横軸に蛍光体の励起光吸収波長をとってグラフとして表した励起光吸収強度−波長曲線が異なる少なくとも２種類の蛍光体を用いることができるようになっているか前記蛍光体に対応する条件設定手段を有しており、前記２種類の蛍光体は、その吸収スペクトルが各吸収スペクトルのピーク位置でない位置で、一方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が正であり他方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が負であるように交差している蛍光体であり、前記励起光は、前記試料に照射されている間の少なくとも一部の時間にわたって波長が周期的に変化するように波長変調されている励起光であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１８】
請求項１７に記載の蛍光分析装置において、前記蛍光分析装置は、前記蛍光標識からの蛍光を波長分離した後、波長分離されたそれぞれの蛍光を光検出器により各蛍光に対応する電気信号に変換し、前記各電気信号を差動増幅器に導いて、同相ノイズを除去する蛍光検出手段を有することを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の蛍光分析装置において、前記励起光は、λ１とλ２を正の数としたとき、前記２種類の蛍光体の吸収スペクトルの各ピーク値を与える両波長λ３とλ４の間にある特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けた励起光であり、前記波長λ０＋λ１とλ０−λ２は、いずれも、前記波長λ３とλ４のうちの短い方の波長よりも長く、かつ、前記波長λ３とλ４のうちの長い方の波長よりも短い波長であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記励起光は前記試料に照射されている間の全時間帯において、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記励起光の波長の変化が特定波長λ０を中心波長とする正弦波であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２２】
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記装置は、生体分子試料における多光子吸収効果による蛍光発光を計測する装置であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２３】
請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記試料は、多光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として付加された生体分子を含む試料であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２４】
請求項２３に記載の蛍光分析装置において、前記装置が、前記試料に２光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として複数付加された試料を用いることができ、複数の成分分析が可能な装置であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２５】
請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記多光子吸収が２光子吸収であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２６】
請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記装置が、前記蛍光の検出に蛍光色素あるいは蛍光タンパク質からの蛍光信号を前記励起光の前記波長変調の周波数と同期した位相検出を行うことを利用している装置であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２７】
請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記試料からの蛍光検出に空間ビーム光学系により構成された蛍光波長の分離機能を有する光学装置を用いることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２８】
請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記試料からの蛍光検出に、前記試料からの蛍光を光ファイバ内を前記励起光と逆方向に進行させるように構成されているとともに、光ファイバカプラおよび光ファイバフィルタモジュールにより構成された蛍光波長の分離機能を有している光学装置を用いることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項２９】
請求項２８に記載の蛍光分析装置において、前記光学装置が試料の平面全体をスキャンできる円盤型レンズアレイを有していることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３０】
請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記差動増幅器に入力される前記２種類の蛍光に基づく信号が、差動増幅を受ける前のいずれかの段階において、振幅が同じで位相が互いに逆位相の関係にある信号になるように制御手段によって制御されることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３１】
請求項３０に記載の蛍光分析装置において、前記制御手段が、電気的手段によって電気的抵抗素子の抵抗値を変える手段であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３２】
請求項１７〜３１のいずれか１項に記載の蛍光分析装置において、前記試料の励起に用いられる励起光の光源の分散補償に、斜め蒸着技術を用いて製造された多層膜を用いた分散補償素子が用いられていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３３】
生体分子等あるいは標識として蛍光体等を付加した生体分子等の試料に励起光を照射して、前記励起光照射によって前記生体分子等あるいは前記生体分子等に標識として付加した蛍光体等から発せられる発光の強度やスペクトルを検出することにより生体分子等の成分を判定することができる分析装置において、前記励起光は、前記試料に照射されている間の少なくとも一部の時間帯において、その波長が、λ１とλ２を正の数としたとき、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で周期的に変化する波長変調を受けた励起光であることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３４】
請求項２７に記載の蛍光分析装置において、前記励起光は前記試料に照射されている間の全時間帯において、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けていることを特徴とする蛍光分析装置。
【請求項３５】
請求項２７または２８に記載の蛍光分析装置において、前記励起光の波長の変化が特定波長λ０を中心波長とした正弦波であることを特徴とする蛍光分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、蛍光分析方法および蛍光分析装置に関し、さらに具体的には、被検体に与えるダメージが少なく、かつ、検出感度が良く、コストの安い蛍光分析方法および蛍光分析装置に関する。
【０００２】
ヒトゲノム・プロジェクトが終了し、人間の遺伝子情報を含む塩基配列は解読された。今後はこの情報を活用して、オーダーメイド医療、創薬、再生医療など、医療技術の改革が行われようとしている。このような生命科学分野の動きの中に、ＤＮＡやタンパク質を解析するための装置に関連する分野がある。現在、ＤＮＡやタンパク質は、ＤＮＡチップ、あるいはタンパク・チップと呼ばれる基板（マイクロ・アレイ・チップともよばれる）に、多数の異なる標準ＤＮＡをマス目状に配列しておき、細胞等から採取したサンプルＤＮＡと反応させることで情報を得ている。
【０００３】
産業的にも注目されているゲノム創薬などを実現するためには、今後、さまざまな手法を用いて、ＤＮＡやタンパク質の情報を収集しなければならない。ところが、人ひとりの塩基配列は約３０億個であり、現状では、ひとりの人間の塩基配列のスキャンには約３００億円程度の費用が発生するなどといった試算があり、極めて膨大な検査コストが発生することが分っている。したがって、ゲノム応用産業を現実のものにするには、情報分析のコストダウン技術が強く望まれており、本発明はそのコストダウンを実現する分析方法および分析装置に関するものである。
【０００４】
【従来の技術】
人間の全遺伝子情報（ヒトゲノム）を含む塩基配列がほとんど決定されつつあり、そのような遺伝情報を具体的に活用することを目的にしたタンパク質の構造や機能を解明しようとする動きが活発になってきた。こうした動きの中で、個人個人の遺伝情報の分析にかかるコストが問題になってきている。
【０００５】
産業的視点からも注目されているゲノム創薬を実現するには、今後、さまざまな手法を用いて、さまざまな角度から、タンパク質の基礎情報を収集しなければならない。ところが、前記のように、人ひとりの塩基配列は約３０億塩基であり、例えば、１０００人のゲノム情報は約３テラ塩基、ということになり、その情報収集コストが１塩基あたり１円と仮定しても膨大な検査コストが発生する。したがって、ゲノム創薬を実現し、オーダーメイド医療を現実のものにするには、基礎研究と並行して、コストダウンを考慮した計測手法の開発が不可欠である。
【０００６】
その一環として、マイクロ・アレイ・チップを高密度化、あるいは３次元化するなどの研究開発が進められている。１枚のチップ状の分析密度を上げることで、コストダウンを計ろうという戦略である。ところが、従来の手法により、密度を上げると、
（１）励起光と蛍光の波長が接近していて、微弱な蛍光を検出できなくなる。しかし、密度が上がると、励起光の強度を増大させなければならなくなる。というような相反する課題が発生する。
（２）また、可視光の波長を直接励起するため、サンプルのダメージも考慮しなければならない。など、マイクロチップの高密度化と並行して、光源の課題も克服しなければならない。
【０００７】
一方、２光子吸収あるいは多光子吸収効果を利用した共焦点蛍光顕微鏡システムはフェムト秒光パルスの特徴をいかした装置として近年普及しつつある。この手法の特長を簡単に整理すると、以下のようになる。
▲１▼通常、フェムト秒パルスの波長は近赤外領域であるため、細胞の破壊が少ない。
▲２▼多光子吸収過程が生じる焦点部分は、基本波を集光している部分より小さいため、基本波の回折限界で決まる分解能よりも高分解能の観測が可能となる。
▲３▼よって、集光レンズの共焦点深度に影響されることなく、微小部分を励起できるため、深さ方向のスキャン（３次元スキャン）も可能となる。
【０００８】
以上のことなどにより、従来型の顕微鏡では計測できなかった高精度の観測が可能となっている。ここにあげた技術的特長は現時点では蛍光顕微鏡にとどまっているが、この技術を高密度化したマイクロチップアレイ分析に適用することにより、飛躍的な感度の向上や、分析時間の短縮、ひいては、分析コストの削減などが期待できる。
【０００９】
これらの分析に関する従来の技術の代表的な例として、特表２０００−５００８７４号公報「時間分解蛍光測定を使用する蛍光分子群識別のためのシステム」（以下、文献１という）、特表平１０−５１２９５２号公報「フロー蛍光法及び装置」（以下、文献２という）、特開平１０−３１８９２４号公報「パルスレーザを備えた光学装置」（以下、文献３という）、特開２００１−１００１０２号公報「顕微鏡システム」（以下、文献４という）、特表平９−５０７５７９号公報「試料の化学分析用信号処理方法及び装置」（以下、文献５という）をあげることができる。
【００１０】
文献１には、分析物分子と結合し、異なる蛍光特性を有する最低２種類の分子群を使用することが記載されている。
【００１１】
文献２には、２光子励起を用いた分析装置が述べられている。
【００１２】
文献３には、サブピコ秒パルスレーザを光源に用い、２光子吸収、多光子吸収を利用した蛍光検出装置が述べられている。
【００１３】
文献４には、分子を基底状態から第１の励起状態へ励起するための第１の波長を有するポンプ光としての第１のレーザ光と、第１の励起状態から第２の励起状態へ励起するための第２の波長を有するイレース光としての第２のレーザ光を試料に照射して、二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡システムが述べられており、第１の波長と第２の波長はレーザ光を波長変調して発生させている。
【００１４】
文献５には、波長変調を利用して発生させた波長が３〜４０ｎｍ離れた２つの異なる波長のレーザ光を試料に照射して蛍光を測定することが述べられている。
【００１５】
これらの文献１〜５には、レーザ光を照射した試料から発せられる蛍光の測定するにあたっての精度向上や感度向上、試料の保護など種々の改良を試みたことが記されている。そして、その共通する技術思想は、試料の吸収スペクトルあるいは蛍光発光スペクトルのピーク値を利用しようとする技術思想であり、レーザ光は狭い波長領域で周期的に変動するようなレーザ光ではなく、むしろ安定したレーザ光を利用することである。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来の蛍光分析方法及び装置では、分析コストが高く、分析精度も十分とはいえず、試料に与えるダメージへの配慮も十分とはいえないのが現状であり、特に分析コストの低減が強く望まれている。
【００１７】
本発明の目的は、既存のフェムト秒共焦点顕微鏡の基本技術を生かし、ＤＮＡチップ、あるいは、タンパク・チップを用いた蛍光計測における、その感度と分解能を向上させるために、コストバランスの良いフェムト秒レーザー技術を導入し、複数の蛍光標識による観測技術を比較的に向上させる装置を提供することである。
【００１８】
ここに、フェムト秒レーザーとは、パルス幅が１ピコ秒より狭いフェムト秒のオーダーのパルス光レーザのことをいう。
【００１９】
社会的背景と産業上の視点から、装置の普及を促進することが最大の課題であり、そのために、装置コストのほとんどを決定してしまうフェムト秒レーザー光源のコストを下げる技術を開発することが重要となる。光源のコストダウンを行うためには、発振条件の最適化による省電力化とコストダウンのために、フェムト秒レーザー光源の出力強度を必要最低限まで減少させる工夫を行うことである。また、システムとして装置をとらえた場合、マイクロチップアレイの研究開発の流れを考慮し、アレイの高密度化への対応、および、減少させたレーザー出力による励起でも、蛍光色素からの信号を十分なＳ／Ｎで検出できるように、信号検出技術を工夫することである。
【００２０】
具体的に技術的項目を整理すると以下のようになる。
ＤＮＡチップなどの遺伝子情報の検査コストを削減するための一環として、チップの高密度化が進められている。従来の分析装置では、通常のレーザーが励起光源として使用されている。この技術では、ドットサイズが高密度化し、１ミクロン以下になったときの分解能低下が避けられない。
【００２１】
また、ドットサイズが１ミクロン以下になると、各ドットからの蛍光強度が弱くなる。そこで、励起レーザー強度を上げることで感度を維持しようとするが、従来の手法では、強くなるレーザーと基本的に微弱な蛍光との分離が問題となる。
【００２２】
レーザー共振器内部の精密な分散補償を実現し、最適なモード同期条件を制御すれば、蛍光色素や蛍光タンパクを励起するのに必要十分な省エネルギー型光源が実現できる。
【００２３】
そのためには、分散量を連続可変できる機能を有する多層蒸着ミラーが必要となる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】
本発明はこれらの課題の多くを解決するためになされたものである。
【００２５】
本発明の特に顕著な特徴は次のようになる。
【００２６】
（１）本発明は、通常、ＤＮＡチップ、あるいはタンパク・チップ検査装置では、赤色と緑色に発色するような２種類の蛍光色素が標識として使われることを考慮して、その特長をそのまま生かし、２種類の蛍光を差動増幅することにより、検出感度の向上を行ったところにある。
【００２７】
即ち、２種類の蛍光標識を使用することにより、各蛍光標識の吸収スペクトルの傾斜および、各吸収スペクトルの交差を利用して、その吸収スペクトルの交差点付近に対応する波長を中心波長とする波長変調を行った光を励起光とすることにより、それぞれの蛍光に１８０度の位相差情報を付加し、さらに、それぞれの蛍光標識からの蛍光を波長分離した後、それぞれの蛍光を光検知器により各蛍光に対応する電気信号に変換し、各電気信号を差動増幅器に導いて、励起光の混入が主要因となる同相ノイズを１００ｄＢ程度の同相ノイズ除去比により除去する蛍光検出手段を提案した。
【００２８】
（２）また、本発明の例では、励起光源としてフェムト秒レーザーを使用し、２光子吸収効果を利用すれば、励起波長を赤外線領域に設定できるため、従来の励起のように、励起波長と蛍光波長が近接していることによる、散乱光の混入などに起因する検出感度の低下などを回避することができる。
【００２９】
（３）本発明の例では、フェムト秒光パルスを照射することによって生じる２光子あるいは多光子吸収過程では、焦点部分は、基本波を集光している部分より小さいため、このことだけで基本波の回折限界で決まる集光分解能よりも高分解能の観測が可能となる。
【００３０】
さらに、上記の２種類の蛍光標識が同時に結合した分子試料を使用する場合は、集光領域内部において蛍光標識が同時に発光するような場所を特定したことになり、単一蛍光色素の場合の２光子吸収過程による計測よりも、より高分解能となる。
【００３１】
このような、電気的な高感度化と、蛍光標識の分子サイズの結合を活用できるようなフェムト秒レーザー光の導入により、アレイ・ドットの高密度化に対応することができる。
【００３２】
（４）本発明の例では、発振条件の最適化による小型化と総合的なコストダウンを実施するために、従来の蒸着薄膜による分散補償ミラーと斜蒸着による分散補償量可変型ミラーを製造し、レーザー共振器内部の精密な分散補償を実現し、最適なモード同期条件を制御することにより、低コスト小型フェムト秒レーザー光を実現するることができる。
【００３３】
以下、本発明の特徴を詳細に説明する。
【００３４】
本発明の目的の達成を図るため、本発明の蛍光分析方法の例は、励起光を生体分子試料に照射することにより、前記生体分子試料あるいは前記生体分子試料に標識として付加されている蛍光体から発せられる蛍光の強度やスペクトルを検出することにより生体分子試料の成分を判定する蛍光分析方法であって、前記蛍光体として、励起光に対する吸収スペクトルと定義する縦軸に蛍光体の励起光吸収強度をとり横軸に蛍光体の励起光吸収波長をとってグラフとして表した励起光吸収強度−波長曲線が異なる少なくとも２種類の蛍光体が用いられ、前記２種類の蛍光体は、その吸収スペクトルが各吸収スペクトルのピーク位置でない位置で、一方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が正であり他方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が負であるように交差している蛍光体であり、前記励起光は、前記試料に照射されている間の少なくとも一部の時間にわたって波長が周期的に変化するように波長変調されている励起光であることを特徴としている。
【００３５】
そして、本発明の蛍光分析方法の例は、前記蛍光標識からの蛍光を波長分離した後、波長分離されたそれぞれの蛍光を光検出器により各蛍光に対応する電気信号に変換し、前記各電気信号を差動増幅器に導いて、同相ノイズを除去する蛍光検出手段を用いることを特徴としている。
【００３６】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記励起光が、λ１とλ２を正の数としたとき、前記２種類の蛍光体の吸収スペクトルの各ピーク値を与える各波長λ３とλ４の間にある特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けた励起光であり、前記波長λ０＋λ１とλ０−λ２は、いずれも、前記波長λ３とλ４のうちの短い方の波長よりも長く、かつ、前記波長λ３とλ４のうちの長い方の波長よりも短い波長であることを特徴としている。
【００３７】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記励起光が前記試料に照射されている間の全時間帯において、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けていることを特徴としている。
【００３８】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記励起光の波長の変化が特定波長λ０を中心波長とする正弦波であることを特徴としている。
【００３９】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記検出される蛍光が、生体分子試料における多光子吸収効果による蛍光発光を計測する方法であることを特徴としている。
【００４０】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記試料が、多光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として付加された生体分子を含む試料であることを特徴としている。
【００４１】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記試料が、多光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として複数付加されており、複数の成分分析が可能であることを特徴としている。
【００４２】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記多光子吸収が２光子吸収であることを特徴としている。
【００４３】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記蛍光の検出に蛍光色素あるいは蛍光タンパク質からの蛍光信号を前記励起光の前記波長変調の周波数と同期した位相検出を行うことを利用していることを特徴としている。
【００４４】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記試料からの蛍光検出に空間ビーム光学系により構成された蛍光波長の分離機能を有する光学装置を用いることを特徴としている。
【００４５】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記試料からの蛍光検出に、前記試料からの蛍光を光ファイバ内を前記励起光と逆方向に進行させるように構成されているとともに、光ファイバカプラおよび光ファイバフィルタモジュールにより構成された蛍光波長の分離機能を有している光学装置を用いることを特徴としている。
【００４６】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記光学装置が試料の平面全体をスキャンできる円盤型レンズアレイを有していることを特徴としている。
【００４７】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記差動増幅器に入力される前記２種類の蛍光に基づく信号が、差動増幅を受ける前のいずれかの段階において、振幅が同じで位相が互いに逆位相の関係にある信号になるように制御手段によって制御されることを特徴としている。
【００４８】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記制御手段が、電気的手段によって電気的抵抗素子の抵抗値を変える手段であることを特徴としている。
【００４９】
本発明の蛍光分析方法の例は、前記試料の励起に用いられる励起光の光源の分散補償に、斜め蒸着技術を用いて製造された多層膜を用いた分散補償素子が用いられていることを特徴としている。
【００５０】
そして、本発明の蛍光分析方法の例は、前記本発明の各特徴をいくつか併せもっていることを特徴としている。
【００５１】
本発明の目的の達成を図るため、本発明の蛍光分析装置の例は、励起光を生体分子試料に照射することにより、前記生体分子試料あるいは前記生体分子試料に標識として付加されている蛍光体から発せられる蛍光の強度やスペクトルを検出することにより生体分子試料の成分を判定することができる蛍光分析装置であって、前記装置は、前記蛍光体として、励起光に対する吸収スペクトルと定義する縦軸に蛍光体の励起光吸収強度をとり横軸に蛍光体の励起光吸収波長をとってグラフとして表した励起光吸収強度−波長曲線が異なる少なくとも２種類の蛍光体を用いることができるようになっているか前記蛍光体に対応する条件設定手段を有しており、前記２種類の蛍光体は、その吸収スペクトルが各吸収スペクトルのピーク位置でない位置で、一方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が正であり他方の蛍光体の吸収スペクトルの傾斜が負であるように交差している蛍光体であり、前記励起光は、前記試料に照射されている間の少なくとも一部の時間にわたって波長が周期的に変化するように波長変調されている励起光であることを特徴としている。
【００５２】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記蛍光分析装置が、前記蛍光標識からの蛍光を波長分離した後、波長分離されたそれぞれの蛍光を光検出器により各蛍光に対応する電気信号に変換し、前記各電気信号を差動増幅器に導いて、同相ノイズを除去する蛍光検出手段を有することを特徴としている。
【００５３】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記励起光が、λ１とλ２を正の数としたとき、前記２種類の蛍光体の吸収スペクトルの各ピーク値を与える両波長λ３とλ４の間にある特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けた励起光であり、前記波長λ０＋λ１とλ０−λ２は、いずれも、前記波長λ３とλ４のうちの短い方の波長よりも長く、かつ、前記波長λ３とλ４のうちの長い方の波長よりも短い波長であることを特徴としている。
【００５４】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記励起光は前記試料に照射されている間の全時間帯において、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けていることを特徴としている。
【００５５】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記励起光の波長の変化が特定波長λ０を中心波長とする正弦波であることを特徴としている。
【００５６】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記装置が、生体分子試料における多光子吸収効果による蛍光発光を計測する装置であることを特徴としている。
【００５７】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記試料が、多光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として付加された生体分子を含む試料であることを特徴としている。
【００５８】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記装置が、前記試料に２光子吸収効果を有する有機色素あるいは蛍光タンパク質を標識として複数付加された試料を用いることができ、複数の成分分析が可能な装置であることを特徴としている。
【００５９】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記多光子吸収が２光子吸収であることを特徴としている。
【００６０】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記装置が、前記蛍光の検出に蛍光色素あるいは蛍光タンパク質からの蛍光信号を前記励起光の前記波長変調の周波数と同期した位相検出を行うことを利用している装置であることを特徴としている。
【００６１】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記試料からの蛍光検出に空間ビーム光学系により構成された蛍光波長の分離機能を有する光学装置を用いることを特徴としている。
【００６２】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記試料からの蛍光検出に、前記試料からの蛍光を光ファイバ内を前記励起光と逆方向に進行させるように構成されているとともに、光ファイバカプラおよび光ファイバフィルタモジュールにより構成された蛍光波長の分離機能を有している光学装置を用いることを特徴としている。
【００６３】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記光学装置が試料の平面全体をスキャンできる円盤型レンズアレイを有していることを特徴としている。
【００６４】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記差動増幅器に入力される前記２種類の蛍光に基づく信号が、差動増幅を受ける前のいずれかの段階において、振幅が同じで位相が互いに逆位相の関係にある信号になるように制御手段によって制御されることを特徴としている。
【００６５】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記制御手段が、電気的手段によって電気的抵抗素子の抵抗値を変える手段であることを特徴としている。
【００６６】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記試料の励起に用いられる励起光の光源の分散補償に、斜め蒸着技術を用いて製造された多層膜を用いた分散補償素子が用いられていることを特徴としている。
【００６７】
そして、本発明の蛍光分析装置の例は、前記本発明の各特徴をいくつか併せもっていることを特徴としている。
【００６８】
本発明の目的の達成を図るため、本発明の蛍光分析装置の例は、生体分子等あるいは標識として蛍光体等を付加した生体分子等の試料に励起光を照射して、前記励起光照射によって前記生体分子等あるいは前記生体分子等に標識として付加した蛍光体等から発せられる発光の強度やスペクトルを検出することにより生体分子等の成分を判定することができる分析装置において、前記励起光は、前記試料に照射されている間の少なくとも一部の時間帯において、その波長が、λ１とλ２を正の数としたとき、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で周期的に変化する波長変調を受けた励起光であることを特徴としている。
【００６９】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記励起光は前記試料に照射されている間の全時間帯において、特定波長λ０を挟んでλ０＋λ１からλ０−λ２の間で変化する波長変調を受けていることを特徴としている。
【００７０】
本発明の蛍光分析装置の例は、前記励起光の波長の変化が特定波長λ０を中心波長とした正弦波であることを特徴としている。
【００７１】
そして、本発明の蛍光分析装置の例は、前記本発明の各特徴をいくつか併せもっていることを特徴としている。
【００７２】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。なお、説明に用いる各図は本発明を理解できる程度に各構成要素の寸法、形状、配置関係などを概略的に示してある。そして、本発明の説明の都合上、部分的に拡大率を変えて図示する場合もあり、本発明に用いる図は、必ずしも実施の形態などの実物や記述と相似形でない場合もある。また、各図において、同様な構成要素については同一の番号を付けて示し、重複する説明を省略することもある。
【００７３】
以下において、本発明の実施例を説明する。
【００７４】
【実施例１】
図１〜図５は本発明の基本的技術思想を説明する図で、図１は２光子吸収スペクトルがちょうど交差するような２種類の色素を説明する図、図２は、短い波長側に吸収を持つ色素の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを説明する図、図３は、長い波長側に吸収を持つ色素の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを説明する図、図４は、短い波長側に吸収を持つ色素と長い波長側に吸収を持つ色素のそれぞれの蛍光スペクトルを説明する図、図５は、変調した励起光と変調に依存して変化する蛍光強度を説明する図である。
【００７５】
図１〜図５で、符号１は色素Ａの２光子吸収スペクトル、２は色素Ａの蛍光スペクトル、３は色素Ｂの２光子吸収スペクトル、４は色素Ｂの蛍光スペクトル、５はＸ字状に交差するような２光子吸収スペクトル波長上の交差点の位置を示す点線、６は波長（λ０）を中心にして、周波数変調（±Δλ（ν））した励起光、７は弱くなった場合の蛍光強度スペクトル、８は強くなった場合の蛍光強度スペクトル、９は励起波長の変調が短波長側、λ０−Δλ、に移動するときの状態、１０は励起波長の変調が長波長側、λ０＋Δλ、に移動するときの状態、１１は強くなった場合の蛍光強度スペクトル、１２は弱くなった場合の蛍光強度スペクトルを表す。各図の座標軸の縦軸は光強度、横軸は波長である。
【００７６】
高密度マイクロ・チップ・アレイに適用することを前提にした、集光分解能の向上と検出感度の向上は、２光子吸収現象とよばれる原理に基づいている。
【００７７】
ＤＮＡチップやタンパク・チップなどのマイクロ・チップ・アレイにおいては、蛍光色素を標識として使用する。
【００７８】
この蛍光色素として、図１に示すような、２光子吸収スペクトルがちょうど交差するような色素Ａおよび色素Ｂを選択する。
【００７９】
図１に示したような色素Ａの２光子吸収スペクトル１の長波長側と他方の色素Ｂの２光子吸収スペクトル３の短波長側が点線５の位置の波長でＸ字状に交差する交差点を有する蛍光色素を２種類選択する。
【００８０】
この２光子吸収スペクトル上の交差点の波長（λ０）の２倍の中心波長（λｅ）をもつフェムト秒パルス励起光を色素Ａと色素Ｂに照射して、フェムト秒２光子吸収効果を利用して色素Ａと色素Ｂを励起し、蛍光を計測する。そのとき、２種類の蛍光色素は、観測対象の分子の構造の僅かな違いを反映して、標識の蛍光色素が２種類ともに結合する状態、あるいは、どちらか一方のみが結合する状態、都合３種類の状態を作りだす。
【００８１】
このときのフェムト秒パルス励起光の励起波長λｅとスペクトル交差点５の波長λ０の関係は、次式のように表される。
【００８２】
λ０＝λｅ／２
従来この状態は、赤色に発色する状態、緑色に発色する状態、黄色に見える状態として区別されていた。
【００８３】
ここで、図５に示すように、励起光源の波長を先ほどの２光子吸収スペクトルの交差点
の波長（λ０）を中心にして、周波数変調（波長変調ともいう）（±Δλ（ν））を与えるような光６により励起する。
【００８４】
励起波長が長波長側に移動する変調の時、すなわち、λ０＋Δλ、符号１０の状態のとき、蛍光色素（緑）（色光色素Ａ）の長波長側は吸収スペクトルの右下がりのスペクトルの傾きを感じて蛍光強度は蛍光強度スペクトル７のように弱くなり、他方、蛍光色素（赤）（蛍光色素Ｂ）の短波長側は吸収スペクトルの右上がりの傾きを感じて蛍光強度は蛍光強度スペクトル８のように強くなる。
【００８５】
逆に、励起波長の変調が短波長側に移動するとき、すなわち、λ０−Δλ、符号９の状態のとき、蛍光色素Ａの長波長側は吸収スペクトルの右上がりの傾きを感じて蛍光強度は蛍光強度スペクトル１１のように強くなり、他方、蛍光色素Ｂの短波長側は吸収スペクトルの右下がりの傾きを感じて蛍光強度は蛍光強度スペクトル１２のように弱くなる。
【００８６】
したがって、変調された励起光が照射されると、蛍光波長が短波長側（緑）の蛍光色素Ａの蛍光強度２と長波長側（赤）の蛍光色素Ｂの蛍光強度４は、同一の励起光に対して相補的に同期して蛍光強度が変化する。すなわち、短波長側（緑）の蛍光色素の蛍光強度２が強くなる時には、長波長側（赤）の蛍光色素の蛍光強度４は弱くなるように変化する。
【００８７】
ここで、図８を用いて２種類の蛍光を用いた差動増幅の原理を説明する。
【００８８】
図８は２種類の蛍光体を用いた差動増幅の原理を説明する図で、符号５７は比反転増幅入力、５８は反転増幅入力、５９は差動増幅器、６０は差増贈幅器からの出力、６１は比反転入力端子につながる信号波形、６２は反転入力端子につながる信号波形、６３は同相ノイズ信号、６４は入力信号、６５は入力信号、６６は出力信号である。
【００８９】
一般的な差動増幅器５９には、反転増幅入力５８と、比反転増幅入力５７があり、この二つの入力端子間に加わった電圧、あるいは、電流を適切な増幅度で増幅し、出力端子６０に導く。このとき、入力端子間の信号形態として、反転入力端子につながる信号波形６２、比反転入力端子につながる信号波形６１を考える。
【００９０】
差動増幅器は同相ノイズ除去比が約１００ｄＢ程度あるため、同相ノイズ信号６３は出力６０には表れない。一方、入力信号６４、入力信号６５のように、逆相となっている信号は、出力信号６６として増幅される。
【００９１】
差動増幅器のこの特長を生かし、たとえば、反転入力端子５８に緑色の蛍光色素Ａの蛍光標識からの検出信号を、比反転入力端子５７に赤色の蛍光色素Ｂの蛍光標識からの検出信号を入力すれば、たとえば、同相ノイズ信号６３として混入される可能性の高い励起光に起因する信号は除去される。
【００９２】
図６は、本発明の励起光源も含む高感度蛍光計測系の概略図を示す図である。図６で、符号１３はマスタ信号源、１４はフェムト秒レーザー光源、１５は光変調器、１６は被計測サンプル、１６Ａは被計測サンプル１６から発せられる蛍光、１７は赤色の蛍光を通過する光学フィルター、１８は緑色の蛍光を通過させる光学フィルター、１９と２０は光検知器、２１、２２、２９は増幅器、２３と２４は外部制御機能を有する可変抵抗器、２５は制御装置、２６と２７は出力、２８は位相検波器である。
【００９３】
図６に示すように、マスタ信号源１３により、フェムト秒レーザー光源１４の発振波長を、光変調器１５により変調し、変調された励起光６を発生させる。
そして、被計測サンプル１６からの蛍光１６Ａの、例えば赤色の蛍光を通過する光学フィルター１７、緑色の蛍光を通過させるフィルター１８を通過した光を、それぞれ、光検知器１９および光検知器２０で検出する。次に、それぞれの光検出器からの電気信号をそれぞれ、増幅器２１および増幅器２２により増幅し、外部制御機能を有する可変抵抗器２３および外部制御機能を有する可変抵抗器２４に入力する。
【００９４】
可変抵抗器２３および２４の出力２６および２７は、制御装置２５により監視され、出力２６と出力２７の強度が常に同一となるように制御されているものとする。このように強度がそろえられた蛍光の信号、および、マスタ信号源１３の信号を差動増幅器２８に入力することにより、マスタ信号源１３の周波数（ν）に同期した同期検出を行い、増幅器２９を通過後に、出力３０を得ることができる。
【００９５】
図７に、以上のような動作の状態を横軸を時間軸として示す。
【００９６】
図７は、本発明の高感度蛍光検出装置の前記例における信号タイミングチャートを説明する図で、符号３１はマスタ信号源１３の信号波形、３２は二つの信号すなわち出力２６と出力２７の信号波形の合成信号である。
【００９７】
図示のように、マスタ信号源１３の信号波形３１に全ての信号が同期して示されている。たとえば、蛍光信号強度が一致している出力２６、および、出力２７が差動増幅器２８に入ると、内部では二つの信号の合成信号３２のような状態が作られ、結果として増幅器２９の出力３０は、電圧としてはゼロとなる。
【００９８】
このようにして、同期検出によりこの２種類の波長を検知しておけば、各波長の強度バランス調整により、出力ゼロ状態を発生させることができる。この出力ゼロの状態を実現するのに、制御装置２５が、どのような制御電圧の差を可変抵抗器２３および可変抵抗器２４に与えたかを知れば、フィルタ１７及び１８を通過した蛍光の状態を容易に検知できる。
【００９９】
この特性を利用すると、２種類の蛍光色素を使うときの３つの状態が区別することができる。
【０１００】
すなわち、もし、対象としている分子が、蛍光色素の一方しか結合しない状態ならば、ゼロ電圧のバランスが崩れるため、どちらかの蛍光を計測するだけとなる。このような状態の検出信号３０は、制御装置２５の差動ゲインを調整しても出力ゼロとならない。
【０１０１】
上記のような同期検出手段により、２種類の蛍光色素の結合状態を敏感に検地することが可能となる。
【０１０２】
特に、赤色の発色と緑色の発色の混合として黄色に見える状態を、さらに細かく分離することが可能となる。
【０１０３】
つまり、赤色蛍光と緑色蛍光の強度比をこの検出方法により測定することが可能となる。すなわち、従来のように、蛍光が混合した単なる黄色ではなく、赤の強い黄色か、逆に、緑の強い黄色かの区別を電気的に行うことができる。
【０１０４】
【実施例２】
光源のコストダウンを行うためには、フェムト秒レーザー光源の出力強度を必要最低限まで減少させる工夫を行うことである。フェムト秒光パルスを発生させるためには、光共振器内部の分散を調整し、理想的には共振器内部の分散が発振波長領域に渡ってゼロであることが望ましい。しかし、そのような状況を作りだすことは容易ではなく、通常、個々のミラーの特性のばらつきや、結晶の特性のばらつきなどが重なって、条件を特定することは容易ではない。
【０１０５】
そこで、本発明の１つの実施の形態例として、図９に示すような、斜め蒸着による分散補償量可変型ミラーを提案する。
【０１０６】
図９は本発明の１つの実施の形態例としての斜め蒸着による分散補償量可変型ミラーを説明する図で、符号３３は基板ガラス、３４は分散補償ミラー層、３５は厚みが入射面内方向で変化している層、３６は斜め蒸着ビーム、３７は分散補償特性曲線、３８は分散補償量ミラーの場所を表す横軸、縦軸は２次の群速度分散である。ここで、入射面内方向とは多層膜を構成する各層のミラーの入射面に平行な方向という意味で、各層の中にミラーの入射面に平行な平面を想定し、その平面の方向という意味である。
【０１０７】
厚みが入射面内方向で変化している層３５は、図９では最上部の層のように図示しているが、これに限定されず、分散補償ミラー層３４の各層のうちの一部をこのように形成しても良く、また、分散補償ミラー層３４の全ての層をこのように形成しても良い。
【０１０８】
また、斜め蒸着ビーム３６により分散補償ミラーを作成する場合、基板３３に構造をもたせたり、基板を適宜回転したり、マスクを制御したりするなどにより、ミラーへの光ビーム入射位置と分散補償特性の変化の関係を、適宜調整して作製することができる。
【０１０９】
分散補償量可変型ミラーは、光ビームの入射位置の変化に対して分散補償特性がステップ状に変わるように作成し、多層膜への光ビームの入射位置を、ミラーの入射ビームに対する傾き、ミラーの位置移動、光学系の制御による光ビームの移動などによって適宜選択することができる。
【０１１０】
分散補償量可変型ミラーの光ビームの入射位置あるいは傾きとミラーの分散補償特性の関係はあらかじめ実験などによって調べておき、当該制御系のメモリーに制御データとして記憶させておき、制御の精度を向上させるのに利用することができる。
【０１１１】
このミラーは、基板ガラス３３の上に、膜厚により２次の群速度分散を補償できるミラー層３４を斜め蒸着ビーム３６により作製した構成を有する分散補償量可変型ミラーである。この様な構成のミラーを作製することにより、符号３８により示した分散補償量はミラーの場所に依存して２次の群速度分散−波長特性が変化し、分散補償の内容が変化し、符号３７で示すような分散補償特性曲線となる。
【０１１２】
この分散補償量可変型ミラーを用いた光共振器を構成することにより、共振器内部の分散はミラーの位置を可変にすることで連続的に調整することが可能となり、個々の共振器固有の分散補償を容易にかつ高精度に実施することが可能となる。その結果、分散補償量の微妙なズレに起因して発生していた余剰の励起エネルギーを削減することができ、最終的には光源のコストを抑えることが可能となる。
【０１１３】
【実施例３】
図１０は、本発明の実施の形態例としての、フェムト秒レーザー光源１０を用いた高感度ＤＮＡチップ蛍光分析装置の概略を示す図で、符号３９はマイクロ・アレイ、４０は対物レンズ、４１は蛍光を赤色も緑色も通過するダイクロイックミラー、４２は赤色を反射するダイクロイックミラー、４３と４４は光検知器、４５は検出装置、４６は制御コンピューター、４７は表示装置、４８はスキャンする移動ステージである。
【０１１４】
フェムト秒レーザー光源１０から発生する、マスタ信号源９により変調された、レーザー光６は、励起光を反射するダイクロイックミラー４１により反射され、対物レンズ４０により、ＤＮＡチップ等のマイクロ・アレイ３９上に集光される。
【０１１５】
励起光を照射された結果によるマイクロ・アレイからの蛍光は、図に示されていない、集光した励起ビームの光軸上を、励起光とちょうど逆に進み、蛍光を赤色も緑色も通過するダイクロイックミラー４１を通過し、その後、緑色を透過し、赤色を反射するダイクロイックミラー４２に達する。
【０１１６】
ミラー４２を透過した緑色は、光検知器４３により検出され、ミラー４２で反射された赤色は、光検知器４４により検出される。
【０１１７】
図６に示した位相検波器２８等を含む検出装置４５、および、マイクロチップを平面内でスキャンする移動ステージ４８は、制御コンピューター４６で制御され、マイクロチップ３９からの蛍光情報は表示装置４７上に表示される。
【０１１８】
【実施例４】
図１１は、本発明の実施の形態例としての、フェムト秒レーザー光源１０を用いた高感度ＤＮＡチップ蛍光分析装置において、光ファイバー（ファイバともいう）を用いた場合の実施例の概略を示す図で、符号４９は集光コリメーターレンズ、５０はシングルモード光ファイバー、５１はファイバカプラ、５２はフィルタモジュール、５３と５４は光検知器、５５はコリメート・レンズである。
【０１１９】
フェムト秒レーザー光源１０から発生する、マスタ信号源１３により変調された、レーザー光６は、コリメートレンズ５５により、シングルモード光ファイバー５０に結合される。その後、ファイバカプラ５１に結合され、集光コリメーターレンズ４９により、マイクロチップアレイ３９に集光される。
【０１２０】
マイクロチップアレイ３９からの蛍光は、図に示されていないが、集光した励起ビームの光軸上をちょうど励起ビームと逆の方向に進み、ファイバカプラ５１により分離され、シングルモード光ファイバ５０を経由して、フィルタモジュール５２に結合される。
【０１２１】
フィルタモジュール５２において、赤色と緑色に分離され、ファイバー５０経由で光検知器５３と光検知器５４に入る。
【０１２２】
図６に示した位相検波器２８等を含む検出装置４５、および、マイクロチップアレイを平面内でスキャンする移動ステージ４８は、制御コンピューター４６で制御され、マイクロチップアレイ３９からの蛍光情報は表示装置４７上に表示される。
【０１２３】
【実施例５】
図１２は、本発明の実施の形態例としての、フェムト秒レーザー光源１０を用いた高感度ＤＮＡチップ蛍光分析装置において、光ファイバーを用いた場合の実施例の概略を示す図で、符号５６は円盤型マイクロ・レンズ・アレイである。
【０１２４】
フェムト秒レーザー光源１０から発生する、マスタ信号源１３により変調された、レーザー光６は、コリメート・レンズ５５により、シングルモード光ファイバー５０に結合される。その後、ファイバカプラ５１に結合され、円盤型マイクロ・レンズ・アレイ５６経由で、マイクロ・チップ・アレイ３９に集光される。
【０１２５】
マイクロ・チップ・アレイ３９からの蛍光（図に示されていない）は、集光した励起ビームの光軸上を励起光の光路とちょうど逆に進み、ファイバ・カプラ５１により分離され、シングルモード光ファイバ５０経由で、フィルタ・モジュール５２に結合される。フィルタモジュール５２において、赤色と緑色に分離し、ファイバー経由で光検知器５３と光検知器５４に入る。
【０１２６】
図６に示した位相検波器２８等を含む検出装置４５、および、円盤型マイクロ・レンズ・アレイ５６の回転は、制御コンピューター４６で制御され、マイクロ・チップ・アレイ３９からの蛍光情報は表示装置４７上に表示される。
【０１２７】
以上の説明からわかるように、本発明においては、従来のレーザー励起手段とは異なり、励起波長と蛍光波長が近接していることによる、散乱光の混入などに起因する検出感度の低下などを回避することができる。
【０１２８】
以上、本発明をいくつかの実施例を用いて説明してきたが、本発明はこれに狭く限定されるものではなく、種々のバリエーションを可能にするものである。
【０１２９】
例えば、未知の被検試料に対して、本発明の蛍光測定に利用できる特性を有する蛍光発光体としてどのようなものが含まれているかをサーチし、その結果によって本発明の励起光源や測定系の諸制御条件を適宜設定できるようにすることができ、また、励起光源の分散補償を自動化したり、励起光の被検試料に照射するまでの経路に、光カップリングなどを利用したモニターを配置し、そのモニター結果を制御にフィードバックすることができる。
【０１３０】
分散補償量可変型ミラーは、少なくとも一部が入射ビーム位置の変化による分散補償特性が連続的に変化するミラーになるように構成することもできる。
【０１３１】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明は、生体分析に応用することができる、安いコストで、検出Ｓ／Ｎ比が高く、正確な蛍光測定が可能な蛍光分析方法ならびに蛍光分析装置を提供するものである。しかも、試料に与えるダメージも小さい。
【０１３２】
さらに、本発明のフェムト秒レーザー光を励起光として用いた蛍光検査装置は、検出感度の飛躍的な向上が期待できるため、ＤＮＡチップやタンパクチップの高密度化に対応した光源および検出システムの発展に大きく寄与し、今後の生命科学分野の発展への寄与は極めて大きいものといえる。
【０１３３】
また、本発明は、フローサイトメータ（セルソーター）の光源と検出手法に利用して大きな効果を発揮することができる。
【０１３４】
本発明のように、「斜め蒸着による分散補償量可変型ミラー」を用いた、フェムト秒レーザー光源を製造すると、必要最低限の励起光強度と出力強度の最適化が可能となり、分析のさらなる総合的なコストダウンが実現できる。
【０１３５】
また、本発明によって生命科学にフェムト秒レーザー技術を実用的に導入することは、極めて大きなバイオ産業としての社会的波及効果をもたらすことになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】２光子吸収スペクトルが交差する２種類の色素を説明する図である。
【図２】短い波長側に吸収を持つ色素の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを説明する図である。
【図３】長い波長側に吸収を持つ色素の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを説明する図である。
【図４】短い波長側に吸収を持つ色素と長い波長側に吸収を持つ色素のそれぞれの蛍光スペクトルを説明する図である。
【図５】本発明の実施の形態例としての波長変調した励起光と変調に依存して変化する蛍光強度を説明する図である。
【図６】本発明の実施の形態例としての高感度蛍光検出装置を説明する図である。
【図７】本発明の実施の形態例としての高感度蛍光検出装置における信号タイミングチャートを説明する図である。
【図８】本発明の実施の形態例としての２種類の蛍光体を用いた差動増幅の原理を説明する図である。
【図９】本発明に用いる斜め蒸着による分散補償量可変型ミラーを説明する図である。
【図１０】本発明の実施の形態例としてのフェムト秒レーザー光源を用いた高感度ＤＮＡチップ蛍光分析装置を説明する図である。
【図１１】本発明の実施の形態例としてのフェムト秒レーザー光源を用いた高感度ＤＮＡチップ蛍光分析装置を説明する図である。
【図１２】本発明の実施の形態例としてのフェムト秒レーザー光源を用いた高感度ＤＮＡチップ蛍光分析装置を説明する図である。
【符号の説明】
１，３：２光子吸収スペクトル
２，４：蛍光スペクトル
５：Ｘ字状に交差するような２光子吸収スペクトル波長上の交差点の位置を示す点線
６：波長（λ０）を中心にして、周波数変調（±Δλ（ν））した光
７，８，１１，１２：  蛍光強度スペクトル
９：励起波長の変調が短波長側、λ０−Δλ、に移動するときの状態
１０：励起波長の変調が長波長側、λ０＋Δλ、に移動するときの状態
１３：マスタ信号源
１４：フェムト秒レーザー光源
１５：光変調器
１６：被計測サンプル
１６Ａ：被計測サンプル１６から発せられる蛍光、
１７，１８：光学フィルター
１９，２０，４３，４４，５３，５４：光検知器
２１，２２，２９：増幅器
２３，２４：外部制御機能を有する可変抵抗器
２５：制御装置
２６，２７，３０：出力
２８：位相検波器
３１：マスタ信号源１３の信号波形
３２：二つの信号の合成信号
３３：基板ガラス
３４：分散補償ミラー層
３５：厚みが入射面内方向で変化している層
３６：斜め蒸着ビーム
３７：分散補償特性曲線
３８：分散補償量ミラーの場所を表す横軸
３９：マイクロ・チップ・アレイ
４０：対物レンズ
４１，４２：ダイクロイックミラー
４５：検出装置
４６：制御コンピューター
４７：表示装置
４８：スキャンする移動ステージ
４９：集光コリメーターレンズ
５０：シングルモード光ファイバー
５１：ファイバカプラ
５２：フィルタモジュール
５５：コリメート・レンズ
５６：円盤型マイクロ・レンズ・アレイ
５７：比反転増幅入力
５８：反転増幅入力
５９：差動増幅器
６０：差増贈幅器からの出力
６１：比反転入力端子につながる信号波形
６２：反転入力端子につながる信号波形
６３：同相ノイズ信号
６４，６５：入力信号
６６：出力信号
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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