(57)【要約】【解決手段】繊維状吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤及び菌体栄養成分を担持してなる簡易乾燥培地に、被検試料液と同時に又は被検試料液添加後に卵黄液を添加して培養し、形成されるコロニーを検出することを特徴とするセレウス菌の検出方法。【効果】本発明のセレウス菌検査法により、煩雑な培地調製の必要がなく、検査自体も簡便で経験と労力を必要としない検査が可能となった。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤及び菌体栄養成分を担持してなる簡易乾燥培地に、被検試料液と同時に又は被検試料液添加後に卵黄液を添加して培養し、形成されるコロニーを検出することを特徴とするセレウス菌の検出方法。
【請求項２】
簡易乾燥培地が、（ａ）水及びアルコールに可溶な接着剤、（ｂ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させた簡易培地である請求項１記載のセレウス菌の検出方法。
【請求項３】
簡易乾燥培地が、（ａ）水及びアルコールに可溶な接着剤０．０１〜０．４重量％、（ｂ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有するアルコール懸濁液を、防水性平板上に載置された該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維質吸水性シートに含浸させ、これをアルコールの急速な蒸発を抑制しつつ乾燥して、吸水性シートを防水性平板に固着させてなる簡易培地である請求項１記載のセレウス菌の検出方法。
【請求項４】
卵黄液が、放射線滅菌された卵黄から得られた卵黄液である請求項１〜３のいずれか１項記載のセレウス菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡易培地により簡便かつ正確に食品や環境中のセレウス菌を検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）は、河川、土の中など、自然界に広く分布しており、食中毒の原因菌として知られている。セレウス菌は、増殖に伴って、嘔吐型毒素と下痢型毒素を産生し、セレウス菌による食中毒の症状は嘔吐及び下痢である。また、セレウス菌の毒素は熱に強く、特に嘔吐型毒素は１２６℃で９０分加熱してもこわれにくいため集団食中毒を起こしやすい。
【０００３】
このようにセレウス菌の検出は、食品衛生法に基づく検査項目として重要であり、従来、セレウス菌検出のための検査法としては、ＮＧＫＧ寒天培地などが一般的に使用されてきた。ＮＧＫＧ寒天培地はセレウス菌の選択分離培地で、培地上に発育したセレウス菌は卵黄反応陽性と特徴的なコロニーにより鑑別される。このとき卵黄反応の有無はセレウス菌を鑑別する上で重要な要素となっている。
【０００４】
従来法のＮＧＫＧ寒天培地は培地調製の際に卵黄を添加する必要があり、この卵黄を添加する操作は煩雑で経験を必要としていた。詳しくは、あらかじめ鶏卵から卵黄を無菌的に抽出し、滅菌した食塩水と混合しておき、培地を高圧蒸気滅菌後に４５℃〜５０℃に冷却したところに所定量の卵黄を加えて、シャーレに分注していた。このとき重要な点は、滅菌後の培地の温度を正確に制御しないと卵黄を添加したときに卵黄成分が変性したり、培地の寒天が固まったりする欠点があった。すなわち従来法は培地調製の操作が煩雑で経験や時間を必要としていた。また、従来の検査法では、試料を所定量培地に加えた後、コンラージ棒で培地全体に行き渡るように広げ、試料を培地に染み込ませる操作をするため、この塗沫接種は検査に労力と時間を必要とした。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような問題の多いＮＧＫＧ寒天培地を用いない手段として、あらかじめ菌体栄養成分等を担持した吸水性シートからなる簡易乾燥培地の利用が考えられる。そこで、菌体栄養成分に加えて卵黄も担持した吸水性シートを調製すべく検討したところ、卵黄成分が変性し吸水性シートに担持できないため、簡易培地によるセレウス菌の検出はできなかった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、さらに検討したところ、全く意外にも、繊維状吸水性シートに水可溶性ゲル化剤及び菌体栄養成分を担持してなる乾燥培地に、卵黄液を添加してから被検試料液を添加すると卵黄液の分散が十分でないのに対し、卵黄液を被検試料液と同時又は被検試料液添加後に添加すれば、被検試料液及び卵黄液が均一に吸水性シートに分散し、鑑別可能なコロニーが形成され、セレウス菌の検出が簡便かつ正確にできることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、繊維状吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤及び菌体栄養成分を担持してなる簡易乾燥培地に、被検試料液と同時に又は被検試料液添加後に卵黄液を添加して培養し、形成されるコロニーを検出することを特徴とするセレウス菌の検出方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のセレウス菌の検出方法に用いられる簡易乾燥培地は、繊維状吸水性シートに少なくとも水可溶性ゲル化剤及び菌体栄養成分が担持されていればよく、例えば次の（１）〜（６）の簡易培地が挙げられる。
（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開昭５７−５０２２００号公報）。
（２）防水性基体の上面部に、空気透過性膜、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開平３−１５３７９号公報）。
（３）濾紙等に菌体栄養成分を含浸させ、その表面をカバーシートで覆ってなる検出紙（特開平２−６５７９８号公報）。
（４）防水性平板の表面に冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基、繊維質吸水性シートを順次積層した培地（特開平６−１８１７４１号公報）。
（５）（ａ）水及びアルコールに可溶な接着剤、（ｂ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させた簡易培地（特開平９−１９２８２号公報）。
（６）（ａ）水及びアルコールに可溶な接着剤０．０１〜０．４重量％、（ｂ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有するアルコール懸濁液を、防水性平板上に載置された該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維質吸水性シートに含浸させ、これをアルコールの急速な蒸発を抑制しつつ乾燥して、吸水性シートを防水性平板に固着させてなる簡易培地（特開２０００−３２５０７２公報）。
これらの簡易乾燥培地のうち、（５）及び（６）が好ましく、（６）が特に好ましい。
【０００９】
ゲル化剤としては、水に可溶であればよいが、水に可溶でアルコールに不溶であるのが特に好ましく、例えばキサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン等の天然ゲル化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の合成ゲル化物質が挙げられるが、なかでもキサンタンガムが特に好ましい。かかるゲル化剤は、平均粒径５００μｍ以下、特に０．５〜５０μｍの粉体を使用するのが好ましい。
【００１０】
培地組成物に必要に応じて用いられる接着剤としては、水に可溶であるのが好ましく、水及びアルコールに可溶なものであることが特に好ましい。例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド等が挙げられるが、なかでもヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。
【００１１】
また、菌体栄養成分としては、検出しようとするセレウス菌の生育に適したものが選択される。例えば、肉エキスやペプトン等の栄養成分、糖類、及びセレウス菌以外の菌を抑制するための抗生剤を含有する培地成分が用いられる。
【００１２】
更に、この培地組成物には、コロニーの観察を容易にするために、適当な発色剤を配合するのが好ましい。かかる発色剤には、コロニーを着色する色素、例えばトリフェニルテトラゾリウムクロライド、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド等の色素；５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド等の酵素基質；フェノールレッド、ブロムチモールブルー、ニュートラルレッド、ブロムクレゾールパープル、メチルレッド等のｐＨ指示薬などが含まれる。
【００１３】
培地組成物を懸濁するためのアルコールとしては、例えばエタノール、２−プロパノール等が挙げられる。
【００１４】
上記培地組成物を担持させる繊維質吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散し、かつ培地組成物中のゲル化剤をその網目構造中に担持できるものであることが必要である。そのためには、繊維質吸水性シートはゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有し、かつ厚さも当該粒径より厚いことが必要であり、例えば、網目の大きさが１５〜１００メッシュ、特に２０〜５０メッシュで、厚さが１０〜１０００μｍ、特に５０〜６００μｍのものが好ましい。
【００１５】
このような繊維質吸水性シートとしては、レーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は特に制限されず、正方形、長方形、円形等の何れであってもよい。またその大きさも特に制限されないが、微生物の簡易検出用の場合には長径１〜１５ｃｍのものが好ましい。
【００１６】
上記繊維質吸水性シートを固着させる防水性平板としては、プラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、外部からの観察のため透明のものが好ましい。
【００１７】
本発明方法においては卵黄液を、被検試料液と同時に、又は被検試料液添加後に簡易培地に添加する。ここで卵黄液としては、鳥の卵黄水溶液、特にニワトリの卵黄水溶液が好ましい。なお、当該卵黄液には、安定化剤として無機塩、特に塩化ナトリウムを含有させるのが好ましい。無機塩の濃度は、０．１〜２０重量％、特に０．１〜１０重量％が好ましい。
【００１８】
卵黄液調製に用いる卵黄は、放射線滅菌、例えばガンマ線や電子線、特に表面線量５〜２０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌するのが好ましい。また、卵黄液中の卵黄濃度は吸水性シートへの分散性の点から５〜３０重量％、特に５〜２０重量％とするのが好ましい。
【００１９】
卵黄液と被検試料液を同時に添加する場合には、予め両者を混合して添加してもよいし、添加直前に両者を混合してもよい。被検試料液添加後に卵黄液を添加する場合は、被検試料液添加直後、例えば１０分以内、特に５秒以内に添加するのが好ましい。被検試料液と卵黄液の添加量は、容量比で被検試料液：卵黄液＝１０：１〜１０：５が好ましい。
【００２０】
被検試料液としては、食品懸濁液、調理場や調理器具等の環境ふき取り検体あるいは増菌用培地で培養した培養液、土壌懸濁液、河川水、飲料水等が用いられる。
【００２１】
これらの被検試料液及び卵黄液の接種（添加）は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用される。
【００２２】
被検試料液及び卵黄液添加後培養し、形成されるコロニーを検出すればセレウス菌が検出できる。培養は２８〜３２℃で１８〜２４時間、静置して好気的に行うのが好ましい。
【００２３】
前記の如く簡易培地に被検試料液及び卵黄液を接種すると、これらの液がメッシュ間の立体的な空洞部の毛細管現象によって容易に拡散し、それに続いて膨潤ゲル化が起こって、被検試料液中のセレウス菌は捕捉され、自由移動が抑制され、培養によって卵黄反応が生起し、セレウス菌のコロニーが形成される。従って、培地形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。被検試料液及び卵黄液を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。
【００２４】
【実施例】
実施例１
（１）培地の作製
塩化ナトリウム５ｇ、肉エキス５ｇ、乳糖１０ｇ、ペプトン２０ｇ、グリシン１０ｇ、硫酸ポリミキシンＢ８０万Ｕ、フェノールレッド０．０５ｇ及びキサンタンガム３０ｇをヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）１ｇを含有するエタノール溶液１０００ｍＬに加え、懸濁液とした。このエタノール懸濁液を１ｍＬずつ繊維質吸水性シート（５０φｍｍ）を収納した容器（５０φｍｍ）に分注した後、乾燥させ、蓋をして簡易培地を作製した。本培地を乾燥剤とともにアルミ包材に密封包装した後、表面線量１０〜２０ｋＧｙのガンマ線照射を行って滅菌した。
【００２５】
（２）卵黄液の調製
卵黄をポリ容器に密封し、表面線量５〜２０ｋＧｙのガンマ線照射を行って滅菌した。これを１２１℃で１５分高圧蒸気滅菌した１０重量％塩化ナトリウム水溶液に終濃度１３％となるように無菌的に加え、滅菌済みプラスチック容器に分注し、卵黄液とした。
【００２６】
（３）菌株の供試
供試菌株をトリプトソイブイヨンで２４時間前培養したものを生理食塩水で１０倍段階希釈して１ｍＬを培地に供試した。
【００２７】
比較例
従来法のＮＧＫＧ寒天培地を比較対照とした。
【００２８】
試験例１
実施例１の培地に試験菌液１ｍＬを加えた直後、卵黄液０．３ｍＬを滴下した。蓋をした後３０℃で２４時間培養した。同様に比較対照としてＮＧＫＧ寒天培地に試験菌液０．１ｍＬを加え、コンラージ棒で塗沫接種し、３０℃で２４時間培養した。
その結果を表１及び２に示した。
【００２９】
【表１】
2004073008.tif 000002
【００３０】
【表２】
2004073008.tif 000003
【００３１】
表１及び２の結果より実施例１（１）の培地を用いた本発明検査法は簡易であるにもかかわらず従来法のＮＧＫＧ寒天培地と同等の性能を有していることが確認できた。
【００３２】
試験例２
試験例１において、試験菌液１ｍＬ及び卵黄液０．３ｍＬを混合し、実施例１（１）の培地に滴下した。その後、試験例１と同様に培養し、コロニーを観察したところ、試験例１と同様の結果が得られた。
【００３３】
試験例３
試験例１において、卵黄液０．３ｍＬを添加し、その６０秒後に試験菌液１ｍＬを実施例１（１）の培地に滴下した。その後、試験例１と同様に培養したところ、卵黄液の拡散が不十分であり、卵黄液の行き渡らなかった部分に卵黄反応を生じないセレウス菌のコロニーを認めた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明のセレウス菌検査法により、煩雑な培地調製の必要がなく、検査自体も簡便で経験と労力を必要としない検査が可能となった。