(57)【要約】      （修正有）【課題】広範囲に測定可能であり、長方形に生体分子が並べられたアレイを観察することができ、流れの滞留が改善された表面プラズモン共鳴測定用フローセルを提供する。【解決手段】金属基板上にサンプル液を供給することのできる表面プラズモン共鳴測定用フローセルであって、フローセル内の面積が２０ｍｍ２以上４００ｍｍ２以下、フローセル内のサンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）と、線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）の比（ＬＳ／ＬＬ）が１．００未満であるように構成した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属基板上にサンプル液を供給することのできる表面プラズモン共鳴測定用フローセルであり、フローセル内の面積が２０ｍｍ２以上４００ｍｍ２以下であり、フローセル内のサンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）と、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）の比（ＬＳ／ＬＬ）が１．００未満である表面プラズモン共鳴測定用フローセル
【請求項２】
表面プラズモン共鳴が表面プラズモン共鳴イメージング法である請求項１〜３いずれか記載の表面プラズモン共鳴測定用フローセル
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、広範囲に測定可能であり、長方形に生体分子が並べられたアレイを観察することができ、流れの滞留が改善された表面プラズモン共鳴測定用フローセルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学的なセンサー技術として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が知られている。ＳＰＲは金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、金属薄膜上の屈折率の変化を検出する方法である。ＳＰＲはバイオ分野、環境分野、工業分野へ応用されており、表面に固定化した生体分子の相互作用解析、抗原抗体反応モニター、糖度モニターなどに用いられている。
【０００３】
最近はバイオ分野の生体分子相互作用解析に注目が集まっており、ＳＰＲによるラベルフリーかつリアルタイム解析からＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得る試みがなされている。平衡状態を評価するだけでなく、結合、解離、反応などの速度を解析したＫｉｎｅｔｉｃｓデータは生体分子の機能を明らかにする上で非常に有用な情報となる。
【０００４】
通常のＳＰＲは基本的に一点のみの測定であるため、複数点の解析が可能なＳＰＲイメージング技術が注目されている。ＳＰＲイメージングにおいては、複数の生体分子を金蒸着表面に固定化したアレイを作製し、生体分子が固定化された部位の反射光強度をリアルタイムでモニターすることで、リアルタイムにＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得ることができる。
【０００５】
通常、生体分子のアレイを作製する場合、９６穴プレートや３８４穴プレートに生体分子を含む溶液を用意する。従って、得られるアレイの整列の形は８：１２の長方形となる。しかし、ＳＰＲイメージングにおいて、９６穴プレートや３８４穴プレートからの９６点スポットや３８４点スポットに対応した形のフローセルは、全く検討されていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、広範囲に測定可能であり、長方形に生体分子が並べられたアレイを観察することができ、流れの滞留が改善された表面プラズモン共鳴測定用フローセルに関する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．金属基板上にサンプル液を供給することのできる表面プラズモン共鳴測定用フローセルであり、フローセル内の面積が２０ｍｍ２以上４００ｍｍ２以下であり、フローセル内のサンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）と、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）の比（ＬＳ／ＬＬ）が１．００以下である表面プラズモン共鳴測定用フローセル
２．表面プラズモン共鳴が表面プラズモン共鳴イメージング法である１記載の表面プラズモン共鳴測定用フローセル
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）角は金属の表面に形成される層の厚み、屈折率によって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。従って、ＳＰＲはラベル不要でリアルタイム評価が可能な定量法である。ＳＰＲを応用したＳＰＲイメージングは広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、複数の物質を固定化したアレイを用いて相互作用解析が可能である。
【０００９】
生体分子のアレイを作製する場合、例えば９６穴プレートや３８４穴プレートに生体分子を含む溶液を用意し、溶液をスポットして表面に生体分子を固定化する場合が一般的である。スポットの形状は円形や正方形であるのが一般的であり、スポット間の間隔もすべて同一である場合がほとんどであるため、得られるアレイの整列の形は８：１２の長方形となる。
【００１０】
このような長方形の部分にサンプル液を流すためのフローセルの、サンプル液が流れ、サンプル液と金属基板が接触するフローセル内の面積は２０ｍｍ２以上４００ｍｍ２以下が好ましい。２０ｍｍ２未満であると、非常に狭い領域にアレイを作製する必要があり、高価な自動スポット装置が必要となるだけでなく、ＳＰＲの観察も非常に困難となる。４００ｍｍ２超える場合は、広範囲に光を均一に当てるのが非常に難しく、測定箇所による感度の違いが問題となるだけでなく、広範囲に均一に液を流すのも困難である。
【００１１】
フローセル内のサンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）と、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）の比（ＬＳ／ＬＬ）は１．００未満が好ましく、０．９０以下がより好ましく、０．８０以下がさらに好ましい。サンプルの入口から出口の直線と、長方形に並べられたアレイの長辺は平行であるべきである。長方形に並べられたアレイの長辺の方向に、フローセルは細長く設計されることで、不必要な部分にサンプル液を供給する必要はなくなる。（ＬＳ／ＬＬ）の比が１．００を超える場合は、不必要な部分にまで液を供給することになり、測定に必要なサンプル量が増えるため好ましくない。
また、フローセルが流れの方向に細長く設計されることで流れの滞留を抑制し、均一に液を流すこともできるようになる。
【００１２】
フローセルの材質としては、特に限定されず、金属、ガラス、セラミック、樹脂、などが挙げられる、樹脂としては、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスチレンやＡＢＳ樹脂などのスチレン系樹脂、酢酸ビニル、塩化ビニル、ＰＥＴやＰＢＴやＰＥＴ−Ｇ（Ｒ）等のポリエステル、６−ナイロンや６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、メラミン樹脂、フェノール樹脂、デルリン（Ｒ）やジュラコン（Ｒ）等のアセタール樹脂、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、テフロン（Ｒ）等のフッ素系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のケイ素系樹脂、各種ゴム類、等がある。加工方法としては、削り出し、焼成、エッチング、射出など、それぞれの素材に適合したものであれば、特に限定されるものではない。
【００１３】
また、溶液の流れ込みのために流入孔、流出孔が設けられるが、セル内への溶液のスムーズな拡散のために、流入孔、流出孔形状に工夫をしても良い。
工夫としては、孔のセル内部側にテーパー角を設ける、孔の角度を傾ける、複数の孔にする、スリット状の孔形状とするなどが挙げられる。
【００１４】
本発明のフローセルはＳＰＲ測定、特にＳＰＲイメージング測定に適しており、長方形に並べられたアレイの測定に好適である。
【００１５】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００１６】
［実施例１］
【００１７】
図１に示すフローセル（材質：ポリオキシメチレン）と観察用スライドをＳＰＲイメージング装置（ＳＰＲｉｍａｇｅｒ：ＧＷＣ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にセットして観察を行った。この場合、フローセル内の面積は１５５ｍｍ２と広範囲であり、フローセル内のサンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）は１５ｍｍ、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）は１１．６ｍｍであり、比（ＬＳ／ＬＬ）が０．７７と１．００未満、さらに言うと０．８０以下であった、
観察用スライドは以下の手順で用意した。
【００１８】
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，  Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，Ｓｈｅａｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）をｐＨ７．４のリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。
【００１９】
水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、ウシオ電機社製１０００Ｗ高圧水銀ランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは０．５ｍｍ×０．５ｍｍの正方形が８×１２＝９６個並んだものである。照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ、同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、光を照射した部分に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。
【００２０】
得られたスライドをＳＰＲイメージング装置にセットして純水（ミリＱ水）をポンプによって毎分１００μｌで流した際に観察したＳＰＲイメージング像を図２に示す。このようにアレイ部が観察できている。
さらに流す液をリン酸緩衝液に変えて観察を続けたところ、９０秒後には、９６個の自己組織化表面部の共鳴角が広角側にシフトし、液が効率よく入れ替わっていることが観察された。
この様に、図１フローセルを用い、ＳＰＲイメージング法によって、効率よく固定化した生体分子と測定対象物質の相互作用を観察することが可能である。
【００２１】
［実施例２］
図３に示すフローセル（材質：ポリオキシメチレン）と観察用スライドを実施例１と同様にＳＰＲイメージング装置にセットして観察を行った。この場合、フローセル内の面積は１５０ｍｍ２と広範囲であり、フローセル内のサンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）は１４ｍｍ、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）は１３ｍｍであり、比（ＬＳ／ＬＬ）が０．９３と１．００未満であった、実施例１と同様に液を流して観察したところ、９０秒後に９６個のすべての箇所で液が入れ替わった。
【００２２】
［比較例１］
図４に示すフローセル（材質：ポリオキシメチレン）と観察用スライドを実施例１と同様にＳＰＲイメージング装置にセットして観察を行った。この場合、フローセル内の面積は１７７ｍｍ２と広範囲であるが、フローセル内は円形であり、サンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）は１５ｍｍ、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）は１５ｍｍであり、比（ＬＳ／ＬＬ）は１．００であり、本発明には適さない。実施例１と同様に液を流して観察したところ、９６個のすべての箇所で液が入れ替わるのに１５０秒要し、特に流入孔近辺の円周部分の入れ替わりに時間を要した。
【００２３】
［比較例２］
図５に示すフローセル（材質：ポリオキシメチレン）と観察用スライドを実施例１と同様にＳＰＲイメージング装置にセットして観察を行った。この場合、フローセル内の面積は１６６ｍｍ２と広範囲であるが、フローセル内は丸みを帯びた正方形であり、サンプル入口と出口を結ぶ直線がフローセルによって切り取られた線分の長さ（ＬＬ）は１３ｍｍ、前記線分の垂直二等分線がフローセルによって切り取られる線分の長さ（ＬＳ）も１３ｍｍであり、比（ＬＳ／ＬＬ）は１．００であり、本発明には適さない。実施例１と同様に液を流して観察したところ、９６個のすべての箇所で液が入れ替わるのに１５０秒要し、特に角の部分の入れ替わりに時間を要した。
【００２４】
【発明の効果】
本発明のフローセルは少量のサンプルであっても広範囲に測定可能であり、長方形に生体分子が並べられたアレイを均等な条件で観察することができ、流れの滞留が改善された
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で用いたフローセルの設計図  単位（ｍｍ）
【図２】アレイのＳＰＲイメージング像（イメージ図）
【図３】実施例２で用いたフローセルの設計図  単位（ｍｍ）
【図４】比較例１で用いたフローセルの設計図  単位（ｍｍ）
【図５】比較例２で用いたフローセルの設計図  単位（ｍｍ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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