(57)【要約】【課題】乳汁あるいは獣畜類への病原性微生物の感染の有無を検査するため、獣畜類から搾乳した生乳汁を用いることにより１回に多数の検体を検査することを可能にした。【解決手段】乳汁への病原性微生物の感染の有無を検査する方法としては、用途別の培地を用いて分離同定する方法が汎用されていた。また、獣畜類に関しては、血漿中に存在する病原性微生物に対する抗体の有無を調べる方法が多く用いられていた。これらの方法はいずれも、煩雑で、しかも、多人数を要した。そこで、より簡便な方法を探索したところ、血漿中同様に獣畜類から搾乳された乳汁にも抗体が存在することを見出した。この乳汁を用いて抗体を検出する方法により、乳汁あるいは獣畜類への病原性微生物の感染の有無を正確かつ迅速に検査することを可能にした。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳汁および獣畜類を対象に病原性微生物の感染の有無を検査するため、検体試料として乳汁を用いる抗体検出法。
【請求項２】
乳汁および獣畜類を対象に病原性微生物の感染の有無を検査するため、検体試料として乳汁を用いるＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）。
【請求項３】
乳汁および獣畜類を対象にＱ熱菌の感染の有無を検査するため、検体試料として乳汁を用いる抗体検出法。
【請求項４】
乳汁および獣畜類を対象にＱ熱菌の感染の有無を検査するため、検体試料として乳汁を用いるＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、病原性微生物の検査において病原性微生物に対応する抗体を検出することにより、１回に多数の検体を検査する方法である。
【０００２】
【従来の技術】
獣畜類の乳汁あるいは食肉は無菌なものでなく、Ｑ熱菌あるいはサルモネラ菌など病原性微生物により、しばしば感染している。この感染している生乳汁あるいは生肉を食べた人は、病原性微生物に感染し罹患するケースがある。このため、食用として飼育されている獣畜類については、全数、病原性微生物への感染の有無を検査する必要がある。ところが、食用獣畜類は、極めて多数飼育されているため、従来は、これら獣畜類の全数を検査することはできていなかった。
【０００３】
本発明により、病原性微生物に感染している食用獣畜類の全数について検査することを可能にした。
【０００４】従来の方法
従来、獣畜類の病原性微生物への感染の有無を検査する方法としては、次の方法があった。
１．検査用試料としては、血液、痰あるいは化膿汁などが用いられていた。
２．測定法としては、次の３つの方法が行われていた。
１）血液を用いて、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）あるいは蛍光抗体法（ＩＦＡ）などによる病原性微生物に対する抗体を検出し確認する方法。
２）血液および痰などの検体試料を用いて、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により病原性微生物に特異的なＤＮＡ配列を検出し確認する方法。
３）血液および痰など体液を電子顕微鏡で観察し形態的に同定する方法。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
食用獣畜類のように病原性微生物の検出を必要とし、しかも、多数の検体試料について検査する際の問題点は、検査する対象である検体試料にあった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
病原性微生物への感染の有無を検査する方法のうち、比較的多数の検体を処理できる方法はＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法）である。前処理なしで測定できる試料であれば、１回、数１００検体以上の測定が可能である。
【０００７】
このＥＬＩＳＡ法による獣畜類の検査には、検体試料として血液が汎用されている。
【０００８】
ところが、血液を用いるには前処理として採血が必要である。採血に当っては、牛など大型動物を固定する極めて難しく、時間がかかる作業がある。さらに、この採取した血液を遠心で分離し血漿を分取する煩雑な工程がある。
【０００９】
そこで、血液と同じ抗体が存在し、しかも前処理工程が簡単な方法を探し出すため研究を重ねた。その結果、獣畜類の乳汁に血漿と同じ抗体が存在することを見出した。そこで、乳汁をＥＬＩＳＡ用の検体試料とすることにより多数の乳汁あるいは獣畜類への病原性微生物検査を可能にした。
【００１０】
【発明の実施の形態】
乳汁あるいは獣畜類への病原性微生物の感染の有無を検査する検体試料として、乳汁を用いた。乳汁を検体試料とすることで、乳汁あるいは食用獣畜類の全数検査のような多数の検体試料を測定することを可能にした。
【００１１】
【本検出法の原理】
本検出法の原理は、はじめに、検査目的とする病原性微生物あるいはこの培養液を抗原として用いる。次に、この抗原に抗体を含む乳汁を加え反応させる。さらに、この抗原抗体反応体に標識抗体を加え結合させた後、発色剤を加え発色させる。この発色の大きさは、乳汁中に含まれる抗体量に従うので、吸光度を測定し、これを抗体強度とする。
【００１２】
【Ｑ熱菌に対する抗体が血漿と同様乳汁中に存在することの確認】
Ｑ熱菌・Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ（コクシェイラ・バーネティ）に対する抗体が、生牛乳中に存在するか否かを検討した。
【００１３】（Ａ）試験方法
１）抗原液の調製法
Ｑ熱菌・Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ（コクシェイラ・バーネティ）アメリカ株、Ｎｉｎｅ  Ｍｉｌｅ菌を細胞培養し、この培養液を重炭酸緩衝液で希釈した液を抗原液として用いた。
２）抗体液の調製法
血漿検査でＱ熱菌への抗体が存在することが確認されている牛について、この牛から搾乳した生乳汁を検体とした。この乳汁をポリソルベート加リン酸緩衝液で１０倍、５０倍、８０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、８００倍、１０００倍および２０００倍に希釈し、抗体液とした。
３）ＥＬＩＳＡ法による反応
抗原液をマイクロプレートの各穴に分注し、４℃で一夜放置した。この放置したマイクロプレートの各穴に抗体液１００μｌを加え３７℃で１時間インキュベートした後、反応液を捨てた。次に、この各穴にパーオキサイド標識抗体１００μｌを入れ３７℃で１時間放置した後、この標識反応液を捨てた。残った各穴に発色剤・α−フェニレンジアミン塩素酸・過酸化水素水混合液１００μｌを加え３７℃で３０分間反応させた。３０分経過後、２Ｍ硫酸５０μｌを加え発色反応を停止した。直ちに、各穴について４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
４）抗体強度
各穴について４９２ｎｍでの吸光度を測定し抗体強度とした。
【００１４】（Ｂ）試験結果および考察
血漿検査でＱ熱に対する抗体の存在が確認されている牛について、この牛から搾乳した生乳汁の抗体強度を調べ、この結果を図１に示した。乳汁の濃度が高くなる、すなわち、希釈倍率が小さくなるにつれ、吸光度が大きくなる「正」の用量反応曲線を示した。したがって、血漿中と同様に牛の乳汁中にもＱ熱の抗体が存在することが分かった。
【００１５】
【乳汁と血漿の抗体強度の関係】
Ｑ熱菌・Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ（コクシェイラ・バーネティ）に対する抗体について、牛の血漿中に存在するものと牛乳に存在するものが同じか否かを検討した。
【００１６】（Ａ）試験方法
検体試料としては、Ｑ熱菌に対する抗体の存在が確認されている牛血漿とこの牛より搾乳した牛乳を用いた。上記の「Ｑ熱菌に対する抗体が血漿と同様乳汁中に存在することの確認」の項、（Ａ）試験方法に準じて操作した。すなわち、牛乳および血漿のいずれも１０倍、５０倍、８０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、８００倍、１０００倍および２０００倍に希釈しＥＬＩＳＡ測定用の試料を調製し、以下、同様に操作して試験を行った。
【００１７】（Ｂ）試験結果
１）牛乳と血漿の抗体強度に関する反応用量曲線
前項の「Ｑ熱菌に対する抗体が血漿と同様乳汁中に存在することの確認」に示した（Ｂ）試験結果のとおり、牛乳の抗体濃度が高くなる、すなわち、希釈倍率が小さくなるにつれ吸光度は大きくなった。また、図１に示したとおり、血漿においても抗体濃度が高くなるにつれて吸光度は大きくなった。しかも、牛乳と血漿の用量反応曲線は平行的であった。
２）同一牛における牛乳と血漿の抗体強度の関係
前もって、血漿の抗体が陽性であることが確認されている５頭の牛について、この血漿と牛乳の抗体強度を比較した。図２に示したとおり、いずれの牛においても牛乳と血漿の抗体強度は近似値であった。すなわち、５頭の牛に関し、血漿の抗体強度が大きい牛から搾乳した牛乳は、平行的に抗体強度は大きく、また、血漿の抗体強度が小さい牛から搾乳した牛乳の抗体強度は小さかった。
【００１８】（Ｃ）考察
牛乳および血漿の抗体強度に関する用量反応曲線は、いずれも抗体濃度が高くなる、すなわち、希釈倍率が小さくなるにつれ、抗体強度も大きくなる「正」の関係であった。また、５頭の牛について試験したところ血漿の抗体強度と牛乳の抗体強度は近似値で平行的であった。したがって、牛乳から検出した抗体と血漿から検出した抗体は、Ｑ熱菌に対する同じ抗体であることを検証した。
【００１９】
【本試験法の再現性】
本試験の再現性を検討するため、陽性コントロールと陰性コントロールで調べた。陽性コントロールとしては、Ｑ熱菌に対する抗体の存在が確認されている牛乳と血漿、また、陰性コントロールとしては、Ｑ熱菌に対する抗体が存在していないことが確認されている牛乳と血漿を用いた。各陽性コントロールおよび陰性コントロール共に各マイクロプレートの２穴ずつに入れ、マイクロプレート４００枚について調べた。表１に示したとおり、陽性コントロールはいずれも基準値以上の吸光度を示し「陽性」を示した。また、陰性コントロールはいずれにも発色せず「陰性」を示した。よって、本試験法の再現性は保証されていることが検証された。
【００２０】
【実施例１】牛４００頭について生牛乳を用いてのＱ熱菌への感染検査
【００２１】（Ａ）試験方法
１）牛乳の搾乳法
牛は識別できるよう個別に番号札をつけた。この各々の牛から牛番号を記載した容器に搾乳した牛乳を入れ検体試料とした。
２）ＥＬＩＳＡ用試料液の調製法および試験方法
前項の「Ｑ熱菌に対する抗体が血漿と同様卵黄中に存在することの確認」、（Ａ）試験方法に準じて行った。ただし、ＥＬＩＳＡ法での測定試料液としては１００倍希釈液を用いた。
３）試験の繰り返し回数
同じ生牛乳について、試験は３回繰り返し行った。
【００２２】（Ｂ）試験結果および考察
牛４００頭について、これらの牛から搾乳した生牛乳についてＱ熱菌に対する抗体の有無を検査した。表２に示したとおり、４００頭の牛に対して８．３％の３３頭が陽性であった。３回の繰り返し試験のいずれも同じ結果となった。したがって、今回の検査では、８．３％の牛がＱ熱菌陽性であった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、畜産業者が搾乳している生乳汁および飼育している牛など獣畜類について病原性微生物への感染の有無を全数検査することを可能にした。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｑ熱菌に感染した牛乳あるいは血漿の濃度と抗体強度との関係を説明したグラフである。（「Ｑ熱菌に対する抗体が血漿と同様乳汁中に存在することの確認」の項）
【図２】同一牛における牛乳と血漿の抗体強度の関係を説明したグラフである。（「乳汁と血漿の抗体強度の関係」の項）
【表１】マイクロプレート４００枚を用いて試験の再現性を確認した表である。（「本試験の再現性」の項）
【表２】牛４００頭について生牛乳を用いてＱ熱菌への感染検査の結果。（実施例１）
【図１】
2004279388.tif 000002
【図２】
2004279388.tif 000003
2004279388.tif 000004
2004279388.tif 000005