(57)【要約】【課題】天然由来のジペプチドを有効成分とする医薬剤において、特に血圧上昇抑制作用を有し、安全性が高く、経口投与（摂取）で有効であり、医薬品、特定保健用食品、健康食品等に使用できる血圧降下剤及びその製造方法を提供すること。【解決手段】ジペプチドＶａｌ−Ｐｈｅ及びその塩を有効成分として含有するアンジオテンシン２変換酵素阻害剤、および、紅麹菌を製麹し、それを原料に得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーで処理することを特徴とするその製造方法、および、前記のジペプチドを生産する紅麹菌を原料として得られた抽出物又はその加工食品。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖａｌ−Ｐｈｅ配列のジペプチド及びその塩を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
紅麹菌を製麹し、それを原料に得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーで処理することにより成る請求項１に記載のジペプチドの製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のジペプチドを生産する紅麹菌を原料として得られた抽出物又はその加工食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、紅麹菌、すなわち、天然由来のジペプチドを有効成分とする医薬剤に関し、特に血圧上昇抑制作用を有する血圧上昇抑制剤及びその製造方法、及びその効果を有する医薬品、特定保健用食品、健康食品などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症の発症と高い相関性を有するアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥという）は、主に肺や血管内皮細胞に依存し、レニンにより分解されたアンジオテンシン２に作用して、血管壁平滑筋収縮作用を有する活性ペプチドであるアンジオテンシン２を産生することにより、強い血圧上昇作用を示すことが知られている。さらに、ＡＣＥは、降圧作用を有するブラジキニンを分解し、不活性化する作用を有する。
【０００３】
このように、ＡＣＥは、血圧を上昇させる作用を有するので、この酵素活性を阻害することにより血圧上昇を抑制することができると考えられている。
【０００４】
このようなＡＣＥ阻害活性を作用する物質は、既に数々の天然物や合成物において見出され、それらの物質のいくつかは降圧剤として実用化されている。
【０００５】
例えば、化学合成物質では、カプトリルが有名である。しかし、このような科学合成物は、常に安全性の問題を考慮しなければならないという問題点がある。
【０００６】
一方天然成分には、乳由来のたんぱく質、植物由来のたんぱく質あるいは、魚肉たんぱく質に、様々なＡＣＥ阻害ペプチドが含まれていることが報告されている。
【０００７】
これら天然由来のＡＣＥ阻害物質は、低毒性で安全性の高い降圧剤として実用化が検討されている。
【０００８】
近年、乳酸発酵乳からのＡＣＥ阻害剤が報告されている（Ｊ．Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．７８：７７７−７８３，７８：１２５３−１２５７）。
【０００９】
しかしながら、乳酸発酵の進行と共に、乳酸菌が産生するたんぱく質分解酵素により生じるために、発酵条件によりＡＣＥ阻害活性作用のあるトリペプチド量は変動しやすく、一定の含有量で得ることが困難である。
【００１０】
従って、血圧降下作用の原因物質が明らかで、工業的に安定した生産が可能であり、且つ微量の投与量において有効な安全性の高い天然物質由来の血圧降下ペプチドが望まれている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、安全性が高く、経口投与（摂取）で有効な天然物由来の医薬品、特定保健用食品、健康食品等に使用できる血圧降下剤及びその製造方法を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の別の目的は、前期の血圧降下剤を精製することにより、微量の経口投与（摂取）でも有効な天然物由来の血圧降下剤とその製造法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の目的を達成するために、種々の研究を重ねた結果、紅麹菌の中にアンジオテンシン変換酵素阻害物質の存在が推測され、その紅麹菌中のアンジオテンシン変換酵素阻害物質を逆相分配樹脂に吸着させ、含水有機溶媒により溶出することで、高収量に得られ、簡単に濃縮することができ、そして、得られた阻害物質中の各成分について、カラムクロマトグラフィーを用いて、阻害活性の強い成分を単離し、その成分のＩＣ５０および構造解析を行ったところ、この成分がアミノ酸配列において、Ｖａｌ−Ｐｈｅ配列のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するジペプチドであることが判明したことにより、発明を完成したものである。
【００１４】
本発明によれば、ジペプチドＶａｌ−Ｐｈｅ及びその塩を有効成分として含有するアンジオテンシン２変換酵素阻害剤が提供される。
【００１５】
また、本発明によれば、紅麹菌を製麹し、それを原料に得られた抽出物をカラムクロマトグラフィーで処理することにより成る上記のジペプチドの製造方法が提供される。
【００１６】
また、本発明によれば、上記の紅麹菌を原料として得た抽出物またはその加工食品が提供される。
【００１７】
本発明のジペプチドは、前記のアミノ酸配列で示されるものであり、Ｖａｌ−Ｐｈｅである。また、その塩としては、薬理学上、許容される塩類、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩及びクエン酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、乳酸塩等の有機酸塩などが使用できる。
【００１８】
本発明のジペプチドの調整には、紅麹菌を原料として得られる抽出物を例えば逆相液体カラムクロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記する）などの公知の方法で精製することにより得ることができる。
【００１９】
本発明の血圧降下剤は、ＡＣＥ阻害活性を示し血圧降下作用を有する前記のジペプチド及びその塩を有効成分として含有するので、人間をはじめとして、哺乳動物全般の高血圧の治療、予防に有効である。
【００２０】
本発明の血圧降下剤の投与（摂取）方法は、主に経口投与、静脈注射等で行うことができる。薬剤の形態としては、乾燥粉末とした後に錠剤、顆粒製剤、カプセル製剤等として、更には液体製剤として用いることもできる。
【００２１】
前記ジペプチド及びその塩は、それ自体を前記種々の剤形と成るように調製して使用することができるが、前記ジペプチド及びその塩は、微量でも血圧降下作用を発揮するので、前記カラムクロマトグラフィー処理により得られる精製物を、そのまま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品内に含有させて血圧降下作用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、特定保健用食品及び健康食品等として用いることができる。
【００２２】
本発明の血圧降下剤の投与量は、患者の年齢、症状により異なるが、前記ジペプチド及びその塩の含有量に換算して、０．１ｍｇ／体重ｋｇ・日以上程度が有効である。好ましくは１ｍｇ／体重ｋｇ・日前後で使用するのが望ましい。
【００２３】
【発明の実施の形態】
次に本発明の実施形態について詳細に説明する。紅麹菌は、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓＩＦＯ４４８９を用い、培養して紅麹菌を得る。
【００２４】
この麹に対して３倍溶の蒸留水を加え、室温にて１時間浸透して抽出する。抽出後、ろ過して抽出液を得る。
【００２５】
この紅麹抽出液を逆相分配系樹脂をもちいたカラム内を流通させることにより、アンジオテンシン変換酵素阻害物質を吸着させ、含水アセトニトリル等の含水有機溶媒を用いて溶出させる。
【００２６】
この溶媒により溶出を行なう際も、吸着させた前述の阻害物質の前記溶媒による溶出を効果的に行わせるために、その溶媒を供給する前に、水の供給により、水に溶解する物質を溶出させる処理を行なうことが有効である。
【００２７】
含水有機溶媒により溶出させたアンジオテンシン変換酵素阻害物質は、その溶出液を、濃縮し、凍結乾燥することで、アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主体とする高血圧予防機能を有する機能性食品、特定健康食品および健康食品などの製品が粉末の形態で得られるようになる。
【００２８】
また、このアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを主体とする食品素材は、前述の抽出液を、高速液体クロマトグラフィーを用いて成分の単離を行ない、アセトニトリルでグラジエント溶出するなどにより、アンジオテンシン変換酵素阻害の活性の強い成分に単離精製された形態のものにし得る。
【００２９】
〔実施例１〕
アンジオテンシン変換酵素阻害活性について確認した。
供試菌株として、Ｍ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ４４８９を用い、試験管培地で７日間前培養を行い、三角フラスコにて７日間固体培養して紅麹を得た。
【００３０】
この麹（６０ｇ）に対して３培溶の蒸留水（１８０ｍｌ）を加え、室温にて１時間浸透し、抽出後、ろ過して抽出液とした。
【００３１】
この紅麹抽出液をＳＥＰＡＢＥＡＤＳ　ＳＰ−８２５でエタノール濃度を０％、１０％、１５％、２０％、２５％、４０％、７０％と変化させるステップワイズ法により溶出した。
図１に見られるように、１０％エタノール画分が最も活性が高く、タンパク量も多かったため、次のステップに用いた。
【００３２】
１０％エタノール画分をｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラムに通したところ、図２に示されるような溶出パターンが得られた。それぞれのピークを▲１▼〜▲５▼とし、活性測定とタンパク定量を行った結果、▲４▼で最も高い阻害活性を示した（図３）。タンパク量は少なかったが、活性が高かった▲４▼の画分を次の逆相ＨＰＬＣに用いた。
【００３３】
逆相ＨＰＬＣは、アセトニトリル（０．０５％ＴＦＡを含む）を１分間に１％上昇させるリニアグラジェントで行った。
【００３４】
この結果、多くのピークが得られた（図４）。各ピークを分取し、活性測定を行った結果、ピーク１８で高い活性が見られた（図５）。ピーク１８は、再クロマトを行い、ＨＰＬＣによって均一な物質として確かめられた（図６）ので、プロテインシケンサーを用いてアミノ酸配列を決定した。ピーク１８のアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ｐｈｅと同定された。
【００３５】
なお、この実施例ににおけるアンジオテンシン変換酵素阻害率の測定は、公知のアンジオテンシン変換酵素阻害活性測定法（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ　の測定法を改良した山本等の方法）によって測定した。また、以下の式に従い、阻害活性（％）を求めた。ＩＣ５０値は、阻害物質がＡＣＥを５０％阻害するときの値である。
【００３６】
阻害率（％）＝｛（Ｃ−ＣＢ）／（Ｓ−ＳＢ）｝／（Ｃ−ＣＢ）
Ｃ，Ｓ；コントロール、サンプルの吸光値
ＣＢ，ＳＢ；コントロールブランク、サンプルブランクの吸光値
【００３７】
〔実施例２〕
アンジオテンシン変換酵素阻害ジペプチドを精製した。
【００３８】
紅麹菌３ｋｇを原料とし、その３倍溶の蒸留水９リットルを加え、２時間浸透して抽出させ、ろ過して抽出液を得た。
【００３９】
この抽出液を逆相カラムクロマトグラフィーに供給し、吸着を行わせ、次いで３リットルの含水アセトニトリルにてアンジオテンシン変換酵素阻害ペプチドを溶出させた。ここで用いた逆相樹脂はコスモシール５Ｃ１８−ＡＲ３００（ナカライテスク社製）を用いた。
【００４０】
〔実施例３〕
実施例１で得た抽出液５０ｃｃに、ラクトース　９０ｇと、コーンスターチ　１７ｇとを混合し、この混合物を予めコーンスターチ７ｇから調整したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒にステアリン酸マグネシウム　１ｇを加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１錠あたりアンジオテンシン変換酵素阻害作用成分を５０ｍｇ含有する錠剤１０００個を製造した。
【００４１】
〔実施例４〕
実施例１で得た抽出液の２０％水溶液２００ｇ、酢酸トコフェロール５ｇ、硝酸チアミン１０ｇ、ニコチン酸アミド２０ｇ、無水カフェイン５０ｇ、安息香酸塩及び香料適量に脱イオン水を加えて３０Ｌとし、殺菌した後３０ｍｌずつ無菌的にビンに充填して、内用液剤を製造した。
【００４２】
【発明の効果】
本発明のＶａｌ−Ｐｈｅ配列のジペプチド及びその塩は、ＡＣＥ阻害作用を有する血圧降下剤等として利用可能な安全性が高く、副作用のない新規なペプチドであり、種々の医薬品、特定保健用食品、機能性食品等への利用が期待できる。
【００４３】
また本発明による血圧上昇抑制剤は、前記ジペプチド及びその塩を有効成分として含有するので、ヒト並びに哺乳動物の血圧を有効に降下させることができる。
【００４４】
また有効成分であるジペプチドは、紅麹菌を原料としており、培養により容易にしかも安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】紅麹抽出液の溶出エタノール濃度によるＡＣＥ活性とタンパク量の比較表を示す図である。
【図２】１０％エタノール画分の溶出パターンを示すクロマトグラフの図である。
【図３】１０％エタノール画分の溶出パターンにおけるピーク時のＡＣＥ活性とタンパク量の比較表を示す図である。
【図４】逆相ＨＰＬＣ結果のクロマトグラフを示す図である。
【図５】逆相ＨＰＬＣ結果における各ピーク時のＡＣＥ活性を示す図である。
【図６】ピーク１８の再クロマト結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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