(57)【要約】【課題】培養中の細胞の数をリアルタイムに繰り返し測定できる生細胞数測定方法、及び同方法を用いた細胞培養装置を提供すること。【解決手段】細胞培養モジュールに培地を供給することによって細胞の培養を行うとともに、培養途中で細胞培養モジュールに培地を供給する培養流路から細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行う測定流路に流路を切替えて、生細胞数の測定を行うことにした。【選択図】      図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養モジュールに培地を供給することによって細胞の培養を行うとともに、培養途中で細胞培養モジュールに培地を供給する培養流路から細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行う測定流路に流路を切替えて、生細胞数の測定を行うことを特徴とする生細胞数測定方法。
【請求項２】
前記メディエータとしてベンゾキノン類を用いることを特徴とする請求項１に記載の生細胞数測定方法。
【請求項３】
細胞培養モジュールに培地を供給して細胞の培養を行うための培養流路と、細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行うための測定流路とを、流路切替え手段によって流路を切替えられるように構成したことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
前記メディエータとしてベンゾキノン類を用いることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生細胞数測定方法及び同方法を用いた細胞培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
動物細胞の培養方法には、液体培地を培地循環ポンプによって循環させて培養流路を形成し、同培養流路上に細胞培養床を備えた細胞培養モジュールを配設して、同細胞培養モジュール中の動物細胞を連続的に培養する灌流培養がある（特許文献１。）。
【０００３】
上記灌流培養は、細胞培養モジュールに供給する培地を循環させることにより細胞培養モジュール中の動物細胞を連続的に培養可能としていることから、バイオリアクターに好適に用いられている。このバイオリアクターにおいては、動物細胞による物質生産を調整する目的などのために、細胞培養モジュールにおいて培養されている動物細胞のうち生理活性のある細胞の数（以下、生細胞数ともいう。）を測定して、同細胞の数を制御する必要があるが、従来の生細胞数の測定方法では、測定に用いた動物細胞を死滅させることなくリアルタイムに生細胞数を測定することができなかった。
【０００４】
例えば、従来の生細胞数の測定方法として、ＡＴＰ測定法、ＭＴＴ還元法、１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ／ＷＳＴ還元法などがある。特に、ＡＴＰ測定法は菌数測定法として最も普及しているが、ＡＴＰの抽出や酵素調製などの煩雑な操作を必要とする。また、ＭＴＴ還元法及び１−Ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＭＳ／ＷＳＴ−８還元法は主に動物細胞数の測定に用いられているが、反応に２〜４時間を要する。従って、これらの方法では、バイオリアクターにおける動物細胞の生細胞数をリアルタイムに測定することはできなかった。
【０００５】
また、他の生細胞数の測定方法として、ナフトキノン類を動物細胞に作用させ、その際生じる過酸化水素を発光反応に導いて測定する方法、或いは酵素法により分光学的に測定する方法が開発されている（例えば、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９など。）。この方法は操作が簡便であるため、バッチ系における実用性が高いと思われる。しかし、この方法はナフトキノン類が動物細胞により代謝されている間に活性酸素種が常に生成するため、動物細胞は常に酸化ストレスを受ける。このため、１度測定に供した動物細胞は死滅する。従って、バイオリアクターのように動物細胞を繰り返し利用する場合には、適用することができなかった。
【０００６】
また、バッチ系における生細胞数の測定方法として、酵母細胞或いはトリプシン処理して一時的に浮遊状態にした接着性動物細胞などにキノン類を作用させ、生じた過酸化水素或いはヒドロキノンを固体電極でモニターすることにより細胞数或いは活性を測定する方法が報告されている（例えば、特許文献１０、非特許文献１、非特許文献２など。）。しかし、いずれの方法もキノンを作用させた後に測定対象の生細胞を再利用することは考慮されておらず、バイオリアクターのように動物細胞を繰り返し利用する場合には、適用することができなかった。
【０００７】
また、バイオリアクターにおいて生細胞数をオンラインで測定する方法として、誘電率変化を利用した方法がある（例えば、特許文献１１、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５など。）。細胞は電解液を脂質膜で覆った一種のコロイド（油の粒子）とみなせるため、生細胞が存在すると大きな誘電率が生じる。この方法は誘電率の変化を指標として細胞数を算出する手法である。しかし、既存の誘電測定法は回分培養系における浮遊性細胞やビーズに固定化した付着性細胞の測定にしか適用できず、灌流培養における付着性細胞の測定は不可能であった。また、高価な装置が必要なこと、培地成分の影響を大きく受けることなどの問題点があった。
【０００８】
また、他の生細胞数の測定方法として、多孔質担体（マイクロキャリアービーズ）に付着した動物細胞数をオフラインで測定する方法が開発されている（例えば、非特許文献６、非特許文献７など。）。しかし、これらの方法は、マイクロキャリアービーズに付着した動物細胞から高張液を用いて核を抽出し、色素染色で測定する方法、或いはトリプシン処理することで動物細胞を担体より剥がし、ＭＴＴ発色させて測定する方法をとっているため、動物細胞は死滅してしまう。従って、バイオリアクターのように動物細胞を繰り返し利用する場合には、適用することができなかった。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００３−４７４６１号公報
【特許文献２】
特許第１９０５１２９号公報
【特許文献３】
特開平２−２７６５９４号公報
【特許文献４】
特許第１９０５１２９号公報
【特許文献５】
特開平３−２２８６９７号公報
【特許文献６】
特開平２−２７６５９号公報
【特許文献７】
特許第２８８３１４９号公報
【特許文献８】
特開平５−２９２９９８号公報
【特許文献９】
特許第２８４９７９８号公報
【特許文献１０】
特開平８−２４２８８５号公報
【非特許文献１】
三木、外，「電気化学」，１９９４年，第１２巻，ｐ．１２４９−１２５０
【非特許文献２】
Ｃ．ロセッティ（Ｃ．  Ｒｏｓｓｅｔｔｉ）、外，「ライフ・ケミストリー・レポート（Ｌｉｆｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔ）」，（英国），１９９４年，第１０巻，ｐ．２０９−２１５
【特許文献１１】
特開平８−２１１０２１号公報
【非特許文献３】
ドゥコマン（Ｄｕｃｏｍｍｕｎ）、外，「バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」，（米国），２００２年，第７７巻，ｐ．３１６−３２３
【非特許文献４】
サーケル（Ｃｅｒｃｋｅｌ）、外，「サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（オランダ），１９９３年，第１３巻，ｐ．１８５−１９３
【非特許文献５】
デゴイス（Ｄｅｇｏｕｙｓ）、外，「サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（オランダ），１９９３年，第１３巻，ｐ．１９５−２０２
【非特許文献６】
安田公昭著（小林猛編），「バイオリアクターの世界」，株式会社ハリオ研究，１９９２年，ｐ．７３
【非特許文献７】
マージス（Ｍａｒｇｉｓ）、外，「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ  ｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，（米国），１９８９年，第１８１巻，ｐ．２０９−２１１
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、従来からの生細胞数の測定方法は、灌流培養されている動物細胞のその時点における生細胞数を、動物細胞を死滅させることなくリアルタイムに測定することができず、バイオリアクターのように培養中の動物細胞を繰り返し利用する場合においては、その方法を適用することができなかった。
【００１１】
本発明は、上記問題点を解決して、測定に用いた動物細胞を死滅させることなく灌流培養中の動物細胞の生細胞数をリアルタイムに測定できる新規な生細胞数の測定方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
そこで、請求項１記載の本発明では、細胞培養モジュールに培地を供給することによって細胞の培養を行うとともに、培養途中で細胞培養モジュールに培地を供給する培養流路から細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行う測定流路に流路を切替えて、生細胞数の測定を行うことにした。
【００１３】
また、請求項２記載の本発明では、前記メディエータとしてベンゾキノン類を用いることにした。
【００１４】
また、請求項３記載の本発明では、細胞培養装置において、細胞培養モジュールに培地を供給して細胞の培養を行うための培養流路と、細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行うための測定流路とを、流路切替え手段によって流路を切替えられるように構成した。
【００１５】
また、請求項４記載の本発明では、前記細胞培養装置におけるメディエータとしてベンゾキノン類を用いた。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本実施の形態では、細胞の培養途中で細胞を死滅させることなく生細胞数を測定するために、細胞培養モジュールに培地を供給して細胞の培養を行うための培養流路と、細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行うための測定流路とをそれぞれ設けて、両流路を流路切替え手段によって自在に切替えられるようにしている。そして、培養時と測定時とで両流路を切り替えることにより、培養時には培養流路上に細胞培養モジュールが位置し、測定時には測定流路上に細胞培養モジュールが位置するようにしている。なお、前記細胞培養モジュールは、アパタイトシートなどからなる細胞培養床を備えており、培養中の細胞を保持することができる。
【００１７】
このように、本実施の形態では、細胞を培養するための流路とは別に、測定専用の流路を設けているので、細胞数を測定する際には、細胞培養モジュールを培養流路から取り外したりしなくても、培養流路から測定流路へと流路を切り替えるだけで測定を開始することができ、ある一定時点における細胞培養モジュール中の生細胞の数を、リアルタイムに測定することができる。
【００１８】
しかも、測定終了後には、測定流路から培養流路へと流路を戻すだけで細胞の培養を再開することができ、測定にメディエータなどの試薬を使用しても、同試薬を測定流路内で完全に洗い流した後に培養流路へと流路を切り替えて、培養流路内に試薬が蓄積しないようにすることができる。従って、培養中の細胞を傷めることなく測定と培養とを繰り返し行うことができる。
【００１９】
前記測定流路における生細胞数の測定は、細胞培養モジュールに保持した細胞にメディエータを供給することにより、同メディエータを細胞が代謝して、酸化型のメディエータから還元型のメディエータへと変化させる反応を利用している。
【００２０】
ここで、細胞に供給する酸化型メディエータをベンゾキノン類として生細胞数の測定の原理を説明すると、図１に示すように、細胞培養モジュールに保持されている細胞にベンゾキノン類を作用させれば、同ベンゾキノン類は、エネルギー代謝によって生じるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、或いはそのリン酸化合物（ＮＡＤＰＨ）をもう１つの基質として、細胞膜内及び細胞質に存在するＤＴ−ジアホラーゼにより還元され、還元型メディエータであるヒドロキノンに変化する。このヒドロキノンを固体電極（グラッシーカーボン電極）による定電位電流計測法で検出することにより酸化電流値を得ることができる。この酸化電流値は、細胞培養モジュールに保持されている生細胞の数の多少と相関性があるため、酸化電流値が分かれば細胞培養モジュールに保持されている生細胞の数を算出することができる。
【００２１】
図３には、酸化電流値と生細胞数との相関関係を示している。すなわち、図３には、細胞数の異なるＣＨＯ−Ｋ１細胞をそれぞれディッシュで培養すると共に、各培養上清に最終濃度２０μＭの２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンを添加し、さらに１０分間放置して、３電極を用いた定電位電流計測により酸化電流値を測定した結果を示している。なお、定電位電流計測では、作用電極にグラッシーカーボン、参照電極に銀／塩化銀、対極にＰｔを用いて、作用電極に＋３１０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加している。
【００２２】
図３に示すように、生細胞数と酸化電流値との間には２．３×１０５〜２．７×１０６個の範囲で直線性が得られ、生細胞数の増加に比例して酸化電流値も増加することが確認できる。従って、この生細胞数と酸化電流値との相関性を利用することにより、前述したように細胞培養モジュールに保持されている生細胞の数を酸化電流値から算出することができる。
【００２３】
上記において酸化型メディエータとして例に挙げたベンゾキノン類は、細胞の代謝によってヒドロキノンとなった後もｐＨ中性付近では溶存酸素存在下で比較的安定に存在し、ナフトヒドロキノンなどのように直ちに酸化されて活性酸素種が発生することがない。従って、ベンゾキノン類を酸化型メディエータとして用いれば、培養中の生細胞に酸化ストレスを与えることなく酸化電流値の測定を行うことができる。以下に、ベンゾキノン類の化学構造式を示す。
【００２４】
【化１】
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【００２５】
上記化１に示すベンゾキノンにおいて、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６の４つの置換基のうち少なくとも２つがメチル基であることが好ましい。かかる構造のベンゾキノンとしては、例えば２，３−、２，５−、２．６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンや、２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンなどが挙げられ、中でも、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンや２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンは、細胞による代謝効率が良く、細胞毒性も非常に低く、さらには、還元型であるヒドロキノンが比較的安定していて、ナフトヒドロキノンなどとは異なり測定時においても電極モジュールに到達するまでの間に酸化されることがなく、溶存酸素存在下でも高感度な測定を行うことができる。従って、酸化型メディエータとして特に好適に用いることができる。
【００２６】
図４には、上記２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンと２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンの細胞毒性を、２−メチル−１，４−ナフトキノンを対照として測定した結果を示している。ここでは、９６ウェルプレートに対数増殖期にあるＣＨＯ−Ｋ１細胞を培養し、その培養上清に種々の濃度のキノン類を添加した際の細胞毒性を調べており、同キノン類を添加して２４時間後の細胞の生存率を生細胞数カウントキット（ＷＳＴ）を用いた発色法により測定している。
【００２７】
図４から分かる通り、ベンゾキノン類は２０μＭ濃度レベルでは２４時間接触させてもほとんど毒性は生じなかったのに対し、２−メチル−１，４−ナフトキノンは、２０μＭ濃度レベルでも細胞が死滅している。これは、２−メチル−１，４−ナフトキノンにおいては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞による代謝産物のナフトヒドロキノンが迅速に酸化されて、それに伴う活性酸素種が細胞に酸化ストレスを与えることに起因する。
【００２８】
このことから、ベンゾキノン類は、２０μＭ以下の濃度レベルであれば、２４時間動物細胞に接触させてもほとんど毒性は生じず、酸化型メディエータとして好適に使用できることが分かる。
【００２９】
なお、酸化型メディエータとしては、上記ベンゾキノン類の他にも、細胞毒性の低いフェリシアン化カリウムや、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールなどのインドフェノール類や、フェナジンメトサルフェートなどのフェナジン類を用いることができる。
【００３０】
また、測定流路には上記メディエータだけでなく培地も供給できるようにするのが望ましく、測定前、測定時、測定後に測定流路で細胞培養モジュールに上記メディエータと共に又は別々に培地を供給できるようにするのが望ましい。これは、測定流路においても細胞培養モジュール中の細胞を安全に生息させるためである。
【００３１】
すなわち、測定前に測定流路上の細胞培養モジュールに培地を供給することによって、流路切り替えによって一時的に培地の供給が停止して細胞が死滅又は不活性化するのを防止することができる。
【００３２】
また、測定時に測定流路上の細胞培養モジュールに培地を供給することによって、測定中に培地不足で細胞が死滅又は不活性化するのを防止することができる。
【００３３】
また、測定後に測定流路上の細胞培養モジュールに培地を供給することによって、培地不足で細胞が死滅又は不活性化するのを防止すると共に、メディエータの濃度を迅速に低減させ、メディエータによる悪影響を防止することができる。
【００３４】
ここで、本実施の形態において培養中の細胞の数を測定する場合の生細胞数測定方法と、同測定方法を用いた細胞培養装置とをより具体的に説明する。
【００３５】
本実施の形態では、図２に示す細胞培養装置Ａによって細胞の培養と生細胞数の測定とを両方行うようにしており、同細胞培養装置Ａは、細胞の灌流培養を行うための培養流路１と、同培養流路１で培養されている細胞のうち、生理活性のある細胞数（生細胞数）を測定する測定流路２とを具備する。
【００３６】
培養流路１は、細胞培養床を備えた細胞培養モジュール３と、同細胞培養モジュール３で使用する液体培地を収容した培地瓶４と、同培地瓶４内の液体培地を細胞培養モジュール３へと送液する培地送液ポンプ５とを送液配管６を介して連通連結しており、培養流路１内で液体培地を循環させるようにしている。
【００３７】
前記細胞培養モジュール３の細胞培養床は、アパタイトシートからなり、高密度での長期間の細胞培養を可能としている。
【００３８】
培地瓶４は、内部にガス交換用チューブ７を備えており、同ガス交換用チューブ７をガス交換機８に連通連結して、液体培地のガス濃度を調整するようにしている。図中、９は液体培地へ供給する酸素及び二酸化炭素を貯蔵したガス交換機８のボンベ部であり、１０は前記ボンベ部９から液体培地に供給するガス量を調整するガス交換機８の制御部である。
【００３９】
測定流路２は、前記培養流路１の細胞培養モジュール３を挟んで、上流側に酸化型メディエータ送給機構１１を設けると共に、下流側に還元型メディエータ測定機構１２を設けており、それぞれを送液配管６を介して連通連結して、測定用のメディエータが、酸化型メディエータ送給機構１１、細胞培養モジュール３、還元型メディエータ測定機構１２と続く測定流路２上を流れるようにしている。
【００４０】
しかも、酸化型メディエータ送給機構１１と細胞培養モジュール３との間、及び細胞培養モジュール３と還元型メディエータ測定機構１２との間には三方弁からなる流路切替え手段としての第１・第２切替バルブ１３，１４をそれぞれ設けており、同第１・第２切替バルブ１３，１４を切り替えることによって、測定流路２と前記培養流路１とを切り替えるようにしている。
【００４１】
すなわち、細胞培養モジュール３と第１・第２切替バルブ１３，１４との間を連絡する送液配管６が、測定流路２と培養流路１との両方を兼ねる共用部６ａとなるようにしており、第１・第２切替バルブ１３，１４の三方弁を図２に示すようにそれぞれ弁ａ、弁ｂ、弁ｃとすると、両切替バルブ１３，１４の弁ａと弁ｃを連通させたときには前記共用部６ａが測定流路２となり、両切替バルブ１３，１４の弁ｂと弁ｃを連通させたときには前記共用部６ａが培養流路１となるようにしている。
【００４２】
酸化型メディエータ送給機構１１は、液体培地或いは酸化型メディエータを収容した第１メディエータ瓶１５を最上流に設けると共に、その下流に第１メディエータ送液ポンプ１６を設けて、第１メディエータ瓶１５の内部の液体を測定流路２に送液するようにしている。
【００４３】
しかも、第１メディエータ送液ポンプ１６の下流には、酸化型メディエータを所定量ずつ測定流路２に注入するためのインジェクター１７を設けており、同インジェクター１７によっても酸化型メディエータを測定流路２に送液できるようにしている。
【００４４】
なお、前記インジェクター１７への酸化型メディエータの供給、及びインジェクター１７からの酸化型メディエータの回収は、測定流路２とは別に設けたインジェクター用流路１８を介して行っており、同インジェクター用流路１８には、インジェクター１７よりも上流側に、酸化型メディエータを収容した第２メディエータ瓶１９と、同第２メディエータ瓶１９からインジェクター１７へと酸化型メディエータを送液する第２メディエータ送液ポンプ２０を設けると共に、インジェクター１７よりも下流側に、インジェクター１７から排出された酸化型メディエータを収容可能な第１廃液瓶２１を設けている。
【００４５】
還元型メディエータ測定機構１２は、細胞の代謝により酸化型から還元型となったメディエータの酸化電流値を測定するフロースルー型電極２２を設けると共に、同フロースルー型電極２２よりも下流側に測定流路２内の液体を収容可能な第２廃液瓶２３を設けて、測定に使用されたメディエータを回収するようにしている。図中、２４はフロースルー型電極２２のポテンシオスタットである。
【００４６】
上記構成からなる細胞培養装置Ａにおいて細胞培養モジュール３中の生理活性のある細胞数（生細胞数）を測定する場合には、以下の２つの方法で測定を行うことができる。
【００４７】
１番目は、第１メディエータ瓶１５の内部に液体培地を収容して、同液体培地をキャリアー溶液として測定流路２上に連続送液すると共に、インジェクター１７により細胞培養モジュール３の上流から酸化型メディエータを注入し、細胞の代謝によって生成された還元型メディエータをフロースルー型電極２２によりモニターする方法である。この場合、還元型メディエータを流速１．０〜１．５ｍｌ／ｍｉｎで細胞培養モジュール３中に通過させることで、細胞培養モジュール３の細胞培養床に付着した細胞数に比例した応答電流ピークが得られる。
【００４８】
２番目は、第１メディエータ瓶１５の内部に酸化型メディエータを含有するメディエータ含有液を収容して、同メディエータ含有液をキャリアー溶液として測定流路２上に連続送液し、細胞の代謝によって生成された還元型メディエータをフロースルー型電極２２によりモニターする方法である。この場合、インジェクター１７は使用せず、メディエータ含有液を流速１．０〜１．５ｍｌ／ｍｉｎで細胞培養モジュール３中に通過させることで、細胞培養モジュール３の細胞培養床に付着した細胞数に比例した連続応答電流が得られる。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を図面に基づき説明する。
【００５０】
（第１実施例）
本実施例では、図２に示す細胞培養装置Ａを用いてＩ−１３細胞の連続培養を行った。灌流培養中は、細胞培養モジュール３を挟んで上下流に位置する第１・第２切替バルブ１３，１４の弁ｂと弁ｃをそれぞれ連通させて、細胞培養モジュール３を培養流路１上に位置させた。そして、液体培地にはＤＭＥＭ培地（５％ＦＢＳ含有）を用い、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、流速１０ｍｌ／ｍｉｎで灌流培養を行った。
【００５１】
上記灌流培養の途中で細胞数の測定を行う場合には、前記第１・第２切替バルブ１３，１４の弁ａと弁ｃをそれぞれ連通させて、細胞培養モジュール３を培養流路１上から測定流路２上へと移行させた。そして、測定流路２へ移した細胞培養モジュール３に第１メディエータ瓶１５に収容したＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を数分送液した後、第１メディエータ瓶１５の収容物をＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）から２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に変えて、同ベンゾキノンを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を細胞培養モジュール３の上流から一定時間連続送液した。
【００５２】
測定終了後には、第１メディエータ瓶１５の収容物を再びＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）に戻して、同ＤＭＥＭ培地（２％ＦＢＳ含有）を数分送液し、測定流路２上に残留する２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンを洗い流した。その後、第１・第２切替バルブ１３，１４の弁ｂと弁ｃをそれぞれ連通させることにより、測定流路２上の細胞培養モジュール３を再び培養流路１上へと移行させて、灌流培養を継続した。
【００５３】
上述したように、本実施例では、細胞の灌流培養を行う培養流路１と、培養されている細胞の数を測定する測定流路２とを使い分けて、測定に用いたメディエータが培養流路１内に混入しないようにすると共に、前記メディエータとして細胞毒性が非常に低いベンゾキノン類を用いたので、細胞培養床に付着した細胞の数をオンラインで繰り返し測定することが可能となり、効率的な細胞の培養や物質生産を行うことができる。
【００５４】
（第２実施例）
本実施例では、図２に示す細胞培養装置Ａを用いて細胞培養モジュール３に保持したＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞数の測定を行った。測定中は、細胞培養モジュール３を挟んで上下流に位置する第１・第２切替バルブ１３，１４の弁ａと弁ｃをそれぞれ連通させて、細胞培養モジュール３を測定流路２上に位置させた。そして、第１メディエータ瓶１５に収容したＦ−１２培地（５％ＦＢＳ含有）をキャリアー溶液として送液配管６（内径１ｍｍ）中に送液すると共に、第２メディエータ瓶１９に収容した２０μＭ濃度の２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンを細胞培養モジュール３よりも上流に位置するインジェクター１７により送液配管６へと注入した。
【００５５】
注入された２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンは、第１メディエータ送液ポンプ１６による液体培地の流れに押されて流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで細胞培養モジュール３に到達し、保持されている動物細胞により代謝を受けるので、この動物細胞の代謝により生成されたヒドロキノンを細胞培養モジュール３よりも下流に位置するフロースルー型電極２２でさらに酸化して、その際に得られる電流ピークをモニターした。なお、フロースルー型電極２２における作用電極にはグラッシーカーボン、参照電極には銀／塩化銀、対極にはＰｔを用い、作用電極には＋３１０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加した。
【００５６】
２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノンを連続して送液配管６に注入して測定を行ったが、図５に示すように、ピークの面積にはほとんど変わらない再現性があった。また、ブランクとして細胞を全く保持していない細胞培養モジュール３の測定も行ったが応答ピークは得らなかった。
【００５７】
さらに、細胞培養モジュール３の細胞培養床を静置培養期間の異なるＣＨＯ−Ｋ１細胞を付着させた細胞培養床に変えて同様に測定を行ったところ、図６に示すように、細胞数に比例したピーク面積が得られた。
【００５８】
このことから、上述した細胞培養装置Ａを用いれば、細胞培養モジュール３に保持した動物細胞の生細胞数を正確に測定できることが分かる。
【００５９】
（第３実施例）
本実施例では、図２に示す細胞培養装置Ａを用いて細胞培養モジュール３に保持したＩ−１３細胞の細胞数の測定を行った。測定中は、細胞培養モジュール３を挟んで上下流に位置する第１・第２切替バルブ１３，１４の弁ａと弁ｃをそれぞれ連通させて、細胞培養モジュール３を測定流路２上に位置させた。そして、第１メディエータ瓶１５に収容した１０μＭ濃度の２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を細胞培養モジュール３よりも上流から送液配管６（内径１ｍｍ）へと一定時間連続送液した。このように、本実施例では、インジェクター１７を使用せず、予めメディエータを混合したキャリアー溶液を測定流路２上に送液した。
【００６０】
注入された２，３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンは、第１メディエータ送液ポンプ１６による流れに押されて流速１．３ｍｌ／ｍｉｎで細胞培養モジュール３に到達し、保持されている動物細胞により代謝を受けるので、この動物細胞の代謝により生成されたヒドロキノンを細胞培養モジュール３よりも下流に位置するフロースルー型電極２２でさらに酸化して、その際に得られる電流ピークをモニターした。なお、フロースルー型電極２２における作用電極にはグラッシーカーボン、参照電極には銀／塩化銀、対極にはＰｔを用い、作用電極には＋２５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電位を印加した。
【００６１】
２，  ３，５−トリメチル−１，４−ベンゾキノンを連続送液することで、図７に示すように、培養期間に応じた酸化電流シグナルが得られた。このことから、上述した細胞培養装置Ａを用いれば、細胞培養モジュール３に保持した動物細胞の生細胞数を正確に測定できることが分かる。
【００６２】
【発明の効果】
本発明は上記のような形態で実施されるもので、以下の効果を奏する。
（１）請求項１記載の本発明では、細胞培養モジュールに培地を供給することによって細胞の培養を行うとともに、培養途中で細胞培養モジュールに培地を供給する培養流路から細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行う測定流路に流路を切替えて、生細胞数の測定を行うことにしたので、細胞数を測定する際には、細胞培養モジュールを培養流路から取り外したりしなくても、培養流路から測定流路へと流路を切り替えるだけで測定を開始することができ、ある一定時点における細胞培養モジュール中の生細胞の数を、リアルタイムに測定することができる。しかも、測定終了後には、測定流路から培養流路へと流路を戻すだけで細胞の培養を再開することができ、測定にメディエータなどの試薬を使用しても、同試薬を測定流路内で完全に洗い流した後に培養流路へと流路を切り替えることにより、培養流路内に試薬が蓄積するのを防ぐことができる。従って、培養中の細胞を傷めることなく測定と培養とを繰り返し行うことができる。
（２）請求項２記載の本発明では、前記メディエータとしてベンゾキノン類を用いることにしたので、細胞培養モジュールに保持している細胞を死滅させることなく細胞数の測定を繰り返し行うことができる。
（３）請求項３記載の本発明では、細胞培養モジュールに培地を供給して細胞の培養を行うための培養流路と、細胞培養モジュールにメディエータを供給して同メディエータの還元によって生細胞数の測定を行うための測定流路とを、流路切替え手段によって流路を切替えられるように構成したので、細胞数を測定する際には、細胞培養モジュールを培養流路から取り外したりしなくても、培養流路から測定流路へと流路を切り替えるだけで測定を開始することができ、ある一定時点における細胞培養モジュール中の生細胞の数を、リアルタイムに測定することができる。しかも、測定終了後には、測定流路から培養流路へと流路を戻すだけで細胞の培養を再開することができ、測定にメディエータなどの試薬を使用しても、同試薬を測定流路内で完全に洗い流した後に培養流路へと流路を切り替えることにより、培養流路内に試薬が蓄積するのを防ぐことができる。従って、培養中の細胞を傷めることなく測定と培養とを繰り返し行うことができる。
（４）請求項４記載の本発明では、前記メディエータとしてベンゾキノン類を用いたので、細胞培養モジュールに保持している細胞を死滅させることなく細胞数の測定を繰り返し行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞数の測定原理の説明図である。
【図２】本発明に係る細胞培養装置の一実施例を示す模式図である。
【図３】細胞数と応答電流値との相関関係を示す説明図である。
【図４】キノン類の細胞毒性の説明図である。
【図５】ベンゾキノン類の連続注入による応答電流ピークを示す説明図である。
【図６】細胞数と応答電流値との相関関係を示す説明図である。
【図７】キノンの連続送液による応答電流シグナルを示す説明図である。
【符号の説明】
Ａ  細胞培養装置
ａ  弁
ｂ  弁
ｃ  弁
１  培養流路
２  測定流路
３  細胞培養モジュール
４  培地瓶
５  培地送液ポンプ
６  送液配管
６ａ  共用部
７  ガス交換用チューブ
８  ガス交換機
９  ボンベ部
１０  制御部
１１  酸化型メディエータ送給機構
１２  還元型メディエータ測定機構
１３  第１切替バルブ
１４  第２切替バルブ
１５  第１メディエータ瓶
１６  第１メディエータ送液ポンプ
１７  インジェクター
１８  インジェクター用流路
１９  第２メディエータ瓶
２０  第２メディエータ送液ポンプ
２１  第１廃液瓶
２２  フロースルー型電極
２３  第２廃液瓶
２４  ポテンシオスタット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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