(57)【要約】　　　（修正有）【課題】体重増加抑制剤、そのスクリーニング法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列（２３個アミノ酸）を含有するポリペプチド、そのアミド又はエステル又はその塩を含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加剤、摂食抑制剤。前記ポリペプチド等は、体重増加抑制剤などのスクリーニングなどにも有用である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる体重増加抑制剤。
【請求項２】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる体重減少剤。
【請求項３】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる脂肪量増加抑制剤。
【請求項４】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる摂食抑制剤。
【請求項５】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
さらに、配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング用キット。
【請求項８】
さらに、配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する請求項７記載のスクリーニング用キット。
【請求項９】
請求項５記載のスクリーニング方法または請求項７記載のスクリーニング用キットを用いて得られる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤。
【請求項１０】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を有する化合物またはその塩を含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤。
【請求項１１】
配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤。
【請求項１２】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤。
【請求項１３】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング用キット。
【請求項１５】
請求項１３記載のスクリーニング方法または請求項１４記載のスクリーニング用キットを用いて得られる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤。
【請求項１６】
配列番号：１４９で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項１７】
標識された請求項１６記載のポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１６記載のポリペプチドを用いる請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
（ｉ）請求項１７記載のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる請求項６記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
（ｉ）請求項１７記載のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号：４または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる請求項１９記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
請求項１７記載のポリペプチドおよび配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる請求項２０記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
哺乳動物に対して、（１）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（２）上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を有する化合物またはその塩、または（３）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストの有効量を投与することを特徴とする体重増加抑制方法、体重減少方法、脂肪量増加抑制方法または摂食抑制方法。
【請求項２３】
体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤を製造するための（１）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（２）上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を有する化合物またはその塩、または（３）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
糖尿病をはじめとする生活習慣病の増加は、ＰＰＡＲγなどのいわゆる倹約遺伝子に代表される飢餓状態に備えて脂肪を蓄積する方向性をもった生体機能が、現代の高脂肪食を中心とした食生活または運動不足といった生活環境に適応できなくなっていることが主な原因されている。その結果としての肥満は、糖尿病の原因となるだけでなく、高血圧などのリスクファクターともなるため、副作用の少ない安全な抗肥満薬の開発は、多くの生活習慣病の発症を防ぐことに繋がり、医療経済的に最も要求度の高いものの一つである。こうした抗肥満薬として、現在、カテコラミン・セロトニン再取り込み阻害剤であるｓｉｂｕｔｒａｍｉｎｅおよび脂肪吸収阻害剤であるｏｒｌｉｓｔａｔが使用されている。この他、熱産生促進薬のβ３アゴニスト、中枢性摂食抑制薬ニューロペプチドＹアンタゴニスト、メラノコルチン受容体サブタイプ４アゴニストなどが開発あるいは研究途上にある（Ｊ．　Ｃ．　Ｃｌａｐｈａｍら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｔｈｅｒ．、８９巻、８１−１２１頁、２００１年、Ｍ．　Ｃｈｉｅｓｉら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｓｃｉ．、２２巻、２４７−５４頁、２００１年）。
【非特許文献１】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　２８巻，８４−９１頁，１９９５年
【特許文献１】
ＷＯ　０１／９８４９４号公報
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、さらに新たなメカニズムに基づく作用の強力で副作用の少ない安全な体重増加抑制剤、体重減少剤の開発が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者たちは上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＧＰＲ８（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　２８巻，８４−９１頁，１９９５年）と結合する内因性リガンド（ＷＯ　０１／９８４９４号公報）が体重増加抑制活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる体重増加抑制剤、
（２）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる体重減少剤、
（３）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる脂肪量増加抑制剤、
（４）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる摂食抑制剤、
（５）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング方法、
（６）　さらに、配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（５）記載のスクリーニング方法、
（７）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング用キット、
（８）　さらに、配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上記（７）記載のスクリーニング用キット、
（９）　上記（５）記載のスクリーニング方法または上記（７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤、
（１０）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を有する化合物またはその塩を含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤、
（１１）　配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストを含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤、
（１２）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有してなる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤、
（１３）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを用いることを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング方法、
（１４）　配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含有することを特徴とする体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤のスクリーニング用キット、
（１５）　上記（１３）記載のスクリーニング方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤、
（１６）　配列番号：１４９で表されるアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド、
（１７）　標識された上記（１６）記載のポリペプチド、
（１８）　上記（１６）記載のポリペプチドを用いる上記（５）記載のスクリーニング方法、
（１９）　（ｉ）上記（１７）記載のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（６）記載のスクリーニング方法、
（２０）　（ｉ）上記（１７）記載のポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号：４または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（１９）記載のスクリーニング方法、
（２１）　上記（１７）記載のポリペプチドおよび配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記（２０）記載のスクリーニング方法、
（２２）　哺乳動物に対して、（ｉ）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（ｉｉ）上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を有する化合物またはその塩、または（ｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストの有効量を投与することを特徴とする体重増加抑制方法、体重減少方法、脂肪量増加抑制方法または摂食抑制方法、
（２３）　体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤または摂食抑制剤を製造するための（ｉ）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（ｉｉ）上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を有する化合物またはその塩、または（ｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアゴニストの使用などを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、本発明のポリペプチドと称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するポリペプチドであってもよく、合成ポリペプチドであってもよい。
【０００７】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列に１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：１６で表されるアミノ酸配列中の１〜５個（好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、より好ましくは、１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
【０００８】
配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性（例、体重増加抑制作用、体重減少作用、脂肪量増加抑制作用、摂食抑制作用）などがあげられる。
実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に（例、生理化学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１、配列番号：９２、配列番号：９５、配列番号：９６、配列番号：９７、配列番号：９８、配列番号：９９、配列番号：１００、配列番号：１０１、配列番号：１０２、配列番号：１０３、配列番号：１０４、配列番号：１０５、配列番号：１０６、配列番号：１０７、配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０、配列番号：１１１、配列番号：１１２、配列番号：１１３または配列番号：１４９で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
【０００９】
本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：９９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１００で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０７で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号：１１３で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：１４９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどのＧＰＲ８と特異的に結合する能力を有するポリペプチドがあげられる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの前駆体ポリペプチドをも包含する意味で用いられる。
該前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするポリペプチド等があげられる。
より具体的には、
配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、上記のアミノ酸配列の他、
（ｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１００個（好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号：１５で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１５で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、配列番号：４２、配列番号：５５、配列番号：７２または配列番号：９０で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
上記前駆体ポリペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：４２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：５５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号：７２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列番号：９０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
【００１０】
本発明のポリペプチドに対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明のポリペプチドと結合活性を有し、本発明のポリプチドにより該受容体発現細胞の細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性等）が観察されるものなどがあげられる。
具体的には、（１）ＧＰＲ８（配列番号：４；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４−９１頁、１９９５年）、またはＧＰＲ８と実質的に同一のアミノ酸配列（配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質）、（２）配列番号：１２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体、（３）配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する受容体、（４）ＧＰＲ７（配列番号：１４４；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４−９１頁、１９９５年）などがあげられる。
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１２６で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、本発明の受容体と称する場合がある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１１】
配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：１２６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１２６で表されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列と８６％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、（ｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列に１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：４、配列番号：１２６、配列番号：１３８または配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列中の１〜１５個（好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、より好ましくは、１〜３個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明の受容体の具体例としては、例えば、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１３８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１４４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが用いられる。
【００１２】
本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであっていてもよく、好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。本発明の受容体の構成アミノ酸配列のうち２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。（ｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、（ｉｉ）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（ｉｉｉ）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。具体例としては、（ａ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列中、１番目（Ｍｅｔ）〜１２３番目（Ｐｈｅ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、３０１番目（Ａｓｎ）〜３５８番目（Ｌｙｓ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、５４８番目（Ｔｙｒ）〜５９３番目（Ａｒｇ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、および８４３番目（Ａｌａ）〜８９５番目（Ｉｌｅ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチド、（ｂ）配列番号：１２６で表されるアミノ酸配列中、１番目（Ｍｅｔ）〜８５番目（Ａｓｐ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、または２２２番目（Ｃｙｓ）〜３２９番目（Ａｌａ）のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部を含有するペプチドなどがあげられる。
【００１３】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００１４】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、後述するポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１５】
本発明のポリペプチド、受容体、その部分ペプチド、もしくはそれらの塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１６】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１７】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００１８】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１９】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載された方法があげられる。
（ａ）Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙおよび　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
（ｂ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
（ｃ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｄ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座　１、タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
（ｅ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２０】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００２１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば（ａ）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４、配列番号：１２５または配列番号：１５０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４、配列番号：１２５または配列番号：１５０で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または（ｄ）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
（ｉ）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４、配列番号：１２５または配列番号：１５０で表わされる塩基配列、または（ｉｉ）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ（ｉ）配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：５８、配列番号：５９、配列番号：７５、配列番号：７６、配列番号：９３、配列番号：９４、配列番号：１１４、配列番号：１１５、配列番号：１１６、配列番号：１１７、配列番号：１１８、配列番号：１１９、配列番号：１２０、配列番号：１２１、配列番号：１２２、配列番号：１２３、配列番号：１２４、配列番号：１２５または配列番号：１５０で表される塩基配列、または（ｉｉ）配列番号：１４、配列番号：４１、配列番号：５４、配列番号：７１または配列番号：８９で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２２】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、
（ｉ）配列番号：１６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｉ）配列番号：１７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｉｉ）配列番号：２０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｖ）配列番号：２１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖ）配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉ）配列番号：２３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉｉ）配列番号：２４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｖｉｉｉ）配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：３１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｉｘ）配列番号：５６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘ）配列番号：５７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉ）配列番号：７３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｉ）配列番号：７４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｉｉ）配列番号：９１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｖ）配列番号：９２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：９４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖ）配列番号：９５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖｉ）配列番号：９６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖｉｉ）配列番号：９７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｖｉｉｉ）配列番号：９８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｉｘ）配列番号：９９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘ）配列番号：１００で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉ）配列番号：１０１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉｉ）配列番号：１０２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉｉｉ）配列番号：１０３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：５８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉｖ）配列番号：１０４で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：７５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｖ）配列番号：１０５で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｖｉ）配列番号：１０６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｖｉｉ）配列番号：１０７で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：１０８で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｉｘ）配列番号：１０９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｘ）配列番号：１１０で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２４で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｘｉ）配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｘｉｉ）配列番号：１１１で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号：１１２で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｘｉｖ）配列番号：１１３で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２１で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられ、
（ｘｘｘｖ）配列番号：１４９で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１５０で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】
本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：３２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：４で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（２）配列番号：１２７で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１２６で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（３）配列番号：１３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１３９で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１３８で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（４）配列番号：１４３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１４３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１４３で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：３２、配列番号：１２７、配列番号：１３９または配列番号：１４３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：３２、配列番号：１２７、配列番号：１３９または配列番号：１４３で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２４】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：１２６で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１２７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：１３８で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１３９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、配列番号：１４４で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１４３で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２５】
本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：３２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：３２で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：４で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（２）配列番号：１２７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：１２７で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１２６で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（３）配列番号：１３９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：１３８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１２６で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（４）配列番号：１４３で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：１４３で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１４４で表されるアミノ酸を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：３２、配列番号：１２７、配列番号：１３９または配列番号：１４３で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
また、本発明の受容体の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしてより具体的には、配列番号：４で表されるアミノ酸配列中、１番目（Ｍｅｔ）〜４３番目（Ｐｈｅ）、１０１番目（Ａｓｎ）〜１１８番目（Ｌｙｓ）、１８８番目（Ｔｙｒ）〜２１３番目（Ａｒｇ）および２８３番目（Ａｌａ）〜２９５番目（Ｉｌｅ）で表される部分アミノ酸配列から選択される１または２以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ、またはこれらとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡなどがあげられる。
【００２６】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはアイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの（例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識）、ビオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。好ましくはアイソトープラベル化された本発明のポリペプチドが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチド（以下、これらポリペプチド等をコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらポリペプチド等を単に本発明のポリペプチドと略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２７】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどがあげられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００２９】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）〕，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００３０】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００３１】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　６，　４７−５５（１９８８））などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００３２】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００３３】
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００３４】
本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５　（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（タンパク質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識された抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識されたポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３５】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００３６】
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡを、本発明のアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある））としては、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチド（好ましくは、アンチセンスＤＮＡ）であってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスヌクレオチドがそれぞれ好適である。例えば、本発明のポリペプチドまたは受容体をコードする塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスヌクレオチド（ＤＮＡ）が挙げられる。
アンチセンスヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
本発明のアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、（ａ）本発明のポリペプチド、（ｂ）本発明のＤＮＡ、（ｃ）本発明の抗体および（ｄ）本発明のアンチセンスＤＮＡの用途を説明する。
【００３７】
（１）本発明のポリペプチドが関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のポリペプチドは、本発明の受容体（例、ＧＰＲ８、ＧＰＲ７、ラットＴＧＲ２６、マウスＴＧＲ２６など）の発現細胞の細胞刺激活性を有し、本発明の受容体の内因性リガンドである。
従って本発明のポリペプチドまたは本発明のＤＮＡに異常があったり、欠損している場合、または本発明の受容体または該受容体をコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合には、例えば、体重増加となる可能性が高い。従って、本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤として使用することができる。また、例えば肥満症〔例、悪性肥満細胞症（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、外因性肥満（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過インシュリン性肥満症（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎａｒ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、過血漿性肥満（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、下垂体性肥満（ｈｙｐｏｐｈｙｓｅａｌ　ａｄｉｐｏｓｉｔｙ）、減血漿性肥満症（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、甲状腺機能低下肥満症（ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、視床下部性肥満（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、症候性肥満症（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、小児肥満（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、上半身肥満（ｕｐｐｅｒ　ｂｏｄｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、食事性肥満症（ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、性機能低下性肥満（ｈｙｐｏｇｏｎａｄａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、単純性肥満（ｓｉｍｐｌｅ　ｏｂｅｓｉｔｙ）、中心性肥満（ｃｅｎｔｒａｌ　ｏｂｅｓｉｔｙ）など〕の予防治療剤として使用することができる。
【００３８】
本発明のポリペプチドおよび本発明のＤＮＡは、例えば、生体内において本発明のポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡを該患者に投与し、生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のポリペプチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のポリペプチドの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のＤＮＡを上記の治療・予防剤として使用する場合は、該ＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドを上記の治療・予防剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的（好ましくは皮下投与）に使用できる。例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
【００３９】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
【００４０】
本発明のポリペプチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、体重増加抑制の目的で本発明のポリペプチドを皮下投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該ポリペプチドを約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
（２）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のポリペプチドは本発明の受容体のリガンドとしての機能などを有するため、本発明のポリペプチドの活性や機能を促進する化合物またはその塩は、例えば、体重増加抑制作用、体重減少作用、脂肪量増加抑制作用、摂食抑制作用などを有し、低毒性で安全な体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤などとして使用できる。
一方、本発明のポリペプチドの活性や機能を阻害する化合物またはその塩は、例えば体重増加作用を有し、低毒性で安全な体重増加剤などとして有用である。本発明のポリペプチドの活性や機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングは、本発明のポリペプチドを用いるか、または組換え型本発明のポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いる。このスクリーニングにより、本発明のポリペプチドとその受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）（例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩もスクリーニングすることができる。このような化合物には、本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性など）を有する化合物（即ち本発明の受容体アゴニスト）と該細胞刺激活性を有しない化合物（即ち本発明の受容体アンタゴニスト）などが含まれる。「本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる」とは、本発明のポリペプチドとの結合を阻害する場合と本発明のポリペプチドとの結合を促進する場合の両方を包含するものである。
【００４２】
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法の具体例としては、（ｉ）本発明の受容体またはその部分ペプチド（以下、これらを単に本発明の受容体と略称する場合がある）に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
上記スクリーニング方法においては、（ｉ）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドを接触させた場合と（ｉｉ）上記した本発明の受容体に、本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該本発明の受容体に対するリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較する。
【００４３】
上記スクリーニング方法のさらなる具体例としては、
（ａ）標識された本発明のポリペプチドを、上記した本発明の受容体に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
（ｂ）標識された本発明のポリペプチドを、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
（ｃ）標識された本発明のポリペプチドを、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明のポリペプチドの受容体に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、
【００４４】
（ｄ）本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチド）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法、および
（ｅ）本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドなど）を本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング方法などである。
標識された本発明のポリペプチドの好ましい具体例は、放射性同位元素（例、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）またはランタニド元素などでそれぞれ標識された配列番号：１４９、配列番号：１６、配列番号：６、配列番号：１７、配列番号：５６、配列番号：５７、配列番号：７３、配列番号：７４、配列番号：９１または配列番号：９２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。好ましくは〔１２５Ｉ〕で標識された配列番号：１４９で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げられる。
【００４５】
上記スクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の受容体としては、本発明のポリペプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであってもよいが、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の本発明のポリペプチドの製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。また、本発明の受容体を発現した宿主細胞は、前述の本発明のポリペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００４６】
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の（ａ）〜（ｃ）を実施するためには、適当な本発明の受容体画分と、標識された本発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識されたポリペプチドとしては、例えば放射性同位元素（例、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕など）、蛍光物質〔例、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど〕、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなど）、酵素（例、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）またはランタニド元素などで標識されたポリペプチドなどが挙げられる。このうち好ましくは、〔１２５Ｉ〕で標識されたポリペプチドである。
具体的には、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０．０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識された本発明のポリペプチドを添加し、同時に１０−１０〜１０−７Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のポリペプチドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００４７】
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前記の（ｄ）〜（ｅ）の方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成／抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００４８】
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体またはその塩、本発明の受容体の部分ペプチドまたはその塩、本発明の受容体を含有する細胞、あるいは本発明の受容体を含有する細胞の膜画分、および本発明のポリペプチドを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（ａ）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ギブコ社製）に、０．０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
（ｂ）本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
（ｃ）標識された本発明のポリペプチド
〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識された本発明のポリペプチドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
（ｄ）本発明のポリペプチド標準液
本発明のポリペプチドを０．１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００４９】
２．測定法
（ａ）１２穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ｂ）１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識された本発明のペプチドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍの本発明のポリペプチドを５μｌ加えておく。
（ｃ）反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のポリペプチドを０．２ＮＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
（ｄ）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Ｐｅｒｃｅｎｔ　Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｂ　　：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ（非特異的結合量）
Ｂ０　：最大結合量
【００５０】
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合を変化させる（結合を阻害あるいは促進する）化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）であり、具体的には本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（いわゆる本発明の受容体アゴニスト）、あるいは該刺激活性を有しない化合物（いわゆる本発明の受容体アンタゴニスト）である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記本発明の受容体アゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な評価方法は以下の（ｉ）または（ｉｉ）に従えばよい。
（ｉ）前記（ａ）〜（ｃ）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストであり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
（ｉｉ）（ａ）試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、上記本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
（ｂ）本発明の受容体を活性化する化合物（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体アゴニストなど）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
上記本発明の受容体アゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドと同様に体重増加抑制作用、体重減少作用、脂肪量増加抑制作用、摂食抑制作用などを有し、安全で低毒性な体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤などとして使用することができる。
上記本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリペプチドが有する生理活性を抑制することができるので、安全で低毒性な体重増加剤などして使用することができる。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物を上述の治療・予防剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、体重増加抑制の目的で本発明のポリペプチドの活性・機能を促進する化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
また、例えば、体重増加の目的で本発明のポリペプチドの活性・機能を阻害する化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ当たり）においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００５２】
（３）本発明のポリペプチドの定量
本発明のポリペプチドに対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００５３】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００５４】
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ　：　Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ　：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ　：　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
【００５５】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドの濃度の減少が検出された場合、例えば、体重増加または脂肪量増加である、または将来体重が増加または脂肪量が増加する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明のポリペプチドの濃度の増加が検出された場合には、例えば、体重減少などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドを検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
【００５６】
（４）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現低下が検出された場合は、例えば、体重増加または脂肪量増加である可能性が高いまたは将来体重が増加または脂肪量が増加する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合は、例えば、体重減少などである可能性が高いまたは将来体重減少する可能性が高いと診断することができる。
【００５７】
（５）本発明のアンチセンスＤＮＡを含有する医薬
本発明のアンチセンスＤＮＡは、本発明のポリペプチドまたは受容体の発現を抑制することができ、例えば、体重増加剤などとして使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５８】
（６）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドを中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、体重増加剤などとして使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の体重増加抑制のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【００５９】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ　ｃａｓｔｏｒ　ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００６０】
（７）ＤＮＡ転移動物
外来性の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物も、体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤などをスクリーニングするために用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００６１】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００６２】
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ａ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｂ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００６３】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００６４】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００６５】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ａ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｂ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
（ｃ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｄ）上記（ｃ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｅ）本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６６】
（８）ノックアウト動物
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物も、体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤をスクリーニングするために用いられる。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【００６７】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【００６８】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１−０．５％トリプシン／０．１−５ｍＭＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用である。
【００６９】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。
【００７０】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１、ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００７１】
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００７２】
例えば、体重増加抑制剤をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定する。
【００７３】
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の血糖値が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上低下した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の拒食症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７４】
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物をスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【００７５】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤などとして使用することができる。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えば体重増加剤などとして使用することができる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００７６】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポータ遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７７】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
2004002295.tif 000002
2004002295.tif 000003
2004002295.tif 000004
【００７８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトＧＰＲ８タンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
ヒトＧＰＲ８タンパク質をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、また３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されたヒトＧＰＲ８タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトＧＰＲ８タンパク質の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞株の各クローンにおけるＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量を測定するために使用したｒｉｂｏｐｒｏｂｅの配列を示す。
〔配列番号：６〕
ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのアミノ末端アミノ酸配列解析の結果から得られたアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＷ００７５３１）を示す。
〔配列番号：８〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＩ５００３０３）を示す。
〔配列番号：９〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＩ９９０９６４）を示す。
〔配列番号：１０〕
相補鎖がＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＡ７４４８０４）を示す。
〔配列番号：１１〕
ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列（アクセッション番号：Ｈ３１５９８）を示す。
〔配列番号：１２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
ヒト脳由来ｃＤＮＡから増幅されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１６〕
配列番号：１５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１７〕
配列番号：１５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
後述の参考例１４で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２１〕
後述の参考例１５で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２８）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２２〕
後述の参考例１６で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２７）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
後述の参考例１７で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
後述の参考例１８で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２５）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
後述の参考例１９で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２４）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
配列番号：２０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
配列番号：２１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
配列番号：２２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
配列番号：２４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体ッタンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：４２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
【００７９】
〔配列番号：５１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：５５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５６〕
配列番号：５５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５７〕
配列番号：５５から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５８〕
配列番号：５６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
配列番号：５７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：６３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：７２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７３〕
配列番号：７２から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７４〕
配列番号：７２から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７５〕
配列番号：７３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
配列番号：７４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のＧＰＲ７遺伝子発現量を測定するのにプローブとして用いた合成ＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：７８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
マウス精巣由来ｃＤＮＡから増幅されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのヒトホモログの前駆体タンパク質の一部をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８１〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８４〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８５〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側配列を得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８６〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流側ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８７〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８８〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡを得るのに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８９〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列を示す。
〔配列番号：９０〕
ＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログの前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９１〕
配列番号：９０から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９２〕
配列番号：９０から推定されたＧＰＲ８に対するリガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９３〕
配列番号：９１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：９４〕
配列番号：９２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
後述の参考例４４で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９６〕
後述の参考例４５で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９７〕
後述の参考例４６で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９８〕
後述の参考例４７で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９９〕
後述の参考例４８で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１９）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１００〕
後述の参考例４９で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１８）のアミノ酸配列を示す。
【００８０】
〔配列番号：１０１〕
後述の参考例５０で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１７）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０２〕
後述の参考例５１で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１−１６）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０３〕
後述の参考例５４で合成されたＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０４〕
後述の参考例５５で合成されたラットあるいはマウスＧＰＲ８リガンド（１−２３）酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０５〕
後述の参考例１２で合成されたＦｍｏｃ化ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０６〕
後述の参考例５６で合成された［Ｎα−Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｒｐ１］−ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０７〕
後述の参考例５７で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０８〕
後述の参考例５８で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（４−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１０９〕
後述の参考例５９で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（９−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１０〕
後述の参考例６０で合成されたヒトＧＰＲ８リガンド（１５−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１１〕
後述の参考例６１で合成された［Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｙｒ２］−ヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１２〕
後述の参考例６２で合成された［Ｄ−Ｔｒｐ１］−ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１３〕
後述の参考例６３で合成された［Ｎ−３−Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｐａｎｏｙｌ−Ｔｙｒ２］−ヒトＧＰＲ８リガンド（２−２３）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１４〕
配列番号：９６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１５〕
配列番号：９７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１６〕
配列番号：９８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１７〕
配列番号：９９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１８〕
配列番号：１００で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１１９〕
配列番号：１０１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２０〕
配列番号：１０２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２１〕
配列番号：１０７で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２２〕
配列番号：１０８で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２３〕
配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２４〕
配列番号：１１０で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２５〕
配列番号：６で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号：１２６〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１２７〕
本発明のラット由来新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質ＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２８〕
以下の参考例６７におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２９〕
以下の参考例６７におけるＰＣＲ反応で使用したプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３０〕
以下の参考例６８におけるＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞のＴＧＲ２６レセプター遺伝子発現量を測定するのに使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３１〕
以下の参考例６８におけるＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞のＴＧＲ２６遺伝子発現量を測定するのに使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３２〕
以下の参考例７５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３３〕
以下の参考例７５におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３４〕
以下の参考例７５で得られたマウスＴＧＲ２６をコードするＤＮＡの５’上流端部分の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３５〕
以下の参考例２４におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３６〕
以下の参考例２４におけるＰＣＲ反応で使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３７〕
以下の参考例２４で得られたマウスＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３８〕
マウス由来ＴＧＲ２６のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１３９〕
マウス由来ＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４０〕
以下の参考例６８におけるＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞のＴＧＲ２６遺伝子発現量を測定するのに使用したプローブの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４１〕
ヒトＧＰＲ７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４２〕
ヒトＧＰＲ７をコードするｃＤＮＡのスクリーニングに使用した合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４３〕
５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、また３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されたヒトＧＰＲ７タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。
〔配列番号：１４４〕
ヒトＧＰＲ７の全アミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１４５〕
標準ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡを増幅するのにプライマーとして使用したＤＮＡ塩基配列を示す。
〔配列番号：１４６〕
標準ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡを増幅するのにプライマーとして使用したＤＮＡ塩基配列を示す。
〔配列番号：１４７〕
ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のＧＰＲ７遺伝子発現量を測定するのにプライマーとして用いた合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４８〕
ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞のＧＰＲ７遺伝子発現量を測定するのにプライマーとして用いた合成ＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４９〕
［Ｐｈｅ２］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１５０〕
配列番号：１４９で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
【００８１】
後述の参考例３で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８は、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ１６５６４として、茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５４０として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例２８で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＨｕｍａｎ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ　１６５６８として、茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５４４として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例３２で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＰｏｒｃｉｎｅ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ　１６５６５として、茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−７５４１として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例３６で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＲａｔ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ　１６５６７、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５４３として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例４１で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＭｏｕｓｅ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒは、大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に２００１年２月２７日から寄託番号ＩＦＯ　１６５６６として、茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに２００１年４月１１日から受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７５４２として、それぞれ寄託されている。
後述の参考例６７で得られた形質転換体　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７は、２０００年１０月３１日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６４９６として、２０００年１１月１３日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ））に受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７３６５としてそれぞれ寄託されている。
後述の参考例２４で得られた形質転換体　大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯＭｏｕｓｅＧＰＲ７は、２００１年９月２０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）、財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７０４として、２００１年１０月１５日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７７７５としてそれぞれ寄託されている。
【００８２】
【実施例】
以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００８３】
参考例１　ヒト脳由来ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ８　ｃＤＮＡの増幅
ヒト脳由来ｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡ（クローンテック）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆転写は、タカラＲＮＡ　ＰＣＲ　ｖｅｒ　２．１キット試薬を使用した。次にこの逆転写生成物を鋳型として用い、配列番号：１および配列番号：２で表される合成プライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。合成プライマーは受容体タンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素ＣｌａＩの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素ＳｐｅＩの認識する塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型５μｌ，合成ＤＮＡプライマー各０．４μＭ、０．８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）０．５μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９４℃・６０秒の加熱の後、９４℃・６０秒、６５℃・６０秒、７２℃・１５０秒のサイクルを３５回繰り返した。増幅産物の確認は、０．８％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【００８４】
参考例２　ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ｃＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ｃＤＮＡ配列の確認
参考例１で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。ＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）へサブクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（東洋紡）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ＧＰＲ８を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部に対して制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩによる切断を行ない、挿入されている受容体ｃＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：３）。ヒトＧＰＲ８受容体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列が配列番号：３に、およびそれから翻訳されるヒトＧＰＲ８受容体タンパク質の全アミノ酸配列が配列番号：４に示されている。
【００８５】
参考例３　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例２で配列が確認されたヒト脳由来のＧＰＲ８の全長アミノ酸配列をコードし５’側にＣｌａＩ認識配列を付加し、また３’側にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．　ｃｏｌｉのクローンからＰｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　ＫＩｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで消化してインサートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作により回収された。このインサートＤＮＡをＣｌａＩおよびＳｐｅＩで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｓ．　Ｈｉｎｕｍａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ、１２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年、記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、Ｔ４リガーゼ（宝酒造）を用いてライゲーションを行ない、タンパク質発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８を構築した。このプラスミドｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８で形質転換した大腸菌をＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８）と命名した。
ｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８で形質転換したＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫＫＯ−ＧＰＲ８プラスミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。４．５μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、２４時間前に５　ｘ　１０５または１　ｘ　１０６個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４７クローンを選択した。
【００８６】
参考例４　全長ヒトＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量の高いＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の選択
参考例３で樹立されたＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株４７クローンの全長ＧＰＲ８タンパク質ｍＲＮＡの発現量をＣｙｔｏｓｔａｒ　Ｔ　Ｐｌａｔｅ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用い、添付のプロトコールに従って以下のように測定した。ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株の各クローンをＣｙｔｏｓｔａｒ　Ｔ　Ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌ当たり２．５　ｘ　１０４個ずつ播種して２４時間培養した後、１０％ホルマリンによって細胞を固定した。各ｗｅｌｌに０．２５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を添加して細胞の透過性をあげた後、３５Ｓラベルした配列番号：５のｒｉｂｏｐｒｏｂｅを加えてハイブリダイズさせた。２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ　Ａを各ｗｅｌｌに加えて遊離のｒｉｂｏｐｒｏｂｅを消化し、プレートをよく洗浄した後、ハイブリダイズしたｒｉｂｏｐｒｏｂｅの放射活性をＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒで測定した。放射活性の高い細胞株は、ｍＲＮＡ発現量が高い。ｍＲＮＡ発現量の高い３クローン（＃１７，４１および４６）を以下に実験に用いたが、特にクローン番号１７を用いた。
【００８７】
参考例５　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定
参考例４で作製したＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞およびｍｏｃｋ　ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５　ｘ　１０４　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％　ＢＳＡと２０ｍＭ　ＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した（以下、０．２ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチンと０．０５％　ＢＳＡと２０ｍＭ　ＨＥＰＳを含むハンクスバッファー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、試料と２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させた。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、ｃＡＭＰ　ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【００８８】
参考例６　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する　［３５Ｓ］−Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの結合促進活性を以下の方法により測定した。最初に膜画分の調製法を記載する。１　ｘ　１０８個のＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に１０ｍｌのホモジネートバッファー（１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，　５ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ，　１μｇ／ｍｌ　ｐｅｐｓｔａｔｉｎ，　４μｇ／ｍｌ　Ｅ６４，　２０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）添加し、ポリトロン（１２，０００　ｒｐｍ、１分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００　ｇ，　１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｔｙｐｅ　３０ローター、３０，０００　ｒｐｍ，　１時間）し、得られた沈殿物をＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
ＧＴＰγＳ結合活性の測定は以下の通りである。ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．４），　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１μＭ　ＧＤＰ）で希釈して、タンパク質濃度３０　ｍｇ／ｍｌのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用膜画分溶液２００μｌに、５１．５ｎＭ濃度の［３５Ｓ］−Ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ社）を２μｌと試料を添加し、この混合液を２５℃で一時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ　７．４），　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．１％　ＢＳＡ）１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００８９】
参考例７　ブタ視床下部抽出物に含まれ、ＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞株に対して特異的にｃＡＭＰ産生抑制およびＧＴＰγＳ結合促進を示す活性の検出
ブタ視床下部抽出物の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フラクションを以下に述べる方法で調製した。東京芝浦臓器（株）より購入した、処理当日に屠殺して摘出後は氷冷保存したブタ視床下部５００　ｇ（３０頭分）を細かく切断し、直ぐに沸騰した蒸留水２．０　ｌに投じて１０分間煮沸した。煮沸後、直ちに氷冷し、１２０　ｍｌの酢酸を加えて終濃度１．０　Ｍとし、ポリトロン（２０，０００　ｒｐｍ、６分間）を用いて破砕した。破砕液を遠心（８，０００　ｒｐｍ、３０分）して上清を取り、沈殿には１．０Ｍ酢酸２．０　ｌを加えて再度ポリトロンによって破砕し、一晩攪拌した後、遠心（８，０００　ｒｐｍ、３０分）して上清を得た。上清に２倍量の冷アセトンを４℃でゆっくり滴下した後、１回目の遠心によって得た上清については一晩攪拌し、２回目の遠心によって得た上清については４時間攪拌した。アセトンを加えた抽出液は遠心（８，０００　ｒｐｍ、３０分）して沈殿を除き、得られた上清からエバポレーターによって減圧下にアセトンを溜去した。アセトンを除いた抽出液に等量のジエチルエーテルを加え、分液ロートを使って脂質を含むエーテル層を分離して水層を回収した。エーテル脱脂した抽出液はエバポレーターによって減圧下に濃縮してエーテルを完全に除去した。濃縮液をガラス繊維濾紙（アドバンテック、ＤＰ７０　（９０　ｍｍφ））で濾過し、濾液をガラス製カラム（３０φ　ｘ　２４０　ｍｍ）に充填したＣ１８（ワイエムシー、ＹＭＣｇｅｌ　ＯＤＳ−ＡＭ　１２０−Ｓ５０）カラムに添加した。カラムを１．０　Ｍ酢酸４００　ｍｌで洗浄後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリル５００　ｍｌで溶出した。溶出液を減圧下に濃縮して溶媒を溜去した後、濃縮液を凍結乾燥した。凍結乾燥品約０．５　ｇを３０　ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルに溶解し、１０　ｍｌずつをＣ１８カラム（トーソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ−８０ＴＳ　（２１．５φ　ｘ　３００　ｍｍ））を用いた１０％から６０％の０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの濃度勾配溶出法によるＨＰＬＣにかけた。ＨＰＬＣは３回行なった。溶出液は６０分画に分取し、３回分の溶出液をまとめた。各分画を減圧下に濃縮・乾固し、残渣を０．５　ｍｌのジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）で溶解した。
上記によって得られたＨＰＬＣフラクションのＤＭＳＯ溶液を参考例５に示した方法によってＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定を行なった結果、分画番号３０に顕著なｃＡＭＰ産生抑制活性が認められた。また同様な試料についてＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞用いてＧＴＰγＳ結合促進活性を調べたところ、やはり分画番号３０付近に顕著な活性が確認された。これらの活性は他の受容体発現細胞では認められなかったことからブタ視床下部抽出物にＧＰＲ８特異的なリガンド活性物質が存在することが示された。
【００９０】
参考例８　ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して特異的に細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質のプロナーゼによる失活
参考例７でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示したＨＰＬＣ分画３０をタンパク質分解酵素であるプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ，　ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｔｙｐｅ　ＸＩＶ　（Ｐ５１４７））で処理し、活性物質が蛋白性であるかを調べた。上記視床下部抽出物ＨＰＬＣ分画（＃３０）２μｌを０．２　Ｍ酢酸アンモニウム２００μｌに加え、これにプロナーゼ３μｇを添加して３７℃で２時間インキュベートした後、沸騰水中で１０分間加熱してプロナーゼを失活させた。これにＢＳＡ　０．０５ｍｇおよびＣＨＡＰＳ　０．０５　ｍｇを含む蒸留水２　ｍｌを加えてから凍結乾燥した。プロナーゼそのものあるいは加熱および凍結乾燥の影響を調べるため、プロナーゼのみ、ＨＰＬＣ分画のみおよびプロナーゼのみを加熱処理した後にＨＰＬＣ分画を加えたものについても同様に処理して凍結乾燥した。凍結乾燥した各試料を参考例５に示す方法によってＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に添加して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。ブタ視床下部抽出物中のＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対する細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を示す活性物質はプロナーゼによって完全に失活したことからこの物質がタンパク質もしくはペプチドであることが示された。
【００９１】
参考例９　ブタ視床下部からのＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質の精製
ＧＰＲ８に特異的なリガンド活性を示す物質をＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を指標としてブタ視床下部から精製した代表例を以下に具体的に述べる。参考例７に述べた方法と全く同一の方法により、ブタ視床下部５００　ｇ（３０頭分）を１．０　Ｍ酢酸で抽出し、アセトン沈殿およびエーテル脱脂をした後、Ｃ１８（ワイエムシー、ＹＭＣｇｅｌ　ＯＤＳ−ＡＭ　１２０−Ｓ５０）カラムに吸着させ、０．１％トリフルオロ酢酸を含む６０％アセトニトリルで溶出した。溶出液を濃縮し、凍結乾燥した後、Ｃ１８カラム（トーソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＯＤＳ−８０ＴＳ　（２１．５φ　ｘ　３００　ｍｍ））を用いたＨＰＬＣによって活性分画を得た。活性は分画番号３０に回収された。これを以下の方法によってさらに精製した。
この分画を１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭギ酸アンモニウム１０　ｍｌに溶解し、陽イオン交換カラム（トーソー、ＴＳＫｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷ　（２０　ｍｍφ　ｘ　１５０　ｍｍ））に添加した後、１０％アセトニトリルを含む１０　ｍＭから２．０　Ｍのギ酸アンモニウムの濃度勾配によってカラムを溶出した。活性はギ酸アンモニウム０．８　Ｍ付近に回収された。活性分画を凍結乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリル１．０　ｍｌに溶解し、ＣＮカラム（野村化学、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ　ＣＮ−ＵＧ−５　（４．６　ｍｍφｘ　２５０　ｍｍ））に添加した後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む２１％から２６％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセトニトリル２２．１％付近に出現した。活性分画を凍結乾燥し、０．１　ｍｌのＤＭＳＯで溶解し、さらに０．４　ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルを加えてＯＤＳカラム（和光純薬、Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧ（２．０　ｍｍφｘ　１５０　ｍｍ））に添加した後、０．１％トリフルオ酢酸を含む２２．５％から３２．５％のアセトニトリルの濃度勾配によって溶出した。活性はアセトニトリル２６．５％付近に単一ピークとして出現した（図１）。
【００９２】
参考例１０　ブタ視床下部から精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質のアミノ末端アミノ酸配列の解析およびＧＰＲ８リガンドのヒトおよびラットホモログペプチドの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されるＥＳＴ配列
参考例９で精製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に対して特異的にＧＴＰγＳ結合促進活性を示す活性物質のアミノ末端アミノ酸配列解析を行なった。本活性物質は参考例８に示すようにタンパク質またはペプチドであることが推定されていたので、活性ピークを含む溶出液を用いてパーキンエルマー社Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒによってアミノ末端アミノ酸配列分析を行なった。その結果、アミノ末端から１７残基までに配列番号：６に示す配列が得られた。この配列はリガンドペプチドの一部であると考えられた。
【００９３】
この配列に基づいて遺伝子データベースの検索を行なったところ、そのものもしくはその相補鎖がこのペプチドの前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定される幾つかのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｔａｇ）配列が見出された。それらのアクセッション番号、ｃＤＮＡの由来、配列の長さおよび配列番号は次の通りである。ＡＷ００７５３１　（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ、４３８　ｂａｓｅ、配列番号：７）、ＡＩ５００３０３　（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ、　２６４　ｂａｓｅ、配列番号：８）、ＡＩ９９０９６４　（ｃｏｌｏｎｉｃ　ｍｕｃｏｓａ　ｆｒｏｍ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｒｏｈｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ、４２４　ｂａｓｅ、配列番号：９）、ＡＡ７４４８０４　（ｇｅｒｍｉｎａｌ　ｃｅｎｔｅｒ　Ｂ　ｃｅｌｌ、３７５　ｂａｓｅ、配列番号：１０）、Ｈ３１５９８　（ＰＣ１２　ｃｅｌｌｓ、２６０　ｂａｓｅ、配列番号：１１）。初めの４つはヒト由来であり、最後の１つはラット由来である。これらのＥＳＴのＤＮＡ配列はブタ視床下部より単離した活性ペプチドの配列に相当するアミノ酸配列をコードする領域では極めてよく一致してしており、また翻訳されたアミノ酸配列はブタ視床下部より単離され明らかとなったペプチドの配列とは５残基目のＴｈｒがＶａｌであること以外はほぼ一致した。以上からこれらのＥＳＴはＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトおよびラットホモログの前駆体タンパク質の一部をコードしているものと推定した。
【００９４】
参考例１１　ＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするヒトｃＤＮＡの増幅と増幅ｃＤＮＡ配列の解読
参考例１０に述べたＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体タンパク質の一部をコードすると推定されたＥＳＴ配列に基づいてプライマーを設計し、ヒト脳由来ｃＤＮＡよりＰＣＲによってＧＰＲ８リガンドペプチド前駆体の一部をコードするｃＤＮＡを増幅した。
ヒト脳由来ｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡ（クローンテック）を鋳型として、ランダムプライマーを用いて逆転写反応を行なった。逆転写反応には、ＲＮａｓｅ　Ｈ活性を欠失させたＭＭＬＶ由来の逆転写酵素であるＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（東洋紡）を使用した。続いて参考例１０に述べたＥＳＴ配列に基づいて設計した配列番号：１２および配列番号：１３の合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行なった。反応液の組成は、ｃＤＮＡ鋳型２μｌ、合成ＤＮＡプライマー各０．５μＭ、１．６ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は２０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを４回、９６℃・３０秒、７０℃・４５秒のサイクルを４回、９６℃・３０秒、６８℃・４５秒のサイクルを４回、９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５回、９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅産物の確認は、３％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
ＰＣＲ反応液を３％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＤＮＡを回収した。ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングキット（インビトロゲン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへサブクローニングした。これをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０（インビトロゲン）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＫＩｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１４に示すＤＮＡ配列を得た。このこの配列から翻訳されるＧＰＲ８リガンドぺプチド前駆体タンパク質の一部（配列番号：１５）には予想どおりブタ視床下部より単離されて配列が明らかになった活性ペプチドに相当するペプチド配列が存在した。さらに、そのＣ末側には通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が２ヶ所存在した。このことから、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトホモログのアミノ酸配列は配列番号：１６および１７のいずれかもしくは両方であると推定された。
【００９５】
参考例１２　Ｆｍｏｃ化ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）：Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０５）およびヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１６）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｌｅｕを導入したＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ（０．７６ｍｍｏｌ／ｇ）　０．２５ｍｍｏｌを出発原料とし、ペプチド合成機ＡＢＩ　４３３Ａを用い　Ｆｍｏｃ／　ＤＣＣ／　ＨＯＢｔ法により、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ，　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，　Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ，　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，　Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），　Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ，　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，　Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ），　Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ），　Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，　Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ），　Ｆｍｏｃ−Ａｌａ，　Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ，　Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ），　Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ），　Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の順に縮合を行い、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ　８３０　ｍｇを得た。　この樹脂１５０ｍｇに　ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／　ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）　　５　ｍｌを加え、室温にて　２時間振盪した後樹脂をろ去し、溶媒を濃縮後エーテルを加え、粗　Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕを沈殿として得た。これを　ＹＭＣ　Ｄ−ＯＤＳ−５−ＳＴ　Ｓ−５　１２０Ａカラム（２０　ｘ　１５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣで、Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルによるＡ／Ｂ：　７２／２８〜５２／４８への直線型濃度勾配溶出（６０分）を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末９．７ｍｇを得た。
【００９６】
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２８０５．７　（計算値２８０５．４）
ＨＰＬＣ溶出時間　２５．１分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分　得られた　Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　　５　ｍｇに　２０％　ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ　／　ＤＭＦ　１　ｍＬを加え室温にて　２時間撹拌した。溶媒を留去後　ＹＭＣ　Ｄ−ＯＤＳ−５−ＳＴ　Ｓ−５　１２０Ａカラム（２０　ｘ　１５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣで、Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルによるＡ／Ｂ：　７４／２６〜６４／３６への直線型濃度勾配溶出（６０分）を行い、目的物を含む分画を集め凍結乾燥し白色粉末１．２ｍｇを得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　２５８３．６　（計算値２５８３．４）
ＨＰＬＣ溶出時間　２０．４分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【００９７】
参考例１３　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−３０）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（配列番号：１７）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）を導入したＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｏ−Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ（０．６４ｍｍｏｌ／ｇ）　０．２５ｍｍｏｌを出発原料として参考例１２と同様に配列順通りにアミノ酸を縮合、最後のＴｒｐを導入後樹脂から切り出す前にＦｍｏｃ基を樹脂上で除去したのち、　ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／　ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製しＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐを得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　３５４３．４　（計算値３５４４．２）
ＨＰＬＣ溶出時間　２１．５分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【００９８】
参考例１４　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２９）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号：２０）の製造
参考例１２の樹脂を用い参考例１３と同様に配列順にアミノ酸を縮合したのち樹脂からの切り出しと精製を行いＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕを得る。
【００９９】
参考例１５　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２８）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号：２１）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒを得る。
【０１００】
参考例１６　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２７）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（配列番号：２２）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｐｒｏを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏを得る。
【０１０１】
参考例１７　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２６）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ（配列番号：２３）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒを得る。
【０１０２】
参考例１８　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２５）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：２４）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇを得る。
【０１０３】
参考例１９　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２４）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２５）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）を導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行いＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを得る。
【０１０４】
参考例２０　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
参考例１２で合成した２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）と記載することがある）を種々の濃度で参考例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。結果を図２に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。このことから配列番号：１６の構造を有するペプチドがＧＰＲ８に対するリガンドであることが明らかとなった。
【０１０５】
参考例２１　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
参考例１３で合成した３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）と記載することがある）を種々の濃度で参考例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。結果を図３に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。このことから配列番号：１７の構造を有するペプチドがＧＰＲ８に対するリガンドであることが明らかとなった。
【０１０６】
参考例２２　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例１２で合成したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を種々の濃度で参考例５に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に接触させて細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図４に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。図中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
【０１０７】
参考例２３　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例１３で合成したｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を種々の濃度で参考例５に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に接触させて細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図５に示した。明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞に対して細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。図５中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
【０１０８】
参考例２４　マウスＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス脳ｃＤＮＡを鋳型として配列番号：１３５の合成プライマーと配列番号：１３６の合成プライマーを用いたＰＣＲ法によりマウスＴＧＲ２６ＤＮＡの増幅を行なった。
反応液の組成は、マウス脳ｃＤＮＡ１μｌ、合成プライマー各０．２μＭ、０．８　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ｃＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量を２０μｌとした。サーマルサイクラー　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、９６℃で２分の加熱した後、９６℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で１分の加熱サイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。ＰＣＲ反応液中の約１１００塩基長の増幅ＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従い、ｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯへクローニングした。これをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１３７で表される塩基配列を得た。
配列番号：１３７で表される塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したものをマウスＴＧＲ２６アミノ酸配列とし、配列番号：１３８として示す。
配列番号：１３８をラット由来のＴＧＲ２６のアミノ酸配列と比較したところ、９６．０％のアミノ酸の一致が認められた。
配列番号：１３７で表される塩基配列を有するＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯマウスＧＰＲ７と命名した。
【０１０９】
参考例２５　ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
参考例１１に記載したＧＰＲ８のリガンドペプチドのヒトホモログ（以下、ヒトＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）を基に作製したプライマーでヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型とした５’　ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、ヒト視床下部Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：３３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：３４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はヒト視床下部ｃＤＮＡ　４μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：３３の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・２４０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：３４の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを１７回、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．２％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約１，２００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用���て行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３５に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１０】
参考例２６　ヒト脳ｃＤＮＡの作製
ヒト脳ｃＤＮＡは、Ｍａｒａｔｈｏｎ　ＴＭ　　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてヒト脳ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から作製した。ＲＡＣＥ　ＰＣＲに供されるｃＤＮＡは１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ合成を除き、キットに添付のプロトコールに従って作製した。１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡは、キットに添付の逆転写酵素ＡＭＶの代わりに逆転写酵素ＭＭＬＶ　（−ＲＮＡｓｅ　Ｈ）（ＲｅｖＴｒａＡｃｅ，東洋紡）を用いて、１μｇのヒト脳ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡから合成した。
【０１１１】
参考例２７　ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
参考例１１に記載のヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするヒトｃＤＮＡ配列（配列番号：１４）を基に作製したプライマーでヒト脳ｃＤＮＡを鋳型とした３’　ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行ない、ヒトＧＰＲ８リガンドをコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を明らかにした。３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、ヒト脳ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：３６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：３７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したヒト脳ｃＤＮＡ　１μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：３６の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・２４０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：３７の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを１７回、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約６００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：３８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１２】
参考例２８　ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ヒト視床下部ｃＤＮＡを鋳型として、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基に作製したプライマーとヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ヒト視床下部Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　１μｌ、配列番号：３９の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番号：４０の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５％　ＤＭＳＯ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３５回、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約７００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４１に示すＤＮＡ配列を得た。
この配列（配列番号：４１）はヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯヒトＧＰＲ８リガンド前駆体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　Ｈｕｍａｎ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と命名した。
配列番号：４１に示すＤＮＡ配列には、参考例１１に記載したヒトＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在するが、その５’上流側にはタンパク質翻訳の開始コドンであると予想されるＡＴＧが存在しない。しかし、これまでに幾つかのタンパク質でＡＴＧ以外のコドンを開始コドンとすることが予想されている例が報告されている（ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｈ．　Ｐｒａｔｓ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、８６巻、１８３６−１８４０頁、１９８９年、Ｒ．　Ｚ．　ＦｌｏｒｋｉｅｗｉｃｚおよびＡ．　Ｓｏｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、８６巻、３９７８−３９８１頁、１９８９年）、マウスレチノイン酸受容体β４（Ｓ．　Ｎａｇｐａｌ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、８９巻、２７１８頁、１９９２年）、ヒトホスホリボシルピロリン酸合成酵素（Ｍ．　Ｔａｉｒａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２６５巻、１６４９１−１６４９７頁、１９９０年）、ショウジョウバエコリンアセチル転移酵素（Ｈ．　Ｓｕｇｉｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２６５巻、２１７１４−２１７１９頁、１９９０年））。
これらの例ではＡＴＧに代わりＬｅｕをコードするＣＴＧが開始コドンとして仮定されていることが多い。ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質においても同様であると考え、後述のブタあるいはラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体タンパク質との比較からこれらの前駆体タンパク質における開始コドンと予想されるＡＴＧにほぼ対応する位置に存在するＣＴＧコドンを開始コドンと仮定し、前駆体タンパク質の配列を推定した。この仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４２に示した。また、仮想的ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図６に示した。
【０１１３】
参考例２９　ブタ脊髄ｃＤＮＡの作製
ブタ脊髄ｃＤＮＡは、Ｍａｒａｔｈｏｎ　ＴＭ　　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてブタ脊髄ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡから作製した。ブタ脊髄ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡは、ブタ脊髄から以下のように調製した。ブタ脊髄を、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）中にてポリトロンホモゲナイザーで完全に破砕し、この破砕溶液からＩＳＯＧＥＮ溶液を用いたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ調製法に従ってブタ脊髄ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。次に、ブタ脊髄ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添付のｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムを用いたクロマトグラフィーを２回行なうことにより、７μｇのブタ脊髄ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡを得た。ＲＡＣＥ　ＰＣＲに供したｃＤＮＡは１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ合成を除き、キットに添付のプロトコールに従って作製した。１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡは、キットに添付の逆転写酵素ＡＭＶの代わりに逆転写酵素ＭＭＬＶ　（−ＲＮＡｓｅ　Ｈ）（ＲｅｖＴｒａＡｃｅ，東洋紡）を用いて、１μｇのブタ脊髄ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡから合成した。
【０１１４】
参考例３０　ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
１回目の５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングと、そのＰＣＲ増幅ＤＮＡの塩基配列を利用した２回目の５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングにより、ＧＰＲ８のリガンドペプチドのブタホモログ（以下、ブタＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。
１回目の５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、上記ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：４３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：４４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はキットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ　４μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：４３の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで１００倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：４４の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを３回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１８０秒のサイクルを３回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを１５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．２％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０Ｆ’　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４５に示すＤＮＡ配列を得た。
２回目の５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：４６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：４７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ　１μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：４６の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・１８０秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１８０秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで１００倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：４７の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを２．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約２００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０Ｆ’　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：４８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１５】
参考例３１　ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端の塩基配列を基に作製したプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングにより、ブタＧＰＲ８リガンドペプチドの前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を明らかにした。３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：４９の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：５０の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ　１μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：４９の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、７０℃・１２０秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで１００倍希釈したＰＣＲ反応液１μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：５０の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３１回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを２．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約６５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０Ｆ’　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解���し、配列番号：５１に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１６】
参考例３２　ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ブタ脊髄ｃＤＮＡを鋳型として、ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基に作製したプライマーとブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を基に作製したプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したブタ脊髄ｃＤＮＡ　１μｌ、配列番号：５２の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番号：５３の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、７２℃・７５秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、７０℃・７５秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、６８℃・７５秒のサイクルを４回、次に９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを５回、次に９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・４５秒のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．２％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約６００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：５４に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：５４）はブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯブタＧＰＲ８リガンド前駆体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　Ｐｏｒｃｉｎｅ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と命名した。
配列番号：５４のＤＮＡ配列がコードするブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５５に示した。この前駆体タンパク質のアミノ酸配列には参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列が存在した。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が２ヶ所存在した。このことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログのアミノ酸配列は配列番号：５６および５７のいずれかもしくは両方であると推定された。ブタＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図７に示した。
【０１１７】
参考例３３　ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
参考例１０に記載したように、ＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部から精製したペプチドのアミノ末端から１７アミノ酸配列（配列番号：６）に基づいてデータベース検索を行なったところ、配列番号：１１の塩基配列に合致するラットＥＳＴ塩基配列（アクセッション番号：Ｈ３１５９８）が見出された。このＤＮＡ配列は１５アミノ酸の配列がブタ視床下部から精製したペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）と同一となる翻訳枠を持っていた。このＨ３１５９８は、ラットＰＣ１２細胞から作製したｃＤＮＡライブラリー由来のＥＳＴ配列であり、未確定な７塩基を含む２６０塩基からなる。このＨ３１５９８はＧＰＲ８リガンドのラットホモログペプチド（以下、ラットＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質の一部をコードしていると推定されたのでその正確な塩基配列を決定するため、Ｈ３１５９８の５’塩基配列と３’塩基配列を基に作製したそれぞれのプライマーでラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型としたＰＣＲクローニングを行なった。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。ラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　２μｌ、配列番号：６０の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番号：６１の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、次に９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・６０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを４．０％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約２５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６２に示すＤＮＡ配列を得た。ＰＣＲクローニングしたＤＮＡの塩基配列（配列番号：６２）とＨ３１５９８の塩基配列との比較により、１塩基欠失の読み誤りがＨ３１５９８の塩基配列にあることが明らかになった。
【０１１８】
参考例３４　ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
５’ＲＡＣＥＰＣＲクローニングによりラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、ラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：６３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：６４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　２μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：６３の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・　６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで２００倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：６４の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．２μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３１回、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．２％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約６００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：６５に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１１９】
参考例３５　ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端の塩基配列を基に作製したプライマーおよびラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片配列を基に作製したプライマーを用いた３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングにより、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を明らかにした。３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、ラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型としてキットに添付のＡＰ１プライマーと配列番号：６６の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＡＰ２プライマーと配列番号：６７の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　２μｌ、ＡＰ１プライマー０．５μＭ、配列番号：６６の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで２００倍希釈したＰＣＲ反応液２μｌ、ＡＰ２プライマー０．５μＭ、配列番号：６７の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１８０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．２％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約６００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番���：６８に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１２０】
参考例３６　ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
ラット脳ｃＤＮＡを鋳型として、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基にしたプライマーとラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、ラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ　１μｌ、配列番号：６９の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番号：７０の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・６０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・６０秒のサイクルを３５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．２％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約７５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：７１に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：７１）は、ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするためこのＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯラットＧＰＲ８リガンド前駆体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　Ｒａｔ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と命名した。
配列番号：７１のＤＮＡ配列がコードするラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：７２に示した。この前駆体タンパク質のアミノ酸配列には参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のアミノ酸のみが異なる類似した配列が存在した。さらにその配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトあるいはブタホモログ前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が２ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログのアミノ酸配列は配列番号：７３および７４のいずれかもしくは両方であると推定された。ラットＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図８に示した。
【０１２１】
参考例３７　マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ断片のクローニング
ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ（以下、マウスＧＰＲ８リガンドと記載することがある）の前駆体タンパク質を取得するため、マウス精巣ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅を行ない、増幅ＤＮＡの塩基配列を決定した。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。マウス精巣ｃＤＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　１μｌ、配列番号：７８の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番号：７９の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．４　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを１０回繰り返し、次に９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：８０）。
【０１２２】
参考例３８　マウス脳ｃＤＮＡの作製
マウス脳ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いてマウス脳ｐｏｌｙ　Ａ（＋）　ＲＮＡ　（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）から、キットに添付のプロトコールに従って作製した。合成した１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ溶液を、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで１０倍に希釈し、この溶液をＲＡＣＥ　ＰＣＲ反応に供した。
【０１２３】
参考例３９　マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてＳＭＡＲＴＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔに添付のＵｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘと配列番号：８１の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＮｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒと配列番号：８２の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はマウス脳ｃＤＮＡ　１μｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ　２μｌ、配列番号：８１の合成ＤＮＡプライマー０．２μＭ、０．８　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したＰＣＲ反応液０．５μｌ、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．５μＭ、配列番号：８２の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．８　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約３００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８３に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１２４】
参考例４０　マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流端のクローニング
３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を明らかにした。３’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、マウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてＳＭＡＲＴＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに添付のＵｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘと配列番号：８４の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＮｅｓｔｅｄ　ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｉｍｅｒと配列番号：８５の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス脳ｃＤＮＡ　１μｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ　２μｌ、配列番号：８４の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．８　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したＰＣＲ反応液０．５μｌ、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．５μＭ、配列番号：８５の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．８　ｍＭｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）　０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約７００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８６に示すＤＮＡ配列を得た。
【０１２５】
参考例４１　マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
マウス脳ｃＤＮＡを鋳型として、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を基にしたプライマーとマウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡの３’下流塩基配列を基にしたプライマーでＰＣＲ増幅を行なうことにより、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡをクローニングした。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液は、マウス脳ｃＤＮＡ　０．５μｌ、配列番号：８７の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、配列番号：８８の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、１．６　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝酒造）０．２μｌおよび酵素に付属のＧＣ（Ｉ）バッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６４℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを４０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約７００塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡを、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：８９に示すＤＮＡ配列を得た。この配列（配列番号：８９）は，マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質をコードするため、このＤＮＡを含むプラスミドで形質転換した大腸菌をＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯマウスＧＰＲ８リガンド前駆体（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　Ｍｏｕｓｅ　ＧＰＲ８　Ｌｉｇａｎｄ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）と命名した。
配列番号：８９に示すＤＮＡ配列には、参考例１０に記載のＧＰＲ８発現細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合活性を指標にブタ視床下部より単離されたＧＰＲ８リガンドペプチドのアミノ酸配列分析によって明らかにされたアミノ末端から１７残基までの配列と５残基目および１７残基目のアミノ酸のみが異なる類似したアミノ酸配列をコードするようなフレームが存在する。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体の場合と同様に、その５’上流側にはタンパク質翻訳の開始コドンであると予想されるＡＴＧが存在しない。しかし、ヒトＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質において推測されたように、ブタあるいはラットのＧＰＲ８リガンドホモログの前駆体タンパク質との比較からこれらの前駆体タンパク質における開始コドンと予想されるＡＴＧにほぼ対応する位置に存在するＣＴＧコドンを開始コドンと仮定し、マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質の配列を推定した。この仮想的マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：９０に示した。マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列と予想される配列のカルボキシ末端側にはＧＰＲ８リガンドペプチドのヒト、ブタあるいはラットホモログ前駆体タンパク質の場合と同様に、通常の生理活性ペプチドが切り出されると考えられるＡｒｇ−Ａｒｇの配列（Ｓｅｉｄａｈ，　Ｎ．　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎｎ．　Ｎ．　Ｙ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、８３９巻、９−２４頁、１９９８年）が２ヶ所存在した。これらのことから、ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログのアミノ酸配列は配列番号：９１および９２のいずれかもしくは両方であると推定された。なお、配列番号：９１の２３残基型マウスＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列は、２３残基型ラットＧＰＲ８リガンドのアミノ酸配列（配列番号：７３）と一致している。仮想的マウスＧＰＲ８リガンド前駆体タンパク質のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図９に示した。
【０１２６】
参考例４２　ラクトパーオキシダーゼ法を用いた　［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の作製
ＤＭＳＯ　５μｌに溶かしたｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）（配列番号：１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）１　ｎｍｏｌを０．１　Ｍ塩化ニッケル５μｌと混合し、　０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７）に溶かした　０．００１％過酸化水素水　１０μｌ、０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７）に溶かしたラクトパーオキシダーゼ　（シグマ社）　１０μｇ／ｍｌを１０μｌおよび　［１２５Ｉ］　ＮａＩ　３７　ＭＢｑ　（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社）　１０μｌを混合後、室温で６０分反応し、以下の条件でＨＰＬＣ分取した。
用いたカラムは、ＯＤＳ−８０ＴＭ　（４．６　ｍｍ　ｘ　１５　ｃｍ）（トーソー社）、溶出液Ａとして１０％アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡ、溶出液Ｂとして６０％アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡを用い、０−０　（２　ｍｉｎ）、０−３０　（３　ｍｉｎ）、３０−３８　（５　ｍｉｎ）、３８−４３　（５５　ｍｉｎ）％Ｂ／Ａ＋Ｂのグラディエント溶出法を行なった。流速は１　ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は２５℃、検出は２２０ｎｍの吸光度を用いて行った。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）には、チロシン残基が２つ存在するので、ヨード化によって、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）および　［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）が生成する。このＨＰＬＣ条件では、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）が２４分、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）が３０分、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）が３２分付近に溶出した。
【０１２７】
参考例４３　［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いた受容体結合実験
参考例４２に記載したように作製した［１２５Ｉ］−標識ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）および参考例６に記載した方法と同様にしてヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
ヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．０５％　ＣＨＡＰＳ（３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン硫酸）、０．１％　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、０．２５　ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ　７．４）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５３）に２００μｌずつ分注した。最大結合量（ＴＢ）を測定するために２μｌのＤＭＳＯと７　ｎＭの［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）または［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）　２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合（ＮＳＢ）を測定するために１００μＭ　ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＤＭＳＯ溶液２μｌと７　ｎＭの［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）または［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）　２μｌを膜画分溶液に添加した。２５℃で６０分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ−カウンターを用いてろ紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量（ＳＢ）を見積もった。［１２５Ｉ−Ｔｙｒ２］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いた場合に比べて［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いた方が、特異的結合量が２倍多かったので実際の結合実験には［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いた。膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の特異的な結合が認められた。また、膜画分濃度を５μｇ／ｍｌに設定して阻害率（％）からｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ＩＣ５０値は０．２５　ｎＭであった。図１０に種々の濃度におけるｈＧＰＲＬ（１−２３）の結合阻害を示す。
【０１２８】
参考例４４　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）酸化体：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：９５）の製造
参考例１２の化合物０．４５　ｍｇを　５０％酢酸水０．５　ｍｌに溶解後、０．３％過酸化水素水０．０５　ｍｌを加え、室温にて８時間放置した。減圧濃縮後ＳｅｐＰａｋにより精製し、白色粉末０．４４３　ｍｇを得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：２５９９．２　（計算値２５９９．４）
ＨＰＬＣ溶出時間：１９．１分
溶出条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜０／７０へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１２９】
参考例４５　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２２）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号：９６）の製造
市販　２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３　ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３０】
参考例４６　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２１）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（配列番号：９７）の製造市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｍｅｔを導入したのち参考例−１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３１】
参考例４７　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２０）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号：９８）の製造
市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｌｅｕを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるＭ＋　：２２８２．８　（計算値２２８２．６）
ＨＰＬＣ溶出時間：１７．２分
溶出条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜０／７０へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１３２】
参考例４８　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−１９）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：９９）の製造
市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｌｅｕを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるＭ＋　：２１６９．６（計算値２１６９．５）
ＨＰＬＣ溶出時間：１６．４分
溶出条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜０／７０へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１３３】
参考例４９　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−１８）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号：１００）の製造
市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｇｌｙを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析によるＭ＋　：２０５６．８（計算値２０５６．３）
ＨＰＬＣ溶出時間：１４．２分
溶出条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜０／７０へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１３４】
参考例５０　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−１７）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：１０１）の製造
市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ａｌａを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３５】
参考例５１　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−１６）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号：１０２）の製造
市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ、１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ａｌａを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
【０１３６】
参考例５２　ブタＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：５６）の製造
市販２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ　ｒｅｓｉｎ　（Ｃｌｔ　ｒｅｓｉｎ，１．３３ｍｍｏｌ／ｇ）にＦｍｏｃ−Ｌｅｕを導入したのち参考例１３と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：２５８５．２　（計算値２５８５．４）
ＨＰＬＣ溶出時間：２０．２分
溶出条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜０／７０へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１３７】
参考例５３　ラット／マウスＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕの製造（配列番号：７３および配列番号：９１）
参考例５２と同様に配列順にアミノ酸の縮合と樹脂からの切り出し、精製を行ない目的物を得ることができる。
【０１３８】
参考例５４　ブタＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）酸化体：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０３）の製造
参考例５２の化合物を用い参考例４４と同様に酸化して目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋：２６０１．３　（計算値２６０１．４）
ＨＰＬＣ溶出時間：１８．９分
溶出条件
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８ＨＧ　（４．６　ｘ　１００　ｍｍ）
溶離液：Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、Ａ／Ｂ：　１００／０〜０／７０へ直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速：１．０　ｍｌ／分
【０１３９】
参考例５５　ラット／マウスＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）酸化体：Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０４）の製造
参考例５３の化合物を用い参考例４４と同様に酸化して目的物を得ることができる。
【０１４０】
参考例５６　［Ｎα−Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｒｐ１］−ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）：Ａｃ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０６）の製造
参考例１２で調製した樹脂のＦｍｏｃ基を除去、無水酢酸でアセチル化した後、ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／　ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による　（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２６２６．１２６２５．８　（計算値２６２７．１２６２６．１）
ＨＰＬＣ溶出時間　２１．４分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４１】
参考例５７　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（２−２３）：　Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０７）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のＴｙｒを導入後樹脂から切り出す前にＦｍｏｃ基を樹脂上で除去したのち、　ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２３９７．１　（計算値２３９７．３）
ＨＰＬＣ溶出時間　１９．９分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４２】
参考例５８　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（４−２３）：　Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０８）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のＨｉｓを導入後樹脂から切り出す前にＦｍｏｃ基を樹脂上で除去したのち、　ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２１０６．０　（計算値２１０６．１）
ＨＰＬＣ溶出時間　２０．０分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４３】
参考例５９　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（９−２３）：　Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１０９）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のＡｒｇを導入後樹脂から切り出す前にＦｍｏｃ基を樹脂上で除去したのち、　ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　１６１５．０　（計算値１６１４．９）
ＨＰＬＣ溶出時間　２０．２分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４４】
参考例６０　ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１５−２３）：　Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１１０）の製造
参考例１２と同様に所望のアミノ酸配列を樹脂に導入した。最後のＡｒｇを導入後樹脂から切り出す前にＦｍｏｃ基を樹脂上で除去したのち、　ＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　９０１．４　（計算値９０１．５）
ＨＰＬＣ溶出時間　２０．２分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４５】
参考例６１　［Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｔｙｒ２］−ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（２−２３）：Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１１１）の製造
参考例５７で調製した樹脂を無水酢酸でアセチル化した後、参考例５７と同様に処理、精製し目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２４３９．３　（計算値２４３９．３）
ＨＰＬＣ溶出時間　２０．２分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４６】
参考例６２　［Ｄ−Ｔｒｐ１］−ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（１−２３）：Ｄ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１１２）の製造
参考例１２のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の代りにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）を用い同様に目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２５８３．４　（計算値２５８３．４）
ＨＰＬＣ溶出時間　２０．６分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４７】
参考例６３　［Ｎ−３−Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｐａｎｏｙｌ−Ｔｙｒ２］−ヒトＧＰＲ８　ｌｉｇａｎｄ　（２−２３）：３−Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｐａｎｏｙｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：１１３）の製造
参考例１２のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）の代りに３−Ｉｎｄｏｌｅｐｒｏｐｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄを用い所望の樹脂を得、これをＴＦＡ　／　ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ　／　ｍ−ｃｒｅｓｏｌ　／　ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ　／　ｅｔｈａｎｅｄｉｔｈｉｏｌ　　（８５　／　５　／　５　／　２．５　／　２．５）で処理し樹脂からの切り出しと側鎖保護基の除去を同時に行った。粗ペプチドを参考例１２と同様の方法で精製し目的物を得た。
質量分析による（Ｍ＋Ｈ）＋　　　２５６８．４　（計算値２５６８．４）
ＨＰＬＣ溶出時間　２１．７分
溶出条件
カラム　Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　５Ｃ１８　ＨＧ　　　（４．６　ｘ　１００ｍｍ）
溶離液　Ａ液：　０．１％ＴＦＡ−水、Ｂ液：　０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルを用い、　Ａ／Ｂ：　１００　／　０〜　３０　／　７０へ　直線型濃度勾配溶出（３５分）
流速　１．０ｍｌ／分
【０１４８】
参考例６４　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のＧＴＰγＳ結合促進活性
本明細書に合成法を記載したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体を種々の濃度で参考例６に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与してＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。測定した誘導体の配列番号とＧＴＰγＳ結合促進活性を表１に示した。なお、活性は５０％有効濃度（ＥＣ５０値）で示した。また、参考例２０および２１に記載のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＧＴＰγＳ結合促進活性も合わせて記載した。
【０１４９】
参考例６５　ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体の受容体結合活性
本明細書に合成法を記載したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体の受容体結合活性を参考例４３に記載した方法でＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定した。測定した誘導体の配列番号と受容体結合活性を表１に示した。なお、受容体結合活性は５０％結合阻害濃度（ＩＣ５０値）で示した。また、参考例４３に記載のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の受容体結合活性も合わせて記載した。
【０１５０】
【表１】
2004002295.tif 000005
【０１５１】
参考例６６　ラット全脳由来Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ラット全脳ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を鋳型とし、ヒトＧＰＲ８をコードするＤＮＡの塩基配列を元に設計した２個のプライマー、プライマー１（配列番号：１２８）およびプライマー２（配列番号：１２９）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記ｃＤＮＡを１０分の１量鋳型として使用し、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−２　ｃＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）１／５０量、プライマー３　０．２μＭ、プライマー２　０．２μＭ、ｄＮＴＰｓ　２００μＭ、および酵素に添付のバッファーを加え、２５μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、（ｉ）９４℃・２分の後、（ｉｉ）９４℃・２０秒、７２℃・２分のサイクルを３回、（ｉｉｉ）９４℃・２０秒、６６℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３回、（ｉｖ）９４℃・２０秒、６０℃・２０秒、６８℃・２分のサイクルを３６回繰り返し、最後に６８℃・７分の伸長反応を行った。該ＰＣＲ反応後の反応産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の処方に従い、プラスミドベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングした。これを大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で、ｃＤＮＡを持つクローンを選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列番号：１２７）を得た。このＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：１２６）を含有する新規Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をＴＧＲ２６と命名した（本明細書中、ラットＴＧＲ２６とも称する）。
配列番号：１２６で表されるアミノ酸配列は、既知のヒトＧタンパク質共役型レセプタータンパク質であるＧＰＲ７〔ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），２８巻，８４−９１頁，１９９５年〕との間に８４．８％の相同性を有していた。
ＴＧＲ２６をコードするＤＮＡを挿入したプラスミドを有する前述した形質転換体から１クローンを選択し、アンピシリンを含むＬＢ培地で振とう培養し、プラスミドを得た。これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理し、ＴＧＲ２６をコードするインサート部分を切り出した。同様に制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅＩで処理したｐＡＫＫＯ−１．１１ＨおよびＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ１０Ｂにエレクトロポーレーション法にて導入した。得られたクローンについては、有する発現細胞構築用プラスミドの構造を、制限酵素処理および配列解析で確認したうえ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７と命名した。
ＴＧＲ２６の疎水性プロット図を〔図１１〕に示す。
【０１５２】
参考例６７　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例６６に記載の発現プラスミドｐＡＫ−ｒＧＰＲ７で形質転換したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（東洋紡）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫ−ｒＧＰＲ７プラスミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。５μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、４８時間前に３×１０５個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６ｃｍシャーレ２枚に添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー４４クローンを選択した。
【０１５３】
参考例６８　ＴａｑＭａｎＰＣＲ法を用いたＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞株のＴＧＲ２６発現量の定量
参考例６７で得たＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞株４４クローンを、各２５ｃｍ２フラスコに培養し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔｓ（キアゲン）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した後、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（キアゲン）を用いてＤＮａｓｅ処理をした。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　４μｇをランダムプライマー（宝酒造）５００ｐｍｏｌを含む溶液１２μｌとして７０℃で１０分間処理した後氷冷し、さらに１ｘＦｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　Ｂｕｆｆｅｒ、１０　ｍＭ　ＤＴＴ、５００μＭ　ｄＡ／ｄＣ／ｄＧ／ｄＴＴＰおよび２００　ｕｎｉｔｓ　ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ　ＩＩ（ギブコ）を添加し、混合液２０μｌを、３０℃・１０分、４２℃・６０分、５１℃・３０分、７０℃・１５分で処理することにより逆転写反応を行なった。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　５ｎｇ相当の逆転写産物、または後に述べるようにして作製した１０〜１×１０７コピーの標準ｃＤＮＡ、１ｘＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＰＥバイオシステムズ）、配列番号：１３０で表されるプライマーおよび配列番号：１３１で表されるプライマー各１００ｎＭ、および配列番号：１４０（Ｆａｍ−ｔｃｃｔｃｔｇｃｔｇ　ｇａｃａｃｃｇｔａｃ　ｃａｃｃｔｇａ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅを、それぞれ示す。）で表されるＴａｑＭａｎプローブ　１００ｎＭを含む反応混合液２５μｌについてＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＰＥバイオシステムズ）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、５０℃・２分、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。
標準ｃＤＮＡは、１００ｐｇのＴＧＲ２６発現プラスミドＤＮＡ（ｐＡＫ−ｒＧＰＲ７）、配列番号：１３０で表されるプライマーおよび配列番号：１３１で表されるプライマー各５００ｎＭ、１ｘＰＣＲ　Ｇｏｌｄ　Ｂｕｆｆｅｒ、２．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００μＭ　ｄＡ／ｄＣ／ｄＧ／ｄＴＴＰおよび２０ｕｎｉｔｓ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（ＰＥバイオシステムズ）を含む反応混合液２００μｌを、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ＰＥバイオシステムズ）を用いて、９５℃・１０分で処理後、９５℃・１０秒、６３℃・１５秒、７２℃・１０秒のサイクルを４０回繰り返す条件のＰＣＲを行なって増幅して調製した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製した合成ｃＤＮＡの２６０ｎｍの吸光度を測定して濃度を算出し、さらに標準ｃＤＮＡの正確なコピー数を算出した後、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で希釈し、１ｘ１０８コピー／μｌの濃度の標準ｃＤＮＡ溶液を調製した。また、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ用プローブおよびプライマーはＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．０）（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。
発現量はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、標準ｃＤＮＡの初期濃度の対数値を横軸にとり、標準曲線を作成した。標準曲線より各逆転写産物の初期濃度を算出し、各クローンのｔｏｔａｌ　ＲＮＡ当たりのＴＧＲ２６遺伝子発現量を求めた。その結果、ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞株クローン番号１８および２８が高い発現量を示すことがわかった。以後の実験にはこれら２つのクローンの発現細胞を用いた。
【０１５４】
参考例６９　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定
参考例６８で作製したＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭαバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した〔以下、０．２ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％　ＢＳＡおよび２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭαバッファー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ〕。その後、０．５ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料と２μＭフォルスコリンを含む０．２５ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で３０分間反応させた。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量はｃＡＭＰ　ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【０１５５】
参考例７０　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した２３残基または３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
参考例で得られた２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログ（以下、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）と記載することがある）または参考例で得られた３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログ（以下、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）と記載することがある）を、種々の濃度で参考例６９に記載した方法でＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与し、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。
結果を〔図１２〕に示す。
これより明らかに、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。
図中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
これより、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）が、ＴＧＲ２６に対するリガンドであることが明らかとなった。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のブタ、ラットおよびマウスのホモログおよびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットおよびマウスのホモログを用いても、上記と同様に、濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞細胞内ｃＡＭＰの産生抑制を確認できる。
【０１５６】
参考例７１　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する［３５Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＧＴＰγＳ）の結合促進活性を以下の方法により測定した。
１）膜画分の調製法
１ｘ１０８個のＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞に１０ｍｌのホモジネートバッファー（１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌロイペプチン）を添加し、ポリトロン（１２，０００ｒｐｍ、１分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００ｇ、１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｔｙｐｅ　３０ローター、３０，０００ｒｐｍ、１時間）し、得られた沈殿物をＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
２）ＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１μＭ　ＧＤＰ、０．１％　ＢＳＡ）で希釈して、タンパク質濃度３０μｇ／ｍｌのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用膜画分溶液２００μｌに、５０ｎＭ濃度の［３５Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ社）を２μｌと適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料２μｌとを添加し、この混合液を２５℃で１時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＢＳＡ）１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０１５７】
参考例７２　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定した２３残基または３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログのＧＴＰγＳ結合促進活性
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を種々の濃度で、参考例７１に記載した方法に従い、ＴＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分と混合し、ＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。
結果を〔図１３〕に示す。
これより明らかに、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のブタ、ラットおよびマウスのホモログおよびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットおよびマウスのホモログを用いても、上記と同様に、濃度依存的にＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合促進を確認できる。
【０１５８】
参考例７３　［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いたレセプター結合実験
参考例４２に記載した方法により作製した［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）および参考例７１に記載したＴＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いて以下のようにしてレセプター結合実験を行なった。
ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン硫酸）、０．１％　ＢＳＡ、０．５　ｍＭ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４、ｐＨ　７．４）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５３）に２００μｌずつ分注した。最大結合量を測定するために２μｌのＤＭＳＯと７ｎＭの［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合を測定するために１００μＭ　ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＤＭＳＯ溶液２μｌと７ｎＭの［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）２μｌを膜画分溶液に添加した。２５℃で７５分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過しさらにフィルターを洗浄用バッファー（２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＣＨＡＰＳ、０．１％　ＢＳＡ、ｐＨ　７．４）１．５　ｍｌで２回洗浄した。ろ過後、γ−カウンターを用いてろ紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量を見積もった。
膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の特異的な結合が認められた。膜画分濃度を３μｇ／ｍｌに設定してｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）による［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＴＧＲ２６発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害を調べた。阻害率から５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＩＣ５０値は０．１２ｎＭであった。また、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＩＣ５０値は０．０２８ｎＭであった。
これより、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）がＴＧＲ２６発現細胞膜画分に対して高い親和性を有することが示された。このことは、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）がＴＧＲ２６レセプターの高親和性リガンドであることを意味するものである。
〔図１４〕に種々の濃度におけるｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害を示す。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットおよびマウスのホモログおよびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットおよびマウスのホモログを用いても、上記と同様に、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＴＧＲ２６発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害を確認できる。
【０１５９】
参考例７４　ＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のレセプター結合活性
参考例で得られたＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のレセプター結合活性を、参考例７３に記載した方法でＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞膜画分および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定した。測定した誘導体とレセプター結合活性を表２に示す。レセプター結合活性は、５０％結合阻害濃度（ＩＣ５０値）で示した。
【０１６０】
【表２】
2004002295.tif 000006
【０１６１】
参考例７５　マウスＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの５’上流端のクローニング
５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングによりマウスＴＧＲ２６をコードするｃＤＮＡの５’上流塩基配列を明らかにした。
５’ＲＡＣＥ　ＰＣＲクローニングは、参考例に記載のマウス脳ｃＤＮＡを鋳型としてＳＭＡＲＴＴＭ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔに添付のＵｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘと配列番号：１３２の合成プライマーでＰＣＲ反応を行ない、次にこのＰＣＲ反応液を鋳型としてキットに添付のＮｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒと配列番号：１３３の合成プライマーでＰＣＲ反応を行なうことにより達成された。配列番号：１３２および配列番号：１３３のプライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋに登録のマウスＧＰＲ７ｃＤＮＡ断片配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｕ２３８０７）を基に設計した。ＰＣＲの反応液組成と反応条件は以下のとおりである。反応液はマウス脳ｃＤＮＡ１μｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｍｉｘ２μｌ、配列番号：１３２の合成ＤＮＡプライマー０．２μＭ、０．８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６８℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。次に、キットに添付のＴｒｉｃｉｎｅ−ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５０倍希釈したＰＣＲ反応液０．５μｌ、Ｎｅｓｔｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｐｒｉｍｅｒ０．５μＭ、配列番号：１３３の合成ＤＮＡプライマー０．５μＭ、０．８ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ　２ポリメラーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）０．４μｌおよび酵素に付属のバッファーで総反応量を２０μｌとし、サーマルサイクラー（ＰＥバイオシステムズ）を用い、９６℃・１２０秒の加熱の後、９６℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・６０秒のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃で１０分間保温した。増幅したＤＮＡを１．５％のアガロースゲル電気泳動により分離した後、約４５０塩基長のＤＮＡをカミソリで切り出し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて回収した。このＤＮＡをＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。これをエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＴＯＰ１０　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入して形質転換した後、ｃＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。塩基配列の決定のための反応はＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、配列番号：１３４で表される塩基配列を得た。
【０１６２】
参考例７６　ヒト染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によるヒトＧＰＲ７　ＤＮＡの増幅
ヒト染色体ＤＮＡを鋳型として、２種の合成プライマー（配列番号：１４１および配列番号：１４２）を用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅を行なった。合成プライマーは受容体タンパク質に翻訳される領域の遺伝子が増幅されるように構築したが、その際に遺伝子の５’側に制限酵素Ｃｌａ　Ｉの認識する塩基配列が付加され、３’側に制限酵素Ｓｐｅ　Ｉの認識する塩基配列が付加されるように、５’側および３’側にそれぞれの制限酵素の認識配列を付加した。反応液の組成は、ヒト染色体ＤＮＡ（タカラ）０．５μｇ、合成ＤＮＡプライマー各１μＭ、０．８　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＫＯＤポリメラーゼ（トーヨーボー）１μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μｌとした。増幅のためのサイクルはサーマルサイクラー（タカラ）を用い、９４℃・６０秒の加熱の後、９８℃・１５秒、６５℃・２秒、７４℃・３０秒のサイクルを３５回繰り返した。増幅産物の確認は、０．８％アガロースゲル電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色によって行なった。
【０１６３】
参考例７７　ＰＣＲ産物のプラスミドベクターへのサブクローニングおよび挿入ＤＮＡ部分の塩基配列の解読による増幅ＤＮＡ配列の確認
参考例７６で行なったＰＣＲ反応液を０．８％の低融点アガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作を行なってＤＮＡを回収した。ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＴＭ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）クローニングキット（ストラタジーン）の処方に従い、回収したＤＮＡをプラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）へサブクローニングした。これをエシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＤＨ５αｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（トーヨーボー）に導入して形質転換した後、ＤＮＡ挿入断片を持つクローンをアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地で選択し、白色を呈するクローンのみを滅菌したつま楊枝を用いて分離し、形質転換体Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α／ＧＰＲ７を得た。個々のクローンをアンピシリンを含むＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡｗｅｌｌ　８　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡの一部に対して制限酵素Ｃｌａ　ＩおよびＳｐｅ　Ｉによる切断を行ない、挿入されている受容体ＤＮＡ断片の大きさを確認した。塩基配列の決定のための反応はＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行ない、蛍光式自動シーケンサーを用いて解読した（配列番号：１４３）。配列番号：１４３で表される塩基配列を有するＤＮＡを保持するｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）プラスミドを、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔヒトＧＰＲ７と命名した。配列番号：１４３で表される塩基配列を有するＤＮＡがコードするヒトＧＰＲ７のアミノ酸配列を配列番号：１４４に示した。ここで配列を決定したヒトＧＰＲ７のＤＮＡ配列はＯ’Ｄｏｗｄらの報告（Ｏ’Ｄｏｗｄ，　Ｂ．　Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２８巻、８４−９１頁、１９９５年）にあるＤＮＡ配列とは２塩基が異なっていた。これらは配列番号：１４３の８９３番目および８９４番目に当たり、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告ではそれぞれＣおよびＧであるが、本参考例ではＧおよびＣであった。これにより、翻訳されるアミノ酸配列において配列番号：１４４の２９６番目のアミノ酸が、Ｏ’Ｄｏｗｄらの報告のＴｈｒが本参考例ではＳｅｒとなる。
【０１６４】
参考例７８　ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の作製
参考例７７で配列が確認されたヒトＧＰＲ７の全長アミノ酸配列をコードし５’側にＣｌａ　Ｉ認識配列を付加し、また３’側にＳｐｅ　Ｉ認識配列を付加した遺伝子が導入されたプラスミドによって形質転換されたＥ．　ｃｏｌｉのクローンからＰｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　ＫＩｔ（キアゲン）を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、これを制限酵素ＣｌａＩおよびＳｐｅ　Ｉで消化してインサートＤＮＡを切り出した。インサートＤＮＡは電気泳動後、アガロースゲルからカミソリで切り出し、次に細片化、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿の操作により回収された。このインサートＤＮＡをＣｌａＩおよびＳｐｅ　Ｉで切断した動物細胞発現用ベクタープラスミドｐＡＫＫＯ−１１１Ｈ（Ｈｉｎｕｍａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ、１２１９巻、２５１−２５９頁、１９９４年、記載のｐＡＫＫＯ１．１１Ｈと同一のベクタープラスミド）に加え、Ｔ４ライゲース（タカラ）を用いてライゲーションを行ない、タンパク質発現用プラスミドｐＡＫＫＯ−Ｈｕｍａｎ　ＧＰＲ７を構築した。このプラスミドｐＡＫＫＯ−Ｈｕｍａｎ　ＧＰＲ７で形質転換した大腸菌をＤＨ５α／ｐＡＫＫＯ−Ｈｕｍａｎ　ＧＰＲ７と命名した。
ｐＡＫＫＯ−Ｈｕｍａｎ　ＧＰＲ７で形質転換したＥ．　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（トーヨーボー）を培養後、Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてｐＡＫＫＯ−Ｈｕｍａｎ　ＧＰＲ７プラスミドＤＮＡを調製した。これをＣｅｌｌＰｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて、添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。３μｇのＤＮＡをリン酸カルシウムとの共沈懸濁液とし、２４時間前に５　ｘ　１０５または１　ｘ　１０６個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６　ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、継代し、選択培地である１０％透析ウシ胎児血清を含む核酸不含ＭＥＭα培地で培養した。選択培地中に増殖してくるＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞である形質転換細胞のコロニー２４クローンを選択した。
【０１６５】
参考例７９　ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞株のヒトＧＰＲ７遺伝子発現量の測定
参考例７８に従って作製したヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞株２４クローンを各２５　ｃｍ２フラスコに培養し、増殖した細胞からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡ画分を調製した。このｔｏｔａｌ　ＲＮＡ画分に対してＭｅｓｓａｇｅＣｌｅａｎ　（Ｇｅｎ　Ｈｕｎｔｅｒ社）キットを用いたＤＮａｓｅ　Ｉ処理を行ない、ＤＮＡを含まないｔｏｔａｌ　ＲＮＡを得た。
Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成は、ＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）キットを用いて行なった。反応液の組成は、ＤＮａｓｅ　Ｉ処理したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　４μｇ、ランダムプライマー１μｌ、２５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２溶液４．４μｌ、１０　ｍＭ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘ　２μｌ、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　０．４μｌ、逆転写酵素０．５μｌおよびキットに付属の反応バッファーで、総反応量を２０μｌとした。逆転写反応はサーマルサイクラー（タカラ）を用いて、２５℃・１０分、４８℃・３０分、９５℃・５分の条件で行なった。
標準ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡは、全長ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅ＤＮＡを精製することにより調製された。ＰＣＲ反応液の組成は、参考例７７に記載のｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔヒトＧＰＲ７　５ｐｇ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１４５）０．５μＭ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１４６）０．５μＭ、１．６　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、２．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＬＡＴａｑポリメラーゼ（タカラ）０．５μｌおよび酵素に付属のバッファーで、総反応量は５０μｌとした。増幅のための反応はサーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、９４℃・１２０秒の加熱の後、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・６０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃・１０分間保温した。ＰＣＲ反応液を０．８％のアガロースゲル電気泳動により分離し、バンドの部分をかみそりで切り出した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてＰＣＲ増幅ＤＮＡを回収した。このＰＣＲ増幅ＤＮＡ溶液に混入しているプライマーＤＮＡおよびｄＮＴＰｓを取り除くため、このＤＮＡ溶液をクロモスピンカラム４００（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）ゲルクロマトグラフィーに供し、増幅ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡ溶出画分を得た。この増幅ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡ溶液の２６０　ｎｍの吸収から計算されたＤＮＡ量と増幅ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡ塩基組成から、本増幅ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡ溶液に含まれるＤＮＡのコピー数が算出された。このＤＮＡコピー数が明らかとなった増幅ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡを標準ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡとして、定量を目的としたＴａｑＭａｎ　ＰＣＲに用いることにした。
【０１６６】
ヒトＧＰＲ７ＣＨＯ細胞株の発現ヒトＧＰＲ７遺伝子コピー数は、ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法により決定された。ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ反応液の組成は、蒸留水で１００倍希釈した逆転写ｃＤＮＡ溶液　１μｌまたは種々のコピー数の標準ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡ溶液　１μｌ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１４７）０．２μＭ、合成ＤＮＡプライマー（配列番号：１４８）０．２μＭ、ヒトＧＰＲ７　ＴａｑＭａｎプローブ〔配列番号：７７（Ｆａｍ−ＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡ　ＡＣＣＴＧＧＣＣＡＴ　ＣＧＣ−Ｔａｍｒａ；配列中、Ｆａｍは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを、Ｔａｍｒａは６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅを、それぞれ示す。）で表される塩基配列を有するプローブ〕０．２μＭおよびＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で、総反応量を２５μｌとした。ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、５０℃・２分、９５℃・１０分で保温し、次に９５℃・１５秒、６０℃・６０秒のサイクルを４０回繰り返すことにより行なった。ヒトＧＰＲ７遺伝子発現量はＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００　ＳＤＳソフトウェアによって算出した。リポーターの蛍光強度が、設定された値に達した瞬間のサイクル数を縦軸にとり、種々の標準ヒトＧＰＲ７　ＤＮＡのコピー数の対数値を横軸にとって標準曲線を作成した。標準曲線より逆転写ｃＤＮＡに含まれるヒトＧＰＲ７　ｃＤＮＡのコピー数を算出し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ１ｎｇ当たりのヒトＧＰＲ７遺伝子発現量を決定した。ヒトＧＰＲ７遺伝子発現量の高いクローンＮｏ．　７，　８および　１４を、ヒトＧＰＲ７遺伝子高発現細胞株として選択した。
【０１６７】
参考例８０　ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を用いた細胞内ｃＡＭＰ産生量の測定
参考例７８で作製し、参考例７９に記載したようにして選択したヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに５　ｘ　１０４　ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌで播種し、４８時間培養した。細胞を０．２　ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％　　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭαバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄した（以下、０．２ｍＭ　３−イソブチル−メチルキサンチン、０．０５％　　ＢＳＡおよび２０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むＭＥＭαバッファー（ｐＨ７．４）を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後０．５　ｍｌの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温した。反応用バッファーを除き、新たに０．２５　ｍｌの反応用バッファーを細胞に加えた後、適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料と２μＭフォルスコリンを含む０．２５　ｍｌの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で３０分間反応させた。１００μｌの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより細胞内ｃＡＭＰを抽出した。抽出液中のｃＡＭＰ量は、　ｃＡＭＰ　ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定した。
【０１６８】
参考例８１　ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞を用いて測定した２３残基または３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログの細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を種々の濃度で、参考例８０に記載した方法に従い、ヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に投与して細胞内ｃＡＭＰ産生抑制活性を測定した。結果を図１５に示す。図中、ｃＡＭＰ合成抑制活性は、フォルスコリンを含む反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を１００％として、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を加えたときの細胞内ｃＡＭＰ量から反応用バッファーを添加したときの細胞内ｃＡＭＰ量を減じた量を％として表わした。
明らかにｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞細胞内ｃＡＭＰの産生を抑制した。このことからｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）が、ヒトＧＰＲ７に対するリガンドであることが明らかとなった。ｃＡＭＰ産生量から５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＩＣ５０値は０．０２５　ｎＭであった。また、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＩＣ５０値は０．１３ｎＭであった。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のブタ、ラットおよびマウスのホモログおよびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットおよびマウスのホモログを用いても、上記と同様にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の反応を確認できる。
【０１６９】
参考例８２　［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いた受容体結合実験
参考例４２に記載した方法により作製した［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
最初に膜画分の調製法を以下に記載する。
１ｘ１０８個のヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞に１０ｍｌのホモジネートバッファー（１０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ　ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオライド）、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ６４、２０μｇ／ｍｌ　ロイペプチン）添加し、ポリトロン（１２，０００ｒｐｍ、１分間）を用いて破砕した。細胞破砕液を遠心（１，０００ｇ、１５分間）して上清を得た。次にこの上清を超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｔｙｐｅ　３０ローター、３０，０００ｒｐｍ，１時間）し、得られた沈殿物をヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分とした。
かくして調製された細胞膜画分を、アッセイ用バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＣＨＡＰＳ（３−〔（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパン硫酸）、０．１％　ＢＳＡ、０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌ　ペプスタチン、２０μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４、ｐＨ７．４）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５３）に２００μｌずつ分注した。最大結合量を測定するために２μｌのＤＭＳＯと８　ｎＭの［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）　２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合を測定するために１ｍＭ　ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＤＭＳＯ溶液２μｌと８ｎＭの　［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）　２μｌを膜画分溶液に添加した。２５℃で７５分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過しさらにフィルターを洗浄用バッファー（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＣＨＡＰＳ、０．１％　ＢＳＡ、ｐＨ７．４）１．５ｍｌで２回洗浄した。ろ過後、γ−カウンターを用いてろ紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量を見積もった。
膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の特異的な結合が認められた。膜画分濃度を１０μｇ／ｍｌに設定してｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）による［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害を調べた。阻害率から５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＩＣ５０値は０．０９９ｎＭであった。また、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＩＣ５０値は０．０２５ｎＭであった。
これより、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）がヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分に対して高い親和性を有することが示された。このことは、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）がヒトＧＰＲ７受容体の高親和性リガンドであることを意味するものである。図１６に、種々の濃度におけるｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害を示す。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットおよびマウスのホモログおよびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットおよびマウスのホモログを用いても、上記と同様に［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のヒトＧＰＲ７発現細胞膜画分への特異的結合に対する結合阻害を確認できる。
【０１７０】
参考例８３
１）ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の膜画分を用いたＧＴＰγＳ結合活性の測定
ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に対する［３５Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＧＴＰγＳ）の結合促進活性を以下の方法により測定した。
参考例８２に記載の方法により調製したＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を膜希釈緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ、１μＭ　ＧＤＰ、０．１％　ＢＳＡ）で希釈して、タンパク質濃度３０μｇ／ｍｌのアッセイ用細胞膜画分溶液を調製した。アッセイ用膜画分溶液２００μｌに、５０　ｎＭ濃度の［３５Ｓ］−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ　５’−（γ−ｔｈｉｏ）ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＥＮ社）を２μｌと適当な濃度のＤＭＳＯ溶液とした試料２μｌとを添加し、この混合液を２５℃で１時間保温した。混合液をフィルター濾過し、さらにフィルターを洗浄用バッファー（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％　ＢＳＡ）１．５ｍｌで２回洗浄した後、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。
２）ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＧＴＰγＳ結合促進活性
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）またはｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を種々の濃度で、上記１）に記載した方法に従い、ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与し、ＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。
結果を図１７に示す。
これより明らかに、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）は濃度依存的にＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分のＧＴＰγＳ結合を促進した。
ＧＴＰγＳ結合促進活性から５０％有効濃度（ＥＣ５０値）を算出したところ、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のＥＣ５０値は０．７４ｎＭであった。また、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＥＣ５０値は０．６７ｎＭであった（表３）。
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットおよびマウスのホモログおよびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のブタ、ラットおよびマウスのホモログを用いても、上記と同様にヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞の反応を確認できる。
【０１７１】
参考例８４　ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体のＧＴＰγＳ結合促進活性
参考例で得られたＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体を、種々の濃度で、参考例８３に記載した方法でＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分に投与し、ＧＴＰγＳ結合促進活性を測定した。
測定した誘導体およびＧＴＰγＳ結合促進活性を表３に示す。活性は、５０％有効濃度（ＥＣ５０値）で示した。
【０１７２】
【表３】
2004002295.tif 000007
【０１７３】
参考例８５　ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定したＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体の受容体結合活性
参考例で得られたＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトおよびブタホモログの誘導体の受容体結合活性を、参考例８２に記載した方法でＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分および［１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］−ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を用いて測定した。
測定した誘導体のおよび受容体結合活性を表３に示す。受容体結合活性は５０％結合阻害濃度（ＩＣ５０値）で示した。
【０１７４】
実施例１
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の皮下への持続投与によるラット摂餌量および体重増加に対する作用
（１）摂餌量および体重増加に対する作用
Ｗｉｓｔａｒ雄性ラット（８週齢、日本チャールズリバー）を１週間ほどＭＦ粉末食（オリエンタル酵母（株））で馴化した。生理食塩水に１　ｍＭ濃度で溶解したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）〔ヒトＧＰＲ　８リガンド（１−２３）〕またはｖｅｈｉｃｌｅ群として生理食塩水を２００μｌ充填した浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ，　ＭＩＮＩ−ＯＳＭＯＴＩＣ　ＰＵＭＰ　Ｍｏｄｅｌ　２００１，放出速度；２４μｌ　／ｄａｙ）をペントバルビタール麻酔下の上記ラットの皮下（背中中央）に装着した（各ｎ＝６）。装着日の翌日を０日目とし、ＭＦ粉末食を自由摂食下８日目まで毎日８時と２０時に餌の量と体重を測定した。８時から２０時を明期、２０時から翌朝８時を暗期とした。８日目の８時に測定後断頭屠殺し、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、精巣、腎臓周囲の脂肪、性器周囲の脂肪および褐色脂肪の重量を測定した。動物は全て明期周期１２時間（明：８時から２０時）で飼育した。
摂餌量は、明期では両群での差が見られなかったが、暗期ではｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群はｖｅｈｉｃｌｅ群に比較していずれの測定時点においても減少傾向が見られ（図１８および１９）、１日の摂餌量の総量で減少が見られた（図２０）。体重（平均値±標準誤差）は、投与２日目以降から徐々に差が広がり投与７日目においてｖｅｈｉｃｌｅ群　３７８．４±　５．８　ｇに対してｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群は３６４．６±　６．０　ｇであった（図２１）。また、０日目から７日目までの体重の増加量はｖｅｈｉｃｌｅ群　３９．６±　４．１　ｇに対してｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群は２８．９±　３．２　ｇであり、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の１週間の皮下の持続投与により体重の増加が約１０．７ｇ抑制された（図２２）。
投与８日目の臓器重量を比較すると、ｖｅｈｉｃｌｅ群と比較してｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群では、肝臓（１．６　ｇの減少）ならびに白色脂肪組織である腎臓周囲脂肪（１．２　ｇの減少）および性器周囲脂肪（０．７　ｇの減少）においてそれぞれ０．５　ｇ以上の減少がみられた　（表４）。
【表４】
2004002295.tif 000008
以上の結果からｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の皮下投与によって摂餌量の減少および脂肪重量の低下を伴う体重増加抑制効果が認められた。
（２）血中グルコース、総コレステロールおよびトリグリセリドに対する作用
上記（１）のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群およびｖｅｈｉｃｌｅ群の投与８日目の血中グルコース、総コレステロールおよびトリグリセリドを富士ドライケムを用いて測定した。血中グルコース濃度（ｖｅｈｉｃｌｅ群；　１５０±４．９　ｍｇ／ｄｌ，　ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群；１５５±４．５　ｍｇ／ｄｌ）および血中総コレステロール濃度（ｖｅｈｉｃｌｅ群；　７３．６±２．４　ｍｇ／ｄｌ，ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群；６９．１±１．８　ｍｇ／ｄｌ）に両群の差は認められなかったが、血中トリグリセリド濃度（ｖｅｈｉｃｌｅ群；　１６８±８．９　　ｍｇ／ｄｌ，　ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群；１３４±２８　ｍｇ／ｄｌ）は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群において３０　ｍｇ／ｄｌ以上の低値を示した（図２３）。
以上の結果から、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の皮下投与によって血中トリグリセリド濃度の低下が認められた。
【０１７５】
実施例２
ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）の腹腔内投与によるラットの摂餌量および体重に対する作用
実施例１と同様にＷｉｓｔａｒ雄性ラット（８週齢、日本チャールスリバー）を１週間ほどＭＦ粉末食（オリエンタル酵母（株））で馴化した。生理食塩水に０．２　ｍｇ／ｍｌおよび２　ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）〔ヒトＧＰＲ　８リガンド（１−２３）〕またはｖｅｈｉｃｌｅ群として生理食塩水を１　ｍｌ／ｋｇの割合で暗期の開始直前（１９時４５分から２０時）に腹腔内投与を３日間行なった（各ｎ＝１０）。投与翌日の朝８時に摂餌量および体重を測定した。動物は全て８時から２０時を明期、２０時から翌朝８時を暗期とした明期周期１２時間で飼育した。
摂餌量は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）投与群において用量依存的に減少傾向を示し、２　ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与後３日ともｖｅｈｉｃｌｅ群と比較して有意な（ｐ＜＝０．０５またはｐ＜＝０．０１）減少を示した　（図２４）。
体重増加量は、２　ｍｇ／ｋｇ投与群において３日ともｖｅｈｉｃｌｅ群と比較して減少傾向を示した（平均値の差；１日目；　１．２　ｇ，　　２日目；　３．１　ｇ，　　３日目；　２．３　ｇ）（図２５）。
以上の結果から、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）は、腹腔内投与により暗期での摂餌量の減少および体重増加抑制効果が認められた。
【０１７６】
実施例３
［Ｐｈｅ２］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）：　Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号：１４９）の製造
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機（ＡＢＩ４３３モデル）を使用し、プログラムに従ってＣ端より逐次Ｆｍｏｃ法によりペプチド鎖を延長し目的の保護ペプチド樹脂の合成を行った。
出発アミノ酸樹脂担体はＷａｎｇ（ｐ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｂｅｎｚｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ）樹脂（０．２５　ｍｍｏｌ）を使用し、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）のＦｍｏｃアミノ酸誘導体をＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム　ヘキサフルオロホスフェート）によりシークエンスにしたがって逐次縮合した。
樹脂上へのペプチドの構築が終了後、保護ペプチド樹脂を乾燥した。得られた保護ペプチドの脱保護処理とペプチドの樹脂担体からの切り離しはＴＦＡ処理によって行なった。得られた粗ペプチドは０．１％　ＴＦＡ水によって抽出し、凍結乾燥により粉末固体として得た。続いて、粗ペプチドを逆相高速クロマトグラフィー（島津製作所、分取装置：モデルＬＣ８Ａ）によりアセトニトリル−０．１％　ＴＦＡ水の系（１５−３５％、８０分）を用いて分取精製を行なって目的とする精製ペプチド３５　ｍｇを得た。
精製物を０．２％３−（２−アミノエチル）インドールを含む４Ｎメタンスルホン酸によって１１０℃・２２時間の条件で加水分解して得た加水分解物のアミノ酸分析値は（括弧内は理論値）以下のとおり。
Ｔｈｒ　（１）　０．９３，　Ｓｅｒ　（１）　０．９２，　Ｇｌｙ　（２）　２．０３，　Ａｌａ　（３）　３．０９，　Ｖａｌ　（２）　１．９０，　Ｌｅｕ　（２）　２．０２，　Ｔｙｒ　（１）　１．０２，　Ｐｈｅ　（１）　１．００，　Ｈｉｓ　（２）　１．９１，　Ｌｙｓ　（１）　０．９８，　Ｔｒｐ　（１）　０．８８，　Ａｒｇ　（２）　２．０６，　Ｐｒｏ　（１）　１．０２
純度はＨＰＬＣにより９８．８％と算出された。また、質量分析値は２２６６．６（理論値２２６６．６）であった。
【０１７７】
実施例４
ラクトパーオキシダーゼ法を用いた［Ｐｈｅ２，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）の作製
ＤＭＳＯ　１０μｌに溶かした、実施例３に記載した製法に準じて得られた［Ｐｈｅ２］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）（配列番号：１４９）１０　ｎｍｏｌを、０．１　Ｍ塩化ニッケル水溶液１０μｌ、０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７．６）に溶かした０．００１％過酸化水素水１０μｌ、０．１　Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ　７．６）に溶かしたラクトパーオキシダーゼ　（シグマ社）　１０μｇ／ｍｌを１０μｌ、および［１２５Ｉ］ＮａＩ　４０　ＭＢｑ（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社）１０μｌを混合して室温で５０分間反応させた後、生成した［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）を以下の条件のＨＰＬＣにより分取した。
用いたカラムは、ＯＤＳ−８０ＴＭ　（４．６　ｍｍ　ｘ　１５　ｃｍ）（トーソー社）、溶出液Ａとして１０％アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡ、溶出液Ｂとして６０％アセトニトリル／０．１％　ＴＦＡを用い、０−０　（２　ｍｉｎ）、０−２７　（５　ｍｉｎ）、２７−３２　（４０　ｍｉｎ）　％Ｂ／Ａ＋Ｂのグラディエント溶出法を行なった。流速は１　ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃、検出は２１５　ｎｍとした。このＨＰＬＣ条件では、［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）は２５分付近に溶出した。
【０１７８】
実施例５
［Ｐｈｅ２，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）を用いた受容体結合実験
実施例４に記載した方法によって作製した［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）、参考例８２に記載した方法により調製されたＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分および参考例６に記載した方法により調製されたＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いて受容体結合実験を行なった。
ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞およびＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分をアッセイ用バッファー（２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＣＨＡＰＳ、０．１％　ＢＳＡ、０．５　ｍＭ　ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４μｇ／ｍｌ　Ｅ−６４、２０μｇ／ｍｌロイペプチン、ｐＨ　７．４）で各種濃度に希釈後、ポリプロピレン製試験管（Ｆａｌｃｏｎ　２０５３）に２００μｌずつ分注した。最大結合量を測定するために、２μｌのＤＭＳＯおよび７　ｎＭの［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）　２μｌを膜画分溶液に添加した。また、非特異的結合を測定するために１００μＭヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）のＤＭＳＯ溶液２μｌおよび７　ｎＭの［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）　２μｌを膜画分溶液に添加した。２５℃で７５分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ−カウンターを用いて濾紙上に残った放射活性を測定し、最大結合量から非特異的結合量を引いて特異的結合量を見積もった。膜画分の濃度を変化させると膜画分の濃度に依存した［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）の特異的な結合が認められた。
被験試料のＧＰＲ７受容体またはＧＰＲ８受容体に対する結合阻害活性（阻害率（％））は、最大結合量（ＴＢ）から被検試料および［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）を加えたときに濾紙上に残った放射活性（Ｘ）を減じた値の特異的結合量（ＳＢ）に対する比率（（ＴＢ−Ｘ）／ＳＢ　ｘ　１００　（％））で示される。
ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した膜画分について膜画分濃度を１５μｇ／ｍｌに設定して阻害率からヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）およびヒトＧＰＲ８リガンド（１−３０）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ＩＣ５０値はそれぞれ０．１３　ｎＭおよび０．０３９　ｎＭであった。図２６に種々の濃度におけるヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）およびヒトＧＰＲ８リガンド（１−３０）の結合阻害活性を示す。ＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した膜画分について膜画分濃度を５μｇ／ｍｌに設定して阻害率からヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）およびヒトＧＰＲ８リガンド（１−３０）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を算出したところ、ＩＣ５０値はそれぞれ０．１９　ｎＭおよび０．０３７　ｎＭであった。図２７に種々の濃度におけるヒトＧＰＲ８リガンド（１−２３）およびヒトＧＰＲ８リガンド（１−３０）の結合阻害活性を示す。
【０１７９】
実施例６
［Ｐｈｅ２，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）およびヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いたＧＰＲ７とＧＰＲ８リガンドの結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法
実施例４に記載した方法によって作製した［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）および参考例８２に記載した方法により調製されたＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞膜画分を用いた受容体結合実験によってＧＰＲ７とＧＰＲ８リガンドの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを実施した。
ＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いた上記の実施例５において、２μｌの試験化合物のＤＭＳＯ溶液および７　ｎＭの［Ｐｈｅ２，　１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）　２μｌを膜画分溶液に添加した。２５℃で７５分間反応させた後、ポリエチレンイミン処理したワットマングラスフィルター（ＧＦ−Ｆ）を用いて反応液を吸引ろ過した。ろ過後、γ−カウンターを用いて濾紙上に残った放射活性を測定し、試験化合物添加時の結合量を求めた。最大結合量からこの試験化合物添加時の結合量を減じた値を特異的結合量によって除した百分率を求め、試験化合物の結合阻害活性（％）を算出した。
結合阻害活性を示した試験化合物について、種々の濃度に調製した試験化合物を用いて結合阻害活性を測定し、５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を求めた。より低いＩＣ５０値を与える化合物をＧＰＲ７とＧＰＲ８リガンドとの結合をより強く阻害する化合物として選択した。
一方、結合阻害活性の値として負の値が得られる化合物をＧＰＲ７とＧＰＲ８リガンドとの結合を促進する化合物として選択した。
【０１８０】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡまたは本発明のポリペプチドは、例えば体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤または体重増加薬などのスクリーニングに、あるいは、体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤、体重増加剤として有用である。本発明のポリペプチドを用いるスクリーニング、好ましくは本発明の受容体も用いるスクリーニングで得られる体重増加抑制剤、体重減少剤、脂肪量増加抑制剤、摂食抑制剤は、安全で優れた医薬として用いられる。
【０１８１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｗａｋｏｓｉｌ−ＩＩ　３Ｃ１８ＨＧカラムを用いたＧＰＲ８リガンドの最終段階の精製におけるＨＰＬＣのＵＶ吸収（ａ）と各ピークのＧＴＰγＳ活性（ｂ）を示す。活性は矢印に示すピークに回収された。
【図２】種々の濃度の２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図３】種々の濃度の３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す。
【図４】種々の濃度の２３残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図５】種々の濃度の３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ８細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。
【図６】ＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのヒトホモログ前駆体受容体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのヒトホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図７】ＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのブタホモログ前駆体受容体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのブタホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図８】ＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのラットホモログ前駆体受容体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのラットホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図９】ＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ前駆体タンパク質ｃＤＮＡの全塩基配列およびそれから翻訳されるＧＰＲ８リガンドペプチドのマウスホモログ前駆体受容体タンパク質の全アミノ酸配列を示す。予想される２３残基のＧＰＲ８リガンドのマウスホモログペプチドの配列を四角で示す。
【図１０】ヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分を用いた、［１２５Ｉ］で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドに対する２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドの結合阻害活性を示す図を示す。
【図１１】ＴＧＲ２６の疎水性プロット図である。
【図１２】ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＣＨＯ／ＴＧＲ２６細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す図である。図中、−○−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−△−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１３】ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＣＨＯ／ＴＧＲ２６細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す図である。図中、−○−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−△−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を混合した場合を示す。
【図１４】［１２５Ｉ］で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドのＴＴＧＲ２６発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分への結合に対する種々の濃度のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害活性を示す図を示す。図中、−○−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−△−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１５】種々の濃度の２３残基および３０残基のＧＰＲ８リガンドペプチドヒトホモログのＣＨＯ／ＧＰＲ７細胞に対するｃＡＭＰ産生抑制活性を示す。図中、−●−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−黒四角−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１６】［１２５Ｉ］で標識した２３残基のヒトＧＰＲ８リガンドのヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分への結合に対する種々の濃度のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害活性を示す図を示す。図中、−●−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−黒四角−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１７】ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）のＣＨＯ／ＧＰＲ７細胞膜画分に対するＧＴＰγＳ結合促進活性を示す図である。図中、−●−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−黒四角−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１８】皮下に持続投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの明期での摂餌量に対する作用を示す。図中、□はｖｅｈｉｃｌｅ群を、黒四角は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）群を示す。
【図１９】皮下に持続投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの暗期での摂餌量に対する作用を示す。図中、□はｖｅｈｉｃｌｅ群を、黒四角は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）群を示す。
【図２０】皮下に持続投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの１日の摂餌量に対する作用を示す。図中、□はｖｅｈｉｃｌｅ群を、黒四角はｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）群を示す。
【図２１】皮下に持続投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの体重増加に対する作用を示す。図中、−○−はｖｅｈｉｃｌｅ群を、−□−はｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）群を示す。
【図２２】皮下に持続投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの体重増加に対する作用を示す。図中、−○−はｖｅｈｉｃｌｅ群を、−□−はｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）群を示す。
【図２３】皮下に持続投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの血中グルコース量（ａ）、血中総コレステロール量（ｂ）および血中トリグリセリド濃度（ｃ）に対する作用を示す。○は各個体の数値、−は平均値を示す。
【図２４】腹腔内投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの摂餌量に対する作用を示す。図中、白はｖｅｈｉｃｌｅ群を、灰色は０．２ｍｇ投与群を、黒は２ｍｇ投与群を示す。また、＊は危険率５％で有意、＊＊は危険率１％で有意であることを示す。
【図２５】腹腔内投与したｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）のラットの体重増加量に対する作用を示す。図中、白はｖｅｈｉｃｌｅ群を、灰色は０．２ｍｇ投与群を、黒は２ｍｇ投与群を示す。
【図２６】［Ｐｈｅ２，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のヒトＧＰＲ７発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分への結合に対する種々の濃度のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害活性を示す図を示す。図中、−○−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−□−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図２７】［Ｐｈｅ２，１２５Ｉ−Ｔｙｒ１０］ヒトＧＰＲ８リガンド（１−２０）のヒトＧＰＲ８発現ＣＨＯ細胞から調製した細胞膜画分への結合に対する種々の濃度のｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）およびｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）の結合阻害活性を示す図を示す。図中、−○−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−２３）を投与した場合を、−□−は、ｈＧＰＲ８Ｌ（１−３０）を投与した場合を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年10月6日(2003.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
【配列表】
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