(57)【要約】　　　（修正有）【課題】立体構造の解析に意味のあるドメインを形成するＤｎａＪ様ドメインを形成するタンパク質およびその構造情報などを提供する。【解決手段】（１）ＤｎａＪ様ドメインを形成するアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、（２）ＤｎａＪ様ドメインを形成するアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、（１）のタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質またはその塩、その製造方法、それをコードするポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いるスクリーニング方法、それらの立体構造を用いたスクリーニング方法など。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
【請求項２】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質またはその塩。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載されたタンパク質のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２に記載された塩基配列を含有する請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する発現系。
【請求項６】
請求項３又は請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載された組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項８】
請求項１又は請求項２に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項９】
請求項８に記載の抗体を含む医薬。
【請求項１０】
請求項７に記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成させる工程を含む、請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩の製造方法。
【請求項１１】
無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩の製造方法。
【請求項１２】
請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１又は請求項２に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の抗体を用いた請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩の定量方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の定量方法を用いた、請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
請求項１又は請求項２に記載のタンパク質を細胞内で発現させる工程と、当該細胞内における遺伝子の発現状態を調べる工程とを含む、請求項１又は請求項２に記載のタンパク質と関連する遺伝子を特定する方法。
【請求項１６】
請求項１又は請求項２に記載のタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で特定する工程とを含む請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１又は請求項２に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
前記タンパク質の立体構造に関する情報が、立体構造座標表１〜１０のいずれかに記載されたタンパク質のアミノ酸番号１４〜８８の立体構造情報である請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
立体構造座標表１に記載の立体構造情報のうち、以下のアミノ酸残基に相当する部分の情報を用いる請求項１７に記載のスクリーニング方法。
Ｔｙｒ４１、Ｌｅｕ４２、Ｈｉｓ４５、Ｐｒｏ４６、Ａｓｐ４７、Ｌｙｓ４８、Ｐｒｏ５０、Ｈｉｓ５３、Ａｓｎ５７、Ｐｈｅ６０
【請求項１９】
請求項１６又は請求項１７に記載のスクリーニング方法によって、特定された活性部位と相互作用する化合物を候補化合物として用意し、
請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む請求項１又は請求項２に記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は請求項１又は請求項２に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
立体構造座標表１〜１０のいずれかに記載されたタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する構造未知タンパク質のホモロジーモデリングを行い、前記構造未知タンパク質の立体構造を推定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドメインを形成するヒト由来のタンパク質、それを含有するポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いた活性化合物のスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒトゲノム計画に代表されるさまざまなモデル生物のゲノム塩基配列が次々に解読されている。これらのゲノム配列情報から抽出される遺伝子について、個々の遺伝子にコードされたタンパク質の立体構造を体系的に明らかにし、構造と機能の関係を明確にしようとする“構造ゲノム科学”が、新たな研究分野として急速に立ち上がり、世界各国で大規模なプロジェクトが進行している。
この構造ゲノム科学において、解析対象となるタンパク質数は１０万種類に及ぶとも見られており、その全立体構造の決定を目標とするのは現在の技術レベルでは未だ現実的ではない。
【０００３】
そこで、まず対象タンパク質を妥当な数に絞り、「代表的な構造」を選ぶことが必要である。網羅的な立体構造解析は、例えばａ）対象とするタンパク質のセットとして比較的小さいものに特定する、ｂ）超好熱性古細菌、高度好熱菌、マイコプラズマ等のゲノムサイズの小さい生物種を特定する、或いはｃ）シグナル伝達や遺伝子発現に関与するタンパク質、疾病関連遺伝子産物タンパク質等、生命現象を特定する等、様々な視点から解析対象を選定したプロジェクトが開始されている。
このような研究の流れにおいては、最初のステップとして、約１万種類とも推測されているファミリー（アミノ酸配列が約３０〜３５％の相同性を有するものをファミリーとして分類）のすべてについて代表的な立体構造を１つ以上決定することを１つの目標としている。ある代表的な立体構造（基本構造）があれば、同じファミリーに属する他のタンパク質の構造も、ホモロジーに基づくモデリングにより類推することが可能となる。
このプロジェクトの中で、機能ドメインの三次元構造のタイプ、又はトポロジー（基本構造：フォールド）に注目し、タンパク質の基本構造単位で機能との相関を解明しようとする研究が注目されている。
【０００４】
複数のドメインを有するタンパク質の場合、機能ドメインがモジュールのように組み合わさってできているため、あるドメインがさまざまなタンパク質のなかに違ったドメインとの組み合わせで現れることがしばしば見られる。また、一次配列上のホモロジーが検出されなくても同じ基本構造をもつことはめずらしくない。従って、基本構造の数はタンパク質のファミリーの数よりもかなり少ないはずであり、それぞれの基本構造が分子機能と関連付けられると期待される。この基本構造の数は、約１万〜２万種類と予測されており、このオーダーの解析対象であれば、全対象タンパク質の立体構造を決定することも十分可能になる。
【０００５】
このようにして得られるタンパク質の立体構造と機能に関する情報は、生体機能の解明に新たな知見を与え、医薬品等の開発（例えば、ラショナルドラックデザインやバーチャルスクリーニングによる開発）を飛躍的に発展させるものであり、産業界においても非常に有益である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、タンパク質の立体構造解析には、多くの時間と労力、費用を要するのが実情である。網羅的且つ体系的な構造解析を目指す構造ゲノム科学研究においては、構造解析のハイスループット化を図ることが重要な課題である。
【０００７】
タンパク質の立体構造解析には主にＮＭＲ法およびＸ線結晶構造解析法が使用されている。
タンパク質をＮＭＲを用いて立体構造解析を行うためには、サンプルの分子量は約２００００以下（アミノ酸残基で約２００個以下）であることが好ましい。Ｘ線解析によって立体構造解析を行う場合にも、結晶作成のためのタンパク質の性状に制限がある。
構造解析に適したタンパク質を得るためにタンパク質をランダムに分割すると、切断する部位がβシートやαへリックス構造をとるアミノ酸配列中にあると、多くのタンパク質は生理的に意味のある構造が変形したり、ひも状になり構造を取らなかったり、あるいは凝集することになる。このように本来生体内でとる構造を有しないタンパク質の立体構造を解析しても意味がない。したがって、立体構造の解析に意味のあるドメインを形成するタンパク質を取得することが望まれる。
構造解析に適した、ドメインを有するタンパク質（以下、「ドメインを形成するタンパク質」という）を発現させるためには、ドメイン境界の位置に関する情報が必要である。一般に、このドメイン境界はアミノ酸配列の相同性などを手がかりにして予測される。このようにして予測されたドメイン領域のアミノ酸配列に基づいてタンパク質の発現を行っても実際に構造をとる（フォールドする）ドメインを形成するタンパク質が得られる確率は非常に低く、ドメイン発現が構造解析のボトルネックの１つとなっている。
本発明の対象であるＤｎａＪ様ドメインを形成するタンパク質についても、これまでは取得されておらず、またその構造情報も未知であり、これらを創薬等に利用することはできなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたもので、下記のようなタンパク質、その製造方法、それをコードするポリヌクレオチド、そのタンパク質に対する抗体、それらを用いるスクリーニング方法などを提供する。
（１）配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
（２）配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質またはその塩。
（３）請求項１又は請求項２に記載されたタンパク質のいずれか一つのタンパク質のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（４）配列番号２に記載された塩基配列を含有する（３）に記載のポリヌクレオチド。
（５）（３）又は（４）に記載のポリヌクレオチドを含有する発現系。
（６）（３）又は（４）に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（７）（６）に記載された組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
（８）（１）又は（２）に記載のタンパク質に対する抗体。
（９）（８）に記載の抗体を含む医薬。
（１０）（７）に記載の形質転換体を培養し、タンパク質を生成させる工程を含む、（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩の製造方法。
（１１）無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩の製造方法。
（１２）（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は（１）又は（２）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
（１３）（８）に記載の抗体を用いた（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩の定量方法。
（１４）（１３）に記載の定量方法を用いた、（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩と相互作用をする物質のスクリーニング方法。
（１５）（１）又は（２）に記載のタンパク質を細胞内で発現させる工程と、当該細胞内における遺伝子の発現状態を調べる工程とを含む、（１）又は（２）に記載のタンパク質と関連する遺伝子を特定する方法。
（１６）（１）又は（２）に記載のタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で特定する工程とを含む（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は（１）又は（２）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法。
（１７）　前記タンパク質の立体構造に関する情報が、立体構造座標表１〜１０のいずれかに記載されたタンパク質のアミノ酸番号１４〜８８の立体構造情報である（１６）に記載のスクリーニング方法。
（１８）立体構造座標表１に記載の立体構造情報のうち、以下のアミノ酸残基に相当する部分の情報を用いる（１７）に記載のスクリーニング方法。
Ｔｙｒ４１、Ｌｅｕ４２、Ｈｉｓ４５、Ｐｒｏ４６、Ａｓｐ４７、Ｌｙｓ４８、Ｐｒｏ５０、Ｈｉｓ５３、Ａｓｎ５７、Ｐｈｅ６０
（１９）（１６）又は（１７）に記載のスクリーニング方法によって、特定された活性部位と相互作用する化合物を候補化合物として用意し、
（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む（１）又は（２）に記載のタンパク質またはそれらの塩及び／又は（１）又は（２）に記載のタンパク質のアミノ酸配列を含んだ天然に存在するタンパク質又はそれらの塩と相互作用する物質のスクリーニング方法。
（２０）立体構造座標表１〜１０のいずれかに記載されたタンパク質の立体構造に関する情報を用いて、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と３０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する構造未知タンパク質のホモロジーモデリングを行い、前記構造未知タンパク質の立体構造を推定する方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
【００１０】
（本発明のタンパク質）
本発明のタンパク質は、立体構造をもったドメインを形成するタンパク質である。本発明は、より具体的には、配列番号１で表されるＤｎａＪ様ドメインタンパク質（ＫＩＡＡ０７３０　ｐｒｏｔｅｉｎの７３１−８０５番目のアミノ酸配列）に関する。
以下、本発明のタンパク質の機能などについて説明する。
【００１１】
（ＤｎａＪ　ドメイン）
ＤｎａＪ　ドメイン（Ｊドメイン）は高度に保存された約７０アミノ酸残基のドメインである。ＤｎａＪドメインは、ｈｓｐ７０の熱ショックシステムに関与しており、このドメインはＤｎａＫタンパク質と相互作用を有すると考えられる［Ｃｙｒ　Ｄ．Ｍ．，　Ｌａｎｇｅｒ　Ｔ．，　Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｍ．Ｇ．ＤｎａＪ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｈｓｐ７０．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　１９：　１７６−１８１（１９９４）．］。したがってＤｎａＪドメインは、分子シャペロン機能の一端を担うものと考えられる。ここで分子シャペロン機能とは、細胞内で、タンパク質が遺伝子から翻訳された後、あるいは熱や化学的ストレスなどにより変性した際に正しい立体構造をとる手助けをしている生体内タンパク質の機能をいう。
ＤｎａＪドメインを含むものとして、酵母タンパク質のＭＡＳ５／ＹＤＪ１、ＭＤＪ１、ＳＣＪ１、ＸＤＪ１、ＹＮＬ０７７ｗ、　ＳＥＣ６３／ＮＰＬ１、ＳＩＳ１、ＣＡＪ１、　ＹＦＲ０４１ｃ、ＹＩＲ００４ｗ、ＹＪＬ１６２ｃ、が知られており、熱帯熱マラリア原虫Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　の輪状体に感染した赤血球表面抗原、ｈｕｍａｎ　ＨＤＪ１・ＨＳＪ１、ショウジョウバエ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　のシステイン−ストリング（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｓｔｒｉｎｇ）タンパク質などが知られている。
【００１２】
近年、遺伝子解析が進み、病気と遺伝子の関係が明らかになりつつある。このような疾患関連遺伝子によって発現されたタンパク質の中には、遺伝子からポリペプチドが発現し立体構造を形成する際に正しく折りたたまれず（フォールドせず）病原タンパク質となるものもある。特に神経性疾患についてはタンパク質の変性を原因として発症するケースが多く見られる。したがって、本発明におけるＤｎａＪ様タンパク質ドメインは、神経性疾患の原因となる可能性がある。
殊に、本発明のタンパク質を取得する際に利用したヒトのＳａｃｓｉｎ（サクシン）遺伝子（ＫＩＡＡ０７３０）は、カナダ−ケベック州で見られるある種の常染色体劣性遺伝病であるけいれん性運動失調障害（シャルルボア−サゲネー（Ｃｈａｒｌｅｖｏｉｘ−Ｓａｇｕｅｎａｙ）痙性運動失調症）の原因遺伝子として知られている。Ｓａｃｓｉｎ遺伝子がコードしている全長約３８００残基タンパク質ＳＡＣＳＩＮが同定され、そのＣ末端側の配列中にＤｎａＪ様ドメイン配列が含まれている。したがって、この神経疾患はＳａｃｓｉｎ遺伝子の異常により生産される異常ＳＡＣＳＩＮが分子シャペロンとしての機能を失い、神経細胞中のタンパク質の正しいフォールド形成に働かなくなっていることで、神経細胞の機能を著しく阻害することにより発症しているものと予想される。したがって、ＤｎａＪ様ドメインタンパク質の詳細な立体構造情報を明らかにすることで、けいれん性運動失調障害（シャルルボア−サゲネー（Ｃｈａｒｌｅｖｏｉｘ−Ｓａｇｕｅｎａｙ）痙性運動失調症）の検査試薬、治療薬などの開発への利用も期待できる。
【００１３】
また、本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１若しくは数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加（本明細書において付加には挿入も含まれる。）されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同一の機能を有するタンパク質またはその塩も提供する。
なお、「本発明のタンパク質と実質的に同一の機能を有する」とは、本発明のタンパク質が有する分子機能などと同種の分子機能などを有することを意味する。ここで、そのような分子機能としては、相互作用分子に対する結合活性、分子シャペロン機能等が挙げられる。
【００１４】
（タンパク質の配列）
本発明のタンパク質の配列は次のようにして決定した。ｉ）公知のタンパク質配列情報に基づき、対象とする機能を有するドメイン領域を推定した後、ｉｉ）その推定ドメイン領域のアミノ酸配列を基本パターンとするドメイン候補配列パターンを用意し、ｉｉｉ）各配列パターン毎にタンパク質発現を行い、得られたドメインを形成するタンパク質の構造安定性評価により、良好な結果を示すものを目的タンパク質とした。即ち、本発明のタンパク質は、全長タンパク質中のある一部分（目的とする機能を有する）を断片化してドメインを形成するタンパク質として発現させた時に、安定な構造を有するものを経験的に選別したものであり、ドメイン領域予測の段階では数１００のオーダーで存在するドメイン候補が、種々の要因により絞り込まれて実際は１０〜数１０のオーダーまで厳選される。従って、このように選別されたタンパク質を、立体構造解析に用いることにより、高精度で且つ信頼性に優れた構造解析を行うことが可能となる。
【００１５】
（ドメイン領域の推定）
全長タンパク質中のドメイン領域を推定する手法としては、特に限定されるものではないが、例えばバイオインフォーマティクスなどの情報科学的な手法や計算科学的な手法（特願２００１‐３０９４３４号明細書参照）、ｄｅｌｅｔｅｄ　ＤＮＡライブラリーとＧＦＰの組み合わせ（特願２００１‐０６２７０３号明細書参照）、プロテアーゼによる限定分解などの実験的な手法等、いずれも利用可能である。より精度の高い手法を用いることにより、ドメイン候補群から目的ドメインを選び出す作業効率が向上する。
【００１６】
（ドメイン候補配列パターンの作製）
上記ドメイン候補配列パターンは、上述のように推定されたドメイン領域を基準にしてドメイン境界の位置をＮ末端側又はＣ末端側に伸ばしたり縮めたりすることにより作製される。
例えば、推定ドメイン領域のＮ末端側のドメイン境界におけるアミノ酸残基の位置より、Ｎ末端方向に例えば１又は数十残基分伸長させた、又はＣ末端方向に例えば１又は数十残基分短縮した数種類の境界を新たに設け、それらの境界をＮ末端とするドメイン候補配列パターンが用意される。なお、伸長、短縮するアミノ酸残基の数は、Ｎ末端方向、及びＣ末端方向に例えば１〜２００残基が挙げられ、好ましくは１〜１００残基であり、より好ましくは１〜５０残基である。
同様に、推定ドメイン領域のＣ末端側のドメイン境界においても１又は数種類のドメイン境界を選定し、各境界をＣ末端とするドメイン候補配列パターンが作製されることが好ましい。
【００１７】
（ドメイン境界の伸縮）
上記推定ドメイン領域のドメイン境界を伸縮させる方法としては、例えば上記ドメイン候補配列パターンに対応したｃＤＮＡを作成できるＰＣＲプライマーを個々に合成して、ＰＣＲにより作成する方法が挙げられ、特に特願２００１‐２０１３５６号公報に示される２段階ＰＣＲ法が好適である。
【００１８】
（ドメイン候補配列パターンからの目的ドメインの抽出）
このようなドメイン候補配列パターンから実際に安定な立体構造を有する目的ドメインタンパク質を選び出すためには、まず上述のようにして作製されたドメイン候補配列パターンのｃＤＮＡを用いてそれぞれタンパク合成を行う。
この際、精製用の人工配列やリンカー配列などが用いられても良い。
このドメイン候補配列パターンの発現系としては、特に限定されず、公知の発現系をいずれも使用できる。
次に、得られたタンパク質が実際に安定な立体構造をとっているかどうかを判定し、立体構造を有することが確認できたものを本発明におけるタンパク質として採用する。
【００１９】
このタンパク質の立体構造の安定性の指標としては，例えば合成されたドメインタンパク質が可溶性タンパク質としてＳＤＳゲル電気泳動等により検出され、かつ適当な分子量相当な均一なバンドとして検出されるかという生化学的指標や、Ｃ末端側に融合させたＧＦＰの蛍光強度，ＮＭＲスペクトル，ＣＤスペクトルなどの分光学的指標等が挙げられる。
【００２０】
（安定な立体構造を有することの確認）
上記ＮＭＲスペクトルにおいてドメインを形成するタンパク質のフォールディングの判定を以下に示す。
１Ｄスペクトルにおいて、ドメインを形成するタンパク質がフォールドしていない場合はＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなどのメチル基プロトンに由来するシグナルが０．８ｐｐｍ付近に観測される。しかしフォールドしている場合はメチル基プロトンの環境が変化し、シグナルが高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）にシフトする。
１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣにおける判定は、クロスピーク収束度合いとシグナル強度の均一性の評価を目視により行うことが挙げられる。すなわち、クロスピークが密集した場合は、立体構造を形成していない状態とし、逆に分散した場合は安定な立体構造を形成している状態として立体構造の安定性の評価を行う。
【００２１】
（発現系）
本発明のタンパク質は、本発明の発現系を含む一般的な宿主細胞などから公知の手段を用いて製造することができる。このような発現系としては、本発明のポリヌクレオチドを含む発現系や、その発現系を含み公知の手段により製造された宿主細胞、遺伝子組換え技術を用いて本発明のタンパク質を製造し得る発現系、本発明のタンパク質を製造し得る無細胞タンパク質合成系などが挙げられる。
【００２２】
（ベクター）
本発明の（組換え）ベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド　ＤＮＡ、ファージ　ＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミド　ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２，　ｐＢＲ３２５，　ｐＵＣ１１８，　ｐＵＣ１１９，　ｐＵＣ１８，　ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，　ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，　ＹＥｐ２４，　ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター　ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２３】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００２４】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２５】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，　Ｓ．Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９７２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ　６９，　２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２６】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，　Ｄ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９７８）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　７５，　１９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，　Ｈ．　（１９８３）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５３，１６３−１６８）等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２７】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００２８】
（抗体）
本発明のタンパク質を抗原として用いて、その抗原に対する抗体を調製することができる。
【００２９】
［本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製］
前記の抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、例えばアジュバントを用いて１００〜５００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
【００３０】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなどの非ヒト哺乳動物）に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）等により行うことができる。
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００３１】
［タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製］
上記抗原を用いて動物を免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うため、前記と同様アジュバント（市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を混合してもよい。
【００３２】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。抗原の１回の投与量は、マウスの場合１匹当たり５０μｇである。投与部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、最低２〜３回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
【００３３】
［細胞融合］
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地　（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）　で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１５：１〜２５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在のもとで、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
【００３４】
［ハイブリドーマの選別及びクローニング］
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
次に、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法　（ＥＬＩＳＡ；　ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ）、ＲＩＡ　（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００３５】
［モノクローナル抗体の採取］
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％牛胎児血清含有　ＲＰＭＩ−１６４０培地又はＭＥＭ　培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件　（例えば３７℃，５％　ＣＯ２濃度）　で３〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。
【００３６】
（本発明のタンパク質の製造）
本発明のタンパク質は、例えば、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「本発明の形質転換体を培養する方法」は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
【００３７】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３８】
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４１】
培養後、タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４２】
（無細胞タンパク質合成系を用いるドメインを形成するタンパク質の製造方法）本発明は、無細胞タンパク質合成系を用いる、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するドメインを形成するタンパク質の製造方法も提供する。
無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。「無細胞タンパク質合成系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系、及びＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無細胞翻訳系の両者を含む。無細胞タンパク質合成系は、系を容易に改変することができるため、目的のタンパク質に適した発現系を構築しやすいという利点がある。なお、無細胞タンパク質合成系の詳細については、特許公開２０００−１７５６９５号などに記載されている。
【００４３】
［細胞抽出液］
粗細胞抽出液は、細菌（例えば大腸菌等）、菌類（例えば出芽酵母等）、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核および原核生物細胞からの抽出液であってもよい（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．２３１−２７０，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
粗細胞抽出液はリボソーム、ｔＲＮＡなどのタンパク質合成に必要な成分を含むことが好ましい。粗抽出液の調製は、例えばＰｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９８４），ｐｐ．１７９−２０９，Ｈｅｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．とＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに記載の方法を使用できる。具体的には、フレンチプレッスによる破砕（Ｐｒａｔｔら，上掲）やグラスビーズを用いた破砕によって行うことができる。好ましい細胞抽出液は大腸菌Ｓ３０細胞抽出液である。Ｓ３０細胞抽出液は、大腸菌ＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ　Ｐｌｕｓ株から既知の方法、例えばＰｒａｔｔら（上掲）の方法に従って調製できるし、あるいはＰｒｏｍｅｇａ社やＮｏｖａｇｅｎ社から市販されるものを使用してもよい。細胞抽出液としては、主に大腸菌、小麦胚、ウサギ網赤血球由来のものが使用される。
【００４４】
［透析装置］
透析膜を介して内液と外液とを隔離して含む振とうもしくは攪拌可能な透析装置を用いることができる。小スケール反応用装置としては、例えばＤｉｓｐｏ　Ｄｉａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）やＳｌｉｄｅａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｐｉｅｒｃｅ社製）が挙げられる。
また、大スケール反応用装置としては、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析用チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ社製）を例示できる。
【００４５】
［透析内液］
無細胞タンパク質合成系における透析内液（すなわち、タンパク質合成反応液）には、大腸菌Ｓ３０等の濃縮細胞抽出液の他に、目的のタンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン５’−三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン５’−三リン酸）、緩衝液、塩類、アミノ酸、ＲＮアーゼ阻害剤、抗菌剤、必要によりＲＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡを鋳型として用いる場合）およびｔＲＮＡ、などを含んでもよい。
その他、ＡＴＰ再生系としてホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組合わせまたはクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組合わせ、ポリエチレングリコール（例えば＃８０００）、３’，５’−ｃＡＭＰ、葉酸類、ＲＮアーゼ阻害剤、還元剤（例えばジチオトレイトール）、などを含むことができる。一方、透析外液（すなわち、タンパク質合成基質溶液）は、透析内液組成から細胞抽出液、ＲＮアーゼ阻害剤、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼを除いたものが使用できる。例えば、緩衝液、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ，塩類、アミノ酸、抗菌剤などを含むことができる。添加成分の濃度は任意に選択することができる。
【００４６】
［緩衝液］
緩衝液としては、例えばＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような緩衝剤を使用できる。塩類の例は、酢酸塩（例えばアンモニウム塩、マグネシウム塩など）、グルタミン酸塩などであり、抗菌剤の例はアジ化ナトリウム、アンピシリンなどである。アミノ酸はタンパク質を構成する２０種のアミノ酸である。また、ＤＮＡを鋳型として用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼを反応系に添加するが、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどの市販の酵素を使用できる。
【００４７】
透析膜の内部に上記透析内液を、一方その外部に透析外液を入れた、膜の分子量限界に応じて物質が膜を介して移動可能とする閉鎖系を振とうまたは攪拌（回転攪拌など）し、生成した目的タンパク質を、透析内液または外液から回収することができる。温度および攪拌速度などの反応条件は、タンパク質の種類に応じて任意の条件を使用できる。タンパク質の合成の場合、温度は通常約２５〜約５０℃、好ましくは３７℃であるが、高度好熱菌由来の菌体抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系では５０℃を超える温度でもよい。
また、振とう速度もしくは攪拌速度は低速、例えば１００〜２００ｒｐｍを使用できる。目的のタンパク質の生成を監視しながら、反応時間を適当に選択することができる。
【００４８】
上記無細胞タンパク質合成系の透析外液を、反応速度が低下した時点で新鮮なものと交換することが好ましい。また、透析膜の分子量限界が１００００ダルトンを超えるもの、好ましくは約５００００ダルトンおよびそれ以上のものを使用する場合には、タンパク質の生産量をさらに高めることができる。
【００４９】
［タンパク質の精製］
生成タンパク質の精製は、生細胞からの分離と比べて混在する汚染物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行うことができる。精製法は、タンパク質の性質に応じて従来公知のものを単独にまたは適宜組合わせて使用できる。例えば硫酸アンモニウムもしくはアセトン沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動、クロマトフォーカシングなどの慣用の技術を挙げることができる。生成タンパク質の同定および定量は、活性測定、免疫学的測定、分光学的測定、アミノ酸分析などによって、必要に応じて標準サンプルと比較しながら行うことができる。
【００５０】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法としては、本発明のタンパク質またはその塩と候補物質とを接触させる工程と、前記タンパク質と候補物質とが相互作用をするかどうかを確認する工程とを含む前記タンパク質と相互作用を有する化合物のスクリーニング方法が挙げられる。ここで、「相互作用を有する」とは、化合物とタンパク質が結合して、そのタンパク質の分子機能及び／又は生理活性を抑制または増強すること、などをいう。このスクリーニング方法においては、そのタンパク質と候補化合物を接触させて、そのタンパク質の分子機能または生理活性が変化するか否かを測定する。
【００５１】
［ＮＭＲを用いた相互作用物質探索］
相互作用物質探索にＮＭＲを用いる場合，候補物質の添加前後でのタンパク質のシグナル変化の有無により，相互作用の有無を判定することができる。すなわち，相互作用候補物質がタンパク質と相互作用する場合には，タンパク質の相互作用部位近傍に由来するＮＭＲシグナルの化学シフト値，線幅，個数等に変化が起きることが期待されるので，その変化を検出することで相互作用の有無を判定できる．特に１５Ｎで標識したタンパク質は調製が比較的容易であり，そこから得られる１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルは，分解能や感度が比較的高く，添加した相互作用候補物質由来のＮＭＲシグナルの影響を受けにくいため，その有用性は高い。
【００５２】
（定量方法）
本発明のタンパク質は、例えば本発明の抗体を用いることによっても定量することができる。抗体を用いたタンパク質の定量方法としては、例えば、サンドイッチ免疫測定法、競合法、イムノメトリック法、ネフメトリー法などが挙げられる。また、放射性同位体や酵素、蛍光物質などの標識物質を用いて検出することもできる。
【００５３】
（定量方法を用いたスクリーニング方法）
本発明の抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合するため、本発明の抗体を用いることで、本発明のタンパク質と相互作用する化合物のスクリーングなどに用いることができる。この際のスクリーニング方法としては、公知のスクリーニング方法を用いることができる。
【００５４】
なお、本発明の抗体を用いた、本発明のタンパク質の定量方法によれば、本発明のタンパク質が関与する疾患の予防・診断を行うことができる。
【００５５】
（立体構造解析）
タンパク質の立体構造は、ＮＭＲによる構造解析、Ｘ線構造解析などによって解析することができる。
【００５６】
（ＮＭＲ）
ＮＭＲに用いる試料としては、特に限定されるわけではないが、好ましくは、タンパク質中の１２Ｃ、または１４Ｎを１３Ｃ、１５Ｎ核で安定同位体標識した試料を用いる（多核多次元ＮＭＲ測定）。タンパク質を安定同位体標識する技術は慣用技術であり、例えば、Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．＆　Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，ｐ．１３９０−１３９９，１９９１等の文献に記載されている。特に、主鎖１５Ｎ均一安定同位体標識したタンパク質試料を用いた解析が容易であり好ましい。また、タンパク質の主鎖の骨格を、１３Ｃ、１５Ｎ及び２Ｈのうち少なくとも２種類以上の同位体標識したものを使用してもよい（特表２００１−５１４２３９）。
【００５７】
好ましくは、ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトルの観測等による１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数の測定を行う。「ＩＰＡＰ−ＨＳＱＣスペクトル」とは、準位相、反位相の２つのＨＳＱＣスペクトルを同時に観測し、両者のスペクトルの足しあわせをすることにより、シグナルのオーバーラップを防いで、効果的に１５Ｎ−１Ｈスピン結合定数を読みとるための測定法である。
【００５８】
２種類以上のＮＭＲ法により化学シフト帰属が行われる。例えば、２次元ＮＭＲとしては２Ｄ、ＤＯＱ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ＨＳＱＣ等、多次元ＮＭＲとしては、ＨＮＣＯ、ＨＣＡＣＯ、ＨＮＣＡ、ＨＣＡ（ＣＯ）Ｎ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＨＢ、ＣＢＣＡＮＨ、Ｈ（ＣＡ）ＮＨ、ＨＢＨＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ、ＨＣＡＮＨ、ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ、ＨＣＡＣＯＮ、１５Ｎ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ、１３Ｃ−ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ等が公知技術として知られている。ＮＭＲの一般的手法は周知であり、例えば、「タンパク質のＮＭＲ」（共立出版、１９９６、荒田洋治）；「日本生化学会編　基礎生化学実験法　第３巻　タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」第１８章ＮＭＲによる立体構造解析（東京化学同人、２００１年２月）；伊藤隆ら、日本農薬学会誌２１，ｐ．４５０−４５９、１９９６；田中俊之、化学と工業　第４９巻　第２号　ｐ．１５５−１５８、１９９６等に詳述されている。
【００５９】
立体構造解析にＮＭＲを用いる場合，タンパク質の各プロトン間の核オーバーハウザー効果の大きさから各プロトン間の距離を見積もり，その距離情報に基づき立体構造を決定する方法が一般的である．通常，１５Ｎや１３Ｃで標識したタンパク質に対し異核多次元ＮＭＲの手法を用いることにより，解析の迅速化や立体構造の精度の向上を図る場合が多い．さらに，化学シフト値，スカラーカップリング値，残余双極子カップリング値，水素結合等の情報を加えて立体構造を精密化することも可能である．
【００６０】
ＮＭＲデータから構造解析を行うための多くのプログラムが周知である。好ましくは、化学シフト帰属のためのものとして、ＮＭＲ　Ｐｉｐｅ、ＰＩＰＰ、Ｃａｐｐ、Ｆｅｌｉｘ、ＮＭＲ　Ｖｉｅｗ、ＸＥＡＳＹ、立体構造計算ソフトとしてＸ−ＰＬＯＲ、ＣＮＳ、ＤＹＡＮＡ，ＤＹＮＡＭＯ等を用いて構造解析を行う。
【００６１】
（Ｘ線結晶構造解析）
立体構造解析にＸ線結晶構造解析を用いる場合，結晶化させたタンパク質のＸ線回折像に基づき電子密度図を計算し，立体構造を決定する．すなわち、タンパク質を結晶化し、その結晶に単色化されたＸ線をあて、得られたＸ線の回折像をもとに、該蛋白質の３次元構造を明らかにしていくものである（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｎ．，　ＰＲＯＴＥＩＮ　ＣＲＹＳＴＡＬＬＯＧＲＡＰＨＹ，１−５６５頁，（１９７６）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。
【００６２】
（立体構造情報に基づくスクリーニング方法）
次に、本発明は、前記タンパク質の立体構造に関する情報を用いて、前記タンパク質の活性部位を決定する工程と、当該活性部位と相互作用する化合物をコンピュータ上で検索する工程とを含む、前記タンパク質またはその塩と相互作用する化合物のスクリーニング方法をも提供する。
【００６３】
（インシリコ　スクリーニング）
分子の３次元構造に基づく薬物設計については、医薬品の開発・第７巻「分子設計」（廣川書店）をはじめとして数多くの総説がある。具体的には、第一にＦｌｅｘｉＤｏｃｋ、ＦｌｅｘＸ等のフレキシブルリガンドバインディングシミュレーションソフトウエアを用いて、Ｏｒａｃｌｅ等のリレーショナルデータベースに格納された低分子（分子量１０００以下）化合物のライブラリー（たとえば約１５００００種）をコンピュータでスクリーニングする。このライブラリー内の化学物質はＣＯＮＣＯＲＤ等のプログラムで３次元構造を指定し、活性部位にはめ込める物質を選択することができる。選ばれた物質の中からＩｎｓｉｇｈｔ　ＩＩやＭＯＥ等のシミュレーションプログラムを用いて肉眼により更によく活性部位にあてはまる化合物を絞り込む。一連の過程で利用されるコンピュータソフトウエアは、いずれも以下のような市販のものである。
【００６４】
ＦｌｅｘｉＤｏｃｋ：　Ｔｒｉｐｏｓ　Ｉｎｃ．ＦｌｅｘＸ：　Ｔｒｉｐｏｓ　Ｉｎｃ．ＣＯＮＣＯＲＤ：　Ｔｒｉｐｏｓ　Ｉｎｃ．Ｏｒａｃｌｅ：　Ｏｒａｃｌｅ　Ｃｏｒｐ．Ｉｎｓｉｇｈｔ　ＩＩ：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ．ＭＯＥ：　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉｎｃ．
他の方法は、未知の物質を含めた候補化合物のコンピュータによる設計である。この方法には、メチル、エチル等の化学基を活性部位に並べて適合するものを探す方法と、原子を活性部位にコンピュータプログラムを用いて並べていく方法とが知られている。
【００６５】
（ウエットスクリーニング）
本発明のタンパク質と相互作用する候補化合物の有力候補を選択するために、インシリコスクリーニングにより得られた候補化合物と本発明のタンパク質と接触させ、本発明のタンパク質の分子機能又は生理活性を測定する。候補化合物と本発明のタンパク質の立体構造データをもとに候補化合物を修飾し、より望ましい構造とする。
【００６６】
絞り込まれた化合物を合成し、実際に前記タンパク質と作用させ、スクリーニングする。前記タンパク質の活性を変化させた化合物を、更に動物実験によってインビトロでの活性や、体内動態、あるいは毒性等に関する試験を行う。
【００６７】
（相互作用する物質を含む医薬）
本発明のタンパク質と相互作用を有する物質は、そのタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療剤として用いることができる。そのような医薬は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００６８】
本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００６９】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００７０】
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００　ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００７１】
（配列の説明）
本明細書の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号１］
ＤｎａＪ様ドメインタンパク質（ＫＩＡＡ０７３０ｐｒｏｔｅｉｎ（７３１−８０５））のアミノ酸配列を示す。
［配列番号２］
配列番号１のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。
［配列番号３］
配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端にＴａｇ及びリンカー配列が付加したアミノ酸配列を示す。
［配列番号４］
以下の実施例で用いられる第一次ＰＣＲの５’プライマー１の塩基配列を示す。
［配列番号５］
以下の実施例で用いられる第一次ＰＣＲ　３’プライマー１の塩基配列を示す。
［配列番号６］
以下の実施例で用いられる第二次ＰＣＲ　５’プライマー２の塩基配列を示す。
［配列番号７］
以下の実施例で用いられる第二次ＰＣＲ　３’プライマー２の塩基配列を示す。
【００７２】
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００７３】
（実施例１）
Ｉ　ドメイン領域の推定
本実施例ではドメインを形成するタンパク質の配列を決定するに際し、ドメイン領域の推定方法として、バイオインフォマティクスを用い、以下の手順で行った。
まず、問い合わせ配列が、タンパク質データベースＳＣＯＰ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．５５）に含まれる配列と相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＢＬＡＳＴＰを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。＜ＳＣＯＰ法＞
次に、問い合わせ配列が、タンパク質モチーフデータベースＰＦＡＭ（ｖｅｒｓｉｏｎ６．５）に含まれる配列プロファイルと相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＨＭＭＥＲを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。＜ＰＦＡＭ法＞
問い合わせ配列が、タンパク質モチーフデータベースＰｒｏＤｏｍ（２０００年１月にＷｅｂより取得したバージョン）に含まれるコンセンサス配列のいずれかに対して相同性がある領域が検出された場合、その領域をドメインとして予測した。相同性検出手法はＢＬＡＳＴＰを利用し、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合に相同性があったと判断した。＜ＰｒｏＤｏｍ法＞
また、問い合わせ配列を、タンパク質配列データセット（ＮＣＢＩ−ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、Ｅ−ｖａｌｕｅが０．１以下のヒットがあった場合、その相同性領域をグループとしてまとめ、ドメインとして予測した。＜ＮＲ法＞
更に、問い合わせ配列を、タンパク質配列データセット（ＮＣＢＩ−ｎｒ）に対してＢＬＡＳＴＰによる相同性検索を行い、相同性が検出された頻度を計算した。頻度の高い部分を山、低い部分を谷として表示し、谷となっている部分でドメイン境界となるように、一つの山をドメインとして予測した。＜ＰＡＳＳ法＞
これら５種類のいずれの方法を用いてもドメインとして検出されなかった領域（残余領域）をドメインとして予測した。＜Ｎｏ　Ｈｉｔ法＞
上記６種類のドメイン予測法について、ヒット領域が重なっている場合の優先順位は、ＳＣＯＰ法を最優先として、以下に続くＰＦＡＭ法，ＰｒｏＤｏｍ法，ＮＲ法，ＰＡＳＳ法，ＮｏＨｉｔ法の順序とし、ヒット領域が重なっているものの、ドメイン境界のずれが３０残基以上あり、かつ低い優先度での定義のほうがＮ末側あるいはＣ末側により長く存在している場合は、その差分の配列を別途ドメインとして予測した。＜差分ドメイン境界設定法＞
尚、上述のいずれかの方法で推定されたドメイン領域のうち、Ｌｏｗ−Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ領域（複雑性の低い配列領域）を１箇所以上有するものや、全長３０残基に未満のものは、除外した。
このような手順に従い、本実施例において用いたＫＩＡＡ０７３０　ｐｒｏｔｅｉｎについてドメイン予測を行ったところ、アミノ酸残基位置が７３０番目から８２９番目のアミノ酸配列をＮＲ法によりドメイン候補配列（ベースドメイン配列）と推定した。尚、本領域は、Ｌｏｗ−Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ領域（複雑性の低い配列領域）をもたず、全長も３０残基以上であるため、最終的なドメイン推定の結果とした。種々の検討を行った結果ＫＩＡＡ０７３０ｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸残基位置が７３１番目から８０５番目である領域がＤｎａＪ様ドメインを構成することを見出した。
【００７４】
ＩＩ　コンストラクト作成およびドメインタンパク質合成
このようにして推定されたＫＩＡＡ０７３０　ｐｒｏｔｅｉｎのベースドメイン配列を基準にし、以下に示すようにして該ベースドメイン配列のＮ端およびＣ端の境界を伸ばしたりカットしたりしたコンストラクトを系統的に作成し、得られたコンストラクトを全て発現させ、ＳＤＳゲルで確認した。
【００７５】
ＤｎａＪ様ドメインタンパク質の発現
＜発現ベクターの構築＞
第１次ＰＣＲ
ＫＩＡＡ０７３０　ｐｒｏｔｅｉｎをコードするｃＤＮＡ（ＤＤＢＪ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＡＢ０１８２７３．１）がプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋にクローン化されたプラスミドｈｋ０３６３２を鋳型とし，以下の塩基配列を有する５’プライマー１（配列番号４），３’プライマー１（配列番号５）を用いて，ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成、およびプログラムは、それぞれ表１および表２に示した。
【００７６】
【表１】
2004073045.tif 000002
【００７７】
５’プライマー１（配列番号４）
５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＧＴＧＧ−　３’
３’プライマー１（配列番号５）
５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡＡＡＡＴＧＴＴＣＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧ−　３’
【００７８】
【表２】
2004073045.tif 000003
【００７９】
第２次ＰＣＲ
次に，上記反応によって得られた第１次ＰＣＲ産物と、Ｔ７プロモーター配列の下流にＨｉｓタグ配列を有する５’プライマー２（配列番号６）とＴ７ターミネーター配列を有する３’プライマー２（配列番号７）とを用いて、第２次ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液組成、およびプログラムは、それぞれ表３および表２に示した。
【００８０】
【表３】
2004073045.tif 000004
【００８１】
５’プライマー２（配列番号６）
５’　−　ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＡＴＣＣ　−　３’
３’プライマー２（配列番号７）
５’　−　ＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＡ　−　３’
【００８２】
クローン化
上記第２次ＰＣＲ反応により得られたＤＮＡ断片を，ＴＯＰＯ　ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ　（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）　により，ベクターｐＰＣＲ２．１（ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）にクローン化することにより、発現ベクターＰ０１０９０５−０２を構築した．
【００８３】
＜透析法を用いた無細胞タンパク質合成反応による１５Ｎ標識ＤｎａＪ様ドメインタンパク質の合成＞
大腸菌Ｓ３０抽出液は、Ｚｕｂａｙら（Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｇｅｎｅｔｉ．　７，　２６７−２８７，　１９７３）の方法に従って、大腸菌ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ株から調製した。
【００８４】
透析法を用いた無細胞タンパク質合成反応は、反応液３ｍＬ、透析外液３０ｍＬのスケールで、３０℃で一晩行った。反応液組成および透析外液組成は、それぞれ表４および表５に示した。ＤｎａＪ様ドメインタンパク質が得られたことを、ＳＤＳゲルにて確認した。その結果を図１に示す。図１中第１レーンは、上清のＳＤＳゲルを表し、第２レーンは精製時における目的物を含むフラクションのタンパク質のＳＤＳゲルを表し、Ｍはマーカーレーンを表す。ＤｎａＪ様ドメインタンパク質の分子量は、１０．６ｋＤａと考えられる。第１〜第２レーンのいずれにも１０．６ｋＤａにバンドが見られる。したがって、図１から、ＤｎａＪ様ドメインタンパク質が発現していることがわかる。このＤｎａＪ様ドメインタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１のＮ末端にＨｉｓＴａｇ配列及びリンカー配列を有する配列番号３に示されるものであった。
【００８５】
【表４】
2004073045.tif 000005
【００８６】
【表５】
2004073045.tif 000006
【００８７】
ＩＩＩ　　立体構造安定性の評価
＜１５Ｎ標識ＤｎａＪ様ドメインタンパク質の精製＞
続いて良好な発現状態であることが確認できたタンパク質断片について精製を行った。
１５Ｎ標識ＤｎａＪ様ドメインタンパク質の精製には，ヒスチジンタグとニッケルの親和性を利用した．操作は４℃で行った．まず合成反応終了後，３　ｍｌの反応液を４．２ｍｌの洗浄緩衝液［５０　ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ　８．０）／３００　ｍＭ塩化ナトリウム／１０　ｍＭイミダゾール］で希釈，回収し，１９６０×ｇ，　５分間遠心して沈殿を取り除いた．次に，得た上清を０．８　ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲン社）に通して吸着させ，９．６　ｍｌの洗浄緩衝液を通すことで夾雑物を除去した．最後に４　ｍｌの溶出緩衝液［５０　ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ　８．０）／３００　ｍＭ塩化ナトリウム／５００　ｍＭイミダゾール］を通すことでサンプルを樹脂から遊離させた．以上の手順により，０．８８　ｍｇの精製サンプルを得た．
【００８８】
＜立体構造安定性評価の為の試料の調製＞
精製サンプルをＮＭＲ測定に適した溶媒にするために，２０　ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ　６．０）／１００　ｍＭ塩化ナトリウム溶液に置換した．その後，サンプルを０．２５　ｍｌ　（サンプル濃度０．２８　ｍＭ）まで濃縮した．以上の操作には限外ろ過装置（ビバスピン２；　ザルトリウス社）を用いた．最後に０．０３　ｍｌの重水を添加して，立体構造安定性評価の為の試料とした．
【００８９】
＜立体構造安定性の判定＞
ＮＭＲ測定用のサンプル管にはシゲミ社の対称型ミクロ試料管（５　ｍｍプローブ用）を用いた．ＮＭＲ測定は，６００　ＭＨｚのＮＭＲ装置（Ａｖａｎｃｅ６００；　ブルカー社）で，温度２５℃のもとで行った．判定には，１Ｈの１次元スペクトル（以後１Ｄスペクトルと略記），および１Ｈ−１５Ｎ２次元ＨＳＱＣスペクトル（以後１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルと略記）を用いたその条件は表６のとおりであった．その結果を図２に示す。
【００９０】
【表６】
2004073045.tif 000007
【００９１】
ＮＭＲ測定の結果，１Ｄスペクトルのメチル領域の高磁場側（０．７ｐｐｍから−０．５ｐｐｍ付近）に，高磁場シフトしたシグナルが認められた。さらに，１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルには，７ｐｐｍから９ｐｐｍにわたって分離したアミドプロトンのシグナルが認められた。これらのシグナルの現れ方は，安定な立体構造を形成しているタンパク質に特徴的であることから，得られたＤｎａＪ様ドメインタンパク質は安定な立体構造を形成していると判定した。
【００９２】
このように、タンパク質全長からコンピュータによりタンパク質の構造・機能を有する構成要素（ドメイン）を予測して、予測した領域を中心にＮ端、Ｃ端へ伸ばしたりカットしたりしたコンストラクトを各種作成し、これらのタンパク質全てについて無細胞タンパク質合成を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでその発現を確認した。発現状態の良好なものについて、構造を有するか否かは１Ｈ−１５ＮＨＳＱＣスペクトル測定を行い、確認した。この操作により、実際に構造をもつ（フォールドする）ドメインタンパク質の配列上の位置を正確に決定できた。また、このような分子量の小さいドメインタンパク質を用いることで、全長では難しいとされる立体構造解析を容易に行うことができた。
【００９３】
ＩＶ　立体構造解析
上述のようにして得られた安定な立体構造を有するＤｎａＪ様ドメインタンパク質について１３Ｃ１５Ｎ多核多次元ＮＭＲ法により立体構造解析を行った。
＜１３Ｃ１５Ｎ標識ドメインの精製＞
炭素核および窒素核は全てそれぞれ安定同位体である炭素１３、窒素１５によりおよそ１００％まで濃縮された配列番号３に記載のタンパク質を上述の無細胞タンパク質合成系により作成した。配列番号３に記載されたタンパク質は、配列番号１に記載されたタンパク質のＮ末端に精製のためのＴａｇおよびリンカーのアミノ酸配列を付加したもので、立体構造には影響を与えないものである。したがって、配列番号３に記載されたタンパク質の立体構造を解析することは配列番号１に記載されたタンパク質の立体構造を解析することとなる。得られた高純度標品は高速遠心機用の限外濾過膜付タンパク質濃縮器を用いて標品濃度およそ８００μｍｏｌ／ｌ　まで濃縮し、再びＮＭＲ解析用標品緩衝液により１０倍に希釈した。以上の濃縮、希釈の操作を３回繰返し、標品精製用の緩衝液をＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全置換した。ただし、用いられたＮＭＲ解析用標品緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ｌ　燐酸ナトリウム緩衝液　１００ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム　０．０２％　アジ化ナトリウムであり、ｐＨは６．０である。ＮＭＲ解析用標品緩衝液に完全置換された標品の最終的な標品濃度およそ８００μｍｏｌ／ｌ　である。得られた標品は外径５ｍｍのＮＭＲ測定用試料管に入れた後、２５℃にて２時間保存することにより安定化させた。
【００９４】
＜２次元および３次元ＮＭＲ測定＞
ＮＭＲ実験にはスイスＢｒｕｋｅｒ社製ＤＲＸ６００およびＤＲＸ８００を使用した。全ての測定は温度２５℃にて行われた。主鎖シグナル帰属を目的としたＮＭＲ実験として、２次元スペクトルとしては１Ｈ−１５Ｎ　ＨＳＱＣを，　３次元スペクトルとしてＨＮＣＯ，　ＨＮ（ＣＡ）ＣＯ，　ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ，　ＨＮＣＡ，　ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ，　ＨＮＣＡＣＢ，　ＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨ，　Ｈ（ＣＣＣＯ）ＮＨ，　Ｃ（ＣＣＣＯ）ＮＨ，　１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ　を測定した。また、側鎖シグナル帰属を目的としたＮＭＲ実験として、２次元スペクトルとしては１Ｈ−１３Ｃ　ＨＳＱＣを，　３次元スペクトルとして脂肪族系側鎖用ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ，　芳香族系側鎖用ＨＣＣＨ−ＣＯＳＹ，　ＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ，　脂肪族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ，　芳香族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ　を測定した。
【００９５】
＜測定データの解析＞
測定データは米シリコングラフィックス社製ワークステーションを用いてフーリエ変換計算を行い、それぞれ２次元および３次元スペクトルを得た。得られたスペクトルデータに基づいて、アミノ酸残基における主鎖シグナルとしてα位およびβ位の炭素核、Ｃα、Ｃβ、カルボニル基の炭素核、Ｃ’、α位およびβ位の水素核、Ｈα、Ｈβ、アミド基の水素核、ＨＮ、アミド基の窒素核、Ｎを連鎖帰属法により帰属した。ただし連鎖帰属法とは、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡによる隣接残基上のＣαシグナルの化学シフト値に一致するＣαシグナルをＨＮＣＡ上で検索し、残基とＣαシグナルの連続性を明らかにする。この操作を繰り返すことによりプロリン残基あるいはＨＮシグナルが何らかの原因で観測できない場合を除いて全てのＣαシグナルをアミノ酸残基の連続性として帰属できる。同様の操作をＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨと　ＨＮ（ＣＡ）ＣＯによりＣ’シグナル、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨと　ＨＮＣＡＣＢによりＣβシグナル、さらにＨＢＨＡ（ＣＢＣＡＣＯ）ＮＨと１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹによって得られるＨα、　Ｈβシグナルの連続性も利用することにより連鎖帰属の高い正確さと完全性を達成することができる。得られた主鎖帰属情報、ならびに側鎖帰属用に測定されたスペクトルデータに基づいて、アミノ酸残基における側鎖シグナルとしてγ位以降γ、δ、ε、ζ、η位の炭素核、窒素核、水素核を帰属した。以上の操作により全アミノ酸残基のシグナル帰属が終了したことにより、シグナルの完全帰属データを得た。また、１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄＮＯＥＳＹ、脂肪族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ，　芳香族系側鎖用１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹスペクトル上において見出されたＮＯＥピーク群をテーブル化したＮＯＥデータを得た。主鎖帰属の際に得られたＣα、Ｃβ、Ｃ’、Ｈα、Ｈβ、ＨＮ、Ｎシグナルの化学シフトを元に、ポリペプチド主鎖二面角であるφ角、およびψ角を高精度で予測するソフトウエアＴＡＬＯＳを用いることで３４残基に対するφ、ψ角データを得た。シグナルの完全帰属データ、ＮＯＥデータ、φ、ψ角データを元に、ＮＯＥの完全自動帰属、およびタンパク質立体構造計算用ソフトウエアであるＤｙａｎａ−ＣＡＮＤＩＤを用いることで、ＮＯＥの帰属とドメイン構造の計算を行った。計算には１１１０個の１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ由来のＮＯＥ、２１９個の１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ由来のＮＯＥを用いた。得られたエネルギー的に低い１０個の構造群に対して主鎖原子のＲＭＳＤ値を計算したところ０．４５Åであり、収斂度の高い構造が得られた事が分かった。その後、得られた立体構造に基づいて、シグナルの完全帰属データと帰属されなかったＮＯＥ群とを比較検討しながらシグナルの完全帰属データをさらに最適化した。これら立体構造計算と帰属データの最適化を繰り返すことで、最終的に最も良くＮＭＲの構造データを満たす立体構造を１０個得ることができた。これらの構造に対して更に、タンパク質立体構造ソフトエアであるＣＮＳを用いて最終的な立体構造計算を行った。計算には１２１３個の１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ由来のＮＯＥ、６６９個の１５Ｎ−ｅｄｉｔｅｄ　ＮＯＥＳＹ由来のＮＯＥを用いた。得られた最終���造の収斂度は主鎖の原子団に対してＲＭＳＤ値が０．４０Åとなり、エネルギーの低い立体構造を１０個得ることができた。その結果を以下の立体構造座標表１〜１０にそれぞれ示す。以下の立体構造座標データは、プロテインデータバンク（ＰＤＢ）のフォーマットに準じて記載されているものである。１行目のＡＴＯＭは、この行が原子座標の行であることを示し、２列目は、その原子の順番を、３列目はアミノ酸残基等における原子の区別を、４行目はアミノ酸残基等を、５列目は配列番号３に対応したアミノ酸の番号を、６，７，８列目は原子の座標（ａ軸、ｂ軸、ｃ軸方向の順番でÅ単位）を、９列目は、その原子の占有率（本発明においては全て１．００）を、１０列目はそのげんしの温度因子を示している。最終行は、それぞれの表の終わりの行であることを示している。また、最安定構造であった、立体構造座標表１に記載の立体構造のリボン図を図３に示す。　　
【００９６】
2004073045.tif 000008
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【００９７】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】Ｖインシリコスクリーニング［データベース最適化］
低分子化合物データベースの対象データベースとしてＳＰＥＣＳ社から提供されている低分子化合物カタログデータベースを用いた。１エントリーに複数分子を含むものは１分子ごとに分割した上で、重複を除いたライブラリをスクリーニングの母集団として用いた。ここには１５２３２３分子含まれている。
”Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ　Ｒｕｌｅ　ｏｆ　５”に基づき、低分子化合物データベースについてのターゲット非依存最適化を行った。ここで用いた絞り込み条件は以下の通りである。
分子量１００以上５００以下
計算ＬｏｇＰ値（ｏ／ｗ）５以下　（ＸＬＯＧＰ−１アルゴリズム使用）
水素結合アクセプター原子数　（低分子化合物に含まれるＮとＯの数）　１０以下
水素結合ドナー原子数　（低分子化合物に含まれるＮＨとＯＨの数）　５以下
更にドッキング計算を適切に行うために以下のような分子を除外している。
回転可能な単結合数が２１以上のもの
ラジカルを含むもの
Ｈ，　Ｃ，　Ｎ，　Ｏ，　Ｆ，　Ｓ，　Ｐ，　Ｃｌ，　Ｂｒ，　Ｉ以外の元素を含むもの
絞り込み後の分子数は１０３７７３となった。
【０１０７】
［結合部位予測］
ＤｎａＪ様ドメインタンパク質のループ部分で強く保存されたＨＰＤ配列（Ｈｉｓ４５，Ｐｒｏ４６及びＡｓｐ４７）近傍を結合部位予測の対象とした［Ｋｅｌｌｅｙ，　Ｗ．　Ｌ．，　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｓｃｉ．　２３，　２２２　（１９９８）］．まずＤｏｃｋ付属のプログラムＳＰＨＧＥＮによりターゲット表面にスフィアと呼ばれる球状のプローブを生成し，ＨＰＤ残基より６Å以内のものを選択した．
【０１０８】
［スクリーニング］
１）一次スクリーニング
Ｄｏｃｋ　４．０を用いて、結合サイトについて、先に最適化を行った低分子化合物ライブラリ全体に対してドッキングを行った。　Ｄｏｃｋのｅｎｅｒｇｙ　ｓｃｏｒｅに基づいて低分子化合物をランク付けした。
２）二次スクリーニング
１次スクリーニングの結果得られた上位９０００分子について、　ＡｕｔｏＤｏｃｋ　３．０．５　を用いて、詳細なドッキングを行った。ドッキングの際に使用したスフィアーから４Å以内にある化合物への絞り込み、更に計算が異状終了した分子を除去した結果、最終的に８６３０分子についてドッキング構造を得た。さらに得られた化合物のうち、ΔＧ（結合自由エネルギー変化）＝−７．００、Ｋｄ＝約１μＭを化合物選定の基準とし、この基準値より高い結合性を有する化合物１０００個を相互作用候補化合物として得た。
【０１０９】
ＶＩ　ファーマコフォア定義における重要な残基の探索
ターゲットであるＤｎａＪドメインタンパク質の立体構造座標表１から、Ｄｏｃｋ付属のプログラムＳＰＨＧＥＮによりターゲット表面にスフィアと呼ばれる球状のプローブを生成し，ＨＰＤ残基より４Å以内のものを選択することにより、ファーマコフォア定義における重要なアミノ酸（Ｔｙｒ４１、Ｌｅｕ４２、Ｈｉｓ４５、Ｐｒｏ４６、Ａｓｐ４７、Ｌｙｓ４８、Ｐｒｏ５０、Ｈｉｓ５３、Ａｓｎ５７、Ｐｈｅ６０）を求めた。
【０１１０】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明のＤｎａＪ様ドメインタンパク質は、生理的に意味のある構造を有し、タンパク質の生理機能を有していることから、ドメインタンパク質またはその塩と相互作用する生理活性物質のスクリーニングに用いることができる。また、本発明のＤｎａＪ様タンパク質の立体構造解析を行うことにより、本発明のドメインタンパク質及び／又は本発明のドメインタンパク質を含んだ天然タンパク質に作用する化合物をコンピュータ上で探索・設計できる。
したがって、本発明のタンパク質を提供することで、タンパク質の構造―機能解析を基礎としたゲノム創薬を効果的に行うことができる。
【０１１１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、配列番号３で表されるドメインタンパク質のＳＤＳゲル発現図である。図中、第１レーンは上清、第２レーンは精製時の目的物を含むフラクションのタンパク質についてのＳＤＳゲル発現図であり、Ｍはマーカーレーンである。
【図２】図２は、配列番号３で表されるドメインタンパク質の１次元核磁気共鳴スペクトルと１Ｈ　−１５ＮＳＱＣスペクトルを示す。
【図３】図３は、配列番号３で表されるドメインタンパク質のリボン図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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