(57)【要約】【課題】  試料中の大腸菌群を簡易迅速に検知する方法を提供する。【解決手段】試料を、大腸菌群以外の微生物の増殖を選択的に阻害する選択阻害物質で処理して大腸菌群以外の微生物の増殖を阻害した後、該試料を培養して培養後試料を得、該培養後試料のｐＨを１０以上とした状態で、該培養後試料のカタラーゼ活性を測定することを特徴とする大腸菌群の測定方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を、大腸菌群以外の微生物の増殖を選択的に阻害する選択阻害物質で処理して大腸菌群以外の微生物の増殖を阻害した後、
該試料を培養して培養後試料を得、
該培養後試料のｐＨを１０以上とした状態でカタラーゼ活性を測定することを特徴とする大腸菌群の測定方法。
【請求項２】
前記試料が食品であることを特徴とする請求項１記載の大腸菌群の測定方法。
【請求項３】
前記選択阻害物質として、ブリリアントグリーン、デオキシコール酸ソーダ、ラウリル硫酸ソーダ、牛胆汁末、胆汁酸塩、クリスタルバイオレット、亜硫酸ソーダ、塩基性フクシン、エオジンＹ、およびメチレンブルーからなる群から選ばれる１種以上が用いられることを特徴とする請求項１または２のいずれか１項に記載の大腸菌群の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大腸菌群を簡易迅速に検出できる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳製品をはじめとする各種の食品において、大腸菌汚染の有無を、製品出荷前に確認することは重要である。
大腸菌の検出方法としては、乳糖ブイヨン法、ＢＧＬＢ培地法、デオキシコレート寒天培地法などが知られている（非特許文献１参照）。
また、乳中の微生物の数を、微生物に由来するカタラ−ゼ活性を利用して生菌数を測定する方法も提案されている（特許文献１参照）。
【非特許文献１】日本薬学会編、「衛生試験法・注解  ２０００」、２０００年版  第１刷、金原出版株式会社、ｐ６９−７０
【特許文献１】特開平５−１５３９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前者の方法は、実施するのに培養設備と培養技術者が必要であるうえ、検出に要する時間が、作業時間を除いても２０〜４８時間かかるという問題があった。
一方、後者の方法は、試料のｐＨを９〜１１．５に調製することによって、生乳中に存在する牛由来のカタラ−ゼの活性を低下させ、この状態で該試料のカタラーゼ活性を測定することにより、微生物由来のカタラーゼの活性を選択的に測定するものである。しかしながら、この方法で測定された結果に基づいて大腸菌汚染の有無を判定することは困難であった。
【０００４】
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、試料中の大腸菌群を簡易迅速に検知する方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するために、本発明の大腸菌群の測定方法は、試料を、大腸菌群以外の微生物の増殖を選択的に阻害する選択阻害物質で処理して大腸菌群以外の微生物の増殖を阻害した後、該試料を培養して培養後試料を得、該培養後試料のｐＨを１０以上とした状態でカタラーゼ活性を測定することを特徴とする。
前記試料として、食品を好ましく適用できる。
前記選択阻害物質として、ブリリアントグリーン、デオキシコール酸ソーダ、ラウリル硫酸ソーダ、牛胆汁末、胆汁酸塩、クリスタルバイオレット、亜硫酸ソーダ、塩基性フクシン、エオジンＹ、およびメチレンブルーからなる群から選ばれる１種以上が好ましく用いられる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、試料中の大腸菌群を簡易迅速に検知することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明における試料は特に限定されないが、食品が好適であり、特に乳製品を好ましく適用することができる。試料は液体で供されることが好ましい。固体状の試料を殺菌処理したイオン交換水に溶解または分散させたものを用いてもよい。または液体状の試料を殺菌処理したイオン交換水で希釈して用いてもよい。
【０００８】
本発明の大腸菌群の測定方法の一実施形態について説明する。
まず、試料に、大腸菌群以外の微生物の増殖を選択的に阻害する選択阻害物質を添加する。
本発明で用いられる選択阻害物質は、大腸菌群の増殖を阻害せずに、大腸菌群以外の微生物の増殖を阻害し得るものであればよく、例えばブリリアントグリーン、デオキシコール酸ソーダ、ラウリル硫酸ソーダ、牛胆汁末、胆汁酸塩、クリスタルバイオレット、亜硫酸ソーダ、塩基性フクシン、エオジンＹ、およびメチレンブルー等が好ましく用いられる。これらは、いずれか１種を用いてもよく２種以上を併用してもよい。
これらの選択阻害物質を１種または２種以上使用することにより、一般的に大腸菌群の測定が行われる試料中に存在し得る微生物であって、カタラーゼ活性を利用して大腸菌群の測定を行う際に測定結果に悪影響を与え得る微生物、例えば、ブドウ球菌（スタフィロコッカス）、シュードモナス、各種乳酸菌、ミクロコッカス、バチルス、ストレプトコッカス等の増殖を効果的に阻害することができる。
上記の選択阻害物質の中でも、ブリリアントグリーン、デオキシコール酸ソーダ、牛胆汁末、胆汁酸塩がより好ましい。２種以上の選択阻害物質を併用する場合、特に好ましい組み合わせはブリリアントグリーンと牛胆汁末の組み合わせ、ブリリアントグリーンとデオキシコール酸ソーダの組み合わせ、ブリリアントグリーンと胆汁酸塩の組み合わせである。
【０００９】
選択阻害物質の添加量は、試料中の大腸菌群以外の微生物の増殖を阻害できる程度であればよい。上記に挙げた選択阻害物質の適切な添加量の例を下記表１に示す。表１における添加濃度は、添加後の試料における選択阻害剤の濃度を示している。
２種以上の選択阻害物質を試料に添加する場合は、各選択阻害物質による効力の総和が、各選択阻害物質を単独で、下記表１に示す添加濃度で使用したときに得られる効力と同等となるように設定するのが好ましい。
【００１０】
【表１】
2004159650.tif 000002
【００１１】
次に、選択阻害物質で処理された試料を培養して、培養後試料を得る。
培養条件は大腸菌群の生育に適した条件とすることが好ましい。具体的には、培養温度は、３５〜３７℃が好ましい。培養時間は、長いほど大腸菌群の数が増えるので検知感度が向上するが、迅速に検知を行うためには短い方が好ましい。例えば、培養時間を５時間以上とすれば、生菌数を３万倍以上とすることができるので、良好な検知感度を得るうえで好ましい。
【００１２】
そして得られた培養後試料のｐＨを１０以上とした状態で、該培養後試料のカタラーゼ活性を測定する。
具体的には、培養後試料に、必要であれば塩基性溶液を添加して、該培養後試料のｐＨを１０以上、好ましくは１０以上１１．５以下に調整する。ｐＨ調整のために使用する塩基性溶液は、測定結果に悪影響を与えないものであればよく特に限定されないが、水酸化ナトリウム水溶液を用いるのが簡便である。
【００１３】
カタラ−ゼ活性の測定は、過酸化水素（水溶液）を、基質として培養後試料に添加して生成する酸素の量を測定し、酸素の生成速度（生成酸素の増加速度）を求め、得られた酸素の生成速度の値をカタラーゼ活性の値として採用する方法で好ましく行うことができる。
添加する過酸化水素（水溶液）の濃度は、特に限定されず、例えば濃度３０質量％の市販品をそのまま使用することができる。また過酸化水素の添加量は、測定系全量の３ｐｐｍ以下とすることが好ましく、１〜２ｐｐｍとすることがより好ましい。
生成する酸素の量を測定する手法は特に限定されないが、溶存酸素計を用いる手法を好ましく用いることができる。溶存酸素計を用いて酸素生成量を測定する場合は、過酸化水素を添加する前に、予め培養後試料に窒素ガスなどの不活性ガスを通気して溶存酸素を除去することが必要である。溶存酸素を除去した後の培養後試料中の溶存酸素は、要求される測定精度にもよるが、２ｐｐｍ以下とすることが好ましい。
酸素の生成は、過酸化水素の添加直後から生じるので、その添加直後の任意の時期に継続的に生成酸素量を測定し、これより酸素の生成速度を求める。
なお、培養後試料の代わりに殺菌したイオン交換水を使用し、同様の操作を行って酸素の生成速度を求める空試験を行い、培養後試料における酸素の生成速度からこの空試験における酸素の生成速度を差し引いて測定値を補正することが好ましい。
【００１４】
ここで、任意の試料に過酸化水素を作用させて生じる酸素の生成速度と、該試料におけるカタラーゼ活性とは相関関係があり、該試料におけるカタラーゼ活性と、該試料中に存在する微生物の生菌数との間にも相関関係があることが知られている（特開昭６２−３７９８号公報）。
ところで、測定対象とされる試料には、大腸菌群以外の微生物が存在している可能性があるが、本実施形態では、試料を前記選択阻害物質で処理した後に培養が行われるので、大腸菌群だけが生育して増菌し、これによってカタラーゼ活性の測定における大腸菌群以外の微生物の影響を実質的に排除することができる。
また、試料には、試料中に存在する微生物が有しているカタラーゼの他に、原料由来のカタラーゼが存在している可能性があるが、後述する実施例にも示されるように、培養後試料のｐＨを１０以上に調整することにより、原料由来のカタラーゼ活性のみを阻害することができ、これによってカタラーゼ活性の測定における、原料由来のカタラーゼの影響を実質的に排除することができる。
したがって、本実施形態において測定される酸素の生成速度は、大腸菌群以外の微生物の影響や原料由来のカタラーゼ活性の影響が実質的に排除されており、該試料中に存在する大腸菌群の生菌数と実質的に相関する。
【００１５】
このように、本実施形態で測定される酸素の生成速度は、試料中に存在する大腸菌群に由来するカタラーゼ活性を表しており、これを用いて試料中における大腸菌群の有無を効率良く検出することができる。
また、培養によって大腸菌群が選択的に生育するので、これにより検知感度が向上し、試料における大腸菌群による汚染が極くわずかであっても検出可能となる。例えば８時間の培養で検出感度が１０００万倍以上になる。なお、培養には５〜８時間程度の時間が必要であるが、従来の特定の培地を用いる方法では２０〜４８時間も要していたので、大腸菌群の検出時間を大幅に短縮することができ、製品出荷前に大腸菌群汚染を迅速に検査することも可能である。また、本発明における培養は、培地の調製を必要とせず、特殊な培養技術も要しないので、簡単に、かつ安価に行うことができる。
【００１６】
また、予め、大腸菌群の生菌数が既知の参照用試料を用いて、同様の条件で酸素の生成速度の測定を行い、測定対象の試料における測定値と参照用試料における測定値とを対比することによって大腸菌群による汚染の有無を判定することができる。または、参照用試料における測定値を用いて、酸素の生成速度（カタラーゼ活性）と大腸菌群の生菌数との関係を表す検量線を求めておけば、大腸菌群の有無だけでなく、培養後試料中の大腸菌群の生菌数を測定することも可能である。
【実施例】
【００１７】
（試験例１）
普通ブイヨン培地に大腸菌（Escherichia  coli  Ｏ−１１１）を１００個／ｍｌ程度となるように接種したものを３本（試料Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３）用意した。
また、普通ブイヨン培地にブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）を１００個／ｍｌ程度となるように接種したものを３本（試料Ｓ−１、Ｓ−２、Ｓ−３）用意した。
試料Ｅ−１およびＳ−１はそのままとし、試料Ｅ−２およびＳ−２にはブリリアントグリーンを、添加後の濃度が２６ｐｐｍとなるように添加し、試料Ｅ−３およびＳ−３にはデオキシコール酸ソーダを、添加後の濃度が０．１質量％となるように添加した。
これらの試料Ｅ−１〜３およびＳ−１〜３を３７℃で５時間培養した。
【００１８】
各培養後試料について、それぞれ以下の手順でカタラーゼ活性を測定した。
まず、培養後試料の３ｍｌを測定用セルに入れ、そこに１規定の水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを１１に調整した。
次いで測定用セル中の培養後試料にＮ２ガスを通気させた後、密栓をした。Ｎ２ガス通気後の培養後試料中の溶存酸素は０．３ｐｐｍであった。
続いて、栓の中心に設けられた細孔を通して、マイクロシリンジで、濃度３０質量％の過酸化水素水を６μｌ注入し、注入直後から５秒毎に、培養後試料中の酸素濃度を溶存酸素計（ＭＥＴＴＬＥＲ社製、商品名：ＭＯ１２８）を用いて測定した。この間、測定セル内はマグネットスタ−ラ−で常時撹拌し、反応温度を２８〜３０℃に保持した。
そして、過酸化水素水を注入した５秒後から４５秒後までの５秒毎に、溶存酸素濃度の増加量（ｐｐｍ／ｍｉｎ）を計算した。得られた計算値をカタラ−ゼ活性（単位Ｄｏｐｐｍ）とした。
測定結果を図１に示す。
【００１９】
図１の結果より、大腸菌については、試料Ｅ−１、Ｅ−２、Ｅ−３のいずれもほぼ同じカタラーゼ活性を示しており、また、培養前の試料における大腸菌群の数が１００個／ｍｌと少ないにもかかわらず、カタラーゼ活性を感度良く検知することができた。このことから、大腸菌は、ブリリアントグリーンおよびデオキシコール酸ソーダによって増殖が阻害されず、カタラーゼ活性も阻害されないことが認められた。
これに対して、ブドウ球菌については、試料Ｓ−１が高いカタラーゼ活性を示したのに対して、Ｓ−２およびＳ−３はほとんどカタラーゼ活性がみられなかった。このことから、ブドウ球菌はブリリアントグリーンおよびデオキシコール酸ソーダによって増殖が阻害されたことが認められた。
【００２０】
（試験例２）
無菌処理したイオン交換水に大腸菌（Escherichia  coli  Ｏ−１１１）を、５２００００個／ｍｌとなるように懸濁させた大腸菌懸濁液を用意した。
無菌処理したイオン交換水に、牛肝製カタラーゼ凍結乾燥粉末（和光純薬社製、商品名：生科学用牛肝製カタラーゼ凍結乾燥粉末）を、濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように溶解させた牛肝製カタラーゼ水溶液を用意した。牛肝製カタラーゼは、乳製品に含まれ得る原料由来の主要なカタラーゼの１つである。
大腸菌懸濁液について、ｐＨ７（試験Ａ−７）およびｐＨ１１（試験Ａ−１１）にそれぞれ調整してカタラーゼ活性を測定した。
また、牛肝製カタラーゼ水溶液についても、ｐＨ７（試験Ｂ−７）およびｐＨ１１（試験Ｂ−１１）にそれぞれ調整してカタラーゼ活性を測定した。
カタラーゼ活性の測定は、ｐＨをそれぞれ所定の値に調整する以外は、上記試験例１と同様にして行った。
測定結果を図２に示す。
【００２１】
図２の結果より、試料Ａ−７、Ａ−１１のいずれもほぼ同じカタラーゼ活性を示しており、大腸菌が有するカタラーゼはｐＨの違いによってカタラーゼ活性の測定結果が大きく変わることはなかった。
これに対して、試料Ｂ−７が高いカタラーゼ活性を示したのに、Ｂ−１１はカタラーゼ活性がほとんどみられなかった。このことから、原料由来のカタラーゼである牛肝製カタラーゼは、ｐＨの違いによってカタラーゼ活性の測定結果が大きく変化することが認められた。
【００２２】
（実施例１）
本発明の方法を用いて、牛乳における大腸菌群による汚染の有無を検査した。牛乳は、大腸菌群によって汚染されていないことが要求され、製品中に大腸菌群が存在する陽性と判定された場合は出荷できないものである。
すなわち、試料として牛乳１パック（１リットル）を用意し、これに選択阻害剤としてブリリアントグリーンおよびデオキシコール酸ソーダを、添加後の濃度が、ブリリアントグリーンは３０ｐｐｍ、デオキシコール酸ソーダは０．１質量％となるように添加した後、３７℃で６時間培養した。
培養後試料の３ｍｌを測定用セルに入れ、そこに１規定の水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを１１に調整した。
次いで測定用セル中の試料にＮ２ガスを通気させた後、密栓をした。Ｎ２ガス通気後の培養後試料中の溶存酸素は０．５ｐｐｍであった。
続いて、栓の中心に設けられた細孔を通して、マイクロシリンジで、濃度３０質量％の過酸化水素水を６μｌ注入し、注入直後から２秒毎に、培養後試料中の酸素濃度を溶存酸素計（ＭＥＴＴＬＥＲ社製、商品名：ＭＯ１２８）を用いて測定した。この間、測定セル内はマグネットスタ−ラ−で常時撹拌し、反応温度を２８〜３０℃に保持した。
そして、過酸化水素水を注入した１０秒後から２０秒後までの１０秒間における生成酸素の増加量を計算した。
一方、空試験として、測定セルに培養後試料の代わりに殺菌処理したイオン交換水を３ｍｌ入れたほかは同様にして生成酸素の増加量を測定した。
牛乳について得られた生成酸素の増加量から空試験における生成酸素の増加量を差し引いて、得られた酸素の生成速度をカタラーゼ活性の値とした。
その結果、牛乳におけるカタラーゼ活性の値は０．２であった。
【００２３】
また、参照試験として、予め無菌とした牛乳に１〜５０個／パック程度の大腸菌を添加した参照用試料について、同様にしてカタラーゼ活性の値を測定した。
このような参照試験を２０回繰り返し、得られたカタラーゼ活性の値の平均値と標準偏差を求めた。その結果、参照用試料におけるカタラーゼ活性の平均値は１．６で、標準偏差は０．３であった。
牛乳についての測定結果と参照用試料の測定結果とを比較し、牛乳は大腸菌群陰性であると判定した。
ここで、判定の基準はカタラーゼ活性が０．５以下である場合は、大腸菌群による汚染が無い陰性、カタラーゼ活性が１．０以上である場合は、大腸菌群による汚染が有る陽性、カタラーゼ活性が０．５を超えて１．０未満である場合は擬陽性でさらに確認試験を要する、とした。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明に係る選択阻害剤で、大腸菌群以外の生物の増殖が選択的に阻害されることを確認するための試験例のグラフである。
【図２】本発明に係るカタラーゼ活性測定において、ｐＨの違いによって原料由来のカタラーゼ活性が大きく変化することを確認するための試験例のグラフである。
【図１】
2004159650.tif 000003
【図２】
2004159650.tif 000004