(57)【要約】      （修正有）【課題】発現対象の核酸を、根、葉肉、葉脈に特異的に発現させること、根、葉肉、葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させること、根、葉肉、葉脈における遺伝子の機能を解析すること、根、葉肉、葉脈における遺伝子による植物体への影響を解析すること等の少なくとも１つを可能にする手段を提供すること。【解決手段】特定の塩基配列を含有した核酸を用いて、発現対象の核酸を組織特異的に発現させる、遺伝子の発現方法；上記塩基配列を有した組織特異的プロモーターを保持する核酸；該核酸を含有した核酸導入用担体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
又は、
下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を含有した核酸を用いて、発現対象の核酸を組織特異的に発現させることを特徴とする、遺伝子の発現方法。
【請求項２】
（Ｉ）下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
の下流に、発現対象の遺伝子が作動可能に結合した核酸構築物を含有した核酸導入用担体を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ＩＩ）前記（Ｉ）で得られた形質転換植物細胞を培養して、植物体を得るステップ、
を含み、ここで、該発現対象の核酸の発現産物は、葉肉に特異的に発現する、請求項１記載の遺伝子の発現方法。
【請求項３】
（ｉ）下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
の下流に、発現対象の遺伝子が作動可能に結合した核酸構築物を含有した核酸導入用担体を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ｉｉ）前記（ｉ）で得られた形質転換植物細胞を培養して、植物体を得るステップ、
を含み、ここで、該発現対象の核酸の発現産物は、根又は葉脈に特異的に発現する、請求項１記載の遺伝子の発現方法。
【請求項４】
下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有してなる、組織特異的プロモーターを保持する核酸。
【請求項５】
下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有してなる、組織特異的プロモーターを保持する核酸。
【請求項６】
請求項４又は請求項５記載の核酸を含有してなる、核酸導入用担体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織、具体的には、植物組織に特異的なプロモーター、遺伝子の発現方法及び核酸導入用担体に関する。具体的には、発現対象の核酸を、組織、具体的には、植物組織に特異的に発現させることができる、組織特異的プロモーターを保持する核酸、遺伝子の発現方法、並び核酸導入用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
窒素は、植物の主要な生育制限栄養素の１つであり、ほとんどの高等植物における該窒素の供給源は、根から吸収された硝酸である。高等植物においては、根により、硝酸が取り込まれ、ついで、細胞質における硝酸還元酵素により、該硝酸が、亜硝酸に還元される。その後、亜硝酸は、プラスチドの亜硝酸還元酵素（ＮｉＲ）により、アンモニウムに還元され、ついで、該アンモニウムは、炭素骨格に取り込まれ、アミノ酸等の種々の窒素代謝物を形成する。
【０００３】
硝酸の還元は、根及び苗条の両方で起こりうる。例えば、オオムギにおいては、硝酸還元の速度は、苗条における硝酸還元に対する根における硝酸還元の割合は、明／暗サイクルにより調節され、これらの２つの器官のそれぞれにより、還元窒素の様々な必要性を反映する〔非特許文献１〕。硝酸還元の主要なステップに関与するこれらの酵素の日周及び／又は光依存性調節は、高等植物の苗条においてよく知られている〔非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７を参照のこと〕。
【０００４】
しかしながら、根における硝酸還元の調節については、タバコ根における硝酸同化が、昼も夜も同様の割合で起こり、根における硝酸還元が、苗条とは異なって調節されるという最近の報告〔非特許文献８を参照のこと〕以外は、ほとんど知られていないのが現状である。
【０００５】
硝酸の還元は、根及び苗条の両方で起こるが、ＮｉＲ遺伝子の数、構造等は、植物種により異なることが知られている。例えば、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ホウレンソウ及びオオムギは、１種のＮｉＲ遺伝子、イネ、トウモロコシ及びトウガラシは、２種のＮｉＲ遺伝子、大豆は、３種のＮｉＲ遺伝子を有することが知られている〔非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４及び非特許文献１５を参照のこと〕。
【０００６】
タバコは、４種のＮｉＲを有する点で独特である〔非特許文献１６を参照のこと〕。
【０００７】
しかしながら、４種のＮｉＲの遺伝子のうち１種の遺伝子が、完全にクローン化されているにすぎず、４種のＮｉＲの構造や機能等、不明な点が多いのが現状である。
【０００８】
【非特許文献１】
オオジ（Ｏｊｉ  Ｙ）ら、Ｐｌａｎｔａ、１７９、３５９−３６６、１９８９
【非特許文献２】
ラジャセクハール（Ｒａｊａｓｅｋｈａｒ  ＶＫ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、８８、２４２−２４４、１９８８
【非特許文献３】
シュスター（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｃ．）ら、Ｐｌａｎｔａ．、１８１、３２７−３３４、１９９０
【非特許文献４】
ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ  ＴＷ．）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９、３６７−３７９、１９９２
【非特許文献５】
ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ  ＴＷ．）ら、Ｐｌａｎｔａ．、１８８、３９−４７、１９９２
【非特許文献６】
カイザル（Ｋａｉｓｅｒ  ＷＭ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１０６、８１７−８２１、１９９４
【非特許文献７】
ラム（Ｌａｍ  Ｈ−Ｍ）ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、７、８８７−８９８、１９９５
【非特許文献８】
ストェール（Ｓｔｏｅｈｒ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ、５２、１２８３−１２８９、２００１
【非特許文献９】
タナカ（Ｔａｎａｋａ  Ｔ．）ら、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ５、５７−６１、１９９４
【非特許文献１０】
バック（Ｂａｃｋ  Ｅ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１２、２０−２６、１９８８
【非特許文献１１】
ダンカンソン（Ｄｕｎｃａｎｓｏｎ  Ｅ．）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、８７、１５１−１６０、１９９２
【非特許文献１２】
テラダ（Ｔｅｒａｄａ  Ｙ．）ら、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５９、２１８３−２１８５、１９９５
【非特許文献１３】
ラーナーズ（Ｌａｈｎｅｒｓ  Ｋ．）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８８、７４１−７４６、１９８８
【非特許文献１４】
キム（Ｋｉｍ  Ｃ−Ｈ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ  ９、１５２−１５７、１９９９
【非特許文献１５】
キム（Ｋｉｍ  Ｃ−Ｈ．）ら、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２８、１０３１−１０３８、２００１
【非特許文献１６】
クローネンベルガー（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｊ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２３６、２０３−２０８、１９９３
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、発現対象の核酸を、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に発現させること、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させること、根、葉肉、葉脈における遺伝子の機能を解析すること、根、葉肉、葉脈における遺伝子による植物体への影響を解析すること等の少なくとも１つを可能にする、遺伝子の発現方法を提供することを目的とする。また、本発明は、発現対象の核酸を、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に発現させること、発現対象の核酸を、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に効率よく発現させること、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導すること、本発明の遺伝子の発現方法を効率よく行なうこと等の少なくとも１つを可能にする、組織特異的プロモーターを保持する核酸を提供することを目的とする。さらに、本発明は、本発明の核酸を効率よく導入すること、本発明の遺伝子の発現方法を効率よく行なうこと等を可能にする、核酸導入用担体を提供することを目的とする。なお、本発明により解決することができるその他の課題は、本明細書における記載より明らかであろう。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、
〔１〕  下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
又は、
下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を含有した核酸を用いて、発現対象の核酸を組織特異的に発現させることを特徴とする、遺伝子の発現方法、
〔２〕  （Ｉ）下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
の下流に、発現対象の遺伝子が作動可能に結合した核酸構築物を含有した核酸導入用担体を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ＩＩ）前記（Ｉ）で得られた形質転換植物細胞を培養して、植物体を得るステップ、
を含み、ここで、該発現対象の核酸の発現産物は、葉肉に特異的に発現する、前記〔１〕記載の遺伝子の発現方法、
〔３〕  （ｉ）下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
の下流に、発現対象の遺伝子が作動可能に結合した核酸構築物を含有した核酸導入用担体を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ｉｉ）前記（ｉ）で得られた形質転換植物細胞を培養して、植物体を得るステップ、
を含み、ここで、該発現対象の核酸の発現産物は、根又は葉脈に特異的に発現する、前記〔１〕記載の遺伝子の発現方法、
〔４〕  下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有してなる、組織特異的プロモーターを保持する核酸、
〔５〕  下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有してなる、組織特異的プロモーターを保持する核酸、並びに
〔６〕  前記〔４〕又は前記〔５〕記載の核酸を含有してなる、核酸導入用担体、
に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本明細書において、ｎｉｉ３及びｎｉｉ４は、タバコの亜硝酸還元酵素（以下、「ＮｉＲ」とも表記する）の１種である。前記ｎｉｉ３は、いわゆる葉型亜硝酸還元酵素であり、前記ｎｉｉ４は、いわゆる根型亜硝酸還元酵素である。
【００１２】
本発明の遺伝子の発現方法は、下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
又は、
下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を含有した核酸を用いて、発現対象の核酸を組織特異的に発現させることを１つの大きな特徴とする。
【００１３】
ここで、前記（Ａ）の配列番号：１７は、タバコの亜硝酸還元酵素のうちの１つをコードする遺伝子であるｎｉｉ３のプロモーターの塩基配列であり、前記（ａ）の配列番号：１８は、タバコの亜硝酸還元酵素のうちの１つをコードする遺伝子であるｎｉｉ４のプロモーターの塩基配列である。
【００１４】
前記ｎｉｉ３のプロモーターは、驚くべく、葉肉において、遺伝子を特異的に発現させ、前記ｎｉｉ４のプロモーターは、驚くべく、葉脈及び根において、遺伝子を特異的に発現させうるという優れた性質を有する。
【００１５】
本発明の遺伝子の発現方法は、前記ｎｉｉ３のプロモーター又は前記ｎｉｉ４のプロモーターが用いられるため、前記プロモーターのいずれかの下流に、作動可能に結合した発現対象の核酸を、所定の組織に特異的に発現させることができるという優れた効果を発揮する。
【００１６】
また、ｎｉｉ３は、硝酸塩処理により、葉において、そのｍＲＮＡレベルが著しく増加するが、根においては、実質的に増加は見られないため、前記ｎｉｉ３のプロモーターによれば、作動可能に結合した発現対象の核酸を、葉肉において誘導し、特異的に発現させうる。一方、ｎｉｉ４は、硝酸塩処理により、根において、そのｍＲＮＡレベルが著しく増加するが、葉においては、葉脈以外では実質的に増加は見られないため、前記ｎｉｉ４のプロモーターによれば、作動可能に結合した発現対象の核酸を、根及び葉脈において誘導し、特異的に発現させうる。
【００１７】
本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するために認識し、特異的に結合するＤＮＡ領域をいう。
【００１８】
本明細書において、「作動可能に結合した」とは、本来の機能を発揮するように配置された状態を意味し、例えば、プロモーターにより、制御できるように、発現対象の核酸が配置され、かつ該核酸によりコードされた産物が該プロモーターの制御下に発現されるように配置された状態を意味する。
【００１９】
自然界においては、天然の遺伝子が自然発生的に変異を起こして生じたバリアントであっても、該遺伝子によりコードされる産物が、本来の機能を発揮する場合がある。したがって、本発明において、ｎｉｉ３のプロモーター及びｎｉｉ４のプロモーターは、それぞれと同等の機能を発揮するバリアントであってもよい。すなわち、前記ｎｉｉ３のプロモーターの塩基配列は、（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列であってもよい。また、前記ｎｉｉ４のプロモーターの塩基配列は、（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列であってもよい。なお、かかるバリアントは、人為的に、例えば、慣用の部位特異的変異導入方法等により作製されうる。
【００２０】
前記（Ｂ）の塩基配列としては、例えば、（Ｂ１）配列番号：１７において、少なくとも１塩基の変異（置換、欠失、挿入、付加等）を有する塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、（Ｂ２）配列番号：１７の核酸とストリンジェント、好ましくは高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、（Ｂ３）配列番号：１７に対し、ＨｉｇｇｉｎｓらによるＣｌｕｓｔａｌＷ法によるマルチプルアライメント（例えば、Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ５、Ｆｉｘｅｄ  Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  １０、ｗｉｎｄｏｗｓ  ｓｉｚｅ  ５、Ｆｌｏａｔｉｎｇ  Ｇａｐ  １０）により、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上である塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列等が例示される。
【００２１】
前記（ｂ）の塩基配列としては、例えば、（ｂ１）配列番号：１８において、少なくとも１塩基の変異（置換、欠失、挿入、付加等）を有する塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、（ｂ２）配列番号：１８の核酸とストリンジェント、好ましくは高ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸の塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、（ｂ３）配列番号：１８に対し、前記マルチプルアライメントにより、最適な状態にアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも７０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上である塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列等が例示される。
【００２２】
本明細書において、前記「ストリンジェントな条件」とは、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性断片化サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミドを含む溶液中、プローブとともに４２℃で一晩保温し、低イオン強度、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、３７℃以上、ストリンジェントには、４２℃以上、よりストリンジェントには、５０℃以上、より一層ストリンジェントには、６０℃以上等の条件下での洗浄を行なう条件により達成されうる。
【００２３】
前記核酸多型は、具体的には、▲１▼  ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始するために認識し、特異的に結合するＤＮＡ領域としての機能、▲２▼  発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能等を発揮するための構造を維持する範囲での多型であればよい。
【００２４】
前記▲１▼の機能は、例えば、植物、具体的には、タバコのＲＮＡポリメラーゼと、試験対象の核酸（例えば、配列番号：１７、１８、それらのバリアント）との結合の有無を検出することにより評価されうる。結合の有無の検出は、ゲルシフトアッセイ、表面プラズモン解析、フットプリント法（例えば、ＤＮａｓｅＩフットプリンティング）等により行われうる。なお、ＲＮＡポリメラーゼは、他の転写因子の存在下に、プロモーターを認識し、結合する場合があるため、適切な転写因子の存在下において、試験対象の核酸との結合の有無を評価してもよい。
【００２５】
前記ゲルシフトアッセイにより、結合の有無を検出する場合、
−  ＲＮＡポリメラーゼと、慣用の標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質等）で標識した試験対象の核酸と、任意に、他の転写因子とを混合し、
−  得られた混合物をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
該核酸に対応するバンドの移動度が、ＲＮＡポリメラーゼと任意の転写因子との非存在下の場合の核酸のバンド（対照）の移動度と比較して、遅延していた場合、試験対象の核酸が前記▲１▼の核酸の機能を有することの指標となる。
【００２６】
前記表面プラズモン解析により、結合の有無を検出する場合、例えば、
−  試験対象の核酸又はＲＮＡポリメラーゼを固定化したセンサーチップに、それに対応して、ＲＮＡポリメラーゼ又は試験対象の核酸と、任意に、他の転写因子を含有した溶液を一定の流速で送液し、
−  適切な検出手段〔例えば、光学的検出（蛍光度、蛍光偏向度等）、質量分析計との組み合わせ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計：ＥＳＩ−ＭＳ等）〕により、光学的変動又は質量の変動として、試験対象の核酸とＲＮＡポリメラーゼとの結合を検出し、
例えば、光学的センサーグラム又は質量センサーグラムが、送液により変動した場合、試験対象の核酸が前記▲１▼の核酸の機能を有することの指標となる。
【００２７】
前記フットプリント法により、結合の有無を検出する場合、例えば、
−  ＲＮＡポリメラーゼと、慣用の標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質等）で標識した試験対象の核酸（二本鎖ＤＮＡ）と、任意に、他の転写因子とを混合し、
−  得られた混合物を、ＤＮａｓｅＩにより部分消化するか、又はマキサム・ギルバート法により化学分解し、
−  得られた産物を、尿素含有変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
例えば、フットプリントが検出された場合、試験対象の核酸が前記▲１▼の核酸の機能を有することの指標となる。なお、フットプリントが生じた部分は、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位であることが推定される。
【００２８】
前記▲２▼の機能は、例えば、
−  試験対象の核酸の下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結させ、構築物を得
−  得られた構築物を、植物細胞に、慣用の遺伝子導入法により導入して、形質転換植物細胞を得、
−  得られた形質転換植物細胞を培養して、葉に再分化させ、
−  葉肉又は葉脈におけるレポーター遺伝子の発現の有無を検出する
ことにより、評価されうる。
【００２９】
ここで、前記レポーター遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子、Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＤｓＲｅｄ）遺伝子等に代表される慣用のレポーター遺伝子が挙げられる。
【００３０】
前記植物細胞としては、リーフディスク、茎、根外植片、カルス、プロトプラスト等が挙げられる。なかでも、器官特異的発現解析の観点から、リーフディスクや根外植片が好適である。前記リーフディスクは、例えば、無菌培養したタバコの葉を、無菌的に切断することにより得られる。また、前記カルスは、例えば、タバコの芽、根の先端、節の切片、発芽種子、枝等の外植片を、切り出して植物体から単離し、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素等で洗浄し、オーキシン、ジベレリン等を含む栄養培地上で培養することにより、未分化の細胞塊として得られる。さらに、前記プロトプラストは、前記カルス等を、セルラーゼ、ペクチナーゼ等により処理し、遠心分離することにより得られる。
【００３１】
前記植物細胞の作製の際に用いる培地としては、例えば、ＭＳ培地〔ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，１５：４７３，（１９６２）〕、ＬＳ培地〔リンスマイヤー（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ＥＭ）ら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，１８：１００，（１９６５）〕、ＷＰＭ（Ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｅｄｉｕｍ）〔ルロイド（Ｌｌｏｙｄ  ＧＢ．）ら、Ｃｏｍｂ．Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｐａｇａｔｏｒｓ  Ｓｏｃ．，３０：４２１，（１９８０）〕等が挙げられる。
【００３２】
前記遺伝子導入法としては、生物的導入法、直接的導入法等により行なわれうる。
【００３３】
前記生物的導入法としては、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法等が挙げられる。かかるアグロバクテリウムを用いる方法においては、ｐＩＧ１２１等の植物への遺伝子導入に用いられる慣用のベクター中の外来遺伝子発現用プロモーターを除去し、前記構築物を連結して得られた発現ベクターが用いられる。
【００３４】
前記直接的導入法としては、エレクトロポレーション法、パーティクルガンを用いたボンバードメント法等が挙げられる。
【００３５】
前記形質転換植物細胞から葉への再分化は、例えば、プロトプラストの場合、該プロトプラストを固体栄養培地で培養して、細胞壁を合成させ、ついで、液体培地中で、激しく攪拌させながら、培養し、カルスを得、得られたカルスをオーキシンおよびサイトカイニンの存在下に培養することにより行なわれうる。なお、カルスから葉への再分化は、例えば、低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行われうる。リーフディスクから葉の再分化は、例えば、リーフディスクを低濃度のオーキシンと高濃度のサイトカイニンとの存在下に培養することにより行われうる。
【００３６】
前記形質転換植物細胞から葉への再分化の際に用いられる培地としては、例えば、カルス誘導培地（１ｍｇ／ｌ  インドール酢酸と１ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）、シュート誘導培地（０．１ｍｇ／ｌ  インドール酢酸と１ｍｇ／ｌ  ベンジルアミノプリンとを含むＭＳ培地）等が挙げられる。
【００３７】
葉肉又は葉脈におけるレポーター遺伝子の発現の有無は、用いたレポーター遺伝子の発現産物に応じた方法により検出されうる。
【００３８】
本発明の遺伝子の発現方法としては、より具体的には、
（Ｉ）下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
の下流に、発現対象の遺伝子が作動可能に結合した核酸構築物を含有した核酸導入用担体を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ＩＩ）前記（Ｉ）で得られた形質転換植物細胞を培養して、植物体を得るステップ、
を含み、ここで、該発現対象の核酸の発現産物は、葉肉に特異的に発現する、遺伝子の発現方法（態様１）；
（ｉ）下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
の下流に、発現対象の遺伝子が作動可能に結合した核酸構築物を含有した核酸導入用担体を植物細胞に導入して、形質転換植物細胞を得るステップ、
（ｉｉ）前記（ｉ）で得られた形質転換植物細胞を培養して、植物体を得るステップ、
を含み、ここで、該発現対象の核酸の発現産物は、根又は葉脈に特異的に発現する、遺伝子の発現方法（態様２）
等が挙げられる。
【００３９】
前記ステップ（Ｉ）及び（ｉ）において、核酸導入用担体は、前記（Ａ）、（Ｂ）、（ａ）及び（ｂ）のいずれかの塩基配列からなる核酸（プロモーター）と、発現対象の核酸と、ｐＩＧ１２１等の植物への遺伝子導入に用いられる慣用のベクターにおいて、外来遺伝子発現のためのプロモーターを除去して得られたベクター骨格とを含有するものであり、前記プロモーターと、発現対象の核酸とは、作動可能に結合したものである。
【００４０】
また、前記ステップ（Ｉ）及び（ｉ）において、植物細胞への核酸導入用担体の導入は、前記と同様の生物的導入法、直接的導入法等により行なわれる。
【００４１】
前記ステップ（ＩＩ）及び（ｉｉ）において、前記形質転換植物細胞から葉への再分化の手法及び用いられる培地は、前記と同様である。
【００４２】
前記態様１の方法によれば、前記（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかの塩基配列からなる核酸を用いられるため、発現対象の核酸を、葉肉に特異的に発現させることができ、葉肉に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、前記態様１の方法によれば、葉肉における遺伝子の機能を解析すること、葉肉における遺伝子による植物体への影響を解析すること等が可能になる。また、前記態様２の方法によれば、前記（ａ）又は（ｂ）のいずれかの塩基配列からなる核酸を用いられるため、発現対象の核酸を、根又は葉脈に特異的に発現させることができ、根又は葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、前記態様１の方法によれば、根又は葉脈における遺伝子の機能を解析すること、根又は葉脈における遺伝子による植物体への影響を解析すること等が可能になる。
【００４３】
本発明の遺伝子の増幅方法に用いられる前記プロモーター、すなわち、下記（Ａ）若しくは（Ｂ）：
（Ａ）配列番号：１７に示される塩基配列、若しくは
（Ｂ）配列番号：１７とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有した組織特異的プロモーターを保持する核酸（核酸１）、
下記（ａ）若しくは（ｂ）：
（ａ）配列番号：１８に示される塩基配列、若しくは
（ｂ）配列番号：１８とは、少なくとも１塩基が、核酸多型により異なる塩基配列であって、かつ該塩基配列の下流に作動可能に結合した発現対象の核酸を組織特異的に発現させる機能を有するポリヌクレオチドの塩基配列、
を有した組織特異的プロモーターを保持する核酸（核酸２）も本発明に含まれる。
【００４４】
前記核酸１は、前記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を含有するため、該塩基配列の下流に発現対象の核酸を配置した場合、該発現対象の核酸を、葉肉に特異的、効率よく発現させることができ、葉肉に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させることができるという優れた効果を発揮する。また、前記核酸２は、（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含有するため、該塩基配列の下流に発現対象の核酸を配置した場合、発現対象の核酸を、根又は葉脈に特異的、効率よく発現させることができ、根又は葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４５】
また、本発明の遺伝子の増幅方法に用いられる前記核酸導入用担体は、本発明の核酸を効率よく導入することができ、本発明の遺伝子の発現方法を効率よく行なうことができるものであり、本発明に含まれる。
【００４６】
本発明の核酸導入用担体は、本発明の核酸を含有したものであり、より具体的には、前記（Ａ）、（Ｂ）、（ａ）及び（ｂ）のいずれかの塩基配列からなる核酸（プロモーター）と、発現対象の核酸と、ｐＩＧ１２１等の植物への遺伝子導入に用いられる慣用のベクターにおいて、外来遺伝子発現のためのプロモーターを除去して得られたベクター骨格とを含有するものであり、前記プロモーターと、発現対象の核酸とは、作動可能に結合したものである
【００４７】
また、本発明の核酸導入用担体は、核酸成分を、金粒子等に担持させて得られた担体、リポソーム等に包含させて得られた担体等であってもよい。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。なお、下記実施例において、特に明記しない限り、遺伝子操作は、用いたキットに添付の説明書、慣用のプロトコール〔例えば、前記モレキュラークローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル  第２版、モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル  第３版等を基に行なわれた。
【００４９】
実施例１
タバコの亜硝酸還元酵素遺伝子ｎｉｉ３及びｎｉｉ４のクローニングを試みた。
【００５０】
ｎｉｉ３に特異的な遺伝子プローブ（ｎｉｉ３遺伝子プローブ）を得るため、タバコゲノムを鋳型とし、組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ〔タカラバイオ社製〕を用いて、ゲノム断片を増幅した。プライマー対として、５’−ＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＧＴＧＧＡＧ−３’  （配列番号：１、フォワードプライマー）と５’−ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧ−３’  （配列番号：２、リバースプライマー）とからなるプライマー対を用いた。ＰＣＲ条件は、９５℃１分間と５８℃１分間と７２℃２分間とを１サイクルとする３０サイクルである。
【００５１】
得られた増幅断片を、商品名：ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（東洋紡社製）で精製し、ＴＡクローニングにより、商品名：ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕にクローン化した。
【００５２】
その後、商品名：ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  ジェネティックアナライザー〔アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製〕を用いて、ジデオキシチェーンターミネーション法で、得られた増幅断片をシークエンスした。
【００５３】
その結果、１．６ｋｂの断片が、ｎｉｉ３に特異的であることが見出された。そこで、前記１．６ｋｂの断片を、タバコゲノムライブラリー〔クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製〕をスクリーニングするためのｎｉｉ３遺伝子プローブとして用いた。
【００５４】
スクリーニングは、慣用のプラークハイブリダイゼーションにより行なった。その結果、前記ｎｉｉ３遺伝子プローブとハイブリダイズした陽性ファージクローンが得られた。
【００５５】
その結果、得られた陽性ファージクローンから、商品名：ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｍｂｄａ  Ｍｉｄｉキット〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて、ＤＮＡを抽出した。
【００５６】
ついで、前記ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、消化ＤＮＡについて、前記ｎｉｉ３遺伝子プローブを用いて、サザンブロット解析を行なった。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝液〔組成：５０％  ホルムアミド、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ〕中、４２℃で一晩インキュベーションすることにより行ない、その後、２×ＳＳＣ、室温で１５分間、ついで、２×ＳＳＣ，１．０％  ＳＤＳ、６５℃で２０分間、０．２×ＳＳＣ、１．０％  ＳＤＳ、６５℃で２０分間の洗浄を行なった。
【００５７】
その結果、制限酵素ＳａｌＩで消化したＤＮＡのレーンにおいて、約８．０ｋｂの位置と約１．４ｋｂの位置、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡのレーンにおいて、約２．５ｋｂの位置に、前記ｎｉｉ３遺伝子プローブとハイブリダイズしたことを示すシグナルが見られた。
【００５８】
ついで、シグナルが見られた位置の陽性ＤＮＡ断片をゲルから抽出し、該陽性ＤＮＡ断片を、商品名：ｐＢＳＳＫ−〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕にクローン化し、前記と同様に、シークエンスした。
【００５９】
一方、ｎｉｉ４に特異的な遺伝子プローブ（ｎｉｉ４遺伝子プローブ）を得るため、まず、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーと商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕とを用いて、タバコの根から単離された全ＲＮＡを、４２℃５０分間インキュベートして、一本鎖ｃＤＮＡに変換した。なお、前記全ＲＮＡは、９週令のタバコ植物それぞれの葉及び根から、チョムションクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）ら〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６２、１５６−１５９、１９８７〕の方法に従って抽出したものである。
【００６０】
前記一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、下記プライマー対を用い、Ｐｆｕポリメラーゼ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕を用いて、ＰＣＲ増幅を行なった。ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒と５５℃で１分と７２℃で３０秒とを１サイクルとする３０サイクルである。
【００６１】
プライマー対として、５’−ＧＡＴＴＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧ−３’  （配列番号：３、フォワードプライマー）と５’−ＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＧＧＡＴＧＣ−３’  （配列番号：４、リバースプライマー）とからなるプライマー対を用いた。
【００６２】
ついで、得られた増幅断片を、ｎｉｉ２  ｃＤＮＡに認識部位を有するＫｐｎＩ、ＳｔｙＩ、及びＰｖｕＩＩで消化した。その結果、ＳｔｙＩとＰｖｕＩＩとで消化されうるが、ＫｐｎＩでは消化され得ない断片を得、該断片を、ＴＡクローニングでクローン化した。ｎｉｉ４に特異的なサブクローンを、タバコゲノムライブラリー〔クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製〕をスクリーニングするための遺伝子プローブ（ｎｉｉ４遺伝子プローブ）として用いた。
【００６３】
スクリーニングは、慣用のプラークハイブリダイゼーションにより行なった。その結果、前記ｎｉｉ４遺伝子プローブとハイブリダイズした陽性ファージクローンが得られた。
【００６４】
陽性ファージクローンから、商品名：ＱＩＡＧＥＮ  Ｌａｍｂｄａ  Ｍｉｄｉキット〔キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製〕を用いて、ＤＮＡを抽出した。
【００６５】
ついで、前記ＤＮＡを種々の制限酵素で消化し、消化ＤＮＡについて、前記ｎｉｉ４遺伝子プローブを用いて、サザンブロット解析を行なった。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション緩衝液〔組成：５０％  ホルムアミド、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、０．２ｍｇ／ｍｌ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ〕中、４２℃で一晩インキュベーションすることにより行ない、その後、２×ＳＳＣ、室温で１５分間、ついで、２×ＳＳＣ，１．０％  ＳＤＳ、６５℃で２０分間、０．２×ＳＳＣ、１．０％  ＳＤＳ、６５℃で２０分間の洗浄を行なった。
【００６６】
その結果、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡのレーンにおいて、約６．１ｋｂの位置、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡのレーンにおいて、約２．２ｋｂの位置に、前記ｎｉｉ４遺伝子プローブとハイブリダイズしたことを示すシグナルが見られた。
【００６７】
ついで、シグナルが見られた位置の陽性ＤＮＡ断片をゲルから抽出し、該陽性ＤＮＡ断片を、ｐＢＳＳＫ−〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕にクローン化し、前記のように、シークエンスした。
【００６８】
図１に、クローン化したｎｉｉ３及びｎｉｉ４を含め、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｘａｎｔｈｉ  ＸＨＦＤ８）由来の４つのＮｉＲ遺伝子：ｎｉｉ１（配列番号：５）、ｎｉｉ２（配列番号：６）、ｎｉｉ３（配列番号：７）及びｎｉｉ４（配列番号：８）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列を示す。
【００６９】
ｎｉｉ３は、４つのエキソン及び３つのイントロンを有し、それは、バウチェレット（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ  Ｈ．）ら〔Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２，５５９−５６９、１９９２〕により報告されたｎｉｉ１のものと非常に類似することが示された。
【００７０】
ｎｉｉ３のＯＲＦ（アクセッション番号：ＡＢ０９３５３３）の長さは、図１に示されるように、ｎｉｉ１のものと同じであることが推定された。
【００７１】
ｎｉｉ４は、４つのエキソンと３つのイントロンとを有し、それは、ｎｉｉ１〔前記バウチェレット（Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ）ら、１９９２〕及びｎｉｉ３と非常に類似することが示された。
【００７２】
ゲノム配列から推定されたｎｉｉ４のＯＲＦ（アクセッション番号：ＡＢ０９３５３４）は、５８４アミノ酸をコードする１７５５ｂｐであることが推定された。
【００７３】
実施例２
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｘａｎｔｈｉ  ＸＨＦＤ８）の種子を、２．５％（ｖ／ｖ）  次亜塩素酸で表面殺菌した。ついで、窒素源を含まない固体Ｂ培地〔０．３％（ｗ／ｖ）  ジェランガム（ｐＨ５．６）含有；組成について、バウアジン（Ｂｏｕｒｇｉｎ  ＪＰ）ら、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ４５、２８８−２９２  １９７９参照〕を含むペトリ皿に、前記種子を蒔いた。前記ペトリ皿中の種子を、２３．０±０．３℃で、７０±４％の相対湿度、照度３０〜４０μＥ  ｍ−２ｓ−１、蛍光灯下１６時間：８時間の明暗サイクルで維持した。
【００７４】
播種から２週間後、１０ｍＭ  コハク酸アンモニウムと、１０ｍＭ  ＫＣｌとを含有した含む固体Ｂ培地〔組成：０．２％（ｗ／ｖ）  ジェランガム含有〕を含むプラスチック容器に、生育した植物を移した。さらに前記植物を、無菌状態で２週間生育させた。
【００７５】
その後、植物を、土〔バーミキュライト及びパーライト〔体積（ｖ／ｖ）比１：１）を含むプラスチックポットに植え替え、さらに５週間２２．０±０．３℃、７０±４％の相対湿度で、照度７０μＥ  ｍ−２ｓ−１、連続光下に生育させた。なお、４日毎に、１０ｍＭ  コハク酸アンモニウムと１０ｍＭ  ＫＣｌとを含むコイェック（Ｃｏｉｅｃ）とレセント（Ｌｅｓａｉｎｔ）の培地（改変培地）を、前記植物に与えた。
【００７６】
タバコの亜硝酸塩処理は、以下のように行なった。コイック（Ｃｏｉｅｃ）とレセント（Ｌｅｓａｉｎｔ）の培地の改変培地による生育開始から、２５日後、窒素源を含まない前記コイック（Ｃｏｉｅｃ）とレセント（Ｌｅｓａｉｎｔ）の培地を植物に与えた。その後、２〜３日毎に、窒素源を含まないコイック（Ｃｏｉｅｃ）とレセント（Ｌｅｓａｉｎｔ）の培地を植物に与え、育成を続けた。１０日後、１０ｍＭ  ＫＮＯ３を含むコイック（Ｃｏｉｅｃ）とレセント（Ｌｅｓａｉｎｔ）の培地を、植物に与えてＮｉＲ発現を誘導した。この時点を０時間として定義し、その後、ｍＲＮＡ発現を４時間調べた。
【００７７】
硝酸塩処理をした９週令のタバコ植物及び硝酸塩非処理の９週令のタバコ植物それぞれの葉及び根から、チョムションクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）ら〔Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６２、１５６−１５９、１９８７〕の方法に従って、全ＲＮＡを抽出した。
【００７８】
下記プライマー対と、鋳型としてλＤＮＡと、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ〔タカラバイオ社製〕を用い、製造者の説明書に従い、ＰＣＲにより、葉ＮｉＲ遺伝子及び根ＮｉＲ遺伝子それぞれの競合的ＤＮＡを合成した。
【００７９】
葉ＮｉＲ遺伝子のＣｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡを増幅するためのプライマー対として、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＧＴＧＧＡＧＧＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣ−３’  （配列番号：９、フォワードプライマー）と５’−ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧ−３’  （配列番号：１０、リバースプライマー）とからなるプライマー対、根ＮｉＲ遺伝子のＣｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡを増幅するためのプライマー対として、５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＧＴＡＣＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＣ−３’  （配列番号：１１、フォワードプライマー）と５’−ＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＣＧＣＣＡＴＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＴＣＣ−３’  （配列番号：１２、リバースプライマー）とからなるプライマー対を用いた。これらの４つのプライマーにおいて、タバコＮｉＲ  ｃＤＮＡの配列を下線で示す。
【００８０】
商品名：Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ〔タカラバイオ社製〕を用いて、ＳＰ６プロモーターから、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡをＲＮＡに転写させた。２６０ｎｍでの吸収により、Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡを定量した。Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＲＮＡの連続希釈物を、タバコの葉又は根から単離した全ＲＮＡと混合し、商品名：Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素〔ギブコ−ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）社製〕を用いて、５０℃で５０分間、共増幅させた。
【００８１】
葉ＮｉＲ及びｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒのＰＣＲ条件は、９５℃１分間と、６０℃２分間と７２℃１分間とを１サイクルとする３０サイクルである。また、根ＮｉＲ及びＣｏｍｐｅｔｉｔｏｒのＰＣＲ条件は、９５℃１分間と、５６℃２分間と７２℃１分間とを１サイクルとする３０サイクルである。
【００８２】
葉ＮｉＲ  ｃＤＮＡ及びそのＣｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡを増幅するためのプライマー対として、５’−ＴＴＧＧＣＡＧＡＴＴＣＧＴＧＧＡＧ−３’  （前記配列番号：１、フォワードプライマー）と５’−ＣＴＧＣＴＴＧＡＡＣＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＧ−３’  （前記配列番号：２、リバースプライマー）とからなるプライマー対を用い、根ＮｉＲ  ｃＤＮＡ及びそのＣｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡを増幅するためのプライマー対として、５’−ＧＧＴＧＧＧＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧ−３’  （配列番号：１３、フォワードプライマー）と５’−ＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣ−３’  （配列番号：１４、リバースプライマー）とからなるプライマー対を用いた。
【００８３】
得られたＰＣＲ産物を、１．８％（ｗ／ｖ）  アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。ついで、ＮｉＲ  ｃＤＮＡ由来の得られたバンド及びＣｏｍｐｅｔｉｔｏｒ由来の得られたバンドの強度を定量し、ＮｉＲ  ｍＲＮＡの濃度を、高橋（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ．）ら〔Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１２６、７３１−７４１、２００１〕に記載のように測定した。
【００８４】
なお、タバコβ−チューブリン遺伝子（アクセッション番号：Ｕ９１５６３）を、ＲＴ−ＰＣＲの内部対照として用いた。タバコβ−チューブリン遺伝子の増幅のためのプライマー対として、５’−ＴＡＣＡＣＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＡＴＧＧ−３’  （配列番号：１５、フォワードプライマー）及び５’−ＣＴＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣＧＣＴＴＡＴＣ−３’  （配列番号：１６、リバースプライマー）を用いた。また、用いたプライマーの特異性は、ｎｉｉ１及びｎｉｉ３に特異的な制限酵素により、増幅された葉ＮｉＲバンドを消化することにより、臭化エチジウム染色後に、バンドの完全な消失をもたらすことにより検証された。これにより、根ＮｉＲアンプリコンの混入の可能性を無視できることが示された。同じことが、ｎｉｉ２及びｎｉｉ４に特異的なプライマー対により増幅された根ＮｉＲバンドにもあてはまった。
【００８５】
図２及び図３に、硝酸塩処理によるＮｉＲ遺伝子の発現の誘導の前後のタバコの葉における葉ＮｉＲ遺伝子と、硝酸塩処理によるＮｉＲ遺伝子の発現の誘導の前後のタバコの根ＮｉＲ遺伝子とのそれぞれについて、定量競合ＲＴ−ＰＣＲ解析により決定されたｍＲＮＡレベルを示す。
【００８６】
葉ＮｉＲ遺伝子は、硝酸塩による誘導無しに、葉で明確に発現し、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、１μｇ  全ＲＮＡあたり、６．７×１０５コピーであった。硝酸塩誘導後、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、著しく増加し、誘導後４時間で６倍に増加した（１μｇ  全ＲＮＡあたり４．２×１０６コピーまで）。
【００８７】
しかしながら、図３に示されるように、根において、葉ＮｉＲ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、硝酸塩誘導の前（１μｇ  全ＲＮＡあたり３．０×１０４コピー）及び後（１μｇ  全ＲＮＡあたり５．０×１０５コピー）の両方で低かった。このことより、硝酸塩処理が、葉における葉ＮｉＲ遺伝子の発現レベルを著しく増加させるが、根においては増加させないことが定量的に立証される。
【００８８】
硝酸塩処理前の根における根ＮｉＲ遺伝子のｍＲＮＡレベルは、１μｇ  全ＲＮＡあたり１．０×１０６コピーであった。硝酸塩処理後、根遺伝子のｍＲＮＡレベルは、根で１５倍を超えて増加した（１μｇ  全ＲＮＡあたり１．８×１０７コピー）。この結果により、硝酸塩処理により、根における根ＮｉＲ遺伝子が非常に誘導されることを定量的に立証される。
【００８９】
図３に示されるように、葉における根遺伝子のｍＲＮＡは、根における根遺伝子のｍＲＮＡと比較し、硝酸塩処理の前（１μｇ  全ＲＮＡあたり２．３×１０５コピー）及び後（１μｇ  全ＲＮＡあたり１．８×１０６コピー）の両方で低いレベルのままであった。硝酸塩処理後の葉における根ＮｉＲ遺伝子のｍＲＮＡレベルが、これらの器官における葉ＮｉＲのｍＲＮＡレベルの約１／３未満であるが、硝酸塩処理後の根における葉遺伝子のｍＲＮＡレベルは、これらの器官における根遺伝子のｍＲＮＡレベルの１／３０未満であったことに注目すべきであろう。これにより、根ＮｉＲが、葉において役割を果たすことが示唆される。また、これが、硝酸塩による誘導の前及び後の両方の葉で葉遺伝子：根遺伝子  ｍＲＮＡ割合が３：１であり、根における割合が３：１００であることに一致しており、根におけるＮｉＲが、もっぱら根遺伝子から得られることを示唆する（図３）。
【００９０】
硝酸塩処理に応答した根ＮｉＲのｍＲＮＡレベルの増加は、根（１５倍を超える）において、葉（７倍を超える）よりも、より大きかった。非常に類似した結果が、葉ＮｉＲで得られ、硝酸塩処理に応答したそのｍＲＮＡレベルの増加は、根では、１５倍を超えたが、葉では、６倍未満であった（図３参照）。
【００９１】
実施例３
ベクターｐＩＧ１２１−Ｈｍ（名古屋大学  中村研三先生より提供）のＧＵＳ遺伝子の上流にｎｉｉ３プロモーター（図４、配列番号：１７）又はｎｉｉ４プロモーター（図５、配列番号：１８）を連結し、得られたベクター（カナマイシン耐性及びハイグロマイシン耐性）を、アグロバクテリウムの感染を介して、タバコのリーフディスクに導入した。ベクターが導入されたものの選択マーカーとして、ハイグロマイシンを使用した
【００９２】
感染させたリーフディスクを、カルス誘導培地（ＣＩＭ）、シュート誘導培地（ＳＩＭ）、シュート伸長培地（ＳＥＭ）で、再分化させ、再分化してきた個体を得た。ついで、再分化した植物の葉を切り取り、Ｘ−Ｇｌｕｃ〔５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド溶液に浸漬させ、ＧＵＳ染色を行なった。
【００９３】
その結果、ｎｉｉ３プロモーター−ＧＵＳを導入したタバコの葉は、図６のパネルＡに示されるように、葉肉細胞でＧＵＳ遺伝子の発現が見られた。一方、ｎｉｉ４プロモーター−ＧＵＳを導入したタバコの葉は、図６のパネルＢのに示されるように、葉脈だけが青く染まった。
【００９４】
これらの結果より、ｎｉｉ３プロモーターとｎｉｉ４プロモーターとは、葉における組織特異性が異なると考えられる。
【００９５】
また、ｎｉｉ４プロモーター−ＧＵＳの葉は、切口がよく染色されたため、傷害に誘導されているよう可能性があることが推定された。
【００９６】
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、ｎｉｉ３遺伝子プローブ作製用フォワードプライマーの配列を示す。
【００９７】
配列番号：２は、ｎｉｉ３遺伝子プローブ作製用リバースプライマーの配列を示す。
【００９８】
配列番号：３は、ｎｉｉ４遺伝子プローブ作製用フォワードプライマーの配列を示す。
【００９９】
配列番号：４は、ｎｉｉ４遺伝子プローブ作製用リバースプライマーの配列を示す。
【０１００】
配列番号：９は、葉ＮｉＲ遺伝子のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡ作製用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１０１】
配列番号：１０は、葉ＮｉＲ遺伝子のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡの作製用リバースプライマーの配列を示す。
【０１０２】
配列番号：１１は、根ＮｉＲ遺伝子のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡの調製用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１０３】
配列番号：１２は、根ＮｉＲ遺伝子のｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡの作製用リバースプライマーの配列を示す。
【０１０４】
配列番号：１３は、根ＮｉＲ遺伝子又はそのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡの増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１０５】
配列番号：１４は、根ＮｉＲ遺伝子又はそのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  ＤＮＡの増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１０６】
配列番号：１５は、タバコβチューブリン遺伝子の増幅用フォワードプライマーの配列を示す。
【０１０７】
配列番号：１６は、タバコβチューブリン遺伝子の増幅用リバースプライマーの配列を示す。
【０１０８】
【発明の効果】
本発明の遺伝子の発現方法によれば、発現対象の核酸を、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に発現させることができ、根、葉肉、葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導させることができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の遺伝子の発現方法によれば、根、葉肉、葉脈における遺伝子の機能の解析、根、葉肉、葉脈における遺伝子による植物体への影響の解析等が可能になる。また、本発明の組織特異的プロモーターを保持する核酸によれば、発現対象の核酸を、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に、効率よく発現させ、組織、具体的には、植物組織、より具体的には、根、葉肉、葉脈に特異的に発現対象の核酸の発現を誘導することができるという優れた効果を奏する。したがって、本発明の核酸によれば、本発明の遺伝子の発現方法を効率よく行なうことができる。さらに、本発明の核酸導入用担体によれば、本発明の核酸を効率よく導入することができ、本発明の遺伝子の発現方法をより効率よく行なうことができるという優れた効果を奏する。
【０１０９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｘａｎｔｈｉ  ＸＨＦＤ８）由来の４つのＮｉＲ遺伝子：ｎｉｉ１、ｎｉｉ２、ｎｉｉ３及びｎｉｉ４のオープンリーディングフレームの塩基配列（それぞれ、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７及び配列番号：８）を示す。４つの塩基配列について、ＤＮＡＳＩＳプログラム（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を用いたｂｅｓｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ法により、アラインメントした。ドットは、第１配列と同一の残基を示し、ダッシュは、アラインメントを最大にするギャップを示す。ｎｉｉ２／ｎｉｉ４  ｃＤＮＡの増幅に用いられたプライマーを、グレーの四角により示す。定量ＲＴ−ＰＣＲに用いた葉ＮｉＲ及び根ＮｉＲを増幅するプライマーを、白及び濃い灰色の四角でそれぞれ示す。
【図２】図２は、硝酸塩処理の前後のタバコの葉及び根における葉及び根ＮｉＲ遺伝子のｍＲＮＡレベルの定量競合ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果の電気泳動図を示す。葉ＮｉＲ  ｃＤＮＡ及びそのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの産物のサイズは、それぞれ、７０１ｂｐ及び５９８ｂｐであり、根ＮｉＲ  ｃＤＮＡ及びそのｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒの産物のサイズは、それぞれ、４３５ｂｐ及び３３２ｂｐである。
【図３】図３は、硝酸塩処理の前後のタバコの葉及び根における葉及び根ＮｉＲ遺伝子のｍＲＮＡレベル（１μｇ  全ＲＮＡあたりのコピー数）を示す。
【図４】図４は、ｎｉｉ３プロモーターの配列（配列番号：１７）を示す。
【図５】図５は、ｎｉｉ４プロモーターの配列（配列番号：１８）を示す。
【図６】図６は、ｎｉｉ３プロモーター及びｎｉｉ４プロモーターによる遺伝子発現の局在性を調べた結果を示す。パネルＡは、ｎｉｉ３プロモーター−ＧＵＳを導入したタバコの葉を示す。パネルＡ中、バーは、２５ｍｍである。パネルＢは、ｎｉｉ４プロモーター−ＧＵＳを導入したタバコの葉を示す。パネルＢ中、バーは、１０ｍｍである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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