(57)【要約】【課題】本発明の技術的課題は、１）胚性幹細胞をインビトロで分化させ、ある特定の組織の幹細胞を誘導すること、２）誘導した細胞を精製すること、３）精製した細胞が成熟細胞への分化能を有することを立証すること、である。【解決手段】インビトロで胚性幹細胞から分化させた種々の中胚葉系幹細胞を、３種類の特別な細胞表面マーカー、ＰＤＧＦＲα、Ｅ−ＣａｄおよびＦＬＫ１の発現様式を指標に精製する。【選択図】図３
2004159614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた中胚葉系幹細胞であって、αＰＤＧＦＲ陽性、Ｅ−Ｃａｄ陰性かつＦＬＫ１陽性である細胞。
【請求項２】
インビトロにおいて多能性幹細胞から分化させた中軸中胚葉系幹細胞であって、αＰＤＧＦＲ陽性、Ｅ−Ｃａｄ陽性かつＦＬＫ１陰性である細胞。
【請求項３】
多能性幹細胞が哺乳動物由来である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１ないし３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
哺乳動物に移植するための、請求項１ないし４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
ａ）多能性幹細胞を培養すること、
ｂ）αＰＤＧＦＲおよびＦＬＫ１を発現し、かつ、Ｅ−Ｃａｄを発現していない細胞を選別し分離すること、
の各段階を含む、中胚葉系幹細胞の調製方法。
【請求項７】
ａ）多能性幹細胞を培養すること、
ｂ）αＰＤＧＦＲおよびＥ−Ｃａｄを発現し、かつ、ＦＬＫ１を発現していない細胞を選別し分離すること、
の各段階を含む、中軸中胚葉系幹細胞の調製方法。
【請求項８】
該選別段階が、抗αＰＤＧＦＲ抗体、抗Ｅ−Ｃａｄ抗体および抗ＦＬＫ１抗体の少なくとも１つを使用するものである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
該選別段階がＦＡＣＳによるものである、請求項６ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞を分化させる段階をさらに含む、請求項６ないし９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンＩＶでコートした培養プレート上で多能性幹細胞を培養することにより多能性幹細胞を中胚葉系細胞に分化させる、請求項６ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物の多能性幹細胞を使用する、請求項６ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞として胚性幹細胞を使用する、請求項６ないし１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多能性幹細胞から分化した中間幹細胞の混合物から高度に精製された、中胚葉系幹細胞に関するものである。また、本発明は、そのような細胞の精製を可能にする新しい精製、調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，  ＥＳ細胞）は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であり、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る。最も研究が進んでいるマウスの胚性幹細胞は、発生３．５日の胞胚内の内部細胞塊より樹立された多能性と自己複製能を持つ細胞である。この細胞は、通常の培養培地に血清と白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）と呼ばれる増殖因子を加えるだけで、未分化の状態を保持させつつ、増殖を維持させることが可能である。マウス胚性幹細胞は、発生３．５日目の胞胚に注入し、その胞胚を母体に戻すことによって、インビボで再びすべての組織細胞に分化することができ、キメラマウスやノックアウトマウスの作成に利用されている。また、近年、胚性幹細胞をインビトロで操作して、様々な成熟組織細胞へ分化させることが可能になっている。このような、胚性幹細胞の持つ分化多能性と簡単な操作性から、将来の医療において、細胞を用いる移植治療の材料としての利用が期待されている。
【０００３】
胚性幹細胞を強制的にインビトロで分化させた場合、成熟細胞が出現することは本発明者や他のグループの研究で明らかとなった（例えば、非特許文献１ないし３参照）。現在、胚性幹細胞は様々な分化段階にある幹細胞（中間幹細胞）を経て完全な成熟細胞に至ると考えられているが、その分化過程には未だ不明な点が多い。
【０００４】
【非特許文献１】
西川伸一、外４名、「デベロップメント（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、（英国）、１９９８年、１２５号、ｐ．１７４７−１７５７
【非特許文献２】
仲野徹、他２名、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、（米国）、１９９４年、２６５号、１０９８−１１０１頁
【非特許文献２】
江良拓実、他４名、「ブラッド（ｂｌｏｏｄ）」、（米国）、２０００年、９５号、８７０−８７８頁
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細胞移植治療のためには、試験管内（インビトロ）において胚性幹細胞を分化させ、特定の胚葉系に分化する中間幹細胞を出現させ、さらにそれを精製して１種類の中間幹細胞を調製することが求められる。細胞移植治療に利用される細胞材料として、中間幹細胞は成熟細胞よりも以下の点において利用価値が高い。
１．ほとんどの組織の成熟細胞の増殖能は低いが、中間幹細胞のインビトロでの増殖能ははるかに高い。即ち、適切な条件さえ整えば、インビトロで強制的に増幅させることが可能となる。
２．１種類の中間幹細胞が多種類の成熟細胞に分化するので、治療効果を比較した場合、少ない細胞でより高い成果をあげることが可能である。
従って、本発明の技術的課題は、１）胚性幹細胞をインビトロで分化させ、ある特定の組織の中間幹細胞を誘導すること、２）誘導した細胞を精製すること、３）精製した細胞が成熟細胞への分化能を有することを立証すること、である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために研究を重ねた結果、インビトロで胚性幹細胞から分化させた種々の中胚葉系幹細胞は、３種類の特別な細胞表面マーカー、即ち、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α：ＰＤＧＦＲα）、上皮カドヘリン（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ：Ｅ−Ｃａｄ）および胎児肝キナーゼ１（ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅ−１：ＦＬＫ１）を、ある一定の様式で発現していることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００７】
【発明の実施の形態】
従って、本発明の目的は、一定の様式でＰＤＧＦＲα、Ｅ−ＣａｄおよびＦＬＫ１の細胞表面マーカーを発現している中胚葉系幹細胞を提供することにある。他の目的は、そのような細胞を他の細胞から選別し分離する調製方法を提供することにある。これらの目的およびその他の目的は、当業者にとって、以下に記載する本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【０００８】
本発明は、ＰＤＧＦＲα陽性、Ｅ−Ｃａｄ陰性かつＦＬＫ１陽性である、インビトロで胚性幹細胞から分化した中胚葉系幹細胞を提供する。この細胞は、生体に移植した場合、血管、血液、骨、軟骨、筋肉組織などに分化し得る。
【０００９】
本発明はまた、ＰＤＧＦＲα陽性、Ｅ−Ｃａｄ陽性かつＦＬＫ１陰性である、インビトロで胚性幹細胞から分化した中軸中胚葉系幹細胞を提供する。この細胞は、生体に移植した場合、骨、軟骨、筋肉組織などに分化し得る。
【００１０】
本発明は、以下の段階を含む中胚葉系幹細胞の調製方法を提供する。
ａ）胚性幹細胞を培養すること、
ｂ）ＰＤＧＦＲαおよびＦＬＫ１を発現し、かつ、Ｅ−Ｃａｄを発現していない細胞を選別し分離すること。
【００１１】
本発明はさらに、以下の段階を含む中軸中胚葉系幹細胞の調製方法を提供する。
ａ）胚性幹細胞を培養すること、
ｂ）ＰＤＧＦＲαおよびＥ−Ｃａｄを発現していて、かつ、ＦＬＫ１を発現していない細胞を選別し分離すること。
【００１２】
上記の調製方法では、好ましくは、抗ＰＤＧＦＲα抗体、抗Ｅ−Ｃａｄ抗体および抗ＦＬＫ１抗体の少なくとも１つを使用する。また、各分子の発現に基づいて細胞を選別するために、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用できる。さらに、上記の方法による精製に先立ち、胚性幹細胞を分化させることができる。
【００１３】
本明細書において、「インビトロ」とは、反応や培養が胚を含む生体外で実施されることを意味する。インビトロで細胞を培養および／または分化させる際には、細胞の成育に適するあらゆる培地、試薬及び容器を使用し得る。また、本明細書における「インビボ」は、反応や培養が胚を含む生体内で実施されること、またはある現象が生体内で起こることを意味する。
【００１４】
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、外胚葉、中胚葉および内胚葉系幹細胞から選ばれる少なくとも２つに分化する能力を有する自己複製可能な幹細胞を意味し、これには、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：  ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ：  ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ：  ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：  ＡＰＳ細胞）、骨髄幹細胞などが含まれる。ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジを含む哺乳類、鳥類、爬虫類などの多様な動物に由来する多能性幹細胞を使用し得るが、通常は哺乳類に由来するものである。
【００１５】
本明細書において、「胚性幹細胞」は、初期胚に存在する分化多能性を有する細胞であって、他の胚盤胞中に注入されると生殖細胞をも含む種々の細胞に分化し得る細胞を意味する。本発明では、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立した胚性幹細胞を使用してもよく、あるいは既に樹立された細胞系統を使用してもよい。
【００１６】
本明細書において、「中間幹細胞」は、多能性幹細胞の分化が進んだ細胞であって、外胚葉、中胚葉、内胚葉系幹細胞のいずれか１つに分化する能力を有する細胞を意味する。
【００１７】
本明細書における「中胚葉系幹細胞」は、中胚葉系の組織に属する細胞に分化する中間幹細胞であって、内胚葉および外胚葉系の組織に属する細胞には分化しない細胞を意味する。母体内のマウスの発生では、発生６．５日から７．５日にかけて起こる原腸胚形成の際、胞胚を形成する上皮組織の一定領域から離脱した予定中胚葉細胞が胚の内部に入り込み、予定外胚葉と予定内胚葉の間を移動して予定中胚葉を形成する。これら予定外胚葉、予定内胚葉および予定中胚葉を構成する細胞がそれぞれ、外胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞および中胚葉系幹細胞である。
【００１８】
予定中胚葉が形成される時期における、もっとも腹側の中胚葉細胞群は側板中胚葉と呼ばれ、これらは主に将来、血管、血液細胞へと分化する。一方、筋肉、骨、軟骨へと分化する中胚葉系細胞は原始線条のすぐ近傍の両側に存在し、中軸中胚葉と呼ばれている。側板中胚葉に存在する、血管、血液細胞への分化能を有する細胞を「側板中胚葉系幹細胞」と呼び、中軸中胚葉に存在する、筋肉、骨、軟骨への分化能を有する細胞を「中軸中胚葉系幹細胞」と呼ぶ。中胚葉系幹細胞には、これら側板中胚葉および中軸中胚葉が含まれる。
【００１９】
「外胚葉系幹細胞」は同様に、外胚葉系組織に属する細胞に分化する能力を有する中間幹細胞であって、内胚葉および中胚葉系の組織に属する細胞には分化しない細胞を意味する。「内胚葉系幹細胞」も同様である。
【００２０】
ＰＤＧＦＲαは、膜貫通型受容体であり、細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有する。そのリガンドは血小板由来増殖因子である。ＰＤＧＦＲαを欠損したマウスは、体節および血管形成分化に異常をきたす。Ｅ−Ｃａｄは、細胞間の接着を担う膜貫通型の膜タンパク質である。Ｅ−Ｃａｄを欠損したマウスは、極めて早い時期の胎生致死である。ＦＬＫ１は、ＰＤＧＦＲαと同様に、細胞内部分にチロシンキナーゼ活性を有する膜貫通型受容体である。そのリガンドは血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）である。ＦＬＫ１を欠損したマウスは、血液および血管内皮細胞の分化に異常をきたし、胎生致死である。
【００２１】
本明細書において、ある分子について「陽性（＋）である」は、細胞が当該分子を発現していることを意味し、「陰性（−）である」は、発現していないことを意味する。細胞がある分子を発現しているか否かは、後述のＦＡＣＳ等により判定できる。
【００２２】
胚性幹細胞の培養には、細胞の維持または分化の目的に適する組成の培地を使用する。胚性幹細胞維持用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、ＬＩＦ、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を添加したものであり、組成の一例を挙げると、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ  Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦである。また、胚性幹細胞分化用培地は、通常、細胞培養用の最小培地に、血清、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール等を添加したものであり、ＬＩＦを含有しない。組成の一例を挙げると、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンである。各培地には、抗生物質などの培養に有用な他の物質を添加することができ、各成分に代えて、同等の機能を有する代替物を使用してもよい。また、培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。
【００２３】
本発明による胚性幹細胞の培養方法における具体的な操作は、当該技術分野で常套の操作及び条件に従って行うことができる。例えば、中辻憲夫編：実験医学別冊・ポストゲノム時代の実験講座４「幹細胞・クローン研究プロトコール」、羊土社（２００１年）、Ｈｏｇａｎ，  Ｇ．  ら編：マウス胚の操作：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９９４）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．  編：奇形ガンおよび胚性幹細胞、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ  （１９８７）  などの記載を参酌して適宜に決定することができる。
【００２４】
代表的な継代操作と培養条件を挙げれば、以下のとおりである。即ち、ディッシュをゼラチンでコートし、そのディッシュに１０，０００個／ｃｍ２の濃度で胚性幹細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養する。翌日１度培地を交換し、２日目でコンフレントになったら、リン酸緩衝塩水で１〜２回リンスし、その後十分量の０．２５％（Ｗ／Ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡを、細胞層を覆うように添加して約５分間放置する。トリプシン液を除去し、適量の胚性幹細胞培養用培地を添加し、ピペッティングによりディッシュから分離させる。この細胞懸濁液から、通常遠心分離により細胞を沈殿させる。上清を除去後、沈殿した細胞を胚性幹細胞培養用培地に再懸濁し、再び１０，０００個／ｃｍ２の濃度で、ゼラチンコートしたディッシュに播種し、培養する。
【００２５】
各細胞表面マーカーを指標に細胞を選択する際には、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用できる。ＦＡＣＳは、通常、フローサイトメーター、レーザー発生装置、光学系、データ処理装置および細胞分取装置を備えている。ＦＡＣＳの機能は、蛍光標識細胞の自動分離および、蛍光強度のコンピューターによる分析である。ＦＡＣＳにより、特定物質で蛍光標識した細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射し、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布として表示し、特定のシグナル情報を発する細胞を分取することができる。ＦＡＣＳの装置は  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  等から市販されており、製造者の指示に従って当業者が操作することが可能である。
【００２６】
本発明で使用する抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、ＦＡＣＳで使用する場合、モノクローナル抗体が好ましい。そのような抗体は、実施例に記載の方法を参照して当業者が作成することができるが、市販のものを使用してもよい。抗Ｅ−Ｃａｄモノクローナル抗体（品番Ｍ１０８）は宝酒造から、抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体（品番５５８７７４）および抗ＦＬＫ１モノクローナル抗体（品番５５５３０８）は  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  から販売されており、容易に入手できる。
【００２７】
本発明のある実施態様では、胚性幹細胞を中胚葉系幹細胞に分化させる段階が含まれる。当分野で既知のいかなる方法で分化させてもよいが、典型的には、コラーゲンＩＶでコートした培養容器内で、ＬＩＦ不含の培地を使用して胚性幹細胞を培養することによる。このような条件で胚性幹細胞を培養すると、マウスの胚性幹細胞では、通常４日目に本発明による精製に適する中胚葉系幹細胞の数が最大になる。あるいは、上記方法より効率は低いが、従来から行われている胚体形成法（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によっても、胚性幹細胞を中胚葉系幹細胞に分化させることができる。また、効率は低いが、コラーゲンＩＶをゼラチンやフィブロネクチン等に代えても胚性幹細胞を中胚葉系幹細胞に分化させることができる（例えば、Ｗｉｌｅｓ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１１，  ２５９−２６７，  １９９１  参照）。
【００２８】
本発明における細胞の選別方法について、抗体を使用する方法を詳述したが、各細胞表面マーカーのｍＲＮＡの存在を指標にして選別することも可能である。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の１態様を示すと共に、本発明の方法によって調製した中胚葉系幹細胞が成熟細胞への分化能を有することを証明するものである。
【００３０】
【実施例】
実施例１  胚性幹細胞から分化した中胚葉系幹細胞の精製
材料と方法
１．胚性幹細胞の維持
ａ．材料
胚性幹細胞の維持には、表１の試薬および器具を使用した。
【表１】
2004159614.tif 000003
【００３１】
胚性幹細胞維持用培地の組成は、８５％ＫＮＯＣＫＯＵＴ  Ｄ−ＭＥＭ、１５％ＦＢＳ、１０−４Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１０００Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ、であった。胚性幹細胞は、マウス１２９ｓｖ系統由来のＣＣＥ胚性幹細胞を使用した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３２３，  ４４５−４４８，  １９８６）。
【００３２】
ｂ．方法
６ｃｍディッシュをゼラチンでコートした。このディッシュに２ｘ１０５のＣＣＥ胚性幹細胞を播種した。翌日、１度培地を交換した。２日目でコンフレントになったら、トリプシンを使用して細胞をディッシュから分離させ、再び２ｘ１０５の濃度で、ゼラチンコートされたディッシュに播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で行った。
【００３３】
２．胚性幹細胞の分化
ａ．材料
胚性幹細胞の分化には、表２の試薬および器具を使用した。
【表２】
2004159614.tif 000004
【００３４】
胚性幹細胞分化用培地の組成は、９０％αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｘ１０−５Ｍ  ２−ＭＥ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、であった。
【００３５】
ｂ．方法
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲンＩＶコート１０ｃｍディッシュに１ｘ１０５のＣＣＥ胚性幹細胞を播種した。２日目で１度培地を交換した。４日目に細胞分離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を分離させ、その後の実験に使用した。
【００３６】
３．抗体の作製
当業者に周知の方法で各分子の細胞外部分を認識するモノクローナル抗体を作成した。具体的には、以下のように行った。マウスＰＤＧＦＲαの細胞外部分のｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて増幅させ、このＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のＤＮＡ配列と結合させて融合ｃＤＮＡを作成した。このｃＤＮＡをＣＯＳ１細胞に導入し、培養上清中の融合タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  カラムを用いて回収した。回収したタンパク質でラットを免疫した。免疫終了後、脾臓を回収し、脾臓細胞を骨髄腫細胞株Ｘ６３．Ａｇ８と融合させてハイブリドーマ細胞を作成した。目的の抗体を得るために、ハイブリドーマ細胞の培養上清中に含有される抗体の中から、融合蛋白およびＰＤＧＦＲαを発現しているＢａｌｂ／ｃ−３Ｔ３細胞に反応する抗体を選別し、そのハイブリドーマ細胞のクローンを同定した。この方法により、ＰＤＧＦＲαを特異的に認識するモノクロナール抗体を得た。ほぼ同様の方法で抗マウスＦＬＫ１モノクローナル抗体を作成した。抗マウスＥ−Ｃａｄ抗体（ＥＣＣＤ２）は、理化学研究所の竹市雅俊氏より譲渡されたハイブリドーマから精製した。
【００３７】
４．抗体染色と  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  による細胞の選別
ａ．試薬の作成
表３の試薬を使用した。
【表３】
2004159614.tif 000005
脱イオン水９００ｍｌに対して１００ｍｌの１０ｘハンクス緩衝液と１０ｇのＢＳＡ（終濃度１％）を加えてよく撹拌した。ＢＳＡが溶解した後、０．２μｍのフィルターを用いて滅菌した。
【００３８】
ｂ．方法
抗ＰＤＧＦＲα抗体をビオチンで、抗ＦＬＫ１抗体をフィコエリスリンで、抗Ｅ−Ｃａｄ抗体をアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８（すべてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ）でそれぞれ標識し、以下の染色に使用した。分化４日目の細胞を細胞分離緩衝液で分離した後、マウス血清を１０μｌ／細胞１０６個で加え、氷上で２０分間インキュベートした。次にそれぞれの抗体を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。２０分後、１％ＢＳＡハンクス緩衝液で細胞を１回洗浄した。ストレプトアビジン−アロピコシアニン（Ａｌｌｏｐｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＡＰＣ）を含む５００μｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に細胞を再溶解し、氷上で２０分間インキュベートした。最後に１％ＢＳＡハンクス緩衝液で２回洗浄し、細胞１０６個につき１ｍｌの１％ＢＳＡハンクス緩衝液に溶解し、細胞選別に使用した。
【００３９】
ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の使用方法は、付属のガイドブックに準じた。ノズルの振動の頻度は２６０００程度、レベルは３Ｖ、ｄｒｏｐ  ｄｅｌａｙ  は約１２−１４で行った。
【００４０】
結果と考察
中胚葉系幹細胞の分離
発生７．５日のマウス胎児では、ＰＤＧＦＲαが中軸中胚葉と尿膜に、またＦＬＫ１が側板中胚葉、尿膜および胚体外中胚葉に特異的に発現することが知られている（図１）。さらにＥ−ｃａｄは外胚葉および内胚葉細胞で強く発現していることが知られているが、本研究において、本発明者らは、発生８．５日のマウス胎児に抗Ｅ−Ｃａｄ抗体による免疫染色を行い、体節が形成される直前の前体節中胚葉にもこの分子が発現していることを明らかにした（図２）。そこで、このようなマーカーを使い分けることにより、インビボでは困難である中胚葉系細胞の分離を、分化した胚性幹細胞からできるか否かについて検討した（図３、４）。
【００４１】
胚性幹細胞をコラーゲン４上で培養し分化を誘導した場合、これらのマーカーは誘導後３日目から出現し、４日目で最大となり、５日目ではその発現が低下することが判明した（図４）。そこで、４日目の分化した胚性幹細胞におけるＰＤＧＦＲα、Ｅ−Ｃａｄ、ＦＬＫ１の発現を、それぞれの分子を認識するモノクロナール抗体を用いて  ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  にて解析した。約３０％の細胞がＰＤＧＦＲα陽性であり、これらの細胞はさらにＥ−Ｃａｄを弱く発現している分画とＥ−Ｃａｄを発現していない分画に分けられた。また、ＰＤＧＦＲα陽性の細胞の一部はＦＬＫ１を発現しているが、ＰＤＧＦＲα陰性のＦＬＫ１陽性細胞も存在していた（図３）。
【００４２】
次に、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  を使用してこれらの細胞分画を精製し、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて初期分化に関わるいくつかの分子の発現を解析した。その結果、実験で用いた分子は、それぞれの分画に応じて、様々な発現様式をとることが判明した（図５）。特に、中軸中胚葉特異的に発現するｂＨＬＨファミリーの転写因子であるメソゲニン（Ｍｅｓｏｇｅｎｉｎ）は、ＰＤＧＦＲα陽性、Ｅ−Ｃａｄ弱陽性、ＦＬＫ１陰性分画のみで特異的に発現していた。そして、側板および胚体外中胚葉特異的に発現するフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）ファミリーの転写因子であるＨＦＨ−８、およびジンクフィンガーファミリーの転写因子であるＧＡＴＡ２は、両者ともＦＬＫ１陽性分画に特異的に発現していた。従って、ＰＤＧＦＲα陽性、Ｅ−Ｃａｄ弱陽性、ＦＬＫ１陰性（Ｐ＋、Ｅ＋、Ｆ−）の分画が中軸中胚葉系の細胞を含み、ＰＤＧＦＲα陰性、Ｅ−Ｃａｄ陰性、ＦＬＫ１陽性分画（Ｐ−、Ｅ−、Ｆ＋）が側板中胚葉系の細胞を含んでいることが示唆される。
【００４３】
実施例２  中胚葉系幹細胞の移植
ドナー由来であることを識別できるように恒常的にｌａｃＺ遺伝子を発現しているＣＣＥ胚性幹細胞を使用した。その他の材料および方法は、実施例１に記載のものと同様であった。ＬＩＦを加えずに胚性幹細胞をコラーゲン４のプレート上で４日間培養し、分化を誘導した。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  を使用して、この分化した胚性幹細胞から、Ｐ＋、Ｅ＋、Ｆ−分画およびＰ＋、Ｅ−、Ｆ＋分画を精製した。精製後の細胞を、免疫不全マウスであるヌードマウスの腎臓皮膜下へ移植し、２８日後に移植片を摘出して移植細胞の状態を組織レベルで解析した（図６）。
【００４４】
図７は、Ｐ＋、Ｅ＋、Ｆ−分画を移植し、２８日後の移植片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色したものであり、筋肉組織のみが観察された（Ａ．弱拡大、Ｂ強拡大）。図８は、Ｐ＋、Ｅ−、Ｆ＋分画を移植し、２８日後の移植片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色したものである（Ａ，Ｃ：弱拡大、Ｂ，Ｄ：強拡大）。この移植片では、３０％ほどが横紋をもつ筋肉組織（横紋筋Ａ，Ｂ）３０％ほどが軟骨組織（Ｃ，Ｄ）であり、中胚葉由来の組織が半分以上の割合を占めた。
【００４５】
以上の結果より、Ｐ＋、Ｅ−、Ｆ＋分画の細胞が中胚葉系の幹細胞を含むことが示唆される。また、Ｐ＋、Ｅ＋、Ｆ−分画で筋肉細胞のみの分化が観察されたことは、中胚葉系細胞の中で、分化能の違いが胚性幹細胞の分画間ですでに存在していることを示している。この研究により、これらの細胞マーカーを使用することにより、分化した胚性幹細胞から中胚葉系幹細胞を分離、調製することが可能となった。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、胚性幹細胞からインビトロで分化させた中胚葉系幹細胞および中軸中胚葉系幹細胞を高度に精製することが可能になる。このようにして精製された細胞は、生体に移植されると、前者は軟骨組織および筋肉組織に、後者は筋肉組織にのみ分化し、移植治療において使用できる純度であることが立証された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＤＧＦＲα、ＦＬＫ１のマウス発生初期における発現様式を示す。
【図２】ＰＤＧＦＲα、Ｅ−Ｃａｄのマウス発生初期における発現様式を示す。
【図３】インビトロにおいて分化させた胚性幹細胞におけるＰＤＧＦＲα、Ｅ−Ｃａｄ、ＦＬＫ１の発現を示す。
【図４】インビトロにおいて分化させた胚性幹細胞におけるＰＤＧＦＲα、Ｅ−Ｃａｄ、ＦＬＫ１の発現の経時的な変化を示す。
【図５】インビトロにおいて分化させた胚性幹細胞における、いくつかの分化マーカーの発現を示す。
【図６】胚性幹細胞由来のＰ＋、Ｅ−、Ｆ＋分画とＰ＋、Ｅ＋、Ｆ−分画の分化能を解析する実験方法を示す。
【図７】Ｐ＋、Ｅ＋、Ｆ−分画を移植したマウスにおける、移植片の組織学的解析の結果を示す。
【図８】Ｐ＋、Ｅ−、Ｆ＋分画を移植したマウスにおける、移植片の組織学的解析の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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