(57)【要約】【課題】同定される物体中ヘマーカーを組み込むための手順、およびマークされた物体の同定のための方法等を提供する。【手段】ＤＮＡの少なくとも１つの断片、好ましくは、マイクロカプセル化され、そして磁性マイクロスフェア、色素および電気的性質をもつ流体、および／または紫外線および／または赤外線放射に対する蛍光体のような検出の選択されたシステムに結びつけられたマイクロサテライト（ＳＴＲ）および一塩基多型（ＳＮＰ）タイプの複数の多型ＤＮＡ断片、を含む安定したマーカーが提供される。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
同定されるべき物体のマーカーであって、磁性マイクロスフェア、色素、電気的性質をもつ流体、紫外線放射に対する蛍光体、および赤外線放射に対する蛍光体より成る群から選択される少なくとも１つの系に結びつく少なくとも１つのＤＮＡ断片を含んでなるマーカー。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片が、マイクロサテライト（ＳＴＲ）のタイプのＤＮＡの複数の多型断片である、請求項１によるマーカー。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１によるマーカー。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片がマイクロカプセル化されている、請求項１によるマーカー。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片がマイクロカプセル化されて、紫外線放射に感受性の少なくとも１つの物質を含む溶液中に組み込まれる、請求項１によるマーカー。
【請求項６】
紫外線放射に感受性の少なくとも１つの物質が、フルオレセイン、テトラメチル、ローダミナ、ローダミナ３、およびテキサスレッド、およびそれらの混合物より成る群から選択される、請求項１によるマーカー。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片がマイクロカプセル化され、赤外線放射に感受性の少なくとも１つの物質を含む溶液中に組み込まれる、請求項１によるマーカー。
【請求項８】
前記少なくとも１つの物質がナフタレン基に結合されたランタニドイオン類のような上方変換燐光体である、請求項７によるマーカー。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片がマイクロカプセル化されており、そして紫外線放射および／または赤外線放射に感受性である物質または色素を含む溶液中に組み込まれる、請求項１によるマーカー。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＤＮＡ断片がマイクロカプセル化されており、そして赤外線放射および紫外線放射に感受性の物質の混合物により形成される溶液中に組み込まれる、請求項１によるマーカー。
【請求項１１】
前記溶液が、６７０〜７２０ｎｍの波長をもつ０．０００１〜０．０２重量％のフタロシアニン、およびスチルベン、ジヒドロピラゾール、クマリン、カルボスチリロ、およびピレンの化合物より成る群群から選択された０．０５〜０．５％重量のフルオロスフォアを含み、そして前記フルオロスフォアが２５０〜３８０ｎｍの間の波長をもつ、請求項１によるマーカー。
【請求項１２】
同定される物体中へマーカーを組み込むための方法であって、選択された生物からＤＮＡを含む試料を抽出すること；当該抽出ＤＮＡを含む溶液の流動性の程度および濃度を決定し、必要であれば是正し、そして当該溶液をアプリケーターに組み込むこと；および、同定される物体を標識すること：を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２による方法であって、
前記ＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−ＣＩＨ　１０ｍＭ　−　ＥＤＴＡ　０．１ｍＭ，２０％（重量／容積）までのＳＤＳおよびプロテナーゼＫ　１０ｍｇ／ｍｌによる溶液混合物中に解放し、当該ＤＮＡをフェノール／クロロホルム１０／９（容積／容積）で精製すること；
ポリメラーゼ連鎖反応を用いてマイクロサテライトおよび一塩基多型増幅の工程を実施し、１ｍｌ当り６ピコグラムから０．０５マイクログラムの濃度の当該ＤＮＡ試料、溶液ＰＣＲ緩衝液１０Ｘ、ｄＮＴＰ１０Ｘ、各々１つの多型領域１０Ｘに隣接するプライマー類、および５０００単位のＴａｑポリメラーゼを得て、当該溶液および当該ＤＮＡをサーモサイクラーに入れること；および
超遠心分離により当該ＤＮＡを濃縮すること；ＤＮＡを含む当該溶液を溶媒およびポリマー中に０．２５％ないし１０％重量／容積の濃度に溶解し、得られた混合物を、１／４０から４／２００までの溶媒／非溶媒の割合で非溶媒中に導入し、当該ＤＮＡをマイクロカプセル化し、そしてＤＮＡの当該マイクロカプセルを紫外線放射および／または赤外線放射に感受性の物質を含む溶液に可溶化すること；
をさらに含む方法。
【請求項１４】
請求項１３による方法であって、
有機溶媒中にポリマーを溶解してポリ−Ｌ−リシンおよびＣｌＮａより成る群から選択されるポリカチオン剤を含むマイクロカプセルを生成し、そして、多型ＤＮＡを、第１水相を生成する水中に溶解させこと；
当該有機溶媒を第１水相と乳化させ、第１乳状エマルジョンを得ること；
前記ポリカチオン剤をポリビニルアルコールおよび第２水相を生成する水とに溶解すること；および
第１乳状エマルジョンを第２水相と乳化させ、第２乳状エマルジョンを形成し、そして第２乳状エマルジョンの有機溶媒を蒸発させて、多型ＤＮＡを含むマイクロスフェアをつくること；
をさらに含む方法。
【請求項１５】
前記利用されるポリマーは生分解性であり、乳酸、グリコール酸、およびエステルより成る群から選択される、請求項１３による方法。
【請求項１６】
前記エステルが、ポリ無水物類、ポリウレタン類、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、およびそれらの混合物より成る群から選択される、請求項１５による方法。
【請求項１７】
前記利用されるポリマーは非生分解性であり、そしてビニルエチレン酢酸、ポリアクリル酸、ポリアミド、コポリマー、およびそれらの混合物より成る群から選択される、請求項１３による方法。
【請求項１８】
前記利用されるポリマーが、デキストラン、セルロース、コラーゲン、アルブミン、およびカゼインより成る群から選択される天然ポリマーである、請求項１３による方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡが、磁性マイクロスフェア、またはヒトの目に可視性または非可視性の色素に結合している、請求項１３による方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡが電気的性質をもつ流体および／または紫外線および／または赤外線放射に対する蛍光体に結合されている、請求項１３による方法。
【請求項２１】
前記有機溶媒が、クロロホルムおよび塩化メチレンより成る群から選択され、そして前記非溶媒が、エタノールおよびヘキサンより成る群から選択される、請求項１４による方法。
【請求項２２】
請求項１３による方法であって、６７０〜７２０ｎｍの波長をもつ０．０００〜０．０２重量％のフタロシアニン；およびスチルベン、ジヒドロピラゾール、クマリン、カルボスチリロ、およびピレンの化合物より成る群から選択される２５０〜３８０ｎｍの波長をもつ０．０５〜０．５重量％のフルオロスフォアを含む、赤外線放射および紫外線放射に感受性の物質の混合物を加えることをさらに含む方法。
【請求項２３】
前記濃縮工程が、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１００のタイプのマイクロコンセントレーターを加えることを含む、請求項１３による方法。
【請求項２４】
前記決定工程が、１ｍｍ２の表面当り６ピコグラムから１０マイクログラムの間の濃度のマーカーをもつ溶液を提供することを含む、請求項１３による方法。
【請求項２５】
前記組み込み工程が、ニップをもつペン、ボールポイントペン、フェルトチップペン、フィルター、製図器、ペンキブラシ、スタンプおよび自動機械類より成る群から前記アプリケーターを選択すること含む、請求項１３による方法。
【請求項２６】
前記組み込み工程が、前記マーカーを含む溶液中に滴状の有機物質、ゲル状の有機物質、および無機物質より成る群から選択される媒介物を取込ませることを含む、請求項１３による方法。
【請求項２７】
前記組み込み工程が、ニトロセルロース、紙、木材、ボール紙、プラスチック材料、荷電ナイロンおよび布より成る群から選択された媒介物を取込ませることを含む、請求項１３による方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＤＮＡ断片でマークされた物体を同定するための方法であって、
同定されるべき物体を検出すること、該マーク物体中の少なくとも１つのＤＮＡ断片の同定を得ること、および、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて多型領域に隣接するプライマーを検出することによって該マーク物体を証明することを含む方法。
【請求項２９】
前記検出工程が、前記マーカー中に組み込まれた色素およびエレメントの少なくとも１つを視覚化するためのフィルターによって行われる、請求項２８による方法。
【請求項３０】
前記検出工程が、少なくとも１つの放射感受性物質、磁性粒子、および溶液伝導性特徴での波長、磁性、および／または導電性のような放射タイプの少なくとも１つを検出することにより行われる、請求項２８による方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の技術分野】
本発明は、ＤＮＡの少なくとも１つの断片を含む、同定される物体のマーカーに関し；同定される物体中ヘ当該マーカーを組み込むための方法、およびマークされた物体の同定のための方法に関する。
【０００２】
本発明を分かりやすくして容易に実行できるようにするために、実施の好ましい方法の簡潔な説明が後に提供される。そのような説明は、本明細書に記載された本発明の原理から逸脱せずに多様な同等物の中からその成分を選択できる本発明の例証的ではあるが制限的ではない例である。
【０００３】
【発明の背景】
レイアウト　―　物体：
習慣的に行われる取引に一層大きな安全性を提供するための、要素、配備、および機構に対する探究は、恒久不変である。紙幣が造り出された遠い時代から今日まで、人は、強盗、詐欺、および偽造を防ぐ方法を探してきた。印刷方法の完備、および保安要素の組み込みは、そうした探究の明白な事例である。そのような方法は、一般大衆の自由になる機器装置の技術的進歩および初期品質を、上回ってきた。手書きの小切手を抹消して、高い金額に書き直すことの対抗手段として、紙のマーキングが使われ始めた。紙幣および文書一般の偽造は、特殊な紙およびインキ、光学インキ、パルプ中への保安要素の組み込み、半透明フィルムによる防御などの採用をもたらした。
【０００４】
本発明者らは、一人ひとりに独特である指紋およびＤＮＡような要素の存在を承知している。実際、各個人は、今日の技術によりほぼ完全な確実性をもって同定可能な、特定の生物学的痕跡を備えている。また本発明者らは、積極的かつ正確な同定のためにある物体にヒトＤＮＡを組み込むことが、偽造者により容易に利用または使用可能であろうことも承知しているが、それはヒトＤＮＡの単純試料が、その所有者であることだけで入手できるからである。毛髪、コップ中の唾液、１滴の血液、および表皮細胞でさえ、偽造物に添加し、その結果本物らしく見せるのに必要なＤＮＡを得るのに十分である。
【０００５】
これに従って、本発明者らは、同定される物体が、ＤＮＡの少なくとも１つの特定断片、そしてより好ましくは、そのようなＤＮＡの断片の組合せでマークされなければならないと考えた。偽造者が必要とされるＤＮＡを入手し、そしてそれを当該物体へ取込ませることができるとしても、彼らの目的を達成するために用いるのは、非常に多く存在するまたはそれらの可能性のある組合せの中の、どの断片または断片類かを知るのは無理である。それだからこそ、本発明の目的は、ＤＮＡの少なくとも１つの断片から成る、同定される物体のマーカーに頼ること、同定される物体中ヘそのようなマーカー類の組み込みを可能にする手順に頼ること、および当該マーカーでマークされた物体の同定を可能にするための方法に頼ることである。
【０００６】
先行技術：
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、その中に個人の遺伝情報が蓄えられている大きなサイズの分子である。一部の配列は特定の機能をもつ、例えば遺伝子およびそれらの制御因子である。見かけ上サイレントで、それらの機能はまだ不問に付されている他の部分は、当該ゲノム内で極端に多い。一部の配列は、個人ごとに違っている。そのために、これらの多型領域の比較が分子同定の基礎になる。それらの多型領域は両親から子供へ遺伝される（メンデル遺伝）ので、生物学的に近縁な可能性がある個人間の比較によって、それらは個人の同定を可能にする。
【０００７】
任意の個人の同定を可能にするＤＮＡタイピングの技術の開発は、既にその青年期に入っている。彼または彼女のＤＮＡを調べることにより個人の正確な同定を可能にし、そしてそのようなＤＮＡと彼または彼女の親類のＤＮＡとの比較が行われた発見以来、１５年が過ぎている。同定のプロセスの基盤になっている概念的側面は本質的に変わっていないが、方法論的側面は目が回るような革新を経験してきた。新たなマーカーの検出、一部の実験段階の自動化、ならびに大きな記憶能力およびデータ分析を備えたコンピューター化システムの創造は、ヒト同定の分野に不滅の趨勢を記すことになった。多型部位はヒトゲノム中に１９８０年から知られている。
【０００８】
最初に検出されたものは、インスリンの遺伝子のようないくつかの遺伝子の近くの領域に位置するものであった。しかし、多重可変領域（ＭＬＰ）の検出は、ヒトに限らずに、非常に多数の動物および植物種を含む個体同定のシステムの開発を可能にした。思いも寄らない応用使用をもつ科学知識に対するこの偉大な貢献は、１９８５年に英国の科学者アッレク・ジェフレイズおよびその共同研究者らにより行われた。ゲノム全体に分散するそのような可変領域は、メンデル遺伝に従って遺伝される個々人の特定の特徴を明らかにすることを可能にした。当該ゲノム中にこれらの領域の位置を正確に決めることは不可能なため「分子表現型」を得ることをだけが可能である。そうした表現型的比較は、個人同定を可能にする。このタイプの比較は客観的であるが、集団分析に基づく、その統計的評価およびその使用は、大きな社会的インパクトのヒト同定の最初の分子システムの開発を可能にし、それは１９９０年代の始めまで盛んに用いられた。ヒトライブラリー（微生物宿主に含まれる個人の全遺伝情報）をすみからすみまで探すための多座パターンを作製可能なプローブの使用によって、当該ゲノム中に以前に位置づけされた可変部位を検出することが可能になり、そしてある遺伝子座に対して個人の遺伝子型を定めることができる特定遺伝子座（ＳＬＰ）のマーカーが現れた。
【０００９】
この方法はその前任者の交代を許容し、そしてヒト同定の分析手順の標準化に、特に米国におけるＦＢＩにより、またＦｏｒｅｎｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　ｏｆ　Ｅｎｇｌａｎｄ（英国法医学科学サービス）により提示されたもので、大いに寄与した。これらの強健な遺伝マーカーは、１９９５年末まで同定手段として使われた。その後、それらは、短い反復単位の多型配列から成りそしてそれらの分析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に依存する、マイクロサテライトすなわち短い縦列反復（ＳＴＲ）の使用により、次第にとって変わられた。これらのマーカーは、最少量のＤＮＡが分析に必要なだけなので、法医学分析に適するとされる高感度のような特徴を示す。マイクロサテライトすなわちＳＴＲｓが好ましい法医学マーカーとなったのは、この感度、分析のスピード、および結果の単純な解釈による。現在、ＳＴＲｓの数は非常に多いが、商業キットにおける分析の標準化システム中に組み込まれている一群の有効マーカーが選択されている。本群すなわちマーカーのキットは、１６までの多型性ヒトマーカーの同時分析を可能にし、そのうちの１３は、「インテリジェントデータベース」のデザインを可能にした基本群を構成する。
【００１０】
【発明の開示】
本発明者らは、一塩基多型（ＳＮＰ）は、塩基の約１０００対ごとに１つが現れ、ヒトゲノム中ではその結果全部で３百万以上になることを承知している。偽造者らにより再現できない、物体のマーキングを達成するために、本発明者らは、そうした物体に、マイクロサテライト（ＳＴＲ）および一塩基多型（ＳＮＰ）のような、ＤＮＡの多型断片を取込ませることを進めている。
【００１１】
また、本願で本発明者らは、同定される物体にこれらの断片を組み込むための手順ならびにマークされた物体の同定を可能にする方法も明らかにする。書類番号第ＣＮ１３０２９０５号は、マーキング用または刻印するためのインク用にゼラチン、デキストリン、可溶性デンプンの水溶液、またはゴムとの可溶性水Ｍ−ＤＮＡのデカンタした溶液を得るために、高配位力をもつ可溶性金属塩の水溶液をＤＮＡおよびアルコールの溶液と混合することにより調製された、ＤＮＡの金属イオンを含む抗偽造材料に、関する。ＣＮ第１３０６２６６号は、遺伝同定のカード、所有者のＤＮＡの採取を含むその種のカードの調製のための方法、当該情報の処理、およびその印刷に関する。
【００１２】
ＤＥ第４４４６０４２号は、例えば、ポリスチレン、ニトロセルロース、タンパク質、多糖類、またはアルコールのような材料のキャリヤーの使用によって、化学的に関係づけられる異なる分子種の複数の同定を提供する構成要素を含むカードに、関する。当該同定は、酵素、抗体、抗原、およびＤＮＡも可能である。当該カードは、銀行券、香料、書類、などを証明するために使用してもよい。ＵＳ第６１６７５１８号は、登録者の生物学的特徴；例えば、当該登録者の染色体ＤＮＡ、のデジタル表示により形成されたデジタル証明書に、関する。当該表示は、証明書そのものに伝達される個人的メッセージをもつ。当該登録者の同一性は遠隔方法で証明される。当該特徴は、当該証明書から抽出、そして比較が可能である。
【００１３】
ＵＳ第６２１３３９１号は、同定が独特の生物測定特性（例えば、音声分析、ＤＮＡ、など）から開始する同定システムに関する。当該生物測定情報は、業務の管理および保安のような各種の機能に使用される。二次同定コードとして使用されるキーナンバーの作出のためにアルゴリズムが提供される。ＵＳ第６２５６７３７号は、企業資産のユーザーの証明に生物測定尺度を用いるシステム、方法、およびソフトウェアから成る。生物測定管理は、当該ユーザーが当該システムにより証明されることが可能な方法を、決定する。その実施は、少なくとも１つの生物医学的パラメーターを含む。それは、ＤＮＡのような独自の特性での比較による、ユーザーの証明のための科学的方法を使用する。当該方法は、同定パラメーターを保管するために開示される。
【００１４】
ＵＳ第６３１２９１１号は、ＤＮＡを用いるマイクロドットでコードされたメッセージを隠ぺいするための方法、および物体（対象）を同定（識別）するためにコードされたメッセージをもつマークの使用のための方法に、関する。書類番号第ＷＯ００第６８４３１号は、ＤＮＡでコードされたメッセージを隠ぺいするための速記法に関する。当該方法は、マイクロドット中に隠ぺいされたＤＮＡの試料の使用、および興味ある物体の標識および証明を含む。ＷＯ０１第６５３７５号は、資産のユーザーを証明するために計測を用いる、システム、方法、およびソフトウェアに関する。それは、生物測定学的手段により得られ、そしてメモリ中に貯えられたものと比較された、独自の個人的特性を使用する。それらの独自な特性は、とりわけ、指および手の形状寸法；顔および目のイメージの分析、声、ＤＮＡなどである。
【００１５】
説明：
本発明は、同定されるべき物体のマーカーより成り、それは、ＤＮＡの少なくとも１つの断片、具体的には、マイクロサテライト（ＳＴＲ）および一塩基多型（ＳＮＰ）のタイプのＤＮＡの多型断片を同定されるべきそれら物体に組み込んだものである。また本発明は、第１工程、つまりその細胞の任意の１つからＤＮＡの抽出へ進むための生物の選択；第２工程、つまり得られたＤＮＡの精製；第３工程、つまりマイクロサテライトおよび一塩基多型のタイプの多型断片の増幅；第４工程、つまり当該ＤＮＡの濃縮および／またはマイクロカプセル化；第５工程、つまりＤＮＡの当該マイクロカプセルの可溶化；第６工程、つまり当該溶液の流動性の程度および濃度の決定および／または訂正；そして第７工程、つまり適切なアプリケーター中への当該溶液の組み込みおよび所望の物体のマーキング：を含む手順より成る。本発明はまた、マークされた物体の同定のための方法より成る。第１工程では、適切な検出技術が、当該溶液に組み込まれた成分を検出してマークされた物体を個別化することに使われる。第２工程では、組み込まれたマーカーのキーを得る。第３工程では、マークされた物体の証明が、必要な分析を行うことにより達成される。
【００１６】
機能：
本発明の構成およびその性質を説明するために開発された段階の順序が確立されたら、続いてそれらの機能的および作動的関係が補足され、そしてそれらの結果が提供される。貴重品を防衛するための確実な手段を構成する、同定される物体のマーカーを得るために、本発明は、これらの物体へのマーカーの組み込みを提案する。好ましくは、本発明者らは、このマーカーが、その後に検出可能な化学的化合物であるべきと考えた。本発明者らは、同定される物体のマーカーとして、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の使用を好む。特に、本発明者らは、非常に多様な組合せに起因して、マイクロサテライトおよび一塩基多型のタイプのＤＮＡの多型断片の同定すべき物体への組み込みによるマーキングを再現することは不可能であると考えた。
【００１７】
ＤＮＡに言及する場合は、その関係は、特に、前述のその多型セグメントについてであると、説明するのが便利である。すなわち、地球の全生物を違わせているそのものである。さらに、別個の多型セグメントに言及する場合、そうした言及は、短い縦列反復／マイクロサテライト（ＳＴＲ）および一塩基多型（ＳＮＰ）だけに関すると理解されるべきである。この段階で、一卵性双生児のみは、区別化できないであろう多型セグメントを共通に示すであろうという例外を述べておくことも必要である。しかし、本発明の場合、そして一卵性双生児の事象であっても、選択される別個の多型セグメントの組合せに基づいて区別化マーキングを得ることは可能であろう。実際、特定の組合せを用いる場合、物体のマーキングに使われたことがある当該生物のゲノムの数千もの多型部位内部の正確な部位を知る人間は唯一その所有者である。もし必要であれば、そして一旦この部位が明らかになれば、ヒトの同定のためのＤＮＡタイピングを使う世界中のどの研究室においても比較分析を行うことが可能であろう。この状況は、他の管轄区域で当該物体の確認を得ること、そして主に、裁判に訴えることが必要な、それらの場合に主に、この上なく有用である。
【００１８】
同定される物体中にＤＮＡの少なくとも１つの断片を含む、安定したマーカーの組み込みのための手順に関連して、本発明は複数の工程を含む。第１工程では、ある生物が選択され、使われるＤＮＡの抽出へと後に進む。マーカーとしてのある生物のＤＮＡの少なくとも１つの断片の使用が、本発明者らにより提案される。これは広い意味に解釈するべきで、すなわち、彼らの物体の標識を行うことを決定する者は誰でも、当該ＤＮＡ断片の供与者として彼自身または彼女自身を選択できるし、または任意の生物（ヒト、動物または植物）を選択できる。その結果として、偽造者らによる当該マーカーの再生産のごく僅かの可能性もさらに一層減ることになる。
【００１９】
ＤＮＡの抽出は、頬部の綿棒収集物；血液穿刺；表皮細胞、毛髪小胞、およびそれらに類したものの収集物のような通常の技術により得られる細胞または体液の抽出から開始する。第２工程では、得られたＤＮＡが、“Ｔｒｉｓ−ＣＩＨ　１０ｍＭ”−ＥＤＴＡ　０．１（ｍＭ），２０％（重量／容積）までのＳＤＳ、およびプロテナーゼＫ　１０ｍｇ／ｍｌによる溶液混合物中で解放され、次いでフェノール／クロロホルム、１０／９（容積／容積）による精製に進む。第３工程では、ＳＴＲｓおよび／またはＳＮＰｓは、本明細書に参考文献により援用される米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；および第４，８００，１５９号に発表されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより増幅される。サーモサイクラーに入れられる混合物は、１ｍｌ当り、６ピコグラムから０．０５マイクログラムの濃度のＤＮＡの試料，ＰＣＲ緩衝液１０Ｘ，ｄＮＴＰ　１０Ｘ，各々の１つの多型領域１０Ｘに隣接するプライマー、および５０００単位のＴａｑポリメラーゼを含む。第４工程では、そして当該ＤＮＡを分解から保護するために、当該手順は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１００のような微量濃縮器が使われる超遠心分離による濃縮および転相の技術によるマイクロカプセル化から成る。この工程では、マイクロカプセル化されるべき多型ＤＮＡは溶媒中に溶解され、次いで、同じ溶媒中にポリマーが０．２５％ないし１０％重量／容積の終濃度に溶解される。
【００２０】
使われる当該ポリマーは、生分解性のものからでも、非生分解性のものからでも無差別に選択可能である。好ましい生分解性のものは、乳酸およびグリコール酸類、およびポリ無水物類、ポリウレタン類、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ようなエステル類、およびそれらに類したものである。さらに、非生分解性ポリマー類の中では、酢酸ビニルエチレンおよびポリアクリル酸が好ましい。ポリアミン類およびそれらのコポリマー類の混合物の使用も許容される。利用されるポリマー類は、天然のものから選択することも可能である。そうした場合、デキストラン、セルロース、コラーゲン、アルブミン、カゼイン、およびそれらの類似物の使用が好ましい。得られる混合物は、その後、マイクロカプセルの自発的形成を行わせるため、少なくとも１／４０から４／２００までの溶媒／非溶媒の関係で非溶媒中に導入する。この工程では、当該溶媒は、クロロホルムおよび塩化メチレンから選択される有機溶媒であり、そして好ましい非溶媒はエタノールおよびヘキサンである。
【００２１】
別のやり方では、第４工程で、ポリ−Ｌ−リシンおよびＣｌＮａのようなポリカチオン剤によるマイクロカプセルが作製される。そのような場合、第１段階で、既述のものの中から選択されたポリマーが、クロロホルムのような有機溶媒中に溶解される。前記第４工程の第２段階で、多型ＤＮＡは第１水相をつくる水中に溶解される。第４工程の第３段階で、当該有機相は、第１乳状エマルジョンを得るために、第１水相と乳化される。第４工程の第４段階で、前記ＣｌＮａをポリビニルアルコールに溶解し、第２水相をつくる。第４工程の第５段階で、第１乳状エマルジョンを第２水相と乳化し、第２乳状エマルジョンをつくる。最後に、第４工程の第６段階で、第２乳状エマルジョンの有機溶媒を蒸発させ、多型ＤＮＡを含むマイクロカプセルをつくる。
【００２２】
別のやり方では、第４工程で、ＤＮＡは、磁性マイクロスフェア（磁性小胞）に、またはヒトの目に可視性または非可視性の色素に、または電気的性質および／または紫外線および／または赤外線放射に蛍光を持つ流体または色素に、結合させることも可能である。加えて、選択されたＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片類をマスクして当該マーキングの変造をさらに一層困難にするために、
第４工程に記載の別の技術の組合せを使うことも可能である；そして選ばれたものと異なるＤＮＡの他の断片を組込むことも可能である。第５工程では、ＤＮＡのマイクロスフェア（小胞）またはマイクロカプセル化されたＤＮＡを、例えば、フルオレセイン例えばテトラメチルローダミン、ローダミン３、テキサスレッドおよびそれらの類似物のような紫外線放射に感受性の物質；および／またはオキシ硫黄ガリウム様の上方変換燐光体（ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒ）またはナフタレン基に結合したランタニドイオン類およびそれらの類似物のような赤外線放射に感受性の物質を含む溶液中に溶解する。紫外線放射におよび赤外線放射に感受性の物質は、遊離で添加してもよいし、前記のいずれかの技術でマイクロカプセル化してもよい。
【００２３】
別法として、ＤＮＡのマイクロスフェア（小球；小胞）またはマイクロカプセル化されたＤＮＡを、赤外線および紫外線放射に感受性の物質の混合物中に、例えば、６７０および７２０ｎｍの間を振動する波長をもつ０．０００１から０．０２重量％フタロシアニン、および０．０５から０．５％重量の間のスチルベン、ジヒドロピラゾール、クマリン、カルボスチリロ、およびピレンの化合物から選択された２５０および３８０ｎｍの間を振動する波長をもつフルオロスフォア（ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｏｒ；蛍光燐光体）を含む混合物中に溶解することが提案される。第６工程では、マークされる物体中への適用を容易にするのに適切であるべきその溶液の流動性の程度および濃度が決定され、そして、必要であれば是正される。流動性の程度は、そのアプリケーターが、１ｍｍ２表面当り６ピコグラムから１０マイクログラムの間の濃度のマーカーでもって溶液が沈着するようにするべきと考えた。第７工程では、当該マーカーは、ペン（ニップ、ボールポイント、またはフェルトチップをもつペン）、多様なタイプのフィルター、製図器、ペンキブラシ、スタンプ、またはインク噴射式プリンターおよび類似物のような何らかの自動機械の中から選択できるアプリケーターに組み込まれる。
【００２４】
別のやり方では、当該マーカーを含む溶液およびマークされる物体との間に媒介物が使われる。そうした場合、当該媒介物は当該溶液中に吸収される。当該媒介物は、ニトロセルロース、紙、木材、ボール紙、プラスチック材料、荷電ナイロン、布、滴状またはゲル状の有機物質、無機物質、およびそれらの類似物のような多様な物質の中から選択可能である。最後に、選択されたアプリケーターで、指定された物体がマークされる。
【００２５】
ＤＮＡの少なくとも１つの断片でマークされた物体の同定のための方法は、適切なシステムによる当該物体の検出の工程を含む。それをするために、当該システムは、当該マーカーに組み込まれた色素またはエレメントの視覚化を容易にするフィルター、または、感受性物質と結びついた波長のようなある種の放射線、磁性粒子の存在、または当該溶液の伝導性の特徴、およびそれらに類したことの証明を可能にする検出器から成ることが可能である。多様なタイプの磁気検出ならびに伝導性の程度に従って、一定の成分を検出するための電子証明のシステムは先行技術において知られている。
【００２６】
第１工程では、同定される物体が検出される。第２工程では、組み込まれたマーカーのキーが得られる。第３段階は、マークされた物体の認証からなり、そのときポリメラーゼ連鎖反応を用いることによってＤＮＡの多型断片のタイピングのために必要な分析を行う。第３工程は、マークされた物体の所有者が、当該物体上にあるオリゴヌクレオチドセグメントがどれであるかを明らかにする場合にだけ行うことが可能である。この情報が出発点なので、そこから、上記のポリメラーゼ連鎖反応の技術を使用する世界中のどの法医学研究室でも、必要ならばそうしたオリゴヌクレオチドセグメントを増幅することに進め、そしてＳＴＲ／ＳＮＰの多型断片を検出することができる。
【００２７】
当該断片の検出は、先行技術分野で通常用いられる手順および技術により行うことが可能である。例えば、Ｊ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ（１９９４）に従うゲル；ＭｃＣｏｒｄ（１９９３）に従うキャピラリー電気泳動；Ｙ．Ｗａｎｇ（１９９５）により提案された多重ハイブリッド形成または多重キャピラリーのための検出、Ｗｏｏｌｌｅｙ（１９９６）により述べられたようなマイクロチップの使用による；Ｂｅｃｋｅｒ（１９９７）に従う質量分析による；など。ところで、一塩基多型は、Ｏｒｉｔａら（１９８９）により証明されたようにユニーク鎖の立体配座分析によって検出可能である；Ｌａｎｄｅｅｇｒｅｎらが指摘した（１９８８）ように特異的なアレリックオリゴヌクレオチド；Ｓｙｖａｎｅｎら（１９９０）に従うプライマーの多重拡大またはチップ、質量分析などのような他の技術。同様に、万一論争の場合には、全当事者の権利は保証されるが、それは、マークされた物体の同一性に関する試験を世界中のどこにおいても必要なだけ何回でも再現することが可能であるからであり、既述のように、マーカーのＳＴＰおよびＳＮＰはヒトの同定のための日常的な手順だからである。一方、これらのマーカーが国際法医学遺伝学学会により推薦されていることは、言うまでもない。
【００２８】
本明細書に記載のマーカーでもって、絵画、彫刻、スポーツインプット、芸術作品、ハンディクラフト、ビデオカセット、レコーダー、テレビジョン、ホームオブジェクト、コンピューター、プリンター、ソフトウエア、オフィスエレメント、ビジネス備品のような無数の物体を完全確実に同定することが可能であろう。同様に、香水、衣類、札入れ、書類かばん、箱、自動車の部品、航空機、二輪車、紙幣、小切手、公正証書、身分証明書、運転免許証、パスポート、ビザ、クジットカード、テレフォンカード、および卒業証明書、財産目録、宝くじおよび他の勝負事札のような類似の物体、を同定することが可能であろう。このように、本発明の具体性に至る段階の可能な順序の１つおよびそれが働く仕方を、説明した。本資料は、以下の請求事項内の本発明の要約で補足されている。