(57)【要約】【課題】血栓症状の予防および治療、あるいは医療用具の表面処理に使用できる、安価で安全な抗血液凝固剤、そしてこの抗血液凝固剤を含む抗血栓症剤、また、この抗血液凝固剤を含む医療用具の血液接触面処理剤を提供する。【解決手段】グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２モル：１モル：１モルである構成単位を有する多糖、好ましくは式（１）の構成単位を有する多糖、更に好ましくはジェランの水酸基を部分的に硫酸化した化合物を含む抗血液凝固剤、およびこの血液凝固剤を含む抗血栓症剤または医療用具の血液接触面処理剤。2004002355.tif 000009【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２モル：１モル：１モルである構成単位を有する多糖を原料とし、該原料多糖が有する水酸基の８〜８０％が硫酸エステル化された硫酸化多糖または該硫酸化多糖を部分構造として有する化合物を含有する抗血液凝固剤。
【請求項２】
原料多糖が下記の式（１）で示される構成単位を有する多糖である、請求項１に記載の抗血液凝固剤。
2004002355.tif 000008
【請求項３】
原料多糖がジェランである、請求項１に記載の抗血液凝固剤。
【請求項４】
原料多糖が有する水酸基の２０〜５０％が硫酸エステル化された硫酸化多糖または該硫酸化多糖を部分構造として有する化合物を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤。
【請求項５】
硫酸化多糖の平均分子量が１〜１０００ＫＤａである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤。
【請求項６】
硫酸化多糖の平均分子量が１〜３０ＫＤａである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤を含む抗血栓症剤。
【請求項８】
心筋梗塞、脳梗塞または静脈血栓の予防および治療に使用される請求項７に記載の抗血栓症剤。
【請求項９】
静脈内投与、腸管投与または経口投与用の単位製剤の形に加工してなる請求項７または８に記載の抗血栓症剤。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤を含む、医療用具の血液接触面処理剤。
【請求項１１】
請求項１０に記載の血液接触面処理剤を使用して処理された医療用具。
【請求項１２】
請求項１０に記載の血液接触面処理剤を使用して処理されたカテーテル、採血用注射器、人工臓器、輸液パックまたは輸液チューブ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液の凝固を阻止して血栓症状の予防および治療にあるいは医療用具の表面処理に使用される、原料多糖が有する水酸基が部分的に硫酸エステル化された硫酸化多糖類または該硫酸化多糖類を部分構造として有する化合物、特に硫酸化ジェランを含む新規な抗血液凝固剤に関する。なお、本明細書においては、硫酸エステル化を硫酸化と、水酸基が部分的に硫酸エステル化された多糖を硫酸化多糖と称することがある。
【従来の技術】
ヘパリンは動物由来のムコ多糖体硫酸塩であって、哺乳動物（牛、子羊、豚）の腸あるいは肺に存在し、抗血液凝固作用（抗血栓作用）を有する。このためヘパリンは、長年の間、血液凝固系に異常のある疾患の治療や予防、および人工透析・人工心肺などを用いた体外循環血液の凝固抑制など臨床上広く用いられてきた。さらには、生体内に導入される医療器具に抗血液凝固性を付与するためにも用いられてきた。
現在、血液の凝固は、多数の蛋白分解酵素が一定した順序で互いに活性化するカスケード様行程からなる複雑な系であることが判っており、その系に対するヘパリンの抗血液凝固活性のメカニズムもほぼ明らかとなってきている。
このようにヘパリンは貴重な薬物であるが、非常に多い量を与えた場合出血合併症の危険を伴う。これは血液凝固系の内因系、外因系どちらの系にもヘパリンが作用することに起因している。
近年、ヘパリンの低分子量フラクション（ＬＭＷヘパリンと称する）がヘパリンよりもより選択的作用を有する（内因系血液凝固作用のみを有する）ことが認められた。これはＬＭＷヘパリンがヘパリンと類似の特異的抗因子Ｘａ活性を有し、一方、全体的凝固に対するそれらの活性は有意に低いことを意味する。すなわち、ＬＭＷヘパリンはヘパリンと同様に有効な抗血液凝固活性を有しながら、出血合併症をおこすことが少ないという特徴を有する。
【０００２】
これまでに、ＬＭＷヘパリンの製造法に関しては、ヘパリンの酸、アルカリなどによる化学的分解法（例えば、特許文献１、２参照）、ヘパリン分解酵素による解重合反応などの酵素的分解法（例えば、特許文献３参照）などが検討されてきた。しかしながら、ヘパリンそのものが高価である上に、ＬＭＷヘパリンはその調製に前記のような操作が必要であるため、さらに高価なものとなる。これらのヘパリンやＬＭＷヘパリンは先に述べたように牛、豚、子羊などの肺、腸を原料に抽出精製したものであり、基本的に何らかのウイルスやプリオンの混入を完全に排除する事は出来ない。この危険性により牛海綿状脳症（ＢＳＥ）の流行以来、牛臓器由来のヘパリンの使用が禁止され、価格の高騰を招いた。このため安全でかつ安価な抗血液凝固剤の開発が望まれていた。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭６３−１９１８０１号公報
【特許文献２】
特開平２−６４１０２号公報
【特許文献３】
特開平３−２４７２９７号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、血栓症状の予防および治療、あるいは医療用具の表面処理に使用できる、安価で安全な抗血液凝固剤を提供することである。さらに本発明の目的は、この抗血液凝固剤を含む抗血栓症剤を提供することであり、また、この抗血液凝固剤を含む医療用具の血液接触面処理剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記問題点を解決するために鋭意研究を行った。その結果、グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２モル：１モル：１モルである構成単位を有する原料多糖、好ましくは式（１）の構成単位を有する原料多糖、更に好ましくはジェランの水酸基を部分的に硫酸化した硫酸化多糖が、ヘパリン、ＬＭＷヘパリンと同様の抗血液凝固活性を有することを見出した。すなわち、本発明により、安価な多糖を既存の方法で硫酸化することで得られる硫酸化多糖を、ヘパリンまたはＬＭＷヘパリンの代替として提供することが可能となった。
【０００６】
本発明は下記の構成を有する。
（１）グルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２モル：１モル：１モルである構成単位を有する多糖を原料とし、該原料多糖が有する水酸基の８〜８０％が硫酸エステル化された硫酸化多糖または該硫酸化多糖を部分構造として有する化合物を含有する抗血液凝固剤。
（２）原料多糖が下記の式（１）で示される構成単位を有する多糖である、前記（１）項に記載の抗血液凝固剤。
2004002355.tif 000002
（３）原料多糖がジェランである、前記（１）項に記載の抗血液凝固剤。
【０００７】
（４）原料多糖が有する水酸基の２０〜５０％が硫酸エステル化された硫酸化多糖または該硫酸化多糖を部分構造として有する化合物を含有する、前記（１）〜（３）項のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤。
（５）硫酸化多糖の平均分子量が１〜１０００ＫＤａである、前記（１）〜（４）項のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤。
（６）硫酸化多糖の平均分子量が１〜３０ＫＤａである、前記（１）〜（４）項のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤。
【０００８】
（７）前記（１）〜（６）項のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤を含む抗血栓症剤。
（８）心筋梗塞、脳梗塞または静脈血栓の予防および治療に使用される前記（７）項に記載の抗血栓症剤。
（９）静脈内投与、腸管投与または経口投与用の単位製剤の形に加工してなる前記（７）または（８）項に記載の抗血栓症剤。
【０００９】
（１０）前記（１）〜（６）項のいずれか１項に記載の抗血液凝固剤を含む、医療用具の血液接触面処理剤。
（１１）前記（１０）項に記載の血液接触面処理剤を使用して処理された医療用具。
（１２）前記（１０）に記載の血液接触面処理剤を使用して処理されたカテーテル、採血用注射器、人工臓器、輸液パックまたは輸液チューブ。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明の第１はグルコースとグルクロン酸とラムノースの存在比が２モル：１モル：１モルである構成単位を有する原料多糖の水酸基が部分的に硫酸化された硫酸化多糖を含有する抗血液凝固剤である。水酸基の硫酸化度、すなわち原料として使用する前記の多糖が有する水酸基の硫酸化率は８〜８０％であり、２０〜５０％が好ましい。硫酸化多糖の平均分子量は１〜１０００ＫＤａが好ましく、１〜３０ＫＤａがより好ましい。
【００１１】
本発明の抗血液凝固剤を構成する硫酸化多糖の原料の多糖は、化学合成されたものであっても、天然由来の微生物の発酵産物や海藻抽出物などであってもよく、特に起源は限定されるものではない。また、それらは塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸またはその他の酸および水酸化ナトリウムなどのアルカリ化合物などによる加水分解により、あらかじめ低分子量化してから硫酸化反応に用いる事が出来る。
【００１２】
原料多糖の具体例として、式（１）の構成単位を有する多糖をあげることができる。
2004002355.tif 000003
【００１３】
原料多糖としてさらに具体的には、式（１）の構成単位からなる多糖、すなわち、シュードモナス　エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｌｏｄｅａ）が生産する多糖類を脱アシル化処理後精製したジェラン（ｇｅｌｌａｎ　　ＣＡＳ　７１０１０−５２−１）があげられる。ジェランはグルコース、グルクロン酸、ラムノースが主成分である多糖類で、安価に大量に入手することが可能であるから、本発明に好ましく使用する事ができる。
【００１４】
多糖の硫酸化の方法は通常知られている方法が利用できる。例えば、インターナショナル　オブ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　マクロモレキュルズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）２８，３８１（２００１）に宮本　啓一らによって紹介された、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中でクロロスルホン酸を作用させる方法や、ＤＭＦ中でＤＭＦ／ＳＯ３複合体を作用させる方法である。また他にジオキサン−ＳＯ３複合体、トリメチルアミン−ＳＯ３複合体、ピリジン−ＳＯ３複合体などの無水硫酸複合体を作用させる方法が使用可能である。原料の多糖の分子量、反応条件を変えることにより、任意の分子量と硫酸化度を有する硫酸化多糖を得る事ができる。
【００１５】
本発明の抗血液凝固剤には上記の硫酸化多糖が好ましく用いられるが、これら硫酸化多糖を部分構造として有する化合物も同様に用いることができる。硫酸化多糖を導入する基質の例は、アミノ基を有する多糖、アミノ基を有するポリアミノ酸、およびアミノ基を導入した多糖類などである。アミノ基を有する多糖の具体例はキトサンである。アミノ基を有するポリアミノ酸の具体例はポリリジンである。アミノ基を導入した多糖類の具体例はアミノ化セルロースである。その他、本発明の硫酸化多糖の抗血液凝固性を失する物で無ければどのような化合物と結合しても問題ない。
【００１６】
硫酸化多糖を上記の基質に導入する方法の例は、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を触媒に用いて、硫酸化多糖のカルボキシル基と基質のアミノ基を結合する方法、硫酸化多糖の還元末端アルデヒド基と基質のアミノ基を弱アルカリ条件下で反応させ還元剤（テトラヒドロホウ酸ナトリウムやジメチルアミンボラン等）で処理して結合させる方法などである。その他、本発明の硫酸化多糖の抗血液凝固性を失する物で無ければその結合方法は特に限定されるものではない。
【００１７】
本願発明の第２は、本願発明の第１の新規な抗血液凝固剤を含む抗血栓症剤である。
前記の方法で作製した抗血液凝固剤は、ヘパリンおよびＬＭＷヘパリンに対し通常なされている方法に準じた方法で、薬剤投与の形態に変換できる。例えば注射剤とするため水に溶解し、調剤上許容される補助剤（防腐剤およびある種の塩など）を添加することもできる。このような注射剤は、皮下又は静脈内注射（適切には間欠的に）もしくはインフュージョンとして、臨床的に応用される。他の投与方法として、スプレー吸入による肺内投与、又は軟膏剤やクリームによる経皮投与、又は坐薬による粘膜投与も可能である。
【００１８】
調製された抗血栓症剤は、心筋梗塞、脳梗塞または静脈血栓の予防および治療に用いることができる。これらの疾患は血管中での血液凝固による血栓形成が引き金となって起こる。血栓形成の初期段階における本発明の抗血栓症剤投与は血栓形成の進行を遅延させる事が出来る為、予防および治療の目的として非常に有効である。これら抗血栓症剤の投与方法は病態に応じて適切に行われる必要があり、主な手法としては注射による皮下投与や静脈投与、錠剤化しての経口投与、坐薬としての腸管投与などが挙げられる。この他、軟膏剤や湿布剤による経皮投与やスプレー吸入による肺内投与など、薬剤を適切な形態としてその形態に応じた投与方法を選択するのであればいかなる投与方法、薬剤形態としても何ら問題ない。
【００１９】
本願発明の第３は、本願発明の第１の新規な抗血液凝固剤を含む医療用具の血液接触面処理剤であり、当該処理剤を使用して処理された医療用具である。
血液と接触するカテーテル、採血用注射器、人工臓器、輸液パック、輸液チューブなどに代表される医療用器具は、血液凝固の阻止を目的にヘパリンなどによる表面処理がなされている。本発明の抗血液凝固剤もこれらと同様に医療用器具表面における血液凝固の阻止に使用できる。医療用具の表面を処理する具体的な方法の例は、医療用具の表面を、硫酸化多糖を物理吸着または化学結合させることができる置換基で修飾し、硫酸化多糖を物理吸着または化学結合させる方法、硫酸化した多糖を他の置換基を有する化合物と結合させ、医療用具表面に結合させる方法、および硫酸化多糖の一部を他の置換基で置換し医療用具表面に結合させる方法である。本発明の硫酸化多糖の抗血液凝固性を失する事が無ければ、この他いかなる手法でもって結合させてもなんら問題は無い。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明について実施例および比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは無い。実施例において使用する用語の定義および測定方法は以下の通りである。
（１）平均分子量（ＫＤａ）：合成した硫酸化多糖を０．２ｍｏｌ／ｌ−ＮａＣｌ水溶液（イオン交換水にて調製）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、同じＮａＣｌ水溶液を溶出液としたＨＰＬＣによるゲルろ過法により平均分子量を測定した。使用するカラムはＳｈｏｄｅｘ　Ｉｏｎｐａｋ　ＫＳ−８０４およびＫＳ−Ｇを使用し溶出物の検出は示差屈折率検出器により測定した。別途測定した分子量既知のプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＴＡＮＤＡＲＤ　Ｐ−８２）により溶出時間と分子量の検量線を作成し、検量線に当てはめる事で当該物質の平均分子量を決定した。
（２）水酸基の硫酸化率（％）：原料多糖が有する水酸基のうち硫酸エステル化された割合を百分率で表示した。合成した硫酸化多糖の全Ｓ量をＩＣＰによる元素分析により測定し、イオンクロマトグラフィーにより硫酸化多糖本体から遊離した遊離Ｓ量を測定した。全Ｓ量から遊離Ｓ量を差し引いた結合Ｓ量から水酸基の硫酸化率を算出した。
（３）正常血液凝固時間（秒）：プラスチック試験管（ＩＷＡＫＩ社製３．３ｍｌ採血管）に硫酸化多糖を５０μｌであらかじめ分注し（濃度は最終濃度が測定濃度になるように調製しておく）、健常者から採血した直後の血液を硫酸化多糖の入った試験管に１ｍｌずつ加え、すばやく混和し、試験管を反復傾斜させ流動性が消失した時間（秒）を計測した。
【００２１】
（４）活性化部分トロンボプラスチン（ＡＰＴＴ）時間：本法は内因系凝固の動態を検査する方法で、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子、高分子キニノゲン、プレカリクレイン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｖ因子、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｉ因子（フィブリノーゲン）の質・量的異常に感受性を持つ。まず、プラスチック試験管にクエン酸加採血（１／１０容の３．１３ｗｔ％クエン酸ナトリウム添加）した正常（健常者ボランティア）血液を、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上清血漿を得た。測定は、被検血漿とＡＰＴＴ試薬を混和後、塩化カルシウム液を加えた後のフィブリン析出時間（秒）を計測することで行った（自動測定装置使用）。被検血漿には硫酸化多糖を添加濃度０．００１〜１ｍｇ／ｍｌで添加し、基準対照は正常血漿を用いた。
（５）プロトロンビン（ＰＴ）時間：本法は外因系凝固の動態を検査する方法で、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、第Ｉ因子（フィブリノーゲン）の質・量的異常に感受性を持ち、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子の影響はほとんど受けない。まず、プラスチック試験管にクエン酸加採血（１／１０容の３．１３ｗｔ％クエン酸ナトリウム添加）した正常（健常者ボランティア）血液を、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し上清血漿を得る。測定は、被検血漿とＰＴ試薬（組織トロンボプラスチン・塩化カルシウム混合液）を添加しフィブリン析出時間（秒）を計測することで行った（自動測定装置使用）。被検血漿には硫酸化多糖のサンプルを添加濃度０．００１〜１ｍｇ／ｍｌで添加し、基準対照は正常血漿を用いた。
【００２２】
実施例１
ジェラン（和光純薬製）２ｇをあらかじめ０．５ｍｏｌ／ｌ−トリフルオロ酢酸水溶液２００ｍｌに添加し８０℃下で３０分間反応させ加水分解した。得られた低分子量化ジェランを窒素ガスシール下でＤＭＦ５ｇに添加し１０時間、室温で攪拌し膨潤させた。その後、温度を４０℃に上げてＤＭＦ／ＳＯ３錯体（ＳＯ３　１８ｗｔ％）を１４ｇ添加し６時間反応させた。反応終了後氷冷し０．３ｇの水を添加して未反応のＤＭＦ／ＳＯ３錯体を分解、反応停止した。続いて２倍容量のエタノールを添加し反応物を沈殿させ濾過により回収した。回収した沈殿を２０ｍｌのイオン交換水に溶解し１ｍｏｌ／ｌ−ＮａＯＨにて中和し、再び２倍容量のエタノールにて沈殿させ回収した。その後、回収した沈殿を純水に添加し２倍容量のエタノールで沈殿させる手法で精製・洗浄を計３回行い、５０℃の減圧乾燥により１日乾燥し、硫酸化ジェランの粉末１．７ｇ（収率６１％）を得た。硫酸化ジェランの平均分子量を前述の手法で測定したところ８．４ＫＤａであった。又、水酸基の硫酸化率は２４．４％であった。
【００２３】
ＡＰＴＴ時間を測定したところ硫酸化ジェラン未添加のサンプルが３０秒であったのに対し、硫酸化ジェランを１ｍｇ／ｍｌの添加濃度で添加したサンプルでは９５秒に延長していた。ＰＴ時間には有意な時間の延長は見られなかった。
【００２４】
実施例２
使用原料として低分子量化していない通常のジェランを２ｇ用い、硫酸化剤にクロロスルホン酸を３．６ｇ使用し、反応温度を５０℃で行った以外は実施例１に準じた手法で硫酸化したところ、平均分子量が２３ＫＤａ、水酸基の硫酸化率が３６．６％の硫酸化ジェランを得た。ＡＰＴＴ時間、ＰＴ時間および正常血液を使用した凝固時間を測定したところ以下の表１の結果を得た。
【００２５】
2004002355.tif 000004
【００２６】
実施例３
使用原料として実施例１に準じた手法で低分子量化したジェランを使用した他は実施例２と同じ条件で硫酸化したところ、分子量が１３ＫＤａ、水酸基の硫酸化率が３９．８％の硫酸化ジェランを得た。ＡＰＴＴ時間、ＰＴ時間および正常血液を使用した凝固時間を測定したところ以下の表２の結果を得た。
【００２７】
2004002355.tif 000005
【００２８】
実施例４
クロロスルホン酸の添加量を１８ｇで行った他は実施例３と同じ条件で硫酸化したところ、分子量が９ＫＤａ、水酸基の硫酸化率が４６．４％の硫酸化ジェランを得た。ＡＰＴＴ時間、ＰＴ時間および正常血液を使用した凝固時間を測定したところ以下の表３の結果を得た。
【００２９】
2004002355.tif 000006
【００３０】
比較例１
ＤＭＦ／ＳＯ３錯体の添加量を０．４ｇで行った他は実施例１に準じた手法で硫酸化して得られた平均分子量９ＫＤａ、水酸基の硫酸化率５％の硫酸化ジェランにおいてはその１ｍｇ／ｍｌの添加濃度でも正常血液凝固時間の延長は認められなかった。
【００３１】
比較例２
硫酸化ジェランに代えて、ヘパリン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　製）のＡＰＴＴ時間、ＰＴ時間および正常血液を使用した凝固時間を測定したところ、以下の表４の結果を得た。
【００３２】
2004002355.tif 000007
【００３３】
比較例３
硫酸化ジェランに代えて、硫酸化多糖として代表的な市販のコンドロイチン硫酸（和光純薬製）について、正常血液を使用した血液凝固時間を測定したところ、０．０１ｍｇ／ｍｌの添加でもまったく血液凝固時間の延長は観察されなかった。
【００３４】
【発明の効果】
以上のように、本発明によりヘパリンと同様の抗血液凝固作用を有し、かつ低分子ヘパリンと同様の特異性を有する新しい抗血液凝固剤を、ヘパリンおよび低分子ヘパリンより安価に提供する事が可能となった。この抗血液凝固剤は抗血栓症剤や医療用具の血液接触面処理剤に使用することができる。