(57)【要約】【課題】補酵素が漏出することなく、効率的に補酵素の再生を可能とする、補酵素再生系を構築された組換え体の提供、及び補酵素依存性還元酵素による光学活性体、特に光学活性アルコール又は光学活性アミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】細胞表層が強固で、産業的に有用な多種の酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に、補酵素再生系を構成する遺伝子を導入することにより、補酵素の漏出がないロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を作成できる。また、それを使用することにより、光学活性体の効率的な生産が可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補酵素依存性還元酵素又は補酵素依存性酸化酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に、補酵素再生系を構成する遺伝子ＤＮＡが導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体。
【請求項２】
補酵素再生系を構成する遺伝子ＤＮＡ及び補酵素依存性還元酵素をコードする遺伝子ＤＮＡが導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体。
【請求項３】
補酵素がニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である請求項１又は２に記載のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体。
【請求項４】
補酵素再生系を構成する遺伝子ＤＮＡが、ギ酸脱水素酵素遺伝子、グルコース脱水素酵素遺伝子、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子、ヒドロゲナーゼ遺伝子のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体。
【請求項５】
補酵素依存性還元酵素が、アミノ酸脱水素酵素又はアルコール脱水素酵素遺伝子である請求項１〜４のいずれかに記載のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体。
【請求項６】
プラスミドｐＲＦＤ００１  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７８）
【請求項７】
プラスミドｐＲＦＤ００２  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７９）
【請求項８】
プラスミドｐＲＦＤ００１又はｐＲＦＤ００２が導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体。
【請求項９】
ヒドロキシアセトンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を接触させ、１，２−プロピレングリコールを採取することを含む光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１０】
４−ハロ−３−オキソブタン酸エステルに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を接触させ、４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを採取することを含む光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１１】
アセトフェノンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を接触させ、１−フェニルアルコールを採取することを含む光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１２】
キヌクリジノンに、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を接触させ、キヌクリジノールを採取することを含む光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１３】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体がプラスミドｐＲＦＤ００１を含むものである請求項９〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１４】
４−メチル−２−オキソペンタン酸に、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を接触させ、ロイシンを採取することを含む光学活性アミノ酸の製造方法。
【請求項１５】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体がプラスミドｐＲＦＤ００２を含むものである請求項１４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、補酵素再生系を構成する遺伝子ＤＮＡが導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体、及びそれを用いた光学活性アルコール又は光学活性アミノ酸の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
還元型ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが関与する酵素反応において、酵素反応の結果生じた酸化型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）を還元型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生させ、連続的に目的生産物を得る試みがなされている。その際、補酵素の再生は、微生物の持つＮＡＤ（Ｐ）還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化系）を利用する方法、ＮＡＤ（Ｐ）からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物またはその処理物を添加する方法等により実施される。そのような再生を行う酵素としては、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素、アセトアルデヒド脱水素酵素、ヒドロゲナーゼ等が知られている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １，６７７  （１９８３），  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０２，  ７１０４  （１９８０），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔ．  ２，  ４４５  （１９８０），  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０３，  ４８９０  （１９８１））。
【０００３】
しかしながら、従来の再生では、繰り返しの反応や連続的な生産反応の際、微生物菌体の機械的破砕、溶菌等により、再生された補酵素が菌体外へ漏出し、反応系から失われる問題があった。
【０００４】
具体的には、大腸菌組換え体を用いた場合、反応中に溶菌を生じ、反応時に補酵素が菌体外に漏れてしまう問題があった。
【０００５】
また、微生物菌体を適当な担体に固定した固定化酵素を用いた連続生産反応においても上述と同様に、反応と共に補酵素は反応系外へ漏出し、随時、補酵素を添加しなければならなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、再生された補酵素が漏出することなく、効率的に連続生産を可能とする補酵素再生系を構築された遺伝子組換え体の提供、及び補酵素依存性還元酵素による光学活性体、特に光学活性アルコール又は光学活性アミノ酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、細胞表層が強固で、産業的に有用な多種の酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に、補酵素再生系を構成する遺伝子を導入することにより、補酵素の漏出がないロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を作成できることを見いだした。また、それを使用することにより、光学活性体の効率的な生産が可能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
さらには、補酵素再生系を構成する遺伝子及び補酵素依存性還元酵素遺伝子の両者をロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に導入することにより、該補酵素依存性還元酵素による光学活性体の生産が可能であること、且つ菌体外への補酵素の漏れ、添加なく菌体の再利用による生産が可能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、補酵素再生系を構成する遺伝子及び／又は補酵素依存性還元酵素をコードする遺伝子を細胞表層の強固なロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に導入することにより得られるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体、及びその組換え体を使用した光学活性アミノ酸又は光学活性アルコールの製造方法、である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明において、「補酵素」としてはＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＦＡＤ（フラビンアミドアデニンジヌクレオチド）等が挙げられる。
【００１１】
「補酵素再生系」とは、補酵素依存性還元酵素による還元反応の結果として酸化型に変換された補酵素を還元型に再生する、又は補酵素依存性酸化酵素による酸化反応の結果として還元型に変換された補酵素を酸化型に再生することをいう。
【００１２】
上記の補酵素再生系に使用される酵素及びその遺伝子ＤＮＡとしては、上記酸化型又は還元型補酵素が再生できれば特に制限はないが、例えばグルコース脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素など糖関連物質の脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、イソプロパノール脱水素酵素、ブタンオール脱水素酵素などのアルコール脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素、フェニルアラニン脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素などのアミノ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素などの有機酸脱水素酵素、オピン脱水素酵素等、及びそれらをコードする遺伝子ＤＮＡである（Ｊ．Ｐｔｅｒｓ  ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  Ｅｄ．  ｖｏｌ．８ａ  Ｃｈａｐｔｅｒ９  ｐ３９１−４７４）。
【００１３】
ここで、ギ酸脱水素酵素とは、ギ酸を酸化して二酸化炭素に変換する酵素活性を有するものであるが（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３０１，  ６２５−６４３（１９９４））、この酵素反応は酸化還元反応であるため、補酵素の還元力が必要とされる。ギ酸脱水素酵素に用いることのできる補酵素としてはＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＦＡＤ（フラビンアミドアデニンジヌクレオチド）などが挙げられるが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存型の還元酵素が最も多く報告されており、工業的利用を目的とした場合、ＮＡＤ（Ｐ）を用いることがより好ましい。
【００１４】
ギ酸脱水素酵素遺伝子としては、例えばマイコバクテリウム属由来の遺伝子（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｖｏｌ．  ４４  ｐ４７９−４８３（  １９９５  ）  ）、シュードモナス属由来の遺伝子（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １８  ｐ２０１−２０７（  １９９３  ）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ８３  ｐ４８５−４９８（  １９７８  ）  ）、パラコッカス属由来の遺伝子（Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ５６  ｐ１９６６−１９７０（  １９９２  ）  ）、モラクセラ属由来の遺伝子（Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １７０  ｐ３１８９−３１９３（  １９８８  ）  ）、メチロモナス属由来の遺伝子（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  Ｖｏｌ．  ９３  ｐ２８１−２９０（  １９６４  ）、Ｚ．  Ａｌｌｇ．  Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ．  Ｖｏｌ．  ２０  ｐ１６７−１７５（  １９８０  ）、また、酵母としてカンジダ属由来の遺伝子（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  １５２  ｐ６５７−６６２（  １９８５  ）  、Ｇｅｎｅ  Ｖｏｌ．  １６２  ｐ９９−１０４（  １９９５  ）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ６２  ｐ１５１−１６０（  １９７６  ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  Ｖｏｌ．  ５６６  ｐ１２−２０（  １９７９  ）  ）、ハンセヌラ属由来の遺伝子（  ＥＰ０２９９１０８  Ａ１，Ｂ１、特開平２−１２４０９３）ペニバシルス属由来の遺伝子（近畿大学工学部研究報告  Ｎｏ．  １４  ｐ１３３−１３９（  １９８０  ），  Ｎｏ．  １５  ｐ１１５−１２３（  １９８１  ），  Ｎｏ．  １６  ｐ１４１−１５２（  １９８２  ））等が挙げられる。
【００１５】
アミノ酸脱水素酵素とは、α―ケト酸、アンモニアを基質とし、α―ケト酸のα位のカルボニル基をアミノ基に還元する能力を有するものをいう。アミノ酸脱水素酵素に用いることのできる補酵素としてはＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の還元型であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の還元型であるＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ（フラビンアミドアデニンジヌクレオチド）の還元型であるＦＡＤＨなどが挙げられるが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存型の還元酵素が最も多く報告されており、工業的利用を目的とした場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いることが好ましい。
【００１６】
アルコール脱水素酵素とは、α―ケト酸を基質とし、α位のカルボニル基をヒドロキシ基に還元する能力を有するものである。アミノ酸脱水素酵素に用いることのできる補酵素としてはＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の還元型であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）の還元型であるＮＡＤＰＨ、ＦＡＤ（フラビンアミドアデニンジヌクレオチド）の還元型であるＦＡＤＨなどが挙げられるが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存型の還元酵素が最も多く報告されており、工業的利用を目的とした場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いることが好ましい。
【００１７】
まず、本発明は、「補酵素依存性還元酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に、補酵素再生系を構成する遺伝子ＤＮＡが導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体」を提供するものである。
【００１８】
この場合、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌が補酵素依存性還元酵素を産生するので、還元反応の結果、生成した酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する系を構築すれば効率的な生産が可能となる。補酵素依存性還元酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌としては、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  ＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  ＡＴＣＣ１９１４０、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  ＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＪＣＭ３２０１、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）  Ｎ７７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−９６０）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）  ＮＣＩＭＢ１１２１５が例示できる。
【００１９】
酸化型補酵素の還元型補酵素補酵素への再生は、例えば上述したギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素の酵素反応を利用して行う。これらの酵素はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌内で産生させる必要があるため、それらの酵素をコードする遺伝子ＤＮＡをロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌内に導入する。
【００２０】
導入の方法としては、遺伝子工学分野で慣用されている技術に準じて行うことができる＜Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）＞。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に関しては、ロドコッカス  ロドクロス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）やロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）から単離された潜在性プラスミド（特開平４−３３０２８７号公報、特開平４−１４８６８５号公報、特開平９−２８３７９号公報）を利用して構築されたベクターが好適に使用される＜Ｊ．  Ｇｅｎｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３８．，  １００３
（１９９２）、特開平５−６４５８９号公報＞。
【００２１】
次に本発明は、「補酵素依存性酸化酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に、補酵素再生系を構成する遺伝子ＤＮＡが導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体」を提供するものである。該組換え体は、上記と同様の方法で作成することができる。
【００２２】
すなわち、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌が補酵素依存性酸化酵素を産生するので、酸化反応の結果、生成した還元型補酵素を酸化型補酵素に再生する系をロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌内に構築すれば効率的な生産が可能となる。
【００２３】
補酵素依存性酸化酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌としては
ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）  ＲＨＡ１  （ＰＣＢ酸化的分解菌）、ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）  ＴＳＰ２０３  （ＰＣＢ酸化的分解菌）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＫＡ２−５−１  （脱硫菌）が挙げられる。
【００２４】
補酵素の再生は、例えばグルタミン酸脱水素酵素、ＮＡＤＨオキシダーゼ、ＮＡＤＨ脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素等を使用して行い、これらの酵素はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌内で産生させる必要があるため、それらの酵素をコードする遺伝子ＤＮＡをロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌内に導入し、形質導入体（形質転換体）を作製すればよい。
【００２５】
さらには、補酵素再生系を構成する遺伝子及び補酵素依存性還元酵素又は該酸化酵素をコードする遺伝子の両方が導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体を作製することも可能である。その場合、該両遺伝子を含むプラスミドベクターを構築し、組換え体を作製することが好ましい。補酵素依存性還元又は酸化酵素は製造する目的物により適宜選択される。
【００２６】
前記のごとく作成されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体は、微生物変換反応における微生物触媒として使用することができる。この際、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌は、細胞表層が強固な点で、繰り返しの使用や連続反応等で他の菌種に比べ優位である。また、産業的に有用な多種の酵素を産生することから非常に好ましい（特開平１１−１０３８７８号、特開平８−９８６９７号、特開平６−１９７７９１号、特開平６−１７８６９１号等公報参照）。
【００２７】
微生物触媒の調製は、培養を含む工程により調製される。培養方法において、培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものならばいずれも使用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、フルクトース、シュークロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用でき、この他無機塩、微量金属類、ビタミン等が必要に応じて適宜使用される。培養条件は、通常、ｐＨ４〜１０、温度１０〜４０℃の範囲にて好気的に１０〜１８０時間培養する。培養は、液体培養、固体培養のいずれで行うこともできる。
【００２８】
培養後、集菌操作を行い、必要に応じて洗浄を行うことにより微生物触媒を調製する。その使用形態は、集菌した菌体を適当な緩衝液に懸濁させた菌体懸濁液として、又はアクリルアミド、カラギーナン、アガロース等の適当な担体に固定化、またはイオン交換樹脂等に吸着させた固定化担体として使用することができる。それら使用形態は、反応条件等により適宜選択される。
【００２９】
反応は、上記方法で調製した微生物触媒を、基質が溶解又は懸濁した媒体中に添加し、基質と接触することにより行う。媒体は基質の性質（例えば溶解性）及び触媒の安定性等を考慮して適宜選択される。反応終了後の生成物の採取は、定法に従い実施する。
【００３０】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。
【００３１】
＜実施例１＞  ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体の作製
（１）マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  Ｎ１０）の全染色体ＤＮＡの抽出は、特開平１０−２３８９６号の方法に準じて行った。
【００３２】
（２）ギ酸脱水素酵素遺伝子の取得
マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ  Ｎ１０）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子は既にクローニングされており、その全塩基配列が明らかとなっている（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４４，  ４７９−４８３  （１９９５））。
【００３３】
本ギ酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ  （  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ）領域（１２０６ｂｐ）の開始コドンＡＴＧを含む配列とその上流にＸｂａＩ制限部位を付けたプライマー（オリゴヌクレオチドプライマーＡ：配列番号１）と、終止コドンＴＧＡを含む配列とその下流にＳｓｅ８３８７Ｉ制限部位を付けたプライマー（オリゴヌクレオチドプライマーＢ：配列番号２）の二種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（  ｍｏｄｅｌ３９４：ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて合成した。
【００３４】
2004159587.tif 000002
これらのプライマーを用い、上記（１）で調製したマイコバクテリウム・バッカエＮ１０株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ）法によりギ酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ領域すべての増幅を行った。２００μｌ容量のマイクロテストチューブに、以下の各試薬を記載の終濃度になるように加え、２０ｍＭ  トリス塩酸、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム、２５ｍＭ  塩化カリウム、０．０５％  ツイーン２０（  Ｗ／  Ｖ  ）、１００ｍｇ／ｍｌ  牛胎児血清アルブミン、各５０ｍＭ  ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣＴＰ・ｄＴＴＰ、これに染色体ＤＮＡ：１０ｎｇ、プライマーＡ及びＢ：各５０ｐｍｏｌ、２．５ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添加し、総量を１００μｌとした。サーマルサイクラー（宝酒造社製）を用いて、ＤＮＡ変性を９４℃で１分、プライマーのアニーリング６５℃で２分、プライマーの伸長反応７２℃で２分を１サイクルとして、３０サイクルの増幅を行い、１２０６ｂｐのギ酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ  領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００３５】
次にＸｂａＩ，  Ｓｓｅ８３８７Ｉで制限酵素処理を行ったプラスミドｐＳＪ０３４（図１）に、上記の方法で得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ，  Ｓｓｅ８３８７Ｉで制限酵素処理したものを混合し、これに６．６ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び６６ｕＭ  ＡＴＰを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）を２０ｕｌ加え、さらにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３５０  Ｕを加えて１８℃で１６時間反応させてＤＮＡ鎖の連結反応を行い、組み換えプラスミド（ｐＲＦＤ００１）（図２）を作製した。なお、ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２３より特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法により作製したものである。ｐＳＪ０２３は形質転換体  Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＡＴＣＣ  １２６７４／ｐＳＪ０２３  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２３２）  として、またｐＲＦＤ００１は  （ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０７８）  として産業総合技術研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３６】
上記で得られたプラスミドｐＲＦＤ００１を、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  ＡＴＣＣ１２６７４、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  ＡＴＣＣ１９１４０、ロドコッカスロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）  ＡＴＣＣ１７８９５、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）  ＪＣＭ３２０１、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）  Ｎ７７４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−９６０）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）  ＮＣＩＭＢ１１２１５の菌株とそれぞれ混合し、氷上に１０分静置後、電気パルス（２．２５ｋｖ，  ２００ＯＨＭＳ）を行い、ギ酸脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドを導入したロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を作製した。
【００３７】
（３）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体の培養
上記で得られたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を、各々カナマイシンを含むＧＧＰＫ培地〔組成：グルコース  １５ｇ、酵母エキス  １ｇ、グルタミン酸ナトリウム  １０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、Ｍｇ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする（ｐＨ７．２）〕に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。培養後、集菌し、適当な緩衝液等で菌体懸濁液を調製した。
【００３８】
＜実施例２＞    ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を用いた光学活性１，２−プロピレングリコールの生産
１％（  Ｗ／Ｖ  ）ヒドロキシアセトン及び３３ｍＭ  ギ酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）３ｍｌに、実施例１で作成した菌体懸濁液を加えて３０℃で１６時間反応させた。比較対照としてギ酸アンモニウムを添加しない場合の反応も行った。反応収率は、ＨＲ−１７０１カラム（０．５３ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ３０ｍｍ、信和化工（株））を用いたガスクロマトグラフィーにより、光学純度は、光学分割カラムＣＰ−Ｃｈｉｒａｌｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ（０．２５ｍｍＩＤ  ｘ  ２５ｍｍ、クロムパック社）により求めた。
【００３９】
いずれの場合も効率よく１，２−プロピレングリコールを生成していた。ロドコッカス  ロドクロウス  ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＲＦＤ００１については光学純度を調べたところ、９９％ｅ．ｅ．以上の光学純度のＲ―１，２−プロピレングリコールが得られた。一方、ギ酸アンモニウム無添加の場合には生成物が得られなかった（表１参照）。
【００４０】
【表１】
2004159587.tif 000003
＜実施例３＞  ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を用いた光学活性４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルの生産
１％（  Ｗ／Ｖ  ）４−クロロ−３−オキソブタン酸エチル及び３３ｍＭ  ギ酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）３ｍｌに、実施例１で作成した菌体懸濁液を加えて３０℃で１６時間反応させた。反応収率は、ＨＲ−１７０１カラム（０．５３ｍｍ  ＩＤ  ｘ３０ｍｍ、信和化工（株））を用いたガスクロマトグラフィーにより、光学純度は、光学分割カラムＣＰ−Ｃｈｉｒａｌｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ（０．２５ｍｍＩＤ  ｘ  ２５ｍｍ、クロムパック社）により求めた。
【００４１】
その結果、反応収率９０％以上で光学純度７０％ｅ．ｅ．以上のＲ―４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エチルが得られた（表２参照）。
【００４２】
【表２】
2004159587.tif 000004
＜実施例４＞  ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を用いた光学活性１−フェニルエチルアルコールの生産
２５ｍＭ  アセトフェノン及び３３ｍＭ  ギ酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）３ｍｌに実施例１で作成した菌体懸濁液を加えて３０℃で５時間反応させた。比較対照としてギ酸アンモニウムを添加しない場合の反応も行った。反応収率は、ＨＲ−１７０１カラム（０．５３ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ３０ｍｍ、信和化工（株））を用いたガスクロマトグラフィーにより、光学純度は、光学分割カラムＣＰ−Ｃｈｉｒａｌｓｉｌ−ＤＥＸ  ＣＢ（０．２５ｍｍＩＤ  ｘ  ２５ｍｍ、クロムパック社）により求めた。
【００４３】
その結果、光学純度９９％ｅ．ｅ．以上でＳ―１−フェニルエチルアルコールが得られた。一方、ギ酸アンモニウム無添加の場合には反応は進まなかった（表３参照）。
【００４４】
【表３】
2004159587.tif 000005
＜実施例５＞  ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を用いた３−キヌクリジノールの生産
１％（Ｗ／Ｖ）  キヌクリジノン及び３３ｍＭ  ギ酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）３ｍｌに実施例１で作成した菌体懸濁液を加えて、３０℃で１６時間反応させた。比較対照としてギ酸アンモニウムを添加しない場合の反応も行った。また、分析はＨＲ−１７０１カラム（０．５３ｍｍ  ＩＤ  ｘ  ３０ｍｍ、信和化工（株））を用いたガスクロマトグラフィーにより行った。
【００４５】
その結果、効率よく３−キヌクリジノールが得られた。このことから、ギ酸脱水素酵素遺伝子のロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌内への導入により菌体内ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性脱水素酵素の反応がより効率的に行われることが予想された（表４参照）。
【００４６】
【表４】
2004159587.tif 000006
＜実施例６＞  ギ酸脱水素酵素遺伝子及びロイシン脱水素酵素を含むロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体及びそれを用いたＬ−ロイシンの生産
（１）サーモアクチノマイセス・インテルメディウス（  Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  ）の全染色体ＤＮＡの抽出
サーモアクチノマイセス・インテルメディウス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ  ）〔Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．２２２  ｐ３０５−３１２（  １９９４  ）〕を培地（組成：トリプチカーゼ  ダイズ  ブロス３０ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする）４０ｍｌに植菌し、５５℃で振とう培養を行った。培養後、集菌し、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ液（  ０．１Ｍ  ＥＤＴＡ，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ）２ｍｌに懸濁した。３７℃  １時間振とう後、１０ｍｌ  Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ，  ０．１Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（  ｐＨ９．０  ））を加えゆっくり攪拌した。さらにプロテイナーゼ（  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ）を少量加え３０分振とうし、その後１０ｍｌのフェノール液を加え振とうした。次に溶液を遠心し、水層を分離したあと２倍量のエタノールを加え析出した染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き取りエタノールで洗浄した。さらに５ｍｌのＴＥ（  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ＥＤＴＡ  ）に溶解し、ＲＮａｓｅＡを適当量加え３７℃で３０分インキュベートした。その後プロテイナーゼ（  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ）を少量加え、３０分インキュベートした。次に５ｍｌのフェノール液を加え振とうし、遠心し水層を分離したあと２倍量のエタノールを加え析出した染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き取りエタノールで洗浄した。その後１ｍｌの滅菌水に溶解し、染色体ＤＮＡ溶液とした。
【００４７】
（２）ロイシン脱水素酵素遺伝子の取得
ロイシン脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ  （ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ）領域（１１６６ｂｐ）の開始コドンＡＴＧ上流のシャイン・ダルガーノ配列（ＳＤ配列）を含みその上流にＳｐｈＩ制限部位を付けたプライマー（オリゴヌクレオチドＣ：配列番号３）と、終止コドンＴＡＡを含む配列とその下流にＳｓｅ８３８７Ｉ制限部位を付けたプライマー（オリゴヌクレオチドＤ：配列番号４）の二種類のオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（  ｍｏｄｅｌ３９４：ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて合成した。
【００４８】
2004159587.tif 000007
これらプライマーを用い、上記（１）で調製したサーモアクチノマイセス・インテルメディウス株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ）法によりギ酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ領域すべての増幅を行った。
【００４９】
（３）ギ酸脱水素酵素遺伝子の取得
実施例１記載のプライマーＡと、終止コドンＴＧＡを含む配列とその下流にＳｐｈＩ制限部位を付けたプライマーＥ（配列番号５）を用い、実施例１記載の方法と同様にＰＣＲを行い、１２０６ｂｐのギ酸脱水素酵素遺伝子のＯＲＦ  領域を含むＤＮＡ断片を得た。
【００５０】
2004159587.tif 000008
次にＸｂａＩ，  Ｓｓｅ８３８７Ｉで制限酵素処理を行ったプラスミドｐＳＪ０３４（図１）に、上記の方法で得られたギ酸脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＸｂａＩ，  ＳｐｈＩで制限酵素処理したものと（２）で得られたロイシン脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をＳｐｈＩ，  Ｓｓｅ８３８７Ｉで制限酵素処理したものを混合し、これに６．６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴ及び６６ｕＭ  ＡＴＰを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．６）を２０ｕｌ加え、さらにＴ４  ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）３５０Ｕを加えて１８℃で１６時間反応させてＤＮＡ鎖の連結反応を行い、組み換えプラスミド（ｐＲＦＤ００２）（図３）を作製した。ｐＲＦＤ００２は  （ＦＥＲＭ−１９０７９）  として産業総合技術研究所特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００５１】
上記で得られたプラスミドを、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＡＴＣＣ１２６７４株と混合し、氷上に１０分静置後、電気パルス（２．２５ｋｖ，  ２００ＯＨＭＳ）を行い、ギ酸脱水素酵素遺伝子及びロイシン脱水素酵素遺伝子を含むプラスミドを導入したロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を作製した。
【００５２】
（４）ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体の培養
上記で得られたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を、カナマイシンを含むＧＧＰＫ培地〔組成：グルコース１５ｇ、酵母エキス１ｇ、グルタミン酸ナトリウム１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．５ｇ、Ｍｇ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする（ｐＨ７．２）〕に植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。培養後、集菌し、適当な緩衝液等で菌体懸濁液を調製した。
【００５３】
（５）  ギ酸脱水素酵素遺伝子及びロイシン脱水素酵素を含むロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体によるＬ−ロイシンの生産
１００ｍＭ  ４−メチル−２−オキソペンタン酸及び１６６ｍＭ  ギ酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）１０ｍｌに、（４）で作成した菌体懸濁液を加えて３０℃で反応させた。反応時間が８時間経過したところで反応をとめ、菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体をリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で懸濁し、再度遠心分離することにより洗浄した。回収した菌体に１００ｍＭ  ４−メチル−２−オキソペンタン酸及び１６６ｍＭ  ギ酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）を加え１０ｍｌとし、３０℃で再度反応させた。この操作を繰り返し３回目まで反応させた。
【００５４】
定量・分析はＷａｋｏｓｉｌ  ５Ｃ８カラム（和光純薬工業）を用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて行った。また、光学異性体の確認は、光学分割カラムＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＲＳ  １０Ｗ（三菱化学）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより行った。
【００５５】
その結果、ＮＡＤＨを添加することなく、さらには菌体を再利用した３回目の反応においても充分なＬ−ロイシンの生産を確認した。以上より、ギ酸脱水素酵素遺伝子が導入されたロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌において、ＮＡＤＨの再生反応が効率的に行われていることが確認された。
【００５６】
＜比較例１＞  ギ酸脱水素酵素遺伝子及びロイシン脱水素酵素を含む大腸菌組換え体によるＬ−ロイシンの製造
（１）大腸菌組換え体
大腸菌組換え体は、ＪＭ１０９（ｐＦＤＨ／ＬｅｕＤＨ）を使用した。ＪＭ１０９（ｐＦＤＨ／ＬｅｕＤＨ）はＦＥＲＭＰ−１５３５０として産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００５７】
（２）大腸菌組換え体の培養
上記で得られた大腸菌組換え体体ＪＭ１０９（ｐＦＤＨ／ＬｅｕＤＨ）を、アンピシリン及びＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地（組成：グルコース１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇを蒸留水に溶解して１リットルとする（ｐＨ７．０））に植菌し、３０℃で振とう培養を行った。培養後、集菌し、適当な緩衝液等で菌体懸濁液を調製した。
【００５８】
（３）Ｌ−ロイシンの製造
１００ｍＭ  ４−メチル−２−オキソペンタン酸及び１６６ｍＭ  ギ酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）１０ｍｌに、（２）で作成した菌体懸濁液を加えて３０℃で反応させた。また、実施例６と同様の方法で分析を行った。反応時間が６時間経過したところで反応をとめ、菌体を遠心分離により回収した。回収した菌体をリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で懸濁し、再度遠心分離することにより洗浄した。回収した菌体に１００ｍＭ  ４−メチル−２−オキソペンタン酸及び１６６ｍＭ  ギ酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（  ｐＨ７．０  ）を加え１０ｍｌとし、３０℃で再度反応させた。
【００５９】
その結果、１回目の反応では６時間の反応で８０ｍＭのＬ−ロイシンが生成したにもかかわらず、２回目の反応ではわずかの反応しか起こらなかった。この反応液にＮＡＤＨを添加したところ１回目の反応と同程度のＬ−ロイシンが生成が見られた。このことから、大腸菌組換え体においては、補酵素ＮＡＤＨ再生系は機能するものの、菌体内からＮＡＤＨがすみやかに流出するなどの理由から、ＮＡＤＨ無添加条件では繰り返し反応や連続反応には適さないことが明らかとなった。
【００６０】
【発明の効果】
細胞表層が強固で、産業的に有用な多種の酵素を産生するロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌に、補酵素再生系を構成する遺伝子を導入することにより、補酵素の漏出がないロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属組換え体を作成できる。また、それを使用することにより、光学活性体の効率的な生産が可能である。
【００６１】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】プラスミドｐＳＪ０３４の制限酵素地図。
【００６３】
【図２】プラスミドｐＲＦＤ００１の制限酵素地図。
【００６４】
【図３】プラスミドｐＲＦＤ００２の制限酵素地図。
【００６５】
【図４】ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換え体によるＬ−ロイシンの生産を示す図。
【００６６】
【図５】大腸菌組換え体によるＬ−ロイシンの生産を示す図。
【００６７】
【配列表】
2004159587.tif 000009
2004159587.tif 000010
2004159587.tif 000011
2004159587.tif 000012
2004159587.tif 000013
【００６８】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
【図１】
2004159587.tif 000014
【図２】
2004159587.tif 000015
【図３】
2004159587.tif 000016
【図４】
2004159587.tif 000017
【図５】
2004159587.tif 000018