(57)【要約】【課題】製剤中に配合されたタイソウの確認・定量方法を提供すること。【解決手段】ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを指標とする製剤中のタイソウの確認方法。または、製剤中に含まれるジジベオサイドＩＩを定量することによって、タイソウ含有製剤の品質を判定する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを指標とする製剤中のタイソウの確認方法。
【請求項２】
製剤中に含まれるジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを定量することによって、タイソウ含有製剤の品質を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを指標とする製剤中のタイソウの確認方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タイソウ（大棗）は、ナツメの果実であり、緩下剤、利尿剤、強壮剤などに用いられている。このタイソウはｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ，ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３’，５’−ｃｙｃｌｉｃ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含有し、これを指標成分とする分析方法が知られている（非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
しかしながら、ｃＡＭＰは普通に生薬に存在する成分であるため、タイソウを他の生薬成分とともに製剤に配合した場合、ｃＡＭＰを指標として製剤中のタイソウを確認・定量することができなかった。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｊ．Ｃ．Ｃｙｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｃｙｃｌｉｃ  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎ  Ｆｒｕｉｔｓ  ｏｆ  Ｚｉｚｙｐｈｕｓ  Ｊｕｊｕｂａ；  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９８０，  １９，  ２７４７．
【非特許文献２】
原田  正敏  編集「繁用生薬の成分定量」廣川書店、１９８９年、ｐ．２５９
【非特許文献３】
Ｎｏｂｕｙｕｋｉ  Ｏｋａｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ；  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｚｉｚｙｐｈｉ  Ｆｒｕｃｔｕｓ．  Ｖ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｚｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ，  Ｖｏｍｉｆｏｌｉｏｌ  ａｎｄ  Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ；  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ；  ２９（１２），  ３５０７−１４，  １９８１．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、タイソウのみに含まれる特有成分を探索し、これを指標とする分析方法の開発が求められていた。
【０００６】
本発明は、製剤中に配合されたタイソウの確認・定量方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはタイソウを含有する製剤とタイソウを含有しない製剤のＬＣ分析チャートを比較し、タイソウ含有製剤に特有のピークが存在することを見出した。そして、そのピークがタイソウに微量含有されているジジベオサイサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩのものであることを確認した。
【０００８】
かかる知見をもとに完成した本発明の態様の１つは、ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを指標とする製剤中のタイソウの確認方法である。
【０００９】
本発明の他の態様は、製剤中に含まれるジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを定量することによって、タイソウ含有製剤の品質を判定する方法である。
【００１０】
本発明に用いられる「ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩ」は、タイソウ原生薬等にごくわずかに含有されていることが確認されている（非特許文献３参照）。
ジジベオサイドＩＩは微量成分であるので、その確認・定量には、ＬＣ／ＭＳを用いるのが好ましい。
【００１１】
本発明に用いられる「タイソウ」とは、タイソウ原生薬の他、ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩを含有するようにタイソウ原生薬から抽出されたタイソウ軟エキスなどが該当する。
【００１２】
本発明における「製剤」とは、ドリンク剤等の内服液剤の他、顆粒剤、散剤、錠剤等の内服固形製剤が該当し、食品もこれに含まれる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
例えば、タイソウ軟エキスを含む数種の生薬成分を配合した製剤において、予めタイソウ軟エキスの抜き試料について妨害がないことを確認しておけば、ジジベオサイドＩＩを指標とするタイソウの確認試験を行うことができる。そうすることによって、原料としてのエキスの状態から製造直後、長年月を経た製品に至るまで、経時的なタイソウ含有製剤の品質評価を行うことができる。
【００１４】
また、高感度で特異性の高いＬＣ／ＭＳを用いることにより、複雑な前処理を省略して簡便かつ迅速にジジベオサイドＩＩの確認・定量を行うことができる。
【００１５】
【実施例】
以下に実験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
（実験例）
【００１６】
［試料］
ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩ：タイソウ原生薬より単離したもの。構造式を以下に示す。
【００１７】
【化１】
2004279225.tif 000002
【００１８】
タイソウ軟エキス：水製エキス，エキス１ｇは原生薬３．３ｇに相当する。
【００１９】
［分析機器］
ＨＰＬＣ：ナノスペース（資生堂）
質量分析計（ＭＳ）：ＳＣＩＥＸ  ＡＰＩ  ＩＩＩ  ｐｌｕｓ（  ＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ）
（使用ソフト）測定：Ｔｕｎｅ  ２．５，ＲＡＤ  ２．６
解析：Ｍａｃ  Ｓｐｅｃ  ３．３，Ｍａｃ  Ｑｕａｎ  １．３  （  ＰＥ  ＳＣＩＥＸ  ）
【００２０】
［試薬］
プレカラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  １２０    ２．０φ×  １０  ｍｍ（資生堂）
分析カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ  １２０    ２．０φ×１５０  ｍｍ（資生堂）
ギ酸：特級（和光純薬）
ギ酸アンモニウム：特級（和光純薬）
メタノール：特級（国産化学）
【００２１】
［実験１］ジジベオサイドＩＩのＬＣ／ＭＳ測定条件の設定
（１）ジジベオサイド（ｚｉｚｙｂｅｏｓｉｄｅ）ＩＩ単離品について、ＬＣ／ＭＳ測定条件の検討を行った。設定したジジベオサイドＩＩのＬＣ／ＭＳ測定条件を下表１に示す。
【００２２】
【表１】
2004279225.tif 000003
【００２３】
設定したＬＣ／ＭＳ測定条件でのジジベオサイドＩＩ単離品の検出限界及び定量性の確認を行った。ジジベオサイドＩＩ濃度０．０２５〜１０μｇ／ｍＬの試料溶液（移動相溶液）を調製し、表１に示したＬＣ／ＭＳ測定条件で分析を行い、Ｓ／Ｎ比から検出限界を、試料溶液濃度とピーク面積から最小二乗法により直線性を評価した。
【００２４】
（２）結果及び考察
移動相に水／メタノール／ギ酸系を用いて、ジジベオサイドＩＩのＬＣ／ＭＳスキャン分析を行った結果、プロトン化分子［Ｍ＋Ｈ］＋であるｍ／ｚ５９５のイオンは非常に小さく、ｍ／ｚ６１２［Ｍ＋１８］＋のイオンが非常に大きく観察された。
【００２５】
そこで、移動層にギ酸アンモニウムを添加し、ジジベオサイドＩＩを積極的に［Ｍ＋ＮＨ４］＋の形にしてｍ／ｚ６１２を検出することとした。検出感度を確認しながら、添加するギ酸アンモニウム濃度を０．１％に決定した。
【００２６】
ｍ／ｚ６１２［Ｍ＋ＮＨ４］＋をプリカーサーイオンとしてプロダクトイオンスキャンを行ったところ（図１参照）、各フラグメントイオンはすべて構造に帰属可能であった（図２参照）。検出感度及び選択性を高めるために、ｍ／ｚ６１２［Ｍ＋ＮＨ４］＋とプロダクトイオンスペクトルのベースピークであるｍ／ｚ３２５をＳＲＭ（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）モードでのモニターイオンとして設定し、最終的に表１に示したＬＣ／ＭＳ測定条件を設定した。設定した条件でのジジベオサイドＩＩ単離品のＳＲＭクロマトグラムを図３に示す。
【００２７】
表１の条件でジジベオサイドＩＩの検出感度を確認した結果、検出限界はＨＰＬＣへの絶対注入量０．２ｎｇであることがわかった。また、試料溶液濃度０．０２５〜１０μｇ／ｍＬの範囲で、濃度（Ｘ）とピーク面積（Ｙ）の間に相関係数０．９９５以上の良好な直線関係が得られた（表２参照）。
【００２８】
【表２】
2004279225.tif 000004
【００２９】
［実験２］タイソウ軟エキスの分析
（１）タイソウ軟エキス中のジジベオサイドＩＩのピーク確認及び含量評価を行った。エキス中では、他の夾雑成分の影響により単離品と比較してイオン化効率が変化する可能性があるため、単離品の試料溶液濃度（Ｘ）とピーク面積（Ｙ）との相関性及びエキスに単離品を添加した添加試料溶液の濃度（Ｘ）とピーク面積（Ｙ）との相関性を比較し、直線の傾きからイオン化効率に差があるかを確認した。
【００３０】
その結果を踏まえて、エキス中のジジベオサイドＩＩ含量は、標準添加法により算出し、日間差の確認も行った。エキス中でのジジベオサイドＩＩのイオン化効率の確認及び含量評価に用いた試料溶液の調製法は、下の通りである。ＬＣ／ＭＳ測定条件は表１に示した通りである。
【００３１】
【化２】
2004279225.tif 000005
【００３２】
（２）結果及び考察
製造ロットの異なる２つのタイソウ軟エキスの分析結果を図４に示す。何れもジジベオサイドＩＩのピークが良好に確認できた。
【００３３】
ジジベオサイドＩＩ単離品とエキス中でのイオン化効率を比較した結果を下表３に示す。
【００３４】
【表３】
2004279225.tif 000006
【００３５】
表３から明らかなように、両方とも良好な直線関係を示しており、定量性のあることは確認できたが、単離品と添加試料溶液では日によって傾きに差が認められた。このことから、エキス中のジジベオサイドＩＩ含量を算出するには、標準添加法を用いる。標準添加法により求めたタイソウ軟エキス中のジジベオサイドＩＩ含量も表３に掲載した。
【００３６】
製造ロットの異なる２種のタイソウ軟エキス中のジジベオサイドＩＩ含量は、約０．０１％と非常に微量ではあるが、ほぼ同程度の含量であると考えられる。同一ロットについて日間差を確認したところ、得られるデータはほぼ同等であり、本法によりタイソウ軟エキス中のジジベオサイドＩＩの含量測定が可能であることを確認した。
【００３７】
［実験３］製剤中のジジベオサイドＩＩの分析
（１）検出、特異性及び安定性の確認
▲１▼  下表４に掲載したタイソウ軟エキス配合の製剤Ａ及び製剤Ｂ並びにタイソウ未配合の製剤Ｃを用いて、ドリンク剤中のジジベオサイドＩＩの検出、特異性及び安定性の確認を行った。標準溶液にはジジベオサイドＩＩ単離品０．１μｇ／ｍＬ溶液を、試料溶液には各製剤を移動相で２倍に希釈したものを用いた。ＬＣ／ＭＳ測定条件は表１に示した通りである。
【００３８】
【表４】
2004279225.tif 000007
【００３９】
▲２▼  結果及び考察
製剤Ａ、製剤Ｂ及び製剤Ｃ分析時のＳＲＭクロマトグラムを図５に示す。図５のクロマトグラムから明らかなように、タイソウ軟エキス配合の２製剤では、保持時間約７分にジジべオサイドＩＩのピークが明瞭に認められるが、タイソウ未配号の製剤Ｃでは、ジジベオサイドＩＩの溶出位置にピークが認められなかった。ジジベオサイドＩＩを指標にタイソウの有無が容易に確認できると考えられる。
【００４０】
また、製剤Ｂの２つのサンプル（Ｂ−１、Ｂ−２）は、室温で長期間（Ｂ−１は６年４月、Ｂ−２は３年１０月）保存した後のものであるが、ジジベオサイドＩＩのピークは良好に確認された。さらにサンプルＢ−２を６５℃で２週間保存したサンプル（Ｂ−３）を同様に分析した結果、こちらも問題なくピークが確認でき、保存前とほぼ同等のピーク強度であったことから、製剤中のジジベオサイドＩＩの安定性に問題はなく、タイソウの確認試験の指標成分として適当であると判断した。
【００４１】
（２）定量性の確認
▲１▼  製剤中のジジベオサイドＩＩに関してもエキスの場合と同様の操作を行いイオン化効率に差があるかを確認した。その結果を踏まえて、製剤についても標準添加法によりジジベオサイドＩＩ含量を測定した。サンプルには製剤Ａ及びＢを用い、日間差の確認も行った。試料溶液調製法は、下の通りであり、ＬＣ／ＭＳ測定条件は表１に示した通りである。
【００４２】
【化３】
2004279225.tif 000008
【００４３】
▲２▼  結果及び考察
ジジベオサイドＩＩ単離品とドリンク剤中でのイオン化効率を比較した結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
2004279225.tif 000009
【００４５】
表５からも明らかなように、製剤でも良好な直線関係を示しており、定量性のあることは確認できたが、やはり単離品と添加試料溶液では傾きに差が認められたことから、製剤中のジジベオサイドＩＩ含量を算出する場合にも、標準添加法を用いることとした。標準添加法により求めた各製剤中のジジベオサイドＩＩ含量も併せて表５に示した。
【００４６】
各製剤中のジジベオサイドＩＩ含量は、タイソウ軟エキスの配合量により異なるが、エキス中の含量に換算すると約０．００７〜０．０１％という結果であった。非常に微量ではあるが、エキス中のジジベオサイドＩＩ含量とほぼ同等であり妥当な結果であると判断した。製剤についても同じ製造ロットのものについて日間差を確認したところ、得られるデータはほぼ同等であり、本法により製剤中のジジベオサイドＩＩの含量測定が可能であることを確認した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、確認不可生薬であるタイソウについて、特有成分であるジジベオサイドＩＩを指標に、高感度で特異性の高いＬＣ／ＭＳを用いて、製剤における簡便なタイソウ確認試験の方法を確立した。
【００４８】
また、本発明は、検出限界が数百ｐｇ以下と高感度であり、試料溶液濃度０．０２５〜１０μｇ／ｍＬの範囲でも定量可能である。
【００４９】
本発明を用いて、タイソウ軟エキス及び該軟エキス配合製剤の分析を行った結果、何れもジジベオサイドＩＩを良好に確認することができ、特異性及び安定性にも問題はなかった。
【００５０】
更に、標準添加法を用いることにより、エキス中及び製剤中のジジベオサイドＩＩの含量測定も可能であった。
【００５１】
以上のことから、ＬＣ／ＭＳを用いることにより、簡便で種々の製剤で適用できるジジベオサイドＩＩを指標成分とするタイソウの確認試験法を提供することが可能となった。
【００５２】
【図面の簡単な説明】
【図１】ジジベオサイドＩＩのプロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。
【図２】ジジベオサイドＩＩのＣＡＤ（  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ）フラグメンテーションを示す。
【図３】ジジベオサイドＩＩ単離品のＳＲＭクロマトグラムを示すグラフである。
【図４】タイソウ軟エキス中のジジベオサイドＩＩのＳＲＭクロマトグラムを示すグラフである。
【図５】製剤中のジジベオサイドＩＩのＳＲＭクロマトグラムを示すグラフである。
【図１】
2004279225.tif 000010
【図２】
2004279225.tif 000011
【図３】
2004279225.tif 000012
【図４】
2004279225.tif 000013
【図５】
2004279225.tif 000014