(57)【要約】【課題】安全かつ効率的な遺伝子導入剤を提供する。【解決手段】ポリアミドアミンデンドロンを含む遺伝子導入剤組成物。【選択図】図１
2004159504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物。
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ５：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ６：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ７：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ８：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２）２）２）２
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一または異なってアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはアラルキル基を示す。Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）
【請求項２】
さらにリン脂質を含む請求項１に記載の遺伝子導入剤組成物。
【請求項３】
リン脂質がＤＯＰＥである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子導入剤または遺伝子導入剤組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボで細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
遺伝子治療等に用いられる効率の高い遺伝子導入剤としてウィルスベクターが知られているが、該ウィルスベクターは、臨床応用において死に至る重篤な副作用が報告されており、より安全な遺伝子導入剤が求められている。
【０００３】
非ウィルスベクターは、ウィルスベクターと比較してより安全性が高いが、遺伝子の導入効率が低い欠点があった。
【０００４】
本発明は、安全性及び導入効率に優れた遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の遺伝子導入剤、遺伝子導入用キット及び遺伝子導入方法を提供するものである。
項１．  下記式ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８のいずれかで表される化合物を含む遺伝子導入剤組成物。
ＤＬ−Ｇ１：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（ＸＨ２）２
ＤＬ−Ｇ２：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（ＸＨ２）２）２
ＤＬ−Ｇ３：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ４：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ５：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ６：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ７：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２）２）２
ＤＬ−Ｇ８：Ｒ１Ｒ２ＮＸ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（Ｘ（ＸＨ２）２）２）２）２）２）２）２）２
（式中Ｒ１及びＲ２は、同一または異なってアルキル基、アルコキシ基、アリール基またはアラルキル基を示す。Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を示す。）
項２．  さらにリン脂質を含む請求項１に記載の遺伝子導入剤組成物。
項３．  リン脂質がＤＯＰＥである請求項２に記載の組成物。
項４．  項１〜３のいずれかに記載の遺伝子導入剤または遺伝子導入剤組成物を遺伝子とともにイン・ビトロまたはイン・ビボで細胞に適用することを特徴とする遺伝子の細胞への導入方法。
項５．  請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を含有する遺伝子導入用キット。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８のいずれかのポリアミドアミンデンドロンにおいて：
アルキル基としては、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、エイコシル、２−エチルヘキシルなどの炭素数６〜２０の直鎖または分枝を有するアルキル基が挙げられる。
アルコキシ基としては、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、トリデシルオキシ、テトラデシルオキシ、ヘキサデシルオキシ、オクタデシルオキシ、エイコシルオキシ、２−エチルヘキシルオキシなどの炭素数６〜２０の直鎖または分枝を有するアルコキシ基が挙げられる。
アリール基としては、ベンジル、ナフチル、ビフェニル、アントラニル、フェナントリルなどが挙げられる。
アラルキル基としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。
【０００７】
Ｘは、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ−を表し、その末端のＮは、通常２個の水素原子を有するが、１個の水素原子がロイシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、フェニルアラニン、チロシンなどの疎水性アミノ酸で置換されていてもよい。
【０００８】
本発明のポリアミドアミンデンドロンは、例えば以下のようにして製造することができる。
【０００９】
【化１】
2004159504.tif 000003
【００１０】
本発明の好ましいポリアミドアミンデンドロンを以下に示す。
【００１１】
【化２】
2004159504.tif 000004
【００１２】
本発明の遺伝子導入剤組成物は、ポリアミドアミンデンドロンの他に、リン脂質を好適に含むことができる。このようなリン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。このうち、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファリジルコリンをそれぞれ単独で、または組み合わせて用いるのが好ましい。これらのリン脂質の脂肪酸残基は、特に限定されるべきものではないが、炭素数１２から１８の飽和または不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、リノレイル基等を挙げることができ、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）が特に好ましい。
【００１３】
リン脂質の配合量は特に限定されないが、リン脂質とポリアミドアミンデンドロンの合計量を１００重量部とした場合にリン脂質３０〜９０重量部、ポリアミドアミンデンドロン７０〜１０重量部、好ましくはリン脂質５０〜８０重量部、ポリアミドアミンデンドロン５０〜２０重量部、より好ましくはリン脂質６０〜７０重量部、ポリアミドアミンデンドロン４０〜３０重量部である。
【００１４】
リン脂質の他に、遺伝子導入剤組成物に含有され得る添加剤としては、コレステロールなどが例示される。
【００１５】
ポリアミドアミンデンドロン脂質を単独で用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子導入剤を１〜２０重量部、好ましくは３〜１５重量部、より好ましくは５〜７重量部使用する。また、ポリアミドアミンデンドロン脂質とリン脂質の混合物を用いる場合、遺伝子と遺伝子導入剤の配合割合は、遺伝子１重量部に対し、遺伝子導入剤を１〜５０重量部、好ましくは５〜３０重量部、より好ましくは１０〜１５重量部使用する。
【００１６】
遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子が好ましい。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。
【００１７】
遺伝子が導入される細胞としては、ヒトなどの動物細胞、植物細胞などの真核細胞、細菌などの原核細胞が例示できる。
【００１８】
本発明の組成物の形態としては、ポリアミドアミンデンドロン（ＤＬ−Ｇ１〜ＤＬ−Ｇ８）のみが存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質が単に混合物として存在していてもよく、ポリアミドアミンデンドロンとリン脂質とが組み合わさって脂質膜構造体を形成していてもよい。該脂質膜構造体の存在形態およびその製造方法は特に限定されるべきものではないが、例えば、存在形態としては、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。
【００１９】
乾燥した脂質混合物は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことで製造することができる。
【００２０】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは、特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には、粒子径が５０ｎｍから数μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５ｎｍから５０ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成していると考えればよい。
【００２１】
水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されるべきものではないが、水のほかに、グルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが重要である。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが重要である。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、糖水溶液を、凍結保存する場合には、糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。
【００２２】
これらの水系溶媒の添加物の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２から２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５から１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１から５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２から２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が５から５０ｍＭが好ましく、１０から２０ｍＭがさらに好ましい。
【００２３】
水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は、特に限定されるべきものではないが、本発明においては脂質膜構造体として用いるリン脂質の総量の濃度は、０．００１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、０．０１ｍＭから２０ｍＭがさらに好ましい。
【００２４】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、特に限定されるべきものではない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
【００２５】
また、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体をさらに乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上記したように、糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。ここで、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に遺伝子水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために遺伝子自身も効率よく、脂質膜構造体に保持させることができるといったメリットがある。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、遺伝子だけでなく、親水性の大きい薬物、高分子量の生理活性ペプチド類、蛋白質などの細胞内に導入されにくい薬物などにも適用できる。本発明の組成物を用いれば、イン・ビトロ及びイン・ビボのいずれにおいても細胞内に遺伝子を効率良く導入することができる。
【００２７】
イン・ビトロでの遺伝子導入は、標的とする細胞を含む懸濁液に本発明の遺伝子含有導入剤組成物を添加したり、本発明の遺伝子含有組成物を含有する培地で標的とする細胞を培養する等の手段により、行うことができる。
【００２８】
イン・ビボでの遺伝子導入は、本発明の遺伝子含有組成物を宿主に投与すればよい。宿主への投与手段としては、経口投与でも、非経口投与でもよいが、非経口投与が好ましい。剤形としては、通常知られたものでよく、経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等を挙げることができる。また、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、従来の遺伝子導入剤と比較して、遺伝子導入効率を格段に向上し、かつ、細胞毒性の低い遺伝子導入剤が得られ、安全性及び導入効率の両面に優れた遺伝子導入技術が確立された。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明する。
【００３１】
なお、以下の実施例において、「リポプレックス」とは本発明のデンドロン脂質とＤＮＡの複合体を意味する。
実施例１
１．  デンドロン脂質（ＤＬ）の合成
１．１．  ＤＬ−Ｇ−０．５の合成
蒸留したアクリル酸メチル（１４ｍｌ，  ０．１５６ｍｏｌ）にジ−ｎ−ドデシルアミン（２．００ｇ，  ５．６６ｍｍｏｌ）を溶かし、窒素雰囲気において８０℃で１８時間還流した。その後、未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒  石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１）で精製した。（収量２．３８７ｇ，  ９６．１％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８５  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２３  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．３８  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．３５  （ｔ，  Ｈｆ），  δ  ２．４０  （ｔ，  Ｈｄ），  δ  ２．７４  （ｔ，  Ｈｅ），  δ  ３．６３  （ｓ，  ＯＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．１  （Ｃａ），  δ  ２２．７，  ２７．１，  ２７．５，  ２９．３，  ２９．６  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３２．２  （Ｃｆ），  δ  ４９．３  （Ｃｅ），  δ  ５１．４  （ＯＣＨ３），  δ  ５３．９  （Ｃｄ），  δ  １７３．３  （ＣＯＯＣＨ３）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４４０．７  （Ｍ＋１）．１．２．  ＤＬ−Ｇ０の合成
ＤＬ−Ｇ−０．５  （２．１６２ｇ，  ４．９２ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ，  １．２３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０４８ｇ，  ０．９７９ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（１００ｍｌ，  １．５０ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液  メタノール）  によって精製した。（収量１．９４５ｇ，  ８４．６％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８５  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２３  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．４１  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．３３  （ｔ，  Ｈｆ），  δ  ２．３９  （ｔ，  Ｈｄ），  δ  ２．６２  （ｔ，  Ｈｅ），  δ  ２．７６  （ｔ，  Ｈｈ），  δ  ３．２５  （ｍ，  Ｈｇ），  δ  ８．６５  （ｍ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．１  （Ｃａ），  δ  ２２．６，  ２６．６，  ２７．６，  ２９．３，  ２９．６  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３２．７  （Ｃｆ），  δ  ４１．９  （Ｃｈ），  δ  ４２．２  （Ｃｇ），  δ  ５０．３  （Ｃｅ），  δ  ５３．３  （Ｃｄ），  δ  １７３．３  （ＣＯＮＨ）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ４６８．２  （Ｍ＋１）．
１．３．  ＤＬ−Ｇ０．５の合成
ＤＬ−Ｇ０（２．２５６ｇ，  ４．８２ｍｍｏｌ）をメタノール（１７．５ｍｌ，  ０．４３１ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（４３．５ｍｌ，  ０．４８５ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒  石油エーテル：ジエチルエーテル＝２：１  のち  ジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。（収量２．６３４ｇ，  ８５．４％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８４  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２１  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．３９  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．３０  （ｔ，  Ｈｆ），  δ  ２．３８  （ｍ，  Ｈｊ），  δ  ２．３９  （ｍ，  Ｈｄ），  δ  ２．４９  （ｔ，  Ｈｈ），  δ  ２．６７  （ｔ，  Ｈｅ），  δ  ２．７３  （ｔ，  Ｈｉ），  δ  ３．２５  （ｍ，  Ｈｇ），  δ  ３．６３  （ｓ，  ＯＣＨ３），  δ７．７６  （ｍ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．１  （Ｃａ），  δ  ２２．６，  ２６．７，  ２７．６，  ２９．３，  ２９．６，  ３１．９  ａｎｄ  ３２．５  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３３．１  （Ｃｊ），  δ  ３６．９  （Ｃｆ），  δ  ４９．１  （Ｃｉ），  δ  ５０．１  （Ｃｅ），  δ  ５１．５  （ＯＣＨ３），  δ  ５３．０  （Ｃｄ），  δ  ５３．５  （Ｃｈ），  δ  １７２．７  （ＣＯＯＣＨ３），  δ  １７２．８  （ＣＯＮＨ）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ６４０．８  （Ｍ＋１）．１．４．  ＤＬ−Ｇ１の合成
ＤＬ−Ｇ０．５（０．７１４ｇ，  １．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（２０．５ｍｌ，  ０．５０５ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０１１ｇ，  ０．２２４ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（３７．５ｍｌ，  ０．５６２ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液  メタノール）  によって精製した。（収量０．６７４ｇ，  ８６．４％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８４  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２２  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．３８  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．１２  （ｍ，  ＮＨ２），  δ  ２．２８  （ｍ，  Ｈｊ），  δ  ２．３１  （ｍ，  Ｈｆ），  δ  ２．３６  （ｍ，  Ｈｄ），  δ  ２．４６  （ｔ，  Ｈｈ），  δ  ２．６３  （ｔ，  Ｈｅ），  δ  ２．７０  （ｔ，  Ｈｉ），  δ  ２．７９  （ｔ，  Ｈｌ），  δ  ３．１７  （ｍ，  Ｈｇ），  δ  ３．２５  （ｍ，  Ｈｋ），  δ  ７．４５  ａｎｄ  ８．６３  （ｍ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．０  （Ｃａ），  δ  ２２．６，  ２６．５，  ２７．６，  ２９．２，  ２９．６  ａｎｄ  ３１．８  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３２．９  ａｎｄ  ３４．３  （Ｃｆ，  Ｃｊ），  δ  ３７．８  （Ｃｇ），  δ  ４１．３  ａｎｄ  ４１．９  （Ｃｋ，  Ｃｌ），  δ  ５０．０  （Ｃｉ），  δ  ５０．８  （Ｃｅ），  δ  ５２．９  （Ｃｄ），  δ  ５３．３  （Ｃｈ），  δ  １７３．４  ａｎｄ  １７２．９  （ＣＯＮＨ）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ６９７．４  （Ｍ＋１）．
１．５．  ＤＬ−Ｇ１．５の合成
ＤＬ−Ｇ１（１．５３９ｇ，  ２．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（８６．５ｍｌ，  ２．１３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１５２ｍｌ，  １．６９ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において３５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝９：１）で精製した。（収量１．７０３ｇ，  ７４．０％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８８  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２６  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．４５  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．３７  （ｍ，  Ｈｊ），  δ  ２．４４  （ｍ，  Ｈｄ），  δ  ２．５６  （ｍ，  Ｈｈ），  δ  ２．７７  （ｍ，  Ｈｉ），  δ  ３．２９  （ｍ，  Ｈｇ），  δ  ３．６８  （ｓ，  ＯＣＨ３），  δ  ７．０４  ａｎｄ  ８．０８  （ｍ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．１  （Ｃａ），  δ  ２２．７，  ２６．５，  ２７．６，  ２９．４，  ２９．６  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３２．７，  ３３．０  ａｎｄ  ３３．９  （Ｃｊ），  δ  ３７．２  ａｎｄ  ３７．５  （Ｃｇ），  δ  ４９．３  ａｎｄ  ５０．０  （Ｃｉ），  δ  ５０．２  （Ｃｅ），  δ  ５１．７  （ＯＣＨ３），  δ  ５２．８  （Ｃｄ），  δ  ５３．０  ａｎｄ  ５３．４  （Ｃｈ），  δ  １７２．３  （ＣＯＯＣＨ３），  δ  １７２．７  ａｎｄ  １７３．１  （ＣＯＮＨ）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １０４１．５  （Ｍ＋１）．
１．６．  ＤＬ−Ｇ２の合成
ＤＬ−Ｇ１．５（１．７０３ｇ，  １．６４ｍｍｏｌ）をメタノール（４６ｍｌ，  １．１３ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．０３２ｇ，  ０．６５５ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（１３４ｍｌ，  ２．００ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液  メタノール）  によって精製した。（収量１．７１３ｇ，  ９０．８％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８７  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２５  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．４２  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．１３  （ｍ，  ＮＨ２），  δ  ２．３３  （ｍ，  Ｈｊ），  δ  ２．３６  （ｍ，  Ｈｄ），  δ  ２．５２  （ｍ，  Ｈｈ），  δ  ２．７３  （ｍ，  Ｈｉ），  δ  ２．８２  （ｍ，  Ｈｌ），  δ  ３．２４  （ｍ，  Ｈｇ），  δ  ３．２７  （ｍ，  Ｈｋ），  δ  ７．７４，  ７．７９  ａｎｄ  ８．５８  （ｍ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．２  （Ｃａ），  δ  ２２．７，  ２６．６，  ２７．７，  ２９．４，  ２９．７  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３３．０，  ３４．０  ａｎｄ  ３４．３  （Ｃｆ，  Ｃｊ），  δ  ３７．８  （Ｃｇ），  δ  ４１．５  ａｎｄ  ４２．２  （Ｃｋ，  Ｃｌ），  δ  ５０．２  （Ｃｉ），  δ  ５０．５  （Ｃｅ），  δ  ５３．０  （Ｃｄ），  δ  ５３．３  （Ｃｈ），  δ  １７２．６，  １７３．０  ａｎｄ  １７３．４  （ＣＯＮＨ）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １１５３．０  （Ｍ＋）．
１．７．  ＤＬ−Ｇ２．５の合成
ＤＬ−Ｇ２（１．７１３ｇ，  １．４９ｍｍｏｌ）をメタノール（１２０ｍｌ，  ２．９６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（１００ｍｌ，  １．１２ｍｏｌ）に徐々に加え、３０℃で２５時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、シリカゲル（展開溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝８５：１５  のち  ８０：２０）で精製した。（収量１．９００ｇ，  ６９．４％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８８  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２６  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．４５  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．３７  （ｍ，  Ｈｊ），  δ  ２．４４  （ｍ，  Ｈｄ），  δ  ２．５６  （ｍ，  Ｈｈ），  δ  ２．７６  （ｍ，  Ｈｉ），  δ  ３．２８  （ｍ，  Ｈｇ），  δ  ３．６８  （ｓ，  ＯＣＨ３），  δ  ７．１３，  ７．６７  ａｎｄ  ８．１２  （ｍ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．１  （Ｃａ），  δ  ２２．７，  ２６．５，  ２７．６，  ２９．４，  ２９．６，  ２９．７  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３２．７  （Ｃｆ），  ３３．９  （Ｃｊ），  δ  ３７．２  ａｎｄ  ３７．５  （Ｃｇ），  δ４９．３  ａｎｄ  ４９．９  （Ｃｉ），  δ  ５０．２  （Ｃｅ），  δ  ５１．７  （ＯＣＨ３），  δ  ５２．６  （Ｃｄ），  δ  ５３．０ａｎｄ  ５３．４  （Ｃｈ），  δ  １７２．４  （ＣＯＯＣＨ３），  １７３．０  （ＣＯＯＣＨ３）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  １８４０．７  （Ｍ＋）．
１．８．  ＤＬ−Ｇ３の合成
ＤＬ−Ｇ２．５（０．１１５ｇ，  ０．０６３ｍｍｏｌ）をメタノール（２．５３ｍｌ，  ０．６２５ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．００１２ｇ，  ０．０２５ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（５．００ｍｌ，  ０．０７５ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５５時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液  メタノール）  によって精製した。（収量０．１１４ｇ，  ８８．４％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８８  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２６  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．４２  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．３７  （ｂｒ，  Ｈｊ），  δ  ２．５４  （ｂｒ，  Ｈｈ），  δ  ２．７５  （ｂｒ，  Ｈｉ），  δ  ２．８３  （ｂｒ，  Ｈｌ），  δ  ３．２４  （ｂｒ，  Ｈｇ），  δ  ３．２９  （ｂｒ，  Ｈｋ），  δ  ７．９４，  ８．０７  ａｎｄ  ８．５７  （ｂｒ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．２  （Ｃａ），  δ  ２２．７，  ２６．５，  ２７．７，  ２９．４，  ２９．７  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３４．０  ａｎｄ  ３４．３  （Ｃｆ，  Ｃｊ），  δ  ３７．８  （Ｃｇ），  δ  ４１．４  ａｎｄ  ４１．９  （Ｃｋ，  Ｃｌ），  δ  ５０．１  （Ｃｉ），  δ  ５０．５  （Ｃｅ），  δ  ５２．９  （Ｃｄ），  δ  ５３．３  （Ｃｈ），δ  １７２．８  ａｎｄ  １７３．１  （ＣＯＮＨ）；  ＴＯＦ−ＭＳ  ｍ／ｚ  ２０６６．０  （Ｍ＋）．１．９．  ＤＬ−Ｇ３．５の合成
ＤＬ−Ｇ３（１．００４ｇ，  ０．４８６ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍｌ，  ０．９８６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、蒸留したアクリル酸メチル（３５ｍｌ，  ０．３９ｍｏｌ）に徐々に加え、２５℃で５０時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のアクリル酸メチルを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液  メタノール）  により二度精製後、さらにシリカゲル（展開溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝８：２）で精製した。（収量１．１４１ｇ，  ６８．２％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ０．８８  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２３  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  ２．３７  （ｂｒ，  Ｈｊ），  δ  ２．４４  （ｂｒ，  Ｈｄ），  δ  ２．５４  （ｂｒ，  Ｈｈ），  δ  ２．７６  （ｂｒ，  Ｈｉ），  δ  ３．２７  （ｂｒ，  Ｈｇ），  δ  ３．６７  （ｓ，  ＯＣＨ３），  δ  ７．１３，  ７．７１  ａｎｄ  ８．１０  （ｂｒ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４．１  （Ｃａ），  δ  ２２．７，  ２９．４，  ２９．７  ａｎｄ  ３１．９  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３２．７  （Ｃｆ），  ３３．８  （Ｃｊ），  δ  ３７．２  ａｎｄ  ３７．５  （Ｃｇ），  δ  ４９．３  ａｎｄ  ４９．９  （Ｃｉ），  δ  ５０．６  （Ｃｅ），  δ  ５１．７  （ＯＣＨ３），  δ  ５２．５  （Ｃｄ），  δ  ５３．０  （Ｃｈ），  δ  １７２．４  （ＣＯＯＣＨ３），  δ  １７２．６  ａｎｄ  １７３．１  （ＣＯＮＨ）．
１．１０．    ＤＬ−Ｇ４の合成
ＤＬ−Ｇ３．５（１．１４１ｇ，  ０．３３１ｍｍｏｌ）をメタノール（１８．５ｍｌ，  ０．４５６ｍｏｌ）に溶かした。この溶液を、シアン化ナトリウム（０．００６５ｇ，  ０．１３３ｍｍｏｌ）を含む蒸留したエチレンジアミン（３７ｍｌ，  ０．５５４ｍｏｌ）に徐々に加え、窒素雰囲気において４５℃で５５時間撹拌した。その後、メタノールと未反応のエチレンジアミンを減圧留去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラム（溶離液  メタノール）  により二度精製した。（収量０．６９９ｇ，  ５４．２％．）
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ０．８５  （ｍ，  Ｈａ），  δ  １．２６  （ｓ，  Ｈｂ），  δ  １．３７  （ｍ，  Ｈｃ），  δ  ２．２０  （ｂｒ，  Ｈｊ），  δ  ２．３０  （ｂｒ，  Ｈｄ），  δ  ２．５７  （ｂｒ，  Ｈｈ），  δ  ２．６５  （ｂｒ，  Ｈｉ），  δ  ３．０７  （ｂｒ，  Ｈｋ），  δ  ７．９１，  ７．９８  ａｎｄ  ８．１６  （ｂｒ，  ＣＯＮＨ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １４．０  （Ｃａ），  δ  ２２．２，  ２７．０，  ２９．１  ａｎｄ  ３１．４  （Ｃｂ，  Ｃｃ），  δ  ３３．３  （Ｃｆ，  Ｃｊ），  δ  ３７．０  （Ｃｇ），  δ  ４１．７  （Ｃｋ，  Ｃｌ），  δ  ４９．７  （Ｃｉ），  δ  ５２．２  （Ｃｈ），  δ  １７１．６  （ＣＯＮＨ）．
２．  測定
２．１．  電気泳動による複合体形成能の評価
デンドロン脂質（ＤＬ−Ｇ１，ＤＬＧ２，ＤＬＧ−３，ＤＬＧ４）のクロロホルム溶液（ＤＬＧ４についてはメタノール溶液）から溶媒を減圧留去し、脂質薄膜を得た。これにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、調製したデンドロン脂質分散液を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５μｌ）にＮ／Ｐ比が０．２、０．４、０．６、０．７、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６になるように加えて混合し（全量１０μｌ）、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した。調製したリポプレックスを０．６ｗｔ％アガロースゲルに加え、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ／  ２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ／  ２ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａバッファー中において１００Ｖの電位下、３０分間電気泳動を行った。なお、電気泳動は  Ｍｕｐｉｄミニゲル泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ  Ｃｏ．）を用いて行った（図１）。
２．２．  リポプレックスの調製
２．２．１デンドロン脂質とプラスミドＤＮＡとのリポプレックス
カチオン性脂質（ＤＬ−Ｇ１、ＤＬ−Ｇ２、ＤＬ−Ｇ３、ＤＬ−Ｇ４）のクロロホルム溶液（ＤＬ−Ｇ４についてはメタノール溶液）からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去して、脂質薄膜を形成させた。これにＰＢＳを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、脂質分散液を調製した。次に、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）と種々の濃度の脂質分散液（５０μｌ）を加えて混合し、室温で１０分間インキュベーションして、リポプレックスを得た図２。
２．２．２．ＤＬ−Ｇ３、ＤＯＰＥ、プラスミドからなるリポプレックス
ＤＬ−Ｇ３（４１．７μｇ）と種々の量のＤＯＰＥからなる混合薄膜に、ＰＢＳ  ０．５ｍｌを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、混合脂質分散液を調製した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）に混合脂質分散液を種々のＮ／Ｐ（ＤＬ−Ｇ３の１級アミノ基／ＤＮＡのリン酸エステル、モル／モル）比に混合し、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した（図３，図４）。
２．２．３．ＤＣ−ｃｈｏｌ、ＤＯＰＥ、プラスミドからなるリポプレックス
カチオン性脂質ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタンカルバモイル］コレステロール）（１６１．３μｇ）とＤＯＰＥ（２４０μｇ）の混合薄膜にＰＢＳ  ２．５ｍｌを加え、バス型超音波照射装置を用いて超音波を２分間照射し、混合脂質分散液を調製した。２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌのプラスミドＤＮＡ溶液（１μｇ／５０μｌ）に混合脂質分散液をＮ／Ｐ比が２になるように加えて混合し、室温で１０分インキュベーションしてリポプレックスを調製した（図４）。
２．３．  遺伝子導入
アフリカミドリザル腎臓由来のＣＶ−１細胞を２４穴ディッシュ１穴当たり５．０×１０４個になるように撒き、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム０．５ｍｌ中、３７℃で一晩培養した。その後、０．３６ｍＭ  ＣａＣｌ２と０．４２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ（ＰＢＳ（＋））で３回洗浄した後、血清を含まないＤＭＥＭメディウム１ｍｌを加え、１穴当たり所定量のプラスミドＤＮＡを含むリポプレックスを細胞に加え、４時間インキュベーションした。その後ＰＢＳ（＋）で３回洗浄して、細胞に取り込まれていないリポプレックスを除去し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウム１ｍｌを加え４０時間培養した（図２，図３，図４）。
【００３２】
図１〜図４に示されるように、本発明の遺伝子導入剤は、デンドロンがＤＬ−Ｇ２からＤＬ−Ｇ４へ大きくなるにつれて高い遺伝子導入効率を発現することが明らかになった。特にＤＬ−Ｇ４は高い遺伝子導入効率を有している。
２．４．  ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子導入の評価
リポプレックスと処理し、４０時間培養した後、ＰＢＳ（＋）で３回洗浄し、さらにＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、１穴当たり８０μｌの細胞溶解剤を加えて細胞を溶かし、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、その上澄みを回収した。得られた細胞溶解液のルシフェラーゼ活性及びタンパク量を、ピッカジーンルシフェラーゼアッセイキット（東洋インキ）およびＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｐｉｅｒｃｅ）  により行った。
２．５．  リポプレックスの細胞毒性
リポプレックスで処理した細胞を４０時間培養後、メディウムを除去し、新しい１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭメディウムを１穴当たり２００μｌずつ加えた。さらにＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を１穴当たり２０μｌずつ加え、２時間インキュベーションした。次にメディウムを除去して０．１Ｍ  ＨＣｌ含有イソプロパノール（５００μｌ）を加えた。その溶液を遠心チューブに回収し、１５０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離を行った。上澄み液を５７０ｎｍの吸光度を測定することによって生細胞数を求め、リポプレックスと処理していない細胞を培養した場合との比（％）を求めた（図４）。
【００３３】
図４に示されるように、本発明のデンドロン（ＤＬ−Ｇ３）は、従来汎用されているＤＣ−ｃｈｏｌと比較して遺伝子導入活性が向上し（図４Ａ，Ｂ）、かつ、遺伝子導入活性を有する量（ＤＮＡ量が１〜２μｇ）において細胞生存率が６５％以上と有意に高く（図４Ｃ）、高い遺伝子導入活性及び低毒性を同時に達成した、非常に優れた遺伝子導入剤であることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】デンドロン脂質とＤＮＡの複合体形成を示す。図１において、「Ａ」はＤＬ−Ｇ１リポプレックス、「Ｂ」はＤＬ−Ｇ２リポプレックス、「Ｃ」はＤＬ−Ｇ３リポプレックス、「Ｄ」はＤＬ−Ｇ４リポプレックスを各々示す。
【図２】遺伝子導入活性に及ぼす世代数の影響を示す。図２は、各種のＮ／Ｐ比を有するＤＬ−Ｇ２，ＤＬ−Ｇ３またはＤＬ−Ｇ４リポプレックスで処理したＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性（ｇルシフェラーゼ／ｍｇ蛋白質（Ａ）およびｇルシフェラーゼ／ウェル（Ｂ））を示す。細胞（５×１０４）は血清を含まない培地中１μｇのＤＮＡを含むリポプレックスで処理された。ＮおよびＰは、各々脂質の第一級アミノ基及びＤＮＡホスフェートの当量を示す。
【図３】遺伝子導入活性に及ぼす世代数の影響を示す。図３Ａは、ＤＯＰＥ／ＤＬ−Ｇ３比を変化させたリポプレックスで処理されたＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性を示し、図３Ｂは、Ｎ／Ｐ比を変化させたリポプレックスで処理されたＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性を示す。
【図４】ＤＣ−ｃｈｏｌリポプレックスとの比較を示す。図４は、ＤＬ−Ｇ３／ＤＯＰＥリポプレックスまたはＤＣ−ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥリポプレックスで処理されたＣＶ１細胞のルシフェラーゼ活性（（Ａ）：ｇルシフェラーゼ／ｍｇ蛋白質、（Ｂ）：ｇルシフェラーゼ／ウェル）及び細胞生存度（Ｃ）を示す。
【図１】
2004159504.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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