(57)【要約】【課題】生体内条件を模擬した環境下で血小板の動的な形態変化との相互作用を観測する。【解決手段】血小板表面に存在する膜糖蛋白ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａやＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対するモノクローン抗体をＦＩＴＣ等により蛍光標識し、赤血球を含む全血の血液中に混入した試料血液を、損傷血管壁を模擬するコラーゲンやｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）などのマトリックスを上面に塗布などして固相化したガラス板２２を用いたフローチャンバー２０に流しながら、共焦点顕微鏡装置を用いて、血小板の３次元形態を、動画像として撮像する。【選択図】図１
2004251630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンまたはｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の層が流路壁面上に設けられた流路が形成されたフローチャンバーと、
前記フローチャンバーの流路に血液を流す流体ポンプと、
前記フローチャンバーの流路を流れる血液を、繰り返し３次元撮像する共焦点顕微鏡装置とを有することを特徴とする血栓生成過程観測装置。
【請求項２】
請求項１記載の血栓生成過程観測装置であって、
前記フローチャンバーに形成された流路は、流路断面の大きさが相互に異なる、流路方向についての複数の範囲を有することを特徴とする血栓生成過程観測装置。
【請求項３】
血栓生成過程を観測する血栓生成過程観測方法であって、
コラーゲンまたはｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の層が流路壁面上に設けられた流路が形成されたフローチャンバーの流路に、血小板の膜糖蛋白ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する、蛍光標識したモノクローン抗体を混入した血液を流しながら、前記フローチャンバーの流路を流れる血液を、共焦点顕微鏡装置によって、繰り返し３次元撮像することを特徴とする血栓生成過程観測方法。
【請求項４】
血栓生成過程を観測する血栓生成過程観測方法であって、
コラーゲンまたはｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の層が流路壁面上に設けられた流路が形成されたフローチャンバーの流路に、血小板の膜糖蛋白ＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対する、蛍光標識したモノクローン抗体を混入した血液を流しながら、前記フローチャンバーの流路を流れる血液を、共焦点顕微鏡装置によって、繰り返し３次元撮像することを特徴とする血栓生成過程観測方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗血栓薬の薬効評価等のために血栓形成過程を観測する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、抗血栓薬の薬効評価は、血小板をＡＤＰやｔｈｒｏｍｂｉｎなどの活性化物質で活性化したときに惹起される血小板内顆粒の放出や、活性化した血小板の形態変化や、活性化した血小板を攪拌して惹起される血小板凝集などに対する抑制効果を指標として行われきた。
【０００３】
しかし、生体内における血栓形成過程は、血小板が活性化物質に暴露された結果としてではなく、内管壁が損傷し内皮下のマトリックスが血流に暴露されたことを契機に、マトリックス上に血流条件下で血小板が凝集すると共に血小板とマトリックスとが相互作用して、血小板が活性化されることにより進行する。
【０００４】
そこで、実際の血栓形成過程における薬効を評価するために、従来は、マトリックスと相互作用させた血小板検体を固定して標本を観測対象として、走査型電子顕微鏡により血小板の形態を観測することが行われてきた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記走査型電子顕微鏡によって血小板を観測する技術によれば、固定した血小板検体を観測の対象とするために、血小板の動的な形態変化やマトリックスとの相互作用のようすを観測することができない。そして、このために、生体内条件下において、抗血栓薬が血小板機能に及ぼす作用や効果を詳細に評価することができなかった。
【０００６】
そこで、本発明は、生体内条件と同等の条件下において、血小板の動的な形態変化やマトリックスとの相互作用を詳細に観測可能とすることを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題達成のために本発明は、コラーゲンまたはｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の層が流路壁面上に設けられた流路が形成されたフローチャンバーと、前記フローチャンバーの流路に血液を流す流体ポンプと、前記フローチャンバーの流路を流れる血液を、繰り返し３次元撮像する共焦点顕微鏡装置とを備えた血栓生成過程観測装置を提供する。
【０００８】
このような血栓生成過程観測装置によれば、コラーゲンまたはｖＷＦの層によって損傷血管壁を模擬した流路に血流を通しながら、血流内の血小板の３次元形態を、共焦点顕微鏡を用いて、良好な空間解像、時間解像度で動画像として観測することができる。
【０００９】
ここで、このような血栓生成過程観測装置においては、前記フローチャンバーに形成された流路は、流路断面の大きさが相互に異なる、流路方向についての複数の範囲を有するようにするのが良い。
このようにすることにより、共焦点顕微鏡装置によるフローチャンバーの流路上の撮像位置を変えるだけで、異なる壁ずり速度や異なる流路幅による血栓生成過程を観測することができるようになる。
また、前記課題達成のために、本発明は、血栓生成過程を観測する血栓生成過程観測方法として、コラーゲンまたはｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の層が流路壁面上に設けられた流路が形成されたフローチャンバーの流路に、血小板の膜糖蛋白ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する、蛍光標識したモノクローン抗体を混入した血液を流しながら、前記フローチャンバーの流路を流れる血液を、共焦点顕微鏡装置によって、繰り返し３次元撮像する血栓生成過程観測方法を提供する。
【００１０】
このような血栓生成過程観測方法によれば、コラーゲンまたはｖＷＦの層によって損傷血管壁を模擬した流路に血流を通しながら、血流内の血小板の３次元形態を、共焦点顕微鏡を用いて、良好な空間解像、時間解像度で動画像として観測することができる。したがって、血小板の動的な形態変化やマトリックスとの相互作用のようすをより細やかに把握して、抗血栓薬の詳細な評価等を行うことができるようになる。また、蛍光標識したＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローン抗体を介して血小板の形態を撮像することにより、血流中の赤血球に邪魔されることなく、血小板の形態を良好に撮像することができる。
【００１１】
また、同様に、本発明は、血栓生成過程を観測する血栓生成過程観測方法として、コラーゲンまたはｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）の層が流路壁面上に設けられた流路が形成されたフローチャンバーの流路に、血小板の膜糖蛋白ＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対する、蛍光標識したモノクローン抗体を混入した血液を流しながら、前記フローチャンバーの流路を流れる血液を、共焦点顕微鏡装置によって、繰り返し３次元撮像する血栓生成過程観測方法を提供する。
【００１２】
このような血栓生成過程観測方法によれば、コラーゲンまたはｖＷＦの層によって損傷血管壁を模擬した流路に血流を通しながら、血流内の血小板のＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａの分布を、共焦点顕微鏡を用いて、良好な空間解像、時間解像度で動画像として観測することができる。ここで、ＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａは、血小板の活性化によって膜近傍から血小板内部へ移動集中していく現象を呈するので、本方法によれば、血小板の機能変化を、より細やかに把握して、抗血栓薬の詳細な評価等を行うことができるようになる。また、蛍光標識したＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対するモノクローン抗体を介して撮像を行うことにより血流中の赤血球に邪魔されることなく、良好な撮像を実現することができる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。
図１に、本実施形態に係る血栓生成過程観測装置の構成を示す。
本血栓生成過程観測装置は、生体内条件模擬装置と、共焦点顕微鏡装置とよりなる。
そして、生体内条件模擬装置は、血管を模擬した流路が形成されたフローチャンバー２０と、フローチャンバー２０に血流を供給する血流ポンプ３０とより構成され、共焦点顕微鏡装置は、本体部１、フローチャンバー２０を載置するステージ２、レーザ光源３、共焦点スキャナユニット４、ＩＥＥＥ  １３９４規格に従った６６フレーム／秒倍速カメラ等の高速なカメラ５、カメラ５にイメージ増強や高速シャッタ機能などを付加するイメージインテンシファイヤ６、対物レンズ７、対物レンズ７を光軸方向に移動するアクチュエータ８、Ｚ軸走査制御装置９、ビデオキャプチャインタフェースを備えたコンピュータ等である画像処理装置１０、表示装置１１とを有する。
【００１４】
ここで、共焦点顕微鏡装置の原理について説明しておく。
図２に模式的に構成を示すように、共焦点顕微鏡装置の基本構成は、レーザ光を試料５０上に集光させるためのマイクロレンズアレイ１０１と、ピンホールアレイ１０２と、対物レンズ７と、対物レンズ７を光軸方向（図中Ｚ方向）に移動するためのアクチュエータ８と、集光レンズ１０３と撮像素子１０４を備えたカメラ５と、対物レンズ７とピンホールアレイ１０２を通過した試料５０からの反射光の進路をカメラ５方向に変化させるビームスプリッタ１０５とよりなる。
【００１５】
そして、このような構成において、対物レンズ７のＺ方向の位置によってレーザ光の集光点のＺ座標が制御され、マイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２を回転させることによりレーザ光の集光点のＸＹ座標が制御される。すなわち、対物レンズ７のＺ方向位置とマイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２の回転角によって、カメラ５に撮影される試料５０中の走査点を３次元的に制御できるようになっている。
【００１６】
なお、図１における共焦点スキャナユニット４は、図２に示したマイクロレンズアレイ１０１や、ピンホールアレイ１０２や、ビームスプリッタ１０５や、マイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２を回転駆動する回転制御部を収容したものである。また、本実施形態では、試料５０はフローチャンバー２０の内部を流れる血流となる。
【００１７】
また、本共焦点顕微鏡装置は、照明光源１２を備えており、この照明光源１２と、本体部１に収容された光学系とより光学顕微鏡装置としても機能するようになっている。
次に、図３に示すように、生体内条件模擬装置の血流ポンプ３０は、試料血液を供給管に注入する注入器３１と、注入器３１のロッドを設定された速度でシリンダに対して押し込んで行く直動機構を備えた注入装置３２とよりなり、血流ポンプ３０によって供給管３３に注入された試料血液が、血流となってフローチャンバー２０の内部に設けられた流路を通って排出管３４に排出され、収集容器３５に収集される構成となっている。
【００１８】
次に、図４を用いてフローチャンバー２０の構成について説明する。
図４ａはフローチャンバー２０の斜視図を現し、図４ｂはフローチャンバー２０の流路中心線を通る鉛直な平面による断面図を表している。
図示するように、フローチャンバー２０は、金属製のベース２１と、損傷血管壁を模擬するコラーゲンやｖＷＦ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子）などのマトリックスを固相化した層２２１を上面上に設けたガラス板２２（スライドガラス）と、シリコン製の２２０μｍ程度の厚さの流路側壁形成シート２３と、流路への血液供給トンネル２４１と流路からの血液排出トンネル２４２が形成されたガラスブロック２４とを有し、これらを図４ｃに示すように当該記載順に下から重ね、４本のネジ２５によって上下方向に締め付けた構成を有している。ただし、ここでは、共焦点顕微鏡装置にフローチャンバー２０を設置した時に、レーザ光が入射してくる方向を上としている。
【００１９】
さて、前述した血管を模擬した流路は、ガラス板２２上に固相化されたコラーゲンやｖＷＦを下壁とし、流路側壁形成シート２３に設けられた孔の側面を側壁とし、ガラスブロック２４の下面を上壁として形成される。そして、このような構成において、供給管３３からガラスブロック２４に設けられた血液供給トンネル２４１に注入された試料血液が、血液供給トンネル２４１を通って流路に流入し、流路を通った後、血液排出トンネル２４２を通って排出管３４に排出される。
【００２０】
ここで、流路側壁形成シート２３に設けられた孔の形状、従って、試料血液の流路の上下方向から見た形状は、図４ｄに示すように、左右方向に関して、血液流入側から血液排出側に向かって狭まる形状となっている。流路の幅は、たとえば６ｍｍ？２ｍｍ程度とし、長さは３０ｍｍ程度とする。
【００２１】
さて、このような血栓生成過程観測装置による観測は以下のように行う。
まず、血小板の形態変化を中心に観察する場合には、血小板表面に存在する膜糖蛋白ＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａに対するモノクローン抗体をＦＩＴＣ等により蛍光標識し、蛍光標識したモノクローン抗体を赤血球を含む全血の血液中に混入し試料血液とする。一方、血小板の機能変化を中心に観測する場合には、血小板の活性化によって膜近傍から血小板内部へ移動集中していく現象を呈する膜糖蛋白ＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対するモノクローン抗体をＦＩＴＣ等により蛍光標識し、蛍光標識したモノクローン抗体を赤血球を含む全血の血液中に混入し試料血液とする。
【００２２】
そして、試料血液を充填した注入器３１を注入装置３２にセットし、血流ポンプ３０に、フローチャンバー２０における血流の壁ずり速度が一定（たとえば、フローチャンバー２０の流路の流路方向についての中央部において１５００  −１となるような速度で、注入器３１内の血液をフローチャンバー２０に供給させながら、共焦点顕微鏡装置に図５に示す走査シーケンスによる撮像を行わせる。
【００２３】
この図５に示した共焦点顕微鏡装置の走査シーケンスは、図５ａに示すＺ軸走査制御装置９が出力するＴＲＩＧＥＲ信号によって開始される。カメラ５は、ＴＲＩＧＥＲ信号を外部トリガ信号として入力し、図５ｂに示すようにＴＲＩＧＥＲ信号に垂直同期信号を同期させ、撮影を開始する。
【００２４】
また、カメラ５の垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣは、共焦点スキャナユニット４とＺ軸走査制御装置９に出力される。そして、共焦点スキャナユニット４の回転制御部は、入力する垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣに同期して、各映像フレームの撮像期間毎に１回のＸＹ走査を行うようにマイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２を回転駆動する。ここで、撮像期間とは、１映像フレーム期間のうちの、垂直同期信号期間を少なくとも除く期間を指す。なお、撮像期間には水平同期信号期間や、水平同期信号期間や垂直同期信号期間の前後にある画素を撮像しない期間を含めないようにしてもよい。
【００２５】
一方、Ｚ軸走査制御装置９は、図５ｃに示すように、入力する垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣに同期して、各映像フレームの撮像期間中に所定周期のパルスを所定数アクチュエータに、移動制御信号ＣＮＴとして出力する。また、入力する垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣをカウントし、所定カウントに達したならば、パルス出力を停止し、リセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力する。そして、次の垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣが入力したならば、以上と同様に所定数の映像フレーム期間、各映像フレームの撮像期間中に所定数の所定周期のパルスを移動制御信号ＣＮＴとしてアクチュエータ８に出力するステージ２と、１映像フレーム期間パルス出力を停止すると共に、リセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力するステージ２とよりなるシーケンスを繰り返す。
【００２６】
アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９から入力する移動制御信号ＣＮＴのパルスを積分し、図５ｄ、ｅに示すように、垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣの期間は一定値を保ち、映像フレームの撮像期間は一様に増加する駆動信号を生成し、この駆動信号によって対物レンズ７をＺ方向に移動する。なお、ここでは、対物レンズ７の移動量は、駆動信号の大きさに比例するものとしている。もし、対物レンズ７の移動量は、駆動信号の大きさにリニアに比例しない場合は、対物レンズ７が、垂直同期信号Ｖ  ＳＹＮＣの期間は移動せず、映像フレームの撮像期間は一様に移動するように、駆動信号を生成するようにする。なお、対物レンズ７を移動する機構としては、ピエゾ素子を用いた機構などを用いることができる。
【００２７】
そして、アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９からリセット信号ＲＳＴが入力したならば、駆動信号を初期値に戻す。
以上の動作によって、試料５０中の走査点と各映像フレームとの関係は、図５ｇに示すようになる。すなわち、各映像フレーム期間（図５ではＴ１？Ｔ８）のそれぞれにおいて、各映像フレーム期間毎に異なるＺ座標範囲内の映像が撮影される。ここで、本実施形態では、以上のように映像フレームの撮像期間にのみ対物レンズ７をＺ方向に移動する。したがって、いずれのＸＹ座標についても全く撮影されないＺ座標範囲の発生は少ない。なお、本実施形態では、血小板の直径が２μｍ程度であることを考慮して、以上のような対物レンズ７のＺ座標方向への移動により、各フレーム毎に焦点位置をＺ座標方向に、流路下壁付近で、たとえば０．２μｍづつ移動するようにする。また、１回のＺ軸走査で撮像する映像フレーム数（図５の走査シーケンスでは、リセット信号ＲＳＴとリセット信号ＲＳＴの間の映像フレーム数−１）は１０から数１０フレーム程度とする。
【００２８】
さて、画像処理装置１０は、カメラ５から出力される各映像フレームを取り込み記憶すると共に、合成して表示装置１１に表示する処理を繰り返す。ここで、画像処理装置１０には、Ｚ軸走査制御装置９からＴＲＩＧＥＲ信号のタイミングなどを表すタイミング信号が供給されており、画像処理装置１０はこのタイミング信号に従って、各映像フレームとその映像フレームに撮像された試料５０の走査面のＺ方向の順番との対応を認識し、認識した順番に従って各映像フレームを合成又は配置して試料５０の３次元画像を生成し、表示装置１１に表示する。
【００２９】
以上の動作の結果、生体内条件と同等の条件化での、３次元的な、動画像としての、血小板の形態イメージングや膜蛋白の再構築を含む機能イメージングが実現されたことになる。
図６は、このようにしてイメージングした３次元画像の表示例を示すものであり、図６ａがマトリックスに対する角度が１０度の方向から見た流路内の血小板を、図６ｂがマトリックスと垂直な方向から見た流路内の血小板を示している。ただし、実際には、動画像として、血小板の動きや形態変化を記録したり、リアルタイムに表示したりする。
【００３０】
なお、本実施形態では前述したように、フローチャンバー２０内の試料血液の流路の形状を、図４ｄに示すように、左右方向に関して、血液流入側から血液排出側に向かって狭まる形状としているので、フローチャンバー２０の共焦点顕微鏡装置への設置位置を変えるだけで、異なる壁ずり速度や異なる流路幅による血栓生成過程を観測することができるようになる。
【００３１】
また、蛍光標識したＧＰ  ＩＩｂ／ＩＩＩａやＧＰ  Ｉｂａｌｐｈａに対するモノクローン抗体を介して血小板の形態を撮像するので、血流中の赤血球に邪魔されることなく、血小板の形態を良好に撮像することができる。
以上のように本実施形態によれば、フローチャンバー２０を用いて構成した生体内条件を模擬した流路に血流を通しながら、血流内の血小板の３次元形態を、共焦点顕微鏡を用いて、良好な空間解像、時間解像度で動画像として観測することができる。したがって、血小板の動的な形態変化やマトリックスとの相互作用のようすをより細やかに把握して、抗血栓薬の詳細な評価等を行うことができるようになる。
【００３２】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、生体内条件と同等の条件下において、血小板の動的な形態変化やマトリックスとの相互作用を詳細に観測可能とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態に係る血栓生成過程観測装置の構成を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の基本構成を模式的示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係る生体内条件模擬装置の構成をに示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係るフローチャンバーの本発明の実施形態に係る他の走査シーケンスを示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の走査シーケンスを示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る血流内血小板の３次元撮像例を示す図である。
【符号の説明】
１…本体部、２…ステージ、３…レーザ光源、４…共焦点スキャナユニット、５…カメラ、６…イメージインテンシファイヤ、７…対物レンズ、８…アクチュエータ、９…軸走査制御装置、１０…画像処理装置、１１…表示装置、１２…照明光源、２０…フローチャンバー、２１…ベース、２２…ガラス板、２３…流路側壁形成シート、２４…ガラスブロック、２５…ネジ、３０…血流ポンプ、３１…注入器、３２…注入装置、３３…供給管、３４…排出管、３５…収集容器、５０…試料、１０１…マイクロレンズアレイ、１０２…ピンホールアレイ、１０３…集光レンズ、１０４…撮像素子、１０５…ビームスプリッタ、２４１…血液供給トンネル、２４２…血液排出トンネル。
【図１】
2004251630.tif 000003
【図２】
2004251630.tif 000004
【図３】
2004251630.tif 000005
【図４】
2004251630.tif 000006
【図５】
2004251630.tif 000007
【図６】
2004251630.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月20日(2003.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ここで、流路側壁形成シート２３に設けられた孔の形状、従って、試料血液の流路の上下方向から見た形状は、図４ｄに示すように、左右方向に関して、血液流入側から血液排出側に向かって狭まる形状となっている。流路の幅は、たとえば６ｍｍ−２ｍｍ程度とし、長さは３０ｍｍ程度とする。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
そして、アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９からリセット信号ＲＳＴが入力したならば、駆動信号を初期値に戻す。
以上の動作によって、試料５０中の走査点と各映像フレームとの関係は、図５ｇに示すようになる。すなわち、各映像フレーム期間（図５ではＴ１−Ｔ８）のそれぞれにおいて、各映像フレーム期間毎に異なるＺ座標範囲内の映像が撮影される。ここで、本実施形態では、以上のように映像フレームの撮像期間にのみ対物レンズ７をＺ方向に移動する。したがって、いずれのＸＹ座標についても全く撮影されないＺ座標範囲の発生は少ない。なお、本実施形態では、血小板の直径が２μｍ程度であることを考慮して、以上のような対物レンズ７のＺ座標方向への移動により、各フレーム毎に焦点位置をＺ座標方向に、流路下壁付近で、たとえば０．２μｍづつ移動するようにする。また、１回のＺ軸走査で撮像する映像フレーム数（図５の走査シーケンスでは、リセット信号ＲＳＴとリセット信号ＲＳＴの間の映像フレーム数−１）は１０から数１０フレーム程度とする。