(57)【要約】【課題】ＤＮＡ断片あるいは化学合成等で作製されるＤＮＡ鎖を効率よく連結し、遺伝子をコードするなど、産業上有用なＤＮＡ鎖の合成を可能とする。【解決手段】認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合してＤＮＡ鎖を連結する。【選択図】  図１
2004180564.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合する事を特徴とするＤＮＡ鎖の連結方法。
【請求項２】
ＤＮＡをクローニングするクローニングベクターであり、このベクターのクローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに、対称に配置し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で消化時に、挿入されたＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部の両端を切断することにより結合可能な粘着末端を持つＤＮＡ断片を生じせしめる事を特徴とするクローニングベクター。
【請求項３】
目的のＤＮＡ断片の末端部分の配列を両端部分に持つ２本鎖ＤＮＡを、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置したベクターのクローニング部位に挿入し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、該ＤＮＡ断片の末端部分の配列に相補的となる粘着末端を持つベクターを調製し、このベクターにより該ＤＮＡ断片をクローニングする事を特徴とするＤＮＡのクローニング方法。
【請求項４】
クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置することで、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合する事を特徴とするＤＮＡ鎖の連結方法。
【請求項５】
クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置することで、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合してＤＮＡ鎖を作成し、上記操作で得られたクローニング目的のＤＮＡ断片の末端部分の配列を両端部分に持つ２本鎖ＤＮＡを、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置したベクターのクローニング部位に挿入し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、該ＤＮＡ断片の末端部分の配列に相補的となる粘着末端を持つベクターを調製し、このベクターにより該ＤＮＡ断片をクローニングする事を特徴とするＤＮＡのクローニング方法。
【請求項６】
ベクターのクローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに、対称に配置した配列は、ｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃ（配列表の配列番号１）又はｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃ（配列表の配列番号２）である事を特徴とする請求項４のＤＮＡ鎖の連結方法。
【請求項７】
ベクターのクローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに、対称に配置した配列は、ｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃ（配列表の配列番号１）又はｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃ（配列表の配列番号２）である事を特徴とする請求項２のクローニングベクター。
【請求項８】
ベクターのクローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに、対称に配置した配列は、ｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃ（配列表の配列番号１）又はｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃ（配列表の配列番号２）である事を特徴とする請求項３又は５のＤＮＡのクローニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ＤＮＡ鎖の連結方法、及びクローニングベクター、及びＤＮＡのクローニング方法に係るもので、ＤＮＡ断片あるいはＤＮＡ鎖を効率よく連結させることで、新規なＤＮＡ鎖合成方法を得ようとするものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ鎖はある蛋白質をコードする遺伝子となり、これを利用し、遺伝子工学的に蛋白質の生産等に応用できるため、従来より、化学合成ＤＮＡから遺伝子となるＤＮＡ鎖の人工的な合成が行われてきた。また、生物体より遺伝子を採取し、これを利用する技術も発展しているが、人工的に遺伝子を作製する方法は、その生物体からの遺伝子が入手できず、アミノ酸配列情報だけが得られる場合の他、大腸菌等の宿主に入れた場合に宿主に最適な翻訳コドンに基づきその塩基配列を作製し発現効率を高めることができる、耐熱性などの新たな性質を蛋白質に付与する等、天然にない遺伝子を合成する方法として有用である。人工的な遺伝子作製は、従来、その遺伝子の塩基配列について制限酵素地図を作成し、化学合成したＤＮＡ鎖のアニーリング、ライゲーションを行い、数鎖を連結した後、ＤＮＡ鎖内部の塩基配列上存在する制限酵素部位を利用し、化学合成したＤＮＡ鎖の数鎖からなる連結したＤＮＡ鎖を、プラスミドベクター等にクローニングし、このとき塩基配列に誤りがあれば修正等をし、さらにクローニングした断片を連結し、目的の遺伝子を作製した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながらこの方法は、繁雑で、数ヶ月から半年以上の期間を要する問題の他、次のような問題点があった。まず、問題点の一つは、最初に用いる化学合成ＤＮＡに誤りがしばしばある点である。実際、ＤＮＡ合成機でオリゴヌクレオチドを合成する場合、塩基配列に誤りが生じることは少ないことではなく、長鎖になるほどその誤りは増加する。次に、問題点の２つめは、化学合成したＤＮＡを連結したＤＮＡ鎖は、十分に純度が高くなければ、これらをさらに連結するのは、容易ではない点である。これは連結にともなって、副産物が生じるからである。
【０００４】
上記２つの問題点は、作製途中のＤＮＡ鎖を、ＤＮＡ鎖内部の塩基配列上存在する制限酵素部位を利用しプラスミドベクター等にクローニングし、純度を高め、この段階で塩基配列の誤りを修正等をすることはできる。しかしながら使用できる制限酵素切断部位が目的の遺伝子内部になければできない。
【０００５】
また、約５００塩基対からなる小麦のレクチンの遺伝子は塩基配列内部に存在する制限酵素部位を利用し作製された（ヨーロピアンジャーナルバイオケミストリー（Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２１０：  ９８９−９９７，  １９９２））。この例では、オリゴヌクレオチドから約１５０塩基対程度のＤＮＡ鎖が作製され、これらが塩基配列内部に存在する制限酵素部位を利用し別々のプラスミドベクターにクローニングされ、このクローニングされたＤＮＡ鎖を結合し、小麦のレクチンの遺伝子を得ている。この方法は多種の制限酵素を用いる繁雑な方法であった。
【０００６】
また、牛の膵臓のＤＮＡアーゼＩは膵臓にＲＮＡアーゼが多く含まれるため、そこからメッセンジャーＲＮＡを入手するのが難しく、アミノ酸配列をもとにＤＮＡアーゼＩ遺伝子がオリゴヌクレオチドから合成された例がある（ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、２６５巻、２１８８９から２１８９５頁、１９９０年（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２６５：  ２１８８９−２１８９５，  １９９０））。この場合は塩基配列内部に存在する制限酵素部位を利用せず、約８００塩基対が作製されるまで、プラスミドベクターにクローニングしていない、そのため作製途中では塩基配列の誤りを知ることができない。この方法ではオリゴヌクレオチドから５０塩基対程度のＤＮＡ鎖を作製しこれらをＴ４リガーゼで結合させてから、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離精製し、純度の高いＤＮＡ鎖を用いているが、ＤＮＡアーゼＩ遺伝子を作製し終わってから、プラスミドベクターにクローニングをし、塩基配列の誤りが発見され、内部の制限酵素部位を利用し、約５０塩基対の塩基配列を切り出し、これを正しいＤＮＡ鎖に置き換える方法で塩基配列の修正を余儀なくされている。
【０００７】
更に、近年ではポリメラーゼ連鎖反応によって、ＤＮＡ鎖を連結させる方法で遺伝子作製を行う例があり、従来法より繁雑さに関しては改善されている。しかしながら、塩基配列上に生じた誤りについては前記従来方法と同じ問題が残されている。また、リガーゼ連鎖反応といわれる方法でＤＮＡ鎖を連結させる手法も行われている（バイオケミストリーバイオフジックスリサーチコミュニケーション、２４８巻、２００から２０３頁、１９９８年（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２４８：  ２００−２０３，  １９９８））。この方法は、ＤＮＡ鎖を連結する精度が上がり、副産物の精製は少ないが、最初に用いる化学合成ＤＮＡ鎖の誤りについて、作製途中で誤りを検出し、修正する問題点は残る。
【０００８】
また、遺伝子作製に用いる化学合成ＤＮＡにある誤りを回避し、化学合成したＤＮＡを連結したＤＮＡ鎖の純度が高くするためには、プラスミドベクター等にクローニングすることが必要である。これには使用できる制限酵素切断部位が目的の遺伝子内部にあり、それと同じ制限酵素切断部位でクローニングできるベクターを用意することになる。しかしながら使用できる制限酵素切断部位が目的の遺伝子内部になければできない。
【０００９】
本発明は上述の如き課題を解決しようとするものであって、遺伝子をコードする等、産業上有用なＤＮＡ鎖の連結方法に於いて、用いる化学合成ＤＮＡ鎖の誤り、及び連結反応にしたがってＤＮＡ鎖の純度が低下することを回避し、ＤＮＡ鎖の連結を容易に行うことを可能とするようなＤＮＡ鎖の連結方法、クローニングベクター、及びＤＮＡのクローニング方法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上述の如き課題を解決するため、第１発明は、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合する、ＤＮＡ鎖の連結方法である。
【００１１】
また、第２発明は、ＤＮＡをクローニングするクローニングベクターであり、このベクターのクローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに、対称に配置し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で消化時に、挿入されたＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部の両端を切断することにより結合可能な粘着末端を持つＤＮＡ断片を生じせしめるものである。
【００１２】
また、第３発明は、目的のＤＮＡ断片の末端部分の配列を両端部分に持つ２本鎖ＤＮＡを、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置したベクターのクローニング部位に挿入し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、該ＤＮＡ断片の末端部分の配列に相補的となる粘着末端を持つベクターを調製し、このベクターにより該ＤＮＡ断片をクローニングする、ＤＮＡのクローニング方法である。
【００１３】
また、第４発明は、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置することで、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合する、ＤＮＡ鎖の連結方法である。
【００１４】
また、第５発明は、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置することで、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにＤＮＡ鎖をクローニングし、クローニングされた挿入ＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部を、その認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、切断したＤＮＡ断片に予め設定した特異的な粘着末端を付与せしめ、この操作で得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ断片を複数個結合してＤＮＡ鎖を作成し、上記操作で得られたクローニング目的のＤＮＡ断片の末端部分の配列を両端部分に持つ２本鎖ＤＮＡを、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに対称に配置したベクターのクローニング部位に挿入し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断することにより、該ＤＮＡ断片の末端部分の配列に相補的となる粘着末端を持つベクターを調製し、このベクターにより該ＤＮＡ断片をクローニングする、ＤＮＡのクローニング方法である。
【００１５】
また、ベクターは、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を、酵素Ａの制限酵素認識部位と一部重複または重複せずに、対称に配置した配列が、ｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃ（配列表の配列番号１）又はｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃ（配列表の配列番号２）であっても良い。
【００１６】
【発明の実施の形態】
第１、第４発明のＤＮＡ鎖の連結方法では、ＤＮＡ鎖を認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにクローニングする段階（図１−あ）、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素にて、ベクターと挿入ＤＮＡ鎖の境界または挿入ＤＮＡ鎖内部を切断し、あらかじめ設定した特異的な粘着末端を生じせしめる段階（図１−い）、得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ鎖を連結する段階（図１−う）によって目的の遺伝子作製を行う。
【００１７】
また、第３、第５発明のＤＮＡのクローニング方法では、ＤＮＡ鎖を認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにクローニングする段階（図１−あ）、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素にて、ベクターと挿入ＤＮＡ鎖の境界または挿入ＤＮＡ鎖内部を切断し、あらかじめ設定した特異的な粘着末端を生じせしめる段階（図１−い）、得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ鎖を連結する段階（図１−う）、連結したＤＮＡ鎖の両端の特異的な粘着末端に相補する粘着末端を持つベクターで再クローニングする段階（図１−え）によって目的の遺伝子作製を行う。
【００１８】
また、第２発明においてあらかじめ設定した特異的な粘着末端を生じせしめるためのクローニングベクターは、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を対象に配置し、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断時に、挿入されたＤＮＡ鎖とベクターの境界または挿入されたＤＮＡ鎖内部の両端を切ることにより、結合可能な粘着末端を持つＤＮＡ断片を生じるものである（第３〜第５発明における結合粘着末端付与ベクターとする）。酵素Ａと酵素Ｂの認識塩基配列は塩基配列上、図２に示す如く一部重複していても良いし、重複していなくても良い。このようなクローニングベクターを用いることにより、ＤＮＡ鎖の連結やＤＮＡのクローニングを効率的に行うことができる。
【００１９】
前記酵素Ｂはクローニング部位となる制限酵素切断部位に挿入配列があった場合、ベクターと挿入ＤＮＡ鎖の境界または挿入ＤＮＡ鎖内部を切断するものである。このような制限酵素の例としては、Ｂｂｖ  Ｉ、ＢｃｉＶ  Ｉ、Ｂｍｒ  Ｉ、Ｂｐｍ  Ｉ、Ｂｓａ  Ｉ、ＢｓｅＲ  Ｉ、Ｂｓｇ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｎＢ  Ｉ、ＢｓｎＦ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉ、ＢｓｒＤ  Ｉ、Ｂｔｓ  Ｉ、Ｂｂｓ  Ｉ、Ｅａｒ  Ｉ、Ｅｃｉ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｈｐｈ  Ｉ  Ｉ、ＭｂｏＩＩ、Ｐｌｅ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、ＳｆａＮ  Ｉ、ＢｓｔＦ５  Ｉ、Ｆａｕ  Ｉ等があるが、認識塩基配列および粘着末端の一本鎖部分が長い、Ｂｂｓ  Ｉ、Ｂｓａ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉが好ましい。両側に配置された酵素Ｂの切断部位がＢｓａ  Ｉのものである場合はクローニング部位となる制限酵素切断部位はＮｒｕ  Ｉが好ましく、Ｂｂｓ  Ｉの場合は、Ｓｍａ  Ｉが好ましい。
【００２０】
例えば、Ｂｓａ  ＩとＮｒｕ  Ｉを選んだ場合、クローニング部位の周辺の塩基配列は、ｇｇｔｃｔｃｇ  ｃｇａｇａｃｃ（配列表の配列番号１）が好ましい。この場合、Ｂｓａ  Ｉの認識部位は、アンダーラインで示すｇｇｔｃｔｃとｇａｇａｃｃである。Ｎｒｕ  Ｉの認識部位はｔｃｇ  ｃｇａであり、その切断部位を空欄で表している。
【００２１】
また、Ｂｂｓ  ＩとＳｍａ  Ｉを選んだ場合、クローニング部位の周辺の塩基配列は、ｇａａｇａｃｃｃ  ｇｇｇｔｃｔｔｃ（配列表の配列番号２）が好ましい。この場合、Ｂｂｓ  Ｉの認識部位は、アンダーラインで示すｇａａｇａｃとｇｔｃｔｔｃである。Ｓｍａ  Ｉの認識部位はｃｃｃ  ｇｇｇであり、その切断部位を空欄で表している。
【００２２】
次に、図１−うで示す第１、第４発明のＤＮＡ鎖の連結方法及び第５発明のＤＮＡのクローニング方法におけるＤＮＡ鎖の連結工程について説明する。上述の如き粘着末端を生じるクローニングベクターに、作成目的の遺伝子Ｇを構成するＤＮＡ鎖、Ｘ、Ｚ、Ｖをクローニングする。このとき、クローニングされたＤＮＡ鎖が切り出されたときに削られる塩基については重複させる。具体的には、Ｂｓａ  ＩとＮｒｕ  Ｉの組み合わせのベクターを用いた場合（この場合、図１のＲＲＲＲＲＮはｇｇｔｃｔｃｇとなる）、Ｘ、Ｚ、ＶのＤＮＡ鎖がこの順で、結合する場合（Ｘ鎖側を上流、Ｖ鎖側を下流とする）、Ｘ鎖の下流とＺ鎖の上流側のそれぞれ４塩基対が重複するように選ぶ。Ｇを、Ｘ、Ｚ、Ｖの３つの連続するＤＮＡ鎖によって作製する場合、それぞれをあらかじめ酵素Ａで切断した本発明における結合粘着末端付与ベクターにクローニングし、酵素Ｂにより切断するとＸ、Ｚ、ＶのＤＮＡ鎖の両端はこの順で結合するための粘着末端をもって切り出され、特異的な粘着末端によって結合する。
【００２３】
また、連結したＤＮＡ鎖を再クローニングする第３、第５発明では、第２発明における結合粘着末端付与ベクター（クローニングベクター）を用いている。このベクターの、クローニング部位となる一つの平滑末端を生じる制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ａとする）を中心として、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位（この酵素を酵素Ｂとする）を対象に配置したベクターのクローニング部位に、連結したＤＮＡ鎖の末端部分の配列を両端部分に持つＤＮＡ鎖をクローニングし、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断時に、連結したＤＮＡ鎖の末端部分の配列に相補的となる粘着末端を生じるようにする（図３）。このベクターにより連結したＤＮＡを効率良く再クローニングして、分子量の大きな遺伝子を作製することができる（図１−え）。
【００２４】
また、上記第５発明の操作（図１−あ〜え）を繰り返すことにより、複数個のＤＮＡ断片を結合させたＤＮＡ鎖を、更に複数個結合させることができ、長鎖ＤＮＡ合成を効率良く行うことができる。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。第１、第２実施例はクローニングベクターで、その作製手順を示している。第３実施例は、第１実施例のクローニングベクターを用いたＤＮＡ鎖の連結方法及びＤＮＡのクローニング方法である。第４実施例は、第２実施例のクローニングベクターを用いたＤＮＡ鎖の連結方法及びＤＮＡのクローニング方法である。
【００２６】
第１実施例（クローニングベクター：ＢＢＳプラスミドの作製）
プラスミドｐＵＣ１９（５．０μｇ）を２つの制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化した後、この消化物を０．７％のアガロースゲル電気泳動に供与した。電気泳動後、アガロースゲルを１０μｇ／ｍｌのエチジュウムブロマイド水溶液に２時間浸したのち、アガロースゲルをＤＮＡ用紫外線照射機上に置き、紫外線を照射し、オレンジ色に光る約２．７  ｋｂのＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）にて精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１９として保存した。
【００２７】
一方、以下に示した配列からなる２種類のＤＮＡ鎖をＤＮＡ合成機により作製し、それぞれのＤＮＡ鎖を１００ｐｍｏｌ取り、２μｌの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０ｎｍｏｌのＡＴＰを加えた、計２０μｌの反応液中で３７℃、１時間反応させ、ＤＮＡ鎖の５’側をリン酸化した。その後この反応液を５分間６５℃にしたのち、室温に３０分間放置した。
５’  ａｇｃｔｔｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃｔｃｇ  ３’（配列表の配列番号３）
５’  ａａｔｔｃｇａｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃａ  ３’（配列表の配列番号４）
【００２８】
上記ＤＮＡ鎖が混合された反応液９μｌとＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断ｐＵＣ１９を１μｌ混合し、これに試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績株式会社製）１０μｌと混ぜ、１６℃で１５時間、反応させた。コンピテントセル、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌１００μｌを１．５ｍｌ容積のチューブに用意し、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを３．５μｌ加え、１０分間、氷上で時々振り、前述の１６℃で反応させたＤＮＡ溶液を２μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢ（１％ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｒ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム）を加え、３７℃で１時間培養し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で１８時間、保温した。生じた大腸菌コロニー数個を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間、培養し、この培養液を、９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。この菌体からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）によりプラスミドを調製した。
【００２９】
上記で得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムジャパン株式会社製）によりその塩基配列を調べ、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列、つまり、ｐＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の塩基配列が以下のような配列を持つプラスミドを選んだ。この選択されたプラスミドを、ＢＢＳプラスミドとする。また、アンダーライン部分は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素の認識部位（ａａｇｃｔｔ）及びＥｃｏＲＩ制限酵素の認識部位（ｇａａｔｔｃ）を示している。
５’  ａａｇｃｔｔｇａａｇａｃｃｃｇｇｇｔｃｔｔｃｔｃｇａａｔｔｃ    ３’（配列表の配列番号５）
【００３０】
次に、上記で選んだＢＢＳプラスミド（５．０μｇ）を、制限酵素、Ｓｍａ  Ｉにより消化した後、前述のようにアガロースゲル電気泳動に供与し、精製し、最終的に５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解して保存した。
【００３１】
第２実施例（クローニングベクター：ＢＳＡプラスミドの作製）
１．プラスミドｐＵＣ１９のＢｓａ  Ｉ部位の改変
プラスミドｐＵＣ１９（５．０μｇ）を２つの制限酵素、Ｂｐｍ  ＩとＥａｍ１１０５  Ｉにより消化した後、この消化物を０．７％のアガロースゲル電気泳動に供与し、約２．７ｋｂのＤＮＡをアガロースゲルから得、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、Ｂｐｍ  ＩとＥａｍ１１０５  Ｉ切断ｐＵＣ１９として保存した。
【００３２】
一方、以下の配列からなるＤＮＡ鎖をＤＮＡ合成機により作製した。このＤＮＡ鎖はプラスミドｐＵＣ１９に内在するＢｓａ  Ｉ部位ｇｇｔｃｔｃがｇｇｔｃｇｃに変更されたものである（アンダーラインで示す如くｔがｇに変更）。それぞれの鎖を３００ｐｍｏｌと、４μｌの０．１Ｍ酢酸マグネシュウム、０．６６Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭＤＤＴ、０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む０．３３ＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）緩衝液、４ユニットのＴ４ポリメラーゼ、それぞれ５ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加えた、計４０μｌの反応液中で３７℃、２０分間反応させ、続いて、６５℃で３０分間処理した。また、以下の配列はアンダーライン部分が相補的な配列となっている。
５’  ｔａａａｔｃｔｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａｇｃｇｔｇｇｇｔｃｇｃｇｃｇｇｔａｔｃａｔｔｇｃａｇｃａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇａｔｇｇｔａａｇｃｃｃｔｃｃｃｇｔａｔｃｇ  ３’（５’側から２８番目のｔがｇに変更）（配列表の配列番号６）
５’  ｔｇｃｃｔｇａｃｔｃｃｃｃｇｔｃｇｔｇｔａｇａｔａａｃｔａｃｇａｔａｃｇｇｇａｇｇｇｃｔｔａｃｃａｔｃｔｇｇｃｃｃｃａｇｔｇｃｔｇｃａａｔｇａｔａｃｃｇｃ  ３’（配列表の配列番号７）
【００３３】
上記４０μｌのＤＮＡ溶液に４μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加えた後、終濃度７０％になるようにエチルアルコールを加え、マイナス８０℃冷凍庫で凍らせた。２０分後、冷凍庫から取り出し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿をロータリーエパポレターにて乾燥させた。乾燥した沈殿を３０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、これをＢｐｍ  ＩとＥａｍ１１０５  Ｉにより消化し、フェノール／クロロホルム抽出後、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加え、前述のようにエタノール沈殿をし、３０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解した（これをＤＮＡ鎖ＢＰＥＡとする）。
【００３４】
次に、Ｂｐｍ  ＩとＥａｍ１１０５  Ｉ切断ｐＵＣ１９を１μｌ、上記で作製したＤＮＡ鎖ＢＰＥＡを４μｌ、を混合し、これに５μｌの試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを混ぜ、１６℃で１５時間、反応させ、これを用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種した。生じた大腸菌コロニー数個をアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、この菌体からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによりプラスミドを調製した。得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べ、Ｂｓａ  Ｉ部位がｇｇｔｃｇｃに改変されているプラスミドを選びこれをＢＰＥＡプラスミドとした。
【００３５】
２．クローニング部位の付加
１．で作製したＢＰＥＡプラスミドを２つの制限酵素、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩにより消化した後、この消化物を０．７％のアガロースゲル電気泳動に供与し、約２．７ｋｂのＤＮＡをアガロースゲルから得、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製し、５０μｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）に溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ切断ＢＰＥＡプラスミドとして保存した。
【００３６】
一方、以下の配列からなる２種類のＤＮＡ鎖をＤＮＡ合成機により作製し、それぞれの鎖を１００ｐｍｏｌ取り、２μｌの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０ｎｍｏｌのＡＴＰを加えた、計２０μｌの反応液中で３７℃、１時間反応させ、ＤＮＡ鎖の５’側をリン酸化した。その後この反応液を５分間６５℃にしたのち、室温に３０分間放置した。
５’  ａｇｃｔｔｇｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃｃｔｃｇ    ３’（配列表の配列番号８）
５’  ａａｔｔｃｇａｇｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃｃａ    ３’（配列表の配列番号９）
【００３７】
上記二種類のＤＮＡ鎖が混合された反応液４μｌと前述の１０ｍＭトリス塩酸に溶かしたＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断ＢＰＥＡプラスミドを乾燥した沈殿を１μｌを混合し、これに５μｌの試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈと混ぜ、１６℃で１５時間、反応させ、これを用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌を形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種した。生じた大腸菌コロニー数個をアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養し、この菌体からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによりプラスミドを調製した。
得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べ、ＢＰＥＡプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列、つまり、ＢＰＥＡプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の塩基配列が以下のようになるプラスミドを選んだ（これをＢＳＡプラスミドとする）。
５’  ａａｇｃｔｔｇｇｇｔｃｔｃｇｃｇａｇａｃｃｃｔｃｇａａｔｔｃ    ３’（配列表の配列番号１０）
上記において、アンダーライン部分はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位（ａａｇｃｔｔ）及びＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位（ｇａａｔｔｃ）である。
【００３８】
上記で選んだプラスミド（５．０μｇ）は、制限酵素、Ｎｒｕ  Ｉにより消化した後、前述のようにアガロースゲル電気泳動に供与し、精製し、最終的に５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解して保存した。
【００３９】
第３実施例
１．ＤＮＡ鎖の設計
まず、配列表の配列番号１１にヒトＨｓｐ１０の塩基配列を示す。このヒトＨｓｐ１０タンパク質翻訳領域は、１番目のａから３０６番目のｃまででコードされる。また、１番目からのａｇｔは開始コドンであり、３０７番目からのｔｇａは終止コドンである。この配列番号１１に示すヒトＨｓｐ１０の塩基配列をもとに、ヒトＨｓｐ１０をコードする遺伝子の蛋白質翻訳開始コドン（配列番号１１の１番目からのａｔｇ）から始めるセンス鎖の配列の一部である配列表の配列番号１２〜１５の４つの単鎖ＤＮＡ（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ４とする）と、配列番号１６〜１９（Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４とする）のヒトＨｓｐ１０をコードする遺伝子のアンチセンス鎖の一部である４つの単鎖ＤＮＡ、計８つをＤＮＡ合成機により作製した。配列番号１２のＳ１鎖の３’側の２０塩基と配列番号１６のＡ１鎖の３’側２０塩基は相補的な配列となっている。また、配列表１３のＳ２鎖と配列番号１７のＡ２鎖、配列番号１４のＳ３鎖と配列番号１８のＡ３鎖、配列番号１５のＳ４鎖と配列番号１９のＡ４鎖についても同様に、対となるセンス鎖の３’側とアンチセンス鎖の３’側の２０塩基が相補的な配列となっている。
【００４０】
２．二重鎖ＤＮＡのＢＢＳプラスミドへのクローニング
上記Ｓ１鎖およびその対となるＡ１鎖を３００ｐｍｏｌと、４μｌの０．１Ｍ酢酸マグネシュウム、０．６６Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭＤＤＴ、０．１％  ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む０．３３Ｍ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）緩衝液、４ユニットのＴ４ポリメラーゼ、それぞれ５ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加えた、計４０μｌの反応液中で３７℃、２０分間反応させ、続いて、６５℃で３０分間処理した。この４０μｌのＤＮＡ溶液に４μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を加えた後、終濃度７０％になるようにエチルアルコールを加え、マイナス８０℃冷凍庫で凍らせた。２０分後、冷凍庫から取り出し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿をロータリーエパポレターにて乾燥させた。
【００４１】
次に、乾燥した沈殿を３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。このうち１０μｌをとり、これに２μｌの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０ｎｍｏｌのＡＴＰを加え、純水で計２０μｌにし、３７℃、１時間反応させ、ＤＮＡ鎖の５’側をリン酸化した。このリン酸化されたＤＮＡ溶液９μｌと第１実施例で作成したＳｍａ  Ｉにより消化済みＢＢＳプラスミドを１μｌを混合し、これにライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ液を１０μｌ加え、１６℃で１時間、反応させた。
【００４２】
コンピテントセル、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌１００μｌを１．５ｍｌ容積のチューブに用意し、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを３．５μｌ加え、１０分間、氷上で時々振り、１６℃で反応させた反応混液を５μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢを加え、３７℃で１時間培養した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（直径８．５ｃｍ、寒天培地量２５ｍｌ）に１００ｍＭ  ＩＰＴＧを５０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−Ｉインドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトシド、ジメチルホルムアミドに溶解）を塗布し、これに前述の菌液を接種し、３７℃で１８時間、保温した。生じた大腸菌コロニーの内、白いコロニー数個を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間、培養し、この培養液を、９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。この菌体からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによりプラスミドを調製した。
【００４３】
上記で得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムジャパン株式会社製）によりその塩基配列を調べ、ＢＢＳプラスミドのＳｍａ  Ｉ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列、つまり、アンダーラインで示すＢｂｓ  Ｉ制限酵素認識部位（５’側のｇａａｇａｃと３’側のｇｔｃｔｔｃ）に囲まれた配列が以下のようになるものを選び、プラスミドＨ１０−１とした。また、下記において、ベクターと挿入ＤＮＡと境界を空欄で示している。
Ｓ１鎖とＡ１鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号２０）
５’  ｇａａｇａｃｃｃ  ａｔｇｇｃａｇｇａｃａａｇｃｇｔｔｔａｇａａａｇｔｔｔｃｔｔｃｃａｃｔｃｔｔｔｇａｃｃｇａｇｔａｔｔｇｇｔｔｇａａａｇｇａｇｔｇｃｔｇｃｔｇａａａｃｔｇｔａａｃｃａａａｇｇａｇｇｃａｔｔａｔｇｃｔｔ  ｇｇｇｔｃｔｔｃ  ３’
【００４４】
同様にＳ２鎖とＡ２鎖、Ｓ３鎖とＡ３鎖、Ｓ４鎖とＡ４鎖からなる二重鎖ＤＮＡもＢＢＳプラスミドにクローニングし、Ｓｍａ  Ｉ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列を持つプラスミド、それぞれ、プラスミドＨ１０−２、Ｈ１０−３、Ｈ１０−４を選んだ。このときのＢｂｓ  Ｉ制限酵素切断部位（アンダーラインで示す５’側のｇａａｇａｃと３’側のｇｔｃｔｔｃ）に囲まれた塩基配列は、以下の通りである。また、下記においてベクターと挿入ＤＮＡとの境界を空欄で示した。
【００４５】
Ｓ２鎖とＡ２鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号２１）
５’  ｇａａｇａｃｃｃ  ｇｃｔｔｃｃａｇａａａａａｔｃｔｃａａｇｇａａａａｇｔａｔｔｇｃａａｇｃａａｃａｇｔａｇｔｃｇｃｔｇｔｔｇｇａｔｃｇｇｇｔｔｃｔａａａｇｇａａａｇｇ  ｇｔｇｇａｇａｇａｔｔｃａａｃｃａｇｔｔ  ｇｇｇｔｃｔｔｃ  ３’
Ｓ３鎖とＡ３鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号２２）
５’  ｇａａｇａｃｃｃ  ａｇｔｔａｇｃｇｔｇａａａｇｔｔｇｇａｇａｔａａａｇｔｔｃｔｔｃｔｃｃｃａｇａａｔａｔｇｇａｇｇｃａｃｃａａａｇｔａｇｔｔｃｔａｇａｔｇａｃａａｇｇ  ａｔｔａｔｔｔｃｃｔａｔｔｔａｇａｇａ  ｇｇｇｔｃｔｔｃ  ３’
Ｓ４鎖とＡ４鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号２３）
５’  ｇａａｇａｃｃｃ  ｇａｇａｔｇｇｔｇａｃａｔｔｃｔｔｇｇａａａｇｔａｃｇｔａｇａｃｔｇａａａｔａａｇｔｃａｃｔａｔｔｇａａａｔｇｇｃａｔｃａａｃａｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｃａｔｔｃｃａｃｔｇａａｇｔｔｃｔｇａ  ｇｇｇｔｃｔｔｃ  ３’
【００４６】
３．ＤＮＡ断片の切りだし
プラスミドＨ１０−１、４０μｇを２０ｕｎｉｔｓ／μｌの制限酵素Ｂｂｓ  Ｉを含む、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）の緩衝液中、３７℃で一夜反応させ、消化した。消化プラスミドＤＮＡは０．７％のアガロースゲル電気泳動に供与した。分離した約１００ｂｐのＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、ＱｉａｑｕｉｃｋＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製し、３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、Ｈ１０−１断片として保存した。同様にプラスミドＨ１０−２、Ｈ１０−３、Ｈ１０−４からＨ１０−２、Ｈ１０−３、Ｈ１０−４断片を調製した。
【００４７】
４．ＤＮＡ断片の連結
調製したＨ１０−１断片とＨ１０−２断片をそれぞれ６μｌずつと、ライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ液（宝酒造株式会社製）を６μｌ加え、室温で２時間、反応させ、これを混合液１とした。調製したＨ１０−３断片とＨ１０−４断片も同様にライゲーションさせ、混合液２とした。次に混合液１と２をそれぞれ６μｌずつと、ライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ液を６μｌ加え、室温で２時間３０分反応させた。これを混合液３とした。
【００４８】
５．再クローニング用プラスミドベクターの作製
混合液３中の約４００ｂｐのＤＮＡ鎖を再クローニングするために、以下の２種類の化学合成ＤＮＡ鎖を用い、ＢＢＳプラスミドから後述のＢＢＴプラスミドを作製した。
５’  ａｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｔｇａａｇｔｔｃｔｇａ  ３’（配列表の配列番号２４）
５’  ｔｃａｇａａｃｔｔｃａｇｇａｔｃｃｔｇｃｃａｔ  ５’（配列表の配列番号２５）
【００４９】
上記の２３塩基よりなる２種類のＤＮＡ鎖をＤＮＡ合成機により作製し、それぞれのＤＮＡ鎖を１００ｐｍｏｌと、２μｌの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  （ｐＨ７．６）、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０ｎｍｏｌのＡＴＰを加え、純水で計２０μｌにし、３７℃で１時間反応させ、ＤＮＡ鎖の５’側をリン酸化した。その後、この反応液を６５℃で５分間加熱した後、室温に３０分放置した。このリン酸化されたＤＮＡ溶液４μｌと実施例１で作成したＢＢＳプラスミド（Ｓｍａ  Ｉにより消化済み）を１μｌを混合し、これにライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ液を５μｌ加え、１６℃で２時間、反応させた。
【００５０】
コンピテントセル、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌１００μｌを１．５ｍｌ容積のチューブに用意し、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを３．５μｌ加え、１０分間、氷上で時々振り、１６℃で反応させた反応混液を５μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢを加え、３７℃で１時間培養した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート（直径８．５ｃｍ、寒天培地量２５ｍｌ）に１００ｍＭ  ＩＰＴＧを５０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを塗布し、これに前述の菌液を接種し、３７℃で１８時間、保温した。生じた大腸菌コロニーの内、白いコロニー数個を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間、培養し、この培養液を、９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。この菌体からＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔによりプラスミドを調製した。
【００５１】
上記で得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べ、ＢＢＳプラスミドのＳｍａ  Ｉ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列、つまり、アンダーラインで示すＢｂｓ  Ｉ制限酵素切断部位（５’側のｇａａｇａｃと３’側のｇｔｃｔｔｃ）に囲まれた配列が以下のようになるものを選び、このプラスミドをＢＢＴプラスミドとした。また、ベクターと挿入ＤＮＡと境界は空欄で示している。
５’  ｇａａｇａｃｃｃ  ａｔｇｇｃａｇｇａｔｃｃｔｇａａｇｔｔｃｔｇａ  ｇｇｇｔｃｔｔｃ  ３’（配列表の配列番号２６）
【００５２】
次に、上記ＢＢＴプラスミド、５．０μｇを制限酵素Ｂｂｓ  Ｉにより消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離・精製し、５０μｌＴＥ緩衝液に溶解した。ＢＢＴプラスミドは、アンダーラインで示すＢｂｓ  Ｉ制限酵素切断部位（５’側のｇａａｇａｃと３’側のｇｔｃｔｔｃ）に囲まれた配列が以下のように切断され、突出末端が生じている。尚、下記反応の詳細は、図３を参照されたい。
５’    ｇａａｇａｃｃｃ（切断）ｃｔｇａｇｇｇｔｃｔｔｃ  ３’
３’    ｃｔｔｃｔｇｇｇｔａｃｃ（切断）ｃｃｃａｇａａｇ  ５’
【００５３】
６．連結ＤＮＡの再クローニング
作製したＢＢＴプラスミド（Ｂｂｓ  Ｉにより消化済み）を１μｌ、４つのＤＮＡ断片を連結させた混合液３を４μｌ、これにライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ液を５μｌ加え、１６℃で２時間、反応させた。この反応液にてＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌１００μｌを形質転換させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにコロニーを生じせしめ、このコロニーの内、１０個を任意に選び、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間、培養し、この培養液からプラスミドを調製した。得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べたところ、全てのプラスミドが配列表の配列番号２７に示すように、Ｂｂｓ  Ｉ制限酵素部位（配列番号２７の５’側のｇａａｇａｃと３’側のｇｔｃｔｔｃ）に囲まれた配列に、Ｈｓｐ１０の遺伝子配列を持つものであった。
【００５４】
また、本実施例においてＤＮＡ鎖を連結した産物を、アガロースゲル電気泳動により分析したものを図４に示した。レーン１は、分子量マーカで、ラムダファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＴ１４で消化したものである。レーン２も、分子量マーカで、図４に示すバンドの上から、７００、５２５、５００、４００、３００、２００、１００、５０塩基対のＤＮＡを示す。また、レーン３は、Ｓ１鎖及びＡ１鎖から成るＤＮＡ断片、Ｈ１０−１である。また、レーン４は、Ｈ１０−１断片と、Ｓ２鎖及びＡ２鎖から成るＨ１０−２断片をライゲーションした混合液１で、レーン５は、Ｓ３鎖及びＡ３鎖から成るＨ１０−３断片と、Ｓ４鎖及びＡ４鎖から成るＨ１０−４片をライゲーションした混合液２である。また、レーン６は、混合液２とＨ１０−１断片をライゲーションしたもので、レーン７は、混合液１と混合液２をライゲーションした混合液３である。この分析結果によれば、各ＤＮＡ断片が効率よく結合され、Ｈ１０−１、Ｈ１０−２、Ｈ１０−３、Ｈ１０−４断片の４断片の連結でも副産物が少なく、効率良く連結されていることがわかる。
【００５５】
第４実施例
１．ＤＮＡ鎖の設計
ヒトＨｓｐ７０遺伝子のＤＮＡプローブを作製するために、配列表の配列番号２８に示すヒトＨｓｐ７０遺伝子塩基配列をもとに配列表の配列番号２９〜３１に示すセンス鎖、Ｓ２１、Ｓ２２、Ｓ２３及び配列番号３２〜３４に示すアンチセンス鎖、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３をＤＮＡ合成機により作製した。尚、ヒトＨｓｐ７０のタンパク質翻訳領域は、１番目からのａｔｇの開始コドンから始まるものである。また、配列番号２８に示す塩基配列は、ヒトＨｓｐ７０蛋白質のＮ末から１００アミノ酸残基をコードする配列である。
【００５６】
２．二重鎖ＤＮＡのＢＳＡプラスミドへのクローニング
Ｓ２１鎖およびその対となるＡ２１鎖を３００ｐｍｏｌと、４μｌの０．１Ｍ酢酸マグネシュウム、０．６６Ｍ酢酸カリウム、５ｍＭＤＤＴ、０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む０．３３Ｍ  Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）緩衝液、４ユニットのＴ４ポリメラーゼ、それぞれ５ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰを加えた、計４０μｌの反応液中で３７℃、２０分間反応させ、続いて、６５℃で３０分間処理した。この４０μｌのＤＮＡ溶液をエタノール沈殿させ、この沈殿を３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００５７】
このうち１０μｌをとり、これに２μｌの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０ｎｍｏｌのＡＴＰを加え、純水で計２０μｌにし、３７℃で１時間反応させ、ＤＮＡ鎖の５’側をリン酸化した。このリン酸化されたＤＮＡ溶液９μｌと第２実施例で作製したＮｒｕ  Ｉにより消化済みＢＳＡプラスミドを１μｌ混合し、ライゲーションさせ、これを用いてＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌を形質転換させ、この菌液を、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天プレートに接種し、生じた大腸菌コロニーの内、白いコロニー数個を、培養し、この菌体からプラスミドを調製した。
【００５８】
上記で得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べ、ＢＳＡプラスミドのＮｒｕ  Ｉ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列、つまり、アンダーラインで示すＢｓａ  Ｉ制限酵素認識部位（５’側のｇｇｔｃｔｃと３’側のｇａｇａｃｃ）に囲まれた塩基配列が以下のようになるものを選び、プラスミドＨ７０−Ｐ１とした。ベクターと挿入ＤＮＡと境界は空欄で示している。
プラスミドＨ７０−Ｐ１
Ｓ２１鎖とＡ２１鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号３５）
５’  ｇｇｔｃｔｃｇ  ａｔｇｇｃｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｃｇａｔｃｇｇｃａｔｃｇａｃｃｔｇｇｇｃａｃｃａｃｃｔａｃｔｃｃｔｇｃｇｔｇｇｇｇｇｔｇｔｔｃｃａａｃａｃｇｇｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａｔｃｇｃｃａａｃｇ  ｃｇａｇａｃｃｃｔｃｇ  ３’
【００５９】
同様にＳ２２鎖とＡ２２鎖、Ｓ２３鎖とＡ２３鎖からなる二重鎖ＤＮＡもＢＳＡプラスミドにクローニングし、Ｎｒｕ  Ｉ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列を持つプラスミド、プラスミドＨ７０−Ｐ２、Ｈ７０−Ｐ３をそれぞれ選んだ。このときのＢｓａ  Ｉ制限酵素切断部位（アンダーラインで示す５’側のｇｇｔｃｔｃと３’側のｇａｇａｃｃ）に囲まれた塩基配列は以下の通りである。
プラスミドＨ７０−Ｐ２
Ｓ２２鎖とＡ２２鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号３６）
５’  ｇｇｔｃｔｃｇ  ａａｃｇａｃｃａｇｇｇｃａａｃｃｇｃａｃｃａｃｃｃｃｃａｇｃｔａｃｇｔｇｇｃｃｔｔｃａｃｇｇａｃａｃｃｇａｇｃｇｇｃｔｃａｔｃｇｇｇｇａｔｇｃｇｇｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｇｃｇｃｔｇａａｃｃｃｇｃａｇａａ  ｃｇａｇａｃｃ  ３’
プラスミドＨ７０−Ｐ３
Ｓ２３鎖とＡ２３鎖を用いて作製された配列（配列表の配列番号３７）
５’  ｇｇｔｃｔｃｇ  ａｇａａｃａｃｃｇｔｇｔｔｔｇａｃｇｃｇａａｇｃｇｇｃｔｇａｔｃｇｇｃｃｇｃａａｇｔｔｃｇｇｃｇａｃｃｃｇｇｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｇｇａｃａｔｇａａｇｃａｃｔｇｇｃｃｔｔｔｃｃａｇｇｔｇａｔｃａａｃｇａｃｇｇａｇａｃａａｇ  ｃｇａｇａｃｃ  ３’
【００６０】
３．ＤＮＡ断片の切りだし
上記２．で作製したプラスミドＨ７０−Ｐ１、４０μｇを２０ｕｎｉｔｓ／μｌの制限酵素Ｂｓａ  Ｉを含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＤＴＴ  （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）の緩衝液中、３７℃で一夜反応させ、消化した。消化プラスミドＤＮＡは０．７％のアガロースゲル電気泳動に供与した。分離した約１００ｂｐのＤＮＡのバンドを切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製し、３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、Ｈ７０−Ｐ１断片として保存した。同様の方法で、プラスミドＨ７０−Ｐ２、Ｈ７０−Ｐ３からＨ７０−Ｐ２、Ｈ７０−Ｐ３断片を調製した。
【００６１】
４．ＤＮＡ断片の連結
上記３．で調製したＨ７０−Ｐ１断片とＨ７０−Ｐ２断片をそれぞれ６μｌずつと、ライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ  液（宝酒造株式会社製）を６μｌ加え、室温で２時間、反応させ、これを混合液Ｐ１とした。次に１８μｌの混合液Ｐ１にＨ７０−Ｐ３断片とライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ  液を６  μｌずつ加え、室温で２時間３０分反応させた。これを混合液Ｐ２とした。
【００６２】
５．再クローニング用プラスミドベクターの作製
以下に記載する２２塩基よりなる２種類のＤＮＡ鎖をＤＮＡ合成機により作製した。
５’  ａｔｇｇｃｃａａａｇｇａｃｇｇａｇａｃａａｇ    ３’（配列表の配列番号３８）
５’  ｃｔｔｇｔｃｔｃｃｇｔｃｃｔｔｔｇｇｃｃａｔ    ３’（配列表の配列番号３９）
【００６３】
上記のそれぞれのＤＮＡ鎖を１００ｐｍｏｌと、２μｌの０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２を含む０．６６Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．６）、１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０ｎｍｏｌのＡＴＰを加え、純水で計２０μｌにし、３７℃で１時間反応させ、ＤＮＡ鎖の５’側をリン酸化した。その後、この反応液を６５℃で５分間加熱した後、室温に３０分放置した。このリン酸化されたＤＮＡ溶液４μｌとＮｒｕ  Ｉ消化ＢＳＡプラスミドを１μｌを混合し、これにライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｉ  液を５μｌ加え、１６℃で２時間、反応させた。これを用い、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌を形質転換させ、アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で１８時間、保温した。生じた大腸菌コロニーの内、白いコロニー数個を培養し、プラスミドを調製した。
【００６４】
上記で得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べ、ＢＳＡプラスミドのＮｒｕＩ切断部位に正しくＤＮＡ鎖が挿入された配列、つまり、アンダーラインで示すＢｓａ  Ｉ制限酵素切断部位（５’側のｇｇｔｃｔｃと３’側のｇａｇａｃｃ）に囲まれた塩基配列が以下のようになるものを選び、このプラスミドをＢＳＴプラスミドとした。また、ベクターと挿入ＤＮＡと境界は空欄で示している。５’  ｇｇｔｃｔｃｇ  ａｔｇｇｃｃａａａｇｇａｃｇｇａｇａｃａａｇ  ｃｇａｇａｃｃ  ３’（配列表の配列番号４０）
【００６５】
次に、上記ＢＳＴプラスミド、５．０μｇを制限酵素Ｂｓａ  Ｉにより消化した後、アガロースゲル電気泳動により分離・精製し、５０μｌＴＥ緩衝液に溶解した。ＢＳＴプラスミドは、アンダーラインで示すＢｓａ  Ｉ制限酵素切断部位（５’側のｇｇｔｃｔｃと３’側のｇａｇａｃｃ）に囲まれた塩基配列が以下のように切断され、突出末端が生じている。５’    ｇｇｔｃｔｃｇ    （切断）ｃａａｇｃｇａｇａｃｃ  ３’
３’    ｃｃａｇａｇｃｔａｃｃ  （切断）  ｇｃｔｃｔｇｇ  ５’
【００６６】
６．連結ＤＮＡの再クローニング
上記５．で作製したＢＳＴプラスミド（Ｂｓａ  Ｉにより消化済み）を１μｌ、３つのＤＮＡ断片を連結させた混合液Ｐ２を４μｌ、これにライゲーション試薬ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔＩ  液を５μｌ加え、１６℃で２時間、反応させた。この反応液にてＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌を形質転換させ、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにコロニーを生じせしめ、このコロニーの内、数個を任意に選び、培養し、この培養液からプラスミドを調製した。得られたプラスミドについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりその塩基配列を調べたところ、全てのプラスミドが配列表の配列番号４１に示すように、Ｂｓａ  Ｉ制限酵素部位（配列番号４１の５’側のｇｇｔｃｔｃｇと３’側のｃａａｇｃｇａｇａｃｃ）に囲まれた配列に、配列表の配列番号２８に示すヒトＨｓｐ７０遺伝子、１番目から３００番目の配列を持つものであった。
【００６７】
【発明の効果】
本発明は上述の如く構成したものであり、ＤＮＡ断片あるいは化学合成等で作製されるＤＮＡ鎖を効率よく連結し、遺伝子をコードするなど、産業上有用なＤＮＡ鎖の合成が可能となる。まず、ゲノム、ｍＲＮＡ等、遺伝子ライブラリーのソースがなくても、塩基配列の情報のみで目的の遺伝子を作製することができる。また、入手が困難なタンパク質等でも、塩基配列の情報のみで作製することができるし、塩基配列を発現に適したコドンにすることもできる。また、塩基配列を任意に選択することにより、自然界に存在しない遺伝子を作製することができるとともに、一塩基のみ或いは数塩基のもの等、人工的な変異を任意に作り出すことが可能となる。
【００６８】
また、従来はＤＮＡ断片を２つずつしか連結できなかったが、本発明のＤＮＡ鎖の連結方法では、一度のクローニング操作で３つ以上のＤＮＡ断片を連結することができ、形質転換、プラスミド調製のステップを大幅に削減することができ、ＤＮＡ鎖の作製日数を短縮することができる。また、本発明のクローニングベクターを用いることにより、ＤＮＡ断片に内在する制限酵素切断部位を利用せずに、ＤＮＡ断片をベクターにクローニングできる。また、ＰＣＲを用いた方法に比べ、塩基配列の誤り、即ち変異が起こる確率が極めて小さいものとなる。また、本発明のＤＮＡのクローニング方法では、化学合成ＤＮＡ鎖の塩基配列の誤りを修正でき、塩基配列の誤りが少なく精度の高いＤＮＡを効率的に得ることができる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による、ＤＮＡ鎖を認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素部位をクローニング部位の両脇に配置したベクターにクローニングし（図１−あ）、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素にてベクターと挿入ＤＮＡ鎖の境界または挿入ＤＮＡ鎖内部を切断し特異的な粘着末端を生じせしめ（図１−い）、得られた特異的な粘着末端を持つＤＮＡ鎖を連結し（図１−う）、連結したＤＮＡ鎖の両端の特異的な粘着末端に相補する粘着末端を持つベクターで再クローニングする方法を示す概念図。図１において、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｕ、Ｖ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、ＫはＤＮＡ鎖の塩基を示す。ＸとＹ、ＷとＺ、ＵとＶ、ＥとＦ、ＰとＱ、ＲとＫは相補的な塩基である。ＲＲＲＲＲＲは認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素の認識配列を示す。５’  ＲＲＲＲＲＲＮ        ＮＫＫＫＫＫＫ    ３’は、ベクターのクローニング部位である、また、ここでのＮとＮの間のような空欄はそこでＤＮＡ鎖が切られていることを示す。図のＸ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｕ、Ｖ、Ｅ、Ｆ、Ｐ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、Ｋの個数は一例であり、図１での数に限定されるものではない。図１−いの塩基配列上にかかれた実線は、制限酵素による切断部位を示す。
【図２】あらかじめ設定した特異的な粘着末端を生じせしめるためのベクターのクローニング部位の配列を示す概念図。図２において、Ｎ、Ｒ、ＫはＤＮＡ鎖の塩基を示す。
ＲとＫは相補的な塩基である。Ａで示される領域は平滑末端を生じる制限酵素認識部位、Ｂで示される領域は認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素認識部位を示す。５’  ＲＲＲＲＲＲＮ        ＮＫＫＫＫＫＫ    ３’は、ベクターのクローニング部位である、また、ここでのＮとＮの間のような空欄はそこでＤＮＡ鎖が切られていることを示す。図２のＮ、Ｒ、Ｋの個数は一例であり、図２での数に限定されるものではない。
【図３】連結したＤＮＡ鎖を再クローニングするベクターの作製法を示す概念図。連結したＤＮＡ鎖末端部分の配列を両端部分に持つＤＮＡ鎖をクローニングし、認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素で切断時に、連結したＤＮＡ鎖の末端部分の配列に相補的となる粘着末端を生じるようにする。このベクターにより、連結したＤＮＡ鎖を再クローニングできる。図において、Ｘ、Ｙ、Ｐ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、ＫはＤＮＡ鎖の塩基を示す。ＸとＹ、ＰとＱ、ＥとＦ、ＲとＫは相補的な塩基である。ＲＲＲＲＲＲは認識塩基配列とは異なる切断部位を持つ制限酵素の認識配列を示す。５’  ＲＲＲＲＲＲＮ      ＮＫＫＫＫＫＫ    ３’は、ベクターのクローニング部位である、また、ここでのＮとＮの間のような空欄はそこでＤＮＡ鎖が切られていることを示す。図３のＸ、Ｙ、Ｐ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｎ、Ｒ、Ｋの個数は一例であり、図３での数に限定されるものではない。
【図４】第３実施例で調製されたＤＮＡ断片を用いて、ＤＮＡ鎖を連結した産物をアガロースゲル電気泳動により分析したもの。各ＤＮＡ断片が効率よく結合され、Ｈ１０−１、Ｈ１０−２、Ｈ１０−３、Ｈ１０−４断片の４断片の連結でも副産物が少なく、効率よく連結されていることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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