(57)【要約】【課題】ヒト自己抗体に対する直鎖状エピトープを形成するペプチドを提供すること。【解決手段】本発明は、あらかじめ特定の免疫原にさらされた個体、あるいは、Ｒｏ／ＳＳＡ、Ｌａ／ＳＳＢ、ｎＲＮＰまたはＳｍＢ／Ｂ’ポリペプチドあるいは自己抗体の産生を誘因するエピトープ（またはそれらの免疫等価物）と反応性の自己抗体を発現する個体を同定および分類するための付加的な診断薬を提供する。本発明はさらに、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン症候群）を同定および治療するための方法および組成物を提供する。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかの群から選択される、ヒト自己抗体に対する直鎖状エピトープを形成するペプチド：
（ｉ）４０より少ないアミノ酸のペプチドの群であって、該エピトープの配列が以下からなる群より選択される列挙されたアミノ酸配列のアミノ末端のアミノ酸で始まる、ペプチドの群：
Ｌａ／ＳＳＢエピトープ：
ＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦＮＬＰＲＤＫＦＬＫ　（配列番号２０），
ＹＦＧＤＦＮＬＰ　（配列番号２０のアミノ酸８位〜１５位），
ＷＶＰＬＥＩＭＩＫＦＮＲ　（配列番号２１），
ＶＰＬＥＩＭＩＫ　（配列番号２１のアミノ酸２位〜９位），
ＮＲＬＮＲＬＴＴＤＦＮＶＩＶＥ，　（配列番号２３），
ＮＲＬＮＲＬＴＴ　（配列番号２３のアミノ酸１位〜８位），
ＴＤＦＮＶＩＶＥ　（配列番号３０），
ＤＦＮＶＩＶＥＡ　（配列番号３０のアミノ酸２位〜９位），
ＫＴＫＩＲＲＳＰＳＫＰＬ　（配列番号２２），
ＫＩＲＲＳＰＳＫ　（配列番号２２のアミノ酸４位〜１１位），
ＹＫＮＤＶＫＮＲＳＶＹＩＫＧＦＰＴ　（配列番号２９），
ＳＶＹＩＫＧＦＰ　（配列番号２９のアミノ酸９位〜１６位），
ＱＶＬＮＩＱＭＲＲＴＬＨＫＡＦＫＧＳ　（配列番号１９），
ＮＩＱＭＲＲＴＬＨＫＡＦＫ　（配列番号１９のアミノ酸４位〜１６位），
ＲＴＬＨＫＡＦＫ　（配列番号１９のアミノ酸９位〜１６位），
ＩＦＶＶＦＤＳＩＥ　（配列番号２７），
ＦＶＶＦＤＳＩＥ　（配列番号２７のアミノ酸２位〜９位），
ＫＥＴＤＬＬＩＬＦＫＤＤＹＦＡ　（配列番号２８），
ＩＬＦＫＤＤＹＦ　（配列番号２８のアミノ酸７位〜１４位），
ＫＶＥＡＫＬＲＡＫＱ　（配列番号３６），
ＥＡＫＬＲＡＫＱ　（配列番号３６のアミノ酸３位〜１０位）；
ＣＬＬＫＦＳＧＤ　（配列番号３４），
ＲＥＤＬＨＩＬＦ　（配列番号３３），
ＧＥＩＫＷＩＤＦＶＲＧＡＫ　（配列番号２４），
ＫＷＩＤＦＶＲＧＡＫ　（配列番号２４のアミノ酸４位〜１３位），
ＩＤＦＶＲＧＡＫ　（配列番号２４のアミノ酸６位〜１３位），
ＥＧＩＩＬＦＫＥＫＡＫ　（配列番号３１），
ＥＧＩＩＬＦＫＥ　（配列番号３１のアミノ酸１位〜８位），
ＧＮＬＱＬＲＮＫＥＶＴＷ　（配列番号２６），
ＬＲＮＫＥＶＴＷ　（配列番号２６のアミノ酸５位〜１２位），
ＳＬＮＫＷＫＳＫＧＲＲＦＫＧＫＧＫＧＮＫ　（配列番号２５），
ＫＳＫＧＲＲＦＫ　（配列番号２５のアミノ酸６位〜１３位），
ＫＶＱＦＱＧＫＫＴＫＦＡＳＤ　（配列番号３２），
ＫＫＴＫＦＡＳＤ　（配列番号３２のアミノ酸７位〜１４位），および
ＴＧＰＶＫＲＡＲ　（配列番号３５）；
Ｒｏ／ＳＳＡエピトープ：
ＭＮＲＬＨＲＦＬ　（配列番号３７），
ＬＣＦＧＳＥＧＧＴ　（配列番号３８），
ＣＦＧＳＥＧＧＴ　（配列番号３８のアミノ酸２位〜９位），
ＳＥＧＧＴＹＹＩＫＥＱ　（配列番号３９），
ＥＧＧＴＹＹＩＫＥＱ　（配列番号３９のアミノ酸２位〜１１位），
ＧＴＹＹＩＫＥＱ　（配列番号３９のアミノ酸４位〜１１位），
ＧＴＹＹＩ　（配列番号３９のアミノ酸４位〜８位），
ＥＩＫＳＦＳＱＥＧＲＴ　（配列番号４０），
ＫＳＦＳＱＥＧＲ　（配列番号４０のアミノ酸３位〜１０位），
ＳＱＥＧＲＴＴＫＱ　（配列番号４１），
ＧＲＴＴＫＱＥＰＭ　（配列番号４２），
ＳＴＫＱＡＡＦＫＡＶ　（配列番号４３のアミノ酸２位〜１１位），
ＩＳＴＫＱＡＡＦＫＡＶＳ　（配列番号４３），
ＫＱＡＡＦＫＡＶ　（配列番号４３のアミノ酸４位〜１１位），
ＡＦＫＡＶＳＥＶＣ　（配列番号４４），
ＦＴＦＩＱＦＫＫＤＬＫＥＳＭＫ　（配列番号４５），
ＱＦＫＫＤＬＫＥ　（配列番号４５のアミノ酸５位〜１２位），
ＳＭＫＣＧＭＷＧＲＡ　（配列番号４６），
ＭＫＣＧＭＷＧＲＡ　（配列番号４６のアミノ酸２位〜１０位），
ＧＭＷＧＲＡＬＲＫＡＩＡ　（配列番号４７），
ＧＲＡＬＲＫＡＩ　（配列番号４７のアミノ酸４位〜１１位），
ＡＬＡＶＴＫＹＫＱＲＮＧＷＳＨＫＤＬＬＲＬＳＨ　（配列番号４８），
ＴＫＹＫＱＲＮＧ　（配列番号４８のアミノ酸５位〜１２位），
ＱＲＮＧＷＳＨＫ　（配列番号４８のアミノ酸９位〜１６位），
ＬＬＲＬＳＨＬＫＰＳＳ　（配列番号４９），
ＲＬＳＨＬＫＰＳ　（配列番号４９のアミノ酸３位〜１０位），
ＴＫＹＩＴＫＧＷ　（配列番号７１のアミノ酸２位〜９位），
ＩＴＫＧＷＫＥＶ　（配列番号７１のアミノ酸５位〜１２位），
ＨＥＬＹＫＥＫＡ　（配列番号５０），
ＬＹＫＥＫＡＬＳＶ　（配列番号５１），
ＫＡＬＳＶＥＴＥＫＬＬＫＹＬ　（配列番号５２），
ＴＥＫＬＬＫＹＬ　（配列番号５２のアミノ酸７位〜１４位），
ＫＬＬＫＹＬＥＡ　（配列番号５３），
ＬＥＡＶＥＫＶＫＲＴＫＤＥ　（配列番号５４），
ＫＶＫＲＴＫＤＥ　（配列番号５４のアミノ酸６位〜１３位），
ＨＬＬＴＮＨＬＫＳＫＥＶＷＫＡＬＬＱＥＭＰＬ　（配列番号５５），
ＬＫＳＫＥＶＷＫ　（配列番号５５のアミノ酸７位〜１４位），
ＫＳＫＥＶＷＫＡ　（配列番号５５のアミノ酸８位〜１５位），
ＳＫＥＶＷＫ　（配列番号５５のアミノ酸９位〜１４位），
ＡＬＬＲＮＬＧＫＭＴＡ　（配列番号５６），
ＲＮＬＧＫＭＴ　（配列番号５６のアミノ酸４位〜１０位），
ＬＧＫＭＴＡＮＳ　（配列番号５７），
ＬＣＮＥＫＬＬＫＫＡＲＩＨＰＦＨＩ　（配列番号５８），
ＬＬＫＫＡＲＩ　（配列番号５８のアミノ酸６位〜１２位），
ＫＫＡＲＩＨＰＦ　（配列番号５８のアミノ酸８位〜１５位），
ＴＹＫＴＧＨＧＬＲＧＫＬＫＷＲＰＤＥ　（配列番号５９），
ＹＫＴＧＨＧＬ　（配列番号５９のアミノ酸２位〜８位），
ＡＬＤＡＡＦＹＫ　（配列番号６０），
ＡＡＦＹＫＴＦＫＴＶＥＰＴＧＫＲＦＬＬＡ　（配列番号６１），
ＡＳＭＮＱＲＶＬＧＳ　（配列番号６２），
ＥＰＴＧＫＲＦＬ　（配列番号６１のアミノ酸１１位〜１８位），
ＡＭＣＭＶＶＴＲ　（配列番号６３），
ＡＦＳＤＥＭＶＰ　（配列番号６４），
ＶＰＣＰＶＴＴＤ　（配列番号６５），
ＶＬＭＡＭＳＱＩ　（配列番号６６），
ＴＤＣＳＬＰＭＩ　（配列番号６７），
ＬＰＭＩＷＡＱＫＴＮＴＰＡ　（配列番号６８のアミノ酸３位〜１５位），
ＴＦＡＧＧＶＨＰＡＩ　（配列番号６９），
ＴＦＡＧＧＶＨＰ　（配列番号６９のアミノ酸１位〜８位），
ＩＡＬＲＥＹＲＫＫＭＤＩＰＡＫＬ　（配列番号７０），および
ＲＥＹＲＫＫＭＤ　（配列番号７０のアミノ酸４位〜１１位）；
７０ｋＤ　ｎＲＮＰエピトープ：
ＡＬＦＡＰＲＤＰ　（配列番号７２），
ＥＲＭＥＲＫＲＲ　（配列番号７３），
ＭＶＹＳＫＲＳＧ　（配列番号７４），
ＧＫＫＩＤＧＲＲ　（配列番号７５），
ＶＥＲＧＲＴＶＫ　（配列番号７６），
ＶＫＧＷＲＰＲＲ　（配列番号７７），
ＲＲＳＲＳＲＤＫ　（配列番号７８），
ＲＲＲＳＲＥＲＳ　（配列番号７９），
ＳＲＥＲＳＫＤＫ　（配列番号８０），
ＫＲＲＳＳＲＳＲ　（配列番号８１），および
ＲＲＳＨＲＳＥＲ　（配列番号８２）；
ｎＲＮＰ　Ａペプチドエピトープ：
ＬＮＥＫＩＫＫＤ　（配列番号８３），
ＫＫＤＥＬＫＫＳ　（配列番号８４），
ＳＲＳＬＫＭＲＧ　（配列番号８５），
ＰＦＹＤＫＰＭＲ　（配列番号８６），
ＩＩＡＫＭＫＧＴＦ　（配列番号８７），
ＤＲＫＲＥＫＲＫ　（配列番号８８），
ＱＥＴＰＡＴＫＫ　（配列番号８９），
ＡＬＱＧＦＫＩＴ　（配列番号９０），および
ＭＫＩＳＦＡＫＫ　（配列番号９１）；ならびに
ｎＲＮＰ　Ｃペプチドエピトープ：
ＲＫＨＫＥＮＶＫ　（配列番号９２），
ＫＤＹＹＱＫＷＭ　（配列番号９３），
ＡＦＱＱＧＫＩＰ　（配列番号９４），
ＫＩＰＰＴＰＦＳ　（配列番号９５），
ＰＰＰＰＳＬＰＧ　（配列番号９６），
ＳＬＰＧＰＰＲＰ　（配列番号９７），
ＰＰＲＰＧＭＭＰ　（配列番号９８），
ＰＰＰＰＧＭＭＰ　（配列番号９９），
ＧＰＡＰＧＭＲＰ　（配列番号１００），
ＰＰＭＭＲＰＰＡ　（配列番号１０１），および
ＰＧＭＴＲＰＤＲ　（配列番号１０２）
または
（ｉｉ）４個から２５個までのアミノ酸からなる、（ｉ）群に規定されたペプチドの群であって、
ただし、該ペプチドは、ＡＩＡＬＲＥＹＲＫＫＭＤＩＰＡ、ＶＨＰＡＩＡＬＲ、ＫＬＧＬＥＮ、ＫＤＬＫ、ＫＳＫＥ、ＬＴＡＬＬＲ、ＲＧＫＬＫＷ、ＬＫＡＬＤ、ＴＲＴＥＫＤＳ、ＤＥＭＶ、ＥＹＲＫＫＭＤ、ＡＡＡＭ、ＤＰＤＤ、ＬＳＨＬＫ、ＲＴＫＤＥ、ＥＫＤＳおよびＥＶＣＲからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを除き、そして該ペプチドは、ＭＡＶＰＥＴＲＰＮＨＴ、ＲＰＮＨＴＩＹＩＮＮＬＮＥＫＩＫＫＤＥＬＫＫＳＬＹＡＩＦＳＱＦ、ＳＱＦＧＱＩＬＤＩＬＶＳＲＳＬＫＭＲＧＱＡＦＶＩ、ＦＶＩＦＫＥＶＳＳＡＴＮＡＬＲＳＭＱＧＦＰＦ、ＧＦＰＦＹＤＫＰＭＲＩＱＹＡＫＴＤＳＤＩＩＡＫ、ＥＲＤＲＫＲＥＫＲＫＰＫＳＱＥＴＰＡＴＫＫＡＶＱＧＧＧＡＴＰＶＶＧ、ＴＰＶＶＧＡＶＱＧＰＶＰＧＭＰＰＭＴＱＡＰＲＩ、ＱＡＰＲＩＭＨＨＭＰＧＱＰＰＹＭＰＰ、ＹＭＰＰＰＧＭＩＰＰＰＧＬＡＰＧＱＩＰＰＧＡ、ＩＰＰＧＡＭＰＰＱＱＬＭＰＧＱＭＰＰＡＱＰＬＳＥＮＰ、ＥＮＰＰＮＨＩＬＦＬＴＮＬＰＥＥＴＮＥＬＭＬＳ、ＬＳＭＬＦＮＱＦＰＧＦＫＥＶＲＬＶＰＧＲＨＤＩＡＦＶＥＦおよびＡＧＡＡＲＤＡＬＱＧＦＫＩＴＱＮＮＡＭＫＩＳＦＡＫＫからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを除き、
そしてここで、４〜７個のアミノ酸からなるペプチドは、（ｉ）群においてエピトープの始まりの部分として規定されたアミノ酸配列内に含まれるペプチドである、ペプチドの群。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
（発明の背景）
本発明は、自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデスの予防、診断および治療の分野に属する。
【０００２】
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ＡＲ３９５７７、ＡＩ２４７１７、ＡＩ２１５６８、ＡＩ３１５８４およびＡＲ０１８４４、ならびにＶｅｔｅｒａｎ’ｓＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎからの援助により、米国政府が本発明の権利を有する。
【０００３】
【従来の技術】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己抗体が病因および病原において重要であると見い出されそして考えられる他の多くの疾患と類似している。ＳＬＥは、自己抗体を通常与える疾患に分類され得るが、それに対する自己抗体の主な役割は、臨床的発現に導く病原において、まだ充分に確立または理解されていない。このような他の疾患としては、シェーグレン症候群、リウマチ様関節炎、若年性糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウェーグナー肉芽腫症、炎症性腸疾患、およびその他多くの疾患が挙げられる。
【０００４】
代表的には、自己免疫疾患は、非常に多くの症状および臨床的徴候を示す。リボヌクレオプロテイン複合体（ＲＮＰ）に対する循環性自己抗体の産生は、ある種のリウマチ性自己免疫疾患に共通した特性である。ＳＬＥおよびそれと密接に関連した疾患において最も一般的な抗原としては、Ｒｏ／ＳＳＡ、Ｌａ／ＳＳＢ、ｎＲＮＰ、およびＳｍが挙げられる。最初、これらの抗体は、二重免疫拡散を用いて見い出されたが、つい最近、高感度固相アッセイが、自己抗体を定量するために開発された。
【０００５】
Ｒｏ／ＳＳＡ　ＲＮＡタンパク質粒子は、今日まで評価された全てのヒト細胞の構成要素であることが見い出された。シェーグレン症候群（ＳＳ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者の約半数が、抗Ｒｏ／ＳＳＡ沈降素を有する。亜急性皮膚エリテマトーデス患者またはＳＬＥに伴う補体成分Ｃ２欠損患者の約７５％が、抗Ｒｏ／ＳＳＡ沈降素を有する。新生児ループス皮膚炎（ｎｅｏｎａｔａｌｌｕｐｕｓ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）または完全先天性心臓ブロックにかかった新生児の母体の８０％を越える母体が、この自己抗体を有する。リウマチ様関節炎、多発筋炎、および進行性全身硬化症患者の５％程度が、抗Ｒｏ／ＳＳＡを有し、このことは、Ｒ．Ｍ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．　Ｍｅｄ．　２：１０５〜１２０（１９８４）；および、Ｊ．Ｂ．ＨａｒｌｅｙおよびＫ．Ｋ．Ｇａｉｔｈｅｒ、Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．　ＩｎＲｈｅｕｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｌｉｎｉｃｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ：　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ　１４：１，４３〜５６（１９８８）に報告されている。
【０００６】
Ｌａ／ＳＳＢリボヌクレオプロテイン抗原に対する自己抗体もまた、ＳＳおよびＳＬＥの患者に見い出され、このことは、Ａｌｓｐａｕｇｈら、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．　１９：２１６（１９７６）およびＭａｔｔｉｏｌｉら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．　１７：４２１（１９７４）に報告されている。さらに、Ｈｏｒｓｆａｌｌら、Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ　４：１６５（１９９１）によって報告されたこれらの抗体は、抗Ｌａ／ＳＳＢ自己抗体を有する特定の母体において妊娠の間胎児に対する病原となると考えられ、そこでは、抗Ｒｏ／ＳＳＡと共に完全先天性心臓ブロック（ＣＣＨＢ）に関連する。
【０００７】
全身性エリテマトーデスおよびそれに関連する疾患に見い出された多くの自己抗体が、抗原特異的応答を示すか、または、ポリクローナルな抗原非特異的応答を示すかについては、激しい議論の的であった。自己抗体がＳＬＥおよびそれに関連する症候群の発現に重要であるという証拠は納得のいくものである。心臓ブロックの新生児における特異的な減少（Ｈａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．　２８：１３２１〜１３２５（１９８５））およびヒトの皮膚における特異的な抗Ｒｏ／ＳＳＡ免疫グロブリンの沈着（Ｌｅｅ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　８３：１５５６〜１５６２（１９８９））が示されている。特定の濃度の抗Ｒｏ／ＳＳＡが、ループス腎炎に罹患した腎臓からの腎性溶出液の免疫グロブリンにおいて示された（Ｍａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．およびＲｅｉｃｈｌｉｎ，　Ｍ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．　２２：８５８〜８６３（１９７９）））。抗Ｒｏ／ＳＳＡは、シェーグレン症候群および原発性胆汁性肝硬変患者の耳化腺で特異的に濃縮されることが見い出された（Ｐｅｎｎｅｒ，Ｅ．およびＲｅｉｃｈｌｉｎ，　Ｍ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．　２５：１２５０〜１２５３（１９８２））。経胎盤的に獲得した母体のＩｇＧを有する乳児は、新生児ループス皮膚炎および／または完全先天性心臓ブロックが進行するという観察（Ｈａｒｌｅｙ，Ｊ．Ｂ．およびＧａｉｔｈｅｒ，　Ｋ．Ｋ．：　Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．　Ｉｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｌｉｎｉｃｓ　ｏｆ　ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ：　Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ　１４：１，　４３〜５６（１９８８））によって、胎盤を通じて運搬される母性自己抗体（抗Ｒｏ／ＳＳＡまたは抗Ｌａ／ＳＳＢ）が、これらの臨床課題に、十分ではないが必要な重要成分であることが強く示唆される。
【０００８】
タンパク質のＲｏ／ＳＳＡファミリーは、同定された抗原の分子量によって機能的に規定されるいくつかの分子形態を有することが示されている。主な形態は、６０キロダルトン（ｋＤ）の見かけ分子量を有する。このタンパク質は、４つのｈＹＲＮＡの１つと結合している。最近、抗Ｒｏ／ＳＳＡ血清と結合する２つの付加的なタンパク質が、Ｍ．Ｄ．　Ｒａｄｅｒら、Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１５５６〜１５６２（１９８９）により同定され、その分子量は５２ｋＤおよび５４ｋＤであった。４８ｋＤのタンパク質であるカルモジュリンは、抗Ｒｏ／ＳＳＡ血清と結合していることが同定された（ＭｃＣａｕｌｉｆｆｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　８５：１３７９〜１３９１（１９９０））。Ｊ．Ｃ．　ＣｈａｍｂｅｒｓおよびＪ．Ｄ．　Ｋｅｅｎｅ、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８２：２１１５〜２１１９（１９８５）に記載されたように、４８ｋＤのペプチドであるＬａ／ＳＳＢタンパク質はまた、このグループの自己抗体のメンバーであり、小ＲＮＡをポリウリジン末端に結合させる。このことは、Ｊ．Ｅ．Ｓｔｅｐｈａｎｏ，　Ｃｅｌｌ　３６：１４５〜１５４（１９８４）に報告されている。Ｌａ／ＳＳＢは、第三の抗Ｒｏ／ＳＳＡ沈降素陽性血清と結合する。Ｌａ／ＳＳＢタンパク質は、種々の組織源から精製され、そして４６〜５０ｋＤのモノマー性リンタンパク質であることが示され、このことは、Ｈａｂｅｔｓら、ＥＭＢＯＪ．　２：１６２５（１９８３）およびＶｅｎａｂｌｅｓら、Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　５４：７３１（１９８３）に報告されている。それは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物と結合し（このことは、Ｌｅｒｎｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　７６：５４９５（１９７９）およびＳｔｅｉｔｚら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＱｕａｎｔ．　Ｂｉｏｌ．　４７：８９３（１９８３）に報告される）、そしてこの酵素の終結因子として機能し得る（このことは、Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、ＥＭＢＯ　Ｊ．８：８４１（１９８９）に報告される）。核酸依存性ＡＴＰアーゼ／ｄＡＴＰアーゼ酵素活性はまた、Ｂａｃｈｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ　６０：８５（１９９０）によって、Ｌａ／ＳＳＢに起因するとされている。
【０００９】
抗Ｓｍ抗体はＳＬＥとしばしば関係している。これらの自己抗体は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４／Ｕ６、およびＵ５ＲＮＡを含むｓｎＲＮＰを沈降させる。これらの複合体は、スプライセオソームおよびスプライスヘテロ核ＲＮＡを形成し、このことは、Ｓｈａｒｐ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５：７６６（１９８７）、および、ＭａｎｉａｔｉｓおよびＲｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ　３２５：６７３（１９８７）に報告されている。抗Ｓｍ抗体は、以下の６種のポリペプチドの１つまたはその組み合わせを指向する：Ｂ（２６ｋＤａ）、Ｂ’（２７ｋＤａ）、Ｄ（１３ｋＤａ）、Ｅ／Ｆ（１１ｋＤａダブレット）、およびＧ（１０ｋＤａ未満）。
【００１０】
オクタロニー免疫拡散法で抗Ｓｍ沈降素を形成するリウマチ性疾患患者の殆ど全ては、抗ｎＲＮＰ沈降素を有するか、または最終的には発現する。このことは、Ｆｉｓｈｅｒら、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．　２８：１３４８（１９８５）に報告されている。抗Ｓｍおよび抗ｎＲＮＰ沈降素は、オクタロニー免疫拡散法において部分的に同一である沈降線を形成する。このことは、ＭａｔｔｉｏｌｉおよびＲｅｉｃｈｌｉｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ　１１０：１３１８（１９７３）で議論されている。この部分的に同じ抗原性の基礎は、Ｕ　ｓｎＲＮＰ粒子の組成により説明される。抗ｎＲＮＰ沈降素に対する抗原は、Ｕ１ｓｎＲＮＰに独特である７０ｋＤのＡおよびＣペプチドであり、Ｂ／Ｂ’およびＤペプチドはまたＵ１　ｓｎＲＮＰ上に見い出される。Ｂ／Ｂ’およびＤ　Ａｇは、７０ｋＤのＡまたはＣではなく、Ｕ２、Ｕ４／Ｕ６、およびＵ５ｓｎＲＮＰに見い出される。従って、抗Ｓｍおよび抗ｎＲＮＰの両方が、抗Ｕ１　ｓｎＲＮＰ活性を結合するが、抗ＳｍだけがＵ２、Ｕ４／Ｕ６、およびＵ５　ｓｎＲＮＰを結合する。
【００１１】
Ｊｏｈｎ　Ｂ．　Ｈａｒｌｅｙによる１９９１年１月３１日出願の米国出願第０７／６４８，２０５号「自己免疫疾患のアッセイおよび治療」、および１９９０年１月３１日出願の米国出願第０７／４７２，９４７号、発明の名称「自己免疫疾患のアッセイおよび治療」は、特定の疾患に特徴的な自己抗体産生の原因となる病因物質または抗原物質を同定するための特定の方法を記載した。例えば、１またはそれ以上の患者から単離された自己抗体を用いて、抗原がまず最初に単離される。次いで、この抗原は、重複する短いアミノ酸配列に分割され、好ましくは２０個のアミノ酸またはそれ未満、最も好都合にはオクタペプチドに分割される。自己抗体と最大の反応性を有する配列が同定され、次いで、使用可能なコンピューターデータベースを用いて公知のアミノ酸配列の全てと比較する。自己抗体と最大の反応性を有する配列に相同な配列を、最大数または最大比率で有するタンパク質は、病因物質または免疫原として公知の配列決定されたタンパク質の最も適切な候補の中にある。病因物質および抗原配列が判明すると、病因物質および／または自己抗体のいずれかを有する患者の診断および治療のためのアッセイおよび試薬を設計することが可能である。
【００１２】
先の出願の実施例は、ＳＬＥおよびＳＳ患者の抗血清と反応性である、６０ｋＤａＲｏ／ＳＳＡタンパク質およびＬａ／ＳＳＢの配列に由来するペプチドを用いた。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、あらかじめ特定の免疫原にさらされた個体、あるいは、Ｒｏ／ＳＳＡ、Ｌａ／ＳＳＢ、ｎＲＮＰまたはＳｍＢ／Ｂ’ポリペプチドあるいは自己抗体の産生を誘因するエピトープ（またはそれらの免疫等価物）と反応性の自己抗体を発現する個体を同定および分類するための付加的な診断薬を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデスおよびシェーグレン症候群）を同定および治療するための方法および組成物を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一つの局面において、４０より少ないアミノ酸のペプチドの群から選択されるヒト自己抗体に対する直鎖状エピトープであって、該ペプチドが、以下に示されるアミノ酸配列が続くアミノ末端から番号付けられたアミノ酸で始まる、エピトープに関する：
【００１６】
【化１】
2004002441.tif 000002
【００１７】
【化２】
2004002441.tif 000003
【００１８】
【化３】
2004002441.tif 000004
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、４から２５の間のアミノ酸からなる。
【００１９】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、抗Ｒｏ／ＳＳＡポリクローナル抗体と反応性である。
【００２０】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、抗ＳＭ　Ｂ／Ｂ’ポリクローナル抗体と反応性である。
【００２１】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、抗Ｌａ／ＳＳＢポリクローナル抗体と反応性である。
【００２２】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、前記ペプチドが以下からなる群またはそれらの混合物から選択される：
【００２３】
【化４】
2004002441.tif 000005
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、患者へ投与するために薬学的キャリアと組み合わせられる。
【００２４】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、循環性自己抗体を中和するために患者へ投与するのに有効な濃度である。
【００２５】
患者へ投与するために薬学的キャリアをさらに含有する上記エピトープの好ましい実施形態では、該キャリアおよび配列の濃度は宿主に投与したとき免疫応答を誘導する。
【００２６】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、色素、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素、および放射活性ラベルからなる群から選択される化合物でラベルされる。
【００２７】
本発明の上記エピトープの好ましい実施形態では、上記エピトープは、基質上に固定化される。
【００２８】
さらに本発明は、自己免疫疾患の患者をスクリーニングする方法であって、生物学的試料を、４０より少ないアミノ酸のペプチドの群またはそれらの混合物から選択されるエピトープと反応させる工程を包含し、該ペプチドが以下に示されるアミノ酸配列が続くアミノ末端から番号付けられたアミノ酸で始まる、方法に関する：
【００２９】
【化５】
2004002441.tif 000006
【００３０】
【化６】
2004002441.tif 000007
【００３１】
【化７】
2004002441.tif 000008
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、前記エピトープが、色素、蛍光ラベル、化学発光ラベル、酵素、および放射活性ラベルからなる群から選択される化合物でラベルされる。
【００３２】
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、前記ペプチドは基質上に固定化される。
【００３３】
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、上記方法は、患者試料中の自己抗体を検出する工程をさらに包含する。
【００３４】
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、上記方法は、前記患者試料の前記エピトープとの反応性に基づいて患者の予後を予測する工程をさらに包含する。
【００３５】
さらに本発明は、自己免疫疾患の患者を治療する方法であって、４０より少ないアミノ酸のペプチドの群またはそれらの混合物から選択されるエピトープを自己免疫応答をブロックする有効量で患者に投与する工程を包含し、該ペプチドが以下に示されるアミノ酸配列が続くアミノ末端から番号付けられたアミノ酸で始まる、方法に関する：
【００３６】
【化８】
2004002441.tif 000009
【００３７】
【化９】
2004002441.tif 000010
【００３８】
【化１０】
2004002441.tif 000011
【００３９】
【化１１】
2004002441.tif 000012
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、前記エピトープが自己免疫疾患に対するワクチンとして作用する。
【００４０】
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、前記エピトープが前記自己抗体に結合して前記自己免疫応答をブロックする。
【００４１】
本発明の上記方法の好ましい実施形態では、前記エピトープが組み合わせて投与され、一つ以上の自己抗体を含む自己免疫応答をブロックする。
【００４２】
【発明の実施の形態】
（発明の要旨）
多くのオクタペプチドを、ＳＬＥおよびＳＳ患者の血清中に存在する自己抗体に対する直鎖状（ｌｉｎｅａｒ）エピトープを表す、６０ｋＤａＲｏ／ＳＳＡペプチド、Ｌａ／ＳＳＢ自己抗原、７０　ｋＤ核リボヌクレオプロテイン（ｎＲＮＰ）、およびＳｍ　Ｂ／Ｂ’ポリペプチドをコードする配列から生成した。
【００４３】
例えば、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’に由来する最も重要な抗原ペプチドは、
【００４４】
【化１２】
2004002441.tif 000013
である。
別の反応性ペプチドは、
【００４５】
【化１３】
2004002441.tif 000014
に由来し得る。これらは結合性研究により測定された。ＰＰＰＧＭＲＰＰは特に抗原性であり、そしてＢ／Ｂ’配列中で３回繰り返される。他のペプチドの抗原性が測定され、そしてより短いペプチドＰＰＰＧＭＲＰおよびＰＰＰＧＭＲを含む。置換研究もまた実施された。その他の共通の天然に存在する１９のアミノ酸のすべてが、特定位置のアミノ酸を置き換える。例えば、ＰＰＰＧＭＲＰＰの６位のアルギニンは、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹで置換され得る。
【００４６】
これらのペプチドは、これらの自己抗体の存在により特徴付けられる患者に対する固相アッセイにおいて有用であり、そしてＳＬＥに伴う特定の条件の進行の可能性に関して患者を分類するのに使用され得る。ペプチドはまた、固定化ペプチドを用いるこれらの患者の治療において自己抗体を取り除き、自己抗体と自己抗体に反応性の患者の分子との結合をブロックし、またはワクチン成分として潜在的に有用である。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
ＳＬＥおよび他の自己免疫疾患に特徴的なヒト自己抗体と結合する、多くのペプチド（好ましくは８個のアミノ酸からなる）が開示される。これらのペプチドは、公知の自己抗原であるＲｏ／ＳＳＡ、Ｌａ／ＳＳＢ、ｎＲＮＰ、およびＳｍＢ／Ｂ’の公表されたアミノ酸配列に基づいて合成的に得られる。これらは種々の用途を有し、例えば、診断用アッセイ（潜在可能的に治療法として）、そしてこれらの自己免疫疾患の潜在的な原因の研究における成分としての用途を有する。
【００４８】
（直鎖状エピトープの定義および合成方法）
本明細書中で用いるペプチドは、１００個未満のアミノ酸からなるペプチドとして定義され、一般にはオクタペプチドである。４０個のアミノ酸までのペプチド、さらに好ましくは４個と２５個との間のアミノ酸のペプチドが、当業者に公知の任意の方法を用いて合成され得る。好ましい方法は、実施例で詳細に記載される。本明細書の実施例に記載のオクタペプチドは、自己抗原をコードする公表された配列から誘導される。括弧内の数字は、結合する最初のオクタペプチドの最初のアミノ酸残基配列中の位置である。配列のアンダーラインを引いた部分は、最大の結合性を有するオクタペプチドである。
【００４９】
特定の配列を参照して記載されるが、天然または合成のアミノ酸を用いる多くの置換がペプチド中で行われ得、開示された配列と機能的に等価である、直鎖状エピトープとして作用するペプチドを生成する。このことは、実施例３および４で示される。従って、特定の配列で定義されるように、直鎖状エピトープという用語は、本明細書中では、等価の様式または等価な程度で抗体と結合するペプチドを生成する置換を有するペプチドを包含して用いられる。
【００５０】
例えば、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’のペプチド抗原決定基に対するモノクローナル抗体を用いた置換研究によって、Ａ、Ｇ、およびＳが、１つの抗体ＫＳｍ３の結合において、ＰＰＰＧＭＲＰＰ中のＲを置換し得ることが示された。同様に、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｖ、およびＹは、ＫＳｍ３の結合においてＰＰＰＧＩＲＧＰ中のＩを置換し得る。
【００５１】
モノクローナル抗体は有益である大きな可能性を有するが、患者から得られたポリクローナル自己免疫血清は、さらに複雑な結合現象に至ることを実現するために重要である。
【００５２】
（自己抗体への結合によるペプチドのスクリーニング）
自己抗体のペプチドへの固相結合は、連続した直鎖状エピトープを試験することおよびエピトープ構造の重要な残基を規定するのに有用であることが示されたが、直鎖状だが連続でない２つまたはそれ以上のエピトープが三次構造によりもたらされる構造のエピトープまたは領域を規定することにおいてはより有用でないと考えられる。さらに、多くのペプチドは、溶液中において、天然タンパク質構造中には見い出されない構造をとる傾向にあるが、真のエピトープは、この方法によってなお脱直鎖状化され得る。天然分子に見い出される構造と類似の構造を有する傾向にあるこれらのペプチドは、天然タンパク質上の類似配列を結合する自己抗体のより大きい割合と結合し得、そしてより大きな親和性でさえ結合し得る。
【００５３】
以下の実施例は、ペプチドが、結合のためにどのように合成およびスクリーニングされ得るのかを詳細に記載している。
【００５４】
（患者の治療および分類におけるペプチドの使用）
抗原ペプチドのサブセットは、特有の臨床徴候で危険な状態にある患者、または特有の予後徴候グループにある患者を識別する可能性を有する。本明細書中で開示するペプチドは、アッセイ（例えば、固相アッセイ）において組み合わせて用いられることにより患者を分類し得る。
【００５５】
特に、特定の疾患（例えば、腎疾患または中枢神経系に関する疾患）で特徴付けられた患者の自己抗体と結合するペプチドが、アッセイ（例えば、この特定のペプチド集団を結合する自己抗体集団を検出するための試験としてのＥＬＩＳＡ）において選択および組み合わされる。単一の自己抗原または単一のペプチドを用いた場合と比較して、ペプチドの混合物を用いると、このようなアッセイの有効性および信頼性が増大し得る。
【００５６】
ペプチドは、標準的な技術を用いて（例えば、市販の臭化シアンを用いて）、溶液中で用いられ得るか、または固体基質（例えば、アフィニティクロマトグラフィに適切なゲル、またはマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ））に固定化され得る。
【００５７】
ペプチドは、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて治療に用いられ得る。ペプチドは、免疫応答を誘因することにより、自己抗体をブロックするのに効果的な用量で投与され得るか、または自己抗体をブロックするためのワクチンとして投与され得る。ペプチドは、抗体と結合することにより、免疫細胞を刺激または活性化しない機能的アンタゴニストとして作用し、そしてそれによって自己抗原に対する免疫応答をブロックする。
【００５８】
薬学的キャリアは、当業者に公知であり、経口投与用化合物のカプセル化を包含し、例えば、腸溶コーティング、またはバインダー（例えば、ステアレートまたはラクトース）と組み合わせて、あるいは溶液で用いられる。受容可能な溶液としては、滅菌水、生理食塩水、および生理的ｐＨの緩衝溶液が挙げられる。ワクチンとして用いられるペプチドは、経口、筋肉内、または皮下投与され得る。他の化合物は、当業者に用いられる標準的手法に従って投与される。本明細書中で定義するように、薬学的キャリアは、通常それ自身は不活性であるが、生物学的活性を有し得る。例えば、ワクチンは、アジュバントと組み合わせた免疫原性ペプチドまたはタンパク質から構成され得る。
【００５９】
あるいは、治療に用いられるペプチドは、同定された抗原配列に相同なペプチドを包含し得る。これらのペプチド（キャリアと結合しているか、または結合していない）が、特定の特異性を有する循環性抗体の量を減少するために患者に送達され得る。さらに、外来抗原と自己抗原との間で交差反応するエピトープの知見により、耐性の再誘導を考慮し得る。免疫応答の実験的モデルにおいて、抗原を用いた処置により応答が抑制され得、そして耐性が誘導され得ることは周知である。交差反応性配列を用いたペプチド治療は、自己免疫疾患の可能な治療であり得る。
【００６０】
アミノ酸配列はまた、当業者に公知の方法を用いて、循環性抗体を中和するための薬剤を合成するために用いられ得るか、または自己抗体を特異的に除去するための体外デバイスで基質上に固定化され得る。
【００６１】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解され得る。
【００６２】
【実施例】
（実施例１：Ｌａ／ＳＳＢ自己抗原の直鎖状エピトープの同定）
（患者および方法）
（ペプチド合成）　ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から推定されたＬａ／ＳＳＢアミノ酸配列が、Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３：　１８０４３　（１９８８）およびＳｔｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４０：３２１２　（１９８８）により報告されており、これらの教示は本明細書中に援用されている。推定上の完全な４０８アミノ酸Ｌａ／ＳＳＢペプチド配列を用いて、連続したオクタペプチドを同時に構築した。それぞれの配列は、ポリスチレンのピン上で、隣の配列と７アミノ酸が重なっていた。Ｌａ／ＳＳＢタンパク質の完全アミノ酸配列を、８×１２型の９６個のピンの５つのブロック上で合成した。それぞれのピンのブロック上で、３つの同一の陽性コントロールのオクタペプチドを、配列ＥＹＲＫＫＭＤＩとして合成した。これは、ヒト６０ｋＤＲｏ／ＳＳＡタンパク質のカルボキシル末端配列由来の主要なエピトープを表す。それぞれのアッセイを行っている間中、これらのコントロールピンの上で抗Ｒｏ／ＳＳＡ関連血清の希釈物をインキュベートし、プレート間およびアッセイ間での比較を可能にした。
【００６３】
（固相抗ペプチドアッセイ）　ピンのブロックをマイクロタイタープレートウェル中に浸すことにより、全ての工程を行った。ピンを、ブロッキング緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中で室温で１時間インキュベートし、次いで、湿らせたコンテナ中で、希釈剤（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％　Ｔｗｅｅｎ）で１：１００に希釈した血清中で４０℃で終夜インキュベートした。ピンのブロックを、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で１０分間撹拌しながら４回洗浄し、次いで、希釈剤で１：１０００に希釈したアルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，　Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）結合したアフィニティー精製ヤギ抗ヒト鎖特異的抗体に、室温で１時間浸した。上記のように洗浄した後、ピンをパラニトロフェニルリン酸溶液で３７℃で２時間インキュベートした。色の展開をＤｙｎａｔｅｃｈＭＲ５０００　ＥＬＩＳＡプレート読みとり機上で４１０ｎｍで読みとった。
【００６４】
（ピンの再生）　基質展開後、ピンのブロックを、用時調製の１％ドデシル硫酸ナトリウム、および０．１％　２−メルカプトエタノールを含む水浴で１時間、５０℃〜６０℃音波に当てながらインキュベートした。次いで、ピンを蒸留水で２回洗浄し、５０℃〜６０℃で予備加熱し、そして最後に沸騰メタノール中に２分間浸し、風乾した。
【００６５】
（結果の表現）　それぞれのブロック上に存在するＲｏ／ＳＳＡペプチド陽性コントロールピンを基準とすることにより、アッセイ内およびアッセイ間の変動を標準化した。このピンは、３：１０００に希釈した抗Ｒｏ／ＳＳＡリファレンス血清と共にＡ４１０で０．１７５の一定値になるまでインキュベートさせた。従って、全ての吸光度のデータを、変換因子Ａｏｂｓ／０．１７５をかけ算することにより標準化した。ここで、Ａｏｂｓは、あらゆるアッセイについて３：１０００抗Ｒｏ／ＳＳＡリファレンス血清でインキュベートしたＲｏ／ＳＳＡコントロールピンにより示された観測Ａ４１０である。それぞれのオクタペプチドの吸光度を、ＶＡＸ８２５０／ＶＭＳコンピュータの拡大シートプログラム（ＡＯＫ．ａｂｃ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．４）を用いてプロットした。
【００６６】
（試料）　５人の正常で健康な提供者、および主要なＳＳおよび／またはＳＬＥを有する１０人の患者由来の血清を、Ｌａ／ＳＳＢオクタペプチドに結合する抗体に対するピンＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。これらの１０人の患者のうち８人は、抗Ｒｏ／ＳＳＡおよび抗Ｌａ／ＳＳＢ沈降素の両方を形成する自己抗体を有しており、これらの８人のうち７人は、先天性心臓ブロック（ＣＣＨＢ）児を産んでいた。２人の患者は、Ｒｏ／ＳＳＡだけに対する抗体を有した。抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体を、Ｈｏｒｓｆａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈ．１０４：４３　（１９８７）により記載されているＬａ／ＳＳＢ架橋免疫吸収剤上で、２人の患者の血清からアフィニティー精製した。
【００６７】
（直鎖状配列エピトープの評価）　バックグラウンド結合を、Ｌａ／ＳＳＢ配列全体に対する、５つの正常血清の全平均反応性（Ａ４１０）により定義した（Ｏ．Ｄ．＝０．３３３±０．１２８標準偏差）。バックグラウンド結合より３．５の標準偏差（正規分布の０．９９９８に等しい）以上高い反応性であり、そして少なくとも３人の患者の血清が結合した領域は、Ｌａ／ＳＳＢエピトープの可能性を示した。エピトープを、最も反応性が多いエピトープから最も少ないエピトープの順に番号付けした。操作上、血清間の保存の程度の基準として通常平均より３．５の標準偏差以上高い結合する患者の数により、これを最初に定義した。二次的な尺度として、推定上のエピトープの領域における患者間のピーク反応性の平均マグニチュードを用いて、等しい患者血清結合数を有するエピトープを分類した。ある場合では、エピトープは単一オクタペプチドであり得、そしてそれ以外の場合では、数個のオクタペプチドにわたる広い領域での反応性が観察された。これら後者のいくつかの場合、１つより多くの推定上のエピトープが同定された。
【００６８】
（結果）
（Ｌａ／ＳＳＢオクタペプチドに対する抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体の結合）　８人の抗Ｌａ／ＳＳＢ陽性患者の血清の全てが、アミノ末端からカルボキシル末端までの領域の配列全体に及ぶＬａ／ＳＳＢオクタペプチドと選択的に強く結合した。正常な血清も結合するが、非常に低いレベルである。他の高力価の自己抗体を有するが抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体を欠損する血清もまた、Ｌａ／ＳＳＢ配列に対して低い反応性を示し、これはバックグラウンド応答と一致した。これらの研究で用いたヤギ抗ヒトガンマ鎖特異的抗体結合体は、ヒト血清の非存在下ではオクタペプチドと有意に結合しない。
【００６９】
（患者由来の抗Ｌａ／ＳＳＢ血清により定義されるエピトープ）　陽性の反応性を、Ｌａ／ＳＳＢ完全配列由来の重複オクタペプチドに対する５つの正常血清の平均反応性より３．５標準偏差以上高い反応性と定義した。１つまたは２つの自己免疫血清と反応する領域もまたエピトープを構成し得るが、３つ以上の抗Ｌａ／ＳＳＢ血清により認識されたそれらの領域を本研究ではエピトープの可能性有りと定義した。
【００７０】
試験した８つの血清全てが結合したエピトープはなかった；しかし、この方法で定義した１８個のエピトープのうち１３個は、少なくとも４つの血清が結合した。さらに、それぞれのエピトープ内でのピーク反応性は、患者の血清間で変化する傾向があり、それぞれの応答をもたらす。従って、３人の患者がエピトープ１８のオクタペプチドと結合したが、それらの最も強い結合が、同じオクタペプチドとの結合で生じないことが見いだされた。陽性血清はこの基準によりＬａ／ＳＳＢ配列と結合したが、コントロール血清もまたこの基準によりＬａ／ＳＳＢ配列と最小に結合した。しかし、もっと重要なことには、検出可能な抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体を有さない２つの他の自己免疫血清は、正常血清の平均より３．５標準偏差上のマグニチュードでＬａ／ＳＳＢ配列由来のどのオクタペプチドとも結合しない。
【００７１】
エピトープは、表Ｉに示したように、第一に血清反応数を考慮して、そして第二に応答の相対マグニチュードを考慮して、一番大きい方から小さい方へ順番に番号を付けた。これらのエピトープの内いくつかは、Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロット、Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１５７：１０５　（１９８２）により推定された高い抗原指数または親水性の領域と一致する。
【００７２】
（表１．Ｌａ／ＳＳＢ自己エピトープ）
【００７３】
【表１】
2004002441.tif 000015
位置は、Ｎ末端から番号付けしたＬａ／ＳＳＢ配列中のアミノ酸を指す。エピトープは、少なくとも３つの抗Ｌａ／ＳＳＢ患者血清中のバックグラウンドより少なくとも３．５標準偏差上の反応性を有すると定義する。エピトープを結合の程度順に一番大きい方から小さい方へ番号付けする。各推定エピトープの最も強く結合するオクタペプチドに下線を引いている。特定のエピトープ内の２つのオクタペプチドが非常によく似た結合を有する場合、両方の位置に下線を引いている。
【００７４】
（アフィニティー精製抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体の結合）
２人の患者由来の抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体を、Ｌａ／ＳＳＢ架橋免疫吸着剤上でアフィニティー精製した。患者Ｅ１１由来のアフィニティー富化抗Ｌａ／ＳＳＢ調製物は、調製物由来の血清と比較して抗Ｌａ／ＳＳＢ結合活性が特異的に増加する。アフィニティー富化調製物は、エピトープ１７（オクタペプチド３７９）以外の予め同定した１８個のエピトープの内１７個と結合する；しかし、この調製物はエピトープ１７と隣り合ったオクタペプチド、特にオクタペプチド３８０および３８２と結合する。結合が最も富化されたそれらの推定上のエピトープは、エピトープ２、３、６、９、１０、１２、１３、および１５を包含する。これらの同じエピトープは、それぞれの推定上のエピトープに対する反応性のピークまたは平均を比較しても、富化されているようである。本質的に同じ結果が、第二の患者由来の抗Ｌａ／ＳＳＢのアフィニティー富化調製物から得られた。このように抗Ｌａ／ＳＳＢ特異的活性が増加した結合の増強が示されたことは、少なくともこれらのペプチド配列が、抗Ｌａ／ＳＳＢ自己免疫応答の直鎖状エピトープを表すという強力な証拠である。
【００７５】
（Ｌａ／ＳＳＢピンＥＬＩＳＡの再現性）
Ｒｏ／ＳＳＡオクタペプチド（ＥＹＲＫＫＭＤＩ）陽性コントロールピンに結合する抗Ｒｏ／ＳＳＡリファレンス血清の再現性が、研究を通じて得られ、１：１００および３：１００抗Ｒｏ／ＳＳＡリファレンス血清でインキュベートしたピンに対しそれぞれ１４．０％および１６．３％のアッセイ間の平均標準偏差を得た。抗Ｌａ／ＳＳＢ抗体を伴う血清および伴わない血清もまた、ピンＥＬＩＳＡで繰り返した場合、等しく一致した結果を示した。
【００７６】
（強心性関連タンパク質との共通配列）　連続したアミノ酸配列の同一性は、ヒト心臓のβ−ミオシンのＨ鎖とＬａ／ＳＳＢ配列の３つの直鎖状領域との間で同じであり、それらの内２つはＬａ／ＳＳＢエピトープと一致する。エピトープ１３（Ｌａ／ＳＳＢアミノ酸２７７から２８０）内の４つのアミノ酸配列は、心臓のβ−ミオシン（配列残基４５３から４５６）と同じであり、一方エピトープ１８（２０４から２０８）および心臓のβ−ミオシン（６１９から６２３）ではペンタペプチドが同じである。５つの相同配列の内３つは、Ｌａ／ＳＳＢエピトープ内を襲う、リウマチ性心疾患に関与する細菌のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＭ６タンパク質と同じである。特に、２つのペンタペプチドの一致が、Ｌａ／ＳＳＢエピトープ５（５９から６３）および１８（２０３から２０７）で生じ、一方テトラペプチドの一致が、エピトープ１３（２７６から２７９）内で生じる。厳密に言えば、エピトープ１３および１８はまた、ラミニンのＢ１鎖、心臓の筋細胞膜を含む全ての基底膜に見いだされた粘着性の糖タンパク質とアミノ酸配列が同じである。エピトープ１３内の領域は、ラミニンＢ１（１２０２から１２０５、および１３６７から１３７０）に一致する２つの重なり合ったテトラペプチドを含有し、これらはＬａ／ＳＳＢアミノ酸残基２７７から２８０、および２７５から２７８にそれぞれ一致する；一方Ｌａ／ＳＳＢエピトープ１８（２０２から２０７）は、ラミニンＢ１（１４６７から１４７２）と、連続した６アミノ酸が同じである。これらのエピトープに結合する抗体が、ＣＣＨＢの子どもがいる患者由来の７つの血清それぞれにおいて見い出された。
【００７７】
（実施例２：６０ｋＤ　Ｒｏ／ＳＳＡタンパク質の直鎖状エピトープの同定）
６０ｋＤタンパク質への直鎖状エピトープを表すペプチドを、先の出願でもともと存在していた多くを含めて、表２に示す。これらのデータは、７つの正常血清、４つの抗Ｒｏ／ＳＳＡ沈降素陽性血清、および同じ４つの抗Ｒｏ／ＳＳＡ沈降素陽性患者血清由来の抗Ｒｏ／ＳＳＡアフィニティー精製自己抗体からの結果の平均を表す。データにそれぞれの場合の定数をかけ算し、これらの結果において結合のマグニチュードを一定ＩｇＧ濃度の１００μｇＩｇＧ／ｍｌで比較し得た。
【００７８】
本研究は、抗Ｒｏ／ＳＳＡペプチド結合活性が、同時に天然の分子に対する抗Ｒｏ／ＳＳＡ活性を伴って富化されることを証明する。抗原ペプチドおよびＲｏ／ＳＳＡ抗原の両方に対する特異的結合活性が、アフィニティー富化手順により約３倍増加した。これは、ペプチド結合が抗Ｒｏ／ＳＳＡ応答全体の一部分であることを示す。
【００７９】
表２の最初と２番目の縦欄は、Ａ４１０が０．３の閾より上で結合する配列を識別する。ペプチドはＡ４１０＝０．３より大きい平均で正常血清により結合されないので、この閾を選んだ。表２の最初の縦欄は、４つの抗Ｒｏ／ＳＳＡ沈降素血清の平均に由来し、そして２番目の縦欄は、アフィニティー富化抗Ｒｏ／ＳＳＡに由来する。３番目の縦欄中にあるのは、抗原オクタペプチドを構成する抗原配列である。上付きの星印「＊」で、少なくとも０．３のＡ４１０で全ての隣接したコレクションのどれとも最も強く結合するオクタペプチドのオクタペプチド番号を識別する。この部分の配列にはまた下線を引く。２つのオクタペプチドが、互いに１％以内のＡ４１０を有する場合、次いで、２つのオクタペプチドを星印で識別し、そして両方のオクタペプチドに提供されているオクタペプチドに下線を引く。
【００８０】
（表２．０．３のＡ４１０より大きい６０Ｋｄ　Ｒｏ／ＳＳＡペプチドの配列から構築したオクタペプチドに対する４つの抗Ｒｏ／ＳＳＡ血清およびアフィニティー富化抗Ｒｏ／ＳＳＡ調製物の結合平均）
【００８１】
【表２Ａ】
2004002441.tif 000016
【００８２】
【表２Ｂ】
2004002441.tif 000017
（実施例３：７０ｋＤ核リボヌクレオプロテインの直鎖状エピトープの同定）
７０ｋＤの核リボヌクレオプロテイン（ｎＲＮＰ）の配列が、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．　２４：　１０３７３−１０３９１　（１９８７）の中で、Ｒ．　Ａ．　Ｓｐｒｉｔｚらにより報告されており、この教示は本明細書中に援用されている。データ分析を、Ｒｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢ抗原に対して行ったのと同様に行った。それぞれの同定配列は、固相アッセイにおける任意の基準を越えるオクタペプチドに対する抗体の結合を表す。同定した抗原領域は、正常血清の平均より２標準偏差よりも高く、そして半分より多い患者が結合する。７０ｋＤペプチドへの結合では、アッセイにおける閾は、Ａ４１０が０．３８０である。かっこの中の番号は、閾を越える最初のオクタペプチド中の最初のアミノ酸の配列位置である。それぞれの同定配列は、１つ以上のオクタペプチドで構成される。それぞれの配列におけるオクタペプチドの番号は、配列の長さ引く８である。配列の下線部分は、患者の血清によりほとんどが結合されるオクタペプチドである。いくつかの場合では、他のオクタペプチドが本質的に等価であるが、下線は引いていない。
【００８３】
７０ｋＤのｎＲＮＰの抗原配列は：
【００８４】
【化１４】
2004002441.tif 000018
ｎＲＮＰのＡペプチドは、以下の抗原オクタペプチドを有する：
【００８５】
【化１５】
2004002441.tif 000019
平均より２標準偏差上であると定義された閾は、標準化Ａ４１０が０．４００であり、（＊）により識別したオクタペプチド配列が、試験した血清のサブセットにより結合される。この結果に基づく配列は、Ｓｉｌｌｅｋｅｎｓら、ＥＭＢＯＪ．　６：　３８４１−３８４８　（１９８７）中に見いだされ、その教示は本明細書中に援用されている。
【００８６】
ｎＲＮＰのＣペプチドは、以下の抗原オクタペプチドを有する：
【００８７】
【化１６】
2004002441.tif 000020
これらのオクタペプチドの結合に対する閾は、Ａ４１０が０．４４０である。この結果に基づく配列は、Ｓｉｌｌｅｋｅｎｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：　８３０７−８３２１（１９８８）にあり、その教示は本明細書中に援用されている。
【００８８】
（実施例３：Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’ポリペプチドの直鎖状エピトープマッピング）
Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’ペプチドに結合する自己抗体は、一般的にＳｍ　Ｂ／Ｂ’の重なり合ったオクタペプチドに結合するＳＬＥＩｇＧ抗体に関連している。ここで、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’は、抗Ｓｍおよび抗ｎＲＮＰ沈降素を有する１０人の患者で、他の自己免疫血清学を伴う５人の患者で、そして４つの正常ヒト血清で評価した。正常コントロールおよび抗Ｓｍ沈降素を有さない患者のどちらもがＳｍＢ／Ｂ’オクタペプチドのいずれとも全く結合しない。抗Ｓｍ沈降素を含有する試験した全ての血清は、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’配列の８つの領域由来のオクタペプチドと強く結合する。これらの８つの領域の内３つは、同じオクタペプチド配列（ＰＰＰＧＭＲＰＰ）を共有し、この配列は一貫してＳｍＢ／Ｂ’由来の最も免疫反応性なオクタペプチドである。欠失および置換ペプチドへの結合に加え、類似のＰＰＰＧＩＲＧＰとも結合するため、モチーフＰＰＰＧ（Ｉ，Ｍ）（Ｒ，Ｋ）がこの結合を最も良く定義するようであることが示唆される。ｎＲＮＰＣペプチド中のＰＡＰＧＭＲＰＰは、ＰＰＰＧＭＲＰＰと同程度に抗原性であり、そしてＳｍ自己抗体とｎＲＮＰ自己抗体との間で示される交差反応に対する部分的な説明を提供し得る。しかし、ｎＲＮＰＡ由来の配列ＰＰＰＧＭＩＰＰは、抗原性ではない。これらのデータは、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’タンパク質の直鎖状配列自己抗原性を定義する。それらはまた、有力な自己免疫エピトープは、抗原性が破壊されるより前に多様性の制限を可能にするプロリンに富む配列であることを証明する。
【００８９】
Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’の２つの配列が報告されている。Ｒｏｋｅａｃｈら、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６４：　５０２４　（１９８９）は、リンパ芽球細胞（Ｒａｊｉ）ライブラリーから配列を得た。それは、Ｓｈａｒｐｅら、ＦＥＢ　Ｌｅｔｔ．　２５０：５８５　（１９８９）により報告されたＨｅＬａ細胞由来のクローンの一部分と同一であり、そしてＳｃｈｍａｕｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１７：１７３３　（１９８９）により報告されたヒト小脳ライブラリー由来のＳｍ　Ｎと同一である。Ｓｍ　ＢおよびＳｍ　Ｂ’は、非常によく似たアミノ酸配列を有する（ｖａｎＤａｍら、ＥＭＢＯ　Ｊ．　８：　３８５３　（１９８９））。確かに、Ｓｍ　ＢおよびＳｍ　Ｂ’は、同じｍＲＮＡ前駆体から互いにスプライシングした生成物である。
【００９０】
本研究において、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’両配列のコード化領域である重複オクタペプチドを、固相ペプチド合成により合成した。それぞれのオクタペプチドの抗原性を、ＳＬＥ患者由来の種々の血清および正常コントロールを用いて決定した。
【００９１】
（材料および方法）
（血清）　ＳＬＥに対する米国リューマチ協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＲｈｅｕｍａｔｉｓｍＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の分類基準を満たす患者由来、または正常な、年齢が一致し、性別が一致するコントロール由来のヒト血清を、本研究に用いた。狼瘡の患者由来の１５個の血清を試験した。試験したこれらの血清のうちの１０個が、ＳｍおよびｎＲＮＰの両方と強い沈降素線を形成する抗体を含み、３個がｎＲＮＰのみと沈降素線を形成し、１個がＲｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢと沈降素線を形成し、そして１個がＲｏ／ＳＳＡのみと沈降素線を形成した。これらの血清の知見の全てを、個々の血清によって免疫ブロットで結合している報告された抗原に対する適切な分子量バンドによって確認した。
【００９２】
（固相非開裂性ペプチド合成）　公表されたＳｍ　Ｂ／Ｂ’配列を、全ての可能な重複オクタペプチドを構築するのに用いた。ペプチド合成に用いたアミノ酸は、Ｆｍｏｃ保護した第１級アミノ基、およびｔ−ブチル（または他の適切な基）保護した側鎖を有した。重複オクタペプチドは、９６ウェルのマイクロリットルプレート（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ．　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ　ａｎｄ　Ｃｏｓｅｌｃｏ　Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ．　Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のフォーマット中で配列された放射線で誘導化したポリエチレン製のピンの丸められた末端で同時に合成した。Ｆｍｏｃ、ｔ−ブチルアミノ酸溶液（３０ｍＭ）の活性エステルを、３０ｍＭの最終濃度に添加され、そしてマイクロリットルプレートのウェル中に分配された１０のヒドロキシベンゾトリアゾールを有するＤＭＦ中で溶解した。ＲａｊｉＳｍ　Ｂ／Ｂ’配列の２４０個のアミノ酸によって決定されたように各アミノ酸を添加した。１８時間のインキュベートの後、ピンをＤＭＦ中で５分間、メタノールで各２分間４回、そしてもう一度ＤＭＦで５分間洗浄した。次いで、Ｆｍｏｃ保護基を、３０分間、２０％ピペリジン／ＤＭＦ浴により新たに添加したアミノ酸から取り除いた。これらの工程を、８つのアミノ酸の全てが添加されるまで繰り返した。最終のアミノ酸を添加した後、各ペプチドのアミノ末端基を、室温で９０分間、ＤＭＦ：無水酢酸：トリエチルアミンの５：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）混合物中でピンをインキュベートすることによりアセチル化した。この工程の後、ピンを再びＤＭＦで２分間、メタノールで各２分間４回洗浄し、次いで１０分間空気乾燥した。最終的に、側鎖アミノ保護基を、９５：２、５：２．５（ｖ／ｗ／ｖ）のトリフルオロ酢酸：フェノール：エタンジチオールによって取り除いた。洗浄工程は、塩化メチレン中で２分間、５％ジイソプロピルエチレン／塩化メチレン中で各５分間を２回、そして最終の塩化メチレンの５分間洗浄を含んだ。１０分間乾燥した後、ピンを蒸留水中に２分間置き、メタノール浴に移して１８時間置き、そして真空下で１８時間乾燥させた。この手順を繰り返して、カルボキシル末端の３６個のオクタペプチドの別のセットを合成し、先のデータを実証した。さらに他のオクタペプチド（ｖａｎＤａｍ／　Ｏｈｏｓｏｎｅ　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：４２４９（１９８９）配列に記載のアミノ酸変化を含む）もまた合成した。選択された置換および欠失配列（他のタンパク質からの類似の配列とともに）をまた構築した。ＳｍまたはｎＲＮＰ抗原配列中のいずれにも存在しないランダムな配列にあるアミノ酸から構成されるコントロールピンを調製した。さらに、陽性のコントロールピンを、公知の反応性の配列であるＬａ／ＳＳＢペプチドから合成した。
【００９３】
（固相開裂性ペプチド合成）　Ｃｏｓｅｌｃｏ　Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ．は、開裂性ペプチドの生成方法を開発した。これらのペプチドは、付加的なプロリン−リシン−アラニン配列を含む開裂性リンカーアセンブリを含むポリエチレンピン上で合成される。上記のようにペプチドを合成した後、最終的に１５分の超音波処理が、０．１％ＨＣｌ（１：１のメタノール／ｄｄＨ２Ｏ中）中で加えられる。ピンを、等量の０．１Ｍのクエン酸および０．１Ｍのリン酸緩衝液の溶液（ｐＨ　３．０）中で、静かに撹拌して３時間インキュベートする。これは全ての残存不純物を取り除く。次いで、これらのペプチドを、環化およびジケトピペラゾールの形成を引き起こす０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐｈ７．０）中でインキュベートすることによりピンから開裂する。次いで、これらのペプチドをアミノ酸含量について分析した。上記のように４個のオクタペプチドを構築し、そして、適切な比で正確なアミノ酸が、試験された全てのペプチド中に存在した。
【００９４】
（固相抗ペプチドアッセイ）　洗浄工程およびインキュベーションを密封したプラスチック容器中で行った。他のアッセイ工程を、マイクロリットルプレートウェル中へピンを低下することにより行った。最初に、ピンを室温で１時間、ＰＢＳ中にて３％の低脂肪ミルクを用いてブロックした。次いで、ピンを加湿された密封容器中で、４℃にて一晩０．０５％　Ｔｗｅｅｎを含む３％ミルク／ＰＢＳ中で血清を１／１００に希釈してインキュベートした。次いで、ピンブロックを、激しく撹拌して各１０分間、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳを用いて４回洗浄した。次に、各ピンを、ヤギで産生させ、アフィニティ精製し、そしてアルカリホスファターゼ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）に結合された抗ヒトガンマ鎖特異的ＩｇＧと、１／１０，０００希釈でインキュベートした。パラニトロフェニルホスフェートジナトリウムを、アルカリホスファターゼの基質として用い、そしてプレートをＭｉｃｒｏｅｌｉｓａＲｅａｄｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ）を用いて４０５ｎｍで読み取った。次いで、各プレートに対する結果を、陽性のコントロールピンと比較することにより標準化した。同一のコントロールピンを全てのプレートについて用い、そして既知の濃度の標準コントロール血清を用いて、特定のＯＤにまで展開させた。
【００９５】
アッセイの完了後、ピンを超音波処理緩衝液（４０ｇのＳＤＳ、４ｍｌのβ−メルカプトエタノール、および６２．４ｇのリン酸ナトリウムを４リットルにする）中で２時間、超音波処理して、抗体、結合体、および基質を取り除いた。超音波処理の後、ピンを熱水中で２回洗浄し、そしてメタノール中で２分間煮沸した。次いで、ピンを最短１０分間空気乾燥させ、そして乾燥剤と共に保存するか、あるいは別のアッセイに用いた。
【００９６】
（Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’のエピトープマッピング）　ペプチドを、最初、抗ヒトＩｇＧ結合体単独との反応性についてスクリーニングした。抗ヒトＩｇＧ結合体とではバックグラウンドは示されなかった。４つの正常なヒト血清もまた、特異的な抗原領域が示されることなく、最小のバックグラウンド反応性を示した。抗Ｓｍ、抗ｎＲＮＰ以外の自己免疫血清病（ｓｅｒｏｌｏｇｙ）のＳＬＥ患者もまた、任意のオクタペプチドと確信的な特異的反応性を示さなかった。試験した他のリューマチ血清病では、Ｒｏ／ＳＳＡ、ならびにＲｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢＡｇの両方と沈降素を形成した血清を含んでいた。しかし、ＳｍおよびｎＲＮＰを沈殿したいずれの患者も、ＳｍＢ／Ｂ’タンパク質の種々の領域とかなりの反応性を示した。１０個のＳｍ、ｎＲＮＰ血清が試験され、そして全てが類似の結合パターンを有していた。かなりの反応性が、タンパク質のプロリンリッチのカルボキシル末端領域で示された。繰り返しモチーフ（ｍｏｔｉｆ）であるＰＰＰＧＭＲＰＰが、ＳｍＢ／Ｂ’ポリペプチドの３つの領域で見い出され、そしてそれぞれが同様に抗原性である。さらに、密接に関連する第４の領域、ＰＰＰＧＩＲＧＰに、試験した全てのＳｍ、ｎＲＮＰ血清が結合する。
【００９７】
いくつかの他の抗原性領域がまた、ポリペプチドの最初の部分、および中間部分で検出された。これらの領域は、試験した全ての血清中でそれほど反応性が強くなかった；しかし、それらはＢ／Ｂ’Ａｇに対する自己免疫応答を有する個体間の微細な特異性の差違を規定することにより重要であり得る。
【００９８】
どのアミノ酸が反応性に必須であるかを解明するために、各表明されたエピトープの周囲の平均結合を、各々の相応したオクタペプチドの配列と共に図１に表す。アミノ酸２９で始まるオクタペプチド（ＧＴＦＫＡＦＤＫ）は、反応性において８つの残基の全てを必要とする。しかし、オクタペプチド４５の領域内の反応性領域の抗原性は、挿入された（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）アミノ酸スペーサーを有する２つのリシンを必要とすることに基づくようである。挿入スペーサーを有する２つのリシンが除去される際に、結合は、オクタペプチド４４および５３で失われる。
【００９９】
オクタペプチド１４０〜１４５からの配列は全て、適度に高められた平均結合を有した。各々は、結合に重要であると思われるＰＱＧＲ配列を共有する。他方、オクタペプチド１６９の周りの反応性部位は、特異的配列により容易に説明されない。オクタペプチド１９１、２１６、２２３、および２３１で見い出された繰り返しＰＰＰＧＭＲＰＰ、および類似のＰＰＰＧＩＲＧＰは、ヘキサマーＰＰＰＧＸＲを共有し、ここで、Ｘは最も大きい結合を有する全てのオクタペプチド中の未決定のアミノ酸を示す。この繰り返しモチーフは、ＳｍＢ／Ｂ’の直鎖状エピトープへの抗Ｓｍの結合において重要であるように思われる。
【０１００】
（ＰＰＰＧＭＲＰＰを用いる欠失実験）　ＰＰＰＧＭＲＰ配列の欠失実験は、図２ａに示すように、試験された６人の患者血清で８個のアミノ酸の全てが抗原性に必要ではないことを示した。カルボキシル末端アミノ酸を欠失し、ヘプタマーＰＰＰＧＭＲＰ、ヘキサマーＰＰＰＧＭＲ、ペンタマーＰＰＰＧＭ、ならびにＰＰＰＧ、ＰＰＧＭ、ＰＧＭＲ、ＧＭＲＰ、およびＰＰＰＰを含む種々のテトラマーを残したペプチドを合成した。結合には、顕著な反応性が失われる前に、少なくともヘキサマーＰＰＰＧＭＲを必要とするように思われる。第６位のアルギニンが除かれたとき、ＰＰＰＧＭＲＰＰモチーフに対する反応性の６０％以上が破壊される。カルボキシル末端のプロリンの除去は、試験した６人の患者中の結合を顕著に改変するようには見えない。さらに、単独で試験したポリプロリン配列（ＰＰＰＰＰ、ＰＰＰＰ、ＰＰＰ、ＰＰ）は、これらの血清との反応性を示さなかった。抗Ｓｍおよび抗ｎＲＮＰを含む１０個の血清のうち６個が、これらの欠失したペプチドで試験され、そして類似の結果を得た。正常な血清は、任意のこれらのペプチドを結合しなかった。
【０１０１】
（ＰＰＰＧＭＲＰＰ抗原性配列の置換実験）
アルギニン（Ｒ）と他の１９の天然に存在するアミノ酸との置換は、図２ｂに示すように、試験された６個の血清との反応性の変化するレベルを示した。他の正に荷電したアミノ酸リシン（Ｋ）によるアルギニンの置換は、元の反応性の７５％以上を保持する。９個のアミノ酸（Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、およびＹを含む）の別のサブセットは、元の結合の約５０％〜６５％を保持し、これに反して、他の９個のアミノ酸は、２５％未満に結合を減少させる。
【０１０２】
（種々の類似のエピトープの合成）　ＰＰＰＧＭＲＰＰモチーフとかなりの相同性を示した種々のタンパク質の短い配列もまた、ポリエチレンのピン上で合成した。これらの配列およびそれらの反応性は、最初の実験からの抗Ｓｍおよび抗ｎＲＮＰで沈降素を有する６つの異なる患者の血清によって測定したように測定された。ｎＲＮＰＡ（２３）、ｎＲＮＰ　Ｃ（２４）、およびＥＢＶ核Ａｇ−１（２５）由来のオクタペプチドを調製した。ｎＲＮＰＡおよび１つのｎＲＮＰ　Ｃ配列は、相対的に反応性を示さなかった；しかし、第２のｎＲＮＰＣ配列（ＰＡＰＧＭＲＰＰ）は、元の結合の９０％以上を示した。さらに、ＥＢＶ配列（必要な抗原性部分ＰＰＰＧＭＲＰＰと６つのアミノ酸のうち５つの相同性を有する）はまた、Ｓｍ、ｎＲＮＰ沈降素陽性の患者により顕著に結合される。
【０１０３】
本研究で決定された全ての抗原性部位が、正に荷電したアミノ酸を必要とする。これらの部位のサイズは、２つの非連続的な塩基性アミノ酸から、完全なオクタペプチドまで変化する。ＰＰＰＧＭＲＰＰモチーフは試験されたすべてのＳｍ、ｎＲＮＰ血清において主要な直鎖状抗原性エピトープであるようである；しかし、この配列は、抗ｎＲＮＰ沈降素の不在下では抗Ｓｍ沈降素を含む血清によって結合されないようである。Ｓｍ沈降素単独の患者は、ＳｍＢ／Ｂ’の２つの領域を結合する。
【０１０４】
ＰＰＰＧＭＲＰＰモチーフのカルボキシル末端ジプロリンは、抗原性に必要ではない。他の欠失研究はまた、これらの自己抗体の抗原性が、ポリプロリン領域に特異的に関連しないことを示した。２個〜６個のポリプロリンを含むペプチドは、本研究で用いた血清との反応性を示さなかった。さらに、アミノ酸配列１７５〜１８６、および８５〜９２の天然に存在するオクタペプチドは、３個または４個の連続的なプロリンを含む：これらの領域のいずれもが抗原性ではない。また、酷似するＰＰＰＧＭＩＰＰオクタペプチドは、ＳｍおよびｎＲＮＰを沈降する血清に結合しない。
【０１０５】
置換実験は、１つのアミノ酸の変化が配列の反応性の９０％以上を減少し得ることを示した。他の１９個の天然に存在するアミノ酸によるＰＰＰＧＭＲＰＰ配列の６位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）置換は、これらのアミノ酸を３つの別の群に分けた。リシン（Ｋ）（別の塩基性アミノ酸）は、結合の７５％以上の平均を維持する唯一の置換である。試験された各血清で、このアミノ酸置換は、普遍的に最も反応性である。しかし、反応性は９個のアミノ酸で２５％未満まで失われる。このセットは、酸性アミノ酸およびそのアミン、硫黄含有アミノ酸、ならびに疎水性のロイシン、プロリン、およびアラニンを含む。他の９個のアミノ酸は、元の結合の４２％〜６５％の部分を保持する。フェニルアラニンは、この群のうち、一貫して最も反応性であった。それにもかかわらず、アルギニンに置換するリシンの能力は、この位置で正に荷電したアミノ酸が、この配列の抗原性に好適であるという仮説を導く。
【０１０６】
（実施例４：Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’のペプチド抗原決定基に対するモノクローナル抗体の結合）
Ｓｍ　ＢおよびＢ’ペプチド（Ｂ／Ｂ’）を結合する自己抗体は、ヒト、およびＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける全身性エリテマトーデスに共通して関係する。ＫＳｍ　３およびＫＳｍ　５モノクローナル抗体を、ハイブリドーマモノクローナル抗体技術を用いて未操作のＭＲＬｌｐｒ／ｌｐｒマウスから得た。ＫＳｍ　３およびＫＳｍ　５モノクローナル抗体を含有する上澄液を、１０％の胎児ウシ血清、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０中でクローン化マウスハイブリドーマ細胞株から集めた。これらのモノクローナル自己抗体は、両方のＩｇＧ２ａサブクラスである。これらの２つの抗Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’マウスモノクローナル自己抗体の直鎖的な抗原領域を、重複オクタペプチドを用いてマップした。特有のエピトープを各モノクローナルにより同定する。モノクローナル抗体ＫＳｍ５は、Ｓｍ　Ｂポリペプチド中で３度繰り返されるペプチド（ＰＰＰＧＭＲＰＰ）を認識する。ＫＳｍ　３は２つの酷似した、ほぼ近傍にあるオクタペプチドである、ＰＰＰＧＩＲＧＰおよびＰＧＩＲＧＰＰＰと最も結合する。この２つのモノクローナル抗体は交差反応しない。ＳｍＢ／Ｂ’のこれらの領域の両方は、ヒト抗Ｓｍ自己抗体に対する抗原性の主要領域である。抗原性オクタペプチド中のアミノ酸の欠失および置換は、ＫＳｍ　５エピトープへの結合がほんのわずかな改変で失われることを示す。ＰＰＰＧＭＲＰＰの第６位におけるアルギニンが置換される際に、ＫＳｍ５結合がオクタペプチドの予期しないサブセットにおいて見い出される。分子動力学モデル化は、結合が置換アミノ酸の電荷または疎水性よりもむしろ、共有するペプチド骨格構造に関連し得ることを示唆する。対照的に、ＰＰＰＧＩＲＰＰに対するＫＳｍ３の結合は、第６位のアルギニンが任意の他のアミノ酸で置換される際になくなる。これら２つのマウス自己抗体は、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’の別個の直鎖状エピトープを結合し、それらはまた、ヒト抗ＳｍＢ／Ｂ’自己抗体によって結合される。結合したエピトープはプロリンリッチであり、そして第４位、または第６位にアルギニンを含む。従って、アルギニンでの置換、およびモデル化実験は、ＫＳｍ３およびＫＳｍ　５に対する結合が非常に異なることを示唆する。オクタペプチドＰＰＰＧＭＲＰＰの６位でいくつかのアミノ酸側鎖により与えられる特定のペプチド骨格構造は、ＫＳｍ５結合に含まれ得る。一方、ＫＳｍ　３結合は、アルギニン側鎖の特異性を必要とする。天然に産生する自己抗体は、類似のペプチド構造の全く異なる構造と結合し得る。ＰＰＰＧＩＲＧＰの第５位または第６位のアミノ酸いずれかと他の１９個の天然に存在するアミノ酸との置換は、独自のパターンの反応性を示す。第６位のアミノ酸アルギニン（Ｒ）の置換は、いずれのアミノ酸も結合の程度を許容しないことを示す。第５位のイソロイシン（Ｉ）が置換される際に、２０個のアミノ酸のうちの６つ（フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）およびチロシン（Ｙ））は、元のオクタペプチドで示された結合の５０％以上を許容した。これらのうち、トレオニンは、元のオクタペプチドよりも大きな反応性を有する。
【０１０７】
抗原性の群のいずれかのペプチドに共通の構造モチーフを決定するために、分子動力学的シュミレーションをＫＳｍ　５またはＫＳｍ　３に抗原性である選択されたペプチドについて行った。ちょうどナノ秒定角軌道（ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）を示す全部で２５００個の構造を、各ペプチドについて蓄積し、そして骨格二面角をモニターすることにより解析した。少なくとも１つの有力な一致する構造を、安定したセットの骨格二面角によって観察されたように全てのペプチドに対して選択し得た。８つの残基の骨格原子について、ＫＳｍ３陽性ペプチドＰＰＰＧＩＲＧＰとＰＧＩＲＧＰＰＰとの差の二乗平均４．８７Ａは、これら２つのペプチドに共通の骨格がないことを示す。
【０１０８】
対照的に、ＰＰＰＧＭＲＰＰ中の第６位でアルギニン（Ｒ）を置換したペプチドに対するＫＳｍ５の結合は、全く異なる結合の要求性を示唆する。側鎖が−（ＣＨ３）３−ＮＨ−Ｃ−ＮＨＮＨ２、−ＣＨ３、−ＯＨ、および−Ｈを有するアミノ酸全ては、ＫＳｍ５によって結合されるその能力においておおよそ等価であった。電荷または疎水性の特徴はこれらのアミノ酸によって共有されない。また、リシンおよびヒスチジン（通常、アルギニンに最も類似すると考えられているアミノ酸）は、結合を置換および保持し得なかった。１つまたはそれより多いアミノ酸によっていずれかの方向にオフセットされた天然ペプチドＰＰＰＧＭＲＰＰに共通の重要な骨格構造の可能性は、ＯＶＲＬＡＰ１８を用いて除外された。最良の一致が、オフセットなしに骨格の最初の数個の残基に対して見い出された。従って、この構造は結合においてある役割を果たし得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳｍＢ／Ｂ’の抗原領域およびそれらの周辺オクタペプチドを、０．５０より大きい吸光度を示すオクタペプチド結合性でグラフ化している。
【図２ａ】図２は、ＳｍＢ／Ｂ’エピトープＰＰＰＧＭＲＰＰに関する欠失研究の結果をグラフにしている：図２ａは、エピトープからのアミノ酸の除去による結合の減少を示している。
【図２ｂ】図２は、Ｓｍ　Ｂ／Ｂ’エピトープＰＰＰＧＭＲＰＰに関する欠失研究の結果をグラフにしている：図２ｂは、６位アルギニンの置換効果を示している。
【図１】
2004002441.tif 000021
【図２ａ】
2004002441.tif 000022
【図２ｂ】
2004002441.tif 000023