(57)【要約】【課題】本発明は、　一般式（Ｉ）【化１】
2004002447.tif 000014
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムを含有する組成物に関する。【解決手段】一般式（Ｉ）【化２】
2004002447.tif 000015
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムを含有する組成物。【選択図】　なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
2004002447.tif 000013
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムを含有する組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用し、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程に関する。
【０００２】
また、本発明は、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法に関する。
【０００３】
更に、本発明は、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法に関する。
【０００４】
また、本発明は、上記３工程から選択される２以上の工程を含有することを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法に関する。
【０００５】
更に、本発明は、式（Ｉ）
【０００６】
【化２】
2004002447.tif 000002
【０００７】
を有する化合物を、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することに関連する発明に関する。
【０００８】
【従来の技術】
プラバスタチンは、特開昭５７−２２４０号公報（ＵＳＰ４３４６２２７）にＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤として開示されている化合物であり、下記式（ＩＩ）
【０００９】
【化３】
2004002447.tif 000003
【００１０】
を有し、現在、プラバスタチンナトリウムが高脂血症治療剤として発売されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤として、プラバスタチンの他に多くの化合物が知られているが、例えば、アトロバスタチン、フルバスタチン、イタバスタチン等は、全て合成により製造される化合物である。
【００１２】
一方、ロバスタチン及びシンバスタチンは、プラバスタチンと同様に発酵により製造されるものの、一段階の発酵により生成され、この点、プラバスタチンの二段階発酵と相違する。すなわち、プラバスタチンナトリウムは、下記式に示すとおり、二段階にわたって菌により変換培養することにより生成されるものである。
【００１３】
【化４】
2004002447.tif 000004
【００１４】
そもそも、菌を発酵させた場合、化学反応で合成を行うよりも、予想し得ない多くの不純物が生成してしまうものである。各工程毎に精製を行ったとしても不純物を除去しきれるものではなく、特に工業的生産を目的とした大量培養における、各工程の生成物についてはなおさらである。
【００１５】
一方、「安全で有効な医薬を製造するための重要な因子の一つが、高純度の生成物を得ることである。化学物質は、原料物質から化学合成、生物により生産された当該物質を単離・精製する又は遺伝子組換え細胞等を利用した生産で生成された当該物質を単離・精製する等の製法により取得される。一般的に、遺伝子組換法を含めいかなる製法を採用しようが、原料の純度、反応の不完全性、単離・精製過程での分解等により、製造される化学物質は１００％の純度のものを得ることは困難なことが多い。また、医薬の分野において、診断薬、治療薬は、不純物を含むと診断や治療に好ましくない影響を及ぼす可能性を否定することができないのは、本願発明の属する技術分野における技術常識に属することは明らかであり、できる限り高純度の生成物を得る事が重要とされている。」（東京高裁平成９年（行ケ）第３０２号事件（１２年２月１７日判決））のである。
【００１６】
そして、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、血中コレステロールを有効に低下させるために、投与期間が長期にわたるような薬剤であるため、特に高純度であることが必要とされる。
【００１７】
従って、上記のとおり、二段階発酵により生成されるプラバスタチン類は、一段階発酵により生成されるシンバスタチン及びロバスタチンに比べて、不純物もより多く含有するため、精製工程が特に重要であり、不純物を除去し高純度のプラバスタチンを単離・精製する方法を見出すための研究が続けられていた。
【００１８】
本発明者等は、特に、プラバスタチンを二段階発酵して生成する際に、下記一般式（Ｉ）
【００１９】
【化５】
2004002447.tif 000005
【００２０】
を有する化合物が必ず生成され、しかも上記化合物（Ｉ）の生産量が、プラバスタチンに変換培養する際に生成される不純物の中で最も多いことを見出した。しかしながら、このように、高純度のプラバスタチンを得るためには、医薬を製造するにあたり不純物とされる化合物の中でも、上記化合物（Ｉ）を確実に除去することが重要な課題であることがわかったものの、上記化合物（Ｉ）は、プラバスタチンの一つの不斉炭素上の水酸基にかかる光学異性体であるため、他の不純物に比べて除去することが非常に困難であった。
【００２１】
従って、クロマトグラフィーのような煩雑なものではなく、工程生産性を損なわず、しかもクロマトグラフィーで精製される程度の高純度で、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する方法、更に上記化合物（Ｉ）を除去し高純度のプラバスタチンを得ることができるような、簡便な単離・精製方法が望まれていた。
【００２２】
一方、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法としては、以下のものが知られている。
（１）ＷＯ９２／１６２７６号公報（特表平６−５０６２１０号公報）
本公報は、「高性能液体クロマトグラフィーを使用することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、及び、該精製方法により得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤」に関する。
【００２３】
本公報の精製方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製工程において、高性能液体クロマトグラフィーを用いることを特徴とする。一方、本発明の単離・精製方法は、酢酸ｎ−プロピル、酢酸ｎ−ブチルのような式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用することにより、プラバスタチンの不純物を除去するか、及び／又は、無機酸及び／又は無機塩基を用いて分解することにより不純物を除去し、高性能液体クロマトグラフィーを用いずに、高純度のプラバスタチンを得られることを特徴としている点で、本公報の精製方法とは相違する。
【００２４】
また、本発明の「上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下まで除去することを特徴とする」単離・精製方法については記載も示唆もされていない。
【００２５】
ところで、高性能液体クロマトグラフィーは、大量の溶媒を要し、それらに少量の不揮発性不純物が含まれ得るが故に、大規模生産の場合にはより深刻になる。溶媒の除去に際し、これらの不純物は試料に混入する。加えて、このように多量の溶媒を用いることにより、深刻な環境汚染や多額の蒸溜費用を招くことになる。
【００２６】
従って、高性能液体クロマトグラフィーは、煩雑であり、工業的なプラバスタチンの単離・精製に用いられる操作であるとは考えられない。
【００２７】
そして、プラバスタチンの工業生産にあたって、高性能液体クロマトグラフィーを用いたとしても、プラバスタチンの光学異性体である上記化合物（Ｉ）を除去し所望の純度のプラバスタチンを得ることは困難である。
（２）ＷＯ９９／４２６０１号公報
本公報は、「ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の濃縮培養液を、酸でｐＨ４．５乃至７．５に調節した後、酢酸エチルでＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を抽出し、所望によりラクトン化させた後結晶化することにより、９９．６％以上の純度を有するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を得る単離・精製方法」に関する。
【００２８】
本公報の精製方法は、菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、酢酸エチルを使用していることに対して、本発明の精製方法は、酢酸ｎ−プルピル、酢酸ｎ−ブチルのような式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用している点で、本発明の単離・精製方法とは相違する。
【００２９】
更に、本発明の単離・精製方法は、プラバスタチンの不純物を、無機酸及び／又は無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより高純度のプラバスタチンを得ることも特徴としているが、本公報では、無機酸及び／又は無機塩基を用いてＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の不純物を分解する工程については、記載も示唆もされていない。
【００３０】
また、本発明の「上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下まで除去することを特徴とする」単離・精製方法については、記載も示唆もされていない。
【００３１】
確かに、本公報の実施例３では、プラバスタチンの単離・精製方法が記載されているが、本実施例では、酢酸エチルで抽出されたプラバスタチンの純度が７０．３％足らずに留まっており、その後本発明の単離・精製方法とは相違するクロマトグラフィーを用いて精製する記載はあるものの、最終的に得られたプラバスタチンの純度については全く記載されていない。従って、最終的に高純度のプラバスタチンが得られているのか否かはそもそも不明であるし、加えて上記化合物（Ｉ）がプラバスタチンに対して、０．１重量％以下まで精製されているかどうかについても記載も示唆もされていない。
【００３２】
また、本公報の実施例において、９９．６％以上の高純度で得られるとされているロバスタチンでさえ、最終生成物のＨＰＬＣのチャート（Ｆｉｇ．４）を見る限り、純度が９９．６％以上のロバスタチンが得られているとは考えにくく、信憑性がない。
（３）ＷＯ００／１７１８２号公報
本公報は、「置換クロマトグラフィーを使用することを特徴とするＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製方法、及び、該精製方法により得られたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤」に関する。
【００３３】
本公報の精製方法は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の精製工程において、置換クロマトグラフィーを用いることを特徴とする。一方、本発明の単離・精製方法は、酢酸ｎ−プロピル、酢酸ｎ−ブチルのような式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する溶媒を使用して、プラバスタチンの不純物を除去するか、及び／又は、無機酸及び／又は無機塩基を用いて分解することにより不純物を除去し、置換クロマトグラフィーを含む一切のクロマトグラフィーを用いずに、高純度のプラバスタチンが得られることを特徴としている点で、本公報の精製方法とは相違する。
【００３４】
また、本発明の「上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下まで除去することを特徴とする」単離・精製方法については、記載も示唆もされていない。
【００３５】
そして、プラバスタチンの工業的生産にあたって、置換クロマトグラフィーを用いたとしても、煩雑であり、また、プラバスタチンの光学異性体である上記化合物（Ｉ）を除去することは困難である。
【００３６】
なお、上記精製方法の他に、通常、当業者が採用する単離・精製方法としては、例えば、分析用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を挙げることができるが、分析用ＨＰＬＣは、プラバスタチンの単離・精製方法としては実用的手段ではない。分析用ＨＰＬＣは、非常に細い直経の充填カラム（直径４．６ｍｍ×長さ２５ｃｍ）を用い、一回の分析毎に高圧にあるカラムに約１０μｇ（１×１０−２ｍｇ）の試料を添加するものであり、一回の分析は、約３０分を要する。試料はいずれはカラムから流出するものの、極端に稀釈された溶液状であり、分析系では成分検出は可能であるが、収集は実用的でない。更に、分析用ＨＰＬＣには収集系は付属しておらず、それを設置するにしても、固体試料を得たい場合には溶媒除去を要する。プラバスタチンの単離・精製に分析用ＨＰＬＣを使うとすると、僅か１個の５ｍｇ錠を作るに必要なプラバスタチンを単離・精製するのに、５００回の分析と２５０時間を要することとなり、分析用ＨＰＬＣはプラバスタチンの単離・精製の目的には非現実的な操作であるかが明らかである。
【００３７】
また、分取用ＨＰＬＣも、前述の理由により、商業規模のプラバスタチンの単離・精製に適した手法とはいえない。
【００３８】
シリカゲルクロマトグラフィーは、シリカゲル粒子の大きさに基づき、カラムクロマトグラフィーとフラッシュクロマトグラフィーに大別できるが、商業規模の単離・精製に使うに適した手法であるとは期待されなかった。
【００３９】
実際に、各種クロマトグラフィーを用いて、上記化合物（Ｉ）及びその他の不純物の分離を試みたが、上記化合物（Ｉ）はプラバスタチンの立体異性体であるため、該化合物をプラバスタチンから分離できなかった。
【００４０】
再結晶は、医薬品分野で広く用いられている単離・精製操作である。しかしながら、再結晶を使用しても、構造的にプラバスタチンと類似する上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンから選択的に分離し、組成物中のプラバスタチンの純度を所望の水準まで改善するには効果的でなかった。
【００４１】
ガスクロマトグラフィーや蒸溜といった、他の単離・精製法も考慮したが、いずれも試料分子の大きさの差異に準拠した分離に基づいており、両者とも試料の加熱を要する。しかしながら、プラバスタチンはその融点では分解する傾向があるため、これらを単離・精製法とすることができない。
【００４２】
また、上記化合物（Ｉ）を除去するため前記単離・精製方法のいずれかを繰り返し行ったとしても逆にプラバスタチンの収率をも減少させてしまう。
【００４３】
更に、上述されているような、従来知られているいかなる単離・精製方法を組み合わせても、上記化合物（Ｉ）を０．１％以下の量まで除去し、プラバスタチンの工業的生産に適用することはできなかった。
【００４４】
従って、工程生産性を損なうこともなく、高純度のプラバスタチン、特に、プラバスタチンの類縁物質である上記一般式（Ｉ）を有する化合物を除去することにより高純度であるプラバスタチンを得る事ができる単離・精製方法は、今まで全く知られていない。
【００４５】
本発明者らは、プラバスタチンを含有する医薬組成物について鋭意研究を行った結果、高純度のプラバスタチンを得る単離・精製方法、更にプラバスタチンの類縁物質である上記化合物（Ｉ）を含めた不純物を該医薬組成物から除去する単離・精製方法、特に上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンを含有する医薬組成物全量に対して０．１％以下の量まで除去する単離・精製方法を見出し、本発明を完成した。
【００４６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用することを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（２）　プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機酸を用いて、分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（３）　プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機塩基を用いて、分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
に関する。
【００４７】
好適には、
（４）　Ｒがｎ−プロピル基又はｎ−ブチル基である、（１）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（５）　無機酸が、リン酸である、（２）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（６）　無機酸を用いて分解する工程のｐＨが、２乃至５である、（２）又は（５）に記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
【００４８】
更に本発明は、
（７）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、（８）　プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（９）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、並びに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
に関し、好適には、
（１０）　Ｒがｎ−プロピル基又はｎ−ブチル基である、（７）又は（９）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（１１）　無機酸が、リン酸である、（７）乃至（１０）から選択されるいずれか一項に記載にのプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（１２）　無機酸を用いて分解する工程のｐＨが、２乃至５である、（７）乃至（１１）から選択されるいずれか一項に記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
また、本発明は、
（１３）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法に関し、好適には、
（１４）　Ｒがｎ−プロピル基又はｎ−ブチル基である、（１３）記載のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
【００４９】
また、本発明は、
（１５）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことにより、一般式（Ｉ）
【００５０】
【化６】
2004002447.tif 000006
【００５１】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、（１６）　プラバスタチンナトリウムを単離・精製する工程においてに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより、
一般式（Ｉ）
【００５２】
【化７】
2004002447.tif 000007
【００５３】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、（１７）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、並びに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより、
一般式（Ｉ）
【００５４】
【化８】
2004002447.tif 000008
【００５５】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
に関し、好適には、
（１８）　Ｒがｎ−プロピル基又はｎ−ブチル基である、（１５）又は（１７）記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、
（１９）　無機酸が、リン酸である、（１５）乃至（１８）から選択されるいずれか一項に記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法、
（２０）　無機酸を用いて分解する工程のｐＨが、２乃至５である、（１５）乃至（１９）から選択されるいずれか一項に記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
を挙げることができる。
【００５６】
更に本発明は、
（２１）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことにより、
一般式（Ｉ）
【００５７】
【化９】
2004002447.tif 000009
【００５８】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量まで除去することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
に関し、好適には、
（２２）一般式（Ｉ）
【００５９】
【化１０】
2004002447.tif 000010
【００６０】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、工業的に生産されたプラバスタチンナトリウムを含有する組成物、
（２３）　Ｒがｎ−プロピル基又はｎ−ブチル基である、（２１）記載のプラバスタチンナトリウムの単離・精製方法
を挙げることができる。
【００６１】
また、本発明は、
（２４）　（１）乃至（２３）のいずれか一項に記載の単離・精製方法により得られ、一般式（Ｉ）
【００６２】
【化１１】
2004002447.tif 000011
【００６３】
を有する化合物を、プラバスタチンナトリウムに対して、０．１重量％以下の量で含有することを特徴とする、プラバスタチンナトリウムを含有する組成物
に関する。
【００６４】
本発明において、「プラバスタチン類」とは、下記式（ＩＩ）
【００６５】
【化１２】
2004002447.tif 000012
【００６６】
を有するプラバスタチン又はその薬理上許容される塩、及び、上記式（ＩＩ）と類似の構造を有する化合物、即ちプラバスタチンの類縁物質（例えば、上記化合物（Ｉ）を挙げることができる。）をいう。
【００６７】
プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製は、通常、以下に記載する単離・精製方法によって達成される。
【００６８】
まず、変換培養を終えたプラバスタチンを含む培養液を、常法に従って、ろ過及び／又は遠心法により、菌体を分離し、その後濃縮して培養濃縮液を得る。
【００６９】
得られた培養濃縮液は、所望により、酸を用いてｐＨを調節した後、酢酸エチルのような水と混和しにくい有機溶媒を用いてプラバスタチン類を抽出する。例えば、ＷＯ９９／４２６０１号公報では、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む培養濃縮液を、酸を用いてｐＨを４．５〜７．５（好適には５．５〜７．５）に調節した後、酢酸エチルを用いて抽出している。
【００７０】
そのようにして得られたプラバスタチン類は常法に従って、上記抽出液から採取される。例えば、上記抽出液を、水、飽和食塩水等で洗浄後、水酸化ナトリウムを加え、抽出分液し、逆抽出水層としてプラバスタチン塩の水溶液を得る事ができる。得られたプラバスタチン塩は、所望により結晶化することもできる。
【００７１】
所望により行なわれる結晶化は、一般に有機合成化学の技術において周知の方法、例えば、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ，　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”　Ｖｏｌ．　Ａ２４，　５ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ　（１９９３）　，　ｐｐ．　４３７−５０５に記載の方法により以下のように行うことができる。
【００７２】
結晶化の方法としては、例えば、得られたプラバスタチン又はその薬理上許容される塩の組成物に、有機溶媒及び水を加え、加温溶解し、接種することにより、結晶体としてプラバスタチンを得る事ができる。
【００７３】
結晶化に使用される有機溶媒としては、例えば、ヘキサン、ヘプタンのような脂肪族炭化水素類；トルエン、キシレンのような芳香族炭化水素類；酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸ｎ−ブチルのようなエステル類；酢酸のような有機酸類；メタノ−ル、エタノ−ル、ｎ−プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、ｎ−ブタノ−ル、イソブタノ−ル、ｔ−ブタノ−ル、イソアミルアルコ−ル、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノールのようなアルコ−ル類；アセトン、メチルエチルケトンのようなケトン類；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテルのようなエ−テル類；ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルリン酸トリアミドのようなアミド類；ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類；水と１種類以上の上記有機溶媒との混合溶媒；であり、好適には、水と１種類以上の上記有機溶媒との混合溶媒であり、更に好適には、水と、アルコ−ル類、エステル類及びケトン類から選択される１種類以上の有機溶媒との混合溶媒であり、最も好適には、水、アルコール類及びエステル類の混合溶媒である。
【００７４】
本発明の単離・精製方法は、上述のように常法に従って、培養濃縮液を得た後、酢酸エチルではなく、式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）を有する有機溶媒を用いて抽出することを特徴とする。
【００７５】
上記式中、Ｒの定義における「炭素数３以上のアルキル基」は、例えば、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル基のような基であり、好適には、炭素数３乃至６個の直鎖又は分枝鎖アルキル基であり、好適にはＣ３−Ｃ４アルキル基であり、最も好適には、ｎ−プロピル又はｎ−ブチル基である。
【００７６】
また、本発明の単離・精製方法は、上述のようなプラバスタチンの単離・精製方法において、プラバスタチンの不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び／又は、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする。
【００７７】
プラバスタチンの不純物を無機酸を用いて分解する工程及び不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行う場合は、順不同で希望する工程を、単離・精製方法において適宜実施することができる。そのような単離・精製方法の具体例としては、例えば、
（ａ）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機酸を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、（ｂ）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、かつ、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（ｃ）　プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を単離・精製する工程において、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を順不同で行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法、
（ｄ）　菌により生成されたプラバスタチン類を含む培養濃縮液から、有機溶媒を用いて、プラバスタチン類を抽出する工程において、有機溶媒として、
式　ＣＨ３ＣＯ２Ｒ（上記式中、Ｒは炭素数３以上のアルキル基を示す。）
を有する溶媒を使用し、並びに、不純物を無機酸を用いて分解する工程、及び、不純物を無機塩基を用いて分解する工程を行うことを特徴とする、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の単離・精製方法
を挙げることができる。
【００７８】
プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の不純物を無機酸により分解する工程は、不活性溶媒の存在下又は非存在下（好適には、存在下）、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を、ｐＨ２乃至５を付与する条件（好適にはｐＨ３乃至４）で行われる。
【００７９】
不純物の無機酸分解で使用される「無機酸」とは、通常、酸として用いられる無機物質であれば特に限定はないが、例えば、臭化水素酸、塩酸、硫酸、過塩素酸、リン酸、硝酸のような無機酸を挙げることができ、好適には、リン酸又は硫酸である。
【００８０】
反応温度及び反応時間は、ｐＨ値にも依存するが、基本的には、反応温度が低ければ反応時間は長くする必要があり、反応温度が高ければ反応時間は短くする必要があるが、例えば、２０℃〜８０℃（好適には、４０℃〜６０℃）にて、１分間乃至６時間（好適には、５分間乃至２０分間）、処理することにより行なわれる。
【００８１】
不純物の無機酸分解で使用される「不活性溶媒」は、通常、溶媒として使用されるものであれば特に限定はないが、例えば、メタノ−ル、エタノ−ル、ｎ−プロパノ−ル、イソプロパノ−ル、ｎ−ブタノ−ル、イソブタノ−ル、ｔ−ブタノ−ル、イソアミルアルコ−ル、ジエチレングリコール、グリセリン、オクタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブのようなアルコ−ル類；水；水と上記有機溶媒との混合溶媒；であり、好適には、水又は水と上記有機溶媒との混合溶媒であり、最も好適には、水又は水とエタノ−ルとの混合溶媒である。
【００８２】
反応終了後、目的化合物であるプラバスタチンは常法に従って、反応液から採取される。例えば、酢酸エチルのような水と混和しない有機溶媒を加え、目的化合物を含む有機層を分離し、水等で洗浄して、溶剤を留去することによって得られる。更に必要ならば、活性炭を加えて脱色し、ろ過して活性炭を除去した後、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドのような塩を形成する試薬を加え、ロータリエバポレーター等により減圧下濃縮して、プラバスタチンの塩を得ることができる。
【００８３】
プラバスタチン又はその薬理上許容される塩の不純物を無機塩基で分解する工程は、不活性溶媒の存在下又は非存在下（好適には、存在下）に、プラバスタチン又はその薬理上許容される塩を、ｐＨ１０〜１４を付与する条件（好適には、ｐＨ１１〜１３）で行われる。
【００８４】
不純物の無機塩基分解で使用される「無機塩基」とは、通常の反応において塩基として使用される無機物質であれば特に限定はないが、例えば、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムのようなアルカリ金属炭酸塩類；炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムのようなアルカリ金属重炭酸塩類；水素化リチウム、水素化ナトリウム、水素化カリウムのようなアルカリ金属水素化物類；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物類；リチウムメトキシド、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムｔ−ブトキシドのようなアルカリ金属アルコキシド類を挙げることができ、好適には、アルカリ金属水酸化物類であり、最も好適には、水酸化ナトリウムである。
【００８５】
反応温度及び反応時間は、ｐＨ値にも依存するが、基本的には、反応温度が低ければ反応時間は長くする必要があり、反応温度が高ければ反応時間は短くする必要があるが、例えば、−１０℃〜１１０℃（好適には、０℃〜１００℃）にて、１５分乃至６０時間（好適には、３０分間乃至７２時間）、処理することにより行なわれ、より好適には、０℃付近で、３０時間前後である。
【００８６】
不純物の無機塩基分解で使用される「不活性溶媒」は、本反応に不活性なものであれば特に限定はないが、不純物の無機酸分解で使用される不活性溶媒と同様のものを挙げることができる。
【００８７】
反応終了後、目的化合物であるプラバスタチンは常法に従って、上記反応液から採取される。例えば、硫酸水溶液のような酸を加え、酢酸エチルのような水と混和しない有機溶媒を加え、目的化合物を含む有機層を分離し、水等で洗浄して、溶剤を留去することによって得られる。更に必要ならば、活性炭を加えて脱色し、ろ過して活性炭を除去した後、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、水酸化ナトリウムのような塩を形成する試薬を加え、ロータリエバポレーター等により減圧下濃縮して、プラバスタチンの塩を得ることができる。
【００８８】
更に、本発明の単離・精製方法は、得られたプラバスタチン塩を結晶化する工程を含んでいてもよく、結晶化する方法は、上述のように常法に従って行うことができる。
【００８９】
なお、本発明の精製度の分析は、、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を介して行うことができる。ＨＰＬＣの測定条件は、
Ａ：移動相：２０％アセトニトリル、３０％メタノール、５０％ＴＥＡＰ緩衝液（０．３％Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ３．２））；
検出波長：ＵＶ２３８ｎｍ；
カラム：Ｗａｔｅｒｓ社製逆相カラムＳｙｍｍｅｔｒｙ　Ｃ１８　３．５μｍ，φ４．６ｍｍ×１５ｃｍ；
流量：１ｍｌ／ｍｉｎ
Ｂ：移動相：メタノール：水：酢酸（１００）：トリエチルアミン混液（６００：４００：１：１）；
検出波長：ＵＶ２３８ｎｍ；
カラム：エルマ光学製カラムＥＲＣ‐ＯＤＳ‐１２６２　φ６ｍｍ×１０ｃｍ；
カラム温度：３０℃；
流量：１ｍｌ／ｍｉｎ
Ｃ：移動相：メタノール：水：酢酸（１００）：トリエチルアミン混液（４５０：５５０：１：１）；
検出波長：ＵＶ２３８ｎｍ；
カラム：ＢＥＣＫＭＡＮ社製カラムＵＬＴＲＡＳＰＨＥＲＥ　ＯＤＳ　φ４．６ｍｍ×１５ｃｍ　５μｍ；
カラム温度：２５℃；
流量：１．３ｍｌ／ｍｉｎ
である。
【００９０】
以下に、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００９１】
【実施例】
実施例１　培養濃縮液より酢酸ｎ−ブチルを用いた抽出
（１ａ）培養液の濃縮
変換培養を終えたプラバスタチン培養液１０　Ｌを水酸化ナトリウムでｐＨ１２としたのち、５０℃に加温し３０分間撹拌した。培養液を室温に冷却後、ろ過助剤として５００　ｇのセライト５４５（商標）（セライト　コーポレーション社製）を加えてろ過した。分離した菌体に水を３　Ｌ加え、再度懸濁させた後ろ過した。得られた２つの濃縮液を合併し１０　Ｌの培養濃縮液を得た。
（１ｂ）酢酸ｎ−ブチルを用いた抽出
得られた培養濃縮液を２５％硫酸でｐＨ５．７とした後、５　Ｌの酢酸ｎ−ブチルを加え撹拌してプラバスタチンを抽出した。分離した水層を７５％硫酸でｐＨ５．７とした後、５　Ｌの酢酸ｎ−ブチルを加えて撹拌し抽出した。得られた２つの酢酸ｎ−ブチル層を合併し、これに２　Ｌの飽和食塩水を加えて撹拌して洗浄した。上層を分離して得た８Ｌの抽出液に１　Ｌの水を加え、撹拌しながら２５％水酸化ナトリウムを加えてｐＨ９．５とした後、水層を分離してプラバスタチンのナトリウム塩水溶液１　Ｌを得た。ＨＰＬＣ（条件Ａ）によるプラバスタチンナトリウムの純度は、９０％以上であった。本実施例の結果より、酢酸ｎ−ブチルを用いることにより、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られていることが明らかである。
【００９２】
実施例２　培養濃縮液より酢酸ｎ−プロピルを用いた抽出
酢酸ｎ−ブチルのかわりに酢酸ｎ−プロピルを用いて、実施例１と同様に処理をし、プラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。ＨＰＬＣ（条件Ａ）によるプラバスタチンナトリウムの純度は、８５％以上であった。本実施例の結果より、酢酸ｎ−プロピルを用いることにより、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られていることが明らかである。
【００９３】
実施例３　リン酸による不純物の分解
実施例１で得られた水溶液［ＨＰＬＣ（条件Ａ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは９．３％］に３５０　ｍｌのエタノールを加え、リン酸でｐＨ３．０に調整した後５０℃で１０分間撹拌した。ＨＰＬＣ（条件Ａ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは０．９％であった。本実施例の結果より、リン酸を用いることにより、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
【００９４】
実施例４　硫酸による不純物の分解
リン酸のかわりに硫酸を用いて、実施例３と同様に処理をした。ＨＰＬＣ（条件Ａ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは３％であった。本実施例の結果より、硫酸を用いることにより、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
【００９５】
実施例５　水酸化ナトリウムによる不純物の分解、抽出及び結晶化
（５ａ）水酸化ナトリウムによる不純物の分解
プラバスタチンの培養濃縮液５００ｍｌ［ＨＰＬＣ（条件Ｂ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは１２．１％］を１００℃まで加熱した後、２当量分の水酸化ナトリウムを水溶液として添加した（ｐＨ１１．３）。１００℃で３時間攪拌後冷却し、室温にて２０％硫酸水溶液でｐＨ８．５に調整し、水酸化ナトリウムによるアルカリ処理液を得た（プラバスタチンナトリウムの含有量：５６．６ｇ）。ＨＰＬＣ（条件Ｂ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウムは０．４１％であった。本実施例の結果より、水酸化ナトリウムを用いることにより、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
（５ｂ）水酸化ナトリウムによる不純物の分解後の抽出及び結晶化
（５ａ）で得られた水酸化ナトリウムによるアルカリ処理液２６０ｇ（プラバスタチンナトリウムの含有量：１９ｇ）に酢酸ｎ−ブチルを用いて、実施例（１ｂ）と同様にして水層を分離してプラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。
【００９６】
得られたプラバスタチンのナトリウム塩水溶液を約１／２量まで減圧濃縮した後、水７７ｍｌを加え再び減圧濃縮した。濃縮液をプラバスタチンのフリー体に対して６倍量となるように水で液量を調整して０〜５℃まで冷却し、２０％硫酸水溶液を滴下しｐＨ４．６でプラバスタチンのフリー体結晶を析出し、１晩攪拌した後にろ過した。結晶を冷希硫酸（ｐＨ４）で洗浄し、プラバスタチンのフリー体湿品結晶を得た。
【００９７】
プラバスタチンのフリー体湿品に酢酸エチル６３ｍｌを加え室温で溶解した後、室温で攪拌しながら２０％硫酸水溶液でｐＨ４．５に調整し、攪拌抽出分液後酢酸エチル層に水２１ｍｌを加え抽出洗浄後分液した。抽出洗浄した酢酸エチル層にエタノール２５ｍｌを加えた後、室温で攪拌しながら６％水酸化ナトリウム・エタノール溶液でｐＨ８．７に調整しナトリウム塩化液を得た。この後、常法に従って結晶化し、プラバスタチンナトリウム塩の結晶８．９５ｇを得た。この方法で得られたプラバスタチンナトリウム塩のＨＰＬＣ（条件Ｃ）による純度は９９．６７％であり、化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム＝０．１％であった。
【００９８】
本実施例の結果より、水酸化ナトリムによる不純物の分解工程及び酢酸ｎ−ブチルを用いた抽出工程によって、化合物（Ｉ）が顕著に除去されていることが明らかである。
【００９９】
実施例６　酢酸ｎ−ブチルによる抽出、リン酸による不純物の分解、及び結晶化
実施例３で得られた酸処理液に、２５％水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１２としさらに５０℃で３０分撹拌を続けた。溶液を減圧下ロータリーエバポレーターで１　Ｌまで濃縮し、プラバスタチンナトリウム塩を含有する濃縮液を得た。得られた濃縮液を硫酸でｐＨ４．０に調整した後、プラバスタチンを０．５　Ｌの酢酸エチルで抽出し、抽出液を水０．２　Ｌで洗浄した。抽出液に５　ｇの活性炭を加え１０分間放置した後、ろ紙でろ過し、ろ液を２５％水酸化ナトリウムでｐＨ８．７に調整したのち、減圧下ロータリーエバポレーターで乾固して５０　ｇのプラバスタチンナトリウム塩を得た。常法に従って結晶化し、３４　ｇのプラバスタチンナトリウム塩の粗結晶を得た。粗結晶を同じ組成の溶媒を用いて再結晶してプラバスタチンナトリウム塩の純粋な結晶　３２　ｇを得た。
【０１００】
この方法で得られたプラバスタチンナトリウム塩のＨＰＬＣ（条件Ａ）による純度は９９．７％以上であり、化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム＝０．１％であった。
【０１０１】
本実施例より、酢酸ｎ−ブチルによる抽出及びリン酸による不純物の分解工程によって、化合物（Ｉ）が０．１％以下まで除去され、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られたことが明らかである。
【０１０２】
更に、酢酸ｎ−ブチルによる抽出及びリン酸による不純物の分解工程に、水酸化ナトリウムによる不純物の分解工程を加えることにより、化合物（Ｉ）が更に除去され、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られたことが明らかである。
【０１０３】
実施例７　水酸化ナトリウムによる不純物の分解、硫酸による分解及び結晶化実施例（５ａ）で得られた水酸化ナトリウムによるアルカリ処理液から、酢酸エチルを用いて、実施例（５ｂ）と同様にして抽出し、プラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。得られた水溶液に３５０　ｍｌのエタノールを加え、硫酸でｐＨ１．５に調整した後２０℃で１時間撹拌した。常法に従って結晶化し、プラバスタチンナトリウム塩の純粋な結晶を得た。ＨＰＬＣ（条件Ｃ）による化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム＝０．１％以下であった。
【０１０４】
本実施例より、硫酸による不純物の分解及び水酸化ナトリウムによる不純物の分解工程によって、化合物（Ｉ）が０．１％以下まで除去され、高純度のプラバスタチンナトリウムが得られた。
【０１０５】
比較例１
酢酸エチルによるプラバスタチンの抽出
酢酸ｎ−ブチルのかわりに酢酸エチルを用いて、実施例（１ａ）と同様に処理をし、プラバスタチンのナトリウム塩水溶液を得た。ＨＰＬＣ（条件Ａ）によるプラバスタチンナトリウムの純度は、約７０％であった。
【０１０６】
培養濃縮液から、プラバスタチン類を抽出する有機溶媒が、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、及び酢酸ｎ−ブチルである場合の、化合物（Ｉ）／プラバスタチンナトリウム（％）は、以下のとおりである。下記結果より、酢酸エチルで抽出するよりも、酢酸ｎ−プロピル及び酢酸ｎ−ブチルにより抽出することによって、高純度のプラバスタチンが得られていることが明らかである。
【０１０７】
【表１】
実施例（１ａ）　　　実施例２　　　　比較例１
抽出溶媒　　　　　　酢酸ｎ−ブチル　　酢酸ｎ−プロピル　　酢酸エチル
フ゜ラハ゛スタチンの純度（％）　　＞９０　　　　　＞８５　　　　約７０
【０１０８】
【発明の効果】
本発明の精製方法は、カラムクロマトグラフィーのような煩雑かつ生産性の低く、工業的生産に向かない方法を使用することなく、従って、工程生産性及びプラバスタチンの純度を損なうことなく、高純度のプラバスタチン又はその薬理上許容される塩を得ることができた。
【０１０９】
また、本発明の単離・精製方法により上記化合物（Ｉ）をプラバスタチンに対して０．１％以下の量まで除去された。