(57)【要約】      （修正有）【課題】新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供する。【解決手段】本発明にかかるタンパク質及びその遺伝子は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子であり、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／または、該アミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質と、これをコードする遺伝子である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項２】
マウス由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、８３〜２４０７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、８３〜３０２５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列のうち、８３〜２３９８番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号７に示される塩基配列のうち、２０９〜３２３５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項７】
配列番号９に示される塩基配列のうち、７４〜１８５２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項８】
配列番号１１に示される塩基配列のうち、５０７〜２０８７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項９】
配列番号１３に示される塩基配列のうち、１〜２９９１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１または２記載の遺伝子。
【請求項１０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項１２】
分泌タンパク質である請求項１０または１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１５】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞外マトリックスは、組織の細胞を取り巻く細胞支持組織であり、コラーゲン、エラスチン、フィブリリンなどの繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの糖タンパク質、プロテオグリカンなどの複合糖質及びヒアルロン酸などの糖質を含んでいる。
【０００３】
これら細胞外マトリックスは、細胞表面レセプターと結合することにより細胞接着、移動、増殖、分化、形態、代謝など細胞の活動に重大な影響を与えることが知られている。したがって、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍など多くの生体現象と関連することが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｓｃｈｅｅｔｚ  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｌｌｏｙｄ  Ｊｏｎｅｓ著、「Ｔｈｅ  ＴｅｎａｓｃｉｎＦａｍｉｌｙ  ｏｆ  ＥＣＭ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．」、ＷＩＬＥＹ−ＬＥＳＳ，  Ｉｎｃ発行、ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＡＬ  ＤＹＮＡＭＩＣＳ、２１８：  ｐ２３５−２５９  （２０００）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように、細胞外マトリックス因子は細胞、組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。したがって、これら細胞外マトリックス因子の遺伝子、タンパク質やこれらタンパク質に対する抗体は、受精、胚発生、形態形成等を研究する上で、さらに、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で、非常に有用である。また、これらの遺伝子や抗体は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や、その治療効果の検査などにも有用である。そのため、より多くの新規細胞外マトリックス因子を見出し、これを生産し利用する方法の開発が強く望まれていた。
【０００６】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡ、もしくは分泌シグナル配列はもたないが既知細胞外マトリックス因子に高頻度に見られるモチーフを有する特徴的なｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、または特異的抗体を作製し、これらの機能を解析したところ、これらタンパク質は分泌タンパク質であり、新規の細胞外マトリックスタンパク質であること、または細胞外マトリックス因子に特徴的なモチーフを有し、生体内でのタンパク質の発現分布パターンから細胞外マトリックスタンパク質であると予測されること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【０００９】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者が今回新たに細胞外マトリックスタンパク質として単離・同定したものであり、Ｎ末端側に予想分泌シグナル配列を有する。また、後述の実施例に示すように、機能解析の結果、これらタンパク質は細胞外に分泌される分泌タンパク質であり、細胞外マトリックスタンパク質であること等が実験的に確認されている。
【００１０】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、または１３に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１１】
本発明に係る形質転換体は、例えば、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００１２】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１〜図２０に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
本発明は、新規な細胞外マトリックス因子であるタンパク質とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００１５】
本発明者は、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来ｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含む５つのｃＤＮＡをスクリーニングし、これら５つの全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこれら５つのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００１６】
以下の説明では、第１の新規ｃＤＮＡを「２５１６７遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「２５１６７タンパク質」と称して説明する。また、配列を決定した第２の新規ｃＤＮＡを「２９０２７遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「２９０２７タンパク質」と称して説明する。同様に、配列を決定した第３の新規ｃＤＮＡを「４０３４１遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「４０３４１タンパク質」と称して説明する。また、配列を決定した第４の新規ｃＤＮＡを「３５１１２遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「３５１１２タンパク質」と称して説明する。また、配列を決定した第５の新規ｃＤＮＡを「マウステネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）−Ｗ遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「マウステネイシン（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）−Ｗタンパク質」と称して説明する。
【００１７】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよい。
【００１８】
本実施の形態では、具体的には、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、８３〜２４０７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（２５１６７バリアント１遺伝子：マウスａｄｕｌｔ  ｔｅｓｔｉｓ由来）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、８３〜３０２５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（２５１６７バリアント２遺伝子：マウスａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ由来）、▲３▼配列番号５に示される塩基配列のうち、８３〜２３９８番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（２５１６７バリアント３遺伝子：マウスａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ由来）、▲４▼配列番号７に示される塩基配列のうち、２０９〜３２３５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（２９０２７遺伝子：マウス６  ｄａｙｓ  ｎｅｏｎａｔｅ  ｓｋｉｎ由来）、▲５▼配列番号９に示される塩基配列のうち、７４〜１８５２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（４０３４１遺伝子：マウスａｄｕｌｔ  ｍａｌｅ  ｂｏｎｅ由来）、▲６▼配列番号１１に示される塩基配列のうち、５０７〜２０８７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（３５１１２遺伝子：マウス１６  ｄａｙｓ  ｎｅｏｎａｔｅ  ｔｈｙｍｕｓ由来）、▲７▼配列番号１３に示される塩基配列のうち、１〜２９９１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（マウステネイシン−Ｗ遺伝子：マウス１６  ｄａｙｓ  ｅｍｂｒｙｏ  ｈｅａｄ由来）のほか、上記ｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡ等が例示される。これら遺伝子はマウス由来である。
【００１９】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとしてまたはアンチセンス薬物として利用できる可能性がある）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２０】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、７７５のアミノ酸残基からなっている２５１６７バリアント１タンパク質、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、９８１のアミノ酸残基からなっている２５１６７バリアント２タンパク質、▲３▼配列番号６に示されるアミノ酸配列を有しており、７７２のアミノ酸残基からなっている２５１６７バリアント３タンパク質、▲４▼配列番号８に示されるアミノ酸配列を有しており、１００９のアミノ酸残基からなっている２９０２７タンパク質、▲５▼配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有しており、５９３のアミノ酸残基からなっている４０３４１タンパク質、▲６▼配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有しており、５２７のアミノ酸残基からなっている３５１１２タンパク質、▲７▼配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有しており、９４０のアミノ酸残基からなっているマウステネイシン−Ｗタンパク質等が例示される。以下に、これらのタンパク質について詳細に説明する。
【００２１】
＜２５１６７タンパク質＞
図１（ａ）は、２５１６７遺伝子のスプライシングパターンの違いによる３種類のタンパク質のでき方を表している。図１（ｂ）は、上記３種類のタンパク質の１つである２５１６７バリアント２タンパク質の構造を模式的に示す図である。
【００２２】
上記２５１６７タンパク質は、図１（ａ）に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、スプライシングの違いにより少なくとも３つのバリアントタンパク質、すなわち２５１６７バリアント１タンパク質、２５１６７バリアント２タンパク質、２５１６７バリアント３タンパク質が確認されている。
【００２３】
図１（ａ）の数字は、配列番号１に示す２５１６７バリアント１遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列の番号を示す。また、アスタリスク１、２、３（＊１、＊２、＊３）は、それぞれ２５１６７バリアント１遺伝子、２５１６７バリアント２遺伝子、２５１６７バリアント３遺伝子における読み枠で最初に現れる終始コドンの位置を示す。すなわち、２５１６７バリアント２遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からＳ２領域（２３９８〜２４６４番目の領域）がスプライシングにより除かれることにより生成する。また、２５１６７バリアント３遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からＳ３領域（２３９８〜２５４４番目の領域）がスプライシングにより除かれることにより生成する。
【００２４】
この図１（ａ）に示すように、シグナル配列からそのままの読み枠で翻訳されると７７５アミノ酸からなる２５１６７バリアント１タンパク質が生成される。一方、スプライシングによって２３９７番目の塩基と２４６５番目の塩基とがつながる場合、２５１６７バリアント１タンパク質の終始コドン（＊１）は飛ばされて翻訳され、推定膜貫通領域を有する９８１アミノ酸からなる２５１６７バリアント２タンパク質が生成される。また、スプライシングにより２３９７番目の塩基と２５４５番目の塩基とがつながる場合、２５１６７バリアント２遺伝子と異なる読み枠で翻訳され、すぐに終始コドン（＊３）が出現して７７２アミノ酸残基からなる２５１６７バリアント３タンパク質が生成される。同図からも明らかなように、２５１６７バリアント２タンパク質のみが推定膜貫通領域を有し、その他のタンパク質は、推定膜貫通領域を持たないため分泌タンパク質であることが予想される。すなわち、２５１６７バリアント２タンパク質は膜型タンパク質であり、他の２つの２５１６７バリアントタンパク質は分泌型タンパク質と思われる。この２５１６７バリアント２タンパク質の有する推定膜貫通領域は、図１（ｂ）に示すように、９３７番目〜９５３番目のアミノ酸残基から構成されていると考えられる。
【００２５】
なお、２５１６７バリアント１タンパク質をコードするｍＲＮＡの場合、配列番号１に示す２５４４番目〜２５４５番目の領域にはイントロンが存在するが、２３６３番目〜２５４４番目の領域は一つのエキソンであり、２５１６７バリアント２遺伝子のスプライシングはエキソン内スプライシングである。
【００２６】
また、図１（ｂ）に２５１６７バリアント２タンパク質の構造を例に、糖鎖付加予測位置を示す。同図に示す数字は、配列番号４に示す２５１６７バリアント２タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の番号を示す。２５１６７バリアント１タンパク質、２５１６７バリアント２タンパク質および２５１６７バリアント３タンパク質は、７７４番目のアミノ酸残基まで同じアミノ酸配列を有する。また、後述する実施例に示す、２５１６７タンパク質に対する抗体作製のために用いた抗原領域２ケ所を、２５１６７バリアント２タンパク質の下に横線で示した。この図から明らかなように、この２つの抗原領域は、３つの２５１６７バリアントタンパク質に共通している領域であるため、実施例の２５１６７タンパク質に対する特異的抗体は、３つの２５１６７バリアントタンパク質の全てを認識すると考えられる。
【００２７】
また、同図に示すように、２５１６７バリアント１タンパク質および２５１６７バリアント３タンパク質におけるＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）は、６ケ所（６２、１１４、２８９、５１３、５６１、７４５番目のアミノ酸残基）である。２５１６７バリアント２タンパク質におけるＮ型糖鎖結合部位は、１０ケ所（６２、１１４、２８９、５１３、５６１、７４５、８２６、８８４、９１１、９１６番目のアミノ酸残基）である（図１（ｂ）中の黒丸棒で示す位置）。
【００２８】
さらに、その相同性を比較すると、上記３つの２５１６７バリアントタンパク質をコードするｃＤＮＡはいずれも、５’側を除いた領域でヒトｔｅｓｔｉｓ由来のｃＤＮＡ（ＦＬＪ２３５５２遺伝子）と核酸レベルで５５％の相同性を示す。また、２５１６７バリアント２タンパク質は、サルｔｅｓｔｉｓ由来のｃＤＮＡ（Ｍａｃａｃａ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ５３．８ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子）と核酸レベルで６７％、アミノ酸レベルで５５％の相同性を示す。これらのことから、ヒトＦＬＪ２３５５２遺伝子およびＭａｃａｃａ  ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ５３．８ｋＤａ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子はＮ末端（アミノ末端）をコードする領域が欠損していると考えられる。なお、上記両ｃＤＮＡともスプライシングパターンは２５１６７バリアント２タンパク質と同様であり、推定膜貫通領域を有する。
【００２９】
上記２５１６７バリアント１タンパク質、２５１６７バリアント２タンパク質、および２５１６７バリアント３タンパク質のアミノ酸組成は、それぞれ表１〜３に示すようになっている。
【００３０】
【表１】
2004180541.tif 000002
【００３１】
【表２】
2004180541.tif 000003
【００３２】
【表３】
2004180541.tif 000004
【００３３】
＜２９０２７タンパク質＞
図２は、２９０２７タンパク質の構造を模式的に示す図であり、図中の数字は、配列番号８に示す２９０２７タンパク質のアミノ酸配列を示す数字である。上記２９０２７タンパク質は、図２に示すように、１００９アミノ酸残基からなるタンパク質であり、Ｎ末端側から順に、シグナル配列、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン（ＦＮＩＩＩ）、ＥＧＦリピート（ＥＧＦｒ）とラミニンＧドメイン（ＬＧ）との３回交互繰り返し構造を有するものである。この３つあるラミニンＧドメインのうち１番目のドメインおよび３番目のドメインには、細胞外マトリックス因子として知られているフィブロネクチンと細胞膜上に存在するインテグリン分子との結合に重要なＲＧＤ配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列）がそれぞれ１つずつ存在している（配列番号８における４３４〜４３６番目と８７２〜８７４番目）。また、Ｎ型糖鎖結合部位は２ケ所存在する（４７番目、９０９番目のアミノ酸残基）。また、２９０２７タンパク質に対する特異的な抗体作製のための抗原領域としては、ＦＮＩＩＩとＥＧＦｒとの間に存在するスペーサー領域を用いた（図中、横線で示した領域）。一方、推定膜貫通領域は存在しない。
【００３４】
また、その相同性を比較すると、細胞外マトリックス因子の一つであるヒトアグリンのラミニンＧドメインを含む領域とアミノ酸レベルで約３０％の相同性を示している。
【００３５】
上記２９０２７タンパク質のアミノ酸組成は表４に示すようになっている。
【００３６】
【表４】
2004180541.tif 000005
【００３７】
＜４０３４１タンパク質＞
図３は、４０３４１タンパク質の構造を模式的に示す図であり、図中の数字は、配列番号１０に示す４０３４１タンパク質のアミノ酸配列を示す数字である。上記４０３４１タンパク質は、図３に示すように、５９３アミノ酸残基からなり、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有するが、他には既知のドメイン構造を有しない。また、４つのＮ型糖鎖結合部位が認められる（４１、１３４、３０３、５３６番目のアミノ酸残基）。また、セリン−グリシン配列が複数認められ、コンドロイチン硫酸が結合している可能性がある。膜貫通領域は存在しない。また、後述する実施例に示す、４０３４１タンパク質に対する特異的な抗体作製に用いた抗原領域２ケ所を図中に横線で示す。
【００３８】
また、その相同性を比較すると、５７３アミノ酸からなるヒトＦＬＪ２１１２７タンパク質全長とアミノ酸レベルで６７．３％の相同性を示す。このことから、ヒトＦＬＪ２１１２７遺伝子は４０３４１遺伝子のヒトオルソログと考えられる。
【００３９】
上記４０３４１タンパク質のアミノ酸組成は表５に示すようになっており、セリン残基が多く存在している（１０．１２％）。
【００４０】
【表５】
2004180541.tif 000006
【００４１】
＜３５１１２タンパク質＞
図４は、３５１１２タンパク質の構造を模式的に示す図であり、図中の数字は、配列番号１２に示す３５１１２タンパク質のアミノ酸配列を示す数字である。上記３５１１２タンパク質は、図４に示すように、５２７アミノ酸からなり、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有するが、他には既知のドメイン構造を有しない。また、３つのＮ型結合糖鎖部位が認められる（２６３、３５４、４９３番目のアミノ酸残基）。また、後述する実施例に示す、３５１１２タンパク質に対する特異的な抗体作製に用いた抗原領域２ケ所を図中に横線で示す。
【００４２】
また、相同性を比較したところ、既知のタンパク質との相同性は認められなかった。
【００４３】
上記３１４１８タンパク質のアミノ酸組成は表６に示すようになっており、全体的に親水性アミノ酸が多い。
【００４４】
【表６】
2004180541.tif 000007
【００４５】
＜マウステネイシン−Ｗタンパク質＞
図５（ａ）は、マウステネイシン−Ｗタンパク質の部分構造を模式的に示す図であり、図中の数字は、配列番号１４に示すマウステネイシン−Ｗタンパク質のアミノ酸配列を示す数字である。図５（ｂ）は、マウステネイシン−Ｗタンパク質の情報をもとに、セレラ社の予測しているタンパク質の構造を、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質に対応する位置に分けて並べて示した図である。
【００４６】
テネイシン−Ｗ遺伝子の部分配列は９４０アミノ酸をコードしている。マウステネイシン−Ｗタンパク質は、図５（ａ）に示すように、明確な分泌シグナル配列を持たず、Ｎ末端側の一部アミノ酸配列を欠損していると思われるが、８つのフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインとＣ末側（カルボキシル末端）にフィブリノーゲンＣドメインを有する。
【００４７】
この構造は、テネイシンファミリータンパク質に共通に存在する典型的なドメイン構造であることから、本タンパク質も新規なテネイシンファミリータンパク質と考えられる。テネイシンファミリータンパク質は、細胞外マトリックス因子としてこれまでに哺乳動物で４種類報告されており、すべてＮ末端側にいくつかのＥＧＦ様リピート構造を有する。一方、本発明で明らかにされた遺伝子情報とセレラ社が明らかにしたマウスゲノム情報とを比較して考えると、図５（ｂ）に示すように、マウステネイシン−Ｗ遺伝子の上流に３つのＥＧＦ様リピート構造を有する予測遺伝子が存在していると思われる。このため、マウステネイシン−Ｗ遺伝子は、上記３つのＥＧＦ様リピート構造を有する予測遺伝子配列とつながった形で全長タンパク質をコードしている可能性が高い。
【００４８】
また、マウステネイシン−Ｗタンパク質は、糖鎖付加予測位置を３ケ所有する（６８７、８２５、８４４番目のアミノ酸残基）。また、後述する実施例に示す、本タンパク質に対する特異的な抗体作製に用いた抗原領域を図中に横線で示す。
【００４９】
また、その相同性を比較すると、既知の哺乳動物テネイシンファミリータンパク質とは約３０〜３５％の相同性を有する。一方、ゼブラフィッシュで報告されているテネイシン−Ｗタンパク質とはアミノ酸レベルで、フィブロネクチンドメインでは約４０％、フィブリノーゲンＣドメインでは約４８％の相同性を示す。上記の結果から、今回明らかとなった上記タンパク質は、新規テネイシンファミリータンパク質と考えられるため、マウステネイシン−Ｗタンパク質と称し、このタンパク質をコードする遺伝子をマウステネイシン−Ｗ遺伝子と称する。
【００５０】
上記マウステネイシン−Ｗタンパク質の一部アミノ酸組成は表７に示すようになっており、セリン残基、スレオニン残基の割合が高い。
【００５１】
【表７】
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【００５２】
上述のように、本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、すなわち、配列番号２、４、６、８、１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質も含まれるが、ここで、「１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／または付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００５３】
上記変異タンパク質には、野生型の活性に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００５４】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００５５】
（２）新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
上記２５１６７バリアント１タンパク質、２５１６７バリアント３タンパク質、２９０２７タンパク質、４０３４１タンパク質、および３５１１２タンパク質は、何れも、新規な細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）であり（後述の実施例参照）、細胞外マトリックス因子と考えられる。また、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質も分泌タンパク質である可能性を有し、かつ、細胞外マトリックス因子である可能性が高い。上記タンパク質は、それぞれ次のような特徴的な機能を有している。
【００５６】
＜２５１６７タンパク質＞
上記３つの２５１６７バリアントタンパク質（以下、３つの２５１６７バリアントタンパク質をまとめて２５１６７タンパク質と称する）は、成体脳の側脳室周囲と精巣内精細管内部に発現が認められる（後述の実施例、図８参照）。側脳室周囲は、マウス、ヒト等の高等動物では、成体になっても神経細胞に分化する能力を維持した未分化状態の細胞（神経幹細胞）が存在する場所として知られている。また、精細管は精子の発生段階の場であり、この場で精粗細胞から精母細胞を経て精子細胞がつくられる。このようなことから、２５１６７タンパク質は、未分化細胞の分化制御に密接な関わりを有すると考えられる。
【００５７】
＜２９０２７タンパク質＞
上記２９０２７タンパク質は、マウス胚の発生およびマウス組織での発現パターンを調べると、ほとんどの臓器で発現が検出される（後述の実施例、図１０参照）。また、２９０２７タンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体を使ったマウス１５日目胎児や成体脳の組織染色像から、２９０２７タンパク質は末梢、および中枢神経系の神経線維周辺に存在していると思われる（図１１参照）。神経筋接合部でのシナプス形成に重要機能を持つことが知られているアグリンタンパク質と相同性を有することや、細胞外マトリックスタンパク質に特徴的なドメイン構造、およびインテグリン結合モチーフであるＲＧＤのアミノ酸配列を２ケ所有することから、２９０２７タンパク質は中枢または末梢神経系の機能維持に重要な細胞外マトリックス因子だと考えられる。
【００５８】
＜４０３４１タンパク質＞
上記４０３４１タンパク質は、マウス胚の発生およびマウス組織での発現パターンを調べると、ほとんどの臓器で発現が検出される（後述の実施例、図１３参照）。ヒトホモログ遺伝子であるＦＬＪ２１１２７遺伝子のＵｎｉＧｅｎｅクラスター（Ｈｓ．３５１４４０）を見ても広範囲の組織から１９８個ものＥＳＴが記載されており、さまざまな組織で高発現していることがわかる。
【００５９】
また、４０３４１タンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体を使ったマウス１５日目胎児の組織染色では、４０３４１タンパク質は筋肉細胞周囲に存在していると思われる（図１４参照）。成体組織での発現パターンははっきりしないが、シグナル配列を有し、コンドロイチン硫酸修飾を受ける可能性があることから、上記４０３４１タンパク質は分泌タンパク質であるとともに、細胞外マトリックス因子である可能性が高く、細胞や臓器の形態形成や機能維持に普遍的に機能すると考えられる。
【００６０】
＜３５１１２タンパク質＞
上記３５１１２タンパク質は、マウス胚の発生およびマウス組織での発現パターンを調べると、ほとんどの臓器で発現が検出される（後述の実施例、図１６参照）。また、３５１１２タンパク質に対する特異的ポリクローナル抗体を使ったマウス１５日目胎児の組織染色像から、３５１１２タンパク質は末梢神経系の神経線維周辺、筋肉細胞周囲、および顎下腺周囲の基底膜構造に存在していると思われる（図１７参照）。これらの結果と、３５１１２タンパク質が培養細胞で発現させると分泌されるという結果とを合わせて考えると、３５１１２タンパク質は、生体内で基底膜構造などの細胞外マトリックスに組みこまれ、末梢神経や筋肉その他の組織の機能維持に関わると考えられる。
【００６１】
＜マウステネイシン−Ｗタンパク質＞
上記マウステネイシン−Ｗタンパク質は、典型的なテネイシンファミリーに特徴的なドメイン構造を有する新規テネイシンファミリータンパク質である。テネイシンファミリータンパク質は、細胞外マトリックス因子として機能していることが知られており、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質も新規細胞外マトリックスタンパク質である可能性が高い。
【００６２】
また、マウス胚の発生およびマウス組織での発現パターンを調べると、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質は、胎齢１５日目、および１７日目の胎児、成体の骨髄、腎臓、肺、リンパ節、脾臓、胃等で強い発現が認められるほか、その他多くの臓器でも弱いながらも発現が認められる（図１８参照）。また、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質に対する特異的な抗体による免疫組織染色の結果では、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質は、胎齢１５日目では形成途中の骨のまわりや食道、消化管等の平滑筋周囲で強く発現している。また、成体の眼では隅角のシュレム管周囲がメッシュ状に染まっていた（図１９参照）。これら結果から、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質は、骨、腱、消化管などの形成に関わっているほか、シュレム管による眼の眼房水の濾過機能にも関与していると考えられる。
【００６３】
このように、本発明に係る上記各タンパク質は、本発明者らによって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、さらに、それぞれ上述したような特徴的な機能を有する。
【００６４】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用方法
本発明に係る新規細胞外マトリックスタンパク質及びこれをコードする遺伝子は、それ自体を各種薬剤として利用することが可能である。また、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を抗原とする抗体も各種薬剤として好適に用いることができる。
【００６５】
細胞外マトリックス因子は、組織を構成する細胞外環境であることから、細胞接着、移動、増殖、分化、形態、または代謝等の細胞の各種活動に重大な影響を与えるため、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍等多くの生体現象と関連することが知られている。また、同様な観点から様々な組織形成を規定する働きを有することも知られており、細胞外マトリックス因子は、細胞・組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。
【００６６】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で大変有用な道具となり得る。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることができる。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、再生医学における組織再生、生体外における人工組織形成に応用することが可能である。
【００６７】
また、上記各タンパク質は、その構造や、それぞれに特徴的な機能から、以下のような利用可能性がある。
【００６８】
＜２５１６７タンパク質＞
２５１６７タンパク質は、上述したように、組織染色の結果から側脳室周辺と精細管内部という非常に特徴的な部位で発現していることがわかっている。側脳室周辺は高等動物において神経幹細胞が存在している場所である。また、一般にさまざまな組織幹細胞はそれぞれ特有の基底膜様構造に接して存在していると考えられている。しかし、これまでのところ神経幹細胞が接しているはずの基底膜様構造の存在は証明されておらず、その構造を組織上で染色できる抗体も報告されていない。
【００６９】
今回、成体マウス側脳室で観察された２５１６７タンパク質の発現様式は、このタンパク質が神経幹細胞の分化能維持や、分化制御に関わっていることを示唆するものである。したがって、２５１６７タンパク質は、神経幹細胞を生体外において、分化能を維持させたまま、または分化を制御して増殖させるための薬剤、培地、培養方法等に利用できる可能性がある。この場合、幹細胞の由来は脳に限られず、末梢血中や骨髄に存在する血液幹細胞やその他の臓器由来の幹細胞などでも、２５１６７タンパク質を利用して、神経幹細胞を生体外培養できる可能性がある。
【００７０】
また、神経幹細胞自身がこの２５１６７タンパク質を発現している可能性もある。したがって、これまでは特殊な遺伝子組み換えマウスからしかできなかった、生きた状態の神経幹細胞を濃縮することも、この２５１６７タンパク質に対する特異的抗体等を用いることにより、正常マウス等を含む種々のマウスから容易に行うことが可能となる。これらの神経幹細胞は、神経系細胞の再生実験などに非常に有用である。
【００７１】
また、上記２５１６７タンパク質は精細管でも発現しており、精子発生に関与している可能性がある。これまで生体外での精粗細胞や精母細胞からの精子発生・形成は成功していない。このため、２５１６７タンパク質、遺伝子または抗体等を利用することで生体内だけでなく、生体外での精子形成システムの開発への糸口が見つかる可能性もある。また、精子形成不全の治療法、治療薬としても利用価値が高いと思われる。
【００７２】
＜２９０２７タンパク質＞
上記２９０２７タンパク質は、上述したように、末梢・中枢神経線維や後根神経節の神経細胞周囲に発現が認められ、神経ネットワークの形成や神経伝達に直接または間接的に関与している可能性が考えられる。したがって、この遺伝子の異常は一次感覚神経を始め、運動神経などの機能障害を引き起こすことが予想される。その結果として感覚障害や運動機能障害を伴う疾患と関連している可能性が高い。このため、上記２９０２７タンパク質の機能を詳細に研究していくことで、そのような疾患の治療方法や治療薬等の開発へ貢献することが期待され、またその際に特異的抗体を利用することは研究の進展に大いに役立つものと思われる。
【００７３】
また、運動神経線維などは切断されても再生し、もとの筋肉上で再びシナプスを形成する能力があることが知られている。このとき、上記２９０２７タンパク質がその際のガイド役のような機能を担っていれば、切断部位でこのタンパク質や遺伝子等を効率的に機能させることでシナプス再形成を促進させるための方法や薬剤に利用できる可能性がある。
【００７４】
また、神経細胞そのものも発生の時期に移動することが知られている。このため、神経線維のガイド役だけでなく、分化途中の神経細胞の移動にも２９０２７タンパク質が関わっている可能性も考えられる。また、中枢神経系でも末梢神経系でもそれぞれ特有の機能を持った神経細胞が、ある特定の位置に存在し正確なネットワークを形成する。このメカニズムの解明にも、２９０２７タンパク質の機能解析が役立つと思われる。したがって、２９０２７タンパク質、遺伝子または抗体等は、これら神経細胞の移動異常または神経ネットワークの形成異常によって引き起こされる種々の疾患の治療薬や治療方法として利用できる可能性がある。
【００７５】
＜４０３４１タンパク質＞
上記４０３４１タンパク質は、上述したように、非常に広範囲の組織で分泌発現している可能性が高い。例えば、ヒトではこの４０３４１遺伝子ホモログのＥＳＴが多く報告され、マウス胚の発生およびマウス組織での発現パターンを見ても広範囲に発現していることが示唆される。
【００７６】
また、マウス胎児では筋肉細胞周囲に存在することから、広範囲に存在する細胞外の構造体構成成分である可能性が考えられ、細胞外から組織の構造や機能に関わっている可能性が考えられる。したがって、４０３４１タンパク質、遺伝子または抗体等は、筋肉を始め、生体一般に存在する基底膜構造等の細胞外マトリックス構造に依存した組織の再生モデルとして利用可能である。また、細胞外の構造体の構成異常により引き起こされる疾患に対する治療法、治療薬等の開発にも利用価値が高いと思われる。
【００７７】
＜３５１１２タンパク質＞
上記３５１１２タンパク質は、上述したように、末梢神経線維、筋肉細胞周囲の他、顎下腺周囲の基底膜様構造にも存在し、発現パターンも組織全般に広く発現していると思われる。このため、様々な組織の基底膜構造に存在する細胞外マトリックス因子としてそれら組織の形態形成に機能していると考えられる。また末梢神経線維にも存在することから、神経伝達や神経筋接合部シナプス形成にも関わっている可能性が高い。したがって、３５１１２タンパク質、遺伝子または抗体等は、上記組織の形態形成異常、神経伝達、または神経筋接合部シナプス形成の異常等によって引き起こされる種々の疾患の治療薬、治療方法として利用できる可能性がある。
【００７８】
＜マウステネイシン−Ｗタンパク質＞
上記マウステネイシン−Ｗタンパク質は、上述したように、新規テネイシンファミリータンパク質であり、細胞外マトリックス因子として機能していると思われる。テネイシンファミリータンパク質は胎児期から生体まで様々な時期に神経系や骨まわりの結合組織、骨格筋などで機能していることが知られており、胎齢１５日目の胎児の染色パターンを見ても腱や靱帯の形成に重要である可能性を示唆している。したがって、腱や靱帯を切断した場合の治療に上記マウステネイシン−Ｗタンパク質が有効である可能性が考えられる。あるいは、生体外で人工的に靱帯のような組織を作り、治療に利用することもできる可能性がある。
【００７９】
また、成体の眼では眼房水の濾過機能を担っているシュレム管周囲がメッシュ状に染まっていたことから、上記マウステネイシン−Ｗタンパク質はこの機能に大きく関わっていると思われる。眼房水が十分に濾過できなくなると眼圧が高くなり、隅角緑内障の原因となる。すなわち、マウステネイシン−Ｗ遺伝子は、隅角緑内障の原因遺伝子となりうる。このため、マウステネイシン−Ｗタンパク質、遺伝子または抗体等は、上記疾患の治療薬、治療方法等の開発に有用であることはもちろんのこと、マウステネイシン−Ｗ遺伝子情報は遺伝子診断にも利用できる。
【００８０】
また、本発明に係る上記遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００８１】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記３つの２５１６７バリアント遺伝子（以下、３つの２５１６７バリアント遺伝子をまとめて２５１６７遺伝子と称する）、２９０２７遺伝子、４０３４１遺伝子、３５１１２遺伝子、およびマウステネイシン−Ｗ遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００８２】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００８３】
また、上記プローブの配列を、上記各タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列またはＮ型糖鎖結合領域）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記各タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００８４】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各タンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００８５】
本発明に係る上記２５１６７タンパク質、２９０２７タンパク質、４０３４１タンパク質、３５１１２タンパク質、およびマウステネイシン−Ｗタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記各タンパク質またはその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物または動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記各タンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００８６】
上記２５１６７タンパク質、２９０２７タンパク質、４０３４１タンパク質、３５１１２タンパク質、およびマウステネイシン−Ｗタンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，  Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１またはそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／または付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００８７】
このように、本発明に係る遺伝子及びタンパク質は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子である。そのため、細胞外マトリックスが関与する生体現象に関連する各種疾患、疾病の研究、治療法の開発に有用であるが、さらに、前述した特徴的な機能から、様々な研究や病気の診断・治療や医薬品等の開発に有効利用できる可能性を見出すことができる。
【００８８】
【実施例】
以下の実施例では、本発明に係る２５１６７遺伝子、２９０２７遺伝子、４０３４１遺伝子、３５１１２遺伝子、およびマウステネイシン−Ｗ遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、及び本発明にかかる２５１６７タンパク質、２９０２７タンパク質、４０３４１タンパク質、３５１１２タンパク質、およびマウステネイシン−Ｗタンパク質の物性を調べた結果について、図１〜図２０に基づいて、順に説明する。
【００８９】
〔実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
本実施例で作製するｃＤＮＡライブラリーは、本発明に係る２５１６７遺伝子、２９０２７遺伝子、４０３４１遺伝子、３５１１２遺伝子、およびマウステネイシン−Ｗ遺伝子の取得に用いた。
【００９０】
（１）ｍＲＮＡの調製
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）各器官または組織０．５ｇ〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌと、同量のフェノール／クロロホルム（体積比５：１）混合液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを水相から分離沈澱させた。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗い、水８ｍｌに溶解後、２ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０の水溶液１６ｍｌを加えてＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【００９１】
続いて、室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃｌに溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【００９２】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
調製した上記ｍＲＮＡ１５μｇを用いて、逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔにより、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌ  ＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。
【００９３】
なお、プライマーとしては、次に示す制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド１ｓｔ  ＢＳ（配列中、ＶはＡ、ＧまたはＣを示し、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴを示す）を１２．６μｌ用いた。
【００９４】
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’    （配列番号１５）
上記逆転写反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えるこことにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ８μｌ、１０％ＳＤＳ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅフリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【００９５】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。この２段階の反応は、それぞれ、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジトと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件の下、氷上で４５分間行った。
【００９６】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【００９７】
（４）ＲＮａｓｅＩによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記のようにして得られたビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＩで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記ビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の試料７０μｌに、１０×ＲＮａｓｅＩバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ  ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間処理することで１本鎖ＲＮＡを消化した。
【００９８】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンをコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅＩ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｏｒｏｕｓ  ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃｏａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌの溶液にて洗った。
【００９９】
上記ビーズを５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、上記（４）で取得したＲＮａｓｅＩ処理されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。
【０１００】
完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅＨバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅＨ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅＨ３ｕｎｉｔを加え、３７℃で３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ１μｌ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【０１０１】
回収した上清（１本鎖完全長ｃＤＮＡを含む）はフェノール／クロロホルムで抽出し、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００  Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇを加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１０２】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
回収した１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌを、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣｏＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００μＭ  ｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１０３】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／μｌ  ＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ  ６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター６００ｎｇを加え、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ；宝酒造社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１０４】
なお、第２鎖プライマー−アダプターとしては、次に示す配列番号１６の２ｎｄ−Ｘ  プライマーを用いた。
【０１０５】
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’    （配列番号１６）
０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、さらにタンパク質成分を分解するために、１０％ＳＤＳ１μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ１０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１０６】
（８）ライブラリーの調製
ＭｏｂｉＴｅｃ社製のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変してλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクター：λ−ＦＬＣ−１ベクターを作製し、これにｃＤＮＡを挿入してｃＤＮＡライブラリーを調製した（特開２０００−３２５０８０号公報参照）。
【０１０７】
次に、本発明に係る前記各遺伝子およびタンパク質のそれぞれについて、その単離方法および物性等を調べた結果を説明する。
【０１０８】
＜２５１６７遺伝子および２５１６７タンパク質＞
〔実施例２：２５１６７遺伝子の選別〕
（１）Ｔｅｓｔｉｓ由来ｃＤＮＡクローン
上記作製方法により得られたマウスａｄｕｌｔ  ｔｅｓｔｉｓ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、２５１６７遺伝子を選択した。
【０１０９】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーの各クラスターからひとつの代表クローンを選択した。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ  ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにアレイ化した。このとき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ＬＢ培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。
【０１１０】
培養した各クローンを、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養し、遠心分離により大腸菌を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｐｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のアガロースゲル電気泳動を行った。
【０１１１】
得られたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。
【０１１２】
このとき、次に示すセンス鎖のプライマー（配列番号１７）と、アンチセンス鎖のプライマー（配列番号１８）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応させ、Ｌｉｃｏｒ  ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ  ｒｅａｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１１３】
５’−ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ−３’    （センス鎖・配列番号１７）
５’−ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’  （アンチセンス鎖・配列番号１８）
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７及び／またはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製）、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｋｉｔ、及びＣｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳｒｅａｄｅｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１１４】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によって実施した。このとき、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＲＩＳＡ  ３８４、及びＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
【０１１５】
上記ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターへ挿入して組み換えベクターを作製し、この組み換えベクターを用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から、上記代表クローンのアレイ化と同様にしてプラスミドを調製した。
【０１１６】
各代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｈｅａｒｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ  Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【０１１７】
その結果、配列番号１に示すように、上記２５１６７遺伝子のｃＤＮＡは７７５個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記２５１６７タンパク質は、図１に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、６つのＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を含んでいた。また、その相同性を比較すると、５’側を除いた領域でヒトｔｅｓｔｉｓ由来のｃＤＮＡ（ＦＬＪ２３５５２遺伝子）と核酸レベルで５５％の相同性を有していた。しかし、その相同領域は一部一致しないギャップが存在し、スプライシングパターンの違いによるバリアントの存在が示唆された。
【０１１８】
（２）Ｂｒａｉｎ由来ｃＤＮＡクローンの解析
上記２５１６７遺伝子の転写産物にスプライシングによるバリアントの存在が示唆されたので、組織染色で発現が確認されている（後述）脳と精巣の全ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から、当該メーカーのプロトコールに従って、オリゴｄＴプライマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＲＮａｓｅＨ−）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写合成したｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲ反応にて増幅した。ＰＣＲ反応は配列番号２５のフォワードプライマーと、配列番号２６のリバースプライマーを用いて、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社）でアニーリング温度５６℃にて３６回サイクルで行った。
【０１１９】
５’−ＴＡＡＴＡＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＴＣＡＡＣＧＴＣＧ−３’  （フォワード・配列番号２５）
５’−ＡＡＧＧＴＧＴＡＧＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＧ−３’  （リバース・配列番号２６）
ＰＣＲ産物を一部１．５％アガロースゲルで電気泳動し、サイズ確認をしたところ精巣では十分な発現がなかったのかバンドが確認できなかったが、脳では複数のサイズのバンドが検出できた。そこで、脳由来ＰＣＲ反応液の残りからさらに一部取り、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて指定のプロトコール通りにＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯと反応させ、大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に形質転換した。得られた大腸菌から、増幅断片が挿入されたＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯを無作為に抽出し、挿入断片の塩基配列をＡＢＩ社製ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔによって決定した。塩基配列決定には配列番号２７のＭ１３フォワードプライマーと、配列番号２８のＭ１３リバースプライマーを用いた。
【０１２０】
５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ−３’  （Ｍ１３フォワード・配列番号２７）
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’    （Ｍ１３リバース・配列番号２８）
その結果、２５１６７遺伝子の該当領域と一致する塩基配列の他に、配列番号３の２３１４番目〜２５５６番目および配列番号５の２３１４番目〜２４７５番目の塩基配列をもつスプライシングバリアントクローンが得られた。その配列から予想される全長塩基配列を配列番号３、および配列番号５に示す。これらの遺伝子をそれぞれ、２５１６７バリアント２遺伝子、２５１６７バリアント３遺伝子と称する。またこれら遺伝子がコードする予想アミノ酸配列をそれぞれ配列番号４、および配列番号６に示す。これらのアミノ酸配列からなるタンパク質をそれぞれ、２５１６７バリアント２タンパク質、２５１６７バリアント３タンパク質と称する。
【０１２１】
それぞれのアミノ酸配列から２５１６７バリアント２タンパク質にはＣ末端側に推定膜貫通領域が存在することが明らかとなり、また２５１６７バリアント１タンパク質と２５１６７バリアント３タンパク質とは、推定膜貫通領域の前に終始コドンが出現するために推定膜貫通領域が存在せず、すなわち、分泌タンパク質であることが示唆された。
【０１２２】
〔実施例３：２５１６７タンパク質発現用のプラスミドの作製〕
上記２５１６７バリアント１タンパク質を発現させるために、次のようにして作製したプラスミドをベクターとして用いた。
【０１２３】
（１）ｐＣＩｋａｎａの作製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、ネオマイシン／カナマイシンを含む断片を精製した。また、ｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、イントロンを含む断片を精製した。このイントロンを含む断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のネオマイシン／カナマイシンを含む断片のＮｄｅＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａを得た。
【０１２４】
（２）ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの作製
ｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡを増幅するために、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を鋳型とし、配列番号１９（フォワードプライマー）及び配列番号２０（リバースプライマー）に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１２５】
配列番号１９にて表すプライマーは、ｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、さらに、図６（ｂ）に示す、ｃＤＮＡをクローニングするためのマルチクローニングサイトを５’側に配置したものである。また、配列番号２０にて表すプライマーは、ｈｒＧＦＰ  ｃＤＮＡの、翻訳停止コドンから１コドン分５’側にあるＧＴＧ配列を含んだ１９の塩基、１０アミノ酸のｍｙｃ  ｔａｇを２つタンデムにコードする配列、及び、上記プラスミドｐＣＩｋａｎａに組み込むためのＰｓｐＯＭＩサイトをタンデムに配したものである。
【０１２６】
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣ−３’  （配列番号１９）
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’  （配列番号２０）
上記のプライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲにより増幅断片をＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、増幅断片が挿入されたＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯを抽出し、ＥｃｏＲＩサイト及びＰｓｐＯＭＩサイトにて切断して、ｈｒＧＦＰと２つのＭｙｃタグとがつながったｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この精製ＤＮＡ断片を、上記（１）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａのＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃを得た。
【０１２７】
（３）ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃの作製
ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを増幅するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を鋳型として、配列番号２１（フォワードプライマー）及び配列番号２２（リバースプライマー）に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１２８】
配列番号２１に示すプライマーは、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡの、翻訳開始コドンＡＴＧから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、上記（２）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組込むためのＢｓｔＢＩサイトを５’側に配置したものである。また、配列番号２２に示すプライマーは、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡの、翻訳停止コドンから１コドン分５’側にあるＣＴＧ配列を含み、さらに、１０アミノ酸のｍｙｃ  ｔａｇをコードする配列、及び、上記（２）にて得たｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＢｓｔＢＩサイトをタンデムに配したものである。
【０１２９】
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’    （配列番号２１）
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’  （配列番号２２）
上記プライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲによって得られた増幅断片をＰＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この断片を、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの２つのＢｓｔＢＩサイト間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃを作製した。
【０１３０】
上記プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃは、図６（ａ）に示すように、５１２２塩基対からなるプラスミドで、ｐＵＣｏｒｉ、ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒ、ＨＳＴＫｐｏｌｙＡ、ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｉｎｔｒｏｎ、Ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ、ＥＧＦＰ、３ｘＭｙｃ  ｔａｇ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを有している。上記ｐＵＣｏｒｉは、プラスミドを複製させるために必要な配列である。上記Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子である。上記ＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を発現させるためのプロモーター配列である。
【０１３１】
また、図６（ｂ）に示すマルチクローニングサイトは、制限酵素サイトを複数有した配列であり、発現させたい遺伝子やｃＤＮＡ等を挿入するためのものである。マルチクローニングサイトに配された制限酵素サイトは、５’側から順に、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩである。
【０１３２】
上記ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒは、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子やｃＤＮＡを発現させるためのプロモーター配列である。上記ＥＧＦＰは、蛍光標識タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子である。３ｘＭｙｃ  ｔａｇは、標識タンパク質であるＭｙｃタグをコードする塩基配列が３つ連続して設けられているものであり、この３ｘＭｙｃ  ｔａｇの下流領域にＳＴＯＰコドン（Ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ）が設けられている。したがって、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子にコードされているタンパク質が発現されると、このタンパク質のＣ末端下流域にＥＧＦＰと３ｘＭｙｃタグとが融合されることになる。
【０１３３】
〔実施例４：２５１６７バリアント１タンパク質の発現〕
配列番号１に示す上記２５１６７バリアント１遺伝子のｃＤＮＡを、配列番号２３（フォワードプライマー）及び配列番号２４（リバースプライマー）に示すプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。上記配列番号２３及び配列番号２４に示すプライマーは、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡを組み込んでベクターとして用いるための制限酵素部位を有している。
【０１３４】
すなわち、配列番号２３に示すプライマーは、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）にて、翻訳開始コドンＡＴＧを含む７４番目〜９３番目の領域と、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＥｃｏＲＩサイトとを有している。また、配列番号２４に示すプライマーは、配列番号１で表されるｃＤＮＡの２３８２番目〜２４０８番目の塩基配列、及び、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＮｏｔＩサイトを有している。
【０１３５】
５’−ＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＴＴＡＧＣＣＣＧ−３’  （配列番号２３）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＧＴＴＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＧ−３’  （配列番号２４）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて制限酵素処理を行い、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイト間、すなわちＥＧＦＰ−ｍｙｃタグとの融合タンパク質として発現するように挿入してに挿入し、２５１６７バリアント１タンパク質発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に導入して形質転換を行い、大腸菌を増殖させることにより、上記ベクターを精製した。
【０１３６】
続いて、遺伝子導入試薬２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、浮遊系ヒト２９３Ｆ細胞に、精製した上記発現プラスミドを導入して、３日間３７℃、８％ＣＯ２条件下で旋回培養を行った。培養したヒト２９３Ｆ細胞の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル）にて非還元条件下（ＮＲ）、還元条件下（Ｒ）でそれぞれ電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図７に示す。
【０１３７】
図７に示すように、非還元条件下（ＮＲ）では３００〜４００ｋＤａの産物が、還元条件下（Ｒ）では約１２０ｋＤａの産物が検出された（図中の矢印で示す位置）。還元条件下の約１２０ｋＤａの産物は、予想された融合タンパク質のサイズとほぼ同じであり、分泌タンパク質であると考えられる。非還元条件下ではシステイン残基によるジスルフィド結合でダイマーもしくはオリゴマーを形成しているものと思われる。
【０１３８】
〔実施例５：２５１６７タンパク質に対する抗体の作製〕
（１）抗原作製
２５１６７バリアント１タンパク質のアミノ酸配列の中から２ケ所を選んでＧＳＴとの融合タンパクとして発現させ、免疫原とした。抗原として選択した２ケ所はアミノ酸配列の１１６〜２３１番目（抗原１）と２７４〜３６０番目（抗原２）である。なお、この領域は、３つの２５１６７バリアントタンパク質全てに共通の領域である。その領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク発現ベクターに組み込んで融合タンパクの大腸菌大量合成系に供した。
【０１３９】
なお、ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、以下に示す通りで、配列番号２９のプライマーが抗原１の５’側であり、配列番号３０のプライマーが抗原１の３’側であり、配列番号３１のプライマーが抗原２の５’側であり、配列番号３２のプライマーが抗原２の３’側である。
【０１４０】
５’−ＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＡＴＧＧ−３’  （配列番号２９）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＣＡＴＴＧ−３’  （配列番号３０）
５’−ＴＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣ−３’    （配列番号３１）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＧＣＣＡ−３’  （配列番号３２）
実施例１で作製したマウスｃＤＮＡライブラリーから選択した２５１６７遺伝子のｃＤＮＡが入ったプラスミドを鋳型として、上記抗原１および２のプライマーを用いて次の条件でＰＣＲ反応を行い、目的のバンドを得た。
【０１４１】
ＰＣＲ反応は９４℃５分の後、９４℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル行い、１．５％アガロース上電気泳動によって目的サイズのバンドを確認した。増幅したｃＤＮＡ  ０．５μｌとｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ０．５μｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を混ぜてＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）でライゲーション反応を行い、引き続きＴＯＰ１０  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトランスフォーメーションを行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃一晩培養し複数のコロニーを得た。
【０１４２】
得られたコロニーを直接ＰＣＲ反応に供し、目的のｃＤＮＡ断片を含むかどうか確認した。すなわちｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトをはさむＳＰ６プライマー（配列番号３３）とＴ７プライマー（配列番号３４）の組み合わせで、ＳＩＧＭＡ社ＲｅｄＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使ってＰＣＲ反応を行った。
【０１４３】
５’−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’  （配列番号３３）
５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’    （配列番号３４）
上記ＰＣＲ反応は、９４℃５分の後、９４℃３０秒、５５℃４０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして２５サイクル行い、アガロース電気泳動によって目的サイズのバンドが出たクローンから抗原１、抗原２についてそれぞれ２クローンずつ選び、ＡＢＩ社製ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＫｉｔによってｃＤＮＡの全塩基配列を確認した。
【０１４４】
次に、ｃＤＮＡ領域を制限酵素ＳｍａＩとＸｈｏＩとで切断し、アガロース電気泳動後ｃＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ社製Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで抽出し、同様にＳｍａＩ、ＸｈｏＩで切断、抽出したｐＧＥＸ−４Ｔ−１  ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）と混合して、宝酒造社製Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２でライゲーション反応を行った。引き続きＪＭ１０９  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ（宝酒造社製）にトランスフォーメーションを行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃一晩培養し複数のコロニーを得た。目的のｃＤＮＡ断片を含む大腸菌コロニーをクローニングサイト両端のプライマーでＰＣＲ反応をして選択した。
【０１４５】
なお、上記ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は、以下に示す通りで、配列番号３５のプライマーがｐＧＥＸ  ５’プライマーであり、配列番号３６のプライマーがｐＧＥＸ  ３’プライマーである。
【０１４６】
５’−ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ−３’    （配列番号３５）
５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ−３’    （配列番号３６）
上記ＰＣＲ反応は、９４℃５分の後、９４℃３０秒、５８℃４０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、１．５％アガロース上電気泳動した。これによって目的サイズのバンドが出たクローンを抗原１、抗原２について１クローンずつ選び、抗原発現大腸菌クローンとした。
【０１４７】
（２）抗原の精製
上記ＧＳＴ融合抗原タンパクを発現する大腸菌を大量培養し、その大腸菌破砕物からＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎで目的タンパクを精製した。すなわち、一晩ＬＢ培地で増殖させた抗原発現大腸菌１ｍｌを７００ｍｌのＬＢ培地に移し、３７℃で５〜６時間振とう培養し、氷上で１５分置いた後、終濃度０．２ｍＭ  Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２０℃で６時間振とう培養した。大腸菌は遠心により回収し、−２０℃で保存した。融解した大腸菌を１０ｍｌのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，  １００μｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭＤＴＴ、  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）に懸濁し、超音波破砕によって得られた抽出液を遠心によって回収した。
【０１４８】
得られた抽出液はあらかじめＰＢＳ（−）で洗ったＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｃｏｌｕｍｎに２回通し、目的タンパクをカラムに結合させた。カラムをさらにＰＢＳ（−）で洗った後、結合タンパクを２０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを０．５ｍｌずつ添加して回収していき、目的タンパクを含むｆｒａｃｔｉｏｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、クマシー染色で確認した。十分量の目的タンパクを含むｆｒａｃｔｉｏｎをまとめて、大量のＰＢＳ（−）溶液中で透析し抗原溶液とした。濃度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＶＥ社製）で測定した。
【０１４９】
（３）抗原の免疫
得られた２種類の抗原タンパク質を重量比で１：１に混ぜ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に５８ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０１５０】
（４）抗体の精製
免疫に用いた抗原はＧＳＴ融合タンパク質であるため、ＧＳＴタンパク質に反応する抗体を除く目的で、まずＧＳＴカラムを作製した。１ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに２ｍｇの精製ＧＳＴタンパクを結合させ、４０ｍＭのＤｉｍｅｔｈｙｌ  Ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）で室温１時間反応させ結合タンパクを架橋した後、未反応ＧＳＴを除いてＧＳＴカラムとした。そこに抗血清０．５ｍｌを通しＧＳＴ反応抗体を除いてから、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。さらに、大量のＰＢＳ（−）溶液中で透析し、抗２５１６７抗体とした。抗体濃度は２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定して算出した。
〔実施例６：２５１６７タンパク質のマウス組織染色〕
上記２５１６７タンパク質の、マウス胎児及び成体マウス組織での発現パターンを特異抗体を用いた免疫組織染色によって調べた。
【０１５１】
具体的には、約１０週齢のＩＣＲマウス各種臓器、または胎齢１５日目のＩＣＲマウス全身を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ社）で包埋し、（８０℃で凍結後、クライオスタットで約７ミクロンの厚さに切り、ＡＰＳコートしたスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ社）につけ室温で乾燥後、凍結切片とした。得られた凍結切片は組織染色に使用するまで（８０℃で保存した。
【０１５２】
上記２５１６７タンパク質の特異抗体による組織染色は以下のように行った。凍結切片をＰＢＳ（−）で洗った後、０．３％Ｈ２Ｏ２、０．３％正常ヤギ血清（ＤＡＫＯ社）を含むＰＢＳ（−）を添加し、室温で１０〜１５分反応させることで組織に内在するｐｅｒｏｘｙｄａｓｅを失活させた。ＰＢＳ（−）で洗った後、１．５％正常ヤギ血清（ＤＡＫＯ社）を含むＰＢＳ（−）で室温１時間ブロッキングして、再びＰＢＳ（−）で洗った後、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）で上記実施例５の（４）で精製した抗２５１６７抗体（１次抗体）を終濃度２μｇ／ｍｌに希釈して室温１時間反応させた。１次抗体をＰＢＳ（−）で３回洗った後、ＨＲＰ付き抗Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体であるＥＮＶＩＳＩＯＮＴＭ＋  Ｓｙｓｔｅｍ  ＨＲＰ  Ｒａｂｂｉｔ  （ＤＡＫＯ社）で室温１時間反応させ、再びＰＢＳ（−）で３回洗った後、ＤＡＢ基質キット（ＤＡＫＯ社）で室温６分間反応させ発色させた。ＰＢＳ（−）で発色反応を停止させた後、ヘマトキシリン染色を行い、水洗後、エタノールとキシレンに順につけて残った水分を除き、マウント剤で固めてプレパラートとした。プレパラートの観察はＮＩＫＯＮ社の顕微鏡エクリプスＥ６００を用いて行い、染色像はデジタル画像としてＰＣに取り込んだ。染色画像は必要に応じてＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｖｅｒ．  ６．０（Ａｄｏｂｅ社）を用いて解像度、明るさ、コントラストのみ修正した。
【０１５３】
各種臓器の染色像解析の結果を図８（ａ）〜（ｄ）に示す。（ａ）は免疫染色後の成体脳における海馬近くの側脳室を示す図であり（倍率４倍）、（ｂ）は（ａ）の部分拡大図であり（倍率４０倍）、（ｃ）は免疫染色後の成体精細管を示す図であり（倍率１０倍）、（ｄ）は（ｃ）の部分拡大図である（倍率４０倍）。同図に示すように、成体脳の側脳室周囲に基底膜様染色像が認められ、また、精細管内部にも染色性が認められた。
【０１５４】
＜２９０２７遺伝子および２９０２７タンパク質＞
〔実施例７：２９０２７遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス６  ｄａｙｓ  ｎｅｏｎａｔｅ  ｓｋｉｎ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、２９０２７遺伝子を選択した。
【０１５５】
その結果、配列番号７に示すように、上記２９０２７遺伝子のｃＤＮＡは１００９個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記２９０２７タンパク質は、図２に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、さらに２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩドメインに続いてＥＧＦリピートとラミニンＧドメインが交互に３回存在していた。また、１つめと３つめのラミニンＧドメインには、細胞外マトリックス因子として知られているフィブロネクチンと細胞膜上に存在するインテグリン分子との結合に重要なＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）のアミノ酸配列がそれぞれ１つずつ存在する（アミノ酸４３４〜４３６番目と８７２〜８７４番目）。２９０２７タンパク質は２つのＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）を含んでおり、一方、膜貫通領域は存在していなかった。
【０１５６】
さらに、その相同性を比較すると、ヒトアグリンタンパク質と約３０％の相同性を示した。
【０１５７】
〔実施例８：２９０２７タンパク質発現用のプラスミドの作製〕
２９０２７遺伝子（ｃＤＮＡ）をはじめ今回のライブラリークローンは、制限酵素ＳｆｉＩで切り出すことが可能である。どのクローンでもＥＧＦＰ発現ベクターに直接クローニング可能にするため、クロンテック社のｐＥＧＦＰ発現ベクターシリーズのマルチクローニングサイトにＳｆｉＩサイトと反応するようにＰｆｌＭＩサイトを導入した改変発現ベクターを次のようにして作製した。
【０１５８】
（１）ｐＢＳＩＩＰｆｌＭＩの作製
以下に示す２本の合成一本鎖ＤＮＡを等量混ぜて、熱変性後アニーリングしたものをアダプターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋のマルチクローニングサイトに導入した。すなわち、２本の合成オリゴは末端を除いて相補的であり、アニーリングすることで配列番号３７の５’側にＳａｌＩの切り口が、３’側にＮｏｔＩの切り口が生ずる。それをＳａｌＩ−ＮｏｔＩで切断後、アガロースゲル電気泳動で分離、抽出したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋断片にＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２でライゲーションし、大腸菌（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に導入した。得られた形質転換体のプラスミドの該当領域塩基配列を決定し、目的のものをｐＢＳＩＩＰｆｌＭＩとした。これにより、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋のマルチクローニングサイトのＳａｌＩ−ＮｏｔＩの間にライブラリーベクターからＳｆｉＩで切り出されたインサート断片とライゲーション可能なＰｆｌＭＩサイトが入ったことになる。
【０１５９】
５’−ＴＣＧＡＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＣＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＣ−３’  （配列番号３７）
５’−ＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＣＴＴＡＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＡＡＣＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧ−３’  （配列番号３８）
（２）ｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐの作製
これまでにｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クロンテック社）のマルチクローニングサイト内ＳｍａＩサイトを次のようにＮｏｔＩサイトに改変した発現ベクター（ｐＥＧＦＰＣ１ＮｏｔＩ）を構築、所有している。改変によりＫｐｎＩ−ＳｍａＩ間の塩基配列はＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣからＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣとなり、ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩとなっている。また、ＫｐｎＩの上流にＳａｌＩサイトが存在する。（１）で得られたＰｆｌＭＩサイトを含むＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断片をこのｐＥＧＦＰＣ１ＮｏｔＩのＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに組みこんだ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｐ）。次に、このプラスミドのＳａｌＩ−ＮｏｔＩのさらに外側にあるＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩで目的断片を切り出し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに組みこみ、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐを作製した（図２０参照（ａ））。このプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐは、４７８２塩基対からなるプラスミドであって、このプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐに含まれる各種配列の機能は、上記プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃと同様であるため、説明を省略する。
【０１６０】
また、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間のマルチクローニングサイトにおける塩基配列は、配列番号３９の通りである。このマルチクローニングサイトに配された制限酵素サイトは、５’側から順に、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｓｃＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｆｌＭＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩである（図２０（ｂ）参照）。ＥＧＦＰタンパク質をコードする領域はこのＢａｍＨＩサイトの下流に存在する。
【０１６１】
５’−ＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＣＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣ−３’  （配列番号３９）
（３）２９０２７タンパク質発現用のプラスミドの作製と発現
２９０２７遺伝子（ｃＤＮＡ）をＳｆｉＩでライブラリーベクターから切り出し、（２）で作製したｐＥＧＦＰ−Ｎ２ＰのＰｆｌＭＩ断片とライゲーションして組みこんだ。２９０２７遺伝子（ｃＤＮＡ）は終始コドンを含み、ＥＧＦＰタンパク質との融合タンパク質にはならないため、終始コドンをグリシンのコドンに変えてそのままＢａｍＨＩサイトが続くように置換した。すなわち、以下のプライマーで２９０２７遺伝子（ｃＤＮＡ）を鋳型にしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅでＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をＰＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。配列番号４０のプライマーは配列番号７の２４４９番目〜２４６９番目の塩基配列に相当する配列で、プライマー中にＢａｍＨＩサイトが存在する。また、配列番号４１のプライマーは配列番号７の３２２０番目〜３２３５番目の塩基配列に相当する配列とＢａｍＨＩサイトとを有する。
【０１６２】
５’−ＧＡＡＣＴＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣ−３’    （配列番号４０）
５’−ＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＴＡＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＴＧ−３’  （配列番号４１）
ＰＣＲで増幅したＤＮＡからＢａｍＨＩ断片を切り出し、先にｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐにサブクローニングした２９０２７遺伝子（ｃＤＮＡ）の３’側ＢａｍＨＩ領域と同じコーディングの向きに置き換えて、２９０２７−ＥＧＦＰ融合タンパク質として発現するプラスミドとした。
【０１６３】
次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｆ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｆ細胞の培養上清を非還元条件下（ＮＲ）、および還元条件下（Ｒ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図９に示す。
【０１６４】
図９に示すように、非還元条件下（ＮＲ）では、１００ｋＤａ付近に２本のシグナルと２００ｋＤａ付近にブロードなシグナルとが検出されている。また、還元条件下（Ｒ）でも、２００ｋＤａ付近にブロードなシグナルは同様に検出されているが、１００ｋＤａ近く２本のバンドはともに移動度が少し遅くなって、１００ｋＤａより少し大きい位置に来ている。これは、非還元条件下では分子内でジスルフィド結合を取ることにより、分子サイズがコンパクトになっていたのが、還元することでほぐれ、移動度が遅くなったものと思われる。予想サイズは還元状態で認められる約１２０ｋＤａのバンドが最も近い。
【０１６５】
〔実施例９：２９０２７遺伝子のマウス組織での発現〕
上記２９０２７遺伝子の、マウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。
【０１６６】
具体的には、まず、マウス全ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）から、当該メーカーのプロトコールに従って、オリゴｄＴプライマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＲＮａｓｅＨ−）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＲＮＡとしては、１；脳、２；骨髄、３；７日目胎児、４；１１日目胎児、５；１５日目胎児、６；１７日目胎児、７；眼、８；心臓、９；腎臓、１０；肝臓、１１；肺、１２；リンパ節、１３；前立腺、１４；唾液腺、１５；平滑筋、１６；脊髄、１７；脾臓、１８；胃、１９；精巣、  ２０；胸腺、２１；子宮に由来するもの、の計２１種類を用意した。
【０１６７】
上記にて合成したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号７に示す２４４９番〜３２５０番の塩基配列、または２８６２番〜３２５０番の塩基配列を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅しｃＤＮＡの増幅を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、前述配列番号４０（５’末端側）と配列番号４３（３’末端側）に示すプライマーの組み合わせか、配列番号４２（５’末端側）と配列番号４３（３’末端側）に示すプライマーの組み合わせを用いて行った。
【０１６８】
５’−ＣＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣ−３’  （配列番号４２）
５’−ＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣ−３’  （配列番号４３）
ＳＩＧＭＡ社（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ，  ＵＳＡ）製ＲｅａｄｙＭｉｘＴＭ  ＲＥＤＴａｑＴＭ  ＰＣＲ  ＲＥＡＣＴＩＯＮ  ＭＩＸに、上記ｃＤＮＡと上記プライマーとを混合して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３分反応させた後、９５℃にて２０秒、６５℃にて３０秒、７０℃にて１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後、７２℃にて１０分反応させた。次いで、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。
【０１６９】
どちらのプライマーの組み合わせでも同様のパターンだったが、配列番号２１と配列番号２２とのプライマーで行った場合の結果を図１０に示す。なお、予想バンドサイズは８０２ｂｐである。図１０に示すように、１７日目胎児、肝臓、唾液腺等でシグナルが弱かったが、その他の組織ではＰＣＲ増幅産物のバンドを確認した（図中の矢印で示す位置）。このことから一部臓器を除いて、ほとんどの組織で２９０２７遺伝子のｍＲＮＡが発現していることが分かった。
【０１７０】
〔実施例１０：２９０２７タンパク質に対する抗体の作製〕
（１）抗原作製
２９０２７タンパク質のアミノ酸配列の中から２３２〜３４６番目のアミノ酸配列からなるポリペプチドを選んでＧＳＴとの融合タンパク質として発現させ、免疫原とした。実施例４に示した方法と同様に、抗原領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターに組み込んで融合タンパク質の大腸菌大量合成系に供した。
【０１７１】
ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、以下に示す通りであり、配列番号４４のプライマーが５’側であり、配列番号４５のプライマーが３’側である。また、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１  ｖｅｃｔｏｒに抗原領域を組みこむ際の制限酵素サイトは、ＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトとを用いた。
【０１７２】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＧＴＣＣＧＡＡＣＣＣＴＧＧＧ−３’    （配列番号４４）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＧＴＣＡＡＡＧＡＧＣＣＴＴ−３’  （配列番号４５）
以下同様にして抗原発現大腸菌クローンを得た。
【０１７３】
（２）抗原の精製
実施例４の（２）と同様に行った。
【０１７４】
（３）抗原の免疫
得られた抗原タンパク質を、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に８７ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０１７５】
（４）抗体の精製
０．５ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社）に精製抗原タンパク質０．７ｍｇを結合させ、イミドエステル−クロスリンカーであるＤＭＰ（４０ｍＭ、ＰＩＥＲＣＥ社）でカップリング後、２００ｍＭ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅで未反応基をブロッキングし、さらに２０ｍＭ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅで未反応抗原タンパク質を除いて、抗原カラムとした。抗原カラムをＰＢＳで洗った後、（３）で得られた抗血清０．５  ｍｌをアプライし反応抗体を結合させた。ＰＢＳで十分洗浄し、結合した抗体をグリシン塩酸で溶出し、抗体を含むフラクションをさらにゲル濾過カラムに通してバッファーを置換した。免疫に用いた抗原はＧＳＴ融合タンパク質であるため、ＧＳＴタンパク質に反応する抗体を除く目的で、次にＧＳＴカラムを作製した。１ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに２ｍｇの精製ＧＳＴタンパク質を結合させ、４０ｍＭのＤＭＰで室温１時間反応させ結合ＧＳＴタンパク質を架橋した後、未反応ＧＳＴを除いてＧＳＴカラムとした。そこにバッファー置換した精製抗体を数回通しＧＳＴ反応抗体を除いて、抗２９０２７抗体とした。抗体濃度は２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定して算出した。
〔実施例１１：２９０２７タンパク質のマウス組織染色〕
実施例６に示したのと同じ方法で、２９０２７タンパク質特異的抗体でマウス各種臓器の免疫組織染色を行った。ただし、特異抗体は抗原によるアフィニティー精製を行っており、終濃度０．２μｇ／ｍｌで行った。その結果を図１１（ａ）〜（ｄ）に示す。（ａ）は免疫染色後の１５日目胎児上半身正面像を示す図であり（倍率１倍）、（ｂ）は（ａ）の部分拡大図（心臓のすぐ横、倍率１０倍）であり、（ｃ）は免疫染色後の胎児の背骨付近を示す図（後根神経節が見える、倍率４倍）であり、（ｄ）は免疫染色後の成体脳を示す図（線条体付近、倍率１０倍）である。同図に示すように、１５日目胎児の末梢神経線維や、後根神経節の神経細胞周囲などの他、成体脳の一部の神経線維様構造などが染まった。
【０１７６】
＜４０３４１遺伝子および４０３４１タンパク質＞
〔実施例１２：４０３４１遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウスａｄｕｌｔ  ｍａｌｅ  ｂｏｎｅ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、４０３４１遺伝子を選択した。
【０１７７】
その結果、配列番号９に示すように、上記４０３４１遺伝子のｃＤＮＡは５９３個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記４０３４１タンパク質は、図３に示すように、Ｎ末端側の分泌シグナル配列に加えて、４つのＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）が認められた。また、セリン−グリシン配列が複数認められ、コンドロイチン硫酸が結合している可能性がある。膜貫通領域は存在しなかった。
【０１７８】
また、その相同性を比較すると、５７３アミノ酸からなるヒトＦＬＪ２１１２７タンパク質全長とアミノ酸レベルで６７．３％の相同性を示す。このことから、ヒトＦＬＪ２１１２７遺伝子は４０３４１遺伝子のヒトオルソログと考えられる。
【０１７９】
〔実施例１３：４０３４１タンパク質の発現〕
４０３４１遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号４６（フォワードプライマー）および配列番号４７のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、翻訳開始コドンＡＴＧを含む、配列番号９に示す４０３４１遺伝子の６９〜８７番目の塩基配列、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列、発現ベクターへ組込むためにＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーであり、リバースプライマーは、配列番号９に示す４０３４１遺伝子の１８３１〜１８５２番目の塩基配列を含み、発現ベクター組込みのためのＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１８０】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＧＧ−３’    （配列番号４６）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧ−３’    （配列番号４７）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、前記実施例４と同様にして、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃ（実施例３で作製）に挿入して、発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｆ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｆ細胞の培養上清を非還元条件下（ＮＲ）、還元条件下（Ｒ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図１２に示す。
【０１８１】
図１２に示すように、融合タンパク質は培養上清中に見いだされたことから、４０３４１タンパク質は分泌タンパク質であることがわかった。非還元条件下（ＮＲ）では高分子サイズの位置にスメアで検出され、還元条件下（Ｒ）では予想分子量サイズである９０ｋＤａ付近にシングルバンドとして検出された。還元条件下の１５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａ付近にうすくスメアバンドが見られるが、４０３４１タンパク質が翻訳後修飾を受けているかどうかは不明である。
【０１８２】
〔実施例１４：４０３４１遺伝子のマウス組織での発現〕
前記実施例９と同様にして、４０３４１遺伝子のマウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＰＣＲ反応で増幅した領域は配列番号９に示す塩基配列の１５３２番目〜１８６５番目で、以下に示すプライマーの組み合わせで増幅させた。
【０１８３】
５’−ＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＧＧ−３’    （配列番号４８）
５’−ＧＧＴＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＣＡＡＡＣＧＧ−３’  （配列番号４９）
その結果を図１３に示す。なお、予想バンドサイズは３３４ｂｐである。同図に示すように、肺でははっきりしたバンドが検出できなかったが、それ以外の調べた臓器ではすべて強く発現していた（図中の矢印で示す位置）。
【０１８４】
〔実施例１５：４０３４１タンパク質に対する抗体の作製〕
（１）抗原作製
４０３４１タンパク質のアミノ酸配列の中から２ケ所を選んでＧＳＴとの融合タンパクとして発現させ、免疫原とした。抗原に選んだ２ケ所のアミノ酸配列は配列番号１０に示す１６０番目〜３８９番目の領域と３９７番目〜５８２番目の領域とであり、実施例４に示した方法と同様に、抗原領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク発現ベクターに組み込んで融合タンパク質の大腸菌大量合成系に供した。
【０１８５】
ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、以下に示す通りで、配列番号５０と配列番号５１との組み合わせと、配列番号５２と配列番号５３との組み合わせとで増幅させた。また、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１  ｖｅｃｔｏｒに抗原領域を組みこむ際の制限酵素サイトはＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトとを用いた。
【０１８６】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＴＧＣＡＣＴＧ−３’  （配列番号５０）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＣＣＡＧＧＧＴＴＧＣＣＧＣＴＧＡＧＡ−３’  （配列番号５１）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧ−３’  （配列番号５２）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ−３’  （配列番号５３）
以下同様にして抗原発現大腸菌クローンを得た。
【０１８７】
（２）抗原の精製
実施例４の（２）と同様に行った。
【０１８８】
（３）抗原の免疫
得られた２種類の抗原タンパク質を重量比で１：１に混ぜ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に約９０ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０１８９】
（４）抗体の精製
実施例５（４）に記載した方法で抗体を精製した。
〔実施例１６：４０３４１タンパク質のマウス組織染色〕
実施例６に示したのと同じ方法で、４０３４１タンパク質特異的抗体でマウス各種臓器の免疫組織染色を行った。その結果を図１４（ａ）（ｂ）に示す。（ａ）、（ｂ）ともに、免疫染色後の１５日目胎児の筋肉細胞を示す図である（倍率２０倍）。同図に示すように、１５日目胎児の筋肉細胞の周囲の構造が、薄くだが、特異的に染まった。
【０１９０】
＜３５１１２遺伝子および３５１１２タンパク質＞
〔実施例１７：３５１１２遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス１６  ｄａｙｓ  ｎｅｏｎａｔｅ  ｔｈｙｍｕｓ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、３５１１２遺伝子を選択した。
【０１９１】
その結果、配列番号１１に示すように、上記３５１１２遺伝子のｃＤＮＡは５２７個のアミノ酸をコードしていると考えられた。上記３５１１２タンパク質は、図４に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、４つのＮ型結合糖鎖部位が認められた。
【０１９２】
また、その相同性を比較しても既知タンパク質との相同性は認められず、機能的にも未知な新規タンパク質をコードする遺伝子であった。
【０１９３】
〔実施例１８：３５１１２タンパク質の発現〕
３５１１２遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号５４（フォワードプライマー）および配列番号５５のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、翻訳開始コドンＡＴＧを含む、配列番号１１に示す３５１１２遺伝子の５０１〜５２４番目の塩基配列、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列、発現ベクターへ組込むためのＢｇｌＩＩサイトをその５’側に配したプライマーであり、リバースプライマーは、配列番号１１に示す３５１１２遺伝子の２０６２〜２０８７番目の塩基配列を含み、発現ベクター組込みのためのＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１９４】
５’−ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＡＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣ−３’    （配列番号５４）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＴＧ−３’    （配列番号５５）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、前記実施例４と同様にして、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃ（実施例３で作製）のＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩに挿入して、発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｆ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｆ細胞の培養上清を非還元条件下（ＮＲ）、還元条件下（Ｒ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図１５に示す。
【０１９５】
図１５に示すように、融合タンパク質は培養上清中に見いだされたことから、３５１１２タンパク質は分泌タンパク質であることがわかった。還元条件下（Ｒ）では、予想分子量サイズである９０ｋＤａ付近にシングルバンドとして検出された。一方、非還元条件下（ＮＲ）では予想される９０ｋＤａ付近のバンドの他にダイマーと思われる２００ｋＤａを超えるサイズのバンドも検出された。
【０１９６】
〔実施例１９：３５１１２遺伝子のマウス組織での発現〕
前記実施例９と同様にして、３５１１２遺伝子のマウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＰＣＲ反応で増幅した領域は配列番号１１に示す塩基配列の１６８１番目〜２１０８番目の領域で、以下に示すプライマーの組み合わせで増幅した。
【０１９７】
５’−ＴＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＧＡＡＧＴＣＣＧＧＧＴＧＧ−３’  （配列番号５６）
５’−ＧＡＡＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＴＡＴＡＧＣ−３’    （配列番号５７）
その結果、図１６に示すように、精巣でやや発現が弱いが、調べたすべての臓器で発現が認められた（図中矢印で示す位置）。発生の初期から成体の全身において普遍的に発現しているタンパク質であると思われる。なお、予想バンドサイズは４２８ｂｐである。
【０１９８】
〔実施例２０：３５１１２タンパク質に対する抗体の作製〕
（１）抗原作製
３５１１２タンパク質のアミノ酸配列の中から２ケ所を選んでＧＳＴとの融合タンパクとして発現させ、免疫原とした。抗原に選んだ２ケ所のアミノ酸配列は、配列番号１２に示す２５５番目〜３８４番目の領域と３８７番目〜Ｃ末端までの領域とであり、実施例４に示した方法と同様に、抗原領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターに組み込んで融合タンパクの大腸菌大量合成系に供した。
【０１９９】
ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、以下に示す通りで、配列番号５８と配列番号５９との組み合わせと、配列番号６０と配列番号６１との組み合わせで増幅した。また、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１  ｖｅｃｔｏｒに抗原領域を組みこむ際の制限酵素サイトは前者の場合ＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトとを、後者の場合ＳｍａＩサイトとＸｈｏＩサイトとを用いた。
【０２００】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＡＣＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＣＧ−３’    （配列番号５８）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＴＴＴＴＣＣ−３’  （配列番号５９）
５’−ＧＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＣ−３’  （配列番号６０）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＡＧＣＴＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＣ−３’  （配列番号６１）
以下、同様にして抗原発現大腸菌クローンを得た。
【０２０１】
（２）抗原の精製
実施例４の（２）と同様に行った。
【０２０２】
（３）抗原の免疫
得られた２種類の抗原タンパク質を重量比で１：１に混ぜ、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に約７４ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０２０３】
（４）抗体の精製
実施例５（４）に記載した方法で抗体を精製した。
〔実施例２１：３５１１２タンパク質のマウス組織染色〕
実施例６に示したのと同じ方法で、３５１１２タンパク質特異的抗体でマウス各種臓器の免疫組織染色を行った。その結果を図１７（ａ）〜（ｄ）に示す。（ａ）は免疫染色後の１５日目胎児の肩周辺に見える末梢神経線維を示す図であり（倍率４倍）、（ｂ）は１５日目の免疫染色後の胎児筋肉細胞を示す図であり（倍率２０倍）、（ｃ）は免疫染色後の１５日目胎児顎下腺を示す図であり（倍率１０倍）、（ｄ）は免疫染色後の１５日目胎児後脳脈絡叢を示す図である（倍率２０倍）。同図に示すように、１５日目胎児の末梢神経線維、筋肉細胞の周囲や顎下腺周囲の基底膜様構造が特異的に染まっていた。成体脳の神経線維も線条体など部位によって染まっているところがあった。
【０２０４】
＜マウステネイシン−Ｗ遺伝子およびマウステネイシン−Ｗタンパク質＞
〔実施例２２：マウステネイシン−Ｗ遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス１６  ｄａｙｓ  ｅｍｂｒｙｏ  ｈｅａｄ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から細胞外マトリックスタンパク質に特徴的なモチーフ配列を含むｃＤＮＡとして、マウステネイシン−Ｗ遺伝子を選択した。
【０２０５】
その結果、配列番号１３に示すように、上記マウステネイシン−Ｗ遺伝子のｃＤＮＡは９４０個のアミノ酸をコードしていると考えられた。上記マウステネイシン−Ｗタンパク質は、図５（ａ）に示すように、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメインの繰り返し構造とＣ末端側にフィブリノーゲンＣドメインを有しており、新規なテネイシンファミリータンパク質と予想されるが、Ｎ末端に明確な開始コドンが決定できないこと、テネイシンファミリータンパク質はＮ末端の分泌シグナル配列の他にＥＧＦ様リピート構造を持つことなどから、今回決定されたｃＤＮＡ塩基配列は５’側が欠損していると思われる。
【０２０６】
また、その相同性を比較すると哺乳類の既知テネイシンファミリータンパク質よりもＺｅｂｒａ  ｆｉｓｈで報告されているテネイシン−Ｗタンパク質との相同性の方が高かったので、この遺伝子はマウステネイシン−Ｗ遺伝子であると考えられる。
【０２０７】
〔実施例２３：マウステネイシン−Ｗ遺伝子のマウス組織での発現〕
前記実施例９と同様にして、マウステネイシン−Ｗ遺伝子のマウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＰＣＲ反応で増幅した領域は配列番号１３に示す塩基配列の２４６７番目〜２８１２番目で、以下に示すプライマーの組み合わせで増幅した。
【０２０８】
５’−ＣＴＡＣＡＴＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＣＣ−３’  （配列番号６２）
５’−ＣＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＣＡＣＣＣＣ−３’    （配列番号６３）
その結果を図１８に示す。なお、予想バンドサイズは３４６ｂｐである。同図に示すように、１５日目胎児、１７日目胎児、骨髄、腎臓、肺、リンパ節、脾臓、胃での強い発現が認められ、また、７日目胎児、１１日目胎児、脳、脊髄、眼、唾液腺、平滑筋などの組織でも発現しているのが観察された。一方、肝臓、前立腺、精巣などでは検出感度以下であった（図中、矢印で示す位置）。
【０２０９】
〔実施例２４：マウステネイシン−Ｗタンパク質に対する抗体の作製〕
（１）抗原作製
マウステネイシン−Ｗタンパク質のアミノ酸配列の中から１ケ所（配列番号１４に示すアミノ酸配列の２０５番目〜３７６番目）を選んでＧＳＴとの融合タンパク質として発現させ、免疫原とした。実施例４に示した方法と同様に、抗原領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターに組み込んで融合タンパクの大腸菌大量合成系に供した。
【０２１０】
ＰＣＲ反応に用いたプライマーは以下に示す通りで、また、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１  ｖｅｃｔｏｒに抗原領域を組みこむ際の制限酵素サイトは、ＥｃｏＲＩサイトとＸｈｏＩサイトとを用いた。
【０２１１】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＴＴＧＡＣＡＧＣ−３’  （配列番号６４）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣ−３’  （配列番号６５）
以下同様にして抗原発現大腸菌クローンを得た。
【０２１２】
（２）抗原の精製
実施例４の（２）と同様に行った。
【０２１３】
（３）抗原の免疫
得られた抗原タンパク質を、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に７８ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０２１４】
（４）抗体の精製
実施例５（４）に記載した方法で抗体を精製した。
〔実施例２５：マウステネイシン−Ｗタンパク質のマウス組織染色〕
実施例６に示したのと同じ方法で、マウステネイシン−Ｗタンパク質特異的抗体でマウス各種臓器の免疫組織染色を行った。その結果を図１９（ａ）〜（ｄ）に示す。（ａ）は免疫染色後の１５日目胎児の頭蓋を示す図であり（倍率４倍）、（ｂ）は免疫染色後の１５日目胎児の背骨と食道とを示す図であり（倍率４倍）、（ｃ）は免疫染色後の１５日目胎児の消化管を示す図であり（倍率１０倍）、（ｄ）は免疫染色後の成体における眼の隅角を示す図である（倍率２０倍）。同図に示すように、１５日目胎児では、頭蓋、背骨、肋骨などの周囲や食道や腸管の筋層などが染まっていた。また、成体では眼の隅角にあるシュレム管周辺と思われる場所がメッシュ状に染まっていた。
【０２１５】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、それぞれ特徴的な機能を有する新規な細胞外マトリックス因子であり、細胞外マトリックスの研究に関わる研究用試薬のみならず、各タンパク質の機能が関与する疾患、疾病の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬として有効利用できる可能性がある。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生、生体外における人工組織形成等に利用できる可能性がある。
【０２１６】
【配列表】
2004180541.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、本発明に係る２５１６７遺伝子におけるスプライシングパターンの違いにより、３種類のバリアントタンパク質が生産されることを示す図であり、（ｂ）は２５１６７バリアント２タンパク質の一次構造を示す模式図である。
【図２】本発明に係る２９０２７タンパク質の一次構造を示す模式図である。
【図３】本発明に係る４０３４１タンパク質の一次構造を示す模式図である。
【図４】本発明に係る３５１１２タンパク質の一次構造を示す模式図である。
【図５】（ａ）は本発明に係るマウステネイシン−Ｗタンパク質の一次構造を示す模式図であり、（ｂ）はデータベースから予測されるタンパク質の構造を対応する位置に分けて示す模式図である。
【図６】（ａ）は、実施例にて用いたプラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃの構造を示す模式図であり、（ｂ）は、上記プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃのマルチクローニングサイトを示す塩基配列である。
【図７】２５１６７−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を発現するベクターを導入した２９３Ｆ細胞の培養液上清を、非還元条件下または還元条件下にて電気泳動し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体にてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、２５１６７タンパク質の各組織内での発現を特異抗体により検出した免疫組織染色の結果を示す図である。
【図９】２９０２７−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクターを導入した２９３Ｆ細胞の培養液上清を、非還元条件下または還元条件下にて電気泳動し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体にてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図１０】マウスの各組織における２９０２７遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】（ａ）〜（ｄ）は、２９０２７タンパク質の各組織内での発現を特異抗体により検出した免疫組織染色の結果を示す図である。
【図１２】４０３４１−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を発現するベクターを導入した２９３Ｆ細胞の培養液上清を、非還元条件下または還元条件下にて電気泳動し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体にてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図１３】マウスの各組織における４０３４１遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１４】（ａ）（ｂ）は、４０３４１タンパク質の各組織内での発現を特異抗体により検出した免疫組織染色の結果を示す図である。
【図１５】３５１１２−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を発現するベクターを導入した２９３Ｆ細胞の培養液上清を、非還元条件下または還元条件下にて電気泳動し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体にてウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【図１６】マウスの各組織における３５１１２遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１７】（ａ）〜（ｄ）は、３５１１２タンパク質の各組織内での発現を特異抗体により検出した免疫組織染色の結果を示す図である。
【図１８】マウスの各組織におけるマウステネイシン−Ｗ遺伝子のｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１９】（ａ）〜（ｄ）は、マウステネイシン−Ｗタンパク質の各組織内での発現を特異抗体により検出した免疫組織染色の結果を示す図である。
【図２０】（ａ）は、実施例にて用いたプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐの構造を示す模式図であり、（ｂ）は、上記プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ２Ｐのマルチクローニングサイトを示す塩基配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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